ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ QUANG HỌC
ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÂN GIẢI THEO THỜI GIAN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TRUYỀN NĂNG LƯỢNG
CỘNG HƯỞNG
PHẠM THỊ HẰNG
LỚP CAO HỌC LÝ K10.B1
THÁI NGUYÊN, 2018
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới
Thầy giáo hướng dẫn PGS.TS. Nguyễn Thanh Bình. Thầy đã giao đề tài và tận tình
hướng dẫn em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Vũ Thị Bích và Th.S Nguyễn Đình
Công ở Viện Vật Lý Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, PGS. TS. Chu
Việt Hà trường Đại học Sư Phạm – Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện
để em hoàn thành tốt luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn của mình tới toàn thể Thầy Cô giáo trong khoa Vật lý
trường Đại Học Khoa Học - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và giúp đỡ em trong
suốt quá trình học tập tại khoa, và các anh chị, các bạn học viện lớp K10B1 – lớp Cao
học Vật lý đã trao đổi và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè đồng
nghiệp của tôi – những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian học tập và thực hiện luận văn này.
Luận văn được hoàn thành với sự hỗ trợ từ đề tài KHCN cấp Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam thuộc Chương trình phát triển Vật lý tới 2020 cấp:
“Ứng dụng phương pháp huỳnh quang phân giải thời gian và hiệu ứng truyền năng
lượng cộng hưởng FRET thử nghiệm phát hiện độc tố kháng sinh trong thực
phẩm”
Tác giả luận văn
PHẠM THỊ HẰNG
i
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................ iii
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................iv
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................. v
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
Chương 1: Tổng quan ................................................................................................... 3
1.1.Vật liệu nano và ứng dụng ......................................................................................... 3
1.2. Hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) .......................... 5
1.2.1. Khái niệm. ............................................................................................................. 5
1.2.2. Lịch sử phát triển FRET [11] ................................................................................... 7
1.2.3. Ứng dụng hiệu ứng FRET và chấm lượng tử làm nanosensor ............................ 14
Chương 2. Kỹ thuật thực nghiệm .............................................................................. 17
2.1. Kỹ thuật đo hấp thụ .............................................................................................. 17
2.2. Kỹ thuật đo huỳnh quang ....................................................................................... 19
2.3. Kỹ thuật đo huỳnh quang phân giải thời gian ........................................................ 20
2.3.1. Quang phổ phân giải thời gian và thời gian sống phát quang ............................. 20
2.3.2. Hệ đo huỳnh quang phân giải thời gian - TCSPC ............................................... 23
Chương 3: Kết quả và thảo luận ................................................................................ 27
3.1. Quá trình truyền năng lượng giữa AuNPs với phân tử Rh6G ................................ 27
3.2. Quá trình truyền năng lượng giữa Rhodamin 6G và chấm lượng tử CdSe/ZnS .... 33
KẾT LUẬN .................................................................................................................. 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 39
ii
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET
Sóng điện từ EM
BRET
truyền năng lượng cộng hưởng phát quang sinh học
TCSPC time-correlated single photon counting
SPR Surface Plasmon Resonance
AuNPs hạt nanô vàng
Acceptor A
Donor D
Quantum dots QDs
Deoxyribonucleic acid DNA
Phổ huỳnh quang PL
Rh6G-CdSe/ZnS Chấm lượng tử CdSe/ZnS-Rhodamin 6G
AuNPs/Rh6G hạt nano vàng-Rhodamin 6G
iii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Các mẫu nghiên cứu FRET giữa cặp Rh6G (Donor) và AuNPs (Acceptor) ........... 29
Bảng 3.2. Kết quả tính thời gian sống từ fitting đường cong suy giảm huỳnh quang theo hàm
stretch exponent. ....................................................................................................................... 33
Bảng 3.3. Các mẫu nghiên cứu FRET giữa cặp Rhodamin 6G và chấm lượng tử CdSe/ZnS . 34
Bảng 3. 4. Giá trị của tích phân vùng phổ chồng chồng lên nhau, (J ()), hiệu suất truyền
năng lượng Förster, (E%), và khoảng cách cặp donor-acceptor (r) .......................................... 36
iv
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Mô hình hiệu ứng FRET............................................................................................. 6
Hình 1.2: Giản đồ Jablonski mô tả hiệu ứng FRET ................................................................. 10
Hình 1.3: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất Donor và Acceptor .................. 11
Hình 1.4: Hiệu suất truyền năng lượng FRET được vẽ như hàm khoảng cách cặp donor-
acceptor, khoảng cách R0 là khoảng cách mà hiệu suất truyền băng 50% ............................... 12
Hình 1.5: Quang phổ huỳnh quang của donor và acceptor và dung dịch hỗn hợp của donor và
acceptor ..................................................................................................................................... 13
Hình 1.6: Mô hình cơ chế hoạt động của biosensor DNA nano QDs (a,b) .............................. 15
Hình 1.7: Sơ đồ cảm biến FRET cơ bản để phát hiện các protease hoạt động ........................ 16
Hình 2.1: Máy đo phổ hấp thụ Shimazu UV2600 .................................................................... 18
Hình 2.2: Sơ đồ nguyên lý của hệ đo hấp thụ quang học UV-VIS-NIR .................................. 18
Hình 2. 3: Sơ đồ nguyên lý của máy phổ kế huỳnh quang Cary Eclipse ................................. 20
Hình 2.4: (a) Phép đo thời gian sống theo phương pháp miền thời gian;
(b) Phép đo thời gian sống theo phương pháp miền tần số ...................................................... 22
Hình 2.5: Nguyên lý tổng quát của kỹ thuật TCSPC: một photon tín hiệu được ghi nhận tại
mỗi chu kỳ xung kích thích, nhớ vào các cột thời gian (bin time), dựng lại biểu đồ tín hiệu
theo thời gian (histogram) sẽ cho profile cường độ [17] ............................................................ 24
Hình 2.6: Sơ đồ tổng quát của hệ TCSPC ................................................................................ 25
Hình 3.1: Ảnh HRTEM của AuNPs ......................................................................................... 28
Hình 3.2: Phổ hấp thụ của hạt AuNPs trong ............................................................................ 28
Hình 3.3: Phổ PL của các mẫu AuNPs/Rh6G, kích thích = 488nm. .......................................... 30
Hình 3.4. Hiệu suất FRET phụ thuộc vào tỉ lệ N giữa Acceptor và Donor (tam giác đỏ), so
sánh với lý thuyết Förster tại tỉ lệ R/Ro = 0.92 (Đường màu xanh dương) .............................. 30
Hình 3.5: Đường cong suy giảm huỳnh quang của Rh6G ........................................................ 32
Hình 3.6: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của các mẫu Rh6G:CdSe/ZnS với tỉ lệ khác nhau
.................................................................................................................................................. 34
Hình 3.7: Phổ huỳnh quang phân giải thời gian của các mẫu Rh6G:CdSe/ZnS với tỉ lệ thành
phần khác nhau đo tại đỉnh phát xạ 563 nm với bước sóng kích thích 405 nm ....................... 35
v
MỞ ĐẦU
Truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang hay truyền năng lượng cộng
hưởng Förster được đặt tên của nhà khoa học Theodor Förster - người đã tìm ra hiệu
ứng truyền năng lượng giữa hai chất màu hữu cơ, chất huỳnh quang [1]. Trong một thời
gian dài, mục tiêu chính của phương pháp dựa vào FRET là xác định khoảng cách giữa
các phân tử tương tác bằng cách xác định sự thay đổi cường độ huỳnh quang của chất
cho (donor) hoặc chất nhận (acceptor), từ đó xác định hàm lượng thành phần của
donor-acceptor [2,5]. Sau này với sự phát triển của khoa học kỹ thuật đặc biệt là kỹ
thuật đo thời gian sống huỳnh quang, ảnh thời gian sống huỳnh quang, FRET trở thành
công cụ nghiên cứu cấu trúc, tương tác giữa các phân tử trong tế bào. FRET là nguyên
nhân gây ra sự dập tắt huỳnh quang của donor nhưng phần lớn năng lượng phát xạ bởi
acceptor. FRET có các thuộc tính của truyền năng lượng và dập tắt cơ học [4]. Khi hiệu
ứng FRET xảy ra, acceptor với một tập hợp các mức năng lượng quỹ đạo gần hoặc
thấp hơn mức kích thích của donor, có nghĩa là phổ phát xạ của donor phải chồng chập
lên phổ hấp thụ của acceptor, quá trình truyền năng lượng có thể đo được thông qua
thời gian sống huỳnh quang. Xác định FRET qua thời gian sống huỳnh quang có một
số ưu điểm so với phương pháp xác định cường độ phổ đồng thời tránh được trường
hợp không phải FRET (quá trình tái hấp thụ). Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình
bày kết qủa nghiên cứu truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang là cặp donor-
acceptor là: chất màu Rhodamin 6G và hạt nano vàng; Rhodamin 6G và chấm lượng
tử CdSe/ZnS trong môi trường dung môi nước.
Luận văn với tiêu đề: “Ứng dụng phương pháp quang phổ phân giải thời gian
nghiên cứu quá trình truyền năng lượng cộng hưởng”. Ngoài phần mở đầu, kết luận
được chia làm 3 chương:
− Chương 1: Tổng quan tìm hiểu tài liệu về FRET, ứng dụng FRET: trình bày
lich sử phát triển nghiên cứu FRET, lý thuyết FRET và một số ứng dụng của
nó.
1
− Chương 2: Kỹ thuật thực nghiệm: Chuẩn bị mẫu đo, các phương pháp thực
nghiệm được sử dụng trong luận văn như đo phổ hấp thụ, phổ huỳnh quang,
thời gian sống huỳnh quang
− Chương 3. Trình bày các kết quả truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh
quang của 2 cặp donor-acceptor là: chất màu Rhodamin 6G và hạt nano vàng;
Rhodamin 6G và chấm lượng tử CdSe/ZnS trong môi trường dung môi nước.
2
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1.Vật liệu nano và ứng dụng
Vật liệu nano là loại vật liệu được đặc biệt chú ý nghiên cứu trên thế giới và tại
Việt Nam trong hơn mười năm trở lại đây. Hiện nay công nghệ nano đã và đang dần đi
vào cuộc sống, nhiều ngành, nhiều lĩnh vực sử dụng công nghệ nano tạo ra ứng dụng
có tính đột biến lớn. Công nghệ và Vật liệu nano cũng là hướng nghiêu cứu ưu tiên
trong định hướng phát triển khoa học công nghệ của Đảng và Nhà Nước ta trong thời
gian tới. Về bản chất vật liệu nano là loại vật liệu làm việc ở cấp độ nguyên tử phân tử
nên nó có nhiều tính chất khác biệt so với vật liệu ở dạng khối. Vật liệu nano cho thấy
khả năng ứng dụng rất phong phú và đa dạng, vật liệu nano có thể thay thế các loại vật
liệu truyền thống hoặc sử dụng tính chất mới của vật liệu nano để tạo ra ứng dụng mới.
Với ưu điểm là kích thước rất bé (1-100nm) vật liệu nano có thể dễ dàng xâm
nhập vào các tế bào sống. Đây chính là chìa khoá để mở ra khả năng ứng dụng to lớn
trong lĩnh vực y-sinh học. Vật liệu nano có thể kết hợp với các chất hợp sinh để đưa
vào trong cơ thể, tế bào sống mà không bị đào thải và bám vào tế bào đích. Đây chính
là nguyên lý ứng dụng hạt nano đánh dấu nhận biết các tế bào bị bệnh nhằm chẩn đoán
và điều trị, nhằm giảm thiểu các hiệu ứng phụ so với những phương pháp truyền
thống. Cũng với tính chất này, vật liệu nano còn được sử dụng để dẫn truyền thuốc tới
tận các tế bào bệnh, ức chế hoặc tiêu diệt các tế bào. Nhiều phương pháp điều trị bệnh
được xây dựng trên cơ sở sử dụng vật liệu nano như liệu pháp hoá trị (chemotherapy):
chế tạo các hệ thống mang thuốc nano hướng đích làm tăng hiệu quả của thuốc và
giảm các tác dụng phụ; liệu pháp nhiệt trị (thermal therapy): sử dụng nguyên tắc đốt
nội với các nguồn nhiệt là các hạt từ, hạt kim loại kích thước bé hơn tế bào để bóc tách
hoặc diệt tế bào ung thư; liệu pháp thực khuẩn thể (phage therapy) là phương pháp sử
dụng các thực khuẩn thể đặc hiệu gắn với các hạt mang thuốc… Ngoài ra, tính chất
quang của các hạt nano như chấm lượng tử, hạt nano vàng, các hạt nano silica chứa
tâm màu hữu cơ và các hạt nano đất hiếm được sử dụng để đánh dấu, làm tăng độ
tương phản ảnh, tăng độ nhạy cũng như độ chính xác của phép chuẩn đoán hình ảnh.
3
Tại Việt Nam nghiên cứu về vật liệu nano đã được thực hiện gần hai chục năm qua,
hàng ngàn dự án, đề tài khoa học các cấp đã được thực hiện, chúng ta đã thu được
nhiều kết quả khoa học đáng khích lệ, nhiều công trình khoa học đã được công bố,
nhiều kết quả đã được đưa vào ứng dụng trong thực tế …bên cạnh những tính chất,
thông số, đặc trưng vật lý của đơn hạt nano ở trạng thái dừng (steady state) của vật liệu
nano được tập trung nghiên cứu thời gian gần đây, một tính chất khác của vật liệu
nano là tính chất động học – tính chất của vật liệu khi có tương tác với môi trường bên
ngoài ít được chú ý vì ở Việt Nam chúng ta chưa có đầy đủ phương tiện, máy móc để
thực hiện các nghiên cứu này. Gần đây tại viện Vật lý Viện Hàn lâm Khoa Học Công
Nghệ Việt Nam đã phát triển được một số thiết bị cho phép xác định được một số đặc
tính động học của vật liệu nano.
Vật liệu nano có triển vọng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Chẳng hạn, ống
nano cacbon, dây nano silic đóng vai trò quan trọng trong việc chế tạo các linh kiện
điện tử, cũng như các chuyển mạch quang... Các vật liệu gốm trên cơ sở tinh thể nano
Si3N4, SiC... có độ cứng siêu cao, ít bị mài mòn, được dùng trong cơ khí để chế tạo
mũi khoan, dao cắt gọt, các ổ bi.... Vật liệu TiO2 anatase với kích thước cỡ nano mét
cho thấy chúng là một chất xúc tác quang điện hóa mạnh, mở ra một khả năng ứng
dụng làm vật liệu xúc tác, làm sạch môi trường: kính được phủ hạt tinh thể nano TiO2
sẽ không dính ướt; các loại sơn có pha hạt nano TiO2 sẽ có độ bám dính rất cao, làm
cho lớp sơn bền lâu và không bám bụi... Các hạt nano từ: Fe2O3, Fe3O4... được sử dụng
để đốt các tế bào ung thư bằng từ trường ngoài mà không ảnh hưởng đến các tế bào
bình thường.
Các hạt kim loại có cấu trúc nano cũng là một hướng tiếp cận trong các nghiên
cứu khoa học–công nghệ nano. Ở đây, tính chất hấp thụ cộng hưởng plasmon bề mặt
liên quan tới hệ điện tử tự do đặc biệt có ý nghĩa quan trọng. Gần đây, hai loại hạt
nano kim loại được quan tâm nghiên cứu nhiều là vàng (Au) và bạc (Ag). Vàng kích
thước nano (khoảng một vài chục nm) có plasmon bề mặt cộng hưởng ở khoảng 530
nm. Quá trình biến đổi photon–plasmon–photon (vùng phổ cộng hưởng ~530 nm) cho
phép tiếp cận trực tiếp lĩnh vực nano–photonics, tận dụng được các ưu thế "nhanh" của
quang tử (photonics) và "kích thước nano" của điện tử. Plasmon bề mặt trong các hạt
vàng còn được sử dụng để truyền năng lượng ánh sáng cho các tế bào, protein được
4
đánh dấu riêng, nhằm có được sự đốt nóng chọn lọc trong điều trị định vị các mô ung
thư. Các hạt nano bán dẫn (CdS, CdSe, CuInS2...) được sử dụng trong đánh dấu sinh
học, phát hiện các phân tử DNA, phát hiện ung thư, virút hay các ứng dụng trong pin
mặt trời, chiếu sáng rắn... [6]
1.2. Hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET)
1.2.1. Khái niệm.
Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (Fluorescence
Resonance Energy Transfer - FRET ) là một cơ chế truyền năng lượng xảy ra ở cấp độ
nano thông qua tương tác lưỡng cực – lưỡng cực, đây là một hiện tượng vật lý quan
trọng với nhiều lĩnh vực tiềm năng trong lĩnh vực quang điện tử và rất nhiều lĩnh vực
khác. FRET được đưa ra từ thập kỷ 50 của thế kỷ trước, hiện nay đang được ứng dụng
rộng rãi trên nhiều lĩnh vực đặc biệt trong nghiên cứu y sinh học [7,8]. FRET là hiệu
ứng phụ thuộc vào khoảng cách truyền năng lượng từ một chất cho huỳnh quang
(donor) tới một acceptor huỳnh quang (acceptor) phù hợp, là một trong số ít các công
cụ có sẵn để đo khoảng cách nanomet và xác định những thay đổi trong khoảng cách
cả trong in vitro lẫn trong cơ thể. Do có độ nhạy với khoảng cách cao, nên hiệu ứng
FRET đã được sử dụng để nghiên cứu động học, tương tác nguyên tử. [9,10,13]
Cơ chế truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang liên quan đến các chất phát
huỳnh quang mà ở đây là điện tử ở trạng thái kích thích, một phân tử huỳnh quang có
thể truyền năng lượng kích thích của nó cho một acceptor không phát xạ gần đó thông
qua các tương tác lưỡng cực-lưỡng cực tầm xa. Lý thuyết truyền năng lượng được dựa
trên khái niệm về một chất huỳnh quang kích thích như một dao động lưỡng cực có thể
trải qua sự trao đổi năng lượng với một lưỡng cực thứ hai có tần số cộng hưởng tương
tự. Vấn đề này, truyền năng lượng cộng hưởng tương tự như sự dao động cùng tần số.
Ngược lại, năng lượng bức xạ yêu cầu phát xạ và tái hấp thụ một photon phụ thuộc vào
kích thước vật lý và tính chất quang học của mẫu vật, cũng như hình dạng của bề mặt
và quãng đường truyền sóng. Không giống như các cơ chế bức xạ, truyền năng lượng
cộng hưởng có thể mang lại một lượng đáng kể thông tin về cấu trúc liên quan đến các
acceptor.[9,10,12]
5
Một cặp phân tử tương tác với nhau thông qua hiệu ứng FRET được gọi là một
cặp donor- acceptor. Hiện tượng FRET không qua trung gian là quá trình phát xạ
photon. Ngoài ra, nó thậm chí không yêu cầu chất màu nhận được phát huỳnh quang.
Mặc dù trong hầu hết các ứng dụng, các donor và acceptor đều có khả năng phát
huỳnh quang. [13,14]
Tóm lại, FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer - FRET ) hay còn gọi
là hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang. Ở đây truyền năng lượng
cộng hưởng (RET) còn gọi là truyền năng lượng cộng hưởng điện tử (electronic
energy tranfer – EET).
Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) là cơ chế mà
trong đó một hạt nano có thể truyền năng lượng kích thích không bức xạ của nó cho
một hạt nano độc lập khác ở một khoảng cách ngắn (khoảng cách nguyên tử).
Phát xạ
FRET
Donor
Accrptor
Hấp thụ
Huỳnh quang chất cho
Hấp thụ chấp nhận
Hình 1.1: Mô hình hiệu ứng FRET
Một cặp nguyên tử tạo ra một điện trường do sự tương tác lưỡng cực. Đầu tiên
sự hấp thụ ánh sáng xảy ra ở nguyên tử cho (donor molecule), bắt đầu bị kích thích.
Trước khi donor có thể phát huỳnh quang và quay trở lại trạng thái ban đầu, nó đang ở
trạng thái kích thích nên truyền năng lượng cho nguyên tử nhận (acceptor molecule)
gần nhất có trạng thái năng lượng kích thích thấp nhất qua sự trao đổi của một photon
ảo. Nguyên tử cho (the donor) trở về trạng thái cơ bản còn nguyên tử nhận trở lên
trạng thái kích thích.[9,15,16]
Kết quả cuối cùng là nguyên tử nhận bắt đầu chuyển lên trạng thái kích thích
nhờ vào quá trình gián tiếp nhận photon ảo, mặt khác đây cũng là hiện tượng xảy ra rất
tự nhiên [12]. FRET là một hiện tượng tự nhiên đầy lý thú bởi vì nó không phụ thuộc
vào sự tiếp xúc vật lý cũng như truyền điện tử.
6
1.2.2. Lịch sử phát triển FRET [11]
Mặc dù các ứng dụng thực tế của FRET chỉ diễn ra sau năm 1950 nhưng quan
sát hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang được thực hiện từ thực
nghiệm năm 1900 và các nhà khoa học luôn tìm mọi cách để giải thích hiện tượng này.
Bắt đầu với lý thuyết về sóng điện từ (EM) và quang phổ, đồng thời với sự ra đời của
cơ học lượng tử (QM). Những lý thuyết này rất cần thiết cho quan sát và giải thích
đúng về việc truyền năng lượng không bức xạ. Khái niệm EM đưa ra chỉ vài thập kỷ
trước khi quan sát được truyền năng lượng. Lý thuyết đầu tiên cố gắng giải thích
FRET là sử dụng lý thuyết EM cổ điển này. Lý thuyết cơ học lượng tử đầu tiên của
FRET đã được phát triển đồng thời với lý thuyết mới của Heisenberg, Schrodinger và
Dirac (Heisenberg, 1925; Dirac, 1926; Schrodinger, 1926).
Thí nghiệm đầu tiên ghi lại các phép đo truyền năng lượng huỳnh quang cộng
hưởng (quan sát phát xạ của nguyên tử donor) được Carlo và Franck thực hiện trên
khoảng cách lớn hơn bán kính va chạm đã được thực hiện vào năm 1922. Carlo quan
sát phát xạ từ Tali trong một hỗn hợp hơi thủy ngân và Tali, khi hỗn hợp hơi bị kích
thích bởi bước sóng 253,6 nm, Bước sóng này chỉ có thể kích thích các nguyên tử thủy
ngân nhưng lại thu được huỳnh quang của Tali. Huỳnh quang của Tali được gọi là
“huỳnh quang cảm ứng” (sensitized fluorescence) nó quan sát được vì năng lượng từ
các nguyên tử thủy ngân bị kích thích đã truyền cho nguyên tử tali.
Các thí nghiệm tiếp theo của các tác giả khác thấy huỳnh quang cảm ứng xẩy ra
với hơi của các kim loại kiềm như: bạc, cadmium, chì, kẽm và indi với sự có mặt của
hơi thủy ngân. Tầm quan trọng của sự cộng hưởng giữa năng lượng mức giữa các mức
năng lượng của nguyên tử nhạy cảm đã được minh chứng rõ ràng bởi các thí nghiệm
sau nay của Beuler và Josephi (1927-1929), cường độ huỳnh quang tăng với sự tham
gia của hai loại nguyên tử. Điều này phù hợp với nguyên lý Franck (1922): năng lượng
điện tử của một nguyên kích thích không thể chuyển trực tiếp thành động năng của hạt
va chạm. Nếu năng lượng kích thích đã chuyển thành nội năng dập tắt thì sẽ có những
trạng thái kích thích với năng lượng được tăng cường
Cơ học lượng tử và lý thuyết truyền năng lượng [9,10]
Lý thuyết cơ học lượng tử để giải thích sự truyền năng giữa các nguyên tử ở
khoảng cách xa hơn so với bán kính va chạm đã được đề xuất bởi Kallmann và
7
London (1928). Lý thuyết này giả thiết có sự cộng hưởng giữa các mức năng lượng
của các nguyên tử tương tác. Về cơ bản đây là phép tính nhiễu loạn bậc hai để tính
toán năng lượng tương tác. Họ tìm ra rằng chuyển dời giữa các mức năng lượng là các
chuyển dời dipole, tiết diện hiệu dụng q của 2 nguyên tử tương tác tăng -2/3 ( là sự
sai khác mức năng lượng kích thích) khi →0 tiết diện hiệu dụng tiến tới giá trị lớn
hơn bán kính tán xạ. Đây là cơ sở lý thuyết FRET cơ học lượng tử sau này, tương tự
như mô tả của lực London-van der Waals.
Lực London - Van Der Waals) và tương tác Debye-Keesom
Ý tưởng lưỡng cực-lưỡng cực (Dipole-Dipole) tương tác ở khoảng cách giữa
các nguyên tử và phân tử đang được London áp dụng giải thích tương tác phân tử
Vander Waals và truyền năng lượng. Trước đó tương tác này cũng đã được Keesom
(1912); Debye (1920-1921) sử dụng giải thích các tương tác giữa các phân tử có mối
liên hệ giữa phân tử của London và FRET. Sự khác nhau chính ở đây là năng lượng
tương tác của lực Vander Waals và tốc độ thay đổi năng lượng của FRET. Trong
tương tác Vander Waals cả hai phân tử tương tác ở trạng thái cơ bản còn trong FRET
một trong hai phân tử tương tác ở trạng thái kích thích. Biểu thức lực London tương
tác giữa hai nguyên tử liên quan đến cường độ dao động UV-Vis của chuyển dời
quang học tương ứng, giống như FRET (Förster, 1951). Biểu thức đầy đủ cho tương
tác London tổng của các chuyển dời quang học của hai nguyên tử tương tác. Nếu cả
hai nguyên tử đều ở trạng thái cơ bản, lực London luôn là lực hút, hơn nữa, nếu các
nguyên tử tương tác không phải là hình cầu đối xứng có phân cực đẳng hướng, định
hướng tương đối của chúng sẽ ảnh hưởng đến sự tương tác (giống như sự phụ thuộc
định hướng của FRET). Tương tác van der Waals đơn giản (không tính đến thế năng
liên quan đến hiệu ứng Casmir theo lý thuyết của London giảm theo R6, trong đó R là
khoảng cách giữa các nguyên tử; điều này cũng giống nhau khoảng cách phụ thuộc
như FRET giữa hai phân tử huỳnh quang.
Lý thuyết của J. Perrin và F. Perrin
Mô hình J. Perrin (1925): Ông giả thuyết rằng việc truyền năng lượng kích
thích có thể nhảy từ một phân tử tới một phân tử khác thông qua tương tác giữa các
dao động lưỡng cực của các phân tử gần nhau. Theo lý thuyết cổ điển một phân tử kích
thích sẽ dao động ở tần số tương ứng với cường độ của năng lượng kích thích
8
Eexit= h, là sự sai khác giữa hai mức năng lượng. Các phân tử tương tác như trường
dipole điện Hertzian (1888);
Dipole Hertzian dao động như là một dipole tĩnh. Perrin giả định rằng nếu các
phân tử được phân cách bởi khoảng cách đủ nhỏ, năng lượng có thể được chuyển cho
phân tử acceptor không phát xạ. Ông gọi đây là ''transfert d'activation''.
Mô hình F. Perrin
F. Perrin (con trai của J. Perrin) là một trong những người tiên phong về huỳnh
quang (1929), Ông mở rộng J. Perrin lý thuyết truyền giao năng lượng bằng cách phát
triển một mô hình cơ học lượng tử (Perrin, 1932; Perrin, 1933). Tuy nhiên, ông kết
luận, cũng như J. Perrin, rằng tốc độ truyền tỷ lệ thuận với 1/R3; điều này dẫn đến việc
truyền năng lượng ở khoảng cách dài hơn đã được tìm thấy bằng thực nghiệm. F.
Perrin cũng xem xét tới va chạm giữa các phân tử huỳnh quang và các phân tử dung
môi, cũng như hiệu ứng Doppler (Perrin, 1932; Perrin, 1933). Những va chạm này mở
rộng phổ sự hấp thụ và phát xạ của các phân tử, vốn J. Perrin giả thiết là hẹp để đảm
bảo hiệu suất tương tác. Các hiệu ứng va chạm và Doppler như vậy là chủ đề của
nhiều nghiên cứu quang phổ trong hai thập kỷ đầu của thế kỷ 19 và cũng đã được
Kallmann và London nghiên cứu ở pha hơi. Các mở rộng quang phổ là quan trọng vì
lý do sau đây. Năng lượng bị mất bởi donor chính xác bằng năng lượng thu được của
acceptor. Mỗi phân tử chỉ có một xác suất va chạm nhất định. Điều này làm giảm khả
năng cộng hưởng, bởi vì phải có hai lưỡng cực tương tác để có quá trình truyền năng
lượng. F. Perrin đã sử dụng lý thuyết phổ va chạm mở rộng cho truyền năng lượng ở
khoảng cách mới giảm xuống còn khoảng [(/ 2) (t/)]1/6 trong đó t là thời gian giữ
hai lần va chạm; là thời gian sống huỳnh quang
Lý thuyết của Förster's.
Trên cở sở các công trình của các nhà khoa học tiền bối Theodor Förster đã
phát triển lý thuyết truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang xuất bản và công bố
qua hàng loạt công bố từ 1946-1951.
1.2.3. Cơ sở lý thuyết của hiệu ứng FRET.[9,12]
Sự kích thích trên một ion có thể lan truyền sang một ion cùng loại khác sang một
trạng thái cơ bản là một kết quả của sự truyền năng lượng cộng hưởng (FRET) khi
chúng được định xứ gần nhau. Khoảng cách giữa các ion mà tại đó xác suất của quá
9
trình huỳnh quang và năng lượng trở nên cạnh tranh nhau là cỡ vài Angstrom. Sơ đồ
của quá trình truyền năng lượnđg cộng hưởng mô tả như hình dưới:
Hình 1.2: Giản đồ Jablonski mô tả hiệu ứng FRET
Trong quá trình truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang, phân tử huỳnh
quang donor hấp thụ năng lượng tưng ánh sáng tới chuyển lên trạng thái kích thích.[9]
Năng lượng kích thích này truyền cho phân tử huỳnh quang acceptor lân cận. Quá
trình truyền năng lượng này tự nó sẽ làm giảm huỳnh quang của donor (dập tắt) và
tăng cường độ huỳnh quang acceptor đồng thời giảm thời gian sống huỳnh quang
donor
D + h → D*+
D* + A → D +A*
A* →A + h’
D: donor; A: acceptor; dấu “*” kí hiệu trạng thái kích thích
Một số điều kiện cần phải được thỏa mãn để cho FRET xảy ra đó là:
(i) Phổ phát xạ huỳnh quang của các phân tử donor phải chồng lên phổ hấp
thụ hoặc kích thích của chất màu nhận. Mức độ chồng chập lên nhau được gọi là phổ
chồng lên nhau tích hợp (J).
(ii) Donor phải có cường độ huỳnh quang mạnh.
(iii) Hai chất này (donor và acceptor) phải ở khoảng cách gần nhau (thường 1
đến 10 nanomet).
10
(iv) Các lượng cực điện (dipole) của các donor và acceptor phải gần như
song song với nhau.
(v) Thời gian sống huỳnh quang của các phân tử các donor phải có khoảng
thời gian đủ để cho hiệu ứng FRET xảy ra.
ộ đ g n ờ ư C
Bước sóng (nanomet)
Hình 1.3: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất Donor và Acceptor
Hình 1.3. Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất Donor và
Acceptor. Khu vực màu đậm là sự chồng quang phổ gữa quang phổ huỳnh quang của
các donor và phổ hấp thụ của acceptor.[9]
Hiệu suất truyền năng lượng FRET tỉ lệ với nghịch đảo mũ 6 khoảng cách
donor-acceptor
(1.1)
Trong đó R0 là bán kính Förster – là khoảng cách mà ở đó năng lượng
truyền được 50%.
11
g n ă n n ề y u r t t ấ u s u ệ i H
Khoảng cách (Angstorm)
Hình 1.4: Hiệu suất truyền năng lượng FRET được vẽ như hàm khoảng
cách cặp donor-acceptor, khoảng cách R0 là khoảng cách mà hiệu suất truyền băng 50%
(1.2)
Bán kính Förster R0 phụ thuộc vào hiệu suất lượng tử huỳnh quang của donor
(D) khi không có mặt acceptor (fd), chiết suất của dung môi (η), góc định hướng
lưỡng cực của phân tử (K2 ) và sự chồng chập phổ của donor-acceptor (J)
(1.3)
Hiệu suất truyền năng lượng cũng có thể xác định thông qua cường độ huỳnh
quang theo biểu thức:
(1.4)
Trong đó FD là cường độ huỳnh quang của donor; FDA cường độ huỳnh quang
của donor khi có mặt acceptor
Hiệu suất truyền năng lượng cũng có thể xác định thông qua thời gian sống
huỳnh quang theo biểu thức
(1.5)
12
Trong đó DA là thời gian sống huỳnh quang của donor khi có mặt acceptor; D
là thời gian sống huỳnh quang của donor khi không có mặt acceptor
Tóm lại, tỷ lệ FRET phụ thuộc vào mức độ chồng chập quang phổ giữa các cặp
cho – acceptor (hình 1.3), hiệu suất lượng tử của các chất cho, định hướng tương đối
của các donor– acceptor, những khoảng cách chuyển tiếp lưỡng cực và khoảng cách từ
các donor tới acceptor. Bất kỳ quá trình nào có ảnh hưởng đến khoảng cách giữa các
cặp chất cho- acceptor cũng sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất của FRET.
Phát hiện hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET):
Việc phát hiện và định lượng hiệu ứng FRET có thể được thực hiện trong một
số cách khác nhau. Đơn giản chỉ cần hiện tượng này có thể được quan sát bởi một mẫu
vật có chứa cả các donor và các phân tử acceptor với ánh sáng phát ra ở các bước sóng
trung tâm gần với phát xạ. Bởi vì FRET có thể dẫn đến giảm cường độ huỳnh quang
của các phân tử donor cũng như tăng cường độ huỳnh quang của acceptor, nên khi xác
định tỷ lệ số liệu của hai tín hiệu có thể phát hiện được hiệu ứng FRET có xảy ra hay
không [12].
Ưu điểm của phương pháp này là một thước đo của sự tương tác có thể được
thực hiện là độc lập với nồng độ tuyệt đối của cảm biến. Bởi vì không phải tất cả các
gốc acceptor đều phát huỳnh quang, nên chúng có thể được sử dụng như một phương
tiện để dập tắt huỳnh quang. Trong trường hợp này, những tương tác mà kết quả trong
một phân tử các chất huỳnh quang cho đến gần phân tử như vậy sẽ dẫn đến một sự mất
mát tín hiệu.
ộ đ g n ờ ư C
Khoảng cách (Angstorm)
Hình 1.5: Quang phổ huỳnh quang của donor và acceptor và dung dịch hỗn hợp của donor và acceptor
13
Trong Hình 1.5, huỳnh quang của acceptor tăng gần sáu lần khi có sự hiện diện
của chất cho. Trong trường hợp, như huỳnh quang các donor trở thành 1/3 huỳnh
quang các chất cho. Sự thay đổi cường độ huỳnh quang là bằng chứng hình ảnh rõ
ràng của FRET. Các quang phổ huỳnh quang đã được ghi nhận là sự phát huỳnh quang
của donorvà nhận. Đây là hiệu ứng FRET sử dụng các chất 3-octadecyl-2[3-octadecyl-
2(3H)-benzothizolidene) metyl] benzoth) metyl] benzothiazolium perchlorate (chất
cho), Octadecyl rhodamine B (acceptor).
1.2.4. Ứng dụng hiệu ứng FRET và chấm lượng tử làm nanosensor
Nanosensor là cảm biến được xây dựng ở cấp độ nano, với mục đích chủ yếu là
để thu thập số liệu về quy mô nguyên tử và chuyển nó thành dữ liệu có thể dễ dàng
phân tích. Các cảm biến này cũng có thể được định nghĩa là “Một cảm biến hóa học,
cảm biến vật lý, cảm biến sinh học sử dụng các thành phần có kích thước nano, thông
thường là từ kích thước micromet tới nanomet”. Những cảm biến này có độ nhạy cực
kỳ cao và có thể phát hiện các hạt đơn lẻ hoặc thậm chí nồng độ cực thấp dư lượng
một chất nguy hiểm tiềm tàng còn sót lại. Vì hiện nay công nghệ này đã và đang được
nghiên cứu ở rất nhiều hướng khác nhau nên rất khó để có thể cho một định nghĩa duy
nhất về những gì chính xác là một nanosensor.[12]
• Nanosensor xác định DNA
Cũng như nguyên lý của hiệu ứng FRET, các nhà khoa học đang trong giai
đoạn tạo ra loại sensor DNA nano bằng việc sử dụng Qds để xác định các DNA. Trong
kỹ thuật này, các phát minh đã sử dụng QDs là chất CdSe-ZnS được chế tạo bằng kỹ
thuật lõi-vỏ làm donor. Trên bề mặt của chấm lượng tử được biến tính hoạt hóa bằng
chất Streptavisin. Tiếp theo cho chất huỳnh quang Cy5.5 và Biotin tác dụng với chất
Oligonucleotit tạo thành hai tác nhân hoạt hóa với vai trò khác nhau: tác nhân thông
tin (Reporter probe) và tác nhân liên kết (Capture probe). Hai nhóm phân tử chức năng
này liên kết với phân tử DNA cần xác định (mục đích DNA). Cụm phân tử hai chức
năng thông tin và kết hợp có chứa DNA, liên kết với QDs đã biến tính (Steptavidin
Conjugated QDs), tạo thành biosensor DNA nano. Biosenssor DNA nano này có nhóm
biotin kết hợp với chất Steptavidin trên bề mặt QDs. Nhờ vậy hiệu ứng FRET được
14
phát huy. Bằng phương pháp này, ta có thể kiểm chứng được DNA nhanh và độ chính
xác cao[12,13,14]. Hình 1.6 là mô hình cơ chế hoạt động của biosensor DNA nano.
Hình 1.6: Mô hình cơ chế hoạt động của biosensor DNA nano QDs (a,b)
và hiệu ứng kiểm tra (c).
Nhìn chung, biosensor nano hiệu ứng FRET dùng chất phát huỳnh quang QDs
có nhiều ưu điểm so với huỳnh quang hữu cơ. Vì vậy nhiều loại biosensor để xác định
ảnh invivo được nghiên cứu chế tạo.
• Sử dụng nanosensor trong nghiên cứu Enzim
Giáo sư Gae Baik Kim và Young-Pil Kim cùng các cộng sự taị đại học
Hanyang Hàn Quốc cũng nghiên cứu và phát triển phép phân tích Enzim Protease
bằng nanosensor sử dụng chấm lượng tử có hiệu ứng FRET. Nghiên cứu này cho thấy
việc phát triển hoạt động của protease dựa trên sự truyền năng lượng của các chấm
lượng tử. Bằng cách kết hợp một số loại protease vào thiết kế của dạng QDs có cấu
trúc truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) và truyền năng lượng cộng
hưởng phát quang sinh học (BRET), hoạt động của protease dẫn đến những thay đổi
trong hiệu suất truyền năng lượng. Đặc biệt là do đặc tính vượt trội của QDs, nó có thể
15
được xem như là một tác nhân nhận biết protease với độ nhạy cao. Người ta dự đoán
rằng QDs dựa trên FRET/BRET như một đầu dò sẽ có một tiềm năng lớn trong việc
phân tích vai trò cơ bản của protease và có khả năng chế tạo loại thuốc ức chế protease
như thuốc điều trị sinh học dạng nano [12,13,14].
FRET là kỹ thuật phổ biến nhất được sử dụng trong các ứng dụng cảm biến
sinh-hóa hiện nay bởi độ nhạy cao, khả năng phục hồi trạng thái tốt, và khả năng quan
sát trong thời gian thực. Phương pháp thông thường để phát hiện để phát hiện hoạt
động protein được dựa trên phát huỳnh quang với các liên kết peptide hữu cơ. Ví dụ
cho hoạt động protease là đầu dò tự động, đầu dò mang màu kép, và đầu dò dựa trên
các photon hiệu ứng FRET, như mô tả hình 1.7.
Tuy nhiên, việc phát huỳnh quang hữu cơ thường gặp một vài vấn đề chẳng hạn
như hình ảnh bị tẩy trắng, độ nhạy ảnh hưởng bởi môi trường, khó khăn trong việc
phân tích tổ hợp donor và acceptor. Như đã nói trên, những vấn đề trong các nghiên
cứu về FRET có thể được khắc phục khi có phổ huỳnh quang thích hợp hoặc dập tắt
được sử dụng thích hợp với chấm lượng tử (QDs).(hình 1.7). Từ QDs có dải hấp thụ
rộng và phổ phát xạ hẹp cũng như sự ổn định quang cao, sẽ có thuận lợi trong việc
theo dõi lâu dại và cho phép phát hiện, QDs thường được sử dụng như các donor trong
khi các phân tử nhận năng lượng huỳnh quang (chất dập tắt) thường là một peptide
được biến tính thích hợp [12-13-14].
Hình 1.7: Sơ đồ cảm biến FRET cơ bản để phát hiện các protease hoạt động
(A) Quá trình FRET thông thường (B) FRET sử dụng QDs. D và A là chất cho và
nhận tương ứng
16
Chương 2
KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM
2.1. Kỹ thuật đo hấp thụ
Phổ hấp thụ là một công cụ hữu ích trong việc nghiên cứu sự tương tác của vật
liệu với ánh sáng chiếu vào, qua đó, có thể biết được thông tin về các quá trình hấp thụ
xảy ra tương ứng với các chuyển dời quang học từ một số trạng thái cơ bản ni đến một
số trạng thái kích thích nj, từ đó có thể xác định được bước sóng kích thích hiệu quả
cho quá trình quang huỳnh quang (j–i) quan tâm. Môi trường vật chất hấp thụ ánh sáng
tuân theo định luật Beer–Lambert:
(2.1)
I (ν) = I0(ν)e – α (ν )d
trong đó: I0(ν) và I(ν) là cường độ ánh sáng tới và cường độ truyền qua mẫu
vật chất, d là độ dày của mẫu và α(ν) là hệ số hấp thụ vật liệu đối với photon có năng
lượng hν (hay hc/λ, với c là vận tốc ánh sáng).
Muốn xác định hệ số hấp thụ α(ν), người ta lấy in hai vế (2.1), được:
(2.2) Ln [I0(ν) /(I (ν)] = α(ν)d𝛼(𝜈)𝑑
Phổ hấp thụ biểu diễn đồ thị hệ số hấp thụ α (hay độ hấp thụ A) theo bước sóng
hay năng lượng của photon đi qua vật chất. Như vậy, hệ số hấp thụ lớn tại một bước
sóng nào đó cho thấy photon có năng lượng tương ứng bị vật chất hấp thụ mạnh, phần
ánh sáng truyền qua có cường độ yếu. Ý nghĩa của hệ số hấp thụ bằng 1 là khi ánh
sáng truyền qua một môi trường có độ dày 1 cm, cường độ sẽ bị suy giảm đi e (~2,7)
lần. Hai đại lượng I0(ν) và I (ν) đo được bằng thực nghiệm.
Phương pháp đo phổ hấp thụ trong từng vùng phổ đòi hỏi nguồn sáng phát xạ liên
tục trong vùng phổ đó, một phổ kế hoặc là máy đơn sắc lựa chọn bước sóng hay tần số,
thiết bị thu tín hiệu để đo sự truyền qua của ánh sáng đơn sắc. Nguồn sáng thường
được sử dụng là đèn hydrogen và deuterium đối với vùng tử ngoại và đèn dây tóc
(volfram+halogen) cho vùng nhìn thấy và vùng hồng ngoại gần. Trong thí nghiệm đo
phổ hấp thụ, chúng tôi dùng đèn halogen phát xạ trong vùng nhìn thấy. Bằng cách ghi
phổ trải trong vùng năng lượng photon rộng, có thể biết được các quá trình hấp thụ xảy
ra tương ứng với các chuyển dời quang học.
17
Nguyên lý hoạt động của hệ đo: Một chùm ánh sáng được phát ra từ nguồn
sáng, là đèn phát sáng trong vùng tử ngoại UV hoặc phát trong vùng nhìn thấy VIS,
được đưa qua hệ máy đơn sắc là hệ lăng kính hoặc cách tử nhiễu xạ, để được tách ra
thành các bước sóng đơn sắc. Mỗi tia sáng đơn sắc này sẽ lần lượt được chia thành hai
tia để so sánh, có cường độ như nhau nhờ một gương phản xạ bán phần. Một trong hai
tia sáng trên truyền qua một cuvet trong suốt bằng thạch anh chứa dung dịch mẫu cần
nghiên cứu, cường độ của tia sáng sau khi truyền qua mẫu là I. Tia sáng còn lại là tia
sáng so sánh truyền qua một cuvet tương tự nhưng chỉ chứa dung môi không chứa
chấm lượng tử, cường độ của nó sau khi truyền qua dung môi là Io. Cường độ của các
tia sáng sau đó được các detector ghi lại và so sánh trực tiếp trong cùng điều kiện đo.
Hình 2.8: Máy đo phổ hấp thụ Shimazu UV2600
Hình 2.9: Sơ đồ nguyên lý của hệ đo hấp thụ quang học UV-VIS-NIR
18
Nếu mẫu không hấp thụ ánh sáng ở một bước sóng đã cho thì I = Io. Tuy nhiên
nếu mẫu hấp thụ ánh sáng thì I < Io. Các phổ có thể được vẽ dưới dạng phổ truyền
qua :
T(ν) = I(ν)/Io(ν) (2.3)
hoặc phổ hấp thụ:
(2.4) A(ν) = log10[Io(ν)/I(ν)].
2.2. Kỹ thuật đo huỳnh quang
Hệ đo phổ huỳnh quang Cary Eclipse phân giải cao được đặt tại Viện Vật Lý,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nguyên tắc hoạt động của phổ kế
Cary Eclipse được cho trên hình 2.2.
Nguyên lý hoạt động của hệ đo: Nguồn kích thích của Cary Eclipse là đèn
Xenon flash có thể phát bước sóng từ 200 đến 1000nm, nguồn sáng từ đèn xenon đi
qua một máy đơn sắc để chọn bước sóng đơn sắc kích thích. Ánh sáng đơn sắc này
được đưa vào buồng mẫu và hội tụ lên mẫu đo. Tín hiệu huỳnh quang phát ra từ mẫu
được hội tụ lên lối vào của máy đơn sắc thứ hai và thu nhận ở lối ra bằng đầu thu
quang điện. Một phần của ánh sáng kích thích được trích ra đưa vào đầu thu quang
điện thứ hai để đồng bộ với tín hiệu thu. Xeno flash hoạt động ở chế độ xung nên Cary
Eclipse còn có thể đo thời gian sống huỳnh quang của mẫu có thời gian sống dài (lân
quang).
19
Máy đơn sắc kích thích hai cách tử
Nguồn sáng đèn Xê-non
R
Cửa sập Kính lọc Tấm chia chùmc Tấm phân cực
Môđun ef - Cell quang học
Máy đơn sắc phát xạ
Buồng đựng mẫu
Hiển thị
Điều khiển máy đơn sắc
Máy tính
Hình 2. 10: Sơ đồ nguyên lý của máy phổ kế huỳnh quang Cary Eclipse
Với cấu hình này Cary Eclipse cho phép đo phổ huỳnh quang, phổ kích thích
huỳnh quang, thời gian sống huỳnh quang và phổ thời gian sống huỳnh quang (với
mẫu có thời gian sống huỳnh quang lớn). Toàn bộ hệ thống được điều khiển bằng phần
mềm chuyên dụng.
2.3. Kỹ thuật đo huỳnh quang phân giải thời gian
2.3.1. Quang phổ phân giải thời gian và thời gian sống phát quang
Trong khi phép đo huỳnh quang trạng thái dừng là đơn giản, phép đo phân giải
thời gian thông thường yêu cầu thiết bị đo đạc phức tạp và tốn kém. Tuy nhiên phép đo
phân giải thời gian cung cấp nhiều thông tin hơn là từ dữ liệu huỳnh quang trạng thái
dừng. Một ví dụ điển hình của phép đo phân giải thời gian cung cấp những thông tin
mà phép đo huỳnh quang trạng thái dừng không thể thực hiện được đó là thống kê
20
phân biệt và quá trình dập tắt động học trạng thái kích thích sử dụng phép đo thời gian
sống. [7]
Thời gian sống hay thời gian suy giảm phát quang là một thông số động học có ý
nghĩa quan trọng. Giả sử một mẫu phát quang được kích thích bằng một xung ánh
sáng, kết quả là có một độ tích lũy ban đầu trên trạng thái kích thích. Độ tích lũy
trên trạng thái kích thích sẽ giảm dần với tốc độ suy giảm :[22]
(2.5)
Với là độ tích lũy trạng thái trên trạng thái kích thích tại thời điểm t,
là tốc độ phát xạ
là tốc độ suy giảm không phát xạ.
Sự phát xạ là ngẫu nhiên và mỗi trạng thái kích thích cho cùng xác suất phát xạ
trong cùng thời gian. Độ tích lũy trạng thái trên trạng thái kích thích do đó giảm dần
theo hàm exponential:
(2.6)
Với là thời gian sống tổng cộng trên trạng thái kích thích.
Trong thực nghiệm, chúng ta không thể quan sát được độ tích lũy trên trạng thái
kích thích nhưng chúng ta có thể quan sát thông qua cường độ phát xạ tương ứng tỷ lệ
với . Bởi vậy phương trình trên có thể viết lại dưới dạng sự phụ thuộc vào thời
gian của cường độ phát xạ :
(2.7)
Trong đó là cường độ phát quang tại thời điểm ban đầu, chúng ta thường
biểu diễn thang cường độ theo thang logarithm cơ số 10, :
21
(2.8)
(a) (b)
Hình 2.11: (a) Phép đo thời gian sống theo phương pháp miền thời gian; (b) Phép đo thời gian sống theo phương pháp miền tần số
Theo đó ta có thể tính được thời gian sống phát quang . Thời gian sống phát
quang được tính tại thời điểm cường độ phát quang cực đại giảm đi e lần ( )
hoặc từ độ dốc của đường thực nghiệm (hình 2.3) theo thang logarithm cơ số 10
(phương trình 2.8). Tuy nhiên thời gian sống phát quang đo được không phải khi nào
cũng có dạng đơn hàm e mũ (single exponential) như phương trình 2.7, nó có thể có
dạng đa hàm e mũ (multi exponential function) hay dưới dạng không phải đơn hàm e
mũ (non-single exponential). Do đó từ giá trị thực nghiệm chúng ta phải đưa ra các giả
thuyết phù hợp và khớp dữ liệu thực nghiệm theo nó.[7]
Thời gian sống là tổng số thời gian trung bình trên trạng thái kích thích sau khi
mẫu được kích thích. Điều này có thể được thấy được bằng cách tính thời gian trung
bình trong trạng thái kích thích. Giá trị này được tính bằng cách lấy trung bình
thời gian qua sự suy giảm cường độ của mẫu:
(2.9)
Phương trình 2.9 cho thấy đối với dạng suy giảm đơn hàm e mũ thì thời gian
trung bình trên trạng thái kích thích bằng thời gian sống:
22
(2.10)
Điều quan trọng cần lưu ý là phương trình 2.10 là không thật sự đúng đối với các
định luật suy giảm phức tạp, chẳng hạn như suy giảm dạng đa hàm e mũ hoặc không
phải dạng đơn hàm e mũ. Sử dụng một định luật được giả định, thời gian sống trung
bình luôn luôn có thể được tính bằng cách sử dụng phương trình 2.9. Tuy nhiên, thời
gian sống này có thể là một hàm phức tạp của các tham số mô tả cường độ suy giảm
thực tế. Một khái niệm quan trọng đó là thời gian sống được hiểu một như một thống
kê trung bình, và sự phát quang ngẫu nhiên thông qua suy giảm độ tích lũy. Đối với
một độ tích lũy lớn trên trạng thái kích thích, không phải tất cả đều có cùng thời gian
sống, một số sẽ phát xạ nhanh hơn và một số sẽ phát xạ chậm hơn thời gian sống trung
bình. Sự phân bố thời gian của photon phát xạ chính là đường suy giảm cường độ phát
quang.
Có hai phương pháp đo huỳnh quang phân giải thời gian đó là phương pháp miền
tần số và phương pháp miền thời gian [7, 17]. Phép đo phân giải thời gian có độ phân
giải cao đang được sử dụng hiện nay tại các phòng thí nghiệm quang phổ hiện đại đó
là kỹ thuật đếm đơn photon tương quan thời gian (time-correlated single photon
counting - TCSPS). Đây cũng chính là kỹ thuật được chúng tôi sử dụng trong nghiên
cứu quang phổ phân giải thời gian của vật liệu cấu trúc nano.
2.3.2. Hệ đo huỳnh quang phân giải thời gian - TCSPC
❖ Cấu tạo và nguyên lý kỹ thuật TCSPC
Trong phép đo huỳnh quang phân giải thời gian, yêu cầu ghi lại sự phụ thuộc vào
thời gian của dạng đường bao (profile) cường độ tín hiệu huỳnh quang khi đối tượng
nghiên cứu được kích thích bởi một xung ngắn của ánh sáng, thường là một xung
laser. Trong khi về nguyên tắc, người ta có thể cố gắng để ghi lại profile đường cong
suy giảm theo thời gian của cường độ tín hiệu bằng các photodiode nhanh hay các đầu
thu nhanh khác (phương pháp lấy mẫu tương tự) cùng với một bộ lấy mẫu tín hiệu và
chuyển đổi tương tự số có tốc độ cao[7, 19]. Tuy nhiên, sự suy giảm để được ghi lại là
rất nhanh, huỳnh quang đặc trưng có thể kéo dài chỉ vài trăm pico giây đến vài chục
nano giây, đây là khó khăn và giới hạn của hệ điện tử thu tín hiệu. Mặt khác, tín hiệu
huỳnh quang có thể rất yếu và không cho phép ghi nhận trực tiếp bằng phương pháp
23
lấy mẫu tương tự. Giải pháp cho những vấn đề này đó là sử dụng kỹ thuật đếm đơn
photon tương quan thời gian (time-correlated single photon counting - TCSPC).
Hình 2.12: Nguyên lý tổng quát của kỹ thuật TCSPC: một photon tín hiệu được ghi nhận tại mỗi chu kỳ xung kích thích, nhớ vào các cột thời gian (bin time), dựng lại biểu đồ tín hiệu theo thời gian (histogram) sẽ cho profile cường độ [17]
Nguyên lý tổng quát của kỹ thuật TCSPC được mô tả trên hình 2.4. Nguyên lý
này dựa trên sự phát xạ của từng photon là phân bố ngẫu nhiên ứng với sự hồi phục
phát xạ của độ tích lũy trên trạng thái kích thích. Trên cơ sở đó, xác định thời gian tới
của một photon tín hiệu trên mỗi chu kỳ xung kích thích, nhớ vào các cột thời gian
(bin time), và xây dựng lại biểu đồ cường độ tín hiệu theo thời gian ta sẽ thu được
profile đường cong suy giảm theo thời gian của cường độ.[7, 19]
Sơ đồ tổng quát hệ TCSPC cho trên hình 2.5, bao gồm một số khối chính:
− Nguồn kích thích: thường sử dụng laser bán dẫn pico độ rộng xung ~ 50 ps; tần
số lặp lại 4 MHz; công suất trung bình 80 W
− Khối đầu thu: Sử dụng nhân quang tấm vi kênh (microchannel plate
photonmultiplier tube MCP - PMT) MCP 3890R-50 của Hamamatsu (Nhật
bản) có thể đo trong vùng bước sonhs 185-900 nm, đáp ứng thời gian ~ 25 ps.
− Khối đếm đơn photon tương quan thời gian: PicoHarp 300 (Picoquant - Đức) có
phân giải thời gian tới 4 ps tích hợp sẵn 2 lối vào CFD START và STOP.
24
Modul nay nhận tín hiệu từ đầu thu MCP, xử lý và đưa vào máy tính thông qua
giao tiếp USB.
− Phần mền thu nhận điều khiển và xủa lý số liệu có thể điều khiển, đặt thông số
Ex.
Ultra short pulse
Sample
laser
Monochrom-
PD or
Stop
CFD
ator or Filter
PMT
pulse
Computer
Reader and
TDC
TTL
communication
card
Start
đo của của hệ đo như bước sóng, thời gian tích phân …
Amp.
CFD
pulse
PMT Em.
Hình 2.13: Sơ đồ tổng quát của hệ TCSPC
Hệ TCSPC hoạt động như sau: Xung laser được qua gương chia, một phần
được dùng kích thích mẫu, một phần dùng làm xung trigger so sánh. Tín hiệu ánh sáng
từ mẫu phát quang được hội tụ và qua filter hoặc qua máy đơn sắc để thu ánh sáng đơn
sắc. Hệ quang học được điều chỉnh phù hợp để tín hiệu ánh sáng tới đầu thu là những
photon đơn lẻ. Tín hiệu đơn photon được chuyển thành xung tín hiệu điện từ đầu thu,
sau đó được khuếch đại qua khối tiền khuếch đại và đến bộ CFD. Toàn bộ hệ quang và
đầu thu phải được đặt trong buồng tối để tránh nhiễu ánh sáng bên ngoài. Bộ CFD cho
phép trigger và lấy mẫu nhanh với độ chính xác và ổn định cao. Xung tín hiệu ra từ
CFD được chuyển thành xung TTL và đến khối TDC với vai trò xung start (nếu sử
dụng TAC phải có thêm bộ chuyển đổi tương tự số - ADC). Phần laser được sử dụng
để tạo xung so sánh được thu bằng một đầu thu nhanh (như PIN photodiode). Xung so
sánh sau khi được qua bộ tách xung (discriminator có thể là theo phương pháp leading-
edge hoặc CFD) cũng sẽ được chuyển đổi thành xung TTL và đến TDC với vai trò
xung stop. Khối TDC sẽ đo thời gian từ xung start đến xung stop, dữ liệu thời gian
được chuyển sang dạng tín hiệu số và được ghi vào bộ nhớ. Card đọc và ghi dữ liệu,
chuyển sang máy tính để máy tính dựng lại biểu đồ theo thời gian của cường độ.
25
❖ Phân tích dữ liệu
Dữ liệu đo thời gian sống phát quang thường không phải dạng đơn hàm e mũ
mà thường có dạng đa hàm e mũ và phương trình suy giảm phát quang có dạng:
(2.11)
Với là giá trị cực đại của mỗi thành phần. Nếu dữ liệu đo là tập hợp của
rất nhiều hàm mũ như dữ liệu suy giảm phát quang của một tập hợp chấm lượng tử,
việc phân tích kết quả trở nên rất phức tạp. Một phương pháp được đưa ra là sử dụng
phân bố stretched-exponential để mô tả quá trình suy giảm phát quang và tính toán
thời gian sống trung bình của hỗn hợp mẫu cần phân tích [ 7,20, 21, 22]. Phương trình phân
bố thời gian sống stretched-exponential có dạng:
(2.12)
Dữ liệu đo thời gian sống phát quang bằng kỹ thuật TCSPC có thể rất phức tạp
nhưng nếu áp dụng hay đưa ra mô hình vật lý thích hợp và xử lý số liệu chính xác có
thể kết luận được các quá trình quang động học xảy ra trên trạng thái kích thích của vật
liệu.
26
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Quá trình truyền năng lượng giữa AuNPs với phân tử Rh6G
3.1.1. Phương pháp chế tạo hạt nano AuNPs
Các hạt và thanh nano kim loại quý như vàng (Au) và bạc (Ag) có nhiều khả
năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như photonics, optoelectronics, và công
nghệ sinh học. Các ứng dụng thực tế của hạt và thanh nano kim loại đều dựa trên hiện
tượng cộng hưởng plasmon bề mặt (Surface Plasmon Resonance- SPR). Hiện tượng
SPR xẩy ra khi các điện tử dẫn của hạt kim loại như Au hoặc Ag tương tác với trường
điện từ ngoài dẫn đến sự hình thành các dao động đồng pha với một tần số cộng hưởng
nhất định. Các hạt nano kim loại sẽ hấp thụ mạnh photon kích thích ở đúng tần số cộng
hưởng này. Trong trường hợp tổng quát, đỉnh SPR bao gồm cả hai thành phần hấp thụ
và tán xạ. Hiệu ứng SPR phụ thuộc vào hình dạng, kích thước, hằng số điện môi của
bản thân hạt kim loại và phụ thuộc cả vào hằng số điện môi của môi trường xung
quanh.
Có nhiều phương pháp chế tạo hạt nano kim loại khác nhau như phương pháp
hoá khử, quang hoá, phương pháp ăn mòn laser, phương pháp plasma….
Phương pháp hóa khử là phương pháp thông dụng để chế tạo các hạt Au và Ag
có kích thước < 100 nm, với chi phí rẻ và chất lượng mẫu tương đối tốt và có thể điều
khiển kích thước hoặc hình dạng hạt. Tuy nhiên bằng phương pháp này, khó loại bỏ
tiền chất ban đầu trong mẫu nanô thu được. Phương pháp ăn mòn laser là phương pháp
sử dụng laser (liên tục hoặc xung) bắn phá vào bia kim loại đặt trong môi trường lỏng
hoặc khí để tạo ra hạt nanô.
Phương pháp này tạo ra mẫu với độ sạch cao, tuy nhiên độ đồng đều của hạt thu
được lại khó không chế. Điều này phụ thuộc vào độ ổn định công suất, độ rộng xung,
tần số lặp lại laser…
Phương pháp plasma có thể tạo ra hạt nanô có độ sạch như phương pháp ăn
mòn laser nhưng độ đồng đều hạt lại tốt hơn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn
đối tượng nghiên cứu là các hạt nanô vàng (AuNPs) do nhóm Vật lý Plasma - Trung
tâm Vật lý kỹ thuật - Viện Vật lý chế tạo bằng phương pháp plasma.
27
Hạt AuNPs chế tạo bằng phương pháp plasma có hình tựa cầu, kích thước nhỏ dưới
10 nm và có phân bố kích thước tương đối đồng đều. Điều này được thể hiện qua ảnh
HRTEM trong Hình 3.1. Phổ hấp thụ của hạt AuNPs trong môi trường pH =11 chỉ
xuất hiện một đỉnh hấp thụ SPR duy nhất trong vùng khả kiến ở 522 nm ứng với một
mode dao động lưỡng cực (Hình 3.2).
Hình 3.14: Ảnh HRTEM của AuNPs
ụ h t p ấ h ộ đ g n ờ ư C
Bước sóng (nanomet)
Hình 3.15: Phổ hấp thụ của hạt AuNPs trong
điều kiện môi trường pH =11
28
3.1.2. Quá trình truyền năng lượng giữa AuNPs với phân tử Rh6G
Rh6G được biết đến như một chất màu có hiệu suất lượng tử lớn được kích
thích tại bước sóng 488 nm, khi đó Rh6G có hiệu suất lượng tử là 95%. Trong khi đó,
AuNPs có đặc trưng phổ hấp thụ từ 500 nm đến 700 nm phụ thuộc vào hình dạng và
kích thước. Vì vậy ta có thể điều chỉnh kích thước để thu được vùng hấp thụ theo ý
muốn xung quanh vị trí phát xạ của Rh6G (phát= 560 nm), phù hợp để nghiên cứu quá
trình trao đổi truyền năng lượng cộng hưởng - FRET giữa cặp Rh6G (Donor) và
AuNPs (Acceptor).
Để nghiên cứu FRET giữa cặp Rh6G (Donor) và AuNPs (Acceptor), chúng tôi
sử dụng AuNPs chế tạo bằng phương pháp plasma và đưa thêm Rh6G với tỉ lệ khác
nhau (Bảng 3.1). Mẫu được khảo sát khi nồng độ giữa AuNPs và Rh6G thay đổi. Ở
đây, nồng độ của Rh6G được giữ nguyên và nồng độ AuNPs thay đổi để cho tỉ lệ số
hạt N(AuNPs)/N(Rh6G) thay đổi. Ta tạo mẫu nghiên cứu bằng cách: lấy dung dịch
AuNPs từ 0 đến 1 ml cho vào 0.5 ml Rh6G và thêm vào lượng nước để được 3ml. Từ
đó, các mẫu này được sử dụng trong các phép đo hấp thụ, huỳnh quang và thời gian
sống huỳnh quang.
Bảng 3.1: Các mẫu nghiên cứu FRET giữa cặp Rh6G (Donor) và AuNPs (Acceptor)
Tên mẫu AuNPs (ml) H2O (N=5e17) Rh6G (M=0.52 μM) Tỷ lệ N (AuNPs/Rh6G)
0 0.5 2.5 0 S1
0.2 0.5 2.3 0.309 S2
0.4 0.5 2.1 0.618 S3
0.6 0.5 1.9 0.927 S4
0.8 0.5 1.7 1.235 S5
1 0.5 1.5 1.544 S6
Phổ quang huỳnh quang (PL) trạng thái dừng của AuNPs/Rh6G được đo trong
cùng điền kiện (bước sóng kích thích, độ rộng khe…) trước khi xác định thời gian
sống huỳnh quang. Kết quả được trình bày trên Hình 3.3.
29
ụ h t p ấ h ộ đ g n ờ ư C
Bước sóng (nanomet)
Hình 3.16: Phổ PL của các mẫu AuNPs/Rh6G, kích thích = 488nm.
Ta thấy trong khi tỷ lệ nồng độ Acceptor/ Donor là tuyến tính nhưng cường độ
PL của mẫu suy giảm nhanh. Ta có thể nhận thấy cường độ PL giảm rất nhanh ở mẫu
S2 và S3 khi có 0.2 và 0.4 ml AuNPs thêm vào, tương ứng. Tuy nhiên, từ khi có 0.6,
0.8, và 1 ml AuNPCs thêm vào thì cường độ PL giảm chậm hơn. Điều này thể hiện rõ
trên Hình 3.4, khi so sánh hiệu suất truyền năng lượng FRET với tỷ lệ N giữa
Acceptor/ Donor.
g n ă n n ề y u r t t ấ u s u ệ i H
Hình 3.17. Hiệu suất FRET phụ thuộc vào tỉ lệ N giữa Acceptor và Donor (tam giác đỏ), so sánh với lý thuyết Förster tại tỉ lệ R/Ro = 0.92 (Đường màu xanh dương)
Hiệu suất truyền năng lượng E có thể được xác định bằng nhiều cách: sử dụng
các phép đo ở trạng thái dừng hoặc phân giải thời gian. Để xác định E, phương pháp
30
phổ biến nhất là đo cường độ huỳnh quang trạng thái dừng (FD) của mẫu chỉ chứa
Donor (D) và cường độ huỳnh quang (FDA) của mẫu tương ứng khi có thêm Acceptor
(A) theo công thức (3.1). Hoặc cũng có thể tính E theo công thức (1.4) thông qua phép
đo thời gian sống huỳnh quang.
Kết quả tính toán biểu diễn trên Hình 3.4 cho thấy ở tỉ lệ Acceptor/Donor khoảng
> 1, kết quả tính toán thực nghiệm (tam giác đỏ) phù hợp tốt hơn với lý thuyết Förster
tại tỉ lệ R/Ro = 0.92 (Đường màu xanh dương). Điều này là hợp lý vì khi nồng độ
Acceptor thấp, thì xác suất xảy ra FRET thấp, khi đó nhiều Donor tự do và cường độ
huỳnh quang lớn vì không tham gia FRET. Như vậy sai số theo lý thuyết sẽ lớn hơn.
Khi tỉ lệ Acceptor/Donor gần bằng 1 và hơn 1, số Donor tự do không còn đáng kể mà
thay vào đó Donor tham gia vào quá trình FRET, khi đó huỳnh quang thu được phản
ánh Donor tham gia vào tương tác truyền năng lượng FRET.
Xác định thời gian sống huỳnh quang của mẫu AuNPs/Rh6G.
Thời gian sống huỳnh quang là một phép đo quan trọng chứng minh hiệu ứng
FRET có xảy ra hay không. Thông qua TGS huỳnh quang ta có thể phân tích đánh giá
tương tác trao đổi FRET. Đường suy giảm huỳnh quang của Rh6G thay đổi theo nồng
độ AuNPs được đo trên hệ TCSPC và biểu diễn trong Hình 3.5.
𝑡
Thời gian sống huỳnh quang được tính từ việc fitting đường cong suy giảm
𝜏
)𝛽, trong đó τ là thời gian sống huỳnh quang theo hàm stretch-exponent 𝐼 = 𝐼0Exp(−
của điện tử trên trạng thái kích thích và β nằm trong khoảng từ (0-1). Vì hạt AuNPs có
kích thước khác nhau do đó thời gian sống không thể fitting theo hàm exponent đơn
mà sử dụng hàm stretch-exponent. Thời gian sống huỳnh quang nhận được có thể xem
là thời gian sống trung bình của các mẫu có sự tham gia các hạt AuNPs.
31
ộ đ g n ờ ư C
Thời gian sống(ns) Hình 3.18: Đường cong suy giảm huỳnh quang của Rh6G
thay đổi theo nồng độ AuNPs
Trong trường hợp, khi nồng độ mẫu nghiên cứu cao (nồng độ hạt AuNPs tăng
cao) cường độ huỳnh quang sẽ giảm điều này do quá trình tái hấp thụ hoặc truyền năng
lượng của các phân tử cùng loại (homotransfer). Khi đó tính chất quang phụ thuộc vào
nồng độ.
Kết quả tính toán thời gian sống huỳnh quang được trình bày trong Bảng 3.2. Giá
trị tham số β = 1 là mẫu chỉ có Donnor khi không có mặt của Acceptor, điều này
chứng minh được điện tử chỉ có một cách tái hợp phát xạ photon và nồng độ Rh6G sử
dụng trong thí nghiệm này là đủ loãng để không bị ảnh hưởng bởi tái hấp thụ hay
homotransfer. Khi có mặt AuNPCs tham số giảm dần theo chiều tăng nồng độ
AuNPCs, điều này chứng minh được truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang -
FRET từ Donor.
Để rõ hơn, tham số β và thời gian sống τ phụ thuộc vào tỷ lệ N (AuNPs/Rh6G)
(Bảng 3.2). Tham số β giảm từ 1 xuống 0.917 tương ứng với tỷ lệ N từ 0 đến 1.544,
điều này chứng minh được khi (AuNPCs) càng tăng thì hiệu suất FRET cũng tăng theo như lý thuyết Förster đã đưa ra.
32
Bảng 3.2. Kết quả tính thời gian sống từ fitting đường cong suy giảm huỳnh
quang theo hàm stretch exponent.
Tên mẫu (ns)
S1 S2 S3 S4 S5 S6 Tỷ lệ N (AuNPs/Rh6G) 0 0.309 0.618 0.927 1.235 1.544 1 0.991 0.959 0.949 0.927 0.917 4.157 3.836 3.589 3.430 3.218 3.120
Cần lưu ý rằng Donor sử dụng trong nghiên cứu này là phân tử trong khi đó
Acceptor là vật liệu nanô. Kích thước của phân tử Donor (Rh6G) bằng chiều dài phân
tử (1.6 nm), trong khi đó Acceptor là hạt hình cầu có đường kính < 10 nm. Để một A-
D tạo thành cặp FRET thì chúng phải ở khoảng cách đủ gần cỡ khoảng cách Förster,
điều này đòi hỏi các phân tử Rh6G cần phải liên kết như các ligand trên bề mặt hạt
AuNPCs.
3.2. Quá trình truyền năng lượng giữa Rhodamin 6G và chấm lượng tử
CdSe/ZnS
Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn cặp donor-acceptor là Rh6G-CdSe/ZnS
(tan trong nước). Trong đó Rh6G đóng vai trò donor và chấm lượng tử CdSe/ZnS
đóng vai trò acceptor.
Rh6G được biết đến như một chất màu đặc trưng có hiệu suất lượng tử lớn 0,95
và phổ phát xạ trong vùng bước sóng 550-570 nm được dùng để so sánh xác định hiệu
suất lượng tử của chất huỳnh quang khác. CdSe/ZnS được chọn làm acceptor là vật
liệu hứa hẹn sử dụng trong ứng dụng quang điện tử, nhờ hiệu suất lượng tử lớn, có thể
tan tốt trong nước đã và đang được sử dụng làn chất đánh dấu huỳnh quang, y sinh.
Chúng tôi chọn CdSe/ZnS tan trong nước thay vì trong dung môi hữu cơ vì trong nước
chấm lượng tử đã được loại bỏ khỏi ảnh hưởng của các ligand xung quanh, khi đó ảnh
hưởng tới khoảng cách tương tác của cặp donor-acceptor gây ra cũng giảm.
Chấm lượng tử CdSe/ZnS được chế tạo bằng phương pháp hóa ướt từ bột Se,
NaBH4, Na2S.9H2O, CdCl2.2,5H2O, C6H5Na3O7.2H2O và cồn tuyệt đối [23]. Chấm
lượng tử sau khi chế tạo có thể phân tán tốt trong môi trường nước. Kích thước chấm
lượng tử được xác định thông qua ảnh hiển vi truyền qua TEM khoảng 4nm, nồng độ
33
xác định từ lượng tiền chất phản ứng là 1014 hạt/ml. Rhodamine 6G của hãng Sigma
Aldrich được pha trong nước với nồng độ 3.8.10-6M/ml. Các mẫu được chuẩn bị với tỉ
lệ như Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Các mẫu nghiên cứu FRET giữa cặp Rhodamin 6G và chấm lượng tử CdSe/ZnS
TÊN MẪU M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6
0/5 1/5 2/5 3/5 4/5 5/5 5/0 TỈ LỆ: Rh6G:CdSe/ZnS
Mẫu sau khi chuẩn bị được đo phổ hấp thụ trên hệ Shimazu UV2600
(Shimazu), phổ huỳnh quang trên hệ phổ kế huỳnh quang Cary Eclipse (Variant) và
huỳnh quang phân giải thời gian trên hệ đếm đơn photon tương quan thời gian
(TCSPC) PicoHarp300 (Picoquant) và được xử lý bằng phần mềm tính toán chuyên
dụng viết trên Matlab.
ộ đ g n ờ ư C
p ấ h ộ đ g n ờ ư C
Thời gian sống(ns)
Hình 3.19: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của các mẫu Rh6G:CdSe/ZnS với tỉ lệ khác nhau
Để quan sát được một cách rõ rệt sự thay đổi cường độ phổ do tương tác trao đổi
truyền năng lượng chúng tôi đã chuẩn hóa cả phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang. Nhìn
vào hình vẽ có thể thấy rằng trong phổ hấp thụ, ngoài hấp thụ mạnh ở vùng tử ngoại,
mẫu còn có đỉnh hấp thụ tại 527 nm và kéo dài chân hấp thụ tới 650 nm. Khi tỉ lệ
Rh6G trong mẫu tăng thì đỉnh hấp thụ này cũng tăng. Phổ huỳnh quang có 2 đỉnh
chính tại bước sóng 553nm và 615 nm tương ứng với hai đỉnh phát xạ của của Rh6G
và chấm lượng tử CdSe/ZnS. Mẫu chỉ có Rh6G có một đỉnh huỳnh quang tại 553 nm, 34
mẫu chỉ có chấm lượng tử có 1 đỉnh huỳnh quang tại 615 nm. Khi tỉ lệ Rh6G trong
mẫu tăng cùng với một giá trị đỉnh 553 nm chuẩn hóa ta thấy cường độ đỉnh huỳnh
quang tại tăng có nghĩa là tỉ lệ cường độ đỉnh 615 nm trên cường độ đỉnh huỳnh quang
tại 553 nm tăng. Đồng thời có thể thấy vùng chồng chập phổ phát xạ của Rh6G với
phổ hấp thụ của CdSe/ZnS khá rộng từ 500 nm tới 650 nm. Đây chính là bằng chứng
về sự truyền năng lượng của Rh6G:CdSe/ZnS.
ộ đ g n ờ ư C
Thời gian sống(ns)
Hình 3.20: Phổ huỳnh quang phân giải thời gian của các mẫu
Rh6G:CdSe/ZnS với tỉ lệ thành phần khác nhau đo tại đỉnh phát xạ 563 nm với
bước sóng kích thích 405 nm
Để có thể khẳng định hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng của
Rh6G:CdSe/ZnS chúng tôi đã tiến hành đo phổ huỳnh quang phân giải thời gian của
các mẫu Rh6G:CdSe/ZnS và biểu diễn trên hình 3.7.
Để phân tích đánh giá FRET thông qua thời gian sống, kết quả thu được được
phân tích bằng cách làm khớp (fit) hàm exponential, khi phân tử Rh6G độc lập trong
dung môi, huỳnh quang của nó phù hợp với hàm exponent đơn tức là chỉ có một
chuyển dời trạng thái phát photon của nó. Khi có mặt của acceptor ở đây là CdSe/ZnS,
vì kích thước chấm lượng tử CdSe/ZnS là tập hợp các hạt khác nhau phân tán quanh
giá trị 4nm nên thời gian sống của chấm lượng tử tuân theo quy luật hàm multi-
exponential. Hơn nữa ảnh hưởng của hiệu ứng FRET, năng lượng của điện tử trên
trạng thái kích thích ở phân tử Rh6G còn có khả năng tái hợp không phát xạ truyền
năng lượng sang acceptor và như vậy nó có một cách suy giảm điện tử trên trạng thái
kích thích thứ hai, và kết quả thu được được làm khớp với hàm multi-exponential;
35
trong một số trường hợp rất khó để khớp đường phân rã huỳnh quang theo hàm
exponent (single-bi, trip…) người ta thường làm khớp theo tổ hợp các hàm exponent
hay còn gọi stretch-exponential 𝐼 = 𝐼0Exp(− 𝑡/ 𝜏 ) 𝛽 trong đó τ là thời gian sống của
điện tử trên trạng thái kích thích và β là hằng số nằm trong khoảng từ (0-1). Tuy nhiên,
trong trường hợp này thời gian sống huỳnh quang là trung bình của tất cả các quá trình
xẩy ra nên khó để phân tích giải thích cho từng chuyển dời trong vật liệu.
Trong trường hợp cặp donor-acceptor của chúng tôi là Rh6G-CdSe/ZnS, đường
phân rã huỳnh quang của mẫu sau khi năng lượng kích thích cường huỳnh quang đạt
giá trị cực đại rồi giảm nhanh theo hàm exponent, chúng tôi đã làm khớp theo hàm bi-
exponetial.
( 3.1) I(t)=A1.exp(-t/1)+(1-A1).exp(-t/1)
Trong đó A1 là hằng số; 1,2 là thời gian sống huỳnh quang trong đó thời gian sống
2~ 25ns và không thay đổi nhiều với các mẫu có nồng độ CdSe/ZnS khác nhau. Đây
là thời gian sống liên quan tới tái hợp bức xạ các trạng thái bề mặt của chấm lượng tử
còn 1 có giá trị bé hơn và thay đổi theo nồng độ của chấm lượng tử qua tái hợp bức xạ
của lõi QDs.
Các giá trị tính toán về hiệu suất truyền năng lượng, tích phân chồng chập phổ
và khoảng cách donor-acceptor được cho trên Bảng 3.4.
Bảng 3. 4. Giá trị của tích phân vùng phổ chồng chồng lên nhau, (J ()), hiệu suất
truyền năng lượng Förster, (E%), và khoảng cách cặp donor-acceptor (r)
J().1015 r E Mẫu (ns) (nm) (%)
M-1cm-1nm-4
M0 - 2.39 - -
M1 3.22x1015 3.27 11.70 0.21
M2 2.37x1015 3.54 11.09 0.15
M3 2.18x1015 3.70 10.96 0.11
M4 1.31x1015 3.75 10.08 0.10
M5 7.41x1014 3.79 9.16 0.09
M6 - 4.15 - -
36
Từ kết quả Bảng 3.4. ta thấy rằng mẫu có hiệu suất truyền năng lượng tốt nhất
(21%) trong loạt mẫu nghiên cứu gây ra bới sự chồng chập phổ lớn nhất giữa phổ phát
xạ của Rh6G và phổ hấp thụ của CdSe/ZnS đồng thời thời gian sống của cặp donor-
acceptor giảm theo tỉ lệ acceptor trong mẫu. Khi thời gian sống của donor với sự có
mặt của acceptor thay đổi cũng là bằng chứng của FRET [24, 25]. Thông thường khi có
trương tác trao đổi FRET, thời gian sống trên mức kích thích của donor giảm khi có
mặt acceptor [25]. Thời gian sống của donor (Rh6G) tại bước sóng 553 nm là 4.15 ns và
giảm dần khi có mặt của acceptor với tỉ lệ tăng lên. Kết quả tính toán truyền năng
lượng FRET từ thời gian sống huỳnh quang phù hợp với kết quả tính từ cường độ phổ
huỳnh quang, tuy nhiên trong những trường hợp sự thay đổi về giá trị cường độ phổ
nhỏ hoặc phổ huỳng quang nhiễu lớn thì cách tính qua thời gian sống huỳnh quang sẽ
có lợi thế hơn. Tuy nhiên cách tính thời gian sống huỳnh quang cũng có hạn chế đó là
phải chọn được phương pháp làm khớp đường phân rã huỳnh quang thích hợp để tính
được chính xác thời gian sống huỳnh quang và sai số đường khớp với đường thực
nghiệm nhỏ nhất.
37
KẾT LUẬN
Với mẫu chấm lượng tử, hạt nano vàng, chất màu được cung cấp từ viện Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tiến hành đo phổ hấp thụ, phổ huỳnh quang và
thời gian sống huỳnh quang chúng tôi đã thu được một số kết quả chính sau đây:
- Nghiên cứu lý thuyết truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang.
- Xây dựng phương pháp thực nghiệm nghiên cứu truyền năng lượng cộng hưởng
huỳnh quang bằng phương pháp huỳnh quang phân giải theo thời gian.
- Tiến hành nghiên cứu truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang của cặp
donor-acceptor là: chất màu Rhodamin 6G và hạt nano vàng; Rhodamin 6G và chấm
lượng tử CdSe/ZnS trong môi trường dung môi nước.
Quá trình truyền năng lượng giữa AuNPs với phân tử Rh6G:
AuNPc được tổng hợp bằng dung dịch phún xạ plasma, không có chất hoạt
động bề mặt. Chúng tôi quan sát thấy FRET giữa Rhodamine-6G và AuNPs. Sự thay
thời gian sống huỳnh quang khi tăng nồng độ AuNPs. Tính toán chuyển giao năng
lượng hiệu quả (tối đa 72%), ước lượng khoảng cách truyền năng lượng R / R0 = 0,92
Nghiên cứu này đã mở ra việc áp dụng vật liệu nano được tạo ra bằng cách tổng hợp
dung dịch nano phún xạ plasma cho FRET.
Quá trình truyền năng lượng giữa Rhodamin 6G và chấm lượng tử CdSe/ZnS
Chấm lượng tử CdSe/ZnS được chế tạo bằng phương pháp hóa ướt.Chấm lượng
tử sau khi chế tạo có thể phân tán tốt trong môi trường nước. Chúng tôi quan sát thấy
FRET giữa Rhodamin 6G và chấm lượng tử CdSe/ZnS. Sự thay đổi thời gian sống
huỳnh quang khi tăng nồng độ CdSe/ZnS. Hiệu suất truyền năng lượng tốt nhất (21%).
38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Förster T. Ann Phys. 1948; 437:55
2. Thi Thanh Hop Tran, Thi Mai Huong Do, Mai Ha Hoang, Duc Tuyen Nguyen,
Quang Tuan Le, Duc Nghia Nguyen and Trinh Tung Ngo, Adv. Nat. Sci.: Nanosci,
Nanotechnol, 2015, 6, 025007.
3. Duc Nghia Nguyen, Trinh Tung Ngo and Quang Liem Nguyen, Adv. Nat. Sci.:
Nanosci, Nanotechnol, 2012,3, 035011.
4. Mikhail Y. Berezin and Samuel Achilefu, Chem Rev, 2010, 5, 2641–2684.
5. Dibyendu Dey, D. Bhattacharjee, S. Chakraborty, Syed Arshad Hussain, Journal of
Photochemistry and Photobiology, A: Chemistry, 2013, 252, 174– 182.
6. M. G. Williams, R. D. Tomlinson, and M. J. Hampshire, Solid State Commun, 2003,
7, 1831.
7. J. R. Lakowicz , Principles of Fluorescence Spectroscopy - 3rd Ed. Springer, New
York, 2006, Ch. 13.
8. Clare Higgins, Manuela Lunz, A. Louise Bradley, Valerie A. Gerard, Stephen
Byrne, Yurii K. Gun’ko, Vladimir Lesnyak, and Nikolai Gaponik, Optics express,
2010, vol 18, 24486.
9. Sangeeta Saini, Harjinder Singh and Biman Bagchi, Fluorescence resonance energy
transfer (FRET) in chemistry and biology: Non-Förster distance dependence of the
FRET rate, January 2006, 23–35.
10. Robert M Clegg, Fluorescence resonance energy transfer. 1995, 6,103-l10.
11. Robert M. Clegg, THE HISTORY OF FRET: From conception through the labors
of birth.
12. David L. Andrews. Chapter 14 Resonance Energy Transfer: Theoretical
Foundations and Developing Applications.
13. Aaron R. Clapp, Igor L. Medintz, J. Matthew Mauro, Brent R. Fisher, Moungi G.
Bawendi, and Hedi Mattoussi. Fluorescence Resonance Energy Transfer Between
Quantum Dot Donors and Dye-Labeled Protein Acceptors. Published on Web
12/13/2003.
14. Kenny F. Chou and Allison M. Dennis. Förster Resonance Energy Transfer
between Quantum Dot Donors and Quantum Dot Acceptors. 2015, 15, 13288-
39
13325.
15. Nai-Tzu Chen , Shih-Hsun Cheng , Ching-Ping Liu , Jeffrey S. Souris , Chen-Tu
Chen , Chung-Yuan Mou and Leu-Wei Lo . Recent Advances in Nanoparticle-
Based Förster Resonance Energy Transfer for Biosensing, Molecular Imaging and
Drug Release Profiling. Int. J. Mol. Sci. 2012, 13, 16598-16623.
16. Roi Baer, and Eran Rabani. Theory of resonance energy transfer involving
nanocrystals: The role of high multipoles. 14 May 2008.
17. W. Becker , Advanced time-correlated single photon counting techniques,
Springer, 2005.
18. http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/applications/fretintro.h
tml
19. James E. Martin, Lauren E. Shea-Rohwer, Journal of Luminescence, 2006, 121,
573.
20. A. F. van Driel, G. Allan, C. Delerue, P. Lodahl, W. L. Vos, and D.
Vanmaekelbergh, Phys. Rev. Lett, 2005, 95, 236-804.
21. A. F. van Driel, I. S. Nikolaev, P. Vergeer, P. Lodahl, D. Vanmaekelbergh, and W.
L. Vos, Phys. Rev. B, 2007, 75, 035-329.
22. Chu viet Ha, Nguyen Thi bich Ngọc, Nghiem Thị Ha Lien, Vu Thi Kim Lien an
Tran Hong Nhung, Ad. In Optics, Photonics, Spectroscopy & Applycations VIII,
2015, 272.
23. Jaba Saha, DibyenduDey, ArpanDattaRoy, D.Bhattacharjee, Syed Arshad Hussain,
Journal of Luminescence, 2016, 172, 168–174.
24. M. Chao, Z.Fang, H.Lifang, W.Shuizhu, J.Phys. Chem. B, 2011, 115, 874.
40
