Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong Bacillus subtilis ứng dụng trong công nghiệp xử lý vải bông

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ TRỌNG TÀI

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CAO GEN MÃ HÓA PECTINASE TRONG Bacillus subtilis NHẰM Ƣ́ NG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP XƢ̉ LÝ VẢ I BÔNG

Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN TRƢỜNG

Hà Nội - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

LỜ I CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả

cùng cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận

văn là trung thực.

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Lê Trọng Tài

LỜ I CẢ M ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Văn Trường, là người thầy

đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến

thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn

này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật - Viện

Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (nay là

Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật) đã tạo điều kiện cho tôi

hoàn thành khóa học và bản luận văn.

Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh

vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp

tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình.

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn - những người

luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời

gian học tập và nghiên cứu.

Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Lê Trọng Tài

LỜ I CAM ĐOAN ......................................................................................................................... i

LỜ I CẢ M ƠN .............................................................................................................................. ii

MỤC LỤC .................................................................................................................................. iii DANH MỤC TƢ̀ VIẾ T TẮ T ...................................................................................................... v

DANH MỤC BẢ NG .................................................................................................................. vi

DANH MỤC HÌNH .................................................................................................................. vii MỞ ĐẦ U ..................................................................................................................................... 1 TỔ NG QUAN TÀ I LIỆU ............................................................................................................ 3

1.1. Sơ lƣợc về Bacillus subtilis ................................................................................................. 3 1.2. Hệ biểu hiện Bacillus subtilis .............................................................................................. 4

1.3. Pectin ................................................................................................................................... 5 1.4. Pectinase .............................................................................................................................. 6

1.4.1. Khái niệm pectinase.......................................................................................................... 6 1.4.2. Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase .................................................................... 6

1.5. Pectinase của Bacillus subtilis ........................................................................................... 10 1.6. Ứng dụng của pectinase kiềm ............................................................................................ 11

1.6.1. Cấu tạo sợi bông tự nhiên .............................................................................................. 11 1.6.2. Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông ......................................... 12

1.6.3. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy ............................................................. 13

1.6.4. Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến cà phê và trà . 13

1.7. Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam .............................. 13 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁ P ............................................................................................. 14

2.1. Vật liệu ............................................................................................................................. 14

2.1.1. Các chủng vi khuẩn ........................................................................................................ 14

2.1.2. Hóa chất thí nghiệm ....................................................................................................... 15

2.1.3. Các vector sử dụng ......................................................................................................... 15

2.1.4. Trình tự mồi .................................................................................................................... 15

2.2. Môi trƣờng nuôi cấy .......................................................................................................... 16 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................................... 17

2.3.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa ......... 17

2.3.2. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B. subtilis tự nhiên ................................... 17

2.3.3. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp .................................................. 17

2.3.4. Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11] .................................................... 17

2.3.5. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)[10] ........ 19

2.3.6. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi ........................ 21

iii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỤC LỤC

2.3.7. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B. subtilis ........................................................... 22

2.3.8. Tách chiết DNA plasmid từ E. coli ................................................................................. 23

2.3.9. Tách chiết DNA plasmid từ B. subtilis ........................................................................... 23

2.3.10. Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử ...................................................... 23

2.3.11. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp xung điện ........................................ 26

2.3.12. Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B. subtilis 168 .............................................................. 26

2.3.13. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009) ........................................ 27 KẾ T QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................................... 28

3.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis phân lập từ trong nƣớc có hoạt tính pectinase cao ........... 28

3.1.1. Sàng lọc chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch ................................... 28

3.1.2. Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại bào của các

chủng nghiên cứu...................................................................................................................... 29

3.1.3. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi ........................ 31

3.2. Tách dòng gen pectinase trong E. coli .............................................................................. 32 3.2.1. Tách chiết DNA tổng số của các chủng B. subtilis ......................................................... 32

3.2.2. Nhân gen pectinase bằng PCR ....................................................................................... 33

3.2.3. Tách dòng các gen pel vào E. coli .................................................................................. 34

3.2.4. Giải trình tự các gen pectinase ....................................................................................... 36

3.3. Tạo chủng B. subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase .......................................................... 38

3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện gen pectinase trong B. subtilis ............................................... 38

3.3.2. Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B. subtilis ........................................................... 43

3.3.3. Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng .................... 44

3.4. So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh ra từ chủng

tự nhiên ..................................................................................................................................... 47 3.4.1. So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng

tự nhiên ..................................................................................................................................... 47

3.4.2. So sánh ảnh hưởng của pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự

nhiên ......................................................................................................................................... 48 KẾ T LUẬN VÀ KIẾ N NGHI ̣ ................................................................................................... 49

4.1. Kết luận .............................................................................................................................. 49

4.2. Kiến nghị ............................................................................................................................ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................................... 50

Tài liệu tiếng Việt ...................................................................................................................... 50

Tài liệu tiếng Anh ...................................................................................................................... 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC TƢ̀ VIẾ T TẮ T

: Amino acid a.a

: Ammonium persulfate APS

B. subtilis : Bacillus subtilis

: Môi trƣờng khoáng chất Belisky BMM

BSA : Bovine serum albumin

DEAE : Diethylethanolamine

DNA : Deoxyribonucleic axit

DNSA : 3,5-Dinitrosalicylic axit

E. coli : Escherichia coli

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic axit

HTAB : Hecxadecyl trimethyl trimethyl trimethyl trimethyl

ammonium bromide

ISO : International standards organization

kDa : Kilo Dalton

LB : Luria bertani

M : Mole

OD : Optical density

PCR : Polymerase chain reaction

pel : Gen pectinase

Pel : Enzyme pectinase

RR : Rhuthenium red

rPel : Pectinase tái tổ hợp

SDS : Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TEMED : Tetramethylethylenediamine

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

U : Unit

Bảng 1.1. Phân loại các pectinolytic enzyme ............................................................................. 7

Bảng 1.2. Các thành phần cấu tạo sợi bông ............................................................................. 11

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng nhân gen ............................................................................... 23

Bảng 2.2. Chƣơng trình nhân gen bằng PCR ........................................................................... 23

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt pKTH/pUC bằng HindIII ............................................... 24

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt pJET/pel bằng HindIII .................................................... 24

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen pel với promoter ..................................................... 24

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel ................................................. 24

Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc các chủng B. subtilis có khả năng phân hủy pectin trên đĩa thạch.

.................................................................................................................................................. 28

Bảng 3.2. Hoạt tính pectinase ở điều kiện pH phản ứng tối ƣu của các chủng nghiên cứu ..... 30

Bảng 3.3. Hoạt tính pectinase của các enzyme thu đƣợc ......................................................... 31

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC BẢ NG

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin ........................................................................ 6

Hình 1.2. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases ............................................................. 8

Hình 1.3. Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase ........................ 8

Hình 1.4. Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase .............................................................. 9

Hình 1.5. Sự kết nối giữa cellulose và các chất không phải cellulose trong lớp thứ cấp của sợi

bông. Pectin đƣợc tồn tại ở hai loại: pectin axit và esterified pectin. ....................................... 11

Hình 2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn protein ....................................................................................... 18

Hình 2.2. Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành 3 amino, 5-nitrosalicylic axit .. 19

Hình 2.3. Đƣờng chuẩn glucose ............................................................................................... 20

Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit của pectinase ........................................................... 21

Hình 3.1. Hình ảnh một số chủng B. subtilis tạo vòng thủy phân pectin trên đĩa thạch LB 0,2%

pectin. ....................................................................................................................................... 29

Hình 3.2. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng phân hủy pectin của các pectinase từ các chủng

nghiên cứu ................................................................................................................................ 31

Hình 3.3. Điện di DNA tổng số của các chủng B. subtilis. ...................................................... 33

Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pectinase ................................................. 34

Hình 3.5. Khuẩn lạc các thể biến nạp E. coli DH5α mang pJET/pel trên môi trƣờng chọn lọc

LB, 100 µg/ml ampicillin ......................................................................................................... 34

Hình 3.6. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII .......................................................... 35

Hình 3.7. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII ......................................................... 35

Hình 3.8. So sánh theo hàng trình tự amino acid của Pel từ 4 chủng B. subtilis phân lập ở Việt

Nam với Pel từ B. subtilis 168. ................................................................................................. 37

Hình 3.9. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pel trong B. subtilis. ................................................ 39

Hình 3.10. Điện di sản phẩm cắt pKTH/pUC bằng HindIII. ................................................... 40

Hình 3.11. Thu nhận pel từ pJET/pel.. ..................................................................................... 40

Hình 3.12. Sơ đồ nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. ...................................................... 41

Hình 3.13. Nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. ................................................................ 42

Hình 3.14. Kiểm tra gen dung hợp BaP-pel trong pMSE/BaP-pel. .......................................... 42

Hình 3.15. Kiểm tra pMSE/BaP-pel trong tế bào B. subtilis 168 tái tổ hợp. ........................... 44

Hình 3.16. Điện di SDS-PAGE dịch enzyme ngoại bào của chủng B. subtilis tái tổ hợp đa

copy trên môi trƣờng LB+Kan.. ............................................................................................... 45

Hình 3.17. Kiểm tra sự biểu hiện pectinase của các thể biến nạp đa copy trong tế bào B.

subtilis 168 sau 24 giờ nuôi cấy.. ............................................................................................. 45

vii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.18. Kiểm tra hoạt tính pectinase của thể biến nạp đa copy BSM và chủng B. subtilis

168 trên cơ chất pectin axit. ...................................................................................................... 46

Hình 3.19. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzyme........................................................ 47

Hình 3.20. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt tính enzyme ................................................................ 48

viii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỞ ĐẦ U

Ngành công nghiệp dệt may Việt Nam đang phát triển mạnh, chiếm vị trí

quan trọng trong nền kinh tế quốc. Nếu phát triển bông thực hiện đúng tiến độ

theo Quyết định số 36/2008/QĐ-TTg của Thủ tƣớng Chính phủ thì đến năm

2015 sản xuất bông trong nƣớc là 40 ngàn tấn, đáp ứng đƣợc 10% nhu cầu và

đến 2020 là 60 ngàn tấn đáp ứng đƣợc 12% nhu cầu bông xơ tiêu thụ trong

nƣớc. Để “chiến lƣợc phát triển ngành công nghiệp Dệt may Việt Nam đến năm

2015, định hƣớng đến năm 2020” thành công thì ngoài việc thúc đẩy tăng năng

xuất và diện tích trồng bông ra chúng ta cần phải cải tiến công nghệ, ứng dụng

công nghệ enzyme trong quá trình sản xuất vải bông để tạo ra sản phẩm vải

bông chất lƣợng cao, giá thành rẻ và có thể cạnh tranh đƣợc trên thị trƣờng quốc

tế.

Sợi bông tự nhiên đƣợc cấu tạo bao gồm 95% là cellulose và 5% là không

phải cellulose. Vải bông mộc sau khi dệt còn chứa nhiều chất không phải

cellulose. Trong quá trình nhuộm vải, nếu không loại các chất không phải

cellulose đi thì chúng sẽ làm cản trở thuốc nhuộm thâm nhập vào vải, dẫn đến

giảm chất lƣợng của vải nhuộm. Thông thƣờng để loại bỏ các chất này, vải mộc

phải qua bƣớc nấu kiềm (alkaline scouring) để tẩy loại chúng đi, đây là công

nghệ đơn giản nhƣng nảy sinh vấn đề vừa làm giảm sự rắn chắc của sợi bông do

tác động của chất kiềm tới cấu trúc của cellulose, vừa làm ô nhiễm môi trƣờng

và tiêu hao rất lớn năng lƣợng. Để giải quyết vấn đề này, những năm gần đây

các nhà công nghệ trên thế giới đã sử dụng enzyme pectinase, một loại enzyme

pectinase kiềm để phân hủy pectin trong sợi bông, thay vì sử dụng hóa chất kiềm

độc hại. Xử lý vải bông bằng pectinase làm tăng khả năng thấm nƣớc của vải

bông, vải mịn và trơn nhẵn hơn, do đó mang lại hiệu quả cao cho quá tŕnh t ẩy trắng (bleaching) và nhuộm màu (dyeing), làm cho chất lƣợng vải tốt hơn.

Việc ứng dụng enzyme pectinase kiềm trong công nghệ xử lý vải bông

mới phát triển khoảng 10 năm gần đây. Nhƣng đƣợc nhiều nhà công nghệ quan

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tâm vì ích lợi to lớn của chúng trong việc nâng cao chất lƣợng vải bông, rút ngắn 1

thời gian xử lý, tiết kiệm năng lƣợng và giảm thiểu tác hại môi trƣờng. Hiện nay

một số pectinase thƣơng mại đã đƣợc sản xuất và bán trên thị trƣờng để sử dụng

trong công nghiệp dệt nhƣ Bioprep 3000L, ScourL-Novozyme (của hãng

Novozyme), alkaline pectinase (Trung Quốc), Cottonase (Mỹ).

Ở nƣớc ta, công nghệ xử lý sợi bông hiện nay vẫn sử dụng chất kiềm, đây

là lý do tại sao chúng ta không có sản phẩm vải bông chất lƣợng cao và ảnh

hƣởng lớn đến môi trƣờng. Chính vì vậy việc sử dụng enzyme pectinase trong

xử lý vải bông thay thế hóa chất kiềm sẽ giúp cho bảo vệ môi trƣờng, làm cho

vải bông có chất lƣợng cao và giúp cho giá thành sản xuất giảm. Từ đó nâng cao

sự cạnh tranh trong thời buổi kinh tế thị trƣờng.

Hiện nay ở nƣớc ta chƣa có cơ sở nào sản xuất đƣợc pectinase ƣa kiềm

ứng dụng trong công nghiệp. Vì vậy việc nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn sản

xuất enzyme pectinase ƣa kiềm tái tổ hợp để ứng dụng cho ngành sản xuất vải

bông là điều cần thiết, giúp cho ngành công nghiệp dệt nƣớc ta chủ động đƣợc

nguồn enzyme phục vụ cho việc xử lý vải bông, nâng cao chất lƣợng vải bông

để cạnh tranh đƣợc trên thị trƣờng Quốc tế. Đề tài “Nghiên cứu biểu hiện cao

gen mã hóa pectinase trong Bacillus subtilis ứ ng dụng trong cô ng nghiê ̣p xử lý vải bông” sẽ góp phần tạo ra chủng vi khuẩn tái tổ hợp sản sinh pectinase sản

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

lƣợng cao để ứng dụng cho công nghiệp xử lý pectin trong vải bông thô.

TỔ NG QUAN TÀ I LIỆU

1.1. Sơ lƣợc về Bacillus subtilis

Bacillus subtilis (B. subtilis) là vi khuẩn gram dƣơng, thuộc họ Bacillaceae,

chi Bacillus, phân bố rộng rãi trong sinh quyển nhƣng phổ biến nhất là trong đất.

Tế bào B. subtilis có Hình que, có khả năng tạo thành nội bào tử để bảo vệ trong

khi gặp điều kiện bất lợi, cho phép sinh vật chịu đƣợc những điều kiện khắc nghiệt

[35], [43] . Tế bào vi khuẩn B. subtilis đƣợc bao bọc bởi thành vững chắc. Nó bao

gồm các lớp peptidoglycan, là một polymer của các loại đƣờng và amino

acid. Thành tế bào tạo thành các rào cản giữa môi trƣờng và tế bào vi khuẩn. Nó

còn giúp duy trì Hình dạng của tế bào và giúp tế bào chịu đƣợc áp lực cao của môi

trƣờng nội bào [36].

B. subtilis đƣợc tìm thấy tự nhiên rất nhiều trong đất và thảm thực vật, có

ít hơn trong nƣớc hay không khí. B. subtilis phát triển trong phạm vi nhiệt độ trung bình. Nhiệt độ tối ƣu là 25-35oC. B. subtilis là sinh vật hiếu khí sống ký

sinh có bào tử có thể sống sót ở điều kiện nhiệt độ cao, thƣờng thấy khi nấu ăn.

Hệ gen B. subtilis 168 đã đƣợc giải mã thành công và công bố vào năm

1997 [23], bao gồm duy nhất một chromosome dạng vòng. Tổng kích thƣớc hệ

gen là 4,2 Mbp, trong đó 4 100 gen mã hóa cho các phân tử protein. Sự giải mã

thành công hệ gen B. subtilis mang một ý nghĩa to lớn, giúp thúc đẩy các nghiên

cứu về proteome và metabolome của vi khuẩn này.

B. subtilis là vi khuẩn không gây độc và ngày càng trở thành những vi

sinh vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng. Các ứng dụng của chúng bao

trùm hàng loạt lĩnh vực từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công

nghệ lên men hiện đại, sinh học phân tử, y dƣợc học, trong các ngành công

nghiệp và trong xử lí môi trƣờng. Chính vì lẽ đó nên ngày càng nhiều các nghiên

cứu ứng dụng của chúng đối với đời sống con ngƣời. B. subtilis là vi khuẩn có

khả năng tiết một số enzyme quan trọng nhƣ protease, lipase, xylanase,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

pectinase kiềm, trong đó pectinase kiềm là một trong những enzyme quan trọng

có nhiều ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nƣớc ép trái cây, công nghiệp xử

lý giấy và đặc biệt là công nghiệp xử lý vải bông thô.

1.2. Hệ biểu hiện Bacillus subtilis

B. subtilis là vi khuẩn đã đƣợc nghiên cứu khá sâu về sinh học phân tử

(chỉ sau E. coli). Chúng có nhiều đặc điểm quí nhƣ: là vi khuẩn không gây bệnh,

khả năng sinh trƣởng rất mạnh, môi trƣờng lên men đơn giản, rẻ và dễ ứng dụng

trong công nghiệp. Hệ tiết của B. subtilis đƣợc biết là một trong những hệ tiết tốt

nhất để ứng dụng sản xuất protein tái tổ hợp. Vì vậy nhiều tác giả đã chọn hệ

biểu hiện B. subtilis để sản xuất protein tái tổ hợp.

Promoter là yếu tố quan trọng cho sự biểu hiện gen ngoại lai trong B.

subtilis. Việc sử dụng promoter của gen ngoại lai khi biểu hiện trong tế bào B.

subilis thông thƣờng không hiệu quả bằng sử dụng promoter của B. subtilis do

RNA-polymerase holoenzyme của chúng không bám hiệu quả vào promoter

ngoại lai, ngoại trừ một vài trƣờng hợp. Tín hiệu tiết (signal peptide) cũng là yếu

tố quan trọng cho sự biểu hiện hiệu quả của gen ngoại lai. Wang và Doi (1989)

đã định rõ các tín hiệu tiết cần thiết cho việc sao mã và dịch mã của gen ngoại

lai trong B. subtilis và những yếu tố cần thiết để vƣợt qua rào cản của sự biểu

hiện gen [49]. Việc sử dụng vector đa copy hay vector tích hợp gen để biểu hiện

gen ngoại lai cũng cần đƣợc cân nhắc bởi vì mỗi loại vector đều có những ƣu

điểm và nhƣợc điểm. Vector đa copy thông thƣờng có khả năng biểu hiện mạnh

hơn vector tích hợp do có lƣợng bản sao nhiều hơn trong một tế bào chủ nhƣng

lại có tính bền kém hơn. Hệ biểu hiện đa copy luôn luôn cần duy trì áp lực chọn

lọc (nhƣ bổ sung kháng sinh vào môi trƣờng nuôi cấy). Ngƣợc lại vector tích

hợp do đƣợc tích hợp gen ngoại lai vào chromosome của tế bào chủ cho nên có

tính bền cao hơn, không cần đến áp lực chọn lọc khi biểu hiện gen.

Các chủng sản xuất protein tái tổ hợp trong công nghiệp hiện nay phần

lớn là vi khuẩn thuộc họ Bacillus. Lƣợng enzyme tái tổ hợp trong thƣơng mại

hiện nay đƣợc sản xuất từ họ Bacillus chiếm tới 60% [17], [37]. Tuy nhiên, hệ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

biểu hiện B. subtilis cũng có những nhƣợc điểm nhƣ khi biểu hiện gen ngoại lai 4

trong chúng thì một hiện tƣợng hay gặp là sự tƣơng tác bất lợi của sản phẩm

biểu hiện với chủng biểu hiện dẫn đến quá trình biểu hiện có hiệu quả thấp, thậm

chí nhiều trƣờng hợp còn không thể biểu hiện đƣợc. Tuy nhiên, nếu sử dụng gen

biểu hiện là gen có nguồn gốc từ chúng thì khả năng ảnh hƣởng bất lợi trong khi

biểu hiện là hoàn toàn đƣợc loại bỏ. Hƣớng sản xuất protein tái tổ hợp bằng cách

này là một trong những hƣớng sản xuất mang lại hiệu quả biểu hiện cao. Hƣớng

biểu hiện này đã thành công với gen amylase và xylanase tái tổ hợp trong B.

subtilis ở một số nghiên cứu trong nƣớc. [4], [5].

1.3. Pectin

Pectin là các đại phân tử polysaccharide phức tạp có nhiều trong tế bào

thực vật bao gồm: pectin (polymethylgalacturonate), pectin axit

(polygalacturonate) và các oligogalacturonate. Pectin có khả năng tan trong

nƣớc và có ít nhất 75% các nhóm carboxyl của galactoronate bị ester hóa với

methanol. Oligogalacturonate là chất đa phân tử nhỏ hơn, chỉ gồm hai hoặc vài

đơn phân galacturonate. Oligo methylgalacturonate cũng là chất đa phân tử gồm

hai hoặc vài galacturonate, có thể một phần hoặc hoàn toàn bị methyl hóa ở vị trí

C-6 [50].

Hợp chất pectin tiêu biểu cho nhóm polysaccharide có mối liên hệ gần gũi

với nhau. Hai thành tố cơ bản tạo thành hợp chất pectin là galacturonan và

rhamnogalacturonan trong đó carbon ở vị trí C-6 của galactose bị oxy hóa tạo

nhóm carboxyl, ngoài ra còn có arabinan, galactan và arabinogalactan.

Rhamnogalacturonan là thành phần chính trong hợp chất pectin. Chuỗi sơ cấp

gồm các đơn vị α-D-galacturonate liên kết (1-4) với 2-4% L-rhamnose liên kết

β-(1-2) và β-(1-4) với D-galacturonate. Chuỗi bên của rhamnogalacturonan có

thành phần và độ dài đa dạng. Chuỗi bên kéo dài thƣờng là các polymer đồng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nhất của axit D-galacturonic hoặc L-arabinose [50].

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin

Cấu trúc hóa học đặc trƣng của pectin đƣợc thể hiện ở Hình 1.1. Các đơn

vị D-galactorunate liên kết với nhau bằng các liên kết α-1-4 glycoside. Một số

D-galacturonate bị methyl-este hóa vị trí O-6 của nhóm carboxyl hoặc acetyl-

este hóa ở vị trí O-2 hoặc O-3 của nhóm hydroxyl, một số khác bị biến đổi thành dạng COO- hoặc –COOH phụ thuộc vào độ pH. Mức độ methyl hóa và acetyl

hóa rất đa dạng, phụ thuộc vào nguồn pectin [38].

1.4. Pectinase

1.4.1. Khái niệm pectinase

Các enzyme xúc tác phân cắt pectin đƣợc gọi chung là pectinase. Enzyme

pectinase đƣợc tạo ra trong tự nhiên bởi các vi sinh vật nhƣ: vi khuẩn, nấm, nấm

men, côn trùng, giun tròn, nguyên sinh động vật và thực vật. Trong đó vi khuẩn

B. subtilis là một trong nhóm vi khuẩn có khả năng tiết enzyme pectinase.

Pectinase đƣợc sử dụng nhiều trong một số ngành sản xuất nhƣ: sản xuất

rƣợu vang, nƣớc ép trái cây, công nghiệp dệt may, xử lí rác thải. Việc ứng dụng

pectinase kiềm trong công nghệ xử lí vải bông mới phát triển khoảng 10 năm

gần đây nhƣng đƣợc nhiều nhà công nghệ quan tâm vì ích lợi to lớn của chúng

trong việc nâng cao chất lƣợng vải bông, rút ngắn thời gian xử l í, tiết kiệm năng

lƣợng và giảm thải tác hại môi trƣờng. Hiện nay một số pectinase thƣơng mại đã

đƣợc sản xuất và bán trên thị trƣờng để ứng dụng trong công nghiệp dệt.

1.4.2. Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase

Dựa vào cơ chế hoạt động và cơ chất chúng tham gia xúc tác phân cắt mà

pectinase đƣợc phân chia thành các enzyme khác nhau. Pectinase đƣợc phân loại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thành 3 nhóm chính, đƣợc tóm tắt trong Bảng 1.1.

Bảng 1.1. Phân loại các pectinolytic enzyme [50]

EC No. Cơ chất

Sản phẩm

chế

3.1.1.11 3.1.1.- 3.2.1.15 3.2.1.82 4.2.2.2 4.2.2.9 4.2.2.6 4.2.2.10

Pectin Pectin Protopectin Pectin axit Pectin axit Trigalacto- ronate 4:5 (galacturo- nate)n Pectin Pectin axit Pectin axit Unsaturate d digalactu- ronate Pectin

Tên enzyme Esterase - Pectin methylesterase ( pectin esterase) - Pectin acetylesterase Polygalacturonase - Protopectinase - Endopolygalacturonases - Exopolygalacturonases - Oligogalacturonate hydrolases - 4:5 unsaturated oligo- galacturonate hydrolase - Endopolymethylgalac- turonase Lyase - Endopolygalacturonate lyases (endopectinase) - Exopolygalacturonate lyase (exopectinase) - Oligogalacturonate lyase - Endopolymethylgalactu ronate lyase (endopetin lyases)

Pectin axit + Methanol Pectin Oligogalacturonates Monogalacturonate Monogalacturonate Unsaturated monogalaturonate và saturate (n-1) Methyloligogalac- turonates Unsaturated oligogalacturonates Unsaturated digalacturonates Unsaturated monogalacturonates Unsaturated methyloli- gogalacturonates

Cơ xúc tác Thuỷ phân Chƣa xác định Thuỷ phân Thuỷ phân Thuỷ phân Thuỷ phân Thuỷ phân Thuỷ phân Chuyển liên kết Chuyển liên kết Chuyển liên kết Chuyển liên kết

Pectinase có hai cơ chế phản ứng cơ bản: thủy phân (hydrolysis) và phân

cắt chuyển liên kết (trans –element). Cơ chế thủy phân đòi hỏi sự có mặt của

nƣớc, ngƣợc lại, cơ chế chuyển liên kết diễn ra trong điều kiện không cần nƣớc

và tạo ra sản phẩm có một liên kết đôi (Hình 1.4).

Pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) tác động vào pectin để loại bỏ nhóm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

methoxyl từ nhóm carboxyl C-6 của galacturonate bằng con đƣờng thủy phân (Hình 1.2). Sản phẩm cuối cùng của phản ứng là pectin axit, methanol và H+ từ

sự ion hóa các nhóm carboxyl. H+ giải phóng ra từ nhóm carboxyl mới Hình

thành sẽ làm giảm độ pH của môi trƣờng phản ứng. Do vậy, có thể tiến hành đo

pH của dung dịch sau phản ứng để xác định hoạt tính pectin methylesterase.

Hình 1.2. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases

Pectin acetylesterase thủy phân pectin bằng cách loại bỏ nhóm acetyl

khỏi nhóm hydroxyl C2 và C3 của đơn vị galacturonate. Searle-van Leeuwen,

Vincken và cộng sự (1996) lần đầu phát hiện pectin acetylesterase ở Aspergillus

niger [40]. Shevchik và Hugouvieux-Cotte-Pattat (1997) tìm thấy hai pectin

acetylesterase khác ở Erwinia chrysanthemi 3937 [41]. Tuy nhiên, các nghiên

cứu về pectin acetylesterase còn rất hạn chế.

Hình 1.3. Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase

Endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15) và exopolygalacturonase (EC

3.2.1.67) thủy phân liên kết glycosid bên trong của polygalacturonate (Hình 1.3).

Sản phẩm phản ứng là một loạt polygalacturonate mạch ngắn (đối với 8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

endopolygalacturonate) hoặc galacturonate (với exopolygalacturonate). Hoạt

tính của hai enzyme này có thể đƣợc đo bằng cách xác định mức độ Hình thành

nhóm khử với 3,5-dinitrosalycylate.

Endopolymethylgalacturonase: thủy phân polymethylgalacturonate

ngẫu nhiên thành oligomethylgalacturonate [6], [16]. Phản ứng đƣợc xúc tác bởi

sơ đồ sau:

Hoạt tính của endopolymethylgalacturonase cũng có thể đƣợc đo bằng

cách xác định tỷ lệ nhóm khử Hình thành bởi sự thủy phân các liên kết glycosid.

Endopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.2), còn có tên gọi khác là

pectinase. Enzyme này chỉ đƣợc tìm thấy ở vi sinh vật, pH tối ƣu trong khoảng

8-10, cao hơn nhiều so với các enzyme phân giải pectin khác. Để hoạt động chúng cần sự có mặt của Ca2+ và chúng phân cắt liên kết glycosid bằng cơ chế

trans tạo thành liên kết đôi giữa C-4 và C-5 của galacturonate (Hình 1.4).

Phƣơng pháp tốt nhất để xác định hoạt tính enzyme này là phát hiện liên kết đôi

trên máy đo quang phổ ở bƣớc sóng 232 nm [28]. Ngoài ra cũng có thể xác định

hoạt tính bằng phƣơng pháp đƣờng khử với 3,5-dinitrosalicylate [10]. Phản ứng

xúc tác bởi endopolygalacturnate lyase nhƣ sau:

Hình 1.4. Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase

Exopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.9) đƣợc phát hiện chỉ ở một số

loài vi khuẩn nhƣ Clostridium multifermentan; Erwinia aroideae; Erwinia

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

disolvens. Cơ chất thích hợp không phải polymethylgalacturonate mà là

polygalacturonate. Sản phẩm tạo thành là Δ4:5 digalacturonate không no. Độ pH

tối ƣu của các enzyme này trong khoảng 8,0 – 9,5. Hoạt tính của

exopolygalacturonate lyase có thể đƣợc xác định giống với cách tiến hành đối

với endopolygalacturonate lyase. Phản ứng xúc tác bởi enzyme

exopolygalacturonate lyase theo sơ đồ sau:

Endo methylgalacturonate lyase (EC 4.2.2.10) phân cắt pectin bên trong

phân tử pectin, tạo thành sản phẩm cuối cùng là các oligomethylgalacturonates

[6], [16]. Phản ứng xúc tác bởi Endo methylgalacturonate lyase nhƣ sau:

Hoạt tính của enzyme này có thể đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đƣờng

khử [10], [42], hoặc đo trên máy quang phổ phát hiện các liên kết nối đôi ở bƣớc

sóng 232 nm [28].

1.5. Pectinase của Bacillus subtilis

Pectinase từ B. subtilis đã đƣợc Nasser tinh sạch và nghiên cứu tính chất

và biểu hiện trong E. coli từ những năm 90 của thế kỷ trƣớc [31], [30]. Enzyme

này xúc tác phản ứng phân hủy pectin axit ở pH và nhiệt độ tối ƣu là 8,4 và 42 oC. Trọng lƣợng phân tử protein khoảng 45,6 kDa, bao gồm 420 amino acid,

trong đó có 21 amino acid của peptide tín hiệu tiết. Cũng nhƣ các pectinase từ vi sinh vật khác, pectinase của B. subtilis cần bổ sung Ca2+ vào phản ứng xúc tác. Pectinase của B. subtilis có 3 vị trí bám của Ca2+ là Asp-184, Asp-223 và Asp- 227 do đó phản ứng xúc tác của chúng không thể thiếu Ca2+ [32].

Các chủng B. subtilis hiện có ở Việt Nam thông thƣờng sẽ có gen pel này,

các biến chủng của chúng sẽ có một vài sai khác trong gen, do đó dựa vào trình

tự nucleotide đã biết của chúng mà có thể tổng hợp cặp mồi để nhân gen bằng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

PCR một cách dễ dàng.

1.6. Ứng dụng của pectinase kiềm

1.6.1. Cấu tạo sợi bông tự nhiên

Hình 1.5. Sự kết nối giữa cellulose và các chất không phải cellulose trong

lớp thứ cấp của sợi bông. Pectin đƣợc tồn tại ở hai loại: pectin axit và esterified pectin.

Sợi bông tự nhiên đƣợc cấu tạo bởi lớp ngoài mỏng gọi là lớp sơ cấp và

lớp dầy bên trong là lớp thứ cấp. Hàm lƣợng cellulose trong sợi bông chiếm tới

95%, chỉ 5% còn lại là chất không phải cellulose (non- cellulose). Các chất

không phải cellulose này chủ yếu là pectin, ngoài ra còn có chất dị cellulose

(hemicellulose), protein và chất sáp dính (waxe) [9], [39].

Bảng 1.2. Các thành phần cấu tạo sợi bông [9], [39]

Thành phần sợi bông Trọng lƣợng khô (%)

88-96 1,1 – 1,9 0,7-1,2 0,4 – 1.0 0,7-1,6 0,5 – 1.0

- Cellulose - Protein - Pectin - Sáp - Tro - Hemicellulose (xylan...) - Các chất khác (khoáng...)

Chất không phải cellulose chiếm phần lớn trong lớp thứ cấp vì vậy quá

trình xử lý sợi bông chủ yếu là loại bỏ lớp thứ cấp. Pectin trong sợi bông chiếm

khoảng 0,4-1,2%, chúng có vai trò nhƣ chất kết dính liên kết cellulose và chất

không phải cellulose (Hình 1.5). Vì vậy việc loại bỏ pectin sẽ làm cho việc loại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bỏ các chất không phải cellulose khác trong sợi bông dễ dàng hơn.

1.6.2. Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông

Công nghệ xử lý vải bông bằng enzyme đƣợc gọi là “BioScouring” là

công nghệ sử dụng enzyme pectinase kiềm thay thế xút trong khâu nấu kiềm đã

đƣợc nghiên cứu và triển khai trong sản xuất và đã thu đƣợc kết quả tốt ở nhiều

nơi. Tháng tƣ năm 1999, hãng Novozymes (Đan Mạch) đã đƣa chế phẩm

pectinase kiềm ra thị trƣờng có tên thƣơng mại BioPrep 3000L. Sau đó ít lâu,

hãng Bayer (Đức) có sản phẩm enzyme pectinase kiềm là Baylase EVO. Từ dó

công nghệ “BioScouring” sử dụng enzyme pectinase kiềm xử lý vải bông ra đời.

Công nghệ “BioScouring” với các sản phẩm chứa pectinase kiềm đã đƣợc nhiều

nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu cho thấy có hiệu quả tốt, có thể thay thế

xút để loại pectin trong quá trình nấu tẩy [8], [12], [15], [19], [26]. Pectin trong

sợi bông có vai trò nhƣ chất kết dính liên kết cellulose và chất không phải

cellulose. Sử dụng enzyme pectinase kiềm không làm ảnh hƣởng đến cấu trúc

cellulose của sợi vải, do đó tránh tổn hại sợi [22], [29], [48]. Klug-Santner và

cộng sự đã chỉ ra pectinase từ Bacillus pumilus BK2 đã loại 80% pectin của sợi

bông [22]. Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới cho thấy việc kết hợp

pectinase kiềm với một số enzyme khác nhƣ: lipase, protease, xylanase sẽ giúp

hỗ trợ loại bỏ các chất không phải cellulose (lignin, sáp, protein,

hemicellulose…) hiệu quả hơn khi chỉ sử dụng một loại enzyme pectinase trong

công đoạn nấu kiềm [45], [47].

Các chế phẩm pectinase kiềm hiện nay có trên thị trƣờng: Bioprep 3000L,

Pulpzyme HC, Scourzyme L –Novozymes, Baylase EVO – Bayer, Unizim PEC

– Color-Center SA, Baylase EVO, Sera Zyme C – PE của Singapore, Prima

Green Ecoscour của Genencor. Các chế phẩm pectinase kiềm thay thế xút đã

giảm rõ rệt giá thành sản xuất nhờ tiết kiệm nƣớc, năng lƣợng và thời gian xử lý

so với quá trình nấu truyền thống sử dụng xút. Hơn nữa, do các điều kiện xử lý

“ôn hòa” của enzyme pectinase dẫn đến tăng chất lƣợng vải, tăng mức độ thấm,

hút nƣớc và cũng làm tăng độ tƣơi sáng màu sau nhuộm theo Cavaco-Paulo &

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Gübitz (2003) [14].

1.6.3. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy

Trong công nghệ sản xuất bột giấy hiện nay, bƣớc tẩy trắng bằng alkaline

peroxide là bƣớc bắt buộc để tạo sản phẩm giấy trắng tinh khiết. Nếu bột giấy

không đƣợc loại bỏ pectin axit trong bột giấy thì trong quá tình tẩy trắng các

pectina axit này sẽ kết hợp với peroxide tạo ra phức hợp cationic polymer làm

ảnh hƣởng đến độ trắng của giấy. Sử dụng pectinase kiềm để loại pectin axit

trong bột giấy giúp cho quá trình tẩy trắng hiệu quả mà không ảnh hƣởng đến ô

nhiễm môi trƣờng [33], [34].

1.6.4. Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến

cà phê và trà

Pectinase kiềm có khả năng phá vỡ vách tế bào thực vật do đó có khả

năng ứng dụng trong công nghệ chiết xuất dầu thực vật từ các hạt nhƣ hạt cải,

dầu dừa, hạt hƣớng dƣơng, hạt nho v.v.. Việc xử lý các hạt với pectinase kiềm

giúp cho việc chiết rút dầu thực vật hiệu quả hơn so với dùng dung môi hexane

dễ gây ung thƣ [20]. Bổ sung pectinase kiềm cùng với hemicellulase và

protease trong quá trình chế biến cà phê và trà lên men làm tăng năng suất và

chất lƣợng sản phẩm [7].

1.7. Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam

Pectinase là enzyme quan trọng trong công nghiệp do đó đƣợc đã đƣợc

nhiều nhà khoa học quan tâm. Nhiều tác giả đã biểu hiện thành công pectinase

dạng tái tổ hợp trong tế bào E. coli [30], [21], [24], [46], trên tế bào Bacillus

[27] hay tế bào nấm men Pichia pastoris [18], [52]. Tuy nhiên phần lớn các công

bố trên đều biểu hiện enzyme pectinase tái tổ hợp cho mục đích nghiên cứu tính

chất của enzyme, các công bố về tình Hình sản xuất enzyme trong công nghiệp

cũng nhƣ năng suất sản sinh pectinase tái tổ hợp của các chủng tái tổ hợp đều rất

ít thông tin. Trên thực tế có nhiều chế phẩm enzyme pectinase thƣơng mại là

enzyme tái tổ hợp nhƣng có rất ít thông tin về sản xuất pectinase tái tổ hợp trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

công nghiệp đƣợc công bố. Lý giải cho việc không công bố này là do các công

ty đều muốn giữ bí mật công nghệ cho nên không muốn công bố kết quả nghiên

cứu của mình, đây là việc làm bình thƣờng trong kinh doanh. Gần đây Liu và

cộng sự công bố kết quả biểu hiện gen pectinase từ B. subtilis trong B. subtilis

WB600 hiệu suất cao mục đích ứng dụng cho sản xuất công nghiệp. Các tác giả

đã biểu hiện thành công và enzyme tái tổ hợp cho hoạt tính riêng là 445 U/mg

[27]. Không có công bố hoạt tính pectinase cụ thể là bao nhiêu unit/ml dịch

enzyme ngoại bào sau lên men. Công bố mới đây của Zhang và cộng sự đã biểu

hiện cao pectae lyase từ B. subtilis 168 trong tế bào P. pastoris GS115 cho mục

đích loại pectin trong công nghiệp xử lý sợi gai. Các tác giả đã tạo đƣợc chủng P.

pastoris tái tổ hợp có khả năng sản xuất pectinase trên môi trƣờng lên men đạt

102,36 U/ml dịch lên men [52].

Ở Việt Nam hiện nay có nhiều đề tài về enzyme pectinase. Các hƣớng

nghiên cứu tập trung về cảm ứng, thu nhận, khảo sát các đặc tính, tinh sạch, cố

định và ứng dụng của enzyme pectinase trên đối tƣợng chủ yếu là vi nấm, đặc

biệt từ Aspergillus [1], [2], [3].

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁ P

2.1. Vật liệu

2.1.1. Các chủng vi khuẩn

Chủng B. subtilis sử dụng thí nghiệm sàng lọc enzyme pectinase: 20

chủng B. subtilis nguồn gốc Việt Nam từ bộ sƣu tập chủng giống của ngân hàng

chủng giống VTCC- Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia

Hà Nội và Trung tâm Công nghệ sinh học phục vụ đời sống và sản xuất (Biolab)

đƣợc sử dụng để sàng lọc enzyme pectinase.

Chủng vi khuẩn E. coli chủng DH5α, DH10b (Invitrogen) đƣợc sử dụng

cho mục đích tách dòng gen.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chủng B. subtilis 168 M đƣợc sử dụng cho mục đích biểu hiện gen.

2.1.2. Hóa chất thí nghiệm

Các hóa chất trong sinh học phân tử:

Enzyme cắt giới hạn EcoRI, HindIII, XbaI, XhoI, ScaI, Dream Taq DNA

polymerase, T4 ligase, DNA marker, protein marker đƣợc mua từ hãng

Fermentas.

Kit tách DNA plasmid, kit tinh sạch DNA genome từ agarose, dung dịch

Bradford đƣợc mua từ hãng Qiagen (CHLB Đức).

Các hóa chất thông dụng: Pepton, yeast extract, NaCl, agarose, glucose,

trypton, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2 đƣợc

mua từ các hãng Merck (CHLB Đức), Tris-HCl, hecxadecyl trimethyl trimethyl

trimethyl ammonium bromide (HTAB), pectin citrus, pectin axit đƣợc mua của

hãng Sigma.

2.1.3. Các vector sử dụng

Vector cloning: pJET1.2 đƣợc mua từ hãng Fermentas.

Vector biểu hiện trong B. subtilis dạng đa copy pMSE3 đƣợc nhận từ viện

Công nghệ sinh vật Biển Greifswald.

2.1.4. Trình tự mồi

Tên và trình tự mồi Mục đích

Gen đƣợc nhân lên pel

Enzyme treo HindIII HindIII Nhân gen pel tự từ chủng nhiên

BaP-pel vào

Gắn pMSE3

XhoI XbaI

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

BSpelF: atcg aag ctt atg aaa aaa gtg atg tta gc BSpelR: atcg aag ctt tac tgc tga ctg tt pel-BaP-pMSE-XhoIf acttctcgagtcttgtaaatgagttgctag Pel-pMSE- XbaIr Atcgtctagaagctttactgctgactgtt

2.2. Môi trƣờng nuôi cấy

- Môi trường LB (g/l): Pepton 10, cao nấm men 5, NaCl 5

- Môi trường khoáng chất Belitsky (BMM):

Dung dịch

Nồng độ (M) Lƣợng dịch cần (ml) PP khử trùng

Thành phần chính

37,5

0,2

khử trùng ƣớt

KH2PO4

0,2

khử trùng ƣớt

CaCl2

0,025

0,2

khử trùng ƣớt

MnSO4.4H2O

Glutamic axit

0,5

0,9

khử trùng ƣớt

0,0005

0,2

Lọc khuẩn

FeSO4.7H2O

L- Tryptophan

0,039

0,16

Lọc khuẩn

L- Lysin-HCl

0,043

0,16

Lọc khuẩn

Glucose 20%

20%

1,0

khử trùng ƣớt

Nƣớc cất vô trùng

Đến 100

+ Thành phần chính (g/l): (NH4)2SO4 4; MgSO4.7H2O 4; KCl 4; Na3-

citrat. 2H2O 4; Tris-HCl 6,06; pH 7,5.

- Môi trường lên men FM (g/l): Tinh bô ̣t ga ̣o 3; pepton đâ ̣u tƣơng 3,5;

K2HPO4 0,7; KH2PO4 0,3; NaCl 0,5; pH 7,4.

- Môi trường SPII:

Nồng độ 25% 1% 10% 1M 0,1M Lƣợng dịch cần 10 ml 200 µl 100 µl 100 µl 35 µl 50 µl Dung dịch T - base Glucose Casamino acid Yeast extract MgSO4 CaCl2

+ T-base (g/l): (NH4)2SO4 2; K2HPO4.3H2O 18,3; KH2PO4 6; Na3-citrate 1

Tất cả thành phần môi trƣờng đều đƣợc khử trùng ƣớt trƣớc khi sử dụng.

- Môi trường SOC (g/l): Tryptone 20; yeast extract 5; NaCl 0,58; KCl

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

0,186; MgCl2 0,95; MgSO4 2,4; glucose 3,6; pH = 7.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa

Các chủng B. subtilis trong bộ sƣu tập chủng giống đƣợc trẻ hóa trên môi trƣờng LB thạch đĩa qua đêm sau đó cấy vạch sang môi trƣờng LB thạch đĩa bổ sung cơ chất pectin 0,2%, nuôi qua đêm trong tủ ấm 37 ºC. Các đĩa nuôi cấy sau đó đƣợc nhuộm với dung dịch 0,5% hecxadecyl trimethyl trimethyl ammonium bromide (HTAB) để phát hiện vòng thủy phân pectin. Các chủng sinh pectinase sẽ tạo vòng thủy phân xung quanh khuẩn lạc.

2.3.2. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B. subtilis tự nhiên

Các chủng B. subtilis đƣợc trẻ hóa trên môi trƣờng LB lỏng ở 37 ºC, 200 vòng/phút qua đêm sau đó cấy chuyển 1% sang môi trƣờng LB lỏng có bổ sung cơ chất pectin để kích thích sự sản sinh pectinase. Sau 24 giờ nuôi cấy ở cùng điều kiện, dịch enzyme ngoại bào đƣợc thu bằng ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 ºC để loại tế bào, dịch nổi chứa enzyme ngoại bào đƣợc thu nhận và bảo quản ở -20 ºC cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.3.3. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp

Các chủng B. subtilis tái tổ hợp đƣợc trẻ hóa trên môi trƣờng LB lỏng (bổ sung 20 µg/ml Kan) ở 37 ºC, 200 vòng/phút qua đêm sau đó cấy chuyển 1% sang môi trƣờng lỏng (LB, BMM hay FM bổ sung 20 µg/ml Kan). Sau 26 giờ nuôi cấy ở cùng điều kiện, dịch enzyme ngoại bào đƣợc thu bằng ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 ºC để loại tế bào, dịch nổi chứa enzyme ngoại bào đƣợc thu nhận và bảo quản ở -20 ºC cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.3.4. Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11]

Nguyên lý:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Dựa vào trạng thái cân bằng bền của thuốc nhuộm Coomassie Blue G trong dung dịch, ở điều kiện axit mạnh thuốc nhuộm này tạo phức hợp màu đỏ. Khi có mặt protein, thuốc nhuộm sẽ kết hợp với protein làm cho dung dịch chuyển thành màu xanh. Mức độ đậm nhạt của màu phụ thuộc vào nồng độ protein trong dung dịch do đó có thể định lƣợng nồng độ protein bằng việc đo dộ hấp phụ của dịch màu trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 595 nm.

Các bƣớc tiến hành:

Chuẩn bị đƣờng chuẩn protein: pha BSA nồng độ 0, 10, 20, 40, 75, 100,

150 µg/ml trong nƣớc cất.

Pha loãng dung dịch Bradford 5x thành 1x, hút 0,98 ml dịch 1x vào các

ống eppendorf. Bổ sung 20 µl dịch protein BSA, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng. Đo

OD ở 595 nm trên máy đo quang phổ. Thiết lập đƣờng chuẩn bằng chƣơng trình

Exel.

Pha loãng dịch protein cần đo ở các độ pha loãng khác nhau (1/10, 1/20,

1/100). Bổ sung 20 µl dịch protein mẫu ở các độ pha loãng vào 0,98 ml dịch

Bradford 1x. Đo OD ở 595 nm trên máy đo quang phổ.

Chuyển đổi giá trị OD 595 sang nồng độ protein (mg/ml) theo công thức

chuyển đổi.

Đồ thị đƣờng chuẩn protein có dạng nhƣ sau:

Hình 2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn protein

Công thức chuyển đổi từ giá trị OD595 sang nồng độ protein:

(y - 0,3831) a x= -------------- 1,247

Trong đó x là nồng độ protein (mg/ml), y là giá trị OD 595, a là số lần pha

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

loãng mẫu.

2.3.5. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld

1955)[10]

Nguyên lý:

Nguyên lý của phƣơng pháp này dựa vào phản ứng của đầu đƣờng khử

(reducing suger end) của các oligogalacturonate đƣợc tạo ra do phản ứng cắt liên kết

glycoside của cơ chất pectin bởi pectinase với 3,5 dinitrosalicylic axit (DNSA).

Trong phản ứng này, 3,5 dinitrosalicylic axit (màu vàng) bị khử thành 3 amino, 5-

nitrosalicylic axit (màu đỏ cam) (Hình 2.2). Giá trị OD đo ở bƣớc sóng 530 nm của

dung dịch phản ứng phản ánh hoạt tính của enzyme pectinase.

Hình 2.2. Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành 3 amino,

5-nitrosalicylic axit

Các bước tiến hành:

Chuẩn bị cơ chất: 0,2% pectin trong đệm phản ứng: Tris 50 mM, NaCl 20

mM, CaCl2 0,1 mM pH 10.

Phản ứng enzyme:

Hút 50 µl dịch enzyme vào 350 µl dung dịch phản ứng 0,2% pectin, ủ 42oC trong 1 giờ. Mẫu đối chứng đƣợc thay dịch enzyme bằng 50µl nƣớc cất.

Bổ sung 400µl DNSA, đun sôi trong 5 phút, làm nguội ở nhiệt độ phòng. Đo OD ở

bƣớc sóng 530 nm.

Pha dung dịch DNSA: DNSA: 5 g; K-Na-tartarate: 150 g; NaOH 2M:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

100 ml; nƣớc cất: đến 500 ml .

Xây dựng đường chuẩn glucose:

Đƣờng chuẩn glucose đƣợc thiết lập để qui đổi giá trị OD 530nm của dịch

phản ứng enzyme sang đơn vị unit. Glucose đƣợc cân chính xác với độ sai số

0,0001 - 0,0005 mg, đƣợc pha loãng với các nồng độ từ 0,2 đến 20 mM trong

nƣớc cất. 0,5 ml dung dịch glucose ở các nồng độ khác nhau đƣợc bổ sung 0,5

ml DNSA, đun sôi 5 phút, làm nguội tới nhiệt độ phòng sau đó đo OD trên máy

quang phổ ở bƣớc sóng 530 nm. Đồ thị glucose chuẩn đƣợc thiết lập trên đoạn

thẳng trên phƣơng trình hồi qui bằng chƣơng trình Excel có dạng sau:

Hình 2.3. Đƣờng chuẩn glucose

Lƣợng đƣờng khử sau phản ứng enzyme với cơ chất đƣợc tính theo công

thức:

y+ 0,654 x = ---------------

0,7267

Trong đó: x là số mM đƣờng khử đƣợc sinh ra sau phản ứng, y là giá trị

OD của phản ứng so màu ở 530 nm.

Định nghĩa đơn vị hoạt tính enzyme:

Một đơn vị hoạt tính enzyme (unit) đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

pectinase phân cắt cơ chất pectin tạo ra 1 µM glucose trong 1 phút.

Qui đổi từ giá trị OD 530 sang Unit đƣợc tính theo công thức sau:

1000. X E = ------------ t

Trong đó: X là số mM đƣờng khử đƣợc sinh ra sau phản ứng, t là thời

gian phản ứng enzyme (phút), 1000 là hệ số qui đổi mM sang µM đƣờng khử.

2.3.6. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi

Liên kết đôi

Nguyên lý:

Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit của pectinase

Enzyme pectinase phân cắt liên kết glycosid của pectin axit bằng cơ chế chuyển liên kết tạo thành liên kết đôi giữa C-4 và C-5 của galacturonate ở đầu không khử (Hình 2.4). Liên kết đôi này có thể phát hiện trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 232 nm [28].

Các bước tiến hành:

Đệm phản ứng: Tris 50 mM, NaCl 20 mM, CaCl2 0,1 mM (pH tùy thuộc

vào từng thí nghiệm).

Cơ chất pectin: 0,2% pectin axit trong đệm phản ứng.

Phản ứng enzyme:

Hút 50 µl dịch enzyme vào 350 µl dung dịch cơ chất pectin, ủ 42oC trong 1 giờ. Bổ sung 400 µl dung dịch HCl 50 mM để kết thúc phản ứng, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút sau đó đo trực tiếp trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 232 nm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Đối chứng âm: thay dịch enzyme bằng 50 µl dH2O.

2.3.7. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B. subtilis

Nguyên lý:

Để tách chiết đƣợc DNA tổng số cần phá vỡ thành tế bào, phá vỡ các liên

kết của protein với DNA. Khi tách chiết cần phải làm bất hoạt các enzyme phân

hủy DNA.

Các bước tiến hành:

Nuôi 1 khuẩn lạc B. subtilis trong LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37˚C qua

đêm. Hút 1ml dịch nuôi vào ống eppendorf, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút ở 4oC. Loại dịch trên, hòa tan tế bào vào trong 100µl TE pH 8.0. Bổ sung

10 µl lysozyme nồng độ 100 µg/ml, lắc nhẹ, ủ hỗn hợp ở 37 ˚C trong 1 giờ, sau

đó bổ sung thêm 10 µl SDS 1%.

Các bƣớc tiếp theo sử dụng phƣơng pháp tách DNA bằng bộ kit tách

DNA tổng số từ hãng Bioneer theo hƣớng dẫn của hãng nhƣ sau: Trộn đều 100

µl mẫu đã chuẩn bị với 500 µl dung dịch 1 (dung dịch ly giải ) (để phá vỡ tế

bào), ủ hỗn hợp ở 70˚C trong 5 phút, làm mẫu nguội đến nhiệt độ phòng. Thêm

600 µl chloroform, trộn đều hỗn hợp cho tới khi chuyển màu trắng sữa và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 oC.

Chuẩn bị dung dịch kết tủa DNA: pha loãng dung dịch 2 với nƣớc cất tỉ lệ

1/10: hòa 80 µl dung dịch 2 với 720 µl nƣớc cất vô trùng. Dùng pipet hút nhẹ

200 µl dung dịch DNA pha trên cùng sang ống chứa 800 µl dung dịch kết tủa

DNA. Trộn đều hỗn hợp, để 1-2 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 oC. Bỏ hết dịch nổi, hòa tủa trong 150 µl dung dịch 3 (dung

dịch hòa tan), trộn đều trong 10 giây đến khi hòa tan hoàn toàn tủa dƣới đáy ống.

Thêm 450 µl cồn tuyệt đối, trộn đều, để hỗn hợp ở -20 ˚C trong 30 phút, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 oC. Bỏ dịch nổi, thêm 500 µl cồn 75%, trộn đều để rửa tủa DNA, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Loại hết cồn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

và làm khô DNA, hòa tan DNA trong 100 µl dung dịch TE, bảo quản -20 ºC.

2.3.8. Tách chiết DNA plasmid từ E. coli

DNA plasmid từ E. coli đƣợc tách bằng kit tách plasmid của Qiagen, các

bƣớc tách chiết đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của hãng.

2.3.9. Tách chiết DNA plasmid từ B. subtilis

Cấy 1 khuẩn lạc vi khuẩn trong 3 ml môi trƣờng LB + 20 g/ml

kanamycine, lắc qua đêm. Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendoft, li tâm

10.000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch nổi, hòa tế bào lại trong 300 l dung

dịch 1 (50 mM Tris-HCl; 5 mM EDTA; pH 7,5), bổ sung 5 l dung dịch RNase

nồng độ 10 mg/ml và 5 l dung dịch lysozyme nồng độ 20 mg/ml (pha mới

trong ngày), trộn đều, ủ 37º C trong 30 phút. Bổ sung 200 l dung dịch 2 (200

mM NaOH; 1% SDS), đảo ngƣợc ống 3-4 lần. Bổ sung 200 l dung dịch 3 (0,5

M kali acetate; pH 4,2), đảo ngƣợc ống 3-4 lần. Chiết với 0,5 ml chloroform ( lặp lại 2 lần). Tủa plasmid bằng việc bổ sung 1 ml cồn ở - 20oC qua đêm.

Sau khi tủa bằng cồn, li tâm, làm khô và hòa lại plasmid trong 50 ul TE,

bảo quản trong -20oC.

2.3.10. Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử

2.3.10.1. Khuếch đại gen bằng PCR

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng nhân gen

Thành phần dH2O vô trùng Buffer 10X dNTP 2mM Mồi BS pel F 50 µM Mồi BS pel R 50 µM Dream Taq polymerase 5 u/µl DNA khuôn mẫu: từ dịch phản ứng gắn ở mục 3 Tổng thể tích Thể tích (µl) 35 5 5 1 1 0.5 2 50

Bảng 2.2. Chƣơng trình nhân gen bằng PCR

Chu kỳ

2 phút 20 giây 20 giây 1 phút 30 giây 7 phút

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bƣớc Phản ứng Biến tính 1 Biến tính 2 Gắn mồi 3 Kéo dài chuỗi 4 Hoàn tất 5 Kết thúc phản ứng 6 Nhiệt độ (oC) Thời gian 94oC 94oC 55oC 72oC 72oC 4oC

2.3.10.2. Phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt pKTH/pUC bằng HindIII

Thành phần dH2O vô trùng Buffer 10X pKTH/pUC (100 ng/µl) HindIII (500 U/µl) Tổng Thể tích (µl) 60 10 30 1 100

Ủ 37 oC trong thời gian 1 - 16 giờ.

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt pJET/pel bằng HindIII

Thành phần dH2O vô trùng Buffer 10X pJET/pel (100 ng/µl) HindIII (500 U/µl) Tổng thể tích Thể tích (µl) 60 10 30 1 100

Ủ 37 oC trong thời gian 1 - 16 giờ.

2.3.10.3. Thiết kế gen dung hợp

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen pel với promoter

Thành phần dH2O vô trùng Buffer 10X pKTH-BaP pel T4 ligase Tổng thể tích

Thể tích (µl) 10 2 4 4 0.5 20 Ủ 22 oC trong thời gian 15 - 60 phút.

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel

Thể tích (µl) 35 5 5 1 1 0.5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2 Thành phần dH2O vô trùng Buffer 10X dNTP 2mM Mồi 1 (50 µM) Mồi 2 (50 µM) Dream Taq pol (5 u/µl) DNA khuôn mẫu: từ dịch phản ứng gắn ở Bảng 2.5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.3.11. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp xung điện

Nuôi cấy 1 khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH 5α trong môi trƣờng LB lỏng trên máy lắc 200 vòng/phút ở 37oC qua đêm. Cấy chuyển 1% dịch tế bào vào 100 ml môi trƣờng LB lỏng, lắc tiếp 220 vòng/phút ở 37oC cho đến khi OD600 đạt 0,5 -

0,7, sau đó ủ đá trong 1 giờ. Thu dịch và ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Bổ sung nƣớc cất để rửa và ly tâm tiếp 2 lần. Hòa lại cặn trong 0,5 ml nƣớc

khử ion lạnh. Chia tế bào khả biến sang ống eppendoft, mỗi ống 100 µl.

Hút 1 µl sản phẩm gắn gen vào ống eppendoft chứa tế bào khả biến, trộn

nhẹ, đƣa vào cuvet xung điện. Xung điện ở điều kiện 2,5 KV, 250 F

Bổ sung 0,5 ml môi trƣờng SOC, (công thức môi trƣờng xem trong phụ

lục, phần môi trƣờng). Hút dịch từ cuvert ra ống eppendoft. Lắc 220 vòng/phút, 37oC trong 1 giờ.

Trải 100 µl dịch nuôi trên môi trƣờng thạch LB có bổ sung kháng sinh ampycline 100 µg/ml, giữ trong tủ ấm 37oC qua đêm trƣớc khi kiểm tra khuẩn

lạc sau biến nạp.

2.3.12. Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B. subtilis 168

Plasmid pMSE3/BaP-pel đƣợc biến nạp vào B. subtilis 168 theo phƣơng

pháp tế bào tƣơng hợp. Các bƣớc tiến hành cụ thể:

Nuôi 1 khuẩn lạc BS168 trên môi trƣờng SPII hoặc LB (2 ml), lắc 200 vòng/phút, 37oC, qua đêm. Cấy chuyển sang môi trƣờng SPII mới (OD khởi đầu: OD 600=0,1) (0,5 ml dịch nuôi cấy qua đêm cho vào 10 ml SPII), lắc tiếp 37oC, 3

– 4 giờ OD 600 đạt khoảng 0,6 – 0,8.

Thu tế bào: 1 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendorf, li tâm 5000 vòng/phút,

4 phút, loại bỏ 0,9 ml dịch nổi trên bề mặt. Bổ sung 15 µl dịch DNA (hoặc plasmid) nồng độ 2 µg/µl, lắc tiếp 30 phút, 37oC. Bổ sung 500 µl LB, lắc 1 giờ,

cấy trải 50, 200 µl trên đĩa môi trƣờng chọn lọc LB + 20 µg/ml kanamycin, ủ ở

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

37 °C qua đêm.

Thể biến nạp thu đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc mang pMSE3/BaP-pel là

chủng B. subtilis tái tổ hợp sinh pectinase sản lƣợng cao.

2.3.13. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009) [25]

Thành phần gel tách (12%)

Thành phần Nồng độ các thành phần trong gel 10ml

dH2O vô trùng 30% Acrylamid Tris-HCl 1,5M; pH 8,8 10% SDS 10% APS TEMED 12 % 0,375 M 0,1 % 0,1 % 0,002% 3,3 4,0 2,5 0,1 0,1 0,004

Thành phần gel cô (5%)

Nồng độ các thành phần trong gel

Thành phần dH2O vô trùng 30% Acrylamid Tris-HCl 1M; pH 6,8 10% SDS 10% APS TEMED 5 % 0,13 M 0,1 % 0,1 % 0,001% 3ml 2,1 0,5 0,38 0,03 0,03 0,003

15 µl dịch enzyme đƣợc bổ sung 15 µl đệm mẫu 2x. Hỗn hợp đƣợc biến tính nhiệt ở 95oC trong 5 phút, làm lạnh trong đá tan sau đó tra mẫu vào điện di

trên gel polyacrylamide 12%. Sau khi kết thúc điện di, gel đƣợc nhuộm trong

dung dịch nhuộm 0,1% coomassie brilliant blue 1 giờ và rửa trong đệm rửa 5%

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ethanol, 10% acetic acid để phát hiện băng protein.

KẾ T QUẢ VÀ THẢ O LUẬN

3.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis phân lập từ trong nƣớc có hoạt tính

pectinase cao

3.1.1. Sàng lọc chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch

Với mục đích tạo chủng biểu hiện gen pel từ B. subtilis cho công nghiệp

xử lý vải bông cho nên các chủng B. subtilis đƣợc lựa chọn để sàng lọc enzyme

pel. Để chọn đƣợc các chủng B. subtilis mang gen pel, các vi khuẩn B. subtilis

mua từ bộ sƣu tập chủng giống của VTCC- Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh

học, Đại học Quốc gia Hà Nội và Trung tâm Công nghệ sinh học phục vụ đời

sống và sản xuất (Biolab) đƣợc sử dụng. Kết quả sàng lọc đƣợc thể hiện trong

Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc các chủng B. subtilis có khả năng phân hủy pectin trên đĩa thạch.

STT

Tên chủng

Nguồn gốc Vòng

thủy

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

VBS1 VBS2 VBS3 VBS4 VBS5 VBS6 VBS7 VBS8 VBS9 VBS10 VBS11 VBS12 VBS13 VBS14 VBS15 VBS16 VBS17 VBS18 VBS19 VBS20

Tên chủng gốc BIOLAB 1 BIOLAB 2 BIOLAB 3 BIOLAB 4 BIOLAB 5 VTCC-B-380 VTCC-B-1010 VTCC-B-818 VTCC-B-999 VTCC-B-1013 VTCC-B-485 VTCC-B-732 VTCC-B-948 VTCC-B-822 VTCC-B-275 BIOLAB 6 BIOLAB 7 BIOLAB 8 BIOLAB 9 BIOLAB 10

Đất Đất Đất Đất Đất Đất Đất Rễ cây Đất Đất Đất Đất Rong sụn Đất Đất Đất Đất Đất Đất Đất

phân pectin - + + + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ - ++ ++ ++ + - + + +

Chú thích: (-) Không tạo vòng, (+) tạo vòng yếu, (++) tạo vòng mạnh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

với cơ chất pectin.

Các chủng vi khuẩn sau khi làm trẻ hóa trên môi trƣờng LB ở 37oC đƣợc

cấy chuyển sang môi trƣờng LB thạch đĩa có chứa 0,2% pectin sau đó nuôi tiếp

qua đêm để vi khuẩn bộc lộ khả năng sản sinh pectinase. Hoạt tính pectinase

đƣợc phát hiện bằng việc nhuộm đĩa thạch với dung dịch 0,5% hecxadecyl

trimethyl trimethyl trimethyl ammonium bromide (HTAB). Kết quả thể hiện

cho thấy 17 chủng dƣơng tính với pectin trong tổng số 20 chủng vi khuẩn đƣợc

sàng lọc (Bảng 3.1 và Hình 3.1). Điều này chứng tỏ hầu hết các chủng trong

nghiên cứu đều có khả năng biểu hiện pectinase ra môi trƣờng. Kết quả này phù

hợp với các nghiên cứu trƣớc đây về enzyme pectinase trong B. subtilis [31],

[30], [44].

Hình 3.1. Hình ảnh một số chủng B. subtilis tạo vòng thủy phân

pectin trên đĩa thạch LB 0,2% pectin. Thứ tự các chủng từ 1-10: VBS6 đến VBS15.

3.1.2. Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại

bào của các chủng nghiên cứu

Với mục đích chọn đƣợc các chủng B. subtilis sản sinh enzyme pectinase,

là một enzyme pectinase thƣờng hoạt động tối ƣu ở pH kiềm, do đó chúng tôi

quan tâm đến các enzyme pectinase hoạt động mạnh ở pH từ 8 – 10. Trong thí

nghiệm này chúng tôi chọn 9 trong 17 chủng vi khuẩn dƣơng tính mạnh với

pectin trên đĩa thạch để nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng với mục đích thu enzyme

pectinase ngoại bào. Môi trƣờng LB lỏng đƣợc bổ sung 0,2% pectin để kích

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thích sự tiết pectinase của vi khuẩn ra môi trƣờng nuôi cấy. Sau khi nuôi cấy 24

giờ ở 37oC, enzyme ngoại bào đƣợc thu nhận và sử dụng làm phản ứng với cơ

chất pectin để định lƣợng hoạt tính pectinase nhƣ mô tả trong phần phƣơng pháp.

Giá trị OD 530 nm thu đƣợc từ phản ứng enzyme pectinase với cơ chất pectin

bằng phƣơng pháp đƣờng khử đƣợc chuyển đổi sang đơn vị Unit dựa theo đồ thị

chuẩn glucose với phƣơng trình hồi qui y = 0,7267x – 0,0654, và r = 0,9981. Kết

quả thu đƣợc 7 chủng có hoạt tính pectinase tối ƣu ở pH 10 và 2 chủng VBS7 và

VBS10 có hoạt tính pectinase tối ƣu lần lƣợt là pH 9,5-10 và pH 8,5-10 (Bảng

3.2). Nhƣ vậy tất cả 9 chủng B. subtilis đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng đều

là enzyme pectinase kiềm.

Bảng 3.2. Hoạt tính pectinase ở điều kiện pH phản ứng tối ƣu của các

chủng nghiên cứu

STT

Tên chủng pH tối ƣu Hoạt tính pectinae

1 2 3 4 5 6 7 8 9

VBS6 VBS7 VBS8 VBS9 VBS10 VBS11 VBS13 VBS14 VBS15

10 9,5 - 10 10 10 8,5 - 10 10 10 10 10

(U/ml) 24,7 22,3 36,5 22,5 25,5 38,9 30,1 20,1 17,5

So sánh hoạt tính pectinase của các chủng nghiên cứu ở pH tối ƣu cho

thấy hoạt tính pectinase đƣợc xác định thấp nhất là chủng VBS15 (17,5 U/ml),

cao nhất là chủng VBS11 (38,9 U/ml) (Hình 3.2. a, b, c). Điều này có thể giải

thích rằng các chủng B. subtilis tuy cùng loài nhƣng phân lập từ các nguồn khác

nhau cho nên sẽ có sự sai khác nhất định về gen dẫn đến ái lực với pectin của

các enzyme này sẽ khác nhau. Vì vậy việc sàng lọc chúng để chọn đƣợc những

chủng có hoạt tính pectinase cao là một tiêu chí để loại bỏ đƣợc những enzyme

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

có hoạt tính yếu.

a

b

c

Hình 3.2. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng phân hủy pectin của các

pectinase từ các chủng nghiên cứu

3.1.3. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi

Bảng 3.3. Hoạt tính pectinase của các enzyme thu đƣợc

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tên chủng VBS6 VBS7 VBS8 VBS9 VBS10 VBS11 VBS13 VBS14 VBS15 ĐC âm

OD 232 nm 0,514 0,322 0,710 0,296 0,412 0,670 0,503 0,24 0,411 0,005

Chú thích: Đối chứng âm: nƣớc cất; Các chủng có hoạt tính cao đƣợc in

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đậm.

Đặc trƣng của pectinase là phân cắt cơ chất pectin axit theo cơ chế chuyển

liên kết, sản phẩm tạo thành một liên kết đôi trong phân tử đƣờng galacturonate.

Liên kết đôi dễ dàng đƣợc phát hiện bằng máy đo quang phổ ở bƣớc sóng 232 nm

[28]. Để khẳng định các chủng Bacillus trên có sinh enzyme pectinase hay không,

dịch enzyme ngoại bào của các chủng B. subtilis đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng

khoáng đƣợc sử dụng làm phản ứng enzyme với cơ chất pectin axit (90%

demethylation). Sau khi làm phản ứng dịch enzyme với cơ chất pectin axit, hỗn

hợp phản ứng đƣợc đo trực tiếp trên máy đo quang phổ ở bƣớc sóng 232 nm. Kết

quả cho thấy tất cả các chủng nghiên cứu đều cho giá trị OD 232 nm tƣơng đối cao

so với mẫu đối chứng âm. Điều này chứng tỏ enzyme pectinase của các chủng này

đều có khả năng phân cắt pectin axit tạo ra liên kết đôi trong sản phẩm phản ứng

(Bảng 3.3), đồng thời chứng tỏ các enzyme pectinase trên thuộc nhóm pectinase.

So sánh hoạt tính enzyme đo bằng phƣơng pháp phát hiện liên kết đôi

(Bảng 3.3) với phƣơng pháp đƣờng khử (Bảng 3.2) cho thấy các mẫu đều cho

hoạt tính enzyme tỉ lệ thuận với nhau là phù hợp bởi vì cơ chất pectin có tỷ lệ

methyl hóa khoảng 70%, còn 30% là pectin axit do đó enzyme pectinase xúc tác

phản ứng vào các vị trí không bị methyl hóa cho nên tuy là hai cơ chất khác

nhau nhƣng bản chất phản ứng là nhƣ nhau. Bốn chủng VBS6, VBS8, VBS11

và VBS13 cho giá trị OD 232 nm cao đƣợc sử dụng cho thí nghiệm nhân dòng

và giải trình tự gen.

3.2. Tách dòng gen pectinase trong E. coli

3.2.1. Tách chiết DNA tổng số của các chủng B. subtilis

Để nhân gen pectinase từ B. subtilis, việc đầu tiên là phải tách chiết DNA

tổng số từ tế bào của chúng. Độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA khi tách chiết đƣợc

sẽ ảnh hƣởng đến sự thành công của các thí nghiệm tiếp theo.

Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng vật liệu nghiên cứu là 4 chủng B.

subtilis đã qua các bƣớc sàng lọc và đánh giá bƣớc đầu là có khả năng sinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

enzyme pectinase. Việc tách chiết DNA tổng số của các chủng VBS6, VBS8,

VBS11 và VBS13 đã đƣợc thực hiện nhƣ mô tả trong phần phƣơng pháp. DNA

tổng số sau khi tách chiết đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong

đệm TAE. Kết quả điện di cho thấy băng DNA có kích thƣớc lớn, đậm, có thể sử

1 2 3 M 4

dụng cho phân tích PCR hay các nghiên cứu khác sau này (Hình 3.3).

Hình 3.3. Điện di DNA tổng số của các chủng B. subtilis. 1-4: DNA

genome của VBS6, VBS8, VBS11 và VBS13. M: DNA marker (Fermentas);

Thang DNA chuẩn đƣợc đặt ở bên.

3.2.2. Nhân gen pectinase bằng PCR

Mồi nhân gen đƣợc thiết kế dựa theo trình tự gen pectinase ƣa kiềm của

chủng B. subtilis đã đƣợc Nasser và đồng tác giả tách dòng và nghiên cứu [34].

Trình tự cặp mồi đƣợc sử dụng là BspelF, BSpelR nhƣ mô tả trong phần vật liệu.

DNA tổng số của vi khuẩn B. subtilis sau khi tách chiết đƣợc sử dụng

làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen sử dụng cặp mồi

trên. Thành phần phản ứng PCR và chƣơng trình nhân gen đƣợc ghi trong

phần phƣơng pháp.

Sau khi kết thúc phản ứng, sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di

trên gel agarose 0,8%, trong đệm TAE 1X. Kết quả trên ảnh điện di cho thấy

trong 4 mẫu DNA đƣợc sử dụng làm khuôn mẫu đều khuếch đại một đoạn

gen khoảng 1,5 kb đúng nhƣ kích thƣớc của gen pectinase đã đƣợc tính toán

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

từ trƣớc (Hình 3.4).

Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pectinase

1 - 4: sản phẩm PCR của VBS6, VBS8, VBS11 và VBS13: DNA marker. Băng

DNA 1,5 kb đƣợc chỉ bằng mũi tên. Thang DNA chuẩn đƣợc đặt ở bên.

3.2.3. Tách dòng các gen pel vào E. coli

Gắn pel vào pJET1.2 và biến nạp vào E. coli

Băng DNA 1,5 kb trong mục 3.2.2 đƣợc cắt ra, làm sạch bằng gel- extraction kit (Qiagen), làm tù đầu và gắn vào vector pJET1.2/blunt và biến nạp vào E. coli DH5α. Thể biến nạp đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng thạch đĩa LB chứa 100 µg/ml ampicillin ở 37 oC qua đêm.

Hình 3.5. Khuẩn lạc các thể biến nạp E. coli DH5α mang pJET/pel

trên môi trƣờng chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicillin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Những tế bào có chứa vector nhƣng không mang đoạn gen chèn sẽ không thể sinh trƣởng đƣợc do gen gây chết (lethal gene) có trong vùng đa điểm nối (multiple cloning site) của vector gây ra. Ngƣợc lại những tế bào mang vector có đoạn gen chèn sẽ làm hỏng (knock out) gen gây chết trong vector làm cho gen

này không biểu hiện đƣợc do đó tế bào sẽ phát triển thành khuẩn lạc trên môi trƣờng chọn lọc.

Kết quả biến nạp thu đƣợc các thể biến nạp trên môi trƣờng chọn lọc, điều

này chứng tỏ phản ứng gắn và thí nghiệm biến nạp đã thành công (Hình 3.5).

1 2 3 4 5 M 6 kb

3,0 kb

1,5 kb

Phân tích plasmid bằng enzyme giới hạn

1,2,: pJET1.2 mang gen pel của VBS6; 3,5: pJET1.2/pel; 4, 6: pJET1.2 mang gen pel

của VBS8, M: Marker 12 kb (Fermentas). Băng 1,5 kb đƣợc chỉ bằng mũi tên. Thang DNA chuẩn đƣợc đặt ở bên.

M 1 2 3 4

3,0 kb

1,5 kb

Hình 3.6. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII

1 - 2,: pJET1.2 mang gen pel của VBS11; 3 - 4: pJET1.2 mang gen pel của VBS13, M: Marker 10 kb (Fermentas). Băng 1,5 kb đƣợc chỉ bằng mũi tên. Thang DNA chuẩn đƣợc đặt ở bên.

Hình 3.7. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII

Các khuẩn lạc trên môi trƣờng chọn lọc đƣợc nhân lên riêng rẽ trong môi

trƣờng LB lỏng để tách plasmid. Plasmid sau khi tách sạch bằng kit đƣợc cắt

bằng enzyme giới hạn HindIII để kiểm tra đoạn gen đƣợc chèn vào hay không. 35 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Do cả hai mồi dùng để nhân gen đã đƣợc treo sẵn điểm cắt HindIII ở đầu 5’ cho

nên các plasmid mang gen chèn sẽ xuất hiện một băng DNA 1,5 kb và một băng

vector 3 kb khi đƣợc cắt bằng HindIII.

Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid trên gel agarose cho thấy phần lớn

các mẫu cắt đều có một băng vector 3 kb và 1 băng 1,5 kb đúng bằng kích thƣớc

đoạn gen đƣợc nhân lên bằng PCR. Điều này chứng tỏ đoạn gen 1,5 kb nhân lên

từ 4 chủng VBS6, VBS8, VBS11 và VBS13 đã đƣợc chèn vào vector pJET1.2

và đƣợc nhân lên trong tế bào E. coli (Hình 3.6 và 3.7). Nhƣ vậy 4 gen pectinase

từ B. subtilis nguồn gốc Việt Nam đã đƣợc tách dòng vào E. coli trong vector

pJET1.2.

3.2.4. Giải trình tự các gen pectinase

3.2.4.1. Trình tự 4 gen pectinase phân lập từ Việt Nam

Bốn dòng plasmid mang kích thƣớc 1,5 kb của 4 gen pel đƣợc tách dòng

ở trên đƣợc sử dụng để giải trình tự gen trên máy giải trình tự gen tự động. Kết

quả thu đƣợc 4 trình tự nucleotide có độ dài nhƣ nhau, mã hóa cho một protein

420 amino acid. Toàn bộ trình tự nucleotide của 4 gen pel đƣợc chi tiết trong

phụ lục. Trình tự nucleotide của 4 gen pel từ chủng VBS6, VBS8, VBS11 và

VBS13 đã đƣợc đăng trên Genbank với mã số theo thứ tự là JX083068,

JX083069, JX083070, JX083071. So sánh trình tự amino acid (aa) suy diễn của

4 gen trên bằng phần mền so sánh BLAST trên NCBI cho thấy chúng có độ

tƣơng đồng với các trình tự aa của Pel từ B. subtilis168 lần lƣợt là 98,8; 99,7;

99,0 và 99,5%. Điều này chứng tỏ rằng 4 gen pel đƣợc nhân dòng từ 4 chủng vi

khuẩn VBS6, VBS8, VBS11 và VBS13 đều là gen mã hóa cho pectinase.

3.2.4.2. Tính đa dạng của các pectinase phân lập từ B. subtilis nguồn gốc Việt

Nam

Với mục đích đánh giá sự đa dạng của các pectinase phân lập từ Việt

Nam, trình tự aa của PL từ B. subtilis 168 đƣợc sử dụng để so sánh theo hàng

cùng với 4 Pel này. Phần mềm so sánh cụm ClustalW đƣợc sử dụng. Kết quả

cho thấy có 9 vị trí aa khác nhau khi so sánh giữa 5 trình tự aa này với nhau

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

(Hình 3.8).

VBS13 MKKVMLATALFLGLTPAGANAADLGHQTLGSNDGWGAYSTGTTGGSKASSSNVYTVSNRN 60

BS-168 MKKVMLATALFLGLTPAGANAADLGHQTLGSNDGWGAYSTGTTGGSKASSSNVYTVSNRN 60

VBS11 MKKVMLATALFLGLTPAGANAADLGHQTLGSNDGWGAYSTGTTGGSKASSSNVYTVSNRN 60

VBS8 MKKVMLATALFLGLTPAGANAADLGHQTLGSNDGWGAYSTGTTGGSKASSSNVYTVSNRN 60

VBS6 MKKVMLATALFLGLTPAGANAADLGHQTLGSNDGWGAYSTGTTGGSKASSSNVYTVSNRN 60

************************************************************

VBS13 QLVSALGKDATNTTPKIIYIKGTIDMNVDDNLKPLGLNDYKDAPEYDLDKYLKAYDPSTWGK 120

BS-168 QLVSALGKETNTTPKIIYIKGTIDMNVDDNLKPLGLNDYKDAPEYDLDKYLKAYDPSTWGK 120

VBS11 QLVSALGKETNTTPKIIYIKGTIDMNVDDNLKPLGLNDYKDAPEYDLDKYLKAYDPSTWKK 120

VBS8 QLVSALGKETNTTPKIIYIKGTIDMNVDDNLKPLGLNDYKDAPEYDLDKYLKAYDPSTWGK 120

VBS6 QLVSALGKETNTTPKIIYIKGTIDMNVDDNLKPLGLNDYKDAPEYDLDKYLKAYDPSTWGK 120

********:************************************************* *

VBS13 KEPSGTQEEARARSQKNQKARVMVDIPANTTIVGSGTNAKVVGGNFQIKSDNVIIRNIEF 180

BS-168 KEPSGTQEEARARSQKNQKARVMVDIPANTTIVGSGTNAKVVGGNFQIKSDNVIIRNIEF 180

VBS11 KEPSGTQEEARARSQKNQKTRVMVDIPANTTIVGSGTNAKVVGGNFQIKSDNVIIRNIEF 180

VBS8 KEPSGTQEEARARSQKNQKARVMVDIPANTTIVGSGTNAKVVGGNFQIKSDNVIIRNIEF 180

VBS6 KEPSGTQEEARARSQKNQKARVMVDIPANTTIVGSGTNAKVLGGNFQIKSDNVIIRNIEF 180

*******************:*********************:******************

VBS13 QDAYDYFPQWDPTDGSSGNWNSQYDNITINGGTHIWIDHCTFNDGSRPDSTSPKYYGRKY 240

BS-168 QDAYDYFPQWDPTDGSSGNWNSQYDNITINGGTHIWIDHCTFNDGSRPDSTSPKYYGRKY 240

VBS11 QDAYDYFPQWDPTDGSSGNWNSQYDNITINGGTHIWIDHCTFNDGSRPDSTSPKYYGRKY 240

VBS8 QDAYDYFPQWDPTDGSSGNWNSQYDNITINGGTHIWIDHCTFNDGSRPDSTSPKYYGRKY 240

VBS6 HDAYDYFPQWDPTDGSSGNWNSQYDNIAMNGGTHIWIDHCTFNDGSRPDSTSPKYYGRKY 240

:**************************::*******************************

VBS13 QHHDGQTDASNGANYITMSYNYYHDHDKSSIFGSSDSKTSDDGKLKITLHHNRYKNIVQR 300

BS-168 QHHDGQTDASNGANYITMSYNYYHDHDKSSIFGSSDSKTSDDGKLKITLHHNRYKNIVQR 300

VBS11 QHHDGQTDASNGANYITMSYNYYHDHDKSSIFGSSDSKTSDDGKLKITLHHNRYQNIVQR 300

VBS8 QHHDGQTDASNGANYITMSYNYYHDHDKSSIFGSSDSKTSDDGKLKITLHHNRYQNIVQR 300

VBS6 QHHDGQTDASNGANYITMSYNYYHDHDKSSIFGSSDSKTSDDGKLKITLHHNRYQNIVQR 300

******************************************************:*****

VBS13 APRVRFGQVHVYNNYYEGSTSSSSYPFSYAWGIGKSSKIYAQNNVIDVPGLSAAKTISVF 360

BS-168 APRVRFGQVHVYNNYYEGSTSSSSYPFSYAWGIGKSSKIYAQNNVIDVPGLSAAKTISVF 360

VBS11 APRVRFGQVHVYNNYYEGSTSSSSYPFSYAWGIGKSSKIYAQNNVIDVPGLSAAKPISVF 360

VBS8 APRVRFGQVHVYNNYYEGSTSSSSYPFSYAWGIGKSSKIYAQNNVIDVPGLSAAKTISVF 360

VBS6 APRVRFGQVHVYNNYYEGSTSSSSYPFSYAWGIGKSSKIYAQNNVIDVPGLSAAKTISVF 360

*******************************************************.****

VBS13 SGGTALYDSGTLLNGAQINASAANGLSSSVGWTPSLHGSIDASANVKSNVINQAGAGKLN 420

BS-168 SGGTALYDSGTLLNGTQINASAANGLSSSVGWTPSLHGSIDASANVKSNVINQAGAGKLN 420

VBS11 SGGTALYDSGTLLNGTQINASAANGLSSSVGWTPSLHGSIDASANVKSNVINQAGAGKLN 420

VBS8 SGGTALYDSGTLLNGTQINASAANGLSSSVGWTPSLHGSIDASANVKSNVINQAGAGKLN 420

VBS6 SGGTALYDSGTLLNGTQINASAANGLSSSVGWTPSLHGSIDASANVKSNVINQAGAGKLN 420

***************:********************************************

Hình 3.8. So sánh theo hàng trình tự amino acid của Pel từ 4 chủng B.

subtilis phân lập ở Việt Nam với Pel từ B. subtilis 168. Các amino acid không

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tƣơng đồng đƣợc đánh dấu bằng bôi đen.

So sánh riêng rẽ trình tự aa của 4 Pel phân lập với Pel từ B. subtilis 168

cho thấy các Pel này có sự khác nhau nhất định, cụ thể: Pel của VBS6 có 5 aa

(L-162, H-181, A-248, M-249, Q-294), VBS8 có 1 aa (Q-294), VBS11 có 4 aa

(K-118, T-140, Q-294, P-356) và VBS13 có 2 aa (D-69, A-376) sai khác so với

Pel của B. subtilis 168 (Hình 3.8). Điều thú vị là Pel từ VBS6 và VBS11 phân

lập từ đất có số lƣợng aa khác biệt (5 và 4 aa) nhiều hơn Pel từ VBS8 (1 aa)

phân lập từ rễ cây và VBS13 (2 aa) phân lập từ rong sụn. Nhƣ vậy, dƣờng nhƣ

các chủng phân lập từ thực vật có trình tự aa của Pel ít thay đổi hơn so với các

chủng phân lập từ đất. B. subtilis 168 cũng là chủng có nguồn gốc từ chủng B.

subtilis ATCC 6051 phân lập từ thực vật, do Cohn phân lập từ một loại cỏ vào

năm 1875 [51]. B. subtilis 168 đã đƣợc gây đột biến dị dƣỡng tryptophan từ

chủng B. subtilis ATCC 6051 [13].

3.3. Tạo chủng B. subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase

3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện gen pectinase trong B. subtilis

3.3.1.1. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen pel trong B. subtilis

Cấu trúc của gen biểu hiện trong B. subtilis bao gồm: Promoter BaP từ gen

amylase của B. amyloliquefaciens, gen mã hóa pectinase và terminater (Ter) từ

chủng VBS11. Thiết kế vector biểu hiện gen pel bao gồm 2 phần chính:

- Phần 1: tạo gen dung hợp BaP-pel bằng cách nối promoter của gen

amylase từ Bacillus amyloliquefacien (BaP) có trong pKTH với gen pel của B.

subtilis phân lập từ Việt Nam. Plasmid pKTH/pUC là plasmid dung hợp 2

plasmid pKTH và pUC18, mang promoter BaP thông qua điểm HindIII.

- Phần 2: gắn gen dung hợp BaP-pel vào vector biểu hiện đa copy pMSE3

để tạo ra vector biểu hiện hoàn chỉnh. Sơ đồ thiết kế vector đƣợc thể hiện trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.9.

Hình 3.9. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pel trong B. subtilis.

3.3.1.2. Dung hợp promoter BaP vào gen pel

Thu nhận plasmid pKHT-BaP từ plasmid lai pKTH/pUC

Để biểu hiện gen hiệu quả thì cần thiết phải lựa chọn một promoter mạnh

để điều khiển sự biểu hiện của gen. Promoter BaP đã đƣợc biết đến là một

promoter có khả năng biểu hiện mạnh các protein trong tế bào B. subtilis trong

các nghiên cứu trƣớc đây [4], [5]. Do đó phƣơng án sử dụng promoter này để

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

điều khiển biểu hiện gen pel trong tế bào B. subtilis đƣợc lựa chọn.

pKTH/pUC cắt bằng HindIII, 2: DNA marker. Thang DNA chuẩn đƣợc đặt ở bên.

Hình 3.10. Điện di sản phẩm cắt pKTH/pUC bằng HindIII. 1:

Với mục đích thu pKTH-BaP (pKTH mang promoter BaP) plasmid

pKHT/pUC đƣợc cắt với HindIII để loại bỏ pUC18 (2,7 kb), băng DNA 3,7 kb

là băng pKTH-BaP đƣợc thu nhận để cho thí nghiệm tiếp theo (Hình 3.10).

Thành phần phản ứng cắt đƣợc ghi trên Bảng 2.1 trong phần phƣơng pháp.

Thu nhận pel từ pJET/pel

Gen pel trong pJET/pel tách dòng từ chủng VBS11 trong phần 3.2.3 đƣợc

sử dụng để thiết kế vector biểu hiện. Plasmid pJET/pel sau khi cắt bằng HindIII

đƣợc phân tách trên gel 0,8% agarose. Băng DNA 1,5 kb đƣợc thu nhận và làm

sạch bằng gel extraction kit (Qiagen) sau đó kiểm tra lại trên điện di agarose.

Kết quả trên Hình 3.11 cho thấy gen pel thu đƣợc có độ tinh sạch cao, đủ chất

lƣợng cho thí nghiệm tiếp theo.

Hình 3.11. Thu nhận pel từ pJET/pel. Gen pel 1,5 kb đƣợc chỉ bằng

mũi tên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Tạo khuôn mẫu cho phản ứng nhân gen PCR

Để tạo gen dung hợp BaP-pel, trƣớc hết pKTH-BaP và pel đƣợc nối với

nhau bằng T4 ligase để tạo sợi khuôn cho phản ứng PCR. Thành phần phản ứng

nối đƣợc thực hiện nhƣ Bảng 2.3 trong phần phƣơng pháp. Phản ứng nối đƣợc

thực hiện ở 16 °C, qua đêm. Sau khi kết thúc phản ứng, sản phẩm gắn gen đƣợc

sử dụng để làm khuôn mẫu cho phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel.

Nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR

Phản ứng gắn BaP với pel ở trên có hai khả năng xảy ra: khả năng thứ

nhất là BaP nối với pel thuận chiều, tức là promoter BaP đƣợc nối trực tiếp với

đầu 5’ của gen pel. Khả năng thứ hai là BaP nối với pel ngƣợc chiều, tức là BaP

nối trực tiếp với đầu 3’của gen pel. Do mồi xuôi (mồi F) đƣợc thiết kế bám vào

vị trí đầu 5’ của promoter BaP còn mồi ngƣợc (mồi R) bám vào vị trí đầu 3’ của

pel (Hình 3.12) do đó khi làm phản ứng PCR thì chỉ BaP-pel đƣợc nối thuận

chiều mới đƣợc nhân lên. Gen dung hợp BaP-pel sẽ mang promoter BaP và

Primer F

Ter

pKTH

BaP

pel

Sản phẩm ligationnối thuận chiều

Primer R

PCR

XhoI

XbaI

pel

Ter

BaP

Gen dung hợp được nhân lên bằng cặp mồi

terminator của pel.

Hình 3.12. Sơ đồ nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. Vị trí bám

của mồi đƣợc chỉ bằng mũi tên ngang

Với mục đích thiết kế vector biểu hiện đa copy, chúng tôi thiết kế 1 cặp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

mồi nhân gen dung hợp BaP-pel để thiết kế vào pMSE3. Trình tự nucleotid của

mồi đƣợc chi tiết trong phần phƣơng pháp. Thành phần phản ứng PCR của thí

nghiệm đƣợc thể hiện trong Bảng 2.6.

Sau khi thực hiện phản ứng nhân gen bằng cặp mồi trên với khuôn mẫu là

sản phẩm gắn gen ở trên, sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trên điện di agarose

0,8%. Kết quả cho thấy đã nhân lên một đoạn gen khoảng 1,8 kb đúng bằng tổng

chiều dài của promoter BaP (0,384 kb) và gen pel (1,438 kb). Điều này chứng tỏ

promoter BaP đã đƣợc nối thuận chiều với gen pel và gen dung hợp BaP-pel đã

1 2 M

1,8 kb

đƣợc nhân lên bằng PCR (Hình 3.13).

nhân lên bằng cặp mồi 1 và cặp mồi 2, M : DNA marker 1 kb (EUR). Băng DNA 1,8 kb đƣợc

chỉ bằng mũi tên. Thang DNA chuẩn đƣợc đặt ở bên.

Hình 3.13. Nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. 1 và 2: BaP-pel đƣợc

3.3.1.3. Tạo vector đa copy pMSE/BaP-pel

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.14. Kiểm tra gen dung hợp BaP-pel trong pMSE/BaP-pel.

1 - 2: pMSE/BaP-pel đƣợc cắt bằng XhoI và XbaI., M : DNA marker 1 kb (EUR).

Băng DNA 5,6 kb và 1,8 kb đƣợc chỉ bằng mũi tên. Thang DNA chuẩn đƣợc đặt ở bên.

Để đƣa gen BaP-pel vào pMSE3, trƣớc hết pMSE3 và BaP-pel sau khi

nhân lên bằng PCR trong mục 3.2.3 đƣợc làm sạch bằng kit QIAGEN từ

agarose sau đó xử lý với XhoI và XbaI trƣớc khi nối bằng T4 ligase ở 16 ºC qua

đêm. Sản phẩm nối đƣợc biến nạp vào DH10b bằng phƣơng pháp xung điện.

Thể biến nạp đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng LB thạch đĩa bổ sung 50 µg/ml

kanamycin và 20 µg/ml streptomycin. Các thể biến nạp sinh trƣởng đƣợc trên

môi trƣờng chọn lọc đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng để tách chiết plasmid

và kiểm tra bằng enzyme giới hạn. Kết quả trên điện di agarose cho thấy các

plasmid sau khi cắt bằng XhoI và XbaI đều cho 1 băng vector kích thƣớc khoảng

5,6 kb và một băng kích thƣớc 1,8 kb (Hình 3.14). Điều này chứng tỏ gen BaP-

pel đã đƣợc đƣa thành công vào vector pMSE3. Plasmid pMSE3 mang gen BaP-

pel đƣợc đặt tên là pMSE/Bap-pel.

3.3.2. Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B. subtilis

3.3.2.1. Chuẩn bị plasmid đa copy pMSE/BaP-pel

Khác với biến nạp gen trong E. coli, biến nạp gen vào B. subtilis cần phải

có lƣợng plasmid đủ lớn (30-50 µg), nồng độ plasmid phải đủ cao (khoảng 2

µg/µl) thì mới có thể biến nạp thành công. Trong thí nghiệm này, plasmid

pMSE/Ba-pel đƣợc tách sạch từ E. coli bằng kit tách plasmid của Qiagen theo

hƣớng dẫn của hãng. Kết quả tách plasmid đƣợc đánh giá trên điện di agarose

cho băng vector (5,6 kb ) và băng gen dung hợp BaP-pel (1,8 kb) (Hình 3.14).

Điều này chứng tỏ plasmid pMSE/BaP-pel đƣợc tách sạch và đủ chất lƣợng để

cho thí nghiệm biến nạp gen.

3.3.2.2. Biến nạp gen pectinase vào B. Subtilis 168

Plasmid pMSE3/BaP-pel đƣợc biến nạp vào tế bào B. subtilis 168 theo

phƣơng pháp tế bào tƣơng hợp tự nhiên nhƣ mô tả trong phần phƣơng pháp.

Lƣợng plasmid sử dụng để biến nạp là 5 µg trong tổng thể tích 15 µl. Sau khi kết

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thúc biến nạp, các thể biến nạp đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng thạch đĩa bổ sung

20 µg/ml kanamycin. Các thể biến nạp sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng chọn

lọc đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng LB lỏng bổ sung kananmycin để kiểm tra sự

có mặt của plasmid trong tế bào. Các plasmid sau khi tách và phân tích bằng

XhoI và XbaI đƣợc kiểm tra trên điện di agarose. Kết quả cho thấy các plasmid

tách từ các thể biến nạp khác nhau đều xuất hiện băng vector (5,6 kb) và băng

gen dung hợp BaP-pel (1,8 kb) (Hình 3.15). Điều này chứng tỏ plasmid

pMSE3/BaP-pel đã đƣợc biến nạp vào B. subtilis 168. Chủng tái tổ hợp này

1 2 3

5,6 kb 1,8 kb

đƣợc đặt tên là BSM.

1 và 2: pMSE/BaP-pel đƣợc cắt bằng XhoI và XbaI., 3 : DNA marker 1 kb.

Băng vector (5,6 kb) và BaP-pel (1,8 kb) đƣợc chỉ bằng mũi tên.

Hình 3.15. Kiểm tra pMSE/BaP-pel trong tế bào B. subtilis 168 tái tổ hợp.

3.3.3. Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng

Để đánh giá sự biểu hiện pectinase trên môi trƣờng lỏng của chủng BSM,

4 thể biến nạp khác nhau đƣợc trẻ hóa trên môi trƣờng LB lỏng 20 µg/ml

kanamycin sau đó cấy chuyển sang môi trƣờng BMM (tỉ lệ 1%) để kiểm tra sự biểu hiện của gen tái tổ hợp. Sau 24 giờ nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, 37oC,

enzyme ngoại bào đƣợc thu nhận bằng li tâm loại bỏ sinh khối và kiểm tra

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

protein trên điện di SDS-PAGE cũng nhƣ khả năng phân hủy cơ chất pectin.

Hình 3.16. Điện di SDS-PAGE dịch enzyme ngoại bào của chủng B.

ngoại bào của các thể biến nạp khác nhau, 5: dịch lên men từ chủng B. subtilis 168.

subtilis tái tổ hợp đa copy trên môi trƣờng LB+Kan. 1-4: 15 µl dịch enzyme

Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy dịch enzyme của cả 4 thể biến nạp

đƣợc kiểm tra đều xuất hiện 1 băng protein khá đậm kích thƣớc 42 kDa đúng với

kích thƣớc của pectinase nhƣ tính toán. Mẫu đối chứng dịch enzyme từ chủng

BS168 chỉ xuất hiện băng mờ, điều này chứng tỏ băng protein 42 kDa chính là

pectinase tái tổ hợp đã đƣợc biểu hiện, mẫu 5 (dịch enzyme từ chủng B. subtilis

168 do pectinase đƣợc sinh ra tự nhiên nên nồng độ enzyme quá thấp cho nên

không thể phát hiện đƣợc trên điện di protein (Hình 3.16).

Kiểm tra hoạt tính pectinase của các mẫu này với cơ chất pectin cho thấy

hoạt tính pectinase của chủng đối chứng B. subtilis 168 chỉ đạt 15 U/ml trong

khi các mẫu từ chủng tái tổ hợp đạt từ 66 - 72 U/ml (cao hơn 4,6-4,8 lần so với

chủng B. subtilis 168) (Hình 3.17).

Hình 3.17. Kiểm tra sự biểu hiện pectinase của các thể biến nạp đa copy trong tế bào B. subtilis 168 sau 24 giờ nuôi cấy. BSM 1-5: các thể biến nạp đa copy, BS168: chủng B. subtilis 168 không đƣợc biến nạp gen. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hoạt tính pectinase của thể biến nạp cũng đƣợc kiểm tra trên đĩa thạch có

0,2% cơ chất pectin axit bằng phƣơng pháp đục lỗ. Sau khi nhỏ 30 µl dịch

enzyme ngoại bào vào lỗ thạch, mẫu đƣợc ủ 42 ºC qua đêm sau đó nhuộm với

ruthenium red 0,05%. Kết quả cho thấy đƣờng kính vòng hoạt tính mẫu tái tổ

hợp BSM tạo ra là 3 cm, lớn hơn nhiều mẫu đối chứng B. subtilis 168 không

mang gen (1,8 cm) (Hình 3.18).

Hình 3.18. Kiểm tra hoạt tính pectinase của thể biến nạp đa copy

BSM và chủng B. subtilis 168 trên cơ chất pectin axit. BSM: thể biến nạp đa

copy, BS168: chủng B. subtilis 168 không đƣợc biến nạp gen.

Nasser và cộng sự (1993) đã biểu hiện thành công gen pel của B. subtilis

trong tế bào E. coli với hệ biểu hiện T7 promoter, tuy nhiên sản phẩm biểu hiện

đã tạo ra một protein nguyên vẹn có kích thƣớc 42 kDa và một protein không

nguyên vẹn kích thƣớc 33 kDa [30]. Khác với Nasser, kết quả biểu hiện gen pel

trong B. subtilis của chúng tôi chỉ cho một băng protein 42 kDa, điều này chứng

tỏ gen pel đƣợc biểu hiện trong tế bào B. subtilis tốt hơn trong E. coli. Liu và

cộng sự (2011) đã biểu hiện thành công gen pectinase kiềm (Apel) từ B. subtilis

TCCC11286 trong tế bào B. subtilis WB600, kết quả biểu hiện cũng chỉ cho một

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

băng protein duy nhất 45 kDa [27] tƣơng tự nhƣ kết quả biểu hiện của chúng tôi.

3.4. So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase

sinh ra từ chủng tự nhiên

3.4.1. So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và

pectinase từ chủng tự nhiên

Để xác định nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng, dịch enzyme thu đƣợc sau lên

men chủng tái tổ hợp BSM và chủng tự nhiên VBS11 đƣợc ủ với 0,2% pectin

trong đệm Tris 50 mM, 20 mM NaCl, 0,2 mM CaCl2, pH 10 ở các nhiệt độ khác

nhau. Phản ứng enzyme đƣợc thực hiện nhƣ trong phần phƣơng pháp. Giá trị

OD 530 thu đƣợc sau khi đo trên máy quang phổ đƣợc chuyển đổi sang đơn vị

hoạt tính (Unit).

Hình 3.19. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzyme

Kết quả trên Hình 3.19 cho thấy nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng của rPel là 42oC, tƣơng tự nhƣ hoạt tính tối ƣu của chủng tự nhiên VBS11. Hoạt tính

enzyme có xu hƣớng giảm nhanh ở các nhiệt độ phản ứng cao hơn nhiệt độ tối

ƣu. Kết quả này giống với kết quả nghiên cứu trƣớc đây về nhiệt độ tối ƣu của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

enzyme pectinase từ B. subtilis của Nasser và cộng sự [31].

3.4.2. So sánh ảnh hưởng của pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và

pectinase từ chủng tự nhiên

Hình 3.20. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt tính enzyme

Tính chất xúc tác phản ứng phân cắt của enzyme đều phụ thuộc vào pH

của đệm phản ứng do đó cần thiết phải đánh giá sự ảnh hƣởng của pH để tìm ra

pH tối ƣu. Trong thí nghiệm này enzyme đƣợc thực hiện phản ứng với 0,2%

pectin trong đệm tris 50 mM, 10 mM NaCl, 0,2 mM CaCl2 ở các pH khác nhau.

Kết quả thí nghiệm cho thấy hoạt tính enzyme rPel đạt cao nhất ở pH10 (Hình

3.20). pH tối ƣu của rPel cũng tƣơng tự nhƣ pH tối ƣu của enzyme Pel từ chủng

gốc VBS11 đã đƣợc trình bày trong phần 3.1. Điều này chứng tỏ tính chất xúc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tác phản ứng của rPel không thay đổi so với enzyme từ chủng tự nhiên.

KẾ T LUẬN VÀ KIẾ N NGHI ̣

4.1. Kết luận

Đã sàng lọc đƣợc 4 chủng B. subtilis nguồn gốc Việt Nam sinh pectinase cao.

Giải mã đƣợc trình tự gen của 4 gen pectinase: pel6, pel8, pel11 và pel13.

Độ tƣơng đồng của 4 gen phân lập với các trình tự nucleotide với gen có độ

tƣơng đồng cao là từ 96,3, tới 99,5%. Độ tƣơng đồng aa với các trình tự aa của

Pel đã biết đạt 98,8 đến 99,7%.

Tạo đƣợc 01 chủng B. subtilis BSM tái tổ hợp đa copy sinh pectinase sản

lƣợng cao.

Nhiệt độ và pH tối ƣu của enzyme tái tổ hợp rPel là 42 oC, pH 10.

4.2. Kiến nghị

Với kết quả nghiên cứu bƣớc đầu của đề tài đã đạt đƣợc, đề tài cần tiếp

tục đƣợc nghiên cứu:

Nghiên cứu xử lý vải bông thô bằng rPel để loại pectin.

Nghiên cứu tối ƣu điều kiện lên men chủng sinh pectinase tái tổ hợp qui

mô pilot.

Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ xử lý sinh học (Bioscouring)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thay thế xút trong khâu nấu kiềm (alkaline scouring).

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dƣơng Văn Tuân, Lê Thị Hoàng Linh. 2012. 'Nghiên cứu sử dụng hệ enzyme pectinase, cellulase của vi khuẩn B.subtilis, P.lantarum và nấm mốc A.niger, Ph.chrysosporium để xử lý lớp nhớt của vỏ cà phê'. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012.

2. Huỳnh Ngọc Oanh, Trần Ngọc Hùng. 2008. 'Thu nhận enzyme pectinase từ Asp.niger - tinh sạch bằng phƣơng pháp lọc gel và lọc màng'. Science & Technology Development, Vol 11, No.08 - 2008.

3. Nguyễn Nhật Minh Phƣơng , Chế Văn Hoàng , Lý Nguyễn Bình và Châu Trần Diễm Ái. 2011. 'Tác động enzyme pectinase đến chất lƣợng rƣợu vang xoài sau thời gian lên men chính'. Tạp chí Khoa học 2011:20a 127-136.

4. Trƣờng, L. V., Thomas, S. (2010) 'Biểu hiện cao gen mã hóa xylanase trong Bacillus subtilis sử dụng promoter alpha-amylase từ Bacillus amyloliquefaciens', Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3A), pp. 827- 832.

5. Trƣờng, L. V., Việt, H., Hải, T.N. (1998) 'Tách dòng và biểu hiện cao của gen alpha- amylase từ Bacillus amyloliquefaciens trong Bacillus subtilis', Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 36 (2), pp. 12-18.

Tài liệu tiếng Việt

Tài liệu tiếng Anh

6. Albersheim, P. and Killias, U. (1962) 'Studies relating to the purification and

properties of pectin transeliminase', Arch Biochem Biophys, 97, pp. 107-15.

7. Angayarkanni, J., Palaniswamy, M., Murugesan, S. and Swaminathan, K. (2002) 'Improvement of tea leaves fermentation with Aspergillus spp. pectinase', J Biosci Bioeng, 94(4), pp. 299-303.

8. Anis, P. a. E., H. A. (2002) 'Comparison of alkaline scouring of cotton vs. alkaline

pectinase preparation', AATCC Review, 2(12), pp. 22-28.

9. Batra, S. K. (1985) in Lewin, M., and Pearce, E.M. (ed.) Handbook of Fiber Science

and Technology, pp. 727-807.

10. Bernfeld, P. (1955) 'Amylases a and b. In: Colowick SP, Kaplan NO (eds) ', Methods

in enzymeology. New York, pp. 149-155.

11. Bradford, M. M. (1976) 'A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding', Anal Biochem, 72, pp. 248-54.

12. Buchert, J., and Pere. J., (2000) 'Scouring of cotton with pectinases, proteases and lipases', Textile Chemist and Colorist & American Dyestuff Reporter, 31(5), pp. 48-52.

13. Burkholder, P. R. and Giles, N. H., Jr. (1947) 'Induced biochemical mutations in

Bacillus subtilis', Am J Bot, 34(6), pp. 345-8.

14. Cavaco-Paulo, A., Gübitz, G. M. (2003) 'Textile processing with enzyme

', Cambridge: Woodhead Publishing, pp. 17–18, 30–34, 51–52, 90–95, 110, 124–125, 129–131, 158–169.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

15. Etters, J. N., Husain, P. A, N.K. Lange (1999) 'Alkaline pectinase: an ecofriendly

approach to cotton preparation', Textile Asia, pp. 83-86.

16. Finkelman, M. J., J. E. Zajic (1978) 'Developments in Industrial', Microbiology, pp.

459.

17. Fu, L. L., Xu, Z.R., Li, W., Shuai, J. B., Lu, P., Hu, C. X (2007) 'Protein secretion pathways in Bacillus subtilis: imrpelication for optimization of heterologous protein secretion.', Biotechnol. Adv, 25, pp. 1-12.

18. Guo, W., González-Candelas, L., Kolattukudy, P.E. (1995) 'Cloning of a novel constitutively expressed pectinase gene pelB from Fusarium solani f. sp. pisi (Nectria haematococca, mating type VI) and characterization of the gene product expressed in Pichia pastoris', J Bacteriol, 177(24), pp. 7070-7.

19. Hartzell, M. M., Hsieh, Y. L. (1998) 'Enzymeatic scouring to improve cotton fabric

wettability', Text. Res. J., 68(4), pp. 233-41.

20. Kashyap, D. R., Vohra, P.K., Chopra, S., Tewari, R. (2001) 'Applications of pectinases in the commercial sector: a review', Bioresource Technology, 77, pp. 215- 227.

21. Keen, N. T. and S., T. (1986) 'Structure of two pectinase genes from Erwinia chrysanthemi EC1 and their high-level expression in Escherichia coli', J. Bacteriol.

22. Klug-Santner, B. G., Schnitzhofer, W., Vrsanská, M., Weber, J., Agrawal, P.B., Nierstrasz, V.A., Guebitz, G.M. (2006) 'Purification and characterization of a new bioscouring pectinase from Bacillus pumilus BK2', J Biotechnol, 121, pp. 390-401.

23. Kunst, F., et al. (1997) 'The complete genome sequence of the Gram-positive

bacterium Bacillus subtilis', Nature, 390, pp. 249-256.

24. Lei, S. P., Lin, H.C., Heffernan, L., Wilcox, G. (1985) 'Cloning of the pectinase genes from Erwinia carotovora and their expression in Escherichia coli', Gene, 35(1-2), pp. 63-70.

25. Laemmli U., K. 2009. “Clevage of structure proteins during the assembly of the head

of bacteriophage T4”. Nature 227 (5259): 680-685.

26. Li, Y. a. H., I. R. (1998) 'Enzymatic Scouring of Cotton - Surfactants, Agitation, and

Selection of Enzymes', Text. Chem. Col., 30(9), pp. 23-9.

27. Liu, Y., Chen, G., Wang, J., Hao, Y., Li, M., Li, Y., Hu, B., Lu, F. (2012) 'Efficient expression of an alkaline pectinase gene from Bacillus subtilis and the characterization of the recombinant protein', Biotechnol Lett., 34(1), pp. 109-15.

28. Macmillian, J. D., et al. (1966) Methods in enzymeology, pp. 632.

29. Morozova, V.V., Semenova, M.V., Salanovich, T.N., Okunev, O.N., Koshelev, A.V., Bubnova, T.V., Krichevskiĭ, G.E., Timatkov, A.G., Barysheva, N.V., Sinitsyn, A.P. (2006) 'Application of neutral-alkaline pectinase to cotton fabric boil off', Appl Biochem Microbiol, 42, pp. 603-8.

30. Nasser, W., Awadé, A.C., Reverchon, S., Robert-Baudouy, J. (1993) 'Pectinase from Bacillus subtilis: molecular characterization of the gene, and properties of the cloned enzyme', FEBS Lett, 335(3), pp. 319-26.

31. Nasser, W., Chalet, F., Robert-Baudouy J. (1990) 'Purification and characterization of

extracellular pectinase from Bacillus subtilis', Biochimie, 72, pp. 689-695.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

32. Pickersgill, R., Jenkins, J., Harris, G., Nasser, W., Robert-Baudouy, J. (1994) 'The structure of Bacillus subtilis pectinase in complex with calcium', Nature, 1(10), pp. 717 – 723.

33. Reid, I., Ricard, M. (2000) 'Pectinase in papermaking: solving retention problems in mechanical pulps bleached with hydrogen peroxide', Enzyme Microb Technol, 26, pp. 115-23.

34. Reid, I., Ricard, M. (2004) 'Purified pectinase lowers cationic demand in peroxide-

bleached mechanical pulp', Enzyme Microb Technol, 34, pp. 499-504.

35. Ricca, E., Adriano, O., Henriques and Simon M. Cutting (2004) 'Bacterial Spore

Formers: Probiotics and Emerging Applications', Horizon Bioscience Press.

36. Schaechter, M., Ingraham, J.L., Neidhardt, F.C. (2007) 'The road from The Microbial

world to Microbe', Int Microbiol, 10(3), pp. 153-6.

37. Schallmey, M., Singh, A., and Ward, O. P. (2004) 'Developments in the use of

Bacillus species for industrial production', Can. J. Microbiol, 50, pp. 1-17.

38. Schols, H. A., M. A. Posthumus, Voragen, A.G.J.. (1990) 'Structural features of hairy region of pectin isolated from apple juice producted by the liquefation process', Carbohydrate Research, 206(1), pp. 117-129.

39. Seagull, R. W., Oliveri, V., Murphy, K., Binder, A., and Kothari, S. (2000) 'Cotton ﬁber growth and development 2. Changes in cell diameter and wall birefringence ', J. Cotton Sci 4, pp. 97-104.

40. Searle-van Leeuwen, M. J. F., Vincken, J.P., Schipper, D., Voragen, A.G.J., Beldman, G., Voragen, J.V.a.A.G.J. (1996) 'Acetyl esterases of Aspergillus niger: purification and mode of action on pectins', Prog. Biotechnol., pp. 793–798.

41. Shevchik, V. E., J. Robert-Baudouy, Hugouvieux-Cotte-Pattat N. (1997) 'Pectinase PelI of Erwinia chrysanthemi 3937 belongs to a new family', J. Bacteriol 179, pp. 7321-7330.

42. Somogyi, M. (1952) Journal of Biological Chemistry, 195, pp. 19.

43. Sonenshein A.L., H. J., Richard Losick (2002) 'Bacillus subtilis and its closest

Relatives: From Genes to Cells', ASM Press.

44. Soriano, M., Diaz, P., Pastor, F.I.J. (2006) 'Pectinolytic systems of two aerobic sporogenous bacterial strains with high activity on pectin', Curr Microbiol, 50, pp. 114-8.

45. Traore, M. K., Buschle-Diller, G. (2000) 'Environmentally Friendly Scouring

Processes', TCC&ADR, 32(12), pp. 40-43.

46. Truong, L. V., Tuyen, H., Helmke, E., Binh, L.T., Schweder, T. (2001) 'Cloning of two pectinase genes from the marine Antarctic bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis strain ANT/505 and characterization of the enzymes', Extremophiles, 5(1), pp. 35-44.

47. Vigneswaran, M. A., N. Anbumani (2012) 'Neural Network Approach for Optimizing the Bioscouring Performance of Organic Cotton Fabric through Aerodynamic System', Journal of Textile and Apparel technology and Management, 7(3 ).

48. Waddell, R. B. (2002) 'Bioscouring of cotton: commercial applications of alkaline

stable pectinase', AATCC Review 2, pp. 28-30.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

49. Wang, L. F., and Doi, R.H. (1989) 'Heterologous gene expression in Bacillus subtilis', in Butterworth-Heinemann, R.H.D.a.M.M. (ed.) Biology of bacilli: applications to industry. Boston: Mass, pp. 63–104.

50. Whitaker, J. R. (1990) 'Microbial pectolytic enzymes', in William, M.F.a.G., T. Kelly

(ed.) Microbial enzymes and biotechnology. 2 ed.

51. Wipat, A., Harwood, C. R. (1999) 'The Bacillus subtilis genome sequence: the molecular blueprint of a soil bacterium', FEMS Microbiology Ecology 28 (1 ), pp. 1-9.

52. Zhang, C., Yao, J., Zhou, C., Mao, L., Zhang, G., Ma, Y. (2013) 'The alkaline pectinase PEL168 of Bacillus subtilis heterologously expressed in Pichia pastoris is more stable and efficient for degumming ramie fiber', BMC Biotechnology.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong Bacillus subtilis ứng dụng trong công nghiệp xử lý vải bông

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ TRỌNG TÀI

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CAO GEN MÃ HÓA PECTINASE TRONG Bacillus subtilis NHẰM Ƣ́ NG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP XƢ̉ LÝ VẢ I BÔNG

Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN TRƢỜNG

Hà Nội - 2015

DANH MỤC TƢ̀ VIẾ T TẮ T

EC No. Cơ chất

Sản phẩm

chế

Cơ xúc tác Thuỷ phân Chƣa xác định Thuỷ phân Thuỷ phân Thuỷ phân Thuỷ phân Thuỷ phân Thuỷ phân Chuyển liên kết Chuyển liên kết Chuyển liên kết Chuyển liên kết

Hình 1.3. Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase

Dung dịch

Nồng độ (M) Lƣợng dịch cần (ml) PP khử trùng

STT

Tên chủng

Nguồn gốc Vòng

thủy

Tên chủng gốc BIOLAB 1 BIOLAB 2 BIOLAB 3 BIOLAB 4 BIOLAB 5 VTCC-B-380 VTCC-B-1010 VTCC-B-818 VTCC-B-999 VTCC-B-1013 VTCC-B-485 VTCC-B-732 VTCC-B-948 VTCC-B-822 VTCC-B-275 BIOLAB 6 BIOLAB 7 BIOLAB 8 BIOLAB 9 BIOLAB 10

phân pectin - + + + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ - ++ ++ ++ + - + + +

STT

Tên chủng pH tối ƣu Hoạt tính pectinae

(U/ml) 24,7 22,3 36,5 22,5 25,5 38,9 30,1 20,1 17,5

a

b

c

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tên chủng VBS6 VBS7 VBS8 VBS9 VBS10 VBS11 VBS13 VBS14 VBS15 ĐC âm

OD 232 nm 0,514 0,322 0,710 0,296 0,412 0,670 0,503 0,24 0,411 0,005

Tài liệu tiếng Anh

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok