ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT PHENOLIC
TỪ MỘT SỐ THỰC VẬT VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
1
Hà Nội - 2012
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
MỤC LỤC
Trang
MỞ
ĐẦU………………………………………………………………………………1
Chƣơng 1: TỔNG
QUAN…………………………………………………………….3
1.1 Các hợp chất phenolic thực
vật...………………………………………………...3
1.1.1 Giới thiệu về các hợp chất phenolic thực
vật………………………………3
1.1.2 Phân loại các hợp chất phenolic…………………………………………….3 1.1.3 Hoạt tính sinh học của các hợp chất
phenolic…………………………….9
1.1.4 Phƣơng pháp chiết và phân lập các hợp chất
phenolic………………….10
1.1.4.1 Phƣơng pháp
chiết…………………………………………………….11
1.1.4.2 Phƣơng pháp phân lập và tinh
chế…………………………………..14
1.1.4.3 Định tính và xác định cấu
trúc………………………………………16
1.2 Giới thiệu về cây Chẹo lá phong (Engelhardtia spicata Lesh ex.
Blume)…..19
1.2.1 Đặc điểm thực vật
1
học…………………………………………………….19
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
1.2.2 Nơi sống và thu
hái………………………………………………………..19
1.2.3 Công dụng của cây Chẹo lá
phong……………………………………...19
1.1.4 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Engelhardtia (Juglandaceae)……………………………………………………….21
2 Ch ¬ng : NHIỆM VỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU…………………23
2.1 NhiÖm vô cña LuËn
v¨n………………………………………………………..23
2.2 Ph ¬ng ph¸p nghiªn
cøu……………………………………………………….24
2.2.1 C¸c ph ¬ng ph¸p ph©n tÝch, ph©n t¸ch c¸c hçn hîp vµ ph©n lËp c¸c
hîp
chÊt…………………………………………………………………………………..
24
2.2.2 C¸c ph ¬ng ph¸p x¸c ®Þnh cÊu
tróc………………………………………..24
Chƣơng 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO
LUẬN………………………………………...26
3.1 Đối tƣợng nghiên cứu…………………………………………………………...26
chiết các phần chiết từ lá cây Chẹo lá
trình 3.2 Quy phong……………………...26
Phân phần tách chiết etyl axetat
3.3 (EG3)……………………………………….29
Phân phần tách chiết nƣớc
2
3.4 (EG4)……………………………………………..31
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
3.5 Cấu trúc các hợp chất đƣợc phân
lập………………………………………….33
Chƣơng 4: THỰC
NGHIỆM……………………………………………………….38
4.1 Thiết bị và hóa
chất……………………………………………………………..38
4.2 Nguyên liệu thực
vật…………………………………………………………….39
4.3 Điều chế các phần chiết từ cây Chẹo lá
phong………………………………..39
4.4 Phân tích và phân tách phần chiết etyl axetat
(EG3)………………………...40
4.4.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết etyl axetat
(EG3)………………..40
4.4.2 Phân tách phần chiết etyl axetat
(EG3)………………………………….40
Phân sắc kí cột phần chiết nƣớc
4.5 tách (EG4)…………………………………..41
tích sắc ký lớp mỏng phần chiết nƣớc
4.5.1 Phân (EG4)……………………...41
Phân tách phần chiết nƣớc
4.5.2 (EG4)………………………………………..42
4.6 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân lập……………..43
KẾT
LUẬN………………………………………………………………………….46
TÀI LIỆU THAM
3
KHẢO………………………………………………………….47
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN
CC (Column Chromatography): Sắc ký cột thường dưới trọng lực dung môi 13C-NMR (Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
cacbon 13
DEPT (Distortionless Enhancement by Polarition Tranfer): Phổ DEPT
ESI-MS (Electrospray Ionization-Mass Spectrometry): Phổ khối lượng phun bụi
điện tử
FC (Flash Chromatography): Sắc kí cột nhanh 1H-NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
proton
LC (Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng
Mini-C (Mini-column Chromatography): Sắc kí cột tinh chế
4
TLC (Thin-Layer Chromatography): Sắc kí lớp mỏng
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
MỤC LỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ
H×nh 1.1: Cấu trúc minh häa của stilben và lignin
H×nh 1.2: Cấu trúc minh häa của flavonoid, axit phenolic và tannin
H×nh 1.3: Cây Chẹo l¸ phong ( Engelhardtia spicata Lesh ex. Blume, Juglandaceae
)
B¶ng 1.1: Phân loại các hợp chất phenolic thiên nhiên
Bảng 4.1: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ lá cây Chẹo lá phong
Bảng 4.2: Phân tích phần chiết etyl axetat (EG3) bằng TLC
Bảng 4.3: Phân tích phần chiết nước (EG4) bằng TLC
Sơ đồ 1.1: Quy trình chung phân lập các hợp chất phenolic
Sơ đồ 3.1: Điều chế các phần chiết hữu cơ từ nguyên liệu thực vật
Sơ đồ 3.2: Phân tách sắc kí phần chiết etyl axetat (EG3)
5
Sơ đồ 3.3: Phân tách sắc kí phần chiết nước (EG4)
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
MỞ ĐẦU
Các hợp chất phenolic thực vật như các axit phenolic, các flavonoid và các
flavonoid polyme đang ngày càng thu hút được nhiều sự quan tâm do tính chất
chống oxi hóa, tác dụng phòng ngừa ung thư và các bệnh liên quan đến tim mạch
của các hợp chất phenolic. Các nghiên cứu (hóa học, dược lý học, lâm sàng) đã
phần nào lý giải được mối liên quan giữa sức khỏe con người và việc tiêu thụ các
sản phẩm thực phẩm giàu các hoạt chất phenolic thiên nhiên.
Các nghiên cứu theo hướng phát hiện các hợp chất có tác dụng dự phòng ung
thư (cancer chemoprevention) đã thiết lập được một hướng ứng dụng mới của các
hợp chất phenolic. Các hợp chất phân tử nhỏ này thường là các chất chống oxi hóa
và có thể làm giảm sự phát triển của bệnh ung thư bằng cách ngăn chặn sự phát
triển của các tế bào ung thư qua các cơ chế ngăn chặn sự hư hại ADN hoặc ức chế
hoặc đảo ngược quá trình phát triển của các tế bào tiền ác tính đã có sự hư hại
ADN. Một chương trình nghiên cứu các tác nhân dự phòng và chống ung thư từ
nguồn thực vật Việt Nam của chúng tôi đã được xây dựng trên cơ sở lựa chọn các
nhóm hợp chất có các cấu trúc tiềm năng; trong chương trình này các hợp chất
phenolic có tác dụng dự phòng ung thư đã được phát hiện với tỷ lệ cao. Chương
trình nghiên cứu này cũng đã xác định một thách thức được đặt ra cho các nhà hóa
học các hợp chất thiên nhiên là cần có các qui trình phân lập hiệu quả các nhóm cấu
trúc cần thiết từ các nguồn nguyên liệu thực vật, các qui trình này phải dễ được triển
khai tiếp cho các qui mô công nghệ phân lập lượng lớn hoạt chất một khi các hoạt
chất hữu ích được phát hiện.
Các hợp chất phenolic chiếm một vị trí đáng kể trong số các nhóm hợp chất
thiên nhiên có tác dụng dự phòng ung thư; chúng có cấu trúc đa dạng và xuất hiện
phổ biến trong giới thực vật. Việc phân lập các hợp chất này cho các thử nghiệm
hoạt tính sinh học có thể được thực hiện bằng các phương pháp chiết và sắc ký điều
chế; tuy nhiên phổ rộng độ tan của các hợp chất này cho thấy mỗi qui trình phân lập
6
nên được giới hạn vào một nhóm hợp chất phenolic. Các sàng lọc sắc ký lớp mỏng
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
sơ bộ đã xác định được nhóm hợp chất phenolic trong các phần chiết từ các loài
cây: Alnus nepalensis D. Don (Betulaceae), Betula alnoides Buch. Ham. ex D. Don
(Betulaceae) và Engelhardtia spicata Lesch. ex. Blume (Juglandaceae). Mục tiêu
nghiên cứu của luận văn này là xây dựng một qui trình chiết các phần chiết giàu các
hợp chất phenolic và phân lập sắc ký các hợp chất phenolic, sau đó cấu trúc chính
xác của các các hợp chất được phân lập sẽ được xác định bằng các phương pháp
phổ hiện đại. Qui trình này đã được áp dụng thành công để phân lập các hợp chất
7
phenolic thành phần chính từ lá cây Chẹo lá phong (E. spicata Lesch. ex. Blume).
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1 Các hợp chất phenolic thực vật
1.1.1 Giới thiệu về các hợp chất phenolic thực vật [6]
Các hợp chất phenolic là các hợp chất có một hoặc nhiều vòng thơm với một hoặc
nhiều nhóm hydroxy. Chúng được phân bố rộng rãi trong giới thực vật và là các sản
phẩm trao đổi chất phong phú của thực vật. Hơn 8.000 cấu trúc phenolic đã được
tìm thấy, từ các phân tử đơn giản như các axit phenolic đến các chất polyme như
tannin.
Các hợp chất phenolic thực vật có tác dụng chống lại bức xạ tia cực
tím hoặc ngăn chặn các tác nhân gây bệnh, ký sinh trùng và động vật ăn thịt, cũng
như làm tăng các màu sắc của thực vật. Chúng có ở khắp các bộ phận của cây và
vì vậy, chúng cũng là một phần không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con
người.
Các hợp chất phenolic là thành phần phổ biến của thức ăn thực vật (trái cây, rau,
ngũ cốc, ô liu, các loại đậu, sô-cô-la, vv) và đồ uống (trà, cà phê, bia, rượu, vv), và
góp phần tạo nên các đặc tính cảm quan chung của thức ăn thực vật. Ví dụ, các
hợp chất phenolic làm tăng vị đắng, sự se của trái cây và nước trái cây, bởi vì sự
tương tác giữa các hợp chất phenolic, chủ yếu là các procyanidin và glycoprotein
trong nước bọt. Các anthocyanin, một trong sáu phân nhóm của một nhóm
polyphenol thực vật lớn được gọi là các flavonoid, tạo màu da cam, đỏ, xanh
và màu tím của nhiều loại trái cây và rau quả như táo, quả, củ cải và hành tây. Các
hợp chất phenolic được biết đến như là những hợp chất quan trọng nhất ảnh
hưởng đến hương vị và sự khác biệt màu sắc giữa các loại rượu vang trắng, hồng
và đỏ, các hợp chất này phản ứng với oxy và có ảnh hưởng đến việc bảo quản, lên
men và cất giữu rượu vang.
8
1.1.2 Phân loại các hợp chất phenolic [6, 10]
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Các hợp chất phenolic có cấu trúc rất đa dạng và có thể được chia thành 10
nhóm chính được đưa ra trong Bảng 1.1.
B¶ng 1.1: Phân loại các hợp chất phenolic thiên nhiên
Nhóm Cấu trúc cơ bản Số nguyên tử cacbon Nguồn gốc thực vật
Phenol đơn giản C6
Benzoquinon
Axit benzoic C6-C1 Cranberry, ngũ cốc
Táo, mơ,
Acetophenon C6-C2 chuối, súp lơ
Axit phenylaxetic
Axit cinnamic C6-C3
Cà rốt, cam, quýt,cà chua, rau bina, đào, ngũ cốc, lê, cà tím
Phenylpropen
Cà rốt, cần tây, cam chanh, rau mùi tây
9
Coumarin
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Nhóm Cấu trúc cơ bản Số nguyên tử Cacbon Nguồn gốc thực vật
Chromon C6-C3
Naphthoquinon Các loại hạt C6-C4
Xanthon C6-C1-C6
Xoài, măng cụt
Stilben C6-C2-C6
Nho
Anthraquinon
Flavonoid C6-C3-C6 Phân bố rộng
Lignan, Neolignan (C6-C3)2
10
Mè, lúa mạch đen, lúa mì, lanh
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Nhóm Cấu trúc cơ bản Nguồn gốc thực vật Số nguyên tử Cacbon
Tannin thủy phân (C6-C1)n Lựu, quả mâm xôi Polyme không đồng nhất được tạo thành từ các axit phenolic và đường đơn
Lignin Các polime thơm liên kết (C6-C3)n
Các hợp chất phenolic thực vật bao gồm các stilben, các lignan (Hình 1.1), các
axit phenolic, các flavonoid và các tannin (Hình 1.2).
11
Hình 1.1: Cấu trúc minh họa của stilben và lignan
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
H×nh 1.2: Cấu trúc minh häa của flavonoid, axit phenolic và tannin
7
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Các flavonoid là các polyphenol có nhiều nhất trong thức ăn của chúng ta. Một
cấu trúc flavonoid cơ bản là nhân flavan, chứa 15 nguyên tử cacbon được sắp xếp
theo ba vòng (C6-C3-C6), được kí hiệu là A, B và C. Các flavonoid được chia thành
sáu phân nhóm: flavon, flavonol, flavanol, falavanon, isoflavon và anthocyanin theo
trạng thái oxy hóa của vòng C trung tâm.
Sự thay đổi cấu trúc của chúng trong mỗi nhóm một phần là do mức độ và mô
hình hydroxyl hóa, methoxyl hóa, prenyl hóa, hoặc glycosyl hóa.
Một số chất flavonoid phổ biến nhất bao gồm quercetin, một flavonol có rất nhiều
trong hành tây, bông cải xanh, táo; catechin, một flavonol được tìm thấy trong trà và
một số loại trái cây; naringenin, một flavonol có trong quả bưởi; các cyaniding
glycoside, anthocyanin có nhiều trong các loại trái cây mọng (nho đen, mâm xôi,
blackberry, …) và daidzein, genistein và glycitein, các isoflavon trong đậu tương.
Các axit phenolic có thể được chia thành hai nhóm: nhóm các dẫn xuất của axit
benzoic chẳng hạn như axit gallic và nhóm các dẫn xuất của axit cinnamic như
axit coumaric, axit caffeic và axit ferulic. Axit caffeic là một axit phenolic phổ biến
nhất, chứa trong nhiều loại trái cây và rau quả, thường được este hóa với axit quinic
trong axit chlorogenic, là một hợp chất phenolic chủ yếu trong cà phê. Một axit
phenolic phổ biến khác là axit ferulic, đó là chất có trong ngũ cốc và được este hóa tạo
thành các hemicelluose có trong thành tế bào.
Các tannin là một nhóm lớn các polyphenol trong khẩu phần ăn của chúng ta
và thường được chia thành hai nhóm: nhóm các tannin thủy phân và nhóm các
tannin ngưng tụ. Các tannin thủy phân là các hợp chất có chứa nhân của glucose
hoặc polyol khác, được este hóa với axit galic tạo thành các gallotannin, hoặc với axit
hexahydroxydiphenic tạo thành các gellagitannin. Sự đa dạng trong cấu trúc của các
hợp chất này là do khả năng hình thành các liên kết oxy. Phản ứng oxy hóa giữa các
phân tử tạo thành nhiều hợp chất oligomeric có khối lượng phân tử khoảng 2.000 đến
35
5.000 dalton. Các tannin ngưng tụ là các oligome hoặc polymer của flavan-3-ol liên kết
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
với nhau bằng một liên kết cacbon giữa các flavan. Chúng cũng được coi là các
proanthocyanidin bởi vì chúng bị phân hủy thành các anthocyanidin thông qua phản
ứng oxy hóa, trong điều kiện xúc tác axit, nhiệt độ với các dung dịch rượu. Sự đa
dạng cấu trúc các tannin là một kết quả của sự biến đổi trong mô hình thủy phân, lập
thể tại ba trung tâm lập thể, vị trí và loại liên kết giữa các flavan, cũng như mức
độ và mô hình của sự glycosyl hóa, methoxyl hóa và galloyl hóa.
1.1.3 Hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic
Do sự phân bố rộng rãi, các polyphenol có vai trò đối với sức khỏe của con người
nên chế độ ăn uống dinh dưỡng được chú ý trong những năm gần đây. Các nhà nghiên
cứu và các nhà sản xuất thực phẩm đã tập trung vào các polyphenol có đặc tính chống
oxy hóa mạnh trong chế độ ăn uống, các hiệu ứng đáng tin cậy của chúng trong việc
phòng ngừa những chứng bệnh căng thẳng oxy hóa liên quan.Theo các nghiên cứu
dịch tễ học, hấp thụ các hợp chất phenolic sẽ giảm được nguy cơ mắc các bệnh tim
mạch ngăn ngừa được bệnh ung thư. Hơn nữa các polyphenol còn có các tác dụng sinh
lý học cụ thể trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh [6].
Các catechin được tìm thấy nhiều trong hạt nho, trà, ca cao, có tác dụng chống
oxy hóa và có hiệu quả ngăn ngừa ung thư [30].
Các tannin có nhiều trong rượu vang đỏ, trà và các loại hạt làm phát huy các tác
dụng sinh lý, chúng có thể làm giảm áp lực máu, thúc đẩy đông máu, giảm nồng độ
lipit trong huyết thanh, điều chỉnh sự đáp ứng miễn dịch và ngăn ngừa hoại tử gan [10,
30].
Các isoflavon, genistein và daidzein (được tìm thấy trong đậu nành và có ảnh
hưởng tốt đến xương ở phụ nữ mãn kinh, cùng với một số tác dụng nội tiết tốt [30].
Các procyanidin có nồng độ cao trong rượu vang đỏ, nho và hạt nho, ca cao,
nam việt quất, táo, có tác dụng chống viêm và có ảnh hưởng rất tốt đến hệ thống mạch
máu. Chất này cũng được sử dụng làm chất phụ gia thực phẩm để ngăn chặn quá trình
35
oxy hóa của các thành phần trong thực phẩm [30].
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Một stilben, resveratrol là một polyphenol đặc biệt, có tiềm năng chống ung thư
và chống lão hóa [30].
Các quercetin (đại diện chính của lớp flavonol, chứa nhiều trong hành tây, táo,
rượu vang đỏ, bông cải xanh, trà) ức chế chất sinh ung thư và có tác dụng chống oxy
hóa của huyết tương trong cơ thể [30].
1.1.4 Phƣơng pháp chiết và phân lập các hợp chất phenolic
1.1.4.1 Phƣơng pháp chiết
Chiết là một trong những bước quan trọng nhất trong tiền xử lý mẫu nghiên cứu,
là các quy trình được sử dụng nhiều nhất do sự dễ sử dụng, hiệu quả và khả năng áp
dụng rộng [8]. Nói chung, hiệu suất chiết phụ thuộc vào dạng dung môi với các độ
phân cực khác nhau, thời gian chiết và nhiệt độ, tỷ lệ mẫu và dung môi cũng như thành
phần hóa học và các đặc tính vật lý của các mẫu. Độ tan của các phenolic được quyết
định bởi bản chất hóa học của mẫu thực vật, cũng như độ phân cực của các dung môi
được sử dụng. Các nguyên liệu thực vật có thể chứa các hợp chất phenolic từ các hợp
chất đơn giản (ví dụ: các axit phenolic, các anthocyanin) đến các chất được polymer
hóa cao (ví dụ: các tannin ở các lượng khác nhau). Hơn thế nữa các hợp chất phenolic
cũng có thể liên kết với các thành phần thực vật khác như cacbohydrat và các protein.
Do đó phụ thuộc vào hệ dung môi được sử dụng trong khi chiết, một hỗn hợp các hợp
chất phenolic tan trong dung môi sẽ được chiết khỏi nguyên liệu thực vật. Hỗn hợp này
có thể chứa các chất phi phenolic như: đường, các tecpen, các chlorophyll, các axit hữu
cơ và các chất béo [11, 25].
1.1.4.1.1 Chiết bằng dung môi
Các phương pháp chiết các hợp chất phenolic đơn giản (axit benzoic, andehit
bezoic, axit cinnamic và catechin) từ các nguyên liệu rắn chủ yếu được ngâm chiết với
các dung môi hữu cơ. Hiệu suất chiết phụ thuộc vào dạng dung môi với các độ phân
cực khác nhau, thời gian chiết và các đặc trưng vật lý của mẫu chiết. Ánh sáng, không
35
khí và nhiệt độ là các yếu tố thúc đẩy các phản ứng thoái biến.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Các dung môi như: etanol, metanol, propanol, aceton, etyl acetat, và sự kết
hợp của các dung môi này với tỷ lệ khác nhau của nước cũng được sử dụng để chiết
các hợp chất phenolic. Nói chung, chiết dung môi được sử dụng ở độ phòng để tránh sự
thoái biến của các hợp chất phenolic; nhiều nghiên cứu sử dụng nhiệt độ khoảng 20- 40oC. Các hợp chất phenolic bị thủy phân ở nhiệt độ 80-95ºC (sự thủy phân axit)
hoặc 45ºC (sự thủy phân bazơ).
Các anthocyanin thường được chiết từ nguyên liệu thực vật với một dung môi
hữu cơ được axit hóa, phổ biến nhất là metanol. Hệ dung môi này phá hủy các màng tế
bào, hòa tan đồng thời cả các anthocyanin và ổn định chúng. Tuy nhiên, axit có thể
đem lại sự thay đổi dạng gốc của các anthocyanin bằng cách phá vỡ các phức của
chúng với các kim loại và các sắc tố [31].
