Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng IgY nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KH&CN VN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

MAI THỊ THU

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM KHÁNG THỂ ĐA

DÒNG IgY NHẬN BIẾT ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN

NANG F1 CỦA VI KHUẨN DỊCH HẠCH YERSINIA

PESTIS VÀ

ỨNG DỤNG TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội, 11/2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu là do tôi tự thực hiện.

Tất cả các số liệu, kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn

là hoàn toàn trung thực, chưa được bất kỳ tác giả nào công bố trước đây.

Nếu lời cam đoan không đúng sự thật tôi xin chịu hoàn toàn trách

nhiệm.

Tác giả

Mai Thị Thu

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Quang Hòa, trưởng phòng Kỹ

thuật Gen, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách

Khoa Hà Nội người thầy đã luôn hướng dẫn, giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên

sinh vật/Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, đã dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình học tập.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cấp Thủ trưởng và cán bộ phòng Sinh học,

Viện Hóa học - Môi trường Quân sự nơi tôi công tác, đặc biệt là đồng chí Nguyễn

Phượng Minh, chủ nhiệm đề tài:“Nghiên cứu chế tạo test phát hiện nhanh vi

khuẩn dịch hạch Yersinia pestis” đã cung cấp kinh phí, tạo mọi điều kiện để tôi

hoàn thành luận văn của mình.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng hộ

tôi trong suốt thời gian qua!

Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2017

Học viên

Mai Thị Thu

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ ...................................................................... 7

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................... 9

LỜI MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 10

CHƯƠNGI: TỔNG QUAN ................................................................................... 12

I. Bệnh dịch hạch và nguyên nhân gây bệnh dịch hạch ........................................... 12

I.1. Bệnh dịch hạch ................................................................................................... 12

I.2. Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam ................................................. 13

I.2.1. Tình hình dịch hạch trên thế giới .................................................................... 13

I.2.2. Tình hình dịch hạch tại Việt Nam ................................................................... 14

I.3. Biểu hiện của bệnh dịch hạch ............................................................................ 16

I.3.1. Dịch hạch thể hạch .......................................................................................... 16

I.3.2. Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết .................................................................... 18

I.3.3. Dịch hạch thể phổi .......................................................................................... 19

I.4. Cơ chế lây lan bệnh dịch hạch và vi khuẩn Y. pestis ......................................... 20

I.4.1. Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch ................................................................... 20

I.4.2. Vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Y. pestis .......................................................... 22

I.5. Kháng nguyên nang F1 ...................................................................................... 24

I.5.1. Cấu trúc kháng nguyên nang F1 .................................................................... 24

I.5.2. Tính chất của kháng nguyên nang F1 ............................................................. 25

I.6. Các phương pháp phân tích chẩn đoán kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn

Y.pestis...................................................................................................................... 25

I.6.1. Phương pháp miễn dịch ................................................................................. 25

I.6.2. Phương pháp sinh học phân tử. ....................................................................... 30

I.7. Sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng. .......................................................... 31

I.7.1. Định nghĩa IgY ............................................................................................... 31

I.7.2. Sự hình thành kháng thể IgY ở gà .................................................................. 31

I.7.3. Cấu trúc của kháng thể IgY ............................................................................ 32

I.8. Sản xuất kháng thể đơn dòng từ chuột thuần chủng BALB/c ........................... 33

I.8.1. Khái niệm, ứng dụng của kháng thể đơn dòng .............................................. 33

I.8.2. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng ....................................................... 34

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 37

II.1. Vật liệu nghiên cứu........................................................................................... 37

II.1.1. Động vật thí nghiệm ...................................................................................... 37

II.1.2. Hóa chất và vật tư tiêu hao ............................................................................ 37

II.1.3. Thiết bị ........................................................................................................... 37

II.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 38

II.2.1. Sản xuất kháng thể đa dòng IgY kháng F1 ................................................... 38

II.2.2. Sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1 trên chuột BALB/c thuần chủng. .. 42

II.2.3. Ứng dụng sản xuất que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát hiện nhanh F1 ....... 45

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 47

III.1. Sản xuất kháng thể IgY kháng F1 từ trứng gà ................................................ 47

III.1.1. Tạo kháng nguyên F1 dạng dung hợp với MBP (Maltose binding protein)

làm nguyên liệu cho phản ứng ELISA. .................................................................... 47

III.1.2. Tối ưu hóa ELISA đánh giá hiệu giá kháng thể IgY kháng F1 .................. 49

III.2. Tạo dòng tế bào lai có khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1 trên

chuột BALB/c thuần chủng. ..................................................................................... 53

III.2.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột BALB/c thuần chủng. ........................... 53

III.2.2. Kết quả tạo tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên F1 ..................... 55

II.3. Ứng dụng chế phẩm IgY tạo que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát hiện

nhanh F1. .................................................................................................................. 57

III.3.1. Lựa chọn kháng thể IgY in lên vị trí vạch thử nghiệm. .............................. 57

III.3.2. Ảnh hưởng của các loại màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu vạch

thử nghiệm cố định IgY. .......................................................................................... 58

III.3.3. Tối ưu hóa các điều kiện in kháng thể lên vạch kiểm chứng. ...................... 60

III.3.4. Tối ưu hóa các điều kiện in kháng thể IgY lên vạch thử nghiệm. ............... 61

III. 4. Ứng dụng kháng thể đơn dòng thương mại sản xuất que thử. ....................... 64

III.4.1. Ảnh hưởng nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm. ..... 64

III.4.2. Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm. ............... 65

III.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu trên vạch thử

nghiệm. ..................................................................................................................... 65

III.4.4. Xác định độ nhạy của que thử với chế phẩm thương mại G20. ................... 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 68

DANH MỤC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Tình hình dịch hạch trên thế giới từ năm 1954 – 2001

Hình 1.2: Số mắc/chết dịch hạch ở Việt Nam từ năm 1976-2002

Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch ở Việt Nam so với thế giới, 1954-2001

Hình 1.4: Bệnh nhân mắc bệnh dịch hạch

Hình 1.5: Sơ đồ lây lan bệnh dịch hạch

Hình 1.6: Hình ảnh Y. pestis bắt màu đậm 2 đầu khi nhuộm Wayson

Hình 1.7: Mô hình lắp ráp các thành phần của bộ kit ICT(I) và đánh giá kết quả (II)

Hình 1.8: Quá trình chuyển IgY vào lòng đỏ trứng

Hình 1.9: Cấu tạo kháng thể IgG và IgY

Hình 1.10: Qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng

Hình 2.1: Gây miễn dịch trên chuột với kháng nguyên F1

Hình 3.1: Phổ điện di các phân đoạn rửa giải trong quá trình tinh sạch kháng

nguyên F1 tái tổ hợp từ cấu trúc pET22b-(His)10-MBP-F1

Hình 3.2: Xác định độ pha loãng của kháng thể kháng IgY gắn HRP

Hình 3.3: Xác định độ pha loãng của kháng thể IgY kháng F1

Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian thu trứng lên hiệu giá của chế phẩm IgY

Hình 3.5: Hiệu giá kháng thể của chế phẩm IgY từ trứng thu tại thời điểm 30, 35

ngày sau gây miễn dịch lần 1

Hình 3.6: Hiệu giá mẫu huyết thanh chuột trước gây miễn dịch và sau khi gây miễn

dịch ở các độ pha loãng khác nhau

Hình 3.7: Hình ảnh dung nạp tạo tế bào lai có chứa kháng thể đơn dòng có ái lực F1

Hình 3.8: Que thử sàng lọc 240 dòng tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng

nguyên F1

Hình 3.9: Lựa chọn mẫu IgY cần in lên vị trí vạch thử nghiệm

Hình 3.10: Ảnh hưởng của màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu vạch thử

nghiệm cố định IgY

Hình 3.11: Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể M5899 đến cường độ tín hiệu vạch

kiểm chứng

Hình 3.12:Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol bổ sung vào kháng thể M5899 đến

cường độ tín hiệu vạch kiểm chứng

Hình 3.13:Ảnh hưởng của nồng độ IgY đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm

Hình 3.14: Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm

Hình 3.15: Xác định độ nhạy của que thử phát hiện F1 sử dụng chế phẩm IgY

Hình 3.16: Ảnh hưởng của nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm

Hình 3.17: Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm

Hình 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu trên vạch

thử nghiệm

Hình 3.19: Xác định độ nhạy của que thử phát hiện F1 sử dụng kháng thể G20 làm

kháng thể bắt cặp

Bảng 3.1: Nồng độ protein trong các phân đoạn rửa giải khi tinh sạch trên cột sắc

ký ái lực NI-NTA

Bảng 3.2: Giá trị OD 450 nm của mẫu huyết thanh chuột trước và sau khi gây miễn dịch.

Bảng 3.3: Kết quả lai giữa tế bào Myeloma Sp2/0 và tế bào lympho

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Yolk Immunoglobulin IgY

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ELISA

Bovine Serum Albumin BSA

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide

Gel Electrophoresis

HTSKMD Hệ thống sắc ký miễn dịch

Kilo Dalton kDa

Khối lượng phân tử KLPT

Maltose binding protein MBP

Luria – Bertani LB

Immunochromatographic assay ICA

Nitrocellulose NC

Test line TL

Control line CL

immunochromatographic test ICT

LỜI MỞ ĐẦU

Dịch hạch là một bệnh truyền nhiễm tối nguy hiểm do Yersinia pestis gây ra.

Bệnh lây truyền từ động vật sang người qua trung gian truyền bệnh là bọ chét.

Bệnh đã được biết từ thời xa xưa và đã gây ra 3 vụ đại dịch lớn vào các thế kỉ XI,

XIV và XIX với hàng trăm triệu người tử vong. Tuy đã được phát hiện từ lâu

nhưng hiện nay các ổ dịch vẫn còn tồn tại và đang hoạt động trong nhiều khu vực

trên trái đất.

Tuy dịch hạch đã được kiểm soát nhưng công tác điều tra giám sát dịch tễ

học vẫn phải được tiến hành thường xuyên. Bởi vì bệnh dịch hạch có thể xuất hiện

bất cứ khi nào nếu gặp điều kiện thuận lợi và sẽ gây ảnh hưởng to lớn đến cuộc

sống của con người. Đặc biệt vi khuẩn Yesinia pestis vẫn được coi là một trong

những tác nhân dùng để làm vũ khí sinh học.

Trong bối cảnh phức tạp như hiện nay, trên thế giới, khủng bố bằng vũ khí

sinh học đang được các thế lực thù địch tìm cách lợi dụng và phát triển. Trong đó, vi

khuẩn gây bệnh than (Bacillus anthracis) và vi khuẩn gây bệnh dịch hạch (Y. pestis)

là những đối tượng nguy hiểm nhất. So với các loại vũ khí thông thường, thì vũ khí

sinh học rất khó phát hiện, nhưng lại gây chết người hàng loạt trên diện rộng; gây

thiệt hại nặng nề về kinh tế và gây ô nhiễm môi trường một cách trầm trọng.

Các phương pháp phân tích kháng nguyên F1 đặc hiệu cho Y. Pestis đều là

các phương pháp miễn dịch trong đó phổ biến nhất là ELISA và sắc ký miễn dịch

kẹp đôi (Splettstoesser và đồng tác giả, 2004). Que thử phát hiện nhanh kháng

nguyên F1 được tạo ra bằng phương pháp sắc ký miễn dịch kẹp đôi có quy trình

phân tích rất đơn giản, không cần trang thiết bị do vậy rất thích hợp với các phép

phân tích tại hiện trường; đáp ứng nhu cầu củacác phân đội lính trinh sát làm nhiệm

vụ tại các vùng rừng núi hẻo lánh.

Nhiệm vụ của Phòng Sinh học/Viện Hóa học – Môi trường quân sự là

nghiên cứu, chế tạo các trạng thiết bị để thực hiện nhiệm vụ trinh sát, phát hiện

nhanh các tác nhân sinh học. Do vậy việc nghiên cứu sản xuất các test phát hiện

nhanh kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn Y.pestis trong môi trường bằng phương

pháp sắc ký miễn dịch kẹp đôi sử dụng kháng thể đa dòng IgY từ trứng gà là nhiệm

vụ trọng tâm và rất cần thiết.

Vì những lý do và nhu cầu từ thực tế trên, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu

tạo kháng thể nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch

hạch Yersinia pestis và ứng dụng sản xuất que thử phát hiện nhanh.”.

Nội dung nghiên cứu chính của luận văn:

- Tối ưu hóa qui trình gây đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên nang F1 ở gà.

- Tinh sạch kháng thể đa dòng IgY.

- Nghiên cứu thăm dò khả năng sản sản xuất kháng thể đơn dòng IgG có ái

lực cao với kháng nguyên F1.

- Ứng dụng các chế phẩm kháng thể trong sản xuất que thử miễn dịch phát

hiện nhanh kháng nguyên F1.

CHƯƠNGI: TỔNG QUAN

I. Bệnh dịch hạch và nguyên nhân gây bệnh dịch hạch

I.1. Bệnh dịch hạch

Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm cấp tính, tối nguy hiểm thuộc diện kiểm

dịch và khai báo quốc tế do Yersinia pestis (Y.pestis) gây nên. Bệnh lưu hành

trong quần thể động vật thuộc bộ gặm nhấm (Rodentia), chủ yếu là chuột và bọ

chét ký sinh trên chúng, từ đó lây truyền sang các loại súc vật khác và sang người.

Lịch sử loài người đã ghi nhận 3 vụ đại dịch vào các thế kỷ thứ VI, XIV và XIX

với hàng trăm triệu người tử vong và bệnh dịch hạch đã trở thành nỗi kinh hoàng

của nhân loại.

Bệnh dịch hạch được biết đến từ thời xa xưa, thời kì đầu khó có thể xác định

được những thông tin chính xác cần thiết để phân biệt hoặc chứng minh dịch hạch

do vi khuẩn hay vi rút.

Trong khoảng hai ngàn năm qua, các vụ dịch hạch lớn đã lây lan rộng khắp

đến các quốc gia trên thế giới. Đại dịch đầu tiên được ghi nhận vào thế kỷ thứ VI,

vào khoảng từ năm 542 đến 546 xảy ra vụ dịch lớn bắt đầu ở Đế quốc La Mã

phương Đông vào triều đại Vua Justinian 1 ở Ai Cập, lây lan sang Châu Âu, ước

tính làm chết khoảng 100 triệu người ở Châu Á, Châu Phi và Châu Âu. Đại dịch

lần thứ hai nổi tiếng với tên “Bệnh chết đen - Black Death” vào thế kỷ XIV,

khoảng từ năm 1347 đến 1350. Đại dịch lần thứ 2 ước tính làm chết khoảng 50

triệu người trên thế giới, trong đó một nửa số nạn nhân là ở Châu Âu, chiếm một

phần ba dân số Châu Âu thời bấy giờ. Tỷ lệ tử vong trong đại dịch này từ 70 - 80%.

Cuối thế kỷ XIX, đại dịch thứ ba bắt đầu ở Canton và Hồng Kông vào năm

1894, nhanh chóng lan truyền đi khắp thế giới. Trong vòng 10 năm (1894-1903),

dịch đã lan đến 77 thành phố cảng trên khắp 5 châu: Châu Á: 31, Châu Âu: 12,

Châu Phi: 8, Bắc Mỹ: 4, Nam Mỹ: 15 và Châu Úc: 7. Trong đại dịch này, dịch

hạch lây lan mạnh mẽ ở Ấn Độ, chỉ riêng ở Bombay đã làm chết khoảng

13.000.000 người [1].

I.2. Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam

I.2.1. Tình hình dịch hạch trên thế giới

Các vùng dịch hạch lưu hành không cố định mà luôn luôn thay đổi, tuỳ

thuộc vào sự thay đổi của nhiều yếu tố tự nhiên, xã hội như: khí hậu, động đất, sự

di chuyển của các quần thể gặm nhấm, di dân,... Hiện nay, các ổ dịch hạch tự nhiên

tồn tại ở Bắc và Nam Mỹ, Châu Phi, Châu Á và Đông Nam Châu Âu, từ 55 vĩ độ

Bắc đến 40 vĩ độ Nam. Tuy nhiên, trong vành đai này có những vùng không có ổ

dịch hạch như các hoang mạc với một số lượng ít hoặc không có loài vật chủ gặm

nhấm, vùng chí tuyến hoặc những dãy núi cao đóng băng quanh năm.

Từ 1954 - 2001, Tổ chức Y tế thế giới ghi nhận có 38 quốc gia trên thế giới

xảy ra bệnh dịch hạch gồm 89.651 trường hợp mắc và 7.715 bệnh nhân tử vong.

Nhiều nhất là năm 1967 có 6014 trường hợp và thấp nhất năm 1981 có 200 trường

hợp. Trong gần nửa thế kỷ qua, có 7 quốc gia trên thế giới có dịch bệnh xảy ra

hàng năm là Brazil, Cộng hoà dân chủ Công Gô, Madagascar, Myanmar, Pê Ru,

Hoa Kỳ và Việt Nam.

Hình 1.1: Tình hình dịch hạch trên thế giới từ năm 1954 – 2001[1]

Thực tế tình hình dịch hạch trên thế giới cho đến nay vẫn diễn biến phức tạp,

không thể nói rằng sẽ loại trừ dịch hạch trong tương lai gần. Cũng không thể buông

lỏng sự giám sát dịch hạch. Năm 1995 ở Madagascar bắt đầu nghiên cứu phòng

chống dịch hạch toàn diện và tổ chức mạng lưới nghiên cứu vấn đề này trong các

Viện Pasteur (Acip Peste). Tại Trung Quốc mặc dù tình hình dịch hạch đã được

khống chế mạnh mẽ nhưng hệ thống giám sát phòng chống chủ động bệnh dịch này

vẫn được đẩy mạnh và giải quyết chặt chẽ. Những năm gần đây Hội nghị quốc tế

về nghiên cứu và phòng chống dịch hạch vẫn được tổ chức Y tế Thế giới tổ chức,

thu hút được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu về lĩnh vực này tham dự.

Tại hội nghị quốc tế về giám sát và phòng chống dịch hạch tổ chức ở Bangalore,

Ấn Độ từ 15 - 17 tháng 07 năm 2002, theo Tikhomirov E, chuyên gia của Tổ chức

Y tế Thế giới thì có 6 tiêu chuẩn để đánh giá tính ưu tiên trong nghiên cứu và

phòng chống của một bệnh là: Tác động của bệnh đó (nguyên nhân gây mắc và

chết), nguy cơ tác nhân gây nên dịch, hiệu lực trong dự phòng và điều trị bệnh, tầm

quan trọng đối với quốc tế, ảnh hưởng đến kinh tế và nguy cơ sử dụng có mục đích.

Dịch hạch có đầy đủ 6 yếu tố trên và như vậy nên được xem là bệnh cần ưu tiên

nghiên cứu và phòng chống [1].

I.2.2. Tình hình dịch hạch tại Việt Nam

Hơn 1 thế kỷ trước, bệnh dịch hạch đã có mặt ở Việt Nam, có khả năng từ

Hồng Kông xâm nhập vào năm 1898 trong bối cảnh của đại dịch lần thứ ba. Mầm

bệnh vẫn được duy trì, lưu hành có thời kỳ bùng phát xen kẽ với những thời kỳ

lắng dịu nhưng thực sự chưa bao giờ được loại trừ.

Dịch hạch được ghi nhận lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1898 tại Nha

Trang trong bối cảnh vụ đại dịch hạch thế giới lần thứ 3. Dịch xâm nhập chủ yếu

theo hàng hóa của người Trung Hoa. Sau khi xâm nhập dịch lây lan đến những nơi

khác như Bắc Ninh, Hòn Gai, Phan Thiết, Phan Rang, Sóc Trăng.... Dịch tại những

nơi xâm nhập đều có tính chất tạm thời trừ Sài Gòn và Phan Thiết có chiều hướng

trở thành vùng dịch lưu hành dai dẳng. Vào năm 1911 tại Châu Đốc, Long Xuyên,

Thủ Dầu Một xảy ra một vụ dịch lớn với nhiều bệnh nhân dịch hạch thể phổi có

886 người tử vong.

Hình1.2: Số mắc/chết dịch hạch ở Việt Nam từ năm 1976-2002

Từ 1961 đến 1975: dịch bùng phát lan tràn ở Miền Nam. Sau đó tiếp tục lây

lan trên diện rộng ở các tỉnh ven biển Miền Trung, Tây Nguyên, Miền Đông Nam

Bộ. Chính quyền miền Nam dưới sự trợ giúp của Mỹ thông qua chương trình quốc

gia phòng chống dịch hạch đã khống chế được một phần, nhưng nhìn chung dịch

vẫn tồn tại với quy mô lớn. Trong giai đoạn này, hầu hết số bệnh nhân mắc phải

dịch trên thế giới đều là Việt Nam.

Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch ở Việt Nam so với thế giới, 1954-2001

Từ 1975 đến 1990: Sau 1975 dịch bùng phát, số ca mắc - chết tăng vọt tại

các vùng dịch lưu hành như ở các tỉnh ven biển Miền Trung, Tây Nguyên, Miền

Đông Nam Bộ. Đặc biệt trong thời gian này, dịch hạch đã xuất hiện và gây ra một

số vụ dịch nhỏ tại 9 tỉnh/thành phố phía Bắc do có sự giao lưu về lương thực hàng

hóa và các phương tiện giao thông. Đặc biệt chuột và tác nhân gây bệnh Y. pestis

theo gạo và lương thực từ Miền Nam xâm nhập vào Miền Bắc qua cảng biển Hải

Phòng. Trong giai đoạn từ năm 1991 đến 2002 số mắc - chết có chiều hướng giảm

và phạm vi dịch thu hẹp dần, tập trung chủ yếu ở Miền Trung và Tây Nguyên.

Trong 4 năm (1999-2002), dịch chỉ còn ghi nhận tại một số địa phương 2 tỉnh Đắc

Lắc và Gia Lai với diện dịch tập trung dai dẳng vào một số xã thuộc 2 huyện: Đắc

Đoa, tỉnh Gia Lai và EaH’leo, tỉnh Đắk Lắk.

Từ tháng 3/2003 đến nay không ghi nhận bệnh dịch hạch trên người, ca mắc

gần nhất ghi nhận vào tháng 08 năm 2002 tại tỉnh Đắk Lắk. Giám sát dịch động vật

tại các trọng điểm, từ tháng 4/2004 không còn phân lập được Y. pestis từ vật chủ và

trung gian truyền bệnh. Từ năm 2005 xét nghiệm huyết thanh động vật tìm kháng

thể kháng F1 của vi khuẩn Y. pestis đều cho kết quả âm tính.

I.3. Biểu hiện của bệnh dịch hạch

Tùy theo vị trí thương tổn giải phẫu bệnh lý, có thể gặp nhiều thể lâm sàng

với tỷ lệ khác nhau nhưng phổ biến nhất là thể hạch. Thể nhiễm khuẩn huyết và thể

phổi tiên phát hiếm gặp hơn. Các trường hợp nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi thứ

phát có thể xem là biến chứng của thể hạch không được điều trị sớm và tích cực.

Ngoài ra còn gặp các biểu hiện khác như viêm màng não mủ, việm họng, thể xuất

huyết, thể da … Tuy nhiên các biểu hiện này thường gặp trong bệnh cảnh hoặc xảy

ra thứ phát sau thể hạch.

I.3.1. Dịch hạch thể hạch

Thể lâm sàng của bệnh dịch hạch không hằng định và nhiều thể. Tuỳ vào

từng vùng và vụ dịch mà tỷ lệ gặp có khác nhau, nhưng nhìn chung thể hạch vẫn

phổ biến nhất.

Thống kê của một số bệnh viện ở Việt Nam như sau: Bệnh viện Chợ Quán từ

năm 1977 đến 1986 gặp 94 - 98%; Bệnh viện Đắc Lắc từ năm 1976 đến 1986 gặp

97% và Bệnh viện Phú Khánh từ 1982 đến 1986 gặp 98% . Ở New Mexico từ năm

1980 - 1984 gặp 74,7% là thể hạch. Theo qui định của Tổ chức Y tế Thế giới, thời

gian ủ bệnh trong vòng 6 ngày, thời kỳ này kéo dài hơn ở những người đã được

chủng ngừa vắc xin. Thời kỳ ủ bệnh không có triệu chứng gì, sau đó bệnh thường

khởi phát đột ngột với hai nhóm dấu hiệu đặc trưng của bệnh dịch hạch là nhiễm

khuẩn - nhiễm độc và viêm hạch.

* Hội chứng nhiễm trùng - nhiễm độc.

Sốt cao đột ngột là triệu chứng tương đối phổ biến và thường xuất hiện trước

khi viêm hạch. Nếu được điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu thì nhiệt độ hạ, trong

vòng 18 - 24 giờ có thể giảm đến 1,5 đến 2oC, ngày sau có thể hết sốt hoặc sốt nhẹ

thêm 2 - 3 ngày rồi hết hẳn.

Các dấu hiệu nhiễm trùng, nhiễm độc thần kinh biểu hiện mức độ nặng nhẹ

của bệnh và là yếu tố quyết định tiên lượng bệnh. Cần đặc biệt quan tâm khi thấy

xuất hiện sớm trong vòng 24 giờ đầu. Ở thể nhẹ, bệnh nhân mệt mỏi, biếng ăn

nhưng vẫn tươi tỉnh. Bệnh càng nặng, biểu hiện nhiễm độc càng rõ. Mặt đỏ, kết

mạc mắt xung huyết, môi khô, lưỡi bẩn, đau nhức nhiều nơi. Người bứt rứt khó

chịu, vẻ mặt lo âu sợ hãi, hoặc hốt hoảng, vật vã, kích động, nói nhảm hoặc lừ đừ,

mắt đờ đẫn, nằm yên không cử động, không ngủ. Đôi khi gặp ảo giác, trả lời chậm

chạp, khi đúng khi sai, tiếng nói không rõ ràng. Hiếm gặp hơn là động tác bất

thường, thỉnh thoảng gồng người co giật, vã nhiều mồ hôi. Có trường hợp ói mửa,

ỉa chảy. Khó thở nhanh mà không có tổn thương bệnh lý ở phổi.

* Viêm hạch.

Viêm hạch thường xuất hiện đồng thời hoặc sau sốt vài giờ đến 24 giờ, một

số ít trường hợp nổi hạch trước sốt. Viêm hạch dịch hạch là một loại viêm cấp tính

với triệu chứng đau là tính chất nổi bật lên hàng đầu. Đau là triệu chứng sớm nhất

và thường xuất hiện trước khi nổi hạch (87%). Đau tăng lên khi bệnh nhân cử động

hay sờ nắn và bệnh nhân thường ở tư thế nhằm làm giảm sức căng lên vùng đó.

Thuốc giảm đau không hoặc có tác dụng rất ít. Đau tự nhiên, càng nhiều và càng

sớm, đi đôi với sốt cao thường tiên lượng nặng hơn. Đau giảm rõ rệt và nhanh

chóng trong vòng 24 đến 48 giờ sau khi bệnh nhân được điều trị bằng kháng sinh

đặc hiệu.

Thường có một vài hạch và vị trí có hạch liên quan đến vị trí đốt của bọ chét,

phổ biến nhất là vùng đùi bẹn: 62 - 80%. Kế đó là: hạch nách 14 - 20%, hạch cổ,

hạch dưới hàm: 15-18%. Có thể gặp hai hoặc nhiều hạch xuất hiện lần lượt hoặc

cùng một lúc. Biểu hiện này cũng như vị trí hạch vùng cao (cổ, nách, thượng đòn

… ) thường là một biểu hiện nặng cần được chú ý.

Hình 1.4: Bệnh nhân mắc bệnh dịch hạch

Hạch viêm tiến triển nhanh với sưng tấy, nóng, đỏ và rất đau. Kích thước

hạch tuỳ vào thời điểm phát hiện. Ban đầu nhỏ, di động, màu da ngoài bình thường,

trong vòng 1 hoặc 2 ngày đã sưng to có khi đến 10 cm nhưng thường dưới 3 cm. Tổ

chức xung quanh hạch bị viêm, phù nề và dính vào nhau thành 1 khối không di

động, màu da bên ngoài hạch đỏ tía. Trong trường hợp được điều trị sớm, đúng thì

hạch giảm đau nhanh, teo nhỏ lại và “mất đi” trong vòng 2 - 3 tuần hoặc trở nên xơ

hoá để lại một khối rắn trong một thời gian dài sau khi khỏi bệnh [1,2].

I.3.2. Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết

Quan niệm về thể nhiễm khuẩn huyết có nhiều ý kiến khác nhau. Theo

Pollitzer, dịch hạch thể nhiễm khuẩn huyết tiên phát là do sự xâm nhập vào máu

của một số lượng lớn vi khuẩn dịch hạch không qua giai đọan khu trú ở hạch. Một

số tác giả khác (Girard, Dujardin, Beaumetz, Joltrain) cho rằng thể nhiễm khuẩn

huyết chỉ thứ phát sau thể hạch nằm trong sâu, thăm khám bên ngoài không sờ thấy

được. Các tổ chức hạch này vẫn chứa nhiều vi khuẩn[1].

Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết tiên phát là những trường hợp nhiễm khuẩn

huyết được xét nghiệm kết luận là do Y. pestis mà lâm sàng không phát hiện được

triệu chứng viêm hạch. Thể bệnh này không có triệu chứng viêm hạch đặc hiệu nên

rất dễ bị bỏ sót và tử vong cao.

Bệnh nhân đột ngột sốt cao 40 - 410C, rét run, đau đầu dữ dội, tiêu chảy và

ói mửa nhiều lần. Hốt hoảng, vật vã, kích động, nói sảng, tím tái, thở nhanh nông

…sau đó đi vào sốc nhiễm trùng nhiễm độc. Soi tươi các bệnh phẩm sẽ thấy vi

khuẩn dạng dịch hạch. Thường bệnh nhân tử vong nhanh chóng trong vòng 1 vài

ngày nếu không được điều trị sớm và hồi sức tích cực ngay từ những giờ đầu của

bệnh [2].

I.3.3. Dịch hạch thể phổi

Bệnh dịch hạch đáng sợ nhất là thể phổi vì tiến triển nhanh và tỷ lệ tử vong

rất cao. Thể tiền phát là do tác động trực tiếp của vi khuẩn trên tổ chức phổi theo

đường hô hấp trên, bệnh xuất hiện dưới dạng viêm đặc thùy phổi và diễn biến rất

cấp tính. Thời gian nung bệnh của thể phổi thường ngắn hơn, chỉ trong một vài

ngày, thậm chí chỉ trong vòng vài giờ sau khi nhiễm bệnh. Sau đó bệnh khởi phát

rất đột ngột với sốt cao, rét run, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, mạch nhanh, huyết

áp thấp, bệnh nhân bứt rứt. Trong vòng 24 giờ sau, các dấu hiệu của tổn thương hô

hấp xuất hiện nhanh chóng, có rối loạn chức năng hô hấp như đau tức ngực, thở

nhanh nông, khó thở. Lúc đầu ho có đờm nhầy, loãng. Sau đó đờm đặc dần, có vết

máu, có khi có bọt. Triệu chứng thực thể ở phổi rất nghèo nàn: Gõ bình thường

hoặc đục một vài nơi, âm phế bào và rung thanh không thay đổi. Đôi khi tìm thấy

dấu hiệu 3 giảm hoặc tiếng cọ màng phổi. X quang phổi biểu hiện rất sớm, có thể

thấy hình ảnh đông đặc phổi thông thường hoặc nhiều bóng mờ rải rác hoặc hình

ảnh bong bóng giống viêm phổi tụ cầu[1,2]. Ngoài ba thể hay gặp trên còn có các

thể khác ít phổ biến hơn như: thể màng não, thể xuất huyết, thể hầu học…

I.4. Cơ chế lây lan bệnh dịch hạch và vi khuẩn Y. pestis

I.4.1. Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch

Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm, lây truyền trong quần thể gặm nhấm. Bệnh

duy trì trong các ổ dịch thiên nhiên của các loài gặm nhấm và lây truyền qua trung

gian bọ chét sống ngoại ký sinh trên chúng. Phần lớn các loài động vật hoang dại

đều bị nhiễm vi khuẩn dịch hạch nhưng chúng có tính đề kháng tương đối với bệnh

nên không đóng vai trò quan trọng trong vật chủ bệnh dịch hạch.

Trên thế giới bộ gặm nhấm (Rodentia) có khoảng 6.000 loài, trong đó họ

chuột (Muridae) có 150 loài chuột. Ở Việt Nam có 56 loài gặm nhấm và họ chuột

có 43 loài phân bố trên toàn lãnh thổ.

Dịch hạch là bệnh của động vật, chủ yếu là các loài gặm nhấm hoang dại và

chuột, người chỉ là vật chủ ngẫu nhiên, thứ yếu. Có nhiều yếu tố trong cơ chế lan

truyền bệnh dịch hạch, trong đó bọ chét đóng vai trò quan trọng. Bọ chét phải

nhiễm vi khuẩn dịch hạch khi hút máu. Tiếp theo là thời gian sống phải đủ dài để

quá trình nhân lên vi khuẩn đủ số lượng nhiều và sau đó lây truyền vi khuẩn dịch

hạch sang vật chủ khác. Bên cạnh đó, số lượng và thành phần bọ chét cũng như

quần thể vật chủ cũng là yếu tố cần thiết để gây nên nhiễm trùng và lan truyền dịch

bệnh. Trong tự nhiên, bệnh dịch hạch lan truyền theo các con đường sau:

* Phổ biến nhất là lây truyền qua trung gian bọ chét: Theo cơ chế lây truyền

này thì bệnh dịch hạch ở người thường xuất hiện sau dịch hạch ở vật chủ vài ngày

đến một vài tuần. Bọ chét hút máu vật chủ mắc bệnh trong đó có vi khuẩn dịch

hạch, vi khuẩn nhân lên sẽ tạo thành nút nghẽn ở tiền dạ dày (proventriculus). Khi

vật chủ bị bệnh chết, bọ chét bị tắc nghẽn này mất nguồn thức ăn sẽ rời bỏ vật chủ

chết đi tìm ký chủ mới để hút máu nhưng vì ống tiêu hoá bị tắc nghẽn ở tiền dạ

dày, máu không vào được và mỗi lần hút máu lại bị đẩy ra, vi khuẩn dịch hạch theo

vết đốt vào cơ thể vật chủ này và như vậy xảy ra sự lây truyền bệnh.

* Lan truyền trực tiếp từ vật chủ bệnh sang vật chủ lành không qua trung

gian của bọ chét như:

- Vi khuẩn Y.pestis xâm nhập trực tiếp qua da có hoặc có thể không có tổn

thương khi tiếp xúc trực tiếp vào động vật bị bệnh, nhân viên các phòng xét nghiệm

về vi khuẩn Y.pestis hoặc do động vật nuôi trong nhà cắn hoặc cào.

- Hít vào trực tiếp vi khuẩn Y.pestis tồn tại trong không khí do tiếp xúc

trực tiếp với vật chủ bị bệnh hoặc chết vì dịch hạch, nhất là dịch hạch thể phổi.

Đây là một phương thức lây truyền cực kỳ nguy hiểm vì xảy ra rất nhanh cho

người tiếp xúc.

Vi khuẩn dịch hạch xâm nhập qua da, ở nơi bọ chét đốt và theo đường bạch

huyết đến hạch khu vực, sinh sản phát triển mạnh tại đó gây nên dịch hạch thể

hạch. Sau đó, nếu không được điều trị thích hợp vi khuẩn dịch hạch xâm nhập vào

máu gây nên thể nhiễm khuẩn thứ phát. Đối với thể nhiễm khuẩn huyết tiên phát

hoặc thứ phát, ngoài vai trò truyền bệnh của bọ chét còn có thêm yếu tố độc lực của

mầm bệnh và sức đề kháng của cơ thể vật chủ[1].

Hình 1.5: Sơ đồ lây lan bệnh dịch hạch

I.4.2. Vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Y. pestis

Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm cấp tính, tối nguy hiểm thuộc diện kiểm

dịch và khai báo quốc tế do vi khuẩn Y. pestis gây nên. Bệnh lưu hành trong quần

thể động vật thuộc bộ gặm nhấm (Rodentia), chủ yếu là chuột và bọ chét ký sinh

trên chúng, từ đó lây truyền sang các loại súc vật khác và sang người.

Vi khuẩn dịch hạch trải qua nhiều danh pháp khác nhau, đầu tiên khi mới

được phát hiện có tên là Bacterium pestis, đến năm 1900 gọi là Bacillus pestis, sau

năm 1923 đổi thành Pasteurella pestis và tại Hội nghị Sinh vật học Quốc tế lần thứ

10 vào năm 1970 mới có danh pháp như hiện nay là Y. pestis.

Yersinia pestis do Alexandre Yersin phát hiện ra tại Hồng Kông vào ngày 20

tháng 6 năm 1894, trong thời gian đại địch lần thứ 3 đang hoành hành ở đây.

Yersinia pestis trước đây được xếp vào họ Pasteurellaceae, nhưng dựa trên

cơ sở so sánh mã di truyền bằng lai tạo DNA-DNA và RNA ribosom 16S/5S thì

tương tự như Escherichia coli nên chi Yersinia được xếp lại vào họ

Enterobacteriaceae. Chi Yersinia có 11 loài nhưng chỉ có 3 loài được quan tâm vì

có khả năng gây bệnh cho người là Y. pestis, Y.pseudotuberculosis và Y.

enterocolitica.

Yersinia pestis có hình dạng cầu trực khuẩn (0,5 x 1- 2 µm), bắt màu Gram

âm, nhuộm Wayson có màu xanh tím bắt màu ở 2 đầu, ở giữa trống nên gọi là “bắt

màu lưỡng cực”. Vi khuẩn không di động, không hình thành nha bào và không sinh

axít. Y. pestis là vi khuẩn hiếu khí, dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông

thường, mọc tốt nhất ở nhiệt độ 28 - 300C và độ pH từ 7,2 đến 7,6. Trên môi trường

canh thang, khuẩn lạc mọc không làm đục môi trường. Trên môi trường thạch,

khuẩn lạc dạng R điển hình (lồi ở giữa, xung quanh sáng và có mép viền không đều

kiểu đăng ten). Vi khuẩn lên men đường glucose và mannitol, không lên men

đường rhamnose, lactose và sucrose.

Hình1.6: Hình ảnh Y. pestis bắt màu đậm 2 đầu khi nhuộm Wayson.

Dựa vào khả năng khử hóa nitrat thành axít nitric và lên men glycerin, Y.

pestis được chia thành 3 type sinh học là Orientalis, Antiqua và Medievalis. Ba

type này không có sự khác nhau về độc lực cũng như bệnh học đối với người và

động vật, nhưng chúng có phân bố địa lý cũng như tính chọn lọc vật chủ rất khác

nhau nên có vai trò quan trọng về mặt dịch tễ học [2].

Yersinia pestis thuộc nhóm vi khuẩn có sức đề kháng yếu với môi trường

bên ngoài. Ánh sáng, nhiệt độ cao, làm sấy khô có thể phá hủy vi khuẩn. Các chất

sát trùng, tẩy uế như lysol và các chế phẩm chứa Chlorin diệt vi khuẩn trong vòng

10 phút.

Yersinia pestis có cấu trúc kháng nguyên phức tạp và khả năng gây bệnh

phụ thuộc vào nhiều yếu tố, những chủng có độc lực cao có từ 16 đến 18 kháng

nguyên. Kháng nguyên quan trọng thường được chú ý là F1, V, W và 2 yếu tố là P

và Pu. Kháng nguyên nang F1 (capsular antigen): có độc lực cao và mang tính

kháng nguyên mạnh, có tác dụng bảo vệ vi khuẩn sinh trưởng chống lại thực bào;

kháng nguyên thân V: là một phần của nội độc tố; kháng nguyên W: là yếu tố độc

lực liên quan đến khả năng chống lại hiện tượng thực bào.

Burrows và Bacon đã xác định tính kháng thực bào của Y. pestis nhờ kháng

nguyên gọi là V và W có thể hoạt động liên kết hay độc lập với kháng nguyên F1.

Những chủng không độc đều thiếu kháng nguyên F1. Y.pestis tạo ra cả nội độc tố

và ngoại độc tố. Các độc tố dịch hạch có tác động làm tan hồng cầu, tan tơ huyết và

làm đông huyết tương, những yếu tố này giúp vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể vật

chủ. Nội độc tố có tính chất ái thần kinh, gây nên bệnh cảm li bì, u ám, thâm nhiễm

xuất huyết ở các nội mạc tĩnh mạch và những tổn thương thoái hóa của phủ tạng.

Vi khuẩn dịch hạch có thể lây truyền qua cả 4 con đường: đường máu (là chủ yếu),

đường tiêu hóa, đường hô hấp và đường da, niêm mạc [2].

I.5. Kháng nguyên nang F1

I.5.1. Cấu trúc kháng nguyên F1

Kháng nguyên F1 có tính đặc hiệu loài cao, chỉ có chủng Y. pestis mới có

kháng nguyên F1. William và cộng sự đã nghiên cứu trên 300 chủng Y. pestis độc

và không độc cho thấy tất cả các chủng đều có kháng nguyên F1, bởi vậy kháng

nguyên F1 được dùng cho chẩn đoán dịch hạch [6]. Ở Y. pestis, quá trình tổng hợp

và tiết kháng nguyên F1 được mã hóa bởi operon F1 bao gồm 4 gen caf1, caf1M,

caf1A và caf1R nằm trên plasmid pMT1, trong đó caf1 mã hóa kháng nguyên F1,

caf1M và caf1A đóng vai trò trong việc tạo cấu trúc và tiết protein ra bên ngoài tế

bào, caf1R đóng vai trò trong điều hòa quá trình phiên mã các gen trên operon. Về

mặt cấu trúc, kháng nguyên F1 là chuỗi polypeptide, kích thước 17 - 17,6 kDa,

điểm đẳng điện 4,1 - 4,4. F1 là protein kị nước với cấu trúc bậc hai gấp nếp β [7].

Kháng nguyên nang F1 là một dấu hiệu cụ thể để có thể xác định vi khuẩn Y. pestis.

Khi nuôi cấy ở 370C thì kháng nguyên F1 được hình thành nhiều nhất trên bề mặt

tế bào, dễ dàng hòa tan trong môi trường nuôi cấy.

Protein F1 có cấu trúc bậc 4, tương tác kị nước, có cấu trúc bên trong kiểu

hàng rào không gian 3 nhịp với các lỗ thấm có tác dụng như một màng sinh học hỗ

trợ cho thành phần tế bào. Kháng nguyên F1 có thành phần hóa học và cấu trúc đặc

biệt nên ít chịu tác động của các nhân tố hóa lí: bền với nhiệt, đun nóng 80-100oC

trong 15phút mới làm biến đổi một phần tính kháng nguyên và chỉ bị phân hủy

hoàn toàn khi nung nóng 100oC trong 1 giờ. Kháng nguyên F1 có tính sinh miễn

dịch, có khả năng chống lại thực bào của các bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn

nhân và có thể kích thích tạo ra kháng thể chống lại nhiễm trùng ở động vật. Một

tính chất quan trọng khác nữa đã được Janssen và Sunrgalla nhấn mạnh là kháng

nguyên F1 trợ giúp cho Y. pestis trốn được thực bào [8].

Các nghiên cứu sơ bộ đã chứng minh kháng nguyên F1 tồn tại trong mô

động vật và huyết thanh của bệnh nhân dương tính dịch hạch. Sử dụng kĩ thuật

miễn dịch để phát hiện kháng nguyên F1 trên bệnh nhân nghi ngờ mắc dịch hạch

thông qua mẫu hạch, huyết thanh, nước tiểu cho kết quả xác định được 100% các

ca nhiễm bệnh [9]. Do đó kháng nguyên F1 đã được sử dụng rộng rãi trong chẩn

đoán huyết thanh bệnh dịch hạch [10].

I.5.2. Tính chất của kháng nguyên nang F1

Kháng nguyên F1 được sử dụng để nghiên cứu trong các thí nghiệm tiếp

theo của chúng tôi là kháng nguyên F1 được tạo ra bằng phương pháp tái tổ hợp

dung hợp với MBP và kháng nguyên F1được tinh sạch từ chủng Y.pestis tự nhiên.

I.6. Các phương pháp phân tích chẩn đoán kháng nguyên F1 của vi

khuẩn Y.pestis

Để phát hiện kháng nguyên F1 thường sử dụng một số nhóm phương pháp

ELISA và sắc ký miễn dịch kẹp đôi).

chính như phương pháp sinh học phân tử, phương pháp miễn dịch (phổ biến nhất là

I.6.1. Phương pháp miễn dịch

I.6.1.1 Phương pháp ELISA kẹp đôi (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

Sandwich)

Phương pháp này dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và các

kháng thể (kháng thể bắt cặp và kháng thể phát hiện). Trong đó kháng thể bắt cặp

được sử dụng là kháng thể đơn dòng hoặc kháng thể đa dòng, kháng thể phát hiện

thường là kháng thể đơn dòng. Nguyên lý của phương pháp gồm: (1) gắn kháng thể

bắt cặp lên giếng; (2) bổ sung mẫu (kháng nguyên liên kết với kháng thể bắt cặp);

(3) bổ sung kháng thể phát hiện (kháng thể phát hiện sẽ liên kết với kháng nguyên);

(4) bổ sung kháng thể cấp hai liên kết với enzym (kháng thể này liên kết với kháng

thể phát hiện); (5) bổ sung cơ chất (nhằm chuyển hóa thành dạng có thể phát hiện

được nhờ enzym).

Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với

kháng nguyên và thông qua cường độ màu phản ánh nồng độ kháng nguyên cần

phát hiện. Hiện nay, trên thế giới thường sử phương pháp ELISA kẹp đôi để phát

hiện kháng thể kháng F1 trong huyết thanh hoặc các dịch tiết (nước bọt, nước tiểu).

Ưu điểm cơ bản của các phương pháp ELISA kẹp đôi là có độ nhạy phát hiện cao

và có khả năng định lượng. Nồng độ kháng thể kháng F1 tối thiểu có thể phát hiện

được là 4 ng/ml. Độ nhạy là 90,1% đối với huyết thanh và 100% đối với dịch tiết

như nước bọt. Phương pháp chẩn đoán kháng thể kháng F1 bằng ELISA thích hợp

cho việc phát hiện sớm bệnh dịch hạch. Tuy nhiên, điểm hạn chế của các phương

pháp này là đòi hỏi trang thiết bị cùng trình độ kỹ thuật cao để tránh hiện tượng

dương tính giả và do đó chỉ thích hợp với các phân tích tại phòng thí nghiệm,

không có khả năng ứng dụng tại hiện trường.

I.6.1.2. Sắc ký miễn dịch kẹp đôi

Phương pháp sắc ký miễn dịch (immunochromatographic assay (ICA) dựa

trên nguyên lý kết hợp kháng nguyên - kháng thể mà một trong hai thành phần này

được gắn cộng hợp (conjugate) để phát hiện thành phần kia, sau đó nhờ phức hợp

này chuyển dịch do tác dụng mao dẫn trên màng, để rồi được tóm bắt bằng kháng

thể (hoặc kháng nguyên) đã bố trí sẵn tại vạch phát hiện (Hình 1.7). Đây là phương

pháp phân tích nhanh, dễ thực hiện, được phát triển từ năm 1956. Trong 20 năm

gần đây, nhờ ứng dụng công nghệ kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) và

cải tiến nguyên liệu thành phần trong đó có việc sử dụng hạt nano kim loại làm

thành phần cộng hợp (ví dụ: hạt vàng (Au) [14] và cải tiến chất lượng màng

nitrocellulose (NC), cũng như ứng dụng tự động hóa trong sản xuất, ICA đã được

ứng dụng để chế tạo nhiều sinh phẩm chẩn đoán các tác nhân gây bệnh khác nhau,

bao gồm độc tố, dư lượng kháng sinh, vi sinh vật gây bệnh.Ưu điểm của sắc ký

miễn dịch bao gồmtính đơn giản trong sử dụng, thời gian thực hiện nhanh, kết quả

chính xác, giá thành rẻ, có thể dùng như một phương tiện lưu động, không cần máy

móc quy mô và đắt tiền. Có thể sử dụng sắc ký miễn dịch để phát hiện kháng

nguyên hoặc kháng thể. Nguyên lý ứng dụng ICT sử dụng kháng thể phát hiện

kháng nguyên được trình bày ở Hình 1.7.

Hình 1.7. Mô hình lắp ráp các thành phần của bộ kit ICT(I) và đánh giá kết quả (II)

(Nguồn: Cortez Diagnostics, Inc.tại: http://www.rapidtest.com/) (Theo Nguyễn

Đình Phúc và Lê Thanh Hòa, 2008)

+ Về thứ tự sắp xếp lắp ráp

Nguyên liệu gồm có: 1) tấm nhận mẫu; 2) tấm cộng hợp (conjugate); 3) vạch

phát hiện T (test line); 4) vạch đối chứng C (control line); 5) tấm hút mẫu; 6) màng

nitrocellulose; 7) khung đỡ bao bọc (Hình 1.7-I). Màng nitrocellulose, nối tấm cộng

hợp với tấm hút mẫu, đảm bảo cho các phân tử vật chất chuyển động theo nguyên

lý mao dẫn (Hình 1.7-II). Trên màng nitrocellulose bố trí vạch phát hiện T và vạch

đối chứng C. Đầu cuối của bộ sinh phẩm có tấm hút để hút huyễn dịch khi bộ kit

hoạt động. Tất cả được bao bọc bằng một khung nhựa tạo thành hộp, để hở ra bên

ngoài là một giếng tra mẫu và một cửa sổ hình chữ nhật để đánh giá kết quả tại

vạch T và C.

+ Về thành phần tham gia

Có 3 loại kháng thể: 1) Kháng thể 1 (KT1) là kháng thể đơn dòng kháng lại

với một epitopecủa kháng nguyên cần phát hiện, sản xuất trên chuột; 2) Kháng thể

2 (KT2) là kháng thể với một epitope khác của cùng kháng nguyên cần phát hiện;

3) Kháng thể 3 (KT3) là kháng thể kháng lại IgG của loài sinh KT1, có khả năng

kết hợp với bất kỳ kháng thể nào có bản chất cấu trúc là immunoglobulin IgG.

Ngoài ra, thành phần tham gia kit còn có vật chất cộng hợp (conjugate), đó là hạt

vàng (colloidal gold particle), được gắn vào với cấu trúc KT1. Tấm nhận mẫu được

xếp gối lên trên tấm cộng hợp, rồi tấm cộng hợp được xếp chồng dính với màng

nitrocellulose, tại tấm cộng hợp bố trí một lượng KT1 gắn cộng hợp với hạt vàng ở

dạng khô; tại vạch T bố trí cố định KT2 ở dạng khô; và tại vạch C cũng được bố trí

cố định KT3 cũng ở dạng khô, bình thường cả hai vạch này đều không nhìn thấy

được (Hình 1.7-I).

