Luận văn Thạc sĩ Vi sinh vật học thú y: Xác định tỷ lệ nhiễm Escherichia coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn đòng đặc hiệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM ESCHERICHIA COLI O157:H7 TRONG THỊT BÒ BÁN Ở MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM TẠI HÀ NỘI, NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG ĐẶC HIỆU

PHẠM THỊ TÂM

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC THÚ Y

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm ở Việt Nam đang được Chính phủ và

hầu hết các Ngành, các cấp và người tiêu dùng quan tâm. Gần đây báo chí

thường xuyên lên tiếng phản đối việc sử dụng hormone, kháng sinh, thuốc

bảo vệ thực vật không đúng mục đích và không phù hợp với các qui định, gây

ảnh hưởng nguy hiểm đến sức khoẻ con người. Việc phát hiện thấy chất sudan

trong lòng đỏ trứng gà, melamin trong sữa, kim loại nặng gấp nhiều lần so với

ngưỡng quy định là những hồi chuông cảnh báo cho sự mất an toàn của thực

phẩm đang lưu hành tại Việt Nam. Theo số liệu thống kê của Cục Vệ sinh An

toàn Thực phẩm – Bộ Y Tế, năm 2010 cả nước đã xảy ra 132 vụ ngộ độc thực

phẩm với 4.676 người mắc bệnh, 3.281 người nhập viện và có 41 trường hợp

tử vong. Nguyên nhân chính là do vi khuẩn (Salmonella, Streptoccocus, E.

coli Staphylococcus); do độc tố tự nhiên và hóa chất) [2].

E.coli O15:H7 là một trong các chủng vi khuẩn nguy hiểm gây ngộ độc

thực phẩm ở nhiều quốc gia trên thế giới với các hội chứng: tiêu chảy, viêm

ruột xuất huyết, urê huyết (Haemolytic ureamic syndrome-HUS). Thịt bò và

các sản phẩm chế biến từ bò là những loại thực phẩm có nguy cơ cao nhiễm

vi khuẩn E.coli O15:H7. Theo báo cáo của Griffin P.M, (1995) [47], 3,7%

mẫu thịt bò ở vùng Nam Mỹ nhiễm vi khuẩn E.coli O15:H7. Ở Châu Á,

E.coli O157:H7 đã được phát hiện ở Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia

(Yamada, 1993) [144], (Son Radu, 1998) [133]. Ở Việt Nam, vi khuẩn này

được phát hiện thấy trong phân bò với tỷ lệ 2% (Norobu và cộng sự, 2005)

[90]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu của các tác giả trong nước đã phát hiện

thấy các gen độc tố điển hình của vi khuẩn E.coli O157:H7 trong thịt bò, thịt

lợn, phân bò, phân lợn với tỷ lệ mẫu nhiễm khá cao (Phạm Công Hoạt và

cộng sự, 2003) [3], (Trần Thanh Phong và cộng sự, 2007) [5].

Như vậy, với điều kiện chăn nuôi kém vệ sinh và đặc biệt là điều kiện

giết mổ mất vệ sinh, thiếu kiểm soát như hiện nay ở Việt Nam thì nguy cơ

nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 vào các loại thực phẩm và gây ngộ độc thực

phẩm cho người tiêu dùng là rất dễ xảy ra.

Với mục đích xác định sự có mặt của vi khuẩn này trong thịt bò để chủ

động trong công tác phòng, điều trị bệnh ngộ độc thực phẩm và sản xuất

kháng thể đơn dòng phục vụ chế tạo kit xác định nhanh vi khuẩn, chúng tôi

tiến hành thực hiện đề tài: “ Xác định tỷ lệ nhiễm Escherichia coli O157:H7

trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn đòng đặc hiệu”.

2. Mục tiêu của đề tài

- Xác định được tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số

địa điểm tại Hà Nội;

- Sản xuất được kháng thể đơn dòng đặc hiệu của vi khuẩn E.coli

O157:H7.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Việc xác định được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 và các đặc

tính sinh hóa cũng như độc lực của vi khuẩn này sẽ là cơ sở để xác định dịch

tễ học của hội chứng ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn này gây ra, từ đó tạo cơ

sở để xây dựng các biện pháp phòng ngừa quá trình ô nhiễm thực phẩm và

điều trị bệnh do vi khuẩn này gây nên.

- Đề tài đã đưa ra được quy trình chế tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu

với vi khuẩn E.coli O157:H7 có thể ứng dụng để sản xuất các kit chẩn đoán

huyết thanh học xác định vi khuẩn này.

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Đề tài đã xác định được sự có mặt của vi khuẩn E.coli O157:H7 trong

thịt bò bán ở Hà Nội và một số vùng phụ cận, đồng thời chứng minh được

khả năng gây bệnh của các chủng này.

- Đề tài đã chế tạo được 2 kháng thể đơn dòng đặc hiệu 100% với vi

khuẩn E.coli O157:H7. Hai kháng thể này đã được sử dụng trong nghiên cứu

tạo phức hợp kháng thể và hạt nano silica để phát hiện số lượng vi khuẩn

E.coli O157:H7 do Viện Công nghệ sinh học chủ trì thực hiện.

- Việc xác định được vi khuẩn E.coli O157:H7 và sản xuất kháng thể

đơn dòng phục vụ chế tạo kit phát hiện vi khuẩn sẽ góp phần tích cực trong

công tác đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm.

4. Những đóng góp mới của đề tài

Kết quả của đề tài hoàn toàn mới ở Việt Nam, với các lý do:

- Đề tài được thực hiện với đối tượng là vi khuẩn E.coli O157:H7

nhiễm trong thịt bò và đặc tính gây điển hình. Kết quả của đề tài là minh

chứng đầu tiên cho sự có mặt của vi khuẩn này trong thịt bò ở Hà Nội và các

vùng phụ cận.

- Lần đầu tiên ở Việt Nam chế tạo được kháng thể đơn dòng đặc hiệu

của vi khuẩn E.coli O157:H7 để ứng dụng vào quy trình xác định vi khuẩn

trong thực phẩm và chẩn đoán cho bệnh nhân ngộ độc thực phẩm.

Ch−¬ng I. Tæng quan tµi liÖu

1.1 Vi khuÈn E.coli g©y bÖnh

Escherichia coli (E.coli) là vi khuẩn thường trú trong đường ruột của

người và động vật máu nóng. Hầu hết các chủng E.coli là vô hại. Tuy nhiên,

do sự suy giảm miễn dịch hoặc có sự tổn thương ở niêm mạc đường tiêu hoá

mà ngay cả các chủng E.coli thông thường cũng có thể gây bệnh. Với các

chủng gây bệnh, vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể thông qua bề mặt màng

nhày niêm mạc hoặc da và gây nên 3 hội chứng lâm sàng chủ yếu, bao gồm: i)

nhiễm khuẩn đường tiết niệu, ii) nhiễm trùng huyết hoặc viêm màng não, và

iii) viêm ruột, tiêu chảy.

Theo thống kê của James Nataro và cộng sự, (1998) [53], các chủng vi

khuẩn E.coli gây bệnh được chia thành 5 nhóm ( phụ lục bảng 1).

+ Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coli): gồm các chủng E.coli gây

viêm ruột, tiêu chảy ở trẻ em dưới 2 tuổi (Polotsky và cộng sự, 1977) [106].

+ Nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.coli): gồm các chủng E.coli tiết ra 2

độc tố ruột bền nhiệt (heat stable toxin- ST) và độc tố ruột không bền nhiệt

(heat-labile enterotoxin- LT). Trong ®ã, độc tố LT hoạt hóa men adenyl

cyclase trong tế bào ruột làm gia tăng yếu tố C.AMP (cyclic adenozin 5’ monophosphat). Yếu tố này sẽ kích thích ion Cl- và bicarbonat tách ra khỏi tế bào đồng thời ức chế Na+ bên trong tế bào, gây hiện tượng kéo nước từ tế bào,

mô vào lòng ống tiêu hóa và hậu quả là gây tiêu chảy mất nước. Còn độc tố

ST hoạt hóa men guanyl cyclase làm tăng yếu tố C.GMC (cyclic guanosin 5’

monophosphat) bên trong tế bào dẫn đến kích thích bài tiết muối và nước gây

ra tiêu chảy. Những chñng E.coli có cả 2 loại nội độc tố LT và ST sẽ gây ra

tiêu chảy trầm trọng và kéo dài (Levine và cộng sự, 1987) [70].

+ Nhóm EIEC (Enteroinvasine E.coli): những chñng E.coli này bám

lên niêm mạc và làm bong tróc gây loét niêm mạc do đó gây tiêu chảy lẫn

máu (giống triệu chứng bệnh lỵ do vi khuẩn Shigella) (DuPont và cộng sự,

1971) [35].

+ Nhóm EAEC (Enteroaggregative E.coli): là nhóm E.coli gây tiêu

chảy nhưng không sản sinh độc tố (Cravioto và cộng sự, 1979) [29].

+ Nhóm EHEC: là nhóm E.coli gây tiêu chảy xuất huyết, đại diện là vi

khuẩn E.coli O157: H7. Vi khuẩn này gây bệnh ở người với các triệu chứng

cấp tính như: tiêu chảy cấp, xuất huyết đường tiêu hoá, phân có lẫn máu, gây

hội chứng ure huyết (HUS-Haemolytic Uraemic Syndrome), trường hợp

nghiêm trọng có thể gây tử vong. 85-95% các ca bệnh nhiễm E.coli O157:H7

là có biểu hiện hội chứng urê huyết (Riley và cộng sự, 1983) [119].

E.coli O157:H7 là vi khuẩn duy nhất thuộc loài E.coli duy nhất gây ngộ

độc thực phẩm ở người. Theo ước tính của CDC, (1999) [26], hàng năm số ca

nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 tại nước này chiếm khoảng 20.000 người,

trong đó, khoảng 250 trường hợp tử vong. Nguyên nhân của tình trạng ngộ

độc này là do E.coli O157:H7 nhiễm trong nước uống, rau xanh, thịt bò và

các sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ bò.

Theo các tác giả Faith và cộng sự, (1996) [39], Hancock và cộng sự,

(1994) [48], tỷ lệ E. coli O157:H7 trên gia súc non lớn hơn ở gia súc trưởng

thành. Còn theo nghiên cứu của Doyle và cộng sự, (1997) [34] cho biết: E.

coli O157:H7 có mặt trong 3,7% mẫu thịt bò bán lẻ, 1,5% mẫu thịt lợn, 1,5%

mẫu thịt gà, 2% mẫu thịt cừu. Bên cạnh đó, các nghiên cứu khác của Le Saux

và cộng sự, (1993) [68], cũng chứng minh rằng vi khuẩn E. coli O157:H7

nhiễm trong thịt bò tái, sữa tươi và bánh humburger là nguyên nhân gây nhiều

vụ ngộ độc thực phẩm ở Mỹ và Canada. Ngoài ra, người ta cũng đã xác định

được sự có mặt của vi khuẩn này ở sốt mayonaire (Griffin, 1995) [47], nước

hoa quả chưa thanh trùng (Besser và cộng sự, 1993) [14], (Mc Carthy, 1996)

[78] và rau sống (Morgan, 1988) [83].

Ở Việt Nam, mặc dù chưa có báo cáo về số trường hợp ngộ độc thực

phẩm do E.coli O157:H7, tuy nhiên, theo báo cáo của Noboru và cộng sự,

(2005) [90], 2/100 mẫu phân bò nuôi tại Việt Nam có mặt vi khuẩn này. Theo

một số các nghiên cứu ở trong nước của tác giả như: Phạm Công Hoạt và

cộng sự, (2003) [3] đã xác định được 8/33 mẫu phân lợn tiêu chảy nhiễm độc

tố Stx của vi khuẩn E.coli O157:H7. Còn trong nghiên cứu của tác giả Trần

Thanh Phong và cộng sự, (2007) [5], các gen độc tố đặc trưng của vi khuẩn

E.coli O157:H7 như Stx1, Stx2, eae, hly, stb được phát hiện thấy trong thịt bò,

thịt lợn, phân bò, phân lợn bình thường và tiêu chảy với tỷ lệ tương đối cao,

cụ thể: có tới 50% mẫu phân bê tiêu chảy, 57,1% mẫu phân bò bình thường,

55,9% mẫu thịt bò mang 1 đến 8 gen độc lực đặc trưng của nhóm EHEC; còn

trên lợn thì có đến 33,3% mẫu phân lợn con tiêu chảy, 62,5% mẫu phân lợn

con cai sữa tiêu chảy, 20% mẫu phân lợn bình thường, 24,5% mẫu thịt lợn

mang 1 đến 8 gen độc lực đặc trưng của nhóm EHEC.

1.2 Các đặc tính của vi khuẩn E.coli O157:H7

1.2.1 Đặc tính sinh học

1.2.1.1 Đặc điểm hình thái

E.coli O157: H7 là trực khuẩn hình que ngắn, bắt màu gram âm, kích

thước tế bào khoảng 2x0,5µm, không hình thành nha bào, có lông và roi, có

khả năng di động. Khuẩn lạc vi khuẩn dạng S, tròn trơn, bóng, có lớp màng

bao bọc, gắn chặt trên bề mặt môi trường thạch, khuẩn lạc có màu nâu nhạt

trên môi trường thạch Sorbitol MacConkey(SMAC).

1.2.1.2 Đặc tính nuôi cấy

Khác với hầu hết các chủng E.coli khác, E.coli O157:H7 không lên

men đường D-sorbitol, do đó, môi trường thạch Sorbitol MacKonkey được sử

dụng làm môi trường đặc hiệu để phân biệt vi khuẩn này (March và cộng sự,

1986) [77]. Trên môi trường SMAC, vi khuẩn E.coli O157:H7 có màu vàng

nâu nhạt trong khi các chủng vi khuẩn E.coli khác có màu hồng cánh sen.

Theo Thompson, (1990) [139], E.coli O157:H7 không sinh enzyme β-

glucuronidase, do đó trên môi trường có bổ sung cơ chất 4-

methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG), vi khuẩn này không phát quang,

trong khi các vi khuẩn E.coli khác lại có khả năng đó. Vì vậy, người ta có thể

phân biệt được khuẩn lạc E.coli O157:H7 trên môi trường thạch MUG dưới

ánh sáng tử ngoại.

Ngoài ra, khuẩn lạc E.coli O157:H7 có thể phân biệt được trên môi

trường Rainbow Agar O157 (Biolog Inc., Mỹ) hoặc Fluorocult E.coli O157

(Merck, Đức). Trên môi trường thạch Fluorocult® khuẩn lạc của vi khuẩn này

có màu xanh nhạt trong khi các E.coli khác có màu vàng. Còn trên môi trường

thạch Rainbow, khuẩn lạc vi khuẩn E.coli O157 có phổ màu đen, xám, đỏ,

xanh, tím.

1.2.1.3 Sức đề kháng

+ Nhiệt độ: khả năng thích ứng với nhiệt độ của vi khuẩn E.coli nhóm

EHEC, bao gồm cả chủng E.coli O157:H7 tương tự với các nhóm khác. Theo

Doyle và cộng sự, (1984) [32], chủng vi khuẩn này bị ức chế ở điều kiện trên 440C. Tuy nhiên, Palumbo và cộng sự, (1995) [99] lại cho biết, khả năng thích

ứng với nhiệt độ của E.coli O157:H7 phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy:

trong môi trường BHI (Brain Heart Infusion), vi khuẩn này vẫn phát triển tốt ở nhiệt độ 450C, còn với môi trường EC (E.coli) thì chúng lại bị ức chế ở nhiệt độ 440C. Theo Buchanan và cộng sự, (1994) [21], Rajkowski và cộng

sự, (1995) [108], nhiệt độ tối thiểu cho sự sinh trưởng của vi khuẩn E.coli O157:H7 là khoảng 8-100C.

+ Độ pH: theo Buchanan và cộng sự, (1992) [20], pH thích hợp cho vi

khuẩn E.coli O157:H7 là 5,5-7,5. Vi khuẩn này bị ức chế mạnh ở mức pH

4,0-4,5, tuy nhiên ảnh hưởng của pH tới sự phát triển của vi khuẩn còn phụ

thuộc vào các yếu tố có liên quan khác như: thời gian, nhiệt độ nuôi cấy, loại

axit, nồng độ axit sử dụng để chuẩn độ môi trường (Leyer và cộng sự, 1995)

[71]. Còn theo nghiên cứu của Benjamin và cộng sự, (1995) [13], Buchanan

và cộng sự, (1996) [22], các chủng vi khuẩn thuộc nhóm EHEC có khả năng chịu được độ pH 2,5 trong 2-7 giờ ở 370C. Trong các loại thực phẩm lên men

như nước ép trái cây, pho mát, E.coli O157:H7 có thể tồn tại sau vài tháng.

Tuy nhiên, khả năng sống sót của vi khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào thời gian

bảo quản, ví dụ: trong nước ép hoa quả vi khuẩn có thể tồn tại từ 2-3 ngày ở 250C, nhưng ở 80C, vi khuẩn chỉ tồn tại từ 10-30 ngày (Zhao và cộng sự,

1993) [148].

+ Khả năng chịu mặn: theo Buchanan và cộng sự, (1994) [22], vi

khuẩn E.coli O157:H7 có thể chịu được nồng độ muối từ 0,5-5%.

1.2.2 Đặc tính sinh hoá

Kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E.coli O157:H7 được thực hiện

sau bước nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu SMAC. Các khuẩn lạc

có màu vàng nâu nhạt được cấy chuyển lên môi trường thạch LB (Luria Agar), sau 18 giờ nuôi cấy ở 420C, thu nhận các khuẩn lạc đứng riêng rẽ để

làm các phản ứng sinh hóa như trong bảng 1.1.

Bảng 1.1 Các phản ứng sinh hoá của vi khuẩn E.coli O157:H7 ( Samuel

và cộng sự, 1998) [122]

Phản ứng Kết quả phản ứng

β-Glucuronidase Sorbitol Salicin Esculin Arginine dihydrolase Adonitol Inositol Cellobiose Urease Citrate KCN Sucrose Glucose (acid) Glucose (gas) Indol Arabinose Trehalose Mannitol Lactose Maltose Rhamnose Xylose Lysine decarboxylase Ornithine decarboxylase Raffinose Dulcitol - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + + +

Ghi chú: (-): âm tính; (+): dương tính

Phản ứng không lên men đường D-sorbitol được thực hiện trên môi

trường SMAC. Trên môi trường này, vi khuẩn E.coli O157:H7 có màu vàng

nâu nhạt trong khi các chủng vi khuẩn E.coli khác có màu hồng cánh sen.

Phản ứng âm tính β-glucuronidase của vi khuẩn E.coli O157:H7 được

thực hiện với môi trường có bổ sung cơ chất 4-methylumbelliferyl-β-D-

glucuronide (MUG). Vi khuẩn này không sản sinh enzyme β-glucuronidase

vì vậy không thủy phân 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide thành 4-

methylumbelliferone và glucuronide vì vậy khi quan sát khuẩn lạc vi khuẩn

E.coli O157:H7 dưới ánh sáng đèn tử ngoại, ta không nhìn thấy hiện tượng

phát quang do 4-methylumbelliferone.

Các phản ứng lên men đường lactose, glucose, sinh H2S và sinh hơi

được thực hiện trên môi trường thạch KIA (Kligler Iron Agar). Trên môi

trường này, vi khuẩn E.coli O157:H7 gây hiện tượng lên men đường lactose

tạo nên màu vàng ở phần thạch nghiêng, lên men đường glucose tạo màu

vàng ở phần thạch đứng. Vi khuẩn này không sinh H2S nên không tạo màu

đen trong ống thạch.

Phản ứng sinh indol được thực hiện bằng thuốc thử Kovac. Vi khuẩn

E.coli O157:H7 được tăng sinh trong môi trường Tryptone Water Buffer ở 370C trong 20 giờ rồi bổ sung 1ml xylen vào ống canh khuẩn, lắc đều để chiết

tách indol lên lớp dung môi hữa cơ, sau đó nhỏ 1-2 giọt Kovac có chứa p-

dimethylaminobenzaldehyde vào ống canh khuẩn. Vi khuẩn E.coli O157:H7

sản sinh enzyme tryptophanase vì vậy sẽ phân giải tryptophan có trong môi

trường Tryptone Water Buffer để tạo thành indol. Vì vậy, khi nhỏ thuốc thử

Kovac vào canh khuẩn, indol sẽ kết hợp với p-dimethylaminobenzaldehyde

để tạo thành phức hợp có màu đỏ hồng trên bề mặt ống nghiệm.

1.2.3 Đặc tính gây bệnh

Bệnh do vi khuẩn E.coli O157:H7 được coi là bệnh truyền lây giữa

người và gia súc. Vi khuẩn này ký sinh trong đường ruột của bò, hươu, cừu vì

vậy nó có thể nhiễm vào tất cả các loại thực phẩm, thức ăn, nước uống có tiếp

xúc với phân nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, E.coli O157:H7 không gây bệnh cho

các loài gia súc này.

Ở người, E.coli O157:H7 là một serotype thuộc loài E.coli có khả năng

gây ngộ độc thực phẩm, xuất huyết và phù thũng ở màng nhầy niêm mạc ruột

(Griffin, 1990) [46]. Các triệu chứng bệnh do vi khuẩn này thường xuất hiện

sau hai ngày nhiễm khuẩn (phụ lục hình 1). Biểu hiện ban đầu ở bệnh nhân

thường không tiêu chảy nhưng có cảm giác đau quặn bụng và sốt nhẹ. Sau

khoảng 24-48 giờ, bệnh nhân tiêu chảy mạnh, đau bụng và mất nước. Trong

một số trường hợp, bệnh nhân xuất hiện hội chứng urê huyết. Sau 1 tuần mắc

bệnh, bệnh nhân có biểu hiện da dẻ nhợt nhạt, xuất huyết các mạch máu ngoại

vi, giảm tiểu cầu, giảm đi tiểu, phù thũng, suy thận cấp (Moake, 1994) [82].

Theo Tarr, (1995) [138], 10% bệnh nhi dưới 10 tuổi có hội chứng urê huyết

(HUS) do vi khuẩn E.coli O157:H7, trong đó, tỷ lệ tử vong là 3 - 5%, khoảng

12- 30% số đó xuất hiện các di chứng suy thận, tăng huyết áp, thần kinh, tiểu

đường, đột quỵ.

1.2.4 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli O157:H7

1.2.4.1 Độc tố Shiga toxin- Stx

Stx được chia thành 2 loại chính, không gây miễn dịch chéo cho nhau,

đó là Stx1 và Stx2, mỗi chủng vi khuẩn E.coli O157:H7 mang một hoặc cả hai

loại độc tố này. Trong đó, Stx1 có tính ổn định cao, còn Stx2 được chia thành

nhiều nhóm phụ khác nhau như: Stx2c, Stx2v, Stx2vhb, Stx2e. Stx2e gây phù

thũng chủ yếu trên lợn.

Trên thực tế, Stx còn được phát hiện thấy ở các chủng gây bệnh đường

tiêu hoá như: V.cholerae, V.parahaemolyticus, Campylobacter jejuni, E.coli

K-12, và một số chủng E.coli khác (O’Brien và cộng sự, 1987) [91]. Ở dạng

nguyên mẫu, Stx có trọng lượng phân tử là 78 kDa, chứa 2 tiểu phần A và B,

trong đó, tiểu phần A là một phân tử protein có trọng lượng phân tử là 32 kDa

được phân ly thành 2 chuỗi peptide nhỏ là A1 có trọng lượng 28 kDa (mang

hoạt tính enzyme) và A2 có trọng lượng 4 kDa, hai mảnh peptide này liên kết

với nhau bởi các cầu nối disulfua. Phần B có trọng lượng phân tử là 7,7 kDa

chứa 5 liên kết đặc hiệu với điểm thụ cảm globotriaosylceramide (Gb) trên bề

mặt của tế bào vật chủ. Khi độc tố gắn lên màng tế bào, chúng được thẩm

thấu qua các hốc tế bào rồi đi vào hệ thống golgi và lưới nội chất (Sandvig và

cộng sự, 1994) [123], phần A gắn với tiểu phần 60S của ribosom và ức chế

quá trình tổng hợp protein của tế bào vật chủ (hình 1.1). Kết quả là gây gián

đoạn quá trình tổng hợp protein và gây chết các tế bào biểu mô đường tiết

niệu, đường tiêu hoá hoặc các tế bào có chứa Gb3, Gb4. Loài thỏ không có

yếu tố này trên bề mặt tế bào biểu mô ruột nên vi khuẩn E.coli O157:H7

không gây tiêu chảy và các triệu chứng liên quan tới ngộ độc thực phẩm.

Trong đường tiêu hoá, độc tố Stx có thể gây tổn thương hoặc làm chết

các tế bào lông nhung trên biểu mô ruột (Kandel và cộng sự, 1989) [55],

(Keenan và cộng sự, 1986) [61]. Để chứng minh khả năng gây bệnh đường

tiêu hoá của độc tố Stx, Sjogren và cộng sự, (1994) [130] đã sử dụng chủng vi

khuẩn E.coli RDEC-1 gây bệnh tự nhiên trên thỏ với triệu chứng tiêu chảy

không có máu lai với thực khuẩn thể mang gen Stx cho thỏ uống. Kết quả thí

nghiệm cho thấy, thỏ cho uống chủng vi khuẩn lai có biểu hiện bệnh tích nặng

hơn rất nhiều so với thỏ uống chủng tự nhiên E.coli RDEC-1 với các triệu

chứng như: thay đổi huyết áp, phù thũng, xuất hiện nhiều đám tổn thương trên

niêm mạc đường tiêu hóa.

Còn đối với hội chứng urê huyết, các chủng E.coli O157:H7 gây tiêu

chảy lẫn máu thường kèm theo hội chứng này hơn các chủng gây tiêu chảy

thông thường (Griffin, 1995) [47]. Bằng gây nhiễm thực nghiệm tiêm độc tố

Stx1 và Stx2 cho thỏ cho thấy: ở các mô, cơ quan có nhiều điểm thụ cảm Gb3

như ruột non, hệ thần kinh trung ương xuất hiện các đám tổn thương lớn

(Barrett và cộng sự, 1989) [12]. Còn ở thận, do thận thỏ không chứa các điểm

thụ cảm Gb3 nên không xuất hiện tổn thương (Boyd và cộng sự, 1989) [17].

Đối với con người, Gb3 có nhiều trên ống tiết niệu, vì vậy, dưới tác động của

độc tố Stx, các tế bào biểu mô cầu thận căng phồng, tổn thương, có hiện tượng

lắng đọng tiểu cầu, hình thành các sợi tơ trong các tế bào cầu thận (Boyd và

cộng sự, 1989) [17]. Sự tổn thương tế bào biểu mô cầu thận dẫn tới giảm khả

năng lọc của thận, đây chính là nguyên nhân của hội chứng suy thận cấp, biểu

hiện điển hình của HUS. Trên thực tế, Stx2 gây hội chứng urê huyết phổ biến

hơn Stx1 (Boyd và cộng sự, 1989) [17], theo Pickering, (1994) [105] các

chủng E.coli O157:H7 mang độc tố Stx2 thường gây tình trạng HUS mạnh

hơn các chủng chỉ mang độc tố Stx1 hoặc cả hai loại độc tố này.

Hình 1.1 Cấu trúc của độc tố Stx và cơ chế gây bệnh

1.2.4.2 Độc tố east1 (eaec)

Theo Savarino và cộng sự, (1996) [124], tất cả các chủng E.coli

O157:H7 đều mang gen eastA mã hoá nên độc tố east1 (phụ lục hình 2). Khả

năng gây bệnh của độc tố này chưa được xác định nhưng độc tố này đã được

tìm thấy trong phân của một số bệnh nhân tiêu chảy.

1.2.4.3 Enterohemolysin (hly)

Ở vi khuẩn E.coli O157:H7, độc tố hly được mã hoá bởi gen nằm trên

plasmid 60 mDa (phụ lục hình 2) (Schmidt và cộng sự, 1995) [127]. Theo

Beutin và cộng sự, (1994) [15], ở Đức, có khoảng 90% chủng E.coli O157:H7

sinh độc tố Stx có mang gen mã hoá độc tố hly. Vai trò của độc tố này vẫn

chưa được xác định rõ, tuy nhiên, khả năng dung giải hồng cầu và giải phóng

heme cùng sắc tố hemoglobin của độc tố này giúp cho E.coli O157:H7 phát

triển tốt hơn trên môi trường thạch máu.

1.2.4.4 Yếu tố bám dính

Yếu tố bám dính của E.coli O157:H7 là OPM intimin có trọng lượng

phân tử từ 94-97 kDa được mã hoá bởi gen eae. Trên lợn con, E. coli

O157:H7 gây tổn thương dạng A/E ở ruột già với đặc điểm bám dính điển

hình của vi khuẩn lên các tế bào biểu mô. Bên cạnh đó, các tác giả Ashkenazi,

(1992) [8], Fratamico, (1993) [43] cũng cho thấy E.coli O157:H7 còn sản sinh

yếu tố bám dính fimbriae, tuy nhiên các tác giả trên chưa xác định được gen

mã hoá yếu tố này.

1.2.4.5 pO157 plasmid

Theo Schmidt và cộng sự, (1994) [126], 1996 [128] hầu hết các chủng

E.coli O157:H7 đều chứa plasmid pO157 có kích thước từ 93.6-104 kb, trên

đó có các gen: gen mã hoá độc tố hly có trọng lượng 3.4 kb, gen mã hóa

enzyme catalase-peroxidase (KatP), enzyme protease phân hủy serine (EspP).

Trong đó, EspP là một protein ngoại bào có khối lượng phân tử 104 kDa, có

khả năng tách các nhân tố làm đông máu và gây độc đối với các tế bào thận.

Đây là một trong các tác nhân tác động bổ trợ gây nên hội chứng urê huyết

(Brunder, 1996) [20].

1.3 Nguồn tàng trữ vi khuẩn E.coli O157:H7

* Ở bò: Vi khuẩn E.coli O157:H7 có mặt trong thịt, sữa tươi, sữa chua,

phomat do sự tạp nhiễm của vi khuẩn này từ phân bò trong quá trình giết mổ,

bảo quản, chế biến. Theo Zhao và cộng sự, (1995) [149], tỷ lệ nhiễm E.coli

O157:H7 ở bê nhiều hơn bò trưởng thành, tuy vậy vi khuẩn này lại không gây

bệnh ở bò (Brown và cộng sự, 1997) [18]. Nhóm tác giả này đã tiến hành

kiểm tra phân của 965 con bò sữa và 11.881 con bò thịt ở Mỹ, kết quả cho

thấy tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 trong các mẫu phân của bò sữa là 3,2% và bò thịt là 1,6%, với cường độ nhiễm dao động từ 102-105 CFU/1g phân. Tại

Việt Nam, theo số liệu của Noboru và cộng sự, (2005) [90], 2/100 mẫu phân

bò nuôi tại khu vực Hà Nội có chứa vi khuẩn E.coli O157:H7. Theo báo cáo

của Faith và cộng sự, (1996) [39], Meng và cộng sự, (1995) [79], có nhiều

hơn 1 chủng E. coli O157:H7 trong phân của một cá thể hoặc các cá thể trong

một đàn.

* Ở hươu: Theo báo cáo của Keene và cộng sự, (1997) [62]; Rice và

cộng sự, (1995) [118]; Doyle và cộng sự, (1987) [33] khi nghiên cứu về tính

tương đồng giữa các chủng E.coli O157:H7 ở bệnh nhân nhiễm khuẩn do ăn

thịt bò tái nuôi tại khu vực có hươu và đã xác định được hươu tham gia vào

chuỗi truyền lây vi khuẩn với vai trò là nguồn tàng trữ. Trong báo cáo này,

các tác giả còn cho biết, E.coli O157:H7 đã được phát hiện thấy trong phân và

các mảnh cắt của sừng hươu.

* Ở cừu: Theo nghiên cứu của Kudva và cộng sự, (1996) [67], cừu là

nguồn mang vi khuẩn E.coli O157:H7 mặc dù chúng không bị bệnh do vi

khuẩn này. Khả năng bài thải E.coli O157:H7 qua phân cừu phụ thuộc theo

mùa, trong đó mùa hè có 31% mẫu phân dương tính, mùa thu là 5,7%, còn

mùa đông thì không phát hiện mẫu dương tính.

* Ở nước sinh hoạt: Theo Doyle và cộng sự, (1987) [33], nước là

nguồn tàng trữ vi khuẩn E.coli O157:H7 và là nguyên nhân trực tiếp gây bệnh

cho người. Theo báo cáo của Faith và cộng sự, (1996) [39] thì nước cũng

chính là nguồn gây nhiễm vi khuẩn này cho trâu bò.

1.4 Các phương pháp chẩn đoán, xác định vi khuẩn

E.coli O157:H7 là vi khuẩn gây bệnh cho con người nhưng có nguồn

gốc từ gia súc và các sản phẩm thực phẩm, vì vậy, phải có các hệ thống chẩn

đoán, xác định vi khuẩn riêng cho người và động vật (Banatvala và cộng sự,

1996) [10], (Baqui và cộng sự, 1992) [11]. Về nguyên tắc chung, việc chẩn

đoán, xác định vi khuẩn thường dựa trên 3 yếu tố: i) vi khuẩn trong mẫu bệnh

phẩm hoặc thực phẩm; ii) kháng thể kháng O157 hoặc H7; iii) độc tố hoặc các

gen độc tố.

1.4.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn

* Môi trường tăng sinh: thường sử dụng môi trường Peptone Water

Buffer có bổ sung kháng sinh vancomycin 8 mg/lít, cefuroxim 10 mg/lít và

cefixime 0.05 mg/lít để ức chế các vi khuẩn gram âm khác như: Aeromonas

spp., Proteus spp.; hoặc môi trường Modified Trypticase Soy Broth (mTSB)

bổ sung novobiocin 20 mg/lít và acriflavin 10 mg/lít; hoặc môi trường E.coli

Broth bổ sung novobiocin 20 mg/lít. Điều kiện tăng sinh là khác nhau với các đối tượng mẫu khác nhau, cụ thể: mẫu phân bò tăng sinh ở 370C/6 giờ, mẫu thịt tăng sinh ở 41-420C trong 6 giờ, mẫu sữa tăng sinh ở 41-420C trong 24

giờ. Trong trường hợp mật độ vi khuẩn quá ít, người ta có thể sử dụng

phương pháp miễn dịch từ tính đồng thời với quá trình tăng sinh. Về nguyên

lý, phương pháp từ tính sử dụng các hạt nam châm được phủ kháng thể đặc

hiệu với kháng nguyên O157. Trong quá trình tăng sinh, nếu có mặt của vi

khuẩn E.coli O157 thì dưới tác dụng của từ trường, chúng sẽ bị thu hút và gắn

lên hạt nam châm.

* Môi trường phân lập đặc hiệu: khác với các chủng vi khuẩn E.coli

khác, E.coli O157:H7 không có khả năng lên men đường sorbitol và không có

enzyme beta-glucuronidase. Dựa và hai đặc điểm này, người ta sử dụng các

môi trường đặc hiệu cho vi khuẩn, bao gồm: i) thạch SMAC có bổ sung D-

sorbitol 1%, rhamnose 0.5% hoặc potassium tellurite 0,25% và cefixime 0.05

mg/lít. Trên môi trường này, vi khuẩn E.coli O157:H7 có màu vàng nâu nhạt

do không lên men đường sorbitol; hoặc ii) môi trường thạch MUG có chứa 4-

methylumbelliferyl-beta-D-glucuronide. Trên môi trường này, vi khuẩn E.coli

O157:H7 không phát quang khi quan sát dưới tia tử ngoại.

Phương pháp phân lập vi khuẩn trong mẫu phân phụ thuộc vào thời

gian nhiễm khuẩn. Theo Tarr và cộng sự, (1990) [137], thời gian lấy mẫu

phân bệnh nhân nghi nhiễm E.coli O157:H7 là 2 ngày sau khi bắt đầu có triệu

chứng tiêu chảy, lúc này tỷ lệ phát hiện đạt 100%, còn nếu lấy mẫu sau 3-6

ngày hoặc sau 6 ngày thì tỷ lệ phát hiện chỉ còn 91.7 - 33.3%.

1.4.2 Phương pháp miễn dịch học

Các phương pháp này chủ yếu sử dụng để phát hiện kháng nguyên

O157 (kháng nguyên thân có bản chất lipopolysacharide) và H (kháng nguyên

lông có bản chất protein). Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại KIT chẩn

đoán hai loại kháng nguyên này. Tuy nhiên, CDC, (1999) [26] khuyến cáo

nên sử dụng các loại kit latex phát hiện kháng nguyên O157 của các hãng

Oxoid, Richmond Hill, Remel và kit latex phát hiện kháng nguyên H7 của

Remel. Bên cạnh đó, phương pháp ELISA cũng cho hiệu quả chẩn đoán cao,

theo Park và cộng sự, (1996) [101], phương pháp này cho độ nhạy lớn hơn

phương pháp nuôi cấy, phân lập. Tuy vậy, tác giả này cũng cho rằng, kết quả

dương tính ELISA chỉ là cơ sở để tiếp tục thực hiện các phản ứng khác như:

kiểm tra độc tố, PCR hoặc nuôi cấy để kết luận sự có mặt của vi khuẩn.

Ngoài ra, FDA cũng khuyến cáo sử dụng kit sandwich ELISA của hãng

Meridian Diagnostics, Inc. để phát hiện độc tố Stx1 và Stx2 của vi khuẩn

E.coli O157:H7. Phản ứng này sử dụng kháng thể đa dòng kháng Stx và các

kháng thể đơn dòng kháng Stx1, Stx2, vì vậy phản ứng cho phép phát hiện độc

tố trong mẫu vi khuẩn nuôi cấy, mẫu thực phẩm, mẫu phân (trích theo

Acheson và cộng sự, 1994) [7]. Theo Kehl và cộng sự, (1997) [63], kit ELISA

trên có độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng là 100% và 99,7%, trong khi đó,

các giá trị này của phương pháp nuôi cấy trên thạch SMAC chỉ đạt 60% và

100%.

1.4.3 Phương pháp phát hiện độc tố

Phản ứng này dùng để phát hiện độc tố Stx dựa trên khả năng gây bệnh

tích trên tế bào Vero (Karmali, 1987) [56], (Karmali, 1989) [57]. Vi khuẩn

nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu được tăng sinh tiếp trên môi trường CAYE

có thành phần: 2% casamino acid, 0.6% yeast extract, 0.25% NaCl, 0.87% K2HPO4, 0.0005% MgSO4, 0.0005% FeCl3 ở 370C trong 18 giờ để tách độc tố

(Mundell, 1976) [85]. Canh khuẩn E.coli O157:H7 được ly tâm, thu dịch nổi

rồi bổ sung vào các đĩa tế bào thận khỉ xanh châu Phi (VERO) và tiếp tục nuôi ở điều kiện 370C/ 3 ngày trong tủ ấm CO2. Kiểm tra bệnh tích tế bào sau

mỗi 24 giờ và so sánh mẫu với đối chứng dương và âm.

1.4.4 Phương pháp PCR-Mutiplex

Phương pháp này dùng để phát hiện các gen độc tố của vi khuẩn E.coli

O157:H7. Theo Paton và cộng sự, (1997) [100] các gen mã hóa độc tố của vi

khuẩn này là Stx1, Stx2, eae, hly được phát hiện bằng các cặp mồi trong bảng

1.2.

Bảng 1.2 Trình tự các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR-

Multiflex phát hiện các gen độc tố của vi khuẩn E.coli O157:H7 (Paton và

cộng sự, 1997) [100]

Còn theo Blanco và cộng sự, (1997) [16], trật tự các cặp mồi để phát

hiện các gen mã hóa độc tố của vi khuẩn E.coli O157:H7 Stx2e, sta, stb, LT-I

như trong bảng 1.3.

Bảng 1.3 Trình tự các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR-Multiflex

phát hiện các gen độc tố của vi khuẩn E.coli O157:H7 (Blanco và cộng

sự) [16]

1.5. Cấu trúc kháng nguyên của E.coli sp. và E.coli O157:H7

Escherichia coli (E.coli) là vi khuẩn có trong đường ruột của con người

và động vật. Từ nhiều thập kỷ qua, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu

về vi khuẩn này trên tất cả các góc độ: khả năng gây bệnh, đặc điểm hình thái,

sinh hoá, cấu trúc kháng nguyên, cấu trúc gen, độc tố,... Trong đó, cấu trúc bề

mặt của vi khuẩn được xác định là yếu tố quan trọng đặc biệt đối với sinh lý

bệnh, dịch tễ bệnh và khả năng sinh đáp ứng trên vật chủ. Cấu trúc này không

chỉ có vai trò bảo vệ vi khuẩn mà nó chính là các yếu tố kháng nguyên. Theo

James và cộng sự, (1998) [52], cấu trúc kháng nguyên của E.coli gồm 4

nhóm: i) kháng nguyên O (thân), ii) kháng nguyên H (tiên mao, lông), K

(kháng nguyên giáp mô), F (kháng nguyên fimbrae). Ngoài ra, theo Orskov và

cộng sự, (1984) [97], một số chủng E.coli còn mang kháng nguyên M

(mucus- kháng nguyên màng nhầy).

Hiểu biết về đặc điểm bề mặt của tế bào và các kháng nguyên của vi khuẩn

E.coli là cơ sở giúp các nhà khoa học có định hướng nghiên cứu các phương

pháp phòng bệnh, xác định cơ chế tác dụng của thuốc, chế tạo các loại KIT

chẩn đoán và các chế phẩm điều trị bệnh.

Năm 1984, Orskov và cộng sự [97] đã thống kê được 163 kiểu kháng

nguyên O, tương ứng với 56 kiểu kháng nguyên H và 101 kiểu kháng nguyên

K. (phụ lục bảng 2)

1.5.1 Kháng nguyên thân (O)

Là kháng nguyên có mặt ở tất cả các chủng vi khuẩn đường tiêu hoá có

cấu trúc khuẩn lạc dạng S. Kháng nguyên này nằm trên lớp lipo-

polysaccharide (LPS) của thành tế bào trực khuẩn gram âm, có bản chất là polysaccharide, bền với nhiệt và không bị biến tính ở nhiệt độ 1000C. Đây là

kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch trên vật chủ, tạo phản ứng ngưng kết do

ngưng kết tố.

Lớp LPS của thành tế bào vi khuẩn gram âm được chia thành 3 vùng (hình

1.2), bao gồm: i) lipid A được cấu tạo bởi axit hydroxymyristic, glucosamine

và acid béo giúp LPS được neo giữ vào màng ngoài của vi khuẩn bằng các

liên kết đồng hoá trị. Đây là yếu tố đóng vai trò nội độc tố của vi khuẩn; ii)

nhân oligosaccharide có cấu tạo từ các loại đường hoặc các gốc đường và gắn

với vùng lipid A bởi acid 2-keto-3 deoxymannulosoctonic (KDO); iii) vùng

biến đổi, có bản chất polysaccharide đặc trưng cho từng chủng vi khuẩn,

mang tính đặc hiệu cho kháng nguyên O, vùng này bao gồm 10-30 phân tử

oligosaccharide kết hợp lặp lại và tạo nên 3-6 gốc đường (hình 1.2) (Luderitz

và cộng sự, 1973) [74]. Chính nhờ khả năng tái tổ hợp ngẫu nhiên của các

phân tử oligosaccharide và số lượng các các gốc đường trong cấu trúc kháng

nguyên O đã tạo nên tính đa dạng của loại kháng nguyên này, bên cạnh đó,

các gốc O-acetyl hoặc các acid amin là yếu tố làm kéo dài chuỗi poly-

saccharide (phụ lục bảng 3) (Reeves và cộng sự, 1994) [116].

Hình 1.2 Cấu trúc cơ bản của LPS

Năm 1944, Kauffmann [58], bằng phương pháp huyết thanh học đã

định type vi khuẩn E.coli theo các nhóm huyết thanh O. Một năm sau, năm

1945, chính tác giả này đã đưa ra hệ thống phân loại 20 nhóm E.coli dựa trên

huyết thanh O đầu tiên (Kauffmann, 1945) [59]. Năm 1945, Knipschildt [64]

đã bổ sung thêm 5 nhóm huyết thanh O của vi khuẩn E.coli. Năm 1984,

Orskov [97] và cộng sự đã thống kê được 164 kiểu kháng nguyên O. Và từ đó

đến nay, đã có 187 kiểu huyết thanh O của vi khuẩn này được đưa vào hệ

thống phân loại (trích theo CDC, 1999) [26].

Để phát hiện kháng nguyên O, người ta dùng phương pháp ngưng kết

huyết thanh với kháng thể đặc hiệu tương ứng, một số chủng vi khuẩn có giáp

mô bền nhiệt thì phản ứng ngưng kết chỉ xảy ra khi vi khuẩn được xử lý ở nhiệt độ tiệt trùng (1210C/2 giờ). Tuy nhiên, giữa các kháng nguyên O của

E.coli với kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn đường tiêu hoá khác như

Salmonella, Shigella, Klebsiella, Vibrio cholera, thậm chí, giữa các nhóm

hoặc các kiểu kháng nguyên O trong cùng loài E.coli cũng thường xuất hiện

phản ứng chéo (Edwards và cộng sự, 1972) [36], (Frantzen và cộng sự, 1980)

[42], (Ida, 1977) [50], (Kauffmann, 1954) [60] (phụ lục bảng 4,5). Bên cạnh

đó, một số chủng E.coli lại có khả năng biến đổi từ dạng S sang dạng R do đột

biến của một hoặc vài gen quy định tổng hợp và trùng hợp kháng nguyên O,

vì vậy các chủng vi khuẩn này sẽ mất khả năng tổng hợp kháng nguyên thân

dẫn đến việc phát hiện kháng nguyên O bằng kháng thể đặc hiệu không cho

kết quả mong muốn (Ida, 1977) [50].

Hiện nay, kháng nguyên O của vi khuẩn E.coli có thể được phát hiện

bằng các phương pháp miễn dịch học như ELISA (M.Gleeson và cộng sự,

1998) [81], Western blot (Walter và cộng sự, 1995) [141], hoặc sinh học phân

tử như PCR (Chitrita và cộng sự, 2005) [28].

Gen mã hoá kháng nguyên O gồm có: i) gen wzx (orf4) mã hoá enzyme

gắn các tiểu phần kháng nguyên, và ii) wzy (orf2) mã hoá enzyme trùng hợp

kháng nguyên O. Hầu hết các kháng nguyên này đều được tổng hợp bởi hệ

thống gen phụ thuộc wzx, là các gen cho phép tổng hợp các tiểu phần O trên

màng trong của màng nguyên sinh chất tế bào vi khuẩn, sau đó các tiểu phần

này được chuyển qua màng bằng các emzyme phụ thuộc gen wzx để tham gia

quá trình trùng hợp tạo kháng nguyên O được quy định bởi gen wzy (Reeves,

1994) [116].

Đối với E.coli O157:H7, cấu trúc kháng nguyên O gồm có: N-acetyl-D-

perosamine-L-fucose-D-glucose-N-acetyl-D-galactose (Leiwang và cộng sự,

1998) [69]. Gen mã hoá kháng nguyên O157 có chiều dài 14kb, chứa 12 gen

và một đoạn lặp H (hình 1.3), cụ thể: 4 gen mã hoá đường GDP-L-fucose là manB, manC, gmd, fcl; 1 gen per mã hoá GDP-perosamine; 3 gen mã hoá

enzyme mang chức năng vận chuyển đường của các tiểu phần O; 1 gen mã

hoá enzyme vận chuyển acetyl; 1 gen gắn các tiểu phần O và 1 gen trùng hợp

kháng nguyên O.

Hình 1.3 Sơ đồ gen mã hoá kháng nguyên O157

Kháng nguyên O là thành phần gây đáp ứng miễn dịch đối với vật chủ.

Người ta có thể tách chiết kháng nguyên O của vi khuẩn E.coli bằng các loại

dung môi hữu cơ (Kiyoshi và cộng sự, 1971) [65] hoặc bằng phương pháp tái

tổ hợp gen (Lu Feng và cộng sự, 2004) [73] để sản xuất vắc xin phòng bệnh

hoặc gây miễn dịch để chế kháng huyết thanh chẩn đoán.

1.5.2. Kháng nguyên lông (H)

Khác với kháng nguyên thân có bản chất là polysaccharide và định vị

trên thành tế bào, kháng nguyên lông có bản chất protein và định vị trên lông

hoặc tiên mao của vi khuẩn, vì vậy, kháng nguyên này chỉ có ở các loài vi

khuẩn có cấu trúc lông hoặc tiên mao. Tiên mao của vi khuẩn có cấu tạo từ

protein roi, có cấu trúc là một ống rỗng xoắn hoặc uốn cong được gắn với

thành tế bào bằng các phân tử protein vòng. Ở vi khuẩn gram dương, protein

vòng hình thành hai cấu trúc vòng nhẫn, một gắn với màng peptidoglycan và

một gắn với màng nguyên sinh chất. Còn ở vi khuẩn gram âm, có tới 4 cấu

trúc vòng nhẫn để giúp tiên mao gắn chặt và tế bào, bao gồm: vòng L liên kết

với lớp lipopolysaccharide, vòng P liên kết với lớp peptidoglycan, vòng M

nằm trên màng nguyên sinh chất, vòng S gắn trực tiếp vào màng nguyên sinh

chất. Đầu tận cùng của tiên mao là một protein mũ.

Số lượng tiên mao phụ thuộc vào loài vi khuẩn: vi khuẩn tả Vibrio

cholera có một tiên mao, trong khi đó E.coli lại có rất nhiều và phân bố khắp

trên bề mặt tế bào. Cấu trúc tiên mao là cấu trúc đặc trưng cho các chủng vi

khuẩn, chính vì sự khác biệt trên cấu trúc bề mặt của tiên mao đã dẫn đến sự

khác biệt về cấu trúc kháng nguyên H, các chủng vi khuẩn có cấu trúc tiên

mao giống nhau thì có cấu trúc kháng nguyên H giống nhau. Đây chính là cơ

sở để lý giải khả năng gây phản ứng chéo giữa các kháng nguyên H. Theo

Macnab, (1996) [76], các tiểu phần protein cấu tạo nên kháng nguyên tiên

mao của vi khuẩn E.coli được mã hoá bởi gen fliC. Dựa trên hình thái, cấu

trúc của tiên mao, vi khuẩn E.coli được chia làm 6 nhóm, ký hiệu từ A-F (

hình 1.4), với các đặc điểm như sau:

Hình 1.4 Cấu trúc bề mặt tiên mao của vi khuẩn E.coli

- Nhóm A: gồm 2 kiểu huyết thanh H4 và H17. Cấu trúc tiên mao dài,

mảnh, xoắn đều trôn ốc, đường kính 19nm, trọng lượng phân tử 37.000 Da.

Theo Smith và cộng sự, (1971) [131], vi khuẩn Salmonella typhimurium cũng

thuộc nhóm huyết thanh này.

- Nhóm B: gồm 8 kiểu huyết thanh H5, 25, 33, 38, 39, 42, 47 và 52.

Cấu trúc tiên mao dạng sợi mảnh, gồm nhiều tiểu phần liên kết với nhau,

đường kính 20nm, trọng lượng phân tử 46.000 Da. Theo Smith và cộng sự,

(1971) [131], các kháng nguyên H5 và H25 có cấu trúc bề mặt tương tự nhau

và điển hình của nhóm, các kiểu huyết thanh còn lại có sự biến đổi hình thái

bề mặt, một số trường hợp có biểu hiện tương tự nhóm C.

- Nhóm C: gồm 7 kiểu huyết thanh H2, 10, 24, 29, 43, 48 và 53, trong

đó, E.coli K22 có kiểu kháng nguyên H48. Cấu trúc tiên mao dạng R, chứa

nhiều tiểu phần, đường kính 23nm, trọng lượng phân tử 46.000Da. Các kiểu

kháng nguyên tiên mao C và D có tính tương đồng rất cao với vi khuẩn

Salmonella typhimurium.

- Nhóm D: gồm 5 kiểu huyết thanh H8, 11, 21, 27 and 40. Trong đó,

H40 tương đối giống với các kiểu huyết thanh thuộc nhóm C. Cấu trúc tiên

mao chứa nhiều tiểu phần phân cực, xếp theo hình răng cưa, đường kính

22nm, trọng lượng phân tử 56Da.

- Nhóm E: gồm 8 kiểu huyết thanh H1, 7, 12, 23, 34, 45, 49 và 51. Cấu

trúc tiên mao chứa các vòng xếp đều nhau, khoảng cách 10nm tạo thành dạng

vỏ xoắn, đường kính 22nm, trọng lượng phân tử 62.000Da

- Nhóm F: gồm 15 kiểu kháng nguyên H 6, 14, 15, 18, 19, 20, 26, 28,

30, 31, 32, 37, 41, 44 và 46. Cấu trúc tiên mao tương tự nhóm E, tuy nhiên

khoảng cách giữa các vòng xếp là 20nm, đường kính tiên mao là 24nm, trọng

lượng phân tử 56.000Da.

Mặc dù có tới 65 kiểu huyết thanh H nhưng theo Ratiner, (1982) [112],

kháng nguyên này được quyết định bởi 4 gen định vị trên nhiễm sắc thể là

fliC, flkA, fllA, and flmA, trong đó, gen fliC được xác định là gen đặc hiệu mã

hóa nên các kháng nguyên H (Neidhardt và cộng sự, 1989) [89]. Trong số 65

kiểu kháng nguyên H, có tới 43 serotyp mang gen fliC trên nhiễm sắc thể biểu

hiện kháng nguyên này. Do sự tái tổ hợp các phân tử ADN trên gen fliC đã

tạo nên các allen mới và tạo nên sự đa dạng kháng nguyên lông của vi khuẩn

E.coli cũng như của các vi khuẩn gram âm khác. Theo nghiên cứu của các tác

giả Ewing, (1986) [37], Orskov và cộng sự, (1984) [97], Ratiner và cộng sự,

(1973) [111], Ratiner, và cộng sự (1999) [115] đã thống kê được 53 kiểu

kháng nguyên H của vi khuẩn E.coli là: H1 đến H12, H14 đến H21, H23 đến

H49, H51 đến H56. Ngoài ra, còn có các kiểu kháng nguyên H khác không

thuộc 53 kiểu kháng nguyên H đã được xác định (Ratiner và cộng sự 1998)

[114]. Bên cạnh đó, một số chủng E.coli có thể gồm các subtyp H khác nhau,

như H7a,b (H7a,7b); H7a,c (H7a,7c); O55:H2a,b và O55:H2a,c. Chính vì sự

đa dạng kháng nguyên H này đã tạo nên quần thể E.coli đa dạng trong tự

nhiên (Ratiner và cộng sự, 1969) [110], (Ratiner và cộng sự, 1987) [113].

Theo các tác giả Feng và cộng sự, (1998) [41], Whittam, (1995) [142],

E.coli O157:H7 có nguồn gốc từ E.coli O55:H7. Tuy nhiên, người ta đã xác

định được các subtyp của kháng nguyên H7 của chủng E.coli O55:H7 gồm

hai nhóm H7ab và H7ac, còn các subtyp của kháng nguyên H7 của chủng

E.coli O157: H7 thì lại chưa được xác định. Trên cấu trúc gen fliC quy định

kháng nguyên H7, Ratiner và cộng sự, (1998) [114] đã xác định được gồm có

3 vùng: C1, V, C2, trong đó: vùng C1 là vùng hằng định 1, quy định tổng hợp

các bộ ba axit amin từ số 1 đến 176; vùng V là vùng biến đổi, quy định tổng

hợp các bộ ba axit amin từ 177 đến 491; vùng C2 là vùng hằng định 2, quy

định tổng hợp các bộ ba axit amin từ 492 đến 585 ( hình 1.5). Còn theo Sean

và cộng sự, (1999) [129], sự thay đổi trật tự một số bộ ba axit amin trên cấu

trúc protein kháng nguyên H7 chính là cơ sở tạo nên các subtyp của kháng

nguyên này (bảng 1.4).

Hình 1.5 Sơ đồ gen tổng hợp kháng nguyên H7

Bảng 1.4 Trật tự các bộ ba các axit amin và gen fliC của các subtyp

(Chú thích: KN: kháng nguyên)

kháng nguyên H7 ở vi khuẩn E.coli O157: H7

1.5.3 Kháng nguyên giáp mô (K)

E.coli là một trong số các loài vi khuẩn và nấm men có khả năng sản

sinh giáp mô. Trừ 2 chủng E.coli K88 (F4) và E.coli K99 (F5), giáp mô có

bản chất cấu tạo là protein (Isaacson, 1977) [51], giáp mô của các chủng vi

khuẩn E.coli khác đều có cấu tạo bởi các loại đường đa, nằm bên ngoài thành

tế bào, được hình thành trong quá trình sinh trưởng. Quá trình hình thành giáp

mô có liên quan chặt chẽ đến thành phần dinh dưỡng trong môi trường sống,

nếu môi trường nghèo chất dinh dưỡng thì vi khuẩn không sinh hoặc sản sinh

lớp giáp mô mỏng, còn nếu môi trường sống có hàm lượng đường cao thì lớp

giáp mô sinh ra dày.

Về vai trò, giáp mô đóng vai trò bảo vệ vi khuẩn chống lại điều kiện

khô, nóng, các yếu tố thực bào, giúp cho vi khuẩn bám dính lên các bề mặt tự

nhiên, tạo điều kiện tiên quyết cho vi khuẩn xâm nhập vào trong cơ thể hoặc

tổ chức. Bên cạnh đó, giáp mô còn là nguồn dự trữ chất dinh dưỡng của vi

khuẩn. Trên một số loài vi khuẩn, giáp mô còn có khả năng sản sinh độc tố

(Yoshida và cộng sự, 2000) [146].

Năm 1945, Kauffmann và cộng sự [59] đã tách được kháng nguyên

giáp mô và đặt tên là kháng nguyên K (viết tắt của từ giáp mô trong tiếng Đức

là Kapsel). Các tác giả này cũng đã phát hiện được 3 kiểu kháng nguyên K và

ký hiệu là L, A, và B. Các kiểu kháng nguyên này được phân biệt nhờ phản

ứng ngưng kết huyết thanh đặc hiệu. Tuy nhiên, bằng phương pháp này,

người ta cũng rất khó phân biệt kiểu kháng nguyên L và B của vi khuẩn

E.coli, vì vậy, trong một số trường hợp, trên cùng 1 chủng vi khuẩn, người ta

có thể xếp chúng vào typ L hoặc B tùy thuộc vào điều kiện nhiệt độ tăng sinh

vi khuẩn. Do kháng nguyên này là một loại kháng nguyên kém ổn định vì vậy

nó có khả năng thay đổi đặc tính ngưng kết dưới tác dụng của nhiệt độ

(Orskov và cộng sự, 1961) [93].

Như đã đề cập ở trên, kháng nguyên K thường được xác định bằng

phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính. Tuy nhiên, do bản chất của kháng

nguyên giáp mô cũng là polysaccharide, giống với bản chất kháng nguyên O

của vi khuẩn, vì vậy, hai loại kháng nguyên này thường được phân biệt bằng

hai loại huyết thanh ngưng kết là O và OK, nếu một chủng vi khuẩn E.coli

nào đó không có phản ứng ngưng kết với huyết thanh O mà có phản ứng

ngưng kết với kháng nguyên OK thì chủng vi khuẩn đó có kháng nguyên K

(Ida và cộng sự, 1977) [50]. Tuy nhiên, phương pháp ngưng kết huyết thanh

trên phiến kính chỉ có giá trị đúng với các chủng vi khuẩn mang kháng

nguyên K bền nhiệt, với các trường hợp khác, phải sử dụng các phương pháp

khuyếch tán trong thạch (Ouchterlony, 1958) [98] hoặc điện di (Scheidegger,

1955) [125].

Sự đa dạng các chủng E.coli trong tự nhiên dẫn đến khả năng tạo phản

ứng ngưng kết chéo giữa kháng nguyên K với huyết thanh OK của các chủng

vi khuẩn khác nhau là rất phổ biến. Theo nghiên cứu của Orskov và cộng sự,

(1984), [97] các cặp chủng vi khuẩn E.coli mang kháng nguyên K có khả

năng tạo phản ứng ngưng kết chéo là: K18-K22-K100, K13-K20-K23, K53-

K93, K54-K96, K16-K97, K37-K97, K12-K82, K2ab-K2ac, K62, K7-K56.

Một số chủng cũng có đặc điểm này là K2ab, ac-K62, K7-K56, K12-K82.

Bên cạnh đó, do bản chất hoá học của kháng nguyên K là tương tự với kháng

nguyên O vì vậy trong một số trường hợp, có khả năng gây phản ứng chéo

giữa hai loại kháng nguyên này. Theo báo cáo của Orskov và cộng sự, (1961)

[93], kháng nguyên O của chủng E.coli K88:H19 có khả năng ngưng kết với

huyết thanh K87 của chủng E.coli O8:K87. Cũng theo tác giả này, chủng E.coli O8:K87 khi nuôi cấy ở điều kiện 370C có khả năng ngưng kết với huyết

thanh O8 nhưng không ngưng kết với huyết thanh K87, tuy nhiên, trong thí nghiệm với vi khuẩn nuôi cấy ở 180C thì lại cho kết quả ngược lại. Điều này

một lần nữa chứng tỏ tính không ổn định của kháng nguyên K, vì vậy chẩn

đoán sự có mặt của vi khuẩn dựa vào thành phần kháng nguyên này là không

hợp lý.

Ta biết rằng, hầu hết kháng nguyên K của vi khuẩn E.coli đều có bản

chất polysaccharide trừ hai chủng K88 (F4) và K99 (F5) là có kháng nguyên

K có bản chất protein (Rantz, 1962) [109]. Theo Stirm và cộng sự, (1967)

[134], hai chủng vi khuẩn E.coli mang kháng nguyên này đều gây bệnh

đường tiêu hoá cho gia súc, trong đó: K88 (F4) gây bệnh chủ yếu trên lợn,

K99 (F5) gây chủ yếu bệnh trên trâu bò, cừu. Mặc dù, K88 (F4) và K99 (F5)

đều thuộc nhóm kháng nguyên L, có khả năng gây ngưng kết hồng cầu chuột

lang hoặc hồng cầu ngựa nhưng không gây phản ứng ngưng kết chéo với

nhau và với bất kỳ chủng E.coli mang kháng nguyên K nào khác. Theo

Orskov và cộng sự, (1984) [97], chủng E.coli O157:H7 mang kháng nguyên

K88 (F4) có khả năng gây bệnh cho bò, cừu và con người.

Về cấu tạo, thành phần của kháng nguyên K có thể thay đổi phụ thuộc

vào các chủng vi khuẩn. Theo Orskov và cộng sự, 1984 [97], dựa vào bản

chất hoá học, người ta có thể chia kháng nguyên K làm 3 nhóm, bao gồm: i)

nhóm có mặt trên các chủng vi khuẩn mang kháng nguyên O8, O9, O101,

O20; ii) nhóm có mặt trên các chủng E.coli khác O8, O9, O101, O20; và iii)

nhóm có bản chất protein (K88 và K99).

Kháng nguyên K có mặt ở các chủng vi khuẩn E.coli mang kháng

nguyên O8, O9, O101, O20 gồm có hai kiểu: i) có và ii) không liên kết với

các đường amin (phụ lục bảng 6). Với các kiểu kháng nguyên K thứ nhất, nếu loại trừ các đường amin thì kháng nguyên có trọng lượng phân tử là 3x105-106

Os và cấu tạo tương tự kháng nguyên O: gồm một chuỗi polysaccharide dài

gắn với nhân lipid A, cấu trúc của chuỗi polysaccharide cũng tạo nên tính đặc

hiệu của từng kháng nguyên (phụ lục bảng 7). Như vậy, ở các chủng vi khuẩn

có chứa kháng nguyên K, thành tế bào gồm hai lớp lipopolysaccharide, một

lớp cấu tạo nên kháng nguyên O, lớp còn lại cấu tạo nên kháng nguyên K

(Orskov và cộng sự, 1984) [97].

Với các chủng vi khuẩn khác ngoài các chủng O8, O9, O20 và O101,

kháng nguyên K của chúng chứa các polysaccharide tính acid và có trọng

lượng phân tử thấp. Trong thành phần cấu tạo kháng nguyên K của các chủng

này có chứa các thành phần không thường thấy ở các loài vi khuẩn có

polysaccharide khác như N acetylneuraminic acid, N-acetyl mannosa -

minuronic acid ( phụ lục bảng 8).

Ở mức độ phân tử, theo Orskov và cộng sự, (1984) [97], gen tổng hợp

kháng nguyên K định vị gần gen his (hình 1.6), gen này tham gia tổng hợp 3

nhóm kháng nguyên L, B và A của các chủng K8, K9, K25, K57, K26, K27,

K30, K31, K42. Tuy nhiên, theo Orskov và cộng sự, (1974) [95], Orskov và

cộng sự, (1976) [96], quá trình tổng hợp kháng nguyên K lại phụ thuộc vào

gen kpsA (K: kháng nguyên K, ps: polysaccharide, A: đoạn gen đầu tiên có

liên quan đến quá trình tổng hợp kháng nguyên K). Các tác giả này đã xác

định được các kháng nguyên K được tổng hợp bởi gen kps A là K1, K4, K10

và K54. Tuy nhiên, có một số trường hợp như kháng nguyên K7, Smith và

cộng sự, (1971) [131] lại chứng minh được rằng quá trình tổng hợp kháng

nguyên K lại không lên quan đến cả gen kps A và gen định vị gần gen his.

Đặc biệt, với hai kháng nguyên K88 và K99, có bản chất protein thì quá trình

tổng hợp chúng lại do gen plasmide quy định (Orskov và cộng sự, 1966 [94].

Chú thích: Rf: gene tổng hợp LPS, bao gồm: rfa: tổng hợp nhân lipid A, rfb: tổng hợp các

tiểu phần kháng nguyên O, rfc: quy định quá trình kéo dài chuỗi các tiểu phần kháng

nguyên O, rfe: chưa xác định chức năng, kps: tổng hợp chuỗi polysaccharide của kháng

nguyên K, thr: tổng hợp threonine, pro: tổng hợp proline, lac: tổng hợp lactose, gal: tổng

hợp galactose, his: tổng hợp histidin, nal: tổng hợp naxilidic acid, srl: tổng hợp sorbitol,

str: tổng hợp streptomycin, ser: tổng hợp serin, met: tổng hợp methionin, xyl: tổng hợp

xylose, mtl: tổng hợp manitol, pyr: tổng hợp pyrimidin, ilv: tổng hợp isoleucine-valine,

rha: tổng hợp rhamnose.

Hình 1.6 Sơ đồ gen của chủng vi khuẩn E.coli K12

1.6 Kháng thể đơn dòng

Kháng thể là những phân tử globulin miễn dịch (Immunoglobulin- Ig),

là sản phẩm của quá trình đáp ứng miễn dịch và có khả năng liên kết đặc hiệu

với kháng nguyên kích thích sinh ra nó.

Trên bề mặt kháng nguyên có những đoạn phân tử nhỏ gọi là epitope.

Epitope quyết định tính đặc hiệu sinh kháng thể tương ứng của kháng nguyên

và là vị trí để lympho bào mẫn cảm hoặc kháng thể gắn vào kháng nguyên

một cách đặc hiệu. Một kháng nguyên có thể mang nhiều epitope khác nhau.

Kháng thể đơn dòng là các kháng thể giống hệt nhau và chỉ liên kết đặc

hiệu với một epitope trên bề mặt kháng nguyên. Tất cả các kháng thể đơn

dòng cùng một dòng thì giống hệt nhau và được sản xuất bởi cùng một dòng

tương bào (Vũ Triệu An, 2001) [1].

Kháng thể đơn dòng là một công cụ quan trọng trong ngành hóa sinh,

sinh học phân tử và y học. Kháng thể đơn dòng liên kết đặc hiệu với epitope

kháng nguyên phục vụ cho việc phát hiện và tinh chế kháng nguyên đó.

1.6.1 Lịch sử phát triển kháng thể đơn dòng

Đầu thế kỉ 20, Paul Ehrlich là người đầu tiên đưa ra ý tưởng tạo ra một

chất có khả năng nhận biết đặc hiệu một loại tác nhân gây bệnh. Đây là ý

tưởng đầu tiên về kháng thể đơn dòng và ứng dụng của nó. Tuy nhiên, gần

100 năm sau, năm 1976, phát minh về kháng thể đơn dòng đã chính thức công

nhận là của Georges Köhler, César Milstein và Niels Kaj Jerne. Ba nhà khoa

học này đã cùng nhau nhận giải Nobel về y học và sinh lý học vào năm 1984

cho khám phá này. Những điểm đáng chú ý của phát minh là việc tạo ra một

dòng tế bào lai giữa tế bào lách chuột được gây miễn dịch thực nghiệm với tế

bào u tuỷ chuột và chọn lọc được các tế bào lai vừa có khả năng sinh kháng

thể vừa có khả năng tăng sinh không ngừng để sản xuất kháng thể đơn dòng.

Kể từ n¨m 1976 đến nay, các nghiên cứu chế tạo và ứng dụng kháng thể đơn

dòng không ngừng được triển khai và hoàn thiện (phụ lục bảng 9). Năm 1988,

Greg Winter và cộng sự đã là những người tiên phong trong việc ứng dụng kĩ

thuật tạo kháng thể đơn dòng trong điều trị trên người. Trước đó kháng thể

đơn dòng thường được tạo ra nhờ các tế bào lai có nguồn gốc động vật và do

đó gây ra những phản ứng miễn dịch không mong muốn trong cơ thể bệnh

nhân. Nhóm tác giả này đã thành công trong việc nghiên cứu tạo các kháng

thể đơn dòng phù hợp với hệ miễn dịch của người hơn nhằm loại bỏ được

những phản ứng miễn dịch không mong muốn.

1.6.3 Các công nghệ sản xuất kháng thế đơn dòng

1.6.3.1 Phương pháp tạo dòng tế bào lai

Hơn ba mươi năm kể từ khi Georges Köhler, César Milstein công bố

tạo ra kháng thể đơn dòng bằng phương pháp lai tế bào u tuỷ chuột nhắt và tế

bào lách chuột được gây miễn dịch cho đến nay, nhìn chung kỹ thuật tạo

kháng thể đơn dòng bằng phương pháp này không thay đổi nhiều. Dòng tế

bào P3X63Ag8.653 vẫn là dòng tế bào u tuỷ chuột chuẩn để tạo tế bào lai

(Eugene, 2007) [38]. Về nguyên tắc chung, trước hết người ta sử dụng

polyethylene glycol để dung hợp màng tế bào lách chuột với tế bào u tủy

chuột cùng loài, sau đó lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho tế bào

dung hợp phát triển. Do tế bào u tuỷ chuột mất hoạt tính tổng hợp

hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl-transferase (HGPRT) là enzyme cần

thiết cho quá trình tổng hợp các purin theo con đường tái sử dụng các base

nitơ có sẵn (salvage pathway), vì vậy tế bào này chỉ tổng hợp purin theo con

đường mới (de novo synthesis) tạo ra các base nitơ từ các gốc đường và axit

amin. Dựa vào đặc tính này, sau quá trình lai tế bào lách chuột và u tủy chuột,

tế bào lai được nuôi trong môi trường có chứa aminopterin là chất ức chế hoạt

động của enzyme hydrofolate reductase (HFR), làm cho tế bào u tủy chuột

mất cả hai cách tổng hợp base nitơ và chết, còn các tế bào u tủy chuột đã lai

với tế bào lympho B thì vẫn tiếp tục phát triển do tế bào lai này có khả năng

tổng hợp HGPRT. Đồng thời, trong môi trường nuôi cấy nhân tạo, các tế bào

lách chuột cũng không phát triển được do vòng đời của chúng rất ngắn. Các

tế bào lai được tăng sinh, pha loãng và tách dòng sẽ tiết ra các dòng kháng thể

đơn dòng khác nhau. Bằng các phương pháp miễn dịch học như ELISA hoặc

Western blot người ta xác định được các kháng thể đơn dòng đặc hiệu nhất.

Kháng thể đơn dòng có thể thu trực tiếp từ các đĩa nuôi cấy tế bào lai hoặc

tiêm tế bào này vào phúc mạc chuột nhắt để tạo ổ báng và thu dịch báng để

tách bằng phương pháp sắc ký.

Quá trình sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp lai tế bào

gồm 5 bước cụ thể sau (Eugene, 2007) [38]:

+ Bước 1: Lựa chọn, gây miễn dịch cho chuột và tăng sinh tế bào u tuỷ:

chuột sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng là chuột nhắt trắng dòng

Balb/C 20-30 tuần tuổi. Chuột được gây miễn dịch bằng kháng nguyên có bổ sung dầu bổ trợ Freund’s theo liều 50-100µg protein hoặc 106-107 tế bào.

Thời gian gây miễn dịch thường là 6 đợt, mỗi đợt cách nhau khoảng 1-2 tuần.

Sau khi gây miễn dịch 4 tuần, máu chuột được lấy để tách huyết thanh, kiểm

tra hiệu giá kháng thể.

Đồng thời, tế bào u tuỷ ( dòng tế bào chuẩn là P3X63Ag8.653) được

tuần trong môi trường DMEM có bổ sung nuôi khoảng 2

hypoxanthin/thymidine, 8-azaguanine và 10% huyết thanh bào thai bê để đạt mật độ khoảng 106 tế bào/ml. Việc này nhằm đảm bảo độ nhạy cảm của tế

bào lai với môi trường nuôi chọn lọc có chứa hypoxanthine-aminopterin-

thymidine (HAT) sau này.

+ Bước 2: Lai tế bào: là quá trình dung hợp các tế bào lách chuột và tế

bào myeloma trong polyethylene glycol (PEG). Tế bào lách chuột được tách, rửa, đếm số để đạt mật độ 5x107 tế bào/1 ml môi trường DMEM rồi trộn với u

tuỷ chuột với cùng mật độ trên theo tỷ lệ 5 phần tế bào lách: 1 phần tế bào u

tuỷ. PEG được bổ sung vào hỗn hợp tế bào bằng cách nhỏ giọt và lắc nhẹ

nhàng trong thời gian khoảng 1-2 phút để dung hợp màng tế bào. Sau đó,

ngay lập tức bổ sung môi trường DMEM để ổn định tế bào lai, rồi lại ly tâm

để tách môi trường này và PEG thừa. Cuối cùng, bổ sung môi trường DMEM-

HAT và đưa tế bào lai vào các giếng nuôi. Sau khoảng 10-12 ngày nuôi tế

bào, kiểm tra khả năng sinh kháng thể của tế bào lai bằng phản ứng ELISA

với đối chứng dương là huyết thanh chuột gây miễn dịch đã thu lách, đối

chứng âm là huyết thanh chuột Babl/C không được gây miễn dịch và môi

trường nuôi cấy tế bào. Các giếng nuôi tế bào cho phản ứng ELISA dương

tính sẽ tiếp tục được sử dụng để thực hiện bước lựa chọn và tách dòng tế bào

lai.

+ Bước 3: Tách dòng tế bào lai bằng phương pháp pha loãng tới hạn,

mỗi dòng tế bào lai ban đầu phải được tách dòng 3 lần liên tiếp để đảm bảo

tách riêng được các tế bào và trong mỗi giếng nuôi cấy chỉ chứa một tế bào.

Sau quá trình nuôi cấy sẽ tạo ra trong mỗi giếng một dòng tế bào gồm nhiều

tế bào có cùng nguồn gốc. Đồng thời với các quá trình pha loãng, nuôi cấy,

tách dòng, cần phải kiểm tra, xác định dòng tế bào có khả năng sản sinh

kháng thể ổn định nhất để lựa chọn. Nhược điểm của phương pháp này là đôi

khi kháng thể do tế bào lai tiết ra môi trường nuôi cấy lại gây độc với chính

các tế bào lai và làm giảm khả năng tồn tại của chúng.

+ Bước 4: Định typ kháng thể và xác định hoạt tính cố định bổ thể.

+ Bước 5: Tách và tinh chế kháng thể. Người ta có thể tách kháng thể

bằng phương pháp tạo u báng trên chuột hoặc dịch nuôi tế bào lai. Với

phương pháp tách từ dịch tế bào lai, kháng thể có thể bị tạp bởi thành phần

môi trường như các yếu tố sinh trưởng, hormone. Còn với phương pháp tạo ổ

báng trên chuột, kháng thể có thể bị tạp bởi các kháng thể có sẵn trong chuột,

các enzyme như protease, nuclease hoặc virus. Trên thực tế, cả hai phương

pháp tách kháng thể này đều có thể bị tạp bởi các yếu tố cytokin khác do tế

bào lai tiết ra hoặc tạp nhiễm vi khuẩn và các loại độc tố của chúng.

Tuy nhiên, phương pháp tạo u báng trên chuột thường được sử dụng

hơn để thu hoạch kháng thể đơn dòng. Với phương pháp này, người ta sử

dụng chuột Balb/C được tiêm pristane trước 1 tuần để làm giảm khả năng xuất hiện tự miễn trên vật chủ. Sau khi được tiêm tế bào lai với mật độ 106 tế

bào/ml vào xoang bụng, chuột tiếp tục được nuôi khoảng 3-4 tuần cho tới khi

xuất hiện u báng thì tiến hành chọc hút, thu dịch báng rồi ly tâm để tách

kháng thể đơn dòng. Các tế bào thu được từ ổ báng có thể tiêm trở lại chuột

để thu hoạch các lần 2, 3.

Kháng thể đơn dòng thu được từ dịch báng được tinh chế bằng cột sắc

ký ái lực protein A hoặc G, sau khi lọc qua màng lọc kích thước 0,4µm. Tuy

nhiên, với phương pháp này, do pH dung dịch thẩm tách thấp nên thể đơn

dòng rất dễ bị tách khỏi liên kết với protein A/G gây thất thoát trong quá trình

tinh chế, bên cạnh đó, điều kiện pH thấp cũng làm cho các phân tử protein

A/G bị tách khỏi cột và tạp vào kháng thể. Hơn nữa, nồng độ muối cao trong

dung dịch có thể dẫn tới hiện tượng giảm độ mẫn cảm của kháng thể.

Ngoài ra, kháng thể đơn dòng cũng có thể được tách bởi phương pháp

kết tủa nhờ muối amon sulfate bão hòa dựa trên nguyên tắc: kháng thể bị kết

tủa ở nồng độ muối thấp, trong khi đó các phân tử protein khác lại bị kết tủa ở

nồng độ muối cao hơn.

1.6.3.2 Phương pháp tái tổ hợp gen

Mặc dù kĩ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng theo phương pháp lai tế

bào đã phát triển trong một thời gian dài nhưng kĩ thuật này còn nhiều điểm

hạn chế, cụ thể là đòi hỏi nhiều thời gian, chi phí, người kĩ thuật viên phải

thông thạo các kĩ thuật phức tạp bao gồm cả công nghệ tế bào và các kỹ thuật

miễn dịch, phải có các phương tiện kĩ thuật để nuôi cấy tế bào, và phải sử

dụng đến động vật. Ngoài ra, những phân tử kháng nguyên đôi khi lại gây độc

hoặc không có khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên những loài động vật

được sử dụng để sản xuất kháng thể. Thêm vào đó, khi ứng dụng liệu pháp

kháng thể đơn dòng để điều trị bệnh cho người, các kháng thể đơn dòng được

tạo ra từ tế bào lai có nguồn gốc từ động vật (chuột, thỏ) lại không đem lại

hiệu quả do thời gian tồn tại trong cơ thể người bệnh quá ngắn, hệ miễn dịch

của người sẽ coi chúng là các phần tử lạ và loại bỏ nhanh chóng (Lê Quang

Huấn, 2009) [4].

Vì những lý do đó, đã có rất nhiều nghiên cứu, thử nghiệm được tiến

hành để tìm ra các giải pháp nhằm loại bỏ những hạn chế trên của kĩ thuật sản

xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp lai tế bào. Ví dụ như tìm cách tạo

ADN tái tổ hợp bằng cách gắn đoạn gen mã hóa vùng liên kết đặc hiệu của

kháng thể chuột vào gen mã hóa kháng thể của người. Tùy thuộc vào phần

kháng thể của chuột là phần nào, có chức năng gì mà kháng thể đơn dòng

được tổng hợp từ ADN tái tổ hợp đó được gọi là kháng thể đơn dòng lai hoặc

kháng thể đơn dòng nhân hóa. Một phương pháp khác là ứng dụng kĩ thuật

gen, ghép gen mã hóa kháng thể của người vào bộ gen của chuột để sản xuất

kháng thể đơn dòng. Trong số những nghiên cứu đó, phương pháp lựa chọn

các gen trong thư viện gen dựa trên phenotyp (kiểu hình) của polypeptit và

biểu hiện gen mã hóa kháng thể đơn dòng trên vi khuẩn đã tạo ra bước đột

phá trong kĩ thuật sản xuất kháng thể (trích theo Lê Quang Huấn, 2009) [4].

Cơ sở của việc sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp tái tổ

hợp là dựa trên những thư viện khổng lồ chứa các gen mã hóa vùng VH và VL

của kháng thể. Các nguồn gen mã hóa kháng thể đơn dòng được thu từ các

nguồn tự nhiên như các tế bào lympho B hay tương bào của người hoặc động

vật gây nhiễm. Ngày nay, sự phong phú đa dạng của các thư viện gen kháng

thể đơn dòng càng được gia tăng nhờ sự phát triển của các kĩ thuật như tạo

đột biến, hay tái tổ hợp gen (Fazekas, 1980) [40].

Kỹ thuật phage display ngày càng được sử dụng phổ biến để lựa chọn

các kháng thể mong muốn từ thư viện. Đầu tiên, tế bào chủ E.coli sẽ được

biến đổi bằng cách biến nạp với một vector phagemid mang đoạn gen mã hóa

kháng thể từ thư viện. Tế bào chủ có chứa phagemid tái tổ hợp được lựa chọn

nhờ khả năng kháng kháng sinh do một gen nằm trên phagemid quy định. Để

biểu hiện phage đó, môi trường nuôi cấy cần có một phage trợ giúp, phage

này sẽ cung cấp các thành phần cần thiết cho sự hình thành phage. Trong quá

trình này, đoạn gen tái tổ hợp nằm trên phagemid sẽ được sao mã, dịch mã và

tổng hợp ra một protein tái tổ hợp gồm một đoạn dẫn (leader sequence) có

nguồn gốc từ vi khuẩn, một phần phân tử kháng thể mong muốn, và một

protein vỏ có nguồn gốc từ phage (Muyldermans, 1999) [86]. Đoạn protein

dẫn sẽ điều khiển protein tái tổ hợp hướng về vùng cận màng sinh chất và tại

đây protein tái tổ hợp sẽ lắp ghép vào phage thông qua phần vỏ protein và tạo

thành một phage hoàn chỉnh. Phage sau đó sẽ được giải phóng ra ngoài màng

tế bào và biểu hiện từ một đến ba đoạn mã hoá kháng thể mong muốn trên bề

mặt của chúng. Các phage này sau đó dễ dàng được phân lập và cất giữ để sử

dụng.

Khi đã có được một thư viện phage người ta tiến hành quá trình sàng

lọc, lựa chọn phage bằng cách ủ các mẫu phage với một kháng nguyên cố

định. Quá trình lựa chọn phage còn gọi là quá trình lựa chọn sinh học, được

thực hiện thông qua phản ứng miễn dịch trên pha rắn kiểu phản ứng ELISA.

Trong phản ứng này, kháng nguyên chuẩn sẽ được cố định trong các giếng

hoặc trên các hạt có từ tính hoặc được gắn biotin để có thể được giữ lại trong

quá trình sàng lọc. Ngoài ra quá trình lựa chọn cũng có thể được diễn ra trong

tế bào, trên màng tế bào hoặc lát cắt mô. Sau khi rửa trôi các phage không

liên kết được với kháng nguyên, các phage đã gắn với kháng nguyên được

tách ra và nhân lên nhờ quá trình tái bản trong một tế bào chủ mới. Quá trình

lựa chọn này được lặp lại từ một đến ba lần nhằm thu được một mẫu phage có

độ thuần nhất cao nhất gồm phần lớn các phage có khả năng sản xuất kháng

thể mong muốn, ít bị lẫn tạp (Burton, 1995) [24].

Sau bước chọn lọc, các gen mã hóa kháng thể được tách ra và gắn vào

một vector biểu hiện gen. Để tạo ra các mảnh kháng thể hòa tan đã được lựa

chọn, các phagemit không có khả năng tổng hợp vỏ protein của phage đã

được sử dụng trong tách dòng gen mã hóa kháng thể. Người ta tạo các

phagemid không có vỏ bằng cách loại bỏ gen mã hóa protein vỏ của phage.

Trong bước này các tế bào đã biến đổi (tế bào đóng vai trò là vector biểu hiện

gen) sẽ hình thành các khuẩn lạc riêng rẽ, mỗi khuẩn lạc xác định đó sẽ sản

xuất ra một dòng kháng thể. Một số khuẩn lạc sẽ được chuyển sang nuôi trong

các đĩa 48 hoặc 96 giếng, trong điều kiện thuận lợi để tạo thành kháng thể.

Bởi vì các kháng thể có chứa các liên kết disulfide cần thiết cho sự hình

thành cấu trúc không gian và sự liên kết của kháng thể với kháng nguyên, nên

quá trình cuộn gấp phân tử để hình thành cấu trúc không gian của kháng thể

cần phải diễn ra trong điều kiện môi trường oxy hóa. Vi khuẩn Gram âm như

E.coli rất thích hợp để làm vector biểu hiện tổng hợp kháng thể đơn dòng vì

cấu tạo của nó có một khoảng không gian nằm giữa màng sinh chất và thành

tế bào, được gọi là khoảng gian màng (periplasmic space), có điều kiện môi

trường oxy hóa thích hợp cho quá trình hình thành cấu trúc không gian của

kháng thể. Do đó mà người ta cũng gắn thêm một đoạn gen mã hóa đoạn dẫn

có nguồn gốc từ vi khuẩn để điều khiển chuỗi poplypeptide kháng thể đến

vùng periplasmic để tiến hành quá trình cuộn gấp.

Sau quá trình kích thích hình thành kháng thể trong vector biểu hiện

gen, các tế bào chủ sẽ được dung giải bằng cách bổ sung enzyme lysozyme.

Sau đó, kết quả biểu hiện có thể được kiểm tra bằng ELISA hoặc bằng

phương pháp phát hiện khả năng gắn đặc hiệu của kháng thể đơn dòng lên các

điểm thụ cảm trên bề mặt tế bào.

Như vậy, các mảnh kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên

được tạo ra nhờ phương pháp tái tổ hợp gen từ thư viện gen mã hoá. Các

mảnh kháng thể thường được sản xuất theo phương pháp này là Fv, dsFv,

scFv và Fab (hình 1.7). Trong đó, Fv chứa các vùng biến đổi của cả chuỗi nhẹ

(VL) và chuỗi nặng (VH) và là cấu trúc nhỏ nhất có khả năng gắn kết với

kháng nguyên. Tuy nhiên, liên kết giữa hai chuỗi này trong Fv là liên kết

yếu, vì vậy bằng công nghệ gen, người ta đã tạo ra một cầu nối disulfua giữa

hai chuỗi này hoặc để tạo thành đoạn dsFv, hoặc tạo ra cầu nối peptide để liên

kết hai chuỗi nhẹ (VL) và chuỗi nặng (VH) để tạo thành đoạn scFv. Thành

công của kĩ thuật tạo scFv đã mở đầu cho sự ra đời nhiều ABAF khác như

Fab, minibody (scFv- CH3), diabody ( dimer scFv), scFv- Fc,… Các dạng này

có thể có một vùng gắn kháng nguyên (monovalent binding) hoặc 2 vùng gắn

kháng nguyên (bivalent binding) (Muyldermans, 2001) [87]. Trong số các

ABAF, dạng gần với cấu trúc của phân tử kháng thể hoàn chỉnh nhất là dạng

scFv-Fc có hai vùng gắn kháng nguyên. Phần Fc trong scFv-Fc thường có

nguồn gốc từ người, do đó khi vào cơ thể scFv-Fc có đầy đủ khả năng như

một phân tử kháng thể hoàn chỉnh để gây các phản ứng miễn dịch cần đến

phần Fc (như ADCC, CDC, CDCC…) mà scFv không thể gây ra được. Các

kháng thể hai chức năng đã được nghiên cứu chế tạo trên nguyên lý kết hợp

hai đoạn scFv tạo thành dạng nhị phân thông qua cầu nối leucine zipper. Dạng

kháng thể đơn dòng này gọi là dạng kháng thể kép (diabody), nó bao gồm 2

đoạn scFv, với các cặp đôi giữa các vùng biến đổi trong hai chuỗi theo kiểu

VH1 và VL2, VH2 và VL1 (hình 1.7) (Casalvilla, 1999) [25].

Một loại kháng thể đơn dòng tái tổ hợp khác đó là Fab. Cấu trúc của

kháng thể này bao gồm một chuỗi nặng chứa vùng biến đổi và vùng hằng

định đầu tiên hoặc một chuỗi nhẹ chứa vùng biến đổi và vùng hằng định (hình

1.7). Đây là loại kháng thể luôn luôn chỉ có một vùng liên kết kháng nguyên

(Burioni, 1998) [23].

Hình 1.7 Các loại kháng thể đơn dòng tái tổ hợp

Kể từ khi bắt đầu được nghiên cứu thành công, kháng thể đơn dòng tái

tổ hợp thể hiện được 2 ưu điểm so với kháng thể đơn dòng chế tạo theo

phương pháp lai tế bào, đó là: i) thành công trong việc chuyển ADN mã hoá

tạo kháng thể vào tế bào E.coli đã chứng minh được tính hiệu quả của các

phương pháp di truyền học, và ii) khả năng ứng dụng của kháng thể tái tổ

hợp, có bản chất là các mảnh Fab hoặc scFv đem lại hiệu quả cao hơn so với

phân tử IgG nguyên vẹn do đã loại bỏ được phần Fc trong phân tử kháng thể.

Đây là vùng thường gây nên các liên kết không đặc hiệu với kháng nguyên.

Hơn nữa, trong lĩnh vực ứng dụng điều trị bệnh, các phân tử kháng thể tái tổ

hợp với kích thước nhỏ sẽ dễ dàng và nhanh chóng xâm nhập vào trong tế bào

đích vì vậy hiệu quả điều trị cũng tốt hơn. Tuy nhiên, so với phân tử IgG

nguyên vẹn thì ái lực liên kết với kháng nguyên của phân tử này thể hiện tính

ưu việt hơn do mỗi phân tử IgG có tới hai vùng liên kết kháng nguyên, thậm

chí 10 vùng liên kết kháng nguyên như đối với phân tử IgM (Muhammad,

2008) [84].

1.6.3.3 Ứng dụng của kháng thể đơn dòng trong xác định E.coli O157:H7

E.coli O157:H7 có hai loại kháng nguyên có ý nghĩa trong chẩn đoán là

kháng nguyên O157 và H7. Vì vậy, kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các

epitop của hai loại kháng nguyên này thường được sử dụng để xác định vi

khuẩn trong các hệ thống chẩn đoán huyết thanh. Các tác giả Perry và cộng sự

(1988) [104], Szabo và cộng sự (1990) [136] đã ứng dụng thành công kháng

thể đơn dòng đặc hiệu của kháng nguyên O157 để phát hiện E.coli O157:H7

và xác định được rằng, kháng thể này có khả năng nhận biết duy nhất E.coli

O157:H7. Bên cạnh đó, Young He và cộng sự, (1996) [145] khi nghiên cứu

hai kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên H7 trên tổng số 217 chủng

E.coli gồm có: 48 chủng O157:H7, 4 chủng E.coli O157:NM, 23 chủng E.coli

O157:non-H7, 22 chủng E.coli H7:non-O157, 120 chủng E.coli non-

O157:non-H7) và 17 serovar của vi khuẩn Salmonella, 29 chủng vi khuẩn

gram dương khác đã chứng minh rằng hai kháng thể đơn dòng này chỉ nhận

biết đặc hiệu kháng nguyên lông H7 của loài E.coli.

Theo hướng nhận biết kháng nguyên độc tố Stx1, Stx2 của E.coli

O157:H7, các tác giả Padhye và cộng sự, (1989) [102], Perera và cộng sự

(1988) [103], Strocknine và cộng sự (1985) [135] đã sản xuất thành công

kháng thể đơn dòng đặc hiệu với độc tố Stx1 và ứng dụng chúng để phát hiện

tiểu phần A của các loại độc tố này.

Trong thực tế, các hệ thống xác định E.coli O157:H7 sử dụng kháng

thể đơn dòng thường là các kit so màu miễn dịch, ELISA, ngưng kết huyết

thanh và Western blot. Bộ kit O157 Coli Uni-Strip của hãng Coris Bioconcep,

Đức là kit so màu, dùng để xác định vi khuẩn E.coli O157:H7 sau khi tăng

sinh 8 giờ trong môi trường TSB + Novobiocin dựa trên nguyên lý tạo phức

hợp kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên O157 và hạt nano vàng

gắn lên màng nitrocellulose của que nhúng. Khi nhúng que phản ứng vào

canh khuẩn, phản ứng dương tính sẽ tạo hai vạch màu đỏ đậm ở khu vực

màng nitrocellulose còn phản ứng dương tính chỉ tạo được một vạch này. Bên

cạnh đó, để phát hiện các độc tố Stx1 và Stx2, hãng Organon Teknika, Ireland

đã cung cấp bộ kit sandwich ELISA, hệ thống này xác định E.coli O157:H7

dựa trên nguyên tắc sử dụng 2 kháng thể: i) đa dòng để nhận biết các liên kết

với độc tố; ii) đơn dòng để nhận biết đặc hiệu Stx, bộ kit này cho độ đặc hiệu

100% với các chủng vi khuẩn thuộc nhóm EHEC.

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

- Vi khuẩn E.coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số chợ tại Hà Nội.

- Kháng thể đơn dòng đặc hiệu với E.coli O157:H7.

2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Động vật thí nghiệm

- Chuột Balb/c: được cung cấp bởi phòng thí nghiệm của công ty Charles

River, Canada và được nuôi tại phòng thí nghiệm Tế bào gốc, trường Đại

học Khoa học Tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh.

- Thỏ: được cung cấp bởi Công ty thuốc thú y Trung ương và được nuôi tại

phòng thí nghiệm của Viện Đại học Mở Hà Nội.

2.2.2 Hoá chất, vật liệu thí nghiệm

- Tế bào myeloma Sp/2.0-Ag14 (ATCC) (CLS - Cell Lines Service, Đức)

không sản sinh các chuỗi immunoglobin và mất khả năng tổng hợp

enzyme HGPRT (Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase).

- Các chủng vi khuẩn E.coli K88, K99, 987p, O157:H7 M8, O157:H7 M9,

O157:H7 M61, O157:H7 M128, Salmonella enteritidis, Salmonella

typhimurium, Vibrio cholera được phân lập và giữ giống tại phòng thí

nghiệm Vi sinh vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội.

- Chủng Escherichia coli DH5α (F – endA1 hsdR17 (rk-/mk-) supE44 thi λ

–recA1 gyrA96 ∆lacU169 (φ80 lacZ ∆M15) (Promega) dùng để dòng

hóa.

- Thang ADN và protein của Invitrogen, Mỹ (hình 2.1).

(1. Thang DNA chuẩn, 2: Thang protein chuẩn)

Hình 2.1 Kích thước các thang chuẩn

- Các loại môi trường nuôi cấy tế bào: HAT, HT, DMEM, huyết thanh thai

bê, kháng sinh, kháng nấm (phụ lục, phần III);

- Các loại hoá chất dung hợp tế bào, tách chiết kháng nguyên, tách chiết

IgG, chạy diện di gel SDS-PAGE, Western blot, ELISA, PCR (phụ lục,

phần III);

- Các loại môi trường nuôi cấy, phân lập, xác định vi khuẩn E.coli

O157:H7 (phụ lục, phần III);

- Các loại dầu bổ trợ tăng cường đáp ứng miễn dịch (phụ lục, phần III). 2.2.3 Trang thiết bị thí nghiệm

- Nuôi cấy vi khuẩn: tủ cấy vi sinh, tủ ấm, máy lắc;

- Nuôi cấy, quan sát tế bào: tủ ấm CO2, kính hiển vi soi ngược, kính hiển vi

thường;

- Miễn dịch, protein, gen: máy điện di, hộp Western blot, máy đọc đĩa

ELISA, máy nhân gen PCR, máy giải trình tự gen ABI PRISM 3110

Avant. 2.3 Nội dung

2.3.1 Xác định tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số địa

điểm tại Hà Nội

- Thu thập mẫu và phân lập, xác định vi khuẩn bằng phương pháp vi

sinh, hóa sinh và huyết thanh học.

- Giải trình tự gen 16s ARNr để giám định loài vi khuẩn.

2.3.2 Nghiên cứu xác định độc lực của các chủng E.coli O157:H7 phân

lập

- Xác định các gen mã hóa các độc tố điển hình của các chủng vi khuẩn

E.coli O157:H7 phân lập.

- Xác định khả năng gây bệnh của các chủng E.coli O157:H7 phân lập

trên môi trường tế bào VERO. 2.3.3 Nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu

2.3.3.1 Nghiên cứu chế tạo và lựa chọn kháng nguyên của vi khuẩn để

gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm

- Chế tạo kháng nguyên lông, kháng nguyên hoà tan của vi khuẩn

E.coli O157:H7.

- Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ của các kháng

nguyên chế tạo.

2.3.3.2 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của chuột Balb/c đối với kháng

nguyên lông của E.coli O157:H7

- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng kháng nguyên đến đáp ứng

miễn dịch của chuột Babl/C với kháng nguyên H7.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất bổ trợ đến đáp ứng miễn dịch của

chuột Babl/C với kháng nguyên H7.

2.3.3.3 Nghiên cứu các điều kiện dung hợp tế bào lách chuột với tế bào

u tuỷ chuột để tạo dòng tế bào sản sinh kháng thể đơn dòng đặc hiệu với

kháng nguyên H7

- Xác định điều kiện tách tế bào lách chuột mẫn cảm với kháng nguyên

H7.

- Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình dung hợp tế bào u tủy

chuột và tế bào lách chuột mẫn cảm với kháng nguyên H7.

2.3.3.4 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển của tế

bào lai và khả năng sản sinh kháng thể của chúng

Xác định ảnh hưởng của các yếu tố sinh trưởng như huyết thanh thai

bê, insulin, oxaloacetic, pyruvate, đại thực bào đến khả năng sinh trưởng của

tế bào lai và khả năng sản sinh kháng thể của chúng.

2.3.3.5 Tách dòng tế bào lai và đánh giá tính đặc hiệu của kháng thể đơn

dòng tạo ra

- Tách dòng tế bào bằng phương pháp pha loãng tới hạn, đồng thời

kiểm tra thu nhận các dòng tế bào có khả năng sản sinh kháng thể đặc hiệu

với kháng nguyên H7.

- Kiểm tra tính đặc hiệu của các kháng thể đơn dòng với vi khuẩn

E.coli O157:H7 và lựa chọn dòng có độ đặc hiệu cao, ổn định cho mục đích

chẩn đoán, xác định vi khuẩn.

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu thập mẫu (TCVN 4833-1-2002, ISO 3100-1-1991)

[6]

Mẫu thịt bò được thu thập vào buổi sáng, tại một số chợ thuộc huyện

Đông Anh, Ba Vì và hai quận nội thành Hà Nội là Hai Bà Trưng và Hoàng

Mai. Mỗi mẫu thịt có trọng lượng 100g, được chứa trong túi PE vô trùng, bảo

quản trong thùng đá lạnh rồi đưa ngay về phòng thí nghiệm Vi sinh vật, khoa

Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội để phân lập E.coli O157:H7.

2.4.2 Phân lập vi khuẩn E.coli O157:H7 (USDA, 2002) [140]

Sơ đồ phân lập E.coli O157:H7 được trình bày ở phụ lục, phần II, hình

- Cân 10g thịt bò vào túi dập mẫu, dập thịt thành huyễn dịch;

- Bổ sung môi trường Modified Trypticase Soy Broth (mTSB) có

novobiocin 20 mg/lít và acriflavin 10 mg/lít theo tỷ lệ 1/10 để tăng sinh vi khuẩn trong mẫu ở điều kiện 370C trong 18 giờ;

- Cấy chuyển canh khuẩn lên môi trường thạch SMAC, ủ ở điều kiện

370C trong 24 giờ;

- Tách các khuẩn lạc đặc trưng nghi là E.coli O157:H7, chúng có màu

nâu nhạt do không lên men đường sorbitol trên môi trường thạch SMAC (các

chủng E.coli khác có màu hồng cánh sen);

- Các khuẩn lạc nghi ngờ được ria cấy trên môi trường thạch dinh

dưỡng(Nutrient Agar) để làm các phản ứng sinh hoá và định type bằng kháng

huyết thanh.

2.4.3 Các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn E.coli O157:H7 (Samuel và

cộng sự, 1998) [122]

Kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E.coli O157:H7 được thực hiện

sau bước nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu SMAC. Các khuẩn lạc

có màu vàng nâu nhạt được cấy chuyển lên môi trường Nutrient Agar, sau 18 giờ nuôi cấy ở 420C, nhặt các khuẩn lạc đứng riêng rẽ để làm các phản ứng

sinh hóa sau:

- Phản ứng không lên men đường D-sorbitol được thực hiện trên môi

trường SMAC. Trên môi trường này, vi khuẩn E. coli O157:H7 có màu vàng

nâu nhạt trong khi các chủng vi khuẩn E.coli khác có màu hồng cánh sen.

- Các phản ứng lên men đường lactose, glucose, sinh H2S và sinh hơi

được thực hiên trên môi trường KIA. Trên môi trường này, vi khuẩn E.coli

O157:H7 gây hiện tượng lên men đường lactose tạo nên màu vàng ở phần

thạch nghiêng, lên men đường glucose tạo màu vàng ở phần thạch đứng. Vi

khuẩn này không sinh H2S nên không tạo màu đen trong ống thạch.

- Phản ứng sinh indol được thực hiện bằng thuốc thử Kovac. Vi khuẩn

E.coli O157:H7 được tăng sinh trong môi trường Tryptone Water Buffer ở 370C trong 20 giờ rồi bổ sung 1ml xylen vào ống canh khuẩn, lắc đều để chiết

tách indol lên lớp dung môi hữa cơ, sau đó nhỏ 1-2 giọt Kovac vào ống canh

khuẩn E.coli O157:H7. Vi khuẩn này sản sinh enzyme trytophanse vì vậy sẽ

phân hủy tryptophan có trong môi trường Tryptone Water Buffer để tạo thành

indol. Khi nhỏ thuốc thử Kovac vào canh khuẩn, indol sẽ kết hợp với p-

dimethylaminobenzaldehyde để tạo thành phức hợp có màu đỏ hồng trên bề

mặt ống nghiệm.

2.4.4 Giải trình tự gen 16s ARNr (Sambrook và cộng sự, 2001)[121]

2.4.4.1 Tách ADN từ tế bào vi khuẩn

2.4.4.2. Nhân bản gene 16s ARNr bằng phản ứng PCR

- Thành phần phản ứng (phụ lục bảng 10)

- Các bước phản ứng được tiến hành với chu trình nhiệt như sau:

Bước 1: 450C 30 phút Bước 2: 940C 1 phút Bước 3: 940C 50 giây Bước 4: 520C 1 phút Bước 5: 720C 1 phút

Bước 6: Lặp lại 35 chu kì từ bước 3 đến bước 5 Bước 7: 720C 8 phút Bước 8: 40C ∞

Sản phẩm phản ứng PCR sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose

0,8%.

2.4.4.3 Tinh sạch sản phẩm PCR gen 16s ARNr Sản phẩm thu được từ phản ứng PCR được tinh sạch bằng

phương pháp phenol:chloroform:isoamyl alcohol và thu nhận bằng phương

pháp tủa với ethanol tuyệt đối lạnh. Tủa được hòa trong 20 µl TE 1X.

2.4.4.4 Tạo dòng gene 16r ARNr

Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α Cấy chuyền các tế bào E. coli DH5α từ ống nghiệm giữ giống vào

ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LB. Nuôi cấy lắc qua đêm ở 37°C. Cấy

500 µl dịch nuôi cấy trên vào 50 ml môi trường LB, nuôi cấy lắc ở 37°C

trong 2 giờ đến khi đạt giá trị OD600 trong khoảng 0,3 - 0,6. Ly tâm thu

sinh khối tế bào (5000 vòng/phút - 5 phút - 4°C). Hòa sinh khối trong 25 ml

dung dịch CaCl2 100 mM lạnh. Ủ trên nước đá 30 phút. Ly tâm thu sinh

khối tế bào với vận tốc 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C. Huyền phù

nhẹ nhàng sinh khối tế bào trong 1 ml dung dịch CaCl2 100 mM. Cho toàn

bộ phản ứng nối vào 100 µl tế bào khả nạp. Ủ trên nước đá 30 phút. Gây

sốc nhiệt ở 42°C - 90 giây. Chuyển vào khay đá, ủ trong 2 phút. Bổ sung

900 µl môi trường LB và nuôi ủ hoạt hóa trong 1 giờ. Ly tâm thu sinh khối

(10000 vòng/phút - 1 phút). Cô đặc và trải dịch huyền phù vi khuẩn trên đĩa

LB đặc + kanamycin (30 µg/ml). Ủ ở 37°C qua đêm.

Tách chiết thu nhận plasmid pBT bằng phương pháp SDS-kiềm

Cấy chuyển các tế bào E.coli DH5α có mang plasmid pBT tái tổ hợp

từ ống nghiệm giữ giống vào ống nghiệm chứa 2 ml môi trường LB có bổ

sung kanamycin nồng độ 30µg/ml. Tiến hành nuôi cấy lắc qua đêm ở

nhiệt độ 37°C. Ly tâm thu sinh khối (13000 vòng/phút, 5 phút). Bổ sung

100 µl dung dịch I vào eppendorf chứa sinh khối vi khuẩn, vortex thật kỹ.

Bổ sung 200 µl dung dịch II, đảo nhanh eppendorf thật nhẹ nhàng. Ủ trên

nước đá 5 phút. Thêm 150 µl dung dịch III, đảo eppendorf thật kỹ cho đến

khi thấy tủa trắng xuất hiện. Ủ 5 phút trong đá. Ly tâm với vận tốc 13000

vòng/phút - 10 phút ở 4°C. Thu dịch nổi từ eppendorf trên vào một

eppendorf khác. Thu nhận ADN plasmid bằng phương pháp tủa với ethanol

tuyệt đối lạnh. Hòa tủa trong 20 µl TE 1X + 2 µl RNase 10 mg/ml, bảo

quản ở -20°C.

Tách dòng gen 16s ARNr

- Phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzym Bam HI: Thành phần phản

ứng cắt đoạn DNA bằng enzym ở phụ lục bảng 12.

- Trộn đều các thành phần phản ứng với nhau rồi đặt ống phản ứng vào bể ổn nhiệt ở 37oC trong 16 giờ rồi xác định trình tự gen bằng máy tự động

ABI PRISM 3110 Avant và các phần mềm ABI PRISM 3100 Data Collection

1.0, DNA Sequencing Analysis.

2.4.4.5 Phương pháp xác định trình tự nucleotide bằng máy tự động

Sau khi thu được plasmid tinh sạch có chứa sản phẩm PCR, chúng tôi

tiến hành xác định trình tự sản phẩm PCR dựa trên phương pháp của F.Sanger

và cộng sự. Đặc trưng của phương pháp này là ngoài những nucleotide thông

thường còn sử dụng thêm 4 loại dideoxynucleotide trong đó thay nhóm 3’-

OH bằng 3’- H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng

hình thành các cầu nối photphodieste với các nucleotide tiếp theo dẫn đến làm

ngừng quá trình tổng hợp ADN.

2.4.5 Phương pháp điện di ADN (Sambrook, 2001) [121]

Phương pháp này để phân tích định tính và xác định trọng lượng phân

từ của các đoạn ADN. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng gel agarose

nồng độ 0,8%. Quá trình điện di yêu cầu hiệu điện thế luôn giữ ổn định ở 120

V trong khoảng thời gian 25-30 phút. ADN di chuyển từ điện cực âm sang

điện cực dương. Quá trình điện di được ngừng lại khi chất chỉ thị màu dịch

chuyển được khoảng 2/3 chiều dài bản gel.

Bước 1. Tra mẫu ADN: Mẫu ADN có bổ sung màu Bromophenol Blue

với tỉ lệ 1:5 được tra vào các giếng nhỏ trong bản gel cùng với thang chỉ thị

ADN 1 kb.

Bước 2. Phát hiện các băng ADN: Bản gel được lấy nhẹ nhàng ra khỏi

khuôn và ngâm vào dung dịch ethidium bromide nồng độ 2µg/ml trong

khoảng thời gian 5 phút, lắc nhẹ. Bản gel sau đó được tráng qua nước cất và

được quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi chụp gel.

2.4.6 Phương pháp chế kháng nguyên (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [147]

2.4.6.1 Phương pháp chế kháng nguyên lông (H)

- Vi khuẩn được nuôi cấy lắc trong môi trường flagellum broth (2%

nước peptone , 1% cao thịt bò, 0,5% glucose) ở 37oC, trong trong 24 giờ.

- Ly tâm canh khuẩn với tốc độ 15.000 vòng/phút ở 4oC trong 1 giờ, bỏ

dịch nổi, sau đó tiếp tục ly tâm, rửa cặn 3 lần bằng dung dịch PBS và thu cặn

vi khuẩn.

- Tách lông của vi khuẩn bằng máy đồng nhất mẫu, sau đó ly tâm thu

dịch nổi.

- Bổ sung acetone theo tỷ lệ 1:1, lắc đều bằng máy lắc, giữ dịch tách cố định trong 20 phút rồi ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút ở 40C trong 30 phút rồi

thu cặn. Tiếp tục bổ sung PBS, lắc tan cặn rồi ly tâm với điều kiện lặp lại như

trên 2 lần.

- Kháng nguyên thu hoạch, được đo nồng độ protein và giữu ở nhiệt độ

-200C

2.4.6.2 Phương pháp chế kháng nguyên hòa tan

- Vi khuẩn E.coli O157:H7 được tăng sinh trong môi trường BHI ở

điều kiện 370C trong 20 giờ.

- Thu vi khuẩn, cặn vi khuẩn được rửa, ly tâm với bằng dung dịch PBS

3 lần và pha loãng để đạt mật độ 2x108 tế bào/ml.

- Vi khuẩn được bất hoạt ở nhiệt độ 600C trong 1 giờ và phá vỡ tế bào

bằng máy siêu âm siêu tốc trong thời gian 10 giây.

- Đo nồng độ protein và giữ ở nhiệt độ -200C.

2.4.7 Phương pháp gây miễn dịch (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [147]

2.4.7.1 Phương pháp gây miễn dịch trên thỏ

- Chuẩn bị chất gây miễn dịch (immunogen) như sau: 1,2 ml kháng nguyên (vi khuẩn có mật độ 2x108 tế bào/ml) hoặc kháng nguyên H7 được bổ

sung 1,2 ml dầu bổ trợ FCA (Freund's Complete Adjuvant) để đạt nồng độ

500-1000µg/ml.

- Miễn dịch cơ sở: mỗi thỏ tiêm 0,5ml chất gây miễn dịch, chia làm 2

mũi, tiêm dưới da ở hai vị trí hai bên bẹn.

- Tối miễn dịch: thực hiện sau khi gây miễn dịch cơ sở 4, 6 tuần với

cùng lượng kháng nguyên như trên nhưng thay FCA bằng FIA (Freund's

Incomplete Adjuvant) .

- Hàng tuần lấy máu thỏ để kiểm tra biến động hiệu giá kháng thể.

2.4.6.2 Phương pháp gây miễn dịch trên chuột

- Chuẩn bị chất gây miễn dịch (immunogen) như sau: 1,2 ml kháng nguyên (vi khuẩn có mật độ 2x108 tế bào/ml) hoặc kháng nguyên H7 được bổ

sung 1,2 ml FCA để đạt nồng độ 500-1000µg/ml.

- Gây miễn dịch lần cơ sở (MDCS) liều 0,5ml/con chuột

- Gây miễn dịch thứ cấp: lÇn 1: 14 ngµy sau MDCS, tiªm 0,5ml kháng

nguyên/chuét, 24 ngµy sau MDCS, lÊy m¸u kiÓm tra hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ

(HGKT); lÇn 2: 35 ngµy sau MDCS lÆp l¹i quy tr×nh trªn, 45 ngµy sau MDCS

lÊy m¸u kiÓm tra HGKT; lÇn 3: pha kháng nguyên nång ®é 5-50µg/0,5ml

PBS, 65 ngµy sau MDCS giÕt chuét, thu l¸ch và huyết thanh.

2.4.7 Ph−¬ng ph¸p ®iÖn di protein (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [147]

Nguyên tắc:

Điện di là qua trình dịch chuyển của các phân tử protein tích điện trong

một dung dịch đặt trong điện trường. Các phân tử protein mang điện tích âm

sẽ dịch chuyển về phía cực dương của điện trường. Tốc độ dịch chuyển của

các phân tử mang điện phụ thuộc hình dạng và kích thước của phân tử

protein, phân tử có kích thước và khối lượng phân tử lớn sẽ chạy chậm hơn

những phân tử nhỏ.

Kĩ thuật SDS – PAGE được dùng trong nghiên cứu enzyme, để xác định

phân tử lượng protein, hàm lượng, độ tinh sạch của protein.

Tiến hành:

- Bước 1. Chuẩn bị gel SDS-PAGE: thành phẩn bản gel trong phụ lục

bảng 13. Bản gel gồm có gel phân cắt và gel phân tách protein được đổ khuôn

và tạo các giếng chứa protein

- Bước 3. Nhỏ mẫu: kháng nguyên được pha loãng ở các nồng độ nồng

độ khác nhau và nhuộm bằng thuốc nhuộm có chứa commasie blue và β- mercapthoethanol rồi biến tính protein ở 950C/5 phút. Nhỏ 15-20 µl mẫu vào

mỗi giếng, và 10µl marker chuẩn trên một giếng.

- Bước 4. Điện di: quá trình điện di thực hiện ở hiệu điện thế 120 V đến

khi màu thuốc nhuộm chạy đến chân bản gel tách.

- Bước 5. Nhuộm gel: bản gel được nhuộm bằng dung dịch Coomassie

blue R–250 0,1% ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và có lắc.

- Tẩy màu bằng dung dịch tẩy trên máy lắc, thay dung dịch tẩy khoảng 2

– 3 lần đến khi thấy các vạch điện di xuất hiện.

2.4.8 Phản ứng ELISA gián tiếp (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [147]

- Nguyên liệu

+ Đĩa ELISA: đĩa bằng chất liệu nhựa polypropylene có 96 giếng, có khả

năng hấp thụ kháng nguyên tốt.

+ Kháng nguyên chuẩn, huyết thanh thỏ, conjugate (chất gắn kết) có gắn

enzmyme peroxydase, bubtrate (chất tạo màu phản ứng, thường là TMBZ

(3,3’,5,5’ Tetramethybenzodine)), PBS, PBS-Tween, Sữa tách bơ (casein).

+ Máy đọc phản ứng

+ Các dụng cụ thí nghiệm

- Trình tự phản ứng:

Bước 1. Phủ kháng nguyên 100µl kháng nguyên pha loãng ở nồng độ

thích hợp được gắn trực tiếp vào đĩa ELISA. Thời gian ủ kháng nguyên thường là qua đêm ở nhiệt độ 4oC hoặc 37oC trong 2h. Đổ bỏ dung dịch có

trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có

chứa Tween 20 0,05% rửa đĩa 3 lần, và làm khô.

Bước 2. Phủ đĩa bằng 200µl dung dịch sữa tách bơ 5% mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ hoặc lắc ở 37oC sau 1 giờ. Đổ bỏ dung dịch có

trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có

chứa Tween 20 0,05% rửa đĩa 3 lần, và làm khô.

Bước 3. Gắn kháng thể: 100µl huyết thanh pha loãng ở nồng độ thích hợp bằng dung dịch PBS – sữa tách bơ 5%. Kháng thể ủ trong đĩa ở nhiệt độ 37o

C, lắc sau 30 phút. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung

dịch PBS có chứa Tween 20 0,05% rửa đĩa 3 lần, và làm khô.

Bước 4. Kháng thể đặc hiệu loài: 100µl conjugate pha loãng bằng PBS với độ pha loãng là 10.000 lần, nhỏ mỗi giếng và ủ ở 37oC trong 30 phút. Đổ

bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS chứa Tween 20

0,05% rửa đĩa 5 lần, và làm khô.

Bước 4. Cơ chất tạo màu: 100µl TMB vào mỗi giếng, để nhiệt độ phòng

15 phút, phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh lục nếu là dương tính. Dừng

phản ứng bằng dung dịch H2SO4 1M, lúc này phản ứng có màu vàng.

Bước 5. Đọc đĩa trên máy đọc đĩa ELISA ở bước sóng 450 nm.

2.4.9 Phản ứng Western blot (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [147]

Là phản ứng kết hợp kháng nguyên- kháng thể trên màng nitrocellulose.

Kháng nguyên sau khi được điện di trên gel SDS-PAGE sẽ được gắn lên

màng nitrocellulose dưới tác dụng của dòng điện.

Tiến hành phản ứng:

Bước 1. Điện di kháng nguyên ( thực hiện như mục 2.4.9)

Bước 2. Gắn kháng nguyên lên màng nitrocellulose trong buồn điện phân với dòng điện 100V/ qua đêm ở 40C. Lấy màng nitrocellulose, cắt thành các

bản nhỏ có kích thước bằng giếng gel SDS-PAGE.

Bước 3. Phủ màng bằng cách ngâm trong dung dịch PBS sữa tách bơ

6% trong 2h ở nhiệt độ phòng. Bật máy lắc trong khi ngâm. Rửa với PBS-

Tween 0,05% 3 lần, mỗi lần 5 phút.

Bước 4. Lai kháng thể: ngâm màng trong dung dịch kháng thể 1:200

(trong dung dịch PBS). Thời gian ngâm là 2h trong nhiệt độ phòng trên máy

lắc. Lấy màng ra khỏi dung dịch kháng thể. Rửa màng bằng dung dịch PBS

Tween 0,05% 3 lần, mỗi lần 5 phút.

Bước 5. Phủ kháng thể 2: ủ màng với conjugate (kháng thể đặc hiệu loài

có gắn enzyme peroxidase), độ pha loãng là 1/5000 trong dung dịch PBS.

Thời gian ủ khoảng 1 giờ. Rửa màng bằng PBS-Tween 0,05% 3 lần, mỗi lần

5 phút.

Bước 6. Thấm khô màng rồi nhỏ cơ chất sinh màu. Thời gian hiện màu

trong 15 phút. 2.4.10 Phương pháp tạo kháng thể đơn dòng (Yoshihito Kihiwaraki, 2002)

[147]

2.4.10.1 Phương pháp dung hợp tế bào

Bước 1. Thu lách chuột, rửa bằng DMEM 3 lần.

Bước 2. Tách rời các tế bào lách, thu vào ống ly tâm 15ml.

Bước 3. Ly tâm tế bào 1.000 vòng/10’ ở nhiệt độ phòng.

Bước 4. Thu cặn tế bào và bổ sung NH4Cl+ 10ml DMEM

Bước 5. Ly tâm tế bào 1000 vòng/10’ ở nhiệt độ phòng.

Bước 6. Thu cặn tế bào rồi bổ sung 10ml DMEM có 10% huyết thanh bào

thai bê (FCS). Đếm số tế bào để đạt 108 tế bào/10ml.

Bước 7. Trộn tế bào lách chuột với tế bào u tuỷ chuột theo tỷ lệ 10:1 trong

ống ly tâm 50ml.

Bước 8. Ly tâm hỗn hợp tế bào ở 1.000 vòng/10’ ở nhiệt độ phòng.

Bước 9. Thu cặn tế bào và bổ sung 10ml DMEM.

Bước 10. Ly tâm tế bào 1.000 vòng/10’ ở nhiệt độ phòng.

Bước 11. Thu cặn tế bào, bổ sung polyethylene glycol 1450 (Sigma)- PEG

1450 50%, nhẹ nhàng khuấy. Tiếp tục bổ sung 15ml DMEM. Ủ 10 phút ở

nhiệt độ phòng.

Bước 12. Ly tâm tế bào 1000 vòng/10’ ở nhiệt độ phòng.

Bước 13. Thu cặn tế bào, bổ sung 45ml DMEM-OPI-HAT (môi trường

chứa DMEM, các yếu tố kích thích sinh trưởng tế bào, huyết thanh bào thai

bê, hypoxanthin, aminopretin, thymin), khuấy đều, chia vào các giếng của đĩa

96 giếng, mỗi giếng 100µl. Ủ trong tủ ấm CO2. Sau 20 giờ lại bổ sung

100µl/giếng và lại ủ tiếp. Sau 6 ngày bắt đầu kiểm tra các đĩa nuôi cấy tế bào,

sau 10 ngày kiểm tra, các đĩa có tế bào phát triển ở diện tích 1/20 bề mặt

giếng trở lên là đạt.

2.4.10.2 Phương pháp chọn lựa các dòng tế bào lai sản sinh kháng thể đơn

dòng

Bước 1. Đếm tế bào lai (TBL) bằng buồng đếm hồng cầu.

Bước 2. Pha loãng TBL trong DMEM-OPI-HT (môi trường chứa

DMEM, các yếu tố kích thích sinh trưởng tế bào, huyết thanh bào thai bê,

hypoxanthin, thymin) để đạt mật độ 10TBL/ml, 5TBL/ml, 2,5BL/ml, mỗi

nồng độ pha 10ml.

Bước 3. Nuôi TBL ở các nồng độ pha loãng trên vào các đĩa 96 giếng,

mỗi giếng 100µl. Sau 24 giờ, bổ sung thêm OPI-HT.

Bước 4. Sau 7-10 ngày, quan sát sự mọc của tế bào. Chỉ giữ lại các giếng

có 1 khuẩn lạc, các giếng có từ 2 khuẩn lạc trở lên bị loại.

Bước 5. Sau 10 ngày nuôi cấy, thu dịch nuôi tế bào và kiểm tra kháng thể

đặc hiệu. 2.4.11 Phản ứng PCR-multiplex

Thành phần phản ứng

Thể tích cho mỗi ống phản ứng 25µl 5µl Vừa đủ 50 µl

- PCR Master Mix - 10x primer mix, - Nước không chứa RNAse - Mẫu ADN - MgCl2

50 µl

Hàm lượng cuối cùng 1x 0,2 µm/loại primer ≤1 µg DNA/50 µl 3 mM

Tổng thể tích - Chu trình nhiệt

Bước phản ứng

Bước 1: Bước 2: Tháo xoắn Bước 3: Bắt cặp Bước 4: Kéo dài chuỗi Số chu kỳ Bước 5

Thời gian 15 phút 30 giây 90 giây 90 giây 30–45 10 phút

Nhiệt độ 95°C 94°C 57–63°C 72°C 72°C

- Thành phần phản ứng

- Sản phẩm phản ứng được phát hiện bằng phương pháp nhuộm

ethidium bromide rồi điện dị trên gel agarose 0,8%.

2.4.12 Phương pháp xử lý số liệu

- Sử dụng phần mềm EXCEL và các hàm xử lý thống kê.

- Sử dụng phần mềm tối ưu hóa các điều kiện thí nghiệm Design Expert

7.1.6 (Stat Ease.Inc, Mỹ).

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xác định tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số địa

điểm tại Hà Nội

3.1.1 Phân lập, xác định tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 trong thịt bò bán ở

một số địa điểm tại Hà Nội

Theo quy trình xác định vi khuẩn E.coli O157:H7 trong thực phẩm của

USDA, 2002 [140], mẫu thực phẩm được tăng sinh trong môi trường lỏng

TSB có chứa kháng sinh novobiocin và cefixime sau đó cấy chuyển sang môi

trường thạch SMAC (Sorbitol Mac Conkey). Trên môi trường này, khuẩn lạc

nghi là E.coli O157:H7 có màu nâu nhạt, trong khi đó các typ E.coli khác có

màu đỏ cánh sen. Các khuẩn lạc nghi ngờ E.coli O157:H7 được tách ra, ria

cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng (Nutrien Agar) để thử các phản ứng

sinh hóa như khả năng lên men đường lactose, glucose, và khả năng sinh

indol, H2S và định typ bằng kháng huyết thanh H7 và O157.

Trong nghiên cứu này, 143 mẫu thịt bò thu thập tại Ba Vì, Đông Anh

và nội thành Hà Nội được thu thập để nuôi cấy, phân lập E.coli O157:H7

bằng một số đặc tính sinh hóa đặc trưng và định typ kháng khuyết thanh. Kết

quả thu được trình bày trên bảng 3.1.

Các hình ảnh trên hình 3.1 thể hiện vi khuẩn E.coli O157:H7 phân lập

được từ các mẫu thịt bò có các đặc điểm sinh hóa hoàn toàn tương đồng với

nghiên cứu của Samuel và cộng sự, 1998 [122]: cụ thể là trên môi trường

SMAC, vi khuẩn không lên men đường sorbitol nên tạo thành các khuẩn lạc

màu nâu nhạt (hình 3.1a). Trên môi trường sinh hóa KIA, vi khuẩn lên men

các đường glucose và lactose, không sinh H2S (hình 3.1c), có khả năng sinh

indol, khi thử bằng dung dịch Kovac (hình 3.1d). Kết hợp với khả năng ngưng

kết với kháng huyết thanh O157 và H7 trên KIT ngưng kết latex của Remel

(hình 3.1e), chúng tôi đã xác định được 4/143 mẫu thịt bò bị nhiễm vi khuẩn

E.coli O157:H7, các chủng vi khuẩn này có ký hiệu là M8, M9, M61, M128.

Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm

tại Hà Nội

5.0

Đợt I

Huyện Đông

Đợt II

Anh

9.1

Đợt III

Đợt I

Huyện Ba

7.7

Đợt II

Vì

Đợt III

Đợt I

Quận Hai

Đợt II

Bà Trưng

Đợt III

Đợt I

Đợt II

Quận Hoàng

Mai

14.3

Đợt III

Đợt IV

Số lượng Số mẫu Tỷ lệ nhiễm TT Địa điểm/ đợt lấy mẫu mẫu dương tính (%)

4 2,8

143 Tổng số

Hình 3.1 Các hình ảnh hình thái, sinh hóa và định typ bằng kháng huyết

(a: khuẩn lạc E.coli O157:H7 trên môi trường SMAC; b) hình thái vi khuẩn E.coli

O157:H7 (x1600); c) E.coli O157:H7 trên môi trường KIA (glucose, lactose: dương tính;

H2S âm tính); d) E.coli O157:H7 trong dung dịch thuốc thử Kovac (indol: dương tính) ; e)

phản ứng ngưng kết của vi khuẩn E.coli O157:H7 với kháng huyết thanh H7)

thanh của E.coli O157:H7

3.1.2 Giải trình tự gen 16s ARNr của vi khuẩn E.coli O157:H7

E.coli O15:H7 là một trong số những chủng vi khuẩn nguy hiểm gây

ngộ độc thực phẩm ở nhiều nơi trên thế giới. Người ta xác định được rằng loại

thực phẩm chủ yếu tạp nhiễm E.coli O15:H7 là thịt bò và các sản phẩm chế

biến từ đó. Ở Việt Nam, theo số liệu báo cáo từ các nghiên cứu trước cho thấy

vi khuẩn này có trong phân bò (Norobu và cộng sự, 2005) [90], các tác giả

Phạm Công Hoạt và cộng sự, 2003 [3], Trần Thanh Phong và cộng sự, 2007

[5] đã phát hiện thấy các gen độc tố điển hình của E.coli O15:H7 trong thịt và

phân bò, lợn với tỷ lệ tương đối cao.

Như vậy, các nghiên cứu trước về vi khuẩn E.coli O15:H7 ở Việt Nam

đều dừng lại ở mức độ phát hiện các gen độc tố đặc trưng của vi khuẩn hoặc

xác định sự có mặt của vi khuẩn trong phân bò. Chính vì lý do đó, các chủng

E.coli O15:H7 phân lập được từ thịt bò bán ở một số địa bàn tại Hà Nội được

giám định lại bằng phương pháp giải trình tự gen 16s ARNr để có căn cứ kết

luận chính xác về sự có mặt của chủng vi khuẩn này trong thịt bò ở Hà Nội

nói riêng và Việt Nam nói chung.

16S- và 23S-ARNr là các gen sao mã các axit ARN ribosom (ARNr) ở

vi sinh vật nhân sơ, chúng là các gen có tính bảo thủ rất cao nên được sử dụng

như một công cụ trong việc phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa

các chủng vi khuẩn (Woese, 1987) [143]. Theo Ludwig và cộng sự, 2000

[75], có tới hơn 16000 gen 16S-ARNr từ các chủng vi khuẩn đã được xác

định trình tự nucleotid.

3.1.2.1 Tách ADN tổng số và nhân đoạn gen 16s ARNr

Chủng vi khuẩn E.coli O157:H7 M61 phân lập được trong thịt bò được

tăng sinh trong môi trường BHI để thu sinh khối tế bào và tách chiết ADN

tổng số. Đây là công việc hết sức quan trọng vì chất lượng của ADN ảnh

hưởng lớn đến quá trình tách dòng đoạn gen 16s ARNr sau này. Để kiểm tra

kết quả tách chiết ADN, chúng tôi điện di sản phẩm trên gel agarose 1% nhằm

đánh giá độ tinh sạch tương đối của ADN tổng số thu được phục vụ cho các

thí nghiệm tiếp theo (hình 3.2).

Hình 3.2 Kết quả tách chiết ADN tổng số của chủng

(Vạch 1: Chủng E.coli O15:H7 FD41; vạch 2: chủng E.coli O15:H7 M61)

E.coli O157:H7 phân lập

Kết quả điện di cho thấy cả hai mẫu ADN tách chiết từ vi khuẩn E.coli

O157:H7 đều xuất hiện 1 băng sáng, có kích thước bằng nhau, không bị đứt

gãy, chứng tỏ các mẫu ADN có độ nguyên vẹn và tinh sạch tương đối, có thể

sử dụng để nhân bản đoạn gen 16s ARNr bằng kĩ thuật PCR.

Quá trình nhân bản đoạn gen 16s ARNr của E.coli O157:H7 được tiến

hành với cặp mồi đặc hiệu 16s ARNr-R và 16s ARNr-F có trình tự các

nucleotide như sau:16s ARNr-F: 5’-AGA GTT TGA TCM TGG C -3’; 16s

ARNr-R: 5’- TAC CTT GTT ACG ACT T-3’

Sử dụng cặp mồi này chạy PCR chúng tôi thu được kết quả thể hiện

trên ảnh điện di hình 3.3.

(vạch 1: E.coli O157:H7 FD41; vạch 2: E.coli O157:H7 M61; thang ADN chuẩn, )

Hình 3.3 Kết quả phản ứng nhân đoạn gen 16s ARNr

Kết quả điện di cho thấy trên các băng điện di xuất hiện các vạch sáng

và đậm nét với kích thước khoảng 1,5kb. Theo nghiên cứu của Jesus và cộng

sự, 1999 [54], kích thước của đoạn gen 16s ARNr của các loài vi khuẩn là

khoảng 1,5kb, như vậy, kết quả PCR thu được tương ứng với kích thước của

gen 16s ARNr theo tính toán lí thuyết. Điều này có thể khẳng định là đoạn

gen 16s ARNr đã được nhân bản thành công. Tuy nhiên để xác định một cách

chắc chắn xem gen nhân được có phải là gen 16s ARNr hay không để sử dụng

cho việc giải trình tự gen sau này, chúng tôi tiến hành tách dòng và xác định

trình tự nucleotide sản phẩm PCR thu được.

3.1.2.2 Tách dòng gen 16s ARNr

Để tách dòng được một đoạn gen đích nào đó người ta thường gắn sản

phẩm PCR của nó lên một vector để tạo vector tái tổ hợp mang đoạn ADN

này. Trong nghiên cứu này, vector pBT của Fermentas (hình 3.4) được sử

dụng để tách dòng gen 16s ARNr của E.coli O157:H7. Nguyên tắc của phản

ứng nối ghép ADN vào vector dựa trên hoạt tính tự tạo gốc adenin tự do đầu

3’ trên sản phẩm PCR của enzyme Taq polymerase mà không phụ thuộc vào

trình tự khuôn, trong khi đó một gốc thimine tự do được thiết kế trên vector

tách dòng. Điều này cho phép gắn sản phẩm PCR vào vector theo nguyên tắc

bổ sung A-T trở nên dễ dàng hơn khi có enzyme xúc tác.

Hình 3.4 Sơ đồ vector pBT

Vector tái tổ hợp mong muốn sẽ là vector đã gắn thành công đoạn gen

đích. Tuy nhiên, phản ứng gắn sản phẩm PCR với vector xảy ra ngẫu nhiên

nên sản phẩm của phản ứng nối ghép có thể được tạo ra theo một số khả năng

không mong muốn như sau:

• Các sản phẩm PCR tự gắn lại với nhau do đứt gãy ngẫu nhiên.

• Vector mở vòng tự gắn lại với nhau tạo nên ADN plasmid có kích

thước lớn.

• Sản phẩm PCR không đặc hiệu gắn vào các vector tạo ra các vector tái

tổ hợp không mong muốn.

Các trường hợp trên đều phải loại trừ dần trong quá trình tách dòng. Các

vector tái tổ hợp mang gen đích được sàng lọc bằng phương pháp tách chiết

lại những vector tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E.coli đã được biến nạp rồi

kiểm tra bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn và xác định trình tự.

Vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng

DH5α. Nhờ bộ máy tổng hợp của vi khuẩn này, plasmid được tạo ra với số

lượng lớn các bản sao. Canh khuẩn E.coli DH5α tái tổ hợp được cấy trải trên

môi trường thạch LB có chứa ampicillin (100 µg/ml) và nuôi ở 37°C. Sau khi

nuôi qua đêm quan sát thấy trên môi trường xuất hiện hai loại khuẩn lạc màu

xanh và trắng (hình 3.5).

Cấu tạo vector pBT (có kích thước 2705 bp) có gen kháng kháng sinh

ampicillin, gen mã hóa enzyme β-galactosidase (LacZ) (hình 3.4). Còn tế bào

E. coli chủng DH5α có đặc điểm là trong hệ gen của vi khuẩn này có gen

LacI, do đó tạo ra protein ức chế gen LacZ làm cho gen này không hoạt

động. Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp sẽ có màu trắng trong khi các khuẩn

lạc mang vector pBT tự đóng vòng có màu xanh. Các khuẩn lạc phát triển

được trên môi trường có ampicillin là do chúng mang plasmid chứa gen

kháng kháng sinh này. Những khuẩn lạc có màu xanh xuất hiện là do vector

mang gen mã hóa LacZ hoạt động bình thường tạo thành enzyme β-

galactosidase, enzyme này thủy phân cơ chất X-gal có mặt trong môi truờng

để tạo khuẩn lạc có màu xanh. Trong khi đó các khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ

hợp thì đoạn trình tự mã hóa cho LacZ bị dịch khung đọc do có sự chèn vào

của sản phẩm PCR nên không thể tổng hợp được enzyme β-galactosidase

dạng hoạt động nên không phân giải được cơ chất X-gal thành sản phẩm màu

xanh.

Hình 3.5 Khuẩn lạc vi khuẩn E.coli DH5αααα sau biến nạp vector tái tổ hợp

Để khẳng định chính xác vector tái tổ hợp có mang gen đích hay

không, ADN plasmid được tách chiết lại và thực hiện các bước kiểm tra tiếp

theo.

Để kiểm tra kết quả gắn sản phẩm PCR vào vector pBT và biến nạp vào

tế bào E.coli DH5α, một khuẩn lạc xanh và 3 khuẩn lạc trắng được lựa chọn

ngẫu nhiên rồi nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh

ampicilin (100 µg/ml) lắc qua đêm ở 37°C. Sau đó, thu vi khuẩn và tách

plasmide, sản phẩm tách chiết được kiểm tra trên gel agarose 0.8% (hình 3.6).

Kết quả cho thấy các băng điện di ADN của các khuẩn lạc trắng có các

vạch điện di tương tự nhau và khác với khuẩn lạc xanh. Theo lí thuyết, phân

tử ADN nào có kích thước càng lớn thì khi điện di trên gel agarose chúng sẽ

di chuyển càng chậm.

Hình 3.6 Kết quả tách chiết DNA plasmid từ các khuẩn lạc xanh, trắng

(Giếng 1: khuẩn lạc xanh; Giếng 2-4: khuẩn lạc trắng)

Như vậy các vector được gắn sản phẩm PCR thì sẽ có khối lượng lớn

hơn, do đó chạy chậm hơn. Từ kết quả điện di này chúng tôi cho rằng các

vector ở đường chạy số 2,3,4 là các vector có thể mang gen đích 16s ARNr.

Để khẳng định chắc chắn nhận định trên, 3 mẫu ADN plasmid số 2,3,4 để cắt

với enzyme Bam HI. Thành phần phản ứng cắt ADN plasmid như trong bảng

3.2.

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng cắt ADN plasmid

Thành phần Thể tích (µl)

ADN plasmid 1

Bam HI Buffer 1

Enzyme Bam HI 0.5

7.5 H2O

Tổng thể tích 10

Ở vị trí nhận biết đa điểm của vector pBT có một vị trí nhận biết của

enzyme Bam HI. Và khi vector đã gắn sản phẩm PCR thì vị trí này nằm ở hai

đầu của ADN ngoại lai. Do đó, khi xử lý vector tái tổ hợp bằng enzyme giới

hạn Bam HI, enzyme sẽ cắt rời đoạn ADN ngoại lai ra và kích thước của nó

thay đổi không đáng kể. Điều này cho phép xác định kích thước tương đối của

đoạn ADN được cắt ra khỏi vector tách dòng khi so sánh với thang ADN

chuẩn (hình 3.7).

(M: thang ADN chuẩn, 1-3: ADN plasmid được cắt với Bam HI từ các khuẩn lạc trắng)

Hình 3.7 Kết quả cắt ADN plasmide bằng enzyme Bam HI

Kết quả điện di cho thấy các mẫu plasmid tái tổ hợp được xử lý với

enzyme Bam HI đã xuất hiện một băng ADN có kích thước khoảng 1,5 kb,

kích thước này tương ứng với kích thước của sản phẩm PCR ban đầu, và một

băng có kích thước khoảng 2,7kb tương ứng với kích thước của plasmid gốc.

Như vậy, chúng tôi khẳng định rằng phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector

pBT đã thành công.

3.1.2.3 Giải trình tự gen 16s ARNr

Để xác định trình tự nucleotide thì mẫu ADN phải có độ tinh sạch cao

và hàm lượng từ 100-300 ng/µl. Theo phương pháp của F.Sanger sử dụng trên

5’-

máy xác định trình tự tự động ABI 3110 PRISM (Perkin- Elmer) với cặp mồi

GTTTTCCCAGTCACGAC-3’, chúng tôi thu được kết quả xác định trình tự ở

M13-R: 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' và M13-F:

phụ lục hình 3.

So sánh trình tự đoạn 16s ARNr thu được với trình tự trên ngân hàng

gene NCBI bằng công cụ Blast cho thấy trình tự nucleotide của đoạn gen mà

chúng tôi thu được có sự tương đồng 99% với 06 chủng vi khuẩn Escherichia

coli O157:H7 có mã số trong GeneBank như trong bảng 3.3, vì vậy chúng tôi

có thể kết luận rằng vi khuẩn E.coli phân lập được từ thịt bò ở khu vực Hà

Nội là E. coli O157:H7.

Bảng 3.3 So sánh mức độ tương đồng của trình tự gen 16s ARNr

thu được với các trình tự của GeneBank

Mức độ

Mã số

Tên chủng và gen xác định

Phần trăm trình tự được

GeneBank

tương đồng

trình tự

so sánh với GeneBank (%)

(%)

Escherichia

coli

strain

EU118103.1

97%

99%

O157:H7 16S ARNr

Escherichia coli O157:H7 str.

BA000007.2

97%

99%

Sakai DNA, toàn bộ hệ gen

Escherichia coli O157:H7

AE005174.2

97%

99%

EDL933, toàn bộ hệ gen

Escherichia coli O55:H7 str.

CP001846.1

97%

99%

CB9615, toàn bộ hệ gen

Escherichia coli O157:H7 str.

CP001368.1

97%

99%

TW14359, toàn bộ hệ gen

Escherichia coli O157:H7 str.

97%

99%

CP001164.1

EC4115, toàn bộ hệ gen

Như vậy, từ 143 mẫu thịt bò thu thập ở một số địa điểm tại Hà Nội đã xác

định được 4 mẫu thịt nhiễm E.coli O157:H7, tương đương với tỷ lệ nhiễm là 2,8%

Vi khuẩn này được phân lập và giám định bằng phương pháp giải trình tự gen 16s

ARNr.

3.2 Xác định độc tố của các chủng E.coli O157:H7 phân lập trong thịt bò

ở khu vực Hà Nội

3.2.1 Xác định các gen độc tố của các chủng E.coli O157:H7 phân lập

Vi khuẩn E.coli O157:H7 gây ngộ độc thực phẩm có mang các gen mã

hoá độc tố Stx, eae, hly (Beutin và cộng sự, 1994) [15]. Trong nghiên cứu

này, chúng tôi lựa chọn phát hiện 2 gen độc tố của vi khuẩn E.coli O157:H7

là Stx và eae. Sở dĩ, hai gen độc tố này được lựa chọn vì chúng có liên quan

mật thiết đến khả năng gây bệnh của E.coli O157:H7, trong đó, gen Stx mã

hoá độc tố ruột của vi khuẩn, nó là nguyên nhân gây nên hội chứng ure huyết

(HUS) trên bệnh nhân bị ngộ độc thực phẩm do E.coli O157:H7, còn eae là

gen mã hoá yếu tố bám dính OPM intimin là yếu tố then chốt giúp cho vi

khuẩn tấn công qua niêm mạc đường tiêu hoá (James và cộng sự, 1998) [52].

Bốn chủng E.coli O157:H7 phân lập được từ 143 mẫu thịt bò bán ở một

số chợ nội thành Hà Nội, Đông Anh, Ba Vì được tăng sinh trong môi trường BHI ở điều kiện 420C/24 giờ rồi sử dụng để tách chiết ADN tổng số phục vụ

cho mục đích phát hiện các gen mã hóa độc tố Stx và eae. Kết quả tách chiết

được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (hình 3.8) nhằm đánh giá độ

tinh sạch tương đối của ADN tổng số thu được phục vụ cho các thí nghiệm

tiếp theo.

Hình 3.8 Hình ảnh tách ADN tổng số của vi khuẩn E.coli O157:H7

(1: chủng M8, 2: chủng M9, 3: chủng M61, 4: chủng M128)

Kết quả điện di chứng tỏ ADN tổng số tách được từ các chủng E.coli

O157:H7 phân lập có độ nguyên vẹn và tinh sạch cao, đảm bảo chất lượng để

thực hiện phản ứng Multiplex PCR cho mục đích phát hiện các gen độc tố Stx

và eae.

Với ba cặp mồi có trật tự như trong bảng 3.4 chúng tôi thu được kết

quả phản ứng PCR như hình 3.9 và bảng 3.5.

Bảng 3.4 Các cặp mồi sử dụng để xác định gen độc tố của vi khuẩn

Kích

Vị trí

Gen

Trật tự mồi

thước sản

nucleotide

đích

phẩm (bp)

F-5'-CGCTCTGCAATAGGTACTCC-3'

287-306

Stx1

256

R-5'-CGCTGTTGTACCTGGAAAGG-3'

522-541

F-5'-TCCATGACAACGGACAGCAG-3'

623-642

Stx2

185

R-5'-GCTTCTGCTGTGACAGTGAC-3'

788-807

F-5'GCTTAGTGCTGGTTTAGGATTG-3'

271-293

eae

618

R-5'-CCAGTGAACTACCGTCAAAG-3'

871-890

E.coli O157:H7

Bảng 3.5 Kết quả xác định các gen độc tố của các chủng E.coli O157:H7

phân lập

STT Nguồn gốc

Chủng vi khuẩn M8 M9 M61 M128 1 2 3 4 Ba vì Ba vì Đông Anh HN Gen độc tố Stx2 + + + + Stx1 - - + + eae + + + +

Kết quả phản ứng PCR multiplex cho thấy: trên tất cả các băng điện di sản phẩm đều xuất hiện 2 vạch tương đương với kích thước là 618 kb và 185kb, kích thước này tương ứng với kích thước của đoạn gen mã hóa độc tố eae và Stx2, còn đoạn gen mã hóa độc tố Stx1 chỉ xuất hiện được trên 2 chủng E.coli O157:H7 M61 và M128. Như vậy, cả 4 chủng vi khuẩn E.coli O157:H7 phân lập được ở thịt bò bán tại một số địa bàn ở Hà Nội đều mang gen mã hóa độc tố Stx2 và eae, trong khi đó, chỉ có 2 chủng mang gen mã hóa độc tố Stx1. Kết quả này ngược lại với nghiên cứu của Nazmul và cộng sự, (2008) [88] ở Malaysia, đất nước có điều kiện khí hậu tương tự Việt Nam. Theo tác giả này, 10/30 chủng vi khuẩn E.coli O157: H7 gây bệnh cho trẻ em ở Malaysia mang gen mã hóa độc tố Stx1, trong khi đó gen mã hóa Stx2

không có mặt ở cả 30 chủng này. Theo nghiên cứu của Griffin và cộng sự, (1995) [47] và Pickering, (1994) [105] cho biết, các chủng vi khuẩn E.coli O157:H7 mang độc tố Stx2 có khả năng gây hội chứng urê huyết phổ biến hơn và mạnh hơn so với các chủng chỉ mang độc Stx1 hoặc mang cả hai loại độc tố này. Bên cạnh đó, theo Ashkenazi, (1994) [8], eae là gen mã hóa protein intimin có kích thước 94-97 kDa là yếu tố bám dính của vi khuẩn vào tế bào niêm mạc ruột, mở đường cho sự tấn công của vi khuẩn vào vật chủ. Như vậy, cả 4 chủng E.coli O157:H7 mà chúng tôi phát hiện được trong mẫu thịt bò ở địa bàn Hà Nội đều mang cả 2 gen độc tố quyết định khả năng gây bệnh của vi khuẩn, vì vậy, rất có thể các chủng này là các chủng có khả năng gây ngộ độc thực phẩm.

Cũng ở khu vực ngoại thành Hà Nội, theo báo cáo điều tra của Noboru và cộng sự (2005) [90], 2% mẫu phân bò nuôi ở khu vực này có mang các gen độc tố Stx2 và eae của vi khuẩn E.coli O157:H7. Từ kết quả chúng tôi thu được cùng với báo cáo của Noboru và cộng sự (2005) [90] cho thấy: vi khuẩn E.coli O157:H7 có mặt trên cả mẫu phân của bò nuôi và thịt bày bán tại khu vực Hà Nội. Như vậy, với điều kiện vệ sinh chăn nuôi và giết mổ kém vệ sinh, thiếu kiểm soát như hiện nay thì nguy cơ nhiễm chéo vi khuẩn từ phân vào thịt, sữa bò, nước sinh hoạt và thực phẩm khác là rất dễ xảy ra.

M128, 4: chủng vi khuẩn ký hiệu M8, 5: chủng vi khuẩn ký hiệu M9)

Hình 3.9 Xác định các gen độc tố của các chủng E.coli O157:H7 phân lập ( 1: thang DNA chuẩn, 2: chủng vi khuẩn ký hiệu M61, 3: chủng vi khuẩn ký hiệu

3.2.2 Xác định khả năng sinh độc tố gây bệnh của các chủng E.coli

O157:H7 phân lập trên tế bào VERO

E.coli O157:H7 được xác định là một trong các serotyp thuộc loài

E.coli, có khả năng gây ngộ độc thực phẩm trên người. Tuy nhiên, một chủng

vi khuẩn nào đó có khả năng gây ngộ độc thực phẩm thực phẩm hay không,

cần phải chứng minh được khả năng gây bệnh của nó. Trong nghiên cứu này,

tế bào VERO được sử dụng để xác định khả năng gây bệnh tích của độc tố

cytotoxin của các chủng E.coli O157:H7 phân lập được từ các mẫu thịt bò thu

thập ở khu vực Hà Nội.

Độc tố của E.coli O157:H7 được tách bằng phương pháp sốc nhiệt

trong môi trường CAYE có thành phần: 2% casamino acid, 0.6% yeast

extract, 0.25% NaCl, 0.87% K2HPO4, 0.0005% MgSO4, 0.0005% FeCl3

(Chang-Kyu Sohn, 2000) [27] rồi ly tâm canh khuẩn, thu dịch nổi và lọc qua

lưới lọc có kích thước 0.22µm để thu phần dịch phía dưới.

Tế bào thận khỉ xanh Châu phi (VERO) được nuôi trong tủ ấm 5%

CO2, trong môi trường dinh dưỡng gồm có MEM 199 và 5% huyết thanh thai

bê (Invitrogen) cho đến khi tế bào mọc thành lớp ở đáy đĩa rồi bổ sung 50µl dịch chiết độc tố pha loãng với các tỷ lệ từ 10-1-10-10 vào các giếng tế bào.

Sau đó, tiếp tục nuôi các đĩa trong tủ ấm 5% CO2 và kiểm tra bệnh tích tế bào

sau mỗi 6 giờ.

Kết quả theo dõi cho thấy, chỉ có chủng E.coli O157:H7 ký hiệu M61

mới sản sinh độc tố tế bào. Ở các giếng bổ sung độc tố của vi khuẩn này ở độ pha loãng từ 10-1- 10-5. Kể từ 18 giờ sau khi gây nhiễm, tế bào bắt đầu có biểu

hiện biến dạng với các hiện tượng co nguyên sinh chất, đến 24 giờ sau xuất

hiện các đám tế bào chết, bong ra khỏi bề mặt nuôi cấy. Hiện tượng tế bào bị

hủy hoại do tác động của độc tố mạnh mẽ nhất ở giai đoạn sau 48 giờ, ở giai

đoạn này, thảm tế bào rách hàng loạt, tỷ lệ tế bào chết bong ra khỏi bề mặt

nuôi cấy lên đến trên 90% (hình 3.10). Trong khi đó, tế bào VERO được bổ

sung dịch chiết canh khuẩn của 3 chủng E.coli O157:H7 M8, M9 và M128

không có biểu hiện bệnh tích cho đến 5 ngày theo dõi.

gây nhiễm 24 giờ; (d); tế bào sau khi gây nhiễm 48 giờ

Hình 3.10 Biểu hiện bệnh tích trên tế bào VERO bị gây nhiễm bởi độc tố tách từ chủng E.coli O157:H7 M61 (độ pha loãng 10-2) (a): tế bào trước khi gây nhiễm; (b): tế bào sau khi gây nhiễm 18 giờ; (c): tế bào sau khi

Như vậy, mặc dù cả 4 chủng E.coli O157:H7 phân lập được từ thịt bò

đều mang gen mã hóa độc tố Stx2 và eae nhưng thử nghiệm khả năng gây

bệnh tích trên tế bào VERO đã chứng minh được duy nhất 1 chủng E.coli

O157:H7 ký hiệu M61 là có khả năng sản sinh độc tố phá hủy tế bào. Theo

Jame Nataro và cộng sự (1998) [53], độc tố gây bệnh tích tế bào của E.coli

O157:H7 là Stx, như vậy có thể chủng vi khuẩn ký hiệu M61 có khả năng sản

sinh độc tố này. Bên cạnh đó, mặc dù cả 3 chủng E.coli O157:H7 còn lại đều

mang gen mã hóa 1 hoặc 2 loại độc tố Stx nhưng có thể các gen này không

biểu hiện vì vậy không sản sinh ra độc tố hoặc có thể là gây bệnh tích ở các

dạng khác mà kiểm tra bằng tế bào VERO chưa phát hiện được.

Ở nghiên cứu này, chúng tôi mới chỉ xác định được khả năng gây bệnh

tích tế bào của E.coli O157:H7. Tuy nhiên, nghiên cứu của James Paton và

cộng sự, (1998) [52] chỉ rõ vai trò của độc tố eae với khả năng gây bệnh của

vi khuẩn này vì thế cần phải có các nghiên cứu tiếp theo để đánh giá khả năng

gây bệnh của các chủng vi khuẩn E.coli O157:H7 phân lập và vai trò của các

loại độc tố mà chúng sản sinh ra.

Tóm lại, 4 chủng vi khuẩn E.coli O157:H7 tìm thấy trong thịt bò thu thập

ở một số địa bàn tại Hà Nội đều mang gen mã hóa các độc tố Stx2 và eae, độc

tố Stx1 chỉ tìm thấy trong hai chủng ký hiệu M61 và M128. Tuy vậy, chỉ duy

nhất chủng ký hiệu M61 là có khả năng sinh độc tố gây hiệu ứng hủy hoại tế

bào, độc tố này có thể là Stx.

3.3 Chế tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu của E.coli O157:H7

3.3.1 Chế tạo và lựa chọn kháng nguyên của E.coli O157:H7

Cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn E.coli O157: H7 gồm có 4 nhóm

chính đó là: i) kháng nguyên O (kháng nguyên thân) có bản chất

lipopolysaccharide và được coi là một yếu tố độc lực của vi khuẩn. ii) kháng

nguyên H (kháng nguyên lông), có bản chất protein không có tính độc và

cũng không có ý nghĩa trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ nhưng nó có ý

nghĩa rất lớn trong xác định giống loài vi khuẩn (Orskov, 1984) [97]; iii)

kháng nguyên pili (kháng nguyên fimbriae), có bản chất protein, nằm trong

cấu trúc fimbriae trên bề mặt tế bào vi khuẩn; iv) kháng nguyên K ( kháng

nguyên giáp mô), bản chất là một polysaccharide, bao quanh tế bào vi khuẩn.

Trong nghiên cứu này, mục đích của chúng tôi là lựa chọn được loại

kháng nguyên có khả năng tạo đáp ứng mạnh trên động vật thí nghiệm, đồng

thời kích thích sinh kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn E.coli O157:H7. Đây là

công việc quan trọng, quyết định sự thành công của việc nghiên cứu sản xuất

kháng thể đơn dòng.

Như đã phân tích ở trên, mặc dù E.coli O157:H7 có tới 4 loại kháng

nguyên nhưng kháng nguyên H là có ý nghĩa chẩn đoán, vì vậy, ở nghiên cứu

này, chúng tôi tiến hành chế kháng nguyên theo 2 dạng: kháng nguyên H7 và

kháng nguyên hòa tan để lựa chọn dạng thích hợp gây miễn dịch cho chuột

Babl/C sau này. Chủng E.coli O157:H7 sử dụng cho nghiên cứu này là chủng

vi khuẩn ký hiệu FD41 do trường Đại học Khoa học tự nhiên cung cấp.

3.3.1.1 Chế kháng nguyên của vi khuẩn E.coli O157:H7

Đối với kháng nguyên hòa tan, sau khi nuôi cấy vi khuẩn E.coli O157:H7 trong môi trường BHI ở điều kiện 420C/24 giờ, vi khuẩn được rửa,

ly tâm trong dung dịch PBS pH 7,2 3 lần và đếm số, rồi phá vỡ tế bào bằng

máy siêu âm siêu tốc (sonicator). Hàm lượng protein tổng số của vi khuẩn

E.coli O157:H7 xác định được là 12,77mg/ml.

Đối với kháng nguyên lông H7, vi khuẩn được nuôi cấy lắc trong môi trường flagellum broth ở 37oC/24 giờ, rồi ly tâm, rửa vi khuẩn trong dung

dịch PBS pH 7,2 3 lần. Kháng nguyên lông của vi khuẩn được tách bằng máy đồng nhất mẫu và thu bằng cách ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút ở 40C trong

20 phút. Trong dịch nổi thu được chứa kháng nguyên H7 với hàm lượng

protein là 3,79mg/ml.

Trên gel SDS-PAGE, hình ảnh điện di kháng nguyên cho thấy, kháng

nguyên được tinh chế tốt, các thành phần kháng nguyên được phân tách rõ

ràng (hình 3.11). So với kháng nguyên hòa tan tổng số, kháng nguyên H7 có

thành phần protein ít hơn nhiều, nó chứa 2 tiểu phần protein chính, có trọng

lượng phân tử tương ứng khoảng 65kDa và 118kDa. Theo nghiên cứu của

Yongsheng He và cộng sự, (1996) [145] thì kháng nguyên H7 của E.coli

O157:H7 có chứa 1 tiểu phần protein với trọng lượng phân tử là 65kDa, như

vậy, kháng nguyên H7 mà chúng tôi chế tạo được có thành phần tương đồng

với kháng nguyên của nhóm nghiên cứu trên. Bên cạnh đó, việc xuất hiện

thêm tiểu phần protein có trọng lượng 118kDa có phải là sự khác biệt của vi

khuẩn E.coli O157:H7 ở Việt Nam hay không, vấn đề này cần được nghiên

cứu thêm để làm rõ.

Hình 3.11 Kết quả điện di kháng nguyên của vi khuẩn E.coli O157:H7

1-5: kháng nguyên hòa tan tổng số; 6-9: kháng nguyên H7

trên gel SDS-PAGE

3.3.1.2 Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của các kháng nguyên

Mặc dù mục đích của việc nghiên cứu chọn lựa kháng nguyên là xác

định, lựa chọn loại kháng nguyên có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch tốt nhất

trên chuột Babl/c để làm cơ sở cho sản xuất kháng thể đơn dòng, nhưng

nghiên cứu này lại được thực hiện trên thỏ. Sở dĩ chúng tôi đánh giá trước

trên thỏ vì 3 lý do: i) thỏ là loài động vật mẫn cảm với các loại kháng nguyên,

vì vậy phù hợp cho việc đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch; ii) thỏ có

kích thước lớn hơn chuột Balb/C, vì vậy dễ dàng lấy huyết thanh để thực hiện

các phản ứng miễn dịch học đánh giá kháng thể tạo thành; iii) giá mua thỏ

phù hợp hơn so với việc sử dụng chuột Balb/C.

Thỏ được gây miễn dịch với 2 loại kháng nguyên hòa tan và kháng

nguyên lông theo phương pháp của Yoshihito, 2002 [147]. Sau khi gây miễn

dịch, định kỳ 5 ngày 1 lần, thỏ được lấy máu để kiểm tra khả năng gây đáp

ứng miễn dịch của các kháng nguyên bằng phản ứng ELISA. Kết quả kiểm tra

kháng thể tạo thành được trình bày trong bảng 3.6 và đồ thị 3.1.

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ

của các kháng nguyên

Kháng thể tạo thành (OD450) Lô

Lô 1

0.14 0.18 0.54 0.73 0.87 0.93 0.89 0.96 1.04 1.17 1.27 1.28 1.28

Lô 2

0.15 0.25 0.59 0.90 0.97 0.95 0.96 0.98 1.07 1.20 1.25 1.28 1.27

Lô 3

0.11 0.11

0.1 0.13 0.11 0.11 0.12 0.11

0.1 0.12

0.1 0.12 0.12

(Lô 1: tiêm kháng nguyên hòa tan; lô 2: tiêm kháng nguyên lông; Lô 3: tiêm PBS vô

trùng; D: ngày lấy máu)

TN D0 D5 D10 D15 D20 D25 D30 D35 D40 D45 D50 D55 D60

Kết quả thí nghiệm cho thấy, cả hai lô thỏ được tiêm kháng nguyên của

vi khuẩn E.coli O157:H7 đều có đáp ứng miễn dịch tốt. Ở lô thỏ được tiêm

kháng nguyên hòa tan, bắt đầu từ ngày thứ 5 sau khi gây miễn dịch cơ sở,

hàm lượng kháng thể trong máu thỏ đã liên tục tăng nhanh và đạt ngưỡng cực

đại với đáp ứng tiên phát vào ngày thứ 25. Tiếp tục gây miễn dịch lần 2 vào

ngày thứ 28 rồi lấy máu thỏ kiểm tra ở ngày thứ 30, chúng tôi thấy: hiệu giá

kháng thể giảm nhẹ ở thời điểm này sau đó tiếp tục tăng ở các ngày tiếp theo.

Hiện tượng hiệu giá kháng thể giảm không lặp lại sau khi gây miễn dịch lần 3,

tại ngày thứ 42. Điều này có thể giải thích rằng, lượng kháng thể trong máu

thỏ được hình thành ở đáp ứng tiên phát còn ở mức độ thấp, vì vậy, khi tiêm

kháng nguyên vào lần 2, một phần kháng thể đã tham gia trung hòa kháng

nguyên vì vậy gây hiện tượng giảm hiệu giá kháng thể sau lần gây miễn dịch

thứ 2. Còn ở lần gây miễn dịch thứ 3, lúc này hàm lượng kháng thể tạo ra

nhiều, các yếu tố trí nhớ miễn dịch đã ổn định, vì vậy khi tiêm kháng nguyên

vào, hiệu giá kháng thể không biến động nhiều.

( Lô 1: Thỏ được tiêm kháng nguyên hòa tan, lô 2: thỏ được tiêm kháng nguyên lông, lô 3:

thỏ đối chứng được tiêm dung dịch PBS pH 7,2)

Đồ thị 3.1 Biến thiên hàm lượng kháng thể trên thỏ được gây miễn dịch

Đối với lô thỏ được tiêm kháng nguyên lông, xu thế biến động hàm

lượng kháng thể tương tự như lô thỏ được tiêm kháng nguyên hòa tan. Cụ thể:

hàm lượng kháng thể đạt ngưỡng cực đại sau khi gây miễn dịch cơ sở vào

ngày thứ 20 sau đó từ từ giảm ở ngày thứ 25. Sau khi gây miễn dịch lần 2 ở

ngày thứ 28 và lần 3 ở ngày thứ 42, hiện tượng giảm kháng thể cũng lặp lại

như ở lô thỏ được tiêm kháng nguyên hòa tan. Tuy nhiên, kết quả biểu thị

trong đồ thị 3.1 cũng cho thấy rõ, đáp ứng tiên phát ở lô thỏ được tiêm kháng

nguyên lông xảy ra nhanh hơn và mạnh hơn so với lô thỏ được tiêm kháng

nguyên hòa tan. Điều này có thể là do thành phần kháng nguyên hòa tan đa

dạng hơn so với kháng nguyên lông, vì vậy hệ miễn dịch cần có thời gian

nhận biết và đáp ứng lâu hơn. Mặc dù vậy, ở cả hai lô thỏ được tiêm kháng

nguyên, hiệu giá kháng thể luôn duy trì ở ngưỡng cao và ổn định từ các ngày

50-60.

Mặc dù các kháng nguyên hòa tan và kháng nguyên lông của E.coli

O157:H7 có khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch ở thỏ tốt nhưng vấn

đề đặt ra là các kháng thể này có nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E.coli O157:H7

hay không? chúng tôi đã thực hiện phản ứng ELISA với hai loại kháng thể thu

được từ thỏ được gây đáp ứng miễn dịch bằng kháng nguyên lông và kháng

nguyên hòa tan của E.coli O157:H7 với một số chủng vi khuẩn E.coli khác.

Kết quả được trình bày trong bảng 3.7.

Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra khả năng phát hiện đặc hiệu kháng

nguyên của các kháng thể tạo thành trên thỏ

Kháng thể kháng

kháng nguyên hòa tan

kháng nguyên

Vi khuẩn (n)

lông (%)

(%)

E.coli O157:H7 (FD41)

E.coli O157:H7 (n=4)

100

E.coli K88 (n=2)

E.coli K99 (n=2)

E.coli 987P (n=2)

11 chủng vi khuẩn có tên trong bảng 3.6 được tăng sinh trong BHI và

dùng máy siêu âm siêu tốc để phá vỡ tế bào, tạo kháng nguyên hòa tan; huyết

thanh của hai lô thỏ thí nghiệm được pha loãng 1/400 để làm phản ứng

ELISA. Kết quả thu được cho thấy: kháng thể kháng kháng nguyên lông có

độ đặc hiệu 100% với vi khuẩn E.coli O157:H7, chỉ có các chủng vi khuẩn

này mới được phát hiện bởi kháng thể kháng H7. Còn kháng thể kháng kháng

nguyên hoà tan, mặc dù có độ đặc hiệu cao với E.coli O157:H7 nhưng lại

nhận biết 50% các chủng E.coli K88 thí nghiệm. Theo báo cáo của James và

cộng sự (1998), [53], E.coli O157:H7 có chứa kháng nguyên fimbrea thuộc

typ huyết thanh K88, vì vậy, khả năng xuất hiện phản ứng chéo giữa huyết

thanh thỏ được tiêm kháng nguyên hòa tan của E.coli O157:H7 với E.coli

K88 là có thể xảy ra.

Như vậy, kháng nguyên lông của E.coli O157:H7 không chỉ có khả năng

gây đáp ứng miễn dịch cao ở thỏ thí nghiệm mà còn tạo ra kháng thể có tính

đặc hiệu tuyệt đối đối với vi khuẩn này. Kết quả này cho phép lựa chọn kháng

nguyên H7 để gây miễn dịch trên động vật thí nghiệm phục vụ cho các mục

đích chế kháng huyết thanh định typ vi khuẩn hoặc chế kháng thể đơn dòng.

Kết luận: kháng nguyên H7 của E.coli O157:H7 là kháng nguyên có khả

năng kích thích động vật thí nghiệm sinh kháng thể đặc hiệu. Kháng nguyên

này có hai tiểu phần chính có trọng lượng là 65kDa và 118kDa.

3.3.2 Đáp ứng miễn dịch của chuột Babl/C với kháng nguyên lông H7

Một trong những yếu tố chính, có ảnh hưởng lớn đến kết quả nghiên cứu

sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu đó là đáp ứng của chuột đối với kháng

nguyên đặc hiệu. Đối với vi khuẩn E.coli O157:H7, kháng nguyên lông là

kháng nguyên có khả năng gây đáp ứng miễn dịch cao trên thỏ, vì vậy được

sử dụng để gây miễn dịch cho chuột Babl/C phục vụ cho mục đích tạo tế bào

lai sinh kháng thể đơn dòng ở điều kiện in vitro. Vấn đề đặt ra là phải xác

định được ở điều kiện gây miễn dịch nào thì kháng nguyên gây đáp ứng miễn

dịch ở chuột mạnh nhất, tạo ra số lượng tế bào lympho B thích hợp cho mục

đích dung hợp tế bào.

3.3.2.1 Xác định hàm lượng kháng nguyên thích hợp cho khả năng gây đáp

ứng miễn dịch trên chuột

Đáp ứng của động vật không chỉ phụ thuộc vào loại kháng nguyên mà

còn phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như: đường tiêm, hàm lượng kháng

nguyên và chất bổ trợ. Đối với chuột Balb/C, theo nghiên cứu của Freeman và

cộng sự, (1983) [44] thì đưa kháng nguyên vào xoang phúc mạc cho đáp ứng

miễn dịch mạnh hơn so với tiêm dưới da. Vì vậy, trong nghiên cứu này,

chúng tôi thực hiện gây đáp ứng miễn dịch cho chuột với kháng nguyên lông

của E.coli O157:H7 theo đường phúc mạc.

Ba nồng độ kháng nguyên lông của E.coli O157:H7 được tiêm vào xoang

phúc mạc của chuột là: 50µg/ml, 100µg/ml, 200µg/ml. Mỗi lô chuột thí

nghiệm có 3 con, mỗi con được tiêm 0,3ml kháng nguyên ở nồng độ trên. Lô

đối chứng, chuột được tiêm 0,3ml dung dịch PBS vô trùng. Các lô chuột được

tiêm kháng nguyên hoặc PBS nhắc lại vào các ngày thứ 10 và 35. Năm ngày

1 lần, định kỳ lấy máu đuôi chuột để kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản

ứng ELISA, độ pha loãng huyết thanh cho phản ứng này là 1/600.

Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.8 và đồ thị 3.2.

Bảng 3.8 Kết quả theo dõi ảnh hưởng của liều lượng kháng nguyên đến

đáp ứng miễn dịch của chuột

OD450

* OD450

Liều kháng

Lô TN

(ngày thứ

trung

(ngày thứ

nguyên

35)

60)

bình

10)

nhất)

Lô I 50µg/ml 0,78 0,09 0.50 0,75 1.25

Lô II 100µg/ml 0,86 0,09 0,53 0,82 1,45

Lô III 200µg/ml 0,88 0,10 0,52 0.80 1,53

ĐC PBS 0,06 0,09 0,08 0,06 0,06

Bảng 3.8 cho thấy, hàm lượng kháng nguyên càng cao thì đáp ứng miễn trung bình qua 60 ngày theo dõi dịch của chuột càng mạnh, thể hiện là OD450

của lô chuột được tiêm kháng nguyên với hàm lượng 200µg/ml đạt giá trị cao

nhất là 0,88. Tại thời điểm ngày thứ 60, giá trị OD thể hiện rõ nhất mối tương

quan tỷ lệ thuận giữa hàm lượng kháng thể với hàm lượng kháng nguyên.

Đồ thị 3.2 Biến thiên kháng thể trên chuột được tiêm

kháng nguyên H7 với các hàm lượng khác nhau

Kết quả theo dõi đáp ứng miễn dịch của chuột với kháng nguyên lông

của E.coli O157:H7 thể hiện trong đồ thị 3.2 cho thấy: sau khi gây miễn dịch

cơ sở, kháng thể bắt đầu hình thành và tăng dần, đạt ngưỡng tối đa ở ngày thứ

20 sau đó đáp ứng của chuột với kháng nguyên giảm dần từ ngày thứ 25 và

tiếp tục giảm cho đến ngày thứ 35. Tại thời điểm này, chuột được gây miễn

dịch lần 3. Sau lần tiêm kháng nguyên này, kháng thể trong chuột tăng lên

nhanh và mạnh, cho đến ngày thứ 45 thì tất cả các lô chuột thí nghiệm đều có

giá trị OD450>1. Nhìn chung, biến thiên hiệu giá kháng thể ở chuột được tiêm

kháng nguyên tiên mao cũng tương tự như thỏ, đó là sau khi tiêm nhắc lại lần

2, hiệu giá kháng thể giảm nhẹ sau đó lại tăng dần ở các ngày sau đó.

So sánh về khả năng gây đáp ứng miễn dịch cho chuột ở 3 lô kháng

nguyên chúng tôi thấy có sự sai khác rõ rệt giữa đáp ứng miễn dịch của chuột

ở các lô thí nghiệm và lô đối chứng (P<0,0001). Bên cạnh đó, so sánh giữa

các lô thí nghiệm I và II, I và III cũng thấy có sự khác biệt về lượng kháng thể

tạo thành (p>0,003). Tuy nhiên, khi so sánh đáp ứng miễn dịch tạo thành

trong hai lô chuột II và III lại thấy kháng thể tạo thành trong hai lô này không

khác nhau (p>0,1) (phụ lục bảng xử lý số liệu 2). Như vậy, từ thí nghiệm này,

chúng tôi đã xác định được hàm lượng kháng nguyên thích hợp để gây đáp

ứng miễn dịch trên chuột là 100µg/ml, tương đương với 30µg/chuột.

