Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ----------------------

NGUYỄN MẬU HƢNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN

GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME STARCH SYNTHASE TĂNG

CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 1

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ----------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN

GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME STARCH SYNTHASE TĂNG

CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 Học viện: Nguyễn Mậu Hƣng Hƣớng dẫn khoa học: TS. Phạm Bích Ngọc

Hà Nội - 2016

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận văn này hoàn toàn được hoàn thiện bằng quá

trình nghiên c ứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS .

Phạm Bích Ngọc cùng v ới cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công

nghệ Sinh học. Các số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày, trong luận văn này

là trung thực, không sao chép bất cứ tài liệu, công trình nghiên cứu của người

khác mà không chỉ rõ nguồn tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam

đoan của mình trước hội đồng khoa học.

Hà Nội, tháng 1 năm 2016

Học viên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 3

Nguyễn Mậu Hƣng

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã hướng dẫn,

giúp đỡ tận tình để tôi hoàn thành luận văn này:

TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng Công nghệ Tế bào Thực vật -

Viện Công nghệ Sinh học, đã hướng dẫn và hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức,

những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

PGS.TS. Chu Hoàng Hà - Viện trưởng Viện công nghệ sinh học, Viện

trưởng Viện Công nghệ sinh học đã chỉ bảo tận tình về chuyên môn, luôn theo

sát thí nghiệm của tôi để có những lời khuyên bổ ích và kịp thời.

ThS. Lê Thu Ngọc, CN. Nguyễn Khắc Hưng, CN. Phạm Thanh Tùng đã

giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý

báu trong thời gian học tập vừa qua.

Bằng tình cảm chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè

đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

này.

Hà Nội, tháng 1 năm 2016

Học viên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 4

Nguyễn Mậu Hưng

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................................................... 11

Đặt vấn đề ....................................................................................................................................... 11

Mục đích nghiên cứu ....................................................................................................................... 12

Nội dung nghiên cứu ....................................................................................................................... 12

Ý nghĩa khoa học ............................................................................................................................. 13

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................................... 14

1.1.

Tổng quan về tinh bột và sinh tổng hợp tinh bột ............................................................................. 14

1.1.1. Giới thiệu về tinh bột ....................................................................................................................... 14

1.1.2. Cấu trúc của tinh bột ........................................................................................................................ 15

1.1.3. SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT ........................................................................................................ 16

1.1.4. HÌNH DẠNG TINH BỘT ............................................................................................................... 17

1.1.5. Các loại hạt tinh bột hay gặp ........................................................................................................... 17

1.1.6. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan ........................................................................ 18

1.1.7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến quá trình trao đổi tinh bột. ..................... 21

1.2. Cây sắn và tình hình sản xuất cây sắn trên thế giới và Việt Nam .................................................... 22

1.3. Rễ tơ và ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất protein tái tổ hợp ............................................ 26

1.4

Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phƣơng pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực vật ................. 28

1.5

Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật ............................................................... 29

1.6

Nuôi cấy sinh khối rễ tơ................................................................................................................... 30

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 32

2.1. Vật liệu , hóa chất và thiết bị ........................................................................................................... 32

2.1.1 Thực vật .......................................................................................................................................... 32

2.1.2 Chủng khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng ..................................................................................... 32

2.1.3 Hóa chất .......................................................................................................................................... 33

2.1.4. Thiết bị ............................................................................................................................................ 33

2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................................................. 34

2.2.

Phƣơng pháp thu thập mẫu, phân lập, xác định trình tự gen SSIV ............................................. 34

2.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140 ........................................................................ 34

2.2.2. Phản ứng RT-PCR ........................................................................................................................... 34 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 5

MỤC LỤC

2.2.3. Tách dòng sản phẩm bằng vector pENTR™/D-TOPO ................................................................... 36

2.2.4. Kiểm tra các khuẩn lạc bằng phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc ......................................................... 37

2.2.5. Tách chiết plasmid ........................................................................................................................... 38

2.2.6. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank. ....... 39

2.2.7. Thiết kế vector pK7GWIWG2(II) mang đoạn gen SSIV bằng kỹ thuật Gateway. .................... 39

2.2.8. Phƣơng pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở khoai lang nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ...... 42

2.2.9. Phƣơng pháp đánh giá mô chuyển gen trên môi trƣờng chọn lọc ............................................... 43

2.2.10. Phƣơng pháp xử lí số liệu .............................................................................................................. 43

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................................. 44

3.1.

Phân lập, giải trình tự gen SSIV mã hóa cho enzyme Starch Synthase ở sắn .................................. 44

3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140. ....................................................................... 44

3.1.2. Thiết kế mồi đặc hiệu nhân gen SSIV của sắn và tổng hợp cDNA............................................. 44

3.1.3. Phân lập, tách dòng, giải trình tự gen SSIV của sắn .................................................................... 45

Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV và tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium

3.2.

rhizogenes tƣơng ứng ................................................................................................................................. 46

3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV bằng kỹ thuật Gateway ............................. 46

3.2.2. Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc vector chuyển gen đã thiết kế ......................... 47

3.3. Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang mang gen SSIV ............................................................... 48

3.5.

Phân tích các dòng rễ tơ khoai lang chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật PCR ..................................... 50

3.6.

Phân tích cây chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật RT-PCR ............................................................. 51

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................................................................... 55

KẾT LUẬN: ................................................................................................................................................ 55

ĐỀ NGHỊ: .................................................................................................................................................... 55

Tài Liệu Tham Khảo .................................................................................................................................. 56

Phụ Lục: ........................................................................................................................................................ 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 6

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Cấu trúc phân tử của amylopectin và amylose .................................. 15

Hình 2. Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan ................ 19

Hình 3. Cây Sắn .............................................................................................. 23

Hình 4. Sản lƣợng sắn theo châu lục, năm 2006-2011Error! Bookmark not

defined.

Hình 5. Tỷ lệ sản lƣợng sắn các nƣớc trên thế giới, 2012Error! Bookmark

not defined.

Hình 6. Vector pK7GWG2D ........................................................................... 40

Hình 7. RNA tổng số tách chiết từ củ giống sắn KM140 ............................... 44

Hình 8. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen SSIV từ cDNA sắn 45

Hình 9. Colony-PCR chọn lọc các dòng khuẩn mang vector pENTR/SSIV.. 46

Hình 10. Kết quả colony-PCR sử dụng mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R và kiểm tra

sản phẩm cắt plasmid pK7WG2D/SSIV bằng EcoRI. ......................................... 47

Hình 11. Kết quả điện di colony-PCR các dòng khuẩn lạc ......................... 48

Hình 12. Hình ảnh các mảnh lá và thân mẫu khoai lang in vitro trên môi

trƣờng đồng nuôi cấy sau 2 ngày lây nhiễm A.rhizogenes ............................ 49

Hình 13. Hình ảnh các mảnh lá và thân mẫu khoai lang in vitro bắt đầu ra rễ

trên môi trƣờng chọn lọc sau khi chuyển gen 30 ngày ................................... 49

Hình 14. Kết quả tách chiết DNA tổng số một số rễ tơ .................................. 50

Hình 15. Sản phẩm PCR nhân gen SSIV từ DNA tổng số tách chiết từ một số

dòng rễ tơ chuyển gen và không chuyển gen .................................................. 51

Hình 16. Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen

actin trong các dòng rễ tơ chuyển gen M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 15: sản

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 7

phẩm RT-PCR các cây chuyển gen ................................................................. 52

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

Hình 17. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen

......................................................................................................................... 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Diện tích, năng suất và sản lƣợng sắn của thế giới từ năm 2000-2012

......................................................................... Error! Bookmark not defined.

Bảng 2. Trình tự các cặp mồi sử dụng ............................................................ 32

Bảng 3. Kích thƣớc các phân đoạn thu đƣợc khi cắt plasmid tái tổ hợp

pK7GWG2D/SSIV bằng EcoRI ...................................................................... 41

Bảng 4: Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ mang cấu trúc gen tăng cƣờng tổng hợp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 8

tinh bột SSIV ở cây khoai lang ....................................................................... 53

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

STT KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens 1

2 DNA Acid Deoxiribonucleic

3 BA 6-benzyl adenine

4 bp Base pair

5 cDNA Complementary DNA

6 E.coli Escherichia coli

7 EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

8 Etal Đồng tác giả

9 EtBr Ethidium Bromid

10 GFP Green Fluorescent Protein

11 HSPs Heat shock proteins

12 Hyg Hygromycine resistant

13 LB Luria Bertani

14 M Thang Marker chuẩn

15 mRNA RNA thông tin

16 MT Môi trường

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 9

17 MS Murashige and Skoog, 1962

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

18 MT-sHSP Mitochondrial small Heat shock protein

19 MUG 4-methyl-umBelliferyl-β -D-glucoronide

20 µl Micro litte

21 µM Micromolar

22 NAA 1-Naphthaleneacetic acid

23 PCR Polymerase Chain Reaction

24 RT-PCR Reverse transcription polymerase chain

reaction

25 RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

26 SOD Superoxide dismutase

27 SSIV Starch synthase IV

28 T-DNA Transfer-DNA

29 TAE Tris-acetate –EDTA

30 Ti-plasmid Tumor-Inducing Plasmid

31 TP Transit peptide

32 Vir Virulence

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 10

33 WT Dòng không chuyển gen

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Tinh bột là nguồn carbohydrate dự trữ chính của cây trồng, là hợp chất

cao phân tử có hàm lƣợng lớn trong tự nhiên và có ý nghĩa quan trọng đối với

đời sống nhân loại. Tinh bột là chất rắn không hoà tan, có cấu trúc dạng

polymer đƣợc tạo ra các monomer là glucose. Tùy thuộc vào dạng liên kết

của các phân tử glucose mà tạo thành dạng mạch thẳng amylose, hoặc dạng

mạch nhánh amylopectin. Tinh bột đƣợc tích lũy chủ yếu ở cơ quan củ của

thực vật: củ sắn, củ khoai tây, củ khoai lang, củ rong giềng …

Tinh bột có vai trò quan trọng trong đời sống, đây là nguồn cung cấp

cacbonhydrat hay năng lƣợng chính cho con ngƣời. Ngoài ra, tinh bột còn

đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp nhƣ thực phẩm, dƣợc. Trung bình

trên thế giới sử dụng tới 60 triệu tấn tinh bột hàng năm bao gồm bột mỳ, bột

ngô, bột khoai tây, bột gạo, bột sắn, bột khoai lang. Hầu hết tinh bột đƣợc sử

dụng cho các ngành công nghiệp chế biến nhƣ: sử dụng làm chất nền cho quá

trình lên men của vi sinh vật (chủ yếu cho sản xuất mỳ chính), công nghiệp

dệt vải sợi, công nghiệp giấy và nhiều ngành công nghiệp khác.

Hàm lƣợng tinh bột, kích thƣớc hạt tinh bột và hàm lƣợng amylose là

những tính chất quan trọng của tinh bột có ảnh hƣởng nhiều đến các sản

phẩm trong các ngành công nghiệp thực phẩm (mì sợi, bánh bì và bánh

cookies) và phi thực phẩm (dệt, giấy, và dƣợc phẩm). Các tính chất này

quyết định độ nở của bột mì và tinh bột lúa mì, đó là các chỉ số quan trọng

liên quan đến các sản phẩm thực phẩm giàu tinh bột nhƣ mì sợi và mì ăn liền

(McCormick et al., 1991; Konik et al., 1993; Sasaki & Matsuki 1998; Dennett

et al., 2009; Salman et al., 2009). Đặc tính tinh bột chịu ảnh hƣởng của gen

cũng nhƣ môi trƣờng tăng trƣởng (Rharrabti et al., 2001; Kindred et al., 2008;

Weightman et al., 2008). Sự hiểu biến đổi của tính chất tinh bột đƣợc quyết

định bởi hai yếu tố là giống và điều kiện môi trƣờng xung quanh. Cùng một

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 11

điều kiện, tính chất tinh bột có thể thay đổi ở các giống khác nhau. Tƣơng tự,

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

cùng một giống trồng ở môi trƣờng khác nhau tính chất tinh bột cũng thay

đổi, từ đó sẽ gây khó khăn cho các nhà dinh dƣỡng và nhà chế biến thực

phẩm trong việc dự đoán thành phần hóa học và quá trình chế biến. Các

nghiên cứu về chọn lọc các giống cho hàm lƣợng tốt đã và đang đƣợc đẩy

mạnh nghiên cứu. Tuy nhiên, hầu hết chỉ dừng lại ở mức độ chọn lọc giống

cho chất lƣợng tinh bột tốt và ổn định. Các nghiên cứu sâu hơn về hoạt động

của gen liên quan đến các giống tại Việt Nam đang còn ít và chƣa cụ thể.

Xuất phát từ thực tiễn đó, cùng với sự phát triển công nghệ và các nghiên cứu

lâu năm của Phòng Công nghệ tế bào thực vật, nhóm nghiên cứu tiến hành tập

trung đánh giá cụ thể hoạt động của gen Starch Synthase IV. Đây là một trong

5 gen quyết định lớn đến sinh tổng hợp và cấu trúc của tinh bột. Để có đƣợc

Starch Synthase IV cũng nhƣ đánh giá gen này chúng tôi tiến hành: “Nghiên

cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch

synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột”.

2. Mục đích nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen

SSIV mã hóa enzyme starch synthase, đồng thời bƣớc đầu đánh giá hoạt động

của gen này đến khả năng tăng cƣờng sinh tổng hợp tinh bột ở các dòng rễ tơ

khoai lang.

Mục tiêu cụ thể:

- Phân lập và thiết kế vector mang gen SSIV phục vụ cho mục đich chuyển

gen vào cây khoai lang.

- Tối ƣu hóa đƣợc quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium

rhizogenes và tạo đƣợc các dòng rễ tơ.

- Bƣớc đầu đánh giá khả năng hoạt động của gen trong các dòng rễ tơ khoai

lang ở mức độ phiên mã

3. Nội dung nghiên cứu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 12

- Nghiên cứu phân lập gen SSIV từ giống sắn KM140.

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

- Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D mang gen SSIV bằng kỹ

thuật Gateway.

- Tạo chủng Agrobacterium rhizogenes mang cấu trúc vector

pK7WG2D/SSIV.

- Tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen và đánh giá hoạt động của gen SSIV

trong các dòng rễ tơ khoai lang ở mức độ phiên mã.

4. Ý nghĩa khoa học

Làm cơ sở cho việc đánh giá hoạt động của các gen chức năng liên quan đến

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 13

sinh tổng hợp tinh bột ở các cây lƣơng thực tại Việt Nam.

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về tinh bột và sinh tổng hợp tinh bột

1.1.1. Giới thiệu về tinh bột

Tinh bột là một glucan không tan, đƣợc cấu thành từ hai chuỗi polymer

(amylopectin và amylase) đƣợc cấu thành từ các tiểu phần là glucose. Ở thực vật

bậc cao, tinh bột đƣợc tổng hợp trong plastid (thể lạp) của cả tế bào quang hợp

và không quang hợp. Là carbohydrate dự trữ chủ yếu, tinh bột đóng vai trò quan

trọng trong suốt chu kỳ sống của thực vật. Trong lá, một phần nhỏ carbon đồng

hóa thông qua quang hợp đƣợc giữ lại trong các lục lạp ở dạng tinh bột chứ

không đƣợc chuyển đổi thành sucrose để vận chuyển đến các bộ phận khác.

Dạng tinh bột tạm thời này sẽ đƣợc phân hủy vào ban đêm để cung cấp cơ chất

cho quá trình hô hấp ở lá và tiếp tục tổng hợp sucrose cho việc phát triển khác

của cây(McMaugh et al. 2014) . Tinh bột, công thức hóa học: (C6H10O5)n) là

một polysacarit carbohydrate chứa hỗn hợp amyloza và amylopectin, tỷ lệ phần

trăm amilose và amilopectin thay đổi tùy thuộc vào từng loại tinh bột, tỷ lệ này

thƣờng từ 20:80 đến 30:70. Tinh bột có nguồn gốc từ các loại cây khác nhau có

tính chất vật lí và thành phần hóa học khác nhau. Chúng đều là các

polymer carbohydrat phức tạp của glucose (công thức phân tử là C6H12O6). Tinh

bột đƣợc thực vật tạo ra trong tự nhiên trong các quả, củ nhƣ: ngũ cốc. Tinh bột,

cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc nhất trong chế độ

dinh dƣỡng của loài ngƣời cũng nhƣ nhiều loài động vật khác. Ngoài sử dụng

làm thực phẩm ra, tinh bột còn đƣợc dùng trong công nghiệp sản xuất

giấy, rƣợu, băng bó xƣơng. Tinh bột đƣợc tách ra từ hạt nhƣ ngô và lúa mì, từ rễ

và củ nhƣ sắn, khoai tây, dong là những loại tinh bột chính dùng trong công

nghiệp (Evans et al. 2000).

Tinh bột lƣu trữ đƣợc tái sử dụng để hỗ trợ giai đoạn phát triển khác của

cây. Các bộ phận thu hoạch của cây trồng chủ lực của loài ngƣời phần lớn là cơ

quan lƣu trữ tinh bột ở thực vật. Có thể kể đến nhóm hạt ngũ cốc (gạo, ngô, lúa

mì, lúa mạch, lúa miến…) là nhóm quan trọng nhất, tiếp theo là các loại củ than Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 14

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

(khoai tây, khoai lang, khoai mỡ) và rễ củ (sắn, khoai môn), và hạt cây họ đậu.

Hầu hết tinh bột của cây trồng đều dùng trực tiếp làm thực phẩm hoặc thức ăn

cho chăn nuôi. Tuy nhiên nhu cầu dùng tinh bột cho công nghiệp đang ngày một

tăng lên. Đặc biệt tinh bột đang là nguồn vật liệu chủ yếu cho thế hệ nguyên liệu

sinh học đầu tiên do đặc tính dễ lên men.

Cấu trúc phân tử amylopectin Cấu trúc phân tử amylose

Hình 1. Cấu trúc phân tử của amylopectin và amylose

1.1.2. Cấu trúc của tinh bột

Tinh bột đƣợc cấu tạo bởi 2 loại polysaccharid đƣợc gọi là amylose và

amylopectin.

Amylose: phân tử amylose là một chuỗi hiện nay đƣợc biết đến hàng

nghìn đơn vị β-D-glucose nối với nhau theo dây nối (1→ 4). Quan niệm trƣớc

đây cho rằng chỉ có từ 200-400 đơn vị vì do quá trình chiết xuất và phân tích,

mạch bị đứt. Phân tử amylose đa số là các chuỗi thẳng rất ít phân nhánh.

Amylopectin: amylopectin có phân tử lƣợng lớn hơn khoảng 106-107 gồm

5000-50.000 đơn vị glucose và phân nhánh nhiều. Các đơn vị α-D-glucose trong

mạch cũng nối với nhau theo dây nối (1→ 4) còn chỗ phân nhánh thì theo dây

nối (1→ 6). Để xét mức độ phân nhánh, ngƣời ta methyl hóa toàn bộ các nhóm

OH của amylopectin rồi sau đó thủy phân và suy ra từ lƣợng 2, 3

dimethylglucose. Lƣợng 2, 3, 4, 6 tetramethylglucose ứng với những đơn vị tận

cùng của mạch còn lƣợng 2, 3, 6 trimethylglucose ứng với những đơn vị glucose

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 15

trong mạch (Evans et al. 2000).

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

Ngoài ra còn có thể xác định lƣợng glucose cuối mạch dựa vào tính khử

của amylopectin không methyl hóa. Chú ý rằng ở đây là glucose ở cuối mạch có

OH bán acetal tự do. Mạch bên trong (mạch giữa 2 điểm phân nhánh) của

amylopectin có khoảng 5-9 đơn vị glucose, những mạch bên ngoài có từ 10-18

đơn vị. Trong các loại tinh bột, trung bình tỉ lệ amylose là 25% còn amylopectin

là 75%. Tuy nhiên ngƣời ta cũng tạo ra đƣợc những chủng có nhiều amylose, ví

dụ ngô, có tinh bột chứa 75% amylose.

Amylose cho với thuốc thử iod màu xanh đậm có cực đại phổ hấp thu

khoảng 660nm, còn amylopectin thì có màu tím đỏ và cực đại hấp thụ khoảng

540nm. Màu tạo thành giữa tinh bột và iod đƣợc giải thích do sự hấp phụ. Ngƣời

ta cho rằng iod bị hấp phụ vào phía trong hình xoắn ốc. Ứng với một vòng xoắn

ốc thì có 1 phân tử iod. Những phân tử chƣa đủ 6 đơn vị glucose thì không phản

ứng với iod(Mason-Gamer, Weil, and Kellogg 1998).

1.1.3. SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT

Khi thủy phân tinh bột bằng acid thì sản phẩm cuối cùng là glucose

C6H12O6 (C6H10O5)n + nH2O -> (1+n) (C6H12O6)

Sự thủy phân qua các chặng: dextrin, erythrodextrin, achrodextrin,

maltose, glucose. Amylose dễ bị thủy phân hơn amylopectin vì dây nối (1-> 4)

dễ bị cắt hơn là dây nối (1-> 6).

Thủy phân bằng enzym

Enzym amylase. Có 2 loại chính: a-amylase và β-amylase. Enzym a phổ

biến trong cây, nhiều nhất là các hạt ngũ cốc nẩy mầm, ngoài ra còn có trong

nấm mốc, nƣớc bọt, dịch tụy. a-amylase chịu đƣợc nhiệt độ đến 70o, ở nhiệt độ

này thì các enzym khác mất hoạt tính. Enzymβ-amylase có trong khoai lang, đậu

nành và một số hạt ngũ cốc, chịu đƣợc nhiệt độ đến 50onhƣng chịu đƣợc môi

trƣờng acid cao hơn so với enzym a (pH = 3,3). Trong thực tế ngƣời ta dựa vào

ảnh hƣởng khác nhau đó về độ pH và nhiệt độ để tách 2 loại enzym trên.

a) Enzym β cắt xen kẽ những dây nối α-(1->4)-glucosid của amylose để

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 16

tạo thành các đƣờng maltose, kết quả thu đƣợc là 100% đƣờng maltose. Đối với

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

amylopectin thì b-amylase chỉ cắt đƣợc các dây nối (1->4), khi gặp mạch nhánh

thì dừng lại, kết quả tạo thành maltose và dextrin, lƣợng maltose chỉ đạt từ 50-

60%.

b) Enzym α cắt một cách ngẫu nhiên vào dây nối (1->4). Đối với amylose

thì sản phẩm cuối cùng khoảng 90% là maltose ngoài ra có một ít là glucose.

Đối với amylopectin thì α-amylase cũng chỉ tác động đến dây nối (1->4) mà

không cắt đƣợc dây nối(1->6) vì thực tế ngƣời ta tìm thấy các phân tử

isomaltose (= 6-O-α-D-gluco-pyranosyl-D-glucopyranose) trong dịch thủy phân.

Enzym α-amylase tiếp tục cắt đƣợc những dextrin mà enzym b để lại để tạo

thành các dextrin phân tử bé hơn. Nhƣ vậy α-amylase tác dụng lên tinh bột thì

sản phẩm thu đƣợc chủ yếu là maltose rồi đến glucose và dextrin phân tử bé.

Tinh bột nguồn gốc khác nhau, enzym nguồn gốc khác nhau thì khả năng thủy

phân cũng khác nhau.

1.1.4. HÌNH DẠNG TINH BỘT

Tinh bột tồn tại trong cây dƣới dạng hạt có hình dạng và kích thƣớc khác

nhau, đây là một đặc điểm giúp ích cho việc kiểm nghiệm một dƣợc liệu chứa

tinh bột. Tùy theo loài cây và tùy theo độ trƣởng thành của cây mà hình dáng và

kích thƣớc thay đổi. Về hình dáng thì có thể hình cầu, hình trứng, hình nhiều

góc ... kích thƣớc có thể từ 1-100mm đƣờng kính. Soi kính hiển vi thƣờng thấy

hạt tinh bột cấu tạo bởi nhiều lớp đồng tâm sắp xếp chung quanh một điểm gọi

là rốn hạt. Các lớp này tạo nên là do hạt tinh bột lớn dần bằng cách tăng thêm

các lớp ở phía ngoài. Các lớp này khác nhau ở chỉ số chiết quang và hàm lƣợng

nƣớc. Có tác giả cho rằng các lớp khác nhau đó là do những lớp đƣợc tăng thêm

về ban đêm và những lớp tăng thêm về ban ngày nên không hoàn toàn giống

nhau.

Hạt hình trứng và hình thận: Tinh bột khoai tây chế từ củ cây khoai tây

1.1.5. Các loại hạt tinh bột hay gặp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 17

- Solanum tuberosumL. , thuộc họ Cà - Solanaceae. Hạt tinh bột hình trứng, rốn

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

hạt ở đầu hẹp, các vân đồng tâm dễ nhận. Thỉnh thoảng có hạt kép 2 hoặc 3.

Kích thƣớc trung bình 50mm nhƣng có hạt lớn đến 80-100mm.

Tinh bột hoàng tinh chế từ củ cây dong - Maranta arundinacea L. ,

thuộc họ dong - Marantaceae, (đừng nhầm với cây hoàng tinh - Polygonatum

sp.). Hạt hình trứng kích thƣớc 30-60mm.

Tinh bột sen, chế từ hạt cây sen - Nelumbo nucifera Gaertn., họ Sen -

Nelumbonaceae. Hạt tinh bột hình trứng hay hình thận, rốn hạt hình vạch kích

thƣớc hạt từ 3-25mm.

Tinh bột sắn (= khoai mì) chế từ cây sắn (= khoai mì) - Manihot

esculenta Crantz; họ Thầu Dầu- Euphorbiaceae. Hạt hình cầu phần lớn một đầu

bị lẹm và hơi lõm trông nhƣ cái chuông. Rốn hạt hình sao, kích thƣớc 3-35mm.

Tinh bột đậu, chế từ hạt của nhiều loại đậu - Phaseolus spp.; họ Đậu -

Fabaceae. Hạt hình trứng hay hình thận. Rốn hạt dài và phân nhánh, kích thƣớc

trung bình 35mm.

Tinh bột hoài sơn, chế từ củ của cây củ mài - Dioscorea persimilis Prain

và Burkill, họ Củ nâu - Dioscoreaceae. Hạt hình trứng hay hình thận. Rốn hạt

dài, kích thƣớc trung bình 40mm.

Hạt hình đĩa hay hình thấu kính dẹt: Tinh bột mì chế từ hạt của cây lúa

mì - Triticum vulgareL., họ Lúa - Poaceae, kích thƣớc hạt lớn đến 30mm, hạt bé

6-7mm. Tùy theo vị trí nhìn mà thấy hình tròn hoặc hình thấu kính lồi 2 mặt.

Rốn hạt là 1 điểm ở giữa hạt, không rõ.

Hạt hình nhiều góc: Tinh bột gạo chế từ hạt cây lúa - Oriza sativa L.,

họ Lúa - Poaceae. Hạt nhiều góc, nhỏ, kích thƣớc từ 4-6mm, thƣờng đƣợc kết

thành đám. Rốn hạt không rõ.

Tinh bột ngô (= bắp), chế từ hạt cây ngô - Zea mays L. ; họ Lúa -

Poaceae. Hạt nhiều góc, rốn hạt ở giữa rất rõ, kích thƣớc 15-30mm.

1.1.6. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan

Quá trình tổng hợp tinh bột α-1,4 glucan bao gồm ba bƣớc quan trọng xảy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 18

ra trong lục lạp và thể vô sắc: i) cung cấp glucose-6-phosphate (Glc-6-P) vào

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

trong các thể lạp, ii) tổng hợp ADP-glucose (ADPG) từ Glc-1-P, và iii) tổng hợp

tinh bột từ ADPG (Zeeman, Kossmann, and Smith 2010). Nói một cách ngắn

gọn, bƣớc đầu tiên không thể thiếu đƣợc là sự tổng hợp ADPG từ Glc-1-P và

ATP đƣợc xúc tác bởi ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase). Một khi

đƣợc hoạt hóa, starch synthase (SS) chuyển ADPG tới đầu không khử của α-1,4

glucan để tạo thành các sợi α-1,4 glucan. Tiếp theo, các sợi α-1,4 glucan đƣợc

dùng nhƣ là các cơ chất cho các enzyme phân nhánh của tinh bột (BE hoặc Q-

enzyme) tạo ra các liên kết sợi α-1,6 là amylopectin. Cuối cùng amylopectin

đƣợc tinh thể hóa tạo thành tinh bột dƣới tác động của các enzyme phân rã

(DPE), phosphorylase (P-enzyme) và glucanotransferase (D-enzyme). Ngoài ra,

UDP-glucose: protein glucosyltransferase hoặc amylogenin (38 hoặc 45 kDa)

cũng đƣợc dự đoán tham gia vào bƣớc đầu tiên trong quá trình tổng hợp tinh bột

(Zeeman, Kossmann, and Smith 2010), (Egli et al. 2010).

Hình 2. Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan

Các starch synthase (SS) của thực vật bậc cao mã hóa bởi 5 nhóm gen ký

hiệu là GBSS (granule-bound starch synthase), SSI, SSII, SSIII, và SSIV. GBSS

gắn chặt với hạt tinh bột và chịu trách nhiệm tổng họp amylose. Các biến thể

khác nhau của SS (thƣờng gọi là SS hòa tan) tạo ra các chuỗi amylopectin (1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 19

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

dạng tinh bột đã polyme hóa) có thể tan hoặc trong các plastic hoặc một phần

hòa tan một phần gắn với hạt tinh bột. Số liệu di truyền và sinh hóa chỉ ra rằng

mỗi biến thể enzyme SS có các cấu thành khác nhau và vai trò nhất định trong

tổng hợp amylopectin. Phân tích việc phân phối chiều dài chuỗi amylopectin

trong các cây đột biến và cây chuyển gen mất các biến thể enzyme SS đặc trƣng

đã dẫn tới kết luận rằng nhóm SSI, SSII, và SSIII đóng vai trò trong việc kéo dài

các chuỗi ngắn, trung bình và dài tƣơng ứng.

Việc phân nhánh của amylopectin xảy ra đồng thời với quá trình kéo dài

chuỗi. Quá trình phân nhánh đƣợc xúc tác bởi enzyme phân nhánh (BE).

Enzyme này cắt chuỗi α-l,4-glucan sẵn có và chuyển đoạn cắt mang 6 đơn vị

glucose hoặc nhiều hơn tới vi trí C6 của gốc glucosyl ở chuỗi glucan khác. BE

của thực vật bậc cao bao gồm hai nhóm I và II. Nhóm I vận chuyển các chuỗi

dài hơn. Phân tích di truyền chỉ ra rằng hai nhóm BE có vai trò đặc biệt trong

tổng hợp amylopectin.

Bên cạnh SS và BE còn có các enzyme khác nhau tham gia vào quá trình

sinh tổng hợp tinh bột. Các enzyme khừ phân nhánh - (debranching enzymes,

DBE) làm mất các điểm phân nhánh và quan trọng trong việc quyết định cấu

trúc của amylopectin. Thực vật có hai loại DBE— isoamylase (ISA) và

limitdextrinase (LDA, hay còn gọi là pullulanase). Hai loại này khác nhau bởi

trình tự amino acid và cơ chất. ISA có 3 nhóm - ISA1, ISA2, và ISA3. ISA1 và

ISA2 liên quan chặt với tổng hợp amylopectin. Vai trò cơ bản của LDA và ISA3

là phân hủy tinh bột. ISA1 hoạt động mạnh nhất khi cơ chất là các chuỗi glucan

tƣơng đối dài nhƣ là các amylopectin bị hòa tan, trong khi đấy LDA và ISA3 có

hoạt tính cao với các chuỗi glucan ngắn nhƣ β-limit dextrins. ISA2 dƣờng nhƣ

không có hoạt tính xúc tác mà tác dụng điều tiết hoặc ổn định ISA1 chứ không

tham gia trực tiếp vào quá trình hủy phân nhánh. Trong các cây đột biến hoặc

chuyển gen thiếu hụt ISA1, tinh bột dạng hạt bị giảm, thậm chí không có và thay

thế một phần bởi các glucan tan trong nƣớc. Hiện tƣợng này quan sát đƣợc ở

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 20

một số thực vật, ví dụ nhƣ ở nội nhũ non của ngũ cốc, lá Arabidopsis và củ

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

khoai tây. Trong Arabidopsis và khoai tây việc mất hoạt tính ISA2 có ảnh hƣởng

giống nhƣ mất hoạt tính của ISA1 (McMaugh et al. 2014). Đột biến thiếu hoạt

tính DBE (tức là đột biến đồng thời 4 gen: isal, isa2, isa3, Ida) không phát hiện

đƣợc các hạt tinh bột. Kết quả này hoàn toàn đồng nhất với ý kiến cho rằng hoạt

tính DBE là cần thiết cho việc sinh tổng hợp tinh bột. Tuy nhiên các phân tích

sâu hơn về sinh hóa và di truyền chỉ ra rằng việc mất hoàn toàn tinh bột trong

đột biến này là kết quả của việc thay đổi và mất các glucan đƣợc phân nhánh

nhờ các enzyme phân hủy tinh bột chứ không phải việc mất hoạt tính DBE

(Wattebled et al. 2008). Mặc dù có những phát hiện mới trong việc xác định các

enzyme tổng hợp amylopectin synthesis, những vẫn chƣa thể có những hiểu biết

một cách chính xác cấu trúc SS và BE nào đƣợc tạo ra, làm thể nào DBE có thể

khử phân nhánh một cách chọn lọc, hoạt động nào của 3 enzyme này đƣợc phối

hợp nhƣ thế nào để tạo thành một phân tử amylopectin có khả năng tử hình

thành hạt tinh bột. Để giải quyết vấn đề này đòi hỏi phát triển về kỹ thuật trong

phƣơng pháp phân tích và phân tử.

Thành phần amylose của tinh bột đƣợc tổng hợp bởi GBSS. Các cây đột

biến và chuyển gen thiếu enzyme này là cẩn thiết đế tạo ra cây không có

amylose. Các hạt tinh bột không có amylose vẫn có hình thái bình thƣờng, điều

đó chứng tỏ rằng amylopectin là cần thiết cho việc hình thành hạt. GBSS khác

các biến thể khác nhau của enzyme SS ở chỗ vị trí đặc biệt đối với các hạt và

kiểu phản ứng. Không giống các biến the synthase của tinh bột, GBSS chuyển

các gốc glucosyl từ thực vật bậc cao.

1.1.7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến quá trình

trao đổi tinh bột.

Cho đến nay những cố gắng nhàm tăng khả năng tích lũy tinh bột tập

trung vào việc tăng hoạt tính ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) trong

cây. Đây là enyme cung cấp cơ chất cho SS. Một loạt đột biến của gene AGPase

Escherichia coli (glgC16) mã hóa cho các dạng điều khiển khác nhau của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 21

enzyme này đã đƣợc dùng để biểu hiện mạnh trong cây. Khi glgC16 đƣợc biểu

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

hiện ở plastid của cây khoai tây chuyển gen, một vài dòng đã có khả năng tích

luỹ tinh bột cao hơn dòng không chuyển gen là 60%. Tuy nhiên với các cây

khác nhƣ sắn, ngô và các loài khác việc tăng tinh bột không đạt đƣợc mức nhƣ

vậy. Vì thế việc biến đổi một mình AGPase có thể không có đạt đƣợc kết quả

mong muốn tăng tinh bột trong các cơ quan dự trữ. Ngoài ra, có một số bằng

chứng về việc tăng nguồn cung cấp ATP cho các plastid có thể kích thích việc

tạo ra ADP-glucose và dẫn đến việc tăng tốc độ sinh tổng hợp tinh bột. Biểu

hiện mạnh yếu tố dẫn truyền adenylate ở vỏ plastid của Arabidopsis trong khoai

tây làm tăng ADP-glucose lên 2 lần và hàm lƣợng tinh bột tăng lên từ 16-36%

so với đối chứng. Khi kìm hãm adenylate kinase của plastic (enzyme chuyển hóa

hai chiều 2 phân từ ADP thành ATP và AMP) làm ADP-glucose tăng lên 10 lần

và tinh bột tăng lên gấp đôi trong củ khoai tây cả ở trong nhà kính và ngoài đồng

ruộng (Ballicora, Iglesias, and Preiss 2003)

Tăng khả năng phân hủy tinh bột lại có tác dụng đối với cây trồng cung

cấp nguyên liệu sản xuất ethanol. Biểu hiện α-amylase chịu nhiệt trong cây ngô

đã đƣợc ứng dụng để tạo ra cây tự chế biến, giảm giá thành biến đổi từ tinh bột

sang ethanol. Amylase đƣợc biểu hiện trong gian bào nên không tham gia vào

sinh tổng hợp tinh bột hay dự trữ vì thế việc có mặt của nó không ảnh hƣởng

đến việc tích tụ tinh bột trong quá trình phát triển của cây. Khi hạt xay ra đƣợc

làm nóng trong nƣớc để dính hóa tinh bột thì amylase chịu nhiệt sẽ bắt đầu

chuyển đổi tinh bột thành dạng có thể lên men (Zeeman, Kossmann, and Smith

2010).

1.2. Cây sắn và tình hình sản xuất cây sắn trên thế giới và Việt Nam

Sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây lƣơng thực hàng năm. Củ sắn có tỷ lệ

chất khô 38 - 40%, tinh bột 16 - 32%, giàu vitamin C, calcium, vitamin B và các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 22

chất khoáng, nghèo chất béo, muối khoáng, vitamin và nghèo đạm.

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

Hình 3. Cây Sắn

Cây sắn hiện đƣợc trồng trên 100 nƣớc có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới

thuộc ba châu lục: châu Á, châu Phi và châu Mỹ La tinh (Hình 3). Sắn đƣợc

trồng chủ yếu ở các hộ nông dân nhỏ. Sắn đƣợc sử dụng với nhiều mục đích đa

dạng tùy vùng khác nhau trên thế giới. Ở Châu Á và Châu Mỹ Latinh, củ sắn

cung cấp nguyên liệu thô cho chế biến thức ăn cho gia súc và làm tinh bột ở quy

mô nhỏ và lớn. Hiện nay, mặc dù đƣợc trồng bởi các hộ nông dân nhỏ, tại các

vùng đất khó trồng trọt nhất, các sản phẩm từ sắn đang đƣợc chuyển đổi nhanh

chóng từ sản phẩm mang tính truyền thống thành mặt hàng có tính thƣơng mại.

Ở Đông Nam Á, hầu hết sắn thu hoạch đƣợc bán cho các mục đích công nghiệp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 23

trong nƣớc và xuất khẩu (Hoàng Kim và Phạm Văn Biên (1996).

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

Tình hình nghiên cứu chọn tạo và phát triển giống sắn tại Việt Nam

Hầu hết những nghiên cứu đối với cây sắn hiện nay tập trung chủ yếu vào

việc chọn tạo các giống sắn có năng suất cao, thời gian sinh trƣởng ngắn thông

qua các phƣơng pháp lai tạo truyền thống. Một trong những yếu tố chính góp

phần hiệu quả trong việc nâng cao năng suất và sản lƣợng sắn là sự tăng cƣờng

nghiên cứu, nhập nội, lai tạo, ứng dụng công nghệ mới trong việc chọn tạo và

nhân giống sắn lai (Hoàng Kim et al., 2001). Trƣớc năm 1990, Gòn, H34 và

Xanh Vĩnh Phú là những giống sắn phổ biến ở Việt Nam. Từ năm 1986 đến năm

1993, Trung tâm Hƣng Lộc đã thu thập và tuyển chọn đƣợc 3 giống sắn mới là

HL20, HL23 và HL24 đƣợc canh tác mỗi năm ở các tỉnh phía Nam khoảng 70

000 – 80 000 ha (Hoàng Kim et al., 1990). Giai đoạn 1991-2005, Viện Khoa học

Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam phối hợp với Chƣơng trình sắn Việt Nam,

Trung tâm Quốc tế Nông nghiệp Nhiệt đới (CIAT) đã nhập nội, tuyển chọn và

giới thiệu cho sản xuất 5 giống sắn tốt: KM60, KM94, KM95, SM937-26,

KM98-1 (Hoàng Kim et al., 2008; 2010). Tổng diện tích các giống sắn mới ở

Việt Nam năm 2005 ƣớc tính đạt 270.000 ha, chiếm 69,2% tổng diện tích sắn

của cả nƣớc. Năm 2007, giống sắn lai KM140 đƣợc phát triển bởi các nhà khoa

học tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam. Ƣu điểm của giống

KM140 là thời gian sinh trƣởng ngắn 7-10 tháng, năng suất bột tƣơng đƣơng

KM94 (tỷ lệ tinh bột trong củ là ~ 28%), dạng củ đẹp, thịt củ màu trắng, ít đắng,

dạng cây thẳng (Trần Công Khanh et al. 2007, 2008). Ngoài ra, ƣu điểm của các

giống sắn ở Việt Nam là hầu nhƣ không nhiễm các bệnh virus thông thƣờng ở

cây sắn nhƣ virus bệnh khảm sắn, tuy nhiên hiện nay một số vùng trồng sắn đã

có hiện tƣợng sắn nhiễm bệnh chổi rồng có khả năng do nấm gây ra.

Mặc dù những phƣơng pháp lai tạo truyền thống và việc áp dụng chỉ thị

phân tử đã thành công trong việc tạo ra những giống sắn mới có phẩm chất cao

hơn, tuy nhiên trong thực tiễn sản xuất các phƣơng pháp lai tạo truyền thống vẫn

còn tồn tại những vấn đề khó giải quyết đối với việc phát triển và cải tạo cây sắn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 24

theo hƣớng mong muốn . Không giống những cây trồng chủ yếu khác trên thế

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

giới, sắn đặc biệt không thể cải tạo về mặt di truyền qua lai hữu tính. Nhiều

giống sắn hiếm khi ra hoa và năng suất hạt thƣờng rất là thấp. Sắn thƣờng đƣợc

nhân lên bằng sinh sản sinh dƣỡng dựa vào các đoạn thân. Đặc điểm tự nhiên

này gây hạn chế về mặt lai tạo nhƣng đem lại thuận lợi đối với việc sử dụng sinh

học phân tử để cải tạo giống, vì mỗi cây đều đƣợc nhân lên từ một dòng, phân ly

hoặc di chuyển của gen qua lại giữa các loài là rất hạn chế. Chính vì vậy mà áp

dụng những tiến bộ của công nghệ gen đối với cây sắn trở nên cần thiết và là

một trong những yêu cầu mà thực tiễn sản xuất đòi hỏi. Công nghệ gen có thể

tạo ra những giống sắn mới mang những tính trạng mong đợi. Thêm vào đó

công nghệ này có thể chuyển những tính trạng tốt từ các giống sắn dại vào giống

sắn đang canh tác mà điều này thƣờng gặp trở ngại rất lớn do các yếu tố về di

truyền khi sử dụng phƣơng pháp lai truyền thống. Hơn nữa với công nghệ này

các nhà khoa học có thể đƣa vào cây sắn những nguyên liệu di truyền (gen) từ

bên ngoài giúp cải thiện tính kháng của cây chủ với các yếu tố gây bệnh nhƣ

virus, vi khuẩn… .

- Trong kế hoạch 5 năm 2011-2015, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

đƣa ra chủ trƣơng giảm diện tích trồng sắn và nâng cao năng suất trồng sắn. Kế

hoạch đề ra là diện tích trồng sắn duy trì ổn định khoảng 500.000 ha, năng suất

đạt khoảng 178 tạ/ha. Nếu đạt đƣợc theo kế hoạch thì với mức sản lƣợng 8,9

triệu tấn vẫn sẽ xảy ra tình trạng tranh mua nguyên liệu giữa các nhà máy sản

xuất ethanol với các nhà máy thức ăn chăn nuôi, nhà máy sản xuất tinh bột sắn

và lƣợng sắn dùng cho xuất khẩu. Nhƣ vậy, ứng dụng công nghệ sinh học nhằm

cải tạo cây sắn theo hƣớng các tính trạng có lợi nhƣ năng suất cao, chất lƣợng

phù hợp mục đích sử dụng nhằm phục vụ công nghiệp và xuất khẩu là một vấn

đề cấp thiết ở nƣớc ta.

- Phần lớn các nghiên cứu về sắn ở Việt Nam trong thời gian gần đây chủ yếu

sử dụng các phƣơng pháp truyền thống để chọn tạo, lai tạo giống sắn mới từ các

giống nhập nội và giống địa phƣơng nhằm cải tiến năng suất. Ứng dụng công

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 25

nghệ sinh học hiện đại trong nghiên cứu về sắn đang ở giai đoạn khởi đầu và sử

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

dụng các phƣơng pháp đơn giản nhƣ nuôi cấy mô để giữ giống, nhân nhanh in

vitro một số giống mới. Các hƣớng nghiên cứu sâu ở mức độ sinh học phân tử

và di truyền học chƣa đƣợc quan tâm và phát triển. Đặc biệt, chƣa có nghiên cứu

sâu ở mức độ sinh học phân tử nhằm khai thác nguồn gen quý sẵn có từ các

giống sắn tại Việt Nam, phục vụ cho công tác cải tạo giống sắn bằng công nghệ

gen.

1.3. Rễ tơ và ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất protein tái tổ hợp

Rễ tơ là một bệnh ở thực vật gây ra bởi quá trình tƣơng tác giữa vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes - một loại vi khuẩn đất gram âm- với tế bào vật chủ.

Trong quá trình xâm nhiễm, vùng T-DNA ở giữa đoạn biên phải (right border)

và đoạn biên trái (left border) trên Ri-plasmid trong vi khuẩn đƣợc chuyển và

tích hợp vào genome của thực vật, kết quả là hình thành các rễ tơ tại hoặc gần vị

trí xâm nhiễm.

Giống nhƣ Ti-plasmid ở vi khuẩn A. tumefaciens, Ri-plasmid ở vi khuẩn

A.rhizogenes là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lƣợng phân tử lớn từ

200-800 kp gồm 2 vùng chính là T-DNA và vir (virulence). Dựa vào khả năng

sinh tổng hợp các opine ở rễ tơ, Ri-plasmid đƣợc chia làm 2 nhóm chính:

agropine và mannopine, và một số nhóm phụ đƣợc tìm thấy và phân loại sau này

nhƣ cucumopine và mikimopine. Trong đó các chủng thuộc nhóm agropine (

A4, 15834, LBA9402, 1855) đƣợc chứng minh là độc hơn so với chủng thuộc

nhóm mannopine (8196, TR7, TR101) và các chủng này đƣợc sử dụng chủ yếu

trong các nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật (Sevón and Oksman-Caldentey 2002).

T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm 2 vùng chính là vùng

biên trái TL-DNA và biên phải TR-DNA. Hai vùng này đều có kích thƣớc

khoảng 15 - 20 kb và đƣợc xen kẽ bởi 1 đoạn DNA, đoạn DNA này sẽ không

đƣợc chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ. Vùng TR-DNA mang các gen mã

hóa sinh tổng hợp auxin (tms1 and tms2), vùng TL-DNA bao gồm 18 khung đọc

(ORFs), trong đó có 4 loci 10, 11, 12 và 15 mã hóa cho rolA, B, C, and D (root

locus). Các Ri-plasmid của các chủng A.rhizogenes thuộc nhóm mannopine, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 26

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

cucumopine and mikimopine chứa vùng T-DNA đơn, có cấu trúc giống nhƣ

vùng TL-DNA của các chủng thuộc nhóm agropine nhƣng khuyết gen rolD

(Britton et al. 1991). Các gen rolA, rolB and rolC đóng vai trò quan trọng trong

quá trình cảm ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật. Sự biểu hiện đồng thời của ba

gen này gây nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Các rễ tơ

này có khả năng sinh trƣởng và phát triển nhanh hơn rất nhiều so với rễ bình

thƣờng. Trong 3 gen rol trên, gen rolB đóng vai trò quan trọng hơn cả, khi gen

rolB đƣợc biểu hiện, mô tế bào thực vật đã cảm ứng tạo kiểu hình rễ tơ, trong

khi đó khi bất hoạt gen rolB không tạo đƣợc kiểu hình rễ tơ (Alpizar et al. 2008).

Nuôi cấy rễ tơ có nhiều ƣu điểm do rễ tơ có thể sinh trƣởng nhanh, phân

nhánh mạnh trên môi trƣờng không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng,

vì thế loại bỏ đƣợc dƣ lƣợng của các chất này trong sản phẩm tạo ra. Hơn nữa,

rễ tơ có thể đƣợc nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây

chuyền sản xuất các chất thứ cấp hay các dƣợc phẩm sinh học tái tổ hợp. Không

giống với các dạng tế bào thực vật khác nhƣ tế bào huyền phù và mô sẹo thƣờng

có xu hƣớng không ổn định về mặt di truyền và hóa sinh, rễ tơ là cơ quan biệt

hóa nên có sự di truyền ổn định hơn và có thể sản xuất một lƣợng lớn các hợp

chất thứ cấp và protein tái tổ hợp (Kittipongpatana and Sirithunyalug 2006).

Hiện nay, nuôi cấy rễ tơ thực vật đã đƣợc sử dụng cho quá trình sản xuất

protein tái tổ hợp và các dƣợc phẩm sinh học tái tổ hợp nhƣ SEAP (human

secreted alkaline phosphatase), protein huỳnh quang kết hợp với protein ricin B

(GFP-ricin B) và đặc biệt hơn cả là các kháng thể và các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ

của kháng thể. Bên cạnh đó, các protein tái tổ hợp tạo vị ngọt nhƣ thaumatin,

miraculin cũng đã đƣợc biểu hiện thành công ở hệ thống rễ tơ thuốc lá. Ngoài

ra, trong các nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp từ nuôi cây sinh khối rễ

tơ cần kể đến rễ tơ cây đậu tƣơng đƣợc sử dụng làm hệ thống biểu hiện một số

loại protein tái tổ hợp, enzyme tham gia quá trình trao đổi chất ở cây đậu tƣơng

nhằm đánh giá mức độ biểu hiện của gen hay các ứng dụng trong nghiên cứu sự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 27

biểu hiện của promoter qua mức độ biểu hiện của gen chỉ thị nhƣ gen gus, GFP.

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

Các nghiên cứu chủ yếu sử dụng nguồn mẫu là lá mầm và chủng khuẩn K599 để

chuyển gen, sau 10 – 15 ngày sau diệt khuẩn các mẫu lá bắt đầu xuất hiện rễ tơ

với tỷ lệ biểu hiện rễ tơ cao 54- 90 % tùy vào từng giống đậu tƣơng đƣợc sử

dụng.

1.4 Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phƣơng pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực vật

Agrobacterium rhizogenes, tên khoa học khác là Rhizobium rhizogenes, là một

loài vi khuẩn đất gram âm, thuộc họ Rhizobiaceae nằm trong bộ Rhizobiales cố

định đạm. Chúng có khả năng nhận biết đƣợc các phân tử tín hiệu từ các tế bào

thực vật bị tổn thƣơng và tấn công vào vị trí đó. Mô tế bào thực vật bị nhiễm

bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes cảm ứng và phát triển mạnh mẽ các rễ.

Do đó Agrobacterium rhizogenes là một yếu tố cần đƣợc quan tâm đến trong

việc cảm ứng tạo rễ bất định từ tế bào thực vật in vitro.

Agrobacterium đƣợc biết đến từ rất lâu trong nông nghiệp với vai trò là các vi

khuẩn cố định đạm, cung cấp nguồn nitơ cho cây trồng. Trong những thập kỉ

gần đây thì các nhà khoa học đã chú ý đến vai trò của hai loài vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes và Agrobacterium tumefaciens trong mục đích

chuyển gen vào thực vật. Chúng đƣợc xem nhƣ là các ―kĩ sƣ trao đổi chất‖, đƣợc

áp dụng để chuyển gene vào tế bào thực vật nhằm mục đích đẩy mạnh quá trình

sinh tổng hợp ra các hợp chất thứ cấp cần thiết. Trong đó, Agrobacterium

tumefaciens đƣợc biết đến với vai trò cảm ứng tạo ra các khối u (mô sẹo) và

Agrobacterium rhizogenes thì đƣợc biết đến với vai trò cảm ứng tạo ra các rễ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 28

bất định ở thực vật hai lá mầm .

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

Hình 2. Khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Khi các vi khuẩn A.rhizogenes nhiễm vào vết thƣơng của thực vật thì chúng sẽ

chuyển gen của chúng vào các tế bào thực vật tại vị trí đó. Các gen đƣợc chuyển từ

A.rhizogenes vào trong bộ gen của tế bào thực vật đƣợc gọi tên là T-DNA (transfer

DNA). T-DNA sau khi chuyển vào thì sẽ đƣợc gắn ổn định vào bộ gen của thực vật.

Tuy các gen mã hóa T-DNA có nguồn gốc từ vi khuẩn nhƣng nó có mang các trình tự

điều tiết ở Eukaryote nên có thể biểu hiện đƣợc trong tế bào thực vật. Vùng T-DNA

này nằm trong một plasmid lớn của A. rhizogenes và plasmid này đƣợc đặt tên là Ri-

plasmid (root inducing plasmid) do A.rhizogenes có khả năng cảm ứng tạo rễ bất

định.

Ri-plasmid đƣợc chia thành 2 nhóm chính là agropine and mannopine, vi khuẩn

A. rhizogenes chứa Ri-plasmid thuộc loại agropine đƣợc sử dụng chủ yếu cho quá

trình chuyển gen vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo rễ tơ. Ri-plasmid đƣợc chia

thành nhiều vùng nhƣ vùng gây độc (gọi tắt là vùng vir), vùng chuyển gene (T-DNA), vùng ori, vùng phiên mã... Chỉ có đoạn T-DNA của plasmid mới đƣợc chuyển vào bộ

gen của thực vật và việc chuyển gen này thông qua sự hỗ trợ bởi các đoạn gen trong vùng vir của Ri-plasmid. Vùng vir chiếm khoảng 35 kb trong Ri-plasmid và mã hóa sáu locus phiên mã (vir A, B, C, D, E, G), có chức năng quan trọng trong quá trình chuyển gen . Sự phiên mã của vùng vir đƣợc cảm ứng với nhiều hợp chất thuộc nhóm phenol, điển hình là acetosyringone - hợp chất liên quan đƣợc xác định là có vai trò làm tăng tần số của quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium ở nhiều loài thực

vật. Nhiều loại đƣờng cũng đóng vai trò nhƣ chất bổ trợ hoạt động cho acetosyringone

để cảm ứng sự biểu hiện của gene vir ở mức độ cao.

Nhìn chung cơ chế quá trình xâm nhiễm và cơ chế phân tử của quá trình vận

chuyển T-DNA vào tế bào vật chủ của vi khuẩn A. tumefaciens và A.rhizogenes đƣợc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 29

1.5 Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật

chứng minh là tƣơng tự nhau. Tuy nhiên, sự hình thành khối u ở vi khuẩn

A.tumefaciens do gen mã hóa sinh tổng hợp auxin quy định. Trong khi đó, các gen mã

hóa sinh tổng hợp auxin ở vi khuẩn A. rhizogenes có vai trò rất nhỏ trong quá trình

hình thành rễ tơ ở thực vật .

T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm 2 vùng chính là vùng biên

trái TL-DNA và biên phải TR-DNA. Hai vùng này đều có kích thƣớc khoảng 15 - 20

kb và đƣợc xen kẽ bởi 1 đoạn DNA, đoạn DNA này sẽ không đƣợc chuyển vào hệ gen

của tế bào vật chủ. Vùng TR-DNA mang các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin (tms1

and tms2), vùng TL-DNA bao gồm 18 khung đọc (ORFs), trong đó có 4 loci 10, 11, 12 và 15 mã hóa cho rolA, B, C và D (root locus). Các Ri-plasmid của các chủng

A.rhizogenes thuộc nhóm mannopine, cucumopine and mikimopine chứa vùng T-DNA đơn, có cấu trúc giống nhƣ vùng TL-DNA của các chủng thuộc nhóm agropine nhƣng

khuyết gen rolD . Các gen rolA, rolB và rolC đóng vai trò quan trọng trong quá trình

cảm ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật. Sự biểu hiện đồng thời của ba gen này gây nên

kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Các rễ tơ này có khả năng sinh

trƣởng và phát triển nhanh hơn rất nhiều so với rễ bình thƣờng . Trong 3 gen rol trên,

gen rolB đóng vai trò quan trọng hơn cả, khi gen rolB đƣợc biểu hiện, mô tế bào thực

vật đã cảm ứng tạo kiểu hình rễ tơ, trong khi đó khi bất hoạt gen rolB không tạo đƣợc

kiểu hình rễ tơ .

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

Rễ tơ là tên gọi dùng để chỉ các lông rễ đƣợc sản sinh ra mạnh mẽ tại vị trí

bị nhiễm bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. T-DNA từ A. rhizogenes sau khi

chuyển vào tế bào thực vật thì chúng sẽ đƣợc gắn vào bộ gene của thực vật, từ đó tế

bào thực vật sẽ làm nhiệm vụ biểu hiện các gene rol và gen aux (tổng hợp ra IAA)

làm tăng khả năng tạo các lông rễ một cách mạnh mẽ ngay tại vị trí bị tổn thƣơng ở

mô thực vật đó. Số lƣợng các lông rễ đƣợc tạo ra khá nhiều, phát triển thành một hệ

thống lông rễ, hay còn gọi là hệ thống rễ tơ.

1.6 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ

1.7 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN CỦA GEN Ở CÁC MƢC ĐỘ KHÁC NHAU

Trong từng giống, loài, mỗi loại tế bào, tại các giai đoạn phát triển, sinh trƣởng khác nhau, dƣới tác động của các điều kiện ngoại cảnh, và đặc điểm di truyền của từng giống các nhóm gen đặc hiệu sẽ đƣợc biểu hiện để tạo ra các sản phẩm của gen (dịch

mã ra protein) thông qua ARN thông tin (quá trình phiên mã). Sinh tổng họp tinh bột

là quá trình phức tạp, có sự tham gia biểu hiện của nhiều gen. Việc so sánh hoạt động biểu hiện của những gen tham gia vào quá trình tổng họp tinh bột đƣợc hoạt hóa ở

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 30

những giống, dòng nhất định dƣới tác động của ngoại cảnh sẽ cho phép tìm hiểu đƣợc

vai trò của từng gen hoặc nhóm gen có tính quyết định trong các quá trình sinh tổng

hợp tinh bột ở sắn. Việc biểu hiện mạnh, yếu hoặc không biểu hiện của gen đƣợc thể

hiện trƣớc hết qua RNA thông tin, dùng làm khuôn mẫu tổng hợp nên các enzyme chức năng, xúc tác cho chủ trình sinh tổng hợp tinh bột. Với khuôn mẫu là ARN tổng

số tách chiết từ các mẫu sắn thông qua bƣớc tổng hợp cDNA, phƣơng pháp PCR định

lƣợng (quantitative realtime PCR hay qRT-PCR) sẽ đƣợc sử dụng để đánh giá mức độ

biểu hiện của các gen quan tâm tại các mô cơ quan khác nhau hay ở những giai đoạn phát triển. Đây là phƣơng pháp nhanh, nhạy, hiệu quả để xác định sự biểu hiện của các

gen trong quá trình phát triển đặc thù của thực vật.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 31

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu , hóa chất và thiết bị

2.1.1 Thực vật

Giống sắn KM140 đƣợc thu thập tại Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm -

nông nghiệp Hƣng Lộc, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam

Mẫu cây khoai lang KB1 nuôi cấy trong điều kiện in vitro do Phòng Công -

nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

2.1.2 Chủng khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng

- Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes K599, Escherichia coli

DH5(α) do Phòng công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học cung

cấp.

- Vector tách dòng pBT để tách dòng đoạn gen SSIV mã hóa cho enzym

stacrch synthase IV đƣợc phân lập từ giống sắn KM140, Vector chuyển gen pK7GWIWG2 (II) (Ghent Uni. Belgium); vector nhân dòng pENTRTM/D- TOPO®.

Bảng 1. Trình tự các cặp mồi sử dụng

CACCATGGCGTCGAAGCTATCGA

Tên Chiều dài Mục đích Trình tự mồi mồi gen

SSIV_F

CGTGGTTTCTG

EcoRI

TTAGACCTACTTGCTGCCGCTCT TG

Nhân đoạn gen 3,5 kb SSIV

SSIV_R

CCTCTCCTGAACAACCTCCA

SSIV-

GCAAACTTCCCACCTTTTCC

Frag_F Kiểm tra vector 1kb pK7WG2D/SSIV SSIV-

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 32

Frag_R

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

2.1.3 Hóa chất

Dung dịch tách chiết plasmid: Dung dịch 1 (25 nM Tris HCl, pH 8,0; 10

mM EDTA, pH 8,0; 50 mM Glucose); Dung dịch 2 (0,2 M NaOH; 1% SDS);

Dung dịch 3 (3M CH3COOK; 11,5% CH3COOH); Isopropanol, Ehtanol 70%;

dung dịch Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1).

Dung dịch TAE 1X (40 mM Tris, 20mM acetic acid và 1 mM EDTA);

Agarose 0,8%; Ethidium bromide 0,5 µg/ml, thang ADN 1kb (Thermo); kit tinh

sạch ADN Gene JET gel extraction (Thermo)

Kit tách chiết plasmid (QIAprep Spin Miniprep Kit) của hãng QIAGEN (Đức); Gateway® LR ClonaseTM II Enzyme mix Kit (Invitrogen, Cat No: 911791

– 020).

Các hóa chất đa lƣợng, vi lƣợng, vitamin, chất điều hòa sinh trƣởng BAP,

kinetin, IBA, NAA, Yeast extract, Bacto pepton, Trypton, NaCl, Agarose,

Sucrose, Tris HCL, EDTA, MgSO4, Glycerol, Glycine betaine, Proline,

Kanamycin, Rifamycin, Cefotaxime, X-gluc và các loại hóa chất thông dụng

khác đƣợc cung cấp bởi các hãng nhƣ Sigma (Mỹ), Merck (Đức) và Wako (Nhật

Bản).

2.1.4. Thiết bị

Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật và chuyển gen: box

cấy vô trùng, bình nuôi cây, dàn nuôi cấy, nồi khử trùng, máy nuôi lắc, máy đo

pH, máy đo OD. Các thiết bị dùng trong sinh học phân tử: pipetman, máy soi

gel (Bio-Rad), máy chụp ảnh điện di (Amersham Pharmacia Biotech), máy li

tâm (Eppendorf), bộ điện di (Bio-Rad), máy hút chân không (Savant), máy PCR

System 9700 (Appied Biosystem), bể ổn nhiệt, máy biến nạp bằng xung điện,

máy voltex v.v cùng các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ tế bào thực

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 33

vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học.

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2. Phƣơng pháp thu thập mẫu, phân lập, xác định trình tự gen SSIV

2.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140

Quy trình tách chiết RNA đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit

PureLink Plant RNA Reagent, Invitrogen. Đầu tiên nghiền 0,1 g mẫu trong nitro

lỏng. Sau đó bổ sung 0,5 ml PureLink®Plant RNA Reagent lạnh, đảo đều. Ủ 5

phút ở nhiệt độ phòng. Rồi ly tâm 12000 vòng trong 2 phút ở nhiệt độ phòng.

Chuyển phần dịch nổi qua ống ly tâm mới. Bổ sung 0,1 mL NaCl 5 M, trộn đều.

Bổ sung thêm 0,3 mL Chloroform, trộn đều. Ly tâm 12000 vòng trong 10 phút

ở 4°C, chuyển pha trên qua ống ly tâm mới. Thêm 1 lần thể tích isopropanol,

trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm 12000 vòng trong 10 phút

ở 4°C, bỏ phần dịch. Tiếp tục bổ sung 1 ml cồn 75%, trộn đều. Ly tâm 12000

vòng trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch, dùng pipet cẩn thận hút hết dịch

vẫn còn trong ống ly tâm. Bổ sung 30 μL nƣớc khử RNase, trộn đều, mẫu đƣợc

bảo quản ở -80°C.

2.2.2. Phản ứng RT-PCR

- Sử dụng 500 ng RNA tổng số để tổng hợp cDNA

Thành phần Thể tích

RNA tổng số 500 ng

Mồi ngẫu nhiên (Hexam) 1µL

Nƣớc khử ion Dẫn đến 12µl

- Trộn nhẹ, ủ 65°C trong 5 phút. Cắm ngay vào đá, sau đó bổ sung các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 34

thành phần

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

Thành phần Thể tích

5X Reaction buffer 4

dNTP mix (10mM) 2

Ribolock Rnase Inhibitor (20u/µl) 1

M-MuLV Reverse Transcriptase 1

(20u/µl)

Tổng thể tích 20µl

- Trộn nhẹ và cho vào máy spin sau đó chạy chƣơng trình tổng hợp cDNA

25°C/5 phút; 42°C/ 60 phút. Kết thúc phản ứng ở 70°C/5 phút. Bảo quản cDNA

ở -20°C hoặc -70°C. Thực hiện phản ứng PCR

Thành phần Thể tích (µl)

Pfu Buffer with MgSO4 10X 2,5

Pfu DNA polymerase 0,5

dNTPs 2,5

SSIV_F 0,5

SSIV_R 0,5

Khuôn 0,5

Nƣớc 17

Tổng 25

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 35

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (°C) Thời gian Chu kỳ

1 3 phút 1 Biến tính 95

45 2 Biến tính 95oC giây 30 3 Gắn mồi 52oC 30 giây

4 Kéo dài chuỗi 72oC 4 phút 1 5 Hoàn tất kéo dài 72oC 10 phút

6 Kết thúc phản ứng 4oC 

Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng GeneJET PCR Purification Kit của

hãng Thermo Scientific nhƣ sau: Thêm vào 25 µl Binding buffer, trộn đều. Cho

toàn bộ dịch lên cột ly tâm. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch qua

cột. Thêm vào cột 500 Wash buffer. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ

dịch qua cột. Ly tâm tiếp 13000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột ly tâm sang

ống 1,5 ml. Thêm vào cột ly tâm 30 µl nƣớc khử ion vô trùng, ủ ở nhiệt độ

phòng trong 2 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu lấy dịch.

2.2.3. Tách dòng sản phẩm bằng vector pENTR™/D-TOPO

Sản phẩm PCR đƣợc gắn vào vector pENTR theo pENTR™/D-TOPO®

Cloning Kit.

Thành phần Thể tích (µl)

Sản phẩm PCR sạch (200ng) 4

Salt solution TOPO® vector 1

Tổng thể tích 6

Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ 5’ ở nhiệt độ phòng (22-23oC). Đặt phản ứng

trên đá và thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào E.coli One Shot Competent.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 36

Bổ sung 2 µl phản ứng TOPO Cloning vào tế bào khả biến và trộn nhẹ. Ủ trong

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

đá 10 phút. Sốc nhiệt tế bào 30s,ở 42oC rồi chuyển ngay ống vào đá. Bổ sung 250 µl môi trƣờng S.O.C ở nhiệt độ phòng. Nuôi lắc 200v/p, 37oC, 1h. Cấy trải

50-200 µl dịch biến nạp lên đĩa môi trƣờng LB đặc chứa 100 µg/ml Kanamycin và ủ qua đêm ở 37oC.

2.2.4. Kiểm tra các khuẩn lạc bằng phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc

Sau khi nuôi khuẩn đã biến nạp trên môi trƣờng chọn lọc, tiến hành chọn

ra các khuẩn lạc trắng để chạy PCR từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu trên

vector để xác định khuẩn lạc có plasmid mang gen mong muốn. Thành phần

phản ứng PCR từ khuẩn lạc và chu kì nhiệt nhƣ sau:

Thành phần phản ứng PCR từ khuẩn lạc

STT Thành phần Thể tích (µl)

Nƣớc khử ion vô trùng 1 8

2 Maste mix 10

3 Khuẩn lạc

4 M13F 1

5 M13R 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 37

Tổng 20

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR từ khuẩn lạc

Chu Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ ( °C) Thời gian kỳ

5 phút 1 1 Biến tính 94

50giây 2 Biến tính 94oC

30giây 30 3 Gắn mồi 52oC

2 phút 4 Kéo dài chuỗi 72oC

10 phút 1 5 Hoàn tất kéo dài 72oC

6 Kết thúc phản ứng 4oC 

Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ khuẩn lạc trên gel agarose 0,8% để chọn

ra các khuẩn lạc mang gen có kích thƣớc nhƣ mong muốn. Đồng thời, nuôi

những khuẩn lạc dƣơng tính vào 3ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh thích hợp

để tách plasmid.

2.2.5. Tách chiết plasmid

Các dòng khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc nuôi trong 3 ml LB lỏng có bổ sung

kháng sinh thích hợp để tiến hành tách plasmid. Đây là phƣơng pháp tách

plasmid lƣợng bé từ 1-1,5 ml dịch khuẩn E. coli, có số bản copy plasmid cao.

Chuyển 1,5 ml dịch nuôi cấy vào eppendorf, ly tâm 10000 vòng/ phút trong 1

phút, loại dịch trên. Bổ sung 200 µl dung dịch I dùng máy Voltex hòa tan tế bào.

Từ bƣớc này các thao tác phải đƣợc thực hiện trong đá. Bổ sung 400 µl dung

dịch II đảo nhẹ nhàng. Dung dịch II có tác dụng phá vỡ thành tế bào. Bổ sung

300 µl dung dịch III để kết tủa protein, đảo đều. Bổ sung 900 µl Chloroform :

isoamin (24:1), lắc đều. Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút. Dƣới tác dụng

của lực ly tâm, mẫu chia thành ba pha: pha trên chứa DNA plasmid, pha giữa là

protein tủa và pha dƣới cùng là tạp chất. Dùng pipet hút nhẹ nhàng pha trên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 38

cùng chứa DNA plasmid sang ống eppendorf mới. Bổ sung thể tích tƣơng đƣơng

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

isopropanol để tủa plasmid, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm thu DNA

plasmid ở 13000 vòng/ phút trong 10 phút. Bỏ dịch thu cặn. Thêm 500 µl

Ethanol 70%, đảo đều. Ly tâm 7000 vòng/ phút trong 10 phút, bỏ dịch thu cặn

Làm khô mẫu ở nhiệt độ phòng 15 phút. Hòa tan DNA thu đƣợc trong 30 µl

H2O deion. Điện di kiểm ta plasmid trên gel agarose 0,8%.

2.2.6. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tự

tƣơng ứng trên GenBank.

Xác định trình tự nucleotide: Các mẫu plasmid tái tổ đƣợc xác định trình tự trên

máy đọc trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Gentic Analyzer.

Phân tích trình tự: Sử dụng các phần mềm DNAstar, BioEdit, BLAST để so

sánh các trình tự gen.

2.2.7. Thiết kế vector pK7GWIWG2(II) mang đoạn gen SSIV bằng kỹ

thuật Gateway.

Phản ứng LR: Khi đoạn gen cần quan tâm đã đƣa vào entry vector pENTRTM/D-TOPO là vector mang gen kháng Kanamycin, ở bên sƣờn đoạn gen

quan tâm có hai điểm tái tổ hợp (attL1 và attL2). Tiến hành phản ứng tái tổ hợp

LR để chuyển đoạn gen quan tâm vào destination vector pK7GWG2D. Vector

này chứa tất cả trình tự cần biểu hiện nhƣ các điểm tái tổ hợp (attR1 và attR2) ở

giữa hai điểm có đoạn gen chọn lọc âm tính ccdB, các gen chọn lọc

(Spectinomicin hay Streptomycin, Kanamycin). Hai sự tái tổ hợp: một là giữa

attL1 và attR1, hai là attL2 và attR2 tạo ra dòng biểu hiện.

attL1-gene-attL2 x attR1-ccdB-attR2 attB1-gene-attB2 x attP1-ccdB-attP2

(entry clone) (destination vector) (expression clone)

Phản ứng đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của bộ kit Gateway® LR ClonaseTM II Enzyme mix Kit (Invitrogen) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện

phòng thí nghiệm. Bổ sung các thành phần sau vào ống ly tâm 1,5 ml ở nhiệt độ

phòng và trộn nhẹ:

Thành phần phản ứng LR Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 39

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

STT Thành phần Thể tích (µl)

1 Plasmid pENTR/CPi (50 – 150 ng) 1

2 Vector pK7GWIWG2(II) (150 ng/l) 0,5

3 Nƣớc khử ion, khử trùng 2,5

Tổng 4

Làm tan hỗn hợp enzym LR ClonaseTM trên đá khoảng 2 phút. Vortex 2 lần, mỗi lần khoảng 2 giây. Bổ sung vào ống ly tâm 2 µl enzym LR ClonaseTM

để phản ứng và trộn bằng cách vortex nhẹ nhàng 2 lần. Ly tâm nhẹ nhàng. Ủ phản ứng ở 25oC trong 90 phút (thay vì 1 giờ nhƣ trong kit). Bổ sung 1 µl dung dịch proteinase K để kết thúc phản ứng. Vortex nhẹ nhàng. Ủ 37oC trong 10

phút. Hỗn hợp đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli Top10. Chúng tôi thực

hiện phản ứng colony-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F và SSIV-Frag_R

khuếch đại một đoạn ngắn gần 1 kb của gen SSIV

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 40

Hình 4. Vector pK7GWG2D

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

Theo tính toán lý thuyết sản phẩm thu đƣợc sau khi xử lý với enzyme EcoRI sẽ

cho ba phân đoạn DNA có kích thƣớc nhƣ trình bày trong bảng sau.

Bảng 2. Kích thƣớc các phân đoạn thu đƣợc khi cắt plasmid tái tổ hợp

pK7GWG2D/SSIV bằng EcoRI

Mẫu pK7GWG2D/SSIV

Phân đoạn 1 10661 bp

Phân đoạn 2 2201 bp

Phân đoạn 3 1486 bp

Thành phần phản ứng cắt bằng EcoRI nhƣ sau:

STT Thành phần Thể tích (l)

1 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 5

Dung dịch đệm (10X) 2 1

3 EcoRI 1

4 DNA plasmid 3 (l)

Tổng 10

Tách Plasmid và biến nạp pK7GWG2D/SSIV đã có kết quả chọn dòng dƣơng

tính ở trên vào tế bào Agrobacterium rhizogenes K599

Trƣớc khi biến nạp vector tái tổ hợp pK7GWG2D/SSIV vào tế bào

A.rhizogenes K599 bằng phƣơng pháp xung điện, tế bào này đƣợc làm cho khả

biến theo Sambrook và cộng sự (1998). Quy trình biến nạp đƣợc tiến hành nhƣ

sau: Tế bào khả biến đặt trong đá 10-15 phút. Bổ sung 1 µl plasmid tái tổ hợp pK7GWG2D/SSIV vào tế bào khả biến và trộn nhẹ. Rửa Cuvette bằng cồn 100o,

rửa lại bằng nƣớc khử ion, khử trùng rồi thấm khô. Chuyển tất cả hỗn hợp dịch A.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 41

rhizogenes + pK7GWG2D/SSIV vào Cuvette. Xung điện: 2,5 kv, 25µF và điện trở

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

400. Đặt ngay vào đá. Sau 5-10 phút bổ sung 300 µl LB và trộn nhẹ. Chuyển sang ống eppendorf 2 ml. Ủ ở 28oC trong 1 giờ trên máy lắc. Chuyển dịch vào

đĩa chọn lọc chứa kháng sinh Streptomycin 100 mg/l và spectinomycine 1000 mg/l. Ủ ở 28oC từ 24 - 48 giờ.

Chọn dòng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes mang vector chuyển gen:

Sự có mặt của vector chuyển gen đƣợc kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi

đặc hiệu SSIV-Frag_F và SSIV-Frag_R khuếch đại một đoạn ngắn gần 1 kb của

gen SSIV

2.2.8. Phƣơng pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở khoai lang nhờ vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes

Phƣơng pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở cây khoai lang thông qua vi khuẩn A.

rhizogens K599 bao gồm các bƣớc chính sau: Chủng khuần A.rhizogenes

K599/SSIV gốc đƣợc cấy ria trên môi trƣờng YMB đặc bổ sung 100 mg/l spectinomycine và 100 mg/l Streptomycine, nuôi trong tủ ấm 28oC trong 48 giờ.

Lấy một khuẩn lạc nuôi phục hồi trong trong 20 ml YMB lỏng bổ sung kháng

sinh chọn lọc (100 mg/l spectinomycine và 100 mg/l Streptomycine) nuôi lắc

200 vòng/phút qua đêm . Nuôi nhân thu sinh khối: lấy 5 ml dịch khuẩn phục hồi

cho vào 45 ml YMB lỏng (không chứa kháng sinh chọn lọc), nuôi lắc 200 vòng/phút, 28o C trong 4 -6 giờ. Các môi trƣờng nuôi khuẩn đều không bổ sung

kháng sinh do vector pRi 15834 không có gen kháng kháng sinh. Dịch khuẩn đƣợc đem ly tâm 6500 vòng/phút ở 4o C thu sinh khối, loại bỏ môi trƣờng nuôi

cấy. Cặn khuẩn đƣợc hòa tan trong môi trƣờng MS lỏng tạo dịch huyền phù vi

khuẩn. Các mẫu lá khoai lang đƣợc cắt tạo tổn thƣơng sau đó đƣợc lây nhiễm

bằng cách ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn . Sau khi lây nhiễm, mẫu biến

nạp đƣợc thấm khô bằng giấy thấm khử trùng rồi đƣợc đặt vào môi trƣờng đồng

nuôi cấy: MS + saccharose 30 g/l + agar 8g/l . Sau thời gian đồng nuôi cấy,

chuyển mẫu lên môi trƣờng diệt khuẩn: MS + saccharose 30 g/l + agar 8g/l +

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 42

cefotaxime 500 mg/l. Sau 2-4 tuần, các mẫu thực vật bắt đầu cảm ứng tạo rễ và

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

đƣợc cắt ra chuyển lên môi trƣờng MS + saccharose 30 g/l + agar 8g/l +

cefotaxime 500 mg/l.

2.2.9. Phƣơng pháp đánh giá mô chuyển gen trên môi trƣờng chọn lọc

Sàng lọc cây chuyển gen bằng cách chọn lọc: Do không phải toàn bộ các

tế bào và các mẫu chuyển gen đều mang gen chuyển nên nhất thiết phải tiến

hành sàng loc các tế bào chuyển gen Dna vào các gen chọn lọc đƣợc thiết kế

trong vector chuyển gen mà ngƣời ta sử dụng các kháng sinh phù hợp để thu

đƣợc các tế bào, mẫu mang gen chuyển. Gen chọn lọc điển hình là các gen mã

hóa cho các loai enzyme có khá năng khử độc đối vói kháng sinh nhƣ

kanamycin (nptII), hygromycine (hyg), gentamycine (gent),… hoặc chất diệt cỏ

glyphosate hay basta (bar),… Chỉ những tế bào mang gen biến nạp có thể sống

sót trên môi trƣòng chứa chất kháng sinh hoặc chất diệt cỏ. Các loai vector này

dã đƣợc ứng dụng và mang lai thành công trong việc chọn lọc nhiều đối tƣợng

cây chuyển gen nhƣ cây đu đủ, cây hồng, cây lúa, cây bông vái, cây thuốc lá, …

2.2.10. Phƣơng pháp xử lí số liệu

Thiết kế mồi và dữ liệu trình tự DNA đƣợc xử lý bằng phần mềm

Lasergene version 7 cúa DNASTAR Inc., USA; BLAST (Basic Local

Alignment Search Tool; Altschul et al., 1990); BioEdit version 7 (Tom Hall,

Department of Microbiology , North Carolina State University, NC) và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 43

Primer3 Input Version 4 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/).

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập, giải trình tự gen SSIV mã hóa cho enzyme Starch Synthase

ở sắn

3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140.

RNA tổng số đƣợc tách chiết từ củ của giống sắn KM140 bằng hóa chất

chuyên dụng cho việc tách chiết RNA thực vật (PureLink Plant RNA Reagent)

của Invitrogen. Các bƣớc thực hiện đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà sản

xuất. DNA genome tạp nhiễm sau đó đƣợc loại bỏ bằng cách xử lý mẫu với

DNase I và RNA tổng số đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp tủa sử dụng Lithium

chloride (LiCl). Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số trên gel agarose cho thấy

RNA tổng số thu đƣợc có tính toàn vẹn, không bị đứt gẫy, đảm bảo hàm lƣợng

và độ tinh sạch cho các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 5. RNA tổng số tách chiết từ củ giống sắn KM140

3.1.2. Thiết kế mồi đặc hiệu nhân gen SSIV của sắn và tổng hợp cDNA

Do kích thƣớc DNA của gen SSIV rất lớn (hơn 8 kb) nên chúng tôi sử

dụng trình tự CDS của gen SSIV sắn trên phytozome với mã

cassava4.1_000719m để thiết kế cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen SSIV từ

cDNA củ sắn là SSIV_F (5’-

CACCATGGCGTCGAAGCTATCGACGTGGTTTCTG-3’) và SSIV_R

(5’- TTAGACCTACTTGCTGCCGCTCTTG-3’). Trên mồi xuôi có chứa trình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 44

tự CACC ở đầu 5’ giúp quá trình nối ghép gen đích vào vector pENTR đƣợc

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

đơn giản hóa nhờ phản ứng TOPO cloning - một phƣơng pháp tạo dòng của

Invitrogen.

Để tăng hiệu suất cũng nhƣ độ đặc hiệu của phản ứng PCR khuếch đại

gen SSIV từ cDNA sắn, chúng tôi tiến hành tổng hợp cDNA từ RNA tổng số

tách chiết từ củ sắn sử dụng mồi đặc hiệu. Theo đó, cDNA đƣợc tổng hợp theo

kít ―RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit‖ (Thermo

Scientific).

3.1.3. Phân lập, tách dòng, giải trình tự gen SSIV của sắn

Chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế để khuếch đại gen SSIV từ

cDNA sắn đã tổng hợp bằng phản ứng PCR dƣới sự xúc tác của enzyme Pfu

DNA polymerase. Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% cho thấy

chúng tôi đã khuếch đại thành công 1 đoạn DNA có kích thƣớc gần 3,5 kb tƣơng

đƣơng với kích thƣớc đoạn CDS của gen SSIV theo lý thuyết.

Hình 6. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen SSIV từ cDNA

sắn

Đoạn DNA này sau đó đƣợc tinh sạch và gắn vào vector pENTRTM/D-

TOPO trong dung dịch muối đệm tạo thành vector pENTR/SSIV. Sản phẩm của

phản ứng TOPO cloning đƣợc sử dụng để biến nạp vào tế bào khả biến E. coli

One Shot TOP10 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Sàng lọc các dòng khuẩn lạc trên

đĩa biến nạp bằng phƣơng pháp colony-PCR sử dụng cặp mồi M13F/R, chúng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 45

tôi đã chọn đƣợc 3 dòng khuẩn lạc cho kết quả dƣơng tính với kích thƣớc băng

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

DNA đúng nhƣ tính toán là > 3,5 kb. 3 dòng này sau đó đƣợc nuôi lƣợng lớn để

tách chiết plasmid phục vụ cho việc giải trình tự gen.

Hình 7. Colony-PCR chọn lọc các dòng khuẩn mang vector pENTR/SSIV

Kết quả giải trình tự cho thấy gen SSIV của giống sắn KM140 đã phân lập

có kích thƣớc 3189 bp mã hóa cho 1063 axit amin, có độ tƣơng đồng 99% so với

trình tự gen SSIV trên phytozome với mã cassava4.1_000719m, chứng tỏ chúng

tôi đã phân lập thành công gen SSIV từ giống sắn KM140. Trình tự gen SSIV

phân lập đƣợc từ giống sắn KM140 đang đƣợc đăng kí trên ngân hàng GenBank

với mã số dự kiến là KT033500.

3.2. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV và tạo chủng vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenes tƣơng ứng

3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV bằng kỹ thuật

Gateway

Kỹ thuật Gateway là một phƣơng pháp nhân dòng phổ biến và tiện ích

dựa trên cơ sở phản ứng tái tổ hợp đặc hiệu vị trí giữa các điểm chuyên biệt ở

DNA của phage và vi khuẩn đƣợc gọi là các điểm gắn (attachment sites). Với kỹ

thuật này, một hoặc nhiều gen đích có thể di chuyển từ entry clone vào bất kì

vector đích biểu hiện nào theo đúng chiều và khung đọc chỉ trong một bƣớc thao

tác mà không phải sử dụng bất kỳ enzyme cắt giới hạn nào. pK7WG2D là một

vector thuộc hệ thống Gateway với cấu trúc gồm 1 vùng chứa cassette attR1-

ccdB-attR2. Vì vậy, sản phẩm của phản ứng LR là một plasmid có chứa 1 vị trí

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 46

tái tổ hợp mang gen đích có chiều mong muốn.

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

Thành phần và các bƣớc thực hiện phản ứng LR đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ Kit Gateway® LR Clonase™ II Enzyme Mix của Invitrogen với

vector đích là pK7WG2D và entry clone chính là vector pENTR/SSIV đã thiết kế

thành công. Sản phẩm của phản ứng đƣợc sử dụng để biến nạp vào tế bào khả biến E.

coli One Shot TOP10 và chọn lọc trên môi trƣờng có bổ sung Spectinomycin 100

µg/ml. Để sàng lọc các dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pK7WG2D/SSIV

mong muốn, chúng tôi thực hiện phản ứng colony-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu

SSIV-Frag_F và SSIV-Frag_R khuếch đại một đoạn ngắn gần 1 kb của gen SSIV.

Các dòng khuẩn lạc cho kết quả PCR dƣơng tính sẽ đƣợc chọn để nuôi cấy và tiến

hành tách chiết plasmid, sau đó cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn EcoRI.

Hình 8. Kết quả colony-PCR sử dụng mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R và kiểm tra

sản phẩm cắt plasmid pK7WG2D/SSIV bằng EcoRI.

Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng cắt cho thấy chúng tôi đã chọn đƣợc các

dòng plasmid tái tổ hợp pK7WG2D/SSIV cho các băng DNA đúng kích thƣớc theo

tính toán lý thuyết là: 10661 bp, 2201 bp và 1486 bp, chứng tỏ chúng tôi đã thiết kế

thành công vector pK7WG2D/SSIV.

3.2.2. Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc vector chuyển gen

đã thiết kế

Vector chuyển gen pK7WG2D/SSIV đã thiết kế đƣợc sử dụng để biến nạp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 47

vào tế bào khả biến chủng A. rhizogenes K599. Sản phẩm của quá trình biến nạp

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

đƣợc nuôi trên môi trƣờng YMB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 mg/l Spectinomycin, ủ ở 28oC. Sau 2 ngày thu đƣợc một lƣợng lớn khuẩn lạc trên đĩa

thạch. Sau khi sàng lọc bằng phƣơng pháp colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu

ĐC M 1 2 3 4 5 6 7 8

SSIV-Frag_F và SSIV-Frag_R, các dòng Agrobacterium mang cấu trúc chuyển

960 bp

gen sau đó sẽ đƣợc nuôi lỏng trong 3 ml LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc, lắc ở 28oC qua đêm, sau đó đƣợc giữ trong Glycerol 20% và bảo quản trong tủ -84oC.

Hình 9. Kết quả điện di colony-PCR các dòng khuẩn lạc

Kết quả điê ̣n di s ản phẩm PCR cho thấy m ột số dòng khuẩn lạc 1, 2, 3, 4, 8 mang xuất hiện băng PCR kích thƣớ c khoảng 960 bp, đú ng vớ i kích thƣớ c lý thuyết củ a đo ạn gen PCR bằng mồi SSIV-Frag_F và SSIV-Frag_R. Kết quả trên, chƣ́ ng tỏ các dòng vi khu ẩn đã mang gen cần chuyển . Chúng tôi chọn cá c khuẩn la ̣c có k ết quả PCR dƣơng tính nuôi trong môi trƣờ ng LB lỏng và nuôi tạo dịch huyền phù tế bào vi khuẩn để chuyển gen t ạo rễ tơ cây khoai lang

mang gen SSIV.

3.3. Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang mang gen SSIV

Thí nghiệm này chúng tôi chọn hệ thống nuôi cấy rễ tơ với mục đích đánh

giá khả năng tăng cƣờng sinh tổng hợp tinh bột của gen SSIV trên mô hình cây

khoai lang KB1. Đối với mỗi cấu trúc gen SSIV, chúng tôi sử dụng 216 mảnh lá

và đoạn thân khoai lang. Sau khi lây nhiễm và đồng nuôi cấy với vi khuẩn

Agrobacterium, các mảnh khoai lang đƣợc đặt trên môi trƣờng chọn lọc có bổ

sung kanamycin ở nồng độ cao (30 - 50 mg/L). Do trong quá trình xâm nhiễm,

ngoài các cấu trúc gen SSIV, gen SSIV trên vector chuyển gen mã hóa cho Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 48

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

enzyme phân hủy kanamycin cũng đƣơc tích hợp vào genome thực vật chủ nên

chỉ những mô lá, thân đƣợc chuyển gen mới có thể sống sót trên môi trƣờng

kháng sinh kanamycine và cảm ứng tạo rễ ( Hình 10).

Hình 10. Hình ảnh các mảnh lá và thân mẫu khoai lang in vitro trên môi

trƣờng đồng nuôi cấy sau 2 ngày lây nhiễm A.rhizogenes

Hình 11. Hình ảnh các mảnh lá và thân mẫu khoai lang in vitro bắt đầu ra

rễ trên môi trƣờng chọn lọc sau khi chuyển gen 30 ngày

Qua theo dõi, các mô đƣợc lây nhiễm với A.rhizogenes mang cấu trúc

SSIV có khả năng biệt hóa tạo rễ tơ trên môi trƣờng MS bổ sung 30 mg/L

kanamycine.

Quá trình phát sinh kiểu hình rễ tơ diễn ra sau từ 20 đến 30 ngày sau lây

nhiễm Agrobacterium. Các mảnh lá và thân chuyển gen có xu hƣớng hình thành

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 49

rễ ở các cạnh đã cắt bỏ gân giữa gây tổn thƣơng. Các dòng rễ chuyển gen SSIV

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

này mang đầy đủ các đặc điểm hình thái điển hình của rễ tơ nhƣ tốc độ sinh

trƣởng nhanh, thân dễ dày và giảm thiểu sự hƣớng đất ( Hình 13)

Sau ba lô thí nghiệm, chúng tôi thu đƣợc 19 mẫu thân và 28 mảnh lá xuất hiện

kiểu hình rễ tơ với tỷ lệ tạo rễ trung bình lần lƣợt là 18,98% và 24,43%. Qua

quá trình thí nghiệm chúng tôi cũng nhận thấy mảnh lá khoai lang 3 tuần tuổi

là nguồn nguyên liệu phù hợp cho quá trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây khoai

lang giống KB1 (Bảng 8). Các dòng rễ tơ khoai lang tạo thành đƣợc nuôi cấy

riêng rẽ và đƣợc tách chiết DNA tổng số cho thí nghiệm kiểm tra sự có mặt của

gen SSIV.

3.5. Phân tích các dòng rễ tơ khoai lang chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật

PCR

Để khẳng đi ̣nh các r ễ tơ khoai lang chuyển gen sống sót trên môi trƣờng chọn lọc có mang gen SSIV, chúng tôi tiến hành tách chi ết DNA tổng số của 47

dòng rễ tơ khoai lang.

Sản phẩm tách đƣợc định lƣợng DNA bằng máy quang phổ, sau đó sản phẩm đƣơ ̣c tiến hành điê ̣n di trên gel agarose 0,8 %. Kết quả định lƣợng DNA bằng máy đo quang phổ cho thấy các mẫu DNA tách chiết có nồng độ cao, chỉ số

A260/280 đạt trong khoảng 1,8-2, điều đó chƣ́ ng tỏ các mẫu tách chiết đảm bảo đô ̣ tinh sa ̣ch cho các thí nghiê ̣m tiếp theo. Tiếp đó, chúng tôi tiến hành kỹ thuật điện di DNA tổng số trên agarose 0,8% để kiểm tra chất lƣợng của DNA.

Hình 12. Kết quả tách chiết DNA tổng số một số rễ tơ

Sau khi tiến hành kỹ thuâ ̣t điê ̣n di các mẫu DNA tổng số chú ng tôi thấy

rằng, DNA tổng số các rễ tơ khoai lang chuyển gen đƣơ ̣c cho ̣n để tiến hành kỹ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 50

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

thuâ ̣t điê ̣n di đều cho băng rõ nét , không bi ̣ đƣ́ t gãy , đảm bảo điều kiê ̣n tốt nhất để thực hiện các phản ứng tiếp theo.

Các mẫu DNA sau khi tách đƣợc dùng làm khuôn để tiến hành phản ứng

PCR nhân gen SSIV với cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F và SSIV-Frag_R. Kết quả

sản phẩm PCR thu đƣợc cho thấy 15 mẫu rễ tơ xuất hiện băng DNA có kích

thƣớc khoảng 960 bp ứng với băng DNA xuất hiện ở mẫu đối chứng dƣơng và

đúng với kích thƣớc gen SSIV dự kiến. Kết quả cho thấy 15 rễ tơ khoai lang đã

đƣợc chuyển gen SSIV, với tỷ lệ chuyển gen là 4,85% và 8,74% trên nguồn vật

liệu đoạn thân và mảnh lá (Bảng 8). Các dòng này sẽ đƣợc tiếp tục nghiên cứu

(+) (-) 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10

960 bp

đánh giá sự biểu hiện gen thông qua hoạt động phiên mã.

Hình 13. Sản phẩm PCR nhân gen SSIV từ DNA tổng số tách chiết từ một số

dòng rễ tơ chuyển gen và không chuyển gen

3.6. Phân tích cây chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật RT-PCR

Để xác định khả năng hoạt động của gen SSIV trong các dòng rễ tơ mang

gen chuyển SSIV dƣơng tính với PCR, chúng tôi tiến hành phản ứng RT-PCR.

Đây là kỹ thuật cho phép phát hiện nhanh sự biểu hiện của gen chuyển thông

qua hoạt động phiên mã của gen ngoại lai trong rễ tơ chuyển gen. Các dòng rễ tơ

đƣợc tách chiết RNA tổng số sử dụng Kit Dynabeads® mRNA Purification.

Sau đó RNA tổng số đƣợc sủ dụng làm khuân cho phản ứng tổng hợp cDNA.

cDNA tổng hợp đƣợc sủ dụng cho phản ứng kiểm tra sự biểu hiện của gen SSIV

ở mức độ phiên mã.

Trƣớc tiên nhóm nghiên cứu sử dụng cặp mồi actin_F và actin_R để tiến

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 51

hành kiểm tra sự xuất hiện của gen actin, và kiểm tra điều kiện thích hợp cho

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

phản ứng RT-PCR (chất lƣợng, và nồng độ cDNA sử dụng trong phản ứng). Ở

các rễ tơ chuyển gen và không chuyển gen, gen actin đều hoạt động ổn định,

trên gel điện di xuất hiện một băng đặc hiệu ở vị trí khoảng 152 bp khi kiểm tra

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

bằng RT-PCR với cặp mồi actin_F và actin_R.

Hình 14. Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen actin

trong các dòng rễ tơ chuyển gen

M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 15: sản phẩm RT-PCR các cây chuyển gen

Bƣớc kiểm tra trên đã chứng minh chất lƣợng và hàm lƣợng cDNA tổng

hợp ở các mẫu nghiên cứu tƣơng đối đồng đều, có thể sử dụng tốt cho phản ứng

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

RT-PCR với gen đích SSIV.

Hình 15. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen

SSIV trong các dòng rễ tơ chuyển gen

M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 15: sản phẩm RT-PCR các cây chuyển gen

Nhóm nghiên cứu thực hiện phản ứng RT-PCR đối với cặp mồi SSIV_F

và SSIV_R để tiến hành kiểm tra sự biểu hiện ở mức độ phiên mã của gen SSIV

với lƣợng cDNA phù hợp giống nhƣ phản ứng RT-PCR với mồi actin. Kết quả

điện di kiểm tra ở hình 15 cho thấy 11 dòng rễ trong tổng số 15 dòng rễ tơ xuất

hiện một băng DNA với kích thƣớc khoảng 960 bp, tƣơng ứng với kích thƣớc

của gen SSIV. Hiện tƣợng này xảy ra có thể trong quá trình chuyển gen đoạn gen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 52

chuyển đƣợc gắn kết không đặc hiệu vào genome thực vật dẫn đến đoạn gen bị

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

gắn kết vào phần không hoạt động của nhiễm sắc thể hoặc trong quá trình sinh

trƣởng của tế bào, hoạt động của gen chuyển bị ức chế bỏi các thành phần của

hệ gen .

Nhƣ vậy, sau quá trình kiểm tra sự biểu hiện gen SSIV, chúng tôi đã thu

nhận đƣợc 11 dòng rễ tơ (4 dòng có nguồn gốc từ đoạn thân và 7 dòng có nguồn

gốc từ mảnh lá) với tỷ lệ biểu hiện gen đạt 3,9% và 6,05% (Bảng 8).

Bảng 3: Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ mang cấu trúc gen tăng cƣờng tổng hợp

tinh bột SSIV ở cây khoai lang

Tổng Số mẫu tạo rễ tơ Số mẫu dƣơng tính Số mẫu dƣơng

số mẫu (% số mẫu tạo rễ)

PCR (% số mẫu PCR+) tính RT-PCR (% số mẫu RT-PCR+)

25 5 (20 %) 1 (4 %) 1 (4 %)

36 7 (19,44 %) 2 (5,55 %) 1 (2,7 %)

Thân 40 7 (17,5 %) 2 (5 %) 2 (5 %)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 53

TBC 18,98 % 4,85 % 3,90 %

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

31 8 (25,8%) 3 (9,67%) 2 (6,40%)

39 9 (23,07%) 3 (7,69%) 2 (5,10%)

Lá 45 11 (24,44%) 4 (8,88%) 3 (6,66%)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 54

TBC 24,43 % 8,74 % 6,05 %

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

KẾT LUẬN:

- Đã phân lập và đọc trình tự nucleotide thành công gen SSIV từ giống sắn

KM140, trình tự gen SSIV đã đƣợc đăng ký trên Ngân hàng

Genebank:KT033500

- Đã thiết kế thành công vector chuyển gen mang gen SSIV mã hoá enzyme

tăng cƣờng sinh tổng hợp tinh bột và tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium

rhizogenes mang vector tƣơng ứng.

- Đã thu nhận đƣợc 15 dòng rễ tơ khoai lang mang gen SSIV với tỷ lệ PCR

dƣơng tính đạt 4,85% ở mẫu thân và 8,74% ở mẫu lá. Bƣớc đầu đánh giá khả

năng hoạt động của gen SSIV ở mức độ phiên mã nhận đƣợc tỷ lệ dòng chuyển

gen biểu hiện SSIV đạt 3,9% ở mẫu thân đến 6,05% ở mẫu lá.

ĐỀ NGHỊ:

- Tiếp tục nuôi cấy và đánh giá sự tích luỹ tinh bột ở các dòng rễ khoai lang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 55

chuyển gen SSIV

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

Tài Liệu Tham Khảo

1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học

Tài liệu tiếng Việt

2. Hoàng Kim và Phạm Văn Biên (1996) Cây sắn. Nhà xuất bản nông nghiệp

thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

Trần Công Khanh, Hoàng Kim, Nguyễn Hữu Hỷ, Võ Văn Tuấn, Phạm

Văn Biên, Đào Huy Chiên, Reinhardt Howeler, Hernan Cebbalos (2009) Chọn

tạo và phát triển giống sắn KM140. Giải pháp đạt giải nhất Hội thi sang tạo kỹ

thuật toàn quốc lần thứ X (2008-2009)

Hoang Kim, Nguyen Van Bo, Hoang Long, Nguyen Trong Hien, Hernan

Ceballos and Reinhardt Howeler, 2010, Current situation of cassava in Vietnam.

In CIAT (R.H Howeler editor) A New Future for Cassava in Asia: Its Use as Food, Feed and Fuel to Benefit the Poor, 8th Asian Cassava Research Workshop

October 20-24, 2008 in Vientiane, Lao PDR. p. 100-112.

Hoang Kim, Pham Van Bien, Tran Ngoc Quyen, Tran Ngoc Ngoan, Trinh

Phuong Loan and Kazuo Kawano (2005). Cassava breeding and varietal

dissemination in Vietnam from 1975 to 2000. Proceeding of Annual Report of

CIAT.

Trần Công Khanh, Hoàng Kim, Võ Văn Tuấn, Nguyễn Hữu Kỷ, Phạm

Văn Biên, Đào Huy Chiên, Reinhardt Howeler và Hernan Ceballos 2008. Kết

quả chọn tạo và phát triển giống sắn KM140. Tài liệu báo cáo công nhận giống

sắn KM140 (loại xuất sắc). Hội nghị nghiệm thu đề tài Bộ Nông nghiệp &

PTNN. 45 trang. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp (Journal of

Agricultural Sciences and Technology) Trường Đại học Nông Lâm thành phố

Hồ Chí Minh, số 1 & 2 năm 2007, trang 65-71

Hoàng Kim và Phạm Văn Biên (1996) Cây sắn. Nhà xuất bản nông

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 56

nghiệp

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

Nguyễn Trung Nam, Vũ Đình Hoà, Đinh Sơn Quang, Nguyễn Thị Bích

Thuỷ, Võ Thị Thứ, Lê Trần Bình (2001), ―Sàng lọc các chủng vi khuẩn

Bacillus thuringiensis phục vụ cho việc phân lập gen kháng bọ hà ở khoai

lang‖, Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật,

tr.206-213.

Phạm Bích Ngọc, Đinh Thị Phòng, Egnin M., Prakash C.S., Lê Trần Bình

(2002), ―Hoàn thiện phƣơng pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium

10. Lâm Đại Nhân (2000), Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen của gen

tumefaciens‖, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 40, tr. 142-149.

mã hoá protein vỏ (coat protein) từ virus gây bệnh đốm vòng cây đu đủ (PRSV)

11. Nguyễn Văn Uyển (1995), Những phƣơng pháp công nghệ sinh học thực

ở Việt Nam, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, tr 35-36.

vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh. Tập 1.

12. Alpizar, E., E. Dechamp, F. Lapeyre-Montes, C. Guilhaumon, B.

Tài liệu tiếng Anh:

Bertrand, C. Jourdan, P. Lashermes, and H. Etienne. 2008. ―Agrobacterium

Rhizogenes-Transformed Roots of Coffee (Coffea Arabica): Conditions for

Long-Term Proliferation, and Morphological and Molecular Characterization.‖

Annals of Botany 101 (7): 929–40. doi:10.1093/aob/mcn027.

13. Ballicora, Miguel A., Alberto A. Iglesias, and Jack Preiss. 2003. ―ADP-

Glucose Pyrophosphorylase, a Regulatory Enzyme for Bacterial Glycogen

Synthesis.‖ Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR 67 (2): 213–

25, table of contents.

14. Britton, D. R., P. Curzon, R. G. Mackenzie, J. W. Kebabian, J. E.

Williams, and D. Kerkman. 1991. ―Evidence for Involvement of Both D1 and

D2 Receptors in Maintaining Cocaine Self-Administration.‖ Pharmacology,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 57

Biochemistry, and Behavior 39 (4): 911–15.

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

15. Egli, Barbara, Katharina Kölling, Claudia Köhler, Samuel C. Zeeman, and

Sebastian Streb. 2010. ―Loss of Cytosolic Phosphoglucomutase Compromises

Gametophyte Development in Arabidopsis1[W][OA].‖ Plant Physiology 154

(4): 1659–71. doi:10.1104/pp.110.165027.

16. Evans, R. C., L. A. Alice, C. S. Campbell, E. A. Kellogg, and T. A.

Dickinson. 2000. ―The Granule-Bound Starch Synthase (GBSSI) Gene in the

Rosaceae: Multiple Loci and Phylogenetic Utility.‖ Molecular Phylogenetics

and Evolution 17 (3): 388–400. doi:10.1006/mpev.2000.0828.

17. Kittipongpatana, O. S., and J. Sirithunyalug. 2006. ―Development of

Suspending Agent from Sodium Carboxymethyl Mungbean Starches.‖ Drug

Development and Industrial Pharmacy 32 (7): 809–20.

doi:10.1080/03639040500529978.

18. Mason-Gamer, R. J., C. F. Weil, and E. A. Kellogg. 1998. ―Granule-

Bound Starch Synthase: Structure, Function, and Phylogenetic Utility.‖

Molecular Biology and Evolution 15 (12): 1658–73.

19. McMaugh, Stephen J., Jenny L. Thistleton, Emma Anschaw, Jixun Luo,

Christine Konik-Rose, Hong Wang, Min Huang, et al. 2014. ―Suppression of

Starch Synthase I Expression Affects the Granule Morphology and Granule Size

and Fine Structure of Starch in Wheat Endosperm.‖ Journal of Experimental

Botany 65 (8): 2189–2201. doi:10.1093/jxb/eru095.

20. Sevón, Nina, and Kirsi-Marja Oksman-Caldentey. 2002. ―Agrobacterium

Rhizogenes-Mediated Transformation: Root Cultures as a Source of Alkaloids.‖

Planta Medica 68 (10): 859–68. doi:10.1055/s-2002-34924.

21. Wattebled, Fabrice, Véronique Planchot, Ying Dong, Nicolas Szydlowski,

Bruno Pontoire, Aline Devin, Steven Ball, and Christophe D’Hulst. 2008.

―Further Evidence for the Mandatory Nature of Polysaccharide Debranching for

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 58

the Aggregation of Semicrystalline Starch and for Overlapping Functions of

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

Debranching Enzymes in Arabidopsis Leaves.‖ Plant Physiology 148 (3): 1309–

23. doi:10.1104/pp.108.129379.

22. Zeeman, Samuel C., Jens Kossmann, and Alison M. Smith. 2010. ―Starch:

Its Metabolism, Evolution, and Biotechnological Modification in Plants.‖

Annual Review of Plant Biology 61 (1): 209–34. doi:10.1146/annurev-arplant-

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 59

...................................................................

R N L S S Q H K R Q Q L K K A S P E

Q P P N

220 230 240 250 260

270 280

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

MeSSiv-origin

ACCGTAGGTTTTCATTCGCGTGGTGGTGGTGGTGGTGATGATATT~~~GGTGATGATGATAATGATTCCG

T V G F H S R G G G G G D D I G D

D D N D S

MeSSiv

sequencing

..................A.......................GA.ATT......................

T V G F H S S G G G G G D D D I G D

D D N D S

290 300 310 320 330

340 350

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

MeSSiv-origin

AAACTGAGAGCACAGCGGTGCATAGTGTCCCAAGCTTGAATCTTGATGTTGAGAGTAATGAGGAAGTCGT

E T E S T A V H S V P S L N L D V E S

N E E V V

MeSSiv

sequencing

.......T..............................................................

E T D S T A V H S V P S L N L D V E S

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2

360 370 380 390 400

410 420

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng N E E V V

970 980

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng Q N K L L N E E A P L I Q D S T I Q

MeSSiv-origin

TCAATTCATTGAGGGCAGAGAATACATCTCTGAGGACTGATATAGAAGCACTTAAGAGGGAGCTTAGTAA

L N S L R A E N T S L R T D I E A L K

R E L S N

sequencing

MeSSiv

......................................................................

L N S L R A E N T S L R T D I E A L K

R E L S N

990 1000 1010 1020 1030

1040 1050

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

MeSSiv-origin

TGTCAAGGATACAGATGAGCGTGTTATAACACTGGAGAAAGAATGCATGCAGTTGGAGTCTTCTGTGAAA

V K D T D E R V I T L E K E C M Q L

E S S V K

sequencing

MeSSiv

......................................................................

V K D T D E R V I T L E K E C M Q L

E S S V K

1060 1070 1080 1090 1100

1110 1120

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

MeSSiv-origin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 6

D L E S K L S V S Q E D V S K L S S

GCCAACGTCTATAAGTTATCGTCAGAAAAGTTACAGCAGTATAATGAGCTAATGCAGCAAAAGATAAAAC

A N V Y K L S S E K L Q Q Y N E L M

Q Q K I K

sequencing

MeSSiv

......A...............................................................

A N I Y K L S S E K L Q Q Y N E L M

Q Q K I K

1340 1350 1360 1370 1380

1390 1400

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

MeSSiv-origin

TATTGGAGGAACGTCTTCAACAATCTGATGAAGAAATATATTCTTATGTTCAGTTATACCAAGAATCTAT

L L E E R L Q Q S D E E I Y S Y V Q L

Y Q E S I

sequencing

MeSSiv

.....................G................................................

L L E E R L Q R S D E E I Y S Y V Q L

Y Q E S I

1410 1420 1430 1440 1450

1460 1470

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

MeSSiv-origin

ACAGGAATTTCAAGATACACTTAATACTTTGAAAGAAGAAAGCAAGAAAAAGGCACTAGATGAACCTGTA

Q E F Q D T L N T L K E E S K K K A

L D E P V

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 8

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng MeSSiv

sequencing

......................................................................

Q E F Q D T L N T L K E E S K K K A

L D E P V

1480 1490 1500 1510 1520

1530 1540

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

MeSSiv-origin

GATGATATGCCCTGGCAATTTTGGAGTCATTTATTGCTTATGATTGATGGTTGGCTTCTTGAGAAGAAGC

D D M P W Q F W S H L L L M I D G W

L L E K K

sequencing

MeSSiv

......................................................................

D D M P W Q F W S H L L L M I D G W

L L E K K

1550 1560 1570 1580 1590

1600 1610

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

MeSSiv-origin

TAACACTAGATGATGCAAAACTGTTGAGAGATATGGTATGGAAAAGAGAGAGGCGTATTCATGACATATA

L T L D D A K L L R D M V W K R E R R

I H D I Y

sequencing

MeSSiv

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng H H P G K F F W R G Q F Y G E H D D F

sequencing

MeSSiv

......................................................................

H H P G K F F W R G Q F Y G E H D D F

K R F S F

2040 2050 2060 2070 2080

2090 2100

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

MeSSiv-origin

TTTCAGCCGTGCTGCACTTGAATTGCTTCTTCAAGCTGGCAAAAAACCAGACATAATTCATTGCCATGAC

F S R A A L E L L L Q A G K K P D I

I H C H D

MeSSiv

sequencing

......................................................................

F S R A A L E L L L Q A G K K P D I

I H C H D

2110 2120 2130 2140 2150

2160 2170

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

MeSSiv-origin

TGGCAGACAGCTTTTGTTGCACCACTTTATTGGGATATATACGCCCCAAAAGGATTGAATTCAGCTAGAA

W Q T A F V A P L Y W D I Y A P K G

L N S A R

MeSSiv

sequencing

MeSSiv

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 13

K G A V V F S N I V T T V S P T Y A

Q E V R T

2390 2400 2410 2420 2430

2440 2450

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng ......................................................................

MeSSiv-origin

CTGAGGGCGGAAAAGGTCTCCATTCGACGCTTAACTTTCATGCCAAGAAGTTCATTGGAATCCTAAATGG

S E G G K G L H S T L N F H A K K F I

G I L N G

MeSSiv

sequencing

......................................................................

S E G G K G L H S T L N F H A K K F I

G I L N G

2460 2470 2480 2490 2500

2510 2520

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

MeSSiv-origin

TATTGATACTGATGTGTGGAATCCTGCGACTGATACTCTTCTCGAAGTCCAGTACAATGCTAACGATCTT

I D T D V W N P A T D T L L E V Q Y

N A N D L

MeSSiv

sequencing

......................................................................

I D T D V W N P A T D T L L E V Q Y

T L E L G G Q F L L L G S S P V A H

I Q R E F

.....................................................................G

M I A M R Y G S I P I A R K T G G L

N D S V L

2950 2960 2970 2980 2990

3000 3010

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

MeSSiv-origin

GATGTTGATGATGACACAATTCCTCTTCAGTTTCGAAATGGATATACATTCTTGAATCCTGATGAGCAGG

D V D D D T I P L Q F R N G Y T F L

N P D E Q

sequencing

MeSSiv

......................................................................

D V D D D T I P L Q F R N G Y T F L

N P D E Q

3020 3030 3040 3050 3060

3070 3080

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

MeSSiv-origin

GAGTGAATAGTGCTTTAGAACGTGCATTTAACCATTATAGAAACGATCCTGAGAGCTGGCAGCAGCTTGT

G V N S A L E R A F N H Y R N D P E S

W Q Q L V

sequencing

MeSSiv

........................................G.............................

G V N S A L E R A F N H Y R N D P E S

W Q Q L V

3090 3100 3110 3120 3130

3140 3150

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 17

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng

MeSSiv-origin

TCAAAGGGACATGGACATAGATTTTAGTTGGGAATCTTCAGCATCACAGTATGAGGAGCTCTACTCAAAA

Q R D M D I D F S W E S S A S Q Y E E

L Y S K

MeSSiv

sequencing

.....A.......A........................................................

Q K D M N I D F S W E S S A S Q Y E E

L Y S K

3160 3170 3180 3190 3200

3210 3220

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

MeSSiv-origin

TCAGTGGCCAGAGCAAGAGCGGCAGCAAGTAGGTCTTAATTATGGTAAATGGCATTTTCATGGAAAGCCA

S V A R A R A A A S R S *

MeSSiv

sequencing

......................................................................

S V A R A R A A A S R S *

....|..

MeSSiv-origin AGGATCT

MeSSiv sequencing .......

So sánh trình tự của gen SSIV đã phân lập với gen SSIV trên phytozome

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 18

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 19

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng