ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ––––––––––––––––––––
DIỆP THỊ HƯƠNG GIANG
ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA RETINOIC ACID LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN LIÊN QUAN TỚI SỰ LÃO HÓA VÀ CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU NOTCH Ở TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY MKN45
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
THÁI NGUYÊN - 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ––––––––––––––––––––
DIỆP THỊ HƯƠNG GIANG
ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA RETINOIC ACID LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN LIÊN QUAN TỚI SỰ LÃO HÓA VÀ CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU NOTCH Ở TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY MKN45
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 84 20 201
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Phú Hùng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
THÁI NGUYÊN - 2019
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là
trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi kết quả
thu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích
dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
Tác giả
ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Phú Hùng đã định
hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất
trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ Sinh
học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ
bảo và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học.
Đề tài luận văn nhận được sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp bộ mã số
B2017 – TNA48.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã
nhiệt tình động viên cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và
nghiên cứu khoa học.
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019
Tác giả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
Diệp Thị Hương Giang
iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................. v
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... vii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. Dịch tễ học của ung thư dạ dày .................................................................. 3
1.2. Retionic acid ............................................................................................... 4
1.2.1. Khái niệm ................................................................................................ 4
1.2.2. Vai trò của Retinoic acid trong điều trị ung thư ..................................... 6
1.2.3. Thụ thể của Retionic acid trong ung thư dạ dày ........................................ 9
1.3. Sự lão hóa tế bào ...................................................................................... 10
1.3.1. Khái niệm .............................................................................................. 10
1.3.2. Các gen trong con đường tín hiệu của sự lão hóa tế bào ...................... 11
1.4. Con đường tín hiệu NOTCH .................................................................... 12
1.4.1. Vai trò của con đường tín hiệu NOTCH trong ung thư ........................ 12
1.4.2. Vai trò của con đường tín hiệu NOTCH trong ung thư dạ dày ............ 13
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU ................... 15
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 15
2.2 Địa điểm và thời gian ................................................................................ 15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 16
iv
2.3.1. Nuôi cấy tăng sinh tế bào 2D ................................................................ 16
2.3.2. Nuôi cấy tế bào 3D và xử lý tế bào với ATRA ..................................... 16
2.3.3. Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA ........................................ 17
2.3.4. Phân tích sự biểu hiện gen bằng Realtime PCR ................................... 17
2.3.5. Phân tích sự biểu hiện của protein P21 bằng phương pháp miễn
dịch huỳnh quang ............................................................................................ 18
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 20
3.1. Nuôi cấy tăng sinh tế bào và nuôi cấy tạo các tumorsphere 3D .............. 20
3.1.1. Nuôi tăng sinh tế bào trong điều kiện 2D ............................................. 20
3.1.2. Nuôi cấy tạo các tumorsphere 3D và xử lý tumorsphere với ATRA.... 20
3.2. Kết quả tách chiết RNA tổng số ............................................................... 22
3.3. ATRA làm tăng cường sự phiên mã các gen p53, p21 và GADD45 ....... 23
3.4. ATRA cảm ứng sự biển hiện tăng của protein p21 ................................. 25
3.5. ATRA điều hòa sự biểu hiện các gen thuộc con đường tín hiệu phân
tử Notch ........................................................................................................... 26
3.5.1. ATRA ức chế sự biểu hiện của gen Notch ............................................ 26
3.5.2. ATRA điều hòa giảm sự biểu hiện các gen mã hóa cho các Ligand
của Notch ......................................................................................................... 27
KẾT LUẬN .................................................................................................... 31
KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 31
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 32
v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AMP : Adenosine monophosphate
ATRA : Axit retinoic all-trans
CDK : Cyclin-dependent kinases
cDNA : complementary DNA
CK : Cyclin kinases
COX-2 : Cyclooxygenase-2
DAPI : 4′,6-diamidino-2-phenylindole
DMSO : Dimethyl sulfoxit
DNA : Deoxyribonucleic acid
EGF : Epidermal Growth Factor
EMT : Biểu mô trung mô
FGF : Fibroblast growth factor
GCSPC : Tế bào gốc ung thư dạ dày
JNK : Jun N-terminal kinase
mRNA : RNA thông tin
NICD : Vùng Notch nội bào (intracellular domain)
NRR : Vùng điều hòa âm tính
NST : Nhiễm sắc thể
PBS : Phosphate buffer saline
RA : Retinoic acid
RAR / RXR : Bộ dị vòng
RARE : Yếu tố phản ứng RA
RARs : Thụ thể acid retinoic
Rb : Retinoblastoma
RNA : Axit ribonucleic
RXR / RXR : Bộ đồng phân
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
RXR : Thụ thể X retinoid
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Mã số các cặp mồi sử dụng cho Realtime-PCR ........................... 18
Bảng 2.2. Mã số các cặp mồi cho phản ứng Realtime PCR ......................... 18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
Bảng 3.1. Nồng độ RNA tổng số thu được từ quá trình tinh sạch ................ 23
vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc thế hệ thứ nhất của retioids ............................................ 5
Hình 1.2. Cấu trúc thế hệ thứ hai của retioids .............................................. 5
Hình 1.3. Cấu trúc thế hệ thứ ba của retioids ............................................... 5
Hình 1.4. Cơ chế phân chia của tế bào ung thư ........................................... 7
Hình 1.5. Con đường tín hiệu Notch ........................................................... 13
Hình 3.1. Hình ảnh nuôi cấy tăng sinh tế bào trong 3 ngày nuôi cấy ......... 20
Hình 3.2. Nuôi cấy tạo tumorsphere (A) trong 5 ngày và xử lý các
tumorsphere trong 48h với ATRA (B), mũi tên màu đen chỉ
các tế bào chết. ............................................................................ 21
Hình 3.3. Phổ hấp thụ của RNA tổng số thu được từ quá trình tách chiết ........ 22
Hình 3.4. Mức độ biểu hiện gene P21, P53 và GADD45A giữa mẫu
đối chứng và mẫu xử lý với ATRA. ........................................... 23
Hình 3.5 . Ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện của protein p21 ........... 25
Hình 3.6. Ảnh hưởng của ATRA lên sự hiệu hiện của các gen ................. 26
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.7. Ảnh hưởng của ATRA lên sự hiểu hiện các Ligand của Notch ....... 27
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ung thư dạ dày là bệnh lý ác tính của dạ dày. Ung thư dạ dày là loại
ung thư phổ biến thứ tư và là loại ung thư nguy hiểm thứ hai trên toàn thế
giới, với một triệu bệnh nhân mới được chẩn đoán và 600000 ca tử vong mỗi
năm [38]. Khoảng 70% các trường hợp ung thư dạ dày xảy ra ở Đông Á,
Trung và Đông Âu, Nam Phi và Trung và Nam Mỹ [43].
Việt Nam là một trong 20 quốc gia có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao nhất
thế giới, với tỷ lệ mắc trung bình là 16 người trên 100 nghìn dân. Tỷ lệ sống
sót trên 5 năm của các bệnh nhân ung thư dạ dày cũng thấp dưới 20% (theo
Globocan, 2014).
Bằng chứng ủng hộ sự tồn tại của tế bào gốc ung thư trong ung thư dạ
dày đã xuất hiện trong những năm gần đây, các tế bào gốc ung thư thường
được biến đổi từ các tế bào gốc đặc hiệu của mô [73]. Tế bào gốc ung thư, lần
đầu tiên được xác định trong bệnh bạch cầu tủy cấp tính và sau đó là trong các
khối u rắn, đóng vai trò quan trọng trong việc bắt đầu ung thư. Tế bào gốc ung
thư thường là các tế bào gốc đặc hiệu mô hoặc các tế bào tiền thân khuếch đại
chuyển hóa khác biệt. Trong nghiên cứu, điều trị và phát hiện tế bào gốc ung thư
dạ dày, có thể sử dụng các chỉ thị ALDH, CD33 và CD44 [57].
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng Retinoic acid (RA) có khả năng
ức chế sự hình thành và sinh trưởng của khối u trong nhiều loại ung thư khác
nhau như ung thư vú, ung thư tuỵ và cả ung thư dạ dày, RA có thể tác dụng
bằng cách tham gia vào quá trình này thông qua hoạt hóa con đường
apoptosis, ức chế phân chia tế bào, cảm ứng sự lão hoá (senescence) và sự
biệt hoá (differentiation) tế bào. Đặc biệt đối với ung thư dạ dày, RA có khả
năng gây biệt hoá tế bào gốc ung thư dạ dày [40]. Nghiên cứu gần đây đã chỉ
ra được all trans retinoic có khả năng ức chế tế bào gốc ung thư dạ dày, gây
biệt hoá tế bào này. Tuy nhiên vẫn còn thiếu các phân tích về ảnh hưởng của
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
All trans retinoic acid lên các con đường tín hiệu phân tử.
2
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tìm ra cơ chế phân tử của sự ức chế tế bào ung thư dạ dày dưới tác dụng
của All trans retinoic acid thông qua việc phân tích những thay đổi về mức độ
phiên mã của các gen trong con đường tín hiệu của sự lão hoá tế bào và con
đường tín hiệu Notch.
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nuôi cấy tăng sinh tế bào và nuôi cấy tạo các tumorsphere
trong điều kiện nuôi cấy 3D từ các tế bào ung thư dạ dày MKN45.
Nội dung 2: Phân tích sự biểu hiện của các gen trong con đường tín hiệu
lão hoá tế bào bằng Realtime PCR.
Nội dung 3: Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt trong con đường
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
tín hiệu Notch bằng Realtime PCR.
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Dịch tễ học của ung thư dạ dày
Ung thư dạ dày là nguyên nhân phổ biến gây tử vong liên quan đến ung
thư trên thế giới. Hiện nay ung thư dạ dày chiếm 9,7% tổng số ca tử vong liên
quan đến ung thư. Tỷ lệ tử vong cao cũng được ghi nhận ở cả hai giới ở Trung
và Đông Âu, Trung và Nam Mỹ. Đáng chú ý là Hàn Quốc, Trung Quốc và
Nhật Bản là các quốc gia có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao nhất trên thế giới.
Việt Nam là một trong 20 quốc gia có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao nhất thế
giới [54].
Về mặt mô học, ung thư dạ dày được chia thành hai loại là ung thư biểu
mô tuyến thể ruột và ung thư biểu mô tuyến thể phân tán, ngoài ra là một số
dạng vô định. Loại ung thư biểu mô tuyến thể phân tán xảy ra ở tất cả các
nhóm tuổi có sự phân bố giới tính bằng nhau, không giống như loại ung thư
biểu mô tuyến thể ruột chiếm ưu thế ở nam giới và người già. Loại thể phân
tán có xu hướng xâm lấn vào thành dạ dày nhiều hơn và di căn tiến triển bệnh
nhanh hơn và tiên lượng xấu hơn [42], [56].
Ung thư dạ dày có thể phát triển ở bất cứ phần nào của dạ dày, có thể lan
ra khắp dạ dày và đến các cơ quan khác của cơ thể; đặc biệt là thực quản,
phổi, hạch bạch huyết và gan. Nguyên nhân phổ biến nhất là nhiễm vi
khuẩn Helicobacter pylori (H.polyri), chiếm hơn 60% các trường hợp.
Hút thuốc, chế độ ăn uống và béo phì là các yếu tố nguy cơ khác. 1% đến
3% trường hợp là do di truyền từ cha mẹ bị ung thư dạ dày, Nhật Bản và
Hàn Quốc là hai quốc gia có tỷ lệ mắc cao. Ở các nước phát triển và đang
phát triển tỉ lệ nhiễm H.polyri lần lượt là 35% và 85%. Ước tính rằng
khoảng 65% - 80% bệnh ung thư dạ dày không ở tâm vị là do nhiễm H.
pylori và có khả năng phòng ngừa được [61]. Ở Nhật Bản và các nước
khác, sử dụng dương xỉ diều hâu và bào tử làm thức ăn cũng có liên quan đến
tỉ lệ mắc bệnh ung thư dạ dày nhưng nguyên nhân chưa được làm rõ. Tỉ lệ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
4
mắc bệnh ung thư dạ dày chiếm đa số ở đàn ông, có nơi tỉ lệ mắc ở đàn ông/phụ
nữ là 2/1. Hoóc môn estrogen có thể giúp bảo vệ phụ nữ khỏi căn bệnh này và
một tỉ lệ nhỏ ung thư dạ dày dạng phân tán có thể do di truyền [4], [6].
1.2. Retionic acid
1.2.1. Khái niệm
Retinoic acid (RA) là một phân tử lipophilic nhỏ có nguồn gốc từ
vitamin A. Đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, biệt hóa của tế bào.
RA được dùng trong y học, có tác dụng điều tiết sự tăng trưởng tế bào biểu
mô [45].
Retinoids là những hóa chất có cấu trúc hoặc chức năng tương tự retinol,
hoặc vitamin A, thiết yếu cho sự phát triển phôi thai và cân bằng nội môi cơ
thể trưởng thành. Các retinoids giữ lại đuôi kỵ nước polyene gắn vào vòng 6
carbon tuần hoàn. Đuôi polyene được đặc trưng bởi các liên kết đôi carbon-
carbon liên hợp xen kẽ, làm cho retinoids nhạy cảm với ánh sáng. Ngược lại
với các protein tín hiệu khác, retinoids có trọng lượng phân tử thấp hơn nhiều
(300 Da). Retinoids có khả năng hòa tan trong dầu cao và có thể khuếch tán
qua màng tế bào. Hơn 4.000 phân tử tự nhiên và tổng hợp liên quan đến
vitamin A đã được báo cáo. Ba dạng hoạt động chính của retinoids tự nhiên
đã được nghiên cứu rộng rãi: All-trans, 9-cis và 13-cis với All-trans là dạng
sinh lý được quan tâm hơn cả. Retinoids liên quan đến tăng trưởng tế bào, đáp
ứng miễn dịch và tăng trưởng biểu mô thông qua tương tác với các thụ thể hạt
nhân, thụ thể retinoic acid và thụ thể X retinoid [45], [41].
Thế hệ đầu
Có ba thế hệ của retinoids:
tiên gồm có: retinol, retinal, tretinoin (retinoic
Thế hệ thứ hai bao gồm: etretinate và acitretin - chất chuyển hóa của nó.
Thế hệ thứ ba gồm: adapalene, bexarotene, và tazarotene.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
acid), isotretinoin, và alitretinoin.
5
Hình 1.1. Cấu trúc thế hệ thứ nhất của retioids
Hình 1.2. Cấu trúc thế hệ thứ hai của retioids
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 1.3. Cấu trúc thế hệ thứ ba của retioids
6
Retinoids có nhiều chức năng quan trọng đối với cơ thể như thị lực, sự
tăng sinh tế bào và sự biệt hóa tế bào, sự phát triển của tế bào xương, chức
năng miễn dịch và sự kích hoạt các gen ức chế khối u, sự phát triển của thai
nhi bao gồm xương, mắt, tai, tim, phổi và hocmon tăng trưởng, sự sinh tinh
trùng [25]. Sự tăng trưởng sau sinh [11], cân bằng nội môi [17].
1.2.2. Vai trò của Retinoic acid trong điều trị ung thư
Hiện nay tại Việt Nam Retinoic acid chưa được nghiên cứu rộng rãi,
tuy nhiên trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tác dụng của Retinoic acid,
đặc biệt là ảnh hưởng của nó lên các tế bào ung thư.
Retinoic acid được sử dụng trong điều trị nhiều bệnh khác nhau, trong
đó có ung thư. Ung thư là một trong những căn bệnh thế kỷ chiếm tỷ lệ tử
vong cao. Có rất nhiều tác nhân gây ung thư, tất cả đều làm biến đổi và đột
biến các tế bào trong cơ thể dẫn đến sự tăng sinh mất kiểm soát của các tế bào
này. Cơ thể được cấu tạo bởi nhiều loại tế bào, các tế bào phát triển và phân
chia một cách có kiểm soát, các tế bào được “chết” theo chương trình đã được
lập sẵn (quá trình Apoptosis) và thay vào là các tế bào mới khỏe mạnh để duy
trì các chức năng của cơ thể.
Các tác nhân gây đột biến như hóa chất độc hại, tia phóng xạ, các virus
ung thư làm cho các tế bào bình thường bị đột biến gen hoặc nhiễm sắc thể,
nên tế bào mất khả năng kiểm soát sự phân chia và liên kết tế bào. Vật liệu di
truyền (DNA) của một tế bào bị thay đổi hoặc hư hỏng, làm tăng sinh vô tổ
chức các tế bào “lỗi”- tế bào ung thư. Các tế bào ung thư này không chết đi
theo chương trình được lập trình sẵn (quá trình Apoptosis) như các tế bào
bình thường mà tiếp tục tăng sinh và nhân lên mất kiểm soát. Các tế bào này
có thể tạo thành một khối lớn gọi là khối u.
Không phải khối u nào cũng là ung thư. Các khối u không lây lan ra các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
phần khác của cơ thể là khối u lành tính-không phải ung thư. Các khối u lành
7
tính được cắt bỏ, và đa số sẽ không quay trở lại. Các khối u có khả năng di
căn sang các phần khác gọi là u ác tính, được gọi là ung thư.
Cơ chế gây bệnh ung thư do đột biến gen làm mất kiểm soát chu kì tế
bào. Cơ thể có 2 nhóm gen kiểm soát chu kì tế bào là: Nhóm gen quy định
yếu tố sinh trưởng và nhóm gen ức chế khối u. Ở các tế bào bình thường, 2
nhóm gen này hoạt động nhịp nhàng và hài hòa với nhau. Tuy nhiên, khi có
đột biến, cơ chế hoạt động này bị phá hủy.
Hình 1.4. Cơ chế phân chia của tế bào ung thư [29]
Retinoic acid đã được nghiên cứu rộng rãi để sử dụng trong điều trị các
dạng ung thư khác nhau không chỉ trong phòng ngừa mà còn trong điều trị.
Trường hợp bình thường trong cơ thể, retinoic acid có tác dụng phòng ngừa
chống lại sự hình thành ung thư. Sau khi hình thành ung thư, RA trở thành kẻ
tấn công các tế bào ung thư, ngăn chặn sự phát triển và phân chia của chúng,
cũng kích hoạt sự biệt hóa và chết của chúng thông qua các con đường cụ thể.
RA cũng đã được chứng minh là hợp tác với các loại thuốc điều trị ung thư
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
hiệu quả khác chống lại sự tiến triển của ung thư. Các nhà khoa học đã tìm ra
8
RA có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của khối u ác tính và sự hình thành
khối u ác tính ở người [47]. Tác dụng của RA cũng đã được tìm thấy có liên
quan đến sự kích hoạt protein kinase phụ thuộc AMP và sialyltransferase tuần
hoàn [12]. Mặt khác, điều biến của sự kết dính tế bào khối u ác tính với các
thành phần màng đáy đã được chứng minh là bị ảnh hưởng bởi điều trị bằng
RA [58]. RA cũng đã được sử dụng để ức chế các tế bào u ác tính B16F10 di
căn cao bằng cách điều chỉnh các thụ thể integrin bề mặt tế bào chống lại các
protein ngoại bào, đặc biệt là laminin và vitronectin [48]. Sự hình thành của
khối u ác tính có liên quan đến bức xạ, RA đã được tìm thấy để sửa đổi độ
nhạy của sóng radio và phục hồi từ tổn thương tia X trong ống nghiệm [46].
Ngoài khả năng ức chế sự tăng trưởng, RA cũng có khả năng ức chế sự xâm
lấn tế bào khối u ác tính ở người [60].
Retinoic acid và ung thư gan: RA có thể trực tiếp gây ra sự gia tăng tổng
hợp protein của transferrin và albumin trong các tế bào Hep3B, RA đã được
chứng minh có thể điều chỉnh biểu hiện gen của kháng nguyên bề mặt virus
viêm gan B (HBsAg) trong tế bào gan. Đã có những nghiên cứu về ung thư
tập trung vào sự tham gia của topoisomerase trong tăng trưởng tế bào ung
thư, RA có thể ức chế sự biểu hiện của topoisomerase II trong các tế bào
Hep3B. Như vậy RA thực sự là một hợp chất tiềm năng để ngăn chặn sự
phát triển của ung thư gan hoặc kết hợp với một số loại thuốc để hỗ trợ
điều trị ung thư gan [19].
RA và ung thư phổi: Tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong của ung thư phổi làm cho
căn bệnh này trở thành một chủ đề quan trọng trong nghiên cứu ung thư. Sự
bắt giữ G1 qua trung gian RA có liên quan đến việc gây ra sự ức chế p27 và
Cdk3 trong các tế bào ung thư biểu mô vảy phổi. Syndecan-1 là một
proteoglycan làm trung gian sự kết dính của tế bào và ngăn chặn sự xâm lấn
trong các tế bào biểu mô. RA có thể làm tăng biểu hiện syndecan-1 để ngăn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
chặn sự xâm lấn, di căn của ung thư phổi. RA còn được tìm thấy để làm giảm
9
bệnh thần kinh do hóa trị liệu trong một mô hình động vật cũng như bệnh
nhân ung thư phổi [2].
RA và ung thư vú: Năm 1970 lần đầu tiên ứng dụng của RA đã được đề
cặp và cho đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu phát hiện tác dụng của RA đối
với điều trị ung thư vú theo các hướng khác nhau. Đáng chú ý, RA có thể gây
ra sự biệt hóa của các tế bào biểu mô vú biến đổi sớm [1], cho thấy RA có vai
trò phòng ngừa đối với bệnh ung thư vú. RA cũng làm giảm sự phát triển ung
thư vú và di căn phổi [7].
RA và ung thư tuyến tiền liệt: các tế bào ung thư tuyến tiền liệt mong
muốn bổ sung androgen trong giai đoạn đầu của bệnh, 5α-reductase trở nên
quan trọng để cung cấp androgen mạnh. RA đã được tìm thấy có khả năng ức
chế 5α-reductase và do đó trở thành phương pháp điều trị ung thư tuyến tiền
liệt. RA có thể làm chậm sự tiến triển của ung thư tuyến tiền liệt và thúc đẩy
quá trình “tự chết” của các tế bào ung thư. Ngoài ra, cũng giống như ung thư
vú, RA cũng có khả năng ức chế ung thư tiền liệt tuyến theo nhiều hướng
khác nhau [20].
1.2.3. Thụ thể của Retionic acid trong ung thư dạ dày
Retinoid đã được chứng minh là ức chế sự phát triển của nhiều tế bào
khối u ở người. Mặc dù cơ chế phân tử chính xác của ức chế tăng trưởng qua
trung gian retinoid vẫn chưa được biết đến, nhưng tầm quan trọng của thụ thể
acid retinoic (RARs) và thụ thể X retinoid (RXR) đã được nghiên cứu trên tế
bào khối u.
RA tác động đến sự tăng trưởng, biệt hóa và apoptosis của các tế bào
biểu mô bình thường, tiền ung thư và ác tính trong điều kiện in vivo và in
vitro [31]. Tác dụng của RA chủ yếu qua trung gian hai loại thụ thể là retinoic
acid (RARs) và thụ thể X retinoid (RXR) [71], thuộc về họ thụ thể
steroid/tuyến giáp và được mã hóa bởi ba gen khác nhau α, β và γ. Các RXR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
tạo thành các bộ đồng phân (RXR/RXR) và các bộ dị vòng (RAR/RXR) với
10
RAR, sau đó liên kết với các yếu tố phản ứng RA cụ thể (RARE), điều chỉnh
tích cực và ngăn chặn các hoạt động phiên mã của chúng đối với các gen đích
[72], [26]. Các thụ thể này phát huy các chức năng cụ thể và có tác dụng
chống ung thư khác nhau trong các dòng tế bào ung thư khác nhau.
Nghiên cứu của Su Liu và cộng sự đánh giá vai trò của gen RARα làm
thụ thể tác dụng của axit retinoic all-trans (ATRA) trong các tế bào ung thư dạ
dày. ATRA có thể làm cho RARα biểu hiện trong các tế bào MGC80-3,
BGC-823 và SGC-7901 một cách rõ ràng, dẫn đến ức chế tăng trưởng của các
dòng tế bào này. Sau khi gen RARα được chuyển vào các tế bào MKN-45
biểu hiện mức RARα khá thấp và không thể được tạo ra bởi ATRA, sự tăng
trưởng tế bào bị ức chế rõ rệt bởi ATRA. Ngược lại, khi gen RARα antisense
được chuyển vào các tế bào BGC-823, thấy có một ức chế nhỏ của ATRA, so
với các tế bào BGC-82. ATRA có thể tạo ra hoạt động phiên mã của βRARE
trong các dòng tế bào MGC80-3, BGC-823, SGC-7902 và MKN/RARα,
nhưng không phải trong các dòng tế bào MKN45 và BGC/aRARα. Như vậy,
ATRA ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư dạ dày bằng cách điều chỉnh
tăng mức độ RARα; RARα là chất trung gian chính trong hoạt động của ATRA
trong các tế bào ung thư dạ dày. Kết quả đã chỉ ra rằng RARα là cần thiết cho
ATRA để gây ức chế tăng trưởng trên các tế bào ung thư dạ dày [52].
1.3. Sự lão hóa tế bào
1.3.1. Khái niệm
Lão hóa tế bào là một trạng thái mà các tế bào bình thường ngừng phân
chia, do sự ngắn đi của các đoạn telomere ở đầu mút nhiễm sắc thể sau chu kỳ
DNA nhân đôi. Ngoài ra, một số thay đổi ở chức năng của ty thể, biến đổi của
DNA và một số tác động từ bên ngoài đều có thể gây ra sự lão hóa tế bào
[33]. Lão hóa là một đặc tính phổ biến của các sinh vật. Trong số các sinh vật
đa bào, lão hóa được đánh dấu bằng sự suy giảm dần dần chức năng của nhiều
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
tế bào và mô dẫn đến sự chết tế bào. Đặc điểm nổi bật nhất của lão hóa là mất
11
dần chức năng và thoái hóa, xảy ra ở cấp độ phân tử, tế bào, mô và sinh vật. Ở
động vật có vú, thoái hóa liên quan đến tuổi làm phát sinh các bệnh lý như: xơ
vữa động mạch và suy tim, loãng xương, thoái hóa điểm vàng, suy phổi, suy
thận, thoái hóa thần kinh. Các tế bào phát triển và phân chia một cách có kiểm
soát, các tế bào được “chết” theo chương trình đã được lập sẵn và thay vào là
các tế bào mới khỏe mạnh để duy trì các chức năng của cơ thể. Các tác nhân
gây đột biến làm cho các tế bào bình thường bị đột biến gen hoặc nhiễm sắc
thể, hay một số thay đổi ở mức độ phân tử làm cho một số gen ức chế ung thư
bị bất hoạt làm cho tế bào mất khả năng kiểm soát sự phân chia và liên kết tế
bào, tăng sinh vô tổ chức và nhân lên mất kiểm soát, không có hiện tượng lão hóa hình
thành ung thư [3], [5].
1.3.2. Các gen trong con đường tín hiệu của sự lão hóa tế bào
Gen p53 không cho các gen bị tổn thương tự nhân lên. Khi có một thay
đổi lớn trong tế bào, protein p53 còn gọi là "vệ sĩ của bộ gen" sẽ phát đi một
hiệu lệnh để tế bào này tự hủy. Đây là một protein quan trọng nằm trong điều
hòa chu kỳ tế bào - gọi là gen áp chế khối u p53. Khi có tổn thương ở DNA,
p53 làm ngừng chu kỳ tế bào cho đến khi DNA bị tổn thương được sửa chữa
hoặc p53 có thể làm cho tế bào chết theo lập trình nếu không còn khả năng
sửa chữa DNA. Các yếu tố lối sống ảnh hưởng đến cơ chế hoạt động bình
thường của gen p53. Rb (retinoblastoma) là gen có chức năng ngăn cản diễn
tiến chu kỳ tế bào bằng cách gắn kết với E2F1 và ngăn cản sự sao chép các
gen cần thiết cho tế bào. Sở dĩ p53 ngăn cản được chu trình tế bào vì nó hoạt
hóa quá trình phiên mã tạo ra CKI, p21 để luân phiên ức chế sự hoạt hóa
của CDK. Một khi CDK bị hoạt hóa nó sẽ phosphoryl hóa Rb và làm mất tác
dụng của Rb. Protein p16INK4a là sản phẩm từ sự mã hóa của gen JNK4, còn
được gọi là protein ức chế ung thư p16JNK4a. Protein này có vai trò trong
sự điều hòa chu trình tế bào khi ở dạng liên kết. Sự biểu hiện p16JNK4a liên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
quan đến quá trình lão hoá của tế bào và được thừa nhận là chi phối quá trình
12
lão hóa. Khi càng lớn tuổi thì nồng độ p16JNK4a sẽ càng cao. Kết quả nghiên
cứu từ các tế bào có các nguồn gốc khác nhau như tủy xương, tuyến nội tiết ở
tụy. Cũng như não cho thấy là p16JNK4a đã chi phối quá trình lão hóa bằng
cách giới hạn sự tự làm mới của các tế bào có khả năng nhân đôi [50].
Chương trình lão hóa có vai trò quan trọng trong ức chế tế bào tự tăng sinh.
1.4. Con đường tín hiệu NOTCH
1.4.1. Vai trò của con đường tín hiệu NOTCH trong ung thư
Sự thay đổi của con đường tín hiệu Notch có thể dẫn đến các khối u ác
tính của con người, bao gồm cả ung thư dạ dày vì con đường này có vai trò
quan trọng trong điều hòa các quá trình của tế bào như sự phân chia, biệt hóa,
quá trình tự chết hay tự làm mới của tế bào. Con đường này có thể trở thành
một dấu hiệu tiên lượng của ung thư dạ dày và là mục tiêu mới trong điều trị
ung thư dạ dày. Notch có 4 thụ thể là: Notch1, 2, 3 và 4. Chúng được tổng
hợp như một dạng tiền chất bao gồm các miền ngoại bào, xuyên màng và nội
bào. Trong bộ máy Golgi, protein Notch tiền thân bị cắt tạo ra hai tiểu đơn vị.
Một tiểu đơn vị chứa hầu hết các miền ngoại bào và tiểu đơn vị thứ hai bao
gồm phần còn lại của miền ngoại bào và xuyên màng. Họ Notch có 5 thành
viên là Jagged1, Jagged2, Delta1, Delta2, và Delta3 là các protein xuyên
màng loại I. Miền ngoại bào của thụ thể Notch đã được chứng minh có chứa
36 lần lặp lại [27]. Ligand liên kết với vùng lặp lại, mở ra vùng điều hòa âm
tính (NRR) cho phép phân cắt tiếp bởi các metallprotease, giải phóng vùng
Notch nội bào (NICD) vào trong nhân tế bào, tại đó nó đóng vai trò như một
yếu tố đồng phiên mã [28]. Trong nhân tế bào, NICD liên kết với protein gắn
kết DNA RBP-J và các protein đồng hoạt hoá khác trước khi hoạt hoá sự
phiên mã các gen đích có vị trí gắn kết với protein RGP-J. Một số gen được
điều hoà bởi con đường tín hiệu Notch đã được xác định ở cả tế bào thường
và tế bào ung thư, đặc biệt, gen Hes và Hey mã hoá cho yếu tố phiên mã kẹp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
tóc (Helix-loop-Helix) và gen CD25 của tế bào T [30].
13
Hình 1.5. Con đường tín hiệu Notch [36]
1.4.2. Vai trò của con đường tín hiệu NOTCH trong ung thư dạ dày
Các nghiên cứu mới nhất đã chỉ ra rằng trong niêm mạc dạ dày bình
thường, tín hiệu Notch có liên quan đến quá trình biệt hóa biểu mô dạ dày.
Kết quả của các nghiên cứu này đã chứng minh rằng biểu hiện của Notch1,
Notch3, Jagged1, Jagged2 và Hes1 đã được tìm thấy trong ung thư dạ dày ở
người [23]. Thụ thể Notch như Notch1, Notch2 và Notch3, Jagged1 và
Jagged2 cũng đã được phát hiện trong các mẫu mô ung thư dạ dày của con
người. Biểu hiện của Notch1 xuất hiện ở cả mô tiền ung thư và ung thư,
Notch1 có thể đóng một vai trò quan trọng trong cả việc thúc đẩy quá trình
chuyển hóa của các tế bào biểu mô dạ dày và trong việc duy trì sự tăng sinh
liên tục của các tế bào biểu mô đường ruột [53], [59].
Trong số các con đường tín hiệu khác liên quan đến ung thư dạ dày thì
con đường tín hiệu STAT3 và con đường Twist cũng được nghiên cứu. Thụ
thể Notch1 trong các tế bào ung thư dạ dày được kích hoạt sẽ thúc đẩy
tương tác giữa Twist và promoter STAT3, sự biểu hiện của Notch1 khởi
động sự photphorin hoá STAT3, cảm ứng sự hoạt hoá promoter Twist và
tăng cường sự hình thành các colony, sự di căn và xâm lấn của các tế bào
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
ung thư dạ dày [18].
14
Các tín hiệu Notch1 và Notch2 có thể khởi động quá trình phát sinh
ung thư dạ dày thông qua cảm ứng sự biểu hiện của cyclooxygenase-2 COX-
2. Murata và cộng sự đã chứng minh rằng sự biểu hiện quá mức COX-2 trong
ung thư dạ dày có mối tương quan cao với sự xâm lấn của khối u vào các
mạch bạch huyết trong thành dạ dày và di căn đến các hạch bạch huyết [39].
COX-2 có thể có tác động đến quá trình hình thành khối u. Do đó, có thể ức
chế COX-2 bằng cách bất hoạt gen COX-2 bởi quá trình methyl hóa từ đó làm
giảm sự phát triển của khối u [35].
Tóm lại, con đường tín hiệu Notch có liên quan đến sinh bệnh học của
các khối u đường tiêu hóa như ung thư dạ dày và ruột kết. Sự hiểu biết về con
đường tín hiệu Notch trong các mô ở điều kiện sinh lý ở những người có biến
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
đổi ác tính sẽ gợi ý đến một hướng điều trị ung thư mới.
15
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 do phòng thí nghiệm Inserm U1053
- Viện Sức khỏe và nghiên cứu Y học Quốc gia Pháp tại Bordeaux cung cấp.
Dòng tế bào được bảo quản trong nitơ lỏng tại Phòng thí nghiệm Y sinh –
Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.
All trans retionic acid được cung cấp bởi hãng Sigma Aldrick (Pháp).
Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: môi trường nuôi cấy
DMEMF12 và RPMI1640 (Invitrogen cung cấp), huyết thanh bò, trypsin,
kháng sinh Penicillin/Streptomycin, DMSO (Sigma cung cấp).
Các hóa chất sử dụng trong tách chiết RNA và phản ứng Realtime PCR:
RNeasy Mini Kit (Qiagen), Quantitect Reverse Transcriptase (RT) Kit
(Qiagen), TOPreal qPCR 2X PreMix SYBR (Enzynomics).
Các primer dùng trong phân tích mức độ biểu hiện gen do hãng Qiagen
cung cấp.
Các đĩa nuôi cấy tế bào, ống pipette và một số dụng cụ nhỏ khác do
Thermo Fisher cung cấp.
Các thí nghiệm được triển khai trên các hệ thống trang thiết bị hiện đại
gồm máy Realtime PCR (Analytic gena) hệ thống nuôi cấy tế bào
(Memmert), buồng thao tác sinh học an toàn sinh học cấp 2 (Thermo Fisher)
và các trang thiết bị phụ trợ hiện đại khác tại Phòng thí nghiệm Y sinh –
Trường Đại học Khoa học.
2.2. Địa điểm và thời gian
Nghiên cứu được thực hiện tại các Phòng thí nghiệm Y sinh – Trường
Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 04/2018 đến tháng 05/2019.
16
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nuôi cấy tăng sinh tế bào 2D
100.000 tế bào ung thư dạ dày dòng MKN45 được nuôi cấy trong hộp
nuôi cấy diện tích 75 cm2, trong môi trường nuôi cấy RPMI 1640 (Invitrogen)
bổ sung 10% Huyết thanh bò và kháng sinh 1% Penicilline/streptomycine.
Môi trường nuôi cấy được thay ngày một lần bằng một môi trường nuôi cấy
mới. Sau 5 ngày nuôi cấy, các tế bào được xử lý với trypsine 0,05% trong 3
phút. Tế bào được thu lại bằng ly tâm 1300 rpm/phút trong 5 phút và được
cấy chuyển sang một bình nuôi cấy mới. Tế bào sống, chết được đếm dưới
kính hiển vi đảo ngược, xử dụng trypan blue làm thuốc nhuộm cho tế bào
chết. Hình ảnh tế bào được chụp ảnh bằng kính hiển vi đảo ngược Nikon
Eclipse 2.
2.3.2. Nuôi cấy tế bào 3D và xử lý tế bào với ATRA
Nuôi cấy các tế bào ung thư dạ dày MKN45 với mật độ 2000 tế
bào/giếng nuôi cấy có diện tích 3,8 cm2, bề mặt không bám dính để hình
thành nên tumorsphere (khối tế bào ung thư hình cầu). Sử dụng môi trường
DMEMF12/Glutamax (từ Invitrogen) có bổ sung 1%
ampinicillin/streptomycin, yếu tố tăng trưởng biểu mô EGF 20 ng/ml, yếu tố
tăng trưởng thượng bì FGF 20ng/ml, 0,3% glucose, 5µg/ml insulin ở 370C,
5% CO2. Mỗi 2 ngày của quá trình nuôi cấy, loại bỏ 1 ml môi trường nuôi cấy
cũ, đồng thời bổ sung 1 ml môi trường nuôi cấy mới.
Sau 5 ngày nuôi cấy, các tế bào được xử lý với ATRA ở nồng độ 5µM (
nồng độ ức chế sự tăng sinh tế bào được lựa chọn từ một sàng lọc trong giải
nồng độ từ 0 – 10µM trước khi tiến hành nghiên cứu) trong 48 giờ. Mẫu đối
chứng được xử lý bằng DMSO nồng độ 0,01% trong thời gian tương ứng với
mẫu xử lý ATRA. Thu nhận và phân tách các tumorsphere thành các tế bào
đơn bằng enzyme trypsine nồng độ 0,05% trước khi tách chiết RNA tổng số
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
(hóa chất được cung cấp bởi Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France).
17
2.3.3. Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA
RNA tổng số của tế bào MKN45 được tách chiết bằng Trizol theo
hướng dẫn của nhà sản xuất (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France). Tế bào
nuôi cấy trên đĩa 6 giếng được bổ sung 1000µl Trizol, dùng pipette 1ml mix
nhiều lần để tách tế bào ra khỏi bề mặt đĩa. Ủ tế bào ở nhiệt độ phòng trong 5
phút, sau đó ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút ở 40C. Chuyển dịch nổi sang
ống eppendorf mới.
Bổ sung 2ml chloroform, vontex mẫu trong 15 giây và ủ ở nhiệt độ
phòng trong 3 phút. Ly tâm 10.000 rpm/phút trong 15 phút ở 40C. Hút thận
trọng dung dịch pha trên cùng sang một ống eppendoft mới. Bổ sung 500µl
Isopropanol và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm 10.000
rpm/phút trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và rửa RNA bằng 1ml Ethanol 75%
bằng cách ly tâm 7000 rpm/phút trong 5 phút ở 40C, lặp lại 2 lần. Làm khô
RNA trong 5-10 phút và bổ sung 100 µl nước khử ion. Đo quang phổ tại các
bước sóng 260/280nm bằng máy đo quang phổ NanoDrop. Sử dụng 1µg RNA
để tạo cDNA bằng Quantitect Reverse Transcriptase (RT) kit (do Quiagen,
Hilden, Germany cung cấp) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.3.4. Phân tích sự biểu hiện gen bằng Realtime PCR
2.3.4.1. Biểu hiện của các gen chủ chốt cảm ứng lão hóa tế bào
Phân tích Real-Time PCR sử dụng 20ng cDNA cho mỗi phản ứng PCR
với tổng thể tích là 20 µl với chất phát huỳnh quang SYBR Green qPCR do
Invitrogen cũng cấp. Danh sách các gen nghiên cứu với mã số cặp mồi tương
ứng do Quiagen cung cấp và được trình bày trong bảng 2.1. Sự thay đổi về
mức độ biểu hiện gen được tính theo phương pháp Delta delta ct (ΔΔCt) [32].
Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình của 3 lần lặp lại của thí nghiệm
với độ lệch chuẩn SD, cỡ mẫu cho mỗi lần thí nghiệm n=3.
Dữ liệu được thống kê và phân tích bằng phần mềm SPSS16.0F, sử
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
dụng kiểm định Mann-Whitney.
18
Bảng 2.1. Mã số các cặp mồi sử dụng cho Realtime-PCR
Tên gen Mã số cặp mồi
P21 PPH00211E
P53 PPH00228F
GADD45A PPH00148B
2.3.4.2. Biểu hiện của các gen chủ chốt thuộc con đường tín hiệu NOTCH
Thành phần phản ứng Realtime PCR gồm 15µl chứa 20µg cDNA, 3µM
mồi đặc hiệu tương ứng với gen nghiên cứu, sử dụng chất phát quang
SYNBER Green (Quiagen). Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung
bình của tối thiểu 3 thí nghiệm với độ lệch chuẩn SD. Dữ liệu được thống kê
và phân tích bằng phần mềm SPSS16.0F, sử dụng kiểm định Mann-Whitney.
Bảng 2.2. Mã số các cặp mồi cho phản ứng Realtime PCR
Tên gen Mã số cặp mồi
JAG1 PPH06022B
MAML1 PPH06329F
NOTCH1 PPH00526C
NOTCH2 PPH06330B
DLL4 PPH06026A
2.3.5. Phân tích sự biểu hiện của protein P21 bằng phương pháp miễn
dịch huỳnh quang
Phân tích sự biểu hiện của gen P21 bằng phương pháp miễn dịch
huỳnh quang:
Các bước tiến hành
- Bước 1: Các tumorsphere được cố định bằng parafomaldehyde sau đó
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
rửa hai lần bằng đệm PBS.
19
- Bước 2: Nhuộm tiêu bản với kháng thể thứ nhất là kháng thể đơn dòng
(IgG) thỏ kháng lại P21 ở người với tỉ lệ 1/100 trong 30 phút ở nhiệt dộ
phòng, rửa tiêu bản bằng PBS 2 lần.
- Bước 3: Rửa kháng thể 2 gắn AlexaFluor®488 kháng lại kháng thể thứ
1 trong 15 phút ở 40C.
- Bước 4: Tế bào được rửa 2 lần bằng đệm PBS, và nhuộm với Phalodin
647, tỉ lệ 1/1000 trong thời gian 30 phút. Rửa tế bào 2 lần bằng PBS 1X, lần thứ
2 đệm rửa PBS chứa dung dịch nhuộm nhân tế bào DAPI (do Sigma cung cấp).
- Bước 5: Tế bào được quan sát và chụp ảnh bằng hệ thống kính hiển vi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
huỳnh quang Nikon Eclipse Ti2.
20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nuôi cấy tăng sinh tế bào và nuôi cấy tạo các tumorsphere 3D
3.1.1. Nuôi tăng sinh tế bào trong điều kiện 2D
Nuôi cấy tăng sinh tế bào đóng vai quan trọng cho việc chuẩn bị vật liệu
cho các nghiên cứu tiếp theo. Trong nghiên cứu này, dòng tế bào MKN45 đã
được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS và
kháng sinh. Kết quả nuôi cấy được trình bày trong hình 3.1.
Hình 3.1. Hình ảnh nuôi cấy tăng sinh tế bào trong 3 ngày nuôi cấy
Kết quả hình 1 cho thấy, sau 3 ngày nuôi cấy, các tế bào sinh trưởng tốt
trên bề mặt hộp nuôi cấy. Các tế bào bám dính tốt trên bề mặt. Các tế bào có
hình dạng ovan hoặc hình tròn điển hình phù hợp với các kết quả nghiên cứu
trước đó [14]. Đây là cơ sở tốt để chúng tôi tiến hành thu nhận tế bào phục vụ
cho nuôi cấy 3D trước khi tiến hành các nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc.
3.1.2. Nuôi cấy tạo các tumorsphere 3D và xử lý tumorsphere với ATRA
Từ các tế bào nuôi cấy 2D, chúng tôi đã tiến hành thu nhận tế bào bằng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
phương pháp xử lý với trypsine và ly tâm, rửa tế bào với PBS 1X. Các tế bào
21
sau đó được nuôi cấy trên đĩa 24 giếng có bề mặt không bám dính để tạo ra
các tumorsphere. Kết quả nuôi cấy được trình bày trong hình 3.2
A
B
Hình 3.2. Nuôi cấy tạo tumorsphere (A) trong 5 ngày và xử lý các
tumorsphere trong 48h với ATRA (B), mũi tên màu đen chỉ các tế bào chết
Kết quả nuôi cấy cho thấy, trên bề mặt không bám dính và môi trường
chứa các chất sinh trưởng FGF, EGF, insulin, các tế bào gốc ung thư đã tạo ra
các khối cầu hay còn gọi là tumorsphere. Các tumorsphere lơ lửng trong môi
trường nuôi cấy và có kính thước không đồng nhất. Các tumorsphere sau 5
ngày nuôi cấy có đường kính từ 100 – 300 µm, chứa khoảng từ 100 – 200 tế
bào đơn. Đây là tiền đề quan trọng để chúng tôi tiến hành thí nghiệm tiếp theo
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
là xử lý các tumorsphere với ATRA trước khi tiến hành phân tích ảnh hưởng
22
của ATRA lên sự biểu hiện của các gen quan tâm. Kết quả xử lý các
tumorsphere với ATRA được trình bày trong hình B cho thấy, sau 48h xử lý
các tumorsphere bị giảm về kích thước. Mặt khác, các tumorsphere đã bị biến
đổi về hình dạng và có hiện tượng tan rã thành các tế bào đơn. Một số tế bào
có kiểu hình của tế bào chết. Điều này chứng tỏ ATRA đã tác động mạnh lên
sự sinh trưởng, phát triển của các tumorsphere 3D.
3.2. Kết quả tách chiết RNA tổng số
Để thực hiện mục tiêu trọng tâm của đề tài luận văn này là đánh giá tác
động của ATRA lên sự biểu hiện của các gen trong con đường tín hiệu lão
hóa và con đường tín hiệu Notch, RNA tổng số từ các tế bào đối chứng không
xử lý với ATRA và tế bào xử lý với ATRA đã được tách chiết và tinh sạch
bằng phương pháp Trizol như đã trình bày ở trên. Kết quả tách chiết được
biểu thị trong hình 3.3 và bảng 3.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.3. Phổ hấp thụ của RNA tổng số thu được từ quá trình tách chiết
23
Bảng 3.1. Nồng độ RNA tổng số thu được từ quá trình tinh sạch
Phổ hấp thụ huỳnh quang của các mẫu RNA tổng số đã cho thấy RNA
thu được có độ tinh sạch rất tốt thể hiện qua giá trị 260/280 tất cả đều từ 1,92
trở lên. Thêm vào đó, RNA của các mẫu thu được đều có hàm lượng cao thể
hiện ở hàm lượng từ 109,1 đến 200,5ng/µl. Từ nồng độ này chúng tôi đã tính
toán để lấy được lượng RNA là 1µg để tổng hợp lên cDNA phục vụ cho phân
tích realtime PCR trong nghiên cứu tiếp theo.
3.3. ATRA làm tăng cường sự phiên mã các gen p53, p21 và GADD45
Hình 3.4. Mức độ biểu hiện gene P21, P53 và GADD45A giữa mẫu đối
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
chứng và mẫu xử lý với ATRA
24
Để phân tích sự biểu hiện của 3 gen p53, p21 và GADD45, các phản ứng
realtime PCR đã được thực hiện với các cặp mồi đặc hiệu tương ứng với 3
gene do Quiagene cung cấp. Kết quả biểu hiện gen giữa mẫu đối chứng và
mẫu xử lý với ATRA đã được phân tích và trình bày dưới dạng biểu đồ hình
3.4. Biểu đồ so sánh ở hình 3.4 cho thấy có sự biểu hiện tăng ở cả 3 gene nêu
trên. Cụ thể, p53 được biểu hiện tăng 1,5 lần so với đối chứng, trong khi mức
độ biểu hiện của p21 và GADD45 tăng khoảng 2,5 lần và 4 lần so với mẫu
đối chứng.
Gen p53 tham gia vào nhiều quá trình tế bào bao gồm kiểm soát chu kỳ
tế bào, sửa chữa DNA, khiến tế bào trải qua apoptosis đồng thời gây ra lão
hóa qua việc can thiệp làm ngắn dần các đoạn telomere hoặc biểu hiện bất
thường của các các oncogen [44]. Ở người bị ung thư gen p53 thường bị mất
dẫn đến tích tụ các tế bào hư hỏng và dần tiến triển thành ung thư, xử lý các
khối u bằng cách lập trình chu trình chết của tế bào nhờ gen p53 được ghi
nhận, các nghiên cứu gần đây cũng đã chứng minh gen p53 tác động gây nên
việc lão hóa tế bào đóng vai trò then chốt trong hạn chế sự tiến triển của khối
u trong cơ thể con người, các báo cáo cũng cho thấy họ p53 thúc đẩy lão hóa
và duy trì cân bằng nội mô thông qua bảo vệ tế bào gốc tái tạo [8], [64]. Tham
gia vào sự kiện của quá trình lão hóa đặc biệt phải nhắc tới vai trò của p21.
p21 là một trong các yếu tố phiên mã được điều hòa trực tiếp bởi p53 và sự
biểu hiện mạnh của p53 dẫn tới điều hòa tăng sự biểu hiện của p21 trong quá
trình đáp ứng với các stress từ môi trường. Trong trường hợp bức xạ ion hóa,
p53 hoàn toàn cần thiết cho việc tạo ra p21, tia cực tím bước sóng ngắn cũng
gây ra biểu hiện p21 thông qua cơ chế hậu phiên mã liên quan đến sự ổn định
của p21 mRNA, cảm ứng này cũng phụ thuộc vào sự hiện diện của chức năng
của gen p53 [13], [15], [16]. P21 hoạt động như một chất ức chế, được cho là
trực tiếp tham gia vào kiểm soát sự tăng trưởng của tế bào khi tiếp xúc với các
chất có hại. Việc kiểm soát này đóng vai trò quan trọng góp phần cho sự khởi
đầu apotosis. p21 là chất ức chế quá trình tái bản DNA và ức chế các CDK từ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
đó khiến tế bào rơi vào trạng thái dừng chu kỳ tế bào. Ở nhiều dòng tế bào
25
ung thư sự biểu hiện tăng cường p21 thúc đẩy tế bào đi vào trạng thái nghỉ
vĩnh viễn như một tế bào trải qua quá trình lão hóa [15], [63]. Ở nghiên cứu
này, chúng tôi đã chỉ ra rằng ATRA cảm ứng sự biểu hiện tăng cường của cả
p53 và p21 ở mức độ phiên mã đã cho thấy vai trò của chúng trong quá trình
lão hóa tế bào.
GADD45 giữ vai trò quan trọng trong việc dừng sinh trưởng tế bào và
đưa tế bào vào trạng thái lão hóa, điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng
trong việc ngăn ngừa sự sinh sôi của các tế bào có sự sai hỏng về mặt di
truyền, p53 có thể gắn kết vào vùng promoter của gen GADD45 ở các tế
bào đang được điều trị ung thư bằng thuốc và các tế bào lão hóa, khi tăng
cường liên kết của p53 vào promoter của các gen đích, chỉ có p21 và
GADD45 được tăng cường biểu hiện [21]. Trong nghiên cứu của chúng
tôi GADD45 đã tăng mức độ biểu hiện lên gấp 4 lần so với đối chứng đã
cho thấy kết quả nghiên cứu có sự phù hợp với các nghiên cứu trên liên
quan tới cơ chế lão hóa của tế bào.
3.4. ATRA cảm ứng sự biển hiện tăng của protein p21
Như đã trình bày ở trên, sự tăng cường phiên mã của gen p21 có ý nghĩa
đặc biệt quan trọng trong sự hoạt hoá con đường tín hiệu lão hoá tế bào. Để
khẳng định ATRA làm tăng biểu hiện của p21 ở mức độ protein, chúng tôi sử
dụng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang có kháng thể đơn dòng
kháng p21.
Hình 3.5 . Ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện của protein p21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
26
Phalodin phát hiện F-actin màu đỏ; DAP1 nhuộm nhân tế bào màu lam; Kháng thể kháng p21 màu lục; thang tỉ lệ (Scale bar) 20 µm. Kết quả ở hình 3.5 đã chỉ ra rằng p21 được biểu hiện mạnh trong nhân tế bào MKN45 được xử lý với ATRA so với tế bào đối chứng, ATRA điều hòa tăng cường sự biểu hiện của p21 lên gấp 2,5 lần. Kết quả này khẳng định ATRA đã điều hòa tăng mạnh các gen p21, đây là gen chủ chốt liên quan đến quá trình lão hóa tế bào. ATRA gây ra sự khử oxy hóa của p16 và p21 thông qua việc điều chỉnh giảm các methyltransferase 1, 3a và 3b để tạo điều kiện gắn kết Ets1/2 với promoter p16 và gắn p53 vào promoter p21, dẫn đến tăng biểu hiện của chúng và sau đó gây ra lão hóa tế bào trong các dòng tế bào gan HepG2 [22]. Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên chúng tôi chỉ ra rằng ATRA đã điều hòa tăng hoạt động của gen p21 nói riêng và các gen chủ chốt nói chung trong con đường tín hiệu của sự lão hóa dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45.
3.5. ATRA điều hòa sự biểu hiện các gen thuộc con đường tín hiệu phân tử Notch 3.5.1. ATRA ức chế sự biểu hiện của gen Notch
Trong nghiên cứu này của chúng tôi, sự tác động của ATRA lên sự biểu hiện của 5 gen chính trong con đường tín hiệu Notch đã được đánh giá bằng phương pháp Realtime-PCR. Kết quả được chỉ ra trong hình 3.6 cho thấy, ATRA đã ức chế sự biểu hiện của hầu hết các gen nghiên cứu. Cụ thể ATRA làm giảm mức độ biểu hiện của các gen Notch 1 và Notch 2 khoảng 2 lần.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.6. Ảnh hưởng của ATRA lên sự hiệu hiện của các gen
27
Các tín hiệu Notch1 và Notch 2 có thể khởi động quá trình phát sinh ung thư dạ dày thông qua cảm ứng sự biểu hiện của COX-2. Nghiên cứu của Yeh và cộng sự cho rằng dạng hoạt hóa của thụ thể Notch1 tăng cường sự hình thành các colony in vitro, sự tăng trưởng của khối u cấy ghép, sự di cư và xâm lấn thông qua COX-2 trong các tế bào ung thư dạ dày [68]. Sự biểu hiện của Notch2 đã làm tăng sự hình thành các colony, di cư, xâm lấn và sự chuyển dịch biểu mô trung mô (EMT) của tế bào ung thư dạ dày. Sự tương tác giữa vùng nội bào của Notch2 với promoter của COX-2 dẫn tới cảm ứng biểu hiện của COX-2 theo cách phụ thuộc vào CBF1 trong tế bào ung thư dạ dày cũng được xác định. Sự ức chế biểu hiện của COX-2 với NS-398 (chất ức chế của COX-2) đã điều hòa giảm ảnh hưởng của vùng nội bào Nocht2 trong quá trình phát triển ung thư dạ dày [55]. Tuy nghiên nghiên cứu của Sun Y và cộng sự cho thấy Notch1 không được phát hiện trong các biểu mô dạ dày không ung thư và thấy phổ biến trong ung thư dạ dày typ ruột (trên 50%), và typ lan tỏa (23%) [53]. Trong nghiên cứu này ATRA đã làm giảm mức độ biểu hiện của Notch1 và Notch2, đây là hai protein chủ chốt trong con đường tín hiệu Notch.
3.5.2. ATRA điều hòa giảm sự biểu hiện các gen mã hóa cho các Ligand của Notch
Phân tích ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện các gen mã hóa cho các
ligand chính của Notch được trình bày trong hình 3.7
Hình 3.7. Ảnh hưởng của ATRA lên sự hiểu hiện các Ligand của Notch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
28
Hình 3.7 cho thấy rằng ATRA đã làm giảm mức độ biểu hiện của JAG1 lên
tới 5 lần. ATRA không làm thay đổi mức độ phiên mã của DLL4 và dưới tác
dụng của ATRA, MAML1 đã bị điều hòa giảm đáng kể so với mẫu đối chứng.
Trong ung thư dạ dày ở người, 4 thụ thể của Notch và các ligand (phối
tử) của nó là Jagged1 và Fagged2 cũng đã được tìm thấy [24]. Là thành phần
chính của con đường truyền tín hiệu Notch, JAG1 đóng vai trò quan trọng
trong cả điều kiện sinh lý và bệnh lý, bao gồm sự phát triển của phôi thai và
ung thư. Trong số các chức năng sinh lý của nó, điều đáng chú ý là việc loại
bỏ gen Jag1 ở chuột gây ra các khiếm khuyết mạch máu nghiêm trọng gây
chết trong giai đoạn phôi thai sớm và đột biến JAG1 ở người là nguyên nhân
gây ra hội chứng Alagille, một rối loạn phát triển đa cơ quan di truyền [51],
[65]. JAG1 cũng đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng sinh học ung
thư, bao gồm phát sinh khối u, tăng trưởng tế bào tân sinh, tế bào gốc ung thư
(CSC), chuyển tiếp trung biểu mô (EMT), quá trình di căn và khả năng kháng
trị trong một số loại ung thư. JAG1 cũng đã được báo cáo không chỉ được thể
hiện và đóng vai trò trong các tế bào ung thư mà biểu hiện và hoạt động của
nó cũng đã được mô tả trong các loại tế bào khác có trong môi trường vi mô
khối u như trung mô, tế bào nội mô và nguyên bào xương [10], [34], [49].
Điều quan trọng là, biểu hiện JAG1 có thể được gây ra bởi các con đường
truyền tín hiệu khác rất quan trọng trong bệnh ung thư trong đó có con đường
Notch [69]. JAG1 là một trong những ligand chính của thụ thể Notch ở các tế
bào động vật có vú, khả năng liên kết và kích hoạt của JAG1 được kiểm soát
chặt chẽ bởi quá trình glycosyl hóa thụ thể Notch [66].
DLL4 thuộc họ Delta cũng là một trong các ligand quan trọng của Notch.
Giống như các gen Delta khác, DLL4 mã hóa một ligand liên kết màng, được
đặc trưng bởi một vùng ngoại bào có chứa một số miền giống như EGF và
một miền DSL cần thiết cho liên kết với thụ thể. Hoạt động và biểu hiện của
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
DLL4 và các hoạt động khác của các thành viên khác trong họ này cho thấy
29
vai trò của DLL4 trong việc kiểm soát sinh học tế bào nội mô. DLL4 là một
trong những ligand điều chỉnh các hoạt động của con đường Notch, bao gồm
Notch-1,2 và 4 Biểu hiện DLL4 tương quan cao với sự hình thành khối u và
di căn, các báo cáo gần đây tập trung vào các tác động của khối u đối với tế
bào gốc/tế bào gốc ung thư dạ dày (GCSPC), cho thấy nó rất quan trọng trong
quá trình di căn GCSPC. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hệ thống DLL4-Notch
đóng một vai trò quan trọng trong quá trình hình thành khối u và gây ra một
số bệnh ác tính như ung thư biểu mô vòm họng và ung thư tuyến tụy [9], [70].
MAML1 cũng được biết đến là một trong các ligand quan trọng. Để kích
hoạt con đường Notch, họ MAML 1/2/3 cũng cần thiết vì chúng tạo thành
một phức hợp ternary với CBF1-NotchIC. Sau đó, phức hợp này bao gồm
CBF1-NotchIC-MAML hoạt động như một chất kích hoạt phiên mã dẫn đến
sao chép gen mục tiêu Notch [62]. Nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng
ATRA đã áp chế sự biểu hiện của MAML1 trong con đường tín hiệu Notch.
Ở các tế bào ung thư bạch cầu thường có sự thay đổi hoạt động của gen
Notch1 dẫn đến sự hình thành một phức hợp Notch1-TGF-β, trong khi đó
ngăn chặn phản ứng tiền viêm với sự ức chế của phức hợp Notch1-TGF-β dẫn
đến cảm ứng một phần sự lão hóa thông qua con đường trung gian Notch-
Jag1 [37]. Ở một nghiên cứu khác, kích hoạt Notch qua trung gian JAG1 đã
được sử dụng để ngăn chặn sự lão hóa của các tế bào gốc trung mô trong nuôi
cấy tế bào và để tăng cường tiềm năng tạo xương của tế bào in vivo [67]. Ở
đây chúng tôi đã thấy rằng ATRA đã ức chế mạnh sự biểu hiện của Jag1 so
với đối chứng. Điều này cho thấy ATRA đã can thiệp vào con đường tín hiệu
Notch của tế bào MKN45 bằng cách ức chế các ligand của Notch.
Nhưng nghiên cứu này cho thấy rằng sự hoạt hóa con đường lão hóa là
sự đối nghịch với sự hoạt hoá con đường tín hiệu Notch trong tế bào ung thư.
Hay nói cách khác là để kìm hãm ung thư thì cần cảm ứng con đường lão hóa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
và ức chế con đường tín hiệu Notch.
30
Trong nghiên cứu này, ATRA đã tăng cường sự hoạt động của các gen
lão hóa đồng thời làm giảm sự hoạt động của các gen của con đường tín hiệu
Notch như là một cơ chế phân tử, giải thích cho khả năng ức chế ung thư dạ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
dày của ATRA.
31
KẾT LUẬN
1. Đã nuôi cấy tăng sinh và nuôi cấy tạo các tumorsphere 3D của các tế
bào ung thư MKN45 để phục vụ cho quá trình thử thuốc. Đã tách chiết thành
công RNA tổng số từ các tumorsphere của các tế bào MKN45 trong điều kiện
xử lý hoặc không xử lý với ATRA với độ tinh sạch cao và hàm lượng tốt.
2. ATRA đã ảnh hưởng lên sự biểu hiện ở các gen liên quan đến sự lão
hóa tế bào. p53 đã được biểu hiện tăng 1,5 lần. p21 biểu hiện tăng 2,5 lần và
GADD45 tăng khoảng 4 lần so với mẫu đối chứng. ATRA tăng cường biểu
hiện của protein p21 trong nhân tế bào MKN45 được xử lý với ATRA so với
tế bào đối chứng dựa trên phân tích miễn dịch huỳnh quang.
3. ATRA đã điều hòa giảm sự biểu hiện của các gen chủ chốt thuộc con
đường tín hiệu Notch. Trong đó mức độ biểu hiện của Notch1 và Notch2
giảm khoảng 2 lần, JAG1 giảm 5 lần, điều hòa giảm đáng kể đối với
MAML1, và không thay đổi mức độ phiên mã đối với DLL4.
Kết luận chung: ATRA đã ức chế các tế bào ung thư dạ dày thông qua ức
chế sự biểu hiện các gen trong con đường tín hiệu Notch và tăng cường sự
hoạt động của các gen trong con đường lão hóa tế bào.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của Retinoic acid lên sự biểu hiện của
các gene liên quan tới sự lão hóa tế bào và con đường tín hiệu Notch ở tế bào
ung thư dạ dày MKN45, mở ra một hướng tiếp cận mới trong điều trị ung thư
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
dạ dày.
32
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Arisi MF, Starker RA, Addya S, Huang Y, Fernandez SV (2014).“All
transretinoic acid (ATRA) induces re-differentiation of early transformed
breast epithelial cells”, Int J Oncol, 44:1831–42.
2. Arrieta O, Hernandez-Pedro N, Fernandez-Gonzalez-Aragon MC,
Saavedra-Perez D, Campos-Parra AD, Rios-Trejo MA. et al
(2011),”Retin- oic acid reduces chemotherapy-induced neuropathy in an
animal model and patients with lung cancer”, Neurology, 77:987–95.
3. Beausejour CM, Krtolica A, Galimi F, Narita M, Lowe SW, et al
(2003), “Reversal of human cellular senescence: roles of the p53 and p16
pathways”, EMBO J, 22:4212–22.
4. Brooks-Wilson AR, Kaurah P, Suriano G et al (2004), “Germline E-
cadherin mutations in hereditary diffuse gastric cancer: assessment of 42
new families and review of genetic screening criteria”, J. Med. Genet, 41
(7): 508–17.
5. Campisi J, d’Adda di Fagagna F (2007), “Cellular senescence: when bad
things happen to good cells”, Nat Rev Mol Cell Biol, 8:729–40.
6. Chandanos, Evangelos (2007), “Estrogen in the development of
esophageal and gastric adenocarcinoma”, Karolinska Institute, 978-91-
7357-370-2.
7. Chen Q, Ross AC (2012), “All-trans-retinoic acid and the glycolipid
alphagalactosylceramide combined reduce breast tumor growth and lung
metastasis in a 4T1 murine breast tumor model”, NutrCance, 64:1219–27.
8. Chen Z, Trotman LC, Shaffer D, Lin HK, Dotan ZA, Niki M,
Koutcher JA, Scher HI, Ludwig T, Gerald W, Cordon-Cardo C,
Pandolfi PP (2005), “Crucial role of p53-dependent cellular senescence in
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
suppression of Pten-deficient tumorigenesis”, Nature, 436:725–730.
33
9. Chen, H. T., Q. C. Cai, J. M. Zheng, X. H. Man, H. Jiang, B. Song, et al
(2012), “High expression of delta‐like ligand 4 predicts poor prognosis after
curative resection for pancreatic cancer”, Ann. Surg. Oncol, 19:464–474.
10. Choi JH, Park JT, Davidson B, Morin PJ, Shih IeM, Wang TL (2008),
“Jagged-1 and Notch3 juxtacrine loop regulates ovarian tumor growth and
adhesion”, Cancer Res, 68:5716–2310.
11. Christos Antipatis, George Grant and Cheryl J. Ashworth (2007),
“Moderate maternal vitamin A deficiency affects perinatal organ growth and
development in rats”, British Journal of Nutrition, 84: 125-132.
12. Deutsch V, Lotan R (1983), “Stimulation of sialyltransferase activity of
melanoma cells by retinoic acid”, Exp Cell Res, 149:237–45.
13. Dulic V, Kaufmann W. K, Wilson S. J, Tlsty T. D, Lees E, Harper J.
W, Elledge S. J, Reed S. I (1994), “p53-dependent inhibition of cyclin-
dependent kinase activities in human fibroblasts during radiation-induced
G1 arrest”, Cell, 76:1013–1023.
14. Edmondson R., Broglie J.J., Adcock A.F., Yang L (2014), “Three-
dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery
and cell-based biosensors”, Assay Drug Dev. Technol, 12:207–218.
15. Gorospe M, Wang X, Holbrook N. J (1998), “p53-dependent elevation
of p21Waf1 expression by UV light is mediated through mRNA
stabilization and involves a vanadate-sensitive regulatory system”, Mol.
Cell. Biol, 18:1400–1407.
16. Gorospe M, Wang X, Holbrook NJ (1999), “Functional role of p21
during the cellular response to stress”, Gene Expr, 7.4: 377-85.
17. Haw-Jyh Chiu, Donald A. Fischman, and Ulrich Hammerling (2008),
“Vitamin A depletion causes oxidative stress, mitochondrial dysfunction,
and PARP-1-dependent energy deprivation”, The FASBE Journal, 22(11):
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
3878–3887.
34
18. Hsu KW, Hsieh RH, Huang KH (2012), “Activation of the
Notch1/STAT3/Twist signaling axis promotes gastric cancer progression”,
Carcinogenesis, 33:1459–67.
19. Hsu SL, Lin YF, Chou CK (1993), “Retinoic acid biphasically regulates
the gene expression of hepatitis B virus surface antigen in human
hepatoma Hep3B cell”, J BiolChem, 268:23093–7.
20. Huss WJ, Lai L, Barrios RJ, Hirschi KK, Greenberg NM (2004),
“Retinoic acid slows progression and promotes apoptosis of spontaneous
prostate cancer”, Prostate, 61:142–52.
21. Jackson, James G, and Olivia M, Pereira-Smith (2006), “p53 is
preferentially recruited to the promoter of growth arrest genes p21 and
GADD45 during replicative senescence of normal human fibroblasts”,
Cancer Research , 66.77,8356-8360.
22. JooSongLim, Sun-HyePark, Kyung LibJang (2011), “All-trans retinoic
acid induces cellular senescence by up-regulating levels of p16 and p21
via promoter hypomethylation”, Biochemical and Biophysical Research
Communications,412. 3: 500-505.
23. Kang H, An H J, Song J Y, Kim T H, Heo J H, Ahn D H, and Kim G
(2012), “Notch3 and Jagged2 contribute to gastric cancer development and
to glandular differentiation associated with MUC2 and MUC5AC
expression”, Histopathology , 61-576.
24. Kang H, An HJ, Song JY, Kim TH, Heo JH, Ahn DH, Kim G (2012),
“Notch3 and Jagged2 contribute to gastric cancer development and to
glandular differentiation associated with MUC2 and MUC5AC
expression”, Histopathology, 61(4):576-86.
25. Kim, Andrea S. CuppJannette M. Dufour Grace Kim Michael K.
Skinner Kwan Hee (1999), “Action of Retinoids on Embryonic and Early
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
Postnatal Testis Development”, Endocinology, 2343–2352.
35
26. Kliewer SA, Umesono K, Mangelsdorf DJ, Evans RM (1992),
“Retinoid X receptor interacts with nuclear receptors in retinoic acid,
thyroid hormone and vitamin D3 signalling”, Nature, 355:446–449.
27. Koch U, Radtke F (2007), “Notch and cancer: a double- edged sword”,
Cell Mol Life Sci, 64:2746–2762.
28. Kopan R, Ilagan MX (2009), “The canonical Notch signaling pathway:
unfolding the activation mechanism”, Cell, 137:216–33.
29. Lee Yeuan Ting, Dr. OonChernEin (2017), “Cancer and precision
medicine”, Scientific-malaysian.
30. Leong KG, Karsan A. (2006), “Recent insights into the role of Notch
signaling in tumorigenesis”, Blood, 107:2223–33.
31.Li LP, Zhang Z, Han SX (2001), “Retinoic acid in inhibition of cancer
cell proliferation and induction of apoptosis”, ShijieHuarenXiaohuaZazhi,
9:437–440.
32. Livak KJ, Schmittgen TD (2001), “Analysis of relative gene expresion
data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))”,
Method, 25(4): 402-408.
33. López-Otin, Carló, et al (2013), “The hallmarks of aging”, Cell, 153(6):
1194-1217.
34. Lu J, Ye X, Fan F, Xia L, Bhattacharya R, Bellister S, et al. (2013),
“Endothelial cells promote the colorectal cancer stem cell phenotype
through a soluble form of Jagged-1”, Cancer Cell , 23:171–8510.
35. Mao XY, Wang XG, Lu XJ, Xu L, Hang CB (2007), “COX-2
expression in gastric cancer and its relationship with angiogenesis using
tissue microarray”, World J Gastroenterol, 13:3466–71.
36. Marlena Brzozowa, corresponding author ŁukaszMielańczyk, Marek
Michalski, Łukasz Malinowski, GrażynaKowalczyk-Ziomek,
Krzysztof Helewski, MarzenaHarabin-Słowińska, and
RomualdWojnicz (2013), “Role of Notch signaling pathway in gastric
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
cancer pathogenesis”, Wspótczesnaonkologia, 17(1): 1–5.
36
37. Matthew Hoare, Yoko Ito, Tae-Won Kang, Michael P. Weekes,
Nicholas J. Matheson, Daniel A. Patten, Shishir Shetty, Aled J. Parry,
Suraj Menon, RafikSalama, Robin Antrobus, KosukeTomimatsu,
William Howat, Paul J. Lehner, Lars Zender (2016), “NOTCH1
mediates a switch between two distinct secretomes during senescence”,
Nat Cell Biol, 18(9): 979–992.
38. Medicine, Marx J (2004), “Bone marrow cells: the source of gastric
cancer?”, Science, 306:1455–1457.
39. Murata H, Kawano S, Tsuji S, Tsuji M, Sawaoka H, Kimura Y,
Shiozaki H, Hori M (1999), “Cyclooxygenase-2 overexpression enhances
lymphatic invasion and metastasis in human gastric carcinoma”, Am J
Gastroenterol, 94:451–5.
40. Nguyen P. H., Giraud J., Staedel C., Chambonnier L., Dubus P.,
Chevret E., &Soubeyran I (2016), “All-trans retinoic acid targets gastric
cancer stem cells and inhibits patient-derived gastric carcinoma tumor
growth”, Oncogene, 35(43), 5619-5628.
41. Noy, N (2000), “Retinoid-binding proteins: mediators of retinoid action”,
Biochem Journal, 348: 481–495.
42. P, Lauren (1965), “The two histological main types of gastric carcinoma:
diffuse and so-called intestinal-type carcinoma. An attempt at a histo-
clinical classification”, ActaPatholMicrobiolScand, 64:31–49.
43. Pisani P, Parkin DM, Bray F, Ferlay J (1999), “Estimates of the
worldwide mortality from 25 cancers in 1990”, Int J Cancer, 83:18–29.
44. Quian, Yingjuan, and Xinbin Chen (2013), “Senescence regulation by
the p53 protein family”, Methods MolBiol, 965, 37-61.
45. Richard Kin Ting Kam, Yi Deng, YonglongChenEmail author and
Hui ZhaoEmail author (2012), “Retinoic acid synthesis and functions in
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
early embryonic development”, Cell & Bioscience, 2045-3701-2-11.
37
46. Rutz HP, Little JB (1989), “Modification of radiosensitivity and
recovery from X ray damage in vitro by retinoic acid”. Int J
RadiatOncolBiolPhys, 16:1285–8.
47. Salmon, Frank L. Meyskens Jr. and Sydney E (1979), “Inhibition of
human melanoma colony formation by retinoids”, Cacer Research,
39:4055–7.
48. Sengupta S, Ray S, Chattopadhyay N, Biswas N, Chatterjee A (2000),
“Effect of retinoic acid on integrin receptors of B16F10 melanoma cells. J
ExpClin Cancer Res, 19:81–7.
49. Sethi N, Dai X, Winter CG, Kang Y (2011), “Tumor-derived JAGGED1
promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch
signaling in bone cells”, Cancer Cell , 19:192–20510.
50. Sherr, Charles J., and Frank McCormick (2002), “The RB and p53
pathways in cancer”, Cancer cell, 2.2, 103-112.
51. Spinner NB, Colliton RP, Crosnier C, Krantz ID, Hadchouel M,
Meunier-Rotival M (2001), “Jagged1 mutations in Alagille syndrome”,
Hum Mutat, 17:18–3310.
52. Su Liu, Qiao Wu, Zheng-Ming Chen, and Wen-Jin Su (2001), “The
effect pathway of retinoic acid through regulation of retinoic acid receptor a
in gastric cancer cells”, World Journal of gastroenterology, 7(5): 662–666.
53. Sun Y, Gao X, Liu J, et al (2011), “Differential Notch1 and Notch2
expression and frequent activation of Notch signaling in gastric cancers”,
Arch Pathol Lab Med, 135:451–8.
54. Tiing Leong Ang, and Kwong Ming Fock (2014), “Clinical epidemiology of
gastric cancer”, Singapor Medical Jounal, 55(12): 621–628.
55. Tseng Y C, Tsai Y H, Tseng M J, Hsu K W, Yang M C, Huang K H,
Li A F Y, Chi C W, Hsieh R H, Ku H H (2012), “Notch2-induced COX-
2 expression enhancing gastric cancer progresion”, Molecular
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
Carcinogenesis, 51-939.
38
56. Vauhkonen M, Vauhkonen H, Sipponen P (2006), “Pathology and
molecular biology of gastric cancer”, Best Pract Res ClinGastroenterol,
20:651–74.
57. Wakamatsu Y, Sakamoto N, Oo HZ, Naito Y, Uraoka N, Anami K,
Sentani K, Oue N, Yasui W (2012), “Expression of cancer stem cell
markers ALDH1, CD44 and CD133 in primary tumor and lymph node
metastasis of gastric cancer”, PatholInt, 62(2):112-9.
58. Wang Z, Cao Y, D’Urso CM, Ferrone S (1992), “Differential
susceptibility of cultured human melanoma cell lines to enhancement by
retinoic acid of intercellular adhesion molecule 1 expression”, Cancer Res,
52:4766–72.
59. Wang Z, Li Y, Sarkar FH (2010), “Notch signaling proteins: legitymate
targets for cancer therapy”, Curr Protein PeptSci, 11:398–408.
60. Wood WR, Seftor EA, Lotan D, Nakajima M, Misiorowski RL, Seftor
RE. et al (1990), “Retinoic acid inhibits human melanoma tumor cell
invasion”, Anticancer Res, 10:423–32.
61. World Cancer Report 2014 (2014), “World Health Organization”, pp.
Chapter 5.4.
62. Wu L, Aster J C, Blacklow S C, Lake R, Artavanis-Tsakonas S,
Griffin J D (2000), “MAML1, a human homologue of Drosophila
Mastermind, is a transcriptional co-activator for NOTCH receptors”, Nat.
Genet, 26:484–489.
63. Xiong Y, Hannon GJ, Zhang H, Casso D, Kobayashi R. Beach D
(1993), “p21 is a universal inhibitor of cyclin kinases”, Nature, 366.6456,
701-704.
64. Xue W, Zender L, Miething C, Dickins RA, Hernando E,
Krizhanovsky V, Cordon-Cardo C, Lowe SW (2007), “Senescence and
tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
carcinomas”, Nature, 445:656–660.
39
65. Xue Y, Gao X, Lindsell CE, Norton CR, Chang B, Hicks C, et al (1999), “Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1”, Hum Mol Genet, 8:723–3010.
66. Yang LT, Nichols JT, Yao C, Manilay JO, Robey EA, Weinmaster G (2005), “Fringe glycosyltransferases differentially modulate Notch1 proteolysis induced by Delta1 and Jagged1”, MolBiol Cell, 16:927–4210. 67. Ye Tian, Ying Xu, TaiyangXue, Longgang Chen, Bin Shi, Bing Shu,
Chao Xie, Massimo Max Morandi, Todd Jaeblon, John V Marymont, and Yufeng Dong (2017), “Notch activation enhances mesenchymal stem cell sheet osteogenic potential by inhibition of cellular senescence”, Cell Death Dis, 8(2): e2595.
68. Yeh, T.-S., Wu, C.-W., Hsu, K.-W., Liao, W.-J., Yang, M.-C., Li, A.F- Y., Wang, A.-M., Kuo, M.-L., and Chi, C.-W (2009), “The activated Notch1 signal pathway is associated with gastric cancer progression through cyclooxygenase-2”, Cancer Research, 69-5039.
69. Zavadil J, Cermak L, Soto-Nieves N, Bottinger EP (2004), “Integration in epithelial-to-
of TGF-beta/Smad and Jagged1/Notch signalling mesenchymal transition”, EMBO J , 23:1155–6510.
70. Zhang J X, M B Cai, X P Wang, L P Duan, Q Shao, Z T Tong, et al (2013), “Elevated DLL4 expression is correlated with VEGF and predicts poor prognosis of nasopharyngeal carcinoma”, Med. Oncol, 30:390.
71. Zhang XK, Hoffmann B, Tran PB, Graupner G, Pfahl M (1992), “Retinoid X receptor is an auxiliary protein for thyroid hormone and retinoic acid receptors”, Nature, 355:441–446.
72. Zhang XK, Kahl M (1993), “Regulation of retinoid and thyroid hormone through homodimeric and heterodimeric receptors”, Trends
action EndocrinolMetab, 4:156–162.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn
73. Zhu L, Gibson P, Currle DS, Tong Y, Richardson RJ, Bayazitov IT, Poppleton H, Zakharenko S, Ellison DW, Gilbertson RJ (2009), “Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation”, Nature, 457:603–607.
