ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
PHẠM HẢI YẾN
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmCHI VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT51
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
THÁI NGUYÊN – 2018
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
PHẠM HẢI YẾN
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmCHI VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT51
Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số : 8 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu
THÁI NGUYÊN – 2018
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan nội dung trình bày trong luận văn là kết quả nghiên
cứu của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Các số
liệu, kết quả sử dụng trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán
bộ hướng dẫn và nhóm nghiên cứu.
Tác giả luận văn
i
Phạm Hải Yến
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu, người
thầy đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất
giúp tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ này.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ của Đề tài cấp Bộ Giáo dục &
Đào tạo “Nghiên cứu nâng cao hàm lượng isoflavone trong cây đậu tương
bằng công nghệ gen”, mã số B2016-TNA-18 do TS Hoàng Phú Hiệp làm
chủ nhiệm.
Tôi xin cảm ơn cô Trần Thị Hồng, nghiên cứu sinh Lê Thị Hồng Trang
cùng toàn thể các thầy cô và cán bộ Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục
sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã
tạo điều kiện và giúp đã tôi trong quá trình nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động
viên, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành bài luận văn này.
Tác giả luận văn
ii
Phạm Hải Yến
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan…………………………………………………………. i
Lời cảm ơn…………………………………………………………… ii
Mục lục………………………………………………………………. iii
Danh mục bảng………………………………………………….......... iv
Danh mục hình………………………………………………………. v
Danh mục chữ viết tắt………………………………………………... vi
Mở đầu ………………………………………………………………. 1
1. Đặt vấn đề ……………………………………………………........ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ………………………………………………. 2
3. Nội dung nghiên cứu…………………………………………......... 2
Chương 1. Tổng quan tài liệu……………………………………… 3
1.1. Cây đậu tương…………………………………………………… 3
1.1.1. Đặc điểm hình thái cây đậu tương……………………….......... 3
1.1.2. Vai trò của đậu tương……………………………………......... 4
1.2. Isoflavone và enzyme chìa khóa trong quá trình sinh tổng hợp 6 isoflavone..…………………………………………………................
1.2.1. Isoflavone...……………………………………………………. 6
1.2.2. Con đường sinh tổng hợp isoflavone ở đậu tương…….............. 9
1.2.3. Enzyme chalcone isomerase (CHI) và gen GmCHI……............. 10
iii
1.3. Chuyển gen ở đậu tương nhờ Agrobacterium………….………… 13
1.3.1. Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương........................... 13
1.3.2. Nghiên cứu biểu hiện gen CHI……….......……………………. 17
Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.............................. 19
2.1. Vật liệu nghiên cứu……………………………………………… 19
2.2. Hóa chất và thiết bị……………………………………………… 21
2.3. Phương pháp nghiên cứu………………………………………… 21
2.3.1. Phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen………………….. 21
2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử…………………………............ 24
2.4. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận văn……………............ 27
Chương 3. Kết quả và thảo luận………………………………......... 28
3.1. Chuyển cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc vào giống đậu tương ĐT51 28 nhờ A.tumefaciens……………………………………….....................
3.1.1. Kết quả khử trùng hạt………………………………….............. 28
3.1.2. Kết quả tạo nguyên liệu biến nạp……………………………… 29
3.1.3. Kết quả lây nhiễm và tái sinh cây đậu tương …………………. 30
3.2. Phân tích sự có mặt của gen chuyển GmCHI trong đậu tương 35 chuyển gen thế hệ T0…………………………………………………
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số………………………………. 35
3.2.2.Kết quả phân tích khuếch đại gen chuyển GmCHI…………….. 36
3.3. Thảo luận kết quả nghiên cứu…………………………………… 38
Kết luận và đề nghị………………………………………………….. 42
iv
1. Kết luận……………………………………………………………. 42
2. Đề nghị…………………………………………………………….. 42
Công trình công bố liên quan đến luận văn…………………………... 43
Tài liệu tham khảo……………………………………………............. 44
Phụ lục 1………………………………………………………........... 50
v
Phụ lục 2………………………………………………………............ 51
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần đệm tách DNA tổng số................................. 24
Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của các cặp mồi GmCHI-coI- 25
F/GmCHI-cmyc-SacI-R....................................................................
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR nhân bản đoạn GmCHI- 26
cmyc-KDEL………….…………………………………………….
Bảng 2.4. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR……………………….. 26
Bảng 3.1. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI nhờ vi
iv
khuẩn A.tumefaciens qua nách lá mầm hạt chín…………………... 34
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử isoflavone...………………………….. 7
Hình 1.1. Chu trình chuyển hóa isoflavone..…………………....... 11
Hình 2.1. Giống đậu tương ĐT51………………………………… 19
Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc 35S-GmCHi-cmyc trong vector chuyển
gen pCB301_GmCHI trong vi khuẩn A.tumefaciens…………….. 20
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào cây đậu tương qua
nách lá mầm………………………………………………............. 23
Hình 3.1. Khử trùng hạt bằng khí clo trong bình thủy tinh kín 29
Hình 3.2. Hình ảnh hạt đậu tương và hạt nảy mầm trong giai đoạn
chuẩn bị nguyên liệu cho biến nạp……………………………….. 30
Hình 3.3. Hình ảnh của đậu tương trong giai đoạn gây tổn thương
nách lá mầm và biến nạp………………………………………….. 31
Hình 3.4. Hình ảnh của đậu tương chuyển gen trong giai đoạn tạo
chồi và kéo dài chồi………………………………………............. 32
Hình 3.5. Hình ảnh của đậu tương chuyển gen trong giai đoạn ra
rễ và trồng cây đậu tương chuyển gen trên giá thể ………............. 33
Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số tách
từ lá các cây đậu tương chuyển gen và cây không chuyển
gen.................................................................................................... 36
Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại
đoạn gen GmCHI-cmyc-KDEL từ các cây đậu tương chuyển gen
và cây không chuyển gen với cặp mồi GmCHI-NcoI-F/GmCHI-
v
cmyc- SacI-R………………………………………........................ 37
DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Glycine max chalcone isomerase GmCHI
Chalcone isomerse CHI
Polymerase Chain Reaction PCR
A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
HPLC High-performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng áp suất cao)
ER Estrogens receptor (thụ thể estrogens)
Chalcone reductase CHR
Chalcone synthease CHS
Isoflavones synthease IFS
Phenylalanine amoni-lyase PAL
Deoxyribonucleotide acid DNA
Complementary deoxyribonucleotide acid cDNA
6-Benzylaminopurine BAP
Gibberillic acid GA3
Indole-3-acetic acid IAA
vi
Deoxynucleotide triphosphate DNTPs
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill] thuộc họ Đậu (Fabaceae) là loại
cây trồng quan trọng, đứng thứ sáu về sản lượng hạt có dầu được sản xuất
rộng rãi, được trồng ở nhiều vùng khí hậu khác nhau trên thế giới [45]. Đậu
tương có hàm lượng dinh dưỡng cao hơn hẳn so với các thực phẩm khác. Hạt
đậu tương có hàm lượng protein là 40% khối lượng khô, lipid 12-25%, glucid
0-15% và nhiều hợp chất hữu cơ khác. Theo Cục Quản lý Thực Phẩm và
Dược phẩm và Tổ chức Y thế giới đánh giá về chất lượng protein cho trẻ em
và người lớn thì protein đậu tương có chất lượng cao nhất, chứa nhiều amino
acid cần thiết cho người mà cơ thể không tổng hợp ra được, như metionin,
tryptophan, lysine, isoleucine, leucine, phenylalanine, valine Đặc biệt, trong
mầm đậu tương có một chất tương tự như kích thích tố nữ estrogen, đó là
isoflavone. Chất này có công thức hoá học gần giống như kích thích tố nữ
estrogen. Vì thế, nó được mệnh danh là estrogen thực vật (phyto - estrogen)
và có vai trò quan trọng đối với sức khoẻ phụ nữ, bảo vệ phụ nữ trước một số
căn bệnh như: tim mạch, rối loạn tiền mãn kinh, ung thư và loãng xương [46].
Isoflavone là một nhóm các chất chuyển hóa thứ cấp chủ yếu có ở loại
cây họ Đậu và đặc biệt có nhiều trong mầm đậu tương. Tuy nhiên, hàm lượng
isoflavone trong hạt đậu tương thấp, trong khoảng từ 50 – 3000 µg/g và tồn
tại ở hai dạng chính là glycoside và aglucone. Dạng glycoside có trọng lượng
phân tử lớn, chiếm tới trên 90% isoflavone tổng số và được cho là có sự hấp
thụ hạn chế trong hệ tiêu hóa người, trong khi đó, dạng aglucone được hấp thụ
nhanh hơn, nhưng hàm lượng lại rất thấp, chỉ chiếm từ 1% – 5% isoflavone
1
tổng số [16]. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tăng hàm lượng isoflavone dạng
aglucone trong hạt đậu tương. Chính vì vậy hướng tiếp cận nghiên cứu nâng
cao hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương bằng công nghệ gen đang được
quan tâm ứng dụng.
Isoflavone được tổng hợp thông qua con đường phenylpropanoid từ hợp
chất flavonoid trong thực vật bậc cao. Quá trình chuyển hóa tổng hợp
isoflavone là một chuỗi các phản ứng với sự tham gia của nhiều enzyme,
trong đó có hai enzyme chìa khóa là isoflavone synthease (IFS) và chalcone
isomerase (CHI). CHI xúc tác chuyển hóa chalcone thành flavanone và từ
flavanone tạo thành isoflavone với sự tham gia của enzyme IFS. Như vậy,
nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzym chìa khóa trong quá trình
sinh tổng hợp isoflavone ở cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen là một
biện pháp công nghệ có hiệu quả nâng cao hàm lượng isoflavone trong hạt
đậu tương. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành
đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen GmCHI vào giống đậu tương ĐT51”
2. Mục tiêu nghiên cứu
Chuyển được cấu trúc mang gen GmCHI vào giống đậu tương ĐT51
phục vụ tạo dòng đậu tương chuyển gen có hàm lượng isoflavone cao.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI qua nách lá mầm đậu
tương nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và tạo cây đậu tương
chuyển gen.
3.2. Phân tích cây đậu tương chuyển gen thông qua xác định sự có mặt của
2
gen chuyển GmCHI bằng kỹ thuật PCR.
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG
1.1.1. Đặc diểm hình thái cây đậu tương
Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc chi Glycine, họ Đậu
(Fabaceae) có bộ nhiễm sắc thể là 2n = 40. Đậu tương là một trong những loại
cây trồng mà loài người đã biết sử dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn
gốc của cây đậu tương cũng sớm được xác minh. Đậu tương có nguồn gốc
được thuần hóa ở Trung Quốc [8].
Cây đậu tương có rễ cọc gồm một rễ chính và nhiều rễ phụ, rễ chính ăn
sâu trong lòng đất 30 – 50 cm, các rễ phụ có thế phát triển lan rộng 30 – 40
cm2. Trên rễ của đậu tương có nhiều nốt sần là do các vi khuẩn Rhizobium
Japonicum cộng sinh với rễ đậu tương. Trong một nốt sần có khoảng 3 – 4 tỷ
vi sinh vật cố định đạm.
Đậu tương là một loài cây thân thảo, cây trồng ngắn ngày. Thân thường
dài từ 14 – 15 lóng, mỗi lóng có chiều dài khoảng 3 – 10 cm, cây cao khoảng
0,3 - 1,0 m. Toàn thân bao phủ bởi một lớp lông tơ ngắn, mọc dày bao phủ từ
gốc lên đến ngọn và cả cuống lá. Những giống có mật độ lông to dày, màu
sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn, chịu rét khỏe. Ngược lại, những giống
không có lông tơ thường sinh trưởng không bình thường, sức chống chịu kém.
Thân cây có lông dài ngắn, dày thưa, nhiều ít là đặc điểm để phân biệt các
giống đậu tương với nhau. Thân cây thường có màu xanh hoặc tím khi còn
non, về già thì có màu nâu nhạt. Nếu thân non màu xanh thì hoa màu trắng
còn thân non màu tím thì hoa có màu tím đỏ.
3
Lá đậu tương có 3 loại lá mọc ra tùy theo giai đoạn sinh trưởng, đó là:
lá mầm, lá nguyên và lá kép. Lá thường mọc so le, có màu xanh tươi khi già
thì chuyển thành màu vàng nâu. Lá kép thường có 3 lá chét với hình dạng
khác nhau tùy loài, thường có nhiều lông tơ.
Hoa nhỏ, không mùi, thuộc loại cánh bướm. Màu sắc hoa thay đổi tùy
theo giống và thường có màu tím, tím nhạt hoặc trắng. Hoa phát sinh ở nách
lá, đầu cành và đầu thân. Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có 1 - 10 hoa
và thường có 3 - 5 hoa.
Quả đậu tương hơi cong, có chiều dài từ 2 - 7 cm, chứa 2 - 5 hạt, màu
sắc biến động từ vàng trắng tới vàng sẫm, nâu hoặc đen.
Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: tròn, bầu dục, dẹt,... Hạt to nhỏ khác
nhau tùy loài, trung bình có khối lượng 100 - 200 g [9].
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng của hạt đậu tương
Hạt đậu tương chứa 8% nước, 5% chất vô cơ, 15 - 25% glucose, 15-
20% chất béo, 35- 45% chất đạm với đủ các loại amino acid cần thiết và nhiều
khoáng chất. So với thịt động vật, đậu tương có nhiều chất dinh dưỡng hơn:
100 gr đậu tương có 411 calo; 34 gr đạm; 18 gr béo; 165mg calcium; 11mg
sắt; trong khi đó thịt bò loại ngon chỉ có 165 calo, 21gr đạm; 9gr béo; 10mg
calcium và 2,7 mg sắt. Vì có nhiều đạm nên đậu tương đã được coi như “thịt
không xương” ở nhiều quốc gia châu Á. Tại Nhật Bản, Trung Quốc 60% hàm
lượng đạm tiêu thụ hàng ngày đều do đậu tương cung cấp. Đạm này rất tốt để
thay thế cho thịt động vật vì có ít mỡ và cholesterol. Đậu tương có nhiều đạm
hơn thịt, nhiều calcium hơn sữa bò, nhiều lecithin hơn trứng. Các amino acid
cần thiết mà cơ thể không tạo ra được thì đều có trong đậu tương. Khi đậu
tương ăn chung với một số ngũ cốc như ngô thì đạu tương sẽ bổ sung một số
4
amino acid mà ngô không có. Với trẻ em, chất đạm của đậu tương là món ăn
quý giá cho các em bị dị ứng với sữa bò hoặc không tiêu thụ được đường
lactose.
Hàm lượng protein tổng số dao động trong hạt đậu tương từ 29,6 -
50,5%, trung bình là 36 - 40%. Các nhóm protein đơn giản (% so với tổng số
protein): albumin (6 - 8%), globulin (25 - 34%), glutelin(13 - 14%), prolamin
chiếm lượng nhỏ không đáng kể. Protein đậu tương dễ tan trong nước và chứa
nhiều amino acid không thay thế đáp ứng nhu cầu của người và động vật, như
valine, leucine, isoleucine, methionine, tryptophan, threonine, lysine,
phenylalanine.
Đậu tương được chế biến thành nhiều món ăn như đậu phụ, đậu phù
chúc, sữa đậu nành, tào phớ, tương,... Bên cạnh vai trò là một loại cây thực
phẩm, đậu tương cũng có tác dụng chữa bệnh tim mạch và ung thư. Theo các
nghiên cứu từ trước tới nay, việc sử dụng đậu tương có thể làm giảm lượng
cholesterol trong máu 10 - 15%. Lượng cholesterol càng cao thì hiệu quả sử
dụng đậu tương càng rõ. Kể cả khi bệnh nhân đã ăn chế độ ít béo, ít
cholesterol, nếu ăn thêm đậu tương vẫn có tác dụng hạ thấp hơn nữa lượng
cholesterol trong máu. Do vậy, ăn đậu tương được nhiều bác sĩ coi là cách
chữa bệnh vừa hiệu quả, lại ít tốn kém và không độc. Cholesterol chỉ gây tác
hại cho mạch máu nếu bị oxy hóa. Đậu tương không những làm giảm
cholesterol mà còn ức chế khả năng oxy hóa của chất này. Các nhà nghiên
cứu Nhật Bản cho biết, đạm đậu tương hoạt động như một chất chống oxy hóa
mạnh. Ngoài ra, nó còn có khả năng ức chế sự kết hợp cholesterol thành các
tổ chức clot - bước quan trọng dẫn đến rối loạn hoạt động của tim, tạo nên các
cơn đau tim.
Năm 1990, Viện ung thư Quốc gia Mỹ đã xem xét vai trò của đậu tương
5
trong phòng bệnh ung thư và xác định ở đậu tương có năm nhóm chất chống
ung thư. Trong đó, người ta đặc biệt chú ý đến tác dụng chống ung thư của
isoflavone, một nhóm hóa chất gần như không tồn tại trong các thực phẩm
khác ngoài đỗ tương. Tác dụng chống ung thư của đậu tương được giải thích
là do isoflavone của nó đã tác động như một anti-oestrogen, làm vô hiệu hóa
tác động của oestrogen, giống như thuốc Tamoxifen đang được dùng rộng rãi
và có kết quả trong điều trị ung thư vú [49].
Một trong các isoflavone của đậu tương được nghiên cứu nhiều nhất
trong 7 - 8 năm qua là genistein. Các công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng
genistein có khả năng ngăn chặn sự phát triển của khối u. Bên cạnh việc
ngăn cản sự hình thành các mạch máu mới (một điều kiện tiên quyết để khối
u phát triển), genistein còn ức chế các enzyme trong các loại tế bào ung thư,
và do đó, nó được coi là chất có khả năng phòng chống nhiều thể ung thư
khác nhau [49].
1.2. ISOLAVONE VÀ ENZYME CHÌA KHÓA TRONG QUÁ TRÌNH SINH
TỔNG HỢP ISOFLAVONE
1.2.1. Isoflavone
Đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương đã được quan tâm nhiều hơn
trong những năm gần đây, vì đậu tương có vai trò quan trọng đối với sức khỏe
con người. Đậu tương chứa daidzein, genistein, glycitein cùng với dạng
glycosid của chúng, acetyl tương ứng và dẫn xuất malonyl [21]. Vai trò trên
chủ yếu là do một hợp chất trong đậu tương, đó là isoflavone.
Isoflavone là các polyphenol không màu thuộc lớp flavonoid. Trong khi
phần lớn flavonoid có vòng B gắn vào vị trí 2 của vòng tròn C, isoflavone có
vòng B gắn vào vị trí số 3 của vòng C (Hình 1.1). Ngay cả khi chúng không
phải là steroid, chúng có cấu trúc tương đồng với estrogen, đặc biệt là
6
estradiol. Điều này mang lại cho chúng tính chất giả hình, chẳng hạn như khả
năng gắn kết thụ thể estrogen; do đó, chúng được phân loại
như phytoestrogens hoặc estrogen thực vật.
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử isoflavone
(Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Isoflavone)
Isoflavone là các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học tích tụ trong
đậu tương trong quá trình phát triển. Hàm lượng isoflavone có trong hạt đậu
tương là thay đổi, phụ thuộc vào yếu tố di truyền và tác động của môi
trường. Các thí nghiệm được tiến hành để xác định liệu isoflavone được tổng
hợp trong các mô hạt trong quá trình phát triển hay ở các cơ quan của thực
vật và được vận chuyển đến các hạt nơi chúng tích lũy. Phân tích sắc kí khối
phổ (HPLC) phát hiện ra các hợp chất này có trong tất cả các cơ quan của
đậu tương, nhưng hàm lượng isoflavone khác nhau tùy thuộc loại mô và giai
đoạn phát triển. Nồng độ lớn nhất là tìm thấy trong hạt nảy mầm và lá đậu
tương [15].
Isoflavone là một lớp chất của isoflavonoid, hoạt động như kích tố nữ ở
động vật có vú. Isoflavone chủ yếu được tổng hợp trong các cây họ đậu. Các
chất isoflavone hoạt động như phytoestrogens để kích hoạt động giả bằng
7
cách gắn kết các thụ thể estrogens (ER) ở động vật có vú [11], [36].
Các dẫn xuất chính của isoflavone là daidzein, genistein và glycitein
[42]. Các chất này chỉ khác nhau về nguyên tử hydro và các nhóm hydroxyl,
ví dụ như, genistein và daidzein là hai dạng chính trong họ isoflavone,
genistein chỉ khác daidzein ở nhóm hydroxyl liên kết với carbon số 5 [44].
Daidzein và genistein là những chất isoflavone phổ biến nhất, có cấu trúc hóa
học đặc trưng [20].
Isoflavone được coi là chất chống oxy hóa, chống ung thư, kháng khuẩn
và có cả hoạt động chống viêm giống như các flavonoid khác. Isoflavone gợi
lên một hiệu ứng estrogens yếu (agonistic) hoặc chống estrogens (đối kháng),
tùy thuộc vào mức độ estrogens nội sinh và ER [23]. Isoflavone ngăn chặn sự
liên kết của các estrogens mạnh hơn, có vai trò trong việc phòng ngừa ung thư
vú, ung thư cổ tử cung, tuyến tiền liệt hoặc ung thư tinh hoàn [33].
Khi lượng estrogen giảm trong thời kỳ mãn kinh, nhiều phụ nữ sử
dụng liệu pháp hormone. Liệu pháp hormone có thể giúp làm giảm triệu
chứng mãn kinh nhưng nó cũng gây một số rủi ro. Liệu pháp hormone có thể
làm tăng nguy cơ đau tim, đột quỵ, ung thư vú và mất trí nhớ. Isoflavone thì
lại không gây những rủi ro này. Nghiên cứu cho thấy isoflavone làm giảm
nguy cơ u xơ tử cung và nội mạc tử cung. Tỷ lệ người ung thư vú và tuyến
tiền liệt ở người châu Á thấp hơn người ở phương Tây, điều này có thể liên
quan đến mức độ tiêu thụ đáng kể isoflavone khác nhau trong chế độ ăn của
người châu Á (15 – 4mg/ngày) [27] so với chế độ ăn của người phương Tây
(0,15 – 1,7mg/ngày) [29].
Isoflavone có khả năng trung hòa các gốc tự do, trong số các isoflavone,
genistein có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất [47]. Trong những thập kỷ gần
đây, các nghiên cứu dịch tễ học mở rộng, cùng với các thí nghiệm in vivo, in
8
vitro đã chỉ ra rằng isoflavone có lợi cho bệnh nhân bị các bệnh tim mạch, ung
thư, loãng xương và mãn kinh [13], [30]. Isoflavone đã được chứng minh thông
qua các thử nghiệm lâm sàng với vai trò làm giảm nguy cơ tăng cholesteron
máu, bệnh tim mạch và ung thư [14]. Isoflavone có tầm quan trọng đối với các
tương tác giữa thực vật và môi trường như: các chất ức chế nhiễm trùng gây
bệnh (phytoalexins) và tín hiệu các phân tử để cộng sinh với vi khuẩn cố định
đạm [14].
1.2.2. Con đường sinh tổng hợp isoflavone ở đậu tương
Con đường phenylpropanoid tạo ra một loạt các sản phẩm khác nhau có
nguồn gốc tự nhiên của thực vật. Một nhánh của con đường này là nhánh
flavonoids phổ biến hầu hết ở các loài thực vật, một nhánh khác của con
đường phenylpropanoid mà hầu như chỉ họ Đậu (Fabaceae) mới có, hình
thành nên isoflavonoid [14].
Trong đậu tương, isoflavone gồm daidzein, genistein và glycitein được
dự trữ trong không bào [38]. Genistein, daidzein và glycitein được tổng hợp
bởi một nhánh của con đường phenylpropanoid. Trong con đường trao đổi
chất này cũng có sự tổng hợp các hợp chất thực vật quan trọng khác như
tannin, linhin, lignans, anthocyanins, flavone, flavonol, phytoalexin,
glyceollin và pterocarpan có hoạt động kháng khuẩn [16],[18].
Con đường phenylpropanoid có nhiều nhánh với chất xuất phát ban đầu
là phenylalanine, kết quả tạo thành các chất như: glycitein, genistein, flavone,
glyceollin, anthocyanin và tanin đặc (còn được gọi là proanthocyanidin) dưới
tác dụng của hàng loại các enzyme chuyển hóa [17], [39], [40].
Một enzyme quan trọng khác trong con đường tổng hợp isoflavone là
chalcone isomerase (CHI) chuyển đổi chalcone thành flavanone, và chalcone
reductase (CHR), hình thành nên daidzein và glycitein. Các chalcone được
9
tổng hợp bởi CHS được chuyển đổi sang các naringenin flavone (5,7,4’-
trihydroxyflavone) bởi enzyme chalcone isomerase (CHI) [40].
Con đường phenylpropanoid bắt đầu với cơ chất đầu tiên là amino acid L
– phenylalanine (Hình 2.1). Phản ứng đầu tiên của con đường này là khử
nhóm amino (-NH3) của amino acid phenylalanine tạo thành acid cinnamic
bởi phenylalanine amoni-lyase (PAL). Con đường này tiếp diễn thêm hai phản
ứng khác nữa dẫn đến hình thành coumaroyl – CoA. Hợp chất này được biến
đổi thành hai dạng naringenin chalcone hoặc isoliquiritigenin bởi hai enzyme
tương ứng là chalcone synthease (CHS) và reductase chalcone (CHR). Sau đó
từ hai chất trên, naringenin và liquiritigenin được tạo thành nhờ sự xúc tác của
các enzyme chalcone isomerase (CHI).
Naringenin được sử dụng để tổng hợp flavonoid như flavones, flavonols,
tanin cô đặc và anthcyanins, cũng như isoflavone, genistein. Liquiritigenin
trong con đường dẫn chất isoflavonoid của cây họ Đậu (Fabaceae) và được
chuyển đổi thành glycitein và daidzein, tiền thân caue glyceollins, một nhóm
phytoalexins quan trọng [14].
Sự tổng hợp daidzein và genistein từ liquiritigenin và naringenin là hoàn
toàn được xúc tác bởi enzyme isoflavone synthease (IFS) và hydroxyl-
hydroxan dehydratase. Tổng hợp glycitein vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhưng
theo giả thuyết có thể có nguồn gốc từ isoliquiritigenin [18].
1.2.3. Enzyme chalcone isomerase (CHI) và gen GmCHI
Con đường phenylpropanoid với sự tham gia của hàng loạt các enzyme
chia thành hai nhánh tổng hợp, trong đó enzyme then chốt của một nhánh –
chalcone isomerase, xúc tác các phản ứng flavone, là xương sống cho nhiều
chất chuyển hóa như flavonoid và isoflavonoid. Trong con đường tổng hợp
này, phenylalanine thông qua sự xúc tác của nhiều loại enzyme để biến đổi
10
thành naringenin chalcone. Bắt đầu từ hợp chất này, con đường
phenylpropanoid được chia thành hai nhánh. Trong cả hai nhánh, enzyme
chalcone isomerase đều đóng vai trò “chìa khóa”. Nếu vì một lý do nào đó,
gen CHI không hoạt động thì enzyme chalcone isomerase không được tổng
hợp, dẫn theo hàng loạt các dẫn xuất của isoflavone không đươc tạo thành,
con đường phenylpropanoid bị dừng lại.
11
Hình 1.2. Chu trình chuyển hóa isoflavone [18]
Chalcone isomerase (CHI) là enzyme chìa khóa xúc tác các phản ứng sản
sinh ra flavonoid, là khung xương để chuyển hóa thành các chất như flavones
và isoflavone [20]. Flavonoid là một loại chất có nhiều trong thực vật, là một
loại chất chuyển hóa thứ cấp trong con đường phenylpropanoid. Flavonoid có
vai trò quan trọng trong việc giữ các hoạt động sinh lý bình thường trong cây
trồng, ví dụ hình thành màu sắc trong thực vật, bảo vệ cây khỏi bức xạ tia cực
tím, tăng sức đề kháng đối với mầm bệnh, kích thích sự phát triển của phấn
hoa, vận chuyển hormone thực vật và tương tác giữa rễ cây và vi khuẩn
Rhizobium.
Chalcone isomerase là enzyme có vai trò quan trọng trong việc xúc tác
biến đổi chalcone thành (2S) flavanol hoặc (2S)-5-desoxidation flavanol. Đã
xác định được hai dạng của gen CHI, loại I và loại II. CHI loại I có thể xúc
tác 6-hydrox-chalcone vào flavonoid (2S)-flavonoid hoặc (2S)-5-
desoxidation. CHI loại I được tìm thấy ở nhiều loài thực vật như lúa mạnh,
lúa, cải dầu, và Arabidopsis. CHI loại II chủ yếu được tìm thấy trong cây họ
Đậu (Fabaceae), có thể xúc tác cả 6-hydrox-chalcone và 6-deoxidation-
chalcone thành flavonoid (2S)-flavonoid hoặc (2S)-5-desoxidation flavonoid
[43]. Gen CHI từ nhiều loài thực vật khác nhau như: ngô, đậu tương, lúa
mạch, cỏ cari, hoa cẩm chướng và Saussurea medusa đã được nhân bản thành
công [26]. Mô hình biểu hiện gen CHI khác nhau ở các loài thực vật khác
nhau. Thông qua mô hình biểu hiện của gen CHI ở cà chua trong cây thuốc lá
ta thấy sự gia tăng mạnh mẽ của flavonoid trong vỏ và bột của cây cà chua
chuyển gen mà không gây ra bất kì kiểu hình nào khiếm khuyết. Ngăn chặn
con đường tổng hợp flavonoid bằng cách khử hoạt hóa gen CHI trong hành
tây dẫn đến sự tích tụ chalcone ở mức độ cao và làm giảm lượng flavonoid,
kết quả tạo ra ngô vàng. Sử dụng RNAi ức chế biểu hiện của gen CHI làm
12
hàm lượng flavonoid giảm, phấn hoa và cánh hoa biến mất [26].
Gen CHI (cDNA) đã được nhân bản từ nhiều loài thực vật bậc cao, như đậu
tương (G. max), ngô (Z.mays), lạc (A. hypogaea), P.hybrida và S. medusa [22].
Gen CHI có kích thước dao động 0,6 kb - 2,1 kb đã được nghiên cứu từ
nhiều loại cây như bông, đại mạch, cà chua, ích mẫu, cỏ linh lăng, lúa, dã yên
thảo, cam thảo, quýt, bòng, đậu xanh, đậu đỏ, sắn dây.... [23]. Hai mươi tám gen
CHI và 7 FAP được tìm thấy từ 6 mẫu thực vật, trong đó cây họ đậu có nhiều
gen CHI hơn các loài thực vật khác. Các nhà khoa học đã xác định được 12 gen
GmCHI chia thành bốn phân họ: GmCHI 1A, GmCHI 2, GmCHI 3 và FAP
[23] trong đó trong hai phân họ đầu tiên gồm GmCHI1A, GmCHI1B1,
GmCHI1B2 và GmCHI 2 mã hóa enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển
hóa chalcone thành flavones [14]. Ở cây đậu tương, gen CHI được xác định
nằm trên nhiễm sắc thể số 20 [26].
1.3. CHUYỂN GEN Ở ĐẬU TƯƠNG NHỜ AGROBACTERIUM
1.3.1. Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương
Hiện nay có rất nhiều các nghiên cứu khoa học được thực hiện trên
đối tượng nghiên cứu là đậu tương ở thế giới nói chung và Việt Nam nói
riêng. Đậu tương là cây biến đổi gen chiếm diện tích lớn nhất trên toàn thế
giới (60%), sau đó là ngô (22%) và bông vải (11%). Năm 2015, diện tích cây
trồng biến đổi gen trên thế giới đạt 179,7 triệu ha. Trong đó, đậu tương biến
đổi gen được áp dụng rộng rãi nhất, chiếm 83% tổng diện tích trồng đậu
tương trên thế giới (48). Việc tìm kiếm và phát hiện các gen chức năng trong
hệ gen của đậu tương, phân lập, tách dòng, chuyển gen tạo giống, dòng đậu
tương đã thu được nhiều thành tựu. Hiện có tất cả 36 công trình chuyển gen
được công bố, chủ yếu liên quan đến tính trạng kháng sâu và thuốc diệt cỏ,
một số ít liên quan đến tính chịu hạn và tăng hàm lượng các hoạt chất có vai
13
trò quan trọng.
Thứ nhất là tạo các dòng đậu tương chuyển gen có khả năng kháng sâu,
bệnh hại. Nghiên cứu chọn tạo các giống đậu tương biến đổi gen kháng ruồi
đục thân, sâu đục quả, đã thiết kế được bốn vector mới mang gen kháng sâu
cry2Aa, cry4A, cry2Aa + soycy1Ac, cry4A + soycry1Ac; tạo được các dòng
biến đổi gen từ giống William đến thế hệ T2 được xác định qua phân tích
Southern blot mang gen soycry1Ac hoặc vip3A [48].
Thứ hai là tạo các dòng đậu tương chịu các điều kiện ngoại cảnh bất lợi
như hạn, nóng, lạnh. Nghiên cứu chuyển gen chịu hạn Hahb-4 (có nguồn gốc
từ cây hoa hướng dương) đã được công bố và phê duyệt áp dụng tại Argentina
năm 2015. Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới vẫn tiếp tục nghiên cứu
các gen khác liên quan đến tính trạng chịu hạn, đặc biệt là nhóm gen NAC.
Tại Việt Nam, mỗi năm phải nhập khẩu 2,5 triệu tấn đậu tương, sản lượng đậu
tương hàng năm thu được chỉ đáp ứng 18% nhu cầu trong nước do năng suất
thấp mà chủ yếu là kết quả của stress phi sinh học trong đó hạn hán là hạn chế
lớn. Do vậy, việc nghiên cứu, phát triển các giống đậu tương ưu tú có thể đối
phó với tình trạng khan hiếm nước được xem là một mục tiêu quan trọng của
các nhà khoa học trong nước [48].
Thứ ba là chọn tạo giống đậu tương nhằm tăng hàm lượng các chất hoạt
tính có trong đậu tương có vai trò quan trọng như genistein, daidzein,
flavonoid.
Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long đã nghiên cứu tạo chọn dòng đậu
tương chịu hạn (vector pPTN-rd29A-drebIA), kết quả phân tích PCR của 8
dòng T0 kháng thuốc diệt cỏ có 5 dòng có sự hiện diện của gen chịu hạn
drebIA.
Năm 2014, Henry Nguyen và cs đã nghiên cứu chuyển gen GmNAC003
14
và GmNAC004 sử dụng promoter 35S vào cây Arabidopsis. Kết quả cho thấy
cây chuyển gen GmNAC004 so với cây đối chứng có sự gia tăng số lượng và
chiều dài rễ trong điều kiện thường và tăng cao trong điều kiện hạn [31].
Theo nghiên cứu mới nhất của Reem Hussain và cs (Trường Đại học
Nông Nghiệp Huazhong, 2017), đã xác định được 139 gen GmNAC, phân tích
biểu hiện 28 gen GmNAC, kết quả cho thấy biểu hiện gen GmNAC phụ thuộc
vào kiểu gen; 8 trong số 28 gen chọn lọc (GmNAC004, GmNAC021,
GmNAC065, GmNAC066, GmNAC073, GmNAC082, GmNAC083 và
GmNAC087) đã được phát hiện có mức độ biểu hiện cao ở các giống đậu
tương chịu hạn. Nghiên cứu này xác định gen GmNAC có thể được xem là
trọng tâm trong các nghiên cứu trong tương lai trong việc phát triển đậu tương
chịu hạn cao [19].
Trong nghiên cứu của Qu và cs (2016), các tác giả đã thực hiện quá trình
chuyển gen thông qua Agrobacterium trên đối tượng nghiên cứu là đậu tương
bằng cách sử dụng một vector biểu hiện RNAi chứa gen β tiểu đơn vị của
globulin 7S. Phân tích PCR và Southern blot đã được sử dụng để xác nhận
việc gắn của vec tơ vào bộ gen đậu nành có thành công hay không. Trong
nghiên cứu này, việc chuyển đổi cây đậu nành bằng cách sử dụng một vector
biểu hiện RNAi chứa tiểu đơn vị β ở globulin 7S đã thành công. Tổng cộng có
10 cây đậu tương chuyển gen dương tính ở thế hệ T0, 6 cây chuyển gen
dương tính ở thế hệ T1 và 13 cây chuyển gen dương tính ở thế hệ T2. Các
mức độ giao thoa biểu hiện của tiểu đơn vị β trong 7S thay đổi trong mỗi cây
biến đổi gen và cao nhất mức độ can thiệp đạt 77,5%. Do đó, một dòng đậu
tương mới chứa hàm lượng thấp chất gây dị ứng thu được, có chứa vector
biểu hiện RNAi [34].
Yếu tố phiên mã MYB là một trong những họ lớn nhất trong thực vật,
đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự phát triển của cây trồng và
15
sự chuyển hóa sinh lý. Yang và cs (2009) đã nghiên cứu biểu hiện và chức
năng của gen nhân tố phiên mã MYB GMMYBJ6 (GenBank No. DQ902863)
được phân lập từ đậu tương (Glycine max L. Merrill). Mô hình biểu hiện của
GmMYBJ6 trong các cơ quan khác nhau đã được kiểm tra bằng cách sử dụng
phương pháp phân tích thấm nước của Northern. Sự biểu hiện của GmMYBJ6
chỉ được phát hiện trong lá. Khả năng hoạt hóa phiên mã của protein
GmMYBJ6 đã được xác nhận bởi hệ thống xét nghiệm hoạt tính của beta-
galactosidase là 28,48 U/mL. Phân tích bán định lượng RT-PCR chỉ ra rằng
GmMYBJ6 đã cải thiện sự biểu hiện của một số gen sinh tổng hợp flavonoid,
như CHN (Phenylalanine ammoni ligase), C4H (cinnamate-4-hydroxylase),
4CL (4-coumaroyl-CoA ligase), CHS (Chalcone synthase), CHI (Chalcone
isomerase ), F3H (Flavanone 3-hydroxylase) và FLS (Flavonol synthase), kết
quả là sự gia tăng hàm lượng flavonoid trong các chất chuyển hóa thuốc lá
dương tính. Thêm vào đó, sự biểu hiện ngày càng tăng của GMMYBJ6 trong
cây đậu tương Zhongdou 27 do bức xạ UV-B, hạn hán và xử lý muối cao cho
thấy GmMYBJ6 có liên quan đến phản ứng đối với các áp lực abiotic [41].
Trong những năm gần đây đã có một số công trình nghiên cứu ứng
dụng kỹ thuật chuyển gen ở cây đậu tương và tập trung vào hướng cải thiện,
nâng cao khả năng chịu hạn, kháng sâu của cây đậu tương. Trần Thị Cúc
Hòa đã tối ưu hóa quy trình chuyển gen ở đậu tương để làm cơ sở cho công
tác tạo chọn các dòng đậu tương biến đổi gen ở Việt Nam. Nghiên cứu được
thực hiện với phương pháp nách lá mầm qua trung gian A. tumefaciens và
chọn lọc bằng glufosinate trên giống đậu tương nhập nội Maverick. Tối ưu
hóa đạt được bằng cải tiến khâu lây nhiễm với A.tumefaciens qua thử
nghiệm bốn phương pháp lây nhiễm khác nhau. Kết quả qua phân tích
Southern blot cho thấy cách lây nhiễm thông qua gây tổn thương nách lá
mầm trong dung dịch chứa A.tumefaciens, duy trì ở nhiệt độ 21 độ C trong
16
thời gian đồng nuôi cấy (co-cultivation) 5 ngày cho hiệu quả chuyển nạp gen
cao hơn so với các phương pháp lây nhiễm khác, với tần suất chuyển nạp
gen đạt từ 2-6%. Phương pháp lây nhiễm này được đưa vào quy trình chuyển
nạp gen ở đậu tương để nâng cao hiệu quả chuyển nạp gen phục vụ cho công
tác chọn tạo giống đậu tương biến đổi gen ở Việt Nam [8]. Các nghiên cứu
của Nguyễn Thị Thúy Hường (2011) chuyển gen P5CSm vào giống đậu
tương DT84 [6], Nguyễn Thu Hiền (2011) biến nạp cấu trúc chứa đoạn gen
HA1 của virus H5N1 vào giống đậu tương ĐT12 [7], Lò Thị Mai Thu (2014)
chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào hai giống đậu tương ĐT12 và
DT2008 [4], nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào giống đậu
tương DT84 của Lò Thanh Sơn (2015) [3] biến nạp cấu trúc GmDREB2 vào
giống đậu tương DT84 của Đào Xuân Tân (2016) [1] đều được thực hiện
qua nách lá mầm nhờ lây nhiễm A.tumefaciens và đạt hiệu suất trong khoảng
từ 2% đến 5%.
1.3.2. Nghiên cứu biểu hiện gen CHI
Có nhiều công trình khoa học nghiên cứu về gen CHI trên các đối
tượng khác nhau thu được nhiều thành công. Năm 2012 Yue Zhang và cs đã
nhân dòng và biểu hiện gen CHI ở lạc thành công, kết quả chỉ ra rằng đó là
gen CHI loại I mã hóa 1 peptide cho 255 amino acid [43]. Năm 2005 Lyle
Ralston và cs tái lập một phần của flavonoid và isoflavonoid sinh tổng hợp
trong nấm men sử dụng CHI I và CHI II ở đậu tương [25]. Cheng và cs
(2011) đã phân lập được trình tự gen mã hóa enzyme chalcone isomerase từ
lá của cây bạch thảo (Ginkgo biloba L.) được gọi là GbCHI. Gen GbCHI
chứa hai intron và ba exon, mã hóa một peptide gồm 244 amino
acid. RQPCR cho thấy GbCHI đã được biểu hiện theo mô cụ thể trong G.
biloba. Protein tái tổ hợp được biểu hiện thành công trong một dòng E.coli
với vector pET-28a. Hoạt tính enzyme in vitro, được khảo sát bởi phân tích
17
HPLC, chỉ ra rằng protein GbCHI tái tổ hợp có thể xúc tác sự hình thành của
naringenin từ 6'-hydroxychalcone. Phân tích RQPCR cho thấy hoạt động CHI
tương quan với sự thay đổi mức độ sao chép của gen CHI, hoạt động của
GbCHI cũng tương quan dương với nồng độ flavonoid trong lá cây bạch
thảo, cho thấy CHI là một gen chính điều chỉnh sự tích tụ flavonoid trong lá
cây bạch thảo [12].
Wang và cs (2012) đã tiến hành phân lập cDNA CHI từ cây nho (Vitis
vinifera L.), tạo protein tái tổ hợp được tinh chế và đã được tạo ra kháng thể
polyclonal. Sử dụng các công cụ, biểu hiện và mô địa hoá của CHI trong việc
phát triển quả nho đã được phân tích bằng kỹ thuật RT-PCR, gel blot và kỹ
thuật miễn dịch hóa học. Nghiên cứu cho thấy rằng sự biểu hiện của CHI phụ
thuộc vào giai đoạn phát triển, và protein CHI phân bố chủ yếu trong các bó
mạch trên tất cả các giai đoạn phát triển của quả nho [39].
Wang và cs (2018) đã tiến hành phân tích trình tự và kết quả liên kết
đồng đẳng cho thấy chuỗi protein CnCHI có độ tương đồng cao với các chuỗi
protein khác của CHI. Protein CnCHI có một miền bảo thủ Chalcone 3, được
bảo tồn trong quá trình tiến hóa, cho thấy rằng CnCHI là một thành viên của
họ gen CHI. Kết quả phân tích cho thấy biểu hiện CnCHI trong hoa cao hơn
nhiều so với rễ, thân, lá của Chamaemelum nobile, cho thấy gen CnCHI là
một gen biểu hiện khác biệt, là một loại enzyme chủ chốt trong con đường
18
tổng hợp flavonoid trong C.nobile [37].
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Giống đậu tương ĐT51 được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu được cung
cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ, Viện cây Lương thực và
Thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. Hình 2.1 thể hiện hình
thái hạt của giống đậu tương ĐT51 được sử dụng trong nghiên cứu này.
Hình 2.1. Hạt của giống đậu tương ĐT51
Giống đậu tương ĐT51 được chọn tạo bằng con đường lai hữu tính.
Giống được công nhận tạm thời, và hiện đang được đưa vào sản xuất thử
nghiệm trong vùng đồng bằng, trung du Bắc Bộ trong 3 vụ hè, đông và xuân.
Giống đậu tương ĐT51 có hoa màu tím, hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chín có
màu vàng. Chiều cao cây 45 - 55cm, phân cành khá, hơn 2 cành/cây, số quả
chắc cao, tỷ lệ quả 3 hạt đạt 25 - 30 %. Khối lượng 100 hạt khoảng từ 17,5 -
19
20,0 g. Thời gian sinh trưởng trung bình 90 - 95 ngày, năng suất 20 - 29 tạ/ha,
tuỳ thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh. ĐT51 có khả năng gieo trên
chân đất vừa mới thu hoạch mạ, đất ướt nhưng tỷ lệ nảy mầm vẫn đạt rất cao.
Ngoài ra, trong giai đoạn sinh trưởng phát triển nếu có bị ngập 4 - 5 ngày,
giống này vẫn có khả năng sống được, lá không bị héo, rễ không bị thối. Theo
thông tin của nhóm nghiên cứu năm 2016, hàm lượng isoflavone trong hạt
nảy mầm 3 ngày tuổi của giống đậu tương ĐT51 (41,28 mg/100g) cao hơn
hẳn so với 3 giống đậu tương còn lại là DT90 (30,62 mg/100g), DT2008
(26,17 mg/100g) và ĐT84 (29,43 mg/100g) [2].
Chủng vi khuẩn A.tumefaciens chứa cấu trúc mang gen GmCHI do Bộ
môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, trường Đại học
Sư phạm – Đại học Thái Nguyên cung cấp.
Vector chuyển gen pCB301_GmCHI chứa mang gen chuyển GmCHI có
cấu trúc được trình bày ở hình 2.2. Trong cấu trúc chuyển gen này, gen
GmCHI được phân lập từ giống đậu tương ĐT26 có hàm lượng isoflavone
cao. Vi khuẩn A.tumefaciens tái tổ hợp chứa vector pCB301 mang cấu trúc
35S-GmCHI-cmyc-KDEL được làm mới bằng nuôi trên môi trường chọn lọc
chứa kanarmycine và nuôi phục hồi khi mật độ tế bào đạt giá trị OD600nm là
0,8 tạo dịch huyền phù phục vụ cho lây nhiễm.
Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc trong vector chuyển gen
pCB301_GmCHI trong vi khuẩn A.tumefaciens. nptII: gen kháng kanamycin;
CaMV35S: promoter 35S; GmCHI: gene mã hóa chalcone isomerase phân lập
từ cây đậu tương; cmyc: trình tự nucleotde mã hóa peptid cmyc; KDEL: trình
20
tự nucleotde mã hóa peptide KDEL
2.2. Hóa chất và thiết bị
Đề tài đã sử dụng các loại hóa chất cho các thí nghiệm tái sinh in vitro,
chuyển gen, phân tích PCR và các hóa chất được mua từ một số hãng nổi
tiếng như: Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma.
Các hóa chất chính bao gồm: agar, yeast extract, NaCl, agarose,
sucrose, glucose, trypton, KCl, tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2,
glycerol, CaCl2, ethanol; các loại kháng sinh kanamycin, rifamicine,
cefotaxime và các hóa chất thông dụng khác.
Phát triển hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen được sử dụng các thiết
bị nuôi cấy mô tế bào thực vật của Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực
vật, khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên. Các loại thiết bị
chính bào gồm: box cấy, bình nuôi cấy, nồi khử trùng, bể ổn nhiệt, máy nuôi
lắc, máy đo pH, máy quang phổ, ...
Các thiết bị dùng trong sinh học phân tử như máy PCR System 9700
(Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy
chụp ảnh, máy soi gel, máy ly tâm, máy xung điện Gen Plulser cùng với các
trang thiết bị khác sử dụng tại Phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ
gen, Viện Công nghệ Sinh học.
Môi trường tái sinh in vitro từ nách lá mầm đậu tương được trình bày ở
Phụ lục 1.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen
Kỹ thuật tái sinh cây đậu tương từ nách lá mầm được tiến hành theo
phương pháp của Olhoft và cs (2001) và Nguyễn Thu Hiền (2011) có cải tiến
21
[7], [32].
Tạo nguyên liệu biến nạp gen: Hạt đậu tương khử trùng bằng khí clo tạo ra từ
hỗn hợp Javen 15ml + HCl 5ml đậm đặc rồi cho nảy mầm trên môi trường
MS. Sau 4 - 5 ngày, lá mầm được tách đôi, loại bỏ đỉnh sinh trưởng sử dụng
làm nguyên liệu biến nạp gen và nuôi cấy in vitro.
Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm: Nuôi chọn lọc vi khuẩn trong 15ml môi trường
LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc là kanamycin 50 mg/l và rifamicine 50
mg/l ở 28 oC, 200 rpm, 48 giờ. Chuyển 10ml dịch huyền phù tế bào trên vào
50ml LB lỏng không kháng sinh để nuôi phục hồi ở 28 oC, 200 rpm đến khi
OD600nm = 0,6 - 0,8 là đạt số lượng tế bào tối ưu để biến nạp. Ly tâm dịch tế
bào ở 4 oC, 5000 rpm, 15 phút. Hoà tan tế bào lắng tạo huyền phù vi khuẩn
vào 40ml dung dịch môi trường CCM đặt trong nước đá lạnh.
Lây nhiễm và đồng nuôi cấy: Các mảnh lá mầm đậu tương được gây tổn
thương bằng mũi dao nhọn từ 7 - 8 lần vào phần nách lá mầm trong dịch
huyền phù vi khuẩn trong thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu
được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc không kháng sinh.
Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 25 oC trong thời gian 5 ngày.
Cảm ứng tạo chồi trên môi trường SIM: Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu
biến nạp được rửa trong môi trường cảm ứng tạo chồi (SIM) có bổ sung 400
cefotaxime mg/l với thời gian là 10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm
khử trùng. Đặt mẫu lên môi trường tạo chồi SIM có bổ sung cefotaxime 400
mg/l và kanamycin 50 mg/l (lần 1). Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển
sang môi trường SIM đặc có bổ sung cefotaxime 400 mg/l và kanamycin 75
mg/l (lần 2).
22
Kéo dài chồi: Sau 2 - 3 tuần, các cụm chồi sống sót trên môi trường chọn lọc
Tạo nguyên liệu biến nạp gen
Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm
Lây nhiễm và đồng nuôi cấy
Cảm ứng tạo chồi trên môi trường SIM
Kéo dài chồi trên môi trường SEM
Tạo rễ trên môi trường RM
Cây ra giá thể
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm
được loại bỏ lá mầm và chuyển sang môi trường phát triển kéo dài chồi
23
(SEM) có bổ sung cefotaxime 400 mg/l và kanamycin 50 mg/l.
Tạo rễ: Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3 - 4 cm sẽ được chuyển
sang môi trường tạo rễ (RM) có bổ sung cefotaxime 400 mg/l và kanamycin
50 mg/l để tạo cây hoàn chỉnh.
Cây ra giá thể: Những cây hoàn chỉnh, khoẻ mạnh được đưa ra bầu trấu hun :
cát (tỷ lệ 1 : 1). Sau khoảng 1 - 2 tuần, các cây sống sót được trồng ra nhà lưới.
Tính toán thời gian biến nạp và tái sinh để thời điểm ra cây trùng với thời vụ
gieo trồng đậu tương.
2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử
DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Edwards (1991).
Thành phần đệm tách DNA tổng số được thể hiện ở bảng 2.2
Bảng 2.1. Thành phần đệm tách DNA tổng số
STT Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng
Tris-HCl 1M, pH 8 1 100 Mm
NaCl 5M 2 1,4M
EDTA 0,5M, PH 8 3 50 Mm
CTAB 4 2% (w/v)
5 Nước khử ion vô trùng
Các bước tách chiết DNA tổng số:
1) Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ.
2) Bột đã nghiền cho vào ống Eppendorf 1,5 ml. Thêm 700µl đệm tách, đảo
đều và ủ ở 65 oC trong 90 phút.
3) Bổ sung 700µl hỗn hợp Chloroform : Isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) vào mỗi
24
ống, đảo đều sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút.
4) Hút 500 µl dịch nổi pha trên sang ống Eppendorf khác, bổ sung 500 µl
isopropanol lạnh. Để mẫu trong tủ -20 oC trong 30 phút.
5) Ly tâm thu 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút để thu tủa DNA, sau đó
rửa tủa bằng cồn 70 oC.
6) Loại bỏ cồn, làm khô tủa ở điều kiện nhiệt độ phòng và hòa tan DNA trong
nước khử ion vô trùng và bảo quản ở -20 oC.
Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi GmCHI-NcoI-F/GmCHI-cmyc-
SacI-R để nhân bản đoạn GmCHI-cmyc-KDEL chứa gen chuyển GmCHI.
Trình tự nucleotide của cặp mồi CHI-NcoI-F/ CHI-NotI-R được trình bày ở
bảng 2.3.
Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của các cặp mồi GmCHI-NcoI-F/GmCHI-
cmyc-SacI-R
Ký hiệu Trình tự nucleotide (5’ - 3’) Sản phẩm
dự kiến
CHI-NcoI-F CATGCCATGGATGGCAACGATCACCGCGGTT
CCGAGCTCCTAGAGTTCGTCTTTGGAACC
702 bp GmCHI-
cmyc-SacI-R
25
Thành phần của phản ứng PCR được thể hiện ở bảng 2.4.
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR nhân bàn đoạn GmCHI-cmyc-
KDEL
STT Thành phần Nồng độ
1 Nước khử ion 13µl
2 Đệm PCR 10X 2.5µl
3 MgCl2 (25mM) 2µl
4 dNTPs (10mM) 2.5µl
5 Mồi xuôi (10 pmol/µl) 1µl
6 Mồi ngược (10 pmol/µl) 1µl
7 Taq DNA polymerase ( 5 đơn vị/ µl) 1µl
8 DNA khuôn (10 – 20 ng/µl) 2µl
Tổng 25µl
Chu kì nhiệt của phản ứng PCR được thể hiện ở bảng 2.5.
Bảng 2.4. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu
kỳ
1 4 phút 1 Biến tính 94
2 30 giây Biến tính 94 Lặp lại
3 30 giây Gắn mồi 58 30 chu
kỳ 4 90 giây Kéo dài chuỗi 72
5 10 phút 1 Hoàn tất kéo dài 72
6 ∞ Kết thúc phản ứng 4
26
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%.
Hiệu suất chuyển gen được tính theo công thức:
Mỗi mẫu biến nạp là mảnh lá mầm được tái sinh chồi từ nách lá mầm
và hai lần chọn lọc bằng kháng sinh. Các chồi sống sót sau chọn lọc được
chuyển sang môi trường ra rễ và đưa ra trồng trên giá thể. Số cây trồng trên
giá thể của mỗi mẫu biến nạp dương tính với PCR tạo thành một dòng cây
chuyển gen.
2.4. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận văn
Các thí nghiệm chuyển gen ở cây đậu tương được thực hiện tại phòng
thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư
phạm – Đại học Thái Nguyên. Thí nghiệm phân tích PCR thực hiện tại Viện
Công nghệ Sinh học.
Luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục
27
sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm –Đại học Thái Nguyên.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. CHUYỂN CẤU TRÚC 35S-GmCHI-cmyc VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG
ĐT51 NHỜ A.tumefaciens
Chúng tôi tiến hành chuyển cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc vào giống đậu
tương ĐT51 qua nách lá mầm bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp ở thực
vật nhờ A.tumefaciens. Kỹ thuật chuyển gen được thực hiện theo quy trình đã
được mô tả ở mục 2.3.1
3.1.1. Kết quả khử trùng hạt
Hạt đậu tương ĐT51 sau khi chín, đem phơi khô, loại bỏ những hạt lép,
xấu và bị sâu bệnh, sứt mẻ, chỉ lựa chọn những hạt lành lặn, mẩy, có kích
thước tương đương nhau. Sau khi lựa chọn hạt, tiến hành rửa sạch hạt trực
tiếp dưới vòi nước sạch, lấy tay xoa đều để loại bỏ bụi bẩm bám vào hạt. Đổ
hạt đã rửa sạch ra giấm thấm, đợi hạt khô, cho hạt đậu tương đã lựa chọn kĩ
vào một bình tam giác thủy tinh sạch và khô, đậy nút bông, gấp nắp và đem đi
khử trùng. Hạt sẽ được khử trùng bằng khí clo trong bình thủy tinh đậy kín
nắp đặt trong tủ hút. Tiến hành lấy 15ml javen cho vào cốc thủy tinh, đặt vào
trong bình thủy tinh. Tiếp tục cho bình tam giác chứa hạt đậu tương đã rửa
sạch vào, bỏ nắp và nút bông ra để hạt trong bình được tiếp xúc trực tiếp với
khí clo. Từ tử nhỏ 5ml dung dịch HCl đặc vào cốc thủy tinh đã chứa javen.
Đậy kín bình thủy tinh trong thời gian từ 14 đến 16h, sau đó lấy hạt chuẩn bị
28
cho bước gieo hạt trên môi trường GM.
Hình 3.1. Hình ảnh khử trùng hạt bằng khí clo trong bình thủy tinh kín
3.1.2. Kết quả tạo nguyên liệu biến nạp
Sau khi được khử trùng, hạt được cấy trên môi trường nảy mầm GM và
mỗi bình 10 hạt với khoảng cách giữa các hạt đồng đều nhau để tạo điều kiện
cho các hạt nảy mầm (Hình 3.2 A). Tiếp sau, hạt được chuyển sang phòng
nuôi cấy với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì, 16 giờ chiếu sáng và 8
giờ tối, nhiệt độ phòng 25 oC ± 2, cường độ chiếu sáng 200 lux. Khi được 5
ngày, mầm đạt được kích thước 1,5 cm đến 2 cm gồm rễ mầm, thân mầm và
lá mầm (Hình 3.2 B).
Tiến hành cắt bỏ rễ mầm, chồi mầm, bỏ vỏ và thu lá mầm. Tách lá mầm
bằng panh và kéo, cắt bỏ cuống, gây tổn thương nhẹ nhàng nách lá mầm bằng
29
mũi dao nhọn để tạo vật liệu nhận gen.
Hình 3.2. Hình ảnh hạt đậu tương và hạt nảy mầm trong giai đoạn chuẩn bị
nguyên liệu cho biến nạp. A: Hạt đậu tương ĐT51 cấy trên môi trường nảy
mầm (GM); B: Hạt đậu tương ĐT51 nảy mầm được 5 ngày kể từ khi cấy trên
môi trường.
3.1.3. Kết quả biến nạp và tái sinh cây đậu tương chuyển gen
Quá trình biến nạp được tiến hành trong box vô trùng. Sau khi tiến
hành nuôi vi khuẩn A.tumefaciens chứa cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc trong LB
lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/ml và rifamicine 50 mg/ml
trong 4 giờ. Tiếp tục bổ sung LB lỏng và nuôi tiếp thêm 3 giờ nữa, đến khi
nồng độ vi khuẩn đạt OD600 = 0,8 thì tiến hành biến nạp.
Lá mầm đã tổn thương đem ngâm trong dịch huyền phù chứa vi khuẩn
mang cấu trúc chứa gen GmCHI trong 30 phút (Hình 3.3 A). Sau khi ngâm
mảnh lá mầm trong dịch huyền phù, vừa đủ thời gian thì chuyển các mảnh lá
sang các đĩa petri chứa môi trường đồng nuôi cấy (CCM) đặc (Hình 3.2 B).
Đem các đĩa này để trong phòng tối trong khoảng thời gian 5 ngày, nhiệt độ
30
phòng 25oC ± 2.
Hình 3.3. Hình ảnh của đậu tương trong giai đoạn gây tổn thương nách lá
mầm và biến nạp. A: Mảnh lá mầm tổn thương được nhiễm khuẩn
A.tumefaciens tái tổ hợp chứa cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc; B: Mảnh lá mầm
được cấy trên môi trường đồng nuôi cấy (CCM) đặc.
Khi được 5 ngày đồng nuôi cấy trong tối, tiến hành rửa khuẩn. Các mẫu
biến nạp được lắc trong môi trường SIM lỏng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime
trong thời gian 10 – 15 phút để rửa khuẩn ngoại vi. Loại bỏ dịch lỏng, đưa các
mẫu biến nạp lên giấy thấm đã khử trùng. Dùng panh lấy mẫu biến nạp cấy
vào môi trường tạo đa chồi có bổ sung 500 mg/l cefotaxime đã chuẩn bị
trước.
Sau 2 tuần, chuyển mẫu sang môi trường SIM đặc có bổ sung 500 mg/l
cefotaxime và kháng sinh thích hợp. Tiếp theo là chọn lọc những cụm chồi
phát triển tốt trên môi trường SIM, khi các mẫu phát sinh cụm chồi gồm các
chồi nhỏ, tiến hành cắt bỏ lá mầm và chuyển sang môi trường chọn lọc kéo
dài chồi SEM có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 50 mg/l kanamycin.
31
Hình 3.4 trình bày kết quả cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường SIM có
bổ sung BAP (3,5 mg/l) và kanamycin 5 mg/l trong khoảng thời gian 2 tuần
và kết quả kéo dài chồi trên môi trường SEM có bổ sung thêm IAA (0,1
mg/l), GA3 (0,5 mg/l) và kanamycin 50 mg/l.
Hình 3.4. Hình ảnh của đậu tương chuyển gen trong giai đoạn tạo chồi và kéo
dài chồi. A: Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường SIM trong 1 tuần, bổ sung
BAP 2mg/l và kanamycin; B: Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường SIM trong
2 tuần bổ sung BAP 2 mg/l và kanamycin; C: Kéo dài chồi trên môi trường
SEM trong 1 tuần bổ sung IAA (0,1 mg/l) + GA3 (0,5 mg/l) + kanamycin
50mg/l); D: Kéo dài chồi trên môi trường SEM trong 2 tuần bổ sung thêm
32
IAA (0,1 mg/l) + GA3 (0,5 mg/l) + kanamycin 50mg/l).
Các chồi sống sót được kéo dài trên môi trường SEM có kháng sinh
chọn lọc được chuyển sang môi trường ra rễ RM có bổ sung 250 mg/l
cefotaxime để tạo cây hoàn chỉnh. Khi đã tạo được cây hoàn chỉnh tiến hành
đem cây trồng trên giá thể. Cây tái sinh được đưa ra nhà lưới và chăm sóc để
ra hoa, quả và thu hạt, phục vụ phân tích cây chuyển gen (Hình 3.5).
Hình 3.5. Hình ảnh của đậu tương chuyển gen trong giai đoạn ra rễ trong ống
nghiệm và trồng cây đậu tương chuyển gen trên giá thể. A, B: Chồi đậu tương
chuyển gen ra rễ trên môi trường RM có bổ sung 250 mg/l cefotaxime; C:
33
Cây đậu tương chuyển gen được trồng trên giá thể
A
Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen chuyển GmCHI nhờ vi khuẩn A.
tumefaciens qua nách lá mầm hạt chín được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI nhờ vi khuẩn A.
tumefaciens qua nách lá mầm hạt chín
Đối chứng và thí nghiệm Số mẫu tạo chồi
Số chồi ra rễ
Số chồi tái sinh Số chồi kéo dài
Tổng số mẫu biến nạp Số cây đem trồng trên giá thể
Số cây sống sót trong nhà lưới
ĐC0* 50 0 0 0 0 0 0
ĐC1* 50 50 112 57 30 10 10
60 130 76 58 11 Lần 1 100 4
Thí 49 126 65 51 9 Lần 2 75 3 nghiệm
32 98 55 50 8 Lần 3 50 2
Ghi chú: ĐC0* lá mầm đậu xanh không chuyển gen được cấy trên môi trường tái
sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1* lá mầm đậu xanh không chuyển gen được cấy
trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh.
9 Tổng 225 141 354 196 159 28
Thí nghiệm với tổng số mẫu biến nạp là 225 mẫu, lặp lại 3 lần kết quả
thu được 141 mẫu phát sinh chồi và cho 354 chồi, trong đó có 196 chồi sinh
trưởng tốt trong môi trường kéo dài chồi SEM có bổ sung kanamycin 50 mg/l.
34
Khi chuyển sang môi trường ra rễ thu được 159 chồi phát sinh rễ và số cây
đem trồng trên giá thể là 28 cây và 9 cây đậu tương chuyển gen phát triển
bình thường trong nhà lưới. Song song với lô thí nghiệm chuyển gen GmCHI,
hai lô đối chứng không chuyển gen cũng được nuôi cấy trong các môi trường
tạo chồi, ra rễ. Ở lô ĐC0, lá mầm đậu tương không chuyển gen tái sinh trên
môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh, kết quả thu được là tất cả số mầm
đều không phát sinh chồi và chết, còn ở lô ĐC1, lá mầm đậu tương không
chuyển gen tái sinh trên môi trường chọn lọc không bổ sung kháng sinh, kết
quả thu được cả 50 mẫu đều tạo chồi, 57 chồi kéo dài, 30 chồi ra rễ và 10 cây
được trồng trong nhà lưới làm đối chứng.
Như vậy ở giai đoạn tái sinh in vitro, kết quả chọn lọc bằng kháng sinh
thu được 9 cây đậu tương được chuyển gen T0. Hiệu suất chuyển gen ở giai
đoạn chọn lọc bằng kháng sinh chiếm tỷ lệ 4% (9/225).
3.2. PHÂN TÍCH SỰ CÓ MẶT CỦA GEN CHUYỂN GmCHI TRONG CÁC
CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN Ở THẾ HỆ T0
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách từ lá non của các cây đậu tương chuyển gen và
cây đối chứng không chuyển gen. Dung dịch chứa DNA tổng số được kiểm
tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3.6). Hình ảnh điện di
DNA tổng số ở hình 3.6 cho thấy ở tất cả các làn chạy điện di đều cho băng
DNA sắc nét, rõ ràng và ít bị đứt gãy.
Đồng thời với việc chạy điện di, DNA tổng số còn được kiểm tra bằng
quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm. Kết quả đo quang phổ hấp thụ ở bước
35
sóng 260 nm và 280 nm, tính tỷ lệ OD260/OD280 thu được kết quả là 1,8 – 2,0.
Kết quả kiểm tra DNA tổng số bằng phương pháp điện di và quang phổ
hấp thụ đã chứng tỏ các mẫu DNA tổng số tách từ lá non các cây đậu tương
chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen đảm bảo hàm lượng và độ
tinh sạch và có thể sử dụng cho các phản ứng sinh học phân tử tiếp theo.
Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số tách từ lá các cây
đậu tương chuyển gen và cây không chuyển gen. 1-9: DNA tổng số tách từ
các mẫu lá của các cây đậu tương chuyển gen; 10: DNA tổng số tách từ các
mẫu lá của các cây đậu tương không chuyển gen
3.2.2. Kết quả phân tích PCR khuếch đại gen chuyển GmCHI
DNA tổng số của 9 cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 và cây đối
chứng không chuyển gen được sử dụng cho PCR để khuếch đại cấu trúc
GmCHI-cmyc-KDEL. Kết quả PCR với với cặp mồi GmCHI-NcoI-F/GmCHI-
36
cmyc-SacI-R khuếch đại đoạn GmCHI-cmyc-KDEL được thể hiện ở hình 3.8.
Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen
GmCHI-cmyc-KDEL từ các cây đậu tương chuyển gen và cây không chuyển
gen với cặp mồi GmCHI-NcoI-F/GmCHI-cmyc- SacI-R. (+): Sản phẩm PCR
từ vector pCB301- GmCHI; (-): Kết quả PCR từ cây không chuyển gen; 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Kết quả PCR từ các cây đậu tương chuyển gen T0; M; thang
DNA 1 kb.
Sản phẩm điện di ở hình 3.7 cho thấy, trong 9 cây đậu tương chuyển
gen T0 được phân tích đã thu được 8 cây cho kết quả PCR nhân đoạn
GmCHI-cmyc-KDEL từ hệ gen có kích thước khoảng 0,7kb. Hiệu quả chuyển
gen ở giai đoạn T0 đạt 3,56% (8/225). Như vậy, ở thế hệ T0 đã tạo được 8 cây
đậu tương chuyển gen GmCHI.
Gen GmCHI nội tại có kích thước 657 bp [2], [24], cấu trúc GmCHI-
cmyc-KDEL có kích thước 702 bp và khi khuếch đại bằng PCR với cặp mồi
GmCHI-NcoI-F/GmCHI-cmyc-SacI-R thu được đoạn DNA có kích thước
khoảng 700 bp (Hình 3.8). Như vậy bước đầu có thể nhận xét rằng gen
chuyển GmCHI đã xâm nhập vào hệ gen cây đậu tương được chuyển gen. Tuy
37
nhiên, gen chuyển GmCHI có hợp nhất vào hệ gen và có biểu hiện thành
protein tái tổ hợp ở cây đậu tương chuyển gen hay không cần phải tiếp tục
phân tích bằng Southern blot và Western blot.
3.3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Có nhiều phương pháp để thực hiện chuyển một gen ngoại lai mong
muốn vào thực vật, trong đó bao gồm hai phương pháp chính là chuyển gen
trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. Chuyển gen trực tiếp phổ biến như súng bắn
gen, sốc điện, sốc nhiệt, còn chuyển gen gián tiếp thông qua những vi sinh vật
trung gian. Tuy nhiên các phương pháp chuyển gen trực tiếp yêu cầu phải có
thiết bị, hóa chất hiện đại, kỹ thuật cao nên chi phí cho phương pháp này rất
cao, ngược lại chuyển gen gián tiếp qua các vi sinh vật lại dễ dàng thực hiện,
không đòi hỏi quá nhiều chi phí. Chuyển gen gián tiếp chủ yếu là thông qua
hai loại vi khuẩn Agobacterium tumefaciens và Agrobacterium zhirogens do
hai loài này có khả năng xâm nhiễm qua viết thương của hầu hết các loài thực
vật hai lá mầm. Trong đó vi khuẩn A.tumefaciens được sử dụng rộng rãi hơn
vì phương pháp này dễ thực hiện, ít tốn kém nhưng vẫn hiệu quả, thuận lợi
cho phân tích cây chuyển gen và không gây tổn thương tế bào.
Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, người ta thường sử dụng một số
loại promoter như 35S, act, mas,... Trong đó 35S là một promoter mạnh được
phân lập từ virus gây bệnh khảm lá súp lơ (Cauliflower Mosaic Virus -
CaMV). Trong nghiên cứu của chúng tôi, vùng promoter CaMV35S được đưa
vào cấu trúc vector chuyển gen pCB301 chứa gen chuyển GmCHI (Hình 2.2).
Promoter CaMV35S được lựa chọn nhằm hướng đến việc khởi động hoạt
động phiên mã của gen GmCHI để tăng cường sinh tổng hợp enzyme CHI
trong mục đích nâng cao hiệu suất tổng hợp isoflavone ở đậu tương. Một số
thành phần khác trong cấu trúc làm chỉ thị cho chọn lọc trong quá trình biến
nạp và tái sinh cây chuyển gen. Trong cấu trúc chuyển gen, gen nptII mã hóa
38
cho protein kháng kanamycin, là tín hiệu hiệu quả cho chọn lọc cây chuyển
gen; đoạn nucleotide mã hóa cho kháng nguyên c-myc sử dụng cho kỹ thuật
Western blot và ELISA. Hai kỹ thuật nói trên đều dựa trên nguyên tắc bắt cặp
đặc hiệu và ngưng kết giữa kháng thể với kháng nguyên là protein đính kèm
với protein ngoại lai. Việc gắn đuôi c-myc là một lựa chọn tốt và phù hợp vì
tính hiệu quả, phổ biến và kinh tế cho nhiều nghiên cứu hiện nay [10].
Trong những năm gần đây, ở nước ta đã có một số công trình công bố
về chuyển gen vào đậu tương, đó là các nghiên cứu của Trần Thị Cúc Hòa
(2007), Nguyễn Thị Thúy Hường và cs (2009, 2011), Nguyễn Thu Hiền và cs
(2012), Lò Thị Mai Thu và cs (2014), Lò Thanh Sơn và cs (2015), Đào Xuân
Tân (2017). Các nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật chuyển gen vào đậu tương
nhờ A.tumefacies lây nhiễm qua nách lá mầm. Trong nghiên cứu chuyển gen
của chúng tôi, khi sử dụng lá mầm đậu tương làm vật liệu nhận gen đã cho
thấy, lá mầm gây tổn thương vùng nách thuận lợi cho việc xâm nhiễm của
A.tumefaciens tái tổ hợp, điều này cũng được khẳng định ở nghiên cứu của Lò
Thị Mai Thu (2014).
Kết quả thí nghiệm chuyển gen của Nguyễn Thúy Hường (2011) vào
giống đậu tương DT84 thu được 28 cây sống sót trong 1262 mẫu biến nạp
(2,2%) [5]; còng nghiên cứu của Nguyễn Thu Hiền (2011) khi chuyển gen vào
giống đậu tương ĐT12 thu được 32 cây chuyển gen từ 650 mẫu biến nạp
(4,9%) [7]. Lò Thị Mai Thu (2014) tiến hành chuyển cấu trúc RNAi vào hai
giống đậu tương đã thu được 16 cây sống sót từ 370 mẫu ở giống ĐT12
(4,3%) và 32 cây sống sót từ 850 mẫu ở giống DT2008 (3,7%) [4]. Nghiên
cứu của Lò Thanh Sơn (2015) khi biến nạp cấu trúc mang gen GmEXP1 vào
giống đậu tương DT84 thu được 9 cây sống sót từ 380 mảnh lá mầm (2,3%)
[3]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi chuyển cấu trúc pCB301_GmCHI
vào giống đậu tương ĐT51 thu được 9 cây chuyển gen sống sót trong 225
39
mẫu ở ba lần biến nạp, chiếm tỷ lệ 4,0%. Như vậy tỷ lệ cây chuyển gen sống
sót ở thế hệ T0 nằm trong khoảng từ 2,0% đến 5%. Về hiệu suất chuyển gen
ở T0, Nguyễn Thị Thúy Hường (2011) chuyển gen P5CSm vào giống đậu
tương DT84 đạt hiệu suất là 0,24% [6], Hiệu suất chuyển gen trong nghiên
cứu của Nguyễn Thu Hiền (2011) là 1,23% [7], của Lò Thị Mai Thu là
1,35% và 2,24% [4], của Lò Thanh Sơn là 1,23% [3]. Trong nghiên cứu của
mình, chúng tôi tiến hành biến nạp 225, số cây đem trồng trên giá thể là 28
và có 9 cây đậu tương chuyển gen phát triển bình thường trong nhà lưới.
Gen chuyển GmCHI có mặt trong hệ gen của 8 cây đậu tương chuyển gen ở
thế hệ T0 và đã được xác nhận bằng kết quả phân tích PCR. Hiệu suất
chuyển gen đạt 3,56%.
Trong chuyển gen ở cây đậu tương, ngoài những khó khăn chung đối
với chuyển gen thực vật còn gặp một số khó khăn khác như: hàm lượng
protein trong tế bào và mô lớn nên dễ nhiễm khuẩn vệ tinh không mong
muốn, hạt giống khó bảo quản và nhanh mất khả năng nảy mầm; hạt đậu
tương chứa nhiều protein và lipid nên tái sinh các mẫu biến nạp rất khó khăn,
điều kiện khí hậu thời tiết cũng là một trong những nguyên nhân làm cho các
mẫu tái sinh bị nhiễm khuẩn. Khó khăn về mùa vụ sinh thái làm giảm khả
năng tái sinh, sinh trưởng phát triển và sinh sản bình thường của cây biến
đổi gen. Để khắc phục những khó khăn riêng nói trên cần tính toán, khảo sát
nồng độ và chủng loại kháng sinh phù hợp với từng giống sao cho vừa bảo
đảm mẫu tái sinh không bị nhiễm khuẩn và nấm lại vừa bảo đảm khả năng
tái sinh của tế bào và mô tiếp nhận. Đặc điểm về mùa vụ sinh thái là do yếu
tố di truyền của mỗi giống đã được xác lập qua chọn lọc tự nhiên nên khó có
thể thay đổi, lựa chọn giải pháp tính toán thời gian biến nạp và tái sinh sao
cho trùng khớp với thời gian sinh thái của mỗi giống là tốt nhất. Nhìn chung,
đối với cây đậu tương, nghiên cứu tái sinh cây chuyển gen và ra cây trồng
40
vào vụ xuân hay xuân hè là thích hợp và cho hiệu quả tạo cây chuyển gen có
tỷ lệ sống là cao nhất. Ngoài ra có thể sử dụng buồng sinh trưởng để chủ
động điều tiết nhiệt độ và thời gian chiếu sáng cũng là một giải pháp kỹ
thuật được chấp nhận.
Hiệu suất biến nạp gen thấp sẽ khó khăn cho việc chọn lọc cây chuyển
gen, do vậy nghiên cứu tìm biện pháp làm tăng hệ số tái sinh đa chồi, tăng tỷ
lệ sống sót của các cây chuyển gen và đồng thời số lượng mẫu biến nạp phải
rất lớn. Chính vì vậy nghiên cứu điều kiện tối ưu cho tái sinh và chuyển gen ở
41
cây đậu tương vẫn đang là vấn đề được tiếp tục quan tâm và nghiên cứu.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Đã chuyển thành công gen GmCHI vào giống đậu tương ĐT51 nhờ
A.tumafaciens qua nách lá mầm.
1.2. Trong 225 mẫu biến nạp có 141 mẫu phát sinh chồi và tạo được 354 chồi.
Kết quả chọn lọc bằng kháng sinh thu được 196 chồi sống sót trong môi
trường SEM và có 159 chồi sống sót và ra rễ trong môi trường RM. Số cây
đem trồng trên giá thể là 28 và có 9 cây đậu tương chuyển gen phát triển bình
thường trong nhà lưới.
1.3. Gen chuyển GmCHI có mặt trong hệ gen của 8 cây đậu tương chuyển gen
ở thế hệ T0 và đã được xác nhận bằng kết quả phân tích PCR. Hiệu suất
chuyển gen ở giai đoạn thí nghiệm này đạt 3,56%.
2. Đề nghị
Cần tiếp tục nghiên cứu để phân tích sự biểu hiện của gen chuyển
GmCHI trong các thế hệ T1, T2,...nhằm tạo dòng đậu tương chuyển gen có
42
hàm lượng isoflavone cao làm vật liệu chọn giống.
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
Phạm Hải Yến, Lê Thị Hồng Trang, Hoàng Phú Hiệp, Nguyễn Hữu
Quân, Chu Hoàng Mậu (2017), “Chuyển gen mã hóa chalcone isomerase vào
giống đậu tương ĐT51 thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Khoa
43
học và Công nghệ Đại học Thái Nguyên, 171(11), tr.135.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Đào Xuân Tân (2016), Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2
nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max L. Merrill),
Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên.
2. Lê Thị Hồng Trang, Trần Thị Thanh Vân, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thanh
Tùng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2016), “Đặc điểm của gen GmCHI
phân lập từ một số giống đậu tương khác nhau về hàm lượng isoflavone”,
Tạp chí Sinh học 38(2), tr. 236-242.
3. Lò Thanh Sơn (2015), Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmEXP1 liên
quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương (Glycine max (L.)
Merrill, Luận án tiến sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên.
4. Lò Thị Mai Thu (2014), Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus
và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây
đậu tương chuyển gen kháng bệnh, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học
Thái Nguyên.
5. Nguyễn Thị Thuý Hường (2011), Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS
liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt
Nam, Luận án tiến sỹ Sinh học, Đại học Thái Nguyên.
6. Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu
Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, (2009), “Phát triển hệ thống tái
sinh invitro ở cây đậu tương (Glycine max L. Merrill) phục vụ chuyển gen”,
Tạp chí khoa học và công nghệ Đại học Thái Nguyên, 52(4), tr. 82-88.
7. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2011),
44
“Nghiên cứu khả năng tái sinh và biến nạp gen qua nách lá mầm của hai
giống đậu tương (Glycine max L.) DT12 và DT84 bằng Agrobacteriun”,
Tạp chí Công nghệ sinh học, 8(38), tr.1035-1310.
8. Trần Thị Cúc Hòa (2007), “Nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển nạp gen
của các giống đậu tương trồng ở Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp và phát
triển nông thôn, 18:11-16.
9. Trần Văn Điền, (2007), Giáo trình cây đậu tương, NXB Nông nghiệp.
Tiếng Anh
10. Ahn J., Lee K. J., Ko K. (2014), “Optimization of ELISA conditions to
quantify colorectal cancer antigen-antibody complex protein (GA733-
FcK) expressed in transgenic plant", Monoclon Antib Immunodiagn
Immunother., 33(1), pp. 1 - 7.
11. Barros R.P., Gustafsson J.A (2011), “Estrogen receptors and the
metabolic network”, Cell Metab, pp.289–299.
12. Cheng H, Li L, Cheng S, Cao F, Wang Y, Yuan H (2011), “Molecular
cloning ang function assay of a chalcone isomerase gene (GbCHI) from
Ginkgo biloba”, Plant Cell Report, 30(1), pp.49-62.
13. Conklin C.M., Bechberger J.F., MacFabe D., Guthrie N., Kurowska
E.M., Naus C.C. (2007), “Genistein and quercetin increase connexin43
and suppress growth of breast cancer cells”, Carcinogenesis, pp.93–100.
14. Dastmalchi M, Dhaubhadel S. (2015), “Soybean chalcone isomerase:
evolution of the fold, and the differential expression and localization of
the gene family”, Planta, pp.507.
15. Dhaubhadel S, McGarvey BD, Williams R, Gijzen M. (2003),
“Isoflavonoid biosynthesis and accumulation in
45
developing soybean seeds”, Plant Molecular Biology, pp.733.
16. Gutierrez-Gonzalez JJ, Guttikonda SK, Tran LS, Aldrich Dl, Zhong R,
Yu O, Nguyen HT, Sleper DA (2010), “Differential expresstion of
isoflavone biosynthetic genes in soybean during water deficits”, Plant
Cell Physiol, pp.936-948.
17. Hany El-Shemy (2011), “Soybean and health”, Agricultural and
biological sciences, pp.1.
18. Huilan Chen, Philippe Seguin, Annie Archambault, Lea Constan, and
Suha Jabaji (2009), “Gene expression and isoflavone concentrations in
soybean sprouts treated with chitosan”, Crop Science, pp.224–236.
19. Hussain RM, Ali M, Feng X, Li X (2017), “The essence of NAC gene
family to the cultivation of drought-resistant soybean (Glycine max L.
Merr.) cultivars”, BMC Plant Biology, 17(1), pp.55.
20. Jie Yu, Xiaojuan Bi, Bing Yu, and Daiwen Chen, (2016), “Isoflavones:
Anti-inflammatory benefit and possible caveats”, Nutrient, pp.361.
21. Jin-Ho Kang, John McRoberts, Feng Shi, Javier E. Moreno, A. Daniel
Jones, Gregg A. Howe (2014), “The flavonoid biosynthetic enzyme
chalcone isomerase modulates terpenoid production in glandular
trichomes of tomato”, Plant Physiology, Vol.164, No.3, pp.1161-1174.
22. Juan J. Gutierrez-Gonzalez,Satish K. Guttikonda, Lam-Son Phan
Tran,Donavan L. Aldrich, Rui Zhong, Oliver Yu, Henry T.
Nguyen, David A. Sleper (2010), “Differential expression of isoflavone
biosynthetic genes in soybean during water deficits”, Plant and Cells
Physiology, pp.1.
23. Kuiper G.G., Lemmen J.G., Carlsson B., Corton J.C., Safe S.H., van der
Saag P.T., van der Burg B., Gustafsson J.-A.K. (1998), “Interaction of
estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor
46
β”, Endocrinology, pp.4252–4263.
24. Le T. H. T., Ho T. M., Hoang H. P., Le S. V. and Chu M. H. (2016),
Glycine max mRNA for chalcone isomerase RNA (chalcone isomerase
(CHI) gene), cultivar ĐT51. GenBank: LT594995.1.
(2005), “Partial 25. Lyle R., Senthil S., Michiyo M., Oliver Y.,
Reconstruction of Flavonoid and Isoflavonoid Biosynthesis in Yeast
Using Soybean Type I and Type II Chalcone Isomerases”, Plant Physiol,
137(4), pp. 1375–1388.
26. M. Chen, W.J. Zhu, X. You, Y.D. Liu, G.M. Kaleri, Q. Yang (2015),
“Isolation and characterization of a chalcone isomerase gene promoter
from potato cultivars”, Genetics and Molecular Resaerch, pp.18873.
27. Marugame T., Katanoda K. (2006), “International comparisons of
cumulative risk of breast and prostate cancer, from cancer incidence in
five continents vol”, Viii. Jpn. J. Clin. Oncol, pp.399–400.
28. Medjakovic S., Mueller M., Jungbauer A., (2010), “Potential health-
modulating effects of isoflavones and metabolites via activation of ppar
and ahr”, Nutrients, pp.241–279.
29. Mehran Dastmalchi, Sangeeta Dhaubhadel (2015), “Soybean chalcone
isomerase: evolution of the fold, and the differential expression and
localization of the gene family”, Planta, Vol. 241, Is. 2, pp 507-523.
30. Messina M. (2014), “Soy foods, isoflavones, and the health of
postmenopausal women”, Am. J. Clin. Nutr, pp.423–430.
31. Nguyen HT, Quach TN, Tran LS, Valliyodan B, , Kumar
R, Neelakandan AK, Guttikonda SK, Sharp RE (2014), “Functional
analysis of water stress-responsive soybean GmNAC003 and GmNAC004
transcription factors in lateral root development in arabidopsis”, PLoS
47
One. 9(1).
32. Olhoft, P.M., D.A. Somer (2001), “L-Cystein increases
Agrobacteriummediated T – DNA delivery into soybean
cotyledonarynode cells”, Plant Cell Report, 20, pp.706-711.
33. Phetnoo N., Werawatganon D., Siriviriyakul P. (2013), “Genistein could
have a therapeutic potential for gastrointestinal diseases”, Thai J.
Gastroenterol, pp.120–125.
34. Qu J, Liu SY, Wang PW, Guan SY, Fan YG, Yao D, Zhang L, Dai JL
(2016), “Agrobacterium-mediated transformation of the β-subunit gene
in 7S globulin protein in soybean using RNAi technology”, Genetics
Molecular Research, 15(2).
35. Verdrengh M., Jonsson I.M., Holmdahl R., Tarkowski A. (2003),
“Genistein as an anti-inflammatory agent”, Inflamm. Res. Off. J. Eur.
Histamine Res. So, pp.341–346.
36. Vitale D.C., Piazza C., Melilli B., Drago F., Salomone S. (2013),
“Isoflavones: Estrogenic activity, biological effect and
bioavailability”, Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet, pp.15–25.
37. Wang L, Liu X, Meng X, Wu G, Xu F (2018), “Cloning and expression
analysis of a chalcone isomerase (CnCHI) gene from Chamaemelum
nobile”, Biotechology, 17(1), pp.19-25.
38. Wang RK, Zhan SF, Zhao TJ, Zhou XL, Wang CE (2015), “Positive
selection sites in tertiary structure of Leguminosae chalcone
isomerase 1”, Genetics and Molecular Reasearch, pp.1.
39. Wang W, Wang L, Wan B, Zhang P, Zhan C, Huang D (2012), “Chalcone
isomerase in grape vine: gene expression and localization in the
developing fruit”, Biologia Plantarum, 56(3), pp.545-550.
40. Wenbo Giang, Qinggang Yin, Ranran Wu, Guangshun Zheng, Jinyue
Liu, Richard A. Dixon, Yongzhen Pang (2015), “Role of a chalcone
isomerase-like protein in flavonoid biosynthesis in Arabidopsis
48
thaliana”, Journal of Experimental Botany, pp.7165-7179.
41. Yang WJ, Wu YM, Tang YX (2009), “Expressing and functional analysis
of GmMYBJ6 from soybean”, Yi Chuan, 31(6).
42. Yu O, Shi J, Hession AO, Maxwell CA, McGonigle B, Odell JT (2003),
“Metabolic engineering to increase isoflavone biosynthesis in soybean
seed”, Plant Physiology, pp.1
43. Yue Zhang, Han Xia, Mei Yuan, Chuanzhi Zhao, Aiqin Li, Xingjun Wang,
(2011), “Cloning and expression analysis of peanut (Arachis hypogaea L.)
CHI gene”, Electronic Journal of Biotechnology, pp.0717-3458.
Một số trang web
44. http://ajcn.nutrition.org/content/83/5/1118.long
45. http://en.wikipedia.org/wiki/Isoflavone
46. http://eol.org/pages/641527/overview
47. http://khoahoc.tv/doisong/yhoc/suc-khoe/37895_dau-nanh-phuong-
thuoc-quy-gia.aspx
48. http://www.agi.gov.vn/files/files/HNKH2017/3_%20Bao%20cao%20dau
%20tuong%20(N_V_Dong)%20%5BCompatibility%20Mode%5D%20t
hu.pdf
49. http://www.ducquanam.com/SuuTam/chuabenh_daunanh.htm
49
50. http://www.isoflavone.info/what-are-isoflavone.php
PHỤ LỤC 1. Thành phần các môi trường trong tái sinh cây đậu tương
Môi Thành phần trường
Nảy mầm Muối B5(3,052 g/l) + đường (30 g/l) + agar (9 g/l), pH = 5,8 +
(GM) vitamin B5 (1 mg/l).0
Đồng nuôi Muối B5 (0,316 g/l ) + MES (3,9 g/l) + đường (30 g/l) + agar (9
cấy (CCM) g/l), pH = 5,4. Bổ sung trong box vitamin B5 (1 mg/l) +
acetosyringon (0,2 mM) + L-cystatin (400 mg/l) + sodium
thiosulfate (200 mg/l) + DTT (154 mg/l) + GA3 (0,25 mg/l) +
BAP (2,5 mg/l)
Cảm ứng -Môi trường SIM lần 1: Muối B5 (2,0 g/l ) + MES (0,6 g/l) +
tạo chồi đường (30 g/l) + agar (9 g/l), pH = 5,6. Bổ sung trong box
(SIM) vitamin B5 (1 mg/l) + BAP (3,5 mg/l) + cefotaxim 400 mg/l +
kanarmycin 50 mg/l
- Môi trường SIM lần 2: Muối B5 (3,052 g/l ) + MES (0,59 g/l)
+ đường (30 g/l) + agar (9 g/l), PH = 5,6. Bổ sung vitamin B5
(1 mg/l) + BAP (3,5 mg/l) + 400 mg/l + kanarmycin 75 mg/l
Kéo dài MS (4,3 g/l) + MES (0,6 g/l) + đường (30 g/l) + agar (9 g/l),
chồi (SEM) pH = 5,6. Bổ sung trong box vitamin B5 + L-asparagine + L-
pyron glutamic acid + IAA (0,1 mg/l)+ GA3 (0,5 mg/l) +
cefotaxim 400 mg/l + kanarmycin 50 mg/l
Tạo rễ MS (1,58 g/l) + MES (0,59 g/l) + đường (30 g/l) + agar (9 g/l),
(RM) pH = 5,6. Bổ sung IAA (0,5 mg/l)+ vitamin B5 (1 mg/l) +
50
cefotaxim 400 mg/l + kanarmycin 50 mg/l
51
PHỤ LỤC 2. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pcB301
