Luận văn Thạc sĩ Sinh học thực nghiệm: Đánh giá biểu hiện của các gen liên quan tới con đường tín hiệu JAK/STAT ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có nhiễm virus viêm gan B

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------

TRẦN THỊ PHƯƠNG THẢO

ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN LIÊN QUAN TỚI CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU JAK/STAT Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN

NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội – 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------

TRẦN THỊ PHƯƠNG THẢO

ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN LIÊN QUAN TỚI CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU JAK/STAT Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN

NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm

Mã số : 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. Hoàng Văn Tổng 2. TS. Vũ Thị Thu

HÀ NỘI - 2020

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài cho luận văn, tôi đã nhận được sự giúp

đỡ tận tình của nhiều tập thể và cá nhân.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới

TS. Hoàng Văn Tổng - Phòng An toàn Sinh học, Viện nghiên cứu Y Dược học

Quân sự, Học viện Quân y và TS. Vũ Thị Thu - Bộ môn Sinh lý học và Sinh học

người, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà

Nội đã tin tưởng giao đề tài và hướng dẫn tận tình, tạo điều kiện thuận lợi nhất để

tôi có thể hoàn thành luận văn của mình.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các kỹ thuật viên bộ môn Sinh lý

bệnh Học viện Quân y đã hướng dẫn tận tình giúp tôi hoàn thành thí nghiệm của đề

tài luận văn này. Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn tới bác sĩ Nguyễn Việt Phương và các

bác sĩ viện K cơ sở 3 đã cung cấp mẫu mô gan và thông tin lâm sàng để tôi có thể

hoàn thành thí nghiệm và phân tích số liệu của luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể các thầy cô trường Đại học Khoa

học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ, mang lại

cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập tại

trường.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn

ủng hộ, động viên tôi trong cuộc sống cũng như trong suốt quá trình hoàn thành

luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 02 tháng 02 năm 2020

Học viên

TRẦN THỊ PHƯƠNG THẢO

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Trần Thị Phương Thảo, học viên cao học khóa 26 Trường Đại học

Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Sinh học, chuyên ngành Sinh

học thực nghiệm, xin cam đoan:

1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn

khoa học của TS. Hoàng Văn Tổng và TS. Vũ Thị Thu.

2. Công trình này không trùng lập với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được

công bố tại Việt Nam.

3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung

thực và khách quan.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.

Hà Nội, ngày 02 tháng 02 năm 2020

Người viết cam đoan

Trần Thị Phương Thảo

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN..............................................................................................................1

LỜI CAM ĐOAN........................................................................................................2

CHỮ VIẾT TẮT..........................................................................................................5

DANH MỤC HÌNH.....................................................................................................6

DANH MỤC BẢNG...................................................................................................8

ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................9

Chương 1. TỔNG QUAN..........................................................................................11

1.1. Virus viêm gan B và ung thư gan........................................................................11

1.1.1. Tình hình nhiễm hepatitis B virus trên thế giới và ở Việt Nam........................11

1.1.2. Con đường nhân lên của virus..........................................................................11

1.1.3. HBV và đáp ứng miễn dịch của cơ thể.............................................................13

1.2. Ung thư biểu mô tế bào gan................................................................................16

1.2.1 Thực trạng.........................................................................................................16

1.2.2. Các giai đoạn của ung thư biểu mô tế bào gan.................................................17

1.2.3. Ung thư gan do HBV.......................................................................................19

1.2.4. Cơ chế gây ung thư của HBV..........................................................................19

1.3. Con đường tín hiệu JAK/STAT...........................................................................20

1.3.1. Cấu trúc của con đường JAK/STAT.................................................................20

1.3.2. Các phối tử và các thụ thể của con đường JAK/STAT.....................................21

1.3.3. Cơ chế truyền tin của con đường JAK/STAT...................................................23

1.3.4. Điều hòa con đường JAK/STAT.......................................................................30

1.3.4.1. Các protein ức chế con đường truyền tín hiệu JAK/STAT............................30

1.3.4.2. Protein Tyrosine phosphatase (PTPs) điều hòa con đường JAK/STAT.........33

1.4. Tính thiết yếu của đề tài......................................................................................33

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................35

2.1. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................35

2.2. Sơ đồ nghiên cứu................................................................................................35

2.3. Lựa chọn đối tượng, thu thập và bảo quản mẫu nghiên cứu................................35

2.3.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................35

2.3.2. Tiêu chuẩn chọn mẫu.......................................................................................35

2.3.3. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu................................................36

2.4. Phương pháp và kỹ thuật sử dụng.......................................................................36

2.4.1. Phương pháp tách chiết RNA...........................................................................36

2.4.2. Quang phổ hấp thụ đo nồng độ RNA...............................................................37

2.4.3. Kỹ thuật xác định biểu hiện gen bằng phương pháp QuantiGene Plex............38

2.5. Phân tích kết quả.................................................................................................46

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN....................................................................48

3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu.........................................................48

3.1.1. Đặc điểm tuổi và giới.......................................................................................48

3.1.2. Đặc điểm cận lâm sàng....................................................................................48

3.2. Mức độ biểu hiện các gen nghiên cứu...............................................................49

3.2.1. Mức độ biểu hiện, tương quan biểu hiện giữa mô LCU và mô U của nhóm

gen tín hiệu.........................................................................................................49

3.2.2. Mức độ biểu hiện, tương quan biểu hiện giữa mô LCU và mô U của nhóm

gen JAK/STAT....................................................................................................60

3.2.3. Mức độ biểu hiện, tương quan biểu hiện giữa mô LCU và mô U của nhóm

gen đích chức năng..............................................................................................63

3.2.4. Mức độ biểu hiện, tương quan biểu hiện giữa mô LCU và mô U của nhóm

gen điều hòa........................................................................................................68

3.3. Tương quan biểu hiện các gen nghiên cứu với chỉ số lâm sàng và cận lâm sàng...74

3.3.1. Tương quan tỷ lệ biểu hiện các gen với chỉ số mô bệnh học............................74

3.3.2. Tương quan tỷ lệ biểu hiện các gen với chỉ số cận lâm sàng............................76

KẾT LUẬN...............................................................................................................83

KIẾN NGHỊ...............................................................................................................83

TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................84

CHỮ VIẾT TẮT

Phần viết đầy đủ (Tiếng Việt)

Các từ viết tắt AFP ALT AST Alpha-fetoprotein Alanin Amino Transferase Aspartate Amino Transferase

Phần viết đầy đủ (Tiếng Anh) Alpha-fetoprotein Alanin Amino Transferase Aspartate Amino Transferase Carbohydrate antigen 19-9 hoặc Kháng nguyên ung thư CA19-9 CA19-9

Kháng nguyên ung thư CEA Tế bào tua Kháng nguyên lõi HBV Kháng nguyên e của HBV Kháng nguyên bề mặt HBV Virus viêm gan B Ung thư biểu mô tế bào gan Interferon Interleukin CEA DC HBcAg HBeAg HBsAg HBV HCC IFN IL

cancer antigen 19-9 Carcinoembryonic antigen Dendritic cells Hepatitis B core Antigen Hepatitis B evolope Antigen Hepatitis B surface Antigen Hepatitis B virus Hepatocellular Carcinoma Interferon Interleukin The Janus kinase/signal Con đường truyền tín hiệu và JAK/STAT transducers and activators of hoạt hóa phiên mã transcription

Lân cận u

LCU MDSCS

Myeloid-derived suppressor cells Tế bào có nguồn gốc tủy xương Model for End-Stage Liver Mô hình bệnh gan giai đoạn cuối MELD Disease

Yếu tố hạt nhân kappa-ánh sáng Nuclear factor kappa-light- chuỗi tăng cường của các tế bào NF-κB chain-enhancer of activated B

B kích hoạt Tế bào giết tự nhiên Khung đọc mở

Natural Killer cell Open reading frame Suppressor of cytokine signaling Ức chế tín hiệu cytokine Toll-like Recepter Tumor Necrosis Factors Thụ thể giống Toll Yếu tố hoại tử khối u NK ORF SOCS TLR TNF

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Quá trình nhân lên của HBV trong cơ thể ...............................................12

Hình 1.2: Đáp ứng miễn dịch của đại thực bào với các thành phần của HBV ........13

Hình 1.3: Đáp ứng miễn dịch của Đại thực bào và hệ gen của HBV ......................14

Hình 1.4: Đáp ứng miễn dịch và cơ chế chống virus trong tế bào gan ....................15

Hình 1.5: Đáp ứng miễn dịch và cơ chế chống virus trong tế bào gan ....................21

Hình 1.6: Sơ đồ biểu diễn cấu trúc các thành phần của con đường JAK-STAT ......24

Hình 1.7: Sơ đồ hoạt hóa STAT ..............................................................................24

Hình 1.8: Protein STAT điều chỉnh miễn dịch thích ứng ung thư ...........................25

Hình 1.9: Protein STAT điều chỉnh miễn dịch thích ứng ung thư ...........................27

Hình 1.10: Cơ chế phân tử của protein SOCSs khi điều hòa các tín hiệu cytokine ...31

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu của đề tài.....................................................................35

Hình 2.2: Quy trình xác định mức độ biểu hiện gen ...............................................38

Hình 3.1: Biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện mRNA các gen CNTFR, EPOR, IL4R

và IL4 ở mô LCU và mô U......................................................................................50

Hình 3.2: Biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện mRNA các gen CSF1R, EGFR, FAS,

TSLP ở mô LCU và mô U.......................................................................................52

Hình 3.3: Biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện mRNA các gen GHR, INSR,

IFNAR1, IL6ST ở mô LCU và mô U......................................................................54

Hình 3.4: Mức độ biểu hiện mRNA các gen IL10, IL10RA, LEP, LEPR, PRLR ở

mô LCU và mô U....................................................................................................56

Hình 3.5: Tương quan mức độ biểu hiện mRNA các gen LEP, CNTFR, EGFR, FAS

ở mô LCU và mô U.................................................................................................58

Hình 3.6: Tương quan mức độ biểu hiện mRNA các gen IL4, IL4R, INSR, PRLR ở

mô LCU và mô U....................................................................................................58

Hình 3.7: Mức độ biểu hiện mRNA các gen JAK1, JAK2, STAT2, STAT3 ở mô LCU

và mô U................................................................................................................... 60

Hình 3.8: Mức độ biểu hiện mRNA các gen JAK1, JAK2, STAT2, STAT3 ở mô LCU

và mô U................................................................................................................... 60

Hình 3.9: Tương quan mức độ biểu hiện mRNA gen STAT5B ở mô LCU và mô U....62

Hình 3.10: Mức độ biểu hiện mRNA các gen A2M, CCND1, CEBPB, CRK ở mô

LCU và mô U..........................................................................................................63

Hình 3.11: Mức độ biểu hiện mRNA các GPB1, CRP, MPL ở mô LCU và mô U...64

Hình 3.12: Tương quan mức độ biểu hiện mRNA các gen CEBPB và MPL ở mô

LCU và mô U..........................................................................................................67

Hình 3.13: Mức độ biểu hiện mRNA các gen CISH, SOCS2, SOCS3, SLA2 ở mô

LCU và mô U..........................................................................................................68

Hình 3.14: Mức độ biểu hiện mRNA các gen PTPN1, PTPN6, PTPRC, SMAD1,

SMAD2, SMAD3 ở mô LCU và mô U.....................................................................71

Hình 3.15: Tương quan mức độ biểu hiện mRNA CISH ở mô LCU và mô U.........73

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Giai đoạn của ung thư gan và tỷ lệ sống sót tương đối sau 5 năm ..........16

Bảng 1.2: Tiêu chuẩn phân giai đoạn HCC theo AJCC ..........................................17

Bảng 1.3: Các phối tử của con đường JAK/STAT và đích truyền tín hiệu ..............22

Bảng 1.4: STAT1, STAT4 và các gen đích hoạt hóa phiên mã ................................26

Bảng 1.5: STAT3 và các gen đích hoạt hóa phiên mã .............................................28

Bảng 1.6: STAT 5, STAT6 và các gen đích hoạt hóa phiên mã ...............................30

Bảng 1.7: Chức năng, vai trò của SOCS trong sinh lý ............................................32

Bảng 2.1: Dụng cụ hóa chất chính dùng trong nghiên cứu......................................36

Bảng 2.2: Thành phần hỗn hợp hạt từ......................................................................39

Bảng 2.3: Các gen tín hiệu.......................................................................................43

Bảng 2.4: Các gen JAK/STAT..................................................................................44

Bảng 2.5: Các gen đích............................................................................................44

Bảng 2.6: Các gen điều hòa.....................................................................................45

Bảng 3.1: Đặc điểm tuổi và giới của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu...........48

Bảng 3.2: Đặc điểm huyết học của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu..............48

Bảng 3.3: Đặc điểm cận lâm sàng............................................................................49

Bảng 3.4: Tương quan Spearman’r biểu hiện mRNA trong nhóm gen tín hiệu giữa

mô LCU và mô U....................................................................................................57

Bảng 3.5: Tương quan Spearman’r biểu hiện mRNA trong nhóm gen JAK/STAT

giữa mô LCU và mô U............................................................................................62

Bảng 3.6: Tương quan Spearman’r biểu hiện mRNA trong nhóm gen đích chức

năng giữa mô LCU và mô U....................................................................................67

Bảng 3.7: . Tương quan Spearman’r biểu hiện mRNA trong nhóm gen điều hòa giữa

mô LCU và mô U....................................................................................................73

Bảng 3.8: Kết quả phân tích hồi quy đa biến 76 gen và mức độ xâm lấn mạch...........74

Bảng 3.9: Tương quan tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số Fibrinogen..........76

Bảng 3.10: Tương quan tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số AST (SGOT).........77

Bảng 3.11: Tương quan tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số AFP...................80

Bảng 3.12: Tương quan tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số CEA..................81

Bảng 3.13: Tương quan tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số MELD..............81

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư gan là loại ung thư phổ biến thứ sáu và là nguyên nhân hàng đầu

gây tử vong do ung thư trên toàn thế giới vào năm 2018, với khoảng 841.000 trường

hợp mới phát hiện và 782.000 ca tử vong hàng năm. Tỷ lệ mắc và tử vong cao gấp

hai đến ba lần ở nam giới so với nữ giới ở hầu hết các khu vực trên thế giới. Ung

thư gan nguyên phát bao gồm: ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular

‐ Carcinoma - HCC), chiếm khoảng 75% 85%; ung thư đường mật chiếm khoảng

10% 15% và một số loại hiếm gặp khác . Một trong những nguyên nhân chính dẫn ‐

tới HCC là do nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV) mạn tính, chiếm ít

nhất 50% trường hợp HCC trên toàn thế giới .

HBV là một loại virus tấn công vào các tế bào gan gây ra viêm gan cấp tính

và mạn tính. Theo thống kế của tổ chức y tế thế giới (World Health Organization -)

có khoảng 780.000 người trên thế giới chết mỗi năm do HBV và các bệnh lý gan

liên quan như xơ gan và ung thư gan. Viêm gan B hiện tại đang là gánh nặng sức

khỏe cộng đồng nhất là tại những nước đang phát triển trong đó có Việt Nam. Trong

thời kỳ nhiễm HBV, hệ miễn dịch bẩm sinh đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng tới

cơ chế gây bệnh của HBV bằng việc ức chế sao chép trong giai đoạn đầu sau

nhiễm .

Một trong những cơ chế đáp ứng miễn dịch bẩm sinh của cơ thể khi bị nhiễm

HBV là sự tiết ra các interferon (IFN) và các cytokine khi kích hoạt quá trình viêm.

Quá trình này được thực hiện nhờ con đường tín hiệu JAK/STAT (Janus

kinase/signal transducers and activators of transcription - con đường truyền tín hiệu

và hoạt hóa phiên mã). Con đường tín hiệu JAK/STAT hoạt động thông qua sự gắn

phối tử là các IFN, cytokine với thụ thể tiếp nhận trên bề mặt tế bào; protein JAK

được hoạt hóa bằng phosphoryl dẫn tới sự phosphoryl hóa protein STAT. Sau khi

được phosphoryl hóa, STAT di chuyển vào trong nhân tế bào và thực hiện hoạt hóa

yếu tố phiên mã của các gen trong con đường tín hiệu đáp ứng lại với những kích

thích từ bên ngoài môi trường. Bên cạnh đó, khi STAT được hoạt hóa quá mức dẫn

đến sự biểu hiện mạnh mẽ của các gen tiền ung thư (oncogene) là nguyên nhân dẫn

tới sự hình thành và phát triển ung thư trong đó có HCC .

Từ điều kiện thực tế đặt ra, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Đánh giá

biểu hiện của các gen liên quan tới con đường tín hiệu JAK/STAT ở bệnh nhân

ung thư biểu mô tế bào gan có nhiễm virus viêm gan B” với các mục tiêu sau:

- Tìm hiểu mức độ biểu hiện của các gen liên quan tới con đường tín hiệu

JAK/STAT ở mô ung thư và mô lành.

- Tìm hiểu mối tương quan trong biểu hiện của các gen nghiên cứu trong mô

ung thư và mô lành.

- Tìm hiểu mối liên quan giữa mức độ biểu hiện gen với các đặc điểm lâm

sàng và cận lâm sàng ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có nhiễm virus viêm

gan B.

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Virus viêm gan B và ung thư gan

1.1.1. Tình hình nhiễm hepatitis B virus trên thế giới và ở Việt Nam

Nhiễm virus viêm gan B (hepatitis B virus - HBV) hiện đang là một vấn đề

lớn trong sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới, là nguyên nhân phổ biến gây ra các

bệnh lý gan và ung thư gan. Theo số liệu thống kê của tổ chức y tế thế giới, tính đến

thời điểm tháng 7 năm 2018, ước tính có khoảng 257 triệu người đang bị nhiễm

HBV. Số liệu thống kê trong năm 2015, có 887.000 ca tử vong do nhiễm HBV, chủ

yếu là do các biến chứng bao gồm xơ gan và HCC. Trong đó có đến 40% nam giới

và 15% phụ nữ bị nhiễm HBV mạn tính tử vong vì xơ gan và HCC mỗi năm. Cứ

100.000 thì có khoảng 20 người được chẩn đoán mắc HCC, đây là bệnh lý nguy

hiểm được xếp sau ung thư phổi và là một trong những bệnh phổ biến ở các nước

đang phát triển .

Tại Việt Nam, năm 2012, tỷ lệ các ca xét nghiệm dương tính với kháng

nguyên bề mặt của HBV ( Hepatitis B surface Antigen-HBsAg) chiếm từ 10% đến

20% trong toàn dân, từ 20% đến 40% ở những người tiêm chích ma túy và bệnh

nhân dương tính với HIV . Nghiên cứu dịch tễ học năm 2008 đã sử dụng mô hình

toán học dự đoán tỷ lệ mắc HBV ở Việt Nam qua các năm. Ước tính số người

nhiễm HBV mạn tính ở Việt Nam đã tăng từ 6,4 triệu ca vào năm 1990 lên 8,4 triệu

ca vào năm 2005. Tỷ lệ lưu hành HBV có thể được quan sát giữa năm 2003 (8,6

triệu ca) và 2025 (8 triệu ca). Tỷ lệ mắc xơ gan liên quan đến HBV, tỷ lệ HCC và tử

vong liên quan đến HBV được dự đoán sẽ tăng đáng kể trong 15 năm tới. Ước tính

số ca tử vong liên quan đến xơ gan, HCC và liên quan đến HBV sẽ tăng từ 36.500;

15.600 và 23.300 ca vào năm 2005 tương ứng lên 58.600; 25.000 và 40.000 vào

năm 2025 .

1.1.2. Con đường nhân lên của virus

HBV là một thành viên của họ Hepadnaviridae, có hệ gen là DNA. HBV

nhân lên trong tế bào gan thông qua phân tử RNA trung gian và có thể chèn hệ gen

vào hệ gen của vật chủ . Con đường nhân lên của HBV được được mô tả trong Hình

1.1. Khi nhiễm vào cơ thể, HBV xâm nhập vào các tế bào gan thông qua quá trình

hoạt động của các protein bề mặt virus. Trong các thụ thể liên quan đến quá trình

xâm nhập của virus, carboxypeptidase D là đóng vai trò thiết yếu trong quá trình

xâm nhập của HBV. Sau khi đưa hệ gen của virus vào nhân của tế bào chủ, các vùng

cách giữa hai mạch trong hệ gen của virus được sửa chữa bởi protein pol, DNA của

virus được chuyền hóa thành dạng DNA vòng (cccDNA) .

Hình 1.1: Quá trình nhân lên của HBV trong cơ thể

DNA của HBV dạng vòng là khuôn để phiên mã của các nhóm gen và các

RNA của hệ gen và là thành phần ổn định trong chu trình sao chép của virus (Hình

1.2; 1.3). Sau khi xâm nhập vào trong nhân của tế bào vật chủ, các cấu trúc ARN

được tạo ra có vai trò làm sợi trung gian cho quá trình nhân đôi hệ gen virus. Các

RNA pregenomic (pgRNA) được tổng hợp làm khuôn cho phiên mã ngược và là

RNA thông tin cho gen lõi và polymerase; pre-core RNA định hướng dịch mã của

sản phẩm gen precore. Protein HBsAg lớn (L-HBsAg) được dịch từ RNA

subgenomic 2,4 kb, các protein HBsAg trung gian (MHBsAg) và nhỏ (S-HBsAg)

nhỏ từ các dạng khác nhau của RNA 2,1 kb và protein HBxAg từ RNA 0,7 kb .

Sự sao chép hệ gen HBV kết thúc bằng sự đóng gói của bộ gen trong lõi

capsid. Tín hiệu đóng gói là một phần tử cis-acting được gọi là epsilon, có chứa cấu

trúc vòng lặp. Protein của pol tương tác với epsilon và hòa hợp với protein lõi tạo

thành nucleocapsid. Sau khi đóng gói, pol trung hòa phiên mã ngược của pgRNA

thành DNA sợi ngoại vi và tổng hợp sợi dương sau đó. Dạng DNA vòng được hoàn

thành thông qua một số bước phức tạp trong chuyển giao giữa hai sợi âm và dương.

Cuối cùng, hệ gen của virus tương tác với các protein trong lưới nội chất để tập hợp

thành virion trưởng thành, sau đó được đi ra tạo thành virus hoàn chỉnh xâm nhập

vào các tế bào khác .

1.1.3. HBV và đáp ứng miễn dịch của cơ thể

Hậu quả nhiễm HBV cũng như mức độ nghiêm trọng của bệnh lý gan do

HBV gây nên có mức độ khác nhau tùy thuộc từng cá thể. Trong khi hầu hết các

trường hợp nhiễm HBV ở tuổi trưởng thành đều có khả năng tự khỏi - cơ thể tự loại

bỏ virus, chỉ có khoảng 5% người trưởng thành nhiễm bệnh nhưng có khoảng hơn

90% trẻ sơ sinh khi nhiễm HBV sẽ tiến triển thành viêm gan mạn tính . Trong tế bào

gan của những bệnh nhân nhiễm HBV có khả năng tích lũy protein vỏ trong mạng

lưới nội chất rất lớn . Do đó, hậu quả của nhiễm HBV và mức độ nghiêm trọng của

các bệnh lý gan được xác định bởi tính chất và sức mạnh của phản ứng miễn dịch

bẩm sinh của cơ thể vật chủ .

Hình 1.2: Đáp ứng miễn dịch của đại thực bào với các thành phần của HBV

Trong tế bào gan bị nhiễm HBV, virus nhân lên sẽ giải phóng ra các thành

phần của virus như DNA, RNA, capside, được chứa trong các túi tiết, và được phát

hiện bởi hệ thống miễn dịch bẩm sinh (Hình 1.2). Hệ thống miễn dịch nhận biết bởi

các thụ thể nhận dạng mẫu bẩm sinh (PRR) có mặt trong các tế bào miễn dịch, bao

gồm các thụ thể Toll-like (TLR), thụ thể RIG-I-like (RLR), thụ thể NOD-like, các

lectin loại C và các thụ thể khác. PRR trong các tế bào miễn dịch được kích hoạt

bằng các thành phần của virus bao gồm axit nucleic của virus, oligome của protein

vỏ và nucleocapsid gây ra phản ứng tế bào:

- HBcAg (vỏ capsid) tác động tới TLR2, dẫn tới tăng tiết các cytokine như

IL6, IL10, IL12; TNF-α (Hình 1.3) .

- Các hạt HBV được hấp thụ bởi đại thực bào sẽ được nhận diện bằng các

TLR nội sinh trong đại thực bào dẫn tới việc sản xuất các chemokine, kích hoạt các

tế bào trong hệ thống miễn dịch .

- HBV-DNA hoặc HBV-RNA sẽ được các TLR của tế bào miễn dịch nhận

biết, truyền tín hiệu miễn dịch, thay đổi phiên mã và kích hoạt các tế bào. Cụ thể đối

với đại thực bào, HBV dsRNA được nhận biết bởi TLR3; HBV ssRNA được nhận

biết bởi TLR8; HBV DNA được nhận biết bởi TLR9. Sau khi các thụ thể nhận biết

các cấu trúc phân tử của virus HBV sẽ trình diện kháng nguyên, kích hoạt miễn dịch

dẫn tới sự sản xuất các yếu tố miễn dịch như cytokine (IFN-1, IL-12 và IL-18),

chemokine (CCL2, CCL3 và CXCL9), từ đó kích hoạt các tế bào miễn dịch khác

trong hệ miễn dịch bẩm sinh như tế bào NK (Natural killer, giết tự nhiên), tế bào tua

và tế bào T. Các cytokine loại I IFN (IFN-α và IFN-γ), IL-12 và IL-18 sẽ kích thích

đáp ứng miễn dịch loại 1 trong các tế bào T CD4+ và T CD8+. Các tế bào tua được

kích hoạt để trình diện các kháng nguyên virus cho các tế bào T và các tế bào T

được hoạt hóa sẽ phá vỡ những tế bào bị nhiễm (Hình 1.3) .

Hình 1.3: Đáp ứng miễn dịch của Đại thực bào và hệ gen của HBV

DNA/RNA của virus được nhận biết bởi các TLR nội sinh TLR3 (DSRNA),

TLR8 (RNA chuỗi đơn [ssRNA]) và TLR9 (DNA), dẫn đến việc truyền tín hiệu,

hoạt hóa phiên mã và kích hoạt đại thực bào cũng như trình bày kháng nguyên.

Kết quả dẫn tới các cytokine (IFN-1, IL-12 và IL-18) và chemokine (CCL2, CCL3

và CXCL9) được sản xuất thêm, hoạt hóa thêm các tế bào miễn dịch khác của hệ

thống miễn dịch bẩm sinh và thích nghi (tế bào NK, DC và T) (Hình 1.3). Quá

trình phản hồi tích cực được thông qua IFN do tế bào NK tạo ra để kích hoạt lại

các đại thực bào. Các cytokine sản xuất đại thực bào loại I: IFN (IFN-α và IFN-β),

IL-12 và IL-18 kích thích phản ứng miễn dịch loại 1 trong các tế bào T CD4 + và

CD8+. Các DC được tuyển dụng trình bày các kháng nguyên virus, bao gồm các tế

bào T gây độc tế bào CD8 + được kích hoạt, đến các tế bào T, phá hủy các tế bào bị

nhiễm bệnh (Hình 1.3).

Hình 1.4: Đáp ứng miễn dịch và cơ chế chống virus trong tế bào gan

Những cytokine và chemokine này kiểm soát trực tiếp tới sự nhân lên và lan

rộng của virus qua việc truyền tin tế bào qua con đường JAK/STAT hoạt hóa các

gen như IGSs ngăn cản sự hình thành của vỏ virus (Hình 1.4). Các thụ thể PRR

trung gian gây đáp ứng miễn dịch bẩm sinh sớm trong tế bào gan nhiễm virus cũng

được phối hợp kích hoạt và phát triển các phản ứng miễn dịch thích ứng như sản

xuất các IFN, mà mục đích cuối cùng là để loại bỏ sự xâm nhiễm của virus cũng

như tiếp tục bảo vệ cơ thể chống nhiễm trùng có khả năng xảy ra sau khi nhiễm

(Hình 1.4). Khi nhiễm HBV mạn tính, các tế bào luôn kích hoạt trạng thái miễn

dịch; các phân tử cytokine, IFN được tiết ra quá mức đáp ứng của tế bào dẫn tới sự

kích hoạt quá mức con đường tín hiệu JAK/STAT dẫn tới tăng cường biểu hiện các

oncogene .

1.2. Ung thư biểu mô tế bào gan

1.2.1 Thực trạng

Ung thư biểu mô tế bào gan là ung thư thường gặp ở Việt Nam và trên thế

giới. Tỷ lệ mắc HCC từ khoảng 5,6 đến 7,2% đứng thứ năm trong tần suất bắt gặp

và đứng thứ ba về tỷ lệ tử vong trên tổng số các loại ung thư . HCC chiếm 1% các

ca tử vong trên toàn thế giới theo số liệu năm 2004 và là nguyên nhân đứng hàng

thứ hai trong số các bệnh lý ung thư gây tử vong (chiếm 9,1% các ca tử vong do

ung thư) . Tỷ lệ mắc HCC không đồng đều ở các nơi trên thế giới, các trường hợp

mắc chủ yếu ở các nước châu Á và châu Phi (khoảng 80%). Nguyên nhân mắc HCC

ở những nước này do HBV mạn tính chiếm 40-90%. Do tỷ lệ mắc bệnh ở các khu

vực khác nhau nên cũng có sự khác biệt về tỷ lệ tử vong của bệnh ở các khu vực .

Sự tương đồng về tỷ lệ tử vong và tỷ lệ mắc của HCC cho thấy đây là bệnh

lý có tiên lượng sống kém. Thời gian sống trung bình của bệnh nhân HCC thường

dưới 1 năm sau phát hiện. Tuy nhiên nếu không được điều trị đúng và hiệu quả, thời

gian sống trung bình là dưới 5 tháng . Tỷ lệ sống sót cao hơn đối với những bệnh

nhân có thể phẫu thuật để loại bỏ khối u dù đang ở bất kì giai đoạn nào. Đối với

những người bị ung thư gan giai đoạn đầu đã ghép gan, tỷ lệ sống sót sau 5 năm

nằm trong khoảng 60% đến 70% . Do vậy để có thể phát hiện sớm nhằm điều trị

sớm cho những bệnh nhân HCC là một trong những yếu tố quan trọng giúp người

bệnh và gia đình có thêm hy vọng và nâng cao chất lượng sống.

Bảng 1.1: Giai đoạn của ung thư gan và tỷ lệ sống sót tương đối sau 5 năm

Giai đoạn SEER (Surveillance, Tỷ lệ sống tương đối sau 5 năm

Epidemiology, and End Results) Khu trú (Localized) Khu vực (Regional) Di căn (Distant) Tất cả các giai đoạn SEER kết hợp 31% 11% 2% 18%

1.2.2. Các giai đoạn của ung thư biểu mô tế bào gan

Hệ thống phân loại giai đoạn theo hệ thống phân chia giai đoạn khối u rắn -

TNM (Tumor, Note, Metastasis) đã được Ủy ban ung thư Hoa kỳ (American Joint

Committee on Cancer, AJCC) và Hiệp hội phòng chống ung thư quốc tế (Union for

International Cancer Control, UICC) thông qua từ năm 1974 và được sửa đổi theo

các ấn bản mới hơn. Hệ thống phân loại này được áp dụng theo hệ thống phân loại

AJCC phiên bản thứ 7 cho HCC .

Bảng 1.2: Tiêu chuẩn phân giai đoạn HCC theo AJCC [35]

Giai đoạn TNM Mô tả giai đoạn AJCC

Xuất hiện khối u đơn khoảng 2cm (4/5 inch), hoặc khối u nhỏ T1a chưa có sự phát triển của mạch máu. IA

Không lan đến các mạch bạch huyết gần đó hoặc tới vị trí xa. N0 M0

Xuất hiện khối u lớn hơn 2 cm (4/5 inch), tuy nhiên chưa có T1b sự phát triển của mạch máu IB

Không lan đến các mạch bạch huyết gần đó hoặc tới vị trí xa N0 M0

Một khối u có kích thước lớn hơn 2cm (4/5 inch), phát triển

đã có mạch máu hoặc có nhiều hơn một khối u tuy nhiên tổng T2

II kích thước < 5cm

Không lan đến các mạch bạch huyết gần đó hoặc tới vị trí xa

Có nhiều hơn một khối u, ít nhất một khối u lớn hơn 5cm

IIIA Không lan đến các mạch bạch huyết gần đó hoặc tới vị trí xa N0 M0 T3 N0 M0

Xuất hiện ít nhất một khối u (kích thước bất kỳ) đã phát triển

một nhánh chính của một tĩnh mạch lớn trong gan (hệ tĩnh T4

IIIB mạch cửa của gan hoặc tĩnh mạch gan)

Không lan đến các mạch bạch huyết gần đó hoặc tới vị trí xa

IVA

IVB

Một khối u đơn lẻ hoặc nhiều khối u có kích thước bất kì. Lan xa đến các mạch bạch huyết lân cận Chưa lan đến các vị trí xa Một hoặc nhiều khối u có kích thước bất kì Có hoặc không có sự lan đến các hạch bạch huyết lân cận Đã lan xa đến các cơ quan khác như xương, phổi. N0 M0 T N1 M0 T N M1

Theo thống kê của Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ được duy trì bởi viện Ung thư

Quốc gia (NIC) cho thấy tỷ lệ sống sót tương đối sau 5 năm đối với bệnh gan ở Hoa

kỳ (Bảng 1.1). Tuy nhiên cơ sở dữ liệu SEER không nhóm ung thư theo giai đoạn

TNM mà nhóm thành các giai đoạn khu trú (localized), khu vực (regional), và di

căn (distant) .

Khu trú: Không có dấu hiệu cho thấy ung thư đã lan ra ngoài gan. Giai đoạn

này bao gồm giai đoạn I, II và một số bệnh ung thư giai đoạn III theo AJCC.

Điều này bao gồm một loạt các bệnh ung thư, một số trong đó dễ điều trị hơn

những bệnh khác.

Khu vực: Tế bào ung thư đã lan ra ngoài gan, đến các cấu trúc hoặc hạch

bạch huyết gần đó. Điều này bao gồm một số bệnh ung thư giai đoạn III cũng

như ung thư giai đoạn IVA trong hệ thống phân loại AJCC.

Di căn: Ung thư đã lan đến các bộ phận xa của cơ thể, chẳng hạn như phổi

hoặc xương. Điều này bao gồm ung thư giai đoạn IVB.

Hiện nay, có nhiều phương pháp chẩn đoán HCC bao gồm chẩn đoán hình

ảnh, các dấu ấn sinh học và mô bệnh học, trong đó dấu ấn sinh học được sử dụng

trong chẩn đoán sớm, đánh giá giai đoạn và tiên lượng bệnh. Các dấu ấn HCC được

hướng tới như enzyme, isoenzyme, hormone, kháng nguyên ung thư, các epitope

carbonhydrate, các sản phẩm của gen ung thư và đột biến gen. Trong đó alpha-

fetoprotein (AFP) là dấu ấn sinh học được sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Đây là

một glycoprotein bào thai xuất hiện với nồng độ tăng ở những bệnh nhân xơ gan và

ung thư gan. Hơn 70% các trường hợp HCC có nồng độ AFP cao do sự sản xuất của

khối u . AFP cũng tăng trong trường hợp ung thư đường mật trong gan hay trong

một số trường hợp di căn từ ung thư đại tràng . Khuyến cáo của Hội Gan Mật Châu

Á Thái Bình Dương (Asian Pacific Association for the Study of Liver -APASL)

năm 2010 cũng đưa ra nhận định rằng không chỉ sử dụng AFP để chẩn đoán HCC,

nếu sử dụng AFP cần phối hợp cùng hai dấu ấn sinh học khác với ngưỡng chẩn

đoán của AFP là 200 ng/mL .

1.2.3. Ung thư gan do HBV

Nhiễm HBV có thể dẫn tới một loạt các bệnh gan khác nhau, từ cấp tính (bao

gồm cả suy gan cấp), viêm gan mạn tính, xơ gan và HCC. Nhiễm HBV gây nhiễm

trùng cấp tính có thể không có triệu chứng. Hầu hết người lớn bị nhiễm virus sẽ

phục hồi nhờ hoạt động của hệ miễn dịch tự nhiên, còn lại khoảng 5-10% những

người bị nhiễm không có khả năng loại bỏ virus, trở thành những người bị nhiễm

virus mạn tính. Trong số đó có những người bị nhiễm virus mạn tính có thể bị bệnh

gan nhẹ và nhanh lành hoặc không có bệnh. Đa phần những người bị nhiễm virus

mạn tính sẽ phát triển thành viêm gan mạn tính và có thể tiến triển thành xơ gan và

ung thư gan .

Ước tính một phần ba số người bị nhiễm HBV mạn tính cuối cùng sẽ phát

triển các biến chứng khác của bệnh và để lại những hậu quả lâu dài và nghiêm trọng

như xơ gan, chai gan hoặc HCC. Các yếu tố quyết định dẫn tới viêm gan B mạn tính

là từ hai phía, phía virus (nồng độ HBV DNA, kiểu gen HBV, một số dạng đột biến

HBV) và đặc trưng của cơ thể bị nhiễm virus (tuổi, giới tính, nền tảng di truyền,

tình trạng của hệ thống miễn dịch) .

1.2.4. Cơ chế gây ung thư của HBV

Ung thư là kết quả của sự phát triển không kiểm soát của quần thể các tế bào.

Để có thể thay đổi sinh lý tế bào dẫn đến chuyển dạng thành ung thư cần có 6 yếu

tố: (1) có khả năng tự cung cấp các tín hiệu tăng trưởng, (2) không nhạy cảm với

các tín hiệu chống tăng sinh, (3) khả năng trốn thoát khỏi con đường apoptosis, (4)

có khả năng bất tử, tăng sinh không ngừng nghỉ, (5) hình thành và duy trì mạch máu

mới, (6) có khả năng xâm lấn mô và di căn. Các yếu tố gây đột biến hay làm rối

loạn môi trường sinh lý của tế bào dẫn tới sự hoạt động bất thường của tế bào theo

hướng gây ra đầy đủ 6 yếu tố trên đều là các yếu tố nguy cơ gây ung thư .

HBV gây ung thư theo hai cơ chế chính là trực tiếp và gián tiếp thông qua

quá trình viêm mạn tính. Cơ chế trực tiếp như biểu hiện gen gây ung thư của virus

hay đột biến do chèn gen. Trong đó HBx là protein gây ung thư chính, tham gia vào

quá trình phiên mã sửa chữa DNA, qua đó HBx điều chỉnh chu kì tế bào, quá trình

apoptosis và sự mất ổn định của hệ gen . Cơ chế gián tiếp dẫn tới ung thư thông qua

quá trình viêm mạn tính là sự hoạt động bất thường của con đường tín hiệu

JAK/STAT, đặc biệt là sự xuất hiện của protein STAT3 trong nhóm protein STAT .

Các nghiên cứu cho thấy các tế bào viêm, chemokine và cytokine xuất hiện trong

môi trường vi mô của tất cả các khối u trong mô hình động vật thí nghiệm và con

người từ những giai đoạn sớm nhất của sự phát sinh ung thư. Đồng thời, sự điều trị

hướng đích vào các chất trung gian gây viêm như chemokine và cytokine (như

TNF-α và IL-1β), các yếu tố phiên mã quan trọng trong tình trạng viêm (như NF-κB

và STAT3) hay các tế bào viêm sẽ dẫn tới sự giảm tỷ lệ mắc và làm chậm khả năng

phát triển dẫn tới di căn. Ngược lại, sự truyền tế bào viêm khiến chúng biểu hiện

quá mức các cytokine gây viêm sẽ dẫn tới sự thúc đẩy của ung thư .

1.3. Con đường tín hiệu JAK/STAT

1.3.1. Cấu trúc của con đường JAK/STAT

Trong cơ thể sống, mọi hoạt động của tế bào đều có sự tương tác với môi

trường nội môi. Mỗi thụ thể trên màng tế bào có vai trò quan trọng trong tiếp nhận

các kích thích từ môi trường, truyền tín hiệu đến nhân tế bào để tế bào có hoạt động

đáp ứng lại với các kích thích đó. Kết quả của quá trình tiếp nhận và đáp ứng kích

thích của tế bào là sự tăng sinh, biệt hóa, kích hoạt, ức chế, sống sót hay bước vào

quá trình apoptosis của tế bào . Ở động vật có vú, con đường JAK/STAT là cơ chế

truyền tín hiệu tế bào chính với các thụ thể tiếp nhận thông tin của một loạt các

cytokine và các yếu tố tăng trưởng. Sự kích hoạt con đường tín hiệu JAK/STAT sẽ

kích thích tăng sinh tế bào, biệt hóa, chuyển dạng tế bào và apoptosis .

Về mặt cấu tạo, con đường truyền tín hiệu JAK/STAT có 5 thành phần chính

(Hình 1.5 và 1.6):

Các phối tử và các thụ thể. Protein JAK (Janus kinases) Protein STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) Các gen đích Các gen điều hòa

Hình 1.5: Đáp ứng miễn dịch và cơ chế chống virus trong tế bào gan [130]

Tín hiệu được truyền đi khi có sự tương tác giữa các phối tử và các thụ thể

của chúng, từ đó kích thích con đường JAK/STAT (Hình 1.5). Có nhiều nhóm các

phối tử cho con đường JAK/STAT như interleukine, cytokine, hormone,

erythropoietin .

1.3.2. Các phối tử và các thụ thể của con đường JAK/STAT

Để truyền tín hiệu thông qua homodimers hoặc heteromultimers trong con

đường truyền tin, miền phía tế bào chất (cytoplasmic domain) của hai tiểu đơn vị

thụ thể đã được gắn với phối tử phải được liên kết với axit amin tyrosine đã được

phosphoryl hóa của phân tử JAK . Miền đầu tiên là miền điều hòa không xúc tác,

miền thứ hai là miền có tyrosin được phosphryl hóa. Họ protein JAK bao gồm bốn

thành viên: JAK1, JAK2, JAK3 và Tyk2. Kích hoạt JAK xảy ra khi phối tử gắn với

các thụ thể trung gian làm thay đổi cấu trúc của hai thụ thể dẫn tới việc hai protein

JAK được đưa đến gần nhau, cho phép chuyển hóa phosphoryl hóa giữa hai protein

JAK. Các protein JAK được kích hoạt sau đó phosphoryl hóa các mục tiêu bổ sung,

bao gồm cả các thụ thể và các protein STAT .

Các phối tử của con đường gồm hai nhóm:

Các yếu tố của quá trình viêm: IL-6; IL-11; IL-12 (p40+p35); IL-3; IL-5;

Chemokines; IL-2; IL-4; IL-7; IL-9; IL-13; IL-15; IL-19; IL-20; IL-21; IL-

22; IL-23 (p40+p19); IL-24; IL-26; IL-27 (EBI3+p28); IL-28A, IL-28B, IL-

29; IL-31; IL-35 (p35+EBI3); Interferon (IFNα/β); IFN-γ; IL-10; TLSP . Các phối tử khác: EGF; PDGF; CNTF, CT-1, LIF, OSM; G-CSF; Angiotensin;

Serotonin; α-Thrombin; GH; Tpo; Epo, Pro; GM-CSF; Leptin . Phối tử sau khi gắn với thụ thể sẽ hoạt hóa các protein JAK và STAT tương

ứng dẫn tới họa hóa phiên mã của các gen trong tế bào gan đáp ứng với những tín

hiệu nhận được từ phối tử. Các phối tử, thụ thể kích hoạt JAK và STAT được thể

hiện cụ thể trong Bảng 1.3 dưới đây.

Bảng 1.3: Các phối tử của con đường JAK/STAT và đích truyền tín hiệu

Thành viên họ

Phối tử

Thụ thể

JAK

STAT

IL-6

IL-6Ra+gp130

JAK1, 2, TYK2

STAT1, STAT3

IL-11

IL-11R+gp130

JAK1, 2, TYK2

STAT3

CNTF, CT-1, LIF,

CNTFR+gp130, CT-

JAK1, 2, TYK2

STAT3; STAT1,

OSM

1R+gp130, LIFR+gp130,

STAT5

OSMR+gp130

IL-12 (p40+p35)

IL-12Rβ1+IL-12Rβ2

JAK2, TYK2

STAT4

LeptinR

JAK2

STAT3, 5, 6

Leptin

IL-3Rα+βc

JAK2

STAT3, 5, 6

IL-3

IL-5R+βc

JAK2

STAT3, 5, 6

IL-5

CXCR4

JAK2, 3

Chemokines

IL-2Rα+IL-2Rb+γc

JAK1, 2, 3

STAT3, 5

IL-2

IL-4Rα+γcR or IL-4Rα+IL-

JAK1, 3

STAT6

IL-4

13Rα1

IL-7R+γc

JAK1, 3

STAT3, 5

IL-7

IL-9R+γc

JAK1, 3

STAT1, 3 ,5

IL-9

STAT6

IL-13Rα1+IL-4Rα

JAK1, 2, TYK2

IL-13

JAK1, 3

STAT3, 5

IL-15Rα+IL-2Rβ+γc

IL-15

JAK1,

STAT3

IL-20Rα+IL-20Rβ

IL-19

IL-20Rα+IL-20Rβ, IL-

IL-20, IL-24

JAK1,

STAT3

22R+IL-20Rβ

IL-21R+γc

JAK1, 3

STAT1, 3, 5

IL-21

IL-22R+IL-10Rβ

JAK1, TYK2

STAT1, 3, 5

IL-22

IL-20Rα+IL-10Rβ

JAK1, TYK2

STAT3

IL-26

IL-27

gp130+WSX1

JAK1, 2, TYK2

STAT1, 2, 3, 4, 5

(EBI3+p28)

IL-28A, IL-28B,

IL-28R+IL-10Rβ

JAK1, TYK2

STAT1, 2, 3, 4, 5

IL-29

IL-31Rα+OSMR

JAK1, 2, TYK2

STAT1, 3, 5

IL-31

GHR

JAK2

STAT3, 5

EpoR, ProlactinR

JAK2

STAT5

Epo, Pro

Interferon

IFNAR1+IFNAR2

JAK1, TYK2

STAT1, 2, 3, 4, 5

(IFNα/β)

IFN-gR1+IFN-γR2

JAK1, JAK2

STAT1

IFN-γ

IL-10Rα+IL-10Rβ

JAK1, TYK2

STAT1, 3, 5

IL-10

TLSPR và IL-7R

JAK1, JAK2

STAT3, 5

TLSP

EGFR

JAK1

STAT1, 3, 5

EGF

1.3.3. Cơ chế truyền tin của con đường JAK/STAT

Mỗi thành viên họ JAK gồm 4 miền riêng biệt thực hiện vai trò và chức năng

khác nhau. Miền FERM bao gồm ba miền phụ F1, F2, F3 có cấu trúc giống như các

miền Ubiquitin, liên kết CoA và pleckstrin tương ứng chịu trách nhiệm cho các liên

kết protein-protein như sự tương tác của các protein JAK/STAT với các protein trên

màng tế bào (Hình 1.6) . Miền SH2 (Src tương đồng 2) chứa khoảng các 100 axit

amin sẽ liên kết với phosphotyrosine của protein STAT, vai trò của miền SH2 là kích

hoạt và thu nhỏ các STAT (Hình 1.6) . Miền pseudokinase được đặt tên vì tương đồng

với miền Protein Tyrosine Kinase (PTK); tuy nhiên, miền này thiếu chức năng xúc

tác và dường như có vai trò điều tiết . Cuối cùng, một miền PTK bảo tồn nằm ở đầu

C của phân tử, chứa khoảng 250 axit amin và một vị trí gắn ATP nối liền với vùng

xúc tác. Nó chịu trách nhiệm cho quá trình phosphoryl hóa các axit amin tyrosine cụ

thể được định vị trên các chất nền đặc biệt (Hình 1.6).

