Luận văn thạc sĩ Sinh học: Tìm hiểu sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái cây mướp đắng (Momordica charantia L.) trong nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

TRẦN THỊ PHƯƠNG HẠNH

TÌM HIỂU SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ PHÁT SINH HÌNH THÁI CÂY MƯỚP ĐẮNG(momordica charantia L.)TRONG NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

TRẦN THỊ PHƯƠNG HẠNH

TÌM HIỂU SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ PHÁT SINH HÌNH THÁI CÂY MƯỚP ĐẮNG(momordica charantia l.)TRONG NUÔI CẤY IN VITRO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Du Sanh

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết

quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công

trình nào khác.

Người cam ñoan

Trần Thị Phương Hạnh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn tất luận văn này, em xin chân thành cảm ơn

Thầy TS. Nguyễn Du Sanh, người thầy ñã dìu dắt em từ những buổi ñầu khi

em mới tốt nghiệp ñại học, ñã tận tình hướng dẫn, ñộng viên trong lúc khó khăn,

truyền ñạt những kiến thức, những kinh nghiệm quí báu trong quá trình làm ñề tài và

học tập cũng như trong cuộc sống. Suốt thời gian qua, thầy ñã giảng dạy cho em rất

nhiều kiến thức, em ngày càng hiểu thêm và có niềm tin vào bản thân mình hơn

trong quá trình lên lớp.

Thầy TS. Lê Thương, Cô TS. Võ Thị Phương Khanh, Cô Ths. Nguyễn Thị Thu,

Thầy PGS.TS. Nguyễn Anh Dũng, các thầy cô trong Bộ môn SHCS, SHTN, SHTV ñã

giảng dạy, tận tình giúp ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho em trong học tập và công

tác.

Thầy TS. Phan Văn Tân, ñã giảng dạy, bồi dưỡng những kiến thức sinh lý

thực vật, giúp em tập làm quen với nghiên cứu khoa học và truyền ñạt kinh nghiệm

sống thật bổ ích.

Các thầy, cô trong Hội ñồng ñã ñọc, nhận xét và ñưa ra những ý kiến quí báu

về luận văn.

Thầy PGS. TS. Bùi Trang Việt, ñã tạo ñiều kiện thuận lợi trong thời gian em

học tập và làm luận văn tại trường Đại học KHTNTPHCM.

Thầy Hoang, cô Hương, cô Tú, cô Xuân, thầy Kiệt, chị Hiền, anh Kiệt, Chị

Hương và các bạn lớp cao học K18, trường Đại học KHTNTPHCM ñã giúp ñỡ trong

suốt thời gian làm luận văn.

Chị Tuyến, anh Sỹ, chị Thanh, Bốn, Định, Vũ Duyên, anh Huệ, Duyên và các

anh chị lớp cao học SHTN K2 ñã ñộng viên, giúp ñỡ trong quá trình học tập và làm

ñề tài tốt nghiệp.

Các thầy cô ở phòng Đào tạo sau Đại học ñã tạo ñiều kiện thuận lợi trong

thời gian học tập.

iii

Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn ñến ba Tường, mẹ Tham, mẹ Đông ñã

luôn yêu thương, chăm sóc con. Cảm ơn gia ñình chị Lan, gia ñình chị Hằng. Cảm

ơn anh Thảo, người bạn ñời luôn ở bên chia sẻ, ñộng viên, giúp ñỡ em. Cảm ơn con,

Anh Tuấn là niềm tin, thương yêu cho mẹ phấn ñấu.

Trần Thị Phương Hạnh

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D

: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

AIA

: Indol-3acetic acid

: Benzyladenine

CĐHH

: Cường ñộ hô hấp

ĐTD

: Đốt tử diệp (ñốt thân mang tử diệp)

: Tử diệp

: Trụ hạ diệp

: Murashige và Skoog (1962)

GTTLT

: Gia tăng trọng lượng tươi

GTTLK

: Gia tăng trọng lượng khô

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết ..................................................................................................... 1

2. Mục tiêu của ñề tài ............................................................................................ 1

3. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................... 2

4. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................... 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây mướp ñắng .............................................................. 3

1.1.1 Vị trí phân loại .......................................................................................... 3

1.1.2 Đặc tính sinh học ....................................................................................... 3

1.1.2.1 Mô tả hình thái ....................................................................................... 3

1.1.2.2 Điều kiện sống và phân bố ...................................................................... 3

1.1.2.3 Sâu bệnh ................................................................................................. 4

1.1.3 Thành phần và tác dụng các hợp chất tự nhiên của cây mướp ñắng ........... 4

1.2. Sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái ............................................................ 6

1.2.1 Sự tạo mô sẹo ........................................................................................... 6

1.2.2 Sự phát sinh hình thái ................................................................................ 7

1.2.3 Vai trò của các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ........................................... 9

1.2.3.1 Auxin .............................................................................................................. 9

1.2.3.2 Cytokinin ........................................................................................................ 10

1.2.3.3 Sự phối hợp auxin và cytokinin trong phát sinh cơ quan .............................. 11

1.2.2.4. Giberelin ........................................................................................................ 12

1.2.2.5. Acid abcisic (ABA) ....................................................................................... 12

1.2.2.6. Ethylen .......................................................................................................... 12

1.2.3 Một số yếu tố khác ảnh hưởng ñến sự phát sinh hình thái thực vật .................. 13

1.2.3.1 Tuổi của mô cấy ............................................................................................. 13

1.2.3.2. Ánh sáng ........................................................................................................ 13

1.2.3.3. Nhiệt ñộ ......................................................................................................... 13

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước ......................................... 13

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................ 13

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................... 15

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊM CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 16

2.2 Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................. 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 18

2.3.1 Thí nghiệm khử trùng mẫu cấy ........................................................................ 18

2.3.2 Thí nghiệm tạo mô sẹo từ các nguồn mẫu của cây mướp ñắng ........................ 18

2.3.3 Thí nghiệm tạo chồi từ mô sẹo và tạo rễ từ những chồi thu nhận .......................... 24

2.3.4 Thí nghiệm khả năng thích ứng của cây con ngoài vườn ươm ........................ 26

2.3.5 Đo cường ñộ hô hấp ......................................................................................... 26

2.3.6 Xử lý số liệu ..................................................................................................... 26

Chương 3 KẾT QUẢ

3.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ các chất khử trùng và thời gian khử trùng lên

mẫu hột mướp ñắng ........................................................................................... 27

3.2 Sự tạo mô sẹo ............................................................................................... 28

3. 2.1 Sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo từ các nguồn mẫu .......................... 28

3.2.1.1 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lá ...................................... 28

3.2.1.2 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp .................... 31

3.2.1.3 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng tử diệp ..................... 34

3.2.1.4 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp ............... 37

3.2.2 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình tạo mô sẹo .............................................. 41

3.2.3 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược hình

thành từ các nguồn mẫu ............................................................................................. 41

vii

3.2.3.1 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược hình

thành từ lá ................................................................................................................... 42

3.2.3.1 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược hình

thành từ lớp mỏng ñốt tử diệp .................................................................................... 43

3.2.3.1 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược hình

thành từ lớp mỏng tử diệp .......................................................................................... 44

3.2.3.1 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược hình

thành từ lớp mỏng trụ hạ diệp .................................................................................... 45

3.2.3 Sự gia tăng trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mô sẹo ñược hình thành từ

các nguồn mẫu ............................................................................................................ 47

3.3 Sự phát sinh chồi .................................................................................................. 48

3.3.1 Sự hình thành và tăng trưởng của cụm chồi từ mô sẹo ..................................... 48

3.3.2 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình phát sinh chồi ......................................... 52

3.4 Sự phát sinh rễ ...................................................................................................... 54

3.4.1 Sự hình thành và tăng trưởng rễ ....................................................................... 54

3.2.2 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình phát sinh rễ ............................................. 56

3.5 Sự thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm ............................................ 57

Chương 4 BIỆN LUẬN

4.1 Sự hình thành mô sẹo .......................................................................................... 58

4.1.1 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình tạo sẹo ................................................... 58

4.2 Các biến ñổi sinh lý trong quá trình hình thành mô sẹo ...................................... 58

4.2 Sự phát sinh chồi từ mô sẹo của cây mướp ñắng ............................................. 59

4.2.1 Sự thay ñổi hình thái trong sự phát sinh chồi ................................................ 59

4.3.3 Các biến ñổi sinh lý trong quá trình phát sinh chồi .......................................... 60

4.3 Sự phát sinh rễ từ chồi mướp ñắng ...................................................................... 61

4.3.1 Ảnh hưởng của AIA trong sự phát sinh rễ ........................................................ 61

4.3.2 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình phát sinh rễ ............................................. 61

viii

4.3.3 Các biến ñổi sinh lý trong quá trình phát sinh rễ .............................................. 62

4.4 Sự thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm ........................................... 62

KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ .................................................................................... 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 64

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1a Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 19

Bảng 2.1b Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 19

Bảng 2.2a Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 20

Bảng 2.2b Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 20

Bảng 2.3a Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 21

Bảng 2.3b Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 21

Bảng 2.4a Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 22

Bảng 2.4b Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 22

Bảng 2.4c Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 23

Bảng 2.4d Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 23

Bảng 2.6a Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 24

Bảng 2.6b Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 25

Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm ................................................................................. 25

Bảng 3.1a Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lá sau 2, 3, 4,

và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin (2,4-D). ........................... 28

Bảng 3.1b Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lá sau 2, 3, 4,

và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và

cytokinin (BA) .......................................................................................................... .29

Bảng 3.2a Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng

ñốt tử diệp sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin (2,4-

D) ....................................................................................................................... 31

Bảng 3.2b Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng ĐTD

sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và

cytokinin (BA). .................................................................................................................... 32

Bảng 3.3a Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử

diệp cắt dọc sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin

(2,4-D) ............................................................................................................... 34

Bảng 3.3b Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử diệp

sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và

cytokinin (BA). .................................................................................................................... 35

Bảng 3.4a Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ

diêp cắt dọc sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin 2,4-D ... 37

Bảng 3.4b Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ

diệp cắt dọc sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung auxin (2,4-D

hay AIA) và cytokinin (BA). ..................................................................................... 38

Bảng 3.4c Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ

hạ diệp cắt ngang sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung

auxin (2,4-D) ...................................................................................................... 38

Bảng 3.4d Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ

diệp cắt ngang và cắt ngang sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường có và

không bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và cytokinin (BA). ...................................... 39

Bảng 3.5a: Ảnh hưởng của BA lên sự hình thành chồi từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi

cấy. ............................................................................................................................. 48

Bảng 3.5b Ảnh hưởng của BA và AIA lên sự hình thành và tăng trưởng chồi từ mô

sẹo sau 4 tuần nuôi cấy ............................................................................................... 49

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của AIA lên sự hình thành và tăng trưởng rễ từ chồi sau 4 tuần

nuôi cấy. ..................................................................................................................... 54

Bảng 3.7 Khả năng thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm ........................ 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Tỷ lệ mẫu sạch và sống sau khi khử trùng bởi dung dịch chất khử trùng

với nồng ñộ và thời gian khác nhau ........................................................................... 27

Hình 3.2 Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lá theo thời gian. .......... 42

Hình 3.3 Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng ñốt tử diệp theo

thời gian. .................................................................................................................... 43

Hình 3.4 Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử diệp theo thời

gian. ............................................................................................................................ 44

Hình 3.5 Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt

dọc theo thời gian ....................................................................................................... 45

Hình 3.6 Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt

ngang theo thời gian. .................................................................................................. 46

Hình 3.7 Sự gia tăng trọng lượng tươi và gia tăng trọng lượng khô giữa các nghiệm

thức cho mô sẹo tốt nhất ở các nguồn mẫu ................................................................ 47

Hình 3.8 Sự hình thành và tăng trưởng rễ sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có

và không bổ sung AIA. .............................................................................................. 54

xii

DANH MỤC ẢNH

Ảnh 1.1: Cây mướp ñắng ..................................................................................... 3

Ảnh 2.1: Cây khổ qua 10 ngày tuổi (A), lá (B), tử diệp (C), ñốt tử diệp (D), trụ hạ

diệp cắt dọc (1mm) (E), trụ hạ diệp cắt ngang (1mm) (F). ........................................ 17

Ảnh 3.1 Mô sẹo từ lá 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ. ............................................. 30

Ảnh 3.2 Mô sẹo từ lá 5 tuần tuổi. .............................................................................. 31

Ảnh 3.3 Mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ .............. 33

Ảnh 3.4 Mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp 5 tuần tuổi. ............................................... 34

Ảnh 3.5Mô sẹo từ lớp mỏng tử diệp 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ. ..................... 36

Ảnh 3.6 Mô sẹo từ lá lớp mỏng tử diệp 5 tuần tuổi. .................................................. 37

Ảnh 3.7Mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc và ngang 3 tuần tuổi, mũi tên trắng

chỉ rễ. .......................................................................................................................... 40

Ảnh 3.8Mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc và ngang 5 tuần tuổi ..................... 40

Ảnh 3.9 Sự phân chia của tế bào ở gân lá (A), các tế bào mô sẹo phía ngoài sau 2

tuần (B), các tế bào mô sẹo phía ngoài sau 5 tuần (C) ............................................. 41

Ảnh 3.10 Chồi ñược hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 1 tuần nuôi cấy, mũi tên

xanh chỉ nốt tròn, mũi tên trắng chỉ chồi ................................................................... 50

Ảnh 3.11 Chồi ñược hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy .......... 51

Ảnh 3.12 Chồi ñược hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy. .......... 52

Ảnh 3.13 Phẫu thức cắt ngang mô sẹo qua các nốt xanh (A), chồi ñược hình thành từ

các nốt trên mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy (B), 15 ngày (C), mũi tên xanh chỉ nối

xanh, ,mũi tên ñỏ chỉ bó mạch, mũi tên vàng chỉ phát thể lá, mũi tên trẵn chỉ ñỉnh

sinh trưởng. ....................................................................................................................

.................................................................................................................................... 53

Ảnh 3.14 Rễ ñược hình thành sau 4 tuần tuổi nuôi cấy ............................................. 55

xiii

Ảnh 3.15 Phẫu thức cắt ngang gốc thân cây mướp ñắng in vitro 0 ngày (A), 5 ngày

(B), sơ khởi rễ kéo dài (C), rễ (D), nuôi cấy trên môi trường bổ AIA 0,5 mg/l, mũi

tên trắng chỉ tượng tầng libe-mộc, mũi tên mũi xanh chỉ tế bào phân chia, tên mũi ñỏ

chỉ sơ khởi rễ, mũi tên tên vàng chỉ rễ kéo dài .......................................................... 56

Ảnh 3.16 Cây mướp ñắng ngoài vườn ươm .............................................................. 57

1. Tính cấp thiết

Mướp ñắng hay còn ñược gọi là khổ qua, lương qua (Momordica charantia

L.), thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) có nguồn gốc ở vùng nhiệt ñới châu Phi và

miền nam châu Á, hiện nay ñược trồng rộng rãi ở khắp các nơi trong vùng nhiệt

ñới và cận nhiệt ñới [28].

Nước ta có khí hậu thổ nhưỡng rất phù hợp với cây mướp ñắng và cho năng

suất cao. Mướp ñắng ngoài việc sử dụng làm nguồn thực phẩm còn cung cấp dược

liệu cho các nhà bào chế thuốc [26].

Cho ñến nay, ñã có rất nhiều công trình nghiên cứu về mặt dược liệu của

cây mướp ñắng (Momordica charantia L.), chủ yếu tập trung vào việc ly trích,

phân tích các thành phần hoá học của các hợp chất thứ cấp có trong cây [1],[9].

Trong khi những nghiên cứu về sinh lý cơ bản còn rất ít. Ngoài ra, việc nhân

giống cây chủ yếu bằng phương pháp gieo hạt, cây con rất dễ bị bệnh tấn công làm

cho năng suất, hàm lượng và chất lượng các hợp chất tự nhiên trong cây giảm sút.

Vì vậy, việc nhân giống cây dược liệu ñang ñược các nhà nuôi cấy mô quan tâm.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật ñã không ngừng phát triển và ñem lại hiệu quả thiết

thực trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng. Do ñó, ñể có giống cây

mướp ñắng ñồng nhất, sạch bệnh và số lượng lớn, nuôi cấy mô cây mướp ñắng

ñang trở thành việc làm cần thiết.

Đề tài: “Tìm hiểu sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái cây mướp ñắng

(Momordica charantia L.) trong nuôi cấy in vitro” ñược thực hiện nhằm hiểu

biết thêm về khoa học nuôi cấy mô, vi nhân giống trên ñối tượng mướp ñắng. Đây

cũng là nghiên cứu cơ bản ñể ứng dụng cho các ñối tượng khác thuộc họ bầu bí.

2. Mục tiêu của ñề tài

- Tìm ñược môi trường thích hợp nhất cho sự hình thành mô sẹo và phát

sinh hình thái của mướp ñắng trong nuôi cấy in vitro.

- Xác ñịnh khả năng hình thành mô sẹo trên những nguồn mẫu khác nhau

(tử diệp, trụ hạ diệp, lá non,…) và ảnh hưởng của chất ñiều hoà sinh trưởng lên sự

phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro.

3. Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái cây mướp ñắng

trong nuôi cấy in vitro sẽ tìm ra mối liên hệ giữa mô, tế bào, các giai ñoạn phát

sinh hình thái và giải thích vai trò của các chất ñiều hòa tăng trưởng thực vật trong

sự phát sinh cơ quan ở cây mướp ñắng.

