Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân tích proteomics mô ung thư của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn Thị Ngọc Hà

PHÂN TÍCH PROTEOMICS MÔ UNG THƯ CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------

Nguyễn Thị Ngọc Hà

PHÂN TÍCH PROTEOMICS MÔ UNG THƯ CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

Hà Nội – Năm 2012

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, người thầy

đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu khoa

học và thực hiện luận văn này.

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh học,

trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong suốt thời

gian học tập tại Trường.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị, các bạn sinh viên làm

việc tại Phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng

điểm Công nghệ Enzyme và Protein đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học

tập và thực hiện luận văn tại Phòng.

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm,

giúp đỡ của các cán bộ nhân viên thuộc khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh, Bệnh viện

K Tam Hiệp, Hà Nội và khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Việt Đức, Hà nội. Tôi xin

chân thành cảm ơn.

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn khích lệ

động viên tôi trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, tháng 12 năm 2012

Học viên

Nguyễn Thị Ngọc Hà

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

Chương 1 – TỔNG QUAN ...................................................................................... 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ..................................... 3

1.1.1. Ung thư đại trực tràng là gì? .................................................................... 3

1.1.2. Nguyên nhân dẫn đến ung thư đại trực tràng ........................................... 6

1.1.3. Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng .......................... 8

1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƯ ....................... 12

1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thư ............................................................ 12

1.2.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng để nghiên cứu chỉ thị sinh học ung thư ..................................................................................................... 14

1.3. PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 16

1.3.1. Proteomic là gì? .................................................................................... 16

1.3.2. Công cụ nghiên cứu proteomics ............................................................ 17

1.3.3. Ứng dụng của proteomics trong nghiên cứu ung thư đại trực tràng ........ 19

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 28

2.1. NGUYÊN LIỆU .......................................................................................... 28

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 28

2.1.2. Hóa chất ................................................................................................ 28

2.1.3. Thiết bị .................................................................................................. 29

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 29

2.2.1. Xử lý mẫu mô đại trực tràng.................................................................. 29

2.2.2. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ................................... 31

2.2.3. Điện di hai chiều ................................................................................... 31

2.2.4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều .......................................... 33

2.2.5. Cắt và thủy phân spot ............................................................................ 34

2.2.6. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein ............................................... 35

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................... 37

3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG ................................... 37

3.2. PHÂN TÁCH PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRÊN BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU .................................................................................................. 39

3.3. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU ...................... 41

3.4. XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MALDI-TOF MS ........... 44

3.5. ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN BIỂU HIỆN KHÁC BIỆT .. 52

3.5.1. Protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis ............................... 56

3.5.2. Protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể ................... 58

3.5.3. Protein tham gia cấu trúc tế bào............................................................. 60

3.5.4. Protein tham gia các quá trình trao đổi chất ........................................... 61

3.5.5. Protein liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã, cải biến sau phiên mã, dịch mã ........................................................................................................... 62

KẾT LUẬN ........................................................................................................... 64

KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 66

PHỤ LỤC 1. DANH SÁCH BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ............................................................ i

PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU NCBI SỬ DỤNG PHẦN MỀM MASCOT ........................................................................ ii

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2-DE Điện di hai chiều (Two - Dimensional Electrophoresis)

ABC Ammonium Bicarbonate

AcCN Acetonitrile

AFAP

Hội chứng đa polyp tuyến nhẹ di truyền (Attenuated Familial Adenomatous Polypsis)

APC Adenomatous Polyposis Coli

CHAPS 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid

CHCA α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid

CEA Kháng nguyên phôi thai (Carcinoembryonic Antigen)

CK Cytokeratin

cs Cộng sự

Da Dalton

DTT Dithiothreitol

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

FAP

Hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial Adenomatous Polyposis)

HCCS Suppressor of tumorigenicity 20 protein

HNPCC Hội chứng ung thư đại tràng di truyền không phải đa polyp

(Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer)

HSP Protein sốc nhiệt (Heat sock protein)

HUPO Tổ chức nghiên cứu hệ protein người

(Human Proteome Organisation)

IAA Iodoacetamide

IEF Điện di phân vùng đẳng điện (Isoelectric Focusing)

IPG Gradient pH cố định (Immobilized pH gradient)

LC-MS/MS Sắc ký lỏng kết nối với khối phổ

(Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometry)

MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight

Khối phổ (Mass spectrometry) MS

Đệm muối Photphat (Phosphate Buffer Saline) PBS

Đặc trưng khối peptide (Peptide Mass Fingerprint) PMF

Sodium dodecyl sulfate SDS

SDS-PAGE Điện di trên gel polyacrylamide có SDS

(SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

SELDI-TOF Surface-enhanced laser desorption/ionization time - of - flight

Điểm protein Spot

Kháng nguyên liên quan đến khối u (Tumor Associated Antigens) TAA

Trifluoroacetic acid TFA

Tumor – Lympho node – Metastases TNM

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh

khác nhau

Bảng 2 Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 3 Các bước chạy điện di đẳng điện trên thanh IPG strip dài 17cm

Bảng 4 Số lượng spot protein phân tách trên bản gel điện di hai chiều

Bảng 5 Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản gel điện di hai

chiều của 5 bệnh nhân

Bảng 6 Danh sách các protein được xác định bằng MALDI TOF-MS từ bản gel

mô ung thư so sánh với bản gel mô đại trực tràng bình thường của bệnh

nhân ung thư đại trực tràng

Bảng 7 Tóm tắt chức năng chính của các protein đã được định danh biểu hiện

khác biệt giữa mô ung thư đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình

thường

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Hình ảnh đại trực tràng

Hình 2 Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng

Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Hình 3

Phoretix

Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô đại trực tràng Hình 4

bình thường và mô ung thư đại trực tràng trên cùng bản gel

polyacrylamide 10% có SDS

Điện di kiểm tra mẫu tủa của phân đoạn dịch chiết protein PBS 1 và lysis 1 Hình 5

từ mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư đại trực tràng

Phân tách protein mô đại trực tràng của bệnh nhân mã số 11781 trên Hình 6

bản gel điện di hai chiều

Minh họa các spot biểu hiện khác biệt trên bản gel mô ung thư so với Hình 7

mô bình thường

Các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel điện di hai chiều của Hình 8

mẫu mô ung thư đại trực tràng so với mẫu mô đại trực tràng bình

thường của bệnh nhân ung thư đại trực tràng mã số 11781

Phân tích khối phổ các peptide thu được sau khi thủy phân protein Hình 9

T17B33 bằng enzyme trypsin

Hình 10 Kết quả nhận dạng protein bằng tra cứu cơ sở dữ liệu NCBI sử dụng

phần mềm Mascot

Hình 11 Các nhóm protein theo chức năng

Hình 12 Quá trình apoptosis trong tế bào

Sơ đồ trình diện kháng nguyên của phức hệ phù hợp tổ chức mô cho tế Hình 13

bào lympho T

Hình 14 Cơ chế tác dụng của Zinc finger protein đối với quá trình phiên mã

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

MỞ ĐẦU

Ung thư đại trực tràng là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất trên

thế giới, nó đứng thứ ba chỉ sau ung thư phổi và ung thư vú. Đây là căn bệnh có tỷ

lệ tử vong cao và tỷ lệ mắc bệnh có xu hướng ngày càng tăng. Theo thống kê, năm

2008 ước tính có khoảng 1,24 triệu người trên thế giới được chẩn đoán là mắc ung

thư đại trực tràng, chiếm khoảng 10% trong số các loại ung thư. Số ca tử vong do

ung thư đại trực tràng trong năm 2008 là 610.000 ca trên toàn thế giới, chiếm

khoảng 8% số lượng tử vong do ung thư.

Tại Việt Nam, ung thư đại trực tràng là loại ung thư đứng thứ năm trong các

loại ung thư thường gặp, sau ung thư dạ dày, phổi, vú, vòm họng. Theo thống kê

của Bệnh viện Ung Bướu thành phố Hồ Chí Minh, năm 2008, bệnh viện có 306 ca

bệnh ung thư đại trực tràng và con số này ngày càng gia tăng. Tính đến tháng 9 năm

2009, đã có đến trên 220 bệnh nhân mới đến điều trị ung thư đại trực tràng tại đây

[54]. Tỷ lệ mắc ung thư đại trực tràng là 9% tổng số bệnh nhân ung thư [55].

Việc chẩn đoán và phát hiện sớm ung thư đại trực tràng có ý nghĩa rất quan

trọng, giúp làm tăng hiệu quả điều trị bệnh, giảm tỷ lệ tử vong do loại ung thư này

gây ra. Thực tế cho thấy, nếu phát hiện khối u đại trực tràng ở giai đoạn đầu và chữa

trị kịp thời thì tỷ lệ sống sót của bệnh nhân sau 5 năm sẽ là 80 – 100%. Hiện nay,

một số phương pháp xét nghiệm lâm sàng đang được áp dụng để chẩn đoán ung thư

đại trực tràng như chẩn đoán hình ảnh thông quan nội soi, sinh thiết, chụp X quang,

xét nghiệm tìm máu trong phân, thăm khám trực tiếp, sử dụng chỉ thị CEA. Nhược

điểm của các phương pháp này là thường phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn, phương

pháp nội soi thường gây khó chịu cho bệnh nhân, xét nghiệm máu trong phân cho

nhiều kết quả dương tính và âm tính giả nên hiệu quả chẩn đoán và điều trị bệnh

không cao. Vì vậy, nhu cầu đặt ra cho các nhà khoa học là làm thế nào để tìm ra

được các chỉ thị sinh học đặc trưng để chẩn đoán, phát hiện ung thư đại trực tràng ở

giai đoạn sớm.

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Hiện nay, một trong những hướng nghiên cứu chỉ thị sinh học cho ung thư

đại trực tràng đang được các nhà khoa học quan tâm là sử dụng công cụ proteomics.

Bằng việc phân tích sự biến đổi trong thành phần, số lượng các protein có mặt trong

huyết thanh, dịch cơ thể, mô ung thư của bệnh nhân ung thư, các nhà khoa học hi

vọng tìm ra được các chỉ thị sinh học mới, dễ nhận biết để ứng dụng chẩn đoán ung

thư đại trực tràng ở giai đoạn sớm, nhằm phục vụ công tác chẩn đoán, điều trị bệnh

một cách hiệu quả.

Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân

tích proteomics mô ung thư của bệnh nhân ung thư đại trực tràng“ với mục

tiêu:

- Phân tách hệ protein tách chiết từ mô đại trực tràng bình thường và mô

ung thư đại trực tràng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng.

- Phân tích và so sánh sự biểu hiện khác biệt của các protein ở mô ung thư

đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình thường thông qua biểu hiện của các

điểm protein trên bản gel điện di hai chiều.

- Nhận dạng được một số protein biểu hiện khác biệt đặc trưng giữa mô ung

thư đại trực tràng và mô đại trực tràng bình thường.

Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc

phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Chương 1 – TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.1.1. Ung thư đại trực tràng là gì?

Ung thư là thuật ngữ được sử dụng để chỉ các bệnh liên quan đến việc các tế

bào phân chia mất kiểm soát và có thể xâm lấn các mô khác. Các tế bào ung thư có

thể di căn tới các phần khác của cơ thể thông qua máu hoặc hệ bạch huyết.

Ung thư không chỉ là một bệnh mà bao gồm nhiều bệnh. Hiện nay, có hơn

100 loại ung thư khác nhau. Hầu hết ung thư được đặt tên theo cơ quan hoặc loại tế

bào, nơi ung thư phát sinh. Ví dụ ung thư phát sinh từ đại tràng được gọi là ung thư

đại tràng, ung thư phát sinh từ gan được gọi là ung thư gan… [48].

Ung thư là một trong 8 nguyên nhân gây chết đối với nhân loại trên toàn thế

giới. Số lượng người tử vong do ung thư còn lớn hơn số lượng tử vong do nhiễm

HIV, lao và sốt xuất huyết cộng lại. Đối với các nước có nền kinh tế phát triển, ung

thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu. Đối với các nước đang phát triển, ung

thư là nguyên nhân gây tử vong thứ hai, sau bệnh tim mạch [45]. Năm 2008, ước

tính có khoảng 12,66 triệu người mắc ung thư và 7,56 triệu người chết do căn bệnh

này. Trong đó 4 loại ung thư là ung thư phổi, ung thư vú, ung thư dạ dày và ung thư

đại trực tràng chiếm 2/5 tổng số ca mắc ung thư trên thế giới [45].

Ung thư đại trực tràng là loại ung thư phổ biến nhất trong các loại ung thư

đường tiêu hóa [28], bao gồm ung thư đại tràng và ung thư trực tràng được gọi theo

tên của mô, nơi phát sinh ung thư. Đại tràng và trực tràng là một phần của hệ tiêu

hóa. Đại trực tràng (hay còn gọi là ruột già) là phần cuối của ống tiêu hóa ở người,

gồm có đại tràng (hay còn gọi là ruột kết) và trực tràng (hay còn gọi là ruột thẳng).

Đại tràng chia ra làm nhiều phần: manh tràng, đại tràng lên, đại tràng ngang, đại

tràng xuống và đại tràng sigma (Hình 1). Trực tràng nằm ngay trước hậu môn. Ung

thư xảy ra ở đại tràng gọi là ung thư đại tràng và ung thư xảy ra ở trực tràng gọi là

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

ung thư trực tràng. Ung thư ở đại tràng xảy ra thường xuyên hơn ung thư ở trực

tràng [21Error! Reference source not found.].

Hình 1. Hình ảnh đại trực tràng [57]

Ung thư đại trực tràng xảy ra khi một số tế bào ở lớp lót trong (còn gọi là niêm

mạc) của đại tràng hay trực tràng trở nên bất thường và phát triển một cách không

kiểm soát được, tạo thành khối u (còn gọi là polyp). Các khối u này có thể là u lành

tính hay u ác tính. U lành tính thường không gây hại cho cơ thể, có thể cắt bỏ dễ

dàng mà không tái phát trở lại, không xâm lấn các mô xung quanh, không di căn

đến các bộ phận khác của cơ thể và khối u lành tính không phải là ung thư. U ác

tính là ung thư thường gây hại cho cơ thể, có thể cắt bỏ khối u ác tính nhưng đôi khi

chúng sẽ tái phát trở lại. Khối u ác tính thường xâm lấn và gây tổn thương các mô,

cơ quan xung quanh. Các tế bào ung thư từ khối u ác tính có thể phát tán đến các bộ

phận khác của cơ thể bằng cách đi vào máu hoặc hệ bạch huyết và gọi là di căn. Khi

ung thư đại trực tràng phát triển ra ngoài đại tràng và trực tràng, các tế bào ung thư

thường di căn đến các hạch bạch huyết. Khi các tế bào ung thư đến được hạch bạch

huyết, chúng có thể phát tán đến các các hạch bạch huyết khác hay các cơ quan

khác. Các tế bào ung thư đại trực tràng thường phát tán đến gan [10].

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Hầu hết các trường hợp ung thư đại trực tràng là ung thư biểu mô tuyến, chiếm

90 – 95% trong các loại ung thư đại trực tràng [21Error! Reference source not

found.]. Điều này có nghĩa là tế bào ung thư được hình thành từ các tế bào biểu mô

tuyến bất thường ở bề mặt lớp lót bên trong của đại trực tràng. Một số dạng ung thư

đại trực tràng khác, ít gặp hơn là ung thư bắt đầu từ các tế bào lympho và các tế bào

biểu mô vảy.

Ung thư đại trực tràng là ung thư phổ biến thứ ba trên thế giới chỉ sau ung thư

phổi và ung thư vú. Năm 2008 ước tính có khoảng 1,24 triệu người trên thế giới

được chẩn đoán là mắc ung thư đại trực tràng, chiếm khoảng 10% trong số các loại

ung thư. Số ca tử vong do ung thư đại trực tràng trong năm 2008 là 610.000 ca trên

toàn thế giới, chiếm khoảng 8% số lượng tử vong do ung thư [16, 45].

Ung thư đại trực tràng thường gặp ở các nước phát triển nhiều hơn các nước

đang phát triển. Năm 2008, 60% các ca được chẩn đoán ung thư đại trực tràng là ở

các nước phát triển [16]. Tỷ lệ bệnh nhân mắc ung thư đại trực tràng cũng tăng lên

ở các khu công nghiệp và thành thị.

Tỷ lệ ung thư đại trực tràng ở các nhóm tuổi khác nhau là khác nhau. Số lượng

người mắc ung thư đại trực tràng ở nhóm tuổi trên 75 tuổi là cao nhất

(250/100.000/năm). Ung thư đại tràng ít xảy ra ở độ tuổi dưới 45 tuổi và tỷ lệ này là

2/100.000/năm. Ở nhóm tuổi từ 45 đến 54, tỷ lệ mắc ung thư đại tràng là

20/100.000/năm. Nhóm tuổi từ 55 đến 64, tỷ lệ mắc ung thư đại tràng là

55/100.000/năm. Nhóm tuổi từ 65 đến 74, tỷ lệ này là 150/100.000/năm [21Error!

Reference source not found., 30].

Tại Việt Nam, ung thư đại trực tràng là loại ung thư đứng thứ năm trong các

loại ung thư thường gặp, sau ung thư dạ dày, phổi, vú, vòm họng và bệnh này có xu

hướng ngày càng tăng cao. Theo thống kê của Bệnh viện Ung Bướu TPHCM, năm

2007, bệnh viện có 218 ca bệnh ung thư đại trực tràng. Năm 2008 con số này là 306

ca và tính đến tháng 9 năm 2009, đã có đến trên 220 bệnh nhân mới đến điều trị ung

thư đại trực tràng [54]. Theo thống kê của Bệnh viện K, tỷ lệ mắc ung thư đại tràng

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

là 9% tổng số bệnh nhân ung thư [55]. Theo một nghiên cứu được tiến hành tại

Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ, độ tuổi mắc ung thư đại tràng trung bình của các

bệnh nhân điều trị ung thư đại trực tràng ở đây là 54 tuổi, tỉ lệ mắc bệnh nam/nữ là

1,34 [3].

1.1.2. Nguyên nhân dẫn đến ung thư đại trực tràng

Nguyên nhân chính xác dẫn đến ung thư đại trực tràng vẫn chưa được chứng

minh rõ ràng. Tuy nhiên, các nghiên cứu về di truyền học, dịch tễ học cũng đã cho

thấy một số yếu tố có khả năng làm tăng nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng, bao

gồm yếu tố di truyền và yếu tố không di truyền.

Yếu tố không di truyền

Theo một số nghiên cứu, số lượng người mắc ung thư đại trực tràng không

liên quan đến các yếu tố di truyền chiếm 75 - 95% tổng số người mắc bệnh [41].

Các yếu tố này bao gồm: lứa tuổi, giới tính, chế độ ăn uống, thuốc lá, chế độ vận

động của cơ thể, các bệnh liên quan đến viêm đại tràng, polyp đại tràng…

Ung thư đại trực tràng thường gặp ở những người lớn tuổi. Tỷ lệ mắc ung thư

đại trực tràng ở nhóm tuổi trên 75 tuổi là cao nhất (250/100.000/năm). Tỷ lệ mắc ung

thư đại trực tràng ở nam giới thường cao hơn nữ giới và tỷ lệ này là 1,4 : 1,0 [16].

Chế độ ăn uống nhiều chất béo, thịt, uống nhiều rượu có thể làm tăng nguy cơ

mắc ung thư đại trực tràng. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng nguy cơ mắc ung thư

đại trực tràng tăng lên ở những người uống nhiều rượu [13]. Ngoài ra, những người

mắc bệnh béo phì cũng có nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng cao hơn những người

khác. Chế độ ăn uống nhiều rau, hoa quả, bánh mỳ, ngũ cốc thô và duy trì chế độ ăn

kiêng hợp lý có thể làm giảm nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng [41].

Nhiều nghiên cứu đã xem xét mối liên quan giữa hoạt động thể chất với nguy

cơ mắc ung thư đại trực tràng. Hầu hết các nghiên cứu chỉ ra rằng lối sống ít vận

động cũng làm tăng nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng. Khoảng 10% các trường

hợp mắc ung thư đại trực tràng được chỉ ra là có liên quan đến thói quen lười vận

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

động [22]. Mức độ nguy cơ sẽ giảm trung bình là 40% đến 50% nếu cơ thể có một

chế độ vận động hợp lý.

Ngoài ra, nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng cũng tăng lên ở những người hút

thuốc. Ở những bệnh nhân ung thư đại trực tràng sử dụng thuốc lá, nguy cơ tái phát

ung thư đại trực tràng sau khi cắt bỏ polyp cũng tăng lên.

Hầu hết ung thư đại trực tràng phát triển từ polyp đại trực tràng. Do đó, việc

loại bỏ các polyp lành tính là một biện pháp có thể phòng ngừa ung thư đại trực

tràng. Các polyp có thể phát triển thành ung thư khi có sự tổn thương nhiễm sắc thể

xảy ra ở các tế bào tại niêm mạc của đại trực tràng. Những tổn thương này tạo ra

những tế bào bất thường. Các tế bào khi đã tích lũy các tổn thương nhiễm sắc thể thì

sẽ phát triển không kiểm soát được hình thành ung thư. Như vậy, polyp đại trực

tràng ban đầu là lành tính, sau đó do sự tích lũy các tổn thương về nhiễm sắc thể

nên phát triển thành ung thư.

Các nghiên cứu chỉ ra rằng có mối liên hệ giữa ung thư đại tràng và chứng

viêm đại tràng. Nguy cơ mắc ung thư đại tràng tăng lên sau 8 – 10 năm bị viêm đại

tràng. Theo ước tính hiện nay, tỷ lệ mắc ung thư đại tràng có liên quan đến viêm

loét đại tràng là 2,5% sau 10 năm, 7,6% sau 30 năm và 10,8% sau 50 năm. Ngoài

ra, nguy cơ mắc ung thư đại tràng cũng phụ thuộc vào vị trí và mức độ viêm loét đại

tràng [52].

Các yếu tố di truyền

Trường hợp ung thư đại trực tràng liên quan đến bệnh sử ung thư trong gia

đình chỉ chiếm khoảng 20% trong tất cả các trường hợp mắc bệnh. Trong đó, chỉ có

5% các trường hợp là do di truyền các gen gây ung thư từ bố, mẹ sang con cái. Sự

biến đổi gen dẫn đến sự hình thành polyp và sau đó hình thành ung thư. Những đứa

trẻ bị di truyền những gen gây ung thư từ bố mẹ có nguy cơ cao bị ung thư ở giai

đoạn sớm của cuộc đời.

Hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial Adenomatous Polyposis – FAP)

là hội chứng mà các thành viên trong gia đình xuất hiện hàng trăm đến hàng nghìn

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

các polyp đại trực tràng ngay từ khi còn trẻ. Trừ khi các polyp này được phát hiện

và điều trị sớm (bằng cách cắt bỏ đại tràng), bệnh nhân có hội chứng FAP có nguy

cơ mắc ung thư đại trực tràng là 100% khi đến tuổi 40. Nguyên nhân của hội chứng

FAP là do có sự đột biến gen APC, một lại gen có vai trò ức chế sự hình thành của

khối u tân sinh ở đại tràng. Tỷ lệ người có hội chứng FAP tại Mỹ là 1/30.000 –

1/6.000 [49].

Hội chứng đa polyp tuyến nhẹ di truyền (Attenuated Familial Adenomatous

Polypsis – AFAP) là hội chứng mà các thành viên trong gia đình thường có ít hơn

100 polyp đại trực tràng. Tuy số lượng polyp ít hơn nhưng những người có hội

chứng AFAP vẫn có nguy cơ cao mắc ung thư đại trực tràng khi còn trẻ.

Hội chứng ung thư đại tràng di truyền không phải đa polyp (Hereditary

Nonpolyposis Colon Cancer – HNPCC) còn gọi là hội chứng Lynch. Hội chứng này

chiếm khoảng 5% các trường hợp ung thư đại trực tràng. Nguyên nhân của hội

chứng này đã được xác định là do đột biến của một trong năm gen có chức năng sửa

lỗi bắt cặp nhiễm sắc thể (Mismatch Repair Genes), bao gồm các gen MLH1,

MSH2, MSH6, PMS1, PMS2. Người có hội chứng HNPCC có nguy cơ mắc các

bệnh lý ác tính của đại trực tràng chiếm 70-80% trong suốt cuộc đời. Ngoài ra tỷ lệ

mắc các bệnh lý liên quan đến nội mạc tử cung buồng trứng, dạ dày, ruột non, niệu

quản, tuyến bã da chiếm 30-60% [49].

1.1.3. Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng

Việc xác định giai đoạn của ung thư cho biết kích thước của khối u và mức

độ lan rộng của khối u khỏi vị trí ban đầu có ý nghĩa rất quan trọng, giúp cho bác sĩ

quyết định liệu pháp phù hợp nhất để điều trị ung thư. Hiện nay có một số hệ thống

phân giai đoạn ung thư đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới, bao gồm phân loại

theo Duke và phân loại TNM.

Hệ thống phân loại theo Duke [12]

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Năm 1932, Cuthbert E. Dukes, một nhà giải phẫu người Anh đã đưa ra hệ

thống phân loại giai đoạn cho ung thư trực tràng. Theo hệ thống phân loại này, ung

thư trực tràng được chia ra thành 4 giai đoạn:

Duke A: Khối u bị giới hạn ở thành của trực tràng.

Duke B: Khối u xâm lấn qua thành của trực tràng nhưng chưa ảnh hưởng đến

các hạch bạch huyết.

Duke C: Khối u lan tới các hạch bạch huyết cạnh trực tràng.

Duke D: Khối u di căn tới các bộ phận khác trên cơ thể như thận, gan,

phổi…

Cho tới nay, trên thế giới xuất hiện một vài cải biến cho hệ thống phân loại

Duke. Tuy nhiên, hệ thống phân loại này gần như đang được thay thế bằng hệ thống

phân loại chi tiết hơn, đó là hệ thống phân loại TNM.

Hệ thống phân loại TNM

Hệ thống phân loại ung thư đại trực tràng TNM (Tumor – Lympho node –

Metastases) là hệ thống được sử dụng phổ biến nhất hiện nay, do Ủy ban Ung thư

Hoa Kỳ sáng lập. Hệ thống phân loại TNM phân giai đoạn ung thư đại trực tràng

dựa vào kích thước khối u (T), mức độ lây lan của khối u tới các hạch bạch huyết

(N) và mức độ di căn tới các cơ quan khác của cơ thể (M). Con số được thêm vào

phía sau mỗi chữ cái cho biết kích thước hoặc phạm vi của khối u và mức độ di căn.

 Tx: Không đánh giá được khối u nguyên phát.

 T0: Không có bằng chứng về sự hiện diện của khối u nguyên phát.

 Tis (Carcinoma in situ - CIS - ung thư tại chỗ): có sự hiện diện của các tế

T- Khối u nguyên phát (Primary Tumor)

bào bất thường nhưng chúng không lan sang các mô lân cận. Mặc dù không phải là

ung thư nhưng CIS có thể trở thành ung thư và đôi khi nó được gọi là ung thư giai

đoạn tiền xâm lấn.

 T1, T2, T3, T4: Kích thước và/hoặc phạm vi của khối u nguyên phát.

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

 Nx: Không đánh giá được các hạch bạch huyết vùng.

 N0: Không có hạch bạch huyết vùng liên quan.

 N1, N2, N3: Có hạch bạch huyết vùng liên quan (số lượng hạch bạch

N- Hạch bạch huyết vùng (Regional Lympho Nodes)

huyết).

 Mx: Không thể đánh giá được mức độ di căn xa.

 M0: Không có di căn xa.

 M1: Có di căn xa.

M - Di căn (Distant Metastasis)

Ở nhiều loại ung thư, các cách phối hợp TNM này tương ứng với một trong 5

giai đoạn (hình 2). Các loại ung thư khác nhau có những tiêu chuẩn phân giai đoạn

khác nhau. Chẳng hạn như ung thư bàng quang T3N0M0 được xếp vào giai đoạn III

trong khi đó ung thư đại tràng T3N0M0 chỉ được xếp ở giai đoạn II.

Hình 2. Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng [50]

Bảng 1 mô tả các giai đoạn bệnh trong TNM và tỷ lệ sống sót ở các giai đoạn

bệnh khác nhau.

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Bảng 1: Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các

giai đoạn bệnh khác nhau [47]

Giai đoạn

Mô tả

Hình ảnh

TNM

Khả năng sống sót sau 5 năm

100%

Tis N0 M0

Giai đoạn 0

Các tế bào bất thường được tìm thấy ở niêm mạc của đại trực tràng (ung thư biểu mô tại chỗ)

8095%

T12N0M0

Giai đoạn I

Ung thư đã hình thành ở niêm mạc đại trực tràng và xâm lấn tới lớp mô bên dưới lớp niêm mạc của đại trực tràng

T3N0M0

7275%

Giai đoạn IIA

T4N0M0

6566%

Giai đoạn IIB

Ung thư đã xâm lấn qua lớp cơ của đại trực tràng và lan tới lớp màng bao quanh đại trực tràng

5560%

T12N1M0

Giai đoạn IIIA

3542%

T34N1M0

Ung thư đã xâm lấn quan niêm mạc, qua lớp cơ của đại trực tràng và lan tới các

Giai đoạn IIIB

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Giai đoạn

Mô tả

Hình ảnh

TNM

Khả năng sống sót sau 5 năm

2527%

T bất kỳ, N2M0

Giai đoạn IIIC

hạch bạch huyết gần nhất hoặc các mô gần hạch bạch huyết

07%

Giai đoạn IV

T bất kỳ, N bất kỳ, M1

Ung thư lan đến các cơ quan khác của cơ thể thông qua máu và hệ bạch huyết, hay còn gọi là di căn. Các cơ quan mà ung thư này thường di căn đến là phổi, gan, buồng trứng

1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƯ

Chỉ thị sinh học (Biomarker) được định nghĩa là các phần tử được tìm thấy

trong máu, trong các loại dịch của cơ thể hoặc trong mô, đặc trưng cho một quá trình

sinh lý hoặc các giai đoạn bệnh lý. Chỉ thị sinh học có thể được ứng dụng để xem xét

đáp ứng của cơ thể trong quá trình điều trị bệnh hay trong những điều kiện cụ thể.

Chỉ thị sinh học còn được gọi là các chỉ thị phân tử và các phân tử tín hiệu [48].

1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thư

Chỉ thị sinh học là một trong các công cụ quan trọng được ứng dụng để phát

hiện ung thư ở giai đoạn sớm, xác định chính xác giai đoạn bệnh để áp dụng các

biện pháp điều trị thích hợp, tiên lượng bệnh và theo dõi việc điều trị bệnh có hiệu

quả hay không. Chỉ thị sinh học ung thư là những phần tử có trong tế bào hoặc mô

ung thư, trong máu hay dịch cơ thể khác. Chỉ thị sinh học ung thư có thể bao gồm

nhiều loại phần tử khác nhau như ADN, mARN, các yếu tố phiên mã, thụ thể trên

bề mặt tế bào hoặc các protein được tiết ra. Chỉ thị sinh học gồm 2 loại chính là chỉ

thị tế bào và chỉ thị thể dịch. Chỉ thị ung thư dạng tế bào bao gồm các kháng nguyên

bề mặt các tế bào, các thụ thể hormone và thụ thể yếu tố tăng trưởng, những biến

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

đổi ADN, mARN, yếu tố phiên mã của tế bào. Chỉ thị ung thư dạng thể dịch bao

gồm các chất được phát hiện ở nồng độ bất thường có mặt trong huyết thanh, nước

tiểu và các loại dịch khác của cơ thể [2]. Một chỉ thị ung thư lý tưởng là chỉ thị có

thể dễ dàng xác định được, cho kết quả đáng tin cậy, các xét nghiệm sử dụng loại

chỉ thị này có độ đặc hiệu và độ nhạy cao, chi phí thấp. Ngoài ra, chỉ thị ung thư lý

tưởng là loại chỉ thị xuất hiện với số lượng có thể định lượng được trong giai đoạn

đầu hoặc giai đoạn tiền lâm sàng. Hàm lượng của chỉ thị ung thư sẽ phản ánh mức

độ phát triển của ung thư [53].

Một trong những thách thức đặt ra là làm thế nào để xây dựng được mô hình

xét nghiệm sử dụng chỉ thị ung thư một cách đơn giản, đảm bảo độ nhạy, độ đặc

hiệu, chi phí thấp mà vẫn có giá trị lâm sàng. Theo Hiệp hội phát triển và nghiên

cứu chỉ thị ung thư Hoa Kỳ, chỉ thị sinh học đối với ung thư đại trực tràng có thể

chia ra làm nhiều loại tuy theo mục đích ứng dụng như sau:

- Chỉ thị sinh học được sử dụng để đánh giá nguy cơ, dự đoán bệnh. Chỉ thị

này có thể được sử dụng để xác định những cá nhân hay quần thể có nguy cơ cao

mắc bệnh. Chỉ thị này có thể là các biến đổi di truyền hay đánh giá việc tiếp xúc với

cơ chất làm tăng mức độ nguy cơ. Ví dụ về loại chỉ thị này là đột biến gen ức chế

khối u APC (Adenomatous Polyposis Coli) được ứng dụng để chẩn đoán những

người có hội chứng đa polyp tuyến di truyền (FAP).

- Chỉ thị sinh học được ứng dụng để sàng lọc và chẩn đoán ở giai đoạn sớm

của bệnh. Các chỉ thị này giúp hỗ trợ việc chẩn đoán bệnh ở giai đoạn sớm, từ đó có

thể xác định các biện pháp điều trị hiệu quả. Ví dụ về loại chỉ thị này là thử nghiệm

tìm máu trong phân của bệnh nhân ung thư đại trực tràng.

- Chỉ thị sinh học được ứng dụng để chẩn đoán bệnh. Đây là các chỉ thị sinh

học được sử dụng để xác định loại ung thư thông qua các xét nghiệm định lượng sự

có mặt của các chỉ thị này trong máu. Chỉ thị này có thể sử dụng kết hợp với các kỹ

thuật hình ảnh tiêu chuẩn trong chẩn đoán bệnh. Ví dụ về loại chỉ thị chẩn đoán này

là kháng nguyên CEA (Carcinoembryonic antigen) ứng dụng trong chẩn đoán ung

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

thư đại trực tràng. Ngoài ra, còn có các chỉ thị được ứng dụng để chẩn đoán các

bệnh ung thư khác như kháng nguyên đặc hiệu PSA (Postate Specific Antigen) để

chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt và kháng nguyên ung thư 125 (CA-125) thường

được sử dụng trong chẩn đoán ung thư buồng trứng [15].

- Chỉ thị sinh học được ứng dụng trong nghiên cứu tương tác thuốc. Chỉ thị

được ứng dụng để đánh giá dược động học của thuốc, đánh giá tính hiệu quả của

thuốc tới đích tác dụng (như ức chế enzyme, gắn với thụ thể, kích hoạt quá trình

apoptosis) hoặc phản ánh hiệu quả trong điều trị thuốc. Ví dụ về loại chỉ thị sinh

học này là gen mã hóa cho enzyme thiopurine methyltranferase (TMPT) và điều trị

bằng azathioprine trong bệnh Crohn.

- Chỉ thị sinh học được ứng dụng để dự đoán bệnh. Chỉ thị này có thể sử

dụng để dự đoán được những bệnh nhân có thể đáp ứng lại được với các liệu pháp

điều trị. Ví dụ về chỉ thị này là K-ras (Kirsten rat sarcoma viral oncogene) và thụ

thể yếu tố sinh trưởng biểu bì EGFR (Epidermal growth factor receptor). K-ras là

một gen tiền ung thư, thường được tìm thấy đột biến ở 50% các trường hợp ung thư

đa u tuyến có kích thước lớn hơn 1 cm và khoảng 40-50% ung thư biểu mô đại trực

tràng [20].

- Chỉ thị sinh học được ứng dụng để tiên lượng bệnh, dự đoán tiến trình

phát triển của bệnh. Các chỉ thị này sẽ phản ánh khả năng di căn, mức độ lan rộng

của khối u. Có nhiều loại chỉ thị sinh học được phát hiện và đề xuất ứng dụng trong

tiên lượng ung thư nhưng các chỉ thị này đều chưa được thẩm định [29].

1.2.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng để nghiên cứu chỉ

thị sinh học ung thư

Hiện nay, đối với bệnh ung thư đại trực tràng, nội soi trực tràng vẫn được coi

là phương pháp vàng trong chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên, đây là phương pháp thăm

khám trực tiếp, có thể gây khó chịu cho bệnh nhân. Một phương pháp khác hiện

đang được sử dụng rộng rãi là xét nghiệm CEA. Protein này thường được tìm thấy

trong mô của bào thai phát triển trong tử cung. Nồng độ trong máu của protein này

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

biến mất hoặc giảm xuống rất thấp sau khi sinh. Ở người lớn, hàm lượng CEA tăng

lên bất thường có thể được coi là chỉ thị sinh học của ung thư đại trực tràng. Tuy

nhiên, phương pháp xét nghiệm để đánh giá hàm lượng CEA có trong máu có hạn

chế là chỉ chẩn đoán được bệnh ở giai đoạn muộn (giai đoạn III, IV). Hơn nữa, độ

nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này không cao và hàm lượng CEA cũng có

thể tăng lên ở những người bị viêm loét đại tràng, viêm tụy, viêm gan, bệnh Crohn

hoặc ở những người hay hút thuốc lá. Do vậy, hiệu quả ứng dụng CEA trong chẩn

đoán ung thư đại trực tràng là không cao và chi phí xét nghiệm tương đối tốn kém.

Phương pháp xét nghiệm máu trong phân là phương pháp nhằm mục đích

phát hiện có máu trong phân hay không. Hiện tượng trong phân có máu là triệu

chứng thường gặp của các ca ung thư đại trực tràng. Tuy nhiên, phương pháp này

lại có một tỷ lệ các kết quả dương tính giả và âm tính giả rất cao.

Như vậy, việc chẩn đoán và phát hiện sớm ung thư cho đến nay còn gặp rất

nhiều khó khăn. Hầu hết các trường hợp phát hiện ung thư là ở giai đoạn muộn, di

căn hay biến chứng, điều trị gặp rất nhiều hạn chế. Do đó, việc nghiên cứu để tìm ra

các chỉ thị sinh học đặc trưng cho ung thư đại trực tràng đang là hướng nghiên cứu

được nhiều các nhà khoa học quan tâm hiện nay.

Hiện nay, có 3 kỹ thuật sinh học phân tử chính được ứng dụng trong nghiên

cứu chỉ thị sinh học của ung thư bao gồm:

 Sử dụng kỹ thuật genomics để xác định, nhận dạng những biến đổi gen

liên quan đến sự phát sinh ung thư. Những biến đổi gen này có thể được coi như

những chỉ thị sinh học cho ung thư. Hạn chế của kỹ thuật genomics là không nghiên

cứu được về mức độ biểu hiện của gen (cụ thể là các protein), không theo dõi được

sự thay đổi các quá trình sau dịch mã, mối tương tác protein – protein…

 Sử dụng kỹ thuật proteomics để xác định những biến đổi của các protein

liên quan đến quá trình phát sinh, hình thành ung thư. Ưu điểm của kỹ thuật

proteomics là có khả năng nghiên cứu được mức độ biểu hiện của gen thông qua

các phân tử protein tạo ra.

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

 Sử dụng kỹ thuật metabolomics để nghiên cứu tất cả những chất chuyển

hóa được tạo ra trong tế bào, trong mô. Một số dạng ung thư tạo ra những biến đổi

về thành phần và hàm lượng các chất chuyển hóa trong tế bào. Các chất chuyển hóa

1.3. PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

này có thể tìm thấy trong các mô ung thư, dịch cơ thể (đặc biệt là nước tiểu) [34].

1.3.1. Proteomic là gì?

Proteomics là môn khoa học nghiên cứu sản phẩm của hệ gen trong cơ thể

hay chính là nghiên cứu các protein được biểu hiện trong tế bào, mô hoặc cơ thể

trong những điều kiện và thời gian xác định [1]. Không chỉ dừng lại nghiên cứ

u sự tồn tại của protein của một tế bào nào đó, proteomics còn đi sâu nghiên

cứu tất cả các dạng protein đã được cải biến, tương tác giữa các protein, cấu trúc

không gian và các phức hệ cao hơn của protein.

Nghiên cứu proteomics ra đời dựa trên một số thành tựu đã đạt được trong

sinh học hiện đại ở những năm 90 của thế kỷ trước. Ba bước phát triển quan trọng

dẫn đến sự ra đời của proteomics bao gồm sự bùng nổ các nghiên cứu về gen tạo

thành cơ sở dữ liệu về trình tự gen và cơ sở dữ liệu trình tự protein; sự ra đời của

công cụ tin sinh học nhằm tìm kiếm các cơ sở dữ liệu sinh học; cuối cùng là kỹ

thuật vi dãy phản ứng oligonucleotid (oligonucleotide microarray) có khả năng

nghiên cứu biểu hiện của hàng ngàn gen. Như vậy, kỹ thuật proteomics ra đời là

một trong những bước phát triển mới trong nghiên cứu sinh học hiện đại, góp phần

làm thay đổi bức tranh sinh học ở hiện tại và trong tương lai.

Đối tượng nghiên cứu chủ yếu của proteomics là hệ protein. Vậy vì sao phải

nghiên cứu hệ protein? Việc giải mã hoàn chỉnh hệ gen người từ những năm 1999-

2001 là bước phát triển nhảy vọt của nền khoa học. Tuy nhiên, một thực tế đặt ra là

các thông tin di truyền trong hệ gen không cho biết một cách đầy đủ về chức năng

của nó. Do đó, các nghiên cứu về biểu hiện gen là rất cần thiết. Nghiên cứu biểu

hiện gen ở mức độ phiên mã mặc dù đã đạt được một số thành tựu đáng kể nhưng

vẫn còn nhiều hạn chế. Nguyên nhân là do sau dịch mã, đa số các protein bị biến

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

đổi hóa học bởi các quy trình cải biến như phosphoryl hóa, methyl hóa, glycosyl

hóa, gắn thêm các gốc carbonhydrat hay các tương tác protein-protein… Những

biến đổi này đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt chức năng của protein.

Kết quả là từ một gen ban đầu có thể tìm thấy sự đa dạng về biểu hiện, cấu trúc và

chức năng của nhiều loại protein khác nhau. Các nghiên cứu cho thấy, ở người có

khoảng 25.000 gen đã được nhận diện nhưng có khoảng lớn hơn 500.000 protein đã

được tạo ra từ các gen đó [24Error! Reference source not found.]. Do đó, để

nghiên cứu sự biểu hiện của gen không chỉ dựa vào các thông tin trong mã di

truyền, các biến đổi sau dịch mã mà quan trọng hơn phải dựa trên những cải biến

của phân tử protein. Người ta coi protein là phân tử đầu tiên thực hiện chức năng

trong tế bào. Theo các kết quả nghiên cứu thì chỉ có khoảng 2% các bệnh tật đã biết

được xác định là do các sai lệch về gen, còn 98% các bệnh còn lại cần làm sáng tỏ ở

mức độ protein bao gồm biểu hiện protein, cấu trúc protein và tương tác giữa các

protein. Từ đó cho thấy, việc nghiên cứu hệ protein người là cần thiết.

1.3.2. Công cụ nghiên cứu proteomics

Để phân tích cả hệ gồm nhiều protein, kỹ thuật proteomics cần có sự hỗ trợ

của 4 công cụ phân tích sau:

Công cụ đầu tiên là cơ sở dữ liệu. Các dữ liệu về protein, các trình tự biểu

hiện được đánh dấu và trình tự genome hoàn chỉnh là một dữ liệu đầy đủ và chọn

lọc cho tất cả các protein biểu hiện trong các cơ thể. Ví dụ, khi phân tích các trình

tự mã hóa của ruồi giấm Drosophila, chúng ta đã biết rằng có 110 gen mã hóa cho

protein có domain EGF và 87 gen mã hóa cho protein có domain có hoạt tính

tyrosin kinase. Vì vậy, khi phân tích proteomics đối với Drosophila, mặc dù phải

dựa trên một cơ sở dữ liệu lớn nhưng chúng ta vẫn dự đoán được các protein có thể

xuất hiện [24Error! Reference source not found.].

Công cụ thứ hai là khối phổ, đây là bộ phận trung tâm và cơ bản của phân

tích proteomics. Phương pháp khối phổ xuất hiện từ những năm đầu của thế kỷ XX

do Thomson và các nhà khoa học khác tìm ra từ năm 1912. Nó đóng vai trò quan

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

trọng trong việc xác định cấu trúc của những phân tử nhỏ. Sau đó, phương pháp này

cũng được cải tiến để ứng dụng trong nghiên cứu sinh học, đặc biệt là xác định cấu

trúc của các đại phân tử như protein. Proteomics dựa trên nguyên lý khối phổ đã trở

thành một môn khoa học thật sự nhờ các dữ liệu về trình tự gen, trình tự protein

cùng với nhiều thành tựu kỹ thuật vượt bậc trong nghiên cứu nhiều lĩnh vực khác

nhau, đặc biệt phải kể đến sự phát triển của phương pháp ion hóa protein. Các kỹ

thuật này là những kỹ thuật không thể thiếu trong việc phân tích, nhận dạng những

thông tin được mã hóa trong hệ gen.

Trong những năm gần đây, khối phổ (MS) đã trở thành công cụ được lựa

chọn để phân tích hệ protein. Kỹ thuật này phân tích các protein hay các mảnh

peptide theo tỷ số m/z (khối lượng/độ tích điện). Một cách đơn giản, các protein cần

phân tích bị phân cắt thành các mảnh peptide có kích thước thích hợp. Các mảnh

peptide này bị ion hóa, nhờ đó tích điện và di chuyển tự do. Để xác định khối lượng

của các ion này, người ta gia tốc chúng trong một buồng chân không, để đo thời

gian bay (Time of Flight – TOF) của chúng. Như vậy, các ion sẽ được xác định theo

khối lượng dựa vào thời gian bay trong buồng chân không và theo điện tích chúng

mang. Sản phẩm cuối cùng là một phổ khối lượng gồm nhiều đỉnh. Phổ này sẽ là tín

hiệu đặc trưng để nhận dạng các protein.

Công cụ thiết yếu thứ ba là hệ thống phần mềm có thể so sánh, đối chiếu dữ

liệu khối phổ với các trình tự protein đặc trưng trong cơ sở dữ liệu. Việc xác định

trình tự của một peptide từ các số liệu khối phổ là hoàn toàn có thể thực hiện được.

Tuy nhiên, việc xác định trình tự de novo này là nhiệm vụ khá nặng nề và tốn thời

gian, không thể áp dụng để phân tích hàng trăm, hàng nghìn phổ. Các phần mềm

này cho phép điều tra tự động một lượng lớn dữ liệu khối phổ, đối chiếu với trình tự

protein. Người nghiên cứu có thể kiểm tra các kết quả và đánh giá chất lượng của

dữ liệu trong thời gian ngắn hơn và trên quy mô rộng hơn.

Công cụ thiết yếu thứ tư trong nghiên cứu proteomic là các kỹ thuật phân

tách protein. Công việc phân tách protein nhằm hai mục đích chính. Thứ nhất, nó

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

làm đơn giản các phức hệ protein phức tạp bằng cách phân tách chúng thành các

phân tử hay nhóm nhỏ protein độc lập. Thứ hai, việc phân tách này cho cái nhìn

tổng quan về sự khác biệt của hệ protein giữa hai mẫu khác nhau, nhờ đó xác định

được các protein đặc trưng để phân tích. Ngày nay, hai dạng phân tích proteomics

chủ đạo được sử dụng là: điện di hai chiều kết hợp với khối phổ và sắc ký hai chiều

kết hợp với khối phổ.

Điện di hai chiều là kỹ thuật tốt nhất cho việc phân tách các protein trong

một mẫu phức tạp. Kỹ thuật này phân tách các protein dựa vào hai thông số: điểm

đẳng điện và khối lượng phân tử của protein, do đó có độ phân giải cao. Bản điện di

hai chiều trên gel polyacrylamide sẽ là bức tranh đầy đủ nhất của một mẫu protein

phức tạp. Hơn nữa, kỹ thuật điện di hai chiều cũng cho phép nghiên cứu biểu hiện

protein của các dạng bệnh lý hay các giai đoạn khác nhau của quá trình phát triển.

Ngoài ra, các kỹ thuật phân tách khác như điện di một chiều trên gel

polyacrylamide có SDS, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao quản (CE),

điện di phân vùng đẳng điện (IEF) và sắc ký ái lực đều có thể trở thành công cụ hữu

hiệu trong phân tích proteomics. Tuy nhiên, có lẽ hiệu quả nhất vẫn là kỹ thuật sắc

ký lỏng đa chiều (Multidimentional Liquid Chromatography-MDLC). Sắc ký trao

đổi ion kết hợp vơi sắc ký pha đảo trong HPLC là một công cụ mạnh trong việc

phân tách hỗn hợp peptide [24Error! Reference source not found.].

1.3.3. Ứng dụng của proteomics trong nghiên cứu ung thư đại trực tràng

Trên thế giới, sự phát triển của nghiên cứu proteomics được đánh dấu bằng

sự ra đời của tổ chức nghiên cứu hệ protein người (Human Proteome Organisation–

HUPO) tại Pháp năm 2002. Đây là tổ chức lớn nhất trên thế giới về nghiên cứu

proteomics. Bên cạnh đó còn có các tổ chức khu vực, trong đó có tổ chức AOHUPO

(Asia Oceania Human Proteome Organisation) thuộc châu Á-châu Đại Dương.

Một trong những ứng dụng quan trọng đầu tiên của proteomics là trong lĩnh

vực nghiên cứu ung thư. Việc tìm ra những biến đổi trong hệ protein của bệnh nhân

ung thư có thể giúp các nhà khoa học tìm hiểu rõ hơn về cơ chế phát sinh bệnh ở

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

mức độ phân tử. Các protein biến đổi cũng có thể trở thành các chỉ thị sinh học mới

góp phần sàng lọc, chẩn đoán sớm và theo dõi tiến triển của bệnh. Ngoài ra, kỹ

thuật proteomics còn được ứng dụng trong nghiên cứu đích tác dụng của thuốc điều

trị, qua đó tìm ra các thuốc có hiệu quả điều trị tối ưu.

Với những tính năng ưu việt, proteomics là công cụ được các nhà khoa học

lựa chọn trong nghiên cứu ung thư nói chung và ung thư đại trực tràng nói riêng. Đã

có rất nhiều nghiên cứu sử dụng công cụ proteomics được thực hiện trên thế giới

nhằm tìm ra các chỉ thị sinh học đặc trưng cho ung thư đại trực tràng. Hệ protein

được phân tích trong các nghiên cứu này có thể là hệ protein mô ung thư đại trực

tràng, hệ protein trong huyết tương, hệ protein từ dịch cơ thể như nước tiểu.

Phân tích proteomics huyết tương của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Huyết tương tách từ máu người là một hệ protein tuyệt vời cho phân tích

proteomics. Nó tập hợp các protein từ các mô khác nhau trong cơ thể. Những hiểu

biết về hệ protein huyết tương mang lại những thông tin quan trọng về nhiều quá

trình sinh học diễn ra trong cơ thể. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng protein

huyết tương có thể là các chỉ thị sinh học đáng tin cậy trong chẩn đoán một số bệnh

như: ung thư buồng trứng (CA 13-5), ung thư tuyến tiền liệt (PAP), ung thư gan (-

fetoprotein) và các bệnh về tim mạch (C-ractive protein) [14]. Tuy nhiên, do trong

huyết tương chứa hàm lượng lớn (55%) là albumin, nên trước khi tiến hành các kỹ

thuật proteomics, chúng ta phải loại bỏ tối đa lượng albumin có trong mẫu huyết

tương.

Chỉ thị sinh học được tìm thấy trong huyết tương là chỉ thị lý tưởng cho chẩn

đoán ung thư do rất dễ dàng thu thập mẫu huyết tương của bệnh nhân và việc chẩn

đoán sẽ dễ dàng hơn. Hiện nay, chỉ thị CEA có mặt trong máu đang được ứng dụng

rộng rãi để chẩn đoán ung thư đại trực tràng. Tuy nhiên, như đã đề cập ở trên, sử

dụng chỉ thị CEA chỉ có khả năng phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn (giai đoạn III,

IV). Hơn nữa, chi phí cho xét nghiệm CEA tương đối cao. Vì vậy, việc nghiên cứu

để tìm thêm các chỉ thị sinh học trong máu để ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

ung thư đại trực tràng là hết sức cần thiết. Nhiều nghiên cứu proteomics trong huyết

tương của bệnh nhân ung thư đại trực tràng đã được tiến hành nhằm tìm ra các chỉ

thị sinh học mới cho loại ung thư này.

Năm 2004, Yu và cs đã tiến hành phân tích proteomics huyết tương của 182

mẫu khác nhau gồm 55 mẫu huyết tương của bệnh nhân ung thư đại trực tràng, 35

mẫu huyết tương của bệnh nhân u tuyến đại trực tràng và 92 mẫu huyết tương của

người bình thường. Bằng kỹ thuật SELDI-TOF MS kết hợp với công cụ tin sinh

học, các nhà khoa học đã tìm ra 7 protein biểu hiện khác biệt giữa ung thư đại trực

tràng và u tuyến đại trực tràng. Các protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học

với độ đặc hiệu 83% và độ nhạy là 89%. Nghiên cứu cũng chỉ ra 4 protein khác biệt

giữa bệnh nhân ung thư đại trực tràng và người bình thường. Các protein có tiềm

năng trở thành chỉ thị sinh học với độ đặc hiệu 92% và độ nhạy là 89% [39].

Năm 2005, với kỹ thuật SELDI-TOF/MS, Albrethsen và cs đã so sánh các

protein có trong mẫu huyết tương của bệnh nhân ung thư đại tràng với huyết tương

của người khỏe mạnh và protein có trong mô ung thư đại tràng với mô đại tràng

bình thường. Nghiên cứu này cho thấy hàm lượng các protein HNP- 1, HNP- 2 và

HNP- 3, còn được gọi là α-defensin-1, α-defensin-2, α-defensin-3 tăng lên trong

huyết tương của người bệnh và trong mô tại vị trí khối u. Một phần của protein

HNP 1-3 sẽ kết hợp với loại protein khối lượng lớn chưa xác định trong huyết

tương. Nhóm nghiên cứu đề xuất rằng HNP 1-3 có thể được coi như chỉ thị sinh học

trong máu của bệnh nhân ung thư đại tràng. Các protein HNP 1-3 có thể có tác động

lên quá trình phát triển khối u [4Error! Reference source not found.].

Việc tìm ra protein HNP 1-3 có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học trong

máu có ý nghĩa quan trọng, có thể ứng dụng trong việc chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên,

việc nghiên cứu biểu hiện khác biệt của loại protein này trong các giai đoạn phát

triển bệnh khác nhau sẽ giúp dự đoán hiệu quả ứng dụng của protein này trong chẩn

đoán (có thể chẩn đoán ở giai đoạn sớm hay giai đoạn muộn của bệnh), cũng như có

thể giúp phát hiện chính xác giai đoạn ung thư. Phát triển kết quả của các nghiên

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

cứu trước đó, năm 2006, Albrethsen và cs tiếp tục nghiên cứu mức độ biểu hiện của

các protein HNP 1-3 trong huyết thanh và trong mô ung thư đối với các giai đoạn

bệnh khác nhau (theo Duke). Hàm lượng HNP 1-3 trong huyết tương, trong mô ung

thư và trong mô bình thường được định lượng bằng khối phổ. Mức độ biểu hiện của

HNP 1-3 trong huyết tương được xác định bằng kỹ thuật ELISA. Kết quả nghiên

cứu cho thấy hàm lượng HNP 1-3 tăng lên ở mô ung thư của bệnh nhân ở giai đoạn

từ Duke A đến Duke D so với mô thường. Tuy nhiên, hàm lượng HNP 1-3 trong

huyết tương của bệnh nhân chỉ cao hơn huyết tương của người khỏe mạnh khi bệnh

nhân ở giai đoạn Duke D. Nồng độ protein HNP 1-3 được xác định bằng kỹ thuật

ELISA tăng lên ở giai đoạn Duke C và D, nhưng không có sự khác biệt ở giai đoạn

Duke A, B so với nồng độ HNP huyết tương của người khỏe mạnh [5Error!

Reference source not found.]. Như vậy, việc ứng dụng protein HNP 1-3 trong

chẩn đoán ung thư đại trực tràng cũng còn hạn chế, do chỉ phát hiện bệnh ở giai

đoạn muộn của bệnh.

Ngoài các nghiên cứu nhằm tìm kiếm chỉ thị sinh học để chẩn đoán bệnh trong

giai đoạn sớm, các nhà khoa học còn tìm kiếm các chỉ thị sinh học đặc trưng cho tình

trạng di căn của ung thư đại trực tràng. Năm 2010, Xue và cs đã tiến hành nghiên cứu

với mục đích như vậy. Bằng kỹ thuật LC-MS/MS, các nhà khoa học đã so sánh mức

độ thay đổi lượng các chất tiết vào trong máu từ các dòng tế bào ung thư ban đầu và

dòng tế bào đã di căn được lấy trên cùng bệnh nhân ung thư đại trực tràng. 6 protein

khác biệt đặc trưng đã được xác nhận bằng kỹ thuật Western blot. Trong đó, yếu tố

trefoil 3 và yếu tố biệt hóa/sinh trưởng 15 là 2 protein có biểu hiện tăng ở các dòng tế

bào đã di căn. Sử dụng kỹ thuật ELISA bánh kẹp cũng chỉ ra rằng 2 protein này có

mức độ biểu hiện tăng lên đáng kể trong huyết tương ở ung thư đại trực tràng đã di

căn tới hạch bạch huyết. Kết quả thu được từ nghiên cứu này có thể cho thấy trefoil 3

và yếu tố biệt hóa/sinh trưởng 15 có trong huyết tương có thể ứng dụng được để chẩn

đoán ung thư đại trực tràng đã di căn [37].

Cũng trong năm 2010, Trịnh Hồng Thái và cs đã sử dụng kỹ thuật điện di hai

chiều kết hợp với phân tích khối phổ MALDI-TOF MS để phân tích biểu hiện

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

protein khác biệt trong mẫu huyết tương của bệnh nhân ung thư đại trực tràng và

người bình thường. Phân tích 40 spot protein biểu hiện khác biệt, các nhà khoa học

đã nhận dạng được 35 protein, trong đó 31 protein đã được định danh và 4 protein

giả thuyết. Các protein được chia thành 4 nhóm chức năng: các protein tham gia quá

trình miễn dịch (19,35%), protein liên quan đến chu trình tế bào (9,68%), các

protein tham gia vào quá trình apoptosis (12,9%) và nhóm protein khác (58,7%).

Trong các protein nhận dạng được, một số protein biểu hiện khác biệt đáng chú ý

như Interleukin 6, Cyclin D1, Hsp 70 biểu hiện tăng ở huyết tương của bệnh nhân

ung thư đại trực tràng so với người khỏe mạnh. Đặc biệt, protein Hsp 70 và

Interleukin 6 là hai protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học cho ung thư đại

trực tràng (số liệu chưa công bố).

Kết quả từ các nghiên cứu proteomics đối với mẫu huyết thanh của bệnh

nhân ung thư đại trực tràng đã cho chúng ta thấy những protein có tiềm năng trở

thành chỉ thị sinh học trong chẩn đoán ung thư đại trực tràng. Bên cạnh đó, hướng

nghiên cứu proteomics đối với mẫu nước tiểu cũng đã được các nhà khoa học quan

tâm. Theo một nghiên cứu của Ward và cs, các nhà khoa học đã sử dụng kỹ thuật

SELDI và MALDI để phân tích proteomics trên 67 mẫu nước tiểu của bệnh nhân

ung thư đại trực tràng và 72 mẫu nước tiểu của người bình thường. Kết quả nghiên

cứu cho thấy có 19 đỉnh có mức độ khác biệt giữa mẫu bệnh và mẫu đối chứng.

Ứng dụng các protein này để nhận dạng ung thư đại trực tràng có độ nhạy là 78% và

độ đặc hiệu là 87%. Tác giả cũng kết luận rằng sự thay đổi hệ protein trong mẫu

nước tiểu cũng có thể hỗ trợ chẩn đoán ung thư đại trực tràng ở giai đoạn sớm [40].

Phân tích proteomics mẫu mô của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Cùng với nghiên cứu proteomics huyết tương, để tìm hiểu một cách chính

xác hơn về các protein đặc trưng liên quan đến bệnh, chúng ta cần phân tích trực

tiếp protein từ các tế bào của khối u đại trực tràng. Hơn nữa, hầu hết các chỉ thị sinh

học cho ung thư được phát hiện bằng cách sử dụng chính những mô của căn bệnh

này [14].

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Với mục đích nghiên cứu, tìm kiếm chỉ thị sinh học cho ung thư đại trực

tràng, năm 2005, Alfonso và cs đã tiến hành phân tích proteomics ở bệnh nhân ung

thư đại trực tràng nhờ kỹ thuật 2D-PAGE kết hợp MS. Nghiên cứu được tiến hành

với mẫu mô tại vị trí khối u và đối chứng là mẫu mô tại vị trí cận khối u của 7 bệnh

nhân ung thư đại trực tràng. Nghiên cứu đã chỉ ra 72 protein biểu hiện khác biệt

giữa mô ung thư và mô bình thường. Nhận dạng các protein biểu hiện khác biệt

bằng phân tích khối phổ đã xác định được 41 protein. Các protein khác biệt liên

quan đến quá trình điều hòa phiên mã, các protein tín hiệu (annexins IV và V,

relaxin, APC), các protein tham gia tổ chức khung xương tế bào (vimentin,

cytokeratins, beta actin) và các protein liên quan đến quá trình tổng hợp và cuộn gập

protein (HSP 60, cathepsin D, RSP4, calreticulin) [6].

Nghiên cứu của Bai và cs sử dụng kỹ thuật điện di 2 chiều kết hợp với khối

phổ, thực hiện trên mẫu mô tại vị trí khối u đại trực tràng (mẫu bệnh) và mẫu mô tại

vị trí gần khối u (mẫu đối chứng) trên cùng một bệnh nhân. Mẫu mô đại trực tràng

từ 12 bệnh nhân đã được sử dụng cho nghiên cứu này. Kết quả điện di 2 chiều cho

thấy có 60 protein biểu hiện khác biệt (hàm lượng chênh lệch 1,5 lần) giữa mô ung

thư và mô thường. Tiếp tục tiến hành phân tích khối phổ để nhận dạng các protein

biểu hiện khác biệt, 10 protein đã được nhận dạng, bao gồm 2 protein biểu hiện

giảm và 8 protein biểu hiện tăng ở mô ung thư. 2 protein biểu hiện giảm ở mô ung

thư bao gồm carbonic anhydrase II và protein disulfide isomerase. 8 protein biểu

hiện tăng ở mô ung thư bao gồm APC-stimulated guanine nucleotide exchange

factor, phosphoglycerate kinase 1, fumarate hydratase, aldolase A, activator protein

2B, glutathione S-transferase A3, Arginase và zinc finger protein 64 homolog.

Những protein biểu hiện khác biệt này được cho là có liên quan đến quá trình phát

triển của khối u [8].

Phương thức chuyển hóa các chất trong tế bào ung thư đóng vai trò quan

trọng trong quá trình hình thành, phát triển ung thư. Nhằm tìm hiểu sự thay đổi

trong con đường chuyển hóa các chất của tế bào ung thư đại trực tràng, năm 2006,

Xuezhi và cs đã tiến hành nghiên cứu nhằm tìm ra sự biến đổi trong thành phần

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

protein liên quan đến các con đường chuyển hóa các chất trong tế bào ung thư. 7

cặp mô ung thư đại trực tràng và mô lân cận u (đối chứng) được sử dụng cho nghiên

cứu. Dịch chiết protein từ mô ung thư và mô bình thường được phân tách trên bản

điện di hai chiều, pH 7-10. Khi so sánh sự biểu hiện của các spot protein trên bản

gel mô ung thư và mô bình thường, các nhà khoa học xác định được 34 spot protein

với mức độ biểu hiện khác biệt mang ý nghĩa thống kê. 16 trong số 34 spot đã được

nhận dạng bằng MALDI – TOF/TOF. Sự biểu hiện tăng cường của các protein tham

gia quá trình phân giải đường như aldolase A, anolase 1, GAPDH... cho thấy có sự

xuất hiện của tác động Warburg đối với ung thư đại trực tràng. Trong khi đó, một

protein quan trọng trong quá trình tổng hợp glucose lại có biểu hiện giảm, đó là

protein phosphoenolpyruvate carboxykinase. Sự biểu hiện giảm của 2 protein là

UDP-glucose 6-de-hydrogenase (UGDH) và UDP-glucose pyrophosphorylase 2 có

thể dẫn đến ức chế quá trình đồng hóa acid gluconic. Kết quả nghiên cứu cũng đưa

ra sự biểu hiện giảm của các protein tham gia vào bước khởi đầu của chu trình

tricarboxylic acid (aconitase và aconitate hydratase) và sự biểu hiện tăng lên của các

enzyme tham gia vào bước cuối cùng của chu trình này (malate dehydrogenase),

chứng tỏ có sự ức chế chu trình tricarboxylic acid trong tế bào ung thư đại trực

tràng. Từ những kết quả thu được chứng tỏ có sự biến đổi lớn trong con đường

chuyển hóa các chất đối với ung thư đại trực tràng [38Error! Reference source not

found.].

Ngoài việc tìm kiếm các chỉ thị sinh học nhằm ứng dụng trong chẩn đoán

ung thư đại trực tràng, các nhà khoa học còn đi sâu tìm hiểu cơ chế tác dụng của các

biện pháp điều trị ở mức độ phân tử. Năm 2004, Allas và cs đã công bố kết quả

nghiên cứu các protein liên quan đến tính chịu bức xạ của ung thư đại tràng, mục

đích cuối cùng là dự đoán mức độ phản ứng của khối u với biện pháp xạ trị. 17 bệnh

nhân tham gia trong nghiên cứu đều được chẩn đoán mắc ung thư trực tràng. Các

khối u được sinh thiết trước khi tiến hành xạ trị. Sau đó, tất cả các bệnh nhân được

xạ trị bằng 1 liều đầy đủ (tương đương với 50 Gray). Phẫu thuật được tiến hành 6

tuần sau đó và kết quả đáp ứng với bức xạ được đánh giá bằng giải phẫu mô học.

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Kết quả nghiên cứu cho thấy có 7 bệnh nhân đáp ứng hoàn toàn, 7 bệnh nhân đáp

ứng 1 phần và 3 bệnh nhân còn lại chưa được đánh giá. Tiếp tục tiến hành phân tích

proteomics đối với mẫu mô từ các khối u có đáp ứng với xạ trị khác nhau, sử dụng

kỹ thuật điện di 2 chiều kết hợp với phân tích MALDI – TOF MS đã xác định được

một số protein liên quan đến khả năng chịu bức xạ của mô ung thư, bao gồm

tropomodulin, heat shock protein 42, beta-tubulin, annexin V, calsenilin và một số

protein liên quan đến tính nhạy bức xạ bao gồm keratin type I, notch 2 protein

homolog và protein sửa chữa ADN RAD51L3 [7].

Hệ protein mô ung thư đại trực tràng trong các giai đoạn bệnh khác nhau sẽ

có mức độ biểu hiện khác nhau. Nghiên cứu proteomics đối với các mẫu mô ung

thư ở các giai đoạn bệnh khác nhau sẽ giúp tìm ra những chỉ thị sinh học ứng dụng

cho chẩn đoán bệnh trong các giai đoạn khác nhau, làm tăng hiệu quả điều trị bệnh.

Năm 2012, Peng và cs đã tiến hành phân tích protemics trên các mẫu sinh thiết mô

ung thư đại trực tràng ở các giai đoạn TNM khác nhau và mô bình thường, tập trung

vào những biến đổi trong quá trình phát sinh ung thư và những mô hình biểu hiện

chức năng của các protein giữa các giai đoạn bệnh khác nhau. Phân tích khối phổ

MALDI-TOF MS đã nhận dạng các protein liên quan chính đến quá trình trao đổi

năng lượng, acetyl hóa và tham gia vào đường truyền tín hiệu. Nghiên cứu đã sử

dụng kỹ thuật thẩm tách miễn dịch và hóa mô miễn dịch để kiểm chứng dữ liệu điện

di hai chiều. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra một số protein có tiềm năng trở thành chỉ

thị để dự đoán bệnh ở các giai đoạn TNM khác nhau. Các protein bao gồm Glucose-

Regulated Protein precursor (GRP78), Fructose-bisphosphate Aldolase A

(ALDOA), Carbonic Anhydrase I (CA1) và Peptidyl-prolyl cis–trans isomerase A

hoặc Cyclophilin A (PPIA) [31Error! Reference source not found.].

Năm 2012, Tan và cs thuộc trường Đại học quốc gia Singapore đã tiến hành

nghiên cứu so sánh hệ protein của dòng tế bào ung thư đại trực tràng ban đầu (HCT-

116) và dòng tế bào ung thư đại trực tràng đã di căn (E1) bằng cách sử dụng kỹ

thuật điện di hai chiều. Các nhà khoa học đã phát hiện ra 74 protein biểu hiện khác

biệt, có vai trò chức năng trong nhiều quá trình như phiên mã, dịch mã, truyền tín

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

hiệu, cấu trúc bộ khung tế bào. Đây là những quá trình cần thiết trong tế bào liên

quan đến sự di căn của khối u. Trong các protein này, protein stathmin-1 (STMN1)

có biểu hiện tăng lên rõ rệt ở dòng tế bào E1 so với dòng tế bào HCT-116. Protein

này được lựa chọn để nghiên cứu chức năng sâu hơn. Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng

STMN1 biểu hiện tăng dẫn đến những thay đổi quan trọng trong quá trình di chuyển

của tế bào, xâm lấn, sự bám dính và hình thành cụm tế bào. Nghiên cứu sâu hơn đã

chỉ ra rằng, biểu hiện khác biệt của STMN1 có liên quan đến khả năng di căn của tế

bào. Sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch, các nhà khoa học cũng chỉ ra rằng

STMN1 biểu hiện tăng cao trong các khối u đại trực tràng ban đầu và trong mô di

căn khi so sánh với mô đại trực tràng bình thường ở vị trí lân cận u [36].

Ngoài hướng nghiên cứu proteomics đối với mẫu mô ung thư và mẫu huyết

thanh, mẫu nước tiểu, hướng nghiên cứu proteomics trong bào quan ty thể đang

được các nhà khoa học quan tâm. Tiếp cận theo hướng phân tích này, năm 2010,

Trịnh Hồng Thái và cs (số liệu chưa công bố) đã áp dụng kỹ thuật điện di hai chiều

kết hợp với khối phổ MALDI TOF-MS để phân tích proteomics ty thể của bệnh

nhân ung thư đại trực tràng. Kết quả nghiên cứu đã xác định được 30 protein, trong

đó có 24 protein đã được định danh và 6 protein giả thiết. Các protein đã được nhận

dạng trong ty thể gồm các protein thuộc 6 nhóm: protein điều hòa chu trình tế bào,

sự tăng sinh tế bào, quá trình apoptosis (29,2%); protein liên quan đến quá trình

phiên mã, dịch mã, cải biến sau dịch mã (4,2%); protein liên quan tới quá trình trao

đổi chất (41,6%); protein liên quan đến miễn dịch, bảo vệ cơ thể (8,3%); protein

liên quan đến sự tổng hợp ATP (12,5%) và protein liên quan đến sự di căn của các

tế bào ung thư (4,2%). Đặc biệt trong đó, các protein Actin related protein 2/3

complex, ATP synthease subunit beta biểu hiện tăng, Cellular tumor antigen p53

biểu hiện giảm rõ rệt ở mô ung thư.

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là mẫu mô của bệnh nhân ung thư đại trực tràng được lấy tại

vị trí khối u và vị trí lân cận khối u (cách khối u khoảng 5 – 10 cm).

Mẫu mô sử dụng trong nghiên cứu này do Khoa Tế bào – Giải phẫu bệnh,

bệnh viện K Tam Hiệp, Hà Nội và Khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức, Hà

Nội cung cấp. Mẫu mô được đựng trong ống đựng mẫu, được bảo quản trong nitơ

lỏng để vận chuyển từ bệnh viện về phòng thí nghiệm. Các mẫu mô sau đó được

bảo quản trong tủ âm sâu (- 80C) cho tới khi tiến hành những nghiên cứu tiếp theo.

Danh sách bệnh nhân ung thư đại trực tràng tham gia trong nghiên cứu này

được cung cấp tại Phụ lục 1.

2.1.2. Hóa chất

Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này được đề cập ở

bảng 2.

Bảng 2. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên hóa chất Nhà cung cấp

1 Bio–Lyte 4-7 ampholyte, Bio–Lyte 3-10 ampholyte GE Health Care, Mỹ

2 Các peptide chuẩn Insuline B (Mw = 3494,65 Da), Sigma – Aldrich, Mỹ Angiotensine II (Mw = 1046,5423 Da)

3 Chất nền CHCA (α–Cyano–4- hydroxycinnamic Sigma – Aldrich, Mỹ acid)

4 Enzyme trypsin Sigma – Aldrich, Mỹ

5 CHAPS, DTT, IAA, Tris – base Biorad, Mỹ

6 Agarose low melting, Glycine, Urea Sigma, Mỹ

7 SDS, Acrylamide, Bis - Acrylamide Pharmacia - Mỹ

8 Acetone, Acetonitrile, Methanol Merk, Đức

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Tất cả các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ sạch phân

tích.

2.1.3. Thiết bị

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sử dụng các thiết bị, dụng cụ trong Phòng

thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm

Công nghệ Enzyme và Protein. Các thiết bị chính bao gồm:

 Máy ly tâm lạnh 5417R (Eppendorft, Đức), máy ly tâm K30 (Sigma, Đức).

 Thiết bị điện di đẳng điện Protean IEF cell (Biorad - Mỹ), Ettan IPGphor 3

(GE Healthcare, Mỹ).

 Thanh IPG strip pH 3-10, dài 17 cm (Biorad, Mỹ).

 Buồng điện di: Protean II xi multi-cell cho phép chạy 6 bản gel 17cm cùng

một lúc, Protean II XL cell chạy 2 bản gel kích thước 17cm và Mini-Protean

3 cell (Biorad - Mỹ) chạy các gel kích thước 7cm.

 Nguồn điện di PowerPacTMHC (Biorad - Mỹ).

 Hệ thống phần mềm chuyên dụng phân tích hình ảnh bản gel điện di hai

chiều Phoretix (Shimadzu - Nhật Bản).

 Hệ thống phân tích khối phổ AXIMA - CRFPLUS (KRATOS - Anh).

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Xử lý mẫu mô đại trực tràng

Mẫu mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư được lấy ra từ tủ -80oC, rã

đông. Cân 2 mẫu mô với lượng tương đương (khoảng 0,1g) cho vào hai cối sứ riêng

biệt để trên đá. Quy trình xử lý mẫu mô đại trực tràng được thực hiện như sau:

Bước 1. Thu các phân đoạn dịch chiết protein

 Mẫu mô được cắt nát bằng kéo cho đến khi mẫu nát nhỏ. Bổ sung 100 µl

đệm muối phosphate (PBS) 0,05M, pH 7,4. Chuyển toàn bộ mẫu mô đã cắt và dịch

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

đệm vào ống eppendorft để trong 30 phút, ở 4oC. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC để thu dịch nổi là phân đoạn PBS 1.

 Cặn thu được sau ly tâm lần 1 được bổ sung 200µl đệm PBS 0,05M, pH 7,4 để ở 4oC trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC để

thu dịch nổi là phân đoạn PBS 2.

 Cặn thu được sau ly tâm lần 2 được hòa tan bằng 100 µl đệm lysis (Urea 7M, Tris 30mM, CHAPS 4% và DTT 65mM), để ở 4oC trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 1.

 Cặn thu được sau ly tâm lần 3 được hòa tan bằng 100 µl đệm lysis, để ở 4oC trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC để thu dịch

nổi là phân đoạn lysis 2.

 Cặn thu được sau ly tâm lần 4 được hòa tan bằng 200 µl đệm lysis, để ở 4oC trong 60 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC để thu dịch

nổi là phân đoạn lysis 3.

Bước 2. Loại mỡ trong các phân đoạn dịch chiết protein thu được

Ly tâm 5 phân đoạn dịch chiết protein thu được (PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis 2 và lysis 3) ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC và hút loại lớp mỡ phía trên.

Bước loại mỡ được lặp lại ít nhất 2 lần để đảm bảo loại mỡ tối đa.

Bước 3. Loại cặn tế bào, ADN, ARN trong các phân đoạn dịch chiết

protein thu được

Ly tâm 5 phân đoạn dịch chiết protein thu được sau quá trình loại mỡ ở tốc độ 60.000g trong 30 phút ở 4oC, thu dịch nổi phía trên, loại bỏ cặn. Bước này được

lặp lại 2 lần để đảm bảo loại cặn tối đa.

Bước 4. Kiểm tra thành phần protein có trong các phân đoạn chiết và độ

sạch của mẫu

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Dịch chiết protein thu được từ các phân đoạn sẽ được điện di trên gel

polyacrylamide 10% có SDS để kiểm tra thành phần protein có trong mẫu và độ

sạch của mẫu. Các mẫu chưa đạt độ sạch sẽ được tủa bằng dung dịch acetone theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch acetone 100%, để ở -20oC trong ít nhất 2

tiếng đến qua đêm. Các protein lắng tủa được thu lại sau khi ly tâm ở tốc độ 15.000 vòng/phút, ở 4oC trong thời gian 10 phút sẽ được hòa tan lại bằng đệm lysis. Kết

quả làm sạch mẫu dịch protein bằng phương pháp tủa cũng được kiểm tra bằng cách

điện di dung dịch sau khi hòa tủa trên gel polyacrylamide 10% có SDS. Các dịch

chiết của cùng một mẫu được trộn lại để chuẩn bị cho điện di hai chiều.

2.2.2. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford

Để đảm bảo hàm lượng protein tổng số giữa các mẫu nghiên cứu là tương

đương nhau, trước khi điện di hai chiều, chúng tôi tiến hành định lượng protein

trong mẫu dịch chiết protein từ mô ung thư và mô bình thường bằng phương pháp

Bradford. Phương pháp này giúp định lượng protein trong mẫu nghiên cứu dựa trên

nguyên tắc so màu. Các protein khi phản ứng với thuốc nhuộm Coomassie brilliant

blue sẽ hình thành một hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng

595nm. Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein có trong dung dịch [26Error!

Reference source not found.]. Chúng tôi sử dụng albumin huyết thanh bò với nồng

độ đã được biết trước để xây dựng đường chuẩn về độ hấp thụ ánh sáng ở các nồng

độ khác nhau. Các mẫu sẽ lần lượt được tiến hành đo, xác định độ hấp thụ ánh sáng,

từ đó tính toán ra nồng độ protein có trong dung dịch.

Sau khi đã xác định hàm lượng protein có trong mẫu, chúng tôi tiến hành

tính toán sao cho hàm lượng protein có trong dung dịch sử dụng cho điện di hai

chiều của mẫu bệnh và mẫu đối chứng là tương đương nhau.

2.2.3. Điện di hai chiều

Kỹ thuật điện di hai chiều được sử dụng để phân tách các protein trong mẫu

thành các điểm riêng rẽ, trong đó chiều điện di thứ nhất là điện di phân vùng đẳng

điện (IEF) để phân tách các protein theo điểm đẳng điện (pI) và chiều điện di thứ

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

hai là điện di SDS-PAGE để phân tách protein theo khối lượng và hình dạng. Quá

trình này được bắt đầu bằng việc làm trương thanh strip có gradient pH cố định

bằng đệm trương gel có chứa protein. Sau 1,5 giờ dung dịch sẽ ngấm vào thanh

strip. Lượng protein tối đa mà sợi gel IPG strip pH 3 - 10 dài 17cm có thể thấm

được là 400µg.

Điện di đẳng điện được thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell hoặc Ettan

IPGphor3 để tập trung các phân tử protein vào vị trí tương ứng với pI của phân tử

đó trên thanh IPG strip. Quá trình chạy điện di đẳng điện diễn ra theo 5 bước được

trình bày trong bảng 3.

Bảng 3. Các bước chạy điện di đẳng điện trên thanh IPG strip dài 17cm

Bước Hiệu điện thế V Thời gian (t) V.t (V - giờ) Chế độ tăng U

Bước 1 50 12 giờ … Trương gel

Bước 2 125 2 giờ … Tuyến tính

Bước 3 250 15 phút … Nhanh

Bước 4 10.000 2 giờ … Chậm

Bước 5 10.000 … 40.000 Vh Nhanh

≈ 20 giờ ≈ 60.000 Tổng

Kết thúc điện di đẳng điện, các thanh strip được ngâm trong đệm cân bằng I

(Tris HCl 50mM, pH 8,8; Urea 6M; glycerol 30%; SDS 2%; DTT 0,1%) ở nhiệt độ

phòng và đệm cân bằng II (Tris HCl 50mM, pH 8,8; Urea 6M; glycerol 30%; SDS

2%; IAA 0,25%) thực hiện trong bóng tối cũng ở nhiệt độ phòng. Mỗi bước cân

bằng được thực hiện 3 lần, thời gian mỗi lần theo thứ tự là: 5 phút, 10 phút, 10 phút.

Điện di chiều hai được tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS. Kết

thúc điện di chiều hai, các protein được cố định 45 phút trong dung dịch chứa axít

phosphoric 1,3%, methanol 20%, sau đó nhuộm bằng dung dịch Coomassie G250

qua đêm theo phương pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

(1988). Phương pháp nhuộm này đạt độ nhạy cao, có thể hiện lên các spot chỉ chứa

30ng protein [43].

2.2.4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều

Đầu tiên bản gel điện di hai chiều được quét vào máy tính có phần mềm phân

tích chuyên dụng Phoretix (Shimadzu, Nhật Bản). Bước đầu phân tích hình ảnh bản

gel điện di hai chiều, phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trên mỗi bản

gel và đánh số thứ tự cho các spot. Tiếp đó, phần mềm Phoretix sẽ xác định vị trí,

thể tích của từng spot và giá trị cường độ khối trung bình của mỗi spot trên bản gel

(được tính bằng thể tích của spot đó chia cho tổng thể tích các spot trên toàn bản gel

nhân với 100) từ đó giúp chỉ ra các spot tương ứng trên từng bản gel và các spot có

biểu hiện khác biệt giữa bản gel mẫu bệnh so với bản gel mẫu đối chứng (hình 3).

Hình 3. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Phoretix

Kết quả phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều chỉ ra các spot protein

xuất hiện trên bản gel này mà không xuất hiện trên bản gel kia hay các spot biểu

hiện tăng, giảm khác nhau giữa hai bản gel mô ung thư và bản gel đối chứng. Dựa

vào kết quả này, chúng tôi xác định được các spot protein quan tâm để tiến hành

phân tích tiếp theo.

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

2.2.5. Cắt và thủy phân spot

Các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản gel điện di hai chiều được cắt ra

khỏi bản gel. Lúc này các phân tử protein nằm trong gel polyacrylamide liên kết với

phân tử thuốc nhuộm Coomassie. Do đó, trước tiên cần phải loại bỏ chất màu

Coomassie. Protein trong các spot được thủy phân thành các peptide để chuẩn bị

cho phân tích khối phổ. Loại enzyme được sử dụng để thủy phân protein là trypsin.

Enzyme này có tác dụng cắt phân tử protein tại các gốc Lysine (K) và Arginine (R)

ở đầu C và không cắt khi các gốc này liên kết với Prolin (P). Khi đó, phân tử protein

được cắt thành các mảnh peptide có kích thước từ 6 – 20 acid amin, thích hợp cho

phân tích khối phổ về sau [1]. Quá trình tẩy màu các spot, thủy phân protein thành

các mảnh peptide sẵn sàng cho phân tích khối phổ bao gồm các bước cụ thể như

- Cắt spot ra khỏi bản gel.

- Rửa spot bằng nước Mini Q.

- Tẩy màu spot bằng dung dịch chứa ammonium bicarbonate (ABC)

50mM, acetonitrile (AcCN) 50%.

- Làm khô spot bằng AcCN 100%.

- Ủ spot protein với dung dịch enzyme trypsin hoạt động qua đêm ở 37oC

để enzyme cắt hoàn toàn phân tử protein thành các mảnh peptide, chui ra

khỏi gel polyacrylamide và đi vào dịch thủy phân.

Các peptide trong dịch thủy phân sẽ được hấp phụ bằng Ziptip C18 theo quy

trình sau:

- Làm ướt Ziptip bằng dung dịch có trifluoroacetic acid (TFA) 0,1% trong

AcCN 70%.

- Cân bằng Ziptip bằng dung dịch chứa TFA 0,1 %.

- Hấp phụ peptide trong dịch thủy phân vào Ziptip.

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

- Loại muối bằng TFA 0,1%.

- Thôi peptide ra khỏi Ziptip lên đĩa MS bằng dung dịch TFA 0,1% trong

AcCN 70%.

- Cuối cùng, bổ sung lên đĩa MS dung dịch chất nền (CHCA 10mg/ml

trong TFA 0,05%, AcCN 50%).

2.2.6. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein

Tiến hành phân tích khối phổ MALDI – TOF MS để xác định khối lượng của

tập hợp các peptide thu được sau quá trình thủy phân các spot protein bằng enzyme

trypsin. Phương pháp khối phổ (MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách

đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của

các hạt mang điện hay ion trong một điện trường hoặc một từ trường nhất định.

Nguồn MALDI được dùng trong phân tích các hợp chất cao phân tử dựa trên

nguyên lý làm ion hóa và thăng hoa mẫu peptide từ phức hợp chất nền (matrix) ở

dạng tinh thể qua tác động của các xung laser [1].

Mẫu peptide được phân tích đồng thời với các mẫu chuẩn là hỗn hợp hai

peptide Angiotensin II (Mw 1046,54 Da) và Insulin B (Mw 3494,65 Da). Hỗn hợp

peptide được trộn với chất nền CHCA, để khô và đưa vào máy phân tích khối phổ AXIMA – CRFPLUS. Các thông số cài đặt bao gồm:

- Nguồn laser: 55

- Profile: 30 profile cho 1 lần bắn

- Khối lượng tối ưu: 2.000 Da

- Phổ khối lượng: 500 – 5.000 Da

Protein được nhận dạng bằng phương pháp PMF (Peptide Mass Fingerprint).

Phương pháp này nhận dạng protein bằng việc so sánh khối lượng của tập hợp các

peptide thu sau khi thủy phân với cơ sở dữ liệu có sẵn, sử dụng phần mềm Mascot

với chế độ tra cứu như sau:

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

- Cơ sở dữ liệu: NCBI

- Phân loại: Homo sapiens

- Enzyme: Trypsin

- Các cải biến không thay đổi: Cacbamidomethyl (C)

- Các cải biến thay đổi: Oxidation (M)

- Giá trị khối: MH+

- Độ sai lệch cho phép: ± 1 Da

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tách chiết protein từ mô ung thư

đại trực tràng (mẫu bệnh) và mô đại trực tràng bình thường (mẫu đối chứng) của

cùng một bệnh nhân. Mẫu mô được cắt nhỏ, ngâm trong đệm PBS 0,05M, pH 7,4

và đệm phá tế bào lysis rồi thực hiện các bước ly tâm để thu lấy các phân đoạn dịch

chiết protein. Kết quả tách chiết được kiểm tra bằng điện di SDS - PAGE (hình 4).

Hình 4. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư đại trực tràng trên cùng bản gel polyacrylamide 10% có SDS

Giếng 1, 2, 3, 4, 5: Lần lượt là các phân đoạn dịch chiết PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis

2, lysis 3 thu được từ mô đại trực tràng bình thường.

Giếng 6, 7, 8, 9, 10: Lần lượt là các phân đoạn dịch chiết PBS 1, PBS 2, lysis 1,

lysis 2, lysis 3 thu được từ mô ung thư đại trực tràng.

Trong điện di SDS - PAGE, các protein được phân tách theo khối lượng

phân tử, các protein có khối lượng phân tử khác nhau thì được hiện lên dưới dạng

từng vạch băng khác nhau. Hiệu quả tách chiết protein được đánh giá thông qua số

lượng các băng và độ đậm nhạt của các băng. Khi nhuộm bản gel bằng thuốc

nhuộm có chứa Coomassie, băng protein bắt màu thuốc nhuộm càng đậm chứng tỏ

hàm lượng protein loại đó càng lớn. Số lượng băng trong một giếng điện di càng

nhiều, thành phần protein của mẫu càng đa dạng phong phú. Ngoài ra, kết quả điện

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

di SDS – PAGE còn bị ảnh hưởng bởi các thành phần không phải là protein như

mỡ, cặn tế bào, ADN, ARN… Khi có mặt của những thành phần này trong dịch

chiết, kết quả điện di sẽ xuất hiện những vệt dọc, kéo dài và bắt màu đậm với thuốc

thuộm.

Hình 4 cho thấy kết quả điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết thô protein

từ mẫu mô đại trực tràng. Nhìn vào kết quả điện di chúng tôi thấy trong các giếng

đã xuất hiện nhiều băng protein trải đều từ trên xuống dưới chứng tỏ đã tách chiết

thành công protein từ mô đại trực tràng và thành phần protein thu được trong mẫu là

đa dạng và phong phú. Trong các mẫu, phân đoạn PBS 2, lysis 2 và lysis 3 (giếng

số 2, 4, 5 và 7, 9, 10) có các băng vạch rõ nét và không có hoặc ít có vệt kéo dài từ

trên xuống dưới. Điều này chứng tỏ các phân đoạn này là tương đối sạch, ít bị lẫn

các thành phần phi protein. Bên cạnh đó, các phân đoạn PBS 1 và lysis 1 (giếng số

1, 3 và 6, 8) của các mẫu có các băng protein hiện lên chưa rõ ràng và xuất hiện

hiện tượng kéo vệt dọc theo chiều dài giếng. Điều này chứng tỏ các phân đoạn này

có thể lẫn các thành phần phi protein trong mẫu. Do đó, chúng tôi tiến hành tủa mẫu

của các phân đoạn PBS 1 và lysis 1 bằng dung dịch acetone theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch acetone 100% ở -20oC. Protein sau khi tủa được hòa tan lại

bằng chính đệm lysis và được điện đi kiểm tra trên gel polyacrylamide 10% có

SDS. Kết quả điện di kiểm tra mẫu tủa được cho trong hình 5.

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Hình 5. Điện di kiểm tra mẫu tủa của phân đoạn dịch chiết protein PBS 1 và lysis 1 từ

mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư đại trực tràng trên bản gel

polyacrylamide 10% có SDS

Giếng 1, 2,: Lần lượt là mẫu tủa của các phân đoạn dịch chiết PBS 1, lysis 1 thu

được từ mô đại trực tràng bình thường.

Giếng 3, 4: Lần lượt là mẫu tủa của các phân đoạn dịch chiết PBS 1, lysis 1 thu

được từ mô ung thư đại trực tràng.

Kết quả điện di kiểm tra cho thấy các mẫu dịch chiết phân đoạn PBS 1 và

lysis 1 sau khi tủa bằng acetone đã xuất hiện những băng vạch rõ nét, không còn các

vệt dọc kéo dài trên bản gel. Điều này chứng tỏ mẫu sau khi tủa đã loại được đáng

kể các thành phần phi protein trong mẫu dịch chiết thô ban đầu. Mẫu sau khi tủa có

thể sử dụng cho các phân tích tiếp theo.

Các phân đoạn khác nhau của mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư

được trộn lại với nhau tạo thành dịch chiết protein đầy đủ của mô đại trực tràng

dùng để tiến hành bước thí nghiệm tiếp theo.

3.2. PHÂN TÁCH PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRÊN BẢN GEL

ĐIỆN DI HAI CHIỀU

Cho đến nay, điện di hai chiều (2-DE) vẫn là kỹ thuật được dùng phổ biến

nhất để phân tách các protein trong một mẫu phức tạp. Kỹ thuật 2-DE cho phép

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

phân tách các protein khác nhau chỉ đến 0,1 đơn vị pI (isoelectric point) và 1kDa về

khối lượng phân tử [43].

Protein trong dịch chiết mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư của bệnh

nhân ung thư đại trực tràng được phân tách thành các spot protein riêng rẽ bằng kỹ

thuật điện di hai chiều. Chiều thứ nhất là điện di đẳng điện trên thanh IPGstrip, pH 3-

10, dài 17cm. Điện di chiều hai được tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS.

Mẫu mô ung thư và mẫu đối chứng được tiến hành song song, cùng điều kiện để đảm

bảo tính chính xác trong các kết quả so sánh về sau.

Trên bản gel điện di, các protein trong mẫu được phân tách thành các spot

riêng rẽ hoặc các dãy spot của một loại protein, đây là kết quả của việc cải biến sau

phiên mã hay biến đổi sau dịch mã, tạo ra các đồng phân có khối lượng phân tử

A - Mô đại trực tràng bình thường

B - Mô ung thư đại trực tràng

tương tự nhau và điểm đẳng điện gần nhau (hình 6).

Hình 6. Phân tách protein mô đại trực tràng của bệnh nhân mã số 11781 trên bản gel

điện di hai chiều

Chiều 1: Điện di đẳng điện trên thanh IPG strip pH 3-10 dài 17cm;

Chiều 2: Điện di SDS - PAGE trên gel polyacrylamide 10%

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân tách được các protein mô đại trực

tràng bình thường và mô ung thư của 5 bệnh nhân ung thư đại trực tràng trên bản

gel điện di hai chiều, sử dụng thanh strip dài 17 cm, pH 3-10.

3.3. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU

Sử dụng phần mềm phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều Phoretix,

bước đầu chúng tôi đã xác định được tổng số spot protein được phân tách trên mỗi

bản gel điện di hai chiều (bảng 4).

Bảng 4. Số lượng spot protein phân tách trên bản gel điện di hai chiều

Số lượng spot TT Mã bệnh nhân Mô bình thường Mô ung thư

1 11781 188 spot 239 spot

2 10608 139 spot 86 spot

3 10483 106 spot 162 spot

4 10597 130 spot 130 spot

5 11812 120 spot 166 spot

Với phần mềm Phoretix, ngoài việc xác định tự động các spot trên bản điện di

hai chiều, còn cho phép xác định các spot tương ứng trên bản gel, đưa ra giá trị cường

độ khối trung bình của từng spot protein. Bên cạnh đó, phần mềm còn đưa ra hình

ảnh ba chiều (3-D) của các spot protein, trong đó độ lớn của spot được thể hiện bằng

bề rộng đáy spot trên hình ảnh 3-D, độ đậm của spot được thể hiện bằng chiều cao

của spot tính từ đáy lên đỉnh và độ sắc nét của spot nhuộm màu coomassie được thể

hiện bằng độ nhọn của spot trên hình ảnh 3-D (hình 7). Đây là cơ sở để so sánh sự

biểu hiện khác biệt của các spot protein tương ứng giữa các cặp bản gel điện di mẫu

protein mô đại trực tràng.

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

A - Mô bình thường B - Mô ung thư

Hình 7. Minh họa các spot biểu hiện khác biệt trên bản gel mô ung thư so với

mô bình thường

Căn cứ vào các thông số trong quá trình phân tích, chúng tôi đã xác định được

các spot protein biểu hiện khác biệt ở bản gel điện di hai chiều của mẫu protein mô

đại trực tràng bình thường và mô ung thư. Các khác biệt này bao gồm: các spot biểu

hiện tăng (↑) hoặc giảm (↓) ở bản gel mẫu mô ung thư so với bản gel đối chứng; các

spot chỉ xuất hiện, quan sát thấy rõ trên bản gel mô ung thư (+) hoặc các spot chỉ

xuất hiện, quan sát thấy rõ trên bản gel mô đại trực tràng bình thường (-). Hình 7

minh họa về một số spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thư và bản gel đối

chứng.

Tiến hành phân tích độc lập từng cặp bản gel điện di hai chiều, chúng tôi đã

xác định được các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thư so với mô đại

trực tràng bình thường trên từng cặp bản gel. Hình 8 minh họa kết quả so sánh biểu

hiện protein khác biệt trên cặp bản gel điện di hai chiều mẫu mô đại trực tràng của

bệnh nhân mã số 11781.

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

A - Mô đại trực tràng bình thường B - Mô ung thư đại trực tràng

Hình 8. Các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel điện di hai chiều mẫu

mô đại trực tràng bình thường so với mẫu mô ung thư của

bệnh nhân ung thư đại trực tràng mã 11781

↑ O ↓ O : Biểu hiện giảm ở mô ung thư

: Biểu hiện tăng ở mô ung thư

+ O : Chỉ có ở mô ung thư - O : Chỉ có ở mô bình thường

Chúng tôi đã tiến hành thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản

gel điện di hai chiều của cả 5 bệnh nhân. Kết quả được đưa ra trong bảng 5.

Bảng 5. Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản gel

điện di hai chiều của 5 bệnh nhân

Mã bệnh nhân Biểu hiện 11781 10608 10483 10597 11812

17 6 10 12 15 Tăng ở mô ung thư (↑)

5 22 1 9 19 Giảm ở mô ung thư (↓)

11 0 0 1 5 Chỉ xuất hiện ở mô ung thư (+)

0 8 0 14 1 Chỉ xuất hiện ở mô thường (-)

Tổng số khác biệt 33 36 11 36 40

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thư đại

trực tràng so với bản gel mô đại trực tràng bình thường của các bệnh nhân, chúng

tôi nhận thấy có 43 spot biểu hiện khác chung bao gồm 16 spot biểu hiện tăng, 17

spot biểu hiện giảm và 10 spot không xuất hiện ở bản gel mô ung thư đại trực tràng.

3.4. XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MALDI-TOF MS

Sau khi phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, những spot protein biểu

hiện khác biệt giữa mô ung thư so với mô bình thường được cắt và thủy phân, thu

được hỗn hợp peptide sử dụng cho phân tích khối phổ. Sử dụng enzyme trypsin để

thủy phân protein. Sau khi bị phân cắt, mỗi protein cho kết quả là một tập hợp dữ

liệu các peptide khác nhau. Trypsin là một protease thuộc nhóm serine, được sử

dụng phổ biến nhất trong phân tích proteomics. Enzyme này phân cắt các protein tại

đầu C của lysine và arginine. Thông thường, một protein 10kDa sẽ bị trypsin phân

cắt thành 30 đoạn peptide có khối lượng phù hợp để phân tích khối phổ. Một đặc

điểm thuận lợi của trypsin đối với phân tích proteomics là enzyme này thể hiện hoạt

tính mạnh ngay cả trong dung dịch lẫn khi thủy phân trong gel. Bằng kỹ thuật

MALDI-TOF MS chúng tôi đã xác định được các peptide trong mẫu thủy phân

protein và biểu thị bằng các đỉnh trên đồ thị. Với mỗi đỉnh trên đồ thị, trục hoành

biểu diễn khối lượng của peptide (đơn vị dalton) và trục tung biểu thị độ lớn của tín

hiệu tương ứng peptide đó khi phân tích khối phổ (đơn vị mV) (hình 9).

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Hình 9. Phân tích khối phổ các peptide thu được sau khi thủy phân protein T17B33

bằng enzyme trypsin

Sau khi phân tích khối phổ protein được nhận dạng theo phương pháp PMF.

Khối lượng của các peptide được tạo ra sau khi thủy phân được so sánh với cơ sở

dữ liệu NCBI, sử dụng phần mềm Mascot thông qua website w.w.w.

matrixscience.com. Kết quả nhận dạng là một danh sách các protein phù hợp trong

cơ sở dữ liệu và một số thông tin cơ bản như tên protein, ký hiệu, khối lượng phân

tử, trình tự peptide phù hợp, score… Tuy nhiên, protein tra được phải có score lớn

hơn 64 (độ tin cậy lớn hơn 95%). Khi đó, protein tra được sẽ biểu thị bằng cột màu

đỏ, tách ra khỏi vùng màu xanh không có ý nghĩa. Thông tin chi tiết về protein tra

được bao gồm khối lượng phân tử và giá trị pI trên lý thuyết, tổng số lượng các

mảnh peptide được đưa vào cơ sở dữ liệu, tổng số lượng peptide phù hợp với cơ sở

dữ liệu. Ngoài ra, phần mềm còn đưa ra trình tự amino acid của protein được tra

phù hợp với cơ sở dữ liệu (hiển thị bằng phần màu đỏ trong trình tự). Kết quả nhận

dạng protein T17B31 trên bản gel mẫu mô ung thư đại trực tràng theo phương pháp

này được mình họa ở hình 10.

LuËn v¨n th¹c sÜ NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Hình 10. Kết quả nhận dạng protein bằng tra cứu cơ sở dữ liệu NCBI sử dụng phần mềm Mascot

Các spot biểu hiện khác biệt giữa mô ung thư đại trực tràng và mô bình

thường trên tất cả các bản gel 2-DE dài 17cm của 5 bệnh nhân được tiến hành phân

tích khối phổ. Khi so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI, sử dụng phần mềm Mascot đã

nhận dạng được 41 protein trong đó 29 protein đã được định danh và 12 protein giả

thuyết (bảng 6).

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Bảng 6. Danh sách các protein được xác định bằng MALDI TOF-MS từ bản gel mô ung thư so sánh với bản gel mô đại trực tràng bình thường của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

STT

Spot

Tên protein

Pi

Ký hiệu trong NCBI

KLPT (Da)

Biểu hiện

Điểm theo hệ thống MASCOT

Tỷ lệ % phù hợp

Q8NBP6

T17B5

Hypothetical protein NT2RP2000636

84.002

9,10

↑

T17B25

gi|29292410

Immunoglobulin heavy chain

10.137

5,25

↑

T17B135

gi|119612397

T17B28

119.143

8,17

↑

T17B33

TAF2 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor, 150kDa, isoform CRA_a

gi|55769537

T17B31

Zinc finger protein 658

125.674

8,63

↑

T17B38 Q15374

GARS protein

46.585

6,34

↑

gi|340764274

6. T17B108

14.793

8,56

↑

Immunoglobulin heavy chain variable region 7. T17B162 YD49_HUMAN Hypothetical zinc finger protein KIAA1349

88.217

9,29

↑

8. T17T100 Q9NXL8

Hypothetical protein ELJ20171

40.482

8,11

↓

9. T17T116 CAD83811

Sequence 1 from patent WO02063009

24.950

8,52

↓

10. T17T120 GO1496

Transcription factor IIIA (Fragment)

39.762

9,33

↓

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

STT

Spot

Tên protein

Pi

Ký hiệu trong NCBI

KLPT (Da)

Biểu hiện

Điểm theo hệ thống MASCOT

Tỷ lệ % phù hợp

11. T17T139 Q96M66

Hypothetical protein FLJ32790

20.953

9,60

↓

12. T17T178 S53351

67.639

7,92

↓

Malate dehydrogenase (oxaloacetate – decarboxylating) (NADP) (EC 1.1.1.40) precursor, mitochondrial

13. TTB87A K2C1_HUMAN Keratin, type II cytoskeletal 1 (Cytokeratin

66.170

8,16

↑

1) (K1) (CK 1) (67 kDa cytokeratin)

14.

TTB87B ATHUC

Actin, cardiac muscle

42.334

5,23

↑

15.

TTB87C Q16846

11.503

6,37

↑

Tyrosine hydroxylase (EC 1.14.16.2) (FRAGMENT)

gi|85396888

16.

TTB116

Protein tyrosine phosphatase, receptor type, S

169.480

6,16

↑

17.

TTB119 CAB58611

Sequence 1 from patent WO9318147

22.885

6,22

↑

G01523

18.

TTT84

Heat shock protein 27 – human

27.094

8,24

↓

Q86YT1

19.

TTT97

64.760

8,36

↓

Acyl-coenzyme A synthetase ACSM2B, mitochondrial

gi|51127397

20.

CB29

Mutated CMP-sialic acid transporter A1

12.088

8,90

↑

gi|4502517

21.

CB51

Carbonic anhydrase 1

28.909

6,59

↑

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Pi

STT

Spot

Tên protein

Biểu hiện

KLPT (Da)

Ký hiệu trong NCBI

Điểm theo hệ thống MASCOT

Tỷ lệ % phù hợp

Q9H019

32.407

5,62

22.

CT16

Hypothetical protein

↓

S55041

23.201

6,14

23.

CT22

↓

Proteasome endopeptidase complex (EC 3.4.25.1) beta chain C10-II-human

B38431

24.

CT27

Myc- binding factor Max, short form

17.191

6,07

↓

Q8NHR9

25.

CT38

14.481

8,76

↓

Similar to data source: SPTR, source key: P39825, evidence: ISS putative related to PROFILIN

AAA76850

26.

CT40

Creatine kinase (EC 2.7.3.2) chain B

42.786

5,27

↓

gi|194376310

27.

CT41

Unnamed protein product

38.950

5,19

↓

Q29856

28.

CT59

MHC class I (fragment)

21.381

6,24

↓

gi|4501889

29.

CT67

42.249

5,31

↓

Actin, gamma-enteric smooth muscle isoform 1 precursor

gi|82408340

30.

CT74

19.588

6,81

Chain A, Crystal Structure Of Diras2 In Complex With Gdp And Inorganic Phosphate

gi|154959417

31.

CT79

Suppressor of tumorigenicity 20 protein

9.189

8,52

AAH33813

32.

CT82

BCO33813 NID

29.310

5,23

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

STT

Spot

Tên protein

Pi

Ký hiệu trong NCBI

KLPT (Da)

Biểu hiện

Điểm theo hệ thống MASCOT

Tỷ lệ % phù hợp

CT86

gi|4099605

Translational activator GCN1, partial

109.122

5,91

33.

Q8IZJ2

34.

CT94

Plexin D1

196.552

6,55

↓

gi|28175105

35.

CT96

ZFYVE26 protein, partial

55.592

8,90

gi|40807213

36.

CT104

FAM179B protein

88.718

8,94

gi|25140644

37.

CT113

Tyrosine hydroxylase isoform 1

14.144

9,52

gi|7447027

38.

CT120

Glutamate/aspartate transporter II

61.745

6,20

↓

gi|40786418

39.

CT123

Profilin – 4

14.481

8,76

↓

gi|25901054

40.

CT127

SE2-5LT1 protein

89.926

6,31

gi|4139750

41.

CT134

31.377

7,76

Chain A, Crystal Structure Of The Nfkb P50P65 HETERODIMER COMPLEXED To The Immunoglobulin Kb Dna

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

3.5. ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN BIỂU HIỆN KHÁC

BIỆT

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nhận dạng được 41 spot protein tương

ứng với 29 protein đã được định danh và 12 protein giả thiết. Để tìm hiểu mối liên

quan của các protein này với ung thư, chúng tôi tiến hành tìm kiếm cơ sở dữ liệu về

các protein [56]. Các protein được tìm hiểu về chức năng và phân theo nhóm chức

năng như trong bảng 7.

Bảng 7. Tóm tắt chức năng chính của các protein đã được định danh biểu hiện khác biệt giữa mô ung thư đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình thường

Protein

Chức năng chính

Biểu hiện

Protein liên quan đến chu trình tế bào, tăng sinh tế bào và apoptosis: 4 protein

Protein tyrosine

Protein thuộc họ tyrosine phosphatase. Họ protein

↑

phosphatase, receptor

này được biết đến như là phân tử tín hiệu giúp

type, S

điều hòa nhiều quá trình nội bào như sinh trưởng,

biệt hóa, phân bào và chuyển dạng ung thư

Proteasome

Tham gia trong quá trình phản ứng lại nhiễm

↓

endopeptidase complex

virus, tổn hại DNA, quá trình stress oxi hóa, quá

trình apoptosis

Suppressor of

Hoạt động như yếu tố ức chế khối u, thúc đẩy quá

tumorigenicity 20 protein

trình apoptosis trong các tế bào ung thư

ZFYVE26 protein

Hoạt động như yếu tố điều hòa quá trình nguyên

phân

Protein liên quan đến miễn dịch và bảo vệ cơ thể: 6 protein

Immunoglobulin heavy

Tham gia cấu tạo nên phân tử Ig

↑

chain (IgH)

GARS protein (Glycyl –

Enzyme thuộc họ tRNA synthetase, có vai trò xúc

↑

tRNA synthetase)

tác cho việc gắn glycine vào tARN.

Immunoglobulin heavy

Tham gia cấu tạo nên phân tử Ig

↑

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Protein

Chức năng chính

Biểu hiện

chain variable region

MHC class I antigen

Trình diện kháng nguyên nội sinh

↓

Heat shock protein 27

Đáp ứng lại stress, nhiễm virus, kích thích sản

↓

(HSP27)

xuất interleukin-1

Chain A, Crystal

Nfkb có vai trò điều hòa quá trình sao mã của rất

Structure Of The Nfkb

nhiều loại tế bào khác nhau trong đáp ứng với các

kích thích như viêm và miễn dịch

Protein tham gia cấu trúc tế bào: 4 protein

Actin, cardiac muscle

Protein có tính bảo thủ cao, liên quan đến việc cấu

↑

trúc các tế bào vận động và thường được biểu hiện

ở tế bào nhân chuẩn

Actin, gamma-enteric

Protein có tính bảo thủ cao, liên quan đến việc cấu

↓

smooth muscle isoform 1

trúc các tế bào vận động và thường được biểu hiện

precursor

ở tế bào nhân chuẩn

Profilin – 4

Liên kết với actin và ảnh hưởng đến cấu trúc bộ

↓

khung tế bào

Keratin, type II

Điều hòa hoạt động của kinase bằng cách liên kết

↑

cytoskeletal 1

với integrin beta-1 (ITB1) và thụ thể của activated

protein kinase C (RACK1/GNB2L1)

Protein tham gia quá trình trao đổi chất: 10 protein

Malate dehydrogenase

↓

Tham gia trong quá trình trao đổi NADH, quá

trình trao đổi carbohydrate nội bào, quá trình trao

đổi malate, axaloacetate, thao gia vào chu trình

tricarboxylic acid

Tyrosine hydroxylase

Tham gia trong quá trình trao đổi amino acid

↑

mạch vòng. Xúc tác trong quá trình sinh tổng hợp

catecholamine

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Protein

Chức năng chính

Biểu hiện

Acyl-coenzyme A

Tham gia quá trình trao đổi acid béo

↓

synthetase ACSM2B

Mutated CMP-sialic acid

↑

Tham gia trong quá trình vận chuyển

transporter A1

carbohydrate

Carbonic anhydrase 1

↑

Chuyển đổi carbon dioxide và bicarbonate để duy

trì cân bằng acid – base trong máu và các mô khác

Creatine kinase chain B Xúc tác thuận nghịch trong quá trình chuyển đổi

↓

gốc phosphate giữa ATP và nhiều hợp chất

phosphogen như Creatine phosphate

Chain A, Crystal

Thể hiện hoạt động của GTPase yếu, tồn tại chủ

Structure Of Diras2 In

yếu trong các liên kết GTP

Complex With Gdp And

Inorganic Phosphate

Plexin D1

↓

Đóng vai trò quan trọng trong việc truyền tín hiệu

giữa các tế bào

Glutamate/aspartate

↓

Vận chuyển glutamate/aspartate, có tác dụng loại

transporter II

bỏ glutamate ngoại bào

Tyrosine hydroxylase

Enzyme chịu trách nhiệm trong việc xúc tác cho

phản ứng chuyển L-tyrosine thành L-3,4-

dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), có tác dụng

dẫn truyền xung thần kinh

Protein tham gia vào quá trình phiên mã, dịch mã và cải biến sau phiên mã, dịch mã: 5

protein

TAF2 RNA polymerase

Điều hòa hoạt động của RNA polymerase II, giúp

↑

khởi đầu phiên mã một cách chính xác

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Protein

Chức năng chính

Biểu hiện

Zinc finger protein 658

Gắn với ADN tại vị trí liên kết với yếu tố phiên

↑

mã

Transcription factor IIIA

Gắn với vùng điều khiển nội sinh chứa khoảng 50

↓

(Fragment)

base của gen 5S ARN. Có vai trò đảm bảo phiên

mã đúng nhờ RNA polymerase II

Myc- binding factor

Yếu tố điều hòa phiên mã

↓

Max, short form

Translational activator

Hoạt động như yếu tố hoạt hóa dịch mã, gián tiếp

GCN1

điều khiển quá trình dịch mã và thực hiện chức

năng liên quan đến EF3 trong ribosome bằng việc

điều hòa hoạt động của protein GCN2 kinase

(EIF2AK1-4)

Căn cứ vào chức năng của protein cũng như các quá trình sinh học mà các

protein tham gia, chúng tôi chia các protein có biểu hiện khác biệt giữa mô ung thư

và mô đại trực tràng bình thường thành 5 nhóm khác nhau. Tỷ lệ các protein thuộc 5

nhóm này không đồng đều với nhau, trong đó các protein tham gia vào quá trình

trao đổi chất chiếm tỷ lệ lớn nhất (34%), tiếp theo là các protein tham gia vào quá

trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể (21%) và các protein tham gia vào quá trình phiên

mã, dịch mã và cải biến sau phiên mã, dịch mã (19%), thấp nhất là các protein tham

gia cấu trúc tế bào (13%) và protein liên quan đến chu trình tế bào, tăng sinh tế bào,

apoptosis (13%) (hình 10). Từ kết quả này chúng tôi giả thiết rằng quá trình phát

sinh, phát triển ung thư đã gây ảnh hưởng nhiều tới hoạt động trao đổi chất, tổng

hợp năng lượng của tế bào và làm thay đổi biểu hiện của các protein tham gia vào

các quá trình trao đổi chất, tổng hợp năng lượng trong các tế bào ung thư.

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Hình 10. Các nhóm protein theo chức năng

Các protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thư và mô đại trực tràng bình

thường rất có thể là những chỉ thị sinh học đặc trưng cho ung thư đại trực tràng.

Chúng tôi đã tiến hành tìm hiểu kỹ hơn về chức năng của các loại protein biểu hiện

khác biệt và mối liên hệ của các protein này với quá trình phát sinh, hình thành ung

thư đại trực tràng.

3.5.1. Protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis

Apoptosis hay chết theo chương trình là quá trình mà các tế bào tự chết hoặc

được kích hoạt để chết do không còn cần thiết cho cơ thể nữa. Chu trình tế bào và

apoptosis có vai trò quan trọng trong việc duy trì sự tồn tại của tế bào ung thư trong

cơ thể. Các tế bào ung thư để có thể tồn tại được và tăng sinh nhanh chóng thì

chúng phải có các cơ chế chống lại quá trình apoptosis hoặc cơ chế thoát khỏi các

điểm kiểm soát trong chu trình tế bào. Khi tiến hành nhận dạng các protein có biểu

hiện khác biệt giữa mô ung thư và mô đại trực tràng bình thường, chúng tôi xác

định được 4 protein liên quan đến các quá trình này. Trong số đó, chúng tôi đặc biệt

quan tâm tới protein Suppressor of tumorigenicity 20.

Suppressor of tumorigenicity 20 protein (ST20 hay HCCS) thuộc nhóm

protein ức chế khối u. Chức năng của HCCS là thúc đẩy quá trình apoptosis trong

các tế bào ung thư. Trong quá trình apoptosis, một protein ty thể đóng vai trò quan

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

trọng là cytochrome c. Cytochrome c được giải phóng khỏi ty thể, đi vào tế bào

chất. Tại đây, cytochrome c sẽ liên kết với một loại protein trong tế bào chất là

Apaf-1, sử dụng năng lượng ATP hoạt hoá, trở thành phức hệ apoptosome. Phức hệ

này cắt các tiền caspase 9 và hoạt hóa chúng thành caspase 9. Caspases 9 lại hoạt

hóa caspase 3 để caspase 3 hoạt hóa DNase dẫn đến phân hủy DNA (hình 11).

Hình 11. Quá trình apoptosis trong tế bào [27].

Suppressor of tumorigenicity 20 protein có vai trò phân bố cytochrome c từ

ty thể đi vào tế bào chất, từ đó tăng cường hoạt hóa caspase 9 và caspase 3, thúc đẩy

sự chết của tế bào. Suppressor of tumorigenicity 20 protein thường có mặt trong các

tế bào bình thường nhưng lại vắng mặt ở các tế bào ung thư [19]. Việc thiếu hụt loại

protein này chính là nguyên nhân làm giảm quá trình apoptosis và tế bào thoát khỏi

sự chết theo chương trình. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy sự vắng mặt của

protein suppressor of tumorigenicity 20 trong dịch chiết protein từ mô ung thư đại

trực tràng. Điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu về vai trò của loại

protein này trước đó. Như vậy, sự thiếu hụt protein Suppressor of tumorigenicity 20

sẽ tạo điều kiện cho các tế bào thoát khỏi sự chết theo chương trình, tiếp tục phân

chia mạnh mẽ và hình thành ung thư đại trực tràng.

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

3.5.2. Protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể

Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận dạng được 6 protein tham gia vào quá

trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể. Các protein này là thành phần của hệ thống miễn

dịch như chuỗi nặng của phân tử Ig và vùng biến đổi của nó, phân tử MHC lớp I.

Bên cạnh đó, có sự khác biệt của một số protein tham gia vào quá trình bảo vệ cơ

thể, chống lại các gốc tự do, stress như protein sốc nhiệt (HSP 27), GARS protein

và yếu tố Nfkb.

Trong quá trình miễn dịch chống ung thư, dường như vai trò của sự đáp ứng

miễn dịch qua trung gian tế bào thường xuyên chiếm ưu thế. Quá trình này có sự

tham gia của các phức hệ phù hợp tổ chức mô chủ yếu (MHC), ở người gọi là HLA.

Trong phân tích này, chúng tôi nhận dạng được protein MHC lớp I. Protein này biểu

hiện giảm ở mô đại trực tràng ung thư so với mô đại trực tràng bình thường. Protein

MHC lớp I được tích lũy trong lưới nội chất và làm nhiệm vụ như là nơi trung

chuyển phân tử. Trong tế bào mang virus hay tế bào ung thư, các kháng nguyên nội

sinh nằm trong tế bào chất, sẽ được các vi thể proteasome chế biến thành các

peptide kháng nguyên. Các peptide này được TAP vận chuyển vào khoang lưới nội

chất để liên kết với rãnh của MHC lớp I. Sau đó, phức hệ MHC lớp I - peptide

kháng nguyên được đóng gói bằng cách bọc màng và được vận chuyển lên bề mặt tế bào để trình diện cho tế bào TCD8+, kích thích tế bào T sản sinh ra Lymphokin để

tiêu diệt tế bào mang kháng nguyên nội sinh (hình 12). Khi tế bào bị nhiễm virus

nội sinh, lượng MHC lớp I luôn được tổng hợp dư thừa, sẵn sàng làm nhiệm vụ

trình diện kháng nguyên nội sinh. Trong nghiên cứu của chúng tôi, protein MHC

lớp I giảm, điều này gợi ý rằng, quá trình tiến triển thành ung thư ở tế bào đã làm

ảnh hưởng tới sự đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, tế bào ung thư không bị

tiêu diệt do thiếu nhận diện kháng nguyên nội sinh.

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Hình 12. Sơ đồ trình diện kháng nguyên của phức hệ phù hợp tổ chức mô cho tế bào lympho T [51]

Protein sốc nhiệt (Heat shock protein 27 - HSP27) là phân tử đa chức năng,

biểu hiện khác nhau ở các giai đoạn biệt hóa và sinh trưởng tế bào. HSP còn được

gọi là các stress protein, là một nhóm các protein có mặt ở tất cả các tế bào sống và

được đặt tên theo khối lượng phân tử của chúng. Chúng xuất hiện khi một tế bào

phải trải qua những dạng stress của môi trường như nóng, lạnh hay thiếu oxy. Ở

điều kiện bình thường, HSP27 cũng xuất hiện trong tế bào và hoạt động như các

chaperone đảm bảo cho các protein của tế bào hoàn thiện về cấu trúc và phù hợp về

chức năng tại một vị trí, vào một thời điểm thích hợp, đồng thời vận chuyển các

protein đến thùng rác trong tế bào. Protein này còn liên kết với actin giúp tránh phá

hủy actin và ổn định cấu trúc tế bào. Các protein này cũng đóng vai trò trong trình

diện kháng nguyên, giúp hệ miễn dịch nhận ra các tế bào bệnh thông qua việc kích

thích vi thể proteasome chế biến kháng nguyên nội sinh [11]. HSP27 còn kích thích

sản sinh interleukin – 1 giúp hoạt hóa đại thực bào và kích hoạt phản ứng viêm [56].

Ngoài ra, HSP27 còn tham gia đường truyền tín hiệu apoptosis. HSP27 liên kết với

màng ngoài của ty thể và ngăn cản hoạt động của phức hệ cytochrome c/Apaf-

1/dATP, do đó ức chế hoạt động của tiền caspase 9. Như vậy, sự có mặt của HSP27

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

gây ức chế quá trình apoptosis. Biểu hiện bất thường của HSP27 cũng được tìm

thấy trong các nghiên cứu của Li và cộng sự năm 2005 [23].

3.5.3. Protein tham gia cấu trúc tế bào

Trong số các protein được nhận dạng, chỉ có 4 protein liên quan đến chức

năng cấu trúc tế bào có biểu hiện khác biệt giữa mô ung thư và mô đại trực tràng

bình thường, đó là actin và cytokeratin-1 có biểu hiện tăng ở mô ung thư, profilin-4

có biểu hiện giảm ở mô ung thư.

Actin là một loại protein có tính bảo thủ cao, liên quan đến việc cấu trúc các

tế bào vận động và thường được biểu hiện ở tế bào nhân chuẩn. Trong nghiên cứu

này, actin biểu hiện tăng rõ rệt ở mô ung thư. Đây có thể là kết quả của việc tế bào

ung thư tăng sinh nhanh chóng, kéo theo các phần tham gia cấu tạo tế bào cũng tăng

lên.

Cytokeratin-1 là nhóm cytokeratin (CK) axit. Nhóm này gồm có các

cytokeratin sau: CK10, CK12, CK 13, CK14, CK16, CK17, CK18, CK19 và CK20.

Cytokeratin-1 tham gia vào con đường lectin, phản ứng lại với các stress tế bào,

tổng hợp các sợi cơ, điều hòa quá trình hình thành mạch [56]. Nhiều nghiên cứu chỉ

ra mối liên hệ giữa việc thay đổi mức độ biểu hiện của Cytokeratin-1 với sự phát

sinh ung thư. Cytokeratin-1 có thể ảnh hưởng đến quá trình phát sinh ung thư thông

qua một vài đường truyền tín hiệu như PI3K/Akt, Wnt và đường truyền tín hiệu

ERK MAPK. Cytokeratin-1 hoạt động như đích tác dụng của Akt trong đường

truyền tín hiệu PI3K/Akt và của ERK1/2 trong đường truyền tín hiệu ERK MAPK,

điều hòa hoạt động của CK18 trong đường truyền tín hiệu Wnt [42]. Kết quả nghiên

cứu của chúng tôi cho thấy lượng cytokeratin-1 tăng lên ở mô ung thư đại trực tràng

so với mô bình thường. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các kết quả nghiên cứu

trên thế giới. Nghiên cứu của Kim và cộng sự cũng cho thấy sự biểu hiện tăng lên

của cytokeratin 17 ở ung thư đại trực tràng. Protein này có thể đóng vai trò trong

quá trình khối u xâm lấn và di căn. Tác giả cũng đề xuất có thể coi CK 17 là protein

có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học cho ung thư đại trực tràng [18]. Ngoài ra, sự

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

biểu hiện tăng cường của cytokeratin còn được tìm thấy trong ung thư vú, ung thư

tuyến giáp [17, 25].

Profilin là protein liên kết với actin. Chức năng của profilin là điều hòa động

học, tái cấu trúc của actin trong bộ khung tế bào và tham gia vào một số đường

truyền tín hiệu. Profilin có vai trò rất quan trọng trong việc điều khiển về không

gian và thời gian phát triển của các vi sợi actin, là quá trình cần thiết đối với sự di

chuyển và hình dạng của tế bào. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, đột biến gen mã hóa

cho profilin dẫn đến giảm khả năng sinh trưởng, di chuyển và phân chia của tế bào.

Sự có mặt của profilin đóng vai trò quan trọng giúp các tế bào biệt hóa. Ngược lại,

việc giảm nồng độ profilin dưới mức bình thường liên quan đến tình trạng ung thư

vú. Profilin được coi như một loại protein ức chế khối u [44Error! Reference

source not found.]. Trong nghiên cứu của chúng tôi cũng thấy sự suy giảm mức độ

biểu hiện của profilin ở mô ung thư đại trực tràng so với mô bình thường. Kết quả

này phù hợp với dữ liệu Nina Wittenmayer và cộng sự đưa ra trên đối tượng ung

thư vú.

3.5.4. Protein tham gia các quá trình trao đổi chất

Các protein tham gia quá trình trao đổi chất chiếm số lượng nhiều nhất trong

số các protein được nhận dạng (chiếm 34% tổng số các protein xác định được).

Trong đó, nổi bật là protein creatine kinase. Creatine kinase là một enzyme được

biểu hiện ở rất nhiều loại tế bào và mô khác nhau. Protein này biểu hiện giảm ở mô

ung thư đại trực tràng so với mô bình thường theo nghiên cứu này. Chức năng của

creatine kinase là xúc tác thuận nghịch quá trình chuyển đổi gốc phosphate giữa

ATP và nhiều hợp chất phosphogen như creatine phosphate. Theo một nghiên cứu

của Balasubramami và cộng sự, creatine kinase B có liên quan đến ung thư đại trực

tràng. Trong nghiên cứu của họ, protein creatine kinase B biểu hiện giảm ở mô ung

thư đại trực tràng [9]. Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả của nhóm

nghiên cứu này về mối liên quan giữa creatine kinase B với ung thư đại trực tràng

và mức độ biểu hiện của protein này.

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

3.5.5. Protein liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã, cải biến sau

phiên mã, dịch mã

Đối với các protein thuộc nhóm tham gia vào quá trình phiên mã, dịch mã và

cải biến sau phiên mã, dịch mã, chúng tôi xác định được 5 protein có biểu hiện khác

biệt giữa mô ung thư và mô đại trực tràng bình thường. Các protein này bao gồm:

TAF2 RNA polymerase II, Zinc finger protein 658, Transcription factor IIIA, Myc-

binding factor Max và Translational activator GCN1.

Họ protein Zinc finger là một nhóm các protein liên kết với một hay nhiều

ion zinc để ổn định cấu trúc. Những protein này được biết có thể đóng vai trò là các

yếu tố phiên mã hoặc yếu tố đồng phiên mã. Khi hoạt động như một yếu tố phiên

mã, protein này sẽ gắn với ADN và ức chế sự biểu hiện của gen đích. Khi hoạt

động như yếu tố đồng phiên mã, Zinc finger protein sẽ gắn với các yếu tố phiên mã

và điều khiển hoạt động của các yếu tố này. Tùy thuộc vào tình trạng của tế bào mà

protein này có thể điều khiển làm tăng cường hay ức chế phiên mã của gen đích cho

phù hợp (Hình 13) [33]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy sự biểu hiện

tăng lên đáng kể của protein Zinc finger 658 ở mô ung thư so với mô đại trực tràng

bình thường. Sự biến đối của protein này ở mô ung thư chứng tỏ quá trình phiên mã

của một số gen trong tế bào ung thư đã bị ảnh hưởng. Kết quả nghiên cứu của chúng

tôi về sự biểu hiện tăng lên của Zinc finger protein là phù hợp với một số nghiên

cứu khác trên thế giới như nghiên cứu của Xue Bai và cộng sự, của Shi-Yong Li và

cộng sự năm 2010 [8Error! Reference source not found., 35].

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Hình 13. Cơ chế tác dụng của Zinc finger protein đối với quá trình phiên mã [33]

A: Zinc finger protein đóng vai trò như yếu tố phiên mã

B: Zinc finger protein đóng vai trò như yếu tố đồng phiên mã

Ngoài ra, các protein khác như TAF2 RNA polymerase II (TBP-associated

factor, 150 kDa), transcription factor IIIA, protein Max (Myc- binding factor) cũng

đóng vai trò là các yếu tố điều hòa phiên mã. Trong đó, TAF2 RNA polymerase II

điều hòa khởi đầu phiên mã một cách chính xác bằng RNA polymerase II.

Transcription factor IIIA đảm bảo quá trình phiên mã chính xác của RNA

polymerase III. Protein Max cũng đóng vai trò điều hòa quá trình phiên mã bằng

việc tạo phức hợp với protein Myc hoặc Mad để nhận dạng trình tự đặc biệt trên gen

đích. Trong khi phức hệ Myc-Max đóng vai trò hoạt hóa phiên mã thì phức hệ Mad-

Max lại đóng vai trò là yếu tố ức chế phiên mã [56]. Sự thay đổi mức độ biểu hiện

của 3 protein này trong mô ung thư có thể thay đổi mức độ phiên mã của một số gen

trong tế bào ung thư và góp phần trong quá trình phát sinh, phát triển ung thư đại

trực tràng.

Protein GCN1 đóng vai trò là yếu tố hoạt hóa quá trình dịch mã. Nó gián tiếp

điều khiển quá trình dịch mã và thực hiện chức năng liên quan đến EF3 trong

ribosome bằng cách điều hòa họa động của GCN2 protein kinase. Trong nghiên cứu

này, protein GCN1 biểu hiện rất mờ nhạt ở mô ung thư đại trực tràng so với mô đại

trực tràng bình thường. Sự thay đổi này có thể liên quan đến hoạt động dịch mã

trong tế bào ung thư.

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

KẾT LUẬN

Từ những kết quả thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:

1. Bằng kỹ thuật điện di hai chiều đã phân tách được các protein trong mô

ung thư đại trực tràng và mô đại trực tràng bình thường của các bệnh nhân thành

các spot riêng rẽ trên các bản gel điện di hai chiều.

2. Đã xác định được các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thư đại

trực tràng và mô đại trực tràng bình thường của từng bệnh nhân ung thư đại trực

tràng. Trong đó có 43 spot khác biệt chung ở các bệnh nhân gồm: 16 spot biểu hiện

tăng, 17 spot biểu hiện giảm và 10 spot không xuất hiện ở bản gel mô ung thư.

4. Sử dụng kỹ thuật phân tích MALDI - TOF MS đã xác định được 41 spot

tương ứng với 29 protein đã được định danh và 12 protein giả thuyết. Các protein đã

được nhận dạng được chia thành 5 nhóm chức năng bao gồm: nhóm protein liên

quan đến chu trình tế bào và apoptosis; protein liên quan đến quá trình miễn dịch,

bảo vệ cơ thể; protein tham gia cấu trúc tế bào; protein tham gia trong các quá trình

trao đổi chất; protein tham gia vào quá trình phiên mã, dịch mã và cải biến sau

phiên mã, dịch mã. Trong đó, một số protein có biểu hiện khác biệt đặc trưng giữa

mô ung thư đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình thường như Zinc finger

protein 658, cytokeratin-1 biểu hiện tăng ở mô ung thư; các protein MHC class I

antigen, HSP27, Creatine kinase chain B, profilin-4 biểu hiện giảm rõ rệt ở mô ung

thư và Suppressor of tumorigenicity 20 protein chỉ xuất hiện ở mô đại trực tràng

bình thường mà không xuất hiện trong mô ung thư.

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

KIẾN NGHỊ

Từ quá trình nghiên cứu thực tế, chúng tôi đưa ra một số kiến nghị sau:

1. Tiếp tục nhận dạng các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thư

đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình thường trên số lượng bệnh nhân lớn hơn

nhằm tìm ra các protein đặc trưng cho ung thư đại trực tràng.

2. Tiếp tục thu thập mẫu và phân tích proteomics mô đại trực tràng của bệnh

nhân ung thư đại trực tràng ở các giai đoạn ung thư khác nhau nhằm phân tích sự

biến đổi thành phần các protein liên quan đến bệnh.

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Phan Văn Chi (2006), Proteomics – Khoa học về hệ protein, Viện Khoa học và

Công nghệ Việt Nam, Hà Nội.

2. Đỗ Ngọc Liên (2004), Miễn dịch học cơ sở, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà

Nội.

3. Huỳnh Quyết Thắng (2009), ”Điều trị ung thư đại trực tràng gia đoạn II-III tại Bệnh

viện Ung bướu Cần Thơ”, Y Học TP. Hồ Chí Minh, 13(1), pp. 177 – 186.

Tiếng Anh

4. Albrethsen J., Bøgebo R., Gammeltoft S., Olsen J., Winther B., Raskov H.

(2005), “Upregulated expression of human neutrophil peptides 1, 2 and 3

(HNP 1-3) in colon cancer serum and tumours: a biomarker study”, BMC

Cancer, 5(1).

5. Albrethsen J., Moller C. H., Olsen J., Raskov H., Gammeltoft S. (2006), “Human

neutrophil peptides 1, 2 and 3 are biochemical markers for metastatic

colorectal cancer”, Eur J Cancer, 42(17), pp. 3057 – 64.

6. Alfonso P., Núñez A., Lombardia L., and Sánchez L. (2005), “Proteomic

expression analysis of colorectal cancer by two-dimensional differential gel

electrophoresis”, PROTEOMICS, 5(10), pp. 2602-2611.

7. Allal A.S., Kähne T., Reverdin A. K., Lippert H., Schlegel W., Reymond M. A.

(2004), “Radioresistance-related proteins in rectal cancer”, PROTEOMICS,

4(8), pp. 2261-2269.

8. Bai X., Li S. Y., Yu B., An P., Cai H. Y., Du J. F. (2010), “Proteome analysis of

human colorectal cancer tissue using 2-D DIGE and tandem mass

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

spectrometry for identification of disease-related proteins”, African Journal

of Biotechnology, (41), pp. 6840-6847.

9. Balasubramani M., Day B. W., Schoen R. E., Getzenberg R. H. (2006), “Altered

expression and localization of creatine kinase B, heterogeneous nuclear

ribonucleoprotein F, and high mobility group box 1 protein in the nuclear

matrix associated with colon cancer”, Cancer Res.

10. Cancer Research UK (2012), Treating Bowel Cancer - A Quick Guide.

11. Ciocca D. R., Calderwood S. K. (2005), “Heat shock proteins in cancer:

diagnostic, prognostic, predictive, and treatment implications”, Cell Stress

Chaperones, 10(2), pp. 86–103.

12. Dukes C. E. (1932), “The classification of cancer of the rectum”, Journal of

Pathological Bacteriology, 35(3), pp. 323-332.

13. Fedirko V., Tramacere I., Bagnardi V., Rota M., Scotti L., Islami F., Negri

E., Straif K., Romieu I., La V. C., Boffetta P, Jenab M. (2011), "Alcohol

drinking and colorectal cancer risk: an overall and dose-response meta-

analysis of published studies", Annals of oncology : official journal of the

European Society for Medical Oncology / ESMO, 22(9), pp. 1958–1972.

14. Gasparini G., Hayes D. F. (2006), “Biomarkers in Breast Cancer, Molecular

Diagnostics for Predicting and Monitoring Therapeutic Effect”, Humana

Press, pp.18–20.

15. Goldstein M. J., Mitchell E. P. (2005), “Carcinoembryonic antigen in the

staging and follow-up of patients with colorectal cancer”, Cancer Invest;

23(4), pp. 338-51.

16. International Agency for Research on Cancer (2011), Cancer Worldwide,

Cancer Research UK.

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

17. Jing Y., Zhang J., Waxman S., Mira-y-Lopez R. (1996), “Upregulation of

cytokeratins 8 and 18 in human breast cancer T47D cells is retinoid-specific

and retinoic acid receptor-dependent”, Differentiation, 60(2),pp. 109-117.

18. Kim C. Y., Jung W. Y., Lee H. J., Kim H. K., Kim A., Shin B. K. (2012),

“Proteomic analysis reveals overexpression of moesin and cytokeratin 17

proteins in colorectal carcinoma”, Oncol Rep., 27(3), pp. 608-620.

19. Kim T. E., Kim Y. W., Hwang S. Y., Shin S. M., Shin J. W., Lee Y. H., Shin S.

Y., Han K. T., Lee J. M., Namkoong S. E., Kim J. W. (2002), “Candidate

tumor suppressor, HCCS-1 is downregulated in human cancers and induces

apoptosis in cervical cancer”, Int. J. Cancer, 97, pp.780–786.

20. Habermann J. K., Bader F. G., Franke C., Zimmermann K., Gemoll T.,

Fritzsche B., Ried T., Auer G., Bruch H. P., Roblick U. J. (2008), “From

the genome to the proteome - biomarkers in colorectal cancer”,

Langenbeck's Archives of Surgery, 393(1), pp. 93-104.

21. Labianca R., Beretta G. D., Kildani B., Milesi L., Merlin F., Mosconi S., Pessi

M. A., Prochilo T., Quadri A., Gatta G., Braud de F., Wils J. (2010), “Colon

cancer”, Critical Reviews in Oncology/Hematology, 74(2010), 106–133.

22. Lee I. M., Shiroma E. J., Lobelo F., Puska P., Blair S. N., Katzmarzyk P. T.

(2012), “Effect of physical inactivity on major non-communicable diseases

worldwide: an analysis of burden of disease and life expectancy”, Lancet.

23. Li C., Tan Y. X., Zhou H., Ding S. J., Li S. J., Ma D. J., Man X. B., Hong

Y., Zhang L., Li L., Xia Q. C., Wu J. R., Wang H. Y., Zeng R. (2005),

“Proteomic analysis of hepatitis B virus-associated hepatocellular

carcinoma: Identification of potential tumor markers”, Proteomics, 5(4), pp.

1125-1139.

24. Liebler D. C. (2002), Introduction to Proteomics, Humana Press, Totowa, NJ,

USA.

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

25. Lucas S. D., Ek B., Rask L., Rastad J., Akerström G., Juhlin C. (1997),

“Aberrantly expressed cytokeratin 1, a tumor-associated autoantigen in

papillary thyroid carcinoma”, Int J Cancer., 73(2), pp. 171-177.

26. Marion M. B. (1976), “A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of

Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein – Dye

Binding”, Analytical Biochemistry, 72, pp. 248 – 254.

27. Maximilian L. W., Maike A. L., Markus R. (2012), “The central role of initiator

caspase-9 in apoptosis signal transduction and the regulation of its

activation and activity on the apoptosome”, Experimental Cell Research,

318(11), pp. 1213–1220.

28. National Commission of Digestive Disease (2008), “Cancers of the Digestive

System”, Nature, 445, pp. 111-115.

29. Newton K. F., Newman W., Hill J. (2010), “Review of biomarkers in colorectal

cancer”, Colorectal Disease, 14(1), pp. 3-17.

30. Parkin D. M., Bray F. I., Devesa S. S. (2001), “Cancer burden in the year 2000.

The global picture”, Eur J Cancer 2001, 37(8), pp. 4-66.

31. Peng Y., Li X., Wu M., Yang J., Liu M., Zhang W., Xiang B., Wang X., Li

X., Li G., Shen S. (2012), “New prognosis biomarkers identified by

dynamic proteomic analysis of colorectal cancer”, Mol. BioSyst., 8, pp.

3077-3088.

32. Polanski M., Anderson N.L. (2006), “A List of Candidate Cancer Biomarkers

for Targeted Proteomics”, Biomarker Insights, 2, pp. 1-48.

33. Radiya G. A., Helen M. B., Ruth M. A. (2012), “Zinc fingers of the cerebellum

(Zic): Transcription factors and co-factors”, The International Journal of

Biochemistry & Cell Biology, 44(11), pp. 2065–2068.

34. Research Advocacy Network (2010), Biomarkers in Cancer – An Introductory

Guide for Advocates.

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

35. Shi Y. L., Ping A., Hui-Yun C., Xue B., Ying-Nan Z., Bo Y., Fu-Yi Z., Gang

C. (2010), “Proteomic analysis of differentially expressed proteins

involving in liver metastasis of human colorectal carcinoma”, Hepatobiliary

Pancreat Dis Int, 9, pp. 149-153.

36. Tan H. T., Wu W., Ng Y. Z., Zhang X., Yan B., Ong C. W., Tan S., Salto-Tellez

M., Hooi S. C., Chung M. C. (2012), “Proteomic analysis of colorectal

cancer metastasis: stathmin-1 revealed as a player in cancer cell migration

and prognostic marker”, J Proteome Res., 11(2), pp. 1433-1445.

37. Xue H., Lu B., Zhang J., Wu M., Huang Q., Wu Q., Sheng H., Wu D., Hu J.,

Lai M. (2010), “Identification of serum biomarkers for colorectal cancer

metastasis using a differential secretome approach”, J Proteome Res. ;9(1),

pp. 545-55.

38. Xuezhi B., Quingsong L., Tet W. F., Shashikant J., Tao Y., Han-Ming S.,

Choon N. O., Peh Y. C., Kong W. E, Choy-Leong H. (2006), “Proteomic

Analysis of Colorectal Cancer Reveals Alterations in Metabolic Pathways”,

Molecular & Cellular Proteomics, 5(6), pp. 1119 - 1130.

39. Yu J. K., Chen Y. D., Zheng S. (2004), “An integrated approach to the detection

of colorectal cancer utilizing proteomics and bioinformatics”, World J

Gastroenterol, 10, pp. 3127-3131.

40. Ward D. G., Nyangoma S., Joy H., Hamilton E., Wei W., Tselepis C., Steven N.,

Wakelam M. J. O. , Johnson P. J. , Ismail T., Martin A. (2008), “Proteomic

profiling of urine for the detection of colon cancer”, Proteome

Science, 2008, pp. 6-19.

41. Watson A. J., Collins P. D. (2011), “Colon cancer: acivilixation disorder”,

Digestive diseases, 29(2):, pp. 222-228.

42. Weng Y. R., Cui Y., Fang J. Y. (2012), “Biological functions of cytokeratin 18

in cancer”, Mol Cancer Res., 10(4), pp. 485-493.

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

43. Westermeier R., Naven T. (2002), Proteomics in practice, Wiley-VCH Verlag-

GmbH, Freiburg.

44. Wittenmayer N., Jandrig B., Rothkegel M., Schlüter K., Arnold W., Haensch

W., Scherneck S., Jockusch B. M. (2004), “Tumor Suppressor Activity of

Profilin Requires a Functional Actin Binding Site”, Mol Biol Cell., 15(4),

pp. 1600-1608.

45. World Health Organisation (2008), Global Cancer Facts & Figures, 2rd

Edition, American Cancer Society Inc.

Công cụ World Wide Web

46. http://www.cancerstaging.org/staging/index.html (6/12/2012).

47. http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/colon/Patient/page2

(20/12/2012).

48. http://www.cancer.gov/dictionary (20/12/2012).

49. http://giangduongykhoa.wordpress.com/2009/02/22/ung-th%C6% (15/12/2012).

50. http://iwandahnial.wordpress.com/2010/11/16/understanding-colorectal-cancer

(10/12/2012).

51. http://www.lesc.ic.ac.uk/projects/appp.html (12/12/2012).

52. http://www.medicinenet.com/colon_cancer/page2.htm (02/12/2012).

53. http://www.sinobiological.com/Cancer-Biomarker-a-835.html (10/12/2012).

54. http://www.timbacsy.com/tin-tuc-ung-thu-ung-th%C6%B0-d%E1%BA%A1i-

tr%E1%BB%B1c-trang-co-di-truy%E1%BB%81n/ (15/12/2012).

55. http://ungthuvn.org/chude.aspx?id=406 (20/12/2012).

56. http://www.uniprot.org/ (25/12/2012).

57. http://www.webmd.com/digestive-disorders/picture-of-the-colon (25/05/2012).

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

PHỤ LỤC 1. DANH SÁCH BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

Ngày lấy mẫu

TT Mã

Tuổi

Họ và tên bệnh nhân

Giới tính

Vị trí khối u

Phân loại TNM

T2N1M0

8276 Vũ Quang N.

Nam

Đại tràng

05/11/201 0

T3N1M0 10/5/2011

10597 Hoàng Thị Q.

Nữ

10608 Ninh Thị C.

Nữ

11781 Dương Văn T.

Nam

Đại tràng Trực tràng T2N0M0 10/5/2011 Trực tràng T2N0M0 02/8/2011 04/5/2011

10483 Lương Xuân Đ.

Nữ

Trực tràng

T3N0M0

2903 Nguyễn Văn S.

Nam

Đại tràng

T4N0M0

3558 Nguyễn Hữu Đ.

Nam

Trực tràng

T3N0M0

11812 Nguyễn Trung T.

Nam

Trực tràng

T4N1

4644 Hoàng Hữu T.

Nam

Trực tràng

T3N0

4841 Cà Thị V.

Nữ

Trực tràng

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU NCBI

SỬ DỤNG PHẦN MỀM MASCOT

Mascot Search Results

User : Nguyen Ha Email : hanguyen510@gmail.com Search title : Database : NCBInr 20121223 (22321465 sequences; 7672129783 residues) Taxonomy : Homo sapiens (human) (247296 sequences) Timestamp : 28 Dec 2012 at 00:33:13 GMT Top Score : 67 for gi|7512479, heat shock protein 27 - human

Protein score is -10*Log(P), where P is the probability that the observed match is a random event. Protein scores greater than 66 are significant (p<0.05).

Mascot Score Histogram

Format A

Help

Concise Protein Summary

Max. number of hits AUTO

Significance threshold p< 0.05 Preferred taxonomy

All entries

Re-Search All

Concise Protein Summary Report

1. gi|7512479 Mass: 27094 Score: 67 Expect: 0.047 Matches: 7

heat shock protein 27 - human

unnamed protein product [Homo sapiens]

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Ig heavy chain V-III region (JP11) - human (fragment) gi|41473297 Mass: 22320 Score: 30 Expect: 2.6e+02 Matches: 3 unknown [Homo sapiens] gi|28703670 Mass: 67821 Score: 30 Expect: 2.7e+02 Matches: 4 Tubulin tyrosine ligase-like family, member 2 [Homo sapiens] gi|13432057 Mass: 67820 Score: 30 Expect: 2.7e+02 Matches: 4 testis specific protein NYD-TSPG [Homo sapiens] gi|99028883 Mass: 67921 Score: 30 Expect: 2.7e+02 Matches: 4 probable tubulin polyglutamylase TTLL2 [Homo sapiens] gi|45710086 Mass: 67791 Score: 30 Expect: 2.7e+02 Matches: 4 TTLL2 protein [Homo sapiens] gi|7706156 Mass: 31360 Score: 29 Expect: 2.8e+02 Matches: 3 lysine-rich coiled-coil protein 1 [Homo sapiens] gi|119626672 Mass: 7752 Score: 28 Expect: 3.8e+02 Matches : 3 hCG1820572 [Homo sapiens]

gi|194377706 Mass: 59960 Score: 45 Expect: 7.3 Matches: 5 gi|119612620 Mass: 10145 Score: 37 Expect: 54 Matches: 3 PTK2 protein tyrosine kinase 2, isoform CRA_d [Homo sapiens] gi|119593833 Mass: 13334 Score: 32 Expect: 1.5e+02 Matches : 3 hCG1993516 [Homo sapiens] gi|7661690 Mass: 59781 Score: 31 Expect: 1.8e+02 Matches: 4 coiled-coil domain-containing protein 9 [Homo sapiens] gi|150170683 Mass: 19012 Score: 31 Expect: 2.2e+02 Matches : 3 uncharacterized protein C3orf72 [Homo sapiens] gi|119588496 Mass: 6159 Score: 30 Expect: 2.4e+02 Matches : 3 hCG2045252 [Homo sapiens] gi|87849 Mass: 4793 Score: 30 Expect: 2.6e+02 Matches: 2 gi|307309 Mass: 39039 Score: 28 Expect: 4.4e+02 Matches: 3

nueroendocrine-specific protein B [Homo sapiens] gi|26801029 Mass: 9235 Score: 27 Expect: 4.6e+02 Matches: 2 immunoglobulin heavy chain variable region [Homo sapiens] gi|112700182 Mass: 11147 Score: 27 Expect: 4.8e+02 Matches : 3 immunoglobulin heavy chain variable region [Homo sapiens] gi|398777065 Mass: 8999 Score: 27 Expect: 4.8e+02 Matches : 2

iii

bcl-2-like protein 13 isoform i [Homo sapiens] gi|1335090 Mass: 9539 Score: 27 Expect: 4.9e+02 Matches: 2 G-protein coupled receptor kinase 4 [Homo sapiens]

gi|380714668 Mass: 35744 Score: 27 Expect: 5e+02 Matches: 3

glycerol-3-phosphate dehydrogenase [NAD(+)], cytoplasmic isoform 2 [Homo sapiens] gi|27696815 Mass: 4830 Score: 27 Expect: 5.4e+02 Matches: 2 ITGA3 protein [Homo sapiens] gi|392306955 Mass: 9707 Score: 26 Expect: 5.7e+02 Matches: 2 receptor-type tyrosine-protein phosphatase C isoform 5 precursor [Homo sapiens] gi|29292390 Mass: 10007 Score: 26 Expect: 5.7e+02 Matches: 2 immunoglobulin heavy chain [Homo sapiens]

gi|159163962 Mass: 10750 Score: 26 Expect: 5.8e+02 Matches: 2 Chain A, Solution Structure Of The Homeobox Domain Of The Human Hypothetical Protein Flj21616

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

gi|162949598 Mass: 9678 Score: 26 Expect: 5.8e+02 Matches : 2 immunoglobulin heavy chain variable region [Homo sapiens]

2. gi|341916276 Mass: 38542 Score: 41 Expect: 20 Matches: 4 PREDICTED: putative POM121-like protein 1-like [Homo sapiens] gi|9789609 Mass: 3181 Score: 33 Expect: 1.2e+02 Matches: 2 NOVA2 [amino acids 1-28] [Homo sapiens] gi|16076234 Mass: 9199 Score: 27 Expect: 4.7e+02 Matches: 2 immunoglobulin heavy chain variable region [Homo sapiens] gi|410171029 Mass: 38815 Score: 27 Expect: 5.2e+02 Matches : 3 PREDICTED: putative POM121-like protein 1-like isoform 2 [Homo sapiens]

MASCOT Search Results

Protein View: gi|7512479 heat shock protein 27 – human

NCBInr Database: 67 Score: Expect: 0.047 Nominal mass (Mr): 27094 Calculated pI:

8.24

Homo sapiens

Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P. Carbamidomethyl (C)

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Taxonomy: Sequence similarity is available as an NCBI BLAST search of gi|7512479 against nr. Search parameters Enzyme: Fixed modifications: Variable modifications: Oxidation (M) Mass values searched: 8 Mass values matched: 7 Protein sequence coverage: 26% Matched peptides shown in bold red.

1 MSPSRPPITS TNSVVSLKAD VSKPRFRGEL ERMKPKSMWM MWPSASKRIF 51 PLCLRRGNRG EEEAVGNCRG SPLTEGSGRL AEGGCSRLFL PSLWQNHFEA 101 PHRDSSALPG RVEARGLEDC RLDHAYMHCL ANHRGPEENQ GSAVSSSGLS 151 GRDATPRRQI PLSDPVDVVQ FLPEDIIIQT FEGWLLIKAQ HGTRMDEHGF 201 ISRSFTRQYK LPDGVEIKDL SAVLCHDGIL VVEVKDPVGT K Unformatted sequence string: 241 residues (for pasting into other applications).

Sort peptides by

Residue Number

Increasing Mass

Decreasing Mass

Show predicted peptides also

Start – End Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta M Peptide

2 – 18 1770.3000 1769.2927 1768.9683 0.3244 0 M.SPSRPPITSTNSVVSLK.A

37 – 47 1374.0000 1372.9927 1372.5614 0.4313 0 K.SMWMMWPSASK.R + 2 Oxidation (M)

37 – 47 1389.9000 1388.8927 1388.5563 0.3364 0 K.SMWMMWPSASK.R + 3 Oxidation (M)

122 – 134 1638.1000 1637.0927 1636.7351 0.3576 0 R.LDHAYMHCLANHR.G

122 – 134 1654.1000 1653.0927 1652.7300 0.3627 0 R.LDHAYMHCLANHR.G + Oxidation (M)

189 – 203 1742.1000 1741.0927 1740.8114 0.2813 1 K.AQHGTRMDEHGFISR.S

211 – 218 871.0000 869.9927 869.4858 0.5069 0 K.LPDGVEIK.D

No match to: 1682.1000

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Mascot Search Results

User : Nguyen Ha Email : hanguyen510@gmail.com Search title : Database : NCBInr 20121223 (22321465 sequences; 7672129783 residues) Taxonomy : Homo sapiens (human) (247296 sequences) Timestamp : 28 Dec 2012 at 00:58:07 GMT Top Score : 83 for gi|158254664, unnamed protein product [Homo sapiens]

Protein score is -10*Log(P), where P is the probability that the observed match is a

random event.

Protein scores greater than 66 are significant (p<0.05).

Mascot Score Histogram

Format A

Concise Protein Summary

Help

0.05

Significance threshold p<

Max. number of hits

AUTO

Preferred taxonomy

All entries

Re-Search All

gi|158254664 Mass: 42362 Score: 83 Expect: 0.0013 Matches: 8 unnamed protein product [Homo sapiens]

Concise Protein Summary Report

1. gi|4885049 Mass: 42334 Score: 83 Expect: 0.0013 Matches: 8

actin, alpha cardiac muscle 1 proprotein [Homo sapiens] gi|338716770 Mass: 37567 Score: 70 Expect: 0.028 Matches: 7

PREDICTED: actin, aortic smooth muscle isoform 2 [Equus caballus]

actin, aortic smooth muscle [Homo sapiens]

alpha-actin [Homo sapiens]

actin, alpha skeletal muscle [Homo sapiens] gi|119612724 Mass: 30498 Score: 64 Expect: 0.096 Matches: 6 actin, alpha, cardiac muscle, isoform CRA_c [Homo sapiens]

unnamed protein product [Homo sapiens]

actin, gamma-enteric smooth muscle isoform 1 precursor [Homo sapiens]

ACTG2 [Homo sapiens]

gi|297281875 Mass: 38142 Score: 55 Expect: 0.84 Matches: 6

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

gi|4501883 Mass: 42381 Score: 67 Expect: 0.046 Matches: 7 gi|178027 Mass: 42480 Score: 67 Expect: 0.046 Matches: 7 gi|4501881 Mass: 42366 Score: 66 Expect: 0.057 Matches: 7 gi|315570273 Mass: 37459 Score: 60 Expect: 0.24 Matches: 6 actin, gamma-enteric smooth muscle isoform 2 precursor [Homo sapiens] gi|193784876 Mass: 42189 Score: 55 Expect: 0.8 Matches: 6 gi|4501889 Mass: 42249 Score: 55 Expect: 0.8 Matches: 6 gi|49168516 Mass: 42297 Score: 55 Expect: 0.8 Matches: 6

PREDICTED: actin, alpha skeletal muscle-like isoform 3 [Macaca mulatta]

actin prepeptide, partial [Homo sapiens]

unnamed protein product [Homo sapiens]

actin, alpha 1, skeletal muscle [Homo sapiens]

unnamed protein product [Homo sapiens]

HLA-B associated transcript 4 [Homo sapiens]

actin, alpha, cardiac muscle, isoform CRA_b [Homo sapiens]

HLA-B associated transcript 4 [Homo sapiens]

hCG1784313, isoform CRA_a [Homo sapiens]

gi|178067 Mass: 37125 Score: 44 Expect: 11 Matches: 5 gi|194385904 Mass: 37562 Score: 43 Expect: 12 Matches: 5 gi|56204817 Mass: 32370 Score: 42 Expect: 14 Matches: 5 gi|193788501 Mass: 38142 Score: 41 Expect: 18 Matches: 5 gi|221043300 Mass: 38896 Score: 39 Expect: 34 Matches: 5 gi|168986037 Mass: 16759 Score: 38 Expect: 36 Matches: 4 gi|168986036 Mass: 18003 Score: 38 Expect: 44 Matches: 4 gi|119612723 Mass: 22791 Score: 35 Expect: 76 Matches: 4 gi|168986035 Mass: 21516 Score: 34 Expect: 90 Matches: 4 gi|119620538 Mass: 2360 Score: 34 Expect: 92 Matches: 2

2. gi|2135059 Mass: 12659 Score: 46 Expect: 5.8 Matches: 4 effector cell proteinase receptor 1 splice form 1b - human

Search Parameters

Type of search : Peptide Mass Fingerprint Enzyme : Trypsin Fixed modifications : Carbamidomethyl (C) Variable modifications : Oxidation (M) Mass values : Monoisotopic

vii

LuËn v¨n cao häc NguyÔn ThÞ Ngäc Hµ

Protein Mass : Unrestricted Peptide Mass Tolerance : ± 0.7 Da Peptide Charge State : 1+ Max Missed Cleavages : 1 Number of queries : 13

MASCOT Search Results

Protein View: gi|4885049 actin, alpha cardiac muscle 1 proprotein [Homo sapiens]

NCBInr Database: 83 Score: Expect: 0.0013 Nominal mass (Mr): 42334 Calculated pI: Taxonomy:

5.23 Homo sapiens

Sequence similarity is available as an NCBI BLAST search of gi|4885049 against nr.

Search parameters

Enzyme:

Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P.

Fixed modifications:

Carbamidomethyl (C)

Variable modifications: Oxidation (M)

Mass values searched: 13

Mass values matched: 8

Matched peptides shown in bold red.

Protein sequence coverage: 38%

1 MCDDEETTAL VCDNGSGLVK AGFAGDDAPR AVFPSIVGRP RHQGVMVGMG 51 QKDSYVGDEA QSKRGILTLK YPIEHGIITN WDDMEKIWHH TFYNELRVAP 101 EEHPTLLTEA PLNPKANREK MTQIMFETFN VPAMYVAIQA VLSLYASGRT 151 TGIVLDSGDG VTHNVPIYEG YALPHAIMRL DLAGRDLTDY LMKILTERGY 201 SFVTTAEREI VRDIKEKLCY VALDFENEMA TAASSSSLEK SYELPDGQVI 251 TIGNERFRCP ETLFQPSFIG MESAGIHETT YNSIMKCDID IRKDLYANNV 301 LSGGTTMYPG IADRMQKEIT ALAPSTMKIK IIAPPERKYS VWIGGSILAS 351 LSTFQQMWIS KQEYDEAGPS IVHRKCF Unformatted sequence string: 377 residues (for pasting into other applications).

Sort peptides by

Residue Number

Increasing Mass

Decreasing Mass

Show predicted peptides also

Start – End

Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta M Peptide

1 – 20 2230.4500 2229.4427 2228.9236 0.5192 0 -.MCDDEETTALVCDNGSGLVK.A + Oxidation (M)

31 – 41 1198.7800 1197.7727 1197.6982 0.0745 0 R.AVFPSIVGRPR.H

98 – 115 1956.3000 1955.2927 1955.0364 0.2564 0 R.VAPEEHPTLLTEAPLNPK.A

150 – 179 3213.2500 3212.2427 3211.5972 0.6455 0 R.TTGIVLDSGDGVTHNVPIYEGYALPHAIMR.L + Oxidation (M)

180 – 193 1640.0400 1639.0327 1638.8287 0.2040 1 R.LDLAGRDLTDYLMK.I + Oxidation (M)

241 – 256 1791.1500 1790.1427 1789.8846 0.2581 0 K.SYELPDGQVITIGNER.F

294 – 314 2244.3800 2243.3727 2243.0528 0.3199 0 K.DLYANNVLSGGTTMYPGIADR.M + Oxidation (M)

362 – 375 1629.0300 1628.0227 1627.7954 0.2273 1 K.QEYDEAGPSIVHRK.C

No match to: 1060.0400, 1185.2500, 1805.1500, 3165.3000, 3200.2600

viii