Hình 1.6: Sơ đồ biểu diễn cấu trúc các thành phần của con đường JAK-STAT

Protein STAT là một họ gồm 7 thành viên được mã hóa bởi các gen riêng biệt

là: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT6, STAT5A và STAT5B , chúng đều có vai trò

kép là truyền tín hiệu qua tế bào chất và hoạt động như các yếu tố phiên mã ở trong

nhân . STAT được phát hiện thông qua khả năng trung gian truyền tín hiệu từ các

thụ thể INF và IL-6. Các thụ thể cytokine thường không có hoạt tính tyrosine kinase

(đính gốc phospho vào acid amin trosin) nội tại, thay vào đó sẽ kích hoạt tính

tyrosine kinase của các thụ thể liên quan, trong đó nổi bật nhất là kinase Janus

(JAK) .

Hình 1.7: Sơ đồ hoạt hóa STAT

STAT là các yếu tố phiên mã tiềm ẩn cư trú trong tế bào chất cho đến khi

được kích hoạt. Động vật có vú có bảy protein STAT, chúng có các axit amin

tyrosine xuất hiện phía gần đầu C của phân tử và các acid amin sẽ được phosphoryl

hóa bởi JAK. Phosphotyrosine này cho phép thu nhỏ STAT thông qua tương tác với

miền SH2. Sau khi phosphoryl hóa, hai protein STAT sẽ tạo thành dạng dimer (mỗi

phân tử STAT đã được phosphoryl hóa sẽ liên kết với acid amin tyrosine đã được

gắn gốc phospho của phân tử STAT đã được phosphoryl hóa khác - Hình 1.7) .

Dạng dimer của hai phân tử STAT đóng vai trò là một yếu tố kích hoạt quá trình

phiên mã. Sau khi di chuyển vào trong nhân, nó sẽ liên kết với các gen đích trên

chuỗi DNA dẫn tới sự hoạt hóa các gen đích (Bảng 1.4-6). Sự bất hoạt xảy ra khi

nhóm phosphastase loại bỏ các gốc phosphate từ các protein khác nhau trong con

đường truyền tín hiệu .

Hình 1.8: Protein STAT điều chỉnh miễn dịch thích ứng ung thư

Với các phối tử là sản phẩm của quá trình viêm, việc kích hoạt bởi các thụ

thể cytokine khác nhau sẽ dẫn tới sự hình thành các phân tử STAT hoạt động. Mỗi

phân tử STAT dạng dimer sẽ liên kết với một chuỗi DNA cụ thể được tìm thấy trong

các yếu tố điều hòa sự hoạt hóa phiên mã của các gen nhất định. Theo hoạt động

này, mỗi cytokine sẽ kích hoạt một gen hoặc một nhóm gen cụ thể tạo nên đáp ứng

của tế bào .

STAT1 và STAT4 thúc đẩy các tế bào T biệt hóa thành tế bào T hỗ trợ 1 (T

helper 1-TH1) và biểu hiện thụ thể interleukin-12 (IL-12R). Tín hiệu IL-12R thông

qua STAT4 (dạng phosphoryl hóa hoạt hóa của STAT4-p-STAT4) tiếp tục thúc đẩy

biệt hóa thành các tế bào TH1 dẫn đến biểu hiện interferon-γ (IFN-γ) (Hình 1.8).

Trong môi trường có các tế bào TH1, các phản ứng miễn dịch thích nghi kiểm soát

sự phát triển của khối u. Các tế bào T CD8+ có một vai trò quan trọng trong việc

gây độc tế bào chống lại các tế bào khối u. Các tế bào T điều hòa (Regulatory T cell

- Treg) là các tế bào điều hòa âm quan trọng của khả năng miễn dịch chống khối u.

STAT5 rất quan trọng cho biệt hóa và hoạt động của tế bào Treg (Hình 1.8). STAT5

và STAT3 đều góp phần vào biểu hiện của P3, một điểm đánh dấu cho các tế bào

TReg. Đồng thời, hoạt hóa STAT3 trong các tế bào Treg của khối u thúc đẩy sự biểu

hiện của IL-10 và biến đổi yếu tố tăng trưởng (TGFβ)-chất trung gian của các chức

năng ức chế tế bào TReg, dẫn đến điều hòa phản ứng miễn dịch chống khối u. Với

sự biểu hiện của IL-6, TGFβ và IL-23 tăng lên đều có thể được điều chỉnh bởi

STAT3 trong môi trường vi mô khối u, các tế bào TH17 phát triển và tạo ra IL-17.

IL-17 kích hoạt STAT3 trong các tế bào miễn dịch và các tế bào cơ địa khác trong

môi trường vi mô khối u thông qua IL-6, sự hoạt động này có thể thúc đẩy hơn nữa

sự phát triển của khối u (Hình 1.8) .

Bảng 1.4: STAT1, STAT4 và các gen đích hoạt hóa phiên mã

Gen đích của STAT1

Gene A2M APOE B3GAT3 BCL6 CASP4

Gene Vị trí GATA3 12p13.3 19q13.2 GBP1 11q12.3 HSPB1 HSPCA ICAM1

3q27 11q22.2

Gene Vị trí PBF 10p15 JUN 1p22.2 LTC4S 7q11.23 14q32.33 MAT2A 19p13.3

Vị trí 8p21.1 1p32-31 5q35 2p11.2 7q31

Gene REV3L RNMT SEC6L1 SOCS3 TAP1

Vị trí 6q21 18p11.22 5p15.33 17q25.3 6p21.3

MET MHC2T

CLC

19q13.1

IFNA1

9p22

16p13

TIMP1

Xp11.3

CLC CDKN1A

11q13.3 6p21.2

IFNG IL2RA

12q14 10p15

A MUC1 MYC

1q21 8q24.12

22q12.3 4q32

TIMP3 TLR2 TNFRSF

CSF1

1p21-13

IL6ST

5q11

PIM1

6p21.2

20q12

CYP19A

15q21.1

IRF1

5q31.1

PLAU

10q24

5 TNFRSF

1p36

8 TP53 VIP VIP

17p13.1 19p13.12 6q25

1 EGFR FCGR1A FCGR3A FOS

7p12 1q21.2 1q23 14q24.3

IRF7 JAK3 NOL3 NOS2A

11p15.5 19p13.1 16q21 17q11.2

PRF1 PSMB9 PTGFR REG1A

10q22 6p21.3 1p31.1 2p12

Gen đích của STAT4

AICDA

12p13

IL2RA

10p15-14

MYC

8q24.12

PIM1

6p21.2

IFNG

12q14

IRF1

5q31.1

PBF

8p21.1

PRF1

10q22

Các nghiên cứu gần đây đã đưa ra bằng chứng cho thấy vai trò quan trọng

của nhóm protein STAT đặc biệt là STAT3 trong chọn lọc, tạo ra và duy trì môi

trường vi mô có các yếu tố gây viêm tạo chọn lọc dương dẫn tới ung thư và thúc

đẩy sự phát triển của bệnh dẫn tới quá trình chuyển đổi ác tính (Hình 1.9) . STAT3

được coi là nguyên nhân dẫn tới sự phát triển của khối u có liên quan tới sự thay đổi

di truyền trong các tế bào ác tính hay từ các yếu tố môi trường như các chất hóa học

gây ung thư, tia cực tím, nhiễm trùng, hút thuốc lá và căng thẳng .

Hình 1.9: Protein STAT điều chỉnh miễn dịch thích ứng ung thư

STAT3 đưa từ trạng thái viêm tới ung thư tế bào gan qua hai con đường là

nội bào và môi trường. Con đường nội bào được kích hoạt bởi sự thay đổi di

truyền hoặc biểu hiện các gen trong các tế bào bị biến đổi dẫn tới ung thư (Hình

1.9). Những thay đổi này bao gồm những yếu tố gây ra sự biểu hiện quá mức hoặc

kích hoạt liên tục các thụ thể của các yếu tố tăng trưởng với hoạt động tyrosine

kinase nội bào và thụ thể cytokine với các tyrosine kinase liên quan đến JAK . Các

đột biến gây ung thư ở các thành viên họ JAK liên quan đến thụ thể cũng là

nguyên nhân của một số loại ung thư. Cũng giống như các tyrosine khi được hoạt

hóa bằng cytokine, các protein STAT có thể được kích hoạt bằng con đường bên

ngoài như là các yếu tố môi trường có liên quan đến viêm ung thư bao gồm: tia

cực tím (UV), chất gây ung thư hóa học, nhiễm trùng, căng thẳng và khói thuốc lá.

JAK được kích hoạt gây ra bởi cả sự phosphoryl con đường bên trong và bên

ngoài tế bào tác động tới STAT3, từ đó hình thành trạng thái dimer di chuyển vào

nhân tế bào, nơi chúng trực tiếp điều hòa biểu hiện gen . Ngoài việc điều hòa

nhiều gen liên quan đến sự tăng sinh, sống sót, xâm lấn và di căn, STAT3 còn gây

ra biểu hiện của nhiều cytokine, chemokine và các chất trung gian khác, như

interleukin-6 và cyclooxygenase 2, có liên quan đến viêm nhiễm ung thư. Điều

quan trọng là các thụ thể của nhiều cytokine, chemokine và các chất trung gian

này lần lượt kích hoạt STAT3, do đó hình thành các vòng lặp tiết và truyền tín hiệu

tự động dẫn đến thay đổi ổn định chương trình di truyền và thúc đẩy viêm dẫn tới

ung thư (Hình 1.9) .

Bảng 1.5: STAT3 và các gen đích hoạt hóa phiên mã

Gen đích của STAT3

Gen A2M

Vị trí 12p13.3

Vị trí 14q24.3

Gen MIA2

Vị trí 14q13.2

Gen SOCS3

Vị trí 17q25.3

Gen FOS HMOX

B3GAT3

11q12.3

22q13.1 MUC1

1q21

SOS1

2p22-21

BCL2 BCL2L1 BIRC5

18q21.3 20q11.21 17q25

6p12 19p13.1 12q22-23

3q29 8q24.12 16q21-23

STRA13 TIMP1 TIMP3

17q25.3 Xp11.3 22q12.3

1 VEGF JAK3 IGF1

MUC4 MYC NOL3 NOS2

CCL2

17q11.2

IL10

1q31-32

17q11.2

TLR2

4q32

CCND1

11q13

IL2RA

10p15-14

22q12.2

6p21.3

A OSM

TNF TNFRSF

CCND3

6p21

IL6

7p21

OXTR

3p25

20q12

CDKN1

5 TNFRSF

6p21.2

IL6ST

5q11

PBF

8p21.1

10q24.1

6 TNFRSF

CEBPB

20q13.1

IRF1

5q31.1

CSRP1

1q32

1p36

Với vai trò trung tâm trong viêm và ung thư, tín hiệu truyền của các STAT

khác nhau đặc biệt là STAT3 có liên hệ chặt chẽ với yếu tố NF-κB và cytokine. Các

yếu tố này không chỉ được kích hoạt liên tục trong ung thư mà còn cần thiết trong

quá trình truyền tín hiệu qua tế bào chất từ các kích thích ngoại bào. Chúng hoạt

động như các yếu tố hoạt hóa phiên mã cần thiết điều hòa sự hoạt động của các

oncogene như là các gen liên quan đến tăng sinh khối u, sinh sản và tồn tại của các

tế bào u, tạo mạch và xâm lấn (Bảng 1.5). Về mặt cấu trúc và tương tác hóa học,

STAT3 tương tác với yếu tố NF-κB ở nhiều cấp độ khác nhau tùy theo tín hiệu nhận

từ môi trường . Trong khối u, STAT3 tương tác trực tiếp với các thành viên của họ

yếu tố nhân (NF), giữ chúng lại trong nhân góp phần kích hoạt hoạt động của NF-

κB trong các tế bào ung thư . Việc hoạt động bất thường bằng cách kích hoạt các

gen này trái ngược với điều kiện sinh lý bình thường rất quan trọng đối với quá

trình viêm và sự phát triển ác tính. Trong đó, tín hiệu STAT3 là một trong những tín

hiệu chính cho viêm dẫn tới ung thư vì nó thường được kích hoạt trong các tế bào

ác tính và có khả năng hoạt hóa lượng lớn các gen quan trọng cho tình trạng viêm.

Ngoài ra, STAT3 còn được kích hoạt bởi các yếu tố tăng trưởng và sự phosphoryl

hóa tyrosine như yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) và thụ thể yếu tố tăng trưởng

có nguồn gốc tiểu cầu (PDGFR), trong số nhiều thụ thể yếu tố tăng trưởng

polypeptide khác, cũng như các tyrosine kinase không thụ thể. Đây là các yếu tố

dẫn tới sự hoạt động của STAT3 và thường xuyên bị hoạt hóa quá mức trong các

khối u rắn .

Mặc dù rất quan trọng với vai trò gây ra ung thư từ các tình trạng viêm

nhiễm mạn tính, NF-κB vẫn có vai trò trung gian không thể thiếu cho các phản ứng

miễn dịch chống khối u . Ngược lại khi kích hoạt STAT3 dẫn tới sự hạn chế các

phản ứng miễn dịch chống khối u bằng việc làm giảm sự biểu hiện của kháng thể

kháng NF-κB và STAT1 của các cytokine chống khối u như IL-12 và IFN-γ. Tín

hiệu STAT3 trong các tế bào miễn dịch bẩm sinh có tác dụng ức chế miễn dịch và

thúc đẩy khối u của các tế bào ức chế có nguồn gốc tủy xương và các đại thự bào

liên quan đến khối u . STAT3 cũng làm trung gian cho sự phát triển mở rộng tế bào

điều hòa trong các khối u và là yếu tố có thể thúc đẩy sự phát triển của khối u .

Ở một mức độ nào đó, STAT5 và STAT6 có liên quan tới việc ức chế quá

trình miễn dịch chống khối u (Bảng 1.6) . STAT5 và STAT6 được kích hoạt liên tục

trong các khối u ác tính tạo máu khác nhau . Cả STAT5 và STAT6 đã được chứng

minh là điều hòa tăng hoạt động của các gen quan trọng cho sự sống sót và tăng

sinh khối u khi được kích hoạt liên tục trong các tế bào khối u. Kết quả là, việc kích

hoạt liên tục một số STAT, đặc biệt là STAT3, làm trung gian cho việc lan truyền

viêm thúc đẩy khối u và ức chế miễn dịch chống khối u.

Bảng 1.6: STAT 5, STAT6 và các gen đích hoạt hóa phiên mã

Gen đích của STAT5

BCL2

18q21.3

EGFR

7p12

MET

RARA

17q21

7q31

BCL2L1

20q11.21 ESR1

6q25.1 MUC1

RNMT

18p11.22

1q21

BCL6

3q27

ESR2

14q

OSM 22q12.2

SEC6L1

5p15.33

CCND1

11q13

IFNG

12q14

PAX5

9p13

TIMP3

22q12.3

12q22-

CCND2

12p13

IGF1

PBF

8p21.1

TNF

6p21.3

TNFRSF

CCND3

6p21

IL2RA

10p15

PIM1

6p21.2

20q12

Gen đích của STAT6

CCL1

NCOA

ADAM8

10q26.3

17q21.1

20q12

TNF

6p21.3

ALOX15

17p13.3

IRF1

5q31.1

SELE

1q22-25

1.3.4. Điều hòa con đường JAK/STAT

1.3.4.1. Các protein ức chế con đường truyền tín hiệu JAK/STAT

Cytokine là một họ glycoprotein lớn được sản xuất và điều chỉnh các quá

trình sinh học cơ bản bao gồm: miễn dịch, tạo máu. Cytokine truyền thông tin tới

các tế bào đích bằng việc liên kết với các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt của tế bào. Sự

liên kết của cytokine với thụ thể bề mặt dẫn tới sự hoạt động của JAK thông qua

quá trình phosphoryl chéo với tyrosine trong miền tế bào chất của thụ thể cytokine

nơi có các miền miền Src homology 2 (SH2) hay liên kết phosphotyrosine (PTB). ‐

Theo cách này, sự truyền tín hiệu của cytokine qua thụ thể trên bề mặt của tế bào

qua nhiều lớp trung gian truyền tín hiệu như các chuỗi protein bao gồm RAS,

phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K), phospholipase C γ, và tín hiệu truyền và hoạt ‐ ‐

hóa phiên mã (STATs). Những con đường này kết hợp với nhau trong quá trình biểu

hiện của gen ở trong nhân dẫn tới sự biệt hóa cả tế bào đích, tăng sinh sống sót, kích

hoạt hoặc thoát khỏi con đường apoptosis .

Hình 1.10: Cơ chế phân tử của protein SOCSs khi điều hòa các tín hiệu cytokine Vai trò truyền tín hiệu của các cytokine là rất quan trọng trong hoạt động của

tế bào và cơ thể. Sự rối loạn đường truyền tín hiệu hay sự hoạt động quá mức của

cytokine gây ra một loạt các bệnh về miễn dịch như dị ứng, tự miễn, viêm mạn tính,

và ung thư. Các con đường dẫn truyền tín hiệu do cytokine gây ra phải được kiểm

soát chặt chẽ để tránh hậu quả bất lợi của việc kích thích quá mức. Trong số đó, tín

hiệu cytokine và con đường JAK-STAT đóng vai trò quan trọng và thiết yếu trong

quá trình biệt hóa, trưởng thành, tăng sinh và apoptosis của nhiều loại tế bào, có liên

quan đến sự khởi đầu và phát triển của ung thư. Khi quá trình viêm nhiễm kéo dài

dẫn tới sự rối loạn hoạt động của các con đường truyền tín hiệu trong tế bào cụ thể

là con đường JAK/STAT . Gần đây, các nghiên cứu đã cho thấy có ít nhất ba nhóm chất ức chế khác

nhau điều hòa âm đối với tín hiệu cytokine đó là protein tyrosine phosphatases (như

là SHP 1 và CD45), protein ức chế sự hoát hóa của STATs (PIAS) và protein ức chế ‐

tín hiệu cytokine (Suppressor of cytokine signaling - SOCS) proteins. Cytokine kích

hoạt con đường JAK/STAT, dẫn đến sự hoạt động của các gen họ SOCS mã hóa các

protein CIS, SOCS1, SOCS2 và/hoặc SOCS3. Những protein SOCS này sau khi

được mã hóa sẽ thực hiện chức năng ức chế các đường dẫn tín hiệu của cytokine

ban đầu, tín hiệu mà kích hoạt mã hóa chúng. Protein SOCS hoạt động trong một

phần của vòng điều hòa âm (Hình 1.10) . Mặc dù STATs có liên quan mật thiết với

những thay đổi và các bước chuyển dạng từ tế bào lành tới tế bào ung thư nhưng đột

biến của STATs là ít xảy ra . Do đó, sự điều hòa của các protein của họ SOCS tới

con đường JAK/STAT là một trong những cơ chế dẫn tới sự hoạt động bất thường

của STAT được chứng minh là có liên quan tới sự nhân lên của virus và sự hình

thành cùng với phát triển của khối u do nhiễm virus .

Các protein SOCS đã được nghiên cứu và cho thấy chúng liên quan đến việc

điều hòa tín hiệu của hơn 30 loại cytokine bao gồm inteleukin (IL)-6, yếu tố ức chế

bạch cầu, leptin, yếu tố tăng sinh bạch cầu hạt (G-CSF), IL-10, hormone tăng

trưởng. Các dòng tế bào và hệ thống biểu hiện đã được sử dụng để đánh giá, xác

định vai trò của các protein tương tác với SOCS và các cytokine bị ức chế bởi

SOCS .

Bảng 1.7: Chức năng, vai trò của SOCS trong sinh lý

SOCS Vai trò trong tín hiệu Cytokine Tài liệu tham khảo

CISH hormone sinh trưởng, prolactin, IL-2

SOCS1 IFN-γ, IL-2 γc, IL-4

SOCS2 hormone sinh trưởng

SOCS3 G-CSF, IL-6, LIF, IL-23, leptin

SOCS4 Chưa biết

SOCS5 IL-4

SOCS6 Insulin

SOCS7 Insulin

Nghiên cứu trên mô hình chuột viêm nhiễm đa cơ quan cho thấy: SOCS1 có

vai trò quan trọng trong điều hòa âm các tín hiệu interferon loại 1, loại 2 và γ c -

cytokine phụ thuộc vào tế bào T homeostasis qua thụ thể Toll-Like (TLR) và

SOCS1 . CISH và SOCS2 đều có vai trò trong truyền tín hiệu hormone tăng trưởng.

Chuột chuyển gen CISH giống với chuột thiếu gen STAT5 đều có khiếm khuyết về

tăng trưởng và tiết sữa do giảm tín hiệu của hormone tăng trưởng và prolactin.

Chuột chuyển gen CISH tăng cường tín hiệu TCR và làm giảm tín hiệu truyền của

IL-2. Chuột thiếu SOCS2 sẽ dẫn đến sự giảm mặt độ tế bào thần kinh và sự biệt hóa

tế bào thần kinh diễn ra bất thường do rối loạn tín hiệu hormone . Chuột thiếu gen

SOCS4 chưa được báo cáo, chuột thiết gen SOCS5 và SOCS6 không biểu hiện quá

nhiều về mặt kiểu hình tuy nhiên xóa gen SOCS7 trên chuột đã thấy rõ vai trò quan

trọng của nó trong điều hòa tín hiệu insulin .

1.3.4.2. Protein Tyrosine phosphatase (PTPs) điều hòa con đường JAK/STAT

PTP là nhóm protein thứ ba ức chế chức năng truyền tin của con đường

JAK/STAT. Chúng bao gồm một số protein khác nhau và tyrosine dephosphorylate

liên quan đến con đường truyền tín hiệu, do đó điều hòa hoạt động JAK/STAT. Một

trong số PTPs là CD45. CD45 là một thụ thể được biểu hiện cao bởi các tế bào máu,

đặc biệt là tế bào B và T. Nó liên kết trực tiếp với tất cả các loại JAK và cũng có thể

loại bỏ phospho khỏi tyrosine điều hòa của họ Src, tạo điều kiện cho chúng hoạt

động trở lại trong bộ kích hoạt tín hiệu tiếp theo. Họ Src tyrosine kinase tham gia

vào quy định một số lượng lớn các con đường truyền tín hiệu trong các tế bào miễn

dịch. Các nghiên cứu trên các tế bào CD45-/- cho thấy sự phosphoryl hóa JAK tăng

đáng kể và việc loại bỏ CD45 giúp tăng cường sự tạo ra các khuẩn lạc hồng cầu

cũng như cả khả năng chống virus, trong đó nhấn mạnh đến vai trò của CD45 trong

điều hòa âm tính tín hiệu EPO và IFN .

Ngoài ra, các protein khác điều chỉnh chức năng của các phân tử tín hiệu

cũng góp phần điều hòa hoạt động con đường JAK/STAT. Protein-tyrosine

phosphatase 1B (PTP1B) và PTP tế bào T (TCPTP) đã được báo cáo thông qua các

nghiên cứu nhắm mục tiêu gen. Trên thực tế, chúng được phân loại trong nhóm PTP

và được đánh giá là có vai trò quan trọng trong quá trình khử phospho JAK. PTP1B

có thể ức chế hoạt hóa của JAK2 và TYK2 nhưng JAK1 không liên quan .

1.4. Tính thiết yếu của đề tài

Với thực trạng hiện nay về HCC và vai trò của con đường truyền tín hiệu

JAK/STAT đã đặt ra thực tế cần hiểu biết một cách tổng thể và toàn diện hơn về

con đường truyền tín hiệu JAK/STAT và vai trò của nó trong sự hình thành và phát

triển của HCC. Cho đến nay, trên thế giới đã và Việt Nam có nhiều nghiên cứu về

sự biểu hiện của các gen liên quan tới con đường JAK/STAT trong ung thư cũng

như HCC. Tuy nhiên chưa có công bố nào nghiên cứu đối tượng HCC ở Việt Nam

một cách toàn diện về biểu hiện của các gen liên quan đến con đường tín hiệu

JAK/STAT. Đề tài của chúng tôi thực hiện trên mRNA từ mẫu mô u và lân cận u

(LCU) của bệnh nhân HCC với mong muốn đánh giá mức độ biểu hiện của 76 gen

có liên quan tới con đường JAK/STAT. Từ sự đánh giá mức độ biểu hện của 76 gen

ở mô u và mô lành lân cận, chúng tôi có thể tìm hiểu sự khác biệt và mối liên hệ

giữa biệu hiện của các gen ở hai nhóm mô. Với sự đánh giá biểu hiện của các gen

nghiên cứu, chúng tôi có thể tìm ra mối liên quan giữa biểu hiện của các gen liên

quan tới con đường tín hiệu JAK/STAT với thông số lâm sàng và cận lâm sàng của

bệnh nhân HCC. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi góp phần bổ sung hiểu biết về

vai trò của con đường tín hiệu JAK/STAT trong quá trình bệnh sinh của HCC. Qua

đó có thể định hướng nghiên cứu sâu hơn về cơ chế gây HCC và tìm ra đích điều trị

hiệu quả cho bệnh nhân HCC.

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thực nghiệm mô tả.

Cỡ mẫu nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trên 37 bệnh nhân HCC

được chẩn đoán và điều trị tại bệnh viện K cơ sở 3, Tân Triều – Hà Đông – Hà Nội

2.2. Sơ đồ nghiên cứu

Sơ đồ nghiên cứu.

Hình 2.11: Sơ đồ nghiên cứu của đề tài

2.3. Lựa chọn đối tượng, thu thập và bảo quản mẫu nghiên cứu

2.3.1. Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên đối tượng là bệnh nhân ung thư biểu mô tế

bào gan được xác định bởi các bác sĩ bệnh viện K cơ sở 3 dựa trên những kết quả

lâm sàng và cận lâm sàng.

2.3.2. Tiêu chuẩn chọn mẫu

Bệnh nhân ung thư tế bào gan được chẩn đoán theo khuyến cáo của hiệp hội

gan mật Hoa Kỳ (AASLD) năm 2010 với các tiêu chí:

Khối u gan có kích thước > 2cm và ngấm thuốc điển hình trên phim chụp

gan hay có bằng chứng mô bệnh học.

Những bệnh nhân được chẩn đoán HCC có nhiễm HBV trải qua phẫu thuật,

và mẫu mô nghiên cứu được lấy ở hai vị trí:

- Tại vị trí khối u: mẫu mô u.

- Tại vị trí lân cận u: mẫu mô lành.

Mẫu mô được bảo quản bằng dung dịch Trizol trong ống ependorf 1,5mL nắp

vặn tại tủ âm 80oC.

Thao tác chẩn đoán phẫu thuật và lấy mẫu được các bác sĩ chuyên môn của

bệnh viện K cơ sở 3 Tân Triều - Hà Đông - Hà Nội thực hiện.

2.3.3. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

Bảng 2.8: Dụng cụ hóa chất chính dùng trong nghiên cứu

Tên hóa chất thiết bị

Micropipet một kênh và micropipet đa kênh Máy ly tâm Máy ủ lắc Máy ổn nhiệt QuantiGene Plex Assay Kit (1 & 3 Plate Kit) QIAamp® Viral RNA Nhà cung cấp Eppendrof – Đức Hettich – Đức Thermo – Hoa Kỳ Thermo – Hoa Kỳ Thermo – Hoa Kỳ Thermo – Hoa Kỳ

Vật dụng tiêu hao (đầu côn, ống eppendorf .....) Corning – Hoa Kỳ

2.4. Phương pháp và kỹ thuật sử dụng

2.4.1. Phương pháp tách chiết RNA

RNA của các tế bào trong từng cặp mô của bệnh nhân HCC sẽ được tách

chiết và thu lại bởi kit tách chiết RNA tổng số QIAamp Viral RNA với quy trình

tách như sau:

- Bước 1: Nghiền nhỏ mẫu mô: Mẫu mô ung thư gan và mẫu mô gan từ các

bệnh nhân ung thư trải qua phẫu thuật được nghiền nhỏ trong môi trường Nitơ

lỏng để đảm bảo RNA không bị phân hủy.

- Bước 2: Hút 560 µL đệm AVL đã được chuẩn bị vào ống ly tâm 1,5mL. - Bước 3: Thêm 140 µL tế bào mô đã được chuẩn bị vào ống ly tâm 1,5mL có

chứa đệm AVL. Mix bằng máy vortex trong 15giây. - Bước 4: Ủ tại nhiệt độ phòng (15–25°C) trong 10 phút. - Bước 5: Ly tâm nhanh ống, để loại dịch từ trên nắp xuống dưới ống. - Bước 6: Thêm 560 µL ethanol (96–100%) vào mẫu, mix đều bằng máy vortex

trong 15 giây sau đó ly tâm ngắn cho dịch từ trên nắp và thành ống xuống. Chỉ

sử dụng ethanol, vì các rượu khác có thể làm giảm hiệu suất tách và độ tinh

sạch của RNA. Không sử dụng cồn biến tính, có chứa các chất khác như

methanol hoặc methylethylketone.

- Bước 7: Cẩn thận chuyển 630 µL từ Bước 5 vào cột QIAamp Mini (trong ống

collection), tránh giây lên miệng hay thành cột. Đóng nắp và ly tâm ở 6000 xg

(8000 vòng/phút) trong một phút. Sau đó, đặt cột QIAamp Mini vào ống thu

2mL sạch và loại bỏ ống thu cũ chứa dịch. Đóng từng cột khi ly tâm để tránh

nhiễm bẩn chéo trong quá trình ly tâm.

- Bước 8: Cẩn thận mở nắp cột QIAamp Mini và lặp lại bước 6. - Bước 9: Cẩn thận mở nắp QIAamp Mini và thêm 500 µL đệm AW1. Đóng nắp

và ly tâm tại 6000 xg (8000 vòng/phút) trong 1 phút. Đặt cột QIAamp Mini

vào ống thu 2mL sạch và loại bỏ ống thu cũ chứa dịch. - Bước 10: Cẩn thận mở nắp QIAamp Mini và thêm 500 µL đệm AW2. Đóng

nắp và ly tâm tại mức tối đa (20000 xg hoặc 14000 vòng/phút) trong 3 phút.

Sau đó loại bỏ dịch trong ống thu 2mL. - Bước 11: Đặt cột QIAamp Mini vào ống thu 2 mL mới. Ly tâm ở tốc độ tối đa

(20000 xg hoặc 14000 vòng/phút) trong một phút. - Bước 12: Đặt cột QIAamp Mini vào ống ly tâm 1,5 mL sạch (không được

cung cấp). Loại bỏ ống thu cũ chứa dịch lọc. Cẩn thận mở cột QIAamp Mini,

thêm 60 µL đệm AVE cân bằng với nhiệt độ phòng. Đóng nắp và ủ ở nhiệt độ

phòng trong một phút. - Bước 13: Ly tâm tại 6000 xg (8000 vòng/phút) trong một phút. Thu dịch chứa

RNA tổng số và bảo quản -80oC

2.4.2. Quang phổ hấp thụ đo nồng độ RNA

Axit nucleic hấp thụ mạnh ở vùng tia tử ngoại, và hấp thụ mạnh nhất tại

bước sóng 260 nm. Dựa trên nguyên lý này có thể xác định nồng độ DNA và RNA

trong dung dịch. Phương pháp đo quang phổ hấp thụ sử dụng máy NanoDrop 2000

(Thermo Scientific-Mỹ) cho phép phát hiện nồng độ mẫu từ 2 đến 15000 ng/µL đối

với DNA sợi đôi, thể tích mẫu dùng từ 0,5-2 µL .

Phương pháp này cũng được sử dụng để đánh giá độ sạch của mẫu. Khi tỷ số

A260/A280 từ 1,8-2,0 và tỷ số A260/A230 từ 1,8-2,2 thì mẫu được coi là đảm bảo độ sạch,

tuy nhiên chất lượng thật sự của mẫu thường được kiểm chứng qua PCR .

Sau khi tách RNA tổng số, RNA sẽ được định lượng tương đối bằng phương

pháp quang phổ hấp phụ. Mỗi nồng độ RNA tổng số trong kỹ thuật QuantiGene

Plex đều được xác định và đánh giá độ tinh sạch qua chỉ số A260/A280 sau đó pha

loãng về nồng độ giống nhau cho mỗi mẫu.

2.4.3. Kỹ thuật xác định biểu hiện gen bằng phương pháp QuantiGene Plex

Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng kỹ thuật xét nghiệm biểu hiện gen của

QuantiGene Plex (QuantiGene 2.0 assay). Đây là kỹ thuật dựa trên khả năng

tương tác đặc hiệu, lai RNA bằng cách sử dụng các hạt Luminex xMAP và được

thực hiện trên các đĩa 96 giếng. Biểu hiện của 76 gen tham gia và con đường tín

hiệu JAK/STAT và 4 gen đối chứng được định lượng trực tiếp trên các RNA đích

cần xác định qua công nghệ khuếch đại tín hiệu branch DNA (bDNA). Kỹ thuật

này giống ELISA với đối tượng lai trực tiếp là phân tử mRNA với phân tử Label

Extenders đặc hiệu và không cần phiên mã ngược. Hơn nữa kỹ thuật này cho

phép xác định mức độ biểu hiện gen thông qua mRNA lên đến 80 gen quan tâm

và các gen quản gia trong cùng một giếng mà không có phản ứng chéo, làm giảm

số lượng mẫu cần thiết.

Bước 1 Bước 2 Bước 3 Bước 4

Hình 2.12: Quy trình xác định mức độ biểu hiện gen

Bước 1: Mẫu mô ung thư gan và mẫu mô gan từ các bệnh nhân ung thư trải

qua phẫu thuật được nghiền nhỏ trong môi trường lạnh để đảm bảo RNA không bị

phân hủy. Sau đó được tách RNA tổng số.

Bước 2: Mẫu RNA tổng số được ủ qua đêm với các tín hiệu đặc hiệu cho

từng đối tượng RNA đích xác định.

Bước 3: Khuếch đại tín hiệu đạt được bằng cách sử dụng công nghệ branch

DNA (bDNA). Một phân tử Pre-Ampli lai với từng cặp Label Extenders, (không

phải với các đầu dò riêng lẻ). Sau đó, nhiều phân tử Ampli lai với mỗi bộ lọc

PreAmp. Cuối cùng, kết quả cho với mỗi bộ khuếch đại Amp có nhiều

oligonucleotide thăm dò nhãn lai.

Bước 4: Bổ sung streptavidin phycoerythrin (SAPE) để tạo ra tín hiệu tỷ lệ

thuận với lượng RNA đích có trong mẫu. Tín hiệu được đọc bằng Luminex.

Các bước thực hiện cụ thể trong ngày 1:

Bước 1: Pha loãng RNA tổng số về nồng độ 10 ng/μL với thể tích 25 μL/giếng.

Bước 2: Chuẩn bị thể tích hỗn hợp hạt từ (Working Bead Mix) theo tỷ lệ ở

Bảng 2.2. Giữ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng, không để trên đá.

Bảng 2.9: Thành phần hỗn hợp hạt từ

stt 1 2 3 4 5 Hóa chất Nước Nuclease-free Dung dịch Lysis Hóa chất Block Proteinase K Hạt từ (Capture Beads)-Vortex 96 giếng (μL) 2352 4476 269 27 134

30s trước khi thêm vào Bộ Probe

6 Tổng số 806 8064

Bước 3: Vortex hỗn hợp hạt từ đã chuẩn bị trong 10s để trộn, sau đó sử dụng

pipet chia vào các giếng của đĩa lai (Hybridization Plate), mỗi giếng 60 μL sử dụng

pipet đa kênh.

Bước 4: Thêm RNA tổng số của các mẫu đã pha loãng với thể tích là 25

μL/giếng. Mỗi mẫu thay đầu côn 1 lần. Tại giếng chứng: Thêm 40 μL dung dịch

đồng nhất vào 3 giếng chứng. Lặp lại 8 mẫu đầu tiên.

Bước 5: Đậy kín đĩa lai sử dụng miếng dán. Tháo mặt sau của miếng dán, đặt

vào chính giữa trung tâm của đĩa lai, sử dụng con lăn mềm lăn qua để đảm bảo đĩa

lai đã được đậy kín hoàn toàn ngăn chặn sự bay hơi.

Bước 6: Đặt một đĩa đảo ngược (không được cung cấp) vào máy ủ tại nhiệt

độ 56oC. Sau đó đặt đĩa lai vào và ủ trong 18-22h ở 54 oC ± 1oC với tốc độ 600

vòng/phút.

Bước 7: Sau khi ủ, tiến hành đến ngày 2.

Các bước thực hiện cụ thể trong ngày 2:

Bước 1: Bật và hiệu chỉnh máy Luminex theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Phải mất 30 phút cho các tia laser để khởi động. Thiết lập chương trình chạy máy

Luminex trước khi hoàn thành thí nghiệm.

Bước 2: Làm ấm dung dịch Pre-Amplifier, Amplifier, và dung dịch chứa

Label Probe trước khi sử dụng tại nhiệt độ 37oC trong 30 phút để hòa tan kết tủa và

trộn đều bằng cách đảo nhẹ ống trước khi dùng. Đưa về nhiệt độ phòng khi sử dụng,

đưa chất pha loãng SAPE về nhiệt độ phòng.

Bước 3: Thêm 0,6 mL đệm rửa 1 (wash buffer component 1) và 10 mL đệm

rửa 2 (wash buffer component 2) vào 189 mL nước nuclease free water. Thể tích

này đủ cho 1 đĩa. Chuẩn bị dịch theo số lượng đĩa định dùng.

Bước 4: Đưa đĩa lai từ máy ủ VorTemp và điều chỉnh nhiệt độ về 50°C ±

1°C. Sử dụng nhiệt độ đã cài trước đó, restart lại máy để đảm bảo nhiệt độ là 50°C

± 1°C.

Bước 5: Ly tâm đĩa lai tại 240 xg trong một phút ở nhiệt độ phòng. Tháo

miếng đậy và pipet lên xuống 5 lần, sau đó chuyển hoàn toàn từ đĩa lai sang đĩa từ.

Sử dụng pipet đa kênh, mỗi một cột thay đầu côn sau mỗi lần chuyển.

Bước 6: Rửa đĩa

- Đặt đĩa từ vào máy rửa đĩa từ cầm tay (Hand-Held Magnetic Plate Washer)

sao cho vị trí A1 của đĩa 96 giếng khớp với vị trí A1 trên máy rửa. - Khóa đĩa 96 giếng trên đĩa bằng cách đẩy hai thanh bảo vệ nằm ở mỗi đầu

của máy rửa hướng tới đĩa từ cho đến khi chúng chồng lên skirt của đĩa.

Kiểm tra đĩa từ được khóa an toàn bằng cách giữ trong lòng bàn tay và nhẹ

nhàng nhấc đĩa 96 giếng lên. - Đợi 1 phút để hạt từ (Magnetic Beads) có thể lắng xuống mỗi đáy giếng.

- Loại bỏ dung dịch có trong giếng bằng cách nhanh chóng đảo ngược chúng

qua bồn rửa hay thùng rác sau đó nhẹ nhàng thấm qua 1 lớp khăn giấy để

loại bỏ bất cứ dung dịch nào còn sót lại.

- Không di chuyển đĩa từ khỏi máy rửa đĩa từ cầm tay. - Thêm 100 μL dung dịch đệm rửa 1X vào mỗi giếng. - Đợi 15 giây để hạt từ tích lũy lắng xuống dưới đáy giếng. - Loại bỏ đệm rửa trong mỗi giếng bằng cách đảo ngược nhanh đĩa qua bồn

rửa hay thùng rác. Lặp lại hành động rửa hai lần cho tổng số lần rửa đĩa là 3.

Sau lần rửa cuối cùng, đặt đĩa từ 96 giếng lên một vài tờ giấy thẩm để loại bỏ

dịch dư.

Bước 7: Tiền khuếch đại lai (Pre-Amplifier Hybridization)

Chuyển dung dịch tiền khuếch đại lai Pre-Amplifier Hybridization sang bình

chứa thuốc thử thể tích 25 mL và pipet 100 μL dung dịch vào từng giếng

bằng pipet đa kênh. - Bịt kín đĩa từ bằng một tấm dán. Tháo đĩa từ từ máy rửa đĩa cầm tay. Lắc

với tốc độ 800 vòng/phút trong 1 phút ở nhiệt độ phòng để đảm bảo hạt

được nối lại.

Đặt tấm tách từ tính vào máy ủ VorTemp và ủ trong 1 giờ tại 50°C ± 1°C,

600 vòng/phút.

Bước 8: Sau 1 giờ ủ, lấy đĩa ra khỏi VorTemp, gỡ miếng dán, chèn đĩa từ vào

máy rửa đĩa cầm tay, lặp lại quy trình rửa từ bước 6.

Bước 9: Khuếch đại lai (Amplifier Hybridization)

- Chuyển dung dịch Amplifier vào 25 mL thuốc thử sau đó pipet 100 μL vào

mỗi giếng bằng pipet đa kênh.

- Đậy đĩa từ với miếng dán. Tháo đĩa từ từ máy rửa đĩa cầm tay. Lắc với tốc độ

800 vòng/phút tại nhiệt độ phòng.

- Đặt đĩa từ vào máy VorTemp ủ lắc trong vòng 1 giờ tại 50°C ± 1°C tại 600

vòng/phút.

Bước 10: Rửa đĩa. Sau 1 giờ ủ, lấy đĩa ra khỏi VorTemp, gỡ miếng dán, chèn

đĩa từ vào máy rửa đĩa cầm tay, lặp lại quy trình rửa từ bước 6.

Bước 11: Lai Label Probe

Chuyển dung dịch Label Probe vào 25 mL thuốc thử sau đó pipette 100 μL

vào mỗi giếng bằng pipet đa kênh.

Đậy đĩa từ với miếng dán. Tháo đĩa từ từ máy rửa đĩa cầm tay. Lắc với tốc độ

800 vòng/phút tại nhiệt độ phòng.

Đặt Magnetic Separation Plate vào máy VorTemp ủ lắc trong vòng, 1 giờ tại

50°C ± 1°C tại 600 vòng/phút.

Bước 12: Chuẩn bị SAPE

- Vortex và ly tâm ngắn SAPE để trộn đều, sau đó ly tâm ngắn để thu thập các

nội dung ở dưới cùng của ống.

- Trong ống 15 mL, thêm 36 μL SAPE vào 12 mL Dung dịch thuốc thử để pha

loãng SAPE.

- Vortex trong 15 giây để trộn và tránh ánh sáng.

Bước 13: Rửa đĩa. Sau khi ủ 1 giờ, lặp lại quá trình rửa từ bước 6.

Bước 14: Gắn SAPE

Chuyển SAPE Working Reagent vào 25 mL-dung dịch thuốc thử và pipette

100 μL vào mỗi giếng. Sử dụng pipet đa kênh.

Đậy kín đĩa từ bằng tấm dán; tháo đĩa từ từ máy rửa đĩa cầm tay; đặt trên

máy lắc tại nhiệt độ phòng và lắc với tốc độ 800 vòng/phút sau đó lắc tiếp 30

phút ở 600 vòng/phút.

Bước 15: Rửa đĩa, lặp lại quá trình rửa từ bước 6 nhưng sử dụng SAPE

Wash Buffer.

Bước 16:

- Thêm 130 μL of SAPE Wash Buffer vào mỗi giếng. - Đậy kín đĩa từ bằng tấm dán sau đó tháo đĩa từ từ máy rửa đĩa cầm tay và

bọc giấy nhôm. - Đặt đĩa lên máy lắc Microtiter và lắc ở tốc độ 800 vòng/phút trong 3 phút ở

nhiệt độ phòng. - Đọc tấm ngay trên máy Luminex.

Các gen nghiên cứu được đánh giá sẽ được chia làm 4 nhóm và nhóm gen

đối chứng.

a. Nhóm gen tín hiệu

Bảng 2.10: Các gen tín hiệu

Tên viết tắt Tên gen Vị trí trên NST

CLCF1 CNTF CNTFR CSF1R CSF2 Cardiotrophin-like cytokine factor 1 Ciliary neurotrophic factor Ciliary neurotrophic factor receptor Colony stimulating factor 1 receptor Colony stimulating factor 2 11q13.3 11q12.2 9p13 5q32 5q31.1

EGFR EPOR FAS GHR IFNAR1 IFNG IFNGR1 IL10 IL10RA Epidermal growth factor receptor Erythropoietin receptor Fas (TNF receptor superfamily, member 6) Growth hormone receptor Interferon (alpha, beta,omega) receptor 1 Interferon, gamma Interferon gamma receptor 1 Interleukin 10 Interleukin 10 receptor, alpha

7p12 19p13.3-p13.2 10q24.1 5p13-p12 21q22.1|21q22.11 12q14 6q23.3 1q31-q32 11q23 21q22.1-q22.2| IL10RB Interleukin 10 receptor, beta

IL20 IL2RA IL2RG IL4 IL4R 21q22.11 1q32 10p15-p14 Xq13.1 5q31.1 16p12.1-p11.2

Interleukin 20 Interleukin 2 receptor, alpha Interleukin 2 receptor, gamma Interleukin 4 Interleukin 4 receptor Interleukin 6 signal transducer (gp130, IL6ST 5q11

INSR IRF1 LEP LEPR OSM PRLR TSLP oncostatin M receptor) Insulin receptor Interferon regulatory factor 1 Leptin Leptin receptor Oncostatin M Prolactin receptor Thymic stromal lymphopoietin 19p13.3-p13.2 5q31.1 7q31.3 1p31 22q12.2 5p13.2 5q22.1

b. Nhóm gen JAK/STAT

Bảng 2.11: Các gen JAK/STAT

Tên viết tắt Tên gen Vị trí trên NST

JAK1 JAK2 JAK3 1p32.3-p31.3 9p24 19p13.1

Janus kinase 1 Janus kinase 2 Janus kinase 3 Signal transducer and activator of STAT1 2q32.2

transcription 1, 91kda Signal transducer and activator of STAT2 12q13.3

transcription 2, 113kda Signal transducer and activator of STAT3 17q21.31

transcription 3 (acute-phase response factor) Signal transducer and activator of STAT4 2q32.2-q32.3

STAT5A transcription 4 Signal transducer and activator of 17q11.2

transcription 5A Signal transducer and activator of STAT5B 17q11.2

transcription 5B Signal transducer and activator of STAT6 12q13

TYK2 transcription 6, interleukin-4 induced Tyrosine kinase 2 19p13.2

c. Nhóm gen đích

Bảng 2.12: Các gen đích

Tên viết tắt Tên gen Vị trí trên NST

A2M Alpha-2-macroglobulin 12p13.31

BCL2L1 BCL2-like 1 20q11.21

CCND1 Cyclin D1 11q13

CDKN1A 6p21.2

Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), CEBPB 20q13.1

CREBBP 16p13.3

beta CREB binding protein V-crk sarcoma virus CT10 oncogene CRK 17p13.3

CRP 1q21-q23

homolog (avian) C-reactive protein, pentraxin-related Guanylate binding protein 1, interferon- GBP1 1p22.2

ISG15 inducible, 67kda ISG15 ubiquitin-like modifier 1p36.33

JUN Jun proto-oncogene 1p32-p31

MPL 1p34

Myeloproliferative leukemia virus oncogene V-myc myelocytomatosis viral oncogene MYC 8q24.21

homolog (avian) Nuclear factor of kappa light polypeptide NFKB1 4q24 gene enhancer in B-cells 1

d. Nhóm gen điều hòa

Bảng 2.13: Các gen điều hòa

Tên viết tắt Tên gen Vị trí trên

CISH PGK1 Cytokine inducible SH2-containing protein Phosphoglycerate kinase 1 NST 3p21.3 Xq13

PIAS1 PIAS2 PTPN1 PTPN6 PTPRC SH2B1 15q 18q21.1 20q13.1-q13.2 12p13 1q31-q32 16p11.2

Protein inhibitor of activated STAT, 1 Protein inhibitor of activated STAT, 2 Protein tyrosine phosphatase, non-receptor 1 Protein tyrosine phosphatase, non-receptor 6 Protein tyrosine phosphatase, receptor type C SH2B adaptor protein 1 Signaling threshold regulating transmembrane SIT1 9p13-p12

SLA2 SMAD1 SMAD2 SMAD3 SOCS1 SOCS2 SOCS3 SOCS4 SOCS5 SP1 20q11.23 4q31 18q21.1 15q22.33 16p13.13 12q 17q25.3 14q22.1 2p21 12q13.1

adaptor 1 Src-like-adaptor 2 SMAD family member 1 SMAD family member 2 SMAD family member 3 Suppressor of cytokine signaling 1 Suppressor of cytokine signaling 2 Suppressor of cytokine signaling 3 Suppressor of cytokine signaling 4 Suppressor of cytokine signaling 5 Sp1 transcription factor Signal transducing adaptor molecule (SH3 STAM 10p14-p13

domain and ITAM motif) 1 Signal transducing adaptor molecule (SH3 STAM2 2q23.3

domain and ITAM motif) 2 STIP1 homology and U-box containing STUB1 16p13.3

THPO protein 1, E3 ubiquitin protein ligase Thrombopoietin 3q27

e. Nhóm gen đối chứng

Nghiên cứu được thực hiện với 4 gen quản gia là: GUSB, HPRT1, TBP, TFRC.

2.5. Phân tích kết quả

Mức độ biểu hiện của 76 gen được định lượng tương đối sau khi đọc cường

độ huỳnh quang bằng hệ thống máy Luminex. Cường độ huỳnh quang của các gen

trong các giếng được trừ đi với cường độ huỳnh quang của các gen trong giếng

blank (giếng không cho mẫu). Cường độ huỳnh quang của 4 gen quản gia ở từng

mẫu được lấy trung bình cộng. Mức độ biểu hiện tương đối của các gen nghiên cứu

được tính bằng cường độ huỳnh quang của gen đó chia cho trung bình cộng cường

độ huỳnh quang của bốn gen quản gia. Đối với tám mẫu lặp lại, mức độ biểu hiện

của các gen nghiên cứu được tính bằng trung bình cộng mức độ biểu hiện gen của

hai lần lặp lại.

Các kết quả về chỉ số lâm sàng và cận lâm sàng được thu thập từ bệnh án của

các bệnh nhân do bệnh viện K cơ sở 3 cung cấp. Các xét nghiệm được làm theo tiêu

chuẩn thường quy. Các số liệu và kết quả được phân tích theo phương pháp thống

kê thường dùng trong sinh y học là Mann–Whitney U test cho phân tích sự khác

nhau giữa biểu hiện mRNA mô LCU và mô U với mức ý nghĩa α = 0,05; 0,01 hoặc

0,001. Sử dụng thuật toán phân tích Spearman’r cho phân tích tương quan biểu hiện

mRNA của từng gen trong mô LCU và mô U. Phép thử được thực hiện cho từng

gen trong 76 gen nghiên cứu khi phân tích. Để tìm sự liên hệ tương quan giữa chỉ số

lâm sàng, cận lâm và biểu hiện mRNA của từng gen, sử dụng thuật toán phân tích

hồi quy tuyến tính đa biến với mức ý nghĩa α = 0,05; 0,01 hoặc 0,001. Biến độc lập

là tỷ số biểu hiện của các gen mô U chia cho mô LCU, biến phụ thuộc là chỉ số lâm

sàng, cận lâm sàng.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu

3.1.1. Đặc điểm tuổi và giới

Bảng 3.14: Đặc điểm tuổi và giới của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu

Đặc điểm

Tuổi

(năm)

Giới tính <50 >50 Nam Nữ Số bệnh nhân 7 30 31 6 Tỷ lệ (%) 19 81 84 16

Phân bố tuổi và giới tính của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu được thể

hiện trong Bảng 3.1. Trong đó, phần lớn trong nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu

có độ tuổi trên 50 tuổi (chiếm 81%) và chủ yếu là nam giới (84%).

3.1.2. Đặc điểm cận lâm sàng

* Đặc điểm huyết đồ

Bảng 3.15: Đặc điểm huyết học của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu

Chỉ số Hồng cầu (M/uL) Huyết sắc tố (g/dL) Bạch cầu (K/uL) Tiểu cầu (K/uL) Median 4,68 145 6,86 192 25% - 75% 4,17 - 5,1 134 - 153 5,4 - 8,3 150-222 n 37 37 37 37

Số liệu trong Bảng 3.2 cho thấy, chỉ số huyết đồ của các bệnh nhân tham gia

nghiên cứu ở mức độ bình thường, không có bệnh nhân cao hay thấp điển hình. Tuy

nhiên, chỉ số huyết sắc tố và tiểu cầu biến thiên mạnh ở các bệnh nhân.

* Đặc điểm hóa sinh

Bảng 3.16: Đặc điểm cận lâm sàng

Chỉ số PT(s) PT(%) INR Fibrinogen(g/L) APTT(s) AST (SGOT) (U/L) ALT (SGPT) (U/L) BilirubinTP (µmol/L) BilirubinTT ((µmol/L) Abumin (g/L) AFP (ng/mL) CEA (ng/mL) Median 12,5 94 1,03 3,7 31,4 36,5 35,4 10,95 4,5 40,8 20 2,8 25%-75% 11,4 – 14,1 8,3 – 95,5 1,0 – 1,1 2,9 – 4,1 29,8 – 33,8 25 – 42,9 29 – 49,7 8,5 – 14,5 3,4 – 5,9 38,2 – 43,5 7,5 – 186,4 1,7 - 4 n 35 35 35 34 35 37 37 36 36 36 36 28

Số liệu trong Bảng 3.3 cho thấy, chỉ số hóa sinh trung bình của những bệnh

nhân tham gia nghiên cứu ở mức độ bình thường. Nồng độ AFP > 300 ng/mL, là

chỉ số của dấu hiệu ung thư gan nguyên phát ở những bệnh nhân ung thư gan, thấy

rõ sự biến thiên chỉ số ở các bệnh nhân ung thư gan. Bên cạnh đó, các chỉ số ung

thư CEA ở mức bình thường được đánh giá xem xét như chưa có sự xâm lấn di

căn tới các cơ quan nội tạng khác.

3.2. Mức độ biểu hiện các gen nghiên cứu

Mức độ biểu hiện của các gen trong con đường tín hiệu JAK/STAT ở mô

LCU và mô U của các bệnh nhân HCC đã được định lượng tương đối bằng kỹ

thuật QuantiGene Plex. Kết quả cho thấy có sự khác biệt trong mức độ biểu hiện

của một số gen trong con đường tín hiệu JAK/STAT.

3.2.1. Mức độ biểu hiện, tương quan biểu hiện giữa mô LCU và mô U của

nhóm gen tín hiệu

* Mức độ biểu hiện nhóm gen tín hiệu trong mô U và LCU

Nhóm gen có vai trò nhận tín hiệu gồm các phối tử và thụ thể của chúng có

sự khác nhau trong biểu hiện mRNA giữa mô U và mô LCU. Nhóm gen tín hiệu

gồm 28 gen: CLCF1, CNTF, CNTFR, CSF1R, CSF2, EGFR, EPOR, FAS, GHR,

IFNAR1, IFNG, IFNGR1, IL10, IL10RA, IL10RB, IL20, IL2RA, IL2RG, IL4, IL4R,

IL6ST, INSR, IRF1, LEP, LEPR, OSM, PRLR, TSLP. Tuy nhiên, trong nghiên cứu

này sự khác biệt biểu hiện gen tín hiệu giữa mô LCU và mô U ở bệnh nhân HCC

chỉ tìm thấy ở 17 gen, bao gồm: IL10, IL10RA, LEP, LEPR, GHR, INSR, IFNAR1,

IL6ST, CSF1R, EGFR, FAS, TSLP, CNTFR, EPOR, IL4R, IL4, và PRLR. Kết quả

được thể hiện trên Hình 3.1, 3.2, 3.3 và 3.4.

Hình 3.13: Biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện mRNA các gen CNTFR, EPOR, IL4R

và IL4 ở mô LCU và mô U

Hình 3.1 cho thấy mức độ biểu hiện mRNA của các gen CNTFR, EPOR,

IL4R, và IL4 có sự khác biệt đáng kể giữa mô LCU và mô U. Trong đó, biểu hiện

gen EPOR và IL4R ở mô LCU (0,34 và 0,89) cao hơn so với ở mô U (0,29 và

0,74) với giá trị p lần lượt là 0,001 và 0,01. Ngược lại, gen CNTFR và IL4 lại có

biểu hiện mRNA ở mô LCU (2,97 và 0,14) thấp hơn biểu hiện mRNA của chúng ở

mô U (4,00 và 0,16) với p = 0,009 và 0,03.

CNTFR (Ciliary neurotrophic factor receptor) là gen mã hóa thụ thể

CNTFR là thụ thể cho cytokine loại 1 được chứng minh là có liên quan đến con

đường tín hiệu JAK/STAT có vai trò trong sự tăng sinh, biệt hóa, di cư tế bào và

apoptosis. Đặc biệt, CNTFR đặc trưng cho giai đoạn IV của HCC. Sự methyl hóa

của gen CNTFR dẫn tới rối loạn con đường JAK/STAT đưa tới sự biểu hiện bất

thường của các yếu tố phiên mã (NFKB1 trong con đường MAPK và STAT3 trong

con đường JAK/STAT) và các gen đích tương ứng (như GADD45B, FOSB, và

BIRC5) dẫn tới sự rối loạn chức năng tiếp theo trong sự phát triển tế bào,

apoptosis, chu trình tế bào và di căn . Nghiên cứu của chúng tôi đã nhận thấy sự

khác biệt trong biểu hiện mRNA của gen CNTFR giữa mô LCU và mô U có ý

nghĩa thống kê với mức biểu hiện mRNA cao hơn trong mô LCU (Hình 3.1).

EPOR là gen mã hóa cho thụ thể của Erythropoietin là một tín hiệu kích

thích hormone glycoprotein của hồng cầu được sản xuất trong gan và là một thành

viên của siêu họ thụ thể cytokine, biểu hiện chủ yếu trên các đơn vị hình thành

erythroid. Epo thực hiện vai trò thông qua liên kết cụ thể với thụ thể EPOR. Epo

có thể kích hoạt chức năng gen thông qua một chuỗi tín hiệu, Epo kích hoạt

tyrosine kinase JAK2, phosphoryl hóa và chuyển vị trí trong nhân của STAT5, do

đó thúc đẩy sự sống sót của tế bào tiền thân, tăng sinh và biệt hóa thông qua thụ

thể EPOR. EPOR đã được chứng minh có vai trò trong nhiều loại ung thư, như

ung thư vú, ung thư thận, ung thư dạ dày, HCC và ung thư thần kinh trung ương .

Nghiên cứu biểu hiện của mRNA và protein EpoR được thực hiện bằng phương

pháp RT-PCR và phân tích Western blot trên 134 bệnh nhân đã trải qua phẫu thuật

cắt bỏ gan điều trị HCC tiên phát liên quan đến HBV cho thấy biểu hiện EpoR

mRNA và protein trong gan xơ và gan không có khối u có mối tương quan thuận

với sự biệt hóa của tế bào khối u, là yếu tố dự báo thuận lợi cho sự sống sót của

bệnh . Nghiên cứu của chúng tôi nhận thấy biểu hiện mRNA của gen EPOR cao

hơn ở mô LCU so với mô U (hình 3.1).

Interleukin-4 (IL-4) được biết đến như một chất trung gian và là tín hiệu

quan trọng của các phản ứng miễn dịch và viêm. HCC là một loại ung thư liên

quan đến viêm điển hình và các biến thể di truyền trong gen IL-4 có thể liên quan

đến nguy cơ HCC liên quan đến HBV thông qua con đường JAK/STAT. IL-4 ức

chế sự biểu hiện và sự nhân lên của HBV trong dòng tế bào ung thư Hep3B .

Những biến thể di truyền của gen IL4 được chứng minh là yếu tố nguy cơ của

HCC liên quan tới HBV . Nghiên cứu biểu hiện của gen IL4R trong 40 cặp mô u

và LCU ở bệnh nhân HCC về mức độ biểu hiện và khả năng xâm lấn của tế bào

cho thấy IL-4R đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự sống và di căn

của tế bào HCC và điều chỉnh hoạt động của các đường dẫn tín hiệu JAK1/STAT6,

IL-4/IL-4R có thể là mục tiêu điều trị mới cho HCC . Nghiên cứu của chúng tôi

nhận thấy mức độ biểu hiện của IL4 tăng lên trong mô U so với mô LCU nhưng

mức độ biểu hiện của IL4R lại ngược lại, tăng lên trong mô LCU so với mô U

(Hình 3.1).

Hình 3.14: Biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện mRNA các gen CSF1R, EGFR,

FAS, TSLP ở mô LCU và mô U

Hình 3.2 cho thấy biểu hiện mRNA của gen CSF1R, EGFR, FAS, và TSLP

trong mô LCU đều cao hơn mô U với p < 0,001. Cụ thể: gen CSF1 ở mô LCU

(0,65) cao hơn trong mô U (0,26). Biểu hiện mRNA gen EGFR trong mô LCU

(3,09) cao hơn trong mô U (1,97). Biểu hiện mRNA gen FAS trong mô LCU (1,02)

cao hơn mô U (0,62). Biểu hiện mRNA gen TSLP trong mô LCU (0,35) cao hơn

mô U (0,12). Biểu hiện của thụ thể yếu tố kích thích đại thực bào 1 (colony-stimulating

factor 1 receptor - CSF-1R) trong HCC đã được nghiên cứuvà đánh giá các giá trị

tiên lượng của biểu hiện mRNA CSF-1R bằng realtime PCR trên 52 bệnh nhân và

đưa ra kết quả biểu hiện mRNA CSF-1R cao hơn đáng kể ở mô gan lân cận so với

mô u tương ứng . Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy sự biểu hiện mRNA của

gen CSF-1R cao hơn trong mô LCU so với mô U tương ứng (Hình 3.2). EGFR là gen mã hóa thụ thể tăng trưởng biểu mô có vai trò quan trọng

trong sự phát triển và tăng sinh của mô u. EGFR được biểu hiện quá mức ở nhiều

loại ung thư, đóng vai trò quan trọng trong nguyên nhân hình thành khối u và

được xác định là một trong những mục tiêu đầy hứa hẹn trong điều trị ung thư.

Một nghiên cứu đã làm rõ vai trò của biểu hiện EGFR đối với bệnh lý lâm sàng

của HCC khi nghiên cứu biểu hiện của EGFR tại các cặp mô được lấy từ 60 bệnh

nhân HCC. Kết quả cho thấy EGFR biểu hiện cao trong mô u so với mô lân cận và

tương quan đáng kể với giai đoạn lâm sàng, huyết khối u tĩnh mạch cửa, di căn

ngoài cơ thể, số lượng u, sự tái phát của khối u, mức độ biệt hóa của khối u và xơ

gan ở mô lân cận u và chỉ số AFP huyết tương . Nghiên cứu của chúng tôi cho

thấy sự khác biệt trong biểu hiện mRNA của gen EGFR trong đó biểu hiện mRNA

EGFR cao hơn trong mô LCU so với mô U (Hình 3.2). FAS là gen mã hóa cho protein thuộc thành viên của siêu họ thụ thể TNF

đóng vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis của tế bào, là một trong những

thụ thể truyền tín hiệu của con đường JAK/STAT. Nghiên cứu về biểu hiện mRNA

của gen FAS ở những bệnh nhân HCC cho thấy biểu hiện của gen được tăng cường

ở những vùng có tế bào viêm xâm nhập tại vùng không ung thư của mô gan và

trên rìa mô ung thư hay mô LCU so với mô U . Nghiên cứu của chúng tôi đưa ra

kết quả tương đồng, biểu hiện của gen FAS với sự tăng lên có ý nghĩa thống kê của

mô LCU so với mô U (Hình 3.2). Thymic stromal lymphopoietin (TSLP) là một cytokine loại I cùng với IL-7

đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển tế bào T ở người. Nó đã được báo cáo

rằng TSLP kích hoạt JAK1 và JAK2 để gây ra sự phosphoryl hóa STAT5, trong

khi IL-7 đạt được sự phosphoryl hóa STAT5 bằng cách kích hoạt JAK1 và JAK3 .

Vai trò của TSLP trong apoptosis các tế bào ung thư ruột đã được chứng minh,

nhận thấy mức biểu hiện mRNA TSLP giảm đáng kể trong các mô khối U so với

các mô LCU của bệnh nhân ung thư ruột kết và mức TSLP tương quan nghịch với

điểm số lâm sàng của ung thư ruột . Nghiên cứu của chúng tôi về mức độ biểu

hiện mRNA gen TSLP cho thấy sự giảm đáng kể của mức biểu hiện mRNA trong

mô U so với mô LCU ở bệnh nhân HCC (Hình 3.2).

Hình 3.15: Biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện mRNA các gen GHR, INSR,

IFNAR1, IL6ST ở mô LCU và mô U

Kết quả trên Hình 3.3 cho thấy biểu hiện mRNA của các gen GHR, INSR,

IFNAR1, IL6ST ở mô LCU cao hơn mô U. Sự khác biệt đều có ý nghĩa thống kê ở

cả 4 gen. Cụ thể, mức độ biểu hiện gen GHR và IL6ST ở mô LCU (6,64 và 11,44)

cao hơn ở mô U (1,71 và 7,33) với p < 0,001. Biểu hiện mRNA gen INSR và

IFNAR1 ở mô LCU (4,54 và 3,82) cao hơn ở mô U (4,07 và 3,1) với giá trị p lần

lượt là 0,026 và 0,003.

INSR- insulin receptor là gen mã hóa thụ thể protein insulin của người.

Insulin là một trong những phối tử của con đường truyền tín hiệu nội bào

JAK/STAT và được điều hòa bởi SOCS6 và SOCS7. hiều tế bào ung thư cần tín

hiệu insulin để tăng trưởng và insulin truyền tín hiệu qua chính thụ thể của nó là

INSR . Mức độ biểu hiện của INSR được biết đến với vai trò là tín hiệu kích hoạt

tế bào của con đường tín hiệu insulin/IGF, chuột loại bỏ gen INRS đặc hiệu gan

biểu hiện sự ức chế HCC . Ở những bệnh nhân HCC do HCV, tăng mức độ biểu

hiện của INSR-4 góp phần vào hoạt động chống HCV qua tín hiệu IFN-a. IRS4 đã

thúc đẩy tín hiệu JAK/STAT từ IFN-α bằng cách tương tác với USP18. Những kết

quả này cho thấy INRS4 liên kết với USP18 để làm giảm tác động của USP18 đối

với tín hiệu JAK/STAT do IFN-α gây ra. INRS4 là một protein liên kết USP18 có

thể làm tăng khả năng miễn dịch bẩm sinh của vật chủ để kiểm soát HCV và các

loại virus khác nhạy cảm với IFN-α . Kết quả định lượng biểu hiện gen INSR của

chúng tôi cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa mô LCU và mô U.

Biểu hiện INSR tăng cao trong mô LCU so với mô U (Hình 3.3).

Hormone tăng trưởng GH có vai trò quan trọng trong quá trình điều hòa các

chất trong quá trình sinh trưởng của sinh vật thông qua thụ thể GHR. GH là tín

hiệu của nhiều con đường truyền tín hiệu nội bào trong đó có con đường tín hiệu

GHR/JAK2/STAT . Nghiên cứu về biểu hiện GHR ở mô cho thấy GHR biểu hiện

tăng trong mô U ở những bệnh nhân ung thư vú so với mô LCU . Nghiên cứu của

chúng tôi trên mô HCC đưa ra kết quả biểu hiện mRNA gen GHR cao hơn trong

mô LCU có ý nghĩa thống kê so với mô U (Hình 3.3).

Interferon (IFN)-α/β là các cytokine liên quan đến cả đáp ứng miễn dịch

bẩm sinh và thích ứng, đóng vai trò nòng cốt trong phòng chống ung thư, điều hòa

biểu hiện mRNA của hơn 2000 gen thông qua kích hoạt thụ thể IFNAR. Các thụ

thể IFNAR bao gồm hai tiểu đơn vị IFNAR-1 và IFNAR-2 có liên quan đến biểu

hiện lâm sàng của những bệnh nhân nhiễm HBV . Mức độ biểu hiện mRNA của

IFNAR-1 giảm ở mô u của những bệnh nhân ung thư đại trực tràng . Nghiên cứu

về biểu hiện mRNA của gen IFNAR-1 chúng tôi nhận thấy trong mô LCU có biểu

hiện mạnh hơn so với mô U (Hình 3.3).

