Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro cây Nhàu (Morinda Citrifolia L.)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

JULY SENGMANIVONG

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY IN VITRO CÂY NHÀU (Morinda Citrifolia L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN, NĂM 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

JULY SENGMANIVONG

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY IN VITRO CÂY NHÀU (Morinda Citrifolia L.)

Ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ THU NGÀ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN, NĂM 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn: “Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro

cây Nhàu (Morinda Citrifolia L.)” là công trình nghiên cứu của tôi. Mọi kết quả

được liệt kê trong luận văn là kết quả tôi thu được, hoàn toàn không sao chép bất

kì kết quả nào của các bài luận văn đã có trước đây. Về những tài liệu tham khảo

đều có trích dẫn đầy đủ trong bài luận văn.

Thái Nguyên, tháng 6 năm 2019

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

July SENGMANIVONG

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Thu Ngà

người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình

nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Thứ hai tôi xin được cảm ơn các thầy giáo, cô giáo thuộc khoa Sinh học,

bộ phận Sau đại học của Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái

Nguyên đã nhiệt tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa

học.

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới cô Trần Thị Hồng, cán bộ phòng

thí nghiệm Công nghệ tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học

Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi tiến hành luận văn này.

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân trong

gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã tạo điều kiện, giúp đỡ và động viên tôi trong

suốt thời gian học tập.

Thái Nguyên, tháng 6 năm 2019

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

July SENGMANIVONG

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii

MỤC LỤC............................................................................................................ iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................... iv

DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... v

DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... vi

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1

1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2

3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3

1.1. Giới thiệu chung về cây Nhàu ...................................................................... 3

1.1.1. Đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học ................................................. 3

1.1.2. Giá trị dược liệu ......................................................................................... 6

1.1.3. Tình hình nghiên cứu cây Nhàu trên thế giới và ở Việt Nam ................. 10

1.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng .................................... 13

1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro ............................................ 13

1.2.2. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro ......................................... 15

1.3. Thành tựu trong bảo tồn nguồn gen thực vật in vitro ................................. 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 20

2.1. Vật liệu và hóa chất .................................................................................... 20

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 20

2.1.2. Hoá chất, thiết bị ...................................................................................... 20

2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .............................................................. 20

2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 21

2.3.1. Nhóm phương pháp nuôi cấy in vitro ...................................................... 21

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

2.3.2. Phương pháp đưa cây ra vườn ươm ........................................................ 24

2.3.3. Phương pháp xử lí và tính toán số liệu .................................................... 25

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................... 26

3.1. Nghiên cứu công thức khử trùng tạo mẫu sạch .......................................... 26

3.1.1. Kết quả khử trùng hạt cây Nhàu .............................................................. 26

3.1.2. Kết quả khử trùng đoạn thân cây Nhàu ................................................... 29

3.2. Kết quả tạo chồi in vitro cây Nhàu ............................................................. 30

3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy ......... 31

3.2.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát sinh chồi in vitro ............................ 34

3.3. Nghiên cứu khả năng tạo rễ cây Nhàu ........................................................ 36

3.3.1. Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh rễ cây Nhàu ................................. 37

3.3.2. Ảnh hưởng của IAA đến sự phát sinh rễ cây Nhàu ................................. 40

3.4. Nghiên cứu giá thể thích hợp đưa cây Nhàu ra ngoài tự nhiên .................. 44

3.4.1. Giai đoạn bầu đất ..................................................................................... 44

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

: 2,4D-Dichlorophenoxy Acetic Acid

2,4-D

BAP

: 6-Benzyl Amino Purin

BTĐ

: Bệnh tiểu đường

: Cộng sự

: Công thức

CTN

: Cao trái Nhàu

: Cyclophosphamid

DPPH

: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazy

ĐC

: Đối chứng

ĐTĐ

: Đái tháo đường

GA3

: Gibberellin

IAA

: Indoly Acetic Acid

IBA

: Indoly Butyric Acid

Kinetin

: 6-furturylamino purine

: Khử trùng

: Murashige - Skoog (1962)

NAA

: α - Napthalen Acetic Acid

: Noni Juice

TNJ

: Tahitian Noni Juice

: Ovalbumin + Al(OH)3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng javen đến sự nảy

mầm của hạt cây Nhàu .................................................................. 28

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy ............. 33

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy ......... 35

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Nhàu ..................... 39

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ cây Nhàu ..................... 42

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của giá thể đến cây trồng trong bầu ........................... 44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Bảng 3.7. Kết quả ra cây ngoài vườn ươm .................................................... 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cây, hoa và quả Nhàu ..................................................................... 4

Hình 1.2. Hạt quả Nhàu ................................................................................... 6

Hình 3.1. Hạt quả Nhàu sau khi khử trùng nảy mầm .................................... 28

Hình 3.2. Đoạn thân cây Nhàu sau khử trùng trên môi trương MS cơ bản .. 30

Hình 3.3 Cây Nhàu trên môi trường chứa BAP với nồng độ thay đổi......... 34

Hình 3.4 Cây Nhàu trên môi trường chứa Kinetin ...................................... 36

Hình 3.5. Cây Nhàu trên môi trường chứa IBA 0,9mg/l ............................. 40

Hình 3.6. Cây Nhàu trên môi trường chứa IAA 0,5mg/l ............................. 43

Hình 3.7. Cây Nhàu in vitro hoàn chỉnh được trồng trong bầu đất .............. 45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.8. Cây Nhàu in vitro trồng ở vườn ươm ............................................ 46

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Trong những thập niên gần đây, nhờ ứng dụng khoa học kỹ thuật trong

nghiên cứu, khai thác nguồn dược liệu đã có nhiều bước tiến đáng kể, góp phần

nâng cao hiệu quả điều trị, hiệu quả kinh tế. Tuy nhiên cùng với điều đó, nguồn

tài nguyên cũng cạn kiệt dần. Vì vậy, sử dụng hợp lý và tìm nguồn dược liệu

mới, dược liệu thay thế là hết sức cần thiết.

Cây Nhàu thuộc họ Coffee Rubiaceae là giống cây dược liệu quý được trồng

khá phổ biến và cũng là cây dược liệu có nhiều ứng dụng trong y học cổ truyền

của dân tộc Lào và nhiều nơi trên thế giới. Hầu hết các bộ phận của cây đều đã

được sử dụng làm thức ăn, đồ uống. Trong dân gian, cây được dùng làm thuốc với

các tác dụng chữa bệnh như: Mất ngủ, đau lưng, hạ huyết áp, loét dạ dày, viêm

khớp, thuốc nhuận tràng, điều kinh, giảm đau xương khớp, chống oxy hóa, hỗ trợ

chữa trị ung thư,… Hiện nay, việc chữa bệnh bằng thuốc có nguồn gốc từ thảo

dược đã và đang là một trong những xu hướng thu hút sự quan tâm và nghiên cứu

của các nhà khoa học. Chính vì những lợi ích thiết thực với cuộc sống, cây Nhàu

là loại dược liệu cần nhân giống và phổ biến rộng rãi.

Trong những năm trở lại gần đây, nhu cầu sử dụng các sản phẩm từ cây

Nhàu tăng đột biến, đặc biệt nhu cầu từ nước ngoài tăng mạnh, gần như các sản

phẩm từ cây Nhàu luôn trong tình trạng khan hiếm hàng. Trong nước, người tiêu

dùng đã biết đến nhiều hơn các công dụng từ trái Nhàu, dẫn đến nhu cầu nội địa

tăng. Nhiều nơi đã có truyền thống dùng rễ Nhàu được thái mỏng phơi khô sắc

uống để trị đau lưng, phong thấp. Phụ nữ một số vùng còn ăn trái Nhàu chín để

làm nhuận trường, hoạt huyết hoặc điều hòa kinh nguyệt…[18]. Bên cạnh đó còn

có nhiều công ty dược trong nước và trên thế giới đã sản xuất thuốc viên và thuốc

nước từ cây thuốc này với mục đích chữa nhiều bệnh [11].

Việc bảo tồn các giống cây dược liệu nói chung và cây Nhàu nói riêng có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

thể thực hiện bằng nhiều biện pháp truyền thống như chiết cành, ghép cành và

gieo hạt. Tuy nhiên hiệu quả đạt được chưa cao, khó khăn trong chọn cành chiết

- ghép, tỉ lệ hạt nảy mầm yếu… Một vài năm trở lại đây người dân đã dùng cây

Nhàu phổ biến rộng rãi để chữa bệnh. Thực trạng trên đang đặt ra những vấn đề

cần giải quyết.

Sự phát triển của ngành công nghệ sinh học, đặc biệt là việc áp dụng kỹ thuật

nuôi cấy mô tế bào thực vật sẽ giúp cho việc nhân giống, tạo nguồn sản phẩm đáp

ứng cho thị trường trong nước và tiến tới xuất khẩu. Đồng thời giúp giải quyết được

việc làm và nâng cao đời sống vật chất, tinh thần cho người dân.

Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên

cứu môi trường nuôi cấy in vitro cây Nhàu (Morinda Citrifolia L.)” nhằm bảo

tồn nguồn gen quý, nhân giống cây sạch bệnh phục vụ sản xuất, nâng cao chất

lượng và phẩm chất cây Nhàu.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được môi trường nuôi cấy in vitro thích hợp ở cây Nhàu.

3. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu tạo mẫu sạch cây Nhàu.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng BAP, Kinetin

đến sự tạo đa chồi ở cây Nhàu.

- Nghiên cứu môi trường tạo rễ cây Nhàu trong ống nghiệm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

- Nghiên cứu quá trình ra cây ngoài tự nhiên.

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây Nhàu

1.1.1. Đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học

Cây Nhàu có tên khoa học là Morinda citrifolia L. thuộc họ Coffee

Rubiaceae, Bộ Long đởm (Gentianales).

Tên nước ngoài: Great morinda, Indian Mulberry (India), Dog Dumpling

(Barbados), Mengkudu (Malaysia), Tahiti Noni (Ameraca).

Phân loại khoa học

Giới: Plantea

Ngành: Magnoliophyta

Lớp: Magnoliopsida

Bộ: Gentianales

Họ: Rubiaceae

Chi: Morinda

Loài: Morinda citrifolia L.[38].

Cây Nhàu còn gọi là cây Noni Berry, cây Ngao núi, Nhàu rừng, Nhàu núi,

cây Giàu [3], [8], [15].

Chi Morinda thuộc họ Coffee Rubiaceae và bao gồm khoảng 80 loài:

Morinda citrifolia Linn (Morinda citrifolia L.), thường được gọi là Noni hoặc

Mulberry Ấn Độ. Nhàu đã được sử dụng như một cây thuốc của người Polynesia

200 năm trước. Hiện nay, Nhàu là một loại cây điển hình được tìm thấy ở các

vùng khí hậu nhiệt đới của Hoa Kỳ (Hawaii), Brazil, Tahiti, Malaysia và Quần

đảo Fiji. Nghiên cứu đầu tiên về tác dụng của trái cây Nhàu của Heinicke đã

chứng minh rằng Nhàu có chứa xeronine alkaloid. Mặc dù trong trái cây Nhàu

lượng xeronine tự do không đáng kể, chúng vẫn chứa một lượng đáng kể tiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

chất của xeronine, được đặt tên là proxeronine. Một trong những lý giải cho tác

dụng dược liệu của trái cây Nhàu là xeronine có thể điều chỉnh cấu trúc và tính

ổn định của các protein đích. Các tác dụng có lợi của trái cây Nhàu, chẳng hạn

như trong điều hòa kinh nguyệt, tăng huyết áp, bỏng, trầm cảm, xơ vữa động

mạch, tiêu hóa, giảm đau và nhiều tác dụng khác [26].

Hình 1.1. Cây, hoa và quả Nhàu

(Ảnh chụp của tác giả luận văn tại tỉnh Champasak Lào, 3/4/2018)

Cây Nhàu có khoảng 40 loài trên thế giới. Ở Việt Nam hiện đã biết 9 loài

[2]. Nhàu thường mọc ở vùng nhiệt đới và ôn đới. Ở Việt Nam, Nhàu mọc nhiều

ở những vùng ẩm thấp dọc theo bờ sông bờ suối, ao hồ hoặc mương rạch ở khắp

các tỉnh miền Nam, một số tỉnh miền Trung và rải rác ở miền Bắc. Loài này được

miêu tả khoa học lần đầu tiên năm 1753 [38].

Cây Nhàu là một trong những loài cây được xếp vào nhóm cây là vị thuốc quý

ở Việt Nam theo Đỗ Tất Lợi. Một loại cây khá quen thuộc với người dân miền Nam.

Cây Nhàu có nguồn gốc từ châu Úc và châu Á, phân bố ở các quốc gia khác nhau

trong đó có Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Lào ... Cây Nhàu thường

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

mọc ở độ cao 0 đến 500m tính từ mực nước biển [15].

Nhàu là loại cây ưa sáng, ưa ẩm. Khi chưa trưởng thành, cây mọc tự nhiên

có thể núp dưới tán cây khác. Tuy nhiên để có điều kiện tốt nhất để sinh trưởng

và phát triển cây cần đầy đủ ánh sáng. Chính vì vậy, người ta thường thấy loại

cây này trong rừng thứ sinh, nương rẫy của nhiều tỉnh. Loại cây này dễ thích nghi

ở môi trường đất ẩm, đặc biệt là đất bazan, cạnh mương, hồ… Loại đất trồng có

chứa tỉ lệ mùn, tơi xốp và dễ dàng thoát nước. Cây được trồng vào thời vụ xuân,

khi thời tiết có mưa phùn hoặc đầu mùa mưa [4].

