Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột bởi Mucoraceae trong sản xuất rượu truyền thống Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ THỊ QUYÊN

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TINH BỘT

BỞI MUCORACEAE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU

TRUYỀN THỐNG VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ THỊ QUYÊN

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TINH BỘT

BỞI MUCORACEAE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU

TRUYỀN THỐNG VIỆT NAM

Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học

Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Vũ Nguyên Thành

PGS.TS Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN

Luận văn Thạc sĩ này được em thực hiện tại Trung tâm Vi sinh vật Công

nghiệp – Viện Công nghiệp thực phẩm, để có được những kết quả này em xin chân

thành cảm ơn Thầy PGS.TS Vũ Nguyên Thành và Cô PGS.TS Bùi Thị Việt Hà -

những người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều kiện giúp em

thực hiện luận văn.

Để có được nền tảng kiến thức khoa học tốt, phục vụ trong nghiên cứu này em

xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự

nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn tận tình truyền đạt kiến thức, chỉ bảo cho em

trong suốt thời gian sinh viên và học viên cao học. Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm

ơn tới các anh chị cán bộ tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp - Viện Công nghiệp

Thực phẩm đã luôn giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệp, hỗ trợ kỹ thuật trong suốt thời gian

qua.

Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân và

bạn bè, những người luôn động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để em yên tâm

học tập và nghiên cứu khoa học.

Hà Nội, ngày 11 tháng 12 năm 2019

Học viên

Lê Thị Quyên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... v

DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ..................................................... vi

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 3

1.1. Giới thiệu về rượu truyền thống ........................................................................... 3

1.1.1. Men rượu ........................................................................................................... 3

1.1.2. Các giai đoạn lên men rượu .............................................................................. 5

1.2 Giới thiệu về họ Mucoraceae ................................................................................ 9

1.3. Tình hình nghiên cứu về rượu truyền thống Việt Nam ...................................... 11

1.4. Giới thiệu về sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS) ............................................ 12

1.5. Ứng dụng phương pháp HS-SPME GCMS trong phân tích các hợp chất tạo

hương của đồ uống .................................................................................................... 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 16

2.1. Đối tượng ........................................................................................................... 16

2.2. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc ........................................................ 16

2.2.1. Hóa chất .......................................................................................................... 16

2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc ................................................................ 17

2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 17

2.3.1. Phương pháp phân lập .................................................................................... 17

2.3.2. Làm sạch và giữ giống .................................................................................... 17

2.3.3. Chụp ảnh hình thái khuẩn lạc, tế bào ............................................................. 18

2.3.4. Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm mốc, nấm men, giả men ............... 18

2.3.5. Phương pháp tinh chế DNA ............................................................................ 18

2.3.6. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting ................................... 19

2.3.7. Phương pháp điện di ....................................................................................... 20

2.3.8. Nhuộm gel và đọc kết quả ............................................................................... 20

2.3.9. Phương pháp phân loại nấm dựa vào đọc trình tự rDNA .............................. 20

2.3.10. Phân tích hoạt lực enzyme amylase từ các chủng mốc ................................. 21

2.3.11 Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của các chủng mốc đại diện ........................... 23

2.3.12. Kiểm tra sự thủy phân tinh bột của một số nhóm mốc khi có đường ............ 23

2.3.13. Lên men rượu từ các chủng mốc và men thuần chọn lọc.............................. 24

2.3.14. Đo độ cồn bằng sôi kế ................................................................................... 25

2.3.15. Phân tích phổ hương của các mẫu rượu gạo chưng cất bằng máy sắc ký khí

kết nối khối phổ GCMS. ............................................................................................ 26

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 28

3.1. Kết quả phân lập vi nấm từ 15 bánh men........................................................... 28

3.2. Kết quả hình thái khuẩn lạc, tế bào. ................................................................... 28

3.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật PCR-fingerprinting và định danh chủng nấm đại diện

dựa vào phân tích trình tự rDNA .............................................................................. 34

3.4. Phân tích hoạt lực enzyme amylase bằng DNS ................................................. 39

3.5. Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của các chủng mốc đại diện ................................ 43

3.6. Kết quả sự thủy phân tinh bột của một số nhóm mốc khi có đường.................. 45

3.7. Kết quả lên men rượu từ các chủng nấm mốc và nấm men thuần. .................... 47

3.8.Phân nhóm mẫu rượu dựa trên kết quả các hợp chất bay hơi trong các mẫu rượu

thu thập và các mẫu sử dụng chủng thuần. ............................................................... 49

KẾT LUẬN .............................................................................................................. 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 55

iii

PHỤ LỤC ................................................................................................................. 59

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các loại giống khởi động để lên men đồ uống có cồn ở Châu Á ................. 4

Bảng 2.1. Tỷ lệ bổ sung giống ở mỗi mẫu lên men ............................................................ 25

Bảng 3.1. Kết quả phân nhóm các chủng bằng fingerprinting và đọc trình tự các chủng

đại diện ...................................................................................................................... 36

Bảng 3.2. Hoạt lực enzyme amylase của các chủng mốc thuần ............................... 39

Bảng 3.3. Kích cỡ khuẩn lạc trên môi trường tinh bột 1% ở các nhiệt độ ................ 44

Bảng 3.4. Kết quả đo độ cồn của dịch lên men rượu từ các chủng thuần và 15 mẫu

bánh men ................................................................................................................... 47

Bảng 3.5. Các nhóm hợp chất xuất hiện trong các mẫu rượu ................................... 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Một quy trình truyền thống làm men rượu ở Việt Nam .............................. 5

Hình 1.2. Quá trình thủy phân tinh bột bởi các enzyme amylase ............................... 6

Hình 1.3. Sơ đồ tóm tắt quy trình lên men rượu ......................................................... 9

Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo của GC-MS .......................................................................... 13

Hình 1.5. Sơ đồ tách chiết hợp chất bay hơi bằng HS-SPME GCMS ...................... 14

Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các nhóm nấm đại diện ....................... 32

Hình 3.2. Phổ băng DNA fingerprinting ................................................................... 35

Hình 3.3. Hoạt lực enzyme amylase của các chủng nấm mốc (IU/ml)..................... 42

Hình 3.4. Đường kính khuẩn lạc nấm mốc trên môi trường tinh bột 1% ở các nhiệt độ...............................................................................................................................45 Hình 3.5. Kết quả thủy phân tinh bột trong môi trường có đường của các chủng mốc............................................................................................................................46 Hình 3.6. Các nhóm rượu khác nhau từ 32 mẫu rượu………………………..…….51

DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

°C: độ celsius

CNTP: Công nghiệp Thực phẩm

dNTP: deoxyribonucleotide triphosphate.

h: hour (giờ)

ITS: Internal transcribed spacer

PCR: Polymerase chain reaction

rDNA: ribosomal DNA

rpm: round per minute (vòng/phút)

TTVSVCN: Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp

HS-SPME GCMS: headspace-solid phase microextraction gas chromatography

mass spectrometer

MỞ ĐẦU

Rượu truyền thống là loại đồ uống có cồn, xuất hiện từ rất lâu đời và được sử

dùng rộng rãi trong nhân dân. Chúng thường được sản xuất theo quy mô hộ gia đình

và có hương vị đa dạng của từng vùng miền như rượu Làng Vân (tỉnh Bắc Giang), rượu

Kim Sơn (tỉnh Ninh Bình), rượu Bàu Đá (tỉnh Bình Định). Để tạo nên sự khác biệt đó

có nhiều yếu tố như nguyên liệu, cách thức nấu, và đặc biệt là sự biến đổi của hệ vi

sinh vật trong bánh men. Việc sử dụng bánh men với phức hệ vi sinh quá đa dạng

thường gây khó khăn trong quá trình kiểm soát chất lượng sản phẩm rượu, vì vậy việc

nghiên cứu sâu về chủng giống sẽ rất cần thiết. Các loại rượu trên thế giới đều cho thấy

loài Saccharomyces cerevisiae đóng vai trò chủ đạo trong lên men rượu, tuy nhiên nấm

mốc thì khác biệt hơn, với mỗi loại rượu thì loài nấm mốc là khác nhau như khi nói tới

rượu Sake của Nhật Bản thì đều biết đến loài Aspergillus oryzae, khi nhắc tới rượu

Hong Qu ở Trung Quốc thì đều biết đến loài Monascus purpureus, thế nhưng ở Việt

Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào chỉ ra loài nấm mốc nào đóng vai trò chủ đạo trong

lên men rượu truyền thống Việt Nam.

Trong lên men rượu truyền thống Việt Nam hầu hết các nhóm chủng được tìm

thấy thuộc họ Mucoraceae có khả năng thủy phân cơ chất giàu tinh bột thành đường

nhưng chưa được nghiên cứu kỹ về đặc tính liên quan tới đường hóa. Các nghiên cứu

trước đây liên quan tới men rượu thì chủ yếu về tính đa dạng vi sinh vật của bánh men

và lựa chọn các chủng nấm mốc có hoạt lực enzyme cao, chủng nấm men có khả năng

lên men rượu tốt để làm bánh men. Vì vậy, luận văn này được thực hiện nhằm đánh

giá đặc tính thủy phân tinh bột của các chủng nấm mốc thuộc họ Mucoraceae phân lập

từ bánh men rượu từ đó biết được chủng nào đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn

đường hóa và bước đầu thử nghiệm sử dụng chủng mốc thuần kết hợp với chủng nấm

men thuần làm giống khởi động nhằm mục đích so sánh phổ hương rượu với các dòng

rượu truyền thống để từ đó biết được loài nấm mốc nào đóng vai trò quan trọng trong

lên men rượu truyền thống Việt Nam. Việc sử dụng chủng thuần cũng như phương

pháp phân tích sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS) để nghiên cứu hương rượu cũng là

những tính mới của luận văn.

Để thực hiện mục tiêu đề tài đã nêu, các nội dung chính sau đã được thực hiện:

- Phân lập vi nấm từ men rượu truyền thống Việt Nam

- Phân nhóm vi nấm bằng PCR-fingerprinting và định tên chủng đại diện bằng

giải trình tự rDNA

- Đánh giá hoạt tính amylase của nấm mốc thuộc họ Mucoraceae

- Đánh giá khả năng thủy phân tinh bột các chủng mốc thuộc họ Mucoraceae

trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau.

- Đánh giá khả năng thủy phân tinh bột của Mucoraceae trong môi trường

đường.

- Thử nghiệm sử dụng chủng thuần khiết làm giống khởi động, phân tích các

hợp chất bay hơi của dịch chưng cất sau lên men và so sánh với các sản phẩm rượu

truyền thống khác.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về rượu truyền thống

Đồ uống có cồn như bia, rượu là những sản phẩm lên men phổ biến và đóng

vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần và văn hóa của con người. Ở Việt Nam,

rượu gạo đã có từ rất lâu đời, cho đến nay nó vẫn là thức uống phổ biến và chiếm 80%

trong tổng số các loại đồ uống có cồn. Tùy thuộc vào từng địa phương mà thành phần

và quy trình sản xuất rượu có sự khác nhau, do đó rượu được sản xuất có tên địa phương

khác nhau. như rượu Làng Vân (tỉnh Bắc Giang), rượu Kim Sơn (tỉnh Ninh Bình), rượu

Kiên Lao (tỉnh Nam Định), rượu Bàu Đá (tỉnh Bình Định), rượu Gò Đen (tỉnh Long

An). Tuy nhiên, phương thức sản xuất chung đều dựa vào quá trình biến đổi hóa sinh

của hệ vi sinh vật trong men rượu [8].

1.1.1. Men rượu

Việc chuẩn bị và sử dụng men rượu như là nguồn cung cấp vi sinh vật trong

sản xuất rượu gạo là rất quan trọng. Thông thường, giống khởi động cho lên men

rượu gồm 3 thành phần vi sinh cơ bản là: nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Trong đó,

nhóm nấm mốc chủ yếu sinh enzyme amylase để đường hóa tinh bột thành các phân

tử đường khử như glucose, maltose, hay n-dextrin dài hơn. Sau đó, lượng đường này

được nấm men chuyển hóa thành ethanol vì vậy chất lượng của các sản phẩm cuối

cùng phụ thuộc chủ yếu vào hoạt động của các vi sinh vật này. Một trong những cách

tiếp cận để cải thiện sản xuất rượu là thiết lập các điều kiện tối ưu cho quá trình đường

hóa và lên men đồng thời với nuôi cấy hỗn hợp vi sinh vật sinh enzyme thủy phân

tinh bột và lên men ethanol [8].

Như được liệt kê trong Bảng 1.1, các loài mốc chính trong các loại giống khởi

động truyền thống ở Châu Á là Rhizopus spp. và Mucor spp. Nhóm nấm men phổ

biến là Saccharomyces cerevisiae, Hansenula spp., và Candida spp., còn loài giả nấm

men phổ biến là Saccharomycopsis fibuligera.

Bảng 1. 1. Các loại giống khởi động để lên men đồ uống có cồn ở Châu Á

Sản

phẩm

Đất nước

Mốc và men

Bakhar

Ấn Độ

Mucor spp., Rhizopus spp., Saccharomyces cerevisiae

Mucor spp., Rhizopus spp.,, Candida spp.,

Bubud

Philippines

Saccharomycopsis fibuligera, Saccharomyces cerevisiae,

Torulopsis spp.

Aspergillus oryzae, Rhizopus spp., Saccharomyces

Chu

Trung Quốc

cerevisiae

Look-

Mucor spp., Chlamydomucor oryzae, Candida spp.,

Thái Lan

pang

Saccharomyces cerevisiae

Men

Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp.,

Việt Nam

rượu

Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycopsis fibuligera

Rhizopus spp., Mucor spp., Saccharomyces cerevisiae,

Murcha

Nepal

Saccharomycopsis fibuligera.

Aspergillus oryzae, Rhizopus spp., A.niger, Penicillium

Nurock

Hàn Quốc

spp., Mucor spp., Hansenula anomala, Pichia anomala,

Saccharom yces cerevisiae

Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Penicillium

spp., Candida spp., Saccharom yces cerevisiae,

Ragi

Indonesia

Saccharomycopsis fibuligera , Hansenula spp.,

Rhodotorula spp.

Tapai

Malaysia

Rhizopus spp., Saccharomycopsis fibuligera

Các thành phần để làm viên men thường là bột gạo, bột sắn hoặc kết hợp cả

bột gạo và bột sắn- Các loại bột đó có thể được trộn với một số loại thảo mộc, những

thành phần bổ sung này được cho là có vai trò trong việc ức chế sự sinh trưởng của

các vi sinh vật tạp nhiễm. Tỷ lệ giữa bột nghiền với các loại thảo mộc thường là 14:1

theo khối lượng. Sau đó, nước được thêm vào để tạo độ ẩm tương đối cho khối bột là

55-60%, và trộn đều với bột men từ những mẻ trước. Những viên men được nặn hình

tròn với đường kính 4 cm, dày 1 cm. Các khay bánh men được ủ trong điều kiện nhiệt

độ phòng 28-32 ºC trong 2-5 ngày và được hong khô bởi gió hoặc ánh sáng mặt trời

Bột men

Bột thuốc bắc

Nước

Bột gạo

Khối bột với 50-60% hàm ẩm

Nặn viên men tròn

ủ 2-5 ngày

[8].

Hong khô

Hình 1. 1. Một quy trình truyền thống làm men rượu ở Việt Nam

1.1.2. Các giai đoạn lên men rượu

Có 2 giai đoạn chính trong lên men sản xuất rượu đó là: Giai đoạn đường hóa

và giai đoạn lên men rượu

1.1.2.1. Giai đoạn 1- Giai đoạn đường hóa

Gạo sau khi được nấu chín sẽ được tãi ra khay, vải sạch để nguội đến nhiệt độ

30-35°C thì rắc bột bánh men vào với tỉ lệ bột bánh men so với gạo là 1-5% theo khối

lượng. Trộn đều bột bánh men và ủ khoảng 3 ngày để vi sinh vật sinh amylase thủy

phân tinh bột thành đường trong điều kiện hiếu khí [8].

1.1.2.1.1. Đặc điểm của enzyme amylase

Amylase có thể được tổng hợp từ một số loại nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và

xạ khuẩn; Tuy nhiên, nấm mốc được biết đến nhiều nhất vì tính phổ biến và ổn định

của enzyme này. Có 3 loại amylase là α-amylases, β-amylases và γ-amylase, (α-

glucosidase) mỗi loại cắt các vị trí khác nhau. Hình 1.2. minh họa vị trí thủy phân

liên kết của 3 loại enzyme này.

Hình 1. 2. Quá trình thủy phân tinh bột bởi các enzyme amylase

a. α- amylase

α-amylases có khả năng cắt liên kết α,1-4 glycoside ở phía trong của mạch

amylose và amylopectin. Enzyme này được tìm thấy ở rất nhiều loài vi sinh vật, nó

cắt ở các vị trí ngẫu nhiên dọc chuỗi tinh bột, cuối cùng tạo ra glucose, maltose, n-

dextrin. α-amylases có xu hướng hoạt động nhanh hơn β-amylase bởi nó có thể thủy

phân nhiều vị trí của cơ chất. Loại enzyme này được tìm thấy nấm Ascomycetes và

Basidiomycetes, vi khuẩn Bacillus, nước bọt và tuyến tụy ở người [22].

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylases là quá trình đa giai đoạn:

Giai đoạn 1 (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân

tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột

giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh) [2].

Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp ở giai đoạn 1 bị

thủy phân tiếp tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị

thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác

dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7

gốc glucose [2].

Giai đoạn 3: Các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch

polyglucose ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose

và glucose. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành

maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-

amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu

với Iodine. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì

vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch

hóa.[2]

b. β-amylase

β-amylase hay exoamylase có khả năng cắt liên kết α,1-4 glycoside và α,1-6

glycoside. Chúng thủy phân glucose ở phía ngoài của mạch amylose và amylopectin [23].

β-amylase là một enzyme ngoại bào. Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không

khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất. β-amylase phân cắt các liên kết α-1,4glucoside

nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6 glucoside thì nó sẽ

ngừng tác dụng. Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều

liên kết α-1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin [2].

c. γ-amylase

γ-amylase cắt liên kết α(1-6) và α(1-4) glycoside ở đầu không khử của amylose

và amylopectin, tạo ra glucose. Đa số Enzyme này có hoạt lực cao nhất ở vùng PH

3,5-5,5 và nhiệt độ 50ºC. Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong

rượu, aceton [22].

1.1.1.2.2. Đặc điểm của vi nấm trong giai đoạn đường hóa

Quá trình đường hóa tinh bột sẽ cho ra maltose, glucose để sản xuất ethanol

có nguồn gốc từ các quá trình lên men. Thủy phân tinh bột bằng phương pháp enzyme

có nhiều ưu điểm so với phương pháp hóa học, như hoạt động trong điều kiện pH và

nhiệt độ vừa phải, ngăn ngừa ăn mòn thiết bị và các bước trung hòa tiếp theo. Enzyme

có tính đặc hiệu cơ chất, loại bỏ sự hình thành các sản phẩm phụ không mong muốn

như thường được xuất hiện trong quá trình thủy phân axit [26].

1.1.2.2. Giai đoạn 2- Giai đoạn lên men rượu.

Nhóm nấm men thường phân lập được từ bánh men là Saccharomyces

cerevisiae, Pichia anomala, Candida tropicalis trong đó Saccharomyces cerevisiae

được cho là đóng vai trò chính, phát triển trong điều kiện ít oxy, lên men chuyển hóa

đường thành ethanol. Ethanol là sản phẩm chính ở giai đoạn này, khi nồng độ cao

trong dịch lên men sẽ ức chế màng sinh chất, thay đổi tính bán thấm tế bào nấm men

và các vi sinh vật khác. Thực tế sản xuất cho thấy giai đoạn ủ cho lên men phụ thuộc

vào thời tiết, vào những ngày nóng, giai đoạn ủ thường ngắn. Ví dụ như ở vùng Đồng

bằng Sông Cửu Long ở miền Nam Việt Nam, nhiệt độ trung bình 30-33ºC, thời gian

ủ cho giai đoạn 1 là 2-3 ngày, giai đoạn 2 là 3-4 ngày [8].

+ Lên men rắn là phương pháp thường được sử dụng ở các vùng núi cao.

Nguyên liệu cho sản xuất rượu ở những vùng này thường là ngô và sắn. Ngô và sắn

sau quá trình đường hóa trở nên ngọt và mềm, sau đó được thêm nước. Quá trình lên

men diễn ra trong 5-7 ngày và sau đó đem đi chưng cất [3].

+ Lên men lỏng thường được sử dụng ở các làng nghề dưới đồng bằng. Gạo,

sau quá trình đường hóa trở nên mền ngọt và được bổ sung nước theo tỉ lệ 1:1. Lên

men tiếp trong 3-5 ngày. Vào mùa hè nhiệt độ cao thì thời gian lên men thường ngắn

hơn mùa đông [3].

Sản phẩm sau lên men rượu gạo.

Đối với rượu không chưng cất, dịch lên men sau khi kết thúc giai đoạn 2 sẽ

được lọc lấy dịch trong chứa glucose, ethanol, và các chất hòa tan khác, với những

loại rượu không chưng cất độ cồn chỉ khoảng 7-10% (v/v), và rượu sẽ không bảo

quản được lâu. Để giải quyết vấn đề này, người sản xuất sẽ tăng hàm lượng cồn bằng

cách hoặc bổ sung đường vào sau giai đoạn 1 hoặc bổ sung cồn vào sau giai đoạn 2,

như vậy vừa đáp ứng được nhu cầu khách hang vừa kéo dài tuổi thọ cho sản phẩm

[3].

Đối với rượu chưng cất, sử dụng thiết bị chưng cất có nguyên lý hoạt động

như hình dưới, gồm 3 phần cơ bản là: khoang đun, hệ thống làm mát, và khoang chứa

rượu chưng cất. Thông thường, mẫu rượu đầu có nồng độ cồn cao có thể lên đến 65%

(v/v) sau giai đoạn chưng cất đầu tiên, và khoảng 25-30% (v/v) cho mẫu rượu sau

[3].

Hình 1. 3. Sơ đồ tóm tắt quy trình lên men rượu

1.2 Giới thiệu về họ Mucoraceae

Họ Mucoraceae là họ nấm thuộc bộ Mucorales, đặc trưng bởi hệ sợi không

vách ngăn. Một số chi có thể kể đến bao gồm Absidia, Apophysomyces, Mucor,

Rhizomucor, và Rhizopus.Theo ước tính năm 2008, họ này bao gồm 25 chi và 129

loài [15]. Sau đây là một số loài thuộc chi Rhizopus và Mucor thường xuất hiện ở

bánh men rượu.

a. Rhizopus oryzae

Rhizopus oryzae là thành viên của chi Rhizopus, thuộc họ Mucoraceae. Hệ thống

phân loại Rhizopus oryzae không đơn giản. Những nghiên cứu gần đây về Mucorales

dựa trên trình tự ITS đã đưa ra các tên loài đồng nghĩa sau: Amylomyces rouxii,

Rhizopus achlamydosporus, R. arrhizus, R. boreas, R. delemar, R. chiuniang, R.

javanicus, R. oryzae, R. maydis, R. niveus, R. peka, R. tonkinensis [26]. Mặc dù nhiều

chủng nấm mốc trong bánh men đều có khả năng thủy phân tinh bột gạo nhưng

Rhizopus oryzae (hay Amylomyces rouxii được biết đến là chủng điển hình nhất, được

mô tả đầu tiên bởi Calmette năm 1982). Ông coi chủng này đóng vai trò quan trọng

trong quá trình thủy phân tinh bột gạo. Khi sử dụng nấm mốc thuần chủng này và nấm

men thương phẩm ông có thể thu 340 g cồn đặc từ 1000 g gạo thay vì 180 g khi sử

dụng bánh men. Ngoài ra, nấm này cũng được sử dụng trong nghiên cứu tạo bánh men

để sản xuất rượu gạo từ gạo nếp cẩm [1]. Bên cạnh đó, R. oryzae cũng là loài phổ biến

và chiếm ưu thế được phát hiện ở Yao Qu, và ở một số Hồng Qu. Nó cũng được tìm

thấy ở một số giống khởi động khác với khả năng sinh amylase mạnh, đóng góp lớn

cho sản xuất rượu [23]. Nghiên cứu trước còn chỉ ra rằng R. oryzae cũng có thể tạo ra

các hợp chất dễ bay hơi trong quá trình lên men, chẳng hạn như ethanol, 2-methyl-1-

butanol và 3- methyl-1-butanol [4].

b. Rhizopus microsporus

Rhizopus microsporus là nhóm nấm thuộc chi Rhizopus, họ Mucoraceae phổ

biến thứ hai khi phân lập từ bánh men [6]. Các enzyme thủy phân từ các loài Rhizopus

hoạt động tối ưu trong điều kiện pH 4.0-5.5. Nhóm Rhizopus microsporus có khả

năng chịu nhiệt độ cao, chủng Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis có thể sinh

trưởng ở 50°C và sinh amylase tối ưu ở 45°C [7]. Rhizopus microsporus var.

chinensis CICIM-CU F0088 cũng cho thấy khả năng phát triển ở 40°C, và tiết ra các

amylase ở nhiệt độ cao hơn Rhizopus oryzae [17].

Các chủng R. microsporus có thể sinh độc tố rhizoxins, nhưng bản thân nó

không tạo ra mà được tạo bởi vi khuẩn Burkholderia chúng sống bên trong tế bào

nấm. Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn này đã từng được tìm thấy ở chủng

Rhizopus microsporus CBS 111563, được phân lập từ sufu. Một lượng đáng kể

rhizoxins được phát hiện trong sản phẩm cuối cùng [7]. Tuy nhiên vẫn chưa biết rõ

rằng Rhizopus microsporus từ bánh men có độc tố không.

c. Mucor indicus

Các chủng Mucor indicus thuộc nhóm này thường khuẩn lạc có màu vàng đậm

đặc trưng, có nhiệt độ tăng trưởng tối đa 42ºC. Bào tử có màu vàng nhạt, sợi liên tục

phân nhánh, với các nhánh dài. Túi bào tử có màu vàng đến nâu, đường kính lên tới

75 µm, với các màng khác nhau. Cuống gần hình cầu, cao tới 40 µm. Bào tử có vách

trơn, gần cầu tới elip, và có đường kính 4-5 µm. Có nhiều Chlamydospores, đặc biệt

là trong ánh sáng. Bào tử tiếp hợp zygospores có màu đen, hình cầu, có đường kính

lên tới 100 µm [14].

M. indicus có khả năng sinh ethanol từ nhiều nguồn đường khác nhau như

glucose, mannose, fructose, hay galactose. Chúng cũng có khả năng lên men xylose

thành ethanol nhưng chỉ trong điều kiện hiếu khí hoặc vi hiếu khí. Sản lượng ethanol

sau lên men từ xylose xấp xỉ lượng ethanol do Pichia stipites lên men (Pichia stipites

được biết đến là loài sản xuất ethanol tốt nhất từ xylose). Tuy nhiên, nhiều chủng nấm

này không có khả năng lên men đường sucrose, vì vậy M. indicus không thể thay thế

S. cerevisiae để lên men ethanol từ cơ chất chứa sucrose [14].

M. indicus là loài nấm mốc lên men ethanol khá hiệu quả và có thể sinh ra

ethanol 5% khi sinh trưởng trong môi trường chứa glucose. Bên cạnh đó, một nghiên

cứu khác chỉ ra rằng hoạt lực amylase của M. indicus dường như rất thấp hoặc không

có khi sinh trưởng trong môi trường gạo [14].

d. Mucor circinelloides

Trong số nấm thuộc chi Mucor tìm thấy trong bánh men, Mucor circinelloides

là loài cũng khá phổ biến. Tuy nhiên khả năng thủy phân tinh bột của chúng kém

[12]. Chúng là loài dị hình giới tính và có thể phát triển giống nấm mốc và nấm men.

Bên cạnh khả năng thủy phân tinh bột, chúng còn có khả năng thủy phân cellulose

[14].

1.3. Tình hình nghiên cứu về rượu truyền thống Việt Nam

Các nghiên cứu về lên men rượu truyền thống của Việt Nam có thể được phân

loại thành hai nhóm chính: (i) tính đa dạng vi sinh vật của bánh men và (ii) lựa chọn

các chủng nấm mốc có hoạt lực enzyme cao, chủng nấm men có khả năng lên men

rượu tốt để làm bánh men, cải tiến quy trình [25].

Hệ vi sinh của bánh men đã được nghiên cứu khá rõ, mỗi gam bánh men chứa

103-106 CFU mốc, 103-107 CFU men, và 103-106 CFU vi khuẩn lactic. Bánh men chứa

hệ vi sinh vật tương đối ổn định, bao gồm các loài mốc Rhizopus microsporus, Mucor

indicus, Mucor circinelloides, loài giả men Saccharomycopsis ﬁbuligera, loài nấm

men Hyphopichia burtonii, Saccharomyces cerevisiae, Issatchenkia orientalis,

Pichia anomala, Candida tropicalis, Pichia ranongensis, Clavispora lusitaniae,

Pediococcus pentosaceus, và các loài vi khuẩn Lactbacillus plantarum, Lactobacillus

brevis, Weissella confusa, Weissella paramesenteroides. Nó được kết luận rằng hệ vi

sinh trong bánh men tương tự như ragi và các dạng men Châu Á khác. Tuy nhiên, để

có một cái nhìn rõ hơn về đặc tính thủy phân tinh bột của các nhóm chủng vi nấm

xuất hiện phổ biến trong bánh men rượu Việt Nam thì vẫn chưa có nghiên cứu nào

được thực hiện trước đó.

Bên cạnh đó, khi đã chọn các chủng nấm tốt để tạo men rượu cải tiến từ chủng

thuần thì rượu sau khi chưng cất chỉ được đánh giá bằng cảm quan mà ít có phân tích

phổ hương rõ bằng sắc kí khí [9] nên nghiên cứu này sẽ phân tích các hợp chất bay

hơi trong các mẫu rượu sử dụng chủng thuần và so sánh với các sản phẩm rượu truyền

gạo truyền thống.

1.4. Phân tích hợp chất bay hơi

1.4.1. Giới thiệu về sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS)

Sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS) gồm 2 phần chính là GC và MS, trong đó

GC (Gas Chromatography) là loại sắc kí có pha động là khí mang, thường là các khí

trơ như heli, nitơ hay hydro, còn pha tĩnh là một lớp dịch mỏng hoặc polymer bên

trong cột. Mẫu được chạy qua cột bởi dòng khí mang. Các thành phần của mẫu được

tách nhau ra khi đi qua cột dưới một chu trình nhiệt độ từ thấp tới cao. Còn MS (Mass

Spectrometer) là detector khối phổ cho GC, các chất khí sau khi đi qua cột sẽ sang

MS và bị bắn phá thành các mảnh có khối lượng khác nhau, mỗi chất khí có một danh

sách các mảnh khác nhau, dựa vào thông tin khối lượng trên điện tích m/z, sau đó

chất này được so sánh với thư viện phổ để biết tên chất [11].

Sắc kí khí kết nối khối phổ là một phương pháp phân tích kết hợp cả đặc trưng

của sắc kí khí và khối phổ để định tính các hợp chất trong mẫu. GC có thể tách hợp

chất bay hơi và bán bay hơi nhưng không thể định danh chúng. MS có thể cung cấp

thông tin cấu trúc chi tiết cho hầu hết các hợp chất và định danh chúng nhưng MS lại

không tách được chúng khỏi mẫu [16]. Sơ đồ cấu tạo được trình bày ở hình 1.4.

Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo của GC-MS

1.4.2. Ứng dụng phương pháp HS-SPME GCMS trong phân tích các hợp chất

tạo hương của đồ uống

Hương rượu được hình thành bởi nhiều hợp chất dễ bay hơi và nó đặc trưng

cho từng sản phẩm. Thông thường nồng độ các chất này rất thấp và có ngưỡng cảm

giác phát hiện rất thấp (giữa ng/L và µg/L). Để phân tích hương rượu cần cô đặc các

chất bay hơi trước khi thực hiện phân tích sắc ký khí. Một số phương pháp chuẩn bị

mẫu để phân tích đã được biết đến như chưng cất, tách chiết pha lỏng (liquid-liquid

extraction, LLE), tách chiết pha rắn (solid phase extraction, SPE), tách chiết khoảng

trống (dynamic headspace extraction) và vi tách chiết pha rắn-khoảng trống

(headspace-solid phase microextraction, HS-SPME) [28].

HS-SPME GCMS (Headspace-Solid Phase Microextraction Gas

Chromatography Mass Spectrometer) được gọi là phương pháp vi tách chiết pha rắn-

khoảng trống kết hợp với sắc kí khí kết nối với khối phổ trong đó ở bước đầu tiên,

pha tĩnh của sợi fiber sẽ hấp phụ các hợp chất hữu cơ ở không gian đầu phía trên mẫu

chất lỏng. Sau một khoảng thời gian xác định, sợi được kéo vào bên trong kim để bảo

vệ. Tiếp theo, kim được đưa vào injector, và sợi được đẩy ra. Dưới ảnh hưởng của

nhiệt độ cao, các hợp chất được giữ lại trong pha tĩnh được giải hấp rồi nhờ dòng khí

mang định lượng trên cột sắc ký [28].

Ưu điểm của SPME như sau: là thiết bị cầm tay, sử dụng đơn giản, chi phí

tương đối thấp, độ nhạy cao, kích thước nhỏ và loại bỏ dung môi; tính năng quan

trọng nhất là thời gian chuẩn bị mẫu tương đối ngắn trước khi phân tích. Tuy nhiên,

so với các kỹ thuật khác, SPME có nhiều nhược điểm, ví dụ như sự xuống cấp một

phần của pha tĩnh trong quá trình giải hấp nhiệt ở nhiệt độ cao ảnh hưởng tới khả

năng hấp phụ và tuổi thọ sợi fiber.

Hình 1.5. Sơ đồ tách chiết hợp chất bay hơi bằng HS-SPME GCMS

SPME được phát triển vào những năm 1990 bởi Pawliszyn và cộng sự, mỗi

năm có hàng ngàn bài báo khai thác các khía cạnh khác nhau của phương pháp này

và ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau được công bố (phân tích hóa học, phân tích

sinh học, khoa học thực phẩm, khoa học môi trường, khoa học dược và y). Kỹ thuật

chiết mẫu này đã được mô tả là nhanh, đơn giản, không sử dụng dung môi, và phù

hợp cho việc chiết số lượng lớn các hợp chất dễ bay hơi và bán bay hơi từ dung dịch.

Ngoài ra, SPME chỉ cần lượng mẫu nhỏ, kết hợp với sắc ký khí khối phổ (GC/MS)

với độ nhạy cao. Vì những ưu điểm này, nó đã được sử dụng để nghiên cứu hương

của nhiều loại trái cây, rau quả, đồ uống và rượu [28].

Bằng cách sử dụng phương pháp GCMS để đánh giá định tính hoặc định lượng

những khác biệt này, ngoài các kỹ thuật cảm quan, các nhà phân tích có thể thu được

nhiều thông tin về sản phẩm của họ. Các đặc tính cảm quan độc đáo của các sản phẩm

rượu chưng cất thường là do sự khác biệt nhỏ giữa các hợp chất dễ bay hơi [21].

Nghiên cứu trước đây sử dụng phương pháp này để định tính và bán định lượng các

hợp chất bay hơi trong mẫu rượu chưng cất sử dụng bánh men rượu truyền thống

Trung Quốc xác định được 118 hợp chất chủ thuộc 5 nhóm chính là ester (32), alcohol

(22), acid (23), aldehyde (9) và ketone (15) [11]. Các nhóm này cũng xuất hiện ở sản

phẩm makgeolli của Hàn Quốc, ngoài ra còn xuất hiện têm nhóm phenol và terpene

[13]. Đối với sản phẩm rượu của Combodia, phân tích 5 nhóm rượu từ các nhóm bánh

men tương ứng xác định được 25 hợp chất bao gồm ester, alcohol, acid, aldehyde,

and ketone. Trong đó nhóm xuất hiện nhiều nhất là alcohol (chiếm 93% tổng các hợp

chất tạo hương) điển hình như 2-methylbutan-1-ol, 3-methylbutan-1-ol, butane-2,3-

diol, 2-phenylethan-1-ol [18].

Ngoài rượu và các hợp chất tạo hương, đôi khi có khí tạp như khí lưu huỳnh

và có thể dẫn đến mùi hoặc hương vị lạ cho sản phẩm. Bởi vì ngay cả tỷ lệ nhỏ (ppb)

của các hợp chất lưu huỳnh có thể ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Phần lớn các

chất gây ô nhiễm này có mặt trong pha khí, đòi hỏi phải có hệ thống lấy mẫu và phân

tích pha khí. Sắc ký khí (GC) là một công cụ mạnh mẽ trong việc phân tích các sản

phẩm đồ uống có cồn. Các hợp chất tạo hương có xu hướng dễ bay hơi trong tự nhiên,

đáp ứng một trong những yêu cầu chính của GC [21].

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng

Trong nghiên cứu này, 15 mẫu bánh men (ký hiệu từ MQ1-MQ15) từ các tỉnh

Ninh Bình, Tuyên Quang, Thái Bình, Hà Nội, Nam Định, Hà Nam, Hưng Yên, Bắc

Giang đã được thu thập và tiến hành thí nghiệm. Danh sách các mẫu bánh men với

những thông tin cụ thể được trình bày trong phần phụ lục S1.

Ngoài ra, một số chủng nấm đã định danh thuộc bộ sưu tập giống của Viện

Công nghiệp Thực phẩm cũng được sử dụng phục vụ nghiên cứu bao gồm::

Rhizopus oryzae BMM 111, R. oryzae BMM 131, R. oryzae BMM 1015,

Saccharomyces cerevisiae BMQ 467: được dùng làm 3 mẫu rượu từ 1 chủng thuần

mốc với 1 chủng thuần men

Saccharomycopsis fibuligera BMQ 908: bổ sung vào mẫu lên men sử dụng 1

chủng nấm mốc R.oryzae và 1 chủng nấm men S. cerevisiae để so sánh với mẫu không

bổ sung chủng này.

Aspergillus oryzae CNTP 5026 : dùng làm mẫu đối chứng trong thí nghiệm

kiểm tra khả năng thủy phân tinh bột trong môi trường đường.

2.2. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc

2.2.1. Hóa chất

Hóa chất dùng trong nuôi cấy:

Agar (Việt Nam), Malt (Đan Mạch), Glucose, Yeast extract (Ấn Độ), Malt

extract (Ấn Độ), Peptone (Ấn Độ).

Hóa chất dùng cho PCR

Enzyme Taq DNA Polymease Thermo Scientific (Mỹ)

dNTPs Thermo Scientific (Mỹ)

Mồi cho phản ứng PCR Thermo Scientific (Mỹ)

Thang DNA mẫu dùng trong điện di Thermo Scientific (Mỹ)

Agarose dùng trong điện di Biobasic (Tây Ban Nha)

Ethidium Bromide Pharmacia-Biotech (Mỹ)

2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc

Máy móc, thiết bị: bộ điện di ngang, box cấy (Bioblock Scientific, Pháp), cân

điện tử (Precisa, Thụy Điển), kính hiển vi quang học (Eclipse E600-Nikon, Nhật), lò

vi sóng (LG, Hàn Quốc), hệ thống soi và chụp ảnh gel điện di (Syngene), máy đo pH

(Toledo - Anh), máy lắc ổn nhiệt, máy ly tâm cao tốc (Heraeus – Sepatech), máy

PCR, nồi hấp thanh trùng (Himayatoko, Nhật), tủ lạnh giữ giống (Electrolux, Thụy

Điển), tủ nuôi cấy (Sanyo,Nhật), máy phá tế bào (Mini Beadbeater, Biospec

Products), máy đông khô (VirTis Freeze Dryers 2.0)

Dụng cụ: Đĩa Petri, pipette tự động các loại, ống Falcon, ống nghiệm, ống

Eppendorf, ống đong, đèn cồn, bình tam giác (loại từ 20-1000), bình Schott, que

cấy,....

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp phân lập

Sử dụng phương pháp pha loãng mẫu để phân lập nấm mốc, nấm men, giả men

trong bánh men:

Quy trình phân lập như sau:

- Bước 1: Nghiền mịn các mẫu bánh men trong các túi riêng

- Bước 2: Cân 3 gam mẫu bánh men đã nghiền với 27 g dung dịch NaCl 0.9% (đã

hấp) trong ống falcon 50 ml, vortex đều.

- Bước 3: Pha loãng theo hệ số 10 đến nồng độ 10-6

- Bước 4: Sau đó hút 100 µl dịch pha loãng của từng nồng độ chang trên đĩa thạch

Malt 2°Bx rồi nuôi trong điều kiện hiếu khí trong tủ 30°C.

- Bước 5: Từ sau 24 giờ, tiến hành quan sát các khuẩn lạc khác nhau. Chọn lấy

các khuẩn lạc đại diện tiến hành làm sạch và giữ giống.

2.3.2. Làm sạch và giữ giống

Lấy một ít sinh khối cần làm sạch và cấy lên đĩa Petri chứa môi trường Malt

2ºBx, sau đó đem nuôi ở nhiệt độ 30ºC trong 2-3 ngày. Khi thấy nấm đã mọc mà

không thấy xuất hiện khuẩn lạc khác lạ thì lấy một ít sinh khối và cấy giữ giống vào

trong ống nghiệm nút xoáy chứa môi trường Malt 4ºBx. Đem các ống nghiệm nuôi

cấy ở nhiệt độ 30ºC khoảng 2 ngày, sau đó cất giữ trong tủ mát. Trường hợp khuẩn

lạc nào chưa sạch (có khuẩn lạc lạ) thì phải làm sạch lại như cách trên.

Đối với các chủng mốc, sử dụng cách bảo quản cát

Lấy sinh khối mốc thuần cho vào các ống cát sấy khô (kích thước dài 8-10 cm,

đường kính 8mm) với độ dày cát 15 mm, mỗi chủng làm 3-5 ống, đảo đều rồi đưa

vào bình hút ẩm chứa hạt silicagen sấy khô. Đợi 3 đến 5 ngày sau, khi các ống cát

khô tơi, tiến hành nhúng đầu bông vào paraffin nóng chảy để khô rồi bảo quản trong

tủ lạnh 5ºC.

Đối với các chủng nấm men và giả men, sử dụng cách bảo quản lạnh sâu, thành

phần môi trường như sau: peptones 1,5%, yeast extract 0,3%, sodium chloride 0,6%,

glucose 0,1%, glycerol 15%. Dùng pipet Pasteur hút dịch cho vào ống nghiệm đã có

giống lấy hết các tế bào cho vào ông sữa, hàn lại. Hấp các ống nghiệm nút xoáy 2ml,

mỗi ống đựng 3 ống sữa, mỗi chủng làm 6 ống sữa, rồi để vào tủ -80ºC.

2.3.3. Chụp ảnh hình thái khuẩn lạc, tế bào

Các chủng nấm mốc, men và giả men được nuôi cấy trên môi trường Malt

2ºBx ở 30ºC sau 2 ngày lấy ra quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc.

Tiến hành làm tiêu bản và quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi độ phóng đại

40x. Sau đó chụp ảnh lại.

2.3.4. Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm mốc, nấm men, giả men

Tế bào được nuôi cấy trên môi trường Malt 2ºBx sau 2 ngày. Lấy sinh khối tế

bào cho vào Eppendorf vô trùng và thêm 0,75 ml SSC 2x vào mỗi ống. Lắc đều và

đun ở 100ºC trong 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Hút bỏ phần dịch

và tiến hành rửa tế bào 2 lần bằng nước cất vô trùng. Qua mỗi lần rửa ly tâm 13000

vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi. Thêm 100 µl nước cất vô trùng, 100 µl hạt

thủy tinh, 150 µl dung dịch phenol/chlorofom (tỷ lệ 1:1), đặt vào máy phá tế bào

trong 1 phút. Đem ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch trong phía

trên có chứa DNA.

2.3.5. Phương pháp tinh chế DNA

Do DNA của nấm mốc còn chứa nhiều chất ức chế PCR nên trước khi dùng

DNA làm khuôn cho phản ứng PCR, tiến hành tinh chế DNA bằng Silica bead DNA

Gel extraction Kit. Hút 50 µl dịch trong chứa DNA cho vào Eppendorf vô trùng. Bổ

sung 150µl dung dịch Binding buffer có chứa Silica. Đem ly tâm ở 13000 vòng/phút

trong 1 phút. Hút bỏ dịch do DNA đã bám trên bề mặt các hạt thủy tinh. Rửa 3 lần

bằng Washing buffer. Sau đó phơi khô trong box cấy rồi bổ sung 15 µl nước cất vô

trùng dùng cho PCR . Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 1 phút, DNA ở phần dịch nổi

là DNA đã được tinh chế. DNA sau khi tinh chế có thể dùng làm khuôn cho phản ứng

PCR.

2.3.6. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting

Từ các chủng thuần sau khi phân lập, sẽ có nhiều cách khác nhau để phân loại

và định danh loài trong đó phương pháp truyền thống là dựa vào các khóa phân loại

hình thái khuẩn lạc và tế bào, bên cạnh đó các nhà khoa học có thể áp dụng các kỹ

thuật sinh học phân tử để định danh loài một cách chính xác hơn như kỹ thuật PCR-

Fingerprinting.

Phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting: phương pháp fingerprinting là

phương pháp dùng để phân nhóm loài dựa trên sự tương đồng các đoạn ADN vệ tinh.

ADN vệ tinh là các đoạn ADN có trình tự lặp lại lớn, thường không mã hóa cho gen

và ít bị đột biến, thay đổi. Do đó chúng thường được dùng làm công cụ đắc lực trong

phân loại. Sử dụng các mồi được thiết kế theo trình tự của các ADN vệ tinh trong

phản ứng PCR. Sau đó các đoạn ADN vệ tinh đã khuếch đại sẽ được điện di để so

sánh kích thước. Sự tương đồng của các phổ băng thể hiện sự gần gũi của các chủng

nấm mốc. Phản ứng PCR finger printing được tiến hành với thành phần phản ứng như

Taq buffer 10x 10 µl

2 µl MgCl2 (25 mM)

dNTPs (10 µM mỗi loại) 4 µl

4 µl MST2 (GAC)5 (10 µM)

Taq polymerase (5u/µl) 0,5 µl

DNA khuôn 5 µl

H2O PCR 7 3,5 µl

Tổng cộng 100 µl

Tiến hành hút 20 µl master mix vào mỗi ống effendorf nhỏ, rồi bổ sug 1 µl DNA,

mix đều, spin down. Tiến hành nhân đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR sử dụng mồi

MST2 trên máy, chương trình MST2.

Gia nhiệt ở 94ºC trong 3 phút, tiếp theo mẫu được nhân lên bởi 30 chu kì liên

tiếp với các bước: biến tính ở 94ºC trong vòng 1 phút, gắn mồi ở 52ºC trong 1 phút

và kéo dài ở 72ºC trong 10 phút.

2.3.7. Phương pháp điện di

Sản phẩm sau khi chạy PCR được điện di trên gel agarose 1 % với dung dịch

đệm là 0,5x TAE. Để chuẩn bị gel điện di, agarose 1 % được đun tan trong đệm TAE

bằng lò vi sóng. Đợi nhiệt độ gel hạ xuống 60 - 70ºC, đổ gel vào phiến nhựa điện di

(kích thước tùy theo số lượng mẫu cần điện di) được đặt thăng bằng trên mặt phẳng

nằm ngang đã đặt sẵn lược. Để gel đông lại ở nhiệt độ phòng, gỡ bỏ lược, đặt bản gel

vào buồng điện di ngang sao cho bản gel chìm hẳn trong dung dịch đệm TAE. Dùng

micropipette nhỏ các sản phẩm sau PCR vào các giếng của bản gel. Với các gel sử

dụng răng lược nhỏ, dùng 3-5 µl mẫu cho mỗi giếng. Điện di với hiệu điện thế 50-

100V.

2.3.8. Nhuộm gel và đọc kết quả

Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch ethidium bromit 0,5 µg/ml

pha trong nước cất (trong 30 phút), sau đó vớt bản gel ra và rửa qua bằng nước để

loại bỏ Ethidium Bromide bám không đặc hiệu. Sau khi rửa, các băng DNA được

quan sát bằng máy soi gel InGenius của hãng Syngene.

2.3.9. Phương pháp phân loại nấm dựa vào đọc trình tự rDNA

DNA sau khi được tách và tinh chế như trên, tiến hành phản ứng PCR nhằm

khuếch đại vùng ITS hoặc ITS-D1D2 với thành phần master mix như sau:

Đệm phản ứng (10x) 10 l

4 µl MgCl2 (25 mM)

dNTPs (10mM mỗi loại) 4 l

Mồi ITS1 (10 M) 2 l

Mồi ITS4 (10 M) (mốc) hoặc NL4 (men, giả men) 2 l

Taq DNA polymerase (5u/l) 0,5 l

DNA khuôn 1 l

Nước dùng cho PCR 76,5 l

Tổng cộng 100 l

Tiến hành nhân đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR trên máy Gene Amp, System

9700 (PE). Chu trình gia nhiệt như sau: Gia nhiệt ở 94ºC trong 3 phút, tiếp theo mẫu

được nhân lên bởi 30 chu kì liên tiếp với các bước: biến tính ở 94ºC trong vòng 40

giây, gắn mồi ở 50ºC trong 40 giây và kéo dài ở 72ºC trong 10 phút.

Sản phẩm PCR sau đó cũng được kiểm tra bằng điện di và nhuộm bằng

ethidium bromit như trên, và soi bằng máy soi gel. Sau đó sản phẩm PCR được đọc

trình tự với 3 mồi ITS1, ITS4, NL4. Kết quả đọc trình tự được xử lý với các phần

mềm Bioedit.

2.3.10. Phân tích hoạt lực enzyme amylase từ các chủng mốc

Cân 20 g gạo nếp với 20 g nước RO vào các bình tam giác 100 ml, ngâm trong

1 giờ rồi hấp thanh trùng ở 121 °C/15phút. Làm nguội rồi bổ sung 1 vòng tròn thạch

giống đường kính 1 cm. Sau 2 ngày nuôi hiếu khí bổ sung 40g hoặc 60 g đệm

CH3COONa 0.1M, PH 5 rồi lắc 150 rpm/1h/27°C để chiết enzyme amylase, ly tâm

khối dịch ở 5000 rpm/20 phút/4°C thu dịch trong rồi lại ly tâm 10000 rpm/10

phút/4°C.

Phân tích hoạt lực enzyme amylase bằng DNS. [23]

Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc

thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với

nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở bước sóng 540

nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính

được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.

Thành phần DNS

Nước cất 708 g

3,5 Dinitrosalicylic acid (DNS) 5,3g

Sodium hydroxide (NaOH) 9,9 g

Hòa tan và bổ sung thêm:

Rochelle salts (sodium potassium tartrate) 153 g

Phenol tinh thể (để tan trong ở 50C trước khi dùng) 3,8 ml

4,15 g Sodium metabisulfite (Na2S2O5)

Tiến hành xây dựng đường chuẩn:

- 200 µL D-glucose theo các nồng độ trên được cho vào eppendorf 1.5 mL

- Bổ sung thêm 400 µL DNS, mix đều. Phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh

nhanh bằng nước đá

- Lấy 40 µL dịch phản ứng + 180 µL nước cất, mix đều trong vi đĩa.

- Đo OD 540nm. Dựng được đường chuẩn y = ax

- Mẫu Blank: nước cất thay cho đường D-glucose và tiến hành tương tự mẫu thí

nghiệm.

Tiến hành phân tích mẫu enzyme.

Mẫu thí nghiệm:

- Bước 1: Cho 0.3 ml enzyme vào ống nghiệm để vào bể ổn nhiệt 50°C trong 5 phút

(làm ấm ống nghiệm enzyme), ống cơ chất cũng được làm ấm 50°C trong 5 phút.

- Bước 2: Cho 0.6 ml cơ chất vào ống nghiệm enzyme, cho enzyme phản ứng với cơ

chất chính xác 20 phút ở 50°C.

- Bước 3: Nhỏ ngay 0.1 ml NaOH 0.1 M để dừng phản ứng. Làm nguội nhanh bằng

nước đá.

- Bước 4: Bổ sung 0.6 ml DNS vào 0.3 ml hỗn hợp phản ứng, mix đều, phản ứng màu

ở 100°C trong 5 phút. Làm lạnh nhanh bằng nước đá.

- Bước 5: Lấy 0.4 ml dịch phản ứng mix đều với 1.8 ml nước cất trong cuvet. Đo OD

540 nm.

Mẫu đối chứng thí nghiệm (kiểm tra lượng đường có sẵn trong enzyme và

ảnh hưởng của các phản ứng phụ khác)-ký hiệu C1:

Bổ sung 0.3 ml enzyme với 0.1 ml NaOH 0.1M, gia nhiệt ở 100°C trong 10 phút (để

diệt enzyme), làm lạnh nhanh trong nước đá, cho bổ sung 0.6 ml cơ chất vào các ống

đối chứng vortex đều. Sau đó tiến hành các bước tiếp theo từ bước 4.

Mẫu đối chứng cơ chất- không có enzyme (để kiểm tra cơ chất có đường

không)- ký hiệu C2.

Cho 0.4 ml đệm vào 1 ống nghiệm có chứa 0.6 ml cơ chất, vortex đều. Gia nhiệt ở

50°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh trong nước đá. Tiến hành các bước tiếp theo từ

bước 4.

IU/ml =

(𝐓−𝐂𝟏−𝐂𝟐)∗𝐃∗𝐕 𝐚∗𝟎.𝟏𝟖∗𝐭∗𝐯

Trong đó: T: Độ hấp phụ của mẫu thí nghiệm

C1: Độ hấp phụ của mẫu đối chứng 1

C2: Độ hấp phụ của mẫu đối chứng 2

D: hệ số pha loãng

V: tổng thể tích mẫu

a: hệ số góc của đường chuẩn

0.18: 180/1000 của đường D-glucose khan

t: thời gian phản ứng (phút)

2.3.11 Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của các chủng mốc đại diện

Để đảm bảo các chủng giống đều khỏe như nhau, tiến hành lấy giống từ các

ống bảo quản cát rắc lên đĩa Malt 2ºBx, sau 1 đến 2 ngày khi có các đĩa giống thuần,

tiến hành cấy chấm sinh khối mốc trên môi trường tinh bột 1%, thạch 1.8% trong 2

ngày ở 6 điều kiện nhiệt: 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C. Sau 24 giờ, 48 giờ

tiến hành đo đường kính khuẩn lạc để so sánh sự phát triển của các nhóm chủng rồi

chụp ảnh lại.

2.3.12. Kiểm tra sự thủy phân tinh bột của một số nhóm mốc khi có đường

Như chúng ta đã biết, vi sinh vật có khả năng thủy phân tinh bột khi sống trong

môi trường có tinh bột thì chúng sẽ kích hoạt gen, tổng hợp enzyme amylase, enzyme

này sẽ thủy phân tinh bột thành đường dễ sử dụng để phục vụ sự sinh trưởng và phát

triển của loài đó. Tuy nhiên, trong môi trường có cả tinh bột và đường thì liệu rằng

các nhóm nấm khác nhau có xu hướng sử dụng hết đường rồi mới sử dụng đến tinh

bột hay chúng vẫn sinh enzyme thủy phân tinh bột ngay cả khi môi trường có đường.

Để trả lời câu hỏi đó, chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm như sau:

Chọn ra các chủng đại diện mỗi nhóm để kiểm tra tính thủy phân tinh bột khi

trong môi trường có sẵn glucose, ta tiến hành thí nghiệm như sau: thu sinh khối các

chủng mốc sau 2 ngày nuôi trên đĩa thạch Malt 2°Bx ở tủ 30°C, bổ sung 0.7 mL NaCl

0.9%, sau đó trộn đều với 25mL thạch Agar-agar Type I 1.5% chứa soluble starch

0.5%, đổ ra đĩa Petri, cắt miếng tròn d=1.3cm, thả vào mỗi bình dịch YM (đã pha

loãng 10 lần có bổ sung chloramphenicol 0.1%) với nồng độ đường glucose khác

nhau rồi nuôi lắc ở 30°C, 150 rpm. (Thành phần môi trường YM gốc không có glusose

và cao malt: cao nấm men 3g/L; peptone 5g/L.)

- Bình 1: 50 ml YM + 0% glucose

- Bình 2: 50 ml YM + 0.5% glucose

- Bình 3: 50 ml YM + 1% glucose

- Bình 4: 50 ml YM + 2% glucose

Sau 12, 24, 36, và 48 giờ, tiến hành lấy mẫu và nhuộm với dung dịch lugol

0.33%, mẫu nào có nhiều tinh bột chưa bị thủy phân sẽ cho màu tím đậm.

2.3.13. Lên men rượu từ các chủng mốc và men thuần chọn lọc

Từ các thí nghiệm trên, tiến hành chọn nhóm chủng nấm mốc Rhizopus oryzae

có hoạt lực enzyme amyase cao, có khả năng thủy phân tinh bột khi trong môi trường

đường, và nhóm chủng này được cho là an toàn trong thực phẩm để thử nghiệm lên

men rượu kết hợp với chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae hoặc giả men

Saccharomycopsis fibuligera

Sử dụng 3 chủng nấm mốc thuần có hoạt lực enzyme amylase cao, 1 chủng

nấm men có khả năng lên men rượu tốt, và 1 chủng giả nấm men của Viện Công

nghiệp Thực phẩm:

- Chủng nấm mốc: Rhizopus oryzae BMM 111, Rhizopus arrhizus (Rhizopus

oryzae) BMM131, Rhizopus arrhizus (Rhizopus oryzae) BMM1015. Đĩa giống mốc

thu sinh khối sau 2 ngày cấy trên đĩa malt 2°Bx.

- Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae BMQ 467 (nồng độ 107 tế bào)

- Chủng giả nấm men Saccharomycopsis fibuligera BMQ908 (nồng độ 107 bào

tử). Nuôi tăng sinh trong các bình tam giác 100 ml, dịch malt 4°Bx sau 24h nuôi lắc.

Chuẩn bị cơm gạo để lên men rượu như sau: Cân 250 g gạo với 250 g nước

RO (ngâm 2h) vào mỗi bình tam giác 1000 ml. Hấp ở 121°C/15 phút, sau đó để nguội,

bổ sung giống mỗi loại như bảng 2.1. Sau đó lên men ẩm trong 3 ngày, bổ sung 500

ml nước để lên men rượu 7 ngày. Sau 10 ngày thu dịch đem đo độ cồn và chưng cất.

Lượng giống đươc bổ sung như sau:

- Nấm mốc: bổ sung 1 vòng tròn thạch đường kính d= 1.3 cm

- Nấm men: bổ sung 2 ml dịch sinh khối (107 tế bào)

- Giả nấm men: bổ sung 200 µl dịch

Bảng 2. 1. Thành phần giống ở mỗi mẫu lên men

Ký hiệu mẫu Giống bổ sung

Rhizopus oryzae BMM 111 LAB 1 Saccharomyces cerevisiae BMQ 467

Rhizopus oryzae BMM 131 LAB 2 Saccharomyce cerevisiae BMQ 467

Rhizopus oryzae BMM 1015 LAB 3 Saccharomyces cerevisiae BMQ 467

Rhizopus oryzae BMM 111

LAB 4 Saccharomycopsis fibuligera BMQ 908

Saccharomyces cerevisiae BMQ 467

Rhizopus oryzae BMM 131

LAB 5 Saccharomycopsis fibuligera BMQ 908

Saccharomyces cerevisiae BMQ 467

Rhizopus oryzae BMM 1015

LAB 6 Saccharomycopsis fibuligera BMQ 908

Saccharomyces cerevisiae BMQ 467

Ký hiệu: d là đường kính (cm)

2.3.14. Đo độ cồn bằng sôi kế

Đo độ cồn, ta sử dụng sôi kế ebulliometer. Cách đo như sau:

➢ Để đo điểm sôi của nước:

- Bước 1: Rửa sạch buồng sôi cẩn thận bằng nước sạch.

- Bước 2: Thêm khoảng 20mL nước RO vào buồng sôi.

- Bước 3: Lắp nhiệt kế rồi đốt đèn và đặt dưới chân thiết bị.

- Bước 4: Khi nước sôi, quan sát nhiệt kế, khi mức thủy ngân ổn định (> 30 giây)

- Bước 5: Để dụng cụ nguội trước khi tháo nhiệt kế và xả nước.

ghi lại nhiệt độ đọc gần nhất có thể. Nhiệt độ này là T1.

➢ Để đo điểm sôi của rượu:

- Bước 1: Rửa sạch khoang sôi với rượu.

- Bước 2: Đo 50mL rượu và đổ vào buồng sôi.

- Bước 3: Lắp nhiệt kế.

- Bước 4: Đổ đầy khoang ngưng bằng nước lạnh.

- Bước 5: Đốt đèn và đặt dưới chân thiết bị

- Bước 6: Khi rượu sôi, quan sát nhiệt kế. Khi mức thủy ngân ổn định (15-30 giây)

ghi lại nhiệt độ đọc gần nhất có thể. Nhiệt độ này là T2.

- Bước 7: Để dụng cụ nguội trước khi tháo nhiệt kế và xả nước.

➢ Để tính toán nồng độ cồn:

1. Tính giá trị T = T1 - T2

2. Xác định nồng độ cồn từ bảng hiển thị đi kèm

2.3.15. Phân tích phổ hương của các mẫu rượu gạo chưng cất bằng máy sắc ký

khí kết nối khối phổ GCMS.

Thông số chạy máy [21].

Việc đánh giá các hợp chất bay hơi trong sản phẩm lên men được thực hiện sử

dụng phương pháp vi tách chiết pha rắn kết hợp với sắc kí khí kết nối khối phổ

(GCMS).

Các mẫu được phân tích bởi GC/MS sử dụng sắc kí khí SCION 456-GC và

khối phổ SQ.

- Cột: mao quản Rt-Wax, dài 30m, 0.25 mm film thickness

- Khí mang: Heli với độ tinh khiết cao

- Vận tốc khí mang: 42 cm s-1

- Tốc độ dòng là 1.2 ml/min

- Nhiệt độ lò: bắt đầu là 35 ºC giữ trong 2 phút, sau đó tăng 5 ºC/1 phút lên 155 ºC

và giữ 0 phút. Tiếp theo tăng 20ºC/1 phút lên 200 ºC và giữ trong 10 phút

- Sợi fiber SPME được đưa vào trong liner và giữ trong 20 phút, sử dụng chế độ

chia dòng như sau: trong 1 phút đầu là không chia dòng, từ phút 1.01 thì chia dòng

1:10. Đối với MS, nhiệt độ nguồn ion và nhiệt độ transfer line là 230 ºC. Chế độ

electron impact mode là 70 eV.

Sử dụng 32 mẫu rượu chưng cất bao gồm 26 mẫu thu thập (ký hiệu COM) và 6

mẫu của Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp (LAB1-LAB6) để phân tích. Điều kiện

xử lý mẫu trước khi cho vào injector như sau: Đo cồn kế các mẫu rượu chưng cất rồi

pha loãng về độ cồn 12 % (v/v) bằng nước deion, hút 5 ml vào các ống 20 ml chứa 1.5

g NaCl. Bổ sung 5µl chất nội chuẩn là 2-pentanol,4-methyl với nồng độ 5ppm, sử dụng

khuấy từ trong lúc gia nhiệt mẫu lên 60ºC, giữ sợi hấp phụ fiber The Supelco

Carbowax/divinylbenzene (CW/DVB) 65 mm trong 30 phút rồi đưa vào máy.

Việc bán định lượng các chất bay hơi được thực hiện bằng cách sử dụng 2-

pentanol,4-methyl là chất nội chuẩn. Cách tính bán định lượng của những chất bay

𝐴𝑐

hơi đó được tính theo công thức sau [29].

𝐴is

C (µg/L) = x Cis (µg/L)

Trong đó: C: nồng độ tương đối của chất phân tích

Cis: nồng độ chất chuẩn nội trong mẫu rượu

Ac: diện tích chất phân tích

Ais: diện tích của chất nội chuẩn.

Phổ phổ của các hợp chất chưa biết được so sánh với các hợp chất trong thư

viện phổ. Phân tích mỗi mẫu được lặp lại 2 lần, rồi phân nhóm mẫu theo thứ bậc bằng

phần mềm ORANGE.

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả phân lập vi nấm từ 15 bánh men

Để nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột, bước đầu tiên các chủng nấm mốc

được phân lập từ 15 mẫu bánh men thì kết quả là hầu hết các chủng nấm mốc đều thuộc

họ Mucoraceae.

Bằng việc phân lập, quan sát hình thái khuẩn lạc, làm sạch các chủng vi nấm

khác nhau từ 15 mẫu bánh men được thu thập từ các tỉnh Ninh Bình, Tuyên Quang,

Thái Bình, Hà Nội, Nam Định, Hà Nam, Hưng Yên, Bắc Giang, có 73 chủng nấm

mốc, 16 chủng nấm men và 12 chủng giả nấm men. Thông tin chi tiết chủng được ghi

rõ trong phụ lục.

Tổng số chủng được phân lập từ 15 mẫu bánh men là 101, trong đó chủ yếu là

nấm mốc chiếm 73 chủng, nấm men 16 chủng và giả men chỉ có 12 chủng. Nấm mốc

xuất hiện ở tất cả các bánh men, từ 2 đến 8 chủng trên một bánh. Tuy nhiên, các chủng

nấm men phân lập được chỉ xuất hiện ở bánh men MQ2, MQ3, MQ4, MQ7, MQ8,

MQ9, MQ11, MQ12, MQ13 mà không phân lập được ở bánh men MQ1, MQ5, MQ6,

MQ10, MQ14, MQ15. Đối với các chủng giả men cũng vậy, chỉ xuất hiện ở bánh men

MQ2, MQ3, MQ7, MQ8, MQ9, MQ12, MQ13, MQ14 mà không có ở bánh men MQ1,

MQ4, MQ5, MQ6, MQ10, MQ11, MQ15.

3.2. Kết quả hình thái khuẩn lạc, tế bào.

Sau khi phân lập, các chủng cần được xếp nhóm trong đó phân nhóm hình thái

khuẩn lạc và tế bào là một bước rất quan trọng. Các chủng được cấy trên đĩa Petri

Malt 2ºBx, sau 2 ngày nuôi trong tủ 30ºC sẽ được xếp nhóm sơ bộ bằng hình thái

khuẩn lạc dựa trên 3 đặc điểm cơ bản của khuẩn lạc là: hình dạng, kích thước, màu

sắc. Sau đó, tiếp tục làm tiêu bản quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi. Dưới

đây là hình thái khuẩn lạc mặt trước, mặt sau và hình thái tế bào (thứ tự từ trái sang

phải) của các chủng vi nấm đại diện các nhóm.

Nhóm 1 (18 chủng): Rhizopus microsporus MQF 4.2

Nhóm 2(8 chủng): Rhizopus microsporus MQF 1.2

Nhóm 3 (3 chủng): Mucor indicus MQF 12.1

Nhóm 4 (5 chủng): Rhizopus oryzae MQF 2.4

Nhóm 5 (7 chủng): Rhizopus oryzae MQF 2.5

Nhóm 6 (4 chủng): Rhizopus oryzae MQF 1.3

Nhóm 7 (12 chủng): Rhizopus oryzae MQF 10.5

Nhóm 8 (3 chủng): Lichtheimia ramosa MQF 9.4

Nhóm 10(4 chủng): Mucor circinelloides MQF 2.2

Nhóm 11 (5 chủng): Mucor indicus MQF 8.4

Nhóm 12 (2 chủng): Mucor indicus MQF 10.2

Nhóm 13 (2 chủng): Cunninghamella echinulata MQF 8.6

Nhóm nấm men

Nhóm 1(14 chủng): Saccharomyces cerevisiae MQY 4.1

Nhóm 2 (2 chủng): Wickerhamomyces anomalus MQY 11.3

Nhóm giả men

Có 12 chủng. Saccharomycopsis fibuligera MQS 14.1

Hình 3. 1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các nhóm nấm đại diện

Nấm mốc:

Nhóm 1 (18 chủng): Nhóm này có hình thái khuẩn lạc màu xám ghi, hệ sợi

phát triển nhanh, túi bào tử màu đen. Dễ thấy, nhóm khuẩn lạc này rất phổ biến, chúng

xuất hiện ở hầu hết các bánh men từ MQ4 đến MQ15.

Nhóm 2 (8 chủng): Nhóm này đặc trưng bởi hình thái khuẩn lạc màu đen, hệ

sợi bò lan, ít hoặc không có hệ sợi khí, bào tử đen to. Khi quan sát tiêu bản có rễ.

Nhóm này cũng khá phổ biến, chúng xuất hiện ở 7 bánh men MQ 1,4,5,6,10,11,14.

Nhóm 3 (3 chủng): Khuẩn lạc màu sáng, hệ sợi dày bò lan, không có hệ sợi

khí. Khi quan sát tế bào có nhiều Chlamydospore. Nhóm này tần xuất xuất hiện thấp,

chỉ có mặt ở bánh men MQ3, MQ12, và MQ14.

Nhóm 4 (5 chủng): Khuẩn lạc màu trắng sữa phát triển nhanh, hệ sợi bò lan là

chủ yếu, không vách ngăn, dường như không quan sát thấy túi bào tử. Khi làm tiêu

bản để quan sát tế bào thì thấy rất nhiều Chlamydospore ở giữa sợi nấm. Nhóm này

chỉ xuất hiện ở 4 bánh men duy nhất là MQ2,3,7,8

Nhóm 5 (7 chủng): Hệ sợi màu trắng, bò lan và cả sợi khí phát triển tốt. Túi

bào tử to, màu trắng, hệ sợi không vách ngăn, và không quan sát thấy rễ nấm. Nhiều

Chlamydospore giữa sợi nấm. Các chủng thuộc nhóm này được tìm thấy ở MQ2,

MQ9, MQ12, và MQ15.

Nhóm 6 (4 chủng): Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, phát triển nhanh, vừa bò

lan vừa có hệ sợi khí, túi bào tử lớn màu đen có thể nhìn thấy bằng mắt thường, khi

già khuẩn lạc nhìn có màu hơi nâu. Nhóm này chỉ thấy ở 3 bánh men là MQ1, MQ5

và MQ7

Nhóm 7 (12 chủng): Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, phát triển nhanh, chủ yếu

bò lan, hệ sợi khí mọc thưa, túi bào tử lớn màu đen, ít hơn nhưng to hơn bào tử ở

nhóm 6, có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Sợi có nhiều Chlamydospore. Các chủng

thuộc nhóm này xuất hiện ở nhiều các bánh men như MQ2,4,5,6,10,11,14

Nhóm 8 (3 chủng): Khuẩn lạc màu trắng điển hình, sợi mảnh, hệ sợi khí phát

triển tốt. Túi bào tử hình cầu. Nhóm này xuất hiện khá ít, chỉ ở 3 bánh men

MQ9,11,14.

Nhóm 9 (1 chủng): Nhóm này duy nhât phân lập được 1 chủng, xuất hiện ở

bánh men MQ12. Khuẩn lạc màu trắng xốp, sợi mảnh, bào tử đính tròn nhỏ.

Nhóm 10 (4 chủng): Khuẩn lạc màu đậm đặc trưng, hệ sợi dày, Túi bào tử hình

cầu. Các chủng thuộc nhóm này được phân lập từ 3 bánh men là MQ2,3,13.

Nhóm 11 (5 chủng): Các chủng thuộc nhóm này thường khuẩn lạc có màu

vàng ghi đặc trưng, Bào tử có màu vàng nhạt, sợi liên tục phân nhánh, với các nhánh

dài. Túi bào tử có màu vàng đến nâu. Cuống gần hình cầu, cao. Bào tử có vách trơn,

gần cầu tới elip, và có đường kính 4-5 µm. Các chủng thuộc nhóm này thuộc các bánh

men MQ1,8,9.

Nhóm 12 (2 chủng): Khuẩn lạc màu vàng nhạt, sợi mọc lan, ở giữa có ít sợi

khí mọc lên, bào tử. Túi bào tử to, hình tròn đính với cuống lớn hình trụ, bào tử nhỏ

hình gần cầu, elip. Nhóm này rất hiếm gặp, chỉ thấy ở bánh men MQ10.

Nhóm 13 (2 chủng): Khuẩn lạc có màu vàng nhạt, hệ sợi phát triển chậm,

bào tử đính hình tròn. Chỉ duy nhất bánh men MQ8 có sự xuât hiện nhóm chủng

này.

Nấm men:

Nhóm 1: (13 chủng): Khuẩn lạc màu trắng sữa, nhẵn bóng, tế bào gần cầu, có

những tế bào dài đang phân đôi. Nhóm chủng này rất phổ biến, xuất hiện ơ nhiều

bánh men như MQ2,3,4,7,8,9,11,12,13.

Nhóm 2 (2 chủng): Khuẩn lạc có màu trắng sáng, sáng hơn nhóm 1, tế bào

tròn, nhiều tế bào quan sát được đang phân đôi, nảy chồi. Nhóm này chỉ có 2 chủng

duy nhất thuộc 2 bánh men MQ9 và MQ11.

Giả men:

Nhóm 1 (12 chủng): Khuẩn lạc màu trắng sữa, xù xì. Khi quan sát tế bào thì

có nhiều sợi và bào tử

Như vậy, kết quả cho thấy hầu hết các chủng vi nấm được phân lập là nấm

mốc với độ đa dạng về hình thái khuẩn lạc và tế bào hơn là nấm men và giả nấm men.

3.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật PCR-fingerprinting và định danh chủng nấm

đại diện dựa vào phân tích trình tự rDNA

Việc phân loại bước đầu các chủng nấm mốc bằng hình thái khuẩn lạc và tế

bào tương đối nhanh do sự sai khác khá điển hình giữa các nhóm. Tuy nhiên, với các

chủng nấm men hay giả men thì do sự đa dạng và sự sai khác không rõ ràng giữa các

chủng về mặt hình thái khuẩn lạc cũng như tế bào làm cho việc phân loại dựa vào

những đặc điểm này gặp nhiều khó khăn, phân nhóm bằng hình thái là một bước để

giảm bớt sự khó khăn khi phân nhóm bằng các phương pháp tiếp theo. Để đánh giá

tính đa dạng của các chủng phân lập được một cách chính xác, chúng tôi tiến hành

phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting 103 chủng phân lập được sử dụng mồi MST2

(có trình tự 5’-(GAC)5-3’). Kết quả phân nhóm bằng fingerprinting được đối chiếu

lại với kết quả phân nhóm bằng hình thái.

Hình 3. 2. Phổ băng DNA fingerprinting

Ký hiệu: 1-MQF 4.2; 2- MQF 4.4; 3- MQF 5.2; 4 - MQF 5.6; 5 - MQF 6.4; 6 - MQF 6.5; 7 - MQF 7.2; 8 - MQF 8.3; 9 - MQF 9.5; 10 -

MQF 10.3; 11 - MQF 11.1; 12 - MQF 12.5; 13 - MQF 14.3; 14 - MQF 14.7; 15 - MQF 14.8; 16 - MQF 15.3; 17 - MQF 10.1; 18 - MQF

13.1; 19 - MQF 1.2; 20 - MQF 4.1; 21 - MQF 4.5; 22 - MQF 5.3; 23 - MQF 6.3; 24 - MQF 10.4; 25 - MQF 11.2; 26 - MQF 14.1; 27 -

MQF 3.1; 28 - MQF 12.1; 29 - MQF 12.4; 30 - MQF 2.4; 31 - MQF 3.2; 32 - MQF 8.2; 33 - MQF 2.5; 34 - MQF 9.1; 35- MQF 9.6; 36 -

MQF 12.6; 37 - MQF 15.1; 38 - MQF 15.2; 39 - MQF 15.4; 40 - MQF 1.3; 41 - MQF 1.4; 42 - MQF 5.7; 43 - MQF 7.1; 44 - MQF 7.3;

45 - MQF 8.1; 46 - MQF 2.1; 47 - MQF 4.3; 48 -MQF 5.1; 49 - MQF 5.4; 50 - MQF 5.5; 51 - MQF 6.1; 52 - MQF 6.2; 53 - MQF 10.5;

54 - MQF 10.6; 55 - MQF 14.4; 56 - MQF 14.5; 57 - MQF 9.4; 58 - MQF 11.3; 59 - MQF 14.2; 60 - MQF 12.2; 61 - MQF 2.2; 62 - MQF

2.3; 63 - MQF 3.3; 64 - MQF 13.2; 65 - MQF 1.1; 66 - MQF 8.4; 67 - MQF 8.7; 68 - MQF 9.3; 69- MQF 9.7; 70 - MQF 10.2; 71 - MQF

10.7; 72 - MQF 8.5; 73 - MQF 8.6; 74- MQY 2.1; 75- MQY 3.1; 76- MQY 4.1; 77- MQY 4.2; 78- MQY 7.2; 79- MQY 8.1; 80- MQY

8.2; 81- MQY 9.2; 82- MQY 11.1; 83- MQY 11.2; 84- MQY 12.1; 85- MQY 12.2; 86- MQY 13.1; 87- MQY 7.1; 88- MQY 9.3; 89- MQY

11.3; 90- MQS 8.1; 91- MQS 8.2; 92- MQS 3.2; 93- MQS 3.1; 94- MQS 2.2; 95- MQS 2.1; 96- MQS 12.1; 97- MQS 12.2; 98- MQS 13.2;

99- MQS 13.1; 100- MQS 9.2; 101- MQS 14.1.

Kết quả thể hiện ở hình 3.2 cho thấy, sản phẩm PCR nhân với mồi MST2 của

các chủng nấm có các phổ băng khác nhau và rất đa dạng do sự phân bố về số lượng

bản sao cũng như vị trí của DNA vệ tinh trong genome. Kỹ thuật phân nhóm sử dụng

mồi thiết kế dựa trên DNA vệ tinh cho độ phân giải đến loài. Các chủng có cùng hình

thái khuẩn lạc, được điện di cạnh nhau, và cho phổ finger giống nhau như nhóm 1,

nhóm 2, nhóm 3. Bên cạnh đó, các chủng có hình thái khuẩn lạc khác nhau nhưng lại

cho cùng phổ finger như các chủng thuộc nhóm 4,5,6,7. Tùy thuộc vào vị trí phân bố

trên DNA mà số lượng vạch DNA giữa các nhóm có thể khác nhau, ví dụ như nhóm

6,7,8 có nhiều băng DNA nhưng nhóm 9 hay 13 chỉ có 1 băng DNA duy nhất. Các

chủng vừa có hình thái giống nhau, vừa có băng finger giống nhau sẽ được xếp cùng

nhóm. Theo cách đó chúng tôi đã chia 73 chủng nấm mốc thành 13 nhóm, 16 chủng

nấm men thành 2 nhóm, và 12 chủng giả nấm men.

Bảng 3. 1. Kết quả phân nhóm các chủng bằng fingerprinting và đọc trình tự

các chủng đại diện

Nhóm

Chủng

Tên khoa học

Chủng đọc trình tự

Nấm mốc

MQF 4.2

Rhizopus microsporus

(18 chủng) MQF 4.2, MQF 4.4, MQF 5.2, MQF 5.6, MQF 6.4, MQF 6.5, MQF 7.2, MQF 8.3, MQF 9.5, MQF 10.3, MQF 11.1, MQF 12.5, MQF 14.3, MQF 14.7, MQF 14.8, MQF 15.3, MQF 10.1, MQF 13.1

MQF 5.3

(8 chủng) MQF 1.2, MQF 4.1, MQF 4.5, MQF 5.3, MQF 6.3, MQF 10.4, MQF 11.2, MQF 14.1

Rhizopus microsporus

(3 chủng) MQF 3.1, MQF 12.1, MQF 12.4

Mucor indicus

MQF 12.1

MQF 2.4 Rhizopus oryzae

(5 chủng) MQF 2.4, MQF 3.2, MQF 7.3, MQF 8.1, MQF 8.2

MQF 2.5 Rhizopus oryzae

(7 chủng) MQF 2.5, MQF 9.1, MQF 9.6, MQF 12.6, MQF 15.1, MQF 15.2, MQF 15.4

(4 chủng) MQF 1.3, MQF 1.4, MQF 5.7, MQF 7.1

MQF 1.3 Rhizopus oryzae

Rhizopus oryzae

MQF 10.5

(11 chủng) MQF 2.1, MQF 4.3, MQF 5.1, MQF 5.4, MQF 5.5, MQF 6.1, MQF 6.2, MQF 10.5, MQF 10.6, MQF 14.4, MQF 14.5

(3 chủng) MQF 9.4, MQF 11.3, MQF 14.2

MQF 9.4 Lichtheimia ramosa

Nhóm

Chủng

Tên khoa học

Chủng đọc trình tự

(1 chủng) MQF 12.2

MQF 12.2

Cunninghamella bertholletiae

(3 chủng) MQF 2.2, MQF 2.3, MQF 3.3

MQF 2.2 Mucor circinelloides

MQF 8.4 Mucor indicus

(6 chủng) MQF 13.2, MQF 1.1, MQF 8.4, MQF 8.7, MQF 9.3, MQF 9.7

Mucor indicus

(2 chủng) MQF 10.2, MQF 10.7

MQF 10.2

MQF 8.6

(2 chủng) MQF 8.5, MQF 8.6

Cunninghamella echinulata

Nấm men

MQY 4.1

Saccharomyces cerevisiae

(14 chủng) MQY 2.1, MQY 3.1, MQY 4.1, MQY 4.2, MQY 7.2, MQY 8.1, MQY 8.2, MQY 9.2, MQY 11.1, MQY 11.2, MQY 12.1, MQY 12.2, MQY 13.2, MQY 7.1

(2 chủng) MQY 9.3, MQY 11.3

MQY 11.3

Wickerhamomyces anomalus

Giả men

Saccharomycopsis fibuligera

MQS 14.1

(12 chủng) MQS 8.1, MQS 8.2, MQS 3.2, MQS 3.1, MQS 2.2, MQS 2.1, MQS 12.1, MQS 12.2, MQS 13.2, MQS 13.1, MQS 9.2, MQS 14.1

Xếp nhóm và phân loại các chủng dựa vào hình thái và đặc điểm sinh lý thường

rất khó và tốn thời gian. Các loài khác nhau có thể có hình thái giống nhau và các

chủng cùng loài có thể có nhiều kiểu hình. Bằng việc sử dụng mồi PCR (GAC)5

khuếch đại các đoạn ADN vệ tinh có thể xếp nhóm thành công một lượng lớn các

chủng vi nấm.

Dựa vào kết quả phân nhóm bằng fingerprinting chúng tôi chọn ra 16 chủng

đại diện của 16 nhóm (bảng 3.2) để phân tích trình tự. Chúng tôi chọn đoạn D1/D2

của rDNA 26S và vùng ITS của rDNA để phân tích. Do kích thước của các đoạn

này khá ngắn (khoảng 600 bp), tính bảo thủ rất cao giữa các loài. Đồng thời, trình

tự của các đoạn này của các loài đã biết đã được công bố trên GenBank, nên dễ dàng

cho việc so sánh trình tự với các loài mới phân lập được. Như vậy với các ưu điểm

này, đoạn D1/D2 và vùng ITS rất thích hợp cho việc phân tích trình tự để định tên

nấm

DNA của 13 chủng nấm mốc được tách sau đó dùng PCR nhân đặc hiệu đoạn

DNA chứa vùng ITS, nấm men, giả nấm men nhân đoạn D1/D2 bằng cặp mồi ITS1

và NL4. Sản phẩm PCR sau đó được tinh chế và đọc trình tự với mồi ITS4 (nấm

mốc), NL4 (nấm men, giả men). Kết quả đọc trình tự sau đó được so sánh với các

chủng đã được công bố.

Từ kết quả đọc trình tự các chủng đại diện ở bảng 3.2, ta thấy đối với các

chủng nấm mốc.

- Loài Rhizopus oryzae, chiếm 27 chủng (tổng của 5 chủng nhóm 4, 7 chủng

nhóm 5, 4 chủng nhóm 6 và 11 chủng nhóm 7).

- Loài Rhizopus microsporus chiếm 26 chủng (tổng của 26 chủng nhóm 1 và

8 chủng nhóm 2)

- Loài Mucor indicus chiếm 11 chủng (3 chủng nhóm 3, 6 chủng nhóm 11 và

2 chủng nhóm 12)

- Loài Mucor circinelloides có 3 chủng (3 chủng nhóm 10)

- Loài Lichtheimia ramosa có 3 chủng (3 chủng nhóm 8), loài Cunninghamella

echinulata có 2 chủng, và 1 chủng Cunninghamella bertholletiae.

Từ đó có thể kết luận rằng, loài nấm mốc thường gặp ở các bánh men là

Rhizopus oryzae, chiếm 27 chủng trong số 73 chủng nấm được xác định và tiếp theo

là Rhizopus microsporus (26 chủng), Mucor indicus (11 chủng), Mucor circinelloides

(3 chủng), Lichtheimia ramosa (3 chủng), Cunninghamella echinulata (2 chủng),

Cunninghamella bertholletiae (1 chủng). Trong 1 nghiên cứu trước về đa dạng vi sinh

vật trong bánh men truyền thống thì các chủng nấm thuộc họ Mucoraceae không phổ

biến mà loài nấm giả men Saccharomyscopsis ﬁbuligera mới là loài phổ biến hơn cả

[21]. Saccharomyscopsis ﬁbuligera cũng là loài sinh amylase chính ở Loog-pang –

một loại giống khởi động truyền thống ở Thái Lan, tương tự như bánh men Việt Nam.

Trong số các chủng nấm men phân lập được thì chủ yếu các chủng thuộc loài

S.cerevisiae (14 chủng-nhóm 1), Wickerhamomyces anomalus (2 chủng-nhóm 2), và

12 chủng giả nấm men. S. ﬁbuligera. Một nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng loài

nấm S. cerevisiae đóng vai trò chủ yếu trong quá trình lên men rượu vì chúng được

tìm thấy ở tất cả các giai đoạn của quá trình lên men và đến ngày cuối cùng thì chỉ có

sự hiện diện thuần nhất của chúng bên cạnh vi khuẩn, đây được giải thích là kết quả

của việc thuần hóa lâu dài [25].

Kết quả phân lập này tương đồng với nghiên cứu trước đây của Thanh VN và

cộng sự, từ 130 chủng vi nấm được phân lập từ các giai đoạn khác nhau của lên men

rượu gạo. Trong đó, 41 chủng thuộc họ Mucoraceae, 16 chủng giả men là S

.fibuligera, 29 chủng nấm men, chủ yếu là S.cerevisiae [25].

Quá trình lên men gần như thiếu Aspergillus, Trichoderma và Penicillum, loại

nấm hoại sinh phổ biến nhất trong môi trường trong nhà. Lên men rượu truyền thống

của Việt Nam khác biệt đáng kể với quá trình lên men của rượu sake Nhật Bản, nơi

Aspergillus spp. là chủ yếu. Đặc điểm này là do độ ẩm cao của cơ chất được sử dụng

trong quá trình lên men rượu của Việt Nam. Độ ẩm ban đầu của bột làm bánh men và

cơm hấp để lên men rượu nằm trong khoảng từ 50% đến 55%. Đây là điều kiện thuận

lợi cho Mucorceae phát triển vì chúng thích nghi với cơ chất có hàm ẩm cao, điều

kiện lên men vi hiếu khí.

3.4. Phân tích hoạt lực enzyme amylase bằng DNS

Như đã biết, các chủng nấm mốc chủ yếu sinh enzym amylase để thủy phân

cơ chất tinh bột thành đường khử, nên tiến hành phân tích hoạt lực enzyme amylase

với cơ chất là tinh bột hòa tan rồi đo sản phẩm đường khử bằng DNS để xem khả

năng thủy phân tinh bột của các nhóm chủng nấm mốc nhanh hay chậm.

Sau 2 ngày bổ sung chủng mốc với cơm gạo nuôi ở 30ºC dịch đường hóa được

chiết bằng đệm CH3COONa 0.5M rồi ly tâm. Phần dịch phía trên của ống ly tâm chứa

amylase ngoại bào được phân tích hoạt lực bằng phương pháp DNS. Sau đây là bảng

kết quả hoạt lực amylase của 67 chủng nấm mốc Mucoraceae và 1 chủng đối chứng

Cunninghamella echinulata MQF 8.5 (C. echinulata MQF 8.5).

Bảng 3. 2. Hoạt lực enzyme amylase của các chủng mốc thuần

Hoạt lực

amylase

STT

Chủng

STT

Chủng

(IU/ml)

M. circinelloides MQF 2.2

1,89

R.microsporus MQF 4.5

10,17

M. circinelloides MQF 2.3

2,06

R.microsporus MQF 5.3

6,92

M. circinelloides MQF 3.3

2,13

R.microsporus MQF 6.3

11,31

M. circinelloides MQF 13.2

4,88

R.microsporus MQF 10.4

6,91

M. indicus MQF 3.1

0,77

R.microsporus MQF 11.2

13,3

M. indicus MQF 12.1

2,03

R.microsporus MQF 14.1

8,57

M. indicus MQF 12.4

2,14

R.oryzae MQF 2.4

133,46

M. indicus MQF 1.1

2,43

R.oryzae MQF 3.2

117,5

M. indicus MQF 8.4

1,15

R.oryzae MQF 7.3

80,77

M. indicus MQF 8.7

1,88

R.oryzae MQF 8.1

61,35

M. indicus MQF 9.3

1,27

R.oryzae MQF 8.2

73,76

M. indicus MQF 9.7

2,68

R.oryzae MQF 2.5

50,5

M. indicus MQF 10.2

6,14

R.oryzae MQF 9.1

125,6

M. indicus MQF 10.7

3,51

R.oryzae MQF 9.6

72,06

R.microsporus MQF 4.2

7,06

R.oryzae MQF 12.6

74,23

R.microsporus MQF 4.4

7,09

R.oryzae MQF 15.1

59,83

R.microsporus MQF 5.2

7,34

R.oryzae MQF 15.2

50,06

R.microsporus MQF 5.6

11,1

R.oryzae MQF 15.4

79,01

R.microsporus MQF 6.4

4,77

R.oryzae MQF 1.3

128,16

R.microsporus MQF 6.5

16,21

R.oryzae MQF 1.4

141,8

R.microsporus MQF 7.2

7,96

R.oryzae MQF 5.7

127,21

R.microsporus MQF 8.3

3,29

R.oryzae MQF 7.1

129,74

R.microsporus MQF 9.5

15,45

R.oryzae MQF 2.1

92,66

R.microsporus MQF 10.3

27,06

R.oryzae MQF 4.3

185,03

R.microsporus MQF 11.1

33,22

R.oryzae MQF 5.1

148,61

R.microsporus MQF 12.5

4,05

R.oryzae MQF 5.4

109,44

R.microsporus MQF 14.3

7,81

R.oryzae MQF 5.5

190,01

R.microsporus MQF 14.7

4,74

R.oryzae MQF 6.1

85,23

R.microsporus MQF 14.8

15,96

R.oryzae MQF 6.2

112,19

R.microsporus MQF 15.3

13,35

R.oryzae MQF 10.5

116,49

R.microsporus MQF 10.1

12,26

R.oryzae MQF 10.6

159,56

R.microsporus MQF 13.1

12,98

R.oryzae MQF 14.4

183,72

R.microsporus MQF 1.2

14.48

R.oryzae MQF 14.5

128.98

R.microsporus MQF 4.1

11.06

C. echinulata MQF 8.5

1.04

Bảng 3.2 cho thấy nhóm R.oryzae là nhóm có hoạt lực amylase cao nhất, cụ

thể như các chủng cho hoạt lực vượt trội là R.oryzae BMQ 5.5, R.oryzae MQF 4.3,

R.oryzae MQF 14.4, R.oryzae MQF 10.6 với kết quả lần lượt là 190,01;185,03;

183,72; 59,56 (IU/ml). Các chủng thuộc nhóm này cho hoạt lực thấp nhất là R.oryzae

MQF 15.2 với 50,06 (IU/ml), R.oryzae MQF 2.5 với 50,05 (IU/ml).

Đối với các chủng thuộc nhóm R.microsporus cho hoạt lực thấp hơn nhiều

so với nhóm R.oryzae, giá trị đã phân tích trong khoảng 3,29-33,22 (IU/ml), với

chủng cao nhất là R.microsporus MQF 11.1 và chủng thấp nhất là R.microsporus

MQF 8.3.

Ngược lại, nhóm thuộc chi Mucor như Mucor indicus hay Mucor

circinelloides cho hoạt lực thấp nhất chỉ từ 1-2 (IU/ml), dao động không đáng kể và

thấp tương tự chủng đối chứng C. echinulata MQF 8.5 (1,04 IU/ml).

Kết quả này có sự tương đồng với nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng các chủng

thuộc loài R.oryzae có hoạt lực amylase cao vì chúng có khả năng cho vòng thủy phân

tinh bột lớn từ 7,1-9,0 cm sau 2 ngày ở 30°C so với các chủng mốc khác chỉ cho 2,1-

4,7 cm [10]. Hình 3.3 dưới đây mô tả số liệu trong bảng 3.2.

Hình 3. 3. Hoạt lực enzyme amylase của các chủng nấm mốc (IU/ml)

3.5. Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của các chủng mốc đại diện

Bên cạnh hoạt lực enzyme amylase, yếu tố nhiệt độ cũng đóng vai trò quan

trọng trong quá trình thủy phân tinh bột của các chủng nấm mốc, việc tìm ra ngưỡng

nhiệt độ mà các nhóm chủng đó phát triển tốt trên môi trường tinh bột sẽ rất hữu ích

để kiểm soát nhiệt độ khối ủ trong quá trình lên rượu, đặc biệt là khi lên men rượu sử

dụng các chủng thuần làm giống khởi động.

Để kiểm tra khả năng chịu nhiệt của nhóm chủng mốc Mucoraceae đã phân lập

được, tiến hành chọn ra 2 chủng thuộc loài M. circinelloides, 6 chủng thuộc loài M.

indicus, 8 chủng thuộc loài R. Microsporus, 8 chủng thuộc loài R. oryzae và 1 chủng

đối chứng C. echinulata MQF 8.5. Việc chọn lựa các chủng giống phụ vào số lượng

chủng mỗi loại phân lập được và chọn các chủng có nguồn gốc từ các bánh men khác

nhau.25 chủng đại diện được cấy trên môi trường tinh bột gạo 1% rồi nuôi ở 6 điều

kiện nhiệt độ từ thấp đến cao như sau: 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C.

Sau 2 ngày cấy chấm, nuôi trên đĩa thạch tinh bột 1%, các chủng được đo

đường kính khuẩn lạc, kết quả này được thể hiện trong bảng 3.3, cho thấy rõ sự phát

triển và khả năng thủy phân tinh bột trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau của các

chủng khác nhau.

Bảng 3. 3. Đường kính khuẩn lạc phát triển trên môi trường tinh bột 1% ở các

Hầu hết các chủng đại diện đều phát triển tốt ở 30°C, 35°C, mọc chậm ở 40°C,

nhiệt độ

dường như không mọc ở 45°C và 50°C ngoại trừ các chủng R.microsporus có khả

năng chịu được nhiệt cao, đặc biệt là các chủng R.microsporus MQF 1.2, MQF 5.3,

MQF 9.5, MQF 10.3, MQF 11.2 vẫn mọc tốt ở 45°C, mọc chậm ở 50°C. Ngược lại,

các chủng thuộc chi Mucor M. circinelloides khả năng chịu nhiệt kém nhất, chúng

chỉ phát triển tốt ở 25°C, 30°C còn ở 35 độ mọc rất chậm.

Như vậy kết quả này chỉ ra rằng, nhóm loài Rhizopus microsporus là loài chịu

được nhiệt độ nhất trong số tất cả các nhóm nấm mốc đã phân lập. Kết quả này tương

đồng với nghiên cứu trước, khi cho rằng chủng Rhizopus microsporus var.

rhizopodiformis thuộc loài Rhizopus microsporus có thể sinh trưởng ở điều kiện 50°C

và sinh amylase tối ưu ở 45°C [20]. Tương tự như vậy, một báo cáo khác cũng báo

cáo rằng chủng Rhizopus microsporus var.chinensis CICIM-CU F0088 thuộc loài

Rhizopus microsporus cũng sinh trưởng tốt ở 40°C và sinh enzyme thủy phân ở nhiệt

độ cao hơn Rhizopus oryzae [17]. Hình 3.4 mô tả số liệu cho bảng 3.3.

Hình 3. 4. Đường kính khuẩn lạc nấm mốc trên môi trường tinh bột 1% ở các nhiệt độ

3.6. Kết quả sự thủy phân tinh bột của một số nhóm mốc khi có đường

Trong thời gian đầu của quá trình thủy phân tinh bột, tinh bột sẽ được thủy phân

thành đường, lượng đường được sinh ra sẽ phục vụ quá trình trao đổi chất, cung cấp

năng lượng cho tế bào. Vậy liệu rằng, chúng chỉ thủy phân đủ để dùng hay ngay cả

khi trong môi trường có đường và tinh bột, thì enzyme amylase vẫn thủy phân tinh

bột. Để trả lời câu hỏi này, mỗi nhóm chủng mốc chọn ra các 24 chủng đại diện để

kiểm tra khả năng thủy phân tinh bột trong môi trường đường. Với 2 chủng cuối cùng

dùng làm đối chứng Aspergillus oryzae CNTP 5026 và C.echinulata MQF 8.5

Với mỗi mẫu lấy tại các thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ rồi

nhuộm lugol. Những mẫu nào bắt màu xanh đậm với lugol nghĩa là tinh bột chưa

được thủy phân hoặc thủy phân không đáng kể, mẫu nào có màu sáng hơn chứng tỏ

tinh bôt đã được thủy phân đáng kể. Hình 3.4 cho thấy kết quả như sau.

Hình 3. 5. Kết quả thủy phân tinh bột trong môi trường có đường của các

chủng mốc

Theo hàng ngang của mỗi ảnh là mẫu cùng một chủng được lấy ở các nồng độ

đường tăng dần: 0%; 0,5%;1%, 2%. Hàng dọc là các chủng khác nhau. Trong 48 giờ

trong môi trường có tinh bột hay có cả tinh bột và đường thì nhóm loài thuộc chi

Mucor (thuộc họ Mucoraceae) như Mucor indicus hay Mucor circinelloides dường

như không đóng vai trò thủy phân tinh bột, biểu hiện rõ ở màu sắc miếng tinh bột vẫn

đậm màu sau 48 giờ, bên cạnh đó nhóm Rhizopus microsporus (thuộc họ

Mucoraceae) thủy phân hoàn toàn tinh bột sau 36 giờ khi không có đường, khi có

đường thì enzym bị ức chế nên thủy phân yếu hơn. Còn nhóm Rhizopus oryzae (thuộc

họ Mucoraceae) thì một số chủng như Rhizopus oryzae MQF 3.2, Rhizopus oryzae

MQF 15.4 thủy phân rất tốt sau 12 giờ khi không có đường, tuy nhiên khi trong môi

trường có glucose thì ở thời điểm đầu enzym amylase cũng bị ức chế nên thủy phân

yếu miếng tinh bột nhưng sau 36 giờ thì miếng tinh bột ở hầu hết các nồng độ đường

bị thủy phân hoàn toàn.

Như vậy có thể thấy nhóm Rhizopus microsporus và Rhizopus oryzae thuộc

họ Mucoraceae thủy phân tinh bột ngay cả khi trong môi trường đường, trong đó

nhóm Rhizopus oryzae thủy phân nhanh hơn.

Loài đối chứng không thuộc họ Mucoraceae đã phân lập được đó là C.

echinulata MQF 8.5 cho thấy khả năng thủy phân tinh bột trong môi trường đường

kém, cụ thể là sau 48 giờ màu sắc của miếng tinh bột trong môi trường đường như

không thay đổi màu tím đậm. Còn chủng đối chứng Aspergillus oryzae CNTP 5026

thì ngược lại, chủng này enzyme amylase thủy phân tốt cả trong môi trường đường

nên chỉ sau 24 giờ thì miếng tinh bột ở cả 4 nồng độ đường đều bị thủy phân hoàn.

3.7. Kết quả lên men rượu từ các chủng nấm mốc và nấm men thuần.

Từ các thí nghiệm trên, thấy rằng nhóm nấm mốc Rhizopus oryzae thuộc họ

Mucoraceae có tiềm năng ứng dụng làm men rượu trong sản xuất rượu truyền thống.

Do thời gian thực hiện luận văn có hạn nên các chủng R.oryzae đã được định danh,

và cho hoạt lực enzyme amylase cao của Trung tâm vi sinh vật công nghiệp được lựa

chọn cho thí nghiệm này.

Kế thừa 3 chủng nấm mốc Rhizopus oryzae BMM 111, BMM 131, BMM 1015

có hoạt lực amylase cao, 1 chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae BMQ 467 có

khả lên men cồn tốt, 1 chủng giả nấm men Saccharomycopsis ﬁbuligera và công thức

bổ sung giống của Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp -Viện Công nghiệp Thực phẩm,

3 mẫu rượu sử dụng 4 chủng nấm thuần làm giống khởi động đã được lên men. Sau

10 ngày lên men, dịch lên men được đo độ cồn bằng sôi kế ebulliometer và kết quả

được trình bày trong bảng 3.4. Đồng thời cũng so sánh với độ cồn của dịch lên men

sử dụng 15 mẫu bánh men đã thu thập.

Bảng 3.4. Kết quả đo độ cồn của dịch lên men rượu từ các chủng thuần và 15

mẫu bánh men

STT

Công thức

Mẫu

Độ cồn (%v/v)

R. oryzae BMM111

S. cerevisiae BMQ467

12,2

R. oyzae BMM131

S. cerevisiae BMQ467

12,2

R. oryzae BMM1015

S. cerevisiae BMQ467

12,0

R.oryzae BMM111

Chủng thuần khiết

S-copsis fibuligera BMQ908

S. cerevisiae BMQ467

12,2

R.oryzae BMM131

S-copsis fibuligera BMQ908

S. cerevisiae BMQ467

12,1

R.oryzae BMM1015

S-copsis fibuligera BMQ908

S. cerevisiae BMQ467

12,1

MQ1

12,9

MQ2

12,9

MQ3

12,7

MQ4

13,1

MQ5

12,9

MQ6

12,7

MQ7

12,3

Bánh men

MQ8

12,7

truyền thống

MQ9

10,8

MQ10

12,5

MQ11

13,1

MQ12

12,5

MQ13

11,9

MQ14

12,7

MQ15

11,7

Từ kết quả bảng 3.4 cho thấy độ cồn của các mẫu dịch lên men chỉ sử dụng

chủng thuần cho độ cồn khá cao và đồng đều, từ 12 -12,2 (%v/v), so sánh với các

mẫu dịch lên men khi sử dụng 15 mẫu bánh men đã thu thập thì cho độ cồn tương

đương. Số liệu này cho thấy rằng, trong sản xuất rượu, thay vì bổ sung bánh men, nhà

sản xuất chỉ cần bổ sung một chủng nấm mốc Rhizopus oryzae đóng vai trò quan

trọng trong quá trình đường hóa và một chủng nấm men đóng vai trò quan trọng trong

quá trình lên men cồn thì độ cồn của dịch lên men thu được tương đương với các mẫu

sử dụng bánh men truyền thống.

3.8.Phân nhóm mẫu rượu dựa trên kết quả các hợp chất bay hơi trong các mẫu

rượu thu thập và các mẫu sử dụng chủng thuần.

Sau khi đo độ cồn của dịch lên men mà ban đầu sử dụng chủng thuần như là

nguồn giống khởi động, tuy cho độ cồn cao tương đương với các mẫu sử dụng bánh

men truyền thống nhưng liệu rằng các mẫu rượu này có hương vị như thế nào, có

giống với các mẫu rượu truyền thống không, thí nghiệm phân tích hương rượu bằng

sắc kí khí kết nối với khối phổ đã được được thực hiện để minh chứng điều đó.

Các mẫu rượu được đo độ cồn bằng cồn kế, sau đó được pha loãng về 12% độ

cồn với nước deion để phân tích các hợp chất bay hơi trong rượu bằng phương pháp

sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS). Từ sắc kí đồ, dựa vào diện tích peak của chất

nội chuẩn với nồng độ nhất định (5ppm hay 4.04 µg/L) để tính nồng độ tương đối

cho các peak khác. Bảng 3.6 dưới đây cho thấy các nhóm hợp chất xuất hiện trong

các mẫu rượu chạy phân tích GCMS. Tổng cộng có 115 hợp chất bay hơi phân tích

được chủ yếu được xếp vào 8 nhóm chính: alcohol (30 chất), acid (23 chất), ester (24

chất), aldehyde (8 chất), furan (2 chất), phenol (4 chất), hydrocarbon (11 chất), ketone

(5 chất), các hợp chất khác (8 chất). Các nhóm hợp chất esters, alcohols, acids cũng

là các nhóm chất xuất hiện chủ yếu trong các mẫu rượu truyền thống Cambodia [18],

Trung Quốc [29] [27], Thái Lan [16].

Các hợp chất khác nhau có tần xuất xuất hiện và tỷ lệ khác nhau ở các mẫu

khác nhau. Tuy nhiên có một số các hợp chất điển hình ở các mẫu rượu truyền thống

đáng kể tới như với nhóm acid có 4 hợp chất điển hình là Acetic acid; n-Decanoic

acid; Octanoic acid; Pentanoic acid, 2-hydrox.

Bảng 3.5. Các nhóm hợp chất xuất hiện trong các mẫu rượu

Với nhóm alcohol có 4 hợp chất điển hình là 1,6,10-Dodecatrien-3-ol;1-

Butanol,3-methyl-; 1-Propanol, 2-methyl-; Phenylethyl Alcohol;

Với nhóm ester có số hợp chất điển hình nhiều nhất (9 hợp chất) đó là Acetic

acid, 2-phenylethyl; Butanedioic acid, diethyl; Decanoic acid, ethyl ester;

Dodecanoic acid, ethyl ester; Ethyl(s)-(-)-lactate; Ethyl Acetate; Hexadecanoic acid,

ethyl ester; Octanoic acid, ethyl ester; Tetradecanoic acid, ethyl ester; Chỉ một hợp

chất Furan điển hình là Furfural và một hợp chất khá là Silane, triethylfluoro-.

Hình 3.6. Các nhóm rượu khác nhau từ 32 mẫu rượu

Ký hiệu: C1-C13: nhóm 1-13

RQ: rượu quê/ RNM: rượu nhà máy Mỗi mẫu lặp lại 2 lần, thông tin cụ thể về mẫu ghi trong phụ lục S6. Chữ số thứ nhât ghi trong dấu ngoặc thể hiện mã kí hiệu mẫu theo file GCMS COM/LAB, chữ số thứ hai sau dấu phẩy là lần chạy mẫu 1 hoặc 2.

Từ 26 mẫu rượu thu thập (21 mẫu rượu quê, 3 mẫu rượu nhà máy, 2 mẫu rượu

màu) và 6 mẫu rượu sử dụng chủng thuần của Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp

sau khi phân tích và so sánh bằng thuật toán phân nhóm theo thứ bậc (agglomerative

hierarchical clustering) của phần mềm thống kê ORANGE chúng được chia thành 12

nhóm, được mô tả ở hình 3.5. Mỗi mẫu được lặp lại 2 lần.

Nhóm 1: mẫu rượu trắng nhà máy Vodka.

Nhóm 2: gồm 2 mẫu rượu màu là rượu Táo mèo và rượu Táo mèo- Đông trùng

hạ thảo.

Nhóm 3 và 4: mẫu rượu trắng nhà máy ở Tây Ninh

Nhóm 5 và 6: gồm 6 mẫu rượu trắng sử dụng các chủng thuần của TTVSVCN-

Viện CNTP.

Nhóm 7: rượu quê Lạc Đạo- Hưng Yên

Nhóm 8: rượu quê làng Vân-Bắc Giang

Nhóm 9: gồm 4 mẫu rượu quê Hương Sơn-Hà Tĩnh

Nhóm 10: gồm 2 mẫu Kim Sơn-Ninh Bình, 2 mẫu Gia Viễn-Ninh Bình, 1 mẫu

Xuân Trường-Nam Định, 1 mẫu Hải Hậu-Nam Định, 1 mẫu Bình Định.

Nhóm 11: gồm 3 mẫu là 2 mẫu Hiệp Hòa-Bắc Giang, 1 mẫu Yên Sơn-Tuyên

Quang.

Nhóm 12: gồm 2 mẫu Ý Yên-Nam Định, 1 mẫu Khoái Châu-Hưng Yên, 1 mẫu

Tân Độ-Phú Xuyên.

Như vậy, các nhóm rượu được chia khá rõ ràng như mẫu rượu nhà máy Vodka,

rượu nhà máy Tây Ninh, rượu màu Táo mèo được chia làm 3 nhóm riêng biệt và khác

xa so với rượu truyền thống (rượu quê). Với nhóm rượu sử dụng các chủng thuần

gồm 2 nhóm nhỏ (nhóm 5 và 6) cạnh nhau thì gần với nhóm rượu truyền thống hơn.

Bên cạnh đó, 26 mẫu rượu quê thì chúng lại được chia thành 6 nhóm nhỏ, khá đặc

trưng cho vùng địa lý. Vì vậy có thể thấy rằng, sản phẩm rượu của Việt Nam khá đa

dạng, có hương khác biệt và đặc trưng cho các loại rượu. Nhóm rượu sử dụng chủng

thuần tuy có sự khác biệt nhưng gần với rượu truyền thống, vậy các chủng thuần đã

sử dụng là những chủng có tiềm năng về công nghệ.

KẾT LUẬN

1. Đã phân lập được 101 chủng vi nấm từ 15 mẫu bánh men khác nhau thu

thập trên địa bàn Hà Nội và các tỉnh Hải Dương, Ninh Bình, Nam Định, Quảng Nam,

Đà Nẵng, Vĩnh Phúc, Lạng Sơn, Hòa Bình, Bắc Cạn.

2. Dựa trên các đặc điểm hình thái, phổ fingerprinting, phân tích trình tự rDNA

xác định 73 chủng nấm mốc chủ yếu thuộc họ Mucoraceae là Rhizopus oryzae chiếm

27 chủng và tiếp theo là Rhizopus microsporus (26 chủng), Mucor indicus (11 chủng),

Mucor circinelloides (3 chủng), Lichtheimia ramosa (3 chủng), Cunninghamella

echinulata (2 chủng), Cunninghamella bertholletiae (1 chủng). Trong số 16 chủng

nấm men phân lập được thì chủ yếu các chủng thuộc loài S.cerevisiae (14 chủng),

Wickerhamomyces anomalus (2 chủng). Còn giả men Saccharomycopsis ﬁbuligera

(12 chủng).

3. Nhóm R.oryzae thuộc họ Mucoraceae là nhóm có hoạt lực amylase cao nhất

trong tất cả các nhóm.

4. Hầu hết các chủng nấm mốc thuộc họ Mucoraceae đều thủy phân tinh bột

tốt ở 30°C, 35°C, mọc chậm ở 40°C, dường như không mọc ở 45°C và 50°C ngoại

trừ các chủng R.microsporus có khả năng chịu được nhiệt cao ở 45°C, 50°C.

5. Trong 48 giờ trong môi trường có tinh bột hay có cả tinh bột và đường thì

nhóm loài thuộc chi Mucor như Mucor indicus hay Mucor circinelloides dường như

không đóng vai trò thủy phân tinh bột, bên cạnh đó nhóm Rhizopus microsporus và

Rhizopus oryzae thủy phân tinh bột ngay cả trong môi trường đường, trong đó nhóm

Rhizopus oryzae thủy phân nhanh hơn Rhizopus microsporus.

6. Đã phân tích 26 mẫu rượu thu thập và 6 mẫu lên men bằng chủng thuần

khiết và kết quả cho độ cồn và phổ hương sản phẩm rượu từ chủng thuần khiết có độ

cồn cao, hương vị riêng nhưng có sự tương đồng với mẫu truyền thống. Như vậy, các

chủng R.oryzae đóng vai trò quan trọng trong lên men rượu truyền thống Việt Nam.

KIẾN NGHỊ

1. Nghiên cứu sâu hơn về quá trình thủy phân tinh bột bởi các chủng nấm mốc

Mucoraceae bằng kỹ thuật sinh học phân tử

2. Xây dựng thêm cơ sở dữ liệu bằng việc bổ sung số lượng mẫu rượu thu thập

và kết quả phân tích.

3. Phát triển kết hợp phân tích cảm quan và phân tích GC

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Đinh Đức Hiền (2014), Nghiên cứu phân loại nấm men Moniliella phân lập

tại Việt Nam, Luận văn Thạc sĩ khoa học, Viện Công nghiệp Thực phẩm.

2. Nguyễn Lê Hoàng (2010), Bài tiểu luận enzyme amylase, Trường Đại học

Kỹ thuật Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh.

3. Nguyễn Thị Thảo (2018), Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu đặc sản từ

hạt tam giác mạch Hà Giang, Khóa luận tốt nghiệp Đại học, Trường Đại

học khoa học Tự nhiên- ĐHQGHN.

Tiếng Anh

4. Amatayakul T., Somsap N., and Rotsatchakul P. (2012), “Study of volatile

compounds in Thai rice Wine (Sato) produced from wheat”, KKU Res J,

17(6), pp.939–949.

5. De Oliveira A.P.A., Silvestre M.A., Garcia N.F.L. và cộng sự. (2016),

“Production and catalytic properties of amylases from Lichtheimia ramosa

and Thermoascus aurantiacus by solid-state fermentation”, Sci World J,

pp.301-313.

6. Dolatabadi S., de Hoog G.S., Meis J.F. và cộng sự (2014),“Species

boundaries and nomenclature of Rhizopus arrhizus (syn. R. oryzae)”,

Mycoses, 57(3), pp.108–127.

7. Dolatabadi S., Scherlach K., Figge M. và cộng sự. (2016), “Food

preparation with mucoralean fungi: A potential biosafety issue?”, Fungal

Biol, 120(3), pp.393–401.

8. Dung N.T.P., Rombouts F.M., and Nout M.J.R. (2006), “Functionality of

selected strains of moulds and yeasts from Vietnamese rice wine starters”,

Food Microbiol, 23(4), pp.331–340.

9. Dung N.T.P., Rombouts F.M., và Nout M.J.R. (2005), “Development of

defined mixed-culture fungal fermentation starter granulate for controlled

production of rice wine”, Innov Food Sci Emerg Technol, 6(4), pp.429–

441.

10. Dung N.T.P., Rombouts F.M., và Nout M.J.R. (2007), “Characteristics of

some traditional Vietnamese starch-based rice wine fermentation starters

(men)”, LWT - Food Sci Technol, 40(1), pp.130–135.

11. Huang Z.R., Guo W.L., Zhou W. Bin (2019), “Microbial communities and

volatile metabolites in different traditional fermentation starters used for

Hong Qu glutinous rice wine”, Food Res Int, 121, pp.593–603.

12. Hussain S.Z. and Maqbool K. (2014), “GC-MS: Principle, Technique and

its application in Food Science”, Int J Curr Sci, 13, pp.116–126.

13. Jung H., Lee S.J., Lim J.H. (2014), “Chemical and sensory profiles of

makgeolli, Korean commercial rice wine, from descriptive, chemical, and

volatile compound analyses”, Food Chem, 152, pp.624–632.

14. Keikhosro K., Zamani Akram J.,(2013), “Mucor indicus: Biology and

industrial application perspectives: A review”, Biotechnology Advances,

31, pp.466–481.

15. Kirk PM, Cannon PF, Minter DW, Stalpers JA (2008). Dictionary of the

Fungi (10th ed.). Wallingford

16. Kurtzman C.P., Vesonder R.F., và Smiley M.J. (1973), “Formation of

extracellular C14-C182 D hydroxy

fatty acids by species of

Saccharomycopsis”, J Appl Microbiol, 26(4), pp.650–652.

17. Li Y.N., Shi G.Y., Wang W. và cộng sự. (2010), “A newly isolated

Rhizopus microsporus var. chinensis capable of secreting amyloytic

enzymes with raw-starch-digesting activity”, J Microbiol Biotechnol,

20(2), pp.383–390.

18. Ly S., Mith H., Tarayre C. (2018), “Impact of microbial composition of

Cambodian traditional dried starters (dombea) on flavor compounds of rice

wine: Combining amplicon sequencing with HP-SPME-GCMS”, Front

Microbiol, 9, pp.1–15.

19. Miller G.L.

(1959),“Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent

for

Determination of Reducing Sugar”, Anal Chem, 31(3), pp.426–428.

20. Peixoto-Nogueira S.C., Sandrim V.C., Guimarães L.H.S. và cộng

sự.(2008), “Evidence of thermostable amylolytic activity from Rhizopus

microsporus var. rhizopodiformis using wheat bran and corncob as

alternative carbon source”, Bioprocess Biosyst Eng, 31(4), pp.329–334.

21. Restek (2002),“Analyzing Alcoholic Beverages by Gas Chromatography”,

Appl Note, 3, pp.16-18.

22. Tiwari S., Srivasta and R., Singh C. (2015), “Amylases: an Overview With

Special Reference To Alpha Amylase”, Journal of Global Biosciences, 4,

pp. 1886-1901.

23. Thanh V.N., Mai L.T., and Tuan D.A. (2008), “Microbial diversity of

traditional Vietnamese alcohol fermentation starters (banh men) as

determined by PCR-mediated DGGE”, Int J Food Microbiol, 128(2),

pp.268–273.

24. Thanh V.N., Thu Huong N.T., and Quynh Anh N.T. (2005), “Conservation

of the biodiversity of Vietnam traditional alcohol fermentation starters”,

MSA Golden Jubilee International Science Congress (ISC), pp.3–6.

25. Thanh V.N., Thuy N.T., Chi N.T. và cộng sự. (2016), “New insight into

microbial diversity and functions in traditional Vietnamese alcoholic

fermentation”, Int J Food Microbiol, 232, pp.15–21.

26. Walther G., Pawłowska J., Alastruey-Izquierdo A. (2013), “DNA

barcoding in Mucorales: An inventory of biodiversity”, Persoonia Mol

Phylogeny Evol Fungi, 30, pp.11–47.

27. Wang P., Mao J., Meng X. và cộng sự. (2014), “Changes in flavour

characteristics and bacterial diversity during the traditional fermentation of

Chinese rice wines from Shaoxing region”, Food Control, 44, pp.58–63.

28. Wiśniewska P., Śliwińska M., Dymerski T. và cộng sự. (2015),

“Application of Gas Chromatography to Analysis of Spirit-Based

Alcoholic Beverages”, Crit Rev Anal Chem, 45(3), pp.201–225.

29. Xu E., Long J., Wu Z. (2015), “Characterization of Volatile Flavor

Compounds in Chinese Rice Wine Fermented from Enzymatic Extruded

Rice”, J Food Sci, 80(7), pp.1476–1489.

30. Yang S., Choi S.J., Kwak J. và cộng sự. (2013), “Aspergillus oryzae strains

isolated from traditional Korean Nuruk: Fermentation properties and

influence on rice wine quality”, Food Sci Biotechnol, 22(2), pp.425–432.

PHỤ LỤC

S1. Danh sách các mẫu bánh men đã thu thập

Mã ký

Thời gian

STT

Bánh men

Địa chỉ

Dạng men

hiệu

thu thập

Men Kim Sơn,

Nhà bác Trần Văn Hải, xóm 5, xã Quang

Bánh men trắng

MQ1

1/5/2018

Ninh Bình

Thiện, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh bình

đục, đk 5 cm

Men Tuyên

Nhà Ông Hòa, thôn Làng Hản, xã Kim

Bánh men tròn,

MQ2

17/6/2018

Quang

Quan, huyện Yên Sơn, tỉnh Tuyên Quang

màu tối, đk 5 cm

Men thuốc bắc,

Quán men rượu Ngọc Minh, 42 Quán

Bánh men trắng

MQ3

10/6/2018

Quán Gánh

Gánh

ngà, đk 4.5 cm

CS sx men rượu Đức Ngọ, Thôn Tam

Men viên, màu

MQ4

Men Đức Ngọ

10/6/2016

Đồng, xã Thái Thụy, TP. Thái Bình

trắng, đk 3 cm

Nhà Chú Đinh Văn Riễn, xóm 12, xã Hải

Men viên trắng,

MQ5

Men Nam Định

20/5/2018

Tây, huyện Hải Hậu, tỉnh Nam Định

đk 3 cm

Nhà Anh Phạm Văn Hậu, Làng vọc, xã

Men dạng viên,

MQ6

Men Hà Nam

12/6/2018

Vũ Bản, Huyện Bình Lục, tỉnh Hà Nam

đk 4 cm

Bánh men trắng

Nhà Cô Đặng Thị Xuyến, Thôn Tân Độ,

MQ7

Men Tân Độ

vàng, dày, đk 8

22/7/2018

xã Hồng Minh, huyện Phú Xuyên, Hà Nội

Nhà Chú Sông Láng, thôn Trình Viên, xã

Men bánh, hơi

MQ8

Men Sông Láng

22/7/2018

Phú Túc, huyện Phú Xuyên, Hà Nội

vàng, đk 6 cm

Men Bánh, màu

Nhà Bác Nguyễn Thị Sáu, thôn Ngọc, xã

MQ9

Men Hưng Yên

vàng cám, đk 8.5

22/7/2018

Lạc Đạo, huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên

CS Hồng Thắm; 19/27 Giải Phóng, Tổ 6,

Men viên, trắng,

MQ10 Men Đức Hùng

Khối 7, Phường Tân Lợi, TP. Buôn Ma

6/5/2018

đk 3cm

Thuột, Tỉnh Đắk Lắk

Cơ sở chế biến men Trung Tiến, thôn

Dạng bột

Men Trung Tiến

MQ11

Tam Đông, xã Thụy Hải, huyện Thái

(Túi nhỏ 100

15/7/2018

(Hương Nếp)

Thụy, Thái Bình

gram)

Bánh to, dẹt,

Gia đình Bác Thóc, xóm 14 Xuân Kiên,

MQ12

Men Kiên Lao

đường kính 11

5/8/2018

Xuân Trường, Nam Định

Men Bá Dương

Bánh to, trắng

Nhà Bác Canh Giới, làng Bá Dương Nội,

MQ13

Nội, Đan

ngà, đường kính

5/8/2018

xã Hồng Hà, huyện Đan Phượng, Hà Nội

Phượng

8 cm

CS men Trường Nguyên. 155/21 Mai Hắc

Dạng bột (gói

MQ14 Men Hương Lúa

Đế - TP. Buôn Mê Thuột

nhỏ 100g)

MQ15 Men Bắc Giang

Bánh tròn, nhỏ

S2. Thông tin các mẫu rượu Lab

Thí

Mã số

Miêu tả tóm tắt

nghiệm

S. cerevisiae BMQ 467, Rhizopus oryzae BMM 111.

LAB1

EXP1

Gạo nếp cái hoa vàng, lên men 10 ngày

S. cerevisiae BMQ 467, Rhizopus arrhizus BMM 131.

LAB2

EXP2

Gạo nếp cái hoa vàng, lên men 10 ngày

S. cerevisiae BMQ 467, Rhizopus arrhizus BMM 1015.

LAB3

EXP3

Gạo nếp cái hoa vàng, lên men 10 ngày

S. cerevisiae BMQ 467, Saccharomycopsis fibulugera BMQ 908,

Rhizopus oryzae BMM 111.

LAB4

EXP4

Gạo nếp cái hoa vàng, lên men 10 ngày

S. cerevisiae BMQ 467, Saccharomycopsis fibulugera BMQ 908,

Rhizopus arrhizus BMM 131.

LAB5

EXP5

Gạo nếp cái hoa vàng, lên men 10 ngày

S. cerevisiae BMQ 467, Saccharomycopsis fibulugera BMQ 908,

Rhizopus arrhizus BMM 1015.

LAB6

EXP6

Gạo nếp cái hoa vàng, lên men 10 ngày

S3. Danh sách các chủng đọc trình tự 10/2018

>MQF4.2

ITS4 VT2503

TAGTTAAAGAGCATTAAAATATCTGCTGGCTGGCAGAACCCCTAGATTAAATGTTTTTTGGTTGGACCAAAAAAGCACGAT

GGCTAGGTAGTTCGTAATTTAATGAAAATTACAAAGAGGCTGTATTTTAGACAATCGGTATAATAATTAAATCTAACCGAA

TTTGTCCATCACCACATAAAATAAATTTTATGTGTGGGTTGGTTATGATACTGAAGCAAGCGTACTCTATAGAAGATCCAT

AGAGTGCAAGCTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACGTTCTTCA

TCGATGCGAGAACCAAGAGATCCATTGTTAAAAGTTGTTATTATATTATACTTTCAATTCTGAATTCATGGTATATGGTAA

AGGGTACCAGGCGCCTTCCTTCCCAAAGGAAGAAAGGTAATCCTGATTGGCATCGATCAAACCCCAGAACAGGCCTACCCA

TTATAGCCTATATGTCCTGAGTCTCTCCCGAAGGTCAGTTACGACCTTCATCGCCAGAGGTTCACAGTATAGAAGCAAACA

ATACTGAGAAGTAAATCCCAGTAAAGTGCCAATACATTAGTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTA

CGACTTTTACTTC

Rhizopus microsporus

Sequence ID: AB381937.1

Identities 661/661(100%)

>MQF5.3

ITS4 VT2504

GACTTCAGATCATAGTTAAAGATCATTAAAATATCTGCTGGCTAGCAGAACCCCTAGATTATATGTTTTTTGGTTGGACCA

AAAAAGCACGATGGCTAGGTAGTTCGTAATTTAATGAAAATTACAAAGAGGCTGTATTTTAGACAATCGGTATAATAATTA

AATTTAACCGAGCTTGTCCATCACCACATAAAATAAATTTTATGTGTGGGTTGGTTATGATACTGAAGCAAGCGTACTCTA

TAGAAGATCCATAGAGTGCAAGCTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTG

CTACGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCATTGTTAAAAGTTGTTATTATATTATACTTTCAATTCTGAATTCAT

GGTATATGGTAAAGGGTACCAGGCACCTTCCTTCCCAAAGGAAGAAAGGTAATCCTGATTGGCATCGATCAAACCCCAGAA

CAGGCCTACCCATTATAGCCTATATGTCCTGAGTCTCTCCCGAAGGTCAGTTACGACCTTCATCGCCAGAGGTTCACAGTA

TAGAAGCAAACAATACTGAGAAGTAAATCCCAGTAAAGTGCCAATACATTAGTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACG

GAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCC

Rhizopus microsporus

Sequence ID: KF800237.1

Identities: 674/674(100%)

>MQF12.1

ITS4 VT2505

AGATCAAGTTTAAAAAGTTATTTGGGAGGCCCAAAAAGCGGACATCAACATGCTTTACCTTTTCAAAATTAAAAAAGTATC

GGCACTCAATCCACGATATGGCCTGACTTTATTTAAAATGTCTCAACTTGTAAGGTTGCTACACTCATATCTATTCAAAAA

AAGAATTTTGAATAAGGGTTGTTTTTGATACTGAAACAGGCGTACTCAATGGAATACCATTGAGTGCAAGATGCGTTCAAA

GACTCGATGATTCACTGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGA

TCCATTGTTAAAAGTTGTTTTATAGATTTTTTAGGTCTATGTTACAATATTTTAAACTGAATTCTTTTGGTAAGTAATAAT

CGGGTACCAAGCATCAAGCTTGACTATGACTAGGTTAACATTCCATAGGCCTACCCTTATAGCCTAAAGACATCCCCTTAT

ACGTCATAAATAAAAACAGTTCACAGTAAATAAGATAATTATTGAATTATCAGATTATTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCA

CCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCT

Mucor indicus

Sequence ID: KP132475.1

Identities: 586/586(100%)

>MQF2.4

ITS4 VT2506

GACTTCAGATCATAGTTTGAAAGTTGCTGGATTATACTCTTGTACTTTACTTCCTGGGCGAACCAAAGAAAAAGATCCTGA

GACCAGCGTAATATTCCTGCCTAGCAAGCCAGACAGAAAATCACACACATTTTAGGTGCTCACTGTAATAAAACAGCGATG

CGACCCATTACCACATAAACAAATGTTATGTGTGGGTTTGTGATGATACTGAAGCAGGCGTACTCTATAGAAAAACCATAG

AGTGCAAGCTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACGTTCTTCAT

CGATGCGAGAACCAAGAGATCCATTGTTAAAAGTTGTTTTTTATTAAACTTTATAATACTGAATTTCTAGGTTTATTATGA

AGGGTGCTCCTGAAACCAGGAGTGGCATCGATCAAACCCCAGATAGGTCTACCCATGACCAGTCTGAGTCTCTCAGCCAAA

TTTTCACAGTGTAGAAGCAATCACTTACCCCAGAGGAAACCCTAAGGTAAGGCGCTTTAACATAATTAATGATCCTTCCGC

AGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCTCT

Rhizopus oryzae

Sequence ID: MG669195.1

Identities: 609/611(99,67%)

>MQF2.5

ITS4 VT2507

TCATAGTTTGAAAGTTACTGGATTATACTCTTGTACTTTACTTCCTGGGCGAACCAAAAAAAAAGATCCTGAGACCAGCGT

AATATTCCTGCCTAGCAAGCCAGACAGAAAATCACACACATTTTAGGTGCTCACTGTAATAAAACAGCGATGCGACCCATC

ACCACATAAACAAATGTTATGTGTGGGTTTGTGATGATACTGAAGCAGGCGTACTCTATAGAAAAACCATAGAGTGCAAGC

TGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACGTTCTTCATCGATGCGAG

AACCAAGAGATCCATTGTTAAAAGTTGTTTTTTATTAAACTTTATAATACTGAATTTCTAGGTTTATTATGAAGGGTACTC

CTGAAACCAGGAGTGGCATCGATCAAACCCCAGATAGGTCTACCCATGACCAGTCTGAGTCTCTCAGCCAAATTTTCACAG

TGTAGAAGCAATCACTTACCCCAGAGGAAACCCTAAGGTAAGGCGCTTTAACATAATTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACC

TACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCTCTA

Rhizopus oryzae

Sequence ID: MG669209.1

Identities: 601/601(100%)

>MQF1.3

ITS4 VT2508

ACTTCAGATCATAGTTTGAAAGTTGCTGGATTATACTCTTGTACTTTACTTCCTGGGCGAACCAAAGAAAAAGATCCTGAG

ACCAGCGTAATATTCCTGCCTAGCAAGCCAGACAGAAAATCACACACATTTTAGGTGCTCACTGTAATAAAACAGCGATGC

GACCCATTACCACATAAACAAATGTTATGTGTGGGTTTGTGATGATACTGAAGCAGGCGTACTCTATAGAAAAACCATAGA

GTGCAAGCTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACGTTCTTCATC

GATGCGAGAACCAAGAGATCCATTGTTAAAAGTTGTTTTTTATTAAACTTTATAATACTGAATTTCTAGGTTTATTATGAA

GGGTGCTCCTGAAACCAGGAGTGGCATCGATCAAACCCCAGATAGGTCTACCCATGACCAGTCTGAGTCTCTCAGCCAAAT

TTTCACAGTGTAGAAGCAATCACTTACCCCAGAGGAAACCCTAAGAGGTAAGGCGCTTTAACATAATTAATGATCCTTCCG

CAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCTC

Rhizopus oryzae

Sequence ID: MH864361.1

Identities: 609/609(100%)

>MQF10.5

ITS4 VT2509

CAGATCATAGTTTGAAAGTTACTGGATTATACTCTTGTACTTTACTTCCTGGGCGAACCAAAAAAAAAGATCCTGAGACCA

GCGTAATATTCCTGCCTAGCAAGCCAGACAGAAAATCACACACATTTTAGGTGCTCACTGTAATAAAACAGCGATGCGACC

CATCACCACATAAACAAATGTTATGTGTGGGTTTGTGATGATACTGAAGCAGGCGTACTCTATAGAAAAACCATAGAGTGC

AAGCTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACGTTCTTCATCGATG

CGAGAACCAAGAGATCCATTGTTAAAAGTTGTTTTTTATTAAACTTTATAATACTGAATTTCTAGGTTTATTATGAAGGGT

ACTCCTGAAACCAGGAGTGGCATCGATCAAACCCCAGATAGGTCTACCCATGACCAGTCTGAGTCTCTCAGCCAAATTTTC

ACAGTGTAGAAGCAATCACTTACCCCAGAGGAAACCCTAAGGTAAGGCGCTTTAACATAATTAATGATCCTTCCGCAGGTT CACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCTCT

Rhizopus oryzae

Sequence ID: KT899481.1

Identities: 604/604(100%)

>MQF9.4

ITS4 VT2510

AGATGTGAGTTTGTTTAAGAGAAGACCCAAGTTAGATCCTCTCGCTAGTCCGTAAAGATTAAGACCTAGTTCAAGAAGAGA

CTGATTGACTTGGAATTATGAACTCACTAACCAAGTCGTTGCTCCTCAGGCACTCTAGAGTCTACATCCGGCAAATGACTA

AAGCCAATTGCCTAGGACTAAATGTATTTAAGGCCATGACAGCAACTGAATGCCATCAACACAAGCCCATTTCCAGCTCGC

TTAGGTTCAAAGAACCAAGTTGAACTGATTGGTAGTTGCAGATACTGAAACAACTGTGCCTAGTAGATTGACTACTAGGCG

CAAGATGCGTTCGAGAACTCGATGATTCGCTATGAATGCAAGTCGCAATAATTATCGCACTTTGCTACGCTCTTCATCGAT

GCGAGAACCAAGAGATCCATTGCCAAGAGTTGTTTTTAAGTTAACAACTAACTTTTTCGTACATCATGGTTTACACGAGAA

GAATAAACACCTTTGGGGATAGTTAGTACTAGAGCCCCAAAGGCTTGCCTTGCTTGCTTTGACTCGAGACATAGGTCTCCT

GAAAGAAGGGTCCATACGTCTCTTTTCAAGCAGCCTAGATCTTAGTAGTGGCACAAGTCTCCTAAAAGGAGGGTCTCTATG

CCAACAACCAGATCTACAGCACAAGGCAGAGCCAACCAAGTTGACCCGACTTTGCACAAAACTGTGAGGAACTACTAGAGG

GGAAGAGACCCCCAACTAGTGGTTTTTTAGACCTCTCAGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACG

ACTTTTACTTCC

Lichtheimia ramose

Sequence ID: KY828893.1

Identities: 817/820(99%)

>MQF2.2

ITS4 VT2511

ATTTAAAAAAAGTATTATTTGGGAGGCCCCAGCACAGTTTACCGCAAGAGCTTCTCTTTATATTAAAAAAAAGTTCAGGCA

TTCAAACAAGATCAGGCCTTTGTACATTTCAAGAGGTTCGAGATCAGAATAGATCAAGAGACTCTCAGTATTCCTATTCAA

CAAAATGTTGGATAGAGGGTTTGTTTTGATACTGAAACAGGCGTGCTCATTGGAATACCAATGAGCGCAAGTTGCGTTCAA

AGACTCGATGATTCACTGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAG

ATCCGTTGTTAAAAGTTGTTTTATAGATTTTTTAGGTCTATGTTACAATATTAATTCTGAATTCTTTTGGTAAATAATAAT

AGGATACCAAGCCTAAGCTTGATTATGACTCGGTTAGCATCTCCACCGCCTATCCTTATAGCAGTGGAGCATCCCTCAAGC

GTCAAGTAATAATACATTTCACAGTAAATAGATAATAATGGACAAGCCAAAATTATTGATTATTTAATGATCCTTCCGCAG GTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCC

Mucor circinelloides

Sequence ID: KT336541.1

Identities: 602/604(99.69%)

>MQF8.4

ITS4 VT2512

TTTCAGATCAAGTTTAAAAAGTTATTTGGGAGGCCCAAAAAGCGGACATCAACATGCTTTACCTTTTCAAAATTAAAAAAG

TATCGGCACTCAATCCACGATATGGCCTGACTTTATTTAAAATGTCTCAACTTGTAAGGTTGCTACACTCATATCTATTCA

AAAAAAGAATTTTGAATAAGGGTTGTTTTTGATACTGAAACAGGCGTACTCAATGGAATACCATTGAGTGCAAGATGCGTT

CAAAGACTCGATGATTCACTGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAA

GAGATCCATTGTTAAAAGTTGTTTTATAGATTTTTTAGGTCTATGTTACAATATTTTAAACTGAATTCTTTTGGTAAGTAA

TAATCGGGTACCAAGCATCAAGCTTGACTATGACTAGGTTAACATTCCATAGGCCTACCCTTATAGCCTAAAGACATCCCC

TTATACGTCATAAATAAAAACAGTTCACAGTAAATAAGATAATTATTGAATTATCAGATTATTTAATGATCCTTCCGCAGG

TTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCTCTA

Mucor indicus

Sequence ID: KP132475.1

Identities: 590/590(100%)

>MQF10.2

ITS4 VT2513

ATCAAGTTTAAAAAGTTATTTGGGAGGCCCAAAAAGCGGACATCAACATGCTTTACCTTTTCAAAATTAAAAAAGTATCGG

CACTCAATCCACGATATGGCCTGACTTTATTTAAAATGTCTCAACTTGTAAGGTTGCTACACTCATATCTATTCAAAAAAA

GAATTTTGAATAAGGGTTGTTTTTGATACTGAAACAGGCGTACTCAATGGAATACCATTGAGTGCAAGATGCGTTCAAAGA

CTCGATGATTCACTGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATC

CATTGTTAAAAGTTGTTTTATAGATTTTTTAGGTCTATGTTACAATATTTTAAACTGAATTCTTTTGGTAAGTAATAATCG

GGTACCAAGCATCAAGCTTGACTATGACTAGGTTAACATTCCATAGGCCTACCCTTATAGCCTAAAGACATCCCCTTATAC

GTCATAAATAAAAACAGTTCACAGTAAATAAGATAATTATTGAATTATCAGATTATTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACC

TACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCTCTA

Mucor indicus

Sequence ID: MH855050.1

Identities: 573/573(100%)

>MQF8.6

ITS4 VT2515

CCAAAAAAATGGAAAAGTGGGCAAAAGAATTCGTAAAGAACTCTTGAGCTTTTTTTCCCATCAGGAGTCAAAATGATTTAT

AACTCTAGATGTAAAAACATTAAAGCCAATTCTATCATAATTCTTTTTTGCAAAAGGATTAGTCAAGAATTTAACCTTAAC

AGATATTTAAGTCGAGGGTAATCGGGCGTCCCACAGTCGCATCATGTCCTTCAATGAAGAAGGCTGACAAAGGCAAGTTAG

GTTCTTTACTATGCTCCTACCTCCTAGCACCGAGCTTATACCATAAAGATATAAGGGCGGGTAGTGATAGAATTCCGTCAG

GTATAGTCAATAAAGACTATAGCACAGCTTACCCAGGACCATTTATAATTTATCTCTGATCTCATTCTCTATAAAAAAATA

GGATTGAGGGAGATGTTTGAATGGTACTGAAACAGATGTACCCTACGGAATACCATAGGGTGCAAGATGCGTTCAAAGATT

TGATGATTCACTATAGGCAGATCACATTAAATATCGCGATTTGCTGCGTTCTTCATCGATACGAAAGCCGAGAGATCCATT

GCTGAAAGTTGTTTTTATATAAATTAATATATTTTTAAAACAACCATAAATTATGGTCAATCGTTTATTCAGTAAATTTAG

TATAAAAAAATTAATAATATGGTTTTTTAGGCCATATTATAAATAAATAAAGAGTAACCCGAAAGTTAACCCTTTAAAAAA

AAACATTGCGCATGTGGTTTGACCCACATTATGGATGAATTAATGGTGAAAAAGGTTTTTTAAAGCCTTATTCCCCACAAA

TAGTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTT

Cunninghamella echinulata

Sequence ID: JX312541.1

Identities: 843/844 (99.8%)

>MQF 12.2

ITS4 VT2522

TGATTTCAGGCCAAGATTTTAAAAAATATAAGAATGGCTATAAACTTAATAGAAAATAAAAATCTATTAAAGCCGACTAGG

TTTTTACTAGATGCAAGATCTGGTAAAAAAAAGTCGAGCCTTATATTTAGGCCGAGAGTGGTTCTTTTTAATAAAAAAAAA

AAAAGAATCACCAGGACCAGTAATAATTTATCTCTTTTTTTTCTATCATCAAGGATAGAGAGAGATTTATTAGGGGTACTG

AAACAGACGTACCTTATGGAATACCATAAGGGGCAAGATGCGTTCAAAGATTTGATGATTCACTATAGGCAGATCACATTA

CATATCGCGATTTGCTGCGTTCTTCATCGATACGAAAGCCGAGAGATCCATTGCTGAAAGTTGTTTTTTTGTTTAATTATA

ATAAAAAACAACCATAGATTTATGGTCTATCAGTTCAGTAAAATTTAGTATAATAAAAGTAATCTTATCCCCTTTACAAGA

GGTGCCCATCATTAATCTCCCCCCCCCTAAAAAGAGAGAGAAAATAATGAACAACTACCCAAAAATCCCTTGATCTAAGGA

TAAACTCAAGGGGCAGCACTAGACTGAACCAGGCACAAGCGTTAAAAAACATTTCCCACACTGGGGANAAGTTTTTTAAGT CAAAAAAAAATACCCTTTTTCAAACTATTCTTTT

Cunninghamella bertholletiae

Sequence ID: JN205875.1

Identities: 673/682 (98.68%)

>MQY4.1 NL4 VT2516

TCCTTGACTTACGTCGCAGTCCTCAGTCCCAGCTGGCAGTATTCCCACAGGCTATAATACTTACCGAGGCAAGCTACATTC

CTATGGATTTATCCTGCCACCAAAACTGATGCTGGCCCAGTGAAATGCGAGATTCCCCTACCCACAAGGAGCAGAGGGCAC

AAAACACCATGTCTGATCAAATGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCAT

CTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTAGAGCTG

CATTCCCAAACAACTCGACTCTTCGAAGGCACTTTACAAAGAACCGCACTCCTCGCCACACGGGATTCTCACCCTCTATGA

CGTCCTGTTCCAAGGAACATAGACAAGGAACGGCCCCAAAGTTGCCCTCTCCAAATTACAACTCGGGCACCGAAGGTACCA

GATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTAAGGCAATCCCGGTTGGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGAT

ATGCTTAAGTTCAGCGGGTACTCCTACCTGATTTGAGGTCAAACTTTAAGAACATTGTTCGCCTAGACGCTCTCTTCTTAT

CGATAACGTTCCAATACGCTCAGTATAAAAAAGATTAGCCGCAGTTGGTAAAACCTAAAACGACCGTACTTGCATTATACC

TCAAGCACGCAGAGAAACCTCTCTTTGGAAAAAAAAACATCCAATGAAAAGGCCAGCAATTTCAAGTTAACTCCAAAGAGT

ATCACTCACTACCAAACAGAATGTTTGAGAAGGAAATGACGCTCAAACAGGCATGCCCCCTGGAATACCAAGGGGCGCAAT

GTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCG

AGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTTAATATTTTAAAATTTCCAGTTACGAAAATTCTTGTTTTTGACAAAAATTT

AATGAATAAATAAAATTGTTTGGGTTTGTTACCTCTGGGCCCCGATTGCTCGAATGCCCAAAGAAAA

Saccharomyces cerevisiae

Sequence ID: EU649672.1

Identities: 1117/1120(99.73%)

>MQY11.3 NL4 VT2517

GTCAAAGACGCAGCCCTCGATCCAGACAGGCAATATCAGCAGAAGCTATAACACTCCACCGAAGTGAAGCCACATTCAACT

ACCATTATCTTGCCATCCGAATCGATGCTGGCCCAGTGAAATACGAGTGCACAACTCAAGAAGAGAAGATAATCGTAAAAC

ACCAAGTCTGATCTAATGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTC

CATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTAGAGCTGCATTC

CCAAACAACTCGACTCTTCGATAGCACCTTACATAGGAATGGGCATCTCATCAGACGGGATTCTCACCCTCTATGACGTCC

TGTTCCAAGGAACATAGACAAGAGCCAAACCCAAGGTTACCATCTTCAAATTACAACTCGAACACCGAAGGTGCTAGATTT

CAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTAAGGCAATCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCT

TAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTTGAGGTCAAACTTTTAGTTTAATTGTTAAGCCGAGCCTAAAATACTATTCATC

TGCCTAGCTGATATAACGAGTTGGAAGAACCTAATACATTATTTCAGAAAGACGTATAAATTAGTACACTCTTGCTAAGAC

ATGATTTCAAGTTAACCCTATTTAACAGAGTATCACTCAATACCAAACCCAAAGGTTTGAGAGAGAAATGACGCTCAAACA

GGCATACCCTCTGGAATACCAGAGGGTGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGAAAATCTGCAATTCACAATA

Wickerhamomyces anomalus

Sequence ID: LC120363

Identities: 866/899 (99.6 %)

>MQS14.1 NL4 VT2518

TCCTTGCCGAGCGCAGTCCTCAGTCCCAGCAAGTAGATCTCCCCAAGACTATAACACTCCCCGAAGGAAGCCACATTTCAA

GGGGTACTCTACCGCTAAAACTGATATTGGCCCGGTGAAAAACGAGTGCACAGTCCAAGAAGAACTGATAATCATTAAACA

CCAAGTCTGACCTCAAGCCCTTCCCTTTCAGCAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTCTTCAGAGTTCTTTTCATCTTTCC

ATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTAGAGCTGCATTCC

CAAACAACTCGACTCTTCGATAGAATCCCACAAAGAGTAGTATCCAAAATCATACGGGGTTCTCACCCTCTATGACGTCCT

GTTCCAAGGAACATAGATAAAGGACTACTCAAGGAAACTATCTTCAAATTACAACGCGAACACCGAAGGTGCTAGCTTTCA

AATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTAAGGCAATCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTA

AGTTCAGCGGGTATCCTTACCTGATTTGAGGTCAAAATTAATGACAAAGTTATAAGGCCTTGATACACGAGTAAGTCCTTC

GCAAAAGGGTATTTAATAAGTTGGTAGAACCTAATATTAAATCCTTAAGCAAATATATGGAAAACTCAATCAATTGCCAAG

TCATTTCAAAGGAGTTAGCAGAAGCTAACACAACCTTCAATACTAAACCCAAAGGTTTAAGAGAGAAATGACGCTCAAACA

GGCATGCTCTATAGAATACTATAGAGCGCAATATGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGAAAATCTGCAATTCACATTACT

TATCGCAATTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTTTAAACTTTTAGTTTGTAAAA

TCGACTAGTTGTAATTAAAAAAATACATTTCTCTTAAAAAGAGATCTGAGTTTAAAAAGCTGAATAAGATTTAGCAATCAA

TCTTCATCCTTTCGAATGAAAACCAACAAACTAAACCAAATTCGCAAACAAAAACACTGTGTATAAGAAGTTTATTAAACC

GCGCAGTTAA

Saccharomycopsis fibuligera

Sequence ID: CP012809.1

Identities: 1143/1145(99%)

S4. Một số hình ảnh sắc kí đồ chạy máy GCMS

S5. Danh sách tên chủng phân lập được từ 15 mẫu bánh men

Trình tự đã

PP

đọc

ST

Chủng

Loài

Mẫu bánh men

Nguồn mẫu

định

T

D1/D

IT

tên

S

2

MQF 4.2

R.microsporus Men Đức Ngọ

Thái Thụy, Thái Bình

Seq

Finge

MQF 4.4

R.microsporus Men Đức Ngọ

Thái Thụy,Thái Bình

Finge

MQF 5.2

R.microsporus Men Nam Định

Hải Hậu, Nam Định

Finge

MQF 5.6

R.microsporus Men Nam Định

Hải Hậu, Nam Định

Finge

MQF 6.4

R.microsporus Men Hà Nam

Bình Lục, Hà Nam

Finge

MQF 6.5

R.microsporus Men Hà Nam

Bình Lục, Hà Nam

Finge

MQF 7.2

R.microsporus Men Tân Độ

Phú Xuyên, Hà Nội

Finge

MQF 8.3

R.microsporus Men Sông Láng

Phú Xuyên, Hà Nội

Finge

MQF 9.5

R.microsporus Men Hưng Yên

Văn Lâm, Hưng Yên

Finge

10 MQF 10.3 R.microsporus Men Đức Hùng

TP. Buôn Ma Thuột, Tỉnh Đắk Lắk

Finge

11 MQF 11.1 R.microsporus Men Trung Tiến

Thái Thụy, Thái Bình

Finge

12 MQF 12.5 R.microsporus Men Kiên Lao

Xuân Trường, Nam Định

Finge

13 MQF 14.3 R.microsporus Men Hương Lúa

Mai Hắc Đế - TP. Buôn Mê Thuột

Finge

14 MQF 14.7 R.microsporus Men Hương Lúa

Mai Hắc Đế - TP. Buôn Mê Thuột

Finge

15 MQF 14.8 R.microsporus Men Hương Lúa

Mai Hắc Đế - TP. Buôn Mê Thuột

Finge

16 MQF 15.3 R.microsporus Men Bắc Giang

Trung tâm VSVCN

Finge

17 MQF 10.1 R.microsporus Men Đức Hùng

TP. Buôn Ma Thuột, Tỉnh Đắk Lắk

Men Bá Dương

Finge

18 MQF 13.1 R.microsporus

Nội

Đan Phượng, Hà Nội

19 MQF 1.2

R.microsporus Men Kim Sơn

Kim Sơn, Ninh bình

Seq

Finge

20 MQF 4.1

R.microsporus Men Đức Ngọ

Thái Thụy, TP. Thái Bình

Finge

21 MQF 4.5

R.microsporus Men Đức Ngọ

Thái Thụy, TP. Thái Bình

Finge

22 MQF 5.3

R.microsporus Men Nam Định

Hải Hậu, Nam Định

Finge

23 MQF 6.3

R.microsporus Men Hà Nam

Bình Lục, Hà Nam

Finge

24 MQF 10.4 R.microsporus Men Đức Hùng

TP. Buôn Ma Thuột, Tỉnh Đắk Lắk

Finge

25 MQF 11.2 R.microsporus Men Trung Tiến

Thái Thụy, Thái Bình

155/21 Mai Hắc Đế - TP. Buôn Mê

Finge

26 MQF 14.1 R.microsporus Men Hương Lúa

Thuột

Quán men rượu Ngọc Minh, 42 Quán

Finge

27 MQF 3.1 M. indicus

Men thuốc bắc

Gánh

28 MQF 12.1 M. indicus

Men Kiên Lao

Xuân Trường, Nam Định

Seq

Finge

29 MQF 12.4 M. indicus

Men Kiên Lao

Xuân Trường, Nam Định

30 MQF 2.4

R. oryzae

Men Tuyên Quang

Yên Sơn, tỉnh Tuyên Quang

Seq

Finge

31 MQF 3.2

R. oryzae

Men thuốc bắc

42 Quán Gánh

Finge

32 MQF 8.2

R. oryzae

Men Sông Láng

Phú Xuyên, Hà Nội

33 MQF 2.5

R. oryzae

Men Tuyên Quang Yên Sơn, tỉnh Tuyên Quang

Seq

Finge

34 MQF 9.1

R. oryzae

Men Hưng Yên

Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên

Finge

35 MQF 9.6

R. oryzae

Men Hưng Yên

Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên

Finge

36 MQF 12.6 R. oryzae

Men Kiên Lao

Xuân Trường, Nam Định

Finge

37 MQF 15.1 R. oryzae

Men Bắc Giang

Trung tâm VSVCN

Finge

38 MQF 15.2 R. oryzae

Men Bắc Giang

Trung tâm VSVCN

Finge

39 MQF 15.4 R. oryzae

Men Bắc Giang

Trung tâm VSVCN

40 MQF 1.3

R. oryzae

Men Kim Sơn

Kim Sơn, Ninh bình

Seq

Finge

41 MQF 1.4

R. oryzae

Men Kim Sơn

Kim Sơn, Ninh bình

Finge

43 MQF 7.1

R. oryzae

Men Tân Độ

Phú Xuyên, Hà Nội

Finge

44 MQF 7.3

R. oryzae

Men Tân Độ

Phú Xuyên, Hà Nội

Finge

45 MQF 8.1

R. oryzae

Men Sông Láng

Phú Xuyên, Hà Nội

Finge

46 MQF 2.1

R. oryzae

Men Tuyên Quang

Yên Sơn, tỉnh Tuyên Quang

Finge

47 MQF 4.3

R. oryzae

Men Đức Ngọ

Thái Thụy, TP. Thái Bình

Finge

48 MQF 5.1

R. oryzae

Men Nam Định

Hải Hậu, tỉnh Nam Định

Finge

49 MQF 5.4

R. oryzae

Men Nam Định

Hải Hậu, tỉnh Nam Định

Finge

50 MQF 5.5

R. oryzae

Men Nam Định

Hải Hậu, Nam Định

Finge

51 MQF 6.1

R. oryzae

Men Hà Nam

Bình Lục,Hà Nam

Finge

52 MQF 6.2

R. oryzae

Men Hà Nam

Bình Lục,Hà Nam

53 MQF 10.5 R. oryzae

Men Đức Hùng

TP. Buôn Ma Thuột, Tỉnh Đắk Lắk

Seq

Finge

54 MQF 10.6 R. oryzae

Men Đức Hùng

TP. Buôn Ma Thuột, Tỉnh Đắk Lắk

Finge

55 MQF 14.4 R. oryzae

Men Hương Lúa

Mai Hắc Đế - TP. Buôn Mê Thuột

Finge

56 MQF 14.5 R. oryzae

Men Hương Lúa

Mai Hắc Đế - TP. Buôn Mê Thuột

57 MQF 9.4

L. ramosa

Men Hưng Yên

Văn Lâm,Hưng Yên

Seq

Finge

58 MQF 11.3

L. ramosa

Men Trung Tiến

Thái Thụy, Thái Bình

Finge

59 MQF 14.2

L. ramosa

Men Hương Lúa

Mai Hắc Đế - TP. Buôn Mê Thuột

60 MQF 12.2 C. bertholletiae Men Kiên Lao

Xuân Trường, Nam Định

Seq

61 MQF 2.2

circinelloides

Men Tuyên Quang

Yên Sơn,Tuyên Quang

Seq

Finge

62 MQF 2.3

circinelloides

Men Tuyên Quang Yên Sơn, Tuyên Quang

Finge

63 MQF 3.3

circinelloides

Men thuốc bắc

42 Quán Gánh

Men Bá Dương

Finge

64 MQF 13.2 M. indicus

Nội

Đan Phượng, Hà Nội

Finge

65 MQF 1.1 M. indicus

Men Kim Sơn

Kim Sơn, Ninh bình

66 MQF 8.4 M. indicus

Men Sông Láng

Phú Xuyên, Hà Nội

Seq

Finge

67 MQF 8.7 M. indicus

Men Sông Láng

Phú Xuyên, Hà Nội

Finge

68 MQF 9.3 M. indicus

Men Hưng Yên

Văn Lâm, Hưng Yên

Finge

69 MQF 9.7 M. indicus

Men Hưng Yên

Văn Lâm, Hưng Yên

70 MQF 10.2 M. indicus

Men Đức Hùng

TP. Buôn Ma Thuột, Tỉnh Đắk Lắk

Seq

Finge

71 MQF 10.7 M. indicus

Men Đức Hùng

TP. Buôn Ma Thuột, Tỉnh Đắk Lắk

Finge

72 MQF 8.5

C. echinulata

Men Sông Láng

Phú Xuyên, Hà Nội

73 MQF 8.6

C. echinulata

Men Sông Láng

Phú Xuyên, Hà Nội

Seq

Finge

74 MQY 2.1

S. cerevisiae

Men Tuyên Quang Yên Sơn,Tuyên Quang

Finge

75 MQY 3.1

S. cerevisiae

Men thuốc bắc

42 Quán Gánh

76 MQY 4.1

S. cerevisiae

Men Đức Ngọ

Thái Thụy, TP. Thái Bình

Seq

Finge

77 MQY 4.2

S. cerevisiae

Men Đức Ngọ

Thái Thụy, TP. Thái Bình

Finge

78 MQY 7.2

S. cerevisiae

Men Tân Độ

Phú Xuyên, Hà Nội

Finge

79 MQY 8.1

S. cerevisiae

Men Sông Láng

Phú Xuyên, Hà Nội

Finge

80 MQY 8.2

S. cerevisiae

Men Sông Láng

Phú Xuyên, Hà Nội

Finge

81 MQY 9.2

S. cerevisiae

Men Hưng Yên

Văn Lâm, Hưng Yên

MQY

Finge

11.1

S. cerevisiae

Men Trung Tiến

Thái Thụy, Thái Bình

Trình tự đã

PP

đọc

STT

Chủng

Loài

Mẫu bánh men

Nguồn mẫu

định

tên

ITS D1/D2

83 MQY 11.2

S. cerevisiae

Men Trung Tiến

Thái Thụy, Thái Bình

Finger

84 MQY 12.1

S. cerevisiae

Men Kiên Lao

Xuân Trường, Nam Định

Finger

85 MQY 12.2

S. cerevisiae

Men Kiên Lao

Xuân Trường, Nam Định

Finger

86 MQY 13.1

S. cerevisiae

Men Bá Dương Nội

Đan Phượng, Hà Nội

Finger

87 MQY 7.1

S. cerevisiae

Men Tân Độ

Phú Xuyên, Hà Nội

Finger

88 MQY 9.3

W. anomalus

Men Hưng Yên

Văn Lâm, Hưng Yên

Finger

89 MQY 11.3

W. anomalus

Men Trung Tiến

Thái Thụy, Thái Bình

Seq

90 MQS 8.1

S. fibuligera

Men Sông Láng

Phú Xuyên, Hà Nội

Finger

91 MQS 8.2

S. fibuligera

Men Sông Láng

Phú Xuyên, Hà Nội

Finger

92 MQS 3.2

S. fibuligera

Men thuốc bắc

42 Quán Gánh

Finger

93 MQS 3.1

S. fibuligera

Men thuốc bắc

42 Quán Gánh

Finger

94 MQS 2.2

S. fibuligera

Men Tuyên Quang

Yên Sơn, Tuyên Quang

Finger

95 MQS 2.1

S. fibuligera

Men Tuyên Quang

Yên Sơn, Tuyên Quang

Finger

96 MQS 12.1

S. fibuligera

Men Kiên Lao

Xuân Trường, Nam Định

Finger

97 MQS 12.2

S. fibuligera

Men Kiên Lao

Xuân Trường, Nam Định

Finger

98 MQS 13.2

S. fibuligera

Men Bá Dương Nội

Đan Phượng, Hà Nội

Finger

99 MQS 13.1

S. fibuligera

Men Bá Dương Nội

Đan Phượng, Hà Nội

Finger

100 MQS 9.2

S. fibuligera

Men Hưng Yên

Văn Lâm, Hưng Yên

Finger

101 MQS 14.1

S. fibuligera

Men Hương Lúa

Mai Hắc Đế - TP. Buôn Mê Thuột

Seq