Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo dòng thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) mang gen GmDREB2 phận lập từ cây đậu tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.) MANG GEN GmDREB2 PHẬN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS.Vũ Thị Thu Thuỷ

Thái Nguyên, năm 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự

hướng dẫn của TS. Vũ Thị Thu Thủy, sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, cán bộ

Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại Khoa Sinh học– Trường Đại học Sư

phạm- Đại học Thái Nguyên. Các số liệu nêu trong luận văn là trung thực. Các

kết quả chưa được công bố trong bất kỳ các công trình nào khác.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này.

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2015

Tác giả

Nguyễn Thị Phương Thảo

XÁC NHẬN

CỦA KHOA CHUYÊN MÔN

CỦA NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. Vũ Thị Thu Thủy

i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Thị Thu Thủy đã định

hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất

trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng

dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành Bản luận văn thạc sĩ này.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Di truyền &

Sinh học hiện đại, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái

Nguyên; xin cảm ơn chị Trần Thị Hồng - KTV phòng Công nghệ tế bào thực

vật, đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện các thí

nghiệm của đề tài.

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới bạn bè cùng toàn thể gia đình đã động viên,

khuyến khích, giúp đỡ tôi, luôn quan tâm và là chỗ dựa cho tôi trong suốt quá

trình học tập và hoàn thành luận văn.

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2015

Tác giả

Nguyễn Thị Phương Thảo

ii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan ........................................................................................................ i

Lời cảm ơn ........................................................................................................... ii

Mục lục ............................................................................................................... iii

Danh mục chữ cái viết tắt ................................................................................... iv

Danh mục bảng .................................................................................................... v

Danh mục hình .................................................................................................... vi

MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3

1.1. Cây thuốc lá và hệ thống tái sinh cây thuốc lá ......................................... 3

1.1.1 Cây thuốc lá ............................................................................................ 3

1.1.2 Hệ thống tái sinh và chuyển gen cây thuốc lá. ....................................... 4

1.2. Tính chịu hạn và gen liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật................... 6

1.2.1. Hạn và tác hại của hạn lên thực vật ....................................................... 6

1.2.2 Đặc tính chịu hạn của thực vật .............................................................. 8

1.2.3. Gen liên quan đến tính chịu hạn .......................................................... 10

1.2.4. Gen DREB và gen DREB2 .................................................................. 12

1.3. Phương pháp tạo cây trồng chuyển gen.................................................. 18

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 26

2.1. Vâ ̣t liê ̣u hoá chất và thiết bi ̣ .................................................................... 26

2.1.1. Vật liệu................................................................................................. 26

2.1.2. Hóa chất ............................................................................................... 26

2.1.3. Thiết bị ................................................................................................. 26

2.1.4. Đi ̣a điểm nghiên cứ u ............................................................................ 26

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 27

2.2.1. Phương pháp tạo nguyên liệu biến nạp .............................................. 27

iii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.2. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua A. tumefaciens 27

2.2.3. Phân tích sự có mặt của cấu trúc mang gen GmDREB2 bằng phương pháp PCR 29

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................... 32

3.1. Kết quả tạo nguyên liệu biến nạp ........................................................... 32

3.2. Kết quả chuyển vector mang cấu trúc GmDREB2 vào thuố c lá ............ 33

3.2.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch A. tumefaciens và cảm ứng tạo cu ̣m chồi .. 34

3.2.2. Tạo rễ và chuyển cây ra môi trường tự nhiên..................................... 37

3.3. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong các dòng thuốc lá

chuyển gen bằng kỹ thuật PCR ..................................................................... 39 KẾ T LUẬN VÀ ĐỀ NGHI ̣ ............................................................................. 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 43

PHỤ LỤC

iv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Abscisic acid ABA

Acetosyringone AS

A.tumefacines Agrobacterium tumefacines

6-Benzyl Amino Purine BAP

Base pair (cặp base) bp

Deoxyribonucleic Acid DNA

Deoxynucleic triphosphate dNTP

Dehydration Responsive Binding protein DREB

Đối chứng ĐC

Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid EDTA

Indoleacetic acid IAA

Indole-3 butyric acid IBA

Luira and Bertani LB

Late Embryogenesis Abundant LEA

Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) MS

Polymerase chain reaction PCR

Môi trường ra rễ RM

Tris Acetate EDTA TAE

Thermus aquaticus Taq

Ti-plasmid Plasmid tạo khối u

Virulence region Vir

iv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm chiết DNA tổng số ................................ 29

Bảng 2.2. Trình tự nucleotide củ a că ̣p mồ i PCR khuếch đa ̣i đoa ̣n GmDREB2 ... 30 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen GmDREB2 ... 31

Bảng 2.4. Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân gen GmDREB2 ......................... 31

Bảng 3.1. Kết quả cảm ứng chồi từ mảnh lá thuốc lá ....................................... 36

Bảng 3.2. Kết quả tạo rễ và tái sinh cây thuốc lá ở thí nghiệm và đối chứng ... 38

v Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Cây thuốc lá giai đoạn trưởng thành và giai đoạn ra hoa .................... 3

Hình 1.2 Cấu trúc Ti - Plasmid .......................................................................... 22

Hình 1.3. Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens ........................... 23

Hình 3.1. Tạo nguyên liệu biến nạp .................................................................. 32

Hình 3.2. Vùng T-DNA của vector pBI121 - GmDREB2 ................................. 33

Hình 3.3. Hình ảnh nhiễm khuẩn mẫu và đồng nuôi cấy .................................. 35 Hình 3.5. Hình ảnh tạo rễ trên môi trường kháng sinh chọn lọc ....................... 38

Hình 3.6. Các dò ng thuốc lá chuyển gen ở thế hê ̣ T0 trồ ng trên châ ̣u trong nhà lướ i ..................................................................................................................... 39 Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoa ̣n GmDREB2 từ 17 dò ng cây thuốc lá chuyển gen ............................................................................ 40

vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Một trong những hiện tượng thay đổi của môi trường ảnh hưởng tới sự

sinh trưởng và phát triển của thực vật là tình trạng hạn. Hạn hán có ảnh hưởng

xấu ở các mức độ khác nhau trong suốt quá trình hay từng giai đoạn sống của

cơ thể thực vật dẫn đến làm giảm năng suất cây trồng, chậm phát triển và gây

chết. Hiện nay trên thế giới diện tích đất nông nghiệp bị hạn hán ngày càng

tăng. Ở Việt Nam tình trạng hạn hán trở nên báo động trong năm 2015, diện

tích đất nông nghiệp không có nước để sản xuất này càng tăng cao.

Khả năng chịu hạn của thực vật là tính trạng do nhiều gen quy định. Hiện

nay, người ta vẫn chưa tìm được một gen cụ thể nào thực sự quyết định tính

chịu hạn, mà mới chỉ xác định được các gen liên quan đến tính chịu hạn của

cây thực vật. Nhiều trình tự gen liên quan đến tính chịu hạn ở đậu tương đã

được công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế, trong đó có gen DREB.

DREB (Dehydration Responsive Element Binding) là một họ gen sản xuất

protein kích hoạt nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn của thực vật. Việc

nghiên cứu gen DREB2 liên quan đến tính chịu hạn cho thấy đây là nhóm gen

đa dạng về cấu trúc, chức năng và các tác giả khuyến cáo cần tiếp tục mở rộng

nghiên cứu.

Hiện nay, nhờ những tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền mà người ta đã

tạo ra các giống cây trồng có khả năng chịu hạn bằng cách lai giống, đột biến

thực nghiệm, công nghệ tế bào, chuyển gen. Chọn tạo giống cây trồng có thể

được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như chọn dòng biến dị

soma, lai giống, gây đột biến thực nghiệm, sử dụng công nghệ tế bào và chuyển

gen... Đã có nhiều giống cây trồng đã được chọn tạo như các giống lúa chịu

hạn của tác giả Đinh Thị Phòng [17], các dòng lúa chịu nóng của Nguyễn Thị

Tâm [19] Các dòng lạc chịu hạn cũng đã được tạo ra bằng cách gây đột biến

1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thực nghiệm- tác giả Vũ Thị Thu Thủy [23]... Chuyển gen là kỹ thuật cho phép

đưa một hay một số gen nhất định nào đó vào hệ gen của cây chủ được quan

tâm để tạo ra những cây trồng biến đổi gen nhằm cải thiện một số đặc tính

hay tính trạng theo hướng có lợi cho con người . Chuyển gen đang là hướng

nghiên cứu có nhiều triển vọng, đã được tiến hành thực nghiệm trên nhiều

giống cây trồng như: cà chua, lúa, ngô, đậu tương... và được áp dụng ở nhiều

nước trên thế giới. Trong đó chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefacines (A.tumefacines) tỏ ra ưu thế hơn cá kỹ thuật

chuyển gen khác do ít tốn kém, quy trình đơn giản, nhanh chóng, dễ áp dụng

trên nhiều đối tượng cây trồng.

Do hệ thống tái sinh cây thuốc lá tương đối đơn giản và thời gian phân

hóa từ mô thành cây hoàn chỉnh khá ngắn nên trong những nghiên cứu về

chuyển gen các nhà khoa học thường chọn cây thuốc lá làm cây mô hình.

Xuất phát từ cơ sở trên chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành nghiên cứu đề

tài: “Nghiên cứu tạo dòng thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) mang gen

GmDREB2 phận lập từ cây đậu tương”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Tạo được dòng thuốc lá chuyển gen mang gen GmDREB2 phân lập từ

cây đậu tương.

3. Nội dung nghiên cứu

(1) Nghiên cứu tạo nguyên liệu biến nạp từ cây thuốc lá giống K326.

(2) Nghiên cứu lây nhiễm A. tumefaciens mang vector chuyển gen vào mảnh lá

thuốc lá. Tái sinh in vitro, chọn lọc và tạo các dòng cây thuốc lá chuyển gen.

(3) Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen ở thế hệ

T0 bằng kỹ thuật PCR

2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cây thuốc lá và hệ thống tái sinh cây thuốc lá

1.1.1 Cây thuốc lá

Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotiana tabacum L. thuộc ngành hạt

kín, lớp 2 lá mầm, phân lớp Cúc, bộ Cà, họ Cà. Họ này có trên dưới 85 chi với

tổng số trên 1800 loài. Một số loài trong họ này được trồng rộng rãi như khoai

tây, cà chua, ớt và các loại cà, trong đó có chi Nicotiana.

(Hình ảnh chụp tại vườn thực nghiệm khoa Sinh học trường ĐH Sư phạm)

Hình 1.1. Cây thuốc lá giai đoạn trưởng thành và giai đoạn ra hoa

Rễ thuốc lá là một hệ thống gồm rễ cái (rễ trục) và rễ nhánh (rễ bên) và rễ

hấp phụ. Ngoài ra thuốc lá còn có rễ bất định mọc ở cổ rễ, sát mặt đất. Rễ trụ

được hình thành từ trục của rễ cái, thường có độ xiên 30 – 40 độ. Rễ hấp thu

được phát triển trên các rễ nhánh. Có nhiệm vụ cung cấp nước và các chất dinh

dưỡng cho cây. Rễ bất định mọc từ thân, những rễ bất định ở phần sát gốc dễ

phát sinh thành rễ hút khi có độ ẩm không khí cao. Rễ thuốc lá tập trung dày đặc

ở lớp đất 0 – 30 cm, phát triển theo các hướng. [3].

Các dạng thuốc lá trồng có dạng thân đứng, tiết diện thân tròn, chiều cao

thân cây có thể đạt từ 1 – 3m, chia làm nhiều đốt, mỗi đốt mang một lá. Đường

kính thân đạt 2 – 4 cm, nách lá trên thân có chồi sinh trưởng gọi là chồi nách.

Có 2 loại chồi nách: Chồi nách chính và chồi nách phụ [3]. Trên thân chính của

3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

cây thuốc lá có nhiều lá. Lá thuốc lá có các hình dạng chủ yếu là: hình trứng,

hình tim, hình elip, hình mũi mác [3].

Hoa thuốc lá là hoa đơn, lưỡng tính, có năm cánh, nhị cái ở giữa, xung

quanh có 5 nhị đực thường mọc cao hơn nhị cái. Thuộc loại hoa tự hữu hạn,

được hình thành do sự phân hóa đỉnh sinh trưởng thân. Chính giữa chùm hoa có

hoa trung tâm và có các nhánh hoa mọc từ trục chính của chùm hoa [3].

Quả thuốc lá được hình thành trên đài hoa. Mỗi cây có 100 – 150 quả

trên mỗi chùm hoa, có những cây hoặc những giống có tới 400 – 500 quả trên

chùm hoa. Mỗi quả có hai ngăn, khi chín chúng thường tách ra. Hạt thuốc lá rất

nhỏ, khối lượng 1000 hạt của các giống thuốc lá vàng sấy lò là 0,07 – 0,10

gam, trong mỗi gam hạt có từ 10000 đến 15000 hạt [3].

1.1.2 Hệ thống tái sinh và chuyển gen cây thuốc lá

Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang bộ máy thông tin di truyền

giống nhau. Do đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau.

Các tế bào được lấy từ bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh

sinh trưởng, lá mầm, đoạn thân, rễ...) đều có thể được kích thích để tái sinh

thành cây hoàn chỉnh đặc trưng cho loài, phát triển và ra hoa kết quả bình

thường, thông qua phát sinh cơ quan hoặc hình thành phôi vô tính, miễn là

chúng được nuôi cấy trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp và bổ sung các chất

kích thích sinh trưởng cần thiết [62]. Các loại mô đã phân hóa tách từ cơ thể

thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, hoặc là chúng phát

triển thành tế bào mô sẹo. Đó là loại tế bào không phân hóa, phân chia liên tục

và có khả năng phân hóa thành phôi, chồi để tạo cây hoàn chỉnh. Khả năng đó

gọi là tính toàn năng của tế bào. Tính toàn năng chính là cơ sở của kĩ thuật nuôi

cấy mô tế bào, là cơ sở của công nghệ tế bào thực vật đang ngày càng phát triển

và hoàn thiện.

Các nhà khoa học đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở

thực vật đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic. Những chất này

4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng

sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo và hỗ

trợ nhau. Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất

định. Trong nuôi cấy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chát điều tiết

sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin [24], [27]

Tái sinh cây được xem là khâu mấu chốt quyết định thành công trong

nuôi cấy mô và chuyển gen ở thực vật. Nguồn mẫu ban đầu dùng cho tái sinh

cây rất đa dạng như : phôi hữu tính, lá non, lá mầm, phần trụ của lá mầm, đoạn

thân... Các mẫu này được sử dụng trong hệ thống tái sinh thông qua hai con

đường: tái sinh trực tiếp hoặc qua giai đoạn mô sẹo và tái sinh thông qua hình

thành phôi soma trên các môi trường thích hợp.

Theo con đường thứ nhất, sự tái sinh chồi trực tiếp từ các mẫu vật như lá

mầm, nách lá mầm, mảnh lá là một phương pháp có hiệu quả được sử dụng

trong tái sinh và chuyển gen một số loài thực vật. Giai đoạn cảm ứng tạo chồi

là giai đoạn quan trọng trong quá trình phát triển chồi trực tiếp từ nách lá mầm.

Môi trường cảm ứng tạo chồi ở thực vật thường sử dụng các chất kích thích

sinh trưởng nhóm auxin và cytokinin như IBA, IAA, BAP... Trong đó, BAP là

kích thích sinh sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin được sử dụng nhiều trong

môi trường cảm ứng tạo chồi ở thực vật [30], [72]. Sự tái sinh thông qua giai

đoạn mô sẹo thường bắt đầu từ các mẫu vật như phôi trục, lá non, đoạn thân...

Tuy nhiên, mô sẹo được tạo thành cho tỉ lệ đa chồi rất thấp thường là một hoặc

hai chồi, điều này không có ý nghĩa trong chuyển gen.

Con đường tái sinh thứ hai, chồi được tái sinh thông qua hình thành phôi

soma. Các phôi soma thường là sự biến đổi của khối mô sẹo, chúng có cấu trúc

tương tự như phôi hữu tính. Hệ thống tái sinh cây thông qua phôi soma được sử

dụng khá phổ biến trong nuôi cấy in vitro do khả năng tái sinh cây khá cao và

giảm được đáng kể hiện tượng khảm của cây chuyển gen [16].

5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Đối với cây thuốc lá, gen thường được chuyển thông qua trung gian A.

tumefaciens hoặc thông qua các phương pháp chuyển giao DNA trực tiếp như

xung điện hoặc bắn gen bằng vi đạn... Trong lịch sử, cả hai phương pháp đã

được sử dụng để chuyển DNA, tuy nhiên phương pháp chuyển gen qua trung

gian Agrobacterium được áp dụng rộng rãi hơn, thời gian tái sinh cây chuyển

gen ngắn hơn, kết quả các locus gen chuyển từ việc nhiễm khuẩn A.tumefacines

ít phức tạp hơn so với việc được tạo ra bằng các phương pháp chuyển gen trực

tiếp, do đó làm giảm nguy cơ tái sắp xếp gen chuyển và bất hoạt gen. Do đó

thuốc lá thường được chọn làm cây mô hình.

Trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều thành công trong chuyển gen

cây thuốc lá. Gen cryIII được chuyển vào cây thuốc lá và cây khoai tây để

kháng sâu Colorado potato beetle (leptiontarsa deeecemlineata) do Perlak và cs

thực hiện năm 1993 [64]. Liu và cs đã chuyển gen DREB4 vào cây thuốc lá

[57]. Nguyễn Thị Thu Ngà (2014) sử dụng cây thuốc lá để chuyển gen mã hóa

nhân tố phiên mã NAC2 bằng phương pháp xung điện, thành công đã được

minh chứng bằng sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra bằng kĩ thuật lai

Western [16]. Nghiên cứu của Phạm Thị Vân và cs (2009) đã tạo cây thuốc lá

chuyển gen kháng virus TMV bằng kĩ thuật RNAi [25]. Gen kháng kanamycine

cũng được chuyển thành công vào mô thuốc lá là nghiên cứu của Nguyễn Liên

Chi và cs (1989) [3].

1.2. Tính chịu hạn và gen liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật

1.2.1. Hạn và tác hại của hạn lên thực vật

Hạn là tình trạng mất nước ở cây nguyên nhân có thể do nhiều lý do: như

sự thiếu nước trong môi trường hay do nhiệt độ thấp, đốt nóng, nồng độ muối

khoáng trong môi trường quá cao.

Có ba hình thức hạn gặp ảnh hưởng đến cây trồng là hạn đất, hạn không

khí và hạn tổ hợp [11].

6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hạn đất xảy ra khi lượng nước trong đất thiếu nhiều không đủ cho rễ hút để

cung cấp cho cây. Vì thế, cây có thể bị héo và chết. Tuy nhiên, cũng có những

trường hợp đủ nước mà cây vẫn héo, nguyên nhân là do hạn sinh lý gây nên. Hạn

không khí thường xẩy ra khi không khí trong môi trường có nhiệt độ cao và độ

ẩm thấp, ví dụ như gió nóng Israel, gió Lào ở miền Trung nước ta... làm cho cây

thoát hơi nước quá mạnh, vượt xa mức bình thường và dẫn tới hiện tượng mất

nước, do rễ hút vào không đủ bù lượng nước mất đi, làm các bộ phận non của

cây thiếu nước. Hạn tổ hợp là sự phối hợp thiếu nước trong đất và không khí.

Tác hại của hạn lên thực vật

Thiếu nước sẽ gây nên các hậu quả rất lớn đối với hoạt động sống của

cây. Trước tiên ảnh hưởng đến sự cân bằng nước của cây, từ đó ảnh hưởng

đến các chức năng sinh lý khác như quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng và

cuối cùng là ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của thực vật dẫn đến

giảm năng suất.

Khi gặp hạn trạng thái của chất nguyên sinh trong tế bào thay đổi mạnh,

ảnh hưởng đến tính chất hóa lý của chất nguyên sinh như tính thấm, mức độ

thủy hóa keo, thay đổi pH, độ nhớt, dẫn đến sự thay đổi vị trí các thành phần

cấu tạo nên chất nguyên sinh, cuối cùng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất

bình thường của cơ thể [5]. Trong thời gian cây bị hạn, hàm lượng nước tự do

trong lá giảm xuống nhưng hàm lượng nước liên kết lại tăng lên. Chất nguyên

sinh của tế bào có tính đàn hồi lớn thì cây có khả năng chịu hạn cao [ 28].

Hạn còn ảnh hưởng đến hô hấp. Trong thời gian khô hạn, ở những cây

trung sinh thường tăng cường hô hấp. Nhờ gia tăng hô hấp mà cây giữ được độ

ngậm nước của keo nguyên sinh chất [5]. Sự tăng cường quá trình thủy phân

khi gặp điều kiện khô hạn là nguyên nhân tăng cường hô hấp trong cây. Khi

mất nước ban đầu hô hấp tăng, nhưng sau đó giảm đột ngột, nếu tình trạng

thiếu nước kéo dài [28].

7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Thiếu nước ảnh hưởng đến quang hợp. Hạn hán đã ảnh hưởng xấu đến quá

trình hình thành diệp lục, phá hoại lạp thể nên hiệu suất quang hợp giảm xuống

nhanh chóng [28].

Hạn ảnh hưởng đến hoạt động hút khoáng của hệ rễ, dẫn đến tình trạng

thiếu những nguyên tố dinh dưỡng quan trọng trong quá trình trao đổi và tổng

hợp các chất hữu cơ khác nhau trong cơ thể thực vật [5]. Hạn ảnh hưởng trực

tiếp đến quá trình sinh trưởng các tế bào, đặc biệt là trong pha giãn của tế bào,

từ đó mà ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của toàn cây [28].

1.2.2 Đặc tính chịu hạn của thực vật

Mỗi loài cây trồng có một ghới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái

của môi trường như: nhiệt độ, nước, phèn, độ mặn...Hạn tác động lên cây theo

hai hướng chính làm tăng nhiệt độ cây và gây mất nước trong cây. Trong

những nhân tố sinh thái của môi trường thì nước là một nhân tố ghới hạn quan

trọng của cây trồng là sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng của các quá

trình chuyển hóa diễn ra trong cơ thể thực vật.

Cơ sở sinh lý của tính chịu hạn

Nước có ý nghĩa quyết định đến đời sống của thực vật. Thiếu nước cây sẽ

chết non hoặc giảm sức sống, giảm năng suất. Do sự thiếu nước của môi

trường, nhiệt độ thấp hay cao... có thể gây ra hiện tượng mất nước của cây. Để

đáp ứng sự thiếu hụt nước trong điều kiện cực đoan, cây bắt buộc phải có

những cơ chế thích ứng đặc biệt giúp cây duy trì sự tồn tại khi bị hạn.

Khi gặp hạn thực vật luôn có những biến đổi về mặt sinh lý, sinh hoá để

nhằm không mất nước. Có hai cơ chế bảo vệ để thực vật tồn tại trên môi trường

thiếu nước đó là vai trò của bộ rễ và khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu.

Vai trò của bộ rễ: Những cây chịu hạn có bộ rễ khỏe, dài, mập, có sức

xuyên sâu giúp cây hút được nước ở tầng đất sâu. Bộ rễ lan rộng, có nhiều rễ phụ

và có nhiều mô thông khí, cùng với hệ mạch dẫn phát triển giúp cho việc thu

8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nhận và cung cấp nước tới các bộ phận khác của cây trong điều kiện khó khăn về

nước. Thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng khi ở giai đoạn cây non

thường chịu tác động mạnh của hạn vì bộ rễ phát triển chưa đầy đủ còn yếu.

Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu (ASTT): Là một đặc tính quan

trọng của tế bào khi mất nước do nóng hạn. Khi tế bào bị mất nước dần dần,

các chất hòa tan sẽ được tích lũy trong tế bào chất (như: đường, axit hữu cơ,

amino acid, các ion chủ yếu là ion K+...), các chất này có tác dụng điều chỉnh

áp suất thẩm thấu . Những thực vật tồn tại trên môi trường cân bằng về áp suất

thẩm thấu đòi hỏi phải có khả năng chống lại điều kiện khắc nghiệt đó. Trong

điều kiện khô hạn ASTT được điều chỉnh tăng lên giúp cho tế bào thu nhận

được những phân tử nước từ đất. Bằng cơ chế như vậy thực vật có thể chịu

được sự mất nước trong thời gian ngắn [11].

Ngoài ra, thực vật còn có khả năng chống chịu bằng những biến đổi về

hình thái như lá cuộn lại thành ống, lá có nhiều lông, cutin dày để giảm thoát

hơi nước [5].

Cơ sở sinh hóa và di truyền của tính chịu hạn

Khi phân tích thành phần hóa sinh của các cây chịu hạn, các nghiên cứu

đều cho rằng, khi gặp hạn có hiện tượng tăng lên về hoạt độ enzyme, hàm

lượng ABA, hàm lượng proline, nồng độ ion K+, các loại đường, axit hữu

cơ,...giảm CO2, protein và axit nucleic [2],[4],[13],[17].

Nghiên cứu sự đa dạng và hoạt động của enzyme trong điều kiện gây hạn

đã được nhiều tác giả quan tâm. Trần Thị Phương Liên (1999) nghiên cứu đặc

tính hóa sinh của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, hạn đã nhận

xét rằng áp suất thẩm thấu cao ảnh hưởng rõ rệt tới thành phần và hoạt độ

protease, kìm hãm sự phân giải protein dự trữ [11]. Một số nghiên cứu trên các

đối tượng như lạc, lúa, đậu xanh, đậu tương... cho thấy, có mối tương quan

thuận giữa hàm lượng đường tan và hoạt độ α - amylase, giữa hàm lượng

protein và hoạt độ protease [10],[16],[22]... Đường tan là một trong những chất

9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào. Sự tăng hoạt độ α - amylase

sẽ làm tăng hàm lượng đường tan, do đó làm tăng áp suất thẩm thấu và tăng

khả năng chịu hạn của cây trồng [14],[17].

Những thay đổi hóa sinh khác do hạn gây ra cũng đã được nhiều tác giả

quan tâm nghiên cứu, trong đó có sự biến đổi hàm lượng proline. Nghiên cứu

khả năng chịu hạn của một số giông lúa cạn địa phương ở vùng núi phía Bắc,

tác giả Chu Hoàng Mậu và cs đã nhận xét, khả năng chịu hạn của cây lúa cạn

phụ thuộc tuyến tính vào hàm lượng proline [15]. Xử lý bằng dung dịch

sorbitol 5% đối với một số dòng lúa tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước, tác giả

Đinh Thị Phòng cho thấy, hàm lượng proline của các dòng chọn lọc khi bị xử

lý sorbitol tăng lên và vượt xa so với đối chứng [17].

1.2.3. Gen liên quan đến tính chịu hạn

Tính chịu hạn là tính trạng đa gen, được biểu hiện khác nhau trong các giai

đoạn phát triển của cây. Trên thực tế vẫn chưa tìm được gen thực sự quyết định

tính chịu hạn mà mới chỉ tìm thấy các gen liên quan đến tính chịu hạn. Có thể

chia các gen liên quan đến tính chịu hạn làm hai nhóm: (1) Các gen liên quan

đến khả năng chịu hạn của thực vật; (2) Nhóm gen mã hóa protein điều khiển

hoạt động phiên mã của các gen liên quan đến tính chịu hạn.

Nhóm thứ nhất, các gen liên quan đến khả năng chịu hạn tiếp tục được

chia nhỏ thành các nhóm: (i) Các gen tham gia vào quá trình bảo vệ thành tế

bào; (ii) Các gen tham gia vào quá trình tổng hợp các chất điều hòa áp suất

thẩm thấu và (iii) Các gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ. Một số gen được

nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây là: LEA, P5CS, NCED,

PLD...[32],[40],[46].

Gen LEA (Late Embryogenesis Abundant) là một trong những nhóm gen

liên quan tới sự mất nước của thực vật. Bình thường, sản phẩm của gen LEA

được tạo ra với lượng lớn trong giai đoạn muộn của quá trình hình thành phôi.

Khi tế bào bị mất nước protein LEA được tổng hợp nhiều hơn, mức độ phiên

10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

mã của LEA được điều khiển bởi ABA. Biểu hiện mạnh của gen LEA sẽ làm

giảm độ mất nước và tăng áp suất thẩm thấu trong tế bào [32], [45].

Nhóm gen P5CS mã hóa tổng hợp pyrroline 5 carboxylate synthetase.

Biểu hiện của gen P5CS mạnh sẽ làm tăng hàm lượng proline trong cây, theo

đó tăng áp suất thẩm thấu của tế bào và khả năng chống chịu với các yếu tố bất

lợi của cây được cải thiện [8],...

Gen NCED mã hóa tổng hợp 9 - cis epoxycarotenoid dioxygenase. Theo

nghiên cứu của Guerrini và đtg (2005), sự bất lợi của điều kiện về hạn, muối

làm cho gen điều khiển tổng hợp 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase biểu hiện

mạnh hơn. Hoạt động của 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase sẽ biến đổi

neoxathin thành xathoxin, đây chính là giai đoạn trước khi hình thành ABA. Do

đó, hoạt động của NCED được xác nhận có mối liên quan với khả năng chống

chịu của thực vật [46].

Gen PLD mã hóa phospholipase D. Hoạt động của phospholipase D

mạnh mẽ tạo một phân tử phospholipid và một gốc chứa nhóm hydroxyl tự do,

hoạt động của các PLD được khẳng định có liên quan đến hạn [40],[48],[75].

Nhóm thứ hai, các gen mã hóa protein điều khiển phiên mã có khả năng

hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen liên quan đến tính chịu hạn. Cơ chế

hoạt động thông qua việc bám vào trật tự DNA trên vùng khởi động gen

(promoter) và tương tác với RNA polymerase tạo thành phức hợp khởi đầu quá

trình phiên mã. Nhóm gen mã hóa các yếu tố phiên mã chiếm khoảng 8 - 10%

trong hệ gen mỗi loài và đóng vai trò quan trọng trong mọi hoạt động sống như

quá trình sinh trưởng phát triển và chống chịu với bất lợi môi trường. Các nhà

khoa học đã xác định nhóm gen liên quan đến tham gia vào quá trình phiên mã

DREB, NAC, MYB.... [67], [73].

11 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1.2.4.Các nhân tố phiên mã và gen DREB

Nhân tố phiên mã trong tế bào được kí hiệu là TF (transcription factor).

Đặc điểm đặc trưng của các nhân tố phiên mã là có hai vùng hoạt động: (1)

Vùng hoạt hoá các protein chức năng và (2) vùng liên kết với các trật tự DNA

đặc hiệu trên promoter. TF là các protein có khả năng nhận biết các trình tự cis

– yếu tố điều hòa sự phiên mã đặc hiệu trên promoter và hoạt hóa sự phiên mã.

Yếu tố cis chứa trình tự hộp GC là một trình tự dài 11 bp (5’-

C/AACACGTGGCA – 3’) nằm ở phía trước của rất nhiều gen mã hóa cho các

tiểu đơn vị nhỏ của ribulose biphosphate carboxylase [39], [77]. Các protein

tham gia điều khiển biểu hiện gen có chức năng trong việc phản ứng với nhờ

các tiết tấu trình tự có khả năng gắn với DNA như bZIP, MYB, MYC…

Vùng khởi động gen của hầu hết các gen liên quan đến tính chịu hạn

thường chứa một hoặc nhiều trật tự DNA đặc hiệu. Các trật DNA phổ biến là

ABRE (ABA responsive element) và DRE/ CRT (Dehydration responsive

element/ C repeat), NAC, MYB... Trong điều kiện cực đoan, các nhân tố phiên

mã sẽ gắn với các trật tự trên và biểu hiện phụ thuộc hoặc không phụ thuộc vào

nồng độ ABA [77].

Trong điều kiện biểu hiện của các nhân tố phiên mã phụ thuộc vào ABA,

thì ABA được xem là chất có vai trò chủ yếu phối hợp với một hệ thống điều

hòa cho phép thực vật đối phó với điều kiện thiếu nước. Các nhân tố phiên mã

phụ thuộc vào ABA được xác định gần đây gồm MYB, MYC, bZIP ...[40]. Ở

Arabidopsis, MYB gồm nhiều loại và được kí hiệu là AtMYB. Nghiên cứu của

Abe và cs (2008) xác định loại AtMYB2 nhận biết trình tự TGGTTAG trên

promoter để hoạt hóa gen rd22 trong điều kiện mất nước [29]. Gen AtMYB60

biểu hiện trong tế bào khí khổng đã giúp thực vật vượt qua được tình trạng mất

nước [12]. MYC có thể nhận biết trình tự CAxxTG trên promoter (x là một

nucleotit bất kì) [12]. bZIP (nhân tố phiên mã AREB/ABF) có trình tự gắn đặc

hiệu là ACGT [44].

12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Với các nhân tố phiên mã sự biểu hiện không phụ thuộc ABA, các nhân

tố được xác định gần đây phải kể đến như DRE, NAC... Theo Ernst (2004)

NAC liên kết với một đoạn gồm 21bp trong promoter 35S của virus khảm súp

lơ, trung tâm là hai đoạn CGTA và CGTC [42]. Theo Trần và cs (2004), hai

đoạn trên được xem như các motif trung tâm của gen cảm ứng bởi hạn ERD1

(Early response to dehydration 1) ở Arabidopsis [73]. DRE là tên của trình tự

dài 9 bp nằm trên promoter là TACCGACAT [36]. Trong đó, vùng quan trọng

nhất của tiết tấu trình tự DRE là vùng lặp lại giàu C là CCGAC. Các yếu tố gắn

với trình tự DRE được gọi là DREBs. Nhân tố DREB chứa các vùng bảo thủ

như các protein EREBP (ethylene responsive binding protein - tham gia biểu

hiện ethylene) và AP2 (Apetala2 - tham gia vào quá trình biểu hiện ở thực vật

có hoa). Các protein này còn được ký hiệu là nhân tố gắn với CRT (CRT

binding factor – CBF). Chúng phản ứng rất nhanh với trạng thái cực đoan,

trước khi xuất hiện lượng ABA đáng kể [39].

DREB (Dehydration Responsive Binding protein) là họ gen tổng hợp

protein được tìm thấy trong thực vật khi gặp điều kiện bất lợi như hạn, mặn và

lạnh. Các nhà khoa học cho rằng, DREB là nhân tố phiên mã tham gia tích cực

vào quá trình kích hoạt nhanh hoạt động của các gen tham gia chống lại các

điều kiện bất lợi từ môi trường như hạn hán, mặn và lạnh... Khi nghiên cứu cấu

trúc protein họ DREB đã cho thấy chúng có chứa vùng bảo thủ duy nhất để gắn

với trình tự DNA đặc hiệu là AP2/ERF. Các miền AP2/ERF khá bảo thủ và có

khoảng 60 amino acid [36], [52]. DREB đã được các nhà khoa học trên thế giới

quan tâm và nghiên cứu từ những năm 80 của thế kỷ XX, tập trung vào các

giống cây trồng như hoa cúc [54], hướng dương [39], ngô [64], lúa [41]… và

đã thu được nhiều kết quả trong việc cải thiện khả năng chống chịu của thực vật

trong điều kiện khắc nghiệt của môi trường. Ngoài ra, các nhà khoa học Trung

Quốc, Đức, Pháp, Mỹ… đã nghiên cứu giải trình tự gen DREB trên các đối

tượng cây trồng khác nhau như Arabidopsis [56], lúa mì [50], thuốc lá [57]…và

13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

so sánh trình tự gen của các loài cây trồng với hoang dại thấy sự sai khác giữa

chúng. Từ đó, các nhà khoa học nghiên cứu tạo ra các giống cây trồng mới có

khả năng chống chịu cao hơn nhờ phương pháp chuyển gen.

Ở cây Arabidopsis, trên cơ sở số lượng và sự giống nhau của các miền

gắn vào DNA, 145 nhân tố phiên mã được phân thành 5 nhóm: AP2 (14 gen),

RAV (6 gen), DREB (56 gen), ERF (còn gọi là EREBP, 65 gen) và nhóm gen

khác (4 gen). Trên cơ sở tương tự và đặc tính cấu trúc của chuỗi amino acid, 10

họ gen DREB (kí hiệu từ DREB2 đến DREB11) được phân thành 5 nhóm,

nhóm thứ nhất gồm DREB3, DREB4, DREB4 và DREB5; nhóm thứ hai gồm

W5, DREB6, DREB7 và DREB1; nhóm thứ ba gồm DREB2 và DREB8; nhóm

thứ tư gồm có DREB9 và DREB10; nhóm thứ năm gồm DREB11, ERF1 và

ERF2 [56], [68]. Hai gen DREB2A và DREB2B chỉ biểu hiện trong điều kiện

hạn và hoạt hoá các gen chức năng tham gia vào tính chịu hạn của thực vật.

Tuy nhiên, biểu hiện của các gen DREB2A và DREB2B không làm tăng tính

kháng hạn của các cây Arabidopsis chuyển gen, điều này chứng tỏ nhóm gen

này cần quá trình sửa đổi sau phiên mã ví dụ như qua quá trình phosphoryl hóa

để chuyển protein sang dạng hoạt hoá [49]. Gen DREB2A được thay đổi cấu

trúc để loại bỏ 30 amino acid tương ứng với trật tự từ 136 đến 165 để tạo ra

dạng DREB2ACA. Kết quả, sự biểu hiện của gen DREB2ACA giúp cây chuyển

gen Arabidopsis tăng cường đáng kể tính chịu hạn. Các phân tích sử dụng kỹ

thuật DNA microarray và Northern blot đã chứng minh là gen DREB2ACA điều

khiển sự biểu hiện của rất nhiều gen chức năng tham gia vào tính kháng hạn ở

thực vật [49], [56].

Ở lúa (Oryza sativa L.) gen DREB, kí hiệu là OsDREB, Dubouzet và

cộng sự (2003), đã nghiên cứu phân lập 5 họ gen DREB: OsDREB1A,

OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D và OsDREB2A. Biểu hiện của

OsDREB1A và OsDREB1B được gây ra bởi lạnh, còn biểu hiện của

OsDREB2A được gây ra bởi hạn và muối cao. Qua biểu hiện của OsDREB1A

14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trong Arabidopsis chuyển gen làm tăng khả năng chịu hạn, mặn và lạnh. Các

phân tích sử dụng kỹ thuật ADN microarray và Northern blot đã chứng minh là

OsDREB1A rất hữu ích trong việc tạo cây một lá mầm biến đổi gen có khả

năng chịu hạn hán, mặn và lạnh. Gen OsDREB1A (được đăng kí trên Ngân

hàng gen Quốc tế với mã số AF300970) có chiều dài 909 nucleotide, gồm phần

mã hóa gen có chiều dài 720 nucleotide mã hóa 240 amino acid, phần không

mã hóa đầu 5’ có chiều dài 80 nucleotide và phần không mã hóa gen đầu 3’ có

chiều dài 109 nucleotide [41].

Ở Ngô (Zea May), Quin và cộng sự (2007), đã phân lập gen

ZmDREB2A có chiều dài 1283 bp gồm phần mã hóa gen có chiều dài 954 bp

mã hóa cho 318 amino acid, phần không mã hóa gen đầu 5’ có chiều dài 400 bp

và phần không mã hóa gen đầu 3’ có chiều 204 bp [66].

Diaz-Martin và cộng sự (2008), đã phân lập gen DREB2 từ mRNA của

cây hướng dương (Helianthus annuus) và công bố trên ngân hàng gen quốc tế với

mã số AY508007 có kích thước 1301 bp, mã hóa cho 314 amino acid [39].

Javad và cộng sự (2009) đã phân lập 4 gen DREB từ mRNA đặc trưng

của bốn giống lúa mì Alvand, Bayat, Darab1 và Shahi ở Iran và đã công bố

trình tự gen trên ngân hàng gen quốc tế với mã số lần lượt là FC556845,

FC556846, FC556847, FC556850 có kích thước là 500 bp, với sự tương đồng

về trình tự gen của bốn giống này khá cao là 99%. Nghiên cứu protein suy

luận của các gen này, cho thấy, chúng có chứa vùng AP2 với ba chuỗi β –

sheet và một đường xoắn ốc, gồm 57 amino acid bảo tồn vị trí valine thứ 14

và glutamic thứ 19 [50].

Liu và Feng (2008) đã phân lâ ̣p gen DREB4 từ mRNA ở cây thuố c lá

và đã công bố trình tự gen trên ngân hàng gen quốc tế với mã số EU727158 có kích thướ c là 699 bp, mã hóa cho 232 amino acid, trong đó vùng AP2 chứa 59 amino acid [57]. Các tác giả này cũng đã phân lập gen DREB2 từ mRNA ở cây

thuốc lá và công bố trình tự gen trên ngân hàng gen quốc tế với mã số

15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

EU727156 có kích thước là 648 bp, mã hóa cho 215 amino acid, trong đó vùng

AP2 chứa 59 amino acid [57].

Liu và cộng sự (2007) đã nghiên cứu gen DREB2 ở cây hoa cúc

(Dendranthema vestitum, kí hiệu DvDREB2A). DvDREB2A được phân lập có

chứa một khung đọc mở (open reading frame - ORF) dài 1471 bp mã hóa 366

amino acid và được xếp vào phân họ DREB2 dựa trên sự liên kết nhiều trình tự.

Trong đó, trình tự protein điển hình chứa AP2/EREBP với các điểm gắn DNA

gần khu vực đầu N. Trong một phân tích, protein DvDREB2A đã bị ràng buộc

bởi yếu tố DRE (AGCCGAC) và kích hoạt sự biểu hiện của HIS3 và giải

phóng lacZ. Các thí nghiệm cho thấy mức độ biểu hiện của DvDREB2A đã bị

ảnh hưởng đáng kể bởi nhiệt độ, hạn hán, độ mặn cao. Như vậy, gen

DvDREB2A là một yếu tố mới của các yếu tố phiên mã DREB, có thể đóng một

vai trò quan trọng trong việc tăng khả năng chịu áp lực môi trường [54].

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu ở cây đậu tương về protein DREB và

thu được thành quả nhất định cho khoa học như: Liu và cộng sự (2005) đã nghiên

cứu phân lập gen DREB3 từ mRNA ở cây đậu tương với kích thước 819 bp, mã

hóa cho 272 amino acid, trong đó vùng AP2 chứa 60 amino acid và được công bố

trình tự gen trên Ngân hàng gen Quốc tế với mã số DQ055133 [55].

Chen và cộng sự (2007) đã nghiên cứu phân lập gen DREB5 từ mRNA ở

cây đậu tương với kích thước là 927 bp [36]; Cao và cộng sự (2008), phân lập

và nhận dạng GmGβ1 liên quan tới protein GmDREB5 trong đậu tương [33].

Li và cộng sự đã phân lập ba gen DREB (GmDREBa, GmDREBb và

GmDREBc) từ cây đậu tương và cho rằng mỗi phân tử protein của các gen này

chứa một miền AP2 gồm 64 amino acid [52]. Thực nghiệm đã chứng minh cả 3

protein này đều liên quan đến sự mất nước và đáp ứng sự mất nước của tế bào.

Ở nấm men, GmDREBa và GmDREBb có khả năng kích hoạt quá trình phiên

mã còn GmDREBc lại không có khả năng này. Các protein GmDREBa và

16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

GmDREBb trong lá của cây đậu tương được tổng hợp bởi tác động của muối,

hạn, mặn và lạnh.

Năm 2009, nhóm tác giả Charlson và cộng sự nghiên cứu phân lập gen

DREB1 ở đậu tương từ DNA tổng số có kích thước là 705 bp với mã số

FJ965342 trên Ngân hàng gen Quốc tế [38], [35].

Ở Việt Nam, Nguyễn Vũ Thanh Thanh và cộng sự, (2008), đã nghiên

cứu phân lập gen DREB1 ở đậu tương từ DNA tổng số có kích thước 705 bp

với mã số đăng kí trên Ngân hàng gen Quốc tế HE647689 [65].

Tsui-Hung Phang và cộng sự, (2008), đã tổng kết phân họ DREB ở đậu

tương bao gồm các gen biểu hiện không phụ thuộc vào ABA là GmDREBa,

GmDREBb, GmDREBc, GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5,

GmDREB6, GmDREB7 [69].

Như vậy nhóm gen DREB có nhiều chủng loại, kích thước khác nhau,

tham gia vào quá trình chịu hạn của thực vật. Trong đó, có nhóm DREB2 là

nhóm tham gia tích cực vào việc chống hạn. Gen DREB2 được biểu hiện trong

môi trường có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp.

Nakashima và cs đã xác định được ở cây Arabidopsis gen DREB2 có liên

quan đến sự mất nước và độ mặn cao trong biểu hiện gen. Trong cây

Arabidopsis, gen biểu hiện bởi nhân tố phiên mã DRE/CRT là DREB2A và

DREB2B. Khi phân tích thấy rằng, cả hai gen này được biểu hiện bởi sự mất

nước và độ mặn cao. Mức độ biểu hiện của hai gen rất cao ở rễ trong điều kiện

nồng độ muối cao và biểu hiện ở thân, rễ khi cây bị mất nước. Gen DREB2A

nằm trên NST số 5 và DREB2B nằm trên NST số 3 cả hai gen bị gián đoạn bởi

một intron duy nhất tại các vị trí giống hệt nhau [63].

Khi nghiên cứu về tính đa dạng di truyền trong điều kiện khô hạn của một

nhóm đậu tương hoang dã được tìm thấy dọc theo dãy núi Andes ở Nam Mĩ và

17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

khu vực Trung Mĩ, Cortes và cs (2012) cho rằng mức độ đa dạng nucleotide khi

gặp điều kiện khô hạn của DREB2A cao hơn DREB2B [34].

Xiaoshuang Li và cs ( 2014 ) đã nghiên cứu EsDREB2B trong nhóm gen

DREB2 ở 1 nhóm cây họ đậu và thấy rằng EsDREB2B mã hóa cho các

polypeptide DREB2. Sự biến đổi gen quá mức và EsDREB2B làm tăng khả

năng chịu nhiều stress phi sinh học trong cây. EsDREB2B là một gen khả năng

trong DREB2 có thể ảnh hưởng đến phản ứng sinh lý và sinh hóa của thực vật

khi gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi [78].

Chen và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB2 từ cây đậu tương và dựa

trên sự giống nhau về miền AP2, gen GmDERB2 xếp vào phân họ A5 trong gen

GmDREB2 nhóm gen DREB2. Sự biểu hiện của gen GmDREB2 trong môi

trường có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp và AB [36].

Trên Ngân hàng gen Quốc tế (NCBI) trình tự gen GmDREB2 ở cây đậu

tương đã được công bố bởi các tác giả: Chen và cs (2007), Wang và cs (2005)

Theo Chen và cộng sự (2007), nghiên cứu mối quan hệ giữa GmDREB2 và các

gen DREB khác sử dụng phần mềm SMART [75], trình tự amino acid suy diễn

của protein GmDREB2 so với sáu protein DREB của đậu tương thì có sự tương

đồng với vị trí valine thứ 14 và axit glutamic ở vị trí thứ 19 trong vùng AP2.

Trong đó, GmDREB2 có sự liên quan chặt chẽ với gen GmDREB1 (có mã số

trên Ngân hàng gen là AF514908) với 64% sự giống nhau về trình tự amino

acid. Dựa trên cấu trúc gen GmDREB2 do Chen và cộng sự công bố năm 2007,

cho thấy gen GmDREB2 phân lập từ mRNA của cây đậu tương có trình tự gồm

480 nucleotide, mã hóa cho 159 amino acid, với mã số đăng kí trên Ngân hàng

gen Quốc tế là DQ054363 [36]. Thông tin trên, là cơ sở cho việc nghiên cứu

cấu trúc gen GmDREB2 ở đậu tương

1.3. Phương pháp tạo cây trồng chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế

ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh

18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

vật nói chung (vi sinh vật, động vật)... làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng

plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ các gen

này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc

tính mới của cơ thể chuyển gen [1],[20]. Có hai nhóm phương pháp dùng để

chuyển gen vào thực vật: đó là phương pháp chuyển trực tiếp và phương pháp

chuyển gián tiếp.

Phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen được chuyển trực tiếp vào tế

bào thực vật với sự giúp đỡ của các phương tiện hóa học hay vật lí. Có thể

kể đến các phương pháp như: phương pháp chuyển gen nhờ kĩ thuật xung

điện; phương pháp chuyển gen bằng vi tiêm; phương pháp chuyển gen trực

tiếp qua ống phấn; nhờ súng bắn gen ...

Phương pháp bắn gen là phương pháp sử dụng các hạt kim loại nặng được

bao bọc bởi DNA và chuyển vào mô tế bào nhờ súng bắn gen. Ưu điểm của

phương pháp này là thao tác dễ dàng, biến nạp gen vào được nhiều tế bào,

nguyên liệu đa dạng, hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào của các mô biệt hóa và

mô phân sinh. Phôi soma được sử dụng như vật liệu đích đối với kỹ thuật

chuyển gen nhờ vi khuẩn A.tumefacines cũng là vật liệu sử dụng tốt cho kỹ

thuật chuyển gen bằng súng bắn [61],[70]. Ở cây đậu tương, sử dụng súng bắn

gen để biến nạp gen vào phôi sau khi phôi được tạo thành 7 tuần [51].

Chuyển gen bằng xung điện là phương pháp sử dụng xung điện trong thời

gian ngắn để tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần làm cho DNA có thể xâm nhập

vào bên trong tế bào. Ưu điểm phương pháp này có thể thực hiện với các mô in

vivo còn nguyên vẹn. Đoạn DNA ngoại lai được biến nạp có kích thước lớn [21].

Với kỹ thuật chuyển gen qua ống phấn, DNA ngoại lai theo đường ống

phấn chui vào bầu nhụy. Thời gian chuyển gen là lúc hạt phấn mọc qua vòi

nhụy và đưa tinh vào thụ tinh. Thời điểm chuyển gen tốt nhất xảy ra khi quá

trình thụ tinh ở noãn và cho tế bào hợp tử phân chia. Như vậy sự chuyển gen

chỉ xẩy ra ở một tế bào cái duy nhất [21].

19 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Ngoài các phương pháp chuyển gen trực tiếp ở thực vật còn có phương

pháp chuyển gen gián tiếp thông qua virus hoặc vi khuẩn. Những vi khuẩn thực

hiện quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật thông qua các cơ chế rất tự nhiên.

Quy trình chuyển gen gián tiếp ở thực vật bao gồm những bước chính sau: (1)

Xác định thông tin về gen liên quan đến đặc tính quan tâm; (2) Phân lập gen;

(3) Thiết kế vector chuyển gen; (4) Tạo vi khuẩn mang cấu trúc gen chuyển; (5)

Biến nạp cấu trúc gen chuyển vào mô hoặc tế bào thực vật; (6) Chọn lọc các thẻ

biến nạp; (7) Tái sinh cây biến nạp; (8) Phân tích cây chuyển gen [60].

Một trong những phương pháp chuyển gen gián tiếp ở thực vật được sử

dụng, nghiên cứu và ứng dụng khá phổ biến là phương pháp chuyển gen thông

qua loài vi khuẩn đất A.tumefacines.

Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium được nghiên cứu từ những năm

1960- 1970. Việc phát kiến ra Agrobacterium có khả năng chuyển gen vào thực

vật vào đầu năm 1980 đã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan

trọng nhất của công nghệ sinh học thực vật với những ưu điểm nổi trội: số bản

sao của gen biến nạp được chuyển vào tế bào thực vật thấp (khoảng 1-2 gen)

trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn, do vậy, giảm tối thiểu sự không

biểu hiện của gen được chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả

chuyển gen cao, tránh được sự hình thành của các cây chuyển gen khảm, kỹ

thuật đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền...[21].

Agrobacterium là một vi khuẩn đất gram (-) gây bệnh khối u ở thực vật và

có khả năng lây nhiễm một cách tự nhiên từ loài thực vật này sang loài thực vật

khác [7]. Trong tự nhiên, ở vùng cổ rễ các loài thực vật hai lá mầm thường gặp

một số loại khối u gồm các tế bào không phân hóa và phát triển có tổ chức.

Những tế bào trong tế bào khối u này mất khả năng phân cực và phân chia liên

tục giống như tế bào ung thư ác tính ở động vật. Theo cơ chế hình thành, người

ta phân biệt hai loại khối u chính: khối u di truyền và khối u cảm ứng

20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Loại khối u cảm ứng được biết đến nhiều nhất là mụn cây do vi khuẩn

A.tumefaciens gây nên [21]. A.tumefacines là chi vi khuẩn gram (-) bao gồm

các loài gây bệnh kí sinh và vi sinh vật sống trong đất. A.tumefacines là loại vi

khuẩn đất có khả năng chèn gen của mình vào tế bào thực vật chủ và sau đó sử

dụng bộ máy của sinh vật chủ để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất

dinh dưỡng cho chúng. A.tumefacines sẽ tạo ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn

cây - crown gall diease)

Cơ chế hình thành loại khối u cảm ứng này được nghiên cứu từ nhiều năm

nay và mang lại nhiều thành tựu quan trọng trong chuyển gen thực vật. A.

tumefaciens được sử dụng như một hệ thống trung gian hữu hiệu để chuyển gen

vào nhiều loài nấm, chẳng hạn như A. awamori, A. fumigatus, Penecillium

digitatums [59].

Đến nay người ta đã khám phá được bản chất phân tử của quá trình cảm

ứng phát sinh khối u do vi khuẩn A. tumefaciens gây ra ở thực vật. Trước hết là

quá trình nhiễm khuẩn ở vùng tế bào của cây bị thương. Các tế bào bị thương

tiết ra những hợp chất polyphenol thu hút các tế bào vi khuẩn A. tumefaciens.

Tuy nhiên, vi khuẩn không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển gen

vào chúng một đoạn DNA nhỏ (T – DNA: tranferred DNA) nằm trên một loại

plasmid đặc biệt và gây nên trình trạng phát sinh khối u. Plasmid đặc biệt là Ti

plasmid (tumor inducing). T – DNA sẽ tạo ra khối u thực vật và sự phát triển

của khối u sau đó sẽ không phụ thuộc vào sự có mặt của vi khuẩn A.

tumefaciens [21].

Ti- plasmid là một phân tử DNA vòng tương đối lớn, kích thước khoảng

150 kb – 200 kb (Hình 1.2). Tuy nhiên chỉ một đoạn 2 kb – 3 kb có khả năng

thâm nhập vào genome của tế bào chủ. Đó là đoạn T–DNA [58]. T–DNA được

xác định bởi trình tự ở hai đầu khoảng 25 bp gọi là vùng biên (T – DNA

borders), phần còn lại ngoài vùng biên sẽ không có chức năng gì trong quá

trình chuyển gen [20].

21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.2 Cấu trúc Ti - Plasmid (Nguồn : http://www.biotech.ubc)

Trên T – DNA có các gen tạo khối u. Gen tạo khối u sau khi gắn vào hệ

gen của tế bào chủ sẽ tham gia quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin. Đây

là các hợp chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục và dẫn đến hình thành các

khối u [43]. Nhờ đặc điểm này, người ta có thể loại bỏ khả năng gây hại của T

– DNA bằng cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong 2 đầu vùng

biên bằng các gen mong muốn. Khi các gen tạo khối u bị loại bỏ, tế bào hoặc

mô thực vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường. Gen tổng hợp opine cần thiết

để tổng hợp opine. Hợp chất này không được tổng hợp trong A. tumefaciens mà

chỉ được tổng hợp trong tế bào chủ vì gen điều khiển sự biểu hiện của gen sinh

tổng hợp opine chỉ hoạt động trong tế bào nhân chuẩn. Bằng cách này, vi khuẩn

cảm ứng tế bào chủ tạo ra năng lượng và nguồn nitơ cần thiết cho chúng [1].

Ngoài ra, Ti plasmid còn gồm 2 hệ gen: hệ gen gây độc vir và hệ gen sinh

tổng hợp opine. Vùng gen độc vir nằm trên Ti plasmid gồm nhiều gen độc khác

22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nhau cùng tham gia quá trình vận chuyển T – DNA [20]. Khi xâm nhiễm vào tế

bào vật chủ, các gen gây độc vir được biểu hiện, chuyển T – DNA sang tế bào

chủ và khối u được tạo thành do sự hình thành auxin và cytokinin. Đây là các

chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục [21], dẫn đến thay đổi sự cân bằng

hormon thực và hình thành các khối u. Tỷ lệ auxin so với cytokin tạo ra từ các

gen vir sẽ quyết định hình thái khối u. Bên cạnh những gen chức năng, Ti

plasmid gồm gen sinh tổng hợp amino acid hiếm, ví dụ: Một loại u tạo octopine

và loại khác tạo nopanine, vì vậy người ta phân biệt 2 loại Ti plasmid là loại

nopalin và loại octopine. Trình tự nucleotid của chúng chỉ khác nhau ở trình tự

gen mã hóa các enzyme tham gia sinh tổng hợp nopalin và octopin [21]

Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn A. tumefaciens

A. tumefaciens chủ yếu lây nhiễm thực vật qua các vết thương. Thực vật bị

thương sẽ sản sinh ra hợp chất amino acid, trong đó đường và axit vô cơ là

những yếu tố thu hút vi khuẩn xâm nhiễm bằng cách hóa hướng động.

Hình 1.3. Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens [47]

23 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Theo mô hình 1.3, quá trình chuyển gen nhờ A.tumefaciens gồm 10 bước:

Bước thứ nhất, Agrobacterium nhận dạng và tấn công tế bào chủ, sau đó tổ

hợp tín hiệu VirA/VirG của Agrobacterium cảm nhận những tín hiệu thực vật

đặc trưng. Bước thứ ba, sự hoạt hoá của vùng gen vir. Bước thứ tư, T- ADN

được tách ra khỏi Ti-plasmit nhờ phức hợp protein VirD1/D2. Sự tạo thành

phức hợp VirD2- ADN (phức hợp-T chưa thành thục), cùng với một vài protein

Vir khác, đi vào nguyên sinh chất tế bào chủ (bước thứ năm). Bước thứ sáu, sự

kết hợp của VirE2 với sợi-T tạo thành phức hợp-T thành thục đi xuyên qua

nguyên sinh chất tế bào chủ. Bước thứ bảy, phức hợp-T thành thục chủ động đi

vào nhân tế bào chủ. Bước thứ tám, T- ADN bị hấp dẫn tới vị trí hợp nhất.

Bước thứ chín, T- ADN tách khỏi các protein bảo vệ. Và cuối cùng, T- ADN

hợp nhất vào hệ gen của thực vật.

Trong tế bào chủ, T – DNA sẽ hoạt động cùng gen nhân và mã hóa ra

hormon và opine. Hormon kích thích sự phát triển của tế bào chủ, opine là

nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên, cho đến nay người

ta vẫn chưa biết được đầy đủ cơ chế chính xác của quá trình này. Trong tế bào

vật chủ, đầu cùng C của virE2 hướng tới DNA trong nhân và sẽ hòa nhập vào

hệ gen của tế bào chủ. Nếu không có trình tự tương đồng giữa trình tự gen của

tế bào chủ và T – DNA được chuyển, T – DNA sẽ hòa nhập một cách ngẫu

nhiên vào hệ gen của tế bào chủ. Tuy nhiên, nếu những đoạn gen mà có độ

tương đồng cao với hệ gen của tế bào chủ, chúng sẽ tái tổ hợp tương đồng. Tần

suất tái tổ hợp tương đồng khác nhau khi chuyển những đoạn gen có kích thước

khác nhau, nhưng hiệu quả chuyển gen sẽ tăng khi giảm tỷ lệ các đoạn tương

đồng [20].

Hiện nay người ta đã thành công trong việc cải biến Ti plasmid bằng cách

cắt bỏ hầu hết các đoạn gen gây phát triển khối u, chỉ để lại đoạn gen vir và

phần T – DNA tối thiểu mang điểm ghép gen. Loại vector này đang được sử

dụng rất hiệu quả trong việc đưa DNA lạ vào tế bào chủ [60].

24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Để chuyển được các gen mong muốn vào thực vật thông qua

A.tumefaciens trước hết cần phải thay đổi cấu trúc của Ti – plasmid. Do Ti –

plasmid có kích thước lớn, chứa các gen gây khối u và có nhiều vị trí cắt của

enzym giới hạn nên không thể dùng trực tiếp trong các thí nghiệm chuyển gen.

Để giải quyết vấn đề này người ta tiến hành thiết kế các hệ thống vector dùng

cho biến nạp. Trong quá trình này các vùng gen gây ra khối u ở thực vật sẽ

được cắt bỏ, thay thế vào đó là các gen quan tâm có gắn thêm gen chỉ thị cho

chọn lọc.

Những thành tựu trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen thông qua

A.tumefacines

Công nghệ sinh học phát triển đã tạo điều kiện để các nhà khoa học tiếp

tục ngiên cứu chọn tạo giống cây trồng bằng cách chuyển gen mã hóa các đặc

tính mong muốn vào cây trồng.

Năm 1980, những thí nghiệm chuyển gen đầu tiên nhờ vi khuẩn

A.tumefacines vào cây trồng được thực hiện. Năm 1986, các thử nghiệm đầu

tiên trồng cây biến đổi gen trên đồng ruộng ở một số quốc gia. Năm 2006 được

ghi nhận là năm đầu tiên của thập niên thứ hai của việc thương mại hóa cây

trồng chuyển gen 2006 - 2015.

Tại Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu tạo cây chuyển gen thành công như

Nguyễn Thị Thúy Hường và cs chuyển gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn

vào cây đậu tương[8], Nguyễn Thu Hiền và cs chuyển gen mã hóa protein bề

mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật[6] ,

Lò Thanh Sơn nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự

phát triển bộ rễ của cây đậu tương[18].

25 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vâ ̣t liê ̣u hoá chấ t và thiết bi ̣

2.1.1. Vật liệu

Hạt thuốc lá K326 là giống thuốc lá nhập nội do Viện di truyền nông

nghiệp cung cấp

Chủng vi khuẩn A. tumefaciens CV58C1 mang cấu trúc pBI121-

GmDREB2 do Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, khoa Sinh học, trường

ĐH Sư phạm- ĐHTN cung cấp.

2.1.2. Hóa chất

Hóa chất được sử du ̣ng cho chuyển gen bao gồ m: Bacto tripton, yeast

extract, NaCl, agarose, sucrose, glucose, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH,

MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2, ethanol, marker DNA 1kb. Các loại kháng

sinh kanamycin, rifamicine, cefotaxime và các hóa chất thông dụng khác (X-

gal, agarose,...). Các hóa chất chuyển gen được mua ở các hãng có uy tín trên

thế giới như hãng Bioneer, Fermentas, Invitrogen...Hóa chất thông dụng mua

tại các địa chỉ tin cậy.

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: box cấy vô trùng,

bình nuôi cấy, nồi khử trùng, bể ổn nhiệt, máy nuôi lắc, máy đo pH. Một số

thiết bị dùng trong phân tích sinh học phân tử như: Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy chụp

ảnh, máy soi gel, máy ly tâm, cùng với mô ̣t số trang thiết bị khác.

2.1.4. Đi ̣a điểm nghiên cứ u

Các thí nghiệm chuyển gen ở cây thuốc lá thông qua A. tumefaciens được

tiến hành trên trang thiết bị Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào, Khoa Sinh

học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên.

26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Thí nghiệm phân tích cây thuốc lá chuyển gen được tiến hành tại Phò ng

thí nghiệm trong điểm công nghê ̣ gen, Viê ̣n Công nghệ Sinh ho ̣c.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá Nicotania tabacum K326 thông

qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58C1 được tiến hành theo phương

pháp của Topping (1998) [72] có cải tiến, bao gồm các bước: (i) Tạo nguyên

liệu chuyển gen (ii) Tạo dịch huyền phù vi khuẩn (iii) Biến nạp (iv) tái sinh (v)

tạo rễ (vi) ra cây.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các thí

nghiệm của phần nuôi cây mô cây thuố c lá đươ ̣c thực hiện trong phòng nuôi cây với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 25oC ± 2, cường độ chiếu sáng 2000 lux.

2.2.1. Phương pháp tạo nguyên liệu biến nạp

Hạt thuốc lá được cho vào bình pyrex (dung tích 100ml). Bình pyrex

mở hé 1/3 nắp lọ đặt bên cạnh cốc thủy tinh chứa dung dịch Clo. Bổ sung

vào cốc đựng Javen 3ml HCl, hỗn hợp này sẽ tạo ra khí Clo có tác dụng khử

trùng hạt thuốc lá. Đậy kín bình khử trùng và dán parafin.

Sau 4 giờ lấy hạt đã khử trùng rồi tiến hành gieo hạt trên môi trường

MS cơ bản (MS0) gồm: MS1 (20ml/l) + MS 2 (20ml/l) + MS 3 (5ml/l) + MS 4

(5ml/l) + MS5 (5ml/l), có bổ sung aga (10g/l) + sucrose (30g/l).

Lá bánh tẻ ở các cây con khỏe mạnh có 3-4 lá thật được dùng để chuyển

gen. Sử dụng dao cắt bốn cạnh mép lá để gây tổn thương tạo thành mảnh nhỏ, có hình vuông 1cm2 (cắt bỏ đường gân giữa của lá). Lá bị tổn thương được đặt

úp cảm ứng trên môi trường 150ml (MS0 + aga 10g/l + sucrose 30g/l + 1BAP)

trong 2 ngày [26], [27].

2.2.2. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens

Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào

20ml LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn lọc (rifamycine 0,025g/l,

kanamycine 0,05g/l) với chủng A. tumefaciens CV58C1 mang cấu trúc

27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

pBI1221/GmDREB2. Nuôi trong tủ lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 16 giờ. Sau 16 giờ nuôi phục hồi khuẩn trong môi trường không kháng sinh, bổ sung thêm 20ml. LB lỏng đem nuôi lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 2 - 3giờ.

Lấy khoảng 1,5 – 2,0 ml dịch khuẩn và môi trường LB lỏng dùng để nuôi

khuẩn như trên đo OD nếu OD600nm đạt 0.6 - 0.8, đủ điều kiện để biến nạp vào

mảnh lá thuốc lá.

Ly tâm 5.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, bỏ dịch nổi, thu sinh khối

lắng rồi hoà thành dịch huyền phù tế bào trong 40ml (1/2MS0 + 80µl AS).

2.2.3. Biến nạp

Sau 48 giờ cảm ứng, các mẫu lá đươ ̣c ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có

nồng độ OD600nm đạt 0,6 – 0,8 có lắc nhẹ trong thời gian 30 phút. Sau đó, mẫu

được đặt ngửa lên môi trường đồng nuôi cấy GM có bổ sung 200µl AS (thành

phần GM gồm MS0 + aga 10g/l + sucrose 30g/l +BAP 1mg/l). Quá trình đồng

nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 250C trong thời gian là 48 giờ.

2.2.4. Tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh

Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen

Sau thời gian đồng nuôi cấy, ngâm và lắc các mảnh lá biến nạp trong

dung dịch 1/2MS0 có bổ sung cefotaxime (0,4g/l) trong 10 đến 20 phút. Thấm

khô 2 mặt các mảnh lá, chuyển sang môi trường GM có bổ sung kháng sinh

chọn lọc kanamycine 0,05g/l, cefortaxime 0,4g/l để tái sinh.

Theo dõi tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi, số chồi trung bình/cụm sau thời gian 4-

5 tuần để đánh giá khả năng tạo đa chồi của giống thuốc lá. Các cụm chồi

được cắt chuyển sang môi trường kéo dài chồi MS0 có bổ sung: aga 10g/l,

sucrose 30g/l, kanamycine 0,05g/l và cefotaxime 0,4g/l.

Tạo rễ và cây hoàn chỉnh

Khi các chồi đạt chiều cao từ 2-3cm, chọn những cụm phân hóa mạnh sau đó

tách những chồi độc lập cấy chuyển sang môi trường ra rễ RM (MS0 + aga

28 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

10g/l + sucrose 30g/l + IBA 1mg/l + kanamycine 0,05g/l + cefotaxime

0,4mg/l).

Khi cây in vitro có 3-4 lá, có bộ rễ đảm bảo (thường sau 2 tuần nuôi cấy)

sẽ thực hiện việc ra cây. Cây được lấy ra khỏi bình nuôi cấy một cách nhẹ

nhàng, rửa sạch phần agar bám quanh gốc và rễ, sau đó cây được trồng trên bầu

trấu và cát có tỷ lệ 1 : 1.

Cây con 4 - 5 lá thật được đưa ra trồng trên chậu đất có bổ sung phân

bón và trồng trong điều kiện nhà lưới.

2.2.3. Phân tích sự có mặt của cấu trúc mang gen GmDREB2 bằng

phương pháp PCR

Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số từ các mẫu lá non được tách chiết theo phương pháp của

Saghai và cộng sự (1984) với thành phần đệm chiết ở bảng 2.2.

Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm chiết DNA tổng số

STT Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng

Tris-HCl 1M, pH 8 100 mM 1

NaCl 5M 1,4M 2

EDTA 0,5M, PH 8 50 mM 3

CTAB 2% (w/v) 4

Nước khử ion 5

Các bước tiến hành:

(1) Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bột đã nghiền cho vào ống

Eppendorf 1,5 ml. Thêm 700µl dung dịch đệm tách, đảo đều và ủ ở 65oC trong

90 phút.

29 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

(2) Bổ sung 700µl hỗn hợp chloroform : isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) vào mỗi

ống, đảo đều sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút.

(3) Hút 500 µl dịch nổi pha trên sang ống eppendorf khác, bổ sung 500 µl

isopropanol lạnh. Để mẫu trong tủ -20oC trong 30 phút.

(4) Ly tâm thu 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút để thu tủa DNA, sau đó

rửa tủa bằng cồn 70oC.

(5) Loại bỏ cồn, làm khô tủa ở điều kiện nhiệt độ phòng và hòa tan DNA trong

nước khử ion vô trùng và bảo quản ở -20oC.

Khuếch đại đoạn gen GmDREB2

DNA tổng số tách chiết từ lá thuốc lá được sử dụng làm khuôn cho phản

ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhằm xác định sử có mặt của gen chuyển trong

các dòng thuốc lá. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,0%.

Khuếch đại đoạn gen GmDREB2 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc

hiệu GmDREB2 soyF và GmDREB2 soyR được tổng hợp bởi hãng Bioneer có

trình tự nucleotide thể hiê ̣n ở bảng 2.3.

Bả ng 2.2. Trình tự nucleotide củ a cặp mồi PCR khuế ch đa ̣i đoa ̣n gen GmDREB2

Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide

GmDREB2 5’- ATGGAAGAAGCGGGTTTAG-3’

soyF

GmDREB2 5’- CTAATCTTCAGGTTTGGGATAC-3’

soyR

Thành phần phản ứng PCR nhân bản đoa ̣n gen GmDREB2 được trình

bày ở bảng 2.4.

30 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen GmDREB2

STT Thành phần Thể tích (xl) (µl)

1 12,5 Nước khử ion

2 7,5 Master Mix

3 2 DREB2 soyF

4 2 DREB2 soyR

5 1 cDNA

Tổng Tổng thể tích 25µl

Bảng 2.4: Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân gen GmDREB2

Nhiệt độ Bước Phản ứng Thời gian Chu kỳ

1 (0C) 95 Biến tính 4 phút 1

2 95 Biến tính 30 giây

30 3 57 Gắn mồi 30 giây

4 72 Kéo dài chuỗi 45 giây

5 72 Hoàn tất kéo dài 7 phút 1

Kết thúc phản 6 4 ∞

ứng

31 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Trong nghiên cứ u này chú ng tôi tiến hành nuôi cấy in vitro cây thuố c lá để ta ̣o nguyên liê ̣u cho chuyển gen. Khi ta ̣o đủ nguyên liê ̣u, các mảnh lá thuố c lá đươ ̣c sử du ̣ng để biến na ̣p cấu trú c GmDREB2 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và tái sinh ta ̣o cây chuyển gen. Phân tích các dò ng cây chuyển gen bằng kỹ thuâ ̣t sinh ho ̣c phân tử .

3.1. Kết quả tạo nguyên liệu biến nạp

Hạt thuốc lá sau khi khử trùng được gieo trên môi trường MS cơ bản, sau 4 ngày hạt bắt đầu nảy mầm. Theo Banerjee và cộng sự [31], mảnh lá bánh tẻ là nguyên liệu thích hợp để chuyển gen vào cây thuốc lá. Để tạo nguồn nguyên liệu, hạt thuốc lá giống K326 được khử trùng bằng khí Clo trước khi gieo lên môi trường MS để nảy mầm trong điều kiện vô trùng. Theo Phạm Thị Vân và cs [25], [26] có thể sử dụng dung dịch javel thương phẩm nồng độ 30% để loại nấm mốc và vi khuẩn trên hạt thuốc lá. Phương pháp này đạt hiệu quả khử trùng 100% cho tỉ lệ nảy mầm cao trên 90%. Tuy nhiên, đối với hạt có có kích thước nhỏ như hạt thuốc lá, việc lắc rửa nhiều lần làm mất nhiều thời gian và giảm đi một số lượng đáng kể hạt. Trong thí nghiệm này, hạt thuốc lá K326 được khử trùng bằng khí Clo theo phương pháp của Topping (1998) [74] nguồn khí Clo tạo ra từ phản ứng giữa dung dịch HCl và javel sẽ khử trùng bề mặt các hạt thuốc lá.

A B

C D E Hình 3.1. Tạo nguyên liệu biến nạp

32 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Cây thuốc lá K326 sau 4 tuần trên môi trường MS (hình 3.1A, 3.1B)

Lá thuốc lá có kích thước 4-6cm (hình 3.1 C)

Mảnh lá thuốc lá có kích thước 1cm2 (hình 3.1D)

Mảnh lá trên môi trường GM (hình 3.1E)

Các cây con sau khoảng 4 tuần trên môi trường MS có kích thước lá từ 4-6

cm là nguồn nguyên liệu tốt nhất để tái sinh và chuyển gen ở cây thuốc lá.

Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá K326 đã được Phạm Thị Vân và

cs thiết lập [25], [26]. Theo quy trình này, các mảnh lá bánh tẻ được cắt thành những mảnh có kích thước 1cm2 và đặt lên môi trường cảm ứng GM (MS0,

BAP 1mg/l, sucrose 30g/l, 10g/l agar, pH5,8) 2 ngày trước khi biến nạp

3.2. Kết quả chuyển vector pBI121-GmDREB2 vào thuố c lá

Plasmid pBI121 là một dạng Ti-plasmid trong Agrobacterium

tumefacines đã được cải tiến bằng cách loại bỏ gen gây độc và gắn vào gen

kháng kháng sinh để chọn lọc phù hợp với việc chuyển gen vào tế bào thực vật.

pBI121 có kích thước 13,0 kb.

Vector chuyển gen thực vâ ̣t pBI121-GmDREB2 do Bộ môn Di truyền và

Sinh học hiện đại, khoa Sinh học cung cấp (Hình 3.2).

Hình 3.2. Vùng T-DNA của vector pBI121 - GmDREB2

Theo sơ đồ hình 3.2, các vị trí trên T-DNA gồm có:

HindIII, NcoI, NotI là các enzym cắt giới hạn trong đó HindIII và

NcoI là những enzym có chuỗi xác nhận gồm 6bp; NotI có chuỗi xác nhận

8bp. Những enzyme này nhận biết các trình tự DNA đặc hiệu, tuy nhiên vị

trí cắt thường cách xa vị trí nhận biết, có khi đến cả trăm base. Các enzym này cần Mg2+ và ATP để hoạt động. Hoạt động của những enzyme này bắt

đầu bằng việc kiểm tra tình trạng methyl hóa của 2 adenine trong vùng

nhận biết. Nếu cả hai adenine đều không được methyl hóa (dấu hiện cho

33 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thấy đây là DNA ngoại lai), phức hợp enzyme thay đổi cấu hình và thực

hiện hoạt tính phân giải. Ngược lại, nếu có một trong hai adenine được

methyl hóa, chứng tỏ là DNA của tế bào, enzyme khi đó sẽ thực hiện chức

năng của một enzyme methyl hóa cho gốc adenine còn lại để duy trì sự ổn định cho DNA bộ gene.

P35S của vector pBI121 - GmDREB2 là promoter của virus gây bệnh khảm

trên cây hướng dương. Gen lạ được chuyển nạp vào cây chỉ có thể được thể hiện khi

có một trình tự promoter thích hợp kèm theo nó. Việc chọn lọc promoter như vậy

phải tuân theo trình tự: ở đâu, khi nào, bao nhiêu, và trong điều kiện để gen thể hiện

như thế nào. Theo đó, việc lựa chọn P35S vì đây là promoter cực mạnh, gen chuyển

được biểu hiện trong mọi điều kiện khi gắn với promoter P35S.

GmDREB2 của vector pBI121 - GmDREB2 là đoạn gen được phân lập từ

cây đậu tương.

C-myc là chuỗi peptide có khối lượng là khoảng 1.202 Daltons và có 10

amino acid. C-myc được thiết kế vào vector pBI121 - GmDREB2 nhằm phát hiện

kháng nguyên (là protein cần tìm) cho phản ứng lai Western blot phục vụ cho việc

phân tích biểu hiện của gen được chuyển ở các thế hệ phân tích sau này.

NOS của vector pBI121 - GmDREB2 là tín hiệu kết thúc quá trình phiên mã.

3.2.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch A. tumefaciens và cảm ứng tạo cu ̣m chồi

Các mảnh lá có kích thước 1cm2 được cắt ra từ cây in vitro sau 2 ngày đặt

trên môi trường cảm ứng GM được ngâm vào dịch huyền phù vi khuẩn (OD600=

0,6 - 0,8 tốt nhất là 0,7) có lắc nhẹ 30 phút. Việc lắc nhẹ mảnh lá trong dịch

huyền phù vi khuẩn làm tăng thể tích tiếp xúc giữa vết thương thực vật và dịch

khuẩn. Đây là một trong những biện pháp có thể tăng khả năng xâm nhập của

vi khuẩn vào trong tế bào thực vật dẫn tới tăng hiệu quả chuyển gen.

Sau 30 phút nhiễm khuẩn, các mảnh lá được thấm khô và đặt vào đĩa petri

chứa môi trường GM có bổ sung AS để trong tối 2 ngày. Sau quá trình đồng

nuôi cấy, các mảnh lá được chuyển sang môi trường GM có bổ sung kháng

sinh. Do vector pBI121/GmDREB2 có mang đoạn gen kháng kanamycine, nên

34 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

các môi trường sau biến nạp đều được bổ sung kanamycine 50mg/l để chọn lọc

các cụm chồi chuyển gen. Trong nghiên cứu này, những kết quả về cụm

chồi/cây đề cập đến là những cụm chồi/cây sống sót trên môi trường có chứa

kanamycine. Quá trình chọn lọc còn bổ sung vào môi trường cefotacime, nồng

độ 400mg/l nhằm loại vi khuẩn còn sót lại trên các mảnh lá.

Theo dõi số mảnh lá có cảm ứng tạo đa chồi được chúng tôi tiến hành với

các lô thí nghiệm và đối chứng. Trong đó, lô thí nghiệm là các mảnh lá được

chuyển gen GmDREB2 nuôi trên môi trường có kháng sinh. Đối chứng gồm hai

lô, lô đối chứng thứ nhất kí hiệu là ĐC0 gồm những mảnh lá không được chuyển gen và cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh. Lô đối

chứng thứ hai kí hiệu là ĐC1 là những mảnh lá không được chuyển gen và cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh.

Các mảnh lá sau hai ngày đồng nuôi cấy trong tối được rửa khuẩn bằng môi

trường 1/2MS0 có bổ sung kháng sinh cefotaxime 0,4g/l. Trong quá trình rửa

khuẩn tiến hành lắc nhẹ khoảng 20 phút. Sau đó thấm khô và chuyển sang môi

trường GM có bổ sung cefotaxime 0,4g/l, kanamycine 0,05mg/l (Hình 3.3).

A B

C D

Hình 3.3. Hình ảnh nhiễm khuẩn mẫu và đồng nuôi cấy

35 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Các mảnh lá được ngâm trong dung dịch huyền phù vi khuẩn (A); ,mảnh lá

trên môi trường đồng nuôi cấy (B); mảnh lá trên môi trường chọn lọc (C,D)

Quá trình biến nạp được thực hiện với 40 mảnh lá/lần biến nạp, lặp lại thí

nghiệm 3 lần. Ở các lô đố i chứ ng ĐC0 và ĐC1, mỗi lô chỉ tiến hành nuôi cấy

40 mảnh lá. Sau 10 ngày tại vết cắt của mảnh lá xuất hiện những cụm chồi

cứng có màu xanh lá. Theo những nghiên cứu trước về tái sinh cây thuốc lá,

đây là tiền đề cho việc tái sinh chồi. BAP là chất điều hòa sinh trưởng thuộc

nhóm cytokinin, có tác dụng kích thích tạo và phát triển chồi. Kết quả theo dõi

tỷ lệ mẫu cảm ứng ta ̣o chồi được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.4.

Bảng 3.1. Kết quả cảm ứng tạo đa chồi từ mảnh lá

Lô nghiên cứu Số mảnh Số mảnh lá có cảm

lá ứng ta ̣o đa chồi

Thí nghiệm 120 89

ĐC0 40 0

ĐC1 40 35

(Số liệu thống kê sau 4 tuần cảm ứng)

Theo bảng 3.1, ở lô thí nghiệm với 120 mảnh lá được biến nạp thu được

89 mảnh lá có cảm ứng tạo đa chồi, đạt tỷ lệ 74,2%. Kết quả thu được này so

với các công bố cùng trên giống thuốc lá K326 của Lò Thanh Sơn (93,3%)

[18], Nguyễn Thị Thu Ngà (98%) [16] thì tỉ lệ tạo đa chồi ở trên là thấp hơn.

Điều này có thể do nguồn gốc của các hóa chất dùng trong pha chế môi trường

không cùng nguồn gốc. Các mô tái sinh đa chồi trên môi trường GM có bổ

sung kháng sinh ở trên rất có thể vì trong genom của chúng có chứa gen kháng

kanamycine. Do vậy có thể tạm kết luận, các mẫu tái sinh là mẫu đã biến nạp

thành công. Tuy nhiên để chứng minh sự có mặt của gen chuyển đặc biệt là

những biểu hiện của chúng cần có những nghiên cứu sâu hơn.

36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Song song với lô thí nghiệm chuyển gen, lô đối chứng ĐC0 được thiết lập

bằng cách đặt các mảnh lá thuốc lá K326 trực tiếp lên môi trường GM có bổ

sung kháng sinh diệt khuẩn và kháng sinh chọn lọc. Toàn bộ số mảnh lá của

ĐC0 đều ngả màu vàng và chết dần. Kết quả này là do các mảnh lá không được

biến nạp nên không chứa gen kháng kanamycine, vì vậy chúng không có khả

năng tái sinh trên môi trường chọn lọc. Ở lô đối chứng ĐC1, trong số 40 mảnh

lá đặt lên môi trường cảm ứng không bổ sung kháng sinh có 35 mảnh lá tạo đa

chồi, đạt tỷ lệ khoảng 87,5%.

Sau 4-5 tuần nuôi cấy các cụm chồi lớn thu được từ lô thí nghiệm (hình 3.5A), đem tách nhỏ và lựa chọn được các cụm có số lượng chồi phát triển

đồng đều cấy lên môi trường MS bổ sung cefotaxime 0,4g/l, kanamycine

0,05g/l để nhân nhanh chồi (hình 3.5B). Các cụm chồi ở lô ĐC1 cũng được

tách ra và cấy lên môi trường MS không bổ sung kháng sinh.

Kết quả nghiên cứu sự kéo dài chồ i của các lô nghiên cứu đươ ̣c trình bày ở

hình 3.4.

A B

Hình 3.4. Hình ả nh mẫu được cảm ứng và tách cụm kéo dài chồi

Phá t sinh cụm chồ i (A), cụm chồi được kéo dài trên môi trường chọn lọc (B),

3.2.2. Tạo rễ và chuyển cây ra môi trường tự nhiên

Tạo rễ là khâu cuối cùng trong nuôi cấy in vitro và có ý nghĩa quan trọng

đối với kỹ thuật chuyển gen ở thực vật. Những nghiên cứu về tái sinh và

chuyển gen trên cây thuốc lá ghi nhận IBA, NAA và IAA là những hormone

37 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

sinh trưởng được lựa chọn trong nghiên cứu tạo rễ. Nồng độ các chất điều

khiển sinh trưởng dao động trong khoảng 0,1 mg/l. Sau 4 tuần kéo dài, các chồi

có chiều cao 2cm được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ

trong thí nghiệm này chứa IBA 0,1 mg/l. Sau 4-5 tuần, quan sát thấy rễ xuất

hiện ở hầu hết các chồi (Hình 3.5 và Bảng 3.2). Các chồi đều phát triển xanh tốt

và tạo nhiều lá mới. Quan sát thấy các chồi không chuyển gen trên môi trường

đối chứng cũng có quá trình tạo rễ tương tự.

Hình 3.5. Hình ảnh tạo rễ trên môi trường kháng sinh chọn lọc

Bả ng 3.2. Kết quả tạo rễ và tái sinh cây thuốc lá ở thí nghiệm và đối chứng

Số chồi tạo Số chồi Số cây ra Số cây trồng Lô nghiên cứu thành ra rễ giá thể tại nhà lưới

25 Thí nghiệm 116 87 60

- ĐC0 - -

15 ĐC1 100 80 40

Bảng 3.2 cho thấy ở lô thí nghiê ̣m thu đươ ̣c 116 chồi và có 87 cây ra rễ; chọn ra 60 cây khỏe mạnh, có bộ rễ phát triển tốt trồng trên giá thể cát trấu. Sau

đó, trong số cây này chọn những cây phát triển tốt, cơ thể khỏe mạnh đem

trồ ng ta ̣i nhà lướ i 25 cây. Ở lô đố i chứng, thu được 100 chồi, có 80 chồi ra rễ,

lựa chọn cho ra bầu 40 cây và chọn 15 cây đem trồ ng trong nhà lưới.

38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Ra cây là bước chuyển cây từ giai đoạn có điều kiện sống tối ưu trong

phòng thí nghiệm sang giai đoạn cây tự tổng hợp các chất từ điều kiện tự nhiên

phục vụ cho các hoạt động sống của mình. Bước chuyển cây ra giá thể được coi

như bước trung gian để cây thích nghi với điều kiện ngoại cảnh và ra rễ mới.

Giá thể lựa chọn để trồng cây có thành phần trấu và cát có tỉ lệ 1:1.

Với đặc điểm hệ rễ phụ của cây thuốc lá phát triển mạnh, có thể phát triển

những đốt thân gần gốc nên tỉ lệ sống của các dòng khi vào giá thể khá cao, hệ

rễ mới phát triển mạnh, chứng tỏ sự thích nghi của cây với điều kiện ngoại cảnh

khá tốt, là tiền đề để có những cây khỏe mạnh khi cây sống trong điều kiện

ngoại cảnh mới. Sau 14 ngày trồng trên giá thể, tiến hành chuyển cây vào trong

nhà lưới. Tỉ lệ cây sống sót rất cao .

Hình 3.6. Cá c dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hê ̣ T0 trồng trên châ ̣u trong nhà lướ i

3.3. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong các dòng thuốc lá

chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

Cây chuyển gen được đánh giá bằng nhiều cách với mức độ khác nhau.

Việc xác định xem gen GmDREB2 có được chuyển vào trong cây hay không

chúng tôi lựa chọn bằng cách thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.

39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

PCR cho phép nhân bản một số lượng lớn nguyên bản một đoạn DNA trong

một thời gian ngắn. Đây là phương pháp thường được dùng trong phân tích dòng

cây vì thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được một trình

tự đáng quan tâm. Thực hiện đơn giản và ít tốn kém. Theo lý thuyết nếu ta cung

cấp cặp mồi đặc hiệu thì sẽ nhân chính xác được đoạn gen nằm giữa hai mồi đó.

Khi tiến hành PCR trên DNA tách từ cây đã được chuyển gen nếu cho kết quả đặc

hiệu với cặp mồi đó thì ta có thể kết luận rằng cây đó đã mang đoạn gen cần

chuyển.

Các dòng cây thuốc lá chuyển gen sau khi trồng trong nhà lưới được

khoảng 3-4 tuần thì tiến hành thu lá tách chiết DNA tổng số và thực hiện phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của đoa ̣n gen chuyển GmDREB2.

PCR đươ ̣c thực hiê ̣n với cặp mồi đặc hiệu GmDREB2 soyF/GmDREB2

soyR và kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose trên hình 3.7 cho thấy

Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra sả n phẩ m PCR nhân đoa ̣n GmDREB2 từ 17 dòng cây thuốc lá chuyển gen

1-17: 17 dòng thuốc lá chuyển gen; (+) Đối chứng dương là plasmid

pBI121/GmDreb2 ; (-) Đối chứng âm là sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA

tách từ cây thuốc lá không chuyển gen; M: Marker 1kb (Thermo Scientific)

Có 11/17 dòng thuốc lá (64,7%) cho một băng điện di sản phẩm PCR thu

được có kích thước khoảng gần 500 bp, tương tự như kết quả ở mẫu đối chứng dương. Kích thước này hoàn toàn phù hợp với kích thướ c củ a cấu trú c GmDREB2. Sáu dòng còn lại không cho băng như dự kiến. Vì vậy, có thể

khẳng định vector pBI121- GmDREB2 đã được chuyển thành công vào cây

thuốc lá giố ng K326 trong 11/17 dòng thuốc lá.

40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Gen ngoại lai khi được biến nạp vào tế bào có thể tồn tại trong tế bào chủ

ở 3 trạng thái: (1) Tạm thời ở dạng DNA tự do; (2) tồn tại lâu dài dưới dạng

một thể plasmid độc lập tự nhân; (3) tồn tại ổn định như một đoạn DNA của

một hệ gen trong tế bào chủ và được nhân lên theo dạng tương hợp hay không

tương hợp. Kết quả dương tính với PCR chỉ là bước đầu giúp đầu kiểm tra xem

gen được chuyển vào cây hay không. Tuy nhiên, PCR dương tính nhưng chưa

thể khẳng định xem gen đó có hoạt động và tồn tại được qua nhiều thế hệ hay

không [21]. Chính vì vâ ̣y đã có nhiều cách giải thích sự tồn tại của DNA trong

mẫu phân tích, đó là: (i) Vi khuẩn A. tumefaciens mang gen tồn tại trong khối

mô hay trong các gian bào của mẫu phân tích. Hiện tượng này xuất hiện ở

nhiều đối tượng. Nếu là mẫu phân tích của thực vật đã qua nhân giống hữu tính,

tức là qua thế hệ T1, T2...dưới dạng hạt, thì khả năng hoàn toàn bi ̣ loại trừ; (ii)

Gen chuyển tồn tại tự do trong tế bào chất, có thể biến mất qua sinh sản hữu

tính; (iii) Gen chuyển không hoạt động, tức là không được biểu hiện thành

protein có chức năng sinh học [21]. Xuất phát từ những khả năng trên, để

khẳng đi ̣nh gen chuyển tồ n ta ̣i, di truyền và biểu hiện ở các thế hê ̣ cần phải tiếp

tu ̣c phân tích sự có mă ̣t củ a cấu trú c GmDREB2 ở các thế hệ T1, T2..., đánh giá

mứ c đô ̣ biểu hiện và sự ổ n đi ̣nh tính kháng virus ở các thế hê ̣ đó .

41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

KẾ T LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luâ ̣n

1.1. Giống thuốc lá K326 đã được nuôi cấy in vitro và tạo đủ nguyên liệu, có

chất lượng tốt phục vụ thí nghiệm biến nạp vector pBI121- GmDREB2

1.2. Cấu trú c pBI121- GmDREB2 đã được chuyển thành công vào mô lá cây thuố c lá giố ng K326 thông qua lây nhiễm A. tumefaciens.

1.3. Phân tích các dò ng cây thuố c lá chuyển gen đã xác đi ̣nh đươ ̣c 11/17 dò ng thuố c lá chuyển gen ở thế hệ T0 dương tính với phản ứ ng PCR.

2. Đề nghi ̣

Tiếp tục theo dõi, phân tích và đánh giá khả năng chịu hạn củ a các dò ng

thuố c lá chuyển gen ở các thế hê ̣ sau

42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực

vật trong cải tiến giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr30-32.

2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu

ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội.

3. Nguyễn Liên Chi, Nguyễn Hữu Hồ, Nguyễn Văn Uyển (1989), "Chyển gen

kháng kanamycine vào mô thuốc lá (N.tabacum) và mô cây cà úc bằng vi

khuẩn A.tumefacines", Tạp chí Di truyền 1/1989.

4. Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội,

Lê Trần Bình(2003), Mối tương quan giữa hàm lượng proline và tính

chống chịu ở cây lúa , Tạp chí Công nghệ sinh học 1(1), tr 85-95.

5. Trần Kim Đồng, Nguyễn Quang Phổ, Lê Thị Hoa (1991), Giáo trình sinh

lý cây trồng, Nxb Giáo dục.

6. Nguyễn Thu Hiền (2014), Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt

của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật",

Luận án tiến sĩ sinh học- Đại học Thái Nguyên.

7. Nguyễn Huy Hoàng, Vũ Thị Như Trang (2012), Thiết kế vector mang

gen HA1 của virus H5N1 sử dụng trong chuyển gen thông qua vi khuẩn

A.rhizogene. Tạp chí khoa học công nghệ, Đại học Thái Nguyên, Tập

89, tr 147- 151.

8. Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), Phân lập tạo đột biến điểm gen P5CS liên

quan đến tính chịu hạn và thực nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt

Nam, Luận án tiến sĩ sinh học- Đại học Thái Nguyên.

9. Khuất Hữu Khanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng. Nxb Khoa

học kỹ thuật, Hà Nội, tr 56 - 57.

43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

10. Ngô Thị Liêm, Chu Hoàng Mậu (2006), Đặc điểm phản ứng các giống lạc

trong điều kiện hạn sinh lý, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn,

(84), tr 82 - 87.

11. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh và sinh học

phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở

Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, tr 18 - 36.

12. Trần Thị Phương Liên (2010), Protein và tính chống chịu của thực vật,

NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội

13. Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2005), Protein dự trữ và protease

hạt cây trồng, Tạp chí Công nghệ sinh học, 3(4), tr 37 - 45.

14. Trần Thị Phương Liên, Lê Thị Muội (2004), Nghiên cứu thành phần

đường tan trong chọn giống ở đậu tương. Báo cáo khoa học - Những

vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb Khoa học và kỹ

thuật, tr. 473, 475.

15. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Vân Anh (2005), Khảo sát chất lượng hạt và

khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn địa phương ở vùng núi phía

Bắc , Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, (17) tr 19 - 23.

16. Nguyễn Thị Thu Ngà (2014), Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2

liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (Arachis hypogaea L), Luận án tiến

sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên.

17. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu

hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện

công nghệ sinh học, Hà Nội.

18. Lò Thanh Sơn (2015), Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmEXP1 liên

quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương, Luận án tiến sĩ sinh học,

Đại học Thái Nguyên.

19. Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng chịu

nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ sinh học - Viện

công nghệ sinh học, Hà Nội.

44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

20. Nguyễn Quang Thạch (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị

Phương Thảo (2005), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, Nxb

Nông nghiệp - Hà Nội.

21. Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen ở thực vật, Nxb Khoa học kỹ

thuật, tr 28 - 29.

22. Bùi Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Mạnh Quỳnh (2006), Ảnh hưởng

của hạn sinh lý đến một số chỉ tiêu hóa sinh ở hạt nảy mầm của một số giống

lúa, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 12(2), tr. 29 - 33.

23. Vũ Thị Thu Thủy (2011), Tạo dòng chịu hạn và phân lập gen cystatin liên

quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (Arachis hypogaea L.), Luận án tiến sĩ

sinh học- Đại học Thái Nguyên.

24. Phan Hữu Tôn (2004), Giáo trình Công nghệ sinh học trong chọn tạo

giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

25. Phạm Thị Vân, Nguyễn Minh Hùng, Hà Viết Cường, Lê Văn Sơn, Lê Trần

Bình, Chu Hoàng Hà (2009), Tạo cây thuốc lá kháng virus TMV bằng kĩ

thuật RNAi, Hội thảo Quốc gia Bệnh hại Thực vật Việt Nam, 25 -26/7 tại

Viện Nghiên cứu Bông và phát triển NN, Nha Hồ - Ninh Thuận, tr 32-40.

26. Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần

Bình (2008), Tạo cây thuốc lá kháng bệnh virus khảm dưa chuột bằng kỹ

thuật RNAi, Tạp chí Công nghệ sinh học 6(4A), 679- 687.

27. Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nxb Đại học quốc gia Hà

Nội (148 trang).

28. Vũ Văn Vụ , Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (1997), Sinh lý học thực

vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội, tr. 125- 224.

45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Tiếng Anh

29. Abe H., Shinozaki Y., Urao T., Hosokawa D., Shinozaki K. (2008), "Role

of Arabidopsis MYC and MYB Homologs in Drought- and Abscisic

Acid- Regulated Gene Expression", The Plant cell, 9(10), pp. 1859-1868.

30. Akasaka Y., Hiroyuki.,Masashiro M. (2000), Improved plant regeneration

from cultured leaf segments in peanut ( Arachis hypogaea L.) by limited

exposure to thidiazuron , Plant Sci, 156, pp: 169-175.

31. Banerjee A.K., Part S., Hannapel D.J. (2006), Eficinent prodution of

transgenic potato ( S.tuberosum L.ssp.andigena) plants via

Agrobacterium tumefacines - mediated transformation, Plant Science,

170, pp.732 - 738.

32. Bray E.A (1993), Molecular responses to water deficit, Plant Physital, 103:

1035 - 1040.

33. Cao Xin-You, You-Zhi M., (2008), Isolation and identification of a GmGβ1

Interacting Protein with GmDREB5 Protein in Soybean (Glycine max),

Acta agronomica sinica, 34 (10): 1688-1695

34. Cortés A.J., This D, Chararro C., Madrinan S, Blair MW (2012),

Nucleotide ediversity patterns at the drought - related DREB2 encoding

genes in wild and cultivated common bean ( Phaseolus vulgaric L.),

Thear Appl. Genet, 125(5): 1069- 85.

35. Charlson D.V., Korth K.L., Purcell L.C., (2009), Allantoate

amidohydrolase transcript expression is independent of drought tolerance

in soybean, J. Exp. Bot., 60: 847-851.

36. Chen M., Wang Q.Y., Xu Z.S., Li L.C., Ye X.G., Xia L.Q, Ma Y.Z.,

(2007), GmDREB2, a soybean DRE – binding transcription factor,

conferred droungt and high – salt tolerance in transgenic plants, Biochem

Biophys Res Commun, 353(2): 299 – 305.

46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

37. Chen Y., Chen P., and de los Reyes B.G (2004), Analysis of the expression

of DREB1 gene orthogogs in cultivated and wild specises of soybean,

NCBI, GenBank, Accession. AY802779.

38. Clarson D.V., Hu X., Okimoto B., Purcell L.C., (2009), Glycine max

cultivar Jackson drought responsive element binding, NCBI, accession

FJ965342.

39. Diaz-Martin J., Almoguera C., Prieto-Dapena P., Espinosa J.M., Jordano J.,

(2005), Functional interaction between two transcription factors involved

in the developmental regulation of a small Heat stress Protein promoter,

Plant Physiol, 139(3): 1483-1494.

40. Dramé K.N., Clavel D., Repellin A., Passaquet C., Zuily - Fodil Y. (2007),

Water deficicit induces variation in expression of stress - responsive

genes in two peanut ( Arachis hypogaea L.) cultivars with diffierent to

lerance to drough, Plant Physiol Biochem 45 (3-4): 236 - 243.

41. Dubouzet J.G., Sakuma Y., Ito Y., Kasuga M., Dubouzet E.G., Miura S.,

Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., (2003), OsDREB

genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that

function in drought-, high-salt- and cold-responsive gene expression,

Plant J., 33(4):751-63.

42. Ernst H.A (2004), "Structure of the conserved domain of ANAC, a member

of the NAC family of transcription factors", EMBO Rep., 5, pp

43. FAO/WHO (1990) Expert consultation on protein quality evaluation. Food

and Agriculture Organization of the United Nations, Rome.

44. Fujita Y., Fujita M., Satoh R., Maruyama K., Mohammad M., Seki M.,

Shinozaki K., Shinozaki K. (2005), " AREB1 Is a Transcription

Activator of Novel ABRE-Dependent ABA Signaling That Enhances

Drought Stress Tolerance in Arabidopsis", The Plant Cell, 17, pp. 3470-

3488.

47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

45. Goyal K., Walton L.J., Tunnacliffe A. (2005), LEA proteins prevent pritein

aggregation due to water strees, Biochem Journal 388(1): 151 - 157.

46. Guerrini G.I, Trihueiro R.M., Leite R.M., Wilcken C.F., Velini E.D., Mori E.S.,

Furtado E.L., Marino C.L., Maia I.G. (2005), Eucalyptus EST involved in

the production of 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase, a regulatory enzyme of

abscisic acid production, Genet Mol Biol, 28 (3): 640-643.

47. Hanif M.(2004), Chracterization of small GTPase Cdc42 from the

ectomycorrhizal fungus Suillus bovinus and Agrobacterium tumefaciens-

mediated transformation of fungi, University of Helsinki.

48. Hong Y., Zhing S., Wang X., (2008), Dual functions of phospholipase

Dα1 in plant response to drought, Mol. Plant 1, 262- 269.

49. Ishida T., Aida M., Takada M., (2000), In-volvement of CUP-SHAPED

COTYLEDON genes om gy-noecium and ovule development in

Aradopsis thaliana, Plant Cell Physiol, 41: 60-67.

50. Javad K.A., Sasan M., Hassan M., (2009), Isolation and Characterization of

Partial DREB Gene from four Iranian, Triticum aestivum Cultivars

World Journal of Agricultural Sciences, 5(5): 561-566.

51. Khalafalla, M.M., S.M.Rahman, H.A.El - Shemy, Y.Nakamoto, K.Wakasa

and M.Ishimoto (2005). Optimization of praticle bombardment

conditions by monitoring of transient sGFP(S65T) expression in

transformed soybean. Breed. Sci 55: pp. 257 - 263.

52. Li X.P., Tian A.G., Luo G.Z., Gong Z.Z., Zhang J.S., Chen S.Y., (2005),

Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic

stresses, Theor Appl Genet, 110(8): 1355-1362.

53. Liu W. (2010), Clone of resvertrol synthesis gene from peanut, Accession:

FM955403, FM955401, FM955398.

54. Liu L.Q., Zhu K., Yang Y.F., Wu J., Yu D.Y., Chen F.D., (2007),

Molecular cloning, expressional profiling and trans-activation property

48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

studies of a DREB2-like gene from Chrysanthemum (Dendranthema

vestitum), Chrysanthemum vestitum DREB2-like protein (DREB2A)

mRNA, complete cds, NCBI, Accession EF633987.

55. Liu M., Wang N., Ma Y.Z., Cheng X.G., Glycine max dehydration

responsive element-binding protein 3(DREB3) mRNA, complete cds,

ACCESSION DQ055133.

56. Liu Q., Sakuma Y., Abe H., Kasuga M., Miura S., Yamaguchi- Shinozai K.,

Shinozaki K., (1998), Two transcription factors, DREB1 and DREB2,

with an EREBP/AP2 DNA binding domain, separate two cellular singnal

transduction pathways in drought and low temperature responsive gene

expression, respectively, in Arabidopsis, Plant Cell, 10: 1391-1406.

57. Liu W., Feng F., (2008), Cloning and functional analysis of DREB

transcription factors in Nictotiana tabacum, Nicotiana tabacum DREB4

mRNA, complete cds, NCBI, Accession EU727158.

58. Long S. DNA Rebagliati M. (2002), Sensitive two - color whole - mount

in situ hybridizations using digoxygenin - DNA dinitrophenol - labeled

RNA probes. Bio Techniques 32: pp. 494 - 500.

59. Lopez S.J., Kumar R.R., Pius P.K., Muraleedharan N. (2004),

Agrobacterium tumefaciens - mediated genetic transformation in Tea (

Camellia sinensis [L] O. Kuntze). Plant molecular biology reporter 22:

pp. 201a- 201j.

60. Mattews P.R., Wang M.B., Waterhouse P.M., Thornton S., Fieg S.J.,

Gubler F., Jacobsen J.V. (2001), Marker gene elimination from

transgenic barley, using co- transformation with adjacent twin T- DNAs

on stDNAard Agrobacterium transformation vector. Mol Breed 7: pp.

195- 202.

49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

61. Maughan, P.J., R.Philip, M-J. Cho, J.M. Widholm and L.O Vodkin (1999)

Biolistic transformation expression, and inheritance of bovene ß-casein

in soybean ( Glycine max. In Vitro Cell. Biol. Plant 35: pp.344 - 349.

62. Murashige T. and Skoog F. (1962), Arivised medium for rapid growth and

bioassays with tobaceo tissiee- culture, Physiology Planta, 15: 473 - 497.

63. Nakashima K., Shinwari ZK., Skuma Y., Seki M, Miura S, Shinoraki K.,

Yamaguchi - Shinozaki K., (2000), Organization and expression of two

Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE- binding proteins involved in

dehydration and high - salinity - responsive gene expression, Biological

Resources Division, Japan International Research Center for Agricultural

Sciences, Tsukaba, Ibaraki.

64. Perlak, F.J., Stone, T.B., Muskopf, Y.N., Petersen, L.J.,Parker, G.B.,

McPherson, S.A., Wyman, J., Love, S., Reed, G., Biever, D. and

Fischhoff, D.A. (1993). Genetically improved potatoes: protection from

damage by Colorado potato beetles. Plant Molecular Biology 22:313-

321.

65. Nguyễn V.T.T., Chu H.M., Phạm M.D., Hoàng M.V., (2011), Glycine max

dreb1 gene for drought responsive element binding protein 1, cultivar

Cucvang-YenSon, NCBI, Accession HE647689.

66. Qin F., Kakimoto M., Sakuma Y., Maruyama K., Osakabe Y., Tran L.S.,

Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., (2007), Regulation and

functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat

stresses in Zea mays L., Plant J.

67. Sakuma Y., Maruyama K., Osakabe Y., Qin F., Seki M., Shinozaki K.,

Yamaguchi S.K. (2006), Funotion analysis of an Arabidopsis trancription

factor, DREB2a, involved in drought responsive gene expession, The

Plant Cell 18: 1292-1309.

50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

68. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., (2011), Molecular cloning, A

Laboraory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory press.

69. Tsui-Hung P., Guihua S., Hon-Ming L., (2008), Salt Tolerance in Soybean,

Journal of Intrgrative Plant Biology, 50(10): 1196-1212.

70. Sato, S., C. Newell, K.Kolacz, L. Tredo, J. Finer and M. Hinchee (1993)

Stable transformation via particle bombardment in two different soybean

regeneration systems. Plant Cell Rep. 12:pp. 408 - 413.

71. Seo P.J., Xiang F., Qiao M., Park J.Y., Lee Y.N., Kim S.G., Lee Y. H., Park

W.J., Park C.M. (2009), The MYB96 transcription factor mediates

abscisic acid signaling during droughr stress respone in Arabidopsis",

Plant Physiol, 151, 275 - 289.

72. Swathi A.T., Jami S.K., Datla R.S. (2006), Genetic transformation of peanut

(Arachis hypogaea L.) using cotyledonary node as explant and a

promoterless gus: npt I fusion gene based vector , J.Biosci., 31, pp.235-246.

73. Tran L.S.P., Nakashima K., Sakuma Y., Simpson S. D., Fujita Y., Maruyama

K., Fujita M., Seki M., Shinozaki. (2004), "Iso lation and functional

analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind

to a droughtresponsive cis-element in the early responsive to dehydration

stress 1 promoter", The Plant Cell, 16, pp. 2481-2498.

74. Topping JF (1998), Tobacco transformation Methods of Molecuar Biology, 81: 36.

75. Wang X (2005) , Regulatory functions of phospholipase D and

phosphatidic acid in plant growth, development, and stress responses,

Plant Physiol. 139(2): 566- 573.

76. Wang,N., Liu,M., Cheng,X. and Ma,Y (2005), Institute of Agricultural

Resources and Regional Planning, China Academy of Agricultural

Science, 12 Zhongguancun South Street, Haidian, Beijing 100081, China

77. Wang P.R., Deng X.J., Gao X.L., Chen J., Wan J., Jiang H., Xu Z.J.,

(2006), Progress in the study on DREB transcription factor, Yi Chuan,

28(3): 369-740.

51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

78. Xiaoshuang Li, Daoyuan Zhang, Haiyan Li, Yucheng Wang, Yuanming

Zhang and Andrew J Wood (2014), EsDREB2B a novel truncated

DREB2-type transcription factor in the desert legume Eremosparton

songoricum, enhances tolerance to multiple abiotic stress in yeast and

transgenic tobaco, BMC Plant Bilogy, 1471-2229.

79. Zyprian E. and Kudo C.I. (1990), Agobacterium - mediated plant

transformation by novel mini - T- vectors in conjunction with a high-

copy vir region helper plasmid. Plant Mol. Biol, 15, pp:245-256

52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn