VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
--------
NGUYỄN THỊ THU
CHUYỂN GEN BT2 VÀO MỘT SỐ DÕNG NGÔ TRỒNG BẰNG SỬ
DỤNG MÔ PHÂN SINH VÀ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hà Nội, Tháng 11-2015
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
--------
NGUYỄN THỊ THU
CHUYỂN GEN BT2 VÀO MỘT SỐ DÕNG NGÔ TRỒNG BẰNG SỬ
DỤNG MÔ PHÂN SINH VÀ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
MÃ NGÀNH: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. Nguyễn Đức Thành
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hà Nội, Tháng 11-2015
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Tác giả
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Nguyễn Thị Thu
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Đức Thành đã
tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công
trình nghiên cứu này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đặc biệt đến TS. Lê Thị Bích Thủy và tập thể
cán bộ Phòng Di truyền tế bào thực vật đã giúp đỡ tôi về mặt tinh thần, cũng
nhƣ tạo mọi điều kiện về vật chất, các phƣơng tiện kỹ thuật cho tôi trong suốt
quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban Đào tạo Viện Sinh thái
và Tài nguyên Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành chƣơng trình đào tạo.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè và
đồng nghiệp trong suốt thời gian làm luận văn.
Tác giả
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
DNA
: Deoxyribonucleic acid
RNA
: Ribonucleic acid
bp
: Cặp base (base pair)
CTAB
: Cetyltrimethyl amoniumbromide
dNTP
: Deoxynucleosid triphosphat
EDTA
: Ethylene diamin tetra acetate
EtBr
: Ethidium bromide
kb
: Kilo base
PCR
: Phản ứng chuỗi polymerase
(Polymerase chain reaction)
Rnase : Ribonuclease
TBE
: Tris base, Boric acid, EDTA.
TE
: Tris EDTA
DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
MES : 2-morphlinoethanesulfonic acid
PPT : L- Phosphinothricin
AGPase : ADP-Glucose pyrophosphorylase
MS : Murashige and Skoog Medium
BSA : bovine serum albumin fraxtion
BCIP/NBT : 5 – Bromo – 4 – Chloro – 3 – idolyl phosphate, p-
toluidine salt/Nitro Blue Tetrazolium
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
SDS : sodium dodecyl sulfat
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Kết quả chọn lọc các cây chuyển gen trong môi trƣờng chọn lọc ..... 24
Bảng 2: Số dòng cây chuyển gen và số bản sao gen chuyển thu đƣợc từ mỗi dòng ngô............................................................................................................ 29
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Bảng 3: Số lƣợng dòng cây chuyển gen theo các khoảng thời gian gây nhiễm khác nhau .......................................................................................................... 30
DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Một số enzyme quan trọng trong quá trình chuyển hóa sucrose thành tinh bột. ............................................................................................................... 7
Hình 2: Cấu trúc chuyển gen pCambia2300-Ubi-Bt2; ..................................... 15
Hình 3: Chuyển cấu trúc gen pCambia2300-Ubi-Bt2 vào mô phân sinh cây non một số dòng ngô………………………………………………………………23
Hình4: Kết quả tách DNA tổng số các dòng ngô sống sót sau chọn lọc cây chuyển gen………………… ………………………………………………...25
Hình 5: Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen Bt2 trong một số cây ngô chuyển gen bằng PCR với mồi đặc hiệu.. ..................................................................... 26
Hình 6: Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen Ubi trong một số cây ngô chuyển gen bằng PCR với mồi đặc hiệu. ...................................................................... 27
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hình 7: Kết quả kiểm tra Southern một số dòng ngô chuyển gen;................... 28
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
1. Đặt vấn đề .................................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu đề tài ........................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3
1.1 Đại cƣơng về cây ngô. ............................................................................... 3
1.2 Tinh bột và các gen điều khiển quá trình tổng hợp tinh bột ...................... 5
1.3 Các phƣơng pháp chuyển gen thƣờng sử dụng ........................................ 7
1.3.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens ............. 8
1.3.2 Chuyển gen trực tiếp ................................................................................ 10
1.4 Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở ngô ................................................. 11
1.4.1 Các nghiên cứu chuyển gen trên thế giới ................................................. 11
1.4.2 Các nghiên cứu chuyển gen trong nƣớc ................................................... 14
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15
2.1 Vật liệu và hóa chất nghiên cứu .............................................................. 15
2.1.1 Vật liệu ..................................................................................................... 15
2.1.2 Hóa chất .................................................................................................... 16
2.2.2 Đánh giá các cây chuyển gen bằng PCR .................................................. 19
2.2.3 Đánh giá các cây chuyển gen bằng lai Southern ...................................... 20
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 23
3.1 Chọn lọc các dòng ngô chuyển gen ......................................................... 23
3.2 Đánh giá các cây chuyển gen bằng PCR ................................................. 25
3.3 Đánh giá các cây chuyển gen bằng lai Southern ..................................... 28
CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................. 32
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
4.1 Kết luận .................................................................................................... 32
Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
4.2 Kiến nghị ................................................................................................. 32
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngô là cây lƣơng thực đứng thứ hai trên thế giới sau lúa. Nó đóng vai
trò quan trọng đối với đời sống con ngƣời. Không chỉ cung cấp lƣơng thực cho
con ngƣời, ngô còn đóng vai trò xóa đói giảm nghèo ở nhiều vùng kinh tế của
nƣớc ta. Hiện nay dân số đang tăng cao dẫn đến áp lực về lƣơng thực càng trở
nên nóng hơn bao giờ hết. Việc tăng năng suất cây trồng đặc biệt là các cây
lƣơng thực nhƣ ngô, lúa, lúa mì ... đang là thách thức đối với các nhà chọn tạo
giống cây trồng. Hiện nay có hai phƣơng pháp chủ yếu để tăng năng suất cây
trồng đó là cải tiến phƣơng thức canh tác và sử dụng giống mới dựa vào nỗ lực
của các nhà chọn giống. Cho đến nay, các nhà chọn giống thƣờng nghiên cứu
tạo giống mới theo các hƣớng nhƣ: nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen, di
truyền phân tử các tính trạng quan tâm, chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử và công
nghệ gen. Cây ngô là cây trồng thu hạt nên tăng năng suất cây chủ yếu phụ
thuộc vào các yếu tố nhƣ: chiều dài bắp, số lƣợng hạt, khối lƣợng của hạt… Để
ứng dụng công nghệ gen vào việc tăng năng suất cây ngô chúng ta cần nghiên
cứu các quá trình liên quan năng suất cây ngô nhƣ: quá trình quang hợp, quá
trình tổng hợp tinh bột, hoạt động của các gen điều khiển quá trình tổng hợp
sinh khối…
Nhiều nghiên cứu hóa sinh và phân tử đã làm sáng tỏ vai trò của các
enzyme trong quá trình tổng hợp tinh bột. Các nghiên cứu cho thấy ADP-
glucose pyrophosphorylase (AGPase) là enzyme đóng vai trò chìa khóa trong
quá trình điều khiển tổng hợp tinh bột ở hạt ngũ cốc. Enzyme AGPase có cấu
trúc tứ phân gồm 2 tiểu phần nhỏ đƣợc mã hóa bởi gen Brittle 2 (Bt2) và 2 tiểu
phẩn lớn đƣợc mã hóa bởi gen Shrunken 2 (Sh2). Chuyển gen Sh2 và Bt2 vào
ngô là một trong những hƣớng nghiên cứu nhằm tăng khả năng tổng hợp tinh
bột, tăng năng suất cây trồng.
Ứng dụng công nghệ gen chúng tôi tiến hành nghiên cứu: Chuyển gen Bt2
vào một số dòng ngô trồng bằng sử dụng mô phân sinh và Agrobacterium
1
tumefaciens.
2. Mục tiêu nghiên cứu đề tài
Chuyển vector mang gen Bt2 vào các dòng ngô bố mẹ nhằm tăng hàm
lƣợng tinh bột trong cây.
3. Nội dung nghiên cứu
Chuyển gen Bt2 vào các dòng ngô trồng. -
2
Đánh giá sự có mặt của gen Bt2 trong các dòng chuyển gen. -
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Đại cƣơng về cây ngô.
Ngô (Zea mays L.) thuộc chi Maydeae, họ hòa thảo Gramineae, có
nguồn gốc từ Trung Mỹ, là cây lƣơng thực quan trọng trên thế giới bên cạnh
lúa mì và lúa gạo.
Cấu tạo của cây ngô bao gồm: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ), hạt.
Rễ ngô là hệ rễ chùm tiêu biểu cho bộ rễ của các cây họ hòa thảo. Độ
sâu và sự mở rộng của rễ phụ thuộc vào các giống, độ phì nhiêu và độ ẩm của
đất. Ngô có 3 loại rễ chính: rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng.
Rễ mầm (còn gọi là rễ mộng, rễ tạm thời, rễ hạt) gồm có: rễ mầm sơ
sinh và rễ mầm thứ sinh.
Rễ mầm sơ sinh (rễ phôi): là cơ quan đầu tiên xuất hiện sau khi hạt ngô
nảy mầm. Ngô có một rễ mầm sơ sinh duy nhất. Sau một thời gian ngắn xuất
hiện, rễ mầm sơ sinh có thể ra nhiều lông hút và nhánh. Thƣờng thì rễ mầm sơ
sinh ngừng phát triển, khô đi và biến mất sau một thời gian ngắn (sau khi ngô
đƣợc 3 lá). Tuy nhiên cũng có khi rễ này tồn tại lâu hơn, đạt tới độ sâu lớn để
cung cấp nƣớc cho cây (thƣờng gặp ở những giống chịu hạn).
Rễ mầm thứ sinh: còn đƣợc gọi là rễ phụ hoặc rễ mầm phụ. Rễ này xuất
hiện từ sau sự xuất hiện của rễ chính và có số lƣợng khoảng từ 3 đến 7. Tuy
nhiên, đôi khi ở một số cây không xuất hiện lọai rễ này. Rễ mầm thứ sinh cùng
với rễ mầm sơ sinh tạo thành hệ rễ tạm thời cung cấp nƣớc và các chất dinh
dƣỡng cho cây trong khoảng thời gian 2 - 3 tuần đầu, sau đó vai trò này
nhƣờng cho hệ rễ đốt.
Rễ đốt (còn gọi là rễ phụ cố định) phát triển từ các đốt thấp của thân,
mọc vòng quanh các đốt dƣới mặt đất bắt đầu lúc ngô đƣợc 3 - 4 lá. Số lƣợng
rễ đốt ở mỗi đốt của ngô từ 8 – 16 rễ. Rễ đốt ăn sâu xuống đất và có thể đạt tới
3
2,5m, thậm chí tới 5m, nhƣng khối lƣợng chính của rễ đốt vẫn là ở lớp đất phía
trên. Rễ đốt làm nhiệm vụ cung cấp nƣớc và các chất dinh dƣỡng suốt thời kỳ
sinh trƣởng và phát triển của cây ngô.
