Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát một số yếu tố liên quan đến chất lượng tế bào gốc tạo máu phân lập từ máu dây rốn tại ngân hàng tế bào gốc, Bệnh viện Đa khoa Tâm Anh

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Nguyễn Thị Bích

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƢỢNG TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU PHÂN LẬP TỪ MÁU DÂY RỐN TẠI NGÂN HÀNG TẾ BÀO GỐC, BỆNH VIỆN ĐA KHOA TÂM ANH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2021

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Nguyễn Thị Bích

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƢỢNG TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU PHÂN LẬP TỪ MÁU DÂY RỐN TẠI NGÂN HÀNG TẾ BÀO GỐC, BỆNH VIỆN ĐA KHOA TÂM ANH

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hƣớng dẫn 1: TS. Thẩm Thị Thu Nga

Hƣớng dẫn 2: TS. Nguyễn Trung Nam

Hà Nội - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của bản thân dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của TS. Thẩm Thị Thu Nga và TS. Nguyễn Trung Nam. Các số liệu và kết quả thu đƣợc trong luận văn hoàn toàn trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Toàn bộ trích dẫn trong luận văn đều chỉ rõ nguồn gốc.

Tôi xin chịu mọi trách nhiệm liên quan đến nội dung đề tài này.

Hà Nội, tháng 04 năm 2021

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Bích

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Thẩm Thị Thu Nga – giáo viên hƣớng dẫn của tôi. Cảm ơn cô đã cho tôi cơ hội, hƣớng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành luận văn này. Nhờ có sự hỗ trợ của cô tôi mới có đƣợc điều kiện tốt nhất để học tập và nghiên cứu.

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Thị Thanh Mai, ngƣời đã giải đáp cho tôi rất nhiều kiến thức về chuyên môn trong quá trình làm luận văn.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Trung Nam, phó viện trƣởng Viện Công nghệ sinh học, Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã hƣớng dẫn, hỗ trợ trong quá trình hoàn thiện luận văn.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả đồng nghiệp của tôi tại Trung tâm Tế bào gốc, Bệnh viện đa khoa Tâm Anh, Hà Nội đã hỗ trợ rất nhiều trong công việc suốt 2 năm học tập và nghiên cứu.

Xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện học tập và giảng dạy tốt nhất cho học viên để hoàn thành khóa học thành công và hiệu quả.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Bệnh viện đa khoa Tâm Anh Hà Nội đã tạo điều kiện, hỗ trợ thời gian, kinh phí để tôi có thể hoàn thành nghiên cứu này.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình và bạn bè đã là chỗ dựa tinh thần cho tôi khi gặp phải khó khăn, áp lực trong thời gian 2 năm học tập và nghiên cứu vừa qua.

Hà Nội, ngày 11 tháng 04 năm 2021

Nguyễn Thị Bích

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chú giải

AABB American Association of Blood Banks (Hiệp hội truyền máu Hoa Kỳ)

Aorto-Gonado-Mesonephros AGM

Cluster of Differentiation (Cụm biệt hóa) CD

Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) CFU

Cytomegalo virus CMV

DMSO Dimethyl sulfoxide

EDQM

European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare (Cục Quản lý Chất lƣợng Thuốc & Chăm sóc sức khỏe Châu Âu)

FDA Food and Drug Administration (Cục quản lý thuốc và dƣợc phẩm Hoa Kỳ

GVHD Graft versus host disease (Bệnh ghép chống chủ)

HLA Human leukocyte antigen (Kháng nguyên bạch cầu ngƣời)

HPC Hematopoietic progenitor cell (Tế bào tiền thân tạo máu)

Hematopoietic Stem Cell (Tế bào gốc tạo máu) HSC

HSCT Hematopoietic Stem Cell Transplantation (Cấy ghép tế bào gốc tạo máu)

iPSC Induced Pluripotent Stem Cells (Tế bào gốc đa năng cảm ứng)

IT-HSC Intermediate-term Hematopoietic Stem Cell (Tế bào gốc tạo máu trung hạn)

LT-HSC Long-term Hematopoietic Stem Cell (Tế bào gốc tạo máu dài hạn)

MEP Megakaryocyte/erythrocyte progenitors (Tế bào tiền thân Megakaryocyte/erythrocyte)

Multipotent progenitors (Tế bào tiền thân đa năng) MPP

Natural Killer cell (Tế bào giết tự nhiên) NK

ST-HSC Short-term Hematopoietic Stem Cell (Tế bào gốc tạo máu ngắn hạn)

TNC Total Nucleated Cell (Tế bào đơn nhân)

WBMT Worldwide Network for Blood & Marrow Transplantation (Hiệp hội ghép tủy toàn cầu)

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4

1.1. TẾ BÀO GỐC .......................................................................................... 4

1.1.1. Khái niệm ....................................................................................... 4

1.1.2. Phân loại ......................................................................................... 4

1.2. TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU ...................................................................... 5

1.2.1. Khái niệm ....................................................................................... 5

1.2.2. Sự hình thành và phát triển của tế bào gốc tạo máu ...................... 6

1.2.3. Quá trình biệt hóa tế bào gốc tạo máu ........................................... 6

1.2.4. Nguồn phân lập của tế bào gốc tạo máu ...................................... 10

1.3. TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU TỪ MÁU DÂY RỐN ................................ 11

1.2.1. Cấu tạo dây rốn ............................................................................ 11

1.2.2. Đặc điểm tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn .............................. 12

1.2.3. So sánh HSC từ máu dây rốn với tủy xƣơng và máu ngoại vi ..... 13

1.2.4. Ƣu điểm của máu dây rốn trong cấy ghép ................................... 15

1.2.5. Nhƣợc điểm của máu dây rốn trong cấy ghép ............................. 15

1.2.6. Ứng dụng tế bào gốc máu dây rốn ............................................... 15

1.2.7. Ngân hàng tế bào gốc máu dây rốn .............................................. 17

1.2.8. Nghiên cứu trên thế giới về các yếu tố liên quan đến chất lƣợng máu dây rốn ................................................................................................. 20

1.2.9. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc tạo máu tại Việt Nam .............. 22

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ........................................................................... 24

2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................... 24

2.2.2. Hóa chất ........................................................................................ 24

2.2.3. Thiết bị ......................................................................................... 24

2.2.4. Vật tƣ tiêu hao .............................................................................. 25

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 27

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu ...................................................................... 27

2.3.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................... 28

2.3.3. Kỹ thuật thu thập máu dây rốn ..................................................... 29

2.3.4. Kỹ thuật xử lý máu dây rốn .......................................................... 31

2.3.5. Kỹ thuật đánh giá chất lƣợng máu dây rốn sau xử lý .................. 33

2.3.6. Phân tích thống kê ........................................................................ 37

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 39

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................... 39

3.1.1. Kết quả thu thập mẫu ................................................................... 39

3.1.2. Đặc điểm thống kê các đơn vị máu dây rốn đạt tiêu chuẩn ......... 40

a) Đặc điểm sản phụ ............................................................................ 40

b) Đặc điểm trẻ sơ sinh ........................................................................ 42

c) Đặc điểm chỉ số chất lượng máu dây rốn ....................................... 44

3.1.3. Các yếu tố liên quan đến chỉ số chất lƣợng tế bào gốc tạo máu .. 48

a) Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với thể tích máu dây rốn ........... 48

b) Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với số lượng TNC ...................... 50

c) Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với số lượng tế bào CD34+ ....... 52

d) Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với tỷ lệ tế bào CD34+ .............. 53

3.1.4. Tƣơng quan giữa các yếu tố sản phụ và chỉ số đánh giá chất lƣợng của đơn vị máu dây rốn ............................................................................... 54

3.1.5. Tƣơng quan giữa yếu tố trẻ sơ sinh và các chỉ số đánh giá chất lƣợng đơn vị máu dây rốn ........................................................................... 55

3.1.6. Tƣơng quan của một số yếu tố khác ............................................ 56

3.1.7. Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến chất lƣợng của đơn vị máu dây rốn 57

a) Ảnh hưởng của thể tích máu dây rốn đến số lượng TNC ................ 57

b) Ảnh hưởng của thể tích máu đến số lượng tế bào CD34+ .............. 59

c) Ảnh hưởng của thời gian bảo quản mẫu đến tỷ lệ tế bào sống ....... 60

3.1.8. Mô hình ƣớc lƣợng số lƣợng TNC ............................................... 61

3.2. THẢO LUẬN ........................................................................................ 64

3.2.1. Các yếu tố sản phụ ....................................................................... 64

3.2.2. Các yếu tố trẻ sơ sinh ................................................................... 67

3.2.3. Thời gian bảo quản mẫu trƣớc xử lý ............................................ 70

3.2.4. Các chỉ số chất lƣợng tế bào gốc máu dây rốn ............................ 71

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 75

4.1. KẾT LUẬN .......................................................................................... 75

4.2. KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 77

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Sự khác biệt giữa tế bào gốc tạo máu có nguồn gốc khác nhau ..... 14

Bảng 1.2. Tổng hợp các yếu tố có thể ảnh hƣởng đến chất lƣợng máu dây rốn ......................................................................................................................... 20

Bảng 2.1. Danh mục hóa chất ......................................................................... 24

Bảng 2.2. Danh mục thiết bị............................................................................ 24

Bảng 2.3. Danh mục dụng cụ, vật tƣ tiêu hao ................................................. 25

Bảng 2.4. Tóm tắt thông tin nhuộm mẫu với kháng thể ................................. 36

Bảng 3.1. Thống kê các đơn vị máu dây rốn đƣợc tiến hành thu thập ........... 39

Bảng 3.2. Đặc điểm về độ tuổi của sản phụ .................................................... 40

Bảng 3.3. Đặc điểm sản khoa .......................................................................... 41

Bảng 3.4. Đặc điểm thống kê tuổi thai và cân nặng trẻ sơ sinh ...................... 42

Bảng 3.5. Đặc điểm thống kê của các chỉ số chất lƣợng máu dây rốn đạt tiêu chuẩn sau khi xử lý .......................................................................................... 44

Bảng 3.6. Một số yếu tố liên quan với thể tích máu thu thập ......................... 48

Bảng 3.7. Một số yếu tố liên quan đến số lƣợng TNC ................................... 50

Bảng 3.8. Một số yếu tố liên quan với số lƣợng tế bào CD34+ ...................... 52

Bảng 3.9. Một số yếu tố liên quan với tỷ lệ tế bào CD34+ ............................. 53

Bảng 3.10. Tƣơng quan giữa một số yếu tố sản phụ và các chỉ số đánh giá chất lƣợng đơn vị máu dây rốn ....................................................................... 54

Bảng 3.11. Tƣơng quan giữa một số yếu tố sơ sinh và các chỉ số đánh giá chất lƣợng đơn vị máu dây rốn ............................................................................... 55

Bảng 3.12. Tƣơng quan giữa một số yếu tố khác và các chỉ số đánh giá chất lƣợng đơn vị máu dây rốn ............................................................................... 56

Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của thể tích máu dây rốn lên số lƣợng TNC ............. 57

Bảng 3. 14. So sánh chỉ số TNC với ngƣỡng thể tích 80mL .......................... 58

Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của thể tích máu đến số lƣợng CD34+ ....................... 59

Bảng 3.16. Kết quả phân tích hồi quy tuyến tính giữa thể tích máu và số lƣợng tế bào CD34+ ................................................................................................... 60

Bảng 3.17. Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản đến tỷ lệ tế bào sống ............ 60

Bảng 3.18. Kết quả phân tích hồi quy tuyến tính đa biến cho số lƣợng TNC 62

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Sơ đồ quá trình biệt hóa HSC cổ điển (A) và sửa đổi (B) ................ 9

Hình 1.2. Quá trình biệt hóa HSC. (A) mô hình biệt hóa rời rạc, (B) mô hình biệt hóa liên tục ................................................................................................. 9

Hình 1.3. Cấu tạo dây rốn ở ngƣời .................................................................. 11

Hình 1.4. Quy trình từ khi thu thập máu cho đến khi cấy ghép ...................... 17

Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ................................................................ 27

Hình 2.2. Túi máu dây rốn sau khi thu thập .................................................... 31

Hình 2.3. Phân lớp các thành phần máu dây rốn trên một gradient Ficoll- Hypaque .......................................................................................................... 32

Hình 3.1. Phân bố độ tuổi của sản phụ ............................................................ 40

Hình 3.2. Phân bố giới tính trẻ sơ sinh............................................................ 42

Hình 3.3. Phân bố tuổi thai.............................................................................. 43

Hình 3.4. Phân bố cân nặng trẻ sơ sinh ........................................................... 43

Hình 3.5. Phân bố thể tích máu dây rốn của các đơn vị đƣợc thu thập .......... 45

Hình 3.6. Phân bố số lƣợng TNC .................................................................... 45

Hình 3.7. Phân bố số lƣợng tế bào CD34+ ...................................................... 46

Hình 3.8. Phân bố tỷ lệ tế bào sống ................................................................ 47

Hình 3.9. Liên hệ tuyến tính giữa thể tích máu dây rốn và TNC ................... 58

Hình 3.10. Liên hệ tuyến tính giữa thời gian bảo quản mẫu và tỷ lệ tế bào sống ................................................................................................................. 61

MỞ ĐẦU

Tế bào gốc tạo máu là tế bào gốc đa năng có chức năng quan trọng trong việc sản xuất và duy trì tất cả các dòng tế bào máu trƣởng thành trong suốt cuộc đời con ngƣời [1].

Tế bào gốc tạo máu đƣợc sử dụng trong điều trị lâm sàng có hiệu quả đƣợc lấy từ ba nguồn khác nhau: tủy xƣơng, máu ngoại vi và máu dây rốn. Ghép tế bào gốc tạo máu đòi hỏi sự phù hợp HLA rất chặt chẽ nên việc tìm đƣợc ngƣời phù hợp hoàn toàn về HLA là một khó khăn lớn. Khó khăn này tăng thêm ở các quốc gia đa chủng tộc vì hệ HLA có những đặc trƣng riêng theo từng chủng tộc. Theo báo cáo thƣờng niên năm 2019 về ghép tế bào gốc tại châu Âu, năm 2018 trong số gần 18000 bệnh nhân tìm ngƣời cho không cùng huyết thống chỉ có khoảng hơn 9000 ngƣời đƣợc ghép mặc dù có khoảng 1.4 triệu ngƣời đăng ký hiến tế bào gốc tạo máu ở Châu Âu trong năm 2018, nâng tổng số ngƣời hiến lên hơn 14 triệu tại các nƣớc thành viên EU và gần 37 triệu trên toàn thế giới [2, 3].

Ghép tế bào gốc tạo máu bao gồm ghép tự thân và ghép đồng loài. Trong trƣờng hợp ghép đồng loài, ngƣời hiến tủy xƣơng hoặc tế bào gốc tạo máu ngoại vi sẽ đƣợc huy động vào thời điểm bệnh nhân đã đƣợc điều trị hóa chất đủ điều kiện ghép. Vì vậy, hiện nay nhiều quốc gia trên thế giới đã có chƣơng trình đăng ký hiến tủy và hiến tế bào gốc tạo máu từ máu ngoại vi, tế bào gốc sử dụng trong các trƣờng hợp này hoàn toàn không cần phải lƣu trữ. Tế bào gốc tạo máu sử dụng trong trƣờng hợp ghép tự thân đƣợc lƣu trữ đông lạnh nhƣng chỉ trong một thời gian ngắn phải sử dụng ngay sau khi bệnh nhân đƣợc điều trị hóa chất và đủ điều kiện ghép.

Từ khi đƣợc phát hiện vào năm 1980, tế bào gốc tạo máu phân lập từ máu dây rốn đƣợc coi là nguồn tiềm năng cho ghép tế bào gốc tạo máu trong điều trị. Máu dây rốn đƣợc thu thập ngay sau khi sản phụ sinh con, sau đó trải qua quá trình xử lý, lƣu trữ đông lạnh để kéo dài đời sống. Chứng minh thành công rằng máu dây rốn có khả năng phục hồi hệ thống tạo máu và miễn dịch của bệnh nhân cùng với việc xác nhận rằng máu dây rốn có thể bảo quản lạnh để sử dụng sau này dẫn đến việc thành lập các ngân hàng máu dây rốn trên

khắp thế giới đáp ứng nhu cầu ghép tế bào gốc tạo máu đang ngày càng gia tăng. Những bệnh nhân có chỉ định ghép tế bào gốc máu có thể tìm những đơn vị máu dây rốn phù hợp thông qua những dữ liệu lƣu trữ trong ngân hàng máu dây rốn.

Tuy nhiên, một trong những hạn chế của nguồn tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn so với máu ngoại vi đƣợc huy động và từ tủy xƣơng là số lƣợng tế bào gốc tạo máu trong một đơn vị thấp, do vậy máu dây rốn phù hợp để ghép cho trẻ em hơn là ngƣời lớn. Xử lý và bảo quản tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn đòi hỏi thời gian và chi phí tốn kém, do đó ngƣời ta thƣờng cố gắng chỉ xử lý những đơn vị máu dây rốn cho số lƣợng tế bào có nhân và tế bào CD34+ tối ƣu – hai chỉ số đƣợc coi là quyết định thành công của các ca ghép tế bào gốc tạo máu. Do vậy, việc xác định chiến lƣợc hợp lý từ khâu sàng lọc, thu thập mẫu cho đến xử lý mẫu và cuối cùng là ghép không chỉ tránh lãng phí chi phí, tiết kiệm không gian lƣu trữ có giá trị cho các đơn vị chất lƣợng tốt mà còn tạo ra hiệu quả điều trị tốt hơn ngƣời bệnh. Trong đó bƣớc đầu khảo sát các yếu tố có khả năng ảnh hƣởng đến chất lƣợng tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn có vai trò quan trọng chiến lƣợc cải thiện chất lƣợng ngân hàng máu dây rốn. Đồng thời từ kết quả phân tích các yếu tố, đƣa ra những khuyến cáo, tƣ vấn cho bệnh nhân cũng nhƣ giúp tìm ra những nguyên nhân sai sót, cải thiện quy trình kỹ thuật, nâng cao hiệu quả.

Có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hƣởng đến chất lƣợng của sản phẩm tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn bao gồm: các yếu tố sản khoa, yếu tố thuộc về sản phụ, các yếu tố trẻ sơ sinh, các yếu tố trong thu thập và xử lý mẫu. Trong rất nhiều yếu tố có khả năng ảnh hƣởng, các yếu tố sản phụ bao gồm: tuổi ngƣời mẹ, nhóm máu, phƣơng pháp sinh, số lần mang thai, số lƣợng thai; các yếu tố trẻ sơ sinh bao gồm: tuổi thai, cân nặng, giới tính; yếu tố trong xử lý mẫu gồm: thời gian bảo quản mẫu, thể tích máu là những yếu tố đƣợc quan tâm nhiều nhất vì đặc điểm dễ tiếp cận, dễ thu thập thông tin và có nhiều nghiên cứu cho kết quả không thống nhất. Do đó, trong phạm vi của nghiên cứu này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát sự ảnh hƣởng đến các chỉ số chất lƣợng tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn của một số yếu tố kể trên.

Trên thế giới, có nhiều chƣơng trình tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng máu dây rốn, tuy nhiên các yếu tố này có thể thay đổi ở các quốc gia và chủng tộc khác nhau khiến cho các tiêu chuẩn mà thế giới đƣa ra có thể không phù hợp với Việt Nam. Ngân hàng tế bào gốc thuộc Bệnh viện đa khoa Tâm Anh đƣợc xây dựng theo mô hình ngân hàng máu dây rốn tƣ nhân, đƣợc thành lập vào năm 2019. Với mục đích lƣu trữ nguồn tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn chất lƣợng dùng trong điều trị chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu này với các mục tiêu sau :

1- Đánh giá chất lƣợng các đơn vị máu dây rốn thu thập tại Bệnh

viện đa khoa Tâm Anh từ 2019-2021

2- Khảo sát sự ảnh hƣởng của một số yếu tố liên quan đến chất

lƣợng tế bào gốc tạo máu phân lập từ máu dây rốn

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TẾ BÀO GỐC

1.1.1. Khái niệm

Tế bào gốc là những tế bào có khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào chuyên biệt trong cơ thể. Hai đặc điểm xác định một tế bào gốc là khả năng tự làm mới (Self-renewal) và khả năng biệt hóa (Differentiation) thành tế bào trƣởng thành chuyên biệt về chức năng. Khả năng tự làm mới là khả năng tế bào gốc có thể phân chia không giới hạn để tạo thành tế bào con giống hệt tế bào mẹ mang tính gốc. Đặc điểm này giống với tế bào ung thƣ, tuy nhiên khác với tế bào ung thƣ phân chia không kiểm soát, tế bào gốc đƣợc cơ thể điều khiển một cách chính xác và chặt chẽ [4].

1.1.2. Phân loại

 Phân loại theo giai đoạn phát triển

Theo giai đoạn phát triển của cơ thể, tế bào gốc chia thành: tế bào gốc phôi, tế bào gốc trƣởng thành. Tuy nhiên các thuật ngữ này hiện nay trở nên không đầy đủ để mô tả các loại tế bào gốc. Năm 2006, nghiên cứu của giáo sƣ Takahashi cho biết có thể tái lập trình tế bào trƣởng thành về trạng thái giống tế bào gốc phôi, gọi là tế bào gốc đa năng cảm ứng (Induced Pluripotent Stem Cell - iPSC) [5]. Ngƣợc lại, tế bào gốc trƣởng thành cũng đã đƣợc tìm thấy trong thai nhi, nhau thai, máu dây rốn và trẻ sơ sinh [6, 7].

 Phân loại theo tiềm năng biệt hóa

Dựa theo khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào chuyên biệt trong cơ

thể, tế bào gốc đƣợc chia thành:

- Tế bào gốc toàn năng (Totipotent stem cells): là tế bào gốc có khả năng phân chia và biệt hóa thành toàn bộ các dòng tế bào trong cơ thể, có thể hình thành nên cấu trúc phôi và ngoài phôi. Ví dụ nhƣ hợp tử - tế bào hình thành sau khi trứng đƣợc thụ tinh. Hợp tử sau đó có thể phát triển thành thành tất cả các tế bào thuộc ba lớp mầm và nhau thai.

- Tế bào gốc vạn năng (Pluripotent stem cells): là tế bào gốc có thể biệt hóa thành tất cả các tế bào thuộc ba lớp mầm ngoại trừ cấu trúc ngoài phôi nhƣ nhau thai. Ví dụ nhƣ tế bào gốc phôi, iPSC.

- Tế bào gốc đa năng (Multipotent stem cells): là tế bào gốc có khả năng biệt hóa thành các loại tế bào chuyên biệt trong một dòng tế bào cụ thể. Ví dụ nhƣ tế bào gốc tạo máu có khả năng biệt hóa ra các tế bào thuộc dòng máu; tế bào gốc thần kinh; tế bào gốc trung mô.

- Tế bào gốc đơn năng (Unipotent stem cells): là tế bào gốc có phổ biệt hóa hẹp nhất và đặc trƣng bởi tính chất phân chia lặp đi lặp lại. Tế bào gốc đơn năng chỉ có thể biệt hóa thành một loại tế bào duy nhất, ví dụ nhƣ tế bào da (Dermatocytes) [8], tế bào tiền thân đại thực bào [9].

1.2. TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU

1.2.1. Khái niệm

Tế bào gốc tạo máu (Haematopoietic Stem Cells – HSCs) là tế bào gốc đa năng đặc biệt có khả năng tự đổi mới và biệt hóa tạo thành toàn bộ hệ thống tạo máu trong cơ thể. Tế bào gốc tạo máu có thể bổ sung thay thế tất cả các loại tế bào máu. Mỗi tế bào gốc tạo máu đƣợc lập trình để sản xuất các thành phần của máu với các chức năng khác nhau từ hồng cầu vận chuyển oxy, tiểu cầu liên quan đến các yếu tố đông máu, đến các tế bào của hệ thống miễn dịch bẩm sinh hoạt động chống lại sự tấn công của vi khuẩn [10]. Đồng thời, một số lƣợng nhỏ tế bào gốc tạo máu có vai trò tự tăng sinh vẫn giữ tính gốc nhằm duy trì số lƣợng tế bào gốc trong cơ thể, luôn sẵn sàng khi cơ thể có nhu cầu.

Giống nhƣ các tế bào gốc trƣởng thành trong cơ thể, hầu hết tế bào gốc tạo máu đều tồn tại ở trạng thái không hoạt động. Khi cơ thể xảy ra tổn thƣơng, các tế bào gốc tạo máu sẽ thoát khỏi sự im lặng và bắt đầu đi vào chu kỳ tế bào, phân chia, biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa chức năng. Chúng cũng có thể di chuyển từ tủy xƣơng ra máu ngoại vi, từ tủy xƣơng này sang

tủy xƣơng khác,…Điều này cho phép các tế bào gốc tạo máu có thể đƣợc thu hoạch trực tiếp từ máu ngoại vi. Bất kỳ rối loạn nào xảy ra trong quá trình chuyển đổi này có thể dẫn đến cạn kiệt tế bào gốc máu, gây thiếu máu và các bệnh lý về máu, miễn dịch khác.

1.2.2. Sự hình thành và phát triển của tế bào gốc tạo máu

HSC bắt đầu đƣợc xác định trong phôi bằng sự xuất hiện đầu tiên đƣợc nhận thấy ở vùng AGM (Aorto-Gonado-Mesonephros) [11], là vùng thuộc trung bì phôi phát triển trong suốt quá trình phát triển phôi, gần với hệ thống niệu sinh dục, tạo ra tuyến sinh dục, võ não của tuyến thƣợng thận và hậu thận [12]. Sau đó, HSC chuyển sang gan của thai nhi, tại đây, HSC đƣợc nhân lên rồi di chuyển đến lá lách và sau đó đến tủy xƣơng, nơi tế bào gốc tạo máu sẽ cƣ trú trong suốt đời sống sau này [13, 14].

Bên cạnh đó, năm 2005, hai nhóm nghiên cứu độc lập đã xác định nhau thai là một vị trí ngoại phôi có sự phát triển và nhân lên của tế bào gốc tạo máu [15, 16]. Các nghiên cứu này cho thấy sự xuất hiện của các tế bào gốc tạo máu với hoạt động tái tạo trong nhau thai xảy ra song song với quá trình ở vùng AGM. Nhƣng liệu nhau thai có khả năng tạo ra HSC de novo hay chỉ hỗ trợ nhân lên vẫn còn tranh cãi và cần nghiên cứu thêm [17].

1.2.3. Quá trình biệt hóa tế bào gốc tạo máu

Để xác định mối quan hệ giữa HSC và các thế hệ con cháu của chúng, hệ thống phân cấp tạo máu đƣợc xây dựng để mô tả quá trình biệt hóa từ HSC sang các loại tế bào máu khác nhau. Sự biệt hóa của HSC xảy ra thông qua một quá trình nhiều bƣớc từ đa dòng (multilineage), đến các tế bào chỉ có khả năng biệt hóa hạn chế cho một số dòng (oligo-lineage), rồi đến các tế bào đơn dòng (single lineage) và cuối cùng là tế bào máu trƣởng thành [18].

Trƣớc đây, HSC tinh sạch đƣợc coi là quần thể tế bào đồng nhất vì các tế bào này chia sẻ các dấu hiệu bề mặt tế bào giống nhau. Về mặt chức năng, mỗi tế bào trong quần thể đồng nhất này cũng đƣợc coi là có khả năng biệt hóa giống hệt nhau [19]. Tuy nhiên hiện nay, nhiều công cụ phân tích –omics ở độ phân giải đơn bào đã cho thấy những hiểu biết mới về tế bào gốc tạo

máu, từ đó tiết lộ về sự không đồng nhất trong quần thể HSC [20, 21]. Tính không đồng nhất của HSC đƣợc phản ánh trong thực tế rằng mỗi HSC riêng biệt khác nhau về đặc điểm phân tử, số phận tế bào và kết quả chức năng. Việc phát hiện ra tính không đồng nhất của HSC đã định hình lại sự hiểu biết của các nhà khoa học về quá trình biệt hóa phức tạp của loại tế bào gốc đặc biệt này.

Các nghiên cứu trƣớc đây về quá trình biệt hóa của HSC (Hình 1.1A) đã phát hiện ra rằng HSC có thể đƣợc phân loại thành 2 dƣới quần thể: HSC dài hạn (Long-term HSC – LT-HSC) và HSC ngắn hạn (Short-term HSC – ST-HSC). LT-HSC là quần thể tế bào hiếm của tủy xƣơng, sở hữu khả năng phục hồi vĩnh viễn ở những ngƣời nhận bị chiếu xạ. Ở trạng thái ổn định, LT- HSC không hoạt động. Tuy nhiên, một khi tiếp xúc với kích thích, các tế bào này sẽ kích hoạt trở lại và đi vào chu kỳ tế bào. ST-HSC thì có khả năng phục hồi ngắn hạn, khoảng 8-12 tuần sau ghép. ST-HSC biệt hóa thành tế bào tiền thân đa năng (Multipotent progenitors – MPP), so với HSC, ST-HSC có tần suất tiến triển chu kỳ tế bào cao hơn, hoạt động biệt hóa mạnh mẽ hơn, nhƣng không có khả năng tự đổi mới [22]. Tiếp sau MPP là các tế bào tiền thân lympho phổ biến (Common lymphoid progenitors – CLP) có khả năng biệt hóa thành các tế bào bao gồm: tế bào giết tự nhiên (Natural killer – NK) là những tế bào gây độc tế bào cần thiết cho hệ miễn dịch bẩm sinh; tế bào B trƣởng thành trong tủy xƣơng kích hoạt hình thành tế bào plasma tiết ra kháng thể; và tế bào T trƣởng thành trong tuyến ức thành tế bào T gây độc tế bào CD8+ hoặc tế bào T trợ giúp CD4+ với khả năng biệt hóa sâu hơn khi kích hoạt. Cùng với tế bào tiền thân lympho phổ biến còn có tế bào tiền thân dòng tủy phổ biến (Common myeloid progenitors – CMP) có thể biệt hóa thành các tế bào tiền thân megakaryocyte/hồng cầu (Megakaryocyte/erythrocyte progenitors – MEP) – biệt hóa sản xuất tiểu cầu, hồng cầu; và tế bào tiền thân bạch cầu hạt/đại thực bào (Granulocyte/macrophage progenitors – GMP) – biệt hóa cho bạch cầu hạt và đại thực bào. Bạch cầu hạt bao gồm: bạch cầu trung tính (neutrophil) là loại bạch cầu chiếm tỷ lệ lớn nhất (50-60%); bạch cầu ái toan (eosinophil)) có đặc tính gây độc tế bào đặc biệt chống lại ký sinh

trùng (1-3% bạch cầu); bạch cầu ái kiềm (basophil) có vai trò trong phản ứng viêm và là loại bạch cầu ít phổ biến nhất (<2%); và các tế bào mast hoạt động theo cách tƣơng tự nhƣ bạch cầu ái kiềm đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của dị ứng.

Mặc dù sơ đồ phân cấp HSC cổ điển có thể mô tả đƣợc phần lớn quá trình biệt hóa từng bƣớc của HSC, nhƣng sự phức tạp trong biệt hóa các dòng tế bào cùng với việc xác định các loại quần thể tế bào tạo máu mới vẫn chƣa đƣợc làm rõ. Vì vậy, sơ đồ biệt hóa HSC đƣợc sửa đổi một số điểm nhằm cung cấp đầy đủ và chính xác thông tin hơn (Hình 1.1B). Theo đó, ngoài LT- HSC và ST-HSC, còn có HSC trung hạn (Intermediate-term HSCs – IT-HSC) đƣợc xác định bởi khả năng tự đổi mới nằm giới hạn giữa ST-HSC và LT- HSC. Trong sơ đồ mới, IT-HSC nằm giữa LT-HSC và ST-HSC, hoạt động nhƣ một quần thể tế bào tạm thời. Ngoài ra, quần thể MPP đƣợc chia thành 4 nhóm MPP1, MPP2, MPP3 và MPP4. Trong số các quần thể con này, kiểu hình miễn dịch, trạng thái chu kỳ tế bào và khả năng biệt hóa của chúng đều khác nhau. Trong hệ thống biệt hóa HSC đã sửa đổi, MPP1 giống với ST- HSC, trong khi MPP2-4 là các quần thể phụ tƣơng đƣơng, hoạt động cùng nhau để duy trì việc sản xuất máu ở trạng thái ổn định [23]. Ngoài ra, một dƣới quần thể của HSC có biểu hiện gene tạo máu cao đƣợc định nghĩa là tế bào tiền thân lymphoid-primed đa năng (Lymphoid-primed multipotent progenitors – LMPP). Về mặt chức năng, quần thể này ƣu tiên tạo ra các dòng bạch huyết. Về mặt kiểu hình miễn dịch, LMPP có các dấu hiệu bề mặt tƣơng tự với MPP4.

Hình 1.1. Sơ đồ quá trình biệt hóa HSC cổ điển (A) và sửa đổi (B) [19]

Nhƣ vậy, từ việc cho rằng sự biệt hóa HSC trải qua một số bƣớc trung gian rời rạc để tạo ra các tế bào máu trƣởng thành, các quần thể tế bào trung gian đƣợc xác định bằng các dấu hiệu bề mặt đƣợc phân biệt bằng các ranh giới thứ bậc rõ ràng, giờ đây, các nghiên cứu mở rộng sử dụng các xét nghiệm chức năng và phân tích omics đã cho thấy quá trình biệt hóa từ một HSC đến các tế bào máu trƣởng thành chuyên hóa chức năng là một quá trình liên tục, không có ranh giới rõ ràng giữa các quần thể tế bào nằm ở các cấp độ khác nhau [24] (Hình 1.2).

Hình 1.2. Quá trình biệt hóa HSC. (A) mô hình biệt hóa rời rạc, (B) mô hình biệt hóa liên tục [19]

1.2.4. Nguồn phân lập của tế bào gốc tạo máu

Tế bào gốc tạo máu hiện nay có thể đƣợc phân lập từ các nguồn sau:

 Tủy xương

Ở ngƣời trƣởng thành, quá trình tạo máu xảy ra trong tủy xƣơng, đây là một mô mềm xốp, nhiều mạch máu nằm bên trong xƣơng. Có hai loại tủy xƣơng: tủy đỏ (Medulla ossium rubra) – nơi các tế bào tạo máu cƣ trú, và tủy vàng (Medulla ossium flava) – bao gồm chủ yếu là các tế bào mỡ. Lúc mới sinh, tất cả tủy xƣơng đều có tủy đỏ, tỷ lệ tủy vàng tăng dần theo tuổi tác và tỷ lệ giữa hai loại này khoảng 50:50 ở ngƣời trƣởng thành. Tuy nhiên, ở những thời điểm mất máu nặng, tủy vàng có thể chuyển ngƣợc trở lại tủy đỏ nhằm tăng sản xuất tế bào máu thông qua quá trình tạo máu. Nguồn phân lập cổ điển cho tế bào gốc tạo máu là tủy xƣơng. Trong hơn 40 năm, các bác sĩ thực hiện ghép tế bào gốc tạo máu cho bệnh nhân bằng cách chọc hút tủy xƣơng trong mào chậu của khung chậu bằng syringe chuyên dụng. Tế bào trong tủy xƣơng gồm tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc mô đệm, tế bào tiền thân tạo máu, bạch cầu và hồng cầu trƣởng thành [25]. CD34 đƣợc biểu biện trong 1-4% các tế bào có nhân phân lập từ nguồn này [26].

 Máu ngoại vi

Khi đáp ứng lại một số tín hiệu cụ thể, tế bào gốc tạo máu có thể di chuyển từ tủy xƣơng ra máu ngoại vi (huy động) và trở lại tủy xƣơng (homing). CD34 đƣợc biểu hiện trong khoảng 0.06% tế bào có nhân đƣợc tìm thấy trong máu ngoại vi [26]. Huy động tế bào gốc tạo máu từ tủy xƣơng ra máu ngoại vi đƣợc thực hiện thông qua việc sử dụng cytokine yếu tố kích thích tế bào hạt (Granulocyte colony stimulating factor – G-CSF) trong ba hoặc bốn ngày. Điều này làm tăng tỷ lệ CD34+ lên > 1%, các tế bào này sau đó có thể đƣợc thu hoạch bằng phƣơng pháp Leukapheresis. Máu ngoại vi trở thành nguồn tế bào gốc tạo máu bắt đầu từ những năm 2000 [27].

 Máu dây rốn

Thành phần tế bào trong máu dây rốn bao gồm: Tế bào gốc/tiền thân tạo máu, tế bào tiền thân nội mô, bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, tế bào

gốc/tiền thân trung mô [28]. Kể từ khi ca ghép tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn đầu tiên thành công ở một bệnh nhi mắc bệnh thiếu máu Fanconi, việc thu thập và sử dụng nguồn tế bào này đã phát triển nhanh chóng [29]. Máu dây rốn sẽ đƣợc thu thập ngay sau khi đứa trẻ đƣợc sinh ra, sau đó xử lý nhằm phân lập quần thể tế bào gốc tạo máu. Tế bào thu đƣợc sau xử lý có thể đƣợc sử dụng ngay cho việc ghép hoặc lƣu trữ ở -196oC trong nitơ lỏng trong nhiều năm.

1.3. TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU TỪ MÁU DÂY RỐN

1.2.1. Cấu tạo dây rốn

Dây rốn nối liền giữa mẹ và thai nhi qua bánh nhau, có vai trò quan trọng trong việc nuôi dƣỡng thai nhi trong suốt thai kỳ. Dây rốn có cấu tạo bao gồm hai động mạch và một tĩnh mạch, đƣợc bao xung quanh bởi mô liên kết gọi là Wharton’s jelly, bao bên ngoài là màng dây rốn (Hình 1.3). Máu dây rốn phần lớn chứa trong tĩnh mạch. Trong quá trình sinh nở, dây rốn đƣợc cắt rời khỏi trẻ sơ sinh, tĩnh mạch dây rốn có thể quan sát dễ dàng, do vậy việc thu thập máu dây rốn thông qua tĩnh mạch đƣợc thực hiện khá đơn giản.

Hình 1.3. Cấu tạo dây rốn ở ngƣời [30]

Để đảm bảo lấy đƣợc lƣợng máu tốt nhất, thời điểm thu thập máu dây rốn thƣờng là giai đoạn sau khi đẻ thai và trƣớc khi xổ nhau (trẻ đã ra ngoài nhƣng bánh nhau còn nằm trong tử cung ngƣời mẹ). Trong một số tình huống sản khoa đặc biệt không thể thu thập ở giai đoạn trên, có thể thu thập máu dây rốn sau khi xổ nhau. Bánh nhau và dây rốn khi đó sẽ đƣợc xử lý ở khu vực riêng biệt để lấy đƣợc hết lƣợng máu còn lại trong các mạch máu. Tuy nhiên, khi thu thập sau xổ nhau thì thể tích và số lƣợng tế bào máu thƣờng thấp hơn thu thập trƣớc xổ nhau. Vì vậy đa số các trƣờng hợp nên thu thập trƣớc xổ nhau để đƣợc hiệu quả tốt nhất.

1.2.2. Đặc điểm tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn

 Đặc điểm biệt hóa

Tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn có đặc điểm biệt hóa giống với tế bào tạo máu nguồn gốc từ tủy xƣơng. Một tế bào gốc tạo máu trong suốt vòng đời phân chia bất đối xứng thành hai tế bào con: một tế bào gốc tạo máu và một tế bào tiền thân tạo máu (Hematopoietic progenitor cell - HPC). HPC là tế bào tiền thân sớm nhất, không giống HSC, chúng không có khả năng tự làm mới, khả năng biệt hóa bị giới hạn ở một hoặc một vài dòng. Từ HPC sẽ biệt hóa tạo thành tế bào tiền thân dòng tủy, rồi hình thành bạch cầu hạt, hồng cầu, đại thực bào và megakaryocytes; hoặc tế bào tiền thân dòng lympho rồi hình thành tế bào B, tế bào T, tế bào NK.

 Đặc điểm miễn dịch

Cụm biệt hóa (Cluster of differentiation – CD) là một loạt các phân tử protein đƣợc sử dụng làm dấu hiệu (marker) xác định các quần thể tế bào cụ thể. Các phân tử CD thƣờng có chức năng và có thể là thụ thể hoặc phối tử hoặc tham gia vào quá trình kết dính và di chuyển tế bào [26]. Không có phân tử chỉ thị duy nhất để xác định tất cả các HSC. Điều này rất khó khăn vì các phân tử chỉ thị có thể đƣợc tăng cƣờng biểu hiện hoặc mất đi khi tế bào biệt hóa. Phân tử CD34 là marker đầu tiên đƣợc xác định trên HSC và hiện là marker đƣợc sử dụng phổ biến nhất. CD34 đƣợc cho là đóng vai trò nhƣ một phân tử kết dính thông qua việc gắn các HSC và chất nền ngoại bào tủy

xƣơng hoặc với các tế bào mô đệm. Quần thể CD34+ bao gồm phần lớn các tế bào có khả năng tái tạo hệ thống tạo máu, tất cả các tế bào tạo máu dài hạn và nhiều đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit - CFU). Quần thể CD34+ này chứa hỗn hợp HSC và HPC có thể phân biệt bằng các mức độ biểu hiện khác nhau của các marker khác. Kiểu hình miễn dịch của tế bào gốc/tiền thân tạo máu có thể đƣợc xác định bằng cách sử dụng:

- Phân tích tế bào học về sự hiện diện của proteoglycan CD34/CD38

- Phân tích chỉ thị của dòng trƣởng thành (HLA-DR)

- Phân tích thụ thể tyrosine kinase c-kit

Tuy nhiên, có bằng chứng về các tế bào CD34- (không biểu hiện CD34) nguyên thủy nhƣng có đặc tính HSC có thể tạo ra tế bào CD34+ in vitro và in vivo [31, 32]. Các tế bào CD34- này có thể đƣợc đặc trƣng thông qua sự biểu hiện của CD133 và không biểu hiện CD38 và các marker đặc trƣng cho dòng. Biểu hiện của CD133 trên HSC chồng lên sự biểu hiện của CD34. CD133 biểu hiện trên phần lớn các tế bào CD34+ bao gồm các các tế bào HSC CD34-. HSC và HPC không biểu hiện các marker liên quan đến các tế bào máu đã biệt hóa. Những marker này có thể bao gồm: CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD56, CD235a.

1.2.3. So sánh HSC từ máu dây rốn với tủy xƣơng và máu ngoại vi

Các tế bào gốc máu dây rốn khác với tế bào gốc máu từ máu ngoại vi và tủy xƣơng về cả thành phần, số lƣợng và đặc tính [33-35]. Các tế bào trong máu dây rốn (có kiểu hình CD34+/CD38-) đƣợc phát hiện ở pha G0 tăng sinh tốt hơn khi đáp ứng với cytokine và ít phụ thuộc vào các tế bào đệm hơn so với các tế bào tƣơng ứng trong máu ngoại vi và tủy xƣơng [36, 37].

Tỷ lệ tế bào biểu hiện CD34+ trong tổng số tế bào có nhân ở máu dây rốn khoảng 0.02-1.43% thấp hơn tủy xƣơng (0.5-5%) và cao hơn so với máu ngoại vi (<0.01%) (Bảng 1.1).

Bảng 1.1. Sự khác biệt giữa tế bào gốc tạo máu có nguồn gốc khác nhau [38]

Đặc điểm Máu dây rốn Tủy xƣơng/Máu ngoại vi

Tế bào HPP-CFCs Cao hơn Thấp hơn

CFU-E (cụm/mL) 8000 2500

CFU-GM (cụm/mL) 13000 -24000 870 - 1600

Tỷ lệ CD34+ (%) 0.02 - 1.43 0.5 – 5 (Tủy xƣơng)

< 0.01 (Máu ngoại vi)

Tế bào NK Thấp hơn Cao hơn

Tế bào T (Th và Tc) Thấp hơn Cao hơn

Trong máu dây rốn, số lƣợng tế bào Lympho T (Th, Tc) và NK thấp, phần lớn tế bào trong trạng thái nguyên thủy, chƣa trƣởng thành về mặt chức năng, thể hiện ở việc đáp ứng tối thiểu với kích thích của interleukin 2, phytohemagglutinin hoặc alloantigens [39]. Do đó, tế bào gốc tạo máu trong máu dây rốn có khả năng dung nạp miễn dịch cao hơn so với tế bào gốc máu trong máu ngoại vi và tủy xƣơng. Vì khả năng dung nạp miễn dịch tốt nên việc ghép tế bào gốc máu dây rốn có thể đƣợc thực hiện mà không cần phù hợp hoàn toàn HLA, ít nguy cơ gây ghép chống chủ (GVHD) - vốn là một trở ngại lớn trong ghép đồng loài với tủy xƣơng và máu ngoại vi.

Việc ghép tế bào gốc tạo máu không chỉ phụ thuộc vào số lƣợng mà còn phụ thuộc vào chất lƣợng của các tế bào này, liên quan đến khả năng tăng sinh chúng. Để đánh giá khả năng tăng sinh của các tế bào gốc tạo máu đã xác định đƣợc kiểu hình, ngƣời ta sử dụng các xét nghiệm tạo khuẩn lạc (bao gồm CFU-GM (Colony Forming Unit-Granulocyte/Macrophage), CFU-M (Colony Forming Unit-Megakaryote, CFU-E (Colony Forming Unit-Erythroid) và các thí nghiệm nuôi cấy dài hạn. Trong máu dây rốn, các tế bào tạo khuẩn lạc có tiềm năng tăng sinh cao (HPP) và tế bào tiềm năng tăng sinh cao có khả năng hình thành khuẩn lạc (CFC) cũng có mặt với số lƣợng gấp khoảng 8 lần so với trong tủy xƣơng [40]. Phân tích CFC trong máu dây rốn ngƣời cho thấy trong 1mL máu dây rốn có khoảng 8000 BFU-E (gấp 3 lần so với tủy xƣơng

và máu ngoại vi) và khoảng 13000-24000 CFU-GM (gấp 15 lần so với tủy xƣơng và máu ngoại vi) [41].

Các tế bào gốc máu dây rốn cũng đƣợc nghiên cứu cho thấy có DNA telomere dài hơn so với tế bào gốc máu trong tủy xƣơng và máu ngoại vi [37, 42, 43]. Do đó các tế bào gốc máu dây rốn có thời gian tạo máu dài hơn, phân chia nhiều lần hơn và tạo ra số lƣợng tế bào con lớn hơn, dẫn đến hiệu quả điều trị đƣợc nâng cao.

1.2.4. Ƣu điểm của máu dây rốn trong cấy ghép

Nhìn chung, tế bào gốc tạo máu có nguồn gốc từ máu dây rốn có một

số ƣu điểm so với máu ngoại vi và tủy xƣơng nhƣ sau:

 Nguồn cung cấp tế bào gốc sẵn có, dễ dàng thu thập, không ảnh hƣởng

đến ngƣời hiến.

 Khả năng tăng sinh cao.

 Khả năng dung nạp miễn dịch tốt dẫn đến cơ hội lựa chọn mẫu ghép cao hơn, nguy cơ mắc GVHD khi ghép không phù hợp hoàn toàn HLA giảm xuống.

 Dễ dàng bảo quản lạnh và lƣu trữ trong nhiều năm.

1.2.5. Nhƣợc điểm của máu dây rốn trong cấy ghép

Bên cạnh những ƣu điểm, tế bào gốc tạo máu phân lập từ máu dây rốn

cũng tồn tại một số hạn chế nhƣ sau:

 Số lƣợng tế bào gốc tạo máu thu đƣợc hạn chế, phù hợp ghép cho trẻ

em hơn là ngƣời lớn.

 Số lƣợng tế bào thấp cũng dẫn đến thời gian mọc mảnh ghép chậm.

 Chi phí xử lý và lƣu trữ cao.

1.2.6. Ứng dụng tế bào gốc máu dây rốn

Ghép tế bào gốc tạo máu (Hematopoiectic Stem Cell Transplantation - HSCT) là một trong những chiến lƣợc để điều trị nhiều bệnh lý huyết học, các

rối loạn suy giảm miễn dịch khi các liệu pháp khác điều trị không hiệu quả [44]. Tủy xƣơng và máu ngoại vi từ lâu đã là hai nguồn tế bào gốc tạo máu hiệu quả trong ghép điều trị. Tuy nhiên, ghép tế bào gốc tạo máu đòi hỏi sự phù hợp HLA rất chặt chẽ nên việc tìm đƣợc ngƣời cho phù hợp hoàn toàn về HLA là một khó khăn lớn. Do vậy, chỉ có một số lƣợng nhỏ bệnh nhân có thể đƣợc điều trị nhờ ghép tế bào gốc tạo máu từ những nguồn này.

Ngay từ khi đƣợc phát hiện từ năm 1980, tế bào gốc máu dây rốn ngày càng nhận đƣợc nhiều sự đồng thuận trong việc sử dụng cho việc cấy ghép tế bào gốc tạo máu [45]. Năm 1988, Broxmeyer và cộng sự là những ngƣời đầu tiên chứng minh máu dây rốn là một nguồn tế bào gốc/tiền thân tạo máu có thể dùng trong ghép điều trị hiệu quả [46]. Trong cùng năm đó, Gluckman và cộng sự đã thực hiện ca ghép tế bào tạo máu đầu tiên sử dụng máu dây rốn thay vì tủy xƣơng [47], khôi phục hệ thống tạo máu của một bệnh nhi bị thiếu máu Fanconi bằng cách sử dụng máu dây rốn từ anh chị em phù hợp HLA. Một số lợi thế của tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn bao gồm có khả năng dung hợp mảnh ghép không phù hợp một hai locus HLA[48], nguy cơ mắc GVHD cấp và mạn tính thấp [49].

Ghép tế bào gốc tạo máu đã đang và sẽ đem lại nhiều hy vọng cho những bệnh nhân mắc các rối loạn về máu, ung thƣ bao gồm các khối u ác tính về huyết học, các rối loạn chuyển hóa và miễn dịch. Hiện có khoảng 95 bệnh lý đƣợc điều trị bằng cách ghép tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn cho cả trẻ em và ngƣời lớn [50, 51]. Nhiều sản phẩm tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn cũng đƣợc FDA phê duyệt cấp bằng để điều trị nhƣ Allocord, Clevecord, Ducord,... [52] Các sản phẩm này bao gồm các tế bào tiền thân tạo máu, bạch cầu đơn nhân, tế bào lympho và bạch cầu hạt từ máu dây rốn ngƣời, sử dụng trong ghép tế bào tiền thân tạo máu của ngƣời hiến không có quan hệ huyết thống với ngƣời nhận, kết hợp với một phác đồ chuẩn bị thích hợp để phục hồi hệ thống tạo máu và miễn dịch ở những bệnh nhân bị rối loạn hệ thống tạo máu do di truyền, mắc phải hoặc kết quả của điều trị myeloablative (hóa trị liệu liều cao giết chết các tế bào trong tủy xƣơng, bao gồm các tế bào ung thƣ).

Mặc dù tiềm năng ứng dụng rất lớn, nhƣng lƣợng tế bào gốc tạo máu trong một đơn vị máu dây rốn thấp, trong khi việc cấy ghép thành công có tƣơng quan chặt chẽ với số lƣợng tế bào đƣợc truyền vào. Ngoài ra, việc xử lý và bảo quản tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn là một công việc tốn thời gian và tốn kém do đó ngƣời ta thƣờng cố gắng chỉ xử lý những đơn vị máu dây rốn cho tổng số tế bào có nhân và CD34+ tối ƣu. Quy trình chiến lƣợc cho việc từ thu thập mẫu, xử lý cho đến khi cấy ghép không chỉ tránh lãng phí chi phí, tiết kiệm không gian lƣu trữ có giá trị cho các đơn vị chất lƣợng tốt mà còn tạo ra hiệu quả điều trị tốt hơn ngƣời bệnh.

Hình 1.4. Quy trình từ khi thu thập máu cho đến khi cấy ghép [44]

Trong đó bƣớc đầu xem xét các yếu tố có khả năng ảnh hƣởng đến chất lƣợng tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn có vai trò quan trọng trong chiến lƣợc cải thiện chất lƣợng ngân hàng máu dây rốn.

1.2.7. Ngân hàng tế bào gốc máu dây rốn

 Sự thành lập các ngân hàng máu dây rốn

Nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh các tế bào tiền thân tạo máu và tế bào tiền thân đa năng vẫn hoạt động chức năng trong máu dây rốn ở điều kiện có chất chống đông ít nhất 3 ngày ở 4oC hoặc 25oC [46]. Nhờ vậy, máu

dây rốn có thể đƣợc xử lý và sử dụng hoặc bảo quản lạnh cho điều trị bình thƣờng sau quá trình vận chuyển và bảo quản trong một khoảng thời gian nhất định. Phát hiện này dẫn đến tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc máu dây rốn ngày càng lớn, đi cùng với đó là mạng lƣới ngân hàng tế bào gốc máu dây rốn đƣợc thành lập ở nhiều quốc gia trên khắp thế giới. Mô hình ngân hàng máu dây rốn gồm có: ngân hàng máu dây rốn công, nơi lƣu trữ các đơn vị máu dây rốn để sử dụng cho ngƣời nhận không có quan hệ huyết thống với ngƣời hiến; ngân hàng máu dây rốn tƣ nhân, nơi lƣu trữ máu dây rốn sử dụng ghép tự thân hoặc dùng cho ngƣời thân trong gia đình; và ngân hàng hỗn hợp, cung cấp các dịch vụ kết hợp [53]. Ƣớc tính năm 2017 có khoảng hơn 800 000 đơn vị máu dây rốn đƣợc bảo quản lạnh trong các ngân hàng công và hơn 5 triệu đơn vị khác đƣợc lƣu trữ trong các ngân hàng máu dây rốn tƣ nhân [54].

 Tiêu chí đánh giá ngân hàng máu dây rốn

Có nhiều tổ chức trên thế giới nhƣ NetCord, AABB (American Association of Blood Banks), EDQM (European Directorate for the Quality (Assisted Reproductive of Medicines & HealthCare), ARTHIQS Technologies and Haematopoietic stem cells Improvements for Quality and Safety throughout Europe) đƣa ra những tiêu chuẩn cụ thể về các tiêu chí đánh giá ngân hàng máu dây rốn. Các tổ chức khác nhau thì tiêu chuẩn cũng khác nhau, nhƣng nhìn chung có một số tiêu chuẩn thống nhất giữa các tổ chức về các khía cạnh chung của tiêu chí đánh giá áp dụng cho tất cả các loại ngân hàng máu dây rốn bao gồm:

 Thu thập mẫu

 Vận chuyển mẫu

 Dán nhãn

 Xử lý mẫu

 Lƣu trữ

 Kiểm soát chất lƣợng

 Kiểm soát nhiễm khuẩn

 Sử dụng để điều trị

 Kiểm soát chất lượng ngân hàng máu dây rốn

Các ngân hàng máu dây rốn phải thiết lập việc kiểm soát chất lƣợng đối với các quy trình và sản phẩm của ngân hàng để có thể lập hồ sơ về chất lƣợng và an toàn. Vì mục đích đó, một danh sách các thông số quan trọng cần đƣợc kiểm soát sẽ đƣợc thiết lập và một phạm vi giá trị có thể chấp nhận đƣợc xác định. Tất cả các tham số, giá trị của chúng và quy trình cho việc thực hiện các biện pháp kiểm soát phải dựa trên các tài liệu tham khảo khoa học và/hoặc đƣợc xác nhận bởi ngân hàng.

Theo ARTHIQS, các thông số tối thiểu cho kiểm soát chất lƣợng bao

gồm:

o Kiểm soát chất lƣợng mẫu lƣu trữ:

 Số lƣợng TNC lƣu trữ

 Số lƣợng CD34+

 Tỷ lệ tế bào sống

 Kiểm soát nhiễm khuẩn

o Kiểm soát chất lƣợng mẫu ghép:

 Xét nghiệm HLA ( tối thiểu HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1)

 Kết quả tỷ lệ sống của tế bào sau khi rã đông

 Kết quả xét nghiệm nhóm máu ABO, Rh

 Xét nghiệm bệnh lý di truyền

 Sự phù hợp của ngƣời hiến

 Tiêu chí cấp bằng cho một đơn vị tế bào gốc tạo máu từ máu dây

rốn sử dụng trong ghép điều trị

Theo hƣớng dẫn của FDA [55], các tiêu chí chấp nhận tối thiểu cho một

đơn vị tế bào gốc máu dây rốn đối với ngân hàng công bao gồm:

 Kiểm soát nhiễm khuẩn: không có bằng chứng về nhiễm vi sinh vật.

 Số lƣợng TNC: ≥ 5.0 x 108 TNC/đơn vị (dựa trên 20kg cân nặng ngƣời nhận, liều tế bào ≥ 2.5x107 TNC/kg và ≥ 70% phục hồi sau rã đông = 1.7x107 TNC/kg).

 Số lƣợng tế bào CD34+: 1.25x106 tế bào/đơn vị (dựa trên tế bào CD34+

≥ 0.25% TNC trƣớc khi đông lạnh).

 Tỷ lệ tế bào sống: ≥ 85%.

1.2.8. Nghiên cứu trên thế giới về các yếu tố liên quan đến chất

lƣợng máu dây rốn

Đi kèm với việc thành lập các ngân hàng lƣu trữ tế bào gốc máu dây rốn là những khó khăn trong việc xác định chất lƣợng nguồn tế bào đầu vào. Nhiều công bố đã chứng minh chất lƣợng của các đơn vị máu dây rốn ảnh hƣởng đáng kể đến hiệu quả ghép tế bào gốc máu cho bệnh nhân [56]. Có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hƣởng đến chất lƣợng của sản phẩm tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn bao gồm các yếu tố sản khoa, yếu tố thuộc về sản phụ, yếu tố trẻ sơ sinh, các yếu tố trong thu thập và xử lý mẫu (Bảng 1.2).

Bảng 1.2. Tổng hợp các yếu tố có thể ảnh hƣởng đến chất lƣợng máu dây rốn

STT Yếu tố STT Yếu tố

Yếu tố ngƣời mẹ Yếu tố trong thu thập mẫu

1 Tuổi ngƣời mẹ [57, 58] 25 Phƣơng pháp thu thập [57]

Thời gian từ thu thập - xử lý 2 Chủng tộc [59, 60] 26 [59, 61]

3 Cân nặng [58, 62] 27 Thời gian thu thập [63]

Một hay hai ngƣời thu thập 4 Chiều cao [58] 28 [63]

Kinh nghiệm ngƣời thu thập 5 Hút thuốc lá [64] 29 [63]

6 Uống rƣợu [65] Yếu tố trẻ sơ sinh

7 Virus CMV [66] Đƣờng kính lƣỡng đỉnh [67] 30

8 Nhóm máu ABO, Rh [65] Chu vi vòng đầu [67] 31

9 Thời gian mang thai [68] Chu vi bụng [67] 32

10 Tiểu đƣờng thai kỳ [61] Chiều dài xƣơng đùi [67] 33

11 Cao huyết áp thai kỳ [61] Cân nặng [57, 59] 34

12 Tiền sản giật Chiều cao [58] 35

Tiền sử thai sản (số lần 13 36 Dây rốn quấn cổ [70] mang thai) [57, 69]

14 Số lƣợng thai [57] 37 Giới tính [57, 59]

38 Nhóm máu ABO, Rh Yếu tố chuyển dạ và sinh con

Thời gian tách em bé khỏi 15 39 Tuổi thai [57-59] nhau thai

16 Phƣơng pháp sinh [57, 59] 40 Số lƣợng tiểu cầu [70]

Vị trí trẻ sơ sinh khi thu mẫu 17 Thời gian sinh 41 [71]

Ngày sinh 18 Yếu tố nhau thai và dây rốn

Tháng sinh 19 Thể tích máu [61] 42

Năm sinh 20 Cân nặng nhau thai [58, 64] 43

Phân su trong nƣớc ối [58, 21 44 Chiều dài dây rốn [58, 64] 61]

22 Thời gian chuyển dạ [58] 45 pH máu dây rốn [65]

Gây tê ngoài màng cứng 23 46 [72] Nồng độ yếu tố tăng trƣởng biểu bì trong máu dây rốn [73]

Nồng độ vitamin D trong máu 24 Kẹp dây rốn chậm [74] 47 dây rốn [75]

Trong 47 yếu tố đƣợc tổng hợp ở Bảng 1.2, các yếu tố sản phụ bao gồm: tuổi ngƣời mẹ, nhóm máu, phƣơng pháp sinh, số lần mang thai, số lƣợng thai; các yếu tố trẻ sơ sinh bao gồm: tuổi thai, cân nặng, giới tính; yếu tố trong xử lý mẫu gồm: thời gian bảo quản mẫu, thể tích máu là những yếu tố đƣợc quan tâm nhiều nhất vì đặc điểm dễ tiếp cận, dễ thu thập thông tin và có nhiều nghiên cứu cho kết quả không thống nhất. Do đó, trong phạm vi của nghiên cứu này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát sự ảnh hƣởng đến các chỉ số chất lƣợng tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn của một số yếu tố kể trên.

Tổng hợp lại, trên thế giới, các ngân hàng tế bào gốc máu dây rốn đã đƣợc xây dựng và nghiên cứu trong nhiều năm, các tiêu chuẩn cũng đƣợc nhiều tổ chức lớn trên thế giới đƣa ra cho sản phẩm tế bào gốc máu dây rốn, tuy nhiên các tiêu chuẩn này có thể tham khảo nhƣng không hoàn toàn chính xác với hoàn cảnh của Việt Nam. Chất lƣợng của một đơn vị máu dây rốn có thể bị ảnh hƣởng bởi nhiều yếu tố sản khoa, sơ sinh và các yếu tố trong cả quy trình từ khi lấy mẫu cho đến cấy ghép. Để đáp ứng đƣợc những yêu cầu chất lƣợng khắt khe của các tổ chức thế giới về tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn, bắt buộc phải xây dựng một quy chuẩn chất lƣợng đầu vào cho sản phẩm tế bào gốc máu dây rốn phù hợp với thực tế tại Việt Nam.

1.2.9. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc tạo máu tại Việt Nam

Bởi những lợi ích thiết thực mà máu dây rốn mang lại, chất lƣợng máu dây rốn luôn là vấn đề cần quan tâm hàng đầu. Tại Việt Nam hiện đã có một số cơ sở nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc tạo máu cho điều trị bệnh nhƣ Bệnh viện Truyền máu – Huyết học TP HCM, Bệnh viện TW Huế, Bệnh viện quân đội 108, Bệnh viện Huyết học – Truyền máu TW, Bệnh viện Nhi TW. Để phục vụ cho nghiên cứu tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn, việc nghiên cứu xây dụng ngân hàng máu dây rốn cùng với đánh giá chất lƣợng đơn vị máu dây rốn thu thập và lƣu trữ là vô cùng cần thiết. Trong nƣớc đã có một số nghiên cứu liên quan đến đánh giá chất lƣợng máu dây rốn đƣợc thực hiện nhằm tối ƣu quy trình thu thập, xử lý, lƣu trữ máu dây rốn. Tuy nhiên các nghiên cứu đa số chỉ bƣớc đầu đánh giá tình hình thu thập mẫu, sàng lọc và xử lý máu dây rốn tại một số bệnh viện lớn. Chẳng hạn nhƣ nghiên cứu của

Nguyễn Thị Duyên khảo sát một số chỉ số huyết học và chất lƣợng máu dây rốn lƣu trữ tại Bệnh viện Nhi TW từ 2016 đến 2018 [76]. Nghiên cứu của GS. Huỳnh Nghĩa và đồng nghiệp về tình hình thu thập, sàng lọc và xử lý máu dây rốn tại Bệnh viện Truyền máu – Huyết học TP HCM [77]. Báo cáo của Trần Trung Dũng và Lê Thị Dịu Hiền năm 2013 về việc đánh giá chất lƣợng máu dây rốn thu thập tại ngân hàng máu dây rốn tại Bệnh viện Truyền máu – Huyết học TP HCM [78].

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU

2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Đối tƣợng nghiên cứu trong đề tài của chúng tôi là 355 đơn vị máu dây rốn trẻ sơ sinh đƣợc thu thập tại Ngân hàng Tế bào gốc, Bệnh viện Đa khoa Tâm Anh Hà Nội từ 06/2019 đến 03/2021.

2.2.2. Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đƣợc liệt kê theo Bảng 2.1.

Bảng 2.1. Danh mục hóa chất

Hóa chất Hãng sản xuất

CryoMACS® DMSO Miltenyi, Đức

Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Gibco, Mỹ

Ficoll-Paque PREMIUM GE Healthcare, Mỹ

Stem-KitTM Reagent Beckman coulter, Mỹ

PvP-Iodine 10% Danapha, Việt Nam

Ringer lactate B.braun, Đức

2.2.3. Thiết bị

Danh mục thiết bị dùng trong nghiên cứu đƣợc liệt kê trong Bảng 2.2.

Bảng 2.2. Danh mục thiết bị

Thiết bị Hãng sản xuất

Tủ an toàn sinh học ESCO, Singapore

Máy ly tâm văng Eppendorf, Đức

Máy hút dịch chân không Integra, Mỹ

Pipette Aid Thermo Fisher, Mỹ

Navios EX Flow cytometer Beckman coulter, Mỹ

Máy Vortex IKA, Đức

Cân điện tử Ohaus, Mỹ

Nhiệt kế hồng ngoại Fluke, Mỹ

Coolcell box Corning, Mỹ

Tủ lạnh -80oC pHcbi, Nhật Bản

Tủ lạnh -20oC pHcbi, Nhật Bản

Tank Nitơ lỏng Whorthington, Mỹ

Máy in barcode Zebra, Mỹ

Bể ổn nhiệt Memmert, Đức

2.2.4. Vật tƣ tiêu hao

Danh sách vật tƣ tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu đƣợc liệt kê trong

Bảng 2.3.

Bảng 2.3. Danh mục dụng cụ, vật tƣ tiêu hao

Dụng cụ, vật tƣ tiêu hao Hãng sản xuất

Ống ly tâm 50mL Axygen, Mỹ

Ống ly tâm 1.5mL Eppendorf, Đức

Ống lƣu chủng cryotube 1.8mL Corning, Mỹ

Pipet nhựa vô trùng Corning, Mỹ

Túi lấy máu Terumo, Nhật Bản

Pank và kéo vô trùng Aesculap, Đức

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Không đạt

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu

Không thu mẫu

Sàng lọc sản phụ

(Bệnh di truyền, bệnh lây qua đƣờng máu, sốt khi sinh)

Đạt

Thu thập mẫu

Không đạt

Sàng lọc mẫu

Hủy mẫu

(V≥70mL)

Đạt

Xử lý mẫu

Kiểm tra chất lƣợng

Tỷ lệ tế bào sống

Không đạt

Sô lƣợng TNC và tế bào CD34+

(≥80%)

Kiểm soát nhiễm khuẩn

Không đạt

Hủy mẫu

Đạt

Lƣu trữ

Phân tích ảnh hƣởng của các yếu tố liên quan

Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang đƣợc thể hiện trên sơ đồ thiết kế nghiên cứu (Hình 2.1). Đơn vị máu dây rốn trong nghiên cứu đƣợc thu thập, xử lý, lƣu trữ với các tiêu chuẩn chấp thuận và loại trừ dựa trên trên các khuyến cáo của Hiệp hội truyền máu Hoa Kỳ - AABB [79] và các ngân hàng máu dây rốn tại Mỹ [80] bao gồm:

 Tiêu chuẩn sàng lọc sản phụ

Việc lựa chọn thu thập mẫu máu dây rốn trẻ sơ sinh đƣợc tiến hành bằng cách sàng lọc một số tiêu chuẩn áp dụng đối với sản phụ để đảm bảo mẫu thu đƣợc không có tác nhân lây truyền qua đƣờng máu, đảm bảo chất lƣợng của mẫu thu đƣợc, đảm an toàn cho cả ngƣời mẹ, nhân viên thu mẫu và các mẫu đã đƣợc lƣu trữ trong ngân hàng tế bào gốc.

Tiêu chuẩn đối với sản phụ:

 Nhiệt độ < 38oC trong khi sinh.

 Xét nghiệm virus HIV (HIV - ½ Ab), HBV (HbsAg, HbcAb), HCV (HCV Ab), Cytomegalo virus (CMV) IgM, Giang mai (Syphilis), Rubella virus IgM âm tính trong vòng 7 ngày trƣớc sinh.

 Không bị bệnh lý di truyền.

 Tiêu chuẩn sàng lọc mẫu sau thu thập

Tiêu chuẩn mẫu đƣa vào xử lý: Thể tích máu ≥ 70mL/đơn vị túi máu.

 Tiêu chuẩn sàng lọc mẫu sau xử lý

Tiêu chuẩn mẫu đƣa vào lƣu trữ:

 Tỷ lệ tế bào sống: ≥80%

 Kiểm soát nhiễm khuẩn: không phát hiện sự phát triển của vi

khuẩn và vi nấm

2.3.2. Nội dung nghiên cứu

 Các chỉ số đánh giá chất lƣợng đơn vị máu dây rốn

- Thể tích đơn vị máu dây rốn (V)

- Số lƣợng tế bào có nhân (TNC)

- Số lƣợng tế bào CD34+ (CD34+)

- Tỷ lệ sống của tế bào có nhân (% tế bào sống)

 Các yếu tố ảnh hƣởng

- Yếu tố sản phụ (ngƣời mẹ):

 Tuổi sản phụ

 Nhóm máu

 Số lƣợng thai (sinh một/sinh đôi)

 Phƣơng pháp sinh (sinh thƣờng/sinh mổ)

 Phƣơng pháp mang thai (tự nhiên/thụ tinh nhân tạo)

 Tiền sử thai sản (sinh con lần thứ mấy)

- Yếu tố trẻ sơ sinh:

 Cân nặng

 Tuổi thai

 Giới tính

- Yếu tố khác: Thời gian bảo quản mẫu (từ lúc thu thập cho đến

khi xử lý mẫu)

2.3.3. Kỹ thuật thu thập máu dây rốn

 Nguyên lý

Sau khi sàng lọc, sản phụ đƣợc theo dõi liên tục đến khi trở dạ hoặc

chuyển mổ.

Máu dây rốn đƣợc thu thập qua tĩnh mạch dây rốn vào túi máu có chứa chất chống đông CPDA ngay sau khi em bé đƣợc sinh ra. Vị trí chọc kim là tĩnh mạch dây rốn, sau khi dây rốn đã đƣợc kẹp và cắt rời khỏi trẻ sơ sinh.

Quy trình thu thập máu dây rốn chỉ mất từ 2-3 phút, có thể áp dụng cho cả sinh mổ và sinh thƣờng.

Thu thập máu dây rốn có thể thực hiện trƣớc hoặc sau khi xổ nhau. Tuy nhiên để đảm bảo lấy đƣợc lƣợng máu tốt nhất, thời điểm thu thập máu dây rốn thƣờng là trƣớc khi xổ nhau (trẻ đã ra ngoài nhƣng bánh nhau còn nằm trong tử cung ngƣời mẹ). Trong một số tình huống sản khoa đặc biệt không thể thu thập ở giai đoạn trên, có thể thu thập máu dây rốn sau khi xổ nhau. Bánh nhau và dây rốn khi đó sẽ đƣợc xử lý ở khu vực riêng để lấy đƣợc hết lƣợng máu còn lại trong các mạch máu.

Sau khi lƣợng máu trong dây rốn đã hết thì rút kim, túi máu dây rốn đƣợc bảo quản và vận chuyển về Ngân hàng Tế bào gốc để xử lý nhanh trong vòng 24 giờ.

Quá trình thu thập máu dây rốn hoàn toàn không ảnh hƣởng đến sức khỏe của ngƣời mẹ cũng nhƣ trẻ sơ sinh vì các bƣớc chỉ tiến hành sau khi dây rốn đã đƣợc kẹp và cắt, trẻ sơ sinh đã đƣợc tách ra khỏi mẹ và dây rốn.

 Tóm tắt quy trình thu thập mẫu máu dây rốn

- Sát khuẩn dây rốn bằng gạc vô trùng tẩm dung dịch PvP-Iodine 10%

tại chỗ đâm kim.

- Loại bỏ dung dịch kháng khuẩn bằng gạc khô vô trùng.

- Chọc kim của túi lấy máu vào tĩnh mạch dây rốn.

- Lắc túi lấy máu liên tục trong khi lấy máu.

- Khi hết máu, rút kim lấy máu, dồn hết máu xuống túi, đóng nắp kim

và vuốt khóa dây máu về phía túi máu, khóa cố định.

- Thắt 3 nút trên dây lấy máu, mỗi nút thắt cách nhau khoảng 3-5cm.

- Tiếp tục lắc túi lấy máu thêm khoảng 2-3 phút.

- Ghi đầy đủ thông tin về sản phụ trên túi máu (họ tên sản phụ, ngày

tháng năm sinh của sản phụ, ngày lấy máu, địa điểm lấy mẫu).

- Túi máu sau khi đƣợc thu thập xong sẽ ngay lập tức chuyển về phòng thí nghiệm để xử lý hoặc bảo quản ở 2-8oC trong vòng 24h.

Hình 2.2. Túi máu dây rốn sau khi thu thập

- Sau khi vận chuyển về phòng thí nghiệm, túi máu sẽ đƣợc kiểm tra xác nhận tình trạng mẫu, đo nhiệt độ và cân để xác định thể tích máu thu thập đƣợc (Hình 2.2).

2.3.4. Kỹ thuật xử lý máu dây rốn

 Nguyên lý

Máu dây rốn sau thu thập sẽ đƣợc xử lý với nhiều kỹ thuật chuyên sâu và phức tạp để loại bỏ bớt các thành phần thừa nhƣ hồng cầu, huyết tƣơng, giữ lại thành phần chính là lớp tế bào có nhân rất giàu tế bào gốc tạo máu. Điều đó sẽ giúp khối tế bào gốc đƣợc tinh sạch, thu gọn thuận tiện hơn cho việc lƣu trữ bảo quản.

Trong nghiên cứu này, máu dây rốn sau khi thu thập sẽ đƣợc xử lý theo

phƣơng pháp ly tâm phân lớp theo tỷ trọng sử dụng Ficoll.

Tỷ trọng của Ficoll là 1.077, cao hơn tỷ trọng của tế bào đơn nhân nhƣng lại thấp hơn tỷ trọng của hồng cầu và bạch cầu hạt. Khi ly tâm, hồng

cầu và bạch cầu hạt lắng xuống đáy ống ly tâm, còn lớp buffy coat chứa tế bào gốc tạo máu, bạch cầu lympho và các tế bào đơn nhân khác nằm ở giữa lớp Ficoll và huyết tƣơng (Hình 2.3). Thu hoạch lớp buffy coat này sẽ thu đƣợc sản phẩm sau xử lý máu dây rốn chứa tế bào gốc tạo máu mong muốn.

Hình 2.3. Phân lớp các thành phần máu dây rốn trên một gradient Ficoll- Hypaque

 Tóm tắt quy trình thực hiện

- Pha loãng máu dây rốn với dung dịch đệm DPBS, thao tác nhẹ

nhàng tránh gây vỡ hồng cầu.

- Cho nhẹ nhàng máu đã pha loãng lên trên lớp ficoll có trong ống ly

tâm với tỷ lệ thể tích 2:1.

- Ly tâm ống máu ở 400g trong 30 phút.

- Sau ly tâm, loại bỏ lớp huyết tƣơng phía trên cùng, thu lớp buffy coat ở giữa lớp huyết tƣơng và ficoll rồi cho sang ống ly tâm mới.

- Rửa tế bào thu đƣợc 2 lần với DPBS.

- Lấy mẫu xét nghiệm vô khuẩn.

- Lấy mẫu xét nghiệm để đánh giá chất lƣợng mẫu sau khi xử lý.

- Tế bào gốc từ máu dây rốn sau khi xử lý đƣợc trộn với dung dịch bảo quản, hạ nhiệt độ đạt dƣới -80°C, sau đó đƣợc bảo quản đông lạnh trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -150 đến -196°C.

Tế bào gốc tạo máu sẽ đƣợc bảo tồn đầy đủ chức năng vốn có với thời gian lƣu giữ lâu dài. Hiện nay trên thế giới chƣa có tài liệu công bố thời gian tối đa khi lƣu giữ ở nhiệt độ âm sâu trong nitơ lỏng, vì vậy về lý thuyết có thể lƣu giữ không hạn chế về thời gian nếu có nhu cầu.

Khi cần dùng đến, chỉ cần đƣa tế bào gốc máu dây rốn về nhiệt độ cơ

thể 37°C là có thể tiến hành sử dụng.

2.3.5. Kỹ thuật đánh giá chất lƣợng máu dây rốn sau xử lý

 Nguyên lý

Lớp buffy coat chứa tế bào gốc tạo máu thu đƣợc sau khi xử lý máu dây rốn đƣợc tiến hành đánh giá chất lƣợng bằng phƣơng pháp đếm tế bào theo dòng chảy, sử dụng các chỉ thị CD34, CD45 để xác định quần thể CD34+ và TNC, sử dụng thuốc nhuộm 7AAD (7-Amino-actinomycin D) để xác định tỷ lệ tế bào sống.

a. Các tiêu chí xác định tế bào gốc/tiền thân tạo máu

Xác định tế bào gốc/tiền thân tạo máu ở ngƣời theo hƣớng dẫn của Hiệp hội Kỹ thuật ghép và Điều trị huyết học quốc tế (International Society of Hematotherapy and Graft Engineering – ISHAGE) [81] với các tiêu chí:

i) Biểu hiện kháng nguyên CD34

ii) Biểu hiện kháng nguyên CD45 với cƣờng độ nhuộm đặc trƣng của tế bào blast (tức là có thể phát hiện dễ dàng nhƣng ở mức độ thấp hơn so với bạch cầu lympho (Lymphocyte) và bạch cầu mono (Monocyte)

iii) Biểu hiện FSC (forward scatter) và SSC (side scatter) thấp.

b. Kháng nguyên CD34

Kháng nguyên CD34 là một họ các glycoprotein chuỗi đơn xuyên màng loại I đƣợc glycosyl hóa khác biệt đƣợc xác định lần đầu tiên vào năm 1984 trên tế bào gốc và tế bào tiền thân tạo máu [82]. Nó đƣợc biểu hiện trên hầu nhƣ tất cả các tế bào tiền thân tạo máu bao gồm cả tế bào gốc đa năng.

Mặc dù cấu trúc của CD34 đã đƣợc nghiên cứu kỹ lƣỡng, nhƣng vẫn còn tƣơng đối ít thông tin về chức năng của nó. Các nghiên cứu về tế bào gốc tạo máu cho thấy chúng có vai trò trong quá trình tăng sinh và biệt hóa tế bào. Ngoài ra có giả thuyết cho rằng CD34 đóng một vai trò trong việc vận chuyển HSC đến các hốc trong tủy xƣơng [83].

Các kháng thể đơn dòng nhận biết phân tử CD34 đƣợc phát triển và sử dụng trong phƣơng pháp đếm tế bào theo dòng chảy nhƣ một phƣơng tiện để đánh giá tế bào gốc tạo máu và tế bào tiền thân tạo máu.

c. Kháng nguyên CD45

Kháng thể CD45 nhận biết các thành viên trong họ CD45 gồm các kháng nguyên bạch cầu với trọng lƣợng phân tử là 180, 190, 210 và 220 kD, còn đƣợc gọi là bạch cầu kháng nguyên phổ biến (Leukocyte common antigen – LCA). Kháng nguyên bề mặt CD45 đƣợc biểu hiện trên mọi loại tế bào tạo máu trừ hồng cầu trƣởng thành và tiền thân trực tiếp của chúng [84].

d. Thuốc nhuộm 7-Amino-Actinomycin

Tế bào chết theo chƣơng trình, tế bào hoại tử và tế bào hƣ hỏng là những nguồn gây nhiễu trong việc phân tích các tế bào sống trong phƣơng pháp đếm tế bào theo dòng chảy. Các tế bào không sống (Nonviable cells) phải đƣợc đánh giá và phân biệt bằng phƣơng pháp sử dụng thuốc nhuộm 7- Amino-Actinomycin (7-AAD), từ đó xác định đƣợc tỷ lệ tế bào sống/chết trong quần thể tế bào quan tâm.

Thuốc nhuộm 7-AAD là một analog của actinomycin D có chứa nhóm amin đƣợc thay thế ở vị trí số 7 của nhóm mang màu (Chromophore) [85]. 7- AAD có ái lực mạnh với DNA, đi vào tế bào khi màng tế bào tổn thƣơng hay tế bào chết. 7-AAD xen vào giữa các gốc base cytosine và guanine của DNA. Actinomycin là hợp chất có hoạt tính sinh học có chứa nhóm mang màu gồm

một 2-amino-4, 6 dimethylphenoxazone-3 và hai cyclic pentapeptides. Actinomycin tạo phức bền vững với DNA sợi đôi, nhƣng không tạo với RNA, sợi lai RNA-DNA hay với DNA, RNA sợi đơn.

Đặc tính quang phổ của 7-AAD làm cho phân tử này đặc biệt thích hợp cho phƣơng pháp đếm tế bào theo dòng chảy. Phức hợp 7-AAD/DNA hấp thụ bƣớc sóng tối đa trong vùng quang phổ màu xanh lá cây, do đó phù hợp với máy đếm tế bào theo dòng chảy đƣợc trang bị đèn laser argon (bƣớc sóng kích thích 488nm) [85]. Sự phát xạ huỳnh quang màu đỏ đậm của thuốc nhuộm 7- AAD (635 đến 675nm) làm cho việc sử dụng màu nhuộm này dễ dàng hơn khi kết hợp với các kháng thể liên hợp huỳnh quang isothiocyanate (FITC) và phycoerythrin (PE), do phức hợp 7-AAD/DNA cho thấy sự chồng chéo quang phổ tối thiểu với FITC và PE [86]. Do đó, giảm bớt đƣợc thao tác bù màu (Compensation) trƣớc khi chạy mẫu, tiết kiệm hóa chất và thời gian.

e. Stem-count Fluorospheres

Stem-count Fluorospheres hay Flow-count Fluorospheres gồm có các vi cầu (Microsphere) huỳnh quang polystyrene đƣờng kính 10µm trong môi trƣờng huyền phù, chất hoạt động bề mặt và 1% formaldehyde. Mỗi hạt huỳnh quang có chứa chất nhuộm màu có dải phát huỳnh quang từ 525nm đến 700nm khi kích thích ở bƣớc sóng 488nm. Nồng độ thử nghiệm của Stem- count Fluorospheres (fluorospheres/µL) đƣợc lấy từ nhiều lần phân tích lặp lại bằng cách sử dụng máy phân tích kích thƣớc hạt COULTER. Giá trị cụ thể đƣợc ghi trên nhãn lọ. Bằng cách dựa trên giá trị này khi đếm tế bào theo dòng chảy có thể xác định đƣợc số lƣợng tế bào tuyệt đối nếu sử dụng một nồng độ cụ thể.

 Tóm tắt quy trình thực hiện

- Chuẩn bị mẫu và hóa chất:

 Mẫu tế bào thu đƣợc sau khi xử lý máu dây rốn pha loãng với

đệm DPBS

 Chuẩn bị ống chạy mẫu và ống đối chứng. Cho mẫu vào tất cả

các ống.

- Ủ mẫu với kháng thể:

 Bổ sung kháng thể CD34/CD45 vào ống chạy mẫu, kháng thể

CD45 vào ống đối chứng (Bảng 2.4)

 Bổ sung 7AAD vào tất cả các ống

 Vortex và ủ mẫu trong điều kiện tối ở nhiệt độ phòng

- Ly giải hồng cầu:

 Sau thời gian ủ, bổ sung dung dịch đệm ly giải hồng cầu vào

tất cả các ống

 Vortex và ủ mẫu trong điều kiện tối ở nhiệt độ phòng

- Sau khi ủ, bổ sung Stem-count flourospheres vào tất cả các ống.

- Bật máy và chọn chƣơng trình phù hợp tiến hành chạy mẫu.

Bảng 2.4. Tóm tắt thông tin nhuộm mẫu với kháng thể

Hóa chất/Mẫu Ống mẫu 1 Ống mẫu 2 Đối chứng

CD45-FITC/CD34-PE 20µL 20µL 

CD45-FITC 20µL  

7-AAD viability dye 20µL 20µL 20µL

Mẫu tế bào 100µL 100µL 100µL

Vortex - ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Tránh ánh sáng

2mL 2mL 2mL 1x NH4Cl Lysing solution

Vortex - ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Tránh ánh sáng

Stem-count Flourospheres 100µL 100µL 100µL

Vortex - chạy mẫu trong vòng 1h. Tránh ánh sáng

- Phân tích kết quả thu đƣợc:

 Chọn quần thể dƣơng tính với CD45, CD34

 Trên cửa sổ 7-AAD, xác định quần thể tế bào âm tính với 7-

AAD là quần thể tế bào sống

2.3.6. Kiểm soát nhiễm khuẩn mẫu máu dây rốn sau xử lý

Mẫu máu dây rốn sau khi xử lý đƣợc phát hiện ngoại nhiễm vi khuẩn, vi nấm đƣợc thực hiện dựa trên xét nghiệm vi khuẩn vi nấm nuôi cấy định danh và kháng thuốc trên hệ thống tự động BACT/ALERT® (BioMérieux, Pháp) với hai loại môi trƣờng lỏng khác nhau BacT/ALERT® FA Plus và BacT/ALERT® FN Plus (BioMérieux, Pháp) trong thời gian 14 ngày. Hệ thống cấy tự động đánh giá sự thay đổi nồng độ CO2 và N cũng nhƣ độ đục trong chai chấy mỗi 15 phút. Khi hệ thống báo dƣơng tính hoặc âm tính, các chai đƣợc đánh giá độ đục và nhuộm Gram để phát hiện sự hiện diện của tế bào vi khuẩn, vi nấm sau nuôi cấy trên hệ thống. Trong trƣờng hợp hệ thống báo dƣơng tính hoặc phát hiện tế bào vi khuẩn, vi nấm bằng nhuộm Gram, môi trƣờng lỏng đƣợc chuyển sang môi trƣờng đặc gồm Thạch máu (Blood Agar Base + 5% Sheep Blood), thạch Chocolate, MacConkey, Chapman, Sabouraud (MELAB, Việt Nam) để phát hiện sự hiện diện của khuẩn lạc vi khuẩn, vi nấm trong thời gian 2 ngày. Khi có khuẩn lạc vi khuẩn, vi nấm trên môi trƣờng đặc đƣợc định danh và thử nghiệm nhạy kháng sinh bằng hệ thống tự động VITEK 2 (BioMérieux, Pháp).

2.3.7. Phân tích thống kê

 Thống kê mô tả đƣợc sử dụng cho các yếu tố ngƣời mẹ, yếu tố trẻ sơ sinh, yếu tố trong xử lý mẫu và các chỉ số chất lƣợng máu dây rốn.

 Sự khác biệt giữa các yếu tố ảnh hƣởng về các chỉ số chất lƣợng tế bào gốc dây rốn đƣợc đánh giá bằng cách sử dụng kiểm kiểm định ANOVA.

 Mối tƣơng quan giữa các các yếu tố ảnh hƣởng và các chỉ số chất lƣợng tế bào gốc dây rốn đƣợc kiểm tra bằng tƣơng quan Pearson

(Pearson’s correlation). Khi xác định 2 biến có mối tƣơng quan tuyến tính, xem xét độ mạnh/yếu của mối tƣơng quan này thông qua giá trị tuyệt đối của hệ số tƣơng quan r. Theo Andy Field [87]:

 |r| < 0.1: mối tƣơng quan rất yếu

 |r| < 0.3: mối tƣơng quan yếu

 |r| < 0.5: mối tƣơng quan trung bình

 |r| ≥ 0.5: mối tƣơng quan mạnh

 r dƣơng – tƣơng quan thuận

 r âm – tƣơng quan nghịch

 Sử dụng phân tích hồi quy đơn biến và đa biến để kiểm tra sự ảnh hƣởng của từng yếu tố đến chất lƣợng sản phẩm tế bào gốc từ máu dây rốn (số lƣợng TNC, CD34+, tỷ lệ tế bào sống).

 Khoảng tin cậy đƣợc sử dụng là 95% (p<0.05).

 Tất cả các phân tích đƣợc thực hiện trên phần mềm phân tích thống

kê IBM SPSS Statistic 22.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1.1. Kết quả thu thập mẫu

Bảng 3.1. Thống kê các đơn vị máu dây rốn đƣợc tiến hành thu thập

Đơn vị máu dây rốn n %

Tổng số 355 100

Loại 333 93.8

Không đạt tiêu chuẩn 22 6.2

22 100 Tổng số mẫu bị loại

Thể tích máu < 70mL 17 77.3

Nhiễm khuẩn* 2 9.1

Nguyên nhân bị loại

Sốt trong khi sinh 1 4.5

Dƣơng tính** 2 9.1

* Xét nghiệm vi sinh kiểm tra tính vô trùng của mẫu tế bào gốc sau khi đơn vị máu dây rốn đƣợc xử lý.

** Xét nghiệm virus HIV (HIV - ½ Ab), HBV (HbsAg, HbcAb), HCV (HCV Ab), Cytomegalo virus (CMV) IgM, giang mai (Syphilis), Rubella âm tính cho sản phụ trong vòng 7 ngày trƣớc sinh.

Trong khoảng thời gian từ tháng 06/2019 đến tháng 03/2021, tổng số 355 đơn vị máu dây rốn đƣợc thu thập tại Ngân hàng tế bào gốc, Bệnh viện đa khoa Tâm Anh, Hà Nội. Trong đó, số đơn vị đạt tiêu chuẩn sàng lọc đƣợc xử lý và lƣu trữ là 333 đơn vị, chiếm 93.8%. Số đơn vị máu dây rốn không đạt tiêu chuẩn sàng lọc có 22 đơn vị, chiếm 6.2% trong tổng số.

Trong số các đơn vị máu dây rốn bị loại, nguyên nhân bị loại do thể tích máu dƣới 70mL không bao gồm chất chống đông có 17 đơn vị chiếm 77.3%, còn lại là do các nguyên nhân khác nhƣ sản phụ sốt > 38oC trong khi sinh (4.5%), xét nghiệm sản phụ dƣơng tính với một trong bảy xét nghiệm bệnh truyền nhiễm (9.1%) và xét nghiệm vi sinh cho kết quả dƣơng tính sau khi xử lý mẫu (9.1%).

3.1.2. Đặc điểm thống kê các đơn vị máu dây rốn đạt tiêu chuẩn

a) Đặc điểm sản phụ

 Tuổi sản phụ

Bảng 3.2. Đặc điểm về độ tuổi của sản phụ

Nhỏ nhất Lớn nhất Cỡ mẫu (n) Trung bình Độ lệch chuẩn

Tuổi sản phụ 333 18 48 32 5

Hình 3.1. Phân bố độ tuổi của sản phụ

Thống kê cho thấy, trong các đơn vị máu dây rốn đạt tiêu chuẩn, độ tuổi sản phụ trung bình 32±5 tuổi, trong đó, độ tuổi thấp nhất là 18 và cao nhất là 48 tuổi (Bảng 3.2).

Quan sát phân bố độ tuổi của sản phụ (Hình 3.1) cho thấy phần lớn sản phụ nằm trong độ tuổi từ 26-35 tuổi, chiếm tỷ lệ 57.36%. Sản phụ trên 46 tuổi chiếm tỷ lệ thấp nhất (0.3%), độ tuổi sản phụ từ 18-25 cũng chiếm tỷ lệ không nhiều (12.31%).

 Đặc điểm sản khoa

Bảng 3.3. Đặc điểm sản khoa

Yếu tố n %

Sinh con lần đầu 111 33.3

Sinh con ≥ 2 lần 188 56.5 Tiền sử thai sản

Không xác định 34 10.2

Sinh một 314 94.3

Số lƣợng thai

Sinh đôi 19 5.7

Tự nhiên 255 76.6

Phƣơng pháp mang thai

Thụ tinh nhân tạo 78 23.4

Sinh thƣờng 74 22.2

Phƣơng pháp sinh

Sinh mổ 259 77.8

Kết quả cho thấy, nhóm sản phụ sinh con lần thứ 2 trở lên chiếm tỷ lệ cao 56.5%, chủ yếu là thai một chiếm 94.3%, tỷ lệ sinh đôi chiếm 5.7%. Ngoài ra tỷ lệ sản phụ sinh mổ 77.8% lớn hơn nhiều so với sinh thƣờng 22.2%. Đặc biệt, tỷ lệ sản phụ mang thai nhờ phƣơng pháp thụ tinh nhân tạo chiếm tỷ lệ đáng kể 23.4% (Bảng 3.3).

b) Đặc điểm trẻ sơ sinh

 Giới tính trẻ sơ sinh

Trong số các đơn vị máu dây rốn đƣợc thu thập đạt tiêu chuẩn, nhóm trẻ sơ sinh giới tính nam chiếm tỷ lệ 61.93%, cao hơn đáng kể so với nhóm trẻ giới tính nữ chỉ chiếm 38.07% (Hình 3.2).

Hình 3.2. Phân bố giới tính trẻ sơ sinh

 Tuổi thai và cân nặng

Bảng 3.4. Đặc điểm thống kê tuổi thai và cân nặng trẻ sơ sinh

Nhỏ nhất Lớn nhất Cỡ mẫu (n) Trung bình Độ lệch chuẩn

332 29 41 38.6 1.7 Tuổi thai (tuần)

332 1300 4100 3115 453 Cân nặng (gram)

Hình 3.3. Phân bố tuổi thai

Thống kê cho thấy tuổi thai trung bình 38.6 ± 1.7 tuần (Bảng 3.4), nhóm tuổi thai ≥ 37 tuần chiếm tỷ lệ lớn nhất 87.95%, thấp nhất ở nhóm 29- 34 tuần tuổi chiếm 2.71% (Hình 3.3).

Hình 3.4. Phân bố cân nặng trẻ sơ sinh

Về cân nặng trẻ sơ sinh, cân nặng trung bình đạt 3115±453g (Bảng 3.4). Quan sát phân bố cân nặng nhận thấy nhóm trẻ có cân nặng ≥ 3000 chiếm tỷ lệ 59.64% lớn hơn đáng kể so với nhóm trẻ có cân nặng từ 1300- 3000g (Hình 3.4).

c) Đặc điểm chỉ số chất lượng máu dây rốn

Bảng 3.5. Đặc điểm thống kê của các chỉ số chất lƣợng máu dây rốn đạt tiêu chuẩn sau khi xử lý

Chỉ số Nhỏ nhất Lớn nhất Trung bình Cỡ mẫu (n) Độ lệch chuẩn

333 70 216 112 25 Thể tích (mL)

333 72.2 99.6 95.7 4.2 Tế bào sống (%)

333 0.21 9.27 2.72 1.5 TNC (x108 tế bào)

333 0.15 12.31 2.31 1.86 CD34+ (x106 tế bào)

Tỷ lệ CD34+ 333 0.1 5.58 0.90 0.63 (%)

316 19 2990 471.88 419.319

Thời gian bảo quản (phút)

Hình 3.5. Phân bố thể tích máu dây rốn của các đơn vị đƣợc thu thập

Từ Bảng 3.5 cho thấy các đơn vị máu dây rốn có thể tích máu trung bình 112 ± 25mL. Trong đó, các đơn vị máu dây rốn có thể tích trong khoảng 100-129mL chiếm tỷ lệ lớn nhất 47.45%, các đơn vị máu có thể tích trên 160mL chiếm tỷ lệ khá nhỏ, chỉ 4.8% (Hình 3.5).

Hình 3.6. Phân bố số lƣợng TNC

Số lƣợng TNC sau khi máu dây rốn đƣợc xử lý trung bình đạt 2.72±1.5x108 tế bào (Bảng 3.5). Quan sát phân bố số lƣợng TNC so với ngƣỡng 5x108 tế bào cho thấy, số đơn vị máu dây rốn có số lƣợng TNC ≥ 5x108 tế bào chiếm 7.21% (Hình 3.6).

Hình 3.7. Phân bố số lƣợng tế bào CD34+

Số lƣợng tế bào biểu hiện chỉ thị bề mặt CD34 trung bình đạt 2.31±1.86x106 tế bào, tỷ lệ CD34+ trung bình 0.90±0.63% (Bảng 3.5). Thống kê sự phân bố số lƣợng tế bào CD34+ cho thấy số đơn vị máu dây rốn có số lƣợng CD34+ ≥ 1.25x106 tế bào chiếm phần lớn với tỷ lệ 66.37% (Hình 3.7).

Hình 3.8. Phân bố tỷ lệ tế bào sống

Tỷ lệ tế bào sống trung bình đạt 95.7 ± 4.2% (Bảng 3.5). Tỷ lệ tế bào sống ≥ 85% chiếm chủ yếu với 98.8%, đơn vị máu dây rốn có tỷ lệ tế bào sống <85% chỉ chiếm 4.2% (Hình 3.8).

3.1.3. Các yếu tố liên quan đến chỉ số chất lƣợng tế bào gốc tạo máu

a) Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với thể tích máu dây rốn

Bảng 3.6. Một số yếu tố liên quan với thể tích máu thu thập

Thể tích (mL) n p Trung bình Độ lệch chuẩn Nhỏ nhất Lớn nhất

<30 131 110.4 25.9 70 187 0.351 Tuổi ngƣời mẹ >30 202 113.0 24.4 70 216

Sinh con lần 1 111 108.6 23.3 70 180 0.062 Tiền sử thai sản Sinh con ≥ 2 lần 118 114.1 25.4 70 216

Sinh một 314 112.6 1.4 70 216 0.009* Số lƣợng thai Sinh đôi 19 101.8 3.5 79 150

Sinh thƣờng 74 108.6 23.8 70 171 0.182 Phƣơng thức sinh Sinh mổ 259 113.0 25.3 70 216

Tự nhiên 255 112.2 25.2 70 216 0.758 IVF 78 111.2 24.5 75 208 Phƣơng thức mang thai

O+ 130 108.7 21.9 70 171

A+ 58 112.6 26.3 72 216 0.260 B+ 127 114.6 26.2 70 208 Nhóm máu sản phụ AB+ 18 115.3 31.7 75 200

<3000 134 104.5 19.4 72 171 <0.05* >3000 198 117.0 27.1 70 216 Cân nặng trẻ sơ sinh

Nam 205 111.9 25.1 70 216 0.917 Giới tính Nữ 126 112.2 25.1 72 176

<35 tuần 15 99 18.7 75 135 0.04* Tuổi thai >35 tuần 317 112.6 25.1 70 216

Các yếu tố sản phụ

Từ Bảng 3.6 cho thấy thể tích máu trung bình 112.6mL ở nhóm bà mẹ sinh thai một cao hơn so với thể tích máu trung bình 101.8mL ở nhóm bà mẹ sinh thai đôi (p<0.05).

Tuy nhiên, hầu hết các yếu tố thuộc về ngƣời mẹ còn lại không nhận

thấy có sự khác biệt về thể tích:

 Tuổi sản phụ không có ảnh hƣởng đến thể tích máu dây rốn thu thập

 Tiền sử thai sản cũng cho kết quả tƣơng tự ở nhóm sản phụ sinh con lần

đầu và sinh con lần thứ 2 trở lên.

 Phƣơng pháp sinh thƣờng và sinh mổ, nhóm máu sản phụ cũng cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa ở thể tích máu dây rốn thu thập đƣợc.

 Đặc biệt, thể tích máu dây rốn thu thập đƣợc ở hai nhóm sản phụ mang thai tự nhiên và sản phụ mang thai nhờ phƣơng pháp thụ tinh nhân tạo cho kết quả tƣơng đƣơng nhau, không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê.

Các yếu tố trẻ sơ sinh

 Kết quả cho thấy thể tích máu dây rốn thu thập đƣợc cao hơn ở nhóm

trẻ sơ sinh có cân nặng trên 3000g (p<0.05).

 Tuổi thai trên 35 tuần cũng cho kết quả thể tích máu thu thập cao hơn

so với nhóm tuổi thai dƣới 35 tuần (p<0.05).

 Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về thể tích máu dây rốn ở

nhóm trẻ nam và nữ.

b) Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với số lượng TNC

Bảng 3.7. Một số yếu tố liên quan đến số lƣợng TNC

TNC (x108 tế bào) n p Trung bình Độ lệch chuẩn Nhỏ nhất Lớn nhất

<30 131 2.73 1.62 0.21 8.66 0.954 Tuổi ngƣời mẹ >30 202 2.72 1.42 0.34 9.27

Sinh con lần 1 111 2.59 1.48 0.21 8.09 0.361 Tiền sử thai sản 188 2.75 1.41 0.34 9.27 Sinh con ≥ 2 lần

Sinh một 314 2.76 1.50 0.21 9.27 0.029* Số lƣợng thai Sinh đôi 19 1.99 1.29 0.69 6.19

Sinh thƣờng 74 3.01 1.72 0.34 8.09 0.060 Phƣơng thức sinh Sinh mổ 259 2.64 1.43 0.21 9.27

Tự nhiên 255 2.77 1.52 0.21 9.27 0.280 IVF 78 2.56 1.45 0.44 6.52 Phƣơng thức mang thai

O+ 130 2.59 1.37 0.21 8.09

A+ 58 2.60 1.34 0.42 9.27 0.237 B+ 127 2.93 1.65 0.34 8.66 Nhóm máu sản phụ AB+ 18 2.52 1.74 0.45 6.94

<3000 134 2.35 1.30 0.42 8.09 <0.05* Cân nặng trẻ sơ sinh >3000 198 2.96 1.58 0.21 9.27

Nam 205 2.67 1.48 0.34 9.27 0.550 Giới tính Nữ 126 2.77 1.52 0.21 7.22

<35 tuần 15 2.17 1.44 0.69 5.57 0.149 Tuổi thai >35 tuần 317 2.75 1.50 0.21 9.27

Các yếu tố sản phụ

Trong các yếu tố thuộc về sản phụ, chỉ có yếu tố số lƣợng thai nhi ảnh hƣởng lên số lƣợng TNC thu đƣợc, cụ thể, số lƣợng TNC ở nhóm bà mẹ sinh một cao hơn đáng kể so với nhóm bà mẹ sinh đôi (p<0.05).

Các yếu tố sản phụ khác bao gồm tuổi ngƣời mẹ, tiền sử thai sản, phƣơng thức mang thai, hình thức sinh, nhóm máu đều cho kết quả không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong số lƣợng TNC thu đƣợc sau khi xử lý máu dây rốn.

Các yếu tố trẻ sơ sinh

Kết quả phân tích thống kê cho thấy, cân nặng trẻ trên 3000g có số lƣợng TNC trung bình cao hơn so với nhóm trẻ có cân nặng dƣới 3000g (p<0.05).

Yếu tố giới tính và tuổi thai không có sự khác biệt về số lƣợng TNC.

c) Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với số lượng tế bào CD34+

Bảng 3.8. Một số yếu tố liên quan với số lƣợng tế bào CD34+

CD34+ (x106 tế bào) n p Trung bình Độ lệch chuẩn Nhỏ nhất Lớn nhất

<30 131 2.32 1.96 0.27 12.31 0.969 Tuổi ngƣời mẹ >30 202 2.31 1.80 0.15 10.47

Sinh con lần 1 111 2.29 2.07 0.15 10.70 0.765 Tiền sử thai sản Sinh con > 2 lần 188 2.23 1.49 0.18 10.32

Sinh một 314 2.35 1.83 0.18 12.31 0.126 Số lƣợng thai Sinh đôi 19 1.68 2.21 0.15 10.32

Sinh thƣờng 74 2.68 2.06 0.18 10.47 0.057 Phƣơng thức sinh Sinh mổ 259 2.21 1.79 0.15 12.31

Tự nhiên 255 2.25 1.73 0.18 12.31 0.285 IVF 78 2.51 2.23 0.15 10.70 Phƣơng thức mang thai

O+ 130 2.35 1.86 0.23 10.47

A+ 58 2.11 1.48 0.15 6.27 0.441 B+ 127 2.45 2.05 0.18 12.31 Nhóm máu sản phụ AB+ 18 1.81 1.46 0.45 4.92

<3000 134 2.23 1.99 0.15 10.70 0.521 Cân nặng trẻ sơ sinh >3000 198 2.37 1.77 0.18 12.31

Nam 205 2.34 1.91 0.15 12.31 0.731 Giới tính Nữ 126 2.26 1.77 0.23 10.47

<35 tuần 15 2.37 2.63 0.38 10.70 0.903 Tuổi thai >35 tuần 317 2.31 1.82 0.15 12.31

Theo kết quả phân tích, các yếu tố sản phụ bao gồm: tuổi ngƣời mẹ, tiền sử thai sản, nhóm máu, phƣơng thức mang thai, phƣơng thức sinh và các

yếu tố trẻ sơ sinh bao gồm: cân nặng, tuổi thai, giới tính đều không có sự khác biệt về số lƣợng CD34+ sau xử lý (Bảng 3.8).

d) Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với tỷ lệ tế bào CD34+

Bảng 3.9. Một số yếu tố liên quan với tỷ lệ tế bào CD34+

Tỷ lệ CD34+ (%) n p Trung bình Độ lệch chuẩn Nhỏ nhất Lớn nhất

<30 131 0.95 0.76 0.19 5.58 0.319 Tuổi ngƣời mẹ >30 202 0.88 0.53 0.10 3.83

Sinh con lần 1 111 0.93 0.79 0.10 5.58 0.368 Tiền sử thai sản Sinh con > 2 lần 188 0.87 0.49 0.12 3.83

Sinh một 314 0.90 0.61 0.12 5.58 0.936 Số lƣợng thai Sinh đôi 19 0.91 0.86 0.10 3.83

Sinh thƣờng 74 0.89 0.44 0.20 2.42 0.876 Phƣơng thức sinh Sinh mổ 259 0.91 0.67 0.10 5.58

Tự nhiên 255 0.86 0.55 0.14 5.58 0.085 IVF 78 1.04 0.82 0.10 4.88 Phƣơng thức mang thai

O+ 130 0.97 0.67 0.14 5.58

A+ 58 0.87 0.63 0.10 2.96 0.401 Nhóm máu sản phụ B+ 127 0.87 0.87 0.18 4.88

AB+ 18 0.75 0.75 0.22 1.45

<3000 134 0.97 0.69 0.10 4.88 0.113 Cân nặng trẻ sơ sinh >3000 198 0.86 0.58 0.12 5.58

Nam 205 0.92 0.63 0.14 5.58 0.560 Giới tính Nữ 126 0.88 0.63 0.10 4.88

<35 tuần 15 1.24 1.19 0.18 4.88 0.271 Tuổi thai >35 tuần 317 0.89 0.59 0.10 5.58

Kết quả phân tích thống kê cho thấy các yếu tố ngƣời mẹ và yếu tố trẻ sơ sinh đều không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ tế bào CD34+ trong máu dây rốn (Bảng 3.9).

3.1.4. Tƣơng quan giữa các yếu tố sản phụ và chỉ số đánh giá chất

lƣợng của đơn vị máu dây rốn

Bảng 3.10. Tƣơng quan giữa một số yếu tố sản phụ và các chỉ số đánh giá chất lƣợng đơn vị máu dây rốn

TNC Thể tích máu CD34 %CD34

r 0.085 0.033 0.016 -0.28

Tuổi sản phụ p 0.122 0.549 0.777 0.615

n 333 333 333 333

r 0.081 0.041 0.00 -0.43

Tiền sử thai sản p 0.163 0.478 0.998 0.456

n 299 299 299 299

r -1 -0.84 0.04

Số lƣợng thai p 0.068 -0.119 0.029* 0.126 0.936

n 333 333 333 333

r -0.17 -0.059 0.059 0.117*

p 0.758 0.280 0.285 0.033 Phƣơng thức mang thai n 333 333 333 333

Kết quả phân tích tƣơng quan cho thấy số lƣợng thai nhi có tƣơng quan nghịch với số lƣợng TNC (r=-0.119, p<0.05), tuy nhiên mối tƣơng quan yếu. Các yếu tố nhƣ tuổi sản phụ và tiền sử thai sản không nhận thấy có sự tƣơng quan với thể tích máu, số lƣợng TNC và CD34+ (Bảng 3.10).

3.1.5. Tƣơng quan giữa yếu tố trẻ sơ sinh và các chỉ số đánh giá

chất lƣợng đơn vị máu dây rốn

Bảng 3.11. Tƣơng quan giữa một số yếu tố sơ sinh và các chỉ số đánh giá chất lƣợng đơn vị máu dây rốn

Thể tích máu TNC CD34 %CD34

r 0.105 0.079 -0.089 -0.198*

Tuổi thai p 0.056 0.151 0.107 0.000

n 332 332 332 332

r 0.377* 0.312* 0.130* -0.138*

p 0.000 Cân nặng 0.000 0.017 0.012

n 332 332 332 332

r -0.006 -0.033 0.019 0.032

Giới tính p 0.917 0.550 0.731 0.560

n 331 331 331 331

Kết quả phân tích tƣơng quan ở Bảng 3.11 cho thấy , tuổi thai có mối tƣơng quan nghịch với tỷ lệ phần trăm tế bào biểu hiện CD34, hệ số tƣơng quan r = -0.198, p<0.05.

Yếu tố cân nặng của trẻ có tƣơng quan thuận với thể tích máu thu thập (r=0.377, p<0.05), số lƣợng TNC (r=0.312, p<0.05) và số lƣợng CD34 (r=0.13, p<0.05). Tuy nhiên cân nặng lại có tƣơng quan nghịch với phần trăm tế bào biểu hiện CD34 với mức độ tƣơng quan yếu (r=-0.138, p<0.05).

Ngoài ra, kết quả cũng cho thấy giới tính của trẻ cùng với các chỉ số

chất lƣợng máu dây rốn không có sự tƣơng quan nào.

3.1.6. Tƣơng quan của một số yếu tố khác

Bảng 3.12. Tƣơng quan giữa một số yếu tố khác và các chỉ số đánh giá chất lƣợng đơn vị máu dây rốn

% Tế bào sống TNC CD34+ %CD34

r 0.156* 0.721* 0.458* -0.28

Thể tích p 0.04 0.000 0.000 0.609

n 333 333 333 333

r 0.044 0.316* -0.553* -0.261*

p 0.000 0.000 0.437 0.000 Thời gian bảo quản mẫu n 316 316 316 316

Kết quả cho thấy giữa thể tích và số lƣợng TNC có mối tƣơng quan thuận chặt chẽ với hệ số tƣơng quan r=0.721, p<0.05. Cùng với đó, thể tích máu cũng cho thấy mối tƣơng quan thuận trung bình với số lƣợng tế bào CD34+ (r=0.458, p<0.05), tƣơng quan yếu với tỷ lệ tế bào sống (r=0.156, p<0.05) (Bảng 3.12).

Thời gian bảo quản mẫu dây rốn từ khi thu thập đến khi đƣợc xử lý với

tỷ lệ tế bào sống có mối tƣơng quan nghịch khá chặt chẽ (r=-0.553, p<0.05).

3.1.7. Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến chất lƣợng của đơn vị máu

dây rốn

a) Ảnh hưởng của thể tích máu dây rốn đến số lượng TNC

Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của thể tích máu dây rốn lên số lƣợng TNC

p n TNC trung bình (x108) Độ lệch chuẩn

Thể tích

26 70-80mL 1.49 1.59

42 81-90mL 1.57 0.77

65 91-100mL 2.01 0.83

56 101-110mL 2.52 0.79

34 111-120mL 2.96 1.09 <0.05 45 121-130mL 3.02 1.03

41 131-150mL 3.92 1.24

20 151-180mL 5.33 1.43

2 181-200mL 5.38 1.15

2 >200mL 7.33 2.74

Kết quả cho thấy, TNC cao hơn ở những đơn vị máu dây rốn có thể tích

lớn hơn (p<0.05) (Bảng 3.13).

So sánh giá trị trung bình của các chỉ số chất lƣợng máu dây rốn ở hai nhóm thể tích < 80mL và ≥ 80mL cho thấy các đơn vị máu dây rốn thể tích lớn hơn 80mL có số lƣợng TNC và CD34+ cao hơn đáng kể (p<0.05) (Bảng 3.14).

Bảng 3. 14. So sánh chỉ số TNC với ngƣỡng thể tích 80mL

V p Cỡ mẫu (n) Nhỏ nhất Lớn nhất Trung bình Độ lệch chuẩn

< 80mL 26 0.21 8.66 1.49 1.58 <0.05 TNC

(x108 tế bào)

≥ 80mL 307 0.44 9.27 2.83 1.44

Hình 3.9. Liên hệ tuyến tính giữa thể tích máu dây rốn và TNC

Phân tích hồi quy tuyến tính cho thể tích máu dây rốn với tổng số tế bào có nhân (Hình 3.12) cho thấy TNC có liên hệ tuyến tính với thể tích máu dây rốn theo phƣơng trình hồi quy:

 TNC (x108 tế bào) = -2.131 + 0.043 x Thể tích máu (mL)

 R hiệu chỉnh = 0.518

Nhƣ vậy, cứ thể tích máu dây rốn tăng 1mL thì số lƣợng TNC tăng 0.043x108 tế bào. Thể tích máu dây rốn ảnh hƣởng 51.8% sự thay đổi của TNC, hay yếu tố thể tích máu dây rốn dự báo đƣợc 51.8% giá trị TNC

(p≤0.05), 48.2% còn lại do các yếu tố khác ngoài mô hình và sai số ngẫu nhiên.

b) Ảnh hưởng của thể tích máu đến số lượng tế bào CD34+

Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của thể tích máu đến số lƣợng CD34+

V p Cỡ mẫu (n) Nhỏ nhất Lớn nhất Trung bình Độ lệch chuẩn

< 80mL 26 0.18 12.3 1.54 2.33 <0.05 CD34+

(x106 tế bào)

≥ 80mL 307 0.15 10.69 2.37 1.80

Bảng 3.15 cho thấy CD34+ cao hơn ở những đơn vị máu dây rốn có thể

tích lớn hơn từ 80mL trở lên (p<0.05).

Phân tích hồi quy cho thể tích máu dây rốn và số lƣợng CD34+ (Bảng 3.16) cho thấy mối liên hệ tuyến tính giữa thể tích máu và số lƣợng tế bào CD34+ đƣợc thể hiện qua phƣơng trình:

 CD34+ (x106 tế bào) = -1.504 + 0.034 x Thể tích máu (mL)

 Hệ số R bình phƣơng hiệu chỉnh = 0.208

Theo phƣơng trình, thể tích máu chỉ có thể dự báo đƣợc 20.8% giá trị biến thiên của số lƣợng tế bào CD34+ (p≤0.05). Mô hình này không áp dụng đƣợc cho tổng thể.

Bảng 3.16. Kết quả phân tích hồi quy tuyến tính giữa thể tích máu và số lƣợng tế bào CD34+

Tóm tắt mô hìnhb

Durbin-Watson

R

Mô hình

R bình phƣơng

R bình phƣơng hiệu chỉnh

Sai số chuẩn của ƣớc lƣợng

1.977

1 0.458a

0.210

0.208 1.6542691

a. Dự báo: (Hằng số), V (mL) b. Biến phụ thuộc: CD34+ (x106)

Hệ sốa

Sig.

t

Hệ số chƣa chuẩn hóa

Hệ số chuẩn hóa

Thống kê đa cộng tuyến

Mô hình

B

Beta

Tolerance VIF

Sai số chuẩn

1 (Hằng số)

-1.504

0.417 -3.608 0.00

Thể tích (mL) 0.034

0.04

0.458 9.383 0.00

1.000

a. Biến phụ thuộc: CD34+ (x106)

c) Ảnh hưởng của thời gian bảo quản mẫu đến tỷ lệ tế bào sống

Bảng 3.17. Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản đến tỷ lệ tế bào sống

p Thời gian Cỡ mẫu (n) Nhỏ nhất Lớn nhất Trung bình Độ lệch chuẩn

< 24h 314 72.18 99.59 96.0 3.77 <0.05 Tỷ lệ tế bào sống ≥ 24h 19 87.74 95.09 91.4 7.62

Bảng 3.17 cho thấy thời gian bảo quản dƣới 24h cho tỷ lệ tế bào sống

cao hơn so với thời gian bảo quản trên 24h (p<0.05).

Phân tích hồi quy cho thời gian bảo quản và tỷ lệ tế bào sống cho thấy thời gian bảo quản máu dây rốn có liên hệ tuyến tính với tỷ lệ sống của tế bào theo phƣơng trình hồi quy:

 Tỷ lệ tế bào sống = 98.368 – 0.052 x Thời gian bảo quản mẫu (phút)

 Hệ số R bình phƣơng hiệu chỉnh = 0.304

Từ phƣơng trình có thể thấy tăng thời gian bảo quản mẫu dây rốn sẽ dẫn đến giảm tỷ lệ sống của tế bào (p<0.05). Tuy nhiên, thời gian bảo quản mẫu chỉ dự đoán đƣợc 30.4% giá trị tỷ lệ sống của tế bào, phần trăm còn lại do các yếu tố khác ngoài mô hình và sai số ngẫu nhiên.

Hình 3.10. Liên hệ tuyến tính giữa thời gian bảo quản mẫu và tỷ lệ tế bào sống

3.1.8. Mô hình ƣớc lƣợng số lƣợng TNC

Kết quả phân tích tƣơng quan cho thấy thể số lƣợng thai, cân nặng trẻ sơ sinh, thể tích máu dây rốn, thời gian bảo quản mẫu có tƣơng quan với số lƣợng TNC. Do đó, tiến hành phân tích hồi quy tuyến tính đa biến cho các yếu tố này nhằm xây dựng mô hình ƣớc lƣợng số lƣợng TNC cho kết quả nhƣ sau:

Bảng 3.18. Kết quả phân tích hồi quy tuyến tính đa biến cho số lƣợng TNC

Tóm tắt mô hìnhb

Durbin-Watson

Mô hình

R

R bình phƣơng

R bình phƣơng hiệu chỉnh

Sai số chuẩn của ƣớc lƣợng

1.978

1 0.851a

0.724

0.721 0.77612013637348

a. Dự báo: (Hằng số), Thời gian bảo quản, V (mL), Số lượng thai b. Biến phụ thuộc: TNC (x108 tế bào)

Hệ sốa

Mô hình

Sig.

t

Hệ số chƣa chuẩn hóa

Hệ số chuẩn hóa

Thống kê đa cộng tuyến

B

Beta

Tolerance VIF

Sai số chuẩn

1 (Hằng số)

-1.580

0.302 -5.224 0.000

Số lƣợng thai

-0.373

0.195 -0.057

-1.919 0.035

0.989 1.01 1

tích

0.047

0.002

0.812 26.85 0.000

0.969 Thể (mL)

1.03 2

-0.001

0.000 -0.385

-12.78 0.000

0.977 Thời gian bảo quản

1.02 4

a. Biến phụ thuộc: TNC (x108 tế bào)

Mô hình ƣớc lƣợng số lƣợng TNC theo phƣơng trình:

 Số lƣợng TNC (x108 tế bào) = -1.580 – 0.373 x (Số lƣợng thai) +

0.047 x (Thể tích) – 0.001 x (Thời gian bảo quản mẫu)

 Hệ số R bình phƣơng hiệu chỉnh = 0.721 (p ≤ 0.05)

Mô hình này cho thấy 72.1% giá trị biến thiên của TNC có thể đƣợc giải thích bởi các biến độc lập bao gồm: Số lƣợng thai, thể tích mẫu, thời gian bảo quản mẫu (p≤0.05). Cân nặng trẻ có tƣơng quan tới số lƣợng TNC nhƣng không có ý nghĩa trong mô hình hồi quy tuyến tính.

Từ phƣơng trình hồi quy tuyến tính cho thấy cứ số lƣợng thai tăng 1 thì số lƣợng TNC giảm 0.373 (x108 tế bào). Cứ tăng 1mL thể tích máu dây rốn, số lƣợng TNC tăng 0.047 (x108 tế bào). Cứ tăng 1 phút thời gian bảo quản, số lƣợng TNC giảm 0.001 (x108 tế bào).

Trong đó, thể tích mẫu với hệ số hồi quy chuẩn hóa là 0.812 cho thấy

mức độ ảnh hƣởng lớn nhất (p≤0.05).

3.2. THẢO LUẬN

3.2.1. Các yếu tố sản phụ

 Tuổi sản phụ

Theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi, tuổi trung bình của sản phụ là 32±5 tuổi, trong đó, độ tuổi thấp nhất là 18 và cao nhất là 48 tuổi. Phần lớn sản phụ nằm trong độ tuổi từ 26-35 tuổi, chiếm 57.36%. Tuy nhiên, phân tích thống kê cho thấy tuổi của ngƣời mẹ không có sự liên quan đáng kể nào đến thể tích máu dây rốn thu thập, số lƣợng TNC, số lƣợng và tỷ lệ tế bào CD34+. Kết quả này tƣợng tự hầu hết các nghiên cứu đã công bố trên thế giới [88]. Tuy nhiên, một số nghiên cứu nhƣ báo cáo của Kristin M Page và cộng sự năm 2014 cho thấy sự khác biệt về số lƣợng TNC, CD34+ và khả năng tăng sinh của tế bào gốc máu dây rốn ở nhóm các bà mẹ trên 20 tuổi và nhóm trẻ hơn khi phân tích hồi quy logistic đơn biến, nhƣng kết quả này không đƣợc xác nhận khi thực hiện phân tích đa biến [89]. Ở Việt Nam, một số nghiên cứu đã công bố cũng cho thấy không có sự tƣơng quan giữa tuổi ngƣời mẹ với các chỉ số chất lƣợng tế bào gốc máu dây rốn [90, 91]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của Đặng Thị Hà [92] trên 575 đơn vị máu dây rốn cho kết quả các đơn vị máu dây rốn thu thập từ nhóm ngƣời mẹ >35 tuổi có thể tích máu dây rốn thu thập trung bình cao hơn so với nhóm ngƣời mẹ <30 tuổi. Tuy nhiên, nhóm sản phụ trên 35 tuổi trong nghiên cứu này chiếm tỷ lệ thấp trong tổng số. Do vậy, cần những nghiên cứu tiếp theo với số lƣợng đối tƣợng nghiên cứu lớn hơn để có những đánh giá chính xác.

 Tiền sử thai sản

Do giới hạn của nghiên cứu, chúng tôi chỉ thu thập thông tin về lần sinh con của ngƣời mẹ để phân tích về tiền sử sản khoa của sản phụ. Kết quả thu đƣợc cho thấy không có sự khác biệt giữa nhóm sản phụ sinh con lần đầu và sinh con lần thứ 2 trở đi về các chỉ số chất lƣợng tế bào gốc máu dây rốn. Kết quả của chúng tôi tƣơng tự với một nghiên cứu phân tích dữ liệu của 71 báo cáo về các yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng tế bào gốc máu dây rốn, kết quả

cho thấy nhìn chung không có mối tƣơng quan giữa số lần sinh con với các chỉ số chất lƣợng máu dây rốn [88].

Tuy nhiên, sự tăng nhẹ về thể tích máu, số lƣợng TNC và CD34+ đƣợc báo cáo trong một số bài báo. Ví dụ nhƣ nghiên cứu của KK Ballen và cộng sự năm 2001 cho biết nhóm sản phụ sinh con lần đầu có thể tích máu, số lƣợng TNC và CD34+ trung bình lớn hơn so với nhóm sinh sản phụ sinh con thứ 2 trở lên, mỗi một lần sinh trƣớc góp phần làm giảm 3% thể tích, 12% số lƣợng TNC và 17% số lƣợng tế bào CD34+ [93]. Tác giả có đƣa ra giả thuyết về việc sinh con đầu tiên có thời gian chuyển dạ dài hơn, việc chuyển dạ lâu hơn đƣợc báo cáo có liên quan đến số lƣợng TNC cao hơn [74]. Tuy nhiên, chƣa có dữ liệu thuyết phục chứng minh sự cạn kiệt hay lão hóa tế bào gốc tạo máu trong môi trƣờng này.

 Phương pháp sinh

Trong nghiên cứu của chúng tôi, các sản phụ sinh con bằng phƣơng pháp sinh mổ chiếm 77.8%. Điều này phù hợp với xu hƣớng lựa chọn phƣơng pháp sinh hiện nay đang nghiêng về sinh mổ nhiều hơn do nhiều lý do khác nhau nhƣ tai biến sản khoa, giảm cơn đau khi chuyển dạ, chọn ngày giờ sinh.

Kết quả phân tích thống kê trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về các chỉ số thể tích máu, số lƣợng TNC và tế bào CD34+ giữa phƣơng pháp sinh thƣờng và sinh mổ.

Trên thế giới, dữ liệu về ảnh hƣởng của phƣơng pháp sinh đến các chỉ

số chất lƣợng tế bào gốc máu dây rốn vừa phong phú vừa không thống nhất.

Ở một số bài báo, số lƣợng tế bào CD34+ ở đơn vị máu dây rốn thu đƣợc từ nhóm sản phụ sinh thƣờng cao hơn nhóm sinh mổ [59, 61, 94]. Số lƣợng TNC thu đƣợc ở phƣơng pháp sinh thƣờng cũng đƣợc báo cáo cao hơn so với sinh mổ [59, 61, 70, 95]. Tác giả của các công bố này đƣa ra giả thuyết rằng phản ứng đau đớn trong quá trình sinh thƣờng có thể làm tăng nồng độ cytokine, khiến các tế bào sơ cấp đi vào hệ tuần hoàn của thai nhi và do đó làm tăng số lƣợng TNC, tế bào CD34+ và tế bào tiền thân tạo máu [61].

Ở một số nghiên cứu khác, kết quả lại cho thấy ngƣợc lại. Công bố của tác giả Abdelrazik AM và cộng sự năm 2015 cho thấy mối tƣơng quan thuận giữa phƣơng pháp sinh mổ và thể tích máu [68, 96, 97], số lƣợng TNC [57, 97]. Nhiều giả thuyết đƣợc đƣa ra để giải thích kết quả chất lƣợng máu dây rốn tốt hơn khi sinh mổ. Một trong số đó là việc lấy máu dây rốn đƣợc tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình sinh mổ hơn so với sinh thƣờng, vì các ca mổ lấy thai tự chọn thƣờng luôn đƣợc lên lịch. Ngoài ra, số lƣợng TNC cao hơn trong các ca sinh mổ có thể là do kẹp dây rốn nhanh hơn, hỗ trợ duy trì lƣu lƣợng máu, cho phép thu thập lƣợng máu lớn hơn [57]. Một giả thuyết khác là trong khi sinh mổ, trẻ sơ sinh đƣợc đặt phía trên nhau thai trƣớc khi kẹp dây rốn, do đó dƣới tác dụng của trọng lực máu dây rốn có thể chảy xuống khoang nhau thai [97]. Một giả thuyết khác nữa cho rằng sinh mổ cho phép bóc tách nhau thai nhanh chóng do đó giảm nguy cơ hình thành cục máu đông [98].

Tuy nhiên, một số công bố khác lại cho thấy không có mối liên quan nào giữa phƣơng pháp sinh với thể tích máu [67, 99], số lƣợng TNC [67, 100], CD34+[67].

Do đó, hiện chƣa có một kết luận cuối cùng về ảnh hƣởng của phƣơng pháp sinh đến chất lƣợng máu dây rốn do sự bất đồng về kết quả giữa nhiều nghiên cứu đã công bố.

 Phương pháp mang thai

Hiện nay, việc mang thai nhờ phƣơng pháp thụ tinh nhân tạo ngày càng tăng do tỷ lệ vô sinh cao, thành tựu trong công nghệ thụ tinh nhân tạo đạt đƣợc nhiều tiến bộ. Việc phân tích thống kê so sánh sự khác biệt giữa phƣơng pháp mang thai tự nhiên và mang thai do thụ tinh nhân tạo về các chỉ số chất lƣợng máu dây rốn còn rất hạn chế do không có đủ dữ liệu.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, phƣơng pháp mang thai nhờ thụ tinh nhân tạo chiếm 23.4% trong tổng số đơn vị máu dây rốn đạt tiêu chuẩn xử lý. Kết quả cho thấy thể tích máu thu thập, số lƣợng TNC, CD34+ không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa nhóm sản phụ mang thai tự nhiên và nhóm sản phụ

mang thai bằng phƣơng pháp thụ tinh nhân tạo. Điều này có ý nghĩa rất lớn trong việc tƣ vấn lƣu trữ tế bào gốc máu cho những gia đình hiếm muộn, vô sinh muốn có con nhờ phƣơng pháp thụ tinh nhân tạo nhƣng còn lo ngại về chất lƣợng tế bào gốc máu thu thập đƣợc so với việc mang thai tự nhiên. Tuy nhiên, để khẳng định có hay không sự ảnh hƣởng của phƣơng pháp mang thai đến chất lƣợng máu dây rốn, vẫn cần thực hiện các nghiên cứu khác với quy mô lớn hơn và đầy đủ dữ liệu hơn.

 Số lượng thai

Tỷ lệ sinh đôi trong tổng số mẫu thuộc nghiên cứu của chúng tôi chiếm 5.7%. Tỷ lệ này tƣơng đối cao so với nhiều nghiên cứu trên thế giới nhƣ nghiên cứu của Jones J và cộng sự năm 2003 trên 8867 mẫu có tỷ lệ sinh đôi trở lên đạt 2.65% [96], nghiên cứu của Valéria Santos S năm 2011 trên 3473 mẫu cho tỷ lệ mẫu sinh đôi 1.7% [60].

Kết quả phân tích cho thấy nhóm trẻ sinh một có thể tích máu, số lƣợng TNC trung bình cao hơn đáng kể so với nhóm trẻ sinh đôi (p<0.05). Kết quả này tƣơng tự với nhiều nghiên cứu đã công bố nhƣ báo cáo của Valéria Santos S năm 2011 cho kết quả TNC thấp hơn ở mẫu thai đôi [60], số lƣợng thai nhi càng nhiều thì thể tích máu và số lƣợng TNC càng giảm ở nghiên cứu của Harris và cộng sự [101]. Kết quả này là hợp lý vì trẻ sinh một thƣờng có xu hƣớng có cân nặng cao hơn so với trẻ sinh đôi. Ngoài ra, trẻ sinh đôi có trƣờng hợp chung một bánh nhau, do đó lƣợng máu thu thập đƣợc cũng bị giảm đi.

3.2.2. Các yếu tố trẻ sơ sinh

 Tuổi thai

Trong nghiên cứu của chúng tôi, tuổi thai trung bình của trẻ sơ sinh là 38.6±1.7 tuần, nhóm tuổi thai từ 37-40 tuần chiếm 87.95%, nhóm 29-34 tuần chiếm 2.71%. Nhƣ vậy, phần lớn mẫu có tuổi thai ≥ 37 tuần, nằm trong tiêu chuẩn do AABB khuyến cáo [102] và hiện nay hầu hết các ngân hàng lƣu trữ tế bào gốc máu dây rốn áp dụng khi thu thập mẫu.

Khi tiến hành phân tích tuổi thai, kết quả cho thấy tuổi thai trên 35 tuần cho thể tích máu thu thập cao hơn so với nhóm tuổi thai dƣới 35 tuần (p<0.05). Tuy nhiên khi phân tích tƣơng quan cho kết quả tuổi thai không có tƣơng quan với thể tích máu thu thập đƣợc. Nguyên nhân có thể do trẻ có tuổi thai >35 tuần có cân nặng lớn hơn do đó dẫn đến thể tích thu thập đƣợc nhiều hơn.

Ngoài ra, không nhận thấy sự khác biệt giữa nhóm tuổi thai <35 tuần và nhóm ≥35 tuần về số lƣợng TNC và CD34+. Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu cả ở Việt Nam và trên thế giới. Ở Việt Nam, công bố của Nguyễn Hoàng Phƣơng cho kết luận không có sự tƣơng quan giữa tuổi thai và thể tích máu, số lƣợng TNC, và CD34+ [91]. Nghiên cứu của Đỗ Trung Phấn và cộng sự cũng cho kết luận chƣa thấy rõ mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa tuổi thai và thể tích máu dây rốn, số lƣợng tế bào có nhân, tế bào CD34+, nhƣng tuổi thai từ 39-41 tuần có số lƣợng tế bào CD34+ và lƣợng máu dây rốn thu đƣợc nhiều hơn [90]. Nghiên cứu của Đặng Thị Hà trên các mẫu có tuổi thai ≥ 37 tuần trên 575 đơn vị máu dây rốn cho kết quả thể tích máu dây rốn không liên quan với tuổi thai của trẻ, các chỉ số TNC và CD34+ không đủ dữ liệu để phân tích [92]. Trên thế giới, nhiều nghiên cứu cũng cho kết quả tƣơng tự, ví dụ nhƣ công bố của Abdelrazik A và cộng sự năm 2015 trên 200 đơn vị máu dây rốn cho thấy không có sự tƣơng quan giữa tuổi thai trẻ và thể tích máu dây rốn thu thập, không tìm thấy tác động của tuổi thai lên số lƣợng tế bào TNC, CD34+ [68] và một số bài báo khác [64, 65, 103, 104].

Tuy nhiên, có một điều cần lƣu ý đó là những nghiên cứu kể trên phần lớn đƣợc thực hiện trên cỡ mẫu nghiên cứu <600 mẫu. Ở những nghiên cứu khác có cỡ mẫu lớn hơn, nhƣ công bố của Page và cộng sự năm 2013 trên 5239 mẫu cho thấy tuổi thai nhỏ hơn cho số lƣợng tế bào CD34+ cao hơn, trong khi trẻ sơ sinh có tuổi thai ≥38 tuần tuổi cho số lƣợng TNC cao hơn so với trẻ sơ tuổi thai nhỏ hơn [59]. Hay nghiên cứu của Santos năm 2016 trên 7897 đơn vị máu dây rốn cho kết quả các mẫu thu thập thực hiện ở tuần thứ 39 đến 40 của thai kỳ dẫn đến chất lƣợng sản phẩm tế bào gốc máu tốt hơn 46% so với các mẫu thu thập ở tuần thứ 35-36 [57]. Kết quả tƣơng tự với

nghiên cứu của Kurtzberg trên 7581 mẫu [105]. Do đó, để có thể đƣa ra đánh giá chính xác hơn về ảnh hƣởng của tuổi thai lên các chỉ số chất lƣợng máu dây rốn cũng nhƣ lựa chọn ngƣỡng tuổi thai cho việc tiến hành thu thập mẫu cần có những nghiên cứu tiếp theo với cỡ mẫu lớn hơn.

 Cân nặng trẻ sơ sinh

Trong nghiên cứu của chúng tôi, trẻ sơ sinh có cân nặng trung bình 3115g±453, tỷ lệ trẻ có cân nặng trên 3000g chiếm 59.64%. Theo quan sát, nhóm trẻ cân nặng ≥3000g có thể tích máu dây rốn và số lƣợng TNC cao hơn đáng kể, tuy nhiên lƣợng CD34+ chƣa nhận thấy có sự khác biệt. Kết quả của chúng tôi phù hợp với hầu hết các nghiên cứu tƣơng tự ở Việt Nam [90, 92] và trên thế giới [57, 59, 67, 69, 93, 95, 96].

Từ những kết quả trên, cân nặng của trẻ sơ sinh là một trong những biến số liên quan nhất đƣợc công nhận để dự đoán chất lƣợng tế bào gốc máu dây rốn. Yếu tố này rất có lợi thế vì cộng nghệ siêu âm hiện nay có thể đánh giá cân nặng thai nhi trƣớc khi sinh một cách khá chính xác.

 Giới tính trẻ sơ sinh

Trong số các đơn vị máu dây rốn đƣợc thu thập đạt tiêu chuẩn, nhóm trẻ sơ sinh giới tính nam chiếm tỷ lệ 61.93%, cao hơn đáng kể so với nhóm trẻ giới tính nữ chỉ chiếm 38.07%. Nhìn vào số liệu có thể thấy tỷ lệ giới tính mất cân bằng khá nghiêm trọng so với các nghiên cứu những năm về trƣớc.

Theo phân tích, giới tính của trẻ sơ sinh không có sự ảnh hƣởng đến các chỉ số chất lƣợng máu dây rốn nhƣ thể tích, số lƣợng TNC, CD34+. Hầu hết các nghiên cứu đã công bố tại Việt Nam [90-92] và nhiều nghiên cứu trên thế giới đều cho kết quả tƣơng tự với kết quả của chúng tôi [61, 67, 70, 72, 93, 95, 106, 107].

Tuy nhiên, cũng có một số báo cáo cho kết quả khác biệt. Công bố của Page và cộng sự cho biết khi kiểm tra tác động của giới tính trong các phân tích đa biến, trẻ sơ sinh nam có nhiều khả năng có số lƣợng tế bào CD34+ hơn trẻ sơ sinh nữ (p = 0.0002). Điều này liên quan đến thực tế là trẻ sơ sinh nam có trọng lƣợng sơ sinh trung bình cao hơn so với trẻ sơ sinh nữ [59]. Đáng

chú ý, một nghiên cứu ở Nhật Bản cho thấy trẻ sơ sinh nữ có số lƣợng TNC cao hơn so với trẻ sơ sinh nam vì mức độ bạch cầu trung tính cao hơn [69, 108]. Số lƣợng TNC ở trẻ nam thấp hơn cũng đƣợc báo cáo trong một số nghiên cứu [60, 109, 110].

Nhƣ vậy, có nhiều ý kiến trái chiều về vai trò của giới tính trẻ và mối quan hệ của nó với các chỉ số chất lƣợng sản phẩm tế bào gốc máu dây rốn. Có thể nói, chỉ riêng giới tính trẻ sơ sinh không thể giải thích sự khác biệt về hàm lƣợng tế bào gốc tạo máu trong máu dây rốn, bởi các cơ chế di truyền biến đổi có vai trò trong việc điều chỉnh động học tế bào gốc tạo máu và sự phát triển của thai nhi [111].

3.2.3. Thời gian bảo quản mẫu trƣớc xử lý

Nhu cầu thu thập các đơn vị máu dây rốn ngày càng lớn, nhƣng vì một số nguyên nhân khác nhau dẫn đến máu dây rốn không đƣợc xử ngay khi thu thập. Để đánh giá thời gian bảo quản mẫu có thể ảnh hƣởng tới tỷ lệ sống của tế bào hay không, chúng tôi tiến hành phân tích thống kê trên 316 đơn vị máu dây rốn. Kết quả cho thấy có mối tƣơng quan nghịch giữa thời gian bảo quản mẫu từ khi thu thập cho tới khi xử lý với tỷ lệ tế bào sống (r=-0.553, p<0.05). Ở cả 2 nhóm đơn vị máu dây rốn có thời gian bảo quản <24h và ≥24h tỷ lệ tế bào sống trung bình đều trên 85%, nhƣng tỷ lệ tế bào sống ở nhóm có thời gian bảo quản trƣớc xử lý ≥24h cao hơn so với nhóm <24h (p<0.05).

Trong nghiên cứu của chúng tôi, thời gian bảo quản mẫu trung bình đạt 7 giờ 45 phút, với tỷ lệ tế bào sống trung bình đạt 95.7%. Thời gian bảo quản mẫu của chúng tôi thấp hơn so với một số nghiên cứu trên thế giới nhƣ báo cáo của Nakagawa [69] thời gian trung bình là 11 giời 51 phút, Meyer- Monard và cộng sự [112], Page và cộng sự [59] thời gian bảo quản mẫu nhỏ hơn 10 giờ, nghiên cứu của Wu và các đồng nghiệp [61] thời gian nhỏ hơn 12 giờ, công bố của Yang và cộng sự [113] nhỏ hơn 24 giờ. Nguyên nhân có thể là do phòng thí nghiệm chịu trách nhiệm xử lý các đơn vị máu dây rốn của chúng tôi nằm trong cùng một tòa nhà với khoa sản của bệnh viện, nơi tiến hành thu thập đa số các mẫu máu dây rốn đƣợc sử dụng trong nghiên cứu.

Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự chậm trễ trong việc xử lý mẫu bao gồm khoảng cách từ địa điểm thu thập mẫu đến phòng thí nghiệm chịu trách nhiệm xử lý mẫu, quy trình ƣu tiên xử lý mẫu trong phòng thí nghiệm, lịch trình nhận hàng chuyển phát nhanh tại địa phƣơng và tình trạng nhân viên xử lý mẫu. Hiện chƣa có bài báo nào kiểm tra các biến số này nhƣng nhìn chung, đơn vị máu dây rốn nên đƣợc vận chuyển nhanh chóng đến phòng thí nghiệm xử lý ngay khi có thể. Tuy nhiên, một ngân hàng máu dây rốn phát triển sẽ không thể trách khỏi việc phải tiến hành thu thập mẫu ở nhiều địa điểm khác nhau, thậm chí là ở nƣớc ngoài. Vì vậy, để có thể thu thập các đơn vị máu dây rốn ở xa mà vẫn muốn đảm bảo chất lƣợng sản phẩm tế bào gốc máu dây rốn, cần có một nghiên cứu về ngƣỡng thời gian bảo quản mẫu, điều kiện bảo quản mẫu cho phép thu đƣợc sản phẩm đảm bảo đạt các chỉ tiêu về chất lƣợng tế bào gốc máu dây rốn với quy mô lớn và toàn diện hơn.

3.2.4. Các chỉ số chất lƣợng tế bào gốc máu dây rốn

 Thể tích máu dây rốn

Trong nghiên cứu này, thể tích máu trung bình đạt 112±25mL, trong đó, các đơn vị máu dây rốn có thể tích trong khoảng 100-129mL chiếm tỷ lệ lớn nhất 47.45%. Có sự tƣơng quan chặt chẽ giữa thể tích máu dây rốn với số lƣợng TNC (r=0.721, p<0.05) và số lƣợng tế bào CD34+ (r=0.458, p<0.05). Kết quả cũng cho thấy các đơn vị máu dây rốn thể tích lớn hơn 80mL có số lƣợng TNC và CD34+ cao hơn đáng kể. Ngoài ra thể tích máu dây rốn còn cho thấy có mối tƣơng quan thuận với tỷ lệ sống của tế bào (r=0.156, p<0.05), tuy nhiên là mối tƣơng quan yếu.

Mối tƣơng quan với số lƣợng TNC, số lƣợng tế bào CD34+ với thể tích máu dây rốn đã đƣợc chứng minh trong nhiều nghiên cứu trên thế giới [59, 61, 64, 69, 100, 103, 114]. Nguyên nhân do thể tích máu càng nhiều thì càng có khả năng chứa nhiều tế bào hơn. Vì vậy, thể tích máu dây rốn là tiêu chí đầu tiên đƣợc đo sau khi lấy mẫu để đánh giá chất lƣợng đơn vị máu dây rốn. Thể tích máu dây rốn còn có tƣơng quan với cân nặng trẻ sơ sinh, số lƣợng thai và tuổi thai. Tổng hợp các yếu tố tƣơng quan sẽ đƣa ra gợi ý quan trọng

giúp cho việc lựa chọn đối tƣợng thu thập máu dây rốn một cách hiệu quả, đặc biệt là khi phục vụ cho các ngân hàng máu dây rốn công.

 Số lượng TNC và tế bào CD34+

Để ƣớc tính một đơn vị tế bào gốc có thể đƣợc sử dụng cho bệnh nhân ghép điều trị hay không, ngƣời ta sử dụng khái niệm liều tế bào gốc hay số lƣợng tế bào gốc trên một kilogram cân nặng của bệnh nhân. Liều tế bào gốc tối ƣu trong một đơn vị máu dây rốn chƣa đƣợc xác định rõ ràng, mặc dù thông thƣờng thể tích cao liên quan đến chất lƣợng tế bào cao. Các nghiên cứu trƣớc đây cho thấy có mối tƣơng quan chặt chẽ giữa sự phục hồi tế bào gốc tạo máu và thải ghép với số lƣợng TNC và cân nặng của bệnh nhân đƣợc ghép [105]. Điều này khiến ngân hàng tế bào gốc máu dây rốn ƣu tiên cung cấp các đơn vị tế bào gốc máu dây rốn cho trẻ em và ngƣời lớn có trọng lƣợng cơ thể thấp. Số lƣợng tế bào tối thiểu cần thiết cho một đơn vị cấy ghép hiện chƣa thống nhất. Nó phụ thuộc vào các yếu tố nhƣ khả năng tƣơng thích HLA và loại bệnh cơ bản đang đƣợc điều trị. Liều tế bào gốc đƣợc đề xuất tối thiểu có thể ứng dụng cho bệnh nhân là 2.5x107 TNC/kg hoặc 1.5x105 CD34+/kg để cấy ghép thành công [115, 116]. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng chất lƣợng các đơn vị tế bào gốc dây rốn có thể ảnh hƣởng bởi yếu tố sản khoa và sơ sinh [59, 96] . Vì vậy, nghiên cứu của chúng tôi nhằm mục đích điều tra các yếu tố liên quan đến việc thu thập máu dây rốn để có thể thu đƣợc đơn vị máu dây rốn có chất lƣợng tốt hơn và tăng khả năng ghép thành công.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, TNC trung bình đạt 2.72x108 tế bào, số lƣợng CD34+ trung bình đạt 2.31x106 tế bào. Theo FDA khuyến cáo, tiêu chí cấp bằng cho đơn vị máu dây rốn đối với ngân hàng máu dây rốn công phải đạt 5x108 TNC/đơn vị và 1.25x106 CD34+/đơn vị, còn đối với ngân hàng tƣ nhân thì không có tiêu chuẩn cụ thể. Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ đơn vị máu dây rốn có số lƣợng TNC ≥ 5x108 là 7.21%, tỷ lệ đơn vị có số lƣợng CD34+ ≥ 1.25x106 là 66.37%. Nguyên nhân có thể là trong nghiên cứu của chúng tôi, máu dây rốn đƣợc xử lý theo phƣơng pháp ly tâm phân lớp theo tỷ trọng sử dụng Ficoll. Kết quả thu đƣợc, ngoài loại bỏ hồng cầu và huyết tƣơng, lớp buffy coat thu đƣợc đã loại gần hết các bạch cầu hạt có trong

máu dây rốn, TNC sau xử lý chủ yếu là thành phần tế bào đơn nhân (Mononuclear cells - MNC) bao gồm tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, các tế bào miễn dịch, tế bào gốc tạo máu và một số loại tế bào đơn nhân khác. Chính vì vậy số lƣợng TNC của chúng tôi thấp hơn đáng kể so với tiêu chuẩn của thế giới đƣa ra. TNC từ lâu đã đƣợc sử dụng để xác định việc chấp thuận hay loại trừ đơn vị đƣợc lƣu trữ và cấy ghép trong các ngân hàng máu dây rốn trên thế giới. Tuy nhiên, TNC thông thƣờng chứa các nồng độ khác nhau của các tế bào hồng cầu, bạch cầu hạt trƣởng thành, tiểu cầu và các tế bào làm loãng khác. Mà hiện nay, việc ghép tế bào gốc tạo máu chƣa có sự nhất quán về quan điểm cần quần thể thể bào nào và vai trò cụ thể của chúng. Một số nghiên cứu công bố cho thấy TNC tạo ra phản ứng tế bào gốc thấp hơn so với MNC, ngoài ra TNC từ các đơn vị máu dây rốn khác nhau cho hiệu quả ghép thay đổi và khác nhau đáng kể so với MNC [117]. Sự khác biệt về chủng tộc cũng có ảnh hƣởng lớn đến số lƣợng TNC. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy số lƣợng TNC ở ngƣời da trắng cao hơn đáng kể ngƣời da vàng và da màu [118]. Điều này dẫn đến tiêu chí về TNC của các tổ chức của Hoa Kỳ hay Châu Âu có thể cao hơn cho các nƣớc Châu Á, cụ thể là Việt Nam.

Số lƣợng TNC có tƣơng quan thuận với cân nặng trẻ sơ sinh và thể tích máu dây rốn, tƣơng quan nghịch với số lƣợng thai và thời gian bảo quản mẫu. Số lƣợng CD34+ không nhận thấy có sự tƣơng quan với các yếu tố sản khoa và sơ sinh, mà có tƣơng quan thuận với thể tích máu dây rốn thu thập (r= 0.458, p<0.05). Ngoài ra, có sự tƣơng quan thuận chặt chẽ giữa số lƣợng TNC và số lƣợng CD34+ (r=0.614, p<0.05). Kết quả của chúng tôi tƣơng tự với nhiều nghiên cứu đã công bố ở cả Việt Nam [90-92] và trên thế giới [119].

Để ƣớc lƣợng số lƣợng TNC trong đơn vị máu dây rốn, chúng tôi xây dựng mô hình hồi quy tuyến tính với các biến có tƣơng quan với số lƣợng TNC. Nhận thấy chỉ có thể tích máu dây rốn, số lƣợng thai và thời gian bảo quản mẫu có ý nghĩa trong mô hình. Trong đó thể tích máu có ảnh hƣởng lớn nhất trong phƣơng trình (hệ số hồi quy = 0.812, p<0.05). Cân nặng trẻ sơ sinh có tƣơng quan trung bình với số lƣợng TNC (r=0.312, p<0.05) nhƣng không có ý nghĩa trong mô hình hồi quy tuyến tính. Tuy nhiên, nghiên cứu tiếp theo

cần thực hiện với số lƣợng cỡ mẫu lớn hơn và quan sát thêm nhiều yếu tố khác để xây dựng mô hình có thể áp dụng cho tổng thể, các yếu tố khác bao gồm cân nặng, chiều cao ngƣời mẹ, tiểu đƣờng thai kỳ, tăng huyết áp khi mang thai, thời gian vỡ ối cho đến khi sinh phƣơng pháp thu thập mẫu (trƣớc hay sau xổ nhau), nhóm máu trẻ sơ sinh, chiều dài dây rốn, trọng lƣợng bánh nhau,…Đây đều là các yếu tố có thể dễ dàng theo dõi trƣớc và sau khi tiến hành thu thập mẫu.

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Qua kết quả nghiên cứu khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng tế bào gốc tạo máu phân lập từ máu dây rốn, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:

Đánh giá chất lƣợng máu dây rốn

 Số lƣợng đơn vị máu dây rốn đạt tiêu chuẩn xử lý: 333/355 đơn vị

máu dây rốn (93.8%)

 Thể tích trung bình túi máu dây rốn sau thu thập : 112±25mL

 Số lƣợng tế bào có nhân trung bình sau xử lý : 2.72±1.5x108 tế bào

 Số lƣợng tế bào CD34+ trung bình sau xử lý : 2.31±1.86x106 tế bào

 Tỷ lệ tế bào sống trung bình sau xử lý : 95.7±4.2%

 Xét nghiệm vi sinh âm tính cho sản phẩm sau xử lý : 99.4% (333/335

mẫu)

Các yếu tố liên quan

 Yếu tố làm tăng thể tích máu dây rốn thu thập bao gồm: Cân nặng trẻ

sơ sinh ≥ 3000g, sinh thai một và tuổi thai ≥ 35 tuần.

 Yếu tố làm tăng lƣợng TNC: Cân nặng trẻ sơ sinh ≥ 3000g, sinh thai

một, thể tích máu lớn và thời gian bảo quản mẫu ngắn.

 Yếu tố làm tăng số lƣợng tế bào CD34+: thể tích máu lớn và cân

nặng trẻ, nhƣng cân nặng ảnh hƣởng không rõ rệt.

 Yếu tố làm tăng tỷ lệ sống của tế bào: thời gian bảo quản ngắn, thể

tích máu lớn.

 Thể tích máu thu thập và lƣợng TNC, CD34+ có mối tƣơng quan

thuận chặt chẽ.

 Các yếu tố không có ảnh hƣởng đến chất lƣợng máu dây rốn : Tuổi ngƣời mẹ, nhóm máu ngƣời mẹ (ABO, Rh), phƣơng pháp sinh (sinh thƣờng/sinh mổ), phƣơng pháp mang thai (tự nhiên/thụ tinh nhân tạo), giới tính trẻ sơ sinh.

4.2. KIẾN NGHỊ

 Thể tích đơn vị máu dây rốn nên đạt từ 80mL trở lên

 Thu thập mẫu với trẻ có cân nặng đạt ≥3000 gram, tuổi thai ≥35 tuần

 Hạn chế tiến hành thu mẫu với trƣờng hợp sinh đôi

 Tiến hành nhanh chóng xử lý mẫu sau khi thu thập

 Nghiên cứu khảo sát với nhiều yếu tố ảnh hƣởng hơn trên cỡ mẫu lớn

hơn

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Dzierzak, Elaine, Bigas, Anna, 2018, Blood Development: Hematopoietic Stem Cell Dependence and Independence, Cell Stem Cell, 22(5), pp. 639-651.

EBMT, 2019, EBMT Annual Report 2019, European Society for Blood and Marrow Transplantation.

3. World Marrow Donor Association, 2018, Report on import/export and

registry operations within EU Member States, WMDA.

information Stem Cell cell

National Institutes of Health resource for stem cell research, 2008, The stem Basics, https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm.

Induction of Takahashi, Kazutoshi, Yamanaka, Shinya, 2006, Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors, Cell, 126(4), pp. 663-676.

Kögler, Gesine, Sensken, Sandra, Airey, Judith A., 2004, A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential, The Journal of experimental medicine, 200(2), pp. 123-135.

Bajada S., Mazakova I., Richardson J.B., Ashammakhi N., 2008, Updates on stem cells and their applications in regenerative medicine, J Tissue Eng Regen Med, 2(4), pp. 169-183.

Zakrzewski, Wojciech, Dobrzyński, Maciej, 2019, Stem cells: past, present, and future, Stem Cell Research & Therapy, 10(1), p. 68.

Seita J., Weissman I.L., 2010, Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation, Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med, 2(6), pp. 640-653.

10. Ashley P., Alexander, Warren S., 2017, Haematopoietic stem cells:

past, present and future, Cell Death Discovery, 3(1), p. 17002.

11.

Ivanovs A., Rybtsov S., Welch L., Anderson R.A., 2011, Highly potent human hematopoietic stem cells first emerge in the intraembryonic aorta-gonad-mesonephros region, J Exp Med, 208(12), pp. 2417-2427.

12. Pietilä I., Vainio S., 2005, The embryonic aorta-gonad-mesonephros region as a generator of haematopoietic stem cells, Apmis, 113(11-12), pp. 804-812.

13. Medvinsky, Alexander, Rybtsov, Stanislav,Taoudi, Samir, 2011, Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions, Development, 138(6), p. 1017.

14. Dzierzak, Elaine, Speck, Nancy A., 2008, Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells, Nature Immunology, 9(2), pp. 129-136.

15. Gekas C., Dieterlen-Lièvre F., Orkin S.H., 2005, The placenta is a

niche for hematopoietic stem cells, Dev.Cell, 8, pp. 365-375.

16. L., Li, 2005, Finding the hematopoietic stem cell niche in the placenta,

Dev.Cell, 8, pp. 297-298.

17. Xin Gao, Chunliang Xu, Noboru Asada, 2018, The hematopoietic stem

cell niche: from embryo to adult, Development, 145.

18. Morrison S.J., 1995, The biology of hematopoietic stem cells, Annu.

Rev. Cell Dev. Biol, 11, pp. 35-71.

19. Zhang Y., Gao S., Xia J., Liu F., 2018, Hematopoietic Hierarchy – An

Updated Roadmap, Trends in Cell Biology.

20. Copley M.R., 2012, Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center

stage, Cell Stem Cell, 10, pp. 690-697.

21. Crisan M., Dzierzak E., 2016, The many faces of hematopoietic stem

cell heterogeneity, Development 143, pp. 4571-4581.

22. Morrison S.J., 1997, Identification of a lineage of multipotent

hematopoietic progenitors, Development, 124, pp. 1929-1939.

23. Pietras E.M., 2015, Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions, Cell Stem Cell 17, pp. 35-46.

24. Laurenti E., Gottgens B., 2018, From haematopoietic stem cells to

complex differentiation landscapes, Nature 553, pp. 418-426.

25. National Institutes of Health, 2016, Stem Cell Information, NIH Stem Page, Information Home

Cell https://stemcells.nih.gov/info/2001report/chapter5.htm.

26. Laura Jayne Fry, 2014, Cell Separation and Cryopreservation of Cord Blood Fractions for Immunotherapeutic Applications, Doctor of Philosophy degree Thesis, Anthony Nolan and Nottingham Trent University.

27. Sinem Civriz Bozdag, Osman İlhan, 2015, Hematopoietic Stem Cell

Source and Storage, Progress in Stem Cell Transplantation.

28. Pimentel-Coelho P., Rosado-de-Castro P., Barbosa da Fonseca L., 2012, Umbilical cord blood mononuclear cell transplantation for neonatal hypoxic–ischemic encephalopathy, Pediatr Res, 71, pp. 464- 473.

29. Gluckman E., Devergié A., Bourdeau-Esperou H.,

1990, Transplantation of umbilical cord blood in Fanconi's anemia, Nouv Rev Fr Hematol, 32(6), pp. 423-425.

30. Basta M., Lipsett B., 2020, Anatomy, Abdomen and Pelvis, Umbilical

Cord, StatPearls Publishing.

31. Nakamura, Ando, Chargui, Kawada, Sato, 1999, Ex vivo generation of CD34+ cells from CD34- hematopoietic cells, Blood, 94, pp. 4053- 4059.

32. Zanjani, Almeida-Porada, Livingston, Zeng, Ogawa,, 2003, Reversible expression of CD34 by adult human bone marrow long-term engrafting hematopoietic stem cells, Experimental Hematology, 31, pp. 406-412.

33. Marianska, Nowa Med, 1997, The transplantation of hematopoietic stem cells present in peripheral blood and umbilical cord blood, 4, pp. 7-9.

34. Hao Q.L., Shah A.J., Thiemann F.T., 1995, A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow, Blood, 86(10), pp. 3745-3753.

35. Thierry D., Hervatin F., Traineau R., Brossard Y., Stark R., Benbunan M.E., Gluckman, 1992, Hematopoietic progenitors cells in cord blood, Bone Marrow Transplant, 9 Suppl 1, pp. 101-104.

36. Smogorzewska, Barsky, Crooks, Wienberg, 1997, Purification of hematopoietic stem cells from human bone marrow and umbilical cord blood, 22, pp. 232-239.

37. Zhou G., Chen J., Lee S., Clark T., Rowley J.D., Wang S.M., 2001, The pattern of gene expression in human CD34(+) stem/progenitor cells, Proc Natl Acad Sci U S A, 98(24), pp. 13966-13971.

38. Hordyjewska, Anna, Popiołek, 2015, Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood, Cytotechnology, 67(3), pp. 387-396.

39. Harris D.T., Schumacher M.J., Locascio J., 1992, Phenotypic and functional immaturity of human umbilical cord blood T lymphocytes, 89(21), pp. 10006-10010.

40. Stojko R., Witek A., 2005, Umbilical cord blood--a perfect source of

stem cells, Ginekol Pol, 76(6), pp. 491-497.

41. Brunet de la Grange P., Ivanovic Z., Leprivey-Lorgeot V., Praloran V., 2002, Angiotensin II that reduces the colony-forming ability of hematopoietic progenitors in serum free medium has an inverse effect in serum-supplemented medium, Stem Cells, 20(3), pp. 269-271.

42. Dąbrowski, Warsaw, 1998, Blood physiology, pp. 48-56.

43. Fasouliotis S.J., Schenker J.G., 2000, Human umbilical cord blood banking and transplantation: a state of the art, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 90(1), pp. 13-25.

44. Mousavi S.H., Zarrabi M., Abroun S., Ahmadipanah M., Abbaspanah B., 2019, Umbilical cord blood quality and quantity: Collection up to transplantation, Asian J Transfus Sci, 13(2), pp. 79-89.

45. Mayani H., Lansdorp P.M., 1998, Biology of human umbilical cord blood-derived hematopoietic stem/progenitor cells, Stem Cells, 16(3), pp. 153-165.

46. Broxmeyer H., Douglas G., Hangoc G., Cooper S., Bard J., English D., Arny M., Thomas L., Boyse E., 1989, Human umbilical cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells, Proc Natl Acad Sci U S A, 86(10), pp. 3828-3832.

47. Gluckman E., Broxmeyer H., Auerbach A., Friedman H., 1989, Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical cord blood from an HLA-identical sibling, 321.

48. Wagner J.E, Rosenthal J., Sweetman R., Shu X.O, 1996, Successful transplantation of HLA-matched and HLA-mismatched umbilical cord blood from unrelated donors: analysis of engraftment and acute graft- versus-host disease, Blood, 88(3), pp. 795-802.

49. Karanes C., Confer D., Walker T., 2003, Unrelated donor stem cell transplantation: the role of the National Marrow Donor Program, Oncology, 17(8), pp. 1036-1038.

50. Suzanne M., Hua, Peng J., 2017, Umbilical cord blood hematopoietic

stem and progenitor cell expansion for therapeutic use, p. 133.

51. Majhail, Navneet S., Farnia, Stephanie H., 2015, Indications for autologous and allogeneic hematopoietic cell transplantation: guidelines from the American Society for Blood and Marrow Transplantation, 21(11), pp. 1863-1869.

52. FDA, 2021, Approved Cellular and Gene Therapy Products, FDA.

53. Brown K., Rao M., Brown H., 2019, The Future State of Newborn

Stem Cell Banking, J Clin Med, 8(1), p. 117.

54. Kurtzberg J., 2017, A History of Cord Blood Banking and

Transplantation, Stem Cells Transl, 6, pp. 1309-1311.

55. FDA, 2014, Guidance for Industry and FDA Staff: Investigational New Drug Applications for Minimally Manipulated, Unrelated Allogeneic Placental/Umbilical Cord Blood Intended for Hematopoietic and Immunologic Reconstitution in Patients with Disorders Affecting the Hematopoietic System, FDA.

56.

Jeffrey McCullough, David McKenna, Diane Kadidlo, 2005, Issues in the quality of umbilical cord blood stem cells for transplantation, Transfusion, 45, pp. 832-841.

57. Santos S., Barros S., Santos M., 2016, Predictors of high-quality cord

blood units, Transfusion, 56, pp. 2030-2036.

58. Omori A., Takahashi K., Hazawa M., Misaki N., Ohba H., Manabe M., 2008, Maternal and Neonatal Factors Associated with the High Yield of Mononuclear Low-Density/CD34+ Cells from Placental/Umbilical Cord Blood, The Tohoku Journal of Experimental Medicine, 215(1), pp. 23-32.

59. Page K., Mendizabal A., Betz-Stablein B., 2014, Optimizing donor selection for public cord blood banking: influence of maternal, infant, and collection characteristics on cord blood unit quality, Transfusion, 54, pp. 340-352.

60. Valéria Santos S., Marti L., Ribeiro A., Conti F., Barros S. M., 2011, A cross-sectional study of umbilical cord blood donor profiles and their influence on umbilical cord blood collection in a Brazilian hospital, Cytotherapy, 13(9), pp. 1120-1127.

61. Wu S., Xie G., Wu J., 2015, Influence of maternal, infant, and collection characteristics on high-quality cord blood units in Guangzhou Cord Blood Bank, Transfusion, 55, pp. 2158-2167.

62. Manegold-Brauer G., Borner B., Bucher C., 2014, A prenatal prediction model for total nucleated cell count increases the efficacy of umbilical cord blood banking, Transfusion 54, pp. 2946-2952.

63. Askari S., Miller J., Chrysler G., 2005, Impact of donor and collection related variables on product quality in ex utero cord blood banking, Transfusion, 45, pp. 189-194.

64. Hussein A., Bawadi R., Tahtamouni L., 2014, Feasibility of collecting umbilical cord blood in Jordan and the effect of maternal and neonatal

factors on hematopoietic stem cell content, Mediterr J Hematol Infect Dis, 6, pp. 2014-2019.

65. Shlebak A., Roberts I., Stevens T., 1998, The impact of antenatal and perinatal variables on cord blood haemopoietic stem/progenitor cell yield available for transplantation, Br J Haematol, 103, pp. 1167-1171.

66. George T., Sugrue M., George S., 2006, Factors associated with parameters of engraftment potential of umbilical cord blood, Transfusion, 46, pp. 1803-1812.

67. Cobellis L., Castaldi M., Trabucco E., 2013, Cord blood unit bankability can be predicted by prenatal sonographic parameters, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 170, pp. 391-395.

68. Abdelrazik A., El Said M., Abdelaziz H., 2015, The impact of fetal and maternal physiologic factors on umbilical cord blood quality as a source of stem cells in Egyptian population, Transfusion, 55, pp. 2882- 2889.

69. Nakagawa R., Watanabe T., Kawano Y., Kanai S., Suzuya H., Kaneko M., 2004, Analysis of maternal and neonatal factors that influence the nucleated and CD34+ cell yield for cord blood banking, Transfusion, 44(2), pp. 262-267.

70. Al-Sweedan S.A., Musalam L., Obeidat B., 2013, Factors predicting the hematopoietic stem cells content of the umbilical cord blood, Transfus Apher Sci 48, pp. 247-252.

71. Pafumi C., Zizza G., Russo A., 2001, Placing the newborn on the maternal abdomen increases the volume of umbilical cord blood collected, Clin Lab Haematol 23, pp. 397-399.

72. Solves P., Perales A., Moraga R., 2004, Maternal, neonatal and collection factors influencing the haematopoietic content of cord blood units, Acta Haematol, 113, pp. 241-246.

73. Versura P., Buzzi M., Giannaccare G., 2014, Cord blood serumbased eye drops: the impact of donor haematological and obstetric factors on the variability of epidermal growth factor levels, Blood Transfus, 12, pp. 44-50.

74. Donaldson C., Armitage W., Laundy V., 1999, Impact of obstetric factors on cord blood donation for transplantation, Br J Haematol 106, pp. 128-132.

75. Eldjerou L., Cogle C., Rosenau E., 2015, Vitamin D effect on umbilical cord blood characteristics: a comparison between African Americans and Caucasians, Transfusion, 55, pp. 1766-1771.

76. Nguyễn Thị Duyên, Lê Thị Nghĩa, Nguyễn Thị Thúy Mậu, 2019, Khảo sát một số chỉ số huyết học và chất lƣợng mẫu máu cuống rốn lƣu trữ tại Bệnh viện nhi Trung Ƣơng, Tạp chí nghiên cứu y học, 123(7), pp. 15-25.

77. Nghĩa, Huỳnh, 2004, Tình hình thu thập, sàng lọc và xử lý MCR tại BV

Truyền máu –Huyết học TPHCM, Nhà xuất bản Y học, 5-1.

78. Trần Trung Dũng, Lê Thị Dịu Hiền, 2013, Đánh giá chất lƣợng MCR thu thập tại ngân hàng máu cuống rốn BV Truyền máu - Huyết học TPHCM, Nhà xuất bản Y học, 4, pp. 92-96.

79. AABB, 2015, Standards for Cellular Therapy Services 7th edition,

AABB.

80. Netcord FACHT, 2007, International standards for Cord Blood Collection, Processing, Testing, Banking, Selection and Release 3rd Edition, Netcord FACHT.

81. Sutherland D.R., Anderson L., Keeney M., Nayar R., Chin-Yee I., 1996, The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry, J. Hematotherapy, 5, pp. 213-226.

82. Civin C., Strauss L., Brovall C., 1984, Antigenic analysis of hematopoiesis. III. A hematopoietic progenitor cell surface antigen defined by a monoclonal antibody raised against KG-1a cells, J Immunol, 133, pp. 157-165.

83. Nielsen J.S., McNagny K.M., 2009, CD34 is a key regulator of hematopoietic stem cell trafficking to bone marrow and mast cell progenitor trafficking in the periphery, Microcirculation, 16(6), pp. 487-496.

84. Newman W., Targan S.R., Fast L.D., 1984, Immunobiological and immunochemical aspects of the T-200 family of glycoproteins, Mol Imm, 21, pp. 1113-1121.

85. Zelenin A.V., Poletaev A.I., Stepanova N.G., Barsky V.E., Kolesnikov V.A., Nikitin S.M., Zhuze A.L., Gnutchev N.V, 1984, 7-Amino- actinomycin D as a specific fluorophore for DNA content analysis by laser flow cytometry, Cytometry, 5, pp. 348-354.

86. Schmid I., Krall W.J., Uittenbogaart C.H., Braun J., Giorgi J.V, 1992, Dead cell discrimination with 7-aminoactinomycin D in combination

with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry, Cytometry, 13, pp. 204-208.

87. Field, 2009, Discovering statistics using SPSS, SAGE Publications.

88. Faivre L., Couzin C., Boucher H., Domet T., Desproges A., Sibony O., Bechard M., Vanneaux V., Larghero J., Cras A., 2018, Associated factors of umbilical cord blood collection quality, Transfusion, 58(2), pp. 520-531.

89. Page K.M., Mendizabal A., Betz-Stablein B., Wease S., Shoulars K., Gentry T., Prasad V.K., Sun J., Carter S., Balber A.E., Kurtzberg J., 2014, Optimizing donor selection for public cord blood banking: influence of maternal, infant, and collection characteristics on cord blood unit quality, Transfusion, 54(2), pp. 340-352.

90. Đỗ Trung Phấn, 2008, Nghiên cứu ứng dụng quy trình thu gom làm sạch và bảo quản tế bào gốc sinh máu sử dụng cho ghép tủy đồng loài, Nhà xuất bản Y học.

91. Phuong Hoang Nguyen, Van Tinh Nguyen, Thao Thi Chu, Linh Huyen Truong, Thu Thi Hoai Do, Tu Dac Nguyen, Anh Viet Bui, Tien Anh Ngo, Uyen Thi Trang Than, Liem Thanh Nguyen, 2019, Factors Affecting Human Umbilical Cord Blood Quality Before Cryopreservation: The Importance of Birth Weight and Gestational Age, Biopresevation and Biobanking, 00.

92. Đặng Thị Hà, 2015, Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng mẫu máu cuống rốn thu thập và xử lý tại Bệnh viện Nhi trung ƣơng, Luận văn thạc sỹ y học, Bệnh viện Nhi TW.

93. Ballen K., Wilson M., Wuu J., 2001, Bigger is better: maternal and neonatal predictors of hematopoietic potential of umbilical cord blood units, Bone Marrow Transplant, 27, pp. 7-14.

94. Eldaly O., Hafez R., Elqurashi L., 2013, Immunological study of CD34

positive stem cells in cord blood, J Am Sci, 9, pp. 254-260.

95. Al-Qahtani R., Al-Hedythi S., Arab S., Aljuhani A., Jawdat D., 2016, Factor predicting total nucleated cell counts in cord blood units, Transfusion, 56(9), pp. 2352-2354.

96.

Jones J., Stevens C., Rubinstein P., 2003, Obstetric predictors of placental/umbilical cord blood volume for transplantation, Am J Obstet Gynecol, 188, pp. 503-509.

97. Nunes R., Zandavalli F., 2015, Association between maternal and fetal factors and quality of cord blood as a source of stem cells, Rev Bras Hematol Hemoter 37, pp. 38-42.

98. Mancinelli F., Tamburini A., Spagnoli A., Malerba C., Suppo G., Lasorella R, 2006, Optimizing umbilical cord blood collection: impact of obstetric factors versus quality of cord blood units, Transplant Proc, 38(4), pp. 1174-1176.

99. Aufderhaar U., Holzgreve W., Danzer E., 2003, The impact of intrapartum factors on umbilical cord blood stem cell banking, J Perinat Med, 31, pp. 317-322.

100. Keersmaekers

, Mason, Keersmaekers, 2014, Factors affecting umbilical cord blood stem cell suitability for transplantation in an in utero collection program, Transfusion, 54, pp. 545-549.

101. Harris D.T., Brown H.L., Grossman J.D., 2002, Retrospective review of umbilical cord blood collections: singleton versus multiple births, Obstetrics & Gynecology, 99(4), pp. S85-S86.

102. Roback John, 2008, Core Principles in Cellular Therapy, AABB.

103. Philip J., Kushwaha N., Chatterjee T., 2015, Optimizing cord blood collections: assessing the role of maternal and neonatal factors, Asian J Transfus Sci 9, pp. 163-167.

104. Salge Bartels U., Huber H., Kleiner K., 2009, Evaluation of quality parameters for cord blood donations, Transfus Med Hemother 36, pp. 317-324.

105. Kurtzberg J., Cairo M.S., Fraser J.K., 2005, Results of the cord blood transplantation (COBLT) study unrelated donor banking program, Transfusion, 45, pp. 842-855.

106. Rowisha, Mohamed, 2020, Impact of maternal and neonatal factors on

umbilical cord CD34+ cells, Stem cell investigation, 7, p. 5.

107. McGuckin , Basford C., Hanger K., Habibollah S., 2007, Cord blood revelations: The importance of being a first born girl, big, on time and to a young mother, Early Human Development, 83(12), pp. 733-741.

108. Aroviita P., Teramo K., Hiilesmaa V., Kekomäki R., 2005, Cord blood sex, infant

hematopoietic progenitor cell concentration and Transfusion, 45, pp. 613-621.

109. Bijou F., Ivanovic Z., Fizet D., 2015, Neonatal sex and weight influence CD34+ cell concentration in umbilical cord blood but not

stromal cell–derived factor 1-3′ A polymorphism, Cytotherapy, 17, pp. 68-72.

110. Mancinelli F., Tamburini A., Spagnoli A., 2006, Optimizing umbilical cord blood collection: impact of obstetric factors versus quality of cord blood units. , Transplant Proc, 38, pp. 1174-1176.

111. Mousavi S.H., Abroun S., Zarrabi M., Ahmadipanah M., 2017, The effect of maternal and infant factors on cord blood yield, Pediatr Blood Cancer, 64(7).

112. Meyer-Monard S., Tichelli A., Troeger C., 2012, Initial cord blood unit volume affects mononuclear cell and CD341 cell-processing efficiency in a non-linear fashion, Cytotherapy 14, pp. 215-222.

113. Yang H., Loutfy M., Mayerhofer S., 2011, Factors affecting banking quality of umbilical cord blood for transplantation, Transfusion, 51, pp. 284-292.

114. Donaldson C., Armitage W., Laundy V., 1999, Impact of obstetric factors on cord blood donation for transplantation, Br J Haematol, 106, pp. 128-132.

115. Barker J., Scaradavou A., Stevens C., 2010, Combined effect of total nucleated cell dose and HLA match on transplantation outcome in 1061 cord blood recipients with hematologic malignancies, Blood 115, pp. 1843-1849.

116. Eapen M., Klein J.P., Ruggeri A., 2014, Impact of allele-level HLA matching on outcomes after myeloablative single unit umbilical cord blood transplantation for hematologic malignancy, Blood, 123, pp. 133- 140.

117. Patterson J., Moore C.H., Palser E.,, 2015, Detecting primitive hematopoietic stem cells in total nucleated and mononuclear cell fractions from umbilical cord blood segments and units, J Transl Med, 13, p. 94.

118. Akyurekli C., Chan J., Elmoazzen H., 2014, Impact of ethnicity on review.

human umbilical cord blood banking: a systematic 2014;54:2122-7., Transfusion, 54, pp. 2122-2127.

119. Faivre L., Couzin C., Boucher H., 2018, Associated factors of umbilical

cord blood collection quality, Transfusion, 58(2), pp. 520-531.