BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Phạm Thị Thơm
QUÁ TRÌNH THOÁT CỦA PROTEIN MỚI SINH
TẠI ĐƯỜNG HẦM THOÁT RIBOSOME
LUẬN VĂN THẠC SĨ VẬT LÝ
Hà Nội - 2019
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Phạm Thị Thơm
QUÁ TRÌNH THOÁT CỦA PROTEIN MỚI SINH
TẠI ĐƯỜNG HẦM THOÁT RIBOSOME
Chuyên ngành: Vật lý lý thuyết và vật lý toán
Mã số: 8440103
LUẬN VĂN THẠC SĨ VẬT LÝ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
Hướng dẫn : PGS. TS. Trịnh Xuân Hoàng
Hà Nội - 2019
Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn là do sự tìm tòi, học hỏi của bản thân và sự hướng dẫn tận tình của Thầy - PSG.TS Trịnh Xuân Hoàng. Mọi kết quả nghiên cứu cũng như ý tưởng của tác giả khác, nếu có đều được trích dẫn cụ thể. Đề tài luận văn này cho đến nay chưa được bảo vệ tại bất kỳ một hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nào và cũng chưa hề được công bố trên bất kỳ một phương tiện nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về những lời cam đoan trên
Hà Nội, tháng 04 năm 2019
Tác giả luận văn
Phạm Thị Thơm
Lời cảm ơn
Trước khi trình bày nội dung chính của khóa luận, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy – PGS.TS. Trịnh Xuân Hoàng, người đã giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Thầy đã tận tình chỉ bảo cung cấp cho em nhiều kiến thức quan trọng cũng như đã truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới toàn thể các thầy cô giáo Học viện Khoa học Công nghệ đã dạy bảo em tận tình trong suốt quá trình học tập.
Em thực sự cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn bên em, cổ vũ, động viên,
giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Hà Nội, tháng 04 năm 2019
Học viên
Phạm Thị Thơm
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
1.1 (a) Cấu trúc chung của amino acid, (b) Cấu trúc của proline……..
1.2 Chuỗi polypeptide…………………………………………………
1.3 Biểu diễn mạch xương sống của các cấu trúc bậc hai phổ biến của
protein: (a) 2RJX xoắn 𝛼 và (b) 1SHG phiến β…………………..
1.4 Cấu trúc xoắn alpha………………………………………………
3.1 Cấu trúc trạng thái tự nhiên của protein SH3 domain (1SHG) và protein Villin (2RJX)……………………………………………..
3.2 Sự phụ thuộc của năng lượng (E) và số hạt thoát ra ngoài đường hầm (Nout)vào thời gian trong một quỹ đạo mô phỏng cho protein
1SHG tại nhiệt độ T = 0.8 /kB……………………………………
3.3 Phân bố thời gian thoát của protein 1SHG tại 3 nhiệt độ khác nhau. Các biểu đồ thu được từ dữ liệu mô phỏng. Đường liền nét là hàm phân bố thu được bởi lý thuyết khuyếch tán 1 chiều được khớp (fit) với biểu đồ…………………………………………….
3.4 Phân bố thời gian thoát của protein 2RJX tại 3 nhiệt độ khác nhau. Các biểu đồ thu được từ dữ liệu mô phỏng. Đường liền nét là hàm phân bố thu được bởi lý thuyết khuyếch tán 1 chiều được khớp (fit) với biểu đồ…………………………………………….
3.5 Sự phụ thuộc của độ lệch chuẩn của thời gian thoát vào thời gian thoát trung bình cho 2protein 1SHG và 2RJX. Đường đứt nét tương ứng với mô hình khuyếch tán 1 chiều với k không đổi….
3.6 Sự phụ thuộc của thời gian thoát trung bình vào nhiệt độ cho protein 1SHG (a) và protein 2RJX (b) trên thang tọa độ log-log. Đường đứt nét có độ dốc bằng −1 tương ứng với 𝜇𝑇 ∼ 𝑇−1……...
3.7 Sự phụ thuộc của thời gian thoát trung bình (t) vào nhiệt độ (T)
cho 2 protein 1SHG và 2RJX……………………………………
1 MỤC LỤC
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan về quá trình cuốn của các protein mới sinh
1.1. Thành phần hóa học và cấu trúc của protein
1.2. Hiện tượng cuốn protein trong ống nghiệm
1.3. Quá trình tổng hợp protein trong tế bào
1.4. Quá trình cuốn đồng dịch mã của protein
1.5. Đường hầm thoát ribosome
1.6. Ảnh hưởng của đường hầm thoát ribosome lên quá trình cuốn của các protein mới sinh
Chương 2: Các mô hình và phương pháp mô phỏng
2.1. Mô hình Go cho protein
2.2. Mô hình đường hầm thoát ribosome
2.3. Phương pháp động lực học phân tử dựa trên phương trình Langevin
2.4. Mô hình khuyếch tán cho quá trình thoát protein
Chương 3: Một số kết quả nghiên cứu
3.1. Sự phụ thuộc của thời gian thoát của protein vào nhiệt độ.
3.2. Sự phụ thuộc của thời gian thoát vào cấu trúc của protein.
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
2 MỞ ĐẦU
Nghiên cứu về vật lý các phân tử sinh học hiện nay đang là một hướng nghiên cứu nổi bật trong các lĩnh vực khoa học liên ngành do vai trò đặc biệt quan trọng của các phân tử sinh học đối với cơ thể sống và khả năng mang lại những ứng dụng trong y sinh học. Vật lý các phân tử sinh học áp dụng các phương pháp và dựa trên các nền tảng vật lý để nghiên cứu các vấn đề sinh học nhằm mang lại những hiểu biết căn bản cũng như những tiên đoán mang tính định lượng về các hệ sinh học. Bên cạnh các phương pháp thực nghiệm tiên tiến, thì các phương pháp mô hình hóa và mô phỏng máy tính đang được sử dụng rất rộng rãi trong vật lý sinh học phân tử và là các công cụ rất hiệu quả, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí nghiên cứu.
Trong sinh học phân tử thì việc nghiên cứu về protein rất được quan tâm bởi lẽ protein là một thành phần cơ bản của vật chất sống, chúng có mặt trong thành phần nhân và tế bào chất của mọi tế bào [1]. Cấu trúc phức tạp và đa dạng cho phép các protein thực hiện rất nhiều chức năng. Tế bào xâu chuỗi 20 loại amino acid thành mạch thẳng, tạo nên protein. Protein có thể đóng vai trò cấu trúc, ví dụ tạo thành khung tế bào. Protein với khả năng biến đổi hình dạng khi nhiệt độ, nồng độ ion hoặc các tính chất khác của tế bào thay đổi có thể giữ vai trò cảm biến. Protein có thể hấp thu và bài xuất vật chất qua màng tế bào. Chúng có thể là enzyme, chất xúc tác giúp phản ứng hóa học xảy ra nhanh hơn rất nhiều. Chúng có thể là phân tử tín hiệu ngoại bào (do một tế bào giải phóng ra để giao tiếp với các tế bào khác) hoặc phân tử tín hiệu nội bào (mang thông tin bên trong tế bào). Chúng có thể là mô-tơ sử dụng năng lượng hóa học (ATP) để vận động quanh phân tử khác.
Thông tin mỗi loại protein được tạo ra như thế nào, khi nào và ở đâu nằm trong vật liệu di truyền, axit deoxyribonucleic (DNA). Cấu trúc lập thể của DNA chứa hai mạch xoắn, cuộn quanh một trục chung, tạo thành cấu trúc xoắn kép. Chuỗi DNA cấu thành từ các đơn phân gọi là nucleotide (còn được gọi là bazơ do chứa bazơ hữu cơ mạch vòng). Trong DNA có bốn loại nucleotide khác nhau bởi các gốc nucleobase là Adenine (viết tắt là A), Thymine (viết tắt là T), Cytosine (tiếng Việt còn gọi là Xytosine, viết tắt
3 là X hoặc C), và Guanine (viết tắt là G). Ba nucleotide liên tiếp trên mạch mã gốc DNA của gene, sẽ quy định một loại amino acid nhất định. Do đó, mã di truyền còn được gọi là mã bộ ba, và tổ hợp ba nucleotide được gọi là một bộ ba mã hoá.. Các bộ ba nucleotide trong mỗi mạch đơn của chuỗi xoắn kép DNA khi giản phân, là một tổ hợp của 3 trong bốn loại nucleotide này nối liền nhau trong mạch DNA sao cho phần bazơ nhô ra từ khung mạch xoắn. DNA xoắn kép có cấu trúc khá đơn giản: A trên một mạch bắt cặp với T trên mạch kia và G bắt cặp với C. Hai mạch bắt cặp bổ sung mạnh đến mức sau khi bị tách rời chúng sẽ tự gắn lại với nhau nếu điều kiện nhiệt độ và nồng độ muối cho phép. DNA mang thông tin di truyền trong trật tự nucleotide dọc theo mạch thẳng. Phần DNA mang thông tin được chia thành các đơn vị chức năng nằm phân tán gọi là gene. Độ dài của một gene điển hình nằm trong khoảng 5.000 đến 100.000 nucleotide. Gene mã hóa cho protein thường gồm hai phần: Vùng mã hóa đặc hiệu cho trình tự amino acid của protein và vùng điều hòa kiểm soát thời điểm, vị trí tạo protein.
Tế bào sử dụng hai chuỗi quá trình liên tiếp để chuyển thông tin mã hóa trong DNA thành protein. Chuỗi quá trình thứ nhất gọi là phiên mã: Sao chép vùng mã hóa của gene thành axit ribonucleic (RNA) mạch đơn. Trong quá trình này enzyme RNA polymerase sử dụng một mạch khuôn DNA để xúc tác liên kết các nucleotide thành chuỗi RNA mới tạo ra được gia công thành phân tử RNA thông tin ( mRNA) nhỏ hơn. mRNA sau đó chuyển tới tế bào chất, nơi ribosome (bộ máy phân tử rất phức tạp cấu thành từ RNA và protein) thực hiện quá trình thứ hai gọi là dịch mã. Khi dịch mã, ribosome lắp ráp và liên kết các amino acid với nhau theo trật tự chính xác, do trình tự mRNA quy định theo mã di truyền gần như chung cho mọi sinh giới. Ngoài vai trò truyền thông tin từ nhân tới tế bào chất, RNA còn tham gia vào bộ máy phân tử. Ví dụ, ribosome chứa bốn chuỗi RNA kết hợp với hơn 50 protein, tạo thành bộ đọc mRNA và tổng hợp protein rất chính xác và hiệu quả.
Các protein được tổng hợp bởi các ribosome trong tế bào và được chiết xuất vào trong tương bào (cytosol) hoặc lưới nội chất (endoplasmic reticulum) trước khi được vận chuyển tới các địa chỉ khác nhau bên trong hoặc ngoài tế
4 bào. Các protein mới sinh chịu ảnh hưởng của đường hầm thoát ribosome (ribosomal exit tunnel), là nơi protein cần phải di chuyển qua để đi vào tế bào chất. Đường hầm thoát ribosome là một ống chật hẹp, có cấu trúc phức tạp [2], có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình cuốn của các protein mới sinh. Các nghiên cứu thực nghiệm cho thấy protein có thể hình thành các cấu trúc bậc hai (xoắn alpha và phiến beta) bên trong đường hầm thoát [3, 4]. Ngoài ra, đường hầm thoát có thể đóng vai trò tích cực trong việc nhận dạng trình tự amino acid cũng như điều khiển quá trình sinh tổng hợp protein [5, 6].
Các nghiên cứu mô phỏng gần đây [7, 8] cho thấy quá trình thoát của protein tại đường hầm thoát ribosome xảy ra song song với quá trình cuốn và hai quá trình này có ảnh hưởng qua lại lẫn nhau. Quá trình cuốn làm cho protein thoát ra nhanh hơn, trong khi quá trình thoát xảy ra đủ chậm giúp protein cuốn chính xác hơn. Việc protein thoát ra đủ chậm cũng như cuốn chính xác giúp giảm thiểu khả năng kết tụ [11] của các protein mới sinh bên trong tế bào. Ngoài ra, các kết quả mô phỏng cho thấy thời gian thoát phù hợp với mô hình khuyếch tán đơn giản trong trường thế tuyến tính [7, 8]. Điều này mở ra khả năng áp dụng mô hình khuyếch tán trong việc phân tích các kết quả thực nghiệm.
Trong luận văn này, trên cơ sở các nghiên cứu trước đây [7, 8], chúng tôi nghiên cứu quá trình thoát của protein tại đường hầm thoát ribosome nhằm làm rõ hơn sự phụ thuộc của thời gian thoát vào nhiệt độ và vào cấu trúc trạng thái tự nhiên của protein. Để thực hiện điều này, chúng tôi chọn hai protein nhỏ đơn miền có cấu trúc hoàn toàn khác nhau, một protein chỉ bao gồm các phiến beta và một protein chỉ bao gồm các xoắn alpha, để so sánh.
Nghiên cứu trong luận văn sử dụng phương pháp mô hình hóa và mô phỏng máy tính. Protein được xét trong mô hình Go là mô hình đơn giản coi mỗi amino acid là một hạt và sử dụng thế năng Lennard-Jones. Đường hầm thoát ribosome được mô hình hóa là một ống trụ rỗng có tương tác đẩy với các amino acid ở khoảng cách gần. Phương pháp mô phỏng động lực học phân tử với phương trình Langevin được áp dụng để mô phỏng các quá trình
5 mọc protein và quá trình thoát protein tại đường hầm. Các kết quả mô phỏng được phân tích trên cơ sở lý thuyết của mô hình khuyếch tán một chiều.
Các kết quả chính của luận văn đó là chỉ ra rằng các protein khác nhau có phân bố thời gian thoát cũng như sự phụ thuộc của thời gian thoát vào nhiệt độ tương tự nhau. Tuy vậy, protein có cấu trúc phiến beta có thời gian thoát nhanh hơn so với protein có cấu trúc xoắn alpha.
Bố cục của luận văn được chia thành 4 chương, với các nội dung như
sau:
1. Chương 1: Tổng quan về quá trình cuốn của các protein mới sinh.
2. Chương 2: Các mô hình và phương pháp mô phỏng.
3. Chương 3: Một số kết quả nghiên cứu.
4. Chương 4: Kết luận và kiến nghị.
6 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH CUỐN CỦA CÁC PROTEIN MỚI SINH
1.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ CẤU TRÚC CỦA PROTEIN
1.1.1. Thành phần hóa học của protein
Hình 1.1: (a) Cấu trúc chung của amino acid, (b) Cấu trúc của proline [ 7]
Protein(protid hay đạm) là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là amino acid. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein. Chuỗi polypeptide là polymer được cấu thành từ 20 loại amino acid. Trong đó, 19 loại có cấu trúc cơ bản giống nhau như Hình 1.1 (a). Mỗi amino acid có cấu trúc đặc thù gồm một nguyên tử carbon alpha (Cα) gắn với bốn nhóm hóa học khác: Nhóm amin (NH2), axit carboxylic hay nhóm carboxyl (COOH) (bởi đó có tên là amino acid), nguyên tử hydro (H) và một nhóm biến đổi gọi là chuỗi bên hay nhóm R. Loại amino acid thứ 20 còn lại là proline có cấu trúc tương tự như các amino acid khác, nhưng nguyên tử C thuộc chuỗi bên của nó liên kết với nguyên tử N của nhóm amin tạo thành một mạch vòng (Hình 1.1 (b)).
Đặc tính duy nhất của amino acid quyết định vai trò của amino acid trong chuỗi polypeptide là do các tính chất vật lý và hóa học của chuỗi bên R xác định. Các amino acid có thể phân thành các nhóm kị nước (không phân cực), ưa nước (phân cực), tích điện âm (nếu chuỗi bên mang điện tích âm), tích điện dương (nếu chuỗi bên mang điện tích dương).
7
Hình 1.2: Chuỗi polypeptide [7]
Trong protein, các amino acid gắn với nhau thông qua liên kết cộng hóa trị gọi là liên kết peptide, tạo thành mạch thẳng, không phân nhánh. Trong các protein có chứa cysteine, một loại amino acid với chuỗi bên có nguyên tử lưu huỳnh (S), đôi khi các nguyên tử S của hai chuỗi bên khác nhau tạo liên kết cộng hóa trị với nhau gọi là liên kết disulfide. Liên kết peptide hình thành giữa nhóm amin của một amino acid và nhóm carboxyl của amino acid khác và giải phóng một phân tử nước (dehydrat hóa). Kết nối lặp giữa –NH, carbon α (Cα), và –CO và nguyên tử O trong mỗi amino acid cấu thành bộ khung của phân tử protein. Các chuỗi bên (nhóm R) nhô ra từ bộ khung này. Do liên kết peptide, khung có tính định hướng vì tất cả các nhóm –NH nằm cùng một phía với Cα. Do đó một đầu của protein có nhóm amin tự do (không liên kết) gọi là đầu N và đầu kia có nhóm cacboxyl tự do gọi là đầu C. Trình tự của chuỗi protein thường được viết theo thứ tự đầu N nằm bên trái, đầu C nằm bên phải và các amino acid được đánh số thứ tự bắt đầu từ đầu N (số 1).
1.1.2 Cấu trúc của protein
Protein có hình dạng và kích thước rất đa dạng. Cấu trúc lập thể 3 chiều đa dạng của chúng chủ yếu do những khác biệt trong chiều dài và trình tự amino acid quyết định. Nhìn chung, mỗi protein với một trình tự amino acid xác định tại các điều kiện sinh lý bình thường sẽ chỉ gấp nếp thành một hoặc một số ít hình dạng lập thể giống nhau – gọi là cấu hình native. Những khác biệt trong cấu hình native và tính chất hóa học của các chuỗi bên của các amino acid quyết định chức năng của protein. Do đó protein có khả năng thực hiện rất nhiều chức năng khác nhau bên trong và bên ngoài tế bào. Những
8 chức năng này rất quan trọng cho sự sống. Các protein phối hợp hoạt động để duy trì sự sống và đảm bảo chức năng chính xác của tế bào.
1.1.2.1. Cấu trúc bậc một của protein
Cấu trúc bậc một của protein là trình tự amino acid trong protein. Có nhiều thuật ngữ dùng để chỉ chuỗi polymer tạo bởi các amino acid. Chuỗi amino acid ngắn liên kết với nhau bằng liên kết peptide và có trình tự xác định gọi oligopeptide hay chỉ đơn giản là peptide; chuỗi dài gọi là polypeptide. Peptide thường chứa ít hơn 30 amino acid, còn polypepide thường dài từ vài chục tới vài trăm amino acid.
1.1.2.2. Cấu trúc bậc hai của protein
Hình 1.3: Biểu diễn mạch xương sống của các cấu trúc bậc hai phổ biến của
protein: (a) 2RJX xoắn 𝛼 và (b) 1SHG phiến β [7]
Cấu trúc bậc hai là thành tố đặc trưng của cấu trúc protein. Cấu trúc bậc hai là sự sắp xếp không gian địa phương của các vùng trong chuỗi polypeptide. Những phân đoạn này gắn với nhau thông qua liên kết hydro giữa các nhóm –NH và –CO của mạch khung, thường tạo thành các mô hình cấu trúc có tính lặp. Các cấu trúc bậc hai cơ sở là xoắn α, phiến β và đoạn ngoặt β ngắn hình chữ U.
Cấu trúc xoắn α: Trong phân đoạn polypeptide có kiểu gấp nếp xoắn α, mạch khung xoắn lại. Ở cấu trúc dạng này O thuộc nhóm –CO của mỗi liên kết peptide tạo liên kết hydro với H thuộc nhóm –NH của amino acid thứ tư
9 trong chuỗi. Trong xoắn α, mọi nhóm –NH và –CO của mạch khung liên kết hydro với nhau, trừ các nhóm tại hai đầu tận cùng của chuỗi polypeptide. Kiểu sắp xếp liên kết theo chu kì này tạo thành cấu trúc xoắn từ đầu amin đến đầu carboxyl với chiều cao mỗi xoắn là 5,4 Å. Mỗi vòng xoắn chứa 3,6 amino acid, do đó khoảng cách giữa hai nguyên tử Cα liền nhau theo phương trục xoắn là 1,5 Å.
Hình 1.4: Cấu trúc xoắn alpha
Trong xoắn α, liên kết hydro ổn định của các amino acid làm mạch khung có dạng trụ dài, thẳng, từ đó nhóm R của amino acid quay ra ngoài xác định tính chất ưa nước hay kỵ nước của xoắn. Trong dung dịch xoắn kỵ nước thường vùi trong lõi của protein đã cuốn, trong khi xoắn ưa nước thường nằm tại bề mặt của protein, nơi chúng có thể tương tác với môi trường nước.
Cấu trúc phiến β: Chứa các mạch β là một phân đoạn ngắn (5 đến 8 amino acid) và hầu như trải ra hết cỡ. Không như xoắn α, liên kết hydro trong phiến β hình thành giữa các nguyên tử nằm trên khung của các mạch β riêng biệt nhưng liền kề nhau trong không gian ( Hình 1.3 (b)). Liên kết hydro trong mạch phẳng phiến giữ các mạch β với nhau và các nhóm R gắn phía trên hoặc phía dưới mặt phẳng này. Phiến β có tính định hướng do chiều của liên kết peptide. Do đó, trong phiến xếp nếp, các mạch β sát nhau có thể nằm cùng
10 chiều (song song) hoặc ngược chiều (đối song song). Kẹp tóc 𝛽 ( 𝛽 – harpin)
là một cấu trúc đơn giản của phiến 𝛽 chỉ gồm hai mạch 𝛽 phản song song được nối với nhau bởi một đoạn uốn cong chứa từ 2 đến 5 amino acid.
Cấu trúc đoạn ngoặt β: Gồm 4 amino acid tạo thành một đường cong hẹp, uốn mạch khung của chuỗi polypeptide quay ngược lại. Cấu trúc bậc hai hình chữ U ngắn này được ổn định nhờ liên kết hydro giữa hai đầu. Đoạn ngoặt β giúp các protein lớn gấp lại rất gọn. Có 6 loại đoạn ngoặt khác nhau được xác định, cấu trúc chi tiết của chúng phụ thuộc vào sự sắp xếp không gian và liên kết hydro.
1.1.2.3. Cấu trúc bậc ba của protein
Cấu trúc bậc ba của protein là cấu hình tổng thể của chuỗi polypeptide hay sắp xếp ba chiều của toàn bộ các amino acid. Cấu trúc bậc ba chủ yếu ổn định nhờ tương tác kỵ nước giữa các nhóm R không phân cực, liên kết hydro giữa các nhóm R phân cực và tương tác van der Waals. Các tương tác này yếu nên cấu trúc bậc ba của protein không cứng nhắc mà luôn dao động nhỏ và liên tục. Thậm chí một số phân đoạn cấu trúc bậc ba của protein linh động đến mức chúng được coi là bị mất trật tự (không có cấu trúc lập thể bền vững, tường minh). Tuy vậy, sự biến thiên cấu trúc này lại quan trọng đối với chức năng và sự điều hòa của protein.
Tính chất hóa học của nhóm R của amino acid quyết định cấu trúc bậc ba của protein. Amino acid có chuỗi bên phân cực, ưa nước hay tích điện thường nằm trên bề mặt của protein. Những amino acid này tương tác với nước, giúp protein hòa tan trong dung dịch và tạo tương tác không cộng hóa trị với các phân tử không hòa tan trong nước, bao gồm các protein khác. Ngược lại, amino acid với chuỗi bên không phân cực, kỵ nước thường bị cô lập cách xa bề mặt tiếp xúc nước của protein. Trong nhiều trường hợp chúng tạo thành lõi trung tâm không hòa tan trong nước (gọi là mô hình giọt dầu của protein cầu vì lõi tương đối kỵ nước hay “có tính dầu”). Nhóm R phân cực, ưa nước, không tích điện có thể nằm trong bề mặt cũng như trong lõi của protein.
11
Dựa trên cấu trúc bậc ba có thể chia protein thành ba loại: protein sợi, protein cầu và protein xuyên màng. Protein sợi là phần tử lớn, dài, cứng và thường cấu thành từ nhiều trình tự ngắn lặp liên tiếp, tạo thành cấu trúc bậc hai lặp đơn. Protein sợi thường kết tụ thành sợi lớn gồm nhiều protein và không hòa tan trong nước. Chúng thường có vai trò tạo nên cấu trúc hoặc tham gia vào sự vận động của tế bào. Protein cầu thường chứa tập hợp các cấu trúc bậc hai, hòa tan trong nước, gấp nếp chặt và không có hình cầu hoàn hảo. Protein xuyên màng nhúng trong lớp phospholipid kép của màng. Màng này đóng vai trò bức tường của tế bào và cơ quan tử. Ba loại protein này không hoàn toàn độc lập, một số protein cấu thành từ tổ hợp của hai hoặc thậm chí cả ba loại này.
1.1.2.4. Cấu trúc bậc bốn của protein
Một số protein gồm các chuỗi polypeptide tập hợp thành một đại phân tử chức năng. Cấu trúc bậc bốn là cấu trúc của protein do sự tập hợp các tiểu đơn vị polypeptide đó. Cấu trúc bậc bốn là sự sắp xếp không gian giữa các cấu trúc bậc ba của các protein. Ví dụ về các tổ hợp đại phân tử với chức năng cấu trúc bao gồm capsid bao bọc bộ gen của virus và các bó sợi khung tế bào giúp chống đỡ và tạo hình tế bào chất. Các tổ hợp đại phân tử khác hoạt động như các bộ máy phân tử, thực hiện hầu hết các quá trình phức tạp của tế bào bằng cách tích hợp những chức năng riêng lẻ thành một chỉnh thể thống nhất.
1.2. HIỆN TƯỢNG CUỐN PROTEIN TRONG ỐNG NGHIỆM
Tế bào phải thực hiện các quá trình nghiêm ngặt để tạo ra những protein với đầy đủ các chức năng. Sau khi các ribosome liên kết các amino acid thành các chuỗi polypeptide không phân nhánh (là cấu trúc bậc một của protein) thì mỗi chuỗi polypeptide này được cuốn nếp, biến đổi thành cấu hình lập thể mang cấu trúc bậc hai, bậc ba và có thể bậc bốn. Cấu hình này được gọi là trạng thái native (trạng thái tự nhiên của protein). Với hầu hết protein, trạng thái tự nhiên là cấu hình bền vững nhất và theo quan điểm nhiệt động học thì trạng thái này có năng lượng tự do thấp nhất. Quá trình cuốn protein là quá trình biến đổi động lực học của chuỗi polypeptide từ trạng thái duỗi với cấu trúc bậc một tới trạng thái tự nhiên của protein. Tùy thuộc vào
12 điều kiện bên ngoài mỗi chuỗi polypeptide có thể cuốn thành rất nhiều các hình dạng khác nhau. Vì vậy quá trình cuốn có thể cho sản phẩm là một cấu hình khác với cấu hình tự nhiên của protein, gọi là quá trình cuốn lỗi. Protein sẽ mất đi các chức năng sinh học vốn có khi nằm ở trạng thái cuốn lỗi.