Việc thu hồi các hợp chất phenolic từ nguyên liệu thực vật cũng bị ảnh
hưởng bởi thời gian chiết và nhiệt độ, thể hiện tác dụng của sự hòa tan và sự thoái hóa
chất phân tích do quá trình oxy hóa. Tăng nhiệt độ chiết có thể thúc đẩy quá trình hòa
tan chất phân tích bằng cách tăng cả độ tan và tốc độ truyền khối. Ngoài ra, độ
nhớt và sức căng bề mặt của dung môi được giảm xuống ở nhiệt độ cao hơn, giúp các
dung môi tiếp cận được các mẫu chiết, cải thiện tỷ lệ chiết. Tuy nhiên, các hợp
chất phenolic có thể dễ dàng bị thủy phân và oxy hóa. Thời gian chiết lâu dài và nhiệt
độ cao làm tăng khả năng của quá trình oxy hóa các hợp chất phenolic, giảm
sản lượng phenol trong các chất chiết xuất. Ví dụ, thông thường chiết và cô đặc các anthocyanin thường được tiến hành ở nhiệt độ 20-50°C, vì nhiệt độ cao hơn 70oC đã
chứng minh là gây ra sự thoái biến nhanh các anthocyanin. Vì vậy, các yếu tố này đóng
vai trò quan trọng để lựa chọn phương pháp chiết hiệu quả và duy trì sự ổn định của
các hợp chất phenolic [11].
1.1.4.1.2 Chiết pha rắn (SPE) [11, 26]
Chiết pha rắn (SPE) là một kỹ thuật chuẩn bị mẫu trong phân tích ngày càng hữu
35
ích. Với SPE, những vấn đề liên quan đến chiết hai pha lỏng (LLE), chẳng hạn như sự
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
phân tách không hoàn toàn, độ thu hồi thấp, sử dụng và loại bỏ lượng lớn, dung môi
hữu cơ đắt tiền có thể tránh được, mặc dù chi phí của các thiết bị cần thiết cho SPE cao
hơn so với LLE. Kỹ thuật này thường được sử dụng nhất để chuẩn bị các mẫu lỏng và
các chất phân tích bay hơi hoặc không bay hơi, nhưng cũng có thể được sử dụng
với chất rắn được chiết trước vào các dung môi. Các kỹ thuật SPE đa dạng với nhiều
loại chất hóa học, các chất hấp phụ, và kích thước, do đó cần thiết để lựa chọn sản
phẩm SPE phù hợp cho mỗi ứng dụng và mẫu chiết. Phân tích SPE đã được thử
nghiệm để xác định các hợp chất phenolic trong nho, rượu vang và các đồ uống.
Trường hợp chiết các hợp chất phenolic từ các mẫu dầu ô-liu cũng đã được nghiên cứu
rộng rãi.
1.1.4.1.3 Chiết chất lỏng siêu tới hạn (SFE) [4, 19, 24]
Thông thường, các hợp chất phenolic được chiết từ các mẫu thực vật bằng
phương pháp SPE kết hợp các kỹ thuật khác, chẳng hạn chiết chất lỏng siêu tới hạn
(SFE). SFE là một kỹ thuật mới cho ưu điểm hơn so với phương pháp truyền thống,
như sử dụng nhiệt độ thấp, giảm tiêu thụ năng lượng và cho chất lượng sản phẩm cao
do không dùng dung môi trong pha hòa tan.Tuy nhiên, kỹ thuật này được áp dụng cho
các hợp chất phân cực thấp hoặc trung bình. SFE thường được mô tả để chiết các
polyphenol, các đặc điểm chính của phương pháp này là cần các tỷ lệ phần trăm
cao của các chất biến cải hữu cơ, điều này có nghĩa rằng quá trình này xảy ra trong các
điều kiện dưới tới hạn.
Cacbon đioxit siêu tới hạn (SC-CO2) là dung môi được sử dụng rộng rãi nhất cho
SFE do đặc điểm đặc biệt của nó, như điều kiện tới hạn (31,1ºC và 73,8 MPa) và sẵn
có. Đây là phương pháp không độc hại, không dễ cháy nổ và bền hóa
học. Tuy nhiên, SFE sử dụng CO2 làm dung môi chiết không được áp dụng cho các
hợp chất phenolic vì CO2 phân cực thấp hơn so với hầu hết các phenol.
Thông thường, quá trình chiết này có các bước sau: mẫu được nạp lên trên
35
chất hấp phụ của cột SPE và các cột này được lắp vào các bộ phận chiết SPE/SFE. Các
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
chất lỏng siêu tới hạn được sử dụng, có thể là cacbon dioxit, phải đi qua các cột SPE
được đổ đầy mẫu đã được thủy phân. Do đó, các chất phân tích (các hợp chất phenolic)
bị giữ lại toàn lượng bởi một dung môi bẫy (ví dụ: metanol) ở nhiệt độ phòng thí
nghiệm (các dung môi bẫy được làm lạnh tự nhiên trong suốt quá trình chiết bởi sự
giãn nở CO2). Cuối cùng, các dịch chiết được cô quay kiệt, hòa tan trong các pha
động, và được bơm trực tiếp vào hệ thống HPLC/ESI-MS.
1.1.4.1.4 Chiết lỏng dưới áp suất nén (PLE) [15,18]
Chiết lỏng dưới áp suất nén (PLE) sử dụng các dung môi hữu cơ ở các áp
suất cao và nhiệt độ trên điểm sôi bình thường của chúng. Đây là phương pháp hiện đại
mới nhất để phân lập riêng chất phân tích từ các mẫu rắn. Nói chung, với LLE, một
mẫu rắn được nạp vào bộ phận chiết bằng thép không gỉ và được chiết với một dung
môi thích hợp dưới nhiệt độ cao (40-200ºC) và áp lực (5-300 psi) trong một thời gian
ngắn (5-15 phút). Các dịch chiết được gộp vào một bình thu mẫu bằng một loại
khí nén.
Qui trình được mô tả bởi Alonso-Salces và cộng sự, dựa trên sự chiết
polyphenol từ các mẫu táo. PLE đã được chứng minh là một phương pháp chiết hiệu
quả để phân lập các polyphenol và nhiệt độ cao đã được sử dụng để đẩy nhanh quá
trình chiết.
1.1.4.1.5 Chiết bằng vi sóng (MAE) [5, 27]
Công nghệ vi sóng thường được biết đến với việc sử dụng để xử lý nhiệt. Ví dụ,
nó được sử dụng như một quá trình nhiệt cho các sản phẩm trái cây thương phẩm để
đạt được sự khử trùng nhanh và êm dịu của các sản phẩm này. Đồng thời, vi sóng được
sử dụng để xác định độ ổn định của hàm lượng polyphenol sau xử lý. Công nghệ này
cũng được sử dụng để tăng quá trình làm khô trong rượu vang và các mẫu nho tươi, cải
thiện sự tiền xử lý và là qui trình hữu ích để kiểm tra các hợp chất phenolic.
Gần đây, phương pháp chiết bằng vi sóng (MAE), còn được gọi là quá trình vi
35
sóng hỗ trợ (MAP), đã được áp dụng trong việc phát triển các phương pháp chiết các
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
hợp chất hữu cơ từ đất, trầm tích, hạt giống, và các mẫu thực phẩm. Các nghiên cứu
này cho thấy chiết hiệu quả hơn khi năng lượng lò vi sóng được sử dụng. Nghiên cứu
của Sutivisedsak và cộng sự, đã chứng minh tiện ích của vi sóng trong xác định hàm
lượng phenolic trong tám loại đậu thông thường, sử dụng phương pháp đo màu Folin-
Ciocalteau.
1.1.4.1.6 Chiết siêu âm (UAE) [8, 18, 32]
Bức xạ siêu âm là một trợ giúp mạnh mẽ các bước khác nhau của quá
trình phân tích. Năng lượng này giúp nhiều trong việc xử lí các mẫu rắn vì nó làm dễ
dàng và tăng tốc độ các quá trình chiết các hợp chất hữu cơ và vô cơ, đồng nhất và
nhiều ứng dụng khác. Ví dụ, các hệ thống chiết siêu âm đã được sử dụng rộng rãi để
chiết xuất capsaicinoid trong ớt nóng.
Chiết bằng siêu âm (UAE) được cho là một trong các kỹ thuật chiết đơn giản bởi
vì nó dễ thực hiện bằng các thiết bị thông thường trong phòng thí nghiệm. Trong
phương pháp này, mẫu được nghiền nát trộn với dung môi thích
hợp và được đặt vào bể siêu âm, nơi mà nhiệt độ và thời gian chiết định.
Các ứng dụng của chiết siêu âm (UAE) trong công nghệ chế biến thực phẩm dễ
cho việc chiết các thành phần từ các nguyên liệu thực vật. Hiệu suất cao đạt được
trong các qui trình UAE là quan tâm lớn nhất từ khía cạnh công nghiệp, do công nghệ
UAE chỉ là một bước thêm vào qui trình đã có với sự thay đổi tối thiểu, sử dụng được
chiết nước, giảm lượng dung môi sử dụng và rút ngắn thời gian chiết. Sử dụng siêu âm
cho các nguyên liệu chiết thô đắt tiền là sự thay thế kinh tế các phương pháp chiết
truyền thống, là một yêu cầu phát triển của công nghiệp. Siêu âm có thể tăng cường
quá trình chiết hiện có và cho phép chiết được các polyphenol và carotenoid trong cả
hai hệ thống chiết dịch nước và dung môi. Các thử nghiệm chiết hỗ trợ siêu âm đã
chứng minh là cải tiến được hiệu suất chiết từ 6 đến 35%.
35
1.1.4.2. Phƣơng pháp phân lập và tinh chế
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Các phần chiết thực vật thô thường chứa một lượng lớn các hợp chất cacbohydrat
hoặc nguyên liệu lipoid và hàm lượng của các hợp chất phenolic trong phần chiết thực
vật thô có thể thấp. Để cô đặc và có được phân đoạn giàu polyphenol, qui trình bao
gồm: chiết lần lượt hoặc phân bố hai pha lỏng hoặc chiết pha rắn (SPE) dựa trên độ
phân cực và axit thường được sử dụng. Nói chung, việc loại bỏ nguyên liệu lipoid có
thể đạt được bằng cách rửa phần chiết thô với các dung môi không phân cực như
hexan, diclometan, hoặc cloroform.
Trong quá trình phân lập và tinh chế SPE được sử dụng để loại bỏ các hợp chất
không phenolic như các đường và axit hữu cơ. SPE đang trở thành phổ biến vì là kỹ
thuật nhanh, nhạy và kinh tế và vì các cột và đĩa SPE với các chất hấp phụ khác nhau
có thể được sử dụng. Ngoài ra, kỹ thuật này có thể được tự động hóa. Các cột C18 đã
được sử dụng rộng rãi nhất trong phân tách các hợp chất phenolic. Sau khi các mẫu
dung dịch được đưa qua các cột C18 đã được ổn định trước, các cột được rửa bằng
nước axit để loại bỏ các đường, axit hữu cơ và các thành phần tan trong nước khác.
Các polyphenol sau đó được rửa giải bằng metanol tuyệt đối hoặc dung dịch nước
aceton. Phân tách tiếp các hợp chất phenolic đạt được bằng cách điều chỉnh pH của
mẫu cũng như độ pH và độ phân cực của các hệ dung môi. Ví dụ, Pinelo và cộng sự đã
điều chỉnh độ pH của mẫu rượu vang loại ancol đến pH 7.0 và rửa giải hỗn hợp các axit
phenolic với nước trong phân đoạn đầu [28]. Theo bước này, cột C18 được rửa axit với
dung dịch HCl 0,01M và các phenol không polyme như các catechin, anthocyanin, và
flavonol được rửa giải với etyl acetat. Cuối cùng, một hỗn hợp aceton, nước và metanol
được sử dụng để rửa giải các phenol dạng polyme.
Các chất hấp phụ khác như Amberlite XAD-2, XAD-7, XAD-16, Oasis HLB [16,
20, 34] cũng đã được sử dụng để tinh chế các hợp chất phenolic trong các phần chiết
thô hay của các mẫu rượu vang. Sự so sánh một vài cột SPE bao gồm Amberlite, C8
silica gel, copolyme HLB, PH, ENV và MCX C18 silica gel để phân lập các hợp chất
35
phenolic trong rượu vang ở nồng độ thấp cho thấy rằng phương pháp SPE với cột HLB
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
có độ nhạy cao hơn, độ thu hồi và khả năng nạp mẫu cao hơn cột C18 và cột HLB có
thể là một sự thay thế tốt cho cột C18 để phân lập các hợp chất phenolic của rượu vang.
Sắc ký cột cũng đã được sử dụng để phân tách các phần chiết phenolic. Mặc
dù phương pháp này thường tốn nhiều công sức và tiêu thụ dung môi nhưng nó tạo
lượng lớn các phân đoạn tiếp theo cho sự phân lập và xác định các chất tinh khiết. Các
chất hấp phụ cột thường sử dụng là RP-C18, Toyopearl, LH-20 và với mức độ ít hơn
nhựa polyamit [29]. Etanol, metanol, aceton và nước là các dung môi rửa giải thường
được sử dụng. Đặc biệt, sự phân lập các proanthocyanidin (tannin ngưng tụ) thường
xuyên được thực hiện bằng cột sắc ký Sephadex LH-20 [3, 12]. Phần chiết thô được
đưa lên và rửa giải bằng metanol hoặc etanol, chất không tannin sau đó rửa giải với
aceton nước hoặc rượu-nước để nhận được các proanthocyanidin. Sử dụng cột sắc ký
LH-20, methanol thường được dùng hơn etanol để rửa giải các chất không tannin. Hệ
dung môi aceton-nước tốt hơn so với hệ dung môi etanol-nước để rửa giải các
procyanidin từ cột, đặc biệt là các procyanidin dạng polyme. Trong một số trường hợp,
hệ thống HPLC điều chế cũng đã được sử dụng để tinh chế mẫu polyphenol [2, 9].
1.1.4.3 Phân tích và xác định cấu trúc
Các polyphenol cho sự hấp thụ ở vùng UV và UV/VIS. Do đó các phương tiện
phổ biến nhất để phát hiện các hợp chất phenolic được ghép nối với sắc ký lỏng (LC)
là các đetectơ UV/VIS, PDA và UV-huỳnh quang. PDA là phương pháp phổ biến nhất
vì nó cho phép quét phổ UV/VIS của tất cả các chất tan đi qua đetectơ, cung cấp thông
tin của các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp như các phần chiết thực vật
thô. Các phương pháp khác được sử dụng để phát hiện các hợp chất phenolic bao
gồm: kỹ thuật điện hóa (ECD), điện lượng kế, PDA và phát hiện chuỗi điện tử (EAD)
được kết nối online, kỹ thuật phát hiện phản ứng hóa học, phổ khối lượng (MS) và phổ
cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
Các kỹ thuật điện di bao gồm điện di mao quản (CE), vùng điện di mao quản
35
(CZE), sắc ký điện động Mixen kết hợp với phổ UV và ít hơn sự nhận
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
dạng EC và MS cũng được sử dụng để phân tích các hợp chất phenolic [14].
Sơ đồ quy trình phân lập và phân tích các hợp chất phenolic từ nguyên liệu thực
35
vật được trình bày trong Sơ đồ 1.1.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Làm khô không khí, làm khô đông lạnh
Xay
Nghiền Xử lý thô
Đồng nhất
Ngâm chiết
Chiết
Chiết MAE
UAE
PFE (PLE/ASE, SWE, SFE)
SPE
Sắc ký cột Phân lập
CCC Tinh chế
Các thử nghiệm quang phổ kế: FD, F-C, …
GL/LC/điện di với phân tích công cụ
(UV/VIS, FLU, PDA, EAD, điện lượng kế, Phân tích
ECD, MS, NMR)
35
Sơ đồ 1.1: Quy trình chung phân lập các hợp chất phenolic
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
1.2 Giới thiệu về cây Chẹo lá phong (Engelhardtia spicata Lesh ex. Blume)
1.2.1 Đặc điểm thực vật học [1]
Chẹo lá phong còn có tên là Chẹo bông, tên khoa học là Engelhardtia spicata
Lesch ex. Blume, thuộc họ Hồ đào (Juglandaceae).
Chẹo lá phong là cây gỗ lớn cao 10-20 m; cành non có lông hung. Lá mang 9-17
lá chét dài 11,5-22 cm, rộng 5-6 cm, không cân xứng, mép nguyên, gân phụ 13-15
cặp lồi trên cả hai mặt. Hoa đơn tính cùng gốc; cụm hoa dài 11-15 cm; hoa đực có 6-
13 nhị; hoa cái có 4 lá đài, vòi có 2-4 đầu nhuỵ. Chùm mang quả dài 15-30 cm; quả
bế cao 3mm, dầy lông phún; cánh với 3 thuỳ dài 2,5-4,5 cm.
1.2.2 Nơi sống và thu hái [1]
Chẹo lá phong sống chủ yếu ở phía nam châu Á từ bắc Ấn Độ, đến Inđonexia,
Philipin và Việt Nam. Cây mọc ở rừng thứ sinh và rừng thông ở độ cao 1000-2000 m
khắp nước ta.
1.2.3 Công dụng của cây Chẹo lá phong [1]
Ở nước ta cũng như ở Ấn Độ, người ta dùng vỏ để duốc cá. Ở Ấn Độ, nhựa vỏ
35
quả cũng được sử dụng trong Y học dân gian.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
35
Hình 1.3: Cây Chẹo lá phong (Engelhardtia spicata Lesch ex. Blume, Juglandaceae )
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
1.2.4 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi
Engelhardia (Juglandaceae)
Một nghiên cứu hóa học về chi Engelhardtia đã được thực hiện theo hướng phát
hiện các hợp chất có hoạt tính kháng lao từ cây Engelhardtia roxbughiana [23]. Các
hợp chất thiên nhiên mới engelharquinon (1), engelharquinon epoxit (2), engelharolid
(3), và axit engelhardic (4) và 20 hợp chất khác methyl-4-(butyryloxy)benzoat (5),
axit 4-(2-hydroxyphenyl)-4-oxobutyric (6), 5-methoxy-1-naphtalenol (7), 5-hydroxy-
2-hydroxymetyl-1,4-naphtoquinon (8), 5,8-dihydroxy-4-methoxy-1-tetralon (9), β-
sitostenon (10), docosyl trans-ferulat (11), tricosyl trans-ferulat (12), tetracosyl trans-
ferulat (13), hexacosyl trans-ferulat (14), axit 3-epi-betulinic (15), acetovanillon
(16), vanillin (17), 4-hydroxybenzanđehit (18), 2,6-dimetoxy-1,4-benzoquinon (19),
1-methoxynaphtalen (20), 2-(4-hydroxyphenyl) etanol (21), axit cinnamic (22), axit
3,4,5-trimethoxybenzoic (23), axit vanilic (24) đã được phân lập từ rễ cây
Engelhardia roxburghiana. Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất
này đã chứng tỏ tác dụng kháng lao của (−)-4-hydroxy-1-tetralon, 3-methoxyjuglon
engelhardion và engelharquinon (1) đối với Mycobacterium tuberculosis 90-221387.
35
1 2
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
3 4
Cây Engelhardtia chrysolyris Hance có lá khô được sử dụng trong Y học cổ
truyền làm chè chống béo phì và thuốc chống sốt và đau nhức. Các flavonoid astilbin
và taxifolin đã được phân lập từ cây thuốc này [13]: Một nghiên cứu khác đã phân lập
được 2 axit tritecpenoid, axit betulinic và axit ursolic từ cây Engelhardtia serrata Bl.
bằng sự phân lập định hướng hoạt tính gây độc tế bào và gây apoptosis trên dòng tế
bào K562 [22].
Một số hợp chất đã được thông báo từ cây Chẹo lá phong (Engelhardia spicata
Lesch. ex Blume, Juglandaceae) là β-sitosterol, axit 9Z,12Z-octadecadienoic,
metylhexadecanoat, axit-3β-hydroxy-12-ursen-28-oic, galeon, stigmast-β-D-
glucopyranosid, axit gallic, D-glucose và myo- hoặc muco-inositol (Gyanda K. và
cộng sự, số liệu chưa công bố).
Cho đến nay chưa có các nghiên cứu phân lập các hợp chất phenolic từ lá cây
35
Chẹo lá phong (Engelhardia spicata Lesch. ex Blume, Juglandaceae) của Việt Nam.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Chương 2
NHIỆM VỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nhiệm vụ của Luận văn
Các hợp chất phenolic được phân bố rộng rãi trong giới thực vật. Chúng có ở
nhiều bộ phận của cây và là một phần không thể thiếu trong chế độ ăn uống của
con người. Các hợp chất phenolic góp phần vào chất lượng dinh dưỡng và cảm quan
của rau quả về màu sắc và mùi vị. Sự tiếp nhận các hợp chất này là một yếu tố bảo vệ
sức khỏe quan trọng. Các hoạt chất này làm chậm lại hoặc kìm hãm sự oxy hóa lipid
khi tác dụng như các chất quét gốc tự do và do đó là các chất chống oxi hóa thiết yếu
bảo vệ sự phát triển của mạch oxy hóa. Bằng chứng cho vai trò hạn chế các bệnh suy
thoái thần kinh của các hợp chất phenolic đang xuất hiện. Các nghiên cứu in vivo trên
động vật thực nghiệm và in vitro trên các dòng tế bào ung thư đang chứng minh là các
polyphenol có thể đóng vai trò ngăn chặn ung thư và các bệnh tim mạch khi được hấp
thụ hàng ngày ở lượng thích hợp.
Do có nhiều tác dụng tích cực đối với sức khỏe con người cũng như trong mối
quan hệ sinh thái của thực vật với môi trường xung quanh, các hợp chất phenolic đã
được quan tâm nghiên cứu từ lâu trên thế giới. Cây Chẹo lá phong (Engelhardia
spicata Lesch. ex Blume, Juglandaceae) là một cây gỗ cao, mọc phổ biến ở nước ta và
chưa được nghiên cứu nhiều cho các mục đích ứng dụng. Lá cây này đã được phát
hiện có chứa các hợp chất phenolic trong một nghiên cứu sàng lọc sắc ký các loài
thực vật Việt Nam. Để bước đầu đánh giá khả năng sử dụng các hợp chất phenolic
của loài cây này mục tiêu của luận văn này là nghiên cứu phân lập các hợp chất
phenolic có trong lá cây Chẹo lá phong.
35
Luận văn này có các nhiệm vụ sau:
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
1) Xây dựng quy trình chiết và phân lập các hợp chất phenolic phân cực từ lá cây
Chẹo lá phong;
2) Khảo sát sắc kí lớp mỏng các phần chiết chứa các hợp chất phenolic nhận được.
Đánh giá định tính về sự phân giải, khả năng phân tách các phần chiết và phân
lập các hợp chất thành phần;
3) Xây dựng quy trình phân tách các phần chiết để phân lập các hợp chất phenolic
thành phần chính trong lá cây Chẹo lá phong;
4) Xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập.
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Các phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp
chất
Các phương pháp sắc ký phân tích và điều chế sau đã được sử dụng trong Luận
văn này:
1) Sắc kí lớp mỏng (TLC) được sử dụng để phân tích định tính các hỗn hợp chất, định
hướng và kiểm tra các quá trình phân tách và phân lập sắc kí.
2) Sắc kí cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi và được sử
dụng để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chế các hợp chất thiên nhiên. Chất
hấp phụ được dùng cho sắc ký cột là silica gel Merck (Darmstadt, CHLB Đức) theo cơ
chế sắc ký hấp phụ.
3) Sắc ký cột (CC) gradient trên pha đảo polyme có kích thước lỗ cao Dianion HP-20
được sử dụng để phân tách các hợp chất phân cực trong phần chiết nước theo cơ chế
sắc ký phân bố.
4) Sắc ký cột (CC) trên pha Sephadex LH-20 được sử dụng để phân tách các hợp chất
phenolic theo cơ chế sắc ký loại trừ theo kích thước phân tử.
5) Ph ¬ng ph¸p kÕt tinh ®Ó ph©n lËp vµ tinh chÕ c¸c chÊt r¾n.
35
2.2.2 Các phƣơng pháp xác định cấu trúc
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Cấu trúc của các hợp chất được phân lập được xác định bằng cách kết hợp các
phương pháp vật lí hiện đại:
35
1) Phổ khối lượng phun bụi điện tử (ESI-MS); 2) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR); 3) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) và phổ DEPT.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Lá cây Chẹo lá phong (Engelhardtia spicata Lesch. ex Blume, Juglandaceae)
được thu hái tại Tam Sơn, Phú Thọ vào tháng 2 năm 2008.
Nguyên liệu thực vật được phơi khô trong bóng râm, sấy khô ở 45-50oC, sau đó
được nghiền thành bột mịn.
3.2 Quy trình chiết các phần chiết từ lá cây Chẹo lá phong
Các hỗn hợp các hợp chất hữu cơ chứa trong lá cây Chẹo lá phong nhận được
bằng phương pháp chiết với metanol và phân bố chọn lọc với các dung môi hữu cơ có
độ phân cực tăng dần. Theo phương pháp chiết dung môi này, sau khi hợp chất
phenolic được chiết từ nguyên liệu thực vật vào metanol, chiết hai pha lỏng sẽ tách
các hợp chất lipoid, không phải phenolic vào các dung môi hữu cơ n-hexan và
điclometan, phần chiết etyl axetat chứa các hợp chất phenolic có độ phân cực trung
bình và phần chiết nước chứa các hợp chất phenolic phân cực cao hơn. Các hợp chất
này là đối tượng nghiên cứu phân lập của luận văn này.
Qui trình điều chế các phần chiết hữu cơ bao gồm ngâm chiết bột nguyên liệu (lá
cây Chẹo lá phong) trong metanol khan ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại kiệt
MeOH dưới áp suất giảm thu được phần chiết metanol. Sau đó, phần chiết metanol
được phân bố hai pha lỏng lần lượt giữa H2O với các dung môi có độ phân cực tăng
dần n-hexan, điclometan và etyl axetat. Các dịch chiết nhận được được cất loại dung
môi dưới áp suất giảm để cho các phần chiết hữu cơ tương ứng. Phần dịch nước còn
lại cũng được cất loại kiệt để cho một phần chiết nước.
Các phần chiết n-hexan (EG1, hiệu suất chiết 1,6% so với lượng nguyên liệu
35
khô), phần chiết điclometan (EG2, hiệu suất chiết 0,37% so với lượng nguyên liệu
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
khô), phần chiết etyl axetat (EG3, hiệu suất chiết 0,5% so với lượng nguyên liệu khô)
và phần chiết nước (EG4, hiệu suất chiết 0,67 %) đã được điều chế theo phương
pháp chung từ lá cây Chẹo lá phong.
Qui trình chung điều chế các phần chiết từ lá cây Chẹo lá phong được trình bày
35
trên Sơ đồ 3.1.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyên liệu lá tƣơi
1. Phơi khô, sấy ở 45-50oC 2. Nghiền thành bột mịn
Bột lá khô
1. Ngâm chiết với MeOH, nhiệt độ phòng 2. Cất loại MeOH dưới áp suất giảm, 50oC
3. Hòa bằng nước cất
Dịch nƣớc
1. Chiết bằng n-hexan
2. Làm khô bằng Na2SO4 3. Cất loại n-hexan
Phần chiết n-hexan (EG1)
Dịch nƣớc
1. Chiết bằng CH2Cl2
2. Làm khô bằng Na2SO4 3. Cất loại CH2Cl2
Dịch nƣớc
Phần chiết điclometan (EG2)
1. Chiết bằng etyl axetat 2. Làm khô bằng Na2SO4 3. Cất loại etyl axetat
Dịch nƣớc
Phần chiết etyl axetat (EG3)
Cất kiệt nước
Phần chiết nước (EG4)
35
Sơ đồ 3.1: Điều chế các phần chiết từ nguyên liệu thực vật
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
3.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (EG3)
Qui trình phân tách phần chiết etyl axetat bao gồm các bước:
1) Phân tách sắc ký trên silica gel với hệ dung môi rửa giải chứa axit fomic
2) Tinh chế các phân đoạn nhận được bằng sắc ký cột trên silica gel.
Phần chiết etyl axetat (EG3) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) trên
silica gel với các hệ dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic 20:19:1 và 10:19:1,5.
Phân tách hệ thống đã phân bố theo nhóm các hợp chất trong EG3 theo độ phân
cực thành các nhóm phân đoạn từ EG3.1 đến EG3.5 (n-hexan-etyl axetat-axit fomic
20:19:1), EG3.6 đến EG3.9 (n-hexan-etyl axetat-axit fomic 10:19:1,5).
Nhóm phân đoạn EG3.9 được rửa bằng etyl axetat cho chất bột vô định hình
màu vàng chanh (EG3.9). Chất bột này được tinh chế tiếp bằng Mini-C trên silica gel
cho các chất EG3.9.1 (chất III) và EG3.9.2 (chất IV).
35
Kết quả phân tách phần chiết etyl axetat được trình bày trên Sơ đồ 3.2.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
3.4 Phân tách phần chiết nƣớc (EG4)
Qui trình phân tách các hợp chất phân cực trong phần chiết nước bao gồm các
bước sau:
1) Phân tách phần chiết bằng sắc kí cột trên pha đảo Diaion HP-20
2) Tinh chế các phân đoạn nhận được bằng sắc kí cột trên silica gel.
Phần chiết nước (EG4) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) pha đảo trên chất
hấp phụ polyme Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemicals) với H2O và hệ dung môi
MeOH-H2O gradient với các tỉ lệ 20% MeOH, 40% MeOH, 60% MeOH và MeOH.
Các phân đoạn phân tách được thu theo 4 phân đoạn chính: EG4.1 (20%MeOH),
EG4.2 (40% MeOH), EG4.3 (60% MeOH) và EG4.4 (MeOH).
Phân đoạn EG4.3 được phân tách bằng sắc kí cột CC trên silica gel với hệ dung
môi gradient CH2Cl2-CH3OH 15:1, 9:1, 5:1 và n-hexan-EtOAc-axit fomic 10:20:1 cho
5 nhóm phân đoạn. Tinh chế phân đoạn EG 4.3.1 bằng sắc kí cột Mini-C trên silica gel
với hệ dung môi CH2Cl2-CH3OH 40:1, 20:1 và 12:1 cho các chất EG4.3.1.1 (chất I) và
EG4.3.1.2 (chất II). Tinh chế phân đoạn EG 4.3.2 bằng sắc kí cột Mini-C trên silica
gel (40-63 μm), hệ dung môi CH2Cl2-CH3OH 12:1, 10:1 và 9:1 cho chất EG4.3.2 (chất
III). Tinh chế phân đoạn EG 4.3.4 bằng Mini-C trên silica gel, hệ dung môi CH2Cl2-
CH3OH 12:1, 11:1 (100 ml) và 10:1 cho chất EG4.3.4 (chất IV).
35
Kết quả phân tách phần chiết nước được trình bày trên Sơ đồ 3.3.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
3.5 Cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập
3,5,7-Trihydroxychromon (chất I)
Hợp chất I đã được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu vàng, phát quang tử
ngoại cho màu trắng, hiện màu nâu với thuốc thử FeCl3.
Phổ 1H-NMR của chất I cho hai proton tương tác meta với nhau ở δH 6,19 (1H, d,
J = 2,0 Hz) và 6,30 (1H, d, J = 2,0 Hz) phù hợp với sự thế 5,7-dihydroxy của vòng
benzen của khung chromon. Giá trị độ chuyển dịch hóa học ở δH 7,89 phù hợp với sự
liên kết của một nhóm hydroxy vào C-3.
Sáu tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 của chất I ở δC 94,6 (d, C-8), 99,5 (d, C-
6), 106,5 (s, C-10), 159,5 (s, C-9), 163,1 (s, C-5) và 165,7 (s, C-7) phù hợp với vòng
benzen thế hai lần 5,7-dioxy; ba tín hiệu còn lại ở δC 141,4 (d, C-2), 141,7 (s, C-3) và
178,4 (s, C-1) là phần vòng pyran của một cấu trúc chromon thế ở C-3.
Trên cơ sở các dữ kiện phổ 1H-NMR và 13C-NMR cấu trúc của chất I đã được xác
định là 3,5,7-trihydroxychromon [21].
Aromadendrin (II)
Hợp chất II đã được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng, phát quang
35
tử ngoại cho màu trắng, hiện màu nâu với thuốc thử FeCl3.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Phổ ESI-MS của chất II cho các pic ion giả phân tử ở m/z 287,03 ([M H]), 289,10 ([M + H]+) và 311,18 ([M + Na]+) cho phép xác định công thức phân tử
C15H12O6 của chất II.
Phổ 1H-NMR của chất II cho các tín hiệu đặc trưng cho H-6 và H-8 của vòng A
thế 5,7,9,10 của khung flavonoid ở δH 5,90 (1H, d, J = 2,0 Hz) và 5,94 (1H, d, J = 2,0
Hz) và các tín hiệu của vòng B thế 1,4-dioxy ở δH 6,85 (2H, d, J = 8,5 Hz) và 7,37
(2H, d, J = 8,5 Hz). Các tín hiệu cộng hưởng từ proton ở δH 4,99 (1H, d, J = 12,0 Hz)
và 4,56 (1H, d, J = 12,0 Hz) xác định cấu trúc flavanon [δC 198,5 (s, C-4)] của chất II.
