BỘ GIÁO DỤC
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Đỗ Thị Lan
SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÁT HIỆN
ĐỘC TỐ AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM
LUẬN VĂN THẠC SĨ: VẬT LÝ CHẤT RẮN
Hà Nội – 2019
BỘ GIÁO DỤC
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Đỗ Thị Lan
SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÁT HIỆN
ĐỘC TỐ AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM
Chuyên ngành: Vật Lý chất rắn
Mã số: 8.44.01.04
LUẬN VĂN THẠC SĨ: VẬT LÝ CHẤT RẮN
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS: Nguyễn Thanh Bình
Hà Nội – 2019
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn “sử dụng phương pháp quang phổ phát hiện độc tố aflatoxin trong thực phẩm” do PGS.TS Nguyễn Thanh Bình hướng dẫn là công trình nghiên cứu của tôi. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong luận văn này là trung thực và không sao chép các công trình của người khác. Nếu có sai sót tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, tháng 09 năm 2019
Học viên
i
Đỗ Thị Lan
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thanh Bình – người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn!
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô, cán bộ phòng tại Viện Vật Lý – Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện và hoàn thiện luận văn!
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè đồng nghiệp của tôi – những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này!
ii
Trong quá trình thực hiện luận văn, do kiến thức còn hạn chế không tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của quý Thầy Cô để tôi có thể hoàn thiện luận văn này!
MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ ii
MỤC LỤC ...................................................................................................... 1
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................... 3
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................ 4
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ .................................................. 5
MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 7
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................. 9
1.1: TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN .............................................................. 9
1.1.1: Khái niệm các loại aflatoxin ................................................................ 9
1.1.1.1: Khái niệm aflatoxin ....................................................................... 9
1.1.1.2: Lịch sử phát hiện aflatoxin ............................................................ 9
1.1.1.3: Điều kiện gây nhiễm bẩn của aflatoxin ....................................... 10
1.1.1.4: Các dạng aflatoxin và chuyển hóa của chúng ............................. 12
1.1.2: Cấu tạo hóa học và tính chất của aflatoxin B1 ................................... 13
1.1.2.1: Cấu tạo hóa học của aflatoxin B1 ................................................. 13
1.1.2.2: Tính chất của aflatoxin B1 ........................................................... 14
1.1.3: Độc tính và cơ chế gây bệnh của aflatoxin B1 ................................... 15
1.1.3.1: Độc tính của aflatoxinB1 .............................................................. 15
1.1.3.2: Cơ chế gây bệnh của aflatoxin B1 ................................................ 15
1.2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN AFLATOXIN .............................. 17
1.2.1: Phương pháp sử dụng kít thử nhanh độc tố nấm mốc aflatoxin ........ 17
1.2.2: Phương pháp sử dụng sắc ký kết hợp phổ khối ................................. 17
1.2.2.1: Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography – TLC) .......................................................................................................... 17
1
1.2.2.2: Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high ferformane thin layer chromatography – HPTLC) ...................................................... 18
1.2.2.3: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high ferformane liquid chromatography – HPLC) ......................................................................... 19 1.3: PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÁT HIỆN AFLATOXIN ............... 19
1.3.1: Khái niệm hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) ......................................................................................................... 20
1.3.2. Cơ sở lý thuyết của hiệu ứng FRET [8], [27] .................................... 22
CHƯƠNG 2: KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM ................................................. 27
2.1: CHUẨN BỊ MẪU .................................................................................... 27
2.1.1: Aflatoxin B1 ....................................................................................... 27
2.1.2: Chấm lượng tử bán dẫn CdSe/ ZnS ................................................... 27
2.2. PHỔ HẤP THỤ UV – VIS ...................................................................... 28
2.3: PHỔ HUỲNH QUANG ........................................................................... 31
2.4: PHỔ HUỲNH QUANG PHÂN GIẢI THỜI GIAN SỐNG .................... 32
2.4.1. Quang phổ phân giải thời gian và thời gian sống phát quang ........... 32
2.4.2. Cấu tạo và nguyên lý kỹ thuật của hệ đo huỳnh quang phân giải thời gian ............................................................................................................... 35
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 39
3.1: TÍNH CHẤT QUANG CỦA AFLATOXIN B1 ...................................... 39
3.2: TÍNH CHẤT QUANG CỦA CHẤM LƯỢNG TỬ CdSe/ZnS ............... 40
3.3: TRUYỀN NĂNG LƯỢNG HUỲNH QUANG CỘNG HƯỞNG CỦA AFLATOXIN VÀ CHẤM LƯỢNG TỬ CdSe/ZnS. ...................................... 41
3.4: THỬ NGHIỆM XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG NGÔ ................... 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 48
2
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 49
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
*: Trạng thái kích thích
A: Acceptor
AFB1: Aflatoxin B1
D: Donor
ELISA: Enzyme – linked Immunosorbent Assay
FDA: Cục Dược Phẩm và Thực Phẩm Hoa Kỳ
FRET: Truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang
HPLC: Phương pháp sắc ký lỏng cao áp
HPTLC: Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
IAC: Vincam Aflatest P 1 ml
Ml: Microgam/ kg
PBS: Phosphate buffer solution
TCSPC: Đếm đơn photon tương quan thời gian
TLC: Phương pháp sắc ký lớp mỏng
SILAR: Successive ionic layer adsorption and reaction
3
UV – Vis: Phổ hấp thụ vùng tử ngoại- khả kiến
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Các giới hạn tối đa hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm
Bảng 1.2: Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của bộ y tế Việt Nam
Bảng 2.1: Chuẩn bị mẫu aflatoxin B1 – CdSe/ZnS
Bảng 3.1: Thời gian sống huỳnh quang của mẫu aflatoxin B1-CdSe/ZnS
4
tại bước sóng 435 nm và 545 nm
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Aspergillus flavus
Hình 1.2: Aspergillus parasiticus
Hình 1.3: Một số loại nông sản bị nhiễm aflatoxin
Hình 1.4: Cấu tạo hóa học của một số loại aflatoxin
Hình 1.5: Cấu tạo hóa học của aflatoxin B1
Hình 1.6: Mô hình hiệu ứng FRET
Hình 1.7: Giản đồ Jablonski mô tả hiệu ứng FRET
Hình 1.8: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất donor và
accepter
Hình 1.9: Hiệu suất truyền năng lượng FRET được vẽ như hàm khoảng cách cặp donor – acceptor, khoảng cách R0 là khoảng cách mà hiệu suất truyền bằng 50%
Hình 1.10: Quang phổ huỳnh quang của donor và accepter và dung dịch
hỗn hợp của donor – accepter
Hình 2.1: Sơ đồ nguyên lí của hệ đo hấp thụ quang học UV – VIS Hình 2.2: Máy đo quang phổ UV – VIS Hình 2.3: Sơ đồ nguyên lí của máy quang phổ kế huỳnh quang Cary Hình 2.4: Máy đo phổ huỳnh quang Cary Hình 2.5: Nguyên lí tổng quát của kỹ thuật TCSPC Hình 2.6: Sơ đồ tổng quát của hệ TCSPC Hình 3.1: Phổ hấp thụ và huỳnh quang của Aflatoxin B1 Hình 3.2: Phổ hấp thụ và huỳnh quang của chấm lượng tử CdSe/ZnS Hình 3.3: Phổ hấp thụ (a); phổ huỳnh quang (b) của các mẫu aflatoxin
B1 với tỉ lệ hàm lượng khác nhau
5
Hình 3.4: Đường cong suy giảm huỳnh quang của aflatoxin B1 – CdSe/ZnS với tỉ lệ khác nhau đo tại bước sóng 435 nm (a) và 545 nm (b) kích thích tại bước sóng 405 nm
Hình 3.5: Xác định nồng độ aflatoxin B1 theo thời gian sống huỳnh
quang
Hình 3.6: Phổ huỳnh quang trạng thái dừng của aflatoxin B1 chiết suất
6
từ ngô
MỞ ĐẦU
Aflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên bởi một số loài Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus và Aspergillus nomius – đây là các loại nấm mốc. Aflatoxin là độc tố và là tác nhân gây ung thư. Chính vì thế, việc kiểm định độc tố aflatoxin trong thực phẩm giữ vai trò hết sức quan trọng. Các loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa, miến, gạo, lúa mì…), hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông…), gia vị (ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng…) và các loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ, dừa…Trên cơ sở những nghiên cứu của các nhà khoa học, Bộ Y tế đã ban hành QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA ĐỐI VỚI GIỚI HẠN Ô NHIỄM ĐỘC TỐ VI NẤM TRONG THỰC PHẨM. Văn bản pháp quy này được công bố ngày 25 tháng 10 năm 2011.
Nước ta là nước có khí hậu nhiệt đới là điều kiện thuận lợi để các loại vi nấm như aflatoxin phát triển. Do ảnh hưởng của khí hậu nhiệt đới, tác động của các loại vi nấm gây nên tổn thất lớn cho nông sản giai đoạn sau thu hoạch và bảo quản, trong đó tổn thất gây ra do nấm mốc chiếm phần đáng kể. Ngoài việc gây tổn thất về số lượng, nấm mốc còn sinh ra các độc tố đặc biệt nguy hiểm với sức khỏe con người và động vật. Nấm mốc phát triển trên lương thực, ngũ cốc, bên cạnh việc sử dụng chất dinh dưỡng của hạt như protein, glucid, lipid, vitamin… chúng còn sinh ra các độc tố. Aflatoxin có thể gây độc cho người và gia súc như gây tổn thương gan, gây quái thái, đột biến, ung thư, thậm chí với liều lượng cao có thể gây tử vong…
7
Có nhiều phương pháp để xác định aflatoxin như phương pháp sắc ký lỏng, phương pháp khối phổ. Đây là phương pháp cho phép ngưỡng phát hiện rất cao, tuy nhiên các thiết bị rất đắt tiền chỉ có ở cơ sở kiểm định chuyên nghiệp đồng thời quy trình rất phức tạp đòi hỏi nhiều thời gian. Phương pháp sử dụng kít thử nhanh, phương pháp này cho kết quả nhanh tuy nhiên giới hạn phát hiện và độ chính xác lại bị hạn chế. Phương pháp quang phổ dựa trên tính chất quang của độc tố aflatoxin – hấp thụ – phát quang trong vùng nhìn thấy cho phép phát hiện aflatoxin với ngưỡng cao hơn nhiều so với phương
pháp dùng kit thử nhanh với thao tác đơn giản, không cần hóa chất xử lý mẫy, thiết bị phân tích quá đắt tiền.
Mục đích của đề tài:
Sử dụng phương pháp truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) thông qua tương tác của cặp donor – acceptor là aflatoxin B1 – chấm lượng tử CdSe/ZnS phát hiện aflatoxin B1. Phương pháp này cho phép phát hiện hàm lượng aflatoxin B1 tới ppM.
Thử nghiệm phương pháp truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang
phát hiện AFB1 trong ngô.
Phương pháp nghiên cứu
Luận văn được tiến hành chủ yếu bằng phương pháp thực nghiệm
Luận văn với tiêu đề “ Sử dụng phương pháp quang phổ phát hiện độc
tố aflatoxin trong thực phẩm”. Nội dung luận văn được chia làm 3 chương:
Chương 1: Tổng quan. Tìm hiểu về khái niệm aflatoxin, các loại aflatoxin và dạng chuyển hóa của chúng, điều kiện gây nhiễm aflatoxin và độc tính của aflaftoxin. Các phương pháp phát hiện aflatoxin và phương pháp quang phổ phát hiện aflatoxin.
Chương 2: Kỹ thuật thực nghiệm. Trình bày quá trình chuẩn bị mẫu đo, các phương pháp thực nghiệm được sử dụng trong luận văn như đo phổ hấp thụ, phổ huỳnh quang, thời gian sống huỳnh quang.
8
Chương 3: Trình bày các kết quả tính chất quang của aflatoxin, đặc trưng hình thái và tính chất quang của chấm lượng tử CdSe/ZnS. Truyền năng lượng huỳnh quang cộng hưởng của aflatoxin và chấm lượng tử CdSe/ZnS. Thử nghiệm xác định aflatoxin trong hạt ngô.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1: TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN
1.1.1: Khái niệm các loại aflatoxin
1.1.1.1: Khái niệm aflatoxin
Aflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh
tự nhiên bởi một số loài Aspergillus, là một loại nấm mốc, đáng chú ý nhất là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Aflatoxin là độc tố và là tác nhân gây ung thư. Sau khi thâm nhập vào cơ thể, các aflatoxin có thể được gan chuyển hóa thành dạng trung gian epoxit hoạt hóa hoặc được thuỷ phân và trở thành M1 ít độc hơn.
Hình 1.2. Aspergillus parasiticus Hình 1.1. Aspergillus flavus
1.1.1.2: Lịch sử phát hiện aflatoxin
9
Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở Anh bị tổn thất nặng nề, lúc đầu hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là “bệnh gà tây X” (Turkey X disease). Sau đó, các loại gia cầm khác như: Vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và tử vong rất nhiều.Qua điều tra, người ta xác định được bệnh có liên quan đến một loại độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra. Đến năm 1961, người ta đã tìm ra bản chất hóa học của độc tố này là aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus.
Năm 1961, các công trình nghiên cứu công nhận rằng aflatoxin được tạo ra bởi nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây ra khối u gan ở động vật. Trên động vật thủy sản, những nghiên cứu đầu tiên về độc tố aflatoxin trên cá hồi được thực hiện bởi Ashley và các cộng sự.
Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố aflatoxin. Các nhà khoa học cũng đã xác định được công thức phân tử và công thức cấu tạo của aflatoxin.
1.1.1.3: Điều kiện gây nhiễm bẩn của aflatoxin
Các loài sinh aflatoxin thuộc chi Aspergillus phân bố rất rộng trong tự nhiên. Chúng có thể tạo khuẩn lạc và gây nhiễm vào hạt trước khi thu hoạch và trong quá trình bảo quản. Cây chủ rất dễ bị gây nhiễm bởi Aspergillus sau phơi nhiễm kéo dài trong môi trường có độ ẩm cao hoặc bị tổn thương các điều kiện xấu như hạn hán.
Các môi trường sống bản địa của Aspergillus là trong đất, thực vật mục nát và ngũ cốc đang bị giảm sức đề kháng vi sinh vật và nó xâm nhập tất cả các loại chất hữu cơ mỗi khi có điều kiện được thuận lợi cho sự phát triển của nó. Điều kiện thuận lợi bao gồm độ ẩm cao (ít nhất là 7%) và nhiệt độ cao.
10
Hình 1.3. Một số loại nông sản bị nhiễm aflatoxin
Các loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa miến, gạo, lúa mì…), hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông…), gia vị (ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng…) và các loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ, dừa…
Aflatoxin cũng có thể xuất hiện trong sữa của động vật được cho ăn
bằng thức ăn nhiễm aflatoxin.
Hầu như tất cả các nước đều đã có quy chuẩn sử dụng aflatoxin. Tại Hoa Kỳ có hàm lượng aflatoxin từ 0 ppb đến 20 ppb cho tiêu dùng trực tiếp, mặc dù thức ăn dùng để vỗ béo cho bò thịt, lợn, gia cầm trong giai đoạn cuối có thể chấp nhận mức 300 ppb, nhưng trong thực tế thường thấp hơn nhiều mức khuyến cáo an toàn của Cục Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA).
FDA đã đưa ra mức khuyến cáo về hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi nhằm bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng và sức khoẻ động vật.
Tại Việt Nam , Bộ Y tế đã ban hành quy chuẩn QCVN 8-1:2011/BYT Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm trong đó gới hạn đối với aflatoxin được cho trong bảng 1.1 và bảng 1.2
Bảng 1.1. Các giới hạn tối đa hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm
Tiêu chí
Hàm lượng, ppb
20
Đối với ngô và các loại hạt dùng cho vật nuôi chưa trưởng thành (kể cả gia cầm chưa trưởng thành) và các vật nuôi cho sữa hoặc dùng cho các mục đích khác không được công bố; và đối với thức ăn chăn nuôi ngoại trừ ngô và bột từ hạt bông
100 Đối với ngô và các loại hạt dùng cho giống vật nuôi
11
(bò, lợn) hoặc gia cầm đã trưởng thành
200 Đối với ngô và các loại hạt dùng cho lợn thịt từ 100
pound trở lên
300
Đối với ngô và các loại hạt dùng cho bò giai đoạn cuối (ví dụ vỗ béo) và đối với bột hạt bông dùng cho bò, lợn và gia cầm
Bảng 1.2. Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam
Tiêu chí ML
(microgam/kg)
5 Đối với Aflatoxin B1 trong thực phẩm nói chung
15 Đối với Aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong thực phẩm nói
chung
0,5 Đối với Aflatoxin M1 trong sữa và các sản phẩm sữa
1.1.1.4: Các dạng aflatoxin và chuyển hóa của chúng
Aflatoxin có ít nhất 18 dạng khác nhau trong tự nhiên, trong đó Aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1 và M2 được coi là quan trọng vì có độc tố mạnh [6]. Các nhóm aflatoxin khác nhau phân biệt bởi cấu trúc phân tử. Aflatoxin nhóm B (B1 và B2) có một vòng cyclopentane, trong khi nhóm G (G1 và G2) chứa vòng lacton [7]. Aflatoxin nhóm B có huỳnh quang màu xanh dương (Blue), nhóm G thể hiện huỳnh quang màu lục (Green). Trong số các nhóm aflatoxin, aflatoxin B1 là nhiều và phổ biến [8] chiếm 75% tổng số aflatoxin gây ô nhiễm thực phẩm [16].
12
Aflatoxin B1, B2 trong sữa bò được chuyển hóa thành aflatoxin M1, M2.
Hình 1.4. Cấu tạo hóa học của một số loại aflatoxin
Ngoài 6 loại aflatoxin chủ yếu trên, người ta còn phát hiện một số loại aflatoxin khác, người ta đã đề nghị gọi các hợp chất đó là flavatoxin hoặc flavacuramin:
- Aflatoxin P1: là một sản phẩm trao đổi chất, là dẫn xuất fenolic của Aflatoxin B1. Người ta đã phân lập được chúng trên cột ambeclit XAD – 2 (Rohm và Haas). Trọng lượng phân tử của nó xác định bằng khối phổ là 2.8. Sản phẩm này là kết quả sự khử metyl của aflatoxin B1.
- Aflatoxin 3B hay toxin B3: Một chất có Rf thấp, phân lập từ bình nuôi cấy aflatoxin Flavus, dạng tinh thể, màu vàng kim, độ độc kém aflatoxin B1 từ 40 đến 50 lần.
- Aflatoxin B3 còn gọi là prositicol: Nhân xiclopenten tận cùng của aflatoxin B1 được thay thế bằng một chuỗi etanol, do đó chất này là 6 – metoxi – 7 – (2 – hydroxi etyl) difuro Cumarin.
1.1.2: Cấu tạo hóa học và tính chất của aflatoxin B1
1.1.2.1: Cấu tạo hóa học của aflatoxin B1
13
Aflatoxin B1 được coi là dạng độc nhất và được sản sinh bởi Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Có công thứ là C17H12O6 với trọng lượng phân tử là 321. Trong cấu trúc phân tử có nhóm lacton và
metoxyl, không có nhóm hidroxyl tự do. B là chữ viết tắt của blue (màu xanh nước biển), aflatoxin B1 có màu huỳnh quang xanh nước biển.
Hình 1.5. Cấu tạo hóa học của Aflatoxin B1
1.1.2.2: Tính chất của aflatoxin B1
Các aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím. Điều này cho phép xác định các hợp chất này ở nồng độ thấp (0,5ng hay thấp hơn trên một vết ở sắc kí bản mỏng).
Aflatoxin tinh khiết rất bền vững ở nhiệt độ cao lên đến điểm nóng chảy, khi được làm nóng trong không khí. Tuy nhiên, nó tương đối không bền khi để dưới không khí và dưới tia cực tím ở phiến sắc kí bản mỏng, và đặc biệt khi hòa tan ở các dung môi có độ phân cực cao. Các aflatoxin trong các dung môi clorofom và benzen bền vững trong nhiều năm nếu được giữ trong chổ tối và lạnh. Các aflatoxin ít hoặc không bị phân hủy dưới điều kiện nấu bình thường và làm nóng khi thanh trùng. Tuy nhiên, khi có độ ẩm và ở nhiệt độ cao vẫn có thể tiêu hủy aflatoxin trong một thời gian nhất định.
14
Các aflatoxin được hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như clorofom, metanol. Tính tan của aflatoxin trong nước dao động từ 10 – 20mg/l.
Tất cả các aflatoxin đều hiện diện dưới dạng tinh thể nhỏ, mịn, màu
trắng hoặc vàng lợt.
Aflatoxin B1 có màu huỳnh quang xanh nước biển, là loại aflatoxin thường gặp và độc nhất. Aflatoxin B1 là phân tử ái mỡ, có trọng lượng phân tử thấp, dễ dàng được hấp thu sau khi ăn, sự hấp thu là hoàn toàn.
1.1.3: Độc tính và cơ chế gây bệnh của aflatoxin B1
1.1.3.1: Độc tính của aflatoxin B1
Aflatoxin là chất gây ung thư mạnh, trong đó aflatoxin B1 có độc tính
mạnh nhất.
Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết người khoảng 10mg), độc tố aflatoxin còn được coi là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư. Aflatoxin là một trong những chất gây ung thư gan mạnh nhất, nếu hấp thu một lượng là 2,5mg aflatoxin trong thời gian ngắn (khoảng 3 tháng) có thể dẫn đến ung thư gan sau một năm.
Aflatoxin gây ra các tác hại chính sau đây:
- Phá hủy tế bào gan, thận và các bộ phận khác.
- Ức chế lên hệ miễn dịch.
- Ăn mòn thành ruột và dạ dày.
- Suy dinh dưỡng, chậm lớn, chết.
- Gây ra ung thư gan ở người và gia súc.
1.1.3.2: Cơ chế gây bệnh của aflatoxin B1
15
Do cấu trúc hóa học có vòng dihydro – furan nên aflatoxin B1 liên kết với một số enzym làm cản trở trao đổi chất dẫn đến tử vong. Ngoài ra, Aflatoxin B1 còn tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền (DNA, RNA) làm rối loạn cấu trúc di truyền dẫn đến tổn thương gan và ung thư gan. Với phụ nữ mang thai, hấp thu lượng nhất định sẽ dẫn đến dị tật thai nhi hoặc quái thai, nặng có thể gây chết non thai nhi.
Aflatoxin B1 là phân tử ái lực mạnh với thành ruột, có trọng lượng phân tử thấp nên dễ dàng được hấp thu hoàn toàn sau khi ăn. Khi đến ruột non, Aflatoxin B1 sẽ nhanh chóng được hấp thu vào tĩnh mạch và ruột non, tá tràng. Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạch cửa, aflatoxin được tập trung vào gan nhiều nhất (chiếm khoảng 17% lượng aflatoxin của cơ thể) tiếp theo là ở thận, cơ, mô mỡ, tụy, lách... Trong vòng 24 giờ có khoảng 80% bị đào thải theo đường tiêu hóa qua mật, đường tiết niệu qua thận và đáng chú ý nó còn bài tiết qua tuyến sữa gây bệnh cho thai nhi đang bú sữa mẹ.
Cho đến nay, các luận chứng khoa học công nhận khả năng tác động
lên tế bào gan của aflatoxin qua 5 giai đoạn sau:
- Ức chế các men polymerase mà chúng có vai trò tổng hợp DNA và
RNA.
- Làm chậm hoặc ngừng hẳn sự tổng hợp DNA.
- Ngăn cản cơ chế sinh tổng hợp RNA truyền tin.
- Biến đổi hình dạng nhân tế bào.
- Hạn chế quá trình sinh tổng hợp protein.
Hậu quả là gây ung thư biểu mô tế bào gan.
Như vậy, aflatoxin có khả năng gây độc cấp tính và mãn tính ở người và động vật, nghiêm trọng nhất và nguy hiểm nhất là khả năng gây ung thư gan và xơ gan.
16
Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm, an toàn lương thực thực phẩm, không sử dụng các thực phẩm đã bị hỏng, bị nấm mốc là một vấn đề hết sức quan trọng có ý nghĩa trong việc hạn chế tần suất xuất hiện bệnh ung thư gan nguyên phát.
1.2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN AFLATOXIN
1.2.1: Phương pháp sử dụng kít thử nhanh độc tố nấm mốc
aflatoxin
Cơ sở để kiểm tra là dựa trên sự miễn dịch trên que thử. Trên que thử có chứa kháng nguyên- kháng thể (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (ELISA) [19]. Kháng thể đặc hiệu chống lại độc tố aflatoxin và nhận ra aflatoxin trong các phân tử trong mẫu. Kết quả được đánh giá và đọc nhanh bằng hiển thị màu sắc trên kit thử. Phương pháp này đơn giản dễ sử dụng, tuy nhiên độ nhạy còn hạn chế và thường phải kết hợp với các phương pháp khác để phân tích.
1.2.2: Phương pháp sử dụng sắc ký kết hợp phổ khối
Đây là phương pháp có độ chính xác rất cao cho phép phân tích rất nhiều chất [17], [23], [25]. Các phương pháp như sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp phổ khối… đều đáp ứng được yêu cầu và được các cơ quan thẩm quyền của các nước nhập khẩu chấp nhận. Tuy nhiên những phương pháp này đòi hỏi đầu tư, chi phí cao về thiết bị, chi phí vận hành, kỹ năng và trình độ của kỹ thuật viên. Do vậy nó không phù hợp cho các phòng kiểm nghiệm qui mô nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương.
1.2.2.1: Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography –
TLC)
17
Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định hàm lượng aflatoxin đầu tiên vào những năm 1960. Là một kỹ thuật sắc ký được dùng để tách các chất trong hỗn hợp. Phương pháp sắc ký lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp thụ, thường là silicagel, aluminium oxide được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch. Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là cloroform: methnol và clroform: aceton. Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan aflatoxin.
Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc ký, khoảng 1cm từ dưới lên. Bản sắc ký sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp, như methanol hoặc nước, và được đặt vào một vật chứa có nắp. Dung môi di chuyển lên bản sắc ký bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc ký. Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh và độ tan khác nhau trong dung môi. Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có chỗ liên kết với pha tĩnh.
Nhược điểm của phương pháp là phụ thuộc vào người phân tích. Khi
làm sắc ký một số hợp chất có thể tương tự aflatoxin.
1.2.2.2: Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high ferformane
thin layer chromatography – HPTLC)
Do những khuyết điểm trong phương pháp sắc ký lớp mỏng đơn thuần ở các khâu như chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi. Phương pháp HPTLC có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: Đưa mẫu lên bản mỏng một các tự động, cải thiện được sự đồng nhất cả lớp hấp thụ, chạy ban mỏng trong dung môi có kiểm soát.
Quá trình đưa mẫu vào bản mỏng được tự động hóa, do đó các vết được định đúng vị trí và đo lường độ huỳnh quang của vết cũng bằng máy densitimetess.
Thể tích mẫu được dùng trong HPTLC có thể bằng 1 (so với 5 – 10
mẫu trong phương pháp TLC) như vậy sẽ làm giảm đi rất nhiều diện tích
của vết (1mm). Nồng độ chất chuẩn có thể cần 5pg trong phân tích bằng HPTLC, do đó có thể xácđịnh tới 30pg aflatoxin.
Sử dụng kỹ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phương pháp
18
TLC như một phương pháp định lượng aflatoxin có hiệu quả nhất.
1.2.2.3: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high ferformane
liquid chromatography – HPLC)
Hệ thống phân tích high ferformane tự động HPLC là hệ thống phân tích đắt tiền, chọn lọc dùng định lượng aflatoxin. Phương pháp HPLC sử dụng cả hai pha: Pha bình thường và pha phản.
Hệ thống này dựa trên sự hấp thụ tia tím (uv) và xác định cường độ
huỳnh quang.
Mẫu phân tích được tách bằng chloroform: Nước. Ly tâm chất tác dụng
làm sạch qua silicagel pha bình thường sử dụng cột nhối silicagel 0,5 và
.
pha động sử dụng benzen: acetonitrit: acid formic. Giới hạn xác định là 0,5
Husst (1984) đã sử dụng pha phản kết hợp với TFA đồng phân để xác
định được các aflatoxin B1, B2,G1, G2 ở nồng độ 5pg.
Davis (1980) cũng sử dụng pha phản để xác định huỳnh quang của đồng phân iot của aflatoxin B1. Kết quả dẫn đến việc phát triển phương pháp đồng phân cột.
1.3: PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÁT HIỆN AFLATOXIN
19
Là phương pháp dựa trên đặc trưng vật lý của Aflatoxin như phổ hấp thụ, huỳnh quang, hấp thụ hồng ngoại [9], [10], [13], [15]. Phương pháp này cho phép phát hiện nồng độ tương đối cao, có thể tới ppM, trong khi đó vận hành lại tương đối đơn giản và thời gian thực hiện nhanh. Gần đây phương pháp truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) được sử dụng nhiều để xác định các độc tố có hàm lượng thấp bằng cách đưa vào mẫu thử chất huỳnh quang tương thích với chất cần phát hiện. Khi có mặt của chất độc, tính chất huỳnh quang sẽ thay đổi. Dựa vào sự thay đổi này người ta sẽ xác định được hàm lượng chất cần phát hiện.
1.3.1: Khái niệm hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh
quang (FRET)
Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (Fluorescence Resonance Energy Transfer - FRET ) là một cơ chế truyền năng lượng xảy ra ở cấp độ nano thông qua tương tác lưỡng cực – lưỡng cực, đây là một hiện tượng vật lý quan trọng với nhiều lĩnh vực tiềm năng như lĩnh vực quang điện tử và rất nhiều lĩnh vực khác. FRET được đưa ra từ thập kỷ 50 của thế kỷ trước, hiện nay đang được ứng dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực đặc biết trong nghiên cứu y sinh học [4], [15]. FRET là hiệu ứng phụ thuộc vào khoảng cách truyền năng lượng từ một chất cho huỳnh quang (donor) tới một chất nhận huỳnh quang (acceptor) phù hợp, là một trong số ít các công cụ có sẵn để đo khoảng cách nanomet và xác định những thay đổi trong khoảng cách cả trong in vitro lẫn trong cơ thể. Do có độ nhạy với khoảng cách cao, nên hiệu ứng FRET đã được sử dụng để nghiên cứu động học, tương tác nguyên tử. [3], [20], [24].
Cơ chế truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang liên quan đến các chất phát huỳnh quang mà ở đây là điện tử ở trạng thái kích thích (donor), một phân tử huỳnh quang có thể truyền năng lượng kích thích của nó cho một phân tử huỳnh quang khác (acceptor) không phát xạ gần đó thông qua các tương tác lưỡng cực – lưỡng cực tầm xa. Lý thuyết truyền năng lượng được dựa trên khái niệm về một chất huỳnh quang kích thích như một dao động lưỡng cực có thể trải qua sự trao đổi năng lượng với một lưỡng cực thứ hai có tần số cộng hưởng tương tự. Vấn đề này, truyền năng lượng cộng hưởng tương tự như sự dao động cùng tần số. Ngược lại, năng lượng bức xạ yêu cầu phát xạ và tái hấp thụ một photon phụ thuộc vào kích thước vật lý và tính chất quang học của donor – acceptor, cũng như hình dạng của bề mặt và khoảng cách của donor – acceptor. Không giống như các cơ chế bức xạ, truyền năng lượng cộng hưởng có thể mang lại một lượng đáng kể thông tin về cấu trúc liên quan đến các phân tử donor – acceptor [5], [20], [24].
20
Một cặp phân tử tương tác với nhau thông qua hiệu ứng FRET được gọi là một cặp donor – acceptor. Hiện tượng FRET không qua trung gian là quá
trình phát xạ photon. Ngoài ra, nó thậm chí không yêu cầu chất màu nhận được phát huỳnh quang. Mặc dù trong hầu hết các ứng dụng, các donor và acceptor đều có khả năng phát huỳnh quang [3], [14].
Một cặp nguyên tử tạo ra một điện trường do sự tương tác lưỡng cực. Đầu tiên phân tử donor hấp thụ ánh sáng kích, các điện tử chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Nếu không có mặt của phân tử acceptor, phân tử donor có thể phát huỳnh quang và quay trở lại trạng thái cơ bản. Khi có mặt phân tử acceptor một phần năng lượng ở trạng thái kích thích được truyền cho lượng cho phân tử acceptor gần nhất có trạng thái năng lượng kích thích thấp nhất qua sự trao đổi của một photon ảo. Phân tử donor trở về trạng thái cơ bản còn phân tử acceptor chuyển lên trạng thái kích thích [19], [22], [24].
Như vậy phân tử acceptor được kích thích nhờ vào quá trình gián tiếp nhận photon ảo, mặt khác đây cũng là hiện tượng xảy ra rất tự nhiên [5]. FRET là một hiện tượng tự nhiên đầy lý thú bởi vì nó không phụ thuộc vào sự tiếp xúc vật lý cũng như truyền điện tử.
Phát xạ
FRET
r
Donor
Accepter
Hấp thụ
Hấp thụ chấp nhận
Huỳnh quang chất cho
21
Hình 1.6. Mô hình hiệu ứng FRET
1.3.2. Cơ sở lý thuyết của hiệu ứng FRET [5], [24]
Khi cặp phân tử donor – acceptor thỏa mãn các điều kiện để xảy ra FRET, cơ chế truyền năng lượng được minh họa bởi giản đồ năng lượng Jablonski (Hình 1.7). Khi mẫu được kích thích các điện tử của donor chuyển từ trạng thái cơ bản trong vùng hóa trị lên trạng thích kích thích trong vùng dẫn. Tại đây, các điện tử sẽ hồi phục xuống trạng thái năng lượng thấp hơn trong vùng dẫn (thời gian hồi phục trong khoảng từ pico giây tới femto giây), thường khi hồi phục xuống trạng thái cơ bản trong vùng hóa trị và phát ra huỳnh quang. Một phần năng lượng kích thích sẽ truyền cho phân tử acceptor (không phát xạ) làm cho phân tử acceptor bị kích thích. Điện tử kích thích của phân tử acceptor cũng hồi phục và tái hợp với lỗ trống trong vùng hóa trị và phát ra huỳnh quang của acceptor.
Hình 1.7. Giản đồ Jablonski mô tả hiệu ứng FRET
22
Quá trình truyền năng lượng FRET làm giảm huỳnh quang của donor (dập tắt) và tăng cường độ huỳnh quang acceptor đồng thời giảm thời gian sống huỳnh quang donor [24].
D + h → D*+
D* + A → D +A*
A* → A + h’
D: donor; A: acceptor; Dấu “*” kí hiệu trạng thái kích thích
Một số điều kiện cần phải được thỏa mãn để cho FRET xảy ra đó là:
- Phổ phát xạ huỳnh quang của các phân tử donor phải chồng lên phổ hấp thụ hoặc kích thích của chất màu nhận. Mức độ chồng chập lên nhau được gọi là phổ chồng lên nhau tích hợp (J).
- Donor phải có cường độ huỳnh quang mạnh. - Hai chất này (donor và acceptor) phải ở khoảng cách gần nhau
(thường 1 đến 10 nanomet).
- Các lưỡng cực điện (dipole) của các donor và acceptor phải gần như
song song với nhau.
- Thời gian sống huỳnh quang của các phân tử donor phải có khoảng
thời gian đủ để cho hiệu ứng FRET xảy ra.
Hình 1.8. Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất Donor và
23
Acceptor
Hình1.8 mô tả phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất donor và acceptor. Khu vực màu đậm là sự chồng quang phổ giữa quang phổ huỳnh quang của các donor và phổ hấp thụ của acceptor [24].
Hiệu suất truyền năng lượng FRET tỉ lệ với nghịch đảo mũ 6 khoảng
cách donor – acceptor
(1.1)
Trong đó là bán kính Förster – là khoảng cách mà ở đó năng lượng
truyền được 50%.
Hình 1.9. Hiệu suất truyền năng lượng FRET được vẽ như hàm khoảng
cách cặp donor – acceptor, khoảng cách là khoảng cách mà hiệu suất
truyền bằng 50%
(1.2)
Bán kính Förster phụ thuộc vào hiệu suất lượng tử huỳnh quang của
donor ( ), góc ) khi không có mặt acceptor (fd), chiết suất của dung môi (
) và sự chồng chập phổ của donor –
định hướng lưỡng cực của phân tử ( acceptor (J)
24
(1.3)
Hiệu suất truyền năng lượng cũng có thể xác định thông qua cường độ
huỳnh quang theo biểu thức:
(1.4)
Trong đó là cường độ huỳnh quang của donor; cường độ huỳnh
quang của donor khi có mặt acceptor
Hiệu suất truyền năng lượng cũng có thể xác định thông qua thời gian
sống huỳnh quang theo biểu thức
(1.5)
Trong đó là thời gian sống huỳnh quang của donor khi có mặt
acceptor; là là thời gian sống huỳnh quang của donor khi không có mặt
acceptor.
Tóm lại, tỷ lệ FRET phụ thuộc vào mức độ chồng chập quang phổ giữa các cặp donnor – acceptor (hình 1.8), hiệu suất lượng tử của các chất cho, định hướng tương đối của các donor– acceptor, những khoảng cách chuyển tiếp lưỡng cực và khoảng cách từ các donor tới acceptor. Bất kỳ quá trình nào có ảnh hưởng đến khoảng cách giữa các cặp chất donor – acceptor cũng sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất của FRET.
Phát hiện hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang
(FRET):
Việc phát hiện và định lượng hiệu ứng FRET có thể được thực hiện trong một số cách khác nhau. Đơn giản chỉ cần hiện tượng này có thể được quan sát bởi một mẫu vật có chứa cả các donor và các phân tử acceptor khi đó sẽ quan sát được sự thay đổi cường độ huỳnh quang cũng như thời gian sống huỳnh quang của donor và acceptor, khi xác định tỷ lệ số liệu của hai tín hiệu cường độ huỳnh quang hay thời gian sống huỳnh quang có thể phát hiện được hiệu ứng FRET có xảy ra hay không [5].
25
Ưu điểm của phương pháp này là một thước đo của sự tương tác có thể được thực hiện là độc lập với nồng độ tuyệt đối của cảm biến. Bởi vì không phải tất cả các gốc acceptor đều phát huỳnh quang, nên chúng có thể được sử dụng như một phương tiện để dập tắt huỳnh quang. Trong trường hợp này,
những tương tác mà kết quả trong một phân tử các chất huỳnh quang cho đến gần phân tử như vậy sẽ dẫn đến một sự mất mát tín hiệu.
Hình 1.10. Quang phổ huỳnh quang của donor và acceptor và dung
dịch hỗn hợp của donor và acceptor
26
Trong hình 1.10, huỳnh quang của acceptor tăng gần sáu lần khi có sự hiện diện của chất cho. Trong trường hợp, như huỳnh quang các donor trở thành 1/3 huỳnh quang các chất cho. Sự thay đổi cường độ huỳnh quang là bằng chứng hình ảnh rõ ràng của FRET. Các quang phổ huỳnh quang đã được ghi nhận là sự phát huỳnh quang của donor và accepter. Đây là hiệu ứng FRET sử dụng các chất 3 – octadecyl – 2[3 – octadecyl – 2(3H) – benzothizolidene)metyl] benzoth) metyl] benzothiazolium perchlorate (chất cho), Octadecyl rhodamine B (acceptor).
CHƯƠNG 2: KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM
2.1: CHUẨN BỊ MẪU
2.1.1: Aflatoxin B1
Aflatoxin sử dụng để xác định đường chuẩn đo tương tác truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang là Aflatoxin B1, Sigma Aldrich, độ tinh khiết
98.5%. Aflatoxin B1 được pha trong dung môi methanol với nồng độ 20g/ml sau đó pha trộn với chấm lượng tử CdSe/ZnS với tỉ lệ như trong bảng 2.1.
2.1.2: Chấm lượng tử bán dẫn CdSe/ ZnS
Chấm lượng tử sử dụng trong phép đo truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang là chấm lượng tử cấu trúc lõi vỏ CdSe/ZnS có đỉnh huỳnh quang tại 545 nm và hấp thụ mạnh vùng tử ngoại tới 520nm. Chấm lượng tử được tổng hợp bằng phương pháp phản ứng hấp thụ từng lớp ion (Successive ionic layer adsorption and reaction - SILAR).
Bảng 2.1. Chuẩn bị mẫu Aflatoxin B1- CdSe/ZnS
Tên mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6
CdSe/ZnS 0 1000 1500 1900 1950 1990 2000 (l)
Aflatoxin 2000 1000 500 100 50 10 0 (l)
Aflatoxin trong thực tế được chiết suất từ ngô bằng cách lấy 25 g ngô xay đồng nhất, chính xác đến 0,01 g, cho vào bình nón 250 ml. Thêm 5 g natri clorid và 125 mL hỗn hợp methanol: nước (70:30, v/v) và đồng nhất bằng máy trộn trong 2 phút ở tốc độ cao. Lọc hỗn hợp qua giấy lọc.
27
Dùng pipet lấy 15 ml dịch lọc cho vào bình nón 100 ml có nắp đậy thủy tinh. Thêm 30 ml nước, đậy nắp bình và trộn. Lọc dịch chiết đã pha loãng
được lọc nhiều lần qua giấy lọc (có thể dùng ly tâm) để thu được dung dịch trong.
Dùng pipet lấy 15 ml của dịch lọc cho vào phễu gắn với cột IAC (Vicam Aflatest P 1 ml). Cho đi qua cột tách với tốc độ 1-2 giọt/giây. Rửa tạp bằng 10 ml nước, tốc độ 1-2 giọt/giây. Rửa giải các Aflatoxin B1 bằng 1 ml methanol.
Các mẫu aflatoxin trong ngô được chuẩn bị tại Viện Vệ sinh an toàn thực phẩm với 4 nồng độ khác nhau xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và không cho biết trước để so sánh với phương pháp FRET
Mẫu sau khi chuẩn bị được đo phổ hấp thụ trên thiết bị Shimazu UV2600 (Shimazu), phổ huỳnh quang trên hệ phổ kế huỳnh quang Cary Eclipse (Variant) và phổ huỳnh quang phân giải thời gian trên cở sở đếm đơn photon tương quan thời gian (TCSPC) và được xử lý bằng phần mềm tính toán chuyên dụng viết trên Matlab, OriginLab.
2.2. PHỔ HẤP THỤ UV – VIS
Phổ hấp thụ là một công cụ hữu ích trong việc nghiên cứu sự tương tác của vật liệu với ánh sáng chiếu vào, qua đó, có thể biết được thông tin về các quá trình hấp thụ xảy ra tương ứng với các chuyển dời quang học từ một số
trạng thái cơ bản đến một số trạng thái kích thích , từ đó có thể xác định
được bước sóng kích thích hiệu quả cho quá trình quang huỳnh quang ( )
quan tâm . Môi trường vật chất hấp thụ ánh sáng tuân theo định luật Beer– Lambert:
(2.1)
trong đó: và là cường độ ánh sáng tới và cường độ truyền qua
mẫu vật chất, là độ dày của mẫu và là hệ số hấp thụ vật liệu đối với
photon có năng lượng (hay , với là vận tốc ánh sáng).
Muốn xác định hệ số hấp thụ , người ta lấy ln hai vế (2.1), được:
28
(2.2)
Phổ hấp thụ biểu diễn đồ thị hệ số hấp thụ
(hay độ hấp thụ A) theo bước sóng hay năng lượng của photon đi qua vật chất. Như vậy, hệ số hấp thụ lớn tại một bước sóng nào đó cho thấy photon có năng lượng tương ứng bị vật chất hấp thụ mạnh, phần ánh sáng truyền qua có cường độ yếu. Ý nghĩa của hệ số hấp thụ bằng 1 là khi ánh sáng truyền qua một môi trường có độ dày
1cm, cường độ sẽ bị suy giảm đi e (~2,7) lần. Hai đại lượng và đo
được bằng thực nghiệm.
Phương pháp đo phổ hấp thụ trong từng vùng phổ đòi hỏi nguồn sáng phát xạ liên tục trong vùng phổ đó, một phổ kế hoặc là máy đơn sắc lựa chọn bước sóng hay tần số, thiết bị thu tín hiệu để đo sự truyền qua của ánh sáng đơn sắc. Nguồn sáng thường được sử dụng là đèn hydrogen và deuterium đối với vùng tử ngoại và đèn dây tóc (volfram + halogen) cho vùng nhìn thấy và vùng gần hồng ngoại. Trong thí nghiệm đo phổ hấp thụ, chúng tôi dùng đèn halogen phát xạ trong vùng nhìn thấy. Bằng cách ghi phổ trải trong vùng năng lượng photon rộng, có thể biết được các quá trình hấp thụ xảy ra tương ứng với các chuyển dời quang học.
Nguyên lý hoạt động của hệ đo: Một chùm ánh sáng được phát ra từ nguồn sáng, là đèn phát sáng trong vùng tử ngoại UV hoặc phát trong vùng nhìn thấy VIS , được đưa qua hệ máy đơn sắc là hệ lăng kính hoặc cách tử nhiễu xạ , để được tách ra thành các bước sóng đơn sắc. Mỗi tia sáng đơn sắc này sẽ lần lượt được chia thành hai tia để so sánh, có cường độ như nhau nhờ một gương phản xạ bán phần. Một trong hai tia sáng trên truyền qua một cuvet trong suốt bằng thạch anh chứa dung dịch mẫu cần nghiên cứu, cường . Tia sáng còn lại là tia sáng so độ của tia sáng sau khi truyền qua mẫu là sánh truyền qua một cuvet tương tự nhưng chỉ chứa dung môi không chứa
chấm lượng tử, cường độ của nó sau khi truyền qua dung môi là . Cường độ
29
của các tia sáng sau đó được các detector ghi lại và so sánh trực tiếp trong cùng điều kiện đo.
Hình 2.1. Sơ đồ nguyên lý của hệ đo hấp thụ quang học UV-VIS
Hình 2.2. Máy đo quang phổ UV – VIS
Nếu mẫu không hấp thụ ánh sáng ở một bước sóng đã cho thì .
Tuy nhiên nếu mẫu hấp thụ ánh sáng thì . Các phổ có thể được vẽ
dưới dạng phổ truyền qua :
(2.3)
hoặc phổ hấp thụ :
30
(2.4)
2.3: PHỔ HUỲNH QUANG
Hệ đo phổ huỳnh quang Cary Eclipse phân giải cao được đặt tại Viện Vật Lý, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nguyên tắc hoạt động của phổ kế Cary Eclipse được cho trên hình 2.3.
Nguyên lý hoạt động của hệ đo: Nguồn kích thích của Cary Eclipse là đèn Xenon flash có thể phát bước sóng từ 200 đến 1000nm, nguồn sáng từ đèn xenon đi qua một máy đơn sắc để chọn bước sóng đơn sắc kích thích. Ánh sáng đơn sắc này được đưa vào buồng mẫu và hội tụ lên mẫu đo. Tín hiệu huỳnh quang phát ra từ mẫu được hội tụ lên lối vào của máy đơn sắc thứ hai và thu nhận ở lối ra bằng đầu thu quang điện. Một phần của ánh sáng kích thích được trích ra đưa vào đầu thu quang điện thứ hai để đồng bộ với tín hiệu thu. Xeno flash hoạt động ở chế độ xung nên Cary Eclipse cò có thể đo thời gian sống huỳnh quang của mẫu có thười gian sống dài (lân quang)
Máy đơn sắc kích thích hai cách tử
Nguồn sáng đèn Xê-non
Cửa sập Kính lọc Tấm chia chùm
Tấm phân cực
Ref - Cell Môđun quang học
Máy đơn sắc phát xạ
Buồng đựng mẫu
Hiển thị
Điều khiển máy đơn sắc
Máy tính
Hình 2.3. Sơ đồ nguyên lý của máy phổ kế huỳnh quang Cary
31
Eclipse
Với cấu hình này Cary Eclipse cho phép đo phổ huỳnh quang, phổ kích thích huỳnh quang, thời gian sống huỳnh quang và phổ thời gian sống huỳnh quang (với mẫu có thời gian sống huỳnh quang lớn). Toàn bộ hệ thống được điều khiển bằng phần mềm chuyên dụng.
Hình 2.4. Máy đo phổ huỳnh quang Cary
2.4: PHỔ HUỲNH QUANG PHÂN GIẢI THỜI GIAN SỐNG
2.4.1. Quang phổ phân giải thời gian và thời gian sống phát quang
Trong khi phép đo huỳnh quang trạng thái dừng là đơn giản, phép đo phân giải thời gian thông thường yêu cầu thiết bị đo đạc phức tạp và tốn kém. Tuy nhiên phép đo phân giải thời gian cung cấp nhiều thông tin hơn là từ dữ liệu huỳnh quang trạng thái dừng. Một ví dụ điển hình của phép đo phân giải thời gian cung cấp những thông tin mà phép đo huỳnh quang trạng thái dừng không thể thực hiện được đó là thống kê phân biệt và quá trình dập tắt động học trạng thái kích thích sử dụng phép đo thời gian sống [18].
Thời gian sống hay thời gian suy giảm phát quang là một thông số động học có ý nghĩa quan trọng. Giả sử một mẫu phát quang được kích thích bằng
32
một xung ánh sáng, kết quả là có một độ tích lũy ban đầu trên trạng thái
kích thích. Độ tích lũy trên trạng thái kích thích sẽ giảm dần với tốc độ suy
giảm: [4]:
(2.5)
với là độ tích lũy trạng thái trên trạng thái kích thích tại thời điểm .
là tốc độ suy giảm không phát xạ
là tốc độ phát xạ
Sự phát xạ là ngẫu nhiên và mỗi trạng thái kích thích cho cùng xác suất phát xạ trong cùng thời gian. Độ tích lũy trạng thái trên trạng thái kích thích do đó giảm dần theo hàm exponential:
(2.6)
Với là thời gian sống tổng cộng trên trạng thái kích thích.
Trong thực nghiệm, chúng ta không thể quan sát được độ tích lũy trên trạng thái kích thích nhưng chúng ta có thể quan sát thông qua cường độ phát
xạ tương ứng tỷ lệ với . Bởi vậy phương trình trên có thể viết lại dưới
dạng sự phụ thuộc vào thời gian của cường độ phát xạ :
(2.7)
Trong đó là cường độ phát quang tại thời điểm ban đầu, chúng ta
thường biểu diễn thang cường độ theo thang logarit cơ số 10, :
(2.8)
Theo đó ta có thể tính được thời gian sống phát quang
. Thời gian được tính tại thời điểm cường độ phát quang cực đại giảm sống phát quang
đi lần hoặc từ độ dốc của đường thực nghiệm theo thang logarit cơ
33
số 10 (phương trình 2.8). Tuy nhiên thời gian sống phát quang đo được không phải khi nào cũng có dạng đơn hàm e mũ (single exponential) như
phương trình 2.7, nó có thể có dạng đa hàm e mũ (multi exponential function) hay dưới dạng không phải đơn hàm e mũ (non-single exponential). Do đó từ giá trị thực nghiệm chúng ta phải đưa ra các giả thuyết phù hợp và khớp dữ liệu thực nghiệm theo nó [18].
Thời gian sống là tổng số thời gian trung bình trên trạng thái kích thích sau khi mẫu được kích thích. Điều này có thể được thấy được bằng cách tính
thời gian trung bình trong trạng thái kích thích. Giá trị này được tính bằng
cách lấy trung bình thời gian qua sự suy giảm cường độ của mẫu:
(2.9)
Phương trình 2.9 cho thấy đối với dạng suy giảm đơn hàm e mũ thì thời
gian trung bình trên trạng thái kích thích bằng thời gian sống:
(2.10)
Điều quan trọng cần lưu ý là phương trình 2.10 là không thật sự đúng đối với các định luật suy giảm phức tạp, chẳng hạn như suy giảm dạng đa hàm e mũ hoặc không phải dạng đơn hàm e mũ. Sử dụng một định luật được giả định, thời gian sống trung bình luôn luôn có thể được tính bằng cách sử dụng phương trình 2.9. Tuy nhiên, thời gian sống này có thể là một hàm phức tạp của các tham số mô tả cường độ suy giảm thực tế. Một khái niệm quan trọng đó là thời gian sống được hiểu một như một thống kê trung bình, và sự phát quang ngẫu nhiên thông qua suy giảm độ tích lũy. Đối với một độ tích lũy lớn trên trạng thái kích thích, không phải tất cả đều có cùng thời gian sống, một số sẽ phát xạ nhanh hơn và một số sẽ phát xạ chậm hơn thời gian sống trung bình. Sự phân bố thời gian của photon phát xạ chính là đường suy giảm cường độ phát quang.
34
Có hai phương pháp đo huỳnh quang phân giải thời gian đó là phương pháp miền tần số và phương pháp miền thời gian [18], [29]. Phép đo phân giải thời gian có độ phân giải cao đang được sử dụng hiện nay tại các phòng thí
nghiệm quang phổ hiện đại đó là kỹ thuật đếm đơn photon tương quan thời gian (time-correlated single photon counting - TCSPS). Đây cũng chính là kỹ thuật được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu quang phổ phân giải thời gian của vật liệu cấu trúc nano.
2.4.2. Cấu tạo và nguyên lý kỹ thuật của hệ đo huỳnh quang phân
giải thời gian
35
Trong phép đo huỳnh quang phân giải thời gian, yêu cầu ghi lại sự phụ thuộc vào thời gian của dạng đường bao (profile) cường độ tín hiệu huỳnh quang khi đối tượng nghiên cứu được kích thích bởi một xung ngắn của ánh sáng, thường là một xung laser. Trong khi về nguyên tắc, người ta có thể cố gắng để ghi lại profile đường cong suy giảm theo thời gian của cường độ tín hiệu bằng các photodiode nhanh hay các đầu thu nhanh khác (phương pháp lấy mẫu tương tự) cùng với một bộ lấy mẫu tín hiệu và chuyển đổi tương tự số có tốc độ cao [18], [31]. Tuy nhiên, sự suy giảm để được ghi lại là rất nhanh, huỳnh quang đặc trưng có thể kéo dài chỉ vài trăm pico giây đến vài chục nano giây, đây là khó khăn và giới hạn của hệ điện tử thu tín hiệu. Mặt khác, tín hiệu huỳnh quang có thể rất yếu và không cho phép ghi nhận trực tiếp bằng phương pháp lấy mẫu tương tự. Giải pháp cho những vấn đề này đó là sử dụng kỹ thuật đếm đơn photon tương quan thời gian (time-correlated single photon counting - TCSPC).
Hình 2.5. Nguyên lý tổng quát của kỹ thuật TCSPC: một photon tín
hiệu được ghi nhận tại mỗi chu kỳ xung kích thích, nhớ vào các cột thời gian (bin time), dựng lại biểu đồ tín hiệu theo thời gian (histogram) sẽ cho profile cường độ [29].
Nguyên lý tổng quát của kỹ thuật TCSPC được mô tả trên hình 2.5. Nguyên lý này dựa trên sự phát xạ của từng photon là phân bố ngẫu nhiên ứng với sự hồi phục phát xạ của độ tích lũy trên trạng thái kích thích. Trên cơ sở đó, xác định thời gian tới của một photon tín hiệu trên mỗi chu kỳ xung kích thích, nhớ vào các cột thời gian (bin time), và xây dựng lại biểu đồ cường độ tín hiệu theo thời gian ta sẽ thu được profile đường cong suy giảm theo thời gian của cường độ [18], [31].
Sơ đồ tổng quát hệ TCSPC cho trên hình 2.5, bao gồm một số khối
chính:
- Nguồn kích thích: thường sử dụng laser bán dẫn pico độ rộng xung ~
50 ps; tần số lặp lại 4 MHz; công suất trung bình 80 W.
- Khối đầu thu: Sử dụng nhân quang tấm vi kênh (microchannel plate photonmultiplier tube MCP – PMT) MCP 3890R – 50 của Hamamatsu (Nhật Bản) có thể đo trong vùng bước sonhs 185 – 900 nm, đáp ứng thời gian ~ 25 ps.
36
- Khối đếm đơn photon tương quan thời gian: PicoHarp 300 (Picoquant – Đức) có phân giải thời gian tới 4 ps tích hợp sẵn 2 lối vào CFD START và
STOP. Modul nay nhận tín hiệu từ đầu thu MCP , xử lý và đưa vào máy tính thông qua giao tiếp USB.
- Phần mền thu nhận điều khiển và xủa lý số liệu có thể điều khiển, đặt
Ex.
Sample
thông số đo của của hệ đo như bước sóng, thời gian tích phân …
Ultra short pulse laser
Monochrom -ator or
PD or PMT
Stop pulse
Computer
CFD
PMT
TTL
Reader and communication card
Em.
TDC
Amp. CFD
Start pulse
Hình 2.6. Sơ đồ tổng quát của hệ TCSPC
37
Hệ TCSPC hoạt động như sau: Xung laser được qua gương chia, một phần được dùng kích thích mẫu, một phần dùng làm xung trigger so sánh. Tín hiệu ánh sáng từ mẫu phát quang được hội tụ và qua filter hoặc qua máy đơn sắc để thu ánh sáng đơn sắc. Hệ quang học được điều chỉnh phù hợp để tín hiệu ánh sáng tới đầu thu là những photon đơn lẻ. Tín hiệu đơn photon được chuyển thành xung tín hiệu điện từ đầu thu, sau đó được khuếch đại qua khối tiền khuếch đại và đến bộ CFD. Toàn bộ hệ quang và đầu thu phải được đặt trong buồng tối để tránh nhiễu ánh sáng bên ngoài. Bộ CFD cho phép trigger và lấy mẫu nhanh với độ chính xác và ổn định cao. Xung tín hiệu ra từ CFD được chuyển thành xung TTL và đến khối TDC với vai trò xung start (nếu sử dụng TAC phải có thêm bộ chuyển đổi tương tự sỐ - ADC). Phần laser được sử dụng để tạo xung so sánh được thu bằng một đầu thu nhanh (như PIN photodiode). Xung so sánh sau khi được qua bộ tách xung (discriminator có thể là theo phương pháp leading-edge hoặc CFD) cũng sẽ được chuyển đổi thành xung TTL và đến TDC với vai trò xung stop. Khối TDC sẽ đo thời gian
từ xung start đến xung stop, dữ liệu thời gian được chuyển sang dạng tín hiệu số và được ghi vào bộ nhớ. Card đọc và ghi dữ liệu, chuyển sang máy tính để máy tính dựng lại biểu đồ theo thời gian của cường độ.
38
Hệ huỳnh quang phân giải thời gian chúng tôi sử dụng là hệ đo của Viện vật lý sử dụng laser kích thích bước sóng 505 nm, độ rộng xung 100 ps, tần số lặp lại 4MHz, modun đếm đơn photon Picoharp có độ phân giải tới 2ps, sử dụng đầu thu là ống nhân quang điện đa vi kênh Hamamatsu R3890. Độ phân giải chung cả hệ là 35 ps.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1: TÍNH CHẤT QUANG CỦA AFLATOXIN B1
Phổ hấp thụ và huỳnh quang của Aflatoxin B1 được trình bày trên hình 3.1. Phổ hấp thụ trạng thái bản aflatoxin B1 cho thấy sự hiện diện của dải hấp thụ mạnh ở bước sóng 360 nm, ngoài ra trong một số công bố khác còn có đỉnh hấp thụ yếu hơn ở vùng bước sóng 254 nm. Tuy nhiên, trong gới hạn của nghiên cứu này chúng tôi chỉ nghiên cứu trong vùng khả kiến nên phổ chỉ được bước sóng trên 300 nm.
Phổ phát xạ huỳnh quang aflatoxin B1 phụ thuộc vào môi trường dung môi, các nghiên cứu cho thấy răng đỉnh phổ huỳnh quang của aflatoxin có thể thay đổi từ 393 nm trong môi trường benzen tới 440 nm trong môi trường PBS (Phosphate buffer solution). Trong trường hợp chúng tôi sử dụng dung môi methanol đỉnh huỳnh quang của aflatoxin B1 quan sát thấy tại 435 nm, phổ huỳnh quang đối xứng gương với phổ hấp thụ trạng thái cơ bản có cực đại tại 360 nm.
39
Hình 3.1. Phổ hấp thụ và huỳnh quang của Aflatoxin B1
3.2: TÍNH CHẤT QUANG CỦA CHẤM LƯỢNG TỬ CdSe/ZnS
(3.1)
Sau khi chế tạo hai chấm lượng tử CdSe/ZnS cấu trúc lõi/vỏ được khảo sát tính chất bằng hệ đo huỳnh quang và hấp thụ hồng ngoại khả kiến, phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của chấm lượng tử CdSe/ZnS cho thấy trên hình 3.2. Phổ hấp thụ của CdSe/Zn có đỉnh hấp thụ tại 520 nm (2.37 eV) và dải hấp thụ mạnh dưới 490 nm (2.51 eV). Giá trị năng lượng vùng cấm quang tương ứng với đỉnh hấp thụ thứ nhất của phổ hấp thụ. Đỉnh phát huỳnh quang tại 545 nm (2.26 eV).
Khi nghiên cứu tính chất quang của chấm lượng tử, Zeger Hens [27] đã đưa ra công thức xác định độ rộng vùng cấm quang của chấm lượng tử CdSe với cấu trúc tinh thể dạng lập phương giả kẽm từ các kết quả thực nghiệm (công thức 3.1). Sử dụng công thức 3.1 để xác định kích thước hạt D trung
bình của chấm lượng tử dựa vào năng lượng vùng cấm đã tính được từ kết
quả phổ hấp thụ của chấm lượng tử. Kết quả thu được chấm lượng tử CdSe/ZnS chúng tôi sử dụng ở đây có kích thước trung bình 3.5 nm.
40
Hình 3.2. Phổ hấp thụ và huỳnh quang của chấm lượng tử CdSe/ZnS
3.3: TRUYỀN NĂNG LƯỢNG HUỲNH QUANG CỘNG HƯỞNG CỦA AFLATOXIN VÀ CHẤM LƯỢNG TỬ CdSe/ZnS.
Hình 3.3. Phổ hấp thụ (a) và phổ huỳnh quang (b) của các mẫu aflatoxin
B1 với tỉ lệ hàm lượng khác nhau.
Mẫu aflatoxin B1 được chuẩn bị theo nồng độ khác nhau trong môi trường có chấm lượng tử CdSe/ZnS nhằm xác định đường chuẩn theo nồng độ trên cơ sở truyền năng lượng giữa Aflatoxin B1 và chấm lượng tử CdSe/ZnS.
41
Để xác định tương tác truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang giữa Aflatoxin B1 và chấm lưởng tử CdSe/ZnS, hình 3.3 trình bày phổ hấp thụ
và phổ huỳnh quang của mẫu aflatoxin B1 – CdSe/ZnS với tỉ lệ hàm lượng khác nhau như trong bảng 2.1.
Phổ hấp thụ của mẫu aflatoxin B1 – CdSe/ZnS đặc trưng bởi các đỉnh hấp thụ của aflatoxin B1 tại 360 nm và của CdSe/ZnS tại 520 nm và dải hấp thụ mạnh từ tử ngoại tới 500 nm với CdSe/ZnS và từ tử ngoại tới 450 nm với mẫu chỉ có aflatoxin B1. Các mẫu có chứa cả aflatoxin B1 và CdSe/ZnS xuất hiện cả 2 đỉnh 360 nm và 520 nm với cường độ đỉnh tại 520 nm hầu như không đổi, trong khi cường độ đỉnh tại 360 nm giảm dần theo hàm lượng aflatoxin B1 trong mẫu. Mẫu chỉ có aflatoxin B1 (M6) chỉ có một đỉnh hấp thụ tại 360nm; mẫu chỉ có CdSe/ZnS (M0) chỉ có đỉnh tại 520 nm.
Tương tự như vậy, phổ huỳnh quang đặc trưng bởi 2 đỉnh phát xạ tại 435 nm của aflatoxin B1 và 535 – 545 nm của CdSe/ZnS. Với mẫu không chứa aflatoxin B1 đỉnh phát xạ huỳnh quang tại 535 nm, khi có aflatoxin B1 đỉnh phát xạ dịch tới 545 nm. Sự dịch đỉnh này có thể do sự thay đổi trạng thái bề mặt của chấm lượng tử khi có mặt của aflatoxin B1, đồng thời cường độ huỳnh quang của các mẫu này giảm trong khi cường độ huỳnh quang tại 435 nm của aflatoxin B1 của các mẫu này tăng. Phổ phát xạ của aflatoxin B1 (hình 3.3b) chồng chập lên vùng hấp thụ của chấm lượng tử (hình 3.3a). Đây chính là điều kiện để xảy ra hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang.
Theo các nghiên cứu về aflatoxin B1, đỉnh phổ hấp thụ và phát xạ của aflatoxin B1 phụ thuộc vào môi trường dung môi, đỉnh phổ phát xạ có thể thay đổi từ 398 nm, 418 nm, 438nm… tùy thuộc môi trường dung môi là benzene, lipid… hay phosphate buffer solution (PBS).
42
Hiệu suất truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang hoàn toàn có thể tính từ sự thay đổi cường độ huỳnh quang (hình 3.3b). Tuy nhiên trên hình vẽ có thể thấy cường độ huỳnh quang tương đối yếu và có sự thăng giáng đáng kể ở vị trí đỉnh. Hơn nữa để khẳng định có tương tác trao đổi truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang, thì phải có sự thay đổi thời gian sống huỳnh quang, do đó chúng tôi đã đo đường cong suy giảm huỳnh quang để phân tích đánh giá FRET thông qua thời gian sống huỳnh quang.
Hình 3.4 Đường cong suy giảm huỳnh quang của aflatoxin B1 –
CdSe/ZnS với tỉ lệ khác nhau đo tại bước sóng 435 nm (a) và 545nm (b), kích thích tại bước sóng 405 nm
43
Hình 3.4 cho thấy đồ thị đường cong suy giảm huỳnh quang của mẫu aflatoxin B1 – CdSe/ZnS với tỉ lệ khác nhau đo tại bước sóng phát xạ của flatoxin B1 ở 435nm (hình 3.4a) và bước sóng phát xạ của CdSe/ZnS tại 545nm (hình 3.4b). Thời gian sống huỳnh quang của hạt tải trên trạng thái kích thích được tính bằng cách làm khớp (fit) đường cong suy giảm huỳnh quang theo hàm exponent. Trường hợp mẫu chỉ có một quá trình tái hợp (trường hợp đơn phân tử) có thể fit đường suy giảm huỳnh quang theo hàm exponent đơn.
Trường hợp có nhiều quá trình tái hợp xảy ra trong mẫu cần phải fit đường cong theo hàm bi-exponent, trip-exponent…hoặc hàm trung bình stretch – exponent.
Nhìn vào đồ thị hình 3.4 a, tại 435 nm – bước sóng phát xạ của aflatoxin B1, các mẫu có nồng độ aflatoxin B1 lớn (M6, M1, M2) đường cong suy giảm huỳnh quang giảm theo hàm exponent đơn, trong khi đó, mẫu có nồng độ aflatoxin B1 nhỏ, cường độ huỳnh quang yếu, đường cong suy giảm huỳnh quang có đóng góp của đáp ứng hệ đo (<100 ps) do đó chúng tôi đã fit thời gian sống theo hàm bi-exponent, trong đó thời gian sống bé ~ 100 ps và thời gian sống thứ hai là thời gian sống của Aflatoxin B1 trên trạng thái kích thích.
Tại bước sóng phát xạ 545 nm của CdSe/ZnS (hình 3.4 b) cường độ huỳnh quang lớn, thời gian sống của CdSe/ZnS dài không quan sát thấy đáp ứng của hệ. Khi có mặt CdSe/ZnS, aflatoxin B1 đóng vai trò donor nhận năng lượng từ nguồn sáng kích thích, truyền cho CdSe/ZnS đóng vai trò acceptor làm thay đổi thời gian sống huỳnh quang của cả mẫu.
Với chấm lượng tử CdSe/ZnS, thông thường có 2 quá trình tái hợp bức xạ xảy ra liên quan tới tái hợp bức xạ các trạng thái bề mặt và quá trình tái hợp bức xạ của lõi chấm lượng tử, do đó thời gian sống được tính bằng cách fit đường suy giảm huỳnh quang theo hàm bi-exponet.
(3.2)
A1 là hằng số; 1,2 là thời gian sống huỳnh quang, trong đó, thời
gian sống huỳnh quang có giá trị lớn ( =17 ns) hầu như không thay đổi theo
44
nồng độ aflatoxin B1 và thời gian sống giá trị nhỏ hơn (bảng 3.1) thay đổi theo nồng độ aflatoxin B1 trong mẫu, nó liên quan tới quá trình tái hợp bức xạ của lõi chấm lượng tử.
Bảng 3.1. Thời gian sống huỳnh quang của mẫu aflatoxin B1 (AFB1)-
CdSe/ZnS tại bước sóng 435 nm và 545nm.
Nồng độ AFB1 Mẫu 435 545 (ppM)
3.76 - 2500 M0
3.70 1.66 25 M5
3.69 1.75 125 M4
3.57 1.80 250 M3
3.58 2.01 1250 M2
3.50 2.17 2500 M1
- 3.81 - M6
Khi có mặt aflatoxin B1 trong mẫu CdSe/ZnS cường độ huỳnh quang của chấm lượng tử tại 545 giảm theo sự tăng nồng độ aflatoxin B1, đồng thời thời gian sống của chấm lượng tử tăng. Đây là kết quả của quá trình truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang và có thể dùng giá trị này để xác định nồng độ của aflatoxin B1. Nồng độ aflatoxin B1 như hàm đa thức bậc hai của thời gian sống huỳnh quang (hình 3.5)
3.4: THỬ NGHIỆM XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG NGÔ
45
Mẫu aflatoxin B1 chiết suất từ ngô được chuẩn bị từ Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm – Bộ Y tế đã được trình bày trong phần thực nghiệm và xác định nồng độ bằng phường pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp phổ khối để so sánh với kết quả từ phương pháp quang phổ.
Hình 3.5. Xác định nồng độ aflatoxin B1 theo thời gian sống huỳnh quang
46
Các mẫu aflatoxin B1 chiết suất từ ngô có cường độ huỳnh quang rất yếu không đo được trực tiếp trên phổ kế huỳnh quang Cary Eclipse, chúng tôi đã thực hiện đo trên hệ đếm đơn photon tương quan thời gian, tuy nhiên hệ này sử dụng nguồn kích thích là laser bán dẫn picô giây bước sóng 405 nm nên chỉ đo được một phần đỉnh phổ phát xạ của aflatoxin B1 (hình 3.6) do đỉnh phổ phát xạ của aflatoxin B1 quá gần với laser kích thích. Tuy nhiên, ta vẫn có thể thấy rõ bên cạnh đỉnh phát xạ của chấm lượng tử CdSe/ZnZ tại 545nm có một vai tại bước sóng 435 nm của các mẫu M1, M2, M4 chiết suất từ ngô, riêng mẫu M3 không quán sát vai phổ tại vị trí này, do đó có thế kết luận M3 không chứa aflatoxin B1.
Hình 3.6. Phổ huỳnh quang trạng thái dừng của Aflatoxin B1 chiết suất
từ ngô
47
Chúng tôi đo đường suy giảm huỳnh quang và xác định thời gian sống huỳnh quang tại 544 nm và xác định thời gian sống huỳnh quang như với các mẫu chuẩn đã trình bày ở trên. Thời gian sống huỳnh quang của các mẫu M1, M2, M4 thu được tương ứng là 1.07 ns; 0,6 ns và 0.57 ns. Với đường chuẩn nồng độ AFB1 là hàm đa thức bậc 2 (hình 3.5). Nồng độ AFB1 tương ứng của các mẫu này tương ứng là 15 ppM, 10 ppM và 9 ppM. Các giá trị này có thể so sánh được với phương pháp xác định hàm lượng AFB1 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp phổ khối – là phương pháp có độ chính xác rất cao đã xác định tại Viện Kiểm nghiệm Vệ sinh An toàn Thực phẩm là 43 ppm; 25 ppM và 11 ppM
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Các kết quả chính của luận văn được tóm tắt như sau:
1. Nghiên cứu lý thuyết truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang FRET, điều kiện để xảy ra truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang và ứng dụng để phát hiện các chất độc hại có nồng độ thấp.
2. Chọn cặp donor – acceptor thích hợp để phát hiện aflatoxin B1 trong đó aflatoxin B1 đóng vai trò donor, chấm lượng tử bán dẫn CdSe/ZnS đóng vai trò acceptor. Aflatoxin B1 có đỉnh phổ hấp thụ tại 360nm và phát xạ tại 435nm, trong khi chấm lượng tử CdSe/ZnS có một đỉnh hấp thụ tại 520nm và dải hấp thụ mạnh dưới 490nm. Có sự chồng chập lớn giữa phổ phát xạ của AFB1 và CdSe/ZnS QDs, điều kiện đảm bảo để xảy ra FRET
3. Bằng cách chuẩn bị các mẫu chuẩn AFB1 – CdSe/ZnS với nồng độ AFB1 đa biết trước đã xây dựng được đường chuẩn nồng độ AFB1 theo thời gian sống huỳnh quang theo hàm đa thức bậc 2.
4. Đã thử nghiệm phương pháp truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang phát hiện AFB1 trong ngô, kết quả cho phù hợp với kết quả xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao tại viện an toàn vệ sinh thực phẩm Bộ Y tế.
48
Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng phương pháp truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang hoàn toàn có thể sử dụng phát hiện nhanh một số độc tố trong an toàn vệ sinh thực phẩm cũng như trong môi trường.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. A. F. van Driel, G. Allan, C. Delerue, P. Lodahl, W. L. Vos, and D. Vanmaekelbergh (2005), Phys. Rev. Lett. 95, 236804 2. A. F. van Driel, I. S. Nikolaev, P. Vergeer, P. Lodahl, D. Vanmaekelbergh, and W. L. Vos (2007), Phys. Rev. B 75, 035329 3. Aaron R. Clapp, Igor L. Medintz, J. Matthew Mauro, Brent R. Fisher, Moungi G. Bawendi, and Hedi Mattoussi. Fluorescence Resonance Energy Transfer Between Quantum Dot Donors and Dye-Labeled Protein Acceptors. Published on Web 12/13/2003.
4. Clare Higgins, Manuela Lunz, A. Louise Bradley, Valerie A. Gerard, Stephen Byrne, Yurii K. Gun’ko, Vladimir Lesnyak, and Nikolai Gaponik (2010), Optics express, vol 18, 24486 5. David L. Andrews. Chapter 14 Resonance Energy Transfer: Theoretical Foundations and Developing Applications
6. G. C. Dors, S. Caldas, V. Feddern et al., Aflatoxins-Biochemistry and Molecular Biology, pp. 415–438, InTech, Shanghai, China (2011).
7. H. Gourama and L. B. Bullerman, Journal of Food Protection, vol. 58, no. 12, pp. 1389–1394 (1995).
8. H. S. Hussein and J. M. Brasel, Toxicology, vol.167, no. 2, pp. 101–134 (2001).
9. Hyunjung Min, Byoung-Kwan Cho, J. of Biosystems Eng. 40(1) pp.67-77. (2015)
10. J. C. Netto-Ferreira, B. Heyne and J. C. Scaiano, Photochem. Photobiol. Sci., 10, pp. 1701–1708 (2011)
11. J. R. Lakowicz (2006), Principles of Fluorescence Spectroscopy - 3rd Ed. Springer, New York, Ch. 13.
49
12. James E. Martin, Lauren E. Shea-Rohwer (2006), Journal of Luminescence 121, 573.
13. Kaori Fujita, Junichi Sugiyama, Mizuki Tsuta, Mario Shibata, Mito Kokawa, Hiroyuki Onda and Takehito Sagawa, Food Sci. Technol. Res., 19 (4), pp. 539 – 545 (2013)
14. Kenny F. Chou and Allison M. Dennis. Förster Resonance Energy Transfer between Quantum Dot Donors and Quantum Dot Acceptors. 2015, 15, 13288-13325;
15. L. Smeesters, W. Meulebroeck, S. Raeymaekers, H. Thienpont, Food Control Vol. 51 pp 408-416 (2015)
16. M. Ayub and D. Sachan, Malaysian Journal of Nutrition, vol. 3, pp. 161– 197 (1997).
17. MSKatrina Campbell (Dr), Ana L. Ferreira Cavalcante, Pamela Galvin- Kinga,Michalin Oplatowska-Stachowiak (Dra, Catherine Brabet (Dr), Isabelle Metayerb,Didier Montet (Dr.), Simon A. Haughey (Dr.), Christopher T. Elliott (Prof.), Sensors and Actuators B 239 pp. 1087–1097 (2017)
18. Nai-Tzu Chen , Shih-Hsun Cheng , Ching-Ping Liu , Jeffrey S. Souris , Chen-Tu Chen , Chung-Yuan Mou and Leu-Wei Lo . Recent Advances in Nanoparticle-Based Förster Resonance Energy Transfer for Biosensing, Molecular Imaging and Drug Release Profiling. Int. J. Mol. Sci. 2012, 13, 16598-16623
19. Oana Ciobotaru, Iulian Grosu, Calina Petruta Cornea, Animal Science and Biotechnologies, 47 (1), pp 94-98 (2014).
50
20. Robert M Clegg, Fluorescence resonance energy transfer. 1995, 6:103-l 10. 21. Robert M. Clegg, THE HISTORY OF FRET: From conception through the labors of birth 22. Roi Baer, and Eran Rabani. Theory of resonance energy transfer involving nanocrystals: The role of high multipoles. 14 May 2008.
23. Roux, A., Lison, D., Junot, C., and Heilier, J. Applications of liquid chromatography coupled to mass spectrometry-based metabolomics in clinical chemistry and toxicology: A review. Clinical Biochemistry (2010)
24. Sangeeta Saini, Harjinder Singh and Biman Bagchi, Fluorescence resonance energy transfer (FRET) in chemistry and biology: Non-Förster distance dependence of the FRET rate, January 2006, pp. 23–35.
25. Vosough, M., Bayat, M., and Salemi, . Analytica chimica acta, 663(1), pp11–18 (2010)
26. W. Becker (2005), Advanced time-correlated single photon counting techniques, Springer.
51
27. Zeger Hens, Richard Karel Capek, Iwan Moreels, Karel Lambert, David De Muynck, Qiang Zhao, André Van Tomme, Frank Vanhaecke, Optical properties of zincblende Cadmium Selenide Quantum Dots, J, Phys. Chem. C 2010, 114, 6371-6376.