IL6ST là gen mã hóa của nhiều cytokine bao gồm interleukin 6 (IL6). Liên

kết IL6 với IL6R tạo ra sự đồng hóa IL6ST và hình thành phức hợp thụ thể có ái

lực cao để kích hoạt các protein JAK, điều đó gây ra sự phosphoryl hóa tyrosine

IL6ST, từ đó kích hoạt STAT . Nghiên cứu về mức biểu hiện mRNA của gen

IL6ST ở bệnh nhân ung thư vú nhận thấy mức độ biểu hiện mRNA IL6 được phát

hiện ở những mô ung thư vú, và tương quan với mức độ biểu hiện bệnh của bệnh

nhân ung thư vú . Kết quả biểu hiện mRNA của gen IL6ST cao hơn ở mô LCU so

với mô U ở những bệnh nhân HCC (Hình 3.3).

Hình 3.16: Mức độ biểu hiện mRNA các gen IL10, IL10RA, LEP, LEPR, PRLR ở

mô LCU và mô U

Kết quả trên Hình 3.4 cho thấy mức độ biểu hiện mRNA các gen IL10,

IL10RA, LEP, LEPR ở mô LCU cao hơn mô U với giá trị p lần lượt là < 0,001,

<0,001, = 0,03 và < 0,001. Ngược lại, gen PRLR có biểu hiện mRNA ở mô LCU

thấp hơn biểu hiện mRNA ở mô U với p < 0,001.

Interleukin (IL)-10, một cytokine chống viêm Th2, là một trong những yếu

tố chính của các phản ứng viêm, là phối tử của con đường truyền tín hiệu

JAK/STAT. Nghiên cứu về mức độ biểu hiện của IL10 cho thấy, trong mô hình hồi

quy logistic, biểu hiện mRNA IL10 từ trung bình đến cao của các tế bào khối u có

liên quan đáng kể với khối u ác tính ở giai đoạn tăng trưởng. IL10 mRNA được

phát hiện trong các đại thực bào và tế bào lympho liên quan đến khối u ác tính.

Trong khối u ác tính xâm lấn, IL10 mRNA giảm khi mức độ di căn khối u ác tính

tăng lên. Biểu hiện IL10 cao hơn tương quan với sự tiến triển của khối u, với sự

khác biệt giữa khối u ác tính tại chỗ, khối u ác tính xâm lấn và khối u ác tính di

căn . IL10 truyền tín hiệu nội bào thông qua thụ thể của nó là IL10RA. Trong

nghiên cứu ung thư hạch tế bào B cho thấy biểu ức chế IL10RA là một phương

pháp hữu ích để điều trị thông qua sự ức chế con đường IL10RA/ JAK2/STAT3 .

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy mức độ biểu hiện mRNA của IL10 và IL10RA

cao hơn trong mô LCU so với mô U có ý nghĩa thống kê (Hình 3.4).

LEP và LEPR là gen mã hóa leptin và thụ thể của nó. Nghiên cứu về LEP

và LEPR ở những bệnh nhân HCC cho thấy các đa hình của LEP và LEPR có thể

liên quan đến sự phát triển của ung thư. Kết quả cho thấy điểm đa hình LEP

rs7799039A>G và rs2167270G>A có liên quan đến tăng nguy cơ mắc HCC; tuy

nhiên, LEPR rs6588147G>A có liên quan đến giảm nguy cơ mắc HCC ở người

dân Trung Quốc . Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy biểu hiện mRNA của LEP và

LEPR trong mô LCU cao hơn so vớimô U của bệnh nhân HCC(Hình 3.4).

PRLR mã hóa thụ thể prolactin, protein thúc đẩy HCC thông qua JAK2.

Nghiên cứu biểu hiện PRLR cho thấy biểu hiện p-JAK2 cao có liên quan đến khả

năng sống sót kém ở bệnh nhân HCC có PRLR biểu hiện cao . Kết quả nghiên cứu

của chúng tôi đã chỉ ra rằng biểu hiện mRNA của gen PRLR cao hơn trong mô U

so với mô LCU (Hình 3.4). * Tương quan mức độ biểu hiện nhóm gen tín hiệu giữa mô U và LCU

Bảng 3.17: Tương quan Spearman’r biểu hiện mRNA trong nhóm gen tín

hiệu giữa mô LCU và mô U.

Tên gen Spearman’r

IL4 IL4R IL6ST INSR LEP LEPR PRLR TSLP 0,433** 0,418* 0,150 0,417* 0,344* 0,268 0,328* 0,319 p 0,007 0,010 0,377 0,010 0,037 0,108 0,048 0,054

Tên gen Spearman’r CNTFR CSF1R EGFR EPOR FAS GHR IFNAR1 IL10 IL10RA 0,483** 0,019 0,399* 0,056 0,334* 0,291 0,319 0,100 0,269 p 0,002 0,910 0,014 0,741 0,043 0,081 0,054 0,557 0,107

Hình 3.17: Tương quan mức độ biểu hiện mRNA các gen LEP, CNTFR, EGFR,

FAS ở mô LCU và mô U

Hình 3.18: Tương quan mức độ biểu hiện mRNA các gen IL4, IL4R, INSR, PRLR ở

mô LCU và mô U

Kết quả phân tích tương quan Spearman cho thấy trong nhóm gen tín hiệu,

một số gen có sự khác nhau về mức độ biểu hiện mRNA trong mô LCU và mô U

đồng thời có sự tương quan thuận về biểu hiện mRNA giữa mô LCU và mô U như:

CNTFR, EGFR FAS, IL4, IL4R, INSR, PRLR và LEP (Bảng 3.4 và Hình 3.5, 3.6).

Mối tương quan giữa biểu hiện mRNA của các gen ở mô U và LCU là tương quan

thuận. Khi biểu hiện của các gen CNTFR, EGFR FAS, IL4, IL4R, INSR, PRLR và

LEP trong mô U tăng tức là biểu hiện của các gen đó trong mô LCU cũng tăng. Một

số gen tuy có sự khác nhau về mức độ biểu hiện nhưng lại chưa thấy sự tương quan

biểu hiện mRNA giữa mô LCU và mô U như: CSF1R, EPOR, GHR, IFNAR1, IL10,

IL10RA, IL6ST, LEPR và TSLP (Bảng 3.4). Trong số 18 gen thuộc nhóm gen tín

hiệu có sự khác biệt về mức bộ biểu hiện mRNA trong mô LCU và mô U, chỉ có 8

gen có thấy tương quan thuận giữa biểu hiện gen trong mô LCU và mô U. Tương

quan giữa mức độ biểu hiện của các gen này là tương quan yếu cho thấy tiềm năng

là một trong những biomarker và yếu tố điều trị đích HCC của các gen. Khi mức độ

tương quan của các gen là chặt chẽ tức là mức độ biểu hiện của gen tăng trong mô

U chắc chắn sẽ tăng trong mô LCU. Khi đó mức độ biểu hiện của gen không còn ý

nghĩa trong điều trị và chẩn đoán dù có sự khác biệt.

Kết quả phân tích thống kê biểu hiện mRNA của các gen tín hiệu con

đường JAK/STAT ở các bệnh nhân HCC từ mẫu mô gan cho thấy sự khác biệt về

mức độ biểu hiện trong mô gan ở trung tâm khối u và mẫu mô gan lân cận khối u

của 17 gen. Sự biểu hiện mRNA khác nhau của cùng một gen ở mô gan LCU và

mô U cho thấy mức độ hoạt động bất thường của các gen có ảnh hưởng tới sự phát

triển của các tế bào ung thư hay sự tiến triển của ung thư. Với vai trò truyền tín

hiệu tới con đường JAK/STAT để hoạt hóa các gen thì sự khác biệt trong mức độ

biểu hiện mRNA của các gen có thể là điểm sáng cần nghiên cứu để trở thành

những biomarker trong chẩn đoán sớm và điều trị đích ung thư.

Kết quả còn cho thấy hầu hết các gen nghiên cứu có biểu hiện cao hơn ở

những mô LCU so với mô U. Nguyên nhân có thể do khu vực lân cận u là khu vực

các tế bào gan nhiễn virus viêm gan mạn tính đang chuyển dần từ trạng thái viêm

sang trạng thái ung thư. Các tế bào là tế bào lành, chưa ung thư nhưng hoạt động

miễn dịch của cơ thể và tế bào đang diễn ra mạnh mẽ để chiến đấu lại các tác nhân

gây ung thư. Đồng thời khu vực này, các tế bào miễn dịch cũng hoạt động mạnh

mẽ nhằm mục đích tiêu diệt đẩy lùi các tế bào ung thư. Sự hoạt động mạnh mẽ này

có thể dẫn tới sự tiết ra nhiều hơn các cytokine và tăng biểu hiện thụ thể của chúng

trên màng tế bào. Nếu tình trạng này kéo dài có thể chuyển từ tế bào lành thành tế

bào ung thư và kết quả là tế bào ung thư phát triển và lan rộng. Kết quả của chúng

tôi củng cố thêm cho vai trò của con đường JAK/STAT trong HCC và sâu hơn nữa

là vai trò của các gen tín hiệu trong con đường truyền tin JAK/STAT.

3.2.2. Mức độ biểu hiện, tương quan biểu hiện giữa mô LCU và mô U của

nhóm gen JAK/STAT

* Mức độ biểu hiện nhóm gen JAK/STAT giữa mô U và LCU

Hình 3.19: Mức độ biểu hiện mRNA các gen JAK1, JAK2, STAT2, STAT3 ở mô

LCU và mô U

Hình 3.20: Mức độ biểu hiện mRNA các gen JAK1, JAK2, STAT2, STAT3 ở mô

LCU và mô U

Kết quả trên Hình 3.7 và 3.8 cho thấy, biểu hiện mRNA của các gen JAK1,

JAK2, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5B, STAT6 ở mô LCU đều cao hơn mô U trong

đó. Sự khác biệt đều có ý nghĩa thống kê với giá trị p = 0,046 (gen JAK1), p = 0,007

(gen JAK2), p < 0,001 (gen STAT2, STAT4), p = 0,012 (gen STAT3), p = 0,01 (gen

STAT6) và p < 0,001 (gen STAT5B).

Mối quan hệ giữa kích hoạt và tiên lượng ung thư của JAK/STAT đã được

quan sát thấy ở nhiều loại khối u rắn. Nhìn chung, khích hoạt STAT3 hoặc STAT5 có

liên quan đến tiên lượng xấu của ung thư vú, ung thư đại trực tràng và ung thư biểu

mô tế bào vảy đầu cổ . JAK2 có biểu hện cao hơn ở mô lành so với mô u trong những

bệnh nhân HCC, đây được coi là dấu ấn sinh học tiên lượng tốt cho phẫu thuật cắt bỏ

HCC . Sự phosphoryl hóa của STAT5 là một đặc điểm của các tế bào biểu mô vú bình

thường, nơi nó được cho là thúc đẩy sự biệt hóa . Đối với các loại khối u khác, sự

khác biệt trong các chiến lược được sử dụng để định lượng phosphoryl hóa STAT. Có

một số bằng chứng cho thấy trong MPNs, STAT3 có thể chống lại sự tăng sinh ác tính

và cũng có thể xảy ra trong một số tình huống trong khối u rắn .

Zhitao Dong và cộng sự đã nghiên cứu mức độ biểu hiện, giá trị tiên lượng

và cơ chế tiềm năng của các gen trong họ STAT ở những bệnh nhân HCC về tương

quan biểu hiện các gen STAT với mức độ tiên lượng bệnh. Biểu hiện mRNA STAT4

và STAT5B trong mô u thấp hơn so với mô bình thường. Điều quan trọng là kết quả

của họ đã chỉ ra rằng biểu hiện cao hơn của các gen STAT5A, STAT5B và STAT6 có

liên quan đến khả năng sống tốt hơn ở bệnh nhân HCC. Biểu hiện cao của STAT5A,

STAT5B và STAT6 đã tham gia vào các quá trình sinh học liên quan đến miễn dịch,

chuyển hóa thuốc cytochrom P450, con đường tín hiệu JAK-STAT và con đường tín

hiệu PPAR (peroxisome proliferator-activated receptors). Các gen STAT5A, STAT5B

và STAT6 có thể là những dấu hiệu tiên lượng của HCC, khi kết hợp lại có giá trị

tiên đoán tốt hơn cho tiên lượng HCC . Bên cạnh đó, JAK2, TYK2, STAT3, STAT4

và STAT5B được nhận thấy có thể là dấu ấn sinh học tiềm năng cho chẩn đoán tiên

lượng HCC khi nghiên cứu mức độ biểu hiện của các gen trên 21 cặp mô u và lành

của bệnh nhân HCC nhiễm HBV. Hơn nữa, phân tích kết hợp các gen có lợi thế hơn

so với việc phân tích từng gen riêng lẻ cho chẩn đoán .

Nhóm gen JAK và STAT mã hóa các protein JAK và STAT là trung tâm truyền

tin của con đường truyền tín hiệu JAK/STAT. Sự hoạt hóa quá mức của con đường tín

hiệu được nhận thấy trong nhiều loại ung thư, có vai trò trong quá trình hình thành và

phát triển khối u . Trong nghiên cứu này, sự khác nhau trong mức độ biểu hiện

mRNA của các gen truyền tin JAK và STAT trong con đường tín hiệu JAK/STAT ở

mô trung tâm khối u và mô lân cận u cho thấy vai trò của con đường JAK/STAT ở

bệnh nhân HCC. Điều này cho thấy tiềm năng nghiên cứu trở thành các biomarker

trong phát hiện sớm và điều trị đích HCC của các protein JAK và STAT.

* Tương quan mức độ biểu hiện nhóm gen JAK/STAT giữa mô U và LCU

Bảng 3.18: Tương quan Spearman’r biểu hiện mRNA trong nhóm gen

JAK/STAT giữa mô LCU và mô U

Tên gen STAT4 STAT5B STAT6 Spearman’r -0,252 0,392* 0,120 p 0,132 0,016 0,479

Tên gen JAK1 JAK2 STAT2 STAT3 Spearman’r 0,107 0,179 0,305 -0,055 p 0,529 0,290 0,067 0,744

Hình 3.21: Tương quan mức độ biểu hiện mRNA gen STAT5B ở mô LCU và mô U

Kết quả phân tích tương quan Spearman cho thấy trong nhóm gen JAK/STAT,

chỉ gen STAT5B có sự khác biệt về mức độ biểu hiện và sự tương quan thuận về

biểu hiện mRNA giữa mô LCU và mô U (Bảng 3.5 và Hình 3.9). Khi biểu hiện của

các gen STAT5B trong mô U tăng thì biểu hiện của các gen đó trong mô LCU cũng

tăng. Tuy nhiên mức độ tương quan thuận này khá yếu (R = 0,392). Các gen còn lại

(JAK1, JAK2, STAT2, STAT3, STAT4, STAT6) tuy có sự khác nhau về mức độ biểu

hiện nhưng lại chưa thấy sự tương quan biểu hiện mRNA giữa mô LCU và mô U.

Điều này cho thấy được tiềm năng của các gen thuộc nhóm gen JAK/STAT trong

phát hiện sớm và điều trị đích HCC.

Ngoài vai trò thúc đẩy sự phát triển của khối u, STAT5 còn có vai trò thúc

đẩy sự phát triển và biệt hóa của các tế bào T trong hoạt động chống miễn dịch của

cơ thể. Trong nghiên cứu của chúng tôi về mức độ biểu hiện mRNA các gen JAK và

STAT ở mô bệnh nhân HCC nhận thấy chỉ có gen STAT5B biểu hiện cao hơn ở mô u

so với mô LCU. Điều này có thể do quá trình viêm ở các tế bào lân cận u diễn ra

mạnh mẽ, các tế bào đang đấu tranh chuyển dần sang trạng thái ung thư. Các

cytokine tiết ra nhiều bởi các tế bào gan ở trạng thái viêm và các tế bào miễn dịch

cùng với sự biểu tăng biểu hiện mạnh ở các thụ thể của chúng dẫn tới tăng hoạt

động của con đường JAK/STAT ở mô LCU so với mô U. Cụ thể ở đây là tăng sự

hoạt động của nhóm gen JAK và STAT trong mô LCU so với mô U. Trạng thái có

thể cho thấy sự tăng trưởng và lan nhanh của khối u bệnh nhân HCC.

3.2.3. Mức độ biểu hiện, tương quan biểu hiện giữa mô LCU và mô U của

nhóm gen đích chức năng

*Mức độ biểu hiện nhóm gen đích chức năng giữa mô U và LCU

Hình 3.22: Mức độ biểu hiện mRNA các gen A2M, CCND1, CEBPB, CRK ở mô

LCU và mô U

Hình 3.23: Mức độ biểu hiện mRNA các GPB1, CRP, MPL ở mô LCU và mô U

Theo Hình 3.10 và 3.11, các gen A2M, CCND1, CEBPB, CRK, GPB, MPL,

CRP đều có biểu hiện mRNA ở trong mô LCU cao hơn mô U. Trong đó, mức độ

biểu hiện mRNA trong mô LCU của gen A2M (85,45), gen CCND1 (11,51) và gen

CRK (1,62) cao hơn biểu hiện mRNA ở mô U (29,23 - A2M; 9,65 - CCND1 và 1,15

- CRK) với p < 0,001. Gen CEBPB có biểu hiện mRNA ở mô LCU (3,61) cao hơn

biểu hiện mRNA ở mô U (2,66) với p = 0,021. Gen GPB1 và MPL có mức độ biểu

hiện mRNA ở mô LCU (3,45 và 0,06) cao hơn biểu hiện mRNA ở mô U (2,71 và

0,05) với p < 0,027. Gen CRP có biểu hiện mRNA ở mô LCU (26,61) cao hơn biểu

hiện mRNA ở mô U (22,45) với p = 0,004.

A2M là gen mã hóa protein A2M-alpha-2-Macroglobulin là một protein A2M

điều chỉnh sự kết dính, di chuyển và tăng trưởng của tế bào khối u bằng cách ức chế

các con đường truyền tín hiệu thúc đẩy khối u . A2M trong huyết thanh của bệnh

nhân HCC được nhận thấy có liên quan tới thoái hóa tiểu cầu và đáp ứng miễn

dịch . Nghiên cứu của chúng tôi đánh giá mức độ biểu hiện mRNA A2M trong mô

HCC và nhận thấy mức độ biểu hiện của gen cao hơn trong mô LCU so với mô U

(Hình 3.10).

CCND1 (Cyclin D1) là một gen gây ung thư trong HCC. Nghiên cứu về vai

trò của CCND1 ở dòng tế bào gốc ung thư gan về sự hình thành ung thư, tái phát, di

căn và hóa trị của HCC nhận thấy biểu hiện CCND1 cao hơn trong các tế bào HCC

so với tế bào gan thường . Thông qua JAK2/STAT3, CCND1 đã thực hiện chức

năng phát triển các tế bào và thúc đẩy xâm lấn u trong ung thư túi mật. Biểu hiện

mRNA của CCND1 ở mô LCU và mô U bệnh nhân HCC cho thấy biểu hiện gen

cao hơn trong mô LCU so với mô U (Hình 3.10).

CEBPB (CCAAT Enhancer Binding Protein Beta) là gen mã hóa yếu tố

phiên mã điều hòa biểu hiện các gen liên quan đến miễn dịch và viêm . Các protein

liên kết với chất tăng cường CCAAT (CEBP) là các chất điều hòa phiên mã có vai

trò chính trong việc duy trì chức năng gan. CEBPB được cho rằng tham gia vào quá

trình ức chế sự di căn của khối u HCC thông qua tăng hoạt hóa tổng hợp

Orosomucoid 2 (ORM2) một glycoprotein quan trọng chủ yếu được sinh tổng hợp

và tiết ra bởi các tế bào gan . Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy kết quả biểu hiện

mRNA của gen CEBPB cao hơn ở mô LCU so với mô U (Hình 3.10).

Gen CRK, (v-crk sarcoma virus CT10 oncogene homolog) là một gen gây

ung thư, mã hóa các protein P47gag-crk, chứa các miền SH2, SH2' và SH3 và liên kết

các protein theo cách phụ thuộc phosphotyrosine (ptyr). Nghiên của Matsuda và

cộng sự, đã xác định miền SH2 của P47gag-crk cần thiết để liên kết với protein có chứa

ptyr. Việc xóa bỏ vùng SH2 dẫn đến mất khả năng tương tác với các ptyr. Các

polypeptide chứa SH2, SH2', và SH3 của p60v-src và p60c-src liên kết với protein có

chứa ptyr từ các tế bào biến đổi CRK. Do đó, miền SH2 và SH2'của P47gag-crk liên kết

với các protein có chứa ptyr . Miền SH2 là một trong những miền chính trong hoạt

động của protein JAK và STAT có chứa ptyr. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy

biểu hiện của gen CRK cao hơn trong mô LCU so với mô U ở những bệnh nhân

HCC (Hình 3.10).

GPB1 (guanylate binding protein 1, interferon-inducible) là một gen thuộc

họ GPB mã hóa các protein đáp ứng các IFN để loại bỏ virus ra khỏi cơ thể. Do sự

phụ thuộc này, các mRNA GBP1 thường tích lũy ∼4-24 giờ sau khi tiếp xúc với

IFN. Các yếu tố đáp ứng được kích thích bằng IFN cũng liên kết các phức hợp

STAT-1/STAT-2/IRF-9 không đồng nhất (được gọi là yếu tố kích thích IFN 3).

GBP1 hoạt động như một chất ức chế khối u trong ung thư đại trực tràng phát sinh

từ tín hiệu Hippo bị điều hòa . Sự bất hoạt gen GPB1 nhận thấy làm tăng khả năng

xâm lấn và di căn trong mô hình ung thư chuột . Nghiên cứu về biểu hiện của GPB1

ở bệnh nhân HCC cho thấy biểu hiện của GPB1 cao hơn trong mô LCU so với mô

MPL (myeloproliferative leukemia virus oncogene) là một gen có vai trò

quan trọng trong tăng sinh đối với tế bào HCC và được hoạt hóa thông qua con

đường JAK/STAT . MPL được nhận thấy biểu hiện mạnh ở tế bào gan nhưng ít biểu

hiện ở các loại tế bào khác. Trong số các dòng tế bào khối u gan, dòng tế bào Huh7

biểu hiện MPL cao nhất . Biểu hiện mRNA của gen MPL trong mô LCU lớn hơn

trong mô U có ý nghĩa thống kê khi nghiên cứu trong mô bệnh nhân HCC (Hình

3.11).

CRP mã hóa protein reactive C là một dấu hiệu viêm được gan tổng hợp. Khi

phân tích mức độ biểu hiện mRNA của gen CRP ở trong các dòng tế bào HCC

HepG2 và HepG2.2.15 và mức độ biểu hiện CRP ở trong huyết thanh cho thấy mức

độ biểu hiện mRNA CRP trong các tế bào HepG2.2.15 cao hơn trong các tế bào

HepG2. Mức độ CRP trong huyết thanh tăng lên đáng kể ở những người bị nhiễm

viêm gan B (p < 0,05). Mức độ biểu hiện CRP cao hơn đáng kể ở những bệnh nhân

LC và HCC so với những bệnh nhân viêm gan mạn tính . Nghiên cứu sâu hơn về

mức độ biểu hiện mRNA ở mô LCU và mô U của những bệnh nhân HCC chúng tôi

nhận thấy mức độ biểu hiện mRNA gen CRP cao hơn ở mô LCU so với mô U (Hình

3.11).

Từ gen tín hiệu thông qua các protein JAK hay STAT làm thay đổi biểu

hiện gen của các gen đích chức năng trong đó có các gen thúc đẩy khối u và các

gen ức chế khối u. Trong nghiên cứu của chúng tôi đều nhận thấy sự khác biệt có

ý nghĩa thống kê ở mô LCU và mô U ở những bệnh nhân HCC ở các gen A2M,

CCND1, CEBPB, CRK, GPB, MPL,và CRP. Trong đó nhận thấy hầu hết các gen

là các gen thúc đẩy ung thư, chỉ có gen GPB là gen được coi là gen ức chế khối u

trong ung thư đại trực tràng. Mức độ biểu hiện gen có thể do sự phát triển bên

ngoài của các tế bào LCU đang tiến hành quá trình xâm lấn và chuyển đổi của

các tế bào lành thành các tế bào ung thư. Kết quả của chúng tôi cho thấy tiềm

năng của các gen đích tăng lên trong mô LCU so với mô U cũng cho thấy vai trò

của con đường JAK/STAT trong truyền tin và hoạt hóa phiên mã nội bào. Nghiên

cứu của chúng tôi nhận thấy các gen mã hóa cytokine và thụ thể của chúng trong

mô LCU có mức biểu hiện cao hơn trong mô U và nhóm gen JAK/STAT cũng

nhận thấy có biểu hiện gen cao trong mô LCU so với mô U. Kết quả của chúng

tôi cho thấy tiềm năng của các gen trên trong việc trở thành biomarker chẩn đoán

hay điều trị đích HCC.

*Tương quan mức độ biểu hiện nhóm gen đích chức năng giữa mô U và LCU

Bảng 3.19: Tương quan Spearman’r biểu hiện mRNA trong nhóm gen đích

chức năng giữa mô LCU và mô U

Tên gen CRP GBP1 MPL Spearman’r -0,094 0,062 0,446** P 0,580 0,716 0,006

Tên gen A2M CCND1 CEBPB CRK Spearman’r -0,214 0,174 0,495** -0,115 P 0,204 0,304 0,002 0,498

Hình 3.24: Tương quan mức độ biểu hiện mRNA các gen CEBPB và MPL ở mô

LCU và mô U

Kết quả phân tích tương quan Spearman (Hình 3.12) cho thấy trong nhóm

gen đích chức năng, hai gen có sự khác nhau về mức độ biểu hiện mRNA trong mô

LCU và mô u đồng thời có sự tương quan thuận về biểu hiện mRNA giữa mô LCU

và mô U là CEBP và MPL. Mức tương quan giữa biểu hiện mRNA của các gen ở

mô U và LCU đều là tương quan thuận. Khi biểu hiện của các gen CEBP và MPL

trong mô U tăng tức là biểu hiện của các gen đó trong mô LCU cũng tăng (R =

0,495 ở gen CEBP và R = 0,446 ở gen MPL). Các gen còn lại tuy có sự khác nhau

về mức độ biểu hiện nhưng lại chưa tìm thấy sự tương quan biểu hiện mRNA giữa

mô LCU và mô U như: A2M, CCND1, CRK, GPB1, MPL, CRP (Bảng 3.6). Trong bảy gen thuộc nhóm gen đích của con đường truyền tín hiệu

JAK/STAT chỉ tìm thấy được hai gen có mức độ biểu hiện của các gen ở mô LCU

tương quan thuận yếu với mức độ biểu hiện trong mô U. Điều này cho thấy tiềm

năng của các gen A2M, CCND1, CRK, GPB1, MPL, CRP, CEBPB và MPL trong

vai trò biomarker và đích điều trị của HCC.

3.2.4. Mức độ biểu hiện, tương quan biểu hiện giữa mô LCU và mô U của

nhóm gen điều hòa

*Mức độ biểu hiện nhóm gen điều hòa giữa mô U và LCU

Hình 3.25: Mức độ biểu hiện mRNA các gen CISH, SOCS2, SOCS3, SLA2 ở mô

LCU và mô U

Kết quả trên Hình 3.13 cho thấy biểu hiện mRNA ở các gen CISH và

SOCS2 ở mô LCU (0,83 và 2,47) cao hơn ở mô u (0,46 và 0,44) với p = 0,01 và

p < 0,001. Ngược lại, gen SOCS3, SLA2 có biểu hện trong mô u (0,37 và 0,28)

cao hơn so với mô LCU (0,36 và 0,2) với p = 0,016 và p = 0,001.

CISH, SOCS2, và SOCS3 thuộc họ SOCS là họ gen mã hóa protein tham

gia vào chức năng điều hòa âm của con đường JAK/STAT. Nghiên cứu của

chúng tôi về biểu hiện của SOCS2 trong những bệnh nhân HCC cho thấy biểu

hiện của SOCS2 đã giảm trong mô HCC so với mô gan lành. Hơn nữa, giảm biểu

hiện của SOCS2 có liên quan đáng kể với sự hiện diện của di căn nội và mức độ

biến đổi mô học của bệnh nhân HCC. Sự biểu hiện quá mức của SOCS2 đã ức

chế đáng kể sự di chuyển và xâm lấn của các tế bào HCC in vitro và ức chế sự di

căn trong cơ thể. Nghiên cứu đã chứng minh SOCS2 có khả năng ức chế di căn

HCC ở người và là một đích hướng tới tiềm năng trong điều trị HCC .

Năm 2013, Qiu và cộng sự nghiên cứu về ý nghĩa lâm sàng của SOCS2 và

SOCS6 trên 106 bệnh nhân HCC. Kết quả cho thấy mức độ biểu hiện của SOCS2

và SOCS6 ở mức độ mRNA và protein trong khối u thấp hơn so với mô gan bình

thường. Bên cạnh đó, cả SOCS2 và SOCS6 đều giảm và có sự tương quan đáng

kể với sự tiến triển giai đoạn theo hệ thống phân loại TNM và AFP trong huyết

thanh. Đặc biệt, giảm biểu hiện SOCS2 xảy ra thường xuyên hơn ở những bệnh

nhân HCC có sự xâm lấn mạch và SOCS6 liên quan tới sự tái phát của khối u.

Dữ liệu của các tác giả gợi ý rằng giảm biểu hiện của SOCS2 và SOCS6 trong

bệnh nhân HCC có thể là dấu hiệu tiên lượng tiềm năng cho chẩn đoán HCC .

Nghiên cứu của Li và cộng sự năm 2015 và Wang và cộng sự năm 2016 cũng cho

thấy sự giảm biểu hiện của SOCS6 đóng vai trò quan trọng trong tăng trưởng và

xâm lấn của tế bào HCC . Nghiên cứu của chúng tôi đưa ra kết quả tương đồng

với sự biểu hiện mRNA cao hơn rõ rệt ở mô LCU so với mô U (Hình 3.13).

Năm 2016, Yuan và cộng sự đã công bố kết quả khi nghiên cứu về sự hình

thành tế bào ung thư gan do nhiễm HBV. Kết quả cho thấy sự tích lũy các gốc

oxi hóa tự do (ROS) trong ty thể do HBV gây ra đã ức chế SOCS3 và kích hoạt

IL-6/STAT3 trong các tế bào HCC. Giảm biểu hiện SOCS3 thúc đẩy sự tăng sinh

các tế bào HCC và sự phát triển của xenograft khối u ở chuột. Kết quả này cho

thấy tiềm năng của SOCS3 trong chẩn đoán HCC . Năm 2018 Jiang và cộng sự

cũng chỉ ra rằng biểu hiện của SOCS3 ở các mô HCC thấp hơn so với các mô

lành lân cận và SOCS3 có liên quan đến sự xâm lấn của khối u . Tuy nhiên,

nghiên cứu của chúng tôi lại nhận thấy biểu hiện mRNA của SOCS3 trong mô U

cao hơn so với mô LCU. Các nghiên cứu về methyl hóa SOCS3 cho thấy mức độ

methyl hóa của SOCS3 ở những bệnh nhân HCC cao hơn người khỏe mạnh và ở

mô u HCC cao hơn mô lành lân cận .

Năm 2014, Zhang và cộng sự phân tích tổng hợp về sự methyl hóa của họ

SOCSs trong HCC trên 116 bệnh nhân. Kết quả nghiên cứu của họ cho thấy sự

methyl hóa quá mức của gen SOCS2-7 và CISH ít xuất hiện trong HCC. Mức độ

methyl hóa của gen SOCS1-7 và CISH và ý nghĩa lâm sàng của quá trình methyl

hóa SOCS1 đã được định lượng và phân tích thống kê. Kết quả của họ cho thấy

tần số methyl hóa của gen SOCS1 ở khối u là 56,03% và các mô lành lân cận là

54,31%. Các mô khối u đã biểu hiện cường độ methyl hóa cao đặc biệt ở những

bệnh nhân có kích thước khối u lớn hoặc có bệnh nền xơ gan. Ngoài ra tần số và

cường độ methyl hóa quá mức trong gen SOCS1 trong các khối u đều cao hơn

đáng kể so với mô lành lân cận ở bệnh nhân nam và bệnh nhân trên 45 tuổi. Bất

hoạt gen SOCS1 đã quan sát thấy trong 8/25 mẫu khối u. Hơn nữa, biểu hiện quá

mức của SOCS1 có thể kích hoạt con đường tín hiệu p53 trong các dòng tế bào

HCC. Kết quả của họ cho thấy sự mất và giảm biểu hiện của SOCS1 có liên quan

chặt chẽ tới HCC có liên quan tới HBV . Tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng

tôi nhận thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong biểu hiện mRNA ở mô LCU

và mô U của gen CISH với mức biểu hiện cao hơn trong mô LCU so với mô U

(Hình 3.13).

SLA2 (Src-like-adaptor 2) là gen mã hóa protein SLAP có chứa các

domain Src tương đồng SH3 và SH2. SLAP được biểu hiện trong các tế bào T và

khi được biểu hiện trong các tế bào Jurkat T, nó có thể ức chế tín hiệu TCR dẫn

tới hoạt hóa IL-2 phụ thuộc tín hiệu phiên mã. Các miền SH3 và SH2 của SLAP

làm suy giảm tối đa tín hiệu TCR . Miền SH2 của SLAP có khả năng tương tác

với JAK và STAT. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy biểu hiện của SLA2 cao

hơn trong mô U so với mô LCU có ý nghĩa thống kê khi đánh giá biểu hiện

mRNA trong cặp mô U và LCU ở bệnh nhân HCC (Hình 3.13).

Hình 3.26: Mức độ biểu hiện mRNA các gen PTPN1, PTPN6, PTPRC, SMAD1,

SMAD2, SMAD3 ở mô LCU và mô U

Hình 3.14 cho thấy các gen PTPN6, PTPRC, SMAD1 có biểu hiện mRNA ở

mô LCU cao hơn mô U, trong đó: gen PTPN6 có biểu hiện mRNA ở mô LCU

(1,28) cao hơn biểu hiện mRNA ở mô U (1,21) với p = 0,002. Gen PTPRC có biểu

hiện mRNA ở mô LCU (0,52) cao hơn biểu hiện mRNA ở mô U (0,33) với p =

0,008. Gen SMAD1 có biểu hiện mRNA ở mô LCU (0,84) cao hơn biểu hiện mRNA

ở mô U (0,57) với p < 0,001. Ngược lại, các gen PTPN1, SMAD2, SMAD3 có mức

biểu hiện mRNA ở mô LCU thấp hơn so với mô U, cụ thể là: gen PTPN1 có biểu

hiện mRNA ở mô LCU (0,81) thấp hơn biểu hiện mRNA ở mô U (1,01) với p =

0,01 và gen SMAD2 có biểu hiện mRNA ở mô LCU (0,79) cao hơn biểu hiện

mRNA ở mô U (1,1) với p = 0,007. Gen SMAD3 có biểu hiện mRNA ở mô LCU

(0,48) thấp hơn biểu hiện mRNA ở mô U (0,72) với p = 0,015.

Gen PTPN1 mã hóa các protein tyrosine phosphatase không thụ thể. Protein

tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) được giữ trong màng của lưới nội chất (ER),

PTPN1 dephosphoryl hóa thụ thể tyrosine kinase, thụ thể cytokin, JAKs, và STAT

protein, do đó chấm dứt tín hiệu JAK/STAT do cytokine gây ra . Để tìm hiểu thêm

về chức năng của PTPN1 trong HCC, chúng tôi đánh giá biểu hiện mRNA của

PTPN1 trong cặp mô LCU và U của bệnh nhân HCC nhận thấy biểu hiện gen cao

hơn trong mô U so với mô LCU. Cũng giống như PTPN1, PTPN6 mã hóa cho

protein thuộc thành viên họ protein tyrosine phosphatase. PTPN6 là protein điều

hòa âm cho tín hiệu STAT3 . Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy mức độ biểu hiện

mRNA của gen PTPN6 cao hơn trong mô LCU so với mô U (Hình 3.14).

PTPRC là gen mã hóa protein tyrosine phosphatase loại C. Một trong những

sản phẩm của PTPRC là protein tyrosine phosphatase CD45 được biết đến như là

một bộ điều chỉnh tín hiệu thụ thể tế bào B và T. Ngoài ra, CD45 điều hòa âm

enzyme kinase họ JAK tiếp nhận bởi thụ thể cytokine. Biểu hiện CD45 giảm làm

các tế bào T nhạy cảm với các kích thích cytokine khi tăng cường tín hiệu STAT.

CD45 có vai trò ức chế khối u trong bệnh bạch cầu . Nghiên cứu của chúng tôi trên

HCC cho thấy biểu hiện mRNA trong gen PTPRC cao hơn trong mô LCU so với

mô U (Hình 3.15).

SMAD1, SMAD2, và SMAD3 là gen thuộc họ SMAD mã hóa protein SMAD

tham gia vào nhiều con đường tuyền tín hiệu có liên quan đến một loạt các hoạt

động sinh học bao gồm tăng trưởng tế bào, apoptosis, phát triển và đáp ứng miễn

dịch với vai trò điều hòa tín hiệu TGF. Nghiên cứu về ngăn chặn quá trình chuyển

đổi biểu mô, di cư và xâm lấn trong HCC cho thấy phương pháp nhắm mục tiêu

SMAD1 bằng miR-26b-5p là một ứng dụng đầy hứa hẹn cho điều trị HCC . Nghiên

cứu đánh giá biểu hiện của pSMAD2/3 và SMAD4 ở những bệnh nhân viêm gan C

với các giai đoạn xơ hóa và các mức độ viêm hoại tử khác nhau cũng như ở HCC

cho thấy pSMAD2/3 có thể được sử dụng làm dấu hiệu chẩn đoán và/hoặc tiên

lượng cho sự tiến triển của xơ hóa gan liên quan đến HCV dẫn đến xơ gan và tiến

triển thành HCC . Nghiên cứu của chúng tôi cũng nhận thấy sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê trong biểu hiện mRNA các gen trong gia đình SMAD là SMAD1, SMAD2,

và SMAD3 (Hình 3.14) giữa mô LCU và mô U.

Trong các gen điều hòa của con đường JAK/STAT cũng có sự thay đổi trong

biểu hiện mRNA giữa mô U và mô LCU ở những bệnh nhân HCC. Các gen CISH,

SOCS2, PTPN6, PTPRC, SMAD1 có mức biểu hiện ở mô LCU cao hơn mô U, trong

khi các gen SOCS3, PTPN1, SMAD2, SMAD3 lại có mức biểu hiện cao hơn ở mô U so

với mô LCU. Sự khác biệt trong biểu hiện mRNA mô gan ở bệnh nhân HCC cho thấy

vai trò của các gen điều hòa con đường JAK/STAT trong việc hình thành và phát triển

khối u. Sự biểu hiện của SOCS và PTPN6 giảm trong mô U so với mô LCU giải thích

rõ hơn cho sự tăng biểu hiện mạnh mẽ của STAT3 khi không bị ức chế. SOCS2,

PTPRC và CISH tăng trong mô U so với mô LCU là do sự tăng biểu hiện của các gen

JAK/STAT trong mô U so với mô LCU dẫn tới sự điều hòa con đường tuyền tín hiệu ở

các tế bào lân cận u. SMAD2 và SMAD3 tăng lên trong mô u ủng hộ cho vai trò tăng

trưởng tế bào, apoptosis, phát triển và đáp ứng miễn dịch của khối u. Kết quả nghiên

cứu mức độ biểu hiện gen điều hòa con đường JAK/STAT của chúng tôi cho thấy tiềm

năng trong điều trị đích và biomarker phát hiện điều trị HCC của các gen thuộc con

đường JAK/STAT.

*Tương quan mức độ biểu hiện nhóm gen điều hòa giữa mô U và LCU

Bảng 3.20: . Tương quan Spearman’r biểu hiện mRNA trong nhóm gen điều

hòa giữa mô LCU và mô U

Gen CISH PTPN1 PTPN6 PTPRC SLA2 Spearman’r 0,540** 0,229 0,265 0,156 0,205 p 0,001 0,174 0,114 0,357 0,223 Gen SMAD1 SMAD2 SMAD3 SOCS2 SOCS3 Spearman’r 0,143 0,069 0,212 0,089 0,006 p 0,399 0,685 0,208 0,601 0,972

Hình 3.27: Tương quan mức độ biểu hiện mRNA CISH ở mô LCU và mô U

Kết quả phân tích tương quan Spearman cho thấy trong nhóm gen đích chức

năng, gen có sự khác nhau về mức độ biểu hiện mRNA trong mô LCU và mô U

đồng thời có sự tương quan thuận về biểu hiện mRNA giữa mô LCU và mô U là

CISH (Hình 3.15 và Bảng 3.7). Mức tương quan giữa biểu hiện mRNA của các gen

ở mô U và LCU đều là tương quan thuận và có mức độ tương quan yếu. Khi biểu

hiện của các gen CISH trong mô U tăng tức là biểu hiện của các gen đó trong mô

LCU cũng tăng. Một số gen tuy có sự khác nhau về mức độ biểu hiện nhưng lại

chưa tìm thấy sự tương quan biểu hiện mRNA giữa mô LCU và mô U như: PTPN1,

PTPN6, PTPRC, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SOCS2, SOCS3, SLA2 (Bảng 3.7). Kết

quả trên cho thấy tiểm năng trở thành biomarker trong phát hiện và điểu trị HCC

của 10 gen trong nhóm gen điều hòa con đường JAK/STAT.

3.3. Tương quan biểu hiện các gen nghiên cứu với chỉ số lâm sàng và cận lâm

sàng

Để làm rõ hơn vai trò của biểu hiện gen trong mô U và mô LCU trong HCC,

chúng tôi đã xác định hồi quy tuyến tính biểu hiện mRNA các gen với chỉ số trong

mô và trong máu để tìm ra mối quan hệ giữa biểu hiện gen và chỉ số bệnh học.

3.3.1. Tương quan tỷ lệ biểu hiện các gen với chỉ số mô bệnh học

*Tương quan tỷ lệ biểu hiện các gen nghiên cứu với mức độ xâm lấn mạch

Bảng 3.21: Kết quả phân tích hồi quy đa biến 76 gen và mức độ xâm lấn mạch

Mô hình dự đoán (1)

(2)

(3)

FAS FAS STAT1 FAS STAT1 CEBPB Hệ số đã chuẩn hóa (beta) -0,651 -0,594 -0,473 -0,658 -0,463 0,289 p 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,011

Bảng 3.8 cho thấy 3 gen có mối tương quan giữa tỷ lệ biểu hiện gen U/LCU

và mức độ xâm lấn mạch là các gen FAS, STAT1, CEBPB (bảng 3.8). Phương trình

hồi quy chuẩn hóa (1) cho thấy tỷ lệ biểu hiện gen FAS trong mô U/LCU có tương

quan nghịch với khả năng xâm lấn mạch hay tỷ lệ biểu hiện của gen FAS tăng làm

giảm khả năng xâm lấn mạch của mô. Phương trình hồi quy chuẩn hóa (2) cho thấy

tỷ lệ biểu hiện gen FAS và gen STAT1 trong mô U/LCU có tương quan nghịch với

khả năng xâm lấn mạch hay tỷ lệ mức độ biểu hiện của gen FAS và gen STAT1 tăng

làm giảm khả năng xâm lấn mạch của mô. Phương trình hồi quy chuẩn hóa (3) cho

thấy tỷ lệ biểu hiện gen FAS và gen STAT1 trong mô U/LCU có tương quan nghịch

với khả năng xâm lấn mạch, hay tỷ lệ mức độ biểu hiện của gen FAS và gen STAT1

tăng làm giảm khả năng xâm lấn mạch của mô. Tuy nhiên tỷ lệ biểu hiện mRNA

gen CEBPB lại tương quan thuận với mức độ xâm lấn mạch của mô tức là tỷ lệ biểu

hiện gen CEBPB tăng lên làm tăng mức độ xâm lấn mạch của mô.

Mức độ biểu hiện của FAS trong mô u so với mô LCU càng cao càng làm

giảm mức độ xâm lấn mạch của mô. Tín hiệu FAS được truyền tin thông qua STAT1

càng giảm càng dẫn tới làm tăng mức độ hoạt động của CEBPB gây ra sự xâm lấn

mạch của mô. Trong con đường FAS/STAT1/CEBPB thì mức độ biểu hiện của gen

FAS là quan trọng nhất. Với chức năng quan trọng trong quá trình apoptosis của tế

bào, tín hiệu của FAS tăng lên trong mô LCU so với mô U , chúng tôi nhận thấy khi

biểu hiện của gen FAS tăng trong mô U so với mô LCU sẽ dẫn tới sự đẩy mạnh xâm

lấn mạch của khối u HCC. Khác với kết quả khi nghiên cứu độc lập gen CEBPB

trong sự di căn của khối u HCC, Fang và cộng sự nhận thấy mức độ biểu hiện

CEBPB cao hơn ở mô LCU so với mô U . Sự biểu hiện của các gen FAS, STAT1,

CEBPB đóng vai trò trong mức độ xâm lấn mạch của mô u bệnh nhân HCC.

* Tương quan tỷ lệ biểu hiện các gen nghiên cứu với độ biệt hóa

Kết quả phân tích hồi quy đa biến giữa biểu hiện mRNA của 76 gen nghiên

cứu với mức độ biệt hóa cho thấy gen SOCS2 có mối tương quan thuận giữa tỷ lệ

biểu hiện gen SOCS2 mô U/LCU và mức độ biệt hóa với hệ số chuẩn hóa là 0,509

và p = 0,003. Phương trình hồi quy chuẩn hóa cho thấy tỷ lệ biểu hiện gen SOCS2

mô U/LCU tăng lên có liên quan tới sự tăng lên của mức độ biệt hóa.

Nghiên cứu về vai trò của gen SOCS2 đối với sự biến đổi của mô ung thư

gan đã chỉ ra rằng SOCS2 đóng vai trò ngăn cản sự biến đổi và di căn của các tế bào

mô HCC. Do đó, SOCS2 và được nhận định là một trong những tiềm năng trong

điều trị bệnh . Năm 2013, Qiu và cộng sự nghiên cứu về ý nghĩa lâm sàng của

SOCS2 và SOCS6 trên 106 bệnh nhân HCC và đưa ra kết quả tương đồng, biểu hiện

SOCS2 có thể là dấu hiệu tiên lượng tiềm năng cho chẩn đoán HCC về mức độ tiến

triển của bệnh . Khác với các kết quả đã đưa ra, với mức tương quan thuật giữa biểu

hiện gen SOCS2 với sự biệt hóa của các tế bào mô u cho thấy biểu hiện mRNA của

gen SOCS2 càng tăng trong mô U so với mô LCU càng dẫn tới tăng lên về mức độ

biệt hóa tế bào. Tăng biểu hiện của SOCS2 là tăng cường sự đáp ứng với hormone

tăng trưởng dẫn tới sự phát triển và biến đổi của tế bào khối u .

* Tương quan tỷ lệ biểu hiện các gen nghiên cứu với kích thước khối u

Kết quả phân tích hồi quy đa biến giữa biểu hiện mRNA của 76 gen nghiên

cứu với kích thước khối u cho thấy gen TSLP có mối tương quan nghịch giữa tỷ lệ

biểu hiện gen TSLP ở mô U/LCU và kích thước khối u với hệ số beta chuẩn hóa là

-0,398 và p = 0,027. Phương trình hồi quy chuẩn hóa cho thấy tỷ lệ biểu hiện gen

TSLP ở mô U/LCU tăng lên có liên quan tới sự giảm kích thước khối u.

Các bệnh nhân tham gia nghiên cứu có kích thước khối u trước phẫu thuật ở

các giai đoạn khác nhau từ T1 đến T3 theo hệ thống phân loại TNM. Đánh giá mức

tương quan của tỷ lệ biểu hiện các gen nghiên cứu với kích thước khối u cho thấy

chỉ có TSLP có tỷ lệ biểu hiện gen ảnh hưởng tới kích thước khối u. TSLP đóng vai

trò quan trọng trong sự phát triển của tế bào T ở người. TSLP kích hoạt JAK1 và

JAK2 để gây ra sự phosphoryl hóa STAT5 . TSLP có vai trò quan trọng trong

apoptosis, mức biểu hiện mRNA TSLP giảm đáng kể trong các mô khối u so với các

mô LCU của bệnh nhân ung thư ruột và mức độ biểu hiện TSLP và tương quan

nghịch với điểm số lâm sàng của bệnh . Nghiên cứu của chúng tôi đưa ra kết quả

khẳng định thêm cho vai trò của TSLP trong quá trình ức chế sự phát triển của khối

u bằng cách tăng sự apoptosis các tế bào mô u cụ thể là ở bệnh nhân HCC.

3.3.2. Tương quan tỷ lệ biểu hiện các gen với chỉ số cận lâm sàng

* Tương quan biểu hiện mRNA các gen nghiên cứu với chỉ số Fibirinogen

Bảng 3.22: Tương quan tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số Fibrinogen

Mô hình dự đoán 1

2 STAT1 STAT1 ISG15 Hệ số đã chuẩn hóa (Beta) 0,486 0,418 0,361 p 0,006 0,011 0,026

Kết quả phân tích hồi quy đa biến giữa biểu hiện mRNA của 76 gen nghiên

cứu về tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số Fibrinogen tìm được hai phương

trình dự đoán liên quan tới 2 gen STAT1 và ISG15 (Bảng 3.9). Phương trình 1 cho

thấy tỷ lệ biểu hiện gen STAT1 có tương quan thuận với chỉ số Fibrinogen. Phương

trình 2 đưa ra hai gen STAT1 và gen ISG15 cùng có sự tương quan thuận với chỉ số

Fibrinogen.

Chỉ số Fibrinogen là xét nghiệm chức năng đông máu cơ bản được chỉ định

trong trường hợp cần xác định sự có mặt của viêm nhiễm hay tiến triển của các

bệnh lý về gan. Kết quả phân tích hồi quy đa biến nhận thấy biểu hiện của 2 gen

STAT1 và ISG15 tương quan với chỉ số Fibirinogen. Nghiên cứu chức năng của

ISG15 trong quá trình tiến triển HCC và cơ chế liên quan bằng cách sử dụng dữ liệu

lâm sàng, dòng tế bào và mô hình xenograft chỉ ra rằng ISG15 được biểu hiện cao

trong các mô HCC và nhiều dòng tế bào HCC. Biểu hiện ISG15 có liên quan đáng

kể với mức độ biệt hóa, di căn của khối u và sự sống sót của bệnh nhân HCC . Kết

quả này cho thấy có thể thông qua tăng cường biểu hiện con đường STAT1/ISG15,

dẫn tới suy giảm chức năng gan làm chỉ số Fibirinogen tăng lên.

* Tương quan biểu hiện mRNA các gen nghiên cứu với chỉ số AST

Bảng 3.23: Tương quan tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số AST (SGOT)

Mô hình dự Hệ số đã chuẩn p Mô hình dự Hệ số đã chuẩn p

đoán đoán

8 3

6 7

IL10 IL10 JAK1 IL10 JAK1 STAM2 IL10 JAK1 STAM2 THPO IL10 JAK1 STAM2 THPO STUB1 IL10 JAK1 STAM2 THPO STUB1 IL20 hóa (Beta) -0,846 -0,876 0,205 -0,892 0,353 -0,244 -0,630 0,318 -0,379 0,370 -0,576 0,408 -0,354 0,421 -0,216 -0,822 0,458 -0,403 0,689 -0,255 -0,489 0,000 0,000 0,029 0,000 0,002 0,025 0,000 0,002 0,001 0,006 0,000 0,000 0,001 0,001 0,017 0,000 0,000 0,000 0,000 0,004 0,025

IL10 JAK1 STAM2 THPO STUB1 IL20 IL10RB IL4R IL10 JAK1 STAM2 THPO STUB1 IL10RB IL4R IL10 JAK1 STAM2 THPO STUB1 IL20 IL10RB hóa (Beta) -0,766 0,494 -0,509 0,710 -0,266 -0,207 0,232 -0,270 -0,670 0,486 -0,510 0,638 -0,253 0,253 -0,326 -0,861 0,458 -0,433 0,651 -0,271 -0,466 0,147 0,000 0,000 0,000 0,000 0,001 0,320 0,002 0,020 0,000 0,000 0,000 0,000 0,001 0,001 0,002 0,000 0,000 0,000 0,000 0,001 0,022 0,032

Kết quả phân tích hồi quy đa biến giữa biểu hiện mRNA của 76 gen nghiên

cứu trong tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số AST tìm ra được 9 phương trình

liên quan đến các gen là IL10, JAK1, STAM2, THPO, STUB1, IL20, IL10RB, IL4R

(Bảng 3.10). Phương trình 1 cho thấy tỷ lệ biểu hiện gen IL10 có tương quan nghịch

với chỉ số AST. Tại phương trình 2 nhận thấy tỷ lệ biểu hiện của hai gen IL10 và

JAK1 cùng tương quan với chỉ số AST, trong đó gen IL10 tương quan nghịch còn

gen JAK1 tương quan thuận với chỉ số AST. Phương trình 3 cho thấy tỷ lệ biểu hiện

các gen IL10, JAK1 và STAM2 cùng tương quan với chỉ số AST, trong đó tỷ lệ

tương quan của gen JAK1 tương quan thuận còn lại gen IL10 và gen STAM2 tương

quan nghịch với chỉ số AST. Phương trình thứ 4 cho tỷ lệ biểu hiện các gen IL10,

JAK1, STAM2, THPO cùng tương quan với chỉ số AST, trong đó tỷ lệ biểu hiện

IL10 và STAM2 tương quan nghịch còn tỷ lệ biểu hiện gen JAK1và THPO tương

quan thuận với chỉ số AST.

Phương trình 5 đưa ra kết quả đồng tương quan của các tỷ lệ biểu hiện các

gen IL10, JAK1, STAM2, THPO, STUB1 với chỉ số AST, trong đó tỷ lệ biểu hiện các

gen IL10, STUB1 và STAM2 tương quan nghịch còn tỷ lệ biểu hiện gen JAK1 và

THPO tương quan thuận với chỉ số AST. Phương trình 6 cho thấy các gen IL10,

JAK1, STAM2, THPO, STUB1, IL20I cùng tương quan với chỉ số AST, trong đó tỷ

lệ biểu hiện các gen IL10, STUB1, IL20 và STAM2 tương quan nghịch còn tỷ lệ biểu

hiện gen JAK1và THPO tương quan thuận với chỉ số AST. Phương trình 7 đưa ra

kết quả về tỷ lệ biểu hiện các gen IL10, JAK1, STAM2, THPO, STUB1, IL20,

IL10RB đồng thời tương quan với chỉ số AST, trong đó tỷ lệ biểu hiện các gen IL10,

STUB1, IL20 và STAM2 tương quan nghịch còn tỷ lệ biểu hiện gen JAK1, IL10RB

và THPO tương quan thuận với chỉ số AST. Phương trình 8 đưa ra tỷ lệ biểu hiện

các gen IL10, JAK1, STAM2, THPO, STUB1, IL20, IL10RB, IL4R đồng tương quan

với chỉ số AST, trong đó tỷ lệ biểu hiện các gen IL10, STUB1, IL20, IL4R và

STAM2 tương quan nghịch còn tỷ lệ biểu hiện gen JAK1, IL10RB và THPO tương

quan thuận với chỉ số AST. Phương trình cuối cùng đưa ra kết quả tỷ lệ biểu hiện

các gen IL10, JAK1, STAM2, THPO, STUB1, IL10RB, IL4R cùng tương quan với

chỉ số AST, trong đó tỷ lệ biểu hiện các gen IL10, STUB1, IL4R và STAM2 tương

quan nghịch còn tỷ lệ biểu hiện gen JAK1, IL10RB và THPO tương quan thuận với

chỉ số AST.

Chỉ số AST (hay còn gọi là SGOT) mức bình thường vào khoảng từ 20-40

UI/L. Bên cạnh AST, còn có ALT, đây là hai enzyme đặc trưng cho chức năng gan.

Khi có nhiều tế bào gan bị tổn thương, hoại tử, cả hai enzyme này sẽ được “giải

thoát” và ồ ạt phóng thích vào máu. Chỉ số AST cao đặc trưng cho sự tổn thương

của gan. Con đường truyền tín hiệu qua JAK1 của IL10 đến các gen đích cho thấy

có sự ảnh hưởng tới chỉ số AST. Nghiên cứu biểu hiện của gen IL4R trong 40 cặp

mô u và LCU ở bệnh nhân HCC về mức độ biểu hiện và khả năng xâm lấn của tế

bào cho thấy IL-4R đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự sống và di căn

của tế bào HCC và điều hòa hoạt động của các con đường tín hiệu JAK1/STAT6,

IL-4/IL-4R có thể là mục tiêu điều trị mới cho HCC .

STAM2 là một protein liên quan đến việc truyền tín hiệu của các thụ thể

cytokine, protein này hoạt động ở phần sau của JAK kinase và được phosphoryl hóa

để đáp ứng với kích thích cytokine . STAM2 có vai trò trong sự phát triển khối u

bạch cầu . Protein này còn làm bất hoạt gen THPO-thrombopoietin ở gan, làm giảm

số lượng tiểu cầu và tiến triển ung thư vú ở chuột MMTV-PyMT biến đổi gen .

Nghiên cứu về STUB1 nhận thấy E3 ubiquitin ligase STUB1 có mặt khắp nơi và

làm mất ổn định YAP1, do đó ức chế sự sống của tế bào ung thư. Mức độ biểu hiện

STUB1 thấp có liên quan đến mức tăng protein YAP1 trong các dòng tế bào ung thư

dạ dày ở người và mẫu bệnh nhân . Protein được mã hóa bởi gen IL20 này là một

cytokine có cấu trúc liên quan đến interleukin 10 (IL10). Cytokine này truyền tín

hiệu thông qua STAT3 trong tế bào keratinocytes . Nghiên cứu chỉ ra rằng sự biểu

hiện quá mức của IL10R2 và STAT3 góp phần gây ung thư đại trực tràng trong các

khối u thông qua tín hiệu IL22/STAT 3 . Phân tích sự tương quan biểu hiện các gen

với AST cho thấy biểu hiện của các gen IL10, IL20, IL10RB, IL4R, JAK1, STAM2,

THPO và STUB1 có tương quan với chỉ số AST.

* Tương quan biểu hiện mRNA các gen nghiên cứu với chỉ số ALT

Kết quả phân tích hồi quy đa biến giữa biểu hiện mRNA của 76 gen nghiên

cứu về tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số ALT tìm ra được tỷ lệ biểu hiện gen

IL10 tương quan thuận với chỉ số ALT với hệ số chuẩn hóa (beta) là -0,701 và

p<0,001. Chúng tôi nhận thấy chỉ biểu hiện của gen IL10 liên quan tới chỉ số ALT ở

những bệnh nhân HCC. Khi biểu hiện IL10 giảm đi trong mô U so với mô LCU liên

quan tới sự tăng lên của chỉ số ALT. Tuy nhiên khi nghiên cứu về biểu hiện của gen

IL10 cho thấy mRNA IL10 cao hơn đáng kể trong các tế bào u ác tính .

* Tương quan biểu hiện mRNA các gen nghiên cứu với chỉ số AFP

Bảng 3.24: Tương quan tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số AFP

Mô hình dự đoán Hệ số đã chuẩn hóa (Beta) p

SOCS2 SOCS2 STUB1 SOCS2 STUB1 CSF1R 0,371 0,481 -0,406 0,621 -0,409 -0,352 0,033 0,005 0,017 0,001 0,011 0,033

Kết quả phân tích hồi quy đa biến giữa tỷ lệ biểu hiện mRNA của 76 gen

nghiên cứu, về tỷ lệ biểu hiện mRNA giữa U/LCU với chỉ số AFP nhận thấy 3

phương trình dự đoán liên quan đến 3 gen là CSF1R, STUB1, SOCS2 (Bảng 3.11).

Phương trình 1 cho thấy tỷ lệ biểu hiện gen SOCS2 tương quan thuận với chỉ số

AFP. Phương trình 2 đưa ra kết quả về tỷ lệ biểu hiện gen giữa U/LCU của gen

SOCS2 và STUB1 tương quan với chỉ số AFP, trong đó tỷ lệ biểu hiện gen SOCS2

tương quan thuận còn tỷ lệ biểu hiện gen STUB1 tương quan nghịch với chỉ số AFP.

Phương trình 3 nhận thấy kết quả về tỷ lệ biểu hiện gen giữa U/LCU của gen

SOCS2, CSF1R và STUB1 ảnh hưởng tới chỉ số AFP, trong đó tỷ lệ biểu hiện gen

SOCS2 tương quan thuận còn tỷ lệ biểu hiện gen STUB1 và CSF1R tương quan

nghịch với chỉ số AFP.

Con đường tín hiệu CSF1R/ SOCS2/ STUB1 có ảnh hưởng tới chỉ số AFP là

chỉ số xét nghiệm dấu ấn ung thư gan nguyên phát. Trong đó biểu hiện của CSF1R,

STUB1 tăng lên trong mô u so với mô LCU liên quan tới giảm chỉ số AFP. Nghiên

cứu về biểu hiện của CSF1R, STUB1 nhận thấy E3 Ubiquitin Ligase STUB1 có mặt

khắp nơi và làm mất ổn định của YAP1, do đó ức chế sự sống của tế bào ung thư

đồng thời CSF1R hoạt động như chất ức chế khối u, kích hoạt sự hoạt động của đại

thực bào .

* Tương quan biểu hiện mRNA các gen nghiên cứu với chỉ số CEA

Bảng 3.25: Tương quan tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số CEA

Mô hình dự đoán Hệ số đã chuẩn hóa (Beta) p

2 FAS FAS PGK1 0,339 0,551 -0,444 0,050 0,004 0,016

Kết quả phân tích hồi quy đa biến giữa biểu hiện mRNA của 76 gen nghiên

cứu trong tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số CEA tìm ra được hai gen có

tương quan với chỉ số CEA là FAS và PGK1 (Bảng 3.12). Phương trình 1 cho thấy

tỷ lệ mức độ biểu hiện của gen FAS có tương quan thuận với chỉ số CEA. Phương

trình 2 cho kết quả tỷ lệ biểu hiện gen FAS và gen PGK1 đồng thời có tương quan

với chỉ số CEA, trong đó tỷ lệ mức độ biểu hiện của gen FAS có tương quan thuận

và tỷ lệ biểu hiện gen PGK1 tương quan nghịch với chỉ số CEA.

CEA là protein dấu ấn của ung thư biểu mô. Kết quả phân tích hồi quy đa

biến giữa biểu hiện mRNA của 76 gen nghiên cứu,vềtỷ lệ biểu hiện mRNA ở

U/LCU với chỉ số CEA nhận thấy hai gen FAS và PGK1 đồng tương quan với chỉ số

CEA. Sự tăng lên của biểu hiện gen FAS và giảm biểu hiện của gen PGK1 trong mô

U so với mô LCU liên quan tới sự tăng lên của chỉ số CEA. PGK1 cho thấy sự tăng

lên ở mô U so với mô LCU và được coi là yếu tố tiên lượng xấu cho nhiều loại ung

thư đặc biệt là HCC . Tuy nhiên khi nghiên cứu sâu về gen FAS ở những bệnh nhân

HCC nhận thấy biểu hiện mRNA của gen FAS được tăng cường ở những vùng có tế

bào viêm xâm nhập tại vùng không ung thư của mô gan và trên rìa mô ung thư hay

mô LCU so với mô U .

* Tương quan biểu hiện mRNA các gen nghiên cứu với chỉ số MELD

Bảng 3.26: Tương quan tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số MELD

Mô hình dự đoán Hệ số đã chuẩn hóa (Beta) 1

4 IL10 IL10 JAK2 IL10 JAK2 STAT5A JAK2 STAT5A p 0,001 0,006 0,007 0,705 0,000 0,021 0,000 0,000 -0,563 -0,433 -0,420 -0,075 -0,601 0,464 -0,633 0,517

Kết quả phân tích hồi quy đa biến giữa biểu hiện mRNA của 76 gen nghiên

cứu trong tỷ lệ biểu hiện mRNA U/LCU với chỉ số MELD tìm ra được 3 gen có

tương quan với chỉ só MELD là IL10, JAK2 và STAT5A (Bảng 3.13). Phương trình

1 cho thấy tỷ lệ mức độ biểu hiện của gen IL10 có tương quan nghịch với chỉ số

MELD. Phương trình 2 cho kết quả về tỷ lệ biểu hiện gen IL10 và gen JAK2 đồng

tương quan với chỉ số MELD, trong đó tỷ lệ mức độ biểu hiện của cả hai gen JAK2

và IL10 đều có tương quan nghịch với chỉ số MELD. Phương trình 3 cho kết quả về

tỷ lệ biểu hiện gen IL10, STAT5A và gen JAK2 đồng tương quan với chỉ số MELD,

trong đó tỷ lệ mức độ biểu hiện của gen JAK2 và IL10 có tương quan nghịch còn tỷ

lệ biểu hiện gen STAT5A tương quan thuận với chỉ số MELD. Phương trình 4 cho

thấy kết quả về tỷ lệ biểu hiện gen STAT5A và gen JAK2 đồng tương quan với chỉ số

MELD, trong đó tỷ lệ mức độ biểu hiện của gen JAK2 có tương quan nghịch còn tỷ

lệ biểu hiện gen STAT5A tương quan thuận với chỉ số MELD.

MELD là chỉ số biểu thị mức độ tổn thương gan. Kết quả phân tích hồi quy

đa biến giữa biểu hiện mRNA của 76 gen nghiên cứu về tỷ lệ biểu hiện mRNA

U/LCU với chỉ số MELD nhận thấy chỉ số MELD tương quan đồng thời với 3 gen

là IL10, JAK2 và STAT5A. Giảm biểu hiện đồng thời IL10 và JAK2 cùng với sự tăng

lên của STAT5A dẫn tới sự tăng lên của chỉ số MELD là sự tăng lên của mức độ tổn

thương gan. Tuy nhiên khi nghiên cứu về biểu hiện của gen IL10 cho thấy mRNA

IL10 cao hơn đáng kể trong các tế bào u ác tính pha tăng trưởng . Vai trò của JAK2

trong cơ chế bệnh sinh ung thư tế bào gan thông qua điều hòacác quá trình viêm

quan trọng được nghiên cứu và nhận thấy JAK2 đóng vai trò trong quá trình phát

sinh sinh ung thư thông qua quá trìnhviêm .

KẾT LUẬN

1. Đánh giá mức độ biểu hiện của các gen nghiên cứu trong mô u và LCU Xác định được 41 gen có sự khác biệt về mức độ biểu hiện giữa mô u và mô

LCU trong đó:

17 gen giữ vai trò tín hiệu và thụ thể. 7 gen thuộc nhóm tín hiệu JAK/STAT. 7 gen đích chức năng. 10 gen điều hòa.

2. Biểu hiện các gen ở mô U có mức tương quan thuận với biểu hiện gen ở

mô LCU Trong số 41 gen có sự khác biệt trong biểu hiện gen giữa mô U và LCU, nhận

thấy mức độ biểu hiện của 12 gen có tương quan thuận giữa mô U và mô LCU. 3. Mối liên quan giữa biểu hiện gen nghiên cứu với chỉ số lâm sàng.

Biểu hiện SOCS2 có liên quan với mức độ biệt hóa. Biểu hiện TSLP có liên

quan với kích thước khối u. Biểu hiện FAS, STAT1, và CEBPB có liên quan với

mức độ xâm lấn mạch.

Biểu hiện STAT1 và ISG15 có liên quan với nồng độ Fibrinogen. Biểu hiện

IL10, JAK1, STAM2, THPO, STUB1, IL20, IL10RB, IL4R có liên quan với chỉ

số AST (SGOT). Biểu hiện IL10 có liên quan với chỉ số ALT. CSF1R, STUB1,

SOCS có liên quan với chỉ số AFP. Biểu hiện FAS và PGK1 có liên quan với

chỉ số CEA. Biểu hiện IL10, JAK2 và STAT5A có liên quan với chỉ số MELD.

KIẾN NGHỊ

Từ những kết quả đã đạt được, chúng tôi xin kiến nghị cần nghiên cứu sâu

hơn về các gen thuộc con đường tín hiệu JAK/STAT bao gồm: IL10, IL10RA, LEP,

LEPR, GHR, INSR, IFNAR1, IL6ST CSF1R, EGFR, FAS, TSLP CNTFR, EPOR,

IL4R, IL4,PRLR, JAK2, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5B, STAT6, A2M, PTPN6,

PTPRC, SMAD1, SMAD2, SMAD3, CISH, SOCS2, SOCS3 và SLA2 ở mức độ

protein và tìm hiểu mối liên quan với lâm sàng để có thể tìm ra những biomarker

phát hiện sớm hay điều trị đích hiệu quả cho bệnh nhân HCC.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Anh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học thực nghiệm: Đánh giá biểu hiện của các gen liên quan tới con đường tín hiệu JAK/STAT ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có nhiễm virus viêm gan B

ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN LIÊN QUAN TỚI CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU JAK/STAT Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN

NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B

ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN LIÊN QUAN TỚI CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU JAK/STAT Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN

NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B

CHỮ VIẾT TẮT

Thành viên họ

Phối tử

Thụ thể

JAK

STAT

Gen đích của STAT1

Gene A2M APOE B3GAT3 BCL6 CASP4

Gene Vị trí GATA3 12p13.3 19q13.2 GBP1 11q12.3 HSPB1 HSPCA ICAM1

Gene Vị trí PBF 10p15 JUN 1p22.2 LTC4S 7q11.23 14q32.33 MAT2A 19p13.3

Vị trí 8p21.1 1p32-31 5q35 2p11.2 7q31

Gene REV3L RNMT SEC6L1 SOCS3 TAP1

Vị trí 6q21 18p11.22 5p15.33 17q25.3 6p21.3

Gen đích của STAT4

Gen đích của STAT3

Gen A2M

Vị trí 12p13.3

Vị trí 14q24.3

Gen MIA2

Vị trí 14q13.2

Gen SOCS3

Vị trí 17q25.3

Gen FOS HMOX

Gen đích của STAT5

Gen đích của STAT6

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok