Luận văn thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu cải biến chitosan nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

LÊ PHƯƠNG HÀ

TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN CHITOSAN NHẰM TĂNG CƯỜNG HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Buôn Ma Thuột, năm 2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN ……………………….

LÊ PHƯƠNG HÀ

TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN CHITOSAN NHẰM TĂNG CƯỜNG HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN ANH DŨNG

Buôn Ma Thuột, năm 2009

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và

kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, ñược các ñồng tác giả

cho phép sử dụng và chưa từng ñược công bố trong bất kỳ một công trình

nào khác.

Họ tên tác giả

Lê Phương Hà

LỜI CẢM ƠN !

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tôi xin gởi lời

cảm ơn chân thành ñến:

Ban giám hiệu trường Đại học Tây Nguyên.

Các thầy cô Khoa sau Đại học, Khoa KHKT&CN Trường Đại học

Tây Nguyên.

Các thầy cô phòng thí nghiệm Sinh học thực vật – Khoa Nông Lâm

Nghiệp Trường Đại học Tây nguyên ñã ñộng viên và giúp ñỡ cho tôi sớm

hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Ban Giám Hiệu, toàn thể các anh chị, các bạn ñồng nghiệp và ñặc

biệt là Khoa Trồng Trọt trường Cao ñẳng Công Nghệ và Kinh Tế Bảo Lộc

ñã luôn tạo ñiều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian

công tác và học tập.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất ñến PGS.TS Nguyễn Anh

Dũng, người ñã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ dạy và giúp ñỡ trong suốt

thời gian học tập và thực hiện luận văn.

Xin ghi nhận sự giúp ñỡ của các anh chị trong lớp Cao học Sinh Học

Thực Nghiệm K1 ñã luôn ñộng viên và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học

tập và nghiên cứu tại trường.

Cuối cùng tôi vô cùng biết ơn sự quan tâm , khích lệ của người thân

trong gia ñình ñã luôn luôn ñộng viên về mọi mặt ñể tôi hoàn thành tốt khóa

học này.

Xin chân thành cảm ơn!

LÊ PHƯƠNG HÀ

iii

MỤC LỤC

Trang

Các chữ viết tắt………………………………………………………………i

Danh mục ảnh……………………………………………………….............ii

Danh mục bảng……………………………………………………………..iv

Danh mục hình………………………………………………………………v

MỞ ĐẦU……………………………………….……………………............1

Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………...……………...3

1.1. Tổng quan về chitosan và chitosan oligomer…………………………...3

1.1.1. Công thức cấu tạo …………………………………………………….3

1.1.2. Tính chất của chitosan ………………………………………………..4

1.1.3. Các ñặc tính của chitosan .....................................................................6

1.1.4. Ứng dụng của Chitosan và các dẫn suất ……………………...………7

1.1.5. Tình hình nghiên cứu cải biến chitosan ..............................................15

1.1.6. Các dẫn suất cải biến của Chitosan ....................................................20

1.1.6.1. Chitooligosaccharide ……………………………………...…….20

1.1.6.2. Các dẫn suất của Chitosan ……………………………...……….21

1.1.7. Khả năng kháng khuẩn của Chitosan và dẫn suất ..............................25

1.2. Tình hình bảo quản thực phẩm hiện nay ...............................................26 1.3. Một số ñặc ñiểm của ñối tượng nghiên cứu ..........................................27

1.3.1. Vi khuẩn Escherichia coli ..................................................................27

1.3.1.1. Đặc ñiểm chung ...............................................................................27

1.3.1.2. Đặc ñiểm sinh vật ............................................................................28

1.3.1.3. Phòng và trị .....................................................................................28

1.3.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus ........................................................28

1.3.2.1. Đặc ñiểm chung ...............................................................................28

1.3.2.2. Phòng bệnh và chữa bệnh ................................................................29

Phần 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................30

2.1. Nội dung nghiên cứu .............................................................................30

2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................30

2.2.1. Địa ñiểm nghiên cứu ..........................................................................30

2.2.2. Vật liệu hoá chất.................................................................................30

2.2.3. Thiết kế thí nghiệm.............................................................................30

2.2.3.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn ......................................................30

2.2.4. Các bước tiến hành .............................................................................31

2.2.5. Phương pháp nghiên cứu cải biến chitosan ........................................32

2.2.5.1. Phương pháp cải biến chitosan-glucose ..........................................32

2.2.5.2. Phương pháp cải biến chitosan-glucosamine ..................................33

2.2.6. Phương pháp nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất

chitosan cải biến ...........................................................................................33 2.2.6.1. Xác ñịnh khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp ño ñộ ñục....33

2.2.6.2. Xác ñịnh khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuyếch tán trên

ñĩa .................................................................................................................34

2.2.7. Phương pháp thử nghiệm các dẫn suất chitosan cải biến trong bảo

quản thực phẩm ............................................................................................34

2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................37

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................38

3.1. Nghiên cứu chế tạo dẫn suất Chitosan cải biến ....................................38

3.1.1. Ảnh hưởng khối lượng phân tử của chitosan và tỷ lệ nồng ñộ

chitosan/glucose ñến phản ứng Maillard .....................................................38

3.1.2. Ảnh hưởng khối lượng phân tử của chitosan và nồng ñộ ñường

glucose ñến phản ứng Maillard gắn glucosamine vào mạch chitosan..........40

3.2. Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất chitosan cải biến

trong invitro...................................................................................................41

3.2.1. Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chitosan – glucose ...............41

3.2.2. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn chitosan – glucosamine

cải biến .........................................................................................................52

3.3. Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan cải biến bằng

phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ...............................................................62

3.3.1. Đối với chitosan – glucose .................................................................62

3.3.2. Đối với chitosan – glucosamine ........ ................................................65

3.4. Nghiên cứu thử nghiệm các dẫn suất chitosan cải biến trong bảo quản

thực phẩm .....................................................................................................67

3.4.1. Đối với chitosan – glucose .................................................................67

3.4.1.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose ñến trạng thái cảm quan

của thịt trong quá trình bảo quản ..................................................................67

3.4.1.2. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine ñến trạng thái cảm

quan của thịt trong quá trình bảo quản .........................................................71

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................76

4.1. Kết luận ……………………………………….………………………76

4.2. Đề nghị ………………………………………………………………..76

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................77

Tiếng Việt .....................................................................................................77

Tiếng Anh ……………………………………………...…………………..79

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chitosan – glucose Công thức 1 Công thức 2 Công thức 3 Đối chứng Tiêu chuẩn Việt Nam Coefficient of Variation Daton parts per million chitosan - glucose khối lượng phân tử thấp polyethylene glycol

CGC CT1 CT2 CT3 ĐC TCVN CV Da ppm CGC LMWC PEG

vii

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng1.1: . Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan ñến khả năng

kháng khuẩn……..…………………………………………………………17

Bảng 1.2: Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan và DEMC....18

Bảng 2.1: Cơ sở cho ñiểm thịt bò theo TCVN 3215-79…………………...37

Bảng 2.2: Hệ số quan trọng của các chỉ tiêu cảm quan của thịt…………....38

Bảng 2.3: Bảng phân cấp chất lượng thịt…………………………………. 38 Bảng 3.1: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử và nồng ñộ ñường glucose ñến

mức ñộ phản ứng Maillard………………………………………………....40

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử và nồng ñộ ñường

glucosamine ñến mức ñộ phản ứng Maillard………………………………41

Bảng 3.3: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli………………….................43

Bảng 3.4: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus……………………..45

Bảng 3.5: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli…………………………...46

Bảng 3.6: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus…………………....48

Bảng 3.7: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli…………………………...50

Bảng 3.8: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus…………………....51

Bảng 3.9: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus……………….53

viii

Bảng 3.10: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli……………………....55

Bảng 3.11: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus……………...56

Bảng 3.12: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli……………………..57

Bảng 3.13: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus……………...59

Bảng 3.14: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli……………………..60

Bảng 3.15: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose

bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn S. aureus………..62

Bảng 3.16: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose

bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn Escherichia

coli………………………………………………………………………….63

Bảng 3.17: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan -

glucosamine bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn

Staphylococcus aureus…………………………………………………......64

Bảng 3.18: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan -

glucosamine bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn

Escherichia coli…………………………………………………………….65

DANH MỤC HÌNH VẼ, CÁC ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1: Cấu trúc của chitin, chitosan và cellulose………………………...3 Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 250C) ñến trạng thái

cảm quan của thịt…………………………………………………………...67

Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 250C) ñến trạng thái

cảm quan của thịt…………………………………………………………...67

Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 250C) ñến trạng thái

cảm quan của thịt…………………………………………………………...68

Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt ñộ lạnh (50C) ñến trạng thái cảm quan

của thịt……………………………………………………………………...69

Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt ñộ lạnh (50C) ñến trạng thái cảm quan

của thịt……………………………………………………………………...69

Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt ñộ lạnh (50C) ñến trạng thái cảm quan

của thịt……………………………………………………………………...70

Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine có khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 250C) ñến trạng thái

cảm quan của thịt…………………………………………………………...71

Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine có khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 250C) ñến trạng

thái cảm quan của thịt………………………………………………………71

Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine có khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 250C) ñến trạng

thái cảm quan của thịt………………………………………………………72

Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine có khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt ñộ lạnh (50C) ñến trạng thái cảm

quan của thịt………………………………………………………………..72

Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine có khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt ñộ lạnh (50C) ñến trạng thái cảm

quan của thịt………………………………………………………………..73

Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine có khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt ñộ lạnh (50C) ñến trạng thái cảm

quan của thịt………………………………………………………………..73

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những mối quan tâm chung của

toàn xã hội và là vấn ñề thời sự ñược dư luận quan tâm, nhất là khi các cơ

quan chức năng mới phát hiện hàng loạt những vi phạm nghiêm trọng về vệ

sinh an toàn thực phẩm.

Khi xu hướng sử dụng các loại thực phẩm chế biến sẵn của thị trường

ñang gia tăng, ñặc biệt là ñối với các sản phẩm thịt chế biến cổ truyền của

Việt Nam như giò lụa, nem chua, lạp xưởng, xúc xích ñược người tiêu dùng

ngày càng ưa chuộng. Tuy nhiên, theo báo cáo của Chi cục Thú y Thành phố

Hồ Chí Minh (1999) cho thấy 50-60% mẫu xét nghiệm không ñạt tiêu chuẩn

vi sinh và sinh hóa. Ngộ ñộc thực phẩm do vi khuẩn và ñộc tố của nó thường

xảy ra do thiếu sót trong quá trình chế biến, công tác kiểm tra, thanh tra thực

phẩm và nguyên liệu dùng ñể chế biến thực phẩm. Loại ngộ ñộc này thường do

Salmonella enteritidis, Clostridium perfrigens, Staphylococcus aureus,

Escherichia coli,.. Hiện nay, ñể bảo quản các loại thực phẩm tươi như thịt, cá, giò

chả… phần lớn người ta ñã sử dụng các chất hóa học như phân urê, hàn the,

benzoate natri, trong nước mắm có urê hay sử dụng formon trong làm bánh phở,

hàn the ñể làm chả nem, hầu hết các chất này khi vào cơ thể tích tụ lâu ngày sẽ

gây ảnh hưởng ñến sức khỏe của con người và nghiêm trọng hơn nữa là gây ra các

bệnh ung thư và làm giảm giá trị của thực phẩm.

Chitosan là một polimer sinh học, ñược tách từ vỏ tôm, cua, côn trùng, giáp

xác và tế bào nấm. Chitosan là một poly-glucosamin ñược cấu tạo từ các gốc

glucosamin kiên kết với nhau bằng liên kết β- 1,4 glucoside. Chitosan và các

sản phẩm thủy phân của chitosan là chitosan oligomer là các sản phẩm của tự

nhiên, không ñộc, không gây ô nhiểm môi trường nhưng có hoạt tính sinh học

rất cao. Chitosan ñược chứng minh là một chất có hoạt tính kháng khuẩn,

chống nấm và chống oxi hóa nhờ tính chất polycation tự nhiên nên có nhiều

ứng dụng trong nông nghiệp và bảo quản thực phẩm. Tuy nhiên, enzyme của

một số vi khuẩn tiết ra có khả năng phân hủy và làm mất hoạt tính của

chitosan. Vì vậy, ñể tăng cường hoạt tính kháng khuẩn, hạn chế khả năng

phân huỷ của enzyme do vi sinh vật tiết ra, cần phải cải biến thay ñổi cấu trúc

của chitosan. Xuất phát từ thực tiễn ñó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:

“Nghiên cứu cải biến chitosan nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn ñể

ứng dụng trong bảo quản thực phẩm”.

Mục tiêu của ñề tài là:

1. Cải biến chitosan nhằm nâng cao hoạt tính kháng khuẩn. 2. Thử nghiệm ứng dụng chitosan cải biến trong bảo quản thực phẩm.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về chitosan và chitosan oligomer

1.1.1. Công thức cấu tạo

Chitosan là một polymer sinh học với các ñơn phân N-acetyl

glucosamine ñược deacetyl hoá một phần, hiện diện tự nhiên trong vách một

số giống nấm như Mucorales (Muzarelli, 1993)[42]. Tuy nhiên, phần lớn

lượng chitosan hiện ñang ñược thu nhận và sử dụng lại chủ yếu từ quá trình

deacetyl hoá chitin, thành phần chính của trong bộ xương ngoài của ñộng vật

giáp xác như tôm, cua hay mực.

Chitosan dễ tan trong các acid hữu cơ như axít lactic, axít acetic. Khi

phân hủy chitosan bằng các tác nhân khác nhau như axít clohidric, enzyme

chitosanase, cellulase hoặc bức xạ gamma sẽ tạo nên các sản phẩm có chiều

dài mạch ngắn hơn gọi là oligoglucosamine.

Hình 1.1: Cấu trúc của chitin, chitosan và cellulose.

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, trong ñó nhóm (-NH2)

thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C(số 2). Chitosan ñược cấu tạo từ các mắt

xích D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết b-(1-4-glicoside, do vậy

chitosan có thể gọi là poly b-(1,4)-2-amino-2-deoxi-D-glucose hoặc là poly b-

(1-4)-D-glucosamine (cấu trúc bậc III).

Các ñơn vị cấu tạo nên phân tử chitosan là -D-glucosamine hay -(1,4)-

2-amino-2-deoxy-D-glucose.

1.1.2. Tính chất của chitosan

a. Tính chất vật lý

Chitosan là chất rắn, xốp, nhẹ, màu trắng ngà, không mùi, không vị,

hòa tan dễ dàng trong các acid hữu cơ như axít lactic, axít acetic. Ngay từ

năm 1968, K.Arai và cộng sự ñã xác ñịnh chitosan hầu như không có tính

ñộc, không gây ñộc trên ñộng vật thực nghiệm và người. Nhiều tác giả chỉ rõ

chitosan, chitosan glucosamine có nhiều ưu ñiểm: tính chất cơ học tốt, không

ñộc, dễ tạo màng, hòa hợp sinh học không những ñối với ñộng vật mà còn ñối

với các mô thực vật.

b. Tính chất hóa học

Phân tử lượng từ 10 -1000 kDa tùy theo ñiều kiện sản xuất.

Mức ñộ deacetyl hoá thường từ 70% ñến 100%.

Nhiệt ñộ nóng chảy từ 309oC ñến 311oC tùy theo trọng lượng phân tử

và mức ñộ deacetyl hoá.

Chitosan tan trong dung dịch loãng các axít hữu cơ như axít acetic, axít

formic, axít adipic, axít propionic và một số axít vô cơ. Ba thuộc tính cơ bản

nhất của chitosan là: phân tử lượng, mức ñộ deacetyl hoá và ñộ tinh sạch.

Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức –OH, -NHCOCH3

trong các mắt xích axetyl-D-glucosamine và nhóm –OH, nhóm –NH2 trong

mắt xích D-glucosamine có nghĩa chúng vừa là ancol vừa là amin, vừa là

amit. Phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế

O-, dẫn xuất thế N- hoặc dẫn xuất thế O-, N-.

Mặt khác chitosan là những polimer và các monomer ñược nối với

nhau bởi các liên kết b-(1,4)-glicoside, các liên kết này rất dễ bị cắt ñứt bởi

các chất hóa học như: acid, bazơ, tác nhân oxy hóa và các enzime thủy phân.

* Các phản ứng của nhóm –OH

Phản ứng của nhóm –OH có thể tạo ra các dẫn suất.

- Dẫn xuất sunfat.

- Dẫn xuất O-axyl của chitin/chitosan.

- Dẫn xuất O-tosyl hóa chitin/ chitoan.

* Phản ứng ở vị trí N.

- Phản ứng N-acetyl hóa chitosan.

- Dẫn xuất N-sunfat chitosan.

- Dẫn xuất N-glycochitosan(N-hydroxyl-etylchitosan).

- Dẫn xuất acroleylen chitosan.

* Các phản ứng xảy ra tại vị trí O, N.

-Dẫn xuất O,N-cacboxymetylchitosan.

-Dẫn xuất N,O-cacboxymetylchitosan.

- Phản ứng cắt ñứt liên kết b-(1,4) glycoside.

c. Các phương pháp thu nhận chitosan oligomer

Để thu nhận chitosan oligomer từ chitosan hiện nay có 3 phương pháp

chủ yếu:

- Phương pháp hóa học

Đây là phương pháp khá ñơn giản, sử dụng các axít clohidric (6-12N) ñể thủy phân, nhiệt ñộ thủy phân từ 80-1000C Domard,(1989). Tuy nhiên

nhược ñiểm của phương pháp này là chi phí dành cho thiết bị cao, phải có

thiết bị chống ăn mòn axít, gây ô nhiễm môi trường và nhất là hiệu suất thu

hồi các phân ñoạn oligoglucosamine có hoạt tính thấp, sản phẩm là các

monomer là glucosamine cao (>30%).

- Phương pháp phân hủy bằng bức xạ gamma

Bức xạ gamma tăng cường ñộ deacetyl hóa và giảm bớt trọng lượng

phân tử của chitosan. Quá trình deacetyl hóa kiềm mạnh trọng lượng phân tử

của chitosan giảm từ 890 kDa ñến 380 kDa (bức xạ 50 kGy) và 200 kDa (bức

xạ 75 kGy). Điều chế chitosan oligomer ñược thực hiện bởi axít clohidric và

cellulase N.A.Dzung, (2001)[8].

- Phương pháp emzyme

Để thủy phân chitosan có thể sử dụng nhiều loại enzyme như

chitosanase, celluloase, glucanase. Phương pháp này ñược sử dụng khá rộng

rãi hiện nay (Muraki, 1993; Aiba, 2002). Phương pháp này có nhiều ưu ñiểm

như:

+ Hiệu suất thu hồi các phân ñoạn cao.

+ Điều kiện diễn ra phản ứng thủy phân nhẹ nhàng, nhiệt ñộ thấp, pH

ôn hòa nên chi phí thiết bị thấp, không gây ô nhiễm môi trường.

+ Nhược ñiểm của phương pháp này là chi phí dành cho enzyme khá

cao.