Như vậy, yếu tố nào quyết định cấu hình tự nhiên của protein? Cơ chế nào giúp cho protein cuốn về trạng thái tự nhiên nhanh và chính xác? Trước hết, dễ thấy mặt phẳng liên kết peptide hạn chế phương thức cuốn nếp của chuỗi polypeptide. Liên kết peptide có tính chất tương đối giống liên kết đôi nên nguyên tử C của nhóm –CO và N của nhóm –NH và các nguyên tử gắn trực tiếp với chúng phải nằm trên cùng một mặt phẳng cố định. Liên kết peptide không thể tự quay quanh nó. Do vậy biến thiên cấu hình của chuỗi polypeptide chỉ do độ linh động của khung quyết định. Độ linh động này lại do góc quay của các mặt phẳng cố định tạp thành từ liên kết giữa Cα với N
của nhóm –NH (góc quay gọi là ) và liên kết giữa Cα với C của nhóm –CO
(góc quay gọi là ) quyết định ( Hình 1.3). Các góc xoay và bị hạn chế
bởi các ràng buộc địa phương về không gian của các nguyên tử trong chuỗi polypeptide.
Theo nghịch lý Levinthal [9], nếu thời gian protein nằm ở mỗi cấu hình là 10–12 s thì để trải qua tất cả các cấu hình protein sẽ cần một khoảng thời gian lớn hơn tuổi vũ trụ. Thực nghiệm quan sát được thời gian cuốn của protein cỡ từ vài phần nghìn giây tới vài giây. Nghĩa là protein sẽ không trải qua tất cả các cấu hình trước khi đạt tới trạng thái tự nhiên. Các ràng buộc về không gian và các ràng buộc trong liên kết peptide đã hạn chế được đáng kể các cấu hình trung gian. Tuy nhiên, số lượng các cấu hình khả dĩ vẫn tăng theo hàm số mũ của N là số amino acid trong protein vì vậy không loại bỏ được nghịch lý Levinthal.
Các thí nghiệm của Christian Anfinsen [10] về quá trình cuốn của protein biến tính (denatured) trong ống nghiệm cho thấy trình tự bậc một là thông tin cần cho cấu trúc lập thể chính xác. Một số yếu tố, ví dụ như năng lượng nhiệt động từ nhiệt độ, pH khắc nghiệt với khả năng thay đổi điện tích chuỗi bên của amino acid và các hóa chất làm biến tính (denaturants), có thể
13 phá hủy các tương tác không cộng hóa trị yếu, làm entropy tăng nhanh và làm duỗi protein. Tập hợp protein biến tính này chứa rất nhiều loại cấu hình không có hoạt tính sinh học và không trong trạng thái tự nhiên. Các thí nghiệm của Anfinsen cho thấy khi đưa mẫu chứa một loại protein tinh sạch, ở trạng thái biến tính về điều kiện thường (nhiệt độ sinh lý, pH bình thường, pha loãng hoặc loại bỏ chất biến tính) thì hầu hết các chuỗi polypeptide đã biến tính có thể tự phục hồi cấu hình tự nhiên mang hoạt tính sinh học. Điều này khiến Anfinsen đi đến kết luận rằng trình tự chuỗi amino acid là đủ để xác định cấu trúc ba chiều của protein. Quá trình cuốn lại của protein biến tính là tự phát và không cần sự hỗ trợ của các yếu tố liên quan.
1.3. QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP PROTEIN TRONG TẾ BÀO
Quá trình sinh tổng hợp protein là một quá trình trung tâm của sinh học phân tử, là sự truyền thông tin di truyền vào các protein mang chức năng. Quá trình sinh tổng hợp protein là một quá trình phức tạp và bao gồm hai giai đoạn: phiên mã và dịch mã.
1.3.1. Quá trình phiên mã
Phiên mã (sao mã) là quá trình tổng hợp mRNA (messenger RNA – RNA thông tin). Trình tự nucleotide (trong ngôn ngữ bốn bazơ A, G, C và T) trên phân tử DNA được sao chép thành trình tự nucleotide (trong ngôn ngữ bốn bazơ A, G, C và U) trên phân tử mRNA. Quá trình này gồm 3 bước sau:
Khởi đầu phiên mã: Enzyme polymerase liên kết vào đoạn trình tự DNA khởi đầu phiên mã hình thành phức hệ đóng với DNA. Trong giai đoạn này, DNA vẫn duy trì ở dạng sợi kép, trong khi enzyme liên kết vào bề mặt của chuỗi xoắn kép. Sau đó polymerase làm biến đổi vùng DNA xoắn kép gần vị trí khởi đầu hình thành phức hệ mở, DNA tách thành hai mạch đơn.
Kéo dài chuỗi mRNA: Enzyme polymerase di chuyển dọc theo mạch khuôn DNA theo chiều từ 3’ đến 5’ và thay đổi cấu hình để liên kết ổn định vào mạch khuôn đồng thời thực hiện một loạt các chức năng khác: Giãn xoắn mạch DNA ở phía trước, tổng hợp chuỗi RNA theo nguyên tắc bổ sung, tách chuỗi RNA khỏi mạch khuôn DNA và đóng xoắn mạch DNA ở phía sau.
14
Kết thúc phiên mã: Khi RNA polymerase đã phiên mã hết chiều dài gene nó dừng lại giải phóng RNA đã tổng hợp xong và tách khỏi DNA. Sau khi được tổng hợp, mRNA di chuyển tới các ribosome để trực tiếp tổng hợp protein cho tế bào.
1.3.2 Quá trình dịch mã
Là quá trình tổng hợp protein từ tế bào chất, ngôn ngữ bốn bazơ của mRNA được dịch mã thành ngôn ngữ 20 amino acid của protein. Quá trình giải mã trình tự nucleotide trên mRNA thành trình tự amino acid cần sự tham gia của các phân tử tRNA (transfer RNA hay RNA vận chuyển). Ở tế bào vi khuẩn, hiện đã xác định được 30 – 40 loại tRNA và ở tế bào động vật và thực vật có khoảng 50 – 100 loại tRNA. Như vậy, mỗi amino acid (20 loại) có thể gắn với nhiều tRNA. Ngoài ra một loại tRNA có thể bắt cặp với nhiều codon trong mã di truyền (61 loại). Để tổng hợp protein, tRNA mang amino acid được hoạt hóa tới khớp với bộ ba nucleotide (còn gọi là bộ ba hay codon) trên mRNA để amino acid đã hoạt hóa gắn vào chuỗi polypeptide đang được tổng hợp. Quá trình dịch mã bao gồm các bước cơ bản sau:
Hoạt hóa amino acid tự do trong tế bào chất: Amino acid được hoạt hóa nhờ gắn với hợp chất giàu năng lượng adenosinetriphosphate (ATP). Sau đó, các amino acid đã được hoạt hóa liên kết với tRNA tương ứng để tạo nên phức hợp amino acid – tRNA.
Mở đầu chuỗi polypeptide: Các tiểu phần của ribosome lắp ráp gần vị trí khởi đầu dịch mã trên mRNA cùng với tRNA mang methionine có gắn đầu amin sẽ liên kết bazơ với codon mở đầu. Phức hợp amino acid mở đầu – tRNA (aa0 – tRNA) tiến vào ribosome đối mã của nó khớp với mã mở đầu trên mRNA theo nguyên tắc bổ sung.
Kéo dài chuỗi polypeptide: tRNA vận chuyển amino acid thứ nhất tiến vào ribosome đối mã với nó (theo nguyên tắc bổ sung). Enzyme xúc tác tạo thành liên kết peptide giữa amino acid mở đầu và amino acid thứ nhất. Ribosome dịch chuyển đi một bộ ba trên mRNA làm cho tRNA mở đầu rời khỏi ribosome. Tiếp đó aa2 – tRNA tiến vào ribosome, đối mã của nó khớp
15 với mã thứ hai trên mRNA. Liên kết peptide giữa aa1 và aa2 được tạo thành. Sự dịch chuyển lại xảy ra, và cứ tiếp tục như vậy cho đến khi ribosome tiếp giáp với bộ ba kết thúc. Trong mỗi chu trình kéo dài chuỗi, ribosome trải qua hai lần biến đổi hình dạng. Lần đầu tiên cho phép tRNA đang tới gắn chặt vào mRNA và tRNA đã hoàn thành nhiệm vụ giải phóng khỏi mRNA. Lần biến đổi hình dạng thứ hai dẫn tới sự dịch chuyển.
Kết thúc chuỗi polypeptide: Ribosome chuyển dịch sang bộ ba kết thúc và ngừng quá trình dịch mã. Hai tiểu phần của ribosome tách nhau ra. Một enzyme đặc hiệu loại bỏ amino acid mở đầu giải phóng chuỗi polypeptide.
1.4. QUÁ TRÌNH CUỐN ĐỒNG DỊCH MÃ CỦA PROTEIN
Quá trình cuốn của protein xảy ra đồng thời với quá trình tổng hợp protein (hay dịch mã mRNA) được gọi là cuốn đồng dịch mã (cotranslational folding). Protein chỉ có thể cuốn hoàn chỉnh khi được tổng hợp xong và chui ra ngoài đường hầm thoát.
Để có thể tổng hợp một lượng protein đủ nhanh, mỗi phân tử mRNA thường được dịch mã cùng một lúc bởi nhiều ribosome. Tương tác kỵ nước dễ dẫn đến sự kết tụ của các chuỗi polypeptide mới sinh, đặc biệt đối với các chuỗi mới sinh được tổng hợp gần nhau từ cùng một mRNA. Sau khi ribosome đầu tiên kết hợp với mRNA thực hiện dịch mã được một đoạn ngắn, thì ở phía sau, nhiều ribosome khác cũng bám vào mRNA để dịch mã. Cùng một lúc, tại vị trí rất gần nhau trong tế bào sẽ xuất hiện rất nhiều các protein mới sinh có cấu trúc bậc một giống hệt nhau, lại chưa đạt đến cấu trúc cuốn bền vững và chỉ được cuốn một phần. Dịch mã tương đối chậm nên cấu trúc một phần và nhạy cảm với kết tụ sẽ tồn tại trong một khoảng thời gian tương đối dài. Các chuỗi mới sinh đã cuốn một phần rất dễ bám chặt vào nhau, kết tụ thành một khối lớn, không thể tiếp tục cuốn bình thường và cũng không thể thực hiện được các chức năng sinh học nữa. Do hiệu ứng kỵ nước những nhánh kỵ nước lộ ra trên các phân tử khác nhau sẽ bám vào nhau khi chưa kịp vùi vào lõi của protein, thúc đẩy sự kết tụ. Sự kết tụ là nguyên nhân chính gây ra bệnh Alheimer do các protein kết tụ thành các sợi amyloid không hòa tan và hủy các tế bào thần kinh.
16
1.5. ĐƯỜNG HẦM THOÁT RIBOSOME
Trong bán cầu lớn tại PTC (peptidyl transferase center) của ribosome chuỗi polypeptide được sinh tổng hợp. Trong bán cầu lớn này có một đường hầm thoát hẹp dẫn protein mới sinh từ nơi được tổng hợp tới môi trường tế bào. Đường kính của đường của đường hầm thoát có thể thay đổi từ 10 Å – 20 Å và không hoàn toàn thẳng [2]. Đường hầm thoát chật hẹp nhất và hơi uốn cong ở chỗ thắt cách PTC khoảng 20 Å. Đường hầm ribosome được xây dựng bởi các đoạn của phân tử 23S rRNA và một số protein ribosome (L4, L22, L39). Đường hầm có chiều dài trong khoảng 80 Å – 100 Å tùy thuộc vào cách định nghĩa cổng ra. Đường hầm có thể chứa trọng vẹn một chuỗi peptide thẳng gồm 30 amino acid hoặc một chuỗi có cấu trúc xoắn α gồm 60 amino acid. Mặt trong của đường hầm thoát có bản chất ưa nước cho phép chuỗi mới sinh chui ra dễ dàng không bị cản trở.
1.6. ẢNH HƯỞNG CỦA ĐƯỜNG HẦM THOÁT RIBOSOME LÊN QUÁ TRÌNH CUỐN CÁC PROTEIN MỚI SINH
Đường hầm thoát ribosome chật hẹp đã tạo ra một số rào cản không gian cho sự hình thành các cấu trúc của protein mới sinh [2]. Các đơn vị cấu
trúc đơn giản như xoắn α và phiến có thể hình thành bên tại đường hầm
thoát [3]. Và một số vùng cấu trúc nhỏ bậc ba khác có thể hình thành ở cổng ra của đường hầm thoát [4]. Vì vậy, quá trình protein cuốn hoàn thiện chỉ xảy ra bên ngoài đường hầm thoát. Thực nghiệm cho thấy ngay cả khi protein nằm bên ngoài đường hầm ribosome, sự có mặt của ribosome vẫn giúp cho protein cuốn chính xác hơn [12].
Thí nghiệm của Ito và cộng sự [5, 6] cho thấy ribosome ngừng dịch mã khi trong đường hầm xuất hiện trình tự SecM trong chuỗi polypeptide. Điều này gợi ý rằng đường hầm thoát có vai trò nhận biết trình tự amino acid và tham gia tích cực vào quá trình tổng hợp protein. Nghiên cứu mô phỏng trong mô hình đầy đủ các nguyên tử của Pande và các cộng sự cho thấy đường hầm ribosome tạo nên hàng rào năng lượng tự do đối với các amino acid và có cơ chế then cửa (gate-latch mechanism) kiểm soát sự thoát ra của các amino acid [13].
17
Nghiên cứu mô phỏng gần đây của Hoàng và cộng sự [7] cho thấy quá trình cuốn protein tại đường hầm thoát ribosome xảy ra đồng thời với quá trình thoát protein ra khỏi đường hầm, và điều này giúp cho protein cuốn chính xác hơn. Nghiên cứu ảnh hưởng của chiều dài đường hầm lên quá trình thoát protein [8] cũng gợi ý rằng chiều dài của đường hầm ribosome đã được tự nhiên lựa chọn sao cho quá trình khuyếch tán protein ra khỏi đường hầm được hiệu quả đồng thời không làm cho protein thoát ra quá nhanh để tránh các nguy cơ cuốn nhầm và kết tụ.
CHƯƠNG 2: CÁC MÔ HÌNH VÀ PHƯƠNG PHÁP MÔ PHỎNG
2.1 MÔ HÌNH GO CHO PROTEIN
Mô hình Go [14] là một loại mô hình đơn giản hóa cho protein cho phép nghiên cứu động lực học của quá trình cuốn protein. Các thế năng tương tác trong mô hình Go được xây dựng trên cấu trúc trạng thái native của protein sao cho trạng thái này có thế năng cực tiểu. Mô hình Go áp dụng thế năng hút cho các tương tác giữa các amino acid có tiếp xúc trong trạng thái native và thế năng đẩy cho các tương tác giữa các amino acid không tiếp xúc với nhau trong trạng thái native. Ngoài ra, giữa các amino acid lân cận nhau dọc theo chuỗi polypeptide người ta có thể áp dụng các thế năng cho các góc liên kết và góc nhị diện. Các nghiên cứu mô phỏng cho thấy mô hình Go cho cơ chế cuốn phù hợp với các kết quả thực nghiệm [15, 16].
Trong luận văn này, chúng tôi sử dụng một phiên bản mô hình Go [15] với thế năng Lennard-Jones 10-12 và các thế năng góc. Trong mô hình này, mỗi amino acid được coi là một hạt có khối lượng m và có vị trí trùng với vị trí của nguyên tử Cα. Gọi N là số amino acid trong chuỗi protein. Cấu hình phân tử protein được xác định bởi hệ vectơ {𝑟𝑖⃗⃗ }i=1,2,…,N là tọa độ của tất cả các hạt. Năng lượng của protein tại một cấu hình cho trước được xác định bởi:
E = VNative + VRepulsive + VBond + VAngles (2.1)
Số hạng thứ nhất trong phương trình (2.1) là tổng các thế năng Lennard-Jones cho tương tác giữa các amino acid có tiếp xúc trong trạng thái native:
18
native
12
10
𝑖,𝑗>𝑖+3
(2.2) 𝑉Native = ∑ 𝜀 [5 ( ) − 6 ( ) ] 𝜎𝑖𝑗 𝑟𝑖𝑗 𝜎𝑖𝑗 𝑟𝑖𝑗
trong đó rij là khoảng cách giữa hai hạt thứ i và j, ε là tham số năng lượng ứng 𝑛𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒 là tham số được chọn bằng khoảng với độ sâu của thế năng, 𝜎𝑖𝑗 = 𝑟𝑖𝑗 cách giữa hạt i và j trong trạng thái native. Để xác định xem hai amino acid trong trạng thái native có tiếp xúc nhau hay không, chúng tôi sử dụng tiêu chí đề xuất bởi Best và Hummer [17] bằng cách xét tất cả các nguyên tử nặng trong hai amino acid (trừ các nguyên tử hydro). Nếu giữa hai amino acid thứ i và thứ j với i + 3 < j tồn tại một cặp nguyên tử nặng có khoảng cách nhỏ hơn 4,5 Å thì hai amino acid được cho là có tiếp xúc với nhau.
Số hạng thứ hai trong phương trình (2.1) là tổng thế năng đẩy được cho
non-native
12
bởi:
6 )
𝑖,𝑗>𝑖+3
(2.3) 𝑉𝑅𝑒𝑝𝑢𝑙𝑠𝑖𝑣𝑒 = ∑ 4 𝜖 [( ) − ( ] 𝛩(21 6⁄ 𝜎 − 𝑟𝑖𝑗) 𝜎 𝑟𝑖𝑗 𝜎 𝑟𝑖𝑗
trong đó tổng theo i và j được lấy theo tất cả các cặp amino acid không có tiếp
xúc trong trạng thái native, (x) là hàm bước Heavyside, σ = 5 Å.
Các hạt liên tiếp nhau trong chuỗi protein tương tác thông qua thế năng
2
điều hòa. Số hạng thứ ba trong phương trình (2.1) là tổng thế năng điều hòa:
,
𝑁−1 𝑖=1
(2.4) 𝑉Bond = 100𝜀 ∑ (𝑟𝑖,𝑖+1 − 𝑑0)
trong đó d0 = 3.8 Å là khoảng cách giữa hai nguyên tử carbon alpha liên tiếp trong chuỗi protein.
Những hạn chế về không gian liên quan tới mặt phẳng liên kết peptide
trong protein được đặc trưng bởi số hạng thứ tư trong phương trình (2.1)
(2.5) 𝑉𝐴𝑛𝑔𝑙𝑒𝑠 = 𝑉𝐵𝐴 + 𝑉𝐷𝐴,
19 trong đó các số hạng vế phải của phương trình (2.5) lần lượt là thế năng liên quan tới các góc liên kết (bond angle) và các góc nhị diện (dihedral angle) trong chuỗi.
2
𝑁−1 𝑉𝐵𝐴 = ∑ 𝑖=2
(2.6) , (𝜃𝑖 − 𝜃0,𝑖) 𝑘0 2
𝑁−3
với góc liên kết 𝜃𝑖là góc tạo bởi ba nguyên tử carbon alpha liên tiếp, 𝜃0,𝑖 là góc liên kết ở trạng thái native, k0= 20 /rad2 là tham số.
𝑖=2
(2.7) 𝑉𝐷𝐴 = ∑{𝐴[1 + 𝑐𝑜𝑠(𝜙𝑖 − 𝜙0,𝑖)] + 𝐵[1 + 𝑐𝑜𝑠3(𝜙𝑖 − 𝜙0,𝑖)]}
với góc nhị diện 𝜙𝑖 là góc tạo bởi bốn nguyên tử carbon alpha liên tiếp nhau trong chuỗi, 𝜙0,𝑖 là góc nhị diện ở trạng thái gốc, A = − và B = − 0.5 là các tham số.
2.2. MÔ HÌNH ĐƯỜNG HẦM THOÁT RIBOSOME
6
Chúng tôi sử dụng mô hình đơn giản hóa cho đường hầm thoát của ribosome [7, 8] để khảo sát ảnh hưởng của đường hầm thoát lên quá trình thoát của các protein mới sinh. Đường hầm thoát được mô hình hóa như một ống hình trụ rỗng có chiều dài L = 80 Å, đường kính d = 15 Å và tâm chạy dọc theo trục x, với một đáy kín và một đáy mở gắn vào một bức tường phẳng mô phỏng mặt ngoài của ribosome. Giả sử tâm của đáy ống trụ (x = 0) chính là vị trí mọc của protein mới sinh hay PTC (nơi amino acid được gắn vào chuỗi polypeptide đang được tổng hợp). Protein từ đường hầm thoát chui ra ngoài qua đáy còn lại của đường hầm thoát. Tương tác giữa amino acid và tường đường hầm thoát là thế năng đẩy cho bởi thế năng Lennard-Jones bị cắt tại cực tiểu của thế năng:
12 )
4𝜀 [( − ( ) ] + 𝜀, 𝑟 ≤ 21 6⁄ 𝜎 (2.8) 𝜎 𝑟 𝜎 𝑟 𝑉𝑤𝑎𝑙𝑙(𝑟) = {
0, 𝑟 > 21 6⁄ 𝜎
20 trong đó σ = 5 Å và r là khoảng cách ngắn nhất từ tâm các amino acid đến tường của đường hầm cộng thêm 2.5 Å (tương ứng với bán kính Van der Waals của các hạt ảo được giả định là cấu trúc thành mặt trong của đường hầm thoát). Thế năng đẩy cho bởi (2.8) cũng được sử dụng cho tương tác đẩy của cổng ra đường hầm thoát và tường phẳng bao ngoài đáy đường hầm thoát đối với các amino acid.
2.3. PHƯƠNG PHÁP ĐỘNG LỰC HỌC PHÂN TỬ DỰA TRÊN PHƯƠNG TRÌNH LANGEVIN
Động lực học phân tử là kĩ thuật mô phỏng sử dụng để nghiên cứu sự biến đổi theo thời gian trạng thái của một hệ các hạt cổ điển tương tác với nhau qua việc tích phân phương trình chuyển động của chúng. Phương pháp động lực học phân tử cho phép xác định trạng thái của hệ ở một thời điểm t bất kì khi biết trạng thái ban đầu của hệ. Phương pháp động lực học phân tử có thể dùng để nghiên cứu các quá trình động lực học của protein. Trong luận văn này, chúng tôi sử dụng phương pháp động lực học phân tử xét tới các tác động ngẫu nhiên của dung môi lên hạt chuyển động dựa trên phương trình Langevin.
2.3.1. Phương trình Langevin
Chuyển động của các hạt cổ điển tuân theo các phương trình Newton. Trong trường hợp chuyển động của các hạt chịu tác động của các yếu tố ngẫu nhiên do môi trường bên ngoài người ta sử dụng phương pháp động học phân tử dựa trên phương trình Langevin.
Phương trình Langevin có thể được sử dụng để mô tả chuyển động của các hạt lớn như các amino acid trong protein trong dung môi là nước. Ở nhiệt độ T, phương trình Langevin một chiều cho một hạt có dạng:
(2.9) 𝑚𝑥¨(𝑡) = 𝑓(𝑡) − 𝜁𝑥˙(𝑡) + 𝛤(𝑡)
𝜕𝑉(𝑥)
trong đó m là khối lượng của hạt, f là lực tác dụng lên hạt gây bởi các thế
𝜕𝑥
năng tương tác 𝑓 = − ; 𝜁 là hệ số ma sát của dung môi tác động lên hạt;
là lực ngẫu nhiên của dung môi tác động lên hạt, có phân bố Gauss với
21 trung bình bằng không và hàm tương quan theo thời gian thỏa mãn định luật biến thiên tiêu tán:
(2.10) ⟨𝛤(𝑡)𝛤(𝑡 + 𝑡′)⟩ = 2𝜁𝑚𝑘𝐵𝑇𝛿(𝑡′),
với 𝛿(𝑡′) là hàm delta Dirac. Khi = 0 thì phương trình Langevin trở thành phương trình Newton.
2.3.2. Thuật toán Verlet cho phương trình Langevin
Chúng tôi sử dụng thuật toán Verlet cho phương trình Langevin được
đề xuất trong tài liệu [7]. Từ phương trình Langevin ta có:
(2.11) 𝑥¨(𝑡) = [𝑓(𝑡) − 𝜁𝑥˙(𝑡) + 𝛤(𝑡)]. 1 𝑚
Khai triển tọa độ x theo chuỗi Taylor đến bậc hai ta có:
(2.12) 𝑥(𝑡 + ∆𝑡) ≈ 𝑥(𝑡) + 𝑥˙(𝑡)∆𝑡 + 𝑥¨(𝑡)∆𝑡2, 1 2
(2.13) 𝑥(𝑡 − ∆𝑡) ≈ 𝑥(𝑡) − 𝑥˙(𝑡)∆𝑡 + 𝑥¨(𝑡)∆𝑡2, 1 2
trong đó ∆𝑡 là bước thời gian.
𝑥(𝑡+∆𝑡)−𝑥(𝑡−∆𝑡)
Từ (2.12) và (2.13) ta có:
2∆𝑡
(2.14) , 𝑥˙(𝑡) =
(2.15) 𝑥(𝑡 + ∆𝑡) ≈ 2𝑥(𝑡) − 𝑥(𝑡 − ∆𝑡) + 𝑥¨(𝑡)∆𝑡2.
−1
Thay (2.17) và (2.14) và (2.18) ta thu được:
𝑥(𝑡 + ∆𝑡) = (1 + 𝜁) {2𝑥(𝑡) − (1 − 𝜁) 𝑥(𝑡 − ∆𝑡) ∆𝑡 2𝑚 ∆𝑡 2𝑚
+ [𝑓(𝑡) + 𝛤(𝑡)]}. ∆𝑡2 𝑚
(2.16)
22 Thuật toán Verlet cho phép ta tính tọa độ tại thời điểm t + t khi biết tọa độ tại
các thời điểm t và t + t.
Trong các mô phỏng, nhiệt độ được biểu thị bằng đơn vị ε/kB, thời gian
được đo bằng đơng vị 𝜏 = √𝑚 𝜎2 𝜀⁄ . Bước thời gian được chọn là ∆t = 0.002τ, và các mô phỏng được thực hiện với hệ số ma sát ζ = 2.5 mτ−1.
2.4. MÔ HÌNH KHUYẾCH TÁN CHO QUÁ TRÌNH THOÁT PROTEIN
𝜕
𝜕
𝜕𝑈(𝑥)
𝜕
Các nghiên cứu trước đây [7, 8] đã đưa ra mô hình khuyếch tán đơn giản cho quá trình thoát của protein ra khỏi đường hầm ribosome, trong đó quá trình thoát được coi là quá trình khuyếch tán một chiều của một hạt trong một trường thế. Giả sử ta có trường thế U(x), sự khuyếch tán của hạt trong trường thế được mô tả bởi phương trình Smoluchowski một chiều:
𝜕𝑡
𝜕𝑥
𝜕𝑥
𝜕𝑥
(2.17) + 𝐷 (𝛽 𝑝(𝑥, 𝑡; 𝑥0, 𝑡0) = ) 𝑝(𝑥, 𝑡; 𝑥0, 𝑡0),
trong đó 𝑝(𝑥, 𝑡; 𝑥0, 𝑡0) là mật độ xác suất tìm thấy hạt ở tọa độ x vào thời điểm t, nếu tại thời điểm t0 hạt được tìm thấy tại tọa độ x0; 𝜕 𝜕⁄ 𝑡 và 𝜕 𝜕⁄ 𝑥 là các đạo hàm riêng phần theo thời gian và tọa độ; D là hằng số khuyếch tán được giả thiết rằng không phụ thuộc vào tọa độ; 𝛽 = (𝑘𝐵𝑇)−1 là nghịch đảo của nhiệt độ. Đối với khuyếch tán thông thường trong chất lỏng, hằng số khuyếch tán D thỏa mãn hệ thức Einstein-Smoluchowski:
𝑘𝐵𝑇 𝜁
, 𝐷 = (2.18)
trong đó là hệ số ma sát nhớt. Nếu U(x) là thế năng tuyến tính theo tọa độ:
(2.19) 𝑈(𝑥) = −𝑘𝑥,
với k là một hằng số thì phương trình (2.17) có nghiệm chính xác cho bởi
𝐷𝛽𝑘 (2.20) 𝑝(𝑥, 𝑡) ≡ 𝑝(𝑥, 𝑡; 0,0) = 𝑒𝑥𝑝 [ ], −(𝑥 − 𝐷𝛽𝑘𝑡)2 4𝐷𝑡 √4𝜋𝐷𝑡
với điều kiện ban đầu là p(x,0) = (x). Hàm phân bố (2.20) cho ta tọa độ trung
bình của hạt:
23
(2.21) ⟨𝑥⟩ = (𝐷𝛽𝑘)𝑡.
Phương trình trên cho thấy 𝐷𝛽𝑘 là tốc độ khuyếch tán.
Thời gian thoát của protein tại đường hầm ribosome có chiều dài L trong mô hình khuyếch tán chính là thời gian tới đầu tiên (first passage time) của
hạt khuyếch tán có điều kiện ban đầu p(x,0) = (x) tại thời điểm t = 0 và điều
𝐿
kiện biên hấp thụ p(L,t) = 0 tại x = L. Lời giải phân bố thời gian tới đầu tiên cho phương trình Smoluchowski với các điều kiện biên như trên có thể tìm thấy trong tài liệu [18]. Phân bố thời gian tới đầu tiên được cho bởi
−(𝐿−𝐷𝛽𝑘)2 4𝐷𝑡
√4𝜋𝐷𝑡3 𝑒𝑥𝑝 [
(2.22) 𝑔(𝑡) = ].
𝐿
,
Hàm phân bố này cho ta thời gian thoát trung bình:
𝐷𝛽𝑘
(2.23) 𝜇𝑡 ≡ ⟨𝑡⟩ = ∫ 𝑡 𝑔(𝑡)𝑑𝑡 =
và độ lệch chuẩn của thời gian thoát:
√2𝛽𝑘𝐿 𝐷(𝛽𝑘)2
(2.24) 𝜎𝑡 ≡ (⟨𝑡2⟩ − ⟨𝑡⟩2)1 2⁄ =
2
.
Ta thấy rằng tỷ lệ 𝜎𝑡 𝜇𝑡⁄ không phụ thuộc vào hằng số khuyếch tán D mà chỉ phụ thuộc vào k:
𝛽𝑘𝐿
𝜎𝑡 𝜇𝑡
(2.25) = √
Chú ý rằng cả 𝜎𝑡và 𝜇𝑡 đều phân kỳ (bằng vô cùng) khi k = 0, khi đó hàm phân bố g(t) trở thành hàm phân bố Lévy. Mô hình khuyếch tán cho thấy quá trình thoát chỉ hiệu quả với thời gian thoát trung bình hữu hạn khi k > 0.
24 CHƯƠNG 3: MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Sử dụng các mô hình và phương pháp mô phỏng, chúng tôi thực hiện nghiên cứu quá trình thoát của protein mới sinh tại đường hầm thoát ribosome. Nghiên cứu được thực hiện cho hai protein nhỏ đơn miền là protein SH3 domain (Mã PDB: 1SHG) và protein Villin (Mã PDB: 2RJX). Hai protein này được chọn có kích thước tương tự nhau (SH3 domain có chiều dài 57 amino acids, Villin có chiều dài 67 amino acids) nhưng hình dạng của trạng thái tự nhiên khác nhau để so sánh. Để thuận tiện chúng tôi gọi hai protein này là 1SHG và 2RJX. Trạng thái tự nhiên của 1SHG và 2RJX được thể hiện trên Hình 3.1. Cấu trúc của 1SHG gồm hai phiến beta đối song song bó vào nhau, trong khi 2RJX gồm 5 xoắn alpha xếp gần nhau.
Hình 3.1 Cấu trúc trạng thái tự nhiên của protein SH3 domain (1SHG) và protein Villin (2RJX). Các cấu trúc phiến beta được tô màu vàng, xoắn alpha được tô màu đỏ.
1SHG 2RJX
Các mô phỏng được thực hiện cho cả 2 protein tại nhiều nhiệt độ khác
nhau trong khoảng từ T = 0.2 /kB tới T = 2.4 /kB. Tại mỗi một nhiệt độ, 500 quỹ đạo mô phỏng độc lập được thực hiện cho quá trình cuốn đồng dịch mã và quá trình thoát của protein. Quá trình cuốn đồng dịch mã được mô phỏng với protein được mọc dài dần từ đầu N tới đầu C và thời gian để chuỗi
polypeptide mọc dài thêm một hạt là tg = 100 . Sau khi được dịch mã hoàn
25 chỉnh, protein tiếp tục được mô phỏng cho tới khi thoát ra hoàn toàn khỏi đường hầm ribosome. Thời gian thoát được tính từ khi protein được dịch mã hoàn chỉnh cho tới khi protein thoát ra hoàn toàn.
Hình 3.2. Sự phụ thuộc của năng lượng (E) và số hạt thoát ra ngoài đường hầm (Nout)vào thời gian trong một quỹ đạo mô phỏng cho protein 1SHG tại nhiệt độ T = 0.8 /kB.
Hình 3.2 cho thấy sự phụ thuộc vào thời gian của năng lượng E và số hạt nằm ngoài đường hầm Nout trong một quỹ đạo mô phỏng cho protein
1SHG tại nhiệt độ T = 0.8 /kB. Có thể thấy rằng cả E và Nout đều biến thiên theo thời gian với xu hướng là E giảm dần và Nout tăng dần. Quỹ đạo mô phỏng trên Hình 3.2 kết thúc ở thời điểm Nout = N, ứng với thời gian thoát xấp xỉ bằng 580t.
3.1. SỰ PHỤ THUỘC CỦA THỜI GIAN THOÁT CỦA PROTEIN VÀO NHIỆT ĐỘ
Hình 3.3 và Hình 3.4 cho ta thấy phân bố thời gian thoát của hai protein
1SHG và 2RJX tại 3 nhiệt độ khác nhau: T = 0.4 /kB , T = 0.8 /kB và T = 1.2
/kB. Có thể thấy rằng khi nhiệt độ tăng phân bố thời gian thoát bị dịch
26 chuyển về phía thời gian ngắn hơn. Protein thoát ra nhanh hơn khi nhiệt độ tăng. Trong tất cả các trường hợp phân bố thời gian thoát thu được từ mô phỏng có thể khớp khá tốt với mô hình khuyếch tán một chiều (đường liền nét trên các Hình 3.3 và 3.4). Điều này cho thấy mô hình khuyếch tán mô tả khá tốt quá trình thoát của protein.
Hình 3.3. Phân bố thời gian thoát của protein 1SHG tại 3 nhiệt độ khác nhau. Các biểu đồ thu được từ dữ liệu mô phỏng. Đường liền nét là hàm phân bố thu được bởi lý thuyết khuyếch tán 1 chiều được khớp (fit) với biểu đồ.
27
Hình 3.4. Phân bố thời gian thoát của protein 2RJX tại 3 nhiệt độ khác nhau. Các biểu đồ thu được từ dữ liệu mô phỏng. Đường liền nét là hàm phân bố thu được bởi lý thuyết
khuyếch tán 1 chiều được khớp (fit) với biểu đồ.
Từ phân bố thời gian thoát thu được từ mô phỏng ta có thể tính được thời gian thoát trung bình 𝜇𝑡(𝜏) và độ lệch chuẩn của thời gian thoát 𝜎𝑡(𝜏). Hình 3.5 cho thấy sự phụ thuộc của 𝜎𝑡(𝜏) vào 𝜇𝑡(𝜏) cho cả hai protein ở các nhiệt độ khác nhau. Có thể thấy rằng ở vùng 𝜇𝑡(𝜏) và 𝜎𝑡(𝜏) nhỏ (ứng với nhiệt độ cao), 𝜎𝑡(𝜏) phụ thuộc gần như tuyến tính vào 𝜇𝑡. Theo mô hình khuyếch tán cho bởi công thức (2.25) thì sự phụ thuộc tuyến tính này chứng
tỏ rằng βk là không đổi và không phụ thuộc vào nhiệt độ. Với k không đổi, từ công thức (2.23) ta cũng có 𝜇𝑇 ∼ 𝐷−1, tức là thời gian thoát trung bình tỷ lệ
28 nghịch với hằng số khuyếch tán. Ở vùng 𝜇𝑡(𝜏) và 𝜎𝑡(𝜏) lớn (ứng với nhiệt độ thấp) thì sự phụ thuộc của 𝜎𝑡(𝜏) vào 𝜇𝑡(𝜏) bị lệch khỏi hàm tuyến tính. Lúc này, cả k và D đều phụ thuộc vào nhiệt độ.
Hình 3.5. Sự phụ thuộc của độ lệch chuẩn của thời gian thoát vào thời gian thoát trung bình cho 2protein 1SHG và 2RJX. Đường đứt nét tương ứng với mô hình khuyếch tán 1 chiều với k không đổi.
Hình 3.6 mô tả sự phụ thuộc của thời gian thoát trung bình 𝜇𝑡 vào nhiệt độ T trên thang tọa độ log-log cho hai protein 1SHG và 2RJX. Đối với cả hai protein thời gian thoát trung bình giảm khi nhiệt độ tăng. Ở vùng nhiệt độ cao thời gian thoát trung bình phụ thuộc vào nhiệt độ theo quy luật 𝜇𝑇 ∼ 𝑇−1(đường tuyến tính đứt nét trên hình vẽ). Điều này chứng tỏ ở nhiệt độ cao thì hằng số khuyếch tán phụ thuộc tuyến tính vào nhiệt độ, 𝐷 ∼ 𝑇, giống như trong hệ thức Einstein (phương trình 2.18) cho hạt chuyển động Brown. Như vậy ở nhiệt độ cao quá trình thoát của protein là tương tự như quá trình khuếch tán của hạt Brown trong trường thế tuyến tính. Hình 3.6 cho thấy ở
29 vùng nhiệt độ thấp, thời gian thoát trung bình của protein thấp hơn nhiều so với thời gian thoát của hạt Brown. Điều này khẳng định quá trình cuốn của protein tại đường hầm ribosome làm cho protein thoát ra nhanh hơn [7, 8].
30
(a)
(b)
Hình 3.6. Sự phụ thuộc của thời gian thoát trung bình vào nhiệt độ cho protein 1SHG (a) và protein 2RJX (b) trên thang tọa độ log-log. Đường đứt nét có độ dốc bằng −1 tương ứng với 𝜇𝑇 ∼ 𝑇−1.
31 3.2. SỰ PHỤ THUỘC CỦA THỜI GIAN THOÁT VÀO CẤU TRÚC CỦA
PROTEIN
Hình 3.7. Sự phụ thuộc của thời gian thoát trung bình (t) vào nhiệt độ (T) cho 2 protein 1SHG và 2RJX.
Các kết quả ở Mục 3.1 cho thấy mặc dù 2 protein 1SHG và 2RJX có cấu trúc trạng thái tự nhiên rất khác biệt, phân bố thời gian thoát, sự phụ thuộc của thời gian thoát vào nhiệt độ cũng như các tính chất khuyếch tán của cả hai protein đều khá tương đồng. Điều này cho thấy quá trình thoát của protein không phụ thuộc mạnh vào cấu trúc trạng thái tự nhiên.
Hình 3.7 so sánh thời gian thoát trung bình của 1SHG và 2RJX tại các nhiệt độ khác nhau. Có thể thấy rằng 2RJX có thời gian thoát trung bình lớn hơn so với 1SHG ở hầu hết các nhiệt độ, ngoại trừ ở 2 giá trị nhiệt độ rất thấp
T = 0.2 /kB và T = 0.25 /kB . Tuy vậy, sự chênh lệch thời gian thoát trung bình giữa hai protein là không nhiều. Ở các vùng nhiệt độ trung bình và cao, protein 2RJX là protein có cấu trúc xoắn alpha có thời gian thoát trung bình cao hơn khoảng 10% - 20% so với 1SHG là protein có cấu trúc phiến beta.
32 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Trong luận văn này, chúng tôi đã nghiên cứu quá trình thoát của protein
tại đường hầm thoát ribosome sử dụng phương pháp mô phỏng động lực học
phân tử với các mô hình đơn giản hóa cho protein và cho đường hầm thoát
ribosome. Nghiên cứu được thực hiện cho hai protein nhỏ đơn miền với cấu
trúc trạng thái tự nhiên khác nhau. Các kết quả mô phỏng được phân tích và
so sánh với mô hình khuyếch tán trong trường thế tuyến tính một chiều, và
cho các kết luận như sau:
1. Khi nhiệt độ tăng thì thời gian thoát của protein giảm. Phân bố thời
gian thoát phù hợp với mô hình khuyếch tán. Ở vùng nhiệt độ cao thời gian
thoát trung bình tỷ lệ nghịch với nhiệt độ theo hàm mũ 𝑇−1, giống như đối với
hạt chuyển động Brown. Ở vùng nhiệt độ thấp, quá trình cuốn làm protein
thoát ra nhanh hơn so với hạt chuyển động Brown.
2. Thời gian thoát của protein không phụ thuộc mạnh vào cấu trúc trạng
thái tự nhiên của protein. Protein có cấu trúc xoắn alpha thoát ra chậm hơn
10% - 20% so với protein có cấu trúc phiến beta.
Trên đây là các kết quả thu được từ các mô hình đơn giản hóa. Các kết
quả này cần được so sánh với các kết quả của các mô hình chi tiết hơn cho
protein và cho đường hầm thoát ribosome, cũng như được kiểm chứng bởi
thực nghiệm.
33 TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] C. A. Kaiser, M. Krieger, H. Lodish, A. Berk. Molecular Cell Biology, “
Molecular Cell Biology”, WH Freeman (2007).
[2] N. R. Voss, M. Gerstein, T. A. Steitz, and P. B. Moore, “ The geometry
of the ribosomal polypeptide exit tunnel”, J. Mol. Biol. 360, 893 (2006).
[3] J. L. Lu and C. Deutsch, Nat. Struct. Mol. Biol. 12, 1123-1129 (2005).
[4] A. Kosolapov and C. Deutsch, “Tertiary Interactions within the
Ribosomal Exit Tunnel”, Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 405-411 (2009).
[5] H. Nakatogawa and K. Ito, “ The Ribosomal Exit Tunnel Functions as a
Discriminating Gate”, Cell 108, 629- 636 (2002).
[6] H. Nakatogawa and K. Ito, Chem. Bio. Chem. 5, 81 (2004).
[7] P. T. Bui and T. X. Hoang, “ Folding anh escape of nascent proteins at
ribosomal exit tunnel” , J. Chem. Phys. 144, 095102 (2016).
[8] P. T. Bui and T. X. Hoang, “ Protein escape at the ribosomal exit tunnel:
Effects of native interactins, tunnel length, and macromolecular crowding”, J.
Chem. Phys. 149, 045102 (2018).
[9] C. Levinthal C, “ Are there pathways for protein floding ?”, Journal de Chimie Physique. 65, 44-45 (1968).
[10] C. Anfinsen, Biochem,“Principles that govern the folding of protein
chains” , J. 128, 737 (1972).
[11] C. M. Dobson, “ Protein folding and misfolding”, Nature 426, 884 - 890
(2003).
[12] C. M. Kaiser, D. H. Goldman, J. D. Chodera, I. Tinoco, Jr., and C.
Bustamante, “ The ribosome modulates nascent protein folding”, Science 334,
1723 (2011).
34 [13] P. M. Petrone, C. D. Snow, D. Lucent, and V. S. Pande, “ Side – chain
recognition and gating in the ribosome exit tunnel”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S. A. 105, 16549-16554 (2008).
[14] N. Go, “ Theoretical studies of protein folding”, Ann. Rev. Biophys.
Bioeng. 12, 183-210 (1983).
[15] C. Clementi, H. Nymeyer, and J. N. Onuchic, J. Mol. Biol. 298, 937
(2000).
[16] T. X. Hoang and M. Cieplak, “ Sequencing of folding events in Go-like
proteins”, J. Chem. Phys. 113, 8319 (2000).
[17] R. B. Best and G. Hummer, “Molecular crowding enhances native state
stability and refolding rates of globular proteins” Proc. Natl. Acad. Sci. USA
102, 6732–6737 (2005).
[18] D. R. Cox and H. D. Miller, The Theory of Stochastic Processes
(Chapman and Hall, 1965), pp. 219–223.