4. Ý nghĩa thực tiễn

Tìm hiểu sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái cây mướp ñắng trong nuôi

cấy in vitro ñể biết ñược phương pháp, kỹ năng nuôi cấy mô trên ñối tượng mướp

ñắng, góp phần xây dựng thành một qui trình vi nhân giống, nghiên cứu những sản

phẩm nuôi cấy in vitro, …

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 4

BÀN LUẬN

Chương 3

KẾT QUẢ

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

MỞ ĐẦU

1.1 Giới thiệu chung về cây mướp ñắng

1.1.1 Vị trí phân loại

Giới (Kingdom): Plantae

Ngành (Division): Magnoliophyta

Lớp (Class): Magnoliopsida

Bộ (Ordor): Cucurbitales

Họ (Family): Cucurbitaceae

Chi (Genus): Momordica

Loài (species): Momordica charantia L.

Ảnh 1.1: Cây mướp ñắng

1.1.2 Đặc tính sinh học

1.1.2.1 Mô tả hình thái

Mướp ñắng là loại cây dây leo có tua cuốn, thân có góc cạnh, ở ngọn hơi

có lông tơ. Lá mọc so le, dài 5 - 10cm, rộng 4 - 8cm, phiến lá chia 5 - 7 thùy

hình tim tròn, mép có răng cưa ñều, mặt dưới lá mầu nhạt hơn mặt trên, trên gân

lá có lông ngắn. Hoa mọc ñơn ñộc ở kẽ lá, ñực cái cùng gốc, có cuống dài, cánh

hoa màu vàng nhạt, ñường kính của hoa chừng 2cm.

Trái hình thoi dài 8 - 15cm, trên mặt có nhiều u nổi lên, trái chưa chín có

màu xanh hoặc vàng xanh, khi chín có màu vàng hồng, trong trái có hột dẹt dài

13 - 15mm, rộng 7 - 8mm, gần giống hột bí ngô, quanh hột có màng màu ñỏ như

màng gấc [28].

1.1.2.2 Điều kiện sống và phân bố

Mướp ñắng dễ trồng, không kén ñất. Là cây ưa ẩm, ưa sáng, sợ úng. Vì

trái mướp ñắng có hình dạng ngộ nghĩnh, ñẹp nên còn ñược trồng làm cảnh, lấy

bóng mát kết hợp ăn trái, làm thuốc trong gia ñình.

Trên thế giới, mướp ñắng ñược trồng nhiều ở các nước châu Á, Mỹ

Latinh. Ở nước ta, mướp ñắng ñược trồng ở khắp mọi miền. Mùa quả ở miền Bắc

là các tháng 5-6-7. Riêng ở các tỉnh miền Nam, mướp ñắng có quanh năm [28].

1.1.2.3 Sâu bệnh

Sâu hại chính thường có.

- Giòi ñục trái (Zeugodacus caudatus): phải chú ý phòng trừ sớm khi ruồi mới

ñẻ trứng, thường vào giai ñoạn quả mới ñậu hoặc còn non.

- Sâu xanh (Hilecoverpa armigera): sâu hại hoa và trái ở tất cả các thời kỳ.

- Giòi ñục lá (Liriomyza spp.) làm trắng lá, ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng của

cây.

- Khi mật ñộ các loài sâu hại cao có thể sử dụng các biện pháp sau :

+ Thuốc trừ sâu sinh học: các lọai BT, Aztrol, Dipel, Xenteri,... thời gian cách

ly 3 ngày khi cây có hoa và trái non.

+ Thuốc trừ sâu hóa học: Sherpa 25 EC, Match 50 ND, Success 25 SC,

Vertimec 1.8 EC,… theo hướng dẫn ghi trên bao bì, thời gian cách ly từ 7 -10 ngày.

+ Sau thời kỳ ra hoa và ñậu trái non chỉ ñược dùng thuốc sinh học, chủ yếu

các loại thuốc BT.

- Bệnh hại: bệnh phấn trắng (Erysiphe sp.) hại chủ yếu trên lá, cần phòng trừ

sớm bằng các thuốc: Ridomin MZ 72WP nồng ñộ từ 30-50g/10lít nước. Thời gian

cách ly 7-10ngày; Validacin 3SL nồng ñộ 0.1-0.2%. Thời gian cách ly tối thiểu 10

ngày. Khi sử dụng thuốc ñều phải tuân theo hướng dẫn trên nhãn bao bì của từng loại

thuốc [28].

1.1.3 Thành phần và tác dụng các hợp chất tự nhiên của cây mướp ñắng

Năm 1990, Liên Hiệp Quốc phát hành bộ tem dược thảo, mỗi con tem là

một cây thuốc ñược Liên Hiệp Quốc cho là có giá trị chữa bệnh trên thế giới,

mướp ñắng ñược chọn làm một trong 6 cây tiêu biểu [23].

Mướp ñắng có thành phần dinh dưỡng cao. Trong 100g trái mướp ñắng

chứa: chất béo 0,10g; chất ñạm 0,90g; chất bột ñường 4,70g; các khoáng chất

như K 250mg, Ca 22mg, Mg 16mg, Fe 0,9mg, Zn 0,1g. Các vitamin: A 4mg, C

50g, B1 0,05mg, B2 0,03mg, PP 0,40mg…

Trong lá và trái mướp ñắng có chứa polyphenol và flavonoid (mùa ñông cao

hơn mùa hè một chút), hàm lượng polyphenol và flavonoid trong trái cao hơn trong

lá: polyphenol: 3,85% trong trái; 3,09% trong lá già. flavonoid: 1,34% trong trái;

1,12% trong lá già. Các chất quan trọng là glycosid: charantin và momordicin.

Charantin và polypeptid – P có tác dụng làm hạ ñường huyết. Momordicin có tác

dụng diệt vi khuẩn, siêu vi và hỗ trợ cho cơ thể chống lại các tế bào ung thư ñang

phát triển, alkaloid trong mướp ñắng có công hiệu lợi tiểu, máu lưu thông, chống

viêm, hạ sốt, mát gan, sáng mắt, phòng chống ung thư... [24].

Năm 1984, nhiều nhà sinh hóa và dược lý của các nước vùng Caribê ñã công

bố: chất momordicosid trong trái mướp ñắng là một hợp chất có tác dụng sinh học

quan trọng làm giảm glucose trong máu… Đặc biệt, polypeptid-P (P- insulin;

plantinsulin) ñược cô lập từ trái, hột và các mô trong thân, lá… có tác dụng sinh học

gần giống insulin, giúp cơ thể tăng tiết insulin, làm hạ glucose trong máu có tác

dụng cải thiện rõ sự dung nạp glucose ở người tiểu ñường týp II trong giai ñoạn

chưa có biến chứng ñã ñược công bố ở nhiều nước trên thế giới [25].

Theo Nguyễn Minh Đức và cộng sự (2002), từ hột mướp ñắng ñã chiết xuất và

phân lập ñược 4 hợp chất Mc1, Mc2, Mc3, Mc4. Trong ñó Mc1 ñược xác ñịnh là

momordicosid A có tác dụng sinh học (diệt khuẩn) dựa vào mô hình thử tác dụng

ñộc trên ấu trùng tôm biển (Artemia salina) [1].

1.2. Sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái

1.2.1 Sự tạo mô sẹo

Trong nuôi cấy in vitro, mô sẹo là ñám tế bào không phân hoá, có ñặc tính

phân chia mạnh, thường ñược tạo ra từ những xáo trộn trong quá trình tạo cơ

quan. Do ñó, các phần non của cơ thể thực vật (mô phân sinh ngọn, thân, rễ…)

dễ cho mô sẹo trong ñiều kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác ñộng của một auxin

mạnh ñược áp dụng riêng rẽ hay kết hợp với cytokinin. Ngược lại, những mảnh

cơ quan trưởng thành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có

khả năng tạo mô sẹo [10],[11].

Sự tạo mô sẹo, nhờ auxin, thuộc một trong ba quá trình: - Sự phản phân hoá của các tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ

quan).

- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng. - Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ). Trong quá

trình này ñược ưu tiên áp dụng ở cây một lá mầm, vì các cây này không

có các tượng tầng ñiển hình, và các tế bào nhu mô khó phản phân hoá

(so với cây hai lá mầm).

Để tạo mô sẹo, cần chú ý ñến tình trạng sinh lý của mô cấy, sự dùng auxin

riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin, bản chất và nồng ñộ auxin [11].

1.2.2 Sự phát sinh hình thái

Phát sinh hình thái là sự phát triển của cơ thể thực vật: tế bào, mô, cơ quan

theo thời gian, từ lúc khởi ñầu cho ñến lúc trưởng thành, ñể hoàn tất chu trình

phát triển. Bao gồm quá trình:

- Phát sinh mô (histogenesis) - Phát sinh cơ quan (organogenesis) - Phát sinh phôi (embryogenesis)

Trong chu trình phát triển, mỗi thực vật ñều ở trạng thái cử ñộng phát

sinh hình thái. Các cơ quan thực vật tác ñộng lẫn nhau trong sự phát triển của

riêng mình, sự tiến hoá của những cơ quan phụ thuộc vào sự tiến hoá của những

cơ quan khác, cấu trúc toàn vẹn của cơ thể thực vật là do toàn bộ các tương tác

giữa các cấu trúc hợp thành.

Ở môi trường nhân tạo, mô cấy thoát khỏi sự tương quan mà nó phải chịu

trong cơ thể thực vật nguyên vẹn ñể thiết lập một tương quan mới. Tuy nhiên, dù

trong các ñiều kiện in vitro, sự phát triển của thực vật là một chuỗi lần lượt các

quá trình liên tiếp nhau theo một trật tự không thể ñảo ngược.

• Sự phát sinh cơ quan

Phát sinh cơ quan là quá trình các tế bào và mô tạo ra cấu trúc một cực,

cực chồi hoặc cực rễ. Đây là một quá trình liên quan ñến sự tăng sinh và sự phân

hóa tế bào, phụ thuộc vào thành phần và hàm lượng của các chất ñiều hoà tăng

trưởng thực vật khác nhau [11], [29].

Trong thiên nhiên, sự phát sinh cơ quan có nguồn gốc từ các mô phân sinh

ngọn. Mô phân sinh ngọn chồi ở cây hạt kín thường có ñường kính 100 - 200µm,

với các tế bào ñang phân chia, chưa biệt hoá cao về mặt hình thái, nhưng có khả

năng phát sinh hình thái.

Mô phân sinh ngọn có vai trò quan trọng trong sự hình thành cơ quan và

duy trì chính nó. Việc duy trì tính toàn vẹn của mô phân sinh ngọn ñòi hỏi sự

chính xác trong phân chia, tăng rộng và biệt hoá của tế bào. Các tế bào ở vùng vỏ

phân chia theo hướng thẳng góc với bề mặt mô phân sinh cho ra các lớp biểu bì

và dưới biểu bì của thân và lá. Một số ít tế bào từ phân chia trong vỏ và có thể

cho sự khởi lá, thân, nụ nách và các bộ phận của hoa (nếu là nụ hoa). Các tế bào

của vùng thể phân chia vừa theo hướng thẳng góc vừa theo hướng song song với

bề mặt của mô phân sinh làm gia tăng thể tích tế bào [11],[29].

Trong nuôi cấy in vitro, sự phát sinh cơ quan (chồi hay rễ) có thể ñược

thực hiện từ chồi hiện diện sẵn hay từ sự tạo mới.

- Sự phát triển chồi

Các chồi tận cùng và các chồi nách hiện diện sẵn, ở trạng thái hoạt ñộng

hay nghỉ, có thể phát triển in vitro (không phải sự tạo mới cơ quan). Một mô cấy

chứa một chồi duy nhất có thể phát triển thành một chồi duy nhất hay cụm chồi,

tùy thuộc vào loài, trạng thái sinh lý của mô cấy và môi trường nuôi cấy.

Kích thích sự phát triển của chồi hiện diện sẵn là phương pháp vi nhân

giống chậm nhất, nhưng là cách thông dụng, dễ áp dụng nhất trong hầu hết các

loài thực vật, ñặc biệt ñối với các cây gỗ (vì sự sinh phôi thế hệ và tăng trưởng

chồi/rễ bất ñịnh khó thực hiện hơn).

- Sự tạo mới chồi

Mọi cơ quan thực vật ñều có khả năng tái sinh các mô phân sinh ngọn chồi

bởi sự sinh cơ quan trực tiếp hay gián tiếp. Ở cây hột kín, nguồn gốc của mô

phân sinh ngọn chồi có thể là tế bào biểu bì, mô hàng rào (mô dậu), mô khuyết

hay mô bao quanh mạch của mẫu cấy.

Trước sự phân hoá ñể tạo tầng phát sinh của chồi ñược tạo mới, tiền mô

phân sinh hay tế bào phân hoá ñều phải qua sự tái hoạt ñộng. Sự tái hoạt ñộng

này có thể ñược cảm ứng trên cây nguyên bằng sự ñàn áp các hiệu ứng cản tương

quan (thí dụ: cắt bỏ vùng ngọn ñể gỡ ưu tính ngọn) hay trên mô cấy nhờ các môi

trường thích hợp. Sự tái hoạt ñộng gồm hai giai ñoạn: khử phân hoá và tái phân

hóa.

Trong sự tạo mới chồi từ các tế bào lá ñã phân hóa, người ta cho rằng có

sự hiện diện của các nhóm tế bào ñặc biệt, gọi là mô ñích. Các tế bào này là nơi

nhận các thông tin hoá học, ñặc biệt là chất ñiều hòa tăng trưởng thực vật: nếu

auxin có tác dụng tạo rễ ñối với các mô quanh mạch (nguồn gốc nội sinh của rễ)

thì citokinin có tác dụng tạo chồi ñối với các mô ngoại vi (nguồn gốc ngoại sinh

của chồi). Tỷ lệ auxin/cytokinin xác ñịnh một chương trình phát sinh hình thái

(rễ hay chồi) [8].

- Sự phát sinh rễ

Sự thành lập rễ bao gồm 2 giai ñoạn có thể thấy ñược dưới kính hiển vi:

giai ñoạn tạo sơ khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe - mộc hay chu luân

và giai ñoạn kéo dài sơ khởi rễ này.

Trong phần lớn trường hợp, sự hiện diện của cytokinin giúp cho sự tạo

chồi sẽ cản sự tạo rễ. Do ñó môi trường cảm ứng sự tạo rễ phải là môi trường

khác và ñôi khi phải qua nhiều lần cấy chuyền trên môi trường không có

cytokinin.

Một ñiều cần ñược lưu ý trong sự tái sinh cây từ mô sẹo là nguy cơ biến dị

thể hệ. Những biến ñổi về di truyền sẽ xảy ra khi cây ñược tái sinh từ mô sẹo ñược

cấy chuyền qua nhiều lần và duy trì trong thời gian dài [15].

1.2.3 Vai trò của các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật

1.2.3.1 Auxin

Auxin rất cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên nó có vai

trò quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật. Auxin ñược tổng hợp trong

ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non ( là các nơi có sự phân chia

tế bào nhanh). Sau ñó, auxin di chuyển hướng gốc tới rễ và tích tụ trong rễ [11].

Auxin ở nồng ñộ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ nhưng cản sự tăng trưởng

của các sơ khởi rễ này [7]. Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamin (như

thiamin mà rễ không tổng hợp ñược), acid amin (như arginin), và nhất là các hợp

chất ortho-diphenolic (như acid cafeic, acid chlorogenic) [11].

Auxin cảm ứng hoạt ñộng của mô phân sinh rễ, chất này di chuyển từ gốc

ñến ngọn rễ và ñẩy mạnh sự phân chia tế bào tại ñây. Điều này cho thấy tác ñộng

của auxin chủ yếu trong giai ñoạn phân chia tế bào chứ không phải suốt quá trình

kéo dài rễ [15].

Trong số các loại auxin ñược sử dụng trong nuôi cấy in vitro, 2,4-D ñược

xem là một auxin mạnh, có tác ñộng hình thành mô sẹo. Tuy nhiên nếu sử dụng

nồng ñộ quá cao, auxin này sẽ gây ñộc cho tế bào, thậm chí gây biến ñổi di truyền.

Trong sự hình thành sơ khởi rễ bất ñịnh, sử dụng NAA, AIA hay IBA thường ñược

hiệu quả cao hơn so với 2,4-D. Tuy nhiên, tác ñộng của auxin ngoại sinh trong sự

phát sinh hình thái cơ quan còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lý cũng như hàm lượng

chất ñiều hòa sinh trưởng nội sinh trong mô cấy. Trong suốt quá trình tạo rễ bất

ñịnh, hàm lượng AIA tích lũy tăng cao. Điều này ñược giải thích là do auxin ngoại

sinh ức chế hoạt ñộng của enzyme IAA oxidase và IBA có khả năng chuyển ñổi

thành AIA. Do ñó cũng làm tăng nhanh lượng IAA nội sinh, kích thích sự hình

thành rễ bất ñịnh [15].

1.2.3.2 Cytokinin

Trong thực vật, cytokinin ñược tổng hợp chủ yếu từ mô phân sinh ngọn rễ.

Từ ñó chúng ñược vận chuyển trong mạch mộc tới chồi. Tuy nhiên, các chồi và

phôi cũng là nơi tổng hợp cytokinin [11].

Ở rễ, cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích tăng rộng tế bào [7]. Cytokinin

ngăn cản sự lão hóa, thúc ñẩy sự trưởng thành của diệp lạp và là nhân tố chính ñiều

khiển quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi [4]. Trong sự hình thành chồi,

cytokinin có thể ñược sử lý riêng rẻ hay phối hợp ñể làm tăng khả năng hình thành và

chất lượng của chồi.

Ở nồng ñộ cytokinin cao giúp tạo thành cụm chồi. Số lượng chồi hình thành

tùy thuộc vào nồng ñộ cytokinin. Cytokinin ở nồng ñộ thấp kích thích chồi nách phát

triển. Nồng ñộ cao hơn sẽ cảm ứng hình thành chồi bất ñịnh nhưng chồi rất khó ra rễ.

Ở một số loài thực vật, mặc dù sự hình thành chồi ñược cảm ứng bởi cytokinin

nhưng chồi không xuất hiện cho ñến khi mẫu ñược chuyển sang môi trường giảm

hoặc không có cytokinin. Cytokinin cần cho giai ñoạn cảm ứng tạo chồi nhưng kìm

hãm sự kéo dài của chồi. Những vấn ñề này có thể khắc phục bằng cách giảm nồng

ñộ chất ñiều hòa sau vài lần cấy chuyền ñể chồi ñược phát triển tốt [15].

1.2.3.3 Sự phối hợp auxin và cytokinin trong phát sinh cơ quan

Auxin phối hợp với cytokinin giúp tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo

mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Tuy nhiên, ở nồng ñộ cao, auxin cản sự

phát triển của phát thể chồi vừa thành lập hay của chồi nách [11].

Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, nhất là khi phối hợp với auxin.

Cytokinin tác ñộng trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân

bào. Dù hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng nhưng cũng có sự ñối kháng giữa

cytokinin (giúp sự tạo chồi) auxin (giúp sự tạo rễ). Vì vậy, trong con ñường phát

sinh hình thái thông qua mô sẹo, việc phối hợp cytokinin và auxin sẽ quyết ñịnh

chiều hướng phát sinh hình thái. Miller và Skoog (1965) ñã chứng minh mô sẹo

thuốc lá tạo rễ hay chồi tuỳ theo tỷ lệ auxin/cytokinin thấp giúp sự tạo chồi [11].

1.2.2.4 Giberelin

Giberelin kích thích sự kéo dài tế bào bởi cơ chế kiểm soát hướng ñặt của các

vi sợi. Nó cũng có tác dụng kéo dài lóng do sự phối hợp hoạt tính kéo dài và phân

chia tế bào thân. Giberelin kích thích mạnh sự phân chia tế bào nhu mô vỏ và biểu

bì. Giberelin cũng có tác ñộng kích thích sự tăng trưởng chồi và gỡ sự ngủ của chồi.

Tuy nhiên giberelin có những ảnh hưởng khác nhau trên sự hình thành chồi trong

nuôi cấy in vitro ở những loại thực vật khác nhau [11].

1.2.2.5 Acid abcisic (ABA)

ABA ñược xem là một nhân tố kìm hãm quá trình sinh lý, ñặt biệt là sự tăng

trưởng của thực vật. Tuy nhiên, cũng như những hormon khác, tác ñộng kích thích

hay kìm hãm quá trình sinh lý của ABA còn tuỳ thuộc vào nồng ñộ xử lý, và sự

tương tác của ABA với những hormon khác [11].

1.2.2.6 Ethylen

Ethylen là nhóm chất ức chế, gây sự lão suy tế bào. Ethylen ñược hình thành

từ tiền chất là SAM (S-adenosiylmethionin, trước ñó là methionin), thông qua các

enzyme ACC-synthase, và ACC oxydase ñể biến ñổi lần lược thành ACC (acid l –

amino-cyclopropan-l-carboxylic) và etylen. Hoạt tính của các chất trên dễ bị cản bởi

một số hoá chất như: AVG (aminoethoxyvinylglincin), CoCl2 và AgNO3. AVG cản sự ñổi SAM thành ACC. Cobalt cản bước sau cùng ACC thành etylen. Ion Ag+ có

tác ñộng cản hoạt ñộng của etylen [11].

ACC ức chế sự hình thành rễ bằng cách trì hoãn sự xuất hiện rễ và gia tăng

sự hình thành mô sẹo ở gốc của chồi. Ngược lại, cả hai chất ức chế hoạt ñộng của

etylen là AgNO3 và AVG ở nồng ñộ thích hợp ñều thúc ñẩy sự tạo rễ và làm giảm

sự hình thành mô sẹo ở gốc của chồi. AgNO3 kích thích sự xuất hiện và sự tăng

trưởng của rễ trong khi AVG gia tăng số rễ trên một chồi. CoCl2 làm tăng nhẹ số rễ

và sự hình thành rễ. Những ảnh hưởng này là do sự giảm nồng ñộ etylen hoặc ức

chế hoạt ñộng của etylen [15].

1.2.3 Một số yếu tố khác ảnh hưởng ñến sự phát sinh hình thái thực vật

1.2.3.1 Tuổi của mô cấy

Hiệu quả tác ñộng của các chất ñiều hoà tăng trưởng thực vật trên sự phát

sinh hình thái phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của mô cấy.

Ở nhiều loài, ñặc biệt ở cây thân gỗ, chồi bất ñịnh ñược hình thành một cách

dễ dàng ở những mô trẻ từ các bộ phận của cây con mới nẩy mầm hơn những khúc

cắt từ cây trưởng thành [4].

1.2.3.2 Ánh sáng

Ánh sáng có tác ñộng ñến sự tăng trưởng và khả năng phát sinh hình thái của tế bào trong nuôi cấy in vitro. Tuy nhiên mỗi loài thực vật khác nhau có những ñáp

ứng khác nhau với từng loại ánh sáng, cường ñộ và thời gian chiếu sáng khác nhau.

Thường sự hình thành rễ xảy ra trong tối [4].

1.2.3.3 Nhiệt ñộ

Trong nuôi cấy mô in vitro, mỗi loài thực vật khác nhau có những

ngưỡng nhiệt ñộ tối hảo khác nhau. Đa số các loài hình thành chồi ở nhiệt ñộ 220C – 250C [4].

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Li Z. (2004) thuộc Trường ñại học Xihua ở Chengdu, Trung Quốc, nghiên

cứu ñiều kiện nuôi cấy tối ưu mô sẹo mướp ñắng ghi nhận, trong môi trường MS

có bổ sung casein 100mg, glucose 30g/l, BA 0,5mg/l, 2,4-D 0,2mg/l là ñiều kiện

tối ưu cho sự hình thành mô sẹo [17].

Yang và cộng sự (2004) ghi nhận, khi nuôi cấy mô mướp ñắng cho ba loại

mô sẹo khác nhau: mô sẹo vàng trong, vàng xanh và xanh. Những mô sẹo này

tiếp tục nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA 4,0mg/l và kinetin 2,0mg/l

cho chồi bất ñịnh sau ba tuần nuôi cấy. Tỷ lệ chồi bất ñịnh hình thành trên từng

loại mô sẹo khác nhau. 66,7% ñối với mô sẹo vàng xanh, rất thấp ở mô sẹo xanh

(< 15,0%) thậm chí thấp hơn nữa, chồi bất ñịnh không hình thành trên mô sẹo

vàng trong. Môi trường MS bổ sung zeatin 5,0mg/l và kinetin 0,5mg/l thích hợp

cho phát sinh chồi, hệ số phát sinh là 5 - 6. Môi trường ½ MS và kinetin

0,02mg/l hoặc môi trường ½ MS sau 3 tuần nuôi cấy cho thân và rễ. Tỷ lệ sống

sót khi ñem trồng là 70% [20].

Thiruvengadam và cộng sự (2006) nghiên cứu về sự tối ưu hoá hệ thống

phát sinh phôi soma ở mướp ñắng cho thấy, sẹo bở mướp ñắng nuôi cấy trong

môi trường MS lỏng bổ sung 2,4-D 1,5 mg/l cho phôi hình cầu (24,6%). Việc

loại bỏ hoàn toàn 2,4-D ra khỏi môi trường kích thích hình thành nên phôi hình

tim và hình cá ñuối. Từ tế bào soma hình thành nên tế bào tiền phôi, từ ñó phát

triển thành phôi hình tim, hình cá ñuối trong vòng hai tuần trên môi trường MS

không bổ sung chất ñiều hoà sinh trưởng. Nhưng nếu trong môi trường trên ñược

bổ sung thêm PVP (polyvinylpyrrolidone) 50 mg/l và glutamine 40 mg/l, phôi

soma ñược hình thành nhiều hơn và thường xuyên hơn [29].

Agarwal và cộng sự (2006) nghiên cứu sự tổng hợp flavonoid của mô sẹo

và cây mướp ñắng trong nuôi cấy in vitro trên môi trường MS có bổ sung Auxin

và cytokinin với các nồng ñộ khác nhau ghi nhận có 3 loại flavonoid. Hàm lượng

tổng số flavonoid ở mô sẹo sau sáu tuần nuôi cấy là 2,90 mg/g, ở thân là 2,96

mg/g trọng lượng khô… [12].

Al Munsur1 và cộng sự (2009) nhân giống invitro mướp ñắng từ ñốt thân

và rễ cây non sau 10 ñến 12 ngày gieo hạt trên môi trường MS có bổ sung BA

kết hợp với 2,4-D hoặc NAA ghi nhận, mẫu ñốt thân cho tỷ lệ mô sẹo cao nhất

(93,75%) khi nuôi cấy có bổ sung 2,4-D 1,0mg/l và BA 1,0mg/l. Mẫu cấy rễ cho

tỷ lệ mô sẹo cao nhất (85,00%) với NAA 0,6 mg/l. Ngoài ra, bổ sung 2,4-D 1,0

mg/l và BA 1,0 mg/l tỷ lệ tái sinh chồi là 75,00% từ ñốt thân, chồi tái sinh ñạt

chiều cao nhất (5,15cm) khi kết hợp BA 2,5 mg/l và IAA 0,2 mg/l. Không có sự

tái sinh chồi từ mẫu cấy rễ ở bất kì sự kết hợp nào [13].

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong nước có rất ít tài liệu nghiên cứu về cây mướp ñắng ñược công bố.

Nguyễn Bá và cộng sự (1992), bước ñầu xây dựng ñược quy trình nhân

nhanh in vitro cây mướp ñắng và ñã ñưa ra trồng thử nghiệm cây mướp ñắng ở

quy mô nhỏ [26].

2.1 Nội dung nghiên cứu

1- Tìm hiểu thời gian và nồng ñộ chất khử trùng thích hợp. 2- Môi trường & chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp (auxin,

cytokinin) ñể tạo và tăng sinh mô sẹo.

3- So sánh phản ứng tạo mô sẹo giữa các nguồn mẫu cấy khác nhau (tử diệp,

trụ hạ diệp, lá non,…).

4- Khảo sát sự tạo chồi (cụm chồi, tăng trưởng chồi) từ mô sẹo. 5- Khảo sát sự tạo rễ từ những chồi thu nhận. 6- Khảo sát khả năng thích ứng của con in vitro ngoài vườn ươm.

2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Nguồn vật liệu: hột mướp ñắng do công ty GINO - Seed & Agriculture TP Hồ

Chí Minh cung cấp. Hột giống có ñộ sạch ≥ 98%, tỷ lệ nảy mầm ≥ 80%, ñộ ẩm < 12%.

- Lớp mỏng tế bào ñược thu nhận từ các bộ phận khác nhau (Lá non, ñốt tử

diệp, tử diệp, trụ hạ diệp) của cây in vitro 6 – 7 ngày tuổi nảy mầm từ hột mướp ñắng (ñược nuôi trong ñiều kiện nhiệt ñộ 22 ± 20C, ñộ ẩm 55% ± 10%, ánh sáng

2000 lux ± 300lux).

- Trong các thí nghiệm, môi trường nuôi cấy ñược sử dụng là môi trường ña

lượng và vi lượng theo thành phần khoáng của môi trường MS (Murashige và Skoog,

1962) bổ sung thêm các thành phần:

+ Nước dừa 20%

+ Đường saccharose (nhà máy ñường Biên Hòa, Đồng Nai sản xuất): 20 g/l

+ Agar (công ty Hạ Long, Hải Phòng sản xuất): 5,8 - 6 g/l

+ Các chất ñiều hòa tăng trưởng tùy theo từng thí nghiệm: auxin (2,4-D,

AIA), cytokinin (BA).

Môi trường ñược chỉnh pH = 5,8 (chỉnh bằng NaOH 1N và HCl 1N), ñược hấp

khử trùng bằng autoclave ở nhiệt ñộ 121oC và áp suất 1 atm trong thời gian 20 phút.

1cm

B

C

D

E

A

F

Ảnh 2.1: Cây khổ qua 7 ngày tuổi (A), lá (B), tử diệp (C), ñốt tử diệp (D), trụ hạ diệp cắt dọc

(1mm) (E), trụ hạ diệp cắt ngang (1mm) (F).

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiệm ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật - ĐH

Khoa học Tự nhiên TP HCM và phòng thí nghiệm SHTV – ĐH Tây Nguyên.

Thời gian thực hiện: 11/2009 ñến 9/1010. 2.3.1 Thí nghiệm khử trùng hột mướp ñắng

- Dung dịch calcium hypochlorite có nồng ñộ thay ñổi từ 5 - 15% với thời

gian khử trùng từ 10 - 20 phút.

- Dung dịch javel có hàm lượng chlor 38g/l (do cơ sở nước Javel Vân

Phương, Quận 11, TP Hồ Chí Minh sản xuất) pha loãng tỷ lệ javel : nước là 1:0 và

1:1 (V:V) với thời gian khử trùng từ 10 - 20 phút.

- Dung dịch thuỷ ngân chlorite nồng ñộ 0,1% với thời gian khử trùng từ 5 -

15 phút.

Ghi nhận % mẫu sạch, sống sau 6 ngày khử trùng và gieo hạt.

2.3.2 Thí nghiệm tạo mô sẹo từ các nguồn mẫu của cây mướp ñắng

- Lá non cây in vitro 6 - 7 ngày tuổi ñược cắt thành mảnh khoảng 1cm2, tạo

các vết thương (ảnh 2.1B).

- Tử diệp, ñốt tử diệp ñược cắt thành các lớp mỏng (0,5 - 1mm) theo chiều

ngang (ảnh 2.1C, D).

- Trụ hạ diệp ñược cắt thành các lớp mỏng (0,5 - 1mm) theo chiều dọc, chiều

ngang (ảnh 2.1 E, F).

Các mẫu này ñược ñặt trên môi trường MS có bổ sung chất ñiều hoà sinh

trưởng thực vật: auxin (2,4-D hay AIA) có hoặc không có kết hợp với cytokinin (BA)

ở các nồng ñộ thay ñổi như sau:

(cid:1) Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lá

Bảng 2.1 a: Bố trí thí nghiệm

Nghiệm thức

2,4-D (mg/l)

0,2

0,5

Bảng 2.1 b: Bố trí thí nghiệm

Nghiệm thức

2,4-D (mg/l)

BA (mg/l)

0,2

0,5

0,2

0,5

AIA (mg/l)

BA (mg/l)

0,5

L10

0,5

L11

(cid:1) Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp

Bảng 2.2 a: Bố trí thí nghiệm

Nghiệm thức

2,4-D (mg/l)

0,2

0,5

Bảng 2.2 b: Bố trí thí nghiệm

Nghiệm thức

2,4-D (mg/l)

BA (mg/l)

0,2

0,5

0,2

0,5

AIA (mg/l)

BA (mg/l)

0,5

D10

0,5

D11

(cid:1) Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng tử diệp

Bảng 2.3 a: Bố trí thí nghiệm

Nghiệm thức

2,4-D (mg/l)

0,2

0,5

Bảng 2.3 b: Bố trí thí nghiệm

Nghiệm thức

2,4-D (mg/l)

BA (mg/l)

0,2

0,5

0,2

0,5

AIA (mg/l)

BA (mg/l)

0,5

T10

0,5

T11

(cid:1) Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc

Bảng 2.4 a: Bố trí thí nghiệm

Nghiệm thức

2,4-D (mg/l)

HD0

0,2

HD1

0,5

HD2

HD3

Bảng 2.4 b: Bố trí thí nghiệm

Nghiệm thức

2,4-D (mg/l)

BA (mg/l)

0,2

HD4

0,2

HD5

0,5

HD6

0,2

HD7

0,5

HD8

HD9

AIA (mg/l)

BA (mg/l)

0,5

HD10

0,5

HD11

(cid:1) Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt

ngang

Bảng 2.5 a: Bố trí thí nghiệm

Nghiệm thức

2,4-D (mg/l)

HN0

0,2

HN1

0,5

HN2

HN3

Bảng 2.5 b: Bố trí thí nghiệm

Nghiệm thức

2,4-D (mg/l)

BA (mg/l)

0,2

HN4

0,2

HN5

0,5

HN6

0,2

HN7

0,5

HN8

HN9

AIA (mg/l)

BA (mg/l)

0,5

HN10

0,5

HN11

Nuôi cấy trong tối ở 220C ± 20C, ñộ ẩm 55% ± 10%. Theo dõi biểu hiện của

mẫu cấy, trọng lượng tươi, gia tăng trọng lượng tươi, gia tăng trọng lượng khô và

cường ñộ hô hấp sau 2 - 5 tuần nuôi cấy. So sánh phản ứng tạo sẹo giữa các nguồn

mẫu cấy và môi trường có nồng ñộ các chất ñiều hoà sinh trưởng khác nhau.

2.3.3 Thí nghiệm tạo chồi từ mô sẹo và tạo rễ từ những chồi thu nhận

(cid:1) Tạo chồi từ mô sẹo

Mô sẹo ñược chia làm 2 nhóm:

Nhóm 1: mô sẹo ñược hình thành trên môi trường MS chỉ bổ sung 2,4-D hoặc 2,4-D

kết hợp với BA.

Nhóm 2: mô sẹo ñược hình thành trên môi trường MS bổ sung AIA kết hợp với BA.

Chuyển mô sẹo tăng trưởng tốt từ kết quả của 2 nhóm trên vào môi trường MS bổ

sung thêm chất ñiều hoà sinh trưởng cytokinin (BA) có hoặc không có kết hợp với AIA

0,02mg/l.

Bảng 2.6 a: Bố trí thí nghiệm

Nghiệm thức

BA (mg/l)

0,2

0,5

1,5

2,5

Bảng 2.6 b: Bố trí thí nghiệm

Nghiệm thức

BA (mg/l)

AIA (mg/l)

0,2

0,5

S10

1,5

S11

0,02

S12

2,5

S13

S14

(cid:1) Tạo rễ từ những chồi thu nhận

Các cụm chồi hình thành trên môi trường thích hợp ñược tách ra thành các

chồi và tiến hành cấy chuyền vào môi trường MS cơ bản và MS bổ sung thêm AIA

với nồng ñộ thay ñổi nhằm kích thích sự tạo rễ.

Bảng 2.7: Bố trí thí nghiệm

Nghiêm thức

AIA (mg/l)

0,2

0,5

1,5

- Nhiệt ñộ phòng nuôi: 220C ± 20C

- Cường ñộ chiếu sáng 2000 ± 300lux

- Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ngày

- Ẩm ñộ trung bình 55% ± 10%.

• Quan sát thời ñiểm xuất hiện chồi ñầu tiên, tỷ lệ tạo chồi, số chồi ñược ghi

nhận sau 4 tuần nuôi cấy. • Quan sát thời ñiểm xuất hiện rễ ñầu tiên, tỷ lệ tạo rễ, số rễ, chiều dài rễ ñược

ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy. • Quan sát hình thái giải phẫu: mẫu ñược cắt bằng tay và quan sát dưới kính

hiển vi quang học sự biến ñổi trong quá trình phát sinh hình thái chồi và rễ.

2.3.4 Khảo sát khả năng thích ứng của cây con ngoài vườn ươm

•

Cây con in vitro có ñủ rễ ñược trồng trên giá thể trấu hun, tưới nước ngày 2

lần.

•

Theo dõi tỷ lệ cây sống sót và sức sống của cây ngoài vườn ươm.

2.3.5 Đo cường ñộ hô hấp

Cường ñộ hô hấp của các mẫu thí nghiệm ñược xác ñịnh bằng máy ño sự trao ñổi khí Leafab 2 (Hansatech) với ñiện cực oxygen ở nhiệt ñộ 280C, ñơn vị tính là

µmol/g trọng lượng tươi/giờ.

2.3.6 Xử lý số liệu

Khảo sát 10 mẫu/nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.

Các số liệu ñược xử lý thống kê bằng chương trình Statiscal Program

Scienttific System (SPSS) phiên bản 16.0 dùng cho Windows. Sự khác biệt có ý

nghĩa ở mức 0,05 của giá trị ñược biểu hiện bằng các mẫu tự khác nhau.

3.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ các chất khử trùng và thời gian khử trùng lên hột

mướp ñắng

(A)

(B)

(C)

Hình 3.1 Tỷ lệ mẫu sạch và sống sau khi khử trùng bởi dung dịch chất khử trùng với nồng ñộ và thời gian khác nhau (A): javel (B): calcium hypochlorite (C): thủy ngân chlorite

Qua kết quả khử trùng ở hình 3.1 cho thấy:

Trong 3 chất khử trùng trên, dung dịch javel cho tỷ lệ mẫu sạch và sống

thấp nhất (từ 66,67 – 86,67%) ñến dung dịch calcium hypochlorite (từ 66,67 -

90,00%). Dung dịch thủy ngân chlorite 0,1% cho tỷ lệ mẫu sạch và sống cao nhất

(86,67 – 93,33%).

Nhìn chung, ñối với 2 chất khử trùng là dung dịch calcium hypochlorite và

dung dịch javel, khi giảm nồng ñộ chất khử trùng, tỷ lệ mẫu sạch giảm ñáng kể.

Trong khi ñó, ở cùng nồng ñộ, tỷ lệ mẫu sạch không khác biệt nhiều khi xử lý

với thời gian khác nhau. Do ñó, tỷ lệ mẫu sạch bị ảnh hưởng nhiều hơn bởi nồng

ñộ chất khử trùng.

Như vậy, dung dịch thủy ngân chlorite 0,1%, thời gian xử lý 10 - 15 phút

và dung dịch calcium hypochlorite 15% với thời gian khử trùng 20 phút thích

hợp nhất ñể khử trùng hạt mướp ñắng.

3.2 Sự tạo mô sẹo

3. 2.1 Sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo từ các nguồn mẫu

Trong ñiều kiện tối hoàn toàn, ở hầu hết các nghiệm thức có bổ sung auxin

(2,4-D, AIA) có hoặc không kết hợp cytokinin (BA), các nguồn mẫu (lá, lớp mỏng

ñốt tử diệp, lớp mỏng tử diệp, lớp mỏng trụ hạ diệp) ñều hình thành mô sẹo sau một

tuần nuôi cấy. Mô sẹo bắt ñầu xuất hiện tại những vết cắt ngang gân lá, phần ngoài

rìa các nguồn mẫu. Sau ñó, kích thước, trọng lượng tươi của mô sẹo tăng dần theo

thời gian nuôi cấy, ñặc biệt là khối mô sẹo tiếp xúc trực tiếp với môi trường. Ở các

nghiệm thức không bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật (L0, D0, T0, HD0,

HN0) và các nghiệm thức chỉ bổ sung 2,4–D 1mg/l (L1, D1, T1, HD1, HN1) ñều có

sự xuất hiện rễ (ảnh 3.1A, B; 3.3A, B; 3.5A, B; 3.7A, B).

3.2.1.1 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lá

Bảng 3.1a: Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lá sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin (2,4-D)

Trọng lượng tươi (g)

Nghiệm thức

2 tuần 0,02± 0,00a 0,15 ± 0,04b 0,22 ± 0,05b 0,49 ± 0,01e

3 tuần 0,09 ± 0,01a 0,21 ± 0,07b 0,43 ± 0,03cd 0,59 ± 0,02e

4 tuần 0,1 ± 0,01a 0,36 ± 0,02b 0,61 ± 0,04c 0,87 ± 0,01e

5 tuần 0,12 ± 0,01a 0,51 ± 0,02b 0,67 ± 0,03c 0,98 ± 0,29f L3 Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%

Ở các nghiệm thức chỉ bổ sung 2,4-D, mô sẹo ñược hình thành từ lá có màu

vàng, trắng và xốp (ảnh 3.1B). Mô sẹo này bắt ñầu chuyển sang nâu và trở nên

chắc hơn ở tuần thứ 4 và 5. Trọng lượng tươi khối mô sẹo tăng dần theo sự tăng

của nồng ñộ 2,4-D. Trọng lượng tươi khối mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy khoảng 0,51

– 0,98g. Trong ñó, môi trường theo nghiệm thức bổ sung 2,4-D 1mg/l (L3) cho mô

sẹo tốt nhất (0,98g) (bảng 3.1a).

Bảng 3.1b: Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lá sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) kết hợp với cytokinin (BA)

Nghiệm thức

L9

L10

Trọng lượng tươi (g) 3 tuần 0,24 ± 0,04b 0,34 ± 0,02c 0,45 ± 0,05d 0,53 ± 0,02de 0,71 ± 0,02f 0,87 ± 0,05g 0,35± 0,05c 0,47 ± 0,03d

4 tuần 0,42 ± 0,02b 0,71 ± 0,02d 0,65 ± 0,06cd 0,85 ± 0,03e 1,02 ± 0,03f 1,04 ± 0,04f 0,68 ± 0,02cd 0,71 ± 0,02d

2 tuần 0,17 ± 0,03b 0,19 ± 0,02b 0,22 ± 0,05b 0,31 ± 0,03cd 0,39 ± 0,02de 0,59 ± 0,02f 0,19 ± 0,03b 0,25 ± 0,05bc

5 tuần 0,66 ± 0,02c 0,73 ± 0,02cd 0,78 ± 0,06de 1,03 ± 0,01f 1,03 ± 0,02f 1,30 ± 0,05g 0,68 ± 0,03c 0,82 ± 0,02e L11 Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%

Đối với môi trường có bổ sung 2,4-D kết hợp với BA, mô sẹo có màu vàng

hơi xanh, trắng, ít xốp hơn (ảnh 3.1C). Mô sẹo bắt ñầu chuyển sang nâu ở tuần thứ

5, chậm hơn so với những nghiệm thức chỉ có bổ sung 2,4-D (ảnh3.2).

Trọng lượng tươi khối mô sẹo tăng dần theo sự tăng của nồng ñộ 2,4–D và

BA có trong môi trường nuôi cấy. Trọng lượng tươi khối mô sẹo sau 5 tuần nuôi

cấy khoảng 0,66 – 1,30g (bảng 3.1b).

Đối với môi trường có bổ sung AIA kết hợp với BA 0,5mg/l (L10, L11),

mô sẹo hình thành từ tuần 1 ñến tuần 4 có màu vàng xanh, trắng và xốp (ảnh 3.1D).

Trọng lượng tươi khối mô sẹo tăng dần theo sự tăng của nồng ñộ AIA.

Sau 5 tuần nuôi cấy, trọng lượng tươi khối mô sẹo trong khoảng 0,68 –

0,82g, không có sự hình thành rễ ở các nghiệm thức (bảng3.1b, ảnh 3.1D).

Như vậy, nguồn auxin thích hợp cho sự hình thành mô sẹo từ lá mướp ñắng

là 2,4-D, trong ñó môi trường theo nghiệm thức bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l

(L9) cho mô sẹo phát triển tốt nhất (1,30g).

1cm

B

1cm

A

1 cm

C

D

Ảnh 3.1: Mô sẹo từ lá 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ

(A): môi trường MS ñối chứng

(B): môi trường MS bổ sung 2,4-D 1mg/l

(C): môi trường MS bổ sung 2,4-D 1mg/l Và BA 1mg/l (D): môi trường MS bổ sung AIA 2mg/l và BA 0,5mg/l

1 cm

Ảnh 3.2: Mô sẹo từ lá 5 tuần tuổi trên môi trường MS bổ sung 2,4-D1mg/l và BA 1mg/l

3.2.1.2 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp

Bảng 3.2a: Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng ñốt tử diệp sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin (2,4-D)

Trọng lượng tươi (g)

Nghiệm thức

3 tuần 0,03 ± 0,00a 0,23 ± 0,02b 0,27 ± 0,03b 0,64 ± 0,02de

2 tuần 0,02 ± 0,00a 0,12 ± 0,04b 0,12 ± 0,01b 0,25 ± 0,04c

4 tuần 0,11 ± 0,01a 0,46 ± 0,02b 0,53 ± 0,04b 0,86 ± 0,02e

5 tuần 0,19 ± 0,03a 0,53 ± 0,02b 0,66 ± 0,05c 0,94 ± 0,03ef

D0 D1 D2 D3 Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%

Các nghiệm thức chỉ bổ sung 2,4-D, sau 3 tuần nuôi cấy, mô sẹo ñược hình

thành có màu vàng ñậm, trắng và xốp (ảnh 3.3B). Mô sẹo này bắt ñầu chuyển sang

nâu và trở nên chắc hơn ở tuần thứ 4. Trọng lượng tươi khối mô sẹo tăng dần theo

sự tăng của nồng ñộ 2,4-D. Trọng lượng tươi khối mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy

khoảng 0,53 – 0,94g. Trong ñó, môi trường theo nghiệm thức bổ sung 2,4-D 1mg/l

(D3) cho mô sẹo tốt nhất (0,94g) (bảng 3.2a).

Bảng 3.2b: Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng ñốt tử diệp sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) kết hợp với cytokinin (BA)

Trọng lượng tươi (g)

2 tuần 0,15 ± 0,01b 0,15 ± 0,02b 0,19 ± 0,05bc 0,15 ± 0,01b 0,20 ± 0,04bc 0,33 ± 0,01d 0,19 ± 0,01bc 0,24 ± 0,01c

4 tuần 0,47 ± 0,02b 0,67 ± 0,02c 0,73 ± 0,06cd 1,04 ± 0,03f 1,08 ± 0,03f 1,23 ± 0,04g 0,77 ± 0,02d 0,86 ± 0,02e

3 tuần 0,24 ± 0,04b 0,28 ± 0,03b 0,24 ± 0,04b 0,47 ± 0,05c 0,59 ± 0,05d 0,73 ± 0,01e 0,38 ± 0,02c 0,40 ± 0,03c

5 tuần 0,54 ± 0,03b 0,86 ± 0,02de 0,86 ± 0,04de 1,03 ± 0,03f 1,17 ± 0,04g 1,53 ± 0,04h 0,81 ± 0,05d 0,89 ± 0,05de

Nghiệm thức D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%

Đối với môi trường có bổ sung 2,4-D kết hợp với BA, mô sẹo có màu vàng

xanh, trắng, ít xốp hơn ( ảnh 3.3D). Mô sẹo bắt ñầu chuyển sang nâu ở tuần thứ 5,

chậm hơn so với những nghiệm thức chỉ có bổ sung 2,4-D (ảnh3.4).

Trọng lượng tươi khối mô sẹo tăng dần theo sự tăng của nồng ñộ 2,4–D và

BA có trong môi trường nuôi cấy. Trọng lượng tươi khối mô sẹo sau 5 tuần nuôi

cấy khoảng 0,54 – 1,53g (bảng 3.2b).

Đối với môi trường có bổ sung AIA kết hợp với BA 0,5mg/l (D10, D11),

mô sẹo hình thành từ tuần 1 ñến tuần 4 có màu vàng xanh, trắng và xốp. Trọng

lượng tươi khối mô sẹo tăng dần theo sự tăng của nồng ñộ AIA. Trọng lượng tươi

khối mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy trong khoảng 0,81 – 0,89g, không có sự hình thành

rễ ở các nghiệm thức (bảng3.2b, ảnh 3.3D).

Sự hình thành mô sẹo không ñồng ñều ở các lớp mỏng ñốt tử diệp. Lớp mỏng

ñốt tử diệp ở giữa ñốt, mô sẹo ñược hình thành nhiều nhất, ñến ñầu ñốt, sau cùng là

cuối ñốt tử diệp (tính theo chiều từ trên chồi ngọn xuống rễ của cây).

Như vậy, sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo cũng giống như các mẫu lá

tương ứng trên các môi trường chỉ bổ sung 2,4–D hoặc môi trường có bổ sung 2,4–D kết

hợp với BA hay môi trường có bổ sung AIA kết hợp với BA. Nguồn auxin thích hợp

cho sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp là 2,4-D. Môi trường theo nghiệm

thức có nồng ñộ 2,4–D 1mg/l và BA 1mg/l (D3), sự hình thành mô sẹo tốt nhất (1,53g)

(bảng 3.2a, b; ảnh 3.3).

1 cm

A

B

1.2 cm

1 cm

D

C

Ảnh 3.3: Mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp 3 tuần tuổi, mũi tên chỉ rễ

(A): môi trường MS ñối chứng (B): môi trường MS bổ sung 2,4-D 1mg/l

(C): môi trường MS bổ sung 2,4-D 1mg/l Và BA 1mg/l (D): môi trường MS bổ sung AIA 2mg/l và BA 0,5mg/l

1 cm

Ảnh 3.4: Mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp 5 tuần tuổi trên môi trường MS bổ sung 2,4- D1mg/l và BA 1mg/l

3.2.1.3 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng tử diệp

Bảng 3.3a: Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử diệp sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin (2,4-D)

Trọng lượng tươi (g)

2 tuần 0,12 ± 0,03ab 0,11 ± 0,01ab 0,19 ± 0,04abc 0,18 ± 0,04abc

4 tuần 0,13 ± 0,05a 0,33 ± 0,02b 0,49 ± 0,05cde 0,77 ± 0,04f

3 tuần 0,13 ± 0,02a 0,24 ± 0,02b 0,27 ± 0,03bc 0,48 ± 0,02f

5 tuần 0,14 ± 0,0289a 0,41 ± 0,0150b 0,45 ± 0,0502b 0,83 ± 0,0318e

Nghiệm thức T0 T1 T2 T3 Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%

Đối với môi trường chỉ bổ sung 2,4-D, sau 3 tuần nuôi cấy, mô sẹo ñược hình

thành từ lớp mỏng tử diệp có màu vàng hơi xanh, trắng và xốp (ảnh 3.3B). Mô sẹo

này bắt ñầu chuyển sang nâu và trở nên chắc hơn ở tuần thứ 4. Trọng lượng tươi

khối mô sẹo tăng dần theo sự tăng của nồng ñộ 2,4-D. Trọng lượng tươi khối mô

sẹo sau 5 tuần nuôi cấy khoảng 0,41 – 0,83g. Trong ñó, môi trường theo nghiệm

thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l (T3) cho mô sẹo tốt nhất (0,83g) (bảng 3.3a).

Bảng 3.3b: Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử diệp sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) kết hợp với cytokinin (BA)

Trọng lượng tươi (g)

4 tuần 0,41 ± 0,02bc 0,44 ± 0,02cd 0,47 ± 0,05cde 0,95 ± 0,04g 0,94 ± 0,02g 0,81 ± 0,02f 0,54 ± 0,01de 0,57 ± 0,02e

2 tuần 0,12 ± 0,01ab 0,13 ± 0,01ab 0,12 ± 0,05ab 0,25 ± 0,02c 0,22 ± 0,01bc 0,21 ± 0,03abc 0,10 ± 0,05a 0,11 ± 0,04ab

3 tuần 0,26 ± 0,04bc 0,36 ± 0,03de 0,38 ± 0,04de 0,51 ± 0,05f 0,54 ± 0,05f 0,55 ± 0,01f 0,35 ± 0,04cd 0,46 ± 0,03ef

Nghiệm thức 5 tuần 0,42 ± 0,03b T4 0,57 ± 0,02cd T5 0,52 ± 0,04bc T6 0,99 ± 0,03f T7 0,92 ± 0,04ef T8 0,85 ± 0,04e T9 0,60 ± 0,05cd T10 0,64 ± 0,05d T11 Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%

Sự thay ñổi màu sắc, ñặc ñiểm mô sẹo cũng giống như mô sẹo ñược hình

thành từ lớp mỏng ñốt tử diệp tương ứng trên các môi trường bổ sung 2,4-D kết hợp

với BA hay AIA kết hợp với BA (ảnh 3.5, 3.6).

Ở các nghiệm thức có bổ sung 2,4-D kết hợp với BA, trọng lượng tươi khối

mô sẹo tăng dần theo sự tăng của nồng ñộ 2,4–D và BA có trong môi trường nuôi

cấy. Trọng lượng tươi khối mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy khoảng 0,57 – 0,99g (bảng

3.3b).

Đối với môi trường có bổ sung AIA kết hợp với BA 0,5mg/l (T10, T11),

trọng lượng tươi khối mô sẹo tăng dần theo sự tăng của nồng ñộ AIA. Trọng lượng

tươi khối mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy trong khoảng 0,60 – 0,64g, không có sự hình

thành rễ ở các nghiệm thức (bảng3.3b, ảnh 3.5D).

Sự hình thành mô sẹo không ñồng ñều ở các lớp mỏng. Lớp mỏng ñầu tử

diệp, mô sẹo ñược hình thành nhiều nhất, sau ñó giảm dần ñến lát mỏng cuối tử

diệp (tính từ gốc ñến chóp tử diệp).

Như vậy, nguồn auxin thích hợp cho sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng tử

diệp là 2,4-D. Môi trường có nồng ñộ 2,4–D 1mg/l và BA 0,2mg/l (T7), sự hình

thành mô sẹo tốt nhất (0,99g) (bảng 3.3a,b; ảnh 5.5).

B

1cm

A

D

1cm

E

Ảnh 3.5: Mô sẹo từ lớp mỏng tử diệp 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ

(A): môi trường MS ñối chứng (B): môi trường MS bổ sung 2,4-D 1mg/l

(C): môi trường MS bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l (D): môi trường MS bổ sung AIA 2mg/l và BA 0,5mg/l

1cm

Ảnh 3.6: Mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp 5 tuần tuổi trên môi trường MS bổ sung AIA 2mg/l và BA 0,5mg/l

3.2.1.4 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp

Nhìn chung, sự thay ñổi trọng lượng tươi, màu sắc, ñặc ñiểm mô sẹo ñược hình

thành từ lớp mỏng trụ hạ diệp cũng giống như các các nguồn mẫu lớp mỏng ñốt tử diệp,

lớp mỏng tử diệp tương ứng trên các môi trường có bổ sung 2,4-D hoặc môi trường có

bổ sung 2,4-D kết hợp với BA hay môi trường có bổ sung AIA kết hợp với BA. Nhưng

trọng lượng tươi của mô sẹo thấp hơn nhiều so với mô sẹo ñược hình thành từ các nguồn

mẫu trên (0,27-0,57g), (bảng 3.4a, 3.4 b, 3.4c, 3.4d; ảnh3.7; 3.8).

Bảng 3.4a: Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng hạ diệp cắt dọc sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin (2,4-D)

Trọng lượng tươi (g)

Nghiệm thức

HD0 HD1 HD2 HD3

2 tuần 0,03 ± 0,00a 0,12 ± 0,04bc 0,12 ± 0,01bc 0,26 ± 0,04e

3 tuần 0,05 ± 0,00a 0,25 ± 0,02bcd 0,25 ± 0,03bcd 0,49 ± 0,02f

4 tuần 0,08 ± 0,02a 0,26 ± 0,02bc 0,26 ± 0,04bc 0,753 ± 0,12g

5 tuần 0,06 ± 0,03a 0,29 ± 0,02b 0,29 ± 0,05b 0,54 ± 0,03de

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%

Đối với môi trường chỉ bổ sung 2,4-D, trọng lượng tươi của mô sẹo ñược hình

thành từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc sau 5 tuần nuôi cấy trong khoảng 0,29 – 0,54g.

Trong ñó, môi trường theo nghiệm thức bổ sung 2,4-D 1mg/l (HD3) cho mô sẹo tốt

nhất (0,54g) (bảng 3.4a).

Bảng 3.4b: Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng hạ diệp cắt dọc sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) kết hợp với cytokinin (BA) Trọng lượng tươi (g)

Nghiệm thức

HD4 HD5 HD6 HD7 HD8 HD9 HD10 HD11

2 tuần 0,12 ± 0,01bc 0,07 ± 0,02ab 0,12 ± 0,05bc 0,24 ± 0,01de 0,17 ± 0,04cd 0,20 ± 0,01cde 0,12 ± 0,01bc 0,17 ± 0,01cd

4 tuần 0,17 ± 0,02ab 0,30 ± 0,02bcd 0,25 ± 0,06bc 0,51 ± 0,03ef 0,55 ± 0,03f 0,48 ± 0,04ef 0,38 ± 0,02cde 0,42 ± 0,02def

3 tuần 0,21 ± 0,04bc 0,27 ± 0,03cd 0,17 ± 0,04b 0,50 ± 0,05f 0,51 ± 0,05f 0,38 ± 0,01e 0,31 ± 0,02cde 0,32 ± 0,03de

5 tuần 0,27 ± 0,03b 0,30 ± 0,02b 0,32 ± 0,04b 0,54 ± 0,03de 0,57 ± 0,04e 0,48 ± 0,04cde 0,39 ± 0,05bc 0,43 ± 0,05cd Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%

Đối với môi trường có bổ sung 2,4-D kết hợp với BA, trọng lượng tươi khối

mô sẹo ñược hình thành từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc sau 5 tuần nuôi cấy

khoảng 0,3 – 0,57g (bảng 3.4b).

Với môi trường có bổ sung AIA kết hợp với BA 0,5mg/l (HD10, HD11),

Trọng lượng tươi khối mô sẹo ñược hình thành từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc

sau 5 tuần nuôi cấy trong khoảng 0,39 – 0,43g, không có sự hình thành rễ ở các

nghiệm thức (bảng3.4b, ảnh 3.7D).

Vậy, môi trường theo nghiệm thức có bổ sung 2,4–D 1mg/l kết hợp với BA

0,5mg/l, lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc cho mô sẹo tốt nhất (0,57g).

Bảng 3.4c: Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng hạ diệp cắt ngang sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin (2,4-D)

Trọng lượng tươi (g)

Nghiệm thức

HN0 HN1 HN2 HN3

2 tuần 0,02 ± 0,00a 0,06 ± 0,04bc 0,07 ± 0,01bc 0,09 ± 0,04e

3 tuần 0,03 ± 0,00a 0,13 ± 0,02bcd 0,19 ± 0,03bcd 0,16 ± 0,02f

4 tuần 0,04 ± 0,14a 0,21 ± 0,04a 0,26 ± 0,03a 0,20 ± 0,12b

5 tuần 0,04 ± 0,03a 0,30 ± 0,02b 0,35 ± 0,05b 0,40 ± 0,03de

Ở các nghiệm thức chỉ bổ sung 2,4-D, trọng lượng tươi của mô sẹo ñược hình

thành từ lớp mỏng trụ ha diệp cắt ngang sau 5 tuần nuôi cấy trong khoảng 0,30 – 0,40g.

Môi trường theo nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l cho mô sẹo tốt nhất (bảng 3.4a,

ảnh 3,7B)

Bảng 3.4d: Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng hạ diệp cắt ngang sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) kết hợp với cytokinin (BA) Trọng lượng tươi (g)

Nghiệm thức

HN4 HN5 HN6 HN7 HN8 HN9 HN10 HN11

2 tuần 0,04 ± 0,01bc 0,06 ± 0,02ab 0,15 ± 0,05bc 0,13 ± 0,01de 0,11 ± 0,04cd 0,10 ± 0,01cde 0,06 ± 0,01bc 0,08 ± 0,01cd

3 tuần 0,18 ± 0,04bc 0,08 ± 0,03cd 0,23 ± 0,04b 0,38 ± 0,05f 0,29 ± 0,05f 0,15 ± 0,01e 0,10 ± 0,02cde 0,13 ± 0,03de

4 tuần 0,19 ± 0,08a 0,20 ± 0,03a 0,26 ± 0,03a 0,47 ± 0,08ab 0,34 ± 0,09ab 0,17 ± 0,03ab 0,17 ± 0,11a 0,18 ± 0,03ab

5 tuần 0,29 ± 0,03b 0,28 ± 0,02b 0,44 ± 0,04b 0,55 ± 0,03de 0,49 ± 0,04e 0,44 ± 0,04cde 0,36 ± 0,05bc 0,38 ± 0,05cd Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%

Ở các nghiệm thức bổ sung 2,4-D phối hợp với BA, trọng lượng tươi của

mô sẹo ñược hình thành từ lớp mỏng trụ ha diệp cắt ngang sau 5 tuần nuôi cấy

trong khoảng 0,28 – 0,55g (bảng 3.4d).

Với môi trường có bổ sung AIA kết hợp với BA 0,5mg/l (HN10, HN11),

Trọng lượng tươi khối mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy trong khoảng 0,36 – 0,38g,

không có sự hình thành rễ ở các nghiệm thức (bảng3.4d, ảnh 3.7D).

Vậy, nguồn auxin thích hợp cho sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp

là 2,4-D. Nghiệm thức có bổ sung 2,4–D 1 mg/l kết hợp với BA 0,2mg/l, lớp mỏng

trụ hạ diệp cắt ngang hình thành mô sẹo tốt nhất (0,55g).

1cm

Ảnh 3.7: Mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc(A, C) và ngang (B, D) 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ

(A): môi trường MS ñối chứng (B): môi trường MS bổ sung 2,4-D 1mg/l

(C): môi trường MS bổ sung 2,4-D 1mg/l Và BA 1mg/l (D): môi trường MS bổ sung AIA 2mg/l và BA 0,5mg/l

1cm

Ảnh 3.8: Mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc 5 tuần tuổi trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 0,5mg/l

3.2.2 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình tạo mô sẹo

Sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung auxin (2,4-D hoặc AIA) có

hoặc không có kết hợp với cytokinin (BA), vùng dưới biểu bì ở gân lá, vùng mô

tiếp xúc trực tiếp với môi trường bắt dầu phân chia. Ở tuần thứ 2, các tế bào mô sẹo

ngoài tách rời nhau làm mô sẹo trở nên xốp, mô sẹo bên trong trở nên chắc. Các

nhóm tế bào này tiếp tục duy trì sự phân chia và chuyển sang hóa nâu ở tuần thứ 4

và thứ 5 (ảnh3.9).

C

B

A

Ảnh 3.9: Sự phân chia của tế bào ở gân lá (A), tế bào mô sẹo phía ngoài sau 2 tuần (B), các tế bào mô sẹo phía ngoài cùng sau 5 tuần (C)

3.2.3 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược

hình thành từ các nguồn mẫu

Khi xác ñịnh CĐHH bằng máy ño sự trao ñổi khí Hansatech, kết quả cho

thấy, các nghiệm thức chỉ bổ sung 2,4-D có CĐHH cao nhất chủ yếu ở tuần thứ 2,

bắt ñầu giảm ở tuần thứ 3, 4. Còn các nghiệm thức có bổ sung 2,4-D kết hợp với

BA, thường CĐHH cao ở tuần thứ 2, tăng mạnh ở tuần thứ 3, sau ñó giảm dần ở

tuần thứ 4 và thứ 5. CĐHH giảm dần theo sự giảm của nồng ñộ 2,4–D và BA trong

môi trường nuôi cấy (hình 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6).

3.2.3.1 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược

hình thành từ lá

(A)

(B)

Hình 3.2: Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lá theo thời gian. (A) : môi trường chỉ bổ sung 2,4-D ở các nồng ñộ khác nhau (B) : môi trường bổ sung 2,4-D kết hợp với BA ở các nồng ñộ khác nhau

Đối với nguồn mẫu là lá, khi xử lý 2,4-D ở các nồng ñộ khác nhau, kết quả

cho thấy, CĐHH ở các nghiệm thức cao nhất ở tuần thứ 2, bắt ñầu giảm ở tuần thứ

3, 4. Trong ñó, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l (L3) có CĐHH cao nhất

(7,92µmol/g/giờ) (hình 3.2A).

Khi sử lý phối hợp 2,4-D với BA ở các nồng ñộ khác nhau, CĐHH ở các

nghiệm thức cao ở tuần thứ 2, tăng mạnh ở tuần thứ 3, sau ñó giảm dần ở tuần thứ 4

và thứ 5. Trong ñó, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l phối hợp với BA 1mg/l

(L9) có CĐHH cao nhất (9,66µmol/g/giờ) (hình 3.2B).

CĐHH giảm dần theo sự giảm của nồng ñộ 2,4–D và BA trong môi trường

nuôi cấy.

Vậy, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l kết hợp với BA 1mg/l (L9) có

CĐHH cao nhất (9,66µmol/g/giờ).

3.2.3.2 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược

hình thành từ lớp mỏng ñốt tử diệp

(A)

(B)

Hình 3.3: Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng ñốt tử diệp theo thời gian. (A) : môi trường chỉ bổ sung 2,4-D ở các nồng ñộ khác nhau (B): môi trường bổ sung 2,4-D kết hợp với BA ở các nồng ñộ khác nhau

Đối với nguồn mẫu là lớp mỏng ñốt tử diệp, khi xử lý 2,4-D ở các nồng ñộ

khác nhau, kết quả cũng cho thấy, CĐHH ở các nghiệm thức cao nhất ở tuần thứ 2,

bắt ñầu giảm ở tuần thứ 3, 4. Trong ñó, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l (D3)

có CĐHH cao nhất (8,76µmol/g/giờ) (hình 3.3A).

Khi sử lý phối hợp 2,4-D với BA ở các nồng ñộ khác nhau, CĐHH ở các

nghiệm thức cao ở tuần thứ 2, tăng mạnh ở tuần thứ 3, sau ñó giảm dần ở tuần thứ 4

và thứ 5. Trong ñó, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l phối hợp với BA 1mg/l

(D9) có CĐHH cao nhất (11,77µmol/g/giờ) (hình 3.3B).

CĐHH giảm dần theo sự giảm của nồng ñộ 2,4–D và BA trong môi trường

nuôi cấy.

Như vậy, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l kết hợp với BA 1mg/l (D9) có

CĐHH cao nhất (11,77 µmol/g/giờ).

3.2.3.3 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo

ñược hình thành từ lớp mỏng tử diệp

(A)

(B)

Hình 3.4: Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử diệp theo thời gian. (A): môi trường chỉ bổ sung 2,4-D ở các nồng ñộ khác nhau (B): môi trường bổ sung 2,4-D kết hợp với BA ở các nồng ñộ khác nhau

Tương tự như lá và lớp mỏng ñốt tử diệp, khi xử lý 2,4-D ở các nồng ñộ khác

nhau, kết quả cho thấy, CĐHH ở các nghiệm thức cao nhất ở tuần thứ 2, bắt ñầu giảm

ở tuần thứ 3, 4. Trong ñó, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l (T3) có CĐHH cao

nhất (6,00µmol/g/giờ) (hình 3.4A).

Khi sử lý phối hợp 2,4-D với BA ở các nồng ñộ khác nhau, CĐHH ở các

nghiệm thức cao ở tuần thứ 2, tăng mạnh ở tuần thứ 3, sau ñó giảm dần ở tuần thứ 4

và thứ 5. Trong ñó, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l phối hợp với BA 0,2mg/l

(T7) có CĐHH cao nhất (6,10µmol/g/giờ) (hình 3.4B).

CĐHH giảm dần theo sự giảm của nồng ñộ 2,4–D và BA trong môi trường nuôi cấy.

Vậy, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l kết hợp với BA 0,5mg/l (T8) có

CĐHH cao nhất (11,77 µmol/g/giờ).

3.2.3.4 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo

ñược hình thành từ lớp mỏng trụ hạ diệp

(A)

(B)

Hình 3.5: Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc diệp theo thời gian. (A): môi trường chỉ bổ sung 2,4-D ở các nồng ñộ khác nhau, (B): môi trường bổ sung 2,4-D kết hợp với BA ở các nồng ñộ khác nhau

Đối với lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc, sự thay ñổi cường ñộ hô hấp theo

thời gian khi xử lý 2,4-D hay xử lý phối hợp 2,4-D với BA ở các nồng ñộ khác

nhau tương tự như lớp mỏng tử diệp nhưng các nghiệm thức có CĐHH thấp hơn

(hình 3.5).

Trong các nghiệm thức chỉ bổ sung 2,4-D, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D

1mg/l (HD3) có CĐHH cao nhất (2,34µmol/g/giờ) (hình 3.5A).

Ở các nghiệm thức có bổ sung phối hợp 2,4-D với BA, nghiệm thức có bổ

sung 2,4-D 1mg/l phối hợp với BA 0,5mg/l (HD8) có CĐHH cao nhất

(3,50µmol/g/giờ) (hình 3.5B).

CĐHH giảm dần theo sự giảm của nồng ñộ 2,4–D và BA trong môi trường

nuôi cấy. Trong ñó, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l kết hợp với BA 0,5mg/l

(HD8) có CĐHH cao nhất.

(A)

(B)

Hình 3.6: Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt ngang theo thời gian. (A) : môi trường chỉ bổ sung 2,4-D ở các nồng ñộ khác nhau, (B): môi trường bổ sung 2,4-

D kết hợp với BA ở các nồng ñộ khác nhau

Đối với lớp mỏng trụ hạ diệp cắt ngang, sự thay ñổi cường ñộ hô hấp theo thời

gian khi xử lý 2,4-D hay xử lý phối hợp 2,4-D với BA ở các nồng ñộ khác nhau

tương tự như lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc.

Trong các nghiệm thức chỉ bổ sung 2,4-D, nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l

(HN3) có CĐHH cao nhất (2,04µmol/g/giờ) (hình 3.6A).

Ở các nghiệm thức có bổ sung phối hợp 2,4-D với BA, nghiệm thức có bổ

sung 2,4-D 1mg/l phối hợp với BA 0,2mg/l (HN7) có CĐHH cao nhất

(2,56µmol/g/giờ) (hình 3.6B).

Như vậy, CĐHH giảm dần theo sự giảm của nồng ñộ 2,4–D và BA trong môi

trường nuôi cấy. Nghiệm thức có bổ sung 2,4-D 1mg/l kết hợp với BA 0,2mg/l

(HN7) có CĐHH cao nhất.

3.2.4 Sự gia tăng trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mô sẹo ñược

hình thành từ các nguồn mẫu

Hình 3.7: Sự gia tăng trọng lượng tươi và gia tăng trọng lượng khô giữa các nghiệm thức cho mô sẹo tốt nhất ở các nguồn mẫu

Sự gia tăng trọng lượng tươi và gia tăng trọng lượng khô của mô sẹo ñược

hình thành từ lớp mỏng ñốt tử diệp ñược nuôi cấy trên môi trường có bổ sung

2,4-D 1mg/l kết hợp với BA 1mg/l (nghiệm thức D9) là cao nhất (1,51g; 0,17g).

Các nguồn mẫu còn lại, sự gia tăng trọng lượng tươi và gia tăng trọng lượng khô

của mô sẹo giảm dần từ mô sẹo ñược hình thành từ lá (nghiệm thức L9) ñến lớp

mỏng tử diệp (nghiệm thức T7), lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc (nghiệm thức

HD8)và lớp mỏng trụ hạ diệp cắt ngang (nghiệm thức HD7) (Hình 3.7).

Tóm lại, từ những kết quả thu ñược, trong các nguồn mẫu (lá, lớp mỏng

ñốt tử diệp, lớp mỏng tử diệp, lớp mỏng trụ hạ diệp diệp), lớp mỏng ñốt tử diệp

ñược nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2,4-D 1mg/l kết hợp với BA 1mg/l cho

mô sẹo tốt nhất và nguồn auxin thích hợp cho sự hình thành mô sẹo là 2,4-D.

3.3 Sự phát sinh chồi

3.3.1 Sự hình thành và tăng trưởng của cụm chồi từ mô sẹo

Ở các nghiệm thức thuộc nhóm 1 (mô sẹo ñược cảm ứng trong 3 tuần trên

môi trường bổ sung 2,4-D có hoặc không kết hợp với BA) không cảm ứng tạo chồi

sau khi chuyển sang môi trường tạo chồi, mô sẹo tiếp tục phân chia thành khối mô

sẹo lớn hơn.

Trong khi ñó, mô sẹo thuộc nhóm 2 (mô sẹo ñược cảm ứng trong 3 tuần trên

môi trường có bổ sung AIA với nồng ñộ khác nhau kết hợp với BA 0,5mg/l) cho

thấy sự xuất hiện chồi sau khi cấy chuyền sang môi trường tạo chồi. Thời gian xuất

hiện chồi tương ñối sớm (1tuần), số lượng chồi/cụm giảm dần theo sự tăng của

nồng ñộ BA, nhưng chồi to hơn, chồi phát triển tốt (bảng 3.5a, b; ảnh 3.10, 3.11,

3.12).

Bảng 3.5a: Ảnh hưởng của BA lên sự hình thành chồi từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy.

Nghiệm thức

Số chồi/cụm

Tỷ lệ tạo chồi (%)

Thời gian xuất hiện chồi (tuần) 1 1 1 1 1 1 1

S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7

16,67 ± 3,33a 33,33 ± 3,33abc 36,67 ± 3,33abc 43,33 ± 6,67bc 23,33 ± 8,82ab 26,67 ± 8,82abc 33,33 ± 3,33 abc 26,67 ± 6,67 ab

1,00 ± 0,00a 2,33 ± 0,00b 2,67 ± 0,00c 2,33 ± 0,00b 2,00 ± 0,00b 1,67 ± 0,00b 1,33± 0,00a 1,33 ± 0,00a Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%

Những nghiệm thức chỉ bổ sung BA, tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi không cao (16.67

– 43.33%), số lượng chồi/cụm thấp (1,00 – 2,67 chồi). Trong ñó, môi trường theo

nghiệm thức có bổ sung BA 0,5 -1mg/l (S2, S3) cho tỷ lệ chồi và số chồi/cụm cao

nhất (36,6 - 43,33%, 2,33 – 2,65 chồi/ cụm) (bảng 3.5a).

Bảng 3.5b: Ảnh hưởng của BA kết hợp với AIA 0,02 mg/l lên sự hình thành chồi từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy.

Tỷ lệ tạo chồi (%)

Số chồi/cụm

Nghiệm thức

Thời gian xuất hiện chồi (tuần)

S9

S10

S11

S12

3,33 ± 0,33c 7,67 ± 0,00e 4,67 ± 0,00d 2,67 ± 0,00c 3,33 ± 0,13c

S13

2,67 ± 0,33

S14

43,33 ± 1,33bc 53,33 ± 5,77c 43,33 ± 3,33bc 40,00 ± 1,33abc 43,33 ±3,33bc 43,33 ± 1,33bc 36,67 ± 3,33abc

2,33 ± 0,42

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%

Đối với các nghiệm thức có bổ sung BA kết hợp với AIA (0,02mg/l), tỷ lệ

mẫu cấy tạo chồi và số lượng chồi/cụm (36,67 – 53,33%; 2,33 – 7,67 chồi) cao hơn

các nghiệm thức chỉ có bổ sung BA. Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi và số lượng chồi/cụm

giảm dần theo sự tăng của nồng ñộ BA trong môi trường nuôi cấy. Môi trường theo

nghiệm thức có bổ sung BA 0,5mg/l kết hợp với AIA 0,02mg/l (S9) có số lượng

chồi, tỷ lệ tạo chồi cao nhất (53,33%; 7,67 chồi) (bảng 3.5a, b; ảnh 3.6, 3.7, 3.8).

Như vậy, trong sự hình thành chồi từ mô sẹo, các nghiêm thức có sự kết hợp

giữa BA và AIA 0,02mg/l thích hợp cho sự phát sinh chồi từ mô sẹo của cấy mướp

ñắng. Trong ñó, môi trường bổ sung BA 0,5mg/l kết hợp với AIA 0,02mg/l, chồi

phát triển tốt nhất.

1cm

A

B

C

1cm

Ảnh 3.10: Chồi ñược hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 1 tuần nuôi cấy, mũi tên xanh chỉ nốt tròn, mũi tên trắng chỉ chồi. (A): môi trường MS ñối chứng (B): môi trường MS có bổ sung BA 0,5mg/l (C): môi trường MS có bổ sung BA 0,5mg/l và AIA 0,02mg/l

1cm

B

0,6cm m

A

1 cm

C

Ảnh 3.11: Chồi ñược hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy, mũi tên trắng chỉ chồi. (A): môi trường MS ñối chứng (B): môi trường MS có bổ sung BA 0,5mg/l (C): môi trường MS có bổ sung BA 0,5mg/l và AIA 0,02mg/l

1,5cm

B

A

C

1,5cm

Ảnh 3.12: Chồi ñược hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy, mũi tên trắng chỉ chồi. (A): môi trường MS ñối chứng (B): môi trường MS có bổ sung BA 0,5mg/l (C): môi trường MS có bổ sung BA 0,5mg/l và AIA 0,02mg/l

3.3.2 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình phát sinh chồi

Dưới tác ñộng của chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh và nội sinh,

các tế bào phía ngoài khối mô sẹo phân chia mạnh hình thành nên các trung tâm

phân chia. Sau 1tuần, các trung tâm phân chia này tạo thành các nốt màu xanh và

phân hóa thành phát thể chồi (ảnh 3.13).

A

B

C

Ảnh 3.13: Phẫu thức cắt ngang mô sẹo qua các nốt xanh (A), chồi ñược hình thành từ các nốt trên mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy (B), 15 ngày (C), mũi tên xanh chỉ nối xanh,mũi tên ñỏ chỉ bó mạch, mũi tên vàng chỉ phát thể lá, mũi tên trẵn chỉ ñỉnh sinh trưởng.

3.4 Sự phát sinh rễ

3.4.1 Sự hình thành và tăng trưởng rễ Bảng 3.6: Ảnh hưởng của AIA lên sự hình thành và tăng trưởng rễ từ chồi sau 4 tuần nuôi cấy.

Thời gian

Nghiệm

Tỷ lệ tạo rễ

Chiều dài trung

xuất hiện rễ

Số rễ/chồi

thức

sau (%)

bình rễ (cm)

(tuần)

100

4,67 ± 0,88a

5,69 ± 0,84d

R1

1,5

100 52,33 ± 1,76d

4,05 ± 0,26c

1,5

100

32,00± 1,76c

2,69 ± 0,10b

1,5

100

8,33 ± 0,67a

2,14 ± 0,11b

1,5

100

5,76 ± 0,67a

1,15 ± 0,10a

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%

(A)

(B)

Hình 3.8: Sự hình thành rễ (A) tăng trưởng rễ (B) vàsau 4 tuần nuôi cấy trên môi

trường có và không và bổ sung AIA.

Các nghiệm thức không có bổ sung và có bổ sung AIA ñều tạo rễ.

Nghiệm thức không có bổ sung AIA (L0) có chiều dài trung bình rễ cao nhất

(6,69 cm) nhưng số rễ ít (4,67) và thời gian xuất hiện rễ lâu nhất (2 tuần),(bảng 3.8,

hình 3.8 ảnh 3.10A).

Ở các nghiệm thức có bổ sung AIA, số lượng rễ và chiều dài rễ giảm dần theo

sự tăng của nồng ñộ AIA. Trong ñó, môi trường theo nghiệm thức có bổ sung AIA

0,2 mg/l (R1) cho số rễ/chồi cao nhất (52,33 rễ), cây phát triển tốt, rễ chắc (ảnh 3.10

B, C). Các nghiệm thức có nồng ñộ AIA 1 – 1,5mg/l, có sự hình thành mô sẹo trắng

và xanh quanh vết cắt, rễ dễ bị ñứt, cây phát triển yếu hơn so với các nghiệm thức

còn lại (ảnh 3.10 E, CF).

Như vậy, môi trường bổ sung AIA 0,2 mg/l là môi trường thích hợp nhất ñối

với sự tạo rễ.

3 cm

2 cm

A

B

C

2 cm

E

D

Ảnh 3.14: Rễ ñược hình thành sau 4 tuần tuổi nuôi cấy

A): môi trường MS ñối chứng, (B): môi trường MS có bổ sung AIA 0,2 mg/l, (C): môi trường MS có bổ sung AIA 0,5 mg/l, (D): môi trường MS có bổ sung AIA 1 mg/l, (E): môi trường MS có bổ sung AIA 1,5 mg/l

3.2.2 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình phát sinh rễ

Ở các nghiệm thức không bổ sung AIA (R0) và bổ sung AIA 0,2 – 0,5mg/l

(R1, R2), các sơ khởi rễ bất ñịnh ñược hình thành từ vùng tượng tầng libe-mộc. Sau

2 tuần, các sơ khởi này kéo dài ñẩy nội bì và nhu mô vỏ ra ngoài (ảnh 3.15).

A

C

B

D

Ảnh 3.15: Phẫu thức cắt ngang gốc thân cây mướp ñắng in vitro 0 ngày (A), 5 ngày (B), sơ khởi rễ kéo dài (C), rễ (D), nuôi cấy trên môi trường bổ AIA 0,5 mg/l, mũi tên trắng chỉ tượng tầng libe-mộc, mũi tên mũi xanh chỉ tế bào phân chia, tên mũi ñỏ chỉ sơ khởi rễ, mũi tên tên vàng chỉ rễ kéo dài

3.5 Sự thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm

Bảng 3.7 Khả năng thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm

Tỷ lệ (%) cây sống

Tình trạng cây sống

Tình trạng cây chết

73.33%

Cây sống, tăng trưởng tốt Cây héo lá, thân mất nước.

Các cây con in vitro ñược ñem trồng với giá thể trấu hun. Sau 2 tuần, cây tăng

trưởng tốt, tạo rễ mới, lóng kéo dài. Tuy nhiêm, tỷ lệ sống còn thấp (73,33%).

2 cm

4 cm

Ảnh 3.16: Cây mướp ñắng ngoài vườn ươm

4.1 Sự hình thành mô sẹo

4.1.1 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình tạo sẹo

Dưới tác ñộng của auxin là 2,4–D hay AIA không kết hợp hoặc kết hợp

với BA, các tế bào dưới biểu bì ở cả mặt trên và mặt dưới dọc theo gân lá, các tế

bào lớp mỏng ñốt tử diệp, tử diệp, trụ hạ diệp ñều có dấu hiệu phản phân hóa và

bắt ñầu phân chia mạnh mẽ ñể hình thành mô sẹo. Các tế bào ở các lớp mỏng

của các nguồn mẫu tiếp xúc trực tiếp với môi trường ñược cảm ứng bởi chất ñiều

hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh trước tiên nên mô sẹo ñược hình thành sớm

và tăng sinh nhanh. Ở tuần thứ 2, các tế bào mô sẹo ở phía ngoài tách rời nhau

làm mô sẹo trở nên xốp. Lúc này, các tế bào mô sẹo phía ngoài có dạng hình

thay ñổi, chứa không bào to khác với tế bào phía bên trong có kích thước ñều

nhau, tế bào chất ñậm ñặc, nhân to (những tế bào có thể phát sinh hinh thái) [8].

Các nhóm tế bào này tiếp tục duy trì sự phân chia và có tế bào chuyển dần sang

nâu ở tuần thứ 4 và thứ 5 (ảnh 3.9).

4.1.2 Các biến ñổi sinh lý trong quá trình hình thành mô sẹo

Trong giai ñoạn hình thành mô sẹo, dưới tác ñộng của 2,4-D hay AIA có

hoặc không có kết hợp với BA ñến khả năng phân chia của mô sẹo. Ở tế bào, auxin kích thích hoạt ñộng bơm proton của màng nguyên sinh chất, giúp H+

ñược bơm ra vách tế bào làm pH của vách giảm xuống. Sự hạ thấp pH ở vách

cần thiết cho sự gỡ liên kết giữa các vi sợi cellulose và hoạt hóa hoạt ñộng của

một số enzyme thủy giải protein của vách làm vách trở nên lỏng lẻo [11]. Vì vậy

ở tuần thứ 2, dưới tác ñộng của 2,4-D hay AIA, các tế bào mô sẹo ở lớp ngoài

cùng có xu hướng tách rời nhau. Bên cạnh ñó, có lẽ hoạt tính AIA nội sinh cao

trong mô sẹo ñã kích thích các tế bào phân chia mạnh mẽ.

Cường ñộ hô hấp (CĐHH) thể hiện nhu cầu năng lượng trong quá trình

phân chia tế bào, các tế bào ñang phân chia có cường ñộ hô hấp cao hơn các tế

bào ñang phân hóa [8]. Những nghiệm thức có kết hợp với BA có CĐHH tăng ở

tuần thứ 2, tăng mạnh ở tuần thứ 3 kéo dài thời gian phân chia hơn so với những

nghiệm thức chỉ có 2,4-D có CĐHH tăng mạnh ở tuần 2 nhưng bắt ñầu giảm ở

tuần thứ 3. Do ñó, sự gia tăng trọng lượng tươi, gia tăng trọng lượng khô cũng

cao hơn ở các nghiệm thức có kết hợp với BA. Sự giảm trọng lượng tươi, trọng

lượng khô, CĐHH cũng theo sự giảm nồng ñộ auxin (2,4-D, AIA) và cytokinin

(BA) ngoại sinh. Vì vậy, có thể sự giảm hô hấp của mô sẹo theo thời gian thể

hiện sự giảm dần hoạt tính của auxin (2,4-D, AIA) và cytokinin (BA) trong môi

trường nuôi cấy (bảng 3.2, 3.3, 3.4, 3.5; hình 3.2, 3.2, 3.4, 3.5, 3.6).

Trong các nguồn mẫu nuôi cấy, lớp mỏng ñốt tử diệp cho mô sẹo tốt

nhất. Có lẽ, ngoài ảnh hưởng của chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh,

nồng ñộ AIA nội sinh cao do từ lá tổng hợp ñưa xuống, từ hai tử diệp ñi ra và

BA nội sinh từ rễ tổng hợp ñi lên nên tập trung nhiều hơn ở ñốt tử diệp so với

các nguồn mẫu khác.

Trên môi trường không bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật, tất cả

các nguồn mẫu là lá, lớp mỏng ñốt tử diệp, lớp mỏng tử diệp, lớp mỏng trụ hạ

diệp ñều xuất hiện rễ. Có thể nồng ñộ AIA nội sinh ở các nguồn mẫu cao ñủ ñể

kích hoạt sự tạo rễ.

Trong tất cả các nguồn mẫu ñều có chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật

nội sinh. Khi bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh, các nguồn

mẫu có sự ñáp ứng khác nhau dẫn ñến sự khác biệt về trạng thái, trọng lượng

tươi, trọng lượng khô và hô hấp của mô sẹo giữa các loại mẫu cấy. 2,4-D là

một auxin tổng hợp mạnh. Đáp ứng của auxin rất thay ñổi ở các nguồn mẫu.

Thông thường, trong môi trường nuôi cấy có bổ sung 2,4-D cho mô sẹo xốp và

tạo rễ [8].

4.2 Sự phát sinh chồi từ mô sẹo của cây mướp ñắng

4.2.1 Sự thay ñổi hình thái trong sự phát sinh chồi

Một tuần sau khi chuyển mô sẹo sang môi trường MS cơ bản và môi

trường MS có bổ sung BA hoặc BA kết hợp với AIA, các tế bào ñẳng kính, tế

bào chất ñậm ñặc, nhân to là những tê bào tiềm năng (competant cells) từ mô

sẹo bắt ñầu phân chia hình thành nên một ñám tế bào gắn kết với nhau hình

thành nên những nốt phát triển ñộc lập có màu xanh. Bên trong các nốt này

phân hóa hình thành nên các sơ khởi chồi. Cuối cùng, các sơ khởi chồi có sự

phân hóa hình thành nên chồi hoàn chỉnh ñược bảo vệ bằng các phát thể lá.Tuy

nhiên, với môi trường ñược bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật, các nốt

(phát thể chồi) nhiều hơn (ảnh 3.10, 3.11, 3.12, 3.13).

Ở các mô sẹo ñược hình thành trên môi trường có nguồn auxin là AIA,

các nốt ñều tạo chồi. Trong khi ở các mô sẹo ñược hình thành trên môi trường

có nguồn auxin là 2,4-D, các nốt duy trì lâu ở trạng thái hình cầu, không có sự

phân hóa thành chồi. Có lẽ 2,4-D vẫn còn tồn tại trong khối mô sẹo ñã thúc ñẩy

sự phân chia của tế bào, cản sự phân hóa tạo chồi. Do ñó, các tế bào vẫn tiếp tục

phân chia ñể hình thành mô sẹo.

4.2.3 Các biến ñổi sinh lý trong quá trình phát sinh chồi

Khi thời gian nuôi cấy ñủ dài ñể giảm dần tác ñộng của auxin, mô sẹo sẽ

chậm phân chia và dễ dàng phân hóa hơn [11]. Do ñó, mô sẹo 3 tuần tuổi có thể

tạo chồi khi chuyển sang môi trường tạo chồi. Tuy nhiên, ñối với mô sẹo ñược

hình thành trên môi trường có nguồn auxin là 2,4-D, mô sẹo 3 hay 4 tuần tuổi

ñều không thể tạo chồi. Sự tác ñộng của các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật

trong quá trình phát sinh hình thái phụ thuộc rất nhiều vào kiểu mô, trạng thái

sinh lý, bản chất và nồng ñộ của các chất sử dụng cũng như sự phối hợp giữa các

chất [11],[18]. Như vậy, ñối với mô sẹo của cây mướp ñắng ñược hình thành do

sự cảm ứng bởi 2,4-D có thể bị ngăn cản sự tạo chồi mặc dù có sự giảm dần hoạt

tính của 2,4-D theo thời gian nuôi cấy nhưng vẫn còn tồn tại một lượng nhỏ

trong mô sẹo.

Trong khi ñó, mô sẹo ñược hình thành trên môi trường có nguồn auxin là

AIA vẫn tạo thành chồi khi chuyển sang môi trường tạo chồi. AIA là loại auxin

dễ bị phân hủy theo thời gian. Thông thường, hoạt ñộng của các chất ñiều hòa sinh

trưởng thực vật sẽ hiệu quả hơn khi có sự phối hợp, phụ thuộc vào tỷ lệ chất ñiều

hòa sinh trưởng thực vật. Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin nghiêng về auxin, sẽ có sự

hình thành rễ. Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin nghiêng về cytokinin, sẽ có sự hình thành

chồi[18][7]. Vì vậy, khi có sự kết hợp giữa BA từ 0,2 – 3mg/l và AIA 0,02 mg/l,

chồi ñược hình thành nhiều hơn (bảng 3.7).

4.3 Sự phát sinh rễ từ chồi mướp ñắng

4.3.1 Ảnh hưởng của AIA trong sự phát sinh rễ

Auxin cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên có vai trò

quan trọng sự phát sinh hình thái thực vật. Auxin kích thích tạo rễ [4].

AIA với nồng ñộ thay ñổi từ 0,2 – 1,5mg/l ñều kích thích sự phát sinh rễ.

Môi trường không bổ sung AIA cũng kích thích sự tạo rễ. Như vậy, nồng ñộ

AIA nội sinh trong chồi cao, ñủ ñể kích thích sự hình thành rễ. Trong quá trình

xử lý auxin, nếu xử lý với nồng ñộ tối hảo ñối với thực vật sẽ có tác dụng kích

thích sự tăng trưởng. Ngược lại, ở nồng ñộ cao sẽ ức chế sự tăng trưởng và có

thể trở thành ñộc tố [7],[15]. Vì vậy, ñối với chồi mướp ñắng, AIA ở nồng ñộ 0,2

– 0,5 mg/l kích thích mạnh sự ra rễ, còn các nồng ñộ cao hơn như 1 và 1,5mg/l

ức chế sự phát triển rễ, số rễ ít và rễ ngắn, ñồng thời cảm ứng sự tạo và tăng

trưởng mô sẹo quanh vết cắt (bảng 3.8, ảnh 3.14).

4.3.2 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình phát sinh rễ

Rễ bất ñịnh ñược phân hóa từ các tế bào phía trong nội bì (nhu mô: libe,

mộc, tủy) hay tượng tầng libe-mộc ñều có thể họat ñộng ñể cho sinh mô rễ

(nguồn gốc nội sinh). Tại ñây, chúng ñược tạo nên từ ñám tế bào sơ khởi xuất

phát từ sự khử phân hóa các mô ñã phân hóa, hồi phục trở lại thời kỳ phôi, hoạt

ñộng như một sinh mô. Các nghiên cứu cho thấy, sự tạo rễ bất ñịnh gồm 2 giai

ñoạn: giai ñoạn 1, bao gồm sự tạo nhóm tế bào ñể hình thành sơ khởi rễ và giai

ñoạn 2, sự kéo dài các sơ khởi rễ ñể tạo thành rễ bất ñịnh. Cả hai giai ñoạn ñều

có sự tham gia của auxin [4].

Sự tạo rễ bất ñịnh ở cây mướp ñắng cũng trải qua 2 giai ñoạn trên. Tại

tượng tầng libe-mộc, các tế bào phân chia mạnh và tạo nên sơ khởi rễ, các sơ

khởi này tiếp tục kéo dài và có cấu trúc hoàn chỉnh trước khi xuyên qua vùng vỏ

và lớp biểu bì (ảnh 3.15).

4.3.3 Các biến ñổi sinh lý trong quá trình phát sinh rễ

Trên môi trường không bổ sung AIA ngoại sinh, hoạt tính AIA nội sinh

trong chồi ñủ ñể kích thích sự hình thành rễ bất ñịnh, nhưng số lượng rễ rất ít.

Các auxin ngoại sinh với nồng ñộ thích hợp ñã ñược chứng minh có tác ñộng

kích thích sự hình thành rễ bất ñịnh và tăng tích lũy AIA nội sinh trong suốt quá

trình hình thành rễ [11]. Khi bổ sung thêm AIA ngoại sinh, số lượng rễ tăng lên

nhiều và rễ ñược hình thành sớm hơn (bảng 3.8). Do ñó, chính việc bổ sung AIA

vào môi trường tạo rễ, giúp gia tăng tích lũy AIA nội sinh trong mẫu cấy. Từ ñó

ñã kích thích quá trình khử phân hóa của các tế bào tượng tầng libe – mộc ñể trở

về trạng thái sinh mô.

Ngoài ra, dưới tác ñộng của cytokinin nội sinh, các nhóm tế bào ñã

ñược cảm ứng bởi AIA sẽ có hoạt tính phân chia mạnh ñể tạo sơ khởi rễ. Sự

giảm dần hoat tính AIA theo thời gian tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự kéo dài

của các sơ khởi rễ [7],[4]. 4.4 Sự thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm

Khi ñưa ra vườn ươm, tỷ lệ cây sống tương ñối thấp (73,33%). Trong in

vitro, cây sống ở ñiều kiện có ñộ ẩm cao, nhiều chất dinh dưỡng, khí khổng luôn

mở nên khi ñưa ra vườn ươm, cây chưa thích ứng tốt, rất dễ mất nước, rễ mới

chưa hình thành nên việc hấp thu nước và chất khoáng gặp nhiều trở ngại, cây

chết bị héo lá. Những cây có bộ rễ tốt thường có khả năng sống tốt và tăng

trưởng tốt hơn.

KẾT LUẬN

- Dung dịch thủy ngân chlorite nồng ñộ 0,1%, thời gian xử lý 10 - 15

phút và calcium hypochlorite 15% với thời gian khử trùng 20 phút cho tỷ lệ

mẫu sạch và sống cao nhất (90,00 – 93,33%).

- Trong các nguồn mẫu nuôi cấy từ cây mướp ñắng, mô sẹo ñược hình

thành từ lớp mỏng ñốt tử diệp trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l kết

hợp với BA 1mg/l là tốt nhất.

- Về sự tạo chồi từ mô sẹo mướp ñắng, môi trường MS có bổ sung BA

0,5mg/l kết hợp với AIA 0,02 mg/l cho tỷ lệ chồi và số chồi nhiều nhất. Không

có sự hình thành chồi từ mô sẹo ñược cảm ứng bởi môi trường có nguồn auxin là

2,4-D.

- AIA kích thích mạnh sự phát sinh rễ. Trong ñó, môi trường MS có bổ

sung AIA 0,2mg/l cho số rễ nhiều nhất, và rễ phát triển tốt nhất.

- Khi ñưa ra vườn ươm, cây mướp ñắng sống và tăng trưởng tốt, tỷ lệ cây

sống 73,33%. Những cây con chết chủ yếu do mất nước.

ĐỀ NGHỊ

- Cần khảo sát thêm các nồng ñộ chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật khác

ñể cho sự phát triển chồi tốt nhất từ mô sẹo.

- Tìm hiểu sự tạo các hợp chất thứ cấp trong quá trình hình thành mô sẹo

và phát sinh hinh thái. Từ ñó tìm ra mối liên hệ giữa sự hình thành các hợp chất

thứ cấp, sự tạo mô sẹo và sự phát sinh hinh thái ở cấy mướp ñắng.

PHỤ LỤC

Môi trường MS (Murashige and skoog 1962)

mg/lít

Khoáng ña lượng

1900

KNO3

1650

NH4NO3

440

CaCl2.2H2O

370

MgSO4.7H2O

170

KH2PO4

Khoáng vi lượng

µg/l

22300

MnSO4.4H2O

8600

ZnSO4.7H2O

6200

H3BO3

830

CuSO4.5H2O

250

Na2MoO4.2H2O

CoCl2.6H2O

27850

FeSO4.7H2O

37250

Na2EDTA. 2H2O

Vitamin

mg/l

Inositol

100 mg/l

Thiamine HCl

0,1

Nicotinic acid

0,5

Pyridoxine HCl

0,5

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khử trùng và thời gian khử trùng lên tỷ lệ

mẫu sạch và sống của hạt mướp ñắng.

Javel

Thời gian xử lý (phút)

Tỷ lệ % mẫu sạch

Nồng ñộ Javel:nước

1:0

1:1

80,33± 0.58abc 83,33 ±0.88abc 86,67 ± 0.88bc 66,67± 0.58a 70,00 ±0.58ab 71,00 ±0.58ab

1:1

Calcium hypochlorite Nồng ñộ

Thời gian xử lý (phút)

Tỷ lệ % mẫu sạch

66,67 ± 0.33a

66,67 ± 0.67a

76,67 ± 0.33abc

10%

80,00 ± 0.58abc

10%

10 15

15% 15%

76,67 ± 0.33abc 86.67 ± 0.33bc 80,00 ± 0.58abc 90,00 ± 0.58c

15%

Thủy ngân chlorite

Thời gian xử lý (phút)

Tỷ lệ % mẫu sạch 86,67 ± 0.67bc 90,00 ± 0.58c 93,33 ± 0.67c

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật lên sự hình thành và

tăng trưởng mô sẹo từ các nguồn mẫu.

Sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo từ lá

ANOVA

TRONGLUONGTUOI

Sum of Mean

Squares df Square F Sig.

TUAN0 Between Groups (Combined) .000 11 .994 .000 .218

Linear Term Contrast .000 1 .353 .000 .897

Deviation .000 10 .998 .000 .150

.000 24 .000 Within Groups

.000 35 Total

TUAN2 Between Groups (Combined) .812 11 .000 .074 22.430

Linear Term Contrast .113 1 .000 .113 34.214

Deviation .699 10 .000 .070 21.252

.079 24 .003 Within Groups

.891 35 Total

1.552 11 .000 .141 45.501 TUAN3 Between Groups (Combined)

.157 1 .000 .157 50.562 Linear Term Contrast

10 .000 Deviation 1.395 .140 44.995

.074 24 .003 Within Groups

1.626 35 Total

2.485 11 .000 .226 91.151 TUAN4 Between Groups (Combined)

.046 1 .000 .046 18.518 Linear Term Contrast

10 .000 Deviation 2.439 .244 98.415

.059 24 .002 Within Groups

2.545 35 Total

134.66 TUAN5 Between Groups (Combined) 2.984 11 .271 .000 3

Linear Term Contrast .042 1 .042 20.800 .000

146.05 Deviation 2.942 10 .294 .000 0

Within Groups .048 24 .002

Total 3.033 35

Sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp

ANOVA

TRONGLUONGTUOI

Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

TUAN0 Between Groups (Combined) .000 11 .274 .000 .985

Linear Term Contrast .000 1 .017 .000 .897

Deviation .000 10 .300 .000 .974

.000 24 .000 Within Groups

.000 35 Total

TUAN2 Between Groups (Combined) .209 11 .019 9.313 .000

Linear Term Contrast .001 1 .001 .251 .621

Deviation .209 10 .021 10.219 .000

.049 24 .002 Within Groups

.258 35 Total

TUAN3 Between Groups (Combined) 1.373 11 .125 38.673 .000

Linear Term Contrast .086 1 .086 26.760 .000

Deviation 1.287 10 .129 39.864 .000

.077 24 .003 Within Groups

1.450 35 Total

.000 TUAN4 Between Groups (Combined) 3.268 11 .297 115.743

Linear Term Contrast .020 1 .020 7.940 .010

Deviation 3.248 10 .325 126.523 .000

.062 24 .003 Within Groups

3.330 35 Total

.000 TUAN5 Between Groups (Combined) 3.790 11 .345 81.001

Linear Term Contrast .079 1 .079 18.676 .000

Deviation 3.711 10 .371 87.234 .000

.102 24 .004 Within Groups

3.892 35 Total

Sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo từ lớp mỏng tử diệp

ANOVA

Sum of Mean

Squares df Square F Sig.

TUAN0 Between Groups (Combined) .001 11 .000 .787 .650

Linear Term Contrast .000 1 .000 1.790 .193

Deviation .001 10 .000 .687 .726

.002 24 .000 Within Groups

.003 35 Total

.085 11 .008 2.500 .029 TUAN2 Between Groups (Combined)

.031 1 .031 9.987 .004 Linear Term Contrast

.054 10 .005 1.751 .126 Deviation

.074 24 .003 Within Groups

.160 35 Total

.593 11 .054 16.406 .000 TUAN3 Between Groups (Combined)

.010 1 .010 3.081 .092 Linear Term Contrast

.583 10 .058 17.739 .000 Deviation

.079 24 .003 Within Groups

.672 35 Total

2.051 11 .186 55.189 .000 TUAN4 Between Groups (Combined)

.112 1 .112 33.132 .000 Linear Contrast

Term 1.939 10 .194 57.395 .000 Deviation

.081 24 .003 Within Groups

2.132 35 Total

2.060 11 .187 44.024 .000 TUAN5 Between Groups (Combined)

.062 1 .062 14.607 .001 Linear Contrast

Term 1.998 10 .200 46.965 .000 Deviation

.102 24 .004 Within Groups

2.162 35 Total

Sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo từ lớp mỏng hạ diệp cắt dọc

ANOVA

TRONGLUONGTUOI

Sum of Mean

Squares df Square F Sig.

TUAN0 Between Groups (Combined) .000 .757 .677 .000 11

Linear Term Contrast .000 1.088 .307 .000 1

Deviation .000 .724 .695 .000 10

Within Groups .000 24 .000

Total .000 35

TUAN2 Between Groups (Combined) .150 11 .014 6.678 .000

Linear Contrast .007 1 .007 3.583 .071

Term Deviation .143 10 .014 6.987 .000

Within Groups .049 24 .002

Total .199 35

TUAN3 Between Groups (Combined) .670 11 .061 18.877 .000

Linear Term Contrast .019 1 .019 5.866 .023

Deviation .651 10 .065 20.179 .000

Within Groups .077 24 .003

Total .748 35

TUAN4 Between Groups (Combined) .604 11 .055 3.036 .011

Linear Term Contrast .061 1 .061 3.361 .079

Deviation .543 10 .054 3.003 .013

Within Groups .434 24 .018

Total 1.038 35

TUAN5 Between Groups (Combined) .722 11 .066 15.431 .000

Linear Term Contrast .004 1 .004 .990 .330

Deviation .718 10 .072 16.875 .000

Within Groups .102 24 .004

Total .824 35

Sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo từ lớp mỏng hạ diệp cắt ngang

ANOVA

TRONGLUONGTUOI

Sum of Mean

Squares df Square F Sig.

TUAN0 Between Groups (Combined) .000 11 .000 .757 .677

Linear Term Contrast .000 1 .000 1.088 .307

Deviation .000 10 .000 .724 .695

Within Groups .000 24 .000

Total .000 35

TUAN2 Between Groups (Combined) .150 11 .014 6.678 .000

Linear Contrast .007 1 .007 3.583 .071

Term Deviation .143 10 .014 6.987 .000

Within Groups .049 24 .002

Total .199 35

TUAN3 Between Groups (Combined) .670 11 .061 18.877 .000

Linear Term Contrast .019 1 .019 5.866 .023

Deviation .651 10 .065 20.179 .000

Within Groups .077 24 .003

Total .748 35

TUAN4 Between Groups (Combined) .604 11 .055 3.036 .011

Linear Term Contrast .061 1 .061 3.361 .079

Deviation .543 10 .054 3.003 .013

Within Groups .434 24 .018

Total 1.038 35

TUAN5 Between Groups (Combined) .722 11 .066 15.431 .000

Linear Term Contrast .004 1 .004 .990 .330

Deviation .718 10 .072 16.875 .000

Within Groups .102 24 .004

Total .824 35

Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lá nuôi cấy trên môi trường có và

không bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và cytokinin (BA) theo thời gian

ANOVA

Sum of Mean

Squares df Square F Sig.

TUAN2 Between Groups (Combined) 100.242 11.138 43.174 .000 9

Linear Term Contrast 7.278 7.278 28.213 .000 1

Deviation 92.963 45.044 .000 8

5.160 Within Groups

11.620 .258 20 29 105.401 Total

TUAN3 Between Groups (Combined) 18.314 68.793 .000 9 164.822

Linear Term Contrast 4.877 4.877 18.319 .000 1

Deviation 159.945 75.102 .000 8

5.324 Within Groups

19.993 .266 20 29 170.146 Total

TUAN4 Between Groups (Combined) 8.960 24.317 .000 9 80.643

Linear Term Contrast 12.060 12.060 32.727 .000 1

Deviation 68.584 23.265 .000 8

7.370 Within Groups

8.573 .368 20 29 88.013 Total

TUAN5 Between Groups (Combined) 3.726 18.140 .000 9 33.534

Linear Term Contrast 10.383 10.383 50.548 .000 1

Deviation 23.151 14.089 .000 8

4.108 Within Groups

2.894 .205 37.643 20 29 Total

Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng ñốt tử diệp nuôi cấy trên

môi trường có và không bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và cytokinin (BA) theo thời gian.

ANOVA

Sum of Mean

Squares df Square F Sig.

TUAN2 Between Groups (Combined) 165.849 18.428 57.404 9 .000

Linear Term Contrast .441 .441 1.374 1 .255

Deviation 165.408 64.408 8 .000

6.420 Within Groups

20.676 .321 172.270 20 29 Total

TUAN3 Between Groups (Combined) 31.376 88.713 282.380 9 .000

Linear Term Contrast 21.978 21.978 62.143 1 .000

Deviation 260.401 92.035 8 .000

7.073 Within Groups

32.550 .354 289.453 20 29 Total

63.081 9 7.009 .000 20.115 TUAN4 Between Groups (Combined)

9.706 1 9.706 .000 27.856 Linear Term Contrast

8 .000 19.148 Deviation 53.375

6.969 Within Groups

6.672 .348 70.050 20 29 Total

50.799 9 5.644 .000 25.612 TUAN5 Between Groups (Combined)

9.615 1 9.615 .000 43.631 Linear Term Contrast

8 .000 23.360 Deviation 41.184

4.408 Within Groups

5.148 .220 55.207 20 29

Total

Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử diệp nuôi cấy trên môi

trường có và không bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và cytokinin (BA) theo thời gian.

ANOVA

Sum of Mean

Squares df Square F Sig.

TUAN2 Between (Combined) 77.346 8.594 35.516 9 .000

Groups Linear Term Contrast 2.165 2.165 8.946 1 .007

Deviation 75.181 38.837 8 .000

4.840 Within Groups

9.398 .242 20 29 82.185 Total

TUAN3 Between (Combined) 9.294 30.277 9 83.645 .000

Groups Linear Term Contrast 1.597 1.597 5.201 1 .034

Deviation 82.048 33.411 8 .000

6.139 Within Groups

10.256 .307 20 29 89.784 Total

TUAN4 Between (Combined) 2.099 6.733 9 18.888 .000

Groups Linear Term Contrast .127 .127 .407 1 .531

Deviation 18.761 7.523 8 .000

6.234 Within Groups

2.345 .312 20 29 25.122 Total

9 .915 4.553 8.233 .002 TUAN5 Between (Combined)

Groups 1 .098 .487 .098 .493 Linear Term Contrast

8 5.061 8.135 .002 Deviation

4.018 Within Groups

1.017 .201 20 29 12.251

Total

Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc diệp nuôi cấy trên môi trường có và không bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và cytokinin (BA) theo thời gian

ANOVA

Sum of Mean

Squares df Square F Sig.

TUAN2 Between Groups (Combined) 15.822 1.758 4.336 .003 9

Linear Term Contrast .284 .284 .700 .413 1

Deviation 15.538 4.790 .002 8

8.109 Within Groups

1.942 .405 20 29 23.931 Total

9 21.537 2.393 5.696 .001 TUAN3 Between Groups (Combined)

1 .147 .147 .351 .560 Linear Term Contrast

Deviation 21.389 6.364 8 .000

8.403 Within Groups

2.674 .420 29.940 20 29 Total

9 6.347 .705 2.409 .049 TUAN4 Between Groups (Combined)

1 .207 .207 .707 .410 Linear Term Contrast

8 6.140 2.621 .038 Deviation

5.855 Within Groups

.767 .293 20 29 12.202 Total

9 3.943 .438 1.206 .345 TUAN5 Between Groups (Combined)

1 .281 .281 .772 .390 Linear Term Contrast

8 3.663 1.260 .318 Deviation

7.268 Within Groups

.458 .363 20 29 11.211 Total

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của chất ñiều hòa sinh trưởng lên sự hình thành chồi

ANOVA

Sum of Mean

Squares df Square F Sig.

TY LE CHOI Between Groups (Combined) 3924.444 14 280.317 1.777 .091

Linear Term Contrast 1262.976 1 1262.976 8.005 .008

Deviation 2661.468 1.298 .268

Within Groups 4733.333

Total 8657.778 13 204.728 30 157.778 44

SO CHOI Between Groups (Combined) 52.311 14 3.737 42.036 .000

Linear Contrast 7.430 1 7.430 83.585 .000

Term Deviation 44.881 38.840 13 .000

Within Groups 2.667

3.452 .089 Total 30 44 54.978

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của chất ñiều hòa sinh trưởng lên sự hình thành rễ

ANOVA

Sum of Mean

Squares df Square F Sig.

SO RE Between Groups (Combined) 5292.933 4 1323.233 152.681 .000

Linear Contrast 529.200 1 529.200 61.062 .000

Term Deviation 4763.733 .000

86.667 Within Groups

3 1587.911 183.221 8.667 10 14 5379.600 Total

CHIEU DAI RE Between Groups (Combined) 37.588 9.397 67.404 4 .000

Linear Contrast 36.335 36.335 260.631 1 .000

Term Deviation 1.253 2.995 3 .082

1.394 Within Groups

.418 .139 38.982 10 14 Total

Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt ngang

theo thời gian nuôi cấy trên môi trường có và không bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và

cytokinin (BA) theo thời gian.

ANOVA

Sum of Mean

Squares df Square F Sig.

TUAN2 Between Groups (Combined) 12.379 1.375 2.741 9 .029

Linear Term Contrast .560 .560 1.116 1 .303

Deviation 11.818 2.944 8 .024

10.035 Within Groups

1.477 .502 20 29 22.414 Total

TUAN3 Between Groups (Combined) 1.632 6.308 14.692 9 .000

Linear Term Contrast 1.528 1.528 5.905 1 .025

Deviation 13.164 6.358 8 .000

5.176 Within Groups

1.645 .259 19.867 20 29 Total

9 3.723 .414 1.180 .359 TUAN4 Between Groups (Combined)

1 .629 .629 1.793 .196 Linear Term Contrast

8 3.094 1.103 .402 Deviation

7.011 Within Groups

.387 .351 20 29 10.734 Total

9 1.986 .221 1.598 .183 TUAN5 Between Groups (Combined)

1 .369 .369 2.670 .118 Linear Term Contrast

8 1.617 1.464 .232 Deviation

2.762 Within Groups

.202 .138 20 29 4.748 Total

Người hướng dẫn khoa học

TS. Nguyễn Du Sanh

BMT, năm 2010 Người thực hiện Trần Thị Phương Hạnh Chủ tịch hội ñồng TS. Võ Thị Phương Khanh

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Minh Đức, Trần Thị Vy Cầm (2002), “khảo sát hoá học các hợp chất có

tác dụng sinh học từ hạt mướp ñắng”, Nghiên cứu y học, Y học Thành phố Hồ Chí

Minh, tập 6(1).

2. Dương Công Kiên (2003), Nuôi cấy mô thực vật II, Nhà xuất bản Đại học

Quốc Gia 3. TP. HCM.

4. Võ Thị Bạch Mai (2004), Sự phát triển chồi và rễ, Nhà xuất bản Đại học Quốc

Gia TP. HCM.

5. Dương Tấn Nhựt (2007), Công nghệ sinh học thực vật trong công tác nhân

giống và chọn tạo giống hoa, Nhà xuất bản Nông Nghiệp.

6. Dương Tấn Nhựt (2010), Một số phương pháp, hệ thống mới trong nghiên cứu

Công nghệ sinh học thực vật, Nhà xuất bản Nông Nghiệp.

7. Nguyễn Du Sanh (1999), Sự tăng trưởng củ cỏ ống (Panicum repens L.), luận

án tiến sĩ Sinh học, Đại học Quốc Gia TP. HCM.

8. Mai Trần Ngọc Tiếng (2001), Thực vật cấp cao, Nhà xuất bản Đại học Quốc

Gia TP. HCM.

9. Viện Dược liệu (1990), Cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ

thuật, Hà Nội.

10. Bùi Trang Việt (2000), Sinh học tế bào, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.

HCM.

11. Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật ñại cương, phần 2: Phát triển, Nhà

xuất bản Đại học Quốc Gia TP. HCM.

Tiếng Anh

12. Agarwal M., Kamal R.(2006), ”Studies on flavonoid production using in

vitro cultures of Momordica charantia L”, Department of Botany, Government P

G College, Chimanpura, Jaipur, India,

www.cababstractsplus.org/abstracts/Abstract.aspx?AcNo=20073097823 –

13. Al Munsur1 M.A.Z., Haque M.S., Nasiruddin K.M. and Hossain M.S.

(2009), ”In vitro Propagation of Bitter Gourd (Momordica charantia L.) from

Nodal and Root Segments”, Department of Biotechnology, Bangladesh

Agricultural University,Mymensingh, Bangladesh,

baptcb.org/ptc/Full_article/ptc19_1_05.pdf 14. Begley TP., Mean A.R.,O’Malley B.W., Riddiford L., Tashjan A.H. (2005),

Plant Hormon, Publish by Springer Protocols, London.

15. George E.F., Hall M.A. and Klerk G-J (2008), Plant Propagation by Tissue Culture. 3rd Edition. Springer, The Netherland.

16. George E.F., Puttock D.J.M. and George H.J. (1987), Plant culture media,

Fomulations and USAS, vol 1.

17. Li Z. (2004), “Study on the inducing callus of Momordica charantia L and

optimizing the culture conditions”, Coll. Of biological engineering, Xihua

University, China.jst.go.jp/F/C2433A/07A1159304.html - 9k –

18 Taiz L., Zeiger E. (1991), Plant Physiology, The Benjamin/Cumming Publising

Company, Inc. California, 565p. 19. Thiruvengadam M., varisai mohamed S., yang C. H., javabalan N. (2006),

“Development of an embryogenic suspension

culture of bitter melon

(Momordica charantia L.)”, cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=17799260 -

20. Yang M., Zhao M., Zeng Y., Lan L., Chen F. (2004), “Establishment of in

vitro regeneration system of bitter melon (Momordica charantia L.)”,

cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=15814890 –

21. www.asuzacfoods.com.vn/Khoqua.htm

22. www.cimsi.org.vn/tapchi/Duoclieu/2002/so5.htm - 23k

22. www.medinet.hochiminhcity

24. www. nhandan.org.vn/tinbai/ 21

25. www.pharmedicsa.com/upload/bantin/22-9/006.htm.

26. rnd.vista.gov.vn:9000/.../kq_chitiet_du.asp?...

27.www.suckhoedoisong.vn/.../san-xuat-thuoc-tu-nguon-goc-thien-nhien-di-tat-

do...

28. vi.wikipedia.org/.../Chi_Mướp_ñắng.

29. http://en.wikipedia.org/wiki/Plant_morphogenesis

Luận văn thạc sĩ Sinh học: Tìm hiểu sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái cây mướp đắng (Momordica charantia L.) trong nuôi cấy in vitro

Đề tài được thực hiện nhằm hiểu biết thêm về khoa học nuôi cấy mô, vi nhân giống trên đối tượng mướp đắng. Đây cũng là nghiên cứu cơ bản để ứng dụng cho các đối tượng khác thuộc họ bầu bí.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

TRẦN THỊ PHƯƠNG HẠNH

TÌM HIỂU SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ PHÁT SINH HÌNH THÁI CÂY MƯỚP ĐẮNG(momordica charantia L.)TRONG NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

TRẦN THỊ PHƯƠNG HẠNH

TÌM HIỂU SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ PHÁT SINH HÌNH THÁI CÂY MƯỚP ĐẮNG(momordica charantia l.)TRONG NUÔI CẤY IN VITRO

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Du Sanh

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010

LỜI CAM ĐOAN

Trần Thị Phương Hạnh

LỜI CẢM ƠN

Trần Thị Phương Hạnh

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây mướp ñắng .............................................................. 3

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊM CỨU

Chương 3 KẾT QUẢ

Chương 4 BIỆN LUẬN

KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ .................................................................................... 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 64

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1a Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 19

Bảng 2.1b Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 19

Bảng 2.2a Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 20

Bảng 2.2b Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 20

Bảng 2.3a Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 21

Bảng 2.3b Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 21

Bảng 2.4a Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 22

Bảng 2.4b Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 22

Bảng 2.4c Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 23

Bảng 2.4d Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 23

Bảng 2.6a Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 24

Bảng 2.6b Bố trí thí nghiệm ............................................................................... 25

Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm ................................................................................. 25

Bảng 3.1a Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lá sau 2, 3, 4,

Bảng 3.1b Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lá sau 2, 3, 4,

Bảng 3.2a Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng

Bảng 3.2b Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng ĐTD

Bảng 3.3a Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử

Bảng 3.3b Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử diệp

Bảng 3.4a Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ

Bảng 3.4b Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ

Bảng 3.4c Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ

Bảng 3.4d Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ

Bảng 3.5a: Ảnh hưởng của BA lên sự hình thành chồi từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi

Bảng 3.5b Ảnh hưởng của BA và AIA lên sự hình thành và tăng trưởng chồi từ mô

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của AIA lên sự hình thành và tăng trưởng rễ từ chồi sau 4 tuần

Bảng 3.7 Khả năng thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm ........................ 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Tỷ lệ mẫu sạch và sống sau khi khử trùng bởi dung dịch chất khử trùng

Hình 3.2 Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lá theo thời gian. .......... 42

Hình 3.3 Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng ñốt tử diệp theo

Hình 3.4 Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử diệp theo thời

Hình 3.5 Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt

Hình 3.6 Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt

Hình 3.7 Sự gia tăng trọng lượng tươi và gia tăng trọng lượng khô giữa các nghiệm

Hình 3.8 Sự hình thành và tăng trưởng rễ sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có

DANH MỤC ẢNH

Ảnh 1.1: Cây mướp ñắng ..................................................................................... 3

Ảnh 2.1: Cây khổ qua 10 ngày tuổi (A), lá (B), tử diệp (C), ñốt tử diệp (D), trụ hạ

Ảnh 3.1 Mô sẹo từ lá 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ. ............................................. 30

Ảnh 3.2 Mô sẹo từ lá 5 tuần tuổi. .............................................................................. 31

Ảnh 3.3 Mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ .............. 33

Ảnh 3.4 Mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp 5 tuần tuổi. ............................................... 34

Ảnh 3.5Mô sẹo từ lớp mỏng tử diệp 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ. ..................... 36

Ảnh 3.6 Mô sẹo từ lá lớp mỏng tử diệp 5 tuần tuổi. .................................................. 37

Ảnh 3.7Mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc và ngang 3 tuần tuổi, mũi tên trắng

Ảnh 3.8Mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc và ngang 5 tuần tuổi ..................... 40

Ảnh 3.9 Sự phân chia của tế bào ở gân lá (A), các tế bào mô sẹo phía ngoài sau 2

Ảnh 3.10 Chồi ñược hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 1 tuần nuôi cấy, mũi tên

Ảnh 3.11 Chồi ñược hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy .......... 51

Ảnh 3.12 Chồi ñược hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy. .......... 52

Ảnh 3.13 Phẫu thức cắt ngang mô sẹo qua các nốt xanh (A), chồi ñược hình thành từ

Ảnh 3.14 Rễ ñược hình thành sau 4 tuần tuổi nuôi cấy ............................................. 55

Ảnh 3.15 Phẫu thức cắt ngang gốc thân cây mướp ñắng in vitro 0 ngày (A), 5 ngày