Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc bằng kỹ thuật PCR và Realtime PCR

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

----------

PHẠM QUỲNH TRANG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MICROSPORIDIA TRÊN MẪU

BỆNH PHẨM VIÊM LOÉT GIÁC MẠC BẰNG KỸ THUẬT PCR

VÀ REALTIME PCR

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

----------

PHẠM QUỲNH TRANG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MICROSPORIDIA TRÊN MẪU

BỆNH PHẨM VIÊM LOÉT GIÁC MẠC BẰNG KỸ THUẬT PCR

VÀ REALTIME PCR

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Văn Long

Khoa Sinh học phân tử – Bệnh viện Trung ương quân đội 108

Thái Nguyên - 2017

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu cửa tôi dưới sự hưỡng dẫn

của TS. Nguyễn Văn long. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.

Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai

công bố trong một công trình nào khác.

Thái nguyên, tháng 11 năm 2017

Tác giả

Phạm Quỳnh Trang

ii

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu

sắc tới TS. Nguyễn Văn Long đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong

suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Bs. Phan Quốc Hoàn đã tạo điều kiện để

tôi thực hiện luận văn tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân

đội 108; tới các anh chị tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân

đội 108 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học,

Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận

lợi cho tôi học tập và nghiên cứu.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ,

giúp đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này.

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2017

Học viên

Phạm Quỳnh Trang

iii

DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................vi

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... viii

DANH MỤC VIẾT TẮT ................................................................................................ix

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề .................................................................................................................... 1

2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 2

CHƯƠNG I ...................................................................................................................... 3

TỔNG QUAN.................................................................................................................. 3

1. Bệnh mắt - Viêm loét giác mạc ............................................................................... 3

1.1. Giác mạc ........................................................................................................... 4

1.1.1. Biểu mô .................................................................................................... 4

1.1.2. Màng đáy và màng Bowmann ................................................................... 5

1.1.3. Nhu mô ...................................................................................................... 5

1.1.4. Màng Descemet ......................................................................................... 5

1.1.5. Nội mô ....................................................................................................... 5

1.2. Yếu tố nguy cơ gây viêm loét giác mạc ........................................................... 6

1.3. Các triệu chứng lâm sàng thường gặp ở viêm loét giác mạc ........................... 6

1.3.1. Triệu chứng cơ năng .................................................................................. 6

1.3.2. Triệu chứng thực thể.................................................................................. 7

2. Microsporidia ......................................................................................................... 8

2.1. Giới thiệu chung ............................................................................................... 8

2.2. Bệnh học và nguy cơ ...................................................................................... 11

2.3. Đặc điểm dịch tễ kí sinh trùng Microsporidia ............................................... 12

2.4. Chẩn đoán viêm loét giác mạc........................................................................ 12

2.5. Các phương pháp phát hiện Microsporidia .................................................... 13

2.5.1. Chẩn đoán phân biệt ................................................................................... 13

2.5.2. Chẩn đoán xác định ................................................................................. 14

MỤC LỤC

iv

3. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam. ............................................................................ 19

3.1. Tình hình điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam

hiện nay.................................................................................................................. 19

3.2. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng phương pháp PCR và Realtime PCR để điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam. .......... 20

Chương II ....................................................................................................................... 22

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP ........................................................................................ 22

1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................ 22

2. Hóa chất, thiết bị .................................................................................................... 22

2.1. Hóa chất .......................................................................................................... 22

2.2. Thiết bị, máy móc ........................................................................................... 23

2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 24

2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số ..................................................... 24

2.3.2. Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổ

........................................................................................................................... 25

2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose .................................................... 25

2.3.4. Phương pháp xác định trình tự axit nucleic ............................................. 26

2.3.5. Xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng phương pháp PCR và

Realtime PCR .................................................................................................... 28

2.3.5.1. Xác định độ nhạy của phương pháp PCR và Realtime PCR ................ 30

CHƯƠNG III ................................................................................................................. 36

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................................................ 36

3.1. Kết quả xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật PCR và Realtime PCR ........................................................................................................ 36

3.2. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR .................. 39

3.2.1. Đánh giá độ nhạy của kỹ thuật PCR và Realtime PCR ........................... 39

3.2.2. Đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR ..................... 41

3.3. Thiết kế tạo plasmid chuẩn dương Microsporidia ......................................... 43

3.4. Thử nghiệm kỹ thuật PCR và Realtime PCR phát hiện Microsporidia trên các mẫu bệnh phẩm viêm kết giác mạc mắt ................................................................ 46

v

KẾT LUẬN ................................................................................................................... 53

KIẾN NGHỊ ................................................................................................................... 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 55

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Biểu đồ thể hiện các tác nhân gây ra tai nạn về mắt trong lao động sản

xuất (theo thống kê hàng năm của BV Mắt TP HCM)(%) .................................. 3

Hình 2. Thiết đồ cắt dọc giác mạc ......................................................................... 4

Hình 1.3. Hình ảnh minh họa Microsporidia ...................................................... 10

Hình 1.4. Nguyên lí của phản ứng RealTime PCR sử dụng đầu dò Taqman ..... 18

Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA

ribosomal của Microsporidia.. ............................................................................ 36

Hình 3.2. Minh họa kết quả giải trình tự đoạn gen (SSU) rRNA Microsporidia

từ bệnh phẩm chất nạo giác mạc của bệnh nhân KHUYEN. .............................. 37

Hình 3.3. Kết quả so sánh trực tuyến trình tự đoạn gen từ mẫu

Microsporidia_KHUYEN.scf với ngân hàng gen thế giới. ................................ 38

Hình 3.4. Kết quả khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal của Microsporidia

bằng phản ứng Realtime PCR. ............................................................................ 39

Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR đánh giá độ nhạy của kỹ thuật PCR

phát hiện Vittaforma corneae.. ............................................................................ 40

Hình 3.6. Kết quả Realtime PCR đánh giá độ nhạy của kỹ thuật Realtime phát

hiện Vittaforma corneae. ..................................................................................... 41

Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR

phát hiện Microsporidia. ..................................................................................... 42

Hình 3.8. Kết quả Realtime PCR đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật Realtime

PCR phát hiện Microsporidia. ............................................................................ 42

Hình 3.9a. Kết quả điện di sản phẩm PCR clony kiểm tra kết quả phản ứng

ligation tạo plasmid chuẩn dương microsporida bằng cặp mồi vector M13. ...... 43

Hình 3.9b. Kết quả điện di sản phẩm plasmid PCR bằng cặp mồi vector M13

trên plasmid nghi ngờ mang đoạn gen Microsporidia. ....................................... 44

Hình 3.10. Kết quả Realtime PCR trên mẫu plasmid chuẩn dương Microsporidia

pha loãng nồng độ. .............................................................................................. 45

vii

Hình 3.11. Kết quả Realtime PCR trên mẫu plasmid chuẩn dương Microsporidia

pha loãng nồng độ. .............................................................................................. 45

Hình 3.12. A,B. Kết quả điện di PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện

Mắt Trung Ương. ................................................................................................ 47

Hình 3.13 A. Kết quả Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện

Mắt Trung Ương. ................................................................................................ 47

Hình 3.13 B. Kết quả Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện

Mắt Trung Ương. ................................................................................................ 48

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự đoạn gen

tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia sử dụng cặp mồi

MF1&MF2 .......................................................................................................... 28

Bảng 2.2. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá chất lượng ADN sau

tách chiết sử dụng cặp mồi Betaglobin F và Betaglobin R ................................. 29

Bảng 2.3. Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR khuếch đại trình tự

đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia sử dụng

cặp mồi MSRT1&MSRT2 và probe MSRT ....................................................... 30

Bảng 2.4. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá độ nhạy của phương

pháp ..................................................................................................................... 30

Bảng 2.5. Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR đánh giá độ nhạy

của phương pháp ................................................................................................. 31

Bảng 2.6. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá độ đặc hiệu của

phương pháp ........................................................................................................ 32

Bảng 2.7. Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR đánh giá độ đặc

hiệu của phương pháp ......................................................................................... 32

Bảng 2.8. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tạo plasmid ........................ 33

chuẩn dương ........................................................................................................ 33

Bảng 2.9. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tạo plasmid ........................ 34

chuẩn dương ........................................................................................................ 34

Bảng 3.1. Bảng pha loãng ADN tổng số từ mẫu bệnh phẩm chẩn đoán dương

tính với Vittaforma corneae ................................................................................ 40

Bảng 3.2. Bảng tổng hợp số liệu kết quả phát hiện Microsporidia trên 30 mẫu

bệnh phẩm lâm sàng bằng 3 phương pháp nhuộm soi, PCR, realtime PCR. ...... 49

Bảng 3.3. Kết quả phát hiện Microsporidia trên 30 mẫu bệnh phẩm lâm sàng. ..... 50

ix

DANH MỤC VIẾT TẮT

Axit deoxyribonucleic AND

Axít ribonucleic RNA

Small-subunit SUU

Viêm loét giác mạc VLGM

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Viêm loét giác mạc là một bệnh phổ biến nhất trong các bệnh về mắt. Bệnh

phân bố trên toàn thế giới với tỷ lệ từ 17% đến 36% trong bệnh viêm loét giác

mạc nói chung. Tuy vậy, tại các quốc gia có khí hậu nóng, ẩm tỷ lệ bệnh cao

hơn, như ở Ấn độ tỷ lệ bệnh từ 44% đến 47%. Mặt khác, bệnh cũng có liên quan

đến các chấn thương giác mạc và việc sử dụng thuốc không đúng chỉ định

Giác mạc không chỉ dễ bị viêm loét do những tác nhân từ bên ngoài mà

cũng có thể là do mắt chưa được chăm sóc và bảo vệ đúng cách từ bên trong. Có

nhiều tác nhân gây ra vết loét bị nhiễm trùng; thường là do sự tấn công của các

loại vi khuẩn (tụ cầu, liên cầu, phế cầu, lậu cầu, trực khuẩn mủ xanh,

Moraxella,.), do nấm (Aspergillus fumigatus, Fusarium solant, Candida

albicans, Histoblasma,..), do virus (Herpes simplex, Herpes zoster) hoặc do ký

sinh trùng (Acanthamoeba).

Theo các báo cáo gần đây, tỷ lệ viêm loét giác mạc do Microsporidia ngày

càng tăng, nhất là ở các nước vùng nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm như nước ta,

chiếm 0,4% các trường hợp mắc viêm giác mạc do vinh sinh vật gây ra [13].

Loài kí sinh này có thể gây bệnh ở mọi lứa tuổi và nguồn nước không đảm bảo

vệ sinh là tác nhân lây truyền bệnh. Microsporidia là kí sinh trùng dạng bào tử,

kí sinh nội bào, được tìm thấy lần đầu tiên vào hơn 100 năm trước. Bệnh nhân bị

nhiễm Microsporidia biểu hiện các triệu chứng trên lâm sàng như: tiêu chảy cấp,

viêm thành phế nang, viêm loét giác mạc, viêm phế quản, viêm thận, viêm niệu

đạo, viêm tuyến tiền liệt, viêm gan, viêm não, viêm cơ và viêm phúc mạc. Triệu

chứng phổ biến hay gặp nhất ở người liên quan đến bệnh tiêu hóa kết hợp nhiễm HIV.

Phát hiện chính xác Microsporidia giữ vai trò quan trọng trong chẩn đoán

nhanh, phát hiện chủng để lựa chọn đúng phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh

cũng như hiểu biết cơ chế bệnh sinh, dịch tễ học phân bố của Microsporidia.

Tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán và phát hiện chủng Microsporidia được thực

2

hiện qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, transmission electron

microscopy). Tuy nhiên, đây là kỹ thuật chi phí cao, thời gian phân tích lâu, đòi

hỏi người phân tích có trình độ chuyên môn sâu nên không khả thi ứng dụng

thường quy kỹ thuật này trong chẩn đoán. Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh

quang được phát triển từ những năm 1994 để phát hiện chủng Microsporidia,

tuy nhiên kỹ thuật này cũng không được áp dụng rộng rãi do những hạn chế về

kháng thể, các phản ứng không đặc hiệu và những tín hiệu nhiễu không thể loại

bỏ trong mẫu bệnh phẩm. Chính vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử ra đời đã

làm tăng độ nhạy, đặc hiệu trong chẩn đoán phát hiện Microsporidia và các kỹ

thuật này dần được đưa vào sử dụng trong thực hành chẩn đoán lâm sàng. Hiện

nay, ở Việt Nam chưa có nhiều công bố về việc sử dụng công nghệ sinh học

phân tử trong việc hỗ trợ chẩn đoán và điều trị bệnh viêm loét giác mạc do

Microsporida gây ra. Do đó, để hỗ trợ giúp đỡ cho khả năng chẩn đoán nhanh

phát hiện Microsporida chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy

trình phát hiện Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc bằng

kỹ thuật PCR và Realtime PCR.”

1.Mục tiêu của đề tài:

Xây dựng và tối ưu hóa phản ứng PCR và Realtime PCR để phát hiện ra

Microsporidia trên các mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc.

2. Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng được quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật PCR trên

mẫu bênh phẩm viêm giác mạc.

- Xây dựng được quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật Realtime

PCR trên mẫu bênh phẩm viêm giác mạc.

- Áp dụng kỹ thuật PCR và Realtime PCR vào việc phát hiện Micrisporidia

trên các mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc tại Việt Nam.

3

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN

1. Bệnh mắt - Viêm loét giác mạc

Viêm loét giác mạc (VLGM) là bệnh nhiễm trùng nặng ở mắt do vi sinh vật

bao gồm vi khuẩn, nấm, virut, kí sinh trùng.v.v… Bệnh viêm loét giác mạc

thường tiến triển nặng, gây nhiều biến chứng và khi khỏi để lại sẹo dày ở giác

mạc gây mờ đục giác mạc, làm giảm thị lực nghiêm trọng [1, 8].

Ở các nước phát triển như Mỹ, Tây Âu tỷ lệ viêm loét giác mạc do nấm

chiếm khoảng 3% trong tổng số các nguyên nhân gây viêm loét giác mạc. Tỷ lệ

này cao hơn ở các nước đang phát triển như: Ấn Độ, Nê-pan, Băng-la-đét...(dao

động từ 20% đến 60%) [8, 9, 13, 14]. Ở Việt Nam, tại bệnh viện Mắt trung ương

trong 10 năm (1998 - 2007) trong số 3210 bệnh nhân viêm loét giác mạc được

điều trị nội trú thì viêm loét giác mạc chiếm tỷ lệ cao nhất, chiếm tới 50,8% [1].

Có nhiều nguyên nhân gây ra viêm loét giác mạc như: vi khuẩn, vi rút,

nấm, kí sinh trùng, Microsporidia… Tỷ lệ gặp các tác nhân gây bệnh này thay

đổi theo thời gian do có sự thay đổi về môi trường, kinh tế, các yếu tố nguy cơ

và sự hiểu biết của người dân.Ở Việt Nam, theo một số nghiên cứu tại bệnh viện

mắt Trung ương những năm 1991- 1996 thì tỷ lệ viêm loét giác mạc do nấm khá

cao 42,11% nhưng vào năm 2004- 2005 thì tỉ lệ viêm loét giác mạc do nấm lại

được ghi nhận nhiều hơn 59,8% trong khi vi khuẩn chỉ chiếm 29,4%. Điều trị

viêm loét giác mạc tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh và mức độ trầm trọng của

bệnh. Việc điều trị viêm loét giác mạc ở nước ta hiện nay tương đối hiệu quả.

Song tỉ lệ biến chứng sẹo thủng giác mạc, giảm thị lực thậm chí mù lòa tăng lên

rất nhiều nếu việc chẩn đoán và điều trị không kịp thời. Nhất là khi điều kiện kĩ

thuật giúp chẩn đoán ở các cơ sở chưa phát triển và bệnh nhân chưa ý tức được

sự nguy hiểm của bệnh viêm loét giác mạc. Điều này không chỉ gây nên gánh

nặng cho bản thân người bệnh mà còn làm tăng gánh nặng cho gia đình và toàn

xã hội [2, 6, 7].

4

1.1. Giác mạc

Giác mạc là một màng xơ trong suốt, không có mạch máu, chiếm 1/5 diện

tích phía trước của vỏ nhãn cầu diện tích khoảng 123mm vuông. Bán kính độ

cong giác mạc trung bình ở người Việt Nam trưởng thành là 7,71±0,24mm

Đường kính ngang bằng 12mm, đường kính dọc bằng 11mm. Độ dày là

0,509mm ở trung tâm, 0,74mm ở sát vùng rìa. Ranh giới giữa giác mạc và củng

mạc là vùng rìa giác mạc bề rộng của vùng rìa chừng 1mm. Đây là vùng có cấu

tạo giải phẫu rất đặc biệt và vai trò sinh lý rất quan trọng của nhãn cầu [1, 8, 19].

Giác mạc được cấu tạo gồm 5 lớp từ trước ra sau, bao gồm:

- Lớp biểu mô giác mạc

- Lớp màng Bowman

- Lớp nhu mô

- Lớp màng Descemet

- Lớp nội mô

Hình 1.1. Thiết đồ cắt dọc giác mạc

1.1.1. Biểu mô

Biểu mô giác mạc là lớp ngoài cùng, liên tiếp với biểu mô của kết mạc

nhãn cầu và dễ tách ra khỏi màng Bowmann ở dưới, dày khoảng 32-50 µm, gồm

5-7 hàng tế bào không sừng hoá, có dạng trụ ở lớp đáy, càng lên phía trước càng

dẹt đi [1, 8].

Biểu mô giác mạc là lớp bảo vệ, ngăn không cho các vi sinh vật xâm nhập

vào nhu mô giác mạc. Tuy nhiên, khi biểu mô toàn vẹn, các thuốc cũng rất khó

thấm qua biểu mô, nhất là các thuốc không tan trong nước [1, 8].

5

1.1.2. Màng đáy và màng Bowmann

Màng đáy là một màng rất mỏng nằm sát ngay dưới lớp tế bào đáy của biểu

mô (thực chất do tế bào đáy tạo thành), dày khoảng 40-60 µm [1, 8].

Màng Bowmann là một màng trong suốt, dày khoảng 12µm và khá dai. Mặt

trước có giới hạn rõ rệt, mặt sau khó phân tách với nhu mô giác mạc. Màng này

khi bị tổn thương thì không có khả năng hồi phục, ở vùng tổn thương sẽ để lại

sẹo mỏng [2, 19].

1.1.3. Nhu mô

Nhu mô chiếm 90% bề dày giác mạc, cơ bản được tạo thành bởi các lá sợi

collagen xếp song song nhau, các giác mạc bào (keratocytes) và các chất ngoại

bào. Ngoài ra trong nhu mô giác mạc còn có một số bạch cầu di động giữa các lá

collagen và các sợi thần kinh không myelin xuất phát từ thần kinh mi (thuộc

nhánh mắt của dây thần kinh số V) đi theo hình nan hoa vào lớp giữa nhu mô ở

trung tâm giác mạc, sau đó chia nhánh theo kiểu phân đôi và đi lên các lớp nông

giác mạc, qua màng Bowmann và tận cùng bằng các đầu tiếp nhận cảm giác ở

giữa các tế bào biểu mô. Do đó tổn thương giác mạc càng nông thì các triệu

chứng chủ quan của bệnh nhân càng mạnh [1, 8]. Khi nhu mô tổn thương sẽ để

lại sẹo dày.

1.1.4. Màng Descemet

Màng Descemet được cấu tạo bởi các sợi collagen dạng lưới. Màng

Descemet chỉ dày 6µm, tách khỏi nhu mô dễ dàng và có thể được tái tạo bởi lớp

nội mô. Màng Descemet rất dai, có tính đàn hồi cao nên khi bị rách hai mép dễ

thun lại và tách rời nhau khỏi chỗ tổn thương [2]. Màng Descemet tương đối bền

vững, có thể tồn tại kể cả khi giác mạc bị hoại tử gần hết nhu mô [1, 8].

1.1.5. Nội mô

Nội mô gồm một hàng tế bào hình đa giác, đường kính khoảng 20 µm, dày

4 - 6 µm với một nhân lớn chiếm gần hết tế bào, liên kết với nhau bằng những

liên kết chặt và liên kết dạng khe hở [1]. Tế bào nội mô không phân chia và số

6

lượng tế bào nội mô giảm dần theo tuổi tác: lúc sinh mật độ tế bào là 4000 tế

bào/mm2, số lượng tế bào giảm xuống còn khoảng 1400 - 2500 tế bào/mm2 ở

người trưởng thành. Khi mật độ tế bào chỉ còn 400 - 700 tế bào/mm2 hoặc thấp

hơn thì các tế bào nội mô còn lại sẽ mất khả năng bù trừ. Giác mạc sẽ bị ngấm

nước và trở nên phù đục mất đặc tính trong suốt [3, 8].

1.2. Yếu tố nguy cơ gây viêm loét giác mạc

- Chấn thương: làm tổn thương một phần hay toàn bộ giác mạc.

+ Chấn thương nông nghiệp: là yếu tố thường gặp nhất, chủ yếu do các tác

nhân thực vật (cành cây, gai, mảnh gỗ, hạt thóc, lá lúa,…).

+ Chấn thương công nghiệp: các dị vật bắn vào giác mạc (phoi tiện, mảnh

sắt vụn, đá….).

- Các bệnh mãn tính trên bề mặt nhãn cầu (hở mi, lông xiêu, lông quặm,

viêm giác mạc do herpes…) làm khô giác mạc và xước giác mạc.

- Liệt dây thần kinh số V: làm cho giác mạc mất cảm giác. Vì vậy, giác

mạc không được bảo vệ bởi phản xạ nhắm mắt.

- Các yếu tố nguy cơ khác: sử dụng kính tiếp xúc, phẫu thuật ở giác mạc

và kết mạc, suy giảm miễn dịch, sử dụng thuốc kháng sinh và các thuốc

corticosteroid mà không có sự kiểm soát của các bác sĩ chuyên khoa mắt, bệnh

nhân có tiền sử mắc bệnh nấm ở da, niêm mạc, nội tạng… [8, 19].

1.3. Các triệu chứng lâm sàng thường gặp ở viêm loét giác mạc

Viêm loét giác mạc do kí sinh trùng có biểu hiện lâm sàng rất đa dạng. Tuy

nhiên, bệnh có các triệu chứng đặc trưng. Do đó, các triệu chứng có thể giúp

định hướng chẩn đoán nguyên nhân trong trường hợp chưa có kết quả cận lâm

sàng [1, 3, 19].

1.3.1. Triệu chứng cơ năng

- Dấu hiệu kích thích mắt: sợ ánh sáng, cộm, chói, chảy nước mắt, co quắp mi.

- Đau nhức: đau âm ỉ tại mắt, đau có thể lan ra xung quanh hốc mắt hoặc

lan lên đầu.

7

- Nhìn mờ: thị lực giảm nhiều hay ít phụ thuộc vào mức độ tổn thương trên

giác mạc [19].

1.3.2. Triệu chứng thực thể

Các dấu hiệu thường gặp:

- Kết mạc cương tụ rìa hoặc toàn bộ.

- Đặc điểm của ổ loét giác mạc:

+ Vị trí: có thể ở vùng rìa, cạnh trung tâm,

trung tâm hoặc toàn bộ giác mạc.

+ Màu sắc: thường có màu trắng xám và giác mạc xung quanh mờ đục do

phù nề.

+ Kích thước: từ những chấm nhỏ đến toàn bộ giác mạc.

+ Hình thái:

* Bờ ổ loét: thâm nhiễm như lông hoặc dạng sợi, trong nhu mô giác mạc có

những đường phân nhánh tỏa theo hình nan hoa từ bờ của ổ loét ra nhu mô xung

quanh được gọi là thẩm lậu dạng ngón tay hay dấu hiệu chân giả.

* Bề mặt ổ loét: bề mặt gồ cao, toàn bộ hoặc phần lớn đáy ổ loét cao hơn

giác mạc xung quanh, không có hoại tử mềm mà thô ráp khô như một miếng

màng cứng, dạng vảy.

* Áp xe giác mạc: ổ áp xe đặc chiếm hết bề dày nhu mô và tiến triển vào

tiền phòng.

* Mảng nội mô: là mảng xuất tiết trắng, dày bám mặt sau nội mô, có thể

xuất hiện trong trường hợp viêm loét giác mạc không phải do nấm. Một số

trường hợp biểu mô đã hàn gắn hoàn toàn nhưng mảng này vẫn còn tồn tại thì

nghĩ nhiều đến nấm.

* Vòng thâm nhiễm: hay còn gọi là vòng miễn dịch, là vòng trắng bao

quanh ổ loét, thường có một khoảng giác mạc lành ngăn cách với ổ loét, có thể

đây là đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với tác nhân gây bệnh.

* Tổn thương vệ tinh: ở cạnh ổ loét và có vẻ như tách rời ổ loét.

8

+ Phản ứng tiền phòng: biểu hiện của một phản ứng viêm nặng ở mắt,

thường xuất hiện dấu hiệu Tyndall kèm theo nếp gấp ở màng Descemet.

* Mủ tiền phòng: là dấu hiệu thường gặp trong viêm loét giác mạc. Kí sinh

trùng có thể xuyên qua màng Descemet vào tiền phòng ngay cả khi ổ loét giác

mạc nhỏ. Có thể đó là mủ vô trùng do lắng đọng các tế bào viêm. Mủ có thể tái

phát, tái xuất hiện nhanh sau khi rửa mủ tiền phòng [16, 19].

2. Microsporidia

2.1. Giới thiệu chung

Microsporidia là kí sinh trùng dạng bào tử, kí sinh nội bào bắt buộc, được

tìm thấy lần đầu tiên vào hơn 100 năm trước. Microsporidia” không phải là một

từ thuộc phân loại học, có liên hệ đến một vi sinh vật thuộc bộ Microsporida,

ngành Microspora. Thuật ngữ về phân loại học của Microsporidia phức tạp và

thay đổi. Có 14 loài thuộc 07 họ được báo cáo gây bệnh trực tiếp cho người

(Enterocytozoon, Encephalitozoon, Nosema, Pleistophora, Vittaforma,

Trachipleistophora và Brachiola).Trong đó chỉ có hai loài được công nhận gây

bệnh trên mắt là Nosema, Vittaforma. Microsporidia ngày càng được công nhận

là tác nhân truyền nhiễm gây bệnh đường ruột, mắt, viêm xoang, phổi và tiết

niệu. Microsporidia là kí sinh trùng đơn bào nhỏ (dài 3,5-5µm và rộng 2-3µm),

hình oval, kí sinh bắt buộc nội tế bào sinh dưỡng. Theo cây phả hệ,

Microsporidia là sinh vật sinh dưỡng, bởi vì chúng có nhân thực, ribosome

giống sinh vật nhân sơ và thiếu ti thể. Có 7 chi và cả các loài Microsporidia

chưa được phân loại gây bệnh trên bệnh nhân suy giảm miễn dịch và bệnh nhân

có hệ miễn dịch khỏe mạnh [5, 20].

Phần lớn chu kỳ phát triển của Microsporidia ở dạng bào tử, là trạng thái

dễ phát hiện hơn so với ở giai đoạn tăng sinh nội bào. Bào tử kháng lại các yếu

tố bên ngoài, chúng có thể sống sót trong môi trường khắc nghiệt trong thời gian

dài. Sự hình thành ống phân cực ở hầu hết cấu trúc bào tử Microsporidia đánh

dấu sự xâm nhiễm đầu tiên vào tế bào vật chủ, với sự xâm nhiễm trực tiếp thông

9

qua ống phân cực của bào tử được lộn ra phía bên ngoài, tiếp đó chất nguyên

sinh bào tử (sporoplasm) được chuyển vào bên trong tế bào lây nhiễm. Có hai

giai đoạn trong chu kỳ phát triển của Microsporidia: pha bắt đầu tăng sinh

(merogony) tiếp đến là pha tạo bào tử (sporogony) [7, 11, 12].

Chỉ có 2 loài được công nhận gây viêm nhiễm ở mắt. Hai biểu hiện lâm

sàng của bệnh vi bào tử mắt là Viêm giác mạc nhu mô gây bởi Nosema corneum

trên bệnh nhân có hệ miễn dịch khỏe mạnh và Viêm kết giác mạc chấm nông do

dòng Encephalitozoon ở bệnh nhân AIDS hoặc người đeo kính áp tròng. Tuy

nhiên, các báo cáo hiện nay chỉ ra rằng viêm dính giác mạc cũng có thể xảy ra ở

bệnh nhân không bị suy giảm miễn dịch. Năm 2015, Phạm Ngọc Đông và cs. đã

nghiên cứu hồi cứu 12 mắt (11 bệnh nhân) viêm giác mạc nhu mô do

Microsporidia. Tất cả bệnh nhân đều có HIV (-). Thời gian mắc bệnh trung

bình 5,25 ± 6,56 tháng, đã dùng nhiều loại kháng sinh, corticosteroid. Tổn

thương nhu mô kèm theo loét giác mạc gặp ở 10/12 mắt; 2 mắt chỉ có áp xe sâu

trong nhu mô, không có loét giác mạc; 7/12 mắt có mủ tiền phòng; 3/12 mắt

tăng nhãn áp. Điều trị nội khoa gồm kháng sinh fluoquinolon, chống nấm,

albendazol. Chỉ 1 mắt điều trị khỏi bằng thuốc, 2 mắt (của 1 bệnh nhân) bỏ điều

trị. Số còn lại đều phải ghép giác mạc điều trị [2]. Kết luận: viêm giác mạc nhu

mô do Microsporidia lần đầu tiên được phát hiện tại Việt Nam, với các tổn

thương nhu mô không đặc hiệu, chủ yếu gặp ở nữ, người lao động chân tay, có

HIV (-). Việc điều trị nội khoa khó khăn, hầu hết phải ghép giác mạc điều trị.

Bệnh vi bào tử ở mắt của bệnh nhân có hệ miễn dịch khỏe mạnh có thể bị

lẫn với viêm giác mạc do vi rút herpes gây ra. Bệnh nhân thường có biểu hiện

đau kéo dài, đỏ mắt, chảy nước mắt, mờ mắt và giảm tầm nhìn [5, 6, 19].

Một số bệnh nhân bị chẩn đoán nhầm sang trường hợp viêm giác mạc nhu

mô do Herpes vi-rút và được điều trị bằng thuốc kháng vi-rút và steroids. Trong

thăm khám, bệnh nhân có thể có biểu hiện sưng phù mí mắt, xung huyết kết

mạc. Tổn thương ở giác mạc thường thâm nhiễm nhu mô từ nông đến sâu cùng

10

với sưng phù nhu mô xung quanh. Lớp biểu mô phủ trên cùng có thể phù hoặc

trong một số trường hợp có thể có khuyết biểu mô. Có thể có dịch trong nội mô

[19].

Trong số 14 loài Microsporidia có 7 họ lây nhiễm vào con người. Nhận

dạng chúng là một công việc khó khăn bởi chúng không thể tồn tại ngoài tế bào

vật chủ bị nhiễm, chúng có số lượng gen rất nhỏ nhưng lại phát triển rất nhanh.

Các nhà khoa học thuộc đại học Duke đã ứng dụng hai nghiêm cứu di truyền để

chứng minh rằng Microsporidia phát triển rõ rệt từ nấm sinh sản hữu tính, và

đặc biệt là có mối liên hệ chặt chẽ với nấm tiếp hợp [11, 12].

Tín hiệu di truyền này cũng cho thấy rằng Microsporidia và nấm tiếp hợp

dường như có chung tổ tiên, và có quan hệ gần gũi hơn các dòng nấm khác được

biết đến.

Ngoài ra, Microsporidia và nấm tiếp hợp này có cùng gen quy định giới

tính, cùng trình tự trên ADN. Các gen khác có liên quan đến sinh sản hữu tính

cũng có mặt. Điều này cho thấy Microsporidia có thể có chu trình sinh sản quy

định bởi đặc điểm di truyền, có thể nó phải trải qua sinh sản hữu tính khi lây

nhiễm vào cơ thể vật chủ [8].

Ảnh quét điện tử giao tử Microsporidia với một cái ống nhô ra ngoài dùng

để đưa vào tế bào nhân chuẩn. Giao tử sẽ bơm dịch lây nhiễm qua cái ống này.

(Ảnh: CDC/NCID/DPD Parasite Image Library)

Hình 1.2. Hình ảnh minh họa Microsporidia

11

Phát hiện chính xác Microsporidia giữ vai trò quan trọng trong chẩn đoán

nhanh, phát hiện chủng để lựa chọn đúng phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh

cũng như hiểu biết cơ chế bệnh sinh, dịch tễ học phân bố của Microsporidia.

Tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán và phát hiện chủng Microsporidia được thực

hiện qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, transmission electron

microscopy). Tuy nhiên, đây là kỹ thuật chi phí cao, thời gian phân tích lâu, đòi

hỏi người phân tích có trình độ chuyên môn sâu nên không khả thi ứng dụng

thường quy kỹ thuật này trong chẩn đoán. Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh

quang được phát triển từ những năm 1994 để phát hiện chủng Microsporidia,

tuy nhiên kỹ thuật này cũng không được áp dụng rộng rãi do những hạn chế về

kháng thể, các phản ứng không đặc hiệu và những tín hiệu nhiễu không thể loại

bỏ trong mẫu bệnh phẩm. Chính vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử ra đời đã

làm tăng độ nhạy, đặc hiệu trong chẩn đoán phát hiện Microsporidia và các kỹ

thuật này dần được đưa vào sử dụng trong thực hành chẩn đoán lâm sàng. Một

vài cặp primer và cặp primer lồng đã được mô tả sử dụng để khuếch đại trình tự

gen chủng Encephalitozoon và Enterocytozoon bieneusi. Phần lớn các nghiên

cứu ứng dụng kỹ thuật PCR được thiết kế khuếch đại đoạn gen tiểu phần nhỏ

small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia. Trong nghiên cứu này, bước đầu

xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia dựa trên việc áp dụng kỹ thuật PCR

sử dụng cặp mồi có khả năng khuếch đại vùng gen bảo thủ (SSU) rRNA đã được

mô tả phát hiện các chủng gây viêm giác mạc: Nosema và Vittaforma corneae

[2].

2.2. Bệnh học và nguy cơ

Microsporidia được coi là tác nhân nhiễm trùng cơ hội ở bệnh nhân suy

giảm miễn dịch. Nguồn lây nhiễm cho người và con đường truyền bệnh vẫn còn

là bí ẩn, tuy nhiên chúng có thể lây qua đường phân-miệng do phơi nhiễm trực

tiếp hoặc sau tổn thương. Phơi nhiễm trực tiếp có thể do tiếp xúc gần với vật

nuôi như mèo và chim hoặc phát tán từ người mang bệnh. Vòng đời thông

12

thường của Microsporidia bao gồm bao tử xâm nhập vào cơ thể người sau đó

đưa các thành phần cấu tạo của loài này vào tế bào chất.Trong tế bào, bào tử

phân chia để tạo thành thể phân liệt (scizont) có 2-6 nhân, sau đó thể này phân

thành thể đơn bào meront. Tiếp đó, thể này sẽ tiết ra vỏ capsule cứng và trở

thành bào tử hoàn chỉnh có kích thước 2,5x1,5 micron. Tế bào sau cùng vỡ ra để

tiếp tục vòng đời tiếp theo và sau đó phá hủy vật chủ đồng thời phát tán trong

môi trường qua các chất thải của ký chủ như phân, nước tiểu, chất tiết hô hấp [1].

2.3. Đặc điểm dịch tễ kí sinh trùng Microsporidia

Nhiễm Microsporidia ở người gặp ở khắp nơi trên thế giới. Ký sinh trùng

này là nguyên nhân gây bệnh đáng kể ở bệnh nhân bị AIDS, bệnh nhân bị ức chế

miễn dịch sau ghép cơ quan, và ở nhóm người cạnh tranh miễn dịch. Loại nhiễm

ở người thường gặp nhất là Enterocytozoo bieneusi. Tỷ lệ nhiễm toàn bộ

Enterocytozoon bieneusi được báo cáo ở những quần thể chọn lọc như những

người nhiễm HIV có tiêu chảy thay đổi từ 7% - 50%. Nhiễm Encephalitozoon

(trước đây là Septata) intestinalis, Encephalitozoon hellem và Encephalitozoon

cuniculi cũng được ghi nhận với tần số tăng dần, trong khi nhiễm những giống

khác ít hơn [2].

Cách lây nhiễm và những yếu tố nguy cơ lây nhiễm chưa được biết nhiều.

sự có mặt của bào tử Microsporidia trong nước tiểu, phân, dịch hút tá tràng và

chất tiết đường hô hấp cho thấy khả năng lây lan là từ người qua người. Nhiễm ở

mắt có thể do từ bên ngoài do tay bẩn dụi vào mắt. Nhiễm ở đường niệu dục có

thể do lây lan qua đường tình dục. Nước cũng là nguồn nhiễm chủ yếu

Microsporidia. Bệnh do Microsporidia ở người có thể là bệnh động vật, nguồn

nhiễm chủ yếu có liên hệ đến các động vật như chim, chó, heo và thỏ [11, 12].

2.4. Chẩn đoán viêm loét giác mạc

Microsporidia là kí sinh trùng nhỏ, kí sinh nội bào bắt buộc, sản sinh bào

tử gây nhiễm. Chúng là loại vi sinh vật khó nuôi cấy. Ta có thể thu được sinh vật

này bằng cách sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô đặc biệt hiện đang được sử dụng

13

trong một số ít phòng thí nghiệm, do đó việc chẩn đoán vi sinh thường quy khá

khó. Các mẫu tế bào (cố định trong cồn) từ mảnh cạo từ kết mạc, biểu mô mắt

hoặc cả hai hoặc mảnh sinh thiết được chứng minh là rất hữu dụng cho việc biểu

hiện dạng bào tử của Microsporidia. Thường thì mảnh cạo từ kết mạc cũng đủ

cung cấp mẫu đạt tiêu chuẩn cho chẩn đoán tế bào học trong trường hợp viêm

kết giác mạc chấm nông . Kết quả tế bào học cho thấy sinh vật nhỏ hình oval tồn

tại trong tế bào biểu mô, tế bào sừng, mô bào và cấu trúc ngoại bào. Các bào tử

này có dạng oval giống nhau và không có mầm, giúp phân biệt chúng với vi

khuẩn và nấm khác. Chất nhuộm Giemsa được dùng để hiển thị bào tử của

Microsporidia. Trong một số trường hợp bất kì, bào tử bắt màu kém hoặc không

bắt màu chất nhuộm định kì [20].

Hinh 2.1. Hình ảnh nhuộm soi Microsporidia

Bệnh vi bào tử ở mắt, mặc dù không phổ biến, có thể tách là một phần của

nhiễm khuẩn hệ thống. Bệnh này chủ yếu có 2 dạng: viêm dính giác mạc,

thường thấy ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch; viêm giác mạc nhu mô thấy ở

bệnh nhân có hệ miễn dịch khỏe mạnh. Bệnh này được coi là bệnh cơ hội ở bệnh

nhân suy giảm miễn dịch.

2.5. Các phương pháp phát hiện Microsporidia

2.5.1. Chẩn đoán phân biệt

Cần phân biệt với những bệnh lý do các nguyên nhân khác khi biểu hiện

lâm sàng gặp ở đường ruột, gan, mật, hô hấp, niệu dục, mắt, xương cơ, thần kinh

trung ương. Bệnh lý đường ruột nên nghĩ dến nguyên nhân do Microsporidia ở

14

những cá thể suy giảm miễn dịch có tiêu chảy kéo dài hay bệnh gan mật không

rõ nguyên nhân.

Cần chẩn đoán phân biệt với nhiễm những đơn bào đường ruột khác cũng

gây tiêu chảy kéo dài như Cryptosporidium, Cyclospora, Giardia và Isospora. Ở

những cá thể miễn dịch bình thường, bệnh do Microsporidia được nghĩ đến ở

những khách du lịch bị tiêu chảy, trong đó những nguyên nhân bệnh lý thường

qui không thể xác định.

Chẩn đoán nguyên nhân do Microsporidia cũng nên được nghĩ đến ở bệnh

nhân viêm kết giác mạc hay loét giác mạc không giải thích được nguyên do,

bệnh viêm xoang hay bệnh đường hô hấp dưới lan tỏa, suy thận không rõ

nguyên nhân hay có những ca lắng bất thường trong nước tiểu, viêm cơ. Bệnh có

khuynh hướng lan tỏa. Kí sinh trùng này có thể xâm nhập bất kỳ cơ quan nào, kể

cả xương và hệ thần kinh trung ương. Cần xác định được mầm bệnh ở nhiều loại

bệnh phẩm nếu có thể như phân, đàm, nước tiểu, phết mũi, kết mạc, dịch não tủy

bằng tất cả những phương pháp có thể làm được [1, 11].

2.5.2. Chẩn đoán xác định

Chẩn đoán xác định dựa vào tìm thấy bào tử Microsporidia trong phân

sau khi nhuộm bằng các phương pháp đặc biệt như Weber chromotrope, hóa

huỳnh quang, Gram – chromotrope.

Các bệnh phẩm khác như nước tiểu, đờm, dịch rửa phế quản, dịch tá

tràng, phết từ màng nhày mũi, giác mạc, kết mạc. Ly tâm lấy cặn nhuộm bằng

các phương pháp như Gram, Weber chromotrope, Giemsa,Steiner bạc,

trichorome blue cải biến. PAS, kháng thể huỳnh quang đặc hiệu. Nhuộm gram

bào tử ăn màu gram dương rất rõ, nhưng đôi khi ăn màu gram âm hay gram

dương yếu.

Nhuộm mô giải phẫu bệnh từ mẫu sinh thiết hay giải phẫu thì từ các mô bệnh

như giác mạc, kết mạc, xương cơ, ruột non, ruột già, gan, túi mật, mạc treo,

thận, bọng đái, khí quản, phế quản. xương, não. Ở bệnh nhân nhiễm trùng ở mặt

15

– ruột, hỗng tràng và hồi tràng có mật độ nhiễm kí sinh trùng này cao nhất,

phương pháp nhuộm thường là Giemasa, PAS, methenamine bạc, Ziehl –

Neelsen, Kinyoun.

Các phương pháp khác như kháng thể huỳnh quang, sinh học phân tử

PCR, cấy mô, kính hiển vi điện tử ngoài việc chẩn đoán còn giúp định danh loài

Microsporidia [2, 11].

2.5.2.1. Phương pháp nhuộm soi

Trong điều trị viêm loét giác mạc do Microsporidia, việc chẩn đoán sớm có

ý nghĩa vô cùng quan trọng giúp cho việc điều trị đúng hướng ngay từ đầu.

Có nhiều phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng như soi tươi, soi trực tiếp,

ELISA, PCR…nhưng kỹ thuật thường được áp dụng là soi trực tiếp. Nguồn

bệnh phẩm được lấy từ chất nạo ổ loét giác mạc bằng thìa nạo chắp nhỏ hoặc

Spatula Kimura hay đầu của kim tiêm trong da.

Mặc dù nhiều đánh giá so sánh về hiệu quả của các phương pháp nhuộm

trong việc xác định Microsporidia trong các mẫu phân, mật, nước tiểu và tiêu

bản phổi, đánh giá về hiệu quả trong xác định Microsporidia trên mẫu tiêu bản

của mắt vẫn còn hạn chế. Mẫu giác mạc được lấy từ bệnh nhân được chẩn đoán

mà mắc Microsporidia sau đó đem đi dàn trên lam kính.

Cho đến nay ở nước ta, chẩn đoán vẫn chủ yếu dựa vào hình ảnh tổn

thương trên lâm sàng và kết quả nhuộm soi. Tổn thương do Microsporidia

mặc dù có những đặc điểm đặc trưng nhưng không phải lúc nào cũng rõ ràng và

dễ dàng cho chẩn đoán.

Đây là một xét nghiệm không thể thiếu, giúp chẩn đoán chính xác tác

nhân gây bệnh. Tuy nhiên, kỹ thuật nhuộm soi có độ đặc hiệu thấp chỉ áp dụng

đối với những ca nhiễm điển hình có hình thái rõ ràng, dễ nhận định nên đã bỏ

sót một tỷ lệ khá lớn các trường hợp bị bệnh [1].

2.5.2.2. Phương pháp PCR và Realtime PCR

16

Mặc dù phương pháp nhuộm vi sinh hiệu quả và đặc hiệu trong việc chẩn

đoán, xác định Microsporidia ở mắt, nó yêu cầu phải có sự tham gia của các

chuyên gia, đặc biệt vẫn chưa có phương pháp chẩn đoán từ mẫu lam kính.

Thêm vào đó, phương pháp nhuộm này không xác định được loài khác nhau của

Microsporidia. Do đó, hiện nay trên thế giới đã tập trung nghiên cứu phát triển

kỹ thuật PCR và Realtime PCR hỗ trợ cho chẩn đoán Microsporidia [10, 15].

A. Phương pháp PCR (Theo Kary Mullis và cộng sự năm 1985)

Nguyên tắc

Sử dụng ADN polymerase chịu nhiệt để tổng hợp các đoạn ADN mới từ

mạch khuôn trong môi trường có các dNTP và cặp mồi đặc hiệu. Các đoạn ADN

mới được tạo thành lại được sử dụng làm khuôn. Sau nhiều chu kỳ, đoạn ADN

quan tâm được nhân lên gấp bội, nhờ vậy có thể có đủ số lượng phục vụ cho

những nghiên cứu tiếp theo.

Mỗi một chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn sau:

- Giai đoạn biến tính: ADN mạch kép tách thành hai mạch đơn nhờ nhiệt

độ cao (940C-960C).

- Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ thích hợp, hai mồi sẽ bám vào hai đầu của

đoạn ADN đích theo nguyên tắc bổ sung.

- Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng được tăng lên

khoảng 70-800C là nhiệt độ thích hợp để cho Taq ADN polymerase kéo dài chuỗi.

Trong việc xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật khuếch đại

trình tự gen( PCR). Để khuyếch đại đoạn gen tiểu phần nhỏ SSU rRNA( đặc hiệu

cho loài) của Microsporidia, sử dụng cặp mồi MF1 và MF2 đã đc Polly công bố

năm 2011. Cặp mồi này đc tác giả khuyến cáo đc dùng để phát hiện chủng

Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm. Để khẳng định bộ mồi này có thể phát hiện

được chủng Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm mắt của các bệnh nhân viêm loét

giác mạc thì tiến hành tách chiết nhuộm soi 1 mẫu dương tính sau đó tiến hành

khuyếch đại trình tự gen. Sau khi tiến hành khuyếch đại gen, để khẳng định lại tính

17

chính xác thì tiến hành giải trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ SSU rRNA xác định lại

kích thước. Đồng thời, so sánh trực tuyến trình tự đoạn gen với ngân hàng gen thế

giới (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

Để đánh giá độ nhạy của kỹ thuật PCR, ADN tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm

chứa Microsporidia được khẳng định bằng kỹ thuật nhuộm soi và xác định trình tự

axít nucleic theo thang pha loãng 1000 lần (ngµ/L - fg/µL). Sau đó tiến hành phản

ứng PCR như thành phần và điều kiện phản ứng mô tả như trên.

Độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR được đánh giá trên chủng nấm: Aspergillus sp,

Fusarium sp; chủng vi khuẩn: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và

mẫu bệnh phẩm dương tính với HSV, CMV.

B. Phương pháp Realtime PCR

Trong phản ứng PCR kinh điển, sản phẩm khuếch đại được phát hiện qua

phân tích điểm kết thúc, bằng cách điện di ADN trên gel agarose khi phản ứng

kết thúc. Ngược lại, RealTime PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy

ADN khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng này được thực hiện

nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang báo hiệu sự gia tăng

lượng ADN tỷ lệ với sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang. Những hóa chất

phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết ADN và những trình tự gắn

huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe. Những máy luân nhiệt

đặc biệt trang bị bộ phận phát hiện huỳnh quang được sử dụng để kiểm soát tín

hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang được

đo lường phản ánh lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ.

Ưu điểm chính của Real-Time PCR so với PCR truyền thống là nó cho

phép xác định số lượng bản sao khuôn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhạy

cao trong một phạm vi biến thiên rộng. Kết quả Real-Time PCR có thể là kết

quả định tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự ADN) hay định lượng (số

lượng bản sao ADN). Real-Time PCR sử dụng để định lượng ADN được gọi là

PCR định lượng.

18

Đoạn dò TaqMan Probe là đoạn oligonucleotide có trình tự bổ sung với

trình tự của đoạn ADN trên mạch khuôn, giới hạn bởi 2 trình tự bổ sung với

trình tự của hai 2 đoạn mồi trong phản ứng PCR. Hai đầu của đoạn dò được gắn

hai chất gọi là chất phát quang (reporter) và chất ức chế (quencher), khi reporter

và quencher ở gần nhau thì quencher làm mất màu của reporter. Ngược lại, khi

reporter và quencher ở xa nhau thì reporter phát huỳnh quang. Trong mỗi chu kỳ

của phản ứng khuếch đại gene (PCR), đoạn dò và hai đoạn mồi sẽ được gắn vào

sợi khuôn DNA đích cần phát hiện. Tiếp đó, Taq DNA polymerase sẽ tổng hợp

mạch DNA mới dựa trên trình tự nucleotide của sợi khuôn và đoạn mồi, đồng

thời nó cũng phân cắt đoạn dò ra khỏi mạch khuôn khi nó tiến đến vị trí của

đoạn dò, trong quá trình này quencher sẽ tách ra khỏi reporter nên làm reporter

phát quang. Do đó, lượng phát quang sẽ tỉ lệ thuận với lượng DNA khuếch đại

lên. Kỹ thuật Real time PCR dùng đoạn dò TaqMan cho kết quả chính xác.

Hình 1.4. Nguyên lí của phản ứng RealTime PCR sử dụng đầu dò Taqman

Để thuận lợi cho những nghiên cứu tiếp theo, tiến hành tạo nguồn plasmit

chuẩn dương Microsporidia sử dụng các kit tinh sạch. Sản phẩm PCR khuyếch

đại đoạn gen tiểu phần nhỏ (SSU) rRNA sẽ được gắn vào trong vector

PTZ57/RT. Tiến hành đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu của phản ứng Realtime

19

PCR, kỹ thuật Realtime PCR sử dụng cặp mồi MSRT1 và MSRT2 với probe

MSRT chỉ phát hiện đặc hiệu trình tự tiểu phần nhỏ (SSU) rRNA của

Microsporidia mà không bắt cặp không đặc hiệu với các mầm bệnh vi sinh vật khác.

Để đánh giá độ nhạy của kỹ thuật Realtime PCR, ADN tổng số tách chiết

từ mẫu bệnh phẩm chứa Microsporidia được khẳng định bằng kỹ thuật nhuộm

soi và xác định trình tự axít nucleic theo thang pha loãng 1000 lần (ngµ/L -

fg/µL). Sau đó tiến hành phản ứng Realtime PCR như thành phần và điều kiện

phản ứng mô tả như trên.

Độ đặc hiệu của kỹ thuật Realtime PCR được đánh giá trên chủng nấm:

Aspergillus sp, Fusarium sp; chủng vi khuẩn: Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus và mẫu bệnh phẩm dương tính với HSV, CMV.

Hiện nay, ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về việc ứng dụng kỹ

thuật PCR vào việc phát hiện Microsporidia trên các mẫu bệnh phẩm viêm giác

mạc. Năm 2015, đã có nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện

Microsporidia trên cỡ mẫu nhỏ [1]. Đề tài chúng tôi thực hiện là tiếp nối từ kết

quả của nghiên cứu trước đó và phát triển nghiên cứu thêm ứng dụng kỹ thuật

realtime PCR phát hiện Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm mảnh giác mạc.

2.5.2.3. Phát hiện Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm thu thập được tại bệnh

viện trung ương Mắt kết hợp với bệnh viện TW Quân đội 108 từ 2016-2017

Tiến hành trên 30 mẫu bệnh phẩm thu thập được tại bệnh viện trung ương

Mắt kết hợp với bệnh viện TW Quân đội 108 từ 2016- 2017.

3. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong điều trị Microsporidia gây

bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam.

3.1. Tình hình điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt

Nam hiện nay.

Năm 2015, TS. Phạm Ngọc Đông và cs. đưa ra trong số 134 mắt viêm kết

giác mạc do Microsporidia, có tới 99% được điều trị khỏi bằng nhỏ mắt

fluoroquinolone đơn thuần; 4 mắt viêm tái phát, được điều trị khỏi bằng nhỏ

20

fluoroquinolone và phối hợp với albendazole. Tuy nhiên, điều trị viêm giác mạc

nhu mô do Microsporidia thì khó khăn và kết quả kém hơn nhiều. Mặc dù được

điều trị tích cực, kết quả điều trị nội khoa cũng hết sức thất vọng. Chỉ có 1/12

mắt được điều trị khỏi bằng nội khoa, số còn lại đều phải ghép giác mạc điều trị.

Kết quả thị lực sau ghép ở mức thấp, chủ yếu là từ BBT đến 20/400. Thị lực

thấp là do tổn thương nặng ở mắt (đục thể thủy tinh, màng xuất tiết diện đồng

tử…) và cả do chất lượng mảnh giác mạc ghép không tốt, nhưng vẫn phải dùng

để ghép, nhằm bảo tồn nhãn cầu cho bệnh nhân [2].

Theo Garg P. và sc., trong 19 ca điều trị bằng nhỏ mắt polyhexamethylene

biguanide và chlorhexidine, kèm theo uống albendazole hoặc itraconazole thì

hầu hết các bệnh nhân đều không đáo ứng với thuốc, phải ghép giác mạc mới

loại trừ được tác nhân gây bệnh [11].

Theo các báo cáo y khoa đã được công bố về các trường hợp viêm giác

mạc nhu mô do Microsporidia, hầu hết các trường hợp đều thất bại khi điều trị

nội khoa, phải bỏ nhãn cầu hoặc ghép giác mạc điều trị. Tuy cũng có một vài

trường hợp điều trị nội khoa thành công nhưng đây cũng là một thách thức rất

lớn đối với các bác sỹ nhãn khoa trong điều trị nhiễm trùng giác mạc do

Microsporidia.

Vấn đề đặt ra là nếu bệnh nhân không được phát hiện sớm tác nhân gây

bệnh là do kí sinh trùng Microsporidia, và khi điều trị bằng thuốc nhỏ mắt

không có tác dụng hay trong nhiều trường hợp bị viêm nặng sẽ phải chỉ định

phương pháp phẫu thuật dành cho viêm giác mạc. Do đó, vấn đề phát hiện sớm

tác nhân gây bệnh viêm giác mạc nói chung và đặc biệt là do Microsporidia nói

riêng đóng vai trò rất quan trọng trong việc đưa ra phác đồ điều trị sớm.

3.2. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng phương pháp PCR và

Realtime PCR để điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt

Nam.

21

Quả đúng như vậy, khi áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử, sử dụng phương

pháp PCR và Realtime PCR trong điều trị bệnh viêm loét giác mạc do

Microsporidia nói riêng có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng. Phương pháp này

giúp phát hiện sớm nguyên nhân gây viêm loét giác mạc có phải do

Microsporidia hay không, và về hiệu quả thì tối ưu hơn hẳn các phương pháp

thông thường hiện đang được sử dụng ở các Bệnh viện lớn tại Việt Nam hiện

nay như phương pháp nhuộm soi hay nuôi cấy về độ đặc hiệu cũng như độ nhạy

và thời gian làm xét nghiệm. Từ đó góp phần phát hiện sớm, đúng tác nhân và

tác động tích cực đến việc điều trị bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam. Giúp

điều trị sớm, bác sỹ đưa ra được phác đồ điều trị hơp lý và nhằm giảm thiểu chi

phí điều trị cho bệnh nhân cũng như hậu quả của việc phát hiện nguyên nhân

gây bệnh quá muộn gây ra.

Hiện nay, phương pháp PCR đã và đang từng bước được áp dụng để chẩn

đoán và phát hiện Microsporidia là tác nhân gây viêm loét giác mạc tại Bệnh

viện TW Quân đội 108 kết hợp với Bệnh viện Mắt TW. Vậy nên sau kết quả của

đề tài này, nhóm nghiên cứu của chúng tôi hi vọng ứng dụng thực tiễn của kỹ

thuật sinh học phân tử sử dụng phương pháp PCR và Realtime PCR trong việc

phát hiện Microsporidia trong việc điều trị viêm loét giác mạc sẽ được áp dụng

rộng rãi hơn nữa tại các bệnh viện lớn tại Việt Nam và được đưa vào quy trình

thường quy để xét nghiệm phát hiện tác nhân gây bệnh này.

22

Chương II

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

1. Đối tượng nghiên cứu

- 01 Mẫu chứng dương Microsporidia được phân lập từ mẫu bệnh phẩm

viêm giác mạc được xác định bằng phương pháp nhuộm soi tại khoa Xét nghiệm

tổng hợp, Bệnh viện mắt Trung ương.

- Mẫu bệnh phẩm như: mô, dịch giác mạc… của bệnh nhân được chẩn đoán

viêm loét giác mạc bằng phương pháp nhuộm soi do Microsporidia được cung

cấp bởi khoa Kết giác mạc, bệnh viện Mắt Trung ương. Mẫu bệnh phẩm được

lấy theo quy trình thường qui tại bệnh viện. Hồ sơ bệnh án của các bệnh nhân bị

viêm giác mạc nhu mô do Microsporidia được chẩn đoán và điều trị tại Khoa

Kết Giác mạc đến ngày 1 tháng 5 năm 2017.

- Các chủng nấm: Aspergillus sp, Fusarium sp…; Các chủng vi khuẩn:

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureu…và các mẫu bệnh phẩm dương

tính với Herpes Simplex Virus (HSV), Cytomegalovirus (CMV), được sử dụng để

đánh giá tính đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR

2. Hóa chất, thiết bị

2.1. Hóa chất

- GenJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo)

- GenJET PCR Purification Kit (Thermo)

- Các hóa chất, vật tư tiêu hao thông dụng trong sinh học phân tử của các

hãng Sigma, Merk, Invitrogen, Bio-Rad, Corning.

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB gồm 1% trypton, 0,5% cao nấm men,

0,5% NaCl.

Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu được đặt tổng hợp tại hãng IDT (Mỹ).

23

STT Tên Mồi Trình Tự

1 MF1 5’-CAGGTTGATC TGCCTGACG-3’

2 MF2 5’-CCATCTCCAGGCTCCCTCT-3’

Bảng 2.1. Trình tự mồi

2.2. Thiết bị, máy móc

Các trang thiết bị, máy móc được sử dụng tại Khoa Sinh học phân tử, Bệnh

viện TW Quân đội 108 bao gồm:

Tên thiết bị Hãng sản xuất

Hệ thống sequencing CEQ 8800 Beckman

Máy đo pH model 530 Corning

Cân điện tử Sartovius

Lò vi sóng Sanyo

Máy soi gel & chụp ảnh Gel-Doc Dolphin

Bộ điện di Bio-RAD

Máy Real time- PCR ABI7500 Applied BioSystems

Applied BioSystems Máy Fast PCR

Applied BioSystems Máy PCR AB9700

Tủ 40C & -200C Sanyo

Máy ly tâm đa năng Beckman

Máy đo quang phổ DU 730 Beckman

Máy ly tâm lạnh Eppendorf

Máy block nhiệt Eppendorf

Bộ pipets Eppendorf

Máy Vortex M52 IKA

Máy khuấy từ gia nhiệt model RCT IKA

24

2.3. Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ quy trình thí nghiệm tiến hành nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số

Quy trình tách chiết: 200 µl dịch mẫu bệnh phẩm

- Thêm 300 µL dung dịch ly giải tế bào (200 mM NaOH, SDS 2%).

- Ủ ở 95oC trong 15 phút sau đó trung hòa bằng 250 µL 1M Tris-HCl pH 4,8

- Bổ sung 600 µL dung môi 25:24:1 để phân tách DNA tổng số.

- Ly tâm với tốc độ 10000 rpm trong 15 phút.

- Hú t thu di ̣ch pha trên chứa DNA chuyển sang ống eppendorf 1,5 mL mớ i.

- Kết tủa dịch chứa DNA bằng isopropanol theo tỉ lệ 1:1. - Ly tâm lạnh 4oC với tốc độ 13200 rpm trong 20 phút.

- Hú t bỏ dịch nổi, bổ sung 700 µL Ethanol 75% để rử a kết tủ a DNA. - Ly tâm la ̣nh 4oC với tốc độ 13200 rpm trong 5 phú t.

- Hút bỏ ethanol để thu că ̣n DNA.

- Ly tâm că ̣n DNA vớ i tố c đô ̣ 13200 rpm trong 1 phút và dùng pipet loại bỏ

ethanol cò n só t la ̣i ở đáy ố ng và để khô tự nhiên trong 10 phú t.

- Bổ sung 200 µL TE (20 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA) vào că ̣n DNA, ủ

25

56 oC trong 10 phú t để hòa tan că ̣n DNA.

- Đo nồng độ DNA, đánh giá chất lượng DNA (thông qua chỉ số

OD260/OD280) được xem là sạch.

2.3.2. Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổ

Đây là phương pháp cho phép định lượng tương đối nồng độ nucleic acid

có trong mẫu.

Nguyên tắc dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260

nm của các base. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho

phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào mối tương quan: 1 đơn vị

OD260nm tương ứng với nồng độ:

+ 50 µg/mL cho một dung dịch ADN sợi đôi

+ 40 µg/mL cho một dung dịch ADN hay ARN sợi đơn

Hàm lượng ADN được xác định bằng công thức:

[ADN] = OD 260 x 50 x X (µg/mL)

Trong đó X là số lần pha loãng từ dung dịch ADN gốc ban đầu.

Ngoài ra phương pháp này còn có thể xác định được độ sạch mẫu phân tích

dựa trên tỉ số OD260 /OD280 . Nếu tỉ số này > 1,8 thì dung dịch ADN đem đo

2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose

Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các axit

nucleic: Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt (ở pH ~7)

nên khi chịu tác động của một điện trường có hiệu điện thế và cường độ thích

hợp chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường.

Quy trình

Gel agarose được sử dụng trong nghiên cứu có nồng độ từ 0,8% đến 2,5%.

Agarose được hòa tan trong đệm TAE 1X. Đun sôi dung dịch trong lò vi sóng 7-

10 phút cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội đến khoảng 50-600C, đổ

vào khuôn đã được lắp lược để tạo các giếng nhỏ. Khoảng 30 phút sau khi gel đã

26

nguội hoàn toàn thì rút lược ra. Để gel nằm ngang ngập dưới đệm TAE chứa

trong hộp điện di. Tiến hành tra mẫu vào các giếng theo thứ tự.

Quá trình chạy điện di được tiến hành với hiệu điện thế ổn định 110V trong

thời gian từ 30 đến 35 phút. Bản gel sau điện di được nhuộm với Ethidium

Bromide (0,5µl) trong 5 phút. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các bazơ

nitơ của axit nucleic và sẽ phát huỳnh quang dưới ánh sáng tia tử ngoại, giúp

cho việc quan sát các băng và chụp ảnh.

2.3.4. Phương pháp xác định trình tự axit nucleic

Xác định trình tự ADN được tiến hành bằng phương pháp tổng hợp của

Sanger cải biến với bộ sinh phẩm xác định trình tự của hãng Beckman. Công

việc được tiến hành qua 4 bước.

Bước 1: Phản ứng PCR sequencing

Chuẩn bị phản ứng trong ống epeendrof 0.2ml với các thành phần như sau:

Thành phần phản ứng Thể tích phản ứng (µL)

DNTP 6

Mồi xuôi (10pM) 0.5

Khuôn DNA 1.5

7 H2O

15 Tổng thể tích phản ứng

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR sequencing:

960C ---------- 20 giây

550C ---------- 20 giây 30 chu kỳ

600C ---------- 4 phút

40C ---------- 

Bước 2: Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự

- Chuẩn bị ống eppendrof 0,5ml (đã khử trùng, số lượng ống tương đương

với số lượng mẫu cần tinh sạch).

27

- Thêm vào mỗi ống 0,5ml hỗn hợp dung dịch dừng phản ứng (Stop

Solution) với các thành phần và thể tích như sau:

3M Natri Acetate pH 5,2 2µl

2µl 100 mM Na2EDTA pH 8.0

20 mg/ml Glycogen 1µl

- Chuyển toàn bộ dung dịch phản ứng PCR giải trình tự vào ống 0,5ml đã

có hỗn hợp Stop Solution và vortex trong vài giây.

- Thêm vào mỗi ống 60l Ethanol lạnh 96% (được bảo quản trong tủ lạnh –

200C), vortex và ly tâm với tốc độ 13200 vòng/phút trong 30 phút ở 40C. Cẩn

thận hút bỏ dung dịch (giữ lại ADN tủa ở đáy ống).

- Rửa ADN tủa bằng cách thêm 200L Ethanol lạnh 70% (bảo quản trong

tủ lạnh -200C, không dùng cồn để quá lâu) và ly tâm với tốc độ 13200 vòng/phút

trong 10 phút ở 40C. Cẩn thận hút bỏ dung dịch. (Bước này được thực hiện 2 lần).

- Quay khô chân không trong vòng 10 phút hoặc cho đến khô.

- Hoà tan ADN tủa vào trong 40µL SLS (cung cấp kèm theo DTCS Quick

Start Kit)

Bước 3: Chuẩn bị mẫu để đưa vào máy giải trình tự

- Chuyển toàn bộ dung dịch ADN hoà tan trong SLS từ bước tinh sạch vào

giếng tương ứng trên đĩa chạy mẫu (Sample plate).

- Nhỏ một giọt dầu (mineral oil) lên trên (để tránh bay hơi mẫu, mineral oil

được cung cấp kèm theo DTCS Quick Start Kit).

- Bổ sung dung dich Buffer Solution vào trong các giếng tương ứng trên

đĩa Buffer plate (chú ý vị trí các giếng tra buffer phải khớp với vị trí các giếng

tương ứng trên Sample pate).

Bước 4: Xác định trình tự trên máy CEQ 8800 sequencer, Beckman

Coulter, Mỹ.

28

2.3.5. Xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng phương pháp PCR

và Realtime PCR

Để khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA

của Microsporidia, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng cặp mồi MF1 và

MF2 với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày trong Bảng 2.2.

Để đánh giá chất lượng của ADN sau khi tách chiết, chúng tôi tiến hành

phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Betaglobin F và Betaglobin R với thành phần

phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày ở Bảng 2.3.

Bảng 2.2. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự

đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia sử

dụng cặp mồi MF1&MF2

Thành phần phản ứng Thể tích (µL)

1) 2X MasterMix DreamTaq Promega 12,5

2) Mồi MF1 (10pM) 1,0

3) Mồi MF2 (10pM) 1,0

4) ADN mẫu chuẩn dương 5,0

5,5 5) H2O cho PCR

25,0 Tổng thể tích

94oC, 2 phút; 38 chu kì [94oC, 30 giây; 57oC, 30 giây; 72oC, 30

giây]; 72oC, 10 phút; giữ nhiệt ở 4oC

Sản phẩm PCR thu được sẽ được tinh sạch sử dụng bộ sinh phẩm GenJET

PCR Purification Kit (Thermo) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR:

- Bổ sung tỷ lệ 1V Binding Buffer : 1V sản phẩm PCR cần tinh sạch. Nếu

kích thước sản phẩm tinh sạch <500bp thì bổ sung thêm 1V isopropanol.

- Trộn đều hỗn hợp, sau đó chuyển lên cột, ly tâm 11000 vòng/phút trong 1 phút.

- Đổ bỏ dịch trong ống thu, bổ sung 700µl dung dịch Wash Solution lên

cột, ly tâm 11000 vòng/phút trong 1 phút.

29

- Đổ bỏ dịch trong ống thu, ly tâm khan 11000 vòng/phút trong 3 phút để

loại bỏ hoàn toàn cồn.

- Chuyển cột sang ống thu mới, bổ sung Elution Buffer, ủ ở nhiệt độ

thường 2-3 phút, ly tâm 11000 vòng/phút trong 2 phút.

- Bảo quản sản phẩm ỏ -20oC

Sau đó, sản phẩm tinh sạch sẽ được xác định trình tự nucleotide trên hệ

thống máy giải trình tự CEQ 8800 sequencer, Beckman Coulter, Mỹ.

Bảng 2.3. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá chất lượng

ADN sau tách chiết sử dụng cặp mồi Betaglobin F và Betaglobin R

Thành phần phản ứng Thể tích (µL)

1) 2X MasterMix DreamTaq Promega 12,5

2) Mồi BetaglobinF (10pM) 1,0

3) Mồi Betaglobin R (10pM) 1,0

4) ADN mẫu chuẩn dương 5,0

5,5 5) H2O cho PCR

25,0 Tổng thể tích

94oC, 2 phút; 35 chu kì [94oC, 30 giây; 58oC, 30 giây; 72oC, 30

giây]; 72oC, 10 phút; giữ nhiệt ở 4oC

Phản ứng Realtime PCR được sử dụng để khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu

phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia được chúng tôi tiến

hành với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày trong Bảng 2.4.

30

Bảng 2.4. Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR khuếch đại

trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của

Microsporidia sử dụng cặp mồi MSRT1&MSRT2 và probe MSRT

Thành phần phản ứng

1) 2X MasterMix Qiagen 2) Mồi MF1 (10pM) 3) Mồi MF2 (10pM) 4) Probe MSRT (10pM) 4) ADN 5) H2O cho PCR

Thể tích (µL) 12,5 1,0 1,0 1,0 5,0 4,5 25,0 Tổng thể tích

95oC, 15 phút; 45 chu kì [95oC, 15 giây; 60oC,60 giây;]; Kênh màu thu nhận tín hiệu FAM

2.3.5.1. Xác định độ nhạy của phương pháp PCR và Realtime PCR

Mẫu ADN chuẩn dương được tiến hành đo nồng độ ADN ở bước sóng

OD260/280 sau đó được tiến hành pha loãng tới nồng độ tới hạn. Thành phần

phản ứng và chu trình nhiệt của phản ứng PCR và Realtime PCR đánh giá độ

nhạy của phương pháp được trình bày ở Bảng 2.5 và Bảng 2.6.

Bảng 2.5. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá độ nhạy của

phương pháp

Thành phần phản ứng Thể tích (µL)

1) 2X MasterMix DreamTaq Promega 12,5

2) Mồi MF1 (10pM) 1,0

3) Mồi MF2 (10pM) 1,0

4) ADN 5,0

5,5 5) H2O cho PCR

25,0 Tổng thể tích

94oC, 2 phút; 35 chu kì [94oC, 30 giây; 57oC, 30 giây; 72oC, 30

giây]; 72oC, 10 phút; giữ nhiệt ở 4oC

31

Bảng 2.6. Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR đánh giá độ

nhạy của phương pháp

Thành phần phản ứng Thể tích (µL)

1) 2X MasterMix Qiagen 12,5

2) Mồi MF1 (10pM) 1,0

3) Mồi MF2 (10pM) 1,0

4) Probe MSRT (10pM) 1,0

4) ADN mẫu chuẩn dương 5,0

4,5 5) H2O cho PCR

25,0 Tổng thể tích

95oC, 15 phút; 45 chu kì [95oC, 15 giây; 60oC,60 giây;];

Kênh màu thu nhận tín hiệu FAM

2.3.5.2. Xác định độ đặc hiệu của phương pháp PCR và Realtime PCR

Để xác định độ đặc hiệu của hai phương pháp PCR và Realtime PCR phát

hiện Microsporidia, chúng tôi tiến hành chạy trên các mẫu ADN chuẩn dương

đối chứng bao gồm: 2 chủng nấm Aspergillus sp, Fusarium sp, 2 chủng vi khuẩn

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và 2 mẫu bệnh phẩm chẩn

đoán dương tính với virus HSV và CMV.

Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phản ứng PCR và Realtime

PCR đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp được trình bày ở Bảng 2.7 và Bảng 2.8.

32

Bảng 2.7. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá độ đặc hiệu của

phương pháp

Thành phần phản ứng Thể tích (µL)

1) 2X MasterMix DreamTaq Promega 12,5

2) Mồi MF1 (10pM) 1,0

3) Mồi MF2 (10pM) 1,0

4) ADN mẫu chuẩn dương 5,0

5,5 5) H2O cho PCR

25,0 Tổng thể tích

94oC, 2 phút; 38 chu kì [94oC, 30 giây; 57oC, 30 giây; 72oC, 30

giây]; 72oC, 10 phút; giữ nhiệt ở 4oC

Bảng 2.8. Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR đánh giá độ

đặc hiệu của phương pháp

Thành phần phản ứng Thể tích (µL)

1) 2X MasterMix Qiagen 12,5

2) Mồi MF1 (10pM) 1,0

3) Mồi MF2 (10pM) 1,0

4) Probe MSRT (10pM) 1,0

4) ADN mẫu chuẩn dương 5,0

4,5 5) H2O cho PCR

25,0 Tổng thể tích

95oC, 15 phút; 45 chu kì [95oC, 15 giây; 60oC,60 giây;];

Kênh màu thu nhận tín hiệu FAM

33

2.3.5.3. Tạo plasmid chuẩn dương microsporida

Để tiến hành tạo plasmid chuẩn dương Microsporidia dùng trong nghiên

cứu này, chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm InsTAclone PCR Cloning của Thermo.

Quy trình tiến hành được tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Mẫu ADN chuẩn dương sẽ được khuếch đại bằng PCR với thành phần

phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày ở Bảng 2.9.

Bảng 2.9. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tạo plasmid

chuẩn dương

Thành phần phản ứng Thể tích (µL)

1) 2X MasterMix DreamTaq Promega 12,5

2) Mồi MF1 (10pM) 1,0

3) Mồi MF2 (10pM) 1,0

4) ADN mẫu chuẩn dương 5,0

5,5 5) H2O cho PCR

25,0 Tổng thể tích

94oC, 2 phút; 38 chu kì [94oC, 30 giây; 57oC, 30 giây; 72oC, 30

giây]; 72oC, 25 phút; giữ nhiệt ở 4oC

Sản phẩm PCR sau đó sẽ được tinh sạch bằng bộ sinh phẩm GenJET PCR

Purification Kit (Thermo) và được đo nồng độ ADN ở bước sóng OD260/280.

Sau đó, sản phẩm PCR sau tinh sạch sẽ được cloning vào trong vector

pTZ57R/T theo quy trình như sau:

Thành phần phản ứng Thể tích

1) Puri pcr MF1&MF2 3µl

17µl 2) H2O vô trùng

3) Vector pTZ57R/T 3µl

4) 5X ligation buffer 6µl

5) Enzyme T4 ligase 1µl

30µl Tổng thể tích

- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1-2 giờ.

34

- Chuyển 3µl hỗn hợp phản ứng vào trong tế bào khả biến E. Coli DH5α, ủ

trên đá 30 phút.

- Sốc nhiệt 42oC trong vòng 30 giây, sau đó nhanh chóng chuyển lên đá. - Bổ sung 250µl môi trường LB lỏng, lắc 37oC 200 vòng/phút trong 1 giờ.

- Trải lên đĩa thạch có sẵn kháng sinh chọn lọc Ampicilin (100µg/ml) và

IPTG/Xgal, ủ 37oC qua đêm. Tiến hành chọn lọc khuẩn lạc xanh trắng.

Các khuẩn lạc trắng thu được sẽ được sàng lọc sơ bộ bằng phản ứng PCR-

colony với các thành phần được trình bày ở Bảng 2.10.

Bảng 2.10. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tạo plasmid

chuẩn dương

Thành phần phản ứng 1) 2X MasterMix DreamTaq Promega 2) Mồi M13 F(10pM) 3) Mồi M13 R (10pM) 4) Khuẩn lạc 5) H2O cho PCR

Thể tích (µL) 12,5 1,0 1,0 1,0 9,5 25,0 Tổng thể tích

94oC, 2 phút; 35 chu kì [94oC, 30 giây; 55oC, 30 giây; 72oC, 30 giây]; 72oC, 10 phút; giữ nhiệt ở 4oC

Khuẩn lạc nghi ngờ chứa plasmid tái tổ hợp sau đó được nuôi cấy trong

môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicilin (nồng độ 100g/mL) từ 12

đến 16 tiếng ở 37oC 200 vòng/phút. Sau đó, tiến hành tách plasmid sử dụng bộ

sinh phẩm GenJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo) theo quy trình nhà sản xuất

cung cấp như sau:

- Ly tâm thu cặn vi khuẩn sau khi nuôi lắc 12 đên 16 tiếng 8000 vòng/phút

trong 2 phút. Hút bỏ dịch nổi.

- Bổ sung 250µl Resuspension Solution (đã bổ sung Rnase A) vào trong

eppendoff có chứa cặn vi khuẩn. Trộn đều bằng pipet cho đến khi cặn tan hoàn toàn.

- Bổ sung 250µl Lysis Solution, úp ngửa ống eppendoff 4 đến 6 lần hoặc

đến khi dung dịch đồng nhất.

35

- Bổ sung 350µl Neutralization Solution, úp ngửa ống eppendoff 4-6 lần.

Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút.

- Đặt cột lên trên ống thu. Chuyển toàn bộ dịch trong lên trên cột (tránh hút

phải cặn). Ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút.

- Đổ bỏ dịch trong ống thu. Bổ sung 500µl Wash Solution vào trong cột, ly

tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. Bước này lặp lại 2 lần.

- Đổ bỏ dịch trong ống thu. Ly tâm khan 12000 vòng/phút trong 2 phút để

loại bỏ hoàn toàn Wash Solution.

- Bổ sung 50µl Elution Buffer, để ủ 2 đến 3 phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly

tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút.

- Sản phẩm được bảo quản ở -20oC.

Sau đó, plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng phương pháp PCR với cặp

mồi đặc hiệu vector M13 (For&/Rev) để kiểm tra chính xác sự có mặt của trình

tự gen Microsporidia trong vector tiếp nhận pTZ57R/T. Thành phần và điều

kiện của phản ứng PCR đã được trình bày trong Bảng 2.10.

36

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật

PCR và Realtime PCR

Để khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA

của Microsporidia, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi

MF1&MF2 đã được Spencer D.Polly và cs công bố năm 2011. Cặp mồi này có

khả năng khuếch đại trình tự ADN đích từ các chủng Microsporidia nuôi cấy

như: Encephalitozoon intestinalis, Encephalitozoon hellem và bào tử của chủng

Encephalitozoon cuniculi. Sử dụng kỹ thuật khuếch đại gen theo thời gian thực

(RealTime PCR) kết hợp SYBR Green, nhóm tác giả đã phân tích nhiệt nóng

chảy để nhận biết phân biệt bốn chủng Microsporidia: Encephalitozoon

bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Encephalitozoon hellem và

Encephalitozoon cuniculi, dựa trên kích thước các đoạn ADN được nhân lên từ

bốn chủng tương ứng với 262, 282, 291 và 281 bp. Từ kết quả nghiên cứu này

nhóm tác giả khuyến nghị sử dụng cặp mồi MF1&MF2 trong phản ứng

PCR/RealTime PCR phát hiện Microsporidia trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng.

Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA

ribosomal của Microsporidia.

37

Đường chạy số 1, đối chứng âm; Đường chạy số 2, sản phẩm khuếch đại

đoạn gen RNA ribosomal của Microsporidia; Đường chạy số 3, sản phẩm khuếch

đại gen β-globulin của người; M, thang chuẩn DNA.

Sử dụng 02 mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc đã được xác định dương tính

với Microsporidia bằng phương pháp nhuộm soi tại bộ phận Vi sinh, khoa Xét

nghiệm tổng hợp, Bệnh viện Mắt Trung ương, chúng tôi tiến hành tách chiết

ADN tổng số theo phương pháp đã trình bày ở phần trên và thực hiện phản ứng

khuếch đại 02 gen đích: cặp mồi MF1&MF2 trên thực tế khuếch đại trình tự có

kích thước khoảng 254 bp đặc trưng cho tiểu phần nhỏ (SSU) rRNA của

Microsporidia, cặp mồi khác khuếch đại gen nội chuẩn của người, β-globulin

với kích thước 180 bp.

Kết quả ở hình 3.1 cho thấy sử dụng cặp mồi MF1&MF2 đã khuếch đại đặc

hiệu đoạn gen có kích thước khoảng 254 bp. Trong khi đoạn gen có kích thước

180 bp tương ứng đoạn gen nội chuẩn của người β-globulin cũng được khuếch

đại thành công.

Hình 3.2. Minh họa kết quả giải trình tự đoạn gen (SSU) rRNA Microsporidia

từ bệnh phẩm giác mạc của bệnh nhân KHUYEN.

38

Để khẳng định chắc chắn đoạn gen được khuếch đại thành công ở trên là

của Microsporidia, chúng tôi tiến hành giải trình tự gen trực tiếp sản phẩm PCR

ở hình 3.1 sau khi tinh sạch sản phẩm này. Kết quả giải trình tự chúng tôi thu

được trình tự đoạn gen có kích thước sau khi phân tích là 212 nucleotide.

Hình 3.3. Kết quả so sánh trực tuyến trình tự đoạn gen từ mẫu

Microsporidia_KHUYEN.scf với ngân hàng gen thế giới.

Với trình tự thu được ở trên, chúng tôi tiến hành so sánh trực tuyến với

Ngân hàng gen thế giới (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Kết quả ở hình 3.2 cho

thấy đoạn gen 212 bp được xác định là tiểu phần nhỏ ribosome (small subunit

ribosomal) thuộc chủng Vittaforma corneae LVPEI.BB630F trong ngân hàng

gen thế giới, mã đăng kí: KP099416, với độ tương đồng về trình tự gen là 99%.

Chúng tôi tiến hành lập lại quy trình tách chiết ADN, tiến hành phản ứng

PCR và giải trình tự thêm 01 mẫu bệnh phẩm dương tính với Microsporidia

39

(Microsporidia_TIEP), đều cho kết quả phù hợp 100%, khẳng định đoạn gen

chúng tôi nhân bản được là tiểu phần nhỏ ribosome của chủng Vittaforma

corneae thuộc loài Microsporidia.

Hình 3.4. Kết quả khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal của

Microsporidia bằng phản ứng Realtime PCR.

Sau khi có được kết quả giải trình tự mẫu chuẩn dương Microsporidia,

chúng tôi sử dụng cặp mồi MSRT1 và MSRT2 với probe MSRT do nhóm

nghiên cứu thiết kế để khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit

(SSU) rRNA. Kết quả ở Hình 3.4 cho thấy chúng tôi đã khuếch đại thành công

trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia

bằng phương pháp Realtime PCR.

3.2. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR

3.2.1. Đánh giá độ nhạy của kỹ thuật PCR và Realtime PCR

40

Bảng 3.1. Bảng pha loãng ADN tổng số từ mẫu bệnh phẩm chẩn đoán

dương tính với Vittaforma corneae

1) Vittaforma 2) Vittaforma 3) Vittaforma 4) Vittaforma

corneae 224 corneae 2,24 corneae 0,224 corneae 224 pg/L

ng/L pg/L pg/L

5) Vittaforma 6) Vittaforma 7) Vittaforma

corneae 2,24 x corneae 2,24 x 10-3 corneae 2,24 x

10-2 pg/L pg/L 10-4 pg/L

Sử dụng mẫu ADN tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm khẳng định

dương tính với Microsporidia (chủng Vittaforma corneae) (mã mẫu bệnh phẩm:

Microsporidia_KHUYEN) có nồng độ 224 ng/ L, chúng tôi tiến hành pha

loãng nồng độ ADN theo Bảng 3.1, sau đó đánh giá độ nhạy của kỹ thuật PCR

và Realtime PCR trên các mẫu ADN được pha loãng.

Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR đánh giá độ nhạy của kỹ thuật PCR

phát hiện Vittaforma corneae.

Đường chạy số 1 – 7 tương ứng với nồng độ ADN pha loãng của Vittaforma

corneae, 224 ng/L, 224 pg/L, 2,24 pg/L, 0,224 pg/L, 2,24 x 10-2 pg/L,

2,24 x 10-3 pg/L và 2,24 x 10-4 pg/L. Đường chạy số 8, chứng âm. M, thang

ADN chuẩn.

41

Kết quả ở hình 3.5 cho thấy ở nồng độ ADN pha loãng của Vittaforma

corneae đến 2,24 x 10-2 pg/L tương đương 22,4 fg/L, kỹ thuật Realtime PCR

vẫn có thể phát hiện đoạn trình tự tiểu phần nhỏ ribosome của chủng Vittaforma

corneae.

Hình 3.6. Kết quả Realtime PCR đánh giá độ nhạy của kỹ thuật Realtime phát

hiện Vittaforma corneae.

Đường tín hiệu số 1 – 7 tương ứng với nồng độ ADN pha loãng của Vittaforma

corneae, 224 ng/L, 224 pg/L, 2,24 pg/L, 0,224 pg/L, 2,24 x 10-2 pg/L,

2,24 x 10-3 pg/L và 2,24 x 10-4 pg/L.

Kết quả ở hình 3.6 cho thấy ở nồng độ ADN pha loãng của Vittaforma

corneae đến 2,24 x 10-3 pg/L tương đương 2,24 fg/L, kỹ thuật Realtime PCR

vẫn có thể phát hiện đoạn trình tự tiểu phần nhỏ ribosome của chủng Vittaforma

corneae. Kỹ thuật Realtime PCR cho độ nhạy phát hiện cao hơn so với kỹ thuật PCR.

3.2.2. Đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR

Để đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR, chúng tôi sử

dụng 6 mẫu ADN được tách chiết từ các chủng nấm, vi khuẩn và virus bao gồm:

2 chủng nấm Aspergillus sp, Fusarium sp, 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas

42

aeruginosa, Staphylococcus aureus và 2 mẫu bệnh phẩm chẩn đoán dương tính

với virus HSV và CMV.

Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật

PCR phát hiện Microsporidia.

Đường chạy số 1–6, tương ứng chủng nấm Aspergillus sp, Fusarium sp, chủng

vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, và mẫu bệnh phẩm

chẩn đoán dương tính với virus HSV và CMV. (+),đối chứng dương Vittaforma

corneae. (-), đối chứng âm. M, thang ADN chuẩn

Hình 3.8. Kết quả Realtime PCR đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật Realtime

PCR phát hiện Microsporidia.

43

Kết quả ở hình 3.7 và 3.8 cho thấy quy trình phát hiện Microsporidia

bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi MF1&MF2 và kỹ thuật Realtime PCR sử

dụng cặp mồi MSRT1 và MSRT2 với probe MSRT chỉ phát hiện đặc hiệu trình

tự tiểu phần nhỏ (SSU) rRNA của Microsporidia mà không bắt cặp không đặc

hiệu với các mầm bệnh vi sinh vật khác.

3.3. Thiết kế tạo plasmid chuẩn dương Microsporidia

Theo trình bày ở phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu, chúng tôi thực

hiện cloning đoạn trình tự khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal của

Microsporidia vào trong vector pTZ57R/T để tạo vector tái tổ hợp pTZ57RR/T-

Microsporidia bằng phản ứng ligation dưới xúc tác của enzyme T4 ligage.

Sản phẩm của phản ứng ligation sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến

E. Coli DH5α. Các khuẩn lạc sẽ được chọn lọc trên đĩa thạch có trải kháng sinh

ampicillin và IPTG/XGal. Các khuẩn lạc cho kết quả dương tính là các khuẩn

lạc mọc trên đĩa có màu trắng, các khuẩn lạc không xảy ra phản ứng ligation sẽ

cho màu xanh do xảy ra phản ứng cảm ứng với IPTG/XGal.

Hình 3.9A. Kết quả điện di sản phẩm PCR clony kiểm tra kết quả phản ứng

ligation tạo plasmid chuẩn dương microsporida bằng cặp mồi vector M13.

Đường chạy số 1: plasmid pTZ57R/T làm đối chứng âm. Đường chạy số 2 đến 6

và 10 đến 12 là các khuẩn lạc nghi ngờ có chứa plasmid pTZ57R/T-

Microsporidia. Đường chạy số 8,9 là các khuẩn lạc nghi ngờ âm tính. M: thang

chuẩn ADN.

44

Cặp mồi vector M13 có vị trí gắn đặc hiệu trên vector pTZ57R/T cho phép

khuếch đại đoạn gen có kích thước 152bp hoặc 406bp tương ứng với các dòng

mang và không mang plasmid tái tổ hợp pTZ57R/T-Microsporidia.

Chúng tôi tiến hành chọn một khuẩn lạc nghi ngờ dương tính có chứa

plasmid pTZ57R/T-Microsporidia để tiến hành tách plasmid và chạy kiểm

chứng lại bằng phản ứng Colning DNA.

Hình 3.9B. Kết quả điện di sản phẩm plasmid PCR bằng cặp mồi vector M13

trên plasmid nghi ngờ mang đoạn gen Microsporidia.

Đường chạy số 1: plasmid tách từ khuẩn lạc nghi ngờ chứa plasmid pTZ57R/T-

Microsporidia. M: thang chuẩn ADN.

Kết quả từ hình 3.9b cho thấy, khuẩn lạc nghi ngờ có chứa plasmid

plasmid pTZ57R/T-Microsporidia khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu vector M13

nhân lên được đoạn gen có kích thước hơn 400bp (bao gồm đoạn gen của vector

+ đoạn chèn ADN Microsporidia). Từ đó khẳng định, chúng tôi đã cloning được

đoạn gen khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal của Microsporidia vào trong

vector pTZ57R/T.

Để sử dụng plasmid chuẩn dương đã tạo được làm chuẩn dương sử dụng

trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đo OD, tính số bản copies tương ứng

45

của plasmid sau đó tiến hành pha loãng xuống các nồng độ thấp hơn. Sau đó,

chúng tôi tiến hành chạy PCR và Realtime PCR để chọn được nồng độ plasmid

lấy làm chuẩn dương thích hợp.

Hình 3.10. Kết quả Realtime PCR trên mẫu plasmid chuẩn dương

Microsporidia pha loãng nồng độ. Đường tín hiệu từ 1 đến 7: plasmid chuẩn

dương pha loãng nồng độ lần lượt 108, 107, 106,105,104,103,102.

Hình 3.11. Kết quả Realtime PCR trên mẫu plasmid chuẩn dương

Microsporidia pha loãng nồng độ.

Đường chạy từ 1 đến 7: plasmid chuẩn dương pha loãng nồng độ lần lượt 108,

107, 106,105,104,103,102. Đường chạy số 8: chuẩn âm. M: thang nồng độ ADN.

46

Từ kết quả ở Hình 3.10 và 3.11, chúng tôi lựa chọn nồng độ 103 làm nồng

độ plasmid chứng dương sử dụng trong nghiên cứu sau này. Ở nồng độ này, đảm

bảo được quá trình PCR và Realtime PCR không xảy ra hiện tượng dương tính

giả do nhiễm chéo, đảm bảo tính ổn định của phản ứng.

3.4. Thử nghiệm kỹ thuật PCR và Realtime PCR phát hiện Microsporidia

trên các mẫu bệnh phẩm viêm kết giác mạc mắt

Sau khi đã xây dựng được quy trình chẩn đoán Microsporidia bằng phương

pháp PCR và Realtime PCR, chúng tôi tiến hành thu thập các mẫu bệnh phẩm

viêm kết giác mạc mắt nghi ngờ nhiễm Microsporidia tại bệnh viện Mắt Trung

Ương. Có 30 mẫu bệnh phẩm được thu thập có kết quả nhuộm soi.

Kết quả nhuộm soi:

Các mẫu dương tính từ 1 đến 3 : mẫu số 1,2, 3,4,5,6, 7, 9, 11,12, 13,15, 16,

19, 21, 22, 27,28,29,30.

Các mẫu nghi ngờ: mẫu số 14, 15, 17, 24 và 25.

Chúng tôi tiến hành tách chiết ADN tổng số theo phương pháp đã được mô

tả ở chương II, sau đó áp dụng quy trình kỹ thuật PCR và Realtime PCR để tiến

hành đánh giá so sánh hiệu quả của hai kỹ thuật trên với kỹ thuật nhuộm soi hiện

nay đang được sử dụng tại bệnh viện Mắt Trung Ương.

A

B

47

Hình 3.12. A,B. Kết quả điện di PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh

viện Mắt Trung Ương.

Đường chạy từ 1 đến 30: sản phẩm điện di tương ứng lần lượt với 30 mẫu bệnh

phẩm thu thập được. Pos: chuẩn dương. Ne: chuẩn âm. M; thang ADN chuẩn.

A

Hình 3.13 A. Kết quả Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện

Mắt Trung Ương.

Các đường tín hiệu: các mẫu bệnh phẩm dương tính có mã số lần lượt 3, 7, 9,

11, 13 và 14.

48

B

Hình 3.13 B. Kết quả Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện

Mắt Trung Ương. Các đường tín hiệu: các mẫu bệnh phẩm dương tính có mã

số lần lượt 16, 17, 19, 21, 22, 24, 25, 27 và 28.

49

Bảng 3.2. Bảng tổng hợp số liệu kết quả phát hiện Microsporidia trên 30

mẫu bệnh phẩm lâm sàng bằng 3 phương pháp nhuộm soi, PCR, realtime

PCR.

Mẫu bệnh phẩm (kí hiệu) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Kết quả vi sinh Nhuộm soi Âm tính Âm tính Dương tính Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Nghi ngờ Nghi ngờ Dương tính Nghi ngờ Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Nghi ngờ Nghi ngờ Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Kết quả sinh học phân tử PCR Âm tính Âm tính Dương tính Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính Realtime PCR Âm tính Âm tính Dương tính Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính Dương tính Âm tính Âm tính

50

Bảng 3.3. Kết quả phát hiện Microsporidia trên 30 mẫu bệnh phẩm lâm sàng.

Kết quả chẩn Microsporidia

đoán

Dương tính Âm tính Nghi ngờ Tổng số

14 16 0 30 PCR

15 15 0 30 Realtime

PCR

11 14 5 30 Nhuộm soi

Kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy

- Kỹ thuật PCR phát hiện được 14/30 mẫu dương tính với Microsporidia so

với 11/30 của phương pháp nhuộm soi. 11/11 mẫu dương tính nhuộm soi đều

dương tính với PCR. Trong 5 mẫu phương pháp nhuộm soi nghi ngờ thì phương

pháp PCR phát hiện được 3 mẫu dương tính và 2 mẫu âm tính.

- Kỹ thuật Realtime PCR phát hiện được 15/30 mẫu dương tính với

Microsporidia so với 11/30 của phương pháp nhuộm soi. 11/11 mẫu dương tính

nhuộm soi đều dương tính với Realtime PCR. Trong 5 mẫu phương pháp nhuộm

soi nghi ngờ thì phương pháp Realtime PCR phát hiện được 4 mẫu dương tính

và 1 mẫu âm tính.

- Kỹ thuật Realtime PCR phát hiện được mẫu số 25 dương tính (Ct 39) so

với kỹ thuật PCR trả lời âm tính và nhuộm soi trả lời kết quả nghi ngờ cho thấy

độ nhạy của phương pháp realtime PCR là tốt hơn.

Bàn luận

Trong chẩn đoán thường quy, xét nghiệm cần thiết kế tối ưu dễ dàng cho

việc thực hiện với mục đích hạn chế lỗi có thể xẩy ra trong quá trình thao tác,

điều quan trọng cần có độ nhạy và độ đặc hiệu chẩn đoán cao. Các phương pháp

sử dụng để phát hiện Microsporidia như soi trực tiếp bào tử Microsporidia trong

mẫu bệnh phẩm chất nạo giác mạc, sử dụng các kỹ thuật nhuộm, nuôi cấy và

51

PCR. Trong đó kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp bào tử Microsporidia cho kết quả

với độ nhạy cao. Tuy nhiên, đây cũng là kỹ thuật đòi hỏi tính chuyên nghiệp cao

và mẫu bệnh phẩm ngay sau khi thu thập lập tức phải dàn lam, bất kỳ lí do trì

hoãn nào trong kỹ thuật nhuộm, đặc biệt nhuộm với postassium hydroxide và

trắng calcofluor (là phương pháp nhuộm có độ nhạy cao phát hiện bảo từ

Microsporidia), có thể làm mẫu dàn tiêu bản bị khô ảnh hưởng đến tín hiệu

huỳnh quang từ mẫu tiêu bản được nhuộm. Kỹ thuật nuôi cấy Microsporidia đòi

hỏi phòng thí nghiệm được trang bị đầy đủ về trang thiết bị nuôi cấy nên chi phí

cao, bên cạnh đó kỹ thuật nuôi cấy mất nhiều thời gian là những điểm hạn chế

chính của phương pháp này ở các Bệnh viện.

Nghiên cứu mô tả kỹ thuật PCR để phát hiện các vùng trình tự khác nhau

của tiểu phần lớn và tiểu phần nhỏ ribosome và vùng nối giữa các gen để chẩn

đoán và phân biệt chủng Microsporidia gây bệnh trên người. Trong nghiên cứu

này, chúng tôi bước đầu xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ

thuật PCR trên mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc sử dụng cặp mồi khuếch đại đặc

hiệu cho trình tự tiểu phần nhỏ ribosome, small-subunit (SSU) rRNA. Cặp mồi

này được thẩm định về phương pháp để phát hiện vùng gen của bốn chủng E.

hellem, E. cuniculi, E. intestinalis T. hominis. and V. corneae, được mô tả gây

bệnh trên mắt của người. Joseph và cộng sự đánh giá hiệu quả chẩn đoán của kỹ

thuật PCR phát hiện trình tự 16S rRNA Microsporidia gây bệnh về mắt với độ

nhạy và đặc hiệu tương ứng phát hiện là 83% và 98%. Trong nghiên cứu này,

với số lượng mẫu bệnh phẩm còn ít nhưng kỹ thuật PCR cho phép phát hiện

14/30 mẫu dương tính với Microsporidia, 17 mẫu cho kết quả âm tính; kỹ thuật

Realtime PCR phát hiện được 15/30 mẫu dương tính. 11/11 mẫu dương tính với

PCR và Realtime PCR đều cho kết quả dương tính nhuộm soi. So sánh với kết

quả nhuộm soi ở Bảng 3.3 cho thấy, kết qủa PCR và Realtime PCR và kết quả

nhuộm soi là có sự khác biệt về giá trị chẩn đoán. Có 04 trường hợp nhuộm soi

nghi ngờ được khẳng định dương tính khi sử dụng kỹ thuật PCR và Realtime

52

PCR, 01 trường hợp nhuộm soi nghi ngờ được khẳng định là âm tính. Tuy

nhiên, số liệu này không có ý nghĩa về mặt thống kê do cỡ mẫu nghiên cứu còn ít.

Độ nhạy của kỹ thuật PCR và Realtime PCR trong nghiên cứu này được

chúng tôi đánh giá bằng cách pha loãng tới hạn nồng độ ADN tổng số tách chiết

từ mẫu bệnh phẩm soi dương tính với Microsporidia. Kết quả cho thấy, kỹ thuật

PCR cho phép phát hiện 22,4 fg/L nồng độ ADN của Microsporidia trong mẫu

bệnh phẩm, độ nhạy của kỹ thuật Realtime PCR là 2,24 fg/L. Độ đặc hiệu của

kỹ thuật PCR và Realtime PCR cũng được chúng tôi đánh giá trên chủng nấm

Aspergillus sp, Fusarium sp, chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus, và mẫu bệnh phẩm dương tính với virus HSV và CMV.

Kết quả khẳng định cặp mồi sử dụng khuếch đại trình tự gen tiểu phần nhỏ

ribosome của Microsporidia không bắt cặp không đặc hiệu với các chủng nấm,

vi khuẩn và mẫu bệnh phẩm dương tính với virus kể trên.

Kỹ thuật nhuộm soi không định danh được loài Microsporidia, trong khi kỹ

thuật PCR, giải trình tự và định danh loài có thể dễ dàng thực hiện trong thời

gian ngắn từ 2-3 ngày. Kỹ thuật phân lập nuôi cấy có thể phát hiện đặc hiệu loài,

tuy nhiên giá thành cao và thời gian trả lời kết quả sau 2-3 tuần, trong khi kỹ

thuật PCR và Realtime PCR cho kết quả chẩn đoán trong vòng 24 giờ. Các kết

quả công bố trên thế giới cho thấy, phần lớn Microsporidia gây bệnh mắt ở

người là các loài V. corneae, T. hominis. E. hellem, E. cuniculi và E.

intestinalis.

Tuy nhiên đây là kết quả nghiên cứu bước đầu trên số lượng mẫu bệnh

phẩm còn giới hạn, cần đánh giá hai kỹ thuật này trên số lượng mẫu bệnh phẩm

lâm sàng nhiều hơn có so sánh đánh giá với kết quả nhuộm soi để áp dụng

thường quy trong thực hành lâm sàng, nhằm giảm thời gian xét nghiệm, đưa ra

được phác đồ điều trị hợp lý cho bệnh nhân, giảm thiểu chi phí điều trị.

53

KẾT LUẬN

- Kỹ thuật PCR phát hiện Microsporidia trong mẫu bệnh phẩm viêm giác

mạc đã được xây dựng thành công:

 Độ nhạy là 2.24x10-2pg/µL

 Độ đặc hiệu là 100%.

 Thời gian xét nghiệm trong vòng 6h.

- Kỹ thuật Realtime PCR phát hiện Microsporidia trong mẫu bệnh phẩm

viêm giác mạc đã xây dựng thành công:

 Độ nhạy là 0.224x10-2pg/µL

 Độ đặc hiệu là 100%.

 Thời gian xét nghiệm trong vòng 3h.

Tuy nhiên đây là kết quả nghiên cứu bước đầu trên số lượng mẫu bệnh

phẩm còn giới hạn, cần đánh giá kỹ thuật này trên số lượng mẫu bệnh phẩm lâm

sàng nhiều hơn có so sánh độc lập với kỹ thuật nhuộm soi để có thể áp dụng

trong chẩn đoán thường quy.

54

KIẾN NGHỊ

Hướng nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi:

- Tiếp tục nghiên cứu trên cỡ mẫu bệnh phẩm lâm sàng lớn hơn.

55

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt

1. Phan Dẫn, Phạm Trọng Văn, Vũ Quốc Lương (2001), Giác mạc, giải

phẫu-sinh lý- miễn dịch- phẫu thuật, Nhà xuất bản Y học, tr.3-48.

2. Phạm Ngọc Đông (2015), “MICROSPORIDIA: TÁC NHÂN VIÊM

GIÁC MẠC NHU MÔ LẦN ĐẦU TIÊN ĐƯỢC PHÁT HIỆN Ở VIỆT NAM”,

Bệnh viện Mắt TW.

3. Hoàng Thị Minh Châu (2007), “Giác mạc”, Nhãn khoa giản yếu, tập 1,

Nhà xuất bản Y học, tr.146-203.

4. Lê Anh Tâm (2008), Nghiên cứu tình hình viêm loét giác mạc tại bệnh

viện Mắt trung ương trong 10 năm (1998 - 2007), Luận văn Thạc sĩ y học,

Trường Đại học Y Hà Nội.

5.Nguyễn Xuân Trường (2005), “Viêm loét giác mạc”, Giáo trình nhãn

khoa, Nhà xuất bản Giáo dục, tr.143-179.

6. Lê Minh Thông (2005), “Giải phẫu và sinh lý mắt”, Giáo trình nhãn

khoa, Nhà xuất bản giáo dục, tr.9-92.

7. Hội nhãn khoa Mỹ (1997), “Giác mạc”, Bệnh học của mi mắt, kết mạc

và giác mạc, Nhà xuất bản Y học, tr.74-91.

Tài liệu tiếng anh

8. Baum,J., and M.Barza., 1998. Infections of the eye , Infectious

diseases.p .1355–1373.

9. Butrus, S.I., and S.A.Klotz. 1986. Blocking Candida adherence to

contact lenses.Curr.EyeRes. 5:745–750.

10. Chamberlain, J. S., R. A. Gibbs, et al. (1988). "Deletion screening of

the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification."

Nucleic Acids Res 16(23): 11141-56.

11. Garg P. (2013), "Microsporidia infection of the cornea--a unique and

challenging disease". Cornea. 32 Suppl 1: p. S33-8.

56

12. Joveeta Joseph, Somasheila Murthy, Prashant Garg and Savitri

Sharma1 (2006), Use of Different Stains for Microscopic Evaluation of Corneal

Scrapings for Diagnosis of Microsporidial Keratitis.

13. Keratoconjunctivitis in immunocompetent patient in Southern India

14. Liesegang TJ, Foster RF (1980), “Spetrum of microbial keratitis in

South Florida”, Am J Ophthalmol, 90, pp.38-47.

15. Loffler, J., H. Hebart, et al. (1997). "Comparison of different methods

for extraction of DNA of fungal pathogens from cultures and blood." J Clin

Microbiol 35(12): 3311-2.

16. Lee et al. Microsporidia Evolved from Ancestral Sexual Fungi. Current

Biology, 2008.

17. Maurice và Giardini (1961), Vegetative Physiology and Biochemistry:

The Eye

18. Sharma S, Srinivasan M, George C (1993), “Current status of Fusarium

species in mycotic keratitis in South India”, J Med Microbiol, 11, pp.140 – 147.

19. Schell WA, Foulk GN, Perfect JR (2008), “Chapter 15: Fungal

infection of the eye”, Principles and practice of ophthalmology, vol 1, W.B

Saunder company, pp.159-168.

20. Sanjay Kai, M Vanathi, Anita Panda (2009), Corneal Microsporidiosis

21. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989). Molecular cloning I-III.

A Laboratory Mannual Cold Spring Harbor Laboratory Press, London, UK.

22. Upadhyay MP, Karmacharya PC, Koirala S, Smolin G, et al (1991),

“Epidemiologic Character istics, predisposing factors, and etiologic diagnosis of

corneal ulceration in Nepal”, Am J Opthalmol, 111, pp.92-99.