Rễ chân kiềng (còn gọi là là rễ neo hay rễ chống) mọc quanh các đốt sát
mặt đất. Rễ chân kiềng to, nhẵn, ít phân nhánh, không có rễ con và lông hút ở
phần trên mặt đất. Ngoài chức năng chính là bám chặt vào đất giúp cây chống
đỡ, rễ chân kiềng cũng tham gia hút nƣớc và thức ăn.
Thân cây ngô đặc, khá chắc, có đƣờng kính tùy thuộc vào giống, điều
kiện sinh thái và chăm sóc. Chiều cao của thân cây ngô khoảng 1,5 – 4 m.
Thân chính của ngô có nguồn gốc từ chồi mầm. Lá ngô căn cứ vào vị trí trên
thân và hình thái có thể chia lá ngô làm 4 loại: lá mầm, lá thân, lá ngọn, lá bi.
Lá ngô có cấu tạo bởi bẹ lá, bản lá (phiến lá), lƣỡi lá (thìa lìa, tai lá). Tuy nhiên
có loại không có thìa lìa làm cho lá bó, gần nhƣ thẳng đứng theo cây.
Số lƣợng lá, chiều dài, độ rộng, độ dày, lông tơ, màu lá, góc lá và gân lá
thay đổi tùy theo giống khác nhau. Số lá là đặc điểm khá ổn định ở cây ngô, có
quan hệ chặt chẽ với số đốt và thời gian sinh trƣởng. Những giống ngô ngắn
ngày thƣờng có 15 -16 lá, giống ngô trung bình: 18 – 20 lá, giống ngô dài ngày
thƣờng có trên 20 lá.
Ngô là loài cây có hoa khác tính cùng gốc. Hai cơ quan sinh sản: đực
(bông cờ) và cái (bắp) nằm ở những vị trí khác nhau trên cùng một cây.
Hoa đực nằm ở đỉnh cây, xếp theo chùm gồm một trục chính và nhiều
nhánh. Hoa đực mọc thành bông nhỏ gọi là bông chét, bông con hoặc gié. Các
gié mọc đối diện nhau trên trục chính hay trên các nhánh.
Hoa tự cái (bắp ngô) phát sinh từ chồi nách các lá, song chỉ 1 - 3 chồi
khoảng giữa thân mới tạo thành bắp.
Hạt ngô là loại quả dính bao gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi,
nội nhũ và chân hạt. Vỏ hạt là một màng nhẵn bao xung quanh hạt. Lớp alơron
nằm dƣới vỏ hạt, bao lấy nội nhũ và phôi. Nội nhũ là phần chính của hạt chứa
các tế bào dự trữ chất dinh dƣỡng. Nội nhũ có hai phần: nội nhũ bột và nội nhũ
sừng. Tỷ lệ giữa nội nhũ bột và nội nhũ sừng tùy thuộc vào chủng ngô, giống
ngô. Phôi ngô chiếm 1/3 thể tích của hạt và gồm có các phần: ngù, lá mầm, trụ
4
dƣới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm.
1.2 Tinh bột và các gen điều khiển quá trình tổng hợp tinh bột
Tinh bột là hợp chất cacbon sinh học có nhiều trong các cơ quan dự trữ
của thực vật [22]. Tinh bột ngoài việc đóng vai trò quan trọng trong khẩu phần
ăn của con ngƣời còn có vai trò quan trọng trong chăn nuôi và trong các ngành
công nghiệp... Cùng với sự gia tăng dân số nhƣ hiện nay tăng hàm lƣợng tinh
bột trong cây trồng đang là vấn đề đƣợc các nhà khoa học quan tâm. Tinh bột
là sản phẩm của quá trình quang hợp, đƣợc tổng hợp từ đƣờng đơn dƣới sự xúc
tác của các enzyme khác nhau.
Đã có nhiều nghiên cứu về sự ảnh hƣởng của các gen đến các enzyme
xúc tác nói riêng và quá trình tổng hợp tinh bột nói chung. Ví dụ nhƣ: Các đột
biến Sh2 đã đƣợc phát hiện vào năm 1949.Ảnh hƣởng của đột biến gen Sh2 tới
việc thiếu tinh bột trong các hạt tạo thành đã đƣợc chứng minh vào năm 1953
và hoạt động của ADP-Glucose pyrophosphorylase (AGPase) bị mất đã đƣợc
chứng minh vào năm 1966, trong khi sự phân lập của gen đột biến đã phải chờ
đợi cho đến năm 1990 [7]. Ngoài ra có hàng chục đột biến liên quan đến tổng
hợp tinh bột, nhiều đột biến đã đƣợc tạo dòng. Có thêm rất nhiều gen phiên mã
trong hạt ngô đã đƣợc mô tả rất chi tiết. Hầu hết các gen liên quan đến các
bƣớc chủ yếu trong tổng hợp tinh bột đã đƣợc xác định bằng cách phân tích đột
biến. Dọc theo chuỗi phản ứng tổng hợp tinh bột thông qua sucrose, các yếu tố
liên quan đã đƣợc nghiên cứu, Miniature1 (Mn1) mã hóa enzyme Invertase
IncW2 ở thành tế bào, Shrunken1 (Sh1) và Synthase1 Sucrose (Sus1) mã hóa
cho enzyme tổng hợp sucrose, Sh2 và Brittle2 (Bt2) mã hóa cho AGPase, Bt1
mã hóa cho một nhân tố vận chuyển ADP-Glucose, Waxy1 (WX1) mã hóa cho
enzyme tạo liên kết hạt GBSSI (granule-bound starch synthase), trong tổng
hợp tinh bột, Sugary2 (Su2) và Dull1 (Du1) tƣơng ứng mã hóa SSIIa và SSIIIa
, amylose extender1 (Ae1) mã hóa cho enzyme phân nhánh BEIIb, và Su1 mã
hóa cho enzyme phá hủy liên kết nhánh ISAI [12; 18].
Bƣớc đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp tinh bột là sự tổng hợp của
5
ADP-Glucose từ Glucose-1-P và ATP AGPase [29; 36]. Sự tăng cƣờng hoạt
động của AGPase trong hạt ngô chuyển gen Sh2 (12%) và Bt2 (17%) đã đƣợc
chỉ ra đầu tiên cho các dòng ngô bổ sung các gen mã hóa AGPase trong hệ gen
[10] và sau đó là sự phân lập của hai gen bổ sung từ thƣ viện cDNA phôi ngô
[15]. Agp1 (tiểu đơn vị lớn) và Agp2 (tiểu đơn vị nhỏ) cho thấy biểu hiện chủ
yếu trong các phôi qua phƣơng pháp nghiên cứu lai Nothern, ngƣợc lại, Sh2 và
Bt2, đƣợc biểu hiện đặc hiệu trong nội nhũ [16]. Cuối cùng, một tiểu đơn vị
nhỏ thứ ba gen L2, đã đƣợc xác định trong một thƣ viện cDNA từ lá [28]. Các
gen Agp2 và L2 đã đƣợc đổi tên thành Agpsemzm và Agpslzm, tƣơng ứng, khi
cấu trúc intron / exon của Agpslzm đƣợc xác định [17]. Mặc dù ba gen Agps rõ
ràng có một nguồn gốc chung, vai trò sinh lý của chúng đã tách ra sau quá
trình tái bản gen. Trong đó, Agpslzm chịu trách nhiệm về sự tích tụ tạm thời
của tinh bột vào ban ngày trong lá, Agpsemzm và Bt2 chịu trách nhiệm trong
các cơ quan tích trữ tinh bột, trong phôi và nội nhũ. 95% các hoạt động của
AGPase ở nội nhũ các tế bào đƣợc tìm thấy trong các phần tế bào chất [9]. Tsai
và Nelson [36] đã gây đột biến trên gen Sh2, và kết quả cho thấy trên các dòng
đột biến, lƣợng tinh bột đƣợc tổng hợp chỉ bằng 20-30% so với dòng đối
chứng. Đột biến này dẫn đến sự thiếu hoàn toàn hoạt tính của enzyme
adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase (AGPase) trong cả nội nhũ
và phôi hạt. Sự xác định ảnh hƣởng đột biến chỉ ra rằng phần lớn tinh bột trong
các dòng ngô bình thƣờng đƣợc tổng hợp nhờ xúc tác của một hệ thống các
enzyme sử dụng adenosine diphosphate glucose làm cơ chất, sau cùng đƣợc
hình thành nhờ xúc tác của AGPase. Nghiên cứu của Hannah [19] cho thấy sự
tăng cƣờng biểu hiện của gen Sh2 trong các dòng ngô chuyển gen ở điều kiện nhiệt độ cao (trung bình hàng ngày khoảng 330C) làm tăng sản lƣợng ngô
tới 64% nhờ vào việc tăng xác suất phát triển của các hạt ngô dẫn đến tăng
số lƣợng hạt ngô trên một bắp. Ở các loài hoang dại, tỷ lệ các hạt phát triển
trên số lƣợng phôi thực tế chỉ đạt ~50%, vì vậy việc tăng tần số phát triển
hạt là một mục tiêu khả thi trong nông nghiệp, đặc biệt trong điều kiện nhiệt
6
độ cao…
Hình 1: Một số enzyme quan trọng trong quá trình chuyển hóa sucrose thành tinh bột [12]
Tóm lại, thông qua các nghiên cứu chúng tôi nhận thấy: Một trong các
enzyme đóng vai trò then chốt trong quá trình sinh tổng hợp tinh bột là ADP –
glucose pyrophosphorylase (AGPase). Đặc điểm của các gen mã hóa AGPase
trong các cơ quan tổng hợp cũng nhƣ tích trữ của ngô đã đƣợc nghiên cứu và
cho thấy AGPase có cấu trúc tứ phân, gồm hai tiểu đơn vị nhỏ, mã hóa bởi gen
Brittle2 (Bt2), và hai tiểu đơn vị lớn, mã hóa bởi gen Shrunken2 (Sh2) [20].
Dựa trên cơ sở này có thể tiến hành tạo ra dòng ngô tăng cƣờng khả năng tổng
hợp tinh bột nhờ chuyển các bản copy của gen Sh2 và Bt2 vào ngô.
1.3 Các phƣơng pháp chuyển gen thƣờng sử dụng
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đƣa một gen lạ (một đoạn ADN, ARN)
vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở dạng plasmid trong tế bào chủ hoặc
gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế bào chủ. Gen lạ
7
trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc
điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của những cơ thể chuyển
gen.
Cây đƣợc chuyển nạp gen mục tiêu đƣợc gọi là “cây chuyển gen” có hai
phƣơng pháp chuyển nạp gen: chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens [33], và chuyển gen trực tiếp: theo phƣơng pháp vi tiêm (microinjection)
[16], phƣơng pháp xung điện [23], phƣơng pháp bắn gen (biolistic) [32], phƣơng
pháp chuyển qua ống hạt phấn [25] và một số kỹ thuật khác.
1.3.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens [33]
A. tumefacien (Agrobacterium tumefaciens) là loài vi khuẩn đất, có
dạng hình gậy, kích thƣớc 2.5-3.0 x 0.7-0.8 mm, dạng đơn bào, không tạo ra
bào tử, có vỏ và lông roi, là vi khuẩn hiếu khí, nhuộm gram (-) ,khuẩn lạc tròn
và rìa nhẵn. Khuẩn lạc màu trắng kem, nhẵn, bóng, tròn, nhỏ, rìa đều đặn và có
màu xanh da trời nhạt sau đó đậm dần trên môi trƣờng chỉ thị D2M.
* Cơ chế xâm nhập của vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào thực vật.
Cơ chế gây bệnh của các A. tumefaciens là sau khi xâm nhiễm vào tế
bào, chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn
đến sự rối loạn các chất sinh trƣởng nội sinh, tạo ra khối u. Khả năng chuyển
gen này đã đƣợc khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế
bào thực vật theo ý muốn.
Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A. tumefaciens
phải tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thƣơng. Quá trình này đƣợc thực
hiện nhờ các gen chvA và chvB. Gen chvB mã hóa một protein liên quan đến
hình thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một
protein vận chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein vận
chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan nào khoảng giữa thành tế bào và màng
sinh chất. β-1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp
xúc với thành tế bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự
8
dẫn truyền T-DNA.
Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-
DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá
trình cắt T-DNA khỏi Ti-plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà
chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào
chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào gen
của cây chủ.
Thực chất chỉ riêng T-DNA của Ti-plasmid đƣợc chuyển vào gen tế bào
thực vật. Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của các gen vir (vùng vir) và
gen chv quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên T-DNA. Tuy
nhiên, chuỗi DNA 25 bp (Right border (RB) và Left border (LB) của T-DNA)
có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, đặc
biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật. Chúng
hoạt động nhƣ các tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền. Trƣớc
hết gen virA trong tổ hợp gen vùng vir đƣợc phosphoryl hóa nhờ tác động của
các hợp chất phenol nhƣ acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật
tổn thƣơng. Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG.
Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà
hai gen cuối cùng đƣợc hoạt hóa là gen virB và virE.
Trƣớc đó, khi gen virD đƣợc hoạt hóa, sản phẩm của nó cảm ứng nhận
biết RB và LB của T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của Ti-
plasmid thành các sợi đơn. Đồng thời quá trình phosphoryl hóa này cũng làm
thay đổi áp suất thẩm thấu màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra và bị
thủng. Các sợi đơn T-DNA đƣợc gắn vào protein do gen virE tổng hợp và dịch
chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn. Ngay sau đó, sợi T-DNA đƣợc trƣợt từ
vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cầu nối chính là sự tiếp hợp giữa hai tế bào do
cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành. Khi T-DNA đã đƣợc chuyển giao vào tế
bào thực vật, chúng nhanh chóng hợp nhất trong gen tế bào thực vật để ổn định
và di truyền nhƣ các gen bình thƣờng khác.
Ƣu điểm: chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium đơn giản, ít tốn
9
kém, phù hợp với điều kiện nhiều phòng thí nghiệm ở Việt Nam.
1.3.2 Chuyển gen trực tiếp
Chuyển gen bằng súng bắn gen [32]
Ngâm những viên đạn nhỏ (vi đạn) bằng vàng hoặc tungsten có kích
thƣớc cực nhỏ, đƣờng kính khoảng 0,5 - 1,5 m với dung dịch có chứa đoạn
ADN ngoại lai cần chuyển vào tế bào thực vật. Các vi đạn này đƣợc làm khô
trên một đĩa kim loại mỏng có kích thƣớc 0,5 - 0,9 cm. Đĩa kim loại này đƣợc
gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) bằng nhựa, hoặc vật liệu nhẹ.
Khi bắn, áp suất hơi sẽ đẩy viên đạn đi với tốc độ cao. Tới đầu nòng súng, viên
đạn lớn sẽ bị cản lại bởi một lƣới thép mịn, còn các viên đạn nhỏ (vi đạn) vẫn
tiếp tục di chuyển với tốc độ lớn tới 1300 m/giây đến đối tƣợng bắn rồi rồi
xuyên vào tế bào. Sau khi bắn, tách các mô, tế bào và nuôi cấy invitro để tái
sinh cây. Ngƣời ta thƣờng dùng khí nén là helium áp lực cao để bắn gen.
Ƣu điểm: chuyển gen bằng phƣơng pháp sung bắn gen thao tác dễ dàng,
bắn một lần đƣợc nhiều tế bào. Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào
nuôi cấy, tế bào mô hóa và mô phân sinh)
Nhƣợc điểm: phƣơng pháp chuyển gen bằng súng bắn gen có tần số biến
nạp ổn định thấp vì nghiên cứu các gen tạm thời.3
Chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm [16]
Phƣơng pháp này sử dụng vi kim tiêm và kính hiển vi để đƣa ADN
những tế bào nhất định, nhằm tạo ra các dòng biến nạp từ protoplast và cây
biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn.
Ƣu điểm: Phƣơng pháp chuyển gen bằng vi tiêm có thể tối ƣu lƣợng
ADN đƣa vào tế bào. Phƣơng pháp này giúp quyết định đƣợc đƣa ADN vào
loại tế bào nào. Có thể đƣa một cách chính xác thậm chí vào tận nhân và có thể
quan sát đƣợc. Các tế bào có cấu trúc nhỏ nhƣ hạt phấn và tế bào tiền phôi mặc
dù hạn chế về số lƣợng cũng có thể tiêm chính xác. Có thể nuôi riêng lẻ 3ác tế
bào vi tiêm và biến nạp đƣợc vào mọi giống cây.
Nhƣợc điểm: Trong phƣơng pháp này, mỗi lần tiêm chỉ với một tế bào,
10
thao tác trong khi làm đòi hỏi độ chính xác cao.
Chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện [23]
Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gen vào tế bào trần protoplast. Sau khi
tạo protoplast, tiến hành trộn protoplast với plasmid tái tổ hợp mang gen mong
muốn để tạo hỗn hợp dạng huyền phù. Cắm đầu siêu âm của máy xung điện
ngập trong hỗn hợp huyền phù sâu khoảng 3 mm. Cho máy phát xung điện với
tần số 20 KHz theo từng nhịp ngắn, mỗi nhịp khoảng 100 mili giây. Số nhịp
khoảng từ 6 - 9 nhịp với tổng thời gian tác động từ 600 - 900 mili giây.
Sau khi siêu âm, đem protoplast nuôi trong các môi trƣờng thích hợp,
chọn lọc để tách các protoplast đã đƣợc chuyển gen. Nuôi cấy invitro để tái
sinh cây. Chọn lọc cây và đƣa ra trồng ở môi trƣờng ngoài.
Ƣu điểm của phƣơng pháp: phƣơng pháp cho phép chuyển đƣợc lƣợng
protoplast nhiều, không độc hại đối với tế bào.
Nhƣợc điểm: phƣơng pháp này có giá thành thiết bị tƣơng đối cao, đồi hỏi
kỹ thuật cao.
Chuyển gen qua ống phấn [25]
Phƣơng pháp chuyển gen qua ống phấn là phƣơng pháp chuyển gen không
qua nuôi cấy mô invitro. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là ADN ngoại lai
chuyển vào cây theo đầu ống phấn, chui vào bầu nhụy cái. Thời gian chuyển
gen vào lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy và lúc bắt đầu đƣa tinh tử vào thụ tinh,
tốt nhất là sự chuyển gen xảy ra đúng khi quá trình thụ tinh ở noãn và cho tế
bào hợp tử chƣa phân chia.
Nhƣợc điểm: phƣơng pháp này đòi hỏi kỹ thuật cao, phụ thuộc nhiều vào
kinh nghiệm của ngƣời tiến hành.
1.4 Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở ngô
1.4.1 Các nghiên cứu chuyển gen trên thế giới
Hiện nay, có nhiều phƣơng pháp chuyển gen đƣợc các nhà khoa học sử
dụng để chuyển gen vào thực vật trong đó phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi
khuẩn A. tumefaciens đem lại hiệu quả cao và ít tốn kém nhất. Đối với cây ngô,
11
trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu chuyển gen thông qua A.
tumefaciens vào mô sẹo từ đoạn cây con [34], mô sẹo từ lá [5]; mô sẹo từ mô
phân sinh chồi [31] phôi non [13; 14; 21; 38; 37], phôi non và phôi từ mô sẹo
[27]…
Ombori và cộng sự [27] đã tiến hành chuyển vector pTF102 và
pBECK2000.4 sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens EHA 101, LBA4404 vào
callus phôi ngô một số dòng CML78, CML216, CML331, TL18, TL27,
MU25, A188, H627 và PTL02. Các tác giả đánh giá cây chuyển gen bằng
phƣơng pháp PCR kiểm tra sự có mặt của gen gus, gen bar và lai Southern.
Nghiên cứu đã chọn ra đƣợc các dòng cây chuyển gen với hiệu suất chuyển
gen thành công là 1,4%. Takava và cộng sự [35] đã chuyển vector
pCAMBIA3301 vào 4 dòng ngô thuần S61, B73, Mo17, A188 và 2 dòng ngô
lai HiIIB và HiIIC thông qua vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404. Các tác giả
đã lấy phôi có kích thƣớc trung bình từ 1.5 đến 2 mm đồng nuôi cấy với vi
khuẩn A. tumefaciens LBA4404 trong 72 giờ (3 ngày) và sử dụng MES,
timentin và PPT để diệt và chọn lọc mẫu đƣợc gây nhiễm, tạo callus và tái sinh
cây. Hai dòng S61 và A188 cho kết quả tái sinh cao nhất. PCR để phát hiện
gen gus và bar trong hệ gen của cây tái sinh. Tần số xuất hiện hai gen này là
6.45% đối với dòng S61. Vega và cộng sự [37] đã chuyển vector
pCAMBIA3301 và pZY101 vào dòng Hi-II vào phôi non, thời gian đồng nuôi cấy là 3 ngày ở nhiệt độ 200C trên môi trƣờng đồng nuôi cấy bổ sung 100 µM
acetosyringone. Tần số trung bình chuyển gen thành công là 12% và tỉ lệ cao
nhất là 18%. Ishida và cộng sự [21] đã đƣa ra một protocol hoàn chỉnh có thời
gian là 3 tháng bắt đầu từ lúc gây nhiễm và đồng nuôi cấy vào phôi non của
ngô. Theo phƣơng pháp này, 50% phôi non dòng A188 và 15% phôi non dòng
A634, H99 và W117 đã đƣợc chuyển gen thành công. Nửa số cây tái sinh từ
phôi non này cho hy vọng sẽ tạo ra thế hệ thứ 2 và thứ 3. Hơn 90% số cây
chuyển gen có kiểu hình cũng nhƣ tính trạng nông học bình thƣờng. Cũng
chuyển gen vào phôi non, Frame và cộng sự [13; 14] đã xây dựng đƣợc một
quy trình chuyển gen đối với 2 dòng ngô Hi-II và B104. Trong quy trình này,
12
tác giả đã không sử dụng A. Tumefaciens đƣợc nuôi lỏng lần 2 với OD600= 0,6
– 0,8 mà tác giả sử dụng trực tiếp khuẩn lạc đƣợc hòa tan trong môi trƣờng tạo
callus để dung dịch đạt tới OD550= 0,3 – 0,4. Năm 2010, Anima và cộng sự [6]
cũng chuyển hai vector pXBb7-SI-UBIL và pBbm42GW7_GUS vào phôi non
của 3 dòng ngô TL26, CML216 và CML244 với môi trƣờng đồng nuôi cấy có
nồng độ cao hơn các nghiên cứu khác (200 µM acetosyringone) và cũng tạo ra
đƣợc cây chuyển và đời con lai của các dòng chuyển gen trên. Cùng với mục
đích chuyển gen tăng năng suất của cây ngô, các nhà khoa học Trung Quốc đã
dùng kỹ thuật gen tác động vào ADP-glucose pyyrophosphorylase (AGPase)
nhằm tăng quá trình tổng hợp từ glucose thành tinh bột. Wang và cs [38] đã
chuyển vector CAMBIA3301 mang gen glgC vào phôi non của dòng Zong3,
sau 3 thế hệ cho thấy hàm lƣợng tinh bột trong hạt đã tăng từ 13 đến 25%.
Tuy nhiên các nghiên cứu chuyển gen vào phôi non còn gặp một số hạn
chế khó khắc phục nhƣ: thao tác trên phôi non cho tỷ lệ cây bị dị hình cao do
phôi ngô phải trải qua nhiều giai đoạn mới tái sinh. Mặt khác khả năng tái sinh
thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo có nguồn gốc phôi non phụ thuộc vào dạng mô
sẹo và kiểu gen, không phải giống ngô nào cũng cho khả năng tái sinh tốt.
Thêm nữa là thời gian chuyển gen vào phôi non (từ khi xử lý phôi với A.
tumefaciens mang gen đích đến tái sinh và chuyển cây ra đất) phải mất khoảng
trên 3 tháng mới tạo đƣợc cây, nếu tính cả thời gian trồng ngô để lấy phôi thì
phải mất tới 6 tháng [21]. Ngoài ra còn các yếu tố khách quan khác đem lại
nhƣ: cây ngô một năm chỉ cho hai vụ thu hoạch nên thí nghiệm bị hạn chế bởi
thời gian và phôi sử dụng thƣờng có độ tuổi từ 10 đến 20 ngày sau thụ phấn
nên phôi ngô thu đƣợc cũng hạn chế và không tiến hành đƣợc trong thời gian
dài vì thế khó thực hiện đƣợc nhiều thí nghiệm.
Khắc phục các nhƣợc điểm trên, Li và cộng sự [24] đã nghiên cứu
chuyển gen Bt2 và Sh2 vào mô phân sinh cây ngô non của dòng ngô DH4866
sử dụng vi khuẩn A. Tumefaciens đã đem lại hiệu quả khá cao, khoảng 10%
các cây non xử lý đƣợc chuyển gen. Năm 2012, Wang và cộng sự [39] đã sử
dụng mô phân sinh chồi của hai dòng ngô cận giao Tian Tawu và 7922 để
13
chuyển gen mã hóa phytoene synthase (psy) thông qua A. tumefasciens.
Phƣơng pháp này làm giảm thời gian trong nuôi cấy mô truyền thống và đã
chứng tỏ đây là phƣơng pháp chuyển gen đơn giản.
1.4.2 Các nghiên cứu chuyển gen trong nước
Các nhà khoa học trong nƣớc cũng có một số nghiên cứu chuyển gen
vào cây ngô nhƣng chủ yếu tập trung vào tạo ra các giống ngô chịu hạn. Năm
2007, Phạm Thị Lý Thu đã nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non
và xác định phƣơng pháp chuyển gen thích hợp cho hai dòng ngô HR8 và
HR9, tác giả nhận định rằng chuyển gen bằng súng bắn gen có hiệu quả cao
nhất đối với hai dòng ngô nghiên cứu [3]. Đinh Văn Trình và cộng sự [4] đã
nghiên cứu chuyển gen chịu hạn ZmDREB2A vào cây ngô bằng phƣơng pháp
xử lý râu ngô với dung dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium mang vector
chuyển gen trƣớc khi thụ phấn. Trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu chuyển
gen nâng cao tính chịu hạn vào một số dòng ngô bố mẹ đang đƣợc áp dụng
trong sản xuất”, mã số KC.04.02/11-15 do TS. Bùi Mạnh Cƣờng làm chủ
nhiệm, nhóm nghiên cứu đã bƣớc đầu chuyển thành công 3 gen chịu hạn
HVA1, ZmDREB2A và CspB vào những dòng ngô thuần có khả năng tái sinh
cao thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Mới đây, Nguyễn Văn
Đồng và cộng sự [4] đã nghiên cứu chuyển gen chịu hạn NF-TB2 vào một số
dòng ngô. Hiện nay, trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu tọ dòng ngô bố mẹ
đƣợc tăng cƣờng khả năng tổng hợp tinh bột bằng công nghệ gen của PGS. TS
Nguyễn Đức Thành làm chủ nhiệm, nhóm nghiên cứu đã bƣớc đầu tạo đƣợc
một số dòng ngô chuyển gen mang gen Sh2 với hiệu suất chuyển gen từ 1,08
14
% đến 1,77%.
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu và hóa chất nghiên cứu
2.1.1 Vật liệu
Hạt của các dòng ngô bố mẹ H20, H26, H95, và H240 do Viện Nghiên
cứu ngô cung cấp. Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang
vector chuyển gen pCambia2300-Ubi-Bt2 (Hình 2) do phòng Di truyền tế bào
thực vật – Viện Công nghệ Sinh học cung cấp [2]. Cây mang gen sẽ có gen
điều khiển là promoter ubiquitin (promoter đặc hiệu cho các cây một lá mầm),
gen Bt2: gen tăng cƣờng tổng hợp tinh bột, gen chọn lọc là kanamycin, CaMV:
gen điều khiển, NPTII: gen kháng kanamycin, CaMV poly (A) signal: trình tự
kết thúc.
Ubi: promoter Ubiquitin; Bt2: gen Brittle 2; Tnos: trình tự kết thúc; CaMV:
Promoter CaMV35S; NPTII: gen kháng kháng sinh kanamycin; RB: bờ phải;
LB: bờ trái; CaMV poly A signal: trình tự kết thúc.
Hình 2: Cấu trúc chuyển gen pCambia2300-Ubi-Bt2;
Mồi Bt2F: 5’-GCGGATCCACCATGGACATGGCTTTG-3’ có chứa
trình tự điểm cắt của enzyme BamHI.
Mồi Bt2R: 5’- GCGAGCTCAAGCTTCATGTCGCACGT-3’ có chứa
trình tự điểm cắt của enzyme SacI.
Mồi UbiF: 5’ TACTGCAGGTGCAGCGTGACCCG 3’ có chứa trình tự
điểm cắt của enzyme PstI.
Mồi UbiR: 5’TAGGATCCTGCAGAAGTAACACCAAACAA 3’ có
chứa trình tự điểm cắt của enzyme BamHI.
Các mồi Bt2F, Bt2R, UbiF, UbiR đặc hiệu đƣợc thiết kế từ đầu để tách
dòng gen (…) đƣợc chúng tôi sử dụng để kiểm tra sự có mặt của gen trong cây
15
chuyển gen.
2.1.2 Hóa chất
Hóa chất dùng trong nuôi cấy mô bao gồm:
MS I stock: pha 33 g NH4NO3; 38 g KNO3; 7,4 g MgSO4 trong 1 lít
nƣớc cất vô trùng.
MS II stock: pha 33,202 g CaCl2 trong 1 lít nƣớc cất vô trùng.
MS III stock: pha 17 g KH2PO4 trong 1 lít nƣớc cất vô trùng.
MS IV stock: pha 0,62 g H3PO4; 0,86 g ZnSO4.7H2O; 1,69 g
MnSO4.H2O trong 1 lít nƣớc cất vô trùng.
MS V stock: pha 0,25 g Na2MoO4.2H2O; 0,025 g CuSO4.2H2O; 0,025 g
CoCl2.6H2O; 0,83 g KI trong 1 lít nƣớc cất vô trùng.
MS VI stock: pha 3,726 g Na2EDTA; 2,78 g FeSO4.7H2O trong 1 lít
nƣớc cất.
MS VII stock: pha 0,5 g nicotinic acid; 0,5 g Pyridoxine-HCl; 0,1 g
Thiamine-HCl; 2 g Glycine trong 1 lít nƣớc cất vô trùng.
MS VIII stock: pha 10 g Myo-inositol trong 1 lít nƣớc cất vô trùng.
Môi trƣờng MS: hòa tan 50 ml MS I stock, 10 ml MS II stock, 10 ml MS
III stock, 10 ml MS IV stock, 1 ml MS V stock , 10 ml MS VI stock, 1 ml MS
VII stock, 10 ml MS VIII stock, 30 mg sucrose vào 1 lít nƣớc cất. Môi trƣờng
đƣợc chuẩn pH= 5.8 sau đó khử trùng và bảo quản ở nhiêt độ phòng.
100 mM acetosyringone: hòa tan 392,4 mg acetosyringone trong 10 ml
dimethyl sulfoxide. Dung dịch hòa tan đƣợc lọc trong cột lọc vô trùng và bảo quản trong tối ở 40C.
Rifampicin: hòa tan 50 mg rifapicin trong 1 ml dimethyl sufoxide. Dung
dịch hòa tan đƣợc lọc trong cột lọc vô trùng và bảo quản ở -200C.
Cefotaxime: hòa tan 1 g cefotaxime trong 5 ml nƣớc cất khử trùng.
Dung dịch hòa tan đƣợc lọc trong cột lọc vô trùng và bảo quản ở -200C.
LB: pha 25 g Luria- Bertani trong 1 lít nƣớc cất. Khử trùng môi trƣờng ở
nhiệt độ 1210C trong 15 phút.
Hoá chất tách chiết DNA từ các cây ngô chuyển gen theo mô tả của
16
Shaghai Maroof và đồng tác giả (1984 )[30]
Hoá chất tách chiết DNA bao gồm các loại sau: Nitơ lỏng, tris-HCl,
EDTA, SDS, NaCl, CTAB, chloroform, isopropanol, isoamyl alcohol, ethanol,
phenol, RNase của các hãng Sigma, Merck, Labscan.
Pha đệm CTAB: CTAB 1% (w/v); EDTA 0,01 M; NaCl 0,72 M; Tris-
HCl 0,1 M; β-mecaptone 0,02% (v/v).
Hóa chất thực hiện phản ứng PCR bao gồm buffer PCR 1X của Quiagen
hoặc Invitrogen; dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) của Fermentas; taq
polymerase của Fermentas, H2O đƣợc khử ion.
Hóa chất điện di bao gồm các loại nhƣ: Bromophenol blue, ethidium
bromide, agarose, marker 1 kb của hãng Fermentas.
Các dung dịch đệm sử dụng trong lai Southern:
Dung dịch biến tính (denaturation solution): 1,5M NaCl; 0,5M NaOH
Dung dịch trung hòa (Neutralization solution): 1,5 M NaCl; 0,5 M Tris
HCl pH 7,2; 1 mM EDTA.
Dung dịch SSC 20X (Blotting buffer): 3 M NaCl; 0,3 M Na3C6H5O7
(Sodium citrate) pH 7; SSC 6X; SSC 2X; SSC 0,1X.
Dung dịch Denhart 100X: 2% (w/v) BSA, 2% (w/v) Ficoll, 2% (w/v)
polyvinypyrrolidone.
Dung dịch tiền lai: SSC 6X, Denhart 5X, 50 % formamide, 0,5 % SDS,
100 mg/ml DNA tinh dịch cá hồi.
Màng lai Magna Charge Nylon, giấy lọc, giấy thấm, hộp nhựa.
Sản phẩm PCR của gen Bt2 tách từ plasmid pCambia 2300 – Ubi – Bt2
đƣợc tinh sạch theo kit tinh sạch #K0691.
Kit gắn đầu dò: Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit.
Kit phát hiện: Biotin Chromogenic Detection Kit gồm các dung dịch sau:
Dung dịch Blocking/Washing 1X: pha với tỷ lệ 1 dung dịch
blocking/washing 10X với 9 nƣớc deion tạo dung dịch 1X.
Dung dịch Blocking 1%: pha dung dịch blocking reagent với dung dịch
Blocking /washing 1X để thu đƣợc dung dịch blocking 1% (v/v) cần dùng.
Dung dịch streptavidin – Alkaline phosphatase 1X: Pha loãng 4 µl dung
17
dịch streptavidin – Alkaline phosphatase 5000X trong 20 ml blocking 1%.
Dung dịch buffer hiện 1X: hòa 1 thể tích dung dịch hiện 10X trong 9 thể
tích nƣớc.
Dung dịch cơ chất: hòa 1 thể tích dung dịch cơ chất BCIP/NBT với 49
thể tích buffer hiện đã pha loãng.
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Chuyển gen vào các dòng ngô
Khử trùng mẫu: Các hạt ngô mẩy, có màu vàng sáng đƣợc chọn làm vật
liệu để chuyển gen. Chúng tôi tiến hành khử trùng các hạt đã đƣợc chọn lựa
trong cồn 70% trong 10 phút và dung dịch nƣớc Javen 5% trong 20 phút. Các
hạt sau khi khử trùng đƣợc gieo cấy trên môi trƣờng MS [26] có bổ sung 30 g/l
sucrose và 8 g/l agar cho hạt nảy mầm.
Chuẩn bị dịch khuẩn: Chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 mang
vector chuyển gen pCambia2300-Ubi-Bt2 [2] đƣợc nuôi lỏng trong môi trƣờng
LB có bổ sung kanamycin (50 mg/l) và rifampicin (50 mg/l) trong tủ ổn nhiệt 28oC. Sau đó ly tâm để thu cặn tế bào và hòa tan trong môi trƣờng ½ MS đến
khi đạt OD600= 0,6-1,0 đƣợc sử dụng để chuyển gen.
Gây nhiễm: các cây ngô non sau 3 – 5 ngày nuôi cấy cao khoảng 3 - 4
cm đƣợc bóc bỏ lá bao mầm để lộ ra mô phân sinh đỉnh ngọn sau đó tiến hành
tạo vết thƣơng trên mô phân sinh đỉnh ngọn bằng dao cấy sắc và ngâm trong
dung dịch khuẩn A. tumefaicens mang gen Bt2. Thí nghiệm gây nhiễm đƣợc
tiến hành ở điều kiện bình thƣờng trong các khoảng thời gian khác nhau: 2, 4
và 16 giờ (qua đêm).
Đồng nuôi cấy: Sau gây nhiễm các cây non xử lý đƣợc chuyển sang môi
trƣờng đồng nuôi cấy MS có bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar và 100 µM
acetosyringone, nuôi trong điều kiện tối 3 - 5 ngày.
Diệt khuẩn và chọn lọc các cây chuyển gen: Cấu trúc vector chuyển gen
pCambia2300-Ubi-Bt2 có chứa gen chọn lọc nptII kháng kháng sinh
kanamycin vì vậy chúng tôi lựa chọn kháng sinh kanamycin làm kháng sinh
18
chọn lọc cây chuyển gen. Các cây sau khi xử lý gây nhiễm khuẩn và đồng nuôi
cấy đƣợc tiến hành diệt khuẩn và chọn lọc trên trƣờng có chứa cefotaxime và
kanamycin với thời gian 1 tuần trên môi trƣờng MS bổ sung 30 g/l sucrose, 8
g/l agar, kanamycin 100 mg/l, cefotaxime 500 mg/l và 1 tuần trên môi trƣờng
MS bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, kanamycin 200 mg/l). Trên môi trƣờng
chọn lọc chứa kanamycin, các cây chuyển gen sẽ sinh trƣởng bình thƣờng,
không bị bạch tạng (cây chuyển gen T0), các cây không đƣợc chuyển gen sẽ bị
bạch tạng.
2.2.2 Đánh giá các cây chuyển gen bằng PCR
2.2.2.1 Tách chiết DNA tổng số
Các cây ngô sinh trƣởng bình thƣờng trên môi trƣờng chọn lọc (cây
chuyển gen T0) đƣợc chuyển ra trồng trong nhà lƣới, sau đó tiến hành thu mẫu
lá và tách DNA tổng số theo phƣơng pháp CTAB của Saghai Maroof và cộng
sự [30].
Quy trình thực hiện gồm các bƣớc:
Lá của các giống ngô đƣợc cắt làm mẫu, sau đó nghiền mẫu lá trong nitơ
lỏng bằng cối chày sứ. Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 ml; thêm 0,7 ml đệm CTAB đã làm ấm ở 650C trong 10 phút. Để các ống trong bể ổn nhiệt ở điều kiện 650C trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhƣng dứt khoát 15 phút một lần
để việc tách có hiệu quả. Chuyển các ống ở bể ổn nhiệt ra để ở nhiệt độ phòng
5 phút. Thêm 0,7 ml dung dịch Chloroform/ Isoamyl alcohol (24: 1), lắc ống
nhẹ nhàng 10 phút. Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Dùng pipetman hút lớp trên cùng sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm
Isopropanol theo tỉ lệ 1: 1. Sau đó xoay ống nhẹ nhàng vài phút. Để mẫu ở tủ - 200C trong 1 giờ. Ly tâm tốc độ 10.000 vòng/ phút trong 10 phút. Bỏ phần dịch
phía trên thu lấy tủa. Rửa tủa bằng cồn 70 % lạnh. Sau đó, thổi khô và hoà tan
tủa bằng 0,5 ml TE pH 8,0. Bổ sung RNase đã đƣợc đun cách thuỷ trong 20 phút, sau đó ủ ở 370C trong 180 phút. Bổ sung hỗn hợp Phenol/ Chloroform/
Isoamyl alcohol (25: 24: 1) theo tỉ lệ 1: 1, lắc nhẹ trong 10 phút. Ly tâm với
tốc độ 10.000 vòng/ phút. Hút phần dịch trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới,
19
thêm 0,5 ml dung dịch chloroform/ isoamyl alcohol (24: 1), lắc ống nhẹ nhàng
10 phút. Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/ phút trong 10 phút. Hút dịch nổi sang
ống mới. Thêm cồn tuyệt đối lạnh theo tỉ lệ cồn: mẫu (2: 1) vào dịch nổi, bổ
sung 15 μl NaCl 5 M sau đó lắc nhẹ. Ly tâm hỗn hợp 10.000 vòng/ phút trong
10 phút. Bỏ phần dịch nổi phía trên, thu tủa và rửa tủa bằng cồn 70 % lạnh.
Thổi khô tủa trong 20 phút ở Laminar. Sau đó hoà tan tủa bằng TE. Giữ mẫu trong tủ 40C.
2.2.2.2 PCR kiểm tra sự có mặt của các đoạn gen chuyển nạp Bt2, Ubi
DNA tổng số đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho PCR kiểm tra sự có
mặt của các đoạn gen Bt2, Ubi
Kiểm tra sự có mặt của gen Ubi, Bt2 trong các cây ngô chuyển gen.
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với hỗn hợp phản ứng 20 µl gồm 1 µl
DNA tổng số (25 ng/µl); 13,4 µl H2O; 2,0 µl Buffer 10X PCR; 2,5 µl dNTP (1
mM); 0,5 µl mồi F (50 ng/μl); 0,5 µl mồi R (50 ng/μl); 0,1 µl enzyme Taq polymerase (5 U/μl). Điều kiện phản ứng PCR nhƣ sau: 940C trong 4 phút; 35 chu kỳ của 1 phút 940C; 1 phút 580C (gen Ubi); 1 phút 550C (gen Bt2); 2 phút 720C và bƣớc cuối cùng 720C trong 5 phút.
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
2.2.3 Đánh giá các cây chuyển gen bằng lai Southern
Các cây chuyển gen T0 dƣơng tính sau khi kiểm tra sự có mặt của gen
Bt2 bằng PCR đƣợc tiến hành kiểm tra bằng lai Southern theo hƣớng dẫn của
kit K0661 của fermantas. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
Điện di sản phẩm cắt DNA bằng enzyme giới hạn
DNA tổng số đƣợc xử lý với các enzyme giới hạn SacI trƣớc khi điện di
chuyển màng. Gel sử dụng chuyển màng là gel agarose 1% kích thƣớc 10x7
cm, điện di trong đệm TBE 1X ở hiệu điện thế là 20 V trong 8 giờ, mỗi giếng
tra 15 µl mẫu. Sau đó, marker đƣợc cắt đem nhuộm trong ethidium bromide
trong khoảng 10 phút, rửa sạch và chụp gel lấy lại hình ảnh. Phần gel còn lại
20
chứa các mẫu sẽ đƣợc làm biến tính trƣớc khi chuyển lên màng.
Chuyển DNA từ gel lên màng
Gel chứa DNA phải đƣợc làm biến tính trƣớc khi chuyển màng. Sau khi
hoàn thành giai đoạn điện di, gel đƣợc giữ trong dung dịch đệm TBE 1X. Các
bƣớc biến tính gel đƣợc thực hiện trên máy lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng. Đầu tiên,
xử lý gel với 50 ml dung dịch HCl 0,25 N trong 15 phút. Rửa lại gel bằng nƣớc
cất vô trùng, sau đó gel tiếp tục đƣợc xử lý bằng 50 ml dung dịch đệm biến
tính trong 30 phút. Gel đƣợc rửa bằng nƣớc cất vô trùng trƣớc khi trung hoà
bằng 50 ml dung dịch đệm trung hòa. Bƣớc này cũng đƣợc tiến hành trong 30
phút, trong thời gian này chuẩn bị màng, dung dịch chuyển, khay nhựa, giấy
thấm, hệ thống mao dẫn và các dụng cụ cần thiết khác.
Khay đƣợc đổ đầy dung dịch SSC 20X, bên trong khay có 1 tấm nhựa
đƣợc đặt làm cầu. Giấy lọc đƣợc phủ lên trên tấm nhựa làm cầu, 2 đầu giấy lọc
nhúng chìm trong dung dịch SSC 20X. Làm ƣớt đều giấy lọc bằng dung dịch
SSC 20X, sau đó đặt gel agarose lên trên giấy lọc, mặt trên để úp xuống phía
dƣới. Hệ thống chuyển màng đƣợc sắp sếp nhƣ sau: gel - màng nilon - giấy lọc
(2-3 miếng). Bọt khí nằm giữa các lớp này đƣợc loại bỏ bằng que thuỷ tinh.
Một lớp giấy thấm dày đƣợc đặt lên phía trên của hệ thống, và cuối cùng đặt 1
tấm nhựa lên trên cùng, phía trên chặn 1 quyển sách nhỏ để giữ hệ thống và tạo
lực mao dẫn. Hệ thống chuyển màng kéo dài qua đêm ở nhiệt độ phòng.
* Làm khô và cố định DNA trên màng
Sau 16 giờ, toàn bộ DNA trên gel đƣợc chuyển toàn bộ lên màng. Màng
đƣợc lấy khỏi hệ thống và đƣợc rửa trong dung dịch SSC 2X trong 10 phút,
làm khô ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. DNA đƣợc cố định trên lớp màng bằng
cách chiếu đèn UV với cƣờng độ 365 nm trong 20 giây.
* Chuẩn bị mồi dò gắn biotin
Mồi dò có gắn biotin đƣợc chuẩn bị trong ống 1,5 ml với các thành phần
sau: 10 μl sản phẩm gen Bt2 tinh sạch, 10 μl Decanucleotide in 5X Reaction
Buffer, cho thêm nƣớc khử nuclease đến 44 μl. Lắc đều, ly tâm 3 – 5 giây cho
mẫu không bám dính vào thành ống. Ủ trong nƣớc sôi 5 – 10 phút, làm lạnh
21
ngay trong đá, ly tâm 3 – 5 giây để thu mẫu xuống dƣới đáy ống. Tiếp tục bổ
sung các thành phần sau vào trong ống: 5 μl Biotin label mix, 1 μl Klenow fragment exo (5 u). Trộn đều, ly tâm 3 – 5 giây để thu mẫu, ủ mẫu ở 37oC
trong 20 giờ. Phản ứng đƣợc dừng bằng cách bổ sung 1 μl 0,5 M EDTA, pH 8.
* Lai Southern Biến tính DNA tinh dịch cá hồi bằng cách ủ ở 100oC trong vòng 5
phút, làm lạnh ngay trong đá 2 phút và bổ sung vào dung dịch tiền lai cho tới nồng độ 50 – 100 μg/ml. Dung dịch lai (0,2 ml/cm2 màng) đƣợc làm nóng đến 42oC. Sau đó đặt màng lai vào trong khay chứa dung dịch, lắc đều ở 42oC trong 4 giờ.
Đổ bỏ dung dịch tiền lai, thay bằng dung dịch lai đã bổ sung DNA tinh
dịch cá hồi và DNA gắn đầu dò (nồng độ tinh dịch cá hồi là 100 μg/ml và DNA gắn đầu dò 100 ng/ml), ủ mẫu ở 42oC qua đêm, lắc nhẹ. Rửa lại màng lai
2 lần trong dung dịch SSC 2X + SDS 0,1 % trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, và 2 lần trong dung dịch SSC 0,1X + SDS 0,1 % trong 30 phút ở 60oC. Đổ bỏ
dung dịch, dùng giấy lọc làm khô màng lai.
* Phát hiện
Các đoạn DNA trên màng có tƣơng tác với mẫu dò sẽ hiện trên màng
thông qua việc sử dụng kit dò. Các bƣớc hiện màng cũng đƣợc thực hiện trên
máy lắc ở nhiệt độ phòng (rửa, ủ mẫu). Màng lai trƣớc tiên đƣợc rửa với 30 ml
dung dịch Blocking/Washing 1X trong 5 phút. Tiếp đến, rửa lại màng lai với
30 ml dung dịch Blocking 1% trong 30 phút. Ủ màng lai với 20 ml dung dịch
streptavidin – Alkaline phosphatase 1X trong 30 phút. Rửa lại màng lai 2 lần
với 60 ml dung dịch Blocking/Washing 1X trong 15 phút. Ủ màng lai trong 20
ml dung dịch hiện 1X trong 10 phút. Ủ màng lai trong bóng tối với 10 ml cơ
chất đã pha loãng, phản ứng enzyme giữa alkaline phosphatase với BCIP/NBT
(5 – Bromo – 4 – Chloro – 3 – idolyl phosphate, p-toluidine salt/Nitro Blue
Tetrazolium) sẽ tạo ra màu ở vị trí mà DNA tƣơng tác với mẫu dò. Kết thúc
quá trình hiện màu, màng đƣợc rửa lại bằng nƣớc deion 2 lần, làm khô ở nhiệt
22
độ phòng và chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Chọn lọc các dòng ngô chuyển gen
Sau khi khử trùng mẫu các hạt đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS, nuôi
trong tối tạo điều kiện tốt nhất cho hạt nảy mầm. Các hạt sau khi nuôi cấy
trong môi trƣờng MS khoảng 3 – 5 ngày nảy mầm cao khoảng 3 - 4 cm (Hình
3A) đƣợc tiến hành tách bỏ lá bao mầm để gây nhiễm Agrobacterium
tumefacien mang gen chuyển. Chúng tôi tiến hành gây nhiễm vi khuẩn vào mô
phân sinh cây ngô trong các khoảng thời gian gây nhiễm khác nhau: 2 giờ, 4
giờ và 16 giờ. Sau gây nhiễm các mô phân sinh đƣợc nuôi cấy trong tối để tạo
điều kiện cho vi khuẩn tiếp tục xâm nhiễm vào mô phân sinh (Hình 3B). Sau
khoảng 3 – 5 ngày đồng nuôi cấy chúng tôi chuyển các cây sang môi trƣờng
Hình 3: Chuyển cấu trúc gen pCambia2300-Ubi-Bt2 vào mô phân sinh cây non một
số dòng ngô. A: Các hạt ngô dòng H95 nảy mầm sau 3-4 ngày vào mẫu; B: mô phân
sinh dòng ngô H95 sau gây nhiễm trong môi trƣờng đồng nuôi cấy; C: các cây ngô
dòng H95 sau chuyển gen phát triển bình thƣờng trong môi trƣờng chọn lọc chứa
kanamycin; D: các cây ngô dòng H95 sau chuyển gen chuyển sang màu trắng (bạch
tạng) trong môi trƣờng chọn lọc chứa kanamycin; E: các cây ngô chuyển gen sau
chọn lọc đƣợc trồng ra đất.
23
nuôi cấy chọn lọc các cây mang gen.
Khi chuyển gen vào phôi ngô D’Halluin và đồng tác giả [11] đã chọn
đƣợc các cây chuyển gen trên môi trƣờng chứa 200 mg/l kanamycin. Kết quả
của các tác giả cho thấy hầu hết các cây tái sinh mang gen kháng kanamycin
đều phát triển bình thƣờng trong môi trƣờng chọn lọc chứa kanamycin, các cây
tái sinh không mang gen kháng kháng sinh thì lá chuyển sang màu trắng (bạch
tạng). Đây chính là cơ sở cho chúng tôi chọn lựa các cây mang gen chuyển
trong nghiên cứu này, vì trong cấu trúc chuyển gen có chứa gen đích (Bt2) và
gen kháng kanamycin.
Sau 8-10 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc có chứa kháng sinh
kanamycin, một số cây vẫn sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng (Hình 3C),
một số cây lá và thân chuyển từ màu xanh sang màu trắng (Hình 3D). Các cây
có lá và thân chuyển sang màu trắng có thể kết luận là những cây không mang
gen chuyển, ngƣợc lại các cây sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng trong môi
trƣờng chọn lọc có thể là những cây mang gen chuyển Bt2. Sau khi các cây
bình thƣờng ra rễ tốt, chúng đƣợc chuyển ra đất để tiếp tục chăm sóc (hình 3E)
và phân tích tiếp. Các cây này đƣợc xem nhƣ các cây chuyển gen khởi đầu T0.
Bảng 1: Kết quả chọn lọc các cây chuyển gen trong môi trường chọn lọc
STT Dòng Số hạt Số Số cây Số cây Số cây Tỷ lệ cây phát
ngô thí hạt non trên phát triển bình
nghiệm nảy gây môi triển thƣờng (cây bố
mầm nhiễm trƣờng bình chuyển gen) mẹ
chọn thƣờng (%)
lọc
1 H95 500 495 490 490 37 7,55
2 H26 500 492 490 490 29 5,91
3 H240 500 494 490 490 12 2,44
24
4 H20 500 493 490 490 18 3,67
Chúng tôi thu đƣợc các cây chuyển gen T0 từ cả bốn dòng ngô H20,
H26, H95 và H240. Kết quả trong bảng 1 cho thấy tỷ lệ các cây phát triển bình
thƣờng (cây chuyển gen) trong môi trƣờng chọn lọc dao động từ 2,44 đến
7,55%. Tỷ lệ cho cây chuyển gen cao nhất là 7,55% ở dòng ngô H95, tỷ lệ thấp
nhất là 2,44% ở dòng ngô H240. Tỷ lệ này thấp hơn tỷ lệ 10% của Li và đồng
tác giả (2010) thu đƣợc khi chọn lọc cây chuyển gen trong 0,1% glufosinate.
Sự khác nhau này có thể là do các kiểu gen ngô khác nhau trong hai nghiên
cứu.
3.2 Đánh giá các cây chuyển gen bằng PCR
96 cây chuyển gen T0 chọn đƣợc trên môi trƣờng chứa 200 mg/l
kanamycin đƣợc chuyển ra trồng trong nhà lƣới. 82 cây sống sót (chiếm
85,42%) đƣợc tiến hành đánh số thứ tự từ 1 dến 82 để thu mẫu lá tách chiết
1 2 3 4 5 6 7 8 M
DNA tổng số
Hình4: Kết quả tách DNA tổng số các dòng ngô sống sót sau chọn lọc cây chuyển
gen.M: DNA marker 1 kb. 1-8: các cây sống sót đƣợc đánh số từ 1 đến 8.
25
DNA tổng số. Các DNA sau tách chiết đƣợc điện di trên gel agarose 1%.
Các mẫu DNA sau tách chiết đƣợc điện di kiểm tra thu đƣợc các băng
vạch có kích thƣớc phù hợp, băng gọn, có thể sử dụng để kiểm tra sự có mặt
của các gen Bt2 bằng PCR và lai Southern.
DNA tổng số của 82 cây T0 đƣợc PCR kiểm tra sử dụng cặp mồi đặc
hiệu Bt2. DNA của các cây dòng T0 mang gen sẽ cho băng có kích thƣớc
khoảng 1,5 kb sau khi điện di trên gel agarose 1%. Hình 5 là kết quả điện di
Hình 5: Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen Bt2 trong một số cây ngô chuyển gen
bằng PCR với mồi đặc hiệu. M: DNA marker 1 kb; 1: Đối chứng dƣơng (DNA
plasmid); W: cây không chuyển gen; 3-14: các cây ngô chuyển gen kiểm tra: trong
đó 4, 5, 7, 10, 14 là các dòng chuyển gen có mang gen Bt2 từ H26 (4, 5), H95 (7, 10)
và H240 (14).
sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Bt2 trên các dòng cây T0.
Từ hình 5 chúng tôi nhận thấy có một số cây chuyển gen mang các đoạn
gen có kích thƣớc 1,5 kb phù hợp với kích thƣớc đoạn gen chuyển. Sau khi
đánh giá 82 cây chuyển gen đời T0 chúng tôi đã thu đƣợc 22 cây chuyển gen
dƣơng tính. Trong đó có 12 cây từ dòng H95, 7 cây từ dòng H26, 3 cây từ
dòng H240. Không có cây nào từ dòng H20 cho kết quả dƣơng tính. Qua đây
chúng tôi có thể nhận xét rằng các cây cho kết quả dƣơng tính sau khi kiểm tra
bằng PCR là các cây có mang gen Bt2 cần chuyển, các cây cho kết quả âm tính
26
không mang gen Bt2. Các dòng cây chọn lọc vẫn sinh trƣởng phát triển bình
thƣờng trong môi trƣờng chọn lọc nhƣng lại cho kết quả âm tính khi kiểm tra
với cặp mồi đặc hiệu Bt2, Ubi. Điều này có thể lý giải rằng: trong quá trình
chuyển gen vào mô phân sinh, cấu trúc gen chuyển vào cây bị đứt gãy chỉ có
đoạn gen kháng kháng sinh chọn lọc đƣợc chuyển vào cây, còn đoạn gen đích
không đƣợc chuyển vào. Vì vậy mà cây không mang gen mà vẫn có khả năng
phát triển trên môi trƣờng chọn lọc.
DNA tổng số của 82 cây T0 đƣợc tiếp tục kiểm tra sự có mặt của gen
Ubi bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu có trình tự nhƣ UbiF/UbiR promoter.
DNA của các dòng cây T0 mang gen sau khi PCR bằng mồi đặc hiệu
UbiF và UbiR sẽ cho các băng có kích thƣớc khoàng 2 kb sau khi điện di trên
gel agarose 1%. Hình 6 là kết quả điện di sản phẩm PCR DNA tổng số của các
Hình 6: Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen Ubi trong một số cây ngô chuyển gen
bằng PCR với mồi đặc hiệu. M: DNA marker 1 kb; 1: Đối chứng dƣơng (DNA
plasmid); W: cây không chuyển gen; 3-14: các cây ngô chuyển gen kiểm tra: trong
đó 4, 5, 7, 10, 14 là các dòng chuyển gen có mang gen Bt2 từ H26 (4, 5), H95 (7, 10)
và H240 (14).
dòng cây T0 với cặp mồi đặc hiệu UbiF và UbiR.
Từ hình 6 chúng tôi nhận thấy có một số cây chuyển gen mang các đoạn
gen có kích thƣớc 2 kb phù hợp với kích thƣớc đoạn gen chuyển. Sau khi đánh
27
giá 82 cây chuyển gen đời T0 chúng tôi cũng thu đƣợc 22 cây chuyển gen
dƣơng tính. So sánh kết quả đánh giá gen Bt2 và Ubi, chúng tôi thấy rằng cả 22
cây mang gen Bt2 đều mang gen Ubi. Trong đó có 12 cây từ dòng H95, 7 cây
từ dòng H26, 3 cây từ dòng H240. Không có cây nào từ dòng H20 cho kết quả
dƣơng tính. Qua đây chúng tôi có thể nhận xét rằng các cây cho kết quả dƣơng
tính sau khi kiểm tra bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu UbiF và UbiR cho
kết quả tƣơng đƣơng với sử dụng cặp mồi đặc hiệu Bt2F và Bt2R. Điều này
chứng tỏ sự có mặt của vector chuyển gen và gen đích trong các cây chuyển
gen T0. Các cây dƣơng tính nhận đƣợc sau khi kiểm tra gen Bt2 và Ubi bằng
PCR sẽ đƣợc coi nhƣ các dòng cây chuyển gen trong các nghiên cứu tiếp theo.
3.3 Đánh giá các cây chuyển gen bằng lai Southern
22 dòng cây T0 dƣơng tính sau khi kiểm tra gen Bt2 bằng PCR đƣợc tiếp
tục đánh giá bằng lai Southern. DNA tổng số của các dòng cây chuyển gen
đƣợc cắt bằng enzyme SacI, thấm truyền lên màng lai và lai với đoạn gen Bt2.
DNA tổng số đƣợc cắt bằng enzyme SacI cho ra các đoạn có kích thƣớc khác
nhau. Đoạn DNA mang gen đƣợc nhận biết khi lai với đoạn gen Bt2 đƣợc gắn
đầu dò và phát hiện trên màng lai. Kết quả cho thấy các dòng cây chuyển gen
nghiên cứu có từ 1 đến 3 bản sao. Hình 7 là kết quả lai Southern một số dòng cây
chuyển gen. Trên hình 7 có thể thấy dòng số2 (từ H240) có 1 bản sao, dòng số 3
và 4 (từ H95) có 2 bản sao và dòng số 5 (từ H26) có ba bản sao.
1. Đối chứng âm (cây chƣa chuyển gen), 2 – 5 . Các dòng chuyển gen từ H240 (2),
H95 (3,4) và H26 (5).
28
Hình 7: Kết quả kiểm tra Southern một số dòng ngô chuyển gen;
Từ 22 dòng cây T0 dƣơng tính sau phân tích gen Bt2 bằng PCR, sau khi
kiểm tra bằng lai Southern đã nhận đƣợc 17 dòng chuyển gen từ 3 dòng ngô bố
mẹ H26, H95 và H240 mang gen Bt2. Số lƣợng cây chuyển gen và số bản sao
gen chuyển đƣợc trình bầy trong bảng 2.
Bảng 2: Số dòng cây chuyển gen và số bản sao gen chuyển thu đƣợc từ mỗi
dòng ngô.
Số bản Số dòng cây mang gen Bt2 ở các dòng ngô bố mẹ
sao gen H26 H95 H240
1 2 4 1
2 3 3 0
3 1 3 0
6 10 1 Tổng
2,04 0,20 Hiệu suất chuyển 1,22
*Hiệu suất chuyển gen được tính bằng tỷ lệ cây chuyển gen mang gen Bt2
nhận được từ mỗi dòng sau kiểm tra Southern trên số cây non xử lý chuyển gen của
dòng đó.
gen (%)*
Qua bảng 2 có thể thấy các 7 dòng cây chuyển gen có 1 bản sao gen
chuyển, 6 dòng có 2 bản sao và 4 dòng có 3 bản sao. Số dòng chuyển gen nhận
đƣợc dao động từ 1 đến 10 dòng. H95 có 10 dòng mang gen chuyển chiếm
2,04%; dòng H26 có 6 dòng mang gen chuyển chiếm 1,22%; dòng H240 có 1
dòng mang gen chuyển chiếm 0,2%. Kết quả nhận đƣợc cho thấy dòng ngô H95
cho hiệu suất chuyển gen cao hơn cả so với các dòng ngô nghiên cứu khác. So
sánh hiệu suất chuyển gen của nghiên cứu so với nghiên cứu khác trên thế giới
chúng tôi nhận thấy kết quả nghiên cứu của chúng tôi là chƣa cao. Với cùng đối
tƣợng nghiên cứu là mô phân sinh: Li N và cộng sự có hiệu suất chuyển gen là
29
10%. Đối tƣợng nghiên cứu là phôi non: Ombori và cộng sự có hiệu suất chuyển
gen là 1.4%; Vega và cộng sự: 12% - 18%; Ishida và cộng sự: 50% A188, 15%
A634, H99 và W117.
Kết quả đánh giá sự có mặt của gen Bt2 trong các dòng ngô bằng PCR
và lai Southern cũng cho thấy thời gian gây nhiễm tốt nhất cho chuyển gen vào
các dòng ngô sử dụng mô phân sinh và A. tumefaciens là 16 giờ (Bảng 3). Ở
thời gian gây nhiễm 2 giờ không nhận đƣợc cây chuyển gen nào.
Bảng 3: Số lƣợng dòng cây chuyển gen theo các khoảng thời gian gây nhiễm
khác nhau
Số mô phân Thời gian gây Số dòng STT Dòng ngô sinh xử lý Tỷ lệ (%) nhiễm (giờ) mang gen (mô)
0 0 H26 166
0 0 H240 165 1 2 0 0 H95 165
0 0 H20 166
2 1,2 H26 166
0 0 H240 166 2 4 3 1,82 H95 165
0 0 H20 166
4 2,41 H26 166
1 0,6 H240 166 3 16 7 4,24 H95 165
0 0 H20 166
Từ những kết quả nhận đƣợc có thể thấy chuyển gen vào cây ngô bằng
sử dụng mô phân sinh và vi khuẩn A. tumefaciens là hoàn toàn khả thi. Thời
gian tạo cây chuyển gen chỉ còn khoảng một tháng và có thể tiến hành không
30
phụ thuộc vào mùa vụ. Trong công trình này, các mô phân sinh từ cây non 3 –
4 ngày tuổi đƣợc sử dụng, các cây chuyển gen đƣợc chọn lọc trong hai tuần:
tuần đầu trên môi trƣờng chứa 100 mg/l kanamycin, tuần thứ hai trên môi
trƣờng có 200 mg/l kanamycin và chỉ chọn các cây hoàn toàn bình thƣờng đã
cho kết quả tốt. Tuy nhiên, để có hiệu quả cao hơn, cần có những nghiên cứu
tiếp theo nhằm cải tiến phƣơng pháp này với việc sử dụng các chủng A.
tumefaciens và các kiểu gen ngô khác nhau kết hợp với tối ƣu hóa thời gian
đồng nuôi cấy, kích thƣớc mô phân sinh và việc chọn lọc ban đầu các cây
31
chuyển gen để tránh hiện tƣợng khảm.
CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 Kết luận
Từ những kết quả nghiên cứu chuyển gen và đánh giá sự có mặt của gen
Bt2 trong các dòng cây chuyển gen chúng tôi đƣa ra các kết luận sau:
Đã thu đƣợc các dòng mang gen Bt2 và chứng minh đƣợc sự có mặt của
gen Bt2 trong 17 dòng ngô chuyển gen, trong đó 10 dòng từ dòng H95, 6 dòng
từ dòng H26 và 1 dòng từ dòng H240. Các dòng ngô chuyển gen có từ 1 đến 3
bản sao gen. Dòng H95 cho hiệu suất chuyển gen cao nhất.
Đã xác định đƣợc thời gian gây nhiễm mô phân sinh các dòng ngô với
A. tumefaciens mang gen đích là 16 giờ.
Kết quả thu đƣợc trong nghiên cứu này góp phần quan trọng trong
nghiên cứu chuyển gen tổng hợp tinh bột vào các dòng ngô.
4.2 Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu để xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen vào ngô
cho hiệu quả chuyển gen cao hơn, có thể áp dụng đƣợc cho tất cả các gen cần
32
chuyển.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hƣơng, Phạm
Thị Hƣơng, Lê Thị Lan, Nguyễn Chiến Hữu, Nguyễn Hữu Kiên, Trần Duy
Hƣng, Lê Huy Hàm (2015) Nghiên cứu chuyển gien chịu hạn NF-YB2 vào một
số dòng ngô Việt Nam. TC. Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn 7: 25-30
2. Hồ Thị Hƣơng, Nguyễn Đức Thành (2014) Thiết kế vector
chuyển gen mang gen Brittle 2 (Bt2) mã hóa cho ADP-Glucose
pyrophosphorylase – enzyme điều hòa quá trình tổng hợp tinh bột. Tạp chí
Công nghệ Sinh học 12(2):1-6.
3. Phạm Lý Thu (2007) Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ
phôi non và xác định phƣơng pháp chuyển gen thích hợp ở ngô. Luận án Tiến
sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, 2007.
4. Đinh Văn Trình, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Thu Về, Nguyễn, Văn
Toàn, Nguyễn Văn Đồng (2009) Nghiên cứu chuyển gen nguyên cây ở ngô.
TC. Công nghệ Sinh học 2: 221-227.
Tiếng Anh
5. Ahmadabadi M, Ruf S, & Bock R (2007) A leaf-based
regeneration and transformation system for maize (Zea mays L). Trans Res
16(4): 437-448.
6. Anami SE, Mgutu AJ, Taracha C, Coussens G, Karimi M, Hilson
P, Lijsebettens M.V, Machuka J (2010) Somatic embryogenesis and plant
regeneration of tropical maize genotypes, Plant Cell Tiss Organ 102:285-295.
7. Bhave MR, Lawrence S, Barton C, and Hannah LC, (1990)
Identification and molecular characterization of Shrunken-2 cDNA clones of
maize. Plant cell, 2 (6): 581-588.
8. Cobb BG, and Hannah LC, (1998) Shrunken-1 encoded sucrose
synthase is not required for sucrose synthesis in the maize endosperm1. Plant
Physiol., 88: 1219-1221.
9. Denyer K, Dunlap F, Thorbjrnsen T, Keeling P, and Smith AM,
(1996) The major form of ADP-Glucose pyrophosphorylase in maize
endosperm 1s extra-plastidial. Plant Physiol., 112 (2): 779-785.
10. Dickinson DB, Preiss J, (1969) Presence of ADP-Glucose
Pyrophosphorylase in Shrunken-2 and Brittle-2 Mutants of maize endosperm.
Plant Physiol 44 (7) 1058 – 1062.
11. D’Halluin K, Bonne E, Bossut M, Beuckeleer MD, Leemans J
(1992) Transgenic maize plants by tissue electroporation. Plant Cell 4:1495-
1505.
12. Figueiredo DA, Sine LF, Chantereau B, Mestres J, Fliedel C,
Rami G, Courtois JF (2010) Variability of grain quality in sorghum:
association with polymorphism in Sh2, Bt2, SssI, Ae1, Wx and O2. Theo. Appl.
Genet., 121, 1171-1185.
13. Frame BR, Shou H, Chikwamba R, Zhang Z, Xiang C, Fonger T,
Pegg SE, Li B, Nettleton D, Pei P, Wang K (2002) Agrobacterium-mediated
transformation of maize embryos using a standard binary vector system. Plant
Physiol 129: 13-22.
14. Frame BR, McMurray JM, Fonger TN, Main ML, Taylor KW,
Torney FJ, Paz MM., Wang K (2006) Improved Agrobacterium-mediated
transformation of three maize inbred lines using MS salts. Plant Cell Rep
25(10):1024-1034.
15. Giroux MJ, Hannah LC (1994) ADP-glucose pyrophosphorylase
in shrunken-2 and brittle-2 mutants of maize. Mol Gen Genet 243: 400–408.
16. Gordon JW, Scangos GA, Plotkin DJ, Barbosa JA, Ruddle FH
(1980) Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified
DNA. Proc Natl Acad Sci USA 77(12):7380-4.
17. Hannah LC, Shaw JR, Giroux MJ, Reyss A, Prioul JL, Bae JM,
Lee JY (2001) Maize genes encoding the small subunit of ADP-glucose
pyrophosphorylase. Plant Physiol 127: 173–183
18. Hannah LC (2005) Starch synthesis in the maize
endosperm. Maydica 50: 497–506
19. Hannah LC, Futch B, Bing J, Shaw JR, Boehlein S, Stewart JD,
Beiriger R, Georgelis N, and Greene T (2012) A shrunken-2 transgene
increases maize yield by acting in maternal tissues to increase the frequency of
Seed development. Plant Cell 24 (6): 2352 – 63.
20. Huang B, Chen J, Zhang J, Liu H, Tian M, Gu Y, Hu Y, Li Y, Liu
Y and Huang Y (2011) Characterization of ADP-Glucose pyrophosphorylase
encoding genes in source and sink organs of maize. Plant Mol Biol Rep,
29:563 – 572.
21. Ishida Y, Hiei Y, Komari T (2007) Agrobacteium-mediated
transformation of maize. Nature Protocol l.2 (7):1614-1621.
22. James MG, Denyer K, and Myers AM, (2003) Starch synthesis in
the cereal endosperm. Plant Biol 6: 215–222.
23. Joersbo M, Brunstedt J (1990) Direct gene transfer to plant
protoplasts by mild sonication. Plant Cell Rep 9: 207–210.
24. Li N, Zhang S, Zhao Y, Li B, Zhang J (2011) Over-expression of
AGPase genes enhances seed weight and starch content in transgenic maize.
Planta 233:241-250.
25. Luo ZX, WuR (1989) A simple methods for the transformation of
rice via the pollen-tubepathway. Plant Mol boil Reporter 7: 69-77.
26. Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth
and bioassays with T0 bacco tissue cultures. Plant Physiol 15: 473-479.
27. Ombori O, Muoma JVO, Machuka J (2012) Agrobacterium-
mediated genetic transformation of selected tropical inbred and hybrid maize
(Zea mays L.) lines. Plant Cell Tiss Org DOI 10.1007/s11240-012-0247-1.
28. Prioul J Ll, Jeannette E, Reyss A, Grégory N, Giroux M, Hannah
LC, and Causse M (1994). Expression of ADP-glucose pyrophosphorylase in
maize (Zea mays L.) grain and source leaf during grain filling. Plant Physiol
104 (1): 179 – 187.
29. Russell DA, DeBoer DL, Stark DM, Preiss J, Fromm ME (1993)
Plastid targeting of β-glucuronidase and ADP-glucose pyrophosphorylase in
maize (Zea mays L.) cells. Plant Cell Rep 13: 287–292.
30. Saghai-Maroof MA, Soliman KM, Jorgensen RA, Allard RW
(1984) Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley:
Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics.
Proc Natl Acad Sci USA 81: 8014-8018.
31. Sairam RV, Parani M, Franklin G, Lifeng Z, Smith B,
MacDougall J, Wilber C, Sheikhi H, Kashikar N, Meeker K, Al-Abed D, Berry
K, Vierling R, Goldman SL (2003) Shoot meristem: an ideal explant for Zea
mays L. transformation. Genome 46:323–329.
32. Sanford JC, Klein TM, Wolf ED, Allen N (1987). "Delivery of
substances into cells and tissues using a particle bombardment
process". Particulate Science and Technology 5 (1): 27–37.
33. Schell J; Montagu MV (1977) "The Ti-plasmid of Agrobacterium
tumefaciens, a natural vector for the introduction of nif genes in plants?" Basic
Life Sci. 9: 159–79.
34. Sidorov V, Gilbertson L, Addae P, Duncan D (2006)
Agrobacterium-mediated transformation of seedling-derived maize callus.
Plant Cell Rep 25: 320-328.
35. Takava S, Rahnama H, Rahimian H, and Kazemitabar K (2010)
Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays L.) Journal of
Sciences, Islamic Republic of Iran 21(1): 21-29.
36. Tsai CY and Nelson OE (1966) Starch-deficient maize mutant
lacking adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase activity. Science
151: 341 – 343.
37. Vega JM, Yu W, Kennon AR, Chen X, Zhang ZJ (2008)
Improvement of Agrobacterium-mediated transformation in Hi-II maize (Zea
mays L.) using standard binary vectors. Plant Cell Rep 27: 297-305.
38. Wang Z, Chen X, Wang J, Liu T, Liu Y, Zhao L, Wang G (2007)
Inreasing maize seed weight by enhancing the cytoplasmic ADP-glucose
pyrophosphorylase activity in transgenic maize plants. Plant Cell Tiss Org 88:
83-92.
39. Wang TT, Ji J, Wang G, Guan CF, Zhang L, Jin C (2012) Study
on Agrobacterium-mediated transformation of psy gene into shoot meristem of
maize. China Biol 32(8): 36-40.
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN
1. Nguyễn Đức Thành, Trần Thị Lƣơng, Nguyễn Thùy Ninh, Nguyễn Thị
Thu, Hồ Thị Hƣơng, Vƣơng Huy Minh (2015) Tạo cây ngô (Zea mays L.)
chuyển gen gia tăng hàm lƣợng tinh bột và năng suất. TC Sinh học học 37(4):
496-502.
2. Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Thùy Ninh, Trần Thị Lƣơng, Nguyễn Đức
Thành (2014) chuyển gen Bt2 vào mô phân sinh một số dòng ngô trồng thông
qua Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí Công nghệ Sinh học 12(4): 691-698.
3. Trần Thị Lƣơng, Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Thùy Ninh, Nguyễn Đức
Thành (2014) Chuyển gen Shrunken 2(Sh2) mã hóa enzyme ADP-Glucose
pyrophosphorase vào một số dòng ngô bằng phƣơng pháp chuyển gen thông
qua Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí Sinh học, 36(1): 99-109.
4. Nguyễn Thị Thu, Lê Hoàng Đức, Nguyễn Đức Thành (2013) Tách dòng
gen Shrunken 2 (Sh2) từ dòng ngô H14 và thiết kế vector chuyển gen pCambia
1301-Ubi-Sh2.Tạp chí sinh học 35 (3se): 122 – 128.
