Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN HÀ XUYÊN

Nghiên cứ u sả n xuấ t, tinh sa ̣ch Pfu DNA polymerase tá i tổ hơ ̣p từ Escherichia coli

i Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố

Tác giả

trong bất kỳ công trình nào khác.

Nguyễn Hà Xuyên

ii Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới TS. Lê Quang

Hòa, trưởng phòng Kỹ thuật Gen, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực

phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người thầy đã luôn hướng dẫn, định hướng

và giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trường Đại học Thái Nguyên cũng

như các thầy cô thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, các thầy cô Viện Công

nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giảng dạy

và truyền thụ cho tôi kiến thức chuyên môn để thực hiện luận văn này.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cô chị, các bạn đồng nghiệp và các em sinh

viên phòng Kỹ thuật Gen đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong qua trình làm

việc tại phòng thí nghiệm.

Xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bố mẹ những người sinh thành, nuôi dưỡng tôi là

chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn

tới anh chị, bạn bè tôi đã cổ vũ động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.

Một lần nữa tôi vô cùng cảm ơn.

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Học viên

Nguyễn Hà Xuyên

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

iii Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Tên viết tắt Tên đầy đủ

a.a Amino acid

APS Amonium persulphate

Bp Base pair

CBB Coomassie brilliant blue

DNA Pol Deoxyribonucleic acid Polymerase

Dntp Deoxynucleoside triphosphate

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr Ethidium bromide

EtOH Ethanol

IPTG Isopropyl-thio-β-D-galactoside

Kb Kilo base

KDa Kilo Dalton

KLPT Khối lượng phân tử

LB Luria – Bertani

OD Mật độ quang học (optical density)

PCR Polymerase chain reaction

PLysS plasmid plysS mã hóa cho T7 lysozyme

PMSF Phenyl methyl sulphonyl fluoride

RNA Ribonucleic acid

SDS Sodium dodecyl sulphate

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis

ssDNA Sợi đơn DNA (single stranded DNA)

TAE Tris-acetate-EDTA

TEMED N, N, N’, N’-tetramethyl ethylendiamine

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................................................... i

iv Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................................................. iii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................................................... iii

MỤC LỤC................................................................................................................................................... iv

DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ................................................................ vi

DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ................................................................ vii

MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................................... 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................................................... 2

1.1.

Tổng quan về DNA polymerase .................................................................................................... 2

1.1.1.

DNA polymerase ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn ............................................... 3

1.1.2.

Tổng quan về DNA polymerase bền nhiệt ............................................................................ 4

1.2.

Tổng quan về Pfu DNA polymerase ............................................................................................. 6

1.2.1.

Cấu trúc của Pfu DNA polymerase ....................................................................................... 6

1.2.2.

Cơ chế hoạt động sửa sai của Pfu DNA polymerase ............................................................ 8

1.2.3. Một số tính chất của Pfu DNA polymerase ........................................................................ 10

1.2.4. Ứng dụng của Pfu DNA polymerase .................................................................................. 13

1.2.5.

Tình hình nghiên cứu Pfu DNA polymerase tái tổ hợp ...................................................... 15

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 18

2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị ........................................................................................................... 18

2.1.1.

Vật liệu ................................................................................................................................ 18

2.1.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................................. 20

2.2.

Phương pháp ............................................................................................................................... 21

2.2.1.

Tách chiết plasmid .............................................................................................................. 21

2.2.2.

Nhân đoạn gen mã hóa cho Pfu DNA pol bằng phản ứng PCR .......................................... 21

2.2.3.

Điện di DNA trên gel agarose ............................................................................................. 23

2.2.4.

Tinh sạch bằng kit Wizard SV Gel ..................................................................................... 23

2.2.5. Ghép nối gen ...................................................................................................................... 23

2.2.6.

Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt ................................................ 24

2.2.7.

Xác định trình tự DNA ........................................................................................................ 25

2.2.8.

Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho Pfu DNA pol .................................................... 26

2.2.9.

Biểu hiện gen mã hóa cho Pfu DNA pol ............................................................................. 26

2.2.10. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE ........................................................... 26

2.2.11. Sắc ký ái lực qua cột amylose ............................................................................................. 27

2.2.12. Tinh sạch protein đuôi Histag bằng Ni-charged Magbeads ................................................ 28

2.2.13. Kiểm tra hoạt độ tổng hợp DNA của Pfu DNA pol tái tổ hợp ............................................ 28

v Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................................. 29

3.1. Xác định trình tự gen mã hóa cho Pfu DNA pol từ tế bào mang vector pET 11a ...................... 29

3.2.

Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho Pfu DNA pol ............................................................ 36

3.3. Xây dựng quy trình tạo vector biểu hiện ..................................................................................... 38

3.4.

Lựa chọn chủng biểu hiện gen mã hóa cho Pfu DNA pol ........................................................... 42

3.5.

Tinh sạch protein Pfu DNA pol tái tổ hợp .................................................................................. 44

3.6.

Thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp ........................................................................................ 47

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................................. 49

PHỤ LỤC………………………………………………………………………………………………...51

TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………………………………… 55

DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng Tiêu đề Trang

Bảng 1.1 So sánh độ chính xác của các DNA polymerase bền nhiệt trong 11

PCR

vi Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong luận văn 19

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen mã hóa Pfu DNA pol 22

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối ghép 24

Bảng 2.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 25

Bảng 2.5 Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE 27

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp 29

DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN

Hình Tiêu đề Trang

Hình1.1 Cấu trúc tổng thể của Pfu DNA polymerase 8

vii Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Hình 1.2 So sánh trình tự acid amin và cấu trúc của motif β –hairpin (vùng 9

exonulcease) và motif Y-GG/A (vùng ngón tay cái)

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động và sửa sai của Pfu DNA polymerase 11

Hình 3.1 Kết quả điện di kiểm tra DNA plasmid mang đoạn gen Pfu 32

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của đoạn gen mã hóa 31

cho Pfu DNA pol trong vector pET11a trên gel agarose 1%.

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen mã hóa Pfu 32

DNA pol bằng 2 cặp mồi T7- F/ Pfu - R1 và Pfu – F1/ T7- R

Hình 3.4 Kết quả giải trình tự đoạn gen mã hóa Pfu DNA pol từ vector pET11a tái 36

tổ hợp

Hình 3.5 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa Pfu DNA pol 38

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt Pfu và vector pMAL - c5X bằng enzyme 39

giới hạn trên gel agarose 1%

Hình 3.7 Kết quả PCR sàng lọc và tách chiết plasmid các dòng khuẩn lạc mang 41

plasmid pMAL c5X –Pfu điện di trên gel agarose 1%

Hình 3.8 Kết quả biểu hiện protein Pfu DNA pol trong tế bào E. coli BL21(DE3) 43

và E. coli BL21(DE3) pLysS điện di trên gel polyacrylamide 8%

Hình 3.9 Kết quả tinh sạch protein MBP – Pfu bằng xử lý nhiệt điện di trên gel 45

polyacrylamide 8%

Hình 3.10 Kết quả tinh sạch Pfu DNA pol tái tổ hợp điện di trên gel polycrylamide 46

Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp trên 47

gel agarose 1%

viii Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

MỞ ĐẦU

Hiện nay PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản một đoạn

DNA trong ống nghiệm lên hàng triệu bản sao. Kỹ thuật này có ứng dụng rất nhiều trong

các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau như: chẩn đoán bệnh

di truyền, bệnh nhiễm trùng, tách dòng gen và xác định huyết thống… Do tính chất lặp lại

nhiều chu kỳ phản ứng ở các nhiệt độ khác nhau, đặc biệt là sự biến tính DNA ở 95oC nên

PCR đòi hỏi phải có các enzyme DNA polymerase bền nhiệt để đảm bảo việc xúc tác quá

trình nhân bản DNA được thực hiện dễ dàng và đặc hiệu.

Pfu DNA polymerase được tách từ vi khuẩn cổ siêu ưa nhiệt Pyrococcus furiosus sinh

trưởng tối ưu ở 100°C. Pfu DNA polymerase cực kỳ bền nhiệt, vẫn giữ được hơn 95% hoạt

độ ban đầu ở 95°C trong một giờ. Ngoài hoạt tính tổng hợp mạch Pfu DNA polymerase

còn có hoạt tính đọc sửa 3’- 5’ exonuclease làm tăng độ chính xác của quá trình tổng hợp

DNA. Hiện nay Pfu DNA polymerase thương mại có xác suất gắn sai một nucleotide

khoảng 1,3.10-6. Độ chính xác trong quá trình tổng hợp DNA của Pfu DNA polymerase cao

hơn nhiều so với Taq DNA polymerase và được xem là một trong số ít enzyme có tốc độ

tổng hợp ít lỗi nhất trong tất cả các DNA polymerase bền nhiệt đã được nghiên cứu. Chính

vì vậy, Pfu DNA polymerase được sử dụng phổ biến để khuyếch đại các sản phẩm dùng

cho mục đích nhân dòng, biểu hiện hay nghiên cứu các đột biến cũng như tổng hợp gen

[25].

Pfu DNA polymerase đóng vai trò quan trọng trong phản ứng PCR nên việc thu nhận

enzyme này từ vi khuẩn ưa nhiệt trở thành một nhu cầu cấp thiết. Tuy vậy, việc thu nhận

chế phẩm enzyme trực tiếp từ các vi khuẩn ưa nhiệt là không đơn giản vì các vi khuẩn này

thường yêu cầu môi trường sinh trưởng đặc biệt, nhiệt độ sinh trưởng cao và enzyme quan

tâm chỉ được sản xuất ở một lượng rất thấp. Trên thế giới đã có nhiều các công trình khoa

học nghiên cứu và tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp nhưng vẫn gặp khó khăn do

sử dụng các biện pháp tinh sạch chưa tối ưu như Heparin có giá thành đắt [22], cột P11

phosphocellulose và cột mono Q qui trình sử dụng phức tạp [12]…. Ở Việt Nam cho đến

nay chỉ có công trình nghiên cứu sản xuất Pfu DNA pol từ E. coli của Giáo sư Phan Tuấn

1 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Nghĩa được thực hiện vào năm 2005 với qui trình tinh sạch qua sắc ký ái lực với Ni2+ và

Heparin Sepharose [1, 2]. Tuy nhiên Pfu DNA pol tạo ra lại ở dạng dung hợp với 20 a.a

của vector nên có thể ảnh hưởng đến khả năng kéo dài DNA trong phản ứng PCR và hơn

nữa qui tình tinh sạch bằng Heparin khá tốn kém mà lại không đặc hiệu. Trước những

nhược điểm và khó khăn trong việc tinh sạch để thu được Pfu DNA pol tinh khiết, hiện nay

có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm cải thiện khả năng hòa tan của protein tái tổ hợp

trong tế bào E. coli, cũng như khả năng tinh sạch cao khi sử dụng hệ biểu hiện tạo

hexahistidine-tagged maltose-binding protein qua việc sử dụng hệ vector biểu hiện pMAL

[5, 39]. PMAL là hệ vector biểu hiện cho phép protein tạo ra ở trạng thái tan do được dung

hợp với maltose - binding proein (MBP). Ngoài khả năng tạo dạng tan của protein, MBP có

ái lực với amylose nên có thể dễ dàng tinh sạch protein dung hợp qua viêc sử dụng cột

amylose. Điểm cắt của Factor Xa ngay trước Pfu DNA pol giúp hoàn nguyên Pfu DNA

pol. Bên cạnh đó việc sử dụng Histag để tinh sạch bằng Ni2+ ở đầu N lại không ảnh hưởng

đến hoạt tính của Pfu DNA tái tổ hợp [15]. Với những ưu điểm trên, chúng tôi sử dụng hệ

vector biểu hiện pMAL kết hợp đuôi His để thực hiện đề tài: “Nghiên cứ u sả n xuấ t, tinh sa ̣ch Pfu DNA polymerase tá i tổ hơ ̣p từ Escherichia coli’’ với mục tiêu sản xuất Pfu DNA polymerase chất lượng cao góp phần tích cực trong việc phục vụ các nghiên cứu về

sinh học phân tử trong nước.

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về DNA polymerase

2 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

DNA polymerase là nhóm enzyme xúc tác cho sự tổng hợp chuỗi

polydeoxyribonucleotide từ các cơ chất là DNA sợi đơn làm khuôn, cặp mồi, các

deoxyribonucleoside triphosphat (dNTPs) và trong môi trường có ion Mg2+. Mồi là một

đoạn oligonucleotide dài từ 5 đến vài chục nucleotide có bản chất DNA hoặc RNA. Trong

điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp, DNA polymerase kéo dài mồi theo hướng 5’→ 3’ bằng

cách nối các nucleotide qua liên kết phosphodiester theo trình tự bổ sung với sợi làm khuôn

tạo nên chuỗi DNA mạch kép. Ngoài hoạt tính kéo dài chuỗi oligonucleotide hay còn được

gọi là hoạt tính DNA polymerase, một số DNA polymerase còn có hoạt tính của nuclease

với vai trò sửa chữa hoặc giúp cho quá trình tổng hợp DNA được thực hiện chính xác.

Trên thực tế để đảm bảo tính chuẩn xác cho quá trình sao chép DNA tế bào phải sử dụng

không chỉ một loại DNA polymerase [8, 20, 25].

1.1.1. DNA polymerase ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn

Cho đến nay, rất nhiều loại DNA polymerase (DNA pol) khác nhau ở cả sinh vật

nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn đã được phát hiện và nghiên cứu kỹ về tính chất, cấu trúc

cũng như chức năng. Ở sinh vật nhân sơ điển hình là E. coli có tới 5 DNA pol khác nhau và

được ký hiệu là DNA pol I, II, III, IV và V. Ở sinh vật nhân chuẩn các DNA pol được phát

hiện sớm nhất là DNA pol α, β, δ, ε và γ. Trong những năm gần đây, một loạt các DNA pol

mới cũng được phát hiện ở sinh vật nhân chuẩn, đó là các DNA pol có khả năng sửa chữa

các vị trí hỏng như DNA pol ξ, DNA pol η, DNA pol ι, DNA pol κ, Revl và một nhóm các

DNA pol khác được gọi là DNA pol θ, DNA pol λ, DNA pol μ, DNA pol σ, DNA pol Ф

thực hiện các chức năng khác. Việc phát hiện và nghiên cứu tính chất của các DNA pol

khác nhau đã khẳng định rằng một loại DNA pol có thể không chỉ có một chức năng và quá

trình tổng hợp DNA trong các cơ thể có thể cần đến không chỉ một DNA pol, mà tế bào có

thể sử dụng đồng thời một số DNA pol khác nhau cùng thực hiện một chức năng [14].

Phần lớn các DNA pol ở dạng phức hệ gồm nhiều chuỗi polypeptide chứa các tiểu

đơn vị chức năng khác nhau, trong đó không thể thiếu tiểu đơn vị polymer hoá. Các tiểu

đơn vị khác chịu trách nhiệm cho hoạt tính xúc tác khác ví dụ họat tính đọc sửa 3 ’-5’

exonuclease, 5’-3’ exonuclease, hoạt tính tổng hợp các mồi RNA (primase) hay tương tác

với yếu tố sao chép, phối hợp với kháng nguyên nhân tế bào đang phân hóa (proliferating

3 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

cell nuclear antigen - PCNA) với mục đích cuối cùng là làm cho quá trình tổng hợp DNA

diễn ra nhanh chóng và chính xác [20].

Dựa vào tính tương đồng về trình tự và sự giống nhau về cấu trúc, các DNA pol

được chia thành 7 họ khác nhau là: A, B, C, D, X, Y và RT [40]. Mặc dù các DNA pol ở

các họ khác nhau có sự sai khác về mặt cấu trúc nhưng chúng cũng có một vài đặc điểm

chung, chúng cuộn gấp thành hình dạng giống với bàn tay phải của người bao gồm 3 vùng

khác biệt: “lòng bàn tay” (palm), “ngón tay cái” (thumb) và “các ngón tay” (fingers).

Trên cơ sở trình tự của DNA pol α, người ta đã phát hiện có 6 trình tự (I-VI) mang

tính bảo thủ cao trên các DNA pol ở cả sinh vật nhân chuẩn, sinh vật nhân sơ và virus với

trật tự trên chuỗi polypeptide là IV-II-VI-III-I-V, còn khoảng cách giữa các trình tự bảo thủ

là khác nhau ở các loài khác nhau. Trình tự I nằm ở vùng “lòng bàn tay” gần với vùng

“ngón tay cái” và chứa một trong các gốc axit aspartic bảo thủ tạo thành trung tâm xúc tác

của tất cả các DNA pol họ B đã biết (với motif YGDTDS). Axit aspartic khác thuộc trình

tự II có dạng DxxSLYPS nằm ở đầu của lá gấp β cũng thuộc vùng “lòng bàn tay”. Thuộc

vùng này còn có SLYP-II mang tính bảo thủ cao, giữ vai trò quan trọng cho quá trình liên

kết dNTP. Mặc dù các motif này là tuyệt đối bảo thủ ở các dưới họ DNA pol α và DNA pol

δ nhưng ở DNA pol ε lại có sự khác nhau đáng kể, motif trình tự I của DNA pol ε là

ELDTDG còn trình tự II là DxxAMYPN. Các gốc khác có vai trò trong quá trình liên kết

dNTP nằm ở trình tự III và chúng cuộn gấp thành xoắn α nằm ở dưới vùng “các ngón tay”.

Trình tự IV nằm ở đầu N thuộc vùng có hoạt tính 3’- 5’ exonuclease. Hai trình tự bảo thủ

khác V và VI tương ứng nằm ở các dưới vùng “ngón tay cái” và “các ngón tay” [20, 24].

Mức độ bảo thủ cao về trình tự và cấu trúc của các vùng giữa các DNA pol sinh vật

nhân chuẩn, sinh vật nhân sơ và virus chứng tỏ các DNA pol này xuất phát từ một gen tổ

tiên chung. Cấu trúc của chúng đã được tối ưu hoá qua quá trình tiến hoá để thích hợp với

các chức năng chuyên hoá mà mỗi DNA pol thực hiện trong tế bào. Các vùng bảo thủ nhất

chịu trách nhiệm cho các chức năng xúc tác cơ bản và cần thiết, trái lại các phần khác nhau

giữa các DNA pol tiến hóa một cách độc lập để thực hiện các vai trò chuyên biệt [14,20].

1.1.2. Tổng quan về DNA polymerase bền nhiệt

4 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Việc ra đời và ứng dụng của kỹ thuật PCR để nhân bản gen in vitro đã tạo ra sự

quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu đến các DNA pol bền nhiệt. Hàng loạt DNA pol

bền nhiệt từ các vi khuẩn ưa nhiệt đã được phát hiện, nghiên cứu và sử dụng cho PCR cũng

như các nghiên cứu khác của sinh học phân tử. Hầu hết các DNA pol này đều hoạt động tốt

ở nhiệt độ cao và bền với nhiệt. Chúng có khả năng xúc tác cho quá trình tổng hợp DNA ở

nhiệt độ thậm chí trên 70°C, cần thiết cho sự nhân bản đặc hiệu các đoạn DNA, cũng như

chịu được nhiệt độ thậm chí trên 90°C, thích hợp cho việc biến tính DNA (tách các chuỗi

DNA thành các sợi đơn).

Các loại DNA polymerase bền nhiệt

 Vent DNA pol được phân lập đầu tiên từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt Thermococcus

litoralis được tìm thấy ở đáy đại dương với nhiệt độ khoảng 98°C. Vent DNA pol là một

DNA pol thuộc họ B, có trình tự giống với DNA pol α của người và DNA pol II của E. coli

hơn là DNA polymerase I của E. coli [9]. Enzyme này là một protein có KLPT 90 - 93

kDa, enzyme kéo dài mồi với tốc độ 67 nucleotide/giây. Vent™ DNA polymerase bền

nhiệt hơn so với Taq DNA polymerase và có khả năng kéo dài mồi để thu được các sản

phẩm có độ dài 8-13 kb. Vent™ DNA pol có hoạt tính 3’-5’ exonuclease đảm bảo độ chính

xác cao hơn 5-15 lần so với Taq DNA polymerase. Vent™ DNA polymerase cũng tạo ra

trên 90% các đoạn DNA đầu bằng nhờ đó làm đơn giản hóa quá trình nhân dòng trực tiếp

các sản phẩm PCR.

Tma DNA polymerase là một protein có 893 a.a với KLPT 103 kDa, được tách ra từ

khuẩn Gram âm Thermotoga maritima siêu ưa nhiệt, sống kỵ khí ở suối nước nóng, sinh

trưởng ở nhiệt độ trên 90°C. Tma DNA polymerase giống DNA polymerase I ở E. coli ở

chỗ có cả hoạt tính 3’- 5’ exonuclease và 5’- 3’exonuclease. Khi Tma DNA polymerase bị

cắt đi một phần đầu thì tạo thành dạng enzyme thiếu hoạt tính 5’- 3’ exonuclease, giống

như mảnh Klenow và Stoffel, protein này vẫn còn hoạt tính polymerase cũng như hoạt tính

3’- 5’ exonuclease. Các nghiên cứu bước đầu cho thấy độ chính xác trong PCR của enzyme

này gần như 100% nhờ có hoạt tính đọc sửa [6].

 Pfu DNA polymerase được tách từ vi khuẩn cổ siêu ưa nhiệt Pyrococcus furiosus

(Pfu) chiếm ưu thế trong các chất lắng đọng của biển nóng ở Italia, sinh trưởng tối ưu ở

5 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

100°C. Pfu DNA pol thuộc họ B, là một protein có 775 a.a với KLPT khoảng 91 kDa.

Trình tự a.a của Pfu DNA pol tương đồng với DNA pol α. DNA polymerase này cực kỳ

bền nhiệt, vẫn giữ được hơn 95% hoạt độ ban đầu ở 95°C trong một giờ. Hoạt tính đọc sửa

3’- 5’ exonuclease của Pfu DNA pol làm tăng độ chính xác của quá trình tổng hợp DNA.

Xác suất gắn sai một nucleotide của Pfu DNA pol khoảng 1,3.10-6. Độ chính xác trong quá

trình tổng hợp DNA của Pfu DNA pol cao hơn 8 lần so với Taq DNA pol và được xem là

enzyme có tốc độ tổng hợp ít lỗi nhất trong tất cả các DNA polymerase bền nhiệt đã được

nghiên cứu. Chính vì vậy, Pfu DNA pol được sử dụng phổ biến để khuyếch đại các sản

phẩm dùng cho mục đích nhân dòng biểu hiện hay nghiên cứu các đột biến. Pfu DNA pol

cũng có thể phối hợp cùng với Taq DNA pol để khuyếch đại các đoạn DNA có kích thước

lớn với độ chính xác lớn hơn nhiều so với khi sử dụng Taq DNA pol đơn lẻ [1,38].

1.2. Tổng quan về Pfu DNA polymerase

1.2.1. Cấu trúc của Pfu DNA polymerase

Pfu DNA pol là một phân tử có hình donut với tổng kích thước khoảng 50A˚×

80A˚×100 A˚. Cấu trúc của Pfu DNA pol cũng gần giống với cấu trúc kinh điển của các

DNA pol họ B. Pfu pol là một chuỗi đơn polypeptide của 775 a.a được phân thành 5 vùng

cấu trúc riêng biệt: vùng N - terminal (1 - 130, 327 - 368), vùng 3’- 5’ exonuclease (131 -

326), vùng lòng bàn tay (369 - 450 và 501 - 588), vùng các ngón tay (451 - 500) và vùng

ngón tay cái (589 - 775) (Hình 1.1). Vùng các ngón tay và ngón tay cái được xoay ra ngoài

33˚ và 24˚, vì vậy cấu hình tổng thể của Pfu DNA pol tương tự như cấu trúc của KOD1

DNA polymerase [17].

6 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Hình1.1: Cấu trúc tổng thể của Pfu DNA polymerase [41]

Trong đó có 5 vùng riêng biệt: màu xanh da trời - vùng exonuclease, màu tím - vùng

N - terminal, màu cam - vùng lòng bàn tay, màu xanh lá cây - vùng ngón tay, màu đỏ -

vùng ngón tay cái.

Mặc dù cấu trúc của một vài DNA pol cổ đã được xác định nhưng những tìm hiểu

chi tiết về độ trung thực và hoạt tính tổng hợp vẫn chưa được biết đến một cách đầy đủ.

Gần đây nghiên cứu về cấu trúc và đột biến của Pfu DNA pol đã chỉ ra rằng cơ chế phối

hợp giữa hoạt tính đọc sửa và hoạt tính tổng hợp liên quan đến sự tương tác giữa vùng loop

của miền exonuclease và phần gờ tích điện dương của vùng ngón tay cái. Tuy nhiên sự

phá vỡ liên kết giữa hai vùng này cho phép Pfu DNA pol có một cấu hình mở phù hợp với

chức năng sửa chữa hơn là chức năng tổng hợp. Phần gờ của miền các ngón tay có vị trí

tương đương với phần loop của exonuclease trong cấu trúc tinh thể của Pfu DNA pol.

Nhưng trong cấu hình mở tự nhiên lại không có bất kỳ sự tương tác trực tiếp nào giữa các

vùng này.

 Cấu trúc của Pfu DNA pol khi liên kết với DNA

Cấu hình đóng (khi liên kết với DNA) của Pfu DNA pol được mô hình hóa dựa trên

cấu trúc của protein Gp43 có hoạt tính gắn DNA [7].

7 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Từ mô hình cấu tạo đóng, vòng loop của miền exonuclease và phần gờ của miền

ngón tay cái nằm trong khoảng cách liên kết hydro. Trong mô hình cấu tạo đóng, motif -

hairpin (phần dư 243-248) của miền exonuclease được cho là nằm gần và cho phép tiếp

xúc trực tiếp với miền ngón tay cái [37]. Trình tự a.a của các motif β -hairpin cũng là duy

nhất được tìm thấy trong DNA polymerase cổ (Hình 1.2). Các motif -hairpin nằm ở khe nối

của vùng liên kết DNA khuôn và vùng chỉnh sửa đóng một vai trò quan trọng trong chuyển

đổi đầu kết thúc 3’ của sợi mồi giữa vị trí trùng hợp và chỉnh sửa đang hoạt động để việc

nhân bản được nhanh chóng và chính xác [17].

Hình 1.2: So sánh trình tự a.a và cấu trúc của motif β –hairpin (vùng exonulcease)

và motif Y-GG/A (vùng ngón tay cái). Trong đó: KOD, Thermococcus kodakaraensis

DNA polymerase; D. TOK, Desulfurococcus tok DNA polymerase; TGO,

Thermococcusgorgonarious DNA polymerase; 9◦N-7, Thermococcus sp.DNA polymerase;

PFU, Pyrococcusfuriosus DNA polymerase [41].

Hầu hết các loop của DNA polymerase trong từng vùng từ cổ khuẩn ưa nhiệt được

rút ngắn so với các loài khác sống ở nhiệt độ thấp hơn hoặc trong môi trường ấm hơn (ví

dụ sinh vật nhân chuẩn), nhưng phần gờ của miền ngón tay cái trong vi khuẩn cổ vẫn giữ

lại một đoạn của vòng loop dài mặc dù gặp phải áp lực tiến hóa về khả năng chịu nhiệt như

thế nào. Các gờ được bảo tồn của miền ngón tay cái cho phép tương tác chặt chẽ với các

khu vực khác nhau của miền exonuclease, hỗ trợ vai trò điều phối quan trọng của việc đọc

sửa và trùng hợp [41].

1.2.2. Cơ chế hoạt động sửa sai của Pfu DNA polymerase

8 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Mỗi DNA polymerase có thể được phân vào lớp có chức năng nhân bản hay sửa

chữa, cũng như là có lỗi hay dễ bị lỗi dựa trên đặc điểm riêng của từng DNA pol. Các chức

năng khác nhau của DNA pol trong sự tái bản DNA gồm việc polymerase gắn vào khuôn,

vận chuyển nucleotide, đảm bảo độ chính xác và kéo dài chuỗi đã được đề xuất dựa vào

cấu trúc bậc 2/ bậc 3 của DNA pol trong phức hợp với các khuôn DNA khác nhau [11].

Vùng các ngón tay và vùng ngón tay cái thay đổi vị trí phụ thuộc vào việc polymerase

được liên kết với DNA khuôn hay không [30]. Những DNA pol không bị ràng buộc tạo

thành những cấu trúc mở của vùng các ngón tay và vùng ngón tay cái, khi khuôn được gắn

vào 2 vùng này di chuyển xuôi về phía lòng bàn tay để giữ sợi khuôn/ mồi chặt hơn.

Sự tồn tại của những vùng bổ sung ví dụ như vùng exonuclease là thay đổi giữa các

DNA pol. Trong trường hợp các DNA pol từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt bao gồm Pfu DNA pol,

có 5 vùng gồm: vùng các ngón tay, vùng lòng bàn tay, vùng ngón tay cái, exonuclease và

vùng N - terminal [17, 19]. Vùng exonuclease thay đổi cấu trúc của nó tùy thuộc vào trạng

thái của việc DNA pol đang thực hiện tái bản hay sửa chữa DNA. Khi một nucleotide bắt

cặp sai được liên kết vào sợi DNA tổng hợp mới, sợi khuôn/mồi gắn vào polymerase yếu

hơn hoặc bị lệch với vị trí hoạt động của polymerase. Cuối cùng chuỗi xoắn kép tháo ra và

nucleotide đã bắt cặp nhầm được di chuyển tới vị trí hoạt động của vùng exonuclease và

được cắt bỏ (Hình 1.3) [36].

Hình 1.3: Cơ chế hoạt động và sửa sai của Pfu DNA polymerase [27, 41]

9 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Tại DNA pol bị ràng buộc, cấu trúc đóng của vùng ngón tay cái làm cho đầu 3’ của

sợi mồi không thể gắn vào vùng exonuclease do trở ngại về không gian chủ yếu gây ra bởi

phần gờ của vùng ngón tay cái. Chỉ có cấu trúc mở của vùng ngón tay cái mới cho phép

việc gắn sợi đơn DNA mồi (ssDNA) vào vị trí hoạt động của exonuclease. Vì vậy cấu trúc

tổng thể của mỗi vùng là sự kết hợp chặt chẽ với các vùng khác để thực hiện quá trình sao

chép DNA.

Cấu trúc vòng (loop) của vùng exonuclease là vùng bảo tồn mà chỉ có trong DNA

pol của vi khuẩn cổ ưa nhiệt [27]. Khi gây đột biến điểm vùng exonuclease làm cho vị trí

của vùng này gần hơn với vùng ngón tay cái, sẽ ngăn cản sự liên kết đầu 3’ của ssDNA với

vị trí hoạt động của vùng exonulcease, do vậy làm giảm hoạt tính 3’- 5’ exonuclease. Vì

vậy cấu trúc mở tự nhiên của vùng ngón tay cái là cần thiết cho chức năng sửa chữa của

polymerase [41].

1.2.3. Một số tính chất của Pfu DNA polymerase

 Độ chính xác và khả năng kéo dài chuỗi của Pfu DNA pol

Pfu DNA polymerase được cho là hữu ích trong việc khuyếch đại gen với độ chính xác

cao những mục tiêu DNA lên đến 2,5 kb [22]. Nghiên cứu tối ưu hóa bộ đệm với Pfu DNA

pol để đánh giá xem sự chính xác của Pfu DNA pol có thể được tăng cường hơn nữa đã

được nghiên cứu qua tỷ lệ gây lỗi trong PCR được so sánh khi thay đổi nồng độ MgSO4,

dNTP và giá trị pH khác nhau. Kết quả cho thấy rằng, Pfu DNA pol tạo lỗi ít nhất khi phản

ứng PCR được thực hiện với sự có mặt của 2 – 3 mM MgSO4, 100 – 300 µM mỗi loại

dNTP và khoảng pH từ 8,5 – 9,1 ở 25ºC (tương ứng với pH 7,1 – 7,7 ở 72ºC). Những điều

kiện trên cũng là tối ưu để thu được lượng sản phẩm PCR cao. Trong khi đó, với cùng điều

kiện về nồng độ dNTP là 800 µM, sự có mặt của 1 mM MgSO4 lại tạo ra tỷ lệ lỗi cao hơn 3

lần so với 2 – 10 mM MgSO4 [21].

Pfu là DNA pol có độ trung thực cao thường được sử dụng cho PCR và có tỷ lệ lỗi

trung bình là 1,3.10-6 đột biến/bp/phản ứng, chính xác hơn Taq DNA pol 8 lần [21]. Độ

trung thực cao này là do Pfu pol có hoạt tính đọc sửa 3’–5’ exonuclease. Khi loại bỏ hoạt

tính 3’–5’ exnonuclease (exo – Pfu), trong điều kiện PCR có mặt của đệm Pfu PCR (2mM

MgSO4, 200 µM mỗi loại dNTP, pH 8,8) thì exo – Pfu có tỷ lệ lỗi là 4,7.10-5 cao hơn Pfu

10 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

DNA pol 40 lần trong cùng điều kiện phản ứng. Cũng trong điều kiện phản ứng trên nhưng

khi thay đổi pH của đệm từ 8,8 xuống 8,0 thì tỷ lệ lỗi của exo – Pfu DNA pol chỉ cao hơn

Pfu DNA pol 7 lần. Những kết quả trên cho thấy rằng, khi có hoạt tính 3’- 5’ exonuclease

và thực hiện PCR trong những điều kiện thích hợp Pfu DNA pol là một trong số ít các

enzyme DNA pol bền nhiệt cho tỷ lệ lỗi thấp nhất (Bảng 1.1).

Bảng 1.1: So sánh độ chính xác của các DNA polymerase bền nhiệt trong PCR

[21,38]

Các DNA Tỷ lệ sao chép lỗi Tỷ lệ sản phẩm

polymerase bền nhiệt (×10-6) PCR bị đột biến (%)

55 ± 2-e UlTma 110

8 ± 3,9 Taq 16

2,8 ± 0,9 Vent 5,6

2,7 ± 0,2 Deep Vent 5,4

1,3 ± 0,2 Pfu 2,6

Khả năng nhân bản các đoạn DNA có kích thước khác nhau là một điểm đáng lưu ý đối

với các DNA polymerase. Mặc dù Taq DNA pol là enzyme được sử dụng rộng rãi nhất

trong PCR nhưng lại bị hạn chế bởi thiếu hoạt tính đọc sửa. Pfu DNA pol có hoạt tính đọc

sửa 3’–5’ exonuclease nhưng lại có hiệu quả thấp trong việc khuếch đại DNA do khả năng

kéo dài thấp. Khi sử dụng Pfu DNA pol lẻ để nhân đoạn gen 5 kb không cho kết quả dương

tính. Taq DNA pol có khả năng tổng hợp đoạn 5 kb nhưng lại không tổng hợp được đoạn

7,4 kb. Khi kết hợp hai enzyme trên với tỷ lệ 4 Taq: 1 Pfu cho phép tổng hợp được cả 2

đoạn 5 và 7,4 kb [2]. Hiện tượng này liên quan đến hoạt tính 3’- 5’ exonuclease của Pfu

DNA pol, khi có mặt cùng với Taq DNA pol trong phản ứng th Pfu DNA pol đã giúp loại

bỏ những nucleotide bị đưa nhầm vào và làm cho quá trình kéo dài chuỗi được tiếp tục,

nhờ đó nâng cao khả năng kéo dài chuỗi. Tuy nhiên khi kết hợp Taq DNA pol và Pfu DNA

pol theo tỷ lệ 16 Taq: 1 Pfu để khuếch đại đoạn 30 kb, hỗn hợp 2 enzyme này cho tỷ lệ lỗi

5,6.10-6 (sử dụng Taq PCR buffer). Tỷ lệ lỗi trên cao hơn tỷ lệ của Pfu pol 6 lần nhưng lại

thấp hơn tỷ lệ lỗi của Taq DNA pol đơn lẻ 30% trong cùng một điều kiện PCR [21].

11 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

 Ảnh hưởng của một số chất khác nhau lên hoạt động tổng hợp DNA của Pfu DNA

pol

Sự có mặt của các chất có trong phản ứng PCR có ảnh hưởng rất quan trọng đến hoạt

tính tổng hợp của Pfu DNA pol.

Nồng độ dNTP thường được sử dụng trong phản ứng PCR là 20 – 200 μM. Nồng độ

cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại không đặc hiệu. Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành

phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Sự mất cân bằng trong thành phần các

dNTP sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase. Tuy nhiên Pfu DNA pol hoạt

động tốt khi có mặt của 100 – 250 µM mỗi loại dNTP [26].

Nồng độ MgCl2 là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR. Mg2+ rất cần cho

quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Pfu DNA pol, làm tăng Tm của DNA

mạch kép. Mg2+ là Co – factor của Pfu DNA pol nên nếu lượng Mg2+ quá thấp thì Pfu

DNA pol sẽ không thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài, hạn chế quá trình

kéo dài. Ngược lại nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn định sợi đôi DNA và ngăn ngừa sự biến

tính hoàn toàn của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho sản phẩm PCR ít đi; đồng thời,

nồng độ Mg2+ cao có thể làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra nhiều hơn và cho ra những

sản phẩm mong muốn với số lượng quá lớn nhưng mức độ chuyên biệt thấp. Pfu DNA pol

hoạt động tối ưu trong môi trường có 2 mM Mg2+ [33, 44].

NaN3 từ lâu được biết đến là một chất kháng khuẩn tốt với nồng độ hiệu quả là 0,02%

(w/v) tức 3 mM, trong khi đó với phản ứng PCR có 0,1 – 3 mM NaN3 không làm ức chế

hoạt động của Pfu DNA pol. Điều này cho phép bổ sung NaN3 ở nồng độ 3 mM vào chế

phẩm Pfu DNA pol để chống nhiễm khuẩn khi cần thiết mà không làm ảnh hưởng đến hoạt

tính xúc tác của enzyme [1,3].

Tương tự như vậy thì NaF ở nồng độ 1-50 mM, monocaprin ở nồng độ 2-50 mM,

heptyl paraben ở nồng độ 10- 80 mM đều không ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp DNA

của Pfu DNA pol. Ngược lại, kẽm sunphat (ZnSO4) ở nồng độ 0,5 mM và EDTA ở nồng

độ 2 mM trở lên đã ức chế mạnh hoạt động của Pfu DNA pol. Tác dụng ức chế của EDTA

liên quan đến hoạt tính tạo phức của EDTA với ion Mg2+ vốn rất cần cho hoạt động tổng

hợp DNAcủa Pfu DNA pol cũng như các DNA pol khác [1].

12 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

 Độ bền nhiệt của Pfu DNA pol

Pfu DNA pol được phân lập từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt có độ bền nhiệt rất cao vì vậy khi

sản xuất Pfu DNA pol tái tổ hợp, độ bền nhiệt là một chỉ tiêu vô cùng quan trọng để Pfu

DNA pol có thể ứng dụng được trong PCR với các điều kiện gia nhiệt biến tính DNA ở

nhiệt độ cao cũng như thời gian kéo dài. Với một Pfu DNA pol tái tổ hợp có gắn thêm đuôi

6His ở đầu N - terminal vẫn giữ được hoạt tính tổng hợp sau 1 giờ để ở nhiệt độ phòng (25

- 30°C) hay xử lý nhiệt ở 100ºC. Tương tự, việc giữ enzyme ở nhiệt độ phòng trong vòng 4

ngày sau đó thử hoạt độ qua khả năng nhân bản DNA bằng PCR cho thấy Pfu DNA pol tái

tổ hợp vẫn duy trì hoạt tính nhân bản tốt như giữ ở -20°C [2].

 Một số tính chất khác của Pfu pol

Như đã biết, Taq DNA pol có hoạt tính terminal transferase cho phép gắn thêm gốc

adenosine monophosphat (A) vào đầu 3’ của đoạn DNA sợi kép [13]. Chính vì đặc điểm

này mà các sản phẩm nhân bản PCR dùng Taq DNA pol có thể được đưa vào vector hở có

gốc T ở hai đầu 3’, dựa trên sự ghép cặp đặc hiệu gữa A và T. Trong khi đó sản phẩm nhân

bản bằng PCR dùng Pfu DNA pol lại có đầu bằng. Việc tạo ra sản phẩm có đầu bằng tạo

thuận lợi cho việc nối gen vào những vector cũng có đầu tù mà không cần phải dùng đến

một loại enzyme cắt giới hạn nào cả.

1.2.4. Ứng dụng của Pfu DNA polymerase

Chức năng chủ yếu của các DNA pol là tổng hợp chuỗi polynucleotide và sửa lỗi

bằng cách loại bỏ các nucleotide không bổ sung với sợi khuôn, đảm bảo cho quá trình tự

nhân đôi của DNA được diễn ra một cách chính xác. Phần lớn các DNA pol dùng DNA để

làm khuôn cho sự tổng hợp. Tuy vậy, cũng có DNA pol đặc biệt có khả năng phiên mã

ngược sử dụng khuôn là ARN để tổng hợp DNA (Tth DNA polymerase) [12]. Ngoài ra,

cũng phải kể đến một hoạt tính terminal transferase của một số DNA pol cho phép gắn

nuleotide vào đầu phân tử DNA có sẵn. Nhờ những tính chất này mà các DNA pol được

ứng dụng rộng rãi trong sinh học phân tử.

Ứng dụng phổ biến nhất của DNA polymerase chính là dùng trong việc xác định

trình tự nucleotide các gen. Bằng việc dựa trên DNA khuôn để tổng hợp các đoạn sợi

DNA mới chỉ khác nhau một nucleotide mà người ta có thể dễ dàng giải được trình tự của

13 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

DNA. Điều này chỉ đảm bảo chính xác khi DNA pol dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới

tuân thủ nguyên tắc bổ sung một cách nghiêm ngặt.

Nhân bản các gen hay DNA bằng kỹ thuật PCR là ứng dụng phổ biến thứ hai của

các DNA pol. Cho đến nay, kỹ thuật PCR trở thành một phương pháp thường ngày và

không thể thiếu trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử hay kỹ thuật gen. Điều này

cũng nói lên rằng, các DNA pol, mà cụ thể là các DNA pol bền nhiệt luôn luôn được cần

đến.

Ứng dụng Pfu DNA pol trong PCR cần độ chính xác cao: Trong nhiều ứng dụng

sinh học phân tử bao gồm nhân bản, các đột biến có hướng và dịch mã DNA là rất quan

trọng để bảo tồn các chuỗi DNA chính xác trong việc nhân bản PCR. Một nucleotide kết

hợp không chính xác có thể thay đổi codon tương ứng và kết quả là việc bổ sung các a.a sai

trong quá trình dịch mã. Điều này có thể ảnh hưởng đến tính gấp và chức năng của protein.

Ngoài ra, việc xóa một nucleotide có thể phá hủy các khung đọc đúng. Pfu DNA pol có độ

trung thực cao nhất trong các polymerase chịu nhiệt. Tỷ lệ lỗi của Pfu DNA pol thấp hơn

khoảng 8 lần so với polymerase Taq DNA pol. Vì vậy Pfu DNA polymerase có ứng dụng

quan trọng trong PCR cần độ chính xác cao [38].

Sử dụng Pfu DNA pol trong PCR tạo các gen tổng hợp: sử dụng phương pháp PCR

2 giai đoạn (two step – PCR) để tạo nhanh các đoạn gen tổng hợp dựa trên cơ sở những

nucleotide chồng lên nhau (overlapping) có thể tạo ra đoạn cần tổng hợp thông qua nhiều

chu kỳ khuếch đại PCR [29]. Người ta có thể thiết kế một gen tổng hợp có chứa codon tối

ưu được dùng để biểu hiện protein trong cơ thể sinh vật hoặc gen tổng hợp được thiết kế để

thêm vị trí cắt hạn chế tạo điều kiện thuận lợi cho các thí nghiệm về sau. Nguyên tắc của

PCR 2 giai đoạn là hai phản ứng PCR xảy ra liền nhau, phản ứng thứ nhất tạo ra khuôn

tương ứng với gen tổng hợp và sau đó được khuếch đại trong phản ứng PCR thứ hai. Để

tạo độ chính xác cho đoạn gen tổng hợp và các đoạn oligo có thể overlap lên nhau tạo ra

đoạn gen hoàn chỉnh thì enzyme thực hiện phản ứng kéo dài không được tạo đầu lồi (có dư

nucleotide A) như Taq DNA pol. Vì vậy Pfu DNA pol là enzyme phù hợp nhất cho mục

tiêu tổng hợp gen.

14 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Việc sử dụng PCR trong phân tích các mẫu DNA chất lượng kém và nhiễm bẩn ví

dụ như mẫu máu được di truyền pháp y ứng dụng triệt để. Trong phản ứng với nồng độ

Mg2+ cao, Pfu DNA pol có khả năng nhân một đoạn gen từ DNA genome trong môi trường

chứa đến 14% máu. Với khả năng khuếch đại cao và hoạt động tốt trong điều kiện mẫu

máu khác nhau, Pfu DNA pol được ứng dụng trong các phòng thí nghiệm lâm sàng để phân

tích tính đa hình của các sợi đơn DNA (SNPs) trong các mẫu máu [19, 32].

Nhân đoạn gen có % GC cao: đối với các gen mục tiêu có tỷ lệ GC cao việc thiết kế

chương trình nhiệt để khuếch đại các đoạn gen này cũng phải được chú ý để không xảy ra

hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu khi nhiệt độ gắn mồi thấp. Do Pfu DNA pol vẫn giữ

được 94 – 95% hoạt tính sau 1 giờ ở 100ºC nên việc nhân các đoạn gen trên ở nhiệt độ cao

trở nên vô cùng dễ dàng mà không phải lo việc enzyme có bị mất hoạt tính hay không [32].

1.2.5. Tình hình nghiên cứu Pfu DNA polymerase tái tổ hợp

Pfu DNA polymerase đóng vai trò quan trọng trong phản ứng PCR nên việc thu nhận

enzyme này từ vi khuẩn ưa nhiệt trở thành một nhu cầu cấp thiết. Tuy vậy, việc thu nhận

chế phẩm enzyme trực tiếp từ các vi khuẩn ưa nhiệt là không đơn giản vì các vi khuẩn này

thường yêu cầu môi trường sinh trường đặc biệt, nhiệt độ sinh trưởng cao và enzyme quan

tâm chỉ được sản xuất ở một lượng rất thấp. Vì vậy sản xuất enzyme này bằng công nghệ

protein tái tổ hợp hiện đang là giải pháp ưu việt nhất và đã có nhiều công trình khoa học

nghiên cứu sản xuất Pfu DNA pol.

 Trên thế giới

Có rất nhiều các nghiên cứu với mục đích tạo ra các DNA pol bền nhiệt có hoạt tính

cao để ứng dụng trong PCR. Cho đến năm 1991, Marthur và cộng sự đã nhân dòng gen mã

hoá Pfu DNA polymerase từ Pyrococcus furiosus.

Đến năm 1997, Lu và Erickson đã biểu hiện thành công Pfu DNA pol trên tế bào E. coli

BL21 DE3 (pLysS). Trong nghiên cứu của Lu và Erickson đã sử dụng vector pET11 để tạo

Pfu tái tổ hợp và tiến hành tinh sạch bằng cách gia nhiệt ở 70 ºC tiếp đó sử dụng cột P11

phosphocellulose và cột mono Q. Với phương pháp trên nhóm tác giả đã thu được 3,7 mg

Pfu DNA pol tinh sạch từ 1 lít dịch nuôi tế bào cùng độ tinh sạch là 97% và hoạt độ 22.500

unit/mg. Một đơn vị hoạt độ của enzyme (unit) được tính bằng lượng enzyme xúc tác cho

15 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

sự kết hợp của 10 nmol deoxyribonucleotides vào một đoạn polynucleotide trong 30 phút

ở 72 °C. Kết quả tuy thấp hơn việc thu Pfu DNA pol trực tiếp từ chủng Pyrococcus

furiosus (31.713 unit/mg) và biểu hiện qua baculovirus (26.000 unit/mg) nhưng tốc độ kéo

dài chuỗi của Pfu DNA pol tái tổ hợp lại cao hơn so với Pfu DNA pol có nguồn gốc từ tự

nhiên [31, 33]. Ưu điểm của phương pháp này là protein tạo ra mang đúng trình tự a.a mã

hóa cho Pfu DNA pol mà không chứa thêm bất kỳ một a.a nào của vector biểu hiện, điều

này tạo ra Pfu DNA pol cuộn xoắn theo đúng cấu trúc tự nhiên và không ảnh hưởng đến

hoạt tính xúc tác của Pfu DNA pol tái tổ hợp. Tuy nhiên việc tinh sạch Pfu DNA pol tái tổ

hợp gặp khó khăn và đắt tiền do phải sử dụng hệ thống tự động để thu các phân đoạn khi

tinh sạch bằng P11 phosphocellulose và cột mono Q và làm mất mát một lượng lớn

enzyme trong quá trình thực hiện các bước tinh sạch [13].

Để đơn giản hóa quá trình tinh sạch Pfu DNA pol tái tổ hợp, năm 1998 Dabrowski và

Kur đã nghiên cứu biểu hiện 6Histag – Pfu trong tế bào E. coli qua vector biểu hiện

pET30LIC. Vì protein tạo ra có 6His ở đầu N- terminal nên việc tinh sạch chỉ tiến hành qua

bước gia nhiệt và sử dụng duy nhất cột Ni2+ - TED Sepharose. Kết quả sau biểu hiện và

tinh sạch theo phương pháp này cho phép thu được một lượng Pfu DNA pol nhiều hơn 6

lần (24 mg/ 1 lít dịch nuôi) so với nghiên cứu của Lu và cộng sự ở trên và hoạt độ enzyme

thu được tương đương với Pfu DNA pol từ P. furiosus (31.000 unit/mg). Các kết quả cũng

cho thấy rằng khi có thêm đuôi 6His ở đầu N – terminal, Pfu DNA pol vẫn có hoạt tính

tổng hợp chuỗi như Pfu DNA pol tự nhiên và vẫn giữ được hoạt tính tổng hợp sau 8 giờ gia

nhiệt ở 98ºC [15,38]. Bên cạnh những nghiên cứu về Pfu DNA pol, nhóm tác giả cũng đã

chứng minh phương pháp trên cho kết quả tương tự khi áp dụng với Pwo – một DNA pol

có độ tương đồng về nucleotide gần như 100% với Pfu DNA pol [4, 15]. Qui trình tinh

sạch thu được lượng protein nhiều, tuy nhiên việc chỉ tinh sạch bằng gia nhiệt và ái lực với

Ni2+ vẫn chưa đủ tinh khiết để phục vụ các thí nghiệm về sinh học phân tử.

Năm 2013, Ji Hye Heo và cộng sự đã sử dụng semi – nested PCR để nhân đoạn gen mã

hóa cho Pfu DNA pol từ chính DNA có lẫn trong hỗn hợp Pfu DNA pol thương mại và

biểu hiện thành công trên E. coil BL21 DE3 với hệ vector pET21(b). Pfu DNA pol tái tổ

hợp được thu bằng cách gia nhiệt ở 100 ºC trong 10 phút để ly giải và biến tính các protein

16 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

của E.coli sau đó tinh sạch bằng sắc ký qua cột heparin. Ưu điểm của phương pháp này là

chỉ cần 1 - 2 giờ để có thể tinh sạch Pfu DNA pol khi sử dụng một loại đệm, nhưng hóa

chất Heparin sử dụng cho tinh sạch có giá thành cao mà lại liên kết đặc hiệu không chỉ với

với Pfu DNA pol mà còn DNA pol của tế bào vi khuẩn, do vậy enzyme thu được vẫn còn

lẫn tạp do chỉ sủ dụng một bước sắc ký ái lực [23].

 Tại Việt Nam

Mặc dù trên thế giới đã có rất nhiều các công trình khoa học nghiên cứu sản xuất Pfu

DNA pol tái tổ hợp nhưng tại Việt Nam cho đến nay mới chỉ có 1 công trình nghiên cứu

sản xuất Pfu DNA pol tái tổ hợp trên Escherichia coli của Giáo sư Phan Tuấn Nghĩa và

cộng sự được thực hiện vào năm 2005.

Trong nghiên cứu của nhóm tác giả đã sử dụng vector pET28a để biểu hiện và kết hợp

trình tự 6His vào đầu N của Pfu DNA pol, tạo điều kiện cho việc tinh sạch enzym qua cột

sắc ký ái lực Ni - Agarose. Việc phát hiện ra khả năng bám của Pfu DNA pol vào gel

Heparin -Sepharose và bổ sung thêm bước sắc ký ái lực qua cột này một lần nữa loại trừ

khả năng lẫn các protein không mong muốn trong chế phẩm Pfu DNA pol. Qui trình tinh

sạch được thiết lập đã thu được 25-26 mg Pfu DNA pol tinh khiết từ 1 lit dịch tế bào E. coli

nuôi cấy với tổng hoạt độ khoảng 40.000 unit, tương tự như hiệu suất mà Dabrowski và

Kur (1998) thu được khi dùng với hệ thống vector pET30LIC. Mặc dù qui trình thu được

lượng lớn Pfu DNA pol trên nhưng thực hiện qua giai đoạn tinh sạch sử dụng Heparin

Sepharose có giá thành cao mà lại không đặc hiệu do Heparin có thể liên kết với các DNA

pol của tế bào vi khuẩn chủ [1, 2]. Ngoài ra Pfu DNA pol tạo ra lại mang thêm một đoạn

khoảng 20 a.a của vector pET28a ở đầu N, đoạn a.a này có thể làm ảnh hưởng đến khả

năng cuộn xoắn, tổng hợp chuỗi DNA của enzyme.

Vì vậy các nghiên cứu sản xuất Pfu DNA pol trên thế giới và ở Việt Nam vẫn tồn tại

nhiều nhược điểm và khó khăn trong việc tinh sạch để thu được Pfu DNA pol đảm bảo tinh

khiết. Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu với mục đích làm tăng khả năng

hòa tan và tinh sạch protein tái tổ hợp cho hiệu suất cao và tinh khiết từ tế bào E. coli với

hexahistidine-tagged maltose-binding protein (HistagMBP) khi sử dụng hệ vector pMAL

[5, 39]. Hệ vector biểu hiện pMAL có những ưu điểm như: protein tạo ra ở trạng thái tan

17 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

hoàn toàn khi được dung hợp với maltose - binding protein, có thể dễ dàng tinh sạch qua

việc sử dụng sắc ký ái lực qua cột amylose với chi phí rẻ, protein đích được hoàn nguyên

bằng Factor Xa nằm ở ngay trước đầu N của protein tái tổ hợp…Bên cạnh đó việc sử dụng

Histag để tinh sạch bằng Ni2+ ở đầu N lại không ảnh hưởng đến hoạt tính của Pfu DNA tái

tổ hợp. Do vậy chúng tôi đã kết hợp sử dụng hệ vector pMAL gắn thêm đuôi (His)8 để

nghiên cứu sản xuất và tinh sạch Pfu DNA polymerase chất lượng cao sẽ góp phần tích cực

trong việc phục vụ các nghiên cứu về sinh học phân tử trong nước.

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị

2.1.1. Vật liệu

 Nguyên liệu: chủng E. coli mang plasmid pET 11a chứa gen mã hóa cho Pfu được

cung cấp bởi Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách

Khoa Hà Nội; DNA genome chủng Listeria monocytogenes EGD-e dùng làm khuôn cho

phản ứng thử họat tính Pfu tái tổ hợp.

18 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

 Chủng vi sinh vật: chủng E. coli Top 10 được sử dụng để tách dòng gen mã hóa cho

Pfu, chủng E. coli BL21 (DE3) và chủng E. coli BL21 (DE3) pLysS được sử dụng để biểu

hiện protein Pfu DNA pol đều của hãng Thermofisher (Hoa Kỳ).

 Các vector: vector biểu hiện pMAL-c5X (5677 bp) của hãng New England Biolabs

(NEB) (Anh).

 Các cặp mồi: các mồi thiết kế đều được đặt tổng hợp từ hãng Macrogen (Hàn

Quốc), và PHUSA Biochem (Việt Nam).

 Cặp mồi Pfu F-His/ Pfu R dùng để nhân gen, chọn dòng và biểu hiện gen. Trình tự

mồi được thiết kế dựa vào trình tự gen mã hóa cho Pfu DNA pol đã được xác định trình tự

DNA.

 Hai cặp mồi T7-F/T7-R và Pfu-F1/Pfu-R1 dùng để chọn dòng và giải trình tự gen

được thiết kế dựa trên trình tự của vector pET11a và trình tự gen mã hóa cho Pfu DNA pol.

 Cặp mồi pMAL – F/ pMAL – R dùng để chọn dòng tế bào biểu hiện được thiết kế

dựa trên trình tự của vector pMAL - c5X.

 Cặp mồi LmA/LmB dùng trong phản ứng thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp cho

kích thước đoạn gen 234 bp.

Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi sử dụng trong luận văn

STT Tên mồi Trình tự (5’-3’)

Pfu-F His CACCATCACCATCACCATCATCACGGTATGATTTTAGA 1

TGTGGATTACATAACTG

Pfu R CTACCATGGTCAGGATTTTTTAATGTTAAGCCAGGAAG 2

TAATACGACTCACTATAGGG

TTAGGCCGAC

GCTAGTTATTGCTCAGCGG

3 T7- F

4 T7-R

5 Pfu-F1 CCTTGTAGAGTGGTTCTTAC

6 Pfu-R1 TCGAGGGATATAGGGCTCTA

7 pMAL - F GTCGATGAAGCCCTGAAAGA

8 pMAL - R CTTCGCAACGTTCAAATCC

19 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

LmA CGGAGGTTCCGCAAAAGATG 9

LmB CCTCCAGAGTGATCGATGTT 10

2.1.2. Hóa chất và thiết bị

 Hóa chất và enzyme

- Hóa chất: hóa chất nuôi cấy vi sinh (Merck, Đức): NaCl, cao nấm men, tryptone,

agar, ampiciline, chloramphenicol; hóa chất điện di (Sigma, Mỹ): Tris – base, EDTA, acid

acetic, acrylamide, bis-acrylamide, TEMED, APS, SDS; hóa chất cảm ứng: IPTG (Sigma,

Mỹ); kit tinh sạch sản phẩm PCR trên gel: Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System

(Promega, Mỹ), kit tinh sạch sản phẩm PCR: GeneJET Genomic DNA Purification

(Thermofisher, Hoa Kỳ), thang chuẩn DNA (Fermentas, Mỹ), thang c huẩn

protein…

- Enzyme:Q5 Hot Start High-Fidelity DNA polymerase (NEB),Taq DNA

polymerase, enzyme giới hạn NcoI và XmnI (NEB, Anh), T4 Ligase (Fermentas,

Mỹ), RNase…

 Thiết bị

Các máy, thiết bị đều đang trong thời gian được kiểm định chuẩn, bao gồm:

- Máy chu kỳ nhiệt 96 mẫu (Eppendorf, Đức);

- Máy soi chụp ảnh gel (BioRad, Mỹ);

- Bộ điện di DNA Horrizontal mini (CBS Scientific, Mỹ);

- Máy đồng hóa bằng siêu âm Sonics Vibra cell (VCX130, MIDSCI);

- Bộ điện di protein (Bio-rad, Mỹ);

- Máy cô đặc mẫu (Thermo Fisher, Mỹ);

- Máy quang phổ NanoDrop 2000 (Thermo Fisher, Mỹ);

- Nồi khử trùng (Harayama, Nhật Bản);

- Cân phân tích CPA 324S (Satorius, Đức);

- Tủ cấy vô trùng Class II Type A2 (ESCO);

- Máy lắc đảo ngược Mini laboroller (Labnet);

- Máy lắc ổn nhiệt DTU-2C (Taitec, Nhật Bản);

20 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

- Máy lắc ổn nhiệt (eppendorf , Mỹ);

- Máy li tâm lạnh Eppendorf Legend X1R (Thermo Fisher, Mỹ);

- Máy ly tâm (Eppendorf, CHLB Đức);

- Lò vi sóng (Samsung);

-Tủ lạnh (0-4oC) (Toshiba, Nhật);

- Tủ lạnh Biomedical Freezer (Thermo Fisher, Mỹ);

- Máy vortex (Rotolab, OSI); Máy đo pH (HI 8424, HANNA Instruments);

- Micropipette các loại Gilson (Pháp) và Biohit (Phần Lan).

2.2. Phương pháp

2.2.1. Tách chiết plasmid

Quy trình tách chiết DNA plasmid như sau: Cấy chuyển 1 khuẩn lạc mang plasmid cần

tách vào trong ống falcon 50ml chứa 5 ml môi trường LB có bổ sung Amp+ (100 µg/ml), nuôi

lắc qua đêm ở 37ºC, 120 vòng/phút. Chuyển 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống Eppendorf loại 1,5

ml, ly tâm 3 phút tốc độ 12000 vòng/phút. Loại bỏ dịch nổi thu tế bào. Lặp lại bước thu tế bào

một lần nữa. Rửa cặn tế bào bằng 1 ml H2O deion , ly tâm thu cặn. Hòa đều tế bào thu được với

100 µl dung dịch Sol A (50mM Tris-HCl pH 7.5; 10 mM EDTA) bằng cách vortex nhanh.Bổ

sung 100 µl dung dịch Sol B (0.2 M NaOH; 1 % (w/v) SDS), đảo đầu ống Eppendorf nhanh, nhẹ

nhàng để tránh đứt gẫy DNA, ủ nhiệt độ phòng 2 phút. Bổ sung tiếp 100 µl dung dịch Sol C

(1.32 M potassium acetate (CH3COOK pH 4,8) và đảo nhẹ 5 lần, trong hỗn hợp sẽ xuất hiện kết

tủa trắng. Ly tâm 5 phút với tốc độ 14000 vòng/phút. Thu dịch nổi và chuyển sang ống

Eppendorf mới. Cho 1 µl RNAse, ủ 37 oC 30 phút để loại bỏ hết RNA trong mẫu. Bổ sung 125

µl dung dịch 5M guanidine thiocyanate, trộn thật đều và đưa lên cột. Ly tâm cột 14000

vòng/phút, 1 phút, loại dịch ở tube phía bên dưới. Đặt lại cột lên tube, rửa cột bằng 500 µl Sol E

(10 mM Tris pH 7,5; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 50% EtOH), ly tâm 14000 vòng/phút để loại

dịch. Lặp lại bước rửa cột 2-3 lần. Ly tâm khô màng ở 14000 vòng/phút, chuyển cột sang ống

Eppendorf 1,5 ml mới, ủ cột ở 65 oC cho cồn bay hơi hết. Cho 50 µl H2O vào giữa cột, ủ 2 phút,

ly tâm thu dịch chứa DNA plasmid và đo nồng độ DNA bằng máy Nanodrop. Kiểm tra bằng

cách điện di 8 µl trên gel agarose 1%.

2.2.2. Nhân đoạn gen mã hóa cho Pfu DNA pol bằng phản ứng PCR

21 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

PCR (Polymerase chain reaction) được phát minh bởi Kary Mullis (Mulliset al.,

1986), là phương pháp tổng hợp lượng lớn DNA dựatrên mẫu khuôn (một trình tự DNA

đích ban đầu). Thông thường, một phản ứng PCR gồm một chuỗi từ 20-40 chu kỳ, mỗi chu

kỳ có ba bước: biến tính, gắn mồi và kéo dài chuỗi. Sau một khoảng thời gian xác định

lượng DNA sẽ được khuếch đại lên hàng triệu lần.

Một phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 50 µl với các thành phần theo

Bảng 2.2.

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen mã hóa Pfu DNA pol

Thành phần Thể tích (µl)

5x Q5 Reaction Buffer 10

dNTP (10mM) 1

Pfu-F His(10µM) 1,25

Pfu R (10µM) 1,25

DNA khuôn (0,1 ng/µl) 4

Q5 Hot-Start High Fidelity 0,5

32 H2O

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% .

22 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose

Kỹ thuật điện di trên gel agarose được thực hiện để kiểm tra sự phân tách của DNA

theo Sambrook và Russel (Sambrook and Russel, 2001). Vì DNA là các đại phân tử tích

điện âm nên khi chịu tác động của một điện trường đều có hiệu điện thế và cường độ dòng

điện thích hợp, chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dương của điện trường với tốc độ tỷ lệ

nghịch với kích thước đoạn DNA. Từ đó mà DNA được tách thành các vạch khác nhau

trên bản gel. Sự lựa chọn nồng độ gel tùy thuộc vào kích thước trung bình của các đoạn

DNA cần phân tách. Đoạn DNA có kích thước lớn hơn 0,5 kb có thể được phân tách trên

gel agarose nồng độ 0,8-1% (w/v) và nhỏ hơn 0,5 kb có thể phân tách trên gel nồng độ 1,7-

2% (w/v). DNA được điện di trong hệ dung dịch đệm chứa 40 mM Tris-HCl, 20 mM acetic

acid, 2 mM EDTA, pH 8,3 với hiệu điện thế dao động từ 100-120 V. Bản gel sau đó được

nhuộm bằng ethidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml và các băng DNA được quan sát dưới tia

UV.

2.2.4. Tinh sạch DNA bằng kit Wizard SV Gel

Mẫu DNA sau khi được xác định trên bản gel điện di sẽ được tách chiết ra khỏi gel

agarose bằng cách sử dụng kit thôi gel Wizard SV Gel. Quy trình như sau: điện di DNA

trên gel agarose 1%, cắt mảnh gel chứa DNA cho vào ống Eppendorf và cân để xác định

khối lượng gel. Bổ sung Binding Buffer theo tỷ lệ 1g gel:1ml Binding buffer, ủ 60 ºC cho

đến khi gel tan hoàn toàn. Cho toàn bộ hỗn hợp trên lên cột Wizard, ủ nhiệt độ phòng 2

phút, sau đó ly tâm 14000 rpm trong 1 phút, loại dịch bên dưới. Bổ sung 500 µl Washing

Buffer, ủ 2 phút, ly tâm 14000 rpm trong 1 phút, loại dịch; lặp lại bước rửa một lần nữa. Ly

tâm khô màng ở 14000 rpm, 1 phút sau đó đặt cột lên ống tube 1,5 ml mới, ủ cột ở 65ºC 10

phút để cồn bay hơi hết. Bổ sung 50 µl H2O vào giữa cột, ủ nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm

14000 rpm trong 1 phút. Thu dịch bên dưới, đo OD và kiểm tra DNA thu được bằng cách

điện di trên gel agarose 1%.

2.2.5. Ghép nối gen

Vector biểu hiện pMAL – c5X của hãng New England Biolabs (Anh) được sử dụng

để biểu hiện gen mã hóa Pfu DNA pol. Ưu điểm của vector này là có promotor mạnh cho

phép biểu hiện protein tái tổ hợp ở dạng tan hoàn toàn và chiếm tỉ lệ 20 – 40% protein tổng

23 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

số của tế bào. Vector được xử lý với enzyme XmnI cắt đầu bằng và NcoI cắt đầu dính để dễ

dàng nối đoạn gen mã hóa Pfu DNA đã được cắt bằng NcoI. Phản ứng nối sản phẩm PCR

vào vector có sự xúc tác của enzyme T4 DNA ligase.

Phản ứng nối ghép có tổng thể tích là 20 µl với các thành phần được liệt kê theo

Bảng 2.3.

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng nối ghép

Thành phần Thể tích (µl)

Buffer 2X 10

Vector pMAL- c5X 1

Sản phẩm PCR (140ng) 5

T4 DNA Ligase 1

H2O 3

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22 oC trong 1 giờ và 16 oC trong 5giờ, sau đó được biến

nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli Top10.

2.2.6. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt

 Quy trình tạo tế bào khả biến:

Cấy chuyển một khuẩn lạc E. coli (Top10 , BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS) trong

5 ml môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37oC qua đêm.Chuyển 0.5 ml dịch nuôi tế

bào qua đêm sang 50 ml môi trường LB lỏng (pha loãng 100 lần dung dịch tế bào ban đầu),

tiếp tục nuôi lắc ở 200 vòng/phút, 37oC đến khi OD600 nm đạt 0,4 – 0,6. Dịch nuôi cấy sau

khi chuyển sang ống ly tâm được để trong đá 20 phút. Ly tâm 1600 vòng/phút ở 4oC trong

10 phút, loại bỏ dịch, thu cặn tế bào. Tế bào sau khi ly tâm được hòa trong 10 ml CaCl2 0,1

M lạnh. Ủ trong đá 5 phút, ly tâm 1200 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút để thu tế bào. Hòa tan

tế bào vào 10 ml CaCl2 0,1 M lạnh. Ủ trong đá 30 phút, ly tâm 1200 vòng/phút ở 4oC trong

5 phút để thu tủa tế bào. Hòa tế bào vào 2 ml dung dịch CaCl2 0,1 M chứa 20%glycerol.

Chia 100 µl dịch tế bào vào các ống Eppendorf 1,5 ml và bảo quản ở -80oC.

 Quy trình biến nạp:

24 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Tế bào khả biến sau khi lấy ra từ -80oC được làm tan trên đá trong 30 phút (tránh sốc

nhiệt). Bổ sung vào mỗi ống tế bào khả biến 5 µl mẫu sản phẩm ligation (DNA + Vector +

T4 DNA ligase), 2 µl vector pUC19 đã đóng vòng làm mẫu chứng dương, đảo nhẹ nhàng

để DNA phân bố đều trong dịch tế bào khả biến. Sau đó, đặt toàn bộ trên đá trong thời gian

30 phút.

Sốc nhiệt: mẫu đang đặt trên đá được chuyển ngay sang bể ổn nhiệt có nhiệt độ 37oC

trong 1 phút. Sau đó mẫu được lấy ra và đặt ngay lên đá lạnh trong thời gian 5 phút. Bổ

sung 900 µl LB lỏng, lắc hỗn hợp tế bào ở 37oC trong 60 phút. Hút 200 µl dịch tế bào và

cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc có chứa kháng sinh Ampicilin (Amp+) 100 µg/ml đối

với E.coli Top 10 và E.coli BL21(DE3); 100 µg/ml Amp và 50 µg/ml chloramphenicol

(Cam+) đối với E.coli BL21(DE3) pLysS. Ủ đĩa ở 37oC qua đêm.

Bảng 2.4. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường Thành phần Tham khảo

1% (w/v) bacto-tryptone, 0.5% cao nấm men, 1% Luria và cs 1960 LB lỏng (w/v) NaCl, pH 7,0

1% (w/v) bacto-tryptone, 0.5% cao nấm men, 1% Luria và cs 1960 LB rắn (w/v) NaCl, 2% (w/v) agar, pH 7,0

2.2.7. Xác định trình tự DNA

Trình tự nucleotide của gen mã hóa cho Pfu DNA polymerase được xác định theo

phương pháp của Sanger. Đặc trưng của phương pháp này là ngoài những dNTP thông

thường còn sử dụng thêm 4 loại dideoxynucleotide (ddNTPs) trong đó nhóm 3’- OH đã

bịloại oxy chỉ còn là 3’- H, mỗi loại được đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang đặc trưng

khác nhau. Sự có mặt của các ddNTP sẽ làm mất khả năng hình thành các cầu nối

phosphodieste với các nucleotide tiếp theo dẫn đến làm ngừng quá trình tổng hợp DNA.

Các đoạn DNA có kích thước khác nhau một nucleotide được phân tách bằng diện di mao

quản và phát hiện bằng hệ thống phân tích tự động nhờ máy giải trình tự ABI 3700 của

hãng Macrogen, Hàn Quốc.

25 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

2.2.8. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho Pfu DNA pol

Gen mã hóa cho Pfu DNA pol nằm trong vector pET 11a sau khi được xác định

đúng trình tự thiết kế được chuyển vào vector pMAL- c5X để biểu hiện. Xử lý vector

pMAL-c5X với hai enzyme giới hạn là NcoI và XmnI, đoạn gen mã hóa Pfu sau khi nhân

lên bằng PCR được xử lý với enzyme NcoI để tạo đầu dính tương hợp giữa đoạn gen cần

chèn và vector. Sau khi được làm sạch bằng kit tinh sạch GeneJET, gen Pfu và vector

pMAl - c5X được nối ghép với nhau nhờ enzyme T4 DNA ligase và ủ ở 16oC qua đêm. Sau

đó, sản phẩm được biến nạp vào chủng E. coli Top 10 để chọn dòng những vector pMAL -

c5X có chứa gen Pfu. Vector tái tổ hợp này được ký hiệu là pMAL-c5X-His- Pfu, sau đó

được biến nạp vào chủng E. coli BL21 (DE3) và E. coli BL21 (DE3) pLysS để kiểm tra

khả năng biểu hiện trong 2 loại tế bào.

2.2.9. Biểu hiện gen mã hóa cho Pfu DNA pol

Sau khi biến nạp vector tái tổ hợp pMAL-c5X-His- Pfu vào chủng E. coli BL21

(DE3) và E. coli BL21 (DE3) pLysS, các khuẩn lạc phát triển tốt nhất trên đĩa môi trường

chọn lọc LB (môi trường LB có bổ sung Amp+ nồng độ cuối cùng là 100 µg/ml đồi với E.

coli BL21 (DE3) và bổ sung thêm Cam+ nồng độ cuối cùng 50 µg/ml đối với E. coli BL21

(DE3) pLysS) sẽ được chọn và nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC, 200 vòng/phút. Hòa dịch nuôi

cấy qua đêm vào môi trường LB có bổ sung Amp+ và Cam+ tương ứng với loại tế bào

E.coli theo tỷ lệ 1 – 1,5% và nuôi cấy ở cùng điều kiện trên trong khoảng thời gian 2h. Khi

OD600 nm của dịch tế bào đạt 0,6 – 0,8 thì bổ sung IPTG vào môi trường nuôi cấy đến nồng

độ cuối cùng là 0,5 mM và tiếp tục nuôi tế bào ở cùng điều kiện như trên. Mẫu tế bào được

thu ở các thời điểm 0h và 5h sau cảm ứng, tế bào được thu bằng cách ly tâm 4000G trong

thời gian 20 phút ở 4ºC. Cặn tế bào được hòa tan trong dung dịch đệm C (20 mM Tris -

HCl; 200 mM NaCl; 2 mM β - mecaptoethanol; pH 7,5), siêu âm trên đá 2 phút sau đó ly

tâm 6000G, 15 phút ở 4ºC thu dịch nổi và điện di trên gel polyacrylamide.

2.2.10. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE

SDS-PAGE được thực hiện theo phương pháp của Laemmli (Laemmli, 1970) với

các thiết bị của hãng Bio-Rad. Để phân tách các protein có trọng lượng từ 90 - 150 kDa,

26 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

chúng ta sử dụng gel ở nồng độ 8% và 10%. SDS-PAGE được tiến hành trên gel 8% và

10% như ở Bảng 2.5.

Bảng 2.5. Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE

Tên Thành phần

Gel cô 4.5% 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-HCl pH 6,8; 20 l 20% (w/v) SDS; 0,3 ml

30% (w/v) acrylamide; 1,2 ml H2O; 10 l 10% (w/v) APS; 4 l

TEMED

Gel phân 5 ml: 1,3 ml 1,5 M Tris-HCl pH 8,8; 25 l 20% (w/v) SDS; 1,3 ml

tách 8% 30% (w/v) acrylamide; 2,33 ml H2O; 50 l 10% (w/v) APS; 5 l

TEMED

Gel phân 5 ml: 1,25 ml 1,5 M Tris-HCl pH 8,8; 25 l 20% (w/v) SDS; 1,67 ml

tách 10% 30% (w/v) acrylamide; 2,08 ml H2O; 25 l 10% (w/v) APS; 2,5 l

TEMED

Đệm mẫu 20% (v/v) glycerol; 2% β-mercaptoethanol; 4% (w/v) SDS; 0,01 (w/v)

2x bromophenol blue; 125 mM Tris-HCl pH 6,8

Đệm điện di 25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0.1% (w/v) SDS; pH 8,3

Để phân tích mức độ biểu hiện của protein, các bản gel được nhuộm bằng

Coomassie brilliant blue (CBB). Sau khi ủ với dung dịch nhuộm (0,1% (w/v) CBB, 30%

(v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phút, bản gel được tẩy bằng dung dịch tẩy

(30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho đến khi có thể quan sát thấy các băng

protein.

2.2.11. Sắc ký ái lực qua cột amylose

Tinh sạch protein bằng sắc ký qua cột amylose được thực hiện theo quy trình của

hãng NEB như sau:

Nhồi cột: sử dụng cột có kích thước 2 cm×10 cm đã được lót một lớp màng ở bên

dưới cột, sau đó rửa cột bằng cách dùng pipet hút dung dịch đệm C tráng xung quanh cột

và kiểm tra để hệ thống cột không bị rò rỉ dung dịch. Dùng phễu đưa amylose resin lên cột

với tỷ lệ 15 ml resin/ 1lit dịch nuôi cấy, và rửa cột với 5 lần thể tích resin của dung dịch

27 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

đệm C. Loại dung dịch C ra khỏi cột bằng khóa bên dưới được thông ra từ cột, chỉ bớt lại 1

lớp mỏng dung dịch trên bề mặt resin tránh tình trạng resin bị khô.

Tinh sạch protein dung hợp qua cột: bắt đầu đưa dịch chiết tế bào biểu hiện đã được

pha loãng tỷ lệ 1 dịch chiết : 6 đệm C lên cột resin đã rửa, loại dịch sau gắn ra khỏi cột với

tốc độ 3,3 ml/phút, dịch sau gắn được giữ lại để kiểm tra bằng điện đi SDS-PAGE. Rửa cột

để loại hết các protein không gắn với 12 lần thể tích resin của dung dịch đệm C, tốc độ dịch

rửa cột đi ra là 6,6 ml/phút, dịch rửa được giữ lại để điện di kiểm tra. Tiến hành thu protein

đích bằng dung dịch đệm C có bổ sung 10 mM maltose, tiến hành thu 10 phân đoạn mỗi

phân đoạn thu bằng 1/5 thể tích resin (3 ml). Protein đích thường chứa trong 5 phân đoạn

đầu tiên. Các phân đoạn được giữ riêng và điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide.

Chú ý rằng toàn bộ quy trình trên được thực hiện trong điều kiện lạnh để ức chế sự

phá hủy của các protease.

2.2.12. Tinh sạch protein đuôi Histag bằng Ni-charged Magbeads

Dựa vào liên kết giữa đuôi His và Ni2+, sử dụng bi từ có gắn các hạt Ni2+ trên bề mặt

để thu được các phân tử protein có gắn đuôi His. Để rửa giải sử dụng imidazol với nồng độ

cao để đẩy các protein đích ra khỏi bi từ.

Quy trình thực hiện như sau: lắc đều bi từ cho đồng đều trước khi lấy, lấy 100 µl bi

đã lắc đều vào ống Eppendorf mới, đặt ống lên giá từ để bi từ tập trung lại rồi hút loại bỏ

dịch nổi. Bổ sung 1 ml LE buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 8,0), đảo trộn bằng

vortex, cho vào giá từ và loại bỏ dịch nổi, lặp lại bước rửa trên 2 lần. Lấy 0,5 ml dịch chiết

có protein chứa đuôi His pha loãng với 0,5 ml LE buffer, bổ sung dịch pha loãng trên vào

ống bi từ đã rửa ở trên, đảo trộn nhẹ 30 - 60 phút ở 4 ºC. Đặt ống lên giá từ, thu lại dịch sau

gắn để kiểm tra bằng điện di. Bỏ ống ra khỏi giá từ, bổ sung 1 ml WB (50 mM NaH2PO4,

300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8,0), đảo trộn đều, đặt ống vào giá từ loại dịch. Lặp

lại bước rửa trên 3 lần. Rửa giải bằng 100 µl EB (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250

mM imidazole, pH 8,0), đảo trộn và ủ 5 phút, sau đó đặt lên giá từ và thu dịch. Lặp lại

bước rửa giải 3 lần. Các dịch thu lại được điện di trên gel polyacrylamide để kiểm tra.

2.2.13. Kiểm tra hoạt độ tổng hợp DNA của Pfu DNA pol tái tổ hợp

28 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Hoạt tính của Pfu DNA pol thu tái tổ hợp được kiểm tra qua phản ứng PCR với khả

năng kéo dài 2 đoạn DNA có kích thước lần lượt là 234 bp và 2,5 kb. Thành phần và chu

trình nhiệt của 2 phản ứng được thể hiện ở bảng sau:

Bảng 2.6: Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính Pfu tái tổ hợp

Thành phần Thể tích (µl)

Buffer Pfu 10X 2.5

dNTP 2,5 mM 2

Mồi xuôi 10 mM 0,625

Mồi ngược 10 mM 0,625

Pfu DNA pol 1

DNA (100 phiên bản) 2

16,25 H2O

Chương trình nhiệt:

95ºC – 3 phút

95ºC – 30 giây

60ºC – 30 giây, 72ºC – 30 giây (đối với đoạn 234 bp) 30 chu kỳ

54ºC – 30 giây, 72ºC – 2.5 phút (đối với đoạn 2,5 kb)

72ºC – 5 phút

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xác định trình tự gen mã hóa cho Pfu DNA pol từ tế bào E. coli mang vector

pET11a

 Tách DNA plasmid có mang đoạn gen mã hóa cho Pfu DNA pol:

Từ chủng E. coli chứa vector pET11a mang gen mã hóa Pfu DNA pol chúng tôi

tiến hành tách chiết plasmid theo phương pháp ở mục 2.2.1 để làm khuôn cho phản ứng

giải trình tự đoạn gen mã hóa Pfu DNA pol. Kết quả tách chiết được điện di trên gel

agarose 1% (Hình 3.1).

29 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra DNA plasmid mang đoạn gen Pfu

Đường chạy (ĐC) 1: DNA plasmid tách chiết, ĐC M: Fermentas GeneRuler 1kb

Kết quả điện di cho thấy plasmid có 3 băng tương ứng với 3 dạng của plasmid là

siêu xoắn, vòng và thẳng. Điều trên chứng tỏ rằng plasmid chúng tôi tách chiết không bị

đứt gãy, đủ điều kiện làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen Pfu tiếp theo.

Từ nguyên liệu là plasmid vừa tách chiết ở trên, để kiểm tra xem plasmid trên có

chứa đoạn gen 2328 bp mã hóa cho Pfu DNA pol hay không chúng tôi tiến hành chạy phản

ứng PCR với cặp mồi T7-F/T7-R được thiết kế theo trình tự của vector pET 11a. Sản phẩm

của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1% thể hiện ở Hình 3.2.

30 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của đoạn gen mã hóa

cho Pfu DNA pol trong vector pET11a trên gel agarose 1%. ĐC M: Fermentas GeneRuler

1kb, ĐC 1: sản phẩm PCR với khuôn là plasmid, ĐC 2: đối chứng âm PCR.

Kết quả điện di Hình 3.2 cho thấy ở ĐC số 1 xuất hiện một băng DNA duy nhất có kích

thước khoảng 2,5 kb. Kích thước 2,5 kb bao gồm đoạn gen mã hóa Pfu DNA pol 2328 bp

và 1 phần tình tự của vector khoảng hơn 100 bp ở 2 đầu gen khi chạy bằng cặp mồi T7-

F/R. Tuy kết quả PCR xuất hiện đúng băng có kích thước mong muốn nhưng cũng chưa

thể khẳng định đoạn gen có mã hóa cho Pfu DNA pol hay không. Chúng tôi tiếp tục tiến

hành phản ứng PCR với 2 cặp mồi T7- F/ Pfu - R1 và Pfu – F1/ T7- R với 2 mồi Pfu - F1

nằm ở vị trí nằm ở vị trí 1053 – 1072 và Pfu – R1 nằm ở vị trí 1237 – 1218 của đoạn gen

mã hóa cho Pfu DNA pol được công bố trên ngân hàng Gen thế giới theo mã số

KF836420.1. Trình tự 2 cặp mồi như sau :

Pfu-F1: 5’- CCTTGTAGAGTGGTTCTTAC – 3’ nằm ở vị trí 1053 – 1072

Pfu-R1: 5’- TCGAGGGATATAGGGCTCTA – 3’ nằm ở vị trí 1237 – 1218

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% và thể hiện ở Hình 3.3.

31 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen mã hóa Pfu

DNA pol bằng 2 cặp mồi T7- F/ Pfu - R1 và Pfu – F1/ T7- R. Trong đó ĐC 1: sản phẩm

PCR chạy bằng cặp mồi T7- F/ Pfu - R1, ĐC 2: sản phẩm PCR chạy bằng cặp mồi Pfu

– F1/ T7- R, ĐC 3: âm tính PCR, ĐC M: DNA marker D.

Từ hình ảnh điện di trên cho thấy ở ĐC 1 và 2 đều xuất hiện băng kích thước

khoảng 1,3 – 1,4 kb. Băng này tương ứng với kích thước của sản phẩm khi chạy bằng cặp

mồi T7- F/ Pfu - R1 là gần 1,3 kb và cặp mồi Pfu – F1/ T7- R là gần 1,4 kb. Điều đó có thể

khẳng định plasmid chúng tôi tách chiết có mang gen mã hóa cho Pfu DNA pol. Để khẳng

định plasmid có mang chính xác gen mã hóa hay không cũng như xác định trình tự của

đoạn gen trên, chúng tôi tiến hành xác định trình tự đoạn gen mã hóa trên.

 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa Pfu DNA pol từ vector pET11a

Từ plasmid tách chiết được ở trên chúng tôi đã tiến hành giải tình tự đoạn gen bằng

2 cặp mồi T7-F/R và Pfu – F1/R1 được thiết kế theo trình tự đoạn gen mã hóa Pfu DNA

pol. Kết quả giải trình tự được thể hiện ở Hình 3.4.

32 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

33 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

34 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

35 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Hình 3.4: Kết quả giải trình tự đoạn gen mã hóa Pfu DNA pol từ vector pET11a tái

tổ hợp

Kết quả Hình 3.4 cho thấy toàn bộ đoạn gen mà chúng tôi tiến hành giải trình tự có độ

tương đồng 100% với trình tự gen của đoạn Pfu trên ngân hàng gen quốc tế có mã số

KF836420.1. Điều này cũng chứng tỏ rằng plasmid mà chúng tôi tách chiết được ở trên

mang đoạn gen mã hóa cho Pfu DNA pol, không những vậy đoạn gen này còn có độ tương

đồng 100% so với đoạn gen mã hóa Pfu DNA pol được công bố trên ngân hàng Gen quốc

tế vì vậy tự acid amin của Pfu DNA pol mà chúng tôi sẽ biểu hiện tương đồng 100% với

trình tự acid amin của enzyme Pfu DNA pol tự nhiên, đây là cơ sở để tạo ra Pfu pol tái tổ

hợp có hoạt tính xúc tác.

3.2. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho Pfu DNA pol

Từ trình tự chính xác của Pfu DNA pol đã được xác định ở trên chúng tôi tiến hành thiết

kế vector biểu hiện Pfu DNA pol. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector pMAL-

36 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

c5X của hãng New England Biolabs cho mục đích biểu hiện với nhiều đặc điểm ưu việt.

PMAL-c5X có chứa promoter tac (Ptac), là một promoter mạnh nên protein tái tổ hợp được

tạo ra nhiều ở dạng dung hợp với MBP ở dạng tan. MBP có ái lực cao với amylose vì vậy

có thể dùng amylose resin để tinh sạch MBP-Pfu từ hỗn hợp protein tổng số của tế bào.

Ngoài ra giữa MBP và Pfu DNA pol có điểm cắt của Factor Xa là enzyme có tác dụng cắt

Pfu DNA pol ra khỏi MBP–Pfu. Sau hoàn nguyên Pfu DNA pol được tinh sạch qua bước

sắc ký ái lực với Ni2+ để thu được Pfu DNA pol có đuôi His tinh khiết từ hỗn hợp protease

và MBP.

Để tạo được Pfu DNA pol có gắn thêm đuôi His ở đầu N chúng tôi thiết kế mồi xuôi chứa

thêm trình tự của đuôi His và do pMAL-c5X có điểm cắt của enzyme đầu bằng XmnI ngay

sau trình tự của malE nên không cần phải thiết kế thêm enzyme giới hạn vào mồi. Và để có

thể chèn Pfu DNA pol vào vector pMAL–c5X mồi ngược phải chứa trình tự cắt của

enzyme giới hạn có trong vùng đa điểm cắt của vector pMAL–c5X. Các mồi có trình tự

như sau:

5’-CACCATCACCATCACCATCATCACGGTATGATTTTAGATGTGGATTACATAACTG-3’

8 His

Pfu R:

5’- CTACCATGGTCAGGATTTTTTAATGTTAAGCCAGGAAGTTAGGCCGAC-3’

NcoI

Pfu F-His:

Trong đó, mồi xuôi (Pfu F-His) bao gồm một phần trình tự đầu 5’ của đoạn gen mã

hóa cho Pfu DNA pol ở đầu 3’ của mồi và một trình tự gồm 24 nucleotide mã hóa cho 8

gốc Histidine được đặt vào đầu 5’ của mồi. Ngoài ra giữa 2 phần trên chúng tôi đặt

thêm 1 glycine (GGT) để tạo tính linh động cho Pfu DNA pol và đuôi His. Ở mồi

ngược, NcoI là enzyme giới hạn có trong vùng đa điểm cắt của vector pMAL-c5X hơn

nữa lại không cắt trình tự của gen mã hóa Pfu DNA pol nên chúng tôi chọn NcoI để đặt

vào mồi ngược tạo thuận lợi cho việc ghép nối gen vào vector sau này.

Từ những vật liệu trên chúng thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa Pfu DNA pol theo sơ

đồ được thể hiện ở Hình 3.5.

37 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

T4 DNA Ligase

Biểu hiện trong E.coli BL21 DE3

Hình 3.5: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa Pfu DNA pol

3.3. Xây dựng quy trình tạo vector biểu hiện

3.3.1. Nhân đoạn gen mã hóa cho Pfu DNA pol bằng PCR

38 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

 Nhân gen mã hóa Pfu DNA pol bằng PCR:

Phản ứng nhân gen mã hóa cho Pfu DNA pol sử dụng cặp mồi Pfu F-His và Pfu R-

Gly được thực hiện trong tổng thể tích 50 µl mô tả ở phần phương pháp mục 2.2.2, sản

phẩm PCR sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.6).

Hình 3.6: Kết quả điện di sản phẩm cắt Pfu và vector pMAL-c5X bằng enzyme giới hạn trên

gel agarose 1%

A. Kết quả cắt đoạn gen Pfu bằng NcoI, ĐC 1: sản phẩm PCR trước cắt, ĐC 2: sản phẩm PCR

gen Pfu sau khi cắt bằng NcoI, ĐC M: Marker DNA S plus

B. Kết quả cắt vector pMAL-c5X bằng enzyme NcoI và XmnI, ĐC 1: vector pMAL-c5X

trước khi cắt, ĐC 2: sản phẩm Vector sau khi xử lý với NcoI và XmnI, ĐC M: Fermentas

GeneRuler 1kb

Kết quả điện di Hình 3.6 A cho thấy ở đường chạy số 1 xuất hiện một băng DNA sáng rõ

có kích thước khoảng 2.5 kb phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết của đoạn gen mã

hóa cho Pfu DNA pol khi chạy bằng cặp mồi Pfu F-His và Pfu R là 2364 bp. Kết quả trên

cũng cho thấy cặp mồi đã được thiết kế đặc hiệu, chương trình chạy và nồng độ các thành

phần trong phản ứng PCR là thích hợp cho phản ứng nhân gen mã hóa Pfu DNA pol.

39 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Để tạo dòng vector có khả năng biểu hiện Pfu DNA pol, cần phải đưa đoạn Pfu vào vùng

đa điểm cắt của vector pMAL-c5X. Theo sơ đồ thiết kế trên, gen mã hóa Pfu DNA pol

được đưa vào pMAL-c5X tại vị trí cắt của XmnI và NcoI. Vector pMAL-c5X được xử lý

đồng thời với cả hai enzyme XmnI và NcoI. Do XmnI là enzyme cắt đầu bằng nên đoạn gen

mã hóa Pfu DNA pol chỉ cần xử lý với NcoI để tạo đầu dính tương đồng giữa đoạn gen cần

chèn và vector.

Kết quả điện di Hình 3.6A đường chạy số 2 cho thấy đoạn gen mã hóa cho Pfu DNA pol

sau khi cắt bằng NcoI có một băng DNA duy nhất có kích thước khoảng 2,5 kb gần đúng

với kích thước của đoạn Pfu DNA pol. Tương tự như vậy ở Hình 3.6 B, đường chạy số 2

cho thấy có một băng DNA có kích thước khoảng 5,6 kb tương ứng với kích thước của

pMAL-c5X ở dạng mạch thẳng (dạng đã được mở vòng bằng enzyme giới hạn). Sau khi

cắt, chúng tôi tiến hành thôi gel theo kit Wizard SV Gel của Promega để thu được sản

phẩm tinh sạch phục vụ cho phản ứng ghép nối. Vector pMAL-c5X và Pfu sau khi tinh

sạch được nối với nhau với sự có mặt của enzyme T4 DNA ligase ở 22ºC – 1 giờ, 16ºC – 5

giờ và biến nạp vào tế bào E. coil Top 10 để chọn các dòng chứa vector pMAL-c5X mang

gen mã hóa Pfu DNA pol. Vector tái tổ hợp này được ký hiệu pMAL-c5X-His–Pfu và được

biến nap vào tế bào khả biến E. coli Top 10 bằng phương pháp sốc nhiệt.

3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của gen mã hóa cho Pfu DNA pol trong vector pMAL-c5X

Trong quá trình ghép nối gen vào vector biểu hiện pMAL-c5X vẫn có trường hợp vector

tự đóng vòng mà không chứa đoạn gen đích. Vì vậy, để xác định được dòng tế bào mang

plasmid tái tổ hợp mong muốn, các dòng khuẩn lạc được cấy chuyển sang môi trường LB

lỏng chứa Amp+ nuôi lắc 140 rpm/phút qua đêm ở 37ºC. Sau đó pha loãng dịch nuôi 10 lần

để làm khuôn cho phản ứng PCR sàng lọc với cặp mồi đặc hiệu pMAL – F và pMAL – R

được chúng tôi thiết kế ở phần phương pháp. Từ những dòng có mang đoạn gen Pfu chúng

tôi tiến hành tách plasmid để biến nạp vào tể bào biểu hiện E. coli. Kết quả sàng lọc được

thể hiện ở Hình 3.7.

40 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Hình 3.7: Kết quả PCR sàng lọc và tách chiết plasmid các dòng khuẩn lạc mang plasmid

pMAL-c5X-His–Pfu điện di trên gel agarose 1%

A. Kết quả PCR sàng lọc bằng cặp mồi pMAL-F và pMAL-R, ĐC 1: đối chứng âm, ĐC

2 đến 7: sản phẩm PCR các dòng khuẩn lạc, ĐC M: marker DNA S plus.

B. Kết quả tách chiết plasmid các chủng dương tính với cặp mồi pMAL-F và pMAL-R,

ĐC 1, 2, 3: plasmid các dòng khuẩn lạc dương tính, ĐC M: Fermentas GeneRuler 1kb.

Kết quả Hình 3.7A cho thấy, tại các ĐC số 3, 4, 5 xuất hiện một băng DNA có kích thước

khoảng 3 kb tương ứng với kích thước đoạn gen nhân bản bằng cặp mồi pMAL-F và

pMAL-R chứng tỏ rằng tại các dòng này plasmid pMAL-c5X-His- Pfu đã được biến nạp

vào trong tế bào vi khuẩn. Trong khi đó tại các ĐC số 2, 6 và 7 chỉ có một băng với kích

thước khoảng 250 bp là do vector pMAL-c5X tự đóng vòng mà không được chèn đoạn gen

mã hóa Pfu DNA pol. Từ kết quả trên chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid của những

dòng đã được chèn Pfu DNA pol (Hình 3.7B). Kết quả tách chiết Hình 3.7B cũng cho thấy

cả 3 dòng khuẩn lạc mang gen mã hóa Pfu DNA pol đều thu được plasmid với kích thước

tương đương 8 kb là kích thước của pMAL–c5X đã được chèn đoạn Pfu DNA pol. Những

plasmid trên được chúng tôi giải trình tự bằng cặp mồi pMAL- F/R để khẳng định đoạn gen

được chèn đúng chiều và có bị lệch khung đọc hay không.

Kết quả giải trình tự có chủng chỉ mang 7 gốc Histidine ở đầu N hoặc bị đột biến nu bị

chúng tôi loại bỏ. Chỉ có một chủng mang đúng trình tự đoạn His-Pfu DNA pol được trình

41 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

bày ở phụ lục 1 mang đúng trình tự đoạn gen mong muốn. Kết quả phụ lục 1 cho thấy

ngoài phần trình tự của các đoạn 8Histag + Glycine (vị trí nucleotide thứ 9 đến nucleotide

33) và trình tự điểm cắt của NcoI ở đầu 3’ (CCATGG) thì toàn bộ đoạn Pfu DNA pol mà

chúng tôi tiến hành giải trình tự độ tương đồng 100% với trình tự gen của đoạn Pfu DNA

pol trên ngân hàng gen quốc tế có mã số KF836420.1. Ngoài ra khi so sánh với vùng

polylinker của vector pMAL-c5X (phụ lục 2) chúng tôi thấy rằng đoạn gen mã hóa Pfu

DNA pol được chèn vào đúng khung đọc. Điều này cũng chứng tỏ rằng trình tự acid amin

của Pfu DNA potương đồng 100% với trình tự acid amin của enzyme Pfu DNA pol, đây là

cơ sở để tạo ra Pfu DNA pol tái tổ hợp có hoạt tính xúc tác.

Từ những kết quả trên cho thấy chúng tôi đã thiết kế và xây dựng thành công vector

biểu hiện pMAL-c5X-His- Pfu.

3.4. Lựa chọn chủng biểu hiện gen mã hóa cho Pfu DNA pol

Từ vật liệu là vector pMAL-c5X-His–Pfu đã thu được chúng tôi tiến hành biến nạp vào tế

bào E. coli BL21(DE3) và E. coli BL21(DE3) pLysS để lựa chọn được dòng tế bào phù

hợp cho việc biểu hiện Pfu DNA pol. Các dòng tế bào sau khi biến nạp được nuôi cấy trên

môi trường LB đặc, các dòng tế bào E. coli BL21(DE3) được chuyển sang môi trường LB

lỏng có bổ sung Amp+ ở nồng độ cuối cùng là 100 µg/ml và bổ sung thêm 50 µg/ml Cam+

đối với E. coli BL21(DE3) pLysS. Dịch tế bào sau khi được cấy chuyển với tỷ lệ 1% và

nuôi lắc ở 37oC, 200 vòng/phút cho đến khi OD600 nm đạt từ 0,6 – 0,8 thì bổ sung IPTG đến

nồng độ cuối cùng 0,5 mM để cảm ứng. Tiếp theo sinh khối tế bào được thu ở các thời

điểm 0h (trước cảm ứng) và 5h (sau khi cảm ứng). Kết thúc thí nghiệm, sinh khối tế bào có

chứa protein tái tổ hợp được thu nhận hòa trong dung dịch đệm C và tế bào được phá bằng

siêu âm sau đó ly tâm tách pha để điện di trên gel polyacrylamide kiểm tra sự biểu hiện của

protein. Kết quả thể hiện ở Hình 3.8.

42 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Hình 3.8: Kết quả biểu hiện protein Pfu DNA pol trong tế bào E. coli BL21(DE3) và E.

coli BL21(DE3) pLysS điện di trên gel polyacrylamide 8%

Trong đó: ĐC 1: protein của E. coli BL21 (DE3) pLysS không mang vector tái tổ hợp,

ĐC 2: protein của E. coli BL21 (DE3)pLysS mang vector tái tổ hợp nhưng không được

cảm ứng, ĐC 3: protein của E. coli BL21 (DE3)pLysS mang vector tái tổ hợp sau 5 giờ

cảm ứng, ĐC M: GangNam-STAIN™ Prestained Protein Ladder, ĐC 4: protein của E.

coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp nhưng không được cảm ứng; ĐC 5: protein của

E. coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp sau 5 giờ cảm ứng, ĐC 6: protein của E. coli

BL21 (DE3) không mang vector tái tổ hợp.

Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy chỉ có dịch chiết của tế bào E. coli BL21

(DE3) pLysS mang vector pMAL-c5X-His–Pfu được cảm ứng sau 5 giờ là xuất hiện một

băng protein rõ có kích kích thước 135 kDa (ĐC số 3), trong khi đó dịch chiết của tế bào

không mang vector tái tổ hợp hoặc có mang nhưng không được cảm ứng thì không xuất

hiện hoặc chỉ có một băng protein mờ. Protein Pfu DNA pol có kích thước khoảng 92

kDa, nhưng khi đưa vào vector thì một số protein trong vector pMAL-c5X cũng được

biểu hiện đồng thời. Việc đồng biểu hiện này tạo điều kiện thuận lợi cho các bước tách

43 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

chiết và tinh chế protein mong muốn. Do đó protein mới xuất hiện có kích thước khoảng

135 kDa phù hợp với tính toán lý thuyết (bao gồm maltose - binding protein - MBP có

khối lượng phân tử (KLPT) 42,5 kDa nằm ngay trước Pfu DNA pol, một đuôi 8His và

Pfu DNA pol có KLPT 92 kDa). Điều này chứng tỏ có thể Pfu DNA pol đã được biểu

hiện trong tế bào E. coli BL21 (DE3) pLysS. Trong khi đó ở ĐC số 4 và 5 là dịch chiết

của tế bào E. coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp nhưng không mang pLysS các

băng protein đều rất mờ hoặc không có mặc dù tế bào E. coli BL21(DE3) không mang

vector tái tổ hợp vẫn xuất hiện các băng protein (ĐC 6). Kết quả trên có thể giải thích là

do E. coli BL21 (DE3) không mang pLysS sẽ không tạo ra lysozyme – một chất ức chế

sự biểu hiện các protein độc từ vector pMAL - c5X nên Pfu DNA pol được tạo ra dưới

dạng dung hợp vẫn có hoạt tính và làm xáo trộn hoạt động của tế bào vi khuẩn, dẫn đến tế

bào vi khuẩn không phát triển được. Kết quả trên của chúng tôi cũng tương tự với kết quả

của Lu và Erickson năm 1997 khi biểu hiện Pfu DNA pol trong tế bào E. coli BL21(DE3)

rằng có thể có tế bào phát triển nhưng không có protein được biểu hiện khi nuôi ở 30ºC

hoặc tế bào đã bị chết do protein tạo ra gây độc cho tế bào vật chủ khi nuôi ở 37ºC [13].

Từ kết quả trên cho thấy mặc dù biểu hiện dưới dạng dung hợp nhưng Pfu DNA

pol vẫn có hoạt tính vì vậy tế bào vật chủ thích hợp cho biểu hiện Pfu DNA pol là E. coli

BL21 (DE3) pLysS.

3.5. Tinh sạch protein Pfu DNA polymerase tái tổ hợp

Vì Pfu DNA pol là protein bền nhiệt có thể chịu được nhiệt độ 95 ºC trong 1 giờ

mà không bị mất hoạt tính và dựa theo việc xử lý nhiệt dịch chiết của các nghiên cứu

trước đây [1, 3], dịch tế bào sau siêu âm được xử lý 75 ºC ở các thời gian khác nhau 10,

20, 30, 60 phút để đánh giá khả năng bền nhiệt của protein dung hợp đồng thời cũng

biến tính và kết tủa các protein không mong muốn. Dịch sau khi xử lý nhiệt được ly tâm

để thu dịch chiết và kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE thể hiện trên Hình 3.9.

44 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Hình 3.9: Kết quả tinh sạch protein MBP – Pfu bằng xử lý nhiệt điện di trên gel

polyacrylamide 8%

Trong đó: ĐC 1, 2, 3, 4: dịch chiết tế bào sau khi xử lý 75 ºC ở 60, 30, 20, 10 phút;

ĐC 5: dịch chiết tế bào biểu hiện sau 5 giờ cảm ứng; ĐC 6: dịch chiết tế bào biểu hiện

trước khi cảm ứng; ĐC 7: dịch chiết tế bào E.coli BL21 (DE3) pLysS không mang

vector tái tổ hợp; ĐC M: GangNam-STAIN™ Prestained Protein Ladder

Kết quả điện di Hình 3.9 cho thấy khi xử lý nhiệt dịch chiết ở 10, 20, 30, 60 phút

tương ứng với các ĐC 4, 3, 2, 1 không thấy xuất hiện băng protein dung hợp có kích

thước 135 kDa. Trong khi nghiên cứu về Pfu DNA của các tác giả trước đây khi xử lý

nhiệt 75 ºC cho đến 1 giờ thì băng protein Pfu DNA pol không bị mất đi [1]. Có thể giải

thích rằng, protein Pfu DNA pol dung hợp có gắn thêm đoạn MBP ở đầu N, chính MBP

này làm mất đi khả năng bền nhiệt của Pfu DNA po và bị kết tủa cùng các protein

không bền nhiệt khác của tế bào E. coli. Qua đó khẳng định protein Pfu DNA pol dung

hợp có gắn thêm đầu MBP không bền với nhiệt và phương pháp xử lý nhiệt dịch phá tế

bào để tinh sạch Pfu DNA pol là không tối ưu.

Tuy nhiên khi lựa chọn vector pMAL - c5X để biểu hiện, protein tái tổ hợp tạo ra

được gắn thêm một đoạn protein bám maltose ở đầu N, dựa vào đặc điểm trên để tinh

45 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

sạch protein bằng sắc ký qua cột amylose được ghi ở mục 2.2.11. Sản phẩm sau khi qua

cột amylose được điện di trên gel polyacrylamide 10% thể hiện ở Hình 3.10, ĐC 2, 3.

Hình 3.10: Kết quả tinh sạch Pfu DNA pol tái tổ hợp điện di trên gel

polycrylamide

Trong đó: ĐC 1: dịch chiết tế bào trước khi tinh sạch; ĐC 2: dịch loại qua cột

amylose; ĐC 3: Pfu DNA pol dung hợp sau tinh sạch bằng cột amylose; ĐC 4: dịch sau

đổi đệm Pfu DNA pol dung hợp bằng cột amicon, ĐC 5: Pfu DNA pol dung hợp sau

khi cắt bằng Factor Xa (trước khi tinh sạch bằng bi từ gắn Ni2+); ĐC 6: dịch loại sau

gắn khi tinh sạch bằng bi từ; ĐC 7, 8: Pfu DNA pol sau tinh sạch bằng bi từ gắn Ni2+

(rửa giải lần 1 và lần 2); ĐC M: GangNam-STAIN™ Prestained Protein Ladder

Kết quả tinh sạch Hình 3.10 cho thấy, tại ĐC 3, 4 sản phẩm sau khi tinh sạch bằng

sắc ký qua cột amylose tuy đã thu được Pfu DNA pol tái tổ hợp ở dạng dung hợp với

kích thước 135 kDa nhưng vẫn còn rất nhiều băng phụ có kích thước nhỏ hơn. Những

băng phụ này có thể là do MBP bám không đặc hiệu hoặc protein dung hợp tạo ra chưa

hoàn chỉnh chỉ chứa đầu N có MBP. Bên cạnh đó dịch loại qua cột vẫn còn chứa băng

của protein tái tổ hợp. Từ đó có thể khẳng định rằng khả năng bám của amylose với

MBP không cao, không đặc hiệu và hiệu suất tinh sạch qua cột amylose thấp do làm

mất một lượng lớn protein đích qua cột. Tuy thu được lượng ít và nhiễm tạp nhưng dịch

sau tinh sạch vẫn chứa Pfu DNA pol và giữa MBP - Pfu có điểm cắt của Factor Xa,

46 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

chúng tôi đã tiến hành hoàn nguyên Pfu DNA pol bằng cách xử lý dịch sau tinh sạch

trên với Factor Xa theo tỉ lệ 2 Factor Xa : 100 Pfu DNA pol dung hợp (w:w). Dịch sau

cắt được điện di SDS PAGE kiểm tra và thể hiện ở ĐC 5 Hình 3.10 cho thấy băng

protein 135 kDa bị mất đi thay vào đó có 2 băng mới xuất hiện với kích thước khoảng

92 và 42.5 kDa tương ứng với kích thước của Pfu DNA pol và MBP. Ngoài ra còn có

một băng có kích thước gần 75 kDa cũng mới được xuất hiện, băng này không những

có ở dịch sau cắt mà vẫn còn sau khi tinh sạch dịch sau cắt bằng bi từ có gắn Ni2+. Điều

này có thể được giải thích rằng protein tái tổ hợp tạo ra có những mảnh không hoàn

chỉnh bị mất một đoạn nhỏ ở đầu C nên khi tinh sạch bằng MBP hay bi từ có gắn Ni2+,

những mảnh này đều có khả năng bám tốt do MBP và đuôi His đều nằm đầu N hoặc do

siêu âm trong quá trình tinh sạch làm đứt gãy protein. Những suy luận trên cũng hoàn

toàn hợp lý khi tại ĐC số 3 và 4 là dịch sau tinh sạch bằng MBP có một băng nằm giữa

vạch 100 và 135 kDa, còn dịch sau cắt xuất hiện băng gần 75 và 45 kDa. Theo dự đoán

trên thì băng 75 kDa này là một phần của Pfu DNA pol nên có thể sẽ không ảnh hưởng

đến phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính Pfu DNA pol sau khi đã tinh sạch

và hoàn nguyên ở trên.

3.6. Thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp

Pfu là một DNA polymerase có khả năng kéo dài chuỗi DNA từ đầu 3’OH tự do

của mồi vì vậy để đánh giá hoạt độ tổng hợp DNA của Pfu DNA pol tái tổ hợp,chúng

tôi đã tiến hành kiểm tra khả năng tổng hợp của Pfu DNA pol với 2 đoạn gen có kích

thước lần lượt là 234 bp và 2.5 kb theo phương pháp ghi ở mục 2.2.13. Kết quả của

phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1 % và thể hiện trên Hình 3.11.

47 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Hình 3.11: Kết quả điện di sản phẩm PCR thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp

trên gel agarose 1%

A. Kết quả điện di sản phẩm PCR thử hoạt tính Pfu DNA pol với đoạn gen 234 bp

trên gel agarose 1%. Trong đó: ĐC1: mẫu âm tính PCR chạy bằng Pfu DNA pol; ĐC 2,

3, 4, 5: sản phẩm PCR mẫu dương tính chạy bằng Pfu DNA pol ở các độ pha loãng 1, 3,

10, 100 lần; ĐC 6: mẫu âm tính PCR chạy bằng Taq DNA pol thương mại; ĐC 7: mẫu

dương tính PCR chạy bằng Taq DNA pol thương mại; ĐC M: marker DNA S plus

B. Kết quả điện di sản phẩm PCR thử hoạt tính Pfu DNA pol với đoạn gen 2.5 kb

trên gel agarose 1%. Trong đó: ĐC1, 2: sản phẩm PCR mẫu dương tính chạy bằng Pfu

DNA pol ở độ pha loãng 3 và 10; ĐC M: marker DNA S plus; ĐC 3: mẫu âm tính PCR

chạy bằng Taq DNA pol thương mại; ĐC 4: sản phẩm PCR mẫu dương tính chạy bằng

Taq DNA pol thương mại.

Sau khi tinh sạch và hoàn nguyên Pfu DNA pol tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành pha

loãng Pfu DNA pol ra 3, 10 và 100 lần để chạy phản ứng PCR trên cặp mồi LmA/B với

kích thước đoạn gen tạo ra là 234 bp. Kết quả điện di Hình 3.11 A cho thấy, tại ĐC số 2

tương ứng với Pfu DNA pol không pha loãng cho sản phẩm có kích thước 234 bp sáng

rõ nhưng lại có một băng phụ ở trên. Trong khi đó ở ĐC 3, 4 tương ứng với Pfu DNA

pol pha loãng 3 và 10 lần cho kết quả tương đương hoặc ít hơn so với enzyme Taq

DNA pol thương mại khi chạy cùng điều kiện (ĐC số 7). Tuy vậy khi pha loãng đến

100 lần thì không có băng nào được phát hiện trên gel. Từ kết quả trên khẳng định Pfu

48 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

DNA pol tái tổ hợp tạo ra đã có hoạt tính và tối ưu khi sử dụng 1 µl enzyme ở nồng độ

pha loãng 3 đến 10 lần cho một phản ứng 25 µl.

Khả năng kéo dài và tốc độ kéo dài của Pfu DNA pol tái tổ hợp là một thông số rất

quan trọng trong phản ứng PCR. Để đánh giá khả năng kéo dài, phản ứng PCR với cặp

mồi pMAL F/R khuếch đại đoạn 2,5 kb theo thành phần và chương trình nhiệt được ghi

ở mục 2.2.13 đã được thực hiện. Kết quả của phản ứng thể hiện trên Hình 3.11B, tại ĐC

số 1 và 2 là sản phẩm PCR khi dùng Pfu DNA pol không pha loãng và pha loãng 3 lần

đều cho sản phẩm mong muốn là đoạn 2,5 kb. Tuy nhiên ở ĐC 1 đối với Pfu DNA pol

không pha loãng sản phẩm tạo băng phụ, kết quả này cũng tương ứng với kết quả khi

thử hoạt tính với đoạn 234 bp ở Hình 3.11 A, còn ở ĐC 2 cho một băng sáng rõ nét

tương tự như chạy bằng enzyme Taq DNA pol thương mại (ĐC 4). Ngoài ra kết quả

trên cũng cho thấy Pfu DNA pol tái tổ hợp có tốc độ tổng hợp là 1 phút/ 1kb.

Như vậy qua các nghiên cứu trên chúng tôi khẳng định rằng đã biểu hiện thành

công Pfu DNA polymerase trong tế bào E. coli và Pfu DNA pol tái tổ hợp tạo ra có khả

năng tổng hợp đoạn lên đến 2,5 kb với tốc độ tổng hợp là 1 phút/ 1 kb. Pfu DNA pol

tuy còn lẫn một băng phụ nhưng vẫn đảm bảo hoạt tính kéo dài DNA cho các thí

nghiệm sinh học phân tử.

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

49 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Từ những kết quả thu được ở trên, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau:

 Đã thiết kế và xây dựng được vector biểu hiện pMAL-c5X – His – Pfu mang gen

mã hóa Pfu DNA polymerase ở E.coli và biểu hiện được protein Pfu DNA tái tổ hợp ở

dạng dung hợp với Maltose – binding protein và đuôi (His)8 có kích thước khoảng 135

kDa.

 Protein Pfu DNA pol ở trạng thái dung hợp với MBP bị kết tủa khi xử lý với nhiệt

độ cao nên không thể áp dụng phương pháp xử lý nhiệt cho mục đích tinh sạch.

 Bước đầu tinh sạch được Pfu DNA pol qua 2 giai đoạn: sắc ký qua cột amylose,

hoàn nguyên bằng Factor Xa và sử dụng bi từ có gắn Ni2+ tuy nhiên sản phẩm sau tinh

sach vẫn còn 1 băng phụ có kích thước khoảng 70 kDa. Băng phụ bị đứt gãy do quá trình

tinh sạch hoặc việc tổng hợp protein trong tế bào bị dừng lại khi gặp codon hiếm.

 Pfu DNA pol tái tổ hợp có khả năng tổng hợp đoạn 234 bp và 2,5 kb với tốc độ 1

phút/ 1 kb.

KIẾN NGHỊ

 Thay đổi hệ vector biểu hiện để protein tạo ra không bị kết tủa bởi nhiệt độ

 Tăng độ dài đuôi His để tăng hiệu suất tinh sạch qua việc sử dụng ái lực với Ni2+.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Kết quả giải trình tự đoạn His-Pfu DNA pol từ vector pMAL-c5X

50 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

51 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

52 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

53 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Phụ lục 2: Vùng polylinker của vector pMAL – c5X

54 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Thị Hồng Loan, et al. (2005). Một số tính chất của Pfu DNA polymerase. Báo

cáo toàn văn tại Hội nghị khoa học toàn quốc về Công nghệ sinh học trong nghiên cứu

cơ bản. Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội.

2. Phan Tuấn Nghĩa, et al. (2005). "Nhân dòng và biểu hiện gen DNA polymerase của

Pyrococcus furiosus trong E. coli sử dụng vector pET28a." Tạp chí Công nghệ Sinh

học 2.

3. Phan Tuấn Nghĩa, et al. (2005). "Nghiên cứu một số tính chất của Taq DNA

polymerase." Tạp chí Khoa học, Đại học Quốc Gia Hà Nội 21.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

4. Amir Ghasemi, et al. (2011). "Cloning, expression and purifcation of Pwo polymerase

from Pyrococcus woesei." Iranian Journal Microbiology 3(3): 118-122.

5. Austin BP, et al. (2009). "Hexahistidine-tagged maltose-binding protein as a fusion

partner for the production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli."

Methods Mol Biol 498:157-72.

6. Bae H, et al. (2009). "Characterization of DNA polymerase from the hyperthermophilic

archaeon Thermococcus marinus and its application to PCR." Extremophiles 13(4):

657-667.

7. Bedford, E., et al. (1997). "The thioredoxin binding domain of bacteriophage T7 DNA

polymerase confers processivity on Escherichia coli DNA polymerase I." Proceedings

of the National Academy of Sciences of the United States of America 94: 479-484.

8. Bemad, A., et al. (1987). "Structural and functional relationships between prokaryotic and

eukaryotic DNA polymerases." The EMBO J(6).

9. Biles BD and Connolly BA (2004). "Low-fidelity Pyrococcus furiosus DNA

polymerase mutants useful in error-prone PCR." Nucleic Acids Research 32(22).

55 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

10. Braithwaite, D., K, and J. Ito (1993). "Compilation, alignment, phylogenetic

relationships of DNA polymerases." Nucleic Acids Research 21: 787-802.

11. Brautigam CA and Steitz TA (1998). "Structural and functional insights provided by

crystal structures of DNA polymerases and their substrate complexes." Current Opinion

in Structural Biology 8(1): 54-63.

12. Bullard, J. M., et al. (2002). "DNA polymerase III holoenzymee from Thermus

thermophilus identification, expression, purification of components and use to

reconstitute a processive replicase." Journal of Biologycal Chemistry 277: 13401-

13408.

13. Chunlin Lu and Harold P. Erickson (1997). "Expression in Escherichia coli of the

Thermostable DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus." Protein expression and

purification 11.

14. Clark, J. M. (1988). "Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by

prokaryotic and eukaryotic DNA polymerases." Nucleic Acids Research 16: 9677-968

15. Dabrowski, s. and J. Kur (1998). "Cloning and expression in Escherichia coli of the

recombinant His-Tagged DNA polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcus

woesei." Protein expression and purification 14: 131-138.

16. Eckert, K. A. and T. A. Kunkel (1990). "High fidelity DNA synthesis by the Thermus

aquaticus DNA polymerases." Nucleic Acids Research 18: 3739-3744.

17. Hashimoto H, et al. (2011). "Crystal structure of DNA polymerase from

hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1." Journal of Molecular

Biology 306(3): 469-477.

18. Hogrefe, H. H., et al. (2002). "Archaeal dUTPase Enhances PCR Amplifications with

Archaeal DNA Polymerases by Preventing dUTP Incorporation." Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America 99(2): 596-601.

19. Hopfner, K. P., et al. (1999). "Crystal structure of a thermostable type B DNA

polymerase from Thermococcus gorgonarius." Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America 96: 3600-3605.

56 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

20. Hubscher, U., et al. (2002). "Eukaryotic DNA polymerase." Annual Review of

Biochemistry 71: 133-163.

21. Janice Cline, et al. (1996). "PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other

thermostable DNA polymerases." Nucleic Acids Research 14: 3546-3551.

22. Jean-Michel Flaman, et al. (1994). "A rapid PCR fidelity assay." Nucleic Acids

Research 22(15): 3259-3260.

23. Ji Hye Heo and Suhng Wook Kim (2013). "Cloning the Pfu DNA polymerase from

DNA contaminants in preparations of commercial Pfu DNA polymerase." African

Journal of Microbiology Research 7(9): 745-750.

24. Joyce, C. M. and T. A. Steitz (1994). "Function and structure relationships in DNA

polymerases." Annual Review of Biochemistry 63: 777-822.

25. Kornberg (1988). "DNA Replication." Journal of Biologycal Chemistry 265(5 of

January): 1-4.

26. Kristina Böhlke, et al. (2000). "PCR performance of the B-type DNA polymerase from

the thermophilic euryarchaeon Thermococcus aggregans improved by mutations in the

Y-GG/A motif." Nucleic Acids Research 28(20): 3910-3917.

27. Kuroita, T., et al. (2005). "Structural mechanism for coordination of proofreading and

polymerase activities in archaeal DNA polymerases." Journal of Molecular Biology

351: 291-298.

28. Lawyer, F. G., et al. (1993). "High level expression, purification and enzymeatic

characterization of full-length Thermits aquaticus DNA polymerase and a truncated

from deficient in 5 ’ to 3’ activity." PCR methods Appl 2: 257-287.

29. Lei Young and Q. Dong (2004). "Two-step total gene synthesis method." Nucleic Acids

Research 32(7).

30. Li, Y., et al. (1998). "Crystal structures of the Klenow fragment of Thermus aquaticus

DNA polymerase I complexed with deoxyribonucleoside triphosphates." Protein

Science : A Publication of the Protein Society 7(5): 1116-1123.

57 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

31. Liu EP, et al. (2015). "Whole Blood PCR Amplification with Pfu DNA Polymerase and

Its Application in Single-Nucleotide Polymorphism Analysis." Genet Test Mol

Biomarkers.

32. Lundberg, K. S., et al. (1991). "High-fidelity amplification using a thermostable DNA

polymerase isolated from Pyrococcus furiosus." Gene 108: 1-6.

33. Miladi, B., et al. (2013). "An improved strategy for easy process monitoring and

advanced purification of recombinant proteins." Mol Biotechnol 55(3): 227-235.

34. Mroczkowski, B. S., et al. (1994). "Secretion of thermostable DNA polymerase using a

novel baculovirus vector." Journal of Biologycal Chemistry 269: 13522–13528.

35. Myers TW and Gelfand DH (1991). "Reverse transcription and DNA amplification by a

Thermus thermophilus DNA polymerase." Biochemisty 30(31): 7661-7666.

36. P. S. Freemont, et al. (1988). "Cocrystal structure of an editing complex of Klenow

fragment with DNA." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America 85: 8924-8928.

37. Pavlov, A. R., et al. (2002). "Helix-hairpin-helix motifs confer salt resistance and

processivity on chimeric DNA polymerases." Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America 99: 13510-13515.

38. Peter McInerney, et al. (2014). "Error Rate Comparison during Polymerase Chain

Reaction byDNA Polymerase." Molecular Biology International: 8.

39. Pryor KD and Leiting B (1997). "High-level expression of soluble protein in

Escherichia coli using a His6-tag and maltose-binding-protein double-affinity fusion

system." Protein expression and purification 10(3).

40. Singh, M. I. and V. Jain (2013). "Tagging the expressed protein with 6 histidines: rapid

cloning of an amplicon with three options." PLoS One 8(5): e63922.

41. Suhng Wook Kim, et al. (2008). "Crystal structure of Pfu, the high fidelity DNA

polymerase from Pyrococcus furiosus." International Journal of Biological

Macromolecules 42: 356-361.

58 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

42. Y. Kim, et al. (1995). "Crystal structure of Thermus aquatics DNA polymerase."

Nature 376: 612-616.

43. Yan Wang, et al. (2004). "A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced

processivity and improved performancein vitro." Nucleic Acids Research 32(3): 1197-

1207.

59 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật