BỘ GIÁO DỤC
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
PHẠM THỊ THU PHƢƠNG
ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA MÀNG AXIT POLYLACTIC
– NISIN VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
1
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hà Nội – 2014
BỘ GIÁO DỤC
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
PHẠM THỊ THU PHƢƠNG
ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA MÀNG AXIT POLYLACTIC
– NISIN VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM
Chuyên ngành
: Vi Sinh Vật Học
Mã số
: 60 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. LÊ THANH BÌNH
2
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hà Nội – 2014
3
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU
Những vấn đề nan giải đối với thực phẩm hiện nay không những phải đối mặt
với thực trạng mất an toàn vệ sinh nghiêm trọng mà còn phải đáp ứng các nhu cầu tiêu
dùng ngày càng cao về đảm bảo chất lượng, tươi, ngon và cung cấp toàn cầu. Trước
thực trạng đó, nghiên cứu nhằm tạo ra các loại bao bì có khả năng kháng khuẩn là một
ưu tiên trong xu hướng “đóng gói tích cực, active packaging”. Đóng gói tích cực là
giải pháp trong đó có sự tương tác giữa vật liệu bao gói, thực phẩm và môi trường để
gia tăng thời gian bảo quản, độ an toàn, trong khi vẫn bảo đảm chất lượng, các tính
chất cảm quan, độ tươi ngon của thực phẩm.
Trong hơn thập kỷ vừa qua, đã có nhiều công trình nghiên cứu, tìm kiếm, các
loại chất bảo quản có nguồn gốc sinh học và vật liệu thay thế các polymer dầu mỏ,
giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Sử dụng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc sinh học
như bacteriocin, trong đó, đặc biệt là nisin trong bảo quản, chế biến thực phẩm đang
được quan tâm nhiều. Nisin có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của một số nhóm vi
sinh vật gây bệnh, gây hỏng thối hỏng thực phẩm được xem là an toàn (GRAS). Hiện
nay, nisin nằm trong danh mục các chất phụ gia an toàn có ký hiệu quốc tế E234, đã và
đang được dùng để bảo quản thực phẩm ở hơn 50 quốc gia. Sử dụng nisin để bảo quản
thực phẩm đã khắc phục các nhược điểm của các phương pháp bảo quản bằng hoá
chất, chất kháng sinh, chiếu xạ. Ngoài ra, nisin có nhiều tính chất ưu việt như có bản
chất protein, không độc, hoạt tính cao, phổ kháng khuẩn tương đối rộng, khả năng chịu
được nhiệt độ và chịu áp suất cao. Vì vậy, nisin là ứng cử viên hàng đầu cho hướng
nghiên cứu này.
Trong số các polymer phân hủy sinh học, axit polylactic (PLA) được tổng hợp
từ axit L-lactic, một loại axit được sản xuất từ quá trình lên men vi sinh vật. Vì thế,
PLA được xem là lựa chọn hàng đầu trong số các polymer sinh học có khả năng thay
4
thế các polymer từ dầu mỏ. Hiện nay, một số loại sản phẩm nhựa sinh học PLA đã ra đời như BiotaTM-Chai đựng nước bằng nhựa PLA, NobleTM- Bình đựng nước hoa quả bằng nhựa PLA, DannonTM-hộp đựng sữa chua bằng nhựa PLA.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hướng nghiên cứu tạo vật liệu từ các polymer sinh học và chất kháng khuẩn
nguồn sinh học, để tạo ra sản phẩm bao bì thực phẩm có khả năng kháng khuẩn và
phân hủy sinh học- rõ ràng là một giải pháp “thân thiện môi trường” và là lựa chọn căn
cơ cho sự phát triển bền vững.
Xuất phát từ những thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Đánh
giá tác dụng kháng khuẩn của màng axit polylactic – nisin và khả năng ứng dụng
trong bảo quản thực phẩm”. với mục tiêu :
- Đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng axit polylactic – nisin
- Đánh giá khả năng phân hủy sinh học của màng axit polylactic – nisin
- Nghiên cứu điều kiện, thời gian bảo quản màng axit polylactic – nisin
- Ứng dụng màng axit polylactic – nisin để bảo quản thực phẩm lên men (nem chua)
5
và bánh cốm
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1. HIỆN TRẠNG VÀ XU HƢỚNG NGHIÊN CỨU BAO BÌ THỰC PHẨM
KHÁNG KHUẨN VÀ PHÂN HỦY SINH HỌC
Tình trạng thực phẩm hiện nay đang đứng trước các nguy cơ mất an toàn vệ
sinh cao trong khi lại phải đáp ứng các nhu cầu tiêu dùng các loại thực phẩm đảm bảo
chất lượng, tươi, ngon và cung cấp toàn cầu. Xu hướng đó đã dẫn tới những thay đổi
mạnh mẽ của ngành công nghiệp bao bì và đóng gói thực phẩm [18; 71]. Các loại bao
bì an toàn và thân thiện môi trường được phát triển. Các loại chất bảo quản có nguồn
gốc sinh học đang dần thay thế các chất bảo quản hóa học và chất kháng sinh. Hướng
nghiên cứu tạo ra các loại bao bì có khả năng kháng khuẩn, có khả năng ức chế, tiêu
diệt vi khuẩn gây bệnh, gây ngộ độc thực phẩm, bảo đảm chất lương, độ tươi ngon của
thực phẩm, an toàn cho người sử dụng và thân thiện với môi trường đang thu hút nhiều
nghiên cứu [12; 46; 47; 48; 51; 56; 58; 82]. Trong thập kỷ vừa qua, đã có nhiều công
trình nghiên cứu, tìm kiếm, sử dụng các vật liệu có nguồn gốc sinh học để dần thay thế
các polyme dầu mỏ và giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Hiện nay, các loại vật liệu phân
hủy sinh học như axit polylactic (PLA), polyhydroxybutyrate (PHB) được xem là các
ứng cử viên cho hướng phát triển này. Bởi vì, PLA, PHB có khả năng phân hủy trong
tự nhiên, không gây ô nhiễm môi trường, không phụ thuộc vào tăng giá do quá trình
khan hiếm của dầu mỏ... Trong số các polymer phân hủy sinh học, PLA là loại được
tổng hợp từ axit L-lactic, loại axit được sản xuất từ quá trình lên men vi sinh vật từ các
nguồn nguyên liệu rẻ, có sẵn như ngô, khoai, sắn hoặc từ sinh khối thực vật. Vì thế,
PLA được xem là lựa chọn hàng đầu trong số các polyme sinh học có khả năng thay
thế các polyme từ dầu mỏ.
Sử dụng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc sinh học như bacterocin, trong đó,
đặc biệt là nisin trong quá trình bảo quản, chế biến thực phẩm đang được quan tâm
nhiều. Nisin có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật gây
bệnh, gây thối hỏng thực phẩm và được xem là an toàn (GRAS). Nisin là một
bacteriocin, cấu tạo gồm 34 axit amin, có khối lượng phân tử 3,5 kDa, được tổng hợp
bởi một số chủng thuộc loài Lactococcus lactis. Nisin được Tổ chức Nông Lương và Y
tế thế giới (FAO/WHO), cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm (FDA) của Mỹ cho phép 6
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
sử dụng trong bảo quản và làm phụ gia thực phẩm. Hiện nay, nisin nằm trong danh
mục các chất phụ gia có ký hiệu quốc tế E234, đã và đang được dùng để bảo quản thực
phẩm ở hơn 50 quốc gia. Phạm vi ứng dụng của nisin khá rộng, từ các sản phẩm tươi
sống đến các loại thực phẩm lên men, đóng hộp, dạng rắn cũng như dạng nước. Sử
dụng nisin không làm thay đổi cảm quan, không làm biến đổi chất lượng, không để lại
dư lượng trong thực phẩm. Sử dụng nisin để bảo quản thực phẩm đóng hộp, sẽ làm
giảm nhiệt độ và thời gian thanh trùng. Nisin đã trở thành chất chuyên biệt dùng để
bảo quản thực phẩm, là chất bảo quản nguồn gốc sinh học có giá trị, khắc phục được
nhược điểm của các phương pháp sử dụng hoá chất, chất kháng sinh, chiếu xạ. Nisin
có nhiều tính chất ưu việt như có bản chất protein, không độc, hoạt tính cao, phổ
kháng khuẩn tương đối rộng, khả năng chịu được nhiệt độ và chịu áp suất cao [18].
Hướng nghiên cứu tạo vật liệu từ các polyme sinh học và chất kháng khuẩn, để
tạo ra sản phẩm bao bì bảo quản thực phẩm có khả năng kháng khuẩn và phân hủy sinh
học đang là mục tiêu của nhiều nhóm nghiên cứu. Trong công trình của Kritos và cộng
sự [51], đã sử dụng màng natri – casein kết hợp với nisin để tạo ra màng kháng khuẩn.
Trong khi đó, Xu và cộng sự [81] lại tạo màng từ glucomana – gellan - nisin, Millette và
cộng sự [58] tạo ra màng kháng khuẩn sinh học bản chất alginate - nisin... Gần đây,
trong công bố của Liu và cộng sự [56], các tác giả đã sử dụng 80 % PLA, 20 % pectin
và kết hợp với 200 IU nisin/g để tạo ra loại polyme sinh học có tính kháng khuẩn.
An toàn vệ sinh thực phẩm ở Việt nam là một vấn đề vô cùng cấp bách, đang
gây nhiều bức xúc, vấn nạn cho xã hội. Các loại thực phẩm được chế biến, bảo quản
và vận chuyển hầu hết trong điều kiện không an toàn. Thực phẩm chủ yếu chỉ được
đựng và bao gói bằng bao giấy và các màng polyme có nguồn gốc dầu mỏ. Những loại
màng này được tạo ra từ các loại polyme như polyethylene (PE), polypropylene (PP),
polyvinylclorua (PVC). Nhược điểm của các loại màng này và bao giấy là, ngoài việc
gây tổn thất chất dinh dưỡng trong quá trình bảo quản, lại không có tác dụng đối với vi
sinh vật gây bệnh thực phẩm nội tại hay xâm nhập từ bên ngoài. Mặt khác, các màng
này không có khả năng tự phân hủy, nên lại là nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường.
Ngoài ra, việc bảo quản thực phẩm thường lạm dụng quá mức các chất hóa học và đặc
biệt là việc sử dụng các chất kháng sinh trong y học vào bảo quản, chế biến thực 7
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
phẩm, đây là một nguyên nhân dẫn đến tình trạng phát tán nhanh tính kháng thuốc, là
nguy cơ lớn đối với sức khỏe con người.
Việt Nam chưa có nghiên cứu về bao bì có tính kháng khuẩn và tự phân huỷ.
Tuy đã có một số nghiên cứu về polyme sinh học như là chitosan, tinh bột biến tính và
một số polymer được tách từ tự nhiên nhưng những nghiên cứu về chất kháng khuẩn
có nguồn gốc sinh học đầu tiên phải kể đến nhóm nghiên cứu của Lê Thanh Bình và
cộng sự [3; 9]. Tuy nhiên, hầu hết các công trình trên chủ yếu tập trung vào vấn đề tạo
chủng giống, năng suất, công nghệ sản xuất, sản phẩm, hướng nghiên cứu tạo vật liệu
bao bì thực phẩm chưa được đề cập.
1.2. NISIN
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu về nisin
Năm 1877, Pasteur và Joubert đã lần đầu tiên ghi nhận hiện tượng ức chế lẫn
nhau giữa các chủng Bacillus anthracis, một loại vi khuẩn thường được tìm thấy có
mặt trong nước tiểu [73]. Những nghiên cứu tiếp theo của Florey và cộng sự cũng
khám phá ra bệnh than (anthrax) và bệnh bạch hầu (diphtheria) bằng các vi sinh vật
không gây bệnh, có tính đối kháng. Năm 1925, Gratia đã phát hiện đã ra sự ảnh hưởng
lẫn nhau của hai chủng E. coli. Đến năm 1928, Roges là người đầu tiên phát hiện ra
nisin, một polypeptide do chủng Lactococcus tổng hợp có khả năng ức chế chủng L.
lactis. Năm 1946, Gratia và Frederic đã phân lập thành công một chất sinh ra từ chủng
E. coli V có khả năng ức chế E. coi và gọi tên là “colicine”. Vào năm 1953, Jacob và
cộng sự đã sử dụng “bacteriocin” làm thuật ngữ chung cho các chất kháng khuẩn có
bản chất protein được sinh ra từ vi sinh vật. Năm 1982 theo Konisky thì thuật ngữ
colicine ngày nay được dùng để chỉ các bacteriocin được sản xuất bởi một số chủng
thuộc loài E. coli và có quan hệ gần họ với họ Enterobacteriaceae. Chính vì thế mà ý
nghĩa ban đầu của thuật ngữ bacteriocin có đặc trưng phổ biến của colicine như: có
phổ kháng khuẩn hẹp và có khả năng bám lên các thụ thể trên bề mặt tế bào [18]. Sau
đó, phát hiện bổ sung về mối liên quan giữa sự tổng hợp bacteriocin và plasmid. Tại
đây cho thấy có sự khác nhau giữa colicine và bacteriocin được sinh ra bởi các chủng
vi khuẩn Gram dương [18; 73]. Bateriocin được tổng hợp từ các vi khuẩn Gram dương
không có thụ thể đặc biệt để bám trên bề mặt tế bào, thường có khối lượng thấp hơn 8
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
colicine, có thể có cơ chế tiêu diệt khác so với colicine, có phổ tác dụng rộng hơn và khác
nhau về cách vận chuyển và giải phóng trong tế bào và nó có thể có trình tự đầu được
phân chia trong giai đoạn thành thục [18; 45].
Trong suốt 2 thập kỷ gần đây, bacteriocin – một sản phẩm do vi sinh vật sinh ra
có khả năng giết hoặc ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác đã được nghiên cứu
rất nhiều về các đặc tính sinh hóa cũng như các đặc điểm về di truyền ở cấp độ phân tử
bởi vai trò của nó trong vấn đề bảo quản. Bacteriocin có đặc tính giống như một kháng
sinh vì nó có khả năng kháng khuẩn nhưng bacteriocin không phải là kháng sinh.
Bacteriocin khác với các kháng sinh bởi quá trình tổng hợp, cơ chế tác dụng, phổ tác
dụng, tính miễn dịch của chủng sản, đích tấn công… [19]. Bacteriocin có bản chất
protein, được tổng hợp ở ribosome và có phổ kháng khuẩn hẹp, có khả năng ức chế
các vi khuẩn có quan hệ họ hàng với nó [21; 25; 73]. Theo Joger và cộng sự năm 2000,
bacteriocin là một polypeptide được tổng hợp ở ribosome và bị phân hủy rất nhanh bởi
enzym phân hủy protein trong hệ tiêu hóa của người. Vì vậy, để nghiên cứu bản chất
protein của những bacteriocin mới người ta thường thử khả năng nhạy cảm của chúng
với các enzym phân hủy protein.
1.2.2. Cấu trúc của nisin
Nisin có công thức C143H230N42O37S7, là một bacteriocin thuộc nhóm I- còn
gọi là nhóm lantibiotic trong hệ thống phân loại 4 nhóm. Nisin cấu tạo gồm 34 axit
amin, có khối lượng phân tử 3,5 kDa, được tổng hợp bởi một số chủng thuộc dưới loài
L. lactis subsp. lactis, thường được viết là L. lactis [18; 44; 77]. Nisin được phát hiện từ
năm 1928. Tuy nhiên, phải mãi tới năm 1957 mới xuất hiện nisin đầu tiên trong các
phân xưởng sản xuất pho mát quy mô nông trại, để bảo quản các sản phẩm làm ra. Cũng
trong năm này, hãng Aplin và Barrett đã đưa ra chế phẩm nisin thương mại sử dụng
trong thực phẩm. Mặc dù vậy, giá trị của nisin trong bảo quản thực phẩm cũng chỉ được
xác lập trong khoảng ba thập kỷ lại đây. Trong khi những nghiên cứu cơ bản và công
nghệ ngày càng được quan tâm nhiều hơn [18; 67; 77; 85]. Dạng chế phẩm của nisin sẵn
có nhất hiện nay trên thị trường là Nisaplin, với thành phần 2,5 % nisin.
Cấu trúc của nisin được Gross và Morell làm sáng tỏ năm 1971. Nisin là một
chuỗi polypeptide gồm 34 axit amin tạo thành 5 vòng cấu trúc A, B, C, D, E, được nối 9
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
với nhau bằng cầu nối disulfide (hình 1.1). Có ít nhất 6 dạng nisin đã được phát hiện,
ký hiệu từ A đến E và Z. Đến nay, 4 loại nisin đã được nghiên cứu đặc tính là nisin A,
Z, Q và nisin U. Trừ trường hợp nisin U được tổng hợp bởi loài Streptococcus uberis,
tất cả các nisin còn lại đều do loài L. lactis sinh ra.
Phân tử nisin không chứa các axit amin thơm, nên không hấp thụ ở bước sóng
280 nm. Các axit amin dị thường đóng vai trò như một nhóm ái nhân (nucleophile),
được xác định thông qua khả năng phản ứng với các mercaptan. Có thể vì các nhóm
này rất quan trọng để đảm bảo nisin có khả năng xâm nhập vào màng tế bào đích. Cấu
trúc gồm 5 vòng của nisin giúp cho nó có độ vững chắc, đồng thời góp phần đề kháng
lại các tác dụng của enzym proteinase và sự biến tính do nhiệt.
Phân tử nisin có thể tồn tại ở dạng monome với khối lượng phân tử 3500 Dal.
Tuy nhiên, do các phân tử nisin có thể tương tác, liên kết với nhau thông qua các nhóm
axit dehydroamin và các nhóm amin. Vì vậy, nisin có thể tồn tại ở dạng dime hay
tetrame, với khối lượng phân tử tương ứng là 7000 Dal và 14000 Dal.
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử nisin
Những thành tựu nghiên cứu sinh học phân tử gần đây, chứng minh nisin bao
gồm một số peptide có tính kháng khuẩn, một sản phẩm dị gen, bao gồm 11 gen như
sau: Nis A, Nis B, Nis T, Nis C, Nis I, Nis P, Nis R, Nis K, Nis F, Nis E và Nis Z.
Trong tự nhiên, tồn tại chủ yếu 2 dạng nisin là A và Z, chúng khá bền vững.
Cấu tạo của nisin A và Z chỉ khác nhau bởi một axit amin ở vị trí thứ 27, histidine
trong cấu trúc của nisin A, trong khi axit aspartic ở nisin Z.
Do có bản chất là một protein, nên hầu hết các đặc điểm hóa lý của nisin phụ
10
thuộc nhiều vào pH của môi trường xung quanh. Mức độ hoà tan của nisin phụ thuộc
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
rất nhiều vào pH. Nisin kém bền vững và dễ dàng mất hoạt tính ở pH cao.
Nisin là một bacteriocin bền nhiệt. Sau 60 phút xử lý ở 100 oC, nisin vẫn còn 50 % hoạt tính. Ở 121 oC, sau 10 phút, hoạt tính còn 46 %, sau 60 phút còn 22 %. Độ
bền nhiệt của nisin phụ thuộc vào pH, pH càng thấp thì độ bền nhiệt càng cao. So với
các bacteriocin khác, nisin có độ bền nhiệt hơn hẳn.
Nisin không có khả năng tác động đối với vi khuẩn Gram âm, nấm men và nấm
mốc. Trong điều kiện thông thường, nisin chỉ tác động được đối với vi khuẩn Gram
dương, trong đó có vi khuẩn lactic, một số vi khuẩn gây bệnh như Listeria,
Staphylococcus, Mycobacterium và các vi khuẩn sinh bào tử Bacillus, Clostridium.
Nisin tác động có hiệu quả cao hơn ở trong các sản phẩm thực phẩm có độ pH thấp, có
trải qua giai đoạn gia nhiệt, như các sản phẩm rau quả, thực phẩm đóng hộp. Một trong
những cơ chế giải thích tác động của nisin đối với tế bào nhạy cảm là do sự tạo thành
các lỗ thủng, các kênh trên màng nguyên sinh chất, nguyên nhân gây thất thoát các
phân tử, các ion có kích thước nhỏ trong nội bào, làm giảm lực vận chuyển proton
PMF (Proton Motive Force), ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp ATP, dẫn tới sự chết tế
bào [43; 59; 68].
Cơ chế tác động của nisin đối với tế bào nhạy cảm được nghiên cứu nhiều hơn.
Phần lớn các quan điểm cho rằng, để tác động đối với vi khuẩn, nisin phải trải qua hai
bước chính:
- Ban đầu bám trên thành tế bào vi khuẩn nhạy cảm thông qua các thụ thể
- Sau đó xâm nhập qua thành tế bào và tạo các lỗ trên màng nguyên sinh chất và
thông qua các cơ chế theo mô hình “kiểu chèn”, theo kiểu nêm và cơ chế tạo mao quản
có sự tham gia của lipide II [18; 35; 43].
1.2.3. Cơ chế tác dụng của nisin
Nisin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gram (+), đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh,
gây hỏng thực phẩm như Clostridium butiricum và Cl. Tyrobutiricum, Staphylococcus
aureus, Bacillus cereus... [17; 26; 30; 44]. Đối với bào tử, nisin có khả năng ức chế sự
nảy mầm của chúng. Mặc dù không có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gram (-)
nhưng khi kết hợp với EDTA hoặc một vài nhân tố khác như nhiệt độ, axit ...thì nisin
11
có khả năng ức chế sự phát triển của vài loại vi khuẩn này [15]
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Nisin được xem là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi
khuẩn Gram (+). Tác dụng của nisin lên tế bào tại pha sinh trưởng thường mạnh hơn
rất nhiều so với tế bào tại pha cân bằng [26]. Nguyên nhân do sự phá vỡ các tổ chức
cục bộ trên màng tế bào nhạy cảm với nisin, sau đó phá vỡ màng tế bào, xâm nhập
vào tế bào chất và làm chết tế bào vi sinh vật đó [34; 73].
Nisin cũng như phần lớn các bacteriocin khác không có khả năng ức chế và tiêu
diệt vi khuẩn Gram (-), trừ Salmonella typhimurium, E. coli bị ức chế khi có mặt của
EDTA. Ngoài ra bất kỳ sự ức chế nào của vi khuẩn lactic đối với vi khuẩn Gram (-)
đều do các nguyên nhân khác chẳng hạn như pH thấp, H2O2, cạnh tranh về
dinh dưỡng, hay do tính kỵ nước của chúng. Điều này được giải thích là do sự khác
nhau của thành tế bào của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Bacteriocin chỉ tạo được lỗ
thủng trên thành tế bào Gram (+) mà không tạo được lỗ thủng trên thành tế bào Gram
(-) [26].
Tác dụng của nisin lên vi sinh vật nhạy cảm bao gồm 2 kiểu hình . Kiểu
tác dụng không đặc trưng: nisin bám dính lên bề mặt của tế bào nhạy cảm mà không
cần phải có bất kỳ một thụ thể đặc biệt nào của vi khuẩn Gram (+) và phá thủng màng
tế bào làm thoát các thành phần nội bào dẫn đến tiêu diệt vi khuẩn [30]. Kiểu hình thứ
2: nisin tương tác đặc hiệu với lipid II tiền tố peptidoglucan để phá thủng màng tế bào
đích và sự tương tác đặc hiệu có sự tham gia của 2 peptide và lipid II tiền tố thành tế
bào [79].
Mức độ tác động của nisin lên các loại vi khuẩn rất khác nhau, phụ thuộc vào
thành phần của màng phospholipid của tế bào vi khuẩn. Ở vi khuẩn Gram (+),
peptidoglycan chiếm 90% khối lượng thành tế bào, số lớp peptidoglycan có thể
lên tới 25 lớp. Trong khi đó ở vi khuẩn Gram (-) lượng peptidoglycan chỉ
chiếm 10% tổng khối lượng thành tế bào, ngoài ra chúng còn có một lớp màng ngoài
quan trọng (outer membrane – OM). Lớp màng ngoài này có cấu tạo lipid kép tương
tự màng nguyên sinh chất nhưng không chỉ có phospholipids hình thành nên cấu trúc
mà còn có polysaccharide và protein. Lipid và polysaccharide liên kết chặt chẽ
12
với nhau tạo thành một cấu trúc lipopolysaccharide đặc biệt bên ngoài thành tế bào. Vi
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
khuẩn Gram (-) có thể chống chịu lại nhiều tác nhân gây hại đối với tế bào là nhờ vào
lớp màng ngoài OM có khả năng ngăn chặn các tác nhân đó một cách có hiệu quả.
Lớp màng OM không cho phép các phân tử lượng lớn thẩm thấu qua mà chỉ cho phép
các hợp chất kỵ nước khuếch tán một cách hạn chế qua màng. Lớp ngoài cùng
của màng OM không có glycerophospholipid do vậy tăng cường được sự khuếch tán
kị nước.
Chính nhờ lớp màng ngoài OM mà vi khuẩn Gram (-) không bị tác động của các
bacteriocin. Tuy nhiên dưới ảnh hưởng của một số tác nhân thì có thể làm suy giảm
chức năng rào cản của lớp màng ngoài OM, ví dụ như các tác nhân tạo phức “càng”
(chelator) như ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sốc nhiệt, làm lạnh, axit, sốc
thẩm thấu. Chính nhờ điều này mà người ta đã ứng dụng để xử lý kết hợp
với bacteriocin nhằm tiêu diệt vi khuẩn Gram (-). EDTA là hợp chất được
nghiên cứu nhiều nhất về tác động kết hợp nisin đối với vi khuẩn Gram (- ). Stevens
và các cộng sự (1991) đã nghiên cứu sử dụng nisin kết hợp EDTA để tiêu diệt
một số chủng Salmonella. Kết quả cho thấy với nồng độ nisin 50 mg/ml và EDTA 20 nM thì sau 1 giờ xử lý ở 37oC, số lượng tế bào các chủng vi khuẩn nghiên cứu đều giảm từ 10 3,2 đến 10 6,9 CFU/ml. Trong khi đó khi sử dụng chỉ một trong hai tác nhân
EDTA hoặc nisin thì số lượng tế bào giảm không đáng kể.
1.2.4. Khả năng diệt khuẩn của nisin
Khả năng diệt vi khuẩn Gram (+)
Nisin thuộc bacteriocin nhóm I, có tác dụng diệt những vi khuẩn Gram (+) gồm
những loài vi khuẩn có quan hệ họ hàng, các vi sinh vật gây bệnh như B. cereus,
Enterococus, Lactobaccillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococus, L.
monocytogens, L. innocua, L. grayi, L. ivanovii, L. murrayi, L. seeligeri, L.
welchimeri, Staphylococus spp, Mycobacterium. Giá trị quan trọng của nisin đối với
việc bảo quản thực phẩm được thể hiện ở tác động của nó lên các vi khuẩn sinh bào tử
như là Clostridium và Bacillus là tác nhân chính gây thối thực phẩm.
Khả năng diệt vi khuẩn Gram (-)
Trong một số điều kiện nhất định như khi kết hợp với các tác nhân chelate (ví dụ
EDTA), nisin có thể tiêu diệt Salmonella. Trong điều kiện đông lạnh, xử lý nhiệt, pH 13
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
thấp, nisin có thể ức chế một số vi khuẩn Gram âm như Salmonella, Shigella,
Klebsiella, E. coli.
Khả năng diệt nấm mốc
Sử dụng nisin để bảo quản phomat người ta thấy rằng nisin làm giảm đáng kể vi
sinh vật sinh bào tử bao gồm nấm mốc và Bacillus.
Tác dụng của nisin lên nấm men
Nghiên cứu mới đây cho thấy sử dụng nisin với nồng độ50 IU/g đã kéo dài thời
gian bảo quản phomat Galotyri của Hy lạp đến 42 ngày. Các vi sinh vật chiếm ưu thế
trong phomat như lactobacilli, lactoccoci và các nấm men đã giảm một cách đáng kể.
1.2.5. Ứng dụng của nisin trong bảo quản thực phẩm
Việc ứng dụng bacteriocin vào bảo quản thực phẩm, không chỉ do có tác dụng
kháng khuẩn rõ rệt, mang tính thời sự cao mà còn do con người nhận thức rõ hơn về
hậu quả của ô nhiễm môi trường, do việc sử dụng hóa chất và chất kháng sinh trong
bảo quản [18; 43; 59; 68]. Phạm vi ứng dụng của nisin khá rộng, từ các sản phẩm tươi
sống đến các loại thực phẩm lên men, đóng hộp, dạng rắn cũng như dạng nước [18;
77]. Sử dụng nisin không làm thay đổi cảm quan, không làm biến đổi chất lượng,
không để lại dư lượng trong thực phẩm. Dùng nisin để bảo quản thực phẩm đóng hộp,
sẽ làm giảm nhiệt độ và thời gian thanh trùng. Nisin đã trở thành chất chuyên biệt
dùng để bảo quản thực phẩm, là chất bảo quản nguồn gốc sinh học có giá trị, khắc
phục được nhược điểm của các phương pháp sử dụng hoá chất, chất kháng sinh, chiếu
xạ [18; 43]. Sử dụng nisin trong các loại đồ uống có cồn có thể ngăn cản sự lên men
axit lactic. Bổ sung nisin vào quá trình thanh trùng bia có thể kéo dài quá trình cất giữ
bia. Nisin còn được sử dụng để bảo quản các thực phẩm chế biến từ đậu tương và chế
biến từ ngũ cốc, các loại thức ăn đóng gói. Để bảo quản thực phẩm, nisin có thể bổ
sung với hàm lượng 100 mg/kg- 200 mg/kg và tối đa là 500 mg/kg.
Do đặc tính bền nhiệt, bền vững trong điều kiện pH axit hoặc trung tính,
bacteriocin là một giải pháp hay trong bảo quản thực phẩm lên men cũng như không
lên men.
Đối với thực phẩm lên men, người ta bổ sung vào đó các chủng vi khuẩn lactic
phân lập từ thịt có khả năng sinh bacteriocin như là giống khởi động [34]. Các vi 14
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
khuẩn lactic này sinh trưởng tạo ra pH thấp và sinh tổng hợp bacteriocin ức chế các vi
sinh vật gây thối cũng như các vi sinh vật gây bệnh vốn có trong các sản phẩm tự
nhiên. Do đó, sản phẩm lên men vừa có hương vị thơm ngon lại vừa an toàn cho người
sử dụng.
Đối với các sản phẩm thực phẩm không lên men (thịt, cá, rau xanh…),
bacteriocin đóng vai trò là chất bảo quản, giữ cho thực phẩm được tươi sống lâu hơn
do nó ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật gây thối, vi sinh vật gây bệnh
trong sản phẩm tự nhiên.
Bacteriocin của vi khuẩn lactic không những bảo quản thực phẩm được lâu hơn,
tươi hơn mà còn không tạo màu sắc, mùi khó chịu cho sản phẩm bảo quản. Hơn nữa,
chúng được coi là an toàn đối với người sử dụng và làm hạn chế hiện tượng kháng
thuốc [55].
Theo tác giả B. Ten Brink thì bacteriocin của vi khuẩn lactic còn được sử dụng
trong các nghiên cứu phân loại.
Một loại bacteriocin của vi khuẩn lactic được sử dụng như một sản phẩm
thương mại trong bảo quản thực phẩm là nisin. Nisin đầu tiên được sản xuất dưới dạng
thương phẩm là nisin A với tên thương mại là Nisaplin. Nisin được quan tâm nghiên
cứu nhiều cả ở trong phòng thí nghiệm cũng như trong công nghiệp. Nisin được chứng
minh là an toàn cho con người khi sử dụng từ năm 1962 bởi hai tác giả Frazer và Hara.
FAO/WHO cho phép sử dụng nisin trong bảo quản thực phẩm từ năm 1969. Năm
1988, tổ chức FDA của Mỹ công nhận nisin là an toàn cho sử dụng và nó được sử
dụng làm chất bảo quản thực phẩm.
Theo Linda J. Harris và cộng sự (1992), H. Chen và D.G. Hoover năm 2003
[18, 40], nisin rất nhạy cảm với enzym α – Chymotrypsin và không bị phân hủy bởi
enzym trypsin, elastase, carboxypeptidase A, pepsin và erepcin. Nisin có chứa axit
amin lanthionine (Ala-S-Ala) và β – methyllanthionine (Abu-S-Ala), axit amino
butyric (Abu), dehydroalanin (Dha), dehydrobutyrin (Dhb).
Nisin là một bacteriocin duy nhất được cho phép sử dụng trong bảo quản thực
phẩm. Nó được sử dụng trong rất nhiều loại thực phẩm, đặc biệt lĩnh vực áp dụng
chính của nisin vẫn là các sản phẩm thực phẩm thông dụng hàng ngày (nhất là phomat 15
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
và các sản phẩm thực phẩm đóng hộp). Năm 1969, theo JECFA (the Join FAO/WHO
Expert Committee on Food Additive) ngưỡng cho phép sử dụng nisin đầu vào (ADI –
Acceptable Daily Intake) là 0,13 mg/kg thể trọng/ngày nhưng ngưỡng này là quá cao
và đến năm 1988, FDA (Food and Drug Administration) dựa trên liều lượng tính toán
đã đưa ra ADI là 0,049 mg/kg thể trọng/ngày tương ứng với một lượng là 2,9 mg/kg/1
người/ 1 ngày. Đến năm 1992, SCF (the Scientific Committee on Food) cho phép được
sử dụng 0,13 mg nisin tinh khiết/kg thể trọng (với hoạt tính là 40.000 IU/mg). Năm
2001 FDA công nhận tính an toàn của nisin trong việc sử dụng nisin để bảo quản sản
phẩm thịt lợn và thịt gia cầm đã chế biến với hàm lượng nisin có mặt tối đa là 0,0025
% ở trong sản phẩm hoàn thiện. Theo FSANZ [32] thì nisin ngày nay đã được phê
chuẩn cho phép sử dụng như một chất kháng khuẩn an toàn ở hơn 50 quốc gia trên thế
giới bao gồm: Mỹ, Anh, EU, Trung Quốc, MERCOSUR (bao gồm Argentina, Brasil,
Urugoay, Paragoay, Venezuela)…
Ở Việt Nam, vi khuẩn lactic đã được nghiên cứu, ứng dụng trong công nghiệp
thực phẩm để chế biến cũng như bảo quản thực phẩm. Nhiều nông trường quốc doanh
đã sử dụng biện pháp ủ chua thức ăn xanh cho gia súc nhờ quá trình lên men lactic [2].
Nhiều cơ sở chế biến thực phẩm đã sử dụng vi khuẩn lactic để chế biến thực phẩm
dạng: thịt, cá hun khói, tôm chua, cá muối chua, xúc xích, sữa chua… Nhiều chế phẩm
có nguồn gốc từ các vi khuẩn lactic sống được sản xuất ứng dụng trong việc chữa các
bệnh rối loạn đường ruột cho người, các loại sữa có bổ sung khoáng và vi lượng như
Fe, Ca, Mn, Cr… để làm thức ăn bổ sung cho trẻ nhỏ và những bệnh nhân suy nhược
cơ thể. Cùng với sự phát triển của công nghệ chế biến các sản phẩm trong nước thì nhu
cầu sử dụng bacteriocin mà cụ thể là nisin trong bảo quản thực phẩm là rất lớn. Tuy
nhiên, các sản phẩm bảo quản nhập ngoại có giá thành tương đối cao. Thị trường các
chất bảo quản sinh học có nguồn gốc trong nước như bacteriocin còn đang là vấn đề
mở cho các nhà sản xuất.
1.2.6. Công nghệ sản xuất và các hƣớng nghiên cứu về nisin
Nisin là chất diệt khuẩn sinh học được thương mại hóa với mức độ lớn nhất
trong số các bacteriocin. Cho đến nay, nisin đã và đang được sản xuất công nghiệp
bằng việc lên men chủng L. lactis tự nhiên, thông qua việc tối ưu hoá môi trường, điều 16
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
kiện lên men, hoàn thiện công nghệ lên men, thu hồi và tinh sạch sản phẩm [18; 37;
49; 85]. Nhiều công trình nghiên cứu về việc nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp nisin từ
vi khuẩn L. lactis đã được công bố. Jozala và đồng tác giả đã chứng minh, môi trường
MRS và M17 là môi trường gia tăng sự sinh trưởng và tổng hợp nisin từ các chủng L.
lactis. Một số tác giả khuyến cáo rằng, các môi trường tổng hợp thường không làm
tăng tổng hợp nisin [37]. Tuy nhiên, việc phối hợp các chất bổ sung khác để giảm 50
% lượng môi trường MRS và M17 lại giúp giảm giá thành sản xuất. Li và đồng tác giả
(2001) đã nghiên cứu tối ưu hóa, ảnh hưởng của đường saccarose, pepton đậu tương,
chiết nấm men, K2HPO4 , NaCl, MgSO4 đến sự sinh tổng hợp nisin [49]. Khi lên men
trong môi trường được tối ưu, năng suất tổng hợp nisin đã nâng lên từ 1074 IU/ml đến
2150 IU/ml. Taniguchi Mashayuki và cộng sự đã nghiên cứu nâng cao năng suất nisin
của L. lactis trong điều kiện nuôi cấy yếm khí với môi trường có thành phần gồm
đường, các muối khoáng, các nguồn nitơ và sử dụng màng siêu lọc polycrylonitride để
thu nhận nisin trên quy mô công nghiệp [74]. Hiroshi Shmizu và cộng sự lại sử dụng
hệ thống nuôi cấy hỗn hợp loài L. lactis với Kluyveromyces marxianus. Các tác giả
nhận thấy, K. marxianus đã sử dụng lactat sinh ra trong quá trình nuôi cấy L. lactis và
vì vậy đã có tác dụng kiểm soát được pH trong môi trường lên men. Kết quả là, sản
lượng nisin trong nuôi cấy hỗn hợp đạt 9,8 mg/l, cao hơn trong môi trường nuôi cấy
đơn chủng L. lactis (5,8 mg/l) [69]. Tại Trung quốc, sau khoảng gần 6 † 7 năm nghiên
cứu ở Viện Hàn lâm, việc sản xuất nisin ở quy mô công nghiệp trên nồi lên men 100 m3, đã bắt đầu từ khoảng năm 1995.
Ngày nay, bên cạnh những nghiên cứu lý thuyết về cơ chế phân tử sự liên quan
giữa cấu trúc và chức năng, cơ chế tác dụng của nisin, cơ chế miễn dịch của chủng sản
cũng như vai trò của những enzym cải biên, thì hướng áp dụng kỹ thuật di truyền, kỹ
thuật protein nhằm cải tiến hoạt tính, độ hoà tan, tính bền vững, tăng cường tác động
của nisin đối với vi sinh vật thuộc nhóm Gram âm dành được sự quan tâm đặc biệt.
Ngoài ra, xu hướng nghiên cứu sử dụng nisin để chế tạo các màng bao gói thực phẩm,
thay thế phương pháp bổ sung trực tiếp nisin vào thực phẩm, đang hình thành bên cạnh
các nghiên cứu về năng suất và công nghệ tinh sạch cũng như công nghệ lên men.
17
1.3. AXIT POLYLACTIC
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Axit polylactic (PLA)/polylactide là một loại polyme nhiệt dẻo bán tinh thể, giòn và rắn, có nhiệt độ thủy tinh hóa tương đối thấp (~ 60 oC) và có nhiệt độ chảy mềm 175 ÷ 180 oC. Vì thế PLA dễ dàng được gia công trong các thiết bị gia công chất
dẻo thông thường và PLA bị phân hủy theo con đường sinh học [10]. Hiện nay, trong
số các loại nhựa phân hủy sinh học, PLA là đối tượng được quan tâm nghiên cứu và
phát triển nhiều nhất trên thế giới do PLA rất thích hợp để chế tạo ra các bao bì, màng
bao gói thực phẩm, các sản phẩm sử dụng một lần nhằm thay thế các sản phẩm có
nguồn gốc polyme dầu mỏ gây ô nhiễm môi trường [31].
Mặc dù thời gian phát triển mới chỉ khoảng một thập kỷ, nhưng chỉ riêng tại
châu Âu tốc độ phát triển của nhựa phân hủy sinh học đã tăng gấp 10 lần. Điều này
cho thấy tiềm năng chiếm lĩnh thị trường rất lớn của loại sản phẩm này. Một số sản
phẩm đã được thương mại như túi sách, dụng cụ ăn uống sử dụng một lần của Công ty
Mater - Bỉ, các loại móc phát bóng golf, đĩa DVD, đinh tự tiêu trong phẫu thuật... của
Công ty Vegemat. Từ năm 2005, công ty đóng gói bao bì Coopbox của Ý đã sử dụng
PLA làm khay đựng và màng film bao gói bảo quản các loại thịt tươi, rau quả cho
phân phối và sử dụng khắp trong các nước thành viên của liên minh châu Âu [24].
Năm 2002 tập đoàn hóa chất DowChemical và tập đoàn thực phẩm Cargill của
Mỹ đã liên kết đầu tư 300 triệu USD xây dựng nhà máy sản xuất PLA với công suất
140.000 tấn/năm. Cargill Dow đã sử dụng PLA như là nguyên liệu đáng tin cậy thay
L-lactic
L-lactide
Đường, tinh bột và sinh khối thực vật
Phản ứng trùng ngưng (nhiệt độ, áp suất)
Phản ứng cộng mở vòng (nhiệt độ, chất xúc tác)
L-Polylactic Phân tử lương thấp
L-Polylactic Phân tử lượng cao
cho các chất dẻo truyền thống [16].
Hình 1.2. Sơ đồ quy trình sản xuất PLA của hãng Cargill Dow, Mỹ
Tại Nhật Bản, PLA được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Một số hãng điện tử
như NEC, Panasonic, Fujisu sử dụng PLA làm thẻ điện thoại, bàn phím máy tính, vỏ
điện thoại và một số thành phần linh kiện máy tính. Ngoài ra, một số hãng ô tô như 18
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Toyota, Honda sử dụng PLA làm một số thành phần và nội thất của xe. PLA còn được
sử dụng chế tạo các dụng cụ văn phòng, đồ chơi trẻ em, giầy dép trẻ em, vỏ chai, khay
đựng và màng film bao gói thực phẩm [62].
1.3.1. Sản xuất axit L-lactic
Axit lactic có lịch sử lâu đời và được áp dụng phổ biến trong lên men và bảo quản
thực phẩm. Axit lactic được khám phá lần đầu tiên bởi Scheele vào năm 1780, như là một
thành phần của sữa. Năm 1789, Lavoisier đặt tên nó là axit sữa. Đến năm 1857, Pasteur là
người phát hiện, axit lactic còn được tạo ra từ quá trình trao đổi chất của các vi sinh vật
khác [13]. Hiện nay, axit lactic được sản xuất theo hai con đường: tổng hợp hóa học từ
nguyên liệu dầu mỏ, khí đốt và lên men vi sinh vật từ các nguyên liệu có thể tái tạo
(đường, tinh bột và sinh khối thực vật) (Hình 1.2) [78].
Tổng hợp axit lactic theo con đường hóa học đòi hỏi các thiết bị công nghiệp chịu
nhiệt, chịu áp và axit, đồng thời sản phẩm tạo ra theo con đường này thường là hỗn hợp
hai dạng đồng phân D và L-lactic, dẫn đến chi phí cao do việc phân tách hai loại đồng
phân này [22]. Theo cơ quan quản lý Thuốc và Thực phẩm của Mỹ (FDA), axit D(–)-
lactic, không được ứng dụng trong thực phẩm, bởi vì nó không được cơ thể con người
đồng hóa dẫn đến tích lũy axit D(–)-lactic, gây rối loạn axit và làm thất thoát canxi trong
cơ thể [42]. Đồng thời, tổng hợp theo con đường hóa học lại bị giới hạn bởi hai vấn đề
chính đó là sự khan hiếm nguyên liệu dầu mỏ và vấn đề môi trường tạo ra. Để khắc phục
các vấn đề trên, sản xuất axit lactic theo con đường lên men vi sinh vật được cho là một
lựa chọn tối ưu [42].
19
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hình 1.3. Sơ đồ sản xuất axit lactic
(a): bằng con đường hóa học; (b): con đường lên men vi sinh vật
Những vi sinh vật có thể sản sinh ra axit lactic được chia thành hai nhóm: nhóm
vi khuẩn và nhóm vi nấm.
Hiện nay, sản xuất axit lactic bằng lên men vi khuẩn thường sử dụng các loài
Lactobacillus rhamnosus, L. helveticus, L. bulgaricus, L. casei, L. plantarum, L.
pentosus, L. amylophilus, L. delbrueckii.
Vi khuẩn lactic có khả năng lên men đường glucose và lactose thành axit lactic
với hiệu suất cao. Axit lactic tạo ra theo con đường lên men vi khuẩn thường không phải
chỉ có axit L-lactic mà còn có thêm sản phẩm phụ là D - lactic. Tỷ lệ giữa hai đồng phân
này phụ thuộc vào bản chất sinh học của từng loài và từng chủng [54; 83]. Hiện nay,
nhiều nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật di truyền để bất hoạt gen D-lactate dehydrogenase
tổng hợp ra D-lactic, để điều khiển tổng hợp ra 100 % axit L-lactic [17; 27; 28].
Sản xuất axit L-lactic từ vi nấm khác với ở vi khuẩn lactic. Một số loài vi nấm
như Rhizopus oryzae và Rhizopus arrhizus, có thể thủy phân, đồng hóa tinh bột và tạo
ra 100 % đồng phân axit L-lactic. Quá trình này diễn ra trong điều kiện hiếu khí
nghiêm ngặt [50; 75]. Nếu như quá trình lên men vi khuẩn lactic đòi hỏi môi trường
giàu dinh dưỡng thì quá trình lên men của Rhizopus chỉ cần môi trường muối khoáng
thông thường. Vi nấm trong quá trình sinh trưởng trong môi trường dịch thể, sợi dinh
dưỡng bó lại thành dạng pellet, vì thế dễ dàng loại bỏ sinh khối trong quá trình thu hồi
sản phẩm sau lên men [82]. Mặc dù, quá trình sản xuất axit L-lactic từ vi nấm có
nhược điểm là tạo ra lượng nhỏ axit fumaric và ethanol. Tuy nhiên, hai dạng sản phẩm
phụ này có thể bị hạn chế sinh ra bằng cách điều khiển quá trình lên men và loại bỏ
hoàn toàn thông qua quá trình trưng cất thu hồi axit L-lactic [61].
Như vậy, việc sử dụng lên men R. oryzae và R. arrhizus có thể thu nhận được
axit L-lactic có phần dễ dàng hơn so với sử dụng các vi khuẩn lactic.
20
1.3.2. Tách và thu hồi axit L-lactic từ dịch lên men
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hiện nay, axit L-lactic sau lên men được tách và thu hồi theo những cách sau:
Sử dụng phương pháp hóa học: Trong quá trình lên men và sau lên men L-lactic
được kết tủa bằng CaCO3 hoặc Ca(OH)2 để tạo ra L-lactate-Ca. Hợp chất này được
tách ra khỏi dung dịch và hoàn nguyên trở thành L-lactic bằng cách cho L-lactate-Ca
phản ứng với H2SO4. Nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi thiết bị chịu axit
cao và không thu hồi L-lactic một cách triệt để [60].
Sử dụng phương pháp điện thẩm tách-electrodialysis: Hiện nay trong sản xuất
quy mô công nghiệp phương pháp này được sử dụng để tách L-lactic ra khỏi dịch lên
men. Nguyên tắc của phương pháp điện thẩm tách được mô tả trong sơ đồ hình 1.3.
Thiết bị gồm điện trường một chiều và hai màng cation và anion. Dịch lên men đi vào 2+ hoặc Na +) được đi qua màng cation và về phía cực điện trường các ion dương (Ca
âm. Các điện tích âm L-lactic đi qua màng anion và về cực dương. Dựa trên nguyên lý
này dịch L-lactic được tách và thu ở phía đầu cực dương của thiết bị. Ưu điểm của
phương pháp là hiệu suất thu hồi, độ tinh sạch cao và tốn ít năng lượng [38].
1.3.3. Tổng hợp polylactic
Polylactic được tổng hợp từ L-lactic theo hai con đường:
+ Con đường thứ 1 (dựa trên phản ứng trùng ngưng của axit L-lactic): từ monome ban
đầu là L-lactic được trùng ngưng loại nước để tạo ra PLA. Quá trình này được tiến
hành đơn giản trong thiết bị gia nhiệt và bay hơi. Tuy nhiên, sản phẩm PLA tạo ra
thường có phân tử lượng không cao với Mn và Mw từ 1000 ÷ 10.000 [36; 41].
+ Con đường thứ 2 (dựa trên phản ứng trùng hợp cộng mở vòng của L-lactide): từ
monomer là L-lactide dưới tác động của chất xúc tác và nhiệt độ L-lactide được trùng
hợp để tạo ra PLA. Phương pháp cộng mở vòng thường thu được PLA có phân tử
lượng cao với Mn và Mw > 100.000. Hiện nay, chủ yếu các PLA được sử dụng làm
vật liệu phân hủy sinh học được tổng hợp theo con đường này [57].
Để tổng hợp PLA bằng phản ứng cộng mở vòng từ monome axit L-lactic phải
tiến hành qua hai giai đoạn sau:
Giai đoạn I: Tổng hợp dime vòng (lactide) từ axit L- lactic bằng phương pháp trùng
21
ngưng chọn lọc có xúc tác:
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Chi tiết các phản ứng của giai đoạn I:
Bước 1: phản ứng ngưng tụ không xúc tác
Bước 2: phản ứng vòng hóa Unzipping
Giai đoạn II: Trùng hợp mở vòng L-lactide thành PLA:
Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về khả năng sản xuất bao bì dễ phân hủy
từ các vật liệu như tinh bột biến tính, vật liệu blend của polyetylen với các loại polyme
dễ phân hủy có nguồn gốc tự nhiên như PHB [5]. Tuy nhiên, đến nay chưa có loại bao
bì nào thuộc dạng này được đưa ra thị trường. Một số công ty TNHH tại Tp. Hồ Chí
Minh, Vĩnh phúc đã nhập nguyên liệu để sản xuất bao bì dễ phân hủy, nhưng không
phải là polylactic và không có các chất kháng khuẩn nên chỉ đóng vai trò làm bao gói.
22
1.3.4. Khả năng phân hủy sinh học của polylactic
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng phân hủy sinh học của PLA. Do
PLA là polyeste, cho nên nó dễ dàng bị thủy phân bởi các loại enzym của vi sinh vật.
Nghiên cứu của Sawada và cộng sự (2007) đã tiến hành thủy phân PLA bằng
proteinase và lipase tách từ Bacillus subtilis và Bacillus lichenformis [65]. Tại Nhật
Bản công ty SAIDA đã phát triển hệ thống đánh giá khả năng phân hủy sinh học của
các loại nhựa sinh học (Bioplastic) theo tiêu chuẩn ISO 14855-2 có tên là MODA
(MODA-4, MODA-6 và MODA-B). Trong nghiên cứu của Kunioka và cộng sự 2009,
đã sử dụng hệ thống MODA-B để nghiên cứu khả năng phân hủy PLA ở điều kiện kỵ
khí thông qua việc xác định hàm lương CH4 tạo ra. Kết quả là sau 60 ngày 90 % PLA
đã bị phân hủy [53]. Cũng trong nghiên cứu của Kunioka và cộng sự 2006, khi sử
dụng hệ thống MODA-4 để nghiên cứu khả năng phân hủy bột PLA ở điều kiện hiếu
khí và đánh giá khả năng phân hủy thông qua lượng CO2 tạo ra, sau 56 ngày 80 % bột
PLA bị phân hủy [52]. Ở Việt Nam, trong nghiên cứu của Trần Đình Mấn và cộng sự
(2008), đã sử dụng phương pháp chôn lấp màng PLA để đánh giá khả năng phân hủy
của PLA, kết quả thu được là sau 3 tháng chôn lấp 90 % màng PLA đã bị phân hủy [76].
1.4. NGHIÊN CỨU TẠO BAO BÌ BẢO QUẢN THỰC PHẨM
1.4.1. Nghiên cứu tạo và ứng dụng khay đựng thực phẩm sử dụng một lần
Năm 2007, công ty Sealed Air lần đầu tiên giới thiệu nhãn hiệu
Cryovac® NatureTRAY™- sản phẩm khay đựng thực phẩm, được sản xuất từ nhựa
PL [80]. Loại khay này được sử dụng để đựng các loại thịt, cá và rau quả tươi. Theo
khuyến cáo nhà sản xuất loại khay từ nhựa PLA không làm mất hương vị và chất
lượng của thực phẩm. Loại khay này được bổ sung chất kháng khuẩn sinh học nhằm
kéo dài thêm thời gian sử dụng an toàn của thực phẩm. Tại Thái Lan Kasetsart, đã tạo
thành công các khay đựng thực phẩm bằng nhựa PLA, để thay thế cho các loại khay
đựng thực phẩm sản xuất từ dầu mỏ [72]. Ở Việt nam, phần lớn các hay đựng thực
phẩm được sản xuất hoặc được tái chế từ các polyme dầu mỏ.
1.4.2. Tạo màng, bao bì giấy PLA- Nisin và ứng dụng trong bảo quản thực phẩm
Sự kết hợp PLA - nisin có thể tạo ra nhiều dạng sản phẩm có thể ứng dụng
23
trong bảo quản thực phẩm như là màng film PLA - nisin, bao bì giấy tráng phủ PLA -
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
nisin... Các sản phẩm này có tính chất tương tự như các sản phẩm sử dụng polyme dầu
mỏ.
Tạo màng PLA - nisin
Màng polylactic được tạo ra theo phương pháp cán gia nhiệt hoặc tạo màng sử
dụng dung môi. Trong nghiên cứu của Liu và cộng sự, đã đề xuất phương pháp sử
dụng nisin bao lên màng film polylactic và sử dụng màng đã gắn nisin để đánh giá khả
năng kháng khuẩn của màng cũng như các tính chất cơ lý của màng [56]. Jin và cộng
sự, đã tạo ra màng film cố định nisin bằng cách hòa nisin vào dung dịch PLA đã được
hòa tan trong dung môi, tạo ra màng film có độ dày 0,15 mm với lượng nisin được bổ sung vào là 0,04 mg/cm2. Đánh giá khả năng kháng L. monocytogenes Scott A 724, E.
colii 0157:H7, Salmonella của màng PLA - nisin cho thấy, sử dụng màng có khả năng
tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trên có trong thực phẩm, và có thể dùng để bảo quản các thực phẩm tươi ở 4 oC trong 21 ngày [46]. Trong nghiên cứu của Tipayanate và
cộng sự, các tác giả đã sử dụng hỗn hợp 2 % PLA, 2 % axit L-lactic và nisin có nồng
độ 200 IU/ml để tạo màng bao bọc thịt bò tươi. Thịt bò sau khi được bao gói bằng hỗn hợp trên có thể bảo quan ở 4 oC trong 5 ÷ 6 ngày [12].
Tại Nhật Bản, nhiều loại thực phẩm ăn nhanh được bảo quản bằng màng
polyme sinh học có chứa chất kháng khuẩn sinh học mà không làm thay đổi cảm quan,
hương vị và màu sắc của thực phẩm. Những loại màng bao gói dạng như vậy, đang
từng bước thay thế dần cho các phương pháp truyền thống sử dụng các loại lá bao gói
có trong tự nhiên.
Các nhà khoa học Nhật Bản đã chứng minh rằng, các polyme sinh học có khả
năng kháng khuẩn có thể kìm hãm rất tốt vi khuẩn E. coli trên bề mặt polyme. Tuy
nhiên, việc sử dụng loại chất kháng khuẩn nào vẫn là bí mật của các hãng sản xuất.
Ở Việt nam, hướng tạo ra màng film PLA - nisin kháng khuẩn là nghiên cứu
đầu tiên, tạo sản phẩm sử dụng trong bao gói thực phẩm, nhằm khắc phục các vấn đề
về bảo quản, vệ sinh an toàn thực phẩm và về môi trường.
Tạo bao bì PLA - nisin
Trên thực tế, để tăng khả năng chịu nước, các bao bì giấy được tráng phủ các
loại polyme như polyethylen, polypropylene... sau khi sử dụng chỉ có phần giấy bị 24
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
phân hủy còn phần polyme vẫn tồn tại trong đất. Để khắc phục vấn đề này, hãng Nano
Filber Tech đã đưa ra các sản phẩm như hộp đựng, cốc, bao bì giấy có tráng phủ PLA
[80]. Vì thế, các sản phẩm của hãng sau khi sử dụng có thể phân hủy hoàn toàn trong
tự nhiên. Joerger và cộng sự đã thành công trong việc kết hợp PLA và nisin để tráng
phủ bề mặt giấy gói thực phẩm giúp tăng cường an toàn vệ sinh và kéo dài thời gian
bảo quản thực phẩm [48].
Vì vậy, ý tưởng phát triển hệ thống đóng gói kháng khuẩn dựa trên vật liệu
phân hủy sinh học PLA và nisin giải quyết hai vấn đề: an toàn thực phẩm và bảo vệ
môi trường. Vật liệu bao gói là rào cản đối với sự xâm nhập của vi sinh vật. Chất
kháng khuẩn (CKK) có mặt trong thành phần vật liệu đóng gói sẽ không chỉ ngăn cản
sự xâm nhập từ bên ngoài mà còn kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nội tại ở
thực phẩm trong quá trình bảo quản.
Tuy nhiên, do CKK nisin tráng phủ trực tiếp trên bề mặt màng film PLA có thể
bị giảm hoạt tính kháng khuẩn do bề mặt kỵ nước hoặc do bề mặt nhẵn đặc trưng của
màng PLA, sẽ ngăn cản khả năng bám kết của nisin. Bởi vậy, việc nghiên cứu các
phương pháp để gắn kết, phối trộn nisin vào PLA để tăng cường khả năng bám kết của
nisin vào PLA là vô cùng cần thiết và có tính quyết định [11; 20; 39; 63; 70; 84]..
CKK được pha trộn vào bao bì có thể di chuyển, xâm nhập vào thực phẩm qua cơ
chế khuyến tán và phân cắt. Ngoài ra, có thể thông qua cơ chế hấp phụ cân bằng [11;
63]. Bao bì kháng khuẩn có thể được tạo thành bằng cách phối trộn và cố định CKK,
hoặc bằng cách cải biến bề mặt và tráng phủ (coating) được đề cập [11; 63; 70].
Tạo màng film thực phẩm với bacteriocin (nisin, lactacin) bằng cách pha trộn
trực tiếp (direct incorporation) bacteriocin vào polyme. Trong khi có hai phương pháp
tạo màng film là ép nhiệt (heat press) và cán (casting).
Màng film sử dụng để đóng gói thực phẩm tạo ra từ các vật liệu có nguồn gốc
sinh học như axit polylactic và nisin thể hiện tính kháng khuẩn và khả năng phân giải
sinh học, là một lựa chọn đạt hai mục tiêu và là giải pháp thân thiện môi trường.
Phương pháp này không những bảo quản thực phẩm an toàn mà còn kéo dài thời gian
sử dụng, giữ được chất lượng, các đặc điểm cảm quan và tính tự nhiên của thực phẩm.
25
Theo Sunil [70] có ba cách tạo ra bao bì đóng gói kháng khuẩn gồm:
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Phối trộn (incorporation) chất kháng khuẩn vào túi để từ đó các chất kháng khuẩn -
là những chất có thể bay hơi được giải phóng ra trong quá trình bảo quản thực phẩm.
Trộn trực tiếp (direct incorporation) các chất kháng khuẩn vào màng đóng gói. -
Tráng phủ (coating) trên vật liệu bao gói. -
Những chất kháng khuẩn không có khả năng bốc hơi phải tiếp xúc với bề mặt
thực phẩm để chất kháng khuẩn có thể khuyếch tán vào bề mặt và bên trong thực
phẩm. Bởi vậy, việc khuyếch tán của CKK tham gia trong thành phần của vật liệu
đóng gói vào bề mặt thực phẩm là cực kỳ quan trọng, đảm bảo hoạt tính kháng khuẩn
[20]. Tốc độ khuếch tán của CKK còn đóng một vai trò duy trì bền vững hoạt tính
kháng khuẩn đối với thực phẩm. Vì vậy, việc nghiên cứu các tác động ảnh hưởng tới
việc giải phóng CKK rất được quan tâm.
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1 Chủng giống vi sinh vật
Chủng sử dụng để lên men sản xuất nisin là L. lactis subsp. lactis PD15, nisin
sử dụng để tạo màng PLA – nisin là sản phẩm dạng bột có hoạt lực 1000 IU/mg.
Chủng sử dụng để sản xuất axit lactic là R. oryzae VLSH01, từ axit L-lactic nhờ
phản ứng cộng mở vòng tổng hợp nên PLA, sản phẩm PLA thu được có phân tử
26
lượng trung bình Mn và phân tử lượng Mw đạt > 100.000.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Những sản phẩm này thu được từ nghiên cứu của Phòng Công nghệ vật liệu
sinh học, VCNSH, VHLKH&CNVN. Ngoài ra, các chủng sử dụng làm kiểm định là
Lactobacillus plantarum JCM1149 (Nhật Bản), B. cereus, S. aureus, L.
monocytogenes.Tất cả đang được lưu giữ tại bộ phận giống của Phòng.
2.1.2 Môi trƣờng nuôi cấy, hóa chất
Sữa gầy (Skim milk) có xuất xứ Australia. Môi trường nghiên cứu được sử dụng là
môi trường MRS và CM có các thành phần hóa chất như sau:
Môi trường MRS (g/l): Cao thịt (10), cao men (5), peptone (10), glucose (20),
CH3COONa (5), K2HPO4 (2), Amonicitrat (2), MgSO4.7H2O (0,2), MnSO4 (0,04),
Tween 80 (1ml), agar (20). pH 6,8. Bổ sung nước cất cho đủ 1 lít
Môi trường CM (g/l): Saccarose (40), cao nấm men (10), peptone (10), KH2PO4 (0,2),
NaCl (2), MgSO4.7H2O (0,2). pH 6.8 ± 0,2. Bổ sung nước cất đến 1 lít.
2.1.3 Các thiết bị thông dụng dùng cho nghiên cứu
- Lò vi sóng (Sumsung, LG-Intellowave, 220V-50Hz, Max: 1150W);
- Bình phản ứng 500 ml, bình cầu nhám 500 ml, bộ chưng cất áp suất thường; thiết bị
chưng cất chân không quay, máy khuấy từ, thiết bị tạo áp suất; tủ sấy chân không.
- Nhớt kế Ubellohde
- Kính hiển vi quang học Olympius, Model CHD, Nhật Bản
- Kính hiển vi quang học Olympius CH2, Model CHS, Nhật Bản
- Máy đo pH (320 pH Metter) Mettler Toledo, Thuỵ Sĩ
- Máy so màu (Spectophotometer pharmacia, Biotech, Model 80-2088 -64), Anh
- Cân điện tử AB 204, Mettler Toledo, Thuỵ Sỹ
- Máy li tâm Micro Centaur MSE, Anh
- Phân cực kế Model WXG-4, Trung Quốc
- Digital Micropipette Model 5000 DG, Nichipet, Nhật Bản
- Lên men và thu hồi nisin: Sử dụng hệ thống bình lên men 5, 10 l, 100 l và các thiết bị
27
sấy phun, ly tâm, lọc tiếp tuyến của Viện Công nghệ sinh học, VHLKH&CNVN
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.1. Phƣơng pháp xác định hoạt tính nisin
Để lựa chọn chủng có hoạt tính tổng hợp nisin cao trong bộ sưu tập của Phòng,
dựa trên đánh giá tác dụng ức chế chủng kiểm định L. plantarum JCM1149 [8]. Hoạt
tính kháng khuẩn của nisin được xác định bằng phương pháp khuếch tán trong môi
trường thạch có cải tiến theo Phan K.H và cs [8], gồm một số bước:
Bước 1: Chủng kiểm định L. plantarum JCM 1149 được nuôi tĩnh qua đêm (12 giờ)
trong môi trường MRS lỏng ở 30 °C (OD600 = 1,28).
Bước 2: Môi trường MRS bán lỏng (có chứa 0,6 % thạch) được khử trùng ở 121 °C,
15 phút. Sau khi làm lạnh đến nhiệt độ khoảng 37 ÷ 40 °C, bổ sung 0,5 % (v/v) dịch
huyền phù vi khuẩn chủng kiểm định, lắc đều và đổ ra đĩa petri có đường kính 15 cm
(20 ml/đĩa). Đợi thạch nguội, đục giếng. Mỗi giếng có đường kính 7 mm.
Bước 3: Hút 25 µl dịch nisin đã được pha loãng nhỏ vào các giếng thạch và giữ ở nhiệt độ 4 oC trong khoảng 4 giờ, sau đó ủ ở 37 oC qua đêm. Quan sát và đo đường kính
vòng vô khuẩn được hình thành. Trong đó, đường kính vòng vô khuẩn của mẫu nghiên
cứu bằng hiệu của đường kính vòng vô khuẩn đo được và đường kính giếng thạch (D-
d). Căn cứ vào việc xuất hiện vòng vô khuẩn và kích thước đường kính vòng vô khuẩn
để xác định hoạt tính nisin của chủng nghiên cứu.
Hoạt tính của nisin thường được xác định bằng đơn vị quốc tế IU (International Unit).
Việc xác định cơ bản dựa theo phương pháp của Fowler và cộng sự đề xuất 1975..
Chủng kiểm định là L. plantarum JCM1149 một chủng kháng axit và nhạy cảm với
nisin. Nisin chuẩn của hãng Sigma với hoạt tính 1000000 IU/g được pha thành các
nồng độ khác nhau. Xác định hoạt tính của những mẫu này bằng cách đo đường kính
vùng ức chế đối với L. plantarum. Từ đó lập phương trình đường chuẩn tương quan
giữa nồng độ nisin (tính bằng IU/ml hoặc IU/mg) và đường kính vòng ức chế bằng phần mềm Excel của Microsoft, phương trình có dạng hàm số mũ: Y = 102.5 x e 0.281x , hệ số hồi quy R2 = 0.994. Trong công thức này: x = D-d (mm), D: là đường kính vòng
vô khuẩn (mm) , d: là đường kính lỗ khoan (mm);, Y: Hoạt tính chế phẩm (IU/ml hoặc
28
IU/mg) .
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Với đường cong chuẩn đã dựng được, việc xác định hoạt tính các mẫu chứa nisin rất
thuận lợi và nhanh chóng (hình 2.1).
Hình 2.1. Đường cong chuẩn xác định nồng độ nisin (IU)
2.2.2. Phƣơng pháp tạo màng PLA - nisin
Màng PLA - nisin được chuẩn bị theo phương pháp của T. Jin và cộng sự [46].
Cân 0,75 g PLA bổ sung vào bình tam giác nút nhám chứa 25ml DMCL. Dung dịch
được khuấy cho đến khi tan hoàn toàn. Khi dung dịch trong suốt bổ sung 0,25 g nisin
và tăng khuấy. Sau đó, hỗn hợp trên được đổ ra đĩa petri có đường kính 15 cm. Dung
dịch methylene chloride được bay hơi ở nhiệt độ phòng trong tủ hút. 2.2.3. Xác định nồng độ nisin trên 1 cm2 màng PLA – nisin
Đĩa petri để tạo màng có đường kính 15 cm, vậy diện tích đĩa là 176,625 cm2.
Theo công thức tạo màng mục 2.2.2 nisin nồng độ 1000 IU/mg bổ sung vào là 0,25 g tương đương 250000 IU. Vậy 1 cm2 màng sẽ có nồng độ nisin là 1415 IU.
2.2.4. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của màng
Hoạt tính kháng khuẩn của màng được xác định theo 2 cách:
Phương pháp khuếch tán trên thạch bán lỏng: Chủng kiểm định L. plantarum JCM
1149 được nuôi tĩnh qua đêm (12 giờ) trong môi trường MRS lỏng ở 30 °C (OD600 =
1,28). Môi trường MRS bán lỏng (có chứa 0,6 % thạch) được khử trùng ở 121 °C, 15
29
phút. Sau khi làm lạnh đến nhiệt độ khoảng 37 † 40 °C, bổ sung 0,5 % (v/v) dịch
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
huyền phù vi khuẩn chủng kiểm định, lắc đều và đổ ra đĩa petri. Đợi thạch nguội, đặt các miếng màng PLA – nisin lên bề mặt thạch, tiếp theo giữ ở nhiệt độ 4 oC trong khoảng 4 giờ, sau đó ủ ở 37 oC qua đêm. Quan sát và đo đường kính vòng vô khuẩn được
hình thành.
Phương pháp xác định số lượng chủng kiểm định bị tiêu diệt trong môi trường dịch
thể: Cắt màng PLA - nisin ra làm các miếng khác nhau, mỗi miếng màng có diện tích bằng 2 cm2. Các miếng màng được cho vào các ống nghiệm có chứa 2 ml môi trường
MRS dịch thể. Bổ sung 0.5 % dịch huyền phù chủng vi khuẩn kiểm định vào các ống,
mẫu đối chứng cũng bổ sung 0,5 % chủng kiểm định nhưng không cho màng PLA – nisin. Các mẫu nuôi ở 37 oC, lấy mẫu trải đĩa kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn theo
các mốc thời gian: 0; 4; 8; 12; 16; 20; 24; 36; 48 giờ.
Ảnh hưởng của tỷ lệ methylene chloride lên hoạt tính nisin của màng PLA - nisin:
Tỷ lệ methylene chloride được sử dụng trong nghiên cứu này là 10, 15, 20, 25 và 30
ml. Sau khi màng PLA - nisin được tạo ra theo các tỉ lệ dung môi methylene chloride ở
trên, xác định hoạt tính kháng khuẩn của màng.
Ảnh hưởng của tỷ lệ PLA: Màng PLA - nisin được tạo ra như mô tả ở mục 2.2.2.
Nhưng PLA được bổ sung với các lượng khác nhau: 0,5 g; 0,75 g; 0,9 g và 1 g. Sau
khi màng PLA - nisin được tạo ra với các tỉ lệ PLA ở trên, xác định hoạt tính kháng
khuẩn của màng.
Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình tạo màng: Màng PLA - nisin được tạo ra
như mô tả ở mục 2.2.2, nhưng được đặt tại các nhiệt độ khác nhau: 37, 60, 70 và 80
°C. Sau 15 phút, lấy hỗn hợp dung dịch trên đổ ra đĩa petri để tạo màng. Xác định
hoạt tính kháng khuẩn của màng.
2.2.5. Xác định khả năng phân hủy của màng PLA - nisin
Màng được chôn lấp một cách tự nhiên trong đất vườn, sau 1 tháng tiến hành
lấy mẫu cân trọng lượng và quan sát dưới hiển vi điện tử quét. Thí nghiệm được tiến
hành kéo dài đến 6 tháng.
2.2.6. Phƣơng pháp thí nghiệm bảo quản thực phẩm
30
2.2.6.1. Phƣơng pháp bảo quản nem chua
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Mẫu nem chua thí nghiệm là nem đã chín được mua tại làng Vẽ, Đông Ngạc,
Từ Liêm, Hà Nội. Các mẫu thí nghiệm được thay lớp nilon bằng màng PLA – nisin
sau đó lại bọc lá như ban đầu, mẫu đối chứng để nguyên, các mẫu được để ở nhiệt độ thường (30 oC). Đánh giá cảm quan mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng theo ngày.
2.2.6.2. Phƣơng pháp bảo quản bánh cốm
Kiểm tra thành phần và số lượng vi sinh vật có trong bánh cốm bằng phương
pháp pha loãng tới hạn [4]:
Lấy 10 gam mẫu bánh cốm cho vào 90 ml nước muối sinh lý 0,85 % nghiền mịn (thìa dung để nghiền được khử vô trùng). Dịch thu được đã có độ pha loãng là 10 -1. Hút 1ml
dịch này chuyển vào 1 ống nghiệm sạch đã chứa 9 ml nước muối sinh lý khử trùng, được độ pha loãng 10 -2. Tiếp tục pha loãng cho tới khi đạt độ pha loãng 10 -8 hoặc cao hơn.
Dịch đã pha loãng ở mỗi nồng độ được cấy vô trùng và trải đều trên đĩa Petri đã có sẵn môi trường phân lập thích hợp. Các đĩa đã cấy được nuôi trong tủ ấm 37 oC và
theo dõi trong khoảng 1- 2 tuần. Đếm số lượng khuẩn lạc và nhận dạng các vi sinh vật.
Phương pháp bảo quản bánh cốm
Mẫu bánh cốm thí nghiệm sử dụng màng PLA – nisin để bọc thay cho nilon, mẫu đối chứng để nguyên, các mẫu được bảo quản ở nhiệt độ phòng (30 oC). Đánh giá
cảm quan mẫu theo ngày.
31
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. LỰA CHỌN CÁC CHẤT THÀNH PHẦN TẠO MÀNG
Axit polylactic là một trong số các polymer phân hủy sinh học, một loại axit
được sản xuất từ quá trình lên men vi sinh vật, axit này tan trong một số dung môi như
chloroform, methylene chloride (hay còn gọi là dichloromethane). Với mục đích tạo
màng để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm thì màng tạo ra cần phải dai, mịn, cảm
quan phải đẹp mắt, chính vì thế cần lựa chọn được thành phần như thế nào để tạo
màng theo yêu cầu. Kết quả trình bày dưới bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. So sánh màng PLA tạo từ chloroform và methylene chloride
Yêu cầu Chloroform Methylene chloride
Cảm quan màng Màng cứng, đục, giòn Màng dẻo, trong, dai
Vòng vô khuẩn (mm) 5 9
a b
Hình 3.1. Ảnh màng PLA tạo từ chloroform và methylene chloride
a/ màng tạo từ methylene chloride; b/ màng tạo từ chloroform
Kết quả bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy sử dụng dung môi methylene chloride đạt
kết quả tốt hơn, màng dẻo và trong, nisin trải đều khắp bề mặt màng, hoạt tính kháng
khuẩn của màng tốt, vòng ức chế đạt 9 mm. Khi sử dụng chloroform thì nisin bị vón
cục khó giải phóng ra thực phẩm khi bao gói bảo quản, màng đục, cứng và giòn, hoạt
tính kháng khuẩn thấp, vòng ức chế là 5 mm. Quan trọng hơn, methylene chloride
được cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm (FDA) của Mỹ cho phép sử dụng làm chất 32
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
kết dính trong tạo bao bì bảo quản thực phẩm còn chloroform thì không. Chính vì thế
methylene chloride được lựa chọn để làm chất kết dính tạo màng PLA – nisin.
3.2. NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TẠO
MÀNG PLA – NISIN VÀ HOẠT TÍNH KHÀNG KHUẨN CỦA MÀNG
3.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ methylene chloride đến màng PLA - nisin
Tỷ lệ methylene chloride được sử dụng trong quá trình tạo màng có ảnh hưởng
không nhỏ đến khả năng hòa tan PLA, đến độ dày, mỏng của màng cũng như hoạt tính
kháng khuẩn tính cho 1 đơn vị diện tích màng. Thí nghiệm được tiến hành với lượng
methylene chloride là: 10; 15; 20; 25; 30 ml, nisin 0,25 g, PLA 1 g và được phủ lên đĩa
petri cùng diện tích. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ methylene chloride lên
hoạt tính kháng khuẩn của màng được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ methylene chloride đến màng PLA - nisin
Tỷ lệ nisin/methylene chloride (ml) Màng PLA -
nisin 10 15 20 25 30
Vòng kháng 9 8 8 8 8 khuẩn (mm)
Màng Màng Màng dẻo, Cảm quan màng Màng cứng Màng cứng dẻo dẻo, dai dai
Kết quả bảng 3.2 cho thấy tỷ lệ methylene chloride có ảnh hưởng đến quá trình
tạo màng. Trong nghiên cứu này, methylene chloride với lượng 25 ml thích hợp nhất
cho việc tạo màng PLA – nisin, màng tạo thành dẻo, dai, mỏng đều, hoạt tính kháng
khuẩn tốt, vòng ức chế là 8 mm. Ở tỷ lệ thấp hơn thì lượng dung dịch tạo màng không
phủ kín được đĩa có diện tích xác định, đồng thời màng tạo ra rất cứng, không dẻo,
không dai, ở tỷ lệ 10 ml methylene chloride tuy vòng kháng khuẩn đạt 9 mm do nisin
phân bố dày hơn (không phủ kín đĩa) nhưng màng lại rất cứng. Còn nếu ở tỷ lệ cao
hơn thì lượng dung môi thừa sẽ lãng phí. Do đó trong các nghiên cứu tiếp theo chọn tỷ
lệ dung môi methylene chloride là 25 ml cho quá trình tạo màng.
3.2.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ PLA
Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ PLA được tiến hành như sau: sử dụng 0,25 g
nisin, 25 ml methylene chloride, PLA có phân tử lượng là 100000 với các lượng khác 33
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
nhau: 0,5 g; 0,75 g; 0,9 g và 1 g, dung dịch được phủ lên đĩa petri có cùng diện tích.
Sau khi màng PLA - nisin được tạo ra tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn và
cảm quan của màng. Kết quả được trình bày bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ PLA lên hoạt tính kháng khuẩn của màng PLA - nisin
Tỷ lệ PLA (g) Màng PLA - nisin 0,5 0,75 0,9 1
Hoạt tính kháng
8 8 khuẩn (vòng ức chế 9 9
mm)
Màng dai, Màng dai, Màng dai, Màng không Cảm quan màng không mủn, không mủn, không mủn, dai, mủn không giòn cứng cứng
Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.3 cho thấy tỷ lệ PLA 0,75 g
thích hợp nhất cho việc tạo màng PLA - nisin. Ở tỷ lệ PLA này, màng tạo ra không bị
dày, màng dai, không mủn, không bị cứng, hoạt tính kháng khuẩn tốt vòng ức chế là 9
mm, dễ dàng cho việc bao gói thực phẩm. Ở tỷ lệ cao hơn màng bị cứng và hoạt tính
kháng khuẩn kém hơn (8 mm). Ở tỷ lệ 0,5 g tuy vòng kháng khuẩn đạt 9 mm nhưng
màng lại không dai, mủn nên cũng không đáp ứng yêu cầu.
3.2.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ trong quá trình tạo màng
Nhiệt độ trong quá trình tạo màng có thể cũng ảnh hưởng đến tính chất và hoạt
tính kháng khuẩn của màng. Trong nghiên cứu này, quá trình tạo màng được tiến
hành: Cân 0,75 g PLA và 0,25 g nisin cho vào bình tam giác có nút nhám. Sau đó bổ
sung 25 ml dung môi methylene chloride vào và đưa lên máy khuấy từ khuấy ở các
nhiệt độ khác nhau: 37; 60 và 80 °C. Sau 15 phút, lấy hỗn hợp dung dịch trên đổ ra đĩa
petri để tạo màng. Màng sau khi tạo ra được xác định hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả
nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình tạo màng đến hoạt tính kháng
khuẩn của màng.
34
Màng PLA - nisin Nhiệt độ tạo màng (°C)
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
37 60 80
pH của hỗn hợp dung 5 – 5,5 5 – 5,5 5 – 5,5 dịch tạo màng
Màng dai, dẻo, Màng dai, dẻo, Màng dai, dẻo,
không cứng, không cứng, không cứng,
Cảm quan màng không giòn. Nisin không giòn. Nisin không giòn. Nisin
phân bố đều phân bố đều trong phân bố đều trong
trong màng màng màng
*Được tính thông qua đường kính vòng vô khuẩn (mm).
9 8 8 Hoạt tính KK của màng ngay sau khi tạo ra*
Từ kết quả bảng 3.4 cho thấy gia nhiệt trong quá trình tạo màng đã ảnh hưởng
đến hoạt tính kháng khuẩn của màng nhưng không mấy ảnh hưởng đến tính chất màng.
Màng có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất (9 mm) khi trong quá trình tạo màng được
gia nhiệt ở 37 °C, màng dẻo, dai, không cứng không giòn. Ở nhiệt độ cao hơn màng
cũng dẻo, dai nhưng hoạt tính kháng khuẩn bị giảm (8 mm) và nhiệt độ cao làm tốn năng lượng hơn. Do đó nhiệt độ 37 oC là nhiệt độ thích hợp nhất được lựa chọn để tạo
màng PLA - nisin.
3.2.4. Ảnh hƣởng của thời gian và điều kiện bảo quản lên hoạt tính nisin của
màng PLA - nisin
Trong nghiên cứu này, các loại màng được bảo quản ở 2 điều kiện khác nhau (ở 4
°C và ở nhiệt độ phòng). Sau đó theo thời gian các mẫu được lấy ra để xác định hoạt tính.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian và điều kiện bảo quản lên hoạt tính nisin của màng
PLA - nisin
Hoạt tính của màng (đường kính vòng vô khuẩn, mm) Thời gian bảo quản Bảo quản ở 4 °C Bảo quản ở nhiệt độ phòng (ngày) M1 M2 M3 M1 M2 M3
Ngay sau khi tạo ra 9 8 8 9 8 8
35
5 9 8 8 9 8 8
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
15 8 7 7 7 7 7
(Chú thích: M1: màng được tạo ra trong điều kiện ra nhiệt ở 37 °C, M2: màng được
tạo ra trong điều kiện gia nhiệt ở 60 °C, M3: màng được tạo ra trong điều kiện gia
nhiệt ở 80 °C)
Kết quả bảng 3.5 cho thấy nhiệt độ bảo quản ở đây không ảnh hưởng đến hoạt tính
kháng khuẩn của màng nhưng thời gian bảo quản lại có ảnh hưởng đáng kể. Ngay sau
khi tạo ra mẫu M1 có vòng kháng khuẩn là 9 mm, M2 (8 mm), M3 (8 mm), 5 ngày sau
các mẫu vẫn giữ nguyên hoạt tính, nhưng đến 15 ngày hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu
bị giảm đi M1 (8 mm), M2 (7 mm), M3 (7 mm). Như vậy, hoạt tính kháng khuẩn của
màng ổn định trong vòng 5 ngày sau khi tạo ra và hoạt tính này bị giảm đi sau 15 ngày.
3.3. QUY TRÌNH TẠO MÀNG PLA - NISIN
3.3.1. Mô tả chi tiết quy trình
Bước 1: Đồng nhất PLA: PLA được cho vào trong dung dịch methylene chloride theo
tỉ lệ 3:100 (w/v). Sau đó khuấy từ liên tục 20 phút để đồng nhất PLA.
Bước 2: Tạo hỗn hợp PLA - nisin: Nisin được bổ sung vào dung dịch PLA theo tỉ lệ
PLA : Nisin bằng 3:1 (w/w). Khuấy liên tục trong vòng 10 phút để nisin phân bố đều
trong dung dịch.
Bước 3: Tráng phủ PLA - nisin lên đĩa thủy tinh
Bước 4: Màng để khô tự nhiên trong hệ thống tủ hút
3.3.2. Kiểm tra khả năng ức chế một số loại vi khuẩn gây bệnh thực phẩm của
màng PLA - nisin
Khả năng ức chế một số loại vi khuẩn gây bệnh ở thực phẩm của màng PLA -
nisin được trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Khả năng ức chế một số loại vi khuẩn gây bệnh ở thực phẩm của màng
PLA - nisin.
Vi khuẩn Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm)
L. plantarum JCM1149 9
B. cereus 8
36
L. monocytogenes 7
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
S. aureus 6
E. coli 0
E. coli O157:H7 0
Kết quả bảng 3.6 cho thấy màng PLA - nisin có khả năng ức chế mạnh vi khuẩn
kiểm định L. plantarum JCM1149 (vòng vô khuẩn 9 mm), và đặc biệt ức chế các loài
vi khuẩn Gram (+) như B. Cereus (vòng vô khuẩn 8 mm), L. Monocytogenes (vòng vô
khuẩn 7), S. aureus (vòng vô khuẩn 7 mm), các loài này rất dễ nhiễm trong thực
phẩm. Màng không có khả năng kháng lại vi khuẩn Gram (-): E. coli, E. coli
O157:H7. Điều này xảy ra là do nisin tương tác đặc hiệu với lipid II tiền tố
peptidoglucan để phá thủng màng tế bào đích, mà ở vi khuẩn Gram (+),
peptidoglycan chiếm 90% khối lượng thành tế bào, số lớp peptidoglycan có thể
lên tới 25 lớp. Trong khi đó ở vi khuẩn Gram (-) lượng peptidoglycan chỉ chiếm
10% tổng khối lượng thành tế bào, ngoài ra chúng còn có một lớp màng ngoài quan
trọng (outer membrane – OM). Lớp màng ngoài này có cấu tạo lipid kép tương tự
màng nguyên sinh chất nhưng không chỉ có phospholipids hình thành nên cấu trúc
mà còn có polysaccharide và protein. Lipid và polysaccharide liên kết chặt chẽ
với nhau tạo thành một cấu trúc lipopolysaccharide đặc biệt bên ngoài thành tế bào. Vi
khuẩn Gram (-) có thể chống chịu lại nhiều tác nhân gây hại đối với tế bào là nhờ vào
lớp màng ngoài OM có khả năng ngăn chặn các tác nhân đó một cách có hiệu quả.
3.4. ĐÁNH GİÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA MÀNG
3.4.1. Tác dụng kháng khuẩn của màng trên môi trƣờng rắn
Nisin thương phẩm khi kết hợp với một số màng như PLA, cellulose có khả năng
kháng lại một số vi khuẩn L. monocytogenes, S. aureus, L. innocua. Tuy nhiên, trong
nghiên cứu này vật liệu tạo màng sử dụng nisin dạng bột thu nhận được từ lên men
chủng PD15 (sản phẩm của phòng CNVLSH sản xuất). Do đó khả năng kháng khuẩn
của màng PLA - nisin cần phải được xác định, từ đó góp phần định hướng ứng dụng
màng vào bảo quản thực phẩm một cách hiệu quả. Màng PLA - nisin được kiểm tra khả
năng kháng khuẩn với 4 loại vi khuẩn Gram (+) và 3 loại vi khuẩn Gram (-), các loại vi
khuẩn này dễ có trong thực phẩm. Mỗi chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường
dịch thể thích hợp sau đó bổ sung 0,5 % dịch nuôi cấy vào môi trường thạch bán lỏng 37
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
tương ứng, tiếp đó cắt miếng màng PLA – nisin có đường kính 6 mm đặt lên trên bề mặt thạch, ủ đĩa ở 4 oC ít nhất 4 giờ, sau đó đem nuôi ở nhiệt độ thích hợp. Kết quả nghiên
cứu được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Khả năng kháng khuẩn của màng PLA - nisin
Đường kính vòng vô khuẩn của các loại màng (D-d) (mm)
Vi khuẩn kiểm định Đối chứng Thí nghiệm Đối chứng (+) Nisin (-) Màng PLA Màng PLA – nisin
L. plantarum JCM1149 9 0 8
S. aureus 7 0 6
L. monocytogenes 8 0 7
B. cereus 7 0 7
Salmonella. typhymurium 0 0 0
E. coli O157:H7 0 0 0
a b
38
c d
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
e f
Hình 3.2. Khả năng kháng khuẩn của màng PLA – nisin
a/ E. coli O157:H7; b/ S. typhymurium; c/ L. monocytogenes; d/ S. aureus; e/ L.
plantarum JCM1149; f/ B. cereus
Kết quả nghiên cứu trong bảng 3.7 và hình 3.2 cho thấy màng PLA - nisin có
khả năng ức chế các vi khuẩn Gram (+): L. plantarum JCM1149 (vòng vô khuẩn 8
mm); S. aureus (vòng vô khuẩn 6 mm); L. monocytogenes (vòng vô khuẩn 7 mm); B.
cereus (vòng vô khuẩn 7 mm), không có khả năng kháng lại vi khuẩn Gram (-):
Salmonella. typhymurium; E. coli O157:H7. Đồng thời kết quả nghiên cứu cũng cho
thấy, bản thân màng PLA nếu không chứa nisin thì không có khả năng kháng khuẩn
(với tất cả các chủng thí nghiệm đều cho vòng vô khuẩn bằng 0). Rõ ràng, khả năng ức
chế vi khuẩn Gram (+) của màng PLA - nisin là nhờ nisin. Kiểm tra khả năng kháng
khuẩn của nisin với cùng một nồng độ tương ứng với nồng độ nisin trong màng PLA –
nisin, cho kết quả gần như nhau [kết quả đối chứng dương và thí nghiệm: L.
plantarum JCM1149 (9 – 8 mm); S. aureus (7- 6 mm); L. monocytogenes (8 -7 mm);
B. cereus (7 - 7mm)]. Điều này chứng tỏ quá trình tạo màng không ảnh hưởng đến
hoạt tính kháng khuẩn của nisin và nisin trong màng cũng dễ dàng giải phóng và
khuyếch tán vào môi trường. Kết quả nghiên cứu này chứng tỏ màng PLA - nisin được
tạo ra ở đây hoàn toàn có thể ứng dụng được vào bao gói để bảo quản những loại thực
phẩm có nguyên nhân gây thối hỏng là do vi khuẩn Gram (+).
39
3.4.2. Tác dụng kháng khuẩn của màng trong môi trƣờng dịch thể
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Trong nghiên cứu ở phần 3.4.1 cho thấy nisin trong màng PLA - nisin dễ dàng
giải phóng ra môi trường thạch bán lỏng khi nó tiếp xúc trực tiếp với môi trường và
đồng thời nó kháng lại một số chủng vi khuẩn Gram (+). Trong môi trường dịch thể
khả năng giải phóng của nisin ra khỏi màng như thế nào? Với hoạt tính nisin đó có khả
năng tiêu diệt được bao nhiêu vi khuẩn? Để trả lời được câu hỏi này cần tiến hành
nghiên cứu ảnh hưởng của màng PLA – nisin lên sinh trưởng của vi khuẩn B. cereus
trong môi trường LB dịch thể theo như phương pháp mô tả phần phương pháp. Kết
quả nghiên cứu thu được trình bày trong bảng 3.8 và hình 3.3
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của màng PLA - nisin lên sinh trưởng của B. cereus
Thời gian nuôi Số lƣợng vi khuẩn Số lƣợng vi khuẩn
(h)
0
4
8
12 (thí nghiệm, CFU/ml) 2 x 106 4,4 x 103 3,8 x 102 2 x 101
16 0
20 0
24 0
36 0
40
48 (đối chứng, CFU/ml) 2 x 106 3,5 x 106 2,2 x 107 8,2 x 108 1,5 x 1010 1,3 x 1011 2,4 x 1011 8 x 1010 1,9 x 1010 0
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.3. Ảnh hưởng của màng PLA - nisin lên sinh trưởng của B. cereus
Kết quả nghiên cứu trong bảng 3.8 và hình 3.3 cho thấy với số lượng vi khuẩn B. cereus ban đầu lây nhiễm vào môi trường là 2 x 106, ngay sau 16 giờ nuôi ở 37
C, nisin trong màng PLA - nisin giải phóng ra môi trường đã tiêu diệt hoàn toàn số
lượng vi khuẩn B. cereus ở trên. Trong khi ở mẫu đối chứng (không có màng PLA - nisin) số lượng vi khuẩn B. cereus vẫn tiếp tục tăng đạt 1,5 x 1010 CFU/ml. Đồng
thời, kết quả nghiên cứu ở trên cũng cho thấy, vi khuẩn B. cereus rất nhạy cảm với
nisin trong màng PLA - nisin.
3.4.3. Động thái giải phóng nisin từ màng PLA
Đối với một hệ thống đóng gói kháng khuẩn có hiệu quả, hai yếu tố quan
trọng phải xem xét là [63] (i) chất kháng khuẩn khuếch tán từ bao bì vào bề mặt
thực phẩm như thế nào, và (ii) Mức độ ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật. Nếu
chất kháng khuẩn khuếch tán vào thực phẩm chậm hơn so với tốc độ tăng trưởng
của vi sinh vật gây thối hỏng thực phẩm, khi đó vi sinh vật sẽ sinh trưởng thuận lợi.
Mặt khác, nếu chất kháng khuẩn được giải phóng và khuếch tán nhanh hơn tốc độ
tăng trưởng của vi sinh vật, toàn bộ hợp chất kháng khuẩn từ vật liệu đóng gói sẽ
được khuếch tán quá nhanh và phân tán vào thực phẩm, làm giảm nồng độ chất
kháng khuẩn tại bề mặt thực phẩm. Trong trường hợp này hệ thống đóng gói sẽ
41
không có hoặc kém hiệu quả.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Một hệ thống đóng gói kháng khuẩn lý tưởng là ở đó sự giải phóng các hợp
chất kháng khuẩn có tốc độ phù hợp với tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn. Ngoài
ra, tại bất kỳ thời điểm nào, nồng độ hợp chất kháng khuẩn duy trì ở bề mặt thực
phẩm ít nhất phải tương đương với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cần thiết để ức
chế vi sinh vật mục tiêu [20].
Thí nghiệm với màng PLA - nisin được tạo ra có hoạt tính kháng khuẩn ban đầu là 1415 IU/cm2 màng, và tiến hành theo phương pháp được mô tả ở phần phương pháp. Theo đó, cắt 1 cm2 màng có 1415 IU/cm2 màng sau đó cho màng vào 1 ml môi trường MRS giữ ở nhiệt độ 100 oC trong 5 phút. Chuyển ống
nghiệm chứa màng và môi trường ở nhiệt độ phòng 24 giờ và lắc ở 100 rpm/p.
Kiểm tra hoạt tính nisin được giải phóng ra môi trường. Kết quả thể hiện ở bảng
3.9. Nisin giải phóng ra khỏi màng 1200 IU/ml, ở nồng độ này nisin ức chế được
vi sinh vật đích.
Bảng 3.9. Nồng độ nisin giải phóng ra ngoài màng
Thí nghiệm Nồng độ Nisin
Màng PLA - Nisin ban dầu 1415 IU/cm2
Giải phóng ra khỏi màng 1200 IU/ml ±100 IU/ml
Mặt khác, theo dõi động học quá trình giải phóng và khuếch tán nisin vào
thực phẩm sẽ một lần nữa cho thấy màng PLA - nisin phù hợp trong bao gói thực
phẩm. Màng kháng khuẩn PLA - nisin được tạo ra có hoạt tính màng 1415 IU/cm2. Đặt một miếng màng hình tròn đường kính 14 mm lên trên mặt môi trường MRS để 4 oC sau 24 giờ (vị trí 1) chuyển miếng màng đó sang vị trí thứ 2 tiếp tục để 4 oC sau 24 giờ. Tiếp tục như vậy cho đến ngày thứ 7. Đổ 1 lớp môi
trường MRS bán lỏng chứa 0,5 % vi sinh vật kiểm định L. plantarum JCM1149, tiếp tục giữ ở 4 oC trong 4 giờ, sau đó chuyển sang nuôi 37 oC trong 24 giờ, quan
sát vùng ức chế. Kết quả được trình bày trong hình 3.4.
Thời gian
Hoạt tính (D-d)
(ngày)
mm
1
42
5
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2
6
7
4
3
1
18,5
2
12
3
11,5
4
11
5
9
6
8
7 (màng)
12,5
Hình 3.4. Khả năng ức chế L. plantarum của màng PLA – nisin từ ngày 1 – ngày 7
Chú thích: D: đường kính vòng hoạt tính -
- d: đường kính miếng màng
Từ kết quả hình 3.4 và bảng 3.9 cho thấy lượng nisin giải phóng ra khỏi màng
trong toàn bộ thời gian thí nghiệm là 7 ngày. Ngày đầu một lượng lớn nisin được giải
phóng ra (vòng ức chế 18,5 mm) và giảm dần theo thời gian và vẫn ức chế được vi
khuẩn cụ thể ngày thứ 2 vòng ức chế đạt 12 mm, ngày thứ 3 vòng ức chế là 11,5 mm,
ngày thứ 4 vòng ức chế là 11 mm, ngày thứ 5: 9 mm, ngày thứ 6: 8 mm, ngày thứ 7
vòng ức chế đạt 12,5 mm. Như vậy nisin đã khuếch tán ra môi trường từ từ theo thời
gian, điều này rất quan trọng bởi nếu nisin khuếch tán hết ngay vào môi trường nó chỉ
tiêu diệt được những vi khuẩn có mặt lúc đó, còn nếu những vi khuẩn có bào tử hoặc
thời gian sinh trưởng lâu hơn sẽ không bị tiêu diệt và những vi khuẩn bên ngoài cũng
có thể xâm nhập do nồng độ chất kháng khuẩn đã không đủ để ức chế. Điều này chứng
tỏ rằng lượng nisin bổ sung vào trong màng cũng như lượng nisin giải phóng ra khỏi
màng phù hợp với hệ thống đóng gói kháng khuẩn và khá lý tưởng.
3.5. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MÀNG PLA – NISIN SAU THỜI
GIAN VÀ ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN
3.5.1. Ảnh hƣởng của điều kiện, thời gian bảo quản màng PLA - nisin đến hoạt
tính kháng khuẩn.
Hoạt tính kháng khuẩn của màng PLA - nisin ổn định nhất ở pH 2 † 3, nisin ổn
định hoạt tính trong vòng 2 tháng, đến 3 tháng hoạt tính kháng khuẩn của nisin có
43
giảm nhưng sự giảm này không đáng kể (dao động trong khoảng 1 † 2 %) và sau 4
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
tháng hoạt tính kháng khuẩn của nisin đã có sự giảm rõ rệt: ở trong điều kiện bảo quản
ở 4 °C, hoạt tính kháng khuẩn của nisin duy trì xấp xỉ 90 %; ở nhiệt độ phòng và chân
không tương ứng là 80 và 72 % so với ban đầu. Đồng thời kết quả theo dõi ảnh hưởng
của điều kiện bảo quản lên nồng độ tồn dư hoạt tính kháng khuẩn của nisin ở trong
màng không có sự khác biệt nhiều khi thí nghiệm được theo dõi trong vòng 15 ngày.
Để có thể ứng dụng nisin vào trong thực tế, sự thay đổi hoạt tính kháng khuẩn của
màng cần phải được nghiên cứu trong khoảng thời gian bảo quản dài hơn. Chính vì
vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian
bảo quản và điều kiện bảo quản lên nồng độ tồn dư hoạt tính kháng khuẩn của nisin ở
sản phẩm màng PLA. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.10. Từ kết quả
này cho thấy: điều kiện và thời gian bảo quản có ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn
của màng. Bảo quản màng PLA – nisin ở 4 † 10 C cho hoạt tính kháng khuẩn ổn định
hơn bảo quản nisin ở 32 C. Trong điều kiện bảo quản màng ở 4 † 10 C, nisin ổn định hoạt tính trong vòng 3 tháng (1415 IU/cm2); từ 4 tháng trở ra, hoạt tính kháng khuẩn
của nisin bắt đầu giảm và sau 6 tháng hoạt tính nisin giảm 8,5 % so với lúc ban đầu.
Còn bảo quản màng ở 32 C, nisin ổn định hoạt tính trong vòng 2 tháng (1414 IU/cm2); sang tháng thứ 3 nisin bắt đầu giảm hoạt tính, tuy nhiên sự giảm này không
đáng kể (khoảng 2 %) và sau 4 tháng, hoạt tính nisin đã có sự giảm rõ rệt, kết quả sau
6 tháng hoạt tính nisin giảm 40 % so với lúc ban đầu. Vì vậy, nếu muốn đưa màng
PLA - nisin vào bảo quản một sản phẩm nào đó ở nhiệt độ cao thì cần phải bổ sung
lượng nisin vào nhiều hơn so với khi bảo quản ở nhiệt độ thấp.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của điều kiện, thời gian bảo quản màng PLA - nisin đến hoạt
tính kháng khuẩn của nó
Nồng độ tồn dư nisin ở màng PLA - nisin (IU/cm2) theo thời gian bảo quản Bảo
(tháng)
quản (oC) 0 0.5 1 2 3 4 5 6
32 14141,5 14141,7 14141,5 14142,4 13862,1 11311,2 968±1,3 825±2,1
44
4-10 14151 14151 14151,7 14152,3 14021,6 13501,5 1317±1 1294±1
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Trong quá trình bảo quản thực phẩm, hoạt tính kháng khuẩn của nisin phụ thuộc
vào ba yếu tố: nhiệt độ bảo quản, thời gian bảo quản và độ pH bảo quản. Nisin ổn định
hoạt tính nhất khi được bảo quản ở nhiệt độ thấp.
3.5.2. Khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh của màng PLA - nisin ở các điều
kiện và thời gian bảo quản khác nhau.
Hệ vi sinh vật trong thực phẩm khá đa dạng về chủng loại, trong đó có
những loài gây bệnh nguy hiểm tới sức khỏe con người. Các loại màng nilon bọc
thực phẩm thông thường chỉ có tác dụng ngăn tiếp xúc của thực phẩm với môi
trường nhưng lại không có khả năng tiêu diệt được các vi sinh vật tồn tại trong
thực phẩm. Do đó, thực phẩm nhanh bị thối hỏng gây ảnh hưởng tới sức khỏe
người tiêu dùng. Màng phân hủy sinh học PLA - nisin có khả năng khắc phục
được một số nhược điểm trên, có hoạt tính sinh học tiêu diệt vi khuẩn Gram (+),
quan trọng hơn nữa là nó rất dễ bị phân hủy khi chôn lấp chúng ngoài môi trường,
nó không gây ảnh hưởng tới sức khỏe con người cũng như không gây ô nhiễm
môi trường. Trong kết quả nghiên cứu trên, màng PLA - nisin bảo quản ở điều
kiện 4 † 10 C tốt hơn bảo quản ở 32 C. Tuy nhiên ở các điều kiện bảo quản trên,
màng vẫn duy trì hoạt tính trong vòng 2 † 3 tháng, sau 4 tháng hoạt tính kháng
khuẩn trong màng mới bị giảm. Để có thể biết được sự giảm hoạt tính của màng
này ảnh hưởng như thế nào đến khả năng ức chế một số loại vi sinh vật gây bệnh
trong thực phẩm tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh
của màng PLA - nisin ở các điều kiện và thời gian bảo quản khác nhau. Kết quả
trình bày ở bảng 3.11 và hình 3.5.
Bảng 3.11. Khả năng kháng khuẩn của màng PLA – nisin ở các điều kiện và thời
gian bảo quản khác nhau
Vòng kháng khuẩn (mm) STT Màng PLA - nisin B. cereus S. aureus L. monocytogenes
1 17 26
15
2 16,5 26
15
3 Sau 1 ngày, 4 oC Sau 1 ngày, 32 oC Sau 15 ngày, 4 oC 11 13
12,5
45
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
4 Sau 15 ngày, 32 oC 3 10
9
2 1
4 3 1 2
4 3
b a
4 3
1 2
c
Hình 3.5. Khả năng ức chế các chủng vi sinh vật gây bệnh của màng PLA – nisin
a/ B. cereus; b/ S. aureus; c/ L. Monocytogenes 1/ màng sau 1 ngày, 4 oC; 2/ màng sau 1 ngày, 32 oC; 3/ Màng sau 15 ngày, 4 oC; 4/ màng sau 15 ngày, 32 oC
Kết quả bảng 3.11 cho thấy khả năng kháng khuẩn của màng PLA – nisin tốt
nhất khi mới tạo ra, dù bảo quản ở hai nhiệt độ khác nhau nhưng chưa có ảnh hưởng rõ
rệt, màng PLA – nisin kháng lại vi khuẩn B. cereus tốt nhất, vòng vô khuẩn đạt 26
46
mm, với S. aureus vòng vô khuẩn là 17 mm, L. Monocytogenes vòng vô khuẩn là 15
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
mm. Màng sau 15 ngày đã thấy được sự khác biệt rõ ràng giữa 2 điều kiện nhiệt độ bảo quản, ở 4 oC hoạt tính kháng khuẩn của màng bị giảm ít hơn so với 32 oC. Ở 4 oC,
mẫu màng sau 15 ngày bảo quản ức chế vi khuẩn B. cereus với vòng vô khuẩn là 13 mm, S. aureus là 11 mm, L. Monocytogenes là 12,5 mm. Ở 32 oC và mẫu màng sau 15
ngày bảo quản: B. cereus: 3 mm, S. aureus: 10 mm, L. Monocytogenes: 9 mm.
3.6. ĐÁNH GİA KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SİNH HỌC CỦA MÀNG
Màng được chôn lấp một cách tự nhiên trong đất vườn, trong thời gian 6 tháng.
Mẫu lấy hàng tháng, được cân trọng lượng và quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét.
Kết quả cho thấy rằng, ban đầu bề mặt màng phẳng đều, sau 1 tháng xuất hiện bề mặt
lỗ chỗ, đặc biệt 3 tháng ta thấy có sự khác nhau rõ ràng, các liên kết bắt đầu bị phá vỡ,
màng ròn dễ gãy, đến 3 tháng hầu như vỡ vụn. Kết quả bề mặt màng ở các giai đoạn
được trình bày ở bảng 3.12 và chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét (x 2.000) được trình
bày ở hình 3.6.
Từ kết quả ở bảng 3.12 và hình 3.6 cho thấy sau 1 tháng màng bị phân hủy 14,4 %,
sau 2 tháng phân hủy đạt 36,35 % và sau 3 tháng phân hủy đạt trên 50 %. Sau 6 tháng
hầu như vỡ vụn hết.
a. Bề mặt mẫu đối chứng (x 2.000) b. Bề mặt mẫu chôn lấp sau 30 ngày (x
47
2.000)
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
c. Bề mặt mẫu chôn lấp sau 90 ngày (x 2.000)
Hình 3.6. Hình ảnh bề mặt màng polylactic trước và sau khi chôn lấp: mẫu đối chứng
(a); chôn lấp sau 30 ngày (b); chôn lấp sau 90 ngày (c).
Bảng 3.12. Khả năng phân hủy sinh học của màng PLA - nisin theo thời gian (tháng)
Trọng lượng Khả năng Thời
Đánh giá cảm quan màng thí phân hủy, gian
nghiệm (g) (%) (tháng)
Bề mặt chắc chắn, phẳng, nhẵn 100 0 0
Bề mặt xuất hiện phân hủy, tạo các vảy và 85,6 14,4 1 có hiện tượng lồi lõm
Bề mặt phân hủy, bề mặt lồi lõm 63,7 36,3 2
Hiện tượng vỡ nhiều, bề mặt bị lồi lõm 40,5 59,5 3 sâu
Bề mặt lồi lõm sâu, mảnh vỡ vụn nhiều 29,6 70,4 4
Vỡ vụn nhiều 15,3 84,7 5
Vỡ vụn hết 13,2 86,8 6
3.7. ỨNG DỤNG MÀNG PLA – NISIN TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM
Màng PLA – nisin chỉ có tác dụng kháng lại những vi khuẩn Gram (+), chính vì
thế để sử dụng hiệu quả loại màng này thì những thực phẩm có hệ vi sinh vật kiểm
soát được sẽ là lựa chọn hàng đầu. Nem chua là sản phẩm lên men do vi khuẩn lactic
làm tác nhân chính, do môi trường axit nên sẽ rất hạn chế các loài vi sinh vật khác, vì
vậy nem chua được lựa chọn để ứng dụng màng PLA – nisin. Để thấy rõ được khả
48
năng ứng dụng của màng PLA – nisin như thế nào, song song với nem chua chọn sản
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
phẩm có hệ vi sinh vật không xác định như bánh cốm để thấy được sự khác nhau ra
sao giữa hai loại sản phẩm.
3.7.1. Ứng dụng màng PLA - nisin để bảo quản thực phẩm lên men (nem chua)
Nem chua là sản phẩm chế biến từ thịt heo sống, qua những giai đoạn lên men,
tạo vị chua đồng thời làm từ thịt 'chín' để có thể ăn được. Sự biến đổi thịt sống trong
nem chua là do tác động của các loài vi khuẩn bản địa tạo axit lactic để làm chín thịt.
Vi khuẩn lactic được xác định là tác nhân chính trong quá trình lên men lactic do
chiếm ưu thế gần như tuyệt đối có mặt ở nem chua. Trong đó chủ yếu gồm các loài
thuộc chi Lactobacillus với số lượng lớn. Công bố của Doan và cs xác định chi L.
pentosus chiếm 21 %, L. plantarum 29,7 %, L. brevis 5 % và chi L. farciminis chiếm
23 % [29]. Ở Việt Nam có nhiều vùng miền sản xuất nem chua rất nổi tiếng như nem
chua làng Vẽ, Phùng Hà Nội, nem chua Thanh Hóa… Thí nghiệm được tiến hành với
nem chua được làm tại làng Vẽ, xã Đông Ngạc, Từ Liêm, là những nem chua đã chín.
Mẫu thí nghiệm được thay lá bọc bằng màng PLA - nisin, đối chứng là mẫu nem để
nguyên. Thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ phòng. Kết quả được trình bày ở bảng
3.13 và hình 3.7.
Bảng 3.13. Cảm quan của nem chua được bảo quản bằng màng PLA - nisin
Nhiệt độ phòng (30oC) ngày Đối chứng Mẫu
Thơm, mùi không thay đổi, màu Thơm, mùi không thay đổi, màu hồng 1 nhạt hồng nhạt
Thơm, mùi không thay đổi, màu Thơm, mùi không thay đổi, màu hồng 2 nhạt hồng nhạt
Thơm, ngon, mùi không thay đổi, màu 3 Mùi chua, màu hồng nhạt hồng nhạt
Mùi chua, hai đầu nem bị vụn thịt, Thơm ngon, màu hồng nhạt 4 màu nhợt nhạt
49
Mùi chua, hai đầu nem bị vụn, màu Thơm ngon, màu hồng nhạt 5 nhợt nhạt
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Mùi chua, hơi khẳm, màu nhạt → 6 Thơm ngon, màu hồng nhạt, đẹp không ăn được
7 Thơm ngon, màu hồng nhạt, đẹp
8 Thơm ngon, màu hồng nhạt, đẹp
9 Thơm ngon, màu hồng nhạt, đẹp
10 Thơm ngon, màu hồng nhạt, đẹp
11 Thơm ngon, màu hồng nhạt, đẹp
12 Thơm ngon, màu hồng nhạt, đẹp
13 Thơm ngon, màu hồng nhạt, đẹp
14 Thơm ngon, màu hồng nhạt, đẹp
15 Thơm ngon, màu hồng nhạt, đẹp
16 Thơm ngon, màu hồng nhạt, đẹp
17 Thơm ngon, màu hồng nhạt, đẹp
Chua hơn, màu vẫn đẹp, hơi khô hơn 18 ban đầu,
19
Mùi chua ngắt, màu không hồng, góc ngoài thành của nem bị vụn. Hỏng
Vụn, nhớt
a
50
b
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.7. Bảo quản nem chua
a/ nem chua có bọc màng; b/ nem chua không bọc màng
Từ kết quả bảng 3.13 cho thấy ở mẫu đối chứng không sử dụng màng PLA -
nisin thời gian tính từ lúc nem chín đến khi nem hỏng khoảng 5 ngày, trong khi
mẫu thí nghiệm kéo dài được 18 ngày. Nem chua là sản phẩm của quá trình lên men
lactic do hoạt động của vi khuẩn lactic sẽ tạo môi trường axit, trong điều kiện pH
này, hoạt tính nisin lại được tăng cường, gia tăng, vì nisin hoạt động tốt nhất ở điều
kiện pH axit. Vì vậy, nem chua không chỉ giữ được các đặc tính cơ bản mà còn
được kéo dài thời gian bảo quản khá rõ ràng. Đây là kết quả hết sức có ý nghĩa, một
lần nữa chứng tỏ tác dụng của nisin được phát huy, tăng cường mạnh hơn trong
điều kiện pH axit, giúp cho sảm phẩm nem chua ở trạng thái ổn định, đặc biệt hệ vi
khuẩn lactic, làm cho nem chua không chỉ bảo quản được lâu dài mà chất lượng
vẫn được đảm bảo.
3.7.2. Ứng dụng màng PLA - nisin để bảo quản sản phẩm từ tinh bột (bánh cốm)
3.7.2.1. Thành phần và số lƣợng vi sinh vật có trong mẫu bánh cốm
Để việc sử dụng màng PLA - nisin có hiệu quả đối với bánh cốm, thông tin dù
ở mức sơ bộ về sự hiện diện của vi sinh vật ở sản phẩm này là hữu ích. Các mẫu bánh
cốm từ những hiệu bánh nổi tiếng (bánh Cốm - phố Hàng Than thuộc Hà Nội) được
thu thập về và xác định số lượng VSV có trong mỗi loại bánh tại thời điểm ngày đầu
tiên ngay sau khi bánh được sản xuất và sau khi bánh bị hỏng. Kết quả được thể hiện ở
bảng 3.14. Từ kết quả trên bảng 3.14 cho thấy, ngay ngày đầu tiên sau khi bánh cốm
được sản xuất ra, VK có trong tất cả các loại bánh, nấm men và nấm mốc xuất hiện ít hơn. Bánh cốm Yên Ninh bị nhiễm VK ít nhất (8.101 CFU/g), nhưng lại có cả nấm
mốc và nấm men với số lượng nhỏ. Trong thí nghiệm chỉ chọn loại bánh là Nguyên
Ninh, do loại chỉ nhiễm vi khuẩn mà có thể là đích tấn công của nisin.
Quá trình bảo quản được tiến hành như sau: Mẫu thí nghiệm sử dụng màng
PLA - nisin để bọc bánh cốm, trong khi mẫu đối chứng được bọc bằng màng nilon
không có chất kháng khuẩn. Nhiệt độ bảo quản được thực hiện ở nhiệt độ phòng. Tiến
51
hành theo dõi, quan sát sự biến đổi màu sắc, cảm quan bánh theo thời gian. Từ đó
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
đánh giá, so sánh khả năng bảo quản bánh cốm bằng màng PLA - nisin so với việc bảo
quản bằng màng nilon thông thường.
Bảng 3.14. Thành phần, số lượng vi sinh vật (sơ bộ) có trong mẫu bánh cốm ngày đầu
tiên sau khi bánh được sản xuất
Số lượng vi sinh vật (CFU/g) Thương hiệu bánh
Nấm men 4.101 Yên Ninh
Nấm mốc 2.102 2.102 Nguyên Hinh
0 7.103 0 An Ninh
0 Bảo Minh
0 4,2.103 0 Anh Ninh
0 0 Nguyên Linh
0 An Ninh 2
0 Nguyên Sinh
0 0 6.101 2.102 Nguyên Hảo
Vi khuẩn 8.101 8.103 2,4.104 3.104 2.103 4.103 2,4.103 1,8.103 2.104 1,6.102 0 0 Nguyên Ninh
3.7.2.2. Đánh giá chất lƣợng cảm quan và vi sinh vật của bánh cốm trong quá
trình bảo quản
Để đánh giá khả năng bảo quản bánh cốm bằng màng PLA - nisin thì một trong
những tiêu chí cần phải đánh giá đó là đánh giá chất lượng cảm quan của bánh cốm trong
quá trình bảo quản. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.15 và hình 3.8.
Bảng 3.15. Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan của bánh cốm trong quá trình bảo quản
Thời gian
bảo quản Đánh giá chất lượng cảm quan của bánh cốm trong quá trình bảo quản
(ngày)
Đối chứng Thí nghiệm
Bánh có màu xanh ngọc, dẻo, thơm. Bánh có màu xanh ngọc, dẻo, thơm. 0
Bánh có màu xanh ngọc, dẻo, thơm. Bánh có màu xanh ngọc, dẻo, thơm. 3
52
Bánh có màu xanh ngọc, hơi khô, thơm. Bánh có màu xanh ngọc, dẻo, thơm. 4
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Bánh có màu xanh ngọc, hơi khô, hơi
5 cứng, thỉnh thoảng có những đốm trắng Bánh có màu xanh ngọc, dẻo, thơm.
của mốc.
Bánh có màu xanh ngọc, hơi dính, hơi
cứng, lấm tấm những đốm trắng, xanh, Bánh có màu xanh ngọc, dẻo, 6 vàng của nấm mốc. Bánh có mùi ngái thơm.
ngái của mốc.
Bánh có màu xanh ngọc, hơi dính, hơi
cứng, nấm mốc trắng tạo thành từng đám Bánh có màu xanh ngọc, hơi dính,
trên bề mặt bánh, xen kẽ lấm tấm những hơi cứng, thỉnh thoảng có những 7 đốm trắng, xanh, vàng của nấm mốc và đốm trắng của mốc. Bánh không
có chỗ hơi nhớt. Bánh có mùi ngái ngái còn thơm như trước.
của mốc.
Mốc, nhớt
a b
d c
Hình 3.8. Bảo quản bánh cốm
a/ Không bọc màng ban đầu; b/ bọc màng ban đầu; c/ không bọc màng sau 6
53
ngày; d/ bọc màng sau 6 ngày
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Kết quả nghiên cứu đánh giá cảm quan cho thấy, sử dụng màng PLA - nisin có
thể kéo dài thời gian bảo quản bánh cốm được thêm 3 ngày, bánh vẫn thơm, màu xanh
ngọc đặc trưng, dẻo.
Những kết quả thử nghiệm màng PLA - nisin để bảo quản nem chua, bánh cốm
cho thấy có sự khác nhau. Điều này hoàn toàn có thể giải thích được. Bởi lẽ, tác dụng của
màng PLA – nisin là phòng trừ các loại vi khuẩn Gram (+), trong dó có vi khuẩn gây bệnh
thực phẩm B. cereus, S. aureus, L. monocytogenes. Nem chua như đã phân tích ở trên: có
hệ vi sinh vật xác định chủ yếu là vi khuẩn lactic (Gram (+)) còn bánh cốm không xác
định được hệ vi sinh vật chính xác, chỉ là ngẫu nhiên từng mẻ bánh hay từng nơi sản xuất
vì vậy kết quả bảo quản cũng chưa thật chính xác. Như vậy, tác dụng bảo quản của màng
PLA - nisin chỉ hướng tới các vi khuẩn Gram (+) nói trên, sẽ không có tác dụng nếu thực
phẩm bị nhiễm các loại vi khuẩn Gram (-) , nấm mốc, nấm men.
Những kết quả thử nghiệm bảo quản nói trên, không chỉ gợi ý về việc sử dụng
màng PLA - nisin cho loại thực phẩm nào, mà còn là cơ sở để tạo ra các loại bao bì
cho các loại thực phẩm khác nhau, quan trọng hơn là tạo ra loại bao bì có tác dụng
tổng hợp.
IV. KẾT LUẬN
Màng axit polylactic – nisin được tạo ra với công thức: 25 ml methylene chloride,
0,25 g nisin, 0,75 g PLA. Sản phẩm màng tạo ra thể hiện rất rõ ràng hoạt tính kháng
khuẩn đối với vi khuẩn Gram (+) gây bệnh thực phẩm B. cereus, L. monocytogenes, S.
aureus cũng như bị phân hủy hoàn toàn sau 6 tháng trong điều kiện chôn lấp tự nhiên.
Sử dụng màng PLA - nisin thử nghiệm để bảo quản nem chua, bánh cốm. Kết quả
với nem chua là đã kéo dài thời gian bảo quản thêm 10 - 15 ngày, nem chua vẫn có
mùi vị thơm ngon đặc trưng, màu hồng nhạt của thịt rất đẹp mắt. Với bánh cốm cũng
đã kéo dài thêm được 3 ngày (bánh hiệu Nguyên Ninh), bánh cốm có màu xanh ngọc
54
đẹp mắt, mùi thơm đặc trưng.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
V. KIẾN NGHỊ
Màng PLA - nisin là những sản phẩm mới, sản xuất theo công nghệ phối trộn
trên cơ sở sử dụng chất kết dính methylene chloride với các thao tác và công cụ thủ
công. Mặc dù vậy, sản phẩm màng PLA - nisin được tạo ra có các đặc tính cần thiết là
khả năng kháng khuẩn và phân hủy sinh học, đáp ứng các tiêu chí để bảo quản thực
phẩm và bảo vệ môi trường, có tác dụng kéo dài thời gian bảo quản rõ ràng với nem
chua. Tuy nhiên, để có được các tính toán ở phạm vi sản xuất, giá thành vật liệu nisin,
PLA, lựa chọn được công nghệ phù hợp, đánh giá triển vọng sản xuất và ứng dụng...
Hướng nghiên cứu cần được đầu tư thêm thời gian.
55
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn La Anh và cộng sự. (2010). Nghiên cứu công nghệ sản xuất chất bảo quản
sinh học bacterocin bằng phương pháp vi sinh có ứng dụng trong công nghiệp
thực phẩm. Báo cáo Đề tài nghị định thư Việt Nam-Nhật Bản.
2. Lý Kim Bảng, Lê Thanh Bình, Tạ Kim Chỉnh. (1988), „Ứng dụng vi khuẩn lactic
trong việc bảo quản thức ăn xanh cho trâu bò‟, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông
nghiệp, 10: 455-457.
3. Lê Thanh Bình, Phạm ThịNgọc Lan, Trần ThịThuý, Phan Khánh Hoa. (2000). Sự đa
dạng của vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Hội nghị Sinh học
56
quốc gia, Nhà xuất bản Đại học quốc gia, năm 2000, Hà nội, 8
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước,
Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số
phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
5. Nguyễn Thị Đà, Hoa Thị Minh Tú, Lê Thanh Bình. 2009. Nâng cao hoạt tính sinh
tổng hợp bacteriocin của một số chủng Lactococcus bằng cách chọn tế bào
kháng nisin. Báo cáo khoa học hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2009.
Thái nguyên 26-27, 2009, trang: 532-537
6. Phạm Thanh Hà, Trần Đình Mấn, Yutaka Tokiwa (2008). Đột biến nâng cao hoạt
tính sinh tổng hợp Polyhydroxyburate của vi khuẩn Alcaligenes Latus VN1.
Tạp chí công nghệ sinh học 6(4): 489-496.
7. Phan Thị Khánh Hoa, Nguyễn Việt Cường, Phạm Thị Ngọc Lan và Lê Thanh Bình.
2002. Tối ưu hoá sinh tổng hợp nisin của Lactococcus lactis subsp. lactis. Tạp
chí Khoa học và Công nghệ, tập 40, số 6: 24-31
8. Đỗ Thị Huyền. (2009). Nghiên cứu công nghệ sản xuất và sử dụng chất diệt khuẩn
sinh học (Nisin và Enterocin) dùng trong bảo quản nông sản thực phẩm. Báo
cáo tổng hợp, Hà Nội, 299 .
9. Phạm Thị Ngọc Lan, Trần Thị Thuý và Lê Thanh Bình. 1999. Đặc tính hoá các
chủng vi khuẩn lactic tổng hợp bacteriocin có phổ tác dụng rộng. Báo cáo tại
Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2009, Hà nội 9-10/12, trang: 314-318.
Tài liệu nƣớc ngoài
10. Anders S and Mikael S. (2002). Properties of lactic acid based polymers and their
correlation with composition. Progress in Polymer Science, 27: 1123-1163.
11. Appendini P, Hotchkiss JH. 2002. Review of antimicrobial food packaging.
Innovative Food Sci. and Emerging technology 3: 113-126
12. Ariyapitipun T, Mustapha A, Clarke AD. (1999). Microbial shelf life
determination of vacuum-packaged fresh beef treated with polylactic acid, lactic
acid, and nisin solutions. J Food Prot. 62(8): 913-20.
13. Benninga H. (1990). A History of Lactic Acid Making, Kluwer Academic
57
Publishers, Dordrecht, Netherlands: 1–61.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
14. Bruno M.E.C., Monteville T.J. (1993), “Common mechanistic action of bacteriocin
from lactic acid bacteria”, Appl.Environ.Microbiol, 59: 3003-3010.
15. Blackburn P., Polak, J., Guisik S., Rubino S. D. (1989). Nisin composition for use
as enhenced, broad range Bacterioxin,International patent application number
PCT/US89/02625: International publication number W89/12399. Appl.
Microbiol, New York.
16. Cargill Dow LLC, www.natureworkspla.com.
17. Chang D.E., Jung H.C., Rhee J.S., Pan J.G. (1999). Homofermentative production
of D-or L-lactate in metabolically engineered Escherichia coli RR1, Appl.
Environ. Microbiol. 65: 1384–1389.
18. Chinachoti N. (1997). Studies on the efficient production of nisin Z by
Lactococcus lactis IO-1 (JCM 7638). Ph. D. Thesis, The faculty of Agricultrure
Kyushu University.
19. Cleveland J., Montville T.M., Nes I.F. and Chikindas M.L. (2001), “Bacteriocins:
safe, natural antimicrobials for food preservation”, Int. J.Food Microbiol, 71: 1-20.
20. Cooksey K. 2005, Effectiveness of antimicrobial food packaging materials. Food
addit. Contam. 22: 980-987
21. Cotter P.D., Hill C and Ross P. (2005), “Bacteriocins: developing innate immunity for
food”, Nat Rev.Microbiol, 3: 777-788.
22. Datta R, Tsai S.P., Bonsignore P., Moon S.H., Frank J.R. (1995). Technological
and economic potential of poly(lactic acid) and lactic acid derivatives, FEMS
Microbiol. 16: 221–231.
23. Davidson P.M., Sofos J.N., Branen A.L. (2005), Antimicrobials in food, Third
Edition, CRC Press Taylor & Francis Group.
24. Davit K. Platt. (2006). Biodegradable polymers market report. Smithers Rapra
Limited. UK
25. De Vuyst L., Leroy F. (2007), “Bacteriocin from lactic acid bacteria: Production,
purification and food applications”, J.Mol.Microbial.Biotechnol, 13: 194-199.
26. Desmazeaud M. (1996). Growth inhibitors of lactic acid bacteria in Dairy starter
58
cultures, eds. TM. Cogan and J.P.Accolas, 131-155.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
27. Dien B.S., Nichols N.N., Bothast R.J. (2001). Recombinant Escherichia coli
engineered for production of L-lactic acid from hexose and pentose sugars,
Microbiol. Biotechnol. 27: 259–264.
28. Dien B.S., Nichols N.N., Bothast R.J. (2002). Fermentation of sugar mixtures
using Escherichia coli catabolite repression mutants engineered for production
of L-lactic acid, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 29: 221–227.
29. Doan Thi Lam Nguyen, K. Van Hoorde, M. Cnockaert, E.D. Brandt, M. Aerts, K.
De Bruyene, Binh Thanh Le and P. Vandamme. 2013. A culture-dependent and
-independent approach for identification of lactic acid bacteria associated with
the production of nem chua, a Vietnamese fermented meat product. Food
Research International, 50: 232-240
30. Dodd H.M., Horn N., Gasson M.J (1994). “Bacteriocins of Lactic acid bacteria”,
in Genetics and biotechnology of lactic acid bacteria, Blankie Academic and
Professiona, 211-251.
31. Flieger M., Kantorova M., Prella A., Rezanka T., Vontruba J. (2003)
Biodegradable Plastics from Renewable Sources. Folia Microbiol, 48 (1): 27–
44.
32. Food standars Australia New Zealand. Initial assessment report application A565
Nisin-extension of use as food addtivie. 9 August 2006.
33. Fowler G.G., Javis B and Tramer. J. 1975. The assay of nisin in foods. Society of
Applied Bacteriology Technology Ser. 8: 91-105
34. Garriga M., Hugas M., Aymerich T and Monfort J.M. (1993), “Bacteriocinogenic
activity of lactobacilli from fermentated sausages”, J.of App.Bacteriol, 75: 142-148.
35. Geis A., Singh J. and Teuber M. (1983). Potential of Lactic Streptococci to
Produce Bacteriocin. Applied and Environmental Microbiology. 45(1): 205-211.
36. Gruber, P.R., Hall, E.S., Kolstad, J.J., Iwen, M.L., Benson, R.D., and Borchordt, R.L.
(1993). Continuous process for manufacture of a purified lactide. US Patent
59
5,274,073.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
37. Gujarathi, Swapnali S., Bankar, Sandip B., Ananthanarayan and Laxmi A. (2008).
Fermentative. Production, Purification and Characterization of
Nisin," International Journal of Food Engineering. 4(5): 136-142.
38. Hábová R., Melzoch K, Rychtera M., Sekavová B. (2004). Electrodialysis as a
useful technique for lactic acid separation from a model solution and a
fermentation broth. Desalination162: 361-372
39. Hanusova K., J. Dobias and K. Klaudisova.( 2009). Effect of packaging films
releasing antimicrobial agents on stability of food products. Czech. J. food Sci.
Vol. 27 (Special Issue): 347-349
40. Harris L.J., Fleming H.P and Klaenhammer T.R. (1992), “Characterization of wo
nisin-producing Lactococcus lactis subsp lactis strains isolated from a
Commercial Sauerkraut fermentation”, Appl.and Environ.Mrobiol, 58 (5):
1477-1483.
41. Hiltunen K. and Seppa J.V. (1998). The use of different diols in the synthesis of
low-molecular weight lactic-acid-based telechelic prepolymers. J. Appl. Polym.
Sci., 67: 1017–1023.
42. Hofvendahl K., Hägerdal B. H .(2000). Factors affecting the fermentative lactic acid
production from renewable resources, Enzym Microb. Technol. 26: 87–107.
43. Hsust, Breukinke, Tischenko E.Lutters, MA, de Kruijj B, Kaptein R. Bonvin A M,
vanNuland NA.(2004). The nisin-lipid II complex reveals a pyrophosphate cage
that provides a blueprint for novel antibiotics. Nat. Struct. Mol. Biol. 11(10):
963-967.
44. Hurst, A. 1981. Nisin. Adv. Appl. Microbiol. 27: 85-123.
45. Jack R.W., Tagg J.R and Ray B. (1995), “Bacteriocins of Gram positive bacteria”.
Microbiol.Rev, 59 (2): 171-200.
46. Jin T., Zhang H. (2008). Biodegradable polylactic acid polymer with nisin for use
in antimicrobial - food packaging. Journal of Food Science. 73(3): 127-134
47. Jin, Z.T., Liu, L.S., Zhang, H.Q., Hicks, K.B. (2009). Antimicrobial activity of nisin
60
incorporated in pectin and polylactic acid composite films against Listeria
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
monocytogenes. International Journal of Food Science and Technology. 44: 322-
329.
48. Joerger, R. D. (2007). Antimictobial polylactic coasted paper for food applications: an
analysis of quantitative results. Packaging Science and Technology: 774-779
49. Jozala A.F., Cholewa O., Moraes D., Penna T.C.V. (2005). Increase of nisin
production by Lactococcus lactis in different media. African Journal of
Biotechnology. 4 (3): 262-265.
50. Kosakai Y., Park Y.S., Okabe M., (1999). Enhancement of L(+)-lactic acid production
using mycelial flocs of Rhizopus oryzae, Biotechnol. Bioeng. 55: 461–470.
51. Kristo E, Koutsoumanis KP, Biliaderis CG. (2008). Thermal, mechanical and water
vapor barrier properties of sodium caseinate films containing antimicrobials and
their inhibitory action on Listeria monocytogenes. Food Hydrocolloids 22: 373–
86.
52. Kunioka M., Ninomiya F., Funabashi M. and Yagi H. (2009). Anaerobic
Biodegradation Tests of Poly(lactic acid) under Mesophilic and Thermophilic
Conditions Using a New Evaluation System for Methane Fermentation in
Anaerobic Sludge. Int. J. Mol. Sci. 10: 3824-3835.
53. Kunioka, M.; Ninomiya, F.; Funabashi. M (2006). Biodegradation of poly(lactic acid)
powder proposed as the reference test materials for the international standard of
biodegradation evaluation methods. Polym. Degrad. Stab. 91: 1919-1928.
54. Kylä-Nikkilä K.,Hujanen M., Leisola M., Palva A. (2000). Metabolic engineering
of Lactobacillus helveticus CNRZ32 for production of pure L(+)-lactic acid,
Appl. Environ. Microbiol: 3835–3841
55. Le Thanh Binh, Pham Thi Ngoc Lan. (1997), “Lactic acid bacteria fermentation of
by-products of fishing and fisheries processing for the source of animal feed”,
Processing of NCST of Vietnam, 9: 101-108.
56. Liu L. S., Finkenstadt V. L., Liu C.-K., Jin T., Fishman M. L. and Hicks K. B. (2007).
Preparation of poly(lactic acid) and pectin composite films intended for applications
61
in antimicrobial packaging. Journal of Applied Polymer Science, 106:801–810.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
57. Mehta R., Kumar v., Bhunia H., Upadhyay S.N. (2005). Synthesis of Poly(Lactic
Acid): A Review. Polymer Reviews, 45:325–349.
58. Millette M, Le Tien C, Smoragiewicz W, Lacroix M. (2007). Inhibition of
Staphylococcus aureus on beef by nisin-containingmodified alginate films and
beads. Food Control 18: 878–84.
59. Najjar MB., Kashtanov D. and Chikindas ML. (2007). ε-Poly-L-lysine and nisin A
act synergistically against Gram-positive food-borne pathogens Bacillus cereus
and Listeria monocytogenes. Letters in Applied Microbiology 45: 13–18.
60. Narayanan, N and Roychoudhury, P. and Srivastava, A. (2004). L (+) lactic acid
fermentation and its product polymerization”, Microbial Biotechnology 7(2): 26-
29.
61. Oda Y., Saito K., Yamauchi H., Mori M. (2002). Lactic acid fermentation of
potato pulp by the fungus Rhizopus oryzae, Curr. Microbiol. 45: 1–4.
62. Ohshima K. (2003). Biodegradable Plastics Society, Industrial Biodegradable
Plastics as Bio-based Materials in Japan, International Conference on Bio-
based Polymer at RIKEN, Tokyo, Japan.
63. Perez-perez C, Regalaro-Gonzalez C, Rodriguez- Rodrigue C. A, Barbosa-
Rodriguez J.R. and Villasenor-Ortega F. 2006. Incorporation of antimicrobial
agents in food packaging film and coating. Advances in Argicutural and Food
Biotechnology, 193-216, ISBN 81-7736-269-0, Ed. By Ramon Gerardo
Guevara-Gonzalez and Irineo Torres-Pacheco.
64. Rongguang Yang, Monty C. Johnson, and Bibek Ray, 1992. Novel method to
extraction large amounts of bacteriocins from lactic acid bacteria. Appl. and
Environ. Microbiol. 58: 3355-3359
65. Sawada K, Urakawa H and Ueda M. (2007). Modification of Polylactic Acid Fiber
with Enzymatic Treatment. Textile Research Journal 77 (11): 901-905
66. Schagger H, von Jagow G. 1987. Tricine -sodium dodesulphate polyacrylamide
gel electrophoresis for the separation of proteins in range from 1 to 100 kDa.
62
Analytical Biochmistry 166: 368-379
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
67. Sen AK, Narbad A, Horn N, Dodd HM, Parr AJ, Colquhoun I, Gasson MJ. (1999).
Post translation modification of nisin the involvement of nisin B in the
dehydration process, Eur. J. Biochem., 5(62): 524-532.
68. Severina E., Severin A. and Tomasz A. (1998). Antibacterial efficacy of nisin
against multidrug-resistant Grampositive pathogens. Journal of Antimicrobial
Chemotherapy 41: 341–347.
69. Shimizu H., Mizuguchi T, Tanaka E., and Shioya S. (1999). Nisin Production by a
Mixed Culture System Consisting of Lactococcus lactis and Kluyveromyces
marxianus. Applied and Environmental Microbiology 65(7): 3134-314.
70. Sunil Manglassary. 2012, Antimicrobial Food Packaging to enhance food safety:
Current Development and Future Challenges. Food Processing and Technology,
Vol. 3, Issue 5100e103
71. Suppkakul P, J. Miltz, K. Sonneveld and S.W. Bigger, 2003. Ative Packaging
Technologies with an Amphasis on Antimicrobial Packaging and its
application. J. Food Science, Vol. 68 (2): 408-420
72. Suwanmanee1 U, Leejarkpai T., Rudeekit Y., Thumrongrut M. (2010). Life Cycle
Energy Consumption and Greenhouse Gas Emissions of Polylactic acid (PLA)
and Polystyrene (PS) Trays Kasetsart J. Nat. Sci. 44 : 703 – 71.
73. Tagg J.R., Dajani A.S., Wannamarker L.W. (1976), “Bacteriocin of Gram positive
bacteria”, Bacteriol.Rev, 40: 722-756.
74. Taniguchi M, Hoshino K., Urasaki K. and Fujii M. (1994). Continuous production of
an antibiotic polypeptide (nisin) by Lactococcus lactis using a bioreactor coupled to
a microfiltration module. Journal of Fermentation and Bioengineering. 77(6): 704-
708.
75. Tay A., Yang S.T. (2002). Production of L(+)-lactic acid from glucose and starch
by immobilized cells of Rhizopus oryzae ina rotating fibrous bed bioreactor,
Biotechnol. Bioeng.80:1–12.
76. Tran Dinh Man and Nguyen The Trang (2008). Using Lactic Acid Bacteria
63
isolated in Vietnam for aquatic products waste treatment and Lactic Acid
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Production for Polylactic synthesis. Processing Environmental Science &
Technology for the earth, Osaka, Japan: 278-285
77. Twomey, D., R. P. Ross, M. Ryan, B. Meaney, and C. Hill (2002),"Lantibiotics
produced by lactic acid bacteria: structure, function and applications", Antonie
Van Leeuwenhoek, 82, 165-85.
78. VickRoy T.B. (1985) Lactic Acid. In: Comprehensive Biotechnology, Pergamon
Press, New York: 761–776.
79. Wei-Liang Guo, Yi-bo Zhang, Jia-hui Lu, Li-yan Jiang and Yan-chun Liang.
2010. Optimazation of fermentation medium for nisin production from L. lactis
subsp. lactis using respond surface methodology (RSM) combined with
artificial neural network-genetic algorithm(NN-GA)
80. www.nanoecoproduct.com/
81. Xu X, Li B, Kennedy JF, Xie BJ, Huang M. (2007). Characterization of konjac
glucomannan–gellan gum blend films and their suitability for release of nisin
incorporated therein. Carbohydr Polym70:192–7.
82. Yin P., Nishiya N., Kosakai Y., Yahira K., Park Y.S., Okabe M. (1997). Enhanced
production of L(+)-lactic acid from corn starch in a culture of Rhizopus oryzae
using an air-lift bioreactor, J. Ferment. Bioeng. 84: 249–253.
83. Young J.W., Jin N.K., Hwa W. R. (2006). Biotechnological Production of Lactic
Acid, Food Technol. Biotechnol. 44 (2): 163–172.
84. Zang YC, Yam KL, Chikindas ML. 2004. Effective control of Listeria
monocytogenes by combination of nisin formulated and slowly released into a
broth system. Int. J. Food Microbiology 90: 15-22)
85. Zhou X.X., Pan YJ., Wang YB. and Li WF. (2008). Optimization of Medium
Composition for Nisin Fermentation with Response Surface Methodology.
64
Journal of Food Science, 73: 245–249.