Cây Nhàu là cây thân gỗ, thân cây nhẵn, có nhiều cành, thường có chiều

cao khoảng từ 6 - 8 m. Cành non mập, có 4 cạnh rõ, có màu lục hoặc nâu nhạt.

Cành non màu xanh, tiết diện vuông, có rãnh, nhẵn; cành già tiết diện tròn, màu

nâu xám.

Lá: Lá mọc đối, hình bầu dục, nhọn ở đầu, dài 12 - 15 cm, rộng 6 - 8 cm,

mép uốn lượn, mặt trên của lá có màu xanh đậm, bề mặt bóng, mặt dưới màu

xanh nhạt. Gân lá hình lông chim, nổi rõ ở mặt dưới, có 6 - 7 cặp gân phụ. Cuống

lá 1 - 2 cm. Lá kèm nằm giữa 2 lá mọc đối, hình xoan, dài 1 - 1,5 cm, màu xanh

nhạt.

Hoa: Cụm hoa đầu hình tròn hay hơi bầu dục, ở ngoài nách lá. Trục cụm

hoa hình trụ, màu xanh, nhẵn, dài 1 - 2 cm. Đáy cụm hoa có 3 phiến hẹp, dài 5-

8 mm. Hoa đều, lưỡng tính. Đài hoa là một gờ tròn. Có 5 cánh hoa, ống tràng

hình phễu, màu xanh nhạt, cao 7 - 12 mm; có nhiều lông trắng bên trong; 5 thùy

dài khoảng 5 - 8 mm, màu trắng, hình bầu dục, đầu nhọn, đỉnh có một mấu nhỏ

cong vào trong. Khi hoa nở các thùy cong xuống phía dưới; tiền khai van. Có 5

nhị, bằng nhau, rời, gắn ở phần loe của ống tràng xen kẽ với các cánh hoa, chỉ

nhị rất ngắn. Bao phấn hình mũi tên, màu vàng nhạt, dài khoảng 4 mm; 2 ô, mở

dọc, hướng trong, đính gốc. Hạt phấn rời, hình cầu, màu vàng nhạt. Lá noãn 2, ở

vị trí trước sau, bầu dưới, 2 ô, mỗi ô 1 noãn, đính trung trụ. Vòi nhụy dạng sợi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

màu xanh nhạt, dài 5 mm; 2 đầu nhụy dạng phiến mỏng, dài 3 mm, màu xanh.

Đĩa mật dày, hình khoan, màu vàng. Cây ra hoa quanh năm, tập trung nhiều nhất

vào khoảng tháng 11 đến tháng 2 năm sau, cho quả vào khoảng tháng 3 - 5 [38].

Quả: Quả hạch kép do bầu noãn và một phần lá đài của các hoa trên cụm

hoa dính nhau tạo thành. Quả chín vào khoảng thời gian từ tháng 7 đến tháng 8.

Quả khi còn non có màu xanh nhạt, khi chín có màu trắng hoặc vàng nhạt. Quả

có chiều dài khoảng từ 5 - 6 cm, rộng từ 3 - 4 cm. Quả nhẵn bóng, mùi nồng, trên

quả còn vết tích các đĩa mật. Quả thịt, hình trứng, xù xì gồm nhiều quả hạch dính

vào nhau, mềm, ăn được.

Hạt: Hạt nhiều, hình bầu dục, một đầu nhọn, màu nâu đen [3], [8], [15], [38].

Hình 1.2. Hạt quả Nhàu

(Ảnh chụp của tác giả luận văn tại tỉnh Champasak Lào, 3/4/2018)

1.1.2. Giá trị dược liệu

Cây Nhàu đã và đang được các cơ sở nghiên cứu, sản xuất dưới nhiều dạng

bào chế khác nhau để chữa bệnh và bồi dưỡng sức khỏe. Công ty cổ phần xuất

nhập khẩu Y tế Domesco, tỉnh Đồng Tháp sản xuất thuốc viên Morinda

Citriforlia, nước ép trái Nhàu Doromi, rượu Morinda trái Nhàu. Những sản

phẩm này đã được Bộ Y tế cấp số đăng ký và lưu hành trên toàn quốc. Đặc biệt

viên bao phim Morinda Citriforlia đã và đang được xuất khẩu ra thị trường thế

giới [4].

Năm 1996, vì các đặc tính dinh dưỡng và điều trị của Nhàu, NJ thương mại

đã được bán trên thị trường như một chất bổ sung chế độ ăn uống. Sau đó, vào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

năm 2003, Ủy ban Châu Âu đã phê duyệt nước ép Nhàu như một loại thực phẩm

mới của Tổng cục Bảo vệ Sức khỏe và người tiêu dùng. Nhiều nhà khoa học đã

nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong quả Nhàu, cũng như trong

các bộ phận khác của cây, như lá, rễ, vỏ rễ, hạt, thân và hoa, vì những lợi ích

tiềm năng của chúng đối với sức khỏe [26].

Trong y học cổ truyền, Nhàu được xem là cây dược liệu quý được dùng để

chữa nhiều bệnh như: mất ngủ, đau lưng, huyết áp cao, an thẩn, giảm đau, tăng

cường sinh lực,...Tất cả các bộ phận của cây Nhàu đều có dược tính.

Theo Đông y

Trên thế giới, đặc biệt ở Mỹ có nhiều công trình khoa học nghiên cứu về tác

dụng chống khối u và kích thích miễn dịch của trái cây Nhàu trồng ở Hawai [37].

Tại Việt Nam, Nhàu là một trong số 300 vị thuốc Nam được một thầy thuốc

nổi tiếng của miền Nam trước cách mạng Tháng Tám khuyến khích sử dụng xen

kẽ với thuốc Bắc để tiết kiệm cho người bệnh [2].

Nhàu rừng và rễ Nhàu cũng là hai trong số 208 vị thuốc Nam được Việt Cúc

ghi lại trong “Nam dược tính yếu lược” (1965). Đặc biệt từ năm 1952 đã được

công bố nhiều nghiên cứu về tác dụng của rễ Nhàu trên các bệnh nhân [4].

Đỗ Tất Lợi, nhà nghiên cứu nổi tiếng về “Những cây thuốc và vị thuốc Việt

Nam” cũng đã đề cập đến cây Nhàu và xếp vị thuốc này vào danh mục những vị

thuốc về huyết áp [15].

Hiện nay, nhiều xí nghiệp dược trong nước cũng đã sản xuất thuốc viên và

thuốc nước chiết xuất từ Nhàu.

Các bộ phận cây Nhàu được dùng làm thuốc:

Rễ Nhàu: Thu hái vào mùa đông. Ngoài công dụng nhuộm màu vải, đem

ngâm rượu uống chữa bệnh nhức mỏi, đau lưng, dịch trích toàn phần từ rễ Nhàu

có tác dụng làm hạ huyết áp…(có khi dùng quả Nhàu non thái mỏng sao khô

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

thay rễ).

Quả Nhàu: Thu hoạch vào mùa hạ. Có mùi khai mạnh, có vị cay nồng và

hơi chát ăn với muối dễ tiêu, nhuận tràng, làm thuốc điều kinh, trị băng huyết,

bạch đới, ho cảm, hen, đau gan, tiểu đường. Nướng chín ăn để chữa kiệt lỵ. Ăn

ngày 1-3 quả. Vì mùi hăng, nồng và cay nên khó ăn được nhiều.

Lá Nhàu: Thu hoạch quanh năm. Dùng tươi, rửa sạch giã nát đắp chữa mụn

nhọt, mau lành, chóng lên da non. Lá Nhàu phơi khô, thái nhỏ sắc uống chữa kiệt

lỵ, chữa sốt và làm thuốc bổ.

Vỏ cây Nhàu: Nấu nước cho phụ nữ sau khi sinh uống bổ máu [3], [15], [19].

Công dụng và liều dùng: Dùng rễ Nhàu sắc uống hàng ngày thay nước chè

chữa cao huyết áp, uống hàng tháng với liều 30 - 40 g rễ, sắc và uống thay nước

chè trong ngày. Sau 15 hôm sẽ có kết quả, uống tiếp tục 2 - 3 tháng liền sau đó

với liều giảm xuống. Có thế nấu thành cao, hoặc thái nhỏ, sao vàng, ngâm rượu

uống. Quả non thái nhỏ, sao vàng, dùng thay rễ. Lá dùng giã nát đắp ngoài hoặc

sắc uống với liều 8 - 10 g sắc với 500 ml nước, chia làm 2 lần uống trong ngày

chữa bệnh đường ruột, chữa sốt, cảm, nhức đầu, chóng mặt [3], [15], [19].

Một số bài thuốc từ cây Nhàu:

Chữa huyết áp cao: Rễ Nhàu 30 - 40 g, sắc uống thay nước chè, sau hai tuần

là có kết quả, sau đó giảm bớt liều, uống liên tục trong 2 - 3 tháng.

Chữa nhức mỏi tay chân, đau lưng: quả Nhàu non thái mỏng sao khô, 300g

ngâm trong 2 lít rượu 30 - 40 độ sau hai tuần, uống ngày hai lần, lần một ly con

30 - 40 ml.

Chữa lỵ, tiêu chảy, cảm sốt: lá Nhàu tươi 3 - 6 lá, rửa sạch nấu với 500 ml

đun đến khi nước còn 200 ml chia hai lần uống trong ngày. Uống liên tục trong

2 - 5 ngày [4], [15].

Tác dụng dược lý của cây Nhàu: Theo Đỗ Tất Lợi và nhiều nhà khoa học

khác, khi thí nghiệm trên động vật, cây Nhàu có những tác dụng sau: nhuận tràng

nhẹ và lâu dài, lợi tiểu nhẹ, làm êm dịu thần kinh giao cảm, hạ huyết áp, không

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

độc, không gây nghiện [15].

Năm 2000, Phạm Thiệp và cs đã công bố dùng đúng cách thì giá trị chữa

bệnh từ cây Nhàu rất hiệu quả. Rễ Nhàu có tác dụng nhuận tràng, lợi tiểu, làm

êm dịu thần kinh giao cảm, giảm đau nhức, hạ huyết áp; quả có tác dụng nhuận

tràng và lợi tiểu; lá có tác dụng làm tăng lực, hạ sốt, điều hòa kinh nguyệt [21].

Theo Tây y

Do hiệu quả của cây Nhàu, các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu đối

tượng này. Năm 1848, Anderson, nhà khoa học người Pháp đã tách được từ rễ

Nhàu chất moridin có công thức tổng quát C28H30O15. Tiếp theo nhiều nhà khoa

học khác đã tiếp tục nghiên cứu những công trình này [27].

Nhàu có nhiều chất selenium [15]. Hai công trình nghiên cứu điển hình cho

thấy TNJ giúp cơ thể khỏe mạnh, cải thiện sức khỏe và tinh thần, giúp điều hòa

cơ thể. Công trình thứ nhất: “Đánh giá sự thay đổi chất lượng cuộc sống trong

thử nghiệm lâm sàng về Nhàu” được công bố tại hội thảo của Hội Nghiên cứu

Chất lượng cuộc sống Quốc tế lần thứ 12, tổ chức tại California, Mỹ, năm 2005.

và công trình nghiên cứu “Tác dụng của Nhàu lên chất lượng cuộc sống” đăng

trên Tạp chí Y khoa Alternative and Complementary Medicine” [33].

Khi phân tích dược tính của rễ Nhàu, một số tác giả đã thí nghiệm trên vật

nuôi của phòng thí nghiệm và nhận thấy nhiều tính chất của rễ Nhàu: Nhuận

tràng nhẹ, lợi tiểu nhẹ và lâu dài; Làm êm dịu thần kinh trên thần kinh giao cảm;

Hạ huyết áp kéo dài; Rất ít độc và không gây nghiện [4].

Như vậy, có thể nói từ lâu cây Nhàu đã được nghiên cứu và sử dụng trong

y học cổ truyền cũng như trong y học hiện đại.

Y học ngày nay đã biết rất rõ khi thần kinh con người bị căng thẳng sẽ dẫn

đến trương lực cơ bắp gia tăng, hoạt động nội tạng bị rối loạn, huyết áp tăng,

lượng bạch cầu giảm…Trong điều kiện như vậy, tất cả các biện pháp hoặc các

dược chất làm ổn định được thần kinh, trong đó có rễ Nhàu hoặc trái Nhàu đều

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

có khả năng giúp cải thiện tình hình. Tuy nhiên đối với các bệnh có tổn thương

thực thể hoặc các chứng viêm, nhất thiết phải cần các vị thuốc hoặc các phương

pháp đặc trị mà rễ Nhàu không thể thay thể được [39].

Thành phần hóa học trong rễ Nhàu chứa glucozit anthraquinon - còn gọi là

morinda C28H30O15: có tinh thể hình kim màu vàng, tan trong nước sôi, ít tan

trong nước lạnh, không tan trong ete, tan trong các chất kiềm và cho màu vàng

cam. Tác giả Balakrishna và cs (1961), đã xác định trong cây Nhàu không phải

chỉ có một chất anthraglucozit morinda mà là một hỗn hợp gồm nhiều chất

anthraglucozit như: damnacantal hay l-metoxy-2-focmyl-3-oxyanthraquinon,

chất l-metoxyrubiazin hay l-metoxy-2-metyl-3- oxyanthraquinon, chất al-izarin,

chất morinda hay 1-5-6-trioxy-2-metylanthraquinon và chất l-oxy-2-3-

dimetoxyanthraquinon [29].

Các nước ở Châu Á cũng dùng các bộ phận của cây Nhàu để làm thuốc. Ở

Trung Quốc, Nhật Bản, nước sắc rễ Nhàu dùng làm thuốc bổ, thuốc hạ sốt. Ở

Đài Loan, nước sắc rễ Nhàu dùng chữa kiết lỵ. Ở Philipin, cao toàn phần rễ Nhàu

chữa cao huyết áp, sưng huyết trĩ, xuất huyết não. Ở Malaysia, lá Nhàu hơ nóng

đắp lên ngực, bụng chữa ho, nôn mửa, đau bụng, lách to. Nước ép từ quả chữa

ho, sốt, tiểu tiện khó, đái tháo đường, giun sán, kinh nguyệt không đều. Dịch hãm

từ vỏ, rễ, quả dùng để rửa vết thương [4].

1.1.3. Tình hình nghiên cứu cây Nhàu trên thế giới và ở Việt Nam

Trên Thế giới:

Năm 2001, Wang và Su đã nghiên cứu về hiệu quả phòng ngừa ung thư của

Morinda citrifolia (Noni). Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc ngăn ngừa sự hình

thành chất gây ung thư và hoạt động chống oxy hóa của Tahiti Noni Juice (TNJ)

từ trái Nhàu có thể góp phần vào tác dụng phòng ngừa ung thư của Morinda

citrifolia [37].

Năm 2003, Stalman và cs đã tiến hành điều hòa sinh tổng hợp anthraquinone

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

trong nuôi cấy tế bào Nhàu Morinda citrifolia L. Kết quả cho thấy, khi nuôi cấy

tế bào Morinda citrifolia L. có khả năng tích lũy một lượng đáng kể

anthraquinone và sự sinh tổng hợp anthraquinone ở Nhàu bị ức chế mạnh bởi 2,4

- D, nhưng ít hơn nhiều khi sử dụng NAA. Cả hai auxin này đều ngăn cản sự

hoạt động của synthase isochorismate dẫn đến làm giảm tích lũy anthraquinone

[36].

Việc tăng cường tích lũy anthraquinone trong nuôi cấy huyền phù Morinda

citrifolia (Noni fruit) của Komaraiah P. và cs (2005), đã thực hiện bằng cách xử

lý chất kích thích, có kiểm soát trong môi trường sinh trưởng. Kết quả cho thấy,

khi bổ sung với liều lượng phủ hợp, làm tăng sản xuất anthraquinone lên 16,74

mg/g trọng lượng khô, cao hơn gấp bốn lần so với nuôi cấy mẫu đối chứng [32].

Ở Việt Nam:

Nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết từ quả Nhàu lên một số chỉ số miễn

dịch của chuột nhắt bị gây suy giảm miễn dịch bằng tia gamma của Phạm Thị

Vân Anh và cs (2004) cho thấy: Với liều 6g/kg/ngày dùng theo đường uống trong

9 ngày liên tục (sau khi chuột được chiếu tia gamma 6 ngày), cao quả Nhàu làm

tăng trọng lượng lách và tuyến ức tương đối, tăng số lượng bạch cầu lympho,

mono, tế bào diệt tự nhiên và tăng cường phản ứng với kháng nguyên OA so với

lô chuột chỉ chiếu tia gamma đơn thuần không được dùng thêm thuốc thử [1].

Nguyễn Trọng Thông và cs (2004) đã đánh giá tác dụng của cao trái Nhàu

(CTN) đến huyết áp (HA) và tim. CTN dạng lỏng (1ml chứa 5g dược liệu) được

sử dụng thực nghiệm với chó, ếch. Kết quả nghiên cứu cho thấy: Với liều 1,5

g/kg và 2,25 g/kg thể trọng theo đường uống, CTN làm hạ huyết áp 20 - 26% và

32 - 50,7 % so với huyết áp ban đầu, duy trì trong 6 giờ. Cao trái Nhàu làm giảm

một phần tác dụng của adrenalin nhưng hầu như không ảnh hưởng đến tác dụng

của nicotin và acetylcholin đối với huyết áp ở chó. CTN ít ảnh hưởng đến tần số

tim nhưng làm giảm biên độ tim ếch cô lập, tác dụng này phụ thuộc vào liều, liều

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

càng cao tác dụng giảm biên độ càng rõ [21].

Nghiên cứu ảnh hưởng của cao lỏng trái Nhàu (CTN) lên chỉ số miễn dịch

của chuột nhắt bị gây suy giảm miễn dịch của tác giả Nguyễn Trọng Thông và

cs (2004) cho thấy, với liều 6g/kg/ngày (dùng theo đường uống trong 5 ngày liên

tục) CTN làm tăng trọng lượng lách và tuyến ức tương đối, tăng số lượng bạch

cầu lympho, mono, diệt tự nhiên, … so với lô chuột chỉ tiêm CY đơn thuần không

được dùng thêm thuốc thử [20].

Đái Thị Xuân Trang và cs (2012) đã đề xuất nghiên cứu: “Khảo sát hiệu quả

điều trị bệnh tiểu đường của cao ethanol rễ, lá, trái xanh và trái chín cây Nhàu

thông qua khả năng chống oxy hóa và hạ đường huyết in vivo và vi vitro”. Tác

động chống oxy hóa được xác định thông qua khả năng làm sạch gốc tự do DPPH

in vitro. Chuột được gây bệnh tiểu đường bằng dung dịch alloxan monohydrate

(AM). Sau đó, chuột bị bệnh tiểu đường được điều trị bệnh với cao ethanol từ

các bộ phận của cây Nhàu. Kết quả cho thấy, sau khi chuột bị bệnh tiểu đường

uống cao chiết cây Nhàu với liều lượng 200 mg/kg x 2 lần/ngày có đường huyết

tương đương nhóm chuột bị bệnh tiểu đường được điều trị với thuốc trị tiểu

đường glucofast và giảm thiểu stress oxy hóa trong thận. Kết quả cũng chứng

minh rằng dịch chiết ethanol cây Nhàu cải thiện khả năng làm sạch gốc tự do

DPPH in vitro [23].

Võ Thị Mai Hương và Trần Thanh Phong (2013) đã tiến hành nghiên cứu

một số đặc trưng hóa sinh và khả năng kháng khuẩn của dịch chiết quả Nhàu

(Morinda citrifolia L.). Kết quả phân tích một số thành phần hóa sinh trong dịch

chiết quả Nhàu cho thấy: Hàm lượng cellulose trong quả Nhàu (19,33 %) cao

hơn hẳn so với đường khử (5,27 %), protein (2,8 %) và lipid (8,75 %). Trong

nghiên cứu này tác giả đã kết luận rằng hoạt độ một số enzyme và các chất chống

oxy hóa trong quả Nhàu khá cao và các chế phẩm flavonoid đều thể hiện hoạt

tính kháng khuẩn mạnh. Trong đó đáng chú ý là 2 loại vi khuẩn Staphylococcus

aureus và Salmonella typhi là nhạy cảm nhất đối với tất cả các chế phẩm nghiên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

cứu [12].

Nhóm nghiên cứu của Vũ Hương Giang và cs (2015) đã tiến hành điều tra

tình hình phân bố và khả năng tái sinh tự nhiên của một số loài Nhàu ở Việt Nam.

Kết quả tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc làm tăng nguồn dược

liệu [5].

Tác giả Đái Thị Xuân Trang và cs (2016) trong nghiên cứu của mình đã cho

thấy sự thay đổi cấu trúc mô bệnh học tụy tạng của chuột bệnh đái tháo đường

được điều trị bằng cao ethanol từ rễ Nhàu nhằm đánh giá hiệu quả điều trị bệnh

đái tháo đường bằng dịch chiết từ rễ cây Nhàu. Kết quả thí nghiệm chứng minh

cao ethanol từ rễ của cây Nhàu có tác dụng làm giảm glucose huyết trên chuột

bệnh đái tháo đường sau 20 ngày điều trị. Tiêu bản hiển vi lát cắt ngang tụy tạng

chuột cho thấy cấu trúc chung, tụy ngoại tiết và ống bài xuất có sự khác biệt về

mô bệnh học giữa tụy chuột bình thường, chuột bệnh đái tháo đường và chuột đã

điều trị khỏi bệnh bằng cao rễ Nhàu. Cao ethanol rễ Nhàu không có hiệu quả cải

thiện tình trạng tổn thương của tụy nội tiết sau 20 ngày điều trị [24].

1.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng

1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro

Mẫu nuôi cấy: Các nhân tố khi chọn lọc mẫu cấy bao gồm kiểu gen, cơ quan

được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn

mẫu [7].

Điều kiện nuôi cấy: Điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình

sinh trưởng phát triển của mẫu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nhiệt độ nuôi

cấy thích hợp là từ 20 - 27oC. Điều kiện ánh sáng từ 1000 – 3000 lux. Độ pH là

5,7 - 5,8 [7].

Chất kích thích sinh trưởng thực vật: Các chất kích thích sinh trưởng có vai

trò rất quan trọng trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bằng cách cung

cấp các chất kích thích ở một mức hợp lý thì chúng ta có thể điều khiển được quá

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

trình phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy.

Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lí học

thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất. Auxin là những hoocmon thực vật có

tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hóa cơ quan, kiểu tác

động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hóa màng tế bào. Nhóm auxin

bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α-naphtylaxetic

axit (NAA), Indotaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc nhưng có tác dụng

kích thích quá trình phân chia tế bào và thường được sử dụng nhiều nhất, NAA

có tác dụng tạo rễ cho cây non [31].

Nhóm cytokinin là nhóm chất hóa học có ảnh hưởng quyết định đến kích

thích phân chia tế bào. Đại diện cho nhóm cytokinin gồm: Kinetin; 6 - Benzyl

amino purine (BAP); 6-Dimethylalylamnino purine (2iP); Zeatin. Hiện nay một

thế hệ mới của chất điều hòa sinh trưởng, chẳng hạn như thidiazuron (TDZ) -một

cytokinin thuộc các phenylureas, đang nổi lên như là một thay thế thành công

cho tái sinh trực tiếp với tần số cao của phôi vô tính [31].

Nhóm gibberellin là nhóm được phát hiện qua quá trình nghiên cứu bệnh

nấm lúa von. Nó tác động làm tế bào giãn ra và phân chia, làm cây lùn có thể cao

lên được, như ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng. Đại diện

cho nhóm này là axit gibberillic (GA3), được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp

[31].

Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây

nhưng gần đây nó mới được coi là hoocmon thực vật. Ethylen thường được sử

dụng để làm chín quả ở chuối, ra hoa đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnh hưởng đến

quá trình phân bào. Đối với cà chua trong điều kiện ethylen nồng độ cao sẽ kéo

dài không ra rễ của thân [31].

Axit abscisic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởng

đến tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số cây

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

ngắn ngày thông qua việc tổng hợp ARN và protein [31].

Agar: Agar có vai trò rất cần thiết đối với mẫu nuôi cấy, làm đặc môi

trường, giúp mô không bị chìm. Agar thường được sử dụng ở nồng độ 0,6

đến 1% [7].

Chất phụ gia:

Nước dừa chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, được sử dụng để cung cấp dinh

dưỡng cho mẫu nuôi cấy mô tế bào thực vật. Các chất có hoạt tính trong nước

dừa hiện đã được chứng minh là myo-insitol và một số amino acid khác. Nước

dừa được sử dụng để kích thích sự phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây.

Nước dừa thường được lấy từ quả để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản.

Ngoài nước dừa, chuối xanh, khoai tây và cà chua cũng là những chất tự

nhiên giàu dinh dưỡng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật.

Than hoạt tính cũng là một chất phụ gia có nhiều tác dụng tích cực trong

nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu là tạo điều kiện tối cho môi trường nuôi cấy,

có tác dụng hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật như các

hợp chất phenolic, dịch rỉ nâu sinh ra từ môi trường nuôi cấy. Những chất này

gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Than hoạt tính làm thay đổi môi

trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có nó vì thế có sự kích thích sự

hình thành và sinh trưởng của rễ. Ngoài ra, than hoạt tính cũng có thể hấp thụ

các vitamin, cytokinin và auxin, làm thay đổi tỉ lệ thành phần các chất có trong

môi trường nuôi cấy cũng như pH môi trường [14].

1.2.2. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro

Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống vô

tính cổ điển như giâm cành, chiết cành, ghép cành... Nhân giống in vitro là một

trong bốn lĩnh vực của công nghệ tế bào thực vật (làm sạch virus, nhân nhanh các

giống cây quý, sản xuất và chuyển hóa sinh học các hợp chất tự nhiên và cải biến

về mặt di truyền các giống cây trồng) và mang lại hiệu quả kinh tế lớn [7]. Có ba

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

phương thức tạo cây in vitro:

a. Hoạt hóa chồi nách

Hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi cấy

các đỉnh chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương pháp này thì sự hoạt

hóa của chồi nách diễn ra theo hai cách:

Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi nuôi

cấy loài cây hai lá mầm như cây thuốc lá, hoa cúc, ...)

Cách 2: Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi nuôi cấy cây

một lá mầm như lúa, mía...)

Các chồi được tách và nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung

cytokinin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là ức chế ưu thế ngọn

để chồi bên phát triển. Các chồi này tiếp tục được chuyển sang môi trường mới

có bổ sung cytokinin thì các chồi mới tiếp tục được tạo ra. Sau đó, các chồi này

được chuyển sang môi trường tạo rễ và được đưa ra vườn ươm khi đã có rễ hoàn

chỉnh [7].

Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi: (1) Nhu cầu

về loại và nồng độ cytokinin khác nhau. Nồng độ cytokinin thay đổi tùy theo giai

đoạn nuôi cấy, thông thường trong quá trình tạo chồi người ta sử dụng auxin với

nồng độ thấp, phối hợp cùng với cytokinin ở nồng độ cao. Không nên cảm ứng

tạo mô sẹo với nồng độ cytokinin quá cao vì có thể tạo ra chồi bất định mang các

đột biến. (2) Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng được thì cần phải cắt

bỏ chồi ngọn hoặc làm chết chồi ngọn thì chồi bên mới có thể hoạt động. (3) Khi

cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh khối bị thay đổi [7].

1.3. Thành tựu trong bảo tồn nguồn gen thực vật in vitro

Ở Việt Nam việc áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để bảo tồn

các loài thực vật nhiệt đới quý hiếm, có giá trị kinh tế cũng được các nhà nghiên

cứu quan tâm, bắt đầu từ Chùm ngây (Morinda oleifera) là loại cây có giá trị

dinh dưỡng rất cao và dễ trồng, mang lại nhiều lợi ích và công dụng cho người

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

dân cả về sức khỏe lẫn kinh tế [6].

Cây thuốc hoàn ngọc (Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk) được sử

dụng rộng rãi trong dân gian do có chứa nhiều chất khoáng, axit amin và các chất

có hoạt tính sinh học nhóm flavonoid, terpenoid, saponnin, điều trị bệnh về tiêu hóa,

tuyến tiền liệt, u xơ, ung thư giai đoạn đầu, xơ gan, ổn định thần kinh, điều hòa

huyết áp, phục hồi sức khỏe. Năm 2018, Lê Hoài Hương và cs đã thành công trong

việc nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nghiên cứu cây hoàn ngọc [13].

Râu hùm tía (Tacca chantrieri André) được biết là cây dược liệu quý, chủ

yếu sống dưới tán rừng ẩm hoặc núi đá vôi, không chỉ có giá trị làm thuốc mà

còn có giá trị làm cảnh vì có hoa đẹp. Năm 2018, Nguyễn Thị Thơ và cs đã thành

công tạo ra số lượng cây giống lớn, chất lượng tốt cung ứng cho nhu cầu trồng

và phát triển loài cây dược liệu quý này bằng phương pháp in vitro [22].

Lê Thị Như Thảo và cs (2018) đã nghiên cứu thành công bước đầu của quy

trình nhân nhanh in vitro Cây Đinh Lăng lá nhỏ (Polyscias Fruticosa L. Harms), sử

dụng lá đinh lăng được nuôi cấy phát sinh tạo mô sẹo. Mô sẹo được sử dụng làm

vật liệu cho nuôi cấy dịch huyền phù và thu nhận saponin [17].

Năm 2018, Lê Thị Tâm Hồng và cs đã ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô

tế bào thực vật trong bảo tồn và phát triển cây Xạ Đen (Ehretia asperula Zollinger

et Moritzi ) để phát triển nguồn dược liệu quý [9].

Đã có một số công trình nghiên cứu về quá trình nuôi cấy in vitro ở cây

Nhàu.

Năm 2015, Elakkuvan và cs đã nghiên cứu về “Ảnh hưởng của sự khử trùng

bề mặt đến sự sống sót in vitro của mẫu Morinda citrifolia L.”. Thí nghiệm khử

trùng mẫu được tiến hành với sự thay đổi nồng độ các chất HgCl2, NaClO và

Ca(ClO)2, khi kết hợp với các khoảng thời gian khác nhau cho kết quả khác nhau

về ảnh hưởng của việc khử trùng đến tỉ lệ sống của đoạn chồi, chồi ngọn và lá non

Morinda citrifolia L.. Khử trùng bề mặt bằng HgCl2 0,1 % trong 4 phút cho tỉ lệ

sống cao nhất là 82,59 %; 84,26 % và 76,53 % tương ứng với mẫu vật là đoạn chồi,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

chồi ngọn và lá non (đây là chất khử trùng bề mặt mạnh). Xử lý mẫu sạch bằng

sodium hypochlorite (NaClO) 2% trong 10 phút cho tỉ lệ sống tương ứng 71,99 %;

78,79 % và 66,15 % với mẫu là đoạn chồi, chồi ngọn và lá non. Với chất khử trùng

là calcium hypochlorite (Ca(ClO)2) 5% cho tỉ lệ sống của mẫu là 64,23 %; 70,17 %

và 60,57 % tương ứng với đoạn chồi, chồi ngọn và lá non (Đây là chất khử trùng bề

mặt yếu trong các chất nghiên cứu) [30].

Saini và cs trong nghiên cứu về “Tạo lượng lớn chồi Noni (Morinda

citrifolia L.) in vitro từ mẫu đoạn thân” đã cho thấy: Noni (Morinda citrifolia L.)

là cây thuốc được sử dụng rộng rãi để chữa huyết áp, các vấn đề về hô hấp, thiếu

hụt miễn dịch, kháng khuẩn, chống viêm, giảm đau và điều trị chống sung huyết.

Để sản xuất quy mô lớn cây thuốc này, các tác giả đã tiến hành nghiên cứu nuôi

cấy in vitro từ mẫu thân ngoài tự nhiên. Khả năng tạo chồi cao được quan sát

thấy trên môi trường MS chứa BAP 2,0 mg/l. Tuy nhiên, môi trường MS có bổ

sung BAP 2,0 mg/l và Kinetin 1,0 mg/l thể hiện tỉ lệ nhân chồi tối đa trong nuôi

cấy. Tỉ lệ tạo chồi đạt 84,33 % trên môi trường này. Chồi in vitro phát triển và

tạo rễ trong môi trường MS có nồng độ IBA 1,0 mg/l, số rễ/chồi đạt 10 rễ và

chiều dài rễ đạt 3,1 cm. Cây con in vitro có chiều cao 5 - 6 cm được chuyển ra

ngoài tự nhiên. Giá thể được sử dụng là than bùn và xơ dừa. Tỉ lệ sống sót của

cây con đạt 95 % [35].

Nghiên cứu tìm hiểu sự phát sinh hình thái rễ trong nuôi cấy in vitro cây Nhàu

của Nguyễn Thị Ngọc Hương và cs (2009) tiến hành các thí nghiệm khảo sát ảnh

hưởng của một số loại auxin với khả năng hình thành rễ ở trụ hạ diệp và lá Nhàu.

Kết quả cho thấy, NAA 0,1 mg/l kích thích sự hình thành mô sẹo và rễ sơ cấp trên

trụ hạ diệp và lá ở tuần thứ nhất, quá trình kéo dài rễ bắt đầu từ tuần thứ 2. Kết quả

đo hô hấp và hoạt tính của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cũng được thảo

luận để làm rõ những thay đổi sinh lí trong sự hình thành rễ [10].

Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Hương và Võ Thị Bạch

Mai đã tiến hành các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của BAP, zeatin và NAA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

với sự hình thành chồi ở trụ hạ diệp cây Nhàu. Kết quả cho thấy, sự phát sinh

hình thái chồi ở cây Nhàu trải qua 3 giai đoạn. Trong quá trình này, zeatin 1 mg/l

kích thích sự hình thành chồi trong tối (sau 2 tuần) nhanh hơn BAP ở cùng nồng

độ. Khi phối hợp NAA 0,1 mg/l và zeatin 1 mg/l sẽ làm chậm sự hình thành chồi

(sau 5 tuần). Kết quả đo hô hấp và hoạt tính của các chất điều hòa sinh trưởng

thực vật cũng được thảo luận để làm rõ những thay đổi sinh lý trong sự hình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

thành chồi [11].

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu và hóa chất

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu

Sử dụng đoạn thân non và hạt cây Nhàu có nguồn gốc tại làng Soukhouma,

huyện Soukhouma, tỉnh Champasak - Lào.

Thời gian lấy mẫu: Tháng 4 năm 2018.

2.1.2. Hoá chất, thiết bị

Hoá chất

Thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào được tiến hành trên nền môi trường MS cơ

bản (Murashige và Skoog, 1962), cồn tuyệt đối 90°, cồn 70°, Javen, HgCl2, thạch

agar, đường sucrose, nước cất khử trùng.

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và thông dụng có nguồn gốc từ Đức,

Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam như các chất kích thích sinh trưởng BAP, Kinetin,

IBA, IAA.

Thiết bị

Các thiết bị chính dùng trong nuôi cấy mô tế bào: Nồi hấp khử trùng (Auto

Clave) của hãng Tommy (Nhật Bản), tủ sấy (Carbolite, Anh), buồng cấy vô trùng

(Biological Safety Cabinets) của hãng Nuarie (Mĩ), cân điện tử (Đức), bếp điện...

Bộ đồ cấy: Dao cấy, que cấy, đĩa cấy, bình tam giác 250 ml, 500 ml, pipet, ca

nhựa, ống đong, đũa thủy tinh, bông, giấy làm nút, giấy thấm, phễu thủy tinh.

2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện từ tháng 4 năm 2018 đến tháng 5 năm 2019

tại phòng Công nghệ tế bào thực vật - Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

- Đại học Thái Nguyên.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Nhóm phương pháp nuôi cấy in vitro

2.3.1.1. Phương pháp pha môi trường và nuôi cấy

Môi trường cơ bản được sử dụng trong nghiên cứu là môi trường MS

(Murashige và Skoog, 1962).

Nguyên tắc pha môi trường nuôi cấy: Pha môi trường đặc với thành phần

và hàm lượng các chất phù hợp. Môi trường cơ bản là MS, có đầy đủ muối

khoáng, các chất hữu cơ, vitamin…Tất cả các hóa chất phải được tan đều, không

kết tủa. Môi trường có bổ sung chất độn là thạch làm giá đỡ không quá rắn hay quá mềm để khi cấy mẫu được dễ dàng. Khử trùng ở nhiệt độ 1200C, áp suất 1

atm - 1,2 atm, trong thời gian 20 phút. Sau khi khử trùng để nguội, ổn định sau

2-3 ngày và tiến hành cấy mẫu trong buồng cấy vô trùng [16].

Các bước cụ thể trong pha môi trường nuôi cấy:

Xác định công thức cần pha. Ví dụ, pha 1 lít môi trường có công thức: MS

cơ bản + đường sucrose 30 g/l + agar 9 g/l.

(1) Cân đường sucrose 30 g/l, thạch agar 9 g/l.

(2) Dùng ống đong hoặc pipet để lấy dung dịch MS cơ bản, và các chất

kích thích sinh trưởng.

(3) Hòa tan thạch agar và đường trong nước cất.

(4) Bổ sung dung dịch hóa chất đã chuẩn bị ở trên.

(5) Bổ sung nước cất vào hỗn hợp trên cho đủ 1 lít, khuấy tan hết.

(6) Chuẩn độ pH của hỗn hợp trong khoảng từ 5,8 - 6,0.

(7) Đun trên bếp điện.

(8) Chia đều cho các bình tam giác. Làm nút bông, nút giấy cho các bình

tam giác.

(9) Khử trùng ở nhiệt độ 120oC, áp suất 1atm - 1,2 atm. Sau khi khử trùng

để nguội 2 - 3 ngày và tiến hành cấy mẫu trong buồng cấy vô trùng.

Mỗi thí nghiệm tạo mẫu in vitro cấy 30 mẫu, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

với 3 lần lặp lại. Thí nghiệm ngoài vườn ươm được bố trí 3 lần lặp lại mỗi lần 30

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

mẫu.

Điều kiện thí nghiệm

Các thí nghiệm in vitro được tiến hành trong điều kiện nhân tạo, các yếu tố

vật lí như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được duy trì ổn định.

Ánh sáng: Các mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn Neon với cường độ chiếu

sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10 - 12 giờ/ngày.

Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng nuôi cấy được duy trì trong khoảng 25 ± 20C.

Độ ẩm: Phòng nuôi cấy có độ ẩm khoảng 70 %.

2.3.1.2. Phương pháp khử trùng mẫu cấy

 Tạo mẫu sạch in vitro từ hạt cây Nhàu

Mẫu hạt Nhàu là loại hạt vỏ cứng, phải xử lý hạt trước bằng ngâm nước

nóng 50 - 60 °C qua đêm, mang rửa sạch. Dùng vải màn vò hạt thật kỹ để cho

phần thịt dính hạt ra hết. Ngâm nước xà phòng loãng trong 20 - 30 phút sau đó

rửa sạch nhiều lần dưới vòi nước máy.

Các bước cơ bản để khử trùng mẫu hạt bao gồm:

Bước 1: Đưa mẫu vào bình sạch, rửa lại mẫu bằng nước cất khử trùng 1-2 lần.

Bước 2: Khử trùng bằng cồn 700 lắc đều trong 1 phút. Sau đó rửa lại bằng

nước cất khử trùng 2 - 3 lần.

Bước 3: Khử trùng mẫu với Javen 60% lắc đều trong thời gian 15, 20, 25,

30 phút.

Bước 4: Rửa sạch mẫu bằng nước cất khử trùng nhiều lần. Sau đó thấm khô

mẫu trên giấy thấm.

Bước 5: Cấy mẫu vào môi trường MS cơ bản.

Các bước khử trùng thực hiện trong môi trường vô trùng (box cấy) [16].

 Tạo mẫu sạch in vitro từ đoạn thân cây Nhàu

Công thức khử trùng mẫu từ đoạn thân cây Nhàu được tham khảo theo tài

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

liệu của các tác giả Antony và Subramani [28].

Cây ngoài tự nhiên được cắt bỏ lá, cho vào cốc rửa sạch dưới vòi nước máy

và sau đó rửa với nước xà phòng loãng trong 20 - 30 phút, tiếp tục rửa sạch nhiều

lần dưới vòi nước máy.

Các bước cơ bản để khử trùng mẫu cấy bao gồm:

Bước 1: Đưa mẫu vào bình sạch, rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng 2 lần.

Bước 2: Tiến hành khử trùng mẫu 2 lần.

Lần 1, lắc theo tỉ lệ javen : nước cất vô trùng là 1:2, lắc đều mẫu trong 30

phút. Sau đó rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 4 - 5 lần.

Tiếp tục khử trùng mẫu lần 2 bằng HgCl2 0,1 %. Lắc đều mẫu trong thời

gian 5 phút. Rửa mẫu lại bằng nước cất vô trùng 3 - 4 lần. Sau đó thấm khô mẫu

bằng giấy thấm.

Bước 3: Cấy mẫu vào môi trường MS cơ bản.

Theo dõi các chỉ tiêu như : Tỉ lệ mẫu sạch (%), tỉ lệ mẫu bị nhiễm (%), tỉ lệ

mẫu nảy mầm (%); chất lượng chồi từ các mẫu nuôi cấy.

2.3.1.3. Phương pháp nghiên cứu môi trường nuôi cấy

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến sự sinh trưởng

và phát sinh chồi của mẫu cây Nhàu.

Để thăm dò ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến sự sinh trưởng

và phát sinh chồi của cây Nhàu, tất cả các công thức môi trường nuôi cấy đều sử

dụng môi trường MS cơ bản có bổ sung đường sucrose 30 g/l + agar 9 g/l và các

chất kích thích sinh trưởng có hàm lượng thay đổi. Công thức đối chứng sử dụng

môi trường MS cơ bản + đường sucrose 30 g/l + agar 9 g/l, không bổ sung các

chất kích thích sinh trưởng. Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành trên 30 mẫu cấy.

(1) Các đoạn thân mang nách chồi bên được cấy lên môi trường có bổ sung

BAP với nồng độ từ 0,5 mg/l; 1 mg/l; 1,5 mg/l; 2 mg/l. Theo dõi, đánh giá kết quả.

(2) Các đoạn thân mang nách chồi bên được cấy lên môi trường có bổ sung

Kinetin với nồng độ từ 0,5 mg/l; 1 mg/l; 1,5 mg/l; 2 mg/l. Đánh giá kết quả sau 4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

tuần, 6 tuần, 8 tuần nuôi cấy. Các chỉ tiêu theo dõi:

+ Số chồi/mẫu.

+ Chiều cao chồi (cm).

+ Chất lượng chồi.

Chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá to màu xanh đậm (+++)

Chồi sinh trưởng trung bình: Chồi nhỏ, lá xanh (++)

Tổng số chồi trên mẫu

Chồi sinh trưởng kém: Chồi nhỏ, lá nhỏ màu xanh nhạt (+)

Kích thước của các chồi

Số chồi trung bình = Tổng số mẫu thí nghiệm

Chiều cao chồi trung bình = Tổng số mẫu thí nghiệm

Nội dung 2: Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh

Khi các chồi cây Nhàu đạt chiều cao 3 - 4 cm và có 3 - 6 lá được cấy chuyển

sang môi trường ra rễ. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 mẫu.

Môi trường thí nghiệm thăm dò là MS cơ bản có bổ sung IAA với nồng độ thay đổi

0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l và IBA nồng độ 0,3; 0,5; 0,7; 0,9; 1,1 mg/l. Theo

dõi, đánh giá kết quả sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần nuôi cấy.

Các chỉ tiêu theo dõi: Số rễ/chồi; Chiều dài rễ (cm); Chất lượng rễ

Rễ tốt: Rễ mập, dài, màu trắng vàng (+++)

Rễ trung bình: Rễ bình thường, màu trắng vàng (++)

Tổng số rễ trên mẫu

Rễ kém: Rễ gầy, nhỏ, màu vàng (+)

Số lượng rễ trung bình = Tổng số mẫu theo dõi

Tổng kích thước của các rễ

Tổng số mẫu theo dõi

Chiều dài rễ trung bình =

2.3.2. Phương pháp đưa cây ra vườn ươm

Thí nghiệm ngoài vườn ươm được bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần 30 mẫu.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Giai đoạn bầu đất

Cây con in vitro đạt chiều cao 2,5 - 3 cm, mọc 4 - 6 lá, có 3 - 4 rễ, chiều dài

rễ đạt 3 - 4 cm, rễ mập đủ tiêu chuẩn để đưa cây ra ngoài vườn ươm.

Bố trí thí nghiệm: Chúng tôi thăm dò trên 3 loại giá thể: Đất thịt + trấu hun

(tỉ lệ 1:1); Đất thịt + trấu hun + cát (tỉ lệ 1:2:1); Đất thịt.

Tuần đầu tiên để cây ở điều kiện phòng. Tuần thứ hai đưa cây ra nhà lưới.

Tưới phun dưới dạng sương mù vào lúc sáng sớm. Theo dõi, đánh giá tỉ lệ sống

sót và chất lượng cây sau 4 tuần.

Giai đoạn vườn ươm

Những cây Nhàu trong bầu đất đạt chiều cao 3 - 4 cm, hình thành thêm lá

mới, lá xanh sẽ chuyển cây ra ngoài môi trường tự nhiên. Tiến hành bỏ vỏ bầu,

trồng cây trên luống với mật độ 30 cm. Tuần đầu tiên phủ bằng ni lông. Tưới

nước vào buổi chiều. Theo dõi, đánh giá kết quả sau 2 tuần và 4 tuần. Chỉ tiêu

theo dõi: Chiều cao cây (cm), số lá, chất lượng cây.

Chất lượng cây kém (+): cây nhỏ, thấp, lá nhỏ, lá xanh nhạt;

Chất lượng cây trung bình (++): cây thấp, lá xanh đậm;

Chất lượng cây tốt (+++): cây to, phiến lá rộng, lá xanh đậm

2.3.3. Phương pháp xử lí và tính toán số liệu

Sử dụng toán thống kê để xác định các chỉ số thống kê như: Trung bình

mẫu, phương sai, độ lệch chuẩn và sai số trung bình mẫu với n ≥ 30, α = 0,05.

Các số liệu được xử lí trên máy vi tính bằng chương trình Excel [27]. Phương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

pháp được sử dụng là phương pháp phân tích phương sai một nhân tố.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu công thức khử trùng tạo mẫu sạch

Khi tiến hành nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro của bất kì đối tượng

cây trồng nào cũng cần phải có một số lượng lớn mẫu khởi đầu với chất lượng

đồng đều. Do vậy, việc xác định loại mẫu cấy và chế độ khử trùng phù hợp có

vai trò quan trọng trong việc tạo vật liệu ban đầu cho nghiên cứu. Các vật liệu

này phải đảm bảo sạch vi sinh vật và có khả năng phát sinh hình thái như tạo

chồi, callus hay phôi. Một số hóa chất được sử dụng để khử trùng mẫu cấy nhằm

loại bỏ nguồn bệnh và tạo được lượng lớn các mẫu sạch in vitro. Chất khử trùng

thường được sử dụng nhiều và có hiệu quả trong các nghiên cứu là HgCl2 và

NaClO.

3.1.1. Kết quả khử trùng hạt cây Nhàu

Trước khi khử trùng, hạt cây Nhàu được chọn lọc cẩn thận, loại bỏ những

hạt kém chất lượng. Sau đó, khử trùng hạt theo các công thức khác nhau. Trong

nghiên cứu này, việc khảo sát các công thức khử trùng khác nhau nhằm tìm ra

công thức khử trùng tối ưu để hạt nảy mầm tốt nhất cũng như cho chất lượng

thân mầm tốt nhất. Phương pháp khử trùng thích hợp phải đảm bảo được các yêu

cầu như tỉ lệ hạt bị nhiễm thấp, thân mầm to, mập, chồi sinh trưởng phát triển

tốt.

Chúng tôi đã tiến hành vô trùng sơ bộ hạt Nhàu bằng cồn 700 trong thời gian

1 phút và javen 60% trong box cấy vô trùng ở các ngưỡng thời gian khác nhau.

Sau khi khử trùng, hạt được cấy vào môi trường MS có bổ sung đường sucrose

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

30 g/l và agar 9 g/l. Đánh giá khả năng thu được mẫu sạch và khả năng nảy mầm

của hạt là bước tiếp theo để tìm ra công thức khử trùng tốt nhất. Kết quả nghiên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

cứu của chúng tôi được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1.

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng javen đến sự nảy mầm

của hạt cây Nhàu

Thời gian Tỉ lệ Tỉ lệ Tỉ lệ hạt Tỉ lệ hạt Chất Công khử mẫu mẫu sạch không sạch nảy lượng thức trùng sạch nhiễm nảy mầm mầm (%) chồi (phút) (%) (%) (%)

CT1 15 87 13 78 (++) 22

CT2 20 92 8 82 (+++) 18

CT3 25 93 7 68 (++) 32

Ghi chú: (+): cây nhỏ, lá màu xanh nhạt; (++) cây nhỏ, lá màu xanh đậm; (+++) cây

mập, lá to màu xanh đậm.

CT4 30 96 4 60 (+) 40

A B

Hình 3.1. Hạt quả Nhàu sau khi khử trùng nảy mầm sau 3 tháng

A: 15 phút; B: 20 phút

Kết quả thể hiện ở bảng 3.1 cho thấy, với thời gian khử trùng thay đổi, các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

chỉ tiêu nghiên cứu có sự khác nhau rõ rệt. Khử trùng hạt bằng javen 60 % trong

thời gian 20 phút, tỉ lệ hạt sạch nảy mầm cao, hạt bị nhiễm ít, đạt chất lượng chồi

tốt nhất. Khi tăng thời gian khử trùng lên 30 phút thì tỉ lệ hạt nảy mầm thấp hơn

hẳn (60 %), đồng thời tăng tỉ lệ hạt chết là 36 %, chất lượng chồi kém. Nguyên

nhân có thể do javen là chất độc, nếu kéo dài thời gian khử trùng, javen có thể

xâm nhập vào phôi, hạt bị độc nên không thể tái sinh được.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, thời gian khử trùng có ảnh

hưởng khá lớn tới tỉ lệ sống của hạt. Javen có hiệu quả diệt nấm và diệt khuẩn

cao đối với hạt cây Nhàu. Khi lắc nhẹ hạt 20 phút trong javen 60 % là vừa đủ,

vừa có khả năng tiêu diệt mầm bệnh mà lại tác động nhẹ đến thành tế bào nên

cho tỉ lệ sống cao và kích thích mẫu tái sinh.

3.1.2. Kết quả khử trùng đoạn thân cây Nhàu

Chúng tôi sử dụng loại vật liệu nghiên cứu thứ hai là đoạn thân cây Nhàu

ngoài tự nhiên. Đoạn thân cần được khử trùng sạch trước khi đưa vào bình nuôi

cấy. Trước khi khử trùng, đoạn thân được chọn lọc cẩn thận, không quá non và

cũng không quá già. Sau đó, khử trùng mẫu theo công thức nghiên cứu tham

khảo của Antony và cs: Tiến hành khử trùng mẫu 2 lần. Lần 1, tỉ lệ javen : nước

cất vô trùng là 1:2 (50 %), lắc đều mẫu trong 30 phút. Sau đó rửa mẫu bằng nước

cất vô trùng 4 - 5 lần. Tiếp tục khử trùng mẫu lần 2 bằng HgCl2 0,1% lắc đều

mẫu trong thời gian 5 phút. Rửa mẫu lại bằng nước cất vô trùng 3 - 4 lần” [28].

Kết quả thu được sau 4 tuần nuôi cấy được thể hiện ở hình 3.2.

Dựa trên kết quả nghiên cứu của Patade và cs (2011) [34], đã công bố trên

đối tượng cây Nhàu: Đoạn thân mang chồi nách được khử trùng tạo mẫu sạch.

Mẫu được loại bỏ phần bị tổn thương, sau khi khử trùng xong, mẫu được cấy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

trên môi trường MS. Mọi thao tác được thực hiện trong box cấy vô trùng.

A B

Hình 3.2. Đoạn thân cây Nhàu sau khử trùng trên môi trương MS cơ bản

A: Sau 4 tuần; B: Sau 6 tuần

Kết quả khử trùng đoạn thân cây Nhàu cho thấy, với công thức khử trùng

này cho tỉ lệ mẫu sạch bệnh không bị nhiễm khuẩn, mốc, đạt tỉ lệ là 65 %, tỉ lệ

mẫu nhiễm đạt 35 %, tỉ lệ mẫu sạch nảy mầm 100 %, tỉ lệ mẫu sạch không nảy

mầm 0 % với chất lượng chồi tốt, lá to, màu xanh đậm sau 6 tuần nuôi cấy trên

môi trường MS cơ bản.

Như vậy, khử trùng mẫu từ đoạn thân mang chồi nách bằng dung dịch javen:

nước cất vô trùng với tỉ lệ 1:2 (50 %) trong 30 phút và HgCl2 0,1 % trong thời

gian 5 phút cho tỉ lệ mẫu sạch nảy mầm đạt 65 %.

Hiệu quả khử trùng khá thấp có thể do đặc tính của mẫu cấy to, các bẹ lá

bao quanh đỉnh chồi và thân mang chồi gây khó khăn cho việc loại bỏ các vi sinh

vật dẫn đến tỉ lệ mẫu nhiễm cao.

Như vậy với nguồn mẫu ban đầu từ hạt, chúng tôi nhận thấy tỉ lệ tạo mẫu

sạch cao hơn so với nguồn mẫu từ đoạn thân trong phạm vi thí nghiệm của đề

tài. Từ hai nguồn mẫu nuôi cấy ban đầu, chúng tôi lựa chọn mẫu hạt cho các

nghiên cứu tiếp theo.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

3.2. Kết quả tạo chồi in vitro cây Nhàu

Trong môi trường nuôi cấy in vitro, bên cạnh các nguyên tố đa lượng, vi

lượng, vitamin… còn bổ sung nhiều loại kích thích sinh trưởng thuộc nhóm

auxin, cytokinin. Đây là những nhóm chất rất cần thiết để kích thích sự sinh

trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan ở thực vật. Việc tìm công thức môi trường

với nồng độ và tỉ lệ chất kích thích sinh trưởng phù hợp cho cây và từng giai

đoạn nuôi cấy là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo, quyết định sự thành công

của quá trình nhân giống cây trồng in vitro. Môi trường nuôi cấy phù hợp nhất

sẽ cho hệ số nhân chồi cao, chất lượng chồi tốt.

3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy

BAP là chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và được sử dụng phổ

biến trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Chất này ảnh hưởng rõ rệt và đặc trưng đến

sự cảm ứng tạo chồi, kéo dài thời gian hoạt động của mô phân sinh, hạn chế sự hóa

già của tế bào đồng thời thúc đẩy sự phân hóa chồi, kích thích chồi phát triển ở

nhiều loài thực vật khác nhau. Theo nhiều nghiên cứu cho biết, BAP thường được

sử dụng với nồng độ thay đổi từ 1,0 - 4,0 mg/l là thích hợp cho nhiều loại mô nuôi

cấy. Ở các nồng độ cao hơn hoặc thấp hơn đều biểu hiện hiệu quả kích thích kém.

Với nồng độ cao sẽ hoạt hóa hình thành chồi bất định.

Qua tìm hiểu một số kết quả nghiên cứu về tạo đa chồi ở cây Nhàu (Morinda

citrifolia L.) in vitro, tác giả Saini và cs (2015) đã sử dụng đoạn thân đã khử

trùng để làm vật liệu mẫu ban đầu trong tạo đa chồi ở cây Nhàu [35].

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng đoạn thân mầm của các cây nảy

mầm in vitro. Cây Nhàu sử dụng trong thí nghiệm khoảng 15 - 20 ngày tuổi,

trong giai đoạn này mô chưa hóa gỗ hoàn toàn, phần mô phân sinh sẽ tiếp xúc

với các chất kích thích sinh trưởng và biệt hóa tạo các chồi bất định. Thân mầm

cắt thành từng đoạn có chiều dài từ 1cm trước khi chuyển vào môi trường nuôi

cấy có bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau. Theo dõi thí nghiệm và đánh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

giá kết quả sau các khoảng thời gian nuôi cấy. Kết quả theo dõi các chỉ tiêu thí

nghiệm được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.3.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, các đoạn thân mầm cây Nhàu có khả năng tái

sinh chồi trên các môi trường thí nghiệm. Khả năng tạo đa chồi có sự khác biệt

trên các môi trường khi thay đổi nồng độ BAP. Các công thức thí nghiệm đều có

khả năng tạo chồi cao hơn so với công thức đối chứng. Ở môi trường đối chứng,

số chồi/mẫu sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần nuôi cấy đều chỉ có 1 chồi/mẫu. Trên môi

trường nuôi cấy có bổ sung BAP với nồng độ tăng dần từ 0,5 mg/l đến 2,0 mg/l,

quan sát thấy số chồi/mẫu tăng, tăng cao nhất là môi trường nuôi cấy có bổ sung

BAP 2,0 mg/l, hiệu quả tạo đa chồi sau 4 tuần nuôi cấy đạt 1,80 chồi/mẫu (tăng

0,80 so với ĐC), sau 6 tuần mẫu nuôi cấy là 2,03 chồi/mẫu (tăng 1,03 so với

ĐC), sau 8 tuần nuôi cấy số chồi trên mẫu cấy là 2,53. Các công thức thí nghiệm

còn lại cho số chồi/mẫu đạt từ 1,10 đến 1,40 (sau 6 tuần và sau 8 tuần nuôi cấy).

Kết quả theo dõi chỉ tiêu về chiều cao chồi cho thấy, khi tăng nồng độ

BAP (từ 0,5 mg/l đến 2,0 mg/l) dẫn đến chiều cao chồi tăng dần, tăng cao nhất

là môi trường MS có bổ sung BAP 2,0 mg/l. Sau 4 tuần, chiều cao chồi tăng

từ 1,33 - 1,79 cm; sau 6 tuần tăng từ 1,65 - 2,39 cm; sau 8 tuần tăng từ 2,11 -

3,04 cm. Các môi trường thí nghiệm đều thu được kết quả tốt hơn so với đối

chứng.

Kết quả theo dõi về khả năng tạo đa chồi từ mẫu cấy cây Nhàu của chúng tôi

cho thấy, khi bổ sung BAP 2,0 mg/l mẫu tạo đa chồi nhiều nhất trong tất cả các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

công thức nghiên cứu của đề tài.

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy

Số Nồng độ Công Số lá/mẫu Chiều cao Chất chồi/mẫu BAP thức (chồi) chồi (cm) lượng chồi (mg/l) (chồi)

Sau 4 tuần

1,00 3,47±0,16 1,33±0,08 + ĐC 0

1,00 4,40±0,15 1,47±0,09 + CT1 0,5

1,00 4,53 ±0,16 1,63±0,09 ++ CT2 1,0

1,00 4,93 ±0,19 1,71±0,09 ++ CT3 1,5

1,80 ±0,18 5,20 ±0,18 1,79±0,07 +++ CT4 2,0

Sau 6 tuần

1,00 4,40±0,15 1,65±0,08 + ĐC 0

1,10 ±0,06 5,87±0,09 1,81±0,09 ++ CT1 0,5

1,23 ±0,12 5,93 ±0,18 2,09±0,10 ++ CT2 1,0

1,40 ±0,22 6,74 ±0,16 2,15±0,09 ++ CT3 1,5

CT4 2,0 2,03 ±0,24 6,73 ±0,18 2,39±0,07 +++

Sau 8 tuần

1,00 5,47±0,16 2,11±0,09 + ĐC 0

1,10 ±0,06 7,13±0,18 2,35±0,10 ++ CT1 0,5

1,27 ±0,13 7,27 ±0,18 2,67±0,11 ++ CT2 1,0

1,40 ±0,22 7,73±0,21 2,85±0,11 ++ CT3 1,5

CT4 2,0 2,53 ±0,36 8,47 ±0,25 3,04±0,08 +++

Ghi chú: (+) chồi nhỏ, ngắn, lá xanh nhạt; (++) chồi nhỏ, ngắn, lá xanh; (+++) chồi

mập, lá to xanh đậm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

A

B

C D

Hình 3.3 Cây Nhàu trên môi trường chứa BAP với nồng độ thay đổi sau 8 tuần

A: Đối chứng; B: BAP 1,0mg/l; C: BAP 1,5mg/l; D: BAP 2,0mg/l

Xét đồng thời các chỉ tiêu nghiên cứu trong giai đoạn tạo đa chồi cây Nhàu

thì môi trường thích hợp nhất trong các nồng độ thăm dò, cho hiệu quả tạo chồi

cao nhất là MS cơ bản + đường sucrose 30 g/l + agar 9 g/l có bổ sung BAP 2,0

mg/l, cho hệ số tạo chồi đạt 2,53, sự sinh trưởng phát triển của chồi khỏe, chất

lượng chồi tốt. Tuy nhiên, khả năng tạo đa chồi từ mẫu cấy cây Nhàu của BAP

chưa cao.

3.2.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát sinh chồi in vitro

Thân mầm được cắt thành từng đoạn có chiều dài khoảng 1cm trước khi

chuyển vào môi trường nuôi cấy có bổ sung Kinetin với các nồng độ khác nhau.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Theo dõi thí nghiệm và đánh giá kết quả sau các khoảng thời gian nuôi cấy. Kết

quả theo dõi các chỉ tiêu thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.4.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy

Nồng độ Số Công Số lá/mẫu Chiều cao Chất lượng Kinetin chồi/mẫu thức (chồi) chồi (cm) chồi (mg/l) (chồi)

Sau 4 tuần

ĐC 0 3,47±0,16 1,33±0,08 1,00 Nhỏ

CT1 0,5 3,53±0,16 1,36±0,08 1,00 Mập

CT2 1,0 3,67±0,14 1,39±0,09 1,00 Mập

CT3 1,5 3,33±0,53 1,30±0,07 1,00 Nhỏ

CT4 2,0 3,47±0,16 1,24±0,07 1,00 Nhỏ

Sau 6 tuần

ĐC 0 1,00, 4,40±0,15 1,65±0,08 Nhỏ

CT1 0,5 5,40±0,17 1,76±0,09 1,00 Mập

CT2 1,0 5,47±0,16 1,79±0,10 1,00 Mập

CT3 1,5 5,33±0,42 1,68±0,08 1,00 Nhỏ

CT4 2,0 4,80±0,23 1,59±0,08 1,00 Nhỏ

Sau 8 tuần

Nhỏ

ĐC 0 5,47±0,16 2,11±0,09 1,00

CT1 0,5 7,07±0,19 2,25±0,10 1,00 Mập

CT2 1,0 7,27±0,18 2,38±0,10 1,00 Mập

CT3 1,5 6,93±0,39 2,21±0,08 1,00 Nhỏ

CT4 2,0 6,00±0,35 1,98±0,08 1,00 Nhỏ

Kết quả theo dõi chỉ tiêu về chiều cao chồi cho thấy, khi tăng nồng độ

Kinetin từ 0,5 mg/l đến 1,0 mg/l dẫn đến chiều cao chồi tăng dần. Khi tăng nồng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

độ Kinetin từ 1,5 mg/l đến 2,0 mg/l dẫn đến chiều cao chồi giảm dần , tăng cao

nhất là môi trường MS có bổ sung Kinetin 1,0 mg/l. Sau 4 tuần, chiều cao chồi

CT1, CT2, CT3 và CT4 lần lượt là 1,36; 1,39; 1,30; 1,24 (cm), sau 6 tuần chiều

cao chồi ở CT1, CT2,CT3 và CT4 lần lượt là 1,76; 1,79; 1,68; 1,59 (cm); sau 8

tuần, chiều cao chồi ở CT1, CT2, CT3 và CT4 lần lượt là 2,11; 2,25; 2,38; 1,98

(cm).

Kết quả theo dõi về khả năng tạo đa chồi từ mẫu cấy cây Nhàu của chúng tôi

cho thấy, khi bổ sung Kinetin mẫu không tạo đa chồi. Tuy nhiên chồi có chiều cao

tốt nhất trên môi trường có Kinetin 1,0 mg/l trong các công thức nghiên cứu của

đề tài.

Xét đồng thời các chỉ tiêu nghiên cứu trong giai đoạn tạo chồi cây Nhàu thì

môi trường thích hợp nhất trong các nồng độ thăm dò, cho hiệu quả tạo chồi sinh

trưởng tốt là MS cơ bản + đường sucrose 30 g/l + agar 9 g/l có bổ sung Kinetin

1mg/l, sự sinh trưởng phát triển của chồi khỏe, chất lượng chồi tốt. Tuy nhiên, khả

năng tạo đa chồi từ mẫu cấy cây Nhàu của Kinetin có nồng độ từ 0,5 - 2,0 mg/l

thì chưa quan sát thấy.

A B

Hình 3.4 Cây Nhàu trên môi trường chứa Kinetin sau 8 tuần

A: Đối chứng; B: Kinetin 2,0 mg/l

3.3. Nghiên cứu khả năng tạo rễ cây Nhàu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Khi chồi đạt đến một kích thước nhất định, mẫu được chuyển sang môi

trường tạo rễ. Chất kích thích sinh trưởng được dùng chủ yếu ở giai đoạn này

thuộc nhóm auxin. Tác dụng rõ rệt nhất của auxin đối với sự phân hóa tế bào là

khả năng phát sinh rễ đã được kiểm chứng từ năm 1934. Nhiều kết quả nghiên

cứu đã cho thấy vai trò của IBA và IAA tác động đến quá trình phát sinh rễ [14].

IBA và IAA là những chất kích thích chủ yếu tác động lên quá trình phân chia tế

bào và sự hình thành rễ. Để chồi in vitro cây Nhàu phát triển thành cây hoàn

chỉnh trong ống nghiệm, chúng tôi thăm dò ảnh hưởng riêng rẽ của IBA và IAA

đến sự phát sinh rễ ở cây Nhàu.

3.3.1. Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh rễ cây Nhàu

Các chồi in vitro cây Nhàu có chiều cao từ 2,5 cm, 3 - 5 lá được chúng tôi

sử dụng để thăm dò môi trường nuôi cấy. Chồi in vitro được nuôi cấy trong môi

trường có chứa IBA ở các nồng độ khác nhau để nghiên cứu sự ảnh hưởng của

IBA đến sự hình thành rễ. Cây cắt bỏ bớt lá, cấy vào môi trường MS cơ bản +

đường sucrose 30 g/l + agar 9 g/l + IBA thay đổi nồng độ. Môi trường đối chứng

là MS cơ bản + đường sucrose 30 g/l + agar 9 g/l. Mỗi công thức môi trường cấy

30 chồi. Theo dõi sự hình thành rễ của các chồi sau 4, 6 và 8 tuần. Kết quả theo

dõi được thể hiện trong bảng 3.4 và hình 3.5.

Kết quả trên bảng 3.4 và hình 3.5 cho thấy, trên môi trường thí nghiệm có

bổ sung IBA đều cho các chỉ tiêu theo dõi cao hơn đối chứng. Sau 4 tuần, số rễ

trung bình đạt được từ 2,80 - 5,53 rễ/chồi, sau 6 tuần, số rễ trung bình đạt từ 5,48

- 8,73 rễ/chồi; sau 8 tuần, số rễ trung bình đạt được từ 7,43 - 11,83 rễ/chồi. Trong

đó, môi trường bổ sung IBA 0,9 mg/l cho hiệu qủa tạo rễ tốt nhất. Sau 8 tuần, số

rễ trung bình đạt được là 11,83 rễ/chồi.

Nồng độ IBA cũng ảnh hưởng đến sự phát triển chiều dài rễ của cây Nhàu.

Chiều dài trung bình của rễ tăng dần khi nồng độ IBA trong môi trường nuôi cấy

tăng từ 0,3 - 1,1 mg/l. Chiều dài trung bình của rễ tăng cao nhất trên môi trường

có bổ sung IBA nồng độ 0,9 mg/l, đạt 3,75 cm. Khi tiếp tục tăng nồng độ IBA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

thì chiều dài trung bình của rễ cũng giảm.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Nhàu

Nồng độ Chiều dài Chất lượng Công thức Số lượng rễ IBA (mg/l) rễ(cm) rễ

Sau 4 tuần

ĐC 0 0 0

CT1 3,80±0,19 0,70±0,04 0,3 +

CT2 4,30±0,21 0,71±0,04 0,5 ++

CT3 4,73±0,19 0,74±0,04 0,7 ++

CT4 5,53±0,20 0,79±0,03 0,9 ++

CT5 2,80±0,23 0,61±0,04 1,1 +

Sau 6 tuần

ĐC 0 0 0

CT1 6,04±0,28 1,67±0,06 0,3 +

CT2 6,98±0,24 2,09±0,07 0,5 ++

CT3 8,37±0,24 2,51±0,09 0,7 ++

CT4 0,9 8,73±0,13 2,75±0,10 +++

CT5 5,48±0,25 1,11±0,04 1,1 +

Sau 8 tuần

ĐC 0 0 0

CT1 9,13±0,41 3,11±0,10 0,3 +

CT2 9,43±0,25 3,46±0,11 0,5 ++

CT3 10,67±0,25 3,64±0,12 0,7 ++

CT4 11,83±0,30 3,75±0,13 0,9 +++

CT5 7,43±0,26 2,35±0,08 1,1 +

Ghi chú: (+) rễ ngắn, nhỏ, màu vàng; (++): rễ bình thường, màu trắng vàng;

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

(+++): rễ mập, dài, có rễ phụ, màu trắng vàng.

A B

Hình 3.5. Cây Nhàu trên môi trường chứa IBA 0,9mg/l sau 8 tuần

A: Đối chứng; B: IBA 0,9 mg/l

Xét đồng thời các chỉ tiêu theo dõi trong thí nghiệm của chúng tôi cho thấy,

môi trường tối ưu nhất trong các nồng độ nghiên cứu cho việc tạo rễ cây Nhàu

là môi trường bổ sung IBA 0,9 mg/l. Trên môi trường này, số rễ/chồi đạt 11,83

cm, chiều dài trung bình là 3,75 cm, bề mặt rễ sần xùi, có nhiều rễ phụ, màu trắng

vàng.

3.3.2. Ảnh hưởng của IAA đến sự phát sinh rễ cây Nhàu

IAA là chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin, được đưa vào môi

trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và dãn nở của tế bào, tăng cường

quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích sự hình thành rễ. Dựa trên

những đặc tính của IAA, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến

sự phát sinh rễ cây Nhàu. Thí nghiệm được tiến hành trên 5 công thức có bổ sung

IAA ở các nồng độ khác nhau.

Kết quả thu được sau nuôi cấy 4, 6 và 8 tuần được thể hiện trong bảng 3.5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

và hình 3.6.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ cây Nhàu

Nồng độ Chiều dài Chất lượng Công thức Số lượng rễ IAA (mg/l) rễ (cm) rễ

Sau 4 tuần

ĐC 0 0 0

CT1 2,97±0,16 0,55±0,03 0,1 +

CT2 3,43±0,19 0,63±0,04 0,3 ++

CT3 4,60±0,18 1,20±0,35 0,5 +++

CT4 3,83±0,17 0,89±0,02 0,7 ++

CT5 3,57±0,20 0,83±0,34 0,9 ++

Sau 6 tuần

ĐC 0 0 0

CT1 6,97±0,33 0,98±0,03 0,1 +

CT2 7,67±0,36 1,09±0,04 0,3 ++

CT3 9,37±0,50 1,27±0,18 0,5 +++

CT4 8,23±0,40 1,14±0,05 0,7 ++

CT5 7,67±0,36 1,06±0,34 0,9 ++

Sau 8 tuần

ĐC 0 0 0

CT1 7,93±0,28 2,03±0,48 0,1 +

CT2 8,33±0,29 2,07±0,06 0,3 ++

CT3 10,70±0,50 2,37±0,32 0,5 +++

CT4 9,43±0,38 2,12±0,08 0,7 ++

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

CT5 9,17±0,31 1,94±0,31 0,9 ++

Ghi chú: (+) rễ gầy, nhỏ, màu vàng; (++): rễ bình thường, màu trắng vàng;

(+++): rễ mập, dài, màu trắng vàng

Từ kết quả trình bày ở bảng 3.5 cho thấy, trên tất cả các môi trường thí

nghiệm chồi in vitro đều hình thành rễ, tuy nhiên khả năng hình thành rễ của chồi

cây Nhàu khác nhau ở các môi trường có bổ sung IAA với nồng độ khác nhau.

Các môi trường có chất kích thích sinh trưởng IAA đều cho tỉ lệ chồi ra rễ cao

hơn nhiều so với môi trường đối chứng (môi trường không có chất kích thích

sinh trưởng IAA). Trong các công thức môi trường có chất kích thích sinh trưởng

thì môi trường CT3 (môi trường có IAA 0,5 mg/l) là môi trường cho tỉ lệ chồi ra

rễ cao nhất (sau 8 tuần đạt 10,70 rễ). Môi trường CT5 có nồng độ IAA 0,9 mg/l

cao hơn môi trường CT3 có nồng độ IAA 0,5 mg/l nhưng tỉ lệ chồi ra rễ thấp

hơn. Kết quả này cho thấy, nồng độ IAA cao gây ức chế khả năng hình thành rễ

cây Nhàu. Vì vậy, trong thí nghiệm này, công thức môi trường CT3 là môi trường

chứa IAA thích hợp cho sự tạo rễ cây Nhàu.

A B

Hình 3.6. Cây Nhàu trên môi trường chứa IAA 0,5mg/l sau 8 tuần

A: Đối chứng; B: IAA 0.5 mg/l

Từ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng thuộc

nhóm auxin (IBA, IAA) đến sự phát sinh rễ cây Nhàu chúng tôi nhận thấy, cả 2

môi trường đều tạo ra chất lượng rễ tốt. Nếu nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh mang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

đặc điểm hình thái rễ của cây Nhàu (có rễ chính và rễ phụ), thì môi trường bổ

sung IBA là phù hợp. Do vậy, môi trường thích hợp cho sự tạo rễ cây Nhàu trong

phạm vi nghiên cứu của đề tài là môi trường MS cơ bản có bổ sung đường sucrose

30 g/l + agar 9 g/l + IBA 0,9 mg/l.

3.4. Nghiên cứu giá thể thích hợp đưa cây Nhàu ra ngoài tự nhiên

3.4.1. Giai đoạn bầu đất

Việc lựa chọn giá thể thích hợp để đưa cây ra ngoài vườn ươm là khâu cuối

cùng và quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro. Cần phải thực hiện thật

cẩn thận vì đây là khâu quyết định đến sự thành công của quá trình nuôi cấy in

vitro. Giá thể phù hợp là giá thể cho tỉ lệ cây sống cao, sinh trưởng phát triển tốt.

Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về nguồn dinh dưỡng, ánh

sáng, nhiệt độ... Khi chuyển ra ngoài môi trường tự nhiên hoàn toàn khác nên

cây con dễ bị chết do mất nước, nhiệt độ cao... Vì thế cây con phải được thích

nghi dần với điều kiện ngoài tự nhiên. Trước khi đem cây ra trồng ngoài vườn

ươm, đưa cây ra khỏi phòng sinh trưởng, đặt trong điều kiện nhiệt độ phòng bình

thường, để khoảng 2 ngày. Sau đó lấy cây ra khỏi bình, rửa sạch agar bám trên

rễ. Đem trồng trong các giá thể nghiên cứu. 3 loại giá thể để trồng thăm dò: Đất

thịt + trấu hun +cát (tỉ lệ 1:2:1); đất thịt trung bình + trấu hun (tỉ lệ 1:1); đất thịt

trung bình. Trong thời gian cây con thích nghi với điều kiện môi trường (tối thiểu

là khoảng 2 - 3 tuần), cây con cần được chăm sóc và bảo vệ cẩn thận.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của giá thể đến cây trồng trong bầu sau 4 tuần

Tỉ lệ cây sống (%) Chất lượng cây Giá thể

Đất thịt 100 +

Đất thịt + trấu hun (1:1) 100 +++

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Đất thịt +trấu hun + cát (1:2:1) 100 ++

Ghi chú: (+):Cây nhỏ, thấp, lá nhỏ, lá xanh nhạt; (++):cây thấp, lá xanh đậm;

(+++):cây to, phiến lá rộng, lá xanh đậm.

Đất thịt Đất thịt + Trấu hun Đất thịt + Trấu hun +

(1:1) Cát (1:2:1)

Hình 3.7. Cây Nhàu in vitro hoàn chỉnh được trồng trong bầu đất sau 4 tuần

Kết quả bảng 3.6 và hình 3.7 cho thấy, các loại giá thể khác nhau cho tỉ lệ

cây sống và chất lượng cây khác nhau rõ rệt. Tỉ lệ cây sống ở các giá thể sau 4

tuần trồng là 100 %. Trên giá thể đất thịt tỉ lệ sống đạt 100 %, cây sinh trưởng

yếu hơn so với giá thể khác, lá cây có màu vàng nhạt, cây phát triển chậm. Những

cây trồng trên giá thể đất thịt + trấu hun theo tỉ lệ 1:1, tỉ lệ cây sống 100%, cây

sinh trưởng phát triển tốt, cây hình thành thêm lá mới, phiến lá rộng, màu xanh

đậm. Cây trồng trên giá thể đất thịt + trấu hun + cát, tỉ lệ cây sống đạt 100 %,

cây phát triển bình thường trên giá thể này, hình thành lá mới, lá cây chuyển sang

màu xanh nhạt. Do đó, giá thể đất thịt kết hợp với trấu hun tỉ lệ 1:1 trong nghiên

cứu của chúng tôi là phù hợp để trồng cây Nhàu in vitro trong giai đoạn bầu đất.

3.4.2. Ra cây ngoài vườn ươm

Cây Nhàu in vitro sau khi huấn luyện đạt chiều cao khoảng 3 - 4 cm, hình

thành thêm lá mới, lá xanh đậm, chiều dài rễ đạt 4 - 5 cm, cây khỏe mập sẵn sàng

cho việc chuyển cây ra môi trường tự nhiên. Chúng tôi tiến hành chuyển cây

trồng ra luống với mật độ 30 x 30 cm. Tuần đầu tiên phủ bằng ni lông. Tưới nước

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

vào buổi chiều. Theo dõi, đánh giá kết quả sau 2 tuần và 4 tuần chăm sóc. Kết

quả thí nghiệm thể hiện ở bảng 3.7 hình 3.8.

Bảng 3.7. Kết quả ra cây ngoài vườn ươm

Thời gian Chiều cao cây (cm) Số lá/cây Chất lượng cây

2 tuần 5,68 ± 0,27 8,67 ± 0,35 +++

4 tuần 6,70 ± 0,28 10,40 ± 0,34 +++

Ghi chú: Chất lượng cây kém (+): Cây nhỏ, thấp, lá nhỏ, lá xanh nhạt; chất

lượng cây trung bình (++): Cây thấp, lá xanh đậm; chất lượng cây tốt (+++):

Cây to, phiến lá rộng, lá xanh đậm.

A B

Hình 3.8. Cây Nhàu in vitro trồng ở vườn ươm

A: 2 tuần; B: 4 tuần

Qua bảng 3.7 và hình 3.8 cho thấy, cây Nhàu in vitro có sự sinh trưởng phát

triển tốt trong môi trường tự nhiên, chiều cao cây đạt 5,68 sau 2 tuần, đạt 6,70

cm sau 4 tuần. Cũng như số lá có sự tăng lên 8,67 lá sau 2 tuần và 10,4 lá sau 4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

tuần; cây to, phiến lá rộng, lá xanh đậm.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1.1. Hạt Nhàu được khử trùng trong cồn 700 (1 phút), javen 60% trong 20

phút. Ở ngưỡng thời gian này tỉ lệ hạt sạch nảy mầm đạt 82%.

1.2. Trên môi trường MS cơ bản + đường sucrose 30 g/l + agar 9 g/l + BAP

2,0 mg/l cho hiệu quả tạo đa chồi tốt nhất trong các nồng độ nghiên cứu. Trên

môi trường này chồi mập, phát triển tốt, số chồi/mẫu đạt 2,53.

1.3. Môi trường tối ưu cho quá trình tạo cây Nhàu in vitro hoàn chỉnh là MS

cơ bản + đường sucrose 30 g/l + agar 9 g/l có bổ sung IBA 0,9 mg/l. Rễ phát sinh

mập, khỏe, rễ chính mang nhiều rễ phụ.

1.4. Khi ra cây ngoài điều kiện tự nhiên ở giai đoạn bầu đất, giá thể đất thịt

+ trấu hun tỉ lệ 1:1 là phù hợp nhất cho việc huấn luyện cây in vitro.

2. Đề nghị

Nghiên cứu bổ sung phối hợp các chất kích thích sinh trưởng vào môi

trường nuôi cấy để kết quả tạo đa chồi tốt hơn.

Tiếp tục theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của cây Nhàu đến giai đoạn

ra hoa, thu quả. So sánh và phân tích hàm lượng dược chất trong cây tự nhiên và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

cây in vitro.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Phạm Thị Vân Anh, Nguyễn Trọng Thông, Vũ Thị Ngọc Thanh (2004),

“Nghiên cứu ảnh hưởng của cao trái Nhàu (Morinda Citrifolia L.

Rubiaceae) trên động vật thực nghiệm bị suy giảm miễn dịch bằng chiếu

tia xạ”, Tạp chí nghiên cứu Y học, 32(6), tr. 82-86.

2. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học.

3. Võ văn Chi (2000), Cây thuốc trị bệnh thông dụng, NXB Thanh Hóa.

4. Bùi Thế Đồi, Lê Thị Diên (2011), Kỹ thuật trồng ba loài cây thuốc nam

Nhàu, Chóc máu và Củ dòm trên đất rừng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

5. Vũ Hương Giang, Ninh Khắc Bản, Trần Mỹ Linh, Lê Quỳnh Liên (2015),“

Điều tra tình hình phân bố và khả năng tái sinh tự nhiên của một số loài

trong chi Nhàu (Morindacitrifolia L.) ở Việt Nam”, Hội nghị Khoa học

toàn quốc về sinh thái và tái nguyên sinh vật lần thứ 6, tr. 1357-1363.

6. Trương Thị Hồng Hải, Nguyễn Công Hoài Sơn, Trần Thị Thanh (2018),

“Nghiên cứu đa dạng di truyền của một số Chùm ngây (Morinda oleifera)

nhập nội bằng chỉ thị RADP” Hội thảo khoa học công nghệ sinh học toàn

quốc, tr.1554-1563.

7. Lê Văn Hoàng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Khoa

học và kỹ thuật.

8. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Quyển III, NXB Trẻ, TP Hồ

Chí Minh.

9. Lê Thị Tâm Hồng, Lê Thị Thủy Tiên, Trần Văn Minh (2018), “ Bảo tồn

và phát triển cây Xạ Đen (Ehretia Asperula Zollinger Et Moritzi) bằng kỹ

thuật nuôi cấy đốt thân in vitro”, Hội thảo khoa học công nghệ sinh học

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

toàn quốc, tr.1602-1607.

10. Nguyễn Thị Ngọc Hương, Võ thị Bạch Mai (2009), “Tìm hiểu sự phát sinh

hình thái rễ trong nuôi cấy in vitro cây Nhàu (Morinda Citrifolia L.)”, Tạp

chí phát triển khoa học & công nghệ, tập 12 (17), tr. 100 - 105.

11. Nguyễn Thị Ngọc Hương, Võ thị Bạch Mai (2010), “Tìm hiểu sự phát sinh

hình thái chồi trong nuôi cấy in vitro cây Nhàu (Morinda Citrifolia L.)”,

Tạp chí phát triển khoa học & công nghệ, tập13 (1), tr. 209 - 214.

12. Võ Thị Mai Hương, Trần Thanh Phong (2013), “ Một số đặc trưng hóa

sinh và khả năng kháng khuẩn của dịch chiết quả Nhàu (Morinda Citrifolia

L.)”, Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần

thứ 5, tr. 1073-1078.

13. Lê Hoài Hương, Nguyễn Hoàng An Thụy, Bùi Thanh Hòa, Trần văn Minh

(2018), “Nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi cấy tế bào cây thuốc Hoàn

Ngọc (Pseuderanthemum Palatiferum (Nees) Radlk, Ex Lindau) và định

lượng hoạt chất tích tụ ”, Hội thảo khoa học công nghệ sinh học toàn quốc,

tr.1608-1614.

14. Nguyễn Thị Nhật Linh, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Thị Kim Yến, Lê Kim

Cương, Nguyễn Phúc Huy, Dương Tấn Nhựt (2012), “Ảnh hưởng của than

hoạt tính lên khả năng định hướng rễ ở cây Hồng môn và cây Cúc nuôi

cấy in vitro”, Tạp chí Sinh học, 34(3): 377-388.

15. Đỗ Tất Lợi (2015), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Thời

đại, Hà Nội.

16. Nguyễn Quang, Nguyễn Thị Lý Anh (2007), Công nghệ sinh học nông

nghiệp, NXB Đại học Sư phạm.

17. Lê Thị Như Thảo, Nguyễn Trung Hậu, Trần Văn Minh (2018), “ Nuôi cấy

rễ bất định Đinh Lăng lá nhỏ (Polyscias Fruticosa L. Harms) và định

lượng hoạt chất saponin tích lũy”, Hội thảo khoa học công nghệ sinh học

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

toàn quốc, tr.1658-1664.

18. Vũ Văn Thắng, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Phạm Thị Ánh Hồng (2009),“Tách

chiết hợp chất anthraquinone từ rễ cây Nhàu (Morinda Citrifolia L.) ở Việt

Nam”, Báo cáo khoa học hội nghị CNSH toàn quốc 2009, 04-49, tr.693-

696.

19. Phạm Thiệp, Lê Văn Thuần, Bùi Xuân Chương (2000), Cây thuốc Bài

thuốc Biệt dược, NXB Y học.

20. Nguyễn Trọng Thông, Phạm Thị Vân Anh, Nguyễn Thị Vinh Hà, Vũ Thị

Ngọc Thanh (2004), “Nghiên cứu ảnh hưởng của cao trái Nhàu (Morinda

Citrifolia L. Rubiaceae) trên động vật thực nghiệm bị gây suy giảm miễn

dịch bằng Cyclophosphamid”, Tạp chí nghiên cứu Y học, 27(1), tr. 28-33.

21. Nguyễn Trọng Thông, Nguyễn Thành Quân, Phạm Thị Vân Anh, Vũ Thị

Ngọc Thanh (2004), “Sơ bộ nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp cao trái Nhàu

(Morinda citrifolia Linne) trên thực nghiệm”, Tạp chí nghiên cứu Y học,

32(6), tr. 76-81.

22. Nguyễn Thị Thơ, Vũ Thị Phan, Lê Viết Việt, Khuất Thị Hải Ninh, Nguyễn

Thị Hải Hà, Nguyễn Thùy Linh, Bùi Văn Thắng (2018), “Nghiên cứu nhân

giống cây Râu Hùm (Tacca Chantrieri André) bằng kỹ thuật nuôi cấy in

vitro ”, Hội thảo khoa học công nghệ sinh học toàn quốc, tr.1615-1620.

23. Đái Thị Xuân Trang, Nguyên Thị Mai Phương, Võ Thị Ngọc Diễm và

Quách Tú Huê (2012), “Khảo sát hiệu quả hạ đường huyết và chống oxy

hóa của cao chiết cây Nhàu (Morinda citrifolia L.) ở chuột bệnh tiểu

đường”, Tạp chí khoa học, 23b, tr. 115-124.

24. Đái Thị Xuân Trang (2016), “Ảnh hưởng của cao ethanol rễ cây Nhàu

(Morinda citrifolia L.) đến sự thay đổi mô bệnh học của tụy tạng chuột

bệnh đái tháo đường ”, Tạp chí phát triển khoa học và nghiên cứu, tập 19,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

tr. 66-73.

25. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lí thống kê kết quả nghiên

cứu thực nghiệm trong nông lâm ngư nghiệp trên máy vi tính, NXB Nông

nghiệp, Hà Nội.

Tiếng Anh

26. Aline Carla Inada, Priscila Silva Figueiredo, Rosângela Aparecida dos

Santos-Eichler, Karine de Cássia Freitas, Priscila Aiko Hiane, Alinne

Pereira de Castro, and Rita de Cássia Avellaneda Guimarães (2017),

“Morinda citrifolia Linn.(Noni) and Its Potential in Obesity-Related

Metabolic Dysfunction”, Nutrients, 9(6): 540.

27. Anderson T. (1848), “On the Colouring Matter of Morinda Citrifolia” Trans

Roy Soc Edin. 16: 435-443.

28. Antony Selvaraj S., Manju Kamath L. and Subramani J. (2006),

“Micropropagation of Morinda citrifolia”, Intl. J. Noni Res. 1(2).

29. Balakrishna S., Seshadri TR., Venkataramani B. (1961), “Special chemical

component of commercial woods and related plant materials: Part X-

Heartwood of Morinda citrifolia Linn”, J Sci Industrial Res, 20B:331–333.

30. Elakkuvan S., Manivannan K. (2015), “ Effect Of Surface Sterilization On

In vitro Surviva Of Explants Of Noni (Morinda Citrifolia L.) ”,

International Journal of Advance Research in Engineering, Science &

Technology (IJAREST), ISSN(O):2393-9877, ISSN(P): 2394-2444.

31. Gairi A. & Rashid A. (2004), “Direct differentiation of somatic embryos

on different regions of intact seedlings of Azadirachta in response to

thidiazuron”, j plant physiol, 161:1073-1077.

32. Komaraiah P., Kishor, Maria, Magnusson, Karl-Eric (2005),

“Enhancement of anthraquinone accumulation in Morinda citrifolia

suspension cultures”, Plant Science, Vol. 168, 1337-1344.

33. Langford J., Dought A., Wang M., Clayton L., Babich M. (2004), “Effects

of Morinda citrifolia on quality of life and auditory function in

postmenopausal women”, J Altern Complement Med 10 (5): 737-9. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

34. Patade S.S., Tikka SBS., Mishra S., Rathod AH., Yadav SR. and Patil CN.

(2011),“ In vitro micropropagation of Indian Noni (Morinda citrifolia L.)”

Intl. J. Noni Res, 6 (1-2).

35. Saini M. K. and Patel R. M. (2015), “ In vitro Mass Multiplication Of Noni

(Morinda Citrifolia L.) Through Nodal Segment Explants ”, Journal of

Cell and Tissue Research Vol. 15(1) 4877-4882.

36. Stalman M., Koskamp AM., Luderer R., Vernooy JH., Wind JC., Wullems

GJ., Croes AF. (2003), “Regulation of anthraquinone biosynthesis in cell

cultures of Morinda citrifolia”, J Plant Physiol, 160(6): 607-14.

37. Wang MY., Su C. (2001), “Cancer Preventive Effect of Morinda citrifolia

(Noni)”, Annals NY Acad Sci 952: 161-168.

Tài liệu Internet

38. Nhàu (2019), https://vi.wikipedia.org/wiki/Nh%C3%A0u, ngày

26/03/2019.

39. Sử dụng rễ Nhàu trong y học cổ truyền - Lương Y Võ Hà ( 2018),

https://Nonigreen.com/su-dung-re-nhau-trong-y-hoc-co-truyen/, ngày

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

30/11/2018.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro cây Nhàu (Morinda Citrifolia L.)

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY IN VITRO CÂY NHÀU (Morinda Citrifolia L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY IN VITRO CÂY NHÀU (Morinda Citrifolia L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 20

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................... 26

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 48

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Ghi chú: (+) chồi nhỏ, ngắn, lá xanh nhạt; (++) chồi nhỏ, ngắn, lá xanh; (+++) chồi

A

B

C D

Hình 3.3 Cây Nhàu trên môi trường chứa BAP với nồng độ thay đổi sau 8 tuần

A: Đối chứng; B: BAP 1,0mg/l; C: BAP 1,5mg/l; D: BAP 2,0mg/l

Hình 3.4 Cây Nhàu trên môi trường chứa Kinetin sau 8 tuần

A: Đối chứng; B: Kinetin 2,0 mg/l

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok