Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tạo hoạt chất Mangostin Phytosome và đánh giá khả năng chống oxi hóa trên động vật thực nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

HOÀNG MAI LINH

NGHIÊN CỨU TẠO HOẠT CHẤT MANGOSTIN PHYTOSOME VÀ

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA

TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------

HOÀNG MAI LINH

NGHIÊN CỨU TẠO HOẠT CHẤT MANGOSTIN PHYTOSOME VÀ

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA

TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ THỊ TUYÊN

PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội - 2020

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cảm và lòng biết ơn chân thành tới

TS. Đỗ Thị Tuyên, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme thuộc Viện công

nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng

nghiên cứu hướng dẫn, cũng như tạo mọi điều kiện về trang thiết bị, hóa chất để tôi

có thể hoàn thành đề tài.

Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Quang Huy đã cho tôi cơ hội thực hiện luận

văn này tại phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam.

Luận văn được thực hiện bằng kinh phí của đề tài cấp Bộ quốc phòng

“Nghiên cứu bào chế viên nang chứa phytosome của mangostin chiết xuất từ vỏ quả

măng cụt dùng cho bộ đội làm việc trong điều kiện độc hại” do Thiếu tá, Ths Đoàn

Thanh Huyền chủ nhiệm.

Tôi xin cảm ơn tập thể phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ

sinh học đã chỉ bảo, giúp đỡ và chia sẻ tận tình cho tôi những kinh nghiệm chuyên

môn trong quá trình làm thực nghiệm.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn tới các thầy cô trong Khoa sinh

học, Trường đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện

cho tôi trong quá trình học tập.

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên tinh thần để tôi hoàn

thành luận văn này.

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2020

Học viên

Hoàng Mai Linh

i

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i

MỤC LỤC ................................................................................................................. ii

DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... v

DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... vi

CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................... vii

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3

1.1 Hoạt chất α- mangostin ................................................................................... 3

1.1.1 Giới thiệu chung ......................................................................................... 3

1.1.2 Cấu trúc hóa học......................................................................................... 3

1.1.3 Hoạt tính sinh học ...................................................................................... 4

1.2 Phytosome ........................................................................................................ 8

1.2.1 Khái niệm ................................................................................................... 8

1.2.2 Thành phần của phytosome ........................................................................ 8

1.2.3 Phân loại, vai trò phospholipid trong phytosome ..................................... 9

1.2.4 Ưu nhược điểm phytosome ..................................................................... 10

1.2.5 Một số phương pháp bào chế phytosome ................................................ 11

1.2.6. Một số phương pháp đánh giá tương tác giữa hoạt chất và phospholipid

trong phytosome ................................................................................................ 11

1.3 Peroxidase ...................................................................................................... 12

1.4 Peroxy hóa lipid ............................................................................................. 13

1.5 Giới thiệu một số vi sinh vật gây bệnh ở ngƣời .......................................... 14

1.5.1 Staphylococcus aureus ............................................................................. 14

1.5.2 Candida albicans ..................................................................................... 15

1.6 Tình hình nghiên cứu phytosome ............................................................... 15

1.6.1 Trên thế giới ............................................................................................. 15

1.6.2 Ở Việt Nam .............................................................................................. 17

CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................... 19

2.1 Nguyên liệu và hóa chất ................................................................................ 19

ii

2.1.1 Nguyên liệu .............................................................................................. 19

2.1.2 Hóa chất ................................................................................................... 19

2.2 Các thiết bị thí nghiệm .................................................................................. 21

Các thiết bị sử dụng chính trong các thí nghiệm đƣợc liệt kê trong bảng ..... 21

2.3 Động vật thí nghiệm ...................................................................................... 22

2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 23

2.4.1 Tách chiết và tinh sạch α-mangostin ........................................................ 23

2.4.2 Sắc ký cột (Column chromatography - CC) ............................................ 24

2.4.3 Sắc ký bản mỏng ..................................................................................... 25

2.4.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)..............................25

2.4.5 Phương pháp điều chế mangostin phytosome .......................................... 26

2.4.6 Phương pháp đánh giá khả năng tạo phức giữa hoạt chất và phospholipid

........................................................................................................................... 27

2.4.7 Xác định hoạt tính kháng khuẩn .............................................................. 28

2.4.8 Xác định hoạt độ peroxidase .................................................................... 29

2.4.9 Xác định làm lượng malondialdehyde ..................................................... 30

2.4.10 Xác định hàm lượng protein .................................................................. 31

2.4.11 Xác định hàm lượng -SH tự do .............................................................. 31

2.4.12 Xử lý số liệu ........................................................................................... 32

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 33

3.1 Tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin ............................................... 33

3.2. Điều chế mangostin phytosome ................................................................... 37

3.3. Đánh giá tƣơng tác giữa hoạt chất và phospholipid trong phytosome ..... 39

3.3.1 Phân tích phổ hồng ngoại IR .................................................................... 39

3.3.2. Phân tích quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS ....................................... 41

3.4. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của phytosome mangostin ................... 42

3.5 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên động vật thực nghiệm ................. 43

3.5.1 Ảnh hưởng của mangostin phytosome lên hoạt độ peroxidase trong gan

........................................................................................................................... 43

iii

3.5.2 Ảnh hưởng của mangostin phytosome lên hàm lượng MDA trong gan

chuột .................................................................................................................. 45

3.5.2 Ảnh hưởng của mangostin phytosome lên hàm lượng nhóm -SH trong

gan chuột ........................................................................................................... 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 50

KẾT LUẬN .............................................................................................................. 50

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 51

iv

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc của một Chromono ...................................................................... 3

Hình 1.2. Cấu trúc khung xương của phân tử xanthone ............................................ 4

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của α- mangostin ............................................................ 4

Hình 1.4. Cấu tạo của phytosome ............................................................................... 8

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của phosphatidylcholin .............................................. 10

Hình 1.6. Cấu trúc nhân hem của peroxidase. .......................................................... 13

Hình 1.7. Hình dạng vi khuẩn Staphylococcus aureus. ............................................ 14

Hình 1.8. Hình dạng nấm Candida albicans. ........................................................... 15

Hình 2.1. Quy trình tinh sạch α-mangostin từ vỏ quả măng cụt Garcinia

mangostana L. ......................................................................................... 23

Hình 2.2. Sơ đồ bào chế mangostin phytosome ....................................................... 27

Hình 2.3. Đường chuẩn peroxidase có sử dụng chuẩn peroxidase horce ................ 30

Hình 2.4. Đường chuẩn Bradford sử dụng BSA làm chuẩn ..................................... 31

Hình 3.1. Tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin .............................................. 33

Hình 3.2. Ảnh chạy sắc kí bản mỏng sản phẩm tinh sạch α-mangostin ................... 34

Hình 3.3. Hoạt chất α-mangostin dạng tinh thể ........................................................ 36

Hình 3.4. Phổ HPLC của hoạt chất - mangostin .................................................... 36

Hình 3.5. Quá trình bào chế mangostin phytosome .................................................. 39

Hình 3.6. Phổ hồng ngoại của mẫu - mangostin ..................................................... 40

Hình 3.7. Hấp thụ huỳnh quang của phức mangostin phytosome ............................ 41

Hình 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của α-mangostin và mangostin phytosome đối với

nấm Candida albicans (A) và vi khuẩn Staphylococcus aureus (B)....... 42

Hình 3.9. Hoạt độ peroxidase trong gan chuột dưới tác dụng của mangostin

phytosome ................................................................................................ 44

Hình 3.10. Sự thay đổi hàm lượng MDA trong gan dưới tác dụng của mangostin

phytosome. ............................................................................................... 46

Hình 3.11. Sự thay đổi hàm lượng nhóm -SH trong gan dưới tác dụng của

mangostin phytosome .............................................................................. 48

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Danh sách hóa chất chính được sử dụng trong thí nghiệm ....................... 20

Bảng 2.2. Thành phần các loại đệm và dung dịch .................................................... 20

Bảng 2.3. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật. ........................................... 21

Bảng 2.4. Các thiết bị thí nghiệm. ............................................................................. 21

Bảng 2.5. Các nhóm chuột xử lí hóa chất. ................................................................ 22

Bảng 3.1. Tỷ lệ sản phẩm tách chiết so với nguyên liệu thô. ................................... 35

Bảng 3.2. Số liệu phân tích phổ HPLC của mẫu - mangostin tinh sạch ................. 37

Bảng 3.3. Hiệu suất của quá trình điều chế mangostin phytosome .......................... 38

Bảng 3.4. Hoạt độ peroxidase trong gan chuột ......................................................... 44

Bảng 3.5. Hàm lượng MDA trong gan chuột dưới tác dụng của phytosome

mangostin .................................................................................................. 46

Bảng 3.6. Hàm lượng nhóm -SH trong gan chuột dưới tác dụng của phytosome

mangostin ................................................................................................. 48

vi

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DSC

Phân tích nhiệt vi sai

Đối chứng

ĐC

Ethylenediamine tetraacetic acid

EDTA

Ether petroleum

EP

Ethyl acetate

EtOAC

Ethanol

EtOH

Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi

FTIR

High-performance liquid chromatography

HPLC

Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa

HSPC

(Hydrogenated Soy Phosphatidylcholin)

Luria broth

LB

Low density lipoprotein

LDL

Malondialdehyde

MDA

Methanol

MeOH

Minimum inhibitory concentration

MIC

Optical density

OD

PC

Phosphatidylcholin

PDI

Chỉ số phân bố KTTP

Rf

Retention factor

SD

Standard deviation

SDA

Sabouraud dextrose agar

SDS

Sodium dodecyl sulfate

-SH Nhóm sulfhydryl

SEM Kính hiển vi điện tử quét

SKD Sinh khả dụng

SOD

Superoxide dismutase

vii

TB

Trung bình

TBA

Thiobarbituric acid

TL

Trọng lượng

TLC

Thin layer chromatography

TMB

3,3´-5,5´-tetramethyl benzidine

TN

Thí nghiệm

TT

Thể trọng

XRD

Nhiễu

xạ

tia X

(XRay

diffraction)

viii

MỞ ĐẦU

Măng cụt (Garcinia mangostana L.) thuộc họ Clusiaceae (Guttiferae) được

biết đến là “nữ hoàng trái cây” ngoài hương vị thơm ngon còn là một dược liệu quý

giá, vỏ quả măng cụt được sử dụng trong y học dân gian để chữa bệnh tiêu chảy,

kiết lị…Nghiên cứu hóa thực vật cho thấy măng cụt có chứa nhiều chất hóa học

khác nhau như tannin, chất nhựa (resin), pectin và đặc biệt là các dẫn xuất xanthone,

những chất thuộc nhóm chất phenolic. Các chất xanthone của vỏ quả măng cụt đã

được xác định

là: -mangostin, -mangostin, -mangostin,

isomangostin,

normangostin, trong đó hoạt chất -mangostin có hàm lượng cao nhất, chiếm

khoảng 0,02- 0,2%. Các mangostin có nhiều hoạt tính sinh học quý như: hoạt tính

kháng khuẩn, hoạt tính kháng nấm, hoạt tính chống viêm, hoạt tính chống oxi hóa

nên đã và đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu.

Hiện nay cùng với việc sử dụng công nghệ phytosome đang dần được ứng

dụng rộng rãi do khả năng tăng sinh khả dụng rất lớn các hoạt chất có nguồn gốc từ

tự nhiên, có độ an toàn cao, không có tác dụng phụ và liều sử dụng nhỏ. Phytosome

có cấu trúc tương tự màng tế bào sinh học, tương hợp sinh học cao và thuận lợi hơn

để được vận chuyển vào nội bào. Công nghệ phytosome là công nghệ nghiên cứu

bào chế và ứng dụng phức hợp của các hợp chất tự nhiên với phospholipid có cấu

trúc tương tự màng tế bào nhằm tăng khả năng vận chuyển các hoạt chất từ môi

trường thân nước sang môi trường thân lipid để tăng hấp thu cho các hoạt chất tự

nhiên. Sử dụng các hợp chất mangostin kết hợp với công nghệ phytosome sẽ tạo ra

một dòng sản phẩm mới có nguồn gốc tự nhiên phục vụ trong chăm sóc sức khoẻ

ngày càng phổ biến do tính tự nhiên, sự phong phú, tương hợp sinh học cao. Sử dụng

các phospholipid có nguồn gốc tự nhiên, phát triển thành công dạng bào chế

phytosome cho các sản phẩm tự nhiên đã tạo ra một hướng đột phá mới cho xu hướng

phát triển này.

Các nghiên cứu về tinh sạch và tác dụng sinh học của các mangostin, và đặc

biệt là công nghệ phytosome ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Hơn nữa, cũng vẫn

còn thiếu vắng những nghiên cứu sâu về tính kháng khuẩn, tác dụng chống oxi hóa

của hoạt chất mangostin phytosome trên động vật thực nghiệm làm cơ sở khoa học

cho các nghiên cứu tạo sản phẩm ứng dụng các hoạt chất mangostin phytosome

trong việc chăm sóc sức khỏe con người từ nguồn dược liệu quý trong nước. Xuất

phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo hoạt chất

mangostin phytosome và đánh giá khả năng chống oxi hóa của hoạt chất trên động

vật thực nghiệm” với các mục tiêu sau:

(1) Nghiên cứu tách chiết được hoạt chất mangostin sạch;

(2) Nghiên cứu công nghệ tạo hoạt chất mangostin phytosome;

(3) Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của hoạt chất mangostin phytosome trên

động vật thực nghiệm.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hoạt chất α- mangostin

1.1.1 Giới thiệu chung

Hoạt chất α- mangostin là một chất được tách chiết từ vỏ quả măng cụt, chiếm

hàm lượng rất cao trong vỏ quả này khoảng 0,02 % đến 0,2 % trọng lượng khô.

Chất được biết đến với danh pháp quốc tế là: 1,3,6-trihydroxy-7-methoxy-2,8-bis

(3-methylbut-2-enyl) xanthen-9-one, có công thức phân tử là C24H26O6 và khối

lượng phân tử 410,46 g /mol. Là tinh thể có màu vàng, có nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 205-206 0C, chất được coi là gần như không tan trong nước do nồng độ tan rất thấp chỉ khoảng 2,03x10-4 mg/L ở 250C [58], tuy nhiên lại có thể tan trong

các chất như: ancol, aceton, chloroform, ethyl acetat [4].

1.1.2 Cấu trúc hóa học

Hoạt chất α- mangostin có cấu trúc điển hình của một hợp chất xanthone.

Trong đó các hợp chất xanthone được biết đến như là các chất chống oxi hóa mạnh,

có cấu trúc mạch phẳng gồm các vòng 6 carbon nối với nhau bởi nhóm carboxyl và

nguyên tử oxi tạo thành khung xương chính của phân tử. Cấu trúc này có dạng

giống cấu trúc của chromono (hình 1.1). Tuy nhiên thay vì chỉ có một vòng 6

carbon thì xanthone có hai vòng 6 carbon ở hai bên (hình 1.2). Khung xương chính

được nối với các mạch bên khác nhau tạo thành nhiều loại xanthone có đặc tính vật

lý, hóa học, sinh học khác nhau. Ngày nay, người ta đã tìm được hơn 200 loại dẫn

xuất xanthone khác nhau, với 60 loại xanthone có trong vỏ quả măng cụt [5].

Hình 1.1. Cấu trúc của một Chromono [56]

Hình 1.2. Cấu trúc khung xương của phân tử xanthone (PubChem CID:7020) [60]

Dựa trên cấu trúc khung xương của hợp chất xanthone, cấu trúc α-mangostin có

thêm một nhóm methoxyl (- O - CH3), hai nhóm isoprenyl (C5H8) và ba nhóm chức

hydroxyl (- OH ) được mô tả trên hình 1.3. Trong đó nhóm isoprenyl đóng vai trò

quan trọng trong việc giúp α- mangostin có hoạt tính kháng khuẩn [28,45]

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của α- mangostin (PubChem CID: 5281650) [58]

1.1.3 Hoạt tính sinh học

Đã từ lâu, vỏ quả măng cụt được sử dụng trong y học cổ truyền không chỉ tại

Việt Nam mà còn nhiều nước Châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ với tác dụng chữa trị

kiết lỵ, tiêu chảy, chữa đau bụng, làm khô vết thương, chống nhiễm trùng da [6].

Một số nghiên cứu còn cho thấy các hợp chất xanthone có trong vỏ quả măng cụt

còn có khả năng kìm hãm sự phát triển của khối u ung thư, chống oxi hóa, kháng

viêm, kháng khuẩn…

1.1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt chất α-mangostin cùng với các dẫn xuất xanthone được biết đến có khả

năng kháng khuẩn mạnh. Theo nghiên cứu của Pothitirat và cộng sự (2009) cho

thấy α-mangostin có khả năng kháng lại vi khuẩn gram dương Propionibacterium

acnes, một loại vi khuẩn có trên bề mặt da của con người gây nên các bệnh như

mụn trứng cá với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 1,95 µg/ml [41]. Ngoài ra α-

mangostin còn chống lại các vi khuẩn kháng lại kháng sinh, những vi khuẩn này có

nguy cơ gây bệnh không thể kiểm soát với người đã được điều trị bằng kháng sinh

trong dài hạn, Iinuna và cộng sự (1996) đã đề cập đến khả năng hạn chế sự phát

triển của Staphylococcus aureus kháng methicillin của α- mangostin, khả năng này

tăng lên khi kết hợp với hoạt động của kháng sinh vancomynine [25]. Ở một nghiên

cứu khác Sakagami và cộng sự (2005) đã chỉ ra rằng α-mangostin có khả năng

chống lại các vi khuẩn Enterococci kháng vancomycine ở nồng độ ức chế tối thiểu

(MIC) là 6,25 µg/ml và kháng lại S.aureus kháng methicillin ở nồng độ ức chế tối

thiểu (MIC) 6,25-12,5 µg/ml [42]. Nhờ hoạt tính này mà mà α- mangostin góp phần

kiểm soát sự nhiễm trùng do vi khuẩn Enterococci và S.aureus gây ra.

Jun và cộng sự (2013) đã dùng năm hoạt chất xanthone khác nhau thử nghiệm

kháng lại vi khuẩn S.aureus kháng methicillin, kết quả cho thấy α- mangostin có

nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) tốt nhất 0,78-1,56 µg/ml, đồng thời nhóm ông cho

rằng α-mangostin có khả năng diệt S.aureus kháng methicillin nhanh là do sự tương

tác trực tiếp của nhóm isoprenyl trong α- mangostin với lớp lipid kép của màng tế

bào vi khuẩn dẫn đến màng này bị vỡ và làm tăng tính thẩm thấu của màng [28].

Như vậy, α-mangostin và các dẫn xuất xanthone từ quả măng cụt có khả năng giúp

kháng lại một số loại bệnh do vi khuẩn gây nên, đồng thời cũng có thể ngăn chặn

nguy cơ bùng phát dịch bệnh do các vi khuẩn kháng kháng sinh gây ra.

Pimchan và cộng sự (2017) đã nghiên cứu kết hợp α- mangostin và kháng sinh

ceftazidime chống lại vi khuẩn Acinetobacter baumannii kháng ceftazidime kết quả

cho thấy sự kết hợp này có hiệu quả tốt khi làm mỏng các màng peptidoglycan, tăng

tính thấm của màng tế bào của khuẩn A.baumannii đồng thời α- mangostin cho thấy

khả năng ức chế enzyme β-lactamase loại IV của khuẩn này gây ra kìm hãm và tiêu

diệt chúng. Từ nghiên cứu này, cho thấy có thể phát triển sử dụng α- mangostin như

một dược phẩm bổ sung, có thể phối hợp với kháng sinh ceftazidime để tăng cường

khả năng tiêu diệt A.baumannii kháng kháng ceftazidime [39]. Một nghiên cứu

khác, Sivaranjani và cộng sự (2017) đã sử dụng α- mangostin để tiêu diệt khuẩn

Staphylococcus epidermidis RP62A, thu được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và

nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của α-mangostin với khuẩn S.epidermidis

RP62A lần lượt là 1,25 và 5 μg / mL. Trong đó α- mangostin thể hiện khả năng diệt

khuẩn rất tốt khi nhanh chóng làm giảm lượng vi khuẩn S.epidermidis RP62A chỉ

trong vòng năm phút. Cơ chế diệt khuẩn S.epidermidis của α-mangostin được giải

thích do nó có thể ức chế và diệt trừ màng sinh học (biofilm) của loài khuẩn này. Từ

đó, cho thấy tiềm năng của α-mangostin có thể sử dụng hỗ trợ điều trị nhiễm trùng

do vi khuẩn S.epidermidis gây ra [47].

1.1.3.2 Hoạt tính kháng nấm

Các hợp chất xanthone nói chung và α- mangostin được tách chiết từ vỏ quả

măng cụt có khả năng kháng một số loại nấm gây bệnh ở thực vật, là nguyên nhân

gây thiệt hại mùa màng như Fusarium oxysporum, Aliciella tenuis, Aspergillus

oryzae [22]. Ngoài ra α- mangostin còn có khả năng chống lại nấm Candida

albicans, một loại nấm gây bệnh nhiễm trùng đường sinh dục, miệng da và máu.

Người ta dự đoán rằng cơ chế kháng nấm của α- mangostin và các dẫn xuất

xanthone là do chúng tấn công vào cấu trúc và chức năng của tế bào nấm, đặc biệt

là ergosterol, một loại lipid qua trọng trong màng tế bào nấm, mà không có ở tế bào

động vật [16]. Vậy nên điều này có ý nghĩa sử dụng α- mangostin như chất diệt

bệnh nấm trên động vật, mà không sợ ảnh hưởng đến tế bào của chúng.

1.1.3.3 Hoạt tính kháng viêm

Trong nghiên cứu của mình Nakatani và cộng sự (2002), đã chứng minh rằng

cao chiết xanthone từ vỏ quả măng cụt có khả năng ức chế quá trình giải phóng

histamine và tổng hợp prostaglandin E2. Do đó, các chất tách chiết từ vỏ quả măng

cụt chống dị ứng và kháng viêm [37]. Ngoài ra năm 2010, Bumrungpert và cộng sự

đã chứng minh được rằng α- mangostin và γ-mangostin có thể ức chế hoạt động của

LPS (lipopolisaccharide có trong plasma ở người béo phì) lên sự biểu hiện của các

gen quy định protein-enzyme liên quan đến phản ứng viêm và kháng insulin ở đại

thực bào. Hai dẫn xuất xanthone có từ vỏ quả măng cụt này có thể làm suy giảm

khả năng cảm ứng biểu hiện interleukin-6, yếu tố gây lên hoại tử (TFNα) [17]

1.1.3.4 Hoạt tính chống oxi hóa

Các gốc tự do là một sản phẩm tất yếu của các quá trình sinh lý hóa trong cơ

thể. Sự tăng quá mức các gốc tự do làm cho hệ thống chống oxi hóa của các tế bào

không đáp ứng được gây ra sự phá hủy Protein, DNA, chất béo, gây tổn thương tế bào

và quá trình trao đổi chất đẩy nhanh quá trình lão hóa [5]. Williams và cộng sự (1995)

đã chứng minh rằng mangostin có khả năng hoạt động như một chất thu dọn các gốc tự

do để ngăn chặn sự phá của các gốc tự do lên LDL (Low density lipoprotein) [53].

Trong một nghiên cứu khác, Sun và các cộng sự (2009) đã chỉ ra rằng mangostin có thể

trung hòa được các gốc hydroxyl tự do, superoxin anion, ức chế sự hình thành MDA

(malondialdehyde) trong quá trình nuôi cấy tế bào bạch cầu [48]

1.1.3.5 Hoạt tính chống ung thư

Đặc biệt hoạt chất α- mangostin còn được vẫn được nghiên cứu ứng dụng chữa

nhiều bệnh cho đến ngày nay tiêu biểu là ung thư. Shibata cùng cộng sự (2011) đã

chứng minh rằng mangostin từ quả măng cụt có thể gây chết một số dạng tế bào ung

thư trong cơ thể. Nhóm ông đã cho thử nghiệm hoạt tính diệt ung thư của α-

mangostin trên chuột được gây ung thư vú. Sau khi điều trị bằng α- mangostin cho

thấy số chuột có khả năng sống sót cao hơn so với chuột không được điều trị, đồng

thời khối u ung thư trên chuột cũng được ức chế đáng kể [44]. Tiếp đó, Han và cộng

sự (2017) đã chỉ ra rằng α-mangostin có thể ức chế LSD1 (Lysine-specific

demethylase 1) chống lại sự di căn của các khối u ung thư [23]. Cùng năm này,

Wang và cộng sự (2017) đã chứng minh rằng α-mangostin có thể chống lại ung thư

da gây ra bởi anthracene 9,10-dimetylbenzan (DMBA) / TPA thử nghiệm trên

chuột. Trong đó, ung thư da được biết là dạng ung thư phổ biến có thể gây ra tử

vong ở người, tuy nhiên cho đến ngày nay tiến trình điều trị bệnh này vẫn còn chưa

được hiệu quả. Nhóm ông cho rằng sở dĩ α- mangostin ức chế sự hình thành ung thư

da thử nghiệm trên chuột gây ra bởi DMBA / TPA là do chúng có thể ức chế sự

viêm, đồng thời ức chế thúc đẩy sự tự phát và quá trình apoptosis [51]. Tóm lại,

hoạt chất α- mangostin có thể diệt được ung thư theo nhiều cơ chế khác nhau, theo

đó chúng chủ yếu tác động lên tế bào ung thư và gây ra quá trình chết theo chu trình

của các tế bào này.

1.2 Phytosome

1.2.1 Khái niệm

Hình 1.4. Cấu tạo của phytosome

Phytosome là phức hợp của cao chiết hoặc dược chất dược liệu chuẩn hóa

gắn với phospholipid ở mức độ phân tử, nó có cấu trúc tương tự màng tế bào sinh

học, tương hợp sinh học cao và được vận chuyển vào nội bào một cách dễ dàng

[33]. Thuật ngữ "Phyto" nghĩa là “thực vật” trong khi “some” có nghĩa là “giống

như tế bào”, thường được gọi là herbosome trong nhiều tài liệu khác. Thế hệ

phytosome đầu tiên được ra đời bằng việc kết hợp giữa hợp chất polyphenol với

phospholipid trong dung môi không phân cực [18].

1.2.2 Thành phần của phytosome

Phytosome là phức hợp được tổng hợp bởi một phân tử phospholipid tự

nhiên hay

tổng hợp

(phosphatidylcholin, phosphatidylethanolamin hay

phosphatidyiserin) phản ứng với một hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết từ dược

liệu [14]. Cấu tạo của phytosome gồm 2 thành phần: hoạt chất dược liệu ít tan q

nước và phospholipid. Trong phức hợp, các nhóm phân cực của dược chất tương tác

với nhóm phosphat của phospholipid thông qua liên kết hydro, hình thành sự sắp

xếp không gian đặc trưng có thể được chứng minh bằng các loại phổ [18].

Phospholipid là các phân tử lipid nhỏ cấu tạo bởi một glycerol trong đó, hai

gốc rượu gắn với hai acid béo, gốc còn lại gắn với nhóm phosphat [14].

Dược chất: Hoạt chất được gắn vào đầu phân cực của phospholipid, trở thành

bộ phận cấu tạo của màng và có sự hình thành các liên kết hydro giữa hydroxyl phenol

của hoạt chất và nhóm phosphat trên nhánh phospholipid cho từng phân tử hoạt chất.

1.2.3 Phân loại, vai trò phospholipid trong phytosome

1.2.3.1 Phân loại

Phospholipid gồm 3 loại:

Phospholipid tự nhiên: Hay dùng nhất là phosphatidylcholin từ lecithin của

trứng hoặc đậu tương, ngoài ra còn có phosphatidylethanolamin, phosphatidylserin,

phosphatidylglycerol…

Phospholipid tổng hợp: Phosphatidylcholin đậu nành được hydrogen hóa,

disteroyl

phosphatidylcholin,

dioleyl

phosphatidylcholin,

dioleyl

phosphatidylethanolamin…ngoài ra còn có một số loạiphospholipid khác như:

sphingolipid (sphingomyelin, sphingosin…).

Phospholipid được sử dụng chủ yếu là từ đậu nành và trứng, đặc biệt là

phosphatidylcholin là một phospholipid chính trong màng tế bào.

1.2.3.2 Vai trò của phospholipid trong phytosome

Do phospholipid là hợp chất hai chức có chứa một nửa phosphatidyl ưa dầu

và một nửa cholin ưa nước nên có khả năng cải thiện sinh khả dụng của các hợp

chất tự nhiên. Phần nửa ưa nước (nhóm cholin) gắn với hợp chất tự nhiên, trong khi

nửa phần phosphatidyl tan trong lipid dạng đuôi và bao bọc các thành phần liên kết

cholin [11]. Ngoài vai trò là một chất mang thuốc, phosphatidylcholin là thành

phần quan trọng của màng tế bào, là phân tử gốc để xây dựng nên các lipoprotein

và màng tế bào, ngoài ra nó cũng là nguồn cung cấp cholin thiết yếu cho các tế

bào trong cơ thể.

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của phosphatidylcholin [11]

Đồng thời, phospholipid còn làm giảm sức căng bề mặt của hệ phân tán với

dịch tiêu hóa, bằng cách đó phytosome dễ dàng được vận chuyển vào màng, mô,

thành tế bào trong cơ thể [14,38,40].

1.2.4 Ưu nhược điểm phytosome

1.2.4.1 Ưu điểm

Phytosome dễ tan trong dung môi dầu và nước nên tăng khả năng hấp thụ

dược chất, gia tăng sinh khả dụng, dẫn đến giảm liều dùng và tăng được hiệu quả

điều trị. Phospholipid vừa là chất mang, vừa có tác dụng bảo vệ gan. Cholin có

trong phospholipid giúp bổ sung cholin cho gan, bảo vệ gan khỏi nhiễm mỡ. Do

phytosome cải thiện được độ tan của dược chất trong muối mật nên tăng tác dụng

của thuốc tại gan. Giữa các phân tử phosphatidylcholin và các hoạt chất có hình

thành các liên kết hóa học nên dạng bào chế phytosome có ổn định cao. Hướng hoạt

chất đến mô đích hiệu quả hơn và tăng vận chuyển nội bào.

Bên cạnh đó, phytosome giúp tăng tính thấm, hấp thu qua da nên được dùng

nhiều trong mỹ phẩm. Đặc biệt, do phytosome có đặc tính thân dầu nên hoạt chất dễ

vượt qua lớp màng sinh học giàu lipid. Phytosome giúp tăng thời gian bán hủy của

một số hoạt chất nên tăng thời gian tác dụng của hoạt chất trong cơ thể, tăng tác

dụng sinh học của hợp chất [33].

1.2.4.2 Nhược điểm

Hầu hết các phương pháp bào chế phytosome đều sử dụng các dung môi hữu

cơ độc hại như: dichlomethan, methanol… để hòa tan lipid gây ảnh hưởng đến sức

khỏe con người và môi trường. Bào chế phytosome bằng phương pháp siêu tới hạn

có thể khắc phục được nhược điểm này, nhưng đòi hỏi kỹ thuật phức tạp và yêu cầu

áp suất cao 3000-4500 psi [20].

1.2.5 Một số phương pháp bào chế phytosome

Các phương pháp bào chế phytosome là:

(1). Phương pháp bốc hơi dung môi.

(2). Phương pháp kết tủa trong dung môi.

(3). Phương pháp siêu tới hạn.

Phương pháp bào chế phytosome bằng phương pháp bốc hơi dung môi được

sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu bào chế phytosome vì tính tiện lợi, dễ

thực hiện, không yêu cầu công nghệ cao, dễ bổ sung cải tiến và nâng cấp quy mô.

Phospholipid, dược chất và các thành phần khác được hòa tan trong hỗn hợp dung

môi hữu cơ thích hợp. Yêu cầu của hỗn hợp dung môi là phải có khả năng hòa tan

tốt dược chất, tá dược và dễ bay hơi. Sau đó, dung dịch này được đưa vào cốc có

mỏ hoặc bình đáy tròn của máy cất quay; tiến hành khuấy trộn, cách thủy hồi lưu

trong một khoảng thời gian và nhiệt độ thích hợp để hình thành liên kết trong phức

hợp. Kết thúc quá trình này, dung môi hữu cơ được loại khỏi dung dịch bằng cách

bốc hơi, và thu được lớp màng phytosome. Từ lớp màng phytosome này, có thể

hydrat hóa trực tiếp trong bình cất quay tương tự như phương pháp Bangham tạo

hỗn dịch phytosome thô hoặc cũng có thể lấy phức hợp phytosome ra dưới dạng bột

khô và tiến hành hydrat hóa ngoài bình cất quay.

1.2.6. Một số phương pháp đánh giá tương tác giữa hoạt chất và phospholipid trong

phytosome

Để xác định cấu trúc của phytosome cũng như đánh giá tương tác phân tử

giữa hoạt chất – phospholipid, tiến hành quét một số phổ như phổ cộng hưởng từ

hạt nhân (H-NMR, C-NMR, P-NMR), phổ hồng ngoại chuyển đổi (FTIR), phương

pháp đo quang phổ hấp phụ phân tử UV-VIS.

1.3 Peroxidase

Gốc tự do nội sinh là một sản phẩm tất yếu của quá trình sinh lý và sinh hóa

tế bào. Gốc tự do cũng là vũ khí tiêu diệt các vật thể lạ xâm nhập vào cơ thể. Tuy

nhiên, số lượng gốc tự do nội sinh tăng lên một cách bất thường, vượt qua sự kiểm

soát của hệ thống chống oxi hóa của cơ thể sẽ dẫn đến một số bệnh nghiêm trọng.

Khi đó, các gốc tự do nội sinh sẽ tấn công, gây phá vỡ cấu trúc các protein, DNA

của tế bào, làm rối loạn sự kiểm soát quá trình phiên mã, dịch mã, và chết theo chu

trình tế bào, có thể dẫn đến căn bệnh ung thư. Đối với gốc O2 được sinh ra từ O2

trong chuỗi vận chuyển điện tử sẽ bị SOD phân hủy, tuy nhiên quá trình phân giải

này lại tạo ra nhiều phân tử H2O2 mà nó cũng là chất độc đối với tế bào. Vì vậy,

việc loại bỏ H2O2 là rất cần thiết, đảm bảo các hoạt động nội bào diễn ra bình

thường. Peroxidase sử dụng H2O2 như là một chất nhận điện tử xúc tác cho nhiều

phản ứng oxy hóa khử khác nhau trong đó H2O2 bị khử thành H2O. Peroxidase là

một nhóm enzyme xúc tác các phản ứng oxy hóa khử :

+

A

AH2

H2O2

+ H2O

Hầu hết các peroxidase có cùng cơ chế xúc tác phản ứng phân giải H2O2. Peroxidase bị oxi hóa bởi các peroxide (H2O2) tạo thành phức hợp PorFe4+=O (Phức

hợp I), giải phóng ra một phân tử H2O. Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme trong sự

tạo thành phức hợp I rất cao. Các peroxide như H2O2, methyl hydrogen peroxide,

ethyl hydrogen peroxide chỉ có thể tương tác với peroxidase mới tạo thành phức

hợp hoạt động (phức hợp I). Tính đặc hiệu của các phức hợp cơ chất-enzyme này

đối với chất cho hydrogen ở giai đoạn 2 và 3 là khá thấp nên chúng có thể phản ứng

với nhiều cơ chất hữu cơ (AH2) khác như ferrocyanide, indophenol, aminophenol,

4-aminoantipyrine, leucodye, cytochrome C và một số amino acid tạo thành phức

hợp II, sau đó giải phóng enzyme về dạng ban đầu [43]. Những peroxidase khác

nhau có mức độ oligomer khác nhau, như myeloperoxidase

(MPO),

lactoperoxidase

(LPO)

là homodimer, horseradish peroxidase

(HRP)

là

homoheptamer. Tuy nhiên hầu hết các monomer của peroxidase có 10 dải xoắn 

đối song và chứa một nhân hem nằm giữa đầu N và đầu C tận cùng. Đầu C tận

cùng mang phối tử thứ 5 liên kết với ion Fe là gốc histidine chứa vòng imidazol

nằm vuông góc với mặt phẳng porphyrin heme, vòng này còn có một nguyên tử N

khác tham gia hình thành liên kết hydrogen với nhóm cacboxyl của gốc aspartate

(Hình 1.5).

Hình 1.6. Cấu trúc nhân hem của peroxidase.

Cũng như catalase và superoxide dismutase, peroxidase là enzyme chống oxy

hóa quan trọng trong hệ thống sinh học. Chúng có vai trò chính là giải độc tế bào

bằng cách chuyển hóa H2O2 thành H2O. Peroxidase còn tham gia vào những phản

ứng sinh hóa quan trọng khác trong cơ thể như chuyển hóa và tổng hợp lignin, sinh

tổng hợp thành tế bào và một số hormone như PG (prostaglandin), thyroxine,

ethylene, tham gia vào quá trình trao đổi IAA (indole-3-acetic acid), quá trình phân

hủy auxin. Ngoài ra, peroxidase còn có vai trò chống lại các tác nhân gây bệnh xâm

nhiễm vào tế bào và mô, đáp ứng bảo vệ những tổn thương [3].

1.4 Peroxy hóa lipid

Peroxy hóa lipid là quá trình oxy hóa các phân tử lipid có chứa nối đôi trong

mạch carbon. Lipid peroxide là những sản phẩm không chứa gốc tự do được dẫn

xuất từ acid béo, phospholipid, glycolipid, cholesterol có chứa nối đôi trong mạch

carbon. Sự hình thành các sản phẩm này xảy ra trong các phản ứng oxy hóa do

enzyme xúc tác hoặc phản ứng quang oxy hóa và tự oxy hóa mà không cần enzyme

xúc tác, nhưng đều có liên quan đến các gốc tự do. Sản phẩm peroxy hóa sơ cấp là

những phân tử peroxide chứa nối đôi có thể chuyển thành dạng liên hợp. Các sản

phẩm này có thể bị biến đổi thành phân tử lớn hơn nhờ quá trình dimer hóa. Quá

trình peroxy hóa lipid bị ức chế bởi các chất chống oxy hóa: -tocopherol,

ascorbate, formate, β-caroten, manitol, vitamin E, cấu trúc phân tử sẽ chuyển hóa

thành sản phẩm peroxy hóa thứ cấp, hoặc là những phân tử nhỏ hơn bởi sự phân cắt

liên kết C-C (hydrocarbon, aldehyde, epoxide).

MDA cũng có thể được tạo ra từ tiền chất PG (prostaglandin) bằng phản ứng

xúc tác enzyme như thromboxane synthetase tổng hợp MDA từ PG endoperoxide.

MDA có thể tham gia phản ứng tạo thành sản phẩm cộng với amino acid tự do hay

với protein để hình thành những liên kết ngang trong những phân tử protein này, khi

đó có thể cảm ứng gây biến đổi mạnh mẽ những đặc tính hóa sinh của chúng. Hiện

nay MDA được coi là chất chỉ thị quan trọng để đánh giá mức độ ảnh hưởng và tốc

độ phản ứng peroxy hóa lipid diễn ra trong tế bào, cũng như có thể xác định được

hàm lượng các gốc tự do, từ đó cho thấy mức độ, tính chất nguy hại của những tác

nhân lạ được đưa vào cơ thể sinh vật.

1.5 Giới thiệu một số vi sinh vật gây bệnh ở ngƣời

1.5.1 Staphylococcus aureus

Hình 1.7. Hình dạng vi khuẩn Staphylococcus aureus.

(http://en.wikipedia.org)

Staphylococcus aureus hay tụ cầu vàng là chủng vi khuẩn bắt màu gram (+),

đứng thành đám như chùm nho, không sinh bào tử, thường không có vỏ (Hình 1.7).

Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển được ở 10-45C và nồng độ muối cao

tới 10%. Sinh trưởng được trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Trên môi trường

thạch thường, tụ cầu vàng phát triển thành khuẩn lạc S, đường kính 1-2 mm, nhẵn.

Sau 24 giờ ở 37C, khuẩn lạc thường có màu vàng chanh. S. aureus thường gây ra

mưng mủ ở da và nhiễm trùng mô mềm. Sự nhiễm trùng mô mềm do loài vi khuẩn

này gây ra có thể dẫn đến sự xâm nhiễm và gây bệnh nhiễm trùng huyết. Sự nhiễm

trùng của loài này đối với người và động vật không kích thích sự đáp ứng miễn dịch

của hệ thống miễn dịch [36]. Hội chứng nhiễm trùng do S. aureus gây ra là một vấn

đề đáng lo ngại trong bệnh viện, đặc biệt là nhiễm trùng hậu phẫu, khi xuất hiện một

số chủng có hiện tượng kháng lại kháng sinh.

1.5.2 Candida albicans

Hình 1.8. Hình dạng nấm C. albicans.

(http://www.mycology.adelaide.edu.au; http://www.sciencephoto.com)

Chủng C. albicans là loại nấm lưỡng bội, sinh trưởng chủ yếu ở 37-40C, pH 7

(Hình 1.8). Kiểu hình nảy chồi chiếm ưu thế ở nhiệt độ hoặc pH thấp, trong khi đó

kiểu hình dạng sợi chiếm ưu thế ở nhiệt độ và pH cao. Nấm C. albicans có thể sinh

trưởng và gây nhiễm trùng trên bền mặt của khoang miệng, âm đạo và đường tiêu

hóa. Dạng nhiễm trùng do C. albicans gây ra có hai dạng: nhiễm trùng bề mặt như

bệnh tưa miệng, nhiễm nấm ở bề mặt âm đạo; nhiễm trùng sâu như bệnh viêm cơ

tim và nhiễm trùng huyết [28]. Cũng như S. aureus và P. aeruginosa, C. albicans là

một trong những nguyên nhân chính gây ra chứng nhiễm trùng, đặc biệt và nhiễm

trùng hậu phẫu.

1.6 Tình hình nghiên cứu phytosome

1.6.1 Trên thế giới

Năm 2014, Das và cộng sự đã tiến hành nghiên bào chế phytosome rutin bằng

phương pháp bốc hơi dung môi. Nghiên cứu đã sử dụng rutin và phospholipid theo

nhiều tỷ lệ mol khác nhau, trong dung môi là methanol và diclomethan. Phytosome

rutin bào chế được sau đó sẽ đem đi đánh giá các thông số hóa lý bằng các phương

pháp khác nhau như: độ tan, kích thước hạt, quét nhiệt vi sai (DSC), nhiễu xạ tia X

(XRPD), kính hiển vi điện tử quét (SEM), phổ hồng ngoại (FT-IR), kính hiển vi

điện tử truyền qua (TEM). Kết quả chụp TEM chỉ ra các phytosome có cấu trúc túi

rời rạc, hình ảnh phổ hồng ngoại, biểu đồ nhiệt đã chứng minh sự hình thành phức

hợp phyto-phospholipid, phổ nhiễu xạ tia X cho thấy rutin khi tạo phức với

phopsholipid đã chuyển từ trạng thái kết tinh sang dạng vô định hình. Nghiên cứu

chỉ ra rằng, tỷ lệ mol rutin: phospholipid là 1:1 có độ tan, kích thước phân tử tốt hơn

các tỷ lệ khác. Nghiên cứu đã so sánh khả năng thấm thuốc qua da giữa rutin và

phức hợp phytosome (tỷ lệ mol rutin:phospholipid là 1:1). Kết quả cho thấy sau 20

giờ, rutin nguyên liệu chỉ hấp thu được 13± 0,87% trong khi của phytosome hấp

thu được 33±1,33% [33].

Năm 2014, Solmaz và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế quercetin

phytosome bằng phương pháp hydrat hóa màng film. Phospholipid sử dụng trong

nghiên cứu này là phosphatidylcholin (PC) và cholesterol (CH). Phytosome sau khi

bào chế được làm giảm kích thước tiểu phân bằng phương pháp siêu âm. Kết quả

cho thấy phytosome bào chế với tỷ lệ mol quercetin:phosphatidylcholin:

cholesterol là 1:2:0,2 cho kích thước tiểu phân nhỏ (80 nm) và hiệu suất phytosome

hóa cao (98 %). Sự kết hợp hai phospholipid phosphatidylcholin và cholesterol đã

cải thiện một cách đáng kể độ ổn định vật lý của phytosome trong thời gian 3 tuần.

Từ biểu đồ DSC cho thấy pic hấp thụ nhiệt của phytosome giảm, góp phần kết luận

có tương tác giữa dược chất và phospholipid, đồng thời cải thiện độ tan cũng như

tăng sinh khả dụng [46].

Vào năm 2010, Semalty và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế

phytosome naringenin với dung môi là diclomethan với tỷ lệ là 1:1 phospholipid là

phosphatidylcholin. Phức hợp tạo thành đem đi đánh giá 1 số đặc tính vật lý khác

nhau qua phổ nhiễu xạ tia X, DSC, SEM, độ tan và so sánh với 1 số thuốc in vitro

được phát hành. Kết quả là có tương tác giữa dược chất và phospholipid. Hiệu suất

phytosome hóa cao 91,7%. Độ tan trong nước của naringenin được cải thiện từ

43,83 đến 79,31 μg/mL. Sau 10 giờ naringenin ở dạng tự do chỉ giải phóng đươc

27% trong khi ở phức hợp Naringenin đã giải phóng tới 99,80%. Từ kết quả nghiên

cứu có thể kết luận rằng phức hợp phospholipid của naringenin có SKD rất cao, có

thể thay thế naringenin [49]. Qua tham khảo các tài liệu trên thế giới cho thấy còn

rất ít ác công trình nghiên cứu khoa học về việc sử dụng công nghệ phytosome dối

với hoạt chất mangostin mà hủ yếu là nghiên cứu về các hoạt chất quercetin, rutin,

naringenin.

1.6.2 Ở Việt Nam

Năm 2016, Đào Hoàng Bá Tùng đã tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome

quercetin bằng phương pháp bốc hơi dung môi. Phospholipid là lecthin và HSPC.

Quy trình và công thức bào chế được lựa chọn như sau: thời gian phối hợp dược chất:phospholipid kéo dài 5 giờ, nhiệt độ hydrat hóa 50oC với nguyên liệu lecithin và 60oC với nguyên liệu HSPC, thời gian hydrat hóa là 1 giờ, tốc độ quay 150

vòng/phút, tỷ lệ mol quercetin:phospholipid là 1:1. Với quy trình trên, nguyên liệu

HSPC sản phẩm thu được phytosome thu được có kích thước tiểu phân 357,1 ± 2,7

nm; PDI: 0,303 ± 0,006, hiệu suất phytosome hóa 41,01 %, cải thiện độ tan 11-12

lần so với dược chất ban đầu, khả năng giải phóng quercetin nhanh hơn so với bột

nguyên liệu quercetin dihydrat. Đồng thời, nghiên cứu sử dụng các phương pháp FTIR, 1H-NMR, XRD và DSC để chỉ ra tương tác giữa phospholipid và dược chất

[13].

Năm 2016, Vũ Thị Thu Hà tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome quercetin

bằng phương pháp kết tủa trong dung môi. Nguyên liệu phospholipid được lựa chọn

là HSPC, tỷ lệ lựa chọn là 1:1. Nghiên cứu đã khảo sát và lựa chọn được các yếu tố

thuộc về quy trình như sau: trong giai đoạn hình thành phức hợp tốc độ khấy từ là

400 vòng/phút, nhiệt độ là 80°C, thời gian khuấy từ 16 giờ; tốc độ nhỏ dung dịch n-

hexan là 5ml/phút; tốc độ khuấy từ giai đoạn kết tủa là 100 vòng/phút. Các phương

pháp FTIR, XRD và DSC được sử dụng để chứng minh sự tương tác giữa dược chất

và phospholipid. Kết quả cho thấy được phytosome quecertin vừa bào chế được có

kích thước tiểu phân 203,5 nm; PDI là 0,239; giá trị tuyệt đối thế zeta >30; hiệu suất

phytosome hóa 79,92% [12].

Năm 2015, Phạm Thị Minh Huệ và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế

phytosome curcumin bằng phương pháp bốc hơi dung môi, với dung môi hòa tan là

ethanol, phospholipid là phosphatidylcholin đậu nành được hydrogen hóa (HSPC).

Phức hợp curcumin-phospholipid sau bào chế được đánh giá một số đặc tính vật lý

như kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân, thế zeta, độ tan... Kết quả

nghiên cứu cho thấy dạng bào chế phytosome làm tăng độ tan của curcumin trong

cả pha nước và pha dầu, đây là một đặc điểm nổi bật của phytosome nhằm tăng

SKD của dược chất đặc biệt là những dược chất được chiết xuất từ dược liệu. Kích

thước phytosome dưới 500 nm cũng là một trong các lợi thế về SKD khi dùng qua

đường uống và ngoài da. Bằng phương pháp DSC, bước đầu nghiên cứu đã chứng

minh có phản ứng liên kết hoá học giữa curcumin và HSPC [11].

Năm 2010, Đỗ Thị Tuyên và cộng sự đã tách được α-mangostin từ dịch chiết

ethanol của vỏ quả măng cụt sử dụng phương pháp sắc ký cột, hoạt chất -

mangostin tinh sạch có khả năng ức chế vi khuẩn B. subtilis XL62 [10]. Năm 2010,

Nguyễn Thị Mai Phương và cộng sự thử nghiệm α-mangostin ức chế sự hình thành

biofilm của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans UA159, kết quả cho thấy

α-mangostin là chất kháng biofilm tiềm năng thông qua việc làm giảm khả năng

sinh biofilm, ức chế các enzyme glycosyltransferase B và C tham gia vào quá trình

tạo biofilm cũng như làm thay đổi cấu trúc biofilm của vi khuẩn S. mutans [7]. Và

gần đây, Nguyễn Thị Mai Phương và cộng sự (2018) tiếp tục nghiên cứu và đánh

giá hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư phổi A549 của hạt nano polymer bọc α-

mangostin cho kết quả chứng tỏ dạng hạt nano mangostin đã cải tạo được tính tan

của -mangostin mà vẫn duy trì được hoạt tính kháng tế bào ung thư. [8].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành sử dụng công nghệ phytosome theo

phương pháp bốc hơi trong dung môi để tạo hoạt chất mangostin phytosome, sau đó

đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cũn như khả năng chống oxi hóa của hoạt chất.

CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1 Nguyên liệu và hóa chất

2.1.1 Nguyên liệu

2.1.1.1 Chủng vi sinh vật

Chủng S. aureus được cung cấp bởi Phòng Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường

Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Chủng nấm C. albicans ATCC 10231 được mua từ bảo tàng giống chuẩn Mỹ,

10801 University Boulevard Manassas, VA 20110, USA.

2.1.1.2 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng, giống đực, thuần chủng, dòng Swiss, trưởng thành, khỏe

mạnh, trọng lượng 22  2 g (n = 92) được cung cấp từ Ban chăn nuôi Học viện

Quân Y.

2.1.1.3 Nguyên liệu thực vật

Vỏ quả măng cụt được thu thập từ các khu vực ở Hà Nội. Nguyên liệu được

sấy khô trong tủ ấm ở 60C, nghiền thành bột mịn. Bảo quản ở điều kiện khô ráo,

thoáng mát.

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết, được mua từ

các hãng hóa chất có uy tín. Một số hóa chất chính được liệt kê ở bảng 2.1.

Bảng 2.1. Danh sách hóa chất chính được sử dụng trong thí nghiệm

Tên hóa chất

Hãng sản xuất (nƣớc)

Cao nấm men, peptone, Tris-base

ICN (Mỹ)

- mangostin chuẩn

Chromadex (Mỹ)

Silymarin phytosome

Indena (Ấn Độ)

Phosphatidylcholin

Đức

5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid)

Sigma (Mỹ)

Dichlomethane, methanol,

ethanol,

ethyl

Trung Quốc

acetate, ether

petroleum, n-butanol, pyridin

Scharlau Chemie

S.A

n-hexane, silica gel (70-230 mesh) , EDTA

(Châu Âu)

Peroxidase

chuẩn,

3,3´-5,5´-tetramethyl

Sigma (Mỹ)

benzidine, DMSO

Merck (Đức)

Thiobarbituric acid

Các loại đệm và dung dịch sử dụng trong thí nghiệm được pha theo các

bài thực hành chuẩn có thành phần và nồng độ được tóm tắt ở bảng 2.2.

Bảng 2.2. Thành phần các loại đệm và dung dịch

Dung dịch

Thành phần, nồng độ

100 ml 95% ethanol, 350 mg serva

Dung dịch Bradford gốc

blue G, 200 ml 88% phosphoric acid

250 M hydrogen peroxide

Dung dịch cơ chất H2O2

Dung dịch SDS

8,1%

Dung dịch sulfuric acid

2 N sulfuric acid

Dung dịch thiobarbituric acid

0,8% thiobarbituric acid

0,6% 3,3’-5,5’tetramethyl benzidin

Dung dịch TMB

trong DMSO

Đệm sodium acetate pH 3,5

20% sodium acetate; pH 3,5

Đệm nghiền

100 mM tris HCl; pH 7,4

100 mM sodium acetate, 100 mM

Đệm sodium acetate pH 5,5

acetic acid; pH 5,5

Thành phần một số môi trường nuôi cấy vi sinh vật được pha theo bảng 2.3

Bảng 2.3. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật.

Môi trường

Thành phần (w/v)

Môi trường LB

1% peptone; 0,5% cao nấm men; 1% NaCl; pH 7,5

1% peptone; 0,5% cao nấm men; 1% NaCl; pH 7,5; 2%

Môi trường LB đặc

agar

Môi trường SDA

1% peptone, 4% glucose

Môitrường SDA đặc 1% peptone, 4% glucose; 2% agar

2.2 Các thiết bị thí nghiệm

Các thiết bị sử dụng chính trong các thí nghiệm được liệt kê trong bảng

Bảng 2.4. Các thiết bị thí nghiệm.

Tên thiết bị

Xuất xứ

Bể ổn nhiệt VS-1205CW

Vision (Hàn Quốc)

Box cấy vi sinh vật Clean Bench TCV.02-1 Trung tâm chuyển giao công nghệ

Box cấy vi sinh vật Laminar LB-1234

(Việt Nam)

Cân phân tích BL150S

Sartorius (Đức)

Máy đo pH-827

Metrohm (Thụy Sỹ)

Máy lắc rung ProvocellTM

Esco (Mỹ)

Máy li tâm lạnh CF16RXII

Hitachi (Nhật)

Máy li tâm lạnh Hettich Mikro 22R

Hettich (Đức)

Máy nuôi lắc Certomat® HK

Sartorius (Đức)

Máy quang phổ UV 2500

Labomed (Mỹ)

Máy Voltex OSI

Rotolab (Đức)

Nồi khử trùng ES-315

Tomy (Nhật)

Tủ lạnh 4C GR-N45VTV

Toshiba (Nhật)

Tủ lạnh sâu -20C VCF-280

Deawoo

Tủ lạnh sâu -84C MDF-192

Sanyo (Nhật)

Tủ ổn nhiệt MIR-162

Sanyo (Nhật)

Máy FTIR Spectrum two

Perkin Elmer (Mỹ)

2.3 Động vật thí nghiệm

Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng, giống đực, thuần chủng, dòng

Swiss, trưởng thành, khỏe mạnh, trọng lượng 22  2 g (n = 92) được chia ngẫu

nhiên thành chia thành 7 nhóm (Bảng 2.5).

Bảng 2.5. Các nhóm chuột xử lí hóa chất.

Cách xử lý

Nhóm

n

Uống dung dịch 0,9% NaCl

ĐC

11 ĐC (+)

11 Uống dung dịch silymarin phytosome

TN1

16 Gây độc bằng cho uống CCl4

TN2

16 Gây độc bằng cho uống CCl4 + mangostin phytosome liều 0,1 mg/10 g TT

TN3

11 Gây độc bằng cho uống CCl4 + mangostin phytosome

liều 0,2 mg/10 g TT

TN4

16 Uống mangostin phytosome liều 0,1 mg/10 g TT

TN5

11 Uống mangostin phytosome liều 0,2 mg/10 g TT

n: Số cá thể thí nghiệm

Nhóm ĐC: Nhóm chuột đối chứng uống 0,9% NaCl trong 14 ngày với liều

lượng 0,1 ml/10 g thể trọng/ngày.

Nhóm ĐC (+): Nhóm chuột đối chứng uống silymarin phytosome

Nhóm TN1: Nhóm gây độc được uống CCl4 trong 14 ngày : hai ngày đầu uống hỗn hợp CCl4 : dầu ăn với tỷ lệ 1:7; mười ba ngày sau với tỷ lệ 1:5. Liều lượng 0,1 ml hỗn hợp/10 g thể trọng/ngày.

Nhóm TN2: Nhóm chuột gây độc bằng cho uống CCl4 có bổ sung uống thêm

với mangostin phytosome liều lượng 0,1 mg/10 g thể trọng/ngày trong 14 ngày.

Nhóm TN3: Nhóm chuột gây độc bằng cho uống CCl4 có bổ sung uống thêm

với mangostin phytosome liều lượng 0,2 mg/10 g thể trọng/ngày trong 14 ngày.

Nhóm TN4: Nhóm chuột chỉ uống mangostin phytosome liều lượng 0,1 mg/10

g thể trọng/ngày trong 14 ngày..

Nhóm TN5: Nhóm chuột chỉ uống mangostin phytosome liều lượng 0,2 mg/10

g thể trọng/ngày trong 14 ngày.

Trong quá trình thí nghiệm nhóm đối chứng và nhóm nghiên cứu đều được

nuôi dưỡng cùng một điều kiện như nhau, hàng ngày được theo dõi, ghi chép diễn

biến, cân trọng lượng. Động vật thí nghiệm được uống hoạt chất vào một thời gian

nhất định buổi sáng.

Phương pháp cho chuột uống thuốc: dùng kim cong đầu tày chuyên dụng đưa

thuốc vào thẳng dạ dày.

Phương pháp lấy mẫu gan: Cho chuột nhịn ăn 24 giờ trước khi lấy mẫu thử.

Giết chuột bằng cách cắt đầu nhanh. Mổ nhanh lấy gan và cân trọng lượng. Cân 0,3

g gan rửa trong đệm lạnh (100 mM Tris-HCl; 250 mM sucrose, pH 7,4) để loại bỏ

máu và catalase. Sau đó được nghiền đồng thể trong cối chày sứ có cát thủy tinh và

300 l đệm lạnh, với tỷ lệ 1:10. Dịch nghiền được ly tâm 12000 vòng/phút trong 20

phút ở 4C. Bỏ tủa, dịch trong được dùng làm các thí nghiệm xác định hoạt độ

enzyme peroxidase và định lượng protein cũng như hàm lượng MDA và nhóm -SH.

2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1 Tách chiết và tinh sạch α-mangostin

Hoạt chất α-mangostin được tách chiết theo quy trình như hình 2.1.

Hình 2.1. Quy trình tinh sạch α-mangostin từ vỏ quả măng cụt Garcinia

mangostana L.

Vỏ quả măng cụt được rửa sạch, sấy khô trong tủ ấm 600C, sau đó được

nghiền thành bột mịn. Bột măng cụt được bổ sung ethanol 96% (tỉ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:3) ủ ở 600C trong 4 giờ. Dịch chiết được sấy khô chân không đến

khối lượng không đổi, thu cặn, xác định hàm lượng cao chiết ethanol thu được. Cao

chiết được sử dụng để tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp chiết phân đoạn nhằm loại

bớt các hợp chất tan trong nước, sau đó được tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel.

Cuối cùng độ tinh sạch được kiểm tra bằng phương pháp sắc kí bản mỏng [5].

Sau khi thu pha trên và cất cô quay, hoạt chất được hòa tan trở lại n-hexan và

được tinh sạch trên sắc kí cột hạt sillica gel với kích thước 70-230 mesh (Merck

Kiselgel). Cột được cân bằng một giờ với n-hexan. Sau đó mẫu được đẩy với hệ

dung môi chloroform: acetone theo các tỉ lệ lần lượt là 10:1, 5:1 và 0:1. Độ tinh

sạch của các phân đoạn được kiểm tra qua sắc kí bản mỏng sử dụng hệ dung môi

dichlomethane : methanol với tỉ lệ 96:4. Sau đó các phân đoạn có thể hiện

mangostin trên băng sẽ được tinh sạch trên cột silica gel lần hai sử dụng hệ dung

môi n-hexan : ethyl acetate với tỉ lệ 6:1 và 12:1. Mẫu thu được lại được chạy sắc kí

bản mỏng lần nữa để kiểm tra độ tinh sạch, những phân đoạn được tinh sạch xuất

hiện vạch ngang băng so với băng chuẩn α-mangostin được thu lại, cô quay đến kết

tinh, cân xác định khối lượng, hòa trở lại dung môi theo nồng độ xác định và được

đưa thử hoạt tính [5].

2.4.2 Sắc ký cột (Column chromatography - CC)

Sắc ký cột là phương pháp thường được sử dụng để phân tách các chất dựa

vào độ phân cực của chất cần phân tách. Sắc kí cột có pha tĩnh là chất rắn được nhồi

trong cột, pha động là hệ dung môi được đổ vào nên có thể triển khai với các dung

môi có phân cực khác nhau. Việc tinh sạch các chất được thực hiện bằng sắc ký cột

với chất mang là silica gel thường, nên các hợp chất không hoặc kém phân cực sẽ ra

khỏi cột trước còn các hợp chất phân cực cao sẽ ra khỏi cột sau. Do bởi trong các

hạt silica gel có các nhóm silanol những nhóm này dễ tạo liên kết hydro mạnh với

các hợp chất phân cực mang các nhóm: OH, NH2, COOH…và giữ chúng ở lại,

trong khi các hợp chất kém và không phân cực sẽ bị giữ lại bởi lực liên kết hydro

yếu hơn hoặc không bị giữ lại bởi nhóm silanol, nên chúng sẽ bị hệ đẩy ra trước.

Cột thủy tinh được nạp chất hấp phụ đến 2/3 thể tích. Cột được rửa với dung môi

nền là n-hexane trong 1 giờ nhằm ổn định cấu trúc. Mẫu được nạp lên cột, thôi mẫu

bằng hỗn hợp dung dịch chloroform : acetone với tỷ lệ 10:1, 5:1, 0:1. Các phân

đoạn thu được với tỷ lệ dung môi 5:1 được tinh sạch lần 2 bằng cột silica gel với hệ

dung môi n-hexane : ethyl acetate với tỷ lệ 6:1 [22, 25]. Các phân đoạn được kiểm

tra độ sạch bằng sắc kí bản mỏng.

2.4.3 Sắc ký bản mỏng

Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography - TLC) hay còn gọi là sắc ký

phẳng là kỹ thuật phân bố rắn - lỏng. Trong đó pha động là chất lỏng được đi xuyên

qua một lớp chất hấp thụ trơ là pha tĩnh như silicagel hoặc aluminium oxit (nhôm

oxit), chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng, và đều được phủ lên một

nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm, hoặc tấm plastic. Loại sắc ký lớp mỏng này có

thể dùng trong cả phân tích định tính và phân tích định lượng. Trong quá trình di

chuyển pha động kéo theo các cấu tử trong hỗn hợp mẫu di chuyển với các tốc độ

khác nhau phụ thuộc vào độ phân cực của chúng. Trong nghiên cứu này, bản sắc kí

silica gel làm pha tĩnh được phủ trên bản nhôm. Pha động là hỗn hợp hệ dung môi

dichlomethane : methanol với tỉ lệ 96:4. Sắc kí đồ được thể hiện màu bằng phương

pháp nhuộm xông hơi iôt [29].

2.4.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách chất

trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất

nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ

số phân bố của nó.

Trong điều kiện phân tích đã chọn, đại lượng đặc trưng cho một chất là thời

gian lưu tRi của chất đó trên cột tách. Chúng tôi dựa vào thời gian lưu này để định

tính được chất đó thông qua mẫu chuẩn. Sau đó dựa vào các tín hiệu phân tích thu

được (chiều cao pic hoặc diện tích pic) để định lượng các chất. Thông thường trong

phương pháp HPLC người ta biểu diễn quan hệ nồng độ chất phụ thuộc vào chiều

cao pic hoặc diện tích [27].

H = k.Cb S = k.Cb

Trong đó:

H - chiều cao pic sắc ký của chất

S - diện tích pic sắc ký của chất

k - hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký

b - hằng số bản chất, nó nhận giá trị trong vùng: 0 < b ≤ 1

2.4.5 Phương pháp điều chế mangostin phytosome

Điều chế phytosome mangostin dựa trên phương pháp bốc hơi dung môi theo

nghiên cứu của các nhóm tác giả [11,13].

Cân 1 lượng khối lượng magostin và 1 lượng tương ứng phosphatidylcholin

với tỉ lệ 1:1. Hòa tan α-mangostin sạch trong 80 ml methanol khuấy nhẹ trên máy gia nhiệt ở nhiệt độ 50oC, phosphatidylcholine cũng được hòa vào 80 ml diclomethan

khuấy nhẹ trên máy gia nhiệt. Trộn hai dung dịch trên vào bình cầu rồi đun cách thủy hồi lưu trong các thời gian 3h và ở nhiệt độ 400C, tốc độ quay khuấy từ 150

vòng/phút. Sau đó cô quay dung dịch (loại hết dung môi) đến hỗn hợp đậm đặc, tủa

sản phẩm bằng việc bổ sung 50 ml n-hexan vào bình cô quay rồi đem ly tâm thu cặn.

Rửa sản phẩm bằng n-hexan lạnh (2 lần), để khô ở nhiệt độ phòng. Sản phấm thu được sấy ở 4000C trong 2 giờ, thu được mangostin phytosome, bảo quản ở 40C.

Hình 2.2 Sơ đồ bào chế mangostin phytosome

2.4.6 Phương pháp đánh giá khả năng tạo phức giữa hoạt chất và phospholipid

2.4.5.1 Phương pháp đo quang phổ hồng ngoại IR

Nguyên tắc: trong phân tử, các nguyên tử ở mỗi liên kết sẽ dao động với một

tần số đặc trưng nằm trong vùng hồng ngoại. Khi bị chiếu một chùm tia, liên kết đó

sẽ hấp thụ bức xạ có bước sóng đúng bằng dao động giữa các nguyên tử của liên

kết. Các nhóm có cấu tạo khác nhau sẽ dao động ở những số sóng khác nhau và đặc

trưng cho nhóm đó.

Mục đích: Sau khi quét phổ và giải được phổ IR của phytosome, phân tích sự

thay đổi số sóng của các nhóm chức đặc trưng trên phổ đồ để chỉ ra các liên kết mới

hình thành và các nhóm cũ mất đi, từ đó có thể chứng minh liên kết tạo phức giữa

phospholipid và dược chất.

2.4.5.2 Phương pháp đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS

Phương pháp đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS dựa vào hiệu ứng hấp thụ

xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ. Bước sóng được sử dụng từ

200 đến 800 nm. Hiện tượng bức xạ điện từ tuân theo định luật Lamber-Beer

Nguyên tắc: Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên sự tạo phức mầu của các

ion với thuốc thử. Nồng độ của các ion trong phức thay đổi sẽ tạo ra màu khác

nhau, dẫn đến độ hấp thụ quang khác nhau. Độ hấp thụ quang được xác định theo

phương trình :

A = Ɛ.l.C

Trong đó:

Ɛ: Hệ số hấp thụ phụ thuộc vào bản chất màu và bước sóng của ánh sáng tới.

l: Chiều dày cu vet.

C: Nồng độ chất phân tích.

Khi l và Ɛ không đổi, độ hấp thụ quang phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ.

Vì vậy, khi xây dựng được đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa độ hấp

thụ và nồng độ C trong từng trường hợp cụ thể sẽ dễ dàng xác định được nồng độ

chưa biết của một chất thông qua độ hấp thụ quang. Giới hạn phát hiện của phương pháp cỡ 10-5M – 10-6M.

Sau khi đo UV-VIS của phytosome, phân tích sự thay đổi của các nhóm chức

đặc trưng trên phổ đồ để chỉ ra các liên kết mới hình thành và các nhóm cũ mất đi,

từ đó có thể chứng minh liên kết tạo phức giữa phospholipid và dược chất.

2.4.7 Xác định hoạt tính kháng khuẩn

Nguyên lý: Phương pháp khuếch tán quá giếng thạch được sử dụng để xác

định hoạt tính kháng khuẩn, cụ thể phương pháp dựa trên khả năng đối kháng của

hoạt chất đối với vi khuẩn cần ức chế. Những hoạt chất này cho vào trong các giếng

đã đục trên môi trường đã trải sẵn vi khuẩn cần ức chế. Sau khi để hoạt chất khuếch

tán đều trong giếng, đĩa này sẽ được nuôi trong tủ ấm sau khoảng một ngày. Đường

kính vòng vô khuẩn xung quanh giếng thể hiện khả năng kháng vi khuẩn của hoạt

chất. Đường kính này càng lớn chứng tỏ khả năng ức chế của hoạt chất đối với vi

sinh vật càng mạnh và ngược lại.

Tiến hành: Vi khuẩn S. aureus nuôi trong môi trường LB lỏng sau 24 giờ sau

đó được trải đều trên đĩa thạch LB, mỗi lần trải cho 150 µl dịch nuôi. Sau đó đục

giếng thạch, có một giếng đối chứng âm là methanol - chất để hòa tan α-mangostin

và mangostin phytosome, các giếng còn lại là các tỉ lệ của hoạt chất α-mangostin và

phytosome mangostin lần lượt là 200 µg, 400 µg. Các đĩa sau khi cho chất thử hoạt

tính kháng khuẩn vào trong các giếng, sẽ được để trong tủ lạnh 2 giờ nhằm khuếch tán đều hoạt chất trong giếng. Rồi được nuôi trong tủ ấm 37oC sau 24 giờ đem ra quan sát

vòng vô khuẩn. Đối với chủng nấm C.albicans 150 µl dịch nuôi cấy được trải đều lên

đĩa petri. Khi ráo mặt thạch, sử dụng que đục để đục lỗ thạch, bổ sung 100 µl hoạt chất

α-mangostin và mangostin phytosome đã được hòa tan với methanol ở các nồng độ

khác nhau vào các giếng để hàm lượng đạt được trong các giếng lần lượt là 200 µg,

400 µg. Đối chứng sử dụng là 100 µl methanol, riêng với chủng S. aureus đối chứng

dương sử dụng là 100 µl chloramphenicol 0,2%. Tiếp đó, để đĩa thử hoạt tính này

vào tủ lạnh khoảng 2 giờ để cho hoạt chất được khuếch tán sau đó chuyển sang tủ

37ºC, ủ sau 24 giờ, quan sát vòng vô khuẩn quanh giếng.

2.4.8 Xác định hoạt độ peroxidase

Nguyên lý: Hoạt độ peroxidase được xác định bằng phương pháp sử dụng

3,3-5,5-tetramethyl benzidine (TMB) làm cơ chất theo phương pháp của Josephy

và cộng sự [26]. Trong môi trường đệm phản ứng thích hợp có hydrogen peroxide

(H2O2) và cơ chất TMB, H2O2 sẽ được khử thành H2O và oxy hóa cơ chất TMB tạo

thành hợp chất có màu xanh hấp thụ cực đại ở bước sóng 492 nm. Dựa vào đồ thị

đường chuẩn có thể suy ra được hoạt độ peroxidase có trong mẫu cần phân tích

(Hình 2.3).

Tiến hành: Thành phần phản ứng xác định hoạt độ peroxidase: 40 µl 0,6%

TMB; 250 µl đệm 100 mM natri acetate pH 5,5; 50 µl dung dịch enzyme (50 µl

nước cất cho đối chứng); 2 ml nước cất; 10 µl dung dịch 0,5% H2O2. Hỗn hợp phản

ứng được giữ ở 25C trong 15 phút. Dừng phản ứng bằng 100 µl dung dịch 2 N

H2SO4. Đo mật độ quang ở bước sóng 492 nm. Hoạt độ peroxidase được biểu thị

bằng đơn vị g/mg protein.

Hình 2.3. Đường chuẩn peroxidase có sử dụng chuẩn peroxidase horce

(Sigma)

2.4.9 Xác định làm lượng malondialdehyde

Nguyên lý: Hàm lượng MDA được định lượng theo Ohkawa và cộng sự

(1979) [31]. MDA là một trong những sản phẩm thứ cấp trong quá trình peroxy hóa

lipid được gây ra bởi các gốc tự do. Trong môi trường đệm phản ứng thích hợp,

chất này sẽ phản ứng với TBA (thiobarbituric acid) tạo ra hợp chất trimethine có

màu hồng hấp phụ cực đại ở bước sóng 532-535 nm. Đo độ hấp thụ của phức, suy

ra hàm lượng MDA có trong mẫu. Nếu lượng MDA giảm so với mẫu đối chứng,

mẫu được xác định là có hoạt độ chống oxy hóa.

Thành phần phản ứng xác định hàm lượng MDA: 300 l dung dịch 8,1%

SDS; 300 µl đệm 20% sodium acetate pH 3,5; 300 µl dung dịch 0,8% TBA; 80 µl

dung dịch enzyme. Hỗn hợp phản ứng được đun nóng 1 giờ ở 95C, sau đó làm

lạnh. Dùng hỗn hợp dung môi n-butanol : pyridine tỷ lệ 15:1 để chiết, lấy dịch trong

màu hồng đo ở bước sóng 532 nm. Hàm lượng MDA được biểu thị bằng đơn vị đo

g/g tổ chức với hệ số tắt là  = 1,56 x 105 mol-1 x cm-1

2.4.10 Xác định hàm lượng protein

Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford [19]. Phương

pháp này dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với Coomassie Brilliant

Blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước

sóng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Hàm

lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch

albumin huyết thanh bò (Hình 2.4).

Hình 2.4. Đường chuẩn Bradford sử dụng BSA làm chuẩn

2.4.11 Xác định hàm lượng -SH tự do

Nguyên lý phản ứng:

DTNB

5.5’-dithio-bis (2nitrobenzoicacid) + R-SH Thiophenolatanion (màu vàng) Đo độ hấp thụ màu ở 420nm. Sử dụng hệ số ε420nm = 13.000 mM-1 cm-1 tính

nồng độ mmol -SH/mg protein.

Các bước tiến hành:

- Cho dung dịch NaCl 9‰ và đệm phosphat pH: 8,0; 0,2M

- Chia đều mẫu làm 2 ống, ống thử thêm dung dịch Ellmanm

- Đo ở bước sóng 420 nm

- Cách tính:

Trong đó: A: mật độ quang học; D: hệ số pha loãng và ε : hệ số hấp thụ, ở 420nm là 13.000 mM-1cm-1

. Kết quả tính ra mmol -SH/mg protein ở dịch cần đo.

2.4.12 Xử lý số liệu

Phần mềm Microsoft excel được sử dụng để xử lý số lượng thu được trong

quá trình thực nghiệm và tính các giá trị của các tham số thống kê, biểu thị bằng các

biểu đồ thích hợp.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin

Áp dụng quy trình tinh sạch với các điều kiện tối ưu để thu được hiệu suất tách chiết hoạt chất α-mangostin như nhiệt độ là 60oC, thời gian là 4 giờ, dung môi

là ethanol với tỷ lệ dung môi: nguyên liệu là 3:1 từ các nghiên cứu trước [10].

Chúng tôi tiến hành tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin từ vỏ quả măng cụt

Garcinia mangostana L.. Kết quả trên hình 3.1 cho thấy, đã thu nhận được cao

chiết chứa hoạt chất α-mangostin thô từ vỏ quả măng cụt.

A

B

C

Hình 3.1. Tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin

(A); cất cô quay loại dung môi; (B) bình chiết có chứa cao chiết α-mangostin

Sau khi cất cô quay ở 40°C; (C) TLC mẫu cao chiết vỏ quả măng cụt có chứa hoạt

chất α-mangostin sau khi tách chiết theo các thông số đã tối ưu

(C: -mangostin chuẩn; M1-M2 là các mẫu tách chiết lặp lại 2 lần thu nhận hoạt

chất -mangostin).

Dịch chiết ethanol được tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp phân tách phân

đoạn. Cao chiết ethanol thu được chiếm đến 18,8% khối lượng nguyên liệu ban đầu

(Bảng 3.1).

Dịch chiết được sử dụng để tinh sạch bằng cột sắc kí silica gel hai lần. Sau

khi tinh sạch bằng cột silicagel lần 1, các phân đoạn có chứa α-mangostin ở lần tinh

sạch lần một được gộp lại và đưa lên cột tinh sạch lần hai với hệ dung môi là n-

hexan : ethyl acetate tỷ lệ 6:1 và 12:1. Các phân đoạn sau đó được kiểm tra với sắc

kí bản mỏng TLC.

LC 1 2 3 4 C 5 6 7 8 9 10

Hình 3.2. Ảnh chạy sắc kí bản mỏng sản phẩm tinh sạch α-mangostin

qua cột silica gel lần thứ hai với hệ dung môi chloroform: acetone tỷ lệ 5:1 ( C:

α-mangostin chuẩn; LC: mẫu lên cột; 1-10: Các phân đoạn tinh sạch α-mangostin

sau khi lên cột silicagel lần 2)

Kết quả hình 3.2 cho thấy các phân đoạn từ 1-10 xuất hiện duy nhất một

băng ngang chuẩn với α-mangostin (Chromadex) có Rf = 0,7 cm trong hệ dung môi

dichlomethane : methanol với tỷ lệ 96:4 và không xuất hiện băng phụ, điều này

chứng tỏ sau khi qua cột silica gel lần hai, chúng tôi đã thu được α-mangostin sạch.

Kết quả này cao hơn so với nghiên cứu của Misra và cộng sự (2009) khi sử dụng hệ

dung môi chloroform : methanol với 9:1 có Rf = 0,46 cm [36]. Sự chênh lệch giữa

hai giá trị Rf trên có thể là do sự khác nhau của các hệ dung môi được chọn làm pha

động khi TLC. Bảng 3.1 cho thấy lượng -mangostin thu được sau khi tinh sạch

chiếm 0,142% khối lượng nguyên liệu ban đầu. Kết quả này thấp hơn so với nghiên

cứu của Pothitirat và cộng sự (2008), công bố tách chiết được lượng mangostin bao

gồm các hoạt chất -mangostin, -mangostin, -mangostin chiếm 9,94% khối lượng

nguyên liệu [50]. Tuy nhiên, lượng -mangostin thu được ở nghiên cứu này cao

hơn kết quả nghiên cứu của các tác giả Iinuma và cộng sự tách chiết được lượng -

mangostin chiếm 0,0019% khối lượng nguyên liệu thô [25]. Nguyên nhân có thể do

hiệu suất thu hồi trong quá trình sắc kí cột silica gel không ổn định, và nguyên liệu

có nguồn gốc khác nhau thì hàm lượng -mangostin cũng khác nhau.

Bảng 3.1. Tỷ lệ sản phẩm tách chiết so với nguyên liệu thô.

Sản phẩm

So với nguyên liệu thô (%)

Cao chiết ethanol

18,875 ± 0,5210

Cao chiết n- hexan

0, 174 ± 0,0457

0,142 ± 0,0419

- mangostin tinh sạch

Hoạt chất - mangostin tinh sạch được xác định cấu trúc bằng phương pháp

cộng hưởng từ hạt nhân. Từ các phổ 1H-NMR, 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT,

HSQC, HMBC (không dẫn hình); so sánh dữ liệu phổ của hoạt chất - mangostin

với các tài liệu trên thế giới và các đặc trưng vật lí, hợp chất trên được xác định

đúng là -mangostin như các tài liệu đã công bố. Công thức cấu tạo của -

mangostin như sau:

B

A

Hình 3.3. Hoạt chất α-mangostin dạng tinh thể

(A) và công thức cấu tạo của hoạt chất α-mangostin (1,3,6-trihydroxy-7-methoxy-

2,8-bis(3-methylbut-2-enyl)xanthen-9-one)

Độ sạch của -mangostin cũng được kiểm tra bằng phương pháp HPLC. Kết

quả thu được cho thấy mẫu -mangostin chỉ còn một đỉnh duy nhất với thời gian

lưu là 19,968 chiếm tới 98,58% tổng khối lượng chất lên cột. Điều này chứng tỏ,

hoạt chất thu được đã tinh sạch (Hình 3.4, Bảng 3.2). Như vậy, sản phẩm thu được

đủ độ sạch và độ tin cậy cao có thể sử dụng làm nguyên liệu tạo hoạt chất

mangostin phytosome.

Hình 3.4 Phổ HPLC của hoạt chất - mangostin sau khi qua các

cột sắc ký silicagel lần 2

Bảng 3.2 Số liệu phân tích phổ HPLC của mẫu - mangostin tinh sạch

Peak RetTime

Area

Height[mAU Width

Area[%]

[min]

[mAU*S]

[min]

1 19,182

16,6

9,1E-1

0,3036 1,069

2 19,968

1530,9

310,6

0,0755 98,585

3 21,058

5,4

1,1

0,0817 0,346

3.2. Điều chế mangostin phytosome

Hoạt chất α-mangostin hòa tan trong 80 ml methanol, phosphatidylcholine

cũng được hòa vào 80 ml diclomethan. Trộn hai dung dịch trên vào bình cầu rồi đun cách thủy hồi lưu trong thời gian 3 giờ và ở nhiệt độ 400C, tốc độ quay khuấy từ

150 vòng/phút. Sau đó cô quay dung dịch để loại bỏ dung môi, tủa sản phẩm bằng

việc bổ sung 50 ml n-hexan rồi đem ly tâm thu cặn. Rửa sản phẩm bằng n-hexan lạnh (2 lần), để khô ở nhiệt độ phòng rồi sấy ở 4000C trong 2 giờ, thu được

mangostin phytosome là chất bột màu vàng, dẻo và hơi dính.

Bảng 3.3. Hiệu suất của quá trình điều chế mangostin phytosome

Mẫu

α-

phosphatidylcholin

Tỷ lệ KL

Lƣợng phức

Hiệu

mangostin

(P) (g)

(S: P)

phytosome (g)

suất

(S) (g)

( % )

0,5

1 0,5

1: 1

0,689±0,06

68,9

0,5

2

1 1:2

0,46±0,02

30,6

0,5

3 1,5

1:3

1,41±0,13

70,5

Theo bảng 3.3, nhận thấy hiệu suất quá trình điều chế mangostin phytosome

đạt hiệu suất cao nhất ở tỉ lệ 1:3 đạt 70,5%. Khi thay đổi tỷ lệ của phospholipid và

mangostin, càng nhiều phospholipid thì hiệu suất phytosome hóa càng cao do càng

có nhiều phospholipid thì cung cấp càng nhiều vị trí liên kết, phức hợp dễ tạo

thành hơn và lượng α -mangostin tham gia liên kết được nhiều hơn. Kết quả

nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thúy và

cộng sự, khi điều chế phytosome saponin từ củ cây Tam thất ở tỉ lệ 1: 1 có hiệu

suất 70%, tỉ lệ 1:2 có hiệu suất 72,5%, tỉ lệ 1: 3 có hiệu suất 88,76% [9]. Nhưng lại

cao hơn nghiên cứu của Đào Hoàng Bá Tùng đã tiến hành nghiên cứu bào chế

phytosome quercetin, hiệu suất phytosome hóa 41,01 % [11]. Das và cộng sự đã

tiến hành nghiên bào chế phytosome rutin, nghiên cứu đã so sánh khả năng thấm

thuốc qua da giữa rutin và phức hợp phytosome (tỷ lệ mol rutin:phospholipid là

1:1). Kết quả cho thấy sau 20 giờ, rutin nguyên liệu chỉ hấp thu được 13 ± 0,87%

trong khi của phytosome hấp thu được 33 ± 1,33% [49]. Phạm Thị Minh Huệ và

cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome curcumin, với dung môi hòa

tan là ethanol, phospholipid là phosphatidylcholin đậu nành cho hàm lượng

curcumin trong phytosome curcumin là 25,71 ± 0,46% [13]. Vũ Thị Thu Hà tiến

hành nghiên cứu bào chế phytosome quercetin bằng phương pháp kết tủa trong

dung môi, hiệu suất đạt 79,92% [12]. Từ những kết quả thu được cho thấy,

phytosome các hoạt chất khác nhau sẽ cho hiệu suất là khác nhau. Vì thế để tiết

kiệm nguyên liệu cũng như đảm bảo hiệu quả kinh tế, chúng tôi sẽ tiếp tục điều

chế α-mangostin theo tỷ lệ phosphatidylcholin và - mangostin tỷ lệ 1:1 mặc dù

hiệu suất chỉ đạt 68,9% để tạo hoạt chất phức hợp mangostin phytosome cho các

nghiên cứu tiếp theo. Theo như kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đưa ra quy trình

bào chế phytosome mangostin như sau:

Hình 3.5. Quá trình bào chế mangostin phytosome

3.3. Đánh giá tƣơng tác giữa hoạt chất và phospholipid trong phytosome

3.3.1 Phân tích phổ hồng ngoại IR

Đặc tính cảm quan của phức hợp mangostin phytosome thu được là chất bột

màu vàng đậm, dẻo, hơi dính. Mẫu mangostin phytosome này được chúng tôi gửi

sang Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam để đo độ nóng

chảy của hoạt chất cũng như phân tích phổ hồng ngoại. Kết quả thu được cho thấy

nhiệt độ nóng chảy mangostin phytosome chảy 105-106°C trong khi nhiệt độ nóng

chảy của hoạt chất - mangostin đạt 204- 205°C.

Để đánh giá sự tương tác giữa - mangostin và phosphatidylcholin trong

phức hợp phytosome mangostin, tiến hành quét phổ hồng ngoại với 2 mẫu: -

mangostin, mangostin phytosome. Kết quả thu được như hình 3.6.

A

B

Hình 3.6. Phổ hồng ngoại của mẫu - mangostin

(A) và dạng bào chế phytosome mangostin (B) Trong khoảng 3599 – 1750 cm-1, xuất hiện 1 đỉnh mới trong phức mangostin phytosome (B) ở 1733,89 cm-1. Điều này chứng tỏ có sự hình thành liên kết H giữa

mangostin và phospholipid (phosphatidylcholin) trong quá trình tạo phytosome. Trong khoảng từ 1643,12 – 585,01 cm-1, xuất hiện nhiều đỉnh mới ở 874,46 cm-1

phức (B), chứng tỏ sự có mặt của phospholipid trong phức (Hình 3.6). Trong biểu

đồ - mangostin (A) và phức mangostin phytosome (B), một số đỉnh từ 3 miền dao

động có vị trí tương quan thể hiện lớp phospholipid bao phía ngoài quanh

mangostin, điều này dẫn đến sự thay đổi số liệu như ở (A), có những đỉnh đặc trưng

ở vị trí giống nhau chứng tỏ sự tham gia của phospholipid trong phức mangostin

phytosome.

3.3.2. Phân tích quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS

Mẫu - mangostin và phức mangostin phytosome cũng được gửi sang phòng

NanoBioPhotonics, Viện Vật lý, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

để đo kích thước hạt cũng như phổ hấp thụ của các hoạt chất.

A

B

Hình 3.7. Hấp thụ huỳnh quang của phức mangostin phytosome

(A) và phổ hấp thụ phân tử UV-VIS của mẫu - mangostin và dạng bào chế

mangostin phytosome (B)

Kết quả trên hình 3.7 cho thấy phức mangostin phytosome hấp thụ huỳnh

quang ở bước sóng kính sử dụng laser 488nm và đạt cực đại ở bước sóng 318 nm.

Phổ UV-vis của mangostin phytosome thấy có sự thay đổi ở vùng bước sóng 318

nm, chứng tỏ có sự tương tác giữa α-mangostin và photphatidylcholin. Kết quả

nghiên cứu của chúng tôi tương tự như nghiên cứu của Nguyễn Thị Mai Phương và

cộng sự khi đánh giá hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư phổi A549 của hạt nano

polymer bọc α-mangostin đã đo quang phổ UV-vis của chất nghiên cứu trong dải

bước sóng từ 190-400 nm đã được đo để kiểm tra sự thay đổi về nhóm chức có mặt

trong phân tử nano polymer mangostin (NMG) so với α-mangostin (AMG), kết quả

thu được cho thấy phổ UV-vis của mẫu NMG có sự thay đổi ở vùng bước sóng 243

nm khi so với mẫu AMG, chứng tỏ tương tác hóa học nội phân tử giữa α-mangostin

và chất mang ß-cyclodextrin đã xảy ra [8].

3.4. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của mangostin phytosome

Dịch nuôi hoạt hóa của C.albicans, S. aureus được trải đều lên mặt đĩa thạch

SDA và LB, sau đó đục giếng thạch và bổ sung 100 µl hoạt chất α-mangostin và

mangostin phytosome đã được hòa tan với methanol ở các nồng độ khác nhau vào

các giếng để hàm lượng đạt được trong các giếng lần lượt là 200 µg, 400 µg . Đối

chứng âm sử dụng là 100 µl methanol, riêng với chủng S. aureus đối chứng dương

sử dụng là 100 µl chloramphenicol 0,2%. Mẫu được ủ 24 giờ ở 37ºC, sau đó quan

sát các vòng kháng khuẩn ở các giếng và so sánh.

A

B

Hình 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của α-mangostin và mangostin phytosome

đối với nấm Candida albicans (A) và vi khuẩn Staphylococcus aureus (B)

Chủng Candida albicans(A): 1: Đối chứng âm; 2,5: mẫu mangostin

phytosome với nồng độ tương ứng 200 µg, 400 µg; 3,4: mẫu α-mangostin

nồng độ tương ứng 200 µg, 400 µg)

Chủng Staphylococcus aureus (B): 1: Đối chứng âm; 2: Đối chứng dương; 3,4:

mẫu mangostin phytosome với nồng độ tương ứng 200 µg, 400 µg; 5,6: mẫu α-

mangostin nồng độ tương ứng 200 µg, 400 µg)

Kết quả sau khi ủ 24 h ở 37ºC cả α-mangostin và mangostin phytosome đều

có hoạt tính kháng vi khuẩn S. aureus và C.albicans (Hình 3.8). Kết quả cho thấy ở

mẫu đối chứng không có hoạt tính kháng khuẩn, các giếng còn lại đã xuất hiện vòng

kháng khuẩn. Ở giếng chứa mangostin phytosome có hoạt tính kháng khuẩn cao

hơn α-mangostin, khi thử hoạt tính kháng khuẩn với Candida albicans, ở nồng độ

400 µg, mangostin phytosome cho đường kính vòng kháng là 1,3 0,015 cm còn α-

mangostin cho đường kính vòng kháng là 0,7 0,01 cm. Ở nồng độ 200 µg vòng

kháng khuẩn đạt 1,2 0,015 cm (mẫu mangostin phytosome) và 0,5 0,01 cm (mẫu

α-mangostin).

Đối với S. aureus khi thử hoạt tính kháng khuẩn ở nồng độ 400 µg,

mangostin phytosome cho đường kính vòng kháng là 2,1 0,01 cm còn α-

mangostin cho đường kính vòng kháng là 1,5 0,02 cm. Chúng tôi nhận thấy

mangostin phytosome và α-mangostin đều có hoạt tính kháng S. aureus và

C.albicans, kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Đỗ Thi Tuyên và cộng

sự về hoạt tính kháng khuẩn của α-mangostin[10]. Chủng S. aureus là liên cầu

khuẩn Gram dương gây bệnh viêm phổi hay nhiễm trùng máu còn C. albicans là

loại nấm gây nhiễm trùng trên bề mặt của khoang miệng, âm đạo và đường tiêu

hóa. Do đó, hoạt chất mangostin phytosome có khả năng ức chế được sự sinh

trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn và nấm này sẽ định hướng tạo sản

phẩm ứng dụng trong y dược.

3.5 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên động vật thực nghiệm

3.5.1 Ảnh hưởng của mangostin phytosome lên hoạt độ peroxidase trong gan

Peroxidase là enzyme có bản chất hemoglobin, oxy hóa cơ chất hữu cơ để

chuyển hóa chất độc nội sinh H2O2 thành H2O. Peroxidase là enzyme chống oxy

hóa quan trọng đối với cơ thể, có mặt trong tế bào chất và màng ty thể của hầu hết

tế bào sinh vật, đặc biệt hoạt động mạnh ở gan và hồng cầu, những cơ quan có vai

trò quan trọng trong quá trình giải độc và vận chuyển O2 trong cơ thể. Sự thay đổi

hàm lượng và hoạt độ các enzyme chống oxy hóa trong đó có peroxidase là biểu

hiện không bình thường của trạng thái sinh lý, cân bằng nội bào khi cơ thể đáp ứng

với các chất ngoại sinh.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ xác định hoạt độ peroxidase ở gan mà

không xác định hàm lượng peroxidase ở máu, bởi vì cơ thể còn có một số

peroxidase giả như hemoglobin và myoglobin có hoạt độ như peroxidase. Catalase

cũng là enzyme xúc tác chuyển hóa H2O2 thành nước và nhiều chất khác có ảnh

hưởng đến hoạt độ peroxidase.

Bảng 3.4. Hoạt độ peroxidase trong gan chuột

Nhóm

n

Hoạt độ peroxidase

Tỷ lệ % so với

đối chứng

nghiên

(µg/mg protein)

± SD

cứu

11 11,37±1,43

ĐC(-)

11 17,11±3,43

ĐC(+)

50,4%

TN1

16 10,31±3,34

9,3%

TN2

16 17,2±2,6

51%

TN3

11 13,12±4,48

15%

TN4

16 17,61±1,48

54,8%

TN5

11 11,62±3,5

50,4%

n: Số cá thể thí nghiệm;

: giá trị trung bình, SD: sai số.

Hình 3.9. Hoạt độ peroxidase trong gan chuột dưới tác dụng của

mangostin phytosome

Cơ chế tác dụng của các chất ngoại sinh lên các enzyme chống oxy hóa là

phức tạp và đa dạng. Sự thay đổi hàm lượng và hoạt độ peroxidase phụ thuộc vào

nhiều yếu tố như: liều lượng, bản chất chất ngoại sinh, đường lây nhiễm, thời gian

nhiễm, loài và bản chất enzyme. Khi chuột được bổ sung uống mangostin

phytosome, chúng tôi quan sát thấy chuột vẫn khỏe mạnh. Hoạt độ peroxidase của

gan ở các nhóm chuột uống CCl4 có bổ sung uống mangostin phytosome đã tăng.

Chứng tỏ hoạt chất mangostin phytosome giúp khả năng tổng hợp peroxidase ở gan

nhiều hơn mức bình thường hoặc là thúc đẩy hoạt độ enzyme tăng mạnh để làm cho

cơ thể tiêu diệt các gốc tự do khi cơ thể bị nhiễm độc CCl4 (Bảng 3.4). Do CCl4 là

một chất độc, khi vào cơ thể sẽ tạo ra nhiều gốc tự do làm giảm hoạt độ của enzyme

chống oxy hóa, ảnh hưởng đến các chức năng giải độc của gan. Khi quan sát gan

chuột, chúng tôi nhận thấy gan bạc trắng, phù nề, nhiều nốt sần. Điều này chứng tỏ

gan đã bị tổn thương. Kết quả ở Bảng 3.4 cho thấy hoạt độ peroxidase đã giảm

9,3% so với nhóm đối chứng.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với các nghiên cứu trên thế

giới cũng như trong nước. Các kết quả thu được chứng tỏ phytosome mangostin có

tác dụng chống oxy hóa trên gan chuột nhiễm độc CCl4 ở liều 0,1 mg/10g thể trọng

và liều 0,2 mg/10g thể trọng. Như vậy, chế phẩm phytosome mangostin có ảnh

hưởng quan trọng lên sự thay đổi hoạt độ peroxidase ở gan chuột. Trong nghiên cứu

của Devi Sampath và cộng sự (2007) cũng khẳng định rằng -mangostin có khả

năng ngăn chặn sự suy giảm các enzyme chống oxi hóa như glutathione-S-

transferase (GST), glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD),

catalase (CAT) do isoproterenol (một loại hợp chất sử dụng trong điều trị tim mạch)

gây ra[21].

3.5.2 Ảnh hưởng của mangostin phytosome lên hàm lượng MDA trong gan chuột

MDA là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid, xảy ra do tác động của các

chất oxi hóa, gốc tự do tác động lên các phân tử có bản chất lipid trong tế bào.

MDA có thể tham gia phản ứng tạo thành sản phẩm cộng với amino acid tự do hay

với protein để hình thành những liên kết ngang trong những phân tử protein này, khi

đó có thể cảm ứng gây biến đổi mạnh mẽ những đặc tính hóa sinh của chúng Hàm

lượng MDA được coi là chất chỉ thị quan trọng để đánh giá mức độ ảnh hưởng và

tốc độ phản ứng peroxy hóa lipid diễn ra trong tế bào, cũng như có thể xác định

được hàm lượng các gốc tự do, từ đó cho thấy mức độ, tính chất nguy hại của

những tác nhân lạ được đưa vào cơ thể sinh vật.

Bảng 3.5. Hàm lượng MDA trong gan chuột dưới tác dụng của

phytosome mangostin

Nhóm nghiên

n

Tỷ lệ % so

cứu

với

Hàm lƣợng MDA (mol/mg protein) × 10-4

đối chứng

± SD

ĐC(-)

11 443±19,55

ĐC(+)

11 410,96±12,55

7,2%

TN1

16 760,58±22,814

71,6%

TN2

16 606,39±22,009

36,9%

TN3

11 681,75±14,691

12,4%

TN4

16 487,38±15,335

10%

TN5

11 352,84±10,538

20%

n: Số cá thể thí nghiệm;

: giá trị trung bình, SD: sai số.

Hình 3.10. Sự thay đổi hàm lượng MDA trong gan dưới tác dụng của

mangostin phytosome.

Hàm lượng MDA trong gan ở nhóm uống CCl4 tăng rõ rệt, tăng 71,6% so

với nhóm đối chứng. Điều này cho thấy phản ứng peroxy hóa lipid trong tế bào gan

do tác động của CCl4 ở nhóm chuột bị nhiễm độc diễn ra khá mạnh mẽ. Ở nhóm

TN2, nhóm chuột nhiễm độc CCl4 được điều trị bằng mangostin phytosome liều 0,1

mg/10 g thể trọng, hàm lượng MDA giảm so với nhóm nhiễm độc CCl4 khoảng

34,7% nhưng vẫn tăng gần với nhóm đối chứng (Bảng 3.7). Nguyên nhân có thể là

do tác dụng ngăn cản quá trình peroxy hóa lipid bởi CCl4 của mangostin

phytosome.

Thêm

vào

đó,

ở

nhóm

TN5

chỉ

uống

-mangostin liều 0,2 mg/10 g thể trọng, hàm lượng MDA trong gan giảm 20% so

với nhóm đối chứng, giảm 53% so với nhóm nhiễm độc CCl4. Trong nghiên cứu

của Williams và cộng sự (1995) đã chứng minh rằng mangostin có khả năng bảo vệ

các phân tử hàm lượng thấp có bản chất là lipoprotein (LDL) tránh khỏi sự oxi hóa của các ion kim loại (Cu2+) ở nồng độ 100 mM ở thời điểm 4 giờ, ở điều kiện in

vitro [53]. Tương tự, Mahabusarakam và cộng sự (2000) đã chứng minh rằng -

mangostin và các dẫn xuất tổng hợp của nó có thể ngăn chặn sự oxi hóa phân tử

LDL. Sự thay đổi cấu trúc -mangostin, thay C3 và C4 bằng các dẫn xuất

aminoethyl làm tăng cường hoạt hoạt động chống oxi hóa, trong khi thay bằng các

gốc methyl và acetate làm giảm hoạt động chống oxi hóa [35]. Kết quả nghiên cứu

cho thấy mangostin phytosome thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, không chỉ có tác

dụng bảo vệ gan khỏi bị nhiễm độc ngoại sinh mà còn bảo vệ gan khỏi các gốc oxi

hoá nội sinh.

3.5.2 Ảnh hưởng của mangostin phytosome lên hàm lượng nhóm -SH trong gan

chuột

Nhóm -SH đóng vai trò rất quan trọng trong cấu trúc bậc cao và chức năng

của các đại phân tử như protein (enzyme, lipoprotein) trong cơ thể sống. Nhóm -SH

cũng như các nhóm chứa lưu huỳnh nói chung còn tham gia vào quá trình tăng sinh

tế bào, bảo vệ cơ thể chống lại sự nhiễm độc. Người ta đã nghiên cứu và quan sát

thấy có sự liên quan chặt chẽ giữa số lượng nhóm -SH trong phân tử protein của cơ

thể(như dịch cơ thể, máu và các mô) với một số bệnh lý nhất định. Hàm lượng

nhóm -SH trong tế bào và cơ thể càng cao chứng tỏ khả năng bảo vệ cơ thể khỏi sự

tấn công của các nhân tố gây stress oxy hóa càng lớn. Tại gan, việc giảm hàm lượng

nhóm -SH sẽ gây tổn thương gan.

Bảng 3.6. Hàm lượng nhóm -SH trong gan chuột dưới tác dụng của

phytosome mangostin

Nhóm nghiên

n

Hàm lƣợng nhóm SH

Tỷ lệ % so

cứu

với

(mol/mg protein)× 10-4

đối chứng

± SD

ĐC(-)

11 217,29±57,2

ĐC(+)

11 219,75±79,5

1,1%

TN1

16 204,79±93

5,7%

TN2

16 224,52±75,5

3,32%

TN3

11 209,68±89,5

3,5%

TN4

16 223,64±76,6

2,9%

TN5

11 210,52±162,4

3,1%

n: Số cá thể thí nghiệm;

: giá trị trung bình, SD: sai số

Hình 3.11. Sự thay đổi hàm lượng nhóm -SH trong gan dưới tác dụng của

mangostin phytosome

Kết quả trên bảng 3.8 cho thấy hàm lượng nhóm trong gan ở nhóm uống

CCl4 giảm 5,7% so với nhóm đối chứng. Điều này cho thấy các liên kết disulfua của

phân tử protein trong tế bào gan do tác động của CCl4 ở nhóm chuột bị nhiễm độc

bị phá vỡ khá nhiều dẫn đến suy giảm hàm lượng protein trong gan. Ở nhóm TN2,

nhóm chuột nhiễm độc CCl4 được điều trị bằng mangostin phytosome liều 0,1

mg/10 g thể trọng, hàm lượng nhóm SH đã tăng 3,32% so với nhóm đối chứng.

Nguyên nhân có thể là do tác dụng ngăn cản quá trình phá huỷ nhóm -SH bởi CCl4

của mangostin phytosome. Thêm vào đó, ở nhóm TN4 nhóm chuột nhiễm độc CCl4

được điều trị bằng mangostin phytosome liều 0,2 mg/10 g thể trọng, hàm lượng

nhóm -SH trong gan cũng tăng 2,9% so với nhóm đối chứng, tăng 8,6% so với

nhóm nhiễm độc CCl4. Khi chuột uống CCl4 chuột sẽ bị nhiễm độc ở gan dẫn đến

phá hủy protein làm hàm lượng nhóm -SH bị suy giảm, còn khi chuột được điều trị

bằng mangostin phytosome thì hàm lượng nhóm -SH tăng lên đáng kể so với nhóm

đối chứng và nhóm bị nhiễm độc CCl4 chứng tỏ mangostin phytosome đã làm tăng

hàm lượng nhóm -SH, bảo vệ gan khỏi bị nhiễm độc.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Hoạt chất α-mangostin tinh sạch được tách chiết từ vỏ quả măng cụt chiếm

0,142% khối lượng thô ban đầu và độ sạch đạt 98,5% (HPLC). Hoạt chất có

dạng tinh thể màu vàng, nhiệt độ nóng chảy đạt 204 - 205°C, Rf =

0,7 cm trong hệ dung môi dichlomethane : methanol với tỷ lệ 96:4.

2. Điều chế thành công mangostin phytosome có dạng bột màu vàng, dẻo, hơi

dính, nhiệt độ nóng chảy đạt 105-106°C, hấp thụ huỳnh quang cực đại ở

bước sóng 318 nm. Mangostin phytosome có hoạt tính kháng lại một số

chủng vi khuẩn và nấm gây bệnh ở người như S. aureus, C.albicans ở nồng

độ 200 g và 400 g.

3. Mangostin phytosome thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan khỏi sự

tấn công của chất độc có tính oxi hóa mạnh là CCl4. Thể hiện bằng tác dụng

làm tăng hoạt độ peroxidase, tăng hàm lượng nhóm -SH và làm giảm hàm

lượng MDA ở gan chuột trong các nhóm nghiên cứu.

KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục tạo sản phẩm mangostin phytosome và thử nghiệm ảnh hưởng

lên một số các enzyme chống oxy hóa như superoxide dismutase,

glutathione peroxidase và đánh giá trạng thái chống oxy hóa toàn phần để

ứng dụng tạo sản phẩm chống oxy hóa giải độc gan.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Trương Văn Châu, Trần Hồng Quang, Đỗ Ngọc Liên (2004), "Đặc tính kháng

khuẩn của các hợp chất phenolic ở một số loài cây thuộc chi Garcinia L. " Tạp

chí Sinh học 26(4): pp. 59-62.

2. Đào Hùng Cường, Đỗ Thị Thuý Vân (2010), "Nghiên cứu chiết tách và xác

định xanthone từ vỏ quả Măng cụt (Garcinia mangostin L)", Tạp chí Khoa học

và công nghệ, Đại học Đà nẵng, 5(40): pp. 167-173.

3. Nguyễn Thị Ngọc Dao, Đỗ Thị Hồng Cẩm (1997), "Hoạt độ peroxidase ở một

số tổ chức thực vật", Tạp chí Y học Việt Nam, 6: pp. 39-43.

4. Hoàng Văn Huấn (1998), "Nghiên cứu sự biến đổi hệ thống enzyme

cytochrome P450 và một vài thông số hóa sinh có liên quan nhiễm độc thực

nghiệm nhiên liệu lỏng tên lửa", Luận văn thạc sỹ y học, Học viện Quân Y,

Bộ Giáo dục và Đào tạo - Bộ Quốc Phòng.

5. Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học Hà

Nội. 567-568.

6. Hoàng Công Minh (2001), "Nghiên cứu ảnh hưởng của hỗn hợp

dichlorodiethyl sulfide với chlorovinyl dichlorarsine lên một số chỉ tiêu độc

học, hóa sinh, huyết học trên động vật thực nghiệm và tác dụng của thuốc điều

trị", Luận án tiến sỹ y học, Học viện Quân y, Bộ Giáo dục và Đào tạo - Bộ

Quốc phòng.

7. Nguyễn Mai Phương, Nguyễn Thị Thịnh, Nguyễn Diệu Linh, Phan Tuấn

Nghĩa (2010), "Thu nhận và tìm hiểu tác dụng sinh học của chế phẩm chứa

xanthone từ vỏ quả măng cụt (Garcinia Mangostin L.)", Tạp chí công nghệ

sinh học, 8: pp. 717-735.

8. Nguyễn Thị Mai Phương, Trần Đại Lâm, Tạ Thu Mai, Nguyễn Trung Hợp

(2018), "Đánh giá hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư phổi A549 của hạt

nano polymer bọc α-mangostin ", Tạp chí Sinh học, 40(1), pp. 108-114.

9. Nguyễn Thị Thúy, Đào Thị Hồng Bích, Nguyễn Việt Anh, et al. (2016)

“Nghiên cứu thành phần và điều chế Phytosome Saponin toàn phần của củ cây

Tam thất (Panax Notoginseng) trồng ở Tây Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học

ĐHQGHN: Khoa học y dược, Tập 32, Số 1 : 18-24.

nh

10. Đỗ Thị Tuyên , Nguyê Thu Thùy , Nguyê Ngoc Han , Nguyê Thi A

Tuyết, Phùng Văn Trung , Quyền Đinh Thi , Nguyê Thi Maị Phương ,

Nguyê Thi Ngọc Dao (2010), "Nghiên cứu quy trình tách chiết và hoạt tính

kháng khuẩn của alpha-mangostin từ vỏ quả Măng cụt Garcinia mangostana.

L", Hội nghị Khoa học kỉ niệm 35 năm viện Công nghệ và Khoa học Việt

Nam, pp. 136-143.

11. Phạm Thị Minh Huệ, Bùi Văn Thuấn và Đặng Việt Hùng (2015),"Nghiên cứu

bào chế phytosome curcumin", Tạp chí dược học(467), tr. 14-18.

12. Vũ Thị Thu Hà (2016) “Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin bằng

phương pháp kết tủa trong dung môi”, Khóa luận tốt nghiệp dược sỹ đại học,

Trường Đại học Dược Hà Nội, trang 45

13. Đào Hoàng Bá Tùng (2016), “Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin bằng

phương pháp bốc hơi dung môi”, Khóa luận tốt nghiệp dược sỹ đại học,

Trường Đại học Dược Hà Nội, trang 47.

Tiếng Anh

14. Agarwal A., Chakraborty P., Chakraborty D.D. (2012), "Phytosomes:

Complexation, Utilisation and Commerical Status", Journal of Biologically

Active Products from Nature. 2(2), pp.65-77.

15. Anila Suryakant Kadu , Madhavi Apte (2017), “Phytosome: A Novel

Approach to Enhance the Bioavailability of Phytoconstituent”, Asian Journal

of Pharmaceutics, 11 (2), pp. 453-461.

16. Anderson, J. B. (2005). “ Evolution of antifungal-drug resistance: mechanisms

and pathogen fifness”, Nat Rev Microbiol, 3 (7): pp. 547: 556.

17. Bumrungpert, K., Kalpravidh, R. W., Chia-Chi Chuang, C. C., Overman, A.,

Martinez, K., Kennedy, A., McIntosh, M. (2010), “Xanthone from

Mangosteen inhibit inflammation in human macrophates and in human

adipocytes exposed to macrophate-conditioned media” J Nutr, 140: pp. 842-

847. 18. Bombardelli E., Spelta M. (1991), “Phospholipid-polyphenol complex: A new

concept in skin care ingredients”, Cosmetics Toiletries, pp. 69-76.19.

Dagalaki, N.(1980), “Design of an artificial skin. III. Control of pore

structure”, Biomedical Materials Research, 14: pp. 511-528.

19. Daniel, M. B., Michael, D. R., Stuart, J. E. (1996), Protein methods, ed. 2.

Wiley-Liss, New York..

20. Eloy J.O., Claro De Souza M., Petrilli R. (2014), "Liposomes as carriers of

hydrophilic small molecule drugs: Strategies to enhance encapsulation and

delivery", Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 123(0), pp. 345-363.

21. Devi Sampath, P., Vijayaraghavan, K. (2007), "Cardioprotective effect of alpha-

mangostin, a xanthone derivative from mangosteen on tissue defense system

against isoproterenol-induced myocardial infarction in rats", J Biochem Mol

Toxicol, 21(6): pp. 336-339.

22. Gopalakrishman, G., Banumathi, B., Suresh, G. (1997) “ Evaluation of the

antifungal activity of natuaral xanthones from Garcinia mangostana and their

synthetic derivatives”, J Nat Prod, 60 (5): pp. 519-524.

23. Han, C., Li, Z., Hou, J., Wang, J., Xu, D., Xue, G., Kong, L. (2017)

“Bioactivity evaluation of natural product a-mangostin as a novel xanthone-

based lysine-specific demethylase 1 inhibitor to against tumor metastasis”,

Bioorganic Chemistry, 76: pp. 415-419.

24. Huyn, H.K., In R.K., Hye, J. K., Bong, S.P., Su, B.Y. (2016), “α-Mangostin

Induces Apoptosis and Cell Cycle Arrest in Oral Squamous Cell Carcinoma

Cell”, Hindawi Publishing Corporation Evidence-Based Complementary and

Alternative Medicine, Article ID 5352412, 10 pages.

25. Iinuma, M., Tosa, H., Tanaka, T., Asai, F., Kobayasi, Y., Shimano, R.,

Miyauchi, K. (1996), “Antibacterial activity of xanthone from guittifẻacous

plants againts methicillin- resistant Staphylococcus aureus”, J Pharm

Pharmacol, 48 (8): pp. 861-865.

26. Josephy, P. D., Eling, T., Mason, R. P. (1982), "The horseradish-peroxidase

catalyzed oxidation of 3,5,3'5'-tetramethylbenzidine. Free radical and charge-

transfer complex intermediates", J Biol Chem, 257: pp. 3669-3675.

27. Jaleh, V., Naser, T., Farid, D., Mohammad, R.Z (2007), “Development and

validation of a simple HPLC method for simultaneous in vitro determination

of amoxicillin and metronidazole at single wavelength’’, Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 43(1), pp.325- 329.

28. Jun, J.K., Qiu, S., Zou, H., Rajamani, L., Li, J. Zhou, X., Tang, C,. Saraswathi,

P., Verma, C., Tan, D.T.H., Tan, A.L., Liu, S., Roger W.B. (2013), “Rapid

bactericidal action of alpha-mangostin against MRSA as an outcome of

membrane targeting”, Biochimica et Biophysica Acta, 1828 (2): pp. 834–844.

29. Kealey, D., Haines, P.J. (2002), Analytical Chemistry. Printed in the United

States of America.

30. Kim, H.M., Kim, Y.M., Hub, J.H., Lee, E.S., Kwon, M.H., Lee, B.R., Ko, H.J.,

Chung, C.H. (2017) “α-Mangostin ameliorates hepatic steatosis and insulin

resistance by inhibition C-C chemokine receptor 2”, Plos One 12 (6).

31. K Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. (1979), "Assay for lipid peroxides in animal

tissues by thiobarbituric acid reaction", Anal Biochem, 95(2): pp. 351-358.

32. Liu, T., Duan, W., Nizigiyimana, P., Gao, L., Liao, Z., Xu, B., Liu, L., Lei, M.

(2018), “Alphamangostin attenuates diabetic nephropathy in association with

suppression of acid sphingomyelianse and endoplasmic reticulum stress”,

Biochemical and Biophysical Research Communications, 496(2): pp. 394-400.

33. Malay K Das, Bhupen Kalita (2014), “Design and Evaluation of Phyto-

Phospholipid Complexes

(Phytosomes) of Rutin

for Transdermal

Application", Journal of Applied Pharmaceutical Science, 4(10), pp. 51-5734.

Mahlen, S.D. (2011), “Serratia infections: from military experiments to

current practice”, Clinical microbiology reviews, 24 (4): pp. 755-791.

35. Mahabusarakam, W., Proudfoot, J., Taylor, W., Croft, K. (2000), "Inhibition of

lipoprotein oxidation by prenylated xanthones derived from mangostin", Free

Radic Res, 33(5): pp. 643-659.

36. Misra, H., Dwivedi, B.K., Mehta, D., Mehta, B.K., Jain, D.C. (2009),

“Development and validation of high performance thin-layer chromatographic

method for determination of alpha-mangostin in fruit pericarp of mangosteen

plant (Garcinia mangostana L.) using ultraviolet visible detection”, Records

of Natural Products, 3 (4): pp. 178-186.

37. Nakatani, K., Atsumi, M., Arakawa, T., Oosawa, K., Shimura, S., Nakahata, N.,

Ohizumi, Y. (2002) “ Inhibition of histamine release and protaglandin E2

synthesis by mangosteen, a Thai medicinal plant” Biol Pharm Bull, 25 (9): pp,

1137-1141.

38. Patel Amit, Tanwar Y.S, Suman Rakesh, Patel poojan (2013),“Phytosome:

Phytolipid Drug Dilivery System for Improving Bioavailability of Herbal

Drug”, Journal of Pharmaceutical Science and Bioscientific Research, 3(2),

pp. 51-57.

39. Pimchan, T., Maensiri, D., Eumkeb, G. (2017), “Synergy and mechanism of

action of α‐mangostin and ceftazidime against ceftazidime‐resistant

Acinetobacter baumannii” Applied Microbiology 65 (4).

40. Pereira-Lachataignerais J., Pons R., Panizza P. (2006), "Study and formation of

vesicle systems with low polydispersity index by ultrasound method", Chem

Phys Lipids, 140(1-2), pp. 88-97.41. Pothitirat, W., Chomnawang, T.M.,

Gritsanapan, W. (2009), “ Anti-acne inducing bacteria activity and alpha-

mangostin content of Garcinia mangostana fruit rind extracts from different

provenience”, Songklanakarin J Sci Technol, 31 (1): pp. 41-47.

42. Sakagami, Y.,

Iinuma, M., Piyasena, K.G., Dharmaratne, H.R.

(2005)“Antibacterial activity of alpha-mangostin against vancomysin resistant

Enterococci (VRE) and synergism with antibiotics”, Phytomedicine, 12 (3):

pp. 203-208.

43. Szymonik-Lesiuk, S., Czechowska, G., Stryjecka-Zimmer, M., Slomka, M.,

Madro, A., Celinski, K., Wielosz, M. (2003), "Catalase, superoxide dismutase,

and glutathione peroxidase activities in various rat tissues after carbon

tetrachloride intoxication", J Hepatobiliary Pancreat Surg, 10(4): pp. 309-315.

44. Shibata, M. A., Iinuma, M., Morimoto, J., Kurose, H., Akamatsu, K., Okuno,

Y., Akao, Y., Otsuki, Y. (2011), “ Alpha- Mangostin extracted from the

pericarp of the mangosteen (Garcinia mangostana Linn) reduces tumor

growth and lymph node metastatic mammary cancer carying a p53 mutation”,

BMC Med, 9: pp. 69.

45. Sineewan, P., Mullika, C., Kittipot, S., Benjawan, D., Glyn, H., Griangsak, E.

(2016), “Synergism and the mechanism of action of the combination of α-

mangostin isolated from Garcinia mangostana L. and oxacillin against an

oxacillin-resistant Staphylococcussaprophyticus”, BMC Microbiology, 16:

pp. 195.

46. Solmaz Rasaie, Saeed Ghanbarzadeh, Maryam Mohammadi, Hamed

Hamishehkar, (2014), “Nano Phytosomes of Quercetin: A Promising

Formulation

for

fortification

of

Food

Products

with

Antioxidants”,Pharmaceutical sciences, 20, pp. 96-101.

47. Sivaranjani, M., Prakash, M., Gowrishankar, S., Rathna, J., Pandian, S.K.,

Ravi, A.V. (2017), “In vitro activity of alpha-mangostin in killing and

eradicating

Staphylococcus

epidermidis RP62A

biofilms” Applied

Microbiology and Biotechnology, 101 (8): pp. 2249-3359.

48. Sun, D., Zhang, S., Wei, Y., Yin, L. (2009), “ Antioxidant activity of mangostin

in cell-free system and its effect on K562 leukemia cell line in photodynamic

therapy” Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 41 (12): pp. 309-315.

49. Semalty, A., Semalty M., Singh D., Rawat M. S. M. (2010), “ Preparation

andcharacterization of phospholipid complexes of naringenin for effective

drug delivery”, J Incl Phenom Macrocycl Chem, 67(3), pp. 253-260..

50. Werayut, P., Gritsanapan, W. (2008), "Quantitative analysis of total mangostins

in Garcinia mangostana fruit rind", J Health Res, 22(4): pp. 161-166.

51. Wang, F., Ma, H., Liu, Z., Huang, W., Xu, X., Zhang, X. (2017), “ α -

Mangostin inhibits DMBA/TPA-induced skin cancer through inhibiting

inflammation and promoting autophagy and apoptosis by regulating

PI3K/Akt/mTOR

signaling

pathway

in mice”, Biomedicine &

Pharmacotherapy, 92: pp. 672–680.

52. Willets, K.A,. Van Duyne, R.P. (2007), “Localized surface plasmon resonance

spectroscopy and sensing” Physical Chemistry, 58: pp. 267‐297.

53. Williams, P., Ongsakul, M., Proudfoot, J., Croft, K., Beilin, L. (1995),

“Mangostin inhibits the oxidative modification of human low density

lipoprotein”, Free Radic Res, 23 (2): pp. 175-184.

54. Yuichi, Y., Yoshiaki, N., Mikimoto K., Koji N., Nobuhiro H., Yoshiki N.

(2014), “Function of Chemokine (CXC Motif) Ligand 12 in Periodontal

Ligament Fibroblasts”, Plos One, 9 (5).

55. Zhang, J., Chen, Q., Wang, S., Li, T., Xiao, Z., Lan, W., Huang, G., Cai, X.

(2017), “α-Mangostin, A Natural Xanthone, Induces Apoptosis and ROS

Accumulation in Human Rheumatoid Fibroblast-Like Synoviocyte MH7A

Cells”, Current Molecular Medicine (2017), 17 (5): pp. 375-380.

Website

56. Pubchem Chromone │ C9H6O2

Pubchem https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/chromone, accessed:

08/04/201857. Pubchem Acetaminophen │ C8H9NO2

Pubchem

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetaminophen#section=Pharmac

ology-and-Biochemistry, accessed: 02/04/2018.

58. Pubchem Mangostin │ C24H26O6

Pubchem

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Mangostin#section=Information-

Sources accessed: 02/04/2018

59. Fineartamerica Serratia marcescens Bacteria

SEM

https://fineartamerica.com/featured/1-serratia-marcescens-bacteria-sem-

scimat.html accessed: 02/04/2018

60. Pubchem Xanthone │ C13H8O2

Pubchem https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/xanthone#section=Top,

accessed: 08/04/2018

PHỤ LỤC

Hình P1. Hình ảnh chuột trước khi xử lý hóa chất ở các nhóm chuột.

Hình P2. Hình ảnh chuột sau khi xử lý hóa chất (14 ngày)

Bảng P1. Số liệu quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS của mangostin

phytosome và mangostin

Mangostin phytosome

α-mangostin

Wavelength Abs. Wavelength Abs. Wavelength Abs. Wavelength Abs.

nm. nm. nm. nm.

2.5985 510 0.0025 220 2.1592 510 0.0078 220

2.6262 511 0.0027 221 2.1251 511 0.0079 221

2.6524 512 0.0024 222 2.0846 512 0.0081 222

2.7451 513 0.0024 223 2.0535 513 0.0082 223

2.7322 514 0.0023 224 2.0332 514 0.008 224

2.7583 515 0.0026 225 2.0231 515 0.0078 225

2.7104 516 0.0027 226 2.0406 516 0.0078 226

2.7555 517 0.0028 227 2.0693 517 0.0079 227

2.7676 518 0.0027 228 2.1046 518 0.008 228

2.7954 519 0.0024 229 2.137 519 0.0079 229

2.8185 521 0.0022 230 2.176 521 0.0079 230

2.8844 522 0.0021 231 2.232 522 0.0078 231

2.9701 523 0.0022 232 2.2833 523 0.0079 232

3.0479 524 0.0025 233 2.3403 524 0.0078 233

3.0916 525 0.0026 234 2.4023 525 0.0075 234

3.1256 526 0.0026 235 2.4834 526 0.0069 235

3.1293 527 0.0025 236 2.5538 527 0.0067 236

3.1606 528 0.0024 237 2.6184 528 0.0067 237

3.1864 529 0.0023 238 2.6864 529 0.0069 238

3.2954 530 0.0023 239 2.7752 530 0.0069 239

3.3662 531 0.0024 240 2.8525 531 0.007 240

3.3912 532 0.0022 241 2.9265 532 0.0068 241

3.3393 533 0.0022 242 2.9928 533 0.0068 242

3.3568 534 0.0023 243 3.0591 534 0.007 243

3.3951 535 0.0025 244 3.0713 535 0.0073 244

3.4912 536 0.0025 245 3.0765 536 0.0076 245

246 3.5301 537 0.0022 246 3.0715 537 0.0074

247 3.6055 538 0.0023 247 3.0763 538 0.0075

248 3.5726 539 0.0026 248 3.0442 539 0.0074

249 3.523 540 0.0027 249 2.9857 540 0.0076

250 3.5028 541 0.0025 250 2.9455 541 0.0077

251 3.559 542 0.0023 251 2.9084 542 0.008

252 3.5709 543 0.0023 252 2.8558 543 0.0084

253 3.6044 544 0.0025 253 2.793 544 0.0085

254 3.5946 545 0.0026 254 2.7385 545 0.0085

255 3.6317 546 0.0028 255 2.715 546 0.0083

256 3.6143 547 0.0028 256 2.6867 547 0.0082

257 3.6242 548 0.0028 257 2.6688 548 0.0082

258 3.5792 549 0.0027 258 2.6629 549 0.008

259 3.5436 550 0.0027 259 2.6534 550 0.0081

260 3.5071 551 0.0026 260 2.6422 551 0.0081

261 3.5583 552 0.0025 261 2.6172 552 0.0082

262 3.5584 553 0.0021 262 2.5775 553 0.0079

263 3.5141 554 0.0021 263 2.5047 554 0.0076

264 3.4033 555 0.0021 264 2.3976 555 0.0076

265 3.2616 556 0.0023 265 2.2595 556 0.0079

266 3.1001 557 0.0024 266 2.1082 557 0.0082

267 2.8757 558 0.0024 267 1.9401 558 0.0084

268 2.643 559 0.0023 268 1.7774 559 0.0084

269 2.4121 560 0.0023 269 1.6195 560 0.0085

270 2.2165 561 0.0025 270 1.4776 561 0.0085

271 2.0385 562 0.0027 271 1.349 562 0.0085

272 1.8782 563 0.0027 272 1.2364 563 0.0085

273 1.7355 564 0.0028 273 1.1398 564 0.0086

274 1.6091 565 0.0027 274 1.0577 565 0.0085

275 1.5012 566 0.0025 275 0.9854 566 0.0084

276 1.4107 567 0.0022 276 0.9216 567 0.0083

277 1.3334 568 0.002 277 0.8678 568 0.0081

278 1.2679 569 0.0021 278 0.8227 569 0.0081

279 1.2113 570 0.0022 279 0.786 570 0.0081

280 1.1694 571 0.0024 280 0.759 571 0.0083

281 1.1399 572 0.0024 281 0.7401 572 0.0083

282 1.1249 573 0.0023 282 0.7306 573 0.0083

283 1.1218 574 0.0022 283 0.7282 574 0.0083

284 1.1295 575 0.0022 284 0.7328 575 0.0081

285 1.1486 576 0.0023 285 0.7446 576 0.008

286 1.1753 577 0.0022 286 0.7628 577 0.0079

287 1.2083 578 0.0019 287 0.7857 578 0.008

288 1.2498 579 0.0018 288 0.8128 579 0.0079

289 1.2977 580 0.002 289 0.8427 580 0.0079

290 1.3518 581 0.0021 290 0.8766 581 0.0077

291 1.4107 582 0.0022 291 0.9143 582 0.0076

292 1.4718 583 0.0023 292 0.9538 583 0.0075

293 1.5384 584 0.0024 293 0.9969 584 0.0076

294 1.6048 585 0.0024 294 1.0392 585 0.0077

295 1.6762 586 0.0024 295 1.0851 586 0.0078

296 1.7504 587 0.0021 296 1.1313 587 0.0077

297 1.8234 588 0.0023 297 1.1789 588 0.0078

298 1.8968 589 0.0023 298 1.2268 589 0.008

299 1.9743 590 0.0024 299 1.2782 590 0.0081

300 2.0568 591 0.0022 300 1.3325 591 0.0082

301 2.1412 592 0.0021 301 1.3877 592 0.0081

302 2.2308 593 0.0019 302 1.4465 593 0.008

303 2.3309 594 0.0018 303 1.5089 594 0.0078

304 2.4386 595 0.0017 304 1.5792 595 0.0077

305 2.5581 596 0.0017 305 1.651 596 0.0077

306 2.6626 597 0.0017 306 1.7226 597 0.0078

307 2.778 598 0.0019 307 1.794 598 0.0079

308 2.8854 599 0.0021 308 1.867 599 0.008

309 3.0029 600 0.0021 309 1.944 600 0.008

310 3.1179 601 0.0019 310 2.0129 601 0.008

311 3.2279 602 0.0018 311 2.0783 602 0.0081

312 3.2914 603 0.0018 312 2.1395 603 0.0081

313 3.338 604 0.0018 313 2.1984 604 0.008

314 3.3729 605 0.0017 314 2.2462 605 0.0077

315 3.4901 606 0.0018 315 2.2903 606 0.0077

316 3.5806 607 0.002 316 2.3222 607 0.0075

317 3.6691 608 0.0023 317 2.3501 608 0.0075

318 3.7142 609 0.0024 318 2.3603 609 0.0076

319 3.7052 610 0.0024 319 2.3555 610 0.0078

320 3.6791 611 0.0023 320 2.3378 611 0.0079

321 3.6133 612 0.0021 321 2.2983 612 0.008

322 3.5653 613 0.002 322 2.2575 613 0.0079

323 3.4626 614 0.0019 323 2.1954 614 0.0078

324 3.3437 615 0.002 324 2.1273 615 0.0077

325 3.2169 616 0.0022 325 2.0463 616 0.0079

326 3.099 617 0.0023 326 1.9607 617 0.008

327 2.953 618 0.0023 327 1.8648 618 0.0081

328 2.7982 619 0.0025 328 1.7606 619 0.0083

329 2.6325 620 0.0026 329 1.6522 620 0.0082

330 2.4795 621 0.0025 330 1.5494 621 0.0081

331 2.3299 622 0.0023 331 1.4512 622 0.0078

332 2.1899 623 0.0023 332 1.3605 623 0.0077

333 2.0581 624 0.0024 333 1.2796 624 0.0076

334 1.9419 625 0.0025 334 1.2051 625 0.0075

335 1.8394 626 0.0025 335 1.1407 626 0.0073

336 1.7479 627 0.0024 336 1.0822 627 0.007

337 1.6701 628 0.0021 337 1.0335 628 0.007

338 1.6018 629 0.002 338 0.9916 629 0.0069

339 1.5462 630 0.002 339 0.9568 630 0.007

340 1.4975 631 0.0022 340 0.9288 631 0.007

341 1.4601 632 0.0021 341 0.9051 632 0.0071

342 1.4303 633 0.0021 342 0.8878 633 0.0073

343 1.4071 634 0.0021 343 0.8723 634 0.0074

344 1.3894 635 0.0021 344 0.8619 635 0.0075

345 1.375 636 0.0017 345 0.8521 636 0.0072

346 1.3641 637 0.0014 346 0.846 637 0.007

347 1.3531 638 0.0013 347 0.8407 638 0.0066

348 1.346 639 0.0015 348 0.8377 639 0.0068

349 1.3403 640 0.0019 349 0.8346 640 0.0069

350 1.3339 641 0.0022 350 0.8315 641 0.0072

351 1.3273 642 0.0022 351 0.8276 642 0.0074

352 1.3201 643 0.002 352 0.8234 643 0.0075

353 1.3127 644 0.0016 353 0.8181 644 0.0074

354 1.302 645 0.0014 354 0.8123 645 0.0071

355 1.2885 646 0.0012 355 0.8055 646 0.0069

356 1.2729 647 0.0013 356 0.7976 647 0.0069

357 1.2558 648 0.0011 357 0.7884 648 0.0068

358 1.2376 649 0.0009 358 0.7775 649 0.0067

359 1.2187 650 0.0005 359 0.7657 650 0.0065

360 1.1964 651 0.0008 360 0.7519 651 0.0066

361 1.171 652 0.0009 361 0.7364 652 0.0065

362 1.1432 653 0.001 362 0.72 653 0.0061

363 1.1136 654 0.0009 363 0.7022 654 0.0057

364 1.0818 655 0.0007 364 0.6839 655 0.0052

365 1.0489 656 0.0008 365 0.6634 656 0.0052

366 1.0144 657 0.0006 366 0.6425 657 0.0051

367 0.9791 658 0.0007 367 0.6207 658 0.0055

368 0.9411 659 0.0006 368 0.598 659 0.0057

369 0.9015 660 0.0005 369 0.5743 660 0.0058

370 0.8612 661 0.0003 370 0.5503 661 0.0057

371 0.822 662 0.0001 371 0.5262 662 0.0056

372 0.7781 663 0.0002 372 0.4995 663 0.0053

373 0.7333 664 0.0002 373 0.4715 664 0.0051

374 0.6864 665 0.0001 374 0.4432 665 0.0051

375 0.6448 666 0 375 0.4172 666 0.0054

376 0.6046 667 0.0001 376 0.3922 667 0.0058

377 0.5656 668 0.0001 377 0.3677 668 0.006

378 0.5281 669 0.0004 378 0.3443 669 0.0065

379 0.4917 670 0.0005 379 0.3212 670 0.0065

380 0.4579 671 0.0006 380 0.2988 671 0.0067

381 0.4251 672 0.0008 381 0.2768 672 0.0066

382 0.3935 673 0.0009 382 0.2564 673 0.0066

383 0.3635 674 0.0008 383 0.2374 674 0.0069

384 0.3352 675 0.0008 384 0.2194 675 0.0071

385 0.3091 676 0.0009 385 0.2028 676 0.0074

386 0.2841 677 0.0012 386 0.187 677 0.0072

387 0.2609 678 0.0011 387 0.1723 678 0.007

388 0.2389 679 0.0015 388 0.1582 679 0.0069

389 0.2182 680 0.0017 389 0.145 680 0.0069

390 0.1989 681 0.002 390 0.1328 681 0.0072

391 0.181 682 0.002 391 0.1217 682 0.0073

392 0.1648 683 0.0021 392 0.1113 683 0.0074

393 0.1495 684 0.0023 393 0.1018 684 0.0074

394 0.1357 685 0.0022 394 0.0928 685 0.0074

395 0.1229 686 0.0021 395 0.0848 686 0.0073

396 0.1112 687 0.002 396 0.077 687 0.0071

397 0.1005 688 0.0022 397 0.0701 688 0.0072

398 0.0906 689 0.0024 398 0.0638 689 0.0074

399 0.0817 690 0.0025 399 0.0583 690 0.0076

400 0.0738 691 0.0026 400 0.0536 691 0.0077

401 0.0664 692 0.0026 401 0.0491 692 0.0076

402 0.0597 693 0.0026 402 0.045 693 0.0075

403 0.0535 694 0.0025 403 0.0406 694 0.0073

404 0.048 695 0.0023 404 0.037 695 0.0073

405 0.0435 696 0.0025 405 0.034 696 0.0076

406 0.0397 697 0.0027 406 0.0315 697 0.0076

407 0.0364 698 0.0027 407 0.0292 698 0.0078

408 0.0333 699 0.0025 408 0.027 699 0.0076

409 0.0301 700 0.0023 409 0.0249 700 0.0076

410 0.0273 701 0.0025 410 0.0232 701 0.0076

411 0.025 702 0.0025 411 0.0219 702 0.0076

412 0.0232 703 0.0024 412 0.0206 703 0.0077

413 0.0215 704 0.0025 413 0.0196 704 0.0078

414 0.0195 705 0.0024 414 0.0183 705 0.0076

415 0.0181 706 0.0027 415 0.0173 706 0.0076

416 0.0167 707 0.0026 416 0.0161 707 0.0076

417 0.0155 708 0.0026 417 0.0151 708 0.0077

418 0.0143 709 0.0022 418 0.0141 709 0.0074

419 0.0132 710 0.0022 419 0.0132 710 0.0074

420 0.0121 711 0.0021 420 0.0127 711 0.0075

421 0.0114 712 0.0024 421 0.0123 712 0.0081

422 0.0106 713 0.0028 422 0.0118 713 0.0083

423 0.0102 714 0.003 423 0.0113 714 0.0085

424 0.0095 715 0.0031 424 0.0106 715 0.0085

425 0.0089 716 0.0028 425 0.0101 716 0.0084

426 0.0083 717 0.0026 426 0.0097 717 0.0083

427 0.0078 718 0.0026 427 0.0096 718 0.0087

428 0.0076 719 0.0028 428 0.0094 719 0.0091

429 0.0074 720 0.0032 429 0.0091 720 0.0093

430 0.007 721 0.0031 430 0.0088 721 0.0089

431 0.0066 722 0.0029 431 0.0087 722 0.0088

432 0.0063 723 0.0027 432 0.0088 723 0.0088

433 0.0064 724 0.0028 433 0.0088 724 0.0089

434 0.0064 725 0.0029 434 0.0089 725 0.009

435 0.0064 726 0.003 435 0.0086 726 0.0092

436 0.0061 727 0.0031 436 0.0087 727 0.0092

437 0.0062 728 0.0031 437 0.0088 728 0.0089

438 0.0062 729 0.003 438 0.0088 729 0.0084

439 0.0065 730 0.003 439 0.009 730 0.0084

440 0.0063 731 0.0028 440 0.0087 731 0.0085

441 0.0063 732 0.0026 441 0.009 732 0.0087

442 0.0064 733 0.0025 442 0.009 733 0.0085

443 0.0065 734 0.0023 443 0.0089 734 0.0084

444 0.0065 735 0.0024 444 0.0085 735 0.008

445 0.0062 736 0.0023 445 0.0082 736 0.0078

446 0.0059 737 0.0029 446 0.0083 737 0.0077

447 0.0059 738 0.003 447 0.0084 738 0.0077

448 0.0062 739 0.0032 448 0.0087 739 0.0077

449 0.0063 740 0.0028 449 0.0086 740 0.0078

450 0.0061 741 0.0028 450 0.0084 741 0.008

451 0.0056 742 0.0027 451 0.0082 742 0.0079

452 0.0055 743 0.0029 452 0.0081 743 0.0076

453 0.0052 744 0.0031 453 0.0081 744 0.0076

454 0.0052 745 0.0034 454 0.0083 745 0.0078

455 0.0049 746 0.0035 455 0.0082 746 0.0079

456 0.0047 747 0.0031 456 0.0079 747 0.0077

457 0.0046 748 0.0031 457 0.0078 748 0.0076

458 0.0046 749 0.0031 458 0.008 749 0.0075

459 0.0044 750 0.0032 459 0.008 750 0.0076

460 0.0041 751 0.0034 460 0.0074 751 0.0077

461 0.0035 752 0.0034 461 0.0067 752 0.008

462 0.0034 753 0.0035 462 0.0067 753 0.0082

463 0.0034 754 0.0034 463 0.0068 754 0.0082

464 0.0037 755 0.0033 464 0.0071 755 0.0081

465 0.0039 756 0.003 465 0.007 756 0.0081

466 0.0038 757 0.0028 466 0.0072 757 0.008

467 0.0035 758 0.003 467 0.0072 758 0.0081

468 0.0034 759 0.0031 468 0.0074 759 0.0078

469 0.0034 760 0.0033 469 0.0076 760 0.008

470 0.0036 761 0.0033 470 0.0078 761 0.0081

471 0.0035 762 0.0035 471 0.0076 762 0.0083

472 0.0036 763 0.0033 472 0.0076 763 0.0082

473 0.0034 764 0.0032 473 0.0077 764 0.0084

474 0.0034 765 0.0035 474 0.0078 765 0.0086

475 0.0031 766 0.0035 475 0.0076 766 0.0085

476 0.0032 767 0.0037 476 0.0076 767 0.0085

477 0.0029 768 0.0036 477 0.0075 768 0.0087

478 0.0029 769 0.0034 478 0.0075 769 0.0088

479 0.0028 770 0.003 479 0.0075 770 0.0085

480 0.0028 771 0.0027 480 0.0076 771 0.0081

481 0.0027 772 0.0027 481 0.0077 772 0.0078

482 0.0028 773 0.003 482 0.0077 773 0.0079

0.003 774 0.003 483 0.0078 774 0.0081 483

0.003 775 0.0032 484 0.0078 775 0.0086 484

0.0029 776 0.0032 485 0.0077 776 0.0085 485

0.0029 777 0.0032 486 0.0077 777 0.0083 486

0.003 778 0.0032 487 0.0079 778 0.008 487

0.0028 779 0.0029 488 0.0079 779 0.0078 488

0.0023 780 0.0029 489 0.0079 780 0.0079 489

0.0019 781 0.003 490 0.0076 781 0.008 490

0.0018 782 0.0029 491 0.0077 782 0.0083 491

0.0021 783 0.0029 492 0.0077 783 0.0082 492

0.0025 784 0.0026 493 0.0079 784 0.0079 493

0.0025 785 0.0026 494 0.0079 785 0.0078 494

0.0024 786 0.0027 495 0.0079 786 0.0078 495

0.0025 787 0.0027 496 0.0081 787 0.0082 496

0.0028 788 0.0026 497 0.0084 788 0.0081 497

0.0031 789 0.0025 498 0.0087 789 0.0081 498

0.0031 790 0.0028 499 0.0086 790 0.008 499

0.003 791 0.0032 500 0.0082 791 0.0082 500

0.0029 792 0.0035 501 0.008 792 0.0086 501

0.0028 793 0.0035 502 0.0079 793 0.0085 502

0.0024 794 0.0034 503 0.0078 794 0.0088 503

0.0021 795 0.0031 504 0.0078 795 0.0084 504

0.0019 796 0.0027 505 0.0079 796 0.0086 505

0.0023 797 0.0029 506 0.0083 797 0.0086 506

0.0027 798 0.003 507 0.0085 798 0.0089 507

0.0029 799 0.0033 508 0.0083 799 0.0091 508

0.0026 800 0.0032 509 0.0081 800 0.0093 509

0.0025 510 0.0078 510