Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phương pháp xác định một số Steviol glycosides trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------------------

LƢU THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ STEVIOL GLYCOSIDES TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

----------------------------

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LƢU THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ STEVIOL GLYCOSIDES TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 8440112.03

Cán bộ hƣớng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Thị Ánh Hƣờng

TS. Trần Cao Sơn

Hà Nội - 2020

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN......................................................................................3

1.1. Tổng quan về cây cỏ ngọt………………………………………………………3

1.1.1. Giới thiệu……………………………………………………………………..3

1.1.1.1. Thực vật học..………………………………………………………………3

1.1.1.2. Tác dụng.……………………………..…………………………………….4

1.1.1.3. Liều dùng an toàn ở ngƣời………………………………………………….6

1.1.2. Thành phần hóa học trong cây cỏ ngọt……………………………………….7

1.2. Tổng quan về Steviol glycoside………………………………………………...8

1.2.1. Giới thiệu……………………………………………………………………..8

1.2.2. Tính chất vật lý, hóa học……………………………………………………10

1.2.3. Ứng dụng thực tế của Steviol glycosides…………………………………...11

1.3. Các phƣơng pháp xác định Steviol glycosides…………………...…………...12

1.3.1. Sắc ký lớp mỏng…………………………………………………………….13

1.3.2. Phƣơng pháp quang phổ…………………………………………………….14

1.3.3. Phƣơng pháp điện di mao quản……………………………………………..15

1.3.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ…………………………………………17

1.3.5. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao UV-Vis/PDA…………………….19

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................27

2.1. Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………………….27

2.2. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………………27

2.3. Đối tƣợng nghiên cứu………………………………………………………...27

2.4. Nguyên vật liệu – thiết bị, dụng cụ…………………………………………..28

2.4.1. Nguyên vật liệu……………………………………………………………..28

2.4.2. Thiết bị, dụng cụ……………………………………………………………28

2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu...…………………………………..……………….29

2.5.1. Phƣơng pháp phân tích……………………………………………………..29

2.5.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu…………………………………………………….31

2.5.3. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp………………………………...32

2.5.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu………………………………………………….33

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................34

3.1.

Lựa chọn các điều kiện phân tích sắc ký……………………………………..34

3.1.1. Khảo sát nồng độ đệm……………………………………………………..34

3.1.2. Khảo sát pH pha động……………………………………………………..36

3.1.3. Khảo sát nhiệt độ cột………………………………………………………38

3.1.4. Điều kiện tối ƣu phân tích một số Steviol glycosides bằng HPLC………..39

3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu………………………………………………..40

3.2.1. Khảo sát dung môi chiết mẫu………………………………………………40

3.2.2. Khảo sát nhiệt độ chiết mẫu………………………………………………..41

3.2.3. Khảo sát thời gian chiết mẫu……………………………………………….42

3.2.4. Khảo sát điều kiện làm sạch qua SPE……………………………………...42

3.3. Thẩm định phƣơng pháp…………………………….……………………….44

3.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn…………………………………………………….44

3.3.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp………………..46

3.3.3. Độ lặp lại…………………………………………………………………..47

3.3.4. Đánh giá độ thu hồi………………………………………………………..51

3.4. Phân tích mẫu thực tế………………………………………………………..56

KẾT LUẬN............................................................................................................60

TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 62

PHỤ LỤC ..............................................................................................................68

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này đƣợc hoàn thành với sự hỗ trợ, giúp đỡ, động viên của các

Thầy Cô, gia đình và bạn bè, đồng nghiệp.

Với tình cảm chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.

Nguyễn Thị Ánh Hƣờng và TS. Trần Cao Sơn là những ngƣời thầy đã tận tâm

hƣớng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình làm luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các quý Thầy, Cô trong Bộ môn Hóa Phân

tích, khoa Hóa Học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

đã tâm huyết truyền dạy kiến thức và luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi đƣợc học tập,

nghiên cứu tại đây.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện, TS. Vũ Thị Trang và các anh

chị đồng nghiệp tại khoa Dinh dƣỡng và phụ gia thực phẩm, Viện Kiểm nghiệm an

toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình

làm luận văn.

Lời sau cùng, xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những ngƣời thân

trong gia đình, tới những ngƣời bạn, tới lãnh đạo và các đồng nghiệp khoa Dinh

dƣỡng và Phụ gia thực phẩm – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc

gia đã luôn động viên, ủng hộ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong suốt thời

gian học tập và hoàn thành luận văn.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

Association of Official Analytical AOAC Hiệp hội các cộng đồng phân tích Communities

Lƣợng ăn vào hằng ngày ADI Acceptable Daily Intake chấp nhận đƣợc

TLC Thin-layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

CE Capillary Electropherosis Điện di mao quản

High-performance thin-layer HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao chromatography

HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

GC Gas chromatography Sắc ký khí

GC-MS Gas chromatography mass spectrometry Sắc ký khí khổi phổ

LC-MS Liquid chromatography mass pectrometry Sắc ký lỏng khối phổ

MDL Method detection limit Giới hạn phát hiện phƣơng pháp

MQL Method quantification limit Giới hạn định lƣợng phƣơng pháp

MS Mass spectrometry Khối phổ

Photometric Diode Array Mảng Diot quang PDA

Reverse phase high performance liquid RP- Sắc ký lỏng pha đảo HPLC chromatography

Standard Deviation Độ lệch chuẩn SD

Chiết pha rắn SPE Solid phase extration

UV-Vis Tử ngoại – Khả kiến Ultraviolet - Visible

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Lá cây cỏ ngọt ................................................................................................ 3

Hình 1.2: Khung cấu trúc cơ bản của Steviol glycosides .............................................. 8

Hình 1.3: Thành phần chính của Steviol glycosides trong lá cỏ ngọt: a. Stevioside;

b. Rebaudioside A ......................................................................................... 9

Hình 2.1: Hệ thống thiết bị HPLC-PDA ..................................................................... 29

Hình 2.2: Quy trình xử lý mẫu dự kiến ........................................................................ 31

Hình 3.1: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động

5mM. ........................................................................................................... 35

Hình 3.2: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động

10mM .......................................................................................................... 35

Hình 3.3: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động

20mM .......................................................................................................... 35

Hình 3.4: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động

50mM .......................................................................................................... 36

Hình 3.5: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở pH = 7 ........................................... 37

Hình 3.6: Ảnh hƣởng của pH đến độ phân giải của Stevioside và Rebaudioside A.....37

Hình 3.7: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở nhiệt độ cột 20oC ................... 38

Hình 3.8: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở nhiệt độ cột 40oC ................... 38

Hình 3.9: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở nhiệt độ cột 60oC ................... 39

Hình 3.10: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycoside ở nhiệt độ cột 79oC .................. 39

Hình 3.11: Hàm lƣợng của các Steviol glycosides khi sử dụng các dung môi chiết

khác nhau .................................................................................................... 40

Hình 3.12: Hiệu suất thu hồi (H%) của các Steviol glycosides khi làm sạch trên cột

C18 và HLB ................................................................................................ 43

Hình 3.13: Quy trình xử lý mẫu tối ƣu ......................................................................... 44

Hình 3.14: Đồ thị tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ RebA ............................ 45

Hình 3.15: Đồ thị tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ Stevioside ..................... 45

Hình 3.16: Kết quả phân tích tổng hàm lƣợng Steviol glycosides của mẫu cỏ ngọt và

đƣờng ăn kiêng ........................................................................................... 57

Hình 3.17: Kết quả phân tích tổng hàm lƣợng Steviol glycosides của mẫu nƣớc giải

khát ............................................................................................................. 58

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Cấu trúc của các chất nhóm Steviol glycosides và độ ngọt so với đƣờng

sucrose .......................................................................................................... 9

Bảng 1.2: Mức quy định giới hạn sử dụng Steviol glycosides trong thực phẩm ......... 11

Bảng 1.3: Tóm tắt kết quả một số phƣơng pháp xác định Steviol glycosides ............. 23

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH đến thời gian lƣu của nhóm chất

Steviol glycosides ....................................................................................... 37

Bảng 3.2: Hàm lƣợng của các chất Steviol glycosides (mg/g) thu đƣợc với dung

môi chiết khác nhau .................................................................................... 41

Bảng 3.3: Hàm lƣợng của các chất Steviol glycosides ở các nhiệt độ khác nhau ....... 41

Bảng 3.4: Hàm lƣợng Steviol glycosides (mg/g) thu đƣợc với thời gian chiết khác

nhau ............................................................................................................. 42

Bảng 3.5: Quy trình làm sạch qua SPE ........................................................................ 43

Bảng 3.6: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của các chất Steviol

glycosides .................................................................................................. 44

Bảng 3.7: Đƣờng hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ Steviol

glycosides ................................................................................................... 46

Bảng 3.8: Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp (MDL) và giới hạn định lƣợng của

phƣơng pháp (MQL) của các Steviol glycosides ....................................... 47

Bảng 3.9: Độ lặp lại khi phân tích các Steviol glycosides trong mẫu lá cỏ ngọt ......... 48

Bảng 3.10: Độ lặp lại khi phân tích các Steviol glycosides trong mẫu đƣờng ăn

kiêng... ........................................................................................................ 49

Bảng 3.11: Độ lặp lại khi phân tích các Steviol glycosides trong mẫu nƣớc ngọt.. .... 50

Bảng 3.12: Độ thu hồi của các chất Steviol glycosides trên nền mẫu lá cỏ ngọt ........ 52

Bảng 3.13: Độ thu hồi của các chất Steviol glycosides trên nền mẫu đƣờng ăn

kiêng. .......................................................................................................... 53

Bảng 3.14: Độ thu hồi của các chất Steviol glycosides trên nền mẫu nƣớc giải khát. 54

Bảng 3.15: Bảng kết quả độ thu hồi so với yêu cầu của AOAC .................................. 55

Bảng 3.16: Kết quả phân tích một số mẫu thực tế trên nguyên liệu đƣờng cỏ ngọt,

cây cỏ ngọt, đƣờng ăn kiêng ....................................................................... 56

Bảng 3.17: Kết quả phân tích một số mẫu thực tế trên mẫu trà giảm cân và nƣớc

giải khát ...................................................................................................... 57

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay lƣợng đƣờng con ngƣời tiêu thụ ngày càng cao do thói quen trong

bữa ăn hàng ngày, dẫn đến nguy cơ về các bệnh béo phì, tiểu đƣờng ngày càng tăng.

Để ngăn ngừa nguy cơ này, các loại đƣờng thông thƣờng đang có xu hƣớng đƣợc

thay thế bằng các chất phụ gia tạo ngọt nhƣng không sinh năng lƣợng nhƣ

saccharin, natri cyclamate, sucralose, acefulfame K và aspartame. Các loại đƣờng

này có ƣu điểm là rẻ tiền và tiện dụng nhƣng nhƣợc điểm là có thể gây ảnh hƣởng

xấu đến sức khoẻ con ngƣời nếu sử dụng với một thời gian kéo dài. Vì vậy hiện nay

tâm lý chung của ngƣời tiêu thụ, đặc biệt ngƣời bị tiểu đƣờng là tìm về với những

sản phẩm thiên nhiên, trong đó nhóm những chất tạo ngọt thiên nhiên ví dụ nhƣ cây

cỏ ngọt có nhiều ƣu thế và đang đƣợc ƣa chuộng nhất.

Nhóm Steviol glycosides là nhóm hợp chất tạo ngọt tự nhiên thu đƣợc từ loài

cỏ ngọt, có mức độ ngọt gấp 75 – 300 lần so với đƣờng kính [13]. Đây là loại chất

tạo ngọt không sinh năng lƣợng, có tác dụng trong điều trị bệnh tiểu đƣờng, hạ

đƣờng huyết, béo phì, sâu răng, tăng huyết áp, kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng

virus, kháng viêm. Nhiều sản phẩm nhƣ kẹo, bánh ngọt, đƣờng cho ngƣời ăn kiêng

và các loại nƣớc ngọt đã đƣợc sản xuất sử dụng chất tạo ngọt Steviol glycosides.

Mặc dù đây là các hợp chất thu đƣợc từ thiên nhiên, không sinh năng lƣợng khi tiêu

thụ vào cơ thể, nhƣng Ủy ban chuyên gia quốc tế về phụ gia thực phẩm (JECFA)

vẫn đƣa ra mức hấp thụ hàng ngày chấp nhận đƣợc đối với các hợp chất này (mức

ADI) là 4 mg/kg trọng lƣợng cơ thể.

Hiện nay tại Việt Nam chƣa có nhiều phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng các

chất nhóm Steviol glycosides trong thực phẩm, chỉ có một vài nghiên cứu về phân

tích và chiết tách các thành phần này trong nguyên liệu thô. Do đó, việc xây dựng

đƣợc một phƣơng pháp phân tích đồng thời các hợp chất này là rất cần thiết và có ý

nghĩa thực tế trong việc cung cấp thông tin cần thiết cho các nhà quản lý và ngƣời

tiêu dùng để lựa chọn và điều chỉnh hợp lý khẩu phần dinh dƣỡng hàng ngày.

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đƣợc sử dụng rất phổ biến hiện nay và

1

phƣơng pháp này cho thấy khả năng tách cao đối với các hợp chất đƣờng cỏ ngọt

với nhiều ƣu điểm nhƣ độ nhạy và độ chính xác cao, hóa chất phổ biến, quy trình

phân tích đơn giản. Từ những luận giải nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu phƣơng pháp

xác định một số Steviol glycosides trong thực phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký

lỏng” đƣợc thực hiện với mong muốn đóng góp phần nhỏ vào việc xây dựng một

quy trình phân tích hiệu quả trong lĩnh vực đánh giá chất lƣợng sản phẩm thực

phẩm với chỉ tiêu là nhóm Steviol glycosides.

2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về cây cỏ ngọt

1.1.1. Giới thiệu

1.1.1.1 . Thực vật học

Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) là một loài thực

vật thuộc chi Stevia, thuộc họ hoa hƣớng dƣơng

(Asteraceae) [40]. Cỏ ngọt là cây lâu năm có thân rễ

khoẻ, ít phân nhánh, mọc nông từ 0-30 cm tuỳ

thuộc vào độ phì nhiêu, tơi xốp và mực nƣớc ngầm

của đất. Cỏ ngọt có dạng thân bụi, chiều cao 50-60

cm, thâm canh tốt có thể đạt 80-120 cm. Lá mọc

từng cặp đối nhau hình thập tự, mép lá có từ 12-16

răng cƣa, lá hình trứng ngƣợc, lá trƣởng thành dài Hình 1.1. Lá cây cỏ ngọt khoảng 50-70 mm rộng 17-20 mm [24].

Về đặc tính sinh học của cây cỏ ngọt: Sau khi gieo hạt 9-10 ngày thì mọc, nhiệt độ thích hợp cho việc nẩy mầm từ 20-25oC, ẩm độ 60-85%, nhiệt độ dƣới 15oC hạt không nẩy mầm, trên 35oC hạt sẽ chết. Nhiệt độ thích hợp nhất cho cây phát triển từ 25-30oC, độ ẩm 70-75%. Nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao cây sinh

trƣởng chậm. Cỏ ngọt là cây ƣa độ ẩm vừa phải, nếu úng ngập, hạn hán lâu đều gây

hại và có thể chết cây [40].

Cây cỏ ngọt có nguồn gốc từ các vùng của Brazil và Paraguay (Nam Mỹ)

hiện đƣợc trồng ở nhiều nơi trên thế giới để làm chất tạo ngọt và làm thuốc, là

nguồn gốc của các sản phẩm làm ngọt đƣợc gọi chung là stevia và đƣợc bán dƣới

nhiều tên thƣơng mại khác nhau [11]. Các hợp chất hóa học tạo ra vị ngọt của nó là

các glycosides steviol khác nhau (chủ yếu là Stevioside và Rebaudioside ), có độ

3

ngọt gấp 75 lần 300 lần so với đƣờng mía [10]. Ngày nay, nhiều nƣớc trên thế giới

đã phát triển việc dùng loại cây này trong đời sống.

1.1.1.2 . Tác dụng

Đƣờng cỏ ngọt có độ ngọt gấp nhiều lần so với đƣờng mía và có thể đƣợc sử

dụng thay thế cho đƣờng mía. Các hợp chất này khi tiêu hóa không bị phá vỡ cấu

trúc hóa học, không chuyển hóa trong cơ thể con ngƣời, không tạo ra năng lƣợng an

toàn cho những ngƣời cần kiểm soát lƣợng đƣờng trong máu. Điều này có ý nghĩa

vô cùng lớn, đặc biệt là trong bối cảnh của hiện nay, con ngƣời đang tìm kiếm

những thực phẩm tự nhiên và an toàn đối với sức khỏe do tỷ lệ ngƣời mắc bệnh tiểu

đƣờng và béo phì tăng cao và mối lo ngại đối với an toàn thực phẩm ngày càng tăng

khi các chất làm ngọt hóa học đang đƣợc sử dụng rộng rãi [10].

Steviol glycosides đƣợc coi là an toàn [13]; tuy nhiên, các nghiên cứu trên

động vật cho thấy có một số tác động bất lợi do steviol aglycone [10]. Khi sử dụng

đƣờng cỏ ngọt ở ngƣỡng hàm lƣợng cao trong thời gian dài có thể ảnh hƣởng bất lợi

tới sức khỏe. Tại nhiều nƣớc trên thế giới, Stevioside đƣợc dùng làm chất tạo vị

ngọt thay thế các loại đƣờng mía hoặc đƣờng hóa học [2]. Cỏ ngọt phơi khô, sấy

khô có thể làm trà. Bột lá khô có thể trộn với bột làm bánh để thay thế đƣờng.

Trong đầu thập niên 1970, ngƣời Nhật bắt đầu trồng cây và đƣa vào sản xuất

công nghiệp để thay thế các chất làm ngọt nhân tạo nhƣ cyclamate hay saccharin.

Nhật Bản cũng là Quốc gia đầu tiên ở châu Á sử dụng Stevioside nhƣ một chất làm

ngọt trong ngành công nghiệp thực phẩm và dƣợc phẩm. Chúng chiếm 40% thị

trƣờng chất làm ngọt trong năm 2005 tại đất nƣớc này và là nƣớc tiêu dùng lớn nhất

thế giới [13]. Cỏ ngọt hiện nay đƣợc trồng và tiêu thụ ở nhiều nƣớc châu Á

nhƣ: Trung Quốc (từ năm 1984), Hàn Quốc, Thái Lan và Malaysia [24]. Nó cũng

đƣợc tìm thấy ở Nam Mỹ và Israel [13]. Ngƣời dân Trung Quốc xem cỏ ngọt nhƣ

một dƣợc liệu thiên nhiên rất tốt để giúp làm giảm cân, giúp ăn ngon và tiêu hóa tốt.

Hiện nay chất tạo ngọt Stevioside đang đƣợc sử dụng trong kẹo gum, bánh ngọt và

trong các loại nƣớc ngọt nhƣ Coca Cola,…. Hơn nữa, ở các Quốc gia Châu Á và

4

Nam Mỹ đƣờng cỏ ngọt đƣợc công nhận và đƣợc cho phép sử dụng nhƣ một chất

phụ gia. Ngƣợc lại các Quốc gia phƣơng Tây (Anh, Pháp, Hoa Kỳ, Úc Châu,

Canada, v.v…) lại chƣa công nhận đƣờng cỏ ngọt là chất phụ gia để tạo vị ngọt nhƣ

các chất aspartame, natri cyclamate mà chỉ đƣợc xem là một loại thực phẩm bổ

sung.

Tại Việt Nam, từ năm 1988, cỏ ngọt đã đƣợc nhập và trồng ở nhiều vùng nhƣ

Hà Giang, Cao Bằng, Hà Tây, Lâm Đồng... Từ năm 1990 Công ty Dƣợc liệu TWI

hƣớng dẫn kỹ thuật trồng trên diện tích sản xuất công nghiệp để cung ứng cho nhu

cầu trong nƣớc và xuất khẩu.

Cỏ ngọt không tạo năng lƣợng nên rất thích hợp để giảm cân. Cỏ ngọt không

làm bẩn răng, không gây sâu răng, bảo vệ vệ sinh răng miệng và cũng giúp vào việc

làm lành các vết thƣơng ngoài da, bổ tim, lợi tiểu, làm giảm huyết áp ở những ngƣời

huyết áp cao, và đặc biệt nhất là đối với những ngƣời bị bệnh tiểu đƣờng, cỏ ngọt

giúp tuyến tụy trong việc tiết chất insulin. Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cỏ

ngọt có thể mang lại lợi ích điều trị chống tăng đƣờng huyết, chống viêm, chống

khối u, chống tiêu chảy, lợi tiểuvà tác dụng điều hòa miễn dịch.

Một số tác dụng của cây cỏ ngọt đã đƣợc đánh giá [14]:

- Hỗ trợ điều trị đau dạ dày: Trong cây cỏ ngọt có khá nhiều hoạt chất giúp giảm

các cơn đau và chứng bệnh đƣờng tiêu hóa, đặc biệt là rối loạn dạ dày. Do vậy,

cây cỏ ngọt chính là một loại thuốc bổ giúp chống lại các bệnh rối loạn dạ dày,

giảm đau và tiêu hóa tốt.

- Chăm sóc răng miệng: Nhờ chứa nhiều hoạt chất kháng khuẩn mạnh, sử dụng

nƣớc cây cỏ ngọt súc miệng thƣờng xuyên giúp ngăn ngừa chảy máu chân răng

ở những ngƣời mắc bệnh viêm lợi và giúp chăm sóc tốt hơn cho răng miệng.

- Chăm sóc da: cỏ ngọt đƣợc xem là một nguyên liệu tự nhiên chăm sóc da khá

tốt, có tác dụng giảm tiết bã nhờn, làm giảm các vết nhăn, giúp làn da trở lên

sáng trắng hơn, chống viêm da và ngăn ngừa mụn trứng cá.

5

- Chăm sóc tóc: Giúp tóc đẹp, mƣợt và giảm các vấn đề về gàu và da đầu.

- Giải nhiệt, lợi tiểu: Có tác dụng giúp thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu hiệu quả. Cây

cỏ ngọt có thể sử dụng kết hợp với các loại nhân trần, cam thảo, trà atiso uống

mỗi ngày nhƣ nƣớc bình thƣờng, không chỉ giúp thanh nhiệt, giải độc, loại nƣớc

này còn có công dụng lợi tiểu hiệu quả.

- Trị tiểu đƣờng, béo phì, cao huyết áp: Nghiên cứu trên 40 bệnh nhân cao huyết

áp độ tuổi 50 cho thấy uống chè cỏ ngọt trong một tháng, kết quả huyết áp ổn

định hơn, lợi tiểu, ngƣời khỏe và hoạt bát hơn. Cỏ ngọt và Stevioside có vị ngọt

sẽ làm giảm nhu cầu chất đƣờng và chất bột của ngƣời bệnh, vì thế sẽ làm giảm

đƣờng huyết. Liều dùng theo thử nghiệm ở Braxin là mỗi lần 0,25 g steviosid

(hoặc 2,5 g lá cỏ ngọt), ngày 4 lần, uống trong nhiều ngày. Ngoài ra cỏ ngọt và

Stevioside còn chữa béo phì do có vị ngọt sẽ làm giảm nhu cầu đƣờng và tinh

bột của cơ thể, nên cũng có tác dụng chữa béo phì. Liều dùng 0,5 – l g

steviosidchiara dùng 3-4 lần trong ngày, uống nhiều ngày. Lá cỏ ngọt hoặc

Stevioside còn thƣờng dùng làm chất điều vị cho các loại trà thuốc.

Tại Việt Nam, cũng đã có một số chế phẩm trà thuốc có cỏ ngọt nhƣ trà

actisô - stevia. Trà sâm quy - stevia có sâm, tam thất, đƣơng quy, thục địa, táo, long

nhãn, ngũ gia bì và cỏ ngọt. Trà túi lọc Sotevin có dừa cạn, hoa cúc, hoa hoè và cỏ

ngọt.

1.1.1.3 . Liều dùng an toàn ở người

Tính an toàn của steviol glycosides đã đƣợc xác nhận trong nhiều nghiên cứu

độc tính bao gồm độc tính cấp tính và bán cấp tính, độc tính sinh sản, độc tính di

truyền và gây ung thƣ. Do đó, steviol glycosides đƣợc coi là an toàn đối với cơ thể

ngƣời. Một số nghiên cứu Nồng độ Stevioside trong một số nƣớc giải khát ở Nhật

Bản đƣợc ghi nhận là 0,005 - 0,007%. Nếu một ngày uống 1 lít nƣớc thì lƣợng

steviosid đƣa vào cơ thể là 0,05 - 0,07 g tƣơng ứng với khoảng lg lá Cỏ Ngọt. Đây

là liều lƣợng an toàn, đã đƣợc Chính phủ Nhật cho phép. Ủy ban chuyên gia quốc tế

6

về phụ gia thực phẩm (JECFA) đƣa ra mức tiêu thụ chấp nhận hàng ngày đối với

các hợp chất này, mức ADI là 4 mg/kg trọng lƣợng cơ thể.

1.1.2. Thành phần hóa học trong cây cỏ ngọt.

Chất cơ bản tạo nên độ ngọt tự nhiên của loại cây cỏ ngọt là các hợp chất

Steviol glycosides, hợp chất này ngọt gấp 300 lần đƣờng mía (saccarose) [13],

không lên men, ít năng lƣợng và có vị rất thơm ngon, những ngƣời phải kiêng

đƣờng nhƣ bệnh nhân tiểu đƣờng có thể sử dụng hợp chất này để thay thế đƣờng

trong các bữa ăn hàng ngày. Cỏ ngọt thƣờng đƣợc thu hái, phơi khô và có thể sử

dụng cho mọi lứa tuổi.

Thành phần trong lá (tính theo % chất khô) chứa 6,2% protein, 5,6% chất

béo, 52,8% carbohydrate, 15% Stevioside và khoảng 42% chất hòa tan trong nƣớc

là các diterpenoid glycosides và gồm có Stevioside (5 – 10%), rebauvioside A (2 –

4%), rebauvioside C (1 – 2%), và dulcoside A (0,5 – 1%), một số hợp chất khác là

rebauvioside B, D và E. Chất ngọt Stevioside có vị ngọt gấp 300 lần hơn đƣờng mía (saccharose). Stevioside rất ổn định ở nhiệt độ cao 198oC (388 độ F), không bị sạm

màu và caramel hóa [11].

Bên cạnh Stevioside, Rebaudioside có hàm lƣợng ít hơn nhƣng ngọt hơn

Stevioside 1,2 – 1,5 lần. Ngoài ra, trong thành phần cỏ ngọt chứa một hàm lƣợng

thấp các chất: stigmasterol, sitosterol, campesterol, flavonoid, và cosmosiin,

caryophyllen, spathuienol. Một số khoáng đa lƣợng và vi lƣợng đƣợc tìm thấy

trong cỏ ngọt là Ca, Mg,…Về mặt sinh vật học, sự hiện diện của gibberellin A20

trong cỏ ngọt đã chứng minh steviol có thể chuyển hóa thành gibberillin. Phần chiết

stevia có tính chất ức chế rotavirus, chống vi khuẩn Helicobacter pylori, đƣợc ứng

dụng trong điều trị khối u [21]. Những flavonoid trong cây (4,75%) có tính chất

chống vi khuẩn Bacillus subtilus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli... Các thí

nghiệm trên chuột cho thấy chất này ức chế sự phát triển ung thƣ da.

7

1.2. Tổng quan về Steviol glycoside

1.2.1. Giới thiệu

Steviol glycosides là một nhóm glycoside có nguồn gốc từ cây cỏ ngọt , có

thể đƣợc sử dụng làm chất làm ngọt. Bao gồm tám diterpene glycoside: Stevioside,

steviolbioside, Rebaudiosides A, B, C, D và E, và dulcoside A. Steviol glycoside

trong cỏ ngọt đã đƣợc báo cáo là ngọt hơn từ 30 đến 320 lần so với sucrose. Chúng

có cấu trúc tƣơng tự nhau steviol aglycon ở C-4 và C-13 liên kết với mono-, di-

hoặc trisaccharide: glucose hoặc rhamnose hoặc cả hai [11]. Khung cấu trúc của

nhóm Steviol glycosides và thành phần chính đƣợc thể hiện trong hình 1.2 và 1.3.

Cấu trúc bảy chất phân tích trong nhóm Steviol glycosides và độ ngọt so với đƣờng

sucrose đƣợc thể hiện trong bảng 1.1.

Hình 1.2: Khung cấu trúc cơ bản của Steviol glycosides

8

a. b.

Hình 1.3: Thành phần chính của steviol glycosides trong lá cỏ ngọt: a. Stevioside; b. Rebaudioside A

Bảng 1.1: Cấu trúc của các chất nhóm Steviol glycosides và độ ngọt so với đường sucrose

Độ ngọt so

Hợp chất Chuỗi R1 Chuỗi R2 với sucrose

[24].

300 Stevioside β – Glc β-Glc-β-Glc (2 1)

Steviolbioside H β - Glc - β - Glc (2 1) 100-125

β - Glc - β - Glc (2 1) Rebaudioside A β – Glc 250-50 β - Glc – (3 1)

β - Glc - β - Glc (2 1) Rebaudioside B H 300-350 β - Glc – (3 1)

β - Glc - α - Rha (2 1) Rebaudioside C β – Glc 50-120 β - Glc – (3 1)

β - Glc - β - Glc β - Glc - β - Glc (2 1) 250-450 Rebaudioside D (2 1) β - Glc – (3 1)

9

Độ ngọt so

Hợp chất Chuỗi R1 Chuỗi R2 với sucrose

[24].

Dulcoside A β – Glc β - Glc - α - Rha (2 1) 50-120

1.2.2. Tính chất vật lý, hóa học

Stevioside là một loại bột trắng, tan tốt trong nƣớc, ethanol, methanol và không nên sử dụng trực tiếp. Khi đun nóng ở 100oC trong 1 giờ, dung dịch Stevioside ở pH 3-9 cho thấy vị ngọt ít thay đổi và không thay đổi ở 22oC trong 5

tháng [29,33]. Tuy nhiên, sự phân hủy xảy ra ở pH=10. Ngoài ra, có ghi nhận một

số thay đổi của Stevioside và Rebaudioside trong đồ uống có ga do bị acid hóa với phosphor và acid citric trong quá trình bảo quản ở 37oC. Gia nhiệt ở 60oC trong 6

ngày làm mất 0% - 6% độ ngọt. Tiếp xúc ánh sáng mặt trời trong vòng 1 tuần không

ảnh hƣởng đến Stevioside, nhƣng dẫn đến mất 20% Rebaudioside A. Nhờ độ ổn

định cao, Stevioside là một chất làm ngọt phù hợp cho thực phẩm kể cả nấu chín và

cho đồ uống. Stevioside còn ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật trong khoang

miệng [26].

Trong số các thành phần của cỏ ngọt, Rebaudioside A đƣợc đặc biệt quan

tâm nhờ hƣơng vị đƣợc yêu thích. Trong thực tế, Stevioside lại là chất chiếm phần

lớn trong nhóm (60-70% tổng hàm lƣợng glycoside) nhƣng có dƣ vị đắng cùng

hƣơng vị cam thảo còn Rebaudioside A chiếm khoảng 30-40% tổng hàm lƣợng

glycoside và không có dƣ vị đắng (hậu vị cam thảo kéo dài lâu) [26]. Nếu

Rebaudioside A có hàm lƣợng bằng Stevioside có thể loại bỏ dƣ vị đắng của sản

phẩm. Tác dụng làm ngọt của các chất này hoàn toàn là hƣơng vị, không đƣợc tiêu

hóa do không xảy ra phản ứng đƣờng phân khi ăn vì cơ thể ngƣời không thể chuyển

hóa stevia. Do đó, các chất này có ít giá trị dinh dƣỡng, là chất có thể thay thế

đƣờng tự nhiên cho bệnh nhân tiểu đƣờng và những ngƣời trong chế độ ăn kiêng

kiểm soát carbohydrate [41].

10

Steviolbioside là chất tạo ngọt có hoạt tính sinh học, rất hiếm trong cây cỏ

ngọt. Ngoài công dụng là phụ gia thực phẩm tạo ngọt, Steviolbioside còn đƣợc sử

dụng nhƣ chất trung gian sử dụng trong nhiều loại thuốc. Steviolbioside có hoạt tính

chống bệnh lao. Ngoài ra, steviolbioside đã đƣợc sử dụng trong các thử nghiệm

nghiên cứu điều trị nhiễm HIV-1.

1.2.3. Ứng dụng thực tế của Steviol glycosides

Trong thực phẩm, chiết xuất Steviol glycosides chủ yếu đƣợc sử dụng làm

chất làm ngọt trong sản xuất đồ uống trái cây và sữa, món tráng miệng, sữa chua,

bánh kẹo lạnh, sản phẩm hƣơng vị và dƣa chua. Stevioside và Rebaudioside A có

tính ổn định dƣới nhiệt độ cao đƣợc sử dụng trong chế biến thực phẩm và không bị

hóa nâu hoặc caramen khi đun nóng. Đối với các sản phẩm có tính acid, các Steviol

glycosides này cũng có tính ổn định cao [18,19].

Các hợp chất này đƣợc sử dụng nhƣ một chất làm ngọt của thực phẩm, có mã

hóa quốc tế INS 960 [32], có mức quy định giới hạn sử dụng trong thực phẩm theo

thông tƣ 24/2019/TT-BYT về hƣớng dẫn quản lý phụ gia trong thực phẩm. Mức

quy định giới hạn sử dụng Steviol glycosides trong thực phẩm đƣợc thể hiện trong

bảng 1.2.

Bảng 1.2: Mức quy định giới hạn sử dụng Steviol glycosides trong thực phẩm

Loại thực phẩm Mức sử dụng tối đa (mg/kg)

Đồ uống từ sữa, có hƣơng liệu và/hoặc lên men 200

Các sản phẩm tƣơng tự sữa bột hoặc cream bột 330

Đồ tráng miệng từ sữa 330

Kem lạnh thực phẩm, bao gồm nƣớc hoa quả 270 ƣớp lạnh và kem trái cây

Quả ngâm dấm, dầu hoặc nƣớc muối 100

11

Loại thực phẩm Mức sử dụng tối đa (mg/kg)

Mứt, thạch, mứt quả 360

Sản phẩm quả lên men 115

Sản phẩm kẹo cứng, kẹo mềm, kẹo nuga… 700

Kẹo cao su 3500

Đồ uống từ đậu nành 200

Sản phẩm thịt, thịt gia cầm và thịt thú xay nhỏ 100 đã qua xử lý nhiệt

Đồ gia vị 30

Thực phẩm bổ sung 2500

Đồ uống hƣơng liệu 200

200 Đồ uống có cồn hƣơng liệu (bia, vang và đồ

uống có cồn làm lạnh)

Một số nghiên cứu độc tính trên động vật đã cho thấy các dữ liệu đầu tiên về

tác động bất lợi đến sức khỏe. Do đó, các tổ chức quan tâm đến sức khỏe cộng đồng

cũng đã đƣa ra mức tiêu thụ chấp nhận hàng ngày cho hợp chất Steviol glycosides,

mức ADI là 4 mg/kg thể trọng/ngày (cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu – EFSA).

Do đó, cần có phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các chất Steviol glycosides trong

nguyên liệu cỏ ngọt cũng nhƣ các sản phẩm thực phẩm nhằm đánh giá chất lƣợng

an toàn thực phẩm, góp phần kiểm soát đƣợc mức tiêu thụ của ngƣời tiêu dùng.

1.3. Các phƣơng pháp xác định Steviol glycosides

Trên thế giới và tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu đƣợc công

bố về các phƣơng pháp xác định các hợp chất tạo ngọt tự nhiên này bao gồm

phƣơng pháp quang phổ, phƣơng pháp điện di mao quản và các phƣơng pháp sắc

12

ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV (PDA) và sắc ký

lỏng khối phổ. Một số phƣơng pháp phân tích đƣợc liệt kê dƣới đây là tài liệu tham

khảo cho nghiên cứu.

1.3.1. Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một dạng của sắc ký hấp phụ dạng rắn – lỏng, là

kĩ thuật quan trọng dùng trong phân tích nhanh với lƣợng mẫu nhỏ. Sắc ký lớp

mỏng đƣợc thực hiện trên một tấm kính, nhựa hoặc nhôm, đƣợc phủ một lớp mỏng

của vật liệu hấp phụ thƣờng là silica gel, oxit nhôm, hoặc cellulose. Sắc ký lớp

mỏng đã đƣợc phát triển nhƣ là một kỹ thuật định tính nhanh chóng và đơn giản.

Tuy nhiên, với công nghệ hiện đại, TLC có thể cũng là một công cụ của định lƣợng.

Đã có một số công trình nghiên cứu sứ dụng phƣơng pháp TLC scanner để xác định

hàm lƣợng nhóm Steviol glycosides đã đƣợc công bố.

Vikas Jaitak và các cộng sự [39] đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng

hiệu năng cao (HPTLC) để phân tích Steviol glycosides trong cỏ ngọt. Bột lá cỏ

ngọt khô đƣợc chiết với hỗn hợp dung dịch MeOH/H2O (80:20, v/v) trong 12 giờ ở

nhiệt độ phòng và lặp lại ba lần. Dung dịch đƣợc bay hơi đến khô và chiết phân

đoạn với hexane, chloroform, ethyl acetate và butanol. Sử dụng Na2SO4 để loại nƣớc và cô ở áp suất thấp tại 50 ± 5oC thu đƣợc các chiết xuất hexan (30,0 g),

chloroform (10,0 g), ethyl acetate (10,5 g) và butanol (150,2 g) tƣơng ứng. Khai

triển chuẩn và mẫu đƣợc thực hiện trên tấm silicagel 60 F254 (20 cm × 10 cm) có độ

dày 0,20 mm và thuốc thử gồm acid acetic: acid sulfuric: ethanol (01:01:10, v/v/v).

Phƣơng pháp có độ nhạy và tính đặc hiệu cao. Đƣờng chuẩn là tuyến tính trong

khoảng 160–960 ng/điểm đối với steviolbioside, 1–6 g/điểm đối với Stevioside và

0,5–3 g/điểm đối với Rebaudioside A với hệ số tƣơng quan tốt (0,998–0,999).

Phƣơng pháp HPTLC đƣợc phát triển và xác nhận giá trị sử dụng để phân

tích 7 Steviol glycosides trong 6 loại thực phẩm. Morlock và cộng sự [28] đã sử

dụng dung môi chiết mẫu là methanol. Pha động sử dụng trong nghiên cứu là ethyl

acetate - acetic acid - methanol (3:1:1, v/v/v). Phƣơng pháp có độ chính xác thông

13

qua độ thu hồi đạt 92 - 120%, độ lặp lại 3,1 - 5,4% và độ tái lặp 4,0 - 8,4% đƣợc xác

định đối với Stevioside trong nền sữa. Phƣơng pháp HPTLC cho Rebaudioside A

đƣợc so sánh với kết quả của phƣơng pháp HPLC cho thấy kết quả của hai phƣơng

pháp có sự khác nhau không có ý nghĩa thống kê.

Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng là một phƣơng pháp tách phát triển và cũng đã

đƣợc nhiều tác giả trên thế giới áp dụng để tách và xác định một số Steviol

glycosides trong một số đối tƣợng khác nhau. Tuy nhiên phƣơng pháp lại tốn kém

và ít đƣợc sử dụng ở phòng thí nghiệm của Việt Nam.

1.3.2. Phương pháp quang phổ

Mizukami và cộng sự [20] sử dụng enzyme hesperidinase để thủy phân

Stevioside tạo ra steviol và glucose. Sau đó steviol đƣợc đo gián tiếp thông qua việc

xác định hàm lƣợng glucose. Hydrogen peroxide đƣợc tạo ra bởi phản ứng oxy hóa

glucose, sẽ phản ứng với 2, 2’-azino-di- (acid 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic)

(ABTS) tạo thành sản phẩm oxidized ABTS, đƣợc đo phổ hấp thụ phân tử ở bƣớc

sóng 600 nm.

Trình tự của phản ứng nhƣ sau:

Stevioside + 3H2O Steviol + 3Glucose

Glucose + O2 + H2O Gluconic acid + H2O2

H2O2 + ABTS Oxidized ABTS

Quá trình thủy phân enzyme của Stevioside xảy ra trong 2 giờ khi đƣợc ủ ở

50oC với 1 mg hesperidinase trong 1,0 mL dung dịch đệm citrat phosphat, pH 4,0. Quá trình thủy phân mất 5 giờ nếu xảy ra ở 40oC và 2 giờ nếu ở 50 oC. Do đó, quá trình thủy phân đƣợc thực hiện ở 50oC trong 2 giờ. Ngƣợc lại, quá trình thủy phân

enzyme của Rebaudioside A mất 48 giờ để hoàn thành và 10% Rebaudioside A

không thủy phân trong vòng 2 giờ. Độ thu hồi trung bình của 40, 50 và 80 µg

Stevioside đƣợc thêm vào 0,1 mL dịch chiết metanol lá cỏ ngọt chứa 116 µg

14

Stevioside lần lƣợt là 95,0; 98,8 và 96,7%. Độ lặp lại với RSD% là 1,7% và độ tái

lặp thực hiện trong 6 ngày với RSD% là 5,8% cho thấy phƣơng pháp có độ chính

xác tốt. Kết quả đo các mẫu lá cỏ ngọt bằng phƣơng pháp đo quang và phƣơng pháp

TLC cho kết quả có sự khác nhau không có ý nghĩa thống kê.

Udompaisarn và cộng sự [34] đã xây dựng một phƣơng pháp enzym để xác

định hàm lƣợng Stevioside. Β-glucosidase tái tổ hợp BT_3567 (rBT_3567) từ

Bacteroides thetaiotaomicron HB-13 có sự thủy phân chọn lọc Stevioside tại liên

kết β-1,2-glycosidic để tạo ra rubusoside và glucose. Sự kết hợp của enzyme này

với glucose oxidase và peroxidase cho phép định lƣợng hàm lƣợng Stevioside trong

các mẫu Stevia bằng cách sử dụng phƣơng pháp dựa trên phép đo màu. Các phản

ứng để xác định Stevioside có thể đƣợc hoàn thành trong vòng 1 giờ ở 37°C. Việc

xác định Stevioside bằng cách sử dụng enzyme so với kết quả thu đƣợc từ định lƣợng HPLC (r2 = 0,9629, n = 16). Phần trăm biến thiên hệ số (CV) của các thử

nghiệm trong ngày (n = 12) và giữa các ngày (n = 12) thấp hơn 5% và độ chính xác

là 95−105%. Phân tích này chứng minh rằng phƣơng pháp enzym đƣợc phát triển

trong nghiên cứu này là cụ thể, dễ thực hiện, chính xác và mang lại kết quả tốt.

Phƣơng pháp quang phổ là một phƣơng pháp phổ biến tại các phòng thí

nghiệm trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng. Tuy nhiên phƣơng pháp lại

có độ nhạy và chọn lọc kém dẫn đến độ chính xác không cao, để phân tích nhóm

Steviol glycosides các bƣớc xử lý mẫu phức tạp.

1.3.3. Phương pháp điện di mao quản

Các tác giả J. Liu và cộng sự [22] đã dùng kỹ thuật điện di mao quản và

HPLC detector UV để tách các Steviol glycosides trong đƣờng cỏ ngọt bao gồm

Stevioside, Rebaudioside A, Rebaudioside C và dulcoside. Nhóm tác giả tập trung

nghiên cứu các điều kiện phân tích bằng kỹ thuật điện di mao quản, kết quả nhận

thấy kỹ thuật này đơn giản, có thể tách đƣợc 4 hợp chất nghiên cứu. Mẫu đƣờng cỏ

ngọt chiết trong nƣớc deion và làm sạch qua cột SPE. Sử dụng kỹ thuật HPLC để

15

kiểm chứng lại kết quả nghiên cứu và nhận thấy có sự tƣơng đồng kết quả giữa hai

kỹ thuật sử dụng.

Để tách Steviol glycoside trong đồ uống, Vaclav và các cộng sự [37] sử dụng phƣơng pháp điện di mao quản với detector C4D. Phƣơng pháp sử dụng dung dịch

H3BO3 ở nồng độ cao để tạo thành các phức ổn định giữa Steviol glycoside và H3BO3. Việc phân tách điện di đƣợc thực hiện bằng hệ thống HP3D CE-C4D

(Agilent Technologies, Waldbronn, Đức). Nhóm Steviol glycoside đƣợc tách trên

cột mao quản silica với đƣờng kính trong 10 µm, đƣờng kính ngoài 363 µm, tổng

chiều dài 31,5 cm (chiều dài hiệu dụng là 18,0 cm). Dung dịch đệm gồm acid boric

170 mM/LiOH, pH 9,0. Việc phân tách đƣợc thực hiện với điện áp cao +20 kV; các

mẫu đƣợc bơm vào mao quản với áp suất 50 mbar trong 100 giây. Dung dịch phủ

INST với lƣợng 0,5% v/v, ngăn chặn hiệu quả dòng chuyển động điện, đƣợc trộn

vào chất điện phân nền để giúp cho quá trình phân tách lẫn nhau của Rebaudioside

A và Stevioside. Phƣơng pháp CE với sự ngăn chặn EOF đƣợc đặc trƣng bởi sự

phân tách hoàn toàn của Rebaudioside A và Stevioside. Quy trình xử lý mẫu đơn

giản: 1 mg mẫu rắn hoàn tan trong 1 mL nƣớc deion. Sau đó, mẫu đƣợc ly tâm

14100 vòng/phút và lọc qua màng 0,45 µm. Dịch lọc đƣợc pha loãng với ACN trƣớc khi phân tích CE. Độ nhạy cao của C4D kết hợp với phƣơng pháp xử lý mẫu

đảm bảo độ nhạy cao của phƣơng pháp CE với LOD là 0,3 mg/L (0,1 μM). Khoảng

tuyến tính của Reaudioside A từ 10-100 mg/L. Để hiệu suất của tách CE cao nhất

yêu cầu phải sử dụng các mao quản hẹp với đƣờng kính trong khoảng 10 µm.

Phƣơng pháp có độ nhạy cao với Steviol glycosides, không hấp thụ ở vùng UV, độ

nhạy của phƣơng pháp đƣợc kiểm soát bởi độ dẫn của dung dịch trong mao quản.

Thiết bị đơn giản này có thể đƣợc sử dụng để đạt đƣợc giới hạn phát hiện ở nồng độ

thấp.

Một phƣơng pháp điện di mao quản đơn giản và độ nhạy cao đƣợc phát triển

bởi Dacome và cộng sự [16] để định lƣợng glycosides trong cây đƣờng cỏ ngọt. Để

tách một số đƣờng cỏ ngọt nhóm tác giả đã sử dụng mao quản silica dài 70 cm và

đƣờng kính trong 50 µm cùng đệm tách natri tetraborate 30 mM, pH 10,3 chứa 3

16

mM -cyclodextrin và 22,5% acetonitril và 15% metanol là chất điều chỉnh độ phân

cực của dung môi. Khoảng tuyến tính của Rebaudioside-A và Stevioside trong

khoảng 2,09 - 5,63 và 1,95-5,15 mg/mL. Hệ số tƣơng quan cho cả hai chất lần lƣợt

là 0,9986 và 0,9974. Nhận thấy rằng dung dịch đệm borat kiềm có thể làm tăng sự

ion hóa của nhóm silanol và giúp cho việc cải thiện độ phân giải và rút ngắn thời

gian phân tích.

Tác giả Mauri và cộng sự [25] đã sử dụng phƣơng pháp điện di mao quản để

phân tích một số Steviol glycoside. Các phép phân tích đƣợc thực hiện trên cột mao

quản silica với dung dịch đệm natri tetraborat 20 mM, pH 8,3 và natri dodecyl sulfat

30 mM. Các mẫu cỏ ngọt đƣợc chiết trong methanol 50% ở nhiệt độ phòng. Dung

dịch chuẩn Stevioside đƣợc pha trong methanol 20%.

Phƣơng pháp này với ƣu điểm tiết kiệm, lƣợng hóa chất sử dụng rất ít, có thể

phân tích đƣợc nhiều nhóm chất khác nhau. Tuy nhiên, độ nhạy kém đồng thời tính

ổn định không cao, thiết bị không phổ biến cho các phòng thí nghiệm. Do đó, việc

tiến hành thực nghiệm yêu cầu kỹ thuật phân tích chuẩn xác trong các điều kiện

khắt khe.

1.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

Paweł Kubica và cộng sự [30] đã xây dựng và phát triển một phƣơng pháp có

thể xác định đồng thời 8 chất đƣờng hóa học là acesulfame-K, saccharine,

cyclamate, aspartame, sucralose, alitame, neohesperidin dihydrochalcone, neotame

và 5 chất đƣờng cỏ ngọt (nhóm Steviol glycosides) phổ biến (Rebaudioside A,

Rebaudioside C, steviol, steviolbioside và Stevioside) trong đồ uống có cồn và

không cồn bằng cách sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao và kết hợp detector khối

phổ (HPLC-ESI-MS/MS). Đây là công trình đầu tiên sử dụng phƣơng pháp HPLC-

ESI-MS/MS để xác định đồng thời tất cả các chất có độ ngọt cao của EU (không

bao gồm thaumatin) trong một lần phân tích. Quá trình xử lý mẫu đơn giản gồm các

bƣớc pha loãng và ly tâm. Độ thu hồi đƣợc tiến hành ở ba nồng độ thử nghiệm, kết

quả thu đƣợc ở các mức thay đổi từ 97,0 đến 105,7%, với độ lệch chuẩn tƣơng đối

17

thấp hơn 4,1%. Phƣơng pháp đã đƣợc áp dụng thành công cho việc xác định chất

làm ngọt trong 24 mẫu đồ uống có cồn và không chứa cồn khác nhau.

Tác giả Claudio Gardanaa và cộng sự [15] đã nghiên cứu và xác nhận giá trị sử

dụng của phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (UHPLC-MS) để đánh giá steviol-

glycosides hoặc steviol trong lá cỏ ngọt và chất làm ngọt thƣơng mại. Mẫu đƣợc

chiết xuất bằng methanol, làm sạch bằng SPE và các chất đƣợc tách ra bởi hệ thống

UHPLC sử dụng cột HSS C18 (150mm × 2,1mm x 1,8 µm). Pha động sử dụng

đƣợc thêm diclomethan để bổ sung thêm clo làm tăng độ nhạy của phƣơng pháp.

Giới hạn phát hiện (LOD) cho Stevioside, Rebaudioside A, steviolbioside và steviol

lần lƣợt là 15, 50, 10 và 1 ng/mL. Độ thu hồi trong khoảng (89 – 103%), độ chính

xác (<4,3%), độ lặp lại (<5,7%) và khoảng tuyến tính (40 - 180 mg/g). Stevioside

(5,8 ± 1,3%), Rebaudioside A (1,8 ± 1,2%) và Rebaudioside C (1,3 ± 1,4%) là phổ

biến nhất trong nhóm steviol-glycosides đƣợc tìm thấy trong các mẫu của lá cỏ ngọt

(n = 10) từ miền nam nƣớc Ý. Rebaudioside A là thành phần chính của steviol-

glycosides tìm thấy trong các mẫu nguyên liệu thƣơng mại (0,84 ± 0,03%). Lƣợng

steviol-glycosides thu đƣợc bởi phƣơng pháp UHPLC-MS phù hợp với phƣơng

pháp LC-NH2-UV truyền thống. Steviol đƣợc tìm thấy trong tất cả các mẫu đƣợc

chiết xuất từ lá (2,7-13,2 mg/kg) nhƣng không phát hiện thấy trong mẫu thƣơng mại

(<1 µg/kg). Phƣơng pháp UHPLC-MS có thể đƣợc áp dụng để kiểm soát chất lƣợng

của lá cỏ ngọt và các sản phẩm thƣơng mại của chúng.

Molina-Calle và cộng sự [27] đã phát triển một phƣơng pháp LC-MS/MS để

định lƣợng 8 Steviol glycosides trong chiết xuất từ lá cỏ ngọt. Quá trình ion hóa và

các thông số phân mảnh đã đƣợc tối ƣu hóa. Steviol glycoside đƣợc chiết xuất từ lá

hoặc lá + cành cây cỏ ngọt bằng cách ngâm trong 2 giờ sử dụng 25 mL hỗn hợp

etanol-nƣớc (35:65, v/v) làm chất chiết. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng

lần lƣợt là từ 0,1- 0,5 ng/mL và 0,5 – 1 ng/mL. Hàm lƣợng Steviol glycosides đƣợc

chiết xuất từ lá trồng trong nhà kính và trồng trên cánh đồng có sự khác nhau. Cây

trồng ở cánh đồng có nồng độ của Steviol glycosides cao hơn so với những loại

đƣợc trồng trong nhà kính. Nhƣ vậy, các yếu tố môi trƣờng có ảnh hƣởng rõ ràng

18

đến nồng độ của các hợp chất này.

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với khối phổ là kỹ thuật

đƣợc phát triển mạnh mẽ ngày nay với độ đặc hiệu và chọn lọc cao và đƣợc sử dụng

rộng rãi đối với phân tích. Khối phổ cho phép xác định trực tiếp các hợp chất mà

không cần quá trình dẫn xuất hóa, hơn nữa còn cho phép định lƣợng chính xác các

hợp chất mà không yêu cầu việc tách sắc ký rõ ràng. Nhƣ vậy, phƣơng pháp này rất

phù hợp cho việc phân tích đồng thời nhóm hợp chất có tính chất và cấu tạo tƣơng

đồng trong nền mẫu thực phẩm phức tạp. Tuy nhiên, nhóm chất Steviol glycosides

trong mẫu cỏ ngọt có hàm lƣợng cao, nên khi phân tích trên hệ khối phổ cần phải

pha loãng nhiều dẫn đến sai số.

1.3.5. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao UV-Vis/PDA

Để tách đƣợc chín chất trong nhóm Steviol glycosides (Rebaudioside A,

steviolbioside, Stevioside, rubusoside, Rebaudioside B, Rebaudioside C,

Rebaudioside D, Rebaudioside F và dulcoside A, tác giả Venkata Sai Prakash

Chaturvedula và cộng sự [38] đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

kết hợp detector PDA. Các tác giả sử dụng cột C18 A Phenomenex (250 mm x 4,6

mm, 5 μm) để tách các chất thay vì sử dụng cột NH2 do cột C18 có độ bền và khả

năng tái tạo cao hơn. Tuy nhiên, trên cột C18 một số Steviol glycosides rửa giải với

cùng thời gian lƣu (tR). Để khắc phục điều này, nhiệt độ buồng cột đƣợc điều chỉnh trong khoảng 40-60oC.

Tác giả R. Amery và các cộng sự [32] đã phát triển một phƣơng pháp mới để

xác định Steviol glycosides trong sản phẩm từ sữa và sữa đậu nành. Các chất béo từ

sữa, nƣớc uống đậu nành và đồ uống sữa lên men đƣợc loại bỏ bằng cách ly tâm 25

mL mẫu trong 12 phút ở tốc độ 15000 vòng. Protein sau đó đƣợc kết tủa với

acetonitrile. Dịch chiết đƣợc làm giàu qua cột chiết pha rắn SPE C18 và phân tích

bằng hệ thống HPLC với detector UV ở bƣớc sóng 200 nm. Kết quả chỉ ra phƣơng

pháp có độ thu hồi tốt và có sự phù hợp giữa đƣờng chuẩn ngoại với phƣơng pháp

thêm chuẩn và nội chuẩn đƣợc thêm vào trƣớc khi chiết tách.

19

Annie Shirwaikar và các cộng sự [12] đã xây dựng phƣơng pháp xác định

nhanh và định lƣợng Stevioside trong các sản phẩm thƣơng mại bằng HPTLC và

HPLC. Việc nhận biết Stevioside đƣợc thực hiện bằng HPTLC. Quá trình tách đƣợc

thực hiện trên tấm sắc ký bản mỏng silica gel 60F254 với dung môi ethyl acetate:

methanol: nƣớc (75:15:10, v/v/v). sử dụng hỗn hợp thuốc thử anhydride acetic:

sulfuric acid: ethanol (1:1:10, v/v/v), quét phổ tại 510nm. Việc xác định chính xác

các pic sắc ký tƣơng ứng của Stevioside đƣợc khẳng định chắc chắn hơn bằng kỹ

thuật HPLC. Đƣờng chuẩn xây dựng có khoảng tuyến tính từ 0,1 đến 1 mg/mL.

Giới hạn phát hiện của Stevioside là 0,05 mg/mL. Hàm lƣợng Stevioside trong mẫu

bột stevia và lá đƣợc tìm thấy tƣơng ứng là 8,859 và 3,703%. Phƣơng pháp cho

phép xác định và định lƣợng nhanh Stevioside trong các mẫu khác nhau và có thể

đƣợc sử dụng để phân tích thƣờng quy các hợp chất Stevioside trong mẫu thƣơng

mại.

Tác giả Yan-Hong Wang và công sự [41] đã phát triển Phƣơng pháp

UHPLC-UV và phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với detector tán xạ

bay hơi UPLC-UV-ELSD đã đƣợc phát triển để định lƣợng Rebaudioside A,

Stevioside, Rebaudioside D, dulcoside A và steviolbioside từ Stevia rebaudiana và

các sản phẩm liên quan. Với chƣơng trình phân tích 12 phút, năm Steviol glycoside

đã đƣợc phân tách tốt. Hai detertor ELSD và UV cho các kết quả tƣơng đƣơng. Các

phƣơng pháp đã đƣợc đánh giá về độ tuyến tính, độ lặp lại, độ chính xác, giới hạn

phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ). Đối với các Steviol glycoside, kết

quả LOD và LOQ lần lƣợt là 10 và 30 μg/mL. RSD% cho các phân tích trong ngày

và khác ngày là dƣới 2,5% và hiệu suất thu hồi là 90–94%. Đối với dẫn xuất PMP

của glucose, LOD và LOQ tƣơng ứng là 0,01 và 0,05 μg/mL. Độ lặp lại (RSD%)

dƣới 2,6%; độ thu hồi là 98,6–101,7%. Các phƣơng pháp này hiệu quả cho việc xác

định, đánh giá đảm bảo chất lƣợng và chất tạp nhiễm trong S.rebaudiana và chất tạo

ngọt Steviol glycosides (sản phẩm từ cây cỏ ngọt).

Tác giả Ursula và cộng sự [35] đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng để xác

định một số Steviol glycoside chính, chất tạo ngọt diterpene có nguồn gốc từ lá cỏ

20

ngọt. Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện qua một bƣớc chiết rắn lỏng và chiết pha rắn

(SPE). Các cột SPE khác nhau và hai loại cột HPLC đã đƣợc thử nghiệm trong việc

tách các Steviol glycoside, Stevioside và Rebaudioside A. Sự phân tách tốt trên cột

phân tích HILIC của Luna với thành phần pha động bao gồm ACN:H2O (85:15,

v/v). Khoảng tuyến tính trong khoảng từ 10 đến 800 µg/mL và hiệu suất thu hồi cho

Stevioside và Rebaudioside A lần lƣợt là 99 ± 4,4 và 100 ± 5,0%. Phƣơng pháp này

đã đƣợc ứng dụng để phân tích Stevioside và Rebaudioside A từ cây cỏ ngọt đƣợc

trồng ở hai khu vực khác nhau ở Đức. Hàm lƣợng Stevioside và Rebaudioside A

giữa hai mùa vụ cho thấy sự khác biệt đáng kể khi dùng F-test và t-test. Tuy nhiên,

tổng nồng độ (>12%) và tỷ lệ thành phần giữa Stevioside và Rebaudioside A (6:4)

là tƣơng tự cho những mẫu cỏ ngọt khác nhau đƣợc tìm thấy ở các Quốc gia. Dựa

trên sự so sánh sản lƣợng từ các đợt thu hoạch, nhóm tác giả đã thảo luận về việc có

thể trồng rộng rãi cỏ ngọt và đem lại kinh tế ở vùng ôn đới phía bán cầu Bắc Âu.

Phƣơng pháp HPLC dùng chế độ đẳng dòng để phân tích nhanh glycosides

steviol từ lá cỏ ngọt. Tác giả Dominik và cộng sự [17] đã phát triển phƣơng pháp

với độ chọn lọc cao cho 9 loại Steviol glycosides và ít tiêu tốn dung môi rửa giải.

Phƣơng pháp phân tích này đƣợc thực hiện trên cột Purospher STAR RP-18 nối cột Hibar RT (250 mm x 4,6 mm x 3 µm) ở 50 oC với thành phần rửa giải là H2O:ACN

(65:35, v/v). Với tốc độ dòng là 1 mL/phút, chín glycoside steviol đã biết đƣợc phát

hiện chọn lọc sau 15 phút. Đánh giá phƣơng pháp cho thấy đối với Rebaudioside A

LOD là 0,0004 mg/mL và LOQ là 0,0038 mg/mL. Đƣờng chuẩn với hệ số R2=0,9997 ± 0,0002 và 2,01% RSD (n = 12). Độ chính xác của phƣơng pháp thông

qua hiệu suất thu hồi đạt 100,99 ± 2,01%. Độ chụm trong ngày trong khoảng 0,12

đến 1,96% RSD và giữa các ngày thay đổi từ 0,02 đến 1,89% RSD. Những thay đổi

nhỏ đến từ các điều kiện phân tích nhƣ thành phần dung dịch rửa giải (65 ± 2%), nhiệt độ (50 ± 10 oC) hoặc tốc độ dòng chảy (1 ± 0,2 mL/phút) không ảnh hƣởng

đến hiệu suất của phƣơng pháp phân tích. Phƣơng pháp HPLC đáng tin cậy và thích

hợp để áp dụng cho định lƣợng các nhóm Steviol glycosides trong lá cỏ ngọt trong

phòng thí nghiệm và kiểm tra chất lƣợng.

21

Khi xác định thành phần dinh dƣỡng của lá cỏ ngọt tại Việt Nam, các tác giả

Trƣơng Hƣơng Lan và cộng sự [5] đã xác định đƣợc Stevioside và Rebaudioside A

là hai thành phần chính trong số các Steviol glycosides của lá cỏ ngọt Stevia

rebaudiana. Trong nghiên cứu này, hàm lƣợng Stevioside và Rebaudioside A trong

lá khô của 4 giống cỏ ngọt trồng tại Việt Nam đã đƣợc xác định bằng sắc ký lỏng

hiệu năng cao sử dụng detector PDA 2996 ở bƣớc sóng 210 nm và so sánh với 1

giống cỏ ngọt Hàn Quốc. Hàm lƣợng Stevioside trong lá của các giống cỏ ngọt này

dao động từ 2,13% đến 7,72% và Rebaudioside A thay đổi từ 2,05% đến 9,32%.

Trong đó, lá cỏ ngọt S. rebaudiana S77 của Việt Nam có hàm lƣợng Steviol

glycoside lớn nhất (11,53%), có tiềm năng là nguyên liệu để sản xuất các loại

đƣờng phục vụ công nghiệp chế biến thực phẩm. Ngoài ra, một số thành phần dinh

dƣỡng chính của lá cỏ ngọt S. rebaudiana S77 cũng đã đƣợc xác định, trong đó hàm

lƣợng protein, lipit, cacbonhydrat và đƣờng khử, tƣơng ứng là 10,87%; 3,95%;

62,55% và 5,12%.

Trong yêu cầu kỹ thuật của phụ gia mã INS 960, ủy ban về các chất phụ gia

(JECFA) [31] cũng đƣa ra hƣớng dẫn quy trình xác định các thành phần Steviol

glycoside trong quy định. Phƣơng pháp sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao

nhận biết bằng detector UV. Sử dụng chuẩn đối chứng là các dung dịch Stevioside

và Rebaudioside A đƣợc chuẩn bị trong nƣớc – acetonitrile (7:3). Mẫu nguyên liệu

đƣợc hòa tan trong nƣớc – acetonitrile (7:3). Điều kiện phân tích sử dụng: Cột

Capcell pak C18 MG II hoặc Luna C18 hoặc các cột tƣơng đƣơng (250 mm x 4,6 mm x 5 um); tốc độ dòng 1 mL/phút; nhiệt độ buồng cột 40oC; pha động gồm tỷ lệ

32:68 của acetonitrile và dung dịch đệm phosphate 10 mM, pH 2,6; detector cài đặt

ở bƣớc sóng 210 nm; thời gian mỗi lần phân tích là 30 phút. Tóm tắt kết quả của

một số nghiên cứu phƣơng pháp xác định Steviol glycosides đƣợc thể hiện trong

bảng 1.3.

22

Bảng 1.3: Tóm tắt kết quả một số nghiên cứu phương pháp xác định Steviol glycosides

STT Phƣơng Chất phân tích Nền mẫu Điều kiện phân Tác giả LOD,

pháp tích LOQ

1 HPTLC Stevioside, Bột cỏ Chiết mẫu - Vikas và

steviolbioside, ngọt cộng sự MeOH:H2O (80:20)

Rebaudioside A [39]

2 HPTLC Bảy chất trong 6 loại thực Chiết mẫu trong - Morlock

nhóm Steviol phẩm Methanol và cộng

glycosides sự [28]

3 CE-UV Stevioside, Đƣờng cỏ Chiết mẫu trong - J. Liu và

Rebaudisodie ngọt nƣớc làm sạch qua cộng sự

A, C, Dulcoside cột C18 [22]

4 CE-C4D Rebaudioside Mẫu cỏ Chiết trong nƣớc. LOD 0,3 Vaclav và

A, Stevioside ngọt Đệm acid boric 170 mg/L cộng sự

mM/LiOH, pH 9,0 [37]

5 CE- Rebaudioside A Mẫu Đệm tách 30mM - Dacome

DAD và Stevioside đƣờng cỏ tetraborate pH 10,3 và cộng

sự [16] ngọt chứa cyclodextrin,

Acetonitril và

Methanol

6 CE- Stevioside Mẫu cỏ Mẫu chiết trong - Mauri và

MEKC ngọt methanol 50%. Đệm Cộng sự

[25] natri tetraborate

20mM, pH 8,3 và

natri dodecyl sulfat

30mM

23

7 Quang Steviol Mẫu cỏ Sử dụng enzyme - Mizukam

phổ kết ngọt hesperidinease để i và cộng

hợp sự [20] thủy phân

thủy Stevioside. Sử dụng

phân thuốc thử ABTS đo

enzyme độ hấp thụ ở bƣớc

sóng 600 nm.

LC- 8 Rebaudiodide Đồ uống Mẫu đƣợc pha loãng LOQ: Pawel và

ESI- A, C, steviol, có cồn và trong nƣớc và ly 3,23-13,56 cộng sự

MS/MS steviolbioside, không cồn tâm ng/mL [30]

Stevioside

9 UPLC- Stevioside, Lá cỏ Mẫu chiết bằng LOD của Claudio

MS Rebaudioside ngọt, chất Methanol, làm sạch Stevioside, và cộng

A, làm ngọt bằng cột HLB, cột Rebaudiosi sự [15]

Steviolbioside, tách C18, pha động de A,

steviol thêm dichlomathane Steviolbiosi

de, steviol

lần lƣợt là

15,50, 10, 1

ng/mL

10 LC- Tám Steviol Lá và Chiết trong hỗn hợp LOD: 0,1- Molina

MS/MS glycoside cành cỏ etanol:nƣớc (35:65, 0,5 ng/mL; và cộng

ngọt v/v) LOQ: 0,5- sự [27]

1,0 ng/mL

11 HPLC- Rebaudioside - Cột tách C18 (250 x - Venkata

PDA A,B,C,D,F, 4,6 mm x 5 µm), và cộng

Stevioside nhiệt độ buồng cột sự [38]

24

Steviolbioside, 40-60 oC

Rubusoside,

12 HPLC- Steviol Sữa và Mẫu đƣợc kết tủa - R. Amery

UV glycoside sữa đậu bằng ACN và làm và cộng

nành sạch qua cột SPE sự [32]

C18. Sử dụng

Steviol-19--

galactose-13--

glucose làm nội

chuẩn

13 HPLC- Setvioside Bột cỏ Cột C18, pha động LOD 0,05 Annie và

UV ngọt và lá mg/mL cộng sự ACN: H2O (80:20,

cỏ ngọt v/v) [12]

14 HPLC- Rebaudioside Cây cỏ Sử dụng PMP để LOD: 10 Yan

UV và A,D, Dulcoside ngọt dẫn xuất Hong g/mL;

ELSD A, Wang và LOQ: 30

Steviolbioside cộng sự g/mL

[41]

15 HPLC- Stevioside, Lá cỏ ngọt Cột HILIC, pha - Ursula và

RID Rebaudioside A động cộng sự ACN:H2O

(85:15,v/v) [35]

16 HPLC- Stevioside, Lá cỏ ngọt Cột C18, pha động LOD: Dominik

PDA Rebaudioside A (35:65, 0,0004 và cộng ACN:H2O

v/v) mg/mL; sự [17]

LOQ:

0,0038

mg/mL

25

17 HPLC- Stevioside và Lá cỏ ngọt - - Trƣơng

PDA Rebaudioside A ở Việt Lan

Nam Hƣơng và

cộng sự

[5]

18 HPLC- Chín Steviol Nguyên Cột C18, Đệm - JECFA

UV glycosides liệu phosphate pH 2,6: INS 960

đƣờng cỏ ACN (68:32, v/v) [31]

ngọt

Trong các phƣơng pháp tìm hiểu trên, phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng

cao- detector UV-VIS đƣợc sử dụng rất phổ biến hiện nay. Khả năng tách cao đối

với các hợp chất đƣờng cỏ ngọt. Tuy nhiên, phƣơng pháp có hạn chế đối với việc

phân tích trong thực phẩm do độ đặc hiệu thấp tại bƣớc sóng phát hiện cận vùng

UV. Để giải quyết đƣợc nhƣợc điểm này, mẫu cần đƣợc xử lý làm sạch trƣớc khi

phân tích hoặc cần dẫn xuất hóa để tăng độ đặc hiệu của phƣơng pháp.

26

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu phƣơng pháp xác định đồng thời một số Steviol glycosides bằng kỹ

thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp detector PDA.

- Ứng dụng phƣơng pháp nghiên cứu để phân tích hàm lƣợng đƣờng cỏ ngọt trong

một số đối tƣợng thực phẩm.

2.2. Nội dung nghiên cứu

Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, các nội dung cần thực hiện bao gồm :

* Nghiên cứu, khảo sát một số điều kiện để xác định đồng thời 7 Steviol

glycoside: Stevioside, Rebaudioside A, Rebaudioside B, Rebaudioside C,

Rubusoside, Steviolbioside và Dulcoside A bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao.

- Khảo sát nồng độ pha động

- Khảo sát pH pha động

- Khảo sát nhiệt độ cột

* Nghiên cứu, khảo sát quy trình chiết mẫu

- Khảo sát dung môi chiết mẫu

- Khảo sát nhiệt độ và thời gian chiết mẫu

* Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp bao gồm:

- Khảo sát khoảng tuyến tính, xây dựng đƣờng chuẩn

- Xác định giới hạn phát hiện (MDL), giới hạn định lƣợng (MQL) của

phƣơng pháp.

- Đánh giá độ lặp lại (độ chụm) của phƣơng pháp phân tích.

- Đánh giá độ thu hồi (độ đúng) của phƣơng pháp phân tích.

* Áp dụng để phân tích mẫu thực tế

2.3. Đối tƣợng nghiên cứu

Đối tƣợng phân tích là các hợp chất nhóm Steviol glycosides (Stevioside,

Rebaudioside A, Rebaudioside B, Rebaudioside C, Rubusoside, Steviolbioside và

27

Dulcoside A) và đối tƣợng nghiên cứu là các mẫu nguyên liệu nhƣ thân và lá cây cỏ

ngọt khô, đƣờng cỏ ngọt cho ngƣời ăn kiêng, nƣớc giải khát bổ sung đƣờng cỏ ngọt.

Các mẫu phân tích đƣợc lấy trên địa bàn thành phố Hà Nội.

2.4. Nguyên vật liệu – thiết bị, dụng cụ

2.4.1. Nguyên vật liệu

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết phân tích dùng

cho HPLC, cụ thể:

- Chất chuẩn Stevioside (TRC - Canada), chất chuẩn phân tích

- Chất chuẩn Steviolbioside (TRC – Canada), chất chuẩn phân tích

- Chất chuẩn Rebaudioside A (Sigma - adrich), chất chuẩn phân tích

- Chất chuẩn Rebaudioside B (TRC – Canada), chất chuẩn phân tích

- Chất chuẩn Rebaudioside C (TRC – Canada), chất chuẩn phân tích

- Chất chuẩn Rebusoside (TRC – Canada), chất chuẩn phân tích

- Chất chuẩn Dulcoside A (TRC – Canada), chất chuẩn phân tích

- Nƣớc cất 2 lần.

- Acetonitril (Merck) (tinh khiết HPLC)

- Methanol (Merck) (tinh khiết HPLC)

- Natri dihydrophotphat (Merck)

- Các chất chuẩn gốc đƣợc chuẩn bị đơn lẻ trong dung môi Methanol.

2.4.2. Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu bao gồm:

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối PDA (Shimazhu)

- Cột sắc ký C18 (250mm x ID 4,6 mm x 5 μm) và tiền cột tƣơng đƣơng

- Máy ly tâm HermLe Z383K

- Cân phân tích độ chính xác 0,1mg (XT220A, Thụy Sĩ)

- Bếp cách thủy (GFL, Đức)

- Máy lắc Vortex Genie 2 (Mỹ).

- Máy đồng nhất mẫu (Phillip).

28

- Máy rung siêu âm (Elma, Đức).

- Bộ chiết pha rắn

- Cột chiết pha rắn HLB (3mL, 60mg), C18 (3mL, 500mg)

- Dụng cụ thủy tinh thông thƣờng phòng thí nghiệm

2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.5.1. Phương pháp phân tích

HPLC là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là

chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy thuộc vào ái lực của

chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với tốc độ khác

nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau. HPLC có ƣu thế trong việc phân tích cả định

tính và định lƣợng. Phân tích định tính thì sử dụng dữ liệu quan sát phổ, còn định

lƣợng thì dựa vào dữ liệu đo lƣờng đƣợc nhƣ chiều cao pic, diện tích pic... Điều này

cho HPLC một lợi thế hơn các kỹ thuật truyền thống khác. HPLC có sử dụng một

hệ thống máy tính với một bộ lấy mẫu tự động từ bình chứa pha động, máy bơm,

cột và detertor [3,6]. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao tại Viện kiểm nghiệm an

toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia gồm hệ thống bơm cao áp Shimadzu LC-20AD

kết nối detertor SPD-M20A đƣợc thể hiện ở hình 2.1.

Hình 2.1: Hệ thống thiết bị HPLC-PDA

29

Nguyên lý xác định chất phân tích bằng detector PDA: Khi chiếu một chùm

tia bức xạ điện tử với một tần số xác định đi qua môi trƣờng vật chất thì sau khi đi

qua năng lƣợng của bức xạ không thay đổi nhƣng cƣờng độ bức xạ thay đổi. Sự

thay đổi cƣờng độ bức xạ do sự hấp thụ bức xạ của hợp chất có trong hỗn hợp mà

chùm tia bức xạ chiếu qua. Dựa vào sự thay đổi cƣờng độ bức xạ, xác định đƣợc

chất phân tích. Chất phân tích sau khi đƣợc tách khỏi cột sắc ký, đƣợc dẫn vào

flowcell của đầu đo và đƣợc chiếu bởi một chùm tia tử ngoại. Sự hấp thụ tia bức xạ

bởi các chất tan tuân theo định luật Lambert-Beer.

Có thể sử dụng detector UV để thay thế. Tuy nhiên, detector PDA có nhiều

ƣu điểm hơn là có khả năng quét đƣợc một dải bƣớc sóng và xem đƣợc hình dạng

phổ của chất phân tích. Hơn nữa, trong nền mẫu thực phẩm có chứa rất nhiều các

chất có khả năng hấp thụ tại bƣớc sóng 210nm, nếu chỉ dựa vào thời gian lƣu để

khẳng định chất đó là các Steviol glycosides có thể dễ bị nhầm lẫn. Vì vậy, khi kết

hợp giữa thời gian lƣu và hình dạng phổ hấp thụ có thể khẳng định chính xác chất

cần phân tích. Do đó, trong nghiên cứu này đã sử dụng detector PDA tại bƣớc sóng

210 nm để xác định chất phân tích.

Trong nghiên cứu này sử dụng máy HPLC kết nối detector PDA và tiến hành

các bƣớc nghiên cứu sau đây:

Tiến hành khảo sát các thông số để nhận biết và định lƣợng các hợp chất

Steviol glycosides:

 Khảo sát nồng độ pha động: Nồng độ đệm phosphate 5mM, 10mM,

20mM, 50mM

 Khảo sát pH pha động: Khảo sát pH 2,4; 2,6; 2,8; 3; 4; 7.

 Khảo sát nhiệt độ cột: 20 – 79oC

30

2.5.2. Phương pháp xử lý mẫu

Khảo sát các điều kiện chiết tách chất phân tích ra khỏi nền mẫu cỏ ngọt,

nƣớc giải khát và đƣờng ăn kiêng. Tiến hành khảo sát lựa chọn dung môi chiết, thời

gian chiết mẫu, điều kiện làm sạch.

Trên cơ sở tham khảo tài liệu [15,32] quy trình dự kiến xử lý mẫu nhƣ hình

2.2:

Cân chính xác khoảng 0,5-5 g mẫu đồng nhất

Khảo sát dung môi chiết

Vortex 1phút

Rung siêu âm Khảo sát thời gian chiết, nhiệt độ chiết

Chiết lặp, lọc

Khảo sát làm sạch trên cột SPE

Phân tích trên HPLC-PDA

Hình 2.2: Quy trình xử lý mẫu dự kiến

31

Thành phần hàm lƣợng các chất trong nhóm đƣờng cỏ ngọt có sự khác nhau

rất nhiều. Vì vậy, dịch chiết sau khi làm sạch qua cột SPE một phần đem phân tích

luôn trên thiết bị để xác định các chất có hàm lƣợng thấp nhƣ Reb B, Reb C, Rubu,

Dul A, Stev B phần dịch còn lại đem pha loãng 5 lần để xác định Stev và Reb A.

2.5.3. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

Phƣơng pháp phân tích sau khi khảo sát đƣợc các thông số tối ƣu về điều

kiện phân tích sắc ký, tiến hành thẩm định xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng

pháp phân tích [1,8,9]. Các thông số đánh giá bao gồm:

Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn: Khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính của

diện tích pic sắc ký vào nồng độ của các chất. Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành

pha loãng thành dung dịch chuẩn trung gian và dãy chuẩn làm việc ở các nồng độ

khác nhau. Sau đó tiến hành bơm vào hệ thống HPLC. Thiết lập phƣơng trình tƣơng

quan giữa nồng độ và diện tích pic của từng chất theo phƣơng trình hồi quy tuyến

tính. Tiến hành dựng đƣờng chuẩn trong khoảng từ 1-100 mg/L.

Độ lặp lại: Khảo sát các chất Steviol glycosides trong mẫu nguyên liệu cỏ

ngọt khô, đƣờng ăn kiêng, nƣớc giải khát. Chiết mẫu theo quy trình đã khảo sát sau

đó bơm mẫu vào hệ thống HPLC ở các điều kiện đã chọn. Thực hiện phân tích lặp 6

lần trong cùng điều kiện. Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc đánh giá thông qua độ

lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD (%)). Độ lệch chuẩn (SD) tính

theo công thức (1) và độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) tính theo công thức (2) nhƣ

sau:

SD = √ (1)

RSD (%) = × 100 (2)

Trong đó:

là diện tích của pic sắc kí thứ i

+ là diện tích trung bình của n lần chạy

+ n là số lần lặp lại

32

Độ thu hồi: Thực hiện trên nền các nền mẫu lá cỏ ngọt, đƣờng ăn kiêng,

nƣớc giải khát... Các dung dịch này đƣợc thêm cùng một nồng độ chuẩn, lặp lại 6

lần. Độ thu hồi của phƣơng pháp đƣợc đánh giá thông qua hiệu suất tìm lại so với

chuẩn thêm vào.

 Độ thu hồi (H):

H(%) = × 100% (3)

Trong đó:

 H: hiệu suất thu hồi (%)

 : Nồng độ của mẫu thêm chuẩn.

 : Nồng độ của mẫu.

 : Nồng độ chuẩn thêm vào mẫu.

Giới hạn phát hiện (MDL), giới hạn định lƣợng (MQL) của phƣơng pháp:

Thêm các nồng độ nhỏ dần của hỗn hợp các chất Steviol glycosides vào mẫu trắng

(mẫu thực không phát hiện chất phân tích) cho đến khi thu đƣợc tỷ số tín hiệu/nhiễu

(S/N = 3) từ đó đánh giá MDL, MQL.

2.5.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu

- Sử dụng phần mềm phân tích, nhận diện, đo diện tích chiều cao pic sắc ký có

sẵn của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.

- Sử dụng các phƣơng pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm toán

học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Office Excel để tính

toán: kết quả trung bình, độ lệch, độ lệch chuẩn, phƣơng sai, độ lệch chuẩn

tƣơng đối, hệ số biến thiên, độ thu hồi khi xử lý các kết quả thực nghiệm và

đánh giá thẩm định phƣơng pháp.

33

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Lựa chọn các điều kiện phân tích sắc ký

Các Steviol glycosides có khả năng hấp thụ tại bƣớc sóng trong vùng tử

ngoại, tham khảo một số tài liệu [31,38], phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

tiến hành phát hiện và định lƣợng các Steviol glycosides trong thực phẩm trên hệ

thống sắc ký lỏng hiệu năng cao với các điều kiện đƣợc cố định nhƣ sau:

- Detector: PDA , bƣớc sóng 210 nm

- Cột sắc ký Cột C18 (250mm x 5 mm x 4,6 µm)

- Pha động: Đệm phosphat: Acetolnitril (68:32; v/v), chế độ đẳng dòng

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

- Thể tích bơm: 20 μL

3.1.1. Khảo sát nồng độ đệm

Pha động là yếu tố quyết định đến hiệu quả tách sắc ký. Nhìn chung, pha

động có thể ảnh hƣởng đến: độ chọn lọc của hệ pha, thời gian lƣu giữ của chất tan,

hiệu lực của cột tách (đại lƣợng Nef), độ phân giải của các chất, độ rộng của pic sắc

ký...

Qua tham khảo tài liệu [31,38] và phƣơng pháp hiện tại của PTN Viện kiểm

nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, đệm phosphate cho hiệu quả tách

Steviol glycosides là tốt nhất. Tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của đệm phosphat

NaH2PO4 ở các nồng độ 5mM, 10mM, 20mM, 50mM và các điều kiện khác giữ cố

định nhƣ ở mục 3.1. Các sắc ký đồ thu đƣợc biểu diễn trên các hình 3.1 đến 3.4.

34

Hình 3.1: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycoside ở 25ppm tại nồng độ pha động 5mM

Hình 3.2: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở 25 ppm tại nồng độ pha động 10mM

Hình 3.3: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở 25 ppm tại nồng độ pha động 20mM

35

Hình 3.4: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động 50mM

Kết quả phân tích cho thấy: Với cột C18, khi sử dụng pha động là NaH2PO4

5mM cho kết quả đƣờng nền không tốt, ảnh hƣởng bởi nền cao. Khi sử dụng pha

động là NaH2PO4 50 mM cho pic rất nhọn, cân đối nhƣng nồng độ muối cao dẫn

đến ảnh hƣởng đến cột, làm biến tính và giảm tuổi thọ của cột phân tích, có thể gây

áp suất cao cho hệ thống bơm do hàm lƣợng đệm phosphat quá cao. Trong nghiên

cứu này, pha động NaH2PO4 10 mM đƣợc lựa chọn do độ rộng chân pic nhỏ, tín

hiệu chất phân tích tốt, tín hiệu nhiễu đƣờng nền thấp, thời gian phân tích ngắn, tiết

kiệm thời gian phân tích và dung môi.

3.1.2. Khảo sát pH pha động

Trên cơ sở tham khảo tài liệu [38] và tính chất của nhóm Steviol glycoside

bền trong môi trƣờng pH thấp và dễ bị phân hủy bởi môi trƣờng pH cao. Do đó, pha

động pH thấp thƣờng đƣợc sử dụng để đạt đƣợc hiệu quả tách tốt. Trong nghiên cứu

này, pha động NaH2PO4 đƣợc khảo sát với khoảng pH 2,4; 2,6; 2,8; 3; 4, 7 (điều

chỉnh bằng acid orthor phosphoric 85%). Các điều kiện khác đƣợc giữ cố định nhƣ

mục 3.1. Kết quả đƣợc nêu trong hình 3.5; 3.6 và bảng 3.1.

36

f

R

1,3 1,28 1,26 1,24 1,22 1,2 1,18 1,16 1,14

2,4

2,6

2,8

3

pH

Hình 3.5: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở pH 7

Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến độ phân giải của Stevioside và Rebaudioside A

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến thời gian lưu của nhóm chất Steviol glycosides

pH

7,54 7,71 10,53 11,37 15,35 23,03 24,49

7,26 7,91 10,06 10,90 14,87 21,98 23,53

7,21 7,65 10,12 10,86 14,96 22,09 23,50

7,34 7,72 10,21 11,04 14,96 22,19 23,68

2,4 2,6 2,8 3,0

Chất phân tích Stev Reb A Reb C Dul A Rubu Reb B Stev B

Kết quả phân tích cho thấy ở pH càng cao thì khả năng tách của các chất

càng giảm. Ở pH 7, Reb B và Stev B bị phân hủy gần nhƣ hoàn toàn và hai hợp chất

37

chính của nhóm Steviol glycosides là Stevioside và Rebaudioside A gần nhƣ không

tách đƣợc khỏi nhau. Khi pH = 4, Stevioside và Rebaudioside A có sự tách nhau

không đáng kể, đƣờng nền xấu. Nhƣng khi thay đổi pH của pha động từ 2,4 – 3 kết

quả ở pH=2,6 cho hiệu quả tách tốt hơn cả. Do đó, pH 2,6 đƣợc lựa chọn là điều

kiện pH tối ƣu để tách các chất Steviol glycosides.

3.1.3. Khảo sát nhiệt độ cột

Steviol glycosides là một nhóm gồm nhiều hợp chất có tính chất tƣơng tự

nhau nên trong quá trình phân tích để tách sắc ký gặp nhiều khó khăn. Trong đó,

nhiệt độ buồng là một yếu tố quan trọng giúp tách tốt hơn nhóm steviol glycosdies. Tiến hành khảo sát nhiệt độ cột từ 20 – 79oC với nồng độ pha động là 10mM và pH

= 2,6; các kết quả biểu diễn trên các hình 3.7 đến 3.10.

Hình 3.7: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở nhiệt độ cột 20oC

Hình 3.8: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở nhiệt độ cột 40oC

38

Hình 3.9: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở nhiệt độ cột 60oC

Hình 3.10: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở nhiệt độ cột 79oC

Từ kết quả thu đƣợc có thể thấy, hai Steviol glycoside chính Rebaudioside A

(1) và Stevioside (2) và hai hợp chất phụ Rebaudioside C (3) và dulcoside A (4) đƣợc phân tách tốt ở nhiệt độ cao hơn 40oC, 60oC và 79oC. Ba Steviol glycosides

nhỏ khác steviolbioside (7), rubusoside (5), Rebaudioside B (6), có thời gian lƣu không đổi và tách tốt ở mọi nhiệt độ. Từ các thí nghiệm trên, cho thấy nhiệt độ 40oC và 60oC sẽ là điều kiện tốt để tách Steviol glycosides, trong khi một số chất bị phân hủy ở 79oC nhƣ steviolbioside (7). Do đó, nhiệt độ 40oC đƣợc lựa chọn là nhiệt độ

cột thích hợp để tiến hành phân tích.

3.1.4. Điều kiện tối ưu phân tích một số Steviol glycosides bằng HPLC

Từ các kết quả khảo sát trên, thu đƣợc quy trình phân tích các chất Steviol

glycoside bằng HPLC với điều kiện cụ thể nhƣ sau:

39

- Cột C18 (250mm x 4,6 mm x 5 µm)

- Pha động: kênh A: NaH2PO4 10mM, pH=2,6 – kênh B: Acetonitril (68:32,

v/v)

- Tốc độ dòng: 1 mL/phút

- Thể tích bơm mẫu: 20 µL

- Detector: PDA quét dải phổ từ bƣớc sóng 190 nm đến 800 nm

- Bƣớc sóng phát hiện: 210 nm - Nhiệt độ cột: 40oC

Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 3.2.

3.2.1. Khảo sát dung môi chiết mẫu

Thực hiện khảo sát các dung môi khác nhau để chiết mẫu với mẫu là nguyên

liệu lá cỏ ngọt. Qua các tài liệu tham khảo [15,32] và hiểu biết về các chất Steviol

glycosides, đây là các hợp chất trong phân tử có cấu trúc aglycol liên kết với gốc

đƣờng có thể hòa tan trong dung môi phân cực. Về tính tan, một số hợp chất lại tan

tốt trong các dung môi nhƣ ethanol, methanol hơn tan trong nƣớc. Do vậy, lựa chọn

các dung môi chiết khảo sát trong nghiên cứu gồm ethanol, nƣớc, hỗn hợp nƣớc –

methanol (5:5, v/v), acetonitrile (ACN) và methanol. Thêm 25 mL mỗi loại dung

môi chiết, tiến hành chiết lặp hai lần. Kết quả thu đƣợc đƣợc biểu diễn trong Hình

50

RebA

Stev

40

30

Hàm lƣợng (mg/g)

20

10

0

Methanol Methanol 50%

ACN

H2O

Ethanol

3.11 và Bảng 3.2.

Hình 3.11: Hàm lượng của các Steviol glycosides khi sử dụng các dung môi khác

nhau

40

Bảng 3.2: Hàm lượng Steviol glycosides (mg/g) thu được với dung môi chiết khác nhau

Dung môi chiết RebA (mg/g) Stev (mg/g) RebC (mg/g) DulA (mg/g) Rubu (mg/g) RebB (mg/g) StevB (mg/g)

12,1 46,7 3,54 0,803 0,702 0,694 0,423

11,8 44,6 3,53 0,760 0,643 0,590 0,400

Methanol Methanol 50% ACN H2O Ethanol 0,309 12,2 4,85 0,287 42,1 2,38 0 3,25 1,50 0,266 0,685 0,125 0,607 0,432 0,837 0 0,546 0,265 0,050 0,577 0,465

Từ kết quả thu đƣợc có thể thấy dung môi ethanol cho hiệu suất chiết thấp còn

ACN không chiết đƣợc Reb B và Reb C. Dung môi methanol 50% và methanol đều

cho hiệu suất chiết tốt nhƣng lựa chọn dung môi methanol do methanol cho hiệu

suất chiết cao đối với tất cả các Steviol glycosides. Các Stev, Reb B và RebC có

hiệu suất chiết thấp hơn khi sử dụng dung môi Metanol/nƣớc 50%.

3.2.2. Khảo sát nhiệt độ chiết mẫu

Trên cùng một nền lá cỏ ngọt tiến hành chiết ở các mức nhiệt độ khác nhau từ

30-80oC kết hợp với rung siêu âm. Các kết quả thu đƣợc đƣợc thể hiện ở Bảng 3.3.

Bảng 3.3: Hàm lượng của các chất Steviol glycosides ở các nhiệt độ chiết khác nhau

RebA Stev RebC DulA Rubu RebB StevB Nhiệt độ (oC)

12,1 46,7 3,54 0,803 0,702 0,694 0,423 30

12,7 49,6 3,78 0,857 0,759 0,702 0,829 40

13,6 51,5 3,99 0,805 0,759 1,000 0,841 50

12,7 48,3 3,80 0,799 0,753 0,837 0,973 60

12,2 47,9 3,68 0,776 0,832 0,711 0,847 70

12,8 48,9 3,79 0,882 0,754 0,749 0,779 80

41

Từ kết quả thu đƣợc ta thấy từ 30-50oC hàm lƣợng các chất tăng dần và ở nhiệt độ 50oC hàm lƣợng các chất steviol slycosides là lớn nhất cho hiệu quả chiết

tốt nhất. Khi nhiệt độ tiếp tục tăng, hàm lƣợng thu đƣợc có dấu hiệu giảm dần do một phần các chất bị phân hủy. Do đó, cho nhiệt độ chiết mẫu là ở nhiệt độ 50oC để

tránh làm mất chất phân tích.

3.2.3. Khảo sát thời gian chiết mẫu

Tiến hành cân mẫu vào ống ly tâm 50 mL, thực hiện quá trình chiết với methanol sử dụng bể rung siêu âm có điều nhiệt. Khảo sát các thời gian chiết khác nhau là 15, 30, 60, 90 phút cố định nhiệt độ chiết là 50oC, dung môi chiết mẫu là Methanol. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở Bảng 3.4.

Bảng 3.4: Hàm lượng Steviol glycoside (mg/g) thu được với thời gian chiết khác nhau

Chất Stev Reb A Reb B Red C Rubu Dul A StevB 15 (phút) 25,7 6,32 0,434 2,18 0,311 0,221 0,355 30 (phút) 30,3 8,40 0,871 3,02 0,680 0,620 0,870 90 (phút) 52,4 14,3 1,13 3,89 0,850 0,910 1,07 60 (phút) 50,9 13,5 1,03 3,88 0,85 0,84 1,04

Kết quả thu đƣợc cho thấy khi tăng thời gian chiết, lƣợng các Steviol

glycoside thu đƣợc cũng tăng. Thời gian chiết từ 15 đến 30 phút là chƣa đủ để hòa

tan hoàn toàn các chất vào trong dung môi chiết. Tuy nhiên với thời gian chiết là 60

phút và 90 phút cho thấy không có sự khác nhau nhiều về hàm lƣợng Steviol

glycosides thu đƣợc. Do vậy, để rút ngắn thời gian và giảm chi phí năng lƣợng, lựa

chọn thời gian chiết rung siêu âm tối ƣu là 60 phút để thực hiện quy trình phân tích.

3.2.4. Khảo sát điều kiện làm sạch qua SPE

Quá trình thực nghiệm, đối với nền mẫu nguyên liệu cỏ ngọt thô và dạng tinh

chế (dạng bột), dung dịch thu đƣợc trong không có cặn và đồng nhất. Hàm lƣợng

42

các chất trong mẫu cao. Tuy nhiên, mục đích của nghiên cứu thực hiện phân tích

trên một số đối tƣợng thực phẩm có bổ sung đƣờng cỏ ngọt, do vậy cần thiết có quá

trình làm sạch và làm giàu mẫu phân tích, lựa chọn kỹ thuật chiết pha rắn đang rất

phổ biến và hiệu quả ngày nay. Dựa trên các bài báo tham khảo đƣợc, lựa chọn các

quy trình chiết SPE tƣơng ứng với điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm.

Sử dụng dung dịch mẫu chiết từ lá cỏ ngọt khô trong dung môi methanol.

Pha loãng 1 tỷ lệ mẫu với 1 tỷ lệ nƣớc cất 2 lần trƣớc khi chiết qua cột SPE. Kết quả

thu đƣợc thể hiện ở Bảng 3.5 và Hình 3.12.

ảng 5: Quy trình làm sạch qua SPE

Cột SPE C18 - Sulpeco Oasis HLB - Waters

120

Hoạt hóa Nạp mẫu Rửa tạp Rửa giải 3 mL methanol, 3 mL H2O 3 mL methanol, 3 mL H2O Tốc độ 2mL/phút 3 mL H2O, 3 mL ACN 3 mL ACN: H2O (20:80) Tốc độ 2mL/phút 3 mL H2O, 3 mL MeOH : H2O (4-6) 3 mL MeOH: H2O (70:30)

100

80

Cột C18 Cột HLB

60

40

20

0

Reb A

Stev

Rubu

Dul A

StevB

Reb B

Red C Chất phân tích

H (%)

Hình 3.12: Hiệu suất thu hồi (%) của các Steviol glycosides khi làm sạch trên cột

C18 và cột HLB

Kết quả thu đƣợc thực hiện làm sạch qua cột SPE Oasis HLB có hiệu suất tốt

và cao hơn cột C18. Do đó, cột SPE – Oasis HLB đƣợc lựa chọn cùng các điều kiện

chiết pha rắn tƣơng ứng. Nhƣ vậy, từ các kết quả khảo sát trên, quy trình xử lý mẫu

đƣợc thực hiện nhƣ hình 3.13.

43

Cân chính xác khoảng 0,5-5 g mẫu đồng nhất

Thêm 30 mL Methanol

Vortex 1 phút

Chiết lặp 2 lần, lọc

Rung siêu âm Rung siêu âm 50oC, 60 phút

Làm sạch trên cột SPE HLB

Phân tích trên HPLC-PDA

Hình 3.13: Quy trình xử lý mẫu tối ưu

3.3. Thẩm định phƣơng pháp

3.3.1. Xây dựng đường chuẩn

Với các điều kiện đã chọn, tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính của

diện tích pic sắc ký vào nồng độ của các chất. Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành

pha loãng thành dung dịch chuẩn trung gian và dãy chuẩn làm việc ở các nồng độ

khá nhau. Sau đó tiến hành bơm vào hệ thống HPLC. Thiết lập phƣơng trình tƣơng

quan giữa nồng độ và diện tích pic của từng chất theo phƣơng trình hồi quy tuyến

tính. Tiến hành dựng đƣờng chuẩn trong khoảng từ 1,00-100 mg/L, kết quả thu

đƣợc đƣợc thể hiện trong bảng 3.6, 3.7 và Hình 3.14, 3.15 và phụ lục 1.

Bảng 3.6: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ các chất Steviol glycosides

C RebA Stev RebC DulA Rubu RebB stevB (mg/L)

1,00 4362 1427 3625 4356 4903 2722 4210

2,50 12992 6003 10138 12728 12607 8916 9806

44

5,00 26920 11862 22228 27023 26158 18467 21477

10,0 59592 24934 48245 50114 50486 42125 38274

25,0 147231 62748 122332 125488 123854 104471 98403

50,0 295166 126226 244165 250739 252925 209341 192259

700000

600000

y = 5983,8x - 2049,7 R² = 1

500000

400000

100 597262 257695 491428 514361 504933 418688 390189

300000

200000

100000

0

0

20

60

80

100

120

40 C (mg/L)

Tín hiệu

300000

250000

y = 2580,2x - 1195,2 R² = 0,9999

200000

150000

Hình 3.14: Đồ thị tương quan giữa diện tích pic và nồng độ RebA

100000

50000

0

0

20

40

80

100

120

60 C (mg/L)

Tín hiệu

Hình 3.15: Đồ thị tương quan giữa diện tích pic và nồng độ Stevioside

45

Bảng 3.7: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ Steviol glycosides

Tên chất PT Đƣờng chuẩn R2

Stev y = 5983,8x - 2049,7 1,0000

Reb A y = 2580,2x - 1195,2 0,9999

Reb C y = 4930x - 1683,8 1,0000

Dul A y = 5128,7x - 1085,5 0,9998

Rubu y = 5049,4x - 169,67 1,0000

Reb B y = 4203,3x - 1229,8 1,0000

StevB y = 3888,4x + 315,66 0,9999

Từ phƣơng trình hồi quy của 7 hợp chất cho thấy hệ số R2≥ 0,9998. Các hệ số R2 lớn cho thấy khoảng nồng độ từ 1,00 ppm đến 100 mg/L nằm trong phạm vi

tuyến tính của 7 hợp chất, chứng tỏ diện tích pic và nồng độ các Steviol glycosides

có mối quan hệ tuyến tính. Khoảng nồng độ này đã đáp ứng đƣợc yêu cầu ứng dụng

trong thực tế. Đối với các mẫu có nồng độ cao hơn giới hạn tuyến tính cần tiến hành

pha loãng mẫu trƣớc khi phân tích.

3.3.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp

Giới hạn phát hiện đƣợc định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích

mà phƣơng pháp phân tích có thể phát hiện đƣợc với tín hiệu sắc ký lớn gấp 3 lần

tín hiệu đƣờng nền. Đây là một thông số đặc trƣng cho độ nhạy của phƣơng pháp.

Chất nào nhạy hơn sẽ cho giới hạn phát hiện nhỏ. Cũng theo phƣơng pháp này giới

hạn định lƣợng là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà cho tín hiệu lớn gấp 10

lần tín hiệu nhiễu đƣờng nền hay mẫu trắng (S/N = 10).

Do hàm lƣợng của các chất trong nhóm Steviol glycosides khá nhỏ nên cần

xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng để đánh giá khả năng sử dụng

phƣơng pháp khi xác định mẫu thực tế. Để xác định giới hạn phát hiện và giới hạn

46

định lƣợng đã sử dụng phƣơng pháp xác định MDL, MQL dựa trên tỷ số tín

hiệu/nhiễu (S/N). Xác định MDL bằng cách tiến hành thêm các nồng độ nhỏ dần

của hỗn hợp các chất Steviol glycosides vào mẫu trắng (mẫu thử không phát hiện

chất phân tích) cho đến khi thu đƣợc tỷ số tín hiệu/nhiễu (S/N = 3). MQL đƣợc xác

định theo lý thuyết thống kê trong hóa phân tích MQL = 10 x MDL/3. Các kết quả

MDL, MQL của các chất phân tích đƣợc thể hiện trong Bảng 3.8.

Bảng 3.8: Giới hạn phát hiện (MDL) và giới hạn định lượng (MQL) của các Steviol glycosides

Chất phân Reb A Stev Red C Dul A Rubu Reb B StevB tích

MDL 25,0 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 (mg/kg)

MQL 82,5 41,2 41,2 41,2 41,2 41,2 41,2 (mg/kg)

Từ kết quả thu đƣợc, phƣơng pháp đã xây dựng giới hạn phát hiện (MDL)

các chất Steviol glycosides trong khoảng từ 12,5 – 25,0 mg/kg và MDL trong

khoảng từ 41,2 – 82,5 mg/kg. Giới hạn phát hiện này nhỏ, phù hợp để xác định hàm

lƣợng chất trong mẫu thực tế do đó phƣơng pháp có thể áp dụng rất tốt để xác định

các chất Steviol glycosides.

3.3.3. Độ lặp lại

Độ lặp lại là một thông số đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp cho phép

đánh giá độ chụm của các kết quả phân tích.

Tiến hành phân tích các chất Steviol glycosides trong mẫu nguyên liệu cỏ

ngọt khô, đƣờng ăn kiêng, nƣớc giải khát với quy trình chiết mẫu đã khảo sát sau đó

bơm mẫu vào hệ thống HPLC ở các điều kiện đã chọn. Thực hiện phân tích lặp 6

lần trong cùng điều kiện. Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc đánh giá thông qua độ

lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD (%)). Độ lặp lại của các chất

phân tích đƣợc thể hiện trong các bảng 3.9 đến 3.11.

47

Bảng 3.9: Độ lặp lại khi phân tích các Steviol glycosides trong mẫu lá cỏ ngọt

Chất

SD

m (g)

TB (mg/g)

RSD (%)

Reb A

9,61

0,256

2,66

Stev

44,9

0,626

1,39

Reb C

2,31

0,040

1,73

Dul A

1,25

0,036

2,85

Rubu

0,767

0,024

3,18

Reb B

0,079

0,0025

3,10

StevB

0,157

0,002

1,14

0,9951 0,9705 1,0102 0,9934 1,0011 1,0084 0,9951 0,9705 1,0102 0,9934 1,0011 1,0084 0,9951 0,9705 1,0102 0,9934 1,0011 1,0084 0,9951 0,9705 1,0102 0,9934 1,0011 1,0084 0,9951 0,9705 1,0102 0,9934 1,0011 1,0084 0,9951 0,9705 1,0102 0,9934 1,0011 1,0084 0,9951 0,9705 1,0102 0,9934 1,0011 1,0084

Hàm lƣợng (mg/g) 9,39 9,43 9,86 9,74 9,92 9,34 45,3 45,4 44,6 43,8 44,8 45,4 2,34 2,33 2,27 2,24 2,32 2,32 1,22 1,29 1,25 1,22 1,24 1,30 0,803 0,786 0,734 0,761 0,759 0,760 0,079 0,082 0,079 0,082 0,075 0,080 0,158 0,157 0,158 0,158 0,154 0,157

48

Bảng 3.10: Độ lặp lại khi phân tích các Steviol glycosides trong mẫu đường ăn kiêng

Chất SD TB (mg/g) RSD (%) m (g)

Reb A 17,5 0,435 2,48

Stev 4,59 0,080 1,74

Reb C 0,164 0,003 1,77

Dul A 0,115 0,003 2,26

Rubu 0,035 0,0010 2,75

Reb B 0,205 0,0049 2,37

StevB 0,205 0,005 2,37

1,0632 1,0681 1,0073 1,0735 1,0521 1,0632 1,0681 1,0073 1,0735 1,0521 1,0632 1,0681 1,0073 1,0735 1,0521 1,0632 1,0681 1,0073 1,0735 1,0521 1,0632 1,0681 1,0073 1,0735 1,0521 1,0632 1,0681 1,0073 1,0735 1,0521 1,0632 1,0681 1,0073 1,0735 1,0521 Hàm lƣợng (mg/g) 18,2 17,6 17,3 17,3 17,1 4,47 4,66 4,65 4,53 4,58 0,167 0,166 0,160 0,162 0,164 0,116 0,119 0,111 0,116 0,115 0,035 0,033 0,035 0,035 0,035 0,198 0,210 0,208 0,209 0,202 0,198 0,210 0,208 0,209 0,202

49

Bảng 3.11: Độ lặp lại khi phân tích các Steviol glycosides trong mẫu nước ngọt

Hàm lƣợng TB RSD Chất STT SD (mg/mL) (mg/mL) (%)

Reb A 0,950 0,001 0,137

Stev 2,81 0,005 0,169

Reb C 0,110 0,000 0,129

Dul A 0,018 0,0002 0,930

Rubu 0,027 0,0001 0,226

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 0,948 0,950 0,950 0,952 0,952 0,949 0,950 0,951 2,80 2,81 2,81 2,80 2,80 2,80 2,81 2,79 0,110 0,110 0,110 0,110 0,110 0,110 0,110 0,110 0,018 0,017 0,017 0,018 0,017 0,018 0,018 0,017 0,027 0,027 0,027 0,027 0,027

50

Reb B 0,013 0,0002 1,567

StevB 0,021 0,00014 0,677

6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 0,027 0,027 0,027 0,013 0,013 0,013 0,013 0,013 0,013 0,013 0,013 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021

Theo bảng quy định của AOAC về độ lặp lại, mức cho phép ở nồng độ 100

mg/kg tƣơng ứng là ≤ 5,3%, ở nồng độ 0,1% là RSD ≤ 3,7 % và ở nồng độ 0,1-1 %

tƣơng ứng là 2,7 – 3,7%. Kết quả thẩm định độ lặp tƣơng ứng hàm lƣợng 100

mg/kg – 0,1% có RSD từ 1,74 – 5,01%, mức hàm lƣợng 1% có RSD từ 2,63 –

3,68%. Nhƣ vậy phƣơng pháp có độ lặp đạt yêu cầu của AOAC khi phân tích chất

các hợp chất Steviol glycosides.

3.3.4. Đánh giá độ thu hồi

Độ thu hồi hay độ đúng của phƣơng pháp là một trong những thông số để

đánh giá độ chính xác. Thực hiện đánh giá độ thu hồi trên nền các nền mẫu lá cỏ

ngọt, đƣờng ăn kiêng, nƣớc giải khát. Hàm lƣợng các chất Steviol glycosides khác

nhau rất nhiều Do đó, các mẫu này thêm hàm lƣợng các steviol glycosides ở các

hàm lƣợng khác nhau và làm lặp lại 6 lần. Độ thu hồi của phƣơng pháp đƣợc đánh

giá thông qua hiệu suất tìm lại so với chuẩn thêm vào. Kết quả độ thu hồi đƣợc thể

hiện trong các bảng 3.12 đến 3.14.

51

Bảng 3.12: Độ thu hồi của các chất Steviol glycosides trên nền mẫu lá cỏ ngọt

Khối Hàm Hàm lƣợng lƣợng Chất m H lƣợng sau thêm Htb chuẩn phân tích (g) (%) (%) ban đầu chuẩn thêm (mg/g) (mg/g) (mg)

Reb A 9,61 5,00 99,9

Stev 44,9 20,0 99,1

Reb C 2,31 1,00 101

Dul A 1,25 1,00 99,3

Rubu 0,767 0,750 102

1,0181 1,0812 1,0191 1,0381 1,0950 0,9721 1,0181 1,0812 1,0191 1,0381 1,0950 0,9721 1,0181 1,0812 1,0191 1,0381 1,0950 0,9721 1,0181 1,0812 1,0191 1,0381 1,0950 0,9721 1,0181 1,0812 1,0191 1,0381 1,0950 0,9721 1,0181 Reb B 0,079 0,050 14,4 14,3 14,5 14,3 14,0 14,9 64,9 63,2 64,6 63,6 63,1 64,9 3,35 3,43 3,07 3,05 2,96 3,06 2,25 2,22 2,25 2,23 2,15 2,25 0,844 0,838 0,841 0,837 0,839 0,846 0,131 97,5 103 99,9 98,8 97,5 103 102 98,9 100 97,0 99,6 97,2 106 103 103 103 95,6 97,6 102 105 102 102 95,3 97,4 105 102 100 96,6 105 102 105 102

52

StevB 0,157 0,100 97,0

1,0812 1,0191 1,0381 1,0950 0,9721 1,0181 1,0812 1,0191 1,0381 1,0950 0,9721 0,125 0,131 0,129 0,123 0,133 0,255 0,247 0,247 0,246 0,249 0,261 98,8 105 103 95,4 105 99,9 97,3 91,3 92,5 100 101

Bảng 3.13: Độ thu hồi của các chất Steviol glycosides trên nền mẫu đường ăn kiêng

Chất phân tích m (g) H (%) Htb (%) Hàm lƣợng ban đầu (mg/g) Hàm lƣợng sau thêm chuẩn (mg/g) Khối lƣợng chuẩn thêm (mg)

Reb A

17,5 8,00 100

Stev

4,59 4,00 98,9

Reb C

0,164 0,150 101

Dul A

1,0101 1,0154 1,0012 1,0018 1,0101 1,0019 1,0101 1,0154 1,0012 1,0018 1,0101 1,0019 1,0101 1,0154 1,0012 1,0018 1,0101 1,0019 1,0101 1,0154 1,0012 1,0018 1,0101 0,115 0,100 25,2 25,4 25,3 25,7 25,6 25,7 8,58 8,35 8,56 8,45 8,52 8,65 0,306 0,308 0,311 0,32 0,319 0,321 0,214 0,209 0,212 0,217 0,211 97,2 100 97,6 103 102 103 101 95,4 99,4 96,7 99,2 102 95,6 97,5 98,1 104 104 105 100 95,4 97,1 102 97,0 100

53

Rubu

0,035 0,030 100

Reb B

0,205 0,200 102

StevB

1,0019 1,0101 1,0154 1,0012 1,0018 1,0101 1,0019 1,0101 1,0154 1,0012 1,0018 1,0101 1,0019 1,0101 1,0154 1,0012 1,0018 1,0101 1,0019 0,222 0,065 0,064 0,066 0,066 0,064 0,064 0,401 0,408 0,415 0,409 0,402 0,412 0,410 0,409 0,401 0,400 0,411 0,399 0,205 101 107 101 98,2 103 104 97,6 96,9 99,0 103 105 102 99,5 104 104 104 98,1 97,7 104,0 97,2

0,200

Bảng 3.14: Độ thu hồi của các chất Steviol glycosides trên nền mẫu nước giải khát

Chất phân tích H (%) Htb (%) Hàm lƣợng ban đầu (mg/mL)

Reb A

0,950 98,8

Stev

2,81 99,9

Reb C

Hàm lƣợng sau thêm chuẩn (mg/ml) 1,81 1,82 1,88 1,86 1,82 1,85 5,01 5,05 5,06 5,00 4,92 5,01 0,205 0,208 0,205 0,211 95,5 96,7 103 101 96,7 100 100 102 102 99,5 95,9 100 95,0 98,0 95,0 101 0,110 98,0

54

Dul A

0,018 100

Rubu

0,027 98,4

Reb B

0,013 98,3

StevB

0,021 97,0 102 105 95,0 97,5 103 95,0 105 96,0 96,5 100 104 97,6 96,5 100 103 95,0 100 95,0 96,7 95,0 100 93,5 98,5 105 96,5 98,1

0,207 0,212 0,039 0,037 0,037 0,039 0,037 0,039 0,051 0,051 0,052 0,053 0,051 0,051 0,025 0,025 0,024 0,025 0,024 0,025 0,040 0,041 0,040 0,041 0,042 0,040

Bảng 3.15: Bảng kết quả độ thu hồi so với yêu cầu của AOAC

Kết quả của Thông số Mức độ yêu cầu (AOAC) Kết luận khóa luận

Nồng độ ≥ 1-10 % 97,0-103% 97,0 -102 %

Nồng độ ≥ 0,1 % 95,0-105% 95,0 – 104 % Đạt yêu cầu Độ thu hồi AOAC Nồng độ ≥ 100 mg/kg 90,0 – 107 % 91,0 – 105 %

Nồng độ ≥ 10,0mg/kg 80,0– 110% 92,0 – 97,0 %

55

Kết quả đánh gía độ thu hồi thu đƣợc ở các Bảng 3.13 đến 3.14 cho thấy độ thu

hồi ở nồng độ ≥10,0 mg/kg tƣơng ứng là 92,0 – 97,0%, nồng độ ≥100 mg/kg tƣơng

ứng là 91,0 - 105%, nồng độ ≥0,1% từ 95 - 104% và nồng độ 1-10,0 % tƣơng ứng là

97,0 – 102%. So sánh với yêu cầu độ thu hồi của AOAC có thể kết luận phƣơng

pháp có độ thu hồi đạt yêu cầu của AOAC khi phân tích chất các hợp chất Steviol

glycosides.

3.4. Phân tích mẫu thực tế

Trên cơ sở phƣơng pháp đã xây dựng, tiến hành phân tích một số mẫu thực tế

.Kết quả thu đƣợc thể hiện ở Bảng 3.16, 3.17 và hình 3.16; 3.17.

Bảng 3.16: Kết quả phân tích một số mẫu thực tế trên nguyên liệu đường cỏ ngọt, cây cỏ ngọt, đường ăn kiêng

STT Tên mẫu Tổng (%) Stev (mg/g) Reb A (mg/g) Reb C (mg/g) Dul A (mg/g) Rubu (mg/g) Reb B (mg/g) Stev B (mg/g)

1 361 405 133 1,64 1,55 2,23 90,4 -

2 732 232 25,4 2,84 1,93 1,82 1,25 99,7 Nguyên liệu Stevia 1 Nguyên liệu Stevia 2

3 Lá cỏ ngọt 1 31,9 11,5 3,32 0,04 - - - 4,68

4 Lá cỏ ngọt 2 54,9 8,52 2,14 0,15 - - - 6,57

5 9,25 1,28 0,05 Lá cỏ ngọt 3 35,5 - - - 4,61

6 Lá cỏ ngọt 4 25,5 6,25 0,25 - 0,04 - - 3,20

7 Bột cỏ ngọt 1 61,5 3,85 3,56 1,85 - - - 7,08

8 Bột cỏ ngọt 2 54,1 3,35 1,89 0,75 0,041 - - 6,02

9 Bột cỏ ngọt 3 44,9 9,61 2,31 1,25 0,767 0,079 0,157 5,91

- - - 0,017 10 Cành cỏ ngọt 1,21 0,18 0,28 -

- - - 1,00 11 6,51 3,21 0,21 0,05

- - - 0,425 12 3,15 1,05 0,052 - Đƣờng ăn kiêng 1 Đƣờng ăn kiêng 2

56

2,51 0,55 0,010 - - - - 0,301 13

3,25 1,94 0,352 0,005 - - - 0,555 14

8

7

6

5

4

4,33 1,05 0,022 - - - - 0,540 15 Đƣờng ăn kiêng 3 Đƣờng ăn kiêng 4 Đƣờng ăn kiêng 5

3

2

1

0

Hàm lƣợng (%)

Hình 3.16: Kết quả phân tích tổng hàm lượng Steviol glycosides của mẫu cỏ ngọt

và đường ăn kiêng

Bảng 3.17: Kết quả phân tích một số mẫu thực tế trên mẫu trà giảm cân và nước giải khát

STT RebA (mg/g) Stev (mg/g) RebC (mg/g) DulA (mg/g) Rubu (mg/g) RebB (mg/g) StevB (mg/g) Tổng (mg/g) Tên mẫu

- - - - - 0,52 0,12 0,64 1

- - - - 1,05 0,25 0,11 1,41 2

- - - - - 2,02 0,222 2,24 3 Trà giảm cân 1 Trà giảm cân 2 Trà giảm cân 3

57

- - - - 4 0,022 0,013 0,015 0,050 nƣớc ngọt 1

- - - - - 5 0,006 0,001 0,007 nƣớc ngọt 2

- - - - 6 0,002 0,001 0,001 0,003 nƣớc ngọt 3

- - - - - - - 7 - nƣớc ngọt 4

- - - - - 8 0,005 0,001 0,006 nƣớc ngọt 5

- - - - 9 0,004 0,002 0,002 0,008 nƣớc ngọt 6

Ghi chú (-): dưới ngưỡng phát hiện của phương pháp

0,06

0,05

Hàm lƣợng 0,04 (mg/g)

0,03

0,02

0,01

0

nước ngọt 1

nước ngọt 2

nước ngọt 3

nước ngọt 4

nước ngọt 5

nước ngọt 6

nước ngọt 7

- - - - - 0,007 10 0,006 0,001 nƣớc ngọt 7

Hình 3.17: Kết quả phân tích tổng hàm lượng Steviol glycosides của mẫu nước giải

khát

58

Kết quả phân tích các mẫu thực tế thu đƣợc hàm lƣợng các Steviol

glycosides rất khác nhau trong các mẫu lá, có thể do điều kiện canh tác và mùa vụ

thu hoạch. Hàm lƣợng trong mẫu lá dao động từ 3,20 đến 7,08 %, trong mẫu nƣớc

ngọt có 1 mẫu không phát hiện và 6 mẫu có hàm lƣợng trong khoảng từ 0,003-0,050

mg/mL và trong mẫu trà giảm cân từ 0,64-2,24 mg/g. Hàm lƣợng trong mẫu lá lớn

hơn nhiều so với trong cành, nhƣ vậy nguyên liệu để làm đƣờng cỏ ngọt chủ yếu sẽ

từ lá cỏ ngọt. Hàm lƣợng trong mẫu lá và bột cỏ ngọt tƣơng đối cao với thành phần

chính là Stev và RebA, trong đó Stev chiếm chủ yếu từ 69,32 – 83,85%. Ở các mẫu

lá và bột cỏ ngọt, hàm lƣợng Stev cao hơn RebA còn trong mẫu trà và nƣớc ngọt

hàm lƣợng RebA cao hơn do Stev có dƣ vị đắng vì vậy trong thực phẩm ngƣời ta

thƣờng cho hàm lƣợng Stev ít hơn RebA. Các chất Rubu, RebB và StevB ít phát

hiện. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đó về thành phần của nhóm

đƣờng Stevia. Đồng thời hàm lƣợng trong nƣớc giải khát cũng tỷ lệ với hàm lƣợng

các đƣờng trong mẫu nguyên liệu, điều này có thể nói lên việc bổ sung đƣờng cỏ

ngọt vào trong mẫu nƣớc giải khát đƣợc sử dụng nguyên liệu tự nhiên, có thành

phần tƣơng ứng với thành phần của mẫu nguyên liệu tự nhiên mà không có hợp chất

đƣợc tổng hợp trong nhóm stevia. Hàm lƣợng tổng các Steviol glycoside trong mẫu

nƣớc ngọt nhỏ hơn rất nhiều so với giới hạn cho phép của Bộ y tế do đƣờng Steviol

glycosides ngọt hơn nhiều lần so với đƣờng mía nên hàm lƣợng đƣợc bổ sung vào

các mẫu thực phẩm là rất thấp.

59

KẾT LUẬN

Sau khi hoàn thành nghiên cứu này, trên cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực

nghiệm, với mục đích ứng dụng phƣơng pháp HPLC xác định hàm lƣợng một số

Steviol glycosides, luận văn đã thu đƣợc kết quả nhƣ sau:

- Đã lựa chọn đƣợc điều kiện phân tích bằng HPLC đối với các chất phân tích:

 Cột C18 (250mm x 4,6mm x 5 µm).

 Thể tích bơm mẫu: 20 µL

 Pha động: Kênh A: NaH2PO4 10 mM pH 2,6 - Kênh B: ACN (68:32, v/v),

chế độ đẳng dòng

 Thời gian: 29 phút

 Bƣớc sóng: 210 nm

 Nhiệt độ cột 40oC

- Đã khảo sát đƣợc quy trình chiết một số Steviol glycosides trong nền mẫu

nguyên liệu cỏ ngọt khô, đƣờng ăn kiêng, nƣớc giải khát:

 Dung môi chiết Methanol.

 Điều kiện chiết mẫu rung siêu âm ở 50oC trong vòng 60 phút.

 Làm sạch trên cột SPE HLB (3mL, 60mg)

- Thẩm định phƣơng pháp phân tích: xây dựng khoảng đƣờng chuẩn các chất

từ 1 – 100 mg/L; Độ lặp lại RSD% trong khoảng 0,137-3,18% và độ thu hồi trong

khoảng 91,3 – 107% đều đạt theo yêu cầu của AOAC. MDL trong khoảng 12,5-

25,0 mg/kg; MQL trong khoảng 41,2 – 82,5 mg/kg. Nhƣ vậy, phƣơng pháp cho

thấy có độ tin cậy và chính xác tƣơng đối cao, đảm bảo áp dụng phân tích đƣợc các

chất trong nền mẫu.

- Đã thực hiện phân tích 25 mẫu thực phẩm bao gồm cỏ ngọt khô, bột cỏ ngọt,

đƣờng ăn kiêng, trà giảm cân và nƣớc giải khát đang lƣu hành trên thị trƣờng Hà

Nội. Thành phần các chất tạo ngọt rất khác nhau đối với các mẫu khác nhau, hàm

lƣợng Stevioside và Rebaudioside A chiếm tỷ lệ chủ yếu so với các thành phần còn

60

lại. Hàm lƣợng các chất tạo ngọt trong sản phẩm nƣớc giải khát và trà cỏ ngọt cũng

tỷ lệ tƣơng ứng với tỷ lệ thành phần của nguyên liệu.

- Kiến nghị: Kết quả thu đƣợc có thể đƣợc áp dụng thành quy trình thao tác

chuẩn phân tích một số Steviol glycosides. Ngoài ra, trong tƣơng lai phƣơng pháp

phân tích có thể mở rộng để phân tích đồng thời nhiều chất khác thuộc nhóm

glycosides cũng nhƣ trên các đối tƣợng mẫu thực phẩm khác.

61

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Bộ y tế - Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia (2018),

Phương pháp kiểm nghiệm chất lượng và an toàn thực phẩm - Tập 1 - Nhóm

sản phẩm dinh dưỡng, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.

2. Nguyễn Kim Cẩn, Lê Nguyệt Nga (2001), Định lượng Stevioside trong lá cỏ

ngọt, Công trình nghiên cứu khoa học 1987-2000, Viện dƣợc liệu, Nhà Xuất

bản Khoa học và Kỹ thuật, tr 125-128.

3. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Xuân Trung, Nguyễn Văn Ri (2003),

Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc gia Hà

Nội.

4. Tôn Nữ Liên Hƣơng, Võ Hoàng Duy, Dƣơng Mộng Hòa, Đỗ Duy Phúc và

Nguyễn Duy Thanh (2015), “Chiết xuất Stevioside từ cây cỏ ngọt”, Tạp chí

khoa học trường đại học Cần Thơ, Phần A: Khoa học tự nhiên, công nghệ và

môi trường, 36, tr 73-76.

5. Trƣơng Hƣơng Lan, Lại Quốc Phong, Nguyễn Thị Làn, Nguyễn Thị Việt Hà,

Phạm Linh Khoa, Lê Hồng Dũng (2014), “Xác định thành phần của lá cỏ

ngọt Việt Nam”, Tạp chí khoa học và phát triển, 12(1), tr 73-77.

6. Phạm Luận (2014), Phương pháp sắc ký và chiết tách, NXB Bách Khoa Hà

Nội.

7. Hồ Viết Quý (2006), Phân tích Lý –Hóa, NXB Giáo dục.

8. Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình môn học Thống kê trong Hóa phân tích, Nhà

Xuất Bản Đại Học Quốc gia Hà Nội.

62

9. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia (2010), Thẩm định

phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản khoa học

và kỹ thuật Hà Nội.

Tiếng Anh

10. Abbas Momtazi-Borojeni, A., et al. (2017), “A review on the pharmacology

and toxicology of Steviol glycosides extracted from Stevia rebaudiana”,

Current pharmaceutical design, 23(11): p. 1616-1622.

11. Abou-Arab, A.E., A.A, M.F. Abu-Salem (2010), “Physico-chemical

assessment of natural sweeteners Steviosides produced from Stevia

rebaudiana Bertoni plant”, African Journal of Food Science, 4(5): p. 269-

281.

12. Annie Shirwaikar, Vinit Parmar, Jay Bhagat and Saleemulla Khan (2011),

“Identification and estimation of Stevioside in the commercial samples of

stevia leaf and powder by HPTLC and HPLC”, Int. J. of Pharm. & Life Sci.

(IJPLS), pp 1050-1058.

13. Brusick, D. (2008), “A critical review of the genetic toxicity of steviol and

Steviol glycosides”, Food and Chemical Toxicology, 46(7): p. S83-S91.

14. Chatsudthipong, V. a C. Muanprasat (2009), “Stevioside and related

compounds: therapeutic benefits beyond sweetness” Pharmacology &

therapeutics, 121(1): p. 41-54.

15. Claudio Gardana, Martina Scaglianti, Paolo Simonetti (2010), “Evaluation of

steviol and its glycosides in Stevia rebaudiana leaves and commercial

sweetener by ultra-high-performance liquid chromatography-mass

spectrometry”, Journal of Chromatography A, 1217, pp 1463–1470.

16. Dacome, A.S., et al. (2005), “Sweet diterpenic glycosides balance of a new

cultivar of Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni: Isolation and quantitative

distribution by chromatographic, spectroscopic, and electrophoretic

methods”, Process Biochemistry, 40(11): p. 3587-3594.

63

17. Dominik Bergs, Bernhard Burghoff, Matthias Joehnck, Georg Martin,

Gerhard Schembecker (2012), “Fast and isocratic HPLC-method for Steviol

glycosides analysis from Stevia rebaudiana leaves”, Journal of Consumer

Protection and Food Safety, 7:147–154

18. Elsevier Science Publishers B.V. (1989), “Separation of natural product

sweetening agents using overpressured layer chromatography”, Journal of

Chromatography, 464, pp 213-219.

19. Food and agriculture organization of the United Nations (2016), Steviol

glycosides – Chemical and technical assessment, the 82nd JECFA.

20. Hajime Miukami, Keiko Shiiba and Hiromu Ohashi (1982), “Enzymatic

determination of Stevioside in stevia rebaudiana”, Phytochemistry, 21(8), pp

127-193.

21. Jan M. C. Geuns, Johan Buýe, Annelies Vankeirsbilck, Elisabeth H. M. T,

Frans Compernolie, Suzanne Toppet (2006), “Identification of Steviol

Glucuronide in Human Urine”, J. Agric. Food Chem., 54, 2794-2798.

22. J. Liu and S. F. Y. Li (1995), “Separation and Determination of Stevia

Sweeteners by Capillary Electrophoresis and High Performance Liquid

Chromatography”, Journal of Liquid Chromatography, 18(9), pp 1703-1719.

23. Katarzyna Marcinek and Zbigniew Krejpcio (2015), “Stevia rebaudiana

Bertoni – chemical composition and functional properties”, Acta Sci. Pol.

Technol. Aliment, 14(2), 145–152.

24. Lemus-Mondaca, R., et al. (2012), “Stevia rebaudiana Bertoni, source of a

high-potency natural sweetener: A comprehensive review on the

biochemical, nutritional and functional aspects”, Food chemistry, 132(3): p.

1121-1132.

25. Mauri, P., et al. (1996), “Analysis of Stevia glycosides by capillary

electrophoresis”, Electrophoresis, 17(2): p. 367-371.

64

26. Marcinek, K. and Z. Krejpcio (2015), “Stevia rebaudiana Bertoni chemical

composition and functional properties”, Acta Scientiarum Polonorum

Technologia Alimentaria, 14(2): p. 145-152.

27. Molina-Calle M., Sánchez de Medina V., Delgado de la Torre M. P., Priego-

Capote F. and Luque de Castro M. D. (2016), “Development and application

of a quantitative method based on LC–QqQ MS/MS for determination of

Steviol glycosides in Stevia leaves”, Talanta, 154(C), pp 263–269.

28. Morlock G.E., S. Meyer, B.F. Zimmermann, J.-M. Roussel (2014), “High-

performance thin-layer chromatography analysis of Steviol glycosides in

Stevia formulations and sugar-free food products, and benchmarking with

(ultra) high- performance liquid chromatography”, Journal of

Chromatography A, 9673(14), pp 1-31.

29. Paula M. Martins, Bhaskar N. Thorat, Aurea D. Lanchote and Luis A.P.

Freitas (2016), “Green extraction of glycosides from Stevia rebaudiana

(Bert.) with low solvent consumption: A desirability approach”, Resource-

Efficient Technologies Resource-Efficient Technologies, pp 1-7.

30. Paweł Kubica, Jacek Namieśnik, Andrzej Wasik (2014), “Determination of

eight artificial sweeteners and common Stevia rebaudiana glycosides in non-

alcoholic and alcoholic beverages by reversed-phase liquid chromatography

coupled with tandem mass spectrometry”, Anal Bioanal Chem, 407(5), pp 1 -

8.

31. Prepared at the 73rd JECFA (2010) and published in FAO JECFA

Monographs, Steviol glycoside, INS no.960.

32. R. Amery, E. Jooken, J. Geuns4 and B. Meesschaert (2010),“Determination

of Steviol glycosides in Various dairy matrices and soy drink”. Centre for

Surface Chemistry and Catalysis And Leuven Food Science and Nutrition

Research Centre.

33. Roberto Lemus-Mondaca, Antonio Vega-Gálvez, Liliana Zura-Bravo and

Kong Ah-Hen (2012), “Stevia rebaudiana Bertoni, source of a high-potency

65

natural sweetener: A comprehensive review on the biochemical, nutritional

and functional aspects”, Food Chemistry, 132, pp 1121-1132.

34. Udompaisarn, S., D. Arthan, J. Somana (2017), “Development and validation

of an enzymatic method to determine Stevioside content from Stevia

rebaudiana”, Journal of agricultural and food chemistry, 65(15): p. 3223-

3229.

35. Ursula Woelwer-Rieck, Christa Lankes, Andreas Wawrzun, Matthias Wus

(2010), “Improved HPLC method for the evaluation of the major Steviol

glycosides in leaves of Stevia rebaudiana”, Eur Food Res Technol, 231:581–

588.

36. Varanuj Chatsudthipong, Chatchai Muanprasat (2009), “Stevioside and

related compounds: Therapeutic benefits beyond sweetness”, Pharmacology

& Therapeutics ,121, pp 41–54.

37. Václav Pavlícˇek, Petr Tuma (2017),”The use of capillary electrophoresis

with contactless conductivity detection for sensitive determination of

Stevioside and Rebaudioside A in foods and beverages”, Food Chemistry,

219, pp 193–198.

38. Venkata Sai Prakash Chaturvedula, Julian Zamora (2014), “Reversed-Phase

HPLC analysis of Steviol glycoside isolated from stevia rebaudiana bertoni”.

Food and Nutrition Sciences, 18(9), pp 1703-1719.

39. Vikas Jaitak, A.P. Gupta, V.K. Kaul and P.S. Ahuja (2008), “Validated high-

performance thin-layer chromatography method for Steviol glycosides in

Stevia rebaudiana”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 47,

pp 790–794.

40. Yadav A. K., Singh S., Dhyani, D. and Ahuja, P. S. (2011), “A review on the

improvement of Stevia [Stevia rebaudiana (Bertoni)]”, Institute of

Himalayan Bioresource Technology, 91, pp 1-127.

66

41. Yan-Hong Wang , Bharathi Avula , Wenzhao Tang , Mei Wang , Mahmoud

A. Elsohly, Ikhlas A. Khan (2015), “Ultra-HPLC method for quality and

adulterant assessment of Steviol glycosides sweeteners – Stevia rebaudiana

and stevia products”, Food Additives & Contaminants: Part A, Vol. 32, No.

5, 674–685.

67

PHỤ LỤC

600000

500000

y = 4930x - 1683,8 R² = 1

400000

300000

Phụ lục 1. Đƣờng chuẩn một số Steviol glycosides

200000

100000

0

0

20

40

80

100

120

60 C (mg/L)

Tín hiệu

600000

500000

y = 5128,7x - 1085,5 R² = 0,9998

400000

300000

Hình PL1.1: Đường chuẩn xác định RebC bằng phương pháp HPLC-PDA

200000

100000

0

0

20

40

80

100

120

60 C (mg/L)

Tín hiệu

Hình PL1.2: Đường chuẩn xác định Dul bằng phương pháp HPLC-PDA

68

600000

500000

y = 5049,4x - 169,67 R² = 1

400000

300000

200000

100000

0

0

20

40

80

100

120

60

C (mg/L)

Tín hiệu

500000

400000

y = 4203,3x - 1229,8 R² = 1

300000

200000

Tín hiệu

100000

0

0

20

40

80

100

120

60 C (mg/L)

Hình PL1.3: Đường chuẩn xác định Rubu bằng phương pháp HPLC-PDA

450000

400000

y = 3888,4x + 315,66 R² = 0,9999

350000

300000

250000

200000

Hình PL1.4: Đường chuẩn xác định Reb B bằng phương pháp HPLC-PDA

150000

100000

50000

0

0

20

40

60

80

100

120

C (mg/L)

Tín hiệu

Hình PL1.5: Đường chuẩn xác định Stev B bằng phương pháp HPLC-PDA

69

Phụ lục 2 . Sắc ký đồ một số nồng độ chuẩn của nhóm Steviol glycosides

Hình PL2.1: Sắc ký đồ tại chuẩn 100 mg/L của nhóm Steviol glycosides bằng

phương pháp HPLC-PDA

Hình PL2.2: Sắc ký đồ tại chuẩn 2,5 mg/L của nhóm Steviol glycosides bằng

phương pháp HPLC-PDA

Phụ lục 3. Sắc ký đồ phần thẩm định phƣơng pháp

Hình PL 3.1: Sắc ký đồ tại mẫu trắng thêm chuẩn ở mức LOD

70

Hình PL3.2: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền mẫu lá cỏ ngọt

Hình PL3.3: Sắc ký đồ độ thu hồi trên nền mẫu lá cỏ ngọt

Hình PL3.4: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền mẫu nước giải khát

71

Phụ lục 4. Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết mẫu

Hình PL4.1: Sắc ký đồ tại mẫu lá cỏ ngọt sử dụng dung môi chiết methanol

Hình PLD 2: Sắc ký đồ tại mẫu lá cỏ ngọt sử dụng dung môi chiết nước

Phụ lục 5. Sắc ký đồ khảo sát nhiệt độ chiết mẫu

72

Hình PL5.1: Sắc ký đồ tại mẫu lá cỏ ngọt sử dụng dung môi chiết methanol ở 30 oC

Hình PL5.2: Sắc ký đồ tại mẫu lá cỏ ngọt sử dụng dung môi chiết methanol ở 50 oC

73