+ Về nguyên tắc hoạt động của phép thử và đánh giá kết quả

Mẫu phân tích được xử lý bằng dịch chiết phù hợp rồi được nhỏ vào giếng S

(sample) lên trên tấm nhận mẫu, về nguyên tắc, toàn bộ huyễn dịch sẽ được chuyển

dịch theo mao dẫn xuyên qua tấm cộng hợp, đến vạch T và vạch C và đi về phía

tấm hút mẫu (Hình 1.7-II). Có 2 trường hợp kết quả sẽ xảy ra :

i) Nếu trong mẫu bệnh phẩm tra vào có kháng nguyên tương ứng (KN) thì

huyễn dịch mẫu bệnh phẩm sẽ tạo môi trường hoạt động cho KT1 + cộng hợp hạt

vàng (KT1(Au)) và lúc này kháng nguyên sẽ kết hợp với một số phân tử

(KT1(Au)) tạo thành phức hợp KT1(Au)+KN, tất cả đều cùng chuyển dịch đến

vạch T. Tại vạch T, phức hợp này kết hợp tiếp với KT2 tạo thành phức hợp

KT1(Au)+KN+KT2, hay nói cách khác KT2 cố định tại vạch T đã tóm bắt được

kháng nguyên có ở phức hợp KT1(Au)+KN làm cho hạt vàng cộng hợp với KT1

tích tụ lại và hiển thị. Các phân tử (KT1(Au)) còn lại tiếp tục dịch chuyển đến vạch

C, tại đây, phức hợp KT3+KT1(Au) được hình thành do sự kết hợp giữa KT3 là

kháng thể kháng lại IgG của chuột với KT1 có bản chất là IgG của chuột. Hạt vàng

cộng hợp với KT1 cũng được tích tụ lại và hiển thị, về nguyên tắc, sự hiển thị này

bao giờ cũng được hình thành, cho dù bệnh phẩm có kháng nguyên hay không có

kháng nguyên (Hình 1.7- II).

ii) Nếu trong mẫu tra vào không có kháng nguyên tương ứng (KN) thì huyễn

dịch dung môi trong mẫu bệnh phẩm vẫn sẽ hoạt hóa KT1 + cộng hợp vàng

(KT1(Au)) và lúc này, do không có kháng nguyên để kết hợp với (KT1(Au)) nên

phức hợp KN+KT1(Au) không được tạo thành. KT1(Au) đi xuyên qua vạch T mà

không bị KT2 tóm bắt, nên tiếp tục chuyển dịch đến vạch C. Tại vạch C, phức

hợp KT3+KT1(Au) được hình thành do sự kết hợp giữa KT3 là kháng thể kháng

lại IgG của chuột với KT1 có bản chất là IgG của chuột, có vai trò như là một

kháng nguyên, do đó, hạt vàng cộng hợp với KT1 được tích tụ lại và hiển thị

(Hình 1.7-II).

Như vậy: i) khi cả hai vạch T và C hiển thị thì kết quả đánh giá là dương tính

và đã phát hiện sự có mặt của kháng nguyên trong mẫu bệnh phẩm; ii) khi chỉ có

một mình vạch C hiển thị thì kết quả đánh giá là âm tính do trong mẫu bệnh phẩm

không có mặt của kháng nguyên. Trường hợp cả hai vạch không hiển thị, phản ứng

không được đánh giá và cần thiết phải làm lại. Không để phản ứng quá lâu (trên 30

phút) mới đánh giá, vì có thể phát sinh phản ứng phụ làm sai lệch kết quả.

Toàn bộ thời gian thực hiện phản tích chỉ khoảng 5-30 phút. Cho dù là kháng

nguyên hòa tan (dạng polypeptide) hay kháng nguyên liên kết bề mặt của vi sinh

vật, bộ sinh phẩm ICT đều cho phản ứng hoạt động chính xác. Do vậy, bộ sinh

phẩm ICT được coi là công cụ thích hợp trongchẩn đoán sàng lọc các bệnh truyền

nhiễm và phát hiện các độc tố độc chất, hóa chất, hóa dược [16].

Phương pháp sắc ký miễn dịch có ưu điểm nổi bật là thời gian phân tích

ngắn, giá thành rẻ, quy trình thử nghiệm đơn giản không đòi hỏi trình độ kỹ thuật

cao, không cần thể tích mẫu lớn, là công cụ hữu hiệu cho phân tích nhanh ở hiện

trường hoặc mục đích sàng lọc với số lượng mẫu lớn, có thể bảo quản lâu dài ở

điều kiện thường. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn tồn tại một số nhược điểm

như độ nhạy thấp hơn so với các phương pháp sắc ký dụng cụ hay ELISA, có khả

năng phản ứng chéo với các độc tố có cấu trúc tương tự độc tố cần phân tích, có

khả năng xảy ra hiện tượng âm tính hoặc dương tính giả [17].

Nghiên cứu đầu tiên phát triển que thử nhanh phát hiện kháng nguyên nang

F1 được công bố trên tạp chí danh tiếng Lancet vào năm 2003. Bằng cách sử dụng

hai kháng thể đơn dòng từ chuột, các tác giả đã tạo ra được que thử cho phép phát

hiện F1 với ngưỡng rất thấp là 0,5 ng/ml trong vòng 15 phút. Cũng dựa trên kỹ

thuật sắc ký miễn dịch kẹp đôi nhưng Tsui và đồng tác giả (2015) lại sử dụng hai

kháng thể đa dòng từ thỏ để phát hiện F1. Ngưỡng phát hiện F1 của que thử trong

nghiên cứu này chỉ đạt ở mức 50 ng/ml ứng với 105CFU/ml của Y. pestis. Trên thị

trường hiện cũng có một số loại sinh phẩm dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch cho

phép phát hiện nhanh Y. pestis như BADD Plague (Y. pestis) Biowarfare Detection

Test Kit của công ty AdVnt Biotechnologies (ngưỡng phát hiện: 105CFU/ml, giá:

257 USD/10 test); Plague BioDetect™ Test Strips của công ty Alexeter

Technologies; IMASS của công ty BBI cho phép phát hiện đồng thời 8 tác nhân vũ

khí sinh học bao gồm Y. pestis (ngưỡng phát hiện: 108CFU/ml, giá:1200 USD/10

test); BioThreat Alert® Test Strips của công ty Tetracore (ngưỡng phát hiện: 105-6

CFU/ml, giá: 605 USD/25 test). Có thể nhận thấy rằng các bộ sinh phẩm thương

mại có giá thành rất cao và ngưỡng phát hiện cũng ở mức trung bình khi so với

công bố của Chanteau và đồng tác giả (2003).

I.6.2. Phương pháp sinh học phân tử.

Các phương pháp sinh học phân tử thường sử dụng kỹ thuật PCR để phát

hiện các gen mã hóa các độc tố F1 dựa trên các trình tự mồi chuyên biệt cho các

gen mã hóa độc tố F1 là gen caf1. Các phản ứng PCR thường dùng là Multiplex và

gần đây là real-time PCR [3]. Các phương pháp này có ưu điểm là độ nhạy và độ

đặc hiệu rất cao, cho phép phát hiện nhanh Y.pestis tạo độc tố với một lượng mẫu

nhỏ. Tuy nhiên, hạn chế cơ bản của loại phương pháp này là nó chỉ cho biết sự có

mặt hay không của các gen mã hóa cho F1 mà không cho biết sự biểu hiện của các

gen này đồng thời phương pháp này đòi hỏi phải thực hiện trên các trang thiết bị

hiện đại, đắt tiền và cần phải có đội ngũ kỹ thuật viên có trình độ. Tại Việt Nam đã

có nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Thu Hằng và cs 2015 [3] đã giải trình tự 3 gen

là ypo2088, pla và caf1 của chủng vi khuẩn Y. pestis Yp1 phân lập ở Việt Nam và

nhận thấy chủng này có trình tự tương đồng 100% với dữ liệu trên GenBank

(Nguyễn Thị Thu Hà và cộng sự, 2016).

I.7. Sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng.

I.7.1. Định nghĩa IgY

Kháng thể IgY (viết tắt của Yolk Immunoglobulin – có nghĩa là kháng thể

lòng đỏ trứng) là một type kháng thể chủ yếu trong máu các loài chim, bò sát, cá

có mang. Nó cũng được tìm thấy với hàm lượng cao trong lòng đỏ trứng gà.

Giống như các loại kháng thể khác, kháng thể IgY là một lớp protein được hình

thành từ hệ miễn dịch khi phản ứng lại những yếu tố bên ngoài và đặc hiệu với

các yếu tố đó.

I.7.2. Sự hình thành kháng thể IgY ở gà

Kháng thể IgY được chuyển từ máu gà mẹ sang tích lũy ở lòng đỏ trứng như

một cơ chế miễn dịch thụ động được chuyển từ gà mẹ sang bảo vệ phôi và gà con.

Quá trình vận chuyển này bao gồm 2 bước. Bước 1: IgY được chuyển từ máu gà

mái vào lòng đỏ trứng (tương tự như quá trình vận chuyển IgG qua nhau thai ở

động vật có vú). Bước 2: IgY được chuyển từ lòng đỏ trứng sang phôi trong quá

trình phát triển của phôi gà.

Hình 1.8: Quá trình chuyển IgY vào lòng đỏ trứng

I.7.3. Cấu trúc của kháng thể IgY

Về mặt cấu trúc, kháng thể IgY tương đương với kháng thể IgG trong động

vật có vú, bao gồm hai chuỗi nặng H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ L (light chain)

liên kết với nhau bằng các cầu nối disulfua (-S-S-). Hai loại kháng thể này khác

nhau cơ bản ở hai chuỗi nặng, tại đó chuỗi nặng trong kháng thể IgY có khối lượng

phân tử khoảng 65 kDa, và do đó lớn hơn nhiều so với IgG. Chuỗi nhẹ trong kháng

thể IgY, với khối lượng mole khoảng 25 kDa. Do vậy, trọng lượng phân tử của IgY

(180 kDa), lớn hơn so với IgG của động vật có vú (150 kDa). Sự lớn hơn về trọng

lượng phân tử của chuỗi nặng IgY là do sự tăng thêm một tiểu phần cố định

(constant domain) ở chuỗi nặng và kèm theo chuỗi carbohydrate. Sự khác biệt tiếp

theo trong cấu trúc phân tử là vùng bản lề (hinge) của IgY ít linh hoạt hơn so với

kháng thể IgG của động vật. Cấu trúc protein cũng cho thấy IgY chứa nhiều thành

phần phân tử kị nước (hydrophobic molecule) hơn IgG. Điểm khác nữa là IgY có

điểm đẳng điện ở pH 5,7 – 7,6, trong khi đối với IgG là 6,1 – 8,5. Khác với kháng

thể động vật IgG, kháng thể gia cầm IgY hoàn toàn không gắn kết với bổ thể và

cũng không kết hợp với các vùng cố định của kháng thể động vật (Mammalian Fc)

cũng như với các thụ thể của bổ thể (Complement receptors). Kháng thể IgY không

bám vào protein A, protein G cũng như rheumatoid factor, chính vì thế sẽ không có

kết quả phản ứng giả như khi làm phản ứng này với kháng thể động vật IgG.

Hình 1.9: Cấu tạo kháng thể IgG và IgY

I.8. Sản xuất kháng thể đơn dòng từ chuột thuần chủng BALB/c

I.8.1. Khái niệm, ứng dụng của kháng thể đơn dòng

Khái niệm: Kháng thể đơn dòng là kháng thể được sản xuất bởi một dòng tế

bào lympho B. Kháng thể đơn dòng mang tính đặc hiệu có tính đồng nhất về cấu

trúc và tính chất. Trong công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng được tạo ra bởi 2

dòng tế bào lai là tế bào ung thư myolema với tế bào lympho B của hệ miễn dịch.

Ứng dụng của kháng thể đơn dòng:

Kháng thể đơn dòng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu y sinh học cơ

bản, trong chẩn đoán bệnh, và trong điều trị các bệnh như bệnh nhiễm trùng và

ung thư.

+ Ưu điểm của kháng thể đơn dòng (KTĐD):

- Là những chế phẩm tinh khiết có tính đặc hiệu cao đối với một yếu tố

quyết định duy nhất của kháng nguyên.

- Khả năng nhanh, nhạy cảm trong chẩn đoán bệnh.

+ Nhược điểm của kháng thể đơn dòng (KTĐD):

- Hệ thống miễn dịch của con người nhận diện KTĐD (được sản xuất từ tế

bào B của chuột) như là protein lạ nên tạo ra các kháng thể chống lại chúng, thậm

chí trung hòa chúng, làm hiệu quả của chúng suy giảm đáng kể. Hơn nữa, một số

KTĐD khi tiếp cận và bám được vào các kháng nguyên, chúng không trung hòa

hoặc phá hủy được các kháng nguyên gây bệnh.

- Thành phần kết hợp với KTĐD được đưa vào cơ thể bệnh nhân có thể bị

tách ra và đi khắp nơi, gây nên các phản ứng phụ và hậu quả khó lường. Ngoài ra,

với một số khối u được bao bọc chắc chắn bởi các lớp mạch máu nuôi dưỡng,

KTĐD rất khó thâm nhập vào bên trong để phá hủy.

- Giá thành đắt

Để khắc phục những hạn chế trên, các nhà khoa học đã nghiên cứu đưa tế

bào lympho B của người vào cơ thể chuột, các tế bào B này sẽ tạo ra các KTĐD mà

hệ thống miễn dịch của bệnh nhân sẽ chấp nhận như là của mình. Các nghiên cứu

mới đây còn dùng công nghệ gene và thay thế chuột bằng các vi khuẩn để tạo các

KTĐD nhỏ hơn, hoạt động hữu hiệu hơn, gắn chặt các vật mang hơn, thâm nhập

các khối u dễ dàng hơn và đặc biệt là giá thành rẻ hơn.

I.8.2. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng

Năm 1975 hai nhà khoa học là Kohler – Milstein đã đưa ra kỹ thuật sản xuất

kháng thể đơn dòng ngoài cơ thể người dựa trên nguyên tắc lai tế bào u tủy

(Myeloma) với tế bào lympho B đã hoạt hóa, sau này được các tác giả Karsten và

Rudolph cải biên vào năm 1985. Qui trình, công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng.

Hình 1.10: Qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng

Nguyên lý của qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng (Monoclonal

antibodies -mAb) (theo nguyên lý Kohler – Milstein, 1975): i) Tạo dòng tế bào lại

hybridoma giữa tế bào lympho B và tế bào u tủy myeloma. ii) Nhân các tế bào lai

phát triển để tạo thành một dòng tế bào mà sẽ sản xuất ra KTĐD mong muốn.

Tạo dòng tế bào lại hybridoma thực hiện qua các bước sau:

Bước 1: Gây kích ứng miễn dịch cho thú, thường là chuột BALB/c thuần

chủng 3 tuần tuổi.

Bước 2: Sàng lọc chuột để sản xuất kháng thể.

Sau một vài tuần gây miễn dịch các mẫu máu thu được từ chuột được định

lượng kháng thể trong huyết thanh. Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh được xác

định bằng nhiều kỹ thuật khác nhau ví dụ như ELISA hay đếm dòng tế bào. Nếu

như hiệu giá kháng thể cao việc dung hợp tế bào có thể được thực hiện. Nếu như

hiệu giá quá thấp người ta có thể áp dụng các phản ứng mạnh trên chuột cho đến

khi hiệu giá đạt được đầy đủ ví dụ như lấy mẫu máu nhiều lần. Khi hiệu giá kháng

thể đủ cao, chuột được thúc đẩy bằng cách tiêm kháng nguyên mà không có chất bổ

trợ hoặc tiêm vào các tĩnh mạch (thông qua các tĩnh mạch đuôi) 3 ngày trước khi

dung hợp và sau 2 tuần từ đợt gây miễn dịch trước đó. Sau đó những con chuột này

được gây chết và tách lấy lá lách để sản xuất các tế bào hybridoma trong ống

nghiệm.

Bước 3: Chuẩn bị các tế bào myeloma.

Tế bào lá lách sản xuất các tế bào dung hợp có tuổi thọ hạn chế so với các tế

bào bất tử có nguồn gốc từ khối u của tế bào lympho (u tủy) cho kết quả là tạo ra

các hybridoma có khả năng tăng trưởng không giới hạn. Tế bào myeloma là các tế

bào bất tử đựơc nuôi cấy với 8-azaguanine để chắc chắn độ nhạy của nó với HAT,

môi trường được lựa chọn sử dụng sau khi dung hợp tế bào. Một tuần sau khi dung

hợp tế bào, tế bào myeloma được nuôi cấy trong 8-azaguanine. Các tế bào này phải

có tính khả thi cao và tăng trưởng nhanh chóng. Môi trường HAT cho phép chỉ có

các tế bào dung hợp mới tồn tại được.

Bước 4: Dung hợp tế bào myeloma với tế bào lá lách (tế bào lympho B).

Tế bào lá lách đơn thu được từ các con chuột gây miễn dịch được dung hợp

với các tế bào myeloma chuẩn bị trước. Quá trình dung hợp được thực hiện bằng

đồng ly tâm thu các tế bào lá lách và tế bào myeloma trong polyethylene glycol,

một chất có khả năng làm dung hợp màng tế bào. Như đã chú ý ở bước 3, chỉ có

các tế bào dung hợp mới có khả năng phát triển trong môi trường chọn lọc đặc biêt.

Các tế bào này sau đó được chia vào 96 giếng có các feeder cell lấy từ màng bụng

của chuột. Trong các feeder cell này cung cấp các yếu tố cần thiết cho sự phát triển

của tế bào hybridoma. Các chế phẩm thương mại thu được là kết quả từ việc sưu

tập các môi trường hỗ trợ cho việc nuôi cấy tế bào và có chứa sẵn các yếu tố tăng

trưởng có thể sử dụng thay thế cho các tế bào có nguồn gốc từ feeder cell chuột.

Ngoài ra ta cũng có thể sử dụng tủy xương chuột tách từ tiểu thực bào như là các

feeder cell.

Bước 5: Tạo dòng các tế bào hybridoma bằng “dung dịch pha loãng” hoặc

nhân rộng và làm ổn định sản phẩm.

Ở bước mới này, các cụm nhỏ tế bào hybridoma từ 96 giếng cũng có thể phát

triển trong nuôi cấy mô tế bào bằng các kháng nguyên gắn kết họặc phát triển theo

phương pháp cổ chướng ở chuột với phương pháp nhân dòng ở thời gian sau. Tạo

dòng bằng “dung dịch pha loãng” ở thời gian này đảm bảo chắc chắn rằng ít nhất

mỗi giếng có chứa một dòng đơn. Trong một số trường hợp các kháng thể có thể

tiết ra các chất độc hại cho các tế bào yếu đang được duy trì trong ống nghiệm.

Việc tối ưu hóa phương pháp cổ chướng ở chuột trong giai đoạn này có thể cứu

sống các tế bào. Ngoài ra kinh nghiệm của một số nhà nghiên cứu cho thấy rằng

giai đoạn đầu cho các dòng tế bào phát triển theo phương pháp chuột cổ chướng

sau đó cho phát triển trong điều kiện cơ thể hay điều kiện phòng thí nghiệm sẽ giúp

tăng cường khả năng chịu đựng cũng như tối ưu hóa quá trình sản xuất kháng thể.

Nhân các tế bào lai phát triển để tạo thành dòng tế bàolai hybridoma:

Có hai phương pháp để phát triển các tế bào lai: i) Tiêm chúng vào khoang

màng bụng của chuột các tế bào hybridoma sẽ nhân lên và sản xuất ra dịch lỏng

(bệnh cổ trướng) ở bụng. Dịch lỏng này có chứa một nồng độ cao kháng thể. Sản

xuất kháng thể bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột thì rẻ tiền, dễ thực hiện,

và quen thuộc. Tuy nhiên, nếu tích tụ quá nhiều dịch lỏng hoặc nếu hybridoma là

một bệnh ung thư độc, chuột sẽ trải qua đau đớn hoặc nguy hiểm. ii ) Sử dụng trong

kỹ thuật nuôi cấy tế bào in vitro đây là một trong những giải pháp thay thế là gia

tăng số lượng những tế bào hybridoma trong môi trường nuôi cấy tế bào. Kĩ thuật

này yêu cầu một số kiến thức chuyên môn, những phương tiện, thiết bị đặc biệt, có

thể tốn kém về mặt tiền bạc và mất nhiều thời gian. Hiện đã có một số nghiên cứu

đáng kể trong kĩ thuật nuôi cấy tế bào in vitro cho sự phát triển hybridoma, và

những phương pháp mới hơn này ít tốn kém hơn, nhanh hơn,và sản xuất kháng thể

ở một nồng độ cao hơn so với những phương pháp trước đây.

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1. Vật liệu nghiên cứu

II.1.1. Động vật thí nghiệm

Gà siêu trứng Ai Cập được cung cấp bởi Trang trại Gà giống Thụy Phương

(Long Biên, Hà Nội), chuột BALB/c thuần chủng và tế bào Myeloma Sp2/0 do

Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp.

II.1.2. Hóa chất và vật tư tiêu hao

BSA (bovine serum albumin) (Sigma). Các loại độc tố F1 gắn MBP; F1 tự

nhiên, F1 thương mại. Các hóa chất dùng trong tạo cộng hợp: kháng thể đơn dòng

G20 và kháng thể đơn dòng 3YP8; nano vàng 40 nm (Cytodiagnotics). Các loại

dung dịch đệm: NaHCO3 0,1M pH 9,6; Borat 0,1M pH 8,5; PBS 0,01M pH 7,5.

Các loại kháng thể và hóa chất dùng trong các thí nghiệm ELISA bao gồm: kháng

thể phát hiện kháng IgY gắn HRP (Santa Cruz Biotechnology); cơ chất

tetramethylbenzidine (TMB) (Promega); kháng thể phát hiện Ig. Các loại tá dược

tiêm FCA (Freund’s complete adjuvant) và FIA (Freund’s incomplete adjuvant)

(Sigma).

Các loại dụng cụ và vật tư tiêu hao: Màng thẩm tích 0,5ml 10 kDa (Thermo

Scientific). Cột siêu lọc 100 kDa (Ultracell, Millipore). Đĩa vi giếng ELISA high

binding (Costa). Màng nitrocellulose (Whatman), tấm lót plastic vinyl (Whatman),

giấy thấm (Whatman), hạt nano vàng (Cytodiagnotics).

II.1.3. Thiết bị

Các thiết bị sử dụng thuộc Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ

sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học

Bách Khoa Hà Nội, bao gồm: Cân kỹ thuật; cân phân tích CPA 324S; máy Vortex

Delta Mixer; máy ly tâm góp mẫu C1301B-230V; micropipet các loại; máy đo pH;

hệ thống in phun que thử CAMAG-AUTOKUN; máy hút ẩm; máy đo nanodrop; lò

lai phân tử; hệ thống đọc khay vi thể; tủ lạnh sâu -200C; tủ lạnh Heracus 40C; máy

ly tâm Solval.

II.2. Phương pháp nghiên cứu

II.2.1. Sản xuất kháng thể đa dòng IgY kháng F1

II.2.1.1 Tiêm Protein F1 tự nhiên gây đáp ứng miễn dịch trên gà

Gà được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm khoảng 2 tuần bắt

đầu được tiêm gây đáp ứng miễn dịch. Trong thời gian này, các quả trứng được thu

sẽ là trứng âm tính (IgY tinh sạch từ các trứng này sẽ không có khả năng đáp ứng

miễn dịch với F1). Gà đang trong thời kỳ đẻ trứng sau đó sẽ được tiêm gây đáp ứng

miễn dịch ở 2 vị trí trên ức với liều 0,2 mg F1 trong tổng thể tích 1 ml chứa 50% tá

dược FCA (Freund’s complete adjuvant) trong ngày đầu tiên với tỉ lệ thể tích dịch

cộng hợp trong PBS: thể tích “Freund’s complete adjuvant”- FCA (Sigma) là 3:1.

Sau 20 ngày (ngày thứ 20), gà được tiêm nhắc lại lần thứ nhất với liều 0,1 mg F1

trong tổng thể tích 1 ml chứa 50% tá dược FIA (Freund’s incomplete adjuvant).

Sau 15 ngày tiếp theo (ngày thứ 35), gà được tiêm nhắc lại lần thứ hai với liều

lượng tương tự như lần tiêm nhắc lại thứ nhất. Trứng gà không tiêm cũng như

trứng gà tiêm PBS và tá dược FCA/FIA cùng trứng gà ở các thời điểm sau khi tiêm

được thu về và bảo quản ở điều kiện 4oC.

II.2.1.2 Tinh sạch IgY bằng phương pháp tủa PEG

Kháng thể IgY trong trứng gà được tách theo phương pháp kết tủa PEG

[21]. Lòng đỏ sau khi được tách riêng khỏi lòng trắng sẽ được trộn với hai lần thể

tích PBS rồi bổ sung 3,5% PEG 6000 (Sigma) (khối lượng/thể tích), đảo trộn đều

và ủ ở 37oC trong 10 phút, lắc 120 vòng/phút nhằm kết tủa các chất béo có trong

lòng đỏ trứng. Ly tâm ở điều kiện 8000×g, 20 phút, 4oC sẽ giúp loại bỏ cặn chất

béo, còn dịch nổi được lọc qua giấy thấm, và bổ sung 8,5% PEG 6000 (khối

lượng/thể tích), đảo trộn đều và ủ ở 37oC trong 10 phút, rồi ly tâm ở 8000×g, 20

phút, 4oC nhằm kết tủa IgY. Sau đó, kết tủa IgY được hòa tan trong 10 ml PBS rồi

bổ sung 12% PEG 6000 (khối lượng/thể tích), đảo trộn đều và ủ ở 37oC trong 10

phút rồi ly tâm ở 8000×g, 20 phút, 4oC nhằm kết tủa lại IgY. Sau đó, tiến hành hòa

tan kết tủa thu được trong 3 ml PBS và siêu lọc ba lần bằng cột 100 kDa (Ultracell,

Millipore) với PBS để thu nhận chế phẩm IgY tinh sạch. Chế phẩm IgY sau đó

được định lượng bằng cách đo OD ở bước sóng 280 nm và được kiểm tra độ tinh

sạch bằng điện di SDS-PAGE (12%) theo phương pháp của Laemmli.

II.2.1.3. Đánh giá hiệu giá kháng thể của chế phẩm IgY từ lòng đỏ trứng

A, Tạo kháng nguyên nang F1-MBP (Maltose binding protein)

Kháng nguyên F1-MBP được tạo làm nguyên liệu cho phản ứng ELISA

đánh giá hiệu giá kháng thể của chế phẩm IgY. Kháng nguyên F1-MBP được tạo ra

bằng con đường tái tổ hợp. Sử dụng gene Caf1 mã hóa cho protein F1 được được

nối với vectơ pET22 sử dụng để tạo ra một protein dung hợp có dạng MBP-F1-

(His)10. Bên cạnh đó, đuôi ái lực (His)10 cũng được thêm vào ở đầu N nhằm tinh

sạch nhờ sắc ký ái lực gắn Ni. Nội dung này đã được nghiên cứu trong một đồ án

tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Văn Khanh, tác giả đã sản xuất thành công kháng

nguyên này. Do vậy chúng tôi chỉ kiểm tra độ tinh sạch của kháng nguyên trước

khi sử dụng tiêm cho gà bằng phương pháp điện di biến tính protein SDS-PAGE

trên gel polyacrylamide nồng độ 12%. Phương pháp điện di trên gel như sau:

Phương pháp điện di protein

Đổ gel: Lắp 2 phần bản kính vào giá đỡ, bổ sung nước vào giữa 2 bản kính để

kiểm tra độ dò nước.

Nếu có nước bị dò ra khỏi 2 phần bản kính thì điều chỉnh lại cho đến khi

không bị dò nước nữa. Nếu không bị dò thì loại bỏ nước và tiến hành đổ gel.

Sau khi hòa trộn các hóa chất của thành phần gel tách với nhau bằng pippet

một cách nhẹ nhàng, tiến hành nhả dung dịch gel tách vào giữa 2 phần bản kính,

ước lượng khoảng cách phù hợp so với lược (gel tách cách lược 1cm là hợp lý).

Nhanh chóng bổ sung phần trống của bản kính bằng nước deion và đợi gel tách khô.

Loại bỏ phần nước deion, tiến hành đổ gel cô.

Đặt lược thích hợp vào giữa 2 phần bản kính, có khe hở để nhả dung dịch

vào trong.

Hòa trộn các hóa chất thành phần của gel cô với nhau, tiến hành đổ gel tương

tự như đổ gel tách, tránh tạo bóng khí ở trong gel.

Đẩy lược sao cho lược khít với bản kính, đợi gel khô.

Chạy điện di: Lắp bản kính có chứa gel đã đông vào khung chạy điện di, và

gắn vào bể chạy điện di theo đúng chiều dòng điện.

Đổ đầy Tank buffer vào giữa khung chạy điện di để kiểm tra có bị dò nước

hay không. Nếu bị dò thì chỉnh lại bản kính trên khung chạy điện di.Bổ sung Tank

buffer vào bể điện di theo mức được ghi chú trên thành bể.

Rút lược trên bản kính, bổ sung 15µl mẫu đã được xử lý và 4µl marker vào

các giếng thích hợp.

Đậy nắp đúng chiều và tiến hành chạy điện di ở 15 mA (chạy 2 bản ở 25 mA)

(bấm nút A để chạy bằng Ampe, điều chỉnh bằng nút mũi tên lên xuống, bấm nút

RUN để tiến hành chạy điện di).

Sau khi mẫu chạy qua gel cô (marker bắt đầu tách băng) thì nâng cường độ

dòng điện lên 25 mA (chạy 2 bản ở 45 mA) cho đến khi băng màu xanh chạy

xuống đáy bản gel, bấm STOP và tắt máy để kết thúc quá trình chạy điện di.

Nhuộm gel:

Tách bản gel ra khỏi bản kính và tiến hành nhuộm bằng Staining buffer với

lượng vừa đủ, tránh sáng, lắc trong 12 phút.

Đổ dịch nhuộm đã dùng vào chai chứa dịch nhuộm đã dùng.

Rửa bớt dịch nhuộm trên gel bằng nước máy, loại bỏ hết nước, bổ sung lượng

Destaining vừa đủ, tránh sáng, lắc 20 phút.

Loại bỏ dịch tẩy và bổ sung dịch tẩy mới, tiếp tục lắc cho đến khi gel trong trở

lại và các băng protein có thể nhìn thấy rõ ràng.

Tiến hành phân tích và chụp lại hình ảnh kết quả.

B, Phương pháp ELISA Xác định độ pha loãng kháng thể kháng IgY gắn

enzym Horseradish peroxidase (HRP).

Chế phẩm IgY được cố định trên vi giếng, tiếp theo kháng thể phát hiện

kháng IgY gắn enzym HRP được đưa vào giếng để tạo phức hợp (IgY)- (Anti IgY

gắn Enzym HRP); cuối cùng cơ chất TMB được đưa vào giếng tạo sản phẩm có

màu. Theo nguyên lý này, kháng thể IgY được cố định trên đĩa vi giếng bằng

NaHCO3 0,1 M ở các nồng độ 10, 30, 100 µg/ml ủ ở 37oC trong 2 giờ, pH 9,5. Quá

trình khóa giếng được thực hiện như ở mục C. Tiếp đó rửa 3 lần với 300 µl đệm

rửa/lần, bổ sung 100 µl cộng hợp kháng thể phát hiện kháng IgY gắn HRP với các

nồng độ khảo sát là 1; 0,3; 0,1; 0,03 µg/100 µl (tương ứng hệ số pha loãng: 100 X,

300 X, 1000 X, 3000 X trong PBS có bổ sung BSA) và ủ trong 1 giờ ở 37oC. Tiếp

theo, đĩa được rửa 5 lần với dung dịch rửa, và quá trình hiện màu được thực hiện

như ở mục C.

C, Phương pháp ELISA Xác định độ pha loãng kháng chế phẩm IgY

Kháng nguyên F1 được cố định trên giếng, IgY được đưa vào giếng sẽ phản

ứng với kháng nguyên F1 giữ lại trong giếng, tiếp đó kháng thể phát hiện kháng

IgY gắn enzym HRP (Horseradish peroxidase) được thêm vào, cuối cùng cơ chất

TMB (Tetramethylbenzidine) dưới sự chuyển hóa của enzym HRP (Horseradish

peroxidase) tạo sản phẩm có màu. Sự xuất hiện màu phản ánh sự có mặt của IgY

kháng F1. Theo nguyên lý này, đĩa vi giếng (Costa) được phủ bằng 100 µl kháng

nguyên F1-MBP trong đệm NaHCO3 0,1 M (10 µg/ml) qua đêm ở 4oC, pH 9,5. Sau

đó, những vị trí chưa liên kết trên giếng được phủ bằng 300 µl dung dịch PBS chứa

2% BSA trong 2 giờ ở 37oC. Tiếp theo, giếng được rửa 3 lần bằng 300 µl đệm rửa

(PBS được bổ sung 0,05% (khối lượng/thể tích) Tween 20). Để đánh giá hiệu giá

của kháng thể IgY được tạo ra sau khi gây đáp ứng miễn dịch, 100 µl IgY ở các độ

pha loãng tới các nồng độ thích hợp khác nhau và được thêm vào mỗi giếng, ủ ở

37oC trong 1 giờ. Sau 5 lần rửa với 300 µl đệm rửa, 100 µl cộng hợp kháng thể

phát hiện kháng IgY gắn HRP (Santa Cruz Biotechnology) pha loãng tới nồng độ

thích hợp (trong PBS có bổ sung BSA) được thêm vào mỗi giếng và ủ trong 1 giờ ở

37oC. Tiếp theo, giếng được rửa 5 lần với dung dịch rửa, và 100 µl cơ chất

tetramethylbenzidine (TMB) (Promega) được thêm vào mỗi giếng và ủ trong 5

phút ở nhiệt độ phòng. Phản ứng được dừng lại bằng 100 µl H2SO4 0,5 N. Các giá

trị mật độ quang (OD) ở bước sóng 450 nm và 630 nm được đo bằng máy đọc khay

vi thể (Synergy HT, BioTek). Hiệu số của các giá trị OD450nm và OD630nm thể hiện

lượng IgY kháng F1 có trong mẫu.

II.2.2. Sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1 trên chuột BALB/c thuần chủng.

Trong nội dung hạn hẹp của đề tài chúng tôi chỉ tham vọng bước đầu tiếp

cận nghiên cứu thăm dò qui trình gây đáp ứng miễn dịch, sản xuất lựa chọn thành

công các dòng tế bào lai có khả năng đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên F1. Qui

trình sản xuất kháng thể đơn dòng bao gồm: phương pháp in vivo, in vitro hoặc kết

hợp cả hai phương pháp. Nội dung nghiên cứu đề tài sử dụng phương pháp in vitro.

II.2.2.1 Phương pháp gây miễn dịch trên chuột với kháng nguyên F1-MBP

Kháng nguyên F1-MBP được dùng để gây miễn dịch cho chuột. Kháng

nguyên được trộn với chất bổ trợ là Freund's complete adjuvant và Freund's

incomplete adjuvant (Invitrogen) và được tiêm vào gan bàn chân chuột. Quy trình

gây miễn dịch như sau:

Bảng2. 1. Quy trình gây miễn dịch cho chuột nhắt với kháng nguyên F1

Số lần Chất bổ trợ Vị trí tiêm Thời gian tiêm

FCA (Freund’s complete Lần 1 adjuvant)

Gan bàn FIA (Freund’s incomplete Lần 2 1 tuần sau lần 1 chân 2 chân adjuvant)

Lần 3 FIA 1 tuần sau lần 2

Lần 4 FIA 1 tuần sau lần 3

Huyết thanh chuột được thu trước khi gây miễn dịch và 1 tuần sau khi gây

miễn dịch lần thứ 4 để đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của chuột với kháng

nguyên F1-MBP.

Hình2.1: Gây miễn dịch trên chuột với kháng nguyên F1-MBP

II.2.2.2 Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của chuột với kháng nguyên

F1-MBP

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đánh giá khả năng đáp ứng miễn

dịch của chuột với kháng nguyên F1-MPB bằng phản ứng ELISA. Mẫu huyết

thanh chuột trước gây miễn dịch và 1 tuần sau khi gây miễn dịch lần 4 ở các độ pha

loãng khác nhau được sử dụng trong phản ứng ELISA với kháng nguyên gắn bản là

kháng nguyên F1. Các bước thực hiện phản ứng ELISA như sau:

 Kháng nguyên F1 được pha loãng trong đệm 0.05 M Bicarbonate tới nồng

độ 1 µg/ml. Bổ sung 100 µl vào mỗi giếng của đĩa ELISA. Ủ đĩa ở 37C trong 2

giờ hoặc ủ ở 4C qua đêm.

 Loại bỏ kháng nguyên thừa trong các giếng. Rửa các giếng bằng 200

µl/giếng dung dịch PBS + 0.05% Tween 20, lặp lại 3 lần.

 Phủ các giếng (Blocking) của đĩa Elisa bằng dung dịch 1% BSA ở 37C

trong 1giờ.

 Các giếng được rửa bằng dung dịch PBS + 0.05% Tween 20.

 Mẫu huyết thanh chuột trước gây miễn dịch và 1 tuần sau khi gây miễn

dịch lần 4 được pha loãng trong PBS theo tỷ lệ (1:50, 1:100, 1:200… , 1:102400).

Bổ sung 100 µl/giếng, ủ ở 37C trong 1giờ.

 Các giếng được rửa bằng dung dịch PBS + 0.05% Tween 20.

 Bổ sung 100 µl kháng thể cộng hợp (Goat Anti-Mouse IgG Antibody,

HRP conjugate) vào mỗi giếng. Ủ nhiệt độ phòng trong 30 phút.

 Các giếng được rửa bằng PBS 0.05% Tween 20.

 Bổ sung cơ chất hiện màu (TMB), 100 µl/giếng.

 Dừng phản ứng bằng dung dịch HCl 1 N, 100 µl/giếng.

Đọc kết quả bằng máy ELISA ở bước sóng 450 nm và 630 nm.

II.2.2.3. Tạo tế bào lai tiết kháng thể kháng F1

Dựa vào kết quả đánh giá đáp ứng miễn dịch của chuột với kháng nguyên

F1-MBP, tiến hành giết chuột và thu tế bào lympho B ở lách và hạch bẹn để dung

hợp (fusion) với tế bào Myeoloma Sp2/0. Quy trình fusion tạo dòng tế bào lai tiết

kháng thể đơn dòng được thực hiện theo phương pháp của Köhler và Milstein

(Köhler, Milstein, 1975). Tế bào Myeloma Sp 2/0 và tế bào lympho B được trộn

với nhau theo tỷ lệ 1:10, sau đó ly tâm tế bào ở tốc độc 1000 vòng/phút trong 5

phút và thu cặn tế bào. Nhỏ 0,3 ml dung dịch PEG 50% (M.W. 1450; Sigma) vào

cặn tế bào và ủ 60 giây ở nhiệt độ phòng, sau đó bổ sung tiếp 10 ml môi trường tế

bào DMEM (Invitrogen), ly tâm tế bào ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút và thu

cặn tế bào. Sau khi loại bỏ dịch nổi và hoàn nguyên cặn tế bào trong môi trường

chọn lọc DMEM có bổ sung HAT (Hypoxanthine Aminopterin Thymidine), 150 µl

dung dịch tế bào sẽ được đưa vào mỗi giếng trên đĩa 96 giếng và nuôi trong điều

kiện 37ºC, 5% CO2. Sau 10 ngày, loại bỏ dịch nuôi cấy tế bào, thêm vào mỗi giếng

150 µl môi trường chọn lọc DMEM có bổ sung HT (Hypoxanthine Thymidine) và

tiếp tục nuôi các tế bào ở 37ºC, 5% CO2. Thu nhận các dòng tế bào lai sau khi dung

hợp, chúng tôi tiến hành sàng lọc, kiểm tra các dòng tế bào lai có khả năng sinh

kháng thể kháng F1 bằng phương pháp ELISA trên test thử mà chúng tôi đã sản

xuất với vạch Control line (vạch C) được gắn kháng thể đơn dòng kháng chuột và

trên vạch Test line gắn F1 có độ nhạy 1 ng/µl.

II.2.2.4. Sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể bằng que thử

Các dòng tế bào lai tạo ra được sàng lọc bằng phương pháp tạo que thử như

mục II.2.3. Khác ở chỗ que thử loại này chỉ in phun trên vạch thử nghiệm là IgG

được đổi trong đệm phosphat pH 7,4, ly tâm ở điều kiện 8000×g trong 30 phút,

nồng độ 2 µg/µl.Thử với kháng nguyên F1 có bổ sung kháng thể 3YP8 cộng hợp

với bi vàng.

II.2.3. Ứng dụng sản xuất que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát hiện nhanh F1

II.2.3.1. Tạo que thử với kháng thể đa dòng IgY in phun tạo que với G20 và Ig Y

Màng được dán lên tấm đề can và sau đó được sấy khô ở 37oC trong 2 giờ

trước khi in phun. Chế phẩm IgY sau khi tinh sạch được đổi đệm trong đệm borat

10 mM pH 8,5 có bổ sung isopropanol. Mỗi loại dung dịch trên được in phun lên

màng nitrocellulose với thể tích 1 µl/cm để tạo thành que thử với 2 vạch: vạch kiểm

chứng là kháng thể đơn dòng M5899 và vạch thử nghiệm là IgY. Khoảng cách giữa

hai đường in là 0,5cm. Sau khi in phun, phần giấy thấm sẽ được dán lên đề can và

được sấy ở 37oC trong 2 giờ để cố định kháng thể IgY và kháng thể M5899 lên

màng. Tấm đề can có dán màng đã in phun và giấy thấm được cắt thành các que

thử với chiều rộng 4mm.

II.2.3.2. Tạo cộng hợp kháng thểđơn dòng kháng F1 3YP8 với bi vàng

Cộng hợp kháng thể kháng F1-nano vàng được chế tạo bằng phương pháp

hấp phụ thụ động. 500 µl bi vàng 1OD 530 nm (Cytodiagnotics) được trộn với 50

µl đệm HEPES 22 mM pH 7,0. 50 µl kháng thể nồng độ 5 mg/ml trong borat pH 2

mM pH 8,5 (lượng kháng thể là 0,25 mg) được nhỏ từ từ vào bi vàng. Đảo trộn 30

phút ở nhiệt độ phòng. Lượng kháng thể dư được loại bỏ bằng cách ly tâm ở

2500×g trong 30 phút, loại dịch nổi. Sau đó hòa tan lại cặn trong 0,5 ml PBS

0,01M pH 7,5 và ly tâm 2500×g, 30 phút, loại dịch nổi. Hòa tan lại bi vàng trong

0,5 ml PBS 0,01 M pH 7,5 có bổ sung 0,1% BSA, bảo quản ở 4oC.

II.2.3.3. Phương pháp chạy que thử

Phương pháp phân tích mẫu được thực hiện theo phương pháp đã được miêu

tả bởi Koets và đồng tác giả (2006). Mẫu kháng nguyên F1 tinh khiết được pha

loãng trong đệm chạy borat (100 mM borat, pH 8,5; 0,5% BSA; 0,05% Tween 20)

hoặc đệm chạy phosphat (PBS pH 7,4; 0,5% BSA; 0,05% Tween 20) sau đó lấy

100 µl dung dịch nhận được trộn với cộng hợp phát hiện (1-8 µl) và cắm que thử

vào ống. Quan sát kết quả sau 15 phút. Kết quả được coi là âm tính nếu chỉ xuất

hiện vạch kiểm chứng. Ngược lại, kết quả được coi là dương tính nếu xuất hiện tín

hiệu tại cả vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng.

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

III.1. Sản xuất kháng thể IgY kháng F1 từ trứng gà

Về mặt miễn dịch, kháng thể IgY hình thành sau quá trình tiêm gây đáp ứng

miễn dịch có thể truyền từ máu gà vào lòng đỏ trứng. Do vậy, hoàn toàn có thể thu

được kháng thể mà không cần quá trình lấy máu gây đau đớn như trong trường hợp

gây đáp ứng miễn dịch trên động vật có vú.

Mặt khác, chi phí nuôi gà thấp hơn so với thỏ và chuột. Ưu điểm nổi trội của

công nghệ sản xuất kháng thể từ lòng đỏ trứng gà là lượng kháng thể thu được rất

dồi dào vì sau 2 tuần gây miễn dịch trên gà có thể thu trứng liên tục mỗi ngày, tổng

lượng kháng thể thu được từ lòng đỏ trứng có thể lên đến 1120 mg (trong toàn bộ

quá trình thu trứng), và từ 2-10% trong số đó (tương ứng với lượng 22,4 – 112 mg)

là kháng thể mục tiêu (Narat, 2003). Với lượng lớn kháng thể thu được, số lượng

sinh phẩm có thể chế tạo được là rất lớn, góp phần giảm đáng kể chi phí sản xuất.

Khi sử dụng ELISA kẹp đôi hay sắc ký miễn dịch kẹp đôi để phát hiện F1,

việc sử dụng IgY kết hợp với kháng thể đơn dòng từ chuột sẽ làm tăng khả năng

nhận biết các epitope khác nhau của F1 do vậy tăng khả năng phát hiện kháng

nguyên vốn có kích thước nhỏ này. Vì vậy IgY tạo ra từ trứng gà đã trở thành xu

hướng trong những năm gần đây và được xem như giải pháp bổ trợ cho kháng thể

đơn dòng.

III.1.1. Tạo kháng nguyên F1 dạng dung hợp với MBP (Maltose binding

protein) làm nguyên liệu cho phản ứng ELISA.

Để đánh giá hiệu giá kháng thể IgY tạo ra, chúng tôi sử dụng phương pháp

ELISA, do vậy cần lượng lớn kháng nguyên F1. Tuy nhiên kháng nguyên F1 từ tự

nhiên có một số điểm hạn chế như khó kiểm soát nguy cơ lây nhiễm bệnh dịch

hạch từ vật chủ sang người trong quá trình thao tác, giá thành đắt hơn nhiều so với

F1 tạo ra bằng còn đường tái tổ hợp. Mặt khác F1 dung hợp với MBP sẽ tạo ra

phân tử protein có kích thước lớn (63 kDa so với 17 kDa), do có kích thước phân tử

lớn tạo điều kiện để các epitope trên phân tử F1 tiếp xúc với IgY khi thực hiện

ELISA. Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi tạo F1-MBP làm nguyên liệu phản

ứng ELISA, F1được dung hợp với protein MBP (Maltose binding protein) với kích

thước phân tử 42,5 kDa và đuôi (His)10. Protein dung hợp (His)10 -MBP - F1được

biểu hiện, tinh sạch trên cột sắc ký Ni+, thu các phân đoạn có lượng protein thể

hiện trong Bảng 3.1, sau đó tiến hành điện di SDS- PAGE biến tính ở những phân

đoạn cho hàm lượng protein cao. Kết quả điện di thể hiện ở Hình 3.1 cho thấy các

phân đoạn rửa giải của quá trình tinh sạch protein MBP-F1 có 2 băng đậm trong

đó một băng có kích 63 kDa (đây là băng protein cần mong muốn MBP - F1) và

một băng có kích thước 48 kDa (sở dĩ có băng này là do MBP - F1 vẫn chứa đoạn

peptid dẫn đường của F1 tự nhiên có thể đã bị phân cắt bởi enzym nội bào của E.

Coli tạo thành một tiểu phần protein bao gồm (His)10 – MBP-SP có kích thước

khoảng 48 kDa).

Bảng 3.1: Nồng độ protein trong các phân đoạn rửa giải khi tinh sạch trên cột sắc ký ái lực NI-NTA

Nồng độ protein

STT Phân đoạn thu Protein

(mg/ml)

0,056 Phân đoạn 1 1

0,077 Phân đoạn 2 2

0,093 Phân đoạn 3 3

0,180 Phân đoạn 4 4

0,452 Phân đoạn 5 5

0,381 Phân đoạn 6 6

0,248 Phân đoạn 7 7

0,206 Phân đoạn 8 8

0,170 Phân đoạn 9 9

0,152 Phân đoạn 10 10

0,135 Phân đoạn11 11

Hình 3.1: Phổ điện di các phân đoạn rửa giải trong quá trình tinh sạch kháng

nguyên F1 tái tổ hợp từ cấu trúc pET22b-(His)10-MBP-F1

M: thang chuẩn protein GangNam-STAIN

1: phân đoạn rửa giải thứ 5

2 : phân đoạn rửa giải thứ 6

3 : phân đoạn rửa giải thứ 7

4: phân đoạn rửa giải thứ8

Như vậy, sau quá trình tinh sạch trên cột Ni, đã thu được lượng protein

(His)10-MBP–F1 được làm giàu ở phân đoạn 5 có nồng độ 0,45 mg/ml đủ điều kiện

để làm nguyên liệu cho các thử nghiệm tiếp theo.

III.1.2. Tối ưu hóa ELISA đánh giá hiệu giá kháng thể IgY kháng F1

III.1.2.1. Chuẩn hóa độ pha loãng kháng thể phát hiện kháng IgY

Phép chuẩn hóa độ pha loãng kháng thể phát hiện gắn HRP được thực hiện

nhờ phản ứng ELISA trong đó kháng thể IgY được gắn trực tiếp lên giếng với

lượng 10; 30; 100 ng/giếng bằng đệm NaHCO30,1 M, pH 9,6. Kháng thể phát hiện

được sử dụng là kháng thể kháng IgY Goat- Anti Chicken IgY-Antibody- HRP

(Santa Cruz Biotechnology), được pha loãng với độ pha loãng 100; 300; 1000;

3000 lần. Sau quá trình rửa bằng đệm PBS1 X có bổ sung Tween 20, thêm 100 µl

cơ chất TMB, đo giá trị OD. Kết quả thể hiện Hình 3.2

Hình 3.2: Xác định độ pha loãng của kháng thể kháng IgY gắn HRP

Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy với bốn độ pha loãng kháng thể khác

nhau, hiệu giá OD đo được giữa mẫu âm tính và mẫu dương tính có sự khác biệt

rõ rệt. Từ đồ thị trên chúng ta nhận thấy ở độ pha loãng và 3000 lần cho kết quả

khá tuyến tính với lượng IgY cố định trên giếng. Do vậy, chúng tôi quyết định

chọn độ pha loãng kháng thể phát hiện là 3000 lần để tiến hành các thí nghiệm

ELISA tiếp theo.

III.1.2.2. Chuẩn hóa độ pha loãng kháng thể IgY

IgY từ trứng gà không tiêm, trứng gà tiêm F1 thu được ở các thời điểm khác

nhau sau khi tiêm kháng nguyên F1 được tinh sạch và kiểm tra hiệu giá kháng thể

kháng F1 thông qua kỹ thuật ELISA. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành

khảo sát tại 9 điểm thu trứng (trứng thu ngày 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35; 45 sau khi

gây miễn dịch lần 1 tương ứng với các ngày 20/6; 25/6; 30/6; 5/7; 10/7; 15/7 20/7;

25/7; 4/8), pha loãng theo hệ số 10 với độ pha loãng là: 10; 100 ;1000; 10000 lần.

Phản ứng ELISA diễn ra như phần II.2.2.1mục C.Kết quả được trình bầy ở Hình

3.4 cho thấy ở độ pha loãng 10, 100 cho kết quả có chiều hướng biến đổi tương tự

nhau. Kết quả của thí nghiệm này cho thấy hệ số pha loãng 10 lần là thích hợp để

đánh giá so sánh giữa các mẫu kháng thể với nhau.

Hình 3.3: Xác định độ pha loãng của kháng thể IgY kháng F1

III.1.2.3. Lựa chọn thời điểm thu trứng thích hợp

Sau khi lựa chọn được hệ số pha loãng kháng thể là 10 lần, lấy giá trị OD tại

hệ số pha loãng là 10 lần để biểu diễn ở Hình 3.4. Kết quả cho thấy IgY thu được

từ trứng gà sau khi được tiêm F1 15 ngày, bắt đầu có phản ứng với F1. Hiệu giá

kháng thể đối với F1 đạt mức cao nhất trong khoảng thời gian từ 30 đến 35 ngày

sau khi tiêm, hay 9-15 ngày sau lần tiêm cuối cùng. Như vậy, với quy trình gây đáp

ứng miễn dịch gồm 2 lần tiêm, khoảng cách giữa các lần tiêm là 10 ngày, lượng

kháng nguyên F1 được sử dụng là 0,2 và 0,1 mg ở mỗi lần tiêm, hiệu giá kháng thể

đạt cao nhất ở thời điểm 9-14 ngày sau lần tiêm cuối cùng. Điều này phù hợp với

nghiên cứu của Schade và cộng sự (2004) cho thấy ít nhất cần phải có 2 lần tiêm

kháng nguyên để gây nên đáp ứng miễn dịch mạnh trên gà và kháng thể tinh sạch

từ lòng đỏ trứng nên được kiểm tra khoảng 14 ngày sau lần tiêm cuối cùng xem

còn sinh kháng thể hay không. Mặt khác, có thể nhận thấy vẫn có thể thu trứng đến

ngày thứ 45 sau lần tiêm đầu tiên do hiệu giá kháng thể vẫn cao. Tuy nhiên, để đảm

bảo tính ổn định của hiệu giá kháng thể, trứng thu được trong khoảng thời gian từ

ngày 9-14 ngày sau lần tiêm cuối cùng được sử dụng để sản xuất chế phẩm IgY.

Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian thu trứng lên hiệu giá của chế phẩm IgY

III.1.2.3.4.Xác định hiệu giá kháng thể

Để xác định hiệu giá kháng thể, chúng tôi sử dụng phản ứng ELISA ở 2

thời điểm thu trứng cho hiệu giá kháng thể cao nhất là ngày 30 và ngày 35 sau khi

gây miễn dịch lần 1. Kháng nguyên F1 tự nhiên có nồng độ 10 µg/ml được cố định

trên giếng, phương pháp tiến hành như mục I.I.2.2.5 với độ pha loãng kháng thể

1/300; 1/1.000; 1/3.000; 1/9.000; 1/27.000. Kết quả được thể hiện trong hình 3.5

cho thấy chế phẩm IgY ở hệ số pha loãng là 27.000 vẫn cho sự khác biệt có ý nghĩa

về mặt thống kê. Như vậy hiệu giá kháng thể của chế phẩm IgY ở ngày thu trứng

thứ 30 và 35 sau tiêm lần đầu là 27.000.

Hình 3.5: Hiệu giá kháng thể của chế phẩm IgY từ trứng thu tại thời

điểm 30, 35 ngày sau gây miễn dịch lần 1.

III.2. Tạo dòng tế bào lai có khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng

kháng F1 trên chuột BALB/c thuần chủng.

III.2.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột BALB/c thuần chủng.

Trong nghiên cứu này, để đánh giá đáp ứng miễn dịch của chuột với kháng

nguyên F1, huyết thanh chuột trước gây miễn dịch và sau 5 tuần gây miễn dịch lần 1 ở

các độ pha loãng khác nhau được sử dụng trong phản ứng ELISA với kháng nguyên

gắn bản là kháng nguyên F1. Kết quả phản ứng ELISA của mẫu huyết thanh chuột

trước gây miễn dịch và sau 5 tuần gây miễn dịch lần 1 ở các độ pha loãng khác nhau

được thể hiện trong bảng và biểu đồ dưới đây hình 3.6:

Hình 3.6: Hiệu giá mẫu huyết thanh chuột trước gây miễn dịch và sau khi gây miễn dịch ở các độ pha loãng khác nhau

Bảng 3.2: Giá trị OD450 của mẫu huyết thanh chuột trước và sau khi gây

miễn dịch

Giá trị OD450

TT Độ pha loãng mẫu

Trước khi gây miễn dịch Sau khi gây miễn dịch

1/50 1 1.83 1.53

1/100 2 1.80 1.32

1/200 3 1.82 1.07

1/400 4 1.78 0.87

1/800 5 1.79 0.64

1/1600 6 1.75 0.31

1/3200 7 1.74 0.20

1/6400 8 1.69 0.12

1/12800 9 1.34 0.13

1/25600 10 1.01 0.11

1/51200 11 0.83 0.14

1/102400 12 0.52 0.12

Kết quả nghiên cứu của Snyder (Snyder, 1983) đã chỉ ra hiện tượng dương

tính giả của các mẫu huyết thanh âm tính trong phản ứng ELISA là do sự bắt cặp

không đặc hiệu của các protein trong huyết thanh với kháng nguyên. Do đó, để làm

giảm hiện tượng dương tính giả của các mẫu huyết thanh âm tính trong phản ứng

ELISA, các mẫu huyết thanh phải được pha loãng ở độ pha loãng nhất định. Trong

thí nghiệm này, mẫu huyết thanh trước và sau khi gây miễn dịch được pha loãng

theo cơ số 2 bắt đầu từ độ pha loãng 1:50. Quan sát hình 1 cho thấy giá trị OD450 của

mẫu huyết thanh chuột trước gây miễn dịch giảm dần theo các độ pha loãng. Từ độ

pha loãng 1:6400 thì giá trị OD450 của mẫu huyết thanh trước gây miễn dịch không

giảm nữa, đồng thời có sự khác biệt rõ ràng giữa 2 mẫu trước và sau khi gây miễn

dịch. So sánh giá trị OD450 của huyết thanh chuột trước gây miễn dịch và sau 1 tuần

gây miễn dịch lần 4 cho thấy chuột có đáp ứng miễn dịch tốt với kháng nguyên F1.

III.2.2. Kết quả tạo tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên F1

Để tạo được dòng tế bào lai sinh kháng thể kháng kháng nguyên F1, chúng

tôi tiến hành lai tế bào Myeloma Sp2/0 với tế bào lympho B mẫn cảm kháng

nguyên. Sau khi tiến hành dung hợp, tế bào được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc

HAT và HT. Toàn bộ các giếng tế bào được kiểm tra dưới kính hiển vi soi ngược

với độ phóng đại 10 x 20 và đánh dấu những giếng có tế bào lai Hình 3.7.

Hình 3.7: Hình ảnh dung nạp tạo tế bào lai có chứa kháng thể đơn dòng có ái lực F1

Trong nghiên cứu này, 2 đợt thí nghiệm khác nhau được tiến hành để sản

xuất tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng. Mỗi đợt thí nghiệm, sau khi lai giữa tế bào

Myeloma Sp2/0 và tế bào lympho B mẫn cảm kháng nguyên, tế bào được nuôi cấy

trên các đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng. Kết quả quá trình tạo tế bào lai được trình

bày trong bảng 3.3.

Bảng 3.3: Kết quả lai giữa tế bào Myeloma Sp2/0 và tế bào lympho B của

chuột BALB/c được gây miễn dịch với kháng nguyên F1

Số lượng tế bào dùng

Tỷ lệ % số

Số đĩa

để lai

Tổng số

giếng có tế

nuôi cấy

giếng

giếng có

bào

Lần

tế bào

nuôi cấy

tế bào

lai/giếng

lai

Tế bào

dùng (đĩa

tế bào

lai

nuôi cấy tế

Myeoloma

lympho B

96 giếng)

bào

1,6 x 107

1,6 x 108

768

1,6 x 107

1,6 x 108

384

240

62,5

Kết quả Bảng 3.3 cho thấy, ở lần lai đầu tiên không xuất hiện tế bào lai sau

10 ngày theo dõi. Dung nạp lần thứ 2, chúng tôi thực hiện trên 4 đĩa nuôi cấy, có

240 giếng xuất hiện tế bào lai, tỷ lệ lai thành công 62,5%. Các giếng có tế bào lai

được tiếp tục nuôi cấy, dịch nuôi cấy được sử dụng trong quá trình chọn lọc để thu

các tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng mong muốn. Tuy nhiên tỷ lệ giếng có tế bào

lai chưa cao, do đó chúng tôi vẫn chuẩn bị cho các lần lai tiếp theo để thu được

thêm tế bào lai.

Để đánh giá 240 dòng tế bào lại được tạo ra sau lần lai thứ 2, chúng tôi tiến

hành đổi đệm 240 mẫu dịch nuôi dòng tế bào lai trong đệm phosphat pH 7,4, sau đó

in phun lên que thử với nồng độ kháng thể IgG là 4 µg/µl. Tiến hành chạy que thử

với nồng độ F1 100 ng/ml và 3µl cộng hợp phát hiện 3YP8. Kết quả sàng lọc được

trình bày ở Hình 3.8 cho thấy tất cả 240 dòng tế bào lai kể trên đều cho kết quả âm

tính với F1. Thử nghiệm ELISA cũng cho kết quả tương tự. Như vậy hiện nghiên

cứu của chúng tôi chưa tạo ra được dòng tế bào lai mong muốn có ái lực với F1.

Hình 3.8: Que thử sàng lọc 240 dòng tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng

nguyên F1

II.3. Ứng dụng chế phẩm IgY tạo que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi

phát hiện nhanh F1.

III.3.1. Lựa chọn kháng thể IgY in lên vị trí vạch thử nghiệm.

Từ kết quả ELISA, chúng tôi lựa chọn 6 mẫu IgY (ứng với trứng thu ngày

thứ 15, 20; 25; 30; 35; 45 sau khi gây niễm dịch với F1) cho hiệu giá kháng thể

cao, để in thử lên màng. Que thử phát hiện nhanh F1 được phát triển dựa trên kỹ

thuật sắc ký miễn dịch kẹp đôi. Kháng thể đơn dòng kháng chuột thương mại 3YP8

được cộng hợp với hạt nano vàng làm kháng thể phát hiện. Kháng thể đa dòng IgY

làm kháng thể bắt cặp. Dùng 3 µl cộng hợp/que thử, lượng kháng nguyên F1 tham

gia phản ứng có nồng độ là 100 ng/ml. Kết quả được trình bày ở Hình 3.9

Hình 3.9: Lựa chọn mẫu IgY cần in lên vị trí vạch thử nghiệm

1: Mẫu trứng ở ngày thứ 15 2: Mẫu trứng ở ngày thứ 20 3: Mẫu trứng ở ngày thứ 25 4: Mẫu trứng ở ngày thứ 30 5: Mẫu trứng ở ngày thứ 35 6: Mẫu trứng ở ngày thứ 45 1’: Mẫu trứng ở ngày thứ 15 2’: Mẫu trứng ở ngày thứ 20 3’: Mẫu trứng ở ngày thứ 25 4’: Mẫu trứng ở ngày thứ 30 5’: Mẫu trứng ở ngày thứ 35 6’: Mẫu trứng ở ngày thứ 45

Kết quả cho thấy, tại các mẫu âm tính không cho tín hiệu ở vị trí vạch thử

nghiệm, trong khi đó chế phẩm IgY thu được ở ngày thứ 30 và ngày thứ 35 sau khi

gây miễn dịch cho tín hiệu trên vạch thử nghiệm ở mẫu dương tính. Kết quả trên

hoàn toàn trùng khớp với kết quả phản ứng ELISA. Như vậy một lần nữa khẳng

định IgY ngày 30 và ngày thứ 35 cho hiệu giá kháng thể cao nhất. Tuy nhiên IgY ở

ngày 35 cho cường độ tín hiệu mạnh hơn chế phẩm IgY ngày 30 do vậy chúng tôi

sẽ sử dụng chế phẩm IgY ở ngày thứ 35 cho các thí nghiệm tiếp theo.

III.3.2. Ảnh hưởng của các loại màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu

vạch thử nghiệm cố định IgY.

Màng để cố định IgY là màng nitrocellulose có ảnh hưởng lớn tới độ nhạy

của que thử. Màng nhanh sẽ cho độ nhạy thấp, màng chậm sẽ cho độ nhạy cao

nhưng thời gian phân tách dài. Protein cố định với màng nitrocellulose nhờ lực tĩnh

điện, liên kết hydro và liên kết kỵ nước. Mô hình thường được chấp nhận cho liên

kết của protein với nitrocellulose là protein ban đầu tương tác với bề mặt màng bởi

lực hút tĩnh điện. Sau đó, sự cố định lâu dài được thực hiện bởi việc kết hợp của

liên kết kỵ nước và liên kết hydro. Mặt khác sự dịch chuyển của protein trên màng

phụ thuộc vào kích thước lỗ màng. Do vậy ở thí nghiệm này, chúng tôi khảo sát 6

loại màng có kích thước lỗ khác nhau để in kháng thể IgY. Que thử được phản ứng

với F1 ở nồng độ 50 ng/ml. Kết quả được trình bày ở Hình 3.10.

Hình 3.10: Ảnh hưởng của màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm cố định IgY.

1: Màng Uni Sart CN 140 4: Màng CNPC-SS12 (12µm)

2: 200 CNPH-N-SS, 40 nm 5: Màng CNPC-SS12 (10µm)

3: Màng CNPC-SS12 (15µm) 6: Màng Uni Sart CN 95

Kết quả trên Hình 3.10 cho thấy,ở cả 6 lô màng được khảo sát mẫu âm tính

không cho tín hiệu. Trong khi đó ở mẫu dương tính trên màng Uni Sart CN 140;

màng CNPC-SS12 (15µm) và màng Uni Sart CN 95 trên mẫu đều xuất hiện tín

hiệu ở vạch thử nghiệm. Ở màng Uni Sart CN 140 và màng Uni Sart CN 95 tín

hiệu hiển thị mờ và không tập trung như tín hiệu ở màng Uni Sart CN 95. Đối với

màng CNPC-SS12 (12µm) và màng CNPC-SS12 (10µm) không cho tín hiệu, ngoài

ra còn có hiện tượng bi vàng bị dồn lại trên màng. Như vậy loại màng ảnh hưởng

lớn tới kết quả que thử. Từ kết quả này chúng tôi lựa chọn màng Uni Sart CN 95

cho các thử nghiệm tiếp theo.

III.3.3. Tối ưu hóa các điều kiện in kháng thể lên vạch kiểm chứng.

III.3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể M5899 đến cường độ tín hiệu

vạch kiểm chứng.

Kháng thể gắn trên vạch kiểm chứng được chúng tôi sử dụng trong toàn bộ

luận văn này là kháng thể đa dòng kháng IgG từ chuột có số hiệu là M5899. Nồng

độ M5899 được chúng tôi khảo sát ở các nồng độ là 0,5; 1; 2 µg/µl. Kết quả trình

bày ở Hình 3.11.

Hình 3.11: Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể M5899 đến cường độ tín hiệu

vạch kiểm chứng

1, 2, 3 lần lượt tương ứng các nồng độ M5899 là 0,5; 1 và 2 µg/µl

Kết quả sau 3 lần thử nghiệm cho thấy tín hiệu vạch kiểm chứng ở cả 3 nồng

độ M5899 được thử nghiệm mạnh gần như nhau. Tuy nhiên ở nồng độ 0,5 µg/µl

cho kết quả đẹp hơn cả về độ mảnh đường in cũng như cường độ tín hiệu. Do vậy

để giảm chi phí chúng tôi lựa chọn nồng độ kháng thể in lên màng là 0,5µg/µl.

III.3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ isopropanol bổ sung vào kháng thể

M5899 đến cường độ tín in trên vạch kiểm chứng.

Isopropanol được bổ sung vào kháng thể M5899 trước quá trình cố định trên

màng nitrocellulose với các nồng độ 5%; 10% và 15% nhằm tạo độ sắc nét cho

đường in.

Kết quả thí nghiệm ở Hình 3.12 cho thấy, cả 3 nồng độ isopropanol được

thử nghiệm cho kết quả tương tự, băng rõ nét, nên chúng tôi đã lựa chọn nồng độ

isopropanol là 10% nhằm tránh gây mất hoạt tính kháng thể.

Hình 3.12: Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol bổ sung vào kháng thể M5899 đến cường độ tín hiệu vạch kiểm chứng 1, 2, 3 lần lượt tương ứng với nồng độ isopropanol là 5%, 10% và 15%

III.3.4. Tối ưu hóa các điều kiện in kháng thể IgY lên vạch thử nghiệm.

Que thử phát hiện kháng nguyên F1 sử dụng IgY dựa trên nguyên lý sắc ký

miễn dịch kẹp đôi. Trong đó kháng thể đa dòng IgY là kháng thể bắt cặp được gắn

tại vạch thử nghiệm, trên vạch kiểm chứng được gắn với kháng thể đa dòng

M5899. Kháng thể đơn dòng 3YP8 (kháng thể kháng F1) là kháng thể phát hiện.

Kháng thể 3YP8 được cộng hợp với bi vàng sẽ kết hợp với kháng nguyên nang F1

có trong mẫu tạo nên phức hợp (3YP8-Au-F1). Phức hợp này di chuyển trên màng

đến vùng vạch thử nghiệm và bị IgY bắt giữ theo kiểu kẹp đôi tạo ra tín hiệu trên

vạch thử nghiệm. Phần dư kháng thể phát hiện tiếp tục di chuyển đến vạch kiểm

chứng và bị bắt tại đây bằng một kháng thể đa dòng M5899 để tạo tín hiệu ở vạch

kiểm chứng. Kết quả là mẫu có kháng nguyên F1 sẽ tạo nên 2 vạch màu tại vị trí

vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm. Nếu mẫu không có kháng nguyên F1 sẽ chỉ

cho một vạch màu tại vị trí kiểm chứng.

III.3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ IgY tới cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm.

Kháng thể IgY được cố định lên vạch thử nghiệmvới các nồng độ là 4; 7; 10

µg/µl với liều lượng 1 µl/cm. Que thử được chạy thử nghiệm với mẫu âm tính và

mẫu dương tính với nồng độ F1 là 50 ng/ml, đệm chạy pH 7,5.

Hình 3.13: Ảnh hưởng của nồng độ IgY đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm

1, 2, 3: Nồng độ IgY 4,7,10 µg/µl và F1: 0 ng/ml

1’, 2’, 3’:Nồng độ IgY 4,7,10 µg/µl và F1: 50 ng/ml

Kết quả Hình 3.13 cho thấy với nồng độ IgY là 4 µg/µl in trên vạch thử

nghiệm cho tín hiệu rõ ràng, độ rộng vạch thử nghiệm được thu hẹp hơn so với các

lượng in là 7 và10 µg/µl, thời gian hiện màu của vạch thử nghiệm là 15 phút. Do

vậy, chúng tôi lựa chọn lượng IgY in trên vạch thử nghiệm là 4µg/µl với liều lượng

in phun là 1 µl/cm cho các thí nghiệm tiếp theo.

III.3.4.2. Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm

Kháng thể IgY được khảo sát trong các đệm in phun có pH 8,5; 8,0; 7,5; 7,0

và 6,5.Vạch thử nghiệm của que thử được cố định với nồng độ IgY là 4 µg/µl với

liều lượng 1 µl/cm. Kết quả Hình 3.14 cho thấy que thử được in IgY tại pH 8,5 cho

tín hiệu tốt nhất.

Hình 3.14: Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệutrên vạch thử nghiệm

1, 2, 3, 4, 5: lần lượt pH 8,5; 8,0; 7,5; 7,0; 6,5, F1: 0 ng/ml 1’,2’,3’,4’,5’: lần lượt pH 8,5; 8,0; 7,5; 7,0; 6,5 F1: 50 ng/ml

III.3.4.3. Xác định độ nhạy của que thử IgY.

Qua thực nghiệm chúng tôi lựa chọn được các điều kiện in que thử như

sau: Vạch thử nghiệm được in IgY ngày thứ 35 sau khi gây miễn dịch lần 1, nồng

độ kháng thể in lên màng là 4 µg/µl, IgY được đổi trong đệm Borat pH 8,5. Trên

vạch kiểm chứng sử dụng M5899 được đổi trong đệm phosphat pH 7,0 nồng độ

kháng thể in phun là 2 µg/µl, bổ sung isopropanol 10% cả trên vạch thử nghiệm

và vạch kiểm chứng, 2 loại kháng thể này được in phun trên màng Uni Star

CN95, thời gian cho tín hiệu trên vạch thử nghiệm là 15 phút.

Nồng độ kháng nguyên F1 tham gia phản ứng được chúng tôi pha loãng ở

các nồng độ 100; 50; 20; 10; 5 ng/ml. Lượng kháng thể đơn dòng kháng F1 3YP8

cộng hợp hạt nano-vàng là 3 µl/que thử. Kết quả được trình bày ở Hình 3.15

Hình 3.15: Xác định độ nhạy của que thửphát hiện F1 sử dụng chế phẩm IgY

1: Nồng độ F1 0 ng/ml 4: Nồng độ F1 20 ng/ml

2: Nồng độ F1 100 ng/ml 5: Nồng độ F1 10 ng/ml

3 Nồng độ F1 50 ng/ml 6: Nồng độ F1 5 ng/ml

Như vậy với nồng độ là 100; 50 ng/ml kháng nguyên F1 vạch thử nghiệm

cho tín hiệu rất rõ ràng, ở nồng độ là 20, 10 ng/ml tín hiệu trên vạch thử nghiệm rất

thấp chỉ nhìn thấy được bằng mắt thường khi quét ảnh không nhìn thấy. Có thể tạm

kết luận ban đầu độ nhạy của que thử nằm trong khoảng 10-20 ng/ml.

III.4. Ứng dụng kháng thể đơn dòng thương mại sản xuất que thử.

Kháng thể đơn dòng IgG trên chuột vẫn được chúng tôi tiếp tục nghiên cứu,

tối ưu qui trình gây đáp ứng miễn dịch tạo dòng tế bào B, có ái lực cao với kháng

nguyên F1, làm nguyên liệu cho quá trình lai tạo dòng tế bào lai có khả năng sinh

kháng thể kháng F1.

Để so sánh với que thử IgY, chúng tôi sử dụng kháng thể đơn dòng thương

mại G20 in trên vạch thử nghiệm và kháng thể M5899 in lên vạch kiểm chứng.

III.4.1 Ảnh hưởng nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm.

Với kết quả thử nghiệm ở trên, chúng tôi không tiến hành khảo sát các yếu

tố ảnh hưởng trên vạch kiểm chứng mà sử dụng kết quả nghiên cứu trước đã thu

nhận được với que thử IgY. Đồng thời chúng tôi tiếp tục khảo sát các yếu tố ảnh

hưởng đến G20 in trên vạch thử nghiệm.

Sự ảnh hưởng của nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm

được chúng tôi khảo sát ở hai nồng độ là 1 và 2 µg/µl. Kết quả được thể hiện trong

Hình 3.16.

Hình 3.16 : Ảnh hưởng của nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm

1: Nồng độ G20 1 µg/µl, F1: 0 ng/ml

1’: Nồng độ G20 1 µg/µl, F1: 10 ng/ml

2: Nồng độ G20 2 µg/µl, F1: 0 ng/ml

2’: Nồng độ G20 2 µg/µl, F1: 10 ng/ml

Kết quả Hình 3.16 cho thấy với nồng độ G20 là 1µg/µl cho tín hiệu trên

vạch thử nghiệm đậm và sắc nét, độ rộng vạch thử nghiệm được thu hẹp hơn so với

các lượng in là 2 µg/µl. Như vậy chúng tôi lựa chọn nồng độ G20 gắn trên màng là

1 µg/µl.

III.4.2. Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm.

Kháng thể đơn dòng thương mại G20 được đổi đệm pH lần lượt là 7,0; 7,5;

8,0; 8,5 trên cột amicon 10kDa rồi được cố định trên màng. Kết quả trên Hình

3.17 cho thấy, tại pH 8,5 vạch in không được sắc nét, kích thước vạch in lớn nhất.

Tuy nhiên, với G20 trong đệm pH 7,0 cho tín hiệu vạch đậm nhất và. Vì vậy, lựa

chọn pH in G20 là 7,0.

Hình 3.17: Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm

1: G20 đệm pH 7,0 2: G20 đệm pH 7,5

3: G20 đệm pH 8,0 4: G20 đệm pH 8,5

III.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu trên

vạch thử nghiệm.

Isopropanol được bổ sung vào kháng thể G20 trước quá trình cố định trên

màng nitrocellulose với các nồng độ 5%; 10% và 15%. Kết quả thử nghiệm trên

que thử ở Hình 3.18 cho thấy, tại 3 nồng độ Isopropanol đều cho tín hiệu tượng tự

nhau, để tránh sự biến tính của kháng thể G20 chúng tôi lựa chọn nồng độ

Isopropanol là 10%.

Hình 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm.

1: isopropanol 5%, F1: 10 ng/ml 2: isopropanol 10%, F1: 10 ng/ml 3: isopropanol 15%, F1: 10 ng/ml

III.4.4. Xác định độ nhạy của que thử với chế phẩm thương mại G20.

Qua các kết quả khảo sát trên chúng tôi tiến hành tạo que thử bằng chế phẩm

thương mại G20 trên vạch thử nghiệm và M5899 trên vạch kiểm chứng với lượng

kháng thể kháng F1 3YP8 cộng hợp với hạt nano vàng là 3µl bi/que thử, lượng

kháng nguyên F1 tham gia phản ứng được pha loãng ở các nồng độ 10; 2; 1; 0,5

ng/ml, thời gian cho tín hiệu trên vạch thử nghiệm là 15 phút. Kết quả được trình

bày ở Hình 3.19.

Kết quả cho thấy nồng độ kháng nguyên F1 10; 2 ng/ml cho tín hiệu trên

vạch thử nghiệm rất rõ ràng, nồng độ 1 ng/ml tín hiệu cho mờ nhạt và ở nồng độ

0,5 ng/ml cho tín hiệu rất mờ khó có thể quan sát bằng mắt thường. Như vậy có thể

kết luận độ nhạy của que thử phát hiện F1 khi sử dụng kháng thể G20 làm kháng

thể bắt cặp nằm trong khoảng 0,5-1ng/ml.

Hình 3.19: Xác định độ nhạy của que thử phát hiện F1 sử dụng kháng thể G20 làm kháng thể bắt cặp 1: Âm tính; 2, 3, 4, 5: Nồng độ F1 lần lượt là 10;2;1 và 0,5 ng/ml

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

 Sau quá trình nghiên cứu, đã sản xuất được chế phẩm IgY, có lượng là 88,5

mg, hiệu giá kháng thể đạt 27.000 ở trứng thu ngày thứ 35 sau gây miễn dịch lần 1.

 Bước đầu xây dựng qui trình gây đáp ứng miễn dịch và tạo dòng tế bào lai

sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1, tuy nhiên các dòng tế bào lai thu được hiện

chưa có khả năng sinh kháng thể mong muốn.

 Tạo được que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát hiện nhanh F1 bằng chế

phẩm IgY (ngày thu trứng thứ 35) được cố định trên vạch thử nghiệm với các điều

kiện tối ưu như sau:

+ Màng in que thử là màng Uni Sart CN95.

+ Vạch kiểm chứng in kháng thể M5899 với nồng độ kháng thể 0,5 µg/µl,

trong đệm phosphat pH 7,0; nồng độ isopropanol là 10%.

+ Vạch thử nghiệm in phun chế phẩm IgY với nồng độ kháng thể 4 µg/µl,

trong đệm borat pH 8,5; nồng độ isopropanol là 10%.

+ Độ nhạy của que thử phát hiện F1 tinh khiết sử dụng IgY trong khoảng 10-

20 ng/ml; thời gian thử nghiệm 15 phút.

 Tạo được que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát hiện nhanh F1 bằng chế

phẩm thương mại G20 được cố định trên vạch thử nghiệm với các điều kiện tối ưu

như sau:

+ Màng in que thử là màng Uni Sart CN95.

+ Vạch kiểm chứng in kháng thể M5899 với nồng độ kháng thể 0,5 µg/µl,

trong đệm phosphat pH 7,0; nồng độ isopropanol là 10%.

+ Vạch thử nghiệm in phun chế phẩm G20 với nồng độ kháng thể 1µg/µl,

trong đệm phosphat pH 7,0; nồng độ isopropanol là 10%.

+ Độ nhạy của que thử phát hiện F1 tinh khiết sử dụng G20 trong khoảng 0,5-

1 ng/ml; thời gian thử nghiệm 15 phút.

KIẾN NGHỊ

 Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa qui trình gây đáp ứng miễn dịch và tạo dòng

tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng có ái lực cao với kháng nguyên F1.

 Xác định độ đặc hiệu của que thử.

 Xây dựng qui trình chuẩn bị mẫu.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đặng Tuấn Đạt, Phạm Văn Hậu (2003), “Bệnh dịch hạch - dịch tễ học,

giám sát và phòng chống”, NXB Y Học.

2. GS.TS Lê Huy Chính (2006), “Giáo trình Vi sinh vật y học” NXB YHọc.

3. Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn (4/2015), “Nghiên cứu trình tự

một số gen độc lực của Yersinia pestis và phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác

định Yersinia pestis gây bệnh ở Việt Nam”, Tạp chí y – dược học quân sự.

4. Nguyễn Thị Loan (2010), Bước đầu nghiên cứu sản xuất IgG kháng dịch

hạch, luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Đà Lạt.

5. Sha J, Endsley JJ, Kirtley ML, Foltz SM, Huante MB, Erova TE, Kozlova

EV, Popov VL, Yeager LA, Zudina IV, Motin VL, Peterson JW, DeBord KL,

Chopra AK (2011), Characterization of an F1 deletion mutant of Yersinia pestis

CO92, pathogenic role of F1 antigen in bubonic and pneumonic plague, and

evaluation of sensitivity and specificity of F1 antigen capture-based dipsticks, J

Clin Microbiol. 49(5):1708-15.

6. Williams J.E., Gentry M.K., Broden C.A., Tyndal G.L., Altieri P.L.,

Berman S., Robinson D.M ,A. (1988) Monoclonal antibody for the specific

dianogsis of plague Bull. WHO, 66, pp. 77 – 82.

7. Galyov, E. E., O. Y. Smirnov, A. V. Karlishev, K. I. Volkovoy, A. I.

Denesyuk,I. V. Nazimov, K. S. Rubtsov, V. M. Abramov, S. M. Dalvadyanz, and

V. P.Zav’yalov. (1990), Nucleotide sequence of the Yersinia pestis gene encoding

F1 antigen and the primary structure of the protein, FEBS Lett. 277:230–232.

8. Janssen W.A., Surgalla M.J (1969), Plague bacillus survival within host

phagocytes Sciense, 163, pp. 95, 952.

9. Chanteau S, Nato F, Migliani R. (2003), Interest in rapid

immunochromathography tests for surveillance of characteristic diseases epidemic in

developing countries: the example of plague in Madagascar, Med Trop 63: 574–576.

10. Erova TE, Rosenzweig JA, Sha J, Suarez G, Sierra JC, Kirtley ML, van

Lier CJ, Telepnev MV, Motin VL, Chopra AK. (2013), Evaluation of protective

potential of Yersinia pestis outer membrane protein antigens as possible candidates

for a new-generation recombinant plague vaccine, Clin Vaccine Immunol.

20(2):227-38.

11. WHO (2014), "Hepatitis B", Fact sheet N0 204, Updated June 2014

12. Roseanu, A., Jecu, L., Badea, M., Evans, R.W. (2010) Mycotoxins: An

overview on their quantification methods. Rom.J.Biochem. 47-1. 79-86.

13. Brendan, O.F. (2009) Evolution in Lateral Flow–Based Immunoassay

Systems - Lateral Flow Immunoassay (book).

14. Beesley ED, Brubaker RR, Janssen WA, Surgalla MJ (1967) Pesticins. 3.

Expression of coagulase and mechanism of fibrinolysis. J Bacteriol 94: 19–26.

15. Singer JM and Plotz CM (1956). The latex fixation test. I. Application to

the serologic diagnosis of rheumatoid arthritis. Am. J. Med. 21:888.

16. Von Lode P. (2005). Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods. Clin Biochem 38(7):591-606.

Review.

17. Posthuma-Trumpie, G.A., Korf, J., Amerongen, Aart van. (2009). Lateral

flow immunoassay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature

survey. Anal Bioanal Chem 393:569–582.

18.Schade, R. (1996). Egg yolk antibodies, state of the art and future

prospects ALTEX 13.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng IgY nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

MAI THỊ THU

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM KHÁNG THỂ ĐA

DÒNG IgY NHẬN BIẾT ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN

NANG F1 CỦA VI KHUẨN DỊCH HẠCH YERSINIA

PESTIS VÀ

ỨNG DỤNG TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội, 11/2017

Mai Thị Thu

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

LỜI MỞ ĐẦU

CHƯƠNGI: TỔNG QUAN

Hình1.6: Hình ảnh Y. pestis bắt màu đậm 2 đầu khi nhuộm Wayson.

Hình 1.9: Cấu tạo kháng thể IgG và IgY

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nồng độ protein

M: thang chuẩn protein GangNam-STAIN

1: phân đoạn rửa giải thứ 5

2 : phân đoạn rửa giải thứ 6

3 : phân đoạn rửa giải thứ 7

4: phân đoạn rửa giải thứ8

Hình 3.2: Xác định độ pha loãng của kháng thể kháng IgY gắn HRP

Số lượng tế bào dùng

Tỷ lệ % số

Số đĩa

để lai

Tổng số

Tổng số

giếng có tế

nuôi cấy

giếng

giếng có

bào

Lần

tế bào

nuôi cấy

tế bào

lai/giếng

lai

Tế bào

Tế bào

dùng (đĩa

tế bào

lai

nuôi cấy tế

Myeoloma

lympho B

96 giếng)

bào

1, 2, 3: Nồng độ IgY 4,7,10 µg/µl và F1: 0 ng/ml

1’, 2’, 3’:Nồng độ IgY 4,7,10 µg/µl và F1: 50 ng/ml

1: Nồng độ G20 1 µg/µl, F1: 0 ng/ml

1’: Nồng độ G20 1 µg/µl, F1: 10 ng/ml

2: Nồng độ G20 2 µg/µl, F1: 0 ng/ml

2’: Nồng độ G20 2 µg/µl, F1: 10 ng/ml

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

19. Polson, A., Coetzer, T., Kruger, J., vonMaltzahn, E. &

vanderMerwe, K.J. Immunol. Invest.14, 323 (1985).

20.http://www.baoxaydung.com.vn/news/vn/suc-khoe/benh-dich-hach-tren-

the-gioi-va-viet-nam.html

21. Splettstoesser WD, Rahalison L, Grunow R, Neubauer H,

Chanteau S. Evaluation of a standardized F1 capsular antigen capture ELISA

test kit for the rapid diagnosis of plague. FEMS Immunol Med Microbiol.

2004 Jun 1;41(2):149-55.

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm