Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu đặc điểm hình thái và xác định một số trình tự gen phân loại cây sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai)

i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

----------

MAI HOÀNG OANH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ XÁC

ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ GEN PHÂN LOẠI

CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên – 2016

ii

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

----------

MAI HOÀNG OANH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ XÁC

ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ GEN PHÂN LOẠI

CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Hải Yến

Thái Nguyên - 2016

iii

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu,

các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công

bố trong một công trình nào khác.

LỜI CAM ĐOAN

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2016

Tác giả luận văn

Mai Hoàng Oanh

iv

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị

Hải Yến - Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái

Nguyên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn và ThS. Hồ

Mạnh Tường cùng các cán bộ nghiên cứu thuộc Phòng công nghệ ADN ứng

dụng - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo các nhà khoa học đã trực

tiếp giảng dạy truyền đạt những kinh nghiệm, kiến thức khoa học quý báu.

Cảm ơn các thầy cô, đồng nghiệp và bạn bè đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện

tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi luôn trân trọng và biết ơn sự giúp

đỡ hết mình đó.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở đào tạo

thuộc Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo

điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như quá trình

thực hiện đề tài.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tác giả luận văn

Mai Hoàng Oanh

v

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3

1.1. Tổng quan về cây sói rừng ....................................................................... 3

1.1.1. Phân loại học ......................................................................................... 3

1.1.2. Thành phần hóa học của cây sói rừng ................................................. 4

1.1.3. Tác dụng sinh học của cây sói rừng .................................................... 4

1.2. Tổng quan về mã vạch DNA .................................................................... 7

1.2.1. Giới thiệu về DNA Barcode ................................................................ 7

1.2.2. Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode .......................................... 8

1.2.3. Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở thực vật .......................................................................................................... 9

1.2.3.1. Trình tự gen nhân .................................................................................. 9

1.2.3.2. Vùng gen mã hóa ribosome ............................................................... 10

1.2.3.3. Trình tự gen lục lạp ............................................................................. 10

1.3. Ứng dụng của mã vạch DNA trong nhận biết cây dược liệu .................. 14

Chương 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 18

2.1. Vật liệu nghiên cứu, hóa chất và thiết bị ............................................... 18

2.1.1. Vật liệu thực vật .................................................................................. 18

2.1.2. Chủng vi khuẩn ................................................................................... 18

2.1.3. Hóa chất............................................................................................... 18

2.1.4. Thiết bị sử dụng .................................................................................. 19

2.1.5. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 19

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 19

2.2.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái .................................... 19

2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử ........................................................... 20

2.2.2.2. Kiểm tra sản phẩm DNA sau khi tách chiết ...................................... 21

2.2.2.3. Phương pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR ....................... 22

2.2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR ................................................................... 24

vi

2.2.2.5. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector ..................................... 25

2.2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt....... ............................................................................................................ 26

2.2.2.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony - PCR) ............... 26

2.2.2.8. Tách chiết plasmid từ tế bào E. coli .................................................. 28

2.2.2.9. Phương pháp xác định trình tự của gen ............................................. 29

2.2.2.10. Phương pháp phân tích số liệu .................................................... 29

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 30

3.1. Đặc điểm thực vật học của cây sói rừng thu tại Lạng Sơn ................... 30

3.2. Phân lập gen từ mẫu cây sói rừng .......................................................... 32

3.2.1. Tách chiết DNA tổng số ..................................................................... 32

3.2.2. Khuếch đại vùng gen nghiên cứu bằng phản ứng PCR ................... 33

3.2.3. Kết quả ghép nối gen vào vector tách dòng ...................................... 35

3.2.4. Kết quả chọn dòng tế bào mang gen tái tổ hợp ................................ 36

3.2.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp ................................................ 37

3.3. Kết quả xác định trình tự đoạn các đoạn gen nghiên cứu..................... 38

3.3.1. Phân tích trình tự đoạn gen rpoC1 ..................................................... 39

3.3.2. Phân tích vùng ITS ............................................................................. 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 48

vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tên tiếng Anh

Ký hiệu

Base pair

bp

Consortium for the Barcode of Life

CBOL

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

CTAB

Deoxyribonucleic acid

DNA

Deoxyribonucleostide triphosphate

dNTP

Ethylenediaminetetraacetic acid

EDTA

Escherichia coli

E. coli

Isopropylthio-beta-D-galactoside

IPTG

Ultraviolet

UV

Luria Bertani

LB

ITS-rDNA

Internal Transcribed Spacer-rDNA

Kilobase

Kb

Optical density

OD

Polymerase Chain Reaction

PCR

Ribonucleic acid

RNA

Ribosome deoxyribonucleic acid

rDNA

Ribonuclease

Rnase

Sodium dodecyl sulphate

SDS

Solution

Sol

Sequence-Tagged Site

STS

Tris - Acetic acid - EDTA

TAE

Taq polymerase

Thermus aquaticus polymerase

TE

Tris - Ethylenediaminetetraacetic acid

X-gal

X - 5 - brom - 4 - chloro3 - indolyl - β - D - galactosidase

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục

lạp .................................................................................................................. 111

Bảng 2.1. Các máy móc và các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ..................... 19

Bảng 2.2. Thành phần dung dịch đệm rửa ...................................................... 200

Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm tách ................................................... 200

Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR ........................................................ 22

Bảng 2.5. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen ITS .............................. 23

Bảng 2.6. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen rpoC1 ......................... 23

Bảng 2.7. Trình tự mồi dùng trong phản ứng PCR ........................................... 23

Bảng 2.8. Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng .... 25

Bảng 2.9.Thành phần môi trường chọn lọc tế bào vi khuẩn mang ................. 26

Bảng 2.10. Thành phần phản ứng colony - PCR ............................................ 27

Bảng 2.11. Chu trình nhiệt của phản ứng colony-PCR ................................... 27

Bảng 2.12. Thành phần hóa chất tách plasmid ............................................... 28

Bảng 3.1. Các vị trí sai khác giữa trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 ... 41

Bảng 3.2. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự nucleotide của gen

rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng thu tại lạng sơn ............................................ 41

Bảng 3.3. Mức độ tương đồng của gen ITS của mẫu sói rừng nghiên cứu với

một số trình tự trên ngân hàng gen thế giới (NCBI) ....................................... 44

Bảng 3.4. Các vị trí sai khác giữa trình tự nucleotide của đoạn gen ITS ........ 46

Bảng 3.5. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự nucleotide của gen

ITS phân lập từ mẫu sói rừng thu tại lạng sơn ................................................ 46

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh cây sói rừng trong tự nhiên ............................................... 3

Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT ............................................................................ 25

Hình 3.1. Mẫu cây Sói rừng thu thập tại Lạng sơn ......................................... 30

Hình 3.2. Các bộ phận của cây sói rừng ............................................................ 31

Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số cây Sói rừng trên gel agarose 1% ....... 32

Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm nhân gen rpoC1 và sản phẩm nhân gen

ITS từ các cặp mồi đặc hiệu ........................................................................... 34

Hình 3.5. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến .................. 35

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR - clony các khuẩn lạc sử dụng mồi

rpoC1 và mồi ITS ........................................................................................... 37

Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết plasmid .................................. 38

Hình 3.8. Trình tự nucleotide của đoạn rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng và

hai trình tự mang mã số EF380352 và KP256024 trên Genbank ................... 40

Hình 3.9. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng đoạn gen rpoC1 của

mẫu sói rừng với mẫu EF380352 và KP256024 trên Genbank. ..................... 42

Hình 3.10. Trình tự nucleotide của đoạn gen ITS phân lập từ mẫu sói rừng SR và

4 trình tự mang mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 trên ngân

hàng gen quốc tế ............................................................................................... 45

Hình 3.11. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng đoạn vùng gen ITS của

mẫu sói rừng với mẫu có mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601

trên ngân hàng gen quốc tế …………………………………………………..46

1

MỞ ĐẦU

Theo đánh giá của Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh ung thư hiện nay luôn

là gánh nặng của nền kinh tế - xã hội đối với mọi quốc gia, trung bình mỗi

năm có thêm 10 - 16 triệu người mắc bệnh. Đây là một căn bệnh nguy hiểm,

có tỷ lệ tử vong cao. Mặc dù hiện nay đã có rất nhiều phương pháp điều trị

hiện đại nhằm loại bỏ khối u như phương pháp xạ trị, hóa trị, liệu pháp

hormon, liệu pháp sinh học, điều trị trúng đích và ghép tế bào gốc để ức chế

và tiêu diệt tế bào ung thư. Ngoài ra, người bệnh còn phải sử dụng các thuốc

nhằm nâng cao thể trạng, khắc phục hậu quả do khối u gây ra, kéo dài thời

gian sống cho người bệnh. Tuy nhiên, phương pháp này rất tốn kém về mặt

kinh tế [3], [9].

Ngày nay việc sử dụng các loại thuốc thảo dược theo cách cổ truyền

hay các hợp chất được tổng hợp từ các chất có nguồn gốc thiên nhiên có xu

hướng ngày càng tăng và chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học, bởi

chúng có khả năng chữa trị bệnh cao, an toàn và ít tác dụng phụ. Ở Việt Nam

tính đến 2005 đã xác định được 3948 loài thực vật và nấm, 52 loài tảo biển,

408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc. Đa số các cây

thuốc mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu trong các quần xã rừng, chỉ có gần 10 %

trong số đó là cây thuốc trồng [1]. Kết quả này cũng đã cho thấy nguồn dược

liệu ở nước ta rất phong phú đa dạng về chủng loại.

Các nghiên cứu khoa học gần đây cho thấy cây Sói rừng (Sarcandra

Glabra (Thunb.) Nakai) là dược liệu có khả năng chữa trị các bệnh cảm mạo,

viêm phổi, viêm ruột thừa, đau lưng và một số bệnh ung thư như ung thư tụy,

ung thư dạ dày, ung thư gan, ung thư trực tràng, ung thư cuống họng… [2],

[12], [21]. Tuy nhiên việc nghiên cứu sử dụng cây thuốc còn chưa được quan

tâm đúng mức đã và đang làm cho khu vực phân bố của loài bị thu hẹp và trữ

lượng của loài suy giảm một cách nghiêm trọng.

2

Hiện nay thị trường về các nguồn nguyên liệu thảo dược dùng trong sản

xuất dược phẩm có tiềm năng lớn và đang tiếp tục phát triển. Tuy nhiên cùng

với sự phát triển đó, sự giả mạo các nguyên liệu thảo dược thuốc cũng trở

thành vấn đề toàn cầu. Các nguyên liệu thảo dược có thể được thay thế bằng

các loại thảo mộc khác có quan hệ họ hàng gần gũi.

DNA barcode là một trong những phương pháp phục vụ định danh loài

chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng DNA

chuẩn hay còn gọi là chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode). Việc

xác định loài bằng DNA chỉ thị có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài

thực vật.

Xuất phát từ những nguyên nhân và lý do trên, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm hình thái và xác định một số trình

tự gen phân loại cây sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai)”.

 Mục tiêu nghiên cứu

- Mô tả được một số đặc điểm hình thái của cây sói rừng (Sarcandra

Glabra (Thunb.) Nakai

- Xác định được một số trình tự gen phân loại cây sói rừng Sarcandra

Glabra (Thunb.) Nakai.

 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu đặc điểm thực vật học của cây sói rừng

- Nghiên cứu thông tin về trình tự gen rpoC1 và ITS. Nhân bản và tách

dòng hai đoạn gen rpoC1 và ITS .

- Xác định, phân tích sự đa dạng về trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1

và ITS được phân lập từ mẫu sói rừng thu được từ Lạng Sơn.

3

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây sói rừng

1.1.1. Phân loại học

Tên khoa học: Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai.

Phân loại:

Giới: Plantae

Bộ: Chloranthales

Họ: Chloranthaceae

Chi: Sarcandra

Loài: S. glabra.

Ngoài ra còn có tên khác như: Chloranthus brachystachys Blum,

Chlorathus glaber (Thunb.) Makino, Sarcandra Chloranthus Gardeno, thuộc

họ Hoa sói Chloranthaceae.

Ở Việt Nam cây sói rừng còn

có một số tên gọi khác như sói lãng,

sói nhẵn, cửu tiết kim túc lan, cửu

tiết trà, cửu tiết phong, trúc tiết trà,

tiếp cốt liên, thảo sách hồ, tiếp cốt

mộc [5].

Cây Sói rừng phân bố ở nhiều

nước: Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật

Bản, Ấn Độ, Việt Nam và Malaysia.

Ở Việt Nam, cây mọc hoang ở vùng Hình 1.1. Hình ảnh cấy Sói rừng

núi đất, ở bìa rừng và ven đồi ẩm trong tự nhiên

nhiều nơi như: Cao Bằng, Lạng Sơn,

Hòa Bình đến Kon Tum, Lâm Đồng. Thu hái toàn cây vào mùa hạ, dùng tươi

4

hay phơi khô trong râm. Rễ thu hái quanh năm, rửa sạch cắt đoạn, phơi khô

trong râm hoặc dùng tươi [5].

1.1.2. Thành phần hóa học của cây sói rừng

Trong thành phần cây Sói rừng có chứa một số hợp chất có hoạt tính sinh

học cao như: flavonoid, coumarin , sesquiterpen, saponin,… . Các este, phenol,

đường, flavon, cyanogens, axit fumaric, …[7].

Các nhà khoa học Trung Quốc, Mỹ, Nhật khi nghiên cứu về cây thuốc

cho thấy thành phần hóa học chủ yếu của cây Sói rừng là sesquiterpen lactose,

curmarin, flavonoid [17], [19], [46].

Những nghiên cứu gần đây về thành phần hóa học đã xác định Sói rừng

có chứa một số các hợp chất thuộc nhóm flavonoid như chloranoside A;

Tertorigenin 7-glucoside có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương

khớp và tiêu hóa, hợp chất isofraxidin, một vị thuốc trong bài thuốc trị bệnh

vảy nến tại Trung Quốc [4], [6]. Bên cạnh đó, bột cây Sói rừng còn có hoạt

tính kháng gốc tự do, có tác dụng ức chế sự phát triển của các khối u, hỗ trợ

trong điều trị bệnh ung thư. Các kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy dịch

chiết sói rừng có tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư

người Hep-A549, HCT-29, BGC-823 [2], [12].

1.1.3. Tác dụng sinh học của cây sói rừng

Theo Đông y, cây Sói rừng có vị đắng cay, tính hơi ấm, có tác dụng

hoạt huyết giảm đau, khử phong trừ thấp, tiêu viêm giải độc. Trong dân gian,

rễ cây được ngâm rượu, uống chữa đau tức ngực. Lá được sắc uống trị bệnh

lao, hoặc giã đắp chữa rắn cắn, ngâm rượu xoa bóp chữa vết thương, mụn

nhọt, phong thấp, đau nhức xương khớp [4], [6].

Ở Trung Quốc, cây được dùng để chữa một số bệnh ung thư: ung thư

tụy, dạ dày, trực tràng, gan, lỵ, gãy xương, thấp khớp, đau lưng, cảm mạo,

kinh nguyệt không đều, hoa được dùng để ướp trà [4], [7].

5

Ngoài ra dịch chiết từ cây sói rừng có tác dụng chống viêm đạt hiệu quả

97,6% mà không gây tác dụng phụ, đặc biệt phần lá cây có tác dụng kháng

khuẩn mạnh nhất. Các nhà y học cổ truyền Trung Quốc đã bào chế Sói rừng

thành dạng thuốc tiêm bắp để trị bệnh viêm đa khớp dạng thấp một cách hiệu

quả [6], [12].

Theo các tài liệu thu thập được, các nhà khoa học còn tìm hiểu tác dụng

lên hệ miễn dịch của cây sói rừng.

Nghiên cứu về tác dụng kháng u, Zhong L. và cộng sự nghiên cứu ảnh

hưởng của Sói rừng trên phòng và chữa bệnh giảm tiểu cầu sau hóa trị liệu. Kết

quả thí nghiệm đã chứng minh S.glabra có tác dụng rõ rệt trong điều trị giảm

tiểu cầu và có thể ngăn ngừa chứng giảm tiểu cầu gây ra bởi 5-FU.

Wen J. và cộng sự (2003) đã sử dụng dịch chiết Sarcandra glabra

(Thunb.) Nakai tiêm cho chuột được cấy ghép tế bào ung thư gan Hep-A22

đồng thời cũng quan sát tác dụng của dịch chiết trên sự phát triển in vitro của

dòng tế bào này. Kết quả cho thấy dịch chiết đã làm giảm sự phát triển của tế

bào ung thư Hep-A22 cả trên in vitro và in vivo [47].

Trong một nghiên cứu khác của Zhenzhen Z., chất SGP-2, một

polysaccharide chiết xuất từ Sacandra glabra đã ức chế sự tăng sinh và di căn

của tế bào ung thư MG-63 in vitro [55]. Các kết quả nghiên cứu trên đã tạo tiền

đề xây dựng cơ sở khoa học cho những nghiên cứu chống ung thư tiếp theo của

các thành phần có hoạt tính sinh học trong cây sói rừng [29].

Kang và cộng sự [28] nghiên cứu tác dụng ức chế khối u của dịch chiết S.

glabra và gây chết tế bào theo chương trình của dòng tế bào gây ung thư biểu

mô mũi - họng ở người. Kết quả cho thấy dịch chiết Sói rừng ngăn cản sự phát

triển khối u invivo.

Yuan K., Zhu J.X. và cộng sự nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn dịch

chiết n - butanol của Sói rừng. Kết quả cho thấy đường kính vòng vô khuẩn theo

6

mm của các hợp chất kaempferol-3-O-beta-D-glucoronid, isofraxidin-7-O-beta-

D-glucopyranosid, kaempferol được ghi lại có thứ tự là 14,67±0,08; 11,14±1,06;

8,26 ±1,26 [52].

Xu X.D., Hu X.R. và cộng sự [49] nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của

Sói rừng. Kết quả thực nghiệm cho thấy phân đoạn chloroform và EtOAc của

dịch chiết EtOH toàn cây Sói rừng, có tác dụng kháng khuẩn mạnh.

Đồng thời với nghiên cứu ức chế sự phát triển các tế bào u, các nhà khoa

học còn tìm hiểu tác dụng lên hệ miễn dịch của cây sói rừng. Theo các tác giả

He R. (2009) và Sun W. (2015) về tác dụng của dịch chiết Sarcandra Glabra

(Thunb.) Nakai lên hệ miễn dịch của chuột thì dịch chiết có liên quan tới sự cân

bằng của tế bào T, làm tăng phần trăm diệt tự nhiên và hiệu quả bảo vệ theo kiểu

miễn dịch ở chuột bị ung thư thông qua sự cải thiện tỉ lệ và số lượng tế bào miễn

dịch, tăng trọng lượng lách, tuyến ức và tăng số lượng bạch cầu [23], [38].

Trong một thí nghiệm của tác giả Từ Quốc Lượng và cộng sự (2005), dịch

chiết phân đoạn cây sói rừng làm tăng trọng lượng lách, tuyến ức và số lượng

tiểu cầu trên chuột xuất huyết giảm tiểu cầu. Nghiên cứu ảnh hưởng của cây sói

rừng trên điều trị giảm tiểu cầu do hóa trị liệu [39].

Trên các bệnh nhân ung thư biểu mô mũi họng, điều trị tia xạ kết hợp

uống cao Sói rừng đã làm giảm được một số tác dụng phụ do tia xạ so với chỉ

tia xạ đơn thuần [20].

Có rất nhiều bài thuốc dân gian sử dụng cây Sói rừng làm thuốc trong

điều trị viêm khớp, phong thấp. Ngoài ra Sói rừng còn có mặt trong thành phần

của một số thực phẩm chức năng như Flamasol, Hoàng Thấp Linh,viên Gout

Tâm Bình, Tiêu Khiết Thanh, hỗ trợ điều trị cho người bị viêm đau khớp, thấp

khớp, viêm khớp dạng thấp, thoái hóa khớp, giúp phòng ngừa và giảm các triệu

cứng viêm đường hô hấp.

7

1.2. Tổng quan về mã vạch DNA

1.2.1. Giới thiệu về DNA Barcode

Để phân loại và xác định loài ở động, thực vật hiện nay có rất nhiều

phương pháp nghiên cứu khác nhau, hầu hết các phương pháp đều dựa trên

các nguyên tắc như những loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống

nhau, càng gần nhau thì tính chất giống nhau càng nhiều. Trong đó phương

pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được một

hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ

và toàn diện. Tuy nhiên phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác

biệt về hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ quan

sinh sản (hoa) nên cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu

vật đang trong giai đoạn phát triển (chưa ra hoa), những mẫu thực vật có đặc

điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trường hoặc khó nhận

biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài

[24], các mẫu thực vật cần giám định không còn nguyên vẹn, mất hình thái

bên ngoài. Ngoài ra, phương pháp phân loại hình thái thường chỉ thực hiện

được bởi các chuyên gia hình thái học, việc phân loại tốn nhiều thời gian và

công sức [22]. Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh

nghiệm dân gian sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh

học phân tử hiện đại.

Năm 2003, khái niệm mã vạch DNA được Paul Heber, nhà nghiên cứu

tại Đại học Guelph, Ontario đưa ra lần đầu tiên, nhằm giúp nhận diện các mẫu

thực vật [31]. Mã vạch DNA là một phương pháp định danh mà nó sử dụng

một đoạn DNA chuẩn ngắn (400 - 800 bp) nằm trong bộ genome của sinh vật

đang nghiên cứu nhằm xác định sinh vật đó thuộc về loài nào.

Kỹ thuật DNA mã vạch giúp các nhà phân loại học trong công tác phân

loại và xác định loài. Nâng cao năng lực kiểm soát, hiểu biết và tận dụng sự

đa dạng sinh học. Ngoài ra, kỹ thuật này có triển vọng nghiên cứu và ứng

dụng trong khoa học cuộc sống, trong khoa học pháp y, y tế, nghiên cứu y

dược, sản xuất và kiểm soát chất lượng thực phẩm. Phương pháp này vô cùng

8

có ý nghĩa trong các trường hợp các mẫu vật sinh học cần giám định loài đã

được qua xử lý, chế biến như các dạng chế phẩm thuốc hay thực phẩm đã qua

chế biến…

Để thúc đẩy việc sử dụng DNA barcode cho tất cả sinh vật nhân chuẩn

sống trên hành tinh này, CBOL (Consortium for the Barcode of Life ) đã được

thành lập vào tháng 5 năm 2004, gồm hơn 120 tổ chức từ 45 quốc gia. Với

mục tiêu ban đầu là xây dựng một thư viện trực tuyến trình tự barcode cho tất

cả các loài chưa được biết đến, có thể làm tiêu chuẩn phân loại cho bất kỳ

mẫu DNA nào. Với sự hỗ trợ của CBOL, DNA barcode ngày càng phát triển

và trở thành một phương pháp phân loại và định danh loài mới [33].

Trong bối cảnh của nền kinh tế phát triển nhanh và hậu quả tác động

đến động vật, thực vật của các quốc gia khác nhau, sự xác định loài sử dụng

phương pháp nhanh là cần thiết để đánh giá đa dạng sinh học của các khu vực

này nhằm bảo vệ các loài đặc hữu quý hiếm và nguy cấp. Tuy nhiên cần lưu ý

rằng DNA barcode không thể thay thế phân loại nhưng nó là công cụ hữu ích

để tạo ra thông tin về đơn vị phân loại chưa biết. Hiện nay, trên thế giới, kỹ

thuật này đang được sử dụng chủ yếu bởi các nhà phân loại học và nhiều nhà

khoa học ở các lĩnh vực khác như khảo cổ học, công nghiệp sinh học và chế biến

thực phẩm…

1.2.2. Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode

Đặc điểm quan trọng nhất của DNA barcode là phải phổ biến và đặc hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng. Điều này có nghĩa là các đoạn gen được sử dụng như một barcode nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có sự biến đổi giữa các loài nhưng ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi không đáng kể. Do đó, DNA barcode lý tưởng là một đoạn DNA có trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp được với cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để dễ dàng khuếch đại bằng PCR.

Với động vật, hệ gen ty thể với các đặc tính di truyền theo dòng mẹ, tốc độ đột biến cao chủ yếu là các đột biến thay thế trong vùng mã hoá, vùng điều

9

khiển và không tái tổ hợp được coi là một công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu tìm ra nguồn gốc các loài.

Quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực vật gặp nhiều khó khăn. Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối với chỉ thị DNA và hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal Transcribed Spacer) thường được sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên cứu [15], [35], [41]. Trong vòng 5 năm qua, nhiều vùng gen đã được nghiên cứu và đề xuất là chỉ thị DNA cho thực vật [16], [27], [41]. Tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận [16], [30], [34]. Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để định danh loài đối với thực vật [16], [27], [39].

Theo Taberlet P. và cộng sự (2007), hệ thống mã vạch DNA lý tưởng

phải đáp ứng các yêu cầu sau đây:

- Thứ nhất, đoạn DNA chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt giữa các loài nhưng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong cùng loài.

- Thứ hai, hệ thống định danh bằng DNA phải được chuẩn hóa, với cùng một vùng DNA có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau.

- Thứ ba, đoạn DNA chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có

thể dễ dàng định danh loài vào các nhóm phân loại (chi, họ,…).

- Thứ tư, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mồi nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự DNA [39].

1.2.3. Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở

thực vật

1.2.3.1. Trình tự gen nhân

Các trình tự barcode được nhân bản từ DNA hệ gen của bố mẹ dự kiến sẽ cung cấp nhiều hơn thông tin về các loài cần xác định. Tuy nhiên khó khăn trong việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc

10

có bản sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lượng DNA genome và khả năng phân biệt dưới loài do bảo toàn gen chức năng có thể chính là lý do tại sao hạn chế số lượng các gen nhân được thử nghiệm trong xác định loài bằng phương pháp DNA barcode [43], [50].

1.2.3.2. Vùng gen mã hóa ribosome

Gen DNA ribosome (rDNA) là hệ thống đa gen mã hóa phần RNA của ribosome. Các gen rDNA mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi. Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S và xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers) nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S. Vùng mã hóa của ba gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS. Nhìn chung các đơn vị rDNA được lặp lại hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể. Một trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống đa gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khác biệt giữa các loài khác nhau.

Hiện tại, nrITS vùng ITS của gen nhân được xem là một trong những công cụ hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì nó phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chức năng [13]. Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản vô tính cho thấy một số mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 do nhiều nguyên nhân như lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và hình thành gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó. Trên cơ sở này nrDNA có thể được sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả thực vật trong cùng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm, lâu năm, trên cạn, dưới nước) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [43], [50], [51].

1.2.3.3. Trình tự gen lục lạp

Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử DNA mạch vòng có kích thước 120 - 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large single- copy region) và bản sao đơn nhỏ (small single-copy region). Hai bản sao được

11

phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau (IRa và IRb) có độ dài trung bình 20 - 30 kb. Hệ gen lục lạp chứa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao), các gen tRNA (35 gen) và các gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp trong lục lạp (khoảng 100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng [8].

Bảng 1.1. Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp [14], [26], [ 44]

Mồi Trình tự 5’→3’

ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC

rbcL

GAACTCGTCGGATGGAGTG GAGAAATCTTTTTCATTACTACAGTG CGTACTTTTATGTTTACAGGCTAA TAAACGATCCTCTCATTCACGA

matK

AAGTGCATTGTTGGAACTGG ATGCAACGTCAAGCAGTTCC CCGTATGTGAAAAGAAGTATA GATCCCAGCATCACAATTCC

rpoB

GTGGATACACTTCTTGATAATGG GGCAAAGAGGGAAGATTTCG TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC CCATAAGCATATCTTGAGTTGG

rpoC1

→ ← → ← → ← → → ← ← → → ← ←

GGATTATTAGTCACTCGTTGG ACTTTAGAGCATATATTAACTC ACTTACGTGCATCATTAACCA CCCAATACCATCATACTTAC

ycf5 (ccsA) → → ←

CGCGCATGGTGGATTCACAATCC GTTATGCATGAAAGTAATGCTC ACTGCCTTGATCCACTTGGC CGAAGCTCCATCTACAAATGG

CGAAATCGGTAGACGCTACG GGGGATAGAGGGACTTGAAC GGTTCAAGTCCCTCTTATCCC

trnH - psbA

ATTTGAACTGGTGACACGAG3’ GGGCAATCCTGAGCCAA CCATTGAGTCTCTGCACCTATC

trnL-F

a-f a-r matK 1F matK 1R matK 2F matK 2R rpoB 1 rpoB 2 rpoB 3 rpoB 4 rpoC1 1 rpoC1 2 rpoC1 3 rpoC1 4 ycf5 1 ycf5 2 ycf5 3 ycf5 4 trnH2 psbAF trnH(GUG) psb A trnL-c trnL-d trnL-e trnL-f trnL-g trnL-h → ← → ← → ← → ← → ←

Kí hiệu: → mồi xuôi; ← mồi ngược

12

a. Trình tự gen rbcL

Trong các gen lạp thể, rbcL là trình tự gen đặc trưng nhất, mã hóa các

tiểu đơn vị lớn của rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/ oxygenase

(RUBISCO). rbcL là gen đầu tiên được giải trình từ thực vật. rbcL đã được sử

dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật với hơn

10000 trình tự rbcL có sẵn trong GenBank. Do sự dễ dàng trong khuếch đại

PCR ở một số nhóm thực vật, CBOL gần đây đã công nhận rbcL là một trong

những trình tự gen tiềm năng nhất cho các nghiên cứu DNA barcode ở thực

vật. Tuy nhiên, do khả năng phân biệt loài thấp, nên hầu hết các nhóm đều

cho rằng nên sử dụng kết hợp rbcL với các với các chỉ thị barcode khác, ví dụ

như matK là hai locus barcode chuẩn cho thực vật [43], [45], [50].

b. Trình tự gen matK

Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hoá nhanh

nhất, có kích thước khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên quan

đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA. Do matK

tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã được sử dụng như một chỉ

thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật. CBOL

đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt

kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn và đề nghị sử

dụng matK là một trong những locus barcode chuẩn cho thực vật [42], [50].

c. Trình tự gen rpoB và rpoC1

Gen rpoB, rpoC1, rpoC2 mã hóa ba trong 4 tiểu đơn vị của RNA

polymerase lục lạp. Khi nghiên cứu họ Dipterocarpaceae, Tsumura và cộng sự

(1996) đã nhận thấy gen rpoB là thích hợp để nghiên cứu phát sinh loài. Hiện

nay, rpoB là gen được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phát sinh loài và xác

định các loài vi khuẩn, đặc biệt là khi nghiên cứu các chủng có quan hệ gần

gũi. Cùng với gen 16S rRNA, rpoB được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để

13

xác định loài vi khuẩn mới, do vậy các gen này được đề xuất là chỉ thị

barcode độc lập hoặc kết hợp với một số gen khác.

rpoC1 có cấu trúc vòng kép, bền vững. Chiều dài trung bình khoảng

520 bp. Chức năng mã hóa cho enzyme RNA polymerase β – Tiểu đơn vị.

Trong nghiên cứu Liu và cộng sự (2010) đã chỉ ra rpoC1 là một chỉ thị

rất hữu ích khi được sử dụng để phân biệt các loài bryophytes. Do vậy cần có

các nghiên cứu tiếp theo để chứng minh sự phù hợp khi sử dụng rpoB và

rpoC1 làm chỉ thị barcode trong các nghiên cứu giám định loài [41], [45].

d. Trình tự gen ycf5

Gen ycf5 mã hóa cho một protein có chứa 330 amino axit. Gen này

được bảo tồn trên tất cả các vùng thực vật và đã được kiểm nghiệm cho phù

hợp với DNA barcode của một vài nhóm. Tuy nhiên, gen này chưa được công

nhận và sử dụng nhiều trong vai trò của một DNA barcode [42], [43].

e. Trình tự hai gen trnH-psbA

Gen trnH-psbA có kích thước trung bình khoảng 450 bp, nhưng thay

đổi từ 296 đến 1120 bp, trnH-psbA được chứng minh là có khả năng xác định

loài cao. Locus trnH-psbA đã được khuếch đại thành công ở nhiều thực vật

hạt kín và hạt trần. Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín trnH-psbA lại có

kích thước rất ngắn (~ 300 bp), kích thước của gen này thay đổi lớn do sự có

mặt của gen rpS19 hoặc các gen giả nằm giữa cùng gen của hai gen trnH và

psbA. Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử dụng trnH-psbA

như chỉ thị barcode độc lập cho thực vật hay kết hợp với matK. CBOL thấy

rằng khả năng phân biệt loài của trnH-psbA là cao nhất (69%) trong số 7

locus được thử nghiệm và do đó đề nghị nó như là chỉ thị barode bổ sung.

trnH-psbA có thể sử dụng trong hệ thống barcode ba locus khi hệ thống

barcode hai locus không cung cấp đầy đủ khả năng phân tích [37], [43].

14

f. Trình tự hai gen trnL (UAA)-trnF (GAA)

Locus trnL (UAA) - trnF (FAA) chứa gen trnL (UAA), vùng intron và

vùng nằm giữa hai gen trnL (UAA) và trnF (GAA). Taberlet và đtg là nhóm

nghiên cứu đầu tiên sử dụng trnL trong các nghiên cứu hệ thống học thực vật.

Vùng không mã hoá trnL(UAA) và trnF (GAA) không phải là vùng có sự

biến đổi lớn nhất của DNA lục lạp nhưng có ưu thế như cấu trúc bậc 2 với

vùng biến đổi và vùng bảo thủ xen kẽ nhau. Điều này tạo thuận lợi cho các

nghiên cứu tìm kiếm trình tự nucleotide ở các vùng bảo thủ để thiết kế mồi và

sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại các đoạn gen ở vùng biến đổi. Trong

nghiên cứu để xác định trnL (UAA) intron có nên được sử dụng làm vùng

DNA barcode, Taberlet (2007) đã sử dụng 100 loài thực vật và kết luận rằng

trnL intron có thể sử dụng như là một barcode của thực vật, trnL-trnF là một

barcode tiềm năng cho phân tích, xác định các loài thực vật [39], [43], [51].

1.3. Ứng dụng của mã vạch DNA trong nhận biết cây dược liệu

Việt Nam là quốc gia có nguồn tài nguyên sinh vật rất đa dạng và

phong phú với nhiều loài động vật, thực vật, nấm có giá trị kinh tế cao. Trong

đó, thực vật là giới sinh vật có tính đa dạng rất cao về loài. Đến nay, có

khoảng 350.000 loài thực vật đã được nhận dạng. Vậy bằng cách nào để phân

biệt được sự khác nhau hay giống nhau và mối quan hệ giữa các loài, các cá

thể sinh vật. Từ thời thượng cổ, các Nhà khoa học đã biết cách sắp xếp cây cỏ

theo những trật tự nhất định để có thể nhận biết chúng một cách dễ dàng. Con

người đã cố gắng tìm những đặc điểm giống nhau để sắp xếp cây cỏ vào từng

nhóm, nhưng lại dựa vào những đặc điểm sai khác để phân biệt nhóm này với

nhóm kia. Như vậy, theo phương pháp truyền thống, việc phân loại hay giám

định sinh vật chủ yếu dựa trên chỉ thị về hình thái hoặc các đặc tính sinh lý

sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn. Phương pháp

phân loại truyền thống này trong nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và

hạn chế, như: nhiều sinh vật có hình thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất

15

khác nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất khác nhau), ngược lại nhiều

sinh vật có hình thái rất khác nhau nhưng lại rất gần nhau trong hệ thống phân

loại (hệ gen rất giống nhau). Mặt khác, phương pháp phân loại truyền thống

dựa trên các đặc điểm hình thái rất khó phân biệt được sự khác biệt giữa các

biến dị dưới loài. Đặc biệt, đối với những mẫu vật có nguồn gốc sinh vật đã bị

biến đổi về hình thái, như những mẫu sinh vật đã chết, bị chôn vùi dưới đất, ở

các công trình xây dựng, đã qua chế biến thì không thể xác định được bằng

chỉ thị hình thái. Gần đây nhờ vào sự phát triển của khoa học công nghệ nói

chung và các kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã cho phép chúng ta nhanh

chóng xác định được sự khác biệt về vật chất di truyền giữa các loài sinh vật,

thậm chí giữa các cá thể sinh vật trong cùng loài. Từ đó có thể định danh

được sinh vật và xác định được mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần

thể hay xuất xứ. Như vậy, việc kết hợp giữa chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử

DNA sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữa sinh vật này với sinh

vật khác một cách chính xác. Vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử được xem

là công cụ hỗ trợ có hiệu quả cho việc phân tích di truyền ở các loài sinh vật.

Trong đó, mã vạch DNA được xem như là một công cụ để giám định sinh vật

và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài.

Xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch DNA là hướng nghiên cứu mới. Nhận

thấy vai trò, ý nghĩa và sự cần thiết của việc xây dựng ngân hàng mã vạch

DNA, ở Việt Nam các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý cũng đã bắt đầu

tiếp cận và quan tâm đến hướng nghiên cứu này, nhằm hướng tới xây dựng một

ngân hàng dữ liệu mã vạch DNA quốc gia cho các loài sinh vật (Động vật, thực

vật, vi sinh vật, virut,...) phục vụ phân loại, giám định, chẩn đoán bệnh, bảo tồn

và quản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở Việt Nam.

Thực vật dùng làm thuốc thảo dược luôn cần được xác định ở cấp độ

loài, vì vậy xác định chính xác là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về

chất lượng sản phẩm và có tầm quan trọng trong việc nghiên cứu các đặc tính

16

của sự đa dạng di truyền, phát sinh loài và phát sinh vùng địa lý cũng như

bảo vệ các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Cùng với sự phát triển của thị trường

thảo dược, sự giả mạo các nguyên liệu thảo dược thuốc cũng trở thành vấn đề

toàn cầu. Các nguyên liệu thảo dược này có thể được thay thế bằng các loại

thảo mộc khác có quan hệ họ hàng gần gũi, thậm chí từ những nguyên liệu giả

mạo. Việc giả mạo các nguyên liệu thảo dược thường là do:

- Vật liệu không phân biệt được bằng các đặc điểm hình thái

- Những vật liệu có tên tương tự nhau

- Việc thay thế những nguyên liệu có giá trị kinh tế bằng các nguyên

liệu khác rẻ tiền hơn.

Tuy nhiên, việc xác định chính xác các nguyên liệu thảo dược làm

thuốc theo phương pháp truyền thống như sự đánh giá cảm quan và phương

pháp hóa học đôi khi gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là những nguyên liệu có

nguồn gốc từ thực vật đã được chế biến một phần hoặc ở dạng bột. Vì vậy,

phương pháp sử dụng các dấu chuẩn phân tử rõ ràng là chính xác và phổ biến

hơn. Việc nhận biết các nguyên liệu thảo dược sử dụng phương pháp mã vạch

DNA có thể bảo vệ người dùng tránh khỏi tác dụng độc hại của các loại thuốc

giả mạo, đặc biệt trong nhiều trường hợp có thể nguy hiểm đến tính mạng.

Dưới đây trình bày một số mã vạch ADN đã được nghiên cứu và ứng dụng

trong các cây dược liệu.

Vùng ITS cung cấp số lượng thông tin đặc trưng lớn nhất và khả năng

xử lý tốt nhất 6 mẫu của Hedyotis L có họ với Rubiaceae. ITS đã được sử

dụng thành công để phân biệt 14 loài Hedyotis L, bao gồm cả loài chính

thống trong phương thuốc điều trị khối u “Baihuasheshecao” có nguồn gốc từ

H. diffusa Willd, và cả loài giả mạo có nguồn gốc từ H. corymbosa (L.) Lam.

Maturase K trình tự này đã thành công trong việc xác định các loại

thuốc thảo dược "Dahuang" có nguồn gốc từ Rheum palmatum L

17

(Polygonaceae), R. tanguticum (Maxim. Ex Regel) Maxim. ex Balf, R.

officinale Baill., và loài gần gũi Rheum L. với mức độ biến đổi nội bộ loài

và giữa các loài khác nhau là cao. Vì vậy, nó thường được sử dụng để xác

định các nguyên liệu thảo dược ở những vị trí địa lý khác nhau.

trnH-psbA cho thấy tỷ lệ khuếch đại thành công cao nhất (100%) và

tỷ lệ sai khác là 83% trong số chín locus thử nghiệm, bao gồm cả ITS, rbcL

và matK. Vì vậy, trnH - psbA được coi như 1 trình tự hữu ích để phân biệt

các loài thảo mộc với loài giả mạo nó. Nó được dùng để phân biệt loài giả

mạo Shihu Bulbophyllum odoratissimum (Sm.)Lindl.ex.Hook.f. (Orchidaceae)

có nguồn gốc từ loài Dendrobium Sw. với tỷ lệ sai khác trong trình tự là từ

2% đến 3,1%.

Tiểu đơn vị lớn của ribulose-bisphosphate carboxylase-rbcL trình tự

này có chất lượng cao khi làm thử nghiệm trên 7 locus. Tuy mức độ biến đổi

thấp giữa các loài khác nhau nhưng rbcL vẫn cho phép nhận biết được nguyên

liệu thảo dược với loại giả mạo nó (Ví dụ, thảo dược dương xỉ

"Mianmaguanzhong" có nguồn gốc từ Dryopteris crassirhizoma Nakai

(Dryopteridaceae) có 19 nucleotide là đa hình trong trình tự rbcL khi đối

chiếu với loài giả mạo.

18

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu, hóa chất và thiết bị

2.1.1. Vật liệu thực vật

Vật liệu nghiên cứu là cây sói rừng mọc thu được trên địa bàn tỉnh

Lạng Sơn.

2.1.2. Chủng vi khuẩn

Chủng vi khuẩn Escherichia coli (DH5α) sử dụng cho mục đích tách dòng

do Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

2.1.3. Hóa chất

Kit tinh sạch DNA (AccuPrep® Gel Purification Kit) của hãng Bioneer

(Hàn Quốc).

Enzyme hạn chế BamHI, T4 DNA Ligase của Fermentas (Hàn Quốc), Taq

DNA polymerase, RNase được mua từ hãng Fermentas.

Hóa chất dùng cho tách chiết DNA tổng số: Nitơ lỏng, EDTA, CTAB,

natriclorua, Tris hidroclorua, sorbitol, natridihidrophotphat, nước deion,

isopropanol, ethanol, chloroform, isoamyl alcohol, RNase.

Hóa chất dùng cho tách dòng gen: X-gal, IPTG, Vector tách dòng pBT

do phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học cung cấp,

Bacto tryptone, Yeast extract, NaCl, kháng sinh carbecillin

Hóa chất để tách plasmid: Sol I (Tris HCl, EDTA), Sol II (NaOH,

SDS), Sol III (Kali axetat), isopropanol, ethanol, phenol, chloroform.

Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: MgCl2, Buffer , Taq-polymerase, dNTP.

Hóa chất dùng trong điện di DNA: agarose, TAE 1X (Tris - Acetic

acide - EDTA), ethidium bromide.

19

2.1.4. Thiết bị sử dụng

Bảng 2.1. Máy móc và các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

STT

Tên máy, thiết bị

Hãng sản xuất

1

Tủ lạnh -4oC, -80oC

Nuaire (Mỹ)

2

Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire

Nuaire (Mỹ)

4

Cân điện tử (Electronic balances)

Ohaus (Mỹ)

5

Lò vi sóng

Sanyo (Nhật Bản)

6 Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320)

ThommasScientific (Mỹ)

7 Máy lắc ổn nhiệt

N-Biotek (Hàn Quốc)

8 Máy đo OD

ThommasScientific (Mỹ)

9 Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5417R

Đức

10 Máy Votex Micro one

ThommasScientific (Mỹ)

11 Bể ổn nhiệt

3 Máy điện di Powerpac300 Bio-Rad (Mỹ)

12 Máy PCR

PCR Themocycle

13 Máy soi gel với tia UV

Mỹ

14 Tủ hút vô trùng

Savant (Mỹ)

15 Máy phân tích trình tự DNA ABI 3100-Avant

Applied BioSciences (Mỹ)

Jeio Yech – Hàn Quốc)

2.1.5. Địa điểm nghiên cứu

Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học - Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái

Sử dụng phương pháp quan sát mô tả trực tiếp đối tượng lựa chọn đại

diện kết hợp với phương pháp đối chiếu, so sánh với các tài liệu đã có. Đây là

phương pháp thông dụng được dùng trong nghiên cứu thực vật học.

20

Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật về:

- Dạng sống

- Thân

- Lá (hình dạng phiến, chọp, gân, gốc, cuống, kích thước,…)

- Hoa (dạng cụm hoa, vị trí cụm hoa, kích thước,…)

- Quả và hạt (hình dạng, màu sắc, kích thước,…)

+ Dụng cụ và thiết bị hỗ trợ: máy ảnh, thước dây, thước kẹp (palme),..

2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử

2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Bảng 2.2. Thành phần dung dịch đệm rửa

STT Hóa chất Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng

Sorbitol 350 mM 1

Tris-HCl (pH 8,0) 1 M 100 mM 2

EDTA (pH 8,0) 0,5 M 5 mM 3

Sordium metabisulfit 5% 4

Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm tách

STT Hóa chất Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng

NaCl 3 M 1.5 M 1

Tris-HCl (pH 8,0) 1 M 100 mM 2

EDTA (pH 8,0) 0,5 M 20 mM 3

CTAB 4% 4

21

DNA được tách chiết bằng phương pháp CTAB có cải tiến bao gồm các

bước sau.

1. Ngiền nhanh 0,2g lá bằng cối chày sứ trong nitơ lỏng cho đến khi tạo thành

bột thật mịn, sau đó chuyển ngay vào ống Eppendorf 2ml, giữ trong đá.

2. Bổ sung 1ml đệm rửa, lắc mạnh trong 40 giây, ly tâm 12000 vòng/phút,

4oC, 7 phút

3. Loại bỏ dịch nổi và lặp lại từ 2 - 3 lần 4. Bổ sung 800 µl đệm chiết, lắc đều và giữ ở 65oC trong thời gian 30 phút

đến 1giờ

5. Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút

6. Bổ sung 800 µl chloroform : isoamyl alcohol (24:1) vào mẫu, lắc đều

trong thời gian 10 phút

7. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/ phút trong thời gian 15 phút ở 4oC

8. Dùng pipet chuyển dịch nổi sang ống Eppendorf 1,5 ml

9. Bổ sung một thể tích tương đương isopropanol lạnh và đảo nhẹ, giữ mẫu

trong đá 30 phút.

10. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong thời gian 15 phút ở 4oC

11. Loại bỏ dich nổi, rửa DNA bằng cách thêm 500 µl cồn 80%, ly tâm 12000 vòng/ phút trong thời gian 4 phút ở 4oC ( Bước này thực hiện 2 lần), sau

đó đảo nhẹ nhàng lọa bỏ cồn.

12. Làm khô DNA bằng quạt gió

13. Hòa tan trong 100 µl H2O

14. Sau khi DNA được hòa tan hoàn toàn thì bổ sung 3 µl Rnase (10mg/ml).

Giữ sản phẩm ở 37oC trong 1 giờ 15. Bảo quản DNA tổng số ở -20oC

2.2.2.2. Kiểm tra sản phẩm DNA sau khi tách chiết

DNA tổng số của các mẫu thực vật sau khi tách chiết sẽ được điện di trên

gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, ở hiệu điện thế 90V với marker 1kb.

Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số được kiểm tra qua phương

pháp đo mật độ quang phổ hấp phụ ở bước sóng 260 và 280 nm. Mỗi mẫu đo 3

22

lần và giá trị trung bình của ba lần đo được lấy làm kết quả cuối cùng. Độ tinh

sạch của mẫu thể hiện qua thông số A260/280, thông thường A260/280 =1,5 - 2,0 được

260 = 50 µg/µl.

coi là mẫu sạch protein, nồng độ DNA của mẫu được tính thông qua giá trị 1,0A

2.2.2.3. Phương pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR

Thể tích mỗi phản ứng PCR của mỗi mẫu là 25µl, được thực hiện trên máy

PCR. Quy trình nhiệt để nhân bản các đoạn gen và thể tích cụ thể của các thành

phần trong một phản ứng PCR được thể hiện ở Bảng 2.4, Bảng 2.5 và Bảng 2.6.

Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR

TT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl)

Nước khử ion vô trùng 12,75 1

Buffer 10X 2,5 2

25mM 2,0 3 Magie clorua

dNTPs 10mM 2,5 4

Mồi xuôi 10pmol 1,0 5

Mồi ngược 10pmol 1,0 6

Taq DNA polymerase 1u/µl 0,25 7

DNA khuôn 3 8

Tổng thể tích 25 9

23

Bảng 2.5. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân ITS Bảng 2.6. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen rpoC1

Bước

Bước Thời gian Chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ Nhiệt độ (oC)

4p 1 94 60s 1 94 Khởi động Khởi động

40s Biến tính 94 30s 94 Biến tính

35 35 1p Gắn mồi 52 40s Gắn mồi 55

1p Kéo dài 72 50s Kéo dài 72

7p Ổn định 72 10p 1 1 Ổn định 72

Bảo quản 4 4 Bảo quản

Hai cặp mồi được sử dụng để nhân bản 2 gen đích là ITS [21] và rpoC1 [14]. Trong đó vùng ITS của gen nhân và gen rpoC1 là gen lục lạp. Hai cặp mồi này được chúng tôi tham khảo trong các nghiên cứu đã được thực hiện trước đó. Trình tự về hai cặp mồi được thể hiện ở Bảng 2.7.

Bảng 2.7. Trình tự mồi dùng trong phản ứng PCR

Trình tự mồi (5’- 3’)

ST T

Vùng gen nhân bản

Ký hiệu

Kích thước dự kiến

P12F ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG

ITS

P12R

TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC

1

655 bp

(ITS+ITS2)

P7R

CCCAATACCATCATACTTAC

1F

GTGGATACACTTCTTGATAATGG

2

rpoC1

550 bp

1R

TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC

24

Phương pháp chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Chuẩn bị khuôn đổ gel đã cài sẵn răng lược. Hòa tan 1g agarose trong

100ml TAE 1X trong bình thủy tinh chịu nhiệt, đun sôi trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội khoảng 60oC và đổ vào buồng điện đi.

Chiều dày gel khoảng 5mm là thích hợp. Sau 30-40 phút, khi gel đã đông cứng,

gỡ lược ra và đặt bản gel trong bể điện di, đổ đệm TAE 1X vào bể điện di cho

đến khi mức đệm cao hơn mặt gel từ 1-2mm

Trộn 7µl DNA với 4µl dye, tra vào một giếng nhỏ trên gel. Điện di với

dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 110V trong khoảng 30 phút.

Lấy bản gel ra khỏi máy điện di và cho vào khay chứa dung dịch ethidium

bromide 1% trong 10 phút. Lấy bản gel ra, rửa sạch bằng cách ngâm trong nước

cất 2-3 phút. Đem vào máy quan sát dưới đèn tia tử ngoại (UV) và chụp ảnh.

2.2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR

Tinh sạch DNA từ gel agarose bằng “AccuPrep PCR purification Kit”

của hãng “Bioneer” (Hàn Quốc) theo quy trình của nhà sản xuất. Gồm các

bước sau:

1. Điện di sản phẩm khuếch đại, cắt băng gel cho vào ống Eppendorf 1,5

ml

2. Bổ sung đệm hòa tan (GB-Gel binding buffer) theo tỷ lệ Vmẫu:VGB = 1:5 3. Ủ ở nhiệt độ 60oC trong 10 phút, khoảng 2-3 phút lắc nhẹ một lần, sau

khi gel tan hết thì ủ thêm 5 phút để gel tan hoàn toàn.

4. Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột tinh sạch, ly tâm 13000 vòng/phút

trong 1 phút ở 4oC, loại bỏ dịch chảy qua cột.

5. Bổ sung 500 µl đệm GB vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Sau đó

đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. Bước

này nhằm loại bỏ hoàn toàn những thành phần gel agarose còn sót lại.

6. Rửa màng lọc chứa DNA bằng cách thêm 500µl đệm rửa WB (Washing buffer) lên cột. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm lần 2 để đảm bảo loại bỏ hết dịch WB.

25

7. Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf 1,5ml, bổ sung 30µl dung dịch đệm EL (Elution buffer) lên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó đem ly tâm 13000 vòng/ phút trong 1 phút. Loại bỏ cột, thu dịch chứa mẫu DNA đã tinh sạch chuyển sang ống mới. Bảo quản ở - 20oC

8. Điện di kiểm tra sản phẩm sau khi tinh sạch.

2.2.2.5. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector

Sau khi đoạn DNA được tinh sạch, tiến hành gắn chúng vào vector tách

dòng thông qua phản ứng lai DNA sử dụng enzyme DNA T4 - ligase. Vector sử

dụng là vector pBT (Hình 2.1)

Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT

Phản ứng ghép nối ở điều kiện 22oC trong 90 phút. Sản phẩm sau khi

ghép nối được sử dụng để biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α

Bảng 2.8. Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng

Thành phần phản ứng

Thể tích (µl) 3 1 1 1 5 10 H2O Buffer T4 ligase pBT T4 DNA ligase DNA Tổ thể tích

26

2.2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt.

1. Tế bào khả biến được lấy ra từ tủ -84oC và để tan từ từ.

2. Bổ sung 5l vectơ đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn

nhẹ. Hỗn hợp được đặt trong đá 10-15 phút.

3. Chuyển mẫu sang bể ổn nhiệt có nhiệt độ 42oC trong 90 giây. Sau

đó mẫu được lấy ra và đặt ngay lên đá lạnh trong 5 phút.

4. Bổ sung 500l môi trường LB lỏng, hỗn hợp được nuôi ở 370C, lắc

200 v/p trong 1 giờ.

5. Sử dụng que cấy trải, trải 100 - 200 l dịch khuẩn lên đĩa môi

trường LB đặc có chứa 50mg/l Kanamycin. Ủ đĩa ở 37oC qua đêm.

Bảng 2.9. Thành phần môi trường chọn lọc tế bào vi khuẩn mang

DNA tái tổ hợp

Hóa chất Thể tích

Xgal (0,004%) 40 μl

IPTG (100 μM) 20 μl

Carbecilin (100 mg/l) 20 μl

LB đặc 20 ml

2.2.2.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony - PCR)

Sau khi nuôi khuẩn đã biến nạp trên môi trường chọn lọc, từ mỗi đĩa

chọn ra một số khuẩn lạc trắng để tiến hành phản ứng colony - PCR với các

cặp mồi rpoC1 và ITS. Thành phần phản ứng colony - PCR và chu kì nhiệt

được trình bày ở Bảng 2.10 và Bảng 2.11.

27

Bảng 2.10. Thành phần phản ứng colony - PCR

Nồng độ STT Thành phần Thể tích (l)

1 Nước khử trùng 13,8

10X 2 Dung dịch đệm 2,5

25 mM 3 2,5 MgCl2

10 mM 4 dNTPs 2

10 pmol 5 Mồi xuôi 1

10 pmol 6 Mồi ngược 1

7 Dream Taq polymerase 0,2 5U/l

8 Khuẩn lạc VK

Tổng 25

Bảng 2.11. Chu trình nhiệt của phản ứng colony-PCR

Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ Bước

94 5 phút 1 Khởi động

94 30 giây Biến tính

58 50 giây 25 Gắn mồi

72 50 giây Kéo dài

72 10 phút 1 Ổn định

4 ∞ Bảo quản

Điện di kiểm tra sản phẩm colony - PCR trên gel agarose 1% để chọn

ra các khuẩn lạc mang gen có kích thước như mong muốn.

28

2.2.2.8. Tách chiết plasmid từ tế bào E. coli

Quy trình tách DNA plasmid được tiến hành theo phương pháp sử dụng

phenol/chloroform có cải tiến sử dụng hóa chất bao gồm 3 dung dịch Sol I,

Sol II và Sol III .

Bảng 2.12. Thành phần hóa chất tách plasmid

Kí hiệu Thành phần

Sol I Glucose (50 mM), Tris-HCL (25 mM), EDTA (10

mM)

Sol II NaOH (0,2 N), SDS (1%)

Sol III 60 ml potassium acetate 5 M, 11,5 ml axit acetic,

28,5 ml H2O

Các bước tiến hành:

- Lấy dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào Eppendorf 2ml, ly tâm 7000

vòng/phút (v/p) trong 5 phút. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.

- Thêm 100 µl dung dịch Sol, hoà tan bằng vortex cho cặn tan hoàn toàn.

- Bổ sung 200 µl dung dịch Sol II đảo nhẹ.

- Thêm 150 µl dung dịch Sol III đảo nhẹ rồi đặt trong đá 5 phút.

- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Thu dịch nổi.

- Bổ sung dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1) theo tỷ lệ 1:1.

- Ly tâm 13000v/p trong 10 phút. Chuyển pha trên sang ống Eppendorf

1,5 ml mới.

- Bổ sung dung dịch isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1:1, ủ ít nhất 20 phút.

- Ly tâm 13000 v/p trong 20 phút, thu tủa.

- Rửa tủa 2 lần bằng 500µl ethanol 70%, ly tâm 13000 v/p trong 10 phút.

29

- Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng, sau đó thêm 50 µl nước khử ion, để

ở nhiệt độ phòng cho tan hoàn toàn.

Plasmid sau khi tách chiết được tinh sạch và bảo quản ở -200C để phục

vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.2.2.9. Phương pháp xác định trình tự của gen

Trình tự DNA được xác định bằng máy phân tích trình tự tự động

ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer theo nguyên lí của Sanger với bộ

kit BigDye Terminator v. 3.2 Cycle Sequencing (Macrogen Inc. Hàn Quốc).

Trình tự DNA đã giải được xử lý và phân tích bằng phần mềm BioEdit và

DNAstar. Cây phân loại được xây dựng theo phương pháp tối đa (Maximum

Parasimony (MP) trên cơ sở số liệu thu được.

2.2.2.10. Phương pháp phân tích số liệu

Sau khi cây sói rừng đem về sẽ tiến hành đo kích thước như chiều cao cây,

kích thước trung bình của rễ, cuống lá, phiến lá, hoa, quả ,….

Trình tự nucleotide sau khi giải trình tự sẽ được xử lý bằng các phần mềm

bioedit, BLAST, DNAstar. Lập bảng biểu, nhập các số liệu sau đó đưa ra nhận

xét, phân tích và rút ra kết luận.

30

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đặc điểm thực vật học của cây sói rừng thu tại Lạng Sơn

Sói rừng là cây bụi thường

xanh, cao 1 - 2m, có bộ rễ phát

triển, dễ chính dài khoảng 25-

30 cm, đường kính khoảng 0,5 -

1cm, có nhiều rễ con phát triển,

có mầu nâu vàng, rễ cứng.

Cây Sói rừng có thân gỗ,

nhánh tròn, không có lông, thân

có màu xanh đậm, các mấu hơi

phồng ra, phần thân non có mầu

xanh, phần thân già có màu hơi

đỏ tía. Mặt cắt ngang có hình

Hình 3.1. Mẫu cây sói rừng thu thập tại tròn, đường kính thân khoảng

Lạng sơn 0,5 - 1,5 cm. Lá đơn mọc đối,

phiến lá có hình elip, hình trứng

ngược hoặc elip hẹp đến thuôn, chóp lá nhọn, dài 7 - 20cm, rộng 3 - 5cm, gốc

thon nhọn, mép lá có răng cưa nhọn và thô, phần không xẻ gần cuống dài 3 -

3,2cm, gân lông chim, gân chính nổi rõ với 5 - 7 cặp gân nhọn, gân bên hình

cung mờ, gân lồi mặt dưới, cuống ngắn 5 - 10mm. Lá nhẵn, không có lông,

mặt trên có mầu xanh sẫm, mặt dưới nhạt. Bông kép, ít nhánh, nhánh ngắn.

Cụm hoa có mầu xanh nhạt hoặc trắng, dài 3 - 8cm, bông khá dày, dài 1 -

3,5cm. Hoa cái nhỏ, màu trắng, dạng phích hoặc dạng cầu méo, dài 1 -

1,5mm, không cuống và có một nhị.

31

Hình 3.2. Các bộ phận của cây sói rừng

1 - Rễ; 2 - thân ; 3 - Lá; 4 - Cách sắp xếp lá; 5 - Hoa; 6 - cành mang quả; 7- Quả

32

Theo một số nghiên cứu về đặc điểm hình thái của cây sói rừng đã được

tiến hành nghiên cứu trước đó, Sói rừng có bầu nhụy hình trứng và không có

vòi, hóa đực dài 1,3 - 2mm, rộng 1 - 1,3 mm, bao phấn kéo dài từ một nửa

đến toàn bộ chiều dài. Cây sói rừng có quả nhỏ, mọng, hình gần tròn đường

kính 4 - 7 mm. Quả ban đầu xanh, khi chín có màu đỏ hay đỏ gạch, hạt không

mở màu vàng hoặc kem [10]. Cây thường mọc ở vùng núi đất, ở bìa rừng, ven

đồi ẩm, sườn núi, các khu đầm lầy, đồng cỏ, ven suối. Cây có hoa vào tháng 6 - 7,

quả tháng 8 - 9.

Phân bố: Ở Việt Nam cây mọc từ Hà Giang (Vị Xuyên), Sơn La (Mộc

Châu), Cao Bằng (Thạch An, Nguyên Bình, Tĩnh Túc), Lạng Sơn (Hữu Lũng, Bắc

Sơn), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Nội (Hà Tây), Thừa Thiên Huế, Kom Tum ( Đác

lây, KonPlong), Lâm Đồng (Đà Lạt, Bảo Lộc). Trên Thế giới, cây có ở Ấn Độ,

Trung Quốc, Triều Tiên, Malaysia, Indonesia, Lào, Thái Lan, Hàn Quốc.

3.2. Phân lập gen từ mẫu cây sói rừng

3.2.1. Tách chiết DNA tổng số

Marker

DNA tổng số

Để tách được DNA từ mẫu lá của cây sói

rừng có chất lượng tốt và đáp ứng các mục đích

thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp dùng

CTAB (Collins và Symons, 1992) [17] với một số

DNA tổng số

thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí

nghiệm (mục 2.2.2.1). Kết quả điện di (Hình 3.3)

cho thấy DNA thu được có đủ số lượng và chất

lượng cần thiết, các vạch điện di rõ gọn không bị

đứt gãy, ít thấy các vết protein và tạp chất còn dư

trong mẫu, đảm bảo chất lượng cho phản ứng Hình 3.3. Kết quả điện di

nhân gen tiếp theo. DNA tổng số cây Sói rừng

trên gel agarose 1% Trong tách chiết DNA tổng số từ thực vật,

33

có nhiều phương pháp khác nhau đã được ứng dụng, trong đó phương pháp dùng

CTAB có ưu điểm là khá đơn giản, tiết kiệm thời gian mà DNA thu được vẫn

đảm bảo chất lượng. Đã có nhiều cải tiến trong quy trình tách chiết DNA sử

dụng CTAB tỏ ra đặc biệt hiệu quả trong đó với cả các mẫu mô thực vật chứa

nhiều polysaccharid và polyphenol (Porebski và cộng sự, 1997) [28]. Hiện nay,

phương pháp dùng CTAB để tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô thực vật được

sử dụng phổ biến trong các công trình nghiên cứu.

Để xác định hàm lượng và độ tinh sạch, DNA tổng số đươc đo mật độ

quang phổ (OD) ở bước sóng 260nm và 280nm. Kết quả đo được tỉ số A260/280 =

1,95 tương đương với hàm lượng mẫu bằng 191,3 µg/µl. Kết quả đo OD cho

thấy mẫu DNA đủ độ tinh sạch để thực hiện phản ứng PCR ( tỉ số A260/280 trong

khoảng từ 1,5 - 2, 0)

3.2.2. Khuếch đại vùng gen nghiên cứu bằng phản ứng PCR

Khuếch đại đoạn gen là công đoạn đầu tiên nhằm nhân lên các đoạn DNA

chỉ thị mong muốn sử dụng các cặp mồi đặc hiệu. Trong nhiều công bố gần đây

về sử dụng DNA barcode, các tác giả cho thấy việc nhân bản thành công các

trình tự DNA barcode bằng phản ứng PCR phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng

DNA dùng làm khuôn và đặc biệt là nhiệt độ bắt mồi đặc hiệu (Yonghua Li

và cộng sự, 2010) [36].

rpoC1 là một trong những gen cơ bản trong việc nghiên cứu sự phát

sinh loài, đã được sử dụng ở nhiều nhóm sinh vật khác nhau còn ITS là gen

nhân được sử dụng nhiều trong phân tích đa dạng và xác định loài ở thực vật.

Để khuếch đại được đoạn gen rpoC1 và ITS chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc

hiệu như đã trình bày ở bảng 2.4. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của

phản ứng PCR như ở mục 2.2.2.3.

bp

bp

650

550

34

250

750 500 250

750 500

A

B Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm nhân gen rpoC1 (A) và sản phẩm nhân

bản vùng ITS (B) từ các cặp mồi đặc hiệu

M. Maker 1kb; 1. Sản phẩm PCR nhân gen

Kết quả nhân bản gen ITS và rpoC1 cây sói rừng ở Hình 3.4 cho thấy

vùng ITS có kích thước khoảng 650bp, gen rpoC1 có kích thước khoảng

550bp đúng như kích thước dự đoán ban đầu. Kết quả điện di sản phẩm PCR

trên gel agarose 1% cho thấy băng vạch sáng rõ nét và chỉ có một băng duy

nhất điều này chứng tỏ quá trình nhân bản vùng ITS và gen rpoC1 có kết quả

tốt ở mẫu sói rừng nghiên cứu. Do đó, sản phẩm này được chúng tôi sử dụng

cho tách dòng và giải trình tự.

Sản phẩm PCR thu được sau phản ứng khuếch đại gen còn có lẫn các

tạp chất như mồi, đệm PCR, các nucleotide,... và đôi khi có thể chứa các sản

phẩm phụ sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình tách dòng, do vậy cần tiến

hành tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tiến hành quá trình đưa gen vào

vector tách dòng. Việc tinh sạch được thực hiện bằng bộ Kit AccuPrep Gel

Purification Kit. Nguyên lý của phản ứng và quy trình thực hiện được nêu ở

mục 2.2.2.4. Các đoạn gen sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên

gel agarose 1% để kiểm tra chất lượng và xác định sơ bộ hàm lượng DNA

tinh sạch.

35

3.2.3. Kết quả ghép nối gen vào vector tách dòng

Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch, chạy điện di kiểm tra và tính

toán hàm lượng DNA để dùng cho phản ứng ghép nối vào vector tách dòng

pBT. Phản ứng ghép nối là phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa

base Adenin ở đầu 5’ của sản phẩm PCR với base Thymine ở đầu 3’ của

vector tách dòng nhờ hoạt tính nối của enzyme T4 ligase. Nguyên lý và kỹ

thuật ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng được trình bày cụ thể ở mục

2.2.2.5. Kết quả của phản ứng ghép nối sẽ được thể hiện sau khi biến nạp vào

tế bào khả biến E. coli.

Sản phẩm của quá trình chuyển gen vào vector pBT sẽ được biến nạp

vào vi khuẩn E. coli DH5α, sau đó được cấy trải trên môi trường LB đặc có

bổ sung carbenicilin 50 mg/l, X-gal 40 µl/ml và IPTG 100μM. Kết quả của

quá trình này sẽ là sự xuất hiện của những khuẩn lạc xanh và trắng, trong đó

khuẩn lạc trắng là những khuẩn lạc chúng ta quan tâm.

Hình 3.5. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp gen rpoC1 vào tế bào khả biến

Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đều đã được biến nạp

plasmid chứa gen kháng sinh carbenicillin nên có thể phát triển được trên môi

trường chọn lọc này và phát triển thành các khuẩn lạc. Những khuẩn lạc xanh

xuất hiện là do vector không có nhận được gen ngoại lai. Do vector có mang

operon lacZ nên khi operon này hoạt động bình thường và khi có mặt chất

36

cảm ứng IPTG sẽ tổng hợp enzyme β- galactosidase, enzyme này sẽ chuyển

hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng là

do nhận được plasmid mang gen ngoại lai. Gen ngoại lai sẽ chèn vào và nó sẽ

phá vỡ cấu trúc gen lacZ khi có chất cảm ứng IPTG thì gen lacZ cũng không

tổng hợp enzyme β- galactosidase và không xảy ra sự chuyển hóa X-gal. Tuy

nhiên không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmid tái tổ hợp có

chứa đoạn gen barcode chèn vào có thể là chứa đoạn gen là sản phẩm phụ của

phản ứng PCR, sự đột biến trên promoter lac hay sự đứt gãy base thymine đầu

3’ của vector cũng có thể làm cho khuẩn lạc mang màu trắng. Vì vậy để có

thể biết chính xác các khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp cần tiến hành

chọn bằng phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony - PCR) để phục

vụ cho quá trình nghiên cứu tiếp theo.

Từ kết quả trên cho thấy quá trình biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào

khả biến có kết quả tốt. Trên đĩa nuôi cấy xuất hiện những khuẩn lạc xanh và

trắng. Trong đó mật độ là số lượng khuẩn lạc trắng tương đối lớn, đủ để tiến

hành chọn lọc khuẩn lạc.

3.2.4. Kết quả chọn dòng tế bào mang gen tái tổ hợp

Để xác định chính xác khuẩn lạc nào mang vector gắn đoạn DNA quan

tâm chúng tôi tiến hành phản ứng colony-PCR. Với phương pháp này giúp

chúng ta phát hiện nhanh những dòng khuẩn lạc nào mang gen đích, giảm chi

phí và tiết kiệm thời gian. Tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc trắng trên đĩa

khuẩn lạc, sau đó thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu với

gen ITS và rpoC1 như đã trình bày ở Bảng 2.7. Phương pháp tiến hành cụ thể

được trình bày ở mục 2.2.2.6. Sản phẩm colony-PCR được điện di trên gel

agarose 1%.

bp

bp

550

750 500

250

750 500

650 bp

250

37

A B

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR - clony các khuẩn lạc sử dụng

M : thang Marker 1Kb; 1, 2, 3, 4: Sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc chọn lọc

mồi rpoC1(A) và mồi ITS (B)

Khi sử dùng mồi RpoC1 kết quả điện di trên hình 3.6 xuất hiện các

băng vạch duy nhất có kích thước vào khoảng hơn 550 bp. Còn khi sử dụng

mồi ITS nhân lên đoạn gen có kích thước khoảng 650 bp, kết quả điện di Hình

3.6 cho thấy đa phần các khuẩn lạc đều xuất hiện các băng vạch duy nhất có

kích thước khoảng 650bp. Như vậy cho thấy các dòng khuẩn lạc đều mang

gen quan tâm, những khuẩn lạc này sẽ được nuôi và tách plasmid phục vụ cho

việc xác định trình tự DNA.

3.2.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp

Các dòng khuẩn lạc chứa đoạn gen ở trên được lựa chọn và được nuôi

trong 3 ml môi trường LB lỏng có bổ sung carbenicillin 50 mg/l, lắc 200

vòng/phút qua đêm, sau đó tiến hành tách plasmid. Quá trình này được thực

hiện theo quy trình đã được trình bày ở mục 2.2.2.8. Plasmid được điện di

kiểm tra trên gel agarose 1%.

38

Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết plasmid

1,2,3,4 các plasmid mang gen ITS; 5,6,7,8 các plasmid mang gen rpoC1

Qua kết quả điện di plasmid hình 3.7 ta thấy các plasmid tái tổ hợp đều

có 3 băng rõ nét không bị đứt gẫy. Plasmid sẽ được tinh sạch sử dụng để xác

định trình tự trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant

Genetic Analyzer.

3.3. Kết quả xác định trình tự đoạn các đoạn gen nghiên cứu.

Các đoạn DNA sau khi được tách dòng thành công sẽ được xác định

trình tự trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic

Analyzer.

Trình tự DNA được so sánh và liên kết với nhau bằng chương trình

BioEdit và tiếp tục được xác minh, so sánh với các trình tự khác bằng cách sử

dụng công cụ BLAST trên trang wev của Trung tâm Quốc gia về Thông tin

Công nghệ sinh học (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Kết quả đọc trình tự được

xử lý bằng phần mềm BioEdit và DNASTAR và đối chiếu với những trình tự đã

được công bố trên GenBank. Chúng tôi tiến hành phân tích kết quả với các mẫu

nghiên cứu.

39

3.3.1. Phân tích trình tự đoạn gen rpoC1

rpoC1 mã hóa cho enzyme RNA polymerase β- tiểu đơn vị của lục lạp.

Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng loài do vậy

việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh

loài và phân loại thực vật được các nhà khoa học rất quan tâm. Trong nhiều

nghiên cứu đã chỉ ra rằng rpoC1 là một chỉ thị rất hữu ích khi được sử dụng để

phân biệt các loài thực vật.

Kết quả so sánh trình tự nuleotide bằng phần mềm BioEdit ở hình 3.8 cho

thấy, gen rpoC1 phân lập từ mẫu cây Sói rừng thu thập tại Lạng Sơn có kích

thước khoảng 550 bp, đúng so với kích thước lý tính toán thuyết.

Từ kết quả xác định trình tự, chúng tôi tiến hành so sánh mức độ tương

đồng của gen rpoC1 ở mẫu sói rừng nghiên cứu với những kết quả đã công bố

trên ngân hàng gen thế giới - NCBI. Kết quả xác định và so sánh trình tự được

trình bày ở hình 3.8.

Phân tích bằng BLAST trong NCBI cho kết quả trình tự gen rpoC1 phân

lập từ mẫu cây Sói rừng thu thập tại Lạng sơn có độ tương đồng với trình tự gen

rpoC1 mang mã số EF380352và KP256024. Kết quả đã khẳng định đoạn gen

phân lập từ mẫu sói rừng thu thập được chính là gen rpoC1. Như vậy chúng

tôi đã nhân bản thành công và giải trình tự đoạn gen rpoC1 phân lập từ mẫu

Sói rừng từ Lạng Sơn.

Kết quả so sánh trình tự đoạn gen rpoC1 phân lập từ mẫu Sói (SR)

rừng thu tại Lạng sơn cho thấy, mẫu SR và EF380352 trên Ngân hàng gen

(phân lập từ cây sói Chloranthus spicatus tại Trung Quốc) có độ tương đồng

là 98,4%; còn tương đồng với trình tự có mã số KP256024 trên ngân hàng gen

(phân lập từ cây sói nhật Chloranthus japonicus tại Mỹ) có độ là 97,6%.

40

Hình 3.8. Trình tự nucleotide của đoạn rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng và hai trình tự mang mã số EF380352 và KP256024 trên ngân hàng gen

Phân tích vị trí sai khác cho thấy, trình tự nucleotide của gen rpoC1

phân lập từ mẫu Sói rừng có sự sai khác so với trình tự mang mã số

EF380352 ở 10 vị trí và sai khác so với trình tự mang mã số KP256024 ở 14

vị trí. Các vị trí sai khác của trình tự nucleotide mẫu sói rừng so với 2 mẫu

EF380352 và KP256024 trên Genbank được thể hiện ở bảng 3.1 Sự sai khác

về trình tự nucleotide giữa mẫu sói rừng và các mẫu trên Genbank là thông tin

quan trọng để xây dựng mã vach DNA có các mẫu sói rừng khác nhau.

41

Bảng 3.1. Các vị trí sai khác giữa trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1

Trình tự nucleotide của gen rpoC1 của loài có mã số

EF380352 KP256024 SR.rpoC1 Vị trí các điểm sai khác

A A C 5

A G 15

A A G 16

- T C 34

C C T 67

- T C 122

- C T 160

A A G 189

- C T 202

A A C 271

- T G 303

A A G 382

A A G 499

- - G 543

G G A 551

Bảng 3.2. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự nucleotide của gen rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng thu tại Lạng Sơn

42

Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của mẫu sói rừng trên cơ

sở phân tích gen rpoC1 ở hình 3.9 cho thấy, mẫu SR thu thập từ Lạng sơn –

Việt Nam nằm thành một nhánh riêng biệt khác hẳn với nhánh còn lại mang 2

loài thuộc họ hoa sói đã công bố trên Genbank (EF380352 phân lập từ cây sói

Chloranthus spicatus và KP256024 phân lập từ cây sói nhật Chloranthus

japonicus).

Khoảng cách di truyền được xác định trên cơ sở so sánh trình tự

nucleotide của đoạn gen rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng thu tại Lạng Sơn và

2 trình tự trên ngân hàng gen là 1,0 %.

Hình 3.9. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng đoạn gen rpoC1

của mẫu sói rừng với mẫu EF380352 và KP256024 trên Genbank.

Điều này càng khẳng định tính bảo thủ của hệ gen lục lạp ở thực vật

vì 3 trình tự gen so sánh thuộc 3 loài khác nhau và thu được từ ba vùng địa

lý xa nhau.

3.3.2. Phân tích vùng ITS

Vùng ITS (Internal Transcribed Spacers) là một vùng mã hóa cho một

đoạn ARN không đóng vai trò chức năng nằm trong vùng mã hóa cho các

ARN ribosome nhân. Vùng ITS dài khoảng 655 bp gồm ba phần: vùng ITS1

nằm giữa vùng 18S và 5,8S có kích thước khoảng 255-261 bp, vùng 5,8S dài

khoảng 164 bp và vùng ITS2 nằm giữa vùng 5,8S và 28S khoảng 216 - 233 bp.

43

Đây cũng là trình tự thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu hệ thống phát

sinh loài thực vật

Từ kết quả xác định trình tự, chúng tôi tiến hành so sánh mức độ tương

đồng của vùng ITS ở mẫu sói rừng nghiên cứu với những kết quả đã công bố

trên ngân hàng gen thế giới - NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Kết quả

xác định và so sánh trình tự được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.10.

Kết quả xác định trình tự thu được đoạn gen khoảng 650 bp, đúng với

kích thước tính toán lý thuyết của vùng ITS là khoảng 655 bp, so sánh trình tự

DNA vùng gen ITS của mẫu nghiên cứu với 4 trình tự DNA vùng gen ITS của

các loài thuộc chi Sacandra đã được công bố trên Genbank bằng phần mềm

Bioedit kết quả cho thấy có tỷ lệ tương đồng cao giữa mẫu ITS chúng tôi phân

lập và các trình tự trên Genbank. Vùng ITS của mẫu cây sói rừng nghiên cứu

tương đồng 99% so với vùng ITS mã số JN407442, JN407443, KC840060,

KP317601 trên ngân hàng gen quốc tế. Kết quả đã khẳng định đoạn gen phân

lập từ mẫu sói rừng ở trên là vùng ITS. Như vậy chúng tôi đã nhân bản và xác

định được trình tự đoạn vùng ITS phân lập từ mẫu Sói rừng từ Lạng Sơn.

44

Bảng 3.3. Mức độ tương đồng của vùng ITS của mẫu sói rừng nghiên cứu với

một số trình tự trên ngân hàng gen thế giới (NCBI)

Tỷ lệ

Mã số trên tương STT Trình tự tương đồng với ITS đồng NCBI

(%)

Sarcandra glabra isolate shawpc0691I 18S

ribosomal RNA gene, partial sequence;

internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal JN407442 99 1 RNA gene, and internal transcribed spacer

2, complete sequence; and 28S ribosomal

RNA gene, partial sequence

Sarcandra glabra isolate shawpc0692I 18S

ribosomal RNA gene, partial sequence;

internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal JN407443 99 2 RNA gene, and internal transcribed spacer

2, complete sequence; and 28S ribosomal

RNA gene, partial sequence

Sarcandra glabra subsp. brachystachys

voucher KUN 200653 internal transcribed

3 spacer 1, partial sequence; and 5.8S KC840060 99

ribosomal RNA gene and internal

transcribed spacer 2, complete sequence

Sarcandra glabra voucher KWNU91871

internal transcribed spacer 1, partial

4 sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, KP317601 99

complete sequence; and internal transcribed

spacer 2, partial sequence

45

Hình 3.10. Trình tự nucleotide của vùng ITS phân lập từ mẫu sói rừng SR

và 4 trình tự mang mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 trên

ngân hàng gen quốc tế

Kết quả so sánh trình tự đoạn vùng ITS phân lập từ mẫu cây sói rừng với

4 trình tự trên Genbank có độ tương đồng giao động từ 99,1 đến 99,4. Sự sai

khác giao động từ 0,6 – 0,8. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5.

Mặc dù có hệ số tương đồng tương đối cao, nhưng trong trình tự

nucleotide của vùng ITS phân lập từ mẫu Sói rừng vẫn có sự sai khác so với

trình tự mang mã số JN407442, JN407443, KP317601 ở 4 vị trí, và sai khác

so với trình tự mang mã số KC840060 ở 5 vị trí. Các vị trí sai khác của trình

tự nucleotide mẫu SR so với 4 mẫu JN407442, JN407443, KC840060,

KP317601 trên Genbank được thể hiện ở bảng 3.4.

46

Bảng 3.4. Các vị trí sai khác giữa trình tự nucleotide của vùng ITS

Trình tự nucleotide của gen ITS của loài có mã số

Vị trí các điểm sai khác JN407442 JN407443 KC840060 KP317601 SR. ITS

C T C C C 6

G G G C G 66

C C C T C 102

G G G A G 215

C C C T C 375

Bảng 3.5. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự nucleotide của

y l n â h p ố s ệ H

vùng ITS phân lập từ mẫu sói rừng thu tại Lạng Sơn

Hình 3.11. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng đoạn vùng gen ITS của

mẫu sói rừng với mẫu có mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601

47

Sơ đồ hình cây ở hình 3.11 dựa trên kết quả so sánh trình tự nucleotide

của đoạn gen ITS cho thấy 5 mẫu sói rừng được chia thành 2 nhóm chính. Nhóm

thứ nhất gồm các mẫu có mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601

và nhóm thứ 2 là mẫu Sói rừng. Khoảng cách di truyền giữa hai nhánh là 0,3%.

Như vậy dựa vào phương pháp so sánh trình tự ITS, đã góp phần khẳng

định thêm vùng gen ITS là một mã vạch DNA tiềm năng cho nhận diện loài.

Sử dụng mã vạch DNA có vai trò quan trọng trong việc nhận diện các

mẫu thực vật, đặc biệt trong nhân diện các loài thực vật dùng làm thuốc thảo

dược, giúp đảm bảo về chất lượng sản phẩm và có tầm quan trọng trong việc

nghiên cứu các đặc tính của sự đa dạng di truyền. Trong nhiều nghiên cứu trước

đây cũng đã chứng minh trình tự ITS và rpoC1 có vai trò to lớn trong việc nhận

diện nguyên liệu thảo mộc. Chúng tôi đã bước đầu nghiên cứu sử dụng hai trình

tự gen ITS và rpoC1 làm mã vạch DNA. Kết quả giải trình tự và phân tích kết

quả thu được cho thấy mẫu nghiên cứu có độ tương đồng tương đối cao với các

trình tự được công bố trên Genbank. Cùng với các nghiên cứu khác trên thế giới

khẳng định vùng gen ITS và rpoC1 có thể giúp nhận diện loài như một mã vạch

phân tử .

48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

I. Kết luận

1. Đã nghiên cứu đươc một số đặc điểm hình thái của cây sói rừng. Cây thân

bụi, có bộ rễ phát triển, cây thân gỗ, lá mọc đối, bông kép, có nhánh ngắn, quả

nhỏ và mọng.

2. Đã tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số của mẫu sói rừng từ Lạng Sơn.

Nhân bản thành công hai vùng gen ITS và rpoC1 bằng phương pháp PCR và

tạo dòng thành công hai gen nhân bản được.

3. Đã xác định được trình tự nucleotide của 2 đoạn gen rpoC1 và ITS, kết quả

phân tích cho thấy vùng ITS có kích thước khoảng 650 bp và đoạn gen rpoC1

có kích thước 550 bp. Có hệ số tương đồng cao với các trình tự trên ngân

hàng gen thế giới, từ 97,6 % - 98,4 % với gen rpoC1; Còn với vùng ITS, hệ số

tương đồng từ 99,1 - 99,4 %. Khoảng cách di truyền giữa mẫu sói rừng thu

thập tại Lạng sơn và các mẫu trên Genbank dao động từ 0,3 - 1,0.

II. Kiến nghị

Cần tiếp tục phân tích trình tự ncleotide của các gen phân loại khác như

matK, ycf5, trnH-psbA,….. là cở sở phục vụ xây dựng mã vạch DNA cho cây

sói rừng.

49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt

[1] Cục Quản lý Dược (2005), Báo cáo tổng kết công tác dược 2000-2005.

[2] Nguyễn Quỳnh Anh (2013), “ Nghiên cứu ứng dụng cây Sói rừng (

Sarcandra GlaBra (Thunb) Nakai) ở Cao Bằng để hỗ trợ điều trị một số

bệnh ung thư”, Khoa học và công nghệ Cao Bằng

[3] Đái Duy Ban và Lữ Thị Cẩm Vân và cs (2000). Phòng bênh ung thư. Nhà

xuất bản Y học Hà Nội, 150-155.

[4] Võ Văn Chi, Từ điển thực vật thông dụng, Nxb Khoa học kỹ thuật,

tập 2, 2004.

[5] Võ Văn Chi (1999), Từ điền cây thuốc Việt Nam, NXB Y học

[6] Vũ Văn Chuyên, Tóm tắt đặc điểm các họ cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học

Hà Nội, 1976.

[7] Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Nxb trẻ, quyển 1, tr 287, 1999.

[8] Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng, (2008), Cơ sở di truyền học phân tử và tế

bào, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.

[9] Nguyễn Hải Nam (2012). Một số mục tiêu phân tử và ứng dụng trong

nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư hiện nay. Nhà xuất bản Y

học Hà Nội, 18-25.

[10] Bùi Văn Trọng, Nguyễn Cao Xuân Viên, Nguyễn Thanh Nguyên,

(2014), “Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng tới sự hình

thành rễ của hom cây sói rừng ( Sarcandra Glaban (Thunb.) Nakai.) tại

Lâm Đồng ”, Tạp chí Viện dược liệu Hà Nội, tập 19, số 6.

[11] Viện Dược Liệu (1973), Sổ tay cây thuốc Việt Nam. NXB Y học, tr 213.

[12] Mai Thị Hải Yến (2010), “Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác

dụng sinh học của cây Sói rừng”, Luận văn thạc sỹ dược học, Học viện

quân y.

50

Tài liệu tiếng nước ngoài

[13] Alvarez I., Wendel J.F. (2003), “Ribosomal ITS sequences and plant

phylogenetic inference”, Molecular Phylogenetics and Evolution,

29,pp.417-434.

[14] Hamilton B.M. (1999), “Four primer pairs for the amplification of

chloroplast intergenic regions with intraspecific variation”, Molecular

Ecology, 8,pp.513-525.

[15] Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W. (2003), “Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, Journal of Evolutionary Biology, (6), pp. 558-576.

[16] Chase M. W., Nicolas S., Mike W., James M. D., Rao P. K., Nadia H., and Vincent S. (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals”, Philosophical Transactions of the Royal Society, 360 (1462), pp. 1889-1895.

[17] Collons G.G. and Symons R.H. (1992), Plant Molecular Biology Reporter., 10,233.

[18] Feng S., Xu L., Wu M., Hao J., Qiu SX, Wei X., (2010), A new curmarin

from Sarcandra Glabra, Fitoterapia,.

[19] Huang M.J., Zeng G.Y., Tan J.B., Li Y.L., Jan G.S., Zhou Y.J. (2008),

Studies on flavonoid glycosides from Sarcandra Glabra, Zhongguo

zhong yao za zahi, Vol 33(44), p 1700 – 10702.

[20] Huang D., Huang H., Lu Y., (2013), Clinical Observation of Sarcandra

glabra combined chemoradiotherapy for treating patients with local

advanced nasopharyngeal carcinoma. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie Za Zhi,

33(4), 456-458.

[21] Hu X., Xu X., Yang J., (2008), Progree in research on Sarcandra Glabra.

Zhongguo Yao Xue Za Zhi, 43 (10), 721-723.

51

[22] Hebert P.D.N, Cywinska A., Ball S.L., De Waard J.R., (2003),

“Biological indentification through DNA barcodes”, Proc R Soc Lond B

Biol Sci, 270,pp.313-321.

[23] He R.R., Yao X.S., Li H.Y., Dai Y., Duan Y.H., Li Y.F., Kurihara H., (2009), The anti-stress effects of Sarcandra glabra extract on restraint- evoked immunocompromise, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 32(2), 247-252.

[24] Jarman S.N., Elliott N.G., (2000), “DNA evidence for morphological an

cryptic Cenozoic speciations in the Anaspididae, “living fossils” From the Triassic”, Journal of Evolutionary Biology., 13,pp.624-633.

[25] Kesanakurthi R.P., Fazekas A.J., Burgess K.S., Percy D.M., Newmaster

S.G., Graham S.W., Barrett S.C., Hajibabaei M., Husband B.C., (2011),

“Spatial patterns of plant diversity below ground as revealed by DNA

barcoding”, Molecular Ecology, 20, pp.1289-1302.

[26] Kress J.W., Wurdack K.J., Zimmer E.A., Weigt L.A.,Janzen D.H.,

(2005), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, Proc.Natl

Acad.Sci USA, 102,pp.8369-8374.

[27] Kress W. J., Erickson D. L., (2008), “DNA barcodes: Genes, genomics,

and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp. 2761-2762.

[28] Kang M., Tang A.Z., Liang G., Yi X., Liu J., (2008), Study on the

apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cell line administrated with

Sarcandra glabra extracts in vivo and its mechanism. Zhong Yao Cai.

Vol.31 (10):1529-1533.

[29] Leng Y., Li G., Chen S., (2010), Research related to the effectiveness of

anti tumor effect of Herba Sarcandra. Chin J Mod Drug App, l 4, (6), 16-20

[30] Ole S., Gitte P., (2009), “How many loci does it take to DNA barcode a

crocus?”, PLoS ONE, 4(2), pp. 4598.

[31] Paul D.N. Hebert, Alina C., Shelley L.B., Jeremy R.W., (2003),

“Biological identifications through DNA barcodes”. Proc.R.Soc.Lond.B

(270.pp. 313-321;DOI 10.1098/rspb.2002.2218.

52

[32] Porebski S., Baily L.G., Baum B.R., (1997), Modification of a CTAB

DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and

polyphenol components. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 8-15.

[33] Ratnasingham S., Paul D.N. Hebert , (2007), “BOLD: the barcode of life

data system”, Molecular Ecology Resources, 7, pp.355-364.

[34] Savolainen V., Chase M. W., (2003), “A decade of progress in plant

molecular phylogenetics”, Trends Genet, (19), pp. 717-724.

[35] Shaw J., Lickey E.B., Schilling E. E., Small R.L., (2007),” Comparison

of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for

phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III.

Amer. J. Bot, (94), pp. 275-288.

[36] Song J.Y., Yao H., Li Y., Li X.W., Lin Y.L, Liu C., Han J., Xie

C., Chen S., (2009), Authentication of the family Polygonaceae in

Chinese pharmacopoeia by DNA barcoding technique. J Ethnopharm

124: 434–439.

[37] Storchova H., Olson M. S., (2007), “The architecture of the chloroplast

psbA-trnH non coding region in angiosperms”. Plant systematic and

evolution. Biomedical and life Sciences, Vol 268, No 1-4, pp. 235-256.

[38] Sun W., Li J., Lan F., (2014), “Antitumor activities of Zhongjiefeng

injection on FC in mice with precarcinoma of stomach and its toxicity”,

Chinese Traditional Patent Medicine Journal , (3), 169-171.

[39] Taberlet P., Eric C., François P., Ludovic G., Christian M., Alice V.,

Thierry V., Gérard C., Christian B., Eske W., (2007), “Power and

limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA

barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14.

[40] 徐国良,肖兵华,陈奇(2005),肿节风及其分离部位对免疫性血小板 减

少性紫癜小鼠血小板的影响.中国实验方剂学杂志,11(4),120-124.

53

Từ Quốc Lượng, Tiêu Tân Hoa, Trần Kỳ (2005). Tác dụng của thũng

tiết phong và thành phần của thuốc tới tiểu cầu chuột xuất huyết giảm

tiểu cầu. Tạp chí thực nghiệm Trung Quốc, 11(4),120-124.

[41] Van den Berg C., Higgins W. E., Dressler R. L., Whitten W. M., Soto Arenas

M. A., Culham A., Chase M. W., (2000), “A phylogenetic analysis of

Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal

transcribed spacers (ITS) of ribosomal DNA”, Lindleyana (15), pp.96114

[42] Van DeWiel C. C. M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J. L.,

Duistermaat C. H., Smulders ,(2009), “DNA barcoding discriminates the

noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle

ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology

Resources (9), pp.1086-1091.

[43] Vijayan K., Tsou C. H., (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in

a new perspective”, Current science, vol. 99, pp. 1530 - 1540.

[44] Wang X., T.Y., Yoshimaru H., Nagasaka K., Szmidt A.E., (1999),

“Phylogenetic relationships of Eurasian pines (pinut, Pinaceae) based on

chloroplast rbcL, matK, rpl120-rps18 spacer, and trnV intron

sequences”, American Journal of Botany 86,pp.1742-1753.

[45] Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R. (2010), “DNA

barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant

Biology (10), pp.205.

[46] Wang A.Q., Feng S.C., He X., Xu R.S.,. (1988), A new sesquiterpen

lactone from Sarcandra Glabra, Yao xue xue bao, Vol 23 (1): 64 – 66,.

[47] Wen J., Li J., Lan F., Yan G.. (2003), “Antitumor effect of

Zhongjiefeng Injection on mice liver cancer HepA22 and its toxicity”.

Chinese Traditional Patent Medicine Journal, 4, 39-43.

[48] Wu F., Mueller L. A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S. D. (2006),

“Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of

54

single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and

systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics (174),

pp. 1407-1420.

[49] Xu X.D., Hu X.R., Yuan J.Q., Yang J.S., (2008), Studies on chemical

constituents of Sarcandra glabra, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. Vol.

33(8): 900-902.

[50] Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J., (2010), “Use of ITS2 region as

theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5),

pp.13102.

[51] Yong H. L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L., Hui Y. (2010),

“Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”,

Journal of Medicinal Plants Research Vol. 4(24), pp. 2706-2709.

[52] Yuan K., Zhu J.X., Si J.P., Cai H.K., Ding X.D., Pan Y.J. (2008), Studies

on chemical constituents and antibacterial activity from n-butanol extract

of Sarcandra glabra. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. Vol. 33: 1843-1846.

[53] Zhang Z., Liu W., Zheng Y., Jin L., Yao W., Gao X., (2014), SGP-2, an acidic polysaccharidee from Sarcandra Glabra inhibits proliferation and migration of human osteosarcoma cell. Food Funct, 5, 16