Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Phân tích cấu trúc, hàm lượng một số hợp chất phenolic glycoside từ cây Viễn chí (Polygala japonica Houtt.) bằng phương pháp hóa lí hiện đại

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THANH HẢI

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG

MỘT SỐ HỢP CHẤT PHENOLIC GLYCOSIDE TỪ

CÂY VIỄN CHÍ (POLYGALA JAPONICA HOUTT.)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THANH HẢI

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG

MỘT SỐ HỢP CHẤT PHENOLIC GLYCOSIDE TỪ

CÂY VIỄN CHÍ (POLYGALA JAPONICA HOUTT.)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. TRẦN HỒNG QUANG

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Hồng

Quang người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình

làm luận văn.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trường Đại học Khoa

Học - Đại học Thái Nguyên, các thầy cô Viện Hóa Sinh Biển đã truyền đạt

những kiến thức và giúp đỡ em trong suốt quá trình học của mình.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Sở Giáo dục và Đào tạo Hải Phòng,

Ban giám hiệu trường THPT Quang Trung Hải Phòng đã tạo điều kiện thuận

lợi cho tôi tham gia khóa học và trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp, gia đình và bạn

bè những người đã ủng hộ, động viên tạo mọi điều kiện giúp đỡ để tôi có

được kết quả như ngày hôm nay.

Thái Nguyên, tháng 06 năm 2017

Học viên

Nguyễn Thanh Hải

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... a

MỤC LỤC ......................................................................................................... b

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ e

DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................... f

DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ ...................................................................... g

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3

1.1. Đại cương về cây Viễn chí ......................................................................... 3

1.1.1. Khái quát thực vật học ............................................................................ 3

1.1.2. Mô tả đặc điểm ........................................................................................ 3

1.1.3. Phân bố và sinh thái ................................................................................ 4

1.1.4. Bộ phận dùng, tính vị, công năng và công dụng ..................................... 4

1.1.5. Một số bài thuốc có cây Viễn chí ............................................................ 5

1.1.6. Thành phần hóa học ................................................................................ 5

1.1.7. Tác dụng dược lý ................................................................................... 10

1.2. Tổng quan về lớp chất phenolic ............................................................... 11

1.2.1. Khái quát chung .................................................................................... 11

1.2.2. Phân loại các hợp chất phenolic ............................................................ 12

1.2.3. Sinh tổng hợp các hợp chất phenolic .................................................... 17

1.2.4. Tác dụng dược lý và lợi ích ................................................................... 18

1.3. Chiết xuất và phân tích các hợp chất phenolic ......................................... 20

1.3.1. Chiết xuất các hợp chất phenolic thực vật ............................................ 20

1.3.2. Định lượng các hợp chất phenolic trong thực vật ................................. 21

1.3.3. Phương pháp quang phổ ........................................................................ 21

1.3.4. Kỹ thuật sắc ký ...................................................................................... 23

Chương 2. THỰC NGHIỆM ........................................................................ 31

2.1. Mẫu thực vật ............................................................................................. 31

2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất ......................................................... 31

2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ........................................................................ 31

2.2.2. Sắc ký cột (CC) ..................................................................................... 31

2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất....................... 31

2.3.1. Phổ khối lượng phân giải cao (HRESITOFMS) ................................... 31

2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ..................................................... 31

2.4. Dụng cụ và hóa chất ................................................................................. 32

2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết ................................................................ 32

2.4.2. Thiết bị xác định cấu trúc ...................................................................... 32

2.4.3. Hóa chất................................................................................................. 32

2.5. Phân lập các hợp chất ............................................................................... 33

2.6. Phân tích định lượng ................................................................................ 34

2.6.1. Thiết bị và hóa chất ............................................................................... 34

2.6.2. Chuẩn bị mẫu ........................................................................................ 35

2.6.3. Điều kiện sắc ký .................................................................................... 35

2.7. Hằng số vật lí và dữ kiện phổ các hợp chất ............................................. 35

2.7.1. Hợp chất 1 ............................................................................................. 35

2.7.2. Hợp chất 2 ............................................................................................. 36

2.7.3. Hợp chất 3 ............................................................................................. 36

2.7.4. Hợp chất 4 ............................................................................................. 36

2.7.5. Hợp chất 5 ............................................................................................. 36

Chương 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN .......................................................... 37

3.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất ................................................... 37

3.1.1. Xác định cấu trúc hợp chất 1 ................................................................. 37

3.1.2. Xác định cấu trúc hợp chất 2 ................................................................. 43

3.1.3. Xác định cấu trúc hợp chất 3 ................................................................. 48

3.1.4. Xác định cấu trúc hợp chất 4 ................................................................. 54

3.1.5. Xác định cấu trúc hợp chất 5 ................................................................. 59

3.2. Phân tích định lượng ................................................................................ 64

3.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích ......................................................... 64

3.2.2. Phân tích định lượng hợp chất 1 ........................................................... 65

3.2.3. Phân tích định lượng hợp chất 3 ........................................................... 67

3.2.4. Kết quả phân tích định lượng ................................................................ 69

KẾT LUẬN .................................................................................................... 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 71

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13

13C NMR

Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

1H NMR

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều 2D-NMR

Two-Dimensional NMR Spectroscopy

Sắc ký cột CC

Column Chromatography

Bộ phát hiện mảng điot DAD

Diode array detector

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DEPT

Ethylacetate EtOAc

Sắc ký khí GC

Gas Chromatography

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HMBC

Heteronuclear Single Quantum Coherence HSQC

Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử thời HRESITOFMS

gian bay

High Resolution Electronspray Ionization Time-Of-

Flight Mass Spectroscopy

Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

High-performance liquid chromatography

Methanol MeOH

Photodiode Array PDA

Sắc ký lớp mỏng TLC

Thin layer chromatography

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Các nhóm chính của hợp chất phenolic ...................................... 13

Bảng 1.2. Một số kỹ thuật HPLC xác định các hợp chất phenolic trong

thực phẩm ................................................................................... 25

Bảng 1.3. Một số kỹ thuật HPLC xác định các lớp chất phenolic trong

thực phẩm ................................................................................... 27

Bảng 2.1. Chương trình phân tích ............................................................... 35

Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của chất 1 và chất tham khảo ........................ 42

Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của chất 2 và chất tham khảo ........................ 47

Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất 3 và chất tham khảo ................. 53

Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của chất 4 và chất tham khảo ........................ 58

Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của chất 5 và chất tham khảo ........................ 62

Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ HPLC của hợp chất 1 ............................. 65

Bảng 3.7. Kết quả phân tích phương sai cho hợp chất 1 ............................ 65

Bảng 3.8. Kết quả phân tích HPLC của hợp chất 3 .................................... 68

Bảng 3.9. Kết quả phân tích phương sai cho hợp chất 3 ............................ 68

Bảng 3.10. Kết quả phân tích định lượng hợp chất 1 và 3 ........................... 69

DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ chiết phân lớp rễ cây Viễn chí ......................................... 33

Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết BuOH ....................... 33

Hình 1.1. Cây và rễ cây Viễn chí (Polygala japonica Houtt) ....................... 3

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của axit phenolic thông thường và các chất

tương tự từ dược liệu và thực vật ............................................... 16

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp của các hợp chất phenolic ................ 17

Hình 3.1. Phổ khối lượng phân giải cao của hợp chất 1 ............................ 37

Hình 3.2. Phổ 1H–NMR của hợp chất 1 ..................................................... 38

Hình 3.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất 1 ..................................................... 39

Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 ................................................ 40

Hình 3.5. Phổ HSQC của hợp chất 1 .......................................................... 40

Hình 3.6. Phổ HMBC của hợp chất 1 ........................................................ 41

Hình 3.7. Các tương tác HMBC chính của hợp chất 1 .............................. 41

Hình 3.8. Phổ khối lượng phân giải cao của hợp chất 2 ............................ 43

Hình 3.9. Phổ 1H–NMR của hợp chất 2 ..................................................... 44

Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2 ..................................................... 44

Hình 3.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 ................................................ 45

Hình 3.12. Phổ HSQC của hợp chất 2 .......................................................... 45

Hình 3.13. Phổ HMBC của hợp chất 2 ........................................................ 46

Hình 3.14. Các tương tác HMBC chính của hợp chất 2 .............................. 46

Hình 3.15. Phổ khối lượng phân giải cao của hợp chất 3 ............................ 48

Hình 3.16. Phổ 1H–NMR của hợp chất 3 ..................................................... 49

Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của hợp chất 3 ..................................................... 50

Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 ................................................ 51

Hình 3.19. Phổ HSQC của hợp chất 3 .......................................................... 52

Hình 3.20. Phổ HMBC của hợp chất 3 ........................................................ 52

Hình 3.21. Các tương tác HMBC chính của hợp chất 3 .............................. 53

Hình 3.22. Phổ 1H–NMR của hợp chất 4 ..................................................... 55

Hình 3.23. Phổ 13C-NMR của hợp chất 4 ..................................................... 55

Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 ................................................ 56

Hình 3.25. Phổ HSQC của hợp chất 4 .......................................................... 57

Hình 3.26. Phổ HMBC của hợp chất 4 ........................................................ 57

Hình 3.27. Các tương tác HMBC chính của hợp chất 4 .............................. 58

Hình 3.28. Phổ khối lượng phân giải cao của hợp chất 5 ............................ 59

Hình 3.29. Phổ 1H–NMR của hợp chất 5 ..................................................... 60

Hình 3.30. Phổ 13C-NMR của hợp chất 5 ..................................................... 61

Hình 3.31. Phổ DEPT135 của hợp chất 5 .................................................... 61

Hình 3.32. Cấu trúc hóa học của hợp chất 5 ................................................ 62

Hình 3.33. Kết quả khảo sát bước sóng hấp thụ hợp chất 1 ......................... 64

Hình 3.34. Sắc ký đồ hợp chất 1 nồng độ 1.0 mg/mL (A) và dịch chiết

MeOH của viễn chí nồng độ 30 mg/mL (C) .............................. 64

Hình 3.35. Đường chuẩn mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ .. 66

Hình 3.36. Kết quả khảo sát bước sóng hấp thụ hợp chất 3 ......................... 67

Hình 3.37. Sắc ký đồ hợp chất 3 nồng độ 1.0 mg/mL (A) và dịch chiết

MeOH của viễn chí nồng độ 30 mg/mL (C) .............................. 67

Hình 3.38. Đường chuẩn mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ .. 69

MỞ ĐẦU

Hiện nay, các dược phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng được

sử dụng phổ biến trong đời sống với nhiều ưu điểm như dễ hấp thu, ít gây

độc, ít gây tác dụng phụ, có giá trị kinh tế cao … Các hợp chất thiên nhiên thể

hiện hoạt tính sinh học rất phong phú và là một trong những định hướng để

con người có thể tổng hợp ra nhiều loại thuốc mới để chữa bệnh mà ít gây tác

dụng phụ cũng như không ảnh hưởng đến môi sinh.Vì vậy, việc nghiên cứu

nguồn dược liệu trong thiên nhiên để ứng dụng vào sản xuất thuốc phòng và

chữa bệnh đang là xu hướng hiện nay của y học Việt Nam và y học thế giới.

Việt Nam là quốc gia thuộc khu vực Đông Nam Á, nằm trong vùng khí

hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên sinh vật vô cùng

phong phú. Đặc biệt là nguồn tài nguyên thực vật ở nước ta, không chỉ đa

dạng về số lượng loài mà còn chứa đựng giá trị đa dạng sinh học cao chưa

được khám phá. Đây chính là nguồn dược liệu quý phục vụ việc sản xuất

thuốc chữa bệnh. Từ ngàn xưa, người dân đã biết sử dụng nhiều loại cây cối

phối hợp với nhau tạo thành các bài thuốc dân gian có tác dụng chữa nhiều

loại bệnh đồng thời ít để lại di chứng cũng như tác dụng phụ. Tuy nhiên, phần

lớn các cây thuốc và bài thuốc đó đều chỉ mới được sử dụng theo kinh nghiệm

dân gian mà chưa được nghiên cứu, đánh giá một cách khoa học, cũng như

thành phần hóa học, các chất có hoạt tính sinh học cao trong cây có thể sử

dụng để làm thuốc chưa được phân tích và tách chiết ra. Xuất phát từ các cơ

sở trên, việc nghiên cứu và khai thác các chất có hoạt tính sinh học cao từ các

nguồn dược liệu ở Việt Nam là rất cần thiết và đặc biệt có ý nghĩa to lớn về

mặt khoa học cũng như thực tiễn.

Trong y học cổ truyền, Viễn chí được dùng chữa ho, nhiều đờm, viêm

phế quản, hay quên, liệt dương, yếu sức, mộng tinh, bổ cho nam giới và người

già, thuốc làm sáng mắt, thính tai hơn do tác dụng trên thận. Còn chữa đau tức

ngực, lao, ngủ kém, suy nhược thần kinh, ác mộng… Các nghiên cứu về dược

học của cây Viễn chí trên thế giới cho thấy nhiều tác dụng đáng chú ý như

kháng viêm, bảo vệ tế bào thần kinh, tăng cường vận động… Các nghiên cứu

về thành phần hóa học trên thế giới cho thấy chi Viễn chí là nguồn cung cấp

dồi dào các hợp chất thứ cấp có nhiều hoạt tính sinh học, đặc biệt là lớp chất

phenolic. Tuy nhiên, ở nước ta việc nghiên cứu về thành phần hóa học, tác

dụng dược lý, cũng như xác định hàm lượng các thành phần chính trong cây

Viễn chí vẫn còn ít được biết đến. Vì vậy, em đã lựa chọn đề tài: “Phân tích

cấu trúc, hàm lượng một số hợp chất phenolic glycoside từ cây Viễn chí

(Polygala japonica Houtt.) bằng phương pháp hóa lí hiện đại” với mục đích

phân lập, xác định cấu trúc, và định lượng một số hợp chất phenolic glycoside,

qua đó tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc nghiên cứu phát triển

thuốc mới và giải thích tác dụng chữa bệnh của cây thuốc quý này.

Các bước thực hiện của đề tài:

1. Xử lí mẫu và tạo dịch chiết.

2. Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp

chất phenolic glycoside từ rễ cây Viễn chí.

3. Nghiên cứu định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1. Đại cương về cây Viễn chí

1.1.1. Khái quát thực vật học

Tên khoa học: Polygala japonica Houtt [1]

Tên thường gọi: Viễn chí

Tên khác: Viễn chí Nhật, Nam viễn chí, Tiểu Thảo, Kích nhũ nhật

Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida)

Bộ: Đậu (Fabales)

Họ: Viễn Chí (Polygalaceae)

Chi: Polygala

1.1.2. Mô tả đặc điểm

Hình 1.1. Cây và rễ cây Viễn chí (Polygala japonica Houtt) [2]

Cây Viễn chí (Polygala japonica Houtt), còn gọi là Viễn chí Nhật,

hay Tiểu thảo là dạng cây thảo, sống lâu năm, cao 10-20cm, phân cành từ

gốc (Hình 1.1). Cành mọc tỏa rộng, hơi có lông mịn. Lá mọc sole, rất đa

dạng: lá gốc hình elip, lá phía trên hình mác, dài 20mm, rộng 3-5mm, mép

thường cuộn xuống dưới, gân chạy men theo mép lá, gân phụ rõ; cuống dài

0,5mm [1].

Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùm mảnh, có 1 - 3 hoa

màu trắng, đầu nhuốm tím; lá bắc rất nhỏ, sớm rụng, đài 3 răng ngoài rất nhỏ,

2 răng trong rộng hơn, có lông mi; tràng 5 cánh, 2 cánh rời, 3 cánh bên hàn

liền thành cánh cờ, mào lông màu lam hoặc tím, nhị nhẵn; bầu thuôn nhẵn.

Quả nang, có cánh bên, hạt hình trứng, có lông, áo hạt 3 dải. Mùa hoa quả vào

tháng 11 đến tháng 12 [1].

1.1.3. Phân bố và sinh thái

- Phân bố: Chi Polygala có khoảng 500 loài, phân bố rải rác khắp các

vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới ấm trừ New Zealand. Tuy nhiên, vùng

Trung - Nam Mỹ, Bắc Mỹ và Nam Phi là những trung tâm đa dạng của chi

này trên thế giới. Ở Việt Nam, hiện có khoảng 20 loài, trong đó 11 loài được

dùng làm thuốc. Loài viễn chí phân bố chủ yếu ở Trung Quốc (có cả ở Đài

Loan) và Nhật Bản. Ở nước ta, Viễn chí phân bố ở các vùng núi thấp, thuộc

các tỉnh từ Thái Nguyên đến Thanh Hóa.

- Sinh thái: Viễn chí thuộc loại cây thảo ưa sáng, thường mọc trên đất

ẩm, lẫn trong đám cỏ thấp ở ven rừng, nương rẫy hay ruộng cao ở vùng núi.

Vốn là loại cây ở vùng cận nhiệt đới, ưa khí hậu ẩm mát, nên cây mọc ở các

tỉnh phía bắc cũng chỉ thấy xuất hiện vào mùa xuân - hè. Cuối mùa hè, sau

khi đã có quả già, cây bị tàn lụi. Viễn chí tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt và

có thể gieo trồng được [1].

1.1.4. Bộ phận dùng, tính vị, công năng và công dụng

- Bộ phận dùng: Thường dùng rễ cây. Rễ cây được đào lên, loại bỏ tạp

chất, rửa nhanh, ủ cho mềm, cắt thành đoạn, phơi hay sấy khô.

- Tính vị, công năng: Viễn chí có vị hắc, đắng, the, tính hơi ấm, vào 2

kinh tâm và thận, có tác dụng an thần, ích trí, khu đàm, chỉ khái, ích tinh hoạt

huyết, tán ứ, tiêu thũng, giải độc.

- Công dụng: Viễn chí được dùng chữa ho, nhiều đờm, viêm phế quản,

hay quên, giảm trí nhớ, liệt dương, yếu sức, mộng tinh, bổ cho nam giới và

người già, thuốc làm sáng mắt, thính tai do tác dụng trên thận. Còn chữa đau

tức ngực, lao, ngủ kém, suy nhược thần kinh, ác mộng. Ngày 6 - 12g dạng

thuốc sắc hoặc 2 - 5g cao lỏng, bột thuốc hoặc cồn thuốc.

- Ghi chú: Theo sách “Tân biên Trung y”

- Rễ viễn chí phải bỏ lõi trước khi dùng.

- Không dùng liều cao.

- Người có thái, người bị bệnh dạ dày, người thực hỏa không được dùng.

- Dùng ngoài, viễn chí phơi khô, tán bột, tẩm nước, đắp chữa đòn ngã

tổn thương, mụn nhọt, lở loét, sưng và đau vú, rắn độc cắn [1].

1.1.5. Một số bài thuốc có cây Viễn chí

- Chữa ho có đờm:

Viễn chí 8g, cát cánh 6g, cam thảo 6g, sắc chia làm 3 lần uống trong

ngày. Trường hợp người già ho đờm lâu năm, đờm kết gây tức ngực, khó thở,

dùng viễn chí 8g, mạch môn 12g, sắc uống dần từng ngụm, ngày một thang.

- Chữa thần kinh suy nhược, hay quên, đần độn, kinh sợ, hoảng hốt,

kém ăn, ít ngủ:

Viễn chí, đảng sâm, bạch truật, liên nhục, long nhãn, táo nhân (sao đen),

mạch môn, mỗi vị 10g, sắc uống. Hoặc viễn chí, tâm sen, hạt muồng (sao), mạch

môn, nhân hạt táo (sao đen), huyền sâm, dành dành, mỗi vị 12g, sắc uống.

- Chữa trẻ sốt cao sinh co giật:

Viễn chí, sinh địa, câu đằng, thiên trúc hoàng (bột phấn đọng ở trong

đốt cây nứa), mỗi vị 8 - 10g, sắc uống [1].

1.1.6. Thành phần hóa học

Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của

Polygala japonica Houtt đã được các nhà khoa học bắt đầu từ những năm

1947. Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy P. japonica có thành phần hóa

học khá đa dạng, trong đó thành phần chính là các flavonoid, xanthone,

phenolic glycoside, saponin.

1.1.6.1. Các hợp chất flavonoid

Năm 2009, Kim S.H. và cộng sự đã phân lập được bốn flavonoids là

kaempferol (1), chrysoeriol (2), isorhamnetin (3), và kaempferol 3-gentiobioside

(4) từ dịch chiết MeOH của lá P. japonica Houtt theo phương pháp tách chiết

sử dụng phép thử sinh học dẫn đường. Trong số đó, hợp chất 1 và 2 cho thấy

hiệu quả ức chế đáng kể đối với sự sản sinh lipopolysaccharide nitric oxide ở tế

bào BV2 ở nồng độ dao động từ 1.0 đến 100.0 µM [3]. Từ lá của P. japonica,

một số hợp chất flavonoids, bao gồm astragalin (5), kaempferol 3-O-(6''-O-

acetyl)--D-glucopyranoside (6) and kaempferol 3,7-di-O--D-glucopyranoside

(7) được phân lập bởi Do, J.C và cộng sự vào năm 1992 [4]. Năm 2006, Li và

cộng sự đã phân lập được các hợp chất kaempferol-7,4-dimethyl ether (8),

rhamnetin (9), polygalin A (10), 3,5,7-trihydroxy-4-methoxy-flavone-3-O--

D-galactopyranoside (11), 3,5,3-trihydoxy-7,4-dimethoxy-flavone-3-O--D-

galactopyranoside (12), 3,5,3,4-tetrahydroxy-7-methoxy-flavone-3-O--D-

galactopyranoside (13), 3,5,3,4-tetrahydroxy-7-methoxy-flavone-3-O--D-

glucopyranoside (14), polygalin B (15), và polygalin C (16) [5].

1.1.6.2. Các hợp chất xanthone và anthraquinone

Nghiên cứu thực hiện bởi Xue và cộng sự năm 2006 đã phân lập được 3

hợp chất xanthone mới là 1,3-dihydroxy-2,5,6,7-tetramethoxyxanthone (17),

3-hydroxy-1,2,5,6,7-pentamethoxyxanthone(18), và 3,8-dihydroxy-1,2,6-

trimethoxyxanthone (19) từ rễ cây P. japonica [6]. Cũng từ rễ cây này, Fu và

công sự (2006) đã phân lập và xác định được 3 hợp chất xanthone mới là 3,6-

dihydroxy-1,2,7-trimethoxyxanthone (20), 3,7-dihydroxy-1,2-dimethoxy

xanthone (21) và 1,2,7-trihydroxy-3-methoxyxanthone (22). Cùng thời điểm

đó, nhóm nghiên cứu của Li và cộng sự đã phân lập được 2 hợp chất xanthone

physcion (23), guazijinxanthone (24) từ rễ cây này, trong đó hợp chất

guazijinxanthone gây độc tế bào đối với tất cả 5 dòng tế bào ung thư người,

K562, A549, PC-3M, HCT-8 và SHG-44 [5].

Theo nghiên cứu của Kim và cộng sự (2009), 5 hợp chất anthraquinone

bao gồm chrysophanol (25), emodin (26), aloeemodin (27), emodin 8-O--D-

glucopyranoside (28) and trihydroxy anthraquinone (29) đã được phân lập từ

dịch chiết lá cây P. japonica, trong đó các hợp chất 25-28 ức chế đáng kể sự

sản sinh NO ở tế bào BV2 kích thích bởi lipopolysaccharide [3].

1.1.6.3. Các hợp chất phenolic glycoside

Nghiên cứu thực hiện bởi Fu và cộng sự (2008) đã phân lập được một

hợp chất oligosaccharide polyester tên là polygalajaponicose I (30) từ rễ của

P. japonica [7]. Một số hợp chất phenolic glycoside như arillatose A (31),

sibiricose A5 (32), và sibiricose A6 (33) cũng đã được phân lập từ rễ P.

japonica bởi nhóm nghiên cứu của Zhang và cộng sự năm 2005 [8].

1.1.6.4. Các hợp chất saponin

Nghiên cứu thực hiện bởi Li và cộng sự (2006) đã phân lập được 5 hợp

chất saponin mới là polygalasaponins E-J (34-38), trong đó 2 hợp chất saponin

polygalasaponin E và H thể hiện hoạt tính tăng cường vận động trên mô hình

chuột thực nghiệm [9]. Fu và cộng sự (2008) đã phân lập được 5 hợp chất

triterpenoid saponin mới là polygalasaponins XLVII-L (39-42) từ rễ của P.

japonica [7]. Dịch chiết BuOH và EtOAc từ dịch chiết methanol của P. japonica

thể hiện hoạt tính kháng viêm in vivo, và từ các dịch chiết này, Wang và cộng sự

(2006) đã phân lập được 3 hợp chất saponin 3-O--D-glucopyranoside

bayogenin 28-O--D-xylopyranosyl(1→4)--L-rhamnopy ranosyl (1→2)--D-

glucopyranosyl ester (43), polygalasaponin V (44), và bayogenin-3-O--D-

glucopyranoside (45) thể hiện hoạt tính kháng viêm ở mô hình chuột thực

nghiệm [10, 11]. Hợp chất polygalasaponin G (46) phân lập từ P. japonica thể

hiện hoạt tính kích thích sinh trưởng các tế bào thần kinh [12]. Ba hợp chất

saponin mới polygalasaponins LI-LIII (47-49) và 3 saponin đã biết được phân

lập bởi Li và cộng sự (2012), trong đó có hai hợp chất polygalasaponin II (50) và

F (51) thể hiện hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh ở mô hình Aβ25–35 [13].

1.1.7. Tác dụng dược lý

- Tác dụng giảm ho: Trên mô hình thực nghiệm gây ho cho chuột nhắt

trắng bằng cách phun xông ammoniac, liều 0,75g/kg viễn chí cho uống dưới

dạng cao, có tác dụng giảm ho rõ rệt.

- Tác dụng lợi đờm: Thí nghiệm trên thỏ, viễn chí có tác dụng làm tăng

dịch tiết khí phế quản.

- Tác dụng giảm đau: Trên mô hình gây đau biểu hiện bằng các phản

ứng vặn xoắn mình khi tiêm trong màng bụng dung dịch acid acetic, viễn chí

liều uống 0,8g/kg có tác dụng giảm đau rõ rệt ở chuột nhắt trắng.

- Tác dụng trên thời gian ngủ: Viễn chí có tác dụng hiệp đồng, làm kéo

dài thời gian ngủ do thuốc ngủ barbituric ở chuột nhắt trắng.

- Tác dụng trên thần kinh trung ương: Viễn chí có tác dụng ức chế có

mức độ hệ thần kinh trung ương, nhưng không thấy có tác dụng đối kháng với

liều gây co ẹiật do cafein gây nên ở chuột nhắt trắng.

- Tác dụng trên tử cung: Thử tác dụng của cao lỏng viễn chí trên tử

cung thỏ, mèo và chuột cống trắng in vitro và in situ, thấy thuốc có tác dụng

kích thích co bóp cơ tử cung ở cả con vật có thai và không có thai.

- Tác dụng kháng khuẩn: Cao mềm viễn chí có tác dụng kháng khuẩn,

ức chế sự phát triển của các vi khuẩn Staphylococcus aureus, Bacillus

subtilis, Streptococcus hemolyticus, Diplococcus pneumoniae.

- Tác dụng tán huyết: Dịch chiết 5% của rê và bộ phận trên mặt đất của

cây ra hoa có tác dụng tán huyết.

Ngoài ra theo các nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc, P.

japonica được sử dụng kết hợp với các dược liệu khác để phòng và điều trị các

bệnh về gan, xương, đái tháo đường, tăng cường trí nhớ, điều trị ho, tiêu đờm,

cảm lạnh do nhiễm virus v.v… Các kết quả nghiên cứu đã công bố trên thế giới

cho thấy P. japonica không những có giá trị trong các bài thuốc y học cổ truyền

dân gian, mà còn thể hiện nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý như kháng viêm,

bảo vệ tế bào thần kinh, tăng cường vận động v.v…[1, 3, 10, 11, 13]

1.2. Tổng quan về lớp chất phenolic

1.2.1. Khái quát chung

Các hợp chất phenolic là các hợp chất có một hoặc nhiều vòng thơm

với một hoặc nhiều nhóm hydroxyl. Các hợp chất phenolic được xem như là

chất chuyển hóa thứ cấp được tổng hợp ở thực vật trong quá trình phát triển

bình thường và nhằm đáp ứng lại các điều kiện sống khắc nghiệt như nhiễm

khuẩn, bị thương, bức xạ tia cực tím… [14, 15]. Các hợp chất này phổ biến ở

thực vật và là một nhóm hợp chất thực vật rất đa dạng có nguồn gốc từ

phenylalanine và tyrosine (Hình 1.3) [16, 17]. Các hợp chất phenolic thực vật

bao gồm phenol đơn giản, axit phenolic (cả benzoic và các dẫn xuất axit

cinnamic), coumarin, flavonoid, stilbenes, tannin có thể thủy phân và ngưng

tụ, lignans, và lignin. Trong thực vật, phenolics có thể đóng vai trò như

phytoalexin, antifeedants, chất hấp dẫn cho thụ phấn, đóng góp vào các sắc tố

thực vật, chất chống oxy hóa, và các tác nhân bảo vệ chống lại tia UV… [17].

Trong thực phẩm, phenolics có thể đóng góp vào vị đắng, chát, màu sắc,

hương vị, mùi, và sự ổn định oxy hóa của sản phẩm. Phenolics phân bố không

đồng đều trong trong thực vật ở các mô, tế bào, và dưới tế bào. Các phenolics

không hòa tan là các thành phần của thành tế bào, trong khi phenolics hòa tan

được chia ngăn trong không bào tế bào thực vật [14, 15, 18, 19]. Ở cấp độ tế

bào, các lớp bên ngoài của cây chứa hàm lượng phenolic cao hơn các phần

bên trong [18, 20]. Phenolic vách tế bào, chẳng hạn như lignin (polyme của

các đơn vị monolignol) và axit hydroxycinnamic được liên kết với nhiều

thành phần tế bào [21, 22]. Những hợp chất này đóng góp vào sự bền cơ học

của thành tế bào, đóng vai trò điều tiết tăng trưởng thực vật và hình thái và

trong phản ứng tế bào với điều kiện stress và các mầm bệnh [21-24]. Ferulic

và axit p-coumaric, là các axit phenolic chính, có thể được este hóa thành

pectin và arabinoxylan hoặc liên kết chéo với polysaccharide vách tế bào dưới

dạng các chất dimer như dehydroferulates và acid truxillic [21-29]. Những

liên kết chéo này đóng vai trò quan trọng trong việc kết dính các tế bào [28],

đóng vai trò như một nơi hình thành của lignin và góp phần vào sự ổn định

nhiệt của cấu tạo của thức ăn thực vật [29].

Các hợp chất phenolic thực vật có tác dụng chống lại bức xạ tia cực

tím hoặc ngăn chặn các tác nhân gây bệnh, ký sinh trùng và động vật ăn thịt,

cũng như làm tăng các màu sắc của thực vật. Chúng có ở khắp các bộ phận

của cây. Vì vậy, chúng cũng là một phần không thể thiếu trong chế độ ăn

uống của con người. Các hợp chất phenolic là thành phần phổ biến của thức

ăn thực vật (trái cây, rau, ngũ cốc, ô liu, các loại đậu, sô cô la…) và đồ uống

(trà, cà phê, bia, rượu…), và góp phần tạo nên các đặc tính cảm quan chung

của thức ăn thực vật. Ví dụ, các hợp chất phenolic làm tăng vị cay đắng và

chát của trái cây và nước trái cây, bởi vì sự tương tác giữa các hợp chất

phenolic, chủ yếu là các procyanidin và glycoprotein trong nước bọt. Các

anthocyanin, một trong sáu phân nhóm của một nhóm polyphenol thực vật

lớn được gọi là các flavonoid, tạo màu da cam, đỏ, xanh và màu tím của

nhiều loại trái cây và rau quả như táo, quả, củ cải và hành tây. Các hợp chất

phenolic được biết đến như là những hợp chất quan trọng nhất ảnh hưởng

đến hương vị và sự khác biệt màu sắc giữa các loại rượu vang trắng, hồng

và đỏ, các hợp chất này phản ứng với oxy và có ảnh hưởng đến việc bảo

quản, lên men và cất giữ rượu vang [30].

1.2.2. Phân loại các hợp chất phenolic

1.2.2.1. Phân loại các hợp chất phenolic

Cấu trúc của các hợp chất phenolic rất phong phú và đa dạng. Có thể

chia thành 10 nhóm chính. Bảng 1.1 cho thấy các nhóm chính của các hợp

chất phenolic, hầu hết trong số đó được tìm thấy trong tự nhiên kết hợp với

một hoặc nhiều nhóm saccharides (Glycosides) hoặc các dẫn xuất như este

hoặc methyl este cùng với các nguồn chính của các hợp chất phenolic đó

được tìm thấy [30-33].

Bảng 1.1. Các nhóm chính của hợp chất phenolic

Khung

Nguồn gốc

Nhóm

Cấu trúc cơ bản

cơ bản

thực vật

Phổ biến

Phenol đơn giản

trong thực

vật

Benzoquinone

Cranberry,

Axit benzoic

C6-C1

ngũ cốc

Acetophenon

Táo, mơ,

C6-C2

chuối, súp lơ

Axit

phenylaxetic

Cà rốt, cam,

C6-C3

quýt, cà

Axit cinnamic

chua, rau

bina, đào,

Phenylpropene

ngũ cốc, lê,

cà tím

Cà rốt, cần

tây, cam,

Coumarin

chanh, rau

mùi tây

Chromone

Các loại hạt

C6-C3

Naphthoquinone

Các loại hạt

C6-C4

Xoài, măng

Xanthone

C6-C1-C6

cụt

Stilbene

Nho

C6-C2-C6

Anthraquinone

Nho

Phổ biến ở

Flavonoid

C6-C3-C6

thực vật

Mè, lúa

Lignan

mạch đen,

(C6-C3)2

Neolignan

lúa mì, lanh

Polyme không đồng nhất được

Lựu, quả

Tanin thủy phân

tạo thành từ các axit phenolic và

(C6-C1)n

mâm xôi

đường đơn

Lignin

(C6-C3)n

Các polyme thơm liên kết

Gỗ và vỏ cây

Polyphenol

(C6-C3-C6)n

1.2.2.2. Giới thiệu các axit phenolic

Các axit phenolic chia thành hai nhóm: nhóm các dẫn xuất của axit benzoic

chẳng hạn như axit gallic và nhóm các dẫn xuất của axit cinnamic như axit

coumaric, axit caffeic và axit ferulic. Axit caffeic là một axit phenolic phổ biến

nhất, chứa trong nhiều loại trái cây và rau quả, thường được este hóa với axit quinic

trong axit chlorogenic, là một hợp chất phenolic chủ yếu trong cà phê. Một

axit phenolic phổ biến khác là axit ferulic, đó là chất có trong ngũ cốc và được este

hóa tạo thành các hemicelluose có trong thành tế bào [30]. Các axit phenolic là một

nhóm các hợp chất phenolic chủ yếu, xảy ra rộng rãi trong thế giới thực vật [34].

Như hình 1.2, axit phenolic chủ yếu bao gồm các axit hydroxybenzoic (ví dụ, axit

gallic, axit p-hydroxybenzoic, axit protocatechuic, axit vanillic, axit xi-rringic) và

các axit hydroxycinnamic (ví dụ: acid ferulic, axit caffeic, axit p-coumaric, axit

chlorogenic và Axit sinapic) [35]. Các axit phenolic tự nhiên, hoặc xảy ra ở dạng tự

do hoặc liên hợp, thường xuất hiện dưới dạng este hoặc amit. Do sự tương đồng về

cấu trúc của chúng, một số polyphenol khác được xem như các chất tương tự axit

phenolic như capsaicin, rosmarinic acid, gingerol, gossypol, paradol, tyrosol,

hydroxytyrosol, acid ellagic, cynarin và axit salvianolic B (Hình 1.2) [36].

Axit Gallic được phân phối rộng rãi trong các loại thảo mộc dược như

Barringtonia racemosa, Cornus officinalis, Cassia auriculata, Polygonum aviculare,

Punica granatum, Rheum officinale, Rhus chinensis, Sanguisorba officinalis, và

Terminalia chebula cũng như các loại gia vị, ví dụ như cây húng tây và đinh hương

[35-39]. Các axit hydroxybenzoic khác cũng phổ biến trong dược liệu và các loại

thực phẩm (gia vị, trái cây, rau quả). Ví dụ, Dolichos biflorus, Feronia elephantum,

và Paeonia lactiflora chứa axit hydroxybenzoic; Cinnamomum cassia, Lawsonia

inermis, cây thì là, nho và hoa hồi có axit protocatechuic; Foeniculum vulgare,

Ipomoea turpethum, và Picrophylli scrophulariiflora có axit vanillic; Ceratostigma

willmottianum và rơm mía có chứa acid syringic [35-41].

Axit chlorogenic là ester của axit caffeic và là chất nền cho quá trình oxy

hóa enzym dẫn đến màu nâu, đặc biệt là táo và khoai tây. Chúng tôi cũng phát

hiện ra axit chlorogenic là một axit phenolic chính từ cây thuốc, đặc biệt là ở các

loài Apocynaceae và Asclepiadaceae [42]. Salvianolic axit B là một axit

polyphenolic tan trong nước chủ yếu được chiết xuất từ Radix Salviae

miltiorrhizae, một loại thảo dược được sử dụng làm chất chống oxy hoá hàng

ngàn năm nay ở Trung Quốc. Có 9 nhóm phenol hydroxyl kích hoạt có thể chịu

trách nhiệm cho việc giải phóng hydro hoạt động để ngăn chặn phản ứng

peroxidation lipid [43]. Axit rosmarinic là một hợp chất phenolic chống oxy

hóa, được tìm thấy trong nhiều loại gia vị thức ăn như bạc hà, húng quế,

oregano, hương thảo [37]. Gossypol là một aldehyde polyphenolic, có nguồn

gốc từ hạt giống cây bông (chi Gossypium, họ Malvaceae) có hoạt tính ngừa

thai và có thể gây hạ kali máu ở một số đàn ông [44]. Gingerol là hợp chất

phenolic, chịu trách nhiệm cho vị cay gừng [45].

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của axit phenolic thông thường và các chất tương tự từ dược liệu và thực vật

Axit ferulic, caffeic, và p-coumaric có mặt trong nhiều các loại dược

liệu và các loại gia vị, trái cây, rau quả và ngũ cốc [35]. Cám mì là một nguồn

axit ferulic tốt. Các axit ferulic tự do, hòa tan trong ngũ cốc có trong tỷ lệ 0,1:

1: 100 [46]. Trái cây đỏ (blueberry, blackberry, chokeberry, dâu tây, quả mâm

xôi đỏ, anh đào ngọt, anh đào chua, elderberry, nho đen và đỏ chua) giàu axit

hydroxycinnamic (axit caffeic, ferulic, p-coumaric) và và p-hydroxybenzoic,

axit ellagic, góp phần vào hoạt động chống oxy hoá của chúng [47].

1.2.3. Sinh tổng hợp các hợp chất phenolic

Quá trình sinh tổng hợp của các hợp chất phenolic bắt đầu với sự có mặt

của glucose theo con đường pentose phosphate (PPP) và sự chuyển hóa không

thuận nghịch từ glucose-6-phosphate thành ribulose-5-phosphate (Hình 1.3).

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp của các hợp chất phenolic [75]

Bước này được thực hiện bởi enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase

(G6PDH). Mặt khác, sự chuyển hóa của ribulose-5-phosphate giúp khử đương

lượng của nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) đối với các

phản ứng đồng hóa nội bào. Các erythrose-4-phosphate và phosphoenol-

pyruvate sản sinh bởi PPP trong quá trình glycolysis sẽ tham gia vào con

đường phenylpropanoid để tạo ra các hợp chất phenolic sau khi được dẫn đến

con đường axit shikimic (Hình 1.3) [48].

1.2.4. Tác dụng dược lý và lợi ích

Do sự phân bố rộng, các hợp chất phenolic có vai trò quan trọng đối

với sức khỏe của con người, do đó chế độ ăn uống đầy đủ dinh dưỡng ngày

càng được chú ý. Các nhà nghiên cứu đã tập trung vào các phenolic có đặc

tính chống oxy hóa mạnh trong chế độ ăn uống, các hoạt tính sinh học của

chúng trong việc phòng ngừa những chứng bệnh căng thẳng oxy hóa

liên quan. Theo các nghiên cứu dịch tễ học, hấp thụ các hợp chất phenolic

sẽ giảm được nguy cơ mắc các bệnh tim mạch ngăn ngừa được bệnh ung thư.

Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy các hợp chất phenolic được xem

như các hợp chất chống oxy hóa mạnh (ví dụ như quercetin, rutin,

anthocyanin …), có tác dụng trong điều trị các bệnh liên quan đến hiện tượng

stress oxy hóa như bệnh tim mạch, ung thư, hay loãng xương…[49, 50]. Tác

dụng chống oxi hóa của các hợp chất phenolic có thể theo các cơ chế: quét

các gốc tự do ROS/RNS; ức chế hình thành ROS/RNS bằng cách ức chế các

enzyme hoặc các ion kim loại liên quan đến sản sinh gốc tự do; và kích thích

hoặc bảo vệ hệ thống chống oxy hóa của cơ thể [51]. Các hợp chất phenolic

còn thể hiện tác dụng đối với các chức năng sinh học liên quan đến ung thư.

Nhiều dịch chiết tổng phenolic hoặc các hợp chất phenolic từ các thực phẩm

thực vật khác nhau đã được nghiên cứu trên các mô hình tế bào ung thư. Ví

dụ như các dịch chiết từ quả dâu tằm, dâu tây, mâm xôi, việt quất và một số

hợp chất polyphenol như anthocyanins, kaempferol, quercetin, coumaric acid

este, và ellagic axit thể hiện hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư in

vitro. Một số hợp chất polyphenol ức chế sinh trưởng khác như flavone

(apigenin, baicalein, luteolin and rutin), flavanones (hesperidin và naringin)

và lignans từ cây vừng (sesaminol, sesamin, and episesamin) cũng thể hiện

hoạt tính kháng tế bào ung thư [30]. Ngoài các mô hình thử nghiệm in vitro,

nhiều mô hình in vivo đã được thực hiện để đánh giá khả năng chống khối u

thực nghiệm của các dịch chiết phenolic của các thực phẩm thực vật hoặc các

hợp chất. Theo nghiên cứu của Lala và cộng sự (2006), dịch chiết giàu

anthocyanin từ quả việt quất, anh đào, và nho ở thể hiện hoạt tính chống khối

u ở chuột Fischer 344 mang ung thư ruột kết sau 14 tuần điều trị [52]. Khả

năng ức chế khối u của trà và các hợp chất polyphenol từ trà như

epigallocatechin-gallate (EGCG) và theaflavin cũng đã được chứng minh ở

các mô hình động vật thực nghiệm [53, 54].

Các hợp chất phenolic từ thực vật có thể ức chế hấp thụ amylase trong

điều trị các bệnh hấp thụ carbohydrate, như bệnh tiểu đường [55]. Các hợp chất

phenolic như flavonoid và các axit phenolic từ thực vật như quả nho, dâu, và cà

chuacó tác dụng tốt với sức khỏe do tác dụng giảm nguy cơ gây ra các bệnh

trao đổi chất và những rối loạn gây ra bệnh tiểu đường typ 2 [48]. Các hợp chất

polyphenols, đặc biệt là flavonoid, phenolic axit và tannin có tính năng quan

trọng là ức chế enzyme -glucosidase và -amylase, những enzyme đóng vai

trò quan trọng trong phân giải carbohydrate thành glucose. Các polyphenol và

sản phẩm giàu polyphenol từ thực vật có khả năng điều hòa quá trình trao đổi

lipid và carbohydrate, giảm đường huyết, mỡ máu và kháng insulin, cải thiện

chức năng tế bào , kích thích tiết insulin, thúc đẩy quá trình trao đổi mô mỡ và

giảm quá trình stress oxy hóa và viêm. Các phenolic từ đồ uống, rau củ, quả

mọng có thể ngăn chặn sự phát triển các biến chứng của bệnh tiểu đường như

bệnh tim mạch, bệnh thần kinh, bệnh thận [48]. Một số thực phẩm giàu

polyphenol như nho, hạt nho, nước ép lựu, cây nam việt quất có tác dụng làm

giảm các tác nhân gây bệnh tim mạch ở bệnh nhân tiểu đường typ 2. Các hợp

chất phenolic từ quả mọng như dâu có tác dụng ngăn ngừa các bệnh thoái hóa

thần kinh và giảm stress oxy hóa [56, 57]. Từ những nghiên cứu này, có thể

thấy phenolic là lớp chất có quy mô lớn và có vai trò quan trọng trong thiên

nhiên. Là lớp chất phân bố rộng rãi trong thực vật, các thực phẩm thực vật, các

loại đồ uống, và thể hiện nhiều tác dụng dược lý nổi bật. Khi các thực phẩm

thực vật được sử dụng, các hợp chất này được đưa vào cơ thể và đóng góp

nhiều tác dụng bổ ích với sức khỏe con người.

1.3. Chiết xuất và phân tích các hợp chất phenolic

1.3.1. Chiết xuất các hợp chất phenolic thực vật

Chiết xuất các hợp chất phenolic trong nguyên liệu thực vật bị ảnh

hưởng bởi tính chất hóa học của chúng, phương pháp sử dụng, kích thước

mẫu hạt, thời gian lưu trữ và điều kiện, cũng như sự hiện diện của các chất

gây nhiễu. Tính chất hóa học của phenolic thay đổi từ đơn giản đến chất cao

phân tử bao gồm tỷ lệ khác nhau của các axit phenolic, phenylpropanoids,

anthocyanins và tannin. Chúng cũng có thể tồn tại như phức hợp với

carbohydrate, protein và các thành phần thực vật khác; một số phenolics cao

phân tử và phức của chúng có thể khá khó hòa tan. Do đó, các phenolic chiết

xuất từ nguyên liệu thực vật luôn là một hỗn hợp các lớp phenolic khác nhau

hòa tan trong dung môi sử dụng. Sau đó, việc loại bỏ các phenolic không

mong muốn và các chất phi phenolic như sáp, chất béo, tecpen và

chlorophyll có thể sẽ cần thiết [58].

Độ hòa tan của các hợp chất phenolic được chi phối bởi các loại dung

môi (phân cực) được sử dụng, mức độ trùng hợp của phenolics, cũng như

tương tác của phenolics với các thành phần thực phẩm khác và hình thành

phức hợp không hòa tan. Do đó, không có phương pháp nào là hoàn toàn

thỏa đáng cho việc chiết xuất tất cả phenolic hoặc một lớp chất phenolic cụ

thể trong nguyên liệu thực vật. Methanol, ethanol, acetone, nước, ethyl

acetate và, đến một mức độ thấp hơn, propanol, dimethylformamide, và sự

kết hợp của các dung môi này thường được sử dụng để chiết xuất các

phenolic [59]. Thời gian chiết xuất thường từ 1 phút đến 24 giờ, tuy nhiên

thời gian chiết lâu hơn sẽ làm tăng sự oxy hóa các phenolic trừ khi các chất

khử được thêm vào dung môi chiết [60, 61].

1.3.2. Định lượng các hợp chất phenolic trong thực vật

Một số phương pháp quang phổ để định lượng các hợp chất phenolic

trong vật liệu thực vật đã được nghiên cứu và phát triển. Các phương pháp

này dựa trên các nguyên tắc khác nhau và được sử dụng để xác định các nhóm

cấu trúc khác nhau có trong các hợp chất. Phép sắc ký khí (GC) và kỹ thuật

sắc ký lỏng được sử dụng rộng rãi cho cả việc tách và định lượng các hợp

chất phenolic. Mô tả cấu trúc thường đạt được bằng cách kết hợp GC và

HPLC với việc phân tích phổ khối, cũng như các kỹ thuật liên quan khác [62].

1.3.3. Phương pháp quang phổ

Phản ứng thử Folin-Denis là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất

để xác định số phenol tổng số trong vật liệu thực vật [63]. Phản ứng khử

phosphomolybdic-phosphotungstic acid (Folin-Denis) thành phức chất màu

xanh trong dung dịch alkaline xảy ra khi có mặt các hợp chất phenolic. Swain

and Hills đã sửa đổi phương pháp Folin-Denis để phân tích một số lượng lớn

các mẫu. Phương pháp Folin-Ciocalteu cũng được sử dụng để xác định tổng

hàm lượng phenol thực vật thực vật [64, 65]. Cả hai thuốc thử Folin-Denis và

Folin-Ciocalteu đều không đặc hiệu và phát hiện tất cả các nhóm phenolic tìm

thấy trong dịch chiết, kể cả các chất có trong các protein. Một bất lợi khác của

phương pháp này là sự can thiệp của các hợp chất khử như ascorbic acid.

Phương pháp vanillin được sử dụng rộng rãi để định lượng

proanthocyanidins (tannin cô đặc) trong nguyên liệu thực vật [66]. Các thử

nghiệm vanillin là đặc trưng cho flavan-3-ols, dihydrochalcones và

proanthocyanidins có một liên kết ở vị trí 2,3 và có các nhóm meta-hydroxy

tự do trên vòng B. Catechin, flavan-3-ol, thường được sử dụng làm tiêu chuẩn

trong thử nghiệm vanillin [67].

Phương pháp 4-(dimethylamino)-cinnamaldehyde (DMCA) cũng đã được

đề xuất để đánh giá proanthocyanidins [68]. Sự hình thành chromophore xanh

giữa catechin và DMCA lần đầu tiên được báo cáo bởi Thies và Fischer [69].

Tuy nhiên, DMCA không phản ứng với một loạt các flavonoid, bao gồm

dihydrochalcon, flavanones và flavononols cũng như acid phenolic, nhưng thay

vì phản ứng Với indoles và terpenes. Thuốc thử DMCA, so với phản ứng

vanillin, được thực hiện trong methanol, chỉ phản ứng với các nhóm kéo dài của

proanthocyanidins và nó nhạy cảm đối với các đơn vị monomeric và polymeric.

Sự hiện diện của methanol, axeton, ethyl acetate và dimethylformamide không

có bất kỳ ảnh hưởng bất lợi nào đối với tốc độ và cường độ phát triển màu [68].

Phương pháp proanthocyanidin được thực hiện trong dung dịch butanol

và axit clohiđric (95:5, v/v). Với sự có mặt của dung dịch axit này,

proanthocyanidins (tannin kết hợp) được chuyển thành anthocyanidins thông

qua sự tự động oxy hóa của carbocations tạo thành bởi sự phá vỡ liên kết

interflavanoid. Năng suất của phản ứng này phụ thuộc vào nồng độ HCl và

nước, nhiệt độ và thời gian phản ứng, sự hiện diện của kim loại chuyển tiếp,

cũng như mức độ trùng hợp proanthocyanidins [70].

Nhiều phương pháp khác nhau đã được sử dụng để sàng lọc hàm lượng

tanin thủy phân trong một số lượng lớn vật liệu thực vật. Trong số này,

phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là dựa trên phản ứng giữa kali iodat

và tanin thủy phân. Phản ứng này lần đầu tiên được mô tả bởi Haslam [71] và

sau đó được sử dụng bởi Bate-Smith để phát triển một bài kiểm tra phân tích

để ước lượng tannin thủy phân trong các vật liệu thực vật [72]. Gần đây,

Hartzfeld et al. đã sửa đổi phép thử này bằng cách đưa vào một bước

methanolysis theo sau là quá trình oxy hóa với iodat kali [73].

Một số phương pháp được sử dụng để phát triển một phương pháp

quang phổ UV đơn giản và đáp ứng. Các phenol đơn giản có độ hấp thụ tối đa

từ 220 đến 280 nm, nhưng sự hấp thụ của chúng bị ảnh hưởng bởi bản chất

của dung môi và độ pH của dung dịch. Hơn nữa, cần phải xem xét khả năng

can thiệp bởi các chất hấp thụ tia cực tím như protein, axit nucleic và axit

amin [74-76]. Do đó, phát triển một phương pháp UV thỏa đáng là một nhiệm

vụ khó khăn. Ngoài ra, sự thích hợp của các phương pháp UV phụ thuộc vào

nguyên liệu được phân tích. Cả hai phương pháp phổ UV và khả kiến thường

được sử dụng để xác định các hợp chất phenolic riêng biệt, đặc biệt là các

flavonoid để xác định sự có mặt của các nhóm các hợp chất phenolic chính

[77]. Diode array detection (DAD) cũng có thể hiệu quả trong phân tích này.

Monedero et al. đã phát triển một kỹ thuật chemometric để kiểm soát

hàm lượng các aldehyde phenolic và các axit trong quá trình sản xuất rượu bị

tăng nhanh [78]. Edelmann et al. [150] đã phát triển một phương pháp nhanh

chóng phân biệt rượu vang Áo ở Áo dựa trên kỹ thuật hồng ngoại trung bình

[79]. Kiểm tra bằng chiết xuất phenol rượu. Sau đó, Brenna và Pagliarini đã

sử dụng một phân tích đa biến để tạo ra mối tương quan giữa hợp chất

polyphenolic và khả năng chống oxy hoá của rượu vang đỏ [80]. Briadet et al.

[152] đã áp dụng PCA để phân biệt giữa cà phê hòa tan Arabica và Robusta

dựa trên phổ FTIR của chúng [81]. Schulz và cộng sự đã sử dụng phương

pháp quang phổ cận hồng ngoại gần (NIR) để dự đoán các polyphenol trong

lá trà xanh (Camelia sinensis (L.) O. Kuntze) [82].

1.3.4. Kỹ thuật sắc ký

Các kỹ thuật sắc ký khí khác nhau đã được sử dụng để tách và định

lượng các axit phenolic [83], isoflavone [84], capsaicinoid [85], phenol

aldehyde [86] và monome của các chất tan cô đặc [87] . Các cột sắc ký khí

nhiệt độ cao mới, các bộ điều khiển áp suất điện và thiết bị phát hiện đã cải

thiện đáng kể độ phân giải và do đó các hợp chất có trọng lượng phân tử lớn

hơn cũng có thể được phân tích bởi GC. Chuẩn bị mẫu cho GC có thể bao

gồm việc loại bỏ chất lipid từ dịch chiết, giải phóng các phenolic từ các liên

kết ester và glycosidic bằng kiềm [83], thủy phân bằng axit và enzyme

hydrolysis [84], hoặc depolymer hóa tannin với sự có mặt của các nucleophile

như phloroglucinol [87]. Trước khi sắc ký, phenolic thường được biến đổi

thành các chất dẫn xuất dễ bay hơi hơn bằng phương pháp methyl hóa [88,

89], trifluoroacetylation [90], chuyển sang các dẫn chất trimethylsilyl [83],

hoặc tạo ra với N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-metyltrifluoroacetamit [87].

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC hiện nay đang được sử dụng

rộng rãi để phân tách và phân tích định lượng các hợp chất phenolic. Hiên nay có

nhiều phương pháp sắc ký lỏng khác nhau để phân tích các hợp chất anthocyanin,

procyanidin, flavonone, flavonol, flavan-3-ol, procyanidin, flavone, axit phenolic,

và secoiridoid [91-96]. Việc sử dụng các cột pha đảo đã cải thiện đáng kể sự phân

tách của các lớp chất phenolic khác nhau bằng HPLC [97]. Hiện nay trên thế giới

đã có nhiều công bố, trong đó có một số báo cáo tổng hợp về việc áp dụng phương

pháp HPLC cho phân tích các hợp chất phenolic [98-100].

Các bảng 1.2 và 1.3 tóm tắt một số quy trình HPLC hiện đại được sử dụng

để phân tích các hợp chất phenolic trong thực phẩm khác nhau. Các hợp chất

phenolic thực phẩm thường được phát hiện bằng các tia UV-vis, photodiode

array (DAD), và các thiết bị phát hiện bằng huỳnh quang tia cực tím [101-109].

Các phương pháp khác được sử dụng để phát hiện các hợp chất phenolic bao

gồm thiết bị ghi nhận electrochemical coulometric array (EC) [110], kết nối trực

tuyến DAD và máy dò điện tử [111], kỹ thuật phát hiện phản ứng hóa học [112]

và máy dò fluorimetric [113]. Sự kết hợp của phương pháp HPLC và phép đo

điện thế đã thành công trong việc phát hiện, xác định và định lượng hợp chất

phenolic flavonoid và phi flavonoid trong rượu vang. Gần đây, Romani et al.

[114] đã đưa ra sự so sánh giữa hai phương pháp điện hóa (điện áp xung và

amperometric biosensor) và HPLC/DAD để phân tích phenolic trong các nguyên

liệu tự nhiên. Trong số này, kỹ thuật HPLC/DAD cho độ chính xác cao nhất,

trong khi đó kỹ thuật điện áp xung sử dụng các điện cực màn hình được xem

như là một phương pháp tốt và nhanh để kiểm tra polyphenol trong các dịch

chiết từ nguyên liệu thiên nhiên [62].

Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với phổ khối (HPLC-MS tandem)

thường được sử dụng để xác định đặc tính cấu trúc của chất phenolic. Phổ

khối ion hóa phun mù điện tử (ESIMS) đã được sử dụng để xác nhận cấu trúc

của phenolics trong mận, đào, mật ong [106], grapeseeds [115], đậu nành

[116], ca cao [117], dầu ô liu [96], và điều này đã chứng minh rằng phức hợp

của flavonoid với Cu2+ tăng cường sự phát hiện của flavonoid bởi ESIMS.

Bảng 1.2. Một số kỹ thuật HPLC xác định các hợp chất phenolic

trong thực phẩm [62]

Thực

Phenolic Chuẩn bị mẫu

Pha tĩnh

Pha động

phẩm

Extraction

with

70%

EtOH,

Shimpak

centrifugation,

C18 (250

Free

concentration,

mm × 4.6

Isocratic: H2O-acetic acid-

Hạt kê

phenolic

adjusting pH to 2-

mm)

MeOH (80:5:15, v/v/v)

acids

3, extraction with

reversed-

ethyl

acetate,

phase

evaporation,

dilution in MeOH

Extractions:

hot

H2O;

acid

(A) 0.01 M citrate buffer pH

hydrolysis;

acid

Supelcosil

5.4 adjusted with 50% acetic

and

α-amylase

LC-18

acid; (B) MeOH; gradient: 2-

Lúa

Phenolic

hydrolysis;

acid

(150 mm ×

4% B in A, 0-12 min; 4-13%

mạch

acids

and α-amylase and

4.6 mm, 5

B in A, 12-20 min; 13% B in

cellulase

μm)

A, 20-26 min; 13-2% B in A,

hydrolysis;

26-30 min

centrifugation

Extraction with

acetone, filtration,

Hypersil

Quả

evaporation

ODS (125

Isocratic:

MeOH-H2O

cam,

Coumarins

dissolving in

mm × 4

(75:25, v/v)

quýt

MeOH-acetone

mm, 5 μm)

(1:1, v/v), filtration

Solubilization of

oil in hexane-ethyl

Microsorb-

Isocratic:

MeOH-

Dầu

acetone (9:1, v/v),

MV C18

acetonitrile-

cám

γ-Oryzanol

removal of lipids

(250 mm ×

dichloromethane-acetic acid

gạo

using silica column

4.6 mm)

(50:44:3:3, v/v/v/v)

(250 mm × 25

mm)

Extraction with

1,4-dioxane-

95%EtOH (1:1,

v/v),

Econosil

(A) 5% Acetonitrile in 0.01M

Bột hạt

centrifugation,

RP C18

phosphate buffer, pH 2.8; (B)

lanh

Lignans

evaporation,

(250 mm ×

acetonitrile; gradient: 100-

loại béo

alkaline hydrolysis,

4.6 mm, 5

70% A in B, 0-30 min; 70-

acidification to pH

μm)

30% A in B, 30-32 min

3, removal of salt

using C18

reversed-SPE

Extraction with

Vydac C18

(A) Acetonitrile; (B) 0.1%

80% EtOH,

(150 mm ×

TFA; gradient: 0% A in B, 0-1

centrifugation,

Hạt lạc Resveratrol

4.5 mm)

min; 0-15% A in B, 1-3 min;

semi-purification

reversed-

15-27% A in B, 3-23 min; 27-

Al2O3 silica gel

phase

100% A in B, 23-28 min

60R18 (1:1)

Bảng 1.3. Một số kỹ thuật HPLC xác định các lớp chất phenolic

trong thực phẩm [62]

Thực phẩm

Phenolic

Pha tĩnh

Pha động

Chuẩn bị mẫu

Catechins, flavanones, flavones, flavonols

Lingonberry, nam việt quất, hành tây, bông cải xanh

Extraction with 1.2 M HCl in 50% MeOH for 2 h at 90 °C; filtration

Inertsil ODS (150 mm × 4 mm; 3 μm) coupled with C18 guard

(A) 50 mM H3PO4 pH 2.5; (B) acetonitrile; catechins: 86% A in B, isocratic; other flavonoids—gradient: 95% A in B, 0-5 min; 95-50% A in B, 5-55 min; 50% A in B, 55- 65 min; 50-95% A in B, 65-67 min

Xuân đào, đào, mận

Phenolic acids, catechins, flavonols, procyanidins

Extraction with 80% MeOH containing 2mM NaF; centrifugation, filtration

Nucleosil C18 (150 mm × 4.6 mm, 5 μm) reversed- phase coupled with guard containing the same stationary phase

(A) 5% MeOH in H2O; (B) 12% MeOH in H2O; (C) 80% MeOH in H2O; (D) MeOH; gradient: 100% A, 0-5 min; 0-100% B in A, 5- 10 min; 100% B, 10-13 min; 100-75% B in C, 13-35 min; 75-50% B in C, 35-50 min; 50- 0% B in C, 50-52 min; 100% C, 52-57 min; 100% D 57-60 min

Mâm xôi đỏ

Ellagic acids, flavones

Lichrocart 100 RP-18 (250 mm × 4 mm, 5 μm) reversed- phase

(A) 5% formic acid in H2O; (B) MeOH; gradient: 10-15% B in A, 0-5 min; 15-30% B in A, 5-20 min; 30- 50% B in A, 20-35 min; 50-90% B in A, 35-38 min

Extraction with MeOH, filtration, addition of H2O, evaporation, semi- purification of phenolics using Sep-Pak C18, filtration

Dilution with

(A) H2O adjusted to

EtOH, alkaline

pH 2.6 with H3PO4;

hydrolysis,

Lichrosorb

(B) acetonitrile;

Phenolic

acidification,

RP18 (200

gradient: 0-9% B in A,

acids,

extraction of

mm × 3 mm,

0-12 min; 9-13% B in

Sáp ong

flavones,

phenolic with

7 μm)

A, 12-20 min; 13-40%

flavonones,

ethyl acetate,

coupled with

B in A, 20-40 min; 40-

flavonols

evaporation,

C18 guard

70% B in A, 40-60

dissolving in

min; 70% B in A, 60-

EtOH

85 min

Extraction with

70% MeOH,

(A) H2O containing

removal of

0.01% TFA; (B)

carotenoids and

YMC ODS-

acetonitrile containing

Flavonols,

chlorophyll

AQ (250

0.01% TFA; gradient:

Rau bina

flavanones

using ODS-

mm × 4.6, 5

100% A, 0-10 min;

C18 packing

μm)

100-50% A in B, 10-40

min; 50-0% A in B, 40-

material,

50 min

centrifugation,

concentration

MeOH/H2O

(A) 2% CH3COOH in

(80:20, v/v)

H2O; (B) MeOH;

evaporation to

C18 Erbasil

gradient: 95% A/5% B

Phenolic

syrup

column (150

for 2 min; 25% B in A

Dầu ô liu

acids,

concentration;

mm × 4.6

in 8 min; 40% B in A

secoiridoids

addition of

mm)

in 10 min; 50% B in A

acetonitrile,

in 10 min; 100% B in

washing with

10 min

hexane

Dầu ô liu

Phenolic acids, secoiridoids, flavones, lignans

Lichrospher 100 RP-18 (250 mm × 4 mm, 5 μm) reversed- phase

(A) H2O/CH3COOH (97:3, v/v); (B) MeOH/acetonitrile (50:50, v/v); gradient: 5-30% B in A, 0-25 min; 35% B in A in 10 min; 40% B in A in 5 min, 70% B in A in 10 min; 100% B in 5 min

Solid phase- liquid extraction using diol- bonded cartridge; unwanted substances washed out with hexane and hexane/ethyl acetate (90:10, v/v), then phenolics eluted from column with MeOH

Dầu ô liu

Same as Mateos et al. [215e]

Phenolic acids, secoiridoids, lignans

Spherisorb S3 ODS2 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)

(A) H2O/CH3COOH (95:5, v/v); (B) MeOH; (C) acetonitrile; gradient: from 95% A/2.5% B/2.5% C to 34% A/33% B/33%C in 50 min

Quả ô liu, bã trái cây ép

Secoiridoids, flavones

Lichrospher 100 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)

Extraction 80% MeOH containing 100 ppm sodium salt of diethyldithiocar bamic acid; extract purified using C18 cartridge.

(A) H2O (pH 2.5 adjusted with 0.15 M H3PO4); (B) H2O; gradient: from 10% B in A to 30% B in A in 10 min, 30% B in A for 20 min; from 40% B in A in 10 min; 40% B in A for 5 min; 60% B in A in 5 min; 70 % B in A in 5 min; 100% B in 5 min

Phổ khối lượng của các phức hợp flavonoid-kim loại có cường độ

mạnh hơn và dễ phân tích hơn so với các flavonoid tương ứng. Xác định các

phenolics thu được sau khi phân tích HPLC cũng được thực hiện bằng phổ

khối lượng bắn phá điện tử nhanh (FABMS) [105, 118] và phổ khối lượng tác

động điện tử (EIMS) [105]. Mặt khác, kỹ thuật đo khối lượng ion hóa tia laser

ma trận hỗ trợ giải hấp (MALDI-MS) đã được sử dụng để phân tích định tính

và định lượng các anthocyanin trong thực phẩm [119], trong khi MALDI-

TOF được sử dụng để xác định theaflavin và thearubigin từ trà đen [120].

Chương 2

THỰC NGHIỆM

2.1. Mẫu thực vật

Mẫu rễ cây viễn chí (Polygala japonica) thu tại Ninh Bình vào tháng 4 năm

2014 và được giám định bởi TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên

Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản được lưu

giữ tại Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất

2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60

F254 (Marck 1,05715), RP18 F254S (Merck). Phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước

sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun

đếu trên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ tới khi xuất hiện màu.

2.2.2. Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường và

pha đảo. Silicagel pha thường có kích thước hạt là 0.040-0.063 mm (240-430

mesh). Silicagel pha đảo ODS (30-50 m, Fujisilisa Chemical Ltd.).

2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất

2.3.1. Phổ khối lượng phân giải cao (HRESITOFMS)

Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử thời gian bay (Electronspray

Ionization Time-Of-Flight Mass Spectra) được đo trên máy Agilent QTOF 6530

của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

2.3.2.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR)

13C NMR (125MHz) và DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều bao gồm phổ 1H NMR (500 MHz)

Transfer) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrorneter, Viện Hóa

Học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều (2D-NMR)

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, bao gồm HMQC (Heteronuclear

Multiple - Quantum Correlation), HSQC (Heteronuclear Single - Quantum

Correlation), HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) cho phép xác

định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều.

2.4. Dụng cụ và hóa chất

2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết

Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được

sử dụng bao gồm:

+ Bình chiết 30 lít

+ Phễu chiết 2 lít

+ Máy cô quay chân không

+ Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 368 nm

+ Máy sấy

+ Micropipet

+ Bình sắc ký loại phân tích và điều chế

+ Cột sắc ký pha thường và pha đảo với các kích cỡ khác nhau

+ Dung dịch thuốc thử H2SO4 10%

2.4.2. Thiết bị xác định cấu trúc

+ Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectrometer.

+ Máy đo phổ khối lượng AGILENT 1100 LC-MSD Trap.

2.4.3. Hóa chất

+ Silica gel pha thường (0.04-0.063 mm) Merck.

+ Silica gel pha đảo ODS (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.).

+ Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715).

+ Bản mỏng tráng sẵn pha đảo RP18 F254s (Merck).

+ Các loại dung môi hữu cơ như MeOH, EtOAc, CH2Cl2, n-hexane,

acetone, ...

2.5. Phân lập các hợp chất

Mẫu rễ khô của cây Viễn chí (4.5 kg) được chiết bằng MeOH (3 lần x 10

L) ở điều kiện siêu âm thu được dịch chiết MeOH. Sau khi loại dung môi dưới áp

suất giảm, cặn chiết MeOH (450 g) được phân bố đều trong 4 L nước cất và được

chiết phân lớp lần lượt với CH2Cl2, ethyl acetate (EtOAc), và butanol (BuOH) thu

được các phân lớp dịch chiết CH2Cl2, EtOAc, BuOH, và nước (Sơ đồ 2.1).

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ chiết phân lớp rễ cây Viễn chí

Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết BuOH

Phân lớp BuOH được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn

chiết BuOH (PJB, 70 g). Cặn chiết này được phân tách sắc ký trên cột silica gel

pha thường, sử dụng hệ dung môi rửa giải gradient CH2Cl2:MeOH (20:1 v/v ~

100% MeOH) thu được 5 phân đoạn PJB1-PJB5 (Sơ đồ 2.2). Phân đoạn PJB3

được phân tách trên cột silica gel pha đảo C18, sử dụng hệ dung môi rửa giải

MeOH:H2O (10:13, v/v) thu được 3 phân đoạn nhỏ PJB3.1– PJB3.3. Phân đoạn

PJB3.2 được phân tách trên cột sắc ký lọc gel Sephadex LH-20, sử dụng hệ

dung môi rửa giải MeOH:H2O (1:1, v/v) thu được 2 phân đoạn PJB3.2.1 và

PJB3.2.2. Phân đoạn PJB3.2.1 tiếp tục được phân tách qua cột silica gel pha

đảo C18, rửa giải với MeOH:H2O (14:10, v/v) thu được hợp chất 2 (11 mg).

Tương tự, hợp chất 4 (5 mg) được tinh sạch từ phân doạn PJB3.2.2 bằng sắc ký

cột silica gel pha thường, hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH (10:1, v/v).

Phân đoạn PJB3.3 được phân tách trên cột silica gel pha thường, sử dụng hệ

dung môi rửa giải CH2Cl2:MeOH (7:1, v/v), và tiếp tục tinh sạch qua cột sắc ký

lọc gel Sephadex LH-20, sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOH:H2O (1:1, v/v)

thu được hợp chất 1 (100 mg). Phân đoạn PJB4 được phân tách trên cột silica

gel pha đảo C18, sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOH:H2O (1:1, v/v) thu được

5 phân đoạn nhỏ PJB4.1– PJB4.3. Phân đoạn PJB4.2 được phân tách trên cột

silica gel pha đảo C18, sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOH:H2O (1:1, v/v) thu

được 3 phân đoạn PJB4.2.1-PJB3.2.3. Phân đoạn PJB4.2.2 tiếp tục được phân

tách qua cột silica gel pha thường, rửa giải với CH2Cl2:MeOH:H2O (6:1:0.1,

v/v/v) thu được hợp chất 5 (20 mg). Tương tự, hợp chất 3 (70 mg) được phân

tách từ phân doạn PJB4.4 bằng sắc ký cột pha đảo C18, rửa giải với MeOH:H2O

(1:1, v/v), sau đó tinh sạch qua cột cột sắc ký lọc gel Sephadex LH-20, sử dụng

hệ dung môi rửa giải MeOH:H2O (3:1, v/v).

2.6. Phân tích định lượng

2.6.1. Thiết bị và hóa chất

- Hệ thống HPLC Alliance 2695 với detector PDA (hãng Waters – Mỹ). - Cân phân tích Adam AAA 160L (d = 0,0001).

- Cột phân tích Sunfire RP C18 (4.6 x 150 mm, 5µm).

- Dung môi MeOH, acetonitrile, và nước (mức độ tinh khiết dùng cho

phân tích).

2.6.2. Chuẩn bị mẫu

Lấy 10 mg cao chiết MeOH mẫu viễn chí, hòa tan trong 10 mL MeOH, lắc

đều đến khi hòa tan hoàn toàn thu được dung dịch gốc (1 mg/ mL). Các dung dịch

chuẩn của hợp chất cần phân tích pha trong MeOH ở các nồng độ 0.025, 0.05, 0.1, và 0.5 mg/mL, và được bảo quản tránh ánh sáng ở 4 oC cho đến khi phân tích.

2.6.3. Điều kiện sắc ký

- Cột phân tích Sunfire RP C18 (4.6 x 150 mm, 5µm).

- Detector PDA: bước sóng 310 nm (hợp chất 1) và 280 nm (hợp chất 3).

Thể tích bơm mẫu 10µL.

- Pha động: Kênh A: H2O (0.1% axit formic)

Kênh B: Acetonitrile

- Tốc độ dòng 1 mL/phút, rửa giải gradient.

Bảng 1.1. Chương trình phân tích

Thời gian (phút) Kênh A (%) Kênh B (%)

0 - 2 20 80

2 - 20 100 0

20 - 30 100 0

30 - 35 20 80

2.7. Hằng số vật lí và dữ kiện phổ các hợp chất

2.7.1. Hợp chất 1

Các thông số vật lí của hợp chất 1:

- Mô tả: Bột vô định hình màu trắng.

- Công thức phân tử C31H38O17 (M = 682). - Phổ khối lượng phân giải cao: m/z 681.2040 [M-H]- (tính toán cho

công thức C31H37O17, 681.2031).

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1H NMR (CD3OD, 600 MHz) và 13C

NMR (CD3OD, 150 MHz): xem bảng 3.1.

2.7.2. Hợp chất 2

Các thông số vật lí của hợp chất 2:

- Mô tả: Bột vô định hình màu trắng.

- Công thức phân tử C32H40O17 (M = 696). - Phổ khối lượng phân giải cao: m/z 695.2184 [M-H]- (tính toán cho

công thức C32H39O17, 695.2187).

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1H NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C

NMR (CD3OD, 125 MHz): xem bảng 3.2.

2.7.3. Hợp chất 3

Các thông số vật lí của hợp chất 3:

- Mô tả: Bột vô định hình màu trắng.

- Công thức phân tử C36H44O19 (M = 780). - Phổ khối lượng phân giải cao: m/z 779.2387 [M-H]- (tính toán cho

công thức C36H43O19, 779.2399).

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1H NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C

NMR (CD3OD, 125 MHz): xem bảng 3.3.

2.7.4. Hợp chất 4

Các thông số vật lí của hợp chất 4:

- Mô tả: Bột vô định hình màu trắng.

- Công thức phân tử C34H40O18 (M = 736). - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1H NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C

NMR (CD3OD, 125 MHz): xem bảng 3.4.

2.7.5. Hợp chất 5

Các thông số vật lí của hợp chất 5:

- Mô tả: Bột vô định hình màu trắng.

- Công thức phân tử C34H42O19 (M = 754). - Phổ khối lượng phân giải cao: m/z 753.2232 [M-H]- (tính toán cho

công thức C34H41O19, 753.2242).

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1H NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C

NMR (CD3OD, 125 MHz): xem bảng 3.5.

Chương 3

KẾT QUẢ THẢO LUẬN

3.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

3.1.1. Xác định cấu trúc hợp chất 1

Hợp chất 1 được tách ra dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Công

thức phân tử của hợp chất 1 được xác định là C31H38O17 bởi tín hiệu ion [M-H]-

tại m/z 681.2040 (tính toán cho công thức C31H37O17, 681.2031) trên phổ khối

lượng phân giải cao HRESITOFMS (Hình 3.1). Trên phổ 1H NMR của hợp

chất 1 xuất hiện hai tín hiệu singlet của hai proton thơm ở vị trí meta với nhau

tại H 6. 94 (s, H-2) và 6.94 (s, H-6) và tín hiệu của một vòng thơm thế para

tại H 7.93 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-2 và H-6) và 6.84 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-3

và H-5) (Hình 3.2). Phổ 1H NMR cũng ghi nhận tín hiệu doublet của một

proton anomer tại 5.52 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-1) gợi ý sự có mặt của một đơn vị

đường -glucopyranose của đường sucrose [121]. Ngoài ra phổ 1H NMR còn

ghi nhận tín hiệu của một liên kết đôi cấu hình trans tại H 7.74 (1H, d, J = 16.0

Hz, H-7) và 6.57 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8) cùng với tín hiệu của 3 nhóm

methoxy tại H 3.87 (6H, s) và 3.80 (3H, s).

Hình 3.1. Phổ khối lượng phân giải cao của hợp chất 1

Hình 3.2. Phổ 1H–NMR của hợp chất 1

Phổ 13C NMR ghi nhận tín hiệu của 31 carbon, trong đó có 12 carbon

thuộc đường sucrose, 9 tín hiệu carbon của một nhóm 3,4,5-

trihydroxycinnamoyl, 7 tín hiệu carbon của một nhóm benzoyl, cùng với tín hiệu

của ba nhóm methoxy (Hình 3.2). Các tín hiệu carbon của đường sucrose bao

gồm hai tín hiệu carbon anomer tại C 104.8 (C-2) và 93.1 (C-1), sáu tín hiệu

oxymethine, và tín hiệu của ba nhóm oxymethylene tại C 65.6 (C-1), 63.3 (C-6),

và 65.1 (C-6). Tín hiệu của nhóm 3,4,5-trihydroxycinnamoyl được nhận ra

thông qua tín hiệu của một nhóm carbonyl tại C 167.8 (C-9), 3 carbon thơm

bị oxy hóa không liên kết hydro tại C 154.7 (C-3 và C-5) và 141.3 (C-4),

một carbon thơm không liên kết hydro tại C 131.4 (C-1), hai nhóm methine

thơm tại C 106.9 (C-2 và C-6), cùng với tín hiệu của một nối đôi tại C

147.3 (C-7) và 117.7 (C-8). Các tín hiệu bao gồm một nhóm carbonyl tại C

168.1 (C-7), hai carbon thơm không liên kết hydro tại C 122.0 (C-1) và

163.5 (C-4), và hai cặp carbon methine thơm tại C 133.0 (C-2 và C-6) và

116.2 (C-3 và C-5) xác nhận sự có mặt của nhóm p-hydroxybenzoyl trong

phân tử. Từ các phân tích trên, kết hợp với sự trùng khớp khi so sánh số liệu

phổ NMR của hợp chất 1 với một hợp chất phenylpropanoid sucrose ester đã

biết (Bảng 3.1), hợp chất 1 được dự đoán là tenuifoliside A (Hình 3.4) [121].

Hình 3.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất 1

Cấu trúc của hợp chất 1 tiếp tục được khẳng định thêm thông qua các

phân tích trên phổ hai chiều HSQC và HMBC (Hình 3.5 và 3.6). Trên phổ

HMBC xuất hiện các tương tác giữa H 3.87 (6H, s) với C 154.7 (C-3 và C-5)

và giữa H 3.80 (3H, s) với C141.3 (C-4) cho phép xác định vị trí của ba

nhóm methoxy tại C-3, C-4, và C-5 (Hình 3.6). Tương tác HMBC giữa H

5.51 (H-3) với C 167.8 (C-9) xác nhận nhóm 3,4,5-trimethoxycinnamoyl

liên kết với đường fructose ở vị trí C-3 thông qua cầu liên kết O-glycosidic.

Tương tác HMBC giữa H 5.52 (H-1) với C 104.8 (C-2) cho thấy đường -

glucose liên kết với đường fructose tại vị trí C-2. Ngoài ra, tương tác HMBC

giữa H 4.69/4.45 (H2-6) và C 168.1 (C-7) cho thấy nhóm benzoyl định vị

ở vị trí C-6. Qua các phân tích trên, hợp chất 1 được xác định là tenuifoliside

A, có công thức phân tử là C31H38O17 (M = 682).

Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất 1

Hình 3.5. Phổ HSQC của hợp chất 1

Hình 3.6. Phổ HMBC của hợp chất 1

Hình 3.7. Các tương tác HMBC chính của hợp chất 1

H

C -D-Fructofuranosyl 1

C 65.42

a,b C 65.6

104.75 79.50 73.87 83.95 63.27 92.98 72.94 74.79 71.43 72.36 65.04

104.8 79.7 74.0 84.10 63.3 93.1 73.1 74.9 71.6 72.5 65.1

2 3 4 5 6 -D-Glucopyranosyl 1 2 3 4 5 6

a,c (mult., J in Hz) 3.67 (1H, d, 13.0) 3.64 (1H, d, 13.0) 5.51 (1H, d, 8.0) 4.40 (1H, t, 8.0) 3.96 (1H, m) 3.81*/3.73* 5.52 (1H, d, 4.0) 3.50 (1H, dd, 3.5, 9.5) 3.70 (1H, t, 9.0) 3.48 (1H, dd, 9.0, 9.5) 3.50 (1H, m) 4.69 (1H, dd, 2.0, 12.0) 4.45 (1H, dd, 5.5, 12.0)

6.94 (1H, s) 6.94 (1H, s) 7.74 (1H, d, 16.0) 6.57 (1H, d, 16.0) 3.87 (6H, s) 3.80 (3H, s) 7.93 (1H, d, 9.0) 6.84 (1H, d, 9.0) 6.84 (1H, d, 9.0) 7.93 (1H, d, 9.0)

131.37 106.68 154.64 141.06 154.64 106.68 147.35 117.60 167.83 56.63 61.12 121.95 133.03 116.20 163.52 116.20 133.03 168.16

131.4 106.9 154.7 141.3 154.7 106.9 147.3 117.7 167.8 56.8 61.2 122.0 133.0 116.2 163.5 116.2 133.0 168.1

3,4,5- Trimethoxycinnamoyl 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3,5-OCH3 4-OCH3 p-Hydroxybenzoyl 1 2 3 4 5 6 7

a)đo trong CD3OD, b)125MHz, c)500 MHz, *tín hiệu bị che khuất

#C của tenuifoliside A đo trong CD3OD [121]

Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của chất 1 và chất tham khảo

3.1.2. Xác định cấu trúc hợp chất 2

Hợp chất 2 được tách ra dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Công

thức phân tử của hợp chất 2 được xác định là C32H40O17 bởi tín hiệu ion [M-

H]- tại m/z 695.2184 (tính toán cho công thức C32H39O17, 695.2187) trên phổ

khối lượng phân giải cao HRESITOFMS (Hình 3.8).

Hình 3.8. Phổ khối lượng phân giải cao của hợp chất 2

Phân tích so sánh phổ 1H NMR (Hình 3.9) và 13C NMR (Hình 3.10) của

hợp chất 2 với hợp chất 1 cho thấy cấu trúc của hai hợp chất này gần như tương

đồng, điểm khác biệt là hợp chất 2 có thêm sự xuất hiện của tín hiệu của nhóm

methoxy tại H 3.87/H 56.0 (4-OCH3). Tiến hành so sánh các số liệu phổ 1H

NMR và 13C NMR của hợp chất 2 với một hợp chất phenylpropanoid sucrose

ester đã biết là -D-[3-O-(3,4,5-trimethoxycinnamoyl)] - fructofuranosyl-α-D-

[6-O-(4-methoxybenzoyl)]-glucopyranoside cho kết quả hoàn toàn tương

đồng (Bảng 3.2) [122].

Hình 3.9. Phổ 1H–NMR của hợp chất 2

Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2

Cấu trúc của hợp chất 1 được khẳng định thông các tương tác trên phổ hai

chiều HSQC và HMBC (Hình 3.12 và 3.13). Trên phổ HMBC xuất hiện tương

tác giữa tín hiệu của nhóm methoxy tại H 3.87 (3H, s) với C 165.3 (C-4) cho

phép xác nhận một nhóm methoxy định vị ở vị trí C-4 (Hình 3.14). Qua các

phân tích trên, cấu trúc hóa học của hợp chất 2 được xác định là -D-[3-O-

(3,4,5-trimethoxycinnamoyl)]-fructofuranosyl-α-D-[6-O-(4-methoxybenzoyl)]-

glucopyranoside (Hình 3.11), có công thức phân tử là C32H40O17 (M = 696).

Hình 3.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất 2

Hình 3.12. Phổ HSQC của hợp chất 2

Hình 3.13. Phổ HMBC của hợp chất 2

Hình 3.14. Các tương tác HMBC chính của hợp chất 2

H

C -D-Fructofuranosyl 1

C 65.5

a,b C 65.6

104.8 79.6 74.0 84.0 63.2 93.0 73.0 74.8 71.5 72.4 65.5

104.9 79.8 74.1 84.2 63.4 93.1 73.1 74.9 71.7 72.5 65.3

2 3 4 5 6 -D-Glucopyranosyl 1 2 3 4 5 6

131.3 106.8 154.6 141.2 154.6 106.8 147.2 117.6 167.7 56.7 61.1 123.1 132.7 114.8 165.1 114.8 132.7 167.8 56.0

131.5 106.9 154.8 141.4 154.8 106.9 147.3 117.8 167.9 56.8 61.2 123.4 132.8 114.9 165.3 114.9 132.8 167.8 56.0

a,c (mult., J in Hz) 3.66 (1H, s) 3.63 (1H, s) 5.51 (1H, d, 8.0) 4.41 (1H, t, 8.0) 3.95 (1H, m) 3.80*; 3.71* 5.52 (1H, d, 4.0) 3.51 (1H, dd, 4.0, 9.5) 3.70* 3.47* 4.27 (1H, m) 4.71 (1H, dd, 2.5, 12.0) 4.46 (1H, dd, 5.0, 12.0) 6.96 (1H, s) 6.96 (1H, s) 7.75 (1H, d, 16.0) 6.57 (1H, d, 16.0) 3.88 (6H, s) 3.81 (3H, s) 8.02 (1H, d, 9.0) 7.00 (1H, d, 9.0) 7.00 (1H, d, 9.0) 8.02 (1H, d, 9.0) 3.87 (3H, s)

3,4,5-Trimethoxycinnamoyl 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3,5-OCH3 4-OCH3 4-methoxybenzoyl 1 2 3 4 5 6 7 4-OCH3

a)đo trong CD3OD, b)125MHz, c)500 MHz, *tín hiệu bị che khuất #C của -D-[3-O-(3,4,5-trimethoxycinnamoyl)]-fructofuranosyl-α-D-[6-O- (4-methoxybenzoyl)]-glucopyranoside đo trong CD3OD [122]

Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của chất 2 và chất tham khảo

3.1.3. Xác định cấu trúc hợp chất 3

Hợp chất 3 được tách ra dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Công

thức phân tử của hợp chất 3 được xác định là C36H44O19 bởi tín hiệu ion [M-

H]- tại m/z 779.2387 (tính toán cho công thức C36H43O19, 779.2399) trên phổ

khối lượng phân giải cao HRESITOFMS (Hình 3.15).

Hình 3.15. Phổ khối lượng phân giải cao của hợp chất 3

Trên phổ 1H NMR của hợp chất 3 xuất hiện tín hiệu của hai vòng

benzene trong khoảng tín hiệu từ H 7.40 – 7.65, và tín hiệu của một nối đôi

có cấu hình trans tại H 7.74 (d, J = 16.0 Hz, H-7) và 6.54 (d, J = 16.0 Hz,

H-8), gợi ý sự có mặt của một nhánh cinnamoyl và một đơn vị benzoyl

trong phân tử (Hình 3.16). Phổ 1H NMR cũng ghi nhận tín hiệu doublet của

một proton anomer tại H 5.65 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-1) gợi ý sự có mặt của

một đơn vị đường -glucopyranose của đường sucrose. Ngoài ra phổ 1H

NMR còn ghi nhận tín hiệu của một proton anomer khác tại H 4.45 (d, J = 7.0 Hz,

H-1) gợi ý sự có mặt của một đơn vị đường khác trong phân tử.

Hình 3.16. Phổ 1H–NMR của hợp chất 3

Phổ 13C NMR ghi nhận tín hiệu của 36 carbon, trong đó có 12 carbon

thuộc đường sucrose, sáu tín hiệu của một đường glucopyranose, chín tín hiệu

carbon của một nhóm cinnamoyl, bảy tín hiệu carbon của một nhóm benzoyl,

và hai tín hiệu của một nhóm acetyl (C 173.2 và 20.8) (Hình 3.17). Các tín

hiệu carbon của đường sucrose bao gồm hai tín hiệu carbon anomer tại C

103.3 (C-2) và 93.7 (C-1), saus tín hiệu của nhóm oxymethine, và tín hiệu

của ba nhóm oxymethylene tại C 66.2 (C-1), 63.1 (C-6), và 62.2 (C-6). Tín

hiệu của một đường glucopyranose được xác định thông qua tín hiệu carbon

anomer tại C 106.2 (C-1), bốn tín hiệu oxymethine, và một nhóm

oxymethylene tại C 64.0 (C-6). Cấu hình đường glucose này được xác định

là  thông qua hằng số bắt cặp khá lớn của proton anomer (J = 7.0 Hz). Cấu

trúc của đơn vị cinnamoyl được xác nhận thông qua tín hiệu của một nhóm

carbonyl tại C 167.8 (C-9), một carbon thơm không liên kết hydro tại C

135.6 (C-1), năm nhóm methine thơm, cùng với tín hiệu của một nối đôi tại

C 146.6 (C-7) và 118.5 (C-8). Các tín hiệu bao gồm một nhóm carbonyl

tại C 167.3 (C-7), một carbon thơm không liên kết hydro tại C 130.8 (C-

1), hai cặp carbon methine thơm tại C 130.9 (C-2 và C-6) và 129.8 (C-

3 và C-5), và một carbon methine thơm tại C 134.6 (C-4) xác nhận sự

có mặt nhóm benzoyl trong phân tử. Tiến hành so sánh số liệu phổ NMR của

hợp chất 3 với một hợp chất phenolic glycoside đã biết thấy hoàn toàn tương

đồng (Bảng 3.3), do đó hợp chất 3 được dự đoán là -D-[(1-O-cinnamoyl)-(3-

O-benzoyl)]-fructofuranosyl-(21)--D-glucopyranosyl-(21)-6-O-acetyl-

-D-glucopyranoside (Hình 3.18) [122].

Hình 3.17. Phổ 13C-NMR của hợp chất 3

Cấu trúc của hợp chất 3 được khẳng định bằng các phân tích trên phổ hai

chiều HSQC và HMBC (Hình 3.19 và 3.20). Trên phổ HMBC xuất hiện tương

tác HMBC giữa H 5.65 (H-1) với C 103.3 (C-2) cho thấy đường -glucose liên

kết với đường fructose tại vị trí C-2 thông qua liên kết O-glycosidic (Hình 3.21).

Tương tác HMBC giữa H 4.45 (H-1) và C 82.3 (C-2) cho thấy đường -

glucose định vị ở vị trí C-2 của đường -glucose. Tương tác HMBC giữa H

4.62/4.22 (H2-1) với C 167.8 (C-9) xác nhận nhóm cinnamoyl liên kết với

đường fructose ở vị trí C-1 thông qua cầu liên kết O-glycosidic. Tương tác

HMBC giữa H 5.77 (H-3) với C 167.3 (C-7) cho phép xác định nhóm

benzoyl tại vị trí C-3 của đường fructose. Ngoài ra, tương tác HMBC giữa H

4.45 (H-1) với C 75.0 (C-5) và giữa H 4.52/4.22 (H2-6) với C 173.2

(CH3COO) và 75.0 (C-5) cho thấy nhóm acetyl định vị ở vị trí C-6 của đường

-glucose. Kết hợp các phân tích phổ NMR nêu trên với sự tương đồng khi so

sánh với số liệu phổ NMR của hợp chất tham khảo, cấu trúc hóa học của hợp

chất 3 được xác định là -D-[(1-O-cinnamoyl)-(3-O-benzoyl)]-fructofuranosyl-

(21)--D-glucopyranosyl-(21)-6-O-acetyl--D-glucopyranoside, có công

thức phân tử là C36H44O19 (M = 780).

Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất 3

Hình 3.19. Phổ HSQC của hợp chất 3

Hình 3.20. Phổ HMBC của hợp chất 3

Hình 3.21. Các tương tác HMBC chính của hợp chất 3

H

C -D-Fructofuranosyl 1

C 66.1

a,b C 66.2

103.2 79.4 73.1 74.0 63.0 93.6 82.1 73.2 70.6 74.4 62.1 106.0 75.2 77.5 70.8 75.2 63.9

103.3 79.5 73.2 84.1 63.1 93.7 82.3 73.3 70.8 74.5 62.2 106.2 75.1 77.6 70.9 75.0 64.0

2 3 4 5 6 -D-Glucopyranosyl 1 2 3 4 5 6 -D-Glucopyranosyl 1 2 3 4 5 6

6-OAc

173.1 20.8

173.2 20.8

Bảng 2.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất 3 và chất tham khảo

a,c (mult., J, Hz) 4.62 (1H, d, 12.0) 4.22 (1H, d, 12.0) 5.77 (1H, d, 8.5) 4.52* 4.08* 3.92/3.88 5.65 (1H, d, 3.0) 3.44 (1H, dd, 3.5, 9.5) 3.79* 3.51 1H, (t, 9.0) 3.97 (1H, m) 3.90/3.84 4.45 (1H, d, 7.0) 3.47* 3.37* 3.51 (1H, t, 9.0) 3.38* 4.52 (1H, dd, 2.0, 11.5) 4.22 (1H, dd, 4.5, 11.5) 2.07 (3H, s)

135.4 129.2 129.9 131.5 129.9 129.2 146.6 118.4 167.6 130.7 130.9 129.7 134.5 129.7 130.9 167.2

135.6 129.2 129.9 131.6 129.9 129.2 146.6 118.5 167.8 130.8 130.9 129.8 134.6 129.8 130.9 167.3

7.53 (1H, d, 7.5) 7.40 (1H, t, 7.5) 7.40 (1H, t, 7.5) 7.40 (1H, t, 7.5) 7.53 (1H, d, 7.5) 7.74 (1H, d, 16.0) 6.54 (1H, d, 16.0) 8.15 (1H, dd, 1.0, 7.5) 7.53 (1H, t, 7.5) 7.65 (1H, t, 7.5) 7.53 (1H, t, 7.5) 8.15 (1H, dd, 1.0, 7.5)

1-O-Cinnamoyl 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3-O-Benzoyl 1 2 3 4 5 6 7

a)đo trong CD3OD, b)125MHz, c)500 MHz, *tín hiệu bị che khuất #C của -D-[(1-O-cinnamoyl)-(3-O-benzoyl)]-fructofuranosyl-(21)--D- glucopyranosyl-(21)-6-O-acetyl--D-glucopyranoside đo trong CD3OD [122]

3.1.4. Xác định cấu trúc hợp chất 4

Hợp chất 4 được tách ra dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Trên phổ 1H NMR của hợp chất 4 xuất hiện tín hiệu của hai vòng thơm có hệ tương tác

ABX tại [H 7.27 (d, J = 2.0 Hz, H-2), 6.84 (d, J = 8.0 Hz, H-5), và 7.16 (dd,

J = 2.0, 8.5 Hz, H-6)] và [H 7.21 (d, J = 2.0 Hz, H-2), 6.84 (d, J = 8.0 Hz,

H-5), và 7.11 (2.0, J = 8.5 Hz, H-6)] cùng với tín hiệu proton olefin của hai

liên kết đôi mang cấu hình trans tại H 7.75 (d, J = 16.0 Hz, H-7), 6.47 (d, J =

16.0 Hz, H-8), 7.69 (d, J = 16.0 Hz, H-7), và 6.42 (d, J = 16.0 Hz, H-8)

gợi ý sự xuất hiện của hai đơn vị feruloyl trong phân tử (Hình 3.22). Phổ 1H

NMR cũng ghi nhận tín hiệu một proton anomer tại H 5.51 (1H, d, J = 4.5 Hz,

H-1) gợi ý sự có mặt của một đơn vị đường -glucopyranose của đường

sucrose. Ngoài ra trên phổ còn ghi nhận tín hiệu của hai nhóm methoxy tại H

3.92 (6H, s) và tín hiệu của một nhóm methyl tại H 2.10 (3H, s).

Hình 3.22. Phổ 1H–NMR của hợp chất 4

Phổ 13C NMR ghi nhận tín hiệu của 34 carbon, trong đó có 12 carbon

thuộc đường sucrose, 18 tín hiệu carbon của hai đơn vị feruloyl, hai nhóm

methoxy, và một nhóm acetyl [C 172.9 và 20.9] (Hình 3.23). Tiến hành so sánh số liệu phổ 13C NMR của hợp chất 4 với hợp chất 1 thấy có sự tương đồng

về phần cấu trúc của đường sucrose, điểm khác biệt là có sự thay thế đơn vị

3,4,5-trimethoxycinnamoyl và p-hydroxybenzoyl ở hợp chất 1 bằng 2 đơn vị

trans-feruloyl và sự xuất hiện của một nhóm acetyl ở hợp chất 4 (Bảng 3.4).

Hình 3.23. Phổ 13C-NMR của hợp chất 4

Cấu trúc của hợp chất 4 tiếp tục được khẳng định thông qua các phân

tích trên phổ hai chiều HSQC và HMBC (Hình 3.25 và 3.26). Trên phổ HMBC

xuất hiện tương tác giữa H 3.92 với C 149.5 (C-3 và C-3) xác nhận vị trí

của hai nhóm methoxy ở C-3 và C-3 (Hình 3.27). Tương tác HMBC tác

giữa H 5.51 (H-3) với C 168.3 (C-9) và giữa H 4.56/4.52 (H2-6) với C

168.9 (C-9) cho phép xác định vị trí của hai đơn vị feruloyl lần lượt tại vị trí

C-3 của đường fructose và C-6 của đường glucose. Tương tác HMBC từ H

4.60/4.15 (H2-6) tới C 172.9 và 81.3 (C-5) cho phép xác định nhóm acetyl tại

vị trí C-6. Qua các phân tích trên, hợp chất 4 được xác định là 6-acetyl-3,6-

diferuloylsucrose (Hình 3.24), có công thức phân tử là C34H40O18 (M = 736)

[123]. Do hợp chất này đã bị phân hủy trong quá trình lưu trữ mẫu nên đã

không phân tích phổ khối lượng của hợp chất này.

Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất 4

Hình 3.25. Phổ HSQC của hợp chất 4

Hình 3.26. Phổ HMBC của hợp chất 4

Hình 3.27. Các tương tác HMBC chính của hợp chất 4

H

C -D-Fructofuranosyl 1

C 65.7

a,b C 65.7

2 3 4 5 6

104.8 79.5 74.0 84.7 63.3

104.9 79.0 74.4 81.3 65.6

6-OAc

92.7 73.1 75.2 71.7 72.2 65.0

172.9 20.9 92.6 73.1 74.9 71.9 72.2 65.6

-D-Glucopyranosyl 1 2 3 4 5 6

126.0 111.9 148.9 151.5 116.6

127.7 112.1 149.5 151.1 116.6

a,c (mult., J in Hz) 3.65 (1H, s) 3.63 (1H, s) 5.51 (1H, d, 8.0) 3.65* 4.19* 4.60 (1H, dd, 1.5, 12.0) 4.15 (1H, dd, 7.0, 12.0) 2.10 (3H, s) 5.51 (1H, d, 4.5) 3.47 (1H, dd, 4.5, 9.5) 3.65* 3.27 (1H, t, 9.0) 4.23* 4.56 (1H, dd, 6.0, 12.0) 4.52 (1H, br d, 12.0) 7.27 (1H, d, 2.0) 6.84 (1H, d, 8.0)

Feruloyl moieties 1 2 3 4 5

Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của chất 4 và chất tham khảo

123.8 146.3 114.9 167.7 55.9 125.9 111.2 148.8 151.5 116.6 123.8 145.7 114.4 166.9 55.9

124.3 147.9 115.2 168.3 56.5 127.7 111.8 149.5 150.9 116.5 124.2 147.1 114.8 168.9 56.5

7.16 (1H, dd, 2.0, 8.5) 7.75 (1H, d, 16.0) 6.47 (1H, d, 16.0) 3.92 (3H, s) 7.21 (1H, d, 2.0) 6.84 (1H, d, 8.0) 7.11 (1H, dd, 2.0, 8.0) 7.69 (1H, d, 16.0) 6.42 (1H, d, 16.0) 3.92 (3H, s)

6 7 8 9 3-OCH3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3-OCH3

a)đo trong CD3OD, b)125MHz, c)500 MHz, *tín hiệu bị che khuất

#C của 3,6-O-diferuloylsucrose đo trong C5D5N [124]

3.1.5. Xác định cấu trúc hợp chất 5

Hợp chất 5 được tách ra dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Công

thức phân tử của hợp chất 5 được xác định là C34H42O19 bởi tín hiệu ion [M-

H]- tại m/z 753.2232 (tính toán cho công thức C34H41O19, 753.2242) trên phổ

khối lượng phân giải cao HRESITOFMS (Hình 3.28).

Hình 3.28. Phổ khối lượng phân giải cao của hợp chất 5

Tiến hành so sánh các số liệu phổ 1H NMR (Hình 3.29) và 13C NMR

(Hình 3.30) của hợp chất 5 với hợp chất 4 cho thấy cấu trúc của hai hợp chất

này gần như tương đồng, điểm khác biệt là phổ NMR của hợp chất 5 có thêm

tín hiệu của 2 nhóm methoxy tại H 3.84/C 56.8 (5-OCH3) và H 3.81/C

56.8 (5-OCH3) và không ghi nhận sự xuất hiện của nhóm acetyl trong phân

tử. Tiến hành so sánh các số liệu phổ 1H NMR và 13C NMR của hợp chất 5

với một hợp chất phenolic glycoside đã biết cho kết quả hoàn toàn tương

đồng [121] (Bảng 3.5), do đó cấu trúc hóa học của hợp chất 5 được xác định

là -D-(3-O-sinapoyl)-fructofuranosyl--D-(6-O-sinapoyl)-glucopyranoside

(Hình 3.31), có công thức phân tử là C34H42O19 (M = 754).

Hình 3.29. Phổ 1H–NMR của hợp chất 5

Hình 3.30. Phổ 13C-NMR của hợp chất 5

Hình 3.31. Phổ DEPT135 của hợp chất 5

Hình 3.32. Cấu trúc hóa học của hợp chất 5

a,b

a,c (mult., J in Hz)

C

H

-D-Fructofuranosyl

65.73

65.6

3.66 (1H, d, 13.2)

3.61 (1H, d, 13.2)

104.87

104.8

5.53 (1H, d, 8.0)

79.37

79.3

4.51 (1H, t, 8.0)

74.20

74.1

3.99 (1H, m)

84.30

84.2

3.88*/3.77*

63.76

63.7

-D-Glucopyranosyl

5.52 (1H, d, 4.0)

92.68

92.6

1

3.50 (1H, dd, 4.0, 9.5)

73.10

73.0

2

3.70*

75.08

75.0

3

3.35*

71.93

71.8

4

Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của chất 5 và chất tham khảo

4.28 (1H, m)

72.49

72.4

5

4.68 (1H, br d, 10.8)

65.55

65.5

6

4.24 (1H, dd, 5.0, 10.8)

Sinapoyl

125.86

126.5

1

6.88 (1H, s)

107.02

106.9

2

149.58

149.3

3

140.57

139.5

4

149.58

149.3

5

6.88 (1H, s)

107.02

106.9

6

7.67 (1H, d, 16.0)

147.12

147.2

7

6.46 (1H, d, 16.0)

114.87

115.7

8

168.41

169.1

9

3.84 (6H, s)

56.84

56.8

3,5-OCH3

Sinapoyl

125.86

126.5

1

6.84 (1H, s)

107.20

106.8

2

149.62

149.3

3

140.85

139.3

4

149.62

149.3

5

6.84 (1H, s)

107.20

106.8

6

7.58 (1H, d, 16.0)

147.43

147.9

7

6.45 (1H, d, 16.0)

115.33

115.3

8

169.21

168.2

9

56.88

56.8

3.81 (6H, s)

3,5-OCH3

a)đo trong CD3OD, b)100 MHz, c)400 MHz, *tín hiệu bị che khuất

#C của -D-(3-O-sinapoyl)-fructofuranosyl--D-(6-O-sinapoyl)-glucopyranoside

trong CD3OD [121]

3.2. Phân tích định lượng

3.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích

Qua tiến hành khảo sát bước sóng cho độ hấp thụ cực đại (Hình 3.33),

tỷ lệ thành phần pha động, thể tích tiêm mẫu, tốc độ dòng, điều kiện sắc ký

thích hợp để định lượng hợp chất 1 đã được xây dựng như đã trình bày ở phần

thực nghiệm (Bảng 2.1). Với điều kiện sắc ký này, chất (1) có thời gian lưu là

14.9 phút và được tách khỏi các pic khác trong mẫu phân tích (Hình 3.34).

Hàm lượng chất phân tích được xác định dựa vào diện tích pic thu được và

đường chuẩn [125, 126].

Hình 3.33. Kết quả khảo sát bước sóng hấp thụ hợp chất 1

Hình 3.34. Sắc ký đồ hợp chất 1 nồng độ 1.0 mg/mL (A) và dịch chiết

MeOH của viễn chí nồng độ 30 mg/mL (B)

3.2.2. Phân tích định lượng hợp chất 1

Tiến hành sắc ký phân tích 3 lần mẫu chuẩn hợp chất 1 ở các nồng độ

theo điều kiện sắc ký đã chọn. Kết quả cho thấy có sự ổn định cao về thời

gian lưu và diện tích pic chứng tỏ hệ thống sắc ký là phù hợp cho quá trình

phân tích định lượng hợp chất.

Tiến hành phân tích sắc ký các mẫu chuẩn có nồng độ từ 0.025-1.0 mg/mL

theo phương pháp đã chọn và thiết lập mối quan hệ giữa diện tích pic với nồng độ

chất chuẩn (Bảng 3.6). Từ kết quả này sẽ tiến hành xây dựng đường chuẩn.

Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ HPLC của hợp chất 1

Stt Diện tích pic Diện tích pic LT RT (phút)

Nồng độ (mg/mL) 0.025 1 347619 441876 14,9

0.05 2 890622 839080 14,9

0.1 3 1786132 1633487 14,9

0.5 4 7799858 7988749 14,9

1.0 5 16011785 15932825 14,9

Bằng phương pháp phân tích hồi quy tuyến tính một lớp (One way

ANOVA) đã xác định được hệ số tương quan hồi quy giữa nồng độ chất và

diện tích pic thu được trên phổ, từ đó xác định được phương trình hồi quy

tuyến tính theo nguyên tắc là: từ các đám mây điểm thực nghiệm đo được tính

toán sao cho tổng bình phương khoảng cách đến đường hồi quy lý thuyết là

nhỏ nhất (Bảng 3.7).

SUMMARY OUTPUT

Regression Statistics

Multiple R

0.99978

R Square

0.99957

Adjusted R

0.99942

Square

Standard

159954

Bảng 3.7. Kết quả phân tích phương sai cho hợp chất 1

Error

Observations

ANOVA

Significance F

1.77208E+14 1.77E+14 6926.1952

3.824E-06

Regression

76755669931 2.56E+10

Residual

1.77285E+14

Total

Upper

Lower

Upper

Coefficients Standard Error

t Stat

P-value

Lower 95%

95%

99.0%

Intercept

44672

95954

0.466

0.673

-260697

350041

-515788

605132

Nồng độ

15888153

190909

83.224

0.0000038

15280596

16495710 14773072 17003234

(mg/mL)

Kết quả phân tích phương sai cho thấy trong khoảng nồng độ phân tích

có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ hợp chất 1 với hệ

số tương quan R = 0.99978. Qua đó, phương trình hồi quy tuyến tính được

xác định là Y = 15888153Xi + 44672 (trong đó Y – diện tích pic; Xi – nồng

độ chất tương ứng). Từ phương trình hồi quy, tiến hành xây dựng đường

chuẩn của hợp chất 1 để phục vụ cho việc định lượng hợp chất nghiên cứu

trong nguyên liệu (Hình 3.35).

Hình 3.35. Đường chuẩn mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ (1)

Như vậy, với sự ổn định của việc lặp lại các lần đo cộng thêm sự tương

quan chặt chẽ giữa nồng độ hợp chất 1 và diê ̣n tích pic thu được trên sắc ký đồ HPLC, phương pháp này là tối ưu cho việc phân tích đi ̣nh lươ ̣ng hợp chất 1 trong mẫu nghiên cứ u. 3.2.3. Phân tích định lượng hợp chất 3

Tương tự các bước phân tích định lượng hợp chất 1, bước sóng cho độ

hấp thụ cực đại (Hình 3.36), tỷ lệ thành phần pha động, thể tích bơm mẫu, tốc

độ dòng, điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng hợp chất 3 cũng được xây

dựng. Với điều kiện sắc ký này, hợp chất 3 có thời gian lưu là 17.3 phút và

được tách khỏi các pic khác trong mẫu phân tích (Hình 3.37).

Hình 3.36. Kết quả khảo sát bước sóng hấp thụ hợp chất 3

Hình 3.37. Sắc ký đồ hợp chất 3 nồng độ 1.0 mg/mL (A) và dịch chiết MeOH của viễn chí nồng độ 30 mg/mL (B)

Tương tự như phân tích hợp chất 1, các bước phân tích định lượng hợp

chất 3 cũng được thực hiện tương tự và kết quả thu được như sau:

Bảng 3.8. Kết quả phân tích HPLC của hợp chất 3

Nồng độ RT Stt Diện tích pic Diện tích pic LT (mg/mL) (phút)

0.025 1 334555 461890 17.3

0.1 2 1590538 1559487 17.3

0.5 3 7605744 7413333 17.3

1.0 4 14634513 14730640 17.3

SUMMARY OUTPUT

Regression Statistics

Multiple R

0.99975

R Square

0.99951

Adjusted R

Square

0.99926

Standard Error

178102.6

Observations

ANOVA

Significance F

Regression

1.28604E+14 1.28604E+14 4054.268207

0.0002466

Residual

63441078840 31720539420

Total

1.28667E+14

Lower

Upper

Coefficients Standard Error

t Stat

P-value

Lower 95% Upper 95%

99.0%

Intercept

96025

129029

0.74

0.53431

-459143

651193

-1184570

1376620

Nồng độ

(mg/ml)

14634615

229840

63.67

0.00025

13645695

15623536 12353492

16915739

Bảng 3.9. Kết quả phân tích phương sai cho hợp chất 3

Phân tích kết quả từ bảng 3.8 và 3.9 cho thấy hệ số tương quan R =

0,99975 và phương trình hồi qui xác định được là Y = 14634615Xi + 96025

(trong đó Y – diện tích pic; Xi – nồng độ chất tương ứng) (Hình 3.38).

Hình 3.38. Đường chuẩn mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ (3)

3.2.4. Kết quả phân tích định lượng

Từ phương trình hồi quy tuyến tính, kết quả định lượng hợp chất 1 và 3

trong cặn chiết mẫu nghiên cứu thu đươ ̣c lần lượt là 0.237 và 0.0261 (%).

Bảng 3.10. Kết quả phân tích định lượng hợp chất 1 và 3

Nồng độ mẫu Tên chất Diện tích Hàm lượng chất Tỷ lệ Stt (mg/mL) phân tích pic phân tích (mg) (%)

30 Hợp chất 1 1174703 0.0711 0.237 1

30 Hợp chất 3 210923 0.00785 0.0261 2

KẾT LUẬN

1. Sử dụng các phương pháp sắc ký kết hợp, năm hợp chất phenolic

glycoside đã được phân lập từ dịch chiết MeOH của rễ cây Viễn chí. Bằng các

phương pháp phân tích hóa lý hiện đại như phổ khối lượng phân giải cao

HRESITOFMS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR, cấu trúc hóa học của

các hợp chất này được xác định là: tenuifoliside A (1), -D-[3-O-(3,4,5-

trimethoxycinnamoyl)]-fructofuranosyl-α-D-[6-O-(4-methoxybenzoyl)]-

glucopyranoside (2), -D-[(1-O-cinnamoyl)-(3-O-benzoyl)]-fructofuranosyl-

(21)--D-glucopyranosyl-(21)-6-O-acetyl--D-glucopyranoside (3), 6-

acetyl-3,6- diferuloylsucrose (4), và -D-(3-O-sinapoyl)-fructofuranosyl--

D-(6-O-sinapoyl)-glucopyranoside (5).

2. Đã xây dựng được phương pháp định lượng hợp chất tenuifoliside A

(1) và -D-[(1-O-cinnamoyl)-(3-O-benzoyl)]-fructofuranosyl-(21)--D-

glucopyranosyl-(21)-6-O-acetyl--D-glucopyranoside (3) trong cao chiết

MeOH mẫu viễn chí bằng phương pháp HPLC, detector PAD với các điều

kiện sắc ký phù hợp. Hàm lượng hợp chất 1 và 3 trong mẫu nghiên cứu được

xác định lần lượt là 0.237 và 0.0261 (%).

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. ĐỗHuyBíchvàcộngsự "Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam",

Nxb Khoa học và Kỹ tghuật Hà Nội 2003, II, 1059-1060.

2. "http://ydvn.net/contents/view/11804.cay-vien-chi-nhat-polygala-

japonica.html".

3. Kim, S. H.; Jang, S. D.; Lee, K. Y.; Sung, S. H.; Kim, Y. C. "Chemical

constituents isolated from Polygala japonica leaves and their inhibitory

effect on nitric oxide production in vitro", Journal of enzyme inhibition

and medicinal chemistry 2009, 24, 230-233.

4. Do, J. C.; Yu, Y. J.; Jung, K. Y.; Son, K. H. "Flavonoids from the

leaves of Polygala japonica", Saengyak Hakhoechi 1992, 23, 9-13.

5. Li, T. Z.; Zhang, W. D.; Yang, G. J.; Liu, W. Y.; Liu, R. H.; Zhang, C.;

Chen, H. S. "New flavonol glycosides and new xanthone from Polygala

japonica", J. Asian Nat. Prod. Res. 2006, 8, 401-409.

6. Xue, Q. C.; Li, C. J.; Zuo, L.; Yang, J. Z.; Zhang, D. M. "Three new

xanthones from the roots of Polygala japonica Houtt", J. Asian Nat.

Prod. Res. 2009, 11, 465-469.

7. Fu, J.; Zuo, L.; Yang, J.; Chen, R.; Zhang, D. "Oligosaccharide

polyester and triterpenoid saponins from the roots of Polygala

japonica", Phytochemistry 2008, 69, 1617-1624.

8. Zhang, D.; Shan, W. "Chemical constituents from roots of Polygala

japonica", Zhongcaoyao 2005, 36, 1767-1771.

9. Li, T. Z.; Zhang, W. D.; Yang, G. J.; Liu, W. Y.; Chen, H. S.; Shen, Y.

H. "Saponins from Polygala japonica and their effects on a forced

swimming test in mice", J. Nat. Prod. 2006, 69, 591-594.

10. Wang, H.; Gao, J.; Zhu, D.; Yu, B. "Two new triterpenoid saponins

isolated from Polygala japonica", Chemical & Pharmaceutical Bulletin

2006, 54, 1739-1742.

11. Wang, H.; Gao, J.; Kou, J.; Zhu, D.; Yu, B. "Anti-inflammatory

activities of triterpenoid saponins from Polygala japonica",

Phytomedicine 2008, 15, 321-326.

12. Xu, X. H.; Zhou, J. F.; Li, T. Z.; Zhang, Z. H.; Shan, L.; Xiang, Z. H.;

Yu, Z. W.; Zhang, W. D.; He, C. "Polygalasaponin G promotes neurite

outgrowth of cultured neuron on myelin", Neuroscience Letters 2009,

460, 41-46.

13. Li, C.; Fu, J.; Yang, J.; Zhang, D.; Yuan, Y.; Chen, N. "Three

triterpenoid saponins from the roots of Polygala japonica Houtt",

Fitoterapia 2012, 83, 1184-1190.

14. Pridham, J. B. "Phenolics in Plants in Health and Disease", Pergamon

Press, New York, NY 1960.

15. Beckman, C. H. "Phenolic-storing cells: keys to programmed cell death and

periderm formation in wilt disease resistance and in general defence

responses in plants?", Physiol. Mol. Plant Pathol. 2000, 57, 101-110.

16. Shahidi, F. "Antioxidants in food and food antioxidants", Nahrung

2000, 44, 158-163.

17. Shahidi, F.; Naczk, M. "Phenolics in Food and Nutraceuticals: Sources,

Applications and Health Effects", CRC Press, Boca Raton, FL 2004.

18. Bengoechea, M. L.; Sancho, A. I.; Bartolomé, B.; Estrella, I.; Gómez-

Cordovés, C.; Hernández, M. T. "Phenolic Composition of Industrially

Manufactured Purées and Concentrates from Peach and Apple Fruits",

J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 4071-4075.

19. Towers, G. H. N.; Harborne (Ed.), J. B. "Biochemistry of Phenolic

Compounds", Academic Press, London, UK 1964, 249–294.

20. Fernandez de Simon, B.; Perez-Ilzarbe, J.; Hernandez, T.; Gomez-

Cordoves, C.; Estrella, I. "Importance of phenolic compounds for the

characterization of fruit juices", J. Agric. Food Chem. 1992, 40, 1531-1535.

21. Wallace, G.; Fry, S. C. "Phenolic components of the plant cell wall",

International review of cytology 1994, 151, 229-267.

22. Baucher, M.; Monties, B.; Montagu, M. V.; Boerjan, W. "Biosynthesis and

Genetic Engineering of Lignin", Crit. Rev. Plant Sci. 1998, 17, 125-197.

23. Kamisaka, S.; Takeda, S.; Takahashi, K.; Shibata, K. "Diferulic and

ferulic acid in the cell wall of Avena coleoptiles-Their relationships to

mechanical properties of the cell wall", Physiol. Plant 1990, 78, 1-7.

24. Scalbert, J. A. "Polyphenolic Phenomena", INRA, Paris, France 1993.

25. Brett, C. T.; Wende, G.; Smith, A. C.; Waldron, K. W. "Biosynthesis of

cell-wall ferulate and diferulates", J. Sci. Food Agric. 1999, 79, 421-424.

26. Renger, A.; Steinhart, H. "Ferulic acid dehydrodimers as structural

elements in cereal dietary fibre", Eur. Food Res. Technol. 2000, 211,

422-428.

27. Wende, G.; Waldron, K. W.; Smith, A. C.; Brett, C. T. "Developmental

changes in cell-wall ferulate and dehydrodiferulates in sugar beet",

Phytochemistry 1999, 52, 819-827.

28. Ng, A.; Harvey, A. J.; Parker, M. L.; Smith, A. C.; Waldron, K. W.

"Effect of Oxidative Coupling on the Thermal Stability of Texture and

Cell Wall Chemistry of Beet Root (Beta vulgaris)", J. Agric. Food

Chem. 1998, 46, 3365-3370.

29. Waldron, K. W.; Ng, A.; Parker, M. L.; Parr, A. J. "Ferulic Acid

Dehydrodimers in the Cell Walls of Beta vulgaris and their Possible

Role in Texture", J Sci. Food Agric. 1997, 74, 221-228.

30. Dai, J.; Mumper, R. J. "Plant phenolics: extraction, analysis and their

antioxidant and anticancer properties", Molecules (Basel, Switzerland)

2010, 15, 7313.

31. Garcia-Salas, P.; Morales-Soto, A.; Segura-Carretero, A.; Fernandez-

Gutierrez, A. "Phenolic-compound-extraction systems for fruit and

vegetable samples", Molecules (Basel, Switzerland) 2010, 15, 8813-8826.

32. Vermerris, W.; Nicholson, R. "Phenolic compound biochemistry.

Families of phenolic compounds and means of classification", Springer

Science & Business Media, New York 2006, 1–34.

33. Balasundram, N.; Sundram, K.; Samman, S. "Phenolic compounds in

plants and agri-industrial by-products: antioxidant activity, occurrence,

and potential uses", Food Chem. 2006, 99, 191-203.

34. Cai, Y.; Luo, Q.; Sun, M.; Corke, H. "Antioxidant activity and phenolic

compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with

anticancer", Life sciences 2004, 74, 2157-2184.

35. Cai, Y. Z.; Mei, S.; Jie, X.; Luo, Q.; Corke, H. "Structure-radical

scavenging activity relationships of phenolic compounds from traditional

Chinese medicinal plants", Life sciences 2006, 78, 2872-2888.

36. Huang, W. Y.; Cai, Y. Z.; Zhang, Y. "Natural phenolic compounds

from medicinal herbs and dietary plants: potential use for cancer

prevention", Nutrition and cancer 2010, 62, 1-20.

37. Shan, B.; Cai, Y. Z.; Sun, M.; Corke, H. "Antioxidant capacity of 26

spice extracts and characterization of their phenolic constituents", J.

Agric. Food Chem. 2005, 53, 7749-7759.

38. Surveswaran, S.; Cai, Y.-Z.; Corke, H.; Sun, M. "Systematic evaluation

of natural phenolic antioxidants from 133 Indian medicinal plants",

Food Chem. 2007, 102, 938-953.

39. Cai, Y.; Sun, M.; Corke, H. "Antioxidant activity of betalains from plants

of the Amaranthaceae", J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 2288-2294.

40. Sampietro, D. A.; Vattuone, M. A. "Sugarcane Straw and its

Phytochemicals as Growth Regulators of Weed and Crop Plants", Plant

Growth Regul 2006, 48, 21-27.

41. Stagos, D.; Kazantzoglou, G.; Theofanidou, D.; Kakalopoulou, G.;

Magiatis, P.; Mitaku, S.; Kouretas, D. "Activity of grape extracts from

Greek varieties of Vitis vinifera against mutagenicity induced by

bleomycin and hydrogen peroxide in Salmonella typhimurium strain

TA102", Mutation research 2006, 609, 165-175.

42. Huang, W. Y.; Cai, Y. Z.; Xing, J.; Corke, H.; Sun, M. "A potential

antioxidant resource: endophytic fungi isolated from traditional

Chinese medicinal plants", Econ Bot 2007, 61, 14–30.

43. Luk, J. M.; Wang, X.; Liu, P.; Wong, K. F.; Chan, K. L.; Tong, Y.; Hui,

C. K.; Lau, G. K.; Fan, S. T. "Traditional Chinese herbal medicines for

treatment of liver fibrosis and cancer: from laboratory discovery to

clinical evaluation", Liver international: official journal of the

International Association for the Study of the Liver 2007, 27, 879-90.

44. Han, X.; Shen, T.; Lou, H. "Dietary Polyphenols and Their Biological

Significance", Int. J. Mol. Sci. 2007, 8, 950-988.

45. Surh, Y. J. "Cancer chemoprevention with dietary phytochemicals",

Nature reviews. Cancer 2003, 3, 768-780.

46. Adom, K. K.; Liu, R. H. "Antioxidant activity of grains", J. Agric.

Food Chem. 2002, 50, 6182-6187.

47. Jakobek, L.; Seruga, M.; Novak, I.; Medvidovic-Kosanovic, M.

"Flavonols, phenolic acids, and antioxidant activity of some red fruits",

Deut Lebensm- Runsch 2007, 103, 369-378.

48. Lin, D.; Xiao, M.; Zhao, J.; Li, Z.; Xing, B.; Li, X.; Kong, M.; Li, L.;

Zhang, Q.; Liu, Y.; Chen, H.; Qin, W.; Wu, H.; Chen, S. "An overview

of plant phenolic compounds and their importance in human nutrition

and management of type 2 diabetes", Molecules (Basel, Switzerland)

2016, 21, 1374.

49. Scalbert, A.; Manach, C.; Morand, C.; Remesy, C.; Jimenez, L.

"Dietary polyphenols and the prevention of diseases", Critical reviews

in food science and nutrition 2005, 45, 287-306.

50. Hollman, P. C.; Katan, M. B. "Dietary flavonoids: intake, health effects

and bioavailability", Food and Chemical Toxicology 1999, 37, 937-942.

51. Cotelle, N. "Role of flavonoids in oxidative stress", Current topics in

medicinal chemistry 2001, 1, 569-90.

52. Lala, G.; Malik, M.; Zhao, C.; He, J.; Kwon, Y.; Giusti, M. M.;

Magnuson, B. A. "Anthocyanin-rich extracts inhibit multiple biomarkers

of colon cancer in rats", Nutrition and cancer 2006, 54, 84-93.

53. Huang, M. T.; Xie, J. G.; Wang, Z. Y.; Ho, C. T.; Lou, Y. R.; Wang, C.

X.; Hard, G. C.; Conney, A. H. "Effects of tea, decaffeinated tea, and

caffeine on UVB light-induced complete carcinogenesis in SKH-1

mice: demonstration of caffeine as a biologically important constituent

of tea", Cancer Res. 1997, 57, 2623-2629.

54. Chung, F. L.; Wang, M.; Rivenson, A.; Iatropoulos, M. J.; Reinhardt, J.

C.; Pittman, B.; Ho, C. T.; Amin, S. G. "Inhibition of lung

carcinogenesis by black tea in Fischer rats treated with a tobacco-

specific carcinogen: caffeine as an important constituent", Cancer Res.

1998, 58, 4096-4101.

55. Sales, P. M.; Souza, P. M.; Simeoni, L. A.; Silveira, D. "alpha-Amylase

inhibitors: a review of raw material and isolated compounds from plant

source", Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences 2012, 15, 141-183.

56. Costacou, T.; Mayer-Davis, E. J. "Nutrition and prevention of type 2

diabetes", Annual review of nutrition 2003, 23, 147-170.

57. Hung, H. C.; Joshipura, K. J.; Jiang, R.; Hu, F. B.; Hunter, D.; Smith-

Warner, S. A.; Colditz, G. A.; Rosner, B.; Spiegelman, D.; Willett, W.

C. "Fruit and vegetable intake and risk of major chronic disease",

Journal of the National Cancer Institute 2004, 96, 1577-1584.

58. Robbins, R. J. "Phenolic Acids in Foods: An Overview of Analytical

Methodology", J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 2866-2887.

59. Palma, M.; Taylor, L. T. "Extraction of polyphenolic compounds from

grape seeds with near critical carbon dioxide", J. Chromatogr. A 1999,

849, 117-124.

60. Price, M. L.; Butler, L. G. "Rapid visual estimation and

spectrophotometric determination of tannin content of sorghum grain",

J. Agric. Food Chem. 1977, 25, 1268-1273.

61. Khanna, S. K.; Viswanathan, P. N.; Krishnan, P. S.; Sanwal, G. G.

"Extraction of total phenolics in the presence of reducing agents",

Phytochemistry 1968, 7, 1513-1517.

62. Naczk, M.; Shahidi, F. "Extraction and analysis of phenolics in food",

J. Chromatogr. A 2004, 1054, 95-111.

63. "AOAC Association of Official Analytical Chemists. Official Methods

of Analysis (12th ed.)", AOAC, Washington, DC 1980.

64. Deshpande, S. S.; Cheryan, M. "Determination of Phenolic Compounds

of Dry Beans Using Vanillin, Redox and Precipitation Assays", J. Food

Sci. 1987, 52, 332-334.

65. Hoff, J. E.; Singleton, K. I. "A method for determination of tannins in foods

by means of immobilized protein", J. Food Sci. 1977, 42, 1566-1569.

66. Goldstein, J. L.; Swain, T. "Changes in tannins in ripening fruits",

Phytochemistry 1963, 2, 371-383.

67. Sarkar, S. K.; Howarth, R. E. "Specificity of the vanillin test for

flavanols", J. Agric. Food Chem. 1976, 24, 317-320.

68. McMurrough, I.; McDowell, J. "Chromatographic separation and

automated analysis of flavanols", Anal. Biochem. 1978, 91, 92-100.

69. Thies, M.; Fischer, R. "Über eine neue Farbreaktion zum

mikrochemischen Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von

Catechinen", Microchim. Acta 1971, 59, 9-13.

70. Porter, L. J.; Hrstich, L. N.; Chan, B. G. "The conversion of

procyanidins and prodelphinidins to cyanidin and delphinidin",

Phytochemistry 1985, 25, 223-230.

71. Haslam, E. "Galloyl esters in the Aceraceae", Phytochemistry 1965, 4,

495-498.

72. Bate-Smith, E. C. "Astringent tannins of Acer species", Phytochemistry

1977, 16, 1421-1426.

73. Hartzfeld, P. W.; Forkner, R.; Hunter, M. D.; Hagerman, A. E.

"Determination of Hydrolyzable Tannins (Gallotannins and

Ellagitannins) after Reaction with Potassium Iodate", J. Agric. Food

Sci. 2002, 50, 1785-1790.

74. Owades, J. L.; Rubin, G.; Brenner, M. W. "Food Tannins

Measurement, Determination of Food Tannins by Ultraviolet

Spectrophotometry", J. Agric. Food Chem. 1958, 6, 44-46.

75. Blair, R.; Reichert, R. D. "Carbohydrate and phenolic constituents in a

comprehensive range of rapeseed and canola fractions: Nutritional

significance for animals", J. Sci. Food Agric. 1984, 35, 29-35.

76. Naczk, M.; Wanasundara, P. K. J. P. D.; Shahidi, F. "Facile

spectrophotometric quantification method of sinapic acid in hexane-

extracted and methanol-ammonia-water-treated mustard and rapeseed

meals", J. Agric. Food Chem. 1992, 40, 444-448.

77. Mabry, T. J.; Markham, K. R.; Thomas, M. B. "The Systematic

Identification of Flavonoids", Springer-Verlag, New York, NY 1970.

78. Monedero, L.; Olalla, M.; Martín-Lagos, F.; Lopez, H.; Lopez, M. C.

"Application of Chemometric Techniques in Obtaining Macerates with

Phenolic Compound Content Similar to That of Wines from the Jerez-

Shery Region Subjected to Oxidative Aging", J. Agric. Food Chem.

1999, 47, 1836-1844.

79. Edelmann, A.; Diewok, J.; Schuster, K. C.; Lendl, B. "Rapid Method

for the Discrimination of Red Wine Cultivars Based on Mid-Infrared

Spectroscopy of Phenolic Wine Extracts", J. Agric. Food Chem. 2001,

49, 1139-1145.

80. Brenna, O. V.; Pagliarini, E. "Multivariate Analysis of Antioxidant

Power and Polyphenolic Composition in Red Wines", J. Agric. Food

Chem. 2001, 49, 4841-4844.

81. Briandet, R.; Kemsley, E. K.; Wilson, R. H. "Discrimination of Arabica

and Robusta in Instant Coffee by Fourier Transform Infrared Spectroscopy

and Chemometrics", J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 170-174.

82. Schulz, H.; Engelhardt, U. H.; Wegent, A.; Drews, H. H.; Lapczynski,

S. "Application of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy to the

Simultaneous Prediction of Alkaloids and Phenolic Substances in

Green Tea Leaves", J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 5064-5067.

83. Dabrowski, K. J.; Sosulski, F. W. "Quantitation of free and

hydrolyzable phenolic acids in seeds by capillary gas-liquid

chromatography", J. Agric. Food Chem. 1984, 32, 123-127.

84. Liggins, J.; Bluck, L. J. C.; Coward, W. A.; Bingham, S. A. "Extraction

and Quantification of Daidzein and Genistein in Food", Anal. Biochem.

1998, 264, 1-7.

85. Thomas, B. V.; Schreiber, A. A.; Weisskopf, C. P. "Simple Method for

Quantitation of Capsaicinoids in Peppers Using Capillary Gas

Chromatography", J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 2655-2663.

86. Friedman, M.; Kozukue, N.; Harden, L. A. "Cinnamaldehyde Content

in Foods Determined by Gas Chromatography−Mass Spectrometry", J.

Agric. Food Chem. 2000, 48, 5702-5709.

87. Hernes, P. J.; Hedges, J. I. "Determination of condensed tannin

monomers in environmental samples by capillary gas chromatography

of acid depolymerization extracts", Anal Chem 2000, 72, 5115-5124.

88. Jurenitsch, J.; David, M.; Heresch, F.; Kubelka, W. "Detection and

Identification of new Pungent Compounds in Fruits of Capsicum",

Planta Med. 1979, 36, 61-67.

89. Jurenitsch, J.; Leinmüller, R. "Quantifizierung von

nonylsäurevanillylamid und anderen capsaicinoiden in

scharfstoffgemischen von capsicumfrüchten und -zubereitungen durch

gas-flüssig-chromatographie an glaskapillarsäuren", J. Chromatogr. A

1980, 189, 389-397.

90. Chassagne, D.; Crouzet, J.; Bayonove, C. L.; Baumes, R. L.

"Identification of Passion Fruit Glycosides by Gas

Chromatography/Mass Spectrometry", J. Agric. Food Chem. 1998, 46,

4352-4357.

91. Senter, S. D.; Robertson, J. A.; Meredith, F. I. "Phenolic Compounds of

the Mesocarp of Cresthaven Peaches during Storage and Ripening", J.

Food Sci. 1989, 54, 1259-1268.

92. Sanders, T. H.; McMichael, R. W.; Hendrix, K. W. "Occurrence of

Resveratrol in Edible Peanuts", J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 1243-1246.

93. Montedoro, G.; Servili, M.; Baldioli, M.; Miniati, E. "Simple and

hydrolyzable phenolic compounds in virgin olive oil. 1. Their

extraction, separation, and quantitative and semiquantitative evaluation

by HPLC", J. Agric. Food Chem. 1992, 40, 1571-1576.

94. Brenes, M.; García, A.; García, P.; Rios, J. J.; Garrido, A. "Phenolic

Compounds in Spanish Olive Oils", J. Agric. Food Chem. 1999, 47,

3535-3540.

95. Mateos, R.; Espartero, J. L.; Trujillo, M.; Ríos, J. J.; León-Camacho,

M.; Alcudia, F.; Cert, A. "Determination of Phenols, Flavones, and

Lignans in Virgin Olive Oils by Solid-Phase Extraction and High-

Performance Liquid Chromatography with Diode Array Ultraviolet

Detection", J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 2185-2192.

96. Romero, C.; Brenes, M.; García, P.; Garrido, A. "Hydroxytyrosol 4-β-

d-Glucoside, an Important Phenolic Compound in Olive Fruits and

Derived Products", J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3835-3839.

97. Hostettmann, K.; Hostettman, M.; Harborne, J. B.; Mabry (Eds.), T. J.

"The Flavonoids: Advances in Research", Chapman & Hall, New York,

NY 1982, 1–18.

98. Daigle, D. J.; Conkerton, E. J. "Analysis of Flavonoids by HPLC", J.

Liq. Chromatogr. 1983, 6, 105-118.

99. Daigle, D. J.; Conkerton, E. J. "Analysis of Flavonoids by HPLC: An

Update", J. Liq. Chromatogr. 1988, 11, 309-325.

100. Merken, H. M.; Beecher, G. R. "Measurement of Food Flavonoids by

High-Performance Liquid Chromatography: A Review", J. Agric. Food

Chem. 2000, 48, 577-599.

101. Rodriguez-Arcos, R. C.; Smith, A. C.; Waldron, K. W. "Effect of

Storage on Wall-Bound Phenolics in Green Asparagus", J. Agric. Food

Chem. 2002, 50, 3197-3203.

102. Arts, I. C. W.; van de Putte, B.; Hollman, P. C. H. "Catechin Contents

of Foods Commonly Consumed in The Netherlands. 1. Fruits,

Vegetables, Staple Foods, and Processed Foods", J. Agric. Food Chem.

2000, 48, 1746-1751.

103. Cabrera, C.; Giménez, R.; López, M. C. "Determination of Tea

Components with Antioxidant Activity", J. Agric. Food Chem. 2003,

51, 4427-4435.

104. Carando, S.; Teissedre, P.-L.; Pascual-Martinez, L.; Cabanis, J.-C.

"Levels of Flavan-3-ols in French Wines", J. Agric. Food Chem. 1999,

47, 4161-4166.

105. Edenharder, R.; Keller, G.; Platt, K. L.; Unger, K. K. "Isolation and

Characterization of Structurally Novel Antimutagenic Flavonoids from

Spinach (Spinacia oleracea)", J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 2767-2773.

106. Tomás-Barberán, F. A.; Gil, M. I.; Cremin, P.; Waterhouse, A. L.;

Hess-Pierce, B.; Kader, A. A. "HPLC−DAD−ESIMS Analysis of

Phenolic Compounds in Nectarines, Peaches, and Plums", J. Agric.

Food Chem. 2001, 49, 4748-4760.

107. Wang, L.-F.; Kim, D.-M.; Lee, C. Y. "Effects of Heat Processing and

Storage on Flavanols and Sensory Qualities of Green Tea Beverage", J.

Agric. Food Chem. 2000, 48, 4227-4232.

108. Zafrilla, P.; Ferreres, F.; Tomás-Barberán, F. A. "Effect of Processing

and Storage on the Antioxidant Ellagic Acid Derivatives and

Flavonoids of Red Raspberry (Rubus idaeus) Jams", J. Agric. Food

Chem. 2001, 49, 3651-3655.

109. Amaral, J. S.; Seabra, R. M.; Andrade, P. B.; Valentão, P. c.; Pereira, J.

A.; Ferreres, F. "Phenolic profile in the quality control of walnut

(Juglans regia L.) leaves", Food Chem. 2004, 88, 373-379.

110. Aaby, K.; Hvattum, E.; Skrede, G. "Analysis of Flavonoids and Other

Phenolic Compounds Using High-Performance Liquid

Chromatography with Coulometric Array Detection: Relationship to

Antioxidant Activity", J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 4595-4603.

111. Mattila, P.; Astola, J.; Kumpulainen, J. "Determination of Flavonoids in

Plant Material by HPLC with Diode-Array and Electro-Array

Detections", J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 5834-5841.

112. de Pascual-Teresa, S.; Treutter, D.; Rivas-Gonzalo, J. C.; Santos-

Buelga, C. "Analysis of Flavanols in Beverages by High-Performance

Liquid Chromatography with Chemical Reaction Detection", J. Agric.

Food Chem. 1998, 46, 4209-4213.

113. Arts, I. C. W.; Hollman, P. C. H. "Optimization of a Quantitative

Method for the Determination of Catechins in Fruits and Legumes", J.

Agric. Food Chem. 1998, 46, 5156-5162.

114. Romani, A.; Minunni, M.; Mulinacci, N.; Pinelli, P.; Vincieri, F. F.; Del

Carlo, M.; Mascini, M. "Comparison among Differential Pulse

Voltammetry, Amperometric Biosensor, and HPLC/DAD Analysis for

Polyphenol Determination", J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 1197-1203.

115. Peng, Z.; Hayasaka, Y.; Iland, P. G.; Sefton, M.; Høj, P.; Waters, E. J.

"Quantitative Analysis of Polymeric Procyanidins (Tannins) from

Grape (Vitis vinifera) Seeds by Reverse Phase High-Performance

Liquid Chromatography", J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 26-31.

116. Barnes, S.; Coward, L.; Kirk, M.; Sfakianos, J. "HPLC-mass

spectrometry analysis of isoflavones", Proceedings of the Society for

Experimental Biology and Medicine. Society for Experimental Biology

and Medicine (New York, N.Y.) 1998, 217, 254-262.

117. Hammerstone, J. F.; Lazarus, S. A.; Mitchell, A. E.; Rucker, R.; Schmitz,

H. H. "Identification of Procyanidins in Cocoa (Theobroma cacao) and

Chocolate Using High-Performance Liquid Chromatography/Mass

Spectrometry", J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 490-496.

118. Bakker, J.; Bridle, P.; Koopman, A. "Strawberry juice colour: The

effect of some processing variables on the stability of anthocyanins", J.

Sci. Food Agric. 1992, 60, 471-476.

119. Wang, J.; Sporns, P. "Analysis of Anthocyanins in Red Wine and Fruit

Juice Using MALDI-MS", J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 2009-2015.

120. Menet, M. C.; Sang, S.; Yang, C. S.; Ho, C. T.; Rosen, R. T. "Analysis

of theaflavins and thearubigins from black tea extract by MALDI-TOF

mass spectrometry", J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 2455-2461.

121. Ikeya, Y.; Sugama, K.; Okada, M.; Mitsuhashi, H. "Four new phenolic

glycosides from Polygala tenuifolia", Chem. Pharm. Bull. 1991, 39,

2600-2605.

122. Miyase, T.; Ueno, A. "Sucrose derivatives from the roots of Polygala

tenuifolia", Shoyakugaku Zasshi 1993, 47, 267-278.

123. Shimomura, H.; Sashida, Y.; Mimaki, Y. "Bitter phenylpropanoid

glycosides from Lilium speciosum var. rubrum", Phytochemistry 1986,

25, 2897-2899.

124. Shimomura, H.; Sashida, Y.; Mimaki, Y.; Iitaka, Y. "Studies on the

Chemical Constituents of Lilium henryi BAKER", Chem. Pharm. Bull.

1988, 36, 2430-2446.

125. Bliesner, D. M., Validating Chromatographic Methods: A Practical

Guide. John Wiley & Sons, Inc.: Hoboken, 2006.

126. Huber, L., Validation of Analytical Methods. Agilent Technologies:

Germany, 2010.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Phổ khối lượng phân giải cao của hợp chất 1

Phụ lục 2. Phổ 1H–NMR của hợp chất 1

Phụ lục 3. Phổ 13C-NMR của hợp chất 1

Phụ lục 4. Phổ HSQC của hợp chất 1

Phụ lục 5. Phổ HMBC của hợp chất 1

Phụ lục 6. Phổ khối lượng phân giải cao của hợp chất 2

Phụ lục 7. Phổ 1H–NMR của hợp chất 2

Phụ lục 8. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2

Phụ lục 9. Phổ HSQC của hợp chất 2

Phụ lục 10. Phổ HMBC của hợp chất 2

Phụ lục 11. Phổ khối lượng phân giải cao của hợp chất 3

Phụ lục 12. Phổ 1H–NMR của hợp chất 3

Phụ lục 13. Phổ 13C-NMR của hợp chất 3

Phụ lục 14. Phổ HSQC của hợp chất 3

Phụ lục 15. Phổ HMBC của hợp chất 3

Phụ lục 16. Phổ 1H–NMR của hợp chất 4

Phụ lục 17. Phổ 13C-NMR của hợp chất 4

Phụ lục 18. Phổ HSQC của hợp chất 4

Phụ lục 19. Phổ HMBC của hợp chất 4

Phụ lục 20. Phổ khối lượng phân giải cao của hợp chất 5

Phụ lục 21. Phổ 1H–NMR của hợp chất 5

Phụ lục 22. Phổ 13C-NMR của hợp chất 5

Phụ lục 23. Phổ DEPT135 của hợp chất 5

Phụ lục 24. Sắc ký đồ hợp chất 1 nồng độ 1.0 mg/mL (A) và dịch chiết

MeOH của viễn chí nồng độ 30 mg/mL (B)

Phụ lục 25. Sắc ký đồ hợp chất 1 nồng độ 0.025 mg/mL

Phụ lục 25. Sắc ký đồ hợp chất 1 nồng độ 0.05 mg/mL

Phụ lục 26. Sắc ký đồ hợp chất 1 nồng độ 0.1 mg/mL

Phụ lục 27. Sắc ký đồ hợp chất 1 nồng độ 0.5 mg/mL

Phụ lục 28. Sắc ký đồ hợp chất 3 nồng độ 1.0 mg/mL (A) và dịch chiết MeOH của viễn chí nồng độ 30 mg/mL (B)

Phụ lục 29. Sắc ký đồ hợp chất 3 nồng độ 0.025 mg/mL

Phụ lục 30. Sắc ký đồ hợp chất 3 nồng độ 0.1 mg/mL

Phụ lục 31. Sắc ký đồ hợp chất 3 nồng độ 0.5 mg/mL

Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Phân tích cấu trúc, hàm lượng một số hợp chất phenolic glycoside từ cây Viễn chí (Polygala japonica Houtt.) bằng phương pháp hóa lí hiện đại

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG

MỘT SỐ HỢP CHẤT PHENOLIC GLYCOSIDE TỪ

CÂY VIỄN CHÍ (POLYGALA JAPONICA HOUTT.)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG

MỘT SỐ HỢP CHẤT PHENOLIC GLYCOSIDE TỪ

CÂY VIỄN CHÍ (POLYGALA JAPONICA HOUTT.)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

Chuyên ngành: Hóa phân tích

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

13C NMR

1H NMR

Khung

Nguồn gốc

Nhóm

Cấu trúc cơ bản

cơ bản

thực vật

Thực

Phenolic Chuẩn bị mẫu

Pha tĩnh

Pha động

phẩm

Thực phẩm

Phenolic

Pha tĩnh

Pha động

Chuẩn bị mẫu

PHỤ LỤC

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok