ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
HOÀNG NGỌC ANH
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA
ENZYME PEROXIDASE LIÊN QUAN ĐẾN SỰ
TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN
(Catharanthus roseus (L.) G. Don.)
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG
Thái Nguyên - 2017
i
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
HOÀNG NGỌC ANH
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA
ENZYME PEROXIDASE LIÊN QUAN ĐẾN SỰ
TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN
(Catharanthus roseus (L.) G. Don.)
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm
THÁI NGUYÊN – 2017
ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới
sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Mọi trích dẫn trong luận văn
đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là
trung thực và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác.
Thái Nguyên, tháng 09 năm 2016
TÁC GIẢ
Hoàng Ngọc Anh
iii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã
tận tình hướng dẫn và chỉ bảo trong suốt quá trình tôi nghiên cứu và thực
hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn, phòng Công nghệ ADN ứng
dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt
Nam đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện
các thí nghiệm nghiên cứu trong đề tài luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo và cán bộ
Khoa Khoa học sự sống trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành
luận văn; cảm ơn sự đóng góp những ý kiến quý báu trong các buổi
seminar khoa học và báo cáo đề cương luận văn.
Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của kĩ
thuật viên Trần Thị Hồng, phòng Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh
học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên. Tôi xin chân thành
cảm ơn bộ môn Sinh học hiện đại và GD sinh học, Trường Đại học Sư
phạm, Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện
quá trình nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Khoa học sự sống,
các thầy cô và cán bộ Bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Khoa
học – Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
hoàn thành khóa học này.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, quan
tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu.
Thái Nguyên, tháng 9 năm 2016
TÁC GIẢ
Hoàng Ngọc Anh
iv
MỤC LỤC
DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ............. viii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề .................................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Giới thiệu về cây dừa cạn ....................................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm phân loại và phân bố cây dừa cạn ................................... 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây dừa cạn ................................................ 4
1.1.3. Tác dụng của cây dừa cạn ............................................................... 5
1.2. Hợp chất alkaloid và tác dụng ................................................................ 6
1.2.1. Alkaloid ........................................................................................... 6
1.2.2. Alkaloid trong cây dừa cạn ............................................................. 8
1.3. Quá trình sinh tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn ....... 10
1.4. Enzyme peroxidase (Prx) và gen mã hóa Prx ...................................... 12
1.4.1 Enzyme peroxidase Prx .................................................................. 12
1.4.2. Gen mã hóa peroxidase (Prx) ....................................................... 13
1.5. Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ................ 14
1.6. Các nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine
ở cây dừa cạn ............................................................................................... 16
1.6.1. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở
cây dừa cạn bằng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật...................... 16
1.6.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine
ở cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen ............................................ 17
1.7. Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR ..................................... 18
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 20
2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 20
2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................ 20
v
2.1.2. Vật liệu di truyền ........................................................................... 20
2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu............................................ 20
2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu ........................................................ 20
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 21
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 21
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro ...................................................... 21
2.3.2. Phương pháp chuyển gen vào cây dừa cạn ................................... 22
2.3.3. Phân tích cây chuyển gen .............................................................. 26
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 30
3.1. Kết quả tạo cây dừa cạn mang gen chuyển crPrx ................................ 30
3.1.1. Chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào cây dừa cạn nhờ A.
tumefaciens .................................................................................................. 30
3.1.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển crPrx trong hệ gen cây dừa cạn
..................................................................................................................... 35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 38
vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hoa của ba giống Catharanthus roseus (L.) G. Don [24] ................... 4
Hình 1.2. Công thức hóa học của Vinblastine (A) và Vincristine (B) ................. 9
Hình 1.3. Sơ đồ chuyển hóa tạo vinblastine và vincristine ................................. 11
Hình 1.4. Cấu trúc Cấu trúc intron và exon của CrPrx [15] ............................... 13
Hình 2.1. Sơ đồ chuyển gen vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A.
Tumefaciens ............................................................................................................. 23
Hình 3.1. Gieo hạt tạo cây con in vitro ................................................................. 30
Hình 3.2. Ngâm mảnh lá mầm trong dịch huyền phù vi khuẩn .......................... 31
Hình 3.3. Mảnh lá mầm trên môi trường đồng nuôi cấy CCM .......................... 31
Hình 3.4. Mẫu được thấm khô và đặt lên môi trường SIM ................................. 32
Hình 3.5. Mẫu phát triển đa chồi trên môi trường SIM ....................................... 32
Hình 3.6. Chọn lọc kéo dài chồi trên SEM ........................................................... 33
Hình 3.7. Cây ra giá thể .......................................................................................... 33
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen chuyển
crPrx trong các cây dừa cạn chuyển gen .............................................................. 36
vii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Một số loại môi trường tái sinh cây đối với Dừa cạn ......................... 24
Bảng 2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn ......................................... 24
Bảng 2.3 : Hó a chất pha đê ̣m rử a .......................................................................... 28
Bảng 2.4: Hó a chất pha đê ̣m chiết ......................................................................... 28
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 35S ...................................... 28
Bảng 2.6. Chu kỳ phản ứng PCR .......................................................................... 29
Bảng 3.1. Thống kê số lượng các mẫu chuyển gen vào cây dừa cạn ................. 34
viii
DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
AS Acetosyringone
bp base pairs Cặp bazơ nitơ
CrPrx Catharanthus roseus Gen Prx ở cây dừa cạn
peroxidase
Cộng sự cs
Deoxyribonucleic acid
DNA
ELISA
Enzyme-Linked
Cocultivation medium Môi trường đồng nuôi cấy CCM
ImmunoSorbent Assay
EDTA
Ethylene Diamine Tetraacetic
Acid
Xét nghiệm ELISA
Germination medium Môi trường tái sinh GM
Genetic Modify Origanism Lương thực thực phẩm GMO
biến đổi gen
Kilo base kb
Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng cơ LB
bản nuôi cấy vi khuẩn
MS Murashige và Skoog, 1962 Môi trường dinh dưỡng cơ
bản nuôi cấy in vitro theo
Murashige và Skoog
Optical Density Mật độ quang OD
Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR
Peroxidase Gen mã hóa peroxidase Prx
Peroxidase Protein peroxidase Prx
Rooting Medium Môi trường tạo rễ RM
SEM Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi
ix
SIM Shoot Induction Medium Môi trường tạo đa chồi
T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA được chuyển
vào thực vật
Ti-plasmid Tumor inducing – plasmid Plasmid gây khối u
Virulence region Vir
WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới
x
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ung thư và sức khỏe cộng đồng là những vấn đề ngày càng được
quan tâm ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Theo ước tính và thống kê
của Tổ chức y tế thế giới (WHO) hàng năm trên toàn cầu có khoảng 9-10
triệu người mới mắc bệnh ung thư và một nửa trong số đó chết vì căn bệnh
này. Vì vậy, rất nhiều nhà khoa học quan tâm và tìm ra những loại thuốc
mới có tác dụng chống ung thư cao. Ung thư có đặc điểm là tăng trưởng
không giới hạn và di căn, trong khi các khối u lành tính thường là tự giới
hạn, không xâm lấn và di căn.
Hiện có ba phương pháp điều trị ung thư chủ yếu là phẫu thuật, hóa
trị, xạ trị. Ngoài ra, còn có một số phương pháp điều trị mới đang bắt đầu
được ứng dụng vào điều trị cho bệnh nhân ung thư như sinh hóa, nội tiết,
liệu pháp gen… Các liệu pháp điều trị ung thư có thể được sử dụng riêng rẽ
hoặc kết hợp với nhau, loại điều trị phụ thuộc vào vị trí ung thư, mức độ
lan, tuổi và tình trạng sức khỏe của bệnh nhân, các chọn lựa điều trị sẵn có
và các mục tiêu cho việc điều trị. Các phương pháp này gây ra những tác
dụng không mong muốn như làm suy giảm sức đề kháng, mệt mỏi, rụng
tóc, đau nhức.
Trong bối cảnh như vậy cùng với sự phát triển của Công nghệ Sinh
học, các nhà khoa học không ngừng quan tâm nghiên cứu để tìm ra các hợp
chất thứ cấp có giá trị đóng vai trò quan trọng đối với ngành công nghệ dược
phẩm trong việc sản xuất ra các loại thuốc mới, có giá trị, trong số đó quan
trọng nhất là nhóm dược phẩm điều trị ung thư. Một số hợp chất thuộc các
nhóm alkaloid, terpenoid, phenolic, saponin được chiết xuất từ một số thực
vật tiêu biểu như thông đỏ, dừa cạn, trinh nữ hoàng cung, nấm linh chi, giảo
cổ lam được biết đến như là các hợp chất có khả năng trị bệnh ung thư.
1
Dừa cạn là một trong những cây có khả năng sản xuất các indol
alkaloid có dược tính quan trọng trong chế tạo các loại thuốc chống ung
thư, đặc biệt là các loại ung thư máu. Trong các indol alkaloid có mặt trong
cây dừa cạn, hai loại alkaloid là vinblastine và vincristine được sử dụng
nhiều nhất. Nhưng các chất này lại có hàm lượng rất nhỏ trong cây dừa cạn,
khoảng nửa tấn lá khô mới chiết xuất được 1g vinblastine cho sản xuất
dược phẩm, các chất này không thể tổng hợp bằng con đường hóa học do
có cấu trúc rất phức tạp. Trong cây dừa cạn, vinblastine và vincristine được
tạo ra từ sự kết hợp của catharanthine và vindoline. Gen mã hóa enzyme
peroxidase có chức năng xúc tác cho phản ứng tạo tiền chất cho sự tổng
hợp vinblastine và vincristine. Các nghiên cứu đã cho thấy trong các giống
dừa cạn hiện có thì giống dừa cạn hoa hồng nhụy tím có hàm lượng
alkaloid toàn phần và các chất là vinblastine và vincristine đạt cao nhất.
Nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa
cạn phục vụ cho việc tạo thuốc chữa bệnh ung thư là rất cần thiết. Vì những
lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chuyển gen
mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây
dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don.)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tạo được dòng dừa cạn chuyển gen chứa gen mã hóa enzyme
peroxidase.
3. Nội dung nghiên cứu
1. Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase ở cây dừa cạn
2. Phân tích biểu hiện của gen chuyển crPrx trong các dòng cây
chuyển gen ở thế hệ T0 bằng kỹ thuật PCR
2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây dừa cạn
1.1.1. Đặc điểm phân loại và phân bố cây dừa cạn
Cây dừa cạn hay hải đằng, dương giác, bông dừa, trường xuân hoa,
thuộc Họ: Apocynaceae, Chi: Catharanthus, Loài: Catharanthus roseus.
Có tên khoa học là: Catharanthus roseus (L) G.Don [24].
Dừa cạn thuộc họ trúc đào Apocynaceae gồm có 8 loài, loài
Catharanthus pusillus có nguồn gốc từ Ấn Độ, còn tất cả các loài còn lại có
nguồn gốc từ Madagasca, số lượng nhiễm sắc thể cho tất cả các loài
Catharanthus đều là 2n=16 [7], [19]. Tám loài thuộc giống này đó là:
Catharanthus coriaceus Markgr. Madagascar;
Catharanthus lanceus (Bojer ex A.D.C.) Pichon. Madagascar;
Catharanthus longifolius (Pichon) Phichon. Madagascar;
Catharanthus ovalis Markgr. Madagasca;
Catharanthus pusillus (Murray) G.Don India subcontinent;
Catharanthus roseus (L) G. Don. Madagascar;
Catharanthus scintulus (Pichon) Pichon. Madagascar;
Catharanthus trichophyllus (Baker) Pichon. Madagascar. [7], [19]
Cây dừa cạn là nguồn giàu alkaloid thuộc alkaloid terpenoid indole
được phân lập từ 3 giống cây khác nhau: (1) Catharanthus roseus “Roseus”
có hoa màu hồng tím; (2) Catharanthus roseus “Albus” có hoa màu trắng.
Trong đó, hoa màu hồng tím có hàm lượng vincristien và vinblastine cao
nhất [24].
3
A B C
Hình 1.1. Hoa của ba giống Catharanthus roseus (L.) G. Don [24]
A: Catharanthus roseus var. roseus
B: Catharanthus roseus var. ocellatus
C: Catharanthus roseus var. albus
Cây dừa cạn có nguồn gốc ở Madagasca (Châu Phi), mọc hoang và
được trồng ở nhiều nước nhiệt đới và ôn đới như Việt Nam, Ấn Độ,
Indonesia… Cây dừa cạn được người Pháp dưa vào trồng ở Việt Nam để
làm cây cảnh. Cây dễ trồng, phát triển nhanh chịu nắng, chịu hạn tốt, không
kén đất và ít phải chăm sóc, cách chăm sóc không quá đặc biệt nên ít lâu
sau nó đã lan ra ở nhiều địa phương, nhất là ở các tỉnh đồng bằng và ven
biển nước ta [7].
Ở Việt Nam, dừa cạn có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng
từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng biển, tương đối tập
trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên – Huế,
Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định, Phú Yên. Ở những vùng phân bố tự
nhiên ven biển, dừa cạn có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới
rừng phi lao, trảng cỏ, cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất
đai khô cằn của vùng cát ven biển. Cây dừa cạn còn được trồng khắp nơi
trong nước để làm cảnh và làm thuốc [7].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây dừa cạn
Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 – 60 cm, phân
nhiều cành, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên.
Cây dừa cạn mọc thành bụi dày có cành đứng, lá mọc đối, thuôn dài, đầu lá
4
hơi nhọn, phía cuống hẹp nhọn, kích thước thường biến động tùy từng vùng
phân bố dài 3cm – 6cm, rộng 2cm – 3 cm. Mỗi cành thường có 8 – 15 cặp
lá, lá có phiến bầu dục màu xanh thẫm, mặt trên nhẵn, mặt dưới có nhiều
lông, mùa hoa và quả vào tháng 4 – 5 và tháng 9 – 10 hàng năm [7].
Hoa trắng hoặc hồng, mùi thơm, mọc riêng lẻ ở các kẽ lá phía trên.
Quả gồm hai đại dài 2cm – 4cm, rộng 2mm – 3mm, mọc thẳng đứng hơi
ngả hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù, trong quả chứa 12 – 20 hạt
nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột nổi thành đường chạy
dọc [7].
Rễ thường chỉ có một rễ cái và chùm rễ phụ, rễ cái đâm thẳng xuống
đấy có thể đạt chiều dài 30cm – 40cm, rễ phụ mọc thành chùm thưa ngắn,
phát triển theo chiều ngang [7].
1.1.3. Tác dụng của cây dừa cạn
Theo từ điển Cây thuốc Việt Nam, dừa cạn có vị hơi đắng, tính mát, có
độc, có tác dụng kháng ung thư, trấn tĩnh, an thần, hạ huyết áp, thanh nhiệt,
giải độc, hoạt huyết, tiêu thũng. Dừa cạn được nghiên cứu làm thuốc kìm hãm
sự phát triển tế bào và được chỉ định trong điều trị bệnh Hodgkin (một loại
ung thư hệ bạch huyết), bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính, một số ung
thư. Ở Trung Quốc, cây dừa cạn dùng trị cao huyết áp, bệnh bạch cầu
lymphoblastic cấp tính và ung thư, mụn nhọt độc. Còn ở Nouvelle-Calédonie
(châu Đại Dương), dừa cạn cũng là vị thuốc chống ung thư. Ở Australia, nước
hãm rễ cây dừa cạn là loại thuốc dân gian chống tiểu đường [24].
Trong tất cả các bộ phận của cây dừa cạn đều chứa alkaloid. Người ta đã
chiết, phân lập ra trên 150 alkaloid khác nhau, chủ yếu là vinblastine, vincritine,
tetrahydroalstonine, pirinine, vindoline, catharanthine, ajmalicin… Trong đó,
ajmalicin có hiệu quả tốt trong điều trị rối loạn thần kinh tim. Còn vinblastine
và vincristine có tác dụng làm ngừng sự phân chia tế bào ở pha giữa. Vì thế,
chúng được sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị ung thư [7].
5
Hoạt chất trong dừa cạn phụ thuộc vào nơi trồng và thu hái. Giống
trồng ở Việt Nam được đánh giá là thảo dược tốt tương đương dừa cạn ở
Madagascar, chứa khoảng 0,1 – 0,2% alkaloid toàn phần. Tỉ lệ alkaloid
trong rễ (0,7 – 2,4%) cao hơn trong thân (0,46%) và lá (0,37 – 1,15%). Các
nước Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc… cũng đang ra sức bào chế thuốc
từ loại cây này [19].
Hiện nay, y khoa vẫn chưa tìm ra phương pháp nào điều trị bệnh
bạch cầu tốt hơn nên chiết xuất dừa cạn càng trở nên quý với bệnh nhân
ung thư máu. Tuy nhiên, không phải chỉ cần dùng cây dừa cạn sắc lấy
thuốc uống là khỏi bệnh. Vì để chữa được bệnh ung thư cần một liều
vincristine, vinblastine có hàm lượng rất cao. Nhưng dùng các thành phần
này cũng dễ bị ngộ độc nên cần có sự hướng dẫn của bác sỹ điều trị.
Một số bài thuốc dân gian chữa bệnh ung thư của cây dừa cạn:
Chữa ung thư máu, viêm đại tràng: lấy từ 15 – 20 g thân lá dừa cạn
khô sao vàng, sắc, chia từ 2 – 3 lần uống trong ngày.
Chữa bạch cầu cấp (bệnh máu trắng) bằng cách sắc uống thân và lá
cây dừa cạn (khoảng 15g thân lá khô/ ngày).
Điều trị u xơ tuyến tiền liệt: dừa cạn 12g, huyền sâm 12g, xuyên sơn
10g, chè khô 12g, hoàng cung trinh nữ 5g, cát căn 16g, bối mẫu 10g, đinh
lăng 16g; sắc uống ngày chia 1 lần.
1.2. Hợp chất alkaloid và tác dụng
1.2.1. Alkaloid
1.2.1.1. Đặc điểm chung của alkaloid
Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ và có tính base,
thường gặp trong nhiều loại thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài
loài động vật.
6
Đặc biệt, alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao đối với cơ thể con
người và động vật nhất là đối với hệ thần kinh. Chỉ cần một lượng nhỏ
alkaloid là chất độc gây chết người nhưng lại có khi nó là thần dược trị
bệnh đặc hiệu [13].
Alkaloid có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này
dễ kết tinh. Hàm lượng alkaloid có thể đạt tới 10% trong các loại rau quả
thông dụng như khoai tây, chè, cà phê. Chúng là hợp chất nhóm thiên nhiên
rất quan trọng về nhiều mặt. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp
nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao [13].
1.2.1.2. Phân loại alkaloid
Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử
chung của chúng, dựa theo kiểu trao đổi chất được sử dụng để tạo ra phân tử.
Khi không biết nhiều về tổng hợp sinh học của alkaloid, thì chúng
được gộp nhóm theo tên của các hợp chất đã biết. Ví dụ: do các cấu trúc
phân tử xuất hiện trong sản phẩm cuối cùng nên các alkaloid thuốc phiện đôi
khi còn được gọi là các “phenanthren”. Hay gọi tên dựa theo nhóm động vật,
thực vật mà từ đó người ta chiết xuất ra các alkaloid, ví dụ như các alkaloid
chiết từ cây dừa cạn vinca thì được gọi chung là các vinca alkaloid.
Khi người ta biết nhiều hơn về một alkaloid cụ thể nào đó, thì việc
gộp nhóm thường lấy theo tên gọi của amin quan trọng về mặt sinh học và
nổi bật nhất trong tiến trình tổng hợp.
Các nhóm alkaloid hiện nay gồm có:
• Nhóm pyridin: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin,
pilocarpin, cytisin, nicotin, spartein, pelletierin.
• Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohtgrin, nicotin.
• Nhóm tropan: atropin, cocain, ecgonin, scopolamin.
7
• Nhóm quinolin: quinin, quinidin, dihydroquinin, dihydroquinidin,
strychnin, brucin, cevadin.
• Nhóm isoquinolin: các alkaloid gốc thuốc phiện như: morphin,
codein, thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin, berberin.
• Nhóm phenethylamin: mescalin, ephedrin, dopamin, amphetamin.
• Nhóm indol:
- Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin.
- Các ergolin: Các alkaloid từ ngũ cốc/ cỏ như ergin, ergotamin, acid
lysergic.
- Các beta-cacbolin: Harmin, harmalin, yohimbin, reserpin, emetin.
- Các alkaloid từ chi Ba gạc (Rauwolfia): reserpin
• Nhóm purin: Các xanthin (caffein, theobromin, theophyllin).
• Nhóm terpenoit:
- Các alkaloid aconit: aconitin.
- Các steroit: solanin, samandari (các hợp chất amoni bậc bốn):
muscarin, cholin, neurin.
- Các vinca alkaloid: Vinblastine, vincristine…
1.2.2. Alkaloid trong cây dừa cạn
1.2.2.1. Một số alkaloid chính trong cây dừa cạn
Một số alkaloid chính trong cây dừa cạn là vinblastine, vincristine,
ajmalicine, vindolinine và serpentine…
Alkaloid toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0,37 – 1,15%, thân
0,40%, rễ chính 0,7 – 2,4%, rễ phụ 0,9 – 3,7%, hoa 0,14 – 0,84%, vỏ quả
1,14%, hạt 0,18%. Trong khoảng 150 loại alkaloid đã được chiết từ
8
Catharanthus roseus cần đặc biệt chú ý là nhóm 20 alkaloid dimeric là những
nhóm có hoạt tính chống ung thư bao gồm vincristine và vinblastine [19].
Vinblastine (vincaleukoblastine), công thức phân tử: C48H58N4O9, có
ở lá với hàm lượng 0,013 – 0,063%, ở bộ phận trên mặt đất là 0,0015%, ở
rễ 0,23%. Nếu cây bị bệnh astetylow-virus thì sẽ không có vinblastine.
Vincristine (leurocristine) có công thức phân tử: C46H56N4O10, hàm lượng
thấp hơn, trong khoảng 0,0003 – 0,0015% [17].
Lá dừa cạn thu thập ở nhiều địa phương khác nhau chứa 0,7 – 1,2%
alkaloid toàn phần. Vinblastine có với hàm lượng 1,6 – 2 phần vạn ở lá.
Thời gian thu hái nguyên liệu tốt nhất để trên cây có hàm lượng hoạt chất
A
B
cao là vào cuối tháng 8 đến giữa tháng 9 dương lịch [17].
Hình 1.2. Công thức hóa học của Vinblastine (A) và Vincristine (B)
1.2.2.2. Tác dụng của alkaloid trong cây dừa cạn
Các nhà khoa học đã nghiên cứu chiết xuất từ cây dừa cạn hai
alkaloid vinblastine và vincristine là những chất ức chế mạnh sự phân bào.
Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với Tubulin, là protein ống vi thể ở thoi
phân bào, phong bế sự tạo thành các vi ống này và gây ngừng phân chia tế
bào ở pha giữa. Cho nên chúng hạn chế được việc hình thành bạch cầu thừa
ở bệnh nhân ung thư máu. Ở nồng độ cao, thuốc diệt được tế bào, còn ở
nồng độ thấp làm ngừng phân chia tế bào. Ngoài ra, cây dừa cạn còn có tác
dụng hạ huyết áp và kháng một số chủng nấm gây bệnh. Nhưng ở giai đoạn
9
mang thai lại ngăn cản sự phát triển của thai trên động vật gây độc cho thai
nhi, thuốc chỉ dùng ở thời kì mang thai khi bệnh đe dọa đến tính mạng hoặc
các thuốc khác không thể sử dụng được [20].
Hiện nay, vinblastine được ứng dụng rộng rãi vào điều trị bệnh ung
thư ở người và được hấp thu nhanh chóng theo đường tiêm tĩnh mạch,
thuốc phân bố nhanh vào các mô của cơ thể, liên kết nhiều với protein
huyết tương. Vinblastine được chuyển hóa nhiều, chủ yếu ở gan để thánh
desacetyl vinblastine – là chất có hoạt tính mạnh hơn vincristine, thuốc thải
trừ qua mật vào phân và nước tiểu, một số đào thải dưới dạng thuốc không
biến đổi [11].
Hiệu quả chống ung thư vincristine hơn vinblastine cao hơn khoàng
10 lần để điều trị bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính, tác dụng tốt hơn
trên bệnh bạch cầu cấp tính khác, bệnh Hodgkin, lymphosarcoma, sarcom
tế bào lưới và ung thư vú có hiệu lực [11].
1.3. Quá trình sinh tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn
Quá trình sinh tổng hợp vinblastine và cincristine được tạo thành từ
sự ghép nối của hai monomer alkaloid: catharanthine (indole) và vindoline
(dihydroindole). Cả hai đều xuất hiện tự do trong cây. Vincristine cũng có
cấu trúc tương tự như vinblastine nhưng thay nhóm fromyl bằng một nhóm
methyl trên phân tử nitrogen indole của vindoline [22].
10
Hình 1.3. Sơ đồ chuyển hóa tạo vinblastine và vincristine
Những alkaloid này được hình thành bởi sự kết hợp của hai nửa: một
nửa là indole và một nửa là dihydrodole. Vì thế, chúng được biết đến với
tên gọi là “dimer alkaloid” hoặc “bisindole alkaloid” [22].
Deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (DAT) là một enzyme quan
trọng cho bước cuối cùng của quá trình tổng hợp vindoline. Theo Wang và
đồng tác giả (2010) các gen promoter của gen DAT được nhân lên, giải
trình tự và phân tích. Theo đó, promoter của gen DAT gồm khoảng
1773bp. Phân tích trình tự cho biết promoter gen DAT có chưa một số yếu
tố làm cho nó được tham gia vào quá trình điều hòa biểu hiện gen. Hoạt
11
động điều tiết của promoter DAT đã được xác định với các xét nghiệm định
lượng huỳnh quang [22].
Phản ứng dimerization dẫn đến 3’,4’-anhydrovinblastine là một
bước quan trọng để sản xuất các alkaloid chống ung thư. 3’,4’-
anhydrovinblastine là chìa khóa trung gian từ sự ghép nối của catharanthine
và vindoline. Phản ứng dimerization đã thu hút nhiều sự chú ý do tầm quan
trọng của nó và khả năng ứng dụng để sản xuất bán tổng hợp của các
alkaloid dimeric. Việc tìm kiếm các enzyme dimerization trong mô lá phát
hiện một loại peroxidase hiện diện trong lá cây. Enzyme này có tác dụng
quan trọng trong việc xúc tác cho phản ứng kết hợp giữa catharanthine và
vindoline [8], [10].
1.4. Enzyme peroxidase (Prx) và gen mã hóa Prx
1.4.1 Enzyme peroxidase Prx
Peroxidase là một họ các peroxidase cysteine phụ thuộc vào phản
ứng với hydrogen peroxide, axit béo và nhiều chất hydroperoxide thơm,
peroxynitrite. Những enzyme chống oxy hóa phổ biến và cao, biểu hiện ở
nhiều sinh vật bao gồm cả thực vật, vi khuẩn và động vật có thể có tối đa
1% hoặc nhiều hơn các protein tế bào [1].
Peroxidase là enzyme thực vật có khả năng sử dụng H2O2 để oxi hóa
một số chất cho quá trình chuyển hóa trung gian, đặc biệt là hợp chất phenol.
Những enzyme này được định vị trên thành tế bào và không bào [12].
Peroxidase là các enzyme đa chức năng, điển hình của thực vật, xúc
tác quá trình oxy hóa của các phân tử nhỏ. Peroxidase thành tế bào chủ yếu
liên quan đến sự quyết định tính chất cấu trúc và bảo vệ thành tế bào thực
vật, như sinh tổng hợp ligin và suberin. Nó cũng liên qua đến dị hóa auxin,
trong sự trao đổi chất thứ cấp.
12
1.4.2. Gen mã hóa peroxidase (Prx)
Prx gồm các gen mã hóa enzyme peroxidase đã được công bố trên
ngân hàng gen quốc tế, bao gồm: Prx, Prx1, Prx2, Prx3, Prx4…
Theo Kumar và cộng sự (2007) gen mã hóa Prx đã được phân lập từ
cây dừa cạn có 1357 nucleotide, trong đó vùng mã hóa dài 1033 nucleotide.
Vùng mã hóa gồm 993 nucleotide mã hóa một polypeptide gồm 330 amino
acid với 21 amino acid của peptide tín hiệu. Khối lượng phân tử của protein
suy diễn này được tính là 37,43kDa [1], [16].
Để có được một cái nhìn sâu sắc về trình tự hoàn chỉnh của CrPrx,
Kumar và cộng sự (2007) đã thực hiện PCR bằng cách sử dụng cặp mồi
PFLF1 và PFLR1, được thiết kế bám để bảo tồn vùng 5’-UTR và vùng 3’-
UTR của DNA gốc của C.roseus. Sản phẩm khuếch đại khi nhân bản và
trình tự được tìm thấy dài 1793bp. CrPrx bao gồm 4 exon (268bp, 189bp,
172 bp, 405bp, dừng lại ở UAG) và ba intron (95bp, 435bp, 79bp). Intron
thứ hai trong CrPrx đã được tìm thấy có kích thước lớn nhất và lớn hơn so
với các exon. Cấu trúc CrPrx này hỗ trợ các quan điểm về nguồn gốc của
các peroxidase ở dừa cạn từ một gen tổ tiên chung với các loài khác có ba
intron và bốn exon [1], [16].
Hình 1.4. Cấu trúc Cấu trúc intron và exon của CrPrx [15]
13
Phân tích Northern Blot cho thấy biểu hiện của CrPrx trong các cơ
quan khác nhau của C.roseus, tức là lá (non, trưởng thành và già), nụ hoa,
hoa nở, quả, rễ và liên nút gốc mô (internodal stem tissues). Trong các mô
sinh dưỡng, biểu hiện nhiều nhất trong các mô liên nút gốc, tiếp theo là rễ,
lá non và lá trưởng thành. Trong các mô sinh sản, biểu hiện nhiều nhất
trong quả, tiếp theo là nụ hoa. Biểu hiện CrPrx đã không được phát hiện
trong lá già và hoa [17].
Năm 2011, Kumar và cộng sự đã nhân bản và phân tích được đặc
tính của hai gen peroxidase lớp III mới, CrPrx3 và CrPrx4 từ Catharanthus
roseus. Chiều dài đầy đủ của CrPrx3 là 1233bp, mã hóa chuỗi polypeptide
gồm 330 amino acid, cDNA CrPrx4 chứa một ORF của 1055bp có vùng
mã hóa gồm 955 nucleotide và mã hóa cho 318 amino acid. Phân tích phát
sinh loài cho thấy cả hai gen có mô hình biểu hiện đa dạng trong một loạt
các mô thực vật [17].
1.5. Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được
thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và
của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật, …) làm cho gen lạ có thể
tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế
bào chủ các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới
việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen. Gen chuyển phải
được di truyền cho thế hệ sau và ở mỗi thế hệ sản phẩm biểu hiện của gen
phải thể hiện được chức năng sinh học [6].
Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, khẳng định
tính khách quan tự nhiên của vật chất di truyền, khả năng mã hóa cho các
tính trạng nhất định, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền.
Thông qua chuyển gen các nhà sinh lý, hóa sinh và di truyền học có thể
14
nghiên cứu các quá trình điều khiển, thể hiện và ảnh hưởng của các yếu tố
di truyền và ngoại cảnh lên hoạt động của gen.
Có nhiều phương pháp chuyển gen ở thực vật nhưng có thể phân loại
thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen trực tiếp và
phương pháp chuyển gen gián tiếp.
Phương pháp chuyển gen trực tiếp thường được sử dụng là chuyển
gen bằng súng bắn gen (gene gun). Với ưu điểm là thao tác dễ dàng, bắn
một lần được nhiều tế bào và nguyên liệu để bắn đa dạng, trong những năm
gần đây phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen đã được áp dụng
thành công trên lúa, mía, đu đủ, bông. Nhưng phương pháp này đòi hỏi chi
phí thiết bị đắt tiền và có nhiều bản sao trong gen biến nạp được chuyển
vào tế bào cùng lúc gây khó khăn trong việc phân tích biểu hiện gen, dẫn
đến sự biểu hiện của các gen không bền vững.
Phương pháp chuyển gen gián tiếp được sử dụng phổ biến là chuyển
gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
được nghiên cứu từ những năm 1960 – 1970. Việc phát hiện ra
Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) có khả năng chuyển gen vào
thực vật vào đầu năm 1980 đã biến loài này trở thành một công cụ quan
trọng nhất trong chuyển gen thực vật với những ưu điểm nổi trội: (i) Gen
chuyển ít bị đào thải; (ii) Số lượng bản sao ít, do đó tránh được hiện tượng
ức chế và câm lặng lẫn nhau; (iii) Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do
phụ thuộc vào hệ thống protein Vir; (iv) Tránh được sự hình thành các cây
chuyển gen khảm; (v) Kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện và không đòi hỏi
thiết bị đắt tiền. Mặc dù vậy, phương pháp này mới chỉ được sử dụng thành
công ở nhiều cây hai lá mầm, nhưng hiệu quả với cây một lá mầm còn thấp
(do ở cây một lá mầm các tế bào khi bị thương có xu hướng hóa gỗ chứ
không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiếp hợp chất phenol như cây hai lá
mầm). Khi nhược điểm này được khắc phục thì phương pháp chuyển gen
15
nhờ vi khuẩn Agrobacterium sẽ ngày càng được quan tâm và dẫn trở thành
một phương pháp chuyển gen được các nhà nghiên cứu ưu tiên lựa chọn vì
lúa, ngô, lúa mì, … là những cây lương thực thiết yếu [25].
Các bước thực hiện phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium
+ Thiết kế vector mang gen biến nạp
+ Nhân (tách dòng – cloning) vector nhờ vi khuẩn E. coli
+ Chuyển vector mang gen biến nạp từ vi khuẩn E. coli sang
Agrobacterium
+ Lây nhiễm Agrobacterium mang vector chứa gen biến nạp với tế
bào/mô thực vật để tiến hành quá trình chuyển gen biến nạp sang mô/tế bào đích
+ Chọn lọc các tế bào/mô đã được biến nạp thành công
+ Tái sinh mô/tế bào đã được biến nạp thành công thành cây biến
nạp hoàn chỉnh (và đánh giá sự biểu hiện của gen biến nạp).
1.6. Các nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và
vincristine ở cây dừa cạn
1.6.1. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine
ở cây dừa cạn bằng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật
Marfori và Alejar (1993) đã nghiên cứu khả năng sản xuất alkaloid
của những mô sẹo có nguồn gốc từ rễ, thân, lá và hoa của hai giống
C.roseus, trắng và hồng tím. Nghiên cứu chỉ ra rằng, sự thay đổi hàm lượng
alkaloid trong mô sẹo có nguồn gốc từ lá, rễ và hoa của giống dừa cạn hoa
hồng tím và giống hoa trắng phụ thuộc vào nguồn gốc mô sẹo từ lá, rễ hay
hoa và hàm lượng alkaloid ở mô sẹo có nguồn gốc từ rễ của giống dừa cạn
Hoa hồng tím cao hơn ở giống hoa trắng [18].
Zhao và cs (2001) đã thử nghiệm nhiều chất cảm ứng của nấm nhận
được từ 12 loại nấm và ảnh hưởng của chúng lên việc cải thiện sản xuất
16
indole alkaloid ở huyền phù tế bào cây dừa cạn. Kết quả cho thấy, các chất
cảm ứng khác nhau thì kích thích sự tổng hợp khác nhau của các indole
alkaloid (ajmalicine, catharanthine và serpentine), cao hơn từ 2 đến 5 lần so
với đối chứng [23].
Ở Việt Nam, nghiên cứu về cây dừa cạn bắt đầu được công bố vào
năm 2006 với công trình của Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng: “Ảnh hưởng
của chất điều hòa tăng trưởng thực vật và đường saccharose lên dịch nuôi
cấy huyền phù tế bào dừa cạn Catharanthus roseus” [3]. Năm 2011, Đào
Hùng Cường, Lê Xuân Văn đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của
cây dừa cạn bằng phương pháp tách chiết Alkaloid. Bằng việc sử dụng
phương pháp sắc kí lỏng khối phổ (LC – MS) đã xác định được 2 alkaloid
quan trọng là vinblastine và vincristine từ rễ cây dừa cạn hoa hồng [4].
1.6.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và
vincristine ở cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen
Javier và cs (1998) thu được các dòng rễ cây dừa cạn chuyển gen
phát triển rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes chủng A4 trên môi trường
muối B5 1/2, không bổ sung chất kích thích sinh trưởng. Các rễ lông thu
được cho thấy hai hình thái: rễ lông điển hình với khả năng sản xuất
alkaloid cao và rễ có mô sẹo với khả năng sinh trưởng nhanh hơn nhưng
sản xuất alkaloid thấp hơn. Gen AUX1 của A. rhizogenes được phát hiện
bằng PCR và được chỉ ra cho thấy vai trò quan trọng của các gen aux trong
hình thái của rễ biến đổi [14].
Wang và cs (2012) đã phát triển phương pháp chuyển gen ở cây dừa
cạn bằng cách sử dụng Agrobacterium tumefaciens chủng EHA được biến
nạp vector nhị thể pCAMBIA2301chứa gen β-glucuronidase (GUS) và gen
neomycin phosphotransferase II (NTPII). Kết quả là sự phát triển hệ thống
cây dừa cạn chuyển gen với việc sử dụng một gen DAT tham gia vào quá
trình sinh tổng hợp TIAs dẫn đến sự tích tụ cao của vindoline trong cây
17
chuyển gen – là tiền chất của vinblastine và vincristine [21].
1.7. Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
PCR (Polymerase chain reaction) được Kary B Mullis phát hiện ra
năm 1983. Đây là phương pháp ống nghiệm để tổng hợp các trình tự DNA
đặc hiệu nhờ enzyme, sử dụng hai mồi oligonucleotide để khuếch đại vùng
DNA quan tâm nằm giữa hai mồi bằng cách lặp lại nhiều chu kỳ với các
bước biến tính 2 mạch DNA khuôn, bắt cặp các mồi và kéo dài các sợi. Kỹ
thuật PCR đơn giản, dễ thực hiện với hầu hết các phòng thí nghiệm được
trang bị máy PCR. Trong phân tích cây chuyển gen, gen chuyển đã được
biết trình tự, vì vậy chỉ cần sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen đó và tách
chiết DNA từ mẫu thực vật cần xác định làm khuôn là có thể tiến hành
PCR. Sử dụng plasmid mang gen chuyển làm đối chứng, nếu sản phẩm
PCR khi điện di có kích thước đúng như dự kiến và bằng với đối chứng thì
mẫu phân tích được coi là dương tính. Tuy nhiên, PCR dương tính không
đồng nghĩa với chuyển gen thành công, vì có nhiều cách để giải thích sự có
mặt của DNA trong mẫu phân tích: (1) Vi khuẩn A. tumefaciens mang gen
chuyển có thể còn tồn tại trong khối mô hay trong các gian bào của mẫu
phân tích. Hiện tượng này xuất hiện ở nhiều loại đối tượng và được gọi là
dương tính giả. Nếu mẫu phân tích của thực vật đã qua nhân giống hữu tính
tức đã qua một vài thế hệ thì hiện tượng này được loại trừ. (2) Gen chuyển
tồn tại tự do trong tế bào chất (có thể biến mất qua sinh sản hữu tính). (3)
Gen chuyển không hoạt động, tức không được phiên mã và biểu hiện ra
protein có chức năng sinh học. Chính vì những lý do trên mà kết quả PCR
mới chỉ có giá trị định hướng ban đầu khi phân tích cây chuyển gen.
Tuy nhiên, kỹ thuật PCR lại tỏ ra hữu dụng đối với việc phân tích
phát hiện các mẫu lương thực thực phẩm biến đổi gen (genetic modify
origanism-GMO). Để phục vụ việc xác định GMO, PCR còn được phát
triển thành kỹ thuật multiplex PCR (MPCR). Với việc sử dụng đồng thời
18
nhiều cặp mồi nhận biết các gen khác nhau (promoter, teminator, gen chọn
lọc, gen đích… ) trong một phản ứng, MPCR cho phép phát hiện đồng thời
nhiều trình tự đích nếu mẫu có mang các gen đó. Thông thường các cặp
mồi được sử dụng trong multiplex PCR là mồi P35S, TNOS, NPT-II, GUS,
EPSPS. Nếu kết quả dương tính với bất cứ cặp mồi nào thì mẫu cần xác
định rất có thể đã được chuyển gen.
19
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Hạt cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) hoa hồng tím
được thu thập tại vườn trường thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư
phạm Thái Nguyên – tỉnh Thái Nguyên.
2.1.2. Vật liệu di truyền
Vector chuyển gen mang cấu trúc gen crPrx phân lập từ cây dừa cạn
hoa hồng tím: pBI121-CrPrx
Vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang vector
pBI121-CrPrx.
2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu
Hóa chất
Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và thông dụng có nguồn gốc từ
Đức, Trung Quốc như các chất kích thích sinh trưởng BAP, NAA, IBA,
nước dừa, đường sucrose, thạch agar, ethanol, than hoạt tính…
Bộ Kit dùng cho phản ứng PCR, bộ Kit tinh sạch sản phẩm PCR
Accuprep PCR Purification (Bioneer - Hàn Quốc), bộ Kit tách dòng “TA cloning Kit” (hãng Invitrogen), bộ Kit tách plasmid tái tổ hợp “AccuprepTM
Plasmid Mini Extraction Kit”, Kit tinh sạch sản phẩm PCR do hãng Bioneer
cung cấp.
Thiết bị
Dùng trong nuôi cấy và chuyển gen: bình tam giác 250ml, pipetman,
cốc thủy tinh, ca nhựa, đũa thủy tinh, siêu điện, bông, giấy làm nút, giấy
thấm. Bộ đồ cấy: dao cấy, que cấy, đĩa cấy, panh cấy, buồng cấy vô trùng
Biological Safety Cabinets) của hãng Nuarie (Mỹ), nồi khử trùng (Auto
20
Clave) của hãng Tomy (Nhật), tủ sấy (Memmerb, Anh), cân điện tử, máy
chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex
(Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, máy PCR System 9700
(Appied Biosystem, Mỹ) và một số thiết bị khác tại Phòng công nghệ
DNA ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 09 năm 2015, chuyển gen ở cây
dừa cạn được tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ tế bào, khoa Sinh
học, Trường Đại học Sư phạm, đại học Thái Nguyên.
Thí nghiệm phân tích cây chuyển gen được tiến hành tại phòng Công
nghệ ADN ứng dụng, phòng Công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện Công
nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Đề tài nghiên cứu được hoàn thành tại Khoa Công nghệ Sinh học,
trường Đại học Khoa Học, Đại học Thái Nguyên.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nuôi cấy in vitro và chuyển gen vào cây dừa cạn dựa
trên “Nghiên cứu quy trình chuyển gen Gus ở cây dừa cạn” của Bùi Thị Hà
và cộng sự (2016).[9]
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro
Thu mẫu và xử lí mẫu: Quả sau khi thu về được phơi khô 2 – 3 ngày,
sau đó tách lấy hạt. Cho hạt vào ống falcon 50ml lắc nhiều lần để rửa sạch
hạt trước khi tiến hành vào mẫu.
Khử trùng hạt: Hạt dừa cạn được khử trùng bằng cồn 70% trong 1
phút, javen 60% lắc đều trong 15 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất khử
trùng 3 đến 4 lần. Hạt dừa cạn sau khi khử trùng được cấy vào môi trường
dinh dưỡng MS cơ bản, bổ sung thêm sucrose 30 g/ l và agar 8 g/ l.
21
Môi trường tái sinh: Sau khi hạt nảy mầm được chuyển sang môi
trường tái sinh cây là MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 g/ l, agar 8 g/ l và
BAP 0,5 mg/ l [2].
Các môi trường đều được chuẩn pH = 5,8 và khử trùng. Thí nghiệm
được tiến hành ở nhiệt độ 25 ± 2oC, cường độ chiếu sáng 30 – 40 Em-2s-
1, thời gian chiếu sáng 16 giờ sáng/ ngày.
2.3.2. Phương pháp chuyển gen vào cây dừa cạn
Phương pháp chuyển gen thông qua nách lá mầm được tiến hành dựa
trên nghiên cứu của Bùi Thị Hà và cs (2016) [9]. Chúng tôi đã thực hiện thí
nghiệm dựa theo các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen vào cây dừa
cạn đã được tối ưu bao gồm: (i) Vật liệu chuyển gen là lá mầm; (ii) Nồng độ
vi khuẩn OD600nm= 0,8; (iii) Nồng độ acetosyringone là 100µM; (iv) Thời gian
nhiễm khuẩn là 30 phút; (v) Nồng độ kanamycin để chọn lọc chồi chuyển gen
là 50 mg/ l. Quy trình chuyển gen Prx vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens được trình bày trong hình 2.1.
22
Chuẩn bị vi khuẩn A.tumefaciens với mật độ OD600nm = 0,8
Chuẩn bị vật liệu chuyển gen - Gieo hạt tạo cây con in vitro - Thu lá mầm 10 – 14 ngày tuổi
Chuyển gen
- Lá mầm được nhiễm khuẩn trong thời gian 30 phút + AS 100 µM - Đồng nuôi cấy 3 ngày trên môi trường: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 3,9g/ l + muối B5 0,3g/ l + AS 100µM
Chọn lọc chồi chuyển gen Chọn lọc chồi trên môi trường: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l
Tái sinh chồi chuyển gen Chồi sống sót được tái sinh trên môi trường: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l
Tạo cây hoàn chỉnh và ra cây - Chồi tái sinh được chuyển sang môi trường ra rễ: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + BAP 0,5mg/ l + IBA 0,4mg/ l + kanamycin 50 mg/ l. - Đưa cây ra môi trường tự nhiên
Hình 2.1. Sơ đồ chuyển gen vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A. Tumefaciens
23
Bảng 2.1. Một số loại môi trường tái sinh cây đối với Dừa cạn
Loại môi Kí hiệu Thành phần trường
Nảy mầm hạt MS cơ bản + sucrose 30 g/ l + agar 9 g/ l, pH = 5,8
(Germination GM
medium)
Đồng nuôi cấy MS cơ bản + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES
(Co-cultivation CCM 0,39g/ l + muối B5 0,3g/ l + AS 100 µM
medium)
Cảm ứng tạo đa MS cơ bản + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES
0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + chồi (Shoot SIM cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l induction
medium)
Kéo dài chồi MS cơ bản + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES
0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + (Shoot SEM elongation cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l
medium)
MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + BAP 0,5mg/ l + Ra rễ
IBA 0,4mg/ l + kanamycin 50 mg/ l RM (Rooting
medium)
Bảng 2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường Thành phần
LB lỏng Bacto pepton 10 g/ l + NaCl 10 g/ l + Yeast Extract 5 g/ l,
pH = 7
LB đặc LB lỏng + agar 16 g/ l
24
2.3.1.1. Nguyên liệu biến nạp
Khử trùng hạt bằng cồn 70% lắc trong 1 phút. Sau đó ngâm hạt trong
dung dịch nước tẩy (Javel 60%) lắc trong 15 phút. Loại bỏ dung dịch nước
tẩy và rửa hạt bằng nước cất khử trùng. Hạt dừa cạn sau khi khử trùng cho
nảy mầm trên môi trường MS cơ bản. Sau 10 – 14 ngày cây con phát triển,
lá được tách đôi, loại bỏ đỉnh sinh trưởng, sử dụng làm nguyên liệu biến
nạp gen và nuôi cấy in vitro.
2.3.1.2. Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm
Cấy trải A. tumefaciens cất giữ trong glycerol lên đĩa môi trường LB
đặc có bổ sung kanamycin 50 mg/ l và rifamicin 50 mg/ l, nuôi ở 28oC
trong 48 - 96 giờ. Sau đó, lấy một khuẩn lạc vi khuẩn nuôi trong môi
trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin và nuôi lắc với tốc độ
220 vòng/ phút ở 28oC trong 16 – 18 giờ. Lấy 1ml dịch vi khuẩn nuôi hoạt
hóa trong 10ml LB lỏng ở tốc độ 220 vòng/ phút ở 28oC trong 3 – 4 giờ.
Lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy lần 2 ly tâm với tốc độ 5000 vòng/
phút, ở 4oC trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn với môi trường
1/ 2 MS và pha loãng cho tới mật độ tế bào vi khuẩn OD600nm = 0,8.
2.3.1.3. Lây nhiễm và đồng nuôi cấy
Các mảnh lá mầm dừa cạn được gây tổn thương bằng mũi dao nhọn
từ 3 – 4 lần vào phần nách lá mầm trong dịch huyền phù vi khuẩn có bổ
sung acetosyringone 100µM, trong 30 phút sau đó thấm khô. Sau thời gian
nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc
không kháng sinh. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 25oC trong
thời gian 3 ngày.
2.3.1.4 . Cảm ứng tạo chồi trên môi trường SIM
Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được rửa trong môi
trường 1/ 2 MS có bổ sung cefotaxim 500 mg/ l với thời gian là 10 phút,
25
sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Đặt mẫu lên môi trường tạo
cảm ứng đa chồi (SIM) có bổ sung kanamycin 50 mg/ l.
2.3.1.5. Kéo dài chồi
Sau 4 tuần, các cụm chồi sống sót trên môi trường chọn lọc được
loại bỏ lá mầm và chuyển sang môi trường phát triển kéo dài chồi (SEM).
2.3.1.6. Tạo rễ
Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 2 – 3cm sẽ được chuyển
sang môi trường tạo rễ (RM) để tạo cây hoàn chỉnh.
2.3.1.7. Cây ra môi trường tự nhiên
Cây con có chiều cao 8 – 10 cm và rễ đạt từ 5 – 7 cm được đưa ra giá
thể, để nơi tránh ánh sáng trực tiếp. Sau 1 tuần có thể tưới cây bằng dung
dịch MS với tỷ lệ 1/ 10, ngày 1 lần. Sau 2 đến 3 tuần cây sống ra rễ mới, lá
mới có thể đưa ra môi trường.
2.3.2. Phân tích cây chuyển gen
2.3.2.1. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR
Tách chiết DNA tổng số từ lá cây dừa cạn chuyển gen và thực hiện
phản ứng PCR với cặp mồi 35S để xác định sự có mặt của gen crPrx với
thành phần ở bảng 2.5 theo chu trình nhiệt các bước ở bảng 2.6. Kiểm tra kết
quả bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
26
Trình tự mồi 35S:
F: 5’ – CAA CGT CTT CAA AGC AAG TGG – 3’
R: 5’ – TTC TCT CCA AAT GAA ATG AAC TTC C – 3’
Phương pháp tách chiết DNA tổng số
- Cân 200 mg mẫu lá và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng thành dạng
bột mịn, chuyển vào ống E ppendorf 2 ml.
- Bổ sung 1 ml đệm rửa (thành phần bảng 2.3) vào ống Eppendorf 2
ml, voltex tạo thành dịch đồng nhất. Ly tâm 12000 vòng/ phút (v/ p) trong
7 phút ở 4oC.
- Loa ̣i di ̣ch nổi và lă ̣p la ̣i bướ c 2 – 3 từ 1 đến 2 lần.
- Bổ sung 0,8 ml đệm tách chiết (thành phần bảng 2.4), lắc đều và
giữ ở 65oC trong thời gian 30 phú t đến 1 tiếng.
- Giữ mẫu ở nhiệt đô ̣ phò ng trong thờ i gian 10 phú t.
- Bổ sung 0,8 ml chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều trong
thờ i gian 10 phú t. Ly tâm 12000 vò ng/ phút trong 15 phú t ở 4oC.
- Hút dịch nổi cho vào ống Eppendorf 1,5 ml mới.
- Bổ sung mô ̣t thể tích tương đương isopropanol (la ̣nh), đảo nhẹ, để
ở đá trong 30 phú t. Ly tâm 12000 vò ng/ phú t trong 15 phút ở 4oC.
- Loại bỏ dịch nổi thu tủa, bổ sung 0,5 ml cồn 80%. Ly tâm 12000
vò ng/ phú t trong 4 phút ở 4oC (bướ c này thực hiê ̣n 2 lần), sau đó nhẹ nhàng loa ̣i bỏ ethanol.
- Làm khô DNA bằng quạt gió , máy hú t chân không.
- Hòa tan DNA trong 100 µl nước khử ion. Bổ sung 3 µl RNase (10
mg/ ml) ủ ở 37oC trong 1 giờ.
- Bảo quản DNA tổng số ở -20oC.
27
Bả ng 2.3 : Hó a chấ t pha đê ̣m rử a
STT Thể tích Nồ ng đô ̣ Nồ ng đô ̣ sử du ̣ng Hó a chất
stock
Tris- HCl pH 8 1 M 100 mM 5 ml 1
EDTA pH 8 0,5 M 5 mM 0,5 ml 2
Sorbitol 0,35 M 3,1885 g 3 Bô ̣t
0,4% 0,5 g 4 Bô ̣t NaH2PO4
50 ml Thêm nướ c đến thể tích cuố i cù ng là 50 ml
Bả ng 2.4: Hó a chấ t pha đê ̣m chiế t
STT Nồ ng đô ̣ Nồ ng đô ̣ sử Hó a chất Thể tích
stock du ̣ng
CTAB 2% 0,5 g 1 Bô ̣t
NaCl 5 M 1,4 M 7 ml 2
EDTA pH 8 0,5 M 20 mM 1 ml 3
Tris- HCl pH 8 1 M 100 mM 2,5 ml 4
β -MercaptoEthanol 0,1% 25 µl 5
25 ml Thêm nướ c đến thể tích cuố i cù ng 25 ml
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 35S
STT Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl)
- 10 1 H2O
2X 12,5 2 Master mix
10 pmol/ µl 1 3 Mồi xuôi
10 pmol/ µl 1 4 Mồi ngược
100 ng/ µl 0,5 5 AND/ cDNA
25 Tổng
28
Bảng 2.6. Chu kỳ phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 5 phút
2 Biến tính 94 30 giây
3 Gắn mồi 56 30 giây 30 4 Kéo dài chuỗi 72 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 10 phút
6 Kết thúc phản ứng 15 ∞
Chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR
- Cân 0,4g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose
tan hoàn toàn. Để nguội 45 – 50oC đổ vào khuôn gel đã được chuẩn bị sẵn.
Sau 30 phú t khi gel đã nguội và đông cứng thì chuyển khay chứa bản gel
vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm
ngập bản gel khoảng 0,5 – 1 cm.
- Tra mẫu: Sản phẩm PCR tra vào các giếng trên gel.
- Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết
nối với bộ nguồn. Đặt 120V, 90mA, 30 phút.
- Nhuộm bản gel trong dung dịch ethibium trong 15 phú t. - Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, ADN sẽ được phát sáng
nhờ liên kết với EtBr.
- Chụp ảnh gel.
2.3.2.3. Các phương pháp phân tích xử lý số liệu
Hiệu suất chuyển gen được xác định bằng công thức:
Số cây mang gen chuyển
Hiê ̣u suất chuyển gen (%) = x 100 (%)
Tổ ng số mẫu biến na ̣p
29
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tạo cây dừa cạn mang gen chuyển crPrx
3.1.1. Chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào cây dừa cạn nhờ A.
tumefaciens
Hạt dừa cạn được khử trùng bằng cồn 70% lắc trong 1 phút và javen
60% lắc trong 15 phút, sau đó cho nảy mầm trên môi trường MS đến khi
cây con phát triển (hình 3.1 A-B), lá mầm được tách đôi, loại bỏ đỉnh sinh
trưởng để làm vật liệu nhận gen.
B A
C
Hình 3.1. Gieo hạt tạo cây con in vitro
A: Gieo hạt dừa cạn trên môi trường MS;
B: Hạt phát triển thành cây con; C: Hai mảnh lá mầm
30
Lá mầm được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có bổ sung
acetosyringone 100 M trong 30 phút (hình 3.2).
Hình 3.2. Ngâm mảnh lá mầm trong dịch huyền phù vi khuẩn
Sau đó thấm khô, cấy trên môi trường môi trường CCM. Nuôi trong
tối 3 ngày (hình 3.3).
Hình 3.3. Mảnh lá mầm trên môi trường đồng nuôi cấy CCM
31
Hình 3.4. Mẫu được thấm khô và đặt lên môi trường SIM
Hình 3.5. Mẫu phát triển đa chồi trên môi trường SIM
32
Hình 3.6. Chọn lọc kéo dài chồi trên SEM
Các chồi nhỏ sống sót kéo dài trên môi trường SEM có kháng sinh
chọn lọc kanamycin được chuyển sang môi trường ra rễ RM và sau đó đem
trồng lên giá thể (hình 3.7), cây tái sinh được đưa ra môi trường tự nhiên.
Hình 3.7. Cây ra giá thể
33
Chúng tôi tiến hành biến nạp cấu trúc gen crPrx nhờ vi khuẩn A.
tumefaciens qua nách lá mầm hạt chín của cây dừa cạn, các giai đoạn nuôi
cấy và chọn lọc, kết quả như sau: Lá mầm được ngâm trong dịch huyền
phù vi khuẩn có OD600nm = 0,8 bổ sung acetosyringone 100 M trong 30
phút. Sau khi đồng nuôi cấy 3 ngày, chuyển mẫu lên môi trường nuôi cấy
để chọn lọc và tái sinh chồi chuyển gen: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l +
MES 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l +
kanamycin 50 mg/ l. Các mẫu tạo chồi được đưa sang môi trường chọn lọc
như trên để tránh các mẫu chết sản sinh ra các chất làm ức chế tái sinh ở
các mẫu tạo chồi. Chồi đạt chiều cao 2 – 3 cm được chuyển sang môi
trường ra rễ: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + BAP 0,5mg/ l + IBA
0,4mg/ l + kanamycin 50 mg/ l. Cây con có chiều cao 8 – 10 cm và rễ đạt
từ 5 – 7 cm được đưa ra giá thể. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thống kê số lượng các mẫu chuyển gen vào cây dừa cạn
Lô thí nghiệm Số mẫu thí nghiệm Số mẫu tạo chồi Số chồi ra rễ
Số cây chồi kéo dài Số cây sống trên giá thể
Lần 1 300 100 32 18 7
366 97 33 22 8
Lần 2 * 50 0 0 0 0
Ghi chú: * ĐC0 lá mầm dừa cạn không chuyển gen được cấy trên môi trường tái
sinh có bổ sung kháng sinh. *ĐC1 lá mầm dừa cạn không chuyển gen được cấy trên môi
trường tái sinh không bổ sung kháng sinh
50 18 13 10 5 ĐC 0 ĐC* 1
Thí nghiệm chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào giống dừa cạn hoa
hồng nhụy tím qua hai lần biến nạp với 666 mảnh lá mầm (Bảng 3.1) thu
được 197 mẫu tạo chồi, 65 mẫu có chồi kéo dài trên môi trường kháng sinh
chọn lọc SEM, 40 chồi ra rễ khỏe mạnh và thu được 15 cây T0 phát triển
trên giá thể.
34
Song song với thí nghiệm lây nhiễm vi khuẩn chuyển gen crPrx,
chúng tôi có bố trí hai lô đối chứng là ĐC0 và ĐC1 (mỗi lô 50 mẫu). Kết
quả là lô ĐC0 (lá mầm dừa cạn không chuyển gen được cấy trên môi trường
tái sinh bổ sung kháng sinh chọn lọc), các lá mầm đều bị đào thải bởi
kháng sinh; lô ĐC1 (lá mầm dừa cạn không chuyển gen cấy trên tái sinh
không bổ sung kháng sinh chọn lọc) thu được 5 cây tái sinh không chuyển
gen sử dụng làm đối chứng.
Các cây dừa cạn T0 tái sinh sau lây nhiễm được trồng, chăm sóc
ngoài môi trường tự nhiên khoảng 4 tuần thì tiến hành thu mẫu lá để kiểm
tra sự có mặt và hoạt động của gen chuyển crPrx.
3.1.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển crPrx trong hệ gen cây dừa cạn
Trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật, có thể nói, một trong những
thành công sớm nhất và có giá trị nhất đối với lĩnh vực biểu hiện protein
thực vật chính là việc sử dụng các promoter cơ định có nguồn gốc từ virus
và vi khuẩn Agrobacterium làm công cụ biểu hiện gen ngoại lai hiệu quả
trong cây trồng biến đổi gen. Rất nhiều promoter như vậy đã được sử dụng
rộng rãi trong công nghệ gen thực vật và vẫn được tiếp tục là promoter
được chọn lựa trong các nghiên cứu biểu hiện nhanh, đơn giản với rủi ro
thấp. Một trong các promoter được sử dụng rộng rãi để điều khiển biểu
hiện gen ngoại lai trong cây trồng biến đổi gen là 35S. Promoter 35S là
promoter dạng cơ định có khả năng điểu khiển biểu hiện gen ở mức độ cao,
khả năng hoạt động mạnh ở nhiều loại mô của nhiều loài cây, hoạt động
mạnh ở cả các hệ thống biểu hiện tạm thời và các tế bào chuyển gen thực
vật ổn định [5].
Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển crPrx trong cây dừa cạn chuyển
gen, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi 35S để khuếch đại gen cần
xác định. Tiến hành tách chiết, tinh sạch DNA tổng số từ lá của 15 cây dừa
35
cạn chuyển gen và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Kết quả
kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% được thể hiện ở hình 3.8.
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen chuyển
crPrx trong các cây dừa cạn chuyển gen
M: thang chuẩn DNA 1kb; 1-15: sản phẩm PCR các cây chuyển gen; (+):
sản phẩm PCR 35S promoter; (-) sản phẩm PCR cây dừa cạn không chuyển gen
Trên gel điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen crPrx (Hình
3.8), làn chạy điện di của cây số 1-2-4-8-9-10-13 xuất hiện băng DNA với
kích thước khoảng 0,3 kb tương ứng kích thước ước tính cho 35S promoter
và xuất hiện ngang với vị trí của băng DNA ở làn điện di đối chứng dương
(sản phẩm PCR 35S promoter) điều đó chỉ ra rằng, hệ gen của cây dừa cạn
chuyển gen số 1-2-4-8-9-10-13 (ký hiệu DT01- DT02- DT04- DT08- DT09-
DT010- DT013) có mặt của gen crPrx. Hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn
đánh giá này đạt 7/ 666 = 1,05%.
Các cây dừa cạn chuyển gen dương tính với phản ứng PCR chính là
kết quả ban đầu có thể đưa đến thành công của quy trình chuyển gen crPrx
vào cây dừa cạn. Các cây dương tính với phản ứng PCR được chăm sóc và
ưu tiên phát triển nhằm có những phân tích tiếp theo về khả năng hoạt động
và biểu hiện của gen chuyển crPrx.
36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Chuyển thành công gen crPrx vào cây dừa cạn nhờ
Agrobacterium tumefaciens và tạo được 15 cây dừa cạn chuyển gen T0
trồng trong bầu đất ngoài môi trường tự nhiên.
1.2. Gen chuyển crPrx được xác định tồn tại trong hệ gen của 7
cây dừa cạn ở thế hệ T0 và hiệu suất chuyển gen đạt 1,05 %.
2. Đề nghị
Tiếp tục phân tích các dòng dừa cạn chuyển gen qua các thế hệ T1,
T2, T3… nhằm chọn tạo được dòng cây ổn định có khả năng tổng hợp
vinblastine và vincristine cao.
37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Viện dược liệu. (2001), "Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt
Bùi Thị Hà, Lương Thanh Huyền, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng 1. Mậu. (2014), "Tách dòng phân tử gen mã hóa peroxidase từ hai giống dừa cạn Catharanthus roseus", Tạp chí khoa học và công nghệ, Đại học Thái Nguyên, 119(15). 2. Bùi Thị Hà, Trần Thị Anh, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu. (2015), "Nghiên cứu hệ thống tái sinh đa chồi in vitro ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don)", Tạp chí Khoa học, 4, pp. 56 - 62. 3. Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng. (2006), "Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật và đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn Catharanthus roseus.", Tạp chí Phát triển Khoa học & Công nghệ - ĐHQG TPHCM, 9(6), pp. 59 - 66. 4. Đào Hùng Cường, Lê Xuân Văn. (2011), "Nghiên cứu chiết tách alkaloid của rễ cây dừa cạn hoa hồng tại Bình Định", Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Đà Nẵng, 43, pp. 85. 5. Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải. (2007), "Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5(1), pp. 1 - 18. 6. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo. (2005), "Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp", NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 7. Nam", Nxb Khoa học và Kỹ thuật, 1, pp. 57 - 89. Aerts R.J., Stoker A., Beishuizen M., van de Heuvel M., van der 8. Meijden E., Verpoorte R. (1992), "Detrimental effects of Cinchona leaf alkaloids on larvae of the polyphagous insect Spodoptera exigua", J Chem Ecol, 18(11), pp. 1955–1964. 9. Bùi Thị Hà, Chu Hoàng Mậu, Nguyên Thị Tâm, Đỗ Huy Hoàng. (2016), "Nghiên cứu quy trình chuyển gen gus ở cây dừa cạn", Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thái Nguyên, 157, pp. 71-75. 10. Costa M.M., Hilliou F., Duarte P., Pereira L.G., Almeida I., Leech M., et al. (2008), "Molecular cloning and characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the metabolism of anticancer alkaloids in Catharanthus roseus", Plant Physiol, 146(2), pp. 403 - 417. 11. Fattorusso E., Taglialatela O. (2008), "Modern alkaloids: structure, isolation, synthesis and biology", Wiley-VCH, Weinheim, Germany. 12. Ferreres F., Figueiredo R., Bettencourt S., Carqueijeiro I., Oliveira J., Gil-Izquierdo A., et al. (2011), "Identification of phenolic compounds in isolated vacuoles of the medicinal plant Catharanthus roseus and their interraction with vacuator class III peroxidase: an H2O2 affair", J Exp Bot, 62(8), pp. 2841-2854.
38
Javier P., Elisabeth M., Silvia F. (1998), "Effect of Agrobacterium in Solanaceae plants",
and hypocotyls as
functional analysis of the Catharanthus
zz. "http://en.wikipedia.org/wiki/Catharanthus_roseus". zz. "https://en.wikipedia.org/wiki/Agrobacterium".
13. Guggisberg A., Hesse M. (1996), "The Alkaloids", The University of Zurich. 14. rhizogenes T-DNA on alkaloid production Phytochemistry, 52(7), pp. 1287 - 1292. 15. Jinwei Liu, Jianhua Zhu, Le Tang, Wei Wen, Shuangshuang Lv, Rongmin Yu. (2013), "Enhancement of vindoline and vinblastine production in suspension-cultured cells of Catharanthus roseus by artemisinic acid elicitation", MIRCEN Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, DOI:10.1007/s11274-013-1432. 16. Kumar S1., Dutta A., Sinha A.K., Sen J. (2007), "Cloning, characterization and localization of a novel basic peroxidase gene from Catharanthus roseus", FEBS J, 274(5), pp. 1290-1303. 17. Kumar S1., Jaggi M., Taneja J., Sinha A.K. (2011), "Cloning and characterization of two new Class III peroxidase genes from Catharanthus roseus", Plant Physiol Biochem, 49(4), pp. 404-412. 18. Marfori E. C., Alejar A. A. (1993), "Alkaloid yield variation in callus cultures derived from different plant parts of white and rosypurple periwinkle Catharanthus roseus (L.) Don", Philippine Journal of Biotechnology, 4. 19. Pahwa D. (2008), "Catharanthus alkaloids", B Pharm Punjab University Chandigarh, 19(1), pp. 52 - 63. 20. Van der Heijden R., Jabos D., Snoeijer W., Hallard D., Verpoorte R. (2004), "The Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology", Curr Med Chem, 11, pp. 607 – 628. 21. Wang Q., Xing S., Pan Q., Yuan F. (2012), "Development of efficient catharanthus roseus regeneration and transformation system using agrobacterium explants", BMC tumefaciens Biotechnology, 29, pp. 12 - 34. 22. Wang Q., Yuan F., Pan Q., Li M., Wang G., Zhao J., et al. (2010), "Isolation and roseus deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase gene promoter", Plant Cell Rep, 29(2), pp. 185 - 192. 23. Zhao J1., Zhu W., Hu Q. (2001), "Selection of fungal elicitors to increase indole alkaloid accumulation in Catharanthus roseus suspension cell culture", Enzyme Microb Technol, 28(8), pp. 666 - 672. 24. 25.
39
