Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu thành phần hóa học rễ cây tào đông

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

TRỊNH THỊ GIANG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

RỄ CÂY TÀO ĐÔNG (Prunus zippeliana var.crasistyla (Card) J.E.Vid)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

Thái Nguyên, năm 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

TRỊNH THỊ GIANG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

RỄ CÂY TÀO ĐÔNG (Prunus zippeliana var.crasistyla (Card) J.E.Vid)

CHUYÊN NGÀNH : HOÁ HỌC HỮU CƠ

MÃ SỐ

: 60.44.27

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS PHẠM VĂN THỈNH

Thái Nguyên, năm 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số

liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Tác giả TRỊNH THỊ GIANG

iii

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được hoàn thành tại phòng thí nghiệm Hoá hữu cơ trường

Đại học sư phạm Thái Nguyên.

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Văn

Thỉnh - Người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt

quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Quyết Tiến, TS. Phạm Thị

Hồng Minh, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn

thành luận văn.

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hoá - Trường Đại học

Sư phạm Thái Nguyên, các thầy của Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã tận

tình giảng dạy, giúp đỡ và đưa ra nhiều ý kiến quý báu về mặt chuyên môn

trong quá trình tôi nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, khoa Sau Đại học Trường Đại

học Sư phạm Thái Nguyên, phòng hoạt chất Sinh học - Viện hóa học đã tạo

mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bố,Mẹ tôi, những người thân

trong gia đình và các đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi rất nhiều trong

quá trình thực hiện luận văn.

Thái nguyên, tháng 8 năm 2011

Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Trịnh Thị Giang

MỤC LỤC

Trang phụ bìa ................................................................................................. i

Lời cam đoan ................................................................................................. ii

Lời cảm ơn ..................................................................................................... iii

Mục lục ........................................................................................................... iv

Danh mục các hình ......................................................................................... vii

Danh mục bảng biểu, sơ đồ ............................................................................ viii

Danh mục các từ viết tắt ................................................................................. ix

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN CÁC THỰC VẬT CHI PRUNUS VÀ

THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA NÓ ........................................................ 3

1.1- KHÁI QUÁT VỀ CÁC THỰC VẬT CHI PRUNUS.............................. 3

1.2- NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC THỰC VẬT CHI PRUNUS ..... 4

1.2.2- Các hợp chất Gibberellins ................................................................... 7

1.2.3- Các hợp chất secquiterpen ................................................................... 11

1.2.4- Hợp chất điterpen ................................................................................. 11

1.2.5- Các hợp chất flavonoit ......................................................................... 12

1.3- TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HÓA HỌC THỰC VẬT PRUNUS

ZIPPELIANA ................................................................................................. 17

1.4- GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY TÀO ĐÔNG ...................................... 19

1.4.1- Mô tả cây Tào đông. ............................................................................ 20

1.4.2 – Đặc điểm phân bố. .............................................................................. 21

1.4.3. Thành phần hóa học. ............................................................................ 21

1.4.4. Tác dụng dƣợc lý .................................................................................. 21

1.4.5. Đặc điểm thu hoạch và chế biến .......................................................... 22

1.5. MỘT SỐ CÔNG DỤNG CỦA RỄ CÂY TÀO ĐÔNG ......................... 22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

CHƢƠNG 2 THỰC NGHIỆM .................................................................... 24

2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ........................... 24

2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu. ............ 24

2.1.2. Thử hoạt tính sinh học. ......................................................................... 25

2.1.3. Phƣơng pháp phân tích, phân lập các hợp chất từ dịch chiết. .............. 25

2.1.4. Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc hoá học các chất . ............................... 26

2.2. DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU. .................... 26

2.2.1. Dụng cụ, hoá chất. ................................................................................ 26

2.2.2. Thiết bị nghiên cứu. ............................................................................. 27

2.3. CÁC DỊCH CHIẾT CỦA RỄ CÂY TÀO ĐÔNG .................................. 27

2.3.1. Thu nhận các dịch chiết. ....................................................................... 27

2.3.2. Khảo sát định tính dịch chiết.[3] .......................................................... 29

2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất steroit. ..................................................... 29

2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit. .................................................................. 30

2.3.2.3. Phát hiện các flavonoit. ................................................................ 30

2.3.2.4. Phát hiện các cumarin. ................................................................. 30

2.3.2.5. Định tính các glycozit tim. ........................................................... 31

2.3.2.6. Định tính các saponin. .................................................................. 31

2.3.3. Thử hoạt tính sinh học. ......................................................................... 32

2.4. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT. ............................................. 34

2.4.1. Cặn dịch chiết n-hexan của rễ cây Tào đông Prunus zippeliana

var.crasistyla (Card )J.E.Vid .......................................................................... 34

2.4.1.1. Chất HT-1: Stigmast-5,22-dien- 24R-3β-ol. ................................. 34

2.4.1.2- Chất HT-2 :  - Sitosterol. ............................................................ 35

2.4.2- Các chất có trong dịch chiết etylaxetat ................................................ 36

2.4.2.1- Chất ET-1 : Axit 2α-hiđroxyursolic ............................................ 36

2.4.2.2- Chất ET-2 : Kempherol ............................................................... 37

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.4.2.3-Chất ET-3: 5,7,3,,4,5,-pentahidroxiflavan-3-ol hay epigallocatechin. .. 38

CHƢƠNG III THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................ 39

3.1. NGUYÊN TẮC CHUNG ........................................................................ 39

3.2. XÁC ĐỊNH ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT THIÊN NHIÊn ........... 39

3.3. PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG CÁC

DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU CỦA RỄ CÂY TÀO ĐÔNG ......................... 40

3.3.1. Chất HT-1: Stigmast-5,22-dien-24R-3 β –ol. ..................................... 40

3.3.2. -sitosterol (HT-2)3.3.2. -sitosterol (HT-2) ....................................... 47

3.3.3- Hợp chất ET-1 ...................................................................................... 51

3.3.4. Kempherol (ET-2) ................................................................................ 58

3.3.5. Epigallocatechin (ET-3) ....................................................................... 64

KẾT LUẬN ................................................................................................... 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 71

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

PHỤ LỤC CÁC PHỔ ................................................................................... 75

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cây tào đông ................................................................................... 20

Hình 1.3: Lá cây tào đông ............................................................................... 20

Hình 2.1 Kết quả thử hoạt tính sinh học từ dịch chiết rễ cây tào đông .......... 33

Hình ảnh ức chế xung quanh giếng thạch với chủng S. aureus ....................... 33

Hình ảnh ức chế xung quanh giếng thạch với chủng E. Col ........................... 34

Hình 3.1. Phổ FT - IR của Stimastenol ........................................................... 44 Hình 3.2 Phổ 1H- NMR của HT1 .................................................................... 45 Hình 3.3. Phổ 13C - NMR của Stimastenol ..................................................... 46

Hình 3.4: Phổ FT-IR của -sitosterol (HT-2) ................................................. 48

Hình 3.5: Phổ 1H-NMR của -sitosterol (HT-2) ............................................. 49

Hình 3.6: Phổ 13C-NMR và ATP của -sitosterol (HT-2) .............................. 50

Hình 3.7. Phổ MS của ET1 ............................................................................. 54

Hình 3.8. Phổ 1H - NMR của Axit 2α,3α-dihiđroxy-urs-12-en-28 oic (ET-1) .... 55

Hình 3.9. Phổ 13C - NMR của (ET-1) ........................................................... 56

Hình 3.10. Phổ 13C CPD & DEPT của (ET-1) .............................................. 57

Hình 3.11: Phổ 1H-NMR-AcetoneD6 của ET-2 ............................................. 61

Hình 3.12: Phổ 13C-NMR-AcetoneD6 của ET-2 ........................................... 62 Hình 3.13: Phổ 13CCPD & DEPT-AcetoneD6 của ET-2 ................................ 63 Hình 3.14: Phổ 1H-NMR-của: Epigallocatechin ET-3. .................................. 66

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.15: Phổ 13C-NMR- của Epigallocatechin ET-3. ................................ 67 Hình 3.16: Phổ 13CCPD & DEPT của Epigallocatechin ET-3. ...................... 68

viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1: Sơ đồ nghiên cứu thực vật trong dung môi clorofoc và metanol của

Prunus avium (Trƣờng ĐH Haminton-Canada) .............................................. 17

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết mẫu rễ cây Tào đông ........................................ 28

Bảng 2.1: Các hệ dung môi triển khai SKLM ................................................ 26

Bảng 2.2 : Khối lƣợng các cặn chiết thu đƣợc từ rễ cây Tào đông .............. 29

(Prunus zippeliana var.crasistyla) ................................................................... 29

Bảng 2.3: Phát hiện các nhóm chất trong rễ cây tào đông (Prunus zippeliana

var.crasistyla (Card )J.E.Vid ........................................................................... 32

Bảng 2.4 : Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết MeOH ................... 33

từ lá cây tào đông prunus zippelianna. ............................................................ 33

Bảng 3.1: Số liệu phổ 13C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của HT-1 và HT-2 trong

rễ cây Prunus zippelianna và phổ của -sitosterol ......................................... 42

Bảng 3.2 Các số liệu phổ NMR của chất ET-1 .............................................. 52

Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của ET-2 và số liệu phổ trong phần mềm

ACD/NMR của chất kempherol ...................................................................... 59

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 3.4 Các số liệu về phổ NMR của chất ET-3 ......................................... 65

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CC : Column Chromatography (Sắc ký cột).

SKLM : Sắc ký lớp mỏng.

MS : Mass Spectrometry (Phổ khối lƣợng).

LC-MS : Liqud chromatography- Mass Spectroscopy.

EI-MS : Electron Impact Mass Spectrometry.

FT-IR : Fourier Transfrorm Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại biến

đổi Fourie).

NMR : Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ

hạt nhân). 1H-NMR : Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ

hạt nhân proton). 13C-NMR : 13C- Nuclear Magnetic Resonance.( Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

các bon -13).

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer.

HSQC : Heteronuclear Single – Quantum Coherence.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

HMBC : Heteronuclear multiple – Bond Correlation.

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa với diện tích hơn

330.000km2, ba phần tƣ diện tích là đồi núi vì vậy nƣớc ta có một nguồn thực vật

vô cùng phong phú và đa dạng, nhiều loài cây chứa các hợp chất có tác dụng sinh

học cao. Từ xa xƣa ông cha ta đã biết sử dụng cây cỏ trong trong thiên nhiên

làm thuốc chữa bệnh, hƣơng liệu, mĩ phẩm… Tuy nhiên chúng chỉ đƣợc sử

dụng mang tính chất dân gian.

Hiện nay, nhiều nƣớc trên thế giới, nhiều công ty dƣợc đã và đang đẩy

mạnh các công trình nghiên cứu về hóa học thực vật. Các thuốc chữa bệnh

điều chế từ dƣợc liệu nhất là các chất đƣợc bào chế từ thực vật ngày càng

chứng minh đƣợc ƣu thế trong điều trị. Đó là do chúng ít gây ra tác dụng phụ

và nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao hơn so với các sản phẩm tổng

hợp.

Việc sử dụng các loại thuốc thảo dƣợc theo cách cổ truyền hay từ các

hợp chất nguồn gốc tự nhiên có xu hƣớng ngày càng gia tăng đã chiếm một vị

trí quan trọng trong nền Y học. Chế phẩm thảo dƣợc dù chỉ có một loại dƣợc

liệu nhƣng lại là hỗn hợp của nhiều hợp chất khác nhau và trong mọi trƣờng

hợp hầu hết đều chƣa xác định rõ hoạt chất của từng chất. Vì vậy, những bài

thuốc sử dụng thảo dƣợc là đối tƣợng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một

cách đầy đủ về bản chất các hoạt chất có trong cây cỏ thiên nhiên. Từ đó định

hƣớng cho việc nghiên cứu, chiết xuất để tìm ra các loại thuốc mới hay bằng

con đƣờng tổng hợp để tạo ra những chất có hoạt chất trong việc chữa trị

nhiều loại bệnh. Chính vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học từ những

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.

Nghiên cứu và chiết xuất thành công các ancaloit có trong củ bình vôi đã

chế ra các viên rotundin cho ngƣời mất ngủ kéo dài, Nghiên cứu hóa học và chiết

xuất thành công các secquitecpen có trong cây thanh hao hoa vàng đã đƣa Việt

nam thành một cƣờng quốc sản xuất thuốc chống sốt rét, việc nghiên cứu và chiết

xuất thành công axit shikimic từ cây Hồi Lạng sơn, làm nguyên liệu chính để sản

xuất tamiflu làm thuốc trị dịch cúm gia cầm H5N1, hay nhƣ chè cacdorido từ cây

dong riềng đỏ làm thực phẩm chức năng cho ngƣời áp huyết cao v. v… Những

kết quả nói trên có phần đóng góp xứng đáng của các nhà khoa học thuộc nhiều

chuyên ngành nhƣ sinh học, hoá học, công nghệ học, hóa dƣợc, v.v...

Theo hƣớng nghiên cứu trên, cây Tào đông có tên khoa học là Prunus

zippeliana var.Crasistyla (Card) J.E.Vid là một trong số các cây thuốc dân gian

đƣợc chọn làm đề tài của luận văn này. Nghiên cứu sơ bộ ban đầu cho biết cây

tào đông đƣợc đồng bào dân tộc thiểu số ở khu vực miền núi phía Bắc sử dụng

với các công dụng chữa viêm khớp cấp và mãn tính, chữa thống phong, chữa các

chứng đau cột sống, đau cơ, nhức nhối gân xƣơng v.v…. dịch chiết tổng số bằng

ancol rễ cây có tác dụng tốt đối với một số vinh vật kiểm định.

Có đƣợc nhiều ứng dụng nhƣ vậy song chƣa có nhiều công trình nghiên

cứu hoá học về thực vật này. Vì vậy nhằm góp thêm phần hiểu biết về thành phần

hóa học cây thuốc dân gian, chúng tôi chọn đề tài: “ Nghiên cứu thành phần

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

hóa học rễ cây tào đông” là nội dung chính của bản luận văn này.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

CÁC THỰC VẬT CHI PRUNUS VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA NÓ

1.1- KHÁI QUÁT VỀ CÁC THỰC VẬT CHI PRUNUS

Prunus là chi thực vật khá phổ biến ở nhiều nƣớc trên thế giới, từ lâu đã

đƣợc các nhà khoa học chú ý nghiên cứu và đã công bố nhiều công trình khoa

học, đặc biệt là những nghiên cứu về các ứng dụng của các loài thực vật thuộc

chi này trong đời sống trong đó có không ít các công trình nghiên cứu về thành

phần hóa học có trong chúng. Chi Prunus thuộc họ hoa hồng, có khoảng 200 loài

chủ yếu là cây thân gỗ hoặc cây bụi. Các loài cây này phần lớn mọc ở vùng ôn

đới phần Bắc bán cầu. Một số loài đƣợc biết đến nhiều hơn cả nhƣ các loại đào,

các loại mận, mơ, xeri v.v...đƣợc trồng rộng rãi để lấy trái. Cũng có một số loài

trồng làm cây cảnh. Phổ biến nhất của các loài này là các loài hoa anh đào ở Nhật

Bản, các loại đào ở Việt Nam, Trung Quốc, các loại hoa mai, v.v…[2],[5],[8],

một số loài ngoài việc cho sắc đẹp đôi khi còn có mùi thơm. Lá phần lớn thuộc

loại lá đơn, thuộc loại thay lá, thƣờng lá có mép răng cƣa và có hoa 5 cánh trong

các chùm đong đƣa hay thẳng đứng, ngoại trừ những loại có hoa kép có nhiều

cánh lớn hơn. Trái thƣờng ăn đƣợc, có dạng quả hạch, một hạt.[1],[6].

Từ trƣớc khi thực vật Prunus zippeliana đƣợc công bố năm 1858, ngƣời ta

đã công bố chi Prunus có tới 97 loài khác nhau, Cho đến hiện nay trên thế giới đã

biết đƣợc hơn 200 loài thuộc chi prunus có thể nêu ra một số loài tiêu biểu nhƣ

[22].

* Prunus africana * Prunus campanulata

* Prunus alabamensis * Prunus canescens

* Prunus americana * Prunus caroliniana

* Prunus andersonii * Prunus cerasifera

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

* Prunus angustifolia * Prunus cerasoides

* Prunus apetala * Prunus cerasus

* Prunus armeniaca * Prunus ceylanica

* Prunus avium * Prunus cocomilia

* Prunus besseyi * Prunus cornuta

* Prunus bifrons * Prunus crassifolia

* Prunus buergeriana * Prunus davidiana

* Prunus buxifolia * Prunus dom

* Prunus zippeliana

1.2- NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC THỰC VẬT CHI PRUNUS

Theo nhiều công trình nghiên cứu hóa học thực vật cho thấy các thực vật

thuộc chi prunus có thành phần hóa học rất đa dạng, phổ biến và phức tạp. Ngƣời

ta sơ bộ tổng kết từ năm 1982 đến 2006 đã xác định đƣợc cấu trúc 199 chất có

trong chi prunus, đó là các hợp chất thuộc rất nhiều nhóm hợp chất thiên nhiên

khác nhau, phổ biến là các steroit, tecpenoit, các flavonoit, các poliphenol,

secquitecpenlacton, nhiều nhóm glycosid, các oligosacarid và nhiều nhóm hợp

chất khác [13]. Ngoại trừ các loại quả đƣợc dùng làm đồ ăn, các chất đƣợc tách

ra từ các bộ phận khác của các thực vật này cũng có hoạt tính sinh học cao. nhiều

chất có khả năng kháng khuẩn, kháng oxi hóa, chống viêm v.v…[15],[26]. Loài

thực vật Prunus zippeliana hiện đang đƣợc các lang y dùng để chữa bệnh nhƣng

việc nghiên cứu hóa học loài thực vật này còn rất ít.

Kayano S. và các cộng sự [16] đã tách đƣợc các hợp chất axit

caffeoylquinic (CQA), axit hydroxycinnamic, axit benzoic, cumarin, lignan và

flavonoit từ Prunus domestica L [16].

Trong lá cây Prunus laurocerasus có sáp chứa trên 80% các hợp chất

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ankan (C16 –C22) [23].

Các nhà khoa học Hàn Quốc đã thử các hoạt tính chống ôxy hóa in vitro

của một số loài Prunus chọn lọc của Hàn Quốc nhƣ: P. buergeriana, P. daviana,

P.padus, P. pendula, P. sargentii, P. serrulata var. Spontanea và P.yedoensis.

Họ cũng đã tách đƣợc 11 flavonoit đã biết từ phân đoạn tan trong etyl axetat của

dịch chiết metanol từ lá cây P. serrulata var. Spontanea . Các hợp chất này có

hoạt tính oxy hóa cao [23].

Từ rễ cây P. ameniaca ngƣời ta cũng tách đƣợc ba đồng phân kiểu ent-

epiafzelechin- (4α 8; 2α O 7)-epiafzelechin (mahuannin A), ent-

epiafzelechin- (4α 8; 2α O 7)-(+) afzelechinn và ent-epiafzelechin- (4α

8; 2α O 7)-(-) afzelechin [19].

Từ lá trong cây thuộc chi Prunus nhƣ P. serotina và P. virginiana cv

Schubert của phân nhóm Padus và P. ilicifolia và P. lyonii của phân nhóm

Laurocelasus, Santamour F. S. Jr lần đầu tiên đã phát hiện ra amygdalin

diglucozit cyanua. Trong lá của các cây khác ở loài (Subgenera) chỉ chứa

monoglucozit prunazin[27].

Các loài trong chi Prunus khác nhƣ P. perisa. P. armeniaca. P. africana để

chữa ung thƣ, trị ho cũng đã đƣợc mô tả trong sách thuốc chữa của Trung Hoa và

trong những công bố gần đây[3].

Chúng tôi xin giới thiệu một số nhóm chất tiêu biểu mới đƣợc phát hiện

trong những năm gần đây từ một số thực vật thuộc chi prunus.

1.2.1- Một số hợp chất tritecpenoit

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về loài prunus africana.

Từ những năm 1995, phòng thí nghiệm trƣờng đại hoc Pari XI (Pháp) đã công bố

tìm ra một số hợp chất thuộc nhóm tritecpenoit trong đó có một hợp chất mới là

24-O-trans-ferulyl-2α,3α- dihydroxy-urs -12-en- 28-oic axit, có cấu trúc nhƣ sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

[11]

R1 R2 R3

1 α- OH β OH H

2 α -OAc β OH Me

24-O-trans-ferulyl-2α,3α dihydroxy-urs -12-en- 28-oic axit[11]

R1 R2 C-7’=C-8’

3 H β- OH trans

4 H β- OH cis

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

5 α- OH α- OH trans

Chất R1 R2 R3 R4 R5

Me α- OH α- OH Me H 6

Me α- OH α- OH Me Me 7

Me α- OH β- OH Me H 8

Me α- OAc β- OAc Me Me 9

Me β- OH H 10 H CH2OH

Me β- OAc 11 H CH2OAc Me

H α- OH α- OH Me 12 CH2OH

Me α- OAc α- OAc 13 CH2OAc Me

Me α- OH α- OH H 14 CH2OH

Me α- OAc α- OAc 15 CH2OAc Me

1.2.2- Các hợp chất Gibberellins

Tháng 12 năm 2001 các nhà khoa học Masayoshi, Nakayama, Tsukuba,

Ibaraki cùng các cộng tác viên đã công bố xác định đƣợc cấu trúc của 16 nhóm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

hợp chất với 40 chất khác nhau đều đƣợc phân lập từ Prunus persica[17]

16. R1=H, R2=OH 20. R1=H, R2=OH

17. R1=H, R2=H 21. R1=H, R2=H

18. R1=αOH, R2=H 22. R1=αOH, R2=H

19. R1=αOH, R2=OH 23. R1=βOH, R2=H

24. R1=αOH, R2=OH

21. R1=H, R2=OH

22. R1=H, R2=H

23. R1=αOH, R2=H

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

24. R1=βOH, R2=H

25. R1=H, R2=OH 30. R1=H, R2=OH

26. R1=H, R2=H 31. R1=H, R2=H

27. R1=αOH, R2=H 32. R1=αOH, R2=H

28. R1=βOH, R2=H 33. R1=βOH, R2=H

29. R1=αOH, R2=OH 34. R1=αOH, R2=OH

35. R1=αOH, R2=OH 38 36. R1=αOH, R2=H 39 ∆1,2

37. R1=βOH, R2=OH

38. R1=βOH, R2=H

40. R1=CO2H, R2=H 43

41. R1=CHO, R2=H

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

42. R1=CH3, R2=OH

44 45. R= α-OH

46. R= β-OH

47 48. R=H

49. R=OH

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

51. R1=H, R2=H 55. R1=OCH2OCH3, R2=OH

52. R1,R2=OCH2OCH3 56. R1=OCH2OCH3, R2= R1=OCH2OCH3

53 R1=OCH2OCH3, R2=OH

54. R1=OH, R2=OH

1.2.3- Các hợp chất secquiterpen

Từ Prunus amygdalus năm 2002, các nhà khoa học của Viện nghiên cứu

khoa học thực vật trƣờng đại học Rutgers Mỹ đã tìm thấy một secquiterpen mới

có trong vỏ thân của loài thực vật này mà cấu trúc của nó khác với các

secquirtecpen lacton đã đƣợc biết họ gọi là amygdalactone [14],[21].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1.2.4- Hợp chất điterpen

Cũng từ loài Prunus amygdalus Shengmin Sang, Guolin Li, Shiying Tian

và các cộng sự tại Viện nghiên cứu thức ăn của Mĩ đã phát hiện ra một điterpen

mới, công thức của nó đã đƣợc thiết lập bởi các phƣơng pháp quang phổ hiện đại

là: 17-O-β-D-glucopiranoside ent-6,7-epoxy-6-hidroxyl-6,7-secokaur-19-oic acid

[20].

1.2.5- Các hợp chất flavonoit

Tháng 12 năm 1996, Viện nghiên cứu trƣờng Đại học khoa học Lausanne

Scosland đã phân lập đƣợc một hợp chất mono flavonoit và xác định đƣợc cấu

trúc của một số hợp chất từ prunus prostrata là 7-metoxy(+)-catechin và một số

antoxyanidin, công thức cấu tạo của chúng đã đƣợc thiết lập bởi các phƣơng

pháp quang phổ [9],[18].

59 60

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

7- Metoxi-(+)-catechin Epicatechin

Propan-thocyanidins ent- Ent-epiafzelechin(2α-O-7,4α-8)kempferol

-epiafzelechin(2α-O-7,4α-8)quercetin

63 64 Epiafzelechin(2α-O-7,4α-8)epicatechin Epiafzelechin(2α-O-7,4α-8)epiafzelechin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

61 62

65. Ent-epiafzelechin (2α-O-7,4α-8) afzelechin

66. Ent-epiafzelechin (2α-O-7,4α-8) catechin

Năm 2009 từ loài prunus avium khi nghiên cứu về thành phần hóa học

của phần thân và nhân hạt cây Prunus avium các nhà hóa học trƣờng đại học

Hamilton (Canada) đã công bố cấu trúc của một số hợp chất thuộc nhóm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

flavonoid mà công thức cấu tạo của chúng đƣợc công bố nhƣ sau [12],[25].

67 (X=H; OH) 68

chalcone (X=OH) (+/-)-Naringenin 7-Hydroxyflavan

Đặc biệt khi nghiên cứu vỏ thân của loài cây này trong metanol và

clorofom ngƣời ta thấy kết quả nghiên cứu phổ có thể cho kết luận về một số hợp

chất nhƣ sau:

70. (-)-sakuranetin 71. dihydrowogonin

72 (+)-dihydrokaempferol 73. ﬂavonesbaicalein

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

74. galangin 75. apigenin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

76. Tectochrysin

Sơ đồ 1: Sơ đồ nghiên cứu thực vật trong dung môi clorofoc và metanol của

Prunus avium (Trƣờng ĐH Haminton-Canada)

1.3- TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HÓA HỌC THỰC VẬT PRUNUS

ZIPPELIANA

Loài thực vật Prunus zippeliana trên thế gới cũng đã có một số công trình

nghiên cứu về hóa thực vật. Tên của thực vật này đƣợc công bố vào năm 1958,

nó phân bố ở các quốc gia khác nhau còn ở Việt Nam loài thực vật này mới chỉ

đƣợc chú ý đến trong một số năm gần đây [1]. Theo thống kê của ARS về hệ

thống phân loại thực vật học trên thế giới đƣợc cập nhật vào ngày 13 tháng 10

năm 2004, từ năm 1960 ở Ấn Độ ngƣời ta đã tìm thấy một số loài của chi Prunus

zippeliana ban đầu có tên là Pygeum đến năm 1985 thực vật này đã có tên trong “

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Tuyển tập thực vật- Hệ thực vật Ấn Độ” [10]

Năm 1976, loài thực vật này đƣợc tìm thấy ở Okinawa và quần đảo

Ryukyu phía nam Nhật Bản và đƣợc ghi tên vào danh mục hệ thực vật của Nhật

Bản, tiếp sau đó khoảng những năm 1986, ngƣời Trung Quốc cũng phát hiện ra

một số công dụng Y học của loài thực Prunus zippeliana với rất nhiều loài khác

nhau đƣợc tìm thấy đã đƣợc coi nhƣ một vị thuốc quan trọng của Trung Y [10].

Về thành phần hoá học, gần đây, một số nhà hóa học của Viện nghiên cứu

thực vật Anh đã nghiên cứu và công bố một số chất hóa học có trong thành phần

của lá cây tƣơi Prunus zippeliana gồm: 22-dehydroclerosteryl acetate,

stigmasteryl acetate, β-sitosterol, stigmasterol, clerosterol, 22-dehydroclerosterol,

β-sitosterol và stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranoside, ursolic acid, oleanolic

acid, 2α-hydroxyursolic acid, tormentic acid, methyl linolate, phytol, prunasin,

dl-mandelic acid, 3-O-[O-α-L-rhamnopyranosyl-(1 →6)-β-D-glucopyranoside]

kaempferol và d-mandelic acid β-D-glucopyranoside.24α-ethylsterols (β-

sitosterol và stigmasterol) và 24β-ethylsterols (clerosterol và 22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

dehydrochosterol-) [11].

Kitaijma và Tanaka (1993) đã tách đƣợc (2R)2-O-β-D-glucopiranosyl-2-

hydroxy-phenylacetic acid

Ngƣời ta đã tìm thấy nhiều dẫn xuất xianua có trong các hạt và thân cây

của thực vật chi Prunus và cũng có trong cây Prunus zippelianna.[10].

1.4- GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY TÀO ĐÔNG

Cây Tào đông là tên thƣờng gọi của một loại cây thân gỗ dùng làm thuốc

chữa bệnh về cơ, xƣơng, khớp của ngƣời dân địa phƣơng miền núi phía Bắc, có

tên khoa học là Prunus zippeliana var.crasistyla (Card )J.E.Vid thuộc họ hoa

hồng (Rosaceae), bộ Amygdaleae, chi Prunus. Cây tào đông còn gọi là cây vàng

nƣơng vòi mập, cây đào rừng, cây đào chịa, cây tào phia, cây chạ đào...[1] đƣợc

phân bố nhiều nhất ở các tỉnh miền núi phía Bắc nƣớc ta, đặc biệt là ở các tỉnh

Cao Bằng, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Thái Nguyên và nhiều tỉnh miền núi Tây Bắc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

nƣớc ta.

1.4.1- Mô tả cây Tào đông.

Cây Tào đông là cây thân gỗ, to, cứng, lá thuôn có mép răng cƣa cứng,

mọc so le, cuống lá ngắn, lá thƣờng dài từ 5-7cm, rộng từ 3-5cm, có 2 loại đỏ và

trắng. Loại đỏ lá non và ngọn hồng tím, loại trắng và tất cả lá và ngọn đều xanh,

rễ cũng cứng hơn, mọc bám theo vách đá hoặc chui xuống dƣới đất. Loại rễ đi

nổi trên mặt đất thì rất cứng, loại rễ chìm thì mềm hơn, vỏ rễ mềm hơn. Kinh

nghiệm cho thấy sử dụng các loại rễ chìm cho hiệu quả tốt hơn cả mà lại dễ sử

dụng.[7].

Hình 1.1: Cây tào đông Hình 1.2: Thân cây tào đông

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 1.3: Lá cây tào đông

1.4.2 – Đặc điểm phân bố.

Ở nƣớc ta, cây tào đông là loại cây mọc hoang trên những dãy núi đá, hay

mọc ở khu vực miền núi phía Bắc đặc biệt ở các huyện vùng cao thuộc tỉnh Bắc

Kạn nhƣ Yên Cƣ, Hòa Mục, Tân Sơn (Chợ Mới), Sỹ Bình, Vũ Muộn (Bạch

Thông), Côn Minh, Cƣ Lễ (Na Rì), Nam Cƣờng, Bản Thi (Chợ Đồn). Riêng

vùng Côn Minh (Na Rì) và Xuất Hóa ( Thị xã Bắc Kạn) Thực tế hiện nay do khai

thác quá mức nên nguồn dƣợc liệu tự nhiên này cũng dần bị cạn kiệt vì vậy

trong các chƣơng trình trồng rừng của Nhà nƣớc đang tích cực vận động đồng

bào trồng cây tào đông để vừa lấy gỗ vừa làm nguồn cung cấp dƣợc liệu cho các

cơ sở sản xuất thuốc Đông y [3].

1.4.3. Thành phần hóa học.

Từ dịch triết Metanol Tào đông một số flavonoit cũng đƣợc xác nhận

nhƣ quecetin và quecetin – O – β – glucopyranozit, gennistin, các hợp chất

này có hoạt tính chống ôxi hóa nhƣ đã đƣợc công bố, anthocyanin, saponin,

steroid và tanin. Một điều lí thú là trong các mẫu Tào đông thƣơng mại một

hàm lƣợng cao dƣợc liệu thay đổi khá lớn có thể lên tới hai lần. Điều này cho

thấy càn thiết phải chuyển hóa dƣợc liệu nhằm đề xuất việc thu hái loại cây

này một cách thích hợp, để thu đƣợc cao dƣợc liệu có hàm lƣợng cao nhất.

Cây Tào đông cũng đã đƣợc một cơ sở chữa bệnh của Hội Dƣợc liệu triển khai

thí nghiệm lâm sàng chữa một số bệnh có kết quả (Trên 50% bệnh nhân cho

kết quả khả quan).Việc phát hiện các hợp chất trên cho phép giải thích đƣợc

phần nào ứng dụng của cây Tào đông trong y học cổ truyền của Bắc Cạn [3].

1.4.4. Tác dụng dƣợc lý

Tào đông là một cây thuốc mà ngƣời dân tộc ở một số vùng và một số thầy

thuốc sử dụng dƣới dạng sắc hoặc ngâm rƣợu uống để chữa viêm khớp, đau lƣng.

Một vị thuốc mà bệnh viện Y học cổ truyền Tỉnh Bắc Cạn đã sử dụng nhiều năm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

nay để điều trị các chứng bệnh đau lƣng, đau khớp và viêm đa khớp nên trong

chƣơng trình của Bác sĩ Chinh ƣu tiên cho việc xác định giá trị của cây thuốc, tác

dụng của vị thuốc theo kinh nghiệm dân gian. Trữ lƣợng sơ bộ và đặc biệt là

nghiên cứu hoạt tính sinh học, tác dụng chống viêm, độc tính của vị thuốc, trên

cơ sở đó chứng minh cho kinh nghiệm dân gian trong việc sử dụng cây thuốc này

để điều trị các bệnh về khớp.

Kết quả của Bác sĩ Chinh đƣợc ghi nhận nhƣ sau: Dung dịch vị thuốc Tào

đông dùng chống viêm cấp trên thí nghiệm gây phù bàn chân chuột. kết quả

chống viêm này phù hợp với kinh nghiệm của dân gian đã sử dụng để chữa các

trƣờng hợp thấp khớp sƣng nóng đỏ.

Độc tính: Độc tính thấp, LD50 là 31,5g/kg cân nặng [3].

1.4.5. Đặc điểm thu hoạch và chế biến

Bộ phận đƣợc dùng để làm thuốc là rễ, có thể thu hoạch quanh năm. Theo

kinh nghiệm của nhân dân, rễ cây tào đông đƣợc đào về đƣợc rửa sạch, thái nhỏ,

phơi khô ở chỗ dâm mát trƣớc khi đem sử dụng, việc sử dụng thì tùy từng mục

đích chữa bệnh khác nhau mà phối hợp với các vị thuốc khác.[3].

1.5. MỘT SỐ CÔNG DỤNG CỦA RỄ CÂY TÀO ĐÔNG

Theo một số nghiên cứu gần đây, cây tào đông là một trong những vị

thuốc có giá trị chữa bệnh cao. Các tỉnh miền núi vận động đồng bào các dân tộc

trồng cây tào đông nhằm góp phần phủ xanh đất trống đồi trọc, hạn chế xói mòn

chống lũ lụt, lấy gỗ để tạo ra các vật gia dụng. sản phẩm còn lại là rễ có tác dụng

làm thuốc chữa bệnh, kết quả thực nghiệm cho thấy rễ cây tào đông dùng kết hợp

với các vị thuốc khác, có thể trị đƣợc các bệnh viêm cơ cấp, bong gân, thấp khớp

cấp tính.

Nhiều thầy thuốc Đông y ở các tỉnh miền núi phía Bắc hay dùng rễ cây

làm thuốc chữa bệnh đau khớp, đau cột sống và đau dây thần kinh ngoại biên,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

một số thầy thuốc dân gian dùng làm thuốc kiện cƣờng gân cơ, cƣờng tráng cơ

thể. Thông thƣờng ngƣời ta lấy rễ đã phơi khô sắc nƣớc uống, liều lƣợng từ 10

đến 20g/ ngày.