1.1.3. Các ñặc tính của chitosan

Chitosan có ứng dụng rất rộng rãi trong các ngành công, nông nghiệp, y

dược, thực phẩm… nhờ vào những ñặc tính sau Antoni (2005)[73]:

- Tính chất ña ñiện ly mang ñiện tích dương (cationic polyelectrolyte) cho

phép gắn kết với các thành phần sinh học mang ñiện tích âm.

- Có thể tái sinh theo con ñường sinh học trên trái ñất.

- Có khả năng thủy phân sinh học bằng enzyme trong cơ thể.

- Có khả năng tương hợp sinh học với các cơ quan, mô và tế bào ñộng

thực vật.

- Có khả năng kích thích quá trình ñông máu và làm lành vết thương.

- Có khả năng tương tác chuyên biệt với các thành phần của chất nền ngoại

bào và các nhân tố tăng trưởng.

- Giảm cholesterol do liên kết có chọn lọc với các lành axít béo.

- Không gây ñộc do các sản phẩm sau thủy phân ñều là các chất chuyển

hoá tự nhiên.

- Không gây ñáp ứng miễn dịch trong mô và cơ quan ñộng vật.

- Có tác dụng hỗ trợ trong ñiều hòa miễn dịch.

- Có thể xử lý tạo nhiều dạng sản phẩm như dạng miếng, màng, tấm xốp,

sợi, hạt, bột mịn, bông và gel.

1.1.4. Ứng dụng của chitosan và các dẫn suất

Hiện nay, chitosan, chitin và chitosan oligomer là một trong những vật

liệu mới ñã và ñang ñược ứng dụng rất phổ biến trong các lĩnh vực như: công

nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp, dược phẩm, y tế, môi trường, công

nghệ sinh học và vật liệu mới. Tất cả các ứng dụng của chitosan phụ thuộc

chủ yếu vào các tính chất lý hóa và sinh học như: các thuộc tính lưu biến học,

hoạt tính kháng khuẩn, ñiều chỉnh miễn dịch, làm lành vết thương và ñông

máu, liên kết với enzyme, hấp thu kim loại, tạo màng và gel… Tùy vào lĩnh

vực ứng dụng mà người ta sử dụng chitosan ở các mức ñộ tinh sạch khác

nhau.

Chitin, chitosan và oligoglucosamine ñều là các sản phẩm có nguồn

gốc tự nhiên, không gây ñộc hại cho con người và gia súc, có khả năng phân

huỷ sinh học và không gây ô nhiễm môi trường. • Ứng dụng của chitosan trong công nghiệp

+ Xử lý nước thải, hấp thu kim loại nặng

Hiện nay, phương pháp hóa lý là phương pháp tiện dụng và phổ biến

trong hệ thống xử lý nước thải của các nhà máy công nghiệp. Tuy nhiên, bất

lợi chính của phương pháp này là nguy cơ gây ô nhiễm môi trường. Vì thế,

việc tìm ra một phương pháp "xanh" (phương pháp an toàn với môi trường) là

rất cần thiết. Do có nguồn gốc từ tự nhiên và có khả năng thủy phân sinh học,

chitosan là một chất thay thế hợp lý. Chitosan ñã ñược sử dụng trong quá trình

lọc nước từ khoảng 3 thập niên trước. Các nghiên cứu ñã cho thấy chitosan có

khả năng:

- Hấp thu kim loại nặng: chitosan mang ñiện tích dương kết hợp với

những polymer ña ñiện âm tạo phức với các ion kim loại và kết tủa.

Chitosan cũng có thể ñược sử dụng như một chất hấp thụ ñể tách các

ñồng vị phóng xạ nguy hiểm từ nước bị nhiễm phóng xạ và thu hồi

uranium từ nước biển và nước ngọt.

- Loại bỏ 100% các polyme hiện diện trong nước thải.

- Giảm mùi hôi khó chịu (do làm giảm số lượng vi sinh vật gây thối)

- Một số ứng dụng mở rộng khác bao gồm: xử lý vệt dầu loang, xử lý

nước thải sinh hoạt, tái sử dụng nước hồ bơi, thu hồi protein và khoáng

từ nước thải nông nghiệp, phân lập các chất có hoạt tính sinh học trong

nước tiểu và tách các ñộc tố từ dung dịch.

+ Trong công nghiệp sản xuất thực phẩm

Chitosan ñược dùng như một thành phần trong thực phẩm ở Nhật và

Châu Âu từ khoảng 20 năm trước. Chất này có tác dụng ổn ñịnh màu, mùi vị

của thực phẩm. Ngoài ra, chitosan còn thể hiện tác dụng tuyệt vời trong bảo

quản thực phẩm.

Ở Mỹ, chất này ñược sử dụng ñể "bẫy" lipid trong thực phẩm chức

năng chống béo phì. Chitosan ñược ưa chuộng không chỉ vì có tác dụng như

chất xơ, thành phần quan trọng trong khẩu phần ăn, mà còn gắn với lipid

trong dạ dày và ruột tạo thành một dạng chất mà cơ thể không thể hấp thu và

sẽ ñược loại thải ra ngoài. Các nghiên cứu cho thấy chitosan gắn ñược với

lượng chất béo gấp 4 lần khối lượng của chúng Andreu (2003)[14].

+ Trong công nghiệp mỹ phẩm

Chitosan là loại polymer tích ñiện dương tự nhiên duy nhất có khả năng

chuyển thành dạng dung dịch nhớt khi hòa tan trong môi trường acid yếu.

Nhờ tính chất này mà chitosan ñã ñược ứng dụng rất nhiều trong sản phẩm

chăm sóc tóc như dầu gội, dầu xả và sản phẩm tạo nếp Harida (1996)[74].

Ngoài ra, chitosan cũng ñược dùng trong mỹ phẩm chăm sóc da, móng tay do

có các tính chất như bảo vệ, duy trì ñộ ẩm, tạo màng trên da ñồng thời gắn

kết với các dưỡng chất cần thiết, tạo ñiều kiện cho các chất này hoạt ñộng tích

cực trên da. Tính kháng khuẩn của chitosan cũng góp phần vào công dụng của

chitosan trong các sản phẩm mỹ phẩm và chăm sóc cá nhân. Các ứng dụng cụ

thể của chitosan trong lĩnh vực này bao gồm:

- Duy trì ñộ ẩm trên da, trị mụn, làm da khỏe hơn, tươi hơn, bảo vệ lớp

biểu bì.

- Giảm sự tích ñiện trên tóc (gây thương tổn tóc), trị gàu, giúp cho tóc

mềm mại hơn, Andreu (2003)[14].

+ Trong một số công nghiệp khác

- Tăng ñộ bền cơ học và ñộ mịn của giấy, tăng chất lượng in trên giấy do

thấm mực in tốt hơn.

- Chitosan có thể ñược dùng làm chất cầm màu trong khi nhuộm và in

sợi dệt. Khả năng kháng khuẩn giúp vải bền hơn.

Cải tiến quá trình in ảnh khi có mặt trong nhũ tương bạc cản quang. Chitosan

cũng còn ñược dùng làm chất bắt hình ñen trắng • Ứng dụng của chitosan trong nông nghiệp

Chitosan ñược sử dụng như một chất thay thế an toàn cho các chất hoá

học từ lâu vẫn ñược sử dụng có thể gây hại ñến môi trường và sức khỏe con

người. Chitosan tác ñộng hỗ trợ vào cơ chế phòng vệ ở thực vật (như trường

hợp vaccine ñối với con người), kích thích sự tổng hợp và tiết một số loại

enzyme như phytoalexin, chitinase, pectinase, glucanase và lignin (Andreu,

2003)[14]. Các ứng dụng chủ yếu của chitosan trong nông nghiệp gồm có:

+ Phóng thích chậm các hợp chất vào trong ñất

Trong nông nghiệp, việc kéo dài thời gian tác dụng của phân bón, chất

ñiều hòa tăng trưởng hay chất dinh dưỡng là rất cần thiết. Chitosan ñược sử

dụng như chất mang tự nhiên ñể kếp hợp và phóng thích từ từ các hợp chất

mong muốn vào trong ñất. Chitosan bị phân hủy sinh học trong ñất trong

khoảng 2 tháng, kèm theo sự phóng thích các chất. Do ñó, người ta tiết kiệm

ñược ñáng kể lượng chất sử dụng và thời gian bón lặp khi dùng chitosan làm

chất mang.

+ Vỏ bao của hạt

Hoạt ñộng chitinase ñược gia tăng trong giai ñoạn nảy mầm khi bề mặt

của hạt giống ñược bao bằng một lớp chitosan. Khi sử dụng chitosan làm vỏ

bao của hạt, khả năng kháng nấm và vi khuẩn của chitosan hỗ trợ hữu hiệu

cho sự nảy mầm và sự phát triển của cây trồng.

+ Chất bổ sung vào thức ăn gia súc

Các khảo sát liên quan ñến việc bổ sung chitin và chitosan vào thức ăn

gia súc cho một số kết quả sau:

- Ở gà mái và gà giò, chitin và chitosan cho ăn hầu như ñược tiêu hoá

hoàn toàn.

- Ở thỏ khoảng 30% lượng chitin cho ăn ñược tiêu hoá hoàn toàn. Tỉ lệ

này hầu như không thay ñổi sau 25 ngày cho ăn liên tục. Trong khi ñó,

chitosan ñược tiêu hoá 35% sau 5 ngày cho ăn và khả năng này tăng tới

80% sau 15 ngày. Điều này có lẽ là do sự gia tăng số lượng vi khuẩn

ñường ruột, Antoni (2005)[73].

+ Kích thích tăng trưởng thực vật

Hiện nay, oligoglucosamine ñược xếp vào nhóm ñiều hoà sinh trưởng

thế hệ mới (Zubay, 1998)[75]. Hiện nay ñang ñược nghiên cứu sử dụng trong

nuôi cấy mô thực vật cho phong lan (Nagasawa, 2002, Khin Lay Nge, 2002).

Chvagrit (2002) thử nghiệm chitosan chiếu xạ ñể kích thích sinh trưởng

cho phong lan sau 30 ngày sinh khối rễ và cây tăng từ 20-60% so với ñối

chứng ở nồng ñộ thích hợp nhất là 50 ppm. (Sasitorn, 2002) phun chitosan

cho rau cải có thể tăng năng suất từ 13-31%.

Cơ chế tác ñộng của chitosan, oligoglucosamine ñã ñược làm sáng tỏ

bằng kỹ thuật sinh học phân tử. (Hadwiger, 2002)[76] ñã chứng minh

oligoglucosamine là tín hiệu phân tử hoạt hoá và tăng cường hoạt ñộng của

hàng loạt gen trong hệ thống ñề kháng của thực vật và các gen liên quan ñến

trao ñổi chất như chitinase, chitosanase, glucanase, tăng cường tổng hợp

phytoalexin, proteinase inhibitor, tăng cường tổng hợp xenlulose, lignin,…

Tình hình nghiên cứu ứng dụng chitin, chitosan và nhất là

oligoglucosamine còn khá mới mẻ. (Nguyễn Quốc Hiến, 1999) có nghiên cứu

thu nhận các oligoalginate tách ra từ rong biển ñể sử dụng trong nông nghiệp.

Sau ñó, (Nguyễn Quốc Hiến, Phạm Thị Lệ Hà, 1999) cũng nghiên cứu chế tạo

chitosan oligomer bằng kỹ thuật bức xạ gamma. Tuy nhiên, phương pháp này

còn có nhiều nhược ñiểm so với phương pháp enzyme là giá thành cao, các

phân ñoạn oligomer có khối lượng phân tử không tập trung, vì vậy hoạt tính

sinh học thường thấp.

Ngoài ra, ở Việt nam chitosan còn ñược nghiên cứu trong bảo quản trái

cây như chuối, vải thiều, cà chua, dưa chuột (Châu Văn Minh, 1996). Sản

phẩm ñược bảo quản lâu hơn, màu sắc tươi tự nhiên hơn so với ñối chứng.

+ Thuốc bảo vệ thực vật sinh học

Chitosan và chitosan oligomer có hoạt tính kích thích tăng trưởng thực

vật, tăng số lượng vi sinh vật có lợi và hạn chế các nấm gây hại trong ñất,

hoạt hóa tăng cường hệ thống ñề kháng của thực vật.

(Suwalee, 2002) thử nghiệm phun chitosan cho cây ngô ñể trị bệnh bạc

lá, kết quả cho thấy nếu sử dụng nồng ñộ 80 ppm thì chitosan hiệu quả hơn và

an toàn hơn so với các loại thuốc bảo vệ thực vật trên thị trường. (Nguyễn

Anh Dũng, 2006)[62] nghiên cứu sử dụng chitosan oligomer và chitosan

oligomer cải biến ñể kháng nấm Fusarium, vi khuẩn gây bệnh héo xanh cho

lạc Pseudomnas solanacerum và tuyến trùng ký sinh Meloidogine incognita,

số lượng tuyến trùng ký sinh giảm từ 6-8 lần sau khi tưới chitosan oligomer 3

tháng. (Rabea, 2004) cũng nghiên cứu tổng hợp alkyl và aryl-chitosan sử

dụng làm thuốc trừ nấm và trừ sâu.

+ Bảo quản nông sản

Trong bảo quản thực phẩm, chitosan không những phát huy khả năng

kháng khuẩn và nấm, mà còn giúp ñiều chỉnh môi trường bên trong rau quả

thông qua kiểm soát quá trình trao ñổi khí giữa rau quả và môi trường

(Nguyễn Anh Dũng và các cộng sự, 1999). Dung dịch chitosan ñã ñược dùng

ñể tạo lớp màng bảo quản hoa quả và rau củ chống vi khuẩn và nấm. Ở Nhật,

dung dịch chitosan cũng ñược phun lên táo và cam cho mục ñích này. Nghiên

cứu của (André Bégin, 2003)[77] cũng ñề xuất quy trình bảo quản dâu bằng

chitosan. Chitosan còn ñược sử dụng ñể làm bao bảo vệ chống sương giá

(Andreu, 2003)[14].

(Ghaouth, 1996) nghiên cứu cho thấy chitosan có khả năng ức chế các

loại nấm gây hại sau thu hoạch rau quả như Rhizopus, Colletotrichum,

chitosan bảo quản dâu tươi và các loại trái cây khác lâu hơn do hạn chế nấm

gây hư thối và ức chế hô hấp. (Fajado, 1994) cho thấy chitosan ức chế nấm

mốc sinh ñộc tố A. flavus trên lạc, ñậu tương.

Sử dụng chitosan ñể bảo quản trái cây cũng rất ñược chú ý. Chitosan ñã

ñược sử dụng ñể bảo quản xoài, cam, dâu tây (Piyabutr, 2002; Varaporn,

2002; Chucheep, 2002). Sử dụng chitosan bao trái cây (coating) có thể kéo

dài thời gian bảo quản 15 ngày ở nhiệt ñộ phòng so với ñối chứng.

(Hong Kyoon No, Na Young Park, Samuel P. Meyers, 2002) cho thấy

chitosan có hoạt tính kháng khẩn cao hơn chitosan oligomer. Chitosan ñã ức

chế sự sinh trưởng của hầu hết các loại vi khuẩn và có hiệu quả kháng khuẩn

ñối với vi khuẩn gram dương cao hơn vi khuẩn gram âm. Chitosan ñược xem

như là một chất phụ gia thực phẩm ở Hàn Quốc và Nhật Bản trước năm 1995

và 1983. Chitosan với hoạt tính kháng khuẩn cao sẽ ngăn chặn những thực

phẩm bị hỏng do vi khuẩn hoặc kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm.

(Devlieghere, 2004) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và

ứng dụng trong bảo quản rau quả và thực phẩm. Chitosan nghiên cứu có mức

ñộ deacetyl hóa 95%, khối lượng phân tử 43 kDa. Kết quả cho thấy chitosan

có khả năng kháng mạnh ñối với vi khuẩn gram âm, chỉ số MIC là < 60 ppm,

trong khi ñó nấm men và vi khuẩn gram dương là 100 ppm.

• Ứng dụng của chitosan trong lĩnh vực sinh học và y học

Đã có rất nhiều thử nghiệm ñã ñược tiến hành ñể xác nhận tính an toàn

của chitosan như: thử nghiệm khả năng gây ñột biến; khả năng gây ñộc cấp

tính; bán cấp tính và mãn tính; khả năng gây sốt; làm tan máu và gây dị ứng

(Antoni, 2005).

Số liệu ghi nhận trên thỏ, gà mái và gà giò khi ñược cho ăn chitosan với

liều lượng 0,7- 0,8g/kg khối lượng cơ thể/ngày trong 239 ngày là không có

triệu chứng bất thường nào. Khả năng tiêu hoá chitosan biểu kiến ở thỏ là 28-

38% còn ở gà mái, gà giò là hoàn toàn. Khi tiêm chitosan và các phân ñoạn

chitosan vào thỏ với liều lượng 4,5mg/kg khối lượng cơ thể/ ngày trong 7-11

ngày, không phát hiện ñược biểu hiện bất thường nào (Antoni, 2005). Trong

nghiên cứu kéo dài 12 tuần trên người, không có triệu chứng lâm sàng nào

ñược ghi nhận ở những người uống chitosan trong so với những người uống

thuốc giả. Chỉ có 2,6 – 5,4% ñối tượng có triệu chứng buồn nôn và táo bón

tuy nhiên rất nhẹ và tạm thời (Lin, 2004). Với tất cả các bằng chứng trên, việc

ứng dụng các thuộc tính qúy giá của chitosan trong lĩnh vực y sinh là hoàn

toàn hợp lý.

+ Tác nhân hạ cholesterol LDL

Đã có rất nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng giảm cholesterol và

mỡ trong máu của chitosan. Thí nghiệm trên mô hình chuột quá dư thừa

cholesterol trong máu do thiếu apolipoprotein E ñược tiến hành trong 20 ngày.

Mỗi ngày chuột thí nghiệm ñược ăn 5% chitosan trong khẩu phần thức ăn còn

lô ñối chứng thì không ñược cho ăn chitosan. Hàm lượng cholesterol trong

máu giảm ñáng kể sau 20 tuần, chỉ còn 64% so với lô ñối chứng. Ngoài ra,

khả năng ức chế xơ vữa ñộng mạch của chuột ñược ăn chitosan ở ñộng mạch

chủ là 42% và cung ñộng mạch chủ là 50%. Chuột ñược ăn chitosan cũng lớn

nhanh hơn rõ rệt. Thí nghiệm này cũng mở ra khả năng ức chế sự phát triển

chứng xơ vữa ñộng mạch trong ñiều trị bệnh cho người quá dư thừa hàm

lượng cholesterol trong máu, (Heller, 1990)[62]. Ở một nghiên cứu khác trên

người, chitosan hạ 5,8 - 42,6% tổng lượng cholesterol trong huyết tương và

15,1 - 35,1% lipoprotein tỉ trọng thấp (low density lipoprotein – LDL) trong

cơ thể (Lin, 2004).

+ Chitosan dùng làm vật liệu sinh học, y học và dược phẩm

Chitosan có khả năng tương hợp sinh học với mô và tế bào do ñó có thể

sử dụng trong việc cấy ghép vào mô ñộng vật. Vì vậy, người ta ñã tiến hành

ứng dụng chitosan làm vật liệu y sinh học mới như chỉ khâu tự tan trong phẫu

thuật, da nhân tạo trong ñiều trị bỏng và vết thương, kính áp tròng trong ñiều

trị các tật về mắt. Gần ñây, người ta cũng ñã tiến hành nghiên cứu sử dụng

chitosan dạng ống nhằm mục ñích tái sinh dây thần kinh (Krysteva, 1987).

Trong ñiều trị vết thương, chitosan có tác dụng cầm máu, ñẩy nhanh

quá trình phát triển các tế bào ở vùng mô bị thương, tăng cường hoạt ñộng của

chitinase và lysozyme, dẫn ñến mau lành vết thương và giảm nhiễm

trùng[54]. Chitosan ñược báo cáo là bền với dịch mật, dịch tuỵ và nước tiểu

nên ñược dùng trong chỉ khâu phẫu thuật thay thế cho các loại vật liệu khác

có thể bị chất dịch trong cơ thể tấn công và ñứt trước khi vết thương lành hẳn

Harida (1996).

Trong các trường hợp bị bỏng, chitosan có thể tạo thành ở dạng màng

xốp hút nước mạnh và giúp cho oxy phân tán qua màng vào mô tổn thương rất

dễ dàng, tạo ñiều kiện cho các mô này bình phục nhanh chóng.

Trong lĩnh vực dược phẩm, chitosan ñược sử dụng như chất mang an

toàn, có khả năng phóng thích thuốc dần dần trong cơ thể, kéo dài tác dụng

của thuốc hay vật liệu cố ñịnh enzyme trong sản xuất và ñiều trị. Chitosan còn

ñược dùng ñể ñiều chế các chất làm giảm bớt ñộ chua trong dạ dày và các sản

phẩm ngưng tụ của axít benzyl, penicilic với chitosan ñã ñược dùng ñể xác

ñịnh ñộ nhạy penicilin trong cơ thể người.

+ Đặc tính chống ung thư của chitosan

Chitosan có khả năng trung hòa acid và có hoạt tính chống ung thư.

Điều này ñã ñược kiểm chứng ở chó và chuột. Người ta cho rằng chitosan có

ñặc tính tương tự với các chất bao vùng dạ dày.

Ngoài ra, chitosan còn ñược ứng dụng trong ñiều trị bệnh nhân ung thư

ñược xạ trị và hoá trị liệu. Kết quả cho thấy chitosan giúp giảm thiểu sự thay

ñổi về thể trạng, các chỉ tiêu huyết học và sinh hoá ở bệnh nhân ñược ñiều trị

bằng xạ và hoá trị liệu (Nguyễn Anh Dũng và cộng sự, 1996)[1].

+ Đặc tính kháng khuẩn của chitosan

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất của nó ñã nhận

ñược sự quan tâm ñáng kể trong những năm gần ñây. Cơ chế kháng khuẩn

của chitosan là nhờ một số cơ chế sau:

- Chitosan là một polycationic, chúng tương tác với thành phần

polyanion vách tế bào (polysaccharides và protein) của vi sinh vật, kết quả là

sự rò rỉ thành phần nội bào do các thay ñổi trong tính thấm của hàng rào

(barrier), ngăn cản chất dinh dưỡng ñi vào tế bào, ngăn cản sự nhập vào tế bào

(ñặc biệt là chitosan có khối lượng phân tử thấp LMWC ).

- Chitosan có khả năng kết hợp với DNA và nhờ vậy chitosan có khả

năng ức chế tổng hợp RNA và protein.

- Chitosan có khả năng gắn kết gây ñông tụ, kết tủa tế bào vi khuẩn và

dẫn ñến giết chết tế bào.

Chitosan cho thấy một phổ kháng khuẩn rộng kháng lại cả nấm và vi

khuẩn gram-dương và Gram âm (Vishu Kumar, Varadaraj, Gowda, &

Tharanathan, 2005).

Hong Kyoon No (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của sáu loại khối lượng

phân tử khác nhau của chitosan, chitosan oligomer ñến khả năng kháng khuẩn

trên 7 loại vi khuẩn gram dương và 4 vi khuẩn gram âm. Kết quả thấy rằng

chitosan có khối lượng phân tử cao có khả năng kháng khuẩn tốt hơn chitosan

oligomer có khối lượng phân tử thấp hơn. Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan

mạnh hơn ở vi khuẩn gram âm hơn là vi khuẩn gram dương. Chỉ số MIC của

chitosan biến ñộng trong khoảng 0,05-0,1% tùy thuộc vào khối lượng phân tử

và loại vi khuẩn. Hong Kyoon No (2004) cũng khẳng ñịnh rằng hoạt tính

kháng khuẩn của chitosan thể hiện tốt hơn ở môi trường pH thấp.

Bảng1.1: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan ñến khả năng

Vi khuẩn

Phân tử lượng (kDa)1

Bắt

ñầu

Kiểm soát1

6,92

8,59

Gram (-)

Escherichia coli

6,64

8,79

1671 4,94b 3,76b

1106 5,59c 5,47c

746 4,28a 1,57a

470 4,66a 6,45d

224 5,48c 7,70c

28 5,61c 6,17d

Pseudomonas

flourescens

6,54

8,62

4,89b

8,13d

5,21c

4,28a

8,23d

8,62c

Salmonella

typhimurium

6,64

8,79

5,49c

5,31c

4,50b

3,29a

5,39c

5,85d

Vibrio

parahaemolyticus

8,31

ND2a

3,10d

NDa

3,57c

0,30b

2,38c

Gram (+)

Listeria monocytogenes

6,36

8,51

5,25

0,99a

3,62c

1,69ab

2,23b

2,09b

2,48b

Bacillus megaterium

7,54

5,72

2,32c

1,60b

NDa

2,27c

2,15c

Bacillus cereus

8,11

0,53a

1,58b

NDa

1,47b

2,34c

Staphylococcus aureus

6,55

8,45

5,69

3,56c

0,54b

4,80d

NDa

Lactobacillus

plantarum

9,31

6,44

1,78c

NDa

4,55c

4,29d

1,09b

1,08b

Lactobacillus brevis

9,02

6,78

4,62d

1,93b

5,92c

6,48f

1,01a

2,40c

Lactobacillus

bulgaricus

a-f giá trị trung bình trung bình với mức ý nghĩa (p<0,05) 1 số tế bào sống sót sau khi nuôi cấy không có (mẫu kiểm chứng) và có bổ sung 0,1% chitosan trong 24h ở 370C 2ND=không xác ñịnh

kháng khuẩn.

Nguyễn Anh Dũng (2004) cũng nghiên cứu khả năng kháng E.coli của

chitosan, chitosan oligomer và chitosan oligomer cải biến bằng cách gắn với

salicylic aldehyde ñã làm gia tăng hoạt tính kháng khuẩn lên nhiều lần. MIC

của chitosan ñối với E. coli khoảng 250 ppm, oligoglucosamine khoảng 80-

100 ppm và salicyden oligoglucosamine (SO) chỉ còn 30-40 ppm.

Muối ammonium bậc bốn của chitosan thể hiện hoạt tính kháng khuẩn

rất cao. Ví dụ: diethylmethylchitosan cloride thể hiện hoạt tính kháng khuẩn

cao hơn chitosan. Hydroxypropyl chitosan ghép với axit maleic natri ức chế

hơn 99% vi khuẩn S. aureus và E. coli trong 30 phút tiếp xúc với nồng ñộ 100

mg/ml.

Avadi (2004) nghiên cứu chế tạo dẫn suất diethylmethylchitosan

(DEMC) ñể tăng khả năng hòa tan trong dung môi, nước và tăng tính kháng

khuẩn gấp hai lần so với chitosan không cải biến.

Môi trường

Kiểm chứng (mẫu trắng) Chitosan

DEMC

MIC

MBC

MIC MBC MIC

MBC

Nước cất

500

AcOH

0,25%

khối

2500

250

125

lượng

AcOH

0,5%

khối

2500

225

110

lượng

AcOH

0,75%

khối

1250

158

87,5

lượng

AcOH

1,00%

khối

1250

125

62,5

lượng

Bảng 1.2: Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan và DEMC

1.1.5. Tình hình nghiên cứu cải biến chitosan

Theo nhiều nghiên cứu khẳng ñịnh hoạt tính kháng khuẩn của chitosan

+) có khả năng liên kết chặt

là nhờ 3 cơ chế sau:

- Chitosan là polycation tự nhiên (-NH3

với màng vi khuẩn là polyanion, làm rối loạn trao ñổi chất qua màng

và gây chết tế bào.

- Chitosan có khối lượng phân tử nhỏ có khả năng ñi qua màng sinh

chất, liên kết với nhiễm sắc thể của vi khuẩn (ñiện tích âm), ngăn

cản quá trình sao chép, sinh tổng hợp protein.

- Chitosan có hoạt tính gây ñông tụ (coagulation) các tế bào vi khuẩn,

ức chế vi khuẩn sinh trưởng.

Tuy nhiên, có một số vi khuẩn có hoạt tính chitinase, chitosanase và

cellulase ngoại bào nên có khả năng phân hủy ñược chitosan, làm giảm hoạt

tính kháng khuẩn. Vì vậy hiện nay trên thế giới có 3 xu hướng cải biến

chitosan ñể làm thay ñổi cấu trúc ñể làm giảm hoạt tính của enzyme ngoại bào

của vi khuẩn và tăng hoạt tính kháng khuẩn:

- Cải biến bằng cách tăng ñiện tích dương của chitosan. - Cải biến bằng cách tạo nhánh với các phân tử ñường. - Cải biến bằng cách tạo dẫn suất với các gốc hóa học khác như

phosphate, sulfate, salicylic, …

Nguyễn Anh Dũng (2003) nghiên cứu cải biến tạo dẫn suất salicyden-

chitosan ñể nâng cao hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả cho thấy chỉ số MIC

của chitosan oligomer là 100 ppm, trong khi ñó salicyden chitosan oligomer

chỉ có 30ppm. Ying-Chien Chung và các công sự (2005) nghiên cứu cải biến

chitosan khi gắn các gốc ñường glucose, glucosamine, maltose và fructose

bằng phản ứng Maillard ñể tăng khả năng hòa tan và kháng khuẩn của

chitosan. Kết quả cho thấy: xét về tính tan, α-chitosan phù hợp với chuẩn bị

chitosan hoà tan trong nước hơn là β-chitosan. pH tối là 3,3 với nhiệt ñộ phản ứng là 65oC. Hiệu suất tối ưu trong các kết quả của dẫn suất chitosan ñạt ñược

vào các ngày (từ 2 ñến 6 ngày) và phụ thuộc vào việc sử dụng saccharide. Căn

cứ vào các kết quả ñối với hiệu suất, tính tan, mức ñộ deacetyl và pH ổn ñịnh,

nhiều khả năng chitosan hoà tan trong nước là dẫn suất chitosan glucosamin.

Dẫn suất này cho thấy khả năng tạo chelat với các ion kim loại cao hơn và có

hoạt tính kháng khuẩn cao hơn so với chitosan hoà tan trong acid. Các kết quả

này cho thấy rằng dẫn suất chitosan glucosamin sản xuất bằng phản ứng

Maillard là một triển vọng thương mại thay thế cho chitosan hoà tan trong

acid.

Sweetie R. Kanatt, Ramesh Chander, Arun Sharma (2007) cho thấy

phức hợp chitosan glucose là chất ñể bảo quản tốt hơn là chỉ có chitosan, cho

thấy ñó là chất chống ôxi hóa mạnh hơn so với chỉ có chitosan/glucose. Hoạt

tính kháng khuẩn của phức hợp chitosan/glucose thì giống với chitosan ñối

với các thực phẩm bị hỏng phổ biến và các mầm bệnh như: E.coli,

Pseudomonas spp, S. aureus và B. cereus.

Avadi (2004) nghiên cứu cải biến chitosan bằng cách tạo dẫn suất

dimethyl ethyl chitosan. Dẫn suất này có tổng ñiện tích dương tăng ñáng kể

và tăng khả năng kháng khuẩn cũng như hạn chế khả năng phân huỷ do

enzyme ngoại bào của vi khuẩn. Hoạt tính kháng khuẩn của dimethyl ethyl

chitosan ñược thử nghiệm với E. coli. Kết quả cho thấy, trị số MIC của

dimethyl ethyl chitosan nhỏ hơn gấp 2 lần so với chitosan.

Huang (2004) nghiên cứu cải biến tạo dẫn suất chitosan sulfate ñể nâng

cao hoạt tính kháng khuẩn của chitosan. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng

khuẩn của chitosan sulfate cho thấy chitosan sulfate ức chế mạnh vi khuẩn S.

aureus, nhưng lại không ức chế E. coli. Khả năng ức chế ở nồng ñộ < 100

microgam/lít ñối với S. aureus cao hơn axít phenic và một số chất kháng sinh

thông dụng.

1.1.6. Các dẫn suất cải biến của chitosan

Như ñã ñề cập ở phần trên, chitosan có phạm vi ứng dụng rất ña dạng.

Tuy nhiên, khả năng tan hạn chế của chitosan (không tan trong nước, chỉ tan

trong dung dịch có pH axít nhẹ…) ñã làm giới hạn các ứng dụng trong nhiều

trường hợp. Người ta ñã cố gắng tìm ra các phương pháp khắc phục nhược

ñiểm này, tạo ra các loại chitosan tan tốt nhằm phục vụ cho mục ñích phát huy

hiệu quả của chitosan trong các ñiều kiện pH môi trường ñòi hỏi khác nhau.

Các ứng dụng này chia làm hai hướng cơ bản:

- Phân cắt chitosan tạo các chitooligosaccharide có khả năng hòa tan ở

pH trung tính và kiềm.

- Tạo các dẫn xuất có khả năng hoà tan ở pH trung tính và kiềm từ

chitosan.

1.1.6.1. Chitooligosaccharide

Chitooligosaccharide thu ñược từ quá trình phân cắt của chitosan và

gồm một chuỗi các phân tử glucosamine và N-acetyl glycosamine. Xét về tính

chất lý hoá, chitoolidosaccharide là dạng bột màu vàng nhạt, có vị vừa ngọt

vừa ñắng, tan hoàn toàn trong nước, pH khoảng 5-7, tuỳ theo từng mục ñích

ứng dụng cụ thể mà chitooligosaccharide ñược sản xuất có khối lượng phân tử

dưới 3 kDa, dưới 6 kDa hay từ 6 kDa ñến 10 kDa.

Các chitoologosaccharide ñã lôi cuốn rất nhiều chú ý của các nhà khoa

học do khả năng phản ứng, thuộc tính vật lý và các hoạt tính sinh học của

chúng. Chúng có nhiều chức năng sinh lý quan trọng như cảm ứng

phytoalexin, kháng khuẩn, kháng ung thư và khả năng kích thích hệ miễn dịch

Galed (2004)[41]. Ngoài ra, chitooligosaccharide còn ñược chứng minh có

khả năng ngăn ngừa tiến triển của bệnh tiểu ñường và có ái lực với

lipopolysaccharide cao hơn chitosan, Fujii (1978)[40].

Các nghiên cứu cũng ñã ghi nhận tính kháng khuẩn rất tốt và khả năng

ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm của chitooligosaccharide có số mức

ñộ trùng hợp hoá (degree of polimerization) khoảng 8-16, Dumitriu [33] và

cộng sự (1994), Lê Văn Hiệp (2008). Trong một số tài liệu, các nhà nghiên

cứu gọi chúng là chitosan có khối lượng phân tử thấp (LMWC) hoặc phân

ñoạn B. Tuy nhiên, ñể cho thống nhất, chúng tôi sử dụng thuật ngữ

chitooligosaccharide ñể chỉ chitosan có mức ñộ trùng hợp hoá là 8-16.

+ Độ an toàn

Một thử nghiệm về ñộ gây ñộc bán cấp của chitooligosaccharide ñược

Sprague-Dawley tiến hành trên chuột ñực và cái. Các nhóm 36 con chuột cả

ñực và cái thí nghiệm ñược cho ăn các liều 500, 1000 và 2000 mg/kg/ngày

trong 4 tuần. Các xét nghiệm về dấu hiệu bệnh lý, cân nặng, chỉ tiêu huyết

học, sinh hoá và mô bệnh học ñã ñược tiến hành. Kết quả cho thấy chuột

trong nhóm ñối chứng và các nhóm thí nghiệm không khác biệt về các chỉ tiêu

hình thái lẫn hành vi. Thêm vào ñó, cũng không có khác biệt ñáng kể trong

phân tích nước tiểu, huyết học, sinh hoá máu, khối lượng các cơ quan và mô

bệnh học giữa các nhóm nói trên. Vì vậy, có thể kết luận rằng tính ñộc bán

cấp của chitooligosaccharide thấp dưới mức phát hiện với mức ñộ an toàn

ñược ghi nhận là 2.000 mg/kg khi xem xét các chỉ số tác ñộng bất lợi ñến sức

khoẻ chuột, Fisk (1996).

1.1.6.2. Các dẫn suất của chitosan

Như ñã ñề cập, chitosan có nhiều tính năng ứng dụng trong rất nhiều

lĩnh vực. Tuy nhiên, khả năng tan hạn chế ñã gây khá nhiều trở ngại cho chất

này trong các ứng dụng thực tế. Chitosan chỉ tan trong dung dịch axít yếu do

có hiệu ứng proton hoá nhóm amino ở vị trí carbon C-2 của gốc glucosamine.

Các nhà khoa học ñã và ñang nghiên cứu các phương thức làm tăng khả năng

tan của chitosan, ñồng thời vẫn duy trì và khai thác thêm ñược các tính năng

quý giá của chất này. Ngoài phân cắt tạo các chitooligosaccharide, người ta

cũng ñã tiến hành các biến ñổi tạo dẫn xuất từ chitosan.

• Tạo dẫn xuất tại vị trí nhóm –NH2 của C-2

Sự hiện diện của nhóm amino trên phân tử chitosan rất hữu ích do nó

mang ñến các thuộc tính sinh hoá quan trọng. Các nghiên cứu ñược công bố

về khả năng kháng khuẩn của chitosan nhấn mạnh ñến ñộ deacetyl hoá, hay

nói các khác là số lượng nhóm NH2 có mặt trong phân tử. Số lượng này càng

cao thì khả năng kháng khuẩn càng tốt, nhóm NH2 ñã ñược chứng minh ñóng

vai trò quan trọng trong chức năng diệt khuẩn của chitosan (Harish 1996;

Harida và cộng sự 1984)[53] [54].

Ngoài ra, nhóm amino cũng là một vị trí tạo thuận lợi cho việc gắn

thêm các gốc hoá học trong phản ứng tạo dẫn xuất.

+ Gắn ñường khử

Trong phản ứng khử alkyl hoá chitosan có sự hiện diện của tác nhân khử, các ñường ñôi khử như glucose, lactose, galactose, glucosamine… sẽ ñược gắn vào vị trí carbon C-2 của chitosan. Phản ứng này mở mạch vòng của phân tử ñường (Chihara 1993; Lee HW và cộng sự 2003)[28].

Bên cạnh ñó, khi thực hiện phản ứng giữa chitosan và các dẫn xuất formylmethyl của các ñường khử nói trên thì sẽ xảy ra phản ứng gắn không có sự mở vòng, Cui (2001)[30] như sơ ñồ sau:

+ Gắn polyethylene glycol (PEG)

PEG là một polyme ái nước, nên việc gắn PEG lên chitosan có khả năng cải thiện tính tan của chitosan, ñồng thời vẫn giữ nguyên cấu trúc cơ bản của nó, Nguyễn Anh Dũng (2004)[9]. Harris (1984) cũng nghiên cứu thực hiện phản ứng khử alkyl hoá với gốc aldehyde của dẫn xuất PEG ñược trình bày như sau, Chihara (1993)[29]:

+ Gắn nhóm carboxy

Các nhóm carboxy ñược gắn vào phân tử chitosan tạo nên thuộc tính anion và lưỡng tính cho dẫn xuất tạo thành. Carboxymethyl chitosan ñược tạo thành do phản ứng khử của chitosan và nhóm aldehyde của glyoxylic axít với xúc tác NaCNBH3, gắn nhóm carboxymethyl vào carbon C-2 Harris và các cộng sự (1984)[56].

• Tạo dẫn xuất tại vị trí nhóm –OH của C-6

Việc tạo dẫn xuất bằng cách gắn thêm gốc tại vị trí carbon C-3 và C-6 tương ñối khó hơn gắn vào nhóm amino ở C-2. Chính vì vậy, các phản ứng với các ñiều kiện riêng biệt phục vụ cho mục ñích này ñược nghiên cứu rất kỹ lưỡng.

+ Gắn ñường α-mannose

Khi sử dụng 3-O-acetyl-2-N-phthaloyl chitosan là nguyên liệu ñể tiến

hành gắn ñường, α-mannose ñược gắn vào vị trí C-6.

Tương tự, β-galactose, glucosamine và N-acetyl-glucosamine cũng có

thể ñược gắn vào vị trí C-6 như α-mannose, Garnett (1985)[42].

+ Gắn carboxy

Trong môi trường phản ứng kiềm mạnh giữa acid monochloroacetic và

chitosan, nhóm carboxy ñược ưu tiên gắn vào carbon C-6, Harish (2004).

Morimoto và cộng sự (2002) ñã tiến hành chọc lọc gắn gốc vào vị trí

carbon C-6 bằng quy trình:

- Bảo vệ vị trí NH2 ở carbon C-2 và OH ở carbon C-3. - Oxi hoá vị trí C-6[55].

Gỡ bỏ chất bảo vệ, trả lại gốc NH2 và OH tự do.

1.1.7. Khả năng kháng khuẩn của chitosan và dẫn suất

Chitosan và rất nhiều dẫn xuất của nó thể hiện khả năng kháng khuẩn

rất tốt. Tác ñộng kháng khuẩn thường diễn ra rất nhanh (trong vài giờ),

Borges và cộng sự (2007). Thêm vào ñó, chúng ñều là các chất có khả năng

phân giải sinh học và không gây ñộc ñối với tế bào ñộng vật hữu nhũ. Phổ

kháng khuẩn của chúng rộng, bao gồm cả vi khuẩn gram âm và gram dương.

Tuy nhiên, cần nhắc lại là khả năng tuyệt vời này bị hạn chế do tính tan hạn

chế của chitosan (không tan trong môi trường pH >7). Bên cạnh ñó, ñộ nhớt

cao của dung dịch chitosan cũng là một trở ngại, gây kết tụ protein ở ñiều

kiện pH sinh lý. Vì thế, chitooligomer và các dẫn xuất ñã ñược nghiên cứu

nhằm khắc phục những vấn ñề trên.

Cơ chế tác ñộng chính xác của chitosan và các dẫn xuất lên tế bào vi

sinh vật thực tế vẫn chưa ñược tìm ra. Nhiều cơ chế khác nhau ñã ñược ñề

nghị ñể giải thích khả năng này. Ví dụ như tính chất ña ñiện tích dương của

chitosan và các dẫn xuất ñã khởi ñầu cho quá trình gắn kết lên màng tế bào vi

sinh vật có ñiện tích âm. Khi Hwang và các cộng sự (1998) quan sát tế bào vi

khuẩn E. coli sau khi xử lý bằng dung dịch chitosan và các dẫn xuất qua kính

hiển vi ñiện tử truyền qua (TEM), kết quả cho thấy màng sinh chất của tế bào

bị tách ra khỏi màng trong. Sau khi gắn vào tế bào, chitosan và dẫn xuất gây

ảnh hưởng ñến tính thấm của tế bào, làm rò rỉ các thành phần sinh chất và tế

bào chết ñi do thiếu hụt các thành phần này David (1994)[31].

Hay theo một giả thiết khác là chitosan và các dẫn xuất hoạt ñộng như

tác nhân kẹp (chelating agent) lấy các kim loại dạng vết trong tế bào chất của

tế bào trong khi các kim loại này ñóng vai trò tối quan trọng trong chức năng

sinh hoá của vi khuẩn. Sự thiếu hụt các kim loại này ức chế sự tạo thành ñộc

tố, enzyme và sự tăng trưởng của tế bào, Kondo và cộng sự (2000). Bên cạnh

ñó, chitosan và các dẫn xuất cũng ñược cho là ức chế quá trình phiên mã tạo

thành mRNA và quá trình dịch mã tạo protein khi ñi ñược vào trong nhân tế

bào (chitooligosaccharide), Klein (1981)[81].

Tóm lại, trên thế giới trong những năm gần ñây ñã có nhiều nghiên cứu

ứng dụng của chitosan và các dẫn xuất chitosan trong công nghiệp thực phẩm

như là một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên. Tuy nhiên phần lớn các nghiên

cứu còn ở qui mô phòng thí nghiệm, ít có các nghiên cứu thực tế trên các thực

phẩm dùng hàng ngày như các loại thịt, cá.

1.2. Tình hình bảo quản thực phẩm hiện nay

Tác dụng kháng khuẩn là ñặc tính quan trọng của chitosan ñã ñược rất

nhiều nhà khoa học trên thế giới chứng minh. Do ñó việc ứng dụng chitosan

ñể bảo quản thực phẩm là rất cần thiết và cũng là mối quan tâm của nhiều nhà

khoa học. Đã có rất nhiều nghiên cứu về màng chitosan ñể bảo quản thực

phẩm:

- Nghiên cứu về ức chế vi khuẩn gây hư hỏng trên các sản phẩm thịt

chế biến bằng màng chitosan của tác giả Blaise ouattara, Andrebegin, Gabriel

piette, Trung tâm nghiên cứu và phát triển thực phẩm Canada- Đại học

Quebec, Canada.

- Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của màng chitosan bằng việc kết

hợp với dầu tỏi của tác giả Y.Pranoto, S.K Rakskit và V.M.Salokhe thuộc

viện công nghệ Châu Á, Thái Lan.

- Sự hợp tác nghiên cứu giữa các nhà khoa học K.Soontarapa và

N.Suwan thuộc Trường Đại học Chulalongkorn – Thái Lan và K.Tota,

S.Mistushita, Kamiya thuộc Trường Đại học Quốc gia Yokohama – Nhật ñã

nghiên cứu làm tăng hiệu quả trao ñổi ion, tăng ñộ kín màng chitosan bằng

một số hóa chất hay chất kích thích .

- Nghiên cứu chế tạo màng chitosan kết hợp với tinh bột của Y.X.Xu,

K.M.Hana, D.Nag thuộc nghành công nghệ thực phẩm, Đại học Nebraska,

USA. Màng ñược phối trộn bằng cách trộn chitosan và tinh bột theo tỉ lệ 1:1

và nồng ñộ tinh bột ñược thay ñổi, nghiên cứu tính chất cơ lý của màng.

+ Nghiên cứu trong nước:

- Hai nhà khoa học Nguyễn Anh Trinh và Bùi Văn Miên, khoa học

công nghệ thực phẩm, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh ñã nghiên

cứu chế tạo màng chitosan ứng dụng ñể bảo quản thực phẩm giàu ñạm, dễ hư

hỏng như thịt, cá... Đây ñược xem là bao bì có tính năng bảo vệ và có thể sử

dụng như thực phẩm mà không hại tới môi trường. Màng ñược sử dụng ñể

bao bọc xúc xích giúp sản phẩm có hình dáng ñẹp và nó còn có tác dụng

không làm mất màu, mùi vị ñặc trưng của sản phẩm.

- Đống Thị Anh Đào và Châu Trần Diễm Ái thuộc khoa công nghệ hóa

học và dầu khí, Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh ñã ứng dụng

màng chitosan ñể bảo quản nhãn ở môi trường có nồng ñộ CO2 cao hơn trong

môi trường khí quyển. Kết quả là nhãn ñược bao gói bằng màng chitosan vẫn

giữ ñược giá trị thương phẩm sau 45 ngày bảo quản.

PGS.TS Trần Thị Luyến, Trường Đại học Thủy sản Nha Trang ñã

nghiên cứu khả năng chịu lực và ñộ giãn của màng chitosan với phụ liệu ñồng

tạo màng.

Nghiên cứu màng chitosan có bổ sung tinh bột ethylen glycol ñể bao

gói thịt bò bảo quản lạnh của Phạm Thị Hoa, chuyên ngành Công nghệ sinh

học trường Đại học Thủy sản Nha Trang.

Đề tài nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến thời gian bảo

quản và chất lượng trái bơ của Nguyễn Thị Trâm (2004).

1.3. Một số ñặc ñiểm của ñối tượng nghiên cứu

1.3.1. Vi khuẩn Escherichia coli

1.3.1.1. Đặc ñiểm chung

Trực khuẩn ruột già Escherichia coli còn có tên là Bacterium

colicommun, Bacillus colicommunis ñược Escherichia phân lập năm 1885 từ

phân trẻ em. E. coli thường có ở phần sau của ruột, ít khi có ở dạ dày và ruột

non. Bình thường E. coli có trong ruột với số lượng lớn so với các loại vi

khuẩn khác, khi sức ñề kháng của cơ thể yếu hay gia súc mắc bệnh nào ñó thì

E. coli phát triển mạnh tăng ñộc lực và gây bệnh.

1.3.1.2. Đặc ñiểm sinh vật

Hình thái E. coli là trực khuẩn hình que, kích thước dài ngắn khác

nhau, trung bình từ 2-3 µm, rộng 0,5µm, ñôi khi trong môi trường nuôi cấy

trực khuẩn dài 6-8µm. Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn, ñứng riêng lẻ loi

ñôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Phần lớn E. coli di ñộng do có lông ở xung

quanh thân, nhưng một số không thấy di ñộng.

1.3.1.3. Phòng và trị

Do E. coli có rất nhiều typ khác nhau, nên việc chế vaccin và huyết

thanh phòng bệnh là hết sức phức tạp, người ta thường chế vaccin và kháng

huyết thanh ña giá, cũng có thể chế vaccin tại chỗ.

Kháng sinh và các hợp chất nitrofuran dùng ñiều trị ñối với

Colibasillosis là rất có hiệu quả.

Các kháng sinh thường ñược sử dụng là: biomyxin, teramyxin và

xitomyxin.

Cần chú ý việc ñiều trị phải tiến hành sớm mới có hiệu quả cao.

1.3.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus

1.3.2.1. Đặc ñiểm chung

Staphylococcus aureus là những vi khuẩn hình cầu, tụ lại thành từng

ñám thành hình chùm nho. Là loại gây bệnh thường gặp nhất, nó có vai trò và

ý nghĩa ñối với y học và thú y học, khoảng 30% người khỏe mạnh mang vi

khuẩn này ở trên da và trên niêm mạc, khi có những tổn thương ở da và niêm

mạc hoặc những rối loạn về chức năng thì các nhiễm trùng do S. aureus dễ

dàng suất hiện. S. aureus cũng gây nên các nhiễm trùng ở các gia súc nhất là

trong nhưng cơ sở chăn nuôi tập trung có mật ñộ ñàn gia súc lớn gây thiệt hại

ñáng kể về kinh tế. Những nhiễm trùng do S. aureus có thể gây nên nhiều

biểu hiện khác nhau, nhu các nhiễm trùng của da hoặc trong các cơ quan nội

tạng, gây mưng mủ ñiển hình, một số trường hợp chuyển sang chứng huyết

nhiễm trùng, chứng bại huyết. S. aureus còn có khả năng hình thành ñộc tố

trong thực phẩm, do ñó nó có thể gây nên chúng nhiễm ñộc

S. aureus là một trong ba loại thuộc giống tụ cầu khuẩn, ñường kính

khoảng 0,7 - 1µm, không di ñộng, không sinh nha bào và thường không có

vỏ, không có lông, không di ñộng.

Trong bệnh phẩm, tụ cầu trường xếp thành từng ñôi, từng ñám nhỏ hình

chùm nho. Khi nhuộm phương pháp gram, vi khuẩn bắt màu gram dương.

1.3.2.2. Phòng bệnh và chữa bệnh

+ Phòng bệnh

Phòng bệnh bằng vệ sinh: chủ yếu là giữ vệ sinh chung, trong các thao

tác sản khoa, ngoại khoa phải vô trùng, những vết thương phải ñiều trị ñể

tránh trở thành chỗ xâm nhập của vi khuẩn gây nên nhiễm khuẩn nặng.

Phòng bệnh bằng vaccine: có thể dùng vaccine tụ cầu chết hoặc vaccine

giải ñộc tố chế tạo từ các chủng phân lập tại ñịa phương nơi có dịch gọi là

vaccine chuồng. Việc dùng vaccine phòng bệnh vẫn chưa ñạt hiệu quả cao

nên ít ñược dùng.

+ Điều trị

Chữa bệnh bằng thuốc kháng sinh: do ñặc ñiểm của tụ cầu rất dễ kháng

thuốc, hoặc gặp phải chủng kháng kháng sinh, nên khi dùng thuốc kháng sinh

ta phải dùng kháng sinh ñồ. Những loại kháng sinh thường dùng là: nhóm

beta lactamin (penicillin, methicillin, oxacillin), nhóm aminoside trong ñó

thường dùng là kanamycin và gentamycin.

Chữa bệnh bằng vaccine: trong những trường hợp vi khuẩn kháng

thuốc kháng sinh, người ta có thể dùng vaccine ñể ñiều trị, thường dùng là

vaccine tự liệu hoặc vaccine trị liệu.

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Nội dung nghiên cứu

Để ñạt ñược những mục tiêu ñề ra tôi sẽ nghiên cứu những nội dung sau ñây:

+ Nghiên cứu chế tạo dẫn suất Chitosan cải biến nhằm nâng cao hoạt tính

kháng khuẩn của chitosan.

+ Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất chitosan cải biến

trong invitro.

+ Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất

chitosan cải biến trên thực phẩm.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Địa ñiểm nghiên cứu

- Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học Thực vật trường Đại học Tây

Nguyên.

2.2.2. Vật liệu hoá chất

- Các chủng vi sinh vật: Thu thập từ Bộ môn Vi sinh, Đại học Y Dược

Tp. HCM, bao gồm: Escherichia coli ATCC 25922; Staphylococcus aureus

ATCC 25923 (MSSA).

- Chitosan mức ñộ deacetyl hóa 90%, khối lượng phân tử 30 kDa, 300

kDa, 700 kDa, sản phẩm của Kitto life (Hàn Quốc).

- Các hoá chất khác như glucose, glucosamine, N- acetyl glucosamine,

galactose, acid acetic là hóa chất tinh khiết.

2.2.3. Thiết kế thí nghiệm

2.2.3.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn

* Vi khuẩn Escherichia coli và Staphilococcus aureus

+ Môi trường nuôi cấy

Vi khuẩn (Escherichia coli và Staphilococcus aureus) ñược nuôi cấy trong

môi trường Nutrient Broth.

+ Phương pháp giữ giống và bảo quản

Vi khuẩn E. coli và S. aureus ñược nuôi cấy thường xuyên (1 tháng/1

lần) trong ống thạch nghiêng có chứa môi trường Nutrient Broth – agar.

Giống ñược cấy vào các ống nghiệm sau 2 ngày sẽ ñưa vào tủ lạnh ñể bảo quản ở nhiệt ñộ 40C.

+ Phương pháp chuẩn bị giống ñể tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa 10ml dung dịch môi trường Nutrient

Broth, ñem hấp khử trùng. Sau ñó cấy vi khuẩn E. coli và S. aureus vào ống nghiệm, lắc ñều, ñem ủ trong tủ ấm ở nhiệt ñộ 370C. Sau 24h dùng ống giống

này ñể thực hiện thí nghiệm.

2.2.4. Các bước tiến hành

Trong phòng thí nghiệm, tiến hành lần lượt như sau:

+ Chuẩn bị giống vi sinh vật

Một ống E. coli + 10ml Nutrient Broth

Một ống S. aureus + 10ml Nutrient Broth

Được cấy từ ống giống, ñem nuôi ở tủ giữ nhiệt với nhiệt ñộ 370C trong vòng

24 giờ.

+ Chuẩn bị môi trường

10ml môi trường Nutrient Broth/1 ống nghiệm. Hấp khử trùng ở 1210C

trong 10 phút.

+Thiết kế thí nghiệm

Trong một ống nghiệm chứa 10ml môi trường Nutrient Broth ñã hấp

khử trùng, cho vào 0,1ml thể vẩn vi khuẩn (E. coli, S. aureus). Sau ñó bổ sung

chitosan cải biến có khối lượng phân tử khác nhau (30 kDa, 300 kDa, 700

kDa, ñối chứng) với nồng ñộ 50ppm, 100ppm, 150ppm, 200ppm, 300ppm.

Mỗi thí nghiệm thực hiện 3 ống nghiệm với 3 lần lặp lại, mẫu ñược nuôi cấy ở 370C trong 24h.

+ Các chỉ tiêu theo dõi

Sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường có bổ sung chitosan ñược

xác ñịnh bằng phương pháp ño ñộ ñục trên máy quang phổ ở bước sóng 620

nm sau thời gian nuôi cấy 24h.

2.2.5. Phương pháp nghiên cứu cải biến chitosan

2.2.5.1. Phương pháp cải biến chitosan-glucose

* Chuẩn bị thí nghiệm

- Chitosan 30 kDa, 300 kDa, 700 kDa

Pha chitosan 1%: Cân 1g chitosan pha trong 100ml axít acetic 1%

- Glucose 1%: Cân 1g glucose pha trong 100ml nước cất

Chitosan gắn glucose ñược thực hiện bằng phản ứng Maillard theo phương

pháp của Kanatt (2007). Qui trình ñược tóm tắt như sau

- 1% chitosan ñược chuẩn bị trong 1% acid acetic băng.

- Phức hợp chitosan-glucose(CGC) ñược chuẩn bị bằng cách hấp khử

trùng chitosan 1% và glucose 1% trong 15 phút.

Phản ứng Maillard:

Thí nghiệm gồm 3 công thức:

Công thức 1(CT1): Chitosan/glucose theo tỷ lệ nồng ñộ 1 :1 ;

Công thức 2(CT2): Chitosan/glucose theo tỷ lệ nồng ñộ 2 :1 ;

Công thức 3(CT3): Chitosan/glucose theo tỷ lệ nồng ñộ 5 :1 ;

Phản ứng ñược thực hiện ở nhiệt ñộ 1210C trong vòng 15 phút ; mỗi công

thức làm 3 ống và 3 lần lặp lại.

Thí nghiệm cũng ñược thực hiện 3 loại chitosan có khối lượng phân tử

khác nhau là 30 kDa, 300 kDa và 700 kDa.

Các chỉ tiêu theo dõi:

- Mức ñộ gắn của glucose lên mạch chitosan ñược xác ñịnh bằng

phương pháp quang phổ Spectrophotometer theo phương pháp của Ajandouz

(2001). Pha loãng thích hợp với nước cất và ño ñộ hấp phụ ở các bước sóng

420nm.

2.2.5.2. Phương pháp cải biến chitosan-glucosamine

Phương pháp cải biến tương tự như phương pháp chitosan-glucose

ñược tổng hợp bằng phản ứng Maillard theo phương pháp của Kanatt (2005).

Công thức 1(CT1): Chitosan/glucosamine theo tỷ lệ nồng ñộ 1 : 1;

Công thức 2(CT2): Chitosan/glucosamine theo tỷ lệ nồng ñộ 2 : 1;

Công thức 3(CT3): Chitosan/glucosamine theo tỷ lệ nồng ñộ 5 : 1; Phản ứng ñược thực hiện ở nhiệt ñộ 1210C trong vòng 15 phút; mỗi

công thức làm 3 ống và 3 lần lặp lại.

Thí nghiệm cũng ñược thực hiện 3 loại chitosan có khối lượng phân tử

khác nhau là 30 kDa, 300 kDa và 700 kDa.

Các chỉ tiêu theo dõi:

Mức ñộ gắn của glucose lên mạch chitosan ñược xác ñịnh bằng phương

pháp quang phổ Spectrophotometer theo phương pháp của Ajandouz (2001).

Pha loãng thích hợp với nước cất và ño ñộ hấp phụ ở các bước sóng 420nm.

2.2.6. Phương pháp nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất

chitosan cải biến

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan cải biến ñược thực hiện bằng

phương pháp ño ñộ ñục và phương pháp khuếch tán trên ñĩa. 2.2.6.1. Xác ñịnh khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp ño ñộ ñục

Các vi khuẩn chủng gây bệnh E. coli ATCC 25922; S. aureus ATCC

25923 (MSSA), ñược nuôi cấy trong 10ml môi trường Nutrient Broth, các

ống nghiệm ñược bổ sung các sản phẩm chitosan cải biến có khối lượng phân

tử khác nhau (chitosan-glucose; chitosan-glucosamine) với nồng ñộ từ 0 (ñối

chứng có bổ sung 0,015ml axít acetic), 50, 100, 150, 200 và 300 ppm. Vi khuẩn ñược nuôi cấy ở nhiệt ñộ 370C trong 24h. Sinh trưởng của vi khuẩn

ñược xác ñịnh bằng phương pháp ño ñộ ñục ở bước sóng 625 nm. Thí nghiệm

gồm 6 công thức, lặp lại 3 lần.

2.2.6.2. Xác ñịnh khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuyếch tán trên

ñĩa

Các chủng vi khuẩn ñược cấy trên môi trường thạch ñĩa. Các dẫn suất

chitosan cải biến ñược tẩm trên giấy thấm vô trùng có ñường kính 6mm với

nồng ñộ bằng chỉ số MIC, ñặt nhẹ trên bề mặt ñĩa. Vi khuẩn ñược ủ ở nhiệt ñộ 370C trong 48h, ño kích thước vòng vô khuẩn.

Thí nghiệm gồm 4 công thức:

- Công thức 1: Bổ sung chitosan có khối lượng phân tử 30 kDa

- Công thức 2: Bổ sung chitosan có khối lượng phân tử 300 kDa

- Công thức 3: Bổ sung chitosan có khối lượng phân tử 700 kDa

- Công thức 4: Đối chứng

Thí nghiệm gồm 4 công thức, lặp lại 3 lần.

2.2.7. Phương pháp thử nghiệm các dẫn suất chitosan cải biến trong bảo

quản thực phẩm

Các dẫn suất chitosan cải biến có hoạt tính kháng khuẩn cao sẽ ñược

thử nghiệm ñể bảo quản thực phẩm trên ñối tượng là thịt bò.

- Nồng ñộ các dẫn suất sử dụng theo chỉ số MIC ở nội dung 2.

- Thịt bò ñược mua ở chợ về có màu hồng ñỏ tươi, mùi vị ñặc trưng của

thịt tươi, có ñộ ñàn hồi tốt. Sau ñó ñược cắt thành từng miếng nhỏ khoảng từ

15 -30g/ miếng rồi ñem bảo quản bằng cách phun trực tiếp dung dịch chế phẩm lên miếng thịt và ñược bảo quản ở nhiệt ñộ phòng 20-250C và ở 50C.

Chỉ tiêu theo dõi:

Chỉ tiêu cảm quan: màu sắc, ñộ nhớt bề mặt, mùi sản phẩm sau các

khoảng thời gian bảo quản 24, 48, 72, 96, 120, 144 h. Theo phương pháp cho

ñiểm TCVN 7096:2002. Thịt giữ tươi ở nhiệt ñộ phòng thì cứ 6h lấy mẫu kiểm tra một lần và nhiệt ñộ 50C thì cứ 24h lấy mẫu kiểm tra một lần.

Sơ ñồ bố trí thí nghiệm như sau:

- Đối với chitosan-glucose có khối lượng phân tử là 30 kDa:

Thịt tươi

Cắt miếng

Không chitosan Chitosan 1% Chitosan-glucose

(ĐC1) (ĐC2)

CT1 CT2 CT3

Thí nghiệm thực hiện tương tự với chitosan-glucose có khối lượng

phân tử 300 kDa và 700 kDa.

- Đối với chitosan-glucosamine có khối lượng phân tử là 30 kDa:

Thịt tươi

Cắt miếng

Không chitosan Chitosan 1% Chitosan-glucosamine

(ĐC1) (ĐC2)

CT1 CT2 CT3

Tương tự với chitosan-glucosamine có khối lượng phân tử 300 kDa và

700 kDa.

Cơ sở cho ñiểm thịt bò theo tiêu chuẩn Việt Nam 3215-79 (TCVN

3215-79):Sản phẩm thực phẩm – Phân tích cảm quan – Phương pháp cho

ñiểm.

Phương pháp này sử dụng hệ thống thang ñiểm 20 gồm 6 bậc từ 0 ñến

5, ñiểm cao nhất cho một chỉ tiêu là 5 và thấp nhất là 0. Sáu bậc ñánh giá

tương ứng với nội dung mô tả cụ thể như sau:

Bảng 2.1: Cơ sở cho ñiểm thịt bò theo TCVN 3215-79

Bậc

Điểm chưa

ñánh

có trọng

Màu sắc

Mùi

Trạng thái

giá

lượng

Màu ñỏ hồng tươi ñặc

Mùi thơm ñặc trưng

Cơ thịt săn chắc,

trưng của thịt, mặt cắt

của thịt tươi, không

ấn lõm phục hồi

có màu ñỏ tươi và ẩm

có mùi lạ lẫn vào

ngay

ướt

Mùi thơm của thịt

Cơ thịt săn chắc,

Màu hồng nhạt, mặt

tươi, không có mùi

ấn lõm phục hồi

cắt có màu ñỏ hồng

lạ lẫn vào

nhanh

và ẩm ướt

Mùi thơm của thịt

Cơ thịt còn săn

Màu hồng nhạt, mặt

không hể hiện rõ

chắc, ấn lõm phục

cắt có màu hồng và

ràng

hồi hơi chậm

ẩm ướt

Mùi thơm của thịt

Cơ thịt mềm, ấn

Màu hồng rất nhạt,

không còn, các mùi

lõm phục hồi

cho phép một số chỗ

lạ ñã xuất hiện,

chậm

màu xanh lơ hoặc

nhưng ở mức ñộ

xám.

nhẹ

Màu hồng tái xen lẫn

Mùi ôi thiu thể hiện

Cơ thịt mềm, ấn

với màu tái, bề mặt

rất rõ

lõm hầu như

hơi nhớt

không phục hồi

Thịt có màu xanh

Mùi ôi thiu rất khó

Cơ thịt mềm

xám, bề mặt rất nhớt

chịu, có thể gây sốc

nhũn, ấn lõm

không phục hồi

Bảng 2.2: Hệ số quan trọng của các chỉ tiêu cảm quan của thịt

Chỉ tiêu cảm quan Hệ số quan trọng (K)

1,7 Màu sắc

1,3 Mùi

1,0 Trạng thái

Tích giữa ñiểm trung bình của chỉ tiêu với hệ số quan trọng của chỉ

tiêu ñược gọi là ñiểm có trọng lượng của chỉ tiêu ñó. Tổng ñiểm có trọng

lượng của tất cả các chỉ tiêu gọi là ñiểm chung của sản phẩm. Điểm chung của

sản phẩm dùng ñể phân loại hay xếp hạng chất lượng cảm quan của sản phẩm.

Để phân cấp chất lượng người ta sử dụng ñiểm có trọng lượng. Tiêu chuẩn

TCVN 3215-79 qui ñịnh các cấp chất lượng ñối với sản phẩm thực phẩm có

ñiểm chung và các ñiểm trung bình chưa có trọng lượng ñối với một chỉ tiêu,

ñược thể hiện ở bảng sau:

Bảng 2.3: Bảng phân cấp chất lượng thịt

Cấp chất lượng Loại tốt

Điểm chung 18,6 ÷ 20,0

Yêu cầu về ñiểm trung bình chưa có trọng lượng ñối với các chỉ tiêu Các chỉ tiêu quan trọng nhất≥4,7

Loại khá

15,2 ÷ 18,2

Các chỉ tiêu quan trọng nhất≥3,8

Loại trung bình

11,2 ÷ 15,1

Các chỉ tiêu quan trọng nhất≥2,8

7,2 ÷ 11,2

Các chỉ tiêu quan trọng nhất≥1,8

4,0 ÷ 7,1

Các chỉ tiêu quan trọng nhất≥1,0

Loại kém (không ñạt chất lượng trong tiêu chuẩn nhưng vẫn bán ñược) Loại rất kém (không có khả năng bán ñược nhưng khi tái chế còn có thể dùng ñược) Loại hỏng (không sử dụng ñược)

0,0 ÷ 3,9

Các chỉ tiêu quan trọng nhất≥0,0

2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu

- Tất cả các thí nghiệm ñược thực hiện với 3 lần lặp lại và xử lý thống

kê bằng phần mềm MS-STAT.

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu chế tạo dẫn suất chitosan cải biến

Chitosan có hoạt tính kháng khuẩn khá mạnh nhờ tính chất polycation

của các nhóm NH2. Tính chất polycation của chitosan giúp cho chitosan gắn

chặt với màng polyanion của tế bào vi khuẩn làm rối loạn quá trình trao ñổi

chất qua màng và dẫn ñến tế tào vi khuẩn bị chết. Tuy nhiên một số vi khuẩn

có hoạt tính enzyme chitosanase, cellulase ngoại bào có khả năng phân hủy

mạch chitosan làm mất hoạt tính của chế phẩm này. Mục tiêu của nội dung

này là gắn các gốc ñường như glucosamine, glucose vào mạch nhánh của

chitosan (chitosan cải biến) ñể làm thay ñổi cấu trúc của chitosan giúp hạn

chế khả năng phân hủy của hệ enzyme vi khuẩn.

3.1.1. Ảnh hưởng khối lượng phân tử của chitosan và tỷ lệ nồng ñộ

chitosan/glucose ñến phản ứng Maillard

Phản ứng Maillard là phản ứng giữa nhóm amin (-NH2) của chitosan

với nhóm (-CHO) của ñường glucose. Dẫn suất tạo thành có màu vàng hấp

thu ở bước sóng 420nm, mức ñộ gắn tỷ lệ thuận với ñộ hấp thụ (OD) ở

420nm.

Chitosan sử dụng trong thí nghiệm có khối lượng phân tử khác nhau (30 kDa, 300 kDa, 700 kDa) phản ứng với ñường glucose ở nhiệt ñộ 1210C

trong vòng 15 phút, sau ñó ñể nguội rồi ñem ño OD ở bước sóng 420nm ñể

xác ñịnh mức ñộ gắn.

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử và nồng ñộ ñường glucose ñến

mức ñộ phản ứng Maillard

Nghiệm thức Khối lượng

Tỷ lệ chitosan/glucose

OD420

1:1

phân tử 30 kDa

2:1

5:1

1:1

300 kDa

2:1

5:1

1:1

700 kDa

2:1

5:1

0,299 b 0,360ab 0,357ab 0,404ab 0,450a 0,384ab 0,404ab 0,480a 0,440a

** ** ** 4,21

ANOVAz Khối lượng Công thức Khối lượng x công thức CV (%)

z **: khác biệt rất có ý nghĩa ở mức P ≤ 0,01

Kết quả bảng 3.1 cho thấy chitosan có khối lượng phân tử khác nhau thì

khả năng gắn ñường khác nhau. Khối lượng phân tử của chitosan càng lớn thì

khả năng gắn ñường glucose càng lớn. Chitosan khối lượng phân tử 30kDa, tỷ

lệ chitosan/glucose 2:1 có OD420 là 0,360 tăng lên 0,450 ở chitosan 300kDa

và 0.480 ở chitosan 700 kDa. Điều này chứng tỏ mạch chitosan càng dài, số

lượng nhóm NH2 trong mạch càng lớn thì khả năng gắn với nhóm –CHO của

ñường glucose càng lớn. Sự khác biệt khả năng gắn glucose giữa các chitosan

có khối lượng phân tử khác nhau là có ý nghĩa thống kê với mức P ≤ 0,01.

So sánh về ảnh hưởng của tỷ lệ nồng ñộ chitosan/ glucose ñến mức ñộ

phản ứng Maillard cho thấy ở cả ba khối lượng phân tử tỷ lệ chitosan/glucose

thích hợp là 2:1. Tỷ lệ ñường cao chitosan/glucose 1:1 hoặc nồng ñộ ñường

quá thấp chitosan/glucose 5:1 thì phản ứng Maillard diễn ra ở mức ñộ thấp

hơn (bảng 3.1). Ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan/glucose là có ý nghĩa thống kê

với xác suất P≤0,01. Tương quan giũa khối lượng phân tử chitosan và tỷ lệ

nồng ñộ chitosan/glucose là có ý nghĩa thống kê.

3.1.2. Ảnh hưởng khối lượng phân tử của chitosan và nồng ñộ ñường glucose

ñến phản ứng Maillard gắn glucosamine vào mạch chitosan

Cải biến dẫn suất chitosan – glucosamine ñược thực hiện bằng phản

ứng của Maillard. Chitosan có khối lượng phân tử khác nhau (30 kDa, 300

kDa, 700 kDa) hỗn hợp với glucosamine ở các nồng ñộ khác nhau tương tự như thí nghiệm với glucose và thực hiện phản ứng Maillard ở nhiệt ñộ 1210C

trong vòng 20 phút, sau ñó ñể nguội rồi ñem ño OD ở bước sóng 420nm.

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử và nồng ñộ ñường glucosamine

ñến mức ñộ phản ứng Maillard

Công thức(CT) OD420

Nghiệm thức 1 Khối lượng phân tử 1:1

30 kDa 2 2:1

3 5:1

4 1:1

300 kDa 5 2:1

6 5:1

7 1:1

700 kDa 8 2:1

9 5:1 0,210ab 0,277ab 0,294ab 0,168 b 0,181ab 0,192ab 0,221ab 0,309ab 0,350a

z **: khác biệt rất có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01.

** ** ** 7,05 ANOVAz Khối lượng Công thức Khối lượng x công thức CV (%)

Từ kết quả bảng 3.2 cho thấy cũng tương tự như phản ứng Maillard

giữa chitosan và glucose. Tuy nhiên mức ñộ phản ứng thấp hơn so với phản

ứng với glucose, OD420 chỉ biến thiên từ 0,210 ñến 0,350 so với 0,299 - 0,480.

3.2. Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất chitosan cải

biến trong invitro

3.2.1. Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose

* Chitosan–glucose có khối lượng phân tử 30 kDa

Vi khuẩn E.coli ñược nuôi cấy trong môi trường lỏng Nutrient Broth có

bổ sung chitosan-glucose với nồng ñộ từ 50-300 ppm. Mỗi nồng ñộ có 3

công thức chitosan cải biến có tỷ lệ chitosan/glucose khác nhau 1:1; 2:1; và

5:1 với 2 công thức ñối chứng ĐC 1 (bổ sung chitosan chưa cải biến ở cùng

nồng ñộ), ĐC 2 (Vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường Nutrient Broth có bổ

sung axít acetic với lượng tương tự các công thức khác). Sau thời gian nuôi cấy 24h ở nhiệt ñộ 300C, xác ñịnh sinh trưởng của vi khuẩn bằng phương

pháp ño ñộ ñục ở bước sóng 625 nm. Thí nghiệm thực hiện với các sản phẩm

chitosan-glucose cải biến khác nhau. Kết quả ghi nhận trong bảng 3.3.

Bảng 3.3: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 30 kDa ñối với vi khuẩn E. coli

Nồng ñộ

Công thức(CT)

OD625

Nghiệm thức 1

1:1

0,643a

2:1

0,710a

50ppm

5:1

0,662a

ĐC1

0,674a

ĐC2

0,673a

1:1

0,655a

2:1

0,739a

100ppm

5:1

0,044ab

ĐC1

0,535ab

ĐC2

0,646a

1:1

0,643a

2:1

0,391ab

150ppm

5:1

0,025c

ĐC1

0,044b

ĐC2

0,677a

1:1

0,260a

2:1

0,052b

200ppm

5:1

0,017c

ĐC1

0,029b

ĐC2

0,702a

1:1

0,031b

2:1

300ppm

5:1

ĐC1

0,026b 0,007c 0,017b

ĐC2

0,698a

ANOVAz Nồng ñộ Công thức Nồng ñộ x công thức CV (%)

** ** ** 8,9

z **: khác biệt rất có ý nghĩa ở mức P ≤ 0,01

+ ĐC1: Chitosan + Vi khuẩn + Nutrient Broth

+ ĐC2: Acid acetic + Vi khuẩn + Nutrient Broth

Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy chitosan – glucose khối lượng phân tử 30

kDa có mức ñộ ức chế sinh trưởng của vi khuẩn E. coli khác nhau. Khối

lượng phân tử càng lớn thì khả năng kháng khuẩn của chitosan-glucose cải

biến càng lớn. Nguyên nhân là do khối lượng phân tử lớn thì mức ñộ

polycation càng lớn. Kết quả này cũng tương tự nghiên cứu của Hong Kyoon

No (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của sáu loại khối lượng phân tử khác nhau

của chitosan, chitosan oligomer ñến khả năng kháng khuẩn trên 7 loại vi

khuẩn gram dương và 4 vi khuẩn gram âm. Kết quả thấy rằng chitosan có

khối lượng phân tử cao có khả năng kháng khuẩn tốt hơn chitosan oligomer

có khối lượng phân tử thấp hơn.

Nghiên cứu về các mức ñộ gắn khác nhau, kết quả bảng 3.3 cho thấy ở

nồng ñộ 50ppm gần như không có khả năng kháng vi khuẩn E. coli so với ñối

chứng. Tuy nhiên, ñến nồng ñộ 100 ppm khả năng kháng khuẩn mẫu

chitosan/glucose 5:1 cao hơn so với chitosan không cải biến (ĐC 1).

Khi tăng lên nồng ñộ lên 150-200ppm, khả năng kháng khuẩn của

chitosan-glucose 5:1 tăng lên ñáng kể so với các công thức khác và ñối chứng

chitosan không cải biên. Ở nồng ñộ 150ppm, mẫu 5:1 gần như ức chế hoàn

toàn vi khuẩn E.coli (OD625: 0,025) so với ĐC1 là 0,44. Ở nồng ñộ 200ppm,

mẫu 5:1 có OD625 là 0,017 thấp hơn nhiều so với chitosan không cải biến

ĐC 1 là 0,029. Sự khác biệt này qua xử lý thống kê là có ý nghĩa với xác suất

P≤0.01. Điều ñó chứng tỏ chitosan-glucose cải biến có hiệu quả kháng khuẩn

cao hơn so với chitosan chưa cải biến.

So sánh mức ñộ gắn glucose và khả năng kháng khuẩn, kết quả cũng

cho thấy, mức ñộ gắn cao ở công thức 1:1 và 2:1 có khả năng kháng khuẩn

thấp hơn 5:1, thậm chí thấp hơn cả chitosan chưa cải biến. Nguyên nhân, là do

khi mức ñộ gắn qua lớn làm giảm mức ñộ polycation của chitosan dẫn ñến

khả năng kháng khuẩn giảm.

Bảng 3.4: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 30 kDa ñối với vi khuẩn S. aureus

Nồng ñộ

Công thức(CT)

OD625

Nghiệm thức 1

1:1

2:1

0,451ab 0,517ab

50ppm

5:1

0,299ab

ĐC1

0,403ab

ĐC2

1:1

0,592ab 0,220ab

2:1

0,326ab

100ppm

5:1

0,227ab

ĐC1

0,259ab

ĐC2

0,687a

1:1

0,446ab

2:1

150ppm

5:1

0,243ab 0,037 b

ĐC1

0,040 b

ĐC2

0,681a

1:1

0,395ab

2:1

0,257ab

200ppm

5:1

0,027 c

ĐC1

0,043 b

ĐC2

0,763a

1:1

0,040b

2:1

0,043 b

300ppm

5:1

0,017 c

ĐC1

0,033 b

ĐC2

0,552ab

ANOVAz Nồng ñộ Công thức Nồng ñộ x công thức CV (%)

** ** ** 10,3

z **: khác biệt rất có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01

Kết quả bảng 3.4 cho thấy khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn S.

aureus của chitosan-glucose cải biến tương tự như với vi khuẩn E.coli. Ở

nồng ñộ 50ppm. Ở nồng ñộ 100ppm có khả năng ức chế nhẹ ñến sự sinh

trưởng của vi khuẩn S. aureus, CT 5:1 là 0,227 nhỏ hơn CT ĐC 1 là chitosan

chưa cải biến 0,259 và ĐC 2 là 0,687.

Nồng ñộ 150ppm, ở công thức 5:1 có khả năng ức chế sinh trưởng của

vi khuẩn S. aureus mạnh hơn so với ĐC 1 là chitosan chưa cải biến. Nồng ñộ

200ppm, ở công thức chitosan cải biến 5:1 có khả năng ức chế sinh trưởng

của vi khuẩn S. aureus mạnh hơn so với chitosan chưa cải biến. Điều ñó

chứng tỏ, chitosan cải biến với mức ñộ gắn thích hợp có khả năng kháng

khuẩn mạnh hơn chitosan chưa cải biến. Sự khác biệt này là có ý nghĩa thống

kê.

* Chitosan –glucose cải biến có khối lượng phân tử 300 kDa

Bảng 3.5: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 300 kDa ñối với vi khuẩn E. coli

Nồng ñộ

Công thức(CT)

OD625

Nghiệm thức 1

1:1

2:1

50ppm

5:1

ĐC1

ĐC2

1:1

2:1

100ppm

5:1

ĐC1

ĐC2

1:1

2:1

0,530a 0,408ab 0,352ab 0,312ab 0,673a 0,131b 0,055b 0,027b 0,086b 0,646a 0,050b 0,067b

5:1

150ppm

ĐC1

ĐC2

1:1

2:1

200ppm

5:1

ĐC1

ĐC2

1:1

2:1

300ppm

5:1

ĐC1

ĐC2

0,041b 0,079b 0,677a 0,045b 0,029b 0,022b 0,038b 0,702a 0,025b 0,034b 0,022b 0,084b 0,698a

** ** ** 2,1

25 ANOVAz Nồng ñộ Công thức Nồng ñộ x công thức CV (%)

z **: khác biệt rất có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01

Từ kết quả bảng 3.5 cho thấy chitosan – glucose có khối lượng phân tử

300 kDa có khả năng kháng khuẩn tốt hơn chitosan – glucose có khối lượng

phân tử 30 kDa, thể hiện ở các giá trị ño OD trong suốt quá trình nuôi cấy, kết

quả này ñúng với giả thiết Avadi (2004).

Nồng ñộ 100ppm, 150ppm, 200ppm, 300ppm thì ñều có khả năng

kháng khuẩn ñối với vi khuẩn E. coli cao hơn so với ñối chứng chitosan chưa

cải biến (ĐC 1). Trị số ñộ ñục OD của các công thức cải biến ñều thấp hơn so

với ñối chứng chitosan. Cụ thể ở nồng ñộ 100ppm, công thức 2:1 là 0,055 và

công thức 5:1 là 0,027 so với ñối chứng chitosan chưa cải biến là 0,086 và ñối

chứng không chitosan (ĐC 2) là 0,646.

Theo kết quả phân hạng, nhiệm thức 18 và 23 có khả năng kháng khuẩn

với vi khuẩn E. coli tốt nhất, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 1% với các

nghiệm thức 1, 5, 10, 15, 20, 25 và không có sự khác biệt với các nghiệm thức

còn lại.

Bảng 3.6: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 300 kDa ñối với vi khuẩn S. aureus

Nồng ñộ

Công thức(CT)

OD625

1:1

Nghiệm thức 1

0,309def

2:1

0,233def

50ppm

5:1

0,335bcdef

ĐC1

0,307cdef

ĐC2

1:1

0,592abcd 0,175ef

2:1

0,091f

100ppm

5:1

0,042f

ĐC1

0,087f

ĐC2

0,687ab

1:1

0,032f

2:1

0,045f

150ppm

5:1

0,006f

ĐC1

0,052f

ĐC2

1:1

0,681abc 0,003f

2:1

0,004f

200ppm

5:1

0,009f

ĐC1

0,026f

ĐC2

0,763a

1:1

0,001f

2:1

0,002f

300ppm

5:1

0,019f

ĐC1

0,034f

ĐC2

0,552abcde

ANOVAz

Nồng ñộ

Công thức

Nồng ñộ x công thức

CV (%)

16,8

z **: khác biệt rất có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01

Kết quả thể hiện ở bảng 3.6 cho thấy khả năng kháng khuẩn của

chitosan - glucose khối lượng phân tử 300.000 Da có khả năng kháng khuẩn

S. areus mạnh so với ñối chứng chitosan chưa cải biến.

Nồng ñộ 100ppm, 150ppm, 200ppm, 300ppm ñều có khả năng kháng

khuẩn cao ñối với vi khuẩn S. aureus so với ñối chứng. Ở nồng ñộ 100ppm

và 150 ppm chitosan-glucose cải biến với tỷ lệ 5:1 ñã gần như ức chế hoàn

toàn vi khuẩn. Trong khi ñó chitosan chưa cải biến cần nồng ñộ 200-300 ppm.

Kết quả này thể hiện rõ rệt hiệu quả của cải biến chitosan trong kháng khuẩn.

Tuy nhiên ở nồng ñộ 200ppm với CT 1 và 300ppm với CT 1 là ức chế mạnh

nhất. Kết quả này cùng tương ñương với kết quả nghiên cứu của Hong Kyoon

No (2002).

Tóm lại, từ kết quả thống kê ở bảng trên cho thấy nồng ñộ chitosan –

glucose ảnh hưởng lớn ñến khả năng kháng khuẩn S. aureus. Nhưng chỉ tiêu

về công thức thì ảnh hưởng ñến khả năng kháng khuẩn tùy thuộc vào lượng

ñường ñược gắn vào chitosan.

Ở nghiệm thức 21 cho kết quả tốt nhất và có sự khác biệt có ý nghĩa ở

mức xác suất P≤0.01 với các nghiệm thực 5, 10, 15, 20, 25 và không có sự

khác biệt với các nghiệm thức còn lại.

Kết quả từ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 300 kDa với nồng

ñộ từ 100-150ppm ñã ức chế hoàn toàn sự sinh trưởng của vi khuẩn S. aureus

và vi khuẩn E. coli trong quá trình nuôi cấy. Theo S.R.Kanatt (2008), chitosan

100ppm chưa có khả năng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn, và từ 200ppm ñã

thể hiện rõ khả năng này Ana (2004).

* Chitosan –glucose có khối lượng phân tử 700 kDa

Bảng 3.7: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 700 kDa ñối với vi khuẩn E. coli

Nồng ñộ

Công thức(CT)

OD625

Nghiệm thức 1

1:1

2:1

0,560abcd 0,569abcd

50ppm

5:1

0,627abc

ĐC1

0,655ab

ĐC2

0,673ab

1:1

0,250abcd

2:1

0,161abcd

100ppm

5:1

ĐC1

0,191abcd 0,224abcd

ĐC2

0,646ab

1:1

0,158abcd

2:1

150ppm

5:1

0,058cd 0,058cd

ĐC1

0,069cd

ĐC2

0,677a

1:1

2:1

0,301abcd 0,037d

200ppm

5:1

0,037d

ĐC1

0,038d

ĐC2

1:1

0,702a 0,029d

2:1

0,033d

300ppm

5:1

0,033d

ĐC1

0,096bcd

ĐC2

0,698a

ANOVAz

Nồng ñộ

Công thức

Nồng ñộ x công thức

13,6

CV (%)

z **: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01

Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy khả năng kháng khuẩn của chitosan -

glucose có khối lượng phân tử 700 kDa, nồng ñộ 150ppm, 200ppm, 300ppm

có khả năng ức chế ñối với vi khuẩn E. coli. Ở nồng ñộ 200-300ppm với

công thức 1:1; 2:1 và 5:1 có khả năng ức chế hoàn toàn sự sinh trưởng vi

khuẩn E. coli.

Theo kết quả phân hạng, chỉ tiêu về nồng ñộ ảnh hưởng rất lớn ñến khả

năng kháng khuẩn của vi khuẩn E. coli. Nồng ñộ càng cao thì khả năng kháng

khuẩn càng cao, còn chỉ tiêu ở công thức không ảnh hưởng ñến khả năng

kháng khuẩn. Khả năng kháng khuẩn tốt nhất là ở nghiệm thức 21, có sự khác

biệt có ý nghĩa ở mức 1% với các nghiệm thức 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 và

không có sự khác biệt với các nghiệm thức còn lại.

Bảng 3.8: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân

tử 700 k Da ñối với vi khuẩn S. aureus

Nồng ñộ Công thức(CT) OD625

Nghiệm thức 1 1:1

2 2:1

50ppm 3 5:1

4 ĐC1

5 ĐC2

6 1:1

7 2:1

100ppm 8 5:1

9 ĐC1

10 ĐC2

11 1:1 0,608abc 0,528abcd 0,517abcd 0,263abcd 0,592abcd 0,297abcd 0,163bcd 0,164bcd 0,071cd 0,687ab 0,127bcd

12 2:1 0,067cd

150ppm 13 5:1

14 ĐC1 0,061cd 0,050cd

ĐC2 15

1:1 16

2:1 17

200ppm 5:1 18

ĐC1 19

ĐC2 20

1:1 21

2:1 22

300ppm 5:1 23

ĐC1 24

ĐC2 0,681ab 0,035cd 0,065cd 0,035cd 0,063cd 0,763a 0,056cd 0,077cd 0,029d 0,047cd 0,552abcd

25 ANOVAz

Nồng ñộ **

Công thức **

Nồng ñộ x công thức **

z **: khác biệ trất có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01

CV (%) 13,5

Bảng 3.8, khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng

phân tử 700 kDa, nồng ñộ 50ppm và 100ppm khả năng ức chế vi khuẩn S.

aureus không khả quan so với ñối chứng chitosan chưa cải biến.

Nồng ñộ 150ppm, 200ppm, 300ppm cho thấy có khả năng ức chế ñối

với vi khuẩn S. aureus, nhưng tốt nhất với nồng ñộ 300ppm ở công thức 5:1

so với ñối chứng.

Từ kết quả thống kê, hai chỉ tiêu về nồng ñộ và công thức ñều ảnh

hưởng ñến khả năng kháng khuẩn S. aureus. Nồng ñộ cao thì khả năng kháng

khuẩn tốt, ở nghiệm thức 23 cho thấy chitosan – glucose có khả năng kháng

khuẩn hoàn toàn và có sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 1% với các nghiệm thức

1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25 và không có sự khác biệt với các nghiêm thức

còn lại.

Nhìn chung, xét về ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan cải biến

thì 300 kDa là tối ưu cho khả năng kháng khuẩn hơn là 30 kDa và 700 kDa.

Xét về tỷ lệ chitosan/glucose khi cải biến thì công thức 5:1 là tối ưu hơn cả và

nồng ñộ ức chế hoàn toàn (MIC) ñối với E.coli và S. areus là 150ppm so với

chitosan không cải biến là 200-300 ppm.

3.2.2. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn chitosan – glucosamine

cải biến

Gắn ñường glucose lên chitosan có thể làm giảm khả năng kháng khuẩn

nếu mức ñộ gắn lớn. Nguyên nhân là do khi mức ñộ gắn cao làm giảm ñộ tích

ñiện dương polycation của chitosan. Vì vậy, ñể tăng khả năng kháng khuẩn và

hạn chế khả năng ñề kháng của vi khuẩn chúng tôi tiến hành gắn glucosamine

lên chitosan. Glucosamine cũng giống như glucose nhưng có thêm nhóm

NH2, vì vậy tính chất polcation của chitosan không bị ảnh hưởng khi tỷ lệ gắn

thay ñổi cao thấp.

Bảng 3.9: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 30 kDa ñối với vi khuẩn S. aureus

Nồng ñộ

Công thức(CT)

OD625

Nghiệm thức 1

1:1

2:1

50ppm

5:1

ĐC1

ĐC2

1:1

2:1

100ppm

5:1

ĐC1

ĐC2

1:1

0,194b 0,137bcd 0,173bc 0,189b 0,355a 0,088cde 0,083de 0,068de 0,066de 0.,308a 0,078de

2:1

150ppm

5:1

ĐC1

ĐC2

1:1

2:1

200ppm

5:1

ĐC1

ĐC2

1:1

2:1

300ppm

5:1

ĐC1

ĐC2

0,075de 0,056de 0,069de 0,307a 0,063de 0,054e 0,039e 0,062de 0,343a 0,093cde 0,144bcd 0.,070de 0,090cde 0,317a

25 ANOVAz

Nồng ñộ

Công thức

Nồng ñộ x công thức

CV (%)

2,62

z **: khác biệt rất có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01

Khi gắn glucosamine với chitosan có khối lượng phân tử 30kDa ñem

thử nghiệm khả năng kháng khuẩn kết quả cho thấy khả năng kháng vi khuẩn

S. aureus của chitosan – glucosamine tốt hơn chitosan – glucose. Điều này

chứng tỏ chitosan –glucosamine cải biến không làm giảm mức ñộ polycation,

tính chất liên quan trực tiếp ñến tính kháng khuẩn.

Kết quả bảng 3.9 cho thấy chitosan-glucosamine cải biến thể hiện tính

kháng khuẩn ngay ở nồng ñộ thấp 50-100 ppm. ở công thức 1:1 và 5:1 OD là

0,137 so thấp hơn so với ĐC 1 chitosan chưa cải biến là 0,189 và ñối chứng

không chitosan là 0,355.

So sánh ảnh hưởng của mức ñộ gắn glucosamine, kết quả cho thấy ở

ttat cả các nồng ñộ không có sự khác biệt giữa các công thức 1:1; 2:1 và 5:1.

Kết quả này là bằng chứng thực tiễn chứng minh lý thuyết trên.

Bảng 3.10: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 30 kDa ñối với vi khuẩn E. coli

Nồng ñộ

Công thức(CT)

OD625

Nghiệm thức 1

1:1

0,172c

2:1

0,170c

50ppm

5:1

0,100c

ĐC1

0,114c

ĐC2

0,365ab

1:1

0,134c

2:1

100ppm

5:1

0,087c 0,091c

ĐC1

0,081c

ĐC2

0,429a

1:1

0,092c

2:1

0,087c

150ppm

5:1

0,071c

ĐC1

0,080c

ĐC2

0,297b

1:1

0,026c

2:1

0,022c

200ppm

5:1

0,015c

ĐC1

0,016c

ĐC2

0,096ab

1:1

0,094c

2:1

0,088c

300ppm

5:1

0,077c

ĐC1

0,082c

ĐC2

0,339ab

ANOVAz

Nồng ñộ

Công thức

Nồng ñộ x công thức

CV (%)

17,6

z **: khác biệt rất có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01

Với chitosan có khối lượng phân tử 30 kDa khi gắn glucosamine vào

thì khả năng ức chế quá trình sinh trưởng vi khuẩn E. coli ñã cho kết quả khá

tốt. Chỉ tiêu về nồng ñộ ảnh hưởng lớn ñến khả năng kháng khuẩn, với nồng

ñộ 200ppm thì ñã có thể ức chế hoàn toàn vi khuẩn E. coli so với công thức

ñối chứng. kết quả tốt nhất là ở nghiệm thức 18, và có sự khác biệt ở mức 1%

với các nghiệm thức ĐC2 là 5, 10, 15, 20, 25 và không có sự khác biệt với các

nghiệm thức còn lại.