Các tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 của 2 vòng benzen thế xuất hiện ở δC 96,3 (d),
97,3 (d), 101,9 (s), 116,1 (d), 129,3 (s), 130,4 (d), 159,2 (s), 164,6 (s), 165,3 (s) và
168,7 (s). Các tín hiệu của vòng C của một flavanon xuất hiện ở δC 73,6 (d), 84,9 (d) và
198,5 (s). Độ chuyển dịch hóa học của C-4 (δC 198,5) cho thấy sự liên kết hydro của H-
5 với C-4 khẳng định cho cấu trúc này.
Trên cơ sở các dữ kiện phổ ESI-MS, 1H-NMR và 13C-NMR cấu trúc của chất II
đã được xác định là 3,5,7,4-tetrahydroxyflavanon. (aromadendrin) [7].
3,5,7-Trihydroxychromon 3-O--L-rhamnopyanosid (Eucryphin) (chất III)
Hợp chất III đã được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng, phát quang
35
tử ngoại cho màu trắng, hiện màu nâu với thuốc thử FeCl3.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Phổ ESI-MS của chất III cho các pic ion giả phân tử ở m/z 339,05 ([M H]), 341,85 ([M + H]+) và 363,16 ([M + Na]+) cho phép xác định công thức phân tử
C15H16O9 của chất III.
Trên phổ 1H-NMR của chất III nhóm đường rhamnosid đã được xác định bằng
các tín hiệu cộng hưởng từ proton của proton anomeric ở δH 5,34 (1H) và nhóm metyl C-6 ở δH 1,30 (3H, d, J = 6,0 Hz). Các tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 trên phổ 13C-
NMR và DEPT của chất III ở δC 17,9 (q), 71,2 (d), 71,6 (d), 71,9 (d) và 73,5 (d) cho
thấy nhóm rhamnosid có dạng pyranozơ. Cấu hình của nhóm rhamnopyranosyl đã
được xác định từ hằng số tương tác J = 1,5 Hz của proton anomeric (equatorial).
Chín tín hiệu cacbon 13 của chất III ở δC 94,9 (d), 100,0 (d), 102,1 (d), 106,5 (s),
140,4 (s), 147,9 (d), 159,3 (s), 163,5 (s), 166,2 (s) và 178,7 (s) cho thấy cấu trúc
chromon thế ba lần oxy của chất III. Giá trị độ chuyển dịch hóa học ở δH 8,13 phù hợp với sự liên kết của một nhóm hydroxy vào C-3. Phổ 1H-NMR của chất III cho hai
proton tương tác meta với nhau ở δH 6,23 (1H, d, J = 2,0 Hz) và 6,35 (1H, d, J = 2,0
Hz) phù hợp với sự thế 5,7-dihydroxy của vòng benzen của khung chromon.
Trên cơ sở các dữ kiện phổ ESI-MS, 1H-NMR và 13C-NMR cấu trúc của chất III
đã được xác định là 3,5,7-trihydroxychromon 3-O--L-rhamnopyanosid (eucryphin)
35
[17].
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Taxifolin 3-O--L-rhamnopyranosid (Astilbin) (IV)
Hợp chất IV đã được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng, phát quang
tử ngoại cho màu vàng, hiện màu nâu với thuốc thử FeCl3.
Phổ ESI-MS của chất IV cho các pic ion giả phân tử ở m/z 449,09 ([M H]), 451,74 ([M + H]+) và 474,04 ([M + Na]+) cho phép xác định công thức phân tử
C21H22O11 của chất IV.
Phổ 13C-NMR và DEPT của chất IV cho các tín hiệu của 21 cacbon, bao gồm 6
cacbon thế vòng benzen (δC 102,2, 102,5, 146,6, 147,4, 164,1, 165,5 và 168,6), 13
nhóm metin (δC 70,5, 71,8, 72,2, 73,8, 78,6, 83,9, 96,3, 97,4, 115,5, 116,3, 120,5 và
129,1) và một nhóm metyl (δC 17,9). Các tín hiệu trong khoảng độ chuyển dịch hóa học
từ δC 168,6 đến 96,3 thuộc về các cacbon vòng thơm và tín hiệu ở δC 195,9 của một
nhóm cacbonyl liên hợp của một khung flavonoid. Các tín hiệu δC 83,9 (d) và 78,6 (d)
cho thấy cấu trúc dihydroflavonol của chất IV; cấu trúc này được khẳng định bằng các dữ kiện phổ 1H-NMR với hai tín hiệu doublet đặc trưng cho H-2 và H-3 ở δH 5,09 và
4,60 (mỗi tín hiệu có J = 11,0 Hz). Hằng số tương tác J = 11,0 Hz xác định dạng hình
học trans-điaxial giữa các proton H-2 và H-3. Các nhóm tín hiệu proton tương tác meta
ở δH 5,92 (1H, d, J = 2,0 Hz) và 5,94 (1H, d, J = 2,0 Hz) của vòng A và ở δH 6,82 (1H,
d, J = 8,0 Hz), 6,86 (1H, dd, J = 8,0 Hz, 2,0 Hz) và 6,97 (1H, d, J = 8,0 Hz) của một
vòng B thế 1,3,4-trioxy cho thấy cấu trúc phần flavonoid là taxifolin. Các tín hiệu
35
cacbon oxymetin ở δC từ 70,5 đến 73,8 cùng với tín hiệu nhóm metyl ở δC 17,9 (δH
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
1,21, d, J = 6,0 Hz, 3H) xác định nhóm rhamnopyranosyl. Cấu hình của nhóm này đã
được xác định từ hằng số tương tác tín hiệu của tín hiệu proton anomeric ở δH 4,06
(1H, d, J = 1,5 Hz) của nhóm rhamnosyl. Nhóm này được liên kết với C-3 dẫn đến sự
chuyển dịch về phía trường thấp của δC-3 và trường cao δC-2 và δC-4 khi được so sánh
với các giá trị δC tương ứng của aromadendrin.
Trên cơ sở các dữ kiện phổ ESI-MS, 1H-NMR và 13C-NMR cấu trúc của chất IV
35
đã được xác định là taxifolin 3-O--L-rhamnopyranosid (astilbin) [23].
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Chương 4
THỰC NGHIỆM
4.1 Thiết bị và hóa chất
Phân tích sắc kí lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng silica gel
Merck (Darmstadt, CHLB Đức) Alufolien 60 F254 chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm.
Thuốc thử hiện màu là dung dịch sắt (III) clorua 5%.
Phân tách sắc kí cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi.
Phân tách sắc kí cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp suất không khí nén. Chất hấp
phụ được dùng cho sắc kí cột là silica gel Merck (Darmstadt, CHLB Đức) cỡ hạt 40-63
μm.
Cột tách sắc kí thủy tinh Sigma-Aldrich với các kích thước khác nhau được nhồi
silica gel theo phương pháp nhồi ướt đến chiều cao 30 cm.
Sắc kí cột tinh chế (Mini-C) được thực hiện với chất hấp phụ silica gel Merck
(Darmstadt, CHLB Đức) cỡ hạt 40-63 μm và 15-40 μm. Cột tách sắc kí cho Mini-C là
cột Pasteur pipette (0,7 cm và 1 cm i.d.), được nhồi silica gel đến chiều cao 10 cm.
Phân tách sắc ký CC pha đảo được thực hiện trên chất hấp phụ nhựa polyme
Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemicals, Nhật Bản).
Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS) được ghi trên thiết bị Water Auto Spec
Premier Mass spectrometer.
Phổ khối lượng phun bụi điện tử (ESI-MS) được ghi trên thiết bị LC-MS-
Orbitrap-XL (Thermo Scientific, Hoa Kỳ).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) (500 MHz) được ghi trên thiết bị
Brucker A V 500 spectrometer.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) (125 MHz) với chương trình
35
DEPT được ghi trên thiết bị Brucker AV 500 spectrometer.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Độ chuyển dịch hóa học (δ) được đo theo ppm. Tetrametylsilan (TMS) là chất
chuẩn nội zero (δ = 0,00) ppm.
4.2 Nguyên liệu thực vật
Lá cây Chẹo lá phong (Engelhardtia spicata Lesch. ex Blume, Juglandaceae) đã
được thu thập vào tháng 11 năm 2007 tại Tam Sơn, Phú Thọ.
Mẫu thực vật đã được nhà thực vật học, TS. Trần Ngọc Ninh, Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam thu thập và giám định.
4.3 Điều chế các phần chiết từ cây Chẹo lá phong
Lá cây Chẹo lá phong (Engelhardtia spicata Lesch. ex Blume, Juglandaceae)
tươi được rửa sạch, phơi se trong bóng râm và sấy ở 45-50oC trong 2 ngày.
Nguyên liệu thực vật được xay thành bột mịn (3 kg) và ngâm chiết trong
metanol khan ở nhiệt độ phòng 3 lần, mỗi lần trong 3 ngày. Sau khi lọc bỏ phần bã
các dịch chiết metanol được gộp lại và cất loại kiệt dung môi dưới áp suất giảm ở 50oC. Phần chiết metanol tổng được hòa bằng nước cất và chiết phân lớp lần lượt với
các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần: n-hexan, điclometan và etyl axetat.
Các dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4 và cất loại kiệt dung môi dưới áp suất
giảm, cho các phần chiết được điều chế từ lá cây Chẹo lá phong gồm các phần chiết
n-hexan (EG1), điclometan (EG2) và etyl axetat (EG3). Dịch nước được cô kiệt dưới
áp suất giảm cho phần chiết nước (EG4).
Quy trình điều chế các phần chiết từ lá cây Chẹo lá phong đã được trình bày trên
Sơ đồ 3.1, Chương 3: Kết quả và Thảo luận.
Khối lượng và hiệu suất điều chế các phần chiết từ lá cây Chẹo lá phong được
35
trình bày ở Bảng 4.1.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Bảng 4.1: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ lá cây Chẹo lá phong
STT Phần chiết Ký hiệu Khối lượng (g) Hiệu suất (%)*
1 n-hexan 51,6 1,60 EG1
2 điclometan 11,4 0,37 EG2
3 etyl axetat 15,0 0,50 EG3
* tính theo khối lượng nguyên liệu khô ban đầu (3 kg)
4 nước 20,0 0,67 EG4
4.4 Phân tích và phân tách phần chiết etyl axetat (EG3)
4.4.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EG3)
Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck
Alufolien 60 F254 dày 0,2 mm trên nền nhôm (Merck, Darmstadt, CHLB Đức). Thuốc
thử hiện màu là dung dịch FeCl3 5%.
Phần chiết etyl axetat (EG3) được phân tích TLC với các hệ dung môi n-hexan-
etyl axetat-axit fomic với tỷ lệ 20:19:1 và 10:19:1,5.
Kết quả phân tích TLC được trình bày trên Bảng 4.2.
Bảng 4.2: Phân tích phần chiết etyl axetat (EG3) bằng TLC
Hiện màu Hệ dung môi (n-hexan-etyl axetat-axit fomic)
20:19:1
10:19:1,5 STT 1 2 1 2 3 4 Rf 0,35 0,22 0,45 0,22 0,15 0,10 Dạng vệt Tròn Tròn Hình cung Tròn Tròn Tròn Nâu Nâu Nâu Nâu Nâu Nâu
4.4.2 Phân tách phần chiết etyl axetat (EG3)
Phần chiết etyl axetat (EG3) (15 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC,
5 cm i. d. 40 cm) trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 μm) với các hệ dung môi n-
35
hexan-etyl axetat-axit fomic 20:19:1 và 10:19:1,5.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Các phân đoạn phân tách được thu theo 50 ml và được phân tích bằng TLC. Các
phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất
giảm thu được các nhóm phân đoạn từ EG3.1 đến EG3.5 (n-hexan-etyl axetat-axit
fomic 20:19:1và từ EG3.6 đến EG3.9 (n-hexan-etyl axetat-axit fomic10:19:1,5).
Tinh chế phân đoạn EG 3.9
Phân đoạn EG 3.9 (52mg) được phân tách sắc kí cột Mini-C trên silica gel (40-63
μm), hệ dung môi CH2Cl2-CH3OH với các tỉ lệ 11:1 (100 ml), 10:1 (50 ml) và 9:1 (25
ml), thu 5 ml/ phân đoạn cho các chất EG3.9.1 (chất III) và EG3.9.2 (chất IV).
Quá trình phân tách phần chiết EG3 được nêu trên Sơ đồ 3.2, Mục 3.3, Chương
3: Kết quả và Thảo luận.
4.5 Phân tách sắc kí cột phần chiết nƣớc (EG4)
4.5.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết nƣớc (EG4)
Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck
Alufolien 60 F254 dày 0,2 mm trên nền nhôm (Merck, Darmstadt, CHLB Đức). Thuốc
thử hiện màu là dung dịch FeCl3 5%.
Phần chiết nước (EG4) được phân tích TLC với các hệ dung môi diclometan-
metanol với các tỷ lệ 7:1 và 5:1.
Kết quả phân tích TLC được trình bày trên Bảng 4.3.
Bảng 4.3: Phân tích phần chiết nước (EG4) bằng TLC
Hiện màu
Hệ dung môi (diclometan-metanol) STT Rf Dạng vệt
7:1
35
5:1 Tròn Hình cung Tròn Tròn Tròn Nâu Xanh Nâu Nâu Tím 1 2 1 2 3 0,4 0,62 0,48 0,75 0,72
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
4.5.2 Phân tách phần chiết nƣớc (EG4)
Phần chiết nước (EG4) được hòa tan trong MeOH, lọc hút chân không bằng phễu
lọc Buchner và đưa trực tiếp lên cột.
Phần chiết nước được phân tách bằng sắc kí cột (CC) pha đảo trên chất hấp phụ
polyme Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemicals), kích thước cột tách 5 cm i.d. 50 cm,
rửa giải bằng hệ dung môi H2O, MeOH-H2O gradient với các tỉ lệ 20% MeOH, 40%
MeOH, 60% MeOH và MeOH.
Các phân đoạn phân tách được thu theo 250 ml cho đến khi hết chất rửa giải
(phân tích TLC). Các phân đoạn rửa giải cùng với hệ dung môi được gộp lại, sau đó
được cất loại kiệt dung môi dưới áp suất giảm cho 4 nhóm phân đoạn: EG4.1
(20%MeOH), EG 4.2 (40% MeOH) (5,3 g), EG4.3 (60% MeOH) (5 g) và EG4.4
(MeOH) (9,7 g).
Quá trình phân tách phần chiết EG4 được nêu trên Sơ đồ 3.3, Mục 3.4, Chương
3: Kết quả và Thảo luận.
Phân tách phân đoạn EG4.3
Phân đoạn EG4.3 được phân tích bằng sắc kí lớp mỏng (TLC, silica gel, Merck)
với các hệ dung môi triển khai CH2Cl2-CH3OH với các tỉ lệ 9:1, 7:1 và 5:1.
Phân đoạn EG4.3 được phân tách bằng sắc kí cột CC trên silica gel (63-200 μm),
kích thước cột tách 20 1,5 cm i.d, hệ dung môi gradient CH2Cl2-CH3OH với các tỉ lệ
15:1 (100 ml ), 9:1 (500 ml), 5:1 (200 ml) và n-hexan-EtOAc-axit fomic với tỉ lệ
10:20:1 (200 ml). Các phân đoạn phân tách được thu theo 20 ml và phân tích sắc kí lớp
mỏng, các phân đoạn có TLC giống nhau được gộp lại, cất loại dung môi dưới áp suất
giảm cho 5 nhóm phân đoạn.
Tinh chế phân đoạn EG 4.3.1 (73 mg) bằng sắc kí cột Mini-C trên silica gel (40-
63 μm), hệ dung môi CH2Cl2-CH3OH với các tỉ lệ 40:1 (100 ml), 20:1 (25 ml) và 12:1
35
(25 ml), thu 5 ml/phân đoạn cho chất EG4.3.1.1 (chất I) và chất EG4.3.1.2 (chất II).
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Tinh chế phân đoạn EG 4.3.2 (0,6 g) bằng sắc kí cột Mini-C trên silica gel (40-63
μm), hệ dung môi CH2Cl2-CH3OH với các tỉ lệ 12:1 (200 ml), 10:1 (25ml) và 9:1 (25
ml), thu 5 ml/phân đoạn cho chất EG4.3.2 (chất III).
Tinh chế phân đoạn EG 4.3.4 (0,3 g) bằng Mini-C trên silica gel (40-63 μm), hệ
dung môi CH2Cl2-CH3OH với các tỉ lệ 12:1 (50 ml), 11:1 (100 ml) và 10:1 (25 ml) thu
5 ml/phân đoạn cho chất EG4.3.4 (chất IV).
4.6 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân lập
3,5,7-Trihydroxychromon (chất I)
Bột vô định hình màu trắng, phát quang tử ngoại cho màu trắng, hiện màu nâu với
1H-NMR (CD3OD): δ 6,19 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,30 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-
thuốc thử FeCl3 5%.
13C-NMR/DEPT (CD3OD): δ 94,6 (d, C-8), 99,5 (d, C-6), 106,5 (s, C-10), 141,4
6), 7,89 (1H, s, H-2).
(d, C-2), 141,7 (s, C-3), 159,5 (s, C-9), 163,1 (s, C-5), 165,7 (s, C-7), 178,4 (s, C-1).
Aromadendrin (chất II)
Bột vô định hình màu trắng, phát quang tử ngoại cho màu trắng, hiện màu nâu với
thuốc thử FeCl3 5%. ESI-MS: m/z 287,03 [M H], 289,10 [M + H]+, 311,18 [M + Na]+. 1H-NMR (CD3OD): δ 4,56 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-3), 4,99 (1H, d, J = 12,0 Hz),
5,90 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 5,94 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,85 (2H, d, J = 8,5 Hz,
13C-NMR/DEPT (CD3OD): δ 73,6 (d, C-3), 84,9 (d, C-2), 96,3 (d, C-8), 97,3 (d,
H-2, H-6), 7,37 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3, H-5).
C-6), 101,9 (s, C-10), 116,1 (d, C-2, C-6), 129,3 (s, C-1), 130,4 (d, C-3, C-5),
35
159,2 (s, C-4), 164,6 (s, C-9), 165,3 (s, C-5), 168,7 (s, C-7), 198,5 (s, C-4).
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
3,5,7-Trihydroxychromon 3-O--L-rhamopyanosid (Eucryphin) (chất III)
Bột vô định hình màu trắng, phát quang tử ngoại cho màu trắng, hiện màu nâu với
1H-NMR (CD3OD): δ 1,30 (1H, d, J = 6,0 Hz, CH3-6), 3,48 (1H, t, J = 9,5 Hz,
thuốc thử FeCl3 5%. ESI-MS: m/z 339,05 [M H], 341,85 [M + H]+, 363,16 [M + Na]+.
H-4), 3,78 (1H, m, H-5), 3,85 (1H, dd, J = 10,5 Hz, 2,5 Hz, H-3), 4,15 (1H, dd, J =
3,0 Hz, 2,0 Hz, H-2), 5,34 (1H, dd, J = 1,5 Hz, H-1), 6,23 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8),
13C-NMR/DEPT (CD3OD): δ 17,9 (q, C-6), 71,2 (d, C-5), 71,6 (d, C-2), 71,9
6,35 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 8,13 (1H, s, H-2).
(d, C-3), 73,5 (d, C-4), 94,9 (d, C-8), 100,0 (d, C-6), 102,1 (d, C-1), 106,5 (s, C-10),
140,4 (s, C-3), 147,9 (d, C-2), 159,3 (s, C-9), 163,5 (s, C-5), 166,2 (s, C-7), 178,7 (s,
C-4).
Taxifolin 3-O--L-rhamnopyranosid (Astilbin) (chất IV) Tinh thể hình kim màu vàng đ.n.c. 179-180oC, phát quang tử ngoại cho màu vàng,
1H-NMR (CD3OD): δ 1,21 (1H, d, J = 6,0 Hz, CH3-6), 3,32 (1H, m, H-4),
hiện màu nâu với thuốc thử FeCl3 5%. ESI-MS: m/z 449,09 [M H], 451,74 [M + H]+, 474,04 [M + Na]+.
3,56 (1H, dd, J = 3,0 Hz, 1,5 Hz, H-2), 3,68 (1H, dd, J = 10,0 Hz, 3,0 Hz, H-3), 4,06
(1H, d, J = 1,5 Hz, H-1), 4,27 (1H, dd, J = 10,0 Hz, 6,0 Hz, H-5), 4,60 (1H, d, J =
10,5 Hz, H-3), 5,09 (1H, d, J = 10,5 Hz), 5,92 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 5,94 (1H, d, J
= 2,0 Hz, H-8), 6,82 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5), 6,86 (1H, dd, J = 8,0 Hz, 2,0 Hz, H-6),
13C-NMR/DEPT (CD3OD): δ 17,9 (q, C-6), 70,5 (d, C-5), 71,8 (d, C-2), 72,2
6,97 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-2).
(d, C-3), 73,8 (d, C-4), 78,6 (d, C-3), 83,9 (d, C-2), 96,3 (d, C-8), 97,4 (d, C-6),
35
102,2 (s, C-1), 102,5 (s, C-10), 115,5 (d, C-2), 116,3 (d, C-6), 120,5 (d, C-5), 129,1
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
(d, C-1), 146,6 (s, C-3), 147,4 (s, C-4), 164,1 (s, C-9), 165,5 (s, C-5), 168,6 (s, C-7),
35
195,9 (s, C-4).
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
KẾT LUẬN
Luận văn tốt nghiệp “Nghiên cứu phân lập các hợp chất phenolic từ một số loài
thực vật của Việt Nam” thực hiện các nhiệm vụ nghiên cứu phân lập các hợp chất
phenolic từ lá cây Chẹo lá phong. Luận văn đã hoàn thành các nhiệm vụ nghiên cứu
và đạt được các kết quả chính sau:
1. Đã xây dựng được qui trình chiết các hợp chất phenolic vào phần chiết etyl
axetat (EG3), hiệu suất chiết 0,5% so với lượng nguyên liệu khô và phần chiết
nước (EG4) từ lá cây Chẹo lá phong.
2. Đã phân tích sắc kí lớp mỏng (TLC) các phần chiết etyl axetat và phần chiết
nước để xác định điều kiện sắc ký phân tích định tính, xác định các hệ dung
môi thích hợp cho phân tách sắc ký điều chế gradient các phần chiết phenolic
và kiểm tra các quá trình phân tách.
3. Bằng các qui trình phân tách các hợp chất phenolic phân cực kết hợp sắc ký
cột thường (CC) gradient, sắc ký cột tinh chế (Mini-C) và kết tinh lại đã phân
lập được 2 hợp chất chromon và 2 hợp chất flavonoit từ các phần chiết etyl
axetat và phần chiết nước.
4. Sử dụng các phương pháp phổ hiện đại ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT
đã lần đầu tiên xác định được cấu trúc của các hợp chất phenolic thành phần
chính của lá cây Chẹo lá phong là 3,5,7-trihydroxychromon (I), aromadendrin
(II), 3,5,7-trihydroxychromon 3-O--L-rhamopyanosid (eucryphin) (III) và
taxifolin 3-O--L-rhamnopyranosid (astilbin) (IV). Astilbin đã được chứng tỏ là
một hợp chất có tác dụng chống oxi hóa, làm giảm nồng độ cholesterol và lipid
35
trong gan.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học,
Thành phố Hồ Chí Minh, tr. 226.
Tiếng Anh
2. Agarwal, C., Veluri, R., Kaur, M., Chou, S. C., Thompson, J. A.; Agarwal, R.
(2007),“Fractionation of high molecular weight tannins in grape seed extract and
identification of procyanidin B2-3,3'-di-O-gallate as a major active constituent
causing growth inhibition and apoptotic death of DU145 human prostate
carcinoma cells”, Carcinogenesis, 28, pp. 1478-1484.
3. Asquith, T. N., Izuno, C. C., Butler, L. G. (1983), “Characterization of the
condensed tannin (proanthocyanidin) from a group II sorghum”, J. Agric. Food
Chem, 31, pp. 1299-1303.
4. Castro-Vargas, H.I., Rodríguez-Varela, L.I., Ferreira, S.R.S., Parada-
Alfonso, F. (2010), “Extraction of phenolic fraction from guava seeds (Psidium
guajava L.) using supercritical carbon dioxide and co-solvents”, J. Supercrit.
Fluid., 51, pp. 319-324.
5. Chu, T. Y., Chang, C. H., Liao, Y. C., Chen, Y. C. (2001), “Microwave-
accelerated derivatization processes for the determination of phenolic acids by
gas chromatography-mass spectrometry”, Talanta, 54, pp. 1163-1171.
6. Dai, J.; Mumper, R. J. (2010), “Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their
Antioxidant and Anticancer Properties”, Molecules, 15, pp. 7313-7352.
7. De Paule M. Moreira, F., Coutinho, V., Montanher, A. B. P., Caro, M. S. B.,
35
Brighente, I. M. C.; Pizzolatti, M. G. (2003), “Flavonoids and Triterpenes from
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
Bacchsis psendotenui folia - Bioactivity on Arternisia salina”, Quim. Nova, 26,
pp. 309-311.
8. Dobiáš, P., Pavlíková, P., Adam, M., Eisner, A., Beňová, B., Ventura, K. (2010),
“Comparison of pressurised fluid and ultrasonic extraction methods for analysis
of plant antioxidants and their antioxidant capacity”, Cent. Eur. J. Chem, 8, pp.
87-95.
9. Ek, S., Kartimo, H., Mattila, S., Tolonen, A. (2006), “Characterization of
phenolic compounds from lingonberry (Vaccinium vitis-idaea)”, J. Agric. Food
Chem, 54, pp. 9834-9842.
10. Garcia-Salas, P., Morales-Soto, A., Segura-Carretero, A., Fernández-Gutiérrez,
A. (2010), “Phenolic-Compound-Extraction Systems for Fruit and Vegetable
Samples”, Molecules, 15, pp. 8813-8826.
11. Gómez, A. M, Carrasco, A, Cañabate, B, Segura, A, Fernández, A. (2005),
“Electrophoretic identification and quantitation of compounds in the
polyphenolic fraction of extra-virgin olive oil”, Electrophoresis, 26, 3538-3551.
12. Hagerman, A. E., Butler, L. G. (1980), “Condensed tannin purification and
characterization of tannin-associated proteins” J. Agric. Food Chem, 28, pp.
947-952.
13. Igarashi, K., Uchida, Y., Murakami, N., Mizutani, K., Masuda, H. (1996),
“Effect of astilbin in tea processed from leaves of Engelhardtia chrysolepis on
the serum and liver lipid concentrations and on the erythrocyte and liver
antioxidative enzyme activities of rats”, Bioscience Biotechnology and
Biochemistry, 60, pp. 513-515.
14. Jac, P., Polasek, M., Pospisilova, M. (2006), “Recent trends in the
determination of polyphenols by electromigration methods”. J. Pharm. Biomed.
35
Anal, 40, pp. 805-814.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
15. Jáuregui, O., Galceran, M. T. (2001), Handbook of Analytical Separations;
University of Barcelona, Barcelona, Spain, Chapter 6, pp. 196.
16. Kaehkoenen, M. P., Heinaemaeki, J., Ollilainen, V., Heinonen, M. (2003),
“Berry anthocyanins: Isolation, identification and antioxidant activities”, J. Sci.
Food Agric, 83, pp. 1403-1411.
17. Kasai, R.; Hirono, S., Chou, W. H., Tanaka, O., Chen, F. H. (1988), “Sweet
dihydro flavonol rhamnofide from leaves of Engelhardtia chrysolepis, a Chinese
folk medicine, Hung-gi”, Chem. Pharm. Bull., 36, pp. 4167-4170.
18. Klejdusa, B., Kopecký, J., Benesˇová, L., Vaceka, J. (2009), “Solid-
phase/supercritical-fluid extraction for liquid chromatography of phenolic
compounds in freshwater microalgae and selected cyanobacterial species”, J.
Chromatogr. A, 1216, pp. 763-771.
19. Liazid, A., Palma, M., Brigui, J., Barroso, G. C. (2007), “Investigation on
phenolic compounds stability during microwave-assisted extraction”, J.
Chromatogr. A, 1140, pp. 29-34.
20. Llorach, R.; Gil-Izquierdo, A., Ferreres, F., Tomas-Barberan, F. A. (2003),
“HPLC-DAD MS/MS ESI characterization of unusual highly glycosylated
acylated flavonoids from cauliflower (Brassica oleracea L. var. botrytis)
agroindustrial byproducts”, J. Agric. Food Chem, 51, pp. 3895-3899.
21. Lin, Y., Zhang, C., Zhang, M. (2009), “Chemical constituents in herbs of
Polygonum jucundum”, China Journal of Chinese Materia Medica, 34, pp.
1690-1691.
22. Liu, H.; Wang, S., Cai, B., Yao, X. (2004), “Anticancer activity of compounds
isolated from Engelhardtia serrata stem bark”, Archives of Physiology and
35
Biochemistry, 42, pp. 475-477.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
23. Lúcia Q. A. Galotta, A., Amélia D. Boaventura, M., A. R. S. Lima, L. (2008),
“Antioxidant and cytotoxic activities of Euterpe precatoria Mart”. Quim. Nova,
31, pp. 1427-1430.
24. Mahugo, C., Sosa, Z., Torres, M.E., Santana, J.J. (2009) “Methodologies for the
extraction of phenolic compounds from environmental samples: new
approaches”, Molecules, 14, pp. 298-320.
25. Naczk, M., Shahidi, F. (2006), “Phenolics in cereals, fruits and vegetables:
occurrence, extraction and analysis” J. Pharm. Biomed. Anal, 41, pp. 1523-1542.
26. Palma, M., Piñeiro, Z., Barroso, C.G. (2002), “In-line pressurized-fluid
extraction-solid-phase extraction for determining phenolic compounds in
grapes”, J. Chromatogr. A, 968, pp. 1-6.
27. Picouet, P. A., Landl, A., Abadias, M., Castellari, M., Viñas, I. (2009),
“Minimal processing of a Granny Smith apple purée by microwave heating”,
Innov. Food Sci. Emerg, 10, pp. 545-550.
28. Pinelo, M.; Laurie, V.F., Waterhouse, A.L. (2006), “A simple method to
separate red wine nonpolymeric and polymeric phenols by solid-phase
extraction”, J. Agric. Food Chem, 54, pp. 2839-2844.
29. Ranilla, L. G., Genovese, M. I., Lajolo, F. M (2007), “Polyphenols and
antioxidant capacity of seed coat and cotyledon from Brazilian and Peruvian
bean cultivars (Phaseolus vulgaris L.)”, J. Agric. Food Chem, 55, pp. 90-98.
30. Ray Sahelian, M. D. (2006), Polyphenols supplement research study, health
benefit.
31. Ross, K. A.; Beta, T.; Arntfield, S. D. (2009), “A comparative study on the
phenolic acids identified and quantified in dry beans using HPLC as affected by
35
different extraction and hydrolysis methods”, Food Chem, 113, pp. 336- 344.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
32. Vilkhu, K.; Mawson, R., Simons, L., Bates, D. (2008), “Applications and
opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry”, Innov.
Food Sci. Emerg., 9, pp. 161-169.
33. Wu, C. C.; Peng, C. F.; Tsai, I. L.; Abd El-Razek M. H.; Huang H. S.; Chen I. S.
(2007), “Secondary metabolites from the roots of Engelghardia roxburghiana
and their antitubercular activities” Phytochemistry, 68, pp. 1338-1343.
34. Zhang, Y., Seeram, N.P., Lee, R., Feng, L., Heber, D. (2008), “Isolation and
identification of strawberry phenolics with antioxidant and human cancer cell
35
antiproliferative properties. J. Agric. Food Chem., 56, pp. 670-675.
Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của chất EG4.3.1.1 Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR và DEPT của chất EG4.3.1.1
Phụ lục 3: Phổ ESI-MS (+) của chất EG4.3.1.2
Phụ luc 4: Phổ ESI-MS (-) của chất EG4.3.1.2 Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR của chất EG4.3.1.2 Phụ lục 6: Phổ 13C-NMR và DEPT của chất EG4.3.1.2
Phụ lục 7: Phổ ESI-MS (+) của chất EG3.9.1 Phụ lục 8: Phổ ESI-MS (-) của chất EG3.9.1 Phụ luc 9: Phổ 1H-NMR của chất EG3.9.1 Phụ lục 10: Phổ 13C-NMR và DEPT của chất EG3.9.1
Phụ luc 11: Phổ ESI-MS (+) của chất EG4.3.4
35
Phụ lục 12: Phổ ESI-MS (-) của chất EG4.3.4 Phụ lục 13: Phổ 1H-NMR của chất EG4.3.4 Phụ lục 14: Phổ 13C-NMR và DEPT của chất EG4.3.4