3.3.2.2 Ảnh hưởng của chất bổ trợ đến khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của

chuột với kháng nguyên H7

Một trong những yếu tố quan trọng giúp tăng khả năng kích thích sinh

đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên đối với động vật đó là chất bổ trợ. Theo

nghiên cứu của Bahnemann và cộng sự, (1987) [9], nhũ dầu Montanide được

xác định là chất mang kháng nguyên, có tác dụng tạo đáp ứng sinh kháng thể

mạnh trong thời gian dài. Bên cạnh đó, Robinson và cộng sự, (1994) [120] lại

chứng minh rằng dầu Freund’s lại có tác dụng kích thích lợn thí nghiệm sinh

đáp ứng mạnh với kháng nguyên.

Trong thí nghiệm để lựa chọn chất bổ trợ kháng nguyên tiêm cho chuột,

chúng tôi thực hiện 3 lô thí nghiệm: 2 lô được tiêm kháng nguyên có chất bổ

trợ là dầu Montanide ISA 70 và Freund's, 1 lô tiêm kháng nguyên pha trong

PBS (để đánh giá khả năng gây miễn dịch của riêng kháng nguyên H7). Các

chất bổ trợ này được phối trộn với kháng nguyên để đạt hàm lượng là

100µg/ml. Ở lô đối chứng âm, chuột được tiêm PBS vô trùng. Định kỳ lấy

máu đuôi chuột 5 ngày/lần để kiểm tra đáp ứng tạo kháng thể. Kết quả thí

nghiệm được thể hiện trong bảng 3.8 và đồ thị 3.3.

Trong 5 ngày đầu sau khi gây miễn dịch, chuột ở tất cả các lô thí

nghiệm sử dụng các chất bổ trợ là Montanide ISA70, Freund's hay kháng

nguyên đơn thuần đều cho đáp ứng miễn dịch tương đối giống nhau. Tuy

nhiên, bắt đầu từ ngày thứ 35 sau khi gây miễn dịch trở đi, chuột ở các lô tiêm

kháng nguyên phối trộn với các chất bổ trợ Montanide ISA70 và FCA đã có

đáp ứng mạnh hơn nhiều so với lô tiêm kháng nguyên pha trong PBS, thể hiện

là giá trị OD450 cao gấp từ 1,8-2,1 lần. So sánh hiệu quả tạo đáp ứng miễn

dịch của lô chuột được tiêm kháng nguyên với chất bổ trợ Montanide và

Freund's chúng tôi thấy giá trị OD450 trung bình ở lô chuột được tiêm kháng

nguyên trong dầu bổ trợ Freund's cao hơn so với lô sử dụng dầu Montanide

ISA70, điều này có nghĩa là hàm lượng kháng thể tạo ra trong lô chuột được

tiêm với dầu Freund’s cao hơn so với lô chuột được tiêm Montanide ISA70.

Tuy nhiên, so sánh kết quả thí nghiệm trên toàn bộ chuột trong hai lô thí

nghiệm này, chúng tôi thấy sự sai khác giữa hai lô này là không đáng kể

(P>0,001) (phụ lục bảng xử lý số liệu 1).

Bảng 3.9 Kết quả theo dõi ảnh hưởng của chất bổ trợ đến đáp ứng

miễn dịch của chuột

* OD450

OD450

Lô TN

trung

(ngày thứ

5)

10)

35)

60)

bình

0,78

0,13

0,48

0,72

1,48

Lô I: ISA70+kháng

nguyên H7

0,86

0,16

0,52

0,8

1,66

Lô II: FCA/FIA

+kháng nguyên H7

0,45

0,11

0,22

0,41

0,78

Lô III: PBS+kháng

0,01

0,006

0,01

nguyên H7

ĐC: PBS

Trong quá trình theo dõi chuột được gây miễn dịch với kháng nguyên

trộn với các chất bổ trợ chúng tôi thấy: chuột ở các lô tiêm kháng nguyên có

bổ sung dầu Freund's có hiện tượng nổ da, viêm loét tại nơi tiêm, hiện tượng

viêm này dẫn tới tình trạng chuột có biểu hiện kém nhanh nhẹn hơn so với lô

đối chứng cũng như 2 lô thí nghiệm còn lại. Bên cạnh đó, qua theo dõi kháng

thể tạo thành trên các cá thể chuột trong cùng lô sử dụng dầu Freund's cho

thấy, ở các ngày lấy máu thứ 45 và 60, hàm lượng kháng thể có xu hướng

giảm nhẹ ở cá thể chuột có hiểu hiện viêm loét, hoại tử vùng tiêm. Vì vậy,

trong thí nghiệm lựa chọn chất bổ trợ kháng nguyên để gây miễn dịch cho

chuột Babl/C, chúng tôi xác định rằng dầu Montanide ISA 70 là chất bổ trợ

thích hợp, gây kích thích tăng đáp ứng miễn dịch của chuột với kháng nguyên

1.5

Lô 1 (ISA70)

Lô 2 (FCA)

Lô 3 (PBS)

ĐC

0.5

D 5

0 D 0

D 1 0

D 1 5

D 2 0

D 2 5

D 3 0

D 3 5

D 4 0

D 4 5

D 5 0

D 5 5

D 6 0

H7 và an toàn với động vật thí nghiệm.

Đồ thị 3.3 Biến thiên hàm lượng kháng thể của chuột được gây miễn

dịch với các chất bổ trợ khác nhau

Tóm lại, nghiên cứu này đã xác định được liều tiêm kháng nguyên cho

chuột là 30µg/con, chất bổ trợ kháng nguyên là Montanide ISA70. Kháng

nguyên được đưa vào cơ thể chuột bằng đường tiêm vào xoang phúc mạc.

3.3.3 Nghiên cứu các điều kiện lai tế bào lách chuột mẫn cảm với kháng

nguyên H7 và tế bào u tủy chuột

Về nguyên tắc chung, để dung hợp tế bào, người ta phải sử dụng các tế

bào có cùng nguồn gốc loài (De Geus và cộng sự, 1998) [33]. Trong nghiên

cứu này, chúng tôi đã tiến hành lai tế bào lách chuột Babl/C mẫn cảm với

kháng nguyên H7 của vi khuẩn E.coli O157:H7 và tế bào u tủy chuột dòng Sp

2/0-Ag14.

Theo nghiên cứu của Pontecorvo, (1975) [107], polyethylene glycol

được sử dụng làm hóa chất gây dung hợp màng tế bào lách chuột với tế bào u

tủy củng chuột cùng loài, sau đó lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho

tế bào dung hợp phát triển. Do tế bào u tuỷ chuột mất hoạt tính tổng hợp

hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl transferase (HGPRT) là enzyme cần

thiết cho quá trình tổng hợp các purin theo con đường tái sử dụng các base

nitơ có sẵn (salvage pathway), vì vậy tế bào này chỉ tổng hợp purin theo con

đường mới tức là tạo ra các base nitơ từ các gốc đường và axit amin (de novo

synthesis). Dựa vào đặc tính này, sau quá trình lai tế bào lách chuột và u tủy

chuột, tế bào lai được nuôi trong môi trường có chứa aminopterin là chất ức

chế hoạt động của enzyme hydrofolate reductase (HFR- enzyme tham gia vào

quá trình tổng hợp các purin theo con đường mới) làm cho tế bào u tủy chuột

mất cả hai cách tổng hợp base nitơ và chết, còn các tế bào u tủy chuột đã lai

với tế bào lympho B thì vẫn tiếp tục phát triển do tế bào lai này có khả năng

tổng hợp HGPRT. Đồng thời, trong môi trường nuôi cấy nhân tạo, các tế bào

lách chuột cũng không phát triển được do vòng đời của chúng rất ngắn.

Vấn đề đặt ra là: khi dung hợp tế bào thì điều kiện nào? yếu tố nào sẽ

ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lai? các yếu tố đó kết hợp với nhau như

thế nào thì hiệu quả của quá trình dung hợp là tối ưu nhất?

3.3.31 Xác định hàm lượng amon clorua thích hợp để loại bỏ hồng cầu trong

lách chuột Babl/c

Lách thuộc hệ thống miễn dịch của cơ thể, là một trong những nơi tế

bào lympho B tiếp xúc với kháng nguyên và chuyển dạng thành tương bào để

sản sinh kháng thể. Bên cạnh đó, cơ quan này cũng là nơi phân hủy các tế bào

hồng cầu già, chết. Vì vậy, quá trình thu nhận tương bào trong tế bào lách của

chuột được gây đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên phải thực hiện bước loại

bỏ các tế bào hồng cầu.

Lách sau khi được lấy ra khỏi cơ thể chuột ngay lập tức được đưa vào

môi trường DMEM không có huyết thanh và nghiền bằng dụng cụ chuyên

dụng rồi để lắng trong khoảng 5 phút và thu dịch nổi. Để loại bỏ hồng cầu

trong dịch nổi này, chúng tôi tiến hành thí nghiệm thăm dò với hai dung dịch:

i) muối amon clorua (NH4Cl) 0,83%; ii) hỗn hợp các muối NH4Cl 0,8%,

KHCO3 0,1%, EDTA 0,37% với các tỷ lệ khác nhau nhằm xác định yếu tố

gây dung giải hồng cầu và hàm lượng thích hợp nhất cho sự loại bỏ tế bào

này.

Hỗn hợp tế bào trong lách chuột ở các thí nghiệm xử lý phá hủy hồng

cầu được nhuộm bằng thuốc nhuộm Trypan Blue và đếm số bằng buồng đếm

hồng cầu để xác định số lượng tế bào sống và số lượng tế bào hồng cầu còn

sót lại. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.10.

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của các loại muối và nồng độ đến khả năng

phá vỡ hồng cầu trong lách chuột

Tỷ lệ Tỷ lệ hồng Tỷ lệ tế bào cầu ly giải Chất bổ sung (chất bổ sung: tế sống (%) bào lách v/v) (%)

80 82,4 1:1

NH4Cl 0,83% (I)

87 81 2:1

92,6 76 3:1

93 59 4:1

98 51 5:1

82,4 82 1:1

NH4Cl

0,8%+KHCO3

99,7 80,2 2:1

0,1%+EDTA 0,37% (II)

100 74 3:1

100 55 4:1

100 47 5:1

Với mục đích cuối cùng của quá trình tách tế bào lách là để tạo ra được

các dòng tế bào lai giữa tế bào u tủy chuột và tế bào lympho B, vì vậy, yêu

cầu của quá trình này không chỉ đơn thuần là loại bỏ tế bào hồng cầu mà còn

phải giữ được số lượng tế bào sống đủ nhiều để đạt được yếu tố thành công

trong quá trình dung hợp. Kết quả trong bảng 3.8 chỉ rõ: khả năng dung giải tế

bào hồng cầu của cả hai dung dịch đều tỷ lệ thuận với nồng độ các muối thành

phần. Tuy vậy, nồng độ các muối bổ sung lại tỷ lệ nghịch với sức sống của tế

bào lách. So sánh hiệu quả dung giải hồng cầu của 2 dung dịch này chúng ta

thấy: dung dịch II chứa NH4Cl 0,8%+KHCO3 0,1%+EDTA 0,37% có khả

năng dung giải hồng cầu mạnh hơn dung dịch I chứa NH4Cl 0,83%, ở tỷ lệ xử

lý cao nhất là 5:1 (dung dịch ly giải hồng cầu: hỗn hợp tế bào lách) thì dung

dịch II đã dung giải 100% tế bào hồng cầu trong khi đó dung dịch I mới chỉ

dung giải được 98%. Tuy nhiên, quan sát thí nghiệm xử lý hồng cầu bằng

dung dịch II chúng tôi thấy: mặc dù 100% tế bào hồng cầu trong hỗn hợp tế

bào lách chuột Babl/c bị phá hủy ở điều kiện sử dụng dung dịch này theo tỷ lệ

3:1 trở lên nhưng ở các điều kiện này, tỷ lệ tế bào sống giảm đi rất nhiều, cụ

thể ở nồng 2:1 chỉ có 19,8% tế bào chết thì đến tỷ lệ 3:1 đã có 26% tế bào

chết, và ở tỷ lệ 5:1 thì có tới 43% số lượng tế bào trong hỗn hợp tế bào thu từ

lách chuột chết.

Như vậy, từ kết quả ở bảng 3.8 có thể kết luận rằng: dung dịch II

(NH4Cl 0,8%+KHCO3 0,1%+EDTA 0,37%) có khả năng dung giải hồng cầu

chuột tốt nhất, và tỷ lệ xử lý thích hợp là 2:1 (v/v). Ở điều kiện này 99,7% tế

bào hồng cầu bị dung giải và số lượng tế bào sống đạt 80,2%.

3.3.3.2 Xác định các điều kiện tối ưu để dung hợp tế bào

Theo báo cáo của Kohler và Milstein, (1975) [66] quá trình dung hợp tế

bào lách và u tủy chuột có thể xảy với sự tương tác của virus Sendai bất hoạt,

tuy vậy, polyethylene glycol (PEG) được Pontecorvo và cộng sự, (1975)

[107] xác định là yếu tố gây dung hợp tế bào tốt nhất. Bên cạnh đó, Davidson

và cộng sự, (1976) [30] đã đưa ra kết luận là trọng lượng phân tử, hàm lượng,

điều kiện xúc tác của chất này cho quá trình dung hợp các loại tế bào khác

nhau lại rất khác nhau. Một số loại PEG khi làm nóng chảy để sử dụng có thể

sản sinh ra các chất độc như aldehyde hoặc tích lũy peroxide làm giảm hiệu

quả của quá trình lai. Theo báo cáo của Mercer và cộng sự, (1979) [80], PEG

1450 của Sigma cho hiệu quả dung hợp tốt, ổn định, tuy nhiên, tác giả này

cũng cho rằng: hàm lượng PEG, nhiệt độ và thời gian xử lý PEG cũng ảnh

hưởng lớn đến kết quả của các quá trình lai.

Ngoài ảnh hưởng của PEG, quá trình lai tế bào cũng bị ảnh hưởng

nhiều bởi tỷ lệ các tế bào u tủy chuột và lách chuột do cách tổng hợp vòng

purin của 2 nhóm tế bào này khác nhau.

Thí nghiệm xác định điều kiện tối ưu cho quá trình lai tế bào lách và u

tủy chuột được chúng tôi thiết kế bằng phần mềm Design-Expert 7.1.6 (State-

Ease, Inc, Mineapolis, Mỹ) với 4 điều kiện và yếu tố khảo sát sau: i) hàm

lượng PEG 1450 50% (Sigma code P2906), ii) tỷ lệ tế bào u tủy chuột

(myeloma) dòng Sp 2/0-Ag14, iii) thời gian dung hợp, iv) nhiệt độ dung hợp.

Sau quá trình dung hợp tế bào, các ống phản ứng được để trong hộp đá

và giữ ở điều kiện nhiệt độ này trong 2 phút, rồi bổ sung môi trường MEM (370C) và lắc trong tủ ấm trong 5 phút trước khi giữ ống tế bào ở trạng thái tĩnh ở nhiệt độ 370C trong 15 phút. Ly tâm ống lai tế bào và loại bỏ dịch nổi

để loại bỏ PEG 1450 thừa.

Thu 100µl tế bào sau ly tâm và bổ sung 50ml môi trường MEM-HAT có

chứa các thành phần chính gồm: 70% MEM, 20% huyết thanh bào thai bê,

hypoxanthin, aminopretin, thymin, insulin, acid oxaloacetic và sodium

pyruvate. Trộn đều tế bào vào môi trường và chia vào các đĩa nuôi. Theo dõi

tỷ lệ các giếng có tế bào sống để đánh giá hiệu quả của quá trình dung hợp.

Các phương án thí nghiệm được thực hiện theo ma trận Box-Behnken

trong bảng 3.11.

Bảng 3.11 Kết quả theo dõi ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm

Thí nghiệm

Nhiệt độ (0C)

Thời gian (giây)

Hàm lượng PEG 50% (%)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

20 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 20 12,5 5 5 20 12,5 5 12,5 12,5 12,5 5 12,5 5 5 20 12,5 20 12,5 12,5 20

Tỷ lệ myeloma (%) 50 50 50 30 30 30 10 10 30 30 30 30 30 50 30 10 50 50 10 30 30 10 30 10 30 30

24 24 18 24 30 18 24 30 30 24 30 30 18 24 18 18 24 30 24 24 18 24 24 24 24 24

Tỷ lệ giếng có tế bào sống (%) 18 17 18 24 14 12 4 12 24 20 10 5 16 6 6 5 12 7 8 16 7 8 11 9 22 15

120 60 120 120 60 60 120 120 120 180 120 180 120 180 180 120 120 120 120 60 120 180 180 60 120 60

đến quá trình dung hợp tế bào

Phân tích phương sai của mô hình thí nghiệm được trình bày trong

bảng 3.10 cho thấy: mô hình thực nghiệm được xác định trong bảng này là

phù hợp với giá trị F là 2,76 và mức có ý nghĩa P<0,05. Các thông số hàm

lượng PEG 50%, tỷ lệ myeloma trên tổng số tế bào tham gia dung hợp, nhiệt

độ và thời gian đều ảnh hưởng ít nhiều đến quá trình dung hợp tế bào. Tuy

nhiên kết quả trong bảng cũng khẳng định rằng chỉ có các yếu tố tỷ lệ

myeloma tham gia dung hợp, nhiệt độ và thời gian mới có ảnh hưởng lớn đến

quá trình dung hợp (P<0,1), trong đó yếu tố tỷ lệ myeloma ảnh hưởng mạnh

nhất đến kết quả lai với giá trị MS lớn nhất (256,48), sau đó là nhiệt độ và

thời gian dung hợp. Còn yếu tố PEG thì lại không có ảnh hưởng nhiều đến

quá trình này (bảng 3.12).

SS df MS F Mức có

0.0614 0.0547 0.6016 0.0970

1 1 1 1

4.34 4.62 0.29 3.29

80.08 85.33 5.33 60.75

80.08 B-Ty le cac te bao 85.33 5.33 C-Nhiet do 60.75 D-Thoi gian

0.2692 0.5724 0.3719 0.0602 0.2692 0.7336

25.00 6.25 16.00 81.00 25.00 2.25

1.35 0.34 0.87 4.39 1.35 0.12

1 1 1 1 1 1

0.1673 0.0033 0.0121 0.0168

2.19 13.89 8.99 7.93

0.2410

10.05

40.37 256.48 165.94 146.37 18.46 20.11 2.00

40.37 256.48 165.94 146.37 203.08 201.08 2.00 916.46

1 1 1 1 11 10 1 25

Bảng 3.12 Phân tích mô hình thí nghiệm dung hợp tế bào

Thông số Chuẩn ý nghĩa Mô hình 713.38 14 50.96 2.76 0.0488 Tuyến tính A-PEG 50% Tương tác AB AC AD BC BD CD Bình phương A2 B2 C2 D2 Residual Lack of Fit Pure Error Cor Total

Bên cạnh đó, phân tích số liệu bằng phần mềm tối ưu DX 7.3.1 để xác

định các điều kiện thí nghiệm, chúng tôi đã dựng được các đồ thị biểu thị mối

tương quan giữa các yếu tố thí nghiệm với kết quả thu được (hình 3.12).

Trong các đồ thị này, phổ màu đỏ là vùng biểu thị hiệu quả của quá trình dung

hợp cao nhất, màu xanh nước biển biểu thị mức độ thấp nhất. Khi phân tích

sự ảnh hưởng của từng cặp yếu tố thí nghiệm đến kết quả dung hợp tế bào

trên các đồ thị trong hình 3.12 chúng tôi nhận thấy:

- Xét ảnh hưởng của tỷ lệ tế bào myeloma và tỷ lệ PEG 1450 50% thì

điều kiện thích hợp nhất về tỷ lệ hàm lượng của hai thành phần này là: tỷ lệ tế

bào myeloma: 30% và tỷ lệ PEG 1450 50%: 12,5% (hình 3.12a).

- Xét ảnh hưởng của nhiệt độ dung hợp và tỷ lệ PEG 1450 50% thì điều

kiện thích hợp nhất về tỷ lệ hàm lượng của hai thành phần này là: nhiệt độ dung hợp: 240C và tỷ lệ PEG 1450 50%: 12,5% (hình 3.12b).

- Xét ảnh hưởng của thời gian dung hợp và tỷ lệ PEG 1450 50% thì

điều kiện thích hợp nhất về tỷ lệ hàm lượng của hai thành phần này là: thời

gian dung hợp: 240 giây và tỷ lệ PEG 1450 50%: 12,5% (hình 3.12c).

- Xét ảnh hưởng của nhiệt độ dung hợp và tỷ lệ myeloma thì điều kiện

thích hợp nhất về tỷ lệ hàm lượng của hai thành phần này là: nhiệt độ dung hợp: 240C và tỷ lệ tế bào myeloma: 30% (hình 3.12d).

- Xét ảnh hưởng của thời gian dung hợp và tỷ lệ myeloma thì điều kiện

thích hợp nhất về tỷ lệ hàm lượng của hai thành phần này là: thời gian dung

hợp: 120 giây và tỷ lệ tế bào myeloma: 30% (hình 3.12e).

- Xét ảnh hưởng của thời gian dung hợp và nhiệt độ dung hợp thì điều

kiện thích hợp nhất về tỷ lệ hàm lượng của hai thành phần này là: thời gian dung hợp: 120 giây và nhiệt độ dung hợp: 240C (hình 3.12f).

Phân tích ảnh hưởng của tất cả các yếu tố thí nghiệm đến kết quả dung

hợp tế bào, chúng tôi xác định được các yếu tố thời gian và nhiệt độ là: 120 giây và 240C; tỷ lệ hàm lượng các yếu tố dung hợp là: PEG 1450 50%:

12,5%, myeloma dòng Sp/2.0-Ag14: 30% là các yếu tố thích hợp nhất cho

khả năng dung hợp tế bào.

Ty le gieng co te bao song

180.00

30.00

50.00

17.2721

Design-Expert® Software Original Scale Ty le gieng co te bao song

15.4857

Design Points 24

150.00

27.00

40.00

20.4548

o a b

n a

X1 = A: PEG 50% X2 = D: Thoi gian

X1 = A: PEG 50% X2 = C: Nhiet do

X1 = A: PEG 50% X2 = B: Ty le cac te bao

o d t e

21.444

120.00

24.00

30.00

o h T

h N

t c a c

Actual Factors B: Ty le cac te bao = 30.00 C: Nhiet do = 24.00

Actual Factors B: Ty le cac te bao = 30.00 D: Thoi gian = 120.00

l y T

Actual Factors C: Nhiet do = 24.00 D: Thoi gian = 120.00

90.00

21.00

20.00

17.2721

14.0895

17.1164

18.2031

10.9069

60.00

14.9526

18.00

5.00

8.75

12.50

16.25

10.00

5.00

8.75

12.50

16.25

5.00

8.75

12.50

16.25

A: PEG 50%

Ty le gieng co te bao song

180.00

30.00

180.00

9.44634

15.9766

11.1311

Design-Expert® Software Original Scale Ty le gieng co te bao song

13.5539

15.089

12.2677

18.3994

Design Points 24

17.9103

150.00

27.00

150.00

n a

X1 = B: Ty le cac te bao X2 = D: Thoi gian

X1 = B: Ty le cac te bao X2 = C: Nhiet do

X1 = C: Nhiet do X2 = D: Thoi gian

o d t

g i

120.00

24.00

120.00

o h T

h N

o h T

15.9324

Actual Factors A: PEG 50% = 12.50 C: Nhiet do = 24.00

Actual Factors A: PEG 50% = 12.50 D: Thoi gian = 120.00

Actual Factors A: PEG 50% = 12.50 B: Ty le cac te bao = 30.00

90.00

21.00

90.00

12.2826

12.2677

15.9766

8.63285

19.5821

20.8221

9.44634

20.7317

(b) (c) (a)

4.98309

13.5539

60.00

18.00

60.00

10.00

20.00

30.00

40.00

10.00

20.00

30.00

40.00

18.00

21.00

24.00

27.00

B: Ty le cac te bao

C: Nhiet do

(e) (f) (d)

Hình 3.12 Ảnh hưởng của các điều kiện và yếu tố dung hợp đến quá trình

lai tế bào

Tóm lại, điều kiện tối ưu cho quá trình dung hợp tế bào lách chuột mẫn

cảm với kháng nguyên H7 với myeloma dòng Sp/2.0-Ag14 là PGE 1450 50%: 12,5%, tỷ lệ myeloma 30%, nhiệt độ 240C, thời gian 120 giây.

3.3.4 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển của tế bào lai