Bảng 3.11: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 300 kDa ñối với vi khuẩn S. aureus

Nghiệm thức 1

Nồng ñộ

Công thức(CT) 1:1

OD 0.173b

2:1

0.146bc

50ppm

5:1

0.147bc

ĐC1

0.143bcd

ĐC2

0.395a

1:1

2:1

0.141bcd 0.125bcde

100ppm

5:1

0.090bcde

ĐC1

0.105bcde

ĐC2

1:1

0.351a 0.096bcde

2:1

0.051cde

150ppm

5:1

0.054e

ĐC1

ĐC2

0.073cde 0.396cde

1:1

0.092bcde

2:1

0.071cde

200ppm

5:1

0.056de

ĐC1

0.051e

ĐC2

0.371a

1:1

0.089bcde

2:1

0.101bcde

300ppm

5:1

0.066cde

ĐC1

0.093bcde

ĐC2

0.386a

ANOVAz

Nồng ñộ

Công thức

Nồng ñộ x công thức

CV (%)

2,7

z **: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01

Qua kết quả thống kê ở bảng 3.11 chitosan(300 kDa) cải biến, có nồng

ñộ 100ppm, 200ppm, 300ppm ñều có khả năng kháng vi khuẩn S. aureus

mạnh so với ñối chứng. Kết quả này tương ứng với nghiên cứu của Hong

Kyoon No (2002). Kết quả này cũng cho thấy chitosan –glucosamine (300

kDa) chỉ có thể kháng vi khuẩn S. aureus ở nồng ñộ cao hơn so với vi khuẩn

E. coli.

Từ kết quả phân hạng cho thấy nghiệm thức 12 có khả năng kháng vi

khuẩn S. aureus hoàn toàn, với sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 1% so với các

nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 7, 9, 22 các nghiệm thức còn lại không

có sự khác biệt.

Bảng 3.12: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 300 kDa ñối với vi khuẩn E. coli

Nồng ñộ

OD625

Công thức

Nghiệm thức 1

1:1

2:1

50ppm

5:1

ĐC1

ĐC2

1:1

100ppm

2:1

5:1

ĐC1

0,094cde 0,093cde 0,092cde 0,098bcde 0,365a 0,113bcde 0,097de 0,085bcde 0,087cde

ĐC2

1:1

2:1

150ppm

5:1

ĐC1

ĐC2

1:1

2:1

200ppm

5:1

ĐC1

ĐC2

1:1

2:1

300ppm

5:1

ĐC1

ĐC2

0,314abcd 0,053de 0,043e 0,047de 0,087bcde 0,347ab 0,063de 0,057de 0,019e 0,029e 0,219abcde 0,093bcde 0,092cde 0,086bcde 0,084cde 0,369a

25 ANOVAz

Nồng ñộ

Công thức

Nồng ñộ x công thức

7,1

CV (%) z **, NS: khác biệt rất có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01, hoặc không có sự khác biệt.

Kết quả thống kê ở bảng 3.12 cho thấy, khả năng ức chế sự sinh trưởng

vi khuẩn E. coli của chitosan – glucosamine rất hiệu quả ở mọi nồng ñộ so với

ñối chứng. Ngay ở nồng ñộ 50ppm, chitosan-glucosamine ñã cho hiệu quả

kháng khuẩn cao, và không có sự khác biệt khi tăng nồng ñộ lên 100ppm,

200ppm, thậm chí 300 ppm. Kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy không có

sự khác biệt về khả năng kháng khuẩn trong khoảng từ 50-300ppm (NS).

Ở nồng ñộ 200-300ppm có khả năng ức chế hoàn toàn vi khuẩn E. coli

trong suốt quá trình nuôi cấy. Kết quả này tương ñồng với kết quả của

Nguyễn Anh Dũng (2003) ñã sử dụng oligoglucosamine với nồng ñộ 250-

300ppm ñể ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn E. coli. Theo nghiên cứu

của Hirano (1998) liều ức chế vi khuẩn E.coli của chitosan là 200-240ppm.

Bảng 3.13: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 700 kDa ñối với vi khuẩn S. aureus

Công thức(CT)

Nồng ñộ

OD625

Nghiệm thức 1

1:1

2:1

0,181abc 0,205abc

50ppm

5:1

0,185abc

ĐC1

0,151abc

ĐC2

1:1

0,239abc 0,152abc

2:1

0,328a

100ppm

5:1

0,018c

ĐC1

0,025bc

ĐC2

0,275ab

1:1

0,047bc

2:1

150ppm

5:1

0,009c 0,003c

ĐC1

0,007c

ĐC2

0,276ab

1:1

0,013c

2:1

0,005c

200ppm

5:1

0,001c

ĐC1

0,002c

ĐC2

0,340a

1:1

0,017bc

2:1

0,000c

300ppm

5:1

0,000c

ĐC1

0,000c

ĐC2

0,314a

** ** * 7,6

ANOVAz Nồng ñộ Công thức Nồng ñộ x công thức CV (%)

z **, *: khác biệt rất có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01, 0,05.

Bảng 3.13 kết quả cho thấy chitosan – glucosamine có khối lượng phân

tử 700 kDa có khả năng kháng khuẩn S. aureus hoàn toàn ở nồng ñộ tối thiểu

là 100-150 ppm.

Ở nồng ñộ 50ppm, chitosan – glucosamine (700 kDa) cũng ñã thể hiện

khả năng kháng khuẩn, kết quả ñối chứng là 0,239 giảm một nửa xuống còn

0,151 ở công thức 5:1.

Từ nồng ñộ 100ppm ñến 300pm thì khả năng ức chế vi khuẩn S.

aureus hoàn toàn. Nhất là ở nồng ñộ 300ppm thì khả năng kháng khuẩn hoàn

toàn và vi khuẩn không có khả năng phục hồi so với ñối chứng.

Bảng 3.14: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng

phân tử 700 kDa ñối với vi khuẩn E. coli

Nồng ñộ Công thức(CT) OD625

Nghiệm thức 1 1:1

2 2:1

50ppm 3 5:1

4 ĐC1

5 ĐC2

6 1:1

7 2:1

100ppm 8 5:1

9 ĐC1

10 ĐC2

11 1:1

12 2:1

150ppm 13 5:1

14 ĐC1

15 ĐC2 0,328abcd 0,242abcde 0,214abcde 0,183abcde 0,333abcd 0,226abcde 0,114cde 0,087de 0,086de 0,389ab 0,143bcde 0,031e 0,000e 0,000e 0,422a

1:1 16

2:1 17

200ppm 5:1 18

ĐC1 19

ĐC2 20

1:1 21

2:1 22

300ppm 5:1 23

ĐC1 24

ĐC2 0,083de 0,004e 0,000e 0,000e 0,324abcd 0,007e 0,000e 0,000e 0,000e 0,365abc

25 ANOVAz

Nồng ñộ **

Công thức **

Nồng ñộ x công thức **

z **: khác biệt rất có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01

CV (%) 3,49

Ở bảng 3.14, từ kết quả thống kê cho thấy chitosan – glucosamine (700

kDa) có khả năng ức chế hoàn toàn quá trình sinh trưởng và phát triển của vi

khuẩn E. coli từ nồng ñộ 100pp ñến 300ppm.

Tóm lại, Chitosan có khối lượng phân tử khác nhau thì có khả năng

kháng khuẩn khác nhau, chitosan khối lượng phân tử càng lớn khả năng

kháng khuẩn càng cao, khi sử dụng chitosan cải biến bằng phương pháp tạo

nhánh với các phân tử ñường thì hiệu quả kháng khuẩn càng tăng cao.

Đối với chitosan – glucosamine khả năng kháng khuẩn vi khuẩn E. coli,

S. aureus tốt hơn chitosan – glucose.

3.3. Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan cải biến bằng

phương pháp khuyếch tán trên ñĩa

Các chủng vi khuẩn E. coli và S. aureus ñược nuôi trong môi trường

ñĩa thạch. Các dẫn suất chitosan cải biến ñược tẩm trên giấy thấm vô trùng có ñường kính 6mm, ñặt nhẹ trên bề mặt ñĩa. Vi khuẩn ñược ủ ở nhiệt ñộ 370C

trong vòng 48h, sau ñó ñược ñem ño kích thước vòng vô khuẩn.

3.3.1. Đối với chitosan – glucose

Bảng 3.15: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose

bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn S. aureus

Công thức

Nghiệm thức 1

1:1

2:1

Khối lượng phân tử 30.000Da

5:1

ĐC

1:1

2:1

300.000Da

5:1

ĐC

1:1

2:1

700.000Da

5:1

Kích thước vòng vô khuẩn (mm) 0,333d 0,667cd 1,000bcd 0,500cd 0,500cd 1,333bc 1,833ab 0,833cd 1,333bc 1,833ab 2,333a 1333bc

ĐC

ANOVAz Khối lượng Công thức Khối lượng x công thức CV (%)

** ** ** 3,67

z **: khác biệt rất có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01

+ ĐC(Chitosan + Vi khuẩn + Nutrient Broth)

Bảng 3.15 cho thấy kích thước vòng kháng khuẩn của mẫu chitosan –

glucose cải biến là 1,833 và 2,333 cao gấp ñôi so với chitosan chưa cải biến là

0,833 và 1,333.

Từ kết quả thống kê ở bảng 3.15 nhận thấy khi thực hiện phương pháp

khuyếch tán trên ñĩa cũng cho kết quả giống với phương pháp của Kanatt

(2008). Với chitosan – glucose có khối lượng phân tử khác nhau(300 kDa,

700 kDa) sau 2 ngày quan sát ta nhận nhận thấy xung quanh mảnh giấy có

tẩm chitosan cải biến vi khuẩn S. aureus không phát triển tạo thành 1 vòng có

màu sắc sáng hơn xung quanh, ñó là vòng kháng khuẩn S. aureus.

Chitosan có khối lượng phân tử lớn (300 kDa, 700 kDa) thì có vòng

kháng khuẩn lớn, cụ thể là ở nghiệm thức 11 vòng kháng khuẩn ñạt kích

thước lớn nhất so với ñối chứng. Từ kết quả ñó cho ta thấy chitosan khi gắn

thêm ñường với liều lượng thích hợp 5:1 và cộng thêm chitosan có khối lượng

phân tử lớn thì khả năng kháng khuẩn càng cao.

Kết quả này một lần nữa minh chứng khả năng kháng khuẩn chủa

chitosan gia tăng khi cải biến gắn với glucose.

Bảng 3.16: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose

bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn E. coli

lượng

Công thức

Nghiệm thức 1

1:1

2:1

Khối phân tử 30 kDa

5:1

4 5

ĐC 1:1

2:1

300kDa

5:1

8 9

ĐC 1:1

2:1

700kDa

5:1

ĐC

12 ANOVAz Khối lượng Công thức Khối lượng x công thức CV (%)

Kích thước vòng vô khuẩn (mm) 0,333b 0,667b 1,167ab 1,333ab 0,333b 0,833b 1,833ab 1,167ab 0,667b 1,833ab 2,667a 1,000b * 3,49

z **, *: khác biệt rất có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01; 0,05.

ĐC: (Chitosan + Vk+mt Nutrient Broth)

Từ kết quả thống kê cho thấy, nghiệm thức 11 có vòng kháng khuẩn E.

coli lớn nhất, ñiều này ta có thể khẳng ñịnh ñược rằng với chitosan – glucose

có khối lượng phân tử là 700 kDa có khả năng kháng khuẩn tốt nhất ở CT 3,

với sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 1% với các nghiệm thức 1, 2, 5, 6, 9, 12 và

không có sự khác biệt với các nhiệm thức còn lại.

3.3.2. Đối với chitosan – glucosamine

Bảng 3.17: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan -

glucosamine bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn S.

aureus

Công thức

Nghiệm thức

1:1 1

2:1 2 Khối lượng phân tử 30kDa

5:1 3

ĐC 1:1 4 5

2:1 6 300 kDa

5:1 7

ĐC 1:1 8 9

2:1 10 700 kDa

5:1 11

ĐC

Kích thước vòng vô khuẩn (mm) 0,500ab 0,500ab 0,500ab 0,667ab 0,167b 0,667ab 1,667ab 0,667ab 0,167b 0,500ab 2,333a 0,167b NS ** ** 5,2

12 ANOVAz Khối lượng Công thức Khối lượng x công thức CV (%)

z ** khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01; NS: không có sự khác biệt.

Đối với chitosan ñược cải biến với glucosamine thì nhận thấy vòng

kháng khuẩn S. aureus thu ñược rộng hơn ñối với chitosan – glucose. Theo

kết quả thống kê ở bảng 3.17, nghiệm thức 11 có kích thước vòng kháng

khuẩn lớn, và có sự khác biệt ở mức 1% so với các nghiệm thức 5, 9, 12 và

không có sự khác biệt với các nghiêm thức còn lại.

Bảng 3.18: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan -

glucosamine bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn E. coli

Công thức

Nghiệm thức 1 1:1

2:1 2 Khối lượng phân tử 30 kDa

5:1 3

ĐC 4

1:1 5

2:1 6 300 kDa

5:1 7

ĐC 8

1:1 9

2:1 10 700 kDa

5:1 11

ĐC Kích thước vòng vô khuẩn (mm) 0,500ab 2,833ab 3,667a 0,500ab 0,500ab 0,667ab 0,833ab 0,667ab 0,167b 0,500ab 0,667ab 0,167ab

* * * 8,7

z *: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0.05.

12 ANOVAz Khối lượng Công thức Khối lượng x công thức CV (%)

Kết quả thống kê ở bảng 3.18 xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của

chitosan-glucosamine có khối lượng phân tử khác nhau(30 kDa, 300 kDa,

700kDa) bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn E. coli

nhận thấy nghiệm thức 3 cho vòng kháng khuẩn lớn nhất và có sự khác biệt

có ý nghĩa ở mức 5% so với các nghiệm thức 9 và không có sự khác biệt với

các nghiệm thức còn lại.

3.4. Nghiên cứu thử nghiệm các dẫn suất chitosan cải biến trong bảo

quản thực phẩm

3.4.1. Đối với chitosan – glucose

3.4.1.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose ñến trạng thái cảm quan

của thịt trong quá trình bảo quản

Thịt sau khi ñược phun chitosan – glucose ở các công thức của Maille:

CT1, CT2, CT3; có khối lượng phân tử khác nhau: 30 kDa, 300 kDa, 700 kDa. Đem ñi bảo quản ở nhiệt ñộ phòng (khoảng từ 200C – 250C) và nhiệt ñộ lạnh 50C. Sau mỗi khoảng thời gian như ñã nói ở trên ta tiến hành lấy mẫu thịt

ñược bảo quản ñi kiểm tra, ñánh giá và cho ñiểm cảm quan.

Kết quả ñánh giá ñược thể hiện ở ñồ thị 3.1 cho thấy ở nhiệt ñộ bảo quản 250C, sau thời gian bảo quản 36 giờ, thịt bị xám, nhầy ñối với mẫu ñối

chứng. Điểm cảm quan giảm từ 20 xuống còn 8,9, chitosan còn 10 và

chitosan-glucose 5:1 còn giữ ñược 13,1 ñiểm. Rõ ràng là từ kết quả kháng

khuẩn trong invitro ñến trắc nghiệm khuyếch tán trên ñĩa và thí nghiệm bảo

Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 700 kDa ở nhiệt ñộ phòng (20 – 250C) ñến trạng thái cảm quan

của thịt.

So sánh kết quả bảo quản của các mẫu chitosan-glucose có khối lượng phân tử khác nhau 30 kDa, 300 kDa và 700kDa ở nhiệt ñộ 250C kết quả ñiểm

cảm quan không có sự khác biệt. Kết quả này so với kết quả kháng khuẩn

trong invitro có sự khác biệt. Nguyên nhân có thể là do kết quả kháng khuẩn

chỉ thực hiện trên các vi khuẩn gây ngộ ñộc thực phẩm, còn các vi khuẩn gây

thối khác làm giảm ñiểm cảm quan thì không nghiên cứu. Ngoài ra, ñiểm cảm

quan còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác như nhiệt ñộ, ánh sáng, ẩm ñộ không khí. Như vậy ở nhiệt ñộ 250C sử dụng chitosan-glucose có thể bảo

THỜI GIAN(NGAY)

Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có khối lượng phân tử 700 kDa ở nhiệt ñộ lạnh (50C) ñến trạng thái cảm quan của

thịt.

Ở nhiệt ñộ bảo quản lạnh 50C, ñiểm cảm quan của thịt có tốt hơn. Thịt

có thể bảo quản ñược 8 ngày khi xử lý với chitosan-glucose với ñiểm cảm

quan là 16,5-17,4/20 so với ñối chứng là 14 và chitosan không cải biến là 16.

3.4.1.2. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine ñến trạng thái cảm

quan của thịt trong quá trình bảo quản

Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine có khối lượng phân tử 300 kDa ở nhiệt ñộ lạnh (50C) ñến trạng thái cảm quan của thịt.

ĐC1

ĐC2

CT1

CT2

CT3

N A U Q M Ả C M Ể I Đ

THỜI GIAN(NGAY)

Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine có khối lượng phân tử 700 kDa ở nhiệt ñộ lạnh (50C) ñến trạng thái cảm quan

của thịt.

So sánh bảo quản của chitosan-glucosamine ở các ñồ thị 3.7 ñến 3.12,

kết quả cho thấy tương tự như chitosan-glucose. Nhìn chung chitosan-

glucosamine bảo quản thịt tốt hơn so với ñối chứng và chitosan chưa cải biến. Thời gian bảo quản ñược ở nhiệt ñộ 250C là 36h với chitosan-glucose 300 kDa và 8 ngày ở nhiệt ñộ 50C.

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

+ Phản ứng Maillard giữa chitosan và ñường glucose và glucosamine

phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng ñộ chitosan. Khối lượng phân tử

càng lớn thí phản ứng Maillard xảy ra càng mạnh. Tỷ lệ nồng ñộ

chitosan/glucose và chitosan/glucosamine thích hợp cho phản ứng gắn là 2:1.

+ Khả năng kháng khuẩn của chitosan-glucose cải biến và chitosan-

glucosamine cải biến mạnh hơn chitosan. Khối lượng phân tử thích hợp cho

khả năng kháng khuẩn của chitosan cải biến là 300.000 -700.000. Ở khối

lượng phân tử này và tỷ lệ gắn ở công thức 5:1, nồng ñộ ức chế tối thiểu của

chitosan cải biến gắn glucose và glucosamine là 100-150ppm so với chitosan

là 200-300ppm trong invitro.

+ So sánh gắn glucosamine và glucose lên chitosan thì chitosan gắn

glucosamine có hiệu quả kháng khuẩn cao hơn gắn glucose. Khi gắn

glucosamine lên chitosan thì mức ñộ gắn của các công thức 1:1; 2:1 và 5:1

dường như ít ảnh hưởng tới khả năng kháng khuẩn.

+ Bảo quản thịt sử dụng chitosan cải biến gắn glucose và glucosamine

cho kết quả tốt hơn so với chitosan. Thịt có thể bảo quản ñược 36 giờ ở nhiệt ñộ 250C so với ñối chứng là 12 giờ và 8 ngày ở 50C so với ñối chứng là 3-4

ngày. Kết quả bảo quản thịt cho thấy không có sự khác biệt giữa chitosan-

glucose và chitosan-glucosamine.

4.2. Đề nghị

+ Tiếp tục thử nghiệm bảo quản thịt bằng các sản phẩm chitosan-

glucose và chitosan-glucosamine ñể cho kết quả chắc chắn hơn và có thể ñưa

ra ứng dụng thực tiễn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Anh Dũng, Nguyễn Đình Huyên, Trần Tích Cảnh

(1996), Chế tạo chitin Hydrogels làm vật liệu cố ñịnh enzyme bằng kỹ

thuật bức xạ, Hội nghị Vật lý & Kỹ thuật Hạt nhân toàn quốc lần thứ I,

Hà nội, tr. 499-502. 2. Nguyễn Anh Dũng, Nguyễn Đình Huyên, Trần Tích Cảnh

(1997), Nghiên cứu ghép bức xạ acrylamide lên tinh bột bằng phươg

pháp chiếu xạ trước làm chất mang cố ñịnh enzyme, Tạp chí Khoa học

Công nghệ, 35(1), tr. 10-13. 3. Nguyễn Anh Dũng, Nguyễn Đình Huyên, Trần Tích Cảnh

(1999), Nghiên cứu cố ñịnh trypsin trong gels chitosan-gHEMA ., Tạp

chí Khoa học và Công nghệ, 37(1), tr. 10-15. 4. Nguyễn Anh Dũng, Nguyễn Đình Huyên, Trần Tích Cảnh

(1999), Nghiên cứu chế tạo vật liệu chitosan-g-co-HEMA bằng kỹ thuật

bức xạ, Kỷ yếu Hội nghị Vật lý và Kỹ thuật Hạt nhân toàn quốc lần thứ

3, Đà lạt, Nxb Khoa học Kỹ thuật, tr. 647-651. 5. Nguyễn Anh Dũng, Nguyễn Đình Huyên, Trần Tích Cảnh

(1999), Nghiên cứu cố ñịnh trypsin và xellulase lên tinh bột ghép

acrylamide chế tạo bằng kỹ thuật bức xạ, Kỷ yếu Hội nghị Vật lý và

Kỹ thuật Hạt nhân toàn quốc lần thứ 3, Nxb Khoa học Kỹ thuật, tr. 642-

646. 6. Nguyễn Anh Dũng, Nguyễn Đình Huyên, Trần Tích Cảnh

(1999), Nghiên cứu cố ñịnh trypsin lên màng chitin ghép acrylic acid

ñược chế tạo bằng kỹ thuật bức xạ, Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh

học Toàn quốc, Hà nội, Tr. 505-510. 7. Nguyễn Anh Dũng, Nguyễn Tiến Thắng (2000), Nghiên cứu qui

trình sản xuất chitin, chitosan và các dẫn suất từ vỏ tôm phế thải ứng

dung trong Nông nghiệp và y học, Kỷ yếu Hội nghị Khoa học công

nghệ Miền Trung Tây nguyên, tr. 140-145. 8. Nguyễn Anh Dũng, Nguyễn Tiến Thắng (2001), Xây dựng qui

trình công nghệ thu nhận oligoglucosamine từ chitosan và các ứng

dụng trong nông nghiệp, Tuyển tập các công trình nghiên cứu Khoa

học Công nghệ, NXB Nông nghiệp, , Tr. 162-169. 9. Nguyễn Anh Dũng, 2004, Nghiên cứu cố ñịnh Bacillus subtilis

trong hạt chitosan, Kỷ yếu nghiên cứu khoa học Đại học Tây Nguyên,

NXB Nông nghiệp, trang 173-178. 10. Nguyễn Quốc Hiến, Lê Hải, Lê Quang Luân, 2000, Chế tạo

chitosan oligomer bằng kỹ thuật bức xạ, Tạp chí Hóa học, tập 28, Số 2,

trang 22-24. 11. Nguyễn Quốc Hiến, 2002 , Ứng dụng kỹ thuật bức xạ cho sản

xuất chất kích thích sinh trưởng thực vật từ tảo và thuốc trừ nấm từ vỏ

tôm, Tạp chí Hóa học, 11, trang 19-21. 12. Nguyễn Văn Sức, Nguyễn Quốc Hiến 2004, Hấp phụ uranium

bởi chitin/chitosan có mức ñộ deacetyl hóa thấp, ạp chí Hóa học, 42, số

1, trang 1-4.

Tiếng Anh

13. Dzung, N.A; Khanh, V.T.P.; Ngoc, N.T.B, Hong, P.A. (2006)

Advances in Chitin Science and Technology, ISBN: 89-5708-110-

0,505-507.

14. Acosta N., Aranaz I. 2005 Functional characterization of

chitosan for applications in biotechnology, Advances in chitin science

Vol. 7. 15. Andrews J. M., 2001 Determination of minimum inhibitory

concentrations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 48 (Suppl.

1):5-16, (2001) PMID 11420333 16. Bong-Kyu Choi, Kwang-Yoon Kim, Yun-Jung Yoo, Suk-Jung

Oh, Jong-Hoon Choi, Chong-Youl Kim, 2001 In vitro antimicrobial

activity of a chitooligosaccharide mixture against Actinobacillus

actinomycetemcomitans and Streptococcus mutans. International

Journal of Antimicrobial Agents 18 (2001) 553–557 17. Clermont Beaulieu 2005 Chitin and chitosan: Versatile and

multiplatform biomolecules Trends in plastics. 18. David N. S. Hon, 1994 Chitin and chitosan: Medical application

Advances in chitin and chitosan vol. 21 (1994) 632-649. 19. El-Refaie Kenawy, F. Imam Abdel. 2005 Biologically Active

Polymers: Modification and Anti-microbial Activity of Chitosan

Derivatives. Journal of Bioactive and Compatible Polymers, Vol. 20,

No. 1, 95-111 20. Fukamizo T., 2000 Chitinolytic enzymes: catalysis, substrate

binding, and their application Current Protein Peptide Science 1:105-

24. [PMID: 12369923]. 21. H. Sco, K. Mitsuhashi, H. Tanibe 1992 Antibacterial and

antifungal fiber blended by chitosan Advances in chitin and chitosan

Elsevier Applied Science, London, New York p. 34-40. 22. Holme, K.R., and Hall, L.D., 1992 Carbohydr. Res. 225, 291–

306

23. Hwang J.-K., Kim H.-J., Yoon S.-J., Pyun Y.-R., 1998

Advances in Chitin Science; Chen, R.H.; Chen, H.C., Eds.; Rita

Advertising Co. Ltd.; Taiwan, Vol. III, 340-344. 24. Izume, M., Nagae, S., Kawagishi, H., Mitsutomi, M., Ohtakara,

A., 1992 Action pattern of Bacillus sp. No. 7-M chitosanase on

partially N-acetylated chitosan. Bioscience Biotechnology and

Biochemistry 56:448-453. [PMID: 1368330]. 25. Kondo Y., Nakatani A., Hayashi K., Ito M., 2000 Low molecular

weight chitosan prevents the progression of low dose streptozotocine-

induced slowly progressive diabetes mellitus in mice. Biol Pharm Bull

2000, 23(12):1458-1464. 26. Kurita K., Kojima T., Munakata T., Akao H., Mori T.,

Nishiyama Y., Shimojoh M., 1998 Chem. Lett. 317–31. 27. Le Q. Luan, Vo T. T. Ha, Naotsugu Nagasawa. 2005. Biological

effect of irradiated chitosan on plants in vitro. Biotechnol. Appl.

Biochem. (2005) 41, (49–57). 28. Liu X.F., Guan Y.L., Yang D.Z., Li Z., Yao K.D., 2001 J. Appl.

Polym. Sci. 79, 1324. 29. Mitsutomi, M., Isono, M., Uchiyama, A., Nikaidou, N., Ikegami,

T., Watanabe, T., 1998 Chitosanase activity of the enzyme previously

reported as beta-1,3-1,4-glucanase from Bacillus circulans WL-12.

Bioscience Biotechnology and Biochemistry 62:2107-2114. [PMID:

9972232].

30. Mrunal R. Thatte, 2004 Synthesis and bacterial assessment of

water-soluble hydrophobic chitosan derivatives bearing quaternary

ammonium functionality A dissertation submitted to the Graduate

Faculty of the Louisiana State University and Agricultural &

Mechanical Colledge.

31. Muzzarelli R.A.A, Muzaareli C., Cosani A., Terbojevich M.,

1999 Carbohydr. Polym. 39, 361–367 32. Muzzarelli, R.A.A., 1993 Advances in N-acetyl-beta-D-

glucosaminidases Chitin Enzymology (R.A.A. Muzzarelli, editor)

European Chitin Society, Ancona, pages 357-373. 33. Muzzarelli, R.A.A., Xia, W., Tomasetti, M., Ilari, P., 1995

Depolymerization of chitosan and substituted chitosans with the aid of

a wheat germ lipase preparation Enzyme and Microbial Technology

17:541-545. 34. No H., Meyers S., Muzzarelli R, 1997 Preparation of chitin and

chitosan_ Chitin Handbook; European chitin society, p.475. 35. Ohtakara, A., Izume, M., Mitsutomi, M., 1988 Action of

microbial chitosanases on chitosan with different degrees of

deacetylation Agricultural and Biological Chemistry, 52:3181-3182. 36. Riccardo A.A. Muzzarelli and Fabio Tanfani N -(O-

carboxybenzyl) chitosan, n-carboxymethyl chitosan and

dithiocarbamate chitosan: New chelating derivatives of chitosan Pure

&Appl.Chem. Vol.54, No.11, pp.2l41—215O, 1982. 37. Rinaudo M., Milas M., Le Dung Ph., 1993 Int. J. Biol.

Macromol., 281-285 38. Ruey-Shin Juang, Feng-Chin Wu, Ru-Ling Tseng, 2002 Use of

chemically modified chitosan beads for sorption and enzyme

immobilization; Advances in Environmental Research vol. 6 (2002)

171-177. 39. Tsai G.J., Zhang S.L., Shieh P.L., 2004 Antimicrobial activity of

a low-molecular-weight chitosan obtained from cellulase digestion of

chitosan. Journal of Food Protection, Volume 67, Number 2, 1

February 2004, pp. 396-398(3).

40. Thomas Freier, R. Montenegro, Hui Shan Koh, Molly S.

Shoichet, 2005 Chitin based tubes for tissue engineering in the nervous

system Biomaterials 26 (2005) 4624-4632 (*). 41. Uchida Y, Izume M, Ohtakara A., 1989 Preparation of chitosan

oligomers with purified chitosanase and its application. Chitin and

chitosan: sources, chemistry, biochemistry, physical properties and

applications. London: Elsevier Applied Science, 1989:373–82. 42. Whitaker, D.R., 1971 The Enzymes, 3rd edition Vol. V, 273-90,

(Boyer,P.D.). Academic Press. 43. Ying-Chien Chung, Cheng-Lang Kuo, Chiing-Chang Chen, 2005

Preparation and important functional properties of water-soluble

chitosan produced through Maillard reation Bioresource technology 96:

1473-1482. 44. Hadwiger, Klosterman, S.J and Choi, J.J, 2002, Advances in

Chitin Science, Vol. V, pp. 452-457. 45. Ro Dong Park, Kyu Jong Jo, You Young Jo, Yu Lan Jin, 2002,

Advances in Chitin Science, Vol. V, 255-259. 46. Dzung, N.A.; Thuoc, V (2006) Study on effects of chitosan

oligomer on the growth development and disease resistance of rice,

Advances in Chitin Science and Technology, ISBN: 89-5708-110-0,

381-383. 47. Dzung, N.A (2007), Advances in Chitin Science, Vol. X, pp.

453-459. 48. Dzung, N.A., Khanh, V.T.P. (2003), Advances in Chitin Science,

Hirano, S. 1996. Ann. Rev. Biotechnol., 2, 237-258.

Vol.VII, 240-243. 49. 50. Hong Kyoon No et al.,(2002), International Journal of Food

Microbiology, 74, pp. 65-72.

51. Sweetie, R. Kanatt, Ramash, Chander and Arun Sharma (2008),

Food Chemistry, 106, 521-528. 52. Kendra, D. F., Hadwiger, L.A., 1984, Exp. Mycol., 8, 276-281. 53. Dzung, N.A; Khanh, V.T.P. (2004) Proceedings of The 6th Asia-

Pacific on Chitin, Chitosan Symposium, Singapore, ISBN: 981-05-

0904-9. 54. Suwalee Chandrkrachang, 2002, Advances in Chitin Science,

Vol. V, pp. 458-462. 55. Dzung, N.A; Khanh, V.T.P.; Ngoc, N.T.B, Hong, P.A. (2006)

Advances in Chitin Science and Technology, ISBN: 89-5708-110-0,

505-507. 56. Antoni Niekrazewicz, 2005 Chitosan medical dressings Fibre &

Textiles in Eastern Europe January/December 2005, Vol. 13, No. 6

(54). 57. Hadwiger, L.A., Klosterman, S.J and Choi, J.J, 2002, Advances

in Chitin Science, Vol. V, 452-457. 58. Andreu Beùgin, Claude Willemor, Patrick Frustier, 2003 Use of

chitosan on strawberries to increase shelf life: Combination of

treatment and comparison with other treatment Advances in chitin

science Vol. 7. 59. Hong Kyoon No, Na Young Park, Shin Ho Lee, Samuel P.

Meyers (2002), Antibacterial activity of chitosans and chitosan

oligomers with different molecular weights, International Journal of

Food Microbiology 74 (2002) 65 – 72

PHẦN PHỤ LỤC Danh mục các hình ảnh

1. Hình ảnh chitosan, chitosan cải biến:

Ảnh 1: Chitosan(30, 300, 700kDa) 1%

Ảnh 2: Chitosan - glucose có khối lượng phân tử(30, 300, 700kDa)

Ảnh 3: Chitosan - glucosamine có khối lượng phân tử(30, 300, 700kDa)

Ảnh 4: Môi trường Nutrient Broth có vi khuẩn E coli ñược bổ sung chitosan cải biến ở nồng ñộ 50ppm, 100ppm, 150ppm, 200ppm, 300ppm lúc 0 giờ

Ảnh 5: Môi trường Nutrient Broth có vi khuẩn E coli ñược bổ sung chitosan cải biến ở nồng ñộ 50ppm, 100ppm, 150ppm, 200ppm, 300ppm sau 24h

Ảnh 6: Môi trường Nutrient Broth có vi khuẩn S aureus ñược bổ sung chitosan cải biến ở nồng ñộ 50ppm, 100ppm, 150ppm, 200ppm, 300ppm lúc 0 giờ Ảnh 7: Môi trường Nutrient Broth có vi khuẩn S aureus ñược bổ sung chitosan cải biến ở nồng ñộ 50ppm, 100ppm, 150ppm, 200ppm, 300ppm lúc 24h

Ảnh 8: Vòng kháng khuẩn E coli của chitosan-glucose(700kDa)

Ảnh 9: Vòng kháng khuẩn E coli của chitosan-glucose(300kDa)

Ảnh 10: Vòng kháng khuẩn E coli của chitosan-glucose(30kDa)

2.Vòng kháng khuẩn

Ảnh 11: Vòng kháng khuẩn S aureus của chitosan- glucose(700kDa)

Ảnh 12: Vòng kháng khuẩn S aureus của chitosan- glucose (300kDa)

Ảnh 13: Vòng kháng khuẩn S aureus của chitosan- glucose(300kDa)

Ảnh 14: Vòng kháng khuẩn E coli của chitosan- glucosamine(700kDa)

Ảnh 15: Vòng kháng khuẩn E coli của chitosan- glucosamine(300kDa)

Ảnh 16: Vòng kháng khuẩn E coli của chitosan- glucosamine(30kDa)

Ảnh 17: Vòng kháng khuẩn S aureus của chitosan- glucosamine(700kDa)

Ảnh 18: Vòng kháng khuẩn S aureus của chitosan- glucosamine(300kDa)

Ảnh 19: Vòng kháng khuẩn S aureus của chitosan- glucosamine(30kDa)

Ảnh 20: Mẫu thịt tươi ban ñầu

Ảnh 21: Mẫu ñược sử lý bằng chitosan cải biến

3. Hình ảnh bảo quản:

Ảnh 25: Mẫu chitosan – glucose(700kDa), CT3 lúc 36 giờ

Ảnh 24: Mẫu chitosan – glucose(700kDa), CT3 lúc 0 giờ

Ảnh 27: Mẫu chitosan – glucose(300kDa), CT3 lúc 36 giờ

Ảnh 26: Mẫu chitosan – glucose(300kDa), CT3 lúc 0 giờ

Hình ảnh mẫu thịt bò ñược bảo quản bằng chitosan-glucose ở nhiệt ñộ phòng(20-250C) Ảnh 22: Mẫu không chitosan lúc 0 giờ Ảnh 23: Mẫu không chitosan lúc 36 giờ

Ảnh 28: Mẫu chitosan – glucose(30kDa), CT3 lúc 0 giờ

Ảnh 29: Mẫu chitosan – glucose(30kDa), CT3 lúc 36 giờ

Hình ảnh mẫu thịt bò ñược bảo quản bằng chitosan-glucose ở nhiệt ñộ lạnh(50C)

Ảnh 30: Mẫu không chitosan lúc 0 ngày

Ảnh 31: Mẫu không chitosan lúc 8 ngày

Ảnh 33: Mẫu chitosan- glucose(700kDa), CT3 lúc 8 ngày

Ảnh 32: Mẫu chitosan- glucose(700kDa), CT3 lúc 0 ngày

Ảnh 35: Mẫu chitosan – glucose(300kDa), CT3 lúc 8 ngày

Ảnh 34: Mẫu chitosan – glucose(300kDa), CT3 lúc 0 ngày

Ảnh 36: Mẫu chitosan – glucose(30kDa), CT3 lúc 0 ngày

Ảnh 37: Mẫu chitosan – glucose(30kDa), CT3 lúc 8 ngày

Hình ảnh mẫu thịt bò ñược bảo quản bằng chitosan-glucosamine ở nhiệt ñộ phòng(20-250C)

Ảnh 38: Mẫu không chitosan lúc 0 giờ

Ảnh 39: Mẫu không chitosan lúc 36 giờ

Ảnh 41: Mẫu chitosan – glucosamine(700kDa), CT3 lúc 36 giờ

Ảnh 43: Mẫu chitosan – glucosamine(300kDa), CT3 lúc 36 giờ

Ảnh 40: Mẫu chitosan – glucosamine(700kDa), CT3 lúc 0 giờ Ảnh 42: Mẫu chitosan – glucosamine(300kDa), CT3 lúc 0 giờ

Ảnh 45: Mẫu chitosan – glucosamine(700kDa), CT3 lúc 36 giờ

Ảnh 44: Mẫu chitosan – glucosamine(30kDa), CT3 lúc 0 giờ

Hình ảnh mẫu thịt bò ñược bảo quản bằng chitosan-glucose ở nhiệt ñộ lạnh(50C)

Ảnh 46: Mẫu không chitosan lúc 0 ngày

Ảnh 47: Mẫu không chitosan lúc 8 ngày

Ảnh 49: Mẫu chitosan – glucosamine(700kDa), CT3 lúc 8 ngày

Ảnh 48: Mẫu chitosan – glucosamine(700kDa), CT3 lúc 0 ngày

Ảnh 51: Mẫu chitosan – glucosamine(300kDa), CT3 lúc 8 ngày

Ảnh 50: Mẫu chitosan – glucosamine(300kDa), CT3 lúc 0 ngày

Ảnh 53: Mẫu chitosan – glucosamine(30kDa), CT3 lúc 8 ngày

Ảnh 52: Mẫu chitosan – glucosamine(30kDa), CT3 lúc 0 ngày

PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH

Gà Lương Phượng

Gà trắng siêu thịt Japfa

Gà con 7 ngày tuổi

Gà bị phù ñầu

Gà bị liệt chân