Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá khả năng tăng cường tích lũy tinh bột ở cây thuốc lá chuyển gen AGPS và AGPL mã hóa enzyme agpase ở cây sắn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Nguyễn Văn Đoài

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY TINH

BỘT Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN AGPS VÀ AGPL MÃ

HÓA ENZYME AGPASE Ở CÂY SẮN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

(Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm)

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Nguyễn Văn Đoài

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY TINH

BỘT Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN AGPS VÀ AGPL MÃ

HÓA ENZYME AGPASE Ở CÂY SẮN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. Phạm Bích Ngọc

Hà Nội - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận văn này hoàn toàn đƣợc hoàn thành bằng quá trình

nghiên cứu khoa học của bản thân dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Phạm Bích Ngọc cùng

với cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực Vật, viện Công nghệ Sinh học. Các số liệu,

kết quả đƣợc trình bày trong luận văn này là trung thực. Phần văn bản trích dẫn đều

đƣợc ghi rõ nguồn tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình

trƣớc hội đồng khoa học.

Hà nội, tháng 12 năm 2016

Học viên

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được hoàn thành dựa vào kinh phí của đề tài: ““Khai thác và phân

lập nguồn gen có sẵn của tập đoàn giống sắn Việt Nam nhằm phát triển các giống sắn

có khả năng chống chịu bệnh và năng suất cao bằng công nghệ gen”.

Tôi xin chân thành cảm ơn tới TS. Phạm Bích Ngọc đã hướng dẫn và tạo mọi

điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận

văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật –

Viện Công nghệ Sinh học, em Lý Khánh Linh đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm

việc.

Cuối cùng, tôi gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn bên tôi, ủng hộ và

giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành tốt công việc và hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

Học viên

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ I

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. II

MỤC LỤC ..................................................................................................................... III

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... VI

DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... VII

DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................... VIII

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3

1.1. Tinh bột................................................................................................................. 3

1.1.1. Tinh bột ở thực vật ........................................................................................ 3

1.1.2. Cơ chế dự trữ tinh bột ở thực vật................................................................... 4

1.1.3. Dự trữ tinh bột ở lá cây.................................................................................. 6

1.2. Enzyme AGPase ................................................................................................... 7

1.2.1. Enzyme AGPase ở thực vật ........................................................................... 7

1.2.2. AGPase ở sắn ............................................................................................... 10

1.3. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến quá trình trao đổi tinh

bột .............................................................................................................................. 11

1.3.1. Tăng khả năng tích lũy tinh bột ................................................................... 11

1.3.2. Tăng khả năng phân hủy tinh bột ................................................................ 12

1.3.3. Thay đổi thành phần tinh bột ....................................................................... 12

1.4. Công nghệ chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ................................... 13

1.5. Biểu hiện nhiều gene trên cùng một khung đọc mở với 2a peptide ................... 15

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................................... 17

2.1. Vật liệu ............................................................................................................... 17

2.1.1. Vật liệu ........................................................................................................ 17

2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................... 17

2.2. Phƣơng pháp ....................................................................................................... 18

2.2.1. Một số phƣơng pháp sinh học phân tử ........................................................ 18

2.2.2. Phân lập gen AGPS và AGPL từ cây sắn ..................................................... 21

2.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pBI-35S-AGPSL ............................................. 23

2.2.4. Phƣơng pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens .............. 25

2.2.5. Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR ............... 27

2.2.6. Phân tích các dòng cây chuyển gen bằng Western blot .............................. 28

2.2.7. Kiểm tra khả năng tích lũy tinh bột của cây thuốc lá chuyển gen. .............. 28

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 31

3.1. Kết quả tách dòng gen AGPS và AGPL ............................................................. 31

3.1.1. Nhân đoạn gen AGPS và AGPL bằng RT-PCR .......................................... 31

3.1.2. Tách dòng gen AGPS và AGPL ................................................................... 32

3.1.3. Kết quả giải trình tự với mồi M13F và M13R ............................................ 33

3.2. Kết quả thiết kế vector chuyển gen .................................................................... 36

3.2.1. Tổng hợp đoạn XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI.......... 37

3.2.2. Nối XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI với pBI121 ......... 39

3.2.3. Biến nạp pBI-35S-AGPSL vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens ................. 42

3.3. Kết quả chuyển gen AGPSL vào cây thuốc lá .................................................... 42

3.3.1. Tạo cây thuốc lá chuyển gen AGPSL .......................................................... 42

3.3.2. Kiểm tra cây chuyển gen bằng phản ứng PCR ............................................ 44

3.3.3. Phân tích biểu hiện gen AGPSL bằng Western blot .................................... 46

3.4. Kết quả định lƣợng tinh bột tích lũy ở lá............................................................ 48

3.4.1. Kiểm tra tinh bột bằng Iodine ...................................................................... 48

3.4.2. Định lƣợng tinh bột bằng Anthrone ............................................................ 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 58

Kết luận ...................................................................................................................... 58

Kiến nghị ................................................................................................................... 58

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 59

Sách và bài báo .......................................................................................................... 59

Website ...................................................................................................................... 62

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ ..................................................................... 63

Bài báo ....................................................................................................................... 63

Trình tự gen ............................................................................................................... 63

PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 68

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

2-))

Viết đầy đủ Cauliflower mosaic virus 35S promoter 3-Phosphoglyceric acid

Ký hiệu 35S 3-PGA A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ADP ADPG AGPase AGPL AGPS AGPSL ATP cDNA CDS cmyc DBE DNA EDTA GUS isoform kb kDa LB NPTII OD P2a PCR Pi RNA SBE T-DNA Tris WT Adenosine diphosphate Adenosine diphophate glucose ADP-glucose pyrophosphorylase AGPase large subunit (Tiểu phần lớn AGPase) AGPase small subunit (Tiểu phần nhỏ AGPase) AGPS-P2a-AGPL-cmyc Adenosine triphosphate Complementary DNA (Sợi DNA bổ sung) Coding DNA sequence Myc (human c-Myc oncogene) epitope tag Debranching enzyme (Enzyme khử nhánh mạng tinh bột) Deoxyribonucleic Ethylenediaminetetraacetic acid β-Glucuronidase gene đồng phân (enzyme) Kilo base (1000 bazơ) Kilodalton (1000 dalton) Lysogeny broth (Môi trƣờng nuôi cấy Lysogeny) Neomycin phosphotransferase II gene mật độ quang 2a peptide Polymerase Chain Reaction Inorganic phosphate (Photphate vô cơ (HPO4 Ribonucleic Starch branching enzyme (Enzyme phân nhánh mạch tinh bột) Transfer DNA 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Wild type (Kiểu dại)

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Danh sách mồi PCR sử dụng ............................................................. 17

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt PCR với GoTaq® Green

Master Mix 2X............................................................................................................... 18

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng nối hai hoặc nhiều đoạn DNA với T4 ligase.. 19

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt DNA với Enzyme giới hạn ........................ 20

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân

dòng đoạn AGPS và AGPL ............................................................................................ 22

Bảng 2.6. Thành phần và chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR tổng hợp SmaI-P2a-

AGPL-Cmyc-SacI .......................................................................................................... 24

Bảng 2.7. Tóm tắt quy trình chuyển gen và phân tích cây chuyển gen ............. 26

Bảng 3.1. Kết quả so sánh trình tự gen AGPS và AGPL mới phân lập với trình

tự tham chiếu ................................................................................................................. 34

Bảng 3.2. Kết quả định lƣợng tinh bột ở lá sau 2h chiếu sáng ........................... 53

Bảng 3.3 Kết quả định lƣợng tinh bột ở lá sau 14h chiếu sáng .......................... 56

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình chuyển hóa saccharide và tổng hợp tinh bột ở thực vật (theo

Akula Nookaraju) [1] ...................................................................................................... 5

Hình 1.2. Các phản ứng quan trọng trong quá trình tổng hợp tinh bột [48] ........ 6

Hình 1.3 Cấu trúc enzyme AGPase ở khoai tây [20] ........................................... 8

Hình 1.4 Con đƣờng tổng hợp tinh bột ở lục lạp và cơ chế điều hòa AGPase

[37] ................................................................................................................................... 9

Hình 1.5 Sơ đồ vector chuyển gen của Li và cộng sự (2010) [26] .................... 12

Hình 1.6. Sơ đồ mô tả nguyên tắc hoạt động của P2a [47] ................................ 15

Hình 2.1 Sơ đồ đoạn gen P2a:AGPL:cmyc và vị trí của các mồi PCR .............. 23

Hình 2.2. Sơ đồ ghép nối pBI121 với AGPS và P2a-AGPL-Cmyc ................... 25

Hình 3.1. Kết quả RT-PCR nhân đoạn AGPS và AGPL từ RNA tổng số tách ở

lá sắn .............................................................................................................................. 32

Hình 3.2. Kết quả tách dòng gen AGPS và AGPL ............................................. 33

Hình 3.3. Kết quả giải trình tự gen AGPS và AGPL .......................................... 34

Hình 3.4 Trình tự polypeptide AGPS và AGPL mới phân lập .......................... 35

Hình 3.5. Một số phƣơng án biểu hiện hai gen trên cùng một vector ................ 37

Hình 3.6. Kết quả tổng hợp đoạn XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-

SacI ................................................................................................................................ 38

Hình 3.7. Ảnh điện di sản phẩm cắt vector pBI121 với XbaI và SacI (A) và sơ

đồ vector pBI121 (B) ..................................................................................................... 39

Hình 3.8. Kết quả PCR kiểm tra khuẩn lạc biếp nạp pBI-35S-AGPSL ............. 40

Hình 3.9. Kết quả kiểm tra vector và A. tumefaciens mang vector pBI-35S-

AGPSL ........................................................................................................................... 41

Hình 3.10. Một số hình ảnh chuyển gen AGPSL vào cây thuốc lá .................... 43

Hình 3.11. Kết quả phân tích PCR cây thuốc lá chuyển gen AGPase. .............. 45

Hình 3.12 Kết quả lai western blot kiểm tra sự biểu hiện của gen AGPSL........ 47

Hình 3.13 Các bƣớc kiểm tra hàm lƣợng tinh bột lá bằng iodine [49]. ............. 48

Hình 3.14. Ảnh nhuộm iodine lá thuốc lá chuyển gen ....................................... 50

Hình 3.15 Sơ đồ phản ứng Anthrone với Glucose ............................................. 51

Hình 3.16. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng Anthrone (I) (α = 0.05)

....................................................................................................................................... 52

Hình 3.17. Đƣờng chuẩn định lƣợng Anthrone (II) (α = 0.075) ........................ 55

Hình 3.18 Hàm lƣợng tinh bột trong lá cây chuyển gen và cây không chuyển

sau 2h và 14h chiếu sáng ............................................................................................... 56

MỞ ĐẦU

Tinh bột là thành phần quan trọng đối với thực vật cũng nhƣ là nguồn lƣơng

thực và nguyên liệu công nghiệp. Phần lớn tinh bột của cây trồng đều dùng trực tiếp

làm thực phẩm hoặc thức ăn cho chăn nuôi. Tinh bột cũng là nguồn nguyên liệu quan

trọng cho các lĩnh vƣc công nghiệp thực phẩm, đồ uống, dƣợc phẩm, mỹ phẩm, nhiên

liệu, giấy và xây dựng… Nhu cầu dùng tinh bột cho công nghiệp đang ngày một tăng

lên và tinh bột đang là nguồn vật liệu chủ yếu cho thế hệ nguyên liệu sinh học đầu tiên,

do đặc tính dễ lên men. Năm 2015, lƣợng tinh bột đƣợc sản xuất trên thế giới lên đến

85 triệu tấn, gấp đôi so với năm 1995 (40 triệu tấn) [50]. Dự đoán, nhu cầu về tinh bột

sẽ còn tăng mạnh trong tƣơng lai.

Để đáp ứng nhu cầu tinh bột, ngoài việc tăng diện tích trồng trọt, tìm ra các cây

trồng mới thì việc cải tiến các giống cũ là chiến lƣợc quan trọng trong nông nghiệp.

Trong đó, cải tiến cây trồng theo hƣớng tăng năng suất tinh bột, giảm thời gian sản

xuất hay cải tiến chất lƣợng tinh bột là những hƣớng nghiên cứu quan trọng và luôn

đƣợc các nhà khoa học quan tâm hàng đầu. Các phƣơng pháp chọn giống, lai tạo

truyền thống đã đạt đƣợc nhiều thành quả lớn trong cải thiện năng suất cây trồng. Tuy

nhiên, năng suất tinh bột của các giống lai tạo đã gần đạt đến năng suất tối đa, trong

khi đó, diện tích đất canh tác đang ngày càng thu hẹp. Bởi vậy, chọn tạo giống bằng

công nghệ sinh học hiện đại (chuyển gen) đang là chiến lƣợc quan trọng trong sản xuất

tinh bột trên thế giới.

Năm 2000, 81% sản lƣợng tinh bột trên thế giới sản xuất từ ngô, tiếp đó là lúa

mì (5%), khoai tây (8,3%), sắn và các cây trồng khác (5%). Nhƣng đến năm 2010, sản

lƣợng tinh bột từ ngô còn 54%, trong khi đó sản lƣợng sắn tăng mạnh (33%) ) [50].

Thống kê này cho thấy ngô và sắn là hai cây trồng có tiềm năng lớn trong công nghiệp

tinh bột.

Trong gần một thập kỷ qua, với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử

hiện đại, rất nhiều công cụ đƣợc phát triển sẵn sàng phục vụ cho việc phân tích chức

năng gen ở sắn, ví dụ nhƣ bản đồ di truyền, thƣ viện BAC (Bacterial artificial

chromosome), thƣ viện EST (expressed sequence tags). Đặc biệt gần đây toàn bộ hệ

gen của sắn đã đƣợc giải trình tự [52]. Phân tích sự biểu hiện của toàn bộ hệ gen cũng

là một công cụ hữu hiệu nhằm nâng cao khả năng tiếp cận của các nhà khoa học để

nghiên cứu sâu các quá trình sinh học của sắn. Trong đó, nhiều gen liên quan đến sinh

tổng hợp tinh bột đã đƣợc nghiên cứu. Có thể kể đến các gen nhƣ: AGPase, nhóm gen

GBSS, SS, SBE, DBE, ISA ….

Ở thực vật, AGPase là một trong những enzyme xúc tác cho phản ứng biến đổi

glucose-1-P và ATP thành ADP-glucose và pyrophosphate. AGPase là enzyme quan

trọng trong việc nghiên cứu tạo cây trồng chuyển gen tăng khả năng tích lũy tinh bột

[45]. Các nghiên cứu biểu hiện vƣợt mức AGPase phân lập từ thực vật hoặc từ vi

khuẩn trên cây chuyển gen đều làm tăng hàm lƣợng tinh bột tích lũy trong các mô

chuyển gen. Gen AGPase ở sắn cũng đã đƣợc phân lập và chứng minh khả năng làm

tăng khả năng tích lũy tinh bột ở thực vật [45], [46].

Nghiên cứu này xuất phát từ ý tƣởng xây dựng một vector chuyển gen ở thực

vật phục vụ việc tạo cây trồng biến đổi gen tăng cƣờng sinh tổng hợp và tích lũy tinh

bột. Gen AGPS và AGPL mã hóa enzyme AGPase ở sắn đƣợc phân lập và thiết kế

vector biểu hiện trên cây mô hình (thuốc lá), để đánh giá khả năng hoạt động của

vector chuyển gen và tích lũy tinh bột của gen chuyển. Kết quả thu đƣợc có ý nghĩa

trong việc nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen tăng khả năng tích lũy tinh bột. Công

trình này đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh

học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. TINH BỘT

1.1.1. Tinh bột ở thực vật

Tinh bột là một glucan không tan, đƣợc cấu tạo bởi hai loại polyme của glucose

là amylose và amylopectin. Amylose là polysaccharide mạch thẳng đƣợc cấu tạo nên

từ các phân tử α-D-glucose nhờ các liên kết α-1,4-glucoside. Amylose đƣợc tạo ra từ

500-1000 phân tử α-D-glucose hoặc có khi chỉ khoảng 250-300 phân tử. Chuỗi phân

tử glucose xoắn lại với nhau theo hình xoắn lò xo. Sự hình thành dạng xoắn lò xo là do

sự hình thành các liên kết hydro giữa các phân tử glucose. Mỗi vòng xoắn có 6 đơn vị

glucose và đƣợc duy trì bởi liên kết hydro với các dòng xoắn kề bên. Khoảng không

gian giữa các vòng xoắn có kích thƣớc phù hợp cho một số phân tử khác có thể liên

kết vào, ví dụ nhƣ iodine. Khi phân tử iodine liên kết vào vòng xoắn sẽ làm cho các

phân tử glucose thay đổi vị trí và tạo nên phức màu xanh thẫm đặc trƣng. Ái lực của

amylose với iodine phụ thuộc tuyến tính với chiều dài mạch polymer. Amylopectin có

cấu tạo phức tạp hơn amylose. Tham gia cấu tạo của amylopectin có khoảng 500,000

đến 1 triệu phân tử α-D-gluco liên kết với nhau, đƣợc nối với nhau bởi liên kết α-1,4-

glucoside và α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh. Cứ khoảng 24-30 đơn vị

glucose trên mạch sẽ có 1 liên kết α-1,6 glucoside để tạo mạch nhánh. Trên mạch

nhánh cấp 1 lại hình thành mạch nhánh cấp 2, cứ nhƣ vậy phân tử amylopectin phân

nhánh nhiều cấp rất phức tạp.

Ngƣời ta có thể phân biệt đƣợc amylose và amylopectin dựa trên sự khác nhau

về khối lƣợng phân tử; cũng nhƣ về khả năng gắn kết đặc hiệu với dung dịch iodine. Amylopectin có phân tử lƣợng trong khoảng 107 đến 108; trong khi phân tử lƣợng của amylose chỉ khoảng 5x105 đến 106. Ở nhiệt độ 200C, khả năng gắn của amylopectin

với iodine chỉ khoảng 0,2 % khối lƣợng trong khi amylose là 20% khối lƣợng. Ngoài

ra, amylose tƣơng tác với iodine tạo phức có màu xanh dƣơng, trong khi amylopectin

tạo phức màu đỏ nâu.

Ở thực vật bậc cao, tinh bột đƣợc tổng hợp trong plastid (thể lạp) của cả tế bào

quang hợp và không quang hợp. Tinh bột đƣợc coi là nguồn carbohydrate dự trữ chủ

yếu và đóng vai trò quan trọng trong suốt chu kỳ sống của tế bào thực vật. Trong lá,

một phần nhỏ carbon đồng hóa thông qua quang hợp đƣợc giữ lại trong các lục lạp ở

dạng tinh bột chứ không đƣợc chuyển đổi thành sucrose để vận chuyển đến các bộ

phận khác. Dạng tinh bột tạm thời này sẽ đƣợc phân hủy vào ban đêm để cung cấp cơ

chất cho quá trình hô hấp ở lá và tiếp tục tổng hợp sucrose cho việc phát triển khác của

cây.

Trong các cơ quan không diễn ra quá trình quang hợp nhƣ thân, rễ, củ và hạt,

sucrose có thể đƣợc chuyển đổi thành tinh bột dự trữ trong một loại plastid chuyên biệt

gọi là amyloplasts. Tinh bột lƣu trữ đƣợc tái sử dụng để hỗ trợ giai đoạn phát triển

khác của cây. Các bộ phận thu hoạch của cây trồng chủ lực của loài ngƣời phần lớn là

cơ quan lƣu trữ tinh bột ở thực vật. Có thể kể đến nhóm hạt ngũ cốc (lúa, ngô, lúa mì,

lúa mạch, lúa miến… ) là nhóm quan trọng nhất, tiếp theo là các loại củ thân (khoai

tây, khoai mỡ New Zealand) và rễ củ (khoai lang, sắn, khoai môn), và hạt cây họ đậu.

Tinh bột là nguồn carbonhydrate chủ yếu cho con ngƣời và đồng thời cho

nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp. Hiện nay nguồn nguyên liệu tinh bột cho

công nghiệp chủ yếu tách chiết từ ngô, tuy nhiên một lƣợng đáng kể khác từ lúa, lúa

mì, sắn, khoai tây, arrowroot (Maranta arundinacea), và sago palm (Metroxylon

sagu). Tinh bột từ các nguồn khác nhau có thành phần polymer, cấu trúc và thành phần

hóa lý khác nhau. Thành phần hóa lý chính là chức năng của tinh bột quyết định khả

năng ứng dụng của tinh bột.

1.1.2. Cơ chế dự trữ tinh bột ở thực vật

Tổng hợp tinh bột α-1,4 glucan là một quá trình phức tạp, có liên quan đến

quang hợp và sucrose (Hình 1.1) Quá trình này bao gồm ba bƣớc quan trọng xảy ra

trong lục lạp và bột lạp [35] [45].

i) Cung cấp glucose-1-phosphate (Glc-1-P) vào trong các thể lạp. Glc-1-P

có thể đƣợc cung cấp từ quá trình quang hợp ở lục lạp (đối với tế bào

quang hơp) hoặc từ quá trình chuyển hóa sucrose, sucrose nhận đƣợc từ

mạch dẫn (đối với tế bào không quang hợp).

ii) Tổng hợp ADP-glucose (ADPG) từ Glc-1-P và ATP nhờ enzyme

AGPase. Đây là phản ứng quan trọng, có ảnh hƣởng đến tốc độ tổng hợp

tinh bột.

iii) Tổng hợp tinh bột (amylose và amylopectin) từ ADPG.

Hình 1.1 Quá trình chuyển hóa saccharide và tổng hợp tinh bột ở thực vật (theo Akula Nookaraju) [1]

Ghi chú: Sản phẩm của chu trình Calvin (DHAP và GA3P) được biến đổi thành Glucose-1-P

và Fructose-6-P (hoặc 1-6PP). Glucose-1-P được chuyển đổi thành ADP-Glucose dưới sự

xúc tác của AGPase, ADP-Glucose được xúc tác trùng hợp thành mạch tinh bột, quá trình

này diễn ra trong lục lạp hoặc bột lạp. Glucose và Fructose cũng được chuyển hóa thành

sucrose được dự trữ trong không bào hoặc chuyển tới các tế bào khác của cây. AI: acid

invertase; CeSy: cellulose synthase; HK: hexokinase; FRK: fructokinase; FBPase: fructose-

1,6-biphosphatase; N/AI: neutral or alkaline invertase; PFP: pyrophosphate d -frucrose-6-

phospahte 1-phosphotransferase; PGM: phosphoglucomutase; SoSUT1: spinach sucrose

transporter 1; SPP: sucrose phosphate phosphatase; SPS: sucrose phosphate synthase;

SSy: starch synthase; SuP: sucrose phosphorylase; SuSy: sucrose synthase; SXD1: sucrose

export defective 1; UDPase: uridine diphosphate- glucose pyrophosphorylase

Nói một cách ngắn gọn, bƣớc đầu tiên không thể thiếu đƣợc là sự tổng hợp

ADPG từ Glc-1-P và ATP đƣợc xúc tác bởi AGPase. Một khi đƣợc hoạt hóa, enzyme

starch synthase chuyển ADPG tới đầu không khử của α-1,4 glucan để tạo thành các sợi

α-1,4 glucan. Tiếp theo, các sợi α-1,4 glucan đƣợc dùng nhƣ là các cơ chất cho các

enzyme phân nhánh của tinh bột (SBEs hoặc Q-enzyme) tạo ra các liên kết sợi α-1,6 là

amylopectin (Hình 1.2). Cuối cùng amylopectin đƣợc tinh thể hóa tạo thành tinh bột

dƣới tác động của các enzyme phân rã (DPE), phosphorylase (P-enzyme) và

glucanotransferase (D-enzyme). Ngoài ra, UDP-glucose: protein glucosyltransferase

hoặc amylogenin (38 hoặc 45 kDa) cũng đƣợc dự đoán tham gia vào bƣớc đầu tiên

trong quá trình tổng hợp tinh bột [45].

Hình 1.2. Các phản ứng quan trọng trong quá trình tổng hợp tinh bột [48]

1.1.3. Dự trữ tinh bột ở lá cây

Lá cây là cơ quan dự trữ sản phẩm quang hợp tạm thời của cây xanh. Tinh bột

trong lá cây thƣờng đƣợc lƣu trữ ngay trong lục lạp. Tuy nhiên, có sự khác nhau về dự

trữ tinh bột ở lá của một số thực vật. Các loài nhƣ thuốc lá, đậu tƣơng (Glycine max)

[22], củ cải đƣờng (Beta vulgaris) [13] và Arabidopsis [46] … thì một lƣợng lớn tinh

bột đƣợc dự trữ ở lá. Trong khi đó, các loài khác nhƣ đậu Pháp (Phaseolus vulgaris)

[13], rau bina (Pisum sativum) [41] thì lƣu trữ nhiều sucrose thay cho tinh bột. Ngoài

ra, carbohydrate còn đƣợc lƣu trữ ở lá dƣới dạng raffinose và fructan [3], [32]. Ở một

số loài nhƣ Pisum sativum và rau chân vịt, tinh bột chỉ đƣợc tổng hợp khi mà lƣợng

sucrose đƣợc tạo ra vƣợt ngƣỡng dự trữ của lá, khi đó lƣợng tinh bột đƣợc tăng dần và

sucrose giảm dần trong quá trình quang hợp [41]. Tuy nhiên, ở Arabidopsis, thuốc lá

và các loài khác, luôn có một phần glucose từ quang hợp đƣợc tổng hợp thành tinh bột

[46]. Khi đó, quá trình tổng hợp tinh bột và sucrose diễn ra song song, tốc độ tổng hợp

của hai quá trình này đƣợc kiểm soát và phụ thuộc vào điều kiện môi trƣờng (đặc biệt

là thời gian chiếu sáng). Cây trồng trong điều kiện ngày ngắn tích lũy nhiều tinh bột ở

lá hơn so với trồng trong điều kiện ngày dài, khi đó, tinh bột đƣợc dự trữ nhiều hơn để

cung cấp năng lƣợng cho trao đổi chất vào ban đêm [7], [17].

1.2. ENZYME AGPASE

1.2.1. Enzyme AGPase ở thực vật

Ở thực vật, AGPase là một trong những enzyme xúc tác cho các bƣớc đầu tiên

trong quá trình tổng hợp tinh bột. AGPase đƣợc phát hiện ở hầu hết các nhóm thực vật

bao gồm thực vật bậc thấp, thực vật một lá mầm và hai lá mầm. Nó xúc tác cho phản

ứng biến đổi glucose-1-P và ATP thành ADPG và pyrophosphate. AGPase đƣợc xác

định là enzyme dị lập thể (240 kDa), đƣợc cấu tạo bởi hai tiểu phần lớn (AGPL hoặc

β, 51-60 kDa) và hai tiểu phần nhỏ (AGPS hoặc α, 50 – 55 kDa) do hai gen tƣơng tứng

mã hóa (Hình 1.3). Các tiểu phần nhỏ ở các loài khác nhau có độ tƣơng đồng cao (85–

95%) trong khi tiểu phần lớn thì đa dạng hơn (độ tƣơng đồng 50 – 60%) [29].

Hình 1.3 Cấu trúc enzyme AGPase ở khoai tây [20].

Ghi chú: Mã số 1YP2 được đăng ký trên RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org), các tiểu

phần được thể hiện với các màu khác nhau).

Trong các tế bào quang hợp, sự hoạt động của AGPase trong lục lạp chủ yếu

đƣợc điều khiển bởi 3-Phosphoglyceric acid (3-PGA), thế ôxy hóa khử (redox) và

phosphate (Pi) [40] (Hình 1.4). Hợp chất 3-PGA là sản phẩm tham gia vào chu trình

Calvin, xuất hiện khi xảy ra quá trình cố cacbon từ CO2. Sự xuất hiện của 3-PGA đồng

nghĩa với việc bộ máy quang hợp đang hoạt động trong lục lạp, cơ chất glucose 1-

phosphate đƣợc tạo ra. Lúc này, AGPase đƣợc kích hoạt bởi 3-PGA biến đổi glucose

1-phosphate và ATP thành ADP glucose và pyrophosphate. Pyrophosphate đƣợc thủy

phân thành Pi. Sự tích lũy nhiều Pi (đồng nghĩa với việc sản phẩm ADP glucose đƣợc

tạo ra nhiều) trong lục lạp làm ức chế hoạt tính của AGPase. Nhƣ vậy, tỉ lệ 3-GPA/Pi

quyết định khả năng hoạt động của AGPase. Cơ chế điều hòa bằng thế ôxi hóa khử

xảy ra ở tế bào quang hợp và không quang hợp, có ý nghĩa quan trọng trong vào ban

đêm. AGPase bị bất hoạt khi các gốc sulfur cysteine của tiểu phần nhỏ bị ôxi hóa, cầu

disulfide đƣợc hình thành giữa hai tiểu phần. AGPase đƣợc hoạt hóa trở lại nếu các

cầu disulfide này đƣợc cắt bỏ. Tuy nhiên, cơ chế điều hòa gen AGPase các tế bào dự

trữ tinh bột vẫn chƣa đƣợc rõ ràng.

Hình 1.4 Con đường tổng hợp tinh bột ở lục lạp và cơ chế điều hòa AGPase [37]

Ghi chú: Fructose-6-P tạo ra từ chu trình Calvin được chuyển hóa thành Glucose -1-P.

Glucose-1-P được hoạt hóa bởi ATP thành ADP-Glucose nhờ sự xúc tác của enzyme

AGPase. AGPase được hoạt hóa bởi thế ôxi hóa khử và/hoặc 3-Phosphoglyceric acid được

tạo ra từ chu trình Calvin và bị bất hoạt bởi nồng độ cao của Pi. (Viết tắt trên hình: Fru6P,

fructose 6-phosphate; Glc1P, glucose 1-phosphate; Glc6P, glucose 6-phosphate; TPT,

triose-phosphate/phosphate translocator. 3PGA: 3-Phosphoglyceric acid)

Mặc dù đƣợc mã hóa bởi hai gen, tuy nhiên, trong cùng một loài có thể có nhiều

isoform khác nhau. Ở lúa có 3 isoform đƣợc mã hóa bởi AGPS và 4 isoform mã hóa

bởi AGPL [31]. Các isoform khác nhau có các tính chất khác nhau về khả năng xúc

tác, mức nhạy cảm với các cơ chế điều hòa… Các isoform ở lá thƣờng nhạy cảm với

3-PGA/Pi trong khi ở các mô dự trữ thì có thể khác nhau. Ở tế bào nội nhũ lúa mì,

phôi đậu Hà Lan, phôi đậu răng ngựa (Vicia faba) chứa những isoforms của AGPase

có độ nhạy thấp hoặc không nhạy cảm với cơ chế điều hòa 3-PGA/Pi [12]. Đặc biệt,

AGPase ở tế bào nội nhũ lúa mạch (Barley) có thể hoạt động mà không cần hoạt hóa

bởi 3-PGA và ít nhạy cảm với sự ức chế của Pi [21]. Những isoform này mang lại

nhiều ứng dụng trong việc tạo cây trồng biến đổi gen tăng cƣờng khả năng tích lũy

tinh bột.

AGPase là một trong những enzyme quan trọng trong con đƣờng tổng hợp tinh

bột. Nghiên cứu trên cây A.thaliana bị đột biến ở cả hai gen mã hóa cho hai tiểu phần

lớn nhỏ cho thấy lƣợng tinh bột giảm còn 2% so với cây bình thƣờng [27]. Khi biểu

hiện các đoạn đối mã của 2 gen AGPS và AGPL trong cây khoai tây cũng cho kết quả

sự tích lũy tinh bột ở các dòng cây chuyển gen ít đi từ 1,5 - 3 lần trong khi đó hàm

lƣợng các loại đƣờng tan nhƣ glucose, sucrose và fructose tăng khoảng 5 lần. Các

nghiên cứu tăng cƣờng khả năng biểu hiện của một trong hai hoặc cả hai gen đều thu

đƣợc các dòng chuyển gen có hàm lƣơng tinh bột tích lũy cao hơn so với cây đối

chứng.

1.2.2. AGPase ở sắn

Gen AGPase ở sắn đã đƣợc phân lập và giải trình tự thành công [19]. Nghiên

cứu trên các giống sắn TMS 30572 và CM 2177-2, vùng mã hóa (CDS) cho AGPS dài

1572 bp và AGPL dài 1593 bp. Trình tự AGPS và AGPL có độ tƣơng đồng thấp

(40%). Kết quả phân sàng lọc thƣ viện cDNA ở hai giống sắn này chỉ thu đƣợc một

isoform của AGPS và AGPL. Chuỗi AGPS dài 524 amino acid, 57,3 kDa và AGPL

dài 531 amino acid, 58,7 kDa. Cả hai chuỗi AGPS và AGPL đều chứa đoạn Transit

peptide (dài khoảng 69 – 74 amino acid) ở đầu N giúp vận chuyển vào lạp thể. Ở sắn,

tiểu phần AGPS chỉ biểu hiện mạnh ở các mô tổng hợp tinh bột (lá, củ) trong khi

AGPL biểu hiện đồng đều ở tất cả các mô. Điều này dẫn tới AGPase biểu hiện mạnh

nhất trong lá khi quang hợp, tiếp đó là mức biểu hiện ở củ sắn (thấp hơn 4 lần so với

lá), mức độ biểu hiện ở các mô khác là rất ít hoặc không biểu hiện. Cơ chế điều hòa

AGPase có sự khác nhau ở lá và củ sắn. AGPase ở lá chịu tác động mạnh của 3-PGA

và bị bất hoạt tới 90% khi có mặt Pi (2 mM). Trong khi đó, AGPase ở củ không bị ảnh

hƣởng bởi 3-PGA nhƣng bị bất hoạt mạnh bởi Pi [19].

Phân tích dữ liệu genome sắn (V6.1) trên Phytozome 11

(https://phytozome.jgi.doe.gov) [51] cho thấy gen AGPS nằm trên nhiễm sắc thể số 12

(nucleotide số 6583306 đến 6588233) và AGPL nằm trên nhiễm sắc thể số 11

(nucleotide số 11864610 đến 11871278). Vùng mã hóa AGPS có độ tƣơng đồng cao

(89%) với gen mã hóa tiểu phần lớn của glucose-1-phosphate adenylyltransferase

(glgC).

1.3. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC NHẰM CẢI BIẾN

QUÁ TRÌNH TRAO ĐỔI TINH BỘT

Việc biến đổi quá trình trao đổi tinh bột trong cây trồng có thể góp phần tăng

khả năng tích lũy tinh bột trong các cơ quan dự trữ, tăng tốc quá trình tích lũy tinh bột,

ngăn chặn hoặc tăng việc phân hủy tinh bột (tùy thuộc vào loại cây trồng hay nhu cầu

sử dụng), biến đổi cấu trúc tinh bột để tăng hoặc đa dạng chức năng của tinh bột trong

thực phẩm và nguyên liệu của công nghiệp.

Với số lƣợng lớn các enzyme tham gia vào việc xác định cấu trúc của tinh bột

trong một bộ phận nhất định của cây, có thể thấy rằng số tinh bột khác nhau có thể

đƣợc biến đổi qua việc điều khiển của các gen liên quan là rất lớn. Trong các loài

lƣỡng bội mà sinh sản hữu tính thì phƣơng pháp tốt nhất là kết hợp các đột biến ảnh

hƣởng đến các gen mã hóa cho các enzyme trao đổi tinh bột. Các phƣơng pháp công

nghệ sinh học có thể có nhiều ƣu thế và cần thiết nếu cây trồng quan tâm là đa bội và

sinh sản vô tính, các gen quan tâm cần biểu hiện mạnh hơn hoặc giảm một phần hoạt

tính, tính trạng mong muốn là kết quả của việc biểu hiện gen từ loài khác.

1.3.1. Tăng khả năng tích lũy tinh bột

Cho đến nay những cố gắng nhằm tăng khả năng tích lũy tinh bột tập trung vào

việc tăng hoạt tính AGPase trong cây. Đây là enyme cung cấp cơ chất cho SS. Một loạt

đột biến của gene AGPase Escherichia coli (glgC16) mã hóa cho các dạng điều khiển

khác nhau của enzyme này đã đƣợc dùng để biểu hiện mạnh trong cây. Khi glgC16

đƣợc biểu hiện ở plastid của cây khoai tây chuyển gen, một vài dòng đã có khả năng

tích luỹ tinh bột cao hơn dòng không chuyển gen là 60%. Tuy nhiên với các cây khác

nhƣ sắn, ngô và các loài khác việc tăng tinh bột không đạt đƣợc mức nhƣ vậy. Vì thế

việc biến đổi một mình AGPase có thể có hoặc không đạt đƣợc kết quả mong muốn

tăng tinh bột trong các cơ quan dự trữ. Ngoài ra, có một số bằng chứng về việc tăng

nguồn cung cấp ATP cho các plastid có thể kích thích việc tạo ra ADPG và dẫn đến

việc tăng tốc độ sinh tổng hợp tinh bột. Biểu hiện mạnh yếu tố dẫn truyền adenylate ở

vỏ plastid của Arabidopsis trong khoai tây làm tăng ADPG lên 2 lần và hàm lƣợng

tinh bột tăng lên từ 16-36% so với đối chứng. Khi kìm hãm adenylate kinase của

plastic (enzyme chuyển hóa hai chiều 2 phân từ ADP thành ATP và AMP) làm ADPG

tăng lên 10 lần và tinh bột tăng lên gấp đôi trong củ khoai tây cả ở trong nhà kính và

ngoài đồng ruộng [35].

Nghiên cứu của Li N và cộng sự (2011) [26] chuyển gen mã hóa cho tiểu phần

lớn (Sh2) và tiểu phần nhỏ (Bt2) đƣợc phân lập từ sắn dƣới sự điều khiển bởi promoter

CaMV 35S vào cây ngô cho làm tăng cƣờng hàm lƣợng tinh bột và khối lƣợng hạt.

Kết quả biểu hiện vƣợt ngƣỡng Sh2 hoặc Bt2 đều làm tăng hàm lƣợng tinh bột và khối

lƣợng hạt. Tuy nhiên, biểu hiện đồng thời Sh2 và Bt2 (Hình 1.5) cho kết quả cao nhất,

khối lƣợng hạt tăng 15%, hàm lƣợng tinh bột tăng 13,8% so với cây chƣa chuyển gen.

Hình 1.5 Sơ đồ vector chuyển gen của Li và cộng sự (2011) [26]

Ghi chú: Gen mã hóa cho tiểu phần lớn của AGPase (Sh2) và tiểu phần nhỏ (Bt2) được điều

khiển bởi promoter P27kD, hai gen được biểu hiện trên hai khung đọc mở khác nhau.

1.3.2. Tăng khả năng phân hủy tinh bột

Tăng khả năng phân hủy tinh bột lại có tác dụng đối với cây trồng cung cấp

nguyên liệu sản xuất ethanol. Biểu hiện α-amylase chịu nhiệt trong cây ngô đã đƣợc

ứng dụng để tạo ra cây tự chế biến, giảm giá thành biến đổi từ tinh bột sang ethanol.

Amylase đƣợc biểu hiện trong gian bào nên không tham gia vào sinh tổng hợp tinh bột

hay dự trữ vì thế việc có mặt của nó không ảnh hƣởng đến việc tích tụ tinh bột trong

quá trình phát triển của cây. Khi hạt xay ra đƣợc làm nóng trong nƣớc để hồ hóa tinh

bột thì amylase chịu nhiệt sẽ bắt đầu chuyển đổi tinh bột thành dạng có thể lên men

[45].

1.3.3. Thay đổi thành phần tinh bột

Mục đích chính để thay đổi cấu trúc của tinh bột trong cây là biến đổi tỷ lệ

amylopectin và amylose, thay đổi phân bố chiều dài chuỗi trong amylopectin hoặc để

tăng hàm lƣợng phosphate của tinh bột. Do thành phần hóa lý của amylose và

amylopectin nên tính chất có lợi cho công nghiệp là chủ yếu là các tinh bột chỉ có một

trong hai thành phần trên. Nhiều đột biến đã đƣợc mô tả trong nhiều loài ngũ cốc và họ

đậu có chứa tinh bột chỉ có amylopectin hoặc có phần lớn là amylose. Những gen liên

quan đến quá trình tổng hợp tinh bột này mở ra khả năng ứng dụng trong việc tạo ra

các loại củ hoặc hạt có chất lƣợng tinh bột và đƣờng khác nhau với tỷ lệ

amylose/amylopectin khác nhau.

Gen Puroindoline từ lúa mì PINA và PINB đã đƣợc chuyển vào lúa để thay đổi

thành phần tinh bột. Hạt chuyển gen rất mềm và đƣợc gọi là "Soft Rice". Viêc thay đổi

này có rất nhiều lợi thế trong ngành công nghiệp thực phẩm cho phép tạo ra loại gạo

mới có chất lƣợng tốt hơn [23].

Các enzyme SBE (starch branching enzyme) và DBE (debranching enzyme) có

vai trò quan trọng trong việc quyết định thành phần amylose và amylopectin. Quá trình

phân nhánh đƣợc xúc tác bởi SBE. Enzyme này cắt chuỗi α-l,4-glucan sẵn có và

chuyển đoạn cắt mang 6 đơn vị glucose hoặc nhiều hơn tới vi trí C6 của gốc glucosyl ở

chuỗi glucan khác. SBE của thực vật bậc cao bao gồm hai nhóm I và II. Nhóm I vận

chuyển các chuỗi dài hơn. Phân tích di truyền chỉ ra rằng hai nhóm BE có vai trò đặc

biệt trong tổng hợp amylopectin. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, tăng cƣờng biểu

hiện SBE trong cây chuyển gen làm tăng hàm lƣợng amylopectin [9].

1.4. CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN NHỜ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Việc sử dụng Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) bắt đầu từ 1970, khi

ngƣời ta phát hiện vi khuẩn này có khả năng tạo nên khối u ở cây hai lá mầm bị

thƣơng, đƣợc gọi là khối u cổ rễ. Agrobacterium là một loài vi khẩn đất thuộc vi khuẩn

gram âm. Cả chủng A. tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes đều đƣợc sử dụng

phổ biến trong chuyển gen vào thực vật. Theo cơ chế tự nhiên, hai loài này có khả

năng xâm nhiễm qua vết thƣơng của hầu hết thực vật hai lá mầm, kết quả là gây ra

những khối u (crown gall) hay hình thành lông rễ (hairy roots) [42]. Những tế bào của

khối u hay lông rễ có thể phát triển in vitro khi vắng mặt bất cứ hormone thực vật nào.

Khả năng này có đƣợc do tế bào của các dạng hoang dại A. tumefaciens hay A.

rhizogenes chứa một loại plasmid đặc biệt gọi là Ti-plasmid (tumor-inducing plasmid).

Ti-Plasmid có kích thƣớc khoảng >200 kb đã đƣợc xác định trình tự, chứa một đoạn

DNA có chiều dài khoảng 25 Kb gọi là T-DNA có thể chuyển sang tế bào chủ theo cơ

chế tự nhiên [16]. Do đó Agrobacterium là một hệ thống chuyển gen tự nhiên. Bằng

cách cải biên (cắt bỏ các gen gây khối u hay lông rễ, cài xen vào vùng T-DNA những

gen thích hợp, gen này sẽ đƣợc chuyển và gắn vào hệ gen tế bào thực vật dễ dàng.

Những phát hiện này có ý nghĩa rất quan trọng cho sự ra đời của phƣơng pháp chuyển

gen vào thực vật nhờ vi khuẩn A. tumefaciens.

A. tumefaciens nhận biết acetosyringone nhờ một chất nhận, đƣợc mã hóa bằng

một gen ở vùng vir (virulence), vùng vir bao gồm nhiều gen. Sự nhận biết bằng chất

nhận dẫn đến sự hoạt hóa của tất cả gen vir. Một sản phẩm gen vir khác là một

endonuclease nhận biết bờ phải và trái của T-DNA và cắt T-DNA ở những vị trí này.

Sau đó, một protein gắn vào sợi đơn của T-DNA và phức hệ này đƣợc chuyển vào

thực vật cũng nhờ tác dụng của các sản phẩm gen vir.

Ti-plasmid tự nhiên khó đƣợc dùng trực tiếp trong các thí nghiệm chuyển gen

vì có kích thƣớc lớn (>200kb) và mang các gen gây khối u bất lợi cho thực vật. Hơn

nữa, trên trình tự DNA của Ti-plasmid có rất nhiều điểm cắt của enzyme giới hạn, điều

đó gây ra những trở ngại trong quá trình tạo vector tái tổ hợp mang gen mục tiêu để

chuyển vào tế bào thực vật. Mặt khác, khi chuyển Ti-plasmid vào vi khuẩn E. coli

chúng không có khả năng tự tái bản. Tuy nhiên, bên cạnh đó Ti-plasmid có thể cung

cấp những yếu tố cần thiết quan trọng cho kĩ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium. Do đó, cần thiết kế lại để có thể sử dụng Ti-plasmid trong kĩ thuật

chuyển nạp gen vào thực vật.

Ngày nay, hầu hết quy trình chuyển gen sử dụng vector nhị thể (binary vector)

vì những ƣu điểm vƣợt trội trong thiết kế vector và hiệu suất biến nạp. Hệ thống vector

nhị thể thiết kế gồm hai vector (plasmid) cùng có mặt và hoạt động trong

Agrobacterium. Một plasmid tách dòng từ vi khuẩn E. coli, trong đó có thiết kế vùng

bờ trái và bờ phải, nằm giữa hai bờ là các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển.

Plasmid thứ hai là Ti-plasmid cải tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái, bờ phải

bị cắt bỏ chỉ giữ lại vùng gen vir hỗ trợ chuyển gen vào tế bào thực vật, plasmid này

đƣợc gọi là plasmid hỗ trợ. Hệ thống vector nhị thể luôn đƣợc cải tiến để nâng cao

hiệu suất chuyển gen thông qua Agrobacterium. Chính vì vậy, đây là một hệ thống

vector đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay.

Trong báo cáo này sử dụng vector chuyển gen pBI121 mang gen chọn lọc cây

chuyển gen NPTII, gen chọn lọc khuẩn biến nạp KanR và gen chuyển (GUS) đƣợc

điều khiển bởi promoter 35S [33]. Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58

mang vector pGV2260 đƣợc nghiên cứu phù hợp với chuyển gen ở cây thuốc lá và

nhiều loại cây trồng khác [11].

1.5. BIỂU HIỆN NHIỀU GENE TRÊN CUNG MỘT KHUNG ĐỌC MỞ VỚI 2A

PEPTIDE

Hình 1.6. Sơ đồ mô tả nguyên tắc hoạt động của P2a [47]

Ghi chú: 1 - 3: Ribosome hoạt động bình thường đến bộ ba mã hóa cho praline. 4: Chuỗi

peptide LLNFDLLKLAGDVESNPG và Paraline bất hoạt Peptidyl transferase. 5-6: Chuỗi

polypeptide bắt đầu tổng hợp từ paraline.

Ở virus gây bệnh lở mồm long móng Teschovirus hay FMDV (foot-and-mouth

disease virus) và một số Picornaviruses khác, đoạn oligopeptide (khoảng 20 axit

amino) nằm giữa hai protein 2A và 2B trong polyprotein có nhiệm vụ phân cắt tạo ra

hai protein 2A và 2B [36]. Vị trí cắt nằm giữa hai axit amino glycine và praline của

p2a (−LLNFDLLKLAGDVESNPG↓P-) [2] (Hình 1.6). Các nghiên cứu cho thấy, P2a

có khả năng hoạt động khi nằm giữa hai protein trong hầu hết hệ thống biểu hiện gen ở

sinh vật có nhân thật. P2a hoạt động nhƣ một hệ thống độc lập và là công cụ quan

trọng để biểu hiện nhiều protein trên cùng một khung đọc mở.

Trên thực vật, P2a cũng đƣợc chứng minh có hoạt động trên cây A. thaliana [5],

thuốc lá [25] … Nghiên cứu của Buren (2012) trên cây A. thaliana với các gen khác

nhau cho hiệu quả phân cắt khác nhau. Khả năng phân cắt cao nhất (95%) với cấu trúc

CFPGUS-2A-RABD2a, trong đó CFPGUS có chiều dài lớn nhất trong số các protein

đƣợc thử nghiệm. Trong khi đó hiệu suất phân cắt của CFP-2A-RABD2a chỉ đạt 20%.

Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy, P2a có ƣu thế vƣợt trội so với IRES

(Internal ribosome entry site đƣợc phân lập từ Encephalomyocarditis virus - EMCV)

về hiệu suất biểu hiện và tỉ lệ giữa hai chuỗi peptide đƣợc tạo ra. Chuyển gen tổng hợp

tiền vitamin A (β-carotene ) là một trong những thành tựu lớn của công nghệ chuyển

gen thực vật. Để tổng hợp β-carotene trong hạt lúa, hai gen cấu trúc, PSY và crt1 đƣợc

điều khiển bởi promoter Glu1 [30]. Nghiên cứu gần đây của Ha và cộng sự (2010) [18]

đã biểu hiện hai protein PSY và crt1 trên cùng một khung đọc mở với hệ thống biểu

hiện P2a hoặc IRES. Kết quả cho thấy, PSY –P2a-crt1 hoạt động hiệu quả hơn gấp 9

lần so với PSY –IRES-crt1. Các nghiên cứu cũng cho thấy, cấu trúc Protein1–IRES-

protein2 thƣờng biểu hiện không đều, protein đứng sau IRES thƣờng có mức dịch mã

thấp hơn so với protein đứng trƣớc [15].

Nhƣ vậy, P2a là một công cụ hữu hiệu trong biểu hiện nhiều gen trên cùng

khung đọc mở.

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Vật liệu

Giống sắn KM140 đƣợc sử dụng để phân lập gen AGPS và AGPL do Trung tâm

nghiên cứu thực nghiệm nông nghiệp Hƣng Lộc, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp

Miền Nam cung cấp.

Cây thuốc lá N. tabacum K326 in vitro, chủng vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens C58/pGV2260, vi khuẩn Escherichia coli DH5(α), vector chuyển gen

pBI121 và vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công

nghệ sinh học cung cấp.

2.1.2. Hóa chất

Hóa chất tách chiết RNA: TRIzol® Reagent, kit tổng hợp cDNA: RevertAid

RT Reverse Transcription Kit, thang ADN 1kb (cho điện di gel agarose), kit tinh sạch

ADN Gene JET gel extraction (Thermo Fisher Scientific). Kit PCR GoTaq® Green

Master Mix (Promega)

Các hóa chất khác đƣợc trình bày trong phần phƣơng pháp nghiên cứu. Mồi

PCR (Bảng 2.1).

Bảng 2.1. Danh sách mồi PCR sử dụng

STT Tên mồi

Trình tự 5’  3’

Độ dài Ghi chú

TGGAATGGATTCTTGCTGTGTG

Nhân bản AGPL

AGPLcds_F

CAACCAGTCCTTGAACATGC

AGPLcds_R

CTAATGGCGAGTATGGCGGC

Nhân bản AGPS

AGPScds_F

CATCTAGATCACGGTTCCGCT

AGPScds_R

GGCCCCGGGGATCACGGTTCCGCTG

AGPS-XmaI R

Nhân vùng CDS của AGPS

TCTAGAATGGCGGCCATCGG

XbaI-AGPS-F

GGAAGAAAACCCCGGTCCTATGGATTCTTGCTGTG

P2A AGPL F

Nhân vùng CDS của AGPL

AGPL-CMYC-R TCTGAGATGAGTTTCTGTTCTATTACTGTGCCATC

GGGTTTTCTTCCACGTCTCCTGCTTGCTTTAACAG

P2A R

Tổng hợp đoạn C- myc và P2A

AACCCGGGGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAA

10 XmaI-P2A F

TACGAGCTCTCACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTT

11 Cmyc sacI R2

CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC

12 M13 F

tra vector

Kiểm tách dòng

AGCGGATAACAATTTCACACAGGA

13 M13 R

ATGCGATACTTGGTGTGAAT

ITS2

[8]

TCCTCCGCTTATTGATATGC

ITS4

[43]

GAACAAGATGGATTGCACGCA

16 NPTII F3

GATACCGTAAAGCACGAGGAAG

17 NPTII R730

Kiểm cây tra chuyển gen, 727 bp

ATCATTTGTAGCGACT

18 VirC F

AGCTCAAACCTGCTTC

19 VirC R

Kiểm cây tra chuyển gen, 730 bp [38]

2.2. PHƯƠNG PHÁP

2.2.1. Một số phương pháp sinh học phân tử

2.2.1.1. Phương pháp PCR với GoTaq® Green Master Mix

GoTaq® Green Master Mix 2X là dung dịch master mix cho phản ứng PCR đã

đƣợc bổ sung dNTPs, Buffer PCR, enzyme và đệm load mẫu. Khi thực hiện phản ứng

PCR cần bổ sung thêm mồi PCR và DNA khuôn. Thành phần phản ứng và chu trình

nhiệt Bảng 2.2

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt PCR với GoTaq® Green Master Mix 2X

Thành phần Phản ứng 15 µl Phản ứng 25µl

GoTaq® Green Master Mix 2X 7,5 12,5

Mồi xuôi 0,5 1

Mồi ngƣợc 0,5 1

Mẫu DNA 1-50 ng 1-100 ng

Nƣớc Vừa đủ 15µl Vừa đủ 25µl

Chu trình nhiệt Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số vòng lặp

Biến tính mẫu 94 4 phút 1

Biến tính mẫu 94 15 giây 25-30

Bắt cặp mồi Tm 15 giây

Kéo dài 72 1 phút cho mỗi 1 kb

72 5 phút 1

Trong đó:

Mẫu DNA là DNA tổng số thực vật, plasmid, hoặc tế bào vi khuẩn (gọi là cloni-PCR).

Tm được tính Tm(ºC) = 64.9 + 41(((G+C) -16.4)/N)-3 (N là chiều dài mồi).

Chạy 25 chu kỳ cho cloni-PCR và 30 chu kỳ cho phản ứng PCR từ DNA tổng số.

2.2.1.2. Phương pháp nối hai hoặc nhiều đoạn DNA bằng phản ứng ligase với T4

DNA ligase

Các phân đoạn DNA đã tinh sạch đƣợc ghép nối với nhau để tạo plasmid tái tổ

hợp nhờ T4 DNA ligase, thành phần phản ứng trình bày ở Bảng 2.3. Để đạt đƣợc hiệu

quả tốt nhất, vector và đoạn chèn đƣợc đƣa vào với tỉ lệ 1 : 3 theo nồng độ Mol. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 22oC trong 30 phút. Sau đó đặt hỗn hợp phản ứng lên đá lạnh

và tiến hành biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng nối hai hoặc nhiều đoạn DNA với T4 ligase

STT Thành phần phản ứng Thể tích(µl)

1 Vừa đủ

H2O deion Vector đã cắt 2 50 ng

Đoạn chèn 3 10-50 ng

4 T4 DNA ligase Buffer 10X 2

5 T4 DNA ligase (5U/µl) 1

Tổng 10

2.2.1.3. Phương pháp cắt DNA với enzyme cắt giới hạn

Các mẫu DNA hoặc Plasmid đƣợc cắt enzyme để tạo đầu đính hoặc để kiểm tra

Plasmid. Thành phần phản ứng đƣợc trình bày ở Bảng 2.4. Phản ứng cắt đƣợc ủ ở

37ºC trong ít nhất 2 giờ. Sau khi kết thúc phản ứng, một lƣợng nhỏ sản phẩm cắt đƣợc

điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Hoặc điện di lƣợng lớn phục vụ thu hồi các

phân đoạn cắt.

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt DNA với Enzyme giới hạn

STT Thành phần Thể tích (µl)

1 Vừa đủ

2 H2O Buffer 10X 2

3 Enzyme giới hạn (10 U/µl) 1

4 Mẫu DNA <10 µg

Tổng 20

2.2.1.4. Phương pháp biến nạp vector vào E. coli

Sản phẩm nối với enzyme T4 ligase đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli

bằng phƣơng pháp vi sóng. Lấy 5 µl hỗn hợp phản ứng trộn cùng 50 µl tế bào khả biến

E. coli DHα. Giữ trên đá 10 phút. Biến nạp bằng lò vi sóng ở 150 W trong 1 phút, giữ

ngay trên đá. Dịch khuẩn sau biến nạp đƣợc bổ sung 400 µl LB, nuôi phục hồi ở 37ºC

trong 1 h và cấy trải lên đĩa LB đặc có kháng sinh thích hợp. Nuôi đĩa khuẩn qua đêm

ở 37ºC.

2.2.1.5. Phương pháp tách chiết plasmid

Plasmid đƣợc tách từ dịch khuẩn bằng phƣơng pháp ly giải kiềm (alkaline

lysis).

- Ly tâm dịch khuẩn ở 7000 rpm/5 phút để thu dịch khuẩn.

- Bổ sung 200 µl Sol I (25 mM Tris HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA, pH 8,0; 50 mM

Glucose), trộn đều.

- Bổ sung 400 µl Sol II (0,2 M NaOH và 1% SDS) , đảo đều, giữ 5 phút nhiệt độ

phòng.

- Thêm 300 µl Sol III (CH3COOK 2,5 M pH 5.2), đảo đều, giữ 3 phút, li tâm 12000

rpm/10 phút. Thu dịch nổi.

- Thêm 700 µl isopropanol, đảo đều, ly tâm 12000 rpm/10 phút. Thu cặn.

- Rửa cặn 2 lần với ethanol 70%. Làm khô.

- Hòa cặn vào 40 µl nƣớc.

Plasmid sau khi tách đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di agarose 0,8%,

tinh sạch và đo nồng độ bằng máy đo nanodrop.

2.2.2. Phân lập gen AGPS và AGPL từ cây sắn

2.2.2.1. Tách RNA tổng số từ củ sắn KM140

Mẫu RNA đƣợc tách từ lá của giống sắn KM140 bằng TRIzol® Reagent

(Thermo Fisher Scientific):

- Nghiền 0,1 g lá sắn trong nito lỏng.

- Thêm 1 ml Trizol, đảo đều.

- Thêm 200 µl Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1, lắc đều. Li tâm 12000

vòng/phút trong 10 phút. Thu dịch pha trên (500 µl).

- Thêm 500 µl Isopropanol, đảo đều, li tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút.

Thu cặn RNA.

- Rửa cặn RNA với ethanol 75%. Làm khô

- Hòa cặn vào 40 µl nƣớc

- Kiểm tra RNA tổng số sau khi tách bằng điện di trên gel agarose 0.8%

không biến tính.

2.2.2.2. Nhân dòng gen AGPS và AGPL bằng phản ứng RT-PCR

Mẫu RNA tổng số đƣợc sử dụng để tổng hợp cDNA theo hƣớng dẫn của bộ kit

RevertAid RT Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific):

Thành phần Thể tích

RNA tổng số 500 ng

Mồi ngẫu nhiên (Hexamer) 1 µL

Nƣớc khử ion Dẫn đến 12 µl

Ủ 65°C trong 5 phút, sau đó bổ sung với thành phần

Thành phần Thể tích

5X Reaction buffer 4

dNTP mix (10mM) 2

Ribolock Rnase Inhibitor (20 u/µl) 1

M-MuLV Reverse Transcriptase (20 u/µl) 1

Tổng thể tích 20 µl

Chạy chƣơng trình tổng hợp cDNA 25°C/5 phút; 42°C/ 60 phút. Kết thúc phản

ứng ở 70°C/5 phút. Mẫu cDNA sau khi tổng hợp đƣợc sử dụng để thực hiện phản ứng

PCR. Hai gen AGPS và AGPL đƣợc nhân dòng bằng phản ứng PCR với cDNA tổng số

bằng cặp mồi AGPScds-F/R cho AGPS và AGPLcds-F/R (đƣợc thiết kế dựa trên trình

tự hệ gen Manihot esculenta v6.1 genome – Phytozoe) cho AGPL. Thành phần phản

ứng và chu kỳ nhiệt đƣợc trình bày ở Bảng 2.5. Sản phẩm RT-PCR đƣợc kiểm tra

bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%.

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân dòng đoạn AGPS và AGPL

Thành phần Thể tích (µl)

2,5

Pfu Buffer + MgSO4 10X Pfu DNA polymerase 2,5u 0,5

dNTPs 10 mM 2,5

Mồi xuôi 10 pM 1

Mồi ngƣợc 10 pM 1

cDNA 1

Nƣớc Vừa đủ 25 µl

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR:

Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (°C) Thời gian Chu kỳ

1 30 1

1 2 3 4 5 6 Biến tính Biến tính Gắn mồi Kéo dài chuỗi Hoàn tất kéo dài Kết thúc phản ứng 95 95 53 72 72 4 3 phút 45 giây 30 giây 2 phút 10 phút 

2.2.2.3. Tách dòng gen AGPS và AGPL bằng vector pBT

Sản phẩm RT-PCR từ hai gen AGPS và AGPL đƣợc điện di và thu hồi theo

hƣớng dẫn của kit thôi gel Gene JET gel extraction (Thermo Fisher Scientific). Sản

phẩm này đƣợc tạo đầu A bằng phản ứng với GoTaq® Green Master Mix ở 72ºC trong

10 phút. Tiếp đó, sản phẩm tinh sạch đƣợc nối với vector tách dòng pBT và biến nạp

vào E.coli DHα. Cấy trải khuẩn trên đĩa LB đặc chứa Carbenicillin 75 mg/l, IPTG 1

mM, X-gal 20 mg/l và nuôi qua đêm ở 37ºC. Các khuẩn lạc màu trắng đƣợc chọn và

kiểm tra PCR với cặp mồi M13F/R. Khuẩn lạc dƣơng tính nếu xuất hiện băng lớn hơn

164bp so với kích thƣớc đoạn gen chèn vào.

Các khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc nuôi lỏng và tách plasmid. Plasmid đƣợc kiểm

tra lần nữa với mồi M13F/R, sau đó, đọc trình tự với mồi M13-F và M13-R.

2.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pBI-35S-AGPSL

2.2.3.1. Tổng hợp đoạn XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI

Để nối với vector pBI121, AGPS đƣợc bổ sung thêm điểm cắt của enzyme giới

hạn XbaI và SmaI ở hai đầu bằng phản ứng PCR với cặp mồi XbaI-AGPS-F và

AGPS-SmaI-R. Sản phẩm là đoạn XbaI-AGPS-SmaI.

Hình 2.1 Sơ đồ đoạn gen P2a:AGPL:cmyc và vị trí của các mồi PCR

Đoạn SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI đƣợc tổng hợp từ vùng CDS của AGPL,

đƣợc bổ sung thêm trình tự P2A và C-myc cùng vị trí cắt của enzyme SmaI và SacI

bằng 2 phản ứng PCR: (1) nhân vùng CDS của AGPL với mồi P2A-AGPL-F và

AGPL-CMYC-R băng phản ứng PCR; (2) Thực hiện phản ứng nối PCR (overlap

extension PCR) với các mồi XmaI-P2A-F, P2A-R, và Cmyc-sacI-R2 để tạo phân đoạn

SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI hoàn chỉnh (Hình 2.1).

Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt cho phản ứng tổng hợp SmaI-P2a-AGPL-

Cmyc-SacI đƣợc trình bày ở Bảng 2.6. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra và tinh

sạch bằng kit thôi gel Gene JET gel extraction.

Bảng 2.6. Thành phần và chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR tổng hợp SmaI-P2a-AGPL- Cmyc-SacI

Thành phần phản ứng

STT Thành phần Nồng độ Thể tích

Pfu buffer 10X 5 1

dNTPs 2,5mM 5 2

Pfu DNA polymerase 2,5U 1 3

XmarI-P2A-F 10 pM 2 4

P2A-R 10 pM 0,1 5

Cmyc-SacI-R2 10 pM 2 6

AGPL CDS 10ng 1 7

Vừa đủ 50µl 8 H2O

Chu kỳ PCR

STT Nhiệt độ (ºC) Thời gian Chu kỳ

1 72 1 phút

2 Chu kỳ (bƣớc này để tổng hợp đoạn P2a) 2 45 30 giây

3 94 1 phút 1

4 95 20 giây

5 55 20 giây 25 chu kỳ

6 72 1phút 30

7 72 4 phút 1

8 Kết thúc

2.2.3.2. Nối XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI với pBI121

Đoạn XbaI-AGPS-SmaI đƣợc cắt với XbaI và SmaI, SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-

SacI cắt với SmaI và SacI. Sản phẩm cắt đƣợc tinh sạch bằng kit thôi gel. Vector

pBI121 cắt với XbaI và SacI để loại bỏ gen GUS, sản phẩm cắt điện di và thu hồi băng

12,8 kb bằng kit thôi gel.

Tiếp đó, 3 phân đoạn trên đƣợc nối với nhau bằng T4 ligase (Hình 2.2). Sản

phẩm nối đƣợc biến nạp vào Ecoli DH5α, cấy trải lên đĩa LB đặc bổ sung Kanamycin

50mg/l. Chọn lọc khuẩn lạc bằng phản ứng clony PCR với các cặp mồi XmaI P2A-F

/Cmyc-sacI-R2 và XbaI-AGPS-F / Cmyc-SacI-R2. Nuôi lỏng các khuẩn lạc dƣơng

tính và tách chiết Plasmid pBI-35S-AGPSL. Plasmid này đƣợc kiểm tra bằng phản ứng

cắt enzyme SacI và XbaI.

Hình 2.2. Sơ đồ ghép nối pBI121 với AGPS và P2a-AGPL-Cmyc

2.2.3.3. Biến nạp pBI-35s-AGPSL vào tế bào vi khuẩn A. tumefacien C58

Tế bào khả biến đặt trong đá 10-15 phút. Bổ sung 1 µl vector chuyển gen vào tế

bào khả biến và trộn nhẹ. Chuyển tất cả hỗn hợp dịch A.tumefaciens C58 + vector

chuyển gen vào Cuvette. Xung điện: 2,5 kv, 25µF và điện trở 400. Đặt ngay vào đá.

Sau 5-10 phút bổ sung 400 µl LB và trộn nhẹ. Chuyển sang ống eppendorf 2 ml. Nuôi 28oC trong 1 giờ trên máy lắc. Cấy trải dịch vào đĩa LB đặc chứa Kanamycin 50 mg/l, Rifampicin 50 mg/l. Ủ ở 28oC trong hai ngày. Khuẩn lạc đƣợc sàng lọc bằng phƣơng

pháp cloni-PCR với mồi XbaI-AGPS-F và Cmyc-SacI-R2. Các khuẩn lạc dƣơng tính

đƣợc cấy vạch sang đĩa mới và nuôi giữ chủng.

2.2.4. Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens

2.2.4.1. Chẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens

Khuẩn lạc A. tumefaciens đƣợc nuôi lỏng trong 10 ml LB có bổ sung kháng

sinh chọn lọc (Kanamycin 50 mg/l, Rifampicin 50 mg/l), nuôi qua đêm (16h). Sau đó

nuôi phục hồi thêm 4h trong 100 ml LB lỏng. Khuẩn sau khi nuôi đƣợc đem đo

OD650=0,5-0,7 thì sử dụng để biến nạp. Vi khuẩn đƣợc thu hồi bằng li tâm và hòa tan

với dung dịch ½ MS để tạo dịch huyền phù vi khuẩn OD600 = 0,7.

2.2.4.2. Chuyển gen

Lá thuốc lá đƣợc cắt thành những mảnh nhỏ có kích thƣớc 1 cm2, tiền nuôi cấy

trong môi trƣờng GM (MS + 1 mg/l BAP + 30 g/l sucrose) sau 2 ngày. Mảnh lá đƣợc

ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens trong 15 phút ở nhiệt độ phòng,

tiếp đến đƣợc đặt lên môi trƣờng đồng nuôi cấy GM (MS + 1 mg/l BAP + 30 g/l

sucrose + 8 g/l agar, pH=5,8 ) trong 2 ngày. Sau đó tiếp tục nuôi cấy trên môi trƣờng

GM có bổ sung kháng sinh chọn lọc cefotaxime 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l để tái

sinh chồi. Sau 4 đến 5 tuần các chồi 2-3 cm tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc đƣợc cắt

chuyển sang môi trƣờng ra rễ RM (MS + 0,1 mg/l IBA + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar +

500 mg/l cefotaxime, 50 mg/l kanamycin, pH 5,8). Sau 3 đến 4 tuần cây con ra rễ và

phát triển hoàn chỉnh với 3 đến 4 lá thật sẵn sàng cho ra bầu đất nhỏ chứa giá thể TN1. Cây chuyển gen đƣợc huấn luyện với môi trƣờng ngoài ở nhiệt nhiệt độ ở 25oC, độ

ẩm 80 - 90%, điều kiện chiếu sáng 14/24 h, độ rọi 2500 lux. Cây phát triển có 4 đến 5

lá thật thì chuyển ra trồng trong chậu đất chứa giá thể TN1 (viện nông hóa thổ

nhƣỡng) trong buồng sinh trƣởng để phân tích cây chuyển gen. Quy trình đƣợc tóm tắt

ở Bảng 2.7.

Bảng 2.7. Tóm tắt quy trình chuyển gen và phân tích cây chuyển gen

Chẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn

Chuẩn bị vật liệu chuyển gene Cắt lá thành các mảnh hình vuông kích thƣớc 1 cm2 (K326) đặt ngửa lên GM 2 ngày - Nuôi lỏng tạo dịch huyền phù - Ly tâm thu cặn khuẩn, hòa cặn trong ½ MS (OD600 = 0,7)

Chuyển gen (2 ngày)

- Lây nhiễm 15 phút - Đồng nuôi cấy trên GM ở điều kiện tối (2 ngày)

Chọn lọc đa chồi (4-5 tuần) Nuôi mảnh lá trên môi trƣờng GM với kháng sinh chọn lọc

Chọn lọc ra rễ (3-4 tuần)

Cắt chồi, nuôi trên môi trƣờng ra rễ RM

Huấn luyện cây non (1 – 2 tuần)

Trồng trong bầu đất nhỏ, trong phòng nuôi cấy mô

15 ngày: Kiểm tra PCR

20 ngày: kiểm tra tinh bột bằng nhuộm Iodine

Nuôi cây trong buồng sinh trưởng 30 ngày: Kiểm tra tốc độ tích lũy tinh bột 2h sau chiếu sáng

50 ngày: kiểm tra khả năng tích lũy tinh bột 14h sau chiếu sáng

Phân tích Western blot cây in-vitro Kiểm tra các cây dƣơng tính với PCR

2.2.5. Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen bằng phương pháp PCR

DNA tổng số đƣợc tách từ lá cây thuốc lá chuyển gen sau khi trồng 15 ngày

trong chậu đất theo quy trình:

- Nghiền 0,1 g lá trong nitơ lỏng.

- Thêm 500 µl đệm chiết TES (Tris HCl pH8 100 mM, EDTA 50 mM, NaCl

1M), đảo đều. Li tâm 12000 vòng/phút trong 12 phút. Hút dịch chiết sang

ống mới.

- Thêm thể tích tƣơng đƣơng Isopropanol, đảo đều. Li tâm 12000 vòng/phút

trong 12 phút. Thu cặn.

- Rửa cặn DNA với Ethanol 70%, làm khô và hòa vào 40 µl nƣớc.

- Kiểm tra DNA tổng số sau tách bằng phƣơng pháp điện di trên gel Agarose

0,8%.

Mẫu DNA tổng số đƣợc sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR (Gotaq) với

các cặp mồi: ITS2/ITS4, VirC F/R, NPTII F3/R730 và XbaI-AGPS-F / P2A-R.

Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Các

dòng thuốc lá dƣơng tính với phản ứng PCR nếu xuất hiện băng kích thƣớc tƣơng

đƣơng đối chứng dƣơng và đúng với kích thƣớc tính toán lý thuyết.

2.2.6. Phân tích các dòng cây chuyển gen bằng Western blot

Lá cây chuyển gen (100 mg) nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng, bổ sung 100

µl đệm PBS (Phosphate Buffered Saline) 1X. Thu dịch nghiền vào ống eppendorf 2 ml, ly tâm 10.000 vòng ở 4oC, thu dịch protein ở phía trên. Protein tổng số sau tách

đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp so màu của Bradford (1976). Protein đƣợc phân

tách bằng điện di SDS-PAGE 12% theo phƣơng pháp của Laemmli (1970). Sau đó

protein đƣợc chuyển lên màng nitrocellulose bằng máy chuyển màng Fast blotter của

hãng Thermo Scientific Pierce ở 25V, trong 30 phút. Màng nitrocellulose tiếp tục đƣợc

phủ bằng Blocking solution trong 5 giờ, sau đó màng đƣợc ủ qua đêm với kháng thể 1

(anti-cmyc) pha loãng trong Blocking solution với tỉ lệ 1:100. Sau khi ủ kháng thể 1,

màng đƣợc rửa sạch 2 lần, 5 phút/lần với TBST và tiếp tục đƣợc ủ với kháng thể 2

(anti-mouse IgG cộng hợp HRP) pha trong Blocking solution với tỉ lệ 1:2500 trong 2

giờ. Màng lai tiếp tục đƣợc rửa 2 lần (mỗi lần 5 phút) với TBST. Sự có mặt phức hệ

“protein tái tổ hợp + kháng thể 1 + kháng thể 2” trên màng đƣợc phát hiện nhờ phản

ứng hiện màu bằng cơ chất 3,3′-Diaminobenzidine (DAB).

Thành phần dung dịch:

 Đệm PBS (Phosphate Buffer Saline Tween): 11,5 g/L Na2HPO4.2H2O, 2,96 g/L

NaH2PO4.2H2O, 5,84 g/L NaCl, 1 ml/L Tween 20, pH 7,5.

 Đệm biến tính protein (Laemmli sample buffer 4X): 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 200

mM DTT, 4% (w/v) SDS, 50% (v/v) Glycerol, 0,01% (w/v) Bromophenol blue.

 Dung dịch chuyển màng: 25 mM Tris, 250 mM Glycine, 0,2% (w/v) SDS, 20%

methanol.

 Đệm TBST: 10 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 5 ml/L Tween 20, pH 7,5.

 Blocking solution: Thành phần của Blocking solution gồm 5% skim milk (sữa tách

béo) trong TBST solution.

2.2.7. Kiểm tra khả năng tích lũy tinh bột của cây thuốc lá chuyển gen.

Các dòng chuyển gen và không chuyển gen sau khi huấn luyện thích nghi với môi trƣờng bên ngoài đƣợc nuôi trong buồng sinh trƣởng. Điều khiển nhiệt độ ở 25oC

vào ban ngày và 20ºC vào ban đêm, độ ẩm 70%, điều kiện chiếu sáng 14/24 h, độ rọi

7500 lux. Thu lá cùng độ tuổi ở các dòng thuốc lá chuyển gen và dòng không chuyển

gen vào buổi sáng sau 2h chiếu sáng. Hàm lƣợng tinh bột trong lá đƣợc kiểm tra định

tính bằng phƣơng pháp nhuộn iodine và định lƣợng bằng phƣơng pháp Anthrone [44].

2.2.7.1. Phương pháp nhuộm iodine

Cây thuốc lá sau khi nuôi 20 ngày đƣợc kiểm tra tinh bột bằng phƣơng pháp

nhuộm iodine. Thu lá cùng độ tuổi ở các dòng thuốc lá chuyển gen và dòng không

chuyển gen, sau 2h chiếu sáng. Nhúng lần lƣợt từng lá vào nƣớc sôi, giữ khoảng 1 phút. Chiết sạch diệp lục trong lá bằng cách nhúng lá trong cồn 80oC sôi. Rửa lá dƣới

vòi nƣớc để loại bỏ cồn dƣ. Tiến hành nhuộm lá với dung dịch nhuộm (0,2% I2; 0,4%

KI).

2.2.7.2. Phương pháp đo hàm lượng tinh bột bằng Anthrone

Cây thuốc lá sau nuôi 30 ngày (thu sau 2h chiếu sáng) đƣợc thu lá và kiểm tra

tốc độ tích lũy tinh bột. Cây sinh trƣởng đƣợc 50 ngày (thu sau 12h chiếu sáng) đƣợc

kiểm tra khả năng tích lũy tinh bột tối đa.

Cây trồng trong buồng sinh trƣởng đƣợc định lƣợng tinh bột bằng phƣơng pháp

Anthrone. Trong phƣơng pháp này, các mẫu lá đƣợc sấy khô và loại bỏ diệp lục bằng

cách chiết với acetone 100%. Đƣờng tự do trong mẫu đƣợc loại với cồn 80º, sau đó

thủy phân tinh bột trong mẫu với acid HCl để tạo ra các phân tử đƣờng glucose. Cuối

cùng thực hiện phản ứng màu với Anthrone và đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 630 nm.

Quy trình dựa trên mô tả của Yemm và cộng sự (1954) [44] có cải tiến:

- Thu 1 lá thứ 2 hoặc 3 đƣợc chiếu sáng hoàn toàn, giữ trong khay đá.

- Sấy khô ở 80ºC đến khối lƣợng không đổi. Nghiền vụn bằng cối chày sứ.

- Cân lấy 5 – 15 mg bột lá. Nghiền mịn trong nito lỏng.

- Thêm 1,5 ml aceton, lắc đều. Li tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Thu

cặn. Lặp lại 2 – 3 lần cho đến khi thu đƣợc cặn trắng.

- Thêm 2 ml cồn 80%, lắc đều. Li tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Thu

cặn. Lặp lại 1 lần nữa.

- Hòa cặn vào 5 ml HCl 1,25% trong ống facol 15 ml. Ủ 95ºC trong 1h.

- Thêm 1 ml dung dịch Anthrone reagent (0,2 g anthrone trong 100 ml

H2SO4 72%.) vào 200 µl dung dịch trên. Ủ 95ºC trong 11 phút. Giữ ngay

trên nƣớc đá.

- Đo OD ở bƣớc sóng 630.

Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng tinh bột đƣợc xây dựng bằng cách tính OD630

với lƣợng tinh bột đƣợc đƣa vào khác nhau (2 mg - 1,5 mg – 1 mg – 0,5 mg – 0,25 mg

– 0,125 mg). Tiếp đó đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng bằng phần mềm MS Exel 2010.

Lƣợng tinh bột trong lá chuyển gen đƣợc tính toán và so sánh với các cây không

chuyển gen (WT) bằng phƣơng pháp kiểm định giả thuyết trung bình của hai tổng thể

(hàm t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances trong Excel).

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG GEN AGPS VÀ AGPL

3.1.1. Nhân đoạn gen AGPS và AGPL bằng RT-PCR

Giống sắn KM140 là một trong 5 giống sắn ƣu tú mà chúng tôi thu thập đƣợc

trong tập đoàn giống sắn Việt Nam (bao gồm KM94, KM140, SM937-26, KM146,

SA06). KM140 là giống sắn cao sản, bình quân năng suất củ tƣơi đạt 35,0 tấn/ha,

(trong điều kiện thâm canh nhƣ Đồng Nai, Tây Ninh có thể đạt 40- 50 tấn/ha) hàm

lƣợng tinh bột 27,2%. Giống sắn này hiện đã đƣợc trồng rộng rãi trên toàn quốc với

diện tích khoảng 150 ngàn ha. Điển hình tại Tây Ninh, Đồng Nai, Bình Thuận, Gia

Lai, Bình Định đã trồng sắn giống KM140 với diện tích hàng chục ha/hộ, đạt năng

suất từ 30 – 80 tấn/ha. Bởi vậy, chúng tôi sử dụng giống sắn KM140 để làm nguồn

phân lập gen AGPase.

Trong nghiên cứu này, RNA tổng số đƣợc tách chiết từ lá sắn phục vụ cho phản

ứng RT-PCR. Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số trên gel agarose (Hình 3.1 A) cho

thấy, RNA tổng số thu đƣợc có tính toàn vẹn, không bị đứt gẫy, đảm bảo hàm lƣợng

và độ tinh sạch cho các thí nghiệm tiếp theo.

Taq DNA polymerase có nhƣợc điểm là khả năng xuất hiện đột biến trong quá

trình tổng hợp sợi mới cao (1 đột biến trên 3700 nucleotide). Nhƣ vậy, Taq DNA

polymerase không thích hợp cho nhân bản vùng CDS của gen. Pfu DNA polymerase đƣợc sử dụng nhƣ giải pháp thay thế với tỉ lệ sai sót thấp 7.7 × 105 tới 1 × 106

[10][39].

Để tách dòng và đọc trình tự vùng CDS của hai gen AGPS và AGPL, chúng tôi

sử dụng hai cặp mồi đƣợc thiết kế nhân vùng trình tự bao gồm toàn bộ CDS và một

phần trình tự không mã hóa trên mRNA. Trên ảnh điện di cho thấy, AGPS và AGPL đã

đƣợc nhân dòng với kích thƣớc gần đúng nhƣ tính toán (1578 bp với AGPS và 1619 bp

với AGPL) (Hình 3.1 B, C).

(A) (B)

(C)

Hình 3.1. Kết quả RT-PCR nhân đoạn AGPS và AGPL từ RNA tổng số tách ở lá sắn

Ghi chú: (A) Ảnh điện di RNA tổng số tách từ lá sắn KM140. (B) Ảnh điện di sản phẩm RT-

PCR nhân dòng gene AGPS (1578 bp) và AGPL (1619 bp). (C) sơ đồ mRNA của AGPS,

AGPL và vị trí gắn mồi PCR.

3.1.2. Tách dòng gen AGPS và AGPL

Sản phẩm PCR bằng Pfu-DNA polymerase không thể tách dòng trực tiếp bằng

hệ thống TA vector nhƣ pBT. Bởi vậy, phân đoạn AGPS và AGPL đƣợc xử lý tạo đầu

dính adenine (A) bằng phản ứng với Gotaq green mastermix. Tiếp đó, sản phẩm PCR

đƣợc tinh sạch và nối với pBT và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Để giảm

thiểu hiện tƣợng dƣơng tính giả, các khuẩn lạc màu trắng đƣợc cấy vạch và kiểm tra

bằng phƣơng pháp cloni-PCR với mồi pUC18-F/R. Cặp mồi pUC18 -F/R đƣợc thiết kế

bám trên khung vector và nằm hai bên vùng tách dòng. Bởi vậy, chỉ những khuẩn lạc

mang plasmid có gắn đoạn DNA tách dòng mới cho kết quả dƣơng tính với kích thƣớc

lớn hơn 164 bp so với đoạn gen nghiên cứu. Trên bản gel điện di cho thấy, tất cả các

khuẩn lạc pBT-AGPS, khuẩn lạc pBT-AGPL(1) dƣơng tính với phản ứng cloni-PCR.

Các khuẩn lạc pBT-AGPL 3, 2, 1 cho sản phẩm PCR với kích thƣớc nhỏ hơn tính

toán, nhƣ vậy có thể vector pBT đã gắn với các phân đoạn AGPL đứt gãy.

A B

Hình 3.2. Kết quả tách dòng gen AGPS và AGPL

Ghi chú: Ảnh điện di sản phẩm cloni PCR khuẩn lạc biến nạp pBT-AGPS (hình A – tất cả

khuẩn lạc đều dương tính) và pBT-AGPL (hình B – khuẩn lạc số 4 dương tính) với mồi

pUC18-F/R.

3.1.3. Kết quả giải trình tự với mồi M13F và M13R

Các khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc nuôi lỏng, tách plasmid và kiểm tra lại với mồi

pUC18 (kết quả tất cả các mẫu plasmid đều dƣơng tính). Mẫu pBT-AGPS 1,2 và pBT-

AGPL(1) đƣợc giải trình tự với hai mồi M13 F và M13 R (Hình 3.3). Mẫu pBT-AGPS

(1,2) cho trình tự giống nhau.

Kết quả so sánh với trình tự đƣợc công bố Manihot esculenta v6.1 genome –

Phytozome cho thấy đã phân lập thành công AGPS (1572 bp) và AGPL (1584 bp) từ

sắn (Phụ lục 1 và 2). Nhƣ vậy, gen AGPL mới phân lập ngắn hơn kết quả đƣợc công

bố năm 2001 của Tichafa và cộng sự (1593 bp) [19]. Kết quả so sánh vùng CDS

AGPL cho độ tƣơng đồng 99,75% và AGPS 99,68%. Độ tƣơng đồng của AGPS và

AGPL là 60,31 %

Hình 3.3. Ảnh sắc ký giải trình tự gen AGPS và AGPL

Bảng 3.1. Kết quả so sánh trình tự gen AGPS và AGPL mới phân lập với trình tự tham chiếu

AGPS (Kích thƣớc CDS: 1572 bp)

STT Vị trí Tham Chiếu Phân lập Nucleic

Protein

115 T

TTC  CTC Phe  Leu

606 A

TTA  TTG Không đổi

976 T

TTT  CTC Phe  Leu

1070 A

GAG  GGG Glu  Gly

1445 A

GAC  GTC ASP  Val

AGPL (Kích thƣớc CDS: 1584 bp)

291 A

GCA  GCG Không đổi

677 A

TAC  TGC Tyr  Cys

776 A

TAT  TGT Tyr  Cys

1446 G

GCG  GCA Không đổi

Hình 3.4 Trình tự polypeptide AGPS và AGPL mới phân lập

Ghi chú: Mũi tên chỉ vị trí amino acid sai khác. Hộp 1 và Hộp 2: tương đồng với tương tác dị

thể (allosteric binding site) hoặc trung tâm xúc tác (substrate binding site) AGPase của E.

coli (glgC); Hộp 3: Vùng bảo thủ (conserved region) của lõi enzyme; Hộp 4: vùng tương tác

với 3-PGA (đối chiếu với nghiên cứu của Tichafa và cộng sự, 2001) [19].

Trình tự gen AGPS đã phân lập có 5 base khác với trình tự tham chiếu, trong đó

có 4 vị trí làm thay đổi amino acid. Trình tự gen AGPL có 4 base khác với trình tự

tham chiếu và có 2 amino acid bị thay đổi (Bảng 3.1). Nghiên cứu của Tichafa và cộng

sự, 2001[19] đã chỉ ra một số vùng quan trọng trên chuỗi polypeptide AGPS và

AGPL. Bao gồm 4 hộp liên quan đến trung tâm hoạt động, điều chỉnh của enzyme,

trình tự amino acid của AGPS và AGPL trên các hộp này gần giống nhau (Hình 3.4).

Đối chiếu với nghiên cứu trên cho thấy, các sai khác trong AGPS và AGPL mới phân

lập đều không ảnh hƣởng đến 4 hộp này. Tuy nhiên, các sai khác trên có thể làm thay

đổi ít/nhiều đến hoạt tính của enzyme đƣợc tạo ra.

3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN

Để biểu hiện enzyme AGPase ở sắn cần phải thiết kế vector biểu hiện đồng thời

hai gen mã hóa AGPS và AGPL. Các nghiên cứu trƣớc đây, khi biểu hiện đồng thời hai

gen mã hóa AGPS và AGPL thƣờng sử dụng hai khung đọc mở (Hình 3.5. D). Hạn chế

của việc này là làm tăng kích thƣớc vùng T-DNA (hai lần promoter và terminator),

hơn nữa, mức độ tổng hợp của protein của cả hai gen có thể không đều nhau. Vấn đề

này cũng tƣơng tự với việc sử dụng hệ thống vector IRES (Hình 3.5. C) khi nhiều báo

cáo cho thấy protein phía sau IRES đƣợc tổng hợp ít hơn. AGPase của thực vật là một

enzyme phức tạp trong cấu trúc không gian, các đầu C và N của AGPS và AGPL đƣợc

sắp xếp theo các hƣớng khác nhau. Do đó, không thể nối trực tiếp AGPS và AGPL

(Hình 3.5. A). Nhƣ vậy, hệ thống đồng biểu hiện gen sử dụng P2A là phƣơng pháp

thích hợp nhất. Protein đứng trƣớc và sau P2A đƣợc dịch mã bằng cùng một ribosome,

do đó, tỉ lệ hai protein này bằng nhau.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chuyển gen mã hóa đồng thời hai tiểu phần

AGPS và AGPL (phân lập từ cây sắn) trên cùng một khung đọc mở, dƣới sự điều

khiển của promoter 35S vào cây thuốc lá nhằm nghiên cứu tăng cƣờng tích lũy tinh bột

trong cây chuyển gen. Ở AGPL còn bổ sung thêm đuôi C-myc để thuận tiện cho phân

tích biểu hiện gen bằng Western blot.

Hình 3.5. Một số phương án biểu hiện hai gen trên cùng một vector

Ghi chú: Cấu trúc A. Hai gen được nối trực tiếp với nhau và biểu hiện trên cùng một khung

đọc mở; khi đó protein cũng được gắn liền với nhau. Cấu trúc B. Hai gen được nối với nhau

thông qua cầu nối P2A; hai chuỗi polypeptide được tách rời nhau trong quá trình dịch mã ở

vị trí P2A. Cấu trúc C. Hai gen được nối với nhau bằng trình tự IRES. Cấu trúc D. Hai gen

được biểu hiện trên hai khung đọc mở khác nhau. Cấu trúc C và D cho hai chuỗi polypeptide

nhưng tỉ lệ mỗi loại không đều nhau.

3.2.1. Tổng hợp đoạn XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI

Các cặp mồi XbaI-AGPS-F / AGPS-XmaI-R đƣợc thiết kế để nhân bản vùng

CDS của AGPS (bao gồm mã mở đầu, loại bỏ mã kết thúc, XbaI-AGPS-SmaI). Sản

phầm PCR (1572 bp) đƣợc tạo ra có chứa điểm cắt của XbaI và XmaI. Tƣơng tự với

CDS của AGPL cũng đƣợc loại bỏ bộ ba kết thúc và thêm vào một phần trình tự của

P2a và C-myc để thuận lợi cho các bƣớc nhân bản tiếp theo bằng cặp mồi P2A-AGPL-

F/ AGPL-CMYC-R. Sản phẩm PCR của AGPL dài 1620 bp. Kết quả điện di sản phẩm

PCR của mỗi gen thu đƣợc một băng đúng nhƣ kích thƣớc tính toán (Hình 3.6 A).

Tiếp đó, sản phẩm PCR của AGPL ở trên đƣợc sử dụng để làm khuôn cho phản

ứng PCR tổng hợp SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI. Phản ứng PCR sử dụng 3 mồi XmaI-

P2A-F, P2A-R, và Cmyc-sacI-R2. Trong đó, XmaI-P2A-F (chứa điểm cắt XmaI) và

P2A-R có thể tự bắt cặp với nhau để tạo phân đoạn P2a. Phân đoạn này có điểm tƣơng

đồng với CDS của AGPL, vì vậy, 2 phân đoạn này có thể nối với nhau trong các chu

trình nhiệt. Mồi Cmyc-sacI-R2 chứa điểm cắt SacI và có đoạn tƣơng đồng với AGPL-

Cmyc. Nhƣ vậy, sản phẩm PCR với 3 mồi trên là phân đoạn SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-

SacI chứa vị trí cắt của 2 enzyme cắt SmaI và SacI ở hai đầu, P2a, AGPL và C-myc.

Kích thƣớc của sản phẩm PCR là 1683 bp. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra, kết

quả xuất hiện 1 băng tƣơng ứng với kích thƣớc tính toán, băng thứ 2 mờ hơn và có

kích thƣớc nhỏ hơn (Hình 3.6 B). Băng 1683 bp đƣợc thu hồi bằng phƣơng pháp thôi

gel agarose.

Sản phẩm thôi gel đoạn SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI và AGPL (CDS) cũng

đƣợc kiểm tra băng phƣơng pháp điện di trên gel đặc (agarose 2%). Trên bản gel cho

thấy, băng SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI cao hơn so với AGPL (CDS) (Hình 3.6 C).

Mức chênh lệch này phù hợp với kích thƣớc tính toán 64 bp. Nhƣ vậy, SmaI-P2a-

AGPL-Cmyc-SacI đã đƣợc tổng hợp thành công bằng phƣơng pháp PCR.

A B C

Hình 3.6. Kết quả tổng hợp đoạn XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI

Ghi chú: (A) Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn XbaI-AGPS-SmaI (AS, 1572 bp) và vùng

CDS của AGPL (AL, 1620 bp). (B) Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn SmaI-P2a-AGPL-

Cmyc-SacI. (C) Ảnh điện di phân đoạn SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI (AL+P2a, làn 1 và 2

cùng một mẫu) và AGPL-CDS (thấp hơn 64 bp, ảnh điện di trên gel agarose 2%).

3.2.2. Nối XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI với pBI121

Để nối các phân đoạn này với nhau, trƣớc tiên phải xử lý tạo đầu dính hoặc đầu

bằng với enzyme cắt giới hạn. Đoạn XbaI-AGPS-SmaI đƣợc cắt với XbaI và SmaI,

SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI cắt với SmaI và SacI. Các sản phẩm cắt từ sản phẩm PCR

đƣợc tinh sạch ngay bằng kit thôi gel và kiểm tra bằng máy đo Nanodrop. Sản phẩm

thôi gel đƣợc pha loãng về nồng độ 10 ng/µl để thuận lợi cho phản ứng nối.

Vector pBI121 có chứa cấu trúc biểu hiện 35S-GUS-NOS (Hình 3.7 B). Gene

GUS đƣợc loại bỏ bằng phản ứng cắt với XbaI và Sac. Kết quả phân tích điện di sản

phẩm cắt pBI121 thu đƣợc hai băng với kích thƣớc 12,8 Kb (tƣơng ứng với khung

vector) và 1,9 kb (tƣơng ứng với GUS) (Hình 3.7 A). Nhƣ vậy, pBI121 đã đƣợc cắt

hoàn toàn. Phân đoạn 12,8 Kb đƣợc thu hồi bằng kit thôi gel.

A B

Hình 3.7. Ảnh điện di sản phẩm cắt vector pBI121 với XbaI và SacI (A) và sơ đồ vector pBI121 (B)

Tiếp đó, 3 phân đoạn trên đƣợc nối với nhau bằng T4 ligase và biến nạp vào E.

coli DH5α. Chọn lọc khuẩn lạc bằng phản ứng cloni-PCR với nhiều cặp mồi khác

nhau để kiểm tra sự có mặt của hai phân đoạn AGPS và AGPL trong pBI.

Đầu tiên, cặp mồi XmaI P2A-F /Cmyc-sacI-R2 (nhân đoạn SmaI-P2a-AGPL-

Cmyc-SacI) đƣợc sử dụng để kiểm tra các khuẩn lạc sau cấy trải vì kích thƣớc sản

phẩm PCR phù hợp, nhiệt độ gắn mồi, độ dài mồi đảm bảo cho phản ứng PCR đặc

hiệu. Kết quả Cloni-PCR thu đƣợc 3 mẫu khuẩn lạc (2, 5, 17) dƣơng tính trên tổng 20

mẫu đƣợc kiểm tra (Hình 3.8 A). Nhƣ vậy, tỉ lệ này tƣơng đối thấp và hoàn toàn phù

hợp với hiệu suất nối đồng thời 3 phân đoạn bằng T4 ligase.

(A)

(B)

Hình 3.8. Kết quả PCR kiểm tra khuẩn lạc biếp nạp pBI-35S-AGPSL

Ghi chú: (A) Ảnh điện di sản phẩm cloni-PCR khuẩn lạc biến nạp vector pBI-35S-AGPSL với

mồi XmaI P2A-F /Cmyc-sacI-R2, các khuẩn lạc 2, 5, 17 dương tính. (B) Sơ đồ gen AGPase-

P2a-Cmyc và vị trí mồi PCR. (C) Ảnh điện di sản phẩm cloni-PCR khuẩn lạc biến nạp vector

pBI-35S-AGPSL với mồi XbaI-AGPS-F/P2A-R và XbaI-AGPS-F và Cmyc-SacI-R2.

Các khuẩn lạc số 2, 5, 17 đƣợc cấy vạch và kiểm tra lại bằng phản ứng cloni-

PCR với 2 cặp mồi XbaI-AGPS-F/P2A-R (để kiểm tra AGPS, 1622 bp) và XbaI-

AGPS-F/Cmyc-SacI-R2 (3249 bp). Kết quả cloni-PCR với 2 cặp mồi này đều dƣơng

tính ở cả 3 khuẩn lạc (Hình 3.8.C). Trên bản gel điện di xuất hiện 1 băng tƣơng tứng

với tính toán lý thuyết ở tất các các làn chạy.

(A) (B)

Hình 3.9. Kết quả kiểm tra vector và A. tumefaciens mang vector pBI-35S-AGPSL

Ghi chú: (A) Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid pBI-35S-AGPSL với XbaI và SacI, plasmid

số 2 và 17 dương tính. (B) sơ đồ vector pBI-35S-AGPSL. (C) Ảnh điện di sản phẩm cloni-

PCR kiểm tra khuẩn lạc A. tumefaciens biến nạp pBI-35S-AGPSL với mồi XbaI-AGPS-F/

P2A-R .

Nhƣ vậy, các khuẩn lạc 2, 5 và 17 đƣợc nuôi lỏng và tách plasmid. Plasmid

pBI-35S-AGPSL đƣợc kiểm tra bằng phản ứng cắt với hai enzyme SacI và XbaI. Sản

phẩm cắt pBI-35S-AGPSL sẽ cho 2 phân đoạn: phân đoạn 12,85 kb tƣơng ứng với

kích thƣớc khung vector pBI và 3,24 kb tƣơng tứng với phân đoạn AGPS-P2a-AGPL-

Cmyc. Phân tích bản gel điện di sản phẩm cắt cho thấy mẫu plasmid số 2 và 17 dƣơng

tính. Mẫu số 5 cho 2 băng, trong đó 1 băng thấp hơn kích thƣớc của khung vector pBI,

nhƣ vậy, có thể vector đã bị đứt gãy trƣớc khi nối với AGPS-P2a-AGPL-Cmyc.

3.2.3. Biến nạp vector pBI-35S-AGPSL vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens

Plasmid pBI-35S-AGPSL (2) đƣợc biến nạp vào A. tumefaciens C58/pGV2260

bằng phƣơng pháp xung điện. Khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy 2 ngày đƣợc cấy vạch sang

đĩa thạch mới và đƣợc kiểm tra cloni-PCR với mồi XbaI-AGPS-F/ P2A-R. Kết quả

cloni-PCR cho thấy tất cả các khuẩn lạc đều dƣơng tính với một băng có kích thƣớc

bằng với đối chứng dƣơng (Hình 3.9 C). Nhƣ vậy, pBI-35S-AGPSL đã đƣợc biến nạp

thành công vào A. tumefaciens C58/pGV2260.

3.3. KẾT QUẢ CHUYỂN GEN AGPSL VÀO CÂY THUỐC LÁ

3.3.1. Tạo cây thuốc lá chuyển gen AGPSL

Trong chuyển gen thực vật, cây thuốc lá đƣợc xem xét nhƣ là loại cây mô hình

phục vụ cho các nghiên cứu đánh giá chức năng gen bởi vì hệ thống tái sinh và tiếp

nhận gen ngoại lai của cây thuốc lá rất hiệu quả, thời gian phân hóa từ mô đến tạo cây

hoàn chỉnh khá ngắn, mặt khác cây thuốc lá là cây ngắn ngày, dễ trồng và chăm sóc.

Đặc biệt, tinh bột ở lá khi quang hợp đƣợc dữ trữ song song với việc tổng hợp sucrose

(để chuyển xuống cơ quan không quang hợp). Trong cùng điều kiện sống, giống và độ

tuổi của lá và cây thì tỉ lệ tinh bột là gần giống nhau. Bởi vậy, trong nghiên cứu này

chúng tôi chọn cây thuốc lá làm cây mô hình để đánh giá cấu trúc vector chuyển gen

tăng cƣờng sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột đã thiết kế đƣợc.

(A) (B) (C)

(D)

(E) (F)

Hình 3.10. Một số hình ảnh chuyển gen AGPSL vào cây thuốc lá

Ghi chú: (A) Mảnh lá trên môi trường đồng nuôi cấy. (B) Mảnh lá sau biến nạp 3 tuần. (C)

Mẫu biến nạp 5 tuần trên môi trường đa chồi. (D) Cây chuyển gen trên môi trường ra rễ. (E)

cây chuyển gen trồng trong buồng sinh trưởng 15 ngày. (F) cây chuyển gen trong buồng

sinh trưởng 1 tháng 20 ngày.

Phân tích bƣớc đầu cho thấy, chúng tôi đã chuyển thành công cấu trúc 35S-

AGPSL vào cây thuốc lá (Hình 3.10). Kết quả thống kê sau 2 lần làm thí nghiệm

chuyển cấu trúc gen 35S-AGPSL, vào 100 mảnh lá thuốc lá đã thu đƣợc 64 cây chuyển

gen AGPSL. Ngƣợc lại, mảnh lá thuốc lá không đƣợc chuyển gen cấy chuyển lên môi

trƣờng chọn lọc có 50 mg/l kanamycin (làm đối chứng), 100% mẫu bị chết không tái

sinh chồi (Hình 3.10 C). Điều này cho thấy các dòng thuốc lá tái sinh và ra rễ trên môi

trƣờng chọn lọc có thể là các dòng đã đƣợc chuyển gen. Chọn 20 cây thuốc lá chuyển

gen và 5 cây không chuyển gen có kích thƣớc tƣơng đƣơng nhau, hệ rễ khỏe mạnh để

ƣơm trong bầu đất.

3.3.2. Kiểm tra cây chuyển gen bằng phản ứng PCR

PCR là kỹ thuật phổ biến và đơn giản nhất để bƣớc đầu sàng lọc các dòng cây

chuyển gen. Kết quả của phản ứng cho phép kiểm tra sự tồn tại hay không của gen

chuyển trong cây kiểm tra. Để giảm thiểu hiện tƣợng dƣơng tính giả, các cây chuyển

gen sau khi trồng trong chậu đất 15 ngày đƣợc kiểm tra sự có mặt của gen chuyển

bằng phƣơng pháp PCR. Để thực hiện phản ứng PCR, đầu tiên DNA tổng số từ các

mẫu lá thuốc lá chuyển gen và cây đối chứng. Kết quả điện di DNA tổng số của các

dòng thuốc lá chuyển gen trên gel agarose 0,8% cho thấy DNA có chất lƣợng và hàm

lƣợng tốt, đảm bảo cho thí nghiệm PCR tiếp theo (Hình 3.11 A)

Tiếp đó, mẫu DNA tổng số đƣợc kiểm tra PCR với mồi ITS2/ITS4 , VirC F/R,

NPTII F3/R730 và XbaI-AGPS-F / P2A-R.

Cặp mồi ITS2/ITS4 nhằm kiểm tra chất lƣợng DNA tổng số. Cặp mồi

ITS2/ITS4 đƣợc thiết kế để nhân một phần đoạn gen mã hóa ribosome (nằm trong

nhân tế bào) của thực vật. Mẫu DNA tổng số có chất lƣợng đảm bảo cho PCR nếu xuất

hiện một băng ~400 bp trên bản gel điện di. Kết quả phân tích gel cho thấy mẫu số 3

âm tính với ITS2/ITS4 dẫn đến âm tính với các mồi khác, mặc dù kết quả điện di DNA

tổng số vẫn đảm bảo. Nhƣ vậy, mẫu DNA tổng số này không đảm bảo tinh sạch hoặc

có thể chứa các hợp chất ức chế phản ứng PCR. Mẫu số 3 đƣợc tách DNA tổng số lại

và kiểm tra cho kết quả dƣơng tính.

Hai cặp mồi NPTII F3/R730 và XbaI-AGPS-F / P2A-R đƣợc sử dụng để kiểm

tra sự có mặt của gene kháng kanamycine (NPTII) và/hoặc AGPSL trong cây chuyển

gen. Kiểm tra PCR các cây chuyển gen bằng 2 cặp mồi này đều thu đƣợc kết quả

dƣơng tính (mẫu số 3 đã đƣợc kiểm tra lại và cho kết quả dƣơng tính) (Hình 3.11 B).

Cặp mồi VirC F/R đƣợc thiết kế để nhân đoạn gen VirC nằm trên Ti plasmid

của A. tumefaciens. Phản ứng dƣơng tính với VirC F/R chứng tỏ cây chuyển gen có

chứa A. tumefaciens ký sinh. Trong nghiên cứu này, phản ứng PCR kiểm tra cây

chuyển gen với cặp mồi VirC F/R (30 chu kỳ) cho kết quả âm tính ở tất cả các cây

chuyển gen (Hình 3.11 B). Phân tích này cho thấy, kết quả PCR với các cặp mồi

NPTII F3/R730 và XbaI-AGPS-F / P2A-R đảm bảo độ tin cậy.

(A)

(B)

Hình 3.11. Kết quả phân tích PCR cây thuốc lá chuyển gen AGPSL.

Ghi chú: (A) ảnh điện di DNA tổng số tách từ lá thuốc lá chuyển gen, (B) Ảnh điện di sản

phẩm PCR với các mồi . (-) đối chứng âm. (P) plasmid pBI-35s-AGPSL. (+) vi khuẩn A.

tumefaciens, WT: cây không chuyển gen

3.3.3. Phân tích biểu hiện gen AGPSL bằng Western blot

Phân tích Western blot cho phép phát hiện và đánh giá khả năng biểu hiện

protein tái tổ hợp trong cây chuyển gen. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng

phƣơng pháp Western blot để phân tích cây chuyển gen AGPSL ngoài mục đích trên

còn nhằm kiểm tra khả năng hoạt động của P2a trong vector chuyển gen.

Protein tổng số của ba dòng chuyển gen 5, 8 và 9 và cây WT đƣợc tách chiết

protein tổng số. Protein sau tách chiết đƣợc định lƣợng và pha loãng về cùng nồng độ

(2,5 µg/µl) và điện di kiểm tra SDS-PAGE. Kết quả phân tích bản gel SDS-PAGE cho

thấy protein tổng số ở lá thuốc lá đã đƣợc tách chiết thành công, nồng độ protein ở mỗi

làn chạy là gần tƣơng đƣơng nhau, đảm bảo cho phân tích Western blot (Hình 3.12.A).

Do trong trình tự của gen AGPSL chúng tôi đã thiết kế sẵn trình tự mã hóa cho

đuôi c-myc ở cuối gen nên để khẳng định một cách chắc chắn gen chuyển đã hoạt

động và biểu hiện thành protein trong các dòng thuốc lá chuyển gen chúng tôi đã tiến

hành kiểm tra bằng kỹ thuật lai miễn dịch Western blot sử dụng kháng thể anti-cmyc.

Gen AGPSL có chiều dài là 3249 bp trong đó có AGPS và AGPL đƣợc ghép nối

với nhau bởi trình tự P2a, nên theo tính toán lý thuyết, protein AGPSL tái tổ hợp sau

khi đƣợc tổng hợp có tổng độ dài 1080 amino acid và sẽ có tổng khối lƣợng phân tử

khoảng 118 kDa. Mặt khác, do sự hoạt động của P2A, chuỗi polypeptide AGPS/L

đƣợc tổng hợp ngắt quãng thành hai phân đoạn là AGPS-P2A và AGPL-Cmyc (~58,5

kDa) (Hình 3.12.C). Nhƣ vậy, kết quả phân tích Western blot (Hình 3.12.A, B) các cây

chuyển gen AGPSL cho thấy, cả 3 dòng 5, 8, 9 đều biểu hiện dƣơng tính. Trên bản lai

xuất hiện băng ~58,5 kDa tƣơng ứng với phân đoạn AGPL-Cmyc. Tuy nhiên, sự xuất

hiện băng 118,5 kDa ở hai mẫu 5 và 9 chứng tỏ P2a hoạt động không hoàn toàn ở một

số lần dịch mã. Mặc dù vậy, lƣợng AGPSL nhỏ hơn trình tự đƣợc phân cắt rất nhiều

(tính theo mức đậm nhạt của băng) nên có thể kết luận hệ thống biểu hiện gen hoạt

động hiệu quả. Kết quả này phù hợp với những công bố trƣớc đây về khả năng hoạt

động của P2a trên cây thuốc lá và Arabidopsis [5] [25].

Qua độ đậm nhạt của băng protein trên màng lai Western blot có thể thấy có sự

khác nhau về mức độ biểu hiện của gen chuyển ở các dòng thuốc lá khác nhau. Cụ thể,

ở dòng A9 mức độ biểu hiện của các gen chuyển thấp hơn các dòng còn lại. Điều này

có thể đƣợc giải thích do cấu trúc gen đƣợc chuyển đã chèn vào các vùng khác nhau

của hệ genome mà ở các vị trí đó sự hoạt động của các gen là khác nhau. Kết quả này

cho phép khẳng định các protein tái tổ hợp AGPS và AGPL đã đƣợc tổng hợp trong

các dòng thuốc lá chuyển gen.

(A) (B)

(C)

Hình 3.12 Kết quả lai western blot kiểm tra sự biểu hiện của gen AGPSL.

Ghi chú: Hình (A) Ảnh điện di kiểm tra protein sau khi tách (20 µg protein tổng số ở mỗi

mẫu). Hình (B): Màng lai western blot sau khi hiện màu; 5, 8, 9: các mẫu chuyển gen (100 µg

protein tổng số ở mỗi mẫu), M: Marker protein. Hình (C): sơ đồ phân cắt chuỗi polypeptide

AGPS-P2a và AGPL-Cmyc

3.4. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG TINH BỘT TÍCH LŨY Ở LÁ

3.4.1. Kiểm tra tinh bột bằng Iodine

Trong điều kiện in vitro, cây non đƣợc cung cấp đầy đủ dinh dƣỡng và ánh

sáng. Do vậy, đánh giá sự tích lũy tinh bột ở lá in vitro là không phù hợp, vì trong môi

trƣờng nuôi cấy in vitro có bổ sung đƣờng, nên kết quả thu đƣợc sẽ không chính xác.

Để kết quả đƣợc chính xác nhất chúng tôi tiến hành trồng tất cả các mẫu trong tủ nuôi

cấy để đảm bảo thống nhất các điều kiện nhƣ thời gian chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm…,

sau đó tiến hành thu lá ở cùng độ tuổi các dòng chuyển gen và WT ở cùng độ tuổi,

trong cùng thời gian. Điều này có thể thực hiện bằng việc nuôi trong cùng một loại giá

thể, trong buồng sinh trƣởng. Các thông số về nhiệt độ (20ºC ban đêm - 25ºC ban

ngày), độ ẩm (70%), ánh sáng (7500 lux), quang chu kỳ (14 / 24h chiếu sáng) đƣợc

điều khiển để tối ƣu nhất cho sự phát triển của cây thuốc lá.

Hình 3.13 Các bước kiểm tra hàm lượng tinh bột lá bằng iodine [49].

Ghi chú: (1) Đun sôi lá trong khoảng 1 phút. (2) Chiết sạch diệp lục trong lá bằng cách nhúng

lá trong cồn, đun 80ºC. (3) Rửa lá dưới vòi nước để loại bỏ cồn dư. (4) Tiến hành nhuộm lá

với dung dịch nhuộm iodine.

Để đánh giá, so sánh sơ bộ hàm lƣợng tinh bột trong lá của các dòng thuốc lá

chuyển gen và dòng đối chứng WT, chúng tôi tiến hành nhuộm iodine với các cây

đƣợc trồng sau 15 ngày trong buồng sinh trƣởng (Hình 3.13). Trong buồng sinh

trƣởng, lá thuốc lá có cƣờng độ quang hợp rất mạnh, lá sau chiếu sáng trong những giờ

đầu là thích hợp nhất cho việc kiểm tra tốc độ tổng hợp tinh bột bằng iodine. Lá đƣợc

chiếu sáng ở thời gian dài hơn cho hàm lƣợng tinh bột rất lớn. Do đó, độ đậm của lá

sau khi nhuộm iodine rất khó để phân biệt bằng cách so màu thông thƣờng, mặc dù có

sự khác nhau về hàm lƣợng tinh bột. Qua khảo sát vào các thời gian chiếu sáng khác

nhau, chúng tôi nhận thấy lá sau chiếu sáng 1 – 2 h là dễ dàng phát hiện sự khác biệt

trong tích lũy tinh bột bằng phƣơng pháp nhuộm iodine.

Kết quả nhuộm iodine 14 dòng cây chuyển gen và cây WT và cho thấy phần

lớn các dòng thuốc lá chuyển gen có hàm lƣợng tinh bột tích lũy trong lá cao hơn hoặc

bằng so với cây đối chứng. Các dòng số 1, 3, 4, 5, 13, 14 cho kết quả nhuộm iodine

đậm nhất, cao hơn hẳn so với cây WT. Các dòng 2, 7, 8, 9, 10 có mức bắt màu tƣơng

tự cây WT. Nhƣ vậy, tính trung bình, cây chuyển gen có khả năng bắt màu iodine cao

hơn cây WT (Hình 3.14).

Hình 3.14. Ảnh nhuộm iodine lá thuốc lá chuyển gen

3.4.2. Định lượng tinh bột bằng Anthrone

Phƣơng pháp nhuộm iodine chỉ cho phép đánh giá định tính sự xuất hiện tinh

bột của lá cây. Tuy nhiên, phƣơng pháp này không thể sử dụng để tính toán định lƣợng

hàm lƣợng tinh bột của từng lá. Do vậy, để có số liệu chính xác hơn, chúng tôi tiến

hành định lƣợng tinh bột trong lá bằng phƣơng pháp Anthrone. Anthrone hòa tan trong

acid sulfuric có thể đƣợc dùng trong xác định nhiều loại cacbonhydrat khác nhau. Tuy

nhiên, phƣơng pháp này chỉ có thể định lƣợng các loại đƣờng đơn do tạo phản ứng

màu đặc trƣng với từng loại đƣờng riêng biệt. Thông thƣờng, anthrone đƣợc sử dụng

cho việc định lƣợng hàm lƣợng tinh bột hay hàm lƣợng đƣờng hòa tan có trong mẫu

thực vật. Do trƣớc phản ứng, đƣờng tan đã bị loại bỏ qua bƣớc chiết cồn 80º nên lƣợng

glucose phản ứng với anthone đƣợc thủy phân từ tinh bột. Dung dịch Anthrone trong

acid sulfuric thƣờng không bền và cần phải pha mới cho mỗi lần sử dụng. Do đó, cần

thiết phải xây dựng đƣờng chuẩn cho mỗi lần phân tích định lƣợng.

Hình 3.15 Sơ đồ phản ứng Anthrone với Glucose

Ghi chú: Trong môi trường acid H2SO4 đặc, phân tử glucose bị mất nước tạo thành dạng

vòng furfural 5C (HMF). Anthrone cũng được chuyển hóa thành Anthranol bằng phản ứng

thuận nghịch. HMF phản ứng với anthranol thông qua nhóm –CHO tạo thành furfuryl dien

anthrone. Sản phẩm phản ứng có màu xanh và có độ hấp thụ cực đại ở vùng 620 - 630 nm.

3.4.2.1. So sánh tốc độ tích lũy tinh bột của các cây chuyển gen với cây WT

a. Xây dựng đường chuẩn định lượng Anthrone

Đƣờng chuẩn định lƣợng Anthrone đƣợc xây dựng từ tinh bột ngô nguyên chất.

Để thu đƣợc kết quả chính xác nhất, cân 40 mg tinh bột ngô, thêm 40 ml nƣớc. Ủ ở

80ºC để hồ hóa tinh bột, trộn đều và hút lấy 2 ml (2 mg tinh bột) và thực hiện nhƣ các

bƣớc đã mô tả ở phần 2.2.7.2. Dịch thủy phân tinh bột đƣợc pha loãng với các nồng độ

khác nhau, thực hiện phản ứng Anthrone và đo OD và xây dựng đƣờng chuẩn định

lƣợng. Kết quả hồi quy đƣợc kiểm tra bằng hàm Data analysis > Regression trong MS

Exel với mức ý nghĩa α = 0,05 hoặc 0,075. Phƣơng trình hồi quy có ý nghĩa nếu P-

value < α. Kết quả cho thấy, các đƣờng chuẩn đã dựng Hình 3.16 và Hình 3.17 đảm

bảo cho các bƣớc tính toán tiếp theo.

STT OD trung bình Tinh bột (mg)

0,125 0,25 0,5 1 1,5 2 1 2 3 4 5 6 0,104 0,215 0,476 0,8705 1,25 1,5885

Hình 3.16. Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng Anthrone (I) (α = 0.05)

b. Đánh giá tốc độ tích lũy tinh bột ở các cây chuyển gen

Tinh bột đƣợc tổng hợp song song với quá trình quang hợp ở lá. Ở thuốc lá và

hầu hết cây trồng khác trong điều kiện chiếu sáng ổn định, nồng tinh bột đƣợc tích lũy

tăng dần từ lúc bắt đầu quang hợp đến hết thời gian chiếu sáng. Tuy nhiên, điều kiện

buồng sinh trƣởng không có cơ cấu điều tiết lƣợng CO2. Bởi vậy, kiểm tra tốc độ tích

lũy tinh bột vào những giờ đầu chiếu sáng có thể cho kết quả tin cậy nhất. Hơn nữa

kết quả kiểm tra nhuộm iodine cho thấy lá sau chiếu sáng 2 h đã xuất hiện lƣợng tinh

bột vừa đủ để phân tích. Ngoài ra, các lá trƣởng thành có tốc độ tích lũy tinh bột ổn

định nhất. Bởi vậy, trong nghiên cứu này, cây thuốc lá sau nuôi 30 ngày trong buồng

sinh trƣởng đƣợc thu lá (thu sau 2h chiếu sáng) và kiểm tra tốc độ tích lũy tinh bột.

Kết quả định lƣợng tinh bột ở các cây không chuyển gen cho kết quả trung bình

0,807 mg tinh bột /10 mg lá, với phƣơng sai thấp 0,018 (mg) cho thấy các cây thuốc lá

đƣợc trồng ở điều kiện đảm bảo nhƣ nhau và có mức sinh trƣởng giống nhau. Hàm

lƣợng tinh bột trong lá của các dòng thuốc lá chuyển gen lớn hơn trung bình 1,735 lần

so với lƣợng tinh bột trong lá cây đối chứng không chuyển gen (Bảng 3.2) (Phụ lục 3).

Kết quả này chứng tỏ cây chuyển gen tổng hợp nhiều AGPase hơn cây WT.

Tuy nhiên, mức độ tích lũy tinh bột ở các cây chuyển gen khác nhau. Tinh bột

trung bình ở cây chuyển gen là 1,4 mg/10 mg lá với phƣơng sai lớn (0,26 mg) và tăng

từ 1 – 3,2 lần so với cây đối chứng (Bảng 3.2). Ở cây chuyển gen, AGPS và AGPL

đƣợc điều khiển bởi promoter 35S, là một trong những promoter biểu hiện mạnh ở

thuốc lá. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của gen còn phụ thuộc nhiều vào vị trí của gen

chuyển trong genome cây, các cơ chế di truyền biểu sinh và hiện tƣợng câm gen…

[28]. Nhƣ vậy, trong trƣờng hợp này có thể giải thích vị trí gen chuyển đƣợc tích hợp

trong genome cây chủ khác nhau dẫn đến sự sai khác trong hoạt động của gen chuyển,

ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột.

Bảng 3.2. Kết quả định lượng tinh bột ở lá sau 2h chiếu sáng

Mẫu

Trung bình (6)

OD Trung bình (1) Tinh bột (mg) (2) KL lá (mg) (3) H. lượng TB (mg/10mg lá) (4) Tỷ lệ Ch.G/WT (5)

WT1 0,303 0,659 10 0,659

WT2 0,429 0,931 12 0,776

WT3 0,242 0,532 5,5 0,968 0,807

WT4 0,325 0,706 9,9 0,713

WT5 0,3 0,653 7,1 0,920

1 1,125 2,652 10 2,652 3,285

2 0,5205 1,136 8,3 1,369 1,696 1,401 3 0,4325 0,939 12 0,782 0,969

6 0,645 1,426 15,3 0,932 1,154

0,581 7 1,275 9,5 1,343 1,663

0,409 8 0,887 9 0,986 1,221

1,0325 9 2,402 14,4 1,668 2,066

0,321 10 0,697 4,5 1,550 1,920

0,9815 11 2,267 15,6 1,453 1,800

0,9625 13 2,217 13,8 1,607 1,990

(1) Giá trị OD được lấy trung bình giữa hai lần đo

(2) Hàm lượng tinh bột tính từ (1): TinhBot = 2*(0,1914*(1)*(1) + 0,9387*(1) + 0,0277) (tinh

bột trong mẫu được pha loãng 2 lần)

(3) Khối lượng lá khô được phân tích.

(4) Hàm lượng tinh bột trong 10 mg lá = 10* (2) / (3)

(5) Tỉ lệ tinh bột tích lũy giữa cây chuyển gen và cây WT = (4) / 0,8

(6) Giá trị trung bình được lấy từ cột (4) (làm tròn)

Kiểm tra t-Test với mức ý nghĩa α = 0,05 cho thấy |t|>t(α/2) => trung bình hai mẫu khác nhau

(|-3,60508| > 2,160369) (Phụ lục 3)

Tỷ lệ tinh bột cây chuyển gen / cây WT 1,735

Một số nghiên cứu tăng cƣờng biểu hiện gen các gen tham gia quá trình sinh

tổng hợp tinh bột cũng đã thu nhận đƣợc các kết quả khả quan trong cải thiện hàm

lƣợng tinh bột tích lũy ở thực vật. Gamez et al., 2011 thu nhận cây thuốc lá có khả

năng sinh trƣởng, phát triển tốt hơn cũng nhƣ hàm lƣợng tinh bột tích lũy trong lá cao

hơn 30-40% so với cây dối chứng khi tăng cƣờng biểu hiện gen SSIV [14]. Bên cạnh

đó, việc biểu hiện gen SSIV cho phép tăng cƣờng đến 50% hàm lƣợng tinh bột trong lá

vào thời điểm cuối ngày so với cây đối chứng [14]. Carciofi (2012) thu nhận dòng mô

sẹo lúa mạch có hàm lƣợng tinh bột cao hơn 4% so với đối chứng khi tiến hành chuyển

gen GBSS [6]. Tuy các nghiên cứu trên đƣợc tiến hành trong những điều kiện khác

nhau nhƣng đều chứng minh khả năng tăng cƣờng tinh bột khi tăng cƣờng biểu hiện

những gen liên quan đến con đƣờng tổng hợp tinh bột.

Trong nghiên cứu này việc đồng biểu hiện tiểu phần lớn AGPL và tiểu phần

nhỏ AGPS của enzyme AGPase trên cùng khung đọc mở đã tăng cƣờng khả năng tích

lũy tinh bột ở lá các dòng thuốc lá chuyển gen 73,5% so với dòng không chuyển gen.

So sánh với kết quả của Lê Thu Ngọc và cộng sự (chƣa công bố) khi chuyển gen nhân

tạo đã tối ƣu mã thực vật AGPopt có nguồn gốc từ gen glgC mã hóa cho enzyme

AGPase của vi khuẩn E. coli đã làm tăng hàm lƣợng tinh bột tích lũy trong lá từ 18%-

56%. Những bằng chứng này bƣớc đầu cho thấy việc biểu hiện gen mã hóa AGPase là

một chiến lƣợc có tiềm năng tăng cƣờng quá trình sinh tổng hợp tinh bột ở thực vật.

3.4.2.2. Đánh giá khả năng tích lũy tinh bột tối đa ở lá

Để đảm bảo đánh giá chính xác hàm lƣợng tinh bột tích lũy tối đa, lá thuốc lá

đƣợc định lƣợng tinh bột sau 14h chiếu sáng. Kết quả định lƣợng đƣợc tính theo

đƣờng chuẩn Hình 3.17. Lƣợng tinh bột trong cây chuyển gen (dòng 7, 9, 11, 13) trung

bình 2,73 mg/10g lá và cây không chuyển gen (WT1, WT2, WT3) trung bình 2,56

mg/10g lá. Tuy nhiên, sự khác nhau lƣợng tinh bột trong lá chuyển gen và cây không

chuyển gen không có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.3) (Phụ lục 4). Nhƣ vậy, khả năng tích

lũy tinh bột tối đa ở lá cây chuyển gen và cây đối chứng không khác nhau. Mặc dù kết

quả đo sau 2h chiếu sáng ở các dòng này có sự sai khác rõ rệt (Hình 3.18).

STT Tinh bột (mg) OD

1 2 3 4 5 1,95 0,975 0,4875 0,24375 0,060938 1,403 0,622 0,39 0,254 0,048

Hình 3.17. Đường chuẩn định lượng Anthrone (II) (α = 0,075)

Bảng 3.3 Kết quả định lượng tinh bột ở lá sau 14h chiếu sáng

Mẫu

Trung bình (5)

Tinh bột (mg) (2) Lá (mg) (3) Hàm lượng (mg/10mg lá) (4) OD Trung bình (1)

7 0,814 2,265 8,7 2,603

2,73 9 0,959 2,681 9,3 2,883

11 1,181 3,319 12,1 2,743

13 0,996 2,788 10,3 2,706

wt1 0,744 2,063 9,1 2,56 2,267

wt2 0,864 2,408 9,3 2,589

2,810 1,004 2,810

(2) Hàm lượng tinh bột tính từ (1): TinhBot = 2*(1,4368*(1) – 0,0377) (tinh bột trong mẫu

được pha loãng 2 lần)

(3) Khối lượng lá khô được phân tích.

(4) Hàm lượng tinh bột trong 10 mg lá = 10* (2) / (3)

(5) Giá trị trung bình được lấy từ cột (4).

Kiểm tra t-Test với mức ý nghĩa α = 0,75. |t| trung bình hai nhóm giống nhau

(1,05988 < 2,680767) (Phụ lục 4)

10 wt3 (1) Giá trị OD được lấy trung bình giữa hai lần đo

Hình 3.18 Hàm lượng tinh bột trong lá cây chuyển gen và cây không chuyển sau 2h và 14h chiếu sáng

Ghi chú: Số liệu được tính trung bình từ các dòng chuyển gen 7, 9, 11, 13 và không chuyển

gen WT1, WT2, WT3.

Nghiên cứu của Li N và cộng sự (2011) khi biểu hiện đồng thời AGPase sắn

trên ngô cho thấy khối lƣợng hạt tăng 15%, hàm lƣợng tinh bột tăng 13,8% so với cây

chƣa chuyển gen [26]. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đánh giá khả năng tích lũy

tinh bột ở hạt ngô, mô dự trữ tinh bột chính. Ở tế bào nội nhũ, tinh bột đƣợc tổng hợp

liên tục và không bị phân hủy thành sucrose. Ngƣợc lại, quá trình tổng hợp tinh bột ở

lá đƣợc điều hòa bởi nhiều cơ chế phức tạp. Tinh bột ở lá có thể phân hủy để vận

chuyển đến các mô khác vào ban đêm hoặc khi lƣợng tinh bột vƣợt mức chứa của lục

lạp. Hơn nữa, AGPase sắn là enzyme chịu ảnh hƣởng mạnh bởi nồng độ Pi.

Nhƣ vậy, cấu trúc 35S:AGPSL có thể làm tăng tốc độ tổng hợp tinh bột ở lá lên

tới 1,735 lần so với cây đối chứng. Cấu trúc này cũng có tiềm năng làm tăng khối

lƣợng và hàm lƣợng tinh bột ở các mô dự trữ tinh bột. Điều này sẽ đặc biệt ý nghĩa khi

AGPSL đƣợc điều khiển bởi promoter đặc hiệu ở các mô dự trữ nhƣ: ở củ (sắn), hạt

(ngô, lúa, …) hoặc thân củ (khoai tây). Khi đó, tốc độ tích lũy tinh bột ở các mô này

có thể đƣợc cải thiện, khối lƣợng và hàm lƣợng tinh bột tăng, góp phần làm tăng năng

suất, giảm thời gian sản xuất.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

- Đã phân lập thành công gen AGPS và AGPL mã hóa cho AGPase ở sắn, đƣợc

đăng ký trên GenBank (NCBI) với mã số KU243124 và KU243122.

- Đã thiết kế thành công cấu trúc chuyển gen hiệu quả cho khả năng biểu hiện đồng

thời gen AGPS và AGPL (AGPS-P2a-AGPL-Cmyc) và đã tạo đƣợc các dòng thuốc

lá mang gen AGPSL.

- Tốc độ lũy tinh bột ở lá cây thuốc lá chuyển gen AGPSL tăng từ 0 – 3,3 lần so với

cây đối chứng (trung bình 1,735 lần).

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục thử nghiệm cấu trúc AGPSL với promoter biểu hiện đặc hiệu trong mô

dự trữ tinh bột (nội nhũ, củ…) và đánh giá khả năng tích lũy tinh bột trong mô dự trữ.

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Akula Nookaraju, Chandrama P. Upadhyaya, Shashank K. Pandey, Ko Eun Young, Se Jin Hong, Suk Keun Park,Se Won Park (2010), "Molecular approaches for enhancing sweetness in fruits and vegetables", Scientia Horticulturae, 127(1) pp. 1-15.

2. Atkins, J. F., Wills, N. M., Loughran, G., Wu, C.-Y., Parsawar, K., Ryan, M. D., … Nelson, C. (2007), "A case for “StopGo”: reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go)", Rna 13 pp. 803- 810.

3. Bachmann M., Matile P.,Keller F. (1994), "Metabolism of the raffinose family oligosaccharides in leaves of Ajuga reptans L Cold acclimation, translocation, and sink to source transition: discovery of chain elongation enzyme", Plant Physiol, 105 pp. 1335-1345.

4. Bradford M. M. (1976), "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", Anal Biochem, 72 pp. 248-254.

5. Burén S., Ortega-Villasante C., Ötvös K., Samuelsson G., Bakó L.,Villarejo A. (2012), "Use of the Foot-and-Mouth Disease Virus 2A Peptide Co-Expression System to Study Intracellular Protein Trafficking in Arabidopsis", PLoS ONE, 7(12) pp. 51973.

6. Carciofi Massimiliano, Blennow Andreas, Nielsen Morten M., Holm Preben B.,Hebelstrup Kim H. (2012), "Barley callus: a model system for bioengineering of starch in cereals", Plant Methods, 8(1) pp. 36.

7. Chatterton N. J.,Silvius J. E. (1980), "Photosynthate partitioning into leaf starch as affected by daily photosynthetic period duration in 6 species", Physiol. Plant., 49 pp. 141-144.

8. Chen S., Yao H., Han J., Liu C., Song J., Shi L., Zhu Y., Ma X., Gao T., Pang X., Luo K., Li Y., Li X., Jia X., Lin Y.,Leon C. (2010), "Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species", PLoS One, 5(1) pp. 8613.

9. Cheng Li,Robert G. Gilbert (2016), "Progress in controlling starch structure by

modifying starch-branching enzymes", Planta 243(13)

10. Cline J., Braman J. C.,Hogrefe H.H. (1996), "PCR fidelity of Pfu DNA polymerase

and other thermostable DNA polymerases", Nucl. Acid Res., 24 pp. 3546-51.

11. Deblaere R., Bytebier B., De Greve H., Deboeck F, Schell J, Van Montagu M,Leemans J (1985 ), "Efficient octopine Ti plasmid-derived vectors for Agrobacterium-mediated gene transfer to plants", Nucleic Acids Res, 13(13) pp. 4777- 4788.

12. Doan DNP, Rudi H.,Olsen O-A (1999), "The Allosterically Unregulated Isoform of ADP-Glucose Pyrophosphorylase from Barley Endosperm Is the Most Likely Source of ADP-Glucose Incorporated into Endosperm Starch", Plant Physiology, 121(3)

SÁCH VÀ BÀI BÁO

pp.:965-975.

13. Fondy B. R., Geiger D. R.,Servaites J. C. (1989), "Photosynthesis, carbohydrate metabolism and export in Beta vulgaris L and Phaseolus vulgaris L. during square and sinusoidal light regimes", Plant Physiol, 89 pp. 396-402.

14. Gamez-Arjona F. M., Li J., Raynaud S., Baroja-Fernandez E., Munoz F. J., Ovecka M., Ragel P., Bahaji A., Pozueta-Romero J.,Merida A. (2011), "Enhancing the expression of starch synthase class IV results in increased levels of both transitory and long-term storage starch", Plant Biotechnol J, 9(9) pp. 1049-1060.

15. Garry A. Luke, Claire Roulston, Jens Tilsner,Martin D. Ryan (2015), Growing Uses of 2A in Plant Biotechnology, Biotechnology, Associate Prof. Deniz Ekinci (Ed.): InTech

16. Gelvin S. B. (2003), "Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool", Microbiol Mol Biol Rev, 67(1) pp. 16-37, table of contents.

17. Gibon Y., Bläsing O. E., Palacios Rojas N., Pankovic D., Hendriks J. H. M., Fisahn J., Höhne M., GüntherM.,Stitt M (2004), "Adjustment of diurnal starch turnover to short days: depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbonhydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the following light period", Plant J, 39 pp. 847- 862.

18. Ha SH, Liang YS, Jung H, Ahn MJ, Suh SC, Kweon SJ, Kim DH, Kim YM,Kim JK (2010 ), "Application of two bicistronic systems involving 2A and IRES sequences to the biosynthesis of carotenoids in rice endosperm", Plant Biotechnol J, 8(8) pp. 928- 938.

19. Tichafa R. I. Munyikwa, Martin FregeneLuc Suurs, Evert Jacobsen, Richard G. F. Visser (2001), " Isolation and characterisation of cDNAs encoding the large and small subunits of ADP-glucose pyrophosphorylase from cassava (Manihot esculenta Crantz)", Euphytica 120 p. 71.

20. Jin X, Ballicora MA, Preiss J,Geiger JH (2005 ), "Crystal structure of potato tuber

ADP-glucose pyrophosphorylase", EMBO J, 24(4) pp. 694-704.

21. Kleczkowski L. A., Villand P., Luthi E., Olsen O-A.,Preiss J. (1993), " Insensitivity of barley endosperm ADP-glucose pyrophosphorylase to 3-phosphoglycerate and orthophosphate regulation", Plant Physiol, 101 pp. 179-186.

22. Koller H. R. Upmeyer D. J. (1973), "Diurnal trends in net photosynthetic rate and

carbohydrate levels of soybean leaves", Plant Physiol, 51 pp. 871-874.

23. Krishnamurthy K.,Giroux M. J. (2001), "Expression of wheat puroindoline genes in

transgenic rice enhances grain softness", Nat. Biotechnol, 19 pp. 162- 166.

24. Laemmli U. K. (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the

head of bacteriophage T4", Nature Biotechnology, 227(5259) pp. 680-685.

25. Lee D. S., Lee K. H., Jung S., Jo E. J., Han K. H.,Bae H.J. (2012), "Synergistic effects of 2A-mediated polyproteins on the production of lignocellulose degradation enzymes in tobacco plants", Journal of Experimental Botany, 63(13) pp. 4797-4810.

26. Li N., Zhang S., Zhao Y., Li B.,Zhang J. (2011 ), "Over-expression of AGPase genes enhances seed weight and starch content in transgenic maize", Planta, 233(2) pp. 241-

250.

27. Lin T. P., Caspar T., Somerville C.,Preiss J. (1988), "Isolation and characterization of a starchless mutant of Arabidopsis thaliana L. Henyh lacking ADP-glucose pyrophosphorylase activity", Plant Physiol, 86 pp. 1131-1135.

28. Matzke A. J.,Matzke M. A. (1998), "Position effects and epigenetic silencing of plant

transgenes", Curr Opin Plant Biol, 1(2) pp. 142-148.

29. Nakata P. A., Greene T.W., Anderson J.M., Smith-White B.J., Okita T.W.,Preiss J. (1991), "Comparison of the primary sequences of two potato tuber ADP-glucose pyrophosphorylase subunits", Plant Mol Biol 17 pp. 1089-1093.

30. Paine J. A., Shipton C. A., Chaggar S., Howells R.M., Kennedy M.J., Vernon G., Wright S. Y., Hinchliffe E., Adams J. L., Silverstone A. l.,Drake R. (2005), "Improving The Nutritional Value Of Golden Rice Through Increased Pro-Vitamin A Content", Nature Biotechnology 23(4) pp. 482-487.

31. Pandey M. K., Rani N. S., Madhav M. S., Sundaram R. M., Varaprasad G. S., Sivaranjani A. K., Bohra A., Kumar G. R.,Kumar A. (2012 ), "Different isoforms of starch-synthesizing enzymes controlling amylose and amylopectin content in rice (Oryza sativa L.)", Biotechnol Adv, 30(6) pp. 1697-1706.

32. Pollock C. J.,Cairns A. J. (1991), "Fructan metabolism in grasses and cereals", Annu.

Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 42 pp. 77-101.

33. Po-Yen Chen, Chen-Kuen Wang, Shaw-Ching Soong,Kin-Ying To (2003), "Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants", Molecular Breeding 11(4)

34. Rees T. Zeeman S. C. (1999), "Changes in carbohydrate metabolism and assimilate partitioning in starch-excess mutants of Arabidopsis", Plant Cell Environ, 22(1) pp. 445-1453.

35. Regierer Babette, Fernie Alisdair R., Springer Franziska, Perez-Melis Alicia, Leisse Andrea, Koehl Karin, Willmitzer Lothar, Geigenberger Peter,Kossmann Jens (2002), "Starch content and yield increase as a result of altering adenylate pools in transgenic plants", Nat Biotech, 20(12) pp. 1256-1260.

36. Ryan M.D., King A.M.,Thomas G.P (1991), "Cleavage of foot-and-mouth disease virus polyprotein is mediated by residues located within a 19 amino acid sequence", The Journal of General Virology, 72(11) pp. 2727-2732.

37. Samuel C. Zeeman, Steven M. Smith,Alison M. Smith (2007), "The diurnal

metabolism of leaf starch", Biochemical Journal, 401 (1) pp. 13-28.

38. Sawada H., Ieki H.,Matsuda I. (1995), "PCR detection of Ti and Ri plasmids from phytopathogenic Agrobacterium strains", Applied and Environmental Microbiology, 61(2) pp. 828-831.

39. Slater M (1998), "Pfu DNA Polymerase: A high fidelity enzyme for nucleic acid

amplification", Promega Notes, 68 pp. 7-10.

40. Steven M. Smith, Zeeman C., Alison M. Smith (2007), "The diurnal metabolism of

leaf starch", Samuel Biochemical Journal 401 (1) pp. 13-28.

41. Stitt M., Gerhardt R., Kürzel B.,Heldt H. W. (1983), "A role for fructose 2,6- bisphosphate in the regulation of sucrose synthesis in spinach leaves", Plant Physiol,

72 pp. 1139-1141.

42. Suzuki K., Yamashita I.,Tanaka N. (2002), "Tobacco plants were transformed by Agrobacterium rhizogenes infection during their evolution", Plant J, 32(5) pp. 775-87.

43. White T. J., Bruns T., Lee S.,Taylor J. (1990), PCR Protocols: a guide to methods and

applications. New York: Academic Press.

44. Yemm E. W.,Willis A. J. (1954), "The estimation of carbohydrates in plant extracts by

anthrone", Biochemical Journal, 57(3) pp. 508-514.

45. Zeeman S. C., Kossmann J.,Smith A. M. (2010), "Starch: its metabolism, evolution, and biotechnological modification in plants", Annu Rev Plant Biol, 61 pp. 209-34.

46. Zeeman S. C., Ap Rees T. (1999), Changes in carbohydrate metabolism and assimilate export in starch-excess mutants of Arabidopsis, Plant Cell & Environment 22(11) pp. 1445–1453

47. http://viralzone.expasy.org/all_by_protein/914.html Truy cập ngày 1/10/2016.

WEBSITE

49. http://www.nuffieldfoundation.org/practical-biology/testing-leaves-starch-technique

Truy cập ngày 1/10/2016.

50. http://www.starch.dk/isi/stat/rawmaterial.asp Truy cập ngày 1/10/2016.

48. http://www.andrewgray.com/essays/starch.htm Truy cập ngày 1/10/2016.

Truy cập ngày 1/10/2016.

52. https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Mesculenta Truy cập

ngày 1/10/2016.

51. https://phytozome.jgi.doe.gov (Department of Energy's Joint Genome Institute)

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

BÀI BÁO

Tạp chí Công nghệ Sinh học 14(2): 1-7, 2016 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY TINH BỘT Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN AGPS VÀ AGPL MÃ HÓA ENZYME AGPASE Ở CÂY SẮN Nguyễn Văn Đoài1, Nguyễn Minh Hồng2, Lê Thu Ngọc1 , Nguyễn Thị Thơm1, Nguyễn Đình Trọng1, Vũ Huyền Trang1, Nguyễn Thị Thuý Hường1, Phạm Thị Vân1, Phạm Bích Ngọc1 1Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2Đại học Hồng Đức, Thanh Hoá

Enzyme AGPase là một trong những enzyme xúc tác cho các bƣớc đầu tiên trong quá trình tổng hợp tinh bột. Nó có vai trò quan trọng và đã đƣợc chứng minh là enzyme điều hòa, điều chỉnh tốc độ phản ứng của toàn bộ chu trình sinh tổng hợp glycogen ở vi khuẩn và tinh bột ở thực vật. Ở thực vật bậc cao, AGPase đƣợc xác định là enzyme dị lập thể, đƣợc cấu tạo bởi hai tiểu phần lớn (AGPL) và hai tiểu phần nhỏ (AGPS) do hai gen tƣơng tứng mã hóa. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập hai gen mã hóa cho tiểu phần lớn và tiểu phần nhỏ của AGPase từ giống sắn KM140. Hai gen đƣợc nối với nhau bằng trình tự P2a và đƣợc biểu hiện đồng thời trên một khung đọc mở dƣới sự điều khiển của promoter CaMV 35S. Cấu trúc này đƣợc chèn vào vector pBI121 và đƣợc biến nạp vào cây thuốc lá bằng phƣơng pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens. Cây chuyển gen đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR, Western blot và định lƣợng hàm lƣợng tinh bột bằng phƣơng pháp anthrone. Kết quả, hàm lƣợng tinh bột tích lũy trong lá cây chuyển gen cao hơn các cây đối chứng từ 13-116% trong cùng điều kiện nuôi dƣỡng. Nghiên cứu của chúng tôi tạo ra thêm một hƣớng tiếp cận trong việc tạo cây trồng biến đổi gen tăng cƣờng khả năng tích lũy tinh bột.

TÓM TẮT

Từ khóa: AGPase, AGPS, AGPL, chuyển gen, P2a, tinh bột, thuốc lá, sắn

LOCUS KU243124 1578 bp mRNA linear PLN 18-MAY-2016

DEFINITION Manihot esculenta isolate Km140 ADP-glucose pyrophosphorylase small

subunit mRNA, complete cds.

ACCESSION KU243124

VERSION KU243124.1

KEYWORDS .

SOURCE Manihot esculenta (cassava)

ORGANISM Manihot esculenta

Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta;

Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; Gunneridae;

Pentapetalae; rosids; fabids; Malpighiales; Euphorbiaceae;

Crotonoideae; Manihoteae; Manihot.

REFERENCE 1 (bases 1 to 1578)

AUTHORS Doai,N.V., Ngoc,L.T. and Ngoc,P.B.

TITLE Cloning and Sequence Analysis of some starch biosynthesis gene in

TRÌNH TỰ GEN

Vietnam Cassava

JOURNAL Unpublished

REFERENCE 2 (bases 1 to 1578)

AUTHORS Doai,N.V., Ngoc,L.T. and Ngoc,P.B.

TITLE Direct Submission

JOURNAL Submitted (04-DEC-2015) Plant Cell of Biology, Institute of

Biotechnology, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi 100000, Vietnam

COMMENT ##Assembly-Data-START##

Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing

##Assembly-Data-END##

FEATURES Location/Qualifiers

source 1..1578

/organism="Manihot esculenta"

/mol_type="mRNA"

/isolate="Km140"

/db_xref="taxon:3983"

CDS 13..1575

/note="glucose-1-phosphate denylyltransferase small

subunit"

/codon_start=1

/product="ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit"

/protein_id="ANE10471.1"

/translation="MAAIGVPRVPSSSTSSSSQSNSSNLNRRTPVQSLSLSSSSISGD

KIYSKVFSARRGNAYNEKTPRIVSPKAVSDSRNSQTCLDPDASRSVLGIILGGGAGTR

LYPLTKKRAKPAVPLGANYRLIDIPVSNCLNSNISKIYVLTQFNSASLNRHLSRAYAS

NMGGYKNEGFVEVLAAQQSPENPNWFQGTADAVRQYLWLFEEHNVLEFLILAGDHLYR

MDYERFIQAHRETDADITVAALPMDEKRATAFGLMKIDEEGRIIEFAEKPKGEQLKAM

KVDTTILGLDDERAKELPFIASMGIYVVSKNVMLDLLRDKFPGANDLGSEVIPGATSI

GMRVQAYLYDGYWEDIGTIGAFYNANLGITKKPVPDFSFYDRSSPIYTQPRYLPPSKM

LDADVTDSVIGEGCVIKNCKIHHSVVGLRSCISEGAIIEDTLLMGADYYETDADRRFL

AAKGSVPIGIGKNSHIKRAIIDKNARIGVDVKIINGDNVQEAARETDGYFIKSGIVTV

IKDALIPSGTVI"

ORIGIN

1 ctaatggcga gtatggcggc catcggagtt ccgagagtac cgtcttcttc gacttcatct

61 tcttcacagt ccaattcgtc gaatctcaat cggagaacgc ctgtgcaaag cctttcgctc

121 tcctcgtcta gcatctccgg tgataagatt tactccaagg ttttttctgc tcgccgagga

181 aatgcttata atgagaagac tccacggatc gtttctccta aggccgtttc tgattccagg

241 aattcgcaaa cttgtcttga ccctgacgct agtcgaagtg tcttgggaat tattcttgga

301 ggcggtgctg ggacccgcct ttacccactt acaaagaaga gggcaaaacc tgctgttcct

361 ttaggagcaa attacagact gattgatatt cctgtgagca actgcttgaa cagtaatata

421 tcaaagattt acgttcttac acaattcaat tctgcatctc ttaatcgtca cctttcacgg

481 gcatatgcaa gcaacatggg tggctacaag aatgaaggtt ttgttgaagt tcttgcagcc

541 cagcagagcc cagagaatcc aaattggttc cagggcacag ctgatgctgt cagacagtac

601 ttgtggttgt ttgaagagca caatgttctg gaattcttga ttcttgctgg ggatcattta

661 taccgcatgg attatgaaag gtttattcaa gcacacagag aaactgatgc agatataaca

721 gtagctgctc taccaatgga tgaaaaacgt gcaacagcct ttggtctgat gaaaattgat

781 gaagaagggc gcataattga atttgctgag aagccaaaag gggagcaatt gaaagctatg

841 aaggttgata ctacaattct aggtcttgat gatgagagag caaaagagtt gccttttatt

901 gctagtatgg ggatatatgt cgtcagcaaa aatgtgatgt tagatcttct aagagataag

961 tttcctggag ccaatgatct tggaagtgaa gttattcctg gtgctacttc cattgggatg

1021 agagtgcaag cttacttata tgatggctac tgggaagata ttggaacaat tggggcattt

1081 tacaatgcca atctgggtat aactaaaaag ccagtgccag atttcagctt ctatgatcgt

1141 tcatctccaa tttatactca gcctcgatat ttgcctccat ccaagatgct tgatgctgat

1201 gttactgaca gtgttattgg tgaggggtgt gttattaaga actgtaagat tcaccactct

1261 gtggttgggc ttcgatcctg catatcagaa ggtgcaatca tagaggatac attactaatg

1321 ggagcagatt actatgagac tgatgctgac aggaggtttc tggcagccaa gggtagtgtt

1381 ccaattggta ttggcaagaa ttctcatatt aagagagcca ttattgacaa aaatgctcgc

1441 attggggtcg atgtgaagat cattaatggt gataatgtgc aagaagcagc gagggaaact

1501 gatggatatt tcataaagag tggaattgtt accgtaatca aggacgcgtt gattcccagc

1561 ggaaccgtga tctagatg

LOCUS KU243122 1618 bp mRNA linear PLN 18-MAY-2016

DEFINITION Manihot esculenta isolate Km140 AGPase large subunit protein mRNA,

complete cds.

ACCESSION KU243122

VERSION KU243122.1

KEYWORDS .

SOURCE Manihot esculenta (cassava)

ORGANISM Manihot esculenta

Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta;

Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; Gunneridae;

Pentapetalae; rosids; fabids; Malpighiales; Euphorbiaceae;

Crotonoideae; Manihoteae; Manihot.

REFERENCE 1 (bases 1 to 1618)

AUTHORS Doai,N.V., Ngoc,L.T. and Ngoc,P.B.

TITLE Cloning and Sequence Analysis of some starch biosynthesis gene in

Vietnam Cassava

JOURNAL Unpublished

REFERENCE 2 (bases 1 to 1618)

AUTHORS Doai,N.V., Ngoc,L.T. and Ngoc,P.B.

TITLE Direct Submission

JOURNAL Submitted (04-DEC-2015) Plant Cell of Biology, Institute of

Biotechnology, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi 100000, Vietnam

COMMENT ##Assembly-Data-START##

Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing

##Assembly-Data-END##

FEATURES Location/Qualifiers

source 1..1618

/organism="Manihot esculenta"

/mol_type="mRNA"

/isolate="Km140"

/db_xref="taxon:3983"

CDS 4..1587

/note="ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit"

/codon_start=1

/product="AGPase large subunit protein"

/protein_id="ANE10469.1"

/translation="MDSCCVALKANAHVAKTSKGDFMYGDKEFWGERIRGSLNNSIWS

NQMTRSLRAERNAIKVKPGVAHAVLTSNNPKESMTLQPPRFERRKVDPTNVAAIILGG

GAGTQLFPLTRRAATPAVPVGGCYKLIDIPMSNCINSGINKIFVLTQFNSASLNRHLA

RTYFGNGINFGDGFVEVLAATQTPGEAGMQWFQGTADAVRQFIWVFEDAKNRNVENIL

ILSGDHLYRMDYLDFLQHHVDSNADITISCAPVSESRASDCGLVKIDNRGRIVNFAEK

PTGAELKSMQADTTHLGLSLQDALKTPYIASMGVYVFRTEILLKLLRWRYPTSNDFGS

EVIPAAVMEHNVQGYIFRDYWEDIGTIKTFYEANLALTDEPPKFEFYDPKTPFYTSPR

FLPPTKMDKCRIVDAIISHGCFLRECTIQHSVVGERSRLDYGVELKDTVMLGADNYQT

EAEIASLLAEGKVPIGVGRNSKIKNCIIDKNAKVGKNVIITNKDGVQEADRPEKGFYI

RSGITIIAEKATIEDSTVI"

ORIGIN

1 ggaatggatt cttgctgtgt ggccctgaaa gccaatgccc atgtggcaaa aactagcaaa

61 ggtgatttca tgtatggaga taaagagttt tggggtgaaa ggatcagagg gagtctcaac

121 aatagtattt ggtccaatca gatgacaaga agcttaagag ctgagaggaa tgccatcaag

181 gtcaagcctg gtgttgctca tgctgtttta acatcaaaca atcccaagga gtctatgacc

241 ttacaaccac caagatttga gagacgaaaa gtggacccaa caaatgtagc agcgatcata

301 ttgggaggag gtgcagggac tcagctgttt cctcttacca gaagggcagc aacaccagct

361 gtgccagtgg gaggatgcta taaactaata gacattccaa tgagcaactg catcaacagt

421 ggcataaaca aaatatttgt actgacccaa ttcaactctg cttcccttaa tcggcacctt

481 gcacgcacat actttggaaa tggtattaac tttggagacg gttttgtgga ggtcctagca

541 gcaactcaaa cgcctggaga agcaggaatg cagtggttcc aaggaactgc agatgctgtg

601 aggcaattta tttgggtttt tgaggatgcc aagaacagaa atgttgagaa tatattgatc

661 ttgtccggag atcatcttta ccgaatggat tatctggatt ttttgcagca tcatgttgac

721 agtaatgctg atatcacgat ttcatgtgct ccagtcagtg agagccgcgc atcagattgt

781 ggtttggtga agatagacaa caggggacga attgtcaatt ttgctgaaaa accaactggt

841 gctgagctga aatcaatgca agctgatacc actcatctag gattatctct gcaagatgcc

901 ctcaaaaccc cttatatcgc atcaatggga gtctatgtat ttaggactga gattctgctg

961 aagcttctac ggtggagata ccctacatca aatgactttg gatctgaagt catccccgct

1021 gctgttatgg agcacaatgt tcaaggatat atttttagag actactggga agatatagga

1081 acaataaaga cattttatga agcaaacttg gctctcactg atgagcctcc aaagtttgaa

1141 ttttatgacc caaagacacc cttctacaca tctcctcgat ttctaccacc aaccaaaatg

1201 gataagtgcc ggattgtaga tgcgataatt tcccatgggt gcttcttgcg agaatgtact

1261 atacaacact ctgtggttgg tgaacgctca cgtttagatt atggtgtaga gctaaaggac

1321 actgtgatgt tgggagctga caactaccaa actgaagctg aaatcgcatc tcttttggca

1381 gagggcaaag tccctattgg tgttggaaga aactcaaaga tcaagaactg cataattgac

1441 aagaatgcga aagtaggaaa aaatgtgatc atcacaaaca aagatggtgt gcaagaagca

1501 gataggccag aaaaaggatt ttacattcgt tctggaatca caattatagc agagaaggcg

1561 acaatagaag atagcacagt aatataaatg gatccagagc atgttcaagg actggttg

PHỤ LỤC

1. So sánh trình tự AGPL mới phân lập với trình tự tham chiếu

10 20 30 40 50 60 70 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS ATGGATTCTTGCTGTGTGGCCCTGAAAGCCAATGCCCATGTGGCAAAAACTAGCAAAGGTGATTTCATGT M D S C C V A L K A N A H V A K T S K G D F M AL140 ...................................................................... M D S C C V A L K A N A H V A K T S K G D F M 80 90 100 110 120 130 140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS ATGGAGATAAAGAGTTTTGGGGTGAAAGGATCAGAGGGAGTCTCAACAATAGTATTTGGTCCAATCAGAT Y G D K E F W G E R I R G S L N N S I W S N Q M AL140 ...................................................................... Y G D K E F W G E R I R G S L N N S I W S N Q M 150 160 170 180 190 200 210 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS GACAAGAAGCTTAAGAGCTGAGAGGAATGCCATCAAGGTCAAGCCTGGTGTTGCTCATGCTGTTTTAACA T R S L R A E R N A I K V K P G V A H A V L T AL140 ...................................................................... T R S L R A E R N A I K V K P G V A H A V L T 220 230 240 250 260 270 280 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS TCAAACAATCCCAAGGAGTCTATGACCTTACAACCACCAAGATTTGAGAGACGAAAAGTGGACCCAACAA S N N P K E S M T L Q P P R F E R R K V D P T AL140 ...................................................................... S N N P K E S M T L Q P P R F E R R K V D P T 290 300 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS ATGTAGCAGCAATCATATTGGGAGGAGGTGCAGGGACTCAGCTGTTTCCTCTTACCAGAAGGGCAGCAAC N V A A I I L G G G A G T Q L F P L T R R A A T AL140 ..........G........................................................... N V A A I I L G G G A G T Q L F P L T R R A A T 360 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS ACCAGCTGTGCCAGTGGGAGGATGCTATAAACTAATAGACATTCCAATGAGCAACTGCATCAACAGTGGC P A V P V G G C Y K L I D I P M S N C I N S G AL140 ...................................................................... P A V P V G G C Y K L I D I P M S N C I N S G 430 440 450 460 470 480 490 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS ATAAACAAAATATTTGTACTGACCCAATTCAACTCTGCTTCCCTTAATCGGCACCTTGCACGCACATACT I N K I F V L T Q F N S A S L N R H L A R T Y AL140 ...................................................................... I N K I F V L T Q F N S A S L N R H L A R T Y 500 510 520 530 540 550 560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS TTGGAAATGGTATTAACTTTGGAGACGGTTTTGTGGAGGTCCTAGCAGCAACTCAAACGCCTGGAGAAGC F G N G I N F G D G F V E V L A A T Q T P G E A AL140 ...................................................................... F G N G I N F G D G F V E V L A A T Q T P G E A 570 580 590 600 610 620 630 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS AGGAATGCAGTGGTTCCAAGGAACTGCAGATGCTGTGAGGCAATTTATTTGGGTTTTTGAGGATGCCAAG G M Q W F Q G T A D A V R Q F I W V F E D A K

AL140 ...................................................................... G M Q W F Q G T A D A V R Q F I W V F E D A K 640 650 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS AACAGAAATGTTGAGAATATATTGATCTTGTCCGGAGATCATCTTTACCGAATGGATTATCTGGATTTTT N R N V E N I L I L S G D H L Y R M D Y L D F AL140 ..............................................G....................... N R N V E N I L I L S G D H L C R M D Y L D F 710 720 730 740 750 760 770 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS TGCAGCATCATGTTGACAGTAATGCTGATATCACGATTTCATGTGCTCCAGTCAGTGAGAGCCGCGCATC L Q H H V D S N A D I T I S C A P V S E S R A S AL140 ...................................................................... L Q H H V D S N A D I T I S C A P V S E S R A S 780 790 800 810 820 830 840 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS AGATTATGGTTTGGTGAAGATAGACAACAGGGGACGAATTGTCAATTTTGCTGAAAAACCAACTGGTGCT D Y G L V K I D N R G R I V N F A E K P T G A AL140 .....G................................................................ D C G L V K I D N R G R I V N F A E K P T G A 850 860 870 880 890 900 910 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS GAGCTGAAATCAATGCAAGCTGATACCACTCATCTAGGATTATCTCTGCAAGATGCCCTCAAAACCCCTT E L K S M Q A D T T H L G L S L Q D A L K T P AL140 ...................................................................... E L K S M Q A D T T H L G L S L Q D A L K T P 920 930 940 950 960 970 980 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS ATATCGCATCAATGGGAGTCTATGTATTTAGGACTGAGATTCTGCTGAAGCTTCTACGGTGGAGATACCC Y I A S M G V Y V F R T E I L L K L L R W R Y P AL140 ...................................................................... Y I A S M G V Y V F R T E I L L K L L R W R Y P 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS TACATCAAATGACTTTGGATCTGAAGTCATCCCCGCTGCTGTTATGGAGCACAATGTTCAAGGATATATT T S N D F G S E V I P A A V M E H N V Q G Y I AL140 ...................................................................... T S N D F G S E V I P A A V M E H N V Q G Y I 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS TTTAGAGACTACTGGGAAGATATAGGAACAATAAAGACATTTTATGAAGCAAACTTGGCTCTCACTGATG F R D Y W E D I G T I K T F Y E A N L A L T D AL140 ...................................................................... F R D Y W E D I G T I K T F Y E A N L A L T D 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS AGCCTCCAAAGTTTGAATTTTATGACCCAAAGACACCCTTCTACACATCTCCTCGATTTCTACCACCAAC E P P K F E F Y D P K T P F Y T S P R F L P P T AL140 ...................................................................... E P P K F E F Y D P K T P F Y T S P R F L P P T 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS CAAAATGGATAAGTGCCGGATTGTAGATGCGATAATTTCCCATGGGTGCTTCTTGCGAGAATGTACTATA K M D K C R I V D A I I S H G C F L R E C T I AL140 ...................................................................... K M D K C R I V D A I I S H G C F L R E C T I 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS CAACACTCTGTGGTTGGTGAACGCTCACGTTTAGATTATGGTGTAGAGCTAAAGGACACTGTGATGTTGG Q H S V V G E R S R L D Y G V E L K D T V M L AL140 ...................................................................... Q H S V V G E R S R L D Y G V E L K D T V M L 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS GAGCTGACAACTACCAAACTGAAGCTGAAATCGCATCTCTTTTGGCAGAGGGCAAAGTCCCTATTGGTGT G A D N Y Q T E A E I A S L L A E G K V P I G V AL140 ...................................................................... G A D N Y Q T E A E I A S L L A E G K V P I G V 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS TGGAAGAAACTCAAAGATCAAGAACTGCATAATTGACAAGAATGCGAAAGTAGGAAAAAATGTGATCATC G R N S K I K N C I I D K N A K V G K N V I I AL140 .............................................a........................ G R N S K I K N C I I D K N A K V G K N V I I 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AL CDS ACAAACAAAGATGGTGTGCAAGAAGCAGATAGGCCAGAAAAAGGATTTTACATTCGTTCTGGAATCACAA T N K D G V Q E A D R P E K G F Y I R S G I T AL140 ...................................................................... T N K D G V Q E A D R P E K G F Y I R S G I T 1550 1560 1570 1580 ....|....|....|....|....|....|....|....|.... AL CDS TTATAGCAGAGAAGGCGACAATAGAAGATGGCACAGTAATATAA I I A E K A T I E D G T V I * AL140 ............................................ I I A E K A T I E D G T V I *

2. So sánh trình tự AGPS mới phân lập với trình tự tham chiếu 10 20 30 40 50 60 70 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS ATGGCGAGTATGGCGGCCATCGGAGTTCCGAGAGTACCGTCTTCTTCGACTTCATCTTCTTCACAGTCCA M A S M A A I G V P R V P S S S T S S S S Q S AGPS140 ...................................................................... M A S M A A I G V P R V P S S S T S S S S Q S 80 90 100 110 120 130 140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS ATTCGTCGAATCTCAATCGGAGAACGCCTGTGCAAAGCCTTTCGTTCTCCTCGTCTAGCATCTCCGGTGA N S S N L N R R T P V Q S L S F S S S S I S G D AGPS140 ............................................C......................... N S S N L N R R T P V Q S L S L S S S S I S G D 150 160 170 180 190 200 210 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS TAAGATTTACTCCAAGGTTTTTTCTGCTCGCCGAGGAAATGCTTATAATGAGAAGACTCCACGGATCGTT K I Y S K V F S A R R G N A Y N E K T P R I V AGPS140 ...................................................................... K I Y S K V F S A R R G N A Y N E K T P R I V 220 230 240 250 260 270 280 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS TCTCCTAAGGCCGTTTCTGATTCCAGGAATTCGCAAACTTGTCTTGACCCTGACGCTAGTCGAAGTGTCT S P K A V S D S R N S Q T C L D P D A S R S V AGPS140 ...................................................................... S P K A V S D S R N S Q T C L D P D A S R S V 290 300 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AGPSCDS TGGGAATTATTCTTGGAGGCGGTGCTGGGACCCGCCTTTACCCACTTACAAAGAAGAGGGCAAAACCTGC L G I I L G G G A G T R L Y P L T K K R A K P A AGPS140 ...................................................................... L G I I L G G G A G T R L Y P L T K K R A K P A 360 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS TGTTCCTTTAGGAGCAAATTACAGACTGATTGATATTCCTGTGAGCAACTGCTTGAACAGTAATATATCA V P L G A N Y R L I D I P V S N C L N S N I S AGPS140 ...................................................................... V P L G A N Y R L I D I P V S N C L N S N I S 430 440 450 460 470 480 490 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS AAGATTTACGTTCTTACACAATTCAATTCTGCATCTCTTAATCGTCACCTTTCACGGGCATATGCAAGCA K I Y V L T Q F N S A S L N R H L S R A Y A S AGPS140 ...................................................................... K I Y V L T Q F N S A S L N R H L S R A Y A S 500 510 520 530 540 550 560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS ACATGGGTGGCTACAAGAATGAAGGTTTTGTTGAAGTTCTTGCAGCCCAGCAGAGCCCAGAGAATCCAAA N M G G Y K N E G F V E V L A A Q Q S P E N P N AGPS140 ...................................................................... N M G G Y K N E G F V E V L A A Q Q S P E N P N 570 580 590 600 610 620 630 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS TTGGTTCCAGGGCACAGCTGATGCTGTCAGACAGTACTTGTGGTTATTTGAAGAGCACAATGTTCTGGAA W F Q G T A D A V R Q Y L W L F E E H N V L E AGPS140 .............................................G........................ W F Q G T A D A V R Q Y L W L F E E H N V L E 640 650 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS TTCTTGATTCTTGCTGGGGATCATTTATACCGCATGGATTATGAAAGGTTTATTCAAGCACACAGAGAAA F L I L A G D H L Y R M D Y E R F I Q A H R E AGPS140 ...................................................................... F L I L A G D H L Y R M D Y E R F I Q A H R E 710 720 730 740 750 760 770 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS CTGATGCAGATATAACAGTAGCTGCTCTACCAATGGATGAAAAACGTGCAACAGCCTTTGGTCTGATGAA T D A D I T V A A L P M D E K R A T A F G L M K AGPS140 ...................................................................... T D A D I T V A A L P M D E K R A T A F G L M K 780 790 800 810 820 830 840 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS AATTGATGAAGAAGGGCGCATAATTGAATTTGCTGAGAAGCCAAAAGGGGAGCAATTGAAAGCTATGAAG I D E E G R I I E F A E K P K G E Q L K A M K AGPS140 ...................................................................... I D E E G R I I E F A E K P K G E Q L K A M K 850 860 870 880 890 900 910 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS GTTGATACTACAATTCTAGGTCTTGATGATGAGAGAGCAAAAGAGTTGCCTTTTATTGCTAGTATGGGGA V D T T I L G L D D E R A K E L P F I A S M G AGPS140 ...................................................................... V D T T I L G L D D E R A K E L P F I A S M G 920 930 940 950 960 970 980 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS TATATGTCGTCAGCAAAAATGTGATGTTAGATCTTCTAAGAGATAAGTTTCCTGGAGCCAATGATTTTGG I Y V V S K N V M L D L L R D K F P G A N D F G AGPS140 .................................................................C.... I Y V V S K N V M L D L L R D K F P G A N D L G

990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS AAGTGAAGTTATTCCTGGTGCTACTTCCATTGGGATGAGAGTGCAAGCTTACTTATATGATGGCTACTGG S E V I P G A T S I G M R V Q A Y L Y D G Y W AGPS140 ...................................................................... S E V I P G A T S I G M R V Q A Y L Y D G Y W 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS GAAGATATTGGAACAATTGAGGCATTTTACAATGCCAATCTGGGTATAACTAAAAAGCCAGTGCCAGATT E D I G T I E A F Y N A N L G I T K K P V P D AGPS140 ...................G.................................................. E D I G T I G A F Y N A N L G I T K K P V P D 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS TCAGCTTCTATGATCGTTCATCTCCAATTTATACTCAGCCTCGATATTTGCCTCCATCCAAGATGCTTGA F S F Y D R S S P I Y T Q P R Y L P P S K M L D AGPS140 ...................................................................... F S F Y D R S S P I Y T Q P R Y L P P S K M L D 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS TGCTGATGTTACTGACAGTGTTATTGGTGAGGGGTGTGTTATTAAGAACTGTAAGATTCACCACTCTGTG A D V T D S V I G E G C V I K N C K I H H S V AGPS140 ...................................................................... A D V T D S V I G E G C V I K N C K I H H S V 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS GTTGGGCTTCGATCCTGCATATCAGAAGGTGCAATCATAGAGGATACATTACTAATGGGAGCAGATTACT V G L R S C I S E G A I I E D T L L M G A D Y AGPS140 ...................................................................... V G L R S C I S E G A I I E D T L L M G A D Y 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS ATGAGACTGATGCTGACAGGAGGTTTCTGGCAGCCAAGGGTAGTGTTCCAATTGGTATTGGCAAGAATTC Y E T D A D R R F L A A K G S V P I G I G K N S AGPS140 ...................................................................... Y E T D A D R R F L A A K G S V P I G I G K N S 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS TCATATTAAGAGAGCCATTATTGACAAAAATGCTCGCATTGGGGACGATGTGAAGATCATTAATGGTGAT H I K R A I I D K N A R I G D D V K I I N G D AGPS140 ............................................T......................... H I K R A I I D K N A R I G V D V K I I N G D 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AGPSCDS AATGTGCAAGAAGCAGCGAGGGAAACTGATGGATATTTCATAAAGAGTGGAATTGTTACCGTAATCAAGG N V Q E A A R E T D G Y F I K S G I V T V I K AGPS140 ...................................................................... N V Q E A A R E T D G Y F I K S G I V T V I K 1550 1560 1570 ....|....|....|....|....|....|.. AGPSCDS ACGCGTTGATTCCCAGCGGAACCGTGATCTAG D A L I P S G T V I * AGPS140 ................................ D A L I P S G T V I *

t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances

Chuyển gen 0.807185 1.400622148 0.017515 0.259532857 11

3. Kiểm định kết quả định lượng tinh bột ở lá sau 2h chiếu sáng

Mean Variance Observations 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 13 t Stat -3.60508 P(T<=t) one-tail 0.0016 t Critical one-tail 1.770933 P(T<=t) two-tail 0.003201 2.160369 t Critical two-tail t |t|>t(α/2) => trung bình hai mẫu khác nhau

t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances

Variable 2

Variable 1

2.733817 2.555791085 0.013413 0.074580396 3

4 0 3 1.05988 0.183488 1.92432 0.366975 2.680767

4. Kiểm định kết quả định lượng tinh bột ở lá sau 14h chiếu sáng

Mean Variance Observations Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail |t| trung bình hai nhóm như nhau

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá khả năng tăng cường tích lũy tinh bột ở cây thuốc lá chuyển gen AGPS và AGPL mã hóa enzyme agpase ở cây sắn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM

Nguyễn Văn Đoài

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY TINH

BỘT Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN AGPS VÀ AGPL MÃ

HÓA ENZYME AGPASE Ở CÂY SẮN

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY TINH

BỘT Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN AGPS VÀ AGPL MÃ

HÓA ENZYME AGPASE Ở CÂY SẮN

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

Hình 1.1 Quá trình chuyển hóa saccharide và tổng hợp tinh bột ở thực vật (theo Akula Nookaraju) [1]

Hình 1.2. Các phản ứng quan trọng trong quá trình tổng hợp tinh bột [48]

Hình 1.3 Cấu trúc enzyme AGPase ở khoai tây [20].

Hình 1.4 Con đường tổng hợp tinh bột ở lục lạp và cơ chế điều hòa AGPase [37]

Hình 1.5 Sơ đồ vector chuyển gen của Li và cộng sự (2011) [26]

Hình 1.6. Sơ đồ mô tả nguyên tắc hoạt động của P2a [47]

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Bảng 2.1. Danh sách mồi PCR sử dụng

TCTAGAATGGCGGCCATCGG

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt PCR với GoTaq® Green Master Mix 2X

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng nối hai hoặc nhiều đoạn DNA với T4 ligase

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt DNA với Enzyme giới hạn

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân dòng đoạn AGPS và AGPL

Hình 2.1 Sơ đồ đoạn gen P2a:AGPL:cmyc và vị trí của các mồi PCR

Bảng 2.6. Thành phần và chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR tổng hợp SmaI-P2a-AGPL- Cmyc-SacI

Hình 2.2. Sơ đồ ghép nối pBI121 với AGPS và P2a-AGPL-Cmyc

Bảng 2.7. Tóm tắt quy trình chuyển gen và phân tích cây chuyển gen

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hình 3.1. Kết quả RT-PCR nhân đoạn AGPS và AGPL từ RNA tổng số tách ở lá sắn

Hình 3.2. Kết quả tách dòng gen AGPS và AGPL

Hình 3.3. Ảnh sắc ký giải trình tự gen AGPS và AGPL

Bảng 3.1. Kết quả so sánh trình tự gen AGPS và AGPL mới phân lập với trình tự tham chiếu

AGPS (Kích thƣớc CDS: 1572 bp)

AGPL (Kích thƣớc CDS: 1584 bp)

Hình 3.4 Trình tự polypeptide AGPS và AGPL mới phân lập

Hình 3.5. Một số phương án biểu hiện hai gen trên cùng một vector

Hình 3.6. Kết quả tổng hợp đoạn XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI

Hình 3.7. Ảnh điện di sản phẩm cắt vector pBI121 với XbaI và SacI (A) và sơ đồ vector pBI121 (B)

Hình 3.8. Kết quả PCR kiểm tra khuẩn lạc biếp nạp pBI-35S-AGPSL

Hình 3.9. Kết quả kiểm tra vector và A. tumefaciens mang vector pBI-35S-AGPSL

Hình 3.10. Một số hình ảnh chuyển gen AGPSL vào cây thuốc lá

Hình 3.11. Kết quả phân tích PCR cây thuốc lá chuyển gen AGPSL.

Hình 3.12 Kết quả lai western blot kiểm tra sự biểu hiện của gen AGPSL.

Hình 3.13 Các bước kiểm tra hàm lượng tinh bột lá bằng iodine [49].

Hình 3.14. Ảnh nhuộm iodine lá thuốc lá chuyển gen

Hình 3.15 Sơ đồ phản ứng Anthrone với Glucose

Hình 3.16. Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng Anthrone (I) (α = 0.05)

Bảng 3.2. Kết quả định lượng tinh bột ở lá sau 2h chiếu sáng

Hình 3.17. Đường chuẩn định lượng Anthrone (II) (α = 0,075)

Bảng 3.3 Kết quả định lượng tinh bột ở lá sau 14h chiếu sáng

Hình 3.18 Hàm lượng tinh bột trong lá cây chuyển gen và cây không chuyển sau 2h và 14h chiếu sáng

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

Từ khóa: AGPase, AGPS, AGPL, chuyển gen, P2a, tinh bột, thuốc lá, sắn

PHỤ LỤC

Mean Variance Observations 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 13 t Stat -3.60508 P(T<=t) one-tail 0.0016 t Critical one-tail 1.770933 P(T<=t) two-tail 0.003201 2.160369 t Critical two-tail t |t|>t(α/2) => trung bình hai mẫu khác nhau

Mean Variance Observations Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T<=t) one-tail t Critical one-tail P(T<=t) two-tail t Critical two-tail |t| trung bình hai nhóm như nhau

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng