Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 người tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào Escherichia coli trong điều kiện GMP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- - - - -  - - - - -

Nguyễn Thị Minh Thu

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT INTERLEUKIN-2 NGƢỜI TÁI TỔ HỢP

DẠNG CẢI BIẾN TRÊN DÒNG TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI

TRONG ĐIỀU KIỆN GMP

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

GS. TS. Trƣơng Nam Hải

Hà Nội, 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ kết quả trong khóa luận là do chính tôi trực

tiếp thực hiện.

Các số liệu và kết quả đƣợc công bố trong khóa luận là hoàn toàn trung

thực, chính xác và chƣa đƣợc công bố ở bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015

Học viên cao học

i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Nguyễn Thị Minh Thu

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới GS. TS. Trƣơng Nam Hải

và TS. Phùng Thu Nguyệt, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt thời gian tôi

học tập và nghiên cứu.

Tiếp đến tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô của trƣờng

Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái và Tài Nguyên sinh vật, các thầy, cô của Viện

Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giảng dạy cho tôi trong suốt thời gian tham gia

khóa học.

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các cán bộ nghiên cứu, nhân viên của

phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học và Công ty TNHH Vắc xin và

Sinh phẩm số 1(VABIOTECH) trực thuộc Bộ Y Tế-Việt Nam đã tận tình chỉ bảo

động viên và cho tôi những lời khuyên quý giá trong công việc cũng nhƣ cuộc sống.

Và sau cùng, bằng tình cảm chân thành tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới gia

đình và bạn bè, những ngƣời đã hết lòng ủng hộ và động viên tôi trong suốt thời

gian tôi học tập và công tác.

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015

Học viên cao học

ii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Nguyễn Thị Minh Thu

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................. v

DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... vi

DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... vii

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4

1.1. Tình hình ung thƣ ở Việt Nam và trên thế giới .................................................... 4

1.2. Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ ........................................................................ 5

1.3. Tổng quan về Interleukin-2 .................................................................................. 6

1.3.1. Cấu trúc của Interleukin-2 ................................................................................ 6

1.3.2. Cơ chế hoạt động và chức năng sinh học của Interleukin-2 ............................ 8

1.3.3. Vai trò của Interleukin-2 trong điều trị ung thư ............................................... 9

1.4. Hệ biểu hiện E. coli ............................................................................................ 12

1.4.1. Hệ biểu hiện E. coli BL21 ............................................................................... 13

1.4.2. Vector biểu hiện pET22b(+) ........................................................................... 14

1.4. Lên men sản xuất protein tái tổ hợp trên hệ thống lên men Bioreactor ............. 16

1.4. Tinh sạch protein bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................. 17

1.5. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dòng tế bào CTLL2 ......................... 19

1.6. Phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GMP .............................................................. 20

CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 22

2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 22

2.1.1. Chủng giống và plasmid.................................................................................. 22

2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................... 22

2.1.3. Máy móc và thiết bị ......................................................................................... 22

2.1.4. Các môi trường và dung dịch .......................................................................... 24

2.1.4.1. Môi trường sử dụng trong biểu hiện protein ............................................... 24

2.1.4.2. Dung dịch sử dụng trong tiền tinh chế protein Interleukin-2 ...................... 24

iii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.1.4.3. Dung dịch sử dụng trong chạy hệ thống sắc ký HPLC ................................ 24

2.1.4.4. Dung dịch sử dụng trong điện di SDS - PAGE ............................................ 24

2.1.4.5. Dung dịch sử dụng để hiện kết quả điện di SDS – PAGE ............................ 25

2.1.4.6. Dung dịch sử dụng trong phản ứng Western blot ........................................ 26

2.1.4.7. Dung dịch sử dụng trong phương pháp ELISA ............................................ 26

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 27

2.2.1. Biểu hiện protein Interleukin-2 tái tổ hợp trong tế bào E. coli ở các hệ thống

lên men 5 và 10 lít ..................................................................................................... 27

2.2.2. Phá tế bào E. coli và xử lý IL-2 thô (tiền tinh chế) ......................................... 27

2.2.3. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC .................................... 28

2.2.4. Xác định hoạt tính sinh học protein Interleukin-2 trên dòng tế bào CTLL2 .. 29

2.2.5. Kiểm tra tính đặc hiệu của protein bằng phương pháp Western blot............. 32

2.2.6. Kiểm tra độ sạch bằng phần mềm Quantity One ............................................ 33

2.2.7. Kiểm tra nội độc tố bằng LAL kit .................................................................... 33

2.2.8. Xác định hàm lượng protein trong mẫu tinh chế bằng phương pháp ELISA . 34

2.2.9. Điện di SDS-PAGE ......................................................................................... 35

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 37

3.1. Tối ƣu lên men chủng E. coli BL21 IL-2 trên quy mô nồi lên men 5 và 10 lít . 38

3.1.1. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ thống lên men 5 lít ....................... 38

3.1.2. Khảo sát thành phần dinh dưỡng và nồng độ chất cảm ứng .......................... 39

3.1.3. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 ở quy mô hệ thống lên men 10 lít đợt 1 ..... 42

3.1.4. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 ở hệ thống lên men 10 lít đợt 2 .................. 46

3.2. Xử lý tiền tinh chế thu hồi IL-2 từ sinh khối tế bào lên men ............................. 49

3.3. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ....................................... 50

3.4. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dòng tế bào CTLL2 ......................... 53

3.5. Xác định độ tinh sạch của protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế bằngphần mềm

Quantity One ............................................................................................................. 55

3.6. Xác định hàm lƣợng nội độc tố trong sản phẩm IL-2 sau tinh chế .................... 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 59

iv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ............................. 65

PHỤ LỤC .................................................................................................................. 66

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Amp APS Ampicillin Ammoniumpersulfate

AU Absorbance unit

BSA Bovine serum albumin (Albumin huyết thanhbò)

CSE Control standard endotoxin (Nội độc tốchuẩn)

CTL Cytoxic T lymphocyte (Tế bào gây độc)

dH2O Distilled water (nƣớc khử trùng)

DMSO Dimethylsulfoxide

DNA Deoxyribonucleicacid

dOT Dissolved oxygene tension

E. coli Escherichia coli

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay (Kĩ thuật chất hấp phụ

FBS miễn dịch gắnenzym) Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò)

HIV

IPTG Human Immunodeficiency Virus Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside

IL-2R Interleukin-2 Receptor (Thụ thể củaIL-2)

kDa KiloDalton

LAL Limulus AmebocyteLysate

MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium

PBS Phosphate bufferedsaline Bromide

PVDF

PMSF PolyvinylidineDifloride Phenylmethylsulfonyl fluoride

rhIL-2 Recombinant human Interleukin-2 (IL-2 ngƣời tái tổhợp)

SDS Sodium dodecylsulfate

SDS –PAGE Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gelelectrophoresis

TBS Tris buffersaline

TEMED N, N, N’, N’ – TetramethylEthylenediamin

TFA Trifluoroacetic acid

v Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

TMB Tetramethylbenzidine

TweenTris buffer saline

TTBS VABIOTECH Công ty TNHH Một thành viên Vắc xin và Sinh phẩm số 1 DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. 1: Tế bào NK tiêu diệt tế bào ung thƣ .............................................................. 6

Hình 1. 2: Cấu trúc không gian của Interleukin-2 ......................................................... 7

Hình 1. 3: Sự kích thích tăng sinh và biệt hóa của Interleukin-2 lên tế bào T [38] ...... 9

Hình 1. 4: Cơ chế hoạt động của Interleukin-2 ............................................................. 9

Hình 1. 5: Sự phát triển của tế bào ung thƣ biểu mô thận ........................................... 10

Hình 1. 6: Ung thƣ hắc tố ác tính ................................................................................ 11

Hình 1. 7: Sơ đồ cấu trúc vector pET22b+.................................................................. 15

Hình 1. 8: Cơ chế kiểm soát biểu hiện gene nhờ chất cảm ứng IPTG ........................ 16

Hình 1. 9: Lên men trên hệ thống Bioreactor tại phòng đạt tiêu chuẩn GMP ............ 17

Hình 1. 10: Hệ thống tinh sạch protein HPLC ............................................................ 18

Hình 3. 1: Sự biểu hiện protein IL-2 tái tổ hợp trong hệ thống lên men 5 lít ............. 38

Hình 3. 2: Khảo sát bổ sung thành phần chất dinh dƣỡng và nồng độ IPTG trong quá

trình lên men ................................................................................................................ 42

Hình 3. 3: Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng tái tổ hợp E. coli BL21-IL2 đợt 1 ..... 43

Hình 3. 4: Điện di Protein tổng số khi biểu hiện chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ

thống lên men 10 lít đợt 1............................................................................................ 45

Hình 3. 5: Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng tái tổ hợp E. coli BL21-IL2 đợt 2 ..... 47

Hình 3. 6: Điện di Protein tổng số khi biểu hiện chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ

thống lên men 10 lít đợt 2............................................................................................ 48

Hình 3. 7: Kiểm tra sản phẩm tiền tinh chế của 2 đợt lên men trong hệ thống 10 lít . 49

Hình 3. 8: Sắc ký đồ tinh chế IL-2 trên hệ thống HPLC ............................................. 51

Hình 3. 9: Kết quả kiểm tra protein IL-2 sau khi tinh sạch bằng hệ thống HPLC ...... 52

Hình 3. 10: Biểu đồ thể hiện sự kích thích tăng sinh tế bào CTLL-2 của các mẫu IL-2

tái tổ hợp ...................................................................................................................... 53

Hình 3. 11: So sánh hoạt tính sinh học riêng của các mẫu IL-2 ................................. 55

Hình 3. 12: Kiểm tra độ tinh sạch của protein IL-2 bằng Quantity One ..................... 56

vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3. 13: Kết quả độ tinh sạch của IL-2 xác định bằng phần mềm Quantity One .. 56

Hình 3. 14: Hình ảnh kết quả sau khi dừng phản ứng đông gel .................................. 57

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3. 1: Giá trị OD mẫu thu đƣợc sau quá trình lên men ........................................ 40

vii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bảng 3. 2: Giá trị EC50 và hoạt tính riêng của các mẫu IL-2 ..................................... 54

MỞ ĐẦU

Sức khỏe cộng đồng và ung thƣ là những vấn đề ngày càng đƣợc quan tâmở

hầu hết các quốc gia trên thế giới. Trong đó, ung thƣ là nguyên nhân chủ yếu gây tử

vong cho ngƣời bệnh và đang có xu hƣớng ngày càng gia tăng. Theo ghi nhận của

tổ chức Y tế Thế giới (năm 2012), trên thế giới có 14,1 triệu ca ung thƣ mớiđƣợc

phát hiện và 8,2 triệu ngƣời chết vì ung thƣ. Ƣớc tính tới năm 2030, mỗi năm sẽ có

thêm 25 triệu ca mới mắc bệnh. Tại Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế, trong

năm 2010 số ca mắc ung thƣ mới tăng lên tới 126.307, ƣớc tính đến năm 2020 số ca

mắc ung thƣ mới là 190.000 ca. Nguyên nhân chính gây ung thƣ là do môi trƣờng

bên ngoài cùng với chế độ sinh hoạt hằng ngày chiếm tới 90%.

Hiện nay các phƣơng pháp nhƣ phẫu thuật, hóa trị, xạ trị…vẫn là những

phƣơng pháp phổ biến nhất trong điều trị ung thƣ trên thế giới. Tuy nhiên, chúng

còn một số nhƣợc điểm nhƣ là có thể gây tổn thƣơng cho các tế bào lành, ảnh

hƣởng không tốt tới sức khỏe ngƣời bệnh. Ngoài các phƣơng pháp điều trị trên thì

liệu pháp miễn dịch là phƣơng pháp chữa trị hứa hẹn mang lại hiệu quả cao. Liệu

pháp này có thể tiêu diệt tế bào ung thƣ, khống chế khả năng phát triển nhanh chóng

của khối u và không làm tổn thƣơng các tế bào khỏe mạnh, tăng cƣờng khả năng

miễn dịch cho bệnh nhân, kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất lƣợng sống. Do đó,liệu

pháp miễn dịch đƣợc coi là liệu pháp xanh vì có hiệu quả điều trị rõ rệt, không có

tác dụng phụ, an toàn và dung nạp tốt, mở ra một hình thức điều trị hoàn toàn mới

cho bệnh nhân ung thƣ.

Liệu pháp miễn dịch sử dụng cytokine để kích hoạt hệ thống miễn dịch nhằm

nhận biết và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh.Interleukin-2 (IL-2) là một

cytokineđƣợc tiết bởi tế bào lympho T đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn

dịch của cơ thể. Cytokine này tham gia vào quá trình kích thích hệ thống miễn dịch

sản sinh ra các dòng tế bào T, đồng thời kích thích sự tăng sinh và biệt hóa các dòng

tế bào NK và các đại thực bào nhằm tăng cƣờng khả năng miễn dịch của cơ thể. IL-

2 đã đƣợc sử dụng điều trị hiệu quả hai loại ung thƣ biểu mô thận và ung thƣ da.

1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Ngoài ra, IL-2 còn đƣợc sử dụng hỗ trợ điều trị các bệnh ung thƣ khác nhƣ ung thƣ

phổi, ung thƣ bạch cầu, ung thƣ buồng trứng,… và có khả năng kích hoạt hệ thống

miễn dịch để chống bệnh nhiễm HIV.

Năm 1992, Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã cho

phép sử dụng IL-2 tái tổ hợp trong điều trị ung thƣ. Hiện nay, chế phẩm IL-2 với

tên thƣơng phẩm Proleukin® (Aldesleukin) đã đƣợc sản xuất bởi hãng Chiron và

thƣơng mại hóa trên toàn thế giới, tuy nhiên giá thành của Proleukin® còn khá cao

(khoảng 2,5 nghìn USD/ống 1,3 mg). Tại Việt Nam, việc sử dụng IL-2 tái tổ hợp

nói riêng và sản phẩm protein tái tổ hợp trong điều trị nói chung vẫn còn bị bỏ ngỏ

và chƣa có sản phẩm protein tái tổ hợp đƣợc triển khai áp dụng hoàn toàn từ quá

trình nghiên cứu đến quá trình sản xuất . Để chủ động việc sản xuất IL -2 tái tổ hợp

trong nƣớc và giảm giá thành sản xuất với chi phí thấp phục vụ cho việc điều trị

bệnh ung thƣ ta ̣i Viê ̣t Nam , việc nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất IL-2 tái

tổ hợp và chuyển giao sang công ty để sản xuất thử nghiệm là rất cần thiết.

Trong quá trình nghiên cứusản xuất IL-2 ngƣời tái tổ hợp, trình tự amino acid

của IL-2 đã đƣợc cải biến nhằm tạo ra đƣợc sản phẩm Interleukin-2 có trình tự

giống với sản phẩm Proleukin đã đƣợc FDA công nhận. Ngoài ra, việc cải biến trình

tự amino acid sẽlàm tăng hoạt tính và tăng tính an toàn cho sản phẩm. Sản phẩm

Proleukin còn có tên hóa học là desalanyl-1, serein-125 human interleukin-2 tƣơng

ứng đột biến mất alanine ở vị trí amino acid số 1, thay thế cysteine ở vị trí 125 bằng

serine. Để chuyển giao công nghệ sản xuất IL-2 tái tổ hợp từ quy mô phòng thí

nghiệm sang phòng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP, chúng tôi đã tiến hành tối ƣu biểu

hiện protein IL-2 trong hệ thống lên men 5 và 10 lít tại Viện Công nghệ sinh học và

công ty VABIOTECH. Sau đó, sản phẩm lên men đƣợc tiến hành tiền xử lý và tinh

chế bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sản phẩm Interleukin-2 sau tinh

chế đƣợc tiến hành xác định hoạt tính sinh học và kiểm tra một số chỉ tiêu về độ

sạch và độ an toàn, để đáp ứng yêu cầu của sản phẩm tái tổ hợp sử dụng trong điều

trị trên ngƣời với giá thành thấp hơn thƣơng phẩm Proleukin.

Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất

Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào Escherichia coli

2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trong điều kiện GMP”. Đề tài đƣợc thực hiện tại Công ty Vacxin và Sinh phẩm số

1, Bộ Y tế và phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm

3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình ung thƣ ở Việt Nam và trên thế giới

Ung thƣ đang là một căn bệnh hết sức nguy hiểm khiến số lƣợng ngƣời tử

vong cao nhất thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (World Health

Organization, WHO), trong năm 2008 có khoảng 12,7 triệu ca ung thƣ mới (trong

đó 6.672.000 nam giới, 5.779.000 nữ giới) và 7,6 triệu ngƣời đã tử vong do ung thƣ

(4.293.000 nam giới, 3.300.000 nữ giới)[31]. Đến năm 2012, có khoảng 14,1 triệu

ca ung thƣ mới (trong đó 7.410.000 nam giới, 6.658.000 nữ giới) và có 8,2 triệu

ngƣời tử vong (4.653.000 nam giới, 3.548.000 nữ giới) [13], số ngƣời mặc bệnh ung

thƣ tăng 11% so với 4 năm trƣớc. Ƣớc tính đến năm 2030 số ca mắc bệnh ung thƣ

trên thế giới tăng 70% tƣơng đƣơng với 25 triệu ca mới. Số liệu mới nhất theo

thống kê của Hiệp hội ung thƣ Hoa Kỳ (American Cancer Society) cho thấy số ca

ung thƣ mới tại Mỹ năm 2015 là 1.658.370 và có 589.430 ngƣời tử vong, số lƣợng

này đã giảm 0,43% so với năm 2014 số ca ung thƣ mới là 1.665.540 và số ngƣời tử

vong là 589.430 ngƣời.

Theo tổ chức nghiên cứu ung thƣ quốc tế (International Agency for Research

on Cancer) ƣớc tính trên tổng số ca ung thƣ toàn cầu, có khoảng hơn một nửa số ca

ung thƣ và hơn hai phần ba ca ung thƣ sẽ gia tăng và tập trung ở những nƣớc đang

phát triển. Những bệnh ung thƣ chủ yếu nhƣ: ung thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ tiền

liệt tuyến, ung thƣ buồng trứng, ung thƣ gan, ung thƣ máu, ung thƣ thận, ung thƣ

da,… Trong đó ung thƣ thận và ung thƣ da chiếm tỷ lệ khoảng 2 - 3% trên tổng số

ca ung thƣ [31].

Việt Nam là một trong những nƣớc đang phát triển, theo đó là sự thay đổi về

kinh tế, đời sống đƣợc nâng cao, các bệnh gây tử vong trƣớc đây nhƣ bệnh truyền

nhiễm và suy dinh dƣỡng đã giảm mạnh. Vấn đề không dừng lại ở đó, khi kinh tế

phát triển nhanh đồng nghĩa với nhiều vấn đề xảy ra nhƣ: ô nhiễm môi trƣờng, chất

lƣợng thức ăn, béo phì,… Dẫn đến việc gia tăng các bệnh tật nhƣ tiểu đƣờng, tim

mạch và đặc biệt là ung thƣ. Theo nhƣ TS. BS. Bùi Xuân Trƣờng, Bệnh viện Đa

4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

khoa Quốc tế VinMec cho biết, so với tỷ lệ chung trên thế giới thì Việt Nam thuộc

nhóm nƣớc có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất đối với: ung thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ dạ

dày, ung thƣ cổ tử cung, ung thƣ gan, ung thƣ đại-trực tràng [62]. Bên cạnh đó tỷ lệ

ung thƣ gan tại Việt nam cũng thuộc mức cao nhất thế giới, đặc biệt ở nam giới

[62]. Hầu hết các bệnh ung thƣ phổ biến thƣờng gặp tại Việt Nam đều chƣa có xu

hƣớng giảm xuống và vẫn đang tiếp tục tăng lên [62]. Ƣớc tính khoảng 85% số

bệnh nhân ung thƣ tại Việt Nam đƣợc phát hiện khi đã ở độ tuổi trên 40 [62]. Theo

số liệu thống kê của bệnh viện K-Hà Nội và Trung tâm U bƣớu Thành phố Hồ Chí

Minh, mỗi năm có 150.000 ngƣời mắc ung thƣ mớitrong đó có 75.000 ngƣời tử

vong và tại bệnh viện K, tỷ lệ bệnh nhân mắc ung thƣ hằng năm tăng thêm khoảng

20-30% (PGS. TS. Trần Văn Thuấn, Phó giám đốc bệnh viện K, Viện trƣởng Viện

nghiên cứu phòng chống ung thƣ) [63]. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới

năm 2008, dân số Việt Nam có khoảng 87 triệu ngƣời, số ca ung thƣ mới là 111.600

ngƣời (trong đó 55.000 nam giới, 56.500 nữ giới), có 82.000 ca tử vong (43.700

nam giới, 38.300 nữ giới) chiếm tới 73,5% tổng số bệnh nhân ung thƣ [14].Đặc biệt,

theo thống kê mới nhất của Bộ Y tế, trong hội thảo “Phối hợp đa ngành trong phòng

chống ung thƣ quốc gia” tổ chức ngày 8-12-2015, tại Hà Nội, trong năm 2010 số ca

mắc ung thƣ mới tăng lên tới 126.307 và ƣớc tính đến năm 2020 số ca mắc ung thƣ

mới là 190.000 ca [64]. Nhƣ vậy, việc tìm ra các phƣơng pháp phòng và điều trị ung

thƣ nhằm giảm thiểu số ca mắc bệnh ung thƣ và tỉ lệ tử vong là rất cấp bách.

1.2. Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ

Ung thƣ là một căn bệnh nguy hiểm và chiếm tỉ lệ tử vong rất cao, tuy nhiên

nó có thể đƣợc chữa khỏi hoàn toàn nếu phát hiện và điều trị sớm bằng các phƣơng

pháp khác nhau nhƣ: phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, liệu pháp miễn dịch và liệu pháp

gen. Các phƣơng pháp có thể đƣợc sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau để đem lại

hiệu quả điều trị tốt nhất với mục tiêu là chữa khỏi và giúp kiểm soát hoặc làm giảm

nhẹ ung thƣ.Việc chọn lựa phƣơng pháp điều trị phụ thuộc vào từng dạng ung thƣ,

vị trí khối u, giai đoạn của bệnh cũng nhƣ thể trạng của bệnh nhân.

Các phƣơng pháp điều trị truyền thống nhƣ phẫu thuật, xạ trị và hóa trị đều

nhằm mục đích loại bỏ các tế bào ung thƣ, phá hủy chúng bằng thuốc hoặc các tác

5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nhân khác. Tuy nhiên, việc điều trị bằng ba phƣơng pháp này thƣờng gây ra các tác

dụng phụ không mong muốn nhƣ làm tổn thƣơng các mô bình thƣờng và các bộ

phận khác của cơ thể ngƣời bệnh.

Nhiều năm gần đây, những nghiên cứu về hệ thống miễn dịch ngày càng phát

triển mạnh. Điều trị ung thƣ bằng liệu pháp miễn dịch là phƣơng pháp kích thích hệ

miễn dịch của cơ thể gia tăng số lƣợng các tế bào miễn dịch, đặc biệt là các đại thực

bào và tế bào giết tự nhiên (NK) nhằm tăng cƣờng khả năng tiêu diệt tế bào ung thƣ

và khống chế khả năng phát triển, di căn của khối u. So với các phƣơng pháp điều

trị ung thƣ truyền thống thì liệu pháp miễn dịch có rất nhiều ƣu điểm hơn nhƣ là: (i)

an toàn, không gây hại cho cơ thể, không tiêu diệt tế bào khỏe mạnh, không tác

dụng phụ, không biến chứng; (ii) tiêu diệt một cách tự nhiên các tế bào ung thƣ di

căn, giúp dự phòng ung thƣ, ngăn chặn sự hình thành khối u; (iii) giúp bệnh nhân

đang điều trị bằng các liệu pháp khác nhanh chóng hồi phục nhờ có hệ miễn dịch

khỏe mạnh [54]. Trong các loại ung thƣ đƣợc điều trị bằng liệu pháp miễn dịch, ung

thƣ hắc tố da và ung thƣ thận ác tính đã đƣợc điều trị có kết quả nhờ IL-2 [20].

Hình 1. 1: Tế bào NK tiêu diệt tế bào ung thƣ

1.3. Tổng quan về Interleukin-2

Interleukin-2 (IL-2) ngƣời là một cytokine quan trọng trong hệ thống miễn

dịch, đƣợc tiết ra chủ yếu từ tế bào lympho T. IL-2 đƣợc Morgan và cộng sự phát

hiện năm 1975 nhƣ là một nhân tố có tác dụng kích thích sự tăng sinh của tế bào T

[29]. Năm 1983, gene il-2 đƣợc xác định nằm trên nhiễm sắc thể số 4 ở ngƣời và

đƣợc nhân dòng lần đầu tiên [10], sau đó cấu trúc của nó đã đƣợc Taniguchi và

cộng sự làm sáng tỏ vào năm 1992 [39].

6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1.3.1. Cấu trúc của Interleukin-2

Interleukin-2 ngƣời là một glycoprotein có khối lƣợng phân tử khoảng 15 kDa.

Sản phẩm dịch mã ban đầu của IL-2 gồm 153 amino acid và phải trải qua quá trình

biến đổi để tạo protein trƣởng thành. Một đoạn peptide tín hiệu tiết đầu N của

protein IL-2 gồm 20 amino acid đã đƣợc cắt bỏ và tạo thành rhIL-2 hoàn chỉnh chứa

133 amino acid [11]. Cụ thể, cấu trúc không gian có 4 chuỗi α – helix đƣợc cuộn

theo cấu trúc điển hình của họ cytokine loại 1. Các chuỗi xoắn nối với nhau tạo

thành cấu trúc liên kết “up – up – down – down”. Trong đó hai chuỗi xoắn đầu (A,

B) đƣợc định hƣớng vị trí “up” (nhìn từ đầu N) và hai chuỗi xoắn sau (C, D) đƣợc

định hƣớng ở vị trí “down”. Đoạn nối giữa hai chuỗi xoắn A và B có chứa một chuỗi xoắn α nhỏ. Prolin ở vị trí 65 (Pro65) chia chuỗi xoắn B thành hai phần B và

B’. Chuỗi xoắn B nối với đoạn nối C – D bằng việc hình thành cầu nối disulfide giữa 2 amino acid Cys58 và Cys105 tạo cấu trúc ổn định cho IL-2 [16].

Hình 1. 2: Cấu trúc không gian của Interleukin-2

Năm 1987, nghiên cứu của Grace Ju và cộng sự cho thấy có 3 vùng trên phân

tử IL-2 có vai trò quyết định hoạt tính sinh học của protein này đó là: (i) vùng tận

cùng đầu N (các gốc amino acid 1-20), (ii) vùng tận cùng đầu C (các gốc amino acid 121 -133) và (iii) cầu disulfide giữa hai gốc Cys58 và Cys105. Nếu có đột biến

làm mất 20 amino acid ở đầu N và 10 amino acid ở đầu C có thể làm mất 99% hoạt

tính sinh học của IL-2 và khả năng liên kết của IL-2 với các thụ thể chúng [21].

Trình tự amino acid của IL-2 ngƣời tự nhiên có chứa 3 gốc Cystein tại các vị trí 58, 105, 125 trong đó hai gốc Cys58 và Cys105 tạo cầu disulfide. Việc hình thành chính

xác cầu disulfide này sẽ quyết định hoạt tính sinh học của IL-2 [24]. Sự thay đổi hoặc đột biến ở gốc Cys105 làm phá hủy cầu disulfide và làm giảm 8-10 lần hoạt tính 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

của IL-2, bên cạnh đó sự thay thế hoặc đột biến Cys58 làm hoạt tính của IL-2 giảm

mạnh tới 250 lần [24]. Tuy nhiên, đột biến mất gốc Cys tại vị trí 125 chỉ ảnh hƣởng

rất ít đến hoạt tính sinh học của IL-2 do nó không tham gia vào việc nhận diện thụ

thể của IL-2 và đặc biệt khi thay đổi gốc Cys tại vị trí đó thành Ser không làm ảnh

hƣởng tới hoạt tính sinh học của cytokine này [24]. Do vậy, để có thể ngăn cản sự tạo thành cầu disulfide không mong muốn giữa gốc Cys125 với hai gốc Cys58 hoặc Cys105 mà vẫn giữ nguyên hoạt tính của protein thì IL-2 dạng cải biến đƣợc biến đổi gốc Cys125 thành Ser125 [2]. Thêm vào đó, tại đầu N của protein IL-2 có điểm

glycosyl hóa đƣợc nhận biết bởi trình tự Ala – Pro – Thr ở 3 vị trí amino acid đầu

tiên. Trong tự nhiên IL-2 tồn tại ở trạng thái glycosyl hóa có tính thấm cao với

màng tế bào, nếu sử dụng IL-2 liều lƣợng lớn sẽ gây nên độc tính của protein này

trong cơ thể bệnh nhân [2]. Vì vậy IL-2 dạng thƣơng phẩm dùng làm thuốc tiêm sẽ

có các đột biến điểm làm mất điểm glycosyl hóa. Proleukin (Aldesleukin) là một

dạng IL-2 thƣơng phẩm đƣợc sản xuất bởi công ty Chiron Hoa Kỳ, và đã đƣợc FDA

công nhận có khả năng chữa ung thƣ hắc tố da và ung thƣ thƣ biểu mô thận ác tính

vào năm 1992. Sản phẩm thƣơng mại này có trình tự amino acid cải biến bằng cách

loại bỏ amino acid alanine ở đầu N và thay thế cysteine ở vị trí 125 bằng serine

[46]. Một nghiên cứu trƣớc đây cũng đã chứng minh sự thay đổi của 2 yếu tố trên

không làm thay đổi hoạt tính sinh học của protein IL-2 [32].

1.3.2. Cơ chế hoạt động và chức năng sinh học của Interleukin-2

Trong tự nhiên, IL-2 là một glycoprotein đóng vai trò quan trọng trong hệ

thống miễn dịch. IL-2 kích hoạt hệ miễn dịch nhận biết và loại bỏ các tế bào ung

thƣ, cụ thể IL-2 có khả năng hoạt hóa các tế bào bảo vệ đặc hiệu nhƣ tế bào T, tế

bào giết tự nhiên (natural killer-NK) và tế bào gây độc (Cytoxic T lymphocyte -

CTL), biệt hóa tế bào lympho giết tự nhiên (Lymphokine activated killer-LAK

cells). Nhiều nghiên cứu về IL-2 trên thế giới tập trung vào chức năng quan trọng

của IL-2 trong hệ miễn dịch cho thấy IL-2 chủ yếu đƣợc sinh ra từ tế bào T CD4+

(tế bào trợ giúp T helper TH), tế bào T CD8+ và tế bào T giết tự nhiên (Natural

killer T-NKT cells), ở một số điều kiện đặc biệt, lƣợng nhỏ IL-2 cũng có thể đƣợc

8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tạo ra từ các tế bào dendritic hoạt hóa (activated dendritic cells) [6]. Tế bào T hoạt

hóa biểu hiện các thụ thể ở bề mặt của tế bào cùng với sự tiết IL-2, sau đó IL-2 bám

vào thụ thể trên tế bào và kích thích sự phân chia tế bào. Khi tế bào T không còn

đƣợc kích thích bởi IL-2 thì các thụ thể sẽ phân rã và quá trình tăng sinh kết thúc

[44].

Hình 1. 3: Sự kích thích tăng sinh và biệt hóa của Interleukin-2 lên tế bào T [44]

Nhờ có sự kích thích tăng sinh các tế bào có khả năng diệt khối u của IL-2, khi

cơ thể xuất hiện tế bào bất thƣờng, lƣợng lớn tế bào NKT đã hoạt hóa để tấn công

và tiêm những chất làm phân hủy tế bào đích. Cho dù nhỏ hơn tế bào ung thƣ hay

thể virus, tế bào NKT thƣờng có thể tiêu diệt cùng lúc 2 hoặc nhiều tế bào ung thƣ.

Ngoài ra IL- 2 còn kích thích tăng sinh một số tế bào khác nhƣ tế bào T gây độc

CTL, NK và LAK,… Các tế bào này tấn công và phá hủy các mầm bệnh, bao gồm

cả ung thƣ [42].

Hình 1. 4: Cơ chế hoạt động của Interleukin-2

9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1.3.3. Vai trò của Interleukin-2 trong điều trị ung thư

Interleukin-2 đóng vai trò rất quan trọng trong việc hỗ trợ và điều trị các bệnh

ung thƣ. Cho đến nay, IL-2 đã đƣợc công nhận là có hiệu quả trong việc điều trị các

bệnh ung thƣ nhƣ: ung thƣ bạch cầu, ung thƣ phổi, ung thƣ buồng trứng, ung thƣ

vú,... đặc biệt là ung thƣ hắc tố ác tính (Malignant melanoma) và ung thƣ biểu mô

thận (Renal cell carcinoma, RCC) [41]. Bên cạnh đó, IL-2 đã đƣợc chứng minh khi

sử dụng với liều lƣợng thấp có khả năng ngăn ngừa chứng rối loạn tăng sinh các tế

bào lympho [7]. Năm 1992, IL-2 đã chính thức đƣợc FDA cho phép sử dụng trong

điều trị hai loại ung thƣ biểu mô thận và u hắc tố ác tính [35].

Ung thƣ biểu mô tế bào thận là một dạng ung thƣ niêm mạc “ống lƣợn gần”

trong thận [47]. RCC chiếm khoảng 90 – 95% các trƣờng hợp ung thƣ thận, bệnh

thƣờng xuất hiện nhiều nhất trong độ tuổi 50 – 70 và điển hình là nam giới [23].

Nguyên nhân của ung thƣ thận là do đột biến gen, sử dụng thuốc lá, béo phì, sự phơi

nhiễm trong nghề nghiệp, tia xạ,… Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, mỗi

năm ở Mỹ có khoảng 31.200 trƣờng hợp ung thƣ thận đƣợc phát hiện, trong đó

11.900 trƣờng hợp tử vong (năm 2006). Mặc dù ở Việt Nam chƣa có số liệu thống

kê đầy đủ nhƣng ung thƣ thận đƣợc xếp hàng thứ 3 trong các loại ung thƣ của hệ

tiết niệu[55]. Nó có thể di căn trực tiếp sang mô mỡ quanh thận hay dây chằng bao

quanh thận, di căn sang các cơ quan khác qua máu hay mạch bạch huyết đến phổi,

xƣơng hoặc não.

Hình 1. 5: Sự phát triển của tế bào ung thƣ biểu mô thận [56]

Ung thƣ thận không phải là một bệnh không thể điều trị, tuy nhiên nếu không

đƣợc phát hiện và chẩn đoán sớm bệnh sẽ để lại những hậu quả nghiêm trọng. Từ

năm 1994, nghiên cứu của Rosenberg đã sử dụng Interleukin-2 liều cao (High-Dose

10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Interleukin-2, HD IL-2) truyền tĩnh mạch (mỗi liều 720.000 IU/kg, các liều tiêm

cách nhau 8 giờ) trong điều trị ung thƣ biểu mô thận trên 283 bệnh nhân. Trong đó,

một liệu trình gồm tối đa 15 liều, kết thúc liệu trình nếu bệnh nhân đáp ứng đƣợc sẽ

tiếp tục đƣợc điều trị liệu trình thứ hai, kết quả cho thấy 7% bệnh nhân đáp ứng

hoàn toàn với IL-2 và tế bào ung thƣ đƣợc kiểm soát và biến mất toàn bộ, 13% số

bệnh nhân có đáp ứng một phần, 76% trong số các bệnh nhân có đáp ứng hết ung

thƣ với thời gian trên 7 năm [34]. Hiện nay, liệu pháp điều trị ung thƣ thận bằng IL-

2 vẫn đƣợc áp dụng rộng rãi trên thế giới.

Ung thƣ hắc tố ác tính là một loại ung thƣ da xảy ra khi các tế bào da đặc biệt

đƣợc gọi là melanocytes (tế bào biểu bì tạo hắc tố) bị thƣơng tổn do các yếu tố nhƣ

mẫn cảm với ánh nắng mặt trời, cháy nắng, từ các vết bỏng rộp, từ các nốt dị

thƣờng trên cơ thể hoặc do tiền sử gia đình [48][49]. Nếu các thƣơng tổn này không

đƣợc loại bỏ sớm, các tế bào này sẽ phát triển trên bề mặt da và lan sang các mô

khỏe (di căn), lúc này việc điều trị sẽ trở nên khó khăn hơn.

Hình 1. 6: Ung thƣ hắc tố ác tính [66]

Ở Việt Nam, tỷ lệ ngƣời mắc ung thƣ da rất thấp, tuy nhiên trên thế giới tỷ lệ

này là không nhỏ. Trong đó, New Zealand là nƣớc có tỷ lệ ung thƣ da cao nhất và là

loại ung thƣ phổ biến thứ 4 ở Australia [50]. Năm 2010, Viện ung thƣ Quốc gia đã

thống kê ở Mỹ có 68.130 ca mắc ung thƣ mới và có 8.700 ngƣời tử vong vì ung thƣ

này; ở Anh, mỗi năm có khoảng 10.000 ngƣời phát hiện mắc ung thƣ da và có 2.000

ngƣời tử vong. Mặc dù, tỷ lệ số ngƣời mắc ung thƣ da là không cao, nhƣng nó lại là

bệnh ung thƣ có tỷ lệ tử vong rất cao tới 79% [57]. Vì vậy, việc tìm ra một loại

11 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thuốc và liệu pháp điều trị phù hợp là vô cùng cần thiết.

Với hầu hết các loại ung thƣ nếu đƣợc phát hiện kịp thời thì dễ dàng đƣợc loại

bỏ bằng phẫu thuật, xạ trị và hóa trị. Đối với u hắc tố, cắt bỏ khối u là lựa chọn tốt

nhất, sau khi phẫu thuật bệnh nhân đƣợc chỉ định dùng các chất hỗ trợ điều trị nhƣ

interferon-α, Interleukin-2 nhằm ngăn ngừa hiện tƣợng di căn. Đối với ung thƣ da

ác tính nếu bệnh nhân có đáp ứng với IL-2 thì bệnh nhân kéo dài thời gian sống ít

nhất 10 tháng, trong đó tỷ lệ sống trên 5 năm là hơn 10% [22]. Tuy nhiên, với ung

thƣ da ở giai đoạn cuối thì việc điều trị là vô cùng khó khăn. Theo trung tâm kiểm

soát và phòng chống dịch bệnh (Centers for Disease Control and Prevention, CDC),

tại Mỹ, ung thƣ hắc tố ác tính là bệnh nguy hiểm đứng thứ 3 trong số các bệnh ung

thƣ di căn đến não. Nghiên cứu gần đây của Melinda B. Chu đã sử dụng HD IL-2

điều trị các bệnh nhân ung thƣ và theo dõi tại Đại học Saint Louis. Trong quá trình

điều trị, bệnh nhân đƣợc truyền IL-2 để kích thích hệ thống miễn dịch nhận diện và

tiêu diệt tế bào ung thƣ. Các bệnh nhân đƣợc điều trị từ 2 đến 4 liệu trình là tối đa,

mỗi liệu trình gồm có 14 liều HD IL-2. Kết quả cho thấy không có trƣờng hợp nào

tử vong khi điều trị, tỷ lệ sống trung bình của các bệnh nhận bị di căn não là khoảng

4 tháng và của bệnh nhân chƣa di căn là 8,7 tháng. Những phát hiện của nghiên cứu

mở ra một lựa chọn điều trị mới, sử dụng HD IL-2 cho những bệnh nhân ung thƣ

hắc tố di căn não [8].

Ngoài hai ứng dụng chính của IL-2 trong điều trị ung thƣ thận và u hắc tố da,

nhờ khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch, IL-2 còn đƣợc nghiên cứu để chống

bệnh HIV. Kết quả ban đầu cho thấy đây là dƣợc phẩm an toàn và có hiệu quả khi

phối hợp với các liệu pháp khác trong điều trị chống HIV. Cơ chế của IL-2 trong

điều trị bệnh nhân nhiễm HIV có thể theo hai hƣớng: (i) giúp bảo vệ hệ miễn dịch

khỏi sự tấn công của virus HIV, (ii) giúp cho hệ miễn dịch ức chế sự nhân lên của

HIV. Bên cạnh đó, IL-2 còn giúp tăng sinh dòng tế bào CD4+ không bị nhiễm HIV,

kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân [40].

1.4. Hệ biểu hiện E. coli

E. coli là một hệ biểu hiện lý tƣởng, dễ thao tác, có thể sản xuất dạng protein

tái tổ hợp từ nhiều nguồn gốc khác nhau đồng thời có khả năng thu nhận các vector

12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bản chất là plasmid. Vi khuẩn E. coliđáp ứng đƣợc hầu hết các yêu cầu của một hệ

biểu hiện, thực tế trên thế giới rất nhiều phòng thí nghiệm sử dụng vi khuẩn E. coli

làm tế bào chủ để biểu hiện protein tái tổ hợp.

E. coli là vi khuẩn gram âm, mỗi tế bào chỉ tồn tại một nhiễm sắc thể duy nhất hay còn gọi là nucleoid. Kích thƣớc genome của E. coli khoảng 4,6 x 106 base pairs.

Hệ biểu hiện vi khuẩn là sự lựa chọn hàng đầu để sản xuất các protein tái tổ hợp. Lý

do là chi phí để biểu hiện protein bằng hệ vi khuẩn thƣờng khá rẻ. Đặc biệt là với hệ

biểu hiện E. coli, đây là hệ biểu hiện phổ biến nhất để sản xuất protein tái tổ hợp do

có thời gian sinh trƣởng nhanh, có khả năng duy trì lên men và tạo sinh khối lớn

bằng việc cung cấp thêm dinh dƣỡng vào những thời điểm nhất định. Nguyên liệu

sử dụng để nuôi E. coli rẻ tiền và có hiệu suất biểu hiện cao[45]. Quá trình biểu hiện

gene (bao gồm phiên mã và dịch mã) luôn tạo ra phân tử mRNA và proteinnhanh

chóng. Toàn bộ trình tự của vi khuẩn này đã đƣợc giải mã bằng máy giải trình tự thế

hệ[37]. Hầu hết các phòng thí nghiệm đều sử dụng, với nhiều chủng khác nhau

dùng cho các mục đích riêng biệt, nhƣ tách dòng (E. coli DH10B, Coli DH5α,…) và

chủng biểu hiện ( E. coli BL21 DE3, E. coli rossetta, …).

Hạn chế lớn nhất của hệ biểu hiện E. coli chính là việc thiếu các quá trình cải

biến sau dịch mã nhƣ quá trình glycosyl hóa, phosphoryl hóa,… do đó các protein

tái tổ hợp có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn không cuộn xoắn đúng cấu trúc,

protein tái tổ hợp thƣờng tạo thành dạng không tan inclusion body, theo đó là hoạt

tính sinh học cũng bị giảm đi đáng kể. Tuy nhiên, đã có nhiều giải pháp để khắc

phục những những nhƣợc điểm trên [15][18], do vậy cùng với những ƣu điểm vƣợt

trội E.coli vẫn là một trong những chủng biểu hiện rộng rãi nhất trong công nghệ

DNA tái tổ hợp.

1.4.1. Hệ biểu hiện E. coli BL21

E. coliBL21 là chủng thƣơng mại đƣợc sử dụng nhiều làm vật chủ biểu hiện.

Hệ gene của chủng E. coliBL21 đã đƣợc cải biến một số gene là ompT, hsdS, gal,

dcm,λDE3. Ý nghĩa của việc đột biến các gene đó nhƣ sau:

- Gene ompT: là một gene mã cho protease nằm trên màng ngoài tế bào,

chủng khuyết gene ompT giúp tránh việc các protein tái tổ hợp bị phá hủy

13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ngay trong tế bào [17].

- Gene hsdS: là một gene có chức năng phân giải plasmid ngoại lai xâm nhập

tế bào chủ [26], chủng BL21 khuyết hsdS để quá trình biến nạp vector tái tổ

hợp đƣợc hiệu quả hơn.

- Gene gal: chủng BL21 (DE3) khuyết gene gal giúp tránh việc tế bào sử

dụng galactose làm nguồn carbon cho sinh trƣởng [36].

- Gen dcm: là gene methyl hóa trình tự (CCAGG và CCTGG), chủng khuyết

gene dcm tránh việc trình tự gene ngoại lai bị methyl hóa dẫn đến sai khác

trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp [5].

- T7 RNA Polymerase (λDE3 và lacUV5): BL21 (DE3) có hệ promoter

lacUV5 dùng để điều khiển quá trình biểu hiện, đây là một promoter đãđƣợc

đột biến và đƣợc tạo ra từ phage λ, promoter này mạnh hơn bất kỳ promoter

của hệ biểu hiện vi khuẩn tự nhiên nào[27].

Ngoài ra, chủng E. coli BL21 (DE3) còn một dạng thƣơng mại nữa là dạng có

tích hợp thêm plasmis pLysS, plasmid này mang gene mã cho T7 lysozyme làm

một loại protein có 2 chức năng: (i) phân giải thành tế bào vi khuẩn, (ii) là khóa sự

hoạt động của T7 RNA polymerase, sự có mặt của protein này giúp quá trình biểu

hiện nhờ promoter T7 (hay còn gọi là promoter lacUV5) không đƣợc kích hoạt cho

đến khi cảm ứng IPTG, lúc đó số lƣợng T7 RNA Polymerase tăng nhanh chóng,

vƣợt quá khả năng ức chế của T7lysozyme.

1.4.2. Vector biểu hiện pET22b(+)

Để biểu hiện gene trong E. coli BL21 vector đƣợc sử dụng có thể là các

plasmid, phage, cosmid. Vector là một plasmid đƣợc thiết kế nhằm mục đích giúp

sản xuất lƣợng lớn protein khi đƣợc kích thích bằng chất cảm ứng (lactose hoặc

IPTG). Cấu trúc của vector pET22b(+) đƣợc biểu thị trên Hình 1. 8. Plasmid này

chứa một vài yếu tố quan trọng nhƣ gene lacI mã hóa cho protein ức chế biểu hiện

gene ngoại lai, promoter T7 đặc hiệu với RNA polymerase, operator, vị trí đa điểm

cắt multicloning site, điểm khởi đầu tái bản f1, gene chọn lọc (gene kháng kháng

14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

sinh ampicillin).

Hình 1. 7: Sơ đồ cấu trúc vector pET22b+

Gene của protein tái tổ hợp cần sản xuất đƣợc chèn vào vị trí đa điểm cắt

trong vector. Promoter T7 và lac operator đều nằm ở đầu 5’ của gene. Bình thƣờng

T7 RNA polymerase bị ức chế bởi sự kiểm soát của sản phẩm gene lacI là lac

repressor, khi có mặt chất cảm ứng IPTG, chất này sẽ làm thay đổi cấu trúc của lac

repressor và T7 RNA polymerase đƣợc tạo thành từ genome của chủng E. coli

DE3, nhờ đó gene ngoại lai đƣợc phiên mã và dịch mã để tổng hợp protein. Cơ chế

kiểm soát biểu hiện gene bằng chất cảm ứng IPTG đƣợc thể hiện ở sơ đồ Hình

1.8.Trong vector pET22b+ còn có trình tự tiết pelB giúp protein ngoại lai tiết ra

khoang chu chất. Sau khi đi vào khoang chu chất thì đoạn peptide tín hiệu này sẽ bị

15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

cắt bởi một protease xác định.

Hình 1. 8: Cơ chế kiểm soát biểu hiện gene nhờ chất cảm ứng IPTG

1.4. Lên men sản xuất protein tái tổ hợp trên hệ thống lên men Bioreactor

Việc sản xuất protein bằng con đƣờng tái tổ hợp ngày càng phát triển mạnh

đối với rất nhiều protein khác nhau, trong đó có IL-2. Chủng vi sinh vật chủ đƣợc

lựa chọn phụ thuộc vào mỗi loại protein và mục đích nghiên cứu, có rất nhiều chủng

vi sinh vật đƣợc lựa chọn cho sản xuất protein tái tổ hợp nhƣ E. coli, nấm men

Pichia pastoris, Saccharomyces, Bacilus subtilis, tế bào động vật,...Trong đó, chủng

E. coli là chủng đƣợc lựa chọn rộng rãi vì rất nhiều ƣu điểm nhƣ: sinh trƣởng nhanh

trong môi trƣờng nuôi cấy đơn giản và rẻ tiền, cho sinh khối cao,... Tuy nhiên, với

bất kỳ một chủng nuôi cấy nào, để tạo đƣợc sản phẩm protein mong muốn với hiệu

suất cao cần phải có quá trình tối ƣu điều kiện nuôi cấy trƣớc khi đƣa vào sản xuất

thử nghiệm ở quy mô lớn. Trong quá trình lên men, có rất nhiều yếu tố quyết định

đến hiệu suất lên men và chất lƣợng sản phẩm lên men nhƣ: môi trƣờng dinh

dƣỡng, lƣợng oxy hòa tan trong môi trƣờng, nhiệt độ và pH trong quá trình nuôi

cấy, thời gian nuôi cấy,... [25]. Vì vậy, để tối ƣu đƣợc các điều kiện chuẩn trên cần

có một hệ thống lên men trong đó các thông số và diễn biến của quá trình lên men

16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đƣợc kiểm soát chặt chẽ.

Hình 1. 9: Lên men trên hệ thống Bioreactor tại phòng đạt tiêu chuẩn GMP

Hệ thống lên men bioreactor đƣợc sử dụng để tiến hành một quá trình hóa sinh

học mà trong đó các vi sinh vật hoặc các tế bào và mô động thực vật có thể phát

triển và sinh trƣởng nhờ sử dụng các nguyên vật liệu thô trong môi trƣờng, đồng

thời tạo ra các sản phẩm trao đổi chất. Với hệ thống lên men này chúng ta hoàn toàn

có thể dễ dàng theo dõi và điều chỉnh mọi diễn biến của quá trình lên men nhƣ:

nhiệt độ, pH, lƣợng oxy hòa tan, tốc độ khuấy, lƣợng khí sục vào môi trƣờng,... đều

đƣợc kiểm soát chặt chẽ qua hệ thống máy tính, từ đó giúp tăng hiệu quả của quá

trình lên men. Bên cạnh đó, hệ thống bioreactor rất đa dạng cho các quy mô khác

nhau tùy vào mục đích lên men từ 5 lít, 10 lít, 30 lít và 100 lít.

1.4. Tinh sạch protein bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography, HPLC), ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ

phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phƣơng pháp phân tách trong đó pha

động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới

dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang

đã đƣợc cải biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ [30]. HPLC là

một phƣơng pháp tách và phân tích các hợp chất đƣợc sử dụng rộng rãi và phổ biến

nhất hiện nay vì nhiều lí do nhƣ: (i) độ nhạy cao, (ii) khả năng định lƣợng tốt, (iii)

17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thích hợp cho việc tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, (iv)

phạm vi ứng dụng trải rộng trong nhiều lĩnh vực từ nghiên cứu khoa học trong các

phòng thí nghiệm đến công nghiệp và một số lĩnh vực khác.

Hình 1. 10: Hệ thống tinh sạch protein HPLC

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, ngƣời ta chia

HPLC thành nhiều loại. Trong đó, sắc ký phân bố đƣợc ứng dụng nhiều nhất nhờ

vào ƣu điểm có thể phân tích hợp chất ion có khối lƣợng phân tử không quá lớn và

có phổ phân cực rộng (từ hợp chất không phân cực đến những hợp chất phân cực rất

cao). Sắc ký phân bố đƣợc chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tƣơng đối giữa

pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thƣờng (normal phase chromatography) và sắc ký

pha đảo (reversed phase chromatography). Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của

hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tƣơng ứng với tính chất của chúng

(tính bị hấp phụ, tính tan,…). Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động

mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với

pha động và pha tĩnh. Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha

tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ

quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống

sắc ký so với các chất tƣơng tác yếu hơn pha này. Nhờ đặc điểm này mà ngƣời ta có

18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thể tách các chất qua quá trình sắc ký [30].

Trong sắc ký pha thƣờng, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động.

Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực. Sắc ký pha thƣờng dùng để

tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lƣợng không quá lớn.

Sắc ký pha đảo là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân

cực hơn pha động. Phƣơng pháp này dùng để phân tách các hợp chất từ không phân

cực đến phân cực. Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất

thích hợp cho phân tích bằng sắc ký pha đảo. Dung môi sử dụng trong sắc ký pha

đảo là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nƣớc đóng vai trò quan trọng và

giá thành rẻ. Do đó, sắc ký pha đảo đƣợc ứng dụng nhiều và phổ biến hơn sắc ký

pha thƣờng. Nguyên lý của sắc ký pha đảo là protein sẽ gắn vào pha tĩnh theo tƣơng

tác kỵ nƣớc ở các mức độ khác nhau, khi thực hiện tách rửa, gradient nồng độ

isopropanol đƣợc sử dụng tăng dần và gradient nồng độ nƣớc giảm dần dẫn đến sự

tăng dần của tính kỵ nƣớc trong pha động, các protein bám trong pha tĩnh lần lƣợt

đƣợc loại ra ngoài.

1.5. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dòng tế bào CTLL2

Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào động vật đã đƣợc thực hiện từ những năm đầu

của thế kỷ 19 và trở thành các kỹ thuật thông dụng trong phòng thí nghiệm cho các

nghiên cứu khoa học. Công nghệ tế bào động vật có rất nhiều ứng dụng có ý nghĩa

khoa học và thực tiễn. Một trong những ứng dụng quan trọng của nó là trong nghiên

cứu ung thƣ học, các tế bào động vật nuôi cấy in vitro, đặc biệt là các dòng tế bào

ung thƣ là mô hình hiệu quả cho các thử nghiệm sinh học (bioassay) nhằm tìm kiếm

hoạt chất phòng chống và chữa trị ung thƣ [4][3]. Hiện nay có rất nhiều dòng tế bào,

mỗi dòng đƣợc sử dụng cho các phép thử sinh học khác nhau. Dòng tế bào CTLL2

là một dòng tế bào T của chuột, sinh trƣởng phụ thuộc hoàn toàn vào interleukin-2

[58]. Vì vậy, dòng tế bào này thƣờng đƣợc sử dụng để đánh giá hoạt tính sinh học

của interleukin-2 [3]. CTLL2 là dòng tế bào phụ thuộc hoàn toàn vào IL-2, khi môi

trƣờng nuôi cấy dòng tế bào CTLL2 không đƣợc bổ sung IL-2 thì tế bào sẽ chết

trong khoảng 24-48 giờ. Khi đƣợc bổ sung IL-2 vào môi trƣờng nuôi cấy dòng tế

bào CTLL2 thì tùy thuộc vào hoạt tính của IL-2 mà tế bào CTLL2 sẽ duy trì sự

19 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

sống và đƣợc kích hoạt để phát triển và sinh sản. Hoạt tính của IL-2 càng mạnh thì

khả năng hoạt hóa sự phát triển và sinh sản của tế bào CTLL2 càng cao. Dựa vào

đặc tính này, chúng tôi đã lựa chọn dòng tế bào CTLL-2 để xác định hoạt tính sinh

học của protein tái tổ hợp IL-2 sau khi tinh sạch [19]. Sự hoạt động của IL-2 đƣợc

xác định bằng cách đo tổng số thimidine từ ADN tổng hợp của các tế bào CTLL2

tăng sinh. Các tế bào tăng sinh đƣợc xác định bằng cách sử dụng phƣơng pháp MTT

assay [19].

1.6. Phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GMP

Tiêu chuẩn thực hành sản xuất tốt (Good Manufacturing Practice, GMP) áp

dụng để quản lý sản xuất trong các ngành: dƣợc phẩm, mỹ phẩm, thiết bị y tế, thực

phẩm,... là một phần của hệ thống quản lý chất lƣợng nhằm đảm bảo kiểm soát các

điều kiện về nhà xƣởng (cơ sở hạ tầng), điều kiện con ngƣời và kiểm soát các quá

trình sản xuất để đạt những tiêu chuẩn về an toàn vệ sinh cung cấp cho ngƣời tiêu

dùng loại bỏ những nguy cơ nhiễm chéo và lẫn lộn, mang lại phƣơng thức quản lý

chất lƣợng khoa học, hệ thống và đầy đủ, giảm các sự cố, rủi ro trong sản xuất, kinh

doanh [59] [60]. Bắt nguồn từ năm 1933, Luật Thực phẩm Dƣợc phẩm và Mỹ phẩm

của Hoa Kỳ đƣa ra yêu cầu thực hiện GMP trong quá trình sản xuất các sản phẩm

Dƣợc phẩm và Mỹ phẩm [59]. Các yêu cầu của GMP luôn đƣợc cập nhập và mở

rộng phạm vi trên nhiều lĩnh vực khác [59] [61]. Tại Việt Nam, từ năm 1997 đến

nay, đã triển khai áp dụng yêu cầu GMP trên các lĩnh vực: thực phẩm, dƣợc phẩm,

thuốc thú y, thuốc đông y.... [61]. Các tiêu chuẩn thực hành tốt sản xuất sinh phẩm

đƣợc áp dụng cho các quy trình sản xuất sau: (i) nuôi cấy các chủng vi sinh vật và tế

bào có nhân, (ii) chiết xuất hoạt chất từ mô ngƣời, động vật và mô thực vật, (iii) kỹ

thuật DNA tái tổ hợp, (iv) kỹ thuật lai tạo, (v) nhân giống vi sinh vật trong phôi

hoặc động vật. Các sinh phẩm đƣợc tạo ra từ những phƣơng pháp trên gồm có

kháng nguyên, vắc xin, hormone, cytokine, enzyme,... Các tiêu chuẩn để thực hành

tốt sản xuất sinh phẩm nhƣ: tiêu chuẩn về nhân sự, nhà xƣởng và thiết bị, khu chăn

nuôi và chăm sóc động vật, sản xuất, ghi nhãn, hồ sơ lô và hồ sơ phân phối sản

phẩm, đảm bảo chất lƣợng và kiểm tra chất lƣợng đƣợc trình bày chi tiết ở phần phụ

20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

lục II.

Công ty TNHH Một thành viên Vắc xin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) là

một doanh nghiệp nhà nƣớc trực thuộc Bộ Y tế - Việt Nam đƣợc thành lập từ năm

2000. VABIOTECH là một trong những công ty hàng đầu trong lĩnh vực nghiên

cứu, sản xuất và kinh doanh vắc xin, sinh phẩm dùng cho ngƣời ở Việt Nam với cơ

sở vật chất sản xuất đạt các tiêu chuẩn WHO-GMP; hệ thống quản lý chất lƣợng

ISO 9001 – 2008. Hiện tại, VABIOTECH sản xuất và kinh doanh 4 sản phẩm chính

là vắc xin viêm gan A, vắc xin viêm gan B, vắc xin viêm não Nhật Bản và vắc xin

Tả uống đƣợc sử dụng trong Chƣơng trình Tiêm chủng mở rộng Quốc gia - Việt

Nam, thị trƣờng nội địa và xuất khẩu. Do vậy, việc nghiên cứu sản xuất IL-2 ngƣời

tái tổ hợp tại phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GMP của công ty VABIOTECH là

21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hoàn toàn đƣợc tin tƣởng sẽ tạo ra sản phẩm an toàn.

CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Chủng giống và plasmid

Chủng biểu hiện E. coli BL21 (DE3) của hãng Invitrogen.

Vector biểu hiện pET22-il2 desAla: là vector biểu hiện mang gen il2 cải biến,

gen il2 đƣợc biểu hiện thành công trong vector pET22b(+) (của hãng Novagen) tại

Phòng kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học.

Dòng tế bào CTLL2 dùng để xác định hoạt tính sinh học của IL-2 của hãng

ATCC (Mỹ).

2.1.2. Hóa chất

Sodium Chloride, Bacto Trypton, Iso-propanol, Citric acid, 2-

Mecaptoethanol, Cao nấm men, Sucrose, Glucose, Ethanol, Mannitol, Sodium

acetate, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, PEG-400, Glycerol, Formaldehyde,

nHexan, Acetic acid, Guanidine chloride, Aceton nitrile, TFA, Triton-X100,

BisAcrylamide, nội độc tố chuẩn (CSE), PMSF, MTT, FBS, DMSO và các hóa chất

khác thƣờng dùng trong sinh học phân tử và trong nuôi cấy tế bào động vật của các

hãng tin cậy nhƣ Bio-Rad (Mỹ), Merck (Đức), Prolabo (Pháp), Lifetechnology

(Mỹ), Sigma (Mỹ).

2.1.3. Máy móc và thiết bị

Hệ thống nồi lên men (Bioflo 115 và Marubishi), hệ thống HPLC (Shimadzu),

máy lắc (IKA®KS 260 basic), máy siêu âm (Microson™), máy ly tâm nhỏ (Sorvall

Biofuge Fresco), máy ly tâm lớn (Sorvall Legened RT), máy điện di protein, máy

chuyển màng, máy nanodrop, máy đo quang phổ spectrophometer, kit xác định hàm

lƣợng pyrogen LAL-test, bể ổn nhiệt và các máy khác thƣờng dùng trong phòng thí

22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nghiệm sinh học phân tử thuộc các hãng nổi tiếng nhƣ Bio-Rad, New Jersey (Mỹ),

23 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Shimadzu (Nhật).

2.1.4. Các môi trường và dung dịch

2.1.4.1. Môi trường sử dụng trong biểu hiện protein

Tên Thành phần

Môi trƣờng LB Cao nấm men (0,5%), Bacto trypton (1%), NaCl (1%)

Môi trƣờng LBA Thành phần nhƣ môi trƣờng LB, sau đó bổ sung

Ampicillin đến nồng độ cuối cùng là 100 μg/ml

Môi trƣờng bổ sung Glucose 40%, Cao nấm men 20%

2.1.4.2. Dung dịch sử dụng trong tiền tinh chế protein Interleukin-2

Tên Thành phần

Đệm I (Buffer I) Tris 20 mM, EDTA 10 mM, PMSF 0,05 mM

Đệm II (Buffer II) Buffer I + TritonX100 0,1%

Đệm III (Buffer III) Sucrose 60%

Đệm IV (Buffer IV) Tris 50 mM, EDTA 10 mM, Guanidine HCl 7 M

2.1.4.3. Dung dịch sử dụng trong chạy hệ thống sắc ký HPLC

Tên Thành phần

Đệm A (Buffer A) 0,5% Acid citric

Đệm B (Buffer B) 0,5% Acid citric, 60% Iso-propanol

2.1.4.4. Dung dịch sử dụng trong điện di SDS - PAGE

Các loại hóa chất cần thiết cho đổ gel: Bis-acrylamide 30%, Glycerol 50%,

24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Tris HCl 1,5 M (pH = 8,8), Tris HCl 0,5 M (pH = 6,8), APS 10%, TEMED.

Đệm xử lý mẫu trƣớc khi điện di (Treatment buffer 6X): Tris HCl 0,36 M

(pH=8), Glycerol 60%, SDS 12%, Bromophenol blue (0,06%), 2-mecaptoethanol

3/10 (v/v).

Đệm chạy điện di: Glycine 192 mM, Tris base 25 mM, SDS 0,1%.

Công thức cho 2 bản gel SDS-PAGE (gồm 2 lớp gel tách và gel cô):

Hóachất Gel tách(12,6%) Gel cô(5%)

H2O 1 ml 1,3 ml

Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) 2,25 ml 0 ml

Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) 0 ml 0,5 ml

Glycerol 50% 1,8 ml 0 ml

Acrylamide 30% 3,8 ml 0,35 ml

SDS 10% 90 μl 10 μl

APS 10% 60 μl 20 μl

TEMED 6 μl 2 μl

2.1.4.5. Dung dịch sử dụng để hiện kết quả điện di SDS – PAGE

Dung dịch sử dụng cho phƣơng pháp nhuộm Coomassie:

Dung dịch nhuộm gel (Coomassie blue staining): Coomassie Brilliantblue:

0,025%; Methanol 40%; Acid acetic: 10%.

Dung dịch tẩy rửa (Destaining): Methanol: 5%, Acid acetic: 7,5%.

Dung dịch sử dụng cho phƣơng pháp nhuộm bạc (silver stainning):

Dung dịch cố định (Fixing solution): Ethanol 50%, Acetic acid 12%,

Formaldehyde 0,05%.

Dung dịch rửa (Washing solution): Ethanol 50%.

Dung dịch nhạy hóa (Sensitising solution): Na2S2O3. 5H2O 0,02%.

Dung dịch nhuộm bạc (Silver staining solution): AgNO3 0,2%, Formaldehyde

25 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

0,075%.

Dung dịch hiện màu (Developing solution): Na2CO3 6%, Na2S2O3. 5H2O

0,0004%, Formaldehyde 0,05%.

Dung dịch dừng phản ứng (Stopping solution): Glycine 1%.

2.1.4.6. Dung dịch sử dụng trong phản ứng Western blot

Tên Thành phần

Dung dịch Tris-HCl 25mM pH=8, Glycine 190 mM, Methanol

blotting 20%

Dung dịch TBS Dung dịch TBS

Dung dịch TTBS Tris-HCl 25 mM pH=8, NaCl 50 mM, Tween20 0,1%

2.1.4.7. Dung dịch sử dụng trong phương pháp ELISA

Tên Thành phần

Đệm phủ 4,2 g NaHCO3, 5,3 g Na2CO3, thêm H2O để đạt thể

tích 1 lít, chuẩn pH = 9,6

PBS 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na2HPO4, 0,2 g K2HPO4,

thêm H2O để đạt thể tích 1 lít, chuẩn pH = 8

Dung dịch rửa 500 µl Tween 20, 1 lít PBS

Dung dịch khóa 10 g BSA (Bovine serum albumin), 1 lít PBS

Dung dịch pha 0,1 g BSA, 0,01 g Cold fish gelatin, 5 µl Tween 20, 10

loãng kháng thể 1 ml PBS

Dung dịch pha 500 µl Tween 20, 1 lít PBS

26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

loãng kháng thể 2

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Biểu hiện protein Interleukin-2 tái tổ hợp trong tế bào E. coli ở các hệ thống

lên men 5 và 10 lít

Cơ sở lý thuyết

Tế bào vi khuẩn E. coli tái tổ hợp mang gene tổng hợp IL-2 đƣợc nuôi cấy trên

môi trƣờng LBA ở nhiệt độ và độ sục khí thích hợp cho việc sinh trƣởng. Nhờ cơ

chế cảm ứng operon lac bằng hóa chất IPTG, protein IL-2 đƣợc tổng hợp.

Các bƣớc tiến hành

Chuẩn bị 2,8 và 5,6 lít (gọi là V lít) môi trƣờng LB tƣơng ứng trong các hệ

thống lên men 5 và 10 lít. Sục khí và khuấy để bão hoà nguồn oxy trong môi trƣờng

trƣớc khi lên men. Nuôi cấy 1V/14 lít chủng giống E. coli BL21-IL2 qua đêm tại

nhiệt độ 37°C trong môi trƣờng LB có bổ sung Amp 100 μg/ml. Bổ sung toàn bộ

dịch nuôi cấy qua đêm vào bình lên men. Điều kiện lên men ban đầu là: nhiệt độ

37°C, pH môi trƣờng khoảng 6,0 - 7,0, độ sục khí là 0,5 lít khí sục vào/lít môi

trƣờng/phút (vvm), tốc độ khuấy 200 vòng/phút.

Sau 2 giờ nuôi cấy, tăng tốc độ khuấy lên 400 vòng/phút, sau 3 giờ tăng 600

vòng/phút và tăng sục khí lên 1 vvm. Nuôi cấy chủng đến khi chỉ số dOT (nồng độ

oxy hòa tan trong môi trƣờng) giảm xuống dƣới 20% thì bổ sung dinh dƣỡng lần

thứ nhất với nồng độ cuối cùng 1% glucose và 0,5% cao nấm men.

Tiếp tục duy trì tốc độ khuấy 600 vòng/phút và độ sục khí 1 vvm để tăng sinh

khối tế bào sau lên men. Nuôi cấy đến khi dOT giảm xuống dƣới 20% thì tiến hành

bổ sung dinh dƣỡng lần thứ hai với nồng độ cuối cùng 1% glucose và 0,5% cao nấm

men. Khi giá trị OD600 khoảng từ 15 đến 20, tăng nhiệt độ lên đạt 47°C bổ sung 0,1

mM IPTG để cảm ứng quá trình sinh tổng hợp protein IL-2.

Tiếp tục kiểm tra mật độ tế bào theo thời gian sau khi cảm ứng. Mẫu đƣợc lấy

tại các giờ khác nhau và dừng lên men sau 6 giờ cảm ứng. Sinh khối tế bào sau quá

trình lên men đƣợc ly tâm loại bỏ môi trƣờng và tế bào đƣợc hòa lại trong đệm Tris-

HCl 20 mM và giữ ở -80°C.

2.2.2. Phá tế bào E. coli và xử lý IL-2 thô (tiền tinh chế)

27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Nguyên lý

Dịch tế bào E. coli thu lại sau quá trình biểu hiện đƣợc xử lý bằng các loại

dung dịch đệm đặc trƣng, sau đó thành và màng tế bào đƣợc phá vỡ bằng sóng siêu

âm. Protein dạng thể vùi không tan trong dung môi nƣớc nên có thể dễ dàng loại bỏ

các protein tan khác nhờ phƣơng pháp ly tâm. Protein thể vùi chỉ chuyển thành dạng

tan khi xử lý bằng các chất có khả năng biến tính cao nhƣ urea hay guanidine

hydrochloride. Các protein khác nhau trong thể vùi có khả năng trở thành dạng tan

ở những nồng độ chất biến tính khác nhau nên có thể đƣợc phân tách chúng bằng

phƣơng pháp ly tâm.

Phƣơng pháp xử lý tiền tinh chế IL-2

Sinh khối tế bào đƣợc giã đông ở nhiệt độ 37ºC trong 30 phút, sau đó bổ sung

dung dịch đệm I và đƣợc xử lý siêu âm phá tế bào trong10 phút. Ly tâm 5000

vòng/phút trong 10 phút và tủa thu đƣợc hòa tiếp trong dung dịch đệm II. Tiếp tục

siêu âm tƣơng tự lần hai trong 10 phút. Dịch siêu âm đƣợc bổ sung sucrose đến

nồng độ cuối cùng là 20% và ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 20 phút. Tủa đƣợc

hòa lại trong 5 ml dung dịch đệm IV đến khi tan hoàn toàn trƣớc khi ly tâm 10000

vòng/phút trong 30 phút để thu dịch nổi. Dịch nổi đƣợc pha loãng bằng đệm Tris-

HCl 20 mM để đƣa nồng độ guanidine hydrochloride (GnHCl) từ 7 M xuống 3 M, ủ

ở nhiệt độ phòng trong 60 phút. Hỗn hợp sau khi ủ đƣợc ly tâm 10000 vòng/phút

trong 30 phút để thu tủa. Tủa đƣợc hòa tan trong 2,5 ml đệm IV có bổ sung 2-

Mecaptoethanol đến nồng độ 15 mM và khuấy trong điều kiện 4ºC từ 8 đến 10 giờ.

Dịch hòa tan đƣợc ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 phút, loại tủa, thu dịch nổi.

2.2.3. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Cơ sở lý thuyết

Phƣơng pháp sắc ký lỏng HPLC là phƣơng pháp phân tách bao gồm 2 pha,

trong đó pha động là chất lỏng (dịch protein cần phân tách) và pha tĩnh chứa trong

cột chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một

chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc cải biến bằng liên kết hóa học với các

nhóm chức hữu cơ. Sắc ký đảo pha phân tách IL-2 nhờ vào sự khác nhau giữa tính

phân cực của các phân tử protein.

28 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Các bƣớc tiến hành

Mẫu IL-2 thu đƣợc sau quá trình phá sinh khối tế bào và xử lý thô tiền tinh chế

đƣợc bổ sung TFA đến nồng độ cuối cùng là 15 mM, ly tâm 13000 vòng trên phút

trong 10 phút, thu dịch nổi. Sau đó mẫu đƣợc đƣa lên cột theo chƣơng trình đã đƣợc

thiết lập.

Các thông số cơ bản của quá trình tinh chế: (i) cột sắc ký để phân tách mẫu

Bio Wide Pore C5 (10 mm x 250 mm, 10 μm) (Supelco); (ii) thành phần đệm A và

B đã nêu trên; (iii) mẫu đƣợc đƣa lên cột bằng cách bơm qua bộ phận hút mẫu; (iv)

hệ thống phát hiện mẫu sử dụng đèn quang phổ cực tím trong đó bƣớc sóng phát

hiện mẫu là 280 nm; (v) thể tích mẫu mỗi lần hút là 2 ml; (vi) tốc độ dòng 20

ml/phút.

Chƣơng trình chạy: 5 phút đầu tiên chạy gradient từ 0 đến 20% đệm B, 10

phút tiếp theo từ phút thứ 6 đến phút thứ 15 duy trì nồng độ 90% đệm B, 5 phút còn

lại từ phút thứ 16 đến phút thứ 20 duy trì nồng độ 0% đệm B.

Sau khi chƣơng trình chạy mẫu trên hệ HPLC kết thúc, mở sắc ký đồ kết quả

để phân tích và xác định độ tinh khiết của sản phẩm. Lƣu ý thu mẫu trong khoảng từ

phút thứ 9 đến phút 12, thu theo phân đoạn.

2.2.4. Xác định hoạt tính sinh học protein Interleukin-2 trên dòng tế bào CTLL2

Nguyên lý

Dựa vào đặc tính của dòng tế bào CTLL2 là tế bào sinh trƣởng phụ thuộc hoàn

toàn vào IL-2, khi môi trƣờng nuôi cấy dòng tế bào CTLL2 không đƣợc bổ sung IL-

2 thì tế bào sẽ chết trong khoảng 24-48 giờ. Khi bổ sung IL-2 vào môi trƣờng nuôi

cấy dòng tế bào CTLL2 thì tùy thuộc vào hoạt tính của IL-2 mà tế bào CTLL2 sẽ

duy trì sự sống và đƣợc kích hoạt để phát triển và sinh sản. Hoạt tính của IL-2 càng

mạnh thì khả năng tăng sinh của tế bào CTLL2 càng cao. Sự hoạt động của IL-2

đƣợc xác định bằng cách đo tổng số thimidine từ ADN tổng hợp của các tế bào

CTLL2 tăng sinh.

Phƣơng pháp hoạt hóa và duy trì tế bào CTLL-2

Chuẩn bị sẵn ống ly tâm có chứa 10 ml môi trƣờng nuôi cấy RPMI-1640 đầy

đủ có bổ sung 10% FBS. Sau đó, lấy ống tế bào giữ chủng tế bào CTLL2 từ trong

29 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nitơ lỏng và đƣa ngay vào nƣớc ấm 37°C. Khi dung dịch bên trong ống đã tan đá

hoàn toàn, chuyển ngay dung dịch bên trong ống giữ chủng sang ống ly tâm đã

chuẩn bị sẵn môi trƣờng nuôi cấy (bƣớc này để pha loãng nồng độ DMSO

(Dimethyl Sulfoxide) giúp giảm sự gây độc của nó đối với tế bào ở nhiêt độ

thƣờng), ly tâm với tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó hút bỏ dịch nổi để

loại DMSO có trong ống giữ chủng. Tiếp theo hòa cặn tế bào bằng môi trƣờng nuôi

cấy là RPMI-1640đầy đủ có bổ sung 10% FBS, hút và chuyển từ từ dung dịch tế

bào sang chai nuôi cấy thích hợp, bổ sung IL-2. Cuối cùng để chai nuôi vào ủ trong

tủ 37°C, CO2 5% có độ ẩm. Sau 3-5 ngày thì cấy chuyển nhằm duy trì tế bào. Tế

bào đƣợc sử dụng để làm phép xác định hoạt tính sau ít nhất 2 ngày kể từ khi cấy

chuyển.

Phƣơng pháp MTT assay

Hòa loãng mẫu IL-2 tái tổ hợp và mẫu IL-2 chuẩn (USA hoặc China) trong 50

µl môi trƣờng RPMI-1640đầy đủ có bổ sung 10% FBS vào các giếng đầu tiên trong

đĩa microtiter 96 giếng, mỗi một mẫu đƣợc lặp lại 3 lần. Các giếng đối chứng âm

chỉ có tế bào và môi trƣờng nuôi cấy, không có IL-2. Sau tối thiểu 2 ngày nuôi cấy,

khi tế bào ở pha log thì tiến hành thu tế bào CTLL-2 và rửa bằng môi trƣờng RPMI-

1640đầy đủ để loại bỏ IL-2 còn dƣ thừa trong quá trình nuôi cấy tế bào, tránh ảnh

hƣởng đến quá trình làm phép xác định hoạt tính. Hòa cặn tế bào thu đƣợc sau khi ly tâm để đạt mật độ 106 tế bào/ml và nhỏ mỗi giếng thí nghiệm 50 µl. Đĩa thí

nghiệm đƣợc ủ trong tủ 37°C, 5% CO2 có độ ẩm. Sau 24 giờ nuôi, bổ sung 10 µl

MTT (5 mg/ml pha trong PBS) vào từng giếng (chứa 100 µl tế bào), ủ tế bào 4 giờ

trong tủ nuôi 37°C, CO2 5% có độ ẩm. Sau 4 giờ ủ với MTT lấy đĩa nuôi cấy bổ

sung 100 µl isopropanol HCl 0,04N vào mỗi giếng, mix bằng pipet mạnh nhiều lần

để hòa tan các tinh thể mầu xanh đậm, để đĩa ở trạng thái tĩnh khoảng 3 – 5 phút.

Đọc kết quả bằng bƣớc sóng 595 nm.

Phân tích kết quả

Sau khi có kết quả đo mật độ quang học (OD), phần mềm Graphpad Prism 5.0

đƣợc sử dụng để tính giá trị EC50 (half maximal effective concentration, EC50: là

nồng độ mà tại đó các protein thể hiện 50% hoạt tính tối đa (bão hòa)), mẫu thí

30 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nghiệm nào có giá trị EC50 càng thấp thì mẫu đó có hoạt tính càng cao. Sau đó

chúng tôi tiến hành quy đổi và xác định hoạt tính sinh học riêng của IL-2 theo quy

chuẩn quốc tế. + Hoạt tính sinh học riêng (Units/mg) [65]: A(U/mg)= 106 / EC50

+ Hoạt tính sinh học riêng theo chuẩn quốc tế (International Units/mg)[33][43]:

31 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

A (IU/mg) = A(U/mg) x

2.2.5. Kiểm tra tính đặc hiệu của protein bằng phương pháp Western blot

Nguyên lý

Western blotting là phƣơng pháp đƣợc sử dụng để nhận diện một kháng

nguyên đặc hiệu nhờ các kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng tƣơng ứng. Protein nằm

trên gel SDS-PAGE đƣợc chuyển sang màng hấp thụ - Polyvinylidene diflouride

(PVDF), sau đó protein đƣợc xác định bằng phản ứng giữa kháng thể 1 (kháng thể

chuột kháng với Interleukin-2 ngƣời - hãng sigma) và kháng thể 2 (kháng với kháng

thể 1-hãng sigma) có gắn với chất chỉ thị màu.

Quy trình

Mẫu protein đƣợc chạy điện di biến tính bằng SDS-PAGE với các vị trí tƣơng

ứng, khi gỡ gel điện di thì đặt vào trong dung dịch blotting 1x để lạnh, tránh gel bị

khô.

Màng PVDF đƣợc ngâm trong methanol 100% trong 5 phút trƣớc khi chuyển

sang dung dịch blotting. Hộp chuyển màng, xốp, giấy thấm và màng PVDF đƣợc

đặt vào khay đựng blotting 1x lạnh. Màng và gel đƣợc đặt vào hộp chuyển theo thứ

tự mặt đen của hộp chuyển (cực âm), xốp, giấy thấm, gel, màng PVDF, giấy thấm,

xốp, mặt trắng của hộp chuyển (cực dƣơng). Lắp hộp vào bộ chuyển màng, đổ dung

dịch blotting 1x vào ngập bộ chuyển màng, thêm đá vụn vào bộ chuyển màng cho

nhiệt độ không lên quá cao. Sau đó chạy với hiệu điện thế 100V trong 2 giờ ở 4ºC,

khuấy từ nhẹ.

Màng PVDF sau khi thực hiện quá trình chuyển màng đƣợc phủ bằng dung

dịch sữa skim milk 5% trong dung dịch TBS, ở 4ºC qua đêm. Rửa màng bằng dung

dịch TTBS, 3 lần mỗi lần 10 phút rồi rửa tiếp bằng dung dịch TBS, 3 lần mỗi lần 5

phút. Phủ kháng thể 1 (kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu IL-2) pha loãng về nồng

độ cuối cùng khoảng 0,2-0,4 μg/ml trong sữa skim milk 5% (pha trong TBS), lắc ở

nhiệt độ phòng trong 1 giờ.

Màng PVDF đƣợc rửa bằng dung dịch TTBS và TBS lặp lại nhƣ trên trƣớc khi

phủ kháng thể 2 (cộng gộp kháng thể Ig G- kháng thể chuột gắn peroxidase ) pha

32 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

loãng về nồng độ cuối cùng khoảng 0,2-0,4 μg/ml trong dung dịch sữa skim milk

5% pha trong TBS, lắc ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Sau khi phủ kháng thể 2, màng

PVDF đƣợc rửa bằng TTBS và TBS nhƣ trên trƣớc khi hiện mẫu trong dung dịch

hiện màu của BioRad. Màng đƣợc lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và quan

sát.

2.2.6. Kiểm tra độ sạch bằng phần mềm Quantity One

Nguyên lý

Sản phẩm protein sau khi tinh sạch đƣợc điện di trên gel SDS – PAGE. Ảnh

điện di đƣợc xử lý bằng phần mềm Quantity one. Sản phẩm tinh sạch có độ tinh

khiết lớn hơn 95% là đạt yêu cầu.

Quy trình

Thu nhận và lƣu trữ kết quả: Rửa thật sạch bản gel polyacrylamide kết quả,

chụp ảnh bằng máy kỹ thuật số Canon rồi chuyển ảnh vào máy tính, chuyển ảnh từ

định dạng .jpg sang .tiff.

Phân tích kết quả:

Mở kết quả ảnh bằng phầm mềm Quantity One. Xác định các đƣờng chạy trên

ảnh kết quả bằng công cụ Lane frames, các đƣờng chạy nên chọn vị trí chính giữa

của băng protein. Trên đƣờng chạy đã xác định, thêm các thang protein mong muốn

bằng công cụ Add bands. Xác định đƣờng nền cho phổ hấp thụ qua hai chức năng

Sub-background và lane background. Nháy chuột vào nút công cụ Band in lane để

truy xuất kết quả dạng phổ hấp thụ của protein. Xác định đƣờng nền cho toàn bộ

ảnh điện di sao cho độ sạch xác định bằng phần mềm tƣơng ứng với độ sạch lý

thuyết của băng protein chuẩn. Sử dụng chức năng Band attributes để tính toán mức

hấp phụ trên mỗi thang protein và cho kết quả. Giá trị độ tinh khiết của băng

protein cần xác định đƣợc thu nhận theo hai chức năng: (1) export của phần mềm

Quantity One và (2) print screen của hệ điều hành Windows. Kết quả số liệu dạng

bảng đƣợc truy xuất bởi công cụ Report.

2.2.7. Kiểm tra nội độc tố bằng LAL kit

33 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Nguyên lý

Phƣơng pháp đông gel đƣợc sử dụng để kiểm tra hàm lƣợng chí nhiệt tố có

trong mẫu IL-2 sau tinh chế. Sự nhận biết nội độc tố endotoxin đƣợc xác định bởi

sự đông kết của protein có trong máu của Limulus polyphemus. Năm 1995, theo

công bố của Dƣợc điển Hòa Kỳ, hàm lƣợng nội độc tố đƣợc quy định là không vƣợt

quá 0,5 EU (endotoxin units) trên 1 ml đối với các sản phẩm tiếp xúc trực tiếp hoặc

gián tiếp với hệ tuần hoàn và bạch huyết.

Quy trình

Hydrate hóa LAL ngay trƣớc thời điểm sử dụng bằng cách: thêm 1,4 ml nƣớc

sạch (LAL reagent water) vào ống LAL đông khô đi kèm trong bộ sinh phẩm, lắc

nhẹ 30 giây, chú ý không để tạo bọt. Thêm 1 ml nƣớc sạch (LAL reagent water) vào

ống endotoxin chuẩn (CSE) đi kèm trong bộ sinh phẩm, trộn kỹ dịch hoàn nguyên

bằng máy vortex trong 5 phút. Hút ra 3 ống eppendorf vô trùng mỗi ống 100 µl CSE

để làm đối chứng dƣơng đồng thời hút 100 µl H2O vào ống eppendoft vô trùng để

làm đối chứng âm. Hút ra 3 ống eppendoft mỗi ống 100 µl mẫu IL-2 để kiểm tra

(lặp lại thí nghiệm 3 lần).

Bổ sung thêm 100 µl LAL đã hydrat hóa vào 7 ống eppendorf ở trên. Ủ các

ống phản ứng tại nhiệt độ 37ºC trong 60 phút, tránh hiện tƣợng rung lắc trong quá

trình phản ứng. Sau 60 phút, kiểm tra kết quả phản ứng bằng cách đảo ngƣợc 180º.

Nếu gel trong ống phản ứng vẫn giữ nguyên dạng đông đặc, kết quả là dƣơng tính.

Nếu gel có hiện tƣợng chảy dịch xuống, kết quả là âm tính.

2.2.8. Xác định hàm lượng protein trong mẫu tinh chế bằng phương pháp ELISA

Nguyên lý

Tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp Western blotting, phƣơng pháp ELISA dựa trên sự

kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, chúng tôi đánh giá hàm lƣợng

IL-2 trƣớc và sau tinh chế trên đĩa ELISA nhờ kháng thể 1 kháng với IL-2 và kháng

thể 2 kháng với kháng thể 1, mang cấu trúc thủy phân cơ chất có thể phát hiện bằng

máy ELISA ở bƣớc sóng 450 nm. Đây là phƣơng pháp khá nhạy và chính xác nếu

có IL-2 chuẩn đã biết hàm lƣợng.

34 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Các bƣớc tiến hành

Cố định protein tổng số và protein tiền tinh chế đã pha loãng (theo dải từ 22 - 212) trong đệm phủ trên đĩa ELISA, ủ qua đêm ở 4°C. Rửa các giếng 3 lần bằng đệm

rửa. Bổ sung đệm khóa để ngăn chặn sự bám dính không đặc hiệu của kháng thể.

Rửa lại 3 lần bằng đệm rửa. Gắn kháng thể 1 pha loãng 5000 lần, ủ trong 60 phút ở

nhiệt độ phòng. Rửa các giếng 3 lần bằng đệm rửa. Gắn kháng thể 2 pha loãng 5000

lần, ủ trong 60 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa các giếng 3 lần bằng đệm rửa. Bổ sung

cơ chất TMB và dừng phản ứng bằng cách bổ sung H2SO4 2 M. Đo mẫu tại bƣớc

sóng 450 nm trên hệ thống máy đọc ELISA (Elx808 Biotek Instruments của Mỹ).

2.2.9. Điện di SDS-PAGE

Nguyên lý

Điện di là quá trình dịch chuyển của phân tử dƣới tác dụng của điện trƣờng

qua các mạng lƣới. Các phân tử có tốc độ di chuyển tùy thuộc vào điện tích, kích

thƣớc khối lƣợng, hình dạng phân tử. Khi protein đƣợc xử lý với SDS là chất mang

điện âm có khả năng bám vào protein làm protein tích điện tích âm đồng thời biến

tính protein, phá vỡ cấu trúc tạo thành cấu trúc bậc I (dạng thẳng). Do cùng có điện

tích và là dạng thẳng nên protein có tốc độ di chuyển tỉ lệ nghịch với kích thƣớc,

khối lƣợng phân tử. Khi điện di kết thúc, những protein trên gel sẽ đƣợc nhìn thấy

là một dãy các băng bằng cách nhuộm màu Coomassie blue hay nhuộm bạc.

Chuẩn bị điện di

Lắp bản gel vào bộ điện di, kiểm tra đảm bảo đệm đổ vào trong không bị thất

thoát ra ngoài. Tra mẫu điện di vào các giếng theo thứ tự biết trƣớc bằng pipet với

lƣợng từ 5-10 μl, riêng marker 3 μl. Sau khi tra xong lắp điện cực (chú ý đúng điện

cực tƣơng ứng) và bắt đầu chạy điện di.

Chƣơng trình điện di

Đối với 1 bản gel: cƣờng độ dòng điện giữ không đổi là 10 mA trong 15 phút

sau đó tăng cƣờng độ dòng điện lên 20 mA trong khoảng 50-70 phút đến khi vạch

màu chỉ thị chạy gần hết bản gel.

Đối với 2 bản gel: cƣờng độ dòng điện giữ không đổi là 20 mA trong 15 phút

sau đó tăng cƣờng độ dòng điện lên 40 mA trong khoảng 50-70 phút đến khi vạch

35 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

màu chỉ thị chạy gần hết bản gel.

Hiện kết quả chạy điện di bằng phƣơng pháp nhuộm coomassie

Bản gel sau khi chạy điện di xong đƣợc gỡ ra đĩa petri và xử lý với các dung

dịch dành cho phƣơng pháp nhuộm coomassie theo trình tự sau: dung dịch nhuộm

màu tối thiểu 1 giờ (bƣớc này có thể tiến hành qua đêm), dung dịch rửa trong 30

phút 1 lần cho đến khi bản gel hiện rõ các băng và nền bản gel không còn màu của

thuốc nhuộm.

Hiện kết quả chạy điện di bằng phƣơng pháp nhuộm bạc

Bản gel sau khi chạy điện di xong đƣợc gỡ ra và xử lý với các dung dịch dành

cho phƣơng pháp nhuộm bạc theo trình tự sau: dung dịch cố định (Fixing solution)

tối thiểu 1 giờ, dung dịch rửa (Washing solution) trong 20 phút (tiến hành 2 lần liên

tiếp), dung dịch nhạy hóa (Sensitising solution) trong 1 phút, nƣớc loại ion trong 20

giây (thực hiện 3 lần liên tiếp), dung dịch nhuộm bạc (Silver staining solution) trong

20-30 phút, nƣớc loại ion trong 20 giây (tiến hành 2 lần liên tiếp), dung dịch hiện

màu (Developing solution) trong 1 -3 phút, dung dịch ngừng phản ứng (Stopping

solution) trong khoảng 10-30 giây. Lƣu ý trong bƣớc xử lý bằng dung dịch hiện

màu, dùng tay lắc nhẹ đĩa đựng bản gel để ngấm đều dung dịch và quan sát đến khi

các băng điện di hiện rõ thì chuyển ngay sang bƣớc tiếp theo, tránh bản gel điện di

36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bị ngâm quá lâu trong dung dịch hiện màu sẽ làm đen toàn bộ bản gel.

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Nhằm làm tăng hoạt tính và tăng tính an toàn cho sản phẩm IL-2, chúng tôi đã

sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử nhằm tạo đột biến mất amino acid alanine ở

đầu N, thay thế cysteine ở vị trí 125 bằng serine. Trình tự amino acid suy diễn từ

trình tự DNA mã hóa cho IL-2 giống hoàn toàn so với trình tự amino acid của một

sản phẩm IL-2 tái tổ hợp đã đƣợc FDA công nhận cấp phép và đã đƣợc sử dụng

trongđiều trị các bênh nhân ung thƣ biểu mô thận và ung thƣ hắc tố ác tính. Chủng

E. coli BL21-IL2 đã đƣợc biểu hiện thành công ở quy mô phòng thí nghiệm sử dụng

bình tam giác để nuôi (gọi tắt là quy mô bình tam giác) và tinh chế thành công bằng

cột phân tích của hệ thống sắc ký HPLC tại Viện Công nghệ sinh học. Với mục

tiêuchuyển giao thành công công nghệ sản xuất IL-2 tái tổ hợp từ quy mô phòng thí

nghiệm sang phòng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP,cụ thể làbiểu hiện và tinh chế

lƣợng lớnprotein IL-2 có độ tinh sạch, độ an toànvà hoạt tính sinh học cao nhằm tạo

ra sản phẩm IL-2 đảm bảo yêu cầu của sản phẩm tái tổ hợp sử dụng trong điều trị

trên ngƣời với giá thành thấp.

Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:

 ............................................................................................................... T

ối ƣu biểu hiện protein IL-2 trên các hệ thống lên men 5 và 10 lít tại Viện

Công nghệ sinh học và công ty VABIOTECH.

 ............................................................................................................... T

iền xử lý và tinh chế IL-2 bằng hệ thống sắc ký HPLC.

 ............................................................................................................... X

ác định hoạt tính sinh học riêng của protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế.

 ............................................................................................................... K

iểm tra độ tinh sạch và độ an toàn của protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế

bằng phần mềm Quantity One và phép thử LAL kit.

Các kết quả chi tiết trong quá trình thực hiện đề tài đƣợc trình bày chi tiết ở

37 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

các phần dƣới đây:

3.1. Tối ƣu lên men chủng E. coli BL21 IL-2 trên quy mô nồi lên men 5 và 10 lít

3.1.1. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ thống lên men 5 lít

Trƣớc khi chuyển giao công nghệ sang hệ thống lên men quy mô lớn trong

điều kiện tiêu chuẩn GMP, chủng E. coli BL21-IL2 tái tổ hợp trƣớc hết đƣợc lên

men ở quy mô hệ thống lên men 5 lít trong phòng thí nghiệm tại Viện Công nghệ

sinh học. Quá trình lên men đƣợc tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 47ºC, cảm ứng 1

mM IPTG ở thời điểm giá trị OD600 đạt khoảng từ 0,4 đến 0,8 và thu mẫu sau 3 giờ

cảm ứng. Đây là điều kiện đã đƣợc tối ƣu từ kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả

Lê Thị Lan Anh (2013) ở quy mô bình tam giác. Protein tổng số đƣợc thu nhận từ

sinh khối tế bào lên men và đƣợc kiểm tra trên gel SDS-PAGE 12,6%. Kết quả biểu

hiện protein IL-2 tái tổ hợp sau khi lên men đƣợc thể hiện ở Hình 3.1A.

Hình 3. 1:Sự biểu hiện protein IL-2 tái tổ hợp trong hệ thống lên men 5 lít

A: Kiểm tra biểu hiện protein IL-2 bằngSDS-PAGE. B: Kiểm tra biểu hiện protein

IL-2 bằng Western blot. M: Thang protein chuẩn; Đƣờng chạy 1: Protein IL-2 tổng

số; Đƣờng chạy 2: Mẫu IL-2 chuẩn (Trung Quốc).

Kết quả biểu hiện trên Hình 3.1A cho thấy, trên đƣờng chạy 1 có xuất hiện

băng protein kích thƣớc khoảng 15 kDa rõ nét và đậm hơn so với các băng còn lại,

kích thƣớc băng protein này tƣơng đƣơng với kích thƣớc protein IL-2 chuẩn (Trung

38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Quốc, đƣờng chạy 2). Để khẳng định protein biểu hiện là IL-2 tái tổ hợp, phản ứng

lai Western blot kháng nguyên-kháng thể đã đƣợc thực hiện. Kết quả lai Western

blot trên Hình 3.1B cho thấy trên đƣờng chạy số 1 chỉ xuất hiện một băng duy nhất

cùng với vị trí protein IL-2 chuẩn, điều này chứng tỏ protein biểu hiện chính là IL-2

tái tổ hợp do nó có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng thể đơn dòng kháng IL-2.

Protein IL-2 biểu hiện khá tốt ở điều kiện lên men 47ºC đạt khoảng 0,175 mg/ml.

Kết quả này khẳng định chủng E. coli BL21-IL2 đã biểu hiện protein IL -2 trong hệ

thống lên men 5 lít. Tuy nhiên , khi lên men ở điều kiê ̣n này sinh khối tế bào thu

1,4. Nhƣ đƣơ ̣c tƣơng đối thấp , giá trị OD 600 ở thời điểm thu mẫu chỉ đạt khoảng

t sẽ ảnh hƣở ng tớ i viê ̣c sản xuất và gây khó

vậy, vớ i lƣơ ̣ng sinh khối tế bào quá í khăn cho quá trình tinh sạch. Để khắc phục vấn đề này, chúng tôi tiến hành khảo sát

thành phần dinh dƣỡng và nồng độ chất cảm ứng nhằm kích thích tế bào sinh trƣởng

tăng sinh khối tế bào.

3.1.2. Khảo sát thành phần dinh dưỡng và nồng độ chất cảm ứng

Quá trình sinh trƣởng của vi khuẩn nói chung và chủng E. coli nói riêng chịu

ảnh hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nhiệt độ, pH môi trƣờng, oxy hòa tan, nồng độ chất

cảm ứng, và thành phần dinh dƣỡng bổ sung [28]. Đối với chủng vi khuẩn sản xuất

protein tái tổ hợp thì thành phần chất dinh dƣỡng, nồng độ chất cảm ứng và thời

điểm bổ sung chất cảm ứng để biểu hiện protein cũng là một trong các yếu tố quan

trọng ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng của chủng. Trong những nghiên cứu

trƣớc đây, chúng tôi đã tối ƣu đƣợc điều kiện biểu hiện của chủng E. coli BL21 IL-2

ở quy mô bình tam giác [1], tuy nhiên điều kiện biểu hiện protein ở quy mô nhỏ có

sự khác biệt với quá trình lên men trong các hệ thống lên men. Vì vậy, để nâng cao

quá trình sinh tổng hợp IL-2 ở hệ thống lên men 5 lít, chúng tôi tiến hành khảo sát

một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men nhƣ thành phần chất dinh dƣỡng bổ

sung và nồng độ chất cảm ứng trong điều kiện lên men này.

Một số thành phần dinh dƣỡng nhƣ glucose, glycerol, cao nấm men hoặc chất

cảm ứng IPTG có vai trò quan trọng trong sự tổng hợp của protein tái tổ hợp. Cao

nấm men là nội bào của tế bào nấm men, bao gồm tế bào chất, nhân tế bào và các cơ

quan tế bào và thƣờng rất giàu amino acid, vitamin (vitamin B, Glutathione),

39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

cacbon hydrat và muối [67]. Cao nấm men đƣợc sử dụng rất phổ biến nhƣ một

nguồn nitrogene phong phú, glucose và glycerol cũng đƣợc sử dụng nhƣ những

nguồn carbon và nguồn năng lƣợng thiết yếu bổ sung trong quá trình nuôi cấy vi

khuẩn nói chung và E. coli nói riêng, đặc biệt là glucose, thành phần quan trọng

trong con đƣờng chuyển hóa cơ bản của tế bào [9].

Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành lên men ở điểu kiện 47ºC và bổ sung

hỗn hợp dinh dƣỡng bao gồm 1% glucose kết hợp với 0,5% cao nấm men hoặc 1%

glycerol kết hợp với 0,5% cao nấm men tại thời điểm khi nguồn dinh dƣỡng trong

hệ thống lên men giảm (dOT giảm xuống dƣới 20%). Việc sử dụng kết hợp các

nguồn cacbon khác nhau với mục đích làm tăng quá trình sinh trƣởng của tế bào.

Bên cạnh đó để tối ƣu điều kiện tổng hợp IL-2, chất cảm ứng IPTG ở nồng độ 0,5

mM và 1 mM đƣợc bổ sung trong quá trình nuôi cấy. Quá trình bổ sung IPTG đƣợc

tiến hành một hoặc hai lần, cảm ứng lần một ở thời điểm giá trị OD600 đạt khoảng từ

0,4 đến 0,8; sau 1 giờ tiến hành cảm ứng lần hai nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp

protein IL-2. Các mẫu đƣợc thu sau 3 giờ cảm ứng. Kết quả khảo sát một số yếu tố

ảnh hƣởng đến quá trình lên men đƣợc thể hiện trên Bảng 3.1.

Bảng 3. 1: Giá trị OD mẫu thu đƣợc sau quá trình lên men

Thành phần bổ Điều kiện cảm Giá trị Hàm lƣợng Mẫu sung ứng IPTG IL-2 (mg/ml) OD600

1% glucose + 0,5% Cảm ứng 01 lần Mẫu 1 3,91 0,487 cao nấm men 1 mM IPTG

1% glycerol + 0,5% Cảm ứng 01 lần Mẫu 2 3,97 0,342 cao nấm men 1 mM IPTG

1% glucose + 0,5% Cảm ứng 01 lần Mẫu 3 6,26 0,523 cao nấm men 0,5 mM IPTG

1% glycerol + 0,5% Cảm ứng 01 lần Mẫu 4 6,56 0,351 cao nấm men 0,5 mM IPTG

1% glucose + 0,5% Cảm ứng 02 lần Mẫu 5 5,84 0,452 cao nấm men 0,5 mM IPTG

40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Mẫu 6 6,01 0,438 1% glycerol + 0,5% Cảm ứng 02 lần

cao nấm men 0,5 mM IPTG

Đối chứng Không bổ sung chất Cảm ứng 01 lần 1,35 0,174 (-) dinh dƣỡng 1 mM IPTG

Kết quả trên Bảng3.1 cho thấy sau khi dừng quá trình lên men, tất cả các mẫu

lên men đƣợc bổ sung chất dinh dƣỡng đều có giá trị OD600 thu mẫu cao hơn từ 3 -

5 lần và hàm lƣợng IL-2 thu đƣợc cao gấp 2-3 lần so với mẫu đối chứng âm khi

không đƣợc bổ sung chất dinh dƣỡng. Việc bổ sung glycerol hay glucose kết hợp

với cao nấm men đều làm tăng sinh khối tế bào và tăng hàm lƣợng IL-2 đƣợc tổng

hợp, điều này chứng tỏ các nguồn carbon này đều thích hợp bổ sung vào quá trình

nuôi cấy chủng E. coli BL21-IL2. Giá trị OD600 khi thu mẫu ở mẫu 3 và mẫu 4 đạt

cao nhất (khoảng 6,26 và 6,56), tuy nhiên hàm lƣợng IL-2 đƣợc tổng hợp ở hai mẫu

này lại tƣơng đối khác nhau (đạt khoảng 0,523 và 0,351 mg/ml). Điều này chứng tỏ

mặc dù sinh khối tế bào tăng nhƣng quá trình tổng hợp protein khi bổ sung với hai

nguồn cơ chất glycerol và glucose là khác nhau. Khi so sánh hàm lƣợng IL-2 đƣợc

tổng hợp ở các mẫu cho thấy với các mẫu có bổ sung glucose/cao nấm men (mẫu 1,

3, 5) thì IL-2 đƣợc tổng hợp đều cao hơn so với các mẫu có bổ sung glycerol/cao

nấm men (mẫu 2, 4, 6). Kết quả này cho thấy nguồn dinh dƣỡng glucose thích hợp

hơn so với nguồn cơ chất glycerol khi bổ sung vào quá trình lên men. Ngoài ra, việc

cảm ứng với IPTG ở nồng độ 0,5 mM thì hàm lƣợng IL-2 vẫn đạt tƣơng đƣơng nhƣ

khi cảm ứng với IPTG 1 mM. Vì vậy để giảm thiểu chi phí sản xuất khi sử dụng

chất cảm ứng IPTG, chúng tôi lựa chọn nồng độ cảm ứng cho quá trình lên men

tổng hợp IL-2 là 0,5 mM IPTG. Từ các kết quả trên chúng tôi lựa chọn điều kiện bổ

sung chất dinh dƣỡng là 1% glucose kết hợp 0,5% cao nấm men và 0,5 mM IPTG

cho quá trình lên men tiếp theo. Tế bào sau khi lên men đƣợc thu lại và kiểm tra

41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

điện di trên gel SDS-PAGE 12,6%. Kết quả điện di đƣợc thể hiện trên Hình 3.2.

Hình 3. 2: Khảo sát bổ sung thành phần chất dinh dƣỡng và nồng độ IPTG trong

quá trình lên men

M: Thang protein chuẩn;(+): Đối chứng dƣơng (IL-2 chuẩn); (-): Đối chứng âm

(không bổ sung chất dinh dƣỡng); Đƣờng chạy 1 – 6: Mẫu lên men 1-6.

Kết quả điện di trên Hình 3.2 cho thấy, ở tất cả các đƣờng chạy (từ 1 đến 6)

đều xuất hiện băng protein có kích thƣớc khoảng 15 kDa, đúng theo kích thƣớc của

IL-2 theo lý thuyết và của đối chứng dƣơng (IL-2 chuẩn). Các băng protein IL-2 ở

các mẫu có bổ sung dinh dƣỡng đều đậm nét hơn so với mẫu không đƣợc bổ sung

dinh dƣỡng (đối chứng âm). Protein IL-2 đƣợc biểu hiện đậm nhất ở đƣờng chạy số

3, kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả đo hàm lƣợng protein IL-2 trên Bảng

3.1 khi hàm lƣợng IL-2 đạt cao nhất ở điều kiện có bổ sung 1% glucose kết hợp

0,5% cao nấm men và 0,5 mM IPTG.

3.1.3. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 ở quy mô hệ thống lên men 10 lít đợt 1

Để chuyển giao quy trình sản xuất IL-2 tái tổ hợp sang công ty VABIOTECH,

chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm lên men chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ thống

lên men 10 lít tại phòng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP. Trƣớc tiên các điều kiện lên

men tại VABIOTECH đƣợc tiến hành theo các điều kiện đã tối ƣu trên hệ thống lên

42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

men 5 lít tại Viện Công nghệ sinh học. Tế bào đƣợc biểu hiện ở điều kiện nhiệt độ

nhiệt độ 47ºC và cảm ứng với IPTG nồng độ cuối cùng 0,5 mM, quá trình sinh tổng

hợp IL-2 đƣợc kết thúc sau ba giờ cảm ứng IPTG . Tuy nhiên, trong quá trình biểu hiê ̣n protein, khi cảm ƣ́ ng IPTG ở mật độ tế bào thấp giá trị OD 600 cảm ứng từ 0,4

đến 0,8 thì toàn bộ tế bào tập trung vào sinh tổng hợp protein và khả năng sinh

trƣởng của tế bào cũng bị ảnh hƣởng. Bên cạnh đó, theo Current Protocols in

Protein Science cho thấy trong quá trình lên men quy mô lớn thời điểm cảm ứng

thích hợp là khi OD600 đạt từ 15 đến 20. Vì vậy, trong đợt lên men này chúng tôi

tiến hành cảm ứng IPTG tại thời điểm OD600 đạt từ 15 đến 20 thay vì cảm ứng tại

thời điểm OD600 từ 0,4 đến 0,8 nhƣ ở hệ thống lên men 5 lít tại Viện Công nghệ

sinh học. Thành phần dinh dƣỡng bao gồm 1% glucose + 0,5% cao nấm men đƣợc

đƣợc bổ sung vào quá trình lên men khi giá trị dOT giảm xuống dƣới 20%.Quá

trình sinh trƣởng của chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ thống lên men 10 lít đợt 1

đƣợc thể hiện trên Hình 3.3.

Hình 3. 3: Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng tái tổ hợp E. coli BL21-IL2 đợt 1

Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng E. coli BL21-IL2 trên Hình 3.3 cho thấy

chủng sinh tổng hợp IL2 tiếp tục sinh trƣởng mạnh sau khi bổ sung dinh dƣỡng ở

thời điểm 2 và 4 giờ sau khi lên men. ITPG đƣợc bổ sung ở thời điểm khi OD600 đạt 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hơn 20 sau 5 giờ nuôi cấy, tuy nhiên sau khi bổ sung chất cảm ứng tốc độ sinh

trƣờng chủng E. coli BL21-IL2 bị giảm xuống đột ngột chứng tỏ việc bổ sung IPTG

nồng độ cao (0,5 mM) vào môi trƣờng nuôi cấy có mật độ tế bào cao cũng làm giảm

sự sinh trƣởng của tế bào do nồng độ IPTG cao có thể gây độc cho tế bào, dẫn đến

ức chế sinh trƣởng của vi khuẩn. Vì vậy để duy trì sự sinh trƣởng của chủng, chất

dinh dƣỡng tiếp tục đƣợc bổ sung lần ba tại thời điểm sau 6 giờ lên men. Sau khi bổ

sung nguồn chất dinh dƣỡng lần thứ ba, tế bào tiếp tục sinh trƣởng và quá trình lên

men đƣợc kết thúc sau 3 giờ cảm ứng khi OD600 đạt 18,3. Nhƣ vậy, khi dOT giảm

xuống tại thời điểm 2 và 4 giờ chứng tỏ nguồn dinh dƣỡng bị cạn kiệt, gây ra sự suy

giảm khả năng sinh trƣởng của tế bào. Khi bổ sung các thành phần glucose và cao

nấm men thì sự sinh trƣởng của vi khuẩn lại đƣợc phục hồi. Bên cạnh đó, khi cảm

ứng ở thời điểm OD600 đạt từ 15 đến 20 cho kết quả mật độ tế bào ở thời điểm thu

mẫu cao gấp 3 lần so với cảm ứng ở thời điểm OD600 đạt từ 0,4 đến 0,8 ở hệ thống

lên men 5 lít tại Viện Công nghệ sinh học. Điều này có thể đƣợc lý giải là do khi

thay đổi 2 hệ thống lên men khác nhau và điều kiện tại phòng thí nghiệm tại Viện

Công nghệ sinh học khác phòng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP, đặc biệt thời điểm

giá trị OD600 cảm ứng cũng ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng của tế bào. Điện di

kiểm tra sự biểu hiện protein IL-2 tái tổ hợp sau 1, 2, 3 giờ cảm ứng trên gel

44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

polyacrylamide 12,6% (Hình 3.4).

Hình 3. 4: Điện di Protein tổng số khi biểu hiện chủng E. coli BL21-IL2 trong

hệ thống lên men 10 lít đợt 1

M: Thang protein chuẩn; Đƣờng chạy 1, 2, 3: Protein tổng số sau 1, 2, 3 giờ cảm

ứng IPTG; Đƣờng chạy 4: Protein tổng số biểu hiện trong bình tam giác.

Kết quả trên Hình 3.4 cho thấy sự biểu hiện IL-2 ở cùng thời điểm sau 3 giờ

cảm ứng (thời điểm thu mẫu) thì kết quả cho thấy IL-2 tổng hợp trong hệ thống lên

men 10 lít (đƣờng chạy 3) đạt khoảng 0,21 mg/mlkém hơn 3 lần so với lên men

trong bình tam giác (đƣờng chạy 4) mặc dù OD600 tại thời điểm thu mẫu trong hệ

thống lên men 10 lít cao hơn gấp khoảng hơn 9 lần (OD600 đạt khoảng 18) so với lên

men trong bình tam giác (OD600 đạt khoảng 2). Điều kiện lên men trong bình tam

giác không có sự bổ sung các chất dinh dƣỡng trong quá trình sinh trƣởng của

chủng tái tổ hợp nhƣng protein IL-2 lại đƣợc tổng hợp mạnh hơn so với hệ thống

lên men 10 lít. Điều này chứng tỏ việc bổ sung cơ chất nhiều lần có thể làm tăng

sinh khối tế bào nhƣng ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp protein do tế bào tập

trung vào quá trình sinh trƣởng hơn là tập trung vào sự biểu hiện của protein. Vì

vậy, để tối ƣu quá trình biểu hiện IL-2 trong hệ thống lên men 10 lít đạt tiêu chuẩn

GMP, chúng tôi tiến hành lên men đợt 2 với sự thay đổi một số thông số trong quá

45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trình lên men.

3.1.4. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 ở hệ thống lên men 10 lít đợt 2

Trong quá trình lên men lần hai này, chúng tôi đã thay đổi một số điều kiện

nhƣ giảm nồng độ IPTG cảm ứng xuống 0,1 mM, giảm bổ sung dinh dƣỡng xuống

2 lần và tăng thời gian thu mẫu lên 6 giờ sau cảm ứng với mục đích thu đƣợc nhiều

protein IL-2 hơn. Nồng độ chất cảm ứng IPTG đƣợc giảm xuống chỉ còn 0,1 mM

với mục đích giảm sự ức chế sinh trƣởng của tế bào do nồng độ IPTG cao có thể

gây độc đối với tế bào. Cùng với việc giảm số lần bổ sung dinh dƣỡng và tăng thời

gian thu mẫu để tế bào có thể sử dụng hết nguồn dinh dƣỡng bổ sung và tăng quá

trình tổng hợp protein đích IL-2, tránh trƣờng hợp nguồn dinh dƣỡng còn dƣ nhiều

ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy, gây khó khăn cho quá trình tiền tinh chế và tinh chế

về sau.

Quá trình lên men 10 lít đợt 2 đƣợc tiến hành ở điều kiện nhiệt độ nhiệt độ

47ºC có bổ sung dinh dƣỡng hai lần vào các thời điểm lên men 3 và 5,5 giờ, đồng

thời cảm ứng IPTG nồng độ cuối cùng 0,1mM khi OD600 đạt 16,3 tại thời điểm lên

men sau 5,5 giờ. Quá trình lên men kết thúc sau 6 giờ cảm ứng (tƣơng ứng sau 10,5

giờ lên men). Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng E. coli BL21-IL-2 trong hệ thống

46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

lên men 10 lít đợt 2 đƣợc thể hiện trên Hình 3.5.

Hình 3. 5: Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng tái tổ hợp E. coli BL21-IL2 đợt 2

Đƣờng cong sinh trƣởng thể hiện trên Hình 3.5 cho thấy chủngE. coli BL21-

IL2 vẫn phát triển tốt mặc dù có sự khác biệt về quy trình biểu hiện IL-2 so với đợt

1 khi giảm sự bổ sung dinh dƣỡng xuống 2 lần và giảm nồng độ chất cảm ứng IPTG

xuống 0,1 mM. Theo quy trình này thời gian thu mẫu đã đƣợc tăng lên từ 3 giờ lên

6 giờ và giá trị OD600 thu mẫu đạt khoảng OD600 là 18. Nhƣ vậy, quy trình này sẽ

tiết kiệm đƣợc chi phí lên men do giảm thành phần bổ sung dinh dƣỡng và giảm

nồng độ IPTG. Để kiểm tra khả năng biểu hiện của chủng này chúng tôi đã điện di

kiểm tra sản phẩm lên men trên SDS-PAGE với các mẫu lên men thu đƣợc ở các

47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

giờ khác nhau sau khi cảm ứng (Hình 3.6).

Hình 3. 6: Điện di Protein tổng số khi biểu hiện chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ

thống lên men 10 lít đợt 2

M: Thang protein chuẩn; Đƣờng chạy 1-6: Protein tổng số lên men sau 1-6 giờ cảm

ứng IPTG; Đƣờng chạy 7: Protein tổng số biểu hiện trong bình tam giác.

Kết quả trên Hình 3.6 cho thấy lƣợng protein đƣợc tổng hợp tăng dần sau khi

cảm ứng IPTG (từ 1 đến 6 giờ) và gần nhƣ tƣơng đƣơng với lƣợng protein đƣợc

biểu hiện trong bình tam giác theo nghiên cứu của nhóm tác giả Lê Thị Lan Anh

(2013). Hàm lƣợng protein IL-2 tái tổ hợp thu đƣợc sau 6 giờ cảm ứng đƣợc xác

định bằng phƣơng pháp ELISA đạt khoảng 0,86 mg/ml tƣơng ứng với băng protein

IL-2 trên Hình 3.6 (đƣờng chạy 6), cao gấp 4 lần so với hàm lƣợng protein IL-2 lên

men 10 lít đợt 1 và gấp 1,4 lần so với hàm lƣợng protein IL-2 biểu hiện trong bình

tam giác của nhóm tác giả Lê Thị Lan Anh (2013). Kết quả tối ƣu quá trình lên men

này trong hệ thống lên men 10 lít tƣơng đối tốt, vì vậy quy trình lên men này hoàn

toàn phù hợp để tiến hành lên men quy mô lớn hơn trong điều kiện đạt tiêu chuẩn

48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

GMP.

3.2. Xử lý tiền tinh chế thu hồi IL-2 từ sinh khối tế bào lên men

Sinh khối tế bào của 2 đợt lên men 10 lít nói trên đƣợc xử lý theo quy trình

tiền tinh chế đã trình bày ở phần phƣơng pháp. Mục đích của quá trình tiền tinh chế

là để loại bỏ một số protein tạp trƣớc khi đƣa lên hệ thống HPLC tinh chế. Các

protein tạp đƣợc loại bỏ bằng cách tủa với GuHCl ở các nồng độ khác nhau và có

thể loại bỏ đƣợc đa số các protein không mong muốn. Kết quả kiểm tra quá trình

tiền tinh chế của các sản phẩm lên men đƣợc trình bày trên Hình 3.7.

Hình 3. 7: Kiểm tra sản phẩm tiền tinh chế của 2 đợt lên men trong hệ thống 10 lít

M: Thang protein chuẩn, Đƣờng chạy 1: IL-2 chuẩn, Đƣờng chạy 2 - 3: sản phẩm

tiền tinh chế protein IL-2 thu đƣợc sau đợt lên men 1 – 2, Đƣờng chạy 4: sản phẩm

tiền tinh chế protein IL-2 biểu hiện trong bình tam giác.

Kết quả kiểm tra sản phẩm tiền tinh chế của 2 đợt lên men trong hệ thống lên

men 10 lít trên Hình 3.7 cho thấy đa số các protein tạp không mong muốn đã đƣợc

loại bỏ. Sản phẩm IL-2 (băng có kích thƣớc khoảng 15 kDa) tƣơng đối đậm và rõ

nét hơn rất nhiều so với các băng protein khác (đƣờng chạy 2, 3, 4). Khi so sánh hai

đợt lên men với nhau cho thấy kết quả mẫu lên men đợt 1 (đƣờng chạy 2) lƣợng

protein IL-2 thu đƣợc ít hơn so với lên men đợt 2 (đƣờng chạy 3) và vẫn còn nhiều

49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

protein tạp hơn. Bên cạnh đó, kết quả trên còn cho thấy sản phẩm tiền tinh chế

protein IL-2 đợt 2 (đƣờng chạy 3) tƣơng đối giống với sản phẩm tiền tinh chế mẫu

lên men trong bình tam giác(không có sự bổ sung chất dinh dƣỡng - đƣờng chạy 4).

Việc giảm số lần bổ sung dinh dƣỡng trong quá trình lên men có thể dẫn đến giảm

sự biểu hiện các protein khác. Có thể nói,việc thay đổi một số điều kiện của quy

trình lên men đợt 2 là hoàn toàn phù hợp và cho kết quả cao, không khác biệt nhiều

so với kết quả thực hiện trong nghiên cứu ở quy mô nhỏ trƣớc đó. Nhƣ vậy, chất

lƣợng của đợt lên men thứ 2 một lần nữa đƣợc khẳng định là rất tốt và đạt tiêu

chuẩn tiến hành các bƣớc tiền tinh chế cũng nhƣ tinh chế quy mô lớn trong điều

kiện đạt tiêu chuẩn GMP.

3.3. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Kết thúc quá trình xử lý tiền tinh chế, IL-2 đƣợc hòa tan trong dung dịch chứa

50 mM Tris, 10 mM EDTA, 7 M GuHCl và 15 mM 2- mecaptoethanol (có tác dụng

ngăn cản sự hình thành của liên kết disulfide) bằng cách khuấy nhẹ bằng máy khuấy

từ qua đêm ở điều kiện 4ºC. Để giúp ổn định và bảo vệ chất giá có bản chất gel

silica trong cột sắc ký thì giá mẫu protein sau xử lý tiền tinh chế đƣợc bổ sung TFA

để hạ pH của dung dịch xuống còn khoảng 2-3 (pH môi trƣờng thấp ngăn cản sự

hình thành các nhóm chức có khả năng ion hóa của chất giá). Lý do lựa chọn TFA

mà không phải một loại acid khác là vì:(i) TFA có độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại khá

thấp nên không ảnh hƣởng tới kết quả đo sự phát hiện của protein bằng độ hấp thụ

quang học, (ii) TFA là một chất dễ bay hơi, dễ dàng loại bỏ trong quá trình đông

khô, rất thuận tiện cho việc sản xuất chế phẩm thuốc. Dịch IL-2 sau đó đƣợc ly tâm

10000 vòng trên phút để loại bỏ các thành phần tủa còn sót lại của quá trình xử lý

tiền tinh chế và thu dịch nổi để chuẩn bị cho việc đƣa mẫu lên cột HPLC. Quá trình

tinh chế dịch IL-2 tái tổ hợp đƣợc tiến hành nhƣ đã mô tả trong phần phƣơng pháp.

Kết quả tinh chế đƣợc thể hiện chi tiết trên sắc ký đồ HPLC và kết quả điện di kiểm

50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tra sản phẩm IL-2 tinh chế trên Hình 3.9.

Hình 3. 8: Sắc ký đồ tinh chế IL-2 trên hệ thống HPLC

Dựa trên sắc ký đồ ta thấy xuất hiện một đỉnh hấp thụ (peak) lớn nhất tại thời

điểm phút thứ 9,4 đến phút thứ 10, thu đƣợc 2 phân đoạn32 và 33 tƣơng ứng với

đỉnh hấp thụ là 670 mAU và 280 mAU. Kết quả này đồng nhất ở các lần tinh chế

tiếp theo cho thấy tính ổn định và khả năng phân tách tốt của mẫu xử lý trên cột bán

điều chế Bio wide pore C5. Ngoài ra, trên sắc ký đồ còn xuất hiện một vài peak phụ

tách nhau hoàn toàn ở vài phút trƣớc đó, chúng tôi đã kiểm tra trong các lần tinh chế

trƣớc và thấy rằng đây là một số tạp chất cần loại bỏ, điều này chứng tỏ protein IL-2

đã đƣợc phân tách ra khỏi các loại protein tạp khác từ mẫu xử lý thô. Hai phân đoạn

51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

32 và 33 đƣợc thu lại để kiểm tra bằng SDS-PAGE và Western Blotting.

Hình 3. 9: Kết quả kiểm tra protein IL-2 sau khi tinh sạch bằng hệ thống HPLC

A: Điện di SDS-PAGE và nhuộm bạc. B: Kết quả lai miễn dịch Western blotting.

M: Thang protein chuẩn, Đƣờng chạy 1 - 2: Dịch protein trong phân đoạnsố32 - 33

thu đƣợc sau khi tinh sạch.

Kết quả trên Hình 3.9 cho thấy hai băngđiện di phân đoạn 32 và 33 có kích

thƣớc khoảng gần 15 kDa đúng với kích thƣớc tính toán, tuy chúng có độ đậm khác

nhau nhƣng điều đặc biệt là chúng đều có độ tinh sạch cao (không xuất hiện bất kỳ

băng protein nào khác ngoài IL-2) đƣợc thể hiện rõ bởi phản ứng có độ nhạy cao

SDS-PAGE nhuộm bạc (Hình 3.9 A). Bằng kỹ thuật lai miễn dịch Western Blotting,

sử dụng kháng thể đặc hiệu với IL-2 cho thấy băng protein duy nhất chính là IL-2

(Hình 3.9 B). Hàm lƣợng protein của hai phân đoạn 32 và 33 đƣợc xác định bằng

phƣơng pháp ELISA là 0,667 mg/mL và 0,275 mg/mL tƣơng ứng với sự khác nhau

về độ cao của hai đỉnh hấp thụ trên sắc ký đồ. Điều này hoàn toán đúng theo định

luật Beer, độ hấp thụ ánh sáng quang học của một dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ

của dung dịch [38]. Vì vậy, quy trình tinh chế đƣợc áp dụng là phù hợp để tinh chế

52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

mẫu protein IL-2 và có thể sử dụng để tiến hành ở các lần tinh chế tiếp theo.

3.4. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dòng tế bào CTLL2

Trƣớc khi xác định hoạt tính sinh học riêng của sản phẩm IL-2 tái tổ hợp sau

khi tinh sạch, hàm lƣợng protein có trong hai mẫu phân đoạn 32 và 33 đƣợc xác

định bằng phƣơng pháp ELISA và đƣa về cùng nồng độ là 5 µg/mL (bằng với nồng

độ của IL-2 chuẩn (Roche- Hoa Kỳ)) tạo thành dung dịch gốc cho thí nghiệm. Để

bắt đầu thí nghiệm dung dịch gốc đƣợc chúng tôi đƣa về nồng độ ban đầu là 100

ng/mL, từ đó mỗi giếng thí nghiệm chúng tôi pha loãng mẫu 3 lần, tổng số giếng thí

nghiệm cho một lần chạy mẫu là 11 giếng. Mỗi mẫu đƣợc lặp lại 3 lần để đảm bảo

độ chính xác.

Hình 3. 10: Biểu đồ thể hiện sự kích thích tăng sinh tế bào CTLL-2 của các mẫu

IL-2 tái tổ hợp

(trích từ kết quả phân tích dữ liệu bằng phần mềm GraphPad Prism 5)

Sự kích thích tăng sinh tế bào CTLL2 của các mẫu IL2 tái tổ hợp sau khi tinh

53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chế đƣợc thể hiện trên Hình 3.10, cho thấy cả hai mẫu IL-2 tái tổ hợp do chúng tôi

tạo ra và mẫu IL-2 chuẩn (Roche) đều có khả năng hoạt hóa và duy trì sự sống cho tế bào CTLL2. Giá trị R2 của 3 mẫu đạt từ 0,95 đến 0,99, chứng tỏ thí nghiệm xác

định hoạt tính có độ chuẩn xác cao. Mẫu thí nghiệm S1 (phân đoạn 32) và S2 (phân

đoạn 33) có chỉ số EC50 gần tƣơng đƣơng nhau, lần lƣợt đạt 0,4987 và 0,4367.Trong

khi đó, mẫu IL-2 chuẩn của hãng Roche có EC50 cao hơn hai mẫu thí nghiệm đạt

0,6352. Nhƣ vậy, hai mẫu IL2 tái tổ hợpcó hoạt tính sinh học cao hơn mẫu IL-2

chuẩn của Roche(do EC50 càng thấp thì hoạt tính sinh học càng cao).

Sau khi quy đổi đơn vị hoạt tính sinh họcriêng theo chuẩn quốc tế (công thức

quy đổi đã đƣợc trình bày ở phần phƣơng pháp), kết quả quy đổi đƣợc thống kê ở

Bảng 3.2. Các mẫu IL-2 tái tổ hợp do Việt Nam tạo ra có hoạt tính sinh học riêng tƣơng đối tốt S1 (13,19 x 106 IU/mg) và S2 (14,19 x 106 IU/mg). Mẫu IL-2 của Roche có hoạt tính riêng thấp hơn chỉ đạt 10,36 x 106 IU/mg.

Bảng 3. 2: Giá trị EC50 và hoạt tính riêng của các mẫu IL-2

Giá trị Hoạt tính riêng Hoạt tính riêng Tên mẫu EC50 (U/mg) (IU/mg) Giá trị R2 (ng/mL)

rhIL2-desAlaS1 0.4987 2.00 x 106 13.19 x 106 0.95

rhIL2-desAlaS2 0.4637 2.15 x 106 14.19 x 106 0.99

IL-2 chuẩn (Roche) 0.6352 1.57 x 106 10.36 x 106 0.99

rhIL2 1,3 x 105 8,90 x 105 7.4 -

Proleukin (hoạt tính - 16.36 x 106 - - do hãng công bố)

Sản phẩm protein IL-2 ngƣời tái tổ hợp dạng cải biến(ký hiệu rhIL2-desAla)

có trình tự axit amin hoàn toàn giống với sản phẩm Proleukin của Hoa Kỳ. Khi so

sánh với sản phẩm IL-2 pha nghiên cứu trƣớc thuộc đề tài nghiên cứu cấp nhà nƣớc

KC.04.21/06-10 (ký hiệu rhIL2), trình tự axit amin của sản phẩm này chỉ khác (ít

54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hơn) đúng một axit amin Alanine ở đầu N của phân tử, tuy nhiên hoạt tính của sản

phẩm này (14,19 x 106) cao gấp khoảng 14 lần so với sản phẩm của đề tài KC.04.21/06-10 (0,89 x 106) (Hình 3.11). Bên cạnh đó, khi so sánh với IL-2 chuẩn

của hãng Roche và sản phẩm thƣơng mại Proleukin, sản phẩm IL-2 tái tổ hợp của

Việt Nam có hoạt tính sinh học riêng tƣơng đƣơng với IL-2 chuẩn của hãng Roche và gần bằng sản phẩm thƣơng mại Proleukin (16,36 x 106 IU/mg)[12][51], tất cả

đƣợc thể hiện trên Hình3.11.

Hình 3. 11: So sánh hoạt tính sinh học riêng của các mẫu IL-2

3.5. Xác định độ tinh sạchcủa protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế bằng phần

mềm Quantity One

Phần mềm Quantity One của BioRad là phần mềm thông dụng và đƣợc sử

dụng nhiều trên thế giới để xác định độ đậm nhạt của các băng protein trên điện di

đồ. Để xác định đƣợc chính xác độ tinh khiết của protein IL-2, chúng tôi sử dụng

ảnh điện di trên gel polyacrylamide bằng kỹ thuật SDS – PAGE nhuộm Coomassie

và xử lý bằng phần mềm chuyên dụng Quantity One. Cách thao tác trên phần mềm

nhƣ đã trình bày trong phần phƣơng pháp. Kết quả thu đƣợc thể hiện trong Hình

55 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.12.

Hình 3. 12:Kiểm tra độ tinh sạch của protein IL-2 bằng QuantityOne

Hình3.12cho thấy xuất hiện duy nhất một đỉnh hấp phụ tƣơng ứng với vị trí

băng protein trên bản gel điện di. Mẫu IL-2 sau tinh chế khi quét chỉ phát hiện một

băng duy nhất ứng với băng protein IL-2 chứng tỏ mẫu có độ sạch khá cao.

Hình 3. 13: Kết quả độ tinh sạchcủa IL-2 xác định bằng phần mềm Quantity One

Từ kết quả phần mềm đƣa ra cho thấy, sản phẩm IL-2 tái tổ hợp có độ sạch

56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

99,3%. Nhƣ vậy IL-2 sau tinh chế đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết cho sản phẩmdạng

thuốc tiêm và truyền tĩnh mạch theo cơ quan quản lý Dƣợc phẩm và Thực phẩm

Hoa Kỳ (FDA).

3.6. Xác định hàm lƣợng nội độc tố trong sản phẩm IL-2 sau tinh chế

Để kiểm tra tính an toàn của sản phẩm IL-2 chúng tôi tiến hành xác định hàm

lƣợng nội độc tố trong mẫu protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế bằng LAL kit. Để

tăng độ tin cậy cho phép thử chúng tôi tiến hành lặp lại 3 lần và kết quả thu đƣợc

thể hiện trên Hình 3.14.

Hình 3. 14: Hình ảnh kết quả sau khi dừng phản ứng đông gel

Độ nhạy của dung dịch LAL đƣợc cung cấp là 0,25 EU/ml, có nghĩa là với

mẫu có nồng độ nội độc tố lớn hơn hoặc bằng 0,25 EU/ml sẽ cho kết quả dƣơng

tính (tạo gel). Ở mẫu đối chứng dƣơng (nội độc tố chuẩn CSE + LAL), sau khi ủ

37ºC trong 1 giờ cho kết quả dƣơng tính, dịch trong ống eppendorf chuyển sang

trạng thái gel và khi dốc ngƣợc 180º vẫn đọng lại ở đáy ống thể hiện rất rõ ràng trên

Hình 3.14. Ở mẫu đối chứng âm (dH20 tại công ty VABIOTECH + LAL) và mẫu

cần kiểm tra nội độc tố (sản phẩm IL-2 sau tinh chế + LAL) đều cho kết quả âm

tính, saukhi dừng phản ứng toàn bộ dịch vẫn ở trạng thái lỏng và khi dốc ngƣợc

180º thì chảy hoàn toàn xuống miệng ống, chứng tỏ dịch IL-2 sau tinh chế có nồng

độ nội độc tố nhỏ hơn 0,25 EU/ml. Cả 3 lần thí nghiệm đều cho kết quả nhƣ nhau

cho thấy tính ổn định cũng nhƣ đảm bảo chính xác mẫu protein thu đƣợc đáp ứng

57 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tiêu chuẩn của sản phẩm tiêm là nồng độ nội độc tố không quá 0,5 EU/ml.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Sau quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã hoàn thiện đƣợc quy trình sản xuất

protein IL-2, đáp ứng đƣợc yêu cầu về chất lƣợng tại điều kiện phòng sản xuất đạt

tiêu chuẩn GMP tại Công ty VABIOTECH.Một số kết quả cụ thể nhƣ sau:

1. ...................................................................................................................... Đ

ã biểu hiện thành công protein IL-2 tái tổ hợp dạng cải biếntrong hệ thống lên

men 10 lít,với điều kiện nhiệt độ là 47°C, bổ sung hai lần dinh dƣỡng (glucose

1% và cao nấm men 0,5%), cảm ứng IPTG 0,1 mM và thu mẫu sau 6 giờ cảm

ứng. Hàm lƣợng protein IL-2 thu đƣợc sau quá trình lên men đạt 0,86 mg/ml.

2. ...................................................................................................................... Đ

ã tinh chế thành công sản phẩm IL-2 bằng cột bán điều chế của hệ thống sắc

ký HPLC với hàm lƣợng protein IL-2 thu đƣợc sau quá trình tinh chế đạt

0,667 mg/ml.

3. ...................................................................................................................... Đ ã xác định đƣợc hoạt tính sinh học của sản phẩm IL-2 đạt 14,19 x 106 IU/mg.

4. ...................................................................................................................... Đ

ã xác định đƣợc độ sạch của sản phẩm IL-2 là 99,3% và đánh giá đƣợc hàm

lƣợng nội độc tố của IL-2 nhỏ hơn 0,25 EU/ml, đáp ứng tiêu chuẩn về độ sạch

và độ an toàn của sản phẩm tiêm sử dụng trong điều trị ung thƣ.

Kiến nghị

Từ những kết quả đạt đƣợc tôi xin đƣa ra một số kiến nghị sau:

1. ...................................................................................................................... X

ây dựng công thức bán thành phẩm để pha chế IL-2 dạng thƣơng phẩm

2. ...................................................................................................................... K

iểm tra các tiêu chí an toàn của sản phẩm IL-2 trên tế bào động vật nhƣ trên

58 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chuột và thỏ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Anh LTL, Anh LPH, Khoa ĐT, Hong LTT, Nguyet PT, Thuy ĐT, Chien LA, & Hai

TN. (2013). "Nghiên cứu tối ƣu sự biểu hiện gen mã hóa Interleukin-2 trong

Escherichia coli.", pp.19–23.

2. Đặng Trần Hoàng, Đức, V. M., Phùng Thu Nguyệt, & Trƣơng Nam Hải. (2005).

"Biểu hiện gen Interleukin-2 của ngƣời bị đột biến tại các điểm glycosyl hóa và gốc

cystein 125 trong Escherichia coli", 3(2), pp.149–154.

3. Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phƣơng, Vũ Minh Đức, Đặng Trần Hoàng, & Trƣơng Nam

Hải. (2007). "Xác định hoạt tính sinh học của interleukin-2 tái tổ hợp bằng phép thử

sinh học trên tế bào CTLL2", 5(2), pp.157–161.

Tiếng Anh

4. Asgarpanah J. (2010). "Bioassay Methods useful to select the natural product cancer

chemopreventive agents". Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 0(0), pp.71–

71.

5. Bhagwat A. S., Sohail A., & Roberts R. J. (1986). "Cloning and characterization of

the dcm locus of Escherichia coli K-12.". Journal of Bacteriology, 166(3), pp.751–

755.

6. Boyman O., & Sprent J. (2012). "The role of interleukin-2 during homeostasis and

activation of the immune system". Nature Reviews Immunology, 12(3), pp.180–

190.

7. Caligiuri M. A., Murray C., Robertson M. J., Wang E., Cochran K., Cameron C.,

Schow P., Ross M. E., Klumpp T. R., & Soiffer R. J. (1993). "Selective modulation

of human natural killer cells in vivo after prolonged infusion of low dose

recombinant interleukin 2". The Journal of Clinical Investigation, 91(1), pp.123–

132.

8. Chu M. B., Fesler M. J., Armbrecht E. S., Fosko S. W., Hsueh E., Richart J. M.,

Chu M. B., Fesler M. J., Armbrecht E. S., Fosko S. W., Hsueh E., & Richart J. M.

59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

(2013). "High-Dose Interleukin-2 (HD IL-2) Therapy Should Be Considered for

Treatment of Patients with Melanoma Brain Metastases, High-Dose Interleukin-2

(HD IL-2) Therapy Should Be Considered for Treatment of Patients with Melanoma

Brain Metastases". Chemotherapy Research and Practice, Chemotherapy Research

and Practice, 2013, 2013, pp.e726925.

9. Cockshott A. R., & Bogle I. D. L. (1999). "Modelling the effects of glucose feeding

on a recombinant E. coli fermentation". Bioprocess Engineering, 20(1), pp.83–90.

10. Devos R., Plaetinck G., Cheroutre H., Simons G., Degrave W., Tavernier J.,

Remaut E., & Fiers W. (1983). "Molecular cloning of human interleukin 2 cDNA

and its expression in E. coli". Nucleic Acids Research, 11(13), pp.4307–4323.

11. Eckenberg, R., Moreau, J.L., Melnyk, O., & Thèze, J. (2000). "IL-2R beta agonist

P1-30 acts in synergy with IL-2, IL-4, IL-9, and IL-15: biological and molecular

effects.", 1950(165), pp.4312–4318.

12. Eton O., Rosenblum M. G., Legha S. S., Zhang W., Jo East M., Bedikian A.,

Papadopoulos N., Buzaid A., & Benjamin R. S. (2002). "Phase I trial of

subcutaneous recombinant human interleukin-2 in patients with metastatic

melanoma". Cancer, 95(1), pp.127–134.

13. Ferlay J., Soerjomataram I., Dikshit R., Eser S., Mathers C., Rebelo M., Parkin D.

M., Forman D., & Bray F. (2013). "Cancer incidence and mortality worldwide:

Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012: Globocan 2012".

International Journal of Cancer, 136(5), pp.E359–E386.

14. Ferlay, J., Shin, H.-R., Bray F, Forman, D., Mathers, C., & Parkin, D.M. (2010).

"Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008", 127,

pp.2893–2917.

15. Francis D. M., & Page R. (2010). "Strategies to optimize protein expression in E.

coli". Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et

Al.], Chapter 5, pp.Unit 5.24.1–29.

16. Gaffen S. L., & Liu K. D. (2004). "Overview of interleukin-2 function, production

60 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

and clinical applications". Cytokine, 28(3), pp.109–123.

17. Grodberg J., & Dunn J. J. (1988). "ompT encodes the Escherichia coli outer

membrane protease that cleaves T7 RNA polymerase during purification". Journal

of Bacteriology, 170(3), pp.1245–1253.

18. Haacke A., Fendrich G., Ramage P., & Geiser M. (2009). "Chaperone over-

expression in Escherichia coli: apparent increased yields of soluble recombinant

protein kinases are due mainly to soluble aggregates". Protein Expression and

Purification, 64(2), pp.185–193.

19. Hammerling U., Henningsson A. C., & Sjödin L. (1992). "Development and

validation of a bioassay for interleukin-2". Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis, 10(8), pp.547–553.

20. Janice P. Dutcher. (2002, November 1). "Current Status of Interleukin-2 Therapy

for Metastatic Renal Cell Carcinoma and Metastatic Melanoma: Page 2 of 2 |

Cancer Network".

21. Ju G., Collins L., Kaffka K. L., Tsien W. H., Chizzonite R., Crowl R., Bhatt R., &

Kilian P. L. (1987). "Structure-function analysis of human interleukin-2.

Identification of amino acid residues required for biological activity". The Journal

of Biological Chemistry, 262(12), pp.5723–5731.

22. Keilholz U., Conradt C., Legha S. S., Khayat D., Scheibenbogen C., Thatcher N.,

Goey S. H., Gore M., Dorval T., Hancock B., Punt C. J., Dummer R., Avril M. F.,

Bröcker E. B., Benhammouda A., Eggermont A. M., & Pritsch M. (1998). "Results

of interleukin-2-based treatment in advanced melanoma: a case record-based

analysis of 631 patients". Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the

American Society of Clinical Oncology, 16(9), pp.2921–2929.

23. Kush Sachdeva, Brendan Curti, & Bagi RP Jana. (2015). "Renal Cell Carcinoma:

Practice Essentials, Background, Pathophysiology".

24. Liang S. M., Thatcher D. R., Liang C. M., & Allet B. (1986). "Studies of structure-

activity relationships of human interleukin-2". The Journal of Biological Chemistry,

61 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

261(1), pp.334–337.

25. Losen M., Frölich B., Pohl M., & Büchs J. (2004). "Effect of oxygen limitation

and medium composition on Escherichia coli fermentation in shake-flask cultures".

Biotechnology Progress, 20(4), pp.1062–1068.

26. MacWilliams M. P., & Bickle T. A. (1996). "Generation of new DNA binding

specificity by truncation of the type IC EcoDXXI hsdS gene.". The EMBO Journal,

15(17), pp.4775–4783.

27. Moffatt BA, Dunn JJ, & Studier FW. (1984). "Nucleotide sequence of the gene for

bacteriophage T7 RNA polymerase", 173(2), pp.265–269.

28. Monod J. (1949). "The Growth of Bacterial Cultures". Annual Review of

Microbiology, 3(1), pp.371–394.

29. Morgan D. A., Ruscetti F. W., & Gallo R. (1976). "Selective in vitro growth of T

lymphocytes from normal human bone marrows". Science (New York, N.Y.),

193(4257), pp.1007–1008.

30. Oona Mcpolin. (2009). "Preview - An Introduction to HPLC for Pharmaceutical

Analysis - Preview_book_introduction_HPLC.pdf".

31. Peter Boyle B. L. (2008). World Cancer Report.

32. R J Robb R. M. K. (1984). "Amino acid sequence and post-translational

modification of human interleukin 2". Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America, 81(20), pp.6486–90.

33. Roche S. (2010, December). Interleukin-2, human (hIL-2) recombinant (E. coli).

34. Rosenberg S. A., Yang J. C., Topalian S. L., Schwartzentruber D. J., Weber J. S.,

Parkinson D. R., Seipp C. A., Einhorn J. H., & White D. E. (1994). "Treatment of

283 consecutive patients with metastatic melanoma or renal cell cancer using high-

dose bolus interleukin 2". JAMA, 271(12), pp.907–913.

35. Safar M., & Junghans R. P. (2000). "Interleukin 2 maintains biologic stability and

sterility over prolonged time". Immunopharmacology, 49(3), pp.419–423.

36. Schnaitman C. A., & Austin E. A. (1990). "Efficient incorporation of galactose

into lipopolysaccharide by Escherichia coli K-12 strains with polar galE

62 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

mutations.". Journal of Bacteriology, 172(9), pp.5511–5513.

37. Sim M., Seok H.-S., & Kim J. (2013). "A Next-generation Sequence Clustering

Method for E. Coli through Proteomics-genomics Data Mapping". Procedia

Computer Science, 23, pp.96–101.

38. Swinehart D. F. (1962). "The Beer-Lambert Law". Journal of Chemical Education,

39(7), pp.333.

39. Taniguchi T., Matsui H., Fujita T., Takaoka C., Kashima N., Yoshimoto R., &

Hamuro J. (1992). "Structure and expression of a cloned cDNA for human

interleukin-2. 1983". Biotechnology (Reading, Mass.), 24, pp.304–309.

40. Tincati C., d’Arminio Monforte A., & Marchetti G. (2009). "Immunological

mechanisms of interleukin-2 (IL-2) treatment in HIV/AIDS disease". Current

Molecular Pharmacology, 2(1), pp.40–45.

41. Titov K. S., Kiselevskii M. V., Demidov L. V., Mikhailova I. N., Shubina I. Z.,

Rodionova L. M., Sinel’nikov I. E., Topol’ K. Y., & Gritsai A. N. (2009). "Use of

recombinant interleukin-2 for intrapleural therapy of tumor-associated pleurisy".

Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 148(5), pp.794–796.

42. Ulrik Mouritzen, Christiance Voit. (2012). "Neoadjuvant treatment of cancer with

proleukin".

43. WHO. (2004, May 28). 1st Standard for INTERLEUKIN 2 (Human, Jurkat

derived) NIBSC code: 86/504.

44. William Bowers. (2001). "CELL-MEDIATED IMMUNITY: Cell interactions in

specific immune responses".

45. Yin J., Li G., Ren X., & Herrler G. (2007). "Select what you need: a comparative

evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems

for foreign genes". Journal of Biotechnology, 127(3), pp.335–347.

46. DrugBank (Ed.). (2013). "Aldesleukin". In DrugBank.

47. "Renal Cell Cancer Treatment". (2015). National Cancer Institute.

48. "Melanoma Treatment". (2015). National Cancer Institute.

49. "World Health Organization, World Cancer Report 2014". (2014). SEARO.

50. "Melanoma - Cancer Council Australia". (2015).

63 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

51. DrugBank (Ed.). (2015, November 28). "Aldesleukin". In DrugBank.

Internet

52. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/

53. http://www.cancer.gov/about-cancer/what-is-cancer

54. http://www.cancerresearch.org/cancer-immunotherapy/

55. http://vietbao.vn/Suc-khoe/Canh-giac-voi-benh-ung-thu-than/40127601/248/

56. http://www.newhealthadvisor.com/Renal-Cell-Carcinoma-Staging.html

57. http://www.melanomacenter.org/basics/statistics.html

58. http://www.atcc.org/products/all/TIB-214.aspx

59. http://www.ispe.org/gmp-resources/what-is-gmp

60. http://www.isovietnam.com.vn/tu-van-quan-ly-doanh-nghiep/dao-tao-tu-van-gdp-

gpp/95-tieu-chuan-gmp-glp-gsp-gdp-gpp.html

61. http://vesinhantoanthucpham.com.vn/lich-su-hinh-thanh-san-xuat-tot-gmp

62. http://www.vinmec.com/tin-tuc-hoat-dong/so-luoc-tong-quan-tinh-hinh-ung-thu-

tai-viet-nam-a404.html

63.http://www.nihbt.org.vn/tin-trong-nuoc/sung-sot-vi-benh-nhan-ung-thu-tang-

nhanh/p124i6718.html

64.http://www.nhandan.com.vn/mobile/_mobile_suckhoe/_mobile_tintucsk/item/2820

1702.html

65.http://info.ebioscience.com/bid/78957/What-does-ED50-Mean

66. http://www.cancer.gov/types/skin/hp/skin-genetics-pdq

64 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

67. http://sbc-vietnam.com/Tin-tuc/YEAST-EXTRACT-MUA-O-%C4%90AU.aspx

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌCLIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

1. Le Phuong Hoang Anh, Dao Trong Khoa, Nguyen Thi Minh Thu, Phung Thu

Nguyet, Phan Thi Thanh Huyen, Truong Nam Hai (2015). Purification of

recombinant human interleukin-2. National Conference Vietnam Association of

Biochemistry. 74.

2. Lê Phƣơng Hoàng Anh, Nguyễn Thị Minh Thu, Đào Trọng Khoa, Phùng Thu

Nguyệt, Trần Ngọc Tân, Lƣu Anh Chiến, Đoàn Thị Thủy, Trƣơng Nam Hải

(2015). Tinh chế và xác định hoạt tính sinh học của interleukin-2 ngƣời tái tổ

hợp dạng cải biến. Hội nghị khoa học kỷ niệm 40 năm (1975-2015) thành lập

Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam. 13.

3. Nguyễn Thị Minh Thu, Lê Phƣơng Hoàng Anh, Đào Trọng Khoa, Trần Ngọc

Tân, Nguyễn Minh Nga, Lƣu Anh Chiến, Đoàn Thị Thủy, Phùng Thu Nguyệt,

Trƣơng Nam Hải (2015). Nghiên cứu tổng hợp interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp

trong hệ thống lên men 10 (lít) theo tiêu chuẩn GMP. Tạp chí Công nghệ Sinh

65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

học 13(3): 1-10.

PHỤ LỤC

1. ...................................................................................................................... P

hụ lục I.Trình tự vector pET22b(+) mang gen il-2 cải biến loại alanine ở đầu N

66 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

(ký hiệu pET22_IL-2_desAla)

2. ...................................................................................................................... P

67 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hụ lục II.Hƣớng dẫn thực hành tốt sản xuất sinh phẩm

68 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn