Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase và khả năng ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

---------------------------

NGUYỄN TRẦN THIỆN ĐỨC

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH

TỔNG HỢP ENZYME CHITIN DEACETYLASE

VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 6042020

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 9 năm 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

---------------------------

NGUYỄN TRẦN THIỆN ĐỨC

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH

TỔNG HỢP ENZYME CHITIN DEACETYLASE

VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 6042020

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 9 năm 2017

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP. HCM

ngày … tháng … năm …

Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)

TT 1 2 3 4 5 Họ và tên GS.TSKH.Nguyễn Trọng Cẩn PGS.TS.Nguyễn Tiến Thắng TS. Nguyễn Hoàng Dũng TS. Trịnh Thị Lan Anh TS.Nguyễn Ngọc Hồng Chức danh Hội đồng Chủ tịch Phản biện 1 Phản biện 2 Ủy viên Ủy viên, Thư ký

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được

sửa chữa (nếu có).

Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

TP. HCM, ngày..… tháng….. năm 20..…

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Trần Thiện Đức Giới tính:Nam

Ngày, tháng, năm sinh:13/07/1992 Nơi sinh:TP.HCM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV:1541880003

I- Tên đề tài:

Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitin

deacetylase và đánh giá khả năng ứng dụng trong sản xuất chitosan từ chitin của các

chủng vi sinh vật.

II- Nhiệm vụ và nội dung:

- Thu thập mẫu phân lập

- Tăng sinh chọn lọc VSV

- Phân lập chủng VSV thuần khiết từ các nguồn mẫu

- Sàng lọc khả năng sinh tổng hợp CDA của các chủng phân lập

- Khảo sát VSV sàng lọc và định danh

- Thử nghiệm chuyển hóa chitin thành chitosan, sử dụng môi trường lên men cơ

bản nuối cấy các chủng sàng lọc

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn C, N, khoáng đến hiệu suất thu hồi chitosan và

chất lượng chitosan tạo thành (độ deacetyl, độ hòa tan)

- Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách tăng nồng độ acid acetic hòa tan chitosan.

- Tăng hiệu suất thu hồi chitosan bằng cách thay đổi các nguồn cơ chất cảm ứng.

- Khảo sát tính chất chitosan tạo thành bằng phương pháp sinh học so sánh với

chitosan sản xuất bằng phương pháp hóa học và chitosan thương mại

- Đề nghị quy trình sản xuất chitosan từ chitin bằng phương pháp sinh học.

III- Ngày giao nhiệm vụ: 15/02/2016

IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/08/2016

V- Cán bộ hướng dẫn: (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): TS. Nguyễn Hoài Hương

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN

NGÀNH

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết

quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ

công trình nào khác.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã

được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.

TP.HCM, ngày……tháng……năm 2017

Học viên thực hiện Luận văn

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin chân thành cám ơn tất cả quý thầy cô trong trường Đại học Công

Nghệ TP.HCM, thầy cô ngành Công nghệ sinh học đã tận tình giảng dạy, truyền đạt

kinh nghiệm kiến thức, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và tạo

điều kiện thực hiện để tôi hoàn thành luận văn này.

Đặc biệt tôi xin cám ơn Tiến sĩ Nguyễn Hoài Hương đã tận tình hướng dẫn

và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện và hoàn thành tốt luận văn.

Xin được gửi lời cảm ơn đến cô Đỗ Thị Tuyến – Trung tâm phân tích kỹ

thuật cao Sài Gòn STC cùng sinh viên Đỗ Thị Phương Trinh đã giúp tôi hoàn thành

kết quả chạy điện di các mẫu enzyme.

Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn các thầy cô trong hội đồng phản biện đã

dành thời gian đọc và nhận xét cho luận văn này để tôi có thể hoàn thiện nó tốt hơn.

Tôi xin chúc các thầy cô được nhiều sức khỏe và luôn thành công trong

cuộc sống.

Học viên thực hiện Luận văn

Nguyễn Trần Thiện Đức

iii

TÓM TẮT

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP

ENZYME CHITIN DEACETYLASE VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG

CÁC CHỦNG NÀY TRONG SẢN XUẤT CHITOSAN TỪ CHITIN

Trong nghiên cứu này, 26 chủng vi khuẩn đã được phân lập từ các mẫu đất

thu thập từ các địa điểm khác nhau ở Vũng Tàu, Cần Giờ, trong đó chỉ có 3 chủng

(CD1, CD5, CD10) cho thấy khả năng sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase

được định danh là Bacillus cereus, B. amyloliquefaciens và B. siamensis.

Môi trường sử dụng lên men các chủng trên chuyển hóa chitin huyền phù

thành chitosan chứa nguồn C là tinh bột 2%, nguồn N là cao nấm men 1%, nguồn

khoáng là MgSO4 0,04% được bổ sung NaCl 0,1%. Hiệu suất thu hồi chitosan khi

sử dụng acid acetic 2% hòa tan chitosan lần lượt là 73%, 52%, 49% tương ứng với

các chủng CD1, CD5 và CD10. Độ hòa tan, độ nhớt, độ deacetyl hóa và khối lượng

phân tử, hoạt tính kháng khuẩn của chitosan sinh học không khác biệt nhiều so với

chitosan hóa học và chitosan thương mại.

ABSTRACT

ISOLATION AND SCREENING OF CHITIN DEACETYLASE PRODUCING

MICROORGANISMS AND APPLICATION POTENTIAL IN CHITOSAN

PRODUCTION FROM CHITIN.

In this study, 26 bacterial strains were isolated from soil samples, collected

from different locations in Ba Ria Vung Tau Province, among which only three

strains namely CD1, CD5 and CD10 showed their chitin deacetylase activity and

were identified as Bacillus cereus, B. amyloliquefaciens and B. siamensis,

respectively.

The culture medium for above – mentioned strains to convert colloidal chitin

to chitosan contained 2% soluble starch as the carbon source, 1% yeast extract as

the nitrogen source and several minerals such as 0,04% MgSO4 and 0,1% NaCl.

Chitosan recovery yields by using 2% acetic acid to dissolve chitosan were 73%,

52%, 49% for CD1, CD5 and CD10 respectively. Chitosan obtained by biological

method displayed solubility, viscosity, deacetylation degree, molecular weight and

antibacterial activity in the same range as this obtained by chemical method as well

as the commercial one.

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i

LỜI CÁM ƠN ...................................................................................................................... ii

TÓM TẮT ............................................................................................................................ iii

ABSTRACT ....................................................................................................................... iv

MỤC LỤC........................................................................................... ....................... v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.......... .............................................................. ix

DANH MỤC CÁC BẢNG................... ...................................................................... x

DANH MỤC CÁC HÌNH............................. ............................................................. xi

MỞ ĐẦU................................. ..................... ...............................................................1

1. Đặt vấn đề............................. ................................... .......................................1

2. Tính cấp thiết của đề tài.................... ...................... .......................................1

3. Mục tiêu nghiên cứu................... ....................... .............................................2

4. Nhiệm vụ nghiên cứu.................. ..................... ..............................................2

5. Phương pháp nghiên cứu. ................. ..............................................................3

6. Các kết quả đạt được của đề tài.. ............................ ........................................3

7. Kết cấu của luận văn thạc sĩ....... ........................... .........................................4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN....... ..................... ...........................................................5

1.1. Tổng quan về chitin..... .......................... ...............................................................5

1.1.1. Giới thiệu............. ....................... ..............................................................5

1.1.2. Tính chất vật lý............... ........................ ..................................................5

1.1.3. Tính chất hóa học........... ....................... ...................................................6

1.1.4. Tính chất sinh học.......... ..................... .....................................................6

1.1.5. Nguồn nguyên liệu thu nhận.......... ...................... ....................................7

1.1.6. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới. ... .........7

1.1.6.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam ....................... ........7

1.1.6.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu trên thế giới ................................. 8

1.1.7. Ứng dụng............ ................ ......................................................................9

1.2. Tổng quan về chitosan........... ........................... ...................................................9

1.2.1. Giới thiệu........... ............... ........................................................................9

1.2.2. Tính chất hóa lý......................... .................... .........................................10

1.2.3. Tính chất sinh học.................. ................ ................................................10

1.2.4. Các tính chất của chitosan........ ................. .............................................14

1.2.4.1. Mức độ deacetyl hóa...................... ............... ..................................14

1.2.4.2. Trọng lượng phân tử Chitosan........... ......... ....................................14

1.2.4.3. Độ nhớt..................... .................... ..................................................11

1.2.4.4. Tính tan........................ .............. .....................................................11

1.2.4.5. Tỷ trọng............... ................... .........................................................12

1.2.4.6. Khả năng kết hợp với nước và khả năng kết hợp với chất béo ....... 12

1.2.4.7. Khả năng tạo màng............. ................................ ............................12

1.2.4.8. Hoạt tính sinh học của chitosan......... ............. ................................12

1.2.5. Nguồn nguyên liệu thu nhận...... ........ ....................................................14

1.2.6. Công nghệ sản xuất chitosan... ........................ .......................................14

1.2.6.1. Quy trình sản xuất chitosan từ chitin bằng phương pháp hóa học..15

1.2.6.2. Quy trình sản xuất chitosan bằng phương pháp bán sinh học.... .....16

1.2.7. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới.... .......18

1.2.7.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam.......... . ..................18

1.2.7.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu trên thế giới................. ..............19

1.2.8. Ứng dụng...... ..................................................................... .....................19

1.3. Tổng quan về enzyme chitin deacetylase....... ........... .........................................20

1.3.1. Giới thiệu enzyme chitin deacetylase.... ....... ..........................................20

1.3.2. Cơ chế xúc tác................ ................ ........................................................20

1.3.3. Phướng pháp xác định hoạt tính............. ........ ........................................22

1.3.4. Điều kiện hoạt động của enzyme...... ................ .....................................22

1.3.5. Ứng dụng............ ................... .................................................................23

1.3.6. Lịch sử nghiên cứu enzyme chitin deacetylas... ........... ..........................23

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................ ............ 25

2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài.......................... ...... ...............................25

2.1.1. Thời gian............. ................ ...................................................................25

vii

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu............. .............................................. ...................25

2.2. Vật liệu nghiên cứu.................. ................... .......................................................25

2.2.1. Nguồn mẫu.......... ........................ ...........................................................25

2.2.2. Hóa chất........... ..................... ..................................................................27

2.2.3. Thiết bị – dụng cụ................... ................ ................................................27

2.2.3.1. Thiết bị............................ ................................. ...............................27

2.2.3.2. Dụng cụ........................... .................. ..............................................28

2.3. Phương pháp luận......................................... ......................................................28

2.4. Phương pháp nghiên cứu................... .................... .............................................28

2.4.1. Phân lập, sàng lọc vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase30

2.4.1.1. Thu thập mẫu................... ................. ..............................................30

2.4.1.2. Tăng sinh, phân lập chủng thuần khiết................... ........ ................31

2.4.1.3. Sàng lọc...................... ................ .....................................................31

2.4.1.4. Định danh các chủng sàng lọc....................... .............. ...................32

2.4.2. Khảo sát khả năng chuyển hóa chitin thành chitosan bằng các chủng

sàng lọc............. ..................... ...........................................................................36

2.5. Phương pháp xử lý số liệu..................... ...................... .......................................47

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............... .................... .........................48

3.1. Phân lập và sang lọc chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme chitin

deacetylase....... ........................................................................ .................................48

3.1.1. Tăng sinh, phân lập chủng thuần khiết........... ......................... ...............48

3.1.2. Sàng lọc........... .................................................. .....................................48

3.1.3. Định danh sơ bộ các chủng sàng lọc............ ......... .................................49

3.1.3.1. Đặc điểm hình thái..................... .................. ...................................49

3.1.3.2. Kết quả định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng vi

khuẩn.... ........................................................................................................49

3.1.4. Định danh chủng vi khuẩn chọn lọc bằng phương pháp sinh học phân

tử.. ..................................................................................................................... 53

3.2. Khảo sát khả năng chuyển hóa chitin thành chitosan bằng các chủng sàng

lọc................ ................... ..........................................................................................53

viii

3.2.1. Thử nghiệm chuyển hóa chitin thành chitosan, sử dụng môi trường lên

men chọn cơ bản nuôi cấy các chủng sàng lọc.......... .............. .........................53

3.2.1.1. Định tính sự hiện diện của chitosan.......... ............. .........................54

3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của cơ chất đến hiệu suất thu hồi chitosan.... ...... ..55

3.2.2.1. Nguồn Carbon................... ............. .................................................56

3.2.2.2. Nguồn Nitơ........................ ............................. ................................57

3.2.2.3. Thành phần khoáng.................. .................... ...................................58

3.2.3. Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách tăng nồng độ acid acetic hòa tan

chitosan....... ......................................................................................................60

3.2.4. Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách thay đổi cơ chất cảm ứng..................61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............. ............... ......................................................72

Kết luận................. ....................................................................................................72

Kiến nghị.............. .....................................................................................................72

TÀI LIỆU THAM KHẢO............ ..................... ........................................................74

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CS :Chitinase

DDA : Độ deacetyl

CDA : Chitin deacetylase

VSV : Vi sinh vật

LMWC : Low molecular weight chitosan

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Tổng kết các đặc điểm nuôi cấy của các chủng vi sinh vật khảo sát..... .. .52

Bảng 3.2. Khảo sát ảnh hưởng nguồn Carbon đến hiệu suất thu hồi và chất lượng

chitosan tạo thành.............. ....................... .................................................................56

Bảng 3.3. Ảnh hưởng nguồn Nito đến khả năng sản xuất chitosan của 3 chủng VSV

CD1, CD5, CD10........ ..................................................... .........................................57

Bảng 3.4. Ảnh hưởng nguồn Muối đến khả năng sản xuất chitosan của 3 chủng

VSV CD1, CD5, CD10.......... ......................... ..........................................................58

Bảng 3.5. Khảo sát enzyme trong dịch nuôi cấy vi khuẩn tuyển chọn nhằm chuyển

hóa chitin thành chitosan....... ............................ ........................................................59

Bảng 3.6. Ảnh hưởng nồng độ acid acetic đến khả năng sản xuất chitosan của 3

chủng VSV CD1, CD5, CD10......... ........................ .................................................60

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng đến khả năng sản xuất chitosan của 3

chủng VSV CD1, CD5, CD10.......... ........................................ ................................61

Bảng 3.8. So sánh chitosan điều chế từ phương pháp lên men sinh học, chitosan hóa

học, chitosan thương phẩm......... ........................... ...................................................62

Bảng 3.9. Độ deacetyl hóa chitosan chuyển hóa sinh học sơ với chitosan hóa học và

chitosan thương mại.................. ........................................................ ........................63

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin......... .............. ................................................5

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học N-acety-D-glucosamine liên kết với nhau bằng cầu nối

β-(1,4)-glucoside.... .....................................................................................................6

Hình 1.3. Deacetyl hóa chitin thành chitosan........ ................. ..................................10

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của chitosan........ ................ .........................................10

Hình 1.5. Quy trình tổng quát thu nhận chitin và sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm. .14

Hình 1.6. Quy trình sản xuất chitin, chitosan từ nguyên liệu vỏ đầu tôm bằng

phương pháp thuần túy hóa học của Robert, đại học Nottingham Trent (1998)...... .15

Hình 1.7. Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar, viện nghiên cứu

công nghệ thực phẩm, Ấn Độ, 2010......... ............ ....................................................17

Hình 1.8. Cơ chế hoạt động của enzyme chitin deacetylase.... ... ..............................21

Hình 2.1. Các mẫu thu thập sử dụng cho phân lập............ .... ...................................26

Hình 2.2. Quy trình các bước định danh sơ bộ chủng vi sinh vật............ ......... ........33

Hình 2.3. Quy trình sản xuất chitosan bằng chủng vi sinh vật thí nghiệm........ .. ....36

Hình 2.4. Nhớt kế Ostwald............. ................ ..........................................................44

Hình 3.1. Kết quả định tính enzyme chitin deacetylase...................................... ...... 48

Hình 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật chọn lọc............ . ...............49

Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột............. ............. ...........50

Hình 3.4. Thử nghiệm khả năng sinh enzyme chitinase........ ...... .............................50

Hình 3.5. Kết quả khảo sát sự phân giải protein của chủng vi sinh vật.....................51

Hình 3.6. Chitosan được tạo thành từ các vi sinh vật............ .......... .........................54

Hình 3.7. Định tính chitosan bằng phương pháp Lugol/H2SO4... ..... ........................55

Hình 3.8. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của chitosan trên vi khuẩn .Coli... ...65

Hình 3.9. Ống vi khuẩn E.Coli sau 24h nuôi cấy không bổ sung chitosan....... ........66

Hình 3.10. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn chủng CD1............. ........ ...............66

Hình 3.11. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn chủng CD5.............. .......................67

Hình 3.12. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn chủng CD10............. ... ..................68

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Như chúng ta đã biết về chitin – chitosan, đây là một loại polysaccharide tự

nhiên và chiếm tỉ lệ rất lớn, chỉ sau cellulose. Bên cạnh đó chitosan cũng có nhiều

ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau rất hiệu quả và thân thiện với môi trường.

Tuy nhiên để có được nguồn nguyên liệu chitin – chitosan thì đòi hỏi phải có một

quy trình xử lý hiệu quả, bản chất chung của việc sản xuất chitin – chitosan là khử

các thành phần khoáng và hàm lượng protein còn dư thừa trong phế liệu vỏ tôm sẽ

cho ra chitin từ đó tiếp tục sử dụng kiềm mạnh ở nhiệt độ cao để cắt các gốc acetyl

nhằm chuyển chitin thành chitosan. Hiện nay người ta sử dụng phương pháp hóa

học để xử lý, quá trình này sử dụng kiềm mạnh ở nhiệt độ cao trong thời gian dài,

mang tới những nhược điểm như tiêu thụ nhiều năng lượng, lãng phí lượng lớn

kềm, khó xử lý, ăn mòn thiết bị, ô nhiễm môi trường,…

Do đó, việc ứng dụng sinh học mà ở đây là sử dụng vi sinh vật vào quy trình

sản xuất nhằm làm tăng chất lượng, hạ giá thành sản phẩm và thân thiện với môi

trường là một việc làm quan trọng và thiết yếu. Việc áp dụng vi sinh vật sẽ giúp

hoàn toàn loại bỏ những nhược điểm mà phương pháp hoá học hiện nay đang mắc

phải và gia tăng chất lượng sản phẩm chitosan tạo thành.

2. Tính cấp thiết của đề tài

Chitosan, N-deacetylase dẫn xuất của chitin, hòa tan trong dung dịch acid, và

có một phạm vi sử dụng rộng, như một loại thuốc trừ sâu tự nhiên (Thome & Văn

Daele, 1986), một tác nhân kháng khuẩn (Liu et al., 2004; Liu et al., 2004), một

polymer sinh học cho kim loại (Wan et al., 2004), chất xử lý môi trường như một

tác nhân kết bông, hoặc kết tủa chất bẩn. Hiện nay, deacetylation của chitin để tạo

thành chitosan thường đạt được bằng nhiệt hóa học để loại bỏ các nhóm acetyl. Quá

trình này sử dụng kiềm mạnh ở nhiệt độ cao trong thời gian dài. Tuy nhiên, phương

pháp này có năm nhược điểm quan trọng bao gồm:

(1) Tiêu thụ một lượng đáng kể năng lượng;

(2) Lãng phí một lượng lớn kiềm, dẫn đến sự gia tăng về mức độ ô nhiễm môi

trường và làm tăng giá thành sản phẩm;

(3) Các sản phẩm có một loạt các khối lượng phân tử và không đồng nhất mức

độ deacetylation;

(4) Vấn đề thu hồi và xử lý hoá chất;

(5) Điều kiện làm việc với hóa chất (NaOH 50%) ở nhiệt độ cao dễ gây ăn

mòn thiết bị, làm giảm chất lượng Chitosan do làm giảm hoạt tính của nhóm chức –

NH2.

Do đó việc ứng dụng sinh học mà ở đây là sử dụng enzyme chitin deacetylase

vào quy trình sản xuất nhằm làm tăng chất lượng, hạ giá thành sản phẩm và thân

thiện với môi trường là một việc làm quan trọng và thiết yếu. Việc áp dụng enzyme

sẽ giúp hoàn toàn loại bỏ những nhược điểm mà phương pháp hoá học hiện nay

đang mắc phải và gia tăng chất lượng sản phẩm chitosan tạo thành.

3. Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập, sàng lọc vi sinh vật sinh enzyme chitin deacetylase.

Khảo sát khả năng chuyển hóa chitin thành chitosan bằng các chủng sàng

lọc.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu

- Thu thập mẫu phân lập.

- Tăng sinh chọn lọc vi sinh vật.

- Phân lập chủng vi sinh vật thuần khiết từ các nguồn mẫu.

- Sàng lọc khả năng sinh tổng hợp CDA của các chủng phân lập.

- Khảo sát vi sinh vật sàng lọc và định danh.

- Thử nghiệm chuyển hóa chitin thành chitosan, sử dụng môi trường lên men

cơ bản nuôi cấy các chủng sàng lọc.

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn C, N, khoáng đến hiệu suất thu hồi chitosan

và chất lượng chitosan tạo thành (độ deacetyl, độ hòa tan).

- Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách tăng nồng độ acid acetic hòa tan chitosan.

- Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách thay đổi các nguồn cơ chất cảm ứng.

- Khảo sát tính chất chitosan tạo thành bằng phương pháp sinh học so sánh với

chitosan sản xuất bằng phương pháp hóa học và chitosan thương mại

- Đề nghị quy trình sản xuất chitosan từ chitin bằng phương pháp sinh học.

5. Phương pháp nghiên cứu

 Phương pháp tổng hợp tài liệu

- Thu thập, tìm hiểu các tài liệu tham khảo, sách, giáo trình và internet liên

quan đến đề tài.

- Tổng hợp, lựa chọn các tài liệu liên quan đến mục tiêu của đề tài.

 Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh

chitin deacetylase

 Phương pháp định tính chitin deacetylase

 Phương pháp đánh giá khả năng sản xuất chitosan của các chủng vi sinh vật

 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

- Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát.

- Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System (SAS) 9.4 và

Microsoft Excell 2010.

6. Các kết quả đạt được của đề tài

- Tuyển chọn được chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme chitin

deacetylase ứng dụng sản xuất chitosan.

- Thiết lập được quy trình công nghệ chuyển hóa chitin thành chitosan sử dụng

vi sinh vật tuyển chọn.

- Chất lượng chitosan thu được bằng phương pháp chuyển hóa sinh học tương

đương chitosan hóa học và chitosan thương mại.

7. Kết cấu của luận văn thạc sĩ

Phần mở đầu

Chương 1: Tổng quan tài liệu.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên.

Chương 3: Kết quả và thảo luận.

Phần Kết luận và đề nghị.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Sơ lược về chitin

1.1.1. Giới thiệu

Chitin là một chuỗi dài polymer của một N-acetylglucosamine, một dẫn xuất

của glucose. Chitin có công thức hóa học (C8H13NO5)n trong đó C chiếm 47,29%, H

chiếm 6,45%, N chiếm 6,89% và O chiếm 39,37%. Về cấu trúc, chitin (còn gọi là

poly-[1,4-(N-acetyl-β-D-glucosamine)]) là một polysaccharide bao gồm các gốc N-

acetyl-D-glucosamine [GlcNAc, còn gọi là (1,4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-

glucose] gắn với nhau bằng liên kết β-1,4-O-glycoside.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin

1.1.2. Tính chất vật lý

Ở dạng tự nhiên, chitin là một chất rắn màu trắng vô định hình, dai, có sợi,

phụ thuộc vào nguồn gốc và phương pháp thu nhận.

Trong dạng tinh khiết, không biến đổi của nó, chitin có tính mềm dẻo, đàn hồi,

và khá cứng rắn. Tuy nhiên, ở hầu hết các động vật chân đốt, nó thường bị thay đổi,

xảy ra phần lớn như là một thành phần của vật liệu composite, chẳng hạn như trong

sclerotin, tạo thành nhiều bộ xương ngoài của côn trùng. Kết hợp với canxi

cacbonat, như trong vỏ động vật giáp xác và nhuyễn thể, chitin tạo ra một hỗn hợp

mạnh hơn nhiều. Vật liệu composite này cứng hơn nhiều so với chitin nguyên chất,

ít giòn hơn canxi cacbonat tinh khiết.

1.1.3. Tính chất hóa học

Chitin là một polysaccharide có chứa nitơ, nó được tổng hợp từ các đơn vị của

N-acetyl-D-glucosamine. Các đơn vị này hình thành liên kết cộng hóa trị β-(1,4)

(tương tự như mối liên kết giữa các đơn vị glucose tạo thành cellulose). Vì vậy,

chitin có thể được mô tả như là cellulose với một nhóm hydroxyl trên mỗi monome

được thay thế bằng một nhóm acetyl amine. Điều này cho phép tăng liên kết hydro

giữa các polyme liền kề.

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học N-acety-D-glucosamine liên kết với nhau

bằng cầu nối β-(1,4)-glucoside

1.1.4. Tính chất sinh học

Là một vật thể màu trắng vô định hình không mùi. Trong tự nhiên chitin tồn

tại phổ biến trong vỏ ngoài của các loại nấm khuẩn, thực vật cấp thấp, các loại động

vật giáp xác như tôm, cua, côn trùng và trong màng tế bào của các động vật cao

cấp,…

Đây là một loại polymer mạch thẳng, trung tính, không tạo phản ứng hóa học,

không thay đổi trong dịch cơ thể, không phản ứng đào thải với cơ thể, không độc tố,

có tính kháng huyết khối.

1.1.5. Nguồn nguyên liệu thu nhận

Vỏ của tôm (tôm hùm, tôm thẻ), cua và các loài giáp xác ở biển là nguồn cung

cấp chitin tốt nhất.

1.1.6. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới

1.1.6.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam

Việc nghiên cứu, sản xuất chitin và các ứng dụng của chúng trong sản xuất,

phục vụ đời sống là một vấn đề tương đối mới ở nước ta. Vào những năm 1978 đến

1980, Trường đại học Thủy sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitin –

chitosan của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, nhưng chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất.

Gần đây, trước yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách,

trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin – chitosan cũng như tiềm năng thị

trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào việc

nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin – chitosan ở bước cao hơn, đồng

thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp.

Hiện nay, Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitin –

chitosan như: Trường đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm nghiên

cứu polymer – Viện khoa học Việt Nam; Trung tâm công nghệ và sinh học thủy sản

– viện nghiên cứu và nuôi trồng thủy sản.

Hàng năm chitin được sản xuất ra khoảng 5,11 triệu tấn trên toàn thế giới.

Nhật và Mỹ là những nước sản xuất chitin lớn nhất. Ở Việt Nam, chitin chủ yếu là

phế phụ liệu dạng rắn với số lượng khổng lồ được thải ra hằng ngày từ ngành công

nghiệp chế biến và xuất khẩu thủy hải sản

1.1.6.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu trên thế giới

Trước đây, người ta đã thử chiết tách chitin từ thực vật biển nhưng nguồn

nguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu cầu. Trữ lượng chitin phần lớn có nguồn gốc

từ vỏ tôm, cua. Trong một thời gian, các chất phế thải này không được thu hồi mà

lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường.

Năm 1972, hãng Kyowa Oid and Fat của Nhật lần đầu tiên đưa vào sản xuất

chitin.

Năm 1977, Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ) khi tiến hành xác định giá trị của

chitin và protein trong vỏ tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu

sử dụng trong công nghiệp. Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia

súc, còn phần chitin sẽ được dùng như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất

có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp.

Sản lượng chitin năm 1990 trên thế giới là 1200 tấn. Nước sử dụng hàng đầu

là Nhật (600 tấn/năm) và Mỹ (400 tấn/năm). Ngoài ra các nước như Trung Quốc,

Ấn Độ, Pháp cũng đang triển khai thêm các cơ sở sản xuất quy mô 50 kg

chitin/ngày với giá bán là 200 – 300 France/kg. Ở Mỹ, hàng năm tổng giá trị về các

chế phẩm chitin – chitosan sử dụng là 355 triệu USD, trong đó 190 triệu thuộc

ngành y tế, sau đó nông nghiệp (54 triệu) và mỹ phẩm (50 triệu). Theo FAO, nhu

cầu chitin – chitosan có thể lên tới 36.700 tấn/năm trong thập kỷ tới.

Các phòng thí nghiệm của Malaysia và công nghiệp làm ngọt nước biển đã

thành lập công ty liên doanh Seafresh chitosan để khai thác khả năng cung cấp

thương phẩm các dẫn xuất của vỏ tôm. Công ty này đặc biệt quan tâm với chitin và

polysaccharide từ vỏ tôm thải bỏ và hướng hoạt động chính vào các thị trường xuất

khẩu.

Theo tiến sĩ Arisol Alimuniar – giám đốc kỹ thuật, ông hy vọng sản xuất

khoảng 150 – 180 triệu sản phẩm chitin – chitosan/năm góp phần cùng các nước sản

xuất chính khác như Nhật Bản, Mỹ, Na Uy, Canada và Nga.

Ngày nay, người ta tập trung vào các dẫn xuất của chitin và khả năng ứng

dụng của các dẫn xuất này. Toàn bộ quá trình hoạt động khoa học của R.A.A.

Muzzarelli (Đại học Y Khoa Ancona – Ý) tập trung vào chitin và dẫn xuất của nó.

Cho đến nay, trên thế giới đã có rất nhiều quy trình sản xuất chitin, với nhiều nguồn

nguyên liệu khác nhau, nhưng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ.

1.1.7. Ứng dụng

Với kỹ thuật chế biến hiện đại, chitin và các dẫn xuất của chúng có một tiềm

năng to lớn đặc biệt là trong các lĩnh vực như y sinh học, dinh dưỡng, chế biến thực

phẩm, dược phẩm, vi sinh, nông nghiệp và mỹ phẩm. Chitin có thể ứng dụng làm

chất phụ gia trong thực phẩm, tạo độ bền dai cho thực phẩm thay thế một số chất

không cho phép (như hàn the…). Chitin làm chất mang trong cố định enzyme hay

cố định tế bào, làm chất mang tạo các giá thể trồng cây cảnh.

Các oligomer có nguồn gốc từ chitin cũng có hoạt tính kháng khối u, kháng

nấm, kháng khuẩn, là thành phần tạo nên glycolipid và glycoprotein có vai trò quan

trọng trong sinh học và nhiều ứng dụng khác

1.2. Sơ lược về chitosan

1.2.1. Giới thiệu

Chitosan là một polysaccharide mạch thẳng được cấu tạo từ các D-

glucosamine (đơn vị đã deacetyl hóa) và N-acetyl-D-glucosamine (đơn vị chứa

nhóm acetyl) liên kết tại vị trí β-(1,4). Nó được sản xuất từ quá trình xử lý vỏ các

loài giáp xác (ví dụ vỏ tôm, cua) với dung dịch kiềm NaOH.

Hình 1.3. Deacetyl hóa chitin thành chitosan

1.2.2. Tính chất hóa lý

Chitosan là một chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ theo các kích cỡ

khác nhau. Có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị, không tan trong nước, dung

dịch kiềm và acid đậm đặc nhưng tan trong acid loãng (pH 6,0 – 6,6) tạo dung dịch

keo trong, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309ºC – 311ºC.Trọng

lượng phân tử trung bình: 100.000 – 1.200.000 dalton tùy loại

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của chitosan

1.2.3. Tính chất sinh học

Vật liệu chitosan có nguồn gốc tự nhiên, không độc, dùng an toàn cho người.

Chúng có tính hòa hợp sinh học cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học.

Chitosan có nhiều ứng dụng đa dạng như: có khả năng hút nước, giữ ẩm, tính kháng

nấm, kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh

của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác

dụng cầm máu, chống sưng u.

Chitosan không những ức chế các vi khuẩn gram dương, gram âm, mà cả nấm

men và nấm mốc. Khả năng kháng khuẩn phụ thuộc vào một vài yếu tố như loại

chitosan sử dụng (độ deacetyl, khối lượng phân tử), pH môi trường, nhiệt độ, sự có

mặt của một số thành phần thực phẩm.

1.2.4. Các tính chất của chitosan (MargueriteRinaudo, 2006; Li et al., 1997;

Onsoyen E et al., 1990)

1.2.4.1. Mức độ deacetyl hóa

Mức độ deacetyl hóa là một đặc tính quan trọng của quá trình sản xuất

chitosan bởi vì nó ảnh hưởng đến tính chất hóa lý và khả năng ứng dụng của

chitosan sau này. Mức độ deacetyl hóa của chitosan vào khoảng 56 – 99% (nhìn

chung là 80%).

1.2.4.2. Trọng lượng phân tử Chitosan

Chitosan là polymer sinh học có khối lượng phân tử cao. Khối lượng chitin

thường lớn hơn 1 triệu Dalton trong khi các sản phẩm chitosan thương phẩm có

khối lượng khoảng 100.000 – 1.200.000 Dalton.

1.2.4.3. Độ nhớt

Độ nhớt là một nhân tố quan trọng để xác định khối lượng phân tử của

chitosan. Chitosan phân tử lượng cao thường làm cho dung dịch có độ nhớt cao.

1.2.4.4. Tính tan

Chitin tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ, trong khi đó chitosan tan trong

các dung dịch acid pH dưới 6,0. Các acid hữu cơ như acetic, formic và lactic thường

được sử dụng để hòa tan chitosan. Thường sử dụng nhất là dung dịch chitosan 1%

tại pH 4,0. Chitosan cũng tan trong dung dịch HCl 1% nhưng không tan trong

H2SO4 và H3PO4.

1.2.4.5. Tỷ trọng

Trong một số nghiên cứu cho thấy tỷ trọng của chitin và chitosan từ giáp xác

rất cao (0,39 g/cm3). Mức độ deacetyl hóa cũng làm tăng tỷ trọng của chitosan.

1.2.4.6. Khả năng kết hợp với nước và khả năng kết hợp với chất béo

Sự hấp thụ nước của chitosan lớn hơn rất nhiều so với cellulose hay chitin.

Thông thường, khả năng hấp thụ của chitosan khoảng 581 – 1150% (trung bình là

702%), khả năng hấp thụ chất béo của chitin và chitosan trong khoảng 31% – 170%,

chitosan có khả năng thấp hơn rất nhiều so với chitin.

1.2.4.7. Khả năng tạo màng

Chitosan còn có khả năng tạo màng. Màng chitosan được sử dụng nhiều trong

bảo quản thực phẩm. Màng chitosan khá dai, khó xé rách, có độ bền tương đương

với một số chất dẻo vẫn được dùng làm bao gói.

Theo nghiên cứu của Mi và cộng sự (2001, 2003) thì màng chitosan được tạo

theo phương pháp sau: tạo dung dịch chứa hàm lượng chitosan lớn hơn 3%, sau đó

sấy để giảm bớt nước trong dung dịch. Sau khi sấy cho dung dịch trao đổi ion vào

ngâm trong 24 giờ. Cuối cùng sấy cho đến khi màng khô hoàn toàn.

Cũng theo nghiên cứu này cho thấy màng chitosan tạo thành có độ hấp thu

dung dịch đệm phosphate pH = 7,4 (tương tự với dung dịch nội bào) và tốc độ

truyền hơi nước rất cao (Mi et al., 2001; Mi et al., 2003).

1.2.4.8. Hoạt tính sinh học của chitosan

Chitosan là polymer chứa nhóm chức mang điện tích dương cho phép gắn kết

với các thành phần sinh học mang điện tích âm và có thể tái sinh theo con đường

sinh học trên trái đất, có khả năng thủy phân sinh học bằng enzyme trong cơ thể,

tương hợp sinh học với các cơ quan, mô và tế bào động thực vật, kích thích quá

trình đông máu và làm lành vết thương, tương tác chuyên biệt với các thành phần

của chất nền ngoại bào và các nhân tố tăng trưởng. Ngoài ra, chitosan còn có tác

dụng giảm cholesterol do liên kết có chọn lọc với các acid béo, không gây độc do

các sản phẩm sau thủy phân đều là các chất chuyển hoá tự nhiên, không gây đáp

ứng miễn dịch trong mô và cơ quan động vật, có tác dụng hỗ trợ trong điều hòa

miễn dịch. Chitosan có thể xử lý tạo nhiều dạng sản phẩm như dạng miếng, màng,

tấm xốp, sợi, hạt, bột mịn, bông và gel (Antoni, 2005).

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất của nó đã nhận được sự

quan tâm đáng kể trong những năm gần đây. Cơ chế kháng khuẩn của chitosan là

nhờ một số cơ chế sau (Hang et al., 2012):

 Chitosan là một polymer mang điện dương, chúng tương tác với thành phần

polyanion vách tế bào (polysaccharides và protein) của vi sinh vật, kết quả là sự rò

rỉ thành phần nội bào do các thay đổi trong tính thấm của hàng rào (barrier), ngăn

cản chất dinh dưỡng đi vào tế bào (đặc biệt là chitosan có khối lượng phân tử thấp

LMWC).

 Chitosan có khả năng kết hợp với DNA nên chitosan có khả năng ức chế

tổng hợp RNA và protein.

 Chitosan có khả năng gắn kết gây đông tụ, kết tủa tế bào vi khuẩn và dẫn đến

chết tế bào. Chitosan cho thấy một phổ kháng khuẩn rộng kháng cả nấm, vi khuẩn

gram dương và gram âm.

Hoạt tính trong điều trị vết thương, chitosan có tác dụng cầm máu, đẩy nhanh

quá trình phát triển các tế bào ở vùng mô bị thương, tăng cường hoạt động của

chitinase và lysozyme, dẫn đến mau lành vết thương và giảm nhiễm trùng. Chitosan

được báo cáo là bền với dịch mật, dịch tuỵ và nước tiểu nên được dùng trong chỉ

khâu phẫu thuật thay thế cho các loại vật liệu khác có thể bị chất dịch trong cơ thể

tấn công và đứt trước khi vết thương lành hẳn (Alemdaroğlu et al., 2006). Trong các

trường hợp bị bỏng, chitosan có thể tạo thành ở dạng màng xốp hút nước mạnh và

giúp cho oxy phân tán qua màng vào mô tổn thương rất dễ dàng, tạo điều kiện cho

các mô này bình phục nhanh chóng (Trần Thị Nguyệt, 2015).

1.2.5. Nguồn nguyên liệu thu nhận

Hàm lượng chitosan của nấm tiếp hợp như A.coerulea, R.delemar,

C.blackesleeana, M.rouxii, B.poitrasii, dao động từ 6,1 – 11% trọng lượng khô của

tế bào. Nấm của nhóm này có thể dễ dàng phát triển trong phòng thí nghiệm về các

chất dinh dưỡng rẻ tiền và vật liệu thường có thể được sản xuất bằng các quy trình

hóa học đơn giản.

Hiện nay, chitosan đang được sản xuất từ vỏ cua và tôm bằng quá trình nhiệt

hóa học. Tuy nhiên nó có một số nhược điểm như sử dụng dung dịch kiềm ở nồng

độ cao, làm tăng mức độ ô nhiễm môi trường và hình thành sản phẩm không đồng

nhất. Để khắc phục những hạn chế này, chitosan tự nhiên từ một số loại nấm tiếp

hợp có thể được phân lập từ sinh khối sợi. Một số nấm có chitosan trọng lượng phân

tử thấp rất hữu ích cho các ứng dụng y tế và trong nông nghiệp.

1.2.6. Công nghệ sản xuất chitosan

Vỏ, đầu tôm chứa 3 thành phần chủ yếu chitin, protein và khoáng, chủ yếu là

CaCO3. Để thu nhận chitin, phải khử khoáng, khử protein và khử màu. Để được

chitosan cần loại bỏ gốc acetyl (deacetyl hóa). Sơ đồ tổng quát công nghệ thu hồi

chitin từ vỏ, đầu tôm và sản xuất chitosan được trình bày trên hình:

Hình 1.5. Quy trình tổng quát thu nhận chitin và sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm

1.2.6.1. Quy trình sản xuất chitosan từ chitin bằng phương pháp hóa

học

Trong phương pháp hóa học người ta tiến hành khử protein bằng NaOH và

khử khoáng bằng acid vô cơ. Nồng độ hóa chất và điều kiện thay đổi tùy quy trình,

cũng như thứ tự hai quá trình trên có thể đảo ngược.

 Ví dụ về một số quy trình sản xuất chitin – chitosan tiêu biểu:

- Quy trình sản xuất chitin từ tôm song nước ngọt của Mayer và Lee, đại học

Louisiana, Hoa kỳ (1989).

- Quy trình sản xuất của Robert, đại học Nottingham Trent, Vương quốc Anh

(1998).

- Quy trình sản xuất của PGS.TS Trần Thị Luyến, đại học Nha Trang.

- Ngoài ra còn có nhiều nghiên cứu khác đến từ các nước Ấn Độ, Nhật Bản,

Anh, Pháp, Thái Lan,…

Hình 1.6 trình bày một quy trình sản xuất chitin, chitosan bằng phương pháp

hóa học tiêu biểu.

Hình 1.6. Quy trình sản xuất chitin, chitosan từ nguyên liệu vỏ đầu tôm bằng

phương pháp thuần túy hóa học của Robert, đại học Nottingham Trent (1998)

Nhận xét:

Trong phương pháp hóa học người ta tiến hành khử protein bằng NaOH và

khử khoáng bằng acid vô cơ để thu hồi chitin sau đó tiếp tục dùng NaOH đặc nồng

độ 35 – 50% ở nhiệt độ cao trong thời gian dài để deacetyl hóa chitin thu được, thu

hồi chitosan. Nồng độ hóa chất và điều kiện thay đổi tùy từng quy trình. Một trong

những hạn chế của phương pháp này là sử dụng kiềm đặc ở nhiệt độ cao trong thời

gian dài có thể gây ăn mòn thiết bị. Mặt khác, việc xử lý hóa chất sau khi sử dụng

xong khó trung hòa, có thể gây ô nhiễm môi trường.

1.2.6.2. Quy trình sản xuất chitosan bằng phương pháp bán sinh học

Thay vì sử dụng các hóa chất với nồng độ cao, các nhà khoa học đang ứng

dụng sinh học vào quy trình sản xuất và đã đem lại thành công trong vấn đề này.

Đối với phương pháp bán sinh học thì tác nhân khử khoáng là acid lactic sinh

ra do lên men lactic. Tác nhân khử protein thì nhiều tác giả sử dụng enzyme

protease từ Aspergillus oryzae, chế phẩm thương mại Alcalase hay sử dụng trực tiếp

Bacillus spp.

Sau khi khử khoáng và khử protein thì vẫn còn giai đoạn deacetyl hóa vẫn

chưa tìm ra được biện pháp tối ưu.

Hình 1.7. Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar, viện

nghiên cứu công nghệ thực phẩm, Ấn Độ, 2010

Nhận xét:

Trong phương pháp này, người ta chủ yếu dùng vi khuẩn lên men lactic để ủ

tôm. Acid lactic sinh ra sẽ khử khoáng trong nguyên liệu, đồng thời ngăn không cho

các vi sinh vật gây hôi thối phát triển. Đồng thời, các vi sinh vật này sẽ phân hủy

một phần protein còn lại trong nguyên liệu.

Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007) cũng nghiên cứu và tìm được quy

trình thu nhận chitin từ đầu – vỏ tôm phế liệu bằng phương pháp enzyme sử dụng

dịch ép vỏ dứa phế thải chứa proteinase bromelain và giàu các acid hữu cơ, có tác

dụng loại các chất khoáng và protein trong đầu – vỏ tôm. Phương pháp này có ưu

điểm không cần acid để loại khoáng tiêu tốn ít xút cho việc loại bỏ protein, hiệu quả

thu hồi chitin cao ít gây ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi

phải có nguồn nguyên liệu là vỏ chồi dứa cạnh nơi xử lý vỏ đầu tôm, nếu không chi

phí lớn cho thu nhận enzyme từ vỏ dứa.

So sánh hiệu quả quy trình xử lý hóa học và sinh học: chất lượng chitin sản

xuất bằng phương pháp hóa học có hiệu quả khử khoáng và protein thấp hơn nhiều

so với xử lý bằng phương pháp sinh học.

Theo Bhaskar (2010) thì phương pháp sinh học cho hiệu quả khử protein là

92% khử khoáng 78%. Theo Rao (2000) thì hiệu quả khử khoáng có thể đạt 65% và

hiệu quả khử protein cao nhất có thể đạt 86%.

Bước tiếp theo trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ nghiên cứu cải tiến quy

trình thu hồi chitosan từ chitin để đạt được hiệu suất thu hồi tốt nhất nhưng vẫn thân

thiện với môi trường và đạt được mức độ đồng nhất trong sản phẩm thu được.

1.2.7. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới

1.2.7.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu tại Việt Nam

Là nước có nền khoa học kỹ thuật chưa phát triển, việc nghiên cứu và sản xuất

chitin – chitosan còn khá mới mẻ. Công trình vào năm 1978 – 1982 của Đỗ Minh

Phụng tại Đại học Thủy sản là bước đầu về lĩnh vực này, tuy nhiên bước đầu còn

gặp nhiều khó khăn.

Mỗi năm, Việt Nam thải ra gần 70.000 tấn vỏ tôm nhưng vẫn chưa tận dụng

triệt để, gây lãng phí. Đã có nhiều những nghiên cứu để tận dụng nguồn phế liệu

này. Tuy nhiên chỉ dừng lại ở việc sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học từ

nguồn phế liệu vỏ tôm. Chưa hoàn toàn có thể chuyển vỏ tôm thành chitosan bằng

phương pháp sinh học.

Những năm gần đây, trước yêu cầu cấp bách về xử lý tận thu nguồn phế liệu

và những thông tin về kỹ thuật, các nhà khoa học của nước ta bắt đầu nghiên cứu và

hoàn thiện quy trình sản xuất chitin – chitosan cũng như các ứng dụng của nó. Đã

có nhiều trường đại học và cơ quan nghiên cứu như Đại học Tổng hợp, Đại học Y

Dược TPHCM, phân viện khoa học Việt Nam, cùng nhiều nghiên cứu ở các cơ sở

sản xuất như ở TP HCM, Cà Mau.

1.2.7.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu trên thế giới

Sản lượng chitosan trên thế giới vào thập niên cuối của thế kỷ 20 là khoảng

2000 tấn/năm. Hiện nay đi đầu trong lĩnh vực ứng dụng và sản xuất chitosan của

Nhật Bản là 600 tấn/năm, Hoa Kỳ là 400 tấn/năm. Ngoài ra còn các nước khác như

Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp,…

Ở Hoa Kỳ, hàng năm tổng giá trị về các chế phẩm chitin – chitosan sử dụng là

425 triệu USD, trong đó 210 triệu USD thuộc về ngành y tế, sau đó là ngành nông

nghiệp và mỹ phẩm. Một số công ty ở Hoa Kỳ đã nghiên cứu chiết rút chitin –

chitosan từ sự lên men nấm.

Hiện nay có rất nhiều công ty lớn trên thế giới tham gia vào lĩnh vực sản xuất

chitin – chitosan và họ đã nghiên cứu ra nhiều sản phẩm có nguồn gốc từ chitosan

ứng dụng trong việc xử lý nước, khử các ion kim loại độc, bọc hạt và các ứng dụng

trong nông nghiệp.

1.2.8. Ứng dụng

Chitosan có nhiều ứng dụng trong thương mại và y sinh. Nó có thể được dùng

trong nông nghiệp với vai trò xử lý hạt giống và thuốc trừ dịch hại sinh học, giúp

cây trồng chống lại các loại bệnh do nấm. Trong sản xuất rượu vang, nó có thể được

sử dụng như là tác nhân lọc cặn và bảo quản. Trong công nghiệp, nó có thể được sử

dụng trong sơn tự làm liền vết trầy xước polyurethane (PUR). Trong y học, nó có

thể được ứng dụng trong băng gạc y tế để làm giảm chảy máu và chống nhiễm

khuẩn; truyền tải thuốc qua da.

1.3. Sơ lược về enzyme chitin deacetylase

1.3.1. Giới thiệu enzyme chitin deacetylase

Mã số của enzyme chitin deacetylase EC 3.5.1.41

Chitin deacetylase có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 25 – 80 kDa cả

trên điện di gel natri cacbonlamide natri dodecyl sulfate và sắc ký lọc gel, cho thấy

rằng enzyme tồn tại như một monomer [32].

Chitin deacetylase (CDA) là một enzyme đã được tách ra chủ yếu từ nấm hoặc

từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Chitin deacetylase (CDA, E.C. 3.5.1.41) là một

enzyme thuộc về họ hydrolase xúc tác sự thủy phân của các nhóm acetamide của N-

acetylglucosamine trong chitin, thúc đẩy chuyển đổi thành chitosan, một

glucosamin polymer. Trong các loại nấm tiếp hợp, CDA có vai trò quan trọng trong

sự phát triển của nấm, tham gia vào quá trình sinh tổng hợp chitosan của vách tế

bào song song với sự tổng hợp chitinase (CS, EC 2.4.1.16) và cũng có thể liên quan

đến phản ứng deacetyl hóa các oligosaccharide chitin trong quá trình tự hủy sau

hoạt động của endo-chitinase trên thành tế bào.

1.3.2. Cơ chế xúc tác

Enzyme chitin deacetylase tham gia vào sự trao đổi chất đường amino.

Enzyme chitin deacetylase xúc tác theo phương trình:

Chitin + H2O → Chitosan + acetate

Vì vậy, hai cơ chất của enzyme chitin deacetylase là chitin và H2O, trong khi

hai sản phẩm của nó là chitosan và acetate.

Từ các nguồn khác nhau của chitin deacetylase cho thấy các mô hình hoạt

động enzyme khác nhau trên cơ chất chitin. Hai cơ chế chính được mô tả là cơ chế

tấn công nhiều vị trí trên một sợi cơ chất (multiple attack mechanism) và cơ chế tấn

công nhiều sợi cùng lúc (multiple chain mechanism).

Hình 1.8 biểu diễn cơ chế hoạt động của enzyme chitin deacetylase

Hình 1.8. Cơ chế hoạt động của enzyme chitin deacetylase

(A) – cơ chế deacetyl hóa của (GlcNAc)4 bằng một enzyme exo-chitin

deacetylase từ M.rouxii,

(B) cơ chế xúc tác của một endo-chitin deacetylase từ C. lindemuthianum.

(GlcNAc: vòng tròn màu xám, GlcN vòng tròn màu trắng, đầu không khử được

đánh dấu X. Mũi tên chỉ vị trí cắt của CDA).

Trong cơ chế tấn công nhiều vị trí trên một sợi cơ chất CDA liên kết với sợi

chitin, một chuỗi phản ứng deacetyl hóa diễn ra, sau đó enzyme mới liên kết với sợi

chitin khác (Hình 1.8A). Khi nghiên cứu cơ chế hoạt động của CDA từ nấm M.

rouxii, người ta sử dụng cơ chất là chitosan được deacetyl hóa một phần. Enzyme

CDA chỉ có thể deacetyl hóa hữu hiệu khi chitin oligomer có DP (độ polymer hóa)

lớn hơn 2. Phản ứng deacetyl hóa bắt đầu ở đầu không khử của oligomer. Mức độ

deacetyl hóa còn phụ thuộc vào độ dài cơ chất. Oligomer DP 5 có thể được deacetyl

hóa hoàn toàn, trong khi đầu khử của (GlcNAc)3, (GlcNAc)6 và (GlcNAc)7 luôn

luôn được bảo toàn mà chưa rõ tại sao.

Trong hình (B), (GlcNAc)4 được deacetyl hóa bằng CDA từ C.

lindemuthianum theo cơ chế tấn công nhiều chuỗi chitin (cơ chế 2). Người ta gọi 4

vị trí cắt của CDA này là -2, -1, 0 và +1. Enzyme nhận biết sợi chitin gồm 4 đơn

phân và nhóm N-acetyl group của đơn phân ở vị trí 0 luôn được deacetyl hóa. Các

phản ứng deacetyl hóa tiếp theo có thể xảy ra theo nhiều thứ tự khác nhau (hình

1.8B).

1.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính

Các cơ chất khác nhau có mức deacety hóa khác nhau được sử dụng để đo

hoạt tính CDA. Chúng bao gồm chitin glycol, chitin keo, bột chitin, chitin cua,

chitin Katakura, Sigma α-chitin, chitin CHA-2, γ-chitin, carboxymethyl chitin, α-

1→3,1→6-N-acetylgalactosamine galactan, N-acetylglucosamine và (GlcNAc)2-6

Một nghiên cứu phóng xạ sử dụng O-hydroxyethylchitin (glycol chitin), chất

phóng xạ được gắn vào nhóm N-acetyl làm cơ chất để xác định hoạt tính của chitin

deacetylase trong M. rouxii. Phương pháp này rất nhạy, tuy nhiên đòi hỏi phải gắn

đồng vị phóng xạ, được sử dụng chủ yếu theo dõi sự phân bố nhóm nhóm O-

hydroxyethyl trong chitin glycol thương mại mà không thể dùng để theo dõi quá

trình deacetyl hóa cơ chất không được gắn phóng xạ. Kauss và Bausch đã sử dụng

acid nitrous và 3-methyl-2-benzothiazoline hydrazone (MBTH) (Ghormade1 et al.)

để polymer hóa glycol ethylene chitin với NaNO2 và phát hiện màu sắc của

glucosamine thoát ra với MBTH. Hoạt tính của CDA cũng được đo bằng acetate

phóng thích từ hexa-N-acetylchitohexaose bằng phương pháp enzyme của

Bergmeyer thông qua phản ứng enzyme kết hợp.

1.3.4. Điều kiện hoạt động của enzyme

Theo kết quả báo cáo, độ pH tối ưu của hầu hết các enzyme chitin deacetylase

ngoại bào là trung tính hoặc trong khoảng kiềm từ 7 – 12, trong khi hầu hết các

enzyme chitin deacetylase nội bào có các giá trị pH tối ưu trong khoảng 4,5 – 6. Nhiệt độ tối ưu là 50 – 60oC đối với hầu hết các enzyme.

Để xác định nhiệt độ tối ưu, phản ứng enzyme được kiểm soát ở nhiệt độ khác nhau (20 – 70oC) trong 1 giờ. Để ổn định nhiệt độ, enzyme được ủ sẵn ở nhiệt độ

khác nhau (20 – 70ºC) trong 1 giờ mà không có chất nền. Để xác định độ pH tối ưu,

phản ứng enzyme được tiến hành trong dung dịch muối glutamat natri 50 mM (pH

3,5 – 5,5), dung dịch đệm phosphate 50 mM (pH 5,0 – 8,5), dung dịch Tris-HCl 50

mM (pH 7,0 – 9,5) và 50 mM Na2CO3 đệm (pH 9,0 – 11,5) trong 1 giờ. Để ổn định

độ pH, enzyme được ủ trong các bộ đệm pH khác nhau ở nhiệt độ 4ºC qua đêm. Các

nồng độ khác nhau của ion acetate và kim loại đã được thêm vào hỗn hợp phản ứng

enzyme để nghiên cứu ảnh hưởng của chúng đến hoạt động của enzyme.

Hoạt tính CDA bị ức chế mạnh bởi các ion kim loại Hg2+, Zn2+, và EDTA, nhưng được kích hoạt bởi Ca2+ và Co2+ ở 10 mM. Trước đây, đã có báo cáo rằng hoạt động CDA từ C. lindemuthanum ATCC 56676 được thúc đẩy nhẹ bởi Co2+ ở 1

mM, nhưng nó bị ức chế mạnh ở 10 mM .Tuy nhiên, Mortierella sp hoạt động CDA DY-52 đã được tăng lên rất nhiều bởi Co2+ trong phạm vi từ 0,01 – 10 mM. Kết quả

này chưa được báo cáo cho các enzyme CDA từ các chủng sinh vật khác.

1.3.5. Ứng dụng

CDA cũng có thể là một công cụ đa năng trong việc kiểm soát sinh vật gây hại

như côn trùng. CDA có thể được sử dụng kết hợp với các enzyme thủy phân khác

để kiểm soát sâu bệnh và các mầm bệnh.

Trong kiểm soát côn trùng bằng biện pháp sinh học, chitin deacetylase đã

được chứng minh là mục tiêu tiềm năng cho sản xuất thuốc trừ sâu sinh học. Chitin

deacetylase là một protein tổng hợp và tiết ra trong ruột côn trùng trong quá trình

cho ăn; nhờ đó thay đổi thành phần chitin trong ruột để bảo vệ ruột khỏi sự xâm

nhập của vật ký sinh, cũng như ngăn chặn độc tố như lectins. Do đó, sự ức chế

enzyme này là một cơ chế kiểm soát côn trùng gây côn trùng.

Vi khuẩn biển Vibrio vulnificus gây ra nhiễm khuẩn huyết nặng và nhiễm

trùng vết thương với tiến trình bệnh lý nhanh chóng ở tôm cua. Lee và cộng sự cho

thấy một phần phân đoạn chitosan đã ngăn ngừa và điều trị nhiễm trùng do V.

vulnificus.

Ngoài ra, biểu hiện gene mã hóa enzyme chitin synthase và CDA gene trong

cây trồng cũng làm thay đổi cấu trúc vách tế bào thực vật, từ đó cải thiện được khả

năng kháng bệnh của cây và ứng dụng của chúng trong công nghiệp.

1.3.6. Lịch sử nghiên cứu enzyme chitin deacetylase

Một số công trình nghiên cứu về chitin deacetylase trên thế giới:

Con đường hình thành chitosan trong Mucor rouxii nhờ enzyme chitin

deacetylase (Araki, Ito,1975). Sự phát hiện ra enzyme chitin deacetylase trong phần

nổi của nấm Mucor rouxii, enzyme này giải phóng khoảng 30% các nhóm acetyl

glycol chitin, tạo ra một sản phẩm có độ nhạy cảm giảm với lysozyme. Enzyme này

cho thấy pH tối ưu là 5,5. Giá trị Km của glycol chitin là 0,87 g/l hoặc 2,6 mM đối

với lượng monosaccharide. Sự xuất hiện của enzyme chitin deacetylase tạo thành

chitosan trong nấm.

Tinh sạch và mô tả đặc tính của chitin deacetylase từ Absidia coerulea của

Gao và cộng sự (1995). Bài viết này nói về sự tinh sạch bằng cách chạy sắc ký trên

Butyl Toyopearl-650M, Gigapite (hydroxyapatite), và DEAE Toyopearl-650M và

những đặc trưng về nhiệt độ, pH của chitin deacetylase trong nấm Absidia coerulea.

Enzyme này cũng có thể chuyển hóa chitin thành chitosan.

Enzyme deacetyl hóa của chitin bằng chitin deacetylase ngoại bào từ

Mortierella sp. DY-52 (Kim et al.,2008). Tìm ra được mẫu khuẩn nấm DY-52 từ

hàng trăm khuẩn nấm phân lập từ các mẫu đất khác nhau, cho thấy có sự xuất hiện

enzyme chitin deacetylase ngoại bào (CDA), khảo sát yếu tố tăng trưởng trên môi

trường nuôi cấy, nhiệt độ, pH, cơ chất, ion kim loại ảnh hưởng đến sự phát triển của

enzyme này.

Đặc tính và ứng dụng của chitin deacetylase của Yong và cộng sự (2010). Sự

phát hiện enzyme chitin deacetylase từ vi khuẩn biển, ở đề tài này cũng tiến hành

khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh enzyme chitin deacetylase, cơ chế

hoạt động, một cách tổng quan về chitin deacetylase.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

2.1.1. Thời gian

Đề tài này được thực hiện từ tháng 2/2017 đến tháng 8/2017

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu

Đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Khoa Công Nghệ Sinh

Học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí

Minh.

2.2. Vật liệu nghiên cứu

2.2.1. Nguồn mẫu

Nguồn mẫu: có tổng cộng 5 mẫu đã được thu thập từ nhiều nguồn khác nhau.

Các mẫu được cho vào túi PE vô trùng và được bảo quản lạnh để chuyển về phòng

thí nghiệm ngay trong ngày phục vụ cho việc phân lập

Mẫu 1: Bãi vỏ tôm Làng bè Long Sơn – Vũng Tàu

Mẫu 2: Mẫu đất gần nhà máy chế biến hải sản – Đường Trường Sa – Vũng

Tàu

Mẫu 3: Khu bãi rác làng bè sông Chà Và – Vũng Tàu

Mẫu 4: Mẫu đất ở vùng gần biển Suối O – Bình Châu

Mẫu 5: Mẫu đất ven biển Cần Giờ

Hình 2.1. Các mẫu thu thập sử dụng cho phân lập

2.2.2. Hóa chất

- Chitin và chitosan được cung cấp bởi công ty TNHH MTV Chitosan VN

(Kiên Giang). Chitosan có độ deacetyl hóa 75%.

- p-nitroacetanilide độ tinh khiết 98% được cung cấp bởi Sigmaaldrich phân

phối bởi công ty BCE Việt Nam.

- Các hóa chất vi sinh dùng cho việc phân lập và lên men được cung cấp bởi

Himedia Ấn Độ. Có độ tinh khiết 99%.

- E. coli được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học trường Đại

học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM.

2.2.3. Thiết bị – dụng cụ

2.2.3.1. Thiết bị

Nồi hấp Autoclave

2.2.3.2. Dụng cụ

2.3. Phương pháp luận

Để đạt mục đích chuyển hóa chitin thành chitosan bằng phương pháp sinh học

tôi đưa ra mục tiêu luận văn là phân lập vi khuẩn có khả năng sinh enzyme chitin

deacetylase, với hy vọng tìm được các chủng có khả năng tăng sinh khối tốt và khả

năng tổng hợp chitin deacetylase ngoại bào.

Tiếp theo là chúng tôi sử dụng trực tiếp các chủng vi sinh vật tuyển chọn

chuyển hóa chitin thành chitosan, xác định các thông số kỹ thuật cho quá trình

chuyển hóa và đánh giá hiệu quả của việc thu hồi chitosan cũng như các tính chất

chitosan thu được bằng phương pháp sinh học, so sánh với chitosan thu được bằng

phương pháp hóa học và chitosan thương mại.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

 Bố trí thí nghiệm

Mục tiêu Nội dung Phương pháp

Phân lập, sàng lọc

Thu thập mẫu VSV sinh tổng hợp

enzyme CDA

- Hình thái khuẩn lạc Tăng sinh, phân lập

chủng thuần khiết

- Định tính enzyme CDA Sàng lọc chủng sinh bằng thuốc thử p- tổng hợp CDA nitroacetanilide

- Hình thái tế bào

- Một số chỉ tiêu sinh lý,

sinh hóa Định danh các chủng - Khảo sát khả năng sinh sàng lọc enzyme ngoại bào

- Giải trình tự 16S rDNA,

so sánh trên Genbank

Thử nghiệm chuyển - Định tính chitosan tạo Khảo sát khả năng

hóa chitin thành thành sử dụng chuyển hóa chitin

chitosan, sử dụng môi thành chitosan bằng - Lugol/H2SO4

trường lên men cơ bản các chủng sàng lọc

nuối cấy các chủng

sàng lọc

- Hiệu suất thu hồi Khảo sát ảnh hưởng chitosan, độ hòa tan, độ của nguồn C deacetyl

- Hiệu suất thu hồi Khảo sát ảnh hưởng chitosan, độ hòa tan, độ của nguồn N deacetyl

- Hiệu suất thu hồi

chitosan, độ hòa tan, độ Khảo sát ảnh hưởng deacetyl của tỉ lệ khoáng - Xác định hoạt tính

enzyme chitin deacetylase

Tăng hiệu suất thu hồi - Hiệu suất thu hồi, Hiệu

bằng cách tăng nồng độ suất thu hồi chitosan, độ

acid acetic hòa tan hòa tan, độ deacetyl

chitosan

Tăng hiệu suất thu hồi - Hiệu suất thu hồi

bằng cách thay đổi chitosan, độ hòa tan, độ

nguồn cơ chất cảm ứng deacetyl

- Độ nhớt

- Độ deacetyl hóa So sánh chitosan tạo - Khối lượng phân tử thành với chitosan (MW) của chitosan thương mại và chitosan - Khả năng kháng khuẩn hóa học xác định MIC

- Điện di protein

2.4.1. Phân lập, sàng lọc vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme chitin

deacetylase

2.4.1.1. Thu thập mẫu

Sử dụng dụng cụ lấy mẫu vô trùng lấy 50 g mỗi mẫu cho vào bọc nilon, ghi

chú và bảo quản trong thùng lạnh trong quá trình chuyển mẫu về Phòng thí nghiệm

để phân lập.

Những nguồn mẫu được chọn đều có nguồn phế liệu vỏ tôm, cua lớn,… đây

cũng là nguồn chitin dồi dào là cơ chất cảm cảm ứng cho quá trình sinh enzyme

chitinase hoặc chitin deacetylase của các chủng vi sinh vật. Từ đó, ta có thể tiến

hành sàng lọc được tất cả các chủng có hoạt tính 1 trong 2 enzyme này. Trong các

bước tiếp theo, tiếp tục chọn lọc lại các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme

chitin deacetylase.

2.4.1.2. Tăng sinh, phân lập chủng thuần khiết

Phương pháp: Các mẫu thu thập từ các bãi thải vỏ tôm ở các vùng biển, mẫu

đất thu thập từ nhà máy sản xuất chitin được pha loãng và cấy trang tăng sinh trên

môi trường chitin nhằm làm tăng số lượng quần thể vi sinh vật có trong mẫu.

Mẫu đất sau khi được thu thập sẽ tiến hành tăng sinh chọn lọc trên môi trường

NB có bổ sung 2% huyền phù chitin. Nhằm tạo môi trường dinh dưỡng thích hợp

cho các loại vi khuẩn có thể sử dụng nguồn cơ chất chitin.

Sau khi ủ 37oC trong 24 giờ. Pha loãng bằng nước muối sinh lý thành các nồng độ 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. Hút 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng 10-3, 10- 4, 10-5, 10-6 cho vào các đĩa petri chứa môi trường NA bổ sung 2% huyền phù chitin. Trang đều mẫu. Ủ 37oC trong 24 giờ.

Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc (màu sắc, hình dạng và kích thước) trên

đĩa petri, lựa chọn các khuẩn lạc riêng lẻ tiến hành cấy chuyền nhiều lần trên môi

trường NA có bổ sung 2% huyền phù chitin để tiến hành làm thuần.

Các chủng thuần khiết sẽ được cấy sang 2 đĩa môi trường NA bổ sung 2%

huyền phù chitin lần lượt được kiểm tra khả năng sinh enzyme chitin deacetylase.

2.4.1.3. Sàng lọc

Phương pháp: Các chủng thuần khiết sẽ được lần lượt kiểm tra khả năng sinh

enzyme chitin deacetylase. Sự hiện diện chitin deacetylase được định tính bằng cách

sử dụng dải thử nghiệm có tẩm p-nitroacetanilide. Sau thời gian ủ với dịch môi

trường nuôi cấy, sự phát triển của màu vàng trong dải chỉ ra sự hiện diện của vi

khuẩn deacetylase tương ứng được cô lập (Kuldeep et al., 2012).

Thí nghiệm được tiến hành bằng cách tẩm giấy lọc có chứa p-nitroacetanilide

(đã được tiến hành tẩm và sấy khô 2 – 3 lần ở nhiệt độ 50ºC/30 phút).

Các ống nghiệm chứa 5 ml môi trường đã được hấp tiệt trùng thành phần gồm:

1 g yeast extract; 0,4 g (NH4)2SO4 và 0,15 g KH2PO4 (pH 7,0). Cấy khuẩn lạc riêng

lẻ của các chủng phân lập được vào các ống nghiệm. Các ống nghiệm được ủ ở

37°C trong hai ngày. Sau khi ủ, 2 ml dung dịch từ các ống nuôi cấy đã được chuyển

sang các ống nghiệm vô trùng tương ứng chứa các dải thử nghiệm p-

nitroacetanilide. Các ống này tiếp tục được ủ ở 37° C trong 12 – 24 giờ. Sau khi ủ,

sự xuất hiện của màu vàng trong dải cho thấy sự hiện diện của enzyme deacetylase

trong chủng vi khuẩn tương ứng. Các chủng dương tính với thử nghiệm sẽ được sử

dụng cho quá trình khảo sát tiếp theo.

Tiến hành tương tự cho mẫu đối chứng có môi trường lên men không chứa vi

sinh vật.

Deacetylase

Quan sát kết quả đạt được trên mẫu đối chứng và mẫu chứa vi sinh vật.

4 – Nitroaniline

(Màu vàng) p - nitroacetanilide

2.4.1.4. Định danh các chủng sàng lọc

Các bước định danh sơ bộ bằng các thử nghiệm sinh hóa được trình bày

qua sơ đồ sau đây:

Chủng VSV

Các đĩa được sử dụng thực hiện các thử nghiệm sinh hóa

Tăng sinh trên môi trường nuôi cấy chứa 2% chitin

Làm tan chảy Gelatin

Methyl Red Nhuộm gram

Voges Proskauer Nhuộm bào tử

Chitin deacetylase

Simmon Citrate

Test thử nghiệm, sinh lý sinh hóa Catalase

Amylase Indol

Định tính hoạt tính enzyme TSI Chitinase

Định danh sơ bộ Protease

Giải trình tự 16S rDNA, so sánh trên Genbank

Hình 2.2. Quy trình các bước định danh sơ bộ chủng vi sinh vật

 Các thử nghiệm sinh lý, sinh hóa

Thuyết minh quy trình: Chủng vi sinh vật sau làm thuần tiến hành cấy ria trên

môi trường NA bổ sung 2% huyền phù chitin để ta tiến hành các thử nghiệm sinh lý

sinh hóa như: hình thái tế bào, nhuộm Gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm methyl red,

simmon citrate, indol, catalase, TSI, Gelatin để khảo sát sơ bộ chủng vi sinh vật

nhận được.

 Định tính hoạt tính enzyme của chủng vi sinh vật

- Enzyme amylase

Tiến hành thí nghiệm với 2 đĩa song song.

Đĩa 1 (TN): cấy ria chủng trên môi trường NA có chứa 2% tinh bột. Ủ nhiệt độ

phòng, 24 giờ. Nhỏ lugol và quan sát kết quả.

Đĩa 2 (ĐC): cấy ria chủng trên môi trường đối chứng không chứa tinh bột. Ủ

nhiệt độ phòng, 24 giờ. Nhỏ lugol và quan sát kết quả.

- Enzyme chitinase

Tiến hành thí nghiệm với 2 đĩa song song.

Đĩa 1 (TN): cấy điểm chủng vi sinh vật trên môi trường NA có chứa 2% huyền

phù chitin + 2% agar. Ủ nhiệt độ phòng, 24 giờ. Nhỏ lugol và quan sát kết quả

Đĩa 2 (ĐC): cấy điểm chủng trên môi trường đối chứng không chứa chitin. Ủ

nhiệt độ phòng, 24 giờ. Nhỏ lugol và quan sát kết quả

- Enzyme protease

Tiến hành thí nghiệm với 2 đĩa song song.

Đĩa 1 (TN): hút 0,1 ml dịch chứa vi sinh vật vào trong lỗ thạch đã được đục

sẵn trên môi trường phân lập PCA có chứa 2% casein. Ủ nhiệt độ phòng, 24 giờ.

Đĩa 2 (ĐC): hút 0,1 ml dịch chứa vi sinh vật vào trong lỗ thạch đã được đục

sẵn trên môi trường đối chứng PCA không chứa casein. Ủ nhiệt độ phòng, 24 giờ.

Sau thời gian ủ, ta tiến hành nhỏ lugol vào quan sát và đo vòng trong suốt

chính là vòng phân giải casein.

Nếu chủng vi khuẩn thử nghiệm có kết quả sinh protease dương tính khi nhỏ

lugol vào đĩa thạch sẽ xuất hiện vòng trong suốt xung quanh giếng thạch.

Nếu chủng vi khuẩn không có khả năng sinh protease sẽ không hình thành

vòng trong suốt khi nhỏ lugol vào đĩa thạch.

Khả năng phân giải protein được đánh giá qua hiệu số (D – d) mm.

Trong đó: D – d có hiệu số càng lớn thì khả năng sinh enzyme càng cao

D: đường kính vòng phân giải lớn (mm)

d: đường kính vòng đục lỗ hay đường kính khuẩn lạc (mm)

 Định danh chủng vi khuẩn chọn lọc bằng phương pháp sinh học phân tử

Thuyết minh quy trình:

Chủng chọn lọc được định danh bằng giải mã trình tự gene rRNA 16S và so

sánh với GENBANK (do công ty Nam Khoa Biotek thực hiện).

Tách chiết bộ gen vi khuẩn bằng bộ kit của QIAgen, khuếch đại trình tự 16S

rRNA bằng phản ứng PCR với cặp mồi có trình tự như sau:

27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)

1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)

Sản phẩm PCR được tinh chế và giải trình tự. Các trình tự nucleotide hoàn

chỉnh được so sánh với ngân hàng dữ liệu gen của NCBI bằng cách sử dụng công cụ

BLAST.

2.4.2. Khảo sát khả năng chuyển hóa chitin thành chitosan bằng các

chủng sàng lọc.

Chủng vi sinh vật

Lên men vi sinh vật

Nhân giống

Chuẩn bị/tiệt trùng môi trường lỏng Ly tâm thu tủa 12000 v/p x 15p Dịch

NaOH 0,1N Hòa tan tủa bằng NaOH 0,1N

Hấp tiệt trùng 20p

Dịch Ly tâm thu tủa 12000 v/p x 15p

Hòa tan tủa bằng CH3COOH 1%, lắc 150 v/p trong 24h

Ly tâm thu dịch 4000 v/p x 15p Tủa

NaOH 1N Trung hòa dịch

Kiểm tra sự hiện diện chitosan còn sót lại hay không bằng Lugol/H2SO4

Ly tâm thu tủa 4000 v/p x 15p

to=105oC/4h Sấy khô tủa

Chitosan

Hình 2.3. Quy trình sản xuất chitosan bằng chủng vi sinh vật thí nghiệm

Thuyết minh quy trình

- Nhân giống: sau khi chủng vi sinh vật đã được làm thuần, tiến hành cấy

chuyền sang các đĩa môi trường phân lập chứa 2% huyền phù chitin để nhân giống.

- Giống vi khuẩn sẽ được tiến hành tăng sinh trong 25 ml môi trường NB. Ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau 24 giờ, điều chỉnh dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng môi trường

NB sao cho dịch vi khuẩn phải có độ đục bằng độ đục của ống Mc Farland 0,5 – tương đương 1,5 x 108 vi khuẩn/ml (Phụ lục G). Dịch này sẽ được sử dụng cho quá

trình lên men sản xuất chitosan.

- Lên men vi khuẩn: nhằm tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh enzyme chitin

deacetylase sản xuất chitosan từ chitin.

- Thành phần môi trường lên men cơ bản (Phụ lục E).

- Pha môi trường lên men cơ bản có bổ sung 0,05 g huyền phù chitin. Chuẩn

bị bình lên men 100 ml, dùng pipette hút 20 ml môi trường lên men cơ bản cho vào mỗi bình, hấp tiệt trùng 121oC trong 20 phút, sau khi hấp xong dùng micropipette

hút 2 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn (tỉ lệ cấy giống 10%) mật độ cấy giống đạt 1,5 x 108 vi khuẩn/ml vào mỗi bình lên men. Lên men 5 bình môi trường. Các bình lên

men được đem vào lắc tốc độ 150 vòng/phút trong 48 giờ.

- Ly tâm thu tủa 12000 vòng/phút x 15 phút: cho môi trường lên men đã được

cấy khuẩn lạc của chủng vi sinh vật vào mỗi ống eppendorf 2 ml để đem đi ly tâm

(12000 vòng/phút x 15 phút) để đổ dịch thu tủa, tủa gồm có xác vi sinh vật, chitin

và chitosan.

- Hòa tan tủa bằng NaOH 0,1N: nhằm hòa tan xác vi sinh vật trong tủa.

- Hấp tiệt trùng: dịch thu được sau khi hòa tan tủa bằng NaOH 0,1N được cho

vào các ống nghiệm và đem đi hấp tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút.

- Ly tâm thu tủa 12000 vòng/phút x 15 phút: Cho dịch vào các ống eppendorf

2 ml rồi đem đi ly tâm 12000 vòng/phút x 15 phút, đổ dịch thu tủa, tủa lúc này chỉ

còn chitin và chitosan.

- Hòa tan tủa bằng acid acetic 1%: nhằm hòa tan chitosan trong tủa. Tủa thu

được hòa tan bằng acid acetic 1% và đem đi lắc tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ.

Sau khi lắc, tủa chỉ còn lại chitin không tan, chitosan sẽ hòa tan vào acid acetic 1%.

- Ly tâm thu dịch 4000 vòng/phút x 15 phút: Đem các ống falcon chứa dịch

thu được đem ly tâm (4000 vòng/phút x 15 phút) để bỏ tủa thu dịch (tủa lúc này

chứa chitin không tan còn chitosan đã hòa tan vào dung dịch). Kiểm tra tủa xem có

còn lượng chitosan sót lại sau ly tâm hay không bằng phương pháp định tính

chitosan sử dụng Lugol/H2SO4.

- Phục hồi Chitosan: Cho dịch thu được vào các ống falcon mới và hút một

lượng NaOH 1N bằng với lượng acid acetic có trong mỗi ống falcon (tỉ lệ 1:1) để

trung hòa dịch chứa acid acetic. Lúc này, ta thấy có tủa trắng xuất hiện trong dung

dịch.

- Ly tâm (4000 vòng/phút x 15 phút): để bỏ dịch thu tủa, tủa lúc này chính là

chitosan.

- Tủa đã được rửa hai lần bằng nước cất để đạt pH trung tính (pH = 7).

- Sấy khô tủa: chuẩn bị cốc sấy và cân cốc, tiếp theo cho tủa thu được vào mỗi cốc và đem đi sấy ở 105oC/4 giờ. Tủa khô thu được sẽ cho vào đĩa mẫu để định tính

sự hiện diện của chitosan.

 Định tính sự hiện diện của chitosan

Sự hiện diện của chitosan được định tính theo phản ứng:

Kết tủa trắng thu được sau khi phục hồi chitosan được ly tâm ở 4000

vòng/phút x 15 phút. Tủa đã được rửa hai lần bằng nước cất (pH=7). Chuẩn bị cốc sấy và cân cốc, tiếp theo cho tủa thu được vào mỗi cốc và đem đi sấy ở 105oC/4 giờ.

Tủa khô thu được sẽ cho vào đĩa mẫu để định tính sự hiện diện của chitosan. Kết tủa

khô được sử dụng cho các xét nghiệm khẳng định:

- Trên tủa khô nhỏ 2 – 3 giọt dung dịch iốt/kali iốt

- Hỗn hợp được acid hóa với 2 – 3 giọt H2SO4 1%.

 Dựa vào kết quả phản ứng của nhóm oligomers (chitosan) với KI trong điều kiện

acid Phản ứng dương tính thể hiện sau khi bổ sung Iod/KI màu vàng, kết tủa thay

đổi màu sắc thành màu nâu sẫm và việc bổ sung H2SO4 kết tủa màu nâu sẫm chuyển

sang màu tím sẫm trong dung dịch không màu.

 Phương pháp khảo sát hiệu quả của các cơ chất khác nhau đến việc sản xuất

enzyme

Phương pháp: lên men chuyển hóa chitin thành chitosan: môi trường lên men

cơ bản bao gồm glucose 2%, cao thịt (meat extract) 1%, K2HPO4 0,04%, NaCl

0,1%. Thay đổi các thành phần môi trường lên men khác nhau (nguồn C, nguồn N,

nguồn muối) để sản xuất chitosan. Đánh giá hiệu quả sản xuất chitosan dựa vào chất

lượng chitosan tạo thành (độ hòa tan, mức độ deacetyl hóa) và hiệu suất thu hồi

chitosan.

Chitosan thu được sau quá trình lên men được sử dụng để xác định các thông

số:

 Hiệu suất thu hồi chitosan

Hiệu suất thu hồi chitosan được xác định bằng mức độ chuyển đổi chitin thành

chitosan. Ta bố trí thí nghiệm như sau:

- Cốc sứ được cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 105ºC trong 30 phút, đậy nắp cho vào

bình hút ẩm trong 15 phút. Cốc sứ được lấy ra cân ta có khối lượng m0.

- Chitosan thu hồi ở các mẫu được cho vào cốc sứ. Sấy ở nhiệt độ 105ºC trong

4h đến khi khối lượng không đổi. Khi đó lượng nước tự do có trong mẫu sẽ bốc hơi

hết. Đậy nắp, cho cốc vào bình hút ẩm trong 15 phút. Sau đó tiến hành đem cân ta

được khối lượng m1

H (%) = Mchitosan/Mchitin *100

Trong đó: Mchitosan: khối lượng chitosan sau sấy

Mchitin: khối lượng chitin ban đầu sử dụng trong 20 ml môi trường lên

men

 Độ hòa tan chitosan

Độ hòa tan của chitosan được xác định bằng cách hòa tan một lượng mẫu

chitosan trong dung dịch acid acetic 1%. Ly tâm thu tủa, sấy và cân khối lượng tủa.

Độ hòa tan của chitosan là phần trăm chitosan tan trong acid acetic 1%.

Cân 0,25 g chitosan hoà tan trong 50 ml acid acetic 1%, khuấy đều trong 15

phút, lọc thu cặn (nếu còn), rửa bằng nước cất, sấy khô và cân lại. Độ hòa tan:

%: X (%) = [(M – m) x 100]/M

Trong đó: M là khối lượng của chitosan trước hòa tan (g)

m là khối lượng chitosan còn dư sau phản ứng hoà tan (g).

 Xác định độ deacetyl hóa bằng phương pháp chưng cất với acid phosphoric

(H3PO4) (Li et al., 1997)

Nguyên lý: Khi chitosan tác dụng H3PO4 đặc ở nhiệt độ cao, gốc acetyl có

trong chitosan sẽ bị tách ra dưới dạng acetic acid và định lượng bằng NaOH 0,1N

theo phương pháp phân tích thể tích.

Cho 0,3 g chitosan vào dung dịch chứa 50 ml H2O và 50 ml H3PO4 85%, tiến

hành chưng cất với nhiệt độ tăng dần 1ºC trong một phút cho đến 160ºC, duy trì

nhiệt độ này trong 60 phút, định lượng dịch chưng cất bằng dung dịch NaOH 0,1 N

với chất chỉ thị màu phenolphtalein.

Độ deacetyl được tính theo công thức:

DD (%) = 100 – k.V/m

Trong đó: k = 2,03: hệ số liên quan đến phân tử lượng của chitin tính theo

lý thuyết.

V: thể tích thực chuẩn độ mẫu.

m: khối lượng phân tử đã dùng.

- Kết quả được đối chiếu với phân tích phổ FT-IR tại Trung tâm phân tích dịch

vụ thí nghiệm Thành phố

Phương pháp thực hiện:

Bột chitosan đã sấy khô được nghiền mịn sau đó ép viên với KBr. Phổ FT-IR

được ghi nhận trên máy FT-IR Vertex 70.

Phổ của mẫu chitosan dưới dạng đĩa KBr được thu bằng dụng cụ quét phổ IR với dải tần số 4000 – 400 cm-1. Mức độ deacetyl hóa (DDA) được đánh giá bằng cách ghi lại độ hấp thụ ở 1655 cm-1 đối với nhóm amide-I và ở 3450 cm-1 đối với

nhóm OH trong chitosan. Độ hấp thụ của chitosan được sử dụng để tính mức độ

deacetyl hóa (DDA) bằng phương trình sau (Domszy and Roberts, 1985):

DDA(%) = [1- (A1655/ A3450)/1.33 × 100]

Hệ số 1,33: Tỷ lệ A1655 / A3450 đối với N-acetyl hóa hoàn toàn chitosan

Môi trường lên men cơ bản bao gồm glucose 2%, cao thịt (meat extract) 1%,

K2HPO4 0,04%, NaCl 0,1%. Lần lượt khảo sát ảnh hưởng của các nguồn Carbon,

Nitơ, muối vô cơ đến hiệu quả sản xuất Chitosan. Điều kiện lên men được tiến hành theo Guoying Zhou và cộng sự (2010) bao gồm nhiệt độ 37oC, pH=6 và tốc độ lắc

150 vòng/phút.

 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon

Ảnh hưởng của nguồn carbon vào sản xuất CDA đã được thử nghiệm sử dụng

các nguồn carbon sau đây: glucose, sucrose, tinh bột. Mỗi nguồn khác nhau đã được

thử nghiệm riêng bằng cách thêm vào môi trường lên men cơ bản ở nồng độ 2%.

Xác định hiệu suất thu hồi chitosan và đặc điểm chitosan tạo thành (độ hoà tan, độ

deacetyl hoá).

 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ

Để kiểm tra tác động của nguồn nitơ vào sản xuất CDA, các nguồn nitơ sau

đây đã được thử nghiệm: meat extract, casein, yeast extract. Mỗi nguồn khác nhau

đã được thử nghiệm riêng bằng cách thêm nó vào môi trường lên men cơ bản ở

nồng độ 1%. Xác định hiệu suất thu hồi chitosan và đặc điểm chitosan tạo thành (độ

hoà tan, độ deacetyl hoá).

 Khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng

Tác dụng của muối vô cơ vào sản xuất CDA đã được thử nghiệm. Các muối

được khảo sát bao gồm: MgSO4, FeSO4 và K2HPO4. Mỗi muối đã được thử nghiệm

riêng trong môi trường lên men ở nồng độ 0,04%. Xác định hiệu suất thu hồi

chitosan và đặc điểm chitosan tạo thành (độ hoà tan, độ deacetyl hoá) và hoạt độ

enzyme chitin deacetylase.

 Hoạt độ enzyme chitin deacetylase: sử dụng phương pháp của Li (2007).

 Xây dựng phương trình đường chuẩn p-nitroaniline.

Cân 100 mg p-nitroaniline pha trong bình định mức 100 ml, ta có dung dịch p-

nitroaniline 0,1 mg/ml = 100 ug/ml

Quét phổ UV/VIS tìm bước sóng hấp thụ cực đại λ max

DD

Ống 1

Ống 0 (blank)

Ống 2

Ống 3

Ống 4

Ống 5

Ống 6

Ống 7

Ống 8

Ống 9

Ống 10

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

1,8

1,6

1,4

1,2

0,8

0,6

0,4

0,2

100

=100*0,2/2,0 = 10

Chuẩn p- nitroaniline 100 ug/ml, ml H2O 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) Nồng độ p- nitroaaniline, ug/ml OD400

- Thiết lập phương trình đường chuẩn y = ax+b, trong đó y = Aλmax-A(0), x =

nồng độ p-nitroaniline Các thử nghiệm đã được thực hiện sử dụng một ống ly tâm

10 ml trong tổng số 5 ml mẫu. Đầu tiên, 3 ml đệm sodium phosphate (pH 7,4) 50

mM đã được ủ trong 15 phút ở 50°C, sau đó 1 ml dung dịch p-nitroacetanilide 200

mg/l và 1 ml mẫu enzym đã được thêm vào hỗn hợp. Phản ứng được ủ ở 50°C trong

15 phút trong một cốc nước. Sau khi ủ, phản ứng đã được kết thúc trong một cốc

nước sôi và protein đã được gỡ bỏ bằng cách ly tâm tốc độ 4000 rpm trong 10 phút.

Các dịch nổi được phân tích bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng Aλmax bằng máy

quang phổ. Các enzyme bất hoạt đã được sử dụng như mẫu trắng.

- Một đơn vị hoạt lực CDA được định nghĩa như là một lượng enzyme cần

thiết để chuyển hóa p-nitroanilide tạo ra 1 μg p-nitroaniline trong 1 giờ.

Hoạt lực CDA:

HL CDA (µg/ml/giờ) = ((Aƛ max-Ao)-b)*F*60 phút/(a*T phút)

Trong đó:

Aλmax = giá trị hấp thụ của hỗn hợp phản ứng enzyme sau thời gian phản ứng

đo tại bước sóng hấp thụ cực đại.

A(0) = giá trị hấp thụ của hỗn hợp phản ứng với enzyme bất hoạt đo tại bước

sóng hấp thụ cực đại.

F = hệ số pha loãng

T là thời gian phản ứng enzyme (phút)

60 = 60 phút trong 1 giờ

 Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách tăng nồng độ acid acetic hòa tan

chitosan

Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic đến việc thu hồi chitosan được thay đổi

trong phạm vi 1% và 2%. Xác định hiệu suất thu hồi chitosan và đặc điểm chitosan

tạo thành (độ hoà tan, độ deacetyl hoá).

 Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách thay đổi nguồn cơ chất cảm ứng

Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng đến hiệu quả thu hồi chitosan được khảo sát

trên 2 nguồn cơ chất cảm ứng: Huyền phù chitin (Phụ lục B) và chitin thương phẩm

(được cung cấp bởi công ty VN Chitosan Kiên Giang). Xác định hiệu suất thu hồi

chitosan và đặc điểm chitosan tạo thành (độ hoà tan, độ deacetyl hoá).

 So sánh chitosan tạo thành với chitosan thương mại và chitosan hóa học

Sử dụng các điều kiện tối ưu đã được khảo sát tại phòng thí nghiệm: môi

trường lên men, nồng độ acid acetic, cơ chất cảm ứng. Cùng các thông số kỹ thuật của môi trường lên men đã được báo cáo bởi (Guoying et al., 2010): nhiệt độ 37oC,

pH = 6 và tốc độ lắc 150 vòng/phút. So sánh chitosan tạo thành của 3 chủng vi sinh

vật với chitosan thương phẩm (cung cấp bởi công ty VNChitosan Kiên Giang, độ

deacetyl đạt 85%) và chitosan hóa học sản xuất tại Phòng thí nghiệm (phụ lục D).

Đánh giá dựa trên các yếu tố:độ deacetyl, độ nhớt, MW, độ hòa tan, phổ IR, khả

năng kháng khuẩn.

 Độ deacetyl (theo phương pháp trên)

 Khối lượng phân tử MW

Độ nhớt và phân tử lượng trung bình

Hình 2.4. Nhớt kế Ostwald Cân 0,25 g chitosan hòa tan trong 50 ml acid acetic 5%. Lấy 25 ml hỗn hợp

dung dịch trên cho vào nhớt kế Ostwald, đo thời gian dung dịch chitosan chạy từ

vạch A xuống vạch B. Thực hiện tương tự với nước cất.

Đo độ nhớt động học: v/t = vH2O / t H2O

Do đó: η(cp) = ( vH2O / t H2O ) * t (vH2O ở 30ºC = 0,798 cp)

Độ nhớt đặc trưng và phân tử lượng trung bình của chitosan có mối liên hệ

theo công thức mô tả của Chang (1997) [30]:

η’(cp) = K * Ma

Trong đó: η’: Độ nhớt đặc trưng của polyme

η’ = η/C

C: nồng độ chitosan (g/100 ml ) K= 3,04 x 10-5

 Độ hòa tan (theo phương pháp trên)

 Đánh giá khả năng kháng khuẩn chitosan

Khả năng kháng khuẩn của chitosan của 3 chủng CD1, CD5, CD10 trên đối

tượng vi khuẩn gây bệnh E.coli (Gram dương) được đánh giá theo 2 cách:Định tính

bằng phương pháp đục lỗ thạch và định lượng bằng phương pháp MIC.

Các bước thực hiện:

- Chuẩn bị dịch chitosan: Mẫu chitosan của các chủng CD1, CD5, CD10 được

chuẩn bị cho các thử nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn.

- Cân 2 g chitosan mỗi mẫu pha trong 100 ml acid acetic 2% ta được chitosan

nồng độ 20,000 ppm.

- Dung dịch chitosan nồng độ 20,000 ppm được pha loãng sử dụng dung dịch

NB thành các dãy nồng độ 10000 ppm; 5000 ppm; 2500 ppm; 1250 ppm; 625 ppm;

312,5 ppm; 156,25 ppm; 78,125 ppm.

- Các dung dịch chitosan này được sử dụng cho các thử nghiệm khả năng

kháng khuẩn tiếp theo.

Định tính: Phương pháp đục lỗ thạch

- Tăng sinh vi khuẩn trước 24 giờ trong ống nghiệm chứa môi trường Nutrient

Broth.

- Dịch nuôi vi khuẩn được pha loãng trong nước muối sinh lý sao cho dịch vi

khuẩn phải có độ đục bằng độ đục của ống chuẩn Mc Farland 0,5 – tương đương 1,5 x 108 vi khuẩn/ml (Phụ lục G).

- Trang 0,1 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Nutrient Agar.

- Dùng cây đục thạch đục lỗ có đường kính 6 mm. Đục 5 lỗ giếng thạch tương

đương 5 nồng độ chitosan.

- Dùng micropipette nhỏ dịch chitosan vào các giếng thạch tương ứng với 5

nồng độ chitosan 1250 ppm; 625 ppm; 312,5 ppm; 156,25 ppm; 78,125 ppm.

- Sử dụng đĩa đối chứng dương là chitosan 2% và đối chứng âm là chitin.

- Ủ ở 37C trong 24 giờ sau đó đọc kết quả.

- Mục tiêu: khảo sát khả năng tạo vòng kháng khuẩn của màng trên đĩa thạch.

Định lượng: Phương pháp MIC (Minimum Inhibitory Concentration)

- Dịch nuôi vi khuẩn được pha loãng trong nước muối sinh lý sao cho dịch vi

khuẩn phải có độ đục bằng độ đục của ống chuẩn Mc Farland 0,5 – tương đương 1,5 x 108 vi khuẩn/ml (Phụ lục G). Dùng nước muối sinh lý pha loãng 2 lần để nồng độ vi khuẩn đạt 106 vi khuẩn/ml. Sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

- Hút 1ml sinh khối vi khuẩn (mật độ 106 vi khuẩn/ml) vào 9 ml môi trường

NB có chitosan ở 5 nồng độ khác nhau 1250 ppm; 625 ppm; 312,5 ppm; 156,25

ppm, 78,25 ppm.

- Sử dụng ống đối chứng chứa 1ml sinh khối vi khuẩn (mật độ 1,5x106 vi

khuẩn/ml) trong 9 ml môi trường NB không bổ sung chitosan.

- Ủ ở 37C trong 24 giờ sau đó đo các ống ở bước sóng 625 nm. Đọc kết quả.

- Mục tiêu: khảo sát nồng độ tối thiểu của chitosan có khả năng ức chế sự phát

triển của vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy.

 Định lượng protein bằng điện di

SDS-PAGE được thực hiện theo LaemLi. Trong phương pháp này, các phân

tử protein được phân tách theo trọng lượng dưới tác dụng của điện trường không

đổi. Protein được phân tách trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau.

Dưới tác dụng của dòng điện một chiều, các protein có kích thước khác nhau sẽ di

chuyển về điện cực trái dấu. Các phân tử protein gắn với SDS nên chúng sẽ tích

điện âm, do đó sự khác biệt về điện tích được loại trừ.

Khi protein được chạy trong điện trường không đổi, phức hệ protein-SDS sẽ di

chuyển xuyên qua các lỗ gel polyacrylamid với vận tốc phục thuộc vào hình dáng,

kích thước phân tử. Khi đó protein sẽ được phân tách thành các băng, vạch khác

nhau. Gel thường được sử dụng với nồng độ từ 5 – 15% và có thể được chạy theo

chiều nằm ngang hoặc chiều thẳng đứng.

+ Trọng lượng phân tử của thang chuẩn (daltons):

266250

Triosephosphate isomerase

Myoglobin 169500

α-lactalbumin 144370

Aprotinin 65120

34960

Insullib b chain, oxidized

bacitracin 14230

+ Quy trình định lượng protein:

1. Mẫu sau khi được nhận ở dạng khuẩn lạc được cấy ria trên môi trường

nuôi cấy chứa 1% agar và 2% chitin. Ta tiến hành lên men mẫu trong môi

trường lên men chứa 1% chitin huyền phù. Với thời gian lên men lần lượt là

0h, 8h, 16h, 24h, 32h.

2. Sau khi mẫu đạt thời gian lên men ta tiến hành lọc thu dịch. Để loại

bỏ cặn chitin, xác vi sinh vật.

3. Dịch thu được đem ủ cồn, ủ acetat với các tỉ lệ 1:1,1:2,1:3,1:4,1:5,1:6.

Trong thời gian 12h,24h, 32h.

Sau khi ủ dịch ta tiến hành đo hoạt tính của mẫu thí nghiệm, để xác định các

chỉ tiêu thời gian lên men, thời gian ủ, dung dịch ủ. Tiến hành lên men mẫu ở các

điều kiện tối ưu. Tủa dịch enzyme bằng cồn lạnh tuyệt đối. Ly tâm thu enzyme tiến

hành chạy điện di xác định MW protein.

2.5. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft excel 2010.

Các biểu đồ được xử lý bằng phần mềm Microsoft excel 2010.

Các số liệu thô được xử lý bằng phần mềm SAS 9.4.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập và sàng lọc chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme chitin

deacetylase

3.1.1. Tăng sinh, phân lập chủng thuần khiết

Từ 5 mẫu đất từ các địa điểm khác nhau. Ta tiến hành phân lập trên môi

trường chọn lọc chứa chitin. Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc, ta lựa chọn ra

được 26 chủng khuẩn lạc riêng lẻ. Các chủng sẽ được cấy chuyền nhiều lần để làm

thuần và thực hiện các bước sàng lọc tiếp theo.

3.1.2. Sàng lọc

Sự hiện diện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme chitin deacetylase được định

tính bằng cách sử dụng dải thử nghiệm có tẩm p-nitroacetanilide. Sau thời gian ủ, sự

phát triển của màu vàng trong dải chỉ ra sự hiện diện của vi khuẩn deacetylase

tương ứng. (Kuldeep et al., 2012).

Đối chứng CD1 CD5 CD10

Hình 3.1. Kết quả định tính enzyme chitin deacetylase

Kết quả: khi ủ giấy lọc vào môi trường có chứa p-nitroacetanilide trong 24

giờ. Thì giấy lọc có hiện tượng chuyển vàng chứng tỏ có sự hiện diện của enzyme

chitin deacetylase trong chủng vi sinh vật thí nghiệm. Từ đó, ta chọn lọc được 3

chủng có kết quả dương tính với thử nghiệm. Lần lượt là chủng CD1, CD5, CD10.

Ta tiến hành định danh sơ bộ các chủng sàng lọc được.

3.1.3. Định danh sơ bộ các chủng sàng lọc

3.1.3.1. Đặc điểm hình thái

CD5 CD1

Hình 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật chọn lọc. Cả 3 chủng đều có

đặc điểm hình thái khuẩn lạc đục, lồi, có răng cưa

3.1.3.2. Kết quả định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng

vi khuẩn

Việc sản xuất chitosan từ vỏ tôm cua nói chung là cần loại bỏ protein và khử

khoáng. Vì vậy hoạt tính protease của chủng được quan tâm. Hoạt tính chitinase của

vi sinh vật đi kèm với hoạt tính chitin deacetylase sẽ ảnh hưởng đến chiều dài phân

tử chitosan trong sản phẩm cuối cùng. Ngoài ra, các enzyme ngoại bào khác của vi

sinh vật hỗ trợ cho công việc định danh sơ bộ. Và việc phát hiện enzyme ngoại bào

được thực hiện bằng phương pháp cấy trực tiếp hoặc đục lỗ.

 Enzyme amylase

CD10

CD5 CD1 Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột

Kết luận: sau khi nhỏ lugol lên trên bề mặt thạch, các chủng có khả năng thủy

phân tinh bột sẽ không bắt màu lugol. Từ kết quả trên ta thấy, chủng CD10 có khả

năng thủy phân tinh bột mạnh nhất. thủy phân hoàn toàn tinh bột sau 24 giờ nuôi

cấy. CD5, CD1 có khả năng thủy phân tinh bột yếu hơn.

 Enzyme chitinase

CD5 CD10 CD1

Hình 3.4. Thử nghiệm khả năng sinh enzyme chitinase

Kết luận: sau khi cho lugol lên trên bề mặt đĩa thạch ta thấy có vòng phân giải

hiện ra, chứng tỏ cả 3 chủng đồng thời có hoạt tính chitinase.

 Enzyme protease

Đối chứng

CD1

CD10

CD5

Hình 3.5. Kết quả khảo sát sự phân giải protein của chủng vi sinh vật

Kết luận: sau khi nhỏ lugol trong vòng một phút, ta thấy xuất hiện vòng phân

giải trong suốt xung quanh lỗ đục, cho thấy vi sinh vật có phân giải protease. Trong

đó đường kính vòng phân giải CD1 là 15 mm, CD5 là 20 mm và CD10 là 17 mm.

Do đó khả năng phân giải protein của chủng vi sinh vật này tương đối cao.

 Kết quả khảo sát sơ bộ của chủng vi sinh vật thí nghiệm

Các chủng được khảo sát sơ bộ bằng các phản ứng sinh hóa bao gồm: quan sát

hình thái khuẩn lạc, nhuộm gram, nhuộm bào tử, MR-VP, Indole, catalase, TSI,

Citrate, khả năng thủy phân tinh bột, khả năng thủy phân chitosan, protein,… Kết

quả tổng kết được thể hiện trong bảng 3.1.

Bảng 3.1. Tổng kết các đặc điểm nuôi cấy của các chủng vi sinh vật khảo sát

Mẫu CD1 CD5 CD10

Hình thái khuẩn Đục, lồi, có răng Đục, lồi, có răng Đục, lồi, có răng

cưa cưa cưa lạc

+ + Gram +

+ + Bào tử +

- - Indole -

+ + MR +

- - VP -

+ - TSI -

+ + Citrate +

+ + Catalase +

Thủy phân + + + protein

Thủy phân tinh + + + bột

Enzyme chitin + + + deacetylase

Khả năng làm + + + tan chảy Gelatin

Enzyme + + + chitinase

3.1.4. Định danh chủng vi khuẩn chọn lọc bằng phương pháp sinh học

phân tử

Ba chủng chọn lọc (CD1, CD5, CD10) trước khi được nghiên cứu cần được

định danh để đánh giá theo khía cạnh an toàn sinh học và tiềm năng ứng dụng. So

sánh các thử nghiệm sinh hóa của 3 chủng phân lập được trong trong hệ thống phân

loại vi khuẩn của Bergey, bước đầu cho thấy các chủng vi khuẩn có đầy đủ các đặc

điểm của chủng Bacillus.Tiếp tục thực hiện giải mã trình tự gene rRNA 16S và so

sánh với genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Kết quả so sánh trình tự gene rRNA 16S với Genbank cho thấy chủng CD5

trùng lắp với chủng Bacillus amyloliquefaciens strain sh5BAB1848 đến 99%, cho

phép kết luận chủng CD5 là Bacillus amyloliquefaciens, chủng CD1 trùng lắp với

chủng Bacillus cereus strain CCM2010 99%, kết luận chủng này thuộc loài

Bacillus cereus, chủng CD10 có trình tự gene trùng lắp với chủng Bacillus

siamensis PD-A10 mức độ 99% cho phép kết luận chủng CD10 là Bacillus

siamensis. Bacillus amyolquefaciens đã từng được báo cáo có hoạt tính CDA, trong

khi đó Bacillus cereus và Bacillus siamensis lần đầu được phát hiện khả năng sinh

enzyme chitin.

3.2. Khảo sát khả năng chuyển hóa chitin thành chitosan bằng các chủng sàng

lọc

3.2.1. Thử nghiệm chuyển hóa chitin thành chitosan, sử dụng môi trường

lên men chọn cơ bản nuôi cấy các chủng sàng lọc

Chitosan thu được từ quy trình sản xuất chitosan bằng phương pháp sinh học:

Mẫu đối chứng dương sử dụng chitosan thương phẩm từ công ty TNHH MTV

Chitosan Việt Nam

Đối chứng (+)

CD1 CD10 CD5

Hình 3.6. Chitosan được tạo thành từ các vi sinh vật

Nhận xét: từ hình 3.7 Ta dễ dàng nhận thấy chitosan thu được bằng cách sử

dụng enzyme chitin deacetylase có màu sậm hơn, khô và ít mịn hơn so với chitosan

thu được bằng phương pháp hóa học và chitosan thương phẩm.

3.2.1.1. Định tính sự hiện diện của chitosan

Phương pháp thử Lugol trong dung dịch acid H2SO4

Thử nghiệm chitosan được giới thiệu bởi Richards (1951). Dựa vào kết quả

phản ứng của nhóm Oligomers (chitosan) với KI trong điều kiện acid.

Phản ứng dương tính thể hiện sau khi bổ sung Iod/KI màu vàng, kết tủa thay

đổi màu sắc thành màu nâu sẫm và việc bổ sung H2SO4 kết tủa màu nâu sẫm chuyển

sang màu tím sẫm trong dung dịch không màu. Kết quả thử nghiệm bằng

lugol/H2SO4 cho kết quả dương tính chứng tỏ có sự xuất hiện chitosan trong cả 3

mẫu.

Đối chứng (+) Đối chứng (-)

CD1 CD5 CD10

Hình 3.7. Định tính chitosan bằng phương pháp Lugol/H2SO4:

CD1(+), CD5(+), CD10(+)

Nhận xét: kết quả thử nghiệm bằng lugol/H2SO4 cho kết quả dương tính  có

sự xuất hiện chitosan.

Như vậy cả 3 chủng tuyển chọn (CD1, CD5, CD10) đều có thể chuyển hóa

chitin thành chitosan. Nghiên cứu tiếp theo nhằm xác định hiệu suất chuyển hóa và

chất lượng chitosan tạo thành.

3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của cơ chất đến hiệu suất thu hồi chitosan

Sản xuất enzyme CDA từ vi sinh vật rồi sau đó mới sử dụng enzyme trong

chuyển hóa thường rất tốn kém (đặc biệt là giai đoạn tinh sạch enzyme), không có

hiệu quả kinh tế.

Sử dụng vi sinh vật để chuyển hóa sinh học là phương án hiệu quả hơn. Những

nghiên cứu tiếp theo nhằm tăng hiệu suất chuyển hóa chitin thành chitosan sử dụng

trực tiếp. Vì vậy nguồn Carbon, Nitơ và các khoáng cần được điều chỉnh phù hợp.

3.2.2.1. Nguồn carbon

Từ môi trường lên men cơ bản (Phụ lục E), ta tiến hành thay đổi lần lượt các

thành phần môi trường môi trường. Nhằm tiến hành ra môi trường tối ưu cho sự

phát triển và sản xuất chitosan của vi sinh vật. Đầu tiên, ta tiến hành đổi nguồn

carbon từ các nguồn tinh bột, glucose, sucrose. Kết quả được trình bày trong bảng

3.2.

Bảng 3.2. Khảo sát ảnh hưởng nguồn Carbon đến hiệu suất thu hồi và chất

lượng chitosan tạo thành

HIỆU SUẤT THU ĐỘ HÒA TAN ĐỘ DEACETYL HỒI

CD1 CD5 CD10 CD1 CD5 CD10 CD1 CD5 CD10

46,00a Tinh bột 57,67a ± 1 63,33a ± 1 60,33a ± 1 53,33a ± 1 67,67a ± 2 63,00a ± 1 42,00a ± 1 38,00a ± 1 ± 2

53,00 Gluucos

54,67 b ± 3 53,00 b ± 3 46,67 b ± 1 57,00 b ± 1 53,00 b ± 1 38,33 b ± 2 36,00 b ± 2 e 39,00 b ± 2

*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b thì không có sự khác

biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,01.

Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 0,01 trong cùng một cột.

33,67c Sucrose ± 2 46,00c ± 1 46,00c ± 3 46,00c ± 4 42,33c ± 2 53,00 b ± 3 44,00c ± 3 31,00c ± 1 36,00 b ± 1 ± 2

Kết quả:

Trong các nguồn carbon được sử dụng trong quá trình lên men, ta thấy tinh bột

cho hiệu quả sản xuất chitosan cao nhất với chất lượng chitosan (độ hòa tan, độ

deacetyl) và hiệu suất thu hồi cao lần lượt là 42%, 38%, 46% tương ứng với 3

chủng CD1, CD5, CD10. Tiếp đến là nguồn glucose và cho hiệu quả sản xuất

chitosan thấp nhất là nguồn sucrose với hiệu suất thu hồi chỉ đạt 31%; 36%; 33,67%

tương ứng CD1, CD5, CD10. Do đó, ta sử dụng nguồn Carbon là tinh bột cho các

thử nghiệm tiếp theo.

3.2.2.2. Nguồn nitơ

Từ kết quả khảo sát trên, ta có tinh bột là nguồn carbon tốt nhất cho vi sinh

vật. Ta giữ cố định nguồn carbon trong môi trường lên men. Tiến hành thay đổi các

nguồn nitơ khác nhau bao gồm Casein, Yeast, Meat. Kết quả khảo sát ảnh hưởng

của nguồn nitơ được trình bày trong bảng 3.3.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng nguồn Nito đến khả năng sản xuất chitosan của 3 chủng

VSV CD1, CD5, CD10.

HIỆU SUẤT THU ĐỘ HÒA TAN ĐỘ DEACETYL HỒI

CD1 CD5 CD10 CD1 CD5 CD10 CD1 CD5 CD10 36,00c 52,33c 38,00c ± ± Casein 58,67c ± 0,100 58,67c ± 0,130 50,33c ± 0,270 62,67c ± 0,270 61c ± 0,230 ± 0,890 42,00c ± 0,720 0,059 0,270

58,00a 62,67a 42,00a Yeast 71,33a ± 0,320 63,33a ± 0,280 70,33a ± 0,720 69,63a ± 1,300 51,33a ± 0,18 45,67a ± 0,240 ±0,130 ± 0,840 ± 0,320

57,67b

*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b thì không có sự khác

biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,01.

Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 0,01 trong cùng một cột.

Meat 63,33b ± 0,280 60,33b ± 0,240 53,33b ±0,320 67,67b ± 0,290 63,00b ± 0,320 40,00b ± 0,720 46,00b ± 0,890 39,00b ± 0,730 ± 0,240

Kết luận

Trong các nguồn Nito được sử dụng trong quá trình lên men, ta thấy nấm men

(Yeast) cho hiệu quả sản xuất chitosan cao nhất với chất lượng (độ hòa tan, độ

deacetyl) và hiệu suất thu hồi cao ở mức 42%; 51,33%; 45,67% tương ứng với

CD1, CD5, CD10. Tiếp đến là nguồn Meat và cho hiệu quả sản xuất chitosan thấp

nhất là nguồn Casein. Yeast là nguồn nitơ tốt nhất do đó được sử dụng cho các

nghiên cứu tiếp theo.

3.2.2.3. Thành phần khoáng

Từ kết quả khảo sát trên, ta có Yeast là nguồn nitơ tốt nhất cho vi sinh vật.

Ta tiếp tục giữ cố định nguồn carbon là tinh bột, nguồn nitơ là Yeast trong môi

trường lên men. Tiến hành thay đổi nguồn muối khác nhau bao gồm MgSO4,

KH2PO4, CuSO4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn muối được trình bày trong

bảng 3.4.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng nguồn Muối đến khả năng sản xuất chitosan của 3 chủng

VSV CD1, CD5, CD10

HIỆU SUẤT THU ĐỘ HÒA TAN ĐỘ DEACETYL HỒI

CD1 CD5 CD10 CD1 CD5 CD10 CD1 CD5 CD10

MgSO4 70,00a ±0,10 83,00a ± 0,10 73,66a ± 0,20 66,84a ± 0,65 71,60a ± 1,00 70,56a ± 0,58 43,00a ± 1,53 60,00a ± 2,00 48,00a ± 1,00

KH2PO

*Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b thì không có sự khác

biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,01.

Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 0,01 trong cùng một cột.

CuSO4 62,67 b ± 0,50 59,67c ± 0,10 71,33 b ± 0,50 65,33c ± 0,10 63,33 b ± 0,30 62,00c ± 0,10 58,00 b ± 0,58 51,60c ± 0,58 70,33 b ± 0,58 67,67c ± 0,58 69,63 b ± 0,58 65,30c ± 0,73 41,33 b ± 0,58 37,33c ± 0,58 56,67 b ± 0,58 38,33c ± 0,58 45,00 b ± 0,73 39,00c ± 0,73

Nhận xét:

Trong các thành phần khoáng được sử dụng trong quá trình lên men, ta thấy

MgSO4 cho hiệu suất thu hồi chitosan cao nhất đạt 43%, 60%, 48% tương ứng với

các chủng CD1, CD5, CD10. Tiếp đến là nguồn KH2PO4 cho hiệu quả gần như

tương đương so với MgSO4 và cho hiệu quả sản xuất chitosan thấp nhất là CuSO4

(Hình 4). Môi trường lên men chuyển hóa chitin thành chitosan chứa nguồn N cao

nấm men là môi trường tự nhiên, do đó đã chứa nhiều các khoáng đa lượng và vi

lượng. Vì vậy, thành phần khoáng bổ sung chỉ cần bao gồm chất còn thiếu chủ yếu

đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật. Trong trường hợp thí nghiệm, MgSO4

là nguồn dinh dưỡng tốt nhất bổ sung vào môi trường lên men được sử dụng cho

các nghiên cứu tiếp theo.

Từ các kết quả thu được trong ba thí nghiệm trên. Trong môi trường dinh

dưỡng thu được sau cùng được sử dụng để chuyển hóa chitin thành chitosan trong

các thí nghiệm sau. Hoạt lực enzyme CDA để khẳng định vai trò của enzyme này

trong chuyển hóa sinh học

Bảng 3.5. Khảo sát enzyme trong dịch nuôi cấy vi khuẩn tuyển chọn nhằm

chuyển hóa chitin thành chitosan

CHỦNG VI SINH HOẠT LỰC MW PROTEIN VẬT

81669

63696 CD1 156,4 U/ml 38911

13328

58715 CD5 112,15 U/ml 38911

25786 CD10 170,33 U/ml 38911

 Kết quả này cho thấy cả ba chủng chuyển hóa chitin huyền phù thành

chitosan đều tổng hợp enzyme CDA với hoạt lực không chênh lệch quá nhiều. Thu

hồi và kết tủa enzyme bằng cồn sau đó xác định MW protein bằng SDS PAGE cho

thấy CD1 tổng hợp 4 protein, trong khi CD5 và CD10 chỉ tổng hợp 2 protein. Cả ba

chủng đều tồng hợp protein với MW là 38911, từ đó có thể nghi ngờ đấy chính là

CDA (chưa kịp kiểm tra).

3.2.3. Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách tăng nồng độ acid acetic hòa tan

chitosan

Trong các bước thu hồi chitosan sau quá trình lên men, acid acetic đóng một

vai trò quan trọng nhằm hòa tan hoàn toàn lượng chitosan, tách chitosan ra khỏi hỗn

hợp chitin và chitosan. Do đó nồng độ acid acetic cũng ảnh hưởng đến khả năng sản

xuất chitosan của 3 chủng VSV. Kết quả được trình bày trong bảng.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng nồng độ acid acetic đến khả năng sản xuất chitosan của 3

chủng VSV CD1, CD5, CD10

HIỆU SUẤT THU ĐỘ HÒA TAN ĐỘ DEACETYL HỒI

CD1 CD5 CD10 CD1 CD5 CD10 CD1 CD5 CD10

Acid

acetic 65b ± 1,00 76b ± 0,58 70b ± 0,58 65b ± 0,24 71b ± 0,72 70b ± 0,89 56b ± 1,00 65b ± 1,00 58b ± 1,00 1%

Acid

*Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b thì không có sự khác

biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,01.

Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 0,01 trong cùng một cột.

acetic 69a ± 1,15 80a ± 0,58 75a ± 0,58 71a ± 1,50 73a ± 1,10 72a ± 0,89 59a ± 1,30 70a ± 1,20 65a ± 1,00 2%

 Trong các bước thu hồi chitosan sau quá trình lên men, acid acetic là dung

môi hòa tan hoàn toàn chitosan giúp tách chitosan ra khỏi hỗn hợp chitin và

chitosan. Do đó nồng độ acid acetic cũng ảnh hưởng đến khả năng sản xuất chitosan

thu hồi sau lên men. Khi tăng nồng độ acid acetic từ 1% lên 2%, hiệu suất thu hồi

đạt được là 59%, 70% và 65% tương ứng với chủng CD1, CD5, CD10 (hình 5). Do

đó, ta sẽ sử dụng acid acetic 2% cho các thử nghiệm tiếp theo.

3.2.4. Tăng hiệu suất thu hồi bằng cách thay đổi cơ chất cảm ứng

Cơ chất cảm ứng đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất

chitosan. Do mỗi loại chitin có một cấu trúc phân tử khác nhau, nhằm chọn chất

cảm ứng thích hợp cho CDA từ các vi sinh vật tuyển chọn. Do đó, chúng tôi khảo

sát 2 nguồn cơ chất cảm ứng chính bao gồm huyền phù chitin và chitin thương

phẩm. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng đến khả năng sản xuất chitosan của

3 chủng VSV CD1, CD5, CD10

HIỆU SUẤT THU ĐỘ HÒA TAN ĐỘ DEACETYL HỒI

CD1 CD5 CD10 CD1 CD5 CD10 CD1 CD5 CD10

Huyền 70a phù 84a ± 0,10 82a ± 0,20 67a ± 1,15 73a ± 0,58 72a ± 0,58 72a ± 0,10 81a ± 0,20 76a ± 0,20 ± 0,50 chitin

Chitin 53,33b thương 68,00b ± 0,50 77,00b ± 0,10 69,00b ± 0,50 65,00b ± 1,53 69,00b ± 0,58 70,00b ± 0,58 66,00b ± 0,10 ± 0,30 67,33b ± 0,30 phẩm

Sử dụng cơ chất cảm ứng là huyền phù chitin cho hiệu suất thu hồi chitosan là

tốt nhất với hiệu suất hu hồi đạt 72%, 81%, 76% tương ứng chủng CD1, CD5,

CD10 đồng thời tạo ra sản phẩm chitosan có chất lượng tốt về độ hòa tan, độ

deacetyl so với khi sử dụng chitin thương phẩm làm cơ chất cảm ứng. Do đó, ta sẽ

tiếp tục sử dụng huyền phù chitin cho các thử nghiệm tiếp theo.

Sử dụng môi trường lên men tối ưu đã khảo sát ở trên (nguồn carbon là tinh

bột, nguồn nitơ là cao nấm men, nguồi khoáng là MgSO4. Cùng các thông số kỹ

thuật của môi trường lên men được khảo sát bởi (Guoying et al., 2010). Ta tiến

hành so sánh chitosan điều chế từ phương pháp lên với chitosan hóa học và chitosan

thương phẩm. Chất lượng 3 loại chitosan này được trình bày trong bảng 3.7

So sánh chất lượng chitosan:

 Độ hòa tan, độ nhớt, MW

Bảng 3.8. So sánh chitosan điều chế từ phương pháp lên men sinh học, chitosan

hóa học, chitosan thương phẩm

CD1 70,000c Độ hòa tan

(%) Chitosan TP 92,667a ± 0,577 Chitosan hóa học 81,667b ± 0,577

± 0,646 1,198a ± CD5 83,000b ± 0,732 0,962b ± Độ nhớt (cp) 0,86b ± 0,07 0,970b ± 0,03

1,17 1066391a MW (Da) ± 11952 0,04 902492b ± 14043 CD10 81,337b ± 0,577 0,970b ± 0,05 1016165a ± 21320 896745b ± 11530 902577b ± 16345

Độ

Ghi chú: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 0,01 trong cùng một dòng.

deacetylation 66,84c ± 0,7 70,56b ± 0,2 75,64a ± 0,1 70,22bc ± 0,4 71,60b ± 0,1 chitosan (%)

Dựa vào bảng 3.5 có thể nhận thấy Độ hòa tan của mẫu chitosan sinh học nhờ

lên men vi sinh vật CD5 và CD10 là tương đương độ hòa tan chitosan hóa học

(81,667%), tuy nhiên đều thấp hơn so với chitosan thương phẩm (92,667%). Độ hòa

tan chitosan sinh học từ lên men CD1 là thấp nhất (70%).

Độ nhớt là thông số có mối tương quan ngược với độ hòa tan. Độ hòa tan càng

lớn thì độ nhớt càng nhỏ. Thật vậy, theo số liệu thu được trên bảng 2, thì độ nhớt

cao nhất ở mẫu chitosan từ CD1, thấp nhất là chitosan thương phẩm, còn lại độ nhớt

chitosan từ CD5, CD10 và chitosan hóa học là tương đương nhau. Khối lượng phân

tử MW của chitosan là một đại lượng phụ thuộc vào độ nhớt chitosan theo quy luật

độ nhớt càng cao thì khối lượng phân tử càng lớn. Thật vậy, khối lượng phân tử

chitosan thương phẩm là thấp nhất (896745 Da), chitosan từ CD1 có MW cao nhất

(1066391 Da), trong khi đó chitosan từ CD5 và CD10 có MW tương đương

chitosan hóa học (từ 902492 Da đến 1016165 Da).

 Độ deacetyl hóa (DDA)

Là chỉ tiêu quyết định sự thành công của công nghệ chuyển hóa chitin thành

chitosan. DDA của chitosan thương phẩm chỉ đạt 75,64%, trong khi đó DDA của

chitosan từ CD5, CD10 và chitosan hóa học là tương đương nhau và đạt từ 70,22%

đến 71,60% (Bảng 2). Chitosan từ lên men CD1 cho DDA thấp nhất chỉ đạt

66,84%. DDA là thông số có tương quan với độ hòa tan. DDA càng lớn thì số lượng

nhóm NH2- tương tác với nhóm acetate trong môi trường H2O càng nhiều nên độ

hòa tan càng cao. Đặc biệt, độ deacetyl hóa do hoạt lực enzyme chitin deacetylase

quyết định. Tuy nhiên hoạt lực này đo bằng phương pháp sử dụng p-nitroacetanilide

làm cơ chất lại cho kết quả không thích ứng, cụ thể là 156,4 U/ml; 112,15 U/ml;

170,33 U/ml tương ứng ở các chủng CD1, CD5, CD10. Điều này có thể giải thích

được là do p-nitroanilide là cơ chất có ái lực đối với enzyme chitin deacetylase

không thể giống cơ chất chitin đối với enzyme.

Độ deacetyl hóa quyết định hoạt tính sinh học của chitosan, mà đại diện là

hoạt tính kháng khuẩn. Phương pháp đo DDA rất đa dạng. Ngoài phương pháp

chuẩn độ bằng H3PO4 còn phương pháp đo phổ hồng ngoại IR.

Bảng 3.9. Độ deacetyl hóa chitosan chuyển hóa sinh học sơ với chitosan hóa

học và chitosan thương mại

Chitosan hóa CD1 CD5 CD10 Chitosan TP học

Độ deacetyl hóa

chitosan (pp chuẩn 66,84c ± 0,7 71,60b ± 0,1 70,56b ± 0,2 75,64a ± 0,1 70,22bc ± 0,4

độ) (%)

Độ deacetyl hóa

chitosan (pp đo phổ 52 53 54 56 56

IR) (%)

So sánh với phương pháp chuẩn độ bằng H3PO4, phương pháp quét phổ IR từ

đó xác định DDA cho thấy chênh lệch giữa hai phương pháp này gần 20%. Tuy

nhiên từ hai phương pháp DDA chitosan sinh học không khác biệt nhiều so với

chitosan hóa học và thương mại. Chủng CD5 và CD10 thể hiện khả năng deacetyl

cao hơn CD1.

 Đánh giá khả năng kháng khuẩn chitosan

- Định tính

312.5ppm

625ppm

1250ppm

78.125ppm

156.25ppm

Huyền phù chitin Chitosan thương phẩm

312.5ppm

156.25ppm

312.5ppm

625ppm

1250ppm

78.125ppm

625ppm

78.125ppm

156.25ppm

Mẫu CD1 Mẫu CD5

312.5ppm

625ppm

1250ppm

78.125ppm

156.25ppm

Mẫu CD10

Hình 3.8. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của chitosan trên vi khuẩn E.coli

Kết luận: Ta thấy, tất cả các mẫu chitosan đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn.

Trừ mẫu chitin không xuất hiện vòng kháng khuẩn. Không cho thấy khả năng kháng

khuẩn ở mẫu chitin.

- Định lượng

Hình 3.9. Ống vi khuẩn E.coli sau 24h nuôi cấy không bổ sung chitosan

OD625nm= 0,773

CD1:

Hình 3.10. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn chủng CD1

Nồng độ (ppm) 1250 625 312,5 156,25 78,125

OD 0,009 0,011 0,018 0,128 0,359

→ Ở nồng độ chitosan thấp nhất là 312,5 ppm có thể ức chế sự phát triển của

vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy

CD5:

Hình 3.11. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn chủng CD5

Nồng độ (ppm) 1250 625 312,5 156,25 78,125

OD 0,009 0,012 0,016 0,016 0,420

→Ở nồng độ chitosan thấp nhất là 156,25 ppm có thể ức chế sự phát triển của

vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy.

CD10

Hình 3.12. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn chủng CD10

Nồng độ (ppm) 1250 625 312,5 156,25 78,125

OD 0,003 0,008 0,012 0,0138 0,396

→ Ở nồng độ chitosan thấp nhất là 156,25 ppm có thể ức chế sự phát triển của

vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy

Các mẫu chitosan CD10, CD5 đều cho kết quả nồng độ chitosan thấp nhất có

thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn là 156,25 ppm sau 24 giờ nuôi cấy. Ở CD1,

nồng độ chitosan là 312,5 ppm. Tương đương với nồng độ thấp nhất chitosan

thương phẩm có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở nồng độ 156,25 ppm

và của chitosan hóa học là 312,5 ppm. Kết quả này phù hợp với mức độ deacetyl

hóa của chitosan. Mức độ deacetyl hóa càng cao khả năng kháng khuẩn càng tốt.

CD5, CD10, Chitosan thương phẩm có mức độ deacetyl hóa cao nên khả năng

kháng khuẩn tốt hơn so với chitosan CD1 và chitosan hóa học.

- Như vậy quy trình chuyển hóa chitin thành chitosan sử dụng các chủng trên

cũng đã được thiết lập với các thông số kỹ thuật chính sau: Môi trường lên men: pH = 6, mật độ giống:6x107 cfu/ml, nhiệt độ:37oC, tốc độ lắc: 150 vòng/phút.

Sau lên men các quá trình thu hồi chitosan gồm các quá trình sau: ly tâm

12000 vòng/phút x 15 phút thu tủa, phá vỡ tế bào trong dung dịch NaOH 0,1 N; 121oC, 20 phút, loại bỏ mảnh vỡ tế bào bằng ly tâm 12000 vòng/phút x 15 phút, hòa

tan chitosan bằng acid acetic 2%, loại bỏ chitin chưa chuyển hóa bằng ly tâm như

trên, thu hồi chitosan dạng rắn bằng cách trung hòa dịch với NaOH 1N rồi tiếp tục

ly tâm 4000 vòng/phút x 15 phút và cuối cùng sấy khô.

Trong ba chủng vi khuẩn tuyển chọn được sau nghiên cứu, chủng Bacillus

amyloliquefaciens CD5 và Baceillus siamensis CD10 cho hiệu suất thu hồi, độ hòa

tan cao hơn chitosan thu được từ Bacillus cereus CD1, đồng thời độ nhớt nhỏ hơn,

đặc biệt DDA cao hơn và hoạt tính kháng khuẩn E. coli thể hiện qua MIC nhỏ hơn.

Bacillus cereus được biết là vi khuẩn gây bệnh truyền qua thực phẩm (ói mửa), vì

vậy hai chủng CD5 và CD10 nên được tiếp tực nghiên cứu nhằm tăng hiệu suất

chuyển hóa.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Trong số 26 chủng phân lập được từ các nguồn mẫu thu thập sàng lọc được 3

chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase. Các chủng này đều là

vi khuẩn gram dương, sinh bào tử, có khả năng tổng hợp enzyme ngoại bào

amylase, protease, chitinase ngoài enzyme CDA.

Giải trình tự 16S rDNA và so sánh trên Genbank bằng chương trình BLAST

cho thấy các chủng sàng lọc đều thuộc chi Bacillus, trong đó CD1, CD5 và CD10

tương đồng với các loài Bacillus cereus, B. amyloliquefaciens và B. siamensis với tỉ

lệ đều trên 99 %.

Trong đó chủng CD5 và CD10 là hai chủng tiềm năng do là vi sinh vật an

toàn, hiệu suất thu hồi chitosan là 81 và 76%, độ hòa tan trong acid acetic 2% là

80% và 75%, độ nhớt là 0,962 và 0,970; MW là 902492 và 1016165, DDA theo

phương pháp chuẩn độ là 71,60 và 70,56; theo phương pháp quét phổ hồng ngoại là

53 và 54 tương đương chitosan hóa học và thương phẩm.

Quy trình sản xuất chitosan từ chitin có các thông số kỹ thuật chính sau: Môi trường lên men: pH = 6, mật độ giống:6x107 cfu/ml, nhiệt độ:37oC, tốc độ

lắc: 150 vòng/phút.

Sau lên men các quá trình thu hồi chitosan gồm các quá trình sau: ly tâm

12000 vòng/phút x 15 phút thu tủa, phá vỡ tế bào trong dung dịch NaOH 0,1 N; 121oC; 20 phút, loại bỏ mảnh vỡ tế bào bằng ly tâm 12000 vòng/phút x 15 phút, hòa

tan chitosan bằng acid acetic 2%, loại bỏ chitin chưa chuyển hóa bằng ly tâm như

trên, thu hồi chitosan dạng rắn bằng cách trung hòa dịch với NaOH 1N rồi tiếp tục

ly tâm 4000 vòng/phút x 15 phút và cuối cùng sấy khô.

Kiến nghị

- Tiếp tục phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp enzyme CDA hoạt lực cao

chuyển hóa trực tiếp chitin mà không cần xử ý tạo huyền phù và tăng độ DD.

- Chú ý phân lập các chủng kết hợp hoạt tính CDA và chitinase để sản xuất

được chitosan phân tử nhỏ giảm khối lượng phân tử, tăng độ hòa tan, giảm độ nhớt.

- Hoàn thiện công nghệ chuyển hóa chitin thành chitosan, tối ưu hóa thành

phần môi trường và điều kiện nuôi cấy, tiếp liệu môi trường dinh dưỡng để tăng

hiệu suất chuyển hóa, đơn giản hóa các quá trình thu hồi chitosan.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

Vòng Bính Long, Ngô Đại Nghiệp. Tạo các dẫn xuất chitosan bằng phương

pháp hóa học và ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Báo cáo nghiệm thu đề tài

nghiên cứu cấp trường. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, 2011.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

[1] Alemdaroğlu Ceren và Cộng sự (2006), "An investigation on burn wound

healing in rats with chitosan gel formulation containing epidermal growth

factor", Burns. 32 (3), tr. 319-327.

[2] Alfonso C, Nuero OM, Santamaría F, Reyes F. Purification of a heat-stable

chitin deacetylase fromAspergillus nidulans and its role in cell wall

degradation. Curr Microbiol. 1995;30:49 – 54.

[3] Araki Y, Ito E. A pathway of chitosan formation in Mucor rouxii. Eur J

Biochem. 1975;55:71 – 78.

[4] Coutinho PM, Henrissat B. Carbohydrate-active enzymes: An integrated

database approach. In: Gilbert HJ, Davies G, Henrissat B, Svensson B,

editors. Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering. The Royal

Society of Chemistry; Cambridge, UK. 1999. pp. 3 – 12.

[5] Davis LL, Bartnicki-Garcia S. Chitosan synthesis by the tandem action of

chitin synthetase and chitin deacetylase from Mucor

rouxii. Biochemistry. 1984;23:1065 – 1073.

[6] Fwu Long Mi và Cộng sự (2001), "Fabrication and characterization of a

sponge-like asymmetric chitosan membrane as a wound dressing",

Biomaterials. 22, tr. 165-173.

[7] Fwu Long Mi và Cộng sự (2003), "Asymmetric chitosan membranes

prepared by dry/wet phase separation: a new type of wound dressing for

controlled antibacterial release", Journal of Membrane Science. 212, tr. 237-

254.

[8] Gao XD, Katsumoto T, Onodera K. Purification and characterization of

chitin deacetylase from Absidia coerulea. J Biochem. 1995;117:257 – 263.

[9] Gauthier C, Clerisse F, Dommes J, Jaspar-Versali MF. Characterization and

cloning of chitin deacetylases from Rhizopus circinans. Protein Expr Purif.

2008;59:127 – 137.

[10] Gilmore ME, Bandyopadhyay D, Dean AM, Linnstaedt SD, Popham DL.

Production of muramic delta-lactam in Bacillus subtilis spore peptidoglycan.

J Bacteriol. 2004;186:80 – 89.

[11] H. Finger, “Chitin und Chitosan,” Neue Rohstoffe auf dem Weg zur

industriellen Nutzung, WS 1999/2000.

[12] H. J. Bader and E. Birkholz, Chitin Handbook, Atec Edizioni, Grottammare,

Italy, 1997.

[13] Hang Thi Au và Cộng sự (2012), "Fabrication of An Antibacterial Non-

Woven Mat of a poly(lactic acid)/Chitosan Blend by Electrospinning",

Macromolecular Research. 20 (1), tr. 51-58.

[14] Hunt DE, Gevers D, Vahora NM, Polz MF. Conservation of the chitin

utilization pathway in the Vibrionaceae. Appl Environ Microbiol.

2008;74:44 – 51.

[15] J Microbiol Biotechnol. 2008;18:759 – 766.

[16] Jeraj N, Kunič B, Lenasi H, Breskvar K. Purification and molecular

characterization of chitin deacetylase from Rhizopus nigricans. Enzyme

Microb Technol. 2006;39:1294 – 1299.

[17] John M, Rohrig H, Schmidt J, Wieneke U, Schell J. Rhizobium NodB

protein involved in nodulation signal synthesis is a chitooligosaccharide

deacetylase. Proc Natl Acad Sci USA. 1993;90:625 – 629.

[18] Julian G. Domszy, George A. Evaluation of infrared spectroscopic

techniques for analysing chitosan. Volume 186, Issue 8 August 1985 Pages

1671–1677.

[19] Julian G. Domszy,George A. F. Roberts. Evaluation of infrared

spectroscopic techniques for analysing chitosan. Volume 186, Issue 8,

August 1985 , Pages 1671–1677.

[20] Kim YJ, Zhao Y, Oh KT, Nguyen VN, Park RD. Enzymatic deacetylation of

chitin by extracellular chitin deacetylase from a newly screened Mortierella

sp. DY

[21] Kuldeep Kaur, Vikrant Dattajirao, Vikas Shrivastava, and Uma Bhardwaj

(2012). Isolation and Characterization of Chitosan-Producing Bacteria from

Beaches of Chennai, India. Hindawi Publishing Corporation Enzyme

Research, Vol 2012.

[22] Li, J., Revol, J.-F., Marchessault, R. H. Effect of degree of deacetylation of

chitin on the properties of chitin crystallites, Journal of Applied Polymer

Science, 65 (2), 373–380, 1997

[23] Li L.P. Master Thesis. Shandong Agricultural University; Taian, China:

2007. Screening of the Strains Producing Chitin Deacetylase; pp. 19–31.

[24] MargueriteRinaudo. Chitin and chitosan: Properties and applications.

Progress in Polymer Science. Volume 31, Issue 7, July 2006, Pages 603-632.

[25] Nan Liu, Xi-Guang Chen, Hyun-Jin Park, Chen-Guang Liu, Cheng-Sheng

Liu, Xiang-Hong Meng, Le-Jun Yu. Effect of MW and concentration of

chitosan on antibacterial activity of Escherichia coli. 2006; 61 – 62

[26] Onsøyen E, Skaugrud O. Metal recovery using chitosan. J Chem Technol

Biotechnol. 1990;49(4):395-404.

[27] Rong Huei Chen, Jaan Rong Chang, Ju Shii Shyur. Effects of ultrasonic

conditions and storage in acidic solutions on changes in molecular weight

and polydispersity of treated chitosan. Carbohydrate Research 299 (1997)

287-294.

[28] S. R. A. Malek, “Chitin in the hyaline exocuticle of the scorpion,” Nature,

vol. 198, no. 4877, pp. 301–302, 1963. View at Publisher · View at Google

Scholar · View at Scopus.

[29] Shrestha B, Blondeau K, Stevens WF, Hegarat FL. Expression of chitin

deacetylase fromColletotrichum lindemuthianum in Pichia pastoris:

Purification and characterization. Protein Expr Purif.2004;38:196 – 204.

[30] Tokuyasu K, Ohnishi-Kameyama M, Hayashi K. Purification and

characterization of extracellular chitin deacetylase from Colletotrichum

lindemuthianum. Biosci Biotech Biochem. 1996;60:1598 – 1603.

[31] Tsigos I, Bouriotis V. Purification and characterization of chitin deacetylase

from Colletotrichum lindemuthianum. J Biol Chem. 1995;270:26286 –

26291.

[32] V. Ghormade1, S. Kulkarni 1, N. Doiphode1, P.R. Rajamohanan2 and M.V.

Deshpande*. Chitin deacetylase: A comprehensive account on its role in

nature and its biotechnological applications.

[33] Van Daele, Y., and J. P. Thome (1986). Purification of PCB contaminated

water by chitosan: a biological test of efficiency using the common barbel,

Barbus barbus. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 37:858–865.

[34] Vollmer W, Tomasz A. The pgdA gene encodes for a peptidoglycan N-

acetylglucosamine deacetylase inStreptococcus pneumoniae. J Biol Chem.

2000;275:20496 – 20501.

[35] Yuanhao He, Jianping Xu, Shengjie Wang, Guoying Zhou and Junang Liu.

Optimization of medium components for production of chitin deacetylase

by Bacillus amyloliquefaciens Z7, using response surface methodology.

Biotechnol Biotechnol Equip. 2014 Mar 4; 28(2): 242–247.

http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-ung-dung-chitosan-trong-che-bien-va-bao-quan-

TÀI LIỆU INTERNET

rau-trai-53100/

[1]

[2] Wikipedia. Chitin. https://en.wikipedia.org/wiki/Chitin.

[3] Wikipedia. Chitosan. https://vi.wikipedia.org/wiki/Chitosan.

PHỤ LỤC A: CÁC TEST SINH HÓA ĐỊNH DANH SƠ BỘ VI KHUẨN

1. Nhuộm Gram

- Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm.

- Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn.

- Dùng thuốc nhuộm kiềm, tím tinh thể hay tím gentian nhuộm mẫu trong 1

phút. Ở đây, dùng violet.

- Rửa nước tối đa 5 giây.

- Thêm dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút.

- Rửa bằng cồn trong 10 giây.

- Phủ lên mẫu với ethanol 95% (hoặc hỗn hợp acetone:ethanol 95% 5:1) vài

lần cho đến khi không xuất hiện thêm màu trong mẫu (khoảng 1 phút). Dung dịch

này sẽ rửa sạch thuốc nhuộm kiềm không kết gắn, vi khuẩn gram dương giữ lại màu

tím, còn vi khuẩn gram âm mất màu.

- Rửa nước.

- Nhuộm tiếp với safranin hoặc fuchsin Cả hai nhóm vi khuẩn đều bắt giữ

thuốc nhuộm lần này, nhưng vi khuẩn gram dương không bị thay đổi màu nhiều,

trong khi vi khuẩn gram âm trở nên đỏ vàng (nhuộm safranin) hay đỏ tía (fuchsin).

Thời gian: 1 phút theo tài liệu mới nhất.

- Rửa qua nước. Để khô.

2. Nhuộm bào tử

Sử dụng phương pháp Schaefera và Fulton cải tiến theo các bước sau:

Bước một: làm vết bôi và cố định tiêu bản

- Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống thạch nghiêng hòa vào một

giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí, hơ nhanh vết bôi trên

ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính.

- Cố định vết bôi bằng cách nhỏ lên vết bôi 1 – 2 giọt cồn 96º. Đốt cháy và dập

tắt ngay khoảng 10 giây.

- Đặt tiêu bản lên trên giá đỡ, giá đỡ đặt trên cốc bese có chứa một ít nước

đang đun nóng 85 – 90ºC (không để sôi) trên bếp.

Bước hai: tiến hành nhuộm tiêu bản

- Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi.

- Nhỏ 2 – 3 giọt dịch xanh methylen 6% lên vết bôi và tiến hành hơ nước nóng

trong 5 – 10 phút. Nếu thấy thuốc nhuộm trên giấy bị khô thì phải bổ sung.

- Rửa vết bôi bằng nước cất trong 30 giây (lúc đó có tế bào dinh dưỡng sẽ bị

mất màu còn bào tử vẫn giữ lại màu).

- Đặt tiêu bản lên giá đỡ, giá đỡ được đặt lên chậu rửa.

- Đặt giấy lọc lên vết bôi.

- Nhỏ 2 – 3 giọt dung dịch safranin hay fuchsin lên trên miếng giấy lọc, để 30

giây.

- Rửa nước rồi thấm khô hay để khô tự nhiên vết bôi.

Bước ba: quan sát tiêu bản trên kính hiển vi quang học với vật kính đầu

(x100).

→Kết quả: Tiêu bản nhuộm đúng thì bào tử sẽ bắt màu xanh dương, tế bào bắt

màu đỏ hồng

Lưu ý: ở phương pháp nhuộm bào tử thì người ta sử dụng dịch lục malachite

5%, tuy nhiên có thể thay thế dịch lục malachite 5% bằng dung dịch xanh methylen

6%. Ở thí nghiệm này sử dụng dịch xanh methylen 6% nên bào tử sẽ bắt màu xanh

dương thay vì màu xanh lục.

3. Thử nghiệm Methyl Red (MR)

Cơ sở sinh hóa: nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sản xuất và duy trì các

sản phẩm acid bên trong môi trường trong quá trình lên men glucose.

Cách tiến hành: nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose phosphate (MR

– VP broth) ủ trong khoảng 2 – 5 ngày. Thêm vài giọt thuốc thử methyl red được

pha theo tỷ lệ 0,1 g trong 300 ml cồn và cho nước vào để đạt thể tích 500 ml.

4. Thử nghiệm Voges Proskauer (VP)

Cơ sở sinh hóa: nhằm xác định vi sinh vật có khả năng tạo thành acetoin hay

không.

Cách tiến hành: nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose phosphate (MR

– VP broth) ủ trong khoảng 2 – 5 ngày. Nhỏ 3 giọt α-napthol vào rồi tiếp tục nhỏ

thêm 1 giọt KOH 40%, lắc nhẹ và đọc kết quả màu, đọc kết quả sau 20 phút và

chậm nhất là 4 giờ.

5. Thử nghiệm Simmon Citrate

Cơ sở sinh hóa: nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng citrate như là

nguồn carbon duy nhất.

Cách tiến hành: cấy vi sinh vật lên môi trường thạch nghiêng Simmon Citrate

Agar, ủ 37ºC trong 24 giờ rồi đọc kết quả.

6. Thử nghiệm Catalase

Cơ sở sinh hóa: nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase trong vi sinh

vật.

Cách tiến hành: H2O2 30% được giữ lạnh trong chai màu, tránh ánh sáng, dung

dịch đệm phosphate pH 7,4. Sau đó dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối đặt trên

lame. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật.

7. Thử nghiệm Indol

Cơ sở sinh hóa:Nhằm phát hiện khả năng của vi sinh vật có khả năng tạo vòng

indol trong môi trường canh trypton.

Cách tiến hành: vi sinh vật thử nghiệm được nuôi trong môi trường canh

trypton trong khoảng 24 – 48 giờ. Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt môi

trường, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s hoặc thuốc thử Erhlich. Quan sát sau vài

phút.

8. Thử nghiệm trên môi trường TSI

Cơ sở sinh hóa: nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng các nguồn

carbohydrate có mặt trong môi trường, khả năng sinh H2S, khả năng sinh H2S, khả

năng sinh gas trong môi trường.

Cách tiến hành: môi trường TSI được chuẩn bị trong các ống nghiệm với phần

nghiêng cách nắp ống khoảng 2,5 cm; phần sâu có chiều cao khoảng 2,5cm. Dùng

que cấy nhọn đưa vi sinh vật vào phần sâu của ống nhưng không đụng đáy ống, sau

đó cấy ria lên phần nghiêng. Ủ các ống đã cấy ở 37ºC trong 18 – 24 giờ. Ghi nhận

lại các biểu hiện ở phần sâu, phần nghiêng, sinh H2S và sinh gas.

Nếu bảo quản giống ở nhiệt độ phòng thì 15 ngày phải cấy chuyền ống giống,

nếu bảo quản giống trong điều kiện nhiệt độ 4ºC thì 45 ngày phải cấy chuyền giống.

PHỤ LỤC B: QUY TRÌNH CHUẨN BỊ HUYỀN PHÙ CHITIN

Chitin hóa học

Ngâm HCl HCl 37%/24h

Lọc thu dịch Cặn chitin

Ly tâm thu tủa 4000v/15p

Rửa trung tính (3 lần)

Đệm phosphate pH=7

Huyền phù chitin

Thuyết minh quy trình:

Huyền phù hóa chitin: lấy 10 g chitin hóa học được cung cấp bởi công ty

VNchitosan hòa vào 100 ml HCl đậm đặc. Khuấy đều trong 10 phút. Sau đó cho từ

từ nước cất đã làm lạnh đến 500 ml, chitin huyền phù có màu trắng sữa. Để qua

đêm trong ngăn mát tủ lạnh. Sau đó đem đi lọc thu dịch. Huyền phù sẽ được rửa

bằng cách ly tâm (4000 vòng/10 phút) nhiều lần với dung dịch có pH 7 đến khi

huyền phù đạt pH = 6. Bảo quản huyền phù trong tủ mát.

PHỤ LỤC C: HÌNH ẢNH CÁC KẾT QUẢ TEST SINH HÓA

1. Nhuộm gram CD1 CD5

CD10 CD1 CD5

Hình 1. Kết quả nhuộm gram của chủng vi sinh vật

Kết luận: cả ba chủng CD1, CD5, CD10 tế bào đều bắt màu tím → CD1, CD5 CD10 và CD10 là vi khuẩn gram dương

2. Nhuộm bào tử

CD10

CD1

CD5

Hình 2. Kết quả nhuộm bào tử của chủng vi sinh vật

Kết luận: qua việc soi thấy bào tử bắt được màu của methylen blue 6% cho

thấy rằng chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra bào tử khi điều kiện môi trường

cạn kiệt dinh dưỡng, đây là cơ sở khẳng định những chủng này có khả năng tồn tại

trong môi trường khắc nghiệt. Thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì bào tử hình thành

càng nhiều. Nguyên nhân của việc hình thành bào tử là do trong quá trình nuôi cấy

vi sinh vật sử dụng thành phần dinh dưỡng trong môi trường và hình thành một số

sản phẩm bất lợi nên kích thích tế bào hình thành bào tử.

3. Thử nghiệm Methyl Red

Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sản xuất và duy trì các sản phẩm acid

bên trong môi trường trong quá trình lên men glucose.

CD1 CD5 CD10

Hình 3. Kết quả thử nghiệm Methyl Red

Kết luận: đối với chủng vi sinh vật CD1, CD5 và CD10 thì môi trường chuyển

sang đỏ → ba chủng này dương tính với thử nghiệm.

4. Thử nghiệm Voges Proskauer (VP)

CD1 CD5 CD10

Hình 4. Kết quả thử nghiệm VP

Nhận xét: thông qua quan sát ta thấy dung dịch không đổi màu → CD1, CD5

và CD10 âm tính với thử nghiệm. Cho thấy không có khả năng tạo thành và duy trì

acetoin.

5. Thử nghiệm Catalase

CD1

CD5

CD10

Hình 5. Kết quả thử nghiệm catalase của chủng vi sinh vật

Nhận xét: quan sát kết quả thử nghiệm, ta thấy cả 3 chủng CD1, CD5 và CD10

đều có xuất hiện hiện tượng sủi bọt khí. Điều này chứng tỏ rằng các chủng vi khuẩn

được chọn lựa đưa vào test hoạt tính catalase đều có tiết ra enzyme phân giải H2O2

hình thành bọt khí. Hiện tượng ghi nhận kết quả dương tính của thử nghiệm

catalase.

6. Thử nghiệm Indole

CD1 CD5 CD10

Hình 6. Kết quả thử nghiệm Indole

Nhận xét:

Chủng CD1: không xuất hiện vòng đỏ  CD1 âm tính với thử nghiệm.

Chủng CD5:không xuất hiện vòng đỏ  CD1 âm tính với thử nghiệm.

Chủng CD10: không xuất hiện vòng đỏ  CD1 âm tính với thử nghiệm.

7. Thử nghiệm TSI

CD5 CD1 CD10

Hình 7. Kết quả thử nghiệm TSI

Nhận xét:

Chủng CD1: nghiêng vàng, sâu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S 

CD1 dương tính với thử nghiệm.

Chủng CD5: nghiêng đỏ, sâu đỏ, không sinh hơi và không sinh H2S  CD5

âm tính với thử nghiệm.

Chủng CD10: nghiêng đỏ, sâu đỏ, không sinh hơi và không sinh H2S  CD10

âm tính với thử nghiệm.

8. Thử nghiệm Simmon Citrate

CD10 CD1 CD5

Hình 8. Kết quả thử nghiệm citrate của các chủng vi sinh vật

Nhận xét:

Chủng CD1: Môi trường chuyển sang màu xanh dương  CD1 dương tính

với thử nghiệm

Chủng CD5: Môi trường chuyển sang màu xanh dương  CD5 dương tính

với thử nghiệm

Chủng CD10: Môi trường chuyển sang màu xanh dương  CD10 dương tính

với thử nghiệm.

9. Khả năng làm tan chảy Gelatin

ĐC CD1 CD10 CD5

Hình 9. Thử nghiệm khả năng làm tan chảy Gelatin

Nhận xét: cả 3 chủng đều có khả năng làm tan chảy gelatin. Kết quả cả 3

chủng đều dương tính với thử nghiệm deacetylase.

PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ CÁC CHỦNG CD1, CD5, CD10

Kết quả so sánh với Genbank và định danh của chủng CD5

Kết quả so sánh với Genbank và định danh của chủng CD1

Kết quả giải trình tự 16S rRNA của chủng CD1

Kết quả giải trình tự 16S rRNA của chủng CD10

Kết quả so sánh với Genbank và định danh của chủng CD1

PHỤ LỤC E: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG

1. Môi trường tăng sinh (g/l)

Huyền phù chitin 2% 1000 ml

NaCl 0,2% 2g

pH 6

2. Môi trường phân lập (g/l) (Gou Jingxuan và cs, 2012) có bổ sung Yeast

extract

Chitin 2%

1g NaNO3 0,2%

1g K2HPO4 0,1%

1g KH2PO4 0,1%

0,5g MgSO4 0,05%

Yeast Extract 0,1% 1g

NaCl 0,2% 1g

Agar 2% 20g

pH 6

3. Môi trường chọn lọc (Guoying et al., 2010) có bổ sung NaCl 0,2%

Chitin 2%

1g NaNO3

1g K2HPO4

1g KH2PO4

0,5g MgSO4

PN 0,5g

Agar 20g

NaCl 0,2% 1g

Ph 7

t0 370C

4. Môi trường lên men cơ bản:

Chitin 2%

Glucose 2%

1g K2HPO4 0,1%

1g KH2PO4 0,1%

0,5g FeSO4 0,05%

Meat Extract 0,1% 1g

NaCl 0,2% 1g

Ph 7

PHỤ LỤC F: HÌNH ẢNH KẾT QUẢ QUÉT PHỔ P-NITROANILINE CHUẨN

Kết quả quét phổ p-nitroaniline chuẩn

PHỤ LỤC G: SẢN XUẤT CHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC

(Theo phương pháp của Robert, đại học Nottingham Trent (1998).)

- Cân 20 g chitin từ vỏ tôm (được cung cấp bởi công ty VN Chitosan) đã được

khử khoáng và khử protein.

- Tiến hành thủy phân trong 1 lít môi trường NaOH 50%, nhiệt độ 120oC trong

8 giờ.

- Ly tâm 4000 vòng/phút x 15 phút thu tủa chitosan.

- Tiến hành ly tâm rửa tủa bằng nước 4000 vòng/phút x 15 phút 2 lần. - Sấy khô tủa 50oC trong 4 giờ. Thu được chitosan hóa học.

PHỤ LỤC H: ĐỘ ĐỤC CHUẨN McFarland

Độ đục chuẩn 0,5 McFarland phải được chuẩn bị và kiểm định chất lượng

trước khi làm thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh. Nếu độ đục chuẩn được hàn

kín để chống bay hơi và bảo quản trong bóng tối thì có thể sử dụng trong vòng 6

tháng. Độ đục chuẩn McFarland được sử dụng để điều chỉnh độ đục của huyền dịch

nuôi cấy vi khuẩn cho thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh.

Độ đục chuẩn 0,5 Mcfarland hiện nay rất sẵn có trên thị trường. Hoặc có thể tự

chuẩn bị bằng cách trộn:

- Dung dịch BaCl2 1% 0,5ml

99,5 ml - Dung dịch H2SO4 1%

Chia vào các tube thủy tinh và hàn kín để tránh bay hơi, các ống đục chuẩn

này có thể giữ trong vòng 6 tháng trong bóng tối nhiệt ở độ phòng.

- Lắc đều trước khi sử dụng để làm tan các hạt BaSO4 kết tủa trong tube.

- Kiểm tra độ chính xác của độ đục chuẩn 0,5 Mcfaland.

- Đo bằng máy đo độ đục bước sóng 625 nm: OD = 0,08 – 0,1.

PHỤ LỤC I: KẾT QUẢ ĐỌC PHỔ IR CHITOSAN

AB AC AC/AB

log(AC/AB) A3360 DF2 DE DF2/DE LOG(DF2/DE) A 1640 DD

CD1 46 99 2,152174 0,3328774 0,332877 84 60 1,3756

0,13849217

0,138492 52

CD5 46 96 2,086957 0,3195134 0,319513 80 58 1,3487

0,12991536

0,129915 53

CD10 45 95,5 2,122222 0,3267909 0,326791 80 58 1,3487

0,12991536

0,129915 54

TP 45 96 2,133333 0,3290587 0,329059 80 58 1,3339

0,12512327

0,125123 56

HH 45 96 2,133333 0,3290587 0,329059 80 58 1,33339

0,12495719

0,124957 56

Độ hấp thụ của chitosan được sử dụng để tính mức độ deacetyl hóa (DDA)

bằng phương trình sau: (Domszy and Roberts, 1985):

DDA(%) = [1 – (A1655/ A3450)/1,33 × 100]

Hệ số 1,33: Tỷ lệ A1655/A3450 đối với N-acetyl hóa hoàn toàn chitosan

Ta có kết quả được trình bày trong bảng 3.8.

Bảng 3.8. Kết quả đọc phổ IR của 3 mẫu chitosan CD1, CD5, CD10

A3360 A 1640 DD

CD1

0,332877 0,138492 52

CD5 0,319513 0,129915 53

CD10 0,326791 0,129915 54

TP 0,329059 0,125123 56

HH 0,329059 0,124957 56

PHỤ LỤC J: HOẠT TÍNH ENZYME CHITIN DEACETYLASE

Từ kết quả quét phổ p-nitroaniline chuẩn (Phụ lục E), ta tìm được ƛ max= 395

nm.

 Phương trình đường chuẩn p-nitroaniline

0 10 20 30 40 50 Nồng độ

0.8

0.7

y = 0.0132x + 0.0041 R² = 0.997

0.6

0.5

Series1

0.4

Linear (Series1)

0.3

0.2

0.1

0 0.15 0.259 0.39 0.53 0.676 OD

Hình 3.10. Phương trình đường chuẩn p-nitroaniline

HL CDA (µg/ml/giờ) = ((Aλmax-Ao)-b)*F*60 phút/(a*T phút)

Trong đó

Aλmax = giá trị hấp thụ của hỗn hợp phản ứng enzyme sau thời gian phản ứng

đo tại bước sóng hấp thụ cực đại

A(0) = giá trị hấp thụ của hỗn hợp phản ứng với enzyme bất hoạt đo tại bước

sóng hấp thụ cực đại

F = hệ số pha loãng

T là thời gian phản ứng enzyme (phút)

60 = 60 phút trong 1 giờ

PHỤ LỤC K: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PP SDS - PAGE

 Định lượng protein bằng phương pháp điện di SDS - PAGE

Rf là tỷ số giữa khoảng cách di chuyển của protein và khoảng cách di chuyển

của phẩm màu brommophenol blue.

MW Log (MW) Rf

266250 5,4 0,105

169500 5,2 0,183

144370 5,1 0,304

65120 4,8 0,405

34960 4,5 0,605

14230 4,1 0,788

Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa Rf và log( khối lượng phân tử) của protein

Tiến hành xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính liên quan giữa giá trị Rf

và log (MW) của các protein trong thang chuẩn bằng phần mềm excel, ta được

phương trình sau:

Y = - 1,8612X + 5,5914

Trong đó: Y = log (MW) của protein

X = Rf: tỷ số giữa khoảng cách di chuyển của protein và khoảng cách

CD5

CD10

Thang chuẩn

CD1

di chuyển của phẩm màu brommophenol blue.

Kết quả chạy điện di SDS - PAGE

CD1 CD5 CD10

Rf Rf Rf Khoảng cách di chuyển (cm) Khoảng cách di chuyển (cm) Khoảng cách di chuyển (cm)

0,365 1,9 2,3 0,442 3,3 0,634

0,423 2,1 2,8 0,538

2,8 0,538 0,538 2,8

0,788 4,1

Theo kết quả điện di đồ, xác định trọng lượng phân tử trong mẫu ta được:

Giếng 1: CD1: Với Rf = 0.365 thì Y = log MW => MW = 10Y= 10-1.8612.(0.365)+5.5914 = 81669

Rf = 0.423 => Y = log MW => MW = 10Y= 10-1.8612.(0.423)+5.5914 = 63696 Da Rf = 0.538 => Y = log MW => MW = 10Y= 10-1.8612.(0.519)+5.5914 = 38911 Da Rf = 0.788 => Y = log MW => MW = 10Y= 10-1.8612.(0.788)+5.5914 = 13328 Da

Giếng 2: CD10: Với Rf = 0.634 => Y = log MW => MW = 10Y= 10-1.8612.(0.634)+5.5914 = 25786

Với Rf = 0.538 => Y = log MW => MW = 10Y= 10-1.8612.(0.538)+5.5914 = 38911

Giếng 3: CD5: Với Rf = 0.442 => Y = log MW => MW = 10Y= 10-1.8612.(0.634)+5.5914 = 58715

Với Rf = 0.538 => Y = log MW => MW = 10Y= 10-1.8612.(0.538)+5.5914 = 38911

Kết luận:

- Trong mẫu CD1 xuất hiện 4 loại protein có khối lượng phân tử khác nhau.

- Ở mẫu CD10 có xuất hiện 2 loại protein có khối lượng phân tử là 25786 Da

và 38911 Da.

- Ở mẫu CD5 có xuất hiện 2 loại protein có khối lượng phân tử 58715 Da và

Cả 3 mẫu đều có 1 loại protein có cùng khối lượng 38911 Da. Có thể bước đầu nghi ngờ

đây là khối lượng enzyme chitin deacetylase của 3 chủng vi sinh vật.

38911 Da.

PHỤ LỤC L: XỬ LÝ SỐ LIỆU THỐNG KÊ

 Nguồn Carbon CD1 ĐỘ HÒA TAN

‘DO HOA TAN CD1 CAC NGUON CARBON’ 1

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

CD1 3 GLU1 SUC1 TB1

Number of Observations Read 9

Number of Observations Used 9

‘DO HOA TAN CD1 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DOHOATAN

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 2 206.8888889 103.4444444 49.00 0.0002

Error 6 12.6666667 2.1111111

Corrected Total 8 219.5555556

R-Square Coeff Var Root MSE DOHOATAN Mean

0.942308 2.782276 1.452966 52.22222

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

CD1 2 206.8888889 103.4444444 49.00 0.0002

‘DO HOA TAN CD1 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DOHOATAN

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 6

Error Mean Square 2.111111

Critical Value of t 2.44691

Least Significant Difference 2.9029

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N CD1

A 57.667 3 TB1

B 53.000 3 GLU1

C 46.000 3 SUC1

‘DO HOA TAN CD1 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DOHOATAN

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 6

Error Mean Square 2.111111

Critical Value of t 3.70743

Least Significant Difference 4.3983

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N CD1

A 57.667 3 TB1

B 53.000 3 GLU1

C 46.000 3 SUC1

 ĐỘ HÒA TAN CD2 NGUỒN CARBON

‘DO HOA TAN CD5 CAC NGUON CARBON’ 5

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

CD5 3 GLU1 SUC1 TB1

Number of Observations Read 9

Number of Observations Used 9

‘DO HOA TAN CD5 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DOHOATAN

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 2 450.6666667 225.3333333 38.26 0.0004

Error 6 35.3333333 5.8888889

Corrected Total 8 486.0000000

R-Square Coeff Var Root MSE DOHOATAN Mean

0.927298 4.439091 2.426703 54.66667

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

CD5 2 450.6666667 225.3333333 38.26 0.0004

‘DO HOA TAN CD5 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DOHOATAN

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 6

Error Mean Square 5.888889

Critical Value of t 2.44691

Least Significant Difference 4.8483

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N CD5

A 63.333 3 TB1

B 54.667 3 GLU1

C 46.000 3 SUC1

 Độ hòa tan CD3 các nguồn carbon

‘DO HOA TAN CD10 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

CD10 3 GLU1 SUC1 TB1

Number of Observations Read 9

Number of Observations Used 9

‘DO HOA TAN CD10 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DOHOATAN

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 2 308.2222222 154.1111111 34.67 0.0005

Error 6 26.6666667 4.4444444

Corrected Total 8 334.8888889

R-Square Coeff Var Root MSE DOHOATAN Mean

0.920372 3.969386 2.108185 53.11111

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

CD10 2 308.2222222 154.1111111 34.67 0.0005

‘DO HOA TAN CD10 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DOHOATAN

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 6

Error Mean Square 4.444444

Critical Value of t 2.44691

Least Significant Difference 4.2119

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N CD10

A 60.333 3 TB1

B 53.000 3 GLU1

C 46.000 3 SUC1

‘DO HOA TAN CD10 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DOHOATAN

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 6

Error Mean Square 4.444444

Critical Value of t 3.70743

Least Significant Difference 6.3817

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N CD10

A 60.333 3 TB1

B 53.000 3 GLU1

C 46.000 3 SUC1

 Độ deacetyl các nguồn Carbon CD1

‘DO DEACETYL CD1 CAC NGUON CARBON’ 12

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

CD1 3 GLU1 SUC1 TB1

Number of Observations Read 9

Number of Observations Used 9

‘DO DEACETYL CD1 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DODEACETYL

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 2 184.2222222 92.1111111 55.27 0.0001

Error 6 10.0000000 1.6666667

Corrected Total 8 194.2222222

R-Square Coeff Var Root MSE DODEACETYL Mean

0.948513 2.721066 1.290994 47.44444

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

CD1 2 184.2222222 92.1111111 55.27 0.0001

‘DO DEACETYL CD1 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DODEACETYL

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 6

Error Mean Square 1.666667

Critical Value of t 2.44691

Least Significant Difference 2.5793

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N CD1

A 53.333 3 TB1

B 46.667 3 GLU1

C 42.333 3 SUC1

‘DO DEACETYL CD1 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DODEACETYL

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 6

Error Mean Square 1.666667

Critical Value of t 3.70743

Least Significant Difference 3.908

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N CD1

A 53.333 3 TB1

B 46.667 3 GLU1

C 42.333 3 SUC1

 Độ deacetyl các nguồn carbon CD5

‘DO DEACETYL CD5 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

CD5 3 GLU1 SUC1 TB1

Number of Observations Read 9

Number of Observations Used 9

‘DO DEACETYL CD5 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DODEACETYL

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 2 600.8888889 300.4444444 159.06 <.0001

Error 6 11.3333333 1.8888889

Corrected Total 8 612.2222222

R-Square Coeff Var Root MSE DODEACETYL Mean

0.981488 2.392518 1.374369 57.44444

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

CD5 2 600.8888889 300.4444444 159.06 <.0001

‘DO DEACETYL CD5 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DODEACETYL

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 6

Error Mean Square 1.888889

Critical Value of t 2.44691

Least Significant Difference 2.7458

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N CD5

A 67.667 3 TB1

B 57.000 3 GLU1

C 47.667 3 SUC1

 Độ deacetyl của các nguồn Carbon

‘DO DEACETYL CD5 CAC NGUON CARBON’ 19

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

CD10 3 GLU1 SUC1 TB1

Number of Observations Read 9

Number of Observations Used 9

‘DO DEACETYL CD5 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: DODEACETYL

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 2 504.2222222 252.1111111 162.07 <.0001

Error 6 9.3333333 1.5555556

Corrected Total 8 513.5555556

R-Square Coeff Var Root MSE DODEACETYL Mean

0.981826 2.319209 1.247219 53.77778

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

CD10 2 504.2222222 252.1111111 162.07 <.0001

‘DO DEACETYL CD5 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for DODEACETYL

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 6

Error Mean Square 1.555556

Critical Value of t 2.44691

Least Significant Difference 2.4918

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N CD10

A 63.000 3 TB1

B 53.667 3 GLU1

C 44.667 3 SUC1

‘DO DEACETYL CD5 CAC NGUON CARBON’

00:00 Wednesday, October 15, 2014

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme chitin deacetylase và khả năng ứng dụng

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm phân lập, sàng lọc vi sinh vật sinh enzyme chitin deacetylase, khảo sát khả năng chuyển hóa chitin thành chitosan bằng các chủng sàng lọc. Mời các bạn cùng tham khảo.

---------------------------

NGUYỄN TRẦN THIỆN ĐỨC

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH

TỔNG HỢP ENZYME CHITIN DEACETYLASE

VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 6042020

---------------------------

NGUYỄN TRẦN THIỆN ĐỨC

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH

TỔNG HỢP ENZYME CHITIN DEACETYLASE

VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 6042020

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CÁM ƠN

TÓM TẮT

ABSTRACT

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

DD

Ống 1

Ống 0 (blank)

Ống 2

Ống 3

Ống 4

Ống 5

Ống 6

Ống 7

Ống 8

Ống 9

Ống 10

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hình 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật chọn lọc. Cả 3 chủng đều có

CD10

CD5 CD1 Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột

CD10

312.5ppm

312.5ppm

625ppm

625ppm

1250ppm

1250ppm

78.125ppm

78.125ppm

156.25ppm

156.25ppm

312.5ppm

156.25ppm

312.5ppm

625ppm

1250ppm

1250ppm

78.125ppm

625ppm

78.125ppm

156.25ppm

312.5ppm

625ppm

1250ppm

78.125ppm

156.25ppm

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC A: CÁC TEST SINH HÓA ĐỊNH DANH SƠ BỘ VI KHUẨN

PHỤ LỤC B: QUY TRÌNH CHUẨN BỊ HUYỀN PHÙ CHITIN

PHỤ LỤC C: HÌNH ẢNH CÁC KẾT QUẢ TEST SINH HÓA