Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp ở E. coli

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------

Nguyễn Thị Thu Huyền

NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PROTEIN PWO DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E. COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn Thị Thu Huyền

NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PROTEIN PWO DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E. COLI

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 8420101.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Lê Thọ Sơn

TS. Hoàng Thị Mỹ Hạnh

Hà Nội - 2019

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

LỜI CẢM ƠN

Khoảng thời gian học tập và nghiên cứu tại bộ môn Di truyền học - Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN là hành trang quý báu giúp em trưởng thành và có

ích hơn trong cuộc sống.

Lời đầu tiên em xin được cảm ơn các thầy cô của bộ môn Di truyền học đã cùng

với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt những kiến thức chuyên môn cho

chúng em. Thầy cô luôn quan tâm để cho chúng em có một môi trường học tập toàn

diện và gần gũi nhất. Em sẽ coi bộ môn Di truyền như ngôi nhà thứ hai của mình.

Tiếp theo, em xin được cảm ơn hai thầy cô TS. Lê Thọ Sơn và TS. Hoàng Thị

Mỹ Hạnh đã đồng ý hướng dẫn cho em trong luận văn tốt nghiệp này. Thầy cô không

chỉ động viên em trong quá trình học tập mà còn cho em rất nhiều lời khuyên trong

cuộc sống.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn trìu mến tới gia đình và bạn bè, những người luôn

tin tưởng, hỗ trợ và dìu dắt em trong suốt thời gian qua. Đặc biệt là bố, mẹ những

người luôn hy sinh thầm lặng cho cuộc sống của em.

Sau cùng, em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS. Nguyễn Văn Sáng.

Thầy đã cho em có cơ hội hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Thầy luôn là động lực

để em phát triển cũng như cố gắng hơn mỗi ngày.

Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc

gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106-NN.02-2016.58.

Nghiên cứu có sự hợp tác và hỗ trợ cung cấp trình tự gen mã hóa bới Công ty

TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa.

Hà Nội, tháng 12 năm 2019

Học viên

Nguyễn Thị Thu Huyền

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i

MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii

DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................iv

DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................................vi

MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... vii

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 1

1.1. Khái quát DNA polymerase ................................................................................. 1

1.1.1. Phân loại DNA polymerase ........................................................................... 1

1.1.2. Cấu trúc và chức năng của DNA polymerase ............................................... 1

1.1.3. Quá trình sao chép DNA ............................................................................... 2

1.2. Ứng dụng của DNA polymerase .......................................................................... 3

1.2.1. Kỹ thuật giải trình tự ..................................................................................... 4

1.2.2. Kỹ thuật PCR ................................................................................................. 5

1.3. Tình hình nghiên cứu Pwo DNA polymerase ...................................................... 6

1.3.1. Phân loại nguồn gốc ...................................................................................... 6

1.3.2. Nghiên cứu biểu hiện Pwo DNA polymerase tái tổ hợp ............................... 7

1.3.3. Các đặc tính quan trọng của DNA polymerase dùng cho PCR ..................... 8

1.4. Công nghệ protein tái tổ hợp .............................................................................. 10

1.4.1. Tổng hợp gen, tối ưu mã codon ................................................................... 10

1.4.2. Nhân dòng gen đích vào vector mong muốn ............................................... 11

1.4.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp ......................................................................... 12

1.4.4. Các phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp ............................................. 16

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ......................................................... 19

2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 19

2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................................ 19

2.1.2. Dụng cụ và thiết bị ...................................................................................... 19

2.1.3. Hóa chất và môi trường ............................................................................... 19

2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 21

2.2.1. Thiết kế gen đích mã hóa Pwo DNA polymerase ....................................... 21

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

2.2.2. Nhân dòng, tạo vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase ............... 22

2.2.3. Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở E. coli ..................................... 27

2.2.4. Tinh sạch protein Pwo DNA polymerase .................................................... 27

2.2.5. Xác định hoạt tính của protein Pwo DNA polymerase ............................... 30

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 33

3.1. Phân tích gen mã hóa Pwo DNA polymerase tái tổ hợp .................................... 33

3.2. Nhân dòng vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase ............................. 34

3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp pEtM-Pwo ................................................................. 34

3.2.2. Biến nạp vector tái tổ hợp pEtM-Pwo vào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3)... 35

3.2.3. Tách plasmid, kiểm tra trình tự ................................................................... 36

3.3. Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở vi khuẩn E. coli.............................. 38

3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase ........................................... 38

3.4.1. Phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực nickel ................................................. 39

3.4.2. Phương pháp tinh sạch kết tủa bằng muối ammonium sulfate .................... 43

3.5. Xác định hoạt tính của protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase ...................... 44

3.5.1. Tối ưu thành phần buffer PCR .................................................................... 44

3.5.2. Hoạt tính sao chép ....................................................................................... 45

3.5.3. Khả năng chịu nhiệt độ cao ......................................................................... 47

3.5.4. Hoạt tính khi có mặt chất ức chế ................................................................. 47

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 50

iii

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Sự đa dạng trong cấu trúc của một số loại DNA polymerase ............................ 2

Hình 2: Thành phần phức hệ sao chép DNA (replisome) ở vi khuẩn Cổ ....................... 3

Hình 3: Cây phát sinh của nhóm vi khuẩn Cổ chịu nhiệt ................................................ 6

Hình 4: Cơ chế cạnh tranh động học cho một DNA polymerase .................................... 8

Hình 5: Sơ đồ minh họa các bước tổng hợp gen bằng phương pháp POS .................... 10

Hình 6: Thiết kế mồi nhân dòng gen mã hóa protein Pwo-pol ..................................... 12

Hình 7: Cấu trúc vector biểu hiện protein tái tổ hợp ở E. coli ...................................... 15

Hình 8: Sơ đồ mô tả quá trình nhân dòng vector tái tổ hợp pEtM-Pwo ........................ 22

Hình 9: Sơ đồ quá trình tinh sạch protein Pwo-pol ....................................................... 27

Hình 10: Khuếch đại gen mã hóa Pwo-pol và xử lý enzyme cắt giới hạn .................... 34

Hình 11: Biến nạp, nuôi cấy, chọn lọc plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo .......................... 35

Hình 12: Tách chiết và kiểm tra plasmid tái tổ hợp ...................................................... 36

Hình 13: So sánh trình tự amino acid của gen mã hóa Pwo DNA polymerase............. 37

Hình 14: Biểu hiện protein DNA polymerase ở E. coli ................................................ 38

Hình 15: So sánh sự phá vỡ tế bào với nhiệt độ cao ..................................................... 39

Hình 16: Mẫu siêu âm phá vỡ tế bào tinh sạch sắc ký ái lực ........................................ 40

Hình 17: Tinh sạch sắc ký ái lực kết hợp xử lý ở nhiệt độ 70oC ................................... 41

Hình 18: Tinh sạch sắc ký ái lực kết hợp xử lý ở nhiệt độ 95oC ................................... 42

Hình 19: Tinh sạch bằng kết tủa muối AS bão hòa ở 4oC ............................................. 43

Hình 20: Ảnh hưởng của pH đến sự ổn định của buffer PCR ....................................... 44

Hình 21: Ảnh hưởng của nồng độ KCl đến khả năng khuếch đại đoạn gen ngắn ........ 45

Hình 22: Hoạt tính sao chép của Pwo-pol tái tổ hợp sau tinh sạch ............................... 46

Hình 23: Phản ứng của enzyme và protein tái tổ hợp ở nhiệt độ biến tính 98oC .......... 47

Hình 24: Hoạt tính của các proein Pwo-pol trong phản ứng sử dụng khuôn genome .. 48

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Phân loại DNA polymerase ứng dụng giải trình tự ........................................... 4

Bảng 2: Đặc tính của một số enzyme DNA polymerase bền nhiệt ................................. 5

Bảng 3: Các chủng E. coli phổ biến cho biểu hiện protein tái tổ hợp ........................... 13

Bảng 4: Vị trí các đặc điểm của vector biểu hiện pEtM ................................................ 16

Bảng 5: Dung dịch đệm, hóa chất pha stock ................................................................. 20

Bảng 6: Trình tự cặp mồi nhân dòng gen mã hóa Pwo DNA ....................................... 22

Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR nhân dòng gen mã hóa Pwo-pol .......................... 23

Bảng 8: Thành phần phản ứng cắt, nối gen và plasmid................................................. 24

Bảng 9: Trình tự các cặp mồi giải trình tự .................................................................... 26

Bảng 10: Thành phần hóa chất đổ gel điện di SDS-PAGE ........................................... 30

Bảng 11: Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính nhân đoạn gen AcrH .................... 30

Bảng 12: Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính nhân đoạn gen KOD ..................... 31

Bảng 13: Thành phần buffer bảo quản protein Pwo-pol ............................................... 32

Bảng 14: Thành phần 10X buffer PCR tối ưu hoạt tính của protein Pwo-pol .............. 32

Bảng 15: Phân tích sử dụng codon của gen mã hóa Pwo DNA polymerase ................. 33

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tên đầy đủ

aa Acid amin

APS Ammonium persulfate

bp Base pair

BSA Bovine serum albumin

CAI Codon adaptation index

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTPs Deoxynucleoside triphosphate

DTT Dithiothreitol

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid

His Histidine

IMAC Immobilized metal affinity chromatography

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

kb Kilo base

kDa Kilo dalton

Kod-pol T. kodakarensis DNA polymerase

LB Luria-Bertani

NTA Nitrilotriacetic acid

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis

PCR Polymerase Chain Reaction

Pfu-pol P. furiosus DNA polymerase

Pwo-pol P. woesei DNA polymerase

RNA Ribonucleic acid

SDS Sodium dodecyl sulfate

Taq-pol T. aquaticus DNA polymerase

TEMED Tetramethylethylenediamine

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

MỞ ĐẦU

Enzyme DNA polymerase là một trong những enzyme quan trọng được ứng

dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: (1) trong sinh học phân tử, nhằm nghiên cứu

gen và hệ gen; (2) trong y học, để chẩn đoán và phát hiện các bệnh di truyền, tầm soát

ung thư; (3) trong nông nghiệp, như xác định các tác nhân gây bệnh cho cây trồng vật

nuôi, thực vật biến đổi gen; (4) trong khoa học hình sự, để nhận diện các dấu chuẩn di

truyền. Mặc dù có vai trò quan trọng, nhưng ở Việt Nam việc tự sản xuất enzyme

DNA polymerase vẫn gặp nhiều khó khăn về mặt quy trình và đánh giá chất lượng.

Các nghiên cứu nếu có đến nay, hầu hết là quy trình tối ưu cho dòng enzyme DNA

polymerase thế hệ cũ với hoạt tính kém bền, kém ổn định. Do vậy, nguồn enzyme

DNA polymerase thế hệ mới sử dụng cho các mục đích phát triển khoa học công nghệ

ở Việt Nam đã và đang phải nhập từ nước ngoài. Quá trình nhập khẩu thường kèm

theo nhiều vấn đề không mong muốn cho người sử dụng như (1) thời gian vận chuyển

kéo dài từ một đến vài tháng làm chậm tiến độ của đề tài, dự án; (2) chất lượng của

enzyme bị ảnh hưởng do điều kiện bảo quản không đảm bảo trong thời gian dài; (3)

bởi các yếu tố rủi ro mà giá thành mua enzyme từ các công ty hóa chất là rất đắt đỏ.

Hiện nay, các công ty công nghệ sinh học của Việt Nam đang rất cần nguồn enzyme

được sản xuất trong nước với chất lượng tốt, tương đương với quốc tế nhưng có giá

thành rẻ hơn, thời gian cung cấp nhanh hơn để làm nguyên liệu đầu vào cho việc phát

triển các loại kit khác nhau. Do vậy cần thiết phải xây dựng được quy trình sản xuất

enzyme DNA polymerase có chất lượng tốt tại các cơ sở nghiên cứu trong nước. Việc

sản xuất enzyme trong nước sẽ giúp chủ động được nguồn nguyên liệu, giảm giá thành

và các chi phí vận chuyển khi phải nhập enzyme từ nước ngoài, tạo động lực cho sự

phát triển của các công ty công nghệ sinh học của Việt Nam.

Pwo-pol là enzyme có hoạt động ổn định nhất với các chuỗi DNA kích thước

dưới 3 kb. Hiện nay trên thị trường, enzyme này đang được thương mại hóa bởi một số

hãng như Roche (Sigma), Genaxis và peQlab (Avantor) tuy nhiên quy trình sản xuất

lại không được công bố. Xuất phát từ thực tiễn nêu trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“Nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein Pwo DNA

polymerase tái tổ hợp ở E. coli”. Mục đích của nghiên cứu nhằm góp phần đánh giá

chính xác hiệu quả sử dụng enzyme Pwo-pol ở quy mô phòng thí nghiệm đồng thời

vii

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

định hướng cải tiến hiệu quả enzyme trong ứng dụng ở Việt Nam. Nghiên cứu được

thực hiện dựa trên các mục tiêu cụ thể như sau:

1. Thiết kế tối ưu mã bộ ba cho gen mã hóa Pwo DNA polymerase sử dụng công cụ tin

sinh.

2. Tổng hợp và nhân dòng gen mã hóa Pwo DNA polymerase, tạo vector tái tổ hợp

pEtM-Pwo.

3. Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở vi khuẩn E. coli BL21 (DE3).

4. Tinh sạch protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp.

5. Xác định hoạt tính của protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp tinh sạch được.

viii

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Khái quát DNA polymerase

DNA polymerase là thành phần trung tâm tổng hợp nên các chuỗi DNA bổ

sung theo khuôn mẫu trong tế bào sống [7]. Ngoài những vai trò cơ bản nhằm duy

trì tính toàn vẹn của bộ gen bởi quá trình sao chép và sửa chữa, DNA polymerase

còn được sử dụng rộng rãi trong in vitro. Vì vậy, nhiều enzyme DNA polymerase đã

được phân lập để xác định cấu trúc và chức năng của chúng.

1.1.1. Phân loại DNA polymerase

DNA polymerase thể hiện sự đa dạng cả trong cấu trúc và chức năng ở các

sinh vật khác nhau. Vào những năm 1950, nhà khoa học Arthur Kornberg và cộng

sự đã tìm thấy DNA polymerase (pol) I, đầu tiên ở vi khuẩn E. coli. Các nhà nghiên

cứu sau đó tiếp tục phát hiện thêm nhiều loại DNA pol thuộc các loài khác nhau

cung cấp cho khoa học [25].

Theo phân loại dựa trên so sánh trình tự amino acid và mối quan hệ di

truyền, các DNA pol được chia thành 7 họ lần lượt A, B, C, D, X, Y, RT. Họ

polymerase A bao gồm Klenow Fragments của Escherichia coli và DNA

polymerase I của Bacillus, Thermus aquaticus DNA polymerase, và T7 RNA –

DNA polymerases. Họ polymerase B phụ thuộc DNA bao gồm các DNA

polymerase của phage T4, và RB69. Họ polymerase C (như DNA pol III của E.

coli), họ polymerase D (như DNA pol II của Euryarchaeotic), họ polymerase X

(như DNA pol β của người), họ polymerase Y (như DNA pol IV, V của E. coli), họ

polymerase RT.

Mặt khác, dựa trên đặc điểm riêng của mỗi loại DNA polymerase có thể

phân chúng thành các loại có đặc tính (1) sao chép (replicative) như pol α, γ; (2) sửa

chữa (repairing) như pol β; (3) đọc sửa (proofreading) chiều 5’ – 3’ như pol δ, ε

[44]. Cụ thể, các DNA-pol có khả năng sao chép từ sinh vật nhân thực được tìm

thấy trong họ polymerse B (pol α); từ vi khuẩn được tìm thấy trong họ polymerase

A (pol I) và C (pol III); và với vi khuẩn Cổ chúng thuộc họ polymerase B và D [2].

1.1.2. Cấu trúc và chức năng của DNA polymerase

Hiện nay, các nghiên cứu đã xác định được nhiều cấu trúc của DNA

polymerase. Một số DNA pol đại diện ở hình 1 cho thấy sự đa dạng nhưng vẫn duy

trì tính bảo thủ cao về mặt cấu trúc trong quá trình thực hiện chức năng của chúng.

Hình 1: Sự đa dạng trong cấu trúc của một số loại DNA polymerase Được so sánh bởi Steitz và cộng sự, 1999 [39] a. Taq DNA polymerase liên kết DNA; b. Cấu trúc bậc hai của HIV-RT và DNA; c. Mô hình DNA liên kết với RB69 gp43; d. Phức hợp cấu trúc bậc 3 pol β của chuột với DNA và dideoxy-NTP. Các màu khác nhau biểu diễn các miền khác nhau tương ứng trên cả 4 cấu trúc: Miền “thumb” chuỗi màu xanh lá, miền “palm” chuỗi màu đỏ, miễn “finger” chuỗi màu xanh dương, chuỗi màu vàng là vị trí liên kết DNA, và chỉ duy nhất trong cấu trúc pol β của chuột có chứa miền màu tím có khả năng đọc sửa trong quá trình sao chép DNA.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

Theo quan sát tổng thể, các DNA polymerase có hình dạng giống cấu trúc

bàn tay phải, bao gồm các miền “thumb,” “palm,” and “fingers”. Miền palm có

chức năng xúc tác phản ứng chuyển hóa phosphoryl. Trong khi đó, miền finger đảm

nhận các tương tác quan trọng với các nucleoside triphosphate của mạch khuôn

DNA. Miền thumb đóng vai trò xác định vị trí DNA xoắn kép, thúc đẩy quá trình

dịch chuyển và gắn nucleotide của DNA polymerase (processivity). Nghiên cứu của

Kim và cộng sự, 2008 đã so sánh sự tương đồng trong cấu trúc của Pfu DNA

polymerase với KOD1 DNA polymerase (polB). Ngoài 3 thành phần quan trọng là

các miền “fingers, palm, thumb” các DNA polymerase này còn có vùng

exonuclease và N-terminal là những vùng có ý nghĩa quan trọng cho ứng dụng công

nghệ sinh học [23].

1.1.3. Quá trình sao chép DNA

Quá trình sao chép DNA là sự kiện quan trọng diễn ra trong mỗi chu kỳ của

tế bào [37] có sự tham gia của một bộ máy sao chép. Trong đó, các thành phần

chính đã biết có sự tương tác với nhau và với các protein khác (hình 2).

Hình 2: Thành phần phức hệ sao chép DNA (replisome) ở vi khuẩn Cổ Nghiên cứu bởi Li và cộng sự [27], 2010 đã tinh sạch các protein này bằng phương pháp dung hợp đuôi 6xHis-tag và tinh sạch sắc ký ái lực ở Thermococcus kodakarensis. Trong đó, leading strand: mạch tổng hợp liên tục; lagging strand: mạch tổng hợp gián đoạn. Các thành phần của phức hệ này bao gồm enzyme DNA polymerase PolB, polD liên kết kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh (PCNA) tổng hợp nên các đoạn DNA mới; enzyme DNA ligase cũng liên kết với PCNA nối các đoạn tổng hợp ngược chiều tháo xoắn; còn enzyme Fen I liên kết PCNA sửa chữa trình tự tổng hợp; với sự trợ giúp của các enzyme MCM phức hệ protein duy trì liên kết với enzyme tháo xoắn helicase; GINS: liên kết trực tiếp với MCM-helicase và primase enzyme tổng hợp đoạn RNA ngắn; RPA: protein ngăn chặn sự đóng xoắn trở lại của sợi đơn).

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

Nhìn chung, các phức hệ sao chép DNA được duy trì khả năng hoạt động

dựa trên những nguyên tắc chung ở cả ba giới vi khuẩn thông thường (bacteria), vi

khuẩn Cổ (archaea), và sinh vật nhân thực (eukaryotes). Trong số các sinh vật nhân

sơ, bộ máy sao chép của vi khuẩn Cổ được xem là ít phức tạp hơn nhưng lại gần gũi

với sinh vật nhân chuẩn hơn so với các loại vi khuẩn thông thường. Thành phần

chính được mô tả và có chức năng giống nhau giữa chúng là các DNA polymerase

như pol α tương ứng polB hoặc polD; pol δ, ε tương ứng với enzyme Fen I.

1.2. Ứng dụng của DNA polymerase

Hai kỹ thuật PCR và giải trình tự là những kỹ thuật cốt lõi trong nghiên cứu

di truyền học. Đặc biệt được ứng dụng trong các lĩnh vực khoa học và sự sống như:

(1) trong Sinh học: bảo tồn sự đa dạng động thực vật, bảo tồn nguồn gen quý; (2)

trong y học: phân tích đánh giá khả năng mắc các bệnh di truyền; (3) trong khoa học

pháp y: nhận biết các dấu chuẩn di truyền (STR), các đoạn lặp, tìm kiếm đa hình;

(4) trong nông nghiệp: tạo giống cây trồng vật nuôi có hiệu quả kinh tế; (5) trong vi

sinh vật với môi trường: nghiên cứu khả năng tiến hóa, mức độ lây lan ảnh hưởng

tới con người và các sinh vật khác. DNA polymerase đóng vai trò quan trọng trong

cả hai kỹ thuật trên. Cùng với sự phát triển nhanh chóng của các công ty công nghệ

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

sinh học, đã đặt ra những thách thức trong quá trình sản xuất enzyme DNA

polymerase có chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu nghiên cứu và ứng dụng.

1.2.1. Kỹ thuật giải trình tự

Giải trình tự DNA/RNA là một ứng dụng quan trọng trong sinh học của

DNA polymerase. Phương pháp giải trình tự bằng enzyme đã được Frederick

Sanger tiến hành vào năm 1975 bằng cách sử dụng sự kết thúc chuỗi [36]. Từ đó,

việc giải trình tự DNA/RNA trở thành thông lệ trong các nghiên cứu sinh học phân

tử. Các công nghệ giải trình tự thế hệ kế tiếp (NGS) đã được phát triển và liên tục

Bảng 1: Phân loại DNA polymerase ứng dụng giải trình tự Được tổng hợp bởi Chen-Yao, 2014 [5]

Eukaryote (Human)

Archaea

Viruses

Enzyme

Họ

Pol γ (p140/p55/p55)

N.A.

T3, T5, T7

Klenow, KlenTaq, Taq

Bacteria (E. coli) Pol I

Pol θ (p100/p90/p80)

Bst, Bsu, T7

Pol ν

Pol II

Pol α/primase

HSV-1

T4, Ф29, 9 N, KOD1

Pol BI

(p180/p68/pri2/pri1)

RB69, T4

Pfu, Vent

Pol BII

Pol δ (p125/p66/p50/p12)

Pol BIII

Ф29

Pol ε (p260/p59/p17/p12)

Pol ζ (p350/p24)

N.A.

N.A

Pol D

N.A.

Pol III core (α/ε/θ) *N.A.

DP2/DP1

N.A.: không có

cải tiến từ năm 2005 đến nay.

DNA polymerase là thành phần khác biệt trong việc cải tiến các công nghệ

giải trình tự. Ban đầu, giải trình tự Sanger sử dụng enzyme Klenow (một phần phân

tách DNA-pol I của E. coli) để kết hợp hiệu quả với 2 ′, 3′-dideoxynucleotide

(ddNTPs) dẫn đến chấm dứt chuỗi tổng hợp DNA (Atkinson và cộng sự, 1969).

Tiếp theo với sự cải tiến hóa học, các chất nền nucleotide được sử dụng để giải trình

tự DNA trở nên lớn hơn và cồng kềnh hơn, enzyme Klenow ban đầu không còn kết

hợp hiệu quả các cơ chất mới [5]. Thay vào đó, sự đa dạng của DNA polymerase

được sử dụng và thiết kế riêng cho các công nghệ giải trình tự tiếp theo. Hiện nay,

các polymerase bền nhiệt họ polA, pol B đã và đang được cải biến, thử nghiệm trên

các thiết bị điện di mao quản (CE) và NGS.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

1.2.2. Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật nhân bản gen bằng phương pháp PCR là ứng dụng tiềm năng nhất

của các DNA polymerase bền nhiệt (bảng 2) được phát triển bởi Kary Mullis và

cộng sự, 1986 [20]. Như phân loại ở trên, DNA-pol thể hiện sự đa dạng rất cao về

chủng loại cũng như đặc tính của chúng. Hiện nay, khoảng hơn 50 loại khác nhau

Bảng 2: Đặc tính của một số enzyme DNA polymerase bền nhiệt Được tổng hợp bởi Kay Terpe, 2013 [40]

của nhóm DNA-polB bền nhiệt đã được phân lập và xác định hoạt tính [31].

Tên loài

DNA-pol

Họ Chịu nhiệt Tỉ lệ sai sót

Đầu thò

Kéo dài (kb/phút)

Đọc sửa

Dpo4

8x10-3 – 3x10-4

Pfu

0.5 – 1.5

95oC/1h

Bằng

Crenarchaeota Sulfolobus solfataricus Euryarchaeota Pyrococcus furiosus

95oC/23h

1.4

Pyrococcus GB-D Deep Vent

95% bằng

Isis

100oC/5h

Bằng

2.2 – 0.7 (x10-6) 12 – 2.7 (x10-6) 6.7 – 0.6 (x10-6)

Pwo

100oC/2h

Bằng

KOD1

95oC/12h

2.6 (x10-6)

6.0-7.8

Bằng

Vent

95oC/6.7h

1.0

95% bằng

Tgo

95oC/2h

1.5

Bằng

Taq

95oC/40’

1.0 – 4.8

95% 3'A

45 – 2.8 (x10-6) 5.6 – 3.5 (x10-6) 1.8x10-4 – 8.0x10-6

Tbr

96oC/150’

3'A

Tca

95oC/70’

1.0-2.3

3'A

Pyrococcus abyssi Pyrococcus woesei Thermococcus kodakarensis Thermococcus litoralis Thermococcus gorganarius Bacteria Thermus aquaticus Thermus brokianus Thermus caldophilus NP: Chưa công bố

DNA-polB hay còn được gọi là enzyme DNA polymerase thế hệ mới có đặc

tính đọc sửa 3’ – 5’ exonuclease giúp quá trình nhân bản DNA diễn ra chính xác

hơn khi so sánh với Taq-pol (thế hệ enzyme bền nhiệt đầu tiên, có nguồn gốc từ

Thermus aquaticus).

Các nhà nghiên cứu đã nhận ra rằng các loại DNA-polB của vi khuẩn Cổ đã

giải quyết vô số vấn đề gặp phải với Taq-pol như (1) dễ mắc lỗi sao chép khi nhân

những đoạn DNA lớn; (2) hạn chế kích thước đoạn DNA nhân lên được; (3) hiệu

suất PCR giảm do sự bắt cặp không khớp của mồi; (4) sự kết hợp không theo khuôn

mẫu của dAMP khi kết thúc tái bản, một nu A luôn được duy trì ở đầu của mỗi sản

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

phẩm PCR. Bên cạnh đó, các nghiên cứu động học tiết lộ rằng độ chính xác cao của

các loại DNA-polB phụ thuộc rất nhiều vào sự kết hợp nucleotide chính xác cùng

với khả năng đọc sửa exonucleoytic. Do đó, DNA-polB của vi khuẩn Cổ đã được

phát triển để tự xúc tác các phản ứng PCR với hiệu quả cao ngay cả khi có mặt của

chất ức chế. Đồng thời, các loại DNA-polB của vi khuẩn Cổ thường có độ sai sót

thấp (khả năng đọc sửa 3’-5’ proofreading) nên được ứng dụng chính trong gây đột

biến trực tiếp.

So sánh các DNA-pol từ Thermococcus và Pyrococcus có tỷ lệ lỗi trung bình

thấp khoảng 10-6 (bảng 2). Trong đó, KOD1-pol có hiệu suất PCR tốt hơn về các

tiêu chí như (1) kéo dài và tổng hợp sợi DNA nhanh hơn (extension rate); (2) hoạt

động xúc tác hiệu quả hơn (higher processivity); (3) thể hiện hiệu suất vượt trội

trong cả hai loại phản ứng PCR thông thường và real time PCR. Tuy nhiên, chi phí

sản xuất hoặc sử dụng enzyme này thường rất cao. Vì vậy Pwo-Pol của vi khuẩn

thuộc chi Pyrococcus được sử dụng phổ biến hơn bởi độ bền cao, và cũng có độ

chính xác tương đương KOD1-pol.

1.3. Tình hình nghiên cứu Pwo DNA polymerase

1.3.1. Phân loại nguồn gốc

Pwo DNA polymerase có nguồn gốc từ vi khuẩn Cổ Pyrococcus woesei

thuộc chi Pyrococcus được mô tả bởi Zillig và cộng sự, 1987 [46]. P. woesei là một

trong những vi sinh vật ái cực đoan (extremophile) có khả năng sinh trưởng và phát

Hình 3: Cây phát sinh của nhóm vi khuẩn Cổ chịu nhiệt Được xây dưng dựa trên trình tự gen 16S rRNA bằng phần mềm MEGA-7, chỉ ra 2 nhóm ngành chính: Crenarchaeota (nhánh màu đỏ) và Euryarchaeota (nhánh màu xanh) tách biệt với vi khuẩn suối nước nóng T. aquaticus. Trong đó, nhóm ngành Crenarchaeota bao gồm hầu hết các loài được phân lập có khả năng chịu nhiệt cao trên 80oC [8].

triển trong những điều kiện khắc nghiệt nhất với nhiệt độ khoảng từ 95-103oC.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

Hệ gen của P. woesei có sự tương đồng với các loài khác thuộc chi

Pyrococcus (hình 3). Theo thống kê, các trình tự của P. woesei đã công bố trên ngân

hàng gen (28857 bp) bao gồm 22 gen đơn lẻ và 1 cụm ba gen (X59857). Khi so

sánh các trình tự này với các loài trong chi Pyrococcus thấy tỉ lệ tương đồng cao,

giống đến 99% với các gen tương ứng của P. furiosus.

Một nghiên cứu khác đã tiến hành phân tích microarray DNA kết hợp PCR

trên tổng số 2065 khung đọc mở (ORF) của P. woesei. Kết quả đem so sánh với hệ

gen của P. furiosus cho thấy 105 ORF tương đồng bị thiếu trên hệ gen của P.

woesei. Các cụm gen thiếu này bao gồm một cụm (Mal I, PF1737 - PF1751) liên

quan đến chuyển hóa maltose và một cụm khác (PF0691 - PF0695) giúp loại bỏ các

loại nitơ trong phản ứng độc hại. So sánh với các loài khác trong cùng chi

Pyrococcus là P. horikoshii và P. abyssi, độ tương đồng khoảng 75%, do chúng

không có gen mã hóa amylase cũng như không có các yếu tố IS [19, 34].

1.3.2. Nghiên cứu biểu hiện Pwo DNA polymerase tái tổ hợp

Pwo DNA polymerase là một trong những enzyme bền nhiệt đã được nghiên

cứu biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn E. coli. Các công bố này chỉ ra, Pwo-pol

tái tổ hợp có khả năng gây độc đối với tế bào biểu hiện E. coli BL21 (DE3). Để

khắc phục vấn đề này, quá trình tối ưu biểu hiện Pwo-pol đã được tiến hành trên

trên tế bào vật chủ E. coli BL21 (DE3) plysS [6, 12]. Tuy nhiên, tất cả các nghiên

cứu đều chưa có đánh giá nhiều về đặc tính của protein tái tổ hợp này (bảng 2).

Pwo DNA polymease tự nhiên mang nhiều đặc tính nổi trội của nhóm

enzyme bền nhiệt. Do đó, việc phân tích các đặc tính của protein Pwo-pol ở trong tự

nhiên sẽ giúp đánh giá chính xác hoạt tính của protien Pwo-pol tái tổ hợp trong

nghiên cứu.

Tương tự các DNA polymerae khác Pwo-pol cần một co-factor là các ion

Mg2+ hoặc Mn2+ để có thể xúc tác trong suốt quá trình. Lượng ion Mg2+ hoặc Mn2+

sẽ bị mất đi nếu enzyme bị ức chế hoặc bất hoạt trong giai đoạn diễn ra phản ứng

bởi các chất gây ức chế như phospholipit, EDTA, phenol… Một phản ứng PCR với

xúc tác enzyme Pwo-pol có thể được tối ưu từ 1 – 10 mM MgSO4, 100 – 300 µM

dNTP mỗi loại [1].

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

1.3.3. Các đặc tính quan trọng của DNA polymerase dùng cho PCR

Khả năng bền nhiệt (Thermostability): đây là một trong những yếu tố cần

thiết cho phản ứng khuếch đại DNA. Trong mỗi chu kỳ đều có bước biến tính làm

tách mạch DNA bằng nhiệt độ cao (từ 94-98oC). Tính chất bền nhiệt của DNA

polymerase phụ thuộc vào thời gian half-life của nó tại nhiệt độ cao nhất định. Cụ

thể Pwo-pol có thời gian half-life lên đến 2h tại 100oC [6]. Thời gian bền nhiệt cũng

phụ thuộc vào nồng độ protein hoặc một số điều kiện khác như các chất tẩy rửa

(DTT, Tween 20), betaine (BSA) và đường. Chưa có nhiều chứng minh độ pH hay

nồng độ muối ảnh hưởng đến tính bền nhiệt của ezyme DNA polymerase.

Tốc độ kéo dài chuỗi (Extension rate): đại diện cho số lượng dNTPs trùng

hợp mỗi giây trên mỗi phân tử DNA polymerase. Tốc độ kéo dài chuỗi DNA phụ

thuộc mạnh mẽ vào môi trường phản ứng và khuôn mẫu DNA. Một số phân tử

DNA có trình tự giàu GC, thậm chí có thể hình thành các cấu trúc ngăn chặn sự kéo

dài mồi. Tốc độ kéo dài của Pwo-pol sẽ tương tự với Pfu-pol khoảng 0.5-1.5

kb/phút, thấp hơn 5-10 lần enzyme Tkod-pol [40]. Tốc độ kéo dài chuỗi không xem

xét đến khả năng bám cũng như đọc sửa của của DNA polymerase ở trạng thái ổn

định. Tốc độ kéo dài như là sự khác biệt giữa tốc độ trùng hợp và loại bỏ các

nucleotide ở đầu 3’.

υext ~ κpol – κexo

Đặc tính xử lý trình tự (Processivity): là xác suất, sau khi gắn nucleotide,

Hình 4: Cơ chế cạnh tranh động học cho một DNA polymerase Được nghiên cứu bởi Pavlov và cộng sự, 2004 [31].

polymerase sẽ không tách khỏi DNA khi chuyển sang vị trí tiếp theo.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

DNA polymerase nằm trên một điểm liên kết khuôn mẫu với primer (hình 4).

Các hằng số tốc độ bậc một tương ứng: κpol (bổ sung nucleotide); κexo (cắt bỏ

nucleotide); κoff (phân ly polymerase từ phân tử DNA). Khi đó, giá trị processivity

của chúng được tính theo công thức:

P = (κpol – κexo) / (κpol + κexo) + (κpol – κexo) / (κpol + κexo + κoff)

Tương tự như khả năng kéo dài chuỗi, giá trị của P phụ thuộc vào trình tự

DNA khuôn và thành phần phản ứng ví dụ như nồng độ muối.

Hầu hết các enzyme DNA-polB có khả năng xử lý trình tự không cao khoảng

từ 4-30 nucleotide/1 lần bám của DNA polymerase [40]. Điều này gây ra hạn chế

với nhóm enzyme này trong một số ứng dụng sao chép DNA plasmid. Một phương

pháp hiệu quả để cải thiện nhược điểm này là các DNA-pol lai được dung hợp với

một phần protein khác có khả năng bám DNA tốt (như Sso7d).

Sự chính xác (Fidelity): là một đặc tính của DNA polymerase, thể hiện số

nucleotide được chèn chính xác sau mỗi lần chèn sai. Khả năng này cũng được hiểu

là hiệu quả xúc tác cho những cơ chất biến đổi của DNA polymerase. Nếu DNA

polymerse có khả năng xúc tác hiệu quả cao thì sự chính xác trong quá trình chèn

nucleotide càng cao và ngược lại.

Tốc độ đọc sai (Error-rate): Đối với các enzyme DNA polymerase bền

nhiệt, chúng có khả năng đọc sửa (proofreading) nhờ hoạt động exonuclease theo

chiều 3’-5’ để khắc phục nhược điểm chèn sai [43]. Tần số sai sót (đột biến) của

Pwo-pol sau mỗi lần nhân đôi khoảng 10-6 thấp hơn 18 lần so với Taq-pol có sự sai

sót từ 1.8x10-4 – 8.0x10-6 [40].

Các thành phần đệm PCR và điều kiện chu trình nhiệt có thể ảnh hưởng đến

độ chính xác của DNA polymerase theo các cách khác nhau hoặc ở các mức độ

khác nhau. Ví dụ, mặc dù các ion magie được xem như là co-factor giúp DNA

polymerase xúc tác tổng hợp nucleotide chính xác, nhưng lượng magie dư thừa sẽ

làm giảm độ chính xác của chúng. Nồng độ nucleotide không đồng đều cũng sẽ làm

giảm độ chính xác vì sự kết hợp sai của nucleotide nồng độ cao hơn sẽ xảy ra

thường xuyên hơn. Các điều kiện chu trình nhiệt như làm biến tính DNA đến nhiệt

độ cao trong thời gian dài có thể dẫn đến việc giải phóng các bazơ từ chuỗi liên kết

phosphodiester, dẫn đến những sai sót [21].

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

1.4. Công nghệ protein tái tổ hợp

1.4.1. Tổng hợp gen, tối ưu mã codon

Hiện nay, các nhà khoa học có thể dễ dàng truy cập các dữ liệu tin sinh nhằm

khuếch đại và tổng hợp một đoạn trình tự gen đích của đối tượng nghiên cứu. Theo

thống kê trên ngân hàng dữ liệu trình tự của NCBI, đã lưu trữ hệ gen của gần 50

nghìn loài sinh vật khác nhau trong đó bao gồm Eukaryotes (9631 trình tự);

Prokaryotes (220559 trình tự); Viruses (33870 trình tự); Plasmids (19175 trình tự);

Organelles (15058 trình tự). Từ nguồn dữ liệu quý giá này, các nhà khoa học tiếp

tục phát triển nghiên cứu cấu trúc và chức năng của protein được mã hóa.

Tổng hợp gen

Tổng hợp gen de novo là một công cụ thiết yếu trong các nghiên cứu sinh

học như tương tác protein nucleic acid, đột biến gen được định hướng và tối ưu hóa

việc sử dụng codon để biểu hiện gen từ các trình tự đã biết. Một số phương pháp

sinh học phân tử như cắt enzyme giới hạn [29], enzyme nối ligase [11], sau đó

khuếch đại bằng PCR hoặc chèn vào vector nhân dòng để biểu hiện protein tái tổ

hợp [30]. Tuy nhiên, quá trình này thường tạo ra các sản phẩm phụ hoặc không

mong muốn do đột biến.

Gen mã hóa protein Pwo-pol sử dụng trong nghiên cứu này được tổng hợp

dựa trên quy trình lắp ráp oligonucleotide POS (patch oligonucleotide synthesis)

như hình 5 bao gồm 3 bước chính: Phosphorylation, Ligase Chain Reaction,

Polymerase Chain Reaction. POs là một trong những phương pháp tổng hợp gen

Hình 5: Sơ đồ minh họa các bước tổng hợp gen bằng phương pháp POS Được nghiên cứu bởi Yang và cộng sự, 2011 [42]

nhanh chóng và chính xác nhất.

Bước 1: Phosphoryl hóa các đoạn oligo cấu trúc (COs - constructional oligonucleotides) và các đoạn oligo ráp-nối (POs - patch oligonucleotides) Bước 2: Nối các đoạn COs với các đoạn POs bằng phản ứng LCR để hình thành nên đoạn gen hoàn chỉnh Bước 3: PCR khuếch đại đoạn gen hoàn chỉnh sử dụng cặp mồi ở phía ngoài cùng

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

Tối ưu hóa việc sử dụng codon biểu hiện gen

Codon là mã bộ ba, được cấu tạo từ 4 loại nucleotide adenine (A), guanine

(G), cytosine (C) and thymine (T) và có tất cả 64 mã bộ ba mã hóa cho hơn 20 loại

acid amin khác nhau. Vậy nên mã bộ ba có tính dư thừa, nhiều bộ ba có thể quy

định cùng một loại acid amin. Các sinh vật thường ưu tiên sử dụng các mã bộ ba

riêng của chúng, điều này phản ánh sự cân bằng giữa chiều hướng của đột biến và

chọn lọc tự nhiên cho hiệu quả dịch mã.

Trong những năm gần đây, ngày càng có nhiều báo cáo về các gen có mức

độ biểu hiện cao ở một số vi sinh vật đã cung cấp nhiều thông tin về biểu hiện gen.

Trong đó, chủ yếu liên quan đến các gen mã hóa protein là yếu tố phiên mã / dịch

mã (TF), protein ribosome (RP), protease và chaperons (CH), các enzyme phân giải,

sinh tổng hợp, chuyển hóa, quang hợp, hô hấp và glycolysis... là các sản phẩm quan

trọng đối với sinh lý tế bào. Có lẽ, sự chuyển dịch trong thành phần axit amin của

các gen này có thể giảm thiểu chi phí năng lượng sinh tổng hợp đáng kể cho sinh

vật. Bên cạnh các cơ chế khác, người ta cũng đề xuất rằng chuyển dịch codon

(codon bias) có thể ảnh hưởng đến biểu hiện gen bằng cách tối ưu hóa tốc độ dịch

mã và do đó, các gen biểu hiện cao có thể được đặc trưng bởi tối ưu sử dụng mã bộ

ba so với các gen biểu hiện trung bình [35].

Có rất nhiều các mô hình đã đưa ra để đo lường mức độ chuyển dịch codon.

Trong đó, chỉ số CAI (Codon Adaptation Index) do Sharp và Li nghiên cứu đã

nhanh chóng được sử dụng rộng rãi để dự đoán mức độ biểu hiện của các gen khác

nhau [33]. Giá trị của chỉ số CAI dao động từ 0 – 1, là 1 nếu một gen luôn được sử

dụng các condon đồng nghĩa trong tập tham chiếu. Chỉ số CAI được xem xét là phù

hợp cho biểu hiện gen ở E. coli dao động từ 0.8 – 1, %GC của các gen từ 30 – 70%

tổng số nucleotide [14]. Vì vậy, tối ưu hóa mã bộ ba là một bước quan trọng trong

nghiên cứu biểu hiện gen Pwo-pol để phù hợp với vật chủ biểu hiện E. coli.

1.4.2. Nhân dòng gen đích vào vector mong muốn

Kỹ thuật PCR nhân dòng gen

Hình 6: Thiết kế mồi nhân dòng gen mã hóa protein Pwo-pol

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

Nhiều kỹ thuật đã được giới thiệu để lắp ráp các đoạn DNA khác nhau như PCR các

đoạn trình tự chồng gối (overlaping), tuy nhiên phổ biến nhất trong kỹ thuật nhân

dòng gen là việc sử dụng enzyme giới hạn. Yêu cầu của phương pháp là trên cả hai

trình tự DNA chèn và vector phải có cùng vị trí nhận biết của enzyme giới hạn,

chúng sẽ được nối lại từ các vết cắt kiểu đầu dính hoặc đầu bằng. Tuy nhiên không

phải khi nào đoạn gen đích cũng chứa vị trí cắt enzyme giới hạn tương ứng. Việc sử

dụng mồi PCR chứa các vị trí cắt enzyme giới hạn có thể giải quyết hiệu quả vấn đề

này (hình 6). Đoạn gen đích được nhân bản bằng PCR cực kỳ nhanh chóng và hiệu

quả với sự trợ giúp của DNA polymerase bền nhiệt. Giải trình tự các sản phẩm PCR

thu được, kiểm tra và phân tích dữ liệu trước khi chèn vào vector nhân dòng [16].

Escherichia coli được xem như là là một trong những bioreactor phù hợp

nhất trong phần lớn các thí nghiệm nhân dòng gen. Vector plasmid chứa trình tự

gen của sinh vật lạ được chuyển vào và sao chép độc lập với hệ gen của vi khuẩn E.

coli. Đây được gọi là công nghệ DNA tái tổ hợp dựa trên cơ chế biến nạp

(transformation) trong tự nhiên của vi khuẩn nhưng được thực hiện theo phương

pháp sốc nhiệt ở trong phòng thí nghiệm. Trước khi xử lý sốc nhiệt, tế bào vi khuẩn

E. coli được xử lý với canxi ở nồng độ cao khoảng 100mM. Trong điều kiện môi

trường giàu canxi màng tế bào vi khuẩn tích điện dương hơn, và DNA plasmid tích

điện âm có xu hướng tiếp xúc lại gần màng tế bào vi khuẩn. Tế bào khả biến E. coli

sau đó xử lý sốc nhiệt từ 0-42oC dẫn đến màng tế bào bị mất đi một lượng các lipid

và protein [3]. Ở trạng thái cấu trúc màng tế bào lỏng lẻo DNA plasmid dễ dàng

chuyển vào bên trong, khả năng biến nạp tăng lên khoảng 60% so với khi biến nạp

vào tế bào không xử lý với canxi [26].

1.4.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

a. Vật chủ biểu hiện

Các điều kiện vật chủ, vector và nuôi cấy (môi trường, nhiệt độ nuôi cấy) là

ba yếu tố chính quyết định sự thành công trong biểu hiện protein tái tổ hợp. Hiện

nay, có rất nhiều hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp từ đơn giản đến phức tạp

nhưng phổ biến hơn cả là hệ thống biểu hiện ở prokaryote.

Đặc điểm nổi bật của vật chủ E. coli phù hợp biểu hiện protein tái tổ hợp

Một trong những vật chủ được ưu tiên để sản xuất protein tái tổ hợp là E.

coli. Ưu điểm: có tốc độ sinh trưởng nhanh (15 phút/chu kỳ sinh trưởng) và mật độ

tế bào cao, dễ thao tác, mức độ biểu hiện lớn trong thời gian ngắn và chi phí thực

hiện thấp. Nhược điểm: thiếu sự biến đổi sau dịch mã cho nhiều protein có tính chất

phức tạp, kích thước protein biểu hiện bị hạn chế, đôi khi protein biểu hiện có thể ở

dạng thể vùi không tinh sạch được. Tuy nhiên E. coli được biết đến với toàn bộ hệ

gen đã được giải mã. Do đó, nhiều sửa đổi đã được thực hiện trên E. coli để tối ưu

hóa chúng trở thành đối tượng tiềm năng cho nghiên cứu biểu hiện protein. Các nỗ

lực để tăng cường khả năng biểu hiện gen được thể hiện thông qua cải biến di

truyền (genetic engineering) cũng như các kỹ thuật trên phạm vị toàn hệ gen (strain

engineering) [28].

E. coli bao gồm nhiều chủng. Do đó, việc lựa chọn được vật chủ phù hợp có

thể đem lại hiệu quả biểu hiện cho các protein khác nhau. Mặc dù các vật chủ đó

Bảng 3: Các chủng E. coli phổ biến cho biểu hiện protein tái tổ hợp Được tổng hợp bởi Hayat SMG và cộng sự, 2018 [13]

cũng có những ưu điểm và nhược điểm riêng như trong bảng 3.

Chủng

Đặc điểm

Lợi ích

BL21 (DE3)

Phù hợp biểu hiện các gen không tạo độc tố

Có chứa vùng gen DE3 lysogen biểu hiện T7 RNA polymerase Thiếu lon và ompT proteases Cảm ứng bằng IPTG

BL21 (DE3) pLysS

Ngăn chặn sự biểu hiện sớm Phù hợp biểu hiện các gen tạo độc tố

Có chứa vùng gen DE3 lysogen biểu hiện T7 RNA polymerase Có T7 lysozyme để phân giải T7 polymerase trước khi được cảm ứng

Lemo21 (DE3)

Gồm các đặc điểm của BL21 (DE3) Biểu hiện đồng thời được các dòng khác nhau bởi sự đa dạng mức độ của lysozyme

Phù hợp cho biểu hiện các protein khó như: các protein gây độc tố, các protein màng và ít tan

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

Tuner (DE3) Có sự biến đổi lac permerase (lacY)

Cho phép sự tiếp nhận đồng dạng ở tất cả các tế bào trong quần thể Phù hợp biểu hiện protein gây độc và không tan

Có đột biến ở các gen trxB và gor

Origami

Làm tăng sự hình thành các liên kết S-S ở tế bào chất

Rosetta

Phù hợp cho biểu hiện các protein dị hợp

Các dẫn xuất BL21 lacYZ Có thêm các bản sao của gen mã hóa tRNA cho các codon hiếm AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA

Phù hợp cho biểu hiện các protein gây độc hoặc protein màng từ tất cả các sinh vật

C41 (DE3) và C43 (DE3)

Các chủng đột biến của BL21 (DE3) ngăn chặn cái chết của tế bào khi có sự biểu hiện của các protein tái tổ hợp gây độc

Hơn một thập kỷ trước, Walker và cộng sự đã phân lập được các chủng E.

coli đột biến C41 (DE3) và C43 (DE3) mang các đột biến dập tắt tự phát (suppresor

mutations). Vai trò của các đột biến này được cho rằng đã làm giảm độc tính gây ra

từ việc sản xuất protein nội bào dưới sự kiểm soát của promoter T7. Không có gì

đáng ngạc nhiên, sau đó người ta đã phát hiện ra rằng các đột biến ở các chủng này

làm giảm hiệu quả dịch mã của T7 RNA polymerase [9]. Hiện nay, chúng được biết

đến là các chủng đột biến của E. coli BL21 (DE3) và được sử dụng như một vật chủ

phổ biến biểu hiện protein tái tổ hợp. E. coli BL21 được định nghĩa là một trong

những loại chủng B thiếu Lon protease (tế bào chất) và protease OmpT (màng

ngoài). DE3 là các chủng tương ứng có chứa lysogen λDE3, mang gen T7 RNA

polymerase dưới sự kiểm soát của promoter lacUV5. T7 RNA polymerase sẽ được

thể hiện bằng cách bổ sung chất cảm ứng isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside

(IPTG) vào môi trường sinh trưởng [45].

b. Vector biểu hiện

Vector biểu hiện (plasmid thiết kế) đóng vai trò quan trọng trong quá trình

sản xuất protein tái tổ hợp. Vector được thiết kế có khả năng nhân lên độc lập với

hệ gen của vật chủ nuôi cấy, dễ dàng thao tác và kiểm soát mức độ biểu hiện cũng

như tinh sạch protein tái tổ hợp.

Hình 7: Cấu trúc vector biểu hiện protein tái tổ hợp ở E. coli Được xây dựng bởi Jia và Jeon, 2016 [17] a. Cấu trúc vector biểu hiện protein tái tổ hợp ở tế bào chất; b. Cấu trúc vector sử dụng biểu hiện protein ở màng tế bào. D tags (Detection); P tags (Purification); S tags (Solubility and translation initiation); TT (Transcriptional terminator)

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

Cấu trúc vector biểu hiện phổ biến ở vi khuẩn E. coli thường bao gồm các

yếu tố như marker chọn lọc là các gene kháng kháng sinh, điểm khởi đầu sao chép

(Ori), promoter phiên mã (T7-promoter), vùng không dịch mã đầu 5’ (5’UTR) và vị

trí bắt đầu dịch mã. Bên cạnh đó, một điểm quan trọng khác của các vector biểu

hiện là sự có mặt của đuôi dung hợp (His tag, GST tag…) nằm trên cùng khung đọc

mở với gen được biểu hiện, ngược chiều phiên mã với các yếu tố khác (hình 7).

Vùng T7 promoter được sử dụng để kiểm soát mức độ biểu hiện của protein. Cặp

đuôi ái lực giúp định hướng biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp. Đuôi lớn hơn

để bắt đầu biểu hiện protein, phát hiện tính tan và độ hòa tan của protein; đuôi nhỏ

hơn sử dụng để tinh chế protein. Các vị trí cắt enzyme như TEV protease hoặc

thrombin được thiết kế trên vector để loại bỏ các đuôi ái lực sau khi tinh chế

protein. Với các protein tái tổ hợp sản xuất trong tế bào chất các đuôi ái lực được

thiết kế gắn vời đầu C-terminus của protein đích (hình 7b). Trong khi đó, với các

protein tái tổ hợp sản xuất ở màng các đuôi ái lực được thiết kế gắn vời đầu N-

terminator của protein đích (hình 7a).

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hệ thống biểu hiện T7 RNA

polymerase ở vector pET-M (là vector biến thể của pET-32a đã loại bỏ đuôi S-tag

Bảng 4: Vị trí các đặc điểm của vector biểu hiện pET-M

và trình tự gen TrxA) trên tế bào vật chủ E. coli BL21 (DE3)

Đặc điểm pET-M (biến thể pET-32a) Giới hạn

T7 promoter 315-333

T7 transcription start 314

His-Tag coding sequence 140-157

Multiple cloning sites (AvaI-BamHI) 158-198

His-Tag coding sequence 225-242

T7 terminator 26-73

Ribosome binding site 253-275

lac operater 290-314

LacI coding sequence 724-1806

pBR322 origin 3236-3824

bla coding sequence 3995-4855

f1 origin 4987-5442

1.4.4. Các phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp

a. Phương pháp sắc ký ái lực

Khi protein tái tổ hợp đã dễ dàng được biểu hiện ở các vi sinh vật như E. coli

thì yêu cầu đặt ra là cần có phương pháp để tinh sạch các protein tái tổ hợp này. Do

đó, protein tái tổ hợp thường được dung hợp với một số đuôi ái lực như: poly-

histidine, Glutathione S-transferase (GST), vv…

Một trong những phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực phổ biến là IMAC

(Immobilized Metal-Affinity Chromatography) được sử dụng để tinh sạch các

protein tái tổ hợp có chứa đuôi poly-histidine [38]. IMAC dựa trên sự tương tác

giữa các ion kim loại chuyển tiếp (như Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+) được cố định trên

một mạng lưới gel (sepharose) với các chuỗi bên acid amin đặc biệt. Histidine là

axit amin có chứa vòng imidazole đóng vai trò là nhóm cho điện tử, nên dễ dàng

hình thành liên kết phối hợp với kim loại chuyển tiếp bất động. Vì vậy protein tái tổ

hợp chứa chuỗi peptide gồm các histidine liên tiếp sẽ được giữ lại một cách hiệu

quả trên mạng lưới gel IMAC. Hơn nữa, chuỗi poly-histidine cũng dễ dàng được

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

rửa giải bằng cách điều chỉnh pH của dung dịch đệm rửa hoặc bổ sung imidazole tự

do như là chất cạnh tranh với histidine [4].

Phương pháp IMAC đã tinh sạch thành công trên các hệ thống vật chủ biểu

hiện như E. coli, Saccharomyces cerevisiae, tế bào côn trùng, tế bào động vật với

hiệu suất tinh sạch cao lên đến 95%. Tuy nhiên, yêu cầu đối với phương pháp là

mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp phải đủ lớn để tạo nên sự đồng nhất. Trong

một số trường hợp, quy trình tinh sạch đuôi ái lực poly-histidine có thể được thay

đổi để tăng độ tinh sạch như sử dụng hai đuôi ái lực hoặc kết hợp loại bỏ His-tag

với các bước tinh sạch IMAC đảo ngược [24].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cột tinh sạch Glass-Econo Column

(kích thước lỗ màng 30 µm) có chứa các hạt gel gắn nickel (Ni-NTA Agarose,

Qiagen). Khi có mặt nickel, các phân tử NTA cố định ion Ni2+ tạo nên mạng lưới

ion kim loại có ái lực cao với đuôi 6xHis được gắn vào đầu N- của protein tái tổ

hợp.

b. Phương pháp kết tủa ammonium sulfate

Thông thường, có rất ít protein chỉ hòa tan trong nước và hầu hết cần ít nhất

một nồng độ muối nhỏ để duy trì nếp gấp và ổn định. Ở trạng thái tự nhiên, protein

có khả năng tích điện âm hoặc dương tùy thuộc vào từng vùng. Sự có mặt của muối

giúp protein trung hòa điện tích bề mặt, ngăn ngừa sự kết tụ. Tuy nhiên, khi nồng

độ muối tăng lên, protein tiếp tục tích điện dẫn đến sự kết tụ. Độ tan của protein

tăng khi thêm lượng muối nhỏ hơn 0.15 M. Ngược lại, nếu nồng độ muối cao hơn,

protein có xu hướng bị kết tủa. Bên dưới là dãy các ion sắp xếp theo chiều salt-out

giảm dần, salt-in tăng dần, với pH của dung dịch > pI của protein; và ngược lại nếu

- > SCN-

pI của protein < pH của dung dịch [10]:

3- > SO4

Anion: PO4

2- > CH3COO- > Cl- > Br- > ClO4

+ > Rb+ > K+ > Na+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > Ba2+

Cation: NH4

Ammonium sulfate (AS) là một trong những muối có độ hòa tan cao nhất, độ

bão hòa dung dịch là 4.1 M ở 25oC, 4.06 M ở 20oC, 3.97 M ở 10oC, 3.93 M ở 4oC

và 3.9 M ở 0oC. Khả năng hòa tan cao giúp chúng phân ly mạnh thành các ion âm

và ion dương, dễ dàng trung hòa điện tích cho protein. Vì thế, muối AS được sử

dụng trong phương pháp kết tủa mà vẫn duy trì được khả năng cuộn gập tự nhiên

của protein. Tùy thuộc vào khối lượng phân tử, cấu trúc không gian của mỗi protein

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

mà chúng sẽ kết tủa ở nồng độ muối khác nhau. Ở nồng độ muối AS 90% độ bão

hòa, tất cả các protein đều bị kết tủa [41]. Protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp

trong nghiên cứu theo lý thuyết bao gồm 790aa, có pI tương ứng 7.92 và khối lượng

khoảng 92 kDa. Theo một nghiên cứu tương tự, protein Taq DNA polymerase (kích

thước ~90 kDa) đã được tinh sạch thành công sử dụng nồng độ muối AS khoảng

50% độ bão hòa trên tổng thể tích dung dịch [32]. Tuy nhiên phương pháp kết tủa

này được sử dụng phổ biến hơn khi tinh sạch các protein liên kết màng tế bào.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiên tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, và

PTN Sinh học phân tử tế bào (Molecular Cell Biology Lab) thuộc Trung tâm Khoa

học và Sự sống, Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN.

2.1.1. Nguyên vật liệu

 Chủng vi sinh vật sử dụng trong nuôi cấy: dòng tế bào khả biến E. coli BL21

(DE3) được lưu trữ trong bình ni tơ lỏng.

 Vector biểu hiện protein tái tổ hợp trong nghiên cứu: plasmid pEtM (biến thể của

PET32a) nhận được từ phòng thí nghiệm sinh học cấu trúc I thuộc Bộ môn Sinh

học, Khoa khoa học, Đại học Quốc gia Singapore.

 Gen mã hóa Pwo-pol và mồi nhân dòng gen được tổng hợp hóa học bởi công ty

TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa.

2.1.2. Dụng cụ và thiết bị

 Thiết bị dùng trong sinh học phân tử: Máy PCR Mastercycler nexus Eppendorf

(Đức), Bộ điện di ngang Mupid-one (Japan), bộ điện di đứng BioRad (Đức), hệ

thống máy soi gel (Mỹ).

 Thiết bị dùng trong nuôi cấy vi sinh vật: Tủ an toàn sinh học, máy lắc nuôi vi

khuẩn (Hàn quốc).

 Thiết bị dùng trong tinh sạch protein tái tổ hợp: Máy siêu âm LABONIC® M

(Đức), Máy ly tâm ống epp 1.5 ml hoặc 2 ml, máy ly tâm ống falcon tốc độ cao

Eppendorf, Cột tinh sạch Glass-Econo Column – BioRad (Đức)

2.1.3. Hóa chất và môi trường

Nghiên cứu sử dụng 2 loại môi trường (LB lỏng, LB agar) cho nuôi cấy vi

khuẩn và một số dung dịch đệm, hóa chất stock được liệt kê trong bảng 5. Các hóa

chất, dung dịch đệm được pha với các nồng độ stock (50X, 10X…) trước khi đem

sử dụng làm thành phần cho đệm điện di DNA, điện di protein, tinh sạch protein…

Hóa chất để pha các dung dịch đệm được mua từ các hãng uy tín như Merck,

Thermo Scientific, Sigma. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng sử dụng một số bộ kit

thương mại như kít tách chiết plasmid (Thermo Scientific), kít tinh sạch/thôi gel sản

phẩm PCR và sản phẩm cắt, nối DNA/plasmid (iNtRon).

Bảng 5: Dung dịch đệm, hóa chất pha stock

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

Loại dung dịch

Tên hóa chất

Nồng độ

Thành phần

Khối lượng (thể tích)

Môi trường (1L)

LB lỏng

10 g

Tryptone

(bảo quản 4oC)

10 g

NaCl

5 g

Yeast extract

LB agar

LB lỏng

15 g

Agar

Đệm Stock (1L)

Tris HCl

121.1 g

Tris base

1 M

(bảo quản 4oC)

 pH 6.8

80-85 ml

HCl (đặc)

 pH 8.0

40-42 ml

 pH 8.8

32-35 ml

EDTA, pH 8.0

148 g

EDTA

0.5 M

30-40g

NAOH

SDS, pH 6.6

100 g

SDS

10%

APS

100 g

APS

10%

Acrylamide/Bis

Acrylamide

300g

30%

Bis-acrylamide

8 g

(100 ml)

1.296 g

50 mM

NiCl2

NaCl

292.2 g

5 M

KCl

74.55 g

1 M

132.14 g

1 M

(NH4)2SO4

120.37 g

1 M

MgSO4

BPB

0.2 g

0.2%

(-20oC) 100 ml

IPTG

238 g

Imidazole

6.8 g

DTT

154.5 g

BSA

10 g

100 mg/ml

Ampicilin

10 g

100 mg/ml

a. Đệm điện di DNA

Đệm TAE, stock 50X (2 M Tris, 50 mM EDTA) là đệm chạy điên di gel agarose.

Trong 1 lít bao gồm 242 g tris base; 57.1 ml acetic acid (đặc) và 100 ml EDTA 0.5

M, pH 8.0, lưu ý ban đầu chỉ đổ vào khoảng 800ml nước cất để hòa tan các hóa chất

trước khi thêm nước cho đủ 1 lít vì các hóa chất có khối lượng lớn cũng chiếm một

lượng thể tích nhất định.

DNA loading dye (5X) tra mẫu DNA bao gồm 25% Glycerol, 25 mM EDTA, 0.5%

SDS, 0.08% BPB (bromophenol blue), sau khi pha hỗn hợp có màu tím.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

b. Đệm điện di protein

Đệm Running 1X (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH8.3) là dung dịch

đệm chạy điên di gel SDS-PAGE. Trong 1 lít running buffer 1X bao gồm 30.3 g tris

base, 144 g glycine, 10 g SDS. Tương tự pha đệm TAE, dùng khoảng 800 ml nước

cất hòa tan các hóa chất trước khi thêm nước vào để được 1 lít dung dịch.

SDS loading dye (5X) tra mẫu protein bao gồm 250mM Tris, pH 6.8, 10% (g/ml)

SDS, 30% Glycerol, 5% β-mercapitalethanol, 0.02% BPB, sau khi pha hỗn hợp có

màu xanh lục đậm, có thể thay đổi tùy thuộc vào pH của dung dịch.

Đệm nhuộm gel SDS-PAGE gồm có 0.1% (g/ml) Coomassie Brilliant Blue G-250

và 50% methanol, 10% acetic acid tổng thể tích dung dịch đệm.

Đệm tẩy gel SDS-PAGE gồm có 40% methanol, 10% acetic acid tổng thể tích dung

dịch đệm.

c. Đệm tinh sạch và xử lý cột tinh sạch

Các dung dịch đệm sử dụng trong quá trình tinh sạch protein bằng cột sắc ký

ái lực nickel-resin:

Đệm A1 bao gồm 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 5mM Imidazole

Đệm B1 bao gồm 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 30mM Imidazole

Đệm C1 bao gồm 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 500mM Imidazole

Đối với phương pháp tinh sạch protein bằng phương pháp kết tủa (NH4)2SO4

sử dụng 2 dung dịch đệm:

Đệm A2 bao gồm 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA

Đệm B2 bao gồm 50mM Tris HCl, 20% sucrose, 1mM EDTA

Đệm C2 bao gồm 50mM Tris HCl, 300mM NaCl

Đệm thẩm tách cho cả hai phương pháp bao gồm các thành phần: 20mM Tris-HCl,

pH 8.0, 200mM NaCl

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Thiết kế gen đích mã hóa Pwo DNA polymerase

Chúng tôi sử dụng thông tin trình tự amino acid quy định protein DNA

polymerase I của vi khuẩn Pyrococcus woesei đã công bố trên GenBank

(AAB67984) để thiết kế gen đích mã hóa Pwo DNA polymerase. Trình tự gen đích

được tối ưu biểu hiện phù hợp với vật chủ E. coli sử dụng phần mềm online

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

“GenSmart Codon Optimization”. Sau đó, trình tự cặp mồi nhân dòng (bảng 6)

Bảng 6: Trình tự cặp mồi nhân dòng gen mã hóa Pwo DNA

được thiết kế trực tiếp từ trình tự gen tối ưu:

STT

Tên

Trình tự (5'-3')

Độ dài

Tm

GCggatccATTCTGGATGTGGATTATATCAC

31 bp

53.75

1

Pwo- BamHI

CGgaattcTTAGCTTTTCTTAATGTTCAGC

30 bp

53.07

2

Pwo- EcoRI

Thết kế mồi nhân gen Pwo DNA polymerase chứa vị trí cắt enzyme giới hạn

Cặp mồi sử dụng để nhân dòng được thiết kế chính xác ở hai đầu đoạn gen

mã hóa Pwo DNA polymerase. Mồi xuôi được xác định nằm ở đầu 5’ trên mạch bổ

sung (positive strand – cùng chiều phiên mã với f1 origin) của đoạn gen đích gắn

với trình tự cắt giới hạn của enzyme BamHI. Mồi ngược nằm tương ứng ở đầu 5’

trên mạch khuôn (negative strand) của đoạn gen đích gắn với trình tự cắt giới hạn

của enzyme EcoRI. Sau đó, trình tự gen và mồi được tổng hợp theo phương pháp

hóa học bởi Công ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa (PHUSA Biochem). Gen tổng

hợp được chèn vào vector PUC19, bảo quản ở -20oC.

Hình 8: Sơ đồ mô tả quá trình nhân dòng vector tái tổ hợp pEtM-Pwo

2.2.2. Nhân dòng, tạo vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

(1) PCR nhân gen Pwo DNA polymerase

Gen mã hóa Pwo DNA polymerase được khuếch đại bằng phương pháp PCR

sử dụng khuôn plasmid PUC19-Pwo nhận từ công ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa

(PHUSA Biochem). Tiến hành phản ứng PCR theo thành phần như trong bảng 7.

Chu trình nhiệt độ cho phản ứng lần lượt với giai đoạn biến tính ban đầu 98oC/2

phút; 35 chu kỳ lặp lại của các bước biến tính 98oC/30 giây, gắn mồi 60oC/15 giây,

kéo dài 72oC/1 phút; giai đoạn kéo dài cuối cùng 72oC/5 phút.

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, chạy điện đi

100V, 30 phút. Bản gel được ngâm trong dung dịch chứa thuốc nhuộm ethidium

bromide (EtBr), soi gel dưới đèn UV và chụp ảnh bởi hệ thống camera AlphaImager

Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR nhân dòng gen mã hóa Pwo-pol

MINI (của Mỹ).

Nồng độ

Thể tích (µl)

Thành phần phản ứng

H2O pcr

Pwo-BamHI

10 µM

1.5

Pwo-EcoRI

10 µM

1.5

GC buffer

dNTPs

10 mM

2 U/µl

0.5

Phusion (Thermo)

1.5

Khuôn PUC19-Pwo

10 ng/µl

Σ

(2) Tạo plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo

Sản phẩm PCR đem thôi gel sử dụng bộ kit thôi gel/tinh sạch MEGAquick-

spin™ Total Fragment DNA Purification Kit của hãng iNtRon (Hàn Quốc) theo

hướng dẫn của nhà sản xuất.

Quy trình: tra toàn bộ thể tích sản phẩm PCR điện di trên gel agarose 1%,

chạy điện di 100V, 30 phút. Cắt lấy băng đúng kích thước khoảng 2344 bp theo lý

thuyết. Mảnh gel cắt ra có khối lượng không quá 0.3 g đem ủ với 500 µl dung dịch

đệm BNL, ở 56oC khoảng 10 phút. Trong thời gian ủ, cứ 3 phút đảo hỗn hợp một

lần cho đến khi mảnh gel tan hoàn toàn. Hỗn hợp đồng nhất thu được chuyển lên

cột, ly tâm 11000g/30s, đổ bỏ dịch qua cột. Bổ sung 700 µl dung dịch đệm Wash để

rửa các thành phần muối trong dung dịch đệm BNL còn bám trên cột, ly tâm

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

11000g/30s, đổ bỏ dịch rửa qua cột. Cột đem ly tâm khô ở tốc độ cao hơn

15000g/3’ để loại bỏ hoàn toàn cồn có trong dung dịch đệm rửa. Chuyển cột sang

ống epp 1.5 ml mới, ủ lên màng cột 40 µl nước deion khoảng 5-10’, đem ly tâm

15000 g/1 phút. Dung dịch trong ống epp chứa DNA và plasmid đã tinh sạch, được

bảo quản và sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.

Sản phẩm tinh sạch chứa đoạn gen đích và vector pEtM được xử lý với

enzyme cắt giới hạn theo thành phần liệt kê trong bảng 8, hỗn hợp được ủ ở 37oC

liên tục trong 2 tiếng, để thu được sản phẩm cắt hoàn toàn. Sau đó tiếp tục tinh sạch

theo quy trình của bộ kít thôi gel/tinh sạch MEGAquick-spin™ Total Fragment

DNA Purification Kit (iNtRon). Mẫu tinh sạch bao gồm 30 µl gen mã hóa Pwo

DNA polymerase và 30 µl plasmid (V) được trộn đều với 300 µl BNL buffer (5V),

rồi đưa hỗn hợp lên cột. Thu hồi hỗn hợp DNA và plasmid với 40 µl nước PCR

Bảng 8: Thành phần phản ứng cắt, nối gen và plasmid

trước khi đem sử dụng cho phản ứng nối như bên dưới:

Phản ứng cắt

Phản ứng nối

Pwo-DNA (V-µl)

pEtM-Plasmid (V-µl)

Thể tích (µL)

23,5

T4 ligase

H2O

Fast Digest Buffer (10X)

Ligate buffer (10X)

DNA/Plasmid

DNA+Plasmid

BamHI

EcoRI

1,5

Phản ứng nối diễn ra ở nhiệt độ phòng. Nên sau khi trộn đều các dung dịch, ủ ống

hỗn hợp ở nhiệt độ phòng (30oC) khoảng 2 tiếng. Sản phẩm sau khi nối được biến

nạp ngay vào tế bào vi khuẩn E. coli.

(3) Biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3)

Quy trình biến nạp sử dụng tế bào khả biến E. coli chủng BL21 (DE3), các

thao tác được thực hiện trong tủ an toàn sinh học và làm sạch bề mặt khu vực trước

khi thao tác bằng cồn 70o.

Chuẩn bị tế bào: lấy ống tế bào khả biến (100 µl) được bảo quản trong ni tơ

lỏng, để giã đông trên đá khoảng 20 phút. Chia 50 µl tế bào khả biến vào ống epp

1.5 ml đã được bổ sung thêm 20 µl sản phẩm nối DNA và plasmid, ủ hỗn hợp trên

đá 20 phút. Đem cả 2 ống tế bào sốc nhiệt ở 42oC/1 phút, lấy tế bào ra đặt trên đá 5

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

phút. Tiếp tục bổ sung vào 2 ống 600 µl LB lỏng, nuôi tĩnh ở 37oC/15 phút. Khi các

tế bào biến nạp đã ổn định thì chuyển các ống sang nuôi lắc ở 37oC/30 phút để tế

bào sinh trường.

Chuẩn bị đĩa thạch: môi trường LB agar, đĩa cấy đem khử trùng trước khi sử

dụng. Quay môi trường trong lò vi sóng đến khi dung dịch đồng nhất, lấy 30 ml LB

agar để nguội khoảng 40-50oC, bổ sung 30 µl ampicillin (100 mg/ml). Lắc đều dung

dịch, sau đó chia ra 2 đĩa cấy (15 ml/đĩa), để đông khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng.

Biến nạp: đem 2 ống tế bào ly tâm nhẹ khoảng 6000 rpm/phút trong 2 phút ở

nhiệt độ phòng để loại bớt khoảng 500 µl dịch nuôi cấy. Lượng dịch và vi khuẩn

còn lại trong ống trộn đều đem toàn bộ cấy trải trên đĩa thạch đã chuẩn bị. Đĩa thạch

nuôi cấy đem ủ 37oC qua đêm (16-18 tiếng).

(4) Tách dòng plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo

PCR kiểm tra khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo mọc lên từ đĩa

nuôi cấy chọn lọc bằng kháng sinh ampicilin. Chọn lọc 3-5 khuẩn lạc to, tròn đều

đem PCR kiểm tra, sử dụng cặp mồi T7 nằm ở 2 đầu của đoạn gen đích, T7-

promoter cách bộ ba mở đầu 23 aa, T7-terminator cách bộ ba kết thúc 40 aa. Thành

phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt độ tiến hành như phản ứng PCR nhân gen

Pwo DNA polymerase, nhiệt độ gắn mồi được tối ưu cho cặp mồi T7 là 55oC.

Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, chạy điện di 100 V, 30

phút. Theo lý thuyết, nếu khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp sẽ cho sản phẩm PCR

chứa đoạn gen có kích thước 2599 bp. Ngược lại nếu khuẩn lạc chứa vector không

chèn gen thành công sẽ cho sản phẩm PCR có kích thước 266 bp. Như vậy, sau khi

đã sàng lọc được khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp chèn gen thành công, đem nuôi

cấy và tách chiết plasmid.

Tách chiết plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo sử dụng bộ kit Thermo Science

GeneJET Plasmid Miniprep Kit theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất.

Quy trình: 5ml dịch nuôi cấy đem ly tâm 13000 rpm/2 phút, ở nhiệt độ

phòng. Đổ bỏ dịch nuôi cấy, thu cặn tế bào, bổ sung thêm 250 µl dung dịch đệm

Resuspension (có RNase), sau đó vortex cho tan cặn. Hỗn hợp dung dịch thu được

tiếp tục bổ sung 250 µl dung dịch đệm Lysis, đảo đều 4-6 lần hoặc vortex nhanh

cho dung dịch đồng nhất. Tiếp theo, bổ sung 350 µl dung dịch đệm Neutralization,

chú ý chỉ đảo đều 4-6 lần không vortex dung dịch tránh đứt gãy DNA. Lúc này,

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

dịch ly giải tế bào được cân bằng xuất hiện vẩn đục trắng đem ly tâm 13000 rpm/5

phút, ở nhiệt độ phòng. Thu lại phần dịch trong có chứa plasmid đưa lên cột, rồi ly

tâm 13000 rpm/1 phút. Cột tinh sạch được rửa với 500 µl đệm Wash để loại bỏ các

hóa chất thừa, muối, protein từ các bước tinh sạch trước đó. Trước khi thu lại

plasmid cần ly tâm khô khoảng 13000 rpm/3 phút. Chuyển cột sang ống epp 1.5 ml

mới, thêm 50 µl Elution, ủ 5-10 phút ở nhiệt độ phòng rồi ly tâm 13000 rpm/2 phút.

Plasmid tái tổ hợp thu được đem bảo quản ở -20oC cho các thí nghiệm tiếp theo.

(5) Giải trình tự kiểm tra khung đọc

Plasmid tái tổ hợp thu được sau quá trình tách chiết đem pha loãng từ 50-100

lần để sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR giải trình tự. Thực hiện phản ứng

PCR với khuôn plasmid sử dụng cặp mồi T7 tương tự như phản ứng PCR kiểm tra

khuẩn lạc mục (5).

Sản phẩm PCR được tinh sạch sử dụng bộ kít thôi gel/tinh sạch

MEGAquick-spin™ Total Fragment DNA Purification Kit (iNtRon) tương tự quá

trình tinh sạch sản phẩm cắt enzyme giới hạn ở bước trên. Mẫu tinh sạch đem gửi

và giải trình tự bởi công ty 1st base, Malaysia theo phương pháp Sanger, ứng dụng

bộ kít BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit với hệ thống phân tích ABI

PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer.

Kết quả giải trình tự sẽ được xử lý cắt bỏ phần nhiễu ở hai đầu, chú ý phần

đầu T7-promoter cần phải đọc được ít nhất bắt đầu từ đuôi 6xHis, và vị trí cắt

thrombin để chắc chắn trình tự được chèn đúng khung đọc mở. Các đoạn trình tự

Bảng 9: Trình tự các cặp mồi giải trình tự

sau đó được ghép nối dựa trên các vùng chồng gối lên nhau.

STT

Tên

Trình tự (5'-3')

Độ dài

Tm

T7-Promoter

TAATACGACTCACTATAGGG

20 bp

50.32

1

T7-Terminator

TGCTAGTTATTGCTCAGCGG

20 bp

58.06

2

iPwo-F

GACCTATACCCTGGAAGCGG

20 bp

59.52

3

iPwo-R

AATATATTTGCGGCCCCACG

20 bp

58.76

4

Do kích thước của đoạn gen Pwo DNA polymerase có thêm vùng T7 ở hai

đầu, lớn hơn 2500 bp, nên chúng tôi cần 2 cặp mồi như bảng 9 để giải được toàn bộ

đoạn gen.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

2.2.3. Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở E. coli

Nuôi khởi động 1 khuẩn lạc được chọn trong 10 ml LB lỏng có bổ sung

ampicilin (khoảng 16 tiếng). Sau đó, dòng vi khuẩn này được duy trì trong môi

trường nuôi cấy hoặc bảo quản bằng ni tơ lỏng trong thời gian kiểm tra mức độ biểu

hiện của protein tái tổ hợp.

Tối ưu nhiệt độ biểu hiện và nồng độ IPTG biểu hiện

đạt

Cấy chuyển dịch nuôi cấy khởi động sang các bình nhỏ chứa 5 ml môi

trường LB lỏng, nuôi lắc vi khuẩn đến ngưỡng sinh trưởng mạnh nhất, đo OD600

0.6. Các bình vi khuẩn được đánh dấu, ghi nhãn đem thử ở các điều kiện biểu hiện

khác nhau, thời gian biểu hiện đồng nhất 16 tiếng từ khi bắt đầu cho IPTG. Sau đó,

lần lượt so sánh các mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp ở nồng độ IPTG 0.1 mM

với 0.3 mM và mức độ khi biểu hiện ở nhiệt độ thường (25-30oC) với nhiệt độ 37oC

củaòng vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp.Cuối cùng, lựa chọn nhiệt độ tối ưu và

nồng độ IPTG thích hợp để biểu hiện protein Pwo DNA polymerase với lượng lớn.

Cấy chuyển vi khuẩn, nuôi lắc và biểu hiện tương tự như bước thử trong 1 lít môi

trường LB lỏng. Sau 16 tiếng biểu hiện, ly tâm dịch nuôi cấy bằng máy ly tâm tốc

độ cao để thu lấy tế bào vi khuẩn. Bảo quản tế bào thu được ở tủ -30oC, sử dụng cho

quá trình siêu âm, tinh sạch protein Pwo DNA polymerase tiếp theo.

Hình 9: Sơ đồ quá trình tinh sạch protein Pwo-pol

2.2.4. Tinh sạch protein Pwo DNA polymerase

a. Phá vỡ tế bào

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

Pwo DNA polymerase là một trong những loại enzyme sản xuất nội bào, nên

cần được giải phóng ra ngoài trước khi muốn thu hồi. Trong nghiên cứu này, chúng

tôi đã sử dụng kết hợp một vài phương pháp phá vỡ tế bào cho vi khuẩn gram âm E.

coli để giải phóng các protein tái tổ hợp ra ngoài dung dịch như:

Phương pháp siêu âm (ultrasound): sử dụng hệ thống máy siêu âm cung

cấp các xung năng lượng điện áp cao ở tần số 20 kHz, sau đó được chuyển đổi

thành các rung động cơ học. Rung động được khuếch đại, truyền xuống dọc theo

đầu dò (Ф 1 mm) với biên độ cài đặt 40%. Quá trình siêu âm có thể kéo dài từ 1- 2

tiếng, với chu kỳ liên tục sau 5 giây xung bật là 5 giây xung nghỉ.

Phương pháp gây sốc thẩm thấu (osmotic shock): tế bào tiếp xúc với dung

dịch đệm rửa (30 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) không chứa sucrose, nước sẽ

đi vào tế bào. Sau đó, sử dụng dung dịch đệm tương tự được bổ sung sucrose với

nồng độ cao khoảng 20-30% (g/ml).

Phương pháp ly giải nhiệt (thermolysis): được sử dụng phổ biến trong sản

xuất ở quy mô lớn. Protein gian màng (periplasmic proteins) của vi khuẩn gram âm

bị giải phóng khi các tế bào được làm nóng lên đến 50oC. Protein tế bào chất của E.

coli có thể được giải phóng hoàn toàn trong 10 phút ở 90oC. Trong nghiên cứu này,

các tế bào có thể được làm nóng từ 70oC trong 1 tiếng, hoặc 95oC liên tục trong 30

phút. Sau đó, hỗn hợp protein đem ủ trên đá 30 phút để hồi tính.

Có một điểm đặc biệt đáng lưu ý là khi đun nóng ở nhiệt độ cao, các protein

không có khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli có thể bị kết tủa, nên đây có thể

là một phương pháp được kết hợp để tinh sạch protein tái tổ hợp Pwo-pol và loại bỏ

các protein tạp từ E. coli.

b. Các phương pháp tinh sạch protein

Phương pháp (1): Tinh sạch sắc ký ái lực (6xHis-tag) với nickel

Tế bào vi khuẩn biểu hiện từ 100 ml môi trường đem hòa với 10 ml dung

dịch đệm A1 (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 5 mM Imidazole), tiến hành phá vỡ tế

bào theo cả 2 cách siêu âm và nhệt phân. Hỗn hợp dung dịch chứa tế bào bị phá vỡ

được ly tâm ở tốc độ cao 14000 rpm/30 phút ở 4oC, thu dịch ly tâm.

Cung cấp khoảng 1.5 ml NiCl2 50 mM lên cột, ủ 3-5 phút để Ni2+ gắn vào

hạt gel. Rửa cột với 3-5 ml dung dịch đệm A1, rồi đem ủ dịch ly tâm trên cột

khoảng 10 phút, thu dịch qua cột để điện di kiểm tra. Rửa cột nhiều lần và liên tục

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

với 50ml dung dịch đệm B1 (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 30 mM Imidazole). Nồng

độ imidazole trong bước rửa ở mức thấp, nhưng dễ dàng rửa trôi các protein không

chứa đuôi poly-histidine. Nếu protein tái tổ hợp khó tinh sạch, có thể tăng nồng độ

imidazole trong đệm B1 lên khoảng 60-100 mM.

Rút bỏ hòa toàn dung dịch có trong cột trước khi thu lại protein tái tổ hợp

bằng 4 ml đệm C1 (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazole). Nồng độ

imidazole trong đệm C1 rất cao đóng vai trò cạnh tranh với đuôi 6xHis liên kết với

nickel. Khi đó, nickel liên kết với imidazole tự do sẽ giải phóng protein tái tổ hợp ra

môi trường. Dịch qua cột chứa protein tái tổ hợp sẽ được tối ưu điều kiện bảo quản

và đánh giá hoạt tính.

Tái sử dụng resin bằng đệm TEN buffer (20 mM Tris, 100 mM EDTA, 500

mM NaCl, pH 8.0)

Phương pháp (2): Kết tủa ammonium sulfate

Tế bào vi khuẩn biểu hiện từ 100 ml môi trường đem hòa với 10 ml (V) dung

dịch đệm A2 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA), vortex tế bào trong 5 phút

rồi đem ly tâm, đổ bỏ dung dịch rửa. Tiếp tục hòa cặn tế bào với 10 ml (V) dung

dịch đệm B2 (50 mM Tris HCl, 20% sucrose, 1 mM EDTA), vortex dung dịch trong

10 phút để phá vỡ tế bào theo phương pháp sốc thẩm thấu. Để so sánh mức độ phá

vớ tế bào, làm tương tự các bước trên, thay đệm B2 thành đệm C2 (50 mM Tris

HCl, 300 mM NaCl), dùng máy siêu âm phá vỡ tế bào trong 2 tiếng. Ly tâm thu

dịch phá vỡ rồi bổ sung thêm muối ammonium sulfate với lượng từ 20-60% độ bão

hòa, ủ mẫu qua đêm ở 4oC. Ly tâm dung dịch thu tủa, hòa tủa với 1/5V dung dịch

đệm C2, để mẫu tan tự nhiên ở 4oC sau 10 phút.

c. Thẩm tách

Theo nguyên lý của sự khuếch tán, chúng tôi sử dụng màng thẩm tách có tính

chất bán thấm để làm giảm nồng độ muối và imdazole có trong hỗn hợp dung dịch

tinh sạch. Sau đó, chúng được thẩm tách trong dung dịch đệm có nồng độ muối thấp

hơn và không chứa imidazole (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl), ở 4oC.

Tùy vào lượng (thể tích, nồng độ) các chất trong hỗn hợp để sử dụng thể tích dung

dịch đệm thẩm tách tương ứng (tỉ lệ 1 hỗn hợp:20 đệm). Sau 7-8 tiếng thay đệm

thẩm tách một lần, liên tục thay đệm 3 lần.

d. Điện di gel SDS-PAGE

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

Các mẫu trong quá trình biểu hiện và tinh sạch protein Pwo DNA

polymerase được điện di kiểm tra trên gel SDS-PAGE thành phần như bảng 10,

chạy điện di 120V, 90 phút.

Bản gel được ngâm trong đệm nhuộm 30 phút, rồi chuyển sang ngâm trong

Bảng 10: Thành phần hóa chất đổ gel điện di SDS-PAGE

đệm tẩy 30 phút. Rửa lại bản gel, ngâm nước trước khi chụp ảnh phân tích.

Thành phần hóa chất

Gel tách (10%)

Gel cô (5%)

3.162 ml

1.687 ml

H2O

Acrylamide/Bis 30%

2.67 ml

0.5 ml

Tris HCl, 1M pH 8.8

2 ml

Tris HCl, 1M pH 6.8

0.75 ml

SDS 10%

80 µl

30 µl

APS 10%

80 µl

30 µl

TEMED

8 µl

3 µl

8 ml

3 ml

2.2.5. Xác định hoạt tính của protein Pwo DNA polymerase

a. Khả năng sao chép DNA trong in vitro

Protein Pwo DNA polymerase của vi khuẩn P. woesei là một enzyme có hoạt

tính xúc tác cho quá trình sao chép DNA. Để xác định protein tái tổ hợp Pwo DNA

polymerase có hoạt tính sau khi tinh sạch cần tiến hành phản ứng PCR trong ống

nghiệm với thành phần và điều kiện thích hợp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử

dụng plasmid và cặp mồi nhân đoạn gen AcrH kích thước khoảng 400 bp để xác

định hoạt tính của protein tái tổ hợp thu được. Thành phần phản ứng PCR xác định

Bảng 11: Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính nhân đoạn gen AcrH

hoạt tính như trong bảng 11:

Nồng độ

Thể tích (µl) 7.4

Thành phần phản ứng H2O pcr

AcrH-F

10 µM

0.3

AcrH-R

10 µM

0.3

Buffer PCR, pH 8.0

10X

dNTPs

10 mM

0.2

0.5

PwoMCB

Khuôn Duet-AcrH

10 ng/µl

0.3

Σ

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

Chu trình nhiệt tối ưu được sử dụng bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu 95oC/3

phút; 35 chu kỳ lặp lại của các bước biến tính 95oC/15 giây, gắn mồi 57oC/15 giây,

kéo dài 72oC/30 giây; giai đoạn kéo dài cuối cùng 72oC/5 phút.

b. Khả năng chịu nhiệt độ cao trong sao chép in vitro

Protein Pwo DNA polymerase có khả năng chịu nhiệt độ cao, đây là một

trong những đặc điểm nổi trội được chúng tôi tiến hành đánh giá. Kết quả được so

sánh với enzyme Taq DNA polymerse sản xuất thương mại để có kết luận chính xác

và đáng tin cậy. Vì vậy, các enzme cần đánh giá sẽ được heat nhiệt độ cao ở bước

biến tính đầu tiên trong chuỗi phản ứng PCR lên đến 98oC/5 phút. Các bước khác

tiến hành tương tự như một phản ứng PCR thông thường, sử dụng khuôn và mồi

nhân đoạn gen có kích thước nhỏ (khoảng 400 bp) như đã miêu tả ở trên.

c. Khả năng kéo dài chuỗi trong sao chép in vitro

Từ các phương pháp tinh sạch khác nhau, và quá trình tối ưu, protein Pwo

DNA polymerase được kiểm tra nếu có hoạt tính sao chép sẽ tiếp tục đánh giá khả

năng kéo dài chuỗi. Sử dụng plasmid và cặp mồi nhân đoạn gen KOD kích thước

Bảng 12: Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính nhân đoạn gen KOD

khoảng hơn 2 kb với thành phần phản ứng lần lượt như trong bảng dưới đây:

Thành phần phản ứng

Nồng độ

Thể tích (µl)

7.4

H2O pcr

KOD-F

10 µM

0.3

KOD-R

10 µM

0.3

Buffer PCR, pH 8.0

10X

dNTPs

10 mM

0.2

0.5

PwoMCB

0.3

Khuôn pEtM-KOD

10 ng/µl

Σ

Chu trình nhiệt được sử dụng cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen này bao gồm

giai đoạn biến tính ban đầu 95oC/3 phút; 35 chu kỳ lặp lại của các bước biến tính

95oC/15 giây, gắn mồi 55oC/15 giây, kéo dài 72oC/2 phút; giai đoạn kéo dài cuối

cùng 72oC/5 phút.

d. Khả năng sao chép in vitro khi có mặt chất ức chế

Protein Pwo DNA polymerase thu được từ các phương pháp tinh sạch khác

nhau cũng được đánh giá khả năng sao chép khi có mặt các chất ức chế. Trong

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

nghiên cứu này chúng tôi sử dụng mẫu DNA genome từ mô động vật, tách chiết

theo phương pháp phenol-chlorophom cho các phản ứng PCR thử hoạt tính này.

Một phần đoạn gen COI được khuếch đại với cặp mồi universal VF1d/VR1d. Thành

phần phản ứng và chu kỳ nhiệt tương tự như một phản ứng PCR thông thường, sử

dụng khuôn và mồi nhân đoạn gen AcrH có kích thước khoảng 400 bp như đã miêu

tả ở mục 2.26-a.

e. Tối ưu thành phần buffer PCR và buffer bảo quản

Chúng tôi mong muốn thu được một lượng lớn protein có nồng độ cao,

không lẫn các protein tạp khác. Tuy nhiên khi protein ở nồng độ cao thường dễ bị

kết tủa. Với điều kiện phòng thí nghiệm thông thường chỉ có thể bảo quản mẫu ở

nhiệt độ -20oC đến -30oC. Vì vậy, protein tái tổ hợp sau tinh sạch đem cần bảo quản

Bảng 13: Thành phần buffer bảo quản protein Pwo-pol

trong glycerol có bổ sung một số thành phần giúp làm ổn định hoạt tính của protein.

Storage buffer

Tris-HCl [mM]

KCl [mM]

EDTA [mM]

DTT [mM]

Tween 20 (v/v)

NP40 (v/v)

Glycerol (v/v)

20, pH7.5

100

0,1

0.5%

50%

Pwo, Roche

20, pH8.0

0.5%

50%

100

MCB v2

0,1 Chú ý: protein Pwo DNA polymerase sau khi thẩm tách được bổ sung ngay các thành phần bảo quản tương ứng như trong bảng.

Bảng 14: Thành phần 10X buffer PCR tối ưu hoạt tính của protein Pwo-pol

10X buffer PCR

Tris-HCl [mM]

KCl [mM]

(NH4)2SO4 [mM]

MgSO4 [mM]

Triton X (v/v)

BSA [mg/ml]

200

100

pH 7.5 v1

200

100

pH 8.0 v1

200

100

pH 8.8 v1

200

250

100

pH 8.8 v2

Chúng tôi đã tham khảo thành phần buffer cho DNA polymerase từ các nghiên cứu

trước đây và đem so sánh với các hãng enzyme thương mại để chọn ra được một số

buffer phù hợp như trong bảng 13; 14. Các buffer bảo quản và một số phiên bản

khác nhau của buffer PCR sử dụng để tối ưu cho phản ứng PCR trong nghiên cứu

này, được ký hiệu là buffer MCB.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Bảng 15: Phân tích sử dụng codon của gen mã hóa Pwo DNA polymerase

3.1. Phân tích gen mã hóa Pwo DNA polymerase tái tổ hợp

Codon

Số lượng

Codon

Số lượng

Tỉ lệ

aa

Tỉ lệ

aa

UUU

1.93

AAC

Phe

Asn

UUC

0.07

AAA

1.8

Lys

CUG

AAG

0.2

Leu

AUU

2.62

GAU

1.95

Ile

Asp

AUC

0.38

GAC

0.05

AUG

GAA

1.98

Met

Glu

GUG

GAG

0.02

Val

CCG

UGC

Pro

Cys

ACC

UGG

Thr

Trp

GCG

CGU

0.13

Ala

Arg

UAU

1.91

CGC

5.87

Tyr

UAC

0.09

AGC

Ser

CAU

1.86

GGC

His

Gly

CAC

0.14

UAA

TER

CAG

Gln

Theo thống kê, trình tự 775 acid amin của Pwo-pol gồm 20 loại acid amin

khác nhau không kể codon kết thúc (như bảng 15). Trong đó, leucine, isoleucine,

valine là loại acid amin mạch nhánh (BACC) chiếm số lượng lớn mỗi loại (>50 aa).

Nên khi gen được biểu hiện quá trong tế bào, có thể gây độc cho tế bào như các

nghiên cứu trước đã chỉ ra [6]. Do đó, đồng loạt 3 loại acid amin này đã được tối ưu

sử dụng hầu hết các mã codon CUG cho Leu; AUU, AUC cho Ile; GUG cho Val.

Ban đầu, gen mã hóa Pwo-pol đã sử dụng tổng số 57 mã codon (trừ codon

CCG cho proline, CGC, CGA, CGG cho arginie) trong trình tự. Kết quả tối ưu từ

phần mềm thu được trình tự gen mới chỉ sử dụng 28 mã codon cho 20 loại acid

amin trên (bảng 15). Các chỉ số tối ưu khác của gen mã hóa Pwo-pol thu được từ

phần mềm: chỉ số thích ứng codon CAI = 0.94; tỉ lệ GC = 48.4%. Các chỉ số này

đều tăng so với trình tự gen ban đầu: CAI = 0.38; tỉ lệ GC = 39.3%.

Quá trình tối ưu này đã loại bỏ ít nhất 7 codon hiếm ở E. coli là AGG, AGA,

CGA, CGG cho arginine; AUA cho isoleucine; CUA cho leucine, và CCC cho

proline. Các codon này được cho rằng có thể làm giảm số lượng và chất lượng

protein được tổng hợp [18]. Các codon hiếm có thể đóng vai trò quan trọng trong

việc hình thành các cấu trúc thứ cấp RNA đặc biệt cho sự ổn định và tương tác với

ribosome, giúp gấp nếp protein khi kết thúc dịch mã.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

3.2. Nhân dòng vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase

Hình 10: Khuếch đại gen mã hóa Pwo-pol và xử lý enzyme cắt giới hạn Kết quả điện di trên gel agarose 1%, a- sản phẩm PCR nhân dòng gen mã hóa Pwo DNA polymerase sử dụng cặp mồi chứa vị trí cắt enzyme giới hạn, marker 1kb của hãng iNtRon (đường chạy 1) được sử dụng để so sánh kích thước của gen Pwo khuếch đại (đường chạy 2); b- Sản phẩm cắt đồng thời plasmid pEtM (đường chạy 1;2) và gen mã hóa Pwo DNA pol (đường chạy 4;5) bằng hai enzyme cắt giới hạn EcoRI và BamHI so sánh với marker 1 kb của hãng iNtRon (đường chạy 3).

3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp pEtM-Pwo

Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 10a) cho thấy đã nhân dòng chính xác

được đoạn gen mã hóa Pwo DNA polymerase. Sản phẩm nhân gen thể hiện một

băng sáng rõ có kích thước khoảng 2344 bp theo lý thuyết. Tuy nhiên, kết quả PCR

cũng cho thấy một số băng phụ phía trên băng chính (khoảng 4-5 kb). Vì vậy, sản

phẩm PCR đã được thôi gel trước khi sử dụng cho phản ứng cắt enzyme giới hạn.

Tiếp tục đánh giá kết quả kiểm tra cắt gen và plasmid với cả 2 enzyme cắt

giới hạn EcoRI và BamHI được điện di trên gel agarose 1% (hình 10b). Plasmid

pEtM trước khi cắt bao gồm các băng chính sáng rõ tương ứng với các dạng của

plasmid (xoắn, vòng và siêu xoắn). Plasmid sau khi cắt với enzyme giới hạn thu

được 1 băng sáng với kích thước khoảng 6 kb tương ứng với kích thước được mở

vòng. Do đó, enzyme đã cắt chính xác tại các vị trí cắt giới hạn mong muốn trên

vector biểu hiện. Tuy nhiên plasmid có thể chưa được cắt hoàn toàn do vẫn quan sát

thấy một băng mờ ở phía dưới băng plasmid cắt (đường chạy 1). Mặt khác, đoạn

gen trước và sau khi cắt đã thu được kích thước bằng nhau từ kết quả điện di này.

Điều này chứng tỏ đoạn gen đã được cắt đúng vị trí cắt giới hạn ở 2 đầu, cũng như

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

đoạn gen không chứa vị trí cắt bên trong. Vì vậy có thể tiến hành phản ứng nối bình

thường cho gen và plasmid, tạo plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo.

Hình 11: Biến nạp, nuôi cấy, chọn lọc plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo a- Tế bào khả biến E. coli BL21 (DE3) bổ sung plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo cấy trải trên đĩa thạch bổ sung ampicilin. b- Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR chọn lọc khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo, marker 1kb của hãng iNtRon (đường chạy 1) được sử dụng để so sánh kích thước của đoạn gen khuếch đại bằng cặp mồi T7 từ 3 khuẩn lạc tương ứng (đường chạy 2; 3; 4).

3.2.2. Biến nạp vector tái tổ hợp pEtM-Pwo vào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3)

Đĩa thạch nuôi cấy tế bào khả biến có xuất hiện nhiều khuẩn lạc mọc cách

đều nhau như hình 11a. Như vậy, đã biến nạp thành công hỗn hợp plasmid tái tổ

hợp vào vi khuẩn E. coli. Kết quả biến nạp là đáng tin cậy khi đã được so sánh với

đĩa đối chứng không bổ sung hỗn hợp plasmid tái tổ hợp, không quan sát thấy

khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Như vậy tế bào khả biến sử dụng trong quá trình biến

nạp không bị nhiễm gen hoặc plasmid kháng kháng sinh.

Tuy nhiên khuẩn lạc mọc trên đĩa nuôi cấy bổ sung kháng sinh ampicilin (10

µg/ml) có thể xảy ra 2 trường hợp: (1) chứa plasmid tái tổ hợp hoặc (2) chứa

plasmid chưa cắt hoàn toàn từ hỗn hợp sản phẩm cắt và nối enzyme giới hạn ở trên.

Do đó, tiến hành chọn lựa 3 khuẩn lạc từ đĩa nuôi cấy, các khuẩn lạc mọc riêng rẽ,

to, tròn đều sẽ được đem PCR kiểm tra hiệu suất chèn gen của phản ứng cắt nối.

Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn lạc được chọn cho thấy,

khuẩn lạc số 2 và 3 có mang plasmid tái tổ hợp được chèn thành công đoạn gen mã

hóa Pwo-pol (hình 11b). Sản phẩm PCR từ hai khuẩn lạc này xuất hiện các băng có

kích thước khoảng gần 3 kb được so sánh với các băng marker. Kết quả này là đúng

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

với lý thuyết đoạn gen đích được nhân lên từ cặp mồi T7 cho kích thước là 2599 bp.

Trong khi đó, khuẩn lạc số 1 mang plamid chưa chèn thành công đoạn gen đích, với

cặp mồi T7 chỉ nhân lên sản phẩm PCR với kích thước khoảng hơn 250 bp.

Hình 12: Tách chiết và kiểm tra plasmid tái tổ hợp Kết quả điện di trên gel agarose 1% plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo sau khi tách chiết (đường chạy 2) và đoạn gen đích được khuếch đại bằng cặp mồi T7 với các nồng độ khuôn plasmid khác nhau (đường chạy 3; 4; 5), đối chứng âm là phản ứng không bổ sung khuôn plasmid (đường chạy 6). Kích thước được so sánh với marker 1 kb của iNtRon (đường chạy 1)

3.2.3. Tách plasmid, kiểm tra trình tự

Plasmid tái tổ hợp thu được theo như kết quả điện di bao gồm hai băng rõ nét

có kích thước khoảng 3 kb tương ứng với dạng siêu xoắn và 8 kb tương ứng với

dạng vòng của plasmid. Các kích thước của plasmid thu được hoàn toàn phù hợp

với lý thuyết sau khi chèn thành công đoạn gen mã hóa Pwo-pol hơn 2 kb vào

vector pEtM có kích thước khoảng 6 kb. Vì vậy, chúng tôi đã tách chiết thành công,

thu được plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo.

Plasmid tái tổ hợp thu được đã được chèn gen chính xác bởi phản ứng kiểm

tra PCR bằng cặp mồi T7. Với cả 3 nồng độ khuôn plasmid sử dụng trong phản ứng

PCR đều cho kết quả là một băng điện di duy nhất có kích thước khoảng 2599 bp

theo lý thuyết. Kết quả PCR kiểm tra là đáng tin cậy khi so sánh với đối chứng âm

không lên băng tương ứng.

Do đó, sản phẩm PCR thu được từ thí nghiệm có băng sáng rõ, không chứa

băng phụ đã được tinh sạch và gửi giải trình tự. Kết quả kiểm tra sự ghép nối chính

xác gen Pwo vào khung đọc mở chứa đuôi 6xHis-tag và trình tự cắt thrombin của

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

plasmid pEtM như phân tích bên dưới. Dữ liệu phân tích trình tự acid amin này cho

thấy không có sự xuất hiện của các đột biến thay thế hoặc chèn sai khung đọc mở

P.woesei ---------------MILDVDYITEEGKPVIRLFKKENGKFKIEHDRTFRPYIYALLRDD Pwo-tái tổ hợp MHHHHHHSSGLVPRGSILDVDYITEEGKPVIRLFKKENGKFKIEHDRTFRPYIYALLRDD ******************************************** P.woesei SKIEEVKKITGERHGKIVRIVDVEKVEKKFLGKPITVWKLYLEHPQDVPTIREKVREHPA Pwo-tái tổ hợp SKIEEVKKITGERHGKIVRIVDVEKVEKKFLGKPITVWKLYLEHPQDVPTIREKVREHPA ************************************************************ P.woesei VVDIFEYDIPFAKRYLIDKGLIPMEGEEELKILAFDIETLYHEGEEFGKGPIIMISYADE Pwo-tái tổ hợp VVDIFEYDIPFAKRYLIDKGLIPMEGEEELKILAFDIETLYHEGEEFGKGPIIMISYADE ************************************************************ P.woesei NEAKVITWKNIDLPYVEVVSSEREMIKRFLRIIREKDPDIIVTYNGDSFDFPYLAKRAEK Pwo-tái tổ hợp NEAKVITWKNIDLPYVEVVSSEREMIKRFLRIIREKDPDIIVTYNGDSFDFPYLAKRAEK ************************************************************ P.woesei LGIKLTIGRDGSEPKMQRIGDMTAVEVKGRIHFDLYHVITRTINLPTYTLEAVYEAIFGK Pwo-tái tổ hợp LGIKLTIGRDGSEPKMQRIGDMTAVEVKGRIHFDLYHVITRTINLPTYTLEAVYEAIFGK ************************************************************ P.woesei PKEKVYADEIAKAWESGENLERVAKYSMEDAKATYELGKEFLPMEIQLSRLVGQPLWDVS Pwo-tái tổ hợp PKEKVYADEIAKAWESGENLERVAKYSMEDAKATYELGKEFLPMEIQLSRLVGQPLWDVS ************************************************************ P.woesei RSSTGNLVEWFLLRKAYERNEVAPNKPSEEEYQRRLRESYTGGFVKEPEKGLWENIVYLD Pwo-tái tổ hợp RSSTGNLVEWFLLRKAYERNEVAPNKPSEEEYQRRLRESYTGGFVKEPEKGLWENIVYLD ************************************************************ P.woesei FRALYPSIIITHNVSPDTLNLEGCKNYDIAPQVGHKFCKDIPGFIPSLLGHLLEERQKIK Pwo-tái tổ hợp FRALYPSIIITHNVSPDTLNLEGCKNYDIAPQVGHKFCKDIPGFIPSLLGHLLEERQKIK ************************************************************ P.woesei TKMKETQDPIEKILLDYRQKAIKLLANSFYGYYGYAKARWYCKECAESVTAWGRKYIELV Pwo-tái tổ hợp TKMKETQDPIEKILLDYRQKAIKLLANSFYGYYGYAKARWYCKECAESVTAWGRKYIELV ************************************************************ P.woesei WKELEEKFGFKVLYIDTDGLYATIPGGESEEIKKKALEFVKYINSKLPGLLELEYEGFYK Pwo-tái tổ hợp WKELEEKFGFKVLYIDTDGLYATIPGGESEEIKKKALEFVKYINSKLPGLLELEYEGFYK ************************************************************ P.woesei RGFFVTKKRYAVIDEEGKVITRGLEIVRRDWSEIAKETQARVLETILKHGDVEEAVRIVK Pwo-tái tổ hợp RGFFVTKKRYAVIDEEGKVITRGLEIVRRDWSEIAKETQARVLETILKHGDVEEAVRIVK ************************************************************ P.woesei EVIQKLANYEIPPEKLAIYEQITRPLHEYKAIGPHVAVAKKLAAKGVKIKPGMVIGYIVL Pwo-tái tổ hợp EVIQKLANYEIPPEKLAIYEQITRPLHEYKAIGPHVAVAKKLAAKGVKIKPGMVIGYIVL ************************************************************ P.woesei RGDGPISNRAILAEEYDPKKHKYDAEYYIENQVLPAVLRILEGFGYRKEDLRYQKTRQVG Pwo-tái tổ hợp RGDGPISNRAILAEEYDPKKHKYDAEYYIENQVLPAVLRILEGFGYRKEDLRYQKTRQVG ************************************************************ P.woesei LTSWLNIKKS Pwo-tái tổ hợp LTSWLNIKKS **********

Hình 13: So sánh trình tự amino acid của gen mã hóa Pwo DNA polymerase Các trình tự amino acid kí hiệu P. woesei (tương ứng cho Pwo-pol trong tự nhiên) và Pwo- tái tổ hợp (tương ứng trong thí nghiệm) được dóng hàng bằng phần mềm ClustalW online. Đuôi peptide chứa 6 histidine (màu đỏ), và trình tự cắt gồm 6 acid amin của thrombin (màu xanh). Dấu “*” thể hiện sự tương đồng giữa các acid amin của hai trình tự.

của đoạn gen đích trong quá trình nhân dòng và biến nạp.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

Hình 14: Biểu hiện protein DNA polymerase ở E. coli Đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2: mẫu đối chứng không bổ sung IPTG, đường chạy 3: mẫu vi khuẩn nuôi biểu hiện ở 25oC trong 16h, đường chạy số 4; 5: mẫu vi khuẩn nuôi biểu hiện ở 37oC trong 16h. Các mẫu biểu hiện điện di trên gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút.

3.3. Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở vi khuẩn E. coli

Kết quả tối ưu biểu hiện protein Pwo-pol với các nồng độ IPTG ở nhiệt độ

khác nhau được chỉ ra như hình 14. Cả ba mẫu biểu hiện với IPTG (0.1 mM hoặc

0.3 mM ở 37oC hoặc 25oC) đều cho băng biểu hiện kích thước khoảng trên 92 kDa

theo lý thuyết. Các kết quả biểu hiện là đáng tin cậy khi so sánh với các đường chạy

đối chứng (không có IPTG), thấy không có sự biểu hiện protein. Chứng tỏ chất cảm

ứng IPTG đã kích hoạt quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp Pwo-pol như mong

muốn. Tiếp tục so sánh kết quả biểu hiện protein Pwo-pol ở cùng nồng độ IPTG 0.3

mM, thấy có sự khác biệt khi biểu hiện protein ở nhiệt độ 37oC mức độ biểu hiện

cao hơn ở nhiệt độ phòng (25-30oC). Như vậy, ở nồng độ IPTG 0.1 - 0.3 mM và

nhiệt độ 37oC là tối ưu nhất cho khả năng biệu hiện của protein Pwo-pol ở tế bào vi

khuẩn E. coli BL21 (DE3).

3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase

Pwo DNA polymerase tái tổ hợp là một protein có kích thước lớn khoảng 92

kDa. Và việc tinh sạch một protein có kích thước lớn như vậy sẽ gặp phải một số

khó khăn. Do đó, chúng tôi đã thử nghiệm một số quy trình tinh sạch cho protein

này như: tinh sạch sắc ký ái lực, tinh sạch sắc ký ái lực kết hợp nhiệt độ cao giúp

loại bỏ protein của E. coli và phương pháp kết tủa AS.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

3.4.1. Phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực nickel

Dưới đây là kết quả so sánh sự phá vỡ tế bào khi có sự kết hợp phương pháp

siêu âm với nhiệt độ cao. Bước đầu đánh giá khả năng tinh sạch của các phương

Hình 15: So sánh sự phá vỡ tế bào với nhiệt độ cao Mẫu vi khuẩn biểu hiện ở nồng độ IPTG 0.3 mM/16h được siêu âm phá vỡ tế bào, sau đó xử lý nhiệt tương ứng. Ở đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2: dịch siêu âm sau khi ly tâm, không xử lý nhiệt, đường chạy số 3; 4 cặn phá vỡ tế bào thu được sau khi siêu âm kết hợp xử lý với nhiệt độ lần lượt 70oC và 95oC, đường chạy số 5; 6 dịch phá vỡ tế bào sau khi siêu âm kết hợp xử lý nhiệt độ lần lượt 70oC và 95oC. Các mẫu protein được điên di trên gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút.

pháp khác nhau.

Pwo-pol có nguồn gốc từ vi khuẩn Cổ ưa nhiệt, độ bền ít nhất là 2h ở 100oC.

Do đó, chúng tôi tiến hành xử lý tế bào ở nhiệt độ cao khoảng từ 70-95oC trước khi

tinh sạch. Kết quả được so sánh với mẫu tế bào không xử lý nhiệt (mẫu tế bào siêu

âm trên đá lạnh). Tuy nhiên, khi thử mẫu với nhiệt độ cao trong thời gian dài có thể

làm giảm hoạt tính của protein thu được sau tinh sạch [15]. Nên chúng tôi đã thực

hiện xử lý tế bào với nhiệt độ 70oC tối đa 1h ủ mẫu liên tục, còn với nhiệt độ 95oC

tối đa là 30 phút liên tục. Kết quả đáng chú ý, mức độ loại bỏ các protein của E. coli

trong dịch phá vỡ tế bào biểu hiện tăng dần theo nhiệt độ: trên đá lạnh < 70oC <

95oC. Từ kết quả này, tiếp tục tối ưu phương pháp tinh sạch với cột sắc ký ái lực

nilel để loại bỏ những protein không có gắn đuôi 6xHis-tag.

a. Sử dụng mẫu tế bào biểu hiện được phá vỡ bằng sóng siêu âm

Trong quy trình này, chúng tôi tiến hành tất cả các thao tác trên đá lạnh, đảm

bảo protein không bị biến tính, hay ảnh hưởng khác bởi nhiệt độ.

Hình 16: Mẫu siêu âm phá vỡ tế bào tinh sạch sắc ký ái lực a- Quy trình tinh sạch sắc ký ái lực sử dụng máy siêu âm phá vỡ tế bào, đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; 3 lần lượt là mẫu đối chứng không có IPTG và mẫu biểu hiện IPTG 0.3 mM, đường chạy 4; 5 lần lượt là cặn và dịch siêu âm phá vỡ tế bào, đường chạy 6: dịch qua cột sau khi ủ mẫu với nickel, đường chạy 7: dịch tinh sạch chứa protein Pwo-pol. b- Tối ưu quy trình tinh sạch hình a bằng cách tăng nồng độ imidazol trong đệm rửa, đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; 3; 4; tương ứng là đệm rửa 1 (30 mM imidazole), đệm rửa 2 (60 mM imidazole), đệm rửa 3 (100 mM imidazole), đường chạy 5: mẫu được tinh sạch sau khi sử dụng cả 3 loại đêm rửa. Các mẫu protein được điên di trên gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

Kết quả điện di quy trình tinh sạch sắc ký ái lực sử dụng máy siêu âm phá vỡ

tế bào (hình 16a) chỉ ra mẫu sử dụng trong tinh sạch là mẫu biểu hiện IPTG 0.3

mM. Trong đó, băng protein biểu hiện có kích thước khoảng 92 kDa chỉ có ở mẫu

biểu hiện khi so sánh với mẫu đối chứng. Thêm vào đó, lượng protein Pwo-pol vẫn

còn nhiều trong cặn phá vỡ bằng máy siêu âm khi so sánh với dịch phá vỡ thu được.

Do đó, cần tiếp tục tối ưu quá trình phá vỡ tế bào để hiệu suất protein tái tổ hợp thu

được cao hơn. Dịch tinh sạch protein tái tổ hợp thu được có độ tinh sạch kém. Hầu

hết các protein của E. coli vẫn chưa được loại bỏ, chỉ một lượng nhỏ protein không

bám với nickel đã đi qua cột. Vì vậy, các protein tạp này có thể có khả năng liên kết

với nickel nên cần tối ưu thêm bước rửa như tăng nồng độ imidazole trong đệm rửa.

Kết quả tối ưu bước rửa các protein tạp của E. coli trong phương pháp tinh

sạch với cột sắc lý ái lực (hình 16b) không đạt hiệu quả như mong muốn. Khi tăng

nồng độ imdazole trong dung dịch đệm rửa từ 30 mM lên 60mM và 100mM, lượng

protein tái tổ hợp đã bị rửa trôi nhiều hơn. Trong khi đó, lượng protein tạp bị rửa

trôi không đáng kể. Điều này chứng tỏ có khả năng các protein đã liên kết với nhau

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

và liên kết với protein tái tổ hợp. Vì vậy, chúng đã được giữ lại trên cột cùng với

protein tái tổ hợp.

b. Sử dụng mẫu tế bào biểu hiện được phá vỡ bằng sóng siêu âm kết hợp xử lý

Hình 17: Tinh sạch sắc ký ái lực kết hợp xử lý ở nhiệt độ 70oC Đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; 3 lần lượt là mẫu đối chứng không có IPTG và mẫu biểu hiện IPTG 0.3 mM, đường chạy 4; 6 lần lượt là cặn và dịch siêu âm phá vỡ tế bào xử lý với nhiệt độ 70oC, đường chạy 5; 7 lần lượt là cặn và dịch siêu âm phá vỡ tế bào, đường chạy 8: dịch qua cột sau khi ủ mẫu với nickel, đường chạy 9: dịch tinh sạch chứa protein Pwo-pol, đường chạy 10: rửa cột với nước. Các mẫu protein được điên di trên gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút.

ở nhiệt độ 70oC

Kết quả điện di mẫu tinh sạch protein Pwo-pol bằng phương pháp sắc ký ái

lực kết hợp ủ hỗn hợp siêu âm ở 70oC/1h vẫn chưa loại bỏ được các protein không

mong muốn. Kết quả cho thấy, lượng protein Pwo-pol còn lại ở cặn phá vỡ ở 70oC

ít hơn ở cặn siêu âm và dịch phá vỡ ở 70oC lại chứa nhiều hơn ở dịch siêu âm. Do

đó, khả năng ly giải tế bào giải phóng protein tái tổ hợp ở 70oC là hiệu quả hơn so

với chỉ siêu âm phá vỡ tế bào. Thêm vào đó, lượng protein tạp trong dịch đun nóng

70oC lại được giảm đi so với trong dịch siêu âm. Kết quả này chứng tỏ việc đun

nóng đã giúp loại bỏ được protein tạp. Tuy nhiên, mức độ tinh sạch protein Pwo-pol

vẫn chưa được cải thiện so với quy trình tiến hành trước đó.

c. Sử dụng mẫu tế bào biểu hiện được phá vỡ bằng sóng siêu âm kết hợp xử lý

ở nhiệt độ 95oC

Hình 18: Tinh sạch sắc ký ái lực kết hợp xử lý ở nhiệt độ 95oC Đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; 3 lần lượt là mẫu đối chứng không có IPTG và mẫu biểu hiện IPTG 0.3 mM, đường chạy 4; 5 lần lượt là cặn và dịch siêu âm phá vỡ tế bào xử lý với nhiệt độ 95oC, đường chạy 6: dịch qua cột sau khi ủ mẫu với nickel, đường chạy 7: dịch tinh sạch chứa protein Pwo-pol, đường chạy 8: rửa cột với nước. Các mẫu protein được điên di trên gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

Quá trình xử lý mẫu với nhiệt độ cao lên đến 95% đã mang lại hiệu quả khi

loại bỏ phần lớn protein tạp của vi khuẩn E. coli. Như kết quả điện di hình 18, phần

lớn protein Pwo-pol đã nằm trong pha dịch. Độ tinh sạch của mẫu protein thu được

khá cao, hiệu suất thu hồi protein tái tổ hợp đạt trên 50%. Bên cạnh đó, tế bào biểu

hiện khi được xử lý với nhiệt độ cao 95oC trong thời gian 30 phút cũng dễ dàng giải

phóng protein Pwo-pol mà không cần tiến hành bước siêu âm phá vỡ tế bào. Đây là

một trong những điều kiện giúp có thể tinh sạch protein Pwo-pol tái tổ hợp nhanh

chóng và dễ dàng hơn.

Mặc dù đã tiến hành đun nóng tế bào ở nhiệt độ 95oC liên tục trong 30 phút

nhưng vẫn không thể loại bỏ hoàn toàn các protein tạp khác. Vấn đề tồn tại này

trong quá trình tinh sạch protein DNA polymerase được cho là có sự tương tác giữa

các protein tham gia vào bộ máy sao chép DNA cũng như sự liên kết giữa chúng

với các protein khác [27]. Do đó, khi protein Pwo-pol được giữ lại trên cột thì các

protein này cũng được giữ lại. Vì vậy, cách giải quyết có thể sử dụng một số muối

có khả năng gây biến tính tạm thời cho protein, làm giảm khả năng liên kết giữa

chúng. Một số nghiên cứu trước đây đã sử dụng muối ammonium sulfate (AS) để

tinh sạch với Taq-pol hoặc Pfu-pol và thu được những kết quả tốt.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

3.4.2. Phương pháp tinh sạch kết tủa bằng muối ammonium sulfate

Tinh sạch protein Pwo DNA polymerase bằng phương pháp kết tủa AS được

thực hiện nhằm khắc phục vấn đề chưa tinh sạch được protein bằng phương pháp

Hình 19: Tinh sạch bằng kết tủa muối AS bão hòa ở 4oC Đường chạy 1-6 tương ứng với dịch siêu âm phá vỡ tế bào được bổ sung muối AS có nồng độ lần lượt từ 20-60%. Đường chạy 7-11 tương ứng với dịch phá vỡ tế bào bằng sucrose được bổ sung muối AS có nồng độ lần lượt từ 20-60%.

cột sắc ký ái lực Nickel-resin.

Như trong phần tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực đã cho

thấy, khả năng ly giải tế bào bằng sóng siêu âm không hiệu quả bằng phương pháp

đun nóng. Ở phương pháp tinh sạch protein bằng kết tủa với muối (NH4)2SO4 chúng

tôi tiếp tục so sánh dịch phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm với phương pháp sốc thẩm

thấu (có nồng độ sucrose cao). Đem 2 dung dịch này kết tủa với muối (NH4)2SO4

nồng độ từ 20-60% (hình 19), thì lượng protein kết tủa từ dịch phá vỡ bằng sucrose

nhiều hơn so với dịch siêu âm. Kết quả này có thể do trong dịch siêu âm có muối

NaCl với nồng độ cao, độ phân cực tốt, nên đã hạn chế khả năng tủa của muối

(NH4)2SO4 của protein. Tuy nhiên, với phương pháp này, vẫn chưa tinh sạch được

protein tái tổ hợp. Hơn nữa, phương pháp tốn nhiều thời gian để tối ưu do khả năng

tủa bằng muối (NH4)2SO4 có thể bị ảnh hưởng bởi các thành phần trong dung dịch

ly giải. Hầu như tất cả các protein đều bị tủa trong dải nồng độ 20-60% độ muối

(NH4)2SO4 bão hòa.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

3.5. Xác định hoạt tính của protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase

Hình 20: Ảnh hưởng của pH đến sự ổn định của buffer PCR Hàng trên: Sản phẩm nhân gen kích thước nhỏ của các protein Pwo-pol tái tổ hợp từ phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực. Hàng dưới: Sản phẩm nhân gen kích thước lớn của các protein Pwo-pol tái tổ hợp từ phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực. Các protein theo thứ tự lần lượt là Pwo-pol tinh sạch sắc ký ái lực, Pwo-pol tinh sạch sắc ký ái lực sau khi xử lý ở nhiệt độ 70oC, Pwo-pol tinh sạch sắc ký ái lực sau khi xử lý ở nhiệt độ 95oC. Đường chay 1: marker iNtRon, đường chạy 2; 3; 4: phản ứng PCR với buffer pH 7.5, đường chạy 5; 6; 7: phản ứng PCR với buffer pH 8.0, đường chạy 8; 9; 10: phản ứng PCR với buffer pH 8.8. Kết quả điện di trên gel agrose 1%, 100V, 30 phút.

3.5.1. Tối ưu thành phần buffer PCR

Theo các nghiên cứu trước đây, pH là một trong những yếu tố quan trọng

nhất ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của mỗi loại enzyme DNA-pol. Thông

thường các enzyme nhóm DNA-polB có hoạt động tốt trong dải pH từ 8.0 – 9.0

[22]. Do đó, chúng tôi đã thử hoạt tính của enzyme với 3 loại buffer PCR có pH lần

lượt là 7.5; 8.0; và 8.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen AcrH như hình 20

cho thấy protein Pwo-pol tinh sạch bằng quy trình sắc ký ái lực chỉ có hoạt tính ở

10X buffer, pH 8.0. Trong khi đó, cả 2 protein Pwo-pol được tinh sạch bằng quy

trình sắc ký ái lực đã xử lý với nhiệt độ cao lại có phản ứng ổn định ở cả 3 loại

buffer với pH khác nhau. Do đó, có thể mức độ tinh sạch của protein tái tổ hợp đã

ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme trong điều kiện pH chưa tối ưu

Chúng tôi tiếp tục so sánh kết quả điện di sản phẩm PCR có kích thước lớn

hơn (> 2 kb), chỉ có protein Pwo-pol tinh sạch bằng quy trình sắc ký ái lực đã xử lý

với nhiệt độ 95oC. Và protein này có độ tinh sạch tốt nhất nên đã cho hoạt tính ổn

định nhất với cả kích thước nhỏ và kích thước lớn. Tuy nhiên băng chính của sản

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

phẩm PCR kích thước lớn nhân được không sáng rõ như sản phẩm PCR kích thước

nhỏ mờ, và còn có thêm một số băng phụ. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tối ưu một yếu

tố khác là nồng độ KCl cho buffer PCR với pH 8.8, ptrong điều kiện giảm nồng độ

Hình 21: Ảnh hưởng của nồng độ KCl đến khả năng khuếch đại đoạn gen ngắn Hàng trên: phản ứng PCR sử dụng buffer có nồng độ KCl là 100 mM, hàng dưới phản ứng PCR sử dụng buffer có nồng độ KCl là 250 mM. Các thành phần khác của buffer PCR bao gồm 200 mM Tris-HCl pH 8.8, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X, 1 mg/ml BSA. Đường chạy 1: marker iNtRon, đường chạy 2; 3; 4; 5; 6 tương ứng với các nồng độ giảm dần của protein Pwo-pol tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực sau khi xử lý với nhiệt độ 95oC từ 2 – 0.4 mg/ml. Kết quả điện di trên gel agarose 1%, 100V, 15 phút.

khuôn mẫu.

Muối KCl là thành phần quan trọng giúp ổn đinh DNA polymerase trong quá

trình kéo dài, tuy nhiên chúng có thể làm giảm khả năng biến tính của DNA. Tăng

nồng độ KCl giúp làm tăng lượng sản phẩm PCR cho kích thước đoạn gen ngắn

khoảng 400 bp (hình 21). Kết quả này cũng đánh giá một phần ảnh hưởng của nồng

độ protein thử hoạt tính đến độ sáng băng sản phẩm PCR. Với buffer PCR bao gồm

100 mM KCl, độ sáng băng giảm khi nồng độ enzyme dưới 0.8 mg/ml. Trong khi

đó, với buffer bao gồm 250 mM KCl thu được kết quả các sản phẩm PCR có độ

sáng tương đương nhau ở các nồng độ protein khác nhau. Điều này cho thấy KCl đã

giúp làm tăng hoạt độ của protein Pwo-pol tái tổ hợp.

3.5.2. Hoạt tính sao chép

Bên cạnh việc so sánh nồng độ, độ tinh sạch của protein tái tổ hợp bằng điện

di gel SDS-PAGE, cũng cần đảm bảo sau mỗi phương pháp tinh sạch thì protein tái

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

tổ hợp thu được có hoạt tính ổn định, không bị biến tính hay bị ảnh hưởng bởi các

Hình 22: Hoạt tính sao chép của Pwo-pol tái tổ hợp sau tinh sạch a. Phản ứng PCR cho protein Pwo-pol (1) tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực, kết quả so sánh với enzyme thương mại i-Taq ở cùng điều kiện, đường chạy 1: marker 1kb iNtRon, đường chạy 2; 3; 5 phản ứng PCR với nhiệt độ biến tính 95oC, đường chạy 4: phản ứng PCR với nhiệt độ giai đoạn biến tính 98oC; b. Pwo-pol (2) tinh sạch theo phương pháp kết tủa 20% AS, kết quả so sánh với protein Pwo-pol (1) tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực, ở cùng điều kiện, đường chạy 1: marker iNtRon, đường chạy 2; 3; 5 phản ứng PCR với nhiệt độ biến tính 95oC, đường chạy 4: phản ứng PCR với nhiệt độ giai đoạn biến tính 98oC. Kết quả điện di trên gel agarose 1%, 100V, 30 phút.

thành phần hóa chất từ phương pháp tinh sạch.

Protein Pwo-pol ban đầu thử nghiệm với phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực

đã có hoạt tính sao chép tương đương với enzyme i-Taq thương mại (hình 22a) khi

nhân đúng băng có kích thước khoảng 400 bp của gen AcrH. Mặt khác khi sử dụng

nhiệt độ trong giai đoạn biến tính 95oC, sản phẩm PCR của protein Pwo-pol (đường

chạy 2) có vệt smear, nhiều dimer. Điều này có thể bị gây ra do protein chưa được

tinh sạch tốt.

Mặc dù, cả hai protein Pwo-pol (1) tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực

và Pwo-pol (2) tinh sạch theo phương pháp kết tủa đều chưa đảm bảo về độ tinh

sạch, tuy nhiên từ kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 22b) cho thấy protein tinh

sạch bằng cột sắc ký ái lực có hoạt tính tốt hơn (đường chạy 2) so với khi tinh sạch

bằng muối (NH4)2SO4. Nguyên nhân của việc tinh sạch bằng kết tủa có hoạt tính

kém có thể do nồng độ protein Pwo-pol thu được thấp. Mặt khác nồng độ muối cao

gây kết tủa cũng làm giảm khả năng cuộn gập tự nhiên của protein.

Từ kết quả này, có thể kết luận rằng phương pháp tinh sạch protein Pwo-pol

tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực cho hoạt tính sao chép tốt hơn phương pháp tinh

sạch bằng kết tủa muối AS (20% bão hòa). Tiếp tục thử kiểm tra hoạt tính của

protein ở nhiệt độ biến tính cao hơn 95oC.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

Hình 23: Phản ứng của enzyme và protein tái tổ hợp ở nhiệt độ biến tính 98oC Đường chạy 1: marker iNtRon, đường chạy 2: enzyme PhusionMCB, đường chạy 3; 7: enzyme i-Taq pha loãng theo tỉ lệ lần lượt 1:1; 1:8, đường chạy 4; 5; 6; 8: protein Pwo-pol tinh sạch với phương pháp sắc ký ái lực kết hợp xử lý mẫu ở nhiệt độ 70oC pha loãng theo tỉ lệ lần lượt 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 bằng buffer bảo quản. Kết quả điện di trên gel agarose 1%, 100V, 15 phút.

3.5.3. Khả năng chịu nhiệt độ cao

Protein Pwo-pol tái tổ hợp tinh sạch với phương pháp sắc ký ái lực sau khi ủ

mẫu ở nhiệt độ 70oC có hoạt tính rất ổn định khi nhân đoạn gen AcrH (từ kết quả tối

ưu buffer PCR). Thêm vào đó, nồng độ của protein cũng ảnh hưởng đến hoạt tính

nhân gen của chúng. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành pha loãng protein Pwo-pol tái tổ

hợp với buffer bảo quản theo các tỉ lệ lần lượt 1:1, 1:2, 1:4, 1:8. Như kết quả điện di

(hình 23), cho thấy ở tỉ lệ pha loãng 1:8 lượng sản phẩm nhân gen đã giảm đi đáng

kể so với các tỉ lệ khác. Chứng tỏ nồng độ protein Pwo-pol thu được là rất cao, mặc

dù pha loãng 8 lần nhưng vẫn còn hoạt tính nhân gen.

Kết quả thử nghiệm các nồng độ trên là quan trọng để đánh giá khả năng

chịu nhiệt độ cao lên đến 98oC của protein tái tổ hợp. Mẫu pha loãng 1:8 giảm hiệu

suất không gây ra bởi biến tính ở nhiệt độ cao. Kết quả cũng được so sánh với 2

enzyme khác là PhusionMCB và i-Taq. Cả 2 mẫu có sử dụng thành phần enzyme i-

Taq không có phản ứng khuếch đại. Kết quả này chứng minh protein Pwo-pol tái tổ

hợp thu được có khả năng chịu nhiệt cao hơn so với Taq DNA polymerase theo

đúng lý thuyết.

3.5.4. Hoạt tính khi có mặt chất ức chế

Một trong những yêu cầu với việc sản xuất các enzyme DNA polymerase

hiện nay ngoài khả năng chịu nhiệt thì chúng phải đảm bảo hoạt tính ổn định ngay

cả khi phản ứng có mặt chất ức chế. Vì vậy, chúng tôi đã sử dụng khuôn DNA

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

genome tách chiết từ mô động vật theo phương pháp tách chiết phenol-chloroform

Hình 24: Hoạt tính của các proein Pwo-pol trong phản ứng sử dụng khuôn genome a. Protein Pwo-pol được tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực kết hợp xử lý với nhiệt độ 70oC; b. Protein Pwo-pol được tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực kết hợp xử lý với nhiệt độ 95oC. Đường chạy 1: marker iNtRon, đường chạy 2: đối chứng âm không bổ sung khuôn DNA, đường chạy 3: đối chứng dương được bổ sung khuôn DNA có chất lượng tốt, đường chạy 4 – 11: các mẫu genome tách chiết từ mẫu mô của dơi bảo quản bằng cồn trong thời gian dài. Kết quả điện di trên gel agarose 1%, 100V, 15 phút.

để kiểm tra hoạt tính cho protein Pwo-pol tái tổ hợp thu được.

Kết quả điện di cho thấy một phần gen COI (~750 bp) đã được khuếch đại

với protein Pwo-pol được tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực kết hợp xử lý

với nhiệt độ 95oC (hình 24a). Nếu ở hình a, sản phẩm khuếch đại được hầu như

không thể nhìn rõ thì ở hình b đã xuất hiện băng đồng đều ở nhiều mẫu, các băng

sáng rõ, đúng kích thước như đối chứng dương. Kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã

tối ưu được quy trình tinh sạch protein Pwo-pol tái tổ hợp có hoạt tính tốt, đảm bảo

các hoạt tính vốn có của DNA polymerase bền nhiệt

Từ các kết quả thu được, chúng tôi cho rằng quy trình phá vỡ tế bào ở nhiệt

độ 95oC/30’ kết hợp ly tâm ở nhiệt độ cao và tinh sạch bằng sắc ký ái lực nickel là

một trong những phương pháp đơn giản để sản xuất protein Pwo-pol tái tổ hợp.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Đề tài đã đạt được một số kết quả chính như sau:

1. Tối ưu được mã bộ ba của gen mã hóa protein Pwo DNA polymerase.

2. Nhân dòng thành công gen mã hóa Pwo DNA polymerase vào vector pET-M.

3. Biểu hiện được lượng lớn protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp ở vi khuẩn E.

coli BL21 (DE3).

4. Tinh sạch được protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp có độ tinh sạch lên đến

95% khi áp dụng phương pháp đun nóng nhiệt độ cao kết hợp sắc ký ái lực đuôi

6xHis-tag.

5. Protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp thu được sau khi tinh sạch ở nhiệt độ

cao có hoạt tính sao chép ổn định.

Kiến nghị

1. Kiểm tra mức độ nhiễm plasmid của protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp thu

được sau khi tinh sạch.

2. Tối ưu quy trình xử lý DNA bằng enzyme cắt DNase I trước khi tinh sạch protein

Pwo DNA polymerase tái tổ hợp

3. Kiểm tra độ chính xác của protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp sử dụng cặp

mồi gây đột biến trực tiếp.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abu Al-Soud W., Râdström P. (1998), "Capacity of nine thermostable DNA polymerases To mediate DNA amplification in the presence of PCR- inhibiting samples", Applied and environmental microbiology, 64, PP. 3748- 3753. 2. Albà M. M. (2001), "Replicative DNA polymerases", Genome Biology, 2, PP. reviews3002.1.

3. Asif A., Mohsin H., Tanvir R., Rehman Y. (2017), "Revisiting the Mechanisms Involved in Calcium Chloride Induced Bacterial Transformation", Frontiers in microbiology, 8, PP. 2169-2169.

4. Block H., Maertens B., Spriestersbach A., Brinker N., Kubicek J., Fabis R., Labahn J., Schäfer F. (2009), Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review, Academic Press, Elsevier.

5. Chen C.-Y. (2014), "DNA polymerases drive DNA sequencing-by-synthesis technologies: both past and present", Frontiers in microbiology, 5, PP. 305- 305.

6. Dąbrowski S., Kur J. (1998), "Cloning and Expression in Escherichia coli of the Recombinant His-Tagged DNA Polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcus woesei", Protein Expression and Purification, 14, PP. 131-138. 7. Das-Bradoo S., Bielinsky A.-K. (2010), "DNA replication and checkpoint control in S phase", Nature, 9, PP. 74-79. 8. DasSarma S., Coker J. A., DasSarma P. (2009), Archaea (overview), Academic Press, Oxford.

9. Dumon-Seignovert L., Cariot G., Vuillard L. (2004), "The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3)", Protein Expression and Purification, 37, PP. 203-206. 10. Duong-Ly K. C., Gabelli S. B. (2014), Chapter Seven - Salting out of Proteins Using Ammonium Sulfate Precipitation, Academic Press, Elsevier.

11. Ecker D., Khan M. I., Marsh J., Butt T. R., Crooke S. T. (1987), "Chemical synthesis and expression of a cassette adapted ubiquitin gene", Journal of Biological Chemistry, 262, PP. 3524-3527.

12. Ghasemi A., Salmanian A. H., Sadeghifard N., Salarian A. A., Gholi M. K. (2011), "Cloning, expression and purification of Pwo polymerase from Pyrococcus woesei", Iranian journal of microbiology, 3, PP. 118-122. 13. Hayat S. M., Farahani N., Golichenari B., Sahebkar A. (2018), "Recombinant Protein Expression in Escherichia coli (E. coli): What We Need to Know", Current pharmaceutical design, 24, PP. 718-725. 14. Henry I., Sharp P. M. (2006), "Predicting Gene Expression Level from Codon Usage Bias", Molecular Biology and Evolution, 24, PP. 10-12.

15. Heo J. H., Kim S. W. (2013), "Cloning the Pfu DNA polymerase from DNA contaminants in preparations of commercial Pfu DNA polymerase", African Journal of Microbiology Research, 7, PP. 745-750.

16. Hoseini S. S., Sauer M. G. (2015), "Molecular cloning using polymerase chain reaction, an educational guide for cellular engineering", Journal of biological engineering, 9, PP. 2-2.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

17. Jia B., Jeon C. O. (2016), "High-throughput recombinant protein expression in Escherichia coli: current status and future perspectives", Open biology, 6, PP. 160196.

18. Kane J. F. (1995), "Effects of rare codon clusters on high-level expression of in in Escherichia coli", Current Opinion heterologous proteins Biotechnology, 6, PP. 494-500.

19. Kanoksilapatham W., González J. M., Maeder D. L., DiRuggiero J., Robb F. T. (2004), "A proposal to rename the hyperthermophile Pyrococcus woesei as Pyrococcus furiosus subsp. woesei", Archaea (Vancouver, B.C.), 1, PP. 277- 283.

20. Kary M., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G., Erlich H. (1992), "Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. 1986", Biotechnology (Reading, Mass.), 24, PP. 17-27.

21. Khosravinia H., Ramesha K. (2007), "Influence of EDTA and magnesium on DNA extraction from blood samples and specificity of polymerase chain reaction", African Journal of Biotechnology (ISSN: 1684-5315) Vol 6 Num 3, 6, PP. 184-187.

22. Killelea T., Ralec C., Bossé A., Henneke G. (2014), "PCR performance of a in thermostable heterodimeric archaeal DNA polymerase", Frontiers microbiology, 5, PP. 195-195.

23. Kim S. W., Kim D.-U., Kim J. K., Kang L.-W., Cho H.-S. (2008), "Crystal structure of Pfu, the high fidelity DNA polymerase from Pyrococcus furiosus", International journal of biological macromolecules, 42, PP. 356- 361.

24. Kimple M. E., Brill A. L., Pasker R. L. (2013), "Overview of affinity tags for protein purification", Current protocols in protein science, 73, PP. 9.9.1- 9.9.23. 25. Lehman I. (2003), "Discovery of DNA polymerase", The Journal of biological chemistry, 278, PP. 34733-8.

26. Li X., Sui X., Zhang Y., Sun Y., Zhao Y., Zhai Y., Wang Q. (2009), "An improved calcium chloride method preparation and transformation of competent cells", Afr. J. Biotechnol., 9, PP. 8549-8554.

27. Li Z., Santangelo T. J., Čuboňová Ľ., Reeve J. N., Kelman Z. (2010), "Affinity Purification of an Archaeal DNA Replication Protein Network", mBio, 1, PP. e00221-10.

28. Makino T., Skretas G., Georgiou G. (2011), "Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria", Microbial cell factories, 10, PP. 32-32. 29. Mandecki W., Boiling T. J. (1988), "FokI method of gene synthesis", Gene, 68, PP. 101-107.

30. Marsic D., Hughes R. C., Byrne-Steele M. L., Ng J. D. (2008), "PCR-based gene synthesis to produce recombinant proteins for crystallization", BMC Biotechnology, 8, PP. 44.

31. Pavlov A. R., Pavlova N. V., Kozyavkin S. A., Slesarev A. I. (2004), "Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient applications", Trends in Biotechnology, 22, PP. 253-260.

32. Pluthero F. G. (1993), "Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase", Nucleic acids research, 21, PP. 4850-4851.

Luận văn thạc sĩ 2019 Nguyễn Thị Thu Huyền

33. Puigbò P., Bravo I. G., Garcia-Vallve S. (2008), "CAIcal: A combined set of

tools to assess codon usage adaptation", Biology Direct, 3, PP. 38.

34. Robb F. T., Maeder D. L., Brown J. R., DiRuggiero J., Stump M. D., Yeh R. K., Weiss R. B., Dunn D. M. (2001), Genomic sequence of hyperthermophile, Pyrococcus furiosus: implications for physiology and enzymology, Academic Press, Elsevier.

35. Roymondal U., Das S., Sahoo S. (2009), "Predicting gene expression level from relative codon usage bias: an application to Escherichia coli genome", DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes, 16, PP. 13-30.

36. Sanger F., Coulson A. R. (1975), "A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase", Journal of Molecular Biology, 94, PP. 441-448. 37. Sclafani R. A., Holzen T. M. (2007), "Cell cycle regulation of DNA replication", Annual review of genetics, 41, PP. 237-280.

38. Spriestersbach A., Kubicek J., Schäfer F., Block H., Maertens B. (2015), Chapter One - Purification of His-Tagged Proteins, Academic Press, Elsevier. 39. Steitz T. A. (1999), "DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms", The Journal of biological chemistry, 274, PP. 17395-17398.

40. Terpe K. (2013), "Overview of thermostable DNA polymerases for classical PCR applications: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems", Applied Microbiology and Biotechnology, 97, PP. 10243-10254. 41. Wingfield P. (2001), "Protein precipitation using ammonium sulfate", Current protocols in protein science, Appendix 3, PP. Appendix-3F.

42. Yang G., Wang S., Wei H., Ping J., Liu J., Xu L., Zhang W. (2011), "Patch oligodeoxynucleotide synthesis (POS): A novel method for synthesis of long DNA sequences and full-length genes", Biotechnology letters, 34, PP. 721-8. 43. Yoda T., Tanabe M., Tsuji T., Yoda T., Ishino S., Shirai T., Ishino Y., Takeyama H., Nishida H. (2017), "Exonuclease processivity of archaeal replicative DNA polymerase in association with PCNA is expedited by mismatches in DNA", Scientific reports, 7, PP. 44582-44582.

44. Zhang L., Kang M., Xu J., Huang Y. (2015), "Archaeal DNA polymerases in biotechnology", Applied microbiology and biotechnology, 99, PP. 6585- 6597.

45. Zhang Z., Kuipers G., Niemiec Ł., Baumgarten T., Slotboom D. J., de Gier J.- W., Hjelm A. (2015), "High-level production of membrane proteins in E. coli BL21(DE3) by omitting the inducer IPTG", Microbial cell factories, 14, PP. 142-142.

46. Zillig W., Holz I., Klenk H.-P., Trent J., Wunderl S., Janekovic D., Imsel E., Haas B. (1987), "Pyrococcus woesei, sp. nov., an ultra-thermophilic marine archaebacterium, representing a novel order, Thermococcales", Systematic and Applied Microbiology, 9, PP. 62-70.