Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Thiết kế bộ chỉ thị STR phục vụ chẩn đoán hemophilia A trước chuyển phôi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------

Nguyễn Kim Ngân THIẾT KẾ BỘ CHỈ THỊ STR PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN HEMOPHILIA A TRƯỚC CHUYỂN PHÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Kim Ngân THIẾT KẾ BỘ CHỈ THỊ STR PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN HEMOPHILIA A TRƯỚC CHUYỂN PHÔI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS. Đặng Tiến Trường

TS. Trần Đức Long

Hà Nội – 10/2019

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực nghiệm để hoàn thành luận văn,

tôi đã may mắn nhận được sự hỗ trợ cả về vật chất và tinh thần từ các thầy cô, cộng

sự và bạn bè. Tôi luôn trân trọng những sự giúp đỡ quý báu đó.

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS.BS. Đặng Tiến Trường – Phó

Chủ nhiệm Bộ môn Giải Phẫu, Học viện Quân Y, người đã trực tiếp hướng dẫn,

truyền đạt cho tôi những kiến thức, kĩ năng chuyên ngành và tạo mọi điều kiện tốt

nhất để tôi được học tập và nghiên cứu cho đến ngày hoàn thành luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Trần Đức Long – Khoa Sinh học,

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người đã luôn hỗ trợ, động viên, chỉ

bảo tôi khắc phục những thiếu sót và truyền cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong

suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô Khoa Sinh học,

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN và đặc biệt là các thầy cô Bộ môn

Di truyền học - những người đã giảng dạy cho tôi trong quá trình học tập; các cán

bộ của Bộ môn Giải phẫu, Học viện Quân Y, đặc biệt là ThS.BS. Nguyễn Minh

Tâm, các cán bộ tại Trung tâm Hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu TW và

Bệnh viện Nam Học và Hiếm muộn Hà Nội đã tận tình hỗ trợ tôi trong suốt quá trình

thu mẫu.

Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc tới những người bạn, người anh chị em

tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN – chỗ dựa tinh thần vững chắc đã

luôn ở bên cạnh động viên, chia sẻ, giúp đỡ, cổ vũ và giúp tôi vượt qua mọi giai đoạn

khó khăn trong cuộc sống nói chung và trong quá trình hoàn thiện luận văn nói riêng.

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn và ghi nhớ.

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2019

Học viên

Nguyễn Kim Ngân

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3

1.1. Bệnh hemophilia A ...................................................................................................... 3

1.1.1. Tổng quan hemophilia A ................................................................................... 3

1.1.2. Cơ sở phân tử của bệnh ..................................................................................... 5

1.1.3. Chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A ....................................................... 11

1.2. Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A ......................................................... 15

1.2.1. Kỹ thuật chẩn đoán trước chuyển phôi ........................................................... 15

1.2.2. Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A ................................................. 16

1.3. Phân tích di truyền liên kết ....................................................................................... 19

1.3.1. Ứng dụng của phân tích di truyền liên kết ...................................................... 19

1.3.2. Chỉ thị phân tử STR ........................................................................................ 21

1.3.3. Các chỉ số đa hình di truyền ............................................................................ 22

1.4. Kỹ thuật PCR đa mồi ............................................................................................... 22

1.5. Kỹ thuật điện di mao quản ........................................................................................ 24

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 26

2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................ 26

2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 26

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ......................................................................................... 26

2.2.2. Công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu đa hình gen .................................... 27

2.2.3. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................................. 28

2.3. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu................................................................................ 29

2.4. Các kỹ thuật được sử dụng ....................................................................................... 29

2.4.1. Giai đoạn tối ưu và xác định tính đa hình ....................................................... 29

2.4.2. Giai đoạn áp dụng và phân tích di truyền trước chuyển phôi ......................... 38

2.4.3. Giai đoạn xác nhận kết quả bằng chẩn đoán trước sinh .................................. 39

2.5. Các chỉ tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 40

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

2.6. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................................ 40

2.7. Vấn đề y đức và đạo đức trong nghiên cứu ............................................................ 40

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 41

3.1. Bộ STR đa hình liên kết với gen F8 phục vụ PGT-M hemophilia A tại Việt Nam ..................................................................................................................................... 41

3.1.1. Các STR nằm cách gen F8 1Mb ..................................................................... 41

3.1.2. Kết quả tối ưu hóa quy trình PCR đa mồi khuếch đại các STR ...................... 42

3.1.3. Chỉ số đa hình và chỉ số dị hợp tử của các STR ............................................. 48

3.1.4. Chuẩn hóa quy trình PGT-M trên mẫu tế bào phôi ............................................ 52

3.2. Áp dụng bộ chỉ thị STR thiết kế cho gia đình bệnh nhân hemophilia A ........... 56

3.2.1. Áp dụng quy trình PGT-M trên gia đình bệnh nhân ....................................... 56

3.2.2. Kết quả mang thai và chẩn đoán trước sinh cho gia đình bệnh nhân.............. 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 68

Kết luận ............................................................................................................................... 68

Kiến nghị ............................................................................................................................ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 69

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1. Phân loại thể bệnh Hemophilia theo biểu hiện lâm sàng .............................. 4

Bảng 2. Các phương pháp phát hiện đột biến gây bệnh hemophilia ........................ 10

Bảng 3. Một số STR được sử dụng trong chẩn đoán Hemophilia A ....................... 18

Bảng 4. Thành phần D2 ............................................................................................ 32

Bảng 5. Thành phần Mastermix ................................................................................ 33

Bảng 6. Thành phần phản ứng PCR đơn mồi ........................................................... 34

Bảng 7. Chu trình nhiệt tiến hành phản ứng PCR đơn mồi ...................................... 34

Bảng 8. Thành phần phản ứng PCR đa mồi gắn màu huỳnh quang ......................... 35

Bảng 9. Chu trình nhiệt phản ứng PCR đa mồi gắn màu huỳnh quang .................... 35

Bảng 10. Thông tin mồi huỳnh quang ....................................................................... 36

Bảng 11. Thành phần phản ứng biến tính DNA cho điện di mao quản .................... 36

Bảng 12. Chu trình nhiệt biến tính DNA .................................................................. 36

Bảng 13. Thông tin các STR được sử dụng trong nghiên cứu .................................. 42

Bảng 14. Trình tự mồi khuếch đại các chỉ thị STR .................................................. 43

Bảng 15. Kết quả nồng độ và độ tinh sạch DNA tách từ mẫu máu .......................... 44

Bảng 16. Nồng độ mồi trong phản ứng PCR đa mồi ................................................ 47

Bảng 17. Kết quả tính toán chỉ số Ho, He, PIC .......................................................... 49

Bảng 18. Kết quả nồng độ sản phẩm WGA 05 mẫu phôi bào phục vụ tối ưu hóa ... 52

Bảng 19. Kết quả phân tích đột biến gen F8 ở phôi IVF .......................................... 63

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Bệnh nhân hemophilia bị chảy máu trong cơ và biến dạng khớp .................. 3

Hình 2. Vị trí của gen tổng hợp FVIII ........................................................................ 5

Hình 3. Bản đồ vị trí đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A ở Việt Nam ............... 6

Hình 4. Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 22 .............................................................. 7

Hình 5. Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 1 ................................................................. 8

Hình 6. Cơ chế di truyền bệnh Hemophilia A .......................................................... 11

Hình 7. Vị trí 4 mồi A, B, P, Q trong Long-range PCR phát hiện đảo đoạn int22 trong

gen F8 ........................................................................................................................ 12

Hình 8. Kết quả LD-PCR phát hiện đảo đoạn int22 gen F8 ..................................... 13

Hình 9. Vị trí cắt giới hạn của enzyme BclI .............................................................. 14

Hình 10. Sơ đồ nguyên lý 3 kỹ thuật khuếch đại toàn hệ gen .................................. 16

Hình 11. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản ................................... 24

Hình 12. Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................ 28

Hình 13. Phần mềm Tandem Repeat Finder và các chỉ số thiết đặt để sàng lọc ...... 30

Hình 14. Giao diện phân tích kết quả phần mềm Genemapper 4.0. ......................... 37

Hình 15. Sơ đồ vị trí các STR sử dụng trong nghiên cứu trên NST X ..................... 41

Hình 16. Kết quả tối ưu hóa các mồi X1 đến X5 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65 .............. 44

Hình 17. Kết quả tối ưu hóa các mồi X6 đến X10 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65oC ........ 44

Hình 18. Kết quả tối ưu hóa các mồi X11 đến X15 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65oC ...... 45

Hình 19. Kết quả điện di mao quản phản ứng PCR đa mồi cho 14 cặp mồi có ....... 46

Hình 20. Kết quả điện di mao quản phản ứng PCR đa mồi cho 14 cặp mồi có nồng

độ phản ứng đã hiệu chỉnh ........................................................................................ 48

Hình 21. Biểu đồ tần số dị hợp tử quan sát Ho trong các quần thể nghiên cứu ........ 50

Hình 22. Biểu đồ tần số dị hợp tử lý thuyết He trong các quần thể nghiên cứu ........ 50

Hình 23. Biểu đồ chỉ số đa hình PIC trong các quần thể nghiên cứu ....................... 51

Hình 24. Biểu đồ tỉ lệ cá thể dị hợp tử các chỉ thị STR ở 2 bên gen F8 ................... 52

Hình 25. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 1 ............................................................. 53

Hình 26. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 2 ............................................................. 54

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hình 27. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 3 ............................................................. 54

Hình 28. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 4 ............................................................. 55

Hình 29. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 5 ............................................................. 55

Hình 30. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và

phôi Q1 ...................................................................................................................... 57

Hình 31. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và

phôi Q2 ...................................................................................................................... 58

Hình 32. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và

phôi Q3 ...................................................................................................................... 59

Hình 33. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và

phôi Q4 ...................................................................................................................... 60

Hình 34. Kết quả phân tích di truyền liên kết phục vụ PGT-M hemophilia A của gia

đình bệnh nhân tham gia nghiên cứu ........................................................................ 62

Hình 35. Kết quả chẩn đoán trước sinh bằng Longrange PCR do Viện Huyết học –

Truyền máu Trung ương thực hiện ........................................................................... 64

Hình 36. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và

dịch ối ........................................................................................................................ 65

Hình 37. Kết quả chẩn đoán trước sinh bằng phân tích di truyền liên kết sử dụng bộ

STR thiết kế được...................................................................................................... 66

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

ADO Allele drop out Mất allele

Bp base pair Cặp bazơ nitơ

Comparative genomic Lai so sánh hệ gen CGH hybridization

Conformation sensitive gel Điện di phân biệt cấu hình phân CSGE electrophoresis tử

Denaturing high pressure Sắc ký lỏng biến tính hiệu năng DHPLC liquid chromatography cao

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

Degenerate oligonucleotide Khuếch đại bằng mồi thoái hóa DOP primed

F8 F8 gene Gen quy định yếu tố VIII

FVIII Yếu tố VIII

Fluorescence in situ Lai huỳnh quang tại chỗ FISH hybridization

Observed Heterozygosity Chỉ số dị hợp tử quan sát Ho

Expected Heterozygosity Chỉ số dị hợp tử lý thuyết He

Intron 1 Intron 1 Int1

Intron 22 Intron 22 Int22

I-PCR Inversion PCR PCR phát hiện đảo đoạn

IVF In vitro fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm

Intra-cytoplasmic sperm Tiêm tinh trùng vào bào tương ICSI injection trứng

Multiple displacement Khuếch đại đa điểm thay thế MDA amplification

Mbp Mega base pair Triệu cặp bazơ nitơ

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

Multiplex ligation dependent Nhân bản các đoạn đầu dò phụ MLPA probe amplification thuộc vào phản ứng nối

NST Chromosome Nhiễm sắc thể

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase

Preimplantation genetic Chẩn đoán di truyền trước chuyển PGD diagnosis phôi

Preimplantation genetic Xét nghiệm di truyền trước PGT testing chuyển phôi

Preimplantation genetic Xét nghiệm di truyền trước PGT – A testing for Aneuploidies chuyển phôi phát hiện dị bội

Polymorphism Information PIC Hàm lượng thông tin tính đa hình Content

Preimplantation genetic Xét nghiệm di truyền trước

PGT – M testing for monogenic/single chuyển phôi phát hiện bệnh đơn

gene disorders gen

Preimplantation genetic Xét nghiệm di truyền trước

PGT – SR testing for chromosome chuyển phôi phát hiện rối loạn cấu

structural rearrangements trúc nhiễm sắc thể

STR Short tandem repeat Trình tự lặp kế tiếp

WGA Whole genome amplification Khuếch đại toàn bộ hệ gen

Microliter µl Micro lít

Micromole µM Micro mol

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu di truyền liên kết nhiễm sắc thể

(NST) X, do đột biến gen F8, giảm yếu tố VIII, gây chảy máu không cầm, có thể dẫn

tới tử vong. Trên thế giới, tỷ lệ mắc bệnh khoảng 1/5000 người nam [38]. Ở Việt

Nam, theo thống kê của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương, có khoảng

30.000 người mang gen F8 đột biến [82]. Điều trị hemophilia A chủ yếu bằng truyền

máu tươi hoặc yếu tố VIII nên kinh phí điều trị rất cao nhưng không giải quyết được

nguyên nhân bị bệnh. Vì vậy, việc dự phòng không sinh con bị bệnh hoặc không

mang gen bệnh bằng chẩn đoán trước sinh và xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi

là rất cần thiết.

Kỹ thuật chẩn đoán trước sinh giúp tránh sinh con bị bệnh dựa trên việc chọc

ối ở thời điểm thai 16 tuần tuổi - tuy nhiên, cặp vợ chồng mang gen phải đối mặt với

nguy cơ đình chỉ thai nghén khi thai nhi bị bệnh. Để khắc phục hạn chế này, kỹ thuật

xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi (Preimplantation Genetic Testing –PGT)

được ưu tiên sử dụng. PGT là sự kết hợp giữa kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (In

vitro fertilization – IVF) tạo phôi với việc chẩn đoán di truyền. Việc lựa chọn trên

nhiều phôi giúp khả năng chọn được phôi và mang thai không bị bệnh cao hơn nhiều

việc chỉ lựa chọn trên một thai nhi trong chẩn đoán trước sinh. Hơn nữa, PGT giúp

các thai phụ tránh phải đình chỉ thai nghén, giảm gánh nặng về tâm lý và bảo vệ sức

khỏe của người phụ nữ.

Gen F8 lớn, tổn thương trong bệnh hemophilia A phức tạp nên khó có một kỹ

thuật xác định trực tiếp các đột biến gen F8 trên tế bào phôi. Bên cạnh đó, hiện tượng

khuếch đại hỏng một hoặc cả hai allele (Allele DropOut-ADO) ở mẫu tế bào phôi,

được xác định trên 40% các ca chẩn đoán trước chuyển phôi [12], có thể dẫn tới chẩn

đoán sai. Ngoài ra, ngoại nhiễm cũng là nguyên nhân phổ biến thứ hai gây chẩn đoán

sai trong PGT. Do vậy, kỹ thuật phân tích liên kết gen sử dụng nhiều trình tự lặp ngắn

(Short Tandem Repeat – STR) giúp chẩn đoán trước chuyển phôi hemophilia A được

ưu tiên lựa chọn vì giúp kiểm soát ADO và ngoại nhiễm.

Các STR phục vụ PGT phải có tính đa hình cao và nằm gần gen tổn thương để

1

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

đảm bảo tính liên kết. Tỷ lệ dị hợp tử quan sát là một trong những chỉ tiêu quan trọng

đánh giá tính đa hình của các STR, quyết định giá trị của STR trong chẩn đoán. Tỷ lệ

dị hợp tử quan sát càng cao, giá trị STR trong chẩn đoán càng cao. Ngược lại, tỷ lệ dị

hợp tử quan sát thấp, sử dụng các STR này trong chẩn đoán ít có giá trị, gây lãng phí

về kinh tế, thời gian và công lao động. Trên thế giới, một số nghiên cứu đã đánh giá

tính đa hình trên quần thể người Brazil [47, 50], New Zealand [42], Trung Quốc [17,

72], nhằm lựa chọn các STR phục vụ chẩn đoán trước chuyển phôi hemophilia A.

Ngoài ra, lựa chọn các STR nằm càng gần gen tổn thương giúp hạn chế hiện tượng

trao đổi chéo gây chẩn đoán sai.

Tại Việt Nam, đã có nghiên cứu xây dựng quy trình PGT cho bệnh hemophilia

A dựa trên phân tích STR [2] nhưng một số STR nằm khá xa gen F8. Hơn nữa, các

báo cáo trên thế giới thấy tính đa hình của các STR này thấp, thậm chí tỷ lệ dị hợp tử

quan sát chỉ đạt 1,5% trên một số quần thể người khác nhau [6, 61]. Tính đa hình của

các STR phục vụ PGT chưa được đề cập trên quần thể người Việt Nam [2].

Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Thiết kế bộ chỉ thị STR phục vụ

chẩn đoán hemophilia A trước chuyển phôi” với hai mục tiêu:

1. Thiết kế bộ chỉ thị STR phục vụ chẩn đoán hemophilia A cho quần thể

người Việt Nam, đảm bảo liên kết chặt với gen F8 và có chỉ số đa hình cao

trong quần thể này.

2. Áp dụng bộ chỉ thị thiết kế được trong chẩn đoán di truyền trước

chuyển phôi bệnh hemophilia A cho gia đình bệnh nhân người Việt Nam.

Nghiên cứu thuộc đề tài “Ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR phân tích các

trình tự lặp ngắn trong chẩn đoán bệnh hemophilia A trước chuyển phôi tại Hà Nội”

mã số 01C-08/11-2017-3 thực hiện tại Phòng phân tích DNA, Bộ môn Giải Phẫu,

Học viện Quân Y.

2

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Bệnh hemophilia A

1.1.1. Tổng quan hemophilia A

Hemophilia, hay bệnh ưa chảy máu, là bệnh rối loạn đông máu di truyền biểu

hiện lâm sàng chủ yếu là máu chảy khó cầm ở các vết thương như đứt tay, nhổ răng

và các khối máu tụ ở khớp, cơ thường xuất hiện nhiều lần ở một khớp (hình 1). Người

mắc bệnh này phải truyền máu thường xuyên, sống nhờ máu người khác với dung

tích lớn, không được hoạt động mạnh. Cơ chế di truyền của bệnh liên quan đến giới

tính, gen bệnh nằm trên NST X, không có allele tương ứng trên NST Y, gây thiếu hụt

hay bất thường chức năng của các yếu tố đông máu. Bệnh gồm 3 thể: hemophilia A

(80-85%) thiếu yếu tố VIII, hemophilia B (15-20%) thiếu yếu tố IX, hemophilia C

(chủ yếu ở người Do Thái với tỷ lệ mắc đồng hợp tử khoảng 1-3‰ ) thiếu yếu tố XI

[34].

Hình 1. Bệnh nhân hemophilia bị chảy máu trong cơ và biến dạng khớp

[15, 83]

Trong ba thể bệnh trên, hemophilia A là thể phổ biến nhất trên toàn thế giới,

cứ 100000 người nam thì khoảng 10 người mắc bệnh này trong đó 3 – 4 người thuộc

các nước châu Á [49, 74]. Sự xuất hiện của các đột biến tự phát trên gen F8 được

phản ánh qua 30-33% các ca bệnh ở gia đình không có tiền sử. [34, 51, 54]. Người

3

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

đột biến gen F8 gây thiếu hoặc không tổng hợp được yếu tố VIII, làm rối loạn quá

trình đông máu biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của bệnh hemophilia A. Triệu

chứng lâm sàng thể hiện khác nhau giữa các bệnh nhân, trong đó triệu chứng chảy

máu là đặc trưng của bệnh. Các thể xuất huyết nhẹ có triệu chứng xuất huyết xảy ra

khi răng sữa rụng hoặc nhổ răng. Bệnh càng nặng thì triệu chứng xuất hiện càng sớm.

Bệnh hemophilia A thể nặng đặc trưng bởi bầm tím và chảy máu thường xuyên tái

phát vào khớp, đặc biệt là đầu gối, mắt cá chân, hông và khuỷu tay gây giới hạn

chuyển động của các khớp. Bệnh nhân có thể chảy máu tự phát hoặc sau một chấn

thương nhỏ. Đây là nguyên nhân phổ biến khiến bệnh nhân hemophilia A có thể chảy

máu đến chết sau chấn thương.

Có thể chẩn đoán thể bệnh hemophilia A theo mức độ yếu tố VIII: bình thường

nồng độ FVIII ở người là 200 ng/ml, trường hợp bị bệnh, lượng yếu tố VIII giảm

dưới 30%. Hemophilia A được chia làm ba thể: nặng, trung bình và nhẹ. Ở thể nặng,

hoạt tính FVIII dưới 1%, những bệnh nhân này thường bị chảy máu vài lần trong

tháng. Với thể trung bình, hoạt tính FVIII từ 1-5%, những bệnh nhân này chỉ bị chảy

máu sau những chấn thương nhẹ. Còn ở thể nhẹ, hoạt tính FVIII từ 5-30% so với mức

bình thường, những người này chỉ bị chảy máu sau phẫu thuật hoặc những chấn

thương nặng, sau những động tác mạnh khi chơi thể thao [5].

Bảng 1. Phân loại thể bệnh Hemophilia theo biểu hiện lâm sàng [86]

Nồng độ % yếu tố Thể bệnh Biểu hiện chảy máu VIII (đơn vị/ml)

Nặng Chảy máu tự nhiên không liên quan đến chấn 1% (<0,01) (chiếm 70%) thương, thường chảy máu ở khớp và cơ.

Chảy máu tự nhiên hoặc liên quan đến chấn Trung bình 1 – 5 % thương nhỏ. Chảy máu nặng sau chấn (chiếm 15%) (0,01 – 0,05) thương, phẫu thuật.

Nhẹ 5 – 40% Chảy máu sau chấn thương lớn/phẫu thuật. (chiếm 15%) (0,04 – 0,4)

4

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hiện nay đã có nhiều phương pháp điều trị và hỗ trợ bệnh nhân mắc

hemophilia, trong đó điều trị liệu pháp gen hứa hẹn nhiều lợi ích vì bệnh được gây ra

bởi khiếm khuyết gen, có thể điều trị để biến đổi một dạng bệnh từ thể nặng thành

thể nhẹ của bệnh. Sử dụng liệu pháp gen có thể kích hoạt lên đến 150% hoạt động

của FVIII [48]. Các nghiên cứu thực nghiệm trên chuột và chó đã chứng minh sự

thành công khi sử dụng liệu pháp gen điều trị, tuy nhiên vẫn cần thêm các nghiên cứu

và thử nghiệm về khả năng đáp ứng miễn dịch ở người để đảm bảo độ an toàn khi áp

dụng [33]. Thêm vào đó, kinh phí cho liệu pháp gen còn cao so với mặt bằng kinh tế

xã hội ở Việt Nam (trung bình một người bệnh mức độ nặng chảy máu 40 lần 1 năm

với chi phí điều trị có thể lên tới 1 – 2 tỷ đồng [88]) nên việc chẩn đoán hemophilia

nói chung và chẩn đoán di truyền trước sinh và trước chuyển phôi nói riêng là công

tác quan trọng nhằm giảm thiểu tối đa các hậu quả cho thế hệ sau của các gia đình

mang gen bệnh.

1.1.2. Cơ sở phân tử của bệnh

Gen F8 nằm ở vị trí Xq28 trên NST giới tính X (chrX:

154,835,795-155,022,753; University of California, Santa Cruz genome browser,

GRCh38/hg38), là một trong những gen lớn nhất cơ thể, có kích thước 186 kb gồm

26 exon trong đó 24 exon có kích thước từ 62 bp - 262 bp và 2 exon lớn nhất exon 14

(3106 bp) và exon 26 (1958 bp) [27, 65], mã hóa cho protein FVIII gồm 2332 amino

acid và có trọng lượng phân tử khoảng 300 kD.

Hình 2. Vị trí của gen tổng hợp FVIII [65]

5

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Khi gen F8 bị đột biến, tế bào giảm hoặc mất khả năng tổng hợp protein FVIII

gây nên bệnh hemophilia A [18]. Cơ sở phân tử của hemophilia A được phân tích

trong nhiều năm và rất nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh đã được công bố. Các

nghiên cứu khẳng định dạng đột biến khác nhau sẽ gây những kiểu hình đặc trưng

khác nhau [65]: Bệnh nhân hemohilia A thể nặng thường gặp dạng đột biến đảo đoạn

intron 22 (chiếm 45-50%), trong khi đó đột biến điểm chiếm đa số ở bệnh nhân

hemophilia A thể bệnh vừa và nhẹ 90-95% [25] . Ở Việt Nam, đột biến đảo đoạn

chiếm tỷ lệ cao nhất 38,1%. Tiếp theo là đột biến sai nghĩa chiếm tỷ lệ 23,9%. Chiếm

tỷ lệ cao thứ ba là các dạng đột biến mất nucleotide, đột biến vô nghĩa, đột biến thêm

nucleotide với tỷ lệ 9,8%. Tỷ lệ thấp nhất là dạng đột biến ở biên giới exon-intron và

đột biến mất đoạn lớn chiếm tỷ lệ 4,3% [1].

Vào năm 2014, bản đồ đột biến gen F8 của các bệnh nhân Hemophilia ở Việt

Nam đã được xây dựng nhằm hỗ trợ chẩn đoán và điều trị bệnh này (hình 3) [1].

Hình 3. Bản đồ vị trí đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A ở Việt Nam [1]

Nghiên cứu của Kaufman và cộng sự năm 1995 khẳng định dạng đột biến khác

nhau sẽ gây những kiểu hình đặc trưng khác nhau của bệnh nhân mắc hemophilia

[65].

Cụ thể, nhiều cơ chế đột biến khác nhau có thể gây bệnh hemophilia A thể

6

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

nặng, tuy nhiên dạng đột biến thường gặp nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm 45-50%

bệnh nhân (hình 4) và intron 1 chiếm khoảng 5% bệnh nhân (hình 5) của gen F8 [16,

53]. Đảo đoạn intron 22 xảy ra do sự tái tổ hợp giữa bản sao của vùng int22h1 (vùng

lặp lại gồm 9,5 kb) thuộc intron 22 với một trong hai bản sao của vùng tương đồng

nằm ở telomere vùng int22h2, int22h3; vị trí 400 kb ở đầu 5’ ngoài gen F8 [41]. Hiện

tượng đảo đoạn dẫn đến đứt gãy gen F8 và gây thể bệnh nặng cho bệnh nhân với biểu

hiện kiểu hình là chảy máu ở mức độ nặng và biến dạng khớp. Đảo đoạn intron 1 xảy

ra tương tự, do sự tái tổ hợp vùng int1h1thuộc intron 1 (kích thước 900 bp) nằm vị trí

140 kb ở đầu 5’ của gen F8 với bản sao int1h2 nằm ngoài gen F8 [41].

Hình 4. Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 22 [25]

Đột biến mất đoạn lớn phát hiện thấy ở 2-5% bệnh nhân hemophilia A thể

nặng [9], có thể ở dạng mất một exon hoặc mất toàn bộ gen [70]. Dạng đột biến này

là do quá trình tái tổ hợp giữa các đoạn lặp Alu [23, 75, 77]. Đột biến chèn đoạn lớn

làm đứt gãy gen F8 cũng gây hemophilia A thể nặng [55, 68].

Ngoài ra, đột biến thay thế một nucleotide cũng có thể gây hemophilia A thể

nặng: đột biến vô nghĩa (nonsense) tạo mã kết thúc hoặc đột biến mất nucleotide gây

lệch khung dịch mã dẫn đến không tổng hợp hoặc tổng hợp protein không có chức

năng. Đột biến tại biên giới intron và exon đã được các tác giả công bố. Nhiều đột

7

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

biến thay thế ảnh hưởng đến dinucleotide CpG được phát hiện trên một số bệnh nhân,

ví dụ đột biến c.6496C>T dẫn đến chuyển thành Arg2147X (Tại vị trí 6496 trên trình

tự Genebank nucleotide C thay bằng nucleotide T làm thay đổi protein Arginine ở vị

trí 2147 tạo thành stop codon) [39]. Mất đoạn và chèn đoạn nhỏ cũng thường thấy

trong hemophilia A thể nặng, thay đổi từ 1-55 nucleotide. Phổ biến nhất là mất hoặc

chèn nucleotide A vào exon 14 [8], thường xảy ra trong vùng từ c.3637 đến c.4379

[39].

Hình 5. Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 1 [25]

Đối với hemophilia A thể vừa và nhẹ, cơ chế chính là đột biến điểm gây lệch

khung dịch mã và đột biến thay thế nucleotide (missense), chiếm 90-95% bệnh nhân.

Đột biến tại vị trí nối và vùng promoter của gen được phát hiện ở một số bệnh nhân.

Hiện tượng lặp đoạn exon 13 cũng được mô tả ở các bệnh nhân hemophilia A thể nhẹ

[25].

Thông thường, các trường hợp nam giới bị đột biến gen F8 thể nặng gây bệnh

hemophilia A trong cùng một gia đình có những biểu hiện lâm sàng nặng nề tương tự

nhau. Tuy nhiên, hiệu ứng di truyền và môi trường khác nhau có thể thay đổi mức độ

biểu hiện lâm sàng của bệnh [19]. Các nghiên cứu đã chỉ ra 10-15% bệnh nhân với

“kiểu hình đặc trưng” chảy máu mức độ nặng (khi nồng độ FVIII hoạt động <1%) có

biểu hiện triệu chứng tương đối nhẹ trên lâm sàng [12, 22, 59]. Không phải tất cả

8

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

những bệnh nhân hemophilia A thể nặng thường xuyên chảy máu tự phát, thậm chí

trong số những người bị chảy máu, mức độ nặng của bệnh cũng khác biệt đáng kể.

Cơ sở cho sự khác biệt này vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn [36, 71]. Gần đây đã có

báo cáo chứng minh được tần số một số loại đột biến là khác nhau ở hai giới: tỷ lệ

đảo đoạn intron 22 ở tế bào mầm sinh dục nam nhiều hơn 15 lần ở tế bào mầm sinh

dục nữ. Đối với đột biến điểm ở tế bào sinh dục nam cao hơn gấp 5 – 10 lần, còn đột

biến mất đoạn cao hơn 5 lần so với tế bào mầm sinh dục nữ [58].

Nghiên cứu sinh học phân tử giúp phát hiện ra các dạng, các vị trí đột biến trên

gen F8 gây bệnh hemophilia A để chẩn đoán phát hiện người mang gen bệnh. Có

nhiều phương pháp để xác định đột biến gen, tuỳ thuộc vào kiểu đột biến mà có các

phương pháp phân tích khác nhau. Một số kỹ thuật phân tích đột biến được sử dụng

hiện nay là PCR phát hiện đột biến mất exon, Longrange-PCR, Inversion PCR (I-

PCR) phát hiện đảo đoạn intron 22 [41, 44, 69], PCR đa mồi phát hiện đảo đoạn

intron 1 [7] và Southern Blot. Ngoài ra còn có hai kỹ thuật sàng lọc đột biến dựa trên

phân tích sợi kép là phương pháp điện di gel phân biệt cấu hình phân tử

(Conformation Sensitive Gel Electrophoresis - CSGE) và sắc ký lỏng biến tính hiệu

năng cao (Denaturing high pressure liquid chromatography - DHPLC), trong đó

DHPLC hiện là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất để phân tích gen F8 [6, 57].

Những năm gần đây, kỹ thuật nhân bản các đoạn đầu dò phụ thuộc vào phản

ứng nối (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification - MLPA) là phương

pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoán đột biến mất đoạn, lặp đoạn gen F8 [6,

57]. Đây là phương pháp bán định lượng xác định số lượng bản sao tương đối của

trình tự DNA, được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu về bệnh lý di truyền người.

Ngoài ra, MLPA còn giúp phát hiện tổn thương gen, chẩn đoán dị hợp tử với độ chính

xác cao, cho kết quả nhanh chóng [52].

Phương pháp giải trình tự DNA của toàn bộ gen F8 có thể được sử dụng để xác

định các đột biến điểm gây bệnh. Tuy nhiên, do kích thước lớn của gen F8 và các cơ chế

đột biến phức tạp nên giải trình tự cũng không thể giúp chẩn đoán bệnh trong mọi trường

hợp. Tại Việt Nam, phát hiện đột biến gen F8 bằng kỹ thuật giải trình tự hiện nay đang

9

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

được tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội [1].

Bảng 2. Các phương pháp phát hiện đột biến gây bệnh hemophilia

Phương Loại đột biến Ưu điểm Nhược điểm pháp phát hiện

Southern Đảo đoạn Cho phép xác định những Thời gian thực hiện

blot intron 22 đoạn DNA đột biến với lâu, nhiều công đoạn.

nồng độ nhỏ trong hỗn

hợp mẫu mà khó có thể

xác định được bằng các

phương pháp khác.

Longrange- Xét nghiệm phân tích Có nhiều yếu tố ảnh

PCR gen được tiến hành đơn hưởng kết quả PCR;

giản, dễ thực hiện. đòi hỏi nồng độ DNA I-PCR

trong mẫu cao và mẫu Đảo đoạn PCR đa mồi phải được bảo quản intron 1

tốt. PCR Mất exon 14,

26

DHPLC Các dạng đột Có thể phát hiện 85-90% Đòi hỏi thiết bị

biến khác. đột biến gen F8 [6, 26]. chuyên môn đắt tiền, CSGE

tốn kém tiền bạc và MLPA

công sức Giải trình tự

DNA

Kết quả đột biến DNA cần phải được giải thích một cách thận trọng, do những

nguy cơ tiềm ẩn của thể khảm trong gia đình có tiền sử bệnh hemophilia A (chiếm

khoảng 10%) có thể gây ra sự không chắc chắn về tình trạng mang gen bệnh: quy

trình phát hiện đột biến thông thường có thể không phát hiện ra khiếm khuyết di

truyền tiềm ẩn, nếu tỷ lệ các allele đột biến là <5% so với nền allele kiểu thông thường

[61].

10

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

1.1.3. Chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A

Hiện nay với các liệu pháp điều trị có hiệu quả, người bị bệnh hemophilia A

hoàn toàn có thể lập gia đình, sinh con. Tuy vậy, để có thể sinh ra các con không

mang bệnh này và thậm chí loại bỏ được gen bệnh đang tồn tại trong dòng họ, trước

khi tiến tới hôn nhân, cần phải xét nghiệm chẩn đoán toàn thể, mức độ bệnh và có thể

được tư vấn trước sinh. Dựa trên cơ chế di truyền bệnh hemophilia A (hình 6), để loại

bỏ gen bệnh, nếu người cha bị bệnh thì không được sinh con gái vì 100% con gái sẽ

mang gen gây bệnh di truyền từ NST X của bố. Còn với người phụ nữ mang gen

bệnh, hoặc cả hai bố mẹ cùng mang gen bệnh thì ở thời kỳ thai nghén, người phụ nữ

cần làm chẩn đoán trước sinh vì gen gây bệnh từ NST X của mẹ sẽ di truyền cho 50%

con gái và 50% con trai.

Hình 6. Cơ chế di truyền bệnh Hemophilia A [85]

Chẩn đoán trước sinh là sử dụng những phương pháp thăm dò trong thời kỳ

thai nghén nhằm phát hiện các bất thường về hình thái hay những bất thường về nhiễm

sắc thể của thai để chẩn đoán sớm các bệnh và từ đó đưa ra các biện pháp can thiệp

kịp thời nhằm giảm tỷ lệ tử vong sơ sinh, tỷ lệ trẻ bị dị tật, khuyết tật nặng nề và góp

phần nâng cao chất lượng dân số. Các phương pháp cơ bản được ứng dụng hiện nay

là siêu âm chẩn đoán, định lượng các chất đánh dấu và các phương pháp lấy bệnh

11

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

phẩm thai như: chọc hút nước ối, lấy máu tĩnh mạch rốn, sinh thiết bánh rau… để xác

định những bệnh lý liên quan đến bất thường về nhiễm sắc thể. Tuy nhiên, vì các

phương pháp lấy bệnh phẩm thai đều phải sử dụng kỹ thuật xâm lấn nên đều có thể

gây các biến chứng như rỉ ối, sảy thai với tỷ lệ nhất định nếu kỹ thuật viên không tuân

thủ nghiêm ngặt các quy định, hướng dẫn khi thực hiện [87].

Xét nghiệm chẩn đoán trước sinh cho hemophilia nói riêng và các rối loạn đơn

gen nói chung thường tiến hành trên bệnh phẩm thai là dịch ối hoặc DNA tự do của

thai nhi tách từ máu ngoại vi của người mẹ. Ở nước ta hiện nay Long-range PCR

được sử dụng chủ yếu để phát hiện đảo đoạn intron 22. Trong kỹ thuật này, bốn mồi

P, Q, A&B có khả năng phân biệt người nam bị bệnh mang hoặc không mang đảo

đoạn, và người nữ mang gen: hai mồi P&Q được thiết kế trong gen F8 và nằm 2 đầu

int22h1. Hai mồi xa hơn là A&B, nằm 2 đầu int22h2 và 22h3, vùng tương đồng ngoại

gen của int22h1 (hình 7). Các mồi P & Q khuếch đại đoạn 12 kb, A & B đoạn 10 kb

và P & B và A & Q đoạn 11 kb (mỗi cặp) trên gel agarose.

Hình 7. Vị trí 4 mồi A, B, P, Q trong Long-range PCR phát hiện đảo đoạn

int22 trong gen F8

Đoạn A & B luôn được tạo ra và đảm nhiệm với tư cách là một đối chứng

12

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

dương, bởi vì ít nhất một bản sao của int22h2 và int22h3 vẫn còn nguyên vẹn. Sử

dụng tất cả bốn mồi cùng một lúc trong một PCR ống đơn, DNA hệ gen không có

đảo đoạn, mẫu của bệnh nhân nam hoặc bệnh nhân nữ mang đảo đoạn tạo ra ba mô

hình khuếch đại: một băng 12 kb phía trên, và một băng 10 kb phía dưới chỉ có nghĩa

là không có đảo đoạn (làn 2- hình 8). Băng 11 kb ở giữa, và một băng 10 kb ở phía

dưới nghĩa là có sự đảo đoạn ở bệnh nhân nam mắc bệnh (làn 1- hình 8). Các băng

10 kb, 11 kb và 12 kb cho biết một người nữ mang đảo đoạn (làn 3 và 4 - hình 8).

Protocol Longrange-PCR để phát hiện đảo đoạn F8C khác với các protocol long range

PCR tiêu chuẩn [63]. Sự thay đổi bao gồm việc bổ sung nồng độ cao của dimethyl

sulphoxide (DMSO) và kết hợp 7-deaza-dGTP để có thể đọc qua vùng có hàm lượng

GC cao nằm phía đầu của nhân tố gen F8, và tăng đáng kể lượng Taq and Pwo DNA

polymerases. Các sửa đổi bổ sung bao gồm điều chỉnh điều kiện của chu kỳ và các

thành phần khác của phản ứng PCR (Liu và Sommer 1998; Liu và cộng sự 1999) [43,

45]. Tuy nhiên, kỹ thuật này còn nhiều hạn chế như đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, thời

gian thực hiện chưa nhanh chóng, các phương pháp PCR có thể bị âm tính giả. Bên

cạnh đó, hiện tượng nhiễm máu mẹ trong quá trình thu mẫu và ngoại nhiễm trong vận

chuyển, thao tác kỹ thuật trên dịch ối cũng có thể dẫn tới kết quả không chính xác.

Hình 8. Kết quả LD-PCR phát hiện đảo đoạn int22 gen F8 (Làn 1: mẫu nam có

đảo đoạn – người mắc bệnh; Làn 2: mẫu nữ không có đảo đoạn – người không

mang gen bệnh; Làn 3,4: mẫu nữ có đảo đoạn – người mang gen bệnh)

13

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Ngoài ra, trong chẩn đoán trước sinh hemophilia A còn có xét nghiệm phát

hiện đột biến trên intron 18 sử dụng kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt giới

hạn của enzyme BclI. Cụ thể trong phương pháp này, mẫu DNA của người mẹ (tách

từ máu) và thai nhi (tách từ dịch ối) được làm PCR khuếch đại đoạn sản phẩm kích

thước 142bp. Trên NST X bình thường, đoạn này chứa vị trí cắt giới hạn của enzyme

BclI tại nucleotide thứ 99 (hình 9) nên sau khi xử lý với enzyme, kết quả điện di sẽ

cho 2 băng kích thước 99bp và 43bp. Khi xảy ra đột biến điểm làm thay đổi trình tự

tại vị trí nhận biết của BclI, đoạn DNA không bị cắt và giữ nguyên kích thước 142bp.

Trên cơ sở đó, có thể phân tích kết quả xét nghiệm của một số cặp mẹ con làm chẩn

đoán trước sinh bệnh hemophilia A [3]. Đây là phương pháp dễ thực hiện và phù hợp

với điều kiện kinh tế của nhiều gia đình bệnh nhân, nhưng chưa đảm bảo được khả

năng phát hiện đầy đủ đột biến gây bệnh cũng như kết quả chẩn đoán phụ thuộc khá

nhiều vào hoạt tính enzyme, khó tránh khỏi phải lặp lại thí nghiệm nhiều lần hay hiện

tượng âm tính giả khi enzyme mất hoạt tính.

Hình 9. Vị trí cắt giới hạn của enzyme BclI

Do các hạn chế nói trên của chẩn đoán trước sinh, nên các cặp vợ chồng có

người mang gen bệnh hemophilia A được khuyến cáo lựa chọn phương pháp thụ tinh

ống nghiệm (In vitro Fertilization – IVF) và sàng lọc phôi bệnh để có thể tránh được

việc sinh trẻ mắc các bệnh này từ giai đoạn trước mang thai để giảm thiểu tối đa các

rủi ro cho thai nhi cũng như sức khỏe và tâm lý của người mẹ.

14

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

1.2. Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A

1.2.1. Kỹ thuật chẩn đoán trước chuyển phôi

Để nâng cao tỷ lệ thành công và trẻ sinh sống khoẻ mạnh trong điều trị IVF

thì việc chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi (Preimplantation Genetic Diagnosis -

PGD) là một trong những yêu cầu quan trọng, cấp thiết và thực tiễn [21, 30]. Cụ thể,

trong suốt chu trình IVF, một hoặc một số tế bào được sinh thiết vào ngày thứ 3 hoặc

thứ 5. DNA trong tế bào phôi được phân tích kiểu gen, đồng thời phòng thí nghiệm

cũng phân tích DNA trong máu của bố, mẹ và một số thành viên gia đình khác để xác

định kiểu gen gây bệnh và so sánh với phôi để kiểm tra phôi có bị bệnh không. Sau

khi hoàn thành các bước này, các phôi được sàng lọc để chỉ giữ lại phôi không mang

bệnh. PGD được báo cáo lần đầu tiên trên thế giới vào năm 1990, cho đến nay đã

được sử dụng như một phương tiện chẩn đoán lâm sàng trong điều trị và áp dụng một

cách rộng rãi. Hàng năm số trường hợp PGD tăng gần gấp đôi, hàng chục ngàn trẻ ra

đời từ các trung tâm IVF trên thế giới sau chẩn đoán PGD và chưa có công bố nào

tìm thấy ảnh hưởng xấu của PGD ở trẻ ra đời bằng phương pháp này. Hiện nay, thuật

ngữ PGD được thay thế bằng PGT-M (đối với bệnh lý đơn gen); PGT-SR (đối với

cấu trúc NST); PGT-A (đối với dị bội). Hiện nay ngoài kỹ thuật IVF truyền thống thì

kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (Intra-Cytoplasmic Sperm Injection -

ICSI) cũng được thực hiện tạo nhiều trung tâm hỗ trợ sinh sản để tăng hiệu quả thụ

tinh, vì trong IVF trứng được cấy với hàng trăm tinh trùng còn trong ICSI chỉ với một

tinh trùng được lựa chọn là tốt nhất về mặt hình thái cũng như khả năng di động.

Để có thể phân tích DNA từ mẫu phôi đơn bào, trước tiên cần tiến hành khuếch

đại toàn hệ gen (Whole Genome Amplification – WGA). WGA là phương pháp

khuếch đại toàn bộ hệ gen từ những mẫu có lượng DNA rất ít chỉ khoảng vài pg/µl.

Phương pháp này được áp dụng phổ biến trong lĩnh vực pháp y và nghiên cứu, chẩn

đoán các bệnh di truyền [67, 80]. Đây cũng là bước chuẩn bị cho các kỹ thuật tiếp

theo như giải trình tự thế hệ mới [20, 64] và array CGH [35]. Để tiến hành WGA, có

thể sử dụng 1 trong 3 phương pháp: PCR bằng mồi thoái hóa (Degenerate

Oligonucleotide Primed PCR – DOP PCR), khuếch đại thay thế đa điểm (Multiple

15

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Displacement Amplification – MDA), và phương pháp lai (Hybrid methods). Việc

lựa chọn kỹ thuật tùy thuộc vào mục đích sử dụng sản phẩm WGA, dựa trên các đặc

điểm của từng kỹ thuật thể hiện trong hình 10. Trong PGD, phương pháp WGA được

sử dụng là MDA vì phương pháp này khắc phục được các hạn chế của các kỹ thuật

WGA dựa trên PCR khác, như việc tạo các đoạn DNA tương đối ngắn, không đủ

thông tin và nguy cơ xảy ra khuếch đại sai trong sản phẩm gây dương tính hoặc âm

tính giả [60].

Hình 10. Sơ đồ nguyên lý 3 kỹ thuật khuếch đại toàn hệ gen [24]

1.2.2. Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A

Có nhiều cách tiếp cận chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A. Trong đó,

cách tiếp cận đơn giản nhất là sàng lọc giới tính của phôi hoặc thai nhi. Một số kỹ

thuật được sử dụng cho hướng tiếp cận này là kỹ thuật kỹ thuật lai huỳnh quang tại

chỗ (Fluorescence in situ hybridization – FISH) sử dụng đầu dò Vysis [28, 29]; kỹ

thuật PCR khuếch đại các trình tự lặp lại đặc hiệu trên cánh dài nhiễm sắc thể Y [14,

16

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

40] hoặc đồng thời khuếch đại trình tự satellite alpha ở vùng tâm động của nhiễm sắc

thể X và Y để kiểm soát việc kết luận nhầm giới tính do khuếch đại sai [79]. Tuy

nhiên, phương pháp này chỉ giúp lựa chọn được 50% số phôi có thể sử dụng cho

chuyển phôi, 25% phôi nữ mang gen những không bị bệnh bị loại bỏ không cần thiết,

đặc biệt là đối với những cặp vợ chồng có số phôi hạn chế thì đây là nhược điểm rất

lớn. Ngoài ra, các kỹ thuật này còn nhiều hạn chế như lai huỳnh quang đòi hỏi kỹ

thuật phức tạp và giá thành cao.

Cách tiếp cận khác sử dụng kỹ thuật nhận diện trực tiếp đột biến gen F8 gây

bệnh hemophilia khá phức tạp do trong tự nhiên có nhiều dạng dị hợp và các dạng

đảo đoạn lớn. Đặc biệt, hiện tượng ADO ( allele dropout - khuếch đại hỏng 1 trong 2

allele ở tế bào thể dị hợp) ảnh hưởng tới hơn 40% các ca chẩn đoán trước chuyển

phôi, dẫn tới nhiều kết quả không chính xác [66]. Khác với chẩn đoán thông thường

dựa trên DNA tổng số với nhiều bản sao nên độ nhạy của các kỹ thuật không khiến

kết quả bị ảnh hưởng quá nhiều nếu có một vài allele bị khuếch đại hỏng, mẫu DNA

cho chẩn đoán trước chuyển phôi được cung cấp bởi chỉ 1-2 bản sao trong tế bào nên

nếu có ADO, kết quả sẽ bị sai lệch hoàn toàn. Có nhiều nguyên nhân ảnh hưởng tới

chỉ số ADO như quá trình vận chuyển và bảo quản mẫu, điều kiện PCR làm ảnh

hưởng cấu trúc DNA hay lượng DNA đưa vào thí nghiệm không đủ do lỗi trong quá

trình WGA hoặc tách chiết từ mẫu [62].

Ngoài nguy cơ ADO, vì đặc trưng của PCR trong PGT-M là cực nhạy nên rất

dễ nhiễm DNA ngoại lai [73, 76]. Nguồn DNA ngoại lai rất phong phú nhưng chủ

yếu thường xảy ra trong các giai đoạn trước bước tiến hành PCR đó là sinh thiết phôi

và rửa tế bào phôi [76]; DNA ngoại nhiễm có thể từ kỹ thuật viên sinh thiết phôi hoặc

DNA trong khu vực sinh thiết, rửa tế bào. Mẫu giọt rửa làm đối chứng âm xuất hiện

DNA cũng có thể do quá trình sinh thiết phôi không thành công khiến tế bào bị vỡ

làm thất thoát DNA vào giọt rửa.

Để khắc phục các nhược điểm của các hướng tiếp cận trên, nhiều nhóm nghiên

cứu đã sử dụng kỹ thuật phân tích liên kết gen xác định gián tiếp đột biến qua các chỉ

thị di truyền. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu chọn lọc chỉ thị là đoạn lặp

17

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

ngẫu nhiên ngắn (Short tandem repeat – STR) cho hemophilia A ở các quần thể người

bệnh khác nhau như Brazil [47, 50], New Zealand [42], Trung Quốc [17, 72].

Bảng 3. Một số STR được sử dụng trong chẩn đoán Hemophilia A [47]

STT Tần số dị hợp

Tên Locus Trình tự lặp tử quan sát

(%)

Trong gen F8

1 F8Int1 AC 34

2 F8Int6 TG 1.5

3 F8Int9 AG 28

4 F8Int13 AC 46

5 F8Int22 GT 40

6 F8Int25.3 TG 35

Ngoài gen F8

7 DXS9897 CTAT 68

8 DXS15 CA 88

9 DXS9901 CT/TG 82

10 IKBKG TG 22

11 DXS1073 TG 63

12 HA472 CTT 94

13 HA544 TTC 6

14 DXS1108 CA 35

Ở Việt Nam, vào tháng 1 năm 2016 cũng đã có nghiên cứu chẩn đoán trước

chuyển phôi bệnh hemophilia A bằng STR [2]. Đây là một phần nội dung trong đề

tài cấp nhà nước thuộc Chương trình KC 04/11-15 [12]. Nghiên cứu đã tiến thành kỹ

thuật chẩn đoán trước chuyển phôi cho 3 gia đình mang gen bệnh hemophilia A.

Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã sử dụng bộ 14 STR (bảng 3) phục vụ sàng

lọc người mẹ mang gen và chẩn đoán trước chuyển phôi trên các phôi thụ tinh trong

18

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

ống nghiệm. Nhóm tác giả đã tiến hành sàng lọc bằng phương pháp xác định các STR

dị hợp tử sử dụng kỹ thật PCR đơn mồi để tìm các chỉ thị dị hợp tử trên mẫu DNA

của mẹ và trẻ bị bệnh. Do vậy, nhóm nghiên cứu phải tiến hành tối thiểu 14 phản ứng

PCR mỗi mẫu nghiên cứu nhằm tìm được chỉ thị dị hợp tử trên mẫu máu mẹ; sau đó

tiếp tục tiến hành những phản ứng PCR đơn mồi tiếp theo để xác định các STR dị

hợp tự của mẹ trên con. Trong báo cáo, không thấy nhóm nghiên cứu xác định các

allele của các STR trên mẫu của bố, nhằm kiểu soát nhiễm, và tránh sự trùng lặp giữa

các STR dị hợp tử của mẹ này có allele trùng với của mẫu bố.

Tuy sử dụng kỹ thuật phân tích di truyền liên kết nhưng nhóm nghiên cứu chưa

sàng lọc tỷ lệ dị hợp tử quan sát trên đối tượng người Việt Nam. Tiêu chuẩn lựa chọn

chỉ thị STR phục vụ chẩn đoán cần có tỷ lệ dị hợp tử quan sát >50% [6]. Nhiều nghiên

cứu cho thấy, những chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu của nhóm tác giả có tỷ lệ

dị hợp tử quan sát rất thấp, thậm chí chỉ đạt 1,5% [6, 61].

Ưu điểm vượt trội của kỹ thuật phân tích di truyền liên kết sử dụng chỉ thị STR

là giúp hạn chế ảnh hưởng do tỷ lệ nhân gen thất bại, tỷ lệ ADO: khi có nhiều chỉ thị

liên kết với gen cần xác định đột biến, việc mất thông tin từ một số chỉ thị có thể được

khắc phục nhờ thông tin bổ sung từ các chỉ thị khác. Tuy nhiên, kỹ thuật này vẫn

được yêu cầu kiểm tra, đánh giá tỷ lệ ADO, tỷ lệ xác định kiểu gen thành công, thất

bại trong thực hành, trước khi đưa vào chẩn đoán trước chuyển phôi. Trong báo cáo

của nhóm tác giả, kỹ thuật chưa được đánh giá những chỉ số này trên 1 tế bào, trước

khi tiến hành chẩn đoán trên 1 tế bào phôi. Đây là một trong những nhược điểm của

nghiên cứu được nhóm tác giả thừa nhận trong phần bàn luận của công bố này [2].

1.3. Phân tích di truyền liên kết

1.3.1. Ứng dụng của phân tích di truyền liên kết

Phân tích di truyền liên kết là một công cụ hiệu quả trong chẩn đoán bệnh di

truyền, nhằm phát hiện gián tiếp tổn thương gen thông qua nhóm gen liên kết. Một

nhóm gen được gọi là có liên kết khi chúng luôn được di truyền cùng nhau – hay

không bị trao đổi chéo trong quá trình giảm phân. Thông qua việc xác định các gen

19

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

liên kết với gen bệnh, có thể chẩn đoán các rối loạn đơn gen phức tạp và nhiều dạng

như ở bệnh hemophilia A. Quy trình phân tích bao gồm xác định kiểu gen của các

thành viên trong gia đình nghi ngờ mang gen bệnh, sau đó thiết lập sơ đồ phả hệ nhằm

xem xét sự di truyền của nhóm gen liên kết với gen bệnh.

Trong việc sàng lọc chỉ thị cần chú ý tới vị trí locus chứa chúng để lựa chọn

được các chỉ thị nội gen và ngoại gen nằm về cả 2 phía so với gen bệnh để tăng độ

tin cậy của kết quả chẩn đoán. Khoảng cách từ chỉ thị đó đến vị trí đột biến cũng là

một yếu tố quan trọng, vì những chỉ thị ở xa gen sẽ có tần số tái tổ hợp tăng dần. Tái

tổ hợp xảy ra trước lần giảm phân đầu tiên ở các tế bào mầm khi các NST kép trong

mỗi cặp tương đồng xếp thẳng hàng nhau. Lúc này, các trình tự DNA tương đồng

trên NST từ bố và từ mẹ có thể trao đổi với nhau, quá trình này là hiện tượng trao đổi

chéo. Phạm vi tái tổ hợp rộng hay hẹp thay đổi ngẫu nhiên dọc theo chiều dài NST,

chính vì thế 2 gen càng gần nhau thì khả năng trao đổi chéo của chúng sẽ càng giảm

trong suốt quá trình giảm phân hay nói cách khác, tần số tái tổ hợp giữa 2 gen trên

cùng NST càng thấp thì chúng càng liên kết chặt chẽ với nhau và càng ở gần nhau.

Tần số tái tổ hợp có thể tính từ số cá thể con xuất hiện kiểu hình khác với bố mẹ do

quá trình trao đổi chéo các allele khác nhau trên gen.

Mặt khác, chỉ thị càng liên kết tốt với gen có đột biến, khả năng xác định đột

biến đó sẽ càng chính xác. Khoảng cách tương ứng với 1% tần số tái tổ hợp là

centimorgan (cM). Theo nghiên cứu của Harvey Lodish và cộng sự [46], dựa trên kết

quả so sánh khoảng cách vật lý thực tế giữa các gen đã được xác định tần số tái tổ

hợp bằng phân tích phân tử, thì trung bình 1 cM ở người tương ứng với khoảng 7,5.105

bp, hay xấp xỉ 1 Mbp. Theo khuyến cáo của Hội sản khoa và Phôi học Châu Âu, khi

sàng lọc chỉ thị chỉ nên tiến hành nghiên cứu trong phạm vi từ 1 đến 3 Mbps để đảm

bảo độ liên kết giữa chỉ thị và gen cần xác định đột biến [32]. Chính vì thế, trong thiết

kế bộ chỉ thị STR nhằm xác định gián tiếp đột biến trên F8, cần đảm bảo các chỉ thị

được lựa chọn nằm ở 2 bên gen này để nếu xảy ra hiện tượng trao đổi chéo dù với

xác suất nhỏ, vẫn đảm bảo có các chỉ thị được di truyền cùng gen. Ngoài ra, cần chú

ý lựa chọn nhiều chỉ thị khi phân tích nhằm hạn chế khả năng mất thông tin do ADO

20

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

hay do bản thân một chỉ thị nào đó không có thông tin trong gia đình được chẩn đoán.

Với những đặc điểm trên, việc tiến hành nghiên cứu phát hiện gián tiếp đột

biến gen F8 thông qua các chỉ thị liên kết với gen này vừa giúp việc chẩn đoán dễ

dàng hơn, vừa hạn chế được hiện tượng ADO, đáp ứng yêu cầu của chẩn đoán trước

làm tổ. Hơn nữa, kỹ thuật này còn góp phần kiểm soát tình trạng nhiễm chéo và ngoại

nhiễm trong chẩn đoán trước chuyển phôi hemophilia A.

1.3.2. Chỉ thị phân tử STR

Phương pháp phân tích trình tự lặp kế tiếp (Short tandem repeat – STR) là một

trong các công cụ sinh học phân tử hiệu quả nhất được sử dụng rộng rãi trong pháp y,

xét nghiệm huyết thống và chẩn đoán bệnh di truyền.

Cơ sở lý thuyết của phương pháp này là việc so sánh các loci đặc hiệu trong mẫu

DNA từ 2 hay nhiều cá thể khác nhau. Cụ thể, một STR là tập hợp 10 – 60 lần lặp lại

đoạn trình tự khoảng 2 đến 6 bp, và sự đặc thù ở mỗi cá thể của các STR cho phép nhận

biết DNA của từng cá thể hoặc phân tích di truyền liên kết giữa các thế hệ trong cùng

một gia đình: thế hệ con sẽ nhận một allele từ bố và một allele từ mẹ; đối với các locus

trên X thì con trai chỉ nhận từ mẹ [37]. Sự đặc thù này thể hiện ở số lần lặp của đoạn

trình tự, và được phát hiện thông qua phản ứng nhân gen PCR kết hợp điện di mao

quản. PCR giúp nhân bản thông tin từ một lượng nhỏ DNA có trong mẫu sinh phẩm.

Sản phẩm nhân STR có kích thước khoảng 100-500bp, và có thể tiến hành PCR đa mồi

để nhân bản cùng lúc nhiều đoạn STR, sử dụng các mồi được thiết kế gắn màu huỳnh

quang khác nhau và nhân các sản phẩm có kích thước khác nhau.

Mặc dù hệ gen người chứa hàng ngàn chỉ thị STR, nhưng chỉ có một số lượng

nhỏ các loci được lựa chọn để sử dụng trong pháp y và các ứng dụng nhận dạng khác

[10]. Những loci này được gọi là loci hạt nhân (core loci), cho phép so sánh và nhận

dạng di truyền giữa các cá thể. Ngày nay có rất nhiều bộ kit thương mại cho phép tạo

các hồ sơ DNA chứa những STR loci hạt nhân này và có hàng triệu hồ sơ STR được

tạo trên toàn thế giới bởi các chính phủ, trường đại học, các phòng thí nghiệm nhằm

tiến hành nhiều loại xét nghiệm nhận dạng khác nhau bao gồm tạo cơ sở dữ liệu DNA,

pháp y, nhận dạng người mất tích hay nạn nhân trong các thảm họa/ đại dịch, hoặc

21

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

xét nghiệm huyết thống [11].

Việc sử dụng chỉ thị STR có nhiều ý nghĩa: với tính bảo thủ cao, được di truyền

qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cá thể (số lần các đoạn lặp có thể khác nhau

rất nhiều giữa các cá thể khác nhau), việc kiểm soát nguồn ngoại nhiễm trở nên dễ

dàng hơn; kích thước các đoạn lặp không quá lớn (dưới 500bp) nên chỉ thị STR có

thể được nhân bản từ DNA đứt gãy, áp dụng được trên nhiều loại mẫu với chất lượng

khác nhau, vì vậy quy trình vận chuyển, bảo quản mẫu cũng thuận lợi hơn so với chẩn

đoán trực tiếp bằng các đoạn DNA có kích thước lớn khác [4].

1.3.3. Các chỉ số đa hình di truyền

Các chỉ số đa hình di truyền được tính toán dựa trên tần số allen thu được từ

thực nghiệm, dùng để đánh giá lượng thông tin của một chỉ thị sử dụng trong các thử

nghiệm phụ/mẫu hệ (parentage testing). Các chỉ số này bao gồm: tần số dị hợp tử

quan sát (Observed Heterozygosity – Ho), tần số dị hợp tử lý thuyết (Expected

Heterozygosity – He), và hàm lượng thông tin tính đa hình (Polymorphism

Information Content – PIC) [56, 78]. He và PIC càng cao (PIC > 50%) chứng tỏ chỉ

thị càng đa hình và có giá trị. Ho quyết định giá trị của chỉ thị đóng góp thông tin

trong chẩn đoán. Ho càng cao, giá trị trong chẩn đoán càng cao. Khi Ho thấp, việc sử

dụng các chỉ thị này trong sàng lọc sẽ gây lãng phí về kinh tế, thời gian và công lao

động.

Đến nay chưa có nhóm nghiên cứu nào xây hệ thống chỉ thị STR liên kết với

gen F8 đáp ứng các tiêu chuẩn về chỉ số đa hình PIC và các chỉ số dị hợp tử He, Ho

áp dụng cho chẩn đoán trước chuyển phôi bệnh hemophilia A trên quần thể người

Việt Nam.

1.4. Kỹ thuật PCR đa mồi

PCR đa mồi là kỹ thuật nhân gen được giới thiệu lần đầu vào năm 1988 trong

một nghiên cứu phát hiện mất đoạn gen [13]. Với kỹ thuật này, nhiều trình tự DNA

sẽ được khuếch đại cùng lúc, giúp tiết kiệm tối đa thời gian thao tác và chẩn đoán nói

chung. Tuy vậy việc thiết kế mồi và tối ưu hóa phản ứng cần được đặc biệt chú trọng

22

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

để đảm bảo hiệu suất khuếch đại cho từng đoạn DNA đích là tương đối đồng đều,

phục vụ cho bước phân tích được hiệu quả.

Phản ứng PCR đa mồi nói chung có thể chia làm 2 loại:

- PCR đa mồi sử dụng 1 loại khuôn DNA: kỹ thuật này sử dụng một khuôn

DNA tổng số với nhiều cặp mồi xuôi và ngược để khuếch đại nhiều vùng đặc hiệu

trong một khuôn đó.

- PCR đa mồi sử dụng nhiều khuôn DNA: kỹ thuật này sử dụng nhiều khuôn

DNA và nhiều bộ mồi trong cùng một ống phản ứng. Sự tồn tại của nhiều mồi có thể

dẫn tới bắt cặp chéo giữa các mồi với nhau và khả năng bắt cặp nhầm giữa mồi và

khuôn của mồi khác.

Trong việc thiết kết mồi cho PCR đa mồi cần đặc biệt lưu ý tới các thông số

sau để đảm bảo hiệu suất phản ứng đạt mức cao nhất:

- Độ dài mồi: phản ứng PCR đa mồi cần số lượng lớn các mồi, vì vậy các mồi

được thiết kế phải có độ dài phù hợp. Thông thường, các mồi với kích thước ngắn,

trong khoảng 18 – 22 bp sẽ được sử dụng.

- Nhiệt độ nóng chảy: các mồi với Tm giống nhau, thích hợp nhất là 55°C-60°C

thường được sử dụng. Cho các trình tự với tỷ lệ GC cao, khuyến cáo sử dụng các mồi

với Tm cao hơn (thường là 75°C-80°C). Khoảng chênh lệch chấp nhận được giữa các

mồi trong cùng 1 ống phản ứng là vào khoảng 3°C-5° C.

- Độ đặc hiệu: việc cân nhắc độ đặc hiệu của các mồi được thiết kế cho các

trình tự đích là rất quan trọng khi chuẩn bị phản ứng PCR đa mồi, đặc biệt là do sự

tồn tại cạnh tranh của các trình tự đích trong cùng 1 ống phản ứng.

- Tránh tạo primer dimer (sản phẩm do các mồi bắt cặp với nhau tạo thành): các

mồi được thiết kế phải được kiểm tra việc tạo primer dimer, với tất cả các mồi tồn tại trong

cùng hỗn hợp phản ứng. Việc tạo primer dimer sẽ dẫn tới khuếch đại không đặc hiệu.

Ngoài các thông số trên, những yếu tố khác về cơ bản giống với thiết kế mồi

cho PCR thông thường. Với kỹ thuật PCR đa mồi, kỹ thuật viên có thể tiến hành

khuếch đại đồng thời các chứng nội để hạn chế âm tính giả, đồng thời tiết kiệm chi

23

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

phí hóa chất cũng như thời gian làm thí nghiệm so với việc sử dụng nhiều phản ứng

PCR đơn lẻ. Ngoài ra, PCR đa mồi còn cho phép tiến hành xét nghiệm với lượng

DNA đầu vào không quá nhiều (có thể chỉ cần 1 ng hay ít hơn [11]). Với những ưu

điểm này, PCR đa mồi được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: phát hiện

nguồn bệnh, xác định kiểu gen SNP, phân tích đột biến, phân tích mất gen, định lượng

mẫu, phân tích di truyền liên kết, phát hiện RNA, hay lĩnh vực pháp y.

1.5. Kỹ thuật điện di mao quản

Sản phẩm PCR đa mồi có thể phân tích bằng điện di gel agarose hoặc điện di

mao quản. Trong ứng dụng để phân tích di truyền liên kết, thường sử dụng điện di

mao quản vì với phương pháp này có độ phân giải cao hơn (1 bp) so với điện di gel

agarose (khoảng 5 bp).

Hình 11. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản

Nguyên lý của phương pháp là dùng máy điện di có 2 cực: 1 cực âm và 1 cực

dương. Sợi DNA mang điện tích âm khi điện di chạy về cực dương, các đoạn DNA

có kích thước khác nhau sẽ phân tách thành các băng vạch khác nhau. Các cặp mồi

để PCR phân tích bằng điện di mao quản được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh

quang khác nhau gắn vào mồi xuôi (F) hoặc ngược (R), vì vậy sau quá trình PCR sẽ

tạo ra các đoạn DNA được gắn các chất phát huỳnh quang tương ứng. Các DNA này

sau đó được xác định bằng kỹ thuật hiện màu huỳnh quang: các hạt huỳnh quang hấp

24

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

thụ năng lượng từ nguồn sáng laser sau đó phát xạ ánh sáng ở mức năng lượng thấp

hơn (bước sóng cao hơn) và được camera hay bộ cảm biến ghi lại. Một màng lọc sáng

được sử dụng để lọc ánh sáng ở những bước sóng xác định hoặc một khoảng bước

sóng nào đó.

Phương pháp điện di mao quản có nhiều ưu điểm giúp khắc phục những hạn

chế của phương pháp điện di thông thường trong phân tích các chỉ thị STR:

- Thứ nhất: phương pháp điện di mao quản có độ phân giải đến 1 nucleotide.

Do vậy, các allele của các STR chỉ cần khác nhau 1 nucleotide cũng có thể phân biệt

được.

- Thứ hai: trong phân tích STR, có nhiều STR có kích thước vật lý của các

allele (bp) chồng lấn lên nhau. Để phân biệt các STR này, các mồi được gắn huỳnh

quang với màu sắc khác nhau ở đầu 5’ của mồi xuôi. Nhờ vậy, sẽ phân biệt được các

STR có kích thước các allele chồng lấn. Bằng việc kết hợp phân biệt sản phẩm bằng

sự khác nhau về kích thước và màu sắc, kỹ thuật PCR đa mồi có thể được tiến hành

với hàng chục cặp mồi trong cùng 1 ống.

- Thứ ba: tín hiệu huỳnh quang được khuếch đại khi bị ánh sáng kích thích,

kết hợp hệ thống khuếch đại tín hiệu giúp độ nhạy của phương pháp này rất cao. Yếu

tố này giúp quá trình nhân gen ở các mẫu có nồng độ thấp, đặc biệt trên mẫu chỉ có 1

bản sao (mẫu một tế bào) không đòi hỏi số chu kỳ quá lớn, cũng như không cần tiến

hành phản ứng PCR lồng (nested PCR) có nhiều nguy cơ nhiễm chéo.

Sau khi khuếch đại các chỉ thị STR tạo ra các sản phẩm huỳnh quang, việc

phân biệt sản phẩm (allele) của các loci (STR) dựa vào màu sắc và kích thước của

đỉnh tín hiệu huỳnh quang. Kích thước của các đỉnh tín hiệu dựa trên kết quả so sánh

với kích thước của thang chuẩn. Chiều cao của các đỉnh tín hiệu thể hiện độ mạnh

của tín hiệu huỳnh quang. Trường hợp dị hợp tử, 1 locus (STR) sẽ có 2 allele tương

ứng với 2 đỉnh tín hiệu. Trường hợp đồng hợp tử, 1 locus (STR) sẽ có 1 allele, tương

ứng với 1 đỉnh tín hiệu trên hình ảnh phân tích kết quả điện di.

25

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

- Đa hình của các STR được nghiên cứu trên 103 mẫu máu của phụ nữ mang

gen bệnh tình nguyện cung cấp cho Trung tâm Hemophilia, Viện Huyết học – Truyền

máu TW từ tháng 9 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019 và 50 mẫu máu của phụ nữ

không mang gen bệnh thu thập từ các nghiên cứu khác thực hiện tại Phòng Phân tích

DNA, Bộ môn Giải Phẫu, Học viện Quân Y.

- Thiết lập và tối ưu hóa quy trình phân tích đa STR được thực hiện trên một

tế bào từ 05 mẫu phôi dư do Viện mô phôi lâm sàng quân đội, Học viện Quân Y cung

cấp.

- Quy trình PGT Hemophilia A được ứng dụng cho 01 cặp vợ chồng mang gen

bệnh hemophilia A tình nguyện, thỏa mãn các tiêu chí sau:

+ Cơ quan sinh sản bình thường.

+ Chức năng sinh sản bình thường, thông qua xét nghiệm đánh giá chất lượng

tinh trùng, xét nghiệm chức năng buồng trứng.

Các đối tượng sau sẽ bị loại trừ khỏi nhóm theo dõi để đánh giá hiệu quả của

phương pháp sàng lọc:

+ Có hai buồng trứng hoặc tử cung bất thường.

+ Không thực hiện theo các hướng dẫn của bác sĩ và nghiên cứu.

+ Bệnh nhân bị lạc nội mạc tử cung;

+ Không đủ hồ sơ nghiên cứu hỗ trợ sinh sản.

Mẫu phôi cung cấp cho quy trình PGT được sinh thiết tại Bệnh viện Nam học

và Hiếm muộn Hà Nội.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích.

26

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

2.2.2. Công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu đa hình gen

Công thức tính cỡ mẫu xác định tỷ lệ dị hợp tử được lấy theo phần mềm

Sample Size của Tổ chức Y tế thế giới WHO như sau:

Trong đó:

+ n: cỡ mẫu cần thiết

+ α là độ tin cậy của nghiên cứu

+ Z là giá trị biểu thị độ tin cậy thu được từ bảng Z tương ứng với α

+ p: tỷ lệ theo mục tiêu các mẫu đạt tiêu chuẩn nghiên cứu

+ Δ: tỷ lệ sai lệch giữa quần thể mẫu nghiên cứu và quẩn thể thực. Để có ý

nghĩa thống kê, tỷ lệ này chỉ giới hạn từ 0,01% tới 10%

Trong nghiên cứu này, tôi lựa chọn các thông số như sau:

+ Độ tin cậy của nghiên cứu là 95%, tương ứng với α = 0,05 và Z(1-α/2) = 1,96

+ Tỷ lệ mẫu không có thông tin cho chỉ thị STR bất kỳ (đồng hợp tử) thấp

nhất là 45%, tương ứng với p = 0,45

+ Tỷ lệ sai lệch so với quần thể thực là 10% tương ứng Δ = 0,1

Áp dụng vào công thức, cỡ mẫu tối thiểu thu được là 95 mẫu.

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 153 mẫu máu từ các nguồn cung cấp

đối tượng nghiên cứu nêu trên.

27

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

2.2.3. Sơ đồ nghiên cứu

Xây dựng và áp dụng quy trình PGT hemophilia A

Xác định tính đa hình của các STR liên kết gen F8

Lựa chọn các STR phục vụ chuẩn đoán

Xây dựng quy trình phân tích STR trên phôi bào

Thực hiện PGT trên gia đình mang gen

Tối ưu phản ứng nhân bản STR trên thực nghiệm

Chuyển phôi và theo dõi mang thai

Xác định PIC, Ho, He của các chỉ thị STR

Chẩn đoán trước sinh kiểm tra kết quả

Lựa chọn được bộ STR cho chẩn đoán hemophilia A

Hình 12. Sơ đồ nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo 2 giai đoạn: giai đoạn đầu nhằm xác định tính

đa hình của các STR trong bộ chỉ thị thiết kế được. Giai đoạn thứ 2 nhằm tối ưu hóa

các bước thực hiện để xây dựng quy trình PGT hemophilia A áp dụng quy trình xây

dựng được cho gia đình bệnh nhân.

28

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

2.3. Hóa chất và dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

*Hóa chất dùng để tách chiết DNA: QIAGEN blood Minikit; cồn tuyệt đối dùng trong

thí nghiệm sinh học phân tử Merk

*Hóa chất dùng để khuếch đại toàn hệ gen tế bào: REPLI-g Single Cell Kit QIAGEN

*Hóa chất để thực hiện kỹ thuật PCR: QIAGEN Multiplex PCR 2X Mastermix;

QIAGEN Q-Solution; Các cặp mồi (IDT)

*Hóa chất để điện di agarose sản phẩm PCR: Bột Agarose LE (Roche); TBE Buffer

10X (Serva); Agarose gel loading dye 6x (Intron); 100bp Ladder (Norgen); RedSafe

Nucleic Acid staining solution (Intron)

*Hóa chất để điện di mao quản sản phẩm PCR: CE Running buffer 10X (MCLAB),

Nano POP4 dùng cho máy ABI3130/3130XL (MCLAB), Size standard Genscan

500LIZ (Thermo Fisher Scientific), Hi-Di Formamide (Thermo Fisher Scientific)

*Dụng cụ: Ống Eppendorf 1,5 ml - 0,5 ml - 0,2 ml; Ống lấy máu chống đông EDTA;

Găng tay vô khuẩn; Khẩu trang y tế; Hộp giữ mẫu; Pipet, đầu tips các loại dùng cho

kỹ thuật sinh học phân tử

*Thiết bị: Máy Proflex PCR System (Thermo Fisher Scientific); Máy đo NanoDrop

One (Thermo Fisher Scientific); Máy đo Qubit 3.0 Fluorometric Quantitation (Life

Technologies); Bộ điện di NANOPAC 300P (Cleaver); Tủ lạnh sâu: -20oC, -80oC

(Panasonic); Máy ly tâm lạnh Hitech và ly tâm để bàn Boeco; Máy giải trình tự gen

ABI Prism 3130XL Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific); Tủ an toàn sinh

học cấp II dùng trong sinh học phân tử; Máy ủ nhiệt và lắc MTH – 100 (Holdwell);

Máy lắc MS3 basic (IKA); Cân điện tử Practum (Sartorius)

2.4. Các kỹ thuật được sử dụng

2.4.1. Giai đoạn tối ưu và xác định tính đa hình

2.4.1.1. Kỹ thuật sàng lọc chỉ thị STR

Sử dụng cơ sở dữ liệu STR và phần mềm Tandem Repeat Finder (TRF) cung

cấp bởi Gary Benson và cộng sự (http://tandem.bu.edu/trf/trf.html) để tiến hành sàng

lọc chỉ thị xác định đột biến gen F8 theo tiêu chuẩn hướng dẫn bởi Machado năm

29

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

2009 [47], sử dụng trình tự tham chiếu cho NST X của người trên NCBI với mã truy

cập NC_000023: cài đặt thông số align bao gồm Match: 2, Mismatch: 2, Indels: 7; vị

trí tìm kiếm cách 1Mbp về phía trước, sau gen F8 và trong gen; tiêu chí chọn lọc: số

lần lặp trình tự từ 2 đến 6 với điểm Align thấp nhất với trình tự trên NST X tương

ứng là 54, 80, 66, 52 (là điểm thấp nhất của các chỉ thị nội gen F8 có số lần lặp như

vậy và được đánh giá là có giá trị đa hình di truyền thông qua xác định kiểu gen trực

tiếp), % Match ≥ 80.

Hình 13. Phần mềm Tandem Repeat Finder và các chỉ số thiết đặt để sàng lọc

Để lựa chọn hệ thống chỉ thị STR có thể sử dụng trên quần thể người Việt

Nam: từ những STR đã sàng lọc được từ phần mềm TRF, dựa trên dữ liệu được báo

cáo từ các nghiên cứu đã tiến hành trên quần thể người Brazil [47, 50], New Zealand

[42], Trung Quốc [17, 72], tiếp tục chọn ra các chỉ thị STR có các chỉ số PIC, H(exp),

H(ob) > 0,5 và có mồi khuếch đại đáp ứng yêu cầu khuyến cáo của QIAGEN bao gồm:

kích thước 20 – 30 nucleotide, nhiệt độ Tm ≥ 60oC, có không quá 3 nucleotide G hoặc

C ở đầu 3’ và 2 mồi không bắt cặp nhau ở đầu 3’. Tiếp tục chọn lọc theo kích thước

sản phẩm khuếch đại sao cho các sản phẩm cách nhau khoảng 10 nucleotide, từ đó

xác định kích thước sản phẩm nhỏ nhất và chia làm các nhóm với khoảng cách sản

30

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

phẩm khuếch đại là 10 nucleotide. Cuối cùng chọn chỉ thị đại diện sao cho tổng thể

có cả chỉ thị trước, trong và sau gen F8.

Sau khi lựa chọn được các STR và mồi khuếch đại đáp ứng tiêu chí sàng lọc,

sử dụng công cụ In-silico PCR tại https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr với hệ gen

tham chiếu là GRCh38/hg38 kết hợp phần mềm so sánh trình tự BLAST trên NCBI

nhằm xác định sơ bộ các allel của loci để loại bỏ các chỉ thị có trình tự mồi bắt cặp

với các đoạn lặp Alu và các trình tự không đặc hiệu trên NST khác, sau đó gắn huỳnh

quang cho một mồi trong mỗi cặp sao cho các sản phẩm của các mồi cùng màu huỳnh

quang có thể phân biệt được với nhau.

2.4.1.2. Kỹ thuật tách DNA

Sử dụng QIAGEN blood Minikit theo hướng dẫn của nhà sản xuất, cụ thể như sau:

Chuẩn bị hóa chất trước thí nghiệm: Tất cả hóa chất phải đưa về 15-25oC trước khi

sử dụng. Lắc kỹ các lọ hóa chất trước khi tiến hành quy trình. Đặt nhiệt độ của block

máy ủ nhiệt ở 70oC trước khi tiến hành thí nghiệm. AW1, AW2 được chuẩn bị theo

hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thực hiện quy trình: Cho 20 µl proteinase vào ống Eppendorf 1,5 ml. Tiếp theo cho

200 µl mẫu (máu, dịch ối) và 200 µl AL vào ống, đóng nắp, vortex 15 giây. Ủ lắc ở

60oC trong 15 phút. Thêm tiếp 200 µl cồn tuyệt đối vào ống, đóng nắp, vortex 15

giây. Sau đó chuyển toàn bộ hỗ dịch ở bước 4 vào cột lọc QIAamp, không làm ướt

mép ống, đóng nắp, ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 1 phút; đặt cột vào ống 2 ml mới,

bỏ ống chứa dịch lọc đi. Mở nắp cột lọc, thêm 500 µl AW1, không làm ướt mép cột,

đóng nắp, ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 1 phút, đặt cột vào ống 2 ml mới, bỏ ống

chứa dịch lọc đi. Mở nắp cột lọc, thêm 500 µl AW2, không làm ướt mép cột, đóng

nắp, ly tâm ở 18000 vòng/phút trong 2 phút, đặt cột vào ống 2 ml mới, bỏ ống chứa

dịch lọc đi. Ly tâm ở 18000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ ống 2 ml. Đặt cột lọc vào

ống Eppendorf 1,5 ml sạch, thêm 50 µl AE buffer vào trung tâm của màng lọc, không

chạm vào màng lọc; ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Cuối cùng ly tâm ở 10000

vòng/phút trong 1 phút để thu DNA hòa tan từ màng lọc. Bảo quản ở 2-8oC và thực

hiện phản ứng trong cùng ngày tách.

31

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

2.4.1.3. Kỹ thuật khuếch đại toàn hệ gen

Sử dụng REPLI-g Single Cell Kit QIAGEN (USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất,

cụ thể như sau: rã đông REPLI-g sc DNA Polymerase trên đá, các hóa chất còn lại rã

đông ở nhiệt độ phòng, trong đó buffer D2 pha sẵn phải được sử dụng trong vòng 3

tháng. Bổ sung 500µl H2O vào ống Buffer DLB trước khi sử dụng (sau khi pha loãng

phải sử dụng trong vòng 6 tháng và lưu trữ ở -20oC). Nếu sử dụng máy luân nhiệt

(PCR) thay cho bể ổn nhiệt, cài đặt nhiệt độ làm nóng nắp block ở 70OC. Sau đó thực

hiện quy trình bao gồm các bước: cho 4 µl dung dịch PBS chứa tế bào vào ống PCR. Nếu

thể tích mẫu ban đầu ít hơn 4µl, bổ sung thêm PBS để thu được tổng dung dịch chứa tế bào

là 4 µl. Chuẩn bị Buffer D2 (Denaturation buffer) theo bảng 4. Thêm 3 µl Buffer D2

vào mỗi ống. Búng nhẹ để trộn và ly tâm ngắn để thu dung dịch về đáy ống. Ủ ở 65oC

trong 10 phút. Sau đó thêm 3 µl Stop Solution vào mỗi ống rồi búng nhẹ để trộn và

ly tâm ngắn để thu dung dịch về đáy ống. Đặt trên đá lạnh/khay lạnh. Rã đông REPLI-

g sc DNA Polymerase trên đá và các hóa chất khác ở nhiệt độ phòng và chuẩn bị

Mastermix theo bảng 5 (đã lấy dư). Thêm 40 µl mastermix vào mỗi ống. Cài đặt chu

trình nhiệt bao gồm: 30OC trong 8 giờ, 65OC trong 3 phút và lưu trữ ở 4OC. Cài đặt

nắp block nhiệt ở 70oC, lưu trữ và bảo quản mẫu ở -20OC.

Bảng 4. Thành phần D2

Số ống phản ứng DTT, 1M (µl) Buffer DLB (µl)

1 2,75 0,25

12 33 3

24 66 6

25 68,75 6,25

26 71,5 6,5

32

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Bảng 5. Thành phần Mastermix

Số ống phản H2O REPLI-g sc React. REPLIC-g sc DNA

ứng Buffer (µl) Polymerase (µl) (µl)

2 9 1 29

4,4 19,8 2 63,8

6,6 29,7 3 95,7

8,8 39,6 4 127,6

11 49,5 5 159,5

13,2 59,4 6 191,4

15,4 69,3 7 223,3

17,6 79,2 8 255,2

19,8 89,1 9 287,1

22 99 10 319

24,2 108,9 11 350,9

26,4 118,8 12 382,8

27,3 122,85 13 395,85

29,4 132,3 14 426,3

31,5 141,75 15 456,75

33,6 151,2 16 487,2

Kiểm tra nồng độ DNA sau WGA:

Nồng độ của sản phẩm khuếch đại hệ gen được tính bằng cách đo nồng độ của

mẫu sản phẩm pha loãng sau đó nhân hệ số để có nồng độ gốc. Các sản phẩm bước

WGA được pha loãng tỷ lệ 1:10 trước khi tiến hành đo. Chuẩn bị dung dịch Qubit

working solution theo tỷ lệ: 1 µl reagent (dye): 100 µl Buffer. Bổ sung 190 µl dung

dịch Qubit working solution vào các ống 0,5ml mới đã chuẩn bị trước đó. Tiếp tục

thêm 10 µl chất chuẩn 1 và 2 vào hai ống 0,5 ml đã chứa 190 µl dung dịch Qubit

working solution. Các ống còn lại được bổ sung thêm 10 µl các mẫu đã pha loãng

33

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

tương ứng. Trộn đều các ống bằng vortex và ly tâm nhanh. Chuẩn máy đo Qubit sử

dụng 2 ống chất chuẩn vừa chuẩn bị và đo các mẫu rồi ghi lại nồng độ các mẫu.

2.4.1.4. Kỹ thuật PCR đa mồi

Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi: sau khi sử dụng công cụ

http://sg.idtdna.com/calc/analyzer xác định được nhiệt độ nóng chảy Tm từ đó tính

toán nhiệt độ gắn mồi trung bình của tất cả các cặp mồi, tiến hành phản ứng PCR cho

riêng mỗi cặp mồi theo gradient nhiệt độ gắn mồi trung bình với khoảng cách 5oC.

Dựa trên kết quả điện di trên gel agarose 2% (120V trong 30 phút) tiếp tục tối ưu

bằng gradient nhiệt độ với bước nhảy 1oC.

Bảng 6. Thành phần phản ứng PCR đơn mồi (tổng thể tích phản ứng 20µl)

Nồng độ Thể tích (µl/ ống) Thành phần

HPLC Water 7,2

2X QIAGEN Multiplex MasterMix 1X 10

Primer F 0,2 µM 0,4

Primer R 0,2 µM 0,4

DNA Template 2

Bảng 7. Chu trình nhiệt tiến hành phản ứng PCR đơn mồi

Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ

0C

95 5 phút 1

0C

94 30 giây

0C

Dải nhiệt độ tối ưu hóa 30 giây 40

0C

72 45 giây

0C

72 5 phút 1

0C

11 ∞ 1

Tối ưu hóa nồng độ mồi: từ nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho tất cả các cặp mồi đã xác

định khi tối ưu hóa ở giai đoạn trước, tiến hành ghép các mồi vào cùng 1 ống phản

ứng để từ đó điều chỉnh nồng độ mồi bằng cách tăng nồng độ các cặp hoạt động yếu,

giảm nồng độ các cặp hoạt động mạnh theo gradient 0,05 µM dựa trên cường độ tín

34

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

hiệu sản phẩm khuếch đại phân tích được trên gel agarose.

Sau khi xác định được nhiệt độ gắn mồi và nồng độ mồi tối ưu, tiến hành PCR

đa mồi để khuếch đại đồng thời các STR. Sau đó tiếp tục PCR đa mồi gắn huỳnh

quang cho các sản phẩm để phục vụ điện di mao quản theo thành phần phản ứng bảng

8 và chu trình nhiệt bảng 9.

Bảng 8. Thành phần phản ứng PCR đa mồi gắn màu huỳnh quang

Thành phần Nồng độ Thể tích/ 1 ống phản ứng

HPLC H20 6.80 ul

Qiagen PCR Master Mix 1 X 10.00 ul

Sản phẩm PCR vòng trước 2.00 ul

Các mồi Nồng độ Thể tích/ 1 ống phản ứng

M13 (-20) 0.4 ul 0.2 uM

M13 (-41) 0.4 ul 0.2 uM

M13 (CM) 0.4 ul 0.2 uM

Bảng 9. Chu trình nhiệt phản ứng PCR đa mồi gắn màu huỳnh quang

Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ

95 oC 15 phút 1

94 oC 30 giây

60 oC 90 giây 10

72 oC 60 giây

60 oC 30 phút 1

Bảo quản ở 11oC

35

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Bảng 10. Thông tin mồi huỳnh quang

Màu STT Trình tự Mã hóa huỳnh quang

1 5’-/56-FAM/GGTTTTCCCAGTCACGAC-3’ M13-41 FAM

2 5’-/5HEX/GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ M13-20 HEX

3 5’-/NED/CATGGTCATAGCTGTTTCCTG M13-CM NED

2.4.1.5. Kỹ thuật điện di mao quản

Tiến hành điện di mao quản sản phẩm PCR thu được để phân tích kích thước

các STR trong mẫu DNA theo các thành phần và điều kiện ở Bảng 11, 12.

Bảng 11. Thành phần phản ứng biến tính DNA cho điện di mao quản

Thành phần Thể tích/ 1 ống phản ứng

Hi-Di 8.50 ul

GS500 LIZ 0.50 ul

DNA Templates 1.00 ul

Bảng 12. Chu trình nhiệt biến tính DNA

Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ

95o C 5 min 1

Kết quả điện di mao quản được phân tích bằng phần mềm Genemapper version

4.0. Việc xác định các đỉnh tín hiệu phù hợp cho mỗi STR dựa trên thang kích thước

chuẩn từ cơ sở dữ liệu đã được công bố bởi Machado và cộng sự năm 2009 [47].

2.4.1.6. Tính toán chỉ số đa hình

Phần mềm Genemapper version 4.0 cho phép hiển thị kết quả điện di mao quản

dưới dạng hình ảnh các đỉnh tín hiệu sản phẩm khuếch đại với độ cao của đỉnh tương

ứng nồng độ sản phẩm, và kích thước sản phẩm theo bp như minh họa ở hình 15.

36

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hình 14. Giao diện phân tích kết quả phần mềm Genemapper 4.0.

Sau khi thu thập dữ liệu về kích thước sản phẩm khuếch đại của các mẫu, tiến

hành tính toán các tần số dị hợp tử Ho, He và hàm lượng thông tin tính đa hình PIC

theo các công thức cụ thể như sau [31]:

Tần số dị hợp tử quan sát (Observed Heterozygosity – Ho): là tổng tần số các

kiểu gen dị hợp tử quan sát được trong toàn bộ mẫu nghiên cứu.

Số cá thể dị hợp tử Ho= Tổng số cá thể quan sát

k

2

Tần số dị hợp tử lý thuyết (Expected Heterozygosity – He):

i=1

He=1 - ∑ Pi

Trong đó: k là tổng số allele nghiên cứu; Pi là tần số của allele thứ i trong tổng số k

allele.

37

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hàm lượng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content –

k

k-1

k

2

PIC):

2- ∑ ∑ 2Pi

2Pj

i=1

i=1

j=i+1

PIC = 1 - ∑ Pi

Trong đó: Pi, Pi là tần số allele thứ i và j trong tổng số k allele của locus nghiên

cứu.

2.4.2. Giai đoạn áp dụng và phân tích di truyền trước chuyển phôi

2.4.2.1. Kỹ thuật ICSI

Kỹ thuật ICSI được thực hiện tại Bệnh viện Nam học và Hiếm muộn Hà Nội

với quy trình như sau: bệnh nhân được khám, tư vấn, làm các xét nghiệm cơ bản, và

xét nghiệm nội tiết tố sinh dục, siêu âm đếm nang thứ cấp vào ngày 2 của vòng kinh.

Hồ sơ được hoàn thành ngay sau khi đủ kết quả, và được duyệt ngay trong tuần. Sau

đó, tùy từng trường hợp, bệnh nhân sẽ được kích thích buồng trứng với phác đồ phù

hợp [84].

2.4.2.2. Kỹ thuật sinh thiết phôi

Các phôi thụ tinh trong ống nghiệm đạt mốc thời gian 5 ngày tuổi (khoảng 60

tế bào) sẽ được sinh thiết sử dụng tia lase để lấy ra khoảng 3 đến 5 tế bào bởi các

chuyên viên phôi học tại phòng nuôi cấy phôi Bệnh viện Nam học và Hiếm muộn Hà

Nội. Các tế bào này sẽ được chuyển về phòng thí nghiệm DNA thuộc Bộ môn Giải

phẫu của Học viện Quân Y để kiểm tra bất thường về mặt di truyền. Trước khi chuyển

phôi bào ra khỏi phòng nuôi cấy, phôi bào cần được trải qua bước rửa phôi để loại bỏ

các mảnh vụn tế bào vòn sót lại trong quá trình sinh thiết cũng như loại bỏ các cặn

bẩn trong môi trường còn sót lại.

2.4.2.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử

Các kỹ thuật tách DNA, WGA, PCR đa mồi và điện di mao quản được tiến

hành tương tự như mô tả ở mục 2.4.1 với các yếu tố nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi

và số chu kỳ khuếch đại đã được tối ưu hóa.

38

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

2.4.2.5. Kỹ thuật phân tích di truyền liên kết trên mẫu phôi

Để kết luận tình trạng phôi, cần so sánh kích thước các STR khuếch đại từ mẫu

phôi so với mẫu DNA của bố, mẹ và người thân bị bệnh. Theo nguyên tắc phân tích

di truyền liên kết, kích thước STR khuếch đại từ mẫu phôi và DNA của con/ người

thân bị bệnh phải phù hợp với kích thước STR khuếch đại từ mẫu DNA của bố và mẹ

(các con sẽ được di truyền trực tiếp các STR nằm trên 1 NST X từ bố và 1 NST từ

mẹ; trường hợp con trai hoặc phôi mang NST Y sẽ xuất hiện đỉnh sản phẩm 145 bp

của marker Amelogenin trên NST Y). Có 2 trường hợp có thể xảy ra:

- Phôi mang gen bệnh: xuất hiện các kích thước STR giống của mẫu con/ người

thân bị bệnh nhận từ NST X mang gen bệnh của người mẹ

- Phôi không mang gen bệnh: xuất hiện các kích thước STR từ NST X không

mang gen bệnh của người mẹ (không xuất hiện ở mẫu con/ người thân bị bệnh).

2.4.3. Giai đoạn xác nhận kết quả bằng chẩn đoán trước sinh

Khi thai phụ mang thai được 16 tuần, tiến hành chọc ối để xác nhận kết quả

bằng chẩn đoán trước sinh. Mẫu ối được chia làm 2 phần tương đương nhau:

Một phần được tiến hành các kỹ thuật sinh học phân tử tương tự giai đoạn

PGT cùng mẫu máu của các thành viên gia đình và phân tích di truyền liên kết để kết

luận tình trạng thai nhi như mô tả ở mục 2.4.2.5.

Phần còn lại được gửi tới Khoa Di truyền phân tử, Viện Huyết học – Truyền

máu TW để đối chứng bằng phương pháp LD-PCR.

2.4.3.1. Kỹ thuật chọc ối

Thai phụ sẽ được chọc ối dưới hướng dẫn của siêu âm để xác định khoảng

cách an toàn cho thai nhi. Nước ối được rút ra qua thành bụng bằng 1 mũi kim rất

nhỏ, dài và rỗng. Lượng nước ối được lấy là 10 ml, chia đều vào 2 ống fancol để

thuận tiện cho bước tách DNA.

Khi thai phụ mang song thai (2 túi ối), bác sĩ có thể sẽ chọc kim 2 lần vào tử

cung để lấy nước ối từ hai buồng ối riêng biệt.

Sau đó thai phụ sẽ được siêu âm kiểm tra lại tình trạng thai nhi sau thủ thuật.

2.4.3.2. Kỹ thuật tách DNA từ mẫu dịch ối

39

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Ly tâm mẫu dịch ối thu được với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt

độ phòng. Loại bỏ dịch nổi cho tới khi còn lại 1,5 ml trong fancol. Vortex để cặn dưới

đáy fancol hòa tan lại đều trong dung dịch còn lại, và tiến hành tách chiết DNA theo

như mô tả ở bước 2.4.1.2.

2.5. Các chỉ tiêu nghiên cứu

- Chỉ số đa hình PIC và các chỉ số dị hợp tử Ho, He của các chỉ thị STR được

chọn lọc trong các quần thể: 50 người phụ nữ không mang gen bệnh, 103 người phụ

nữ mang gen bệnh, tổng số 153 người phụ nữ mang và không mang gen bệnh

Hemophilia A trong quần thể người Việt Nam.

- Quy trình PGT bệnh Hemophilia A sử dụng bộ chỉ thị STR liên kết với gen

F8 thiết kế được.

- Kết quả áp dụng quy trình PGT bệnh Hemophilia A cho gia đình người Việt

Nam.

- Kết quả kiểm tra bằng chẩn đoán trước sinh cho gia đình được áp dụng quy

trình PGT bệnh Hemophilia A.

2.6. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng Phân tích DNA, Bộ môn Giải Phẫu, Học viện Quân Y.

- Thời gian: Từ tháng 9 năm 2017 đến tháng 7 năm 2019.

2.7. Vấn đề y đức và đạo đức trong nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành và chấp thuận của Hội đồng y đức trong nghiên

cứu y sinh học Học viện Quân Y.

Đối tượng được cung cấp đầy đủ thông tin và tham vấn y khoa trước khi tham

gia nghiên cứu. Các đối tượng nghiên cứu có nhu cầu điều trị, chẩn đoán hoàn toàn

tự nguyện, không lựa chọn giới tính. Đối tượng có thể rút khỏi nghiên cứu ở bất cứ

giai đoạn nào của tiến trình nghiên cứu. Các nguyên tắc về y đức được đảm bảo thực

hiện nghiêm túc.

Trong quá trình thực nghiệm, thu thập, xử lý và báo cáo số liệu, trích dẫn tài

liệu đảm bảo trung thực, rõ ràng, khách quan, không đạo văn.

40

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Bộ STR đa hình liên kết với gen F8 phục vụ PGT hemophilia A tại Việt

Nam

3.1.1. Các STR nằm cách gen F8 1Mb

Sau quá trình sàng lọc bằng công cụ Tin sinh học kết hợp tham khảo các công

bố trên thế giới về chỉ số đa hình của các chỉ thị STR, chúng tôi đã lựa chọn được bộ

chỉ thị ban đầu gồm 13 chỉ thị, bao gồm: 03 chỉ thị nằm phía trước gen F8, 05 chỉ thị

nằm trong gen F8 và 05 chỉ thị nằm phía sau gen này. Khoảng cách từ các chỉ thị đến

gen F8 nằm trong khoảng 1 Mbp, đảm bảo tỷ lệ trao đổi chéo nếu có là dưới 1%. Các

STR liên kết với gen F8 sau khi kiểm tra tính đa hình trên quần thể người Việt Nam

sẽ được đồng khuếch đại với chỉ thị giới tính Amelogenin để phục vụ quy trình PGT.

Do gen F8 và các chỉ thị liên kết nằm trên NST X, không có allele tương ứng

trên NST Y, nên việc đồng khuếch đại với chỉ thị giới tính đặc biệt có ý nghĩa khi

đánh giá nguyên nhân chỉ thu được 1 đỉnh tín hiệu cho chỉ thị STR nào là do ADO

hay do mẫu được phân tích chỉ có 1 NST X. Điều này đồng thời giúp người phân tích

kết quả kiểm soát việc phát hiện thiếu allele và nhầm lẫn ký hiệu mẫu các thành viên

trong cùng một gia đình.

Hình 15. Sơ đồ vị trí các STR sử dụng trong nghiên cứu trên NST X

41

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Bảng 13. Thông tin các STR được sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên STR Mã hóa Vị trí trên Kích thước Dạng lặp

NST* (bp) sản phẩm

PCR (bp)

1 DXS1073 153482143 152 – 172 (TG)n X1

2 REN90682 153668571 129 – 143 (AC)n X2

3 REN90833 153694353 251 – 275 (TTAT)n X3

4 F8Int25.2 153736060 175 – 181 (TG)n X4

5 F8Int22 153757206 207 – 217 (GT)n X5

6 F8Int21 153777976 116 – 128 (AC)n X6

7 F8Int13.2 153817451 309 – 321 (AC)n X8

8 F8Int1 153884082 188 – 198 (AC)n X9

9 stSG604486 154050935 226 – 238 (AC)n X10

(CT)n X11 10 HEMA154130.5 154130572 179 – 215

(GT)n X12 11 THLMEInt2 154415524 234 – 256

X13 12 THLMEInt1.1 154486183 289 – 319 (GAAA)n

X14 13 HEMA154498.9 154498956 235 – 267 (TC)n

* Khoảng cách tính theo bp từ đầu mút cánh ngắn NST X, theo trình tự tham

chiếu NC_000023 human X chromosome. Gen F8 nằm trong khoảng 153717260–

153904192 bp.

3.1.2. Kết quả tối ưu hóa quy trình PCR đa mồi khuếch đại các STR

Các bước tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi và nồng độ mồi khuếch đại 13 STR theo

thông tin bảng 3 (mã hóa từ X1 đến X6 và X8 đến X14) và chỉ thị NST giới tính

Amelogenin (mã hóa là X15) đều thực hiện trên bộ mồi thường với trình tự thiết kế

tương tự bộ mồi gắn huỳnh quang, khuôn DNA tách từ mẫu máu đạt yêu cầu về độ

tinh sạch (A260/A280 đạt từ 1,8 đến 2,0) sau khi tách chiết và được pha loãng về nồng

độ 10 ng/µl để tiến hành PCR. Thông tin trình tự mồi thể hiện trong bảng 14.

42

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Bảng 14. Trình tự mồi khuếch đại các chỉ thị STR [81]

Trình tự mồi (5'-3') Cặp mồi Sản phẩm (bp)

GGTTTTCCCAGTCACGACGAATGCCCTCTCCGAGTTATTAC X1a 152-172 GTTTCTGAGATTGGTGGCCTTTGAAAC

GTAAAACGACGGCCAGTGGAAAATTCTCCTCTCCTGCTCC X2b 129-143 CCTTCTTTCTTCAAATGATGCTTGG

CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGTCAATATGTCTTGGTCTGGC X3c 251-275 GTTTCTCCCATTCTATTCCTAAATAAGATAGC

GTAAAACGACGGCCAGTGCTTGAGACTTGGCAGACTCC X4b 175-181 GTTTCCTTTAGAATCACTCTTGGTGTG

GTAAAACGACGGCCAGTGGAATGCACAGCCTATCCTCC X5b 207-217 GTCAAGGTGTCAAATCCCACG

GGTTTTCCCAGTCACGACCCACTACCAAATCATTGAGCC X6 116-128 GGTCCATTAGCTTATGTGAGTC

GGTTTTCCCAGTCACGACTCAACAAAACTGAACAACTAGAAGG X8a 309-321 AATCTGGATGGCTTCAAGCTC

CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGACCCTGTACTTTTACCATTGGC X9c 188-198 GTTTCTCAGCAACTCGACTTCTGGC

CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGGCAATTTCAGATCACTTCTTTC X10c 226-238 GTTTGTTACGGTTTTCTTTGTGGC

GGTTTTCCCAGTCACGACAATCTATGTGAGTCAGCCCC X11a 179-215 GTTTCTCAAGTAGAAAAGTCCTGTGGC

GTAAAACGACGGCCAGTGCTGTCTGATACAACTGCTGATAC X12b 234-256 GGGTTAGTGGTACTCAAACAC

CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCTGCAACTGTGTCACTG X13c 289-319 GTTTCCCTACTGTCTTGACTATTGTGGC

GGTTTTCCCAGTCACGACGGATTCCAGTGACATTGACTCTATC X14a 235-267 GTATCTACTGTTACATGGACTTGGG

a: Cặp mồi gắn màu HEX; b: Cặp mồi gắn màu FAM; c: Cặp mồi gắn màu NED

CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG X15c 133/139 GTTTCTCAACCATCAGAGCTTAAACTGG

43

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Bảng 15. Kết quả nồng độ và độ tinh sạch DNA tách từ mẫu máu

Tên mẫu Nồng độ DNA Nồng độ DNA sau pha loãng

10,31 ng/µl A260/A280 1,94

20,06 ng/µl GCX1 Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi:

Từ kết quả xác định nhiệt độ nóng chảy Tm của 14 cặp mồi trên

http://sg.idtdna.com/calc/analyzer, chúng tôi tính toán được nhiệt độ gắn mồi trung

bình trên lý thuyết của 11 cặp mồi này là 61.3oC. Từ đó, tiến hành PCR đơn mồi theo

dải nhiệt độ 55oC – 60oC – 65oC và phân tích sản phẩm trên gel agarose. Nhiệt độ

cho băng sản phẩm rõ nét và cường độ tín hiệu ổn định nhất cho cả 11 cặp mồi sẽ

được lựa chọn làm nhiệt độ gắn mồi tối ưu.

Hình 16. Kết quả tối ưu hóa các mồi X1 đến X5 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65

Hình 17. Kết quả tối ưu hóa các mồi X6 đến X10 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65oC

44

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hình 18. Kết quả tối ưu hóa các mồi X11 đến X15 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65oC

Kết quả cho thấy cặp mồi X11 và X14 cho sản phẩm tốt nhất ở 65oC, cặp mồi

X12 và X15 đều có tín hiệu sản phẩm đặc hiệu nhiều ở cả 3 dải nhiệt độ, cặp mồi

X13 không có tín hiệu sản phẩm hoặc chỉ có tín hiệu sản phẩm không đặc hiệu ở cả

3 dải nhiệt độ.

Từ các kết quả tối hóa ở 3 dải nhiệt độ trên, có thể nhận thấy 14 cặp mồi này

có nhiệt độ gắn mồi tối ưu không đồng nhất nhau. Để khắc phục điều này, chúng tôi

sử dụng QIAGEN Multiplex PCR Mastermix với ưu điểm tối ưu điều kiện phản ứng

multiplex về cùng một điều kiện chu trình nhiệt chung của nhà sản xuất (với nhiệt độ

gắn mồi là 60oC), không phụ thuộc nhiều vào thông số của từng cặp mồi trong phản

ứng. Tất cả 14 cặp mồi đều được ghép vào cùng 1 ống phản ứng QIAGEN Multiplex

PCR Mastermix với cùng một nồng độ phản ứng là 0.2 µM. Sản phẩm PCR sau đó

tiếp tục được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR gắn huỳnh quang phục vụ cho bước

điện di mao quản. Việc gắn màu huỳnh quang phụ thuộc kích thước sản phẩm PCR

của các mồi, đảm bảo phân biệt được sản phẩm giữa các cặp mồi có cùng màu huỳnh

45

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

quang.

Kết quả điện di mao quản được phân tích bằng phần mềm Genemapper version

4.0 để từ đó điều chỉnh nồng độ mồi bằng cách tăng nồng độ các cặp mồi hoạt động

yếu, giảm nồng độ các cặp hoạt động mạnh theo gradient 0,05 µM dựa trên cường độ

tín hiệu sản phẩm khuếch đại.

Hình 19. Kết quả điện di mao quản phản ứng PCR đa mồi cho 14 cặp mồi có

cùng nồng độ phản ứng là 0.2 µM

Kết quả cho thấy có sự xuất hiện sản phẩm tương ứng về kích thước và màu

huỳnh quang của cả 14 cặp mồi. Tuy nhiên, cường độ tín hiệu của các cặp mồi này

không đồng đều nhau và có sản phẩm có cường độ tín hiệu khá thấp (dưới 500). Do

đó dựa trên các kết quả này, nồng độ của từng mồi được hiệu chỉnh theo gradient 0.05

µM. Sau nhiều lần hiệu chỉnh, nồng độ phản ứng của từng cặp mồi trong phản ứng

PCR đa mồi được xác định như bảng 16.

46

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Bảng 16. Nồng độ mồi trong phản ứng PCR đa mồi

Tên cặp mồi Màu huỳnh quang Nồng độ (µM)

Xanh dương (FAM) 0.25 X1

X2 Xanh lục (HEX) 0.2

X3 Đen (NED) 0.4

X4 Xanh lục (HEX) 0.2

X5 Xanh lục (HEX) 0.2

X6 Xanh dương (FAM) 0.2

X8 Xanh dương (FAM) 0.7

X9 Đen (NED) 0.2

X10 Đen (NED) 0.6

X11 Xanh dương (FAM) 0.4

X12 Xanh lục (HEX) 0.25

X13 Đen (NED) 0.3

X14 Xanh dương (FAM) 0.3

X15 Đen (NED) 0.15

47

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hình 20. Kết quả điện di mao quản phản ứng PCR đa mồi cho 14 cặp mồi có

nồng độ phản ứng đã hiệu chỉnh

Kết quả điện di cho thấy cường độ tín hiệu sản phẩm của 14 cặp mồi đã được

cải thiện rõ rệt, hầu hết các chỉ thị đều có 2 tín hiệu sản phẩm có kích thước khác

nhau tương ứng với 2 allele dị hợp tử với cường độ sản phẩm tương đương nhau. Chu

trình nhiệt phản ứng PCR đa mồi có: bước khởi đầu phản ứng ở 95oC trong 15 phút;

30 chu kỳ nhiệt: biến tính ở 94oC trong 30 giây, gắn mồi ở 60oC trong 90 giây, kéo

dài mạch ở 72oC trong 60 giây. Bước tổng hợp sản phẩm cuối cùng của các cặp mồi

ở 60oC trong 30 phút.

3.1.3. Chỉ số đa hình và chỉ số dị hợp tử của các STR

Sau bước tổng hợp và tính toán các chỉ số đa hình thu được từ các mẫu mang

và không mang gen bệnh cũng như trên quần thể tổng số 153 mẫu (thống kê ở Phụ

lục), chúng tôi nhận thấy toàn bộ 13 chỉ thị STR được lựa chọn đề có chỉ số dị hợp tử

quan sát và chỉ số đa hình PIC cao trên 0.5, đặc biệt các chỉ thị DXS1073, REN90682,

48

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

stSG604486 có chỉ số này là 1 ở quần thể 50 mẫu đối chứng (không mang gen bệnh).

Như vậy, các chỉ thị này đáp ứng được tiêu chuẩn về tính đa hình. Nghiên cứu của

chúng tôi cũng là nghiên cứu đầu tiên báo cáo đầy đủ về các chỉ số đa hình của các

STR liên kết gen F8 được sử dụng trên quần thể người Việt Nam.

Bảng 17. Kết quả tính toán chỉ số Ho, He, PIC

Tổng 153 mẫu 50 mẫu đối chứng 103 mẫu mang gen bệnh STT Tên chỉ thị STR

Ho He PIC Ho He PIC Ho He 1 1

stSG604486 1

1 DXS1073 2 REN90682 3 REN90833 4 F8Int25.2 5 F8Int22 6 F8Int21 7 F8Int13.2 8 F8Int1 9 10 HEMA154130.5 0.98 0.87 0.86 0.82 0.89 0.88 0.87 0.9 11 THLMEInt2 12 THLMEInt1.1 13 HEMA154498.9 0.98 0.86 0.85 0.75 0.88 0.87 0.82 0.9 PIC 0.78 0.76 0.76 0.86 0.84 0.83 0.86 0.84 0.8 0.78 0.85 0.84 0.82 0.9 0.87 0.86 0.46 0.67 0.64 0.64 0.77 0.74 0.58 0.85 0.84 0.98 0.67 0.62 0.67 0.82 0.79 0.76 0.84 0.82 0.94 0.67 0.62 0.65 0.77 0.73 0.73 0.76 0.72 0.92 0.77 0.74 0.63 0.76 0.72 0.73 0.81 0.78 0.98 0.78 0.75 0.53 0.83 0.81 0.68 0.85 0.83 0.92 0.68 0.63 0.62 0.77 0.74 0.71 0.77 0.74 0.79 0.77 0.56 0.87 0.85 0.69 0.87 0.86 0.89 0.98 0.87 0.86 0.8 0.85 0.84 0.86 0.88 0.87 0.58 0.79 0.77 0.61 0.84 0.82 0.6 0.86 0.84 0.89

Trên cả 3 tập hợp người mang và không mang gen bệnh, chỉ số PIC của các

chỉ thị trong bộ đều đảm bảo cao trên 0,5 – như vậy đột biến trên gen F8 không làm

ảnh hưởng tới tính đa hình và giá trị thông tin của các STR liên kết được lựa chọn.

Đồng thời qua các biểu đồ cột hình 21-23, có thể thấy các chỉ số tính đa hình cao

đồng đều giữa các chỉ thị này và giữa các quần thể người mang và không mang gen

bệnh, như vậy tỷ lệ trường hợp cá thể không có thông tin (đồng hợp tử) với cả 13 chỉ

thị sẽ là rất thấp, đảm bảo giá trị chẩn đoán trên quần thể quy mô lớn.

49

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

Tần số dị hợp tử quan sát Ho

50 mẫu đối chứng 103 mẫu mang gen bệnh Tổng 153 mẫu

Hình 21. Biểu đồ tần số dị hợp tử quan sát Ho trong các quần thể nghiên cứu

1

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

Tần số dị hợp tử lý thuyết He

50 mẫu đối chứng 103 mẫu mang gen bệnh Tổng 153 mẫu

Hình 22. Biểu đồ tần số dị hợp tử lý thuyết He trong các quần thể nghiên cứu

50

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

Chỉ số thông tin đa hình di truyền PIC

50 mẫu đối chứng 103 mẫu mang gen bệnh Tổng 153 mẫu

Hình 23. Biểu đồ chỉ số đa hình PIC trong các quần thể nghiên cứu

Ngoài tính đa hình, vị trí các chỉ thị cũng là yếu tố quan trọng quyết định giá

trị chẩn đoán: trong trường hợp cá thể có quá nhiều chỉ thị trong bộ ở trạng thái đồng

hợp tử, cần ít nhất 01 chỉ thị nằm phía trước (upstream) và 01 chỉ thị nằm phía sau

(downstream) gen trong khoảng 1 Mbp để đảm bảo tính liên kết chặt chẽ. Biểu đồ

hình 24 thể hiện tỉ lệ cá thể không đảm bảo chỉ thị có thông tin nằm ở cả 2 phía của

gen chỉ chiếm khoảng 1% trong quần thể. Như vậy bộ chỉ thị này cũng đáp ứng được

yêu cầu về vị trí so với gen F8, và có thể tiến hành chẩn hóa PCR đa mồi để đưa vào

quy trình PGT hemophilia A cho quần thể người Việt Nam.

51

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

6

5

1.3

1.3

13.7

19.6

4

3.3

13.1

15.7

m a e r t s p u ử t

3

0.7

3.3

6.5

7.8

p ợ h

2

0.7

0.7

3.9

3.9

ị d

1

2.0

1.3

r e k r a m ố S

0

0.7 1

0.7 2

-0.5

0

0.5

1.5

2.5

3

3.5

-1

Tỉ lệ cá thể dị hợp tử trong quần thể 153 người Việt Nam (%)

Số marker dị hợp tử downstream

Hình 24. Biểu đồ tỉ lệ cá thể dị hợp tử các chỉ thị STR ở 2 bên gen F8

sử dụng trong nghiên cứu

3.1.4. Chuẩn hóa quy trình PGT-M trên mẫu tế bào phôi

Tiến hành phản ứng PCR đa mồi khuếch đại 14 chỉ thị STR liên kết gen F8

trên sản phẩm WGA của 05 mẫu tế bào sinh thiết từ phôi dư 5 ngày tuổi, được đo

nồng độ sau WGA bằng máy đo Qubit 4.0 (Thermo) cho kết quả nồng độ DNA đạt

yêu cầu phân tích. Thành phần phản ứng và nồng độ mồi đã được tối ưu hóa trước

đó.

Bảng 18. Kết quả nồng độ sản phẩm WGA 05 mẫu phôi bào phục vụ tối ưu hóa

STT Tên mẫu Nồng độ DNA sau WGA (ng/µl)

NC (đối chứng âm) 1 0.20

2 1 232.1

3 2 456.2

4 3 450.2

5 4 341.1

6 5 256.5

52

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Sản phẩm điện di mao quản phân tích trên phần mềm Genemapper version 4.0

cho hình ảnh kết quả phân tích như sau (các mẫu chạy PCR đa mồi 30 chu kỳ được

kí hiệu từ 1.1 – 5.1, các mẫu chạy 40 chu kỳ kí hiệu từ 1.2 – 5.2):

Hình 25. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 1

53

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hình 26. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 2

Hình 27. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 3

54

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hình 28. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 4

Hình 29. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 5

55

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Các hình ảnh kết quả cho thấy với số chu kỳ là 40, các đỉnh tín hiệu sản phẩm thu

được có cường độ tín hiệu cao hơn hẳn so với số chu kỳ là 30. Đồng thời, các sản

phẩm xuất hiện đầy đủ và độ phân tách giữa đỉnh sản phẩm chính và tín hiệu nền rõ

ràng hơn.

Như vậy, để đảm bảo hiệu quả và độ chính xác cho phép phân tích áp dụng cho

chẩn đoán trước chuyển phôi, số chu kỳ tối ưu cho bước PCR đa mồi là 40 chu kỳ.

3.2. Áp dụng bộ chỉ thị STR thiết kế cho gia đình bệnh nhân hemophilia A

3.2.1. Áp dụng quy trình PGT-M trên gia đình bệnh nhân

Gia đình bệnh nhân tình nguyện tham gia nghiên cứu có con trai (kí hiệu mẫu

He180916 02-P) được chẩn đoán hemophilia A từ 9 tháng tuổi tại bệnh viên Nhi TW,

đến tháng 5/2010 chuyển đến Viện Huyết học – Truyền máu TW khám và làm hồ sơ

quản lý. Kết quả xét nghiệm sinh học phân tử tại Viện Huyết học – Truyền máu TW

cho thấy người mẹ (kí hiệu mẫu He180916 02-M) mang đảo đoạn intron 22 trên gen

F8. Người cha (kí hiệu mẫu He180916 02-F) không mang đột biến gen F8.

Cặp vợ chồng nói trên thực hiện IVF tại bệnh viện Nam học và hiếm muộn Hà

Nội được 04 phôi. Các phôi bào được sinh thiết từ 04 phôi này (kí hiệu từ He180916

02-Q1 tới He180916 02-Q4), thực hiện WGA và phân tích đột biến gen F8 bằng bộ

chỉ thị STR vừa thiết lập, thu được kết quả PGT thể hiện từ hình 30 đến hình 33.

56

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hình 30. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q1

(tương ứng thứ tự từ trên xuống dưới)

57

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hình 31. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q2

(tương ứng thứ tự từ trên xuống dưới)

58

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hình 32. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q3

(tương ứng thứ tự từ trên xuống dưới)

59

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hình 33. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q4

(tương ứng thứ tự từ trên xuống dưới)

60

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Phôi bào He180916 02-Q1 không xuất hiện allele có đỉnh kích thước 145 bp của

chỉ thị Amelogenin trên NST Y (Hình 30), như vậy phôi này nhận các STR trên một

NST X từ bố và một NST X từ mẹ. Ngoài các allele STR nhận từ bố có kích thước

giống với bố (kí hiệu mẫu He180916 02-F), allele STR còn lại giống với bộ allele

STR của người con trai bị bệnh (nhận một NST X mang allele F8 gây bệnh từ mẹ).

Như vậy, phôi bào He180916 02-Q1 mang allele F8 gây bệnh Hemophilia A và không

nên cấy phôi vào tử cung.

Các phôi bào He180916 02-Q2, He180916 02-Q3 không xuất hiện allele có đỉnh

kích thước 145 bp của chỉ thị Amelogenin trên NST Y (Hình 31-32), như vậy phôi

này nhận các STR trên một NST X từ bố và một NST X từ mẹ. Ngoài các allele STR

nhận từ bố có kích thước giống với bố (He180916 02-F), bộ allele STR còn lại không

giống với bộ allele STR của người con trai bị bệnh (He180916 02-P) mà giống với

bộ STR không liên kết với allele F8 gây bệnh của mẹ (He180916 02-M). Như vậy,

các phôi bào He180916 02-E2 và He180916 02-E3 không mang allele F8 gây bệnh

Hemophilia A và có thể tiến hành chuyển phôi.

Phôi bào He180916 02-Q4 xuất hiện allele có đỉnh kích thước 145 bp của chỉ thị

Amelogenin trên NST Y, như vậy phôi này nhận các STR trên một NST X từ mẹ và

một NST Y từ bố. Các allele STR nhận từ mẹ có kích thước không giống với mẫu

He180916 02-P của người con trai bị bệnh. Như vậy, có thể kết luận phôi bào

He180916 02-Q4 không mang allele F8 gây bệnh Hemophilia A và cũng có thể tiến

hành chuyển phôi.

Như vậy, trong số 04 phôi của gia đình bệnh nhân được áp dụng PGT-M, có

01 phôi mang allele F8 gây bệnh là He180916 02-Q1 (không nên cấy vào tử cung)

và 03 phôi không mang allele F8 gây bệnh, có thể cấy vào tử cung là He180916 02-

Q2, He180916 02-Q3 và He180916 02-Q4.

Kết quả tổng hợp được thể hiện trong hình 34 và bảng 19.

61

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hình 34. Kết quả phân tích di truyền liên kết phục vụ PGT-M hemophilia A của gia đình bệnh nhân tham gia nghiên cứu

(N (Normal): Không mang gen bệnh; C (Carrier): Mang gen bệnh; A (Affected): Bị bệnh)

62

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Bảng 19. Kết quả phân tích đột biến gen F8 ở phôi IVF

Kí hiệu gia đình Phôi có allele F8 đột biến Phôi WGA thất bại

He180916 02 Tổng số phôi Phôi không có allele F8 đột biến 03 04 01 0

3.2.2. Kết quả mang thai và chẩn đoán trước sinh cho gia đình bệnh nhân

Sau khi tiến hành chuyển phôi cho gia đình bệnh nhân, thai phụ được theo dõi

và lấy mẫu ối (He180916 02-O) để chẩn đoán trước sinh khi thai nhi đạt 16 tuần tuổi.

Kết quả phân tích di truyền liên kết cho mẫu dịch ối sử dụng bộ chỉ thị STR thiết kế

được cho thấy thai nhi không mang allele F8 gây bệnh hemophilia A.

Kết quả đối chiếu bằng phương pháp Longrange-PCR thực hiện tại Viện Huyết

học - Truyền máu TW cũng cho thấy không phát hiện đảo đoạn intron 22 ở mẫu dịch

ối, đồng thời khẳng định thai nhi không mang allele F8 gây bệnh hemophilia A.

63

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hình 35. Kết quả chẩn đoán trước sinh bằng Longrange PCR do

Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương thực hiện

64

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hình 36. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và dịch ối

65

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Hình 37. Kết quả chẩn đoán trước sinh bằng phân tích di truyền liên kết sử dụng bộ STR thiết kế được

(N (Normal): Không mang gen bệnh; C (Carrier): Mang gen bệnh; A (Affected): Bị bệnh)

66

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

Như vậy, kết quả phân tích gián tiếp đột biến gen F8 thông qua các STR đa

hình liên kết chặt với gen F8 trước chuyển phôi và trước sinh phù hợp với kết quả

phân tích trực tiếp đột biến gen F8 bằng Longrange-PCR (Viện Huyết học - Truyền

máu Trung ương). Nghiên cứu của chúng tôi đã đạt được mục tiêu xây dựng bộ chỉ

thị STR đảm bảo tính đa hình cao, liên kết chặt với gen F8, phục vụ chẩn đoán di

truyền trước chuyển phôi hemophilia A và áp dụng thành công cho gia đình bệnh

nhân.

So với nghiên cứu trước đây ở Việt Nam cũng sử dụng phương pháp phân tích

di truyền liên kết với chỉ thị STR để phục vụ PGT-M hemophilia A nhưng khuếch

đại chỉ thị bằng PCR đơn mồi [2], nghiên cứu của chúng tôi có thời gian chẩn đoán

nhanh và tiết kiệm kinh phí cũng như công lao động hơn trong khi vẫn đảm bảo tính

chính xác nhờ kỹ thuật PCR đa mồi khuếch đại bộ chỉ thị trong cùng một phản ứng.

Khi được áp dụng rộng rãi tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản, quy trình PGT trong

nghiên cứu này sẽ góp phần giảm gánh nặng kinh tế cũng như tâm lý cho các gia đình

có allele F8 gây bệnh. Các em bé được sinh ra sẽ không cần tiến hành sàng lọc gen

bệnh hay tư vấn tiền hôn nhân khi đến tuổi trưởng thành.

Bên cạnh những ưu điểm trên, trong nghiên cứu vẫn có hiện tượng ADO ở

một số chỉ thị STR trên các mẫu phôi được tiến hành chẩn đoán. Hình ảnh đỉnh kích

thước sản phẩm điện di mao quản của mẫu phôi với tín hiệu không cao, hình dạng

không điển hình cho thấy cần phải kiểm soát tốt hơn quy trình sinh thiết cũng như

vận chuyển mẫu để đảm bảo chất lượng tế bào phôi. Trong giai đoạn áp dụng quy

trình PGT cho các gia đình bệnh nhân, khi số lượng phôi được chẩn đoán đủ lớn, cần

tiến hành thống kê để loại bỏ các chỉ thị có tỷ lệ ADO quá cao, tiếp tục tối ưu bộ chỉ

thị để đảm bảo hiệu quả chẩn đoán.

67

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

1. Đã thiết lập thành công bộ chỉ thị gồm 13 STR đa hình cao và di truyền liên

kết chặt chẽ với gen F8, phục vụ chẩn đoán hemophilia A trước chuyển phôi.

2. Đã áp dụng thành công quy trình chẩn đoán hemophilia A trước chuyển

phôi từ bộ chỉ thị xây dựng được cho 01 gia đình bệnh nhân.

Kiến nghị

1. Mở rộng quy mô nghiên cứu chỉ số đa hình của các chỉ thị STR trong bộ

thiết kế được trên các dân tộc khác nhau ở Việt Nam.

2. Áp dụng quy trình PGT-M hemophilia A xây dựng được tại các trung tâm

hỗ trợ sinh sản ở Việt Nam.

68

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt:

1. Lưu Vũ Dũng (2014), Nghiên cứu xác định đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia

A, Đại học Y Hà Nội.

2. Trần Vân Khánh, Phạm Lê Anh Tuấn, Nguyễn Quý Hoài, Nguyễn Thị Minh,

Nguyễn Viết Tiến (2016), "Chẩn đoán tiền làm tổ bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật

Microsattlite DNA", Tạp chí nghiên cứu Y Học, pp. 7.

3. Lê Nhật Minh, Võ Thị Thương Lan và Đỗ Trung Phấn (2004), "Sử dụng phương

pháp ADN (PCR-RFLP) vùng intron 18 để xác định các cá thể mang gen bệnh máu

khó đông Hemophilia A", Tạp chí Y học thực hành. 8, pp. 61 - 62.

4. Vũ Văn Quỳ (2010), Nghiên cứu tần suất alen của một số locus gen ở người Việt,

Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

5. Bạch Quốc Tuyên (1991), Nhân một trường hợp Hemophilia A có kháng thể kháng

VIII- Bàn về kháng đông lưu hành, Bài giảng huyết học.

Tài liệu tiếng Anh:

6. Bagnall R., F. Giannelli and P. Green (2005), "Polymorphism and hemophilia A

causing inversions in distal Xq28: a complex picture", Journal of Thrombosis and

Haemostasis. 3(11), pp. 2598-2599.

7. Bagnall R. D., N. Waseem, P. M. Green and F. Giannelli (2002), "Recurrent

inversion breaking intron 1 of the factor VIII gene is a frequent cause of severe

hemophilia A", Blood. 99(1), pp. 168-174.

8. Bogdanova N., A. Markoff, H. Pollmann, U. Nowak‐Göttl, R. Eisert, B.

Dworniczak, A. Eigel and J. Horst (2002), "Prevalence of small rearrangements in

the factor VIII gene F8C among patients with severe hemophilia A", Human

mutation. 20(3), pp. 236-237.

9. Bogdanova N., A. Markoff, H. Pollmann, U. Nowak‐Göttl, R. Eisert, C. Wermes,

A. Todorova, A. Eigel, B. Dworniczak and J. Horst (2005), "Spectrum of molecular

defects and mutation detection rate in patients with severe hemophilia A", Human

mutation. 26(3), pp. 249-254.

69

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

10. Butler J. M. (2006), "Genetics and genomics of core short tandem repeat loci used

in human identity testing", Journal of forensic sciences. 51(2), pp. 253-265.

11. Butler J. M. (2007), "Short tandem repeat typing technologies used in human

identity testing", Biotechniques. 43(4), pp. Sii-Sv.

12. Castaldo G., V. D'Argenio, P. Nardiello, F. Zarrilli, V. Sanna, A. Rocino, A.

Coppola, G. Di Minno and F. Salvatore (2007), "Haemophilia A: molecular insights",

Clinical Chemical Laboratory Medicine. 45(4), pp. 450-461.

13. Chamberlain J. S., R. A. Gibbs, J. E. Rainer, P. N. Nguyen and C. Thomas (1988),

"Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA

amplification", Nucleic acids research. 16(23), pp. 11141-11156.

14. Cooke H. (1976), "Repeated sequence specific to human males", Nature. 262, pp.

182-186.

15. Cora N. I. R., F. I. Delgado, S. M. M. Ramírez and J. V. Quiñones (2017),

"Acquired Hemophilia A in an advanced age patient of hispanic origin: a case report",

BMC research notes. 10(1), pp. 438.

16. Cumming A. (2004), "The factor VIII gene intron 1 inversion mutation:

prevalence in severe hemophilia A patients in the UK", Journal of Thrombosis and

Haemostasis. 2(1), pp. 205-206.

17. Ding Q., Y. Lu, J. Dai, X. Xi, X. Wang and H. Wang (2012), "Characterisation

and validation of a novel panel of the six short tandem repeats for genetic counselling

in Chinese haemophilia A pedigrees", Haemophilia. 18(4), pp. 621-625.

18. Eaton D., H. Rodriguez and G. A. Vehar (1986), "Proteolytic processing of human

factor VIII. Correlation of specific cleavages by thrombin, factor Xa, and activated

protein C with activation and inactivation of factor VIII coagulant activity",

Biochemistry. 25(2), pp. 505-512.

19. EL‐MAARRI O., U. Herbiniaux, J. Graw, J. Schröder, A. Terzic, M. Watzka, H.

Brackmann, W. Schramm, P. Hanfland and R. Schwaab (2005), "Analysis of mRNA

in hemophilia A patients with undetectable mutations reveals normal splicing in the

factor VIII gene", Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3(2), pp. 332-339.

70

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

20. Fisch E., E. Fricke, S. Baedker, U. Deutsch, R. Ahmed, D. Loeffert and C.

Korfhage (2014), "Accurate Genome Analysis of Single Cells", Journal of

Biomolecular Techniques : JBT.

21. Forman E. J., K. H. Hong, K. M. Ferry, X. Tao, D. Taylor, B. Levy, N. R. Treff

and R. T. Scott Jr (2013), "In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer:

a randomized controlled trial", Fertility and sterility. 100(1), pp. 100-107. e1.

22. Franchini M., M. Montagnana, G. Targher, D. Veneri, M. Zaffanello, G. L.

Salvagno, F. Manzato and G. Lippi (2009), Interpatient phenotypic inconsistency in

severe congenital hemophilia: a systematic review of the role of inherited

thrombophilia, Seminars in thrombosis and hemostasis, © Thieme Medical

Publishers, tr. 307-312.

23. Ganguly A., T. Dunbar, P. Chen, L. Godmilow and T. Ganguly (2003), "Exon

skipping caused by an intronic insertion of a young Alu Yb9 element leads to severe

hemophilia A", Human genetics. 113(4), pp. 348-352.

24. Gawad C., W. Koh and S. R. Quake (2016), "Single-cell genome sequencing:

current state of the science", Nature Reviews Genetics. 17(3), pp. 175.

25. Goodeve A. (2008), Molecular genetic testing of hemophilia A, Seminars in

thrombosis and hemostasis, © Thieme Medical Publishers, tr. 491-501.

26. Goodeve A. C., I. Williams and G. L. Bray (2000), "Relationship between factor

VIII mutation type and inhibitor development in a cohort of previously untreated

patients treated with recombinant factor VIII (Recombinate™)", Thrombosis and

haemostasis. 83(6), pp. 844-848.

27. Graw J., H.-H. Brackmann, J. Oldenburg, R. Schneppenheim, M. Spannagl and

R. Schwaab (2005), "Haemophilia A: from mutation analysis to new therapies",

Nature Reviews Genetics. 6(6), pp. 488-501.

28. Griffin D. K., L. J. Wilton, A. H. Handvside, R. M. Winston and J. D. Delhanty

(1992), "Dual fluorescent in situ hybridisation for simultaneous detection of X and Y

chromosome-specific probes for the sexing of human preimplantation embryonic

nuclei", Human genetics. 89(1), pp. 18-22.

71

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

29. Griffin D. K., L. J. Wilton, A. H. Handyside, G. Atkinson, R. Winston and J.

Delhanty (1993), "Diagnosis of sex in preimplantation embryos by fluorescent in situ

hybridisation", BMJ: British Medical Journal. 306(6889), pp. 1382.

30. Grifo J. A., B. Hodes-Wertz, H.-L. Lee, E. Amperloquio, M. Clarke-Williams and

A. Adler (2013), "Single thawed euploid embryo transfer improves IVF pregnancy,

miscarriage, and multiple gestation outcomes and has similar implantation rates as

egg donation", Journal of assisted reproduction and genetics. 30(2), pp. 259-264.

31. Guo X. and R. J. H. h. Elston (1999), "Linkage information content of

polymorphic genetic markers". 49(2), pp. 112-118.

32. Harton G., M. De Rycke, F. Fiorentino, C. Moutou, S. SenGupta, J. Traeger-

Synodinos and J. J. H. r. Harper (2010), "ESHRE PGD consortium best practice

guidelines for amplification-based PGD". 26(1), pp. 33-40.

33. High K. A. (2012), "The gene therapy journey for hemophilia: are we there yet?",

ASH Education Program Book. 2012(1), pp. 375-381.

34. Hoffbrand V. and P. A. Moss (2011), Essential haematology, Vol. 28, John Wiley

& Sons.

35. Huang J., J. Pang, T. Watanabe, H.-K. Ng and H. Ohgaki (2009), "Whole genome

amplification for array comparative genomic hybridization using DNA extracted

from formalin-fixed, paraffin-embedded histological sections", The Journal of

Molecular Diagnostics. 11(2), pp. 109-116.

36. Jayandharan G. R. and A. Srivastava (2008), The phenotypic heterogeneity of

severe hemophilia, Seminars in thrombosis and hemostasis, © Thieme Medical

Publishers, tr. 128-141.

37. Justice U. D. o. (2002), Using DNA to Solve Cold Cases, National Commission

on the Future of DNA Evidence.

38. Keeney S., M. Mitchell and A. Goodeve (2010), Practice Guidelines for the

Molecular Diagnosis of Haemophilia A, chủ biên, UK Haemophilia Centre Doctors’

Organisation, CMGS Website.

72

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

39. Kemball-Cook G., E. G. Tuddenham and A. I. Wacey (1998), "The factor VIII

structure and mutation resource site: HAMSTeRS version 4", Nucleic acids research.

26(1), pp. 216-219.

40. Kogan S. C., M. Doherty and J. Gitschier (1987), "An improved method for

prenatal diagnosis of genetic diseases by analysis of amplified DNA sequences", New

England Journal of Medicine. 317(16), pp. 985-990.

41. Lakich D., H. H. Kazazian, S. E. Antonarakis and J. Gitschier (1993), "Inversions

disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A", Nature

genetics. 5(3), pp. 236-241.

42. Laurie A., A. Hill, J. Harraway, A. Fellowes, G. Phillipson, P. Benny, M. Smith

and P. George (2010), "Preimplantation genetic diagnosis for hemophilia A using

indirect linkage analysis and direct genotyping approaches", Journal of Thrombosis

and Haemostasis. 8(4), pp. 783-789.

43. Liu J., Q. Liu, Y. Liang, L. Wang, G. Nozary, B. Xiao, Z. Zhu, Y. Zhou, L. Liu

and Y. Guan (1999), "PCR assay for the inversion causing severe Hemophilia A and

its application", Chinese medical journal. 112(5), pp. 419-423.

44. Liu Q., G. Nozari and S. S. Sommer (1998), "Single-tube polymerase chain

reaction for rapid diagnosis of the inversion hotspot of mutation in hemophilia A",

Blood. 92(4), pp. 1458-1459.

45. Liu Q. and S. S. Sommer (1998), "Subcycling-PCR for multiplex long-distance

amplification of regions with high and low GC content: application to the inversion

hotspot in the factor VIII gene", Biotechniques. 25(6), pp. 1022-1028.

46. Lodish H. (2004), Molecular Cell Biology, 5th, ed.

47. Machado F. and E. MEDINA‐ACOSTA (2009), "High‐resolution combined

linkage physical map of short tandem repeat loci on human chromosome band Xq28

for indirect haemophilia A carrier detection", Haemophilia. 15(1), pp. 297-308.

48. Mannucci P. M., R. E. Schutgens, E. Santagostino and E. P. Mauser-Bunschoten

(2009), "How I treat age-related morbidities in elderly persons with hemophilia",

Blood. 114(26), pp. 5256-5263.

73

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

49. Mansouritorghabeh H., L. Manavifar, A. Banihashem, A. Modaresi, A. Shirdel,

M. Shahroudian, G. Shoja-e-Razavi, H. Pousti and H. Esmaily (2013), "An

investigation of the spectrum of common and rare inherited coagulation disorders in

North-Eastern Iran", Blood Transfusion. 11(2), pp. 233.

50. Massaro J., C. Wiezel, Y. Muniz, E. Rego, L. De Oliveira, C. MENDES‐JUNIOR

and A. Simões (2011), "Analysis of five polymorphic DNA markers for indirect

genetic diagnosis of haemophilia A in the Brazilian population", Haemophilia. 17(5),

pp. e936-e943.

51. Mirchandani G. G., J. H. Drake, S. L. Cook, B. C. Castrucci, H. S. Brown and C.

P. Labaj (2011), "Surveillance of bleeding disorders, Texas, 2007", American journal

of preventive medicine. 41(6), pp. S354-S359.

52. MRC-Holland (2008), MRC-Holland,, truy cập ngày 29/9-2016, tại trang.

53. Mühle C., M. Zenker, N. Chuzhanova and H. Schneider (2007), "Recurrent

inversion with concomitant deletion and insertion events in the coagulation factor

VIII gene suggests a new mechanism for X‐chromosomal rearrangements causing

hemophilia A", Human mutation. 28(10), pp. 1045-1045.

54. Myrin‐Westesson L., F. Baghaei and F. Friberg (2013), "The experience of being

a female carrier of haemophilia and the mother of a haemophilic child", Haemophilia.

19(2), pp. 219-224.

55. Nakaya S., T. C. Hsu, S. Geraghty, M. Manco‐Johnson and A. Thompson (2004),

"Severe hemophilia A due to a 1.3 kb factor VIII gene deletion including exon 24:

homologous recombination between 41 bp within an Alu repeat sequence in introns

23 and 24", Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2(11), pp. 1941-1945.

56. Nei M. and A. K. Roychoudhury (1974), "Sampling variances of heterozygosity

and genetic distance", Genetics. 76(2), pp. 379-390.

57. Oldenburg J., V. Ivaskevicius, S. Rost, A. Fregin, K. White, E. Holinski-Feder,

C. R. Müller and B. H. Weber (2001), "Evaluation of DHPLC in the analysis of

hemophilia A", Journal of biochemical and biophysical methods. 47(1), pp. 39-51.

74

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

58. Oldenburg J., J. Schröder, H. H. Brackmann, C. Müller-Reible, R. Schwaab and

E. Tuddenham (2004), Environmental and genetic factors influencing inhibitor

development, Seminars in hematology, Elsevier, tr. 82-88.

59. Oldenburg J., J. Schröder, J. Graw, V. Ivaskevicius, H. Brackmann, W. Schramm,

C. Müller, E. Seifried and R. Schwaab (2003), "[Significance of mutation analysis in

patients with haemophilia A]", Hamostaseologie. 23(1), pp. 6-12.

60. Peng W., H. Takabayashi and K. Ikawa (2007), "Whole genome amplification

from single cells in preimplantation genetic diagnosis and prenatal diagnosis",

European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 131(1),

pp. 13-20.

61. Peyvandi F., G. Jayandharan, M. Chandy, A. Srivastava, S. Nakaya, M. Johnson,

A. Thompson, A. Goodeve, I. Garagiola and S. Lavoretano (2006), "Genetic

diagnosis of haemophilia and other inherited bleeding disorders", Haemophilia.

12(s3), pp. 82-89.

62. Piyamongkol W., M. G. Bermúdez, J. C. Harper and D. Wells (2003), "Detailed

investigation of factors influencing amplification efficiency and allele drop‐out in

single cell PCR: implications for preimplantation genetic diagnosis", Molecular

Human Reproduction. 9(7), pp. 411-420.

63. Poláková H., I. Zmetáková and L. Kádasi (2003), "Long distance PCR in

detection of inversion mutations of F8C gene in hemophilia A patients", General

physiology and biophysics. 22(2), pp. 243-254.

64. QIAGEN (2017), NGS using Whole Genome Amplified DNA, chủ biên.

65. Radal K. (1995), Structure and Biology of factor VIII, Hematology: Basic

principles and practice, Vol. 2.

66. Ray P., R. Winston and A. Handyside (1995), Single cell analysis for diagnosis

of cystic fibrosis and Lesch-Nyhan syndrome in human embryos before implantation,

Nucleic Acids Symposium Series, [London]: Information Retrieval Ltd., c1979-

c2000., tr. 46.

75

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

67. Rosenthal A. and D. Jones (1990), "Genomic walking and sequencing by oligo-

cassette mediated polymerase chain reaction", Nucleic acids research. 18(10), pp.

3095.

68. Rossetti L. C., A. Goodeve, I. B. Larripa and C. D. De Brasi (2004),

"Homeologous recombination between AluSx‐sequences as a cause of hemophilia",

Human mutation. 24(5), pp. 440-440.

69. Rossetti L. C., C. P. Radic, I. B. Larripa and C. D. De Brasi (2005), "Genotyping

the hemophilia inversion hotspot by use of inverse PCR", Clinical chemistry. 51(7),

pp. 1154-1158.

70. Santacroce R., M. Acquila, D. Belvini, G. Castaldo, I. Garagiola, S. Giacomelli,

A. Lombardi, B. Minuti, F. Riccardi and R. Salviato (2008), "Identification of 217

unreported mutations in the F8 gene in a group of 1,410 unselected Italian patients

with hemophilia A", Journal of human genetics. 53(3), pp. 275-284.

71. Santagostino E., M. Mancuso, A. Tripodi, V. Chantarangkul, M. Clerici, I.

Garagiola and P. Mannucci (2010), "Severe hemophilia with mild bleeding

phenotype: molecular characterization and global coagulation profile", Journal of

Thrombosis and Haemostasis. 8(4), pp. 737-743.

72. Shrestha S., S. Dong, Z. Li, Z. Huang and F. Zheng (2016), "Evaluation of factor

VIII polymorphic short tandem repeat markers in linkage analysis for carrier

diagnosis of hemophilia A", Biomedical Reports. 5(2), pp. 228-232.

73. Stern H. (2014), "Preimplantation genetic diagnosis: prenatal testing for embryos

finally achieving its potential", Journal of clinical medicine. 3(1), pp. 280-309.

74. Stonebraker J. S., P. H. BOLTON‐MAGGS, J. Michael Soucie, I. Walker and M.

Brooker (2010), "A study of variations in the reported haemophilia A prevalence

around the world", Haemophilia. 16(1), pp. 20-32.

75. Sukarova E., A. Dimovski, P. Tchacarova, G. Petkov and G. Efremov (2001),

"An Alu insert as the cause of a severe form of hemophilia A", Acta haematologica.

106(3), pp. 126-129.

76

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

76. Thornhill A. R. and K. Snow (2002), "Molecular diagnostics in preimplantation

genetic diagnosis", The Journal of molecular diagnostics: JMD. 4(1), pp. 11.

77. Van de Water N., R. Williams, P. Ockelford and P. Browett (1998), "A 20.7 kb

deletion within the factor VIII gene associated with LINE-1 element insertion",

Thrombosis and haemostasis. 79(5), pp. 938-942.

78. Weir B., J. Reynolds and K. Dodds (1990), "The variance of sample

heterozygosity", Theoretical population biology. 37(1), pp. 235-253.

79. Witt M. and R. P. Erickson (1989), "A rapid method for detection of Y-

chromosomal DNA from dried blood specimens by the polymerase chain reaction",

Human genetics. 82(3), pp. 271-274.

80. Zhang L., X. Cui, K. Schmitt, R. Hubert, W. Navidi and N. Arnheim (1992),

"Whole genome amplification from a single cell: implications for genetic analysis",

Proceedings of the National Academy of Sciences. 89(13), pp. 5847-5851.

81. Zhao M., M. Chen, A. S. Tan, F. S. Cheah, J. Mathew, P.-C. Wong and S. S.

Chong (2017), "Single‐tube tetradecaplex panel of highly polymorphic microsatellite

markers< 1 Mb from F8 for simplified preimplantation genetic diagnosis of

hemophilia A", Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15(7), pp. 1473-1483.

Tài liệu tham khảo trang web:

82. Hối rối loạn đông máu Việt Nam (2017), Việt Nam có khoảng 30.000 người phụ

nữ mang gen bệnh "Rối loạn chảy máu", Viện Huyết học Truyền máu TW, truy cập

ngày 13/8-2019, tại trang web https://www.nihbt.org.vn/hemophilia/viet-nam-co-

khoang-30-000-nguoi-phu-nu-mang-gen-benh-roi-loan-chay-mau/p205i19234.html.

83. Viện Y học ứng dụng Việt Nam Bệnh ưa chảy máu - Hemophilia, truy cập ngày

04/09-2019, tại trang web http://vienyhocungdung.vn/benh-ua-chay-mau-

hemophilia-20161027112625228.htm.

84. Bệnh viện Nam học và hiếm muộn Hà Nội Thụ tinh ống nghiệm (IVF), truy cập

ngày 28/9-2019, tại trang web https://afhanoi.com/thu-tinh-ong-nghiem.

85. Silas H. Haemophilia, truy cập ngày 13/8-2019, tại trang web

https://www.slideshare.net/HelaoSilas/haemophilia-76369646.

77

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

86. Bệnh viện Nhi trung ương Phác đồ chẩn đoán điều trị bệnh Hemophilia, truy cập

ngày 13/8-2019, tại trang web http://benhviennhitrunguong.org.vn/phac-do-chan-

doan-dieu-tri-benh-hemophilia.html.

87. Bệnh viện Phụ sản trung ương, Các phương pháp chẩn đoán trước sinh, Bệnh

viện Phụ sản Trung Ương, truy cập ngày 13/8-2019, tại trang web

http://benhvienphusantrunguong.org.vn/news/tin-tuc-su-kien/cac-phuong-phap-

chan-doan-truoc-sinh.html.

88. Viện huyết học - Truyền máu Trung Ương Xét nghiệm ối loại trừ bệnh máu khó

đông Hemophilia, truy cập ngày 13/8-2019, tại trang web

https://www.nihbt.org.vn/hemophilia/xet-nghiem-oi-loai-tru-benh-mau-kho-dong-

hemophilia/p205i15521.html.

78

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

PHỤ LỤC

F8Int21 116-128

DXS1073 152-172

F8Int13.2 309-321

REN90682 129-143

HEMA154130.5 179-215

F8Int25.2 175-181

173 174 175 176 177 179 180 181 211

2 3 10 2 33 45 2 1 1

308 309 310 311 312 313 314 315 316 317

126 127 128 129 130 132 134 135 136 138

6 22 7 35 4 19 1 2 1 2

13 3 35 5 6 6 21 2 2 2

HEMA154498.9 235-267 Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất 114 117 119 120 121 122 123 124 125 126 127

5 1 1 13 9 15 3 40 5 3 1

151 153 154 155 156 158 159 160 162 164 166 167 168 169 171

2 2 13 1 35 26 1 7 1 1 2 1 4 2 2

210 236 237 238 239 240 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266

1 17 1 26 8 5 1 3 3 12 2 9 1 5 1 2 1 1

166 168 190 191 192 193 194 195 196 197 198 200 208 209 210 211 212 213 217

1 1 1 1 3 2 16 6 25 9 1 1 11 1 11 5 2 1 1

Tần số allele của bộ STR trên 50 mẫu không mang gen bệnh (1):

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

F8Int22 207-217

THLMEInt2 234-256

F8Int1 188-198

stSG604486 226-238

REN90833 251-275

THLMEInt1.1 289-319

194 195 196 197 198 201

2 40 3 34 9 4 2

Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele 297 15 206 298 208 2 301 45 209 302 5 210 303 26 211 305 212 1 306 213 310 315

Tần suất 1 3 24 16 1 11 17 5 1

232 233 234 235 236 237 239 240 241 245

2 9 6 36 5 9 20 2 8 1

256 260 261 264 267 268 271 272 276 279

1 38 5 2 3 6 15 1 1 1

247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 260 261

2 1 12 8 23 13 12 6 11 1 2 1

Tần số allele của bộ STR trên 50 mẫu không mang gen bệnh (2):

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

F8Int21 116-128

DXS1073 152-172

F8Int13.2 309-321

HEMA154130.5 179-215

REN90682 129-143

F8Int25.2 175-181

161 174 175 176 177 178 179 180 191

1 13 25 32 7 36 27 62 3

HEMA154498.9 235-267 Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất 119 120 121 122 123 124 125 126 127 133

5 25 50 1 9 34 77 1 2 2

304 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 319

1 4 1 11 22 21 45 54 8 28 2 4 1

121 123 124 125 126 127 128 129 130 131 133 134 135 136 139

1 1 1 3 1 21 17 63 3 6 16 15 34 1 23

142 144 151 152 153 155 156 157 158 159 160 161 163 165 166 167 168 169 170 171 178

1 2 2 1 1 14 46 8 34 44 1 15 2 5 1 3 4 14 3 4 1

189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 203 204 206 207 208 209 210 211 212 214 215

1 1 2 5 9 6 13 22 49 9 1 1 1 5 13 4 31 10 14 4 3 1 1

232 234 235 236 237 238 241 246 250 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 265 267 273

1 28 11 57 7 1 1 1 1 1 3 7 6 12 7 16 16 6 13 1 6 2 1 1

Tần số allele của bộ STR trên 103 mẫu mang gen bệnh (1):

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

F8Int22 207-217

THLMEInt2 234-256

F8Int1 188-198

stSG604486 226-238

REN90833 251-275

THLMEInt1.1 289-319

Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất 196 207 208 209 210 211 212 220

1 34 47 43 68 3 9 1

231 232 233 234 235 236 237 238 239 240

18 31 42 7 23 22 29 4 11 7

252 257 258 261 262 265 266 269 270 273 274

1 79 41 3 3 7 5 24 34 4 5

1 3 6 48 64 52 23 2 1 2 1 1 2

192 193 195 196 197 198 199 200 201 202 205 207 208

297 298 299 301 302 303 305 306 307 308 309 310 311 312

2 1 1 23 23 56 16 17 45 0 6 3 12 1

237 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 257 258

1 1 2 3 1 29 26 58 8 21 6 21 1 1 16 5

Tần số allele của bộ STR trên 103 mẫu mang gen bệnh (2):

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

F8Int21

DXS1073

HEMA154130.5

HEMA154498.9

F8Int13.2

REN90682

F8Int25.2

116-128

152-172

309-321

179-215

129-143

175-181

235-267 Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất

1 2 16 35 34 40 36 74 64 1 3

161 173 174 175 176 177 178 179 180 181 191

114 117 119 120 121 122 123 124 125 126 127 133

5 1 6 38 60 16 12 76 83 4 3 2

1 4 7 34 29 56 49 73 9 30 3 6 1

304 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 319

1 1 6 3 14 24 52 68 9 6 6 16 36 36 3 2 23

121 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 138 139 HEMA154498.9 235-267

HEMA154130.5 179-215

Allele Tần suất Allele Tần suất 214 215 217

1 1 1

265 266 267 273

3 1 1 1

142 144 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 178

1 2 4 1 3 12 17 80 8 60 45 8 15 1 2 1 5 3 4 8 16 3 6 1

168 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213

1 1 2 3 8 11 22 19 47 58 10 1 2 1 5 0 13 4 42 11 27 9 5 1

232 234 235 236 237 238 239 240 241 246 250 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264

1 28 11 74 8 28 9 5 1 1 1 1 3 7 7 15 10 28 18 15 14 6 7 2

Tần số allele của bộ STR trên tổng 153 mẫu (1):

Nguyễn Kim Ngân – K26 CH

F8Int22 207-217

THLMEInt2 234-256

F8Int1 188-198

stSG604486 226-238

REN90833 251-275

THLMEInt1.1 289-319

Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất Allele Tần suất 196 206 207 208 209 210 211 212 213 220

1 2 34 89 46 104 14 13 2 1

231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 245 257

18 33 51 13 59 27 38 4 31 9 8 1 2

192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 205 207 208

3 3 15 8 96 69 79 23 2 2 2 1 1 2

297 298 299 301 302 303 305 306 307 309 310 311 312 315

3 4 1 58 44 58 30 35 45 6 8 12 1 1

252 256 257 258 260 261 262 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 276 279

1 1 79 41 58 11 3 2 7 5 4 7 24 34 16 1 4 5 2 1

233 234 235 236 237 239 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 260 261

2 5 1 2 4 1 1 2 3 1 31 27 70 16 44 19 33 7 12 1 16 5 2 1

Tần số allele của bộ STR trên tổng 153 mẫu (2):