Rễ cây tào đông thƣờng đƣợc dùng phối hợp với một số vị thuốc khác nhƣ:

Dây cắm, thổ phục linh, dây đau xƣơng. Ngƣời dân địa phƣơng hay dùng nhất là

đem ngâm rƣợu, cách ngâm nhƣ sau: 1 kg rễ cây, 4 lít rƣợu ngâm trong 1 tuần

chắt lấy rƣợu rồi lại đổ tiếp 2 lít rƣợu nữa, ngâm tiếp 1 tuần, trộn lẫn 2 loại rƣợu

này, mỗi ngày uống 2 lần, mỗi lần 30ml sau bữa ăn 1tiếng đồng hồ, ngoài ra có

thể dùng rƣợu này để xoa bóp các khớp đau nhức. Phƣơng thuốc này dùng để

chữa các trƣờng hợp thấp khớp, viêm đa khớp, đau cột sống thắt lƣng [3].

Hiện nay Công ty cổ phần sản xuất thuốc thành phẩm Y học cổ truyền

SAMAN đã và đang thu mua lƣợng lớn rễ cây tào đông trồng tại tỉnh Bắc Kạn

để sản xuất thuốc xoa bóp, phối hợp với một số cây khác chế biến thành thuốc

dƣới dạng viên nang để chữa bệnh viêm khớp, làm thuốc chữa bệnh gút (thống

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

phong) dƣới dạng viên thuốc GÚT SAMAN.

CHƢƠNG 2

THỰC NGHIỆM

Cây Tào đông - Prunus zippeliana var.Crasistyla (Card )J.E.Vid có nhiều

tác dụng trong việc điều trị bệnh. Theo kinh nghiệm của dân gian, dùng rễ cây

làm thuốc chữa bệnh đau khớp, đau cột sống và đau dây thần kinh ngoại biên,

một số lang y còn rễ cây này dùng làm thuốc kiện cƣờng gân cơ, cƣờng tráng cơ

thể. Về thành phần hóa học của cây này cho đến nay có rất ít kết quả nghiên cứu

đƣợc công bố.

Nhiệm vụ của luận văn là nhận dạng, phân lập và xác định cấu trúc hoá

học của các chất tinh khiết thu đƣợc từ rễ cây Tào đông mọc ở vùng núi đất

huyện Ba Bể tỉnh Bắc Kạn.

2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu.

Nguyên liệu để nghiên cứu là rễ cây Tào đông. Mẫu cây tƣơi đƣợc thu vào

tháng 11 năm 2010 tại xã Bản Thi huyện Chợ Đồn tỉnh Bắc Kạn.

Mẫu cây dùng để nghiên cứu hoá thực vật đã đƣợc PGS. TS. Lê Ngọc

Công Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên

giám định tên khoa học là Prunus zippeliana var.crasistyla (Card) J.E.Vid họ

hoa hồng Rosaceae. Ngoài ra, cây còn có những tên gọi theo tiếng địa phƣơng

của ngƣời dân tộc Tày là cây Tào đông, cây Đào rừng, cây Vàng nƣơng vòi mập,

Chạ đào[2],[5],[8].

Bộ phận rễ tƣơi đƣợc thái nhỏ đem sấy ở nhiệt độ 1100C trong 15 phút để diệt men, sau đó hong khô ở nơi thoáng mát hoặc sấy ở nhiệt độ 500C - 60 0C tới

khi khô hoàn toàn. Mẫu khô đƣợc nghiền nhỏ, cho vào bình ngâm chiết với

metanol ở nhiệt độ phòng nhiều lần cho đến khi dung dịch hầu nhƣ hoàn toàn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

mất màu.

Sau khi cất loại dung môi, cặn cô đƣợc dƣới dạng xiro thêm nƣớc vào đến

500ml sau đó chiết lần lƣợt bằng dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan,

etyl axetat, metanol.

Các dịch chiết đƣợc làm khan bằng Na2SO4 rồi cất kiệt dung môi bằng

thiết bị cất quay ở nhiệt độ 500 C dƣới áp suất thấp. Thu đƣợc 3 loại cặn tƣơng

ứng n-hexan, etylaxetat và metanol. Các cặn thô sẽ đƣợc phân chia bằng sắc kí

cột với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân lập các chất có

độ phân cực gần giống nhau, kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi

thích hợp để thu đƣợc các chất sạch. (Bảng 2.1)

Những phần cặn chiết cho phản ứng dƣơng tính với các loại biotest đƣợc

định hƣớng là những đối tƣợng ƣu tiên để phân lập các hoạt chất của mẫu cây

đem nghiên cứu.

Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm.

2.1.2. Thử hoạt tính sinh học.

Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định đối với các dịch chiết thô đƣợc

thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm trƣờng Đại học Y – Dƣợc Thái

Nguyên, từ kết quả thử hoạt tính sẽ xác định bản chất hoá học của hoạt chất.

2.1.3. Phƣơng pháp phân tích, phân lập các hợp chất từ dịch chiết.

Để phát hiện, phân lập đƣợc những hợp chất sạch từ các dịch thô khác

nhau của rễ cây Tào đông chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phƣơng pháp sắc kí,

hòa tan và kết tinh lại trong dung môi thích hợp. Các phƣơng pháp gồm:

- Sắc kí lớp mỏng (SKLM).

- Sắc kí cột silicagen, thƣờng dùng silicagen Merck 63- 200nm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Rửa nhanh bằng dung môi và kết tinh lại.

2.1.4. Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc hoá học các chất .

Các chất phân lập ở dạng tinh khiết đƣợc xác định những hằng số vật

lý đặc trƣng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ nhƣ: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H- NMR, phổ 13C- NMR, phổ khối lƣợng (MS) và các phổ phân giải cao. Các số liệu phổ

thực nghiệm của các chất sạch đƣợc dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của

chúng.

2.2. DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU.

2.2.1. Dụng cụ, hoá chất.

Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng

cho các loại sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế phải sử dụng

loại tinh khiết phân tích (PA).

Sắc kí lớp mỏng dùng bản mỏng đế nhôm DC – Alufolien Kiesegel 60 F254

tráng sẵn, độ dày 0,2mm đƣợc sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong

các dich chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm

thu đƣợc.

Bảng 2.1: Các hệ dung môi triển khai SKLM.

STT Hệ dung môi (Tỉ lệ thể tích) Kí hiệu

1 n-Hexan - EtOAc (90 : 10) hệ A

2 n-Hexan - EtOAc (70 : 10) hệ B

3 Cloroform – metanol (90 : 10) hệ C

4 Cloroform – metanol (70 : 10) hệ D

5 Cloroform – metanol (50 : 10) hệ E

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

6 Toluen –EtOAc- axit focmic (5:4:1) hệ F

Các bản SKLM sau khi sấy khô đƣợc hiện màu bằng vanilin 1% trong dung dịch metanol - H2SO4 5%, sau đó sấy trên 1000C và FeCl3 2% trong dung

môi rƣợu nƣớc.

Rf =

Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai có biểu thức:

Chiều dài di chuyển của chất thử.

Chiều dài di chuyển của dung môi.

Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rf A (B, C,…) x 100.

Sắc ký cột sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 -

0,063 mm) và 230-400 mesh (0,063 đến 0,200 mm).

2.2.2. Thiết bị nghiên cứu.

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boetus hoặc trên máy

Electrothermal IA-9200.

- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Khoa Hoá học - Đại học

Thái Nguyên) dƣới dạng viên nén KBr.

- Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử

dụng mode ESI và đầu dò DAD.

- Phổ 1H và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, chuẩn nội

TMS, dung môi CDCl3, CD3OD, DMSO-d6.

2.3. CÁC DỊCH CHIẾT CỦA RỄ CÂY TÀO ĐÔNG

2.3.1. Thu nhận các dịch chiết.

Mẫu cây tƣơi sau khi thu hái, rửa sạch đƣợc sấy khô đem nghiền nhỏ rồi

ngâm kiệt với metanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi hầu nhƣ hết màu. Dịch chiết

đƣợc cất loại dung môi ở áp suất giảm. Cặn dịch chiết metanol sau khi thêm

nƣớc đƣợc chiết lần lƣợt với n-hexan, etylaxetat phần không hòa tan trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

etylaxetat đƣợc cất đến khô sau đó hòa tan trong metanol sẽ thu đƣợc các cặn

chiết tƣơng ứng, làm khan bằng Na2SO4. Việc thu nhận các dịch chiết từ rễ cây

Tào đông tóm tắt trong sơ đồ 2.1.

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết mẫu rễ cây Tào đông

Mẫu khô nghiền nhỏ

1. MeOH 2. Cất loại dung môi dƣói áp suất giảm 3. Cặn

Cặn tổng Metanol

n-Hexan EtOAc MeOH

HT-2

HT-1

Cặn n- hexan HT Cặn EtOAc ET Cặn MeOH MT

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ET-1 ET-3 ET-2

Các phân đoạn dịch chiết nói trên đƣợc làm khan bằng Na2SO4, lọc rồi cất

kiệt dung môi dƣới áp suất giảm, cặn đƣợc sấy khô và cân đến khối lƣợng không

đổi. Nhƣ vậy, từ rễ cây tào đông Prunus zippeliana var.crasistyla (Card

)J.E.Vid, sẽ có 3 loại cặn chiết đƣợc ký hiệu là HT, ET, MT.

Trong đó:

HT: Cặn chiết n-Hexan của rễ cây Prunus zippeliana var.crasistyla

ET : Cặn chiết EtOAc của rễ cây Prunus zippeliana var.crasistyla

MT : Cặn chiết MeOH của rễ cây Prunus zippeliana var.crasistyla

Kết quả thu nhận các dịch chiết từ rễ cây Prunus zippeliana var.crasistyla

đƣợc nêu trong bảng 2.2

Bảng 2.2 : Khối lƣợng các cặn chiết thu đƣợc từ rễ cây Tào đông

(Prunus zippeliana var Crasistyla)

Mẫu tƣơi Mẫu khô Cặn n-hexan Cặn EtOAc Cặn

(g) (g) (g) (g) MeOH (g)

1250 980 12 150 230

2.3.2. Khảo sát định tính dịch chiết.[4]

2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất steroit.

Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2ml dung dịch NaOH 10% đun

cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn trong 3ml cloroform - lấy dịch cloroform để

làm phản ứng định tính các sterol và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm

hỗn hợp 1ml anhydric acetic + 1ml cloroform để lạnh ở 00C, sau đó cho thêm

1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 1ml dịch cloroform rồi thêm 1 giọt thuốc thử,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

dung dịch xuất hiện màu xanh trong một thời gian là phản ứng dƣơng tính.

2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit.

Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc,

lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nƣớc lọc axit.

Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và

nhiều là phản ứng dƣơng tính .

Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorf, nếu xuất hiện màu da cam là

phản ứng dƣơng tính .

Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dƣơng

tính .

2.3.2.3. Phát hiện các flavonoit.

Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml metanol, đun nóng cho tan

và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nƣớc lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê

(Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài

phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dƣơng tính với

các flavonoit.

2.3.2.4. Phát hiện các cumarin.

Dịch để thử định tính đƣợc chuẩn bị nhƣ mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống

nghiệm, mỗi ống 2ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5ml dung dịch

NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi mỗi ống cho

thêm 4ml nƣớc cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có

thể xem là phản ứng dƣơng tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt

HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong mất màu vàng xuất hiện vẩn đục và có

thể tạo ra tủa là phản ứng dƣơng tính.

Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

trƣờng axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, sẽ là dƣơng tính cho cumarin.

2.3.2.5. Định tính các glycozit tim.

Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm nhƣ mục 2.3.2.1.

+ Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt

dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản

ứng dƣơng tính với vòng butenolid.

+ Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch.

Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5%

Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5%

Cách tiến hành:

Lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung

dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2

theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa

hai lớp chất lỏng. Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các

glucosit tim.

2.3.2.6. Định tính các saponin.

Chuẩn bị dịch thử nhƣ ở mục 2.3.2.1. lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho 2ml

dịch thử. Ống 1 cho 1ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng

ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức

độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng

dƣơng tính.

Trên cơ sở dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất có

hoạt tính sinh lý cao trong thực vật đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp nghiên cứu

hóa học cây thuốc [3], thu đƣợc kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong

rễ cây tào đông Prunus zippeliana var.crasistyla (Card ) J.E.Vid đƣợc nêu trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

bảng 2.3 .

Bảng 2.3: Phát hiện các nhóm chất trong rễ cây tào đông (Prunus

zippeliana var. crasistyla (Card )J.E.Vid

Thuốc thử Hiện tƣợng cần Kết STT Nhóm chất quan sát quả đặc hiệu

Cho kết tủa màu đỏ Đƣờng khử Felinh ++ 1 gạch

Ancaloit Dragendorf Màu vàng da cam - 2

Liberman- Steroit Màu xanh vàng ++ 3 Bourchard

Flavonoit Xianidin Từ hồng đến đỏ ++ 4

Polifenol Xanh thẫm ++ 5 FeCl3

Cumarin Axit và kiềm Kết tủa bông ++ 6

Không có hiện Glycozit tim Kelle-Kiliani - 7 tƣợng gì

Saponin Tạo bọt Bọt bền trong axit ++ 8

Ghi chú : Dấu (+) : Phản ứng dƣơng tính.

(++) : Phản ứng dƣơng tính rất rõ.

( - ) : Không có.

2.3.3. Thử hoạt tính sinh học.

+ Tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của dƣợc liệu tại bộ môn Vi

Sinh trƣờng Đại học Y- Dƣợc Thái Nguyên.

+ Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định.

+ Thử định tính theo phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch, sử dụng khoang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn.

+ Các chủng vi sinh vật gồm đại diện các nhóm:

* Vi khuẩn Gr (-) Escherichia coli

* Vi khuẩn Gr (+) Staphylococcus aureus.

Bảng 2.4 : Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết MeOH

từ lá cây tào đông prunus zippelianna.

Đƣờng kính vùng ức chế STT Chủng vi khuẩn xung quanh giếng thạch (mm)

1 21 Escherichia coli

2 17 Staphylococcus aureus

Nhận xét: Các mẫu thử đều có tác dụng kháng các chủng vi sinh vật trên.

Kết quả thực nghiệm thu đƣợc xem hình 2.1.

Hình 2.1 Kết quả thử hoạt tính sinh học từ dịch chiết rễ cây tào đông

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình ảnh ức chế xung quanh giếng thạch với chủng S. aureus

Hình ảnh ức chế xung quanh giếng thạch với chủng E. Col

2.4. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT.

2.4.1. Cặn dịch chiết n-hexan của rễ cây ào đông Prunus zippeliana

var.crasistyla (Card )J.E.Vid

Lấy toàn bộ cặn chiết n-hexan đem tách trên cột silicagel, rửa giải cột bằng

hệ dung môi n-hexan - etylaxetat với tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi phân

cực từ 0 đến 100% etylaxetat. Dịch rửa giải thoát ra từ cột đƣợc thu ở những

khoảng cách nhỏ (5÷10 ml/ phân đoạn). Kiểm tra cặn thu đƣợc bằng sắc ký lớp

mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin 1% trong dung dịch metanol -H2SO4

5%, sau đó các phân đoạn giống nhau đƣợc dồn lại rồi đem cất loại dung môi đã

thu đƣợc các chất sạch.

2.4.1.1. Chất HT-1: Stigmast-5,22-dien- 24R-3β-ol.

Rửa giải cột với hệ dung môi n-hexan : etylaxetat (95:5), sau khi cất lại

dung môi, cặn thu đƣợc kiểm tra SKLM trong hệ A, kết tinh lại trong dung môi

D = - 430 (C=0,05; CHCl3).

n-hexan thu dƣợc 21 mg là tinh thể hình kim, không màu, không mùi, Rf = 0,72, nóng chảy ở 156-158 0C, []25

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Tiến hành đo phổ chất HT-1 thu đƣợc các thông tin nhƣ sau:

Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3):  (ppm): 5,35 (1H, dd, J=5Hz và 2Hz,

H6); 5,14 (1H, dd, J22,23=15 Hz, J22,20= 5Hz, H-22); 5,02 (1H, dd, J23,22=15 Hz,

J23,24=5 Hz, H-23); 3,49 (1H, m, H-3).

Phổ 13C -NMR (125MHz, CDCl3),  (ppm): 34,2 (t, C-1); 28,3 (t, C-2);

71,1 (d, C-3); 40,2 (t, C-4); 139,5 (s, C-5); 117,4 (d, C-6); 37,2 (t, C-7); 31,8 (d,

C-8); 51,2 (d, C-9); 36,1 (s, C-10); 23,0 (t, C-11); 42,2 (t, C-12); 39,7 (s, C-13);

56,8 (d, C-14); 25,4 (t, C-15); 29,6 (t, C-16); 55,1 (d, C-17); 12,4 (q, C-18); 21,3

(q, C-19); 40,5 (d, C-20); 18,9 (q, C-21); 138,1 (d, C-22); 129,5 (d, C-23); 49,5

(d, C-24); 31,9 (t, C-25); 20,9 (q, C-26); 21,5 (d, C-27); 25,3 (q, C-28); 13,0 (q,

C-29).

2.4.1.2- Chất HT-2 :  - Sitosterol.

Tiến hành phân chia nhờ sắc kí cột bằng hệ dung môi n-hexan -

etylaxetat (90: 10). Sau khi cất loại dung môi, cặn thu đƣợc kiểm tra bằng

sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi B, phát hiện nó bằng vanilin 1% trong

dung dịch metanol-H2SO4 5%, kết tinh lại trong n-hexan thu đƣợc những tinh

thể hình kim, không màu, có khối lƣợng 18 mg, R f = 0,67, nóng chảy ở 135-

136C.

Tiến hành đo phổ chất HT-2 thu đƣợc các thông tin nhƣ sau:

Phổ FT-IR (KBr): νmax(cm-1): 343,15 (OH); 2983; 2932; 2868; 1647,2

(C=C); 1464; 1384; 1064, 804.

Phổ EI-MS, m/z (%): 414 [M]+ (20), 413 [M-1]+ (41), 398 (28), 397 (100),

395 (32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6), 139 (11).

Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3);  (ppm): 0,68 (3H, s, Me-18); 1,01 (3H,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

s, 19-Me); 2 cụm doublet  0,81 và 0,88 (23H, d, J 7,7Hz, Me-26 và Me-27);

0,83 (3H, t, 7.32Hz, Me-29); 0,92 (3H, d, J 10 Hz, Me-21); 3,58 (1H, m, H-3);

5,42 (1H, d, J 5Hz, H-6).

Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3);  (ppm): 140,78 (s, C-5); 121,73 (d,

C-6); 71,84 (d, C-3); 56,79 (d, C-14); 56,09 (d, C-17); 50,17 (d, C-9); 45,87 (d,

C-24); 42,35 (t, C-4); 42,32 (s, C-13); 39,80 (t, C-12); 37,28 (t, C-1); 36,52 (s, C-

10); 36,16 (d, C-20); 31,93 (d, C-8); 31,90 (t, C-7); 31,68 (t, C-2); 29,19 (d, C-

25); 28,26 (t, C-16); 26,13 (t, C-23); 24,31 (t, C-15); 23,10 (t, C-28); 21,10 (t, C-

11); 19,82 (q, C-27); 19,40 (q, C-19); 19,05 (q, C-26); 18,79 (q, C-21); 11,99 (q,

C-29); 11,87 (q, C-18).

2.4.2- Các chất có trong dịch chiết etylaxetat

Cặn thu đƣợc trong dịch chiết EtOAc đƣợc phân lập trên sắc kí cột với

chất hấp phụ silicagel rửa giải bằng dung môi chlorofom-metanol với tỷ lệ

theo độ tăng dần của dung môi phân cực từ 0 đến 100% metanol. Dịch rửa

giải thoát ra từ cột đƣợc thu ở những khoảng cách nhỏ (10÷15 ml/ phân

đoạn). Nhận biết các chất đƣợc phân lập cũng dƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ

phần thực nghiệm với cặn n-hexan chúng tôi thu đƣợc 2 phân đoạn kí hiệu là

ET-1 và hỗn hợp của ET-2 và ET-3.

2.4.2.1- Chất ET-1 : Axit 2α-3α dihiđroxy urs -12 en-28 -olic

Khi phân lập bằng hệ dung môi chlorofom-metanol (95:5), Sau khi cất

loại dung môi, cặn thu đƣợc kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung

môi C thu đƣợc 27mg chất kết tinh vô định hình, tan tốt trong hệ dung môi

chlorofom-metanol, nóng chảy ở 244-245oC, có Rf= 0,68. Phổ MS cho pic [M-

H]+ bằng 471 m/z. Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3):  (ppm): 3,34 ppm (1H),

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3,77 (1H), 5,13 (1H), 2,1 (1H, d, j= 11Hz).

Phổ 13C -NMR (125MHz, CDCl3),  (ppm): 47,41 (t, C-1) : 64,63 (d, C-

2) : 77,82 (d,C-3) ; 37,95 (s, C-4) ; 47,57 (d, C-5) ; 17,56 (t, C-6) ; 32,62 (t, C-

7) ; 39,01 (s, C-8) ; 46,86 (d, C-9) ; 37,24 (s,C-10) ; 22,86 (t, C-11) ; 124,51 (d,

C-12) ; 138,22 (s, C-13) ; 40,00 (s, C-14) ; 27,43 (t, C-15) ; 23,77 (t, C-16) ;

46,77 (sC-17) ; 52,33 (d,C-18) ; 38,40 (d, C-19) ; 38,48 (d, C-20) ; 30,17 (t, C-

21) ; 3,29 (t, C-22) ; 21,06 (q, C-23) ; 28,87 (q, C-24) ; 16,21 (q, C-25) ; 16,91

(q, C-26) ; 23,31 (q, C-27) ; 178,26 (s, C-28) ; 16,99 (q, C-29) ; 21,85 (q, C-30).

2.4.2.2- Chất ET-2 : Kaempherol

Khi thay đổi hệ dung môi CHCl3-MeOH (90 :10) thu đƣợc 50mg chất

bột màu vàng chứa hỗn hợp các chất có độ phân cực rất gần nhau. Lƣợng chất

rắn này tiếp tục đƣợc tinh chế trên cột sắc kí nhỏ hơn và cao hơn với chất hấp

phụ silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi E thu đƣợc 2 chất sạch đƣợc kí hiệu

là ET-2 và ET-3.

Chất ET-2 thu đƣợc sau khi cất loại dung môi, cặn thu đƣợc kiểm tra

bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi F thu đƣợc13mg là chất bột màu

vàng, nóng chảy ở 276-2780C có Rf=0,65 trong hệ dung môi Toluen –ETOAc-

axit focmic.

Phổ LC-MS cho pic [M-H]+ 285m/z, Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3): 

(ppm): 6,20 (1H,d, j=2) H-6; 6,52 (1H,d, j=2,1) H-8; 8,15 (1H,dd,j=8,2 và 2,2)

H-2’ và H-6’; 7,01 (1H; dd, j=8,2 và 2,2) H-3’ và H-5.’

Phổ 13C -NMR (125MHz, CD3COCD3),  (ppm): 176,58 (s-C-4) ; 164,98

(s, C-7) ; 162,30 (s, C-9) ; 160,16 (s, C-4’) ; 157,77 (s, C-5) ; 147,00 (s, C-2) ;

136,52 (s, C-3) ; 130,44 (d, C-2’ và C-6’) ; 123,32 (s, C-1’) ;116,32 (d, C-3’ và C-

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

5’) ; 100,15 (s, C-10) ; 99,17 (d,C-6) ; 94,49 (d, C-8).

2.4.2.3-Chất ET-3: 5,7,3,,4,5,-pentahidroxiflavan-3-ol hay epigallocatechin.

Chất ET-3 thu đƣợc khi rửa giải bằng dung môi CHCl3-MeOH (70 :10) 12

mg, là chất bột màu xám, cho màu đỏ khi tác dụng với vanilin 2% trong HCl đặc,

có Rf= 0,55 trong hệ dung môi F.

Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3): H (ppm): 2,49 (1H,m) H-4a; 2,65 (1H,

m) H-4b; 3,99 (1H, m) H-3; 4,60 (1H, brs) H-2; 5,71 (1H, d, j= 2Hz) H-8; 5,87

(1H, d, j=2Hz) H-6; 6,37 (2H,s) H-2’ và H-6’).

Phổ 13C -NMR (125MHz, CD3COCD3),  (ppm): 78,37 (d.C-2) ; 65,26

(d,C-3) ; 28,40 (t,C-4) ; 156,44 (s,C-5) ; 95,40 (d, C-6) ; 156,77 (s, C-7) ; 84,44

(d, C-8) ; 155,99 (s, C-9) ; 98,95 (s, C-10) ; 130,06 9s, C-1’) ; 106,36 (d, C-2’ và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

C6’) ; 145,61 (s, C-3’ và C-5’) ; 132,40 (s, C-4’).

CHƢƠNG III

THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Nguyên tắc chung

Để phân lập đƣợc các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà không

làm ảnh hƣởng tới thành phần hoá học có trong nó thì trƣớc khi ngâm chiết bằng

dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải đƣợc đƣa đi khử men ngay sau khi thu mẫu

và sấy khô ở điều kiện thích hợp.

Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo 2 cách

phổ biến sau.

1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi

có độ phân cực tăng dần: ete dầu hỏa hoặc n-hexan, cloroform, etylaxetat,

metanol hoặc etanol vv...

2. Chiết tổng bằng các ancol (metanol, etanol) hay hệ dung môi ancol:

nƣớc. Sau đó sàng lọc các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng

dần nhƣ phƣơng pháp 1 để thu đƣợc các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ

phân cực tƣơng đối giống nhau.

Việc chiết mẫu thực rễ cây Tào đông Prunus zippeliana var.Crasistyla

(Card )J.E.Vid đƣợc thực hiện theo phƣơng án 2 (Sơ đồ 2.1).

Các dịch chiết thô đem thử hoạt tính sinh học. Điều đó giúp cho việc định

hƣớng tìm kiếm các hoạt chất trong những dịch chiết có hoạt tính mạnh với các

chủng vi khuẩn đã thử nghiệm.

3.2. Xác định định tính các nhóm chất thiên nhiên

Phân tích định tính các hợp chất hữu cơ thiên nhiên trong các mẫu nghiên

cứu là việc làm cần thiết trƣớc khi tiến hành phân lập và xác định cấu trúc của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

các chất cụ thể.

Để xác định định tính các nhóm hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh lí

cao có trong thực vật thƣờng dùng hơn cả là phân tích bằng các phản ứng đặc

trƣng đối với mỗi nhóm chất đã nêu ra ở bảng 2.2. Từ kết quả chỉ ra ở bảng

này có thể nhận thấy trong cây Prunus zippelianna ít nhất có chƣa tới 6

nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng đó là: đƣờng khử, poliphenol,

flavonoit, cumarin, steroit, saponin. Không phát hiện thấy glycozit tim và

ancanloit có trong các mẫu thử. Từ kết quả phân tích định tính cũng sơ bộ

cho thấy rễ cây tào đông là một nguyên liệu chứa nhiều chất có hoạt tính sinh

học cao, có lợi cho sức khỏe con ngƣời.

3.3. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác

nhau của rễ cây tào đông

Các dịch chiết từ rễ cây tào đông (Prunus zippelianna) đều là những hỗn

hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn

hợp, đã sử dụng các phƣơng pháp sắc ký cột nhƣ: Cột với chất hấp phụ silicagel,

với các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thƣờng phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh

chế các chất thƣờng dùng phƣơng pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung

môi thích hợp. Nhờ đó sẽ thu đƣợc các hợp chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng

các nhu cầu để khảo sát tính chất hóa lý và quang phổ của chúng. Đó là những

yếu tố quan trọng trong quá trình nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các

chất đã phân lập đƣợc từ các đối tƣợng nghiên cứu nói trên. Việc phân lập các

thành phần hóa học từ tào đông đƣợc thực hiện nhƣ sơ đồ 2.1 và đã thu đƣợc các

hợp chất sạch gồm các nhóm chất: steroit, tritecpenoit và flavonoit.

3.3.1. Chất HT-1: Stigmast-5,22-dien-24R-3 β –ol.

Chất HT-1 thu đƣợc từ cặn thô n-hexan của rễ cây Prunus zippelianna

(khi rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan – etyl axetat tỉ lệ (90:10), là chất rắn ở

dạng tinh thể hình kim, không màu, khối lƣợng 21mg. Nóng chảy ở nhiệt độ 156-

D = - 430 (C=0,05; CHCl3).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1580C, []25

Phổ 13C-NMR, phổ DEPT cho biết hợp chất HT-1 có 29 nguyên tử cacbon,

trong đó bao gồm 6 nhóm CH3, 9 nhóm CH2, 11 nhóm CH và 3C bậc bốn. Phổ

EI-MS cho biết chất HT-1 có khối lƣợng phân tử 412 amu từ đó có thể xây dựng

công thức phân tử của chất HT-1 là C29H48O.

Phổ FT-IR cho vân rộng, tù hấp thụ ở 3406cm-1 đặc trƣng cho sự có mặt

của nhóm OH còn trên phổ 1H-NMR cho tín hiệu cộng hƣởng của 1 nguyên tử

hiđro ở δH = 3,58 ppm có thể khẳng định đó chính là hiđro ở vị trí C-3. Phổ FT-

IR còn cho thấy vân hấp thụ ở 1621cm-1 điều này nói lên sự có mặt của các liên

kết đôi trong phân tử nhƣng không ở vị trí liên hợp với nhau. Điều này cũng

đƣợc khẳng định khi phân tích phổ 1H-NMR cho biết có 3H ở các nhóm metin

chƣa no tƣơng ứng với các độ chuyển dịch hoá học δH-6 = 5,35 ppm (dd, J=5Hz

và 2Hz) ; δH-22 = 5,14 ppm (dd, J = 15HZ và 5 HZ) và δH-23 = 5,02 ppm (dd, J =

15Hz và 5 HZ) ; 13C-NMR: C-5 = 140,7 ppm, C6 = 121,6 ppm, C22 = 138,3

ppm, C23 = 129,2 ppm.

So sánh các dữ liệu phổ FT-IR, phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR, phổ EI-MS,

nhiệt độ nóng chảy, các hằng số vật lí khác của chất HT-1 với stigmasterol chuẩn

của phòng thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy chúng hoàn toàn tƣơng tự nhau. Vì

vậy có thể quy kết chất HT-1 là stigmasterol (hay stigmast-5,22-dien-24R-3β-ol).

Độ dịch chuyển hoá học các nguyên tử C của HT- 1 đƣợc nêu trong bảng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.1.

Bảng 3.1: Số liệu phổ 13C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của HT-1 và HT-2

trong rễ cây Prunus zippelianna và phổ của -sitosterol

Chất HT-1 (Stigmasterol) CHẤT HT-2 (-sitosterol)

Vị trí C Vị trí C δ của 13C (ppm)

δ của 13C (ppm) 34,2 t t 1 1 37,2

28,3 t t 2 2 31,7

71,1 d d 3 3 71,8

40,2 t t 4 4 42,3

140,8 s s 5 5 140,8

121,83 d d 6 6 121,7

37,2 t t 7 7 31,9

31,8 d d 8 8 31,9

51,2 d d 9 9 50,1

36,1 s s 10 10 36,5

23,0 t t 11 11 21,1

42,2 t t 12 12 39,8

39,7 s s 13 13 42,3

56,8 d d 14 14 56,8

25,4 t t 15 15 24,3

29,6 t t 16 16 28,3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

55,1 d d 17 17 56,2

12,4 q q 18 18 11,9

21,3 q q 19 19 19,4

40,5 d d 20 20 36,2

18,9 q q 21 21 18,8

138,43 d t 22 22 33,9

129,36 d t 23 23 26,1

49.5 d d 24 24 45,8

31,5 d d 25 25 29,2

20,9 q q 26 26 19,1

21,5 q d 27 27 19,4

25,3 t t 28 28 23,1

13,0 q q 29 29 11,9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

β-sitosterol Stigmasterol

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.1. Phổ FT - IR của Stimastenol

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.2 Phổ 1H- NMR của HT1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.3. Phổ 13C - NMR của Stimastenol

3.3.2. -sitosterol (HT-2)

Khi tiếp tục rửa giải cặn của dịch chiết n-hexan trên sắc ký cột silicagel

bằng hệ dung môi n-hexan : Etylaxetat (90:10) chúng tôi thu đƣợc 18mg chất

HT-2.

Chất HT-2 là những tinh thể hình kim, không màu, điểm nóng chảy ở 139-

1410C. Khi trộn lẫn với chất chuẩn cho một hỗn hợp có nhiệt độ nóng chảy

không thay đổi.

Chất HT-2 trong phổ EI-MS cho mảnh ion phân tử M+ = 414, nhƣ vậy có

nghĩa khối lƣợng phân tử bằng 414 đvC sẽ ứng với công thức phân tử C29H50O.

Trong phân tử có một nhóm OH thể hiện ở phổ FT-IR với vân hấp thụ

rộng ở ν = 3380cm-1.

Mặt khác phổ 1H-NMR cho δ = 3,52 ppm đặc trƣng cho proton trong

nhóm CH liên kết với nhóm hidroxyl.

Phổ 13C-NMR cũng nhận thấy δ = 71,7 ppm đặc trƣng cho cacbon liên kết

trực tiếp với oxy của nhóm hidroxyl.

Trong phân tử còn có một nối đôi thể hiện bởi các đặc trƣng ở phổ FT-IR có

vân ở 3010 cm-1 đặc trƣng cho dao động hoá trị của liên kết C-H và vân ở 1650

cm-1đặc trƣng cho dao động hoá trị của liên kết đôi C=C. Trong phổ 1H-NMR

cũng nhận đƣợc tín hiệu δ = 5,42 ppm đặc trƣng cho H trong liên kết =C-H và tín

hiệu của 2 cacbon mang nối đôi với δ = 140,8 ppm và δ = 121,7 ppm từ đó có thể

1H-NMR và phổ 13C-NMR của chất HT-2 với phổ của β-

quy kết hợp chất PH-1 có một nối đôi giữa vị trí C-5 và C-6.

So sánh phổ

Sitosterol thấy hoàn toàn tƣơng tự nhau (bảng 3.1). Từ các kết quả phân tích

thành phần hoá học, tính chất vật lý, tính chất quang phổ nhất là dựa trên cơ sở

so sánh các số liệu phổ của chất HT-2 với phổ của chất β-sitosterol hoàn toàn có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

thể cho phép quy kết chất HT-2 đã phân lập đƣợc từ rễ cây tào đông β-sitosterol.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.4: Phổ FT-IR của -sitosterol (HT-2)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.5: Phổ 1H-NMR của -sitosterol (HT-2)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.6: Phổ 13C-NMR và ATP của -sitosterol (HT-2)

3.3.3- Hợp chất ET-1

Chất ET-1 thu đƣợc khi phân lập bằng hệ dung môi chlorofom-metanol

(95:5) là chất kết tinh vô định hình (27mg), tan tốt trong hệ dung môi chlorofom- metanol, nóng chảy ở 244-245oC, có Rf= 0,68 trong hệ dung môi chlorofom- metanol 90:10. Phổ IR cho vân rộng trong khoảng 3500-3200cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của nhóm OH có liên kết hiđro; vân 1695cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của nhóm cacboxyl, và vân 1645cm-1 đăc trƣng cho dao động hóa trị

của nhóm C=C.

Phổ 13C-NMR, phổ DEPT và phổ HSQC cho biết phân tử ET-1 có 30

cacbon cho phép khẳng định ET-1 là tritecpen trong đó có 7 nhóm CH3, 8 nhóm

CH2, 8 nhóm CH và 7 cacbon bậc bốn trong đó có 1 cacbon đặc trƣng cho nhóm COOH với δC=178,26 ppm. Phổ khối của chất ET-1 cho píc ion phân tử [M]+

bằng 471 m/z, tổng hợp các dữ liệu của các phổ ta thấy chất ET-1 có công thức

phân tử C30H48O4.

Phổ 1H-NMR của ET-1 cho biết có 7 tín hiệu của nhóm CH3 ở các độ

chuyển dịch hóa học δH 0,735ppm (3H, s, 26-CH3), δH 0,778ppm (3H, s, 24-

CH3), δH 0,812ppm (3H, d, J=6,5, 30-CH3), δH 0,840ppm (3H, s, 29-CH3), δH

0,884ppm (3H, s, 25-CH3), δH 0,91ppm (3H, s, 23-CH3) và δH 1,05ppm (3H, s,

27-CH3). Tín hiệu cộng hƣởng của proton trong các nhóm CH liên kết với nhóm

hiđroxyl ở δH = 3,34ppm tƣơng ứng với proton ở C-2 và δH= 3,77ppm tƣơng ứng

với proton ở C-3. một tín hiệu ở 2,1ppm (1H,d, J=11Hz) chính là tín hiệu của

proton ở vị trí C-18, đó là những tín hiệu đặc trƣng cho tritecpen có khung ursan.

Tín hiệu ở δH =5,14ppm là độ chuyển dịch hóa học của proton trong nhóm CH

liên kết đôi chứng tỏ nguyên tử cacbon chứa nối đôi còn lại là cacbon bậc bốn.

Tất cả các dữ liệu trên hoàn toàn phù hợp với một tritecpen có bộ khung ursan và

có liên kết đôi ở vị trí C13 và C14. Tín hiệu của nhóm CH này ở δC= 124,50ppm,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1 C bậc 4 chứa nối đôi ở δC= 138,21ppm hai nhóm CH-OH ở các độ chuyển dịch

hóa học tƣơng ứng của C và H là δC= 64,63 ppm δH=3,77ppm ứng với CH-OH ở

vị trí số 2 và δC= 77,82 ppm δH= 3,34ppm ứng với CH-OH ở vị trí số 3 (các số

liệu phổ NMR đƣợc trình bày ở bảng 3.2).

Bảng 3.2 Các số liệu phổ NMR của chất ET-1

Vị trí

13C-NMR

1H-NMR

13C-NMR

1H-NMR

Vị trí

C

(ppm)

của C

41,71

23,76

64,63

3,77

46,78

77,82

3,34

52,33

2,10

37,95

38,40

47,57

1,98

38,48

17,56

30,16

32,61

36,29

39,01

21,06

0,91

46,86

28,87

0,73

37,74

16,22

0,90

22,86

16,91

0,90

124,51

5,13

23,31

1,03

138,22

178,26

40,00

16,99

0,89

27,42

21,85

0,81

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Axit 2α,3α-dihiđroxy-urs-12-en-28 oic (ET-1)

So sánh các số liệu về phổ của chất ET-1 với các số liệu mà các tác giả

khác đã công bố khi nghiên cứu các đối tƣợng thực vật khác cho thấy chất ET-1

có phổ hoàn toàn giống với phổ của chất 2α,3α-đihiđroxi-urs-12-en-28-oic. Căn

cứ vào các dữ liệu thực nghiệm và so sánh ở trên chúng tôi quy kết chất ET-1 là

axit 2α-hiđroxyursolic.

Chất có khung tritepen ursan đƣợc xác định là những chất có khả năng

kháng khuẩn, chống viêm cao, là những chất có khả năng kháng gốc tự do, kháng

tế bào ung thƣ gan dòng Hep-G2 và một số dòng tế bào bạch cầu (Leuk-M1) đặc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

biệt là hoạt tính anti-HIV với giá trị nồng độ thấp IC50 6,5mg/ml.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.7. Phổ MS của ET1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.8. Phổ 1H - NMR của Axit 2α,3α-dihiđroxy-urs-12-en-28 oic (ET-1)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.9. Phổ 13C - NMR của (ET-1)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.10. Phổ 13C CPD & DEPT của (ET-1)

3.3.4. Kaempherol (ET-2)

Chất ET-2. Từ cặn etylaxetat ngoài các chất ET-1 trình bày ở trên chúng

tôi còn thu đƣợc một hỗn hợp có màu vàng, cho màu đỏ cam với phản ứng

Xianiđin, màu xanh đen với dung dịch FeCl3 1%, và màu hồng với vanilin 2%

trong axit HCl điều đó nói lên trong hỗn hợp này có flavonoit và poliphenol.

Bằng phƣơng pháp sắc kí cột silica gel hỗn hợp thu đƣợc này, rửa giải

bằng hệ dung môi toluen : etylaxetat : axitfomic (5:4:1) thu đƣợc 13mg chất rắn

màu vàng (có Rf = 0,65 trong hệ dung môi E) và nóng chảy ở 276-278oC.

Phổ khối lƣợng LC-MS cho pic ion phân tử M+ ở m/z =286,9 và M- ở m/z

=285,0 ứng với M = 286 đvC và phù hợp với công thức C15H10O6.

Phân tích phổ 13C-NMR (DEPT) cho thấy hợp chất ET-2 có tổng cộng 15

nguyên tử cacbon trong đó có 9 C bậc 4, có 6 cacbon bậc 3 (có 6 nhóm CH),

không chứa các cacbon bậc 1 và bậc 2. Có thể quy kết các tín hiệu δ = 176,58

ppm là của cacbon cacbonyl C-4; ở độ dịch chuyển hóa học δ = 147,03 ppm là

của cacbon C-2; δ = 136,52 ppm là tín hiệu của C-3, đó là những nguyên tử

cacbon olefin, C-2 liên kết với oxi ở vị trí số 1 còn C-3 liên kết với nhóm OH

và nhóm C=O. Tín hiệu ở δ = 157,78 ppm và δ = 164,98 ppm tƣơng ứng với độ

chuyển dịch hoá học của C-5 và C-7, còn δ = 160,16 ppm là tín hiệu của C-4/ và

3 nguyên tử cacbon này liên kết trực tiếp với các nhóm hiđroxyl.

Theo phổ HSQC của hợp chất ET-2 thì tín hiệu cộng hƣởng proton tại

8,15 ppm (dd, J=8,2 và 2,2) là của H-2/ và H-6/ và tại 7,01 ppm (dd, J=8,2 và

2,2) là tính hiệu của H-3/ và H-5/, còn các tín hiệu δ = 6,26 ppm và 6,52 ppm là

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

của các nguyên tử H-6 và H-8.

Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của ET-2 và số liệu phổ trong phần

mềmACD/NMR của chất kaempherol

Phần mềm ACD của chất Phổ của chất ET-2 kaempherol Vị trí C

13C- NMR

ACD/13C-

1H-NMR (ppm)

ACD/1H-NMR (ppm) NMR

147,03 146,45 - - 2

136,52 135,60 - - 3

176,58 175,80 - - 4

157,78 157,63 - - 5

6,26 (1H, d, 99,17 98,25 6,28 6 J=2,1)

164,98 163,90 - - 7

6,52 (1H, d, 94,49 93,45 6,54 8 J=2,1)

162,30 159,13 - - 9

104,15 103 - -

123,32 121,65 - - 10 1/

8,15 (1H, dd, 130,44 129,40 8,10 2/ J=8,2; 2,2)

7,01(1H, dd, 116,32 115,35 7,00 3/ J=8,2;2,2)

160,16 159,10 - - 4/

7,01(1H, dd, 116,32 115,35 7,00 5/ J=8,2; 2,2)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

8,15 (1H, dd, 130,44 129,40 8,10 6/ J=8,2; 2,2)

Từ phổ HMBC cho thấy H-2’(δ = 8,15 ppm) có tƣơng tác xa với các

nguyên tử cacbon C-1’ (123,32 ppm) và C-3’ (116,32 ppm), H-3’(δ = 7,01

ppm) có tƣơng tác xa với C-2’ (130,44 ppm) và C-4’(160,16 ppm), H-5’

tƣơng tác xa với C-4’ (160,16 ppm) và C-6’ (130,44 ppm), H-6’ tƣơng tác xa

với C-5’ (116,32 ppm) và C-1’ (123,32 ppm), H-6 có tƣơng tác xa với C-5

(157,78 ppm) và C-7 (164,98 ppm). Còn H-8 có tƣơng tác xa với C-7 (164,98

ppm) và C-9 (162,30 ppm).

Qua việc phân tích các loại phổ của hợp chất ET-2 có so sánh với chƣơng

trình mô phỏng phổ ACD/1H-NMR và ACD/13CNMR cho thấy sự phù hợp khá

tốt với độ sai số cho phép điều đó có thể khẳng định hợp chất ET-2 chính là

kempherol.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Kaempherol hay 3,5,7,4/-tetrahidroxi flavon

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.11: Phổ 1H-NMR-AcetoneD6 của ET-2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.12: Phổ 13C-NMR-AcetoneD6 của ET-2

) g n a i G

(

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.13: Phổ 13CCPD & DEPT-AcetoneD6 của ET-2

3.3.5. Epigallocatechin (ET-3)

Từ cột sắc kí dùng để phân chia các chất có màu vàng ngoài chất

kampherol thu đƣợc trên còn thu đƣợc 12mg một chất bột màu xám, cho

phản ứng dƣơng tính với thuốc thử vanilin trong môi trƣờng axit đặc, và

dung dịch FeCl3 1%, không cho phản ứng màu với thuốc thử xianiđin nhƣ

vậy về mặt định tính có thể nghĩ đến chất ET-3 này là chất thuộc nhóm

flavan.

Phân tích phổ 13C-NMR (DEPT) cho thấy hợp chất ET-3 có tổng số 15

nguyên tử cacbon bao gồm 8 cacbon bậc bốn, 6 nhóm CH và 1 nhóm CH2

không thấy nhóm CH3 nào. Dựa trên phân tích phổ HSQC và HMBC của chất

ET-3 cho thấy: Tín hiệu của 3 nguyên tử cacbon no thứ tự ở δ = 28,40 ppm là

của C-4 với các proton tƣơng ứng liên kết với nó cho δH ở 2,49ppm và 2,65ppm

ở dạng muntiplet. Tín hiệu của C-3 ở 65,27ppm còn δH của nguyên tử hiđro

tƣơng ứng là 3,99ppm, tín hiệu của C-2 ở trƣờng thấp hơn một chút với δC=

78,37ppm và δH=4,60ppm. 12 cacbon của vòng thơm trong đó có 6 nguyên tử

cacbon liên kết với oxi hoặc nhóm OH đƣợc phân bố ở vùng trƣờng thấp hơn cả trong đó có 2 nguyên tử cacbon tƣơng đƣơng là C-3’ và C-5’ ở độ chuyển dịch

hóa học δC =145,61ppm, 2 nhóm CH tƣơng đƣơng cho tín hiệu ở 106,36ppm,

còn hiđro liên kết với nguyên tử cacbon này cho tín hiệu singlet ở δH=6,37ppm. Những nguyên tử cacbon bậc bốn không tƣơng đƣơng còn lại là C-1’ cho δC =130,58ppm; C-4’ cho tín hiệu ở δC =132,39ppm; các nguyên tử cacbon bậc bốn ở vòng A liên kết với oxi cho tín hiệu cộng hƣởng ở vùng thấp hơn đó là C-7

cho δC =156,77ppm, C-5 cho δC =156,44ppm và C-9 cho tín hiệu cộng hƣởng ở

δC =155,99ppm. Nguyên tử C-10 cho tín hiệu ở vùng thấp hơn một chút với độ

chuyển dịch hóa học δC =98,95ppm. Cacbon C-6 cho δC =95,41ppm và nguyên

tử hiđro liên kết với nó cho tín hiệu δH=5,87ppm, nguyên tử cacbon C-8 cho tín

hiệu ở 94,44ppm còn nguyên tử hiđro liên kết với cacbon này cho tín hiệu ở

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

δH=5,71ppm. Các số liệu phổ NMR của ET-3 ở bảng 3.4.

Bảng 3.4 Các số liệu về phổ NMR của chất ET-3

Vị trí δH ppm δC ppm

4,60 d 78,38 d C→ H(HMBC) H3,H2’,H6’ 2

3,99 mbr 65,26 d H2, H4 3

2,49 và 2,65 28,40 t H3 4

156,44 s H6,H8,5-OH - 5

5,87, d, j= 2Hz 95,41 d H8, 5OH 6

- 156,77 s H6,H8,7-OH 7

5,71,d, j=2Hz 94,44 d H6 8

- 155,99 s H8 9

- 98,95 s

- 130,06 s

6,37, s 106,36 d

- 145,61 s

- 132,39 s

- 145,61 s

6,37, s 106,36 d H4, H6,H8 H2’, H6’ H6’ H2’, H6’ H2’, H6’ H2’, H6’ H2’ 10 1/ 2/ 3/ 4/ 5/ 6/

Về mặt định tính cho thấy chất ET-3 đƣợc phân lâp từ rễ cây tào đông

hoàn toàn tƣơng tự nhƣ epigallocatechin đƣợc tách ra từ chè xanh. Từ đó chúng

tôi quy kết chất ET-3 là epigallocatechin.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ET-3: Epigallocatechin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.14: Phổ 1H-NMR-của: Epigallocatechin ET-3.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.15: Phổ 13C-NMR- của Epigallocatechin ET-3.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.16: Phổ 13CCPD & DEPT của Epigallocatechin ET-3.

3.4- Hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây tào đông

Từ các số liệu có ở bảng 2.4 cho thấy dịch chiết nƣớc của rễ cây tào đông

thu hoạch tại tỉnh Bắc Kạn có khả năng diệt khuẩn đối với 2 chủng là E.coli và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Staphylococcus aureus.

KẾT LUẬN

1. Từ rễ cây tào đông (Prunus zippellianna var.crasistyla (Card) J.E.Vid ) mọc

hoang tại Bắc Kạn đƣợc nghiên cứu sàng lọc hóa thực vật, đã thiết lập đƣợc quy

trình ngâm chiết mẫu hợp lí thu đƣợc 3 dịch chiết chọn lọc. Từ dịch chiết bằng

metanol rễ cây tào đông (Prunus zippellianna var.Crasistyla (Card) J.E.Vid ), bằng

phƣơng pháp phân tích định tính đã khẳng định trong rễ cây Tào đông có 6 lớp chất:

đƣờng khử, steroit, flavonoit, poliphenol, cumarin và saponin.

2. Đã phân lập và xác định đƣợc cấu trúc hóa học của 5 hợp chất là: β-Sitosterol,

stingmatsterol, Axit 2α,3α-dihiđroxy-urs-12-en-28 oic (ET-1),

kaempherol và epigallocatechin.

3. Đã thử hoạt tính sinh học của dịch chiết Metanol của rễ cây tào đông

(Prunus zippellianna) cho thấy có tác dụng kháng các khuẩn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Staphylococcusauresu (Tụ cầu vàng), E.coli (Trực khuẩn đƣờng ruột).

TÀI LIỆU THAM KHẢO

A. Tiếng Việt

1. Nguyễn Tiến Bân và các cộng sự (2003), “Danh mục các loài thực vật Việt

Nam” (Tập II- Trung tâm nghiên cứu tài nguyên và môi trƣờng- Đại học quốc

gia Hà Nội).

2. Võ Văn Chi, (1999). “Từ điển cây thuốc Việt Nam”, NXB Y học.

3. Nguyễn Xuân Dũng (2005). “Nghiên cứu sử dụng một số cây thuốc của tỉnh

Bắc Cạn nhằm tạo nguồn nguyên liệu hóa dược phục vụ chữa bệnh và xuất

khẩu”. Tài liệu nghiên cứu khoa học cấp Bộ.

4. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tị (1985) “Phương pháp nghiên cứu khoa

học cây thuốc” Nxb Y học chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh.

5. Phạm Hoàng Hộ (1970,1972). “Cây cỏ miền mam Việt Nam”, Tập 1,2 –TT

học liệu.

6. Đỗ Tất Lợi (2000) “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Y học.

7. Nguyễn Thị Minh, Hoàng Văn Lựu; Nguyễn Xuân Dũng Số 4-2007 tr 450-

454. Tóm tắt kỷ yếu “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Đào rừng

prunus zippeliannavar. Crassistyla (Card) J.E. Vid lấy từ tỉnh Bắc Cạn”.

Nguồn trích: Tuyển tập các công trình Hội nghị khoa học và công nghệ hóa

học hữu cơ toàn quốc lần thứ tƣ- Hội hóa học Việt Nam.

8. Tuệ Tĩnh, Hồng Nghĩa (1989) “Giác tư y thư”. NXB Y học.

B. Tiếng Anh

9. A. R. Bilia,* I. Morelli, M. Hambrger and Hostetmann. (1996) “Flavans and

a- type proanthosyanidins from prunus prostrata”. Phytochemistry, Vol. 43,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

No.4 pp.887-892.

10. Brigida D. Abrosca, Marina DellaGreca, Antonio Fiorentino, Pietro

Monaco, Lucio Previtera, Ana M. Simonet, Armando Zarrelli. (2001).

“Potential allelochemicals from Sambucus nigra”. Phytochemistry 58 (2001)

1073-1081.

11. C.Fourneau, R. Hocquemiller and A. Cave.(1996) “Triterpenes from

Prunusafricana bark”. Phytochemistry,vol.42,No.5.pp 1387-1389,1996.

12. Carmela Gerardi, Federica Blando, Angedo Santino, Giuseppe Zacheo.

“Prurification and charaterisasion of a β–glucosidase abundantly expressed

in ripe sweet cherry (Prunus avium L.) fruit”, Plan Sience 160 (2001) 795 –

805.

13. [Đĩa] – Chapman & Hall/CRC, DNP on CD-Rom, (1982)-2006 Version

15:1.

14. Iikay Erdogan-Orhan, Murat Kartal “Insghts into on phytochemistry and

biological activities of Prunus armeniaca L. (apricot)”. Food Research

Internationnal.

15. Koetsu Takahashsi, Youhei Tsutsumi, Hiroya Ohtani, Toshio Katsuki

“Variation of constituents in the leaves of Prunus”. Biochemical Systematics

and Ecology 34 (2006) 127 -135 .

16. Kayano S. Kikuzaki H. Ymada NF..Aoki A..Ymasaky Y..Ilami T.. Suzuki .T

Mitani T..Nakatani N. Antioxidant properties of prunes (Prunus domestica)

and their consituents. Biofactors.2(1-4) )(2004) 309-13.

17. Masayyoshi Nakayama, Masaji Koshioka, Hiroyuki Matsui, Hitoshi Ohara

Lewis N. Mander, Sarah K. Leitch, Bruce Twitchin, Petra Kraft-Klaunzer.

Richard P.Phasisd, Takao Yokota. “Endogennous gibberellins in immature

seeds of Prunus presica L”: identification of GA118, GA119,. GA120,

GA121, GA122 and GA126. Phytochemistry 57(2001) 749-758.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

18. Y. Kumarasamy, P.J. Cox, M. Jaspars, L. Nahar, S.D. Sarker (2003).

“Cyanogenic glycosids from Prunus spinosa( Rosaceae)”. Biochemical

Systematics and Ecology 31(2003) 1063-1065.

19. Rawat M.S.M Prasad D.. Joshi R.K and Pant G.. “Proanthocyanidins from

Prunus armeniaca roots”, Phylochemistry, 50 (2)(1999) 321 -324.

20. Shengmin Sang, Guoli, Shiyng Titan, Karen Lapslay, Ruth E. Stask,

Ravindra K panday, Robert T. Rosen and Chi- Tangho.(2003). “An unusual

diterpene glycoside from the nuts of almond ( prunus amydalus Batsch)”.

Tetrahedron Letters 44 (2003) 1199-1202.

21. Shengmin Sang, Xiaofang Cheng, Hui-Yin Fu, Den-En Shieh, Naisheng Bai, Karen Lapsley, Ruth E.Stark, Robert T. Rosen and Chi-Tang Ho (2002) “New

type sesquiterpene lactone from almond hulls Prunus amygdalus Batsch”.

Tetrahedron letters 43(2002)2547-2549.

22. Tạp chí dƣợc học: www.ars-grin.gov/.../taxon.pl.

23. Jung H.A.. Kim A.R.. Chung H.Y.. Choi J.S.. “In vitro antioxidant activity

of som selected Prunus speccies in Korea, Arch, Pharm”. Res. 25(6) (2002)

865-72.

24. M. S. M. Rawat, D. Prasad, R.K. Joshi, G. Pant.(1998) “Proanthocyanidins

from Prunus armeniaca roots”. Department of chemistry, H.N.B. Garhwal

University, Post Box 63, Srinagar, Garhwal-246 174, India Received 23 june

1998.

25. James , Jerald J. Nair, Endreddy Bollareddy, Kunal Keskar, Amol thorata,

Denis J. Crankshaw, Alison C. Lolloway, Ghaznia Khan, Gerad D. Linda Ejimc(2009) “Isolation ojjPlavonoit ofb Flavonoids from the heartwood and

resin of Prunus avioum and some preliminary biological investigations”.

Phytochemistry 70( 2009) 2040-2046.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

26. Fernando Dourado, Pedro Madureira, Vera Carvalho, Ricardo Coelho, Manuel A. Coimbra Vilanova, Manuel Motaa and Francico M. Gâm

“Purification, structure and immunobiological activity of an arabinan- rich

pectic polysaccharide from the cells of Prunus dulcis seeds”. Carbohydrate

Research 339 (2004) 2555-2566.

27. Frank S.Santamour. Jr. “Amygdalin in Prunus leaves”. Phytochemistry.47(8)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

(1998) 1537 – 1538.

PHỤ LỤC CÁC PHỔ

Tên các phổ Trang

1. Phổ chất HT-1: Stigmast-5,22-dien-24R-3 β –ol ......................................... 75

2. Phổ chất HT- 2: -sitosterol (HT-2) .............................................................. 78

3. Phổ chất ET-1: Axit 2α,3α-dihiđroxy-urs-12-en-28 oic (ET-1) ................. 85

4.Phổ chất ET-2: Kampherol ............................................................................ 98

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

108

(Giang)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

109

(Giang)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

110

(Giang)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

111

(Giang)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

112

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

113

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

114

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

115

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

116

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

117

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

118

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

119

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

120

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

121

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

122

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu thành phần hóa học rễ cây tào đông

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn nhằm phân lập và xác định đƣợc cấu trúc hóa học của 5 hợp chất là: β-Sitosterol, stingmatsterol, Axit 2α,3α-dihiđroxy-urs-12-en-28 oic (ET-1), kaempherol và epigallocatechin. Mời các bạn cùng tham khảo!

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

RỄ CÂY TÀO ĐÔNG (Prunus zippeliana var.crasistyla (Card) J.E.Vid)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

Thái Nguyên, năm 2011

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

RỄ CÂY TÀO ĐÔNG (Prunus zippeliana var.crasistyla (Card) J.E.Vid)

CHUYÊN NGÀNH : HOÁ HỌC HỮU CƠ

MÃ SỐ

: 60.44.27

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS PHẠM VĂN THỈNH

Thái Nguyên, năm 2011

CÁC THỰC VẬT CHI PRUNUS VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA NÓ

Vị trí

13C-NMR

1H-NMR

13C-NMR

1H-NMR

Vị trí

C

(ppm)

(ppm)

(ppm)

(ppm)

của C

13C- NMR

1H-NMR (ppm)

) g n a i G

(

) g n a i G

(

) g n a i G

(

) g n a i G

(

) g n a i G

(

) g n a i G

(

) g n a i G

(

) g n a i G

(

) g n a i G

(

(Giang)

(Giang)

(Giang)

(Giang)

(Giang)

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok