Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ HƯỜNG

PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10 LIÊN QUAN ĐẾN

KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN - 2015

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ HƯỜNG

PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10 LIÊN QUAN ĐẾN

KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN - 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự

hƣớng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, sự giúp đỡ của các cán bộ

Khoa Khoa học sự sống – Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên,

Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố

trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này.

Thái Nguyên, ngày 04 tháng 11 năm 2015

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

NGUYỄN THỊ HƯỜNG

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh

Thanh, ngƣời đã hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quá

trình thực hiện đề tài và hoàn chỉnh luận văn của mình.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Khoa học sự sống –

Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận

lợi cho tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài này.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn và các cán bộ, kỹ thuật viên

phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tốt nhất để tôi có

thể hoàn thành đề tài nghiên cứu này.

Cuối cùng, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình,

đồng nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ những khó khăn

cùng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Thái Nguyên, ngày 04 tháng 11 năm 2015

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Nguyễn Thị Hường

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii

MỤC LỤC ........................................................................................................ iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ............................................. v

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN .......................................... vi

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

1. Đ t vấn đề ...................................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3

1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY NGÔ ..................................................... 3

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây ngô ............................................................. 3

1.1.2. Đ c điểm sinh học của cây ngô ............................................................... 3

1.1.3. Đ c điểm hóa sinh hạt ngô ...................................................................... 6

1.1.4. Giá trị kinh tế .......................................................................................... 7

1.1.5. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới ....................................................... 7

1.1.6. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam ...................................................... 10

1.2. MỌT NGÔ VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA MỌT NGÔ ĐẾN QUÁ TRÌNH

BẢO QUẢN NÔNG SẢN .............................................................................. 11

1.2.1. Đ c điểm của mọt hại ngô (Sitophilus zeamais Motschulsky) ............. 11

1.2.2. Côn trùng hại ngô trong quá trình bảo quản nông sản .......................... 14

1.3. CYSTEINE PROTEINASE VÀ CYSTATIN ......................................... 16

1.3.1. Cysteine proteinase ............................................................................... 16

1.3.2. Cystatin - chất ức chế Cysteine proteinase ........................................... 18

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 21

2.1. VẬT LIỆU................................................................................................ 21

2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ...................... 21

2.2.1. Hóa chất................................................................................................. 21

2.2.2. Thiết bị .................................................................................................. 21

2.2.3. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 22

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 22

2.3.1. Phƣơng pháp sinh lí ............................................................................... 22

2.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử .............................................................. 22

2.3.3. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide ............................................ 30

2.3.4. Phƣơng pháp xử lí trình tự gen ............................................................. 30

2.3.5. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu .................................... 30

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 31

3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA CÁC GIỐNG

NGÔ BẰNG NHIỄM MỌT NHÂN TẠO ...................................................... 31

3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10 ......................................... 33

3.2.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số............................................................ 33

3.2.2. Kết quả tổng hợp cDNA và nhân gen ................................................... 33

3.2.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR .......................................................... 34

3.2.4. Kết quả tách dòng gen ........................................................................... 35

3.2.5. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp ............................................................. 36

3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN.................. 37

3.3.1. Kết quả so sánh trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG và HG ..... 38

3.3.2. Kết quả so sánh hai trình tự nghiên cứu (BG, HG) với hai trình tự đã

đƣợc công bố (CB2, MX4) và BN000514 trên GenBank ................................ 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 50

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ABA Abscisic acid

bp base pair (c p bazơ)

cDNA complementary DNA

cs cộng sự

DEPC diethyl pyrocarbonate

DNA Deoxyribose nucleic acid

dNTP deoxynucleoside triphosphate

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

E. coli Escherichia coli

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

kb kilo base

kDa kilo Dalton

µg µl mRNA Microgam Microlite messenger ribonucleic acid

NCBI OD National Center for Biotechnology Information Optical density

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RNA Ribonucleic acid

RT- PCR

TAE Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi phiên mã ngƣợc) Tris-acetate-EDTA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

UV X-gal Ultra violet 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-pyranoside

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng 1.1. Tỉ lệ các bộ phận hạt ngô và thành phần hóa học của chúng ….….6

Bảng 1.2. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới trong 10 năm gần đây ............. 8

Bảng 1.3. Tình hình sản xuất ngô của một số quốc gia trên thế giới năm 20149

Bảng 1.4. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 2006 - 2013 ....................... 10

Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA .................................... 24

Bảng 2.2. C p mồi nhân gen Cystatin 10 ........................................................ 25

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PT-PCR nhân gen Cystatin 10 .................... 25

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen Cystatin 10 vào vector PBT .......... 27

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng colony – PCR .............................................. 28

Bảng 2.6. Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony – PCR ..................................... 28

Bảng 3.1. Lƣợng ngô hao hụt theo thời gian của 6 giống ngô nghiên cứu ..... 31

Bảng 3.2. Giá trị tỉ lệ phổ hấp thụ A260/A280 và hàm lƣợng RNA của giống

ngô nghiên cứu ................................................................................................ 33

Bảng 3.3. Sự sai khác giữ các trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG, HG38

Bảng 3.4. Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự gen của hai mẫu ngô BG, HG ... 39

Bảng 3.5. Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin10

ở hai giống ngô BG, HG ................................................................................. 40

Bảng 3.6. Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự amino acid của 2 mẫu nghiên

cứu .................................................................................................................. 41

Bảng 3.7. Sự khác nhau giữa trình tự gen Cystatin 10 của BG, HG với CB2,

MX4 và BN000514 trên GenBank ...................................................................... 44

Bảng 3.8. Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự gen của 2 mẫu nghiên cứu với

CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank ............................................................. 45

Bảng 3.9. Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin10

ở hai mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank ................... 47

Bảng 3.10. Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự amino acid của 2 mẫu nghiên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

cứu với CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank ................................................ 48

vii

DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN VĂN

Hình 1.1. Mọt ngô Sitophilus zeamais ............................................................ 11

Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn lƣợng thức ăn hao hụt theo thời gian ở các mẫu

ngô nghiên cứu ................................................................................................ 32

Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RT - PCR nhân gen Cystatin 10 ở 2

giống ngô nghiên cứu ...................................................................................... 34

Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch gen Cystatin 10 ở 2 mẫu ngô

nghiên cứu. ...................................................................................................... 35

Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen Cystatin 10 ở 2 mẫu

ngô nghiên cứu. ............................................................................................... 36

Hình 3.5. Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp. ....................................... 37

Hình 3.6. So sánh trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG, HG ............... 38

Hình 3.7. Trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin 10 ở hai mẫu

nghiên cứu ....................................................................................................... 40

Hình 3.8. So sánh trình tự gen Cystatin 10 của BG, HG với CB2, MX4 và

BN000514 trên GenBank ................................................................................... 42

Hình 3.9. Trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin 10 ở hai mẫu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nghiên cứu với CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank .................................... 46

MỞ ĐẦU

1. Đ t vấn ề

Cây ngô (Zea mays L.) là một trong năm loại cây lƣơng thực chính của

thế giới. Hạt ngô chứa khá đầy đủ các chất dinh dƣỡng cho ngƣời và gia súc.

Ở Việt Nam, ngô là cây lƣơng thực quan trọng thứ hai sau lúa gạo. Trong

những năm gần đây, sản xuất ngô ở Việt Nam tăng nhanh nhờ sự thúc đẩy của

ngành chăn nuôi và công nghiệp chế biến. Ngô là cây thức ăn chăn nuôi quan

trọng nhất hiện nay, 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp của gia súc là từ

ngô. Gần đây, cây ngô còn là cây thực phẩm; ngƣời ta dùng bắp ngô bao tử

làm rau cao cấp vì nó sạch và có hàm lƣợng dinh dƣỡng cao; ngô nếp, ngô

đƣờng (ngô ngọt) đƣợc dùng làm quà ăn tƣơi (luộc, nƣớng) ho c đóng hộp

làm thực phẩm xuất khẩu. Ngô còn là nguyên liệu của ngành công nghiệp

lƣơng thực, thực phẩm và công nghiệp nhẹ để sản xuất rƣợu, cồn, tinh bột,

dầu, glucôzơ, bánh kẹo. Trong y dƣợc, ngô đƣợc dùng để trị áp huyết, râu ngô

đƣợc dùng để làm thuốc [46].

Hiện nay, diện tích ngô ngày càng đƣợc mở rộng và có sự phát triển

tiến bộ trong công tác chọn tạo giống cây trồng nhằm tạo ra những giống ngô

có năng suất cao, có khả năng kháng sâu bệnh hại, chống chịu hạn tốt. Tùy

theo mục đích sử dụng mà sản phẩm ngô phải đƣợc bảo quản trong điều kiện

khác nhau và thời gian bảo quản khác nhau. Trong quá trình bảo quản sản

phẩm ngô theo thời gian có rất nhiều loại côn trùng phá hoại làm giảm phẩm

chất, chất dinh dƣỡng nông sản,…. Thành phần sâu mọt hại ngô tƣơng đối đa

dạng xuất hiện trong kho bảo quản ngô nhƣ mọt gạo, mọt răng cƣa, mọt đục

thân, mọt thóc,…. Vì vậy, việc nghiên cứu chọn tạo ra giống ngô có năng suất

cao và khả năng kháng mọt tốt là yêu cầu thực tiễn đ t ra cho ngành trồng trọt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nói chung và ngành chọn giống ngô nói riêng.

Cystatin là một dạng protein ức chế hoạt động của cysteine proteinase (Cysteine proteinase inhibitor- CPI). Chúng có m t trong vi sinh vật, động vật và thực vật. Các nghiên cứu gần đây bàn luận nhiều về mối liên quan giữa cystatin tới tính chống chịu yếu tố bất lợi của ngoại cảnh nhƣ: hạn, lạnh, muối, sự già và bảo vệ thực vật chống lại côn trùng, vi sinh vật gây bệnh và đ c biệt là khả năng kháng mọt. Ở động vật không xƣơng sống, cysteine proteinase là enzyme tiêu hóa, nếu cysteine proteinase bị ức chế thì hoạt động tiêu hóa của mọt s bị cản trở. Chính vì vậy, nghiên cứu theo hƣớng tăng cƣờng khả năng ức chế cysteine proteinase ở mọt bằng kỹ thuật chuyển gen đƣợc quan tâm nghiên cứu.

Để tạo cơ sở cho việc thiết kế vector chuyển gen có khả năng kháng mọt phục vụ việc tạo giống ngô kháng mọt tốt, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Phân lập gen Cystatin 10 liên quan ến khả năng kháng mọt của một số giống ngô”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và xác định đƣợc trình tự gen Cystatin 10 của hai giống ngô

(kháng mọt tốt và kháng mọt kém).

3. Nội dung nghiên cứu

- Thu thập và đánh giá khả năng kháng mọt của một số giống ngô.

- Nhân gen, tách dòng và xác định trình tự gen Cystatin 10 của hai giống ngô

kháng mọt tốt và kém bằng kỹ thuật RT-PCR.

- So sánh trình tự gen Cystatin 10 nghiên cứu với trình tự trên ngân hàng

gen và trình tự gen Cystatin 10 đã công bố.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

- So sánh trình tự amino acid suy diễn trong protein cystatin 10 nghiên cứu với trình tự trên ngân hàng gen và trình tự amino acid trong protein cystatin 10 đã công bố.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY NGÔ

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây ngô

Cây ngô có tên khoa học là Zea may L., thuộc chi Maydeae, họ hòa thảo

(Gramineae), bộ hòa thảo (Graminales) [13]. Có nhiều giả thuyết khác nhau về

nguồn gốc cây ngô dựa trên những kết quả nghiên cứu về khảo cổ học, di

truyền học, thực vật học và địa lý học... cho rằng quá trình thuần hóa ngô ban

đầu diễn ra ở Mexico, sau đó việc gieo trồng lan rộng ra khu vực Bắc Mỹ. Ngô

đƣợc đƣa tới châu Âu (Tây Ban Nha) lần đầu tiên vào năm 1494, là kết quả của

chuyến thám hiểm lần thứ hai của Columbus. Đầu thế kỷ XVI, bằng đƣờng

thủy với các tàu của Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Ý đã đƣa cây ngô đến hầu hết

các nơi trên thế giới. Ở Việt Nam, cây ngô có nguồn gốc từ Trung Quốc, đƣợc

trồng vào khoảng thế kỷ XVII (theo “Vân Đài loại ngữ” của Lê Quý Đôn). Tuy

nhiên, do là một nƣớc có truyền thống sản xuất lúa nƣớc nên trong thời gian

đầu ngô ít đƣợc chú ý mà chỉ phát triển trong những năm gần đây.

Ngô có nhiều cách phân loại khác nhau, có thể phân loại theo đ c điểm

thực vật học, sinh thái học, nông học, thời gian sinh trƣởng và thƣơng phẩm.

Phân loại theo đ c điểm thực vật học thì dựa vào hạt có mày hay không có

mày, hình thái bên ngoài và cấu trúc nội nhũ của hạt, ngô đƣợc phân thành

các loài phụ: ngô bọc, ngô đá, ngô răng ngựa, ngô đƣờng, ngô nổ, ngô bột,

ngô nếp, ngô đƣờng bột, ngô bán răng ngựa. Từ các loài phụ căn cứ vào màu

sắc hạt và màu sắc lõi ngô để phân thành các thứ [3].

1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây ngô

Ngô là thực vật một lá mầm có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau

nhƣng thích hợp nhất là đất có thành phần cơ giới nhẹ độ màu mỡ cao, dễ

thoát nƣớc, tầng canh tác dày, pH 6-7 [13]. Cây ngô gồm các bộ phận: rễ,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thân, lá, hoa (bông cờ, bắp ngô) và hạt.

Ngô có hệ rễ chùm tiêu biểu trong bộ rễ các cây họ Hòa thảo. Tùy theo

vị trí, chức năng, nhiệm vụ và thời gian sinh trƣởng mà rễ hoàn chỉnh của cây

đƣợc chia làm 3 loại: Rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng. Rễ mầm (rễ tạm thời,

rễ hạt) mọc từ trụ lá mầm, chức năng chính của rễ này là hút nƣớc, thức ăn

khi cây còn non. Rễ đốt (rễ phụ cố định) phát triển từ các đốt thấp của thân,

mọc vòng quanh các đốt dƣới m t đất bắt đầu lúc ngô đƣợc 3 - 4 lá. Đây là

loại rễ quyết định quá trình sinh trƣởng phát triển của cây ngô, nó giúp cây

hút nƣớc và các chất dinh dƣỡng suốt đời sống của cây. Rễ chân kiềng (rễ

neo, rễ chống) mọc quanh các đốt thấp sát m t đất. Rễ này giúp cây chống đỡ

và bám ch t vào đất, ngoài ra còn tham gia hút nƣớc và dinh dƣỡng [6].

Thân ngô đ c, đƣờng kính từ 2 - 4 cm, cao từ 1,8 - 2 m. Thân ngô

trƣởng thành bao gồm nhiều lóng nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ.

Thân ngô ngoài nhiệm vụ giúp cây đứng vững, là bộ phận dự trữ và vận

chuyển chất hữu cơ, ngoài ra còn có khả năng quang hợp để tổng hợp chất

hữu cơ [6].

Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và mọc đối xứng xen k nhau. Căn cứ vào

vị trí và hình thái lá trên cây, lá ngô đƣợc chia thành các nhóm: lá mầm, lá

thân, lá ngọn, lá bi. Lá ngô điển hình đƣợc cấu tạo bao gồm các bộ phận: bẹ

lá, phiến lá (bản lá), thìa lá (lƣỡi lá, tai lá). Lá ngô là cơ quan làm nhiệm vụ

quang hợp, đồng thời làm nhiệm vụ trao đổi khí, hô hấp, dự trữ dinh dƣỡng…

Số lƣợng lá, chiều dài, chiều rộng, độ dày, lông tơ, màu lá, góc lá và gân lá

thay đổi tùy theo từng giống khác nhau. Số lá là đ c điểm khá ổn định ở ngô,

có quan hệ ch t với số đốt và thời gian sinh trƣởng. Những giống ngô ngắn

ngày thƣờng có 15 - 16 lá, giống ngô trung bình có 18 - 20 lá, giống ngô dài

ngày thƣờng có trên 20 lá [6]. Lá ngô là cơ quan làm nhiệm vụ quang hợp,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đồng thời làm nhiệm vụ trao đổi khí, hô hấp, dự trữ dinh dƣỡng…

Ngô là loại cây có hoa khác tính cùng gốc. Cơ quan sinh sản đực và cái

tuy cùng nằm trên một cây song ở những vị trí khác nhau. Hoa đực nằm ở

đỉnh cây, xếp theo chùm gồm một trục chính và nhiều nhánh, hoa cái mọc ở

các nách lá ở giữa thân cây ngô, số mầm nách nhiều nhƣng chỉ có 1-3 mầm

nách trên cùng phát triển thành bắp, số bắp trên cây phụ thuộc vào giống, điều

kiện tự nhiên và mật độ gieo trồng, chế độ chăm sóc.

Hạt ngô thuộc loại quả dĩnh gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơrôn, phôi,

nội nhũ và chân hạt. Vỏ hạt là một màng nhẵn bao xung quanh hạt. Lớp

alơrôn nằm dƣới vỏ hạt bao lấy nội nhũ và phôi. Nội nhũ là phần chính của

hạt chứa các tế bào dự trữ dinh dƣỡng. Nội nhũ gồm hai phần nội nhũ bột và

nội nhũ sừng. Tỷ lệ giữa nội nhũ bột và nội nhũ sừng tùy vào chủng ngô,

giông ngô. Phôi ngô chiếm 1/3 thể tích hạt ngô, gồm có: ngù (phần ngăn cách

giữa nội nhũ và phôi), lá mầm, trụ dƣới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm. Trong

bốn phần này thì lá mầm thƣờng phát triển rõ rệt nhất. Màu sắc hạt phụ thuộc

đ c tính di truyền của giống và chủng loại, vì vậy hạt ngô có nhiều màu sắc

khác nhau nhƣ: trắng, vàng, tím, da cam, đỏ…Mỗi bắp ngô có từ 200 - 1000

hạt phụ thuộc vào giống, điều kiện ngoại cảnh, sinh thái, trung bình mỗi bắp có

từ 500 - 600 hạt [2].

Quá trình sinh trƣởng, phát triển của cây ngô đƣợc chia thành hai giai

đoạn: Giai đoạn sinh dƣỡng là từ khi gieo đến khi xuất hiện nhị cái và giai đoạn

sinh trƣởng thực bắt đầu từ khi hoa cái thụ tinh cho đến khi hạt chín hoàn toàn.

Căn cứ đ c điểm sinh lý và thời gian sinh trƣởng có thể chia ra các thời kì sinh

trƣởng phát triển quan trọng sau: Thời kì hạt nảy mầm và mọc, thời kì từ 3 lá đến

6 lá, thời kì từ 8 đến 10 lá, thời kì xoáy nõn, thời kì nở hoa và thời kì chín [5].

Trong từng giai đoạn cây ngô yêu cầu các điều kiện khác nhau và mỗi

giai đoạn đều có ảnh hƣởng khác nhau đến các yếu tố tạo thành năng suất và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chất lƣợng hạt ngô.

1.1.3. Đặc điểm hóa sinh hạt ngô

Hạt ngô có giá trị dinh dƣỡng cao, chứa tƣơng đối đầy đủ các chất dinh dƣỡng cần thiết cho con ngƣời và gia súc. Bột ngô chiếm 65 - 83% khối lƣợng hạt, là nguyên liệu quan trọng trong công nghiệp chế biến bột. Thành phần chủ yếu của hạt ngô gồm tinh bột và protein, ngoài ra còn có một số chất nhƣ đƣờng, cellulose, chất khoáng, sinh tố.

Bảng 1.1. Tỉ lệ các bộ phận hạt ngô và thành phần hóa học của chúng [11]

Thành phần hóa học (tính theo % chất khô) Tỉ lệ (%)

Các bộ phận của hạt ngô Toàn hạt 100 Tinh bột 71,5 Protein 0,3 Lipid 4,8

Nội nhũ 82,3 86,4 9,4 0,8

Phôi 11,5 8,2 18,8 34,5

Vỏ 5,3 7,3 3,7 1,0

Mày 0,8 5,3 9,1 3,8

Thành phần chính trong hạt ngô là tinh bột (60 - 70%), chúng tập trung chủ yếu ở nội nhũ. Hàm lƣợng tinh bột ở ngô tẻ nhiều hơn ngô nếp (68% so với 65%) và đƣợc chia thành tinh bột mềm (tinh bột bột) và tinh bột cứng (tinh bột sừng). Ngô nếp đƣợc cấu tạo hoàn toàn từ amylopectin nên có độ dẻo hơn ngô tẻ [11].

Vitamin của ngô tập trung ở lớp ngoài hạt ngô và ở mầm. Ngô cũng có nhiều vitamin C, vitamin B (B1, B2, B6..). Vitamin PP hơi thấp cộng với thiếu tryptophan một amino acid có thể tạo vitamin PP. Riêng ngô vàng chứa nhiều carotene (tiền vitamin A) [16].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Tỷ lệ chất béo trong hạt ngô tƣơng đối cao (3 - 6%), chủ yếu tập trung trong mầm ngô. Trong chất béo của ngô có 50% là acid linoleic, 31% là axít oleic, 13% là axít panmitic và 3% là stearic. Hàm lƣợng lipid là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lƣợng hạt [9].

1.1.4. Giá trị kinh tế

Ngô là một trong những cây lƣơng thực quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu, 1/3 dân số trên thế giới dùng ngô làm lƣơng thực chủ yếu. Toàn thế giới sử dụng khoảng 21% sản lƣợng ngô làm lƣơng thực cho con ngƣời, các nƣớc ở Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng ngô làm lƣơng thực chính, các nƣớc Đông Nam Phi sử dụng 85% sản lƣợng lƣơng thực cho ngƣời [13].

Ngô đƣợc sử dụng nhiều trong công nghiệp nhƣ chế biến thực phẩm, công nghiệp nhẹ... Các loại ngô nếp, ngô đƣờng đƣợc đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu. Bột ngô đƣợc dùng để nấu cồn sản xuất đƣờng glucose, làm môi trƣờng nuôi cấy nấm penicillin, sản xuất acid acetic. Lõi ngô đƣợc chế biến làm chất cách điện, nhựa hóa học. Phôi ngô dùng để ép dầu, phục vụ trong công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm. Ví dụ, nƣớc Mỹ hàng năm sử dụng 18% tổng sản lƣợng ngô để sản xuất tinh bột, 37% sản xuất cồn và 5,8% sản xuất bánh kẹo [18].

Ở nƣớc ta, ngô là cây lƣơng thực chính đứng hàng thứ hai sau lúa nƣớc, giữ một vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân nói chung và nền sản xuất nông nghiệp nói riêng, đ c biệt với đồng bào vùng cao miền núi thì cây ngô còn góp phần xóa đói giảm nghèo [6]. Hàng năm, nƣớc ta phải nhập khẩu một lƣợng lớn ngô từ các nƣớc nhƣ: Braxin, Achentina, Ấn Độ, Thái Lan, Camphuchia, Lào. Theo báo cáo thống kê tháng 9 năm 2015 của Trung tâm Tin học và Thống kê - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, lƣợng ngô nƣớc ta nhập khẩu từ tháng 9/2014 đến tháng 8/2015 là 4.263.903 tấn tƣơng đƣơng 963.184.000 USD [49].

1.1.5. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Ngô là một loại ngũ cốc quan trọng trên thế giới đứng thứ 3 sau lúa mì và lúa gạo, có địa bàn phân bố rộng, đƣợc gieo trồng rộng khắp trên thế giới với sản lƣợng hàng năm cao hơn bất kỳ cây lƣơng thực nào. Do điều kiện khí hậu, thổ nhƣỡng, tập quán canh tác dẫn đến diện tích, sản lƣợng và năng suất ngô ở các khu vực có sự khác nhau. Sự chênh lệch này đƣợc thể hiện ở bảng 1.2.

Bảng 1.2. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới trong 10 năm gần đây

Năm

Sản lượng (triệu tấn) 728,92 713,68 706,84 789,88 830,34 820,00 851,17 888,01 872,07 1016,74 Năng suất (tạ/ha) 49,44 48,17 48,10 49,82 50,98 51,62 51,80 51,61 49,16 55,2 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 Diện tích (triệu ha) 147,45 148,16 146,96 158,53 162,87 158,85 164,31 172,05 177,38 184,19

Nguồn: FAOSTAT, 2014 [48]

Theo số liệu trong bảng, sản lƣợng toàn thế giới năm 2013 là 1016,74

triệu tấn trong khi đó năm 2004, năng suất ngô trung bình của thế giới chỉ đạt

728,92 triệu tấn. Đến năm 2007 năng suất đã đạt gần 50 tạ/ha. Diện tích gieo

trồng tăng dần theo các năm đồng thời sản lƣợng và năng suất cũng đƣợc tăng

theo. Sản lƣợng tăng không chỉ do diện tích gieo trồng tăng mà còn nhờ có sự

đổi mới, phát triển của khoa học công nghệ, nhiều loài ngô có năng suất cao

đƣợc đƣa vào sản xuất. Diện tích gieo trồng ngô giữa các châu lục có sự

chênh lệch nhau, Nhìn chung diện tích trồng ngày càng đƣợc mở rộng. Năm

2004 diện tích trồng là 147,45 triệu ha nhƣng đến năm 2013 đã đƣợc mở rộng

lên 184,19 triệu ha. Năm 2009 diện tích trồng bị giảm xuống còn 158,85 triệu

ha tuy nhiên năng suất vẫn tăng.

Do có nhiều giá trị sử dụng và giá trị kinh tế, ngô đã trở thành một loại

ngũ cốc quan trọng thứ 3 của thế giới. Hiện nay do điều kiện tự nhiên cũng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nhƣ sự phát triển về khoa học kỹ thuật mà tình hình sản xuất ngô giữa các

quốc gia trên thế giới có sự khác biệt cả về diện tích, năng suất lẫn sản lƣợng,

sự khác biệt đó đƣợc thể hiện qua bảng 1.3.

Bảng 1.3. Tình hình sản xuất ngô của một số quốc gia trên thế giới năm 2014

Nước

Mỹ Trung Quốc Braxin Ấn Độ Ý Hy Lạp Israel Diện tích (triệu ha) 35,48 35,26 15,32 9,50 0,80 0,19 0,004 Sản lượng (triệu tấn) 353,70 217,73 80,54 23,29 6,5 2,19 0,11 Năng suất (tạ/ha) 99,70 61,75 52,58 24,52 80,96 115,00 225,56

Nguồn: FAOSTAT, 2014 [48]

Qua bảng trên có thể thấy rằng, trên thế giới Mỹ là quốc gia có diện

tích trồng ngô lớn nhất với 35,48 triệu ha và có sản lƣợng lớn nhất với 335,70

triệu tấn tuy nhiên sản lƣợng chỉ đạt 99,70 tạ/ha, trong khi đó cao nhất lại là

Israel với diện tích chỉ có 0,004 triệu ha nhƣng lại có năng suất đạt tới 225,56

tạ/ha. Cùng với đó, Hy Lạp cũng có diện tích rất nhỏ 0,19 triệu ha nhƣng có

năng suất là 115,00 tạ/ha.

Sau Mỹ đó là Trung Quốc, một cƣờng quốc đang phát triển và lớn mạnh.

Với diện tích lãnh thổ lớn nhất thế giới nền sản xuất ngô của nƣớc này lớn thứ

2 với diện tích 35,26 triệu ha có sản lƣợng 217,73 triệu tấn. Sản lƣợng ngô trên

thế giới tăng nhanh trong những năm gần đây, chủ yếu là tăng năng suất nhờ

giống mới và kỹ thuật canh tác tƣới tiêu. Trong giai đoạn hiện nay, ngô cùng

với lúa nƣớc, lúa mỳ vẫn là những cây lƣơng thực chiếm vị trí quan trọng nhất,

nuôi sống toàn nhân loại. Vì vậy, việc lựa chọn các giống ngô có đ c tính tốt,

năng suất cao và biện pháp kỹ thuật canh tác tiên tiến là một trong những giải

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

pháp quan trọng để chống lại khủng hoảng lƣơng thực toàn cầu.

1.1.6. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam

Ở Việt Nam, ngô là cây lƣơng thực quan trọng thứ hai sau cây lúa và là

cây màu quan trọng nhất đƣợc trồng ở nhiều vùng sinh thái khác, đa dạng về

mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác. Trƣớc đây sản xuất ngô ở nƣớc ta

còn nhỏ lẻ, phân tán, m t khác do kỹ thuật canh tác kém và chất lƣợng giống

kém dẫn đến năng suất rất thấp. Trong những năm gần đây sản xuất ngô ở

nƣớc ta có sự thay đổi đáng kể, đƣợc thể hiện qua bảng 1.4.

Bảng 1.4. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 2006 - 2013

Diện tích Sản lượng Năng suất Năm (triệu ha) (triệu tấn) (tạ/ha)

2006 1,033 3,85 37,31

2007 1,096 4,30 39,26

2008 1,440 4,57 31,75

2009 1,089 4,37 40,14

2010 1,126 4,61 40,90

2011 1,121 4,84 43,13

2012 1,118 4,80 42,95

2013 1,170 5,19 44,35

Nguồn: FAOSTAT 2014 [48]

Nhìn chung sản lƣợng ngô của nƣớc ta ngày càng tăng. M c dù diện

tích gieo trồng không tăng nhiều năm 2006 là 1,033 triệu ha đến năm 2013 là

1,170 triệu ha nhƣng năng suất tăng mạnh từ 3,85 triệu tấn lên 5,19 triệu tấn.

Năm 2008 diện tích gieo trồng tăng mạnh lên 1,440 triệu ha nhƣng năng suất

chỉ đạt 31,75 tạ/ha. Đến năm 2009 thì diện tích này lại giảm xuống chỉ còn

1,089 triệu ha nhƣng năng suất lại đạt trên 40 tạ/ha. Qua những số liệu này

cho ta thấy những hạn chế trong nền sản xuất nƣớc nhà. Trong những năm

gần đây do có sự đầu tƣ về khoa học kỹ thuật, áp dụng các công nghệ mới

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trong sản xuất vì vậy năng suất gieo trồng ngày càng đƣợc cải thiện.

1.2. MỌT NGÔ VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA MỌT NGÔ ĐẾN QUÁ

TRÌNH BẢO QUẢN NÔNG SẢN

1.2.1. Đặc điểm của mọt hại ngô (Sitophilus zeamais Motschulsky)

1.2.1.1. Sơ lược về mọt hại ngô

Mọt hại ngô (gọi tắt là mọt ngô) có tên khoa học là Sitophyllus zeamais

Motsch, thuộc bộ Coleoptera, họ Curculionidae. Mọt ngô là loại đa thực,

chúng có thể ăn đƣợc hầu hết các loại ngũ cốc, các loại đậu, hạt có dầu và

nhiều sản phẩm thực vật khác. Thức ăn thích hợp nhất với nó là ngô hạt. Mọt

này có phổ biến ở hầu hết các nƣớc trên thế giới, nhất là ở châu Á, vùng Địa

Trung Hải (Châu Âu) và Bắc Mỹ. Ở nƣớc ta trong các kho lƣơng thực, nhất là

kho bảo quản ngô, gạo thƣờng g p loài mọt này. Mọt có thể đẻ trứng ở ngoài

đồng và cả trong kho. Nó thuộc loại phá hoại nghiêm trọng [35].

Con đ c Con cái

Hình 1.1. Mọt ngô Sitophilus zeamais

Mọt gây hại trên bắp và hạt ngô ngay giai đoạn ngô chín sáp ngoài

đồng, chúng theo ngô vào kho và gây hại liên tục trong suốt quá trình bảo

quản. Trong kho mọt hoạt động nhanh nhẹn, hay bay bò và có tính giả chết,

chúng thích bò lên các vị trí cao trong đống hạt. Khi g p điều kiện độ nhiệt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

cao, mọt thƣờng tập trung vào k kho, mép bao… để ẩn nấp.

1.2.1.2. Đặc điểm hình thái của mọt ngô

Giai đoạn trƣởng thành mọt ngô rất giống mọt gạo, vì thế trong phân loại trƣớc đây, có nhiều ý kiến khác nhau. Có ngƣời cho rằng mọt ngô và mọt gạo là cùng loài nhƣng khác tên, nhiều ngƣời khác cho rằng mọt ngô và mọt gạo là 2 loài độc lập với nhau [33]. Cho đến nay, mọt ngô đƣợc xem nhƣ một loài riêng biệt, rất gần với mọt gạo. Về hình dạng ngoài, mọt ngô rất giống mọt gạo, nhƣng kích thƣớc cơ thể lớn hơn (3,5- 5mm). Cánh trƣớc trơn bóng và các điểm màu đỏ tròn cánh khá rõ. Các lỗ chấm trên tấm lƣng ngực trƣớc thô và dày ở phía trƣớc. Do đó việc phân biệt chủ yếu dựa vào dạng cơ quan sinh dục đực (penis) ở mọt gạo có hình bán nguyệt, còn ở mọt ngô là hình 3 góc. Bề m t phía trên của penis ở mọt gạo đơn giản, không có lông dài, còn ở mọt ngô thì có 2 lông dài. Đầu máng đẻ trứng của con cái mọt gạo có hình chữ Y, còn của mọt ngô là hình móc nhọn.

Các lỗ chấm ở ngực trƣớc khá trơn và không có vùng lỗ chấm lộn xộn ở giữa. Chấm lõm trên đầu rất rõ ràng. Đoạn trƣớc trán rất bằng dẹt, phần gốc vòi có 3 chiếc máng, dọc theo viền mép ngực trƣớc còn có một dảy chấm lõm. Chấm lõm trên mảnh lƣng ngực trƣớc hình tròn, ở khu giữa chấm lõm rất dày, chấm lõm ở 2 cạnh gần nhƣ hỗn hợp lại. Cánh cứng có 2 vệt chấm màu trắng đỏ, một ở bên vai, một ở gần đoạn cuối. Chấm lõm ở m t bụng thân mình dày hơn. Cánh sau phát triển và có thể bay đƣợc. Cánh màu nâu đen bóng. Các điểm vá màu vàng đỏ hình bán nguyệt rất rõ. Trên m t ngoài của gai giao cấu (Aedeagus) con đực có các rãnh chạy dọc; các con cái đầu nhánh r hình chữ Y hóa cứng mạnh nên nhọn.

Giai đoạn trứng có đ c điểm: dài 0,5-0,7mm, rộng 0,25- 0,3mm, hình bầu dục hơi dài màu trắng sữa. Giai đoạn sâu non: Khi đã lớn dài 3-3,2 mm, rất mập, lƣng cong lại nhƣ hình bán nguyệt, m t bụng tƣơng đối bằng. Toàn thân màu sữa đến màu nâu nhạt. Giai đoạn nhộng: dài 3-4 mm, hình bầu dục, cân đối 2 đầu, lúc đầu màu vàng sữa sau chuyển sang màu vàng nâu.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Cũng nhƣ mọt gạo, mọt ngô có thể bay đƣợc, nó còn bay mạnh hơn mọt gạo cho nên mọt ngô đã gây hại ngay từ ngoài đồng. Trên các ruộng ngô ở Tây Nguyên, mọt ngô thƣờng xuất hiện và phát triển vào thời kỳ chuẩn bị thu hoạch [8], [29].

1.2.1.3. Đặc điểm về chu kì sống

Khả năng sinh trƣởng và phát triển của mọt ngô trong ngô hạt là lớn

nhất, sau đó mới đến thóc và các ngũ cốc khác.

Toàn bộ thời gian phát triển cho vòng đời của S. zeamais trung bình 36

ngày. Thời gian phát triển này là gần giống nhƣ S. oryzae và nhanh hơn so với

S. granarius khoảng 7 ngày trong điều kiện tƣơng tự. Hầu hết trứng đƣợc lắng

đọng trong nội nhũ. Tốc độ sinh sản tối đa của mỗi con cái đạt 6,7/quả

trứng/ngày, thời gian phát triển và số lƣợng các thế hệ con cháu sản xuất là tối

ƣu ở 30 C và độ ẩm 75% [51].

Khi đẻ trứng, mọt dùng vòi khoét một lỗ sâu vào hạt, rồi đẻ trứng vào

những lỗ này, sau đó tiết ra một thứ dịch nhầy để bít kín lỗ đó lại. Sâu non nở

ra ăn hại ngay trong hạt và lớn lên. Khi ăn hạt, nó thƣờng ăn phôi trƣớc, sau

đó mới đến nội nhũ và các bộ phận khác làm hạt chỉ còn lại một lớp vỏ mỏng,

nhìn bề ngoài dễ lẫn với hạt còn nguyên vẹn. Khi đẫy sức, sâu non đục những

lỗ nhỏ lộ rõ trên m t hạt để vũ hoá bay ra ngoài. Tùy theo điều kiện mà mọt

đẻ ít hay nhiều, nhiều nhất mỗi con cái có thể đẻ đƣợc 384 trứng [47].

Thức ăn có ảnh hƣởng rất lớn đến đời sống của mọt, trong cùng một

điều kiện độ nhiệt và độ ẩm nhƣ nhau, nuôi mọt ngô bằng thức ăn khác nhau

đã thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Khi nuôi bằng ngô hạt, thời gian vòng đời của

mọt là 34 ngày; khi thay bằng loại thức ăn khác là gạo, thời gian vòng đời s

là 47 ngày; thóc là 53 ngày.

Ở nhiệt độ 0 C, mọt có thể sống đƣợc 37 ngày, ở -5 C mọt chết sau 23

ngày, còn ở -10 C tất cả các giai đoạn phát triển của mọt chết sau 13 ngày. Ở

55 C, mọt chết sau 6 giờ, ở 60 C chết sau 2 giờ. Trong điều kiện độ nhiệt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

25 C mọt có thể sống không có thức ăn 18 - 26 ngày [31], [47].

1.2.2. Côn trùng hại ngô trong quá trình bảo quản nông sản

Sau khi thu hoạch, ngô cần đƣợc bảo quản để sử dụng làm lƣơng thực,

thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nhiều mục đích khác nhau. Do vậy, bảo quản

đúng kỹ thuật s góp phần giảm tỷ lệ hao hụt, thối hỏng ở mức thấp nhất. Đ c

biệt, với đ c điểm khí hậu nƣớc ta nóng ẩm quanh năm, nấm mốc, mối mọt,

côn trùng động vật hại phát triển mạnh. Có nhiều loại côn trùng hại ngô, chúng

có khả năng thích ứng rộng với điều kiện ngoại cảnh và có sức sinh sản nhanh.

Ngô là loại cây trồng bị nhiều loại sâu bệnh gây hại. Những ngƣời làm

công tác bảo vệ thực vật đã thống kê đƣợc hơn 100 loài sâu hại và gần 100

loại bệnh hại ngô [4]. Theo kết quả điều tra của Nguyễn Thị Giáng Vân và cs

đã ghi nhận đƣợc thành phần côn trùng trong kho của Việt Nam gồm 46 loài

sâu mọt hại lƣơng thực cất trữ trong 28 tỉnh thuộc 3 miền Bắc, Trung và Nam

[21]. Trong số này có 38 loài mọt thuộc bộ Cánh cứng với 19 họ khác nhau, 8

loài mọt thuộc bộ Cánh vảy với 5 họ khác nhau. Trên ngô, sâu mọt chính gồm:

mọt ngô (Sitophilus zeamais), mọt gạo (Sitophilus oryzae), mọt đục hạt

(Rhyzopertha dominica), mọt cà phê (Aracerus fasciculatus), mọt thò đuôi

(Carpophilus pilosellus). Theo kết quả điều tra giai đoạn 1996 - 2000 của Cục

Bảo vệ thực vật trên phạm vi toàn quốc và trên các loại lƣơng thực khác nhau đã

thu thập đƣợc 115 loài sâu mọt hại thuộc 44 họ trong 8 bộ và 1 lớp nhện [19].

Sự phá hại của côn trùng rất đa dạng. Trƣớc hết phải kể đến làm giảm

phẩm chất ho c làm cho vật dữ trự bị giảm hay mất hoàn toàn giá trị sử dụng.

Thiệt hại do sâu bệnh hại gây ra cho các loại cây lƣơng thực (trong đó có ngô)

ƣớc tính hàng năm từ 10 - 30%. Ở nƣớc ta, theo kết quả điều tra của Trần Văn

Chƣơng và cs về tổn thất ngô sau thu hoạch trung bình lên tới 15%, cá biệt ở

miền núi lên tới 20-25% sau 6 tháng bảo quản [1]. Số liệu điều tra của

Nguyễn Văn Liêm và cs thì thiệt hại do các loại mọt gây ra trên ngô ở vùng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bắc Hà - Lào Cai sau 12 tháng bảo quản lên tới 38,95%. Đối với ngô lai, tổn

thất sau thu hoạch còn có thể cao hơn do loại ngô này thƣờng có hàm lƣợng

protein cao, vỏ mỏng nên rất dễ bị mốc. Thông thƣờng giá ngô giảm 10 - 20%

sau khoảng 3 - 6 tháng tồn trữ nếu bị nhiễm mọt và nấm mốc. Ở Việt Nam,

mọt ngô Sitophilus zeamais đƣợc coi là đối tƣợng nguy hiểm hàng đầu trên

ngô giai đoạn sau thu hoạch [22].

Theo FAO (1999), hàng năm trên thế giới mức tổn thất về lƣơng thực

trong bảo quản trung bình từ 6-10 %, riêng ở Việt Nam thì tỷ lệ này là 8-15

%. Đối với sản xuất ngô, tổn thất sau thu hoạch là rất lớn. Riêng về số lƣợng

dao động trong khoảng 18-19 %, thậm chí là 23-28 % tùy theo vùng và vụ

mùa thu hoạch. Đối với ngô lai bị thiệt hại nhiều hơn do vỏ mỏng và có hàm

lƣợng protein cao [22].

Mọt ngô là một trong những loài gây hại trong quá trình bảo quản

lƣơng thực. Gần đây, nguồn kháng mọt ngô là một yếu tố quan trọng đã đem

lại sự thành công cho một chƣơng trình nhân giống để giải quyết những thiệt

hại về hạt sau khi thu hoạch. Mục tiêu của của nghiên cứu này nhằm đánh giá

sức đề kháng của các gen ở ngô đối với mọt ngô, và đó là một tiêu chuẩn để

họ sử dụng trong chƣơng trình nhân giống. Tổng cộng có 175 kiểu gen đã

đƣợc thử nghiệm về tính kháng mọt ngô, khối lƣợng hạt ngô giảm, trọng

lƣợng của hạt ngô bị hỏng và hạt không bị hƣ hỏng đều đƣợc đo. Sự khác biệt

đáng kể (P < 0,001) đã đƣợc quan sát giữa các kiểu gen của tất cả các đ c

điểm đánh giá. Sự phân bố của các kiểu gen giữa các loại khác nhau của tính

kháng là một dấu hiệu của sự tồn tại biến dị di truyền. Các kiểu gen kháng nhất

là ở giống ngô CKPH08003 và BRAZ2451, trong khi dễ bị mọt nhất là ở

PH3254 và BRAZ4, trong số các giống lai và giống tƣơng ứng. Phần khối lƣợng

hạt giảm, và trọng lƣợng bột đƣợc xác định là những đ c điểm quan trọng nhất

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

để phát hiện các kiểu gen có tính kháng côn trùng qua phân tích [36].

Nhƣ vậy, những thiệt hại do mọt ngô đem lại là rất lớn, không những

làm giảm số lƣợng, chất lƣợng, và giá trị thƣơng phẩm (làm giảm protein,

lipid, vitamin, …), mà còn gây thiệt hại về kinh tế, đồng thời cũng làm giảm

sức nảy mầm của hạt. Do đó, trong những năm gần đây đã có rất nhiều nhà

khoa học đã và đang nghiên cứu các gen, nhóm gen có liên quan đến khả

năng chống lại sâu mọt, nhằm hạn chế những tổn thất do chúng gây ra trong

quá trình bảo quản, và tạo ra những giống có khả năng kháng mọt và thích

nghi với những điều kiện ngoại cảnh bất lợi, để đem lại hiệu quả cao nhất.

1.3. CYSTEINE PROTEINASE VÀ CYSTATIN

1.3.1. Cysteine proteinase

Cysteine proteinase là enzyme có vai trò thiết yếu trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật, sự già và chết theo chƣơng trình của tế bào, sự tích lũy protein trong hạt, huy động protein dự trữ và khả chống chịu với sâu bệnh, stress của môi trƣờng.

Trong cơ thể sống cysteine proteinase thực hiện nhiều chức năng quan trọng nhƣ: trƣởng thành protein, làm mới protein để phù hợp với những thay đổi bên ngoài và loại bỏ protein bất thƣờng [18].

Trong điều kiện hạn hán, cystatin protease giảm biểu hiện ở các giống có khả năng chịu hạn và không thay đổi hay là tăng ở các giống có khả năng chịu hạn kém. Cystatin đóng vai trò nhƣ là cơ chất để xâm nhập vào trung tâm hoạt động của cystatin protease, ức chế khả năng hoạt động của enzyme.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Dựa vào gốc amino acid thiết yếu ở vị trí trung tâm hoạt động, sự thay đổi hoạt động ở pH tối ƣu, sự tƣơng đồng của trình tự amino acid và sự tƣơng đồng về các chất ức chế mà ngƣời ta phân proteinase thành 4 nhóm proteinase bao gồm: serine-, cysteine-, aspartic- và metallo- proteinase. Trong bốn nhóm này, một lƣợng lớn chất ức chế của serine- và cysteine- proteinase đã đƣợc nghiên cứu nhiều trong khi các chất ức chế của aspartic- và metallo- proteinase vẫn còn nhiều bí ẩn [18].

Cysteine proteinase xúc tác phân cắt chuỗi peptide ở vị trí bên trong

mạch polypeptide (endopeptidyl hydrolase). Trung tâm hoạt động của enzyme

này có chứa nhóm sunfuhydryl (hay còn gọi là thiol, nhóm SH), đây là nhóm

có khả năng phản ứng cao. Nhóm sunfuhydryl tham gia vào nhiều hoạt động

biến đổi hóa học.

Cystatin đƣợc phân bố ở cả động vật, thực vật và vi sinh vật. Quá trình

phân giải protein thực vật diễn ra phức tạp với sự tham gia của nhiều enzyme,

bằng nhiều con đƣờng khác nhau trong các thành phần khác nhau của tế bào.

Cysteine proteinase chiếm tới 30% tổng hoạt động phân giải protein và liên

quan đến quá trình tiêu hóa, hoạt hóa tiền enzyme, giải phóng các peptide

hoạt động sinh lí, hoạt hóa bổ sung và các quá trình viêm…

Cysteine proteinase hoạt động bằng cách loại bỏ đoạn amino tận trong

chuỗi polypeptide để tạo ra các enzyme hoạt động. Vùng amino tận (hay còn

gọi là proregion) không những giữ vai trò trong việc ức chế hoạt động của

enzyme mà còn giúp protein mới đƣợc tổng hợp cuộn xoắn chính xác và bảo

vệ enzyme chống lại tác động bất lợi của ngoại cảnh.

Trong động vật có xƣơng sống, các proteinases cysteine đƣợc tham

gia vào hệ thống phân hủy protein lysosome. Trong động vật không có

xƣơng sống nhƣ giun tròn, proteinases cysteine là một trong các enzym tiêu

hóa [39]. Trong động vật chân đốt nhƣ tôm hùm, chúng đóng vai trò tiêu

hóa, nhƣng cũng có liên quan trong hệ thống thần kinh [25]. Trong côn

trùng, chúng đƣợc sử dụng trong quá trình tiêu hóa nhƣng đƣợc tìm thấy

trong nhiều mô khác [39]. Các nghiên cứu về sự phụ thuộc độ pH của hoạt

động proteinase cysteine trong chiết xuất dầu thô của ấu trùng côn trùng đã

chỉ ra rằng, chúng hoạt động chủ yếu trong phạm vi pH kiềm, đó là độ pH

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tối ƣu cho các hoạt động của proteinases cysteine [24], [26], [42].

Ở thực vật, cysteine proteinase đƣợc tìm thấy chủ yếu trong không bào

và có thể tham ra biến đổi protein dự trữ trong suốt quá trình nảy mầm của

hạt, điều đó cung cấp nguồn dinh dƣỡng nitơ hỗ trợ cho sự phát triển của cây

non, ngoài ra cystatin proteinase còn đƣợc tìm thấy ở môi trƣờng ngoại bào

cây sung và cây đu đủ [14].

1.3.2. Cystatin - chất ức chế Cysteine proteinase

Cystatin (CYS) là chất ức chế có bản chất là protein. Chúng có m t trong vi

sinh vật, động vật và thực vật. Trong những năm gần đây bàn luận nhiều về mối

liên quan giữa cystatin tới tính chống chịu yếu tố bất lợi của ngoại cảnh nhƣ : hạn,

lạnh, muối, sự già và bảo vệ thực vật chống lại côn trùng, vi sinh vật gây bệnh và

đ c biệt là tính kháng mọt. Protein này có mối quan hệ về m t cấu trúc và chức

năng với chất ức chế của cysteine proteinase, nó đƣợc mô tả lần đầu tiên ở lòng

trắng trứng gà và sau đó đƣợc gọi là cystatin lòng trắng trứng gà [20], [24].

Lƣợng cystatin có sự thay đổi theo bậc thang tiến hóa, thể hiện vai trò

quan trọng trong sự thích nghi của thực vật, điều này đƣợc chứng minh qua

việc nghiên cứu nguồn gốc và sự tiến hóa của các cystatin, papain và cystatin

proteinase ở thực vật [22], [38].

Các cystatin kìm hãm hoạt động của cysteine protenase có liên hệ với

nhau về m t tiến hóa, hình thành nên siêu họ cystatin. Các thành viên của siêu

họ này đƣợc phân chia thành ba nhóm có mối liên hệ ch t ch với nhau, sự

phân loại đó dựa trên sự tƣơng đồng của trình tự bậc một, khối lƣợng phân tử,

số lƣợng liên kết disulfide và sự định vị của chúng trong tế bào.

Cystatin họ 1, đƣợc biết là họ stefin, không chứa liên kết disulfide ho c

các nhóm carbohydrate, nó có trọng lƣợng phân tử khoảng 11 kDa, gồm 100

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

gốc amino acid.

Cystatin họ 2, là protein có 2 liên kết disulfide trong chuỗi ở gần đầu carbon cuối cùng và đƣợc glycosyl hóa, có trọng lƣợng phân tử khoảng 13 - 24 kDa với 115 amino acid.

Cystatin họ 3, có tên là Kininogen, bao gồm các Kininogen huyết tƣơng, nó lớn hơn các thành viên khác của hai họ kia và hầu hết các phức hợp phân tử cystatin có trọng lƣợng phân tử cao (60 - 120 kDa) với khoảng 355 gốc amino acid có chứa các liên kết disulfide. Các kininogen giữ vai trò quan trọng trong quá trình đông máu.

Ngoài ba họ trên, dựa vào sự khác nhau giữa cystatin phân lập từ động vật và thực vật, ngƣời ta còn bổ sung thêm họ phytocystatin [21], gồm hầu hết các chất ức chế cysteine proteinase của thực vật, chúng có tính chất chung với hầu hết các cystatin họ I và II. Trong họ phytocystatin thì oryzacystatin từ hạt gạo là chất ức chế nguồn gốc thực vật đầu tiên đƣợc nghiên cứu. Nó có mối liên hệ về m t cấu trúc và chức năng với cystatin lòng trắng trứng gà. Oryzacystatin cũng đƣợc xếp vào cystatin nhóm I do sự vắng m t của liên kết disulfide, chuỗi pentapeptide cũng đƣợc tạo thành bởi Gln-Val-Val-Ala-Gly (gốc thứ 57 - 61) và khối lƣợng phân tử xấp xỉ 11,5 kDal với 102 gốc amino acid. Trình tự amino acid của oryzacystatin giống 30% với cystatin họ II, nó có vùng trình tự Phe-Ala-Val (gốc thứ 29 - 31) và Phe - Try (gốc thứ 83 - 84), điều đó chứng tỏ oryzacysstatin cũng có thể xếp vào nhóm cystatin họ II.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Gen cystatin đƣợc phân lập đầu tiên từ mRNA của cây lúa, ký hiệu là OC1 có đoạn mã hóa dài 309 nucleotide, mã hóa phân tử protein dài 102 amino acid [18]. Ở cây đậu xanh, gen cystatin đƣợc Kang và cs phân lập, đọc trình tự từ mRNA và công bố tại ngân hàng gen Quốc tế có mã số D38130 với kích thƣớc 304 nucleotide, đoạn mã hóa gồm 267 nucleotide mã hóa 88 amino acid [50]. Cũng thuộc nhóm cây đậu đỗ, gen cystatin ở cây đậu tƣơng khá lớn, có kích thƣớc 5863 bp trên đó có 4 exon và 3 intron đƣợc Misaka phân lập năm 2000 [48]. Ở cây lạc, Vũ Thị Thu Thủy cũng đã phân lập đƣợc đoạn gen cystatin có chiều dài 461 bp với 2 exon và 1 intron; Protein do gen mã hóa có 98 amino acid [18]. So với gen cystatin phân lập từ DNA hệ gen, gen cystatin phân lập từ mRNA chiếm số lƣợng lớn hơn.

Kết quả nghiên cứu ở ngô cho thấy, có 10 gen cystatin của ngô, các gen

ký hiệu là CC gồm có CC1, CC2, CC3, CC4, CC5, CC6, CC7, CC8, CC9, và

CC10. Trong 10 gen cystatin ở ngô, có 9 gen đƣợc phân lập từ mRNA, chỉ có

gen CC1 phân lập từ DNA. Kích thƣớc gen CC1 chứa 2024bp, trong đó có 3

exon và 2 intron, 3 exon mã hóa phân tử protein dài 134 amino acid. Sự biểu

hiện của gen cystatin là khác nhau ở các thời kỳ phát triển khác nhau của cây

ngô. Trong 10 gen cystatin ở ngô, CC1 ƣu tiên biểu hiện trong cờ non, hai gen

CC8, CC10 biểu hiện trong việc phát triển hạt, 7 gen CC còn lại biểu hiện

trong hai ho c nhiều mô khác nhau. Riêng trong điều kiện chịu ảnh hƣởng của

sự thiếu hụt nƣớc có tới 5 gen cùng biểu hiện, đó là các gen CC2, CC3, CC4,

CC5 và CC9 [34].

Gen cystatin đã đƣợc nghiên cứu và phân lập ở táo [40], lúa [27], cà rốt

[37], đậu tƣơng [28], khoai tây [44], đậu đũa [30] và ngô [17], [23].

Nghiên cứu về tác động của chất ức chế proteinase lên sinh lý tiêu hóa

của côn trùng là một lĩnh vực quan trọng và đã thu đƣợc những kết quả đáng

kể trong công tác kiểm soát sinh học đối với côn trùng có hại. Nhiều nghiên

cứu về tƣơng tác của chất ức chế proteinase lên chế độ ăn của côn trùng đã

đƣợc phát triển trong một thời gian dài. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra

rằng, khi có m t các chất ức chế này trong thức ăn của côn trùng có hại s làm

tăng tỷ lệ tử vong. Soyacystatin (scN) có khả năng ức chế sự sinh trƣởng của

mọt đậu đũa (C. maculatus) thế hệ I và II [32]. Oryzacystatin – I dạng dại và

dạng đột biến (có tên là OC – Idelta D86 – bị loại bỏ gốc Asp86) đều biểu

hiện tác động xấu lên sự sinh trƣờng và phát triển của Globodera pallida (một

loại giun tròn ký sinh thực vật).

Vì vậy, một hƣớng nghiên cứu mới với những ứng dụng thực tiễn trong

việc tạo ra thực vật chuyển gen ức chế proteinase nhờ công nghệ DNA tái tổ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hợp để nâng cao khả năng kháng mọt của cây trồng [45].

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU

khuyễn nông TP. Hà Giang; CB (Cao Bằng) - Trạm Khuyến nông – Khuyến lâm

thành phố Cao Bằng; BK (Bắc Kạn) – Trạm khuyến nông huyện Ba Bể; TQ

- Sử dụng 6 giống ngô để làm vật liệu nghiên cứu: HG (Hà Giang) – Trạm

nông TP. Thái Nguyên; BG (Bắc Giang) – Trạm khuyến nông huyện Tân Yên.

(Tuyên Quang) – Trạm khuyến nông Hàm Yên; TN (Thái Nguyên) – Trạm khuyến

2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.2.1. Hóa chất

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và chuyên dụng có nguồn gốc từ

các hãng nổi tiếng trên thế giới (hãng Invitrogen, Fermentas), bao gồm:

Enzyme Taq-polymerase, buffer PCR, SDS, EDTA, Tris, agarose…

2.2.2. Thiết bị

Thiết bị sử dụng là các thiết bị hiện đại của các hãng nổi tiếng đƣợc trang bị

tại các phòng thí nghiệm, đảm bảo độ chính xác cho kết quả của thí nghiệm.

Các thiết bị sử dụng gồm có:

+ Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ) + Máy PCR (Mỹ)

+ Bộ điện di (Mỹ) + Máy đo pH 151 Martini (Nhật)

+ Bể ổn nhiệt (Mỹ) + Máy ly tâm lạnh Hettich (Đức)

+ Máy lắc (Hàn Quốc) + Tủ lạnh sâu -80o C, -20o C (Italy)

+ Máy đo quang phổ (Đức) + Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức)

+ Máy soi gel (Mỹ) + Nồi khử trùng (Đài Loan)

+ Cân kĩ thuật (Đức) + Máy vortex (Mỹ)

Ngoài các thiết bị trên còn cần một số đồ dụng thiết bị cần thiết khác

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

phục vụ cho nghiên cứu.

2.2.3. Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm đƣợc tiến hành tại phòng Công nghệ DNA và ứng dụng

Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam, phòng thí nghiệm Sinh học Trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái

Nguyên.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phương pháp sinh lí

Để đánh giá nhanh khả năng kháng mọt của 06 giống ngô địa phƣơng,

chúng tôi đã thực hiện phƣơng pháp đánh giá tổn thất thức ăn theo tác giả Hà

Quang Hùng [9].

Tính lƣợng thức ăn hao hụt sau một thời gian theo dõi đối với loài mọt

ngô Sitophilus zeamais bằng cách bố trí 2 lô theo dõi: lô thí nghiệm (thả mọt)

nhắc lại 3 lần và lô đối chứng (không thả mọt). Cân 50 g ngô cho vào một lọ

nhựa, mỗi lọ nhựa thả 15 c p mọt trƣởng thành. Ðộ hao hụt do mọt tiêu hao

đƣợc theo dõi sau 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày, 50 ngày, 60 ngày.

Trọng lƣợng thức ăn hao hụt đƣợc tính theo công thức:

P = 50 – Pt – P0 (g)

Trong đó:

P: trọng lƣợng thức ăn hao hụt ở công thức thí nghiệm

Pt: trọng lƣợng thức ăn cân đƣợc sau một thời gian bảo quản

P0: trọng lƣợng thức ăn hao hụt ở công thức đối chứng

50 g: trọng lƣợng thức ăn đƣa vào thí nghiệm

2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử

2.3.2.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số

Chúng tôi tiến hành tách chiết RNA tổng số bằng Trizol Reagent Kit

Quy trình tách chiết RNA tổng số:

- Nghiền mẫu bằng nitơ lỏng (100 mg lá ngô non). Bột đã nghiền cho

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

vào ống eppendorf 2 ml

- Bổ sung 1ml Trizol để 3 phút ủ đá.

- Bổ sung 0,2 ml Chloroform vào ống, lắc mạnh trong 15 giây, để 3 phút

ủ đá. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC.

- Hút 400 µl chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml. Bổ sung 0,5 ml

isopropanol, ủ ở - 20oC trong 30 phút.

- Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa

- Rửa tủa với cồn 70% DEPC. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong vòng 10

phút. Sấy khô mẫu.

- Bổ sung 30 µl DEPC – H2O.

- Sử dụng 1µl để định lƣợng RNA tổng số bằng máy Nano drop.

2.3.2.2. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của RNA tổng số

Kiểm tra độ tinh sạch của RNA bằng 2 phƣơng pháp:

(1) Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ

Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của RNA trên máy quang phổ ở bƣớc

sóng λ = 260 nm và λ = 280 nm. Hàm lƣợng và độ sạch của nucleic acid trong

dung dịch tách chiết đƣợc tính theo công thức:

Hàm lƣợng RNA (ng/μl) = OD260×40× hệ số pha loãng.

Độ sạch RNA = OD260/OD280.

Trong đó:

OD260: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260 nm

OD280: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 280 nm

Nếu độ sạch RNA = 1,8 - 2,0 thì mẫu đƣợc coi là sạch.

(2) Phƣơng pháp điện di

Điện di RNA bằng bộ điện di, chạy điện di ở điện thế 110V với gel

agarose 0,8% trong dung dịch TAE 1X. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng

ethidium bromide, sau đó đƣợc soi dƣới ánh đèn UV và chụp ảnh.

Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của RNA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.

2.3.2.3. Phương pháp tổng hợp cDNA

Tổng hợp cDNA từ mRNA theo bộ kit ReverdAid First Stand cDNA

Synthesis (Thermo Scientific).

Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA

Thể tích (µl) STT Thành phần

1 1 Mồi OligoT

2 RNA khuôn 6

3 5

H2O (DEPC) Mix nhẹ, ủ ở 650C trong 5 phút, sau đó cho ngay

vào đá.

Tiếp theo bổ sung thêm các thành phần sau:

4 4 5X Reaction Buffer

5 1 RiboLock RNase Inhibitor (20 U/µl)

6 2 dNTP 10 Mm

7 1 RevertAid H Minus Transcriptase (200 U/µl)

Tổng thể tích Ủ 25OC trong 5 phút - 42OC trong 60 phút – 70OC

trong 5 phút. Bƣớc cuối ủ 4OC.

Điện di sản phẩm trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X. Sau đó

nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣới ánh đèn tử ngoại.

2.3.2.4. Kỹ thuật PCR

Sau khi tổng hợp xong cDNA, tiến hành khuếch đại sản phẩm gen phục

vụ cho bƣớc gắn gen vào vector tách dòng pBT theo phƣơng pháp của

Sambrook và cs (2001) [41].

Chúng tôi sử dụng c p mồi đ c hiệu dùng cho phản ứng gồm mồi xuôi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

và mồi ngƣợc có trình tự nhƣ sau:

Bảng 2.2. C p mồi nhân gen Cystatin 10

Nhiệt ộ

Mồi

Trình tự mồi (5’ – 3’)

CYS10-F CGT CGA CGA TGG CTC GTG GGC TCG GCG CTT

gắn mồi 580C

CYS10-R CAA GCT TGT TAC TTG GCG GCC GCC GGC GCG

580C

Thực hiện phản ứng PCR nhân gen Cystatin 10 với chu trình nhiệt:

35 chu kỳ

94oC 94oC

72oC 72oC 4 phút 30 giây

7 phút 45 giây

58oC 30 giây

4oC ∞

- Thành phần phản ứng RT-PCR nhân gen Cystatin10 ở ngô đƣợc trình

bày ở bảng 2.3.

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RT-PCR nhân gen Cystatin 10

STT Thành phần Thể tích (μl)

PCR Master Mix 12,5 µl 1

1 µl 2 cDNA (50ng/µl)

1 µl 3 Mồi xuôi (10pM/µl)

1 µl 4 Mồi ngƣợc (10pM/µl)

9,5 µl 5 H2O

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

25 µl Tổng

Sau khi thu đƣợc sản phẩm nhân gen, chúng tôi tiến hành kiểm trên gel

agarose 1%, nhuộm bản gel trong ethidium bromide. Sau đó chụp ảnh dƣới

ánh sáng của đèn cực tím.

2.3.2.5. Làm sạch sản phẩm PCR

Sau khi nhân đƣợc gen, bƣớc tiếp theo là cần thu nhận gen ở dạng sạch

và không lẫn gel agarose để sử dụng cho công việc tạo dòng. Vì vậy, chúng

tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR theo bộ kít GeneJET Gel Extraction Kit

của hãng Thermo. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:

- Điện di sản phẩm PCR (một giếng sản phẩm, một giếng marker).

- Cắt giếng marker và giếng đối chứng nhuộm trong ethidium bromide

10phút và soi dƣới ánh đèn cực tím.

- Cắt gel có sản phẩm cho vào ống Eppendorf 1,5 ml.

- Cân gel theo quy ƣớc 1 mg tƣơng đƣơng 3µl.

- Bổ sung dịch bám (binding solution) theo tỷ lệ 1: 1. - Ủ ở nhiệt độ 50 - 600C trong 15 phút, trộn nhẹ cho gel tan hoàntoàn.

- Chuyển hỗn hợp lên cột thôi gel, ly tâm 12000 vòng/ phút, 1 phút,

bỏ dịch.

- Bổ sung 700µl dung dịch rửa (wash solution) vào cột, ly tâm 12000

vòng/ phút, 1 phút, bỏ dịch.

- Ly tâm cột tiếp 12000 vòng/ phút,1 phút. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút.

- Hòa tan trong 30µl nƣớc khử ion, đ t cột sang ống Eppendoft mới.

- Ly tâm 12000 vòng/ phút, 3 phút. Thu dịch, loại bỏ cột. - Sản phẩm đƣợc giữ ở -20oC.

2.3.2.6.. Tách dòng gen

Tạo plasmid tái tổ hợp

Sản phẩm PCR đã làm sạch đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

với thành phần phản ứng trong bảng 2.4.

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen Cystatin 10 vào vector PBT

Thể tích STT Thành phần (µl)

Gen Cystatin 10 đã đƣợc tinh 1 5,0 sạch

2 Buffer T4 ligase 1,0

3 Vector pBT 1,0

4 T4 ligase (2 unit/µl) 1,0

5 2,0 H2O

Tổng 10,0

Hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ 22o C trong 1 giờ và sau đó đƣợc biến nạp

vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5 .

Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5

Biến nạp là quá trình chuyển DNA plasmid trực tiếp vào tế bào thể nhận.

Cơ chế biến nạp là việc làm thay đổi thành phần cấu trúc thành tế bào của vi

khuẩn để DNA plasmid dễ dàng vào tế bào thể nhận. Những tế bào có khả

năng tiếp nhận DNA plasmid ngoại lai đƣợc gọi là tế bào khả biến. Quá trình

biến nạp DNA vào tế bào E.coli đƣợc tiến hành nhƣ sau:

- Tế bào khả biến lấy trong tủ -800C. Sau đó để trên đá trong 10 phút.

- Cho 10 µl vector tái tổ hợp vào ống chứa tế bào khả biến E.coli

DH5α, trộn nhẹ, đ t ổn định trên đá 10 phút.

- Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút 30 giây, đ t trong đá 10 phút.

- Bổ sung 500 µl LB lỏng vào ống tế bào đã sốc nhiệt, sau đó đem đi

nuôi phục hồi ở 37oC trong 1h.

- Lấy ra cấy trải trên môi trƣờng LB đ c có kháng sinh ampicilin (100

mg/l), IPTG (0,1 mM) và X - gal (40 mg/l). Chọn khuẩn lạc có màu trắng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nuôi qua đêm trong môi trƣờng LB lỏng (có bổ sung ampicilin 100 mg/l).

Kiểm tra sản phẩm chọn dòng

Để kiểm tra sản phẩm chọn dòng, chúng tôi tiến hành lấy 2 ml dịch nuôi

chứa vi khuẩn E.coli đã đƣợc biến nạp đem đi li tâm, thu c n, bổ sung 20 µl

H2O thu đƣợc tế bào E.coli có khả năng mang vector tái tổ hợp. Sau đó thực

hiện phản ứng PCR với c p mồi đ c hiệu nhân gen.

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng colony – PCR

Thành phần Thể tích (µl)

PCR Mastermix 2X 7,5

5 TB E.coli đã đƣợc biến nạp

Cystatin F (10pM/µl) 0,5

Cystatin R (10pM/µl) 0,5

1,5 H2O

Tổng 15

Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony – PCR trình bày ở bảng 2.6.

Bảng 2.6. Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony – PCR

Bước Phản ứng Nhiệt ộ (0C) Thời gian Chu kỳ

1 Biến tính 94 4 phút 1

2 Biến tính 94 30 giây

30 3 Gắn mồi 58 30 giây

4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút

5 Hoàn tất kéo dài 72 7 phút 1

6 Kết thúc phản ứng 4 ∞

Sản phẩm PCR chọn dòng đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose

1% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide và chụp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.

2.3.2.7. Tách plasmid tái tổ hợp

- Giữ chủng vi khuẩn : Cho 300 µl glycerol 100% và 700 µl khuẩn cho vào nito lỏng. Sau đó đƣa vào tủ -80oC để bảo quản. Nếu giữ ở tủ -20oC,

lấy 500 µl khuẩn và 500 µl glycerol 50%.

- Tách plasmid:

A. Chuẩn bị

1. Sol I: 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl pH=8,0; 10 mM EDTA

pH=8,0

2. Sol II: 0,2N NaOH; 1% SDS (phá vỡ màng tế bào)

3. Sol III: 60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml acetic acid; 28,5 ml H2O

4. Dung dịch: Phenol: Chloroform(1:1)

5. Lysozyme : 20 mg/ml

Các dung dịch pha ở trên đƣợc bảo quản trong tủ lạnh (trừ dung dịch SolII)

B. Quy trình

1. Hút 2 ml dịch khuẩn cho vào Eppendorf, ly tâm 5000 vòng/phút

trong 5 phút, 40C.

2. Bỏ dịch nổi, thu sinh khối c n

3. Bổ sung 200 µl Sol I, vortex cho tan đều.

4. Bổ sung 10 µl lysozyme 20 mg/ml, đảo nhẹ, để lắng trong đá 10 phút.

5. Bổ sung 400 µl Sol II lắc nhẹ nhàng 5 lần cho tan đều đ t ngay trong đá.

6. Bổ sung 300 µl Sol III đảo nhẹ vài lần để trong đá lạnh (3-5 phút). 7. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Hút dịch nổi (pha trên)

cho vào ống Eppendorf mới.

8. Thêm chloroform: Isoamyl (24:1) theo tỉ lệ 1:1 (v/v) vortex đều, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC. Hút dịch pha trên cho vào ống

Eppendorf mới.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

9. Bổ sung Isopropanol theo tỉ lệ 1:1 để trong tủ -20oC trong 30 phút. 10. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, 40C, loại dịch thu c n.

12. Thêm 1 ml cồn 70% để rửa. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, 40C.

13. Bỏ dịch, thu c n, làm khô.

14. Hòa tan c n trong 30 µl nƣớc chứa RNase. 15. Giữ trong tủ -20oC để bảo quản.

2.3.3. Phương pháp xác định trình t nucleotide

Trình tự của gen Cystatin10 đƣợc xác định trên máy đọc trình tự

nucleotide tự động tại Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam.

2.3.4. Phương pháp xử lí trình t gen

Sử dụng phần mềm BioEdit, BLAST để phân tích, so sánh.

2.3.5. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu

Sử dụng phƣơng pháp thống kê bằng phần mềm Microsoft Office Excel

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

[12].

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA

CÁC GIỐNG NGÔ BẰNG NHIỄM MỌT NHÂN TẠO

Mọt thƣờng tấn công vào phôi trƣớc, sau đó đến nội nhũ và các bộ phận

khác làm cho hạt chỉ còn lại một lớp vỏ mỏng. Thời gian phá hoại của mọt

trong chu kỳ sinh trƣởng tƣơng đối dài. Năng suất, chất lƣợng ngô bị ảnh

hƣởng nhiều khi bị mọt tấn công. Để đánh giá khả năng kháng mọt của các

mẫu ngô nghiên cứu, chúng tôi dựa vào việc tính toán lƣợng thức ăn hao hụt

sau một thời gian theo dõi (10 – 20 – 30 – 40 – 50 – 60 ngày) đối với loài mọt

ngô Sitophilus zeamais. Mỗi lọ thí nghiệm chứa 50 g ngô hạt sau đó tiến hành

gây mọt nhân tạo mỗi lọ thí nghiệm cho vào 15 c p mọt trƣởng thành. Kết

quả số liệu đánh giá kháng mọt đƣợc trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Lƣợng ngô hao hụt theo thời gian của 6 giống ngô nghiên cứu

(Đơn vị: gam)

Ngày

Trung

10 ngày

20 ngày

30 ngày

40 ngày

50 ngày

60 ngày

Mẫu

bình

0,22 ± 0,04 1,14 ± 0,12

1,91 ± 0,13

2,73 ± 0,21

3,40 ± 0,29

4,14 ± 0,41

HG

2,26

0,39 ± 0,13 1,56 ± 0,26

2,90 ± 0,30

4,23 ± 0,37

5,45 ± 0,63

6,99 ± 0,37

CB

3,59

0,94 ± 0,14 2,10 ± 0,24

3,23 ± 0,29

4,41 ± 0,27

5,59 ± 0,43

6,89 ± 0,52

BK

3,86

1,52 ± 0,34 3,06 ± 0,32

4,70 ± 0,48

6,42 ± 0,66

8,00 ± 0,68

9,69 ± 0,73

TQ

5,57

3,04 ± 0,11 5,95 ± 0,11

9,04 ± 0,09

12,15 ± 0,11

15,03 ± 0,27

18,01 ± 0,44

TN

10,54

3,77 ± 0,36 7,41 ± 0,52 10,92 ± 0,67

14,51 ±0,86

18,02 ± 0,85

21,51 ± 0,76

BG

12,69

1,65

3,54

5,45

7,41

9,25

11,20

Trung bình

Kết quả thể hiện ở bảng 3.1 cho ta thấy sau 10 – 20 – 30 – 40 – 50 – 60

ngày, tất cả các giống ngô nghiên cứu đều bị mọt xâm hại, mức độ thức ăn

hao hụt tăng theo thời gian: Sau 10 ngày, lƣơng ngô hao hụt trung bình ở các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

giống ngô nghiên cứu là 1,65 g; sau 20 ngày là 3,54 g; sau 30 ngày là 5,45 g;

sau 40 ngày là 7,41 g; sau 50 ngày là 9,25 g, sau 60 ngày 11,20 g. Ở ngày thứ

60 trọng lƣợng hao hụt của giống ngô BG là cao nhất (21,51 g) và thấp nhất là

giống ngô HG (4,14 g).

Để kiểm tra xem lƣợng ngô hao hụt ở các mẫu thí nghiệm trên có thực sự

khác nhau hay không, chúng tôi thực hiện phƣơng pháp so sánh nhiều mẫu

độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis [12], kết quả tính đƣợc giá trị H = 17,16 > X5(0,005) = 16,75. Do đó có thể kết luận: Lƣợng

thức ăn hao hụt ở các mẫu thí nghiệm thực sự khác nhau ở mức tin cậy

99,5%.

Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn lƣợng thức ăn hao hụt theo thời gian

ở các mẫu ngô nghiên cứu

Kết quả thể hiện ở hình 3.1 cho ta thấy lƣợng ngô hao hụt do mọt ăn

tăng dần theo thời gian. Lƣợng hao hụt càng cao chứng tỏ khả năng kháng

mọt của mẫu ngô kém và ngƣợc lại. Dựa vào số liệu và biểu đồ trên, có thể

nhận thấy mẫu ngô HG là giống kháng mọt tốt nhất (lƣợng thức ăn hao hụt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trung bình là 2,26 g) và mẫu ngô BG là giống kháng mọt kém nhất (lƣợng

thức ăn hao hụt trung bình là 12,69 g). Chúng tôi lựa chọn hai mẫu này để

tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10

3.2.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số

Chúng tôi sử dụng lá non 7 ngày tuổi của 2 mẫu ngô BG và HG để tách

chiết RNA tổng số. Sau khi tách chiết, chúng tôi kiểm tra chất lƣợng RNA tổng số

bằng cách đo trên máy quang phổ NanoDrop, kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.2.

Bảng 3.2. Giá trị tỉ lệ phổ hấp thụ A260/A280 và hàm lƣợng RNA của giống ngô nghiên cứu

TT Giống A260/A280 Hàm lượng RNA (ng/µl)

1 HG 1,92 500

2 BG 1,96 786

3.2.2. Kết quả tổng hợp cDNA và nhân gen

Để tiến hành nhân gen Cystatin 10 của mẫu ngô kháng mọt tốt bằng

phƣơng pháp RT-PCR, chúng tôi đã dựa vào trình tự gen Cystatin 10 đƣợc

phân lập từ ngô có mã số BN000514 đƣợc công bố trên Ngân hàng gen NCBI

để thiết kế c p mồi đ c hiệu. Thành phần phản ứng đƣợc thể hiện ở bảng 2.1.

Trong quá trình thực hiện, chúng tôi nhận thấy rằng phản ứng PCR xảy ra tối ƣu trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 58oC. Sau chu kỳ phản ứng, kết

quả nhân gen đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% với Marker 1kb và đƣợc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trình bày ở hình 3.2.

Marker BG HG

500 bp→ ← 450 bp

Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RT - PCR nhân gen Cystatin 10 ở 2

giống ngô nghiên cứu

Kết quả thể hiện ở hình 3.2 cho thấy mẫu cả 2 mẫu (BG và HG) đều cho sản phẩm với kích thƣớc khoảng 450 bp, kích thƣớc này phù hợp theo tính toán lý thuyết và tƣơng ứng với kích thƣớc của gen Cystatin10 của giống ngô mang mã số BN000514 công bố trong ngân hàng gen quốc tế. Nhƣ vậy, bƣớc đầu có thể sơ bộ kết luận đã nhân đƣợc gen Cystatin10 từ khuôn cDNA.

3.2.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR

Thông thƣờng sau khi chạy PCR, ngoài đoạn gen quan tâm còn có các sản phẩm phụ không mong muốn, các nucleotide dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme... Những chất lẫn tạp này có thể ảnh hƣởng đến các kết quả của quá trình tách dòng. Vì vậy, để quá trình biến nạp đạt hiệu quả cao nhất, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm bằng bộ kít: GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Các đoạn gen sau khi tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lƣợng. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR đƣợc trình bày ở hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm làm sạch gen cho ta thấy một băng DNA duy nhất với kích thƣớc khoảng 450bp, chứng tỏ đã thu nhận đƣợc đoạn gen mong muốn. Các băng vạch rõ nét chứng tỏ các DNA không bị đứt gãy trong quá trình tinh sạch, có thể tiến hành tiếp phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng.

Marker BG HG

← 450 bp 500 bp→

Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch gen Cystatin 10

ở 2 mẫu ngô nghiên cứu.

3.2.4. Kết quả tách dòng gen

Sau khi tinh sạch đƣợc sản phẩm RT - PCR ở trên, sản phẩm đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 22oC trong 1giờ 30 phút với sự xúc tác của enzyme T4 ligase cho phản ứng xảy ra hoàn toàn. Sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α bằng cách sốc nhiệt ở 42 oC trong 1 phút 30 giây và tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng LB đ c. Sau 16 giờ nuôi ổn định ở 37oC, các khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng mọc đƣợc trên môi trƣờng chứng tỏ chúng đều mang vector pBT. Khuẩn lạc xanh là các khuẩn lạc mang pBT tự đóng vòng nên vẫn còn khả năng sinh tổng hợp protein β-galactosidase để phân giải cơ chất X-gal từ không màu thành màu xanh. Còn các khuẩn lạc màu trắng do mang vector pBT đã gián đoạn gen lacZ nên không thể phân giải cơ chất thành màu xanh, đây chính là dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chọn khuẩn lạc có màu trắng, hình tròn trên đĩa thạch chuyển sang nuôi cấy trên môi trƣờng LB lỏng (bổ sung ampicilin) nuôi qua đêm. Lấy dịch nuôi khuẩn tiến hành phản ứng colony- PCR với c p mồi đ c hiệu đã nhân gen để xác định khuẩn lạc mang gen mong muốn. Kiểm tra sản phẩm colony-

PCR bằng điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong dung dịch TAE 1X và đƣợc thể hiện trên hình 3.4.

Marker BG HG

← 450 bp 500 bp→

Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen Cystatin 10

ở 2 mẫu ngô nghiên cứu.

Kết quả điện di ở hình 3.4 cho thấy, sản phẩm phản ứng colony- PCR từ

khuẩn lạc màu trắng thu đƣợc một băng duy nhất có kích thƣớc khoảng 450 bp,

kích thƣớc này phù hợp với kích thƣớc của gen Cystatin 10 đã nhân ở trên.

3.2.5. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp

Kết quả tách plasmid tái tổ hợp của gen Cystatin 10

Chọn lọc khuẩn lạc trắng tƣơng ứng với các mẫu nghiên cứu có sản

phẩm colony PCR ở trên để tách plasmid tái tổ hợp. Sản phẩm DNA plasmid

tái tổ hợp đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X. Kết quả điện di

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

plasmid mang gen Cystatin 10 thể hiện ở hình 3.5.

Marker BG HG

3000 bp → ← 3155 bp

Hình 3.5. Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp

Kết quả điện di trên hình 3.5 cho thấy, sản phẩm tách plasmid tái tổ

hợp mang gen Cystatin 10 đạt kết quả tốt, các băng vạch gọn và rõ nét. Theo

tính toán lý thuyết, vector pBT có kích thƣớc 2705 bp, sản phẩm PCR gen

đích khoảng 450 bp thì plasmid tái tổ hợp có kích thƣớc khoảng 3155 bp. Nhƣ

vậy, chứng tỏ plasmid tái tổ hợp không bị đứt gãy, đảm bảo chất lƣợng và số

lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen Cystatin 10.

3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN

Để xác định trình tự nucleotide của gen đã tách dòng, chúng tôi gửi đọc

trình tự nucleotide của gen quan tâm trên thiết bị giải trình tự tự động ABI

PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer tại viện Công nghệ Sinh học. Kết

quả đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit.

Kết quả xác định trình tự gen đƣợc so sánh trên phần mềm BLAST của

Ngân hàng gen NCBI cho thấy, trình tự gen mà chúng tôi phân lập có độ

tƣơng đồng cao so với trình tự gen có mã số BN000514 trên NCBI. Nhƣ vậy,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trình tự gen của hai mẫu ngô nghiên cứu đã đƣợc xác định chính xác.

3.3.1. Kết quả so sánh trình t gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG và HG

3.3.1.1. So sánh trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG và HG

Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự gen Cystatin 10 của giống ngô BG

và HG với nhau, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.6, bảng 3.3 và bảng 3.4.

Hình 3.6. So sánh trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG, HG

Kết quả thể hiện ở hình 3.6 cho thấy trình tự gen của hai mẫu ngô

nghiên cứu đều có kích thƣớc 447 bp, hai trình tự này khác nhau ở 06 vị trí

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

(191, 195, 214, 306, 331, 390).

Bảng 3.3. Sự sai khác giữ các trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu ngô BG, HG

BG HG Mẫu Vị trí

A C 191

G T 195

G T 214

G A 306

G A 331

G C 390

Kết quả thể hiện ở bảng 3.3 cho thấy trình tự nucleotide tại vị trí 191

của mẫu ngô BG là A (Adenine), HG là C (Cytosine); trình tự nucleotide tại

hai vị trí 195, 214 của mẫu ngô BG là G (Guanine), HG là T (Thymine); trình

tự nucleotide tại hai vị trí 306, 331 của mẫu ngô BG là G, HG là A; trình tự

nucleotide tại vị trí 390 của mẫu ngô BG là G, HG là C.

Bảng 3.4. Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự gen của hai mẫu ngô BG, HG (%)

Mẫu BG HG

100 98,6 BG

100 HG

Kết quả thể hiện ở bảng 3.4 cho thấy hệ số tƣơng đồng của trình tự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

gen cystatin 10 ở mẫu ngô BG và HG là 98,6%.

3.3.1.2. So sánh trình tự amino acid của protein suy diễn từ gen

Cystatin 10 ở hai mẫu ngô BG và HG

Kết quả so sánh trình tự amino acid của protein suy diễn từ gen

Cystatin 10 ở hai mẫu ngô BG, HG đƣợc trình bày qua hình 3.7, bảng 3.5 và

bảng 3.6.

Hình 3.7. Trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin 10 ở hai mẫu

nghiên cứu

Kết quả thể hiện ở hình 3.7 cho thấy chuỗi polypeptide của hai mẫu

ngô BG, HG đều có chiều dài 148 amino acid, trình tự amino acid của hai

chuỗi này có sự khác nhau ở 04 vị trí (64, 65, 72, 111).

Bảng 3.5. Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin10

ở hai giống ngô BG, HG

BG HG Mẫu Vị trí

Q P 64

E D 65

A S 72

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

E K 111

Kết quả thể hiện ở bảng 3.5 cho thấy trình tự amino acid tại vị trí 64

của mẫu ngô BG là Q, HG là P; trình tự amino acid tại vị trí 62 của mẫu ngô

BG là E, HG là D; trình tự amino acid tại vị trí 72 của mẫu ngô BG là A, HG

là S; trình tự amino acid tại vị trí 111 của mẫu ngô BG là E, HG là K.

Bảng 3.6. Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự amino acid của 2 mẫu

nghiên cứu (%)

Mẫu BG HG

100 97,2 BG

100 HG

Kết quả thể hiện ở bảng 3.6 cho thấy hệ số tƣơng đồng về trình tự

amino acid suy diễn của protein cystatin 10 ở mẫu ngô BG và HG là 97,2%.

Sự sai khác về trình tự nucleotide và amino acid suy diễn ở trên là cơ sở

để so sánh khả năng kháng mọt giữa hai giống ngô kháng mọt tốt nhất và kháng

mọt kém nhằm tìm kiếm tính quy luật của sự thay đổi vị trí các nucleotide và

amino acid liên quan đến tính kháng mọt của các giống ngô. Đây chính là tiền đề

cơ sở cho việc nghiên cứu chọn tạo các giống ngô có khả năng kháng mọt tốt,

năng suất cao, phục vụ sản xuất và đời sống.

3.3.2. Kết quả so sánh hai trình t nghiên cứu (BG, HG) với hai trình

t đã được công bố (CB2, MX4) và BN000514 trên GenBank

3.3.2.1. So sánh trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu nghiên cứu (BG,

HG) với hai trình tự đã được công bố (CB2, MX4) và BN000514 trên ngân

hàng gen

Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự gen Cystatin 10 của hai mẫu

nghiên cứu (BG, HG) với hai trình tự đã đƣợc công bố CB2, MX4 (CB2 là

giống ngô địa phƣơng ở tỉnh Cao Bằng, MX4 là giống ngô lai) [10] và

BN000514 trên Ngân hàng gen NCBI, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.8,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bảng 3.7 và bảng 3.8.

Hình 3.8. So sánh trình tự gen Cystatin 10 của BG, HG với CB2, MX4 và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

BN000514 trên GenBank

Kết quả thể hiện ở hình 3.7 cho thấy các trình tự gen đƣợc so sánh có

sự khác nhau ở 15 vị trí (30, 50, 108, 110, 168, 176, 204, 207, 226, 252, 255,

261, 327, 352, 411). Đ c biệt, cả bốn mẫu ngô Việt Nam là BG, HG, CB2,

MX4 đều bị mất 12 nucleotide (từ vị trí số 61 đến 72) so với trình tự gen

Cystatin10 có mã số BN000514 trên Ngân hàng gen. Hơn nữa, riêng hai mẫu

nghiên cứu bị mất 9 nucleotide (từ vị trí số 262 đến 270) so với trình tự gen

Cystatin10 có mã số BN000514 trên Ngân hàng gen.

Do có sự mất nucleotide nên kích thƣớc gen Cystatin 10 của bốn mẫu

(BG, HG, CB2, MX4) ngắn hơn so với kích thƣớc gen cystatin 10 của

BN000514 trên Ngân hàng gen, cụ thể là: Kích thƣớc gen cystatin 10 của

BN000514 là 468 bp, BG và HG là 447 bp, CB2 và MX4 là 453 bp. Nhƣ vậy

là gen cystatin 10 của BG và HG có kích thƣớc ngắn hơn gen cystatin 10 của

CB2, MX4 và BN000514.

Kết quả thể hiện ở hình 3.7 còn cho ta thấy có sự sai khác giống nhau

về trình tự nucleotide của bốn mẫu BG, HG, CB2, MX4 tại hai vị trí so với

trình tự nucleotide của BN000514, cụ thể là: Tại vị trí 108, trình tự nucleotide

của BN000514 là T, trình tự nucleotide của BG, HG, CB2, MX4 là C; Tại vị

trí 176, trình tự nucleotide của BN000514 là C, trình tự nucleotide của BG,

HG, CB2, MX4 là G.

Đ c biệt, ở hai giống ngô có khả năng kháng mọt tốt (HG và CB) có

sự sai khác giống nhau về trình tự nucleotide tại ba vị trí so với trình tự

nucleotide của BN000514, cụ thể là: Tại hai vị trí 327, 352 trình tự nucleotide

của BN000514 là G, trình tự nucleotide của HG, CB2 là A; Tại vị trí 411,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trình tự nucleotide của BN000514 là G, trình tự nucleotide của HG, CB2 là C.

Bảng 3.7. Sự khác nhau giữa trình tự gen Cystatin 10 của BG, HG với CB2,

MX4 và BN000514 trên GenBank

Mẫu BN000514 HG CB2 BG MX4 Vị trí

G C G G 30 G

C C C G 50 C

C C C C 108 T

G A G G 110 G

G C G G 168 G

G G G G 176 C

C A A A 204 A

T G G G 207 G

T G G G 226 G

A C A A 252 A

T C T T 255 T

C G C C 261 C

A A G G 327 G

A A G G 352 G

C C G C 411 G

Kết quả thể hiện ở bảng 3.7 cho thấy trình tự nucleotide của BG có sự

sai khác với trình tự nucleotide của BN000514 tại 2 vị trí (108, 176), sai khác

với trình tự nucleotide của CB2 tại 9 vị trí (30, 110, 168, 252, 255, 261, 327,

352, 411), sai khác với trình tự nucleotide của MX4 tại 2 vị trí (50, 411).

Trình tự nucleotide của HG có sự sai khác với trình tự nucleotide của

BN000514 tại 8 vị trí (108, 176, 204, 207, 226, 327, 352, 411), sai khác với

trình tự nucleotide của CB2 tại 9 vị trí (30, 110, 168, 204, 207, 226, 252, 255,

261), sai khác với trình tự nucleotide của MX4 tại 6 vị trí (50, 204, 207, 226,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

327, 352).

Nhƣ vậy, sự sai khác về trình tự nucleotide của BG so với BN000514

(2 vị trí) là ít hơn sự sai khác về trình tự nucleotide của HG so với BN000514

(8 vị trí). Sự sai khác về trình tự nucleotide của BG so với CB2 (9 vị trí) bằng

với sự sai khác về trình tự nucleotide của HG so với CB2 (9 vị trí), tuy nhiên

các vị trí sai khác không hoàn toàn trùng nhau. Sự sai khác về trình tự

nucleotide của BG so với MX4 (2 vị trí) là ít hơn sự sai khác về trình tự

nucleotide của HG so với MX4 (6 vị trí). Do đó, hệ số tƣơng đồng giữa các

trình tự trên có sự khác biệt (Bảng 3.8).

Kết quả thể hiện ở bảng 3.7 còn cho thấy điều đ c biệt là tại hai vị trí

(327, 352) ở hai giống ngô kháng mọt tốt (HG, CB2) đều là A, còn ở hai

giống ngô kháng mọt kém (BG, MX4) đều là G. Điều này chứng tỏ là khả

năng kháng mọt tốt và kém có thể liên quan đến trình tự nucleotide tại hai vị

trí này.

Bảng 3.8. Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự gen của 2 mẫu nghiên cứu với

CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank

BN000514 BG HG CB2 MX4

BN000514 100 95,0 93,8 94,4 95,9

BG 100 98,6 96,6 96,9

HG 100 96,6 96,0

CB2 100 96,7

MX4 100

Kết quả thể hiện ở bảng 3.8 cho thấy hệ số tƣơng đồng của mẫu BG với

BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt là 95,0%, 96,6%, 96,9%; hệ số tƣơng đồng

của mẫu HG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt là 93,8%, 96,6%, 96,0%.

3.3.2.2. So sánh trình tự amino acid của protein suy diễn từ gen cystatin 10 ở

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hai mẫu ngô BG, HG với CB2, MX4 và BN000514

Kết quả so sánh trình tự amino acid của protein suy diễn từ gen Cystatin

10 ở hai mẫu ngô BG, HG với CB2, MX4 và BN000514 đƣợc trình bày qua

hình 3.9, bảng 3.9 và bảng 3.10.

Hình 3.9. Trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin 10 ở hai mẫu

nghiên cứu với CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank

Kết quả thể hiện ở hình 3.9 cho thấy trình tự các chuỗi polypeptide có

sự sai khác ở 8 vị trí (17, 37, 59, 68, 69, 76, 84, 118) và có sự đột biến mất

amino acid ở một số vị trí, cụ thể là: Tại vị trí 24, 25, 26, 27 cả bốn mẫu BG,

HG, CB2, MX4 đều bị đột biến mất bốn amino acid (P, A, A, A) so với

BN000514; Tại vị trí 88, 89, 90 có mẫu BG và HG bị đột biến mất ba amino

acid (G, G, G) so với BN000514; Tại vị trí 90 có mẫu CB2 bị đột biến mất

một amino acid (G) so với BN000514; Tại vị trí 122 có mẫu MX4 bị đột biến

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

mất một amino acid (G) so với BN000514.

Bảng 3.9. Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein Cystatin10

ở hai mẫu nghiên cứu với CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank

BN000514 HG CB2 BG MX4 Mẫu Vị trí

A A A G 17 A

G E G G 37 G

R R R R 59 P

P Q Q Q 68 Q

D E E E E 69

S A D A E 76

E E D E E 84

K E K E E 118

Kết quả thể hiện ở bảng 3.9 cho thấy trình tự amino acid của protein

Cystatin 10 ở hai mẫu nghiên cứu (BG, HG) có sự sai khác so với mẫu CB2,

MX4 và BN000514, cụ thể là: Trình tự amino acid của BG sai khác với trình

tự amino acid của BN000514 tại vị trí 59, sai khác với trình tự amino acid của

CB2 tại 4 vị trí (37, 76, 84, 118), sai khác với trình tự amino acid của MX4 tại

2 vị trí (17, 76). Trình tự amino acid của HG sai khác với trình tự amino acid

của BN000514 tại 5 vị trí (59, 68, 69, 76, 118), sai khác với trình tự amino

acid của CB2 tại 5 vị trí (37, 68, 69, 76, 84), sai khác với trình tự amino acid

của MX4 tại 5 vị trí (17, 68, 69, 76, 118).

Nhƣ vậy, sự sai khác về trình tự amino acid của BG với trình tự amino

acid của BN000514, CB2, MX4 (7 vị trí sai khác) là ít hơn so với sự sai khác

về trình tự amino acid của HG với trình tự amino acid của BN000514, CB2,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MX4 (15 vị trí sai khác).

Kết quả thể hiện ở bảng 3.9 còn cho thấy điều đ c biệt là tại vị trí 118,

hai giống ngô kháng mọt tốt (HG, CB2) đều có trình tự amino acid là K, còn

hai giống ngô kháng mọt kém (BG, MX4) có trình tự amino acid là E. Do đó,

khả năng kháng mọt tốt và kém có thể liên quan đến trình tự amino acid tại vị

trí này.

Bảng 3.10. Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự amino acid của 2 mẫu

nghiên cứu với CB2, MX4 và BN000514 trên GenBank

Mẫu BN000514 BG HG CB2 MX4

BN000514 100 94,8 92,2 94,1 95,4

BG 100 97,2 96,6 96,6

HG 100 95,3 94,0

CB2 100 96,0

MX4 100

Kết quả thể hiện ở bảng 3.10 cho thấy hệ số tƣơng đồng của mẫu BG

với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt là 94,8%, 96,6%, 96,6%; hệ số tƣơng

đồng của mẫu HG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt là 92,2%, 95,3%,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

94,0%.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

I. Kết luận

1. Đã xác định đƣợc mức độ kháng mọt của 6 giống ngô nghiên cứu.

Trong đó, giống có khả năng kháng mọt tốt nhất là HG và giống có khả năng

kháng mọt kém nhất là BG.

2. Đã phân lập và xác định đƣợc trình tự gen Cystatin 10 của mẫu ngô

HG và BG với kích thƣớc 447 bp.

3. Hệ số tƣơng đồng trình tự nucleotide của gen Cystatin10 ở 2 mẫu

nghiên cứu là 98,6%. Hệ số tƣơng đồng của trình tự nucletide ở mẫu BG với

BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt là 95,0%, 96,6%, 96,9%; hệ số tƣơng đồng

của mẫu HG với BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt là 93,8%, 96,6%, 96,0%.

4. Trình tự amino acid suy diễn từ protein Cystatin10 của 2 mẫu

nghiên cứu có độ tƣơng đồng là 97,2%. Hệ số tƣơng đồng của trình tự amino

acid suy diễn từ protein Cystatin10 của mẫu BG với BN000514, CB2, MX4

lần lƣợt là 94,8%, 96,6%, 96,6%; hệ số tƣơng đồng của mẫu HG với

BN000514, CB2, MX4 lần lƣợt là 92,2%, 95,3%, 94,0%.

II. Đề nghị

Tiếp tục thiết kế vector phục vụ chuyển gen để có thể tạo ra đƣợc những

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

giống ngô có khả năng kháng mọt tốt.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Trần Văn Chƣơng (2000), Khảo sát hiện trạng chất lượng ngô 4 huyện

vùng núi cao phía Bắc tỉnh Hà Giang và một số biện pháp thích hợp giảm tổn

thất sau thu hoạch, Báo cáo kết quả nghiên cứu khoa học, Sở Khoa học và

Công nghệ Hà Giang.

2. Đƣờng Hồng Dật (2004), Cây ngô: kỹ thuật thâm canh tăng năng suất,

NXB Lao động - Xã hội.

3. Đƣờng Hồng Dật (2006), Sâu bệnh hại ngô, cây lương thực trồng cạn và

biện pháp phòng trừ, NXB Lao động - Xã hội.

4. Lê Doãn Diên (1995), Sử dụng kỹ thuật của công nghệ sinh học để bảo

quản, chế biến nông sản sau thu hoạch, NXB Nông nghiệp.

5. Trƣơng Văn Đích, (2005), Kĩ thuật trồng ngô năng suất cao, NXB Khoa

học và Kỹ thuật.

6. Nguyễn Xuân Hiển (1972), Một số kết quả nghiên cứu về cây ngô, NXB

Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

7. Mai Lề, Bùi Đức Hợi, Lƣơng Hồng Nga, Phạm Văn Hùng, (2009), Công

nghệ bảo quản lương thực, NXB khoa học và kỹ thuật Hà Nội, tr: 28 – 36.

8. Bùi Công Hiển (1995), Côn trùng hại kho, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà

Nội.

9. Hà Quang Hùng (2005), Giáo trình Kiểm dịch thực vật và dịch hại nông

sản sau thu hoạch, NXB Nông nghiệp.

10. Dƣơng Thị Hồng Khánh (2015), “Xác định trình tự gen Cystatin10 của 2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

giống ngô có khả năng kháng mọt khác nhau”, Khóa luận tốt nghiệp.

11. Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2000), Giáo

trình cây lương ngô, NXB Nông nghiệp.

12. Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học trong sinh học, NXB ĐHQG

Hà Nội.

13. Trần Văn Minh, (2008), Cây ngô nghiên cứu và sản xuất, NXB nông

nghiệp, Hà Nội.

14. Ngô Hữu Tình (1997), Cây ngô, NXB nông nghiệp.

15. Ngô Hữu Tình (2003), Cây ngô, NXB Nghệ An.

16. Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR và ứng

dụng trong phân tích DNA, tập II, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ.

17. Vì Thị Xuân Thủy, Hồ Mạnh Tƣờng, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh

Thanh, Chu Hoàng Mậu (2014), “Tách dòng gen Cystatin2 phân lập từ một số

mẫu ngô địa phƣơng Việt Nam”, Tạp chí sinh học, 36(1): 110-117.

18. Vũ Thị Thu Thủy (2011), “Tạo dòng chịu hạn và phân lập gen Cystatin

liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc”, Luận án tiến sĩ sinh học, Trƣờng Đại

học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên.

19. Phòng Kiểm dịch thực vật - Cục Bảo vệ thực vật (2003), Thành phần

côn trùng hại kho ở Việt Nam năm 1996 - 2000, một số ứng dụng bảo vệ thực

vật vào sản xuất nông nghiệp, NXB Nông nghiệp.

20. Vũ Quốc Trung (1981), “Sâu hại nông sản trong kho và phòng trừ”,

NXB Nông Nghiệp Hà Nội.

21. Nguyễn Thị Giáng Vân (1996), Thành phần côn trùng kho ở Việt Nam,

Báo cáo kết quả nghiên cứu khoa học, Cục Bảo vệ thực vật.

22. Nguyễn Kim Vũ (2000), Báo cáo tổng kết khoa học công nghệ đề tài

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

KH 08-12, Bộ Khoa học và Công nghệ.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

23. Abe M., Arai S. (1991), “Some properties of a cystein proteinase

inhibitor from corn endosperm’’, Agricultural and biological chemistry,

55(9), pp. 2417- 2418.

24. Adeniala S. O., José X. F., Sales M. P.(2003), "Cysteine proteinases and

cystatins", Braz. arch. biol. technol, 46 (1), pp. 99-104.

25. Barrett, A. J. (1994) "Classification of peptidases", Methods Enzymol.

244, pp. 1–15.

26. Bode W., Engh R., Musil D., Thiele U., Huber R.,Karshnikov A., Brzin J.,

Kos J. & Turk V. (1990), " Mechanism of interaction oF cysteine ptoteinases

and their protein inhibitors as compared to the serine proteinase inhibitor

interaction", Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 371, pp. 111-118.

27. Bolter C.J (1993), “Methyl jasmonate induces papain inhibitors in

tomato leaves’’, Plant physiol, 103, pp. 1347- 1355.

28. Chou W.M., Shigaki j., Dammann C., Liu J. Q., Bhattachamy M.K.

(2004), “Inhibiton of pathogenesis- related genes in soybean plant biology’’,

6, pp. 664- 672.

29. David R. (2004), Insects stored products. CSIRO Australia.

30. Fernsndes K.V.S., Paolo a., sabelli P.a., Barratt D.H.P., Richardson.,

Xavier- Filho J., Shewry P.R (1993), “The resistance of coepea seeds to

bruchid beetle is not related to levels of cystein protease inhibitors’’, Plant

mlercular biology, 23(1), pp. 215- 219.

31. James A. O., Adebayo A. O (2012), "Rearing the Maize Weevil,

Sitophilus zeamais, on an Artificial Maize - Cassava Diet", J Insect Sci, 12.

32. Koiwa H, Shade RE, Zhu- Salzman K, Subramanian L, Murdock Ll,

Nielsen SS, Bressan RA, Hasegawa PW (1998), “Phage display selection can

differentiate insecticidal activity of soybean cystatin’’, Plant J, 14(3), pp.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

371- 379.

33. Kuschel G. (1961), "On problem of synonymy in the Sitophyllus oryzae complex (30th contribution, Col. Curculionidea)", Annals and Magazine of

Nature History, 13(4), pp. 241-244.

34. Melo F.R., Rigden D.J., Franco O.L., Mello L.V., Ary M.B., Grossi de Sá

M.F., Bloch C. Jr. (2002), "Inhibition of trypsin by cowpea thionin:

characterization, molecular modeling, and docking", Proteins, 48(2), pp:311–319.

35. Mikami A. Y., Carpentieri P. V., Ventura M. U. (2012), "Resistance of

maize landraces to the maize weevil Sitophilus zeamais Motsch.(Coleoptera:

Curculionidae)." Neotrop Entomol, 41 (5), 404-8.

36. Mwololo J.K., Mugo S., Okori P., Tefera T., Otim M., Munyiri S.W.,

(2012), “Sources of Resistance to the Maize Weevil Sitophilus zeamains in

Tropical Maize”, Journal of Agricultural Science, 4(11): 206 – 215.

37. Ojima A., Shiota H., higashi K., Shimma Y., Uwada M., Satoh S.

(1997), “An extracularin soluble inhibitor of cysteine proteinase in cell

cultrures and seed Carrot’’, Plant molecular biology, 34, pp. 99- 109.

38. RamanjuluS., Bartels D. (2002), “Drought- and desiccation- induced

modulation of gene expression in plant’’, Plant cell and environment, 25(2),

pp. 141- 151.

39. Rawlings, N. D. & Barrett, A. J. (1999) "MEROPS:The peptidase

database", Nucleic Acids Res, 27, pp. 325–331.

40. Ryan S.N., Mc Manus M.J., Laiing W.A (2003), “Indentification and

characterization of proteinase inhibitor and their gen from seeds of apple

(malus domestica)’’, Japanese Biochemical society, 134(1), pp. 31- 42.

41. Sambrook J., Russel D.W (2001), Molecular cloning, A laboratory

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

manual, Vol. 2, Third edition, CSHL Press, pp:8.1-8.24.

42. Shu-Guo FAN, WU G. J. (2005), "Characteristics of plant proteinase

inhibitors and their applications in combating phytophagous insects", Bot.

Bull. Acad Sin, 46, 273-92.

43. Snelson J.T. (1987), Grain protectants, ACIAR Monographs Series 3,

Australian Centre for International Agricultural Research.

44. Waldron C., Uwegrich L.M., Merlo P.A.O, Walsh J. A. (1993),

Characterization of a genemic sequence coding for potato multicystatin, An

eight- domain cysteine proteinase inhibitor”, Plant molecular biology, 23(4),

pp.801- 812.

45. Zhang X., Liu S., Takano T. (2008), “Two cysteine proteinase inhibitors

from Arabidposis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt,

drought, oxidation and cold tolerance’’, Plant Moll Biol, 68(1-2).

TÀI LIỆU TRANG WEB

46. www.cpv.org.vn

47. http://www.ctu.edu.vn.

48. http://faostat.fao.org/

49. www.mard.gov.vn

50. http://www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/AF45439

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

51. http://old.padil.gov.au/pbt/index.php?q=node/70&pbtID= 217

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Phân lập gen Cystatin 10 liên quan đến khả năng kháng mọt của một số giống ngô

PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10 LIÊN QUAN ĐẾN

KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP GEN CYSTATIN 10 LIÊN QUAN ĐẾN

KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Nhiệt ộ

Mồi

Trình tự mồi (5’ – 3’)

gắn mồi 580C

Ngày

Trung

10 ngày

20 ngày

30 ngày

40 ngày

50 ngày

60 ngày

Mẫu

bình

HG

2,26

CB

3,59

BK

3,86

TQ

5,57

TN

10,54

BG

12,69

1,65

3,54

5,45

7,41

9,25

11,20

Trung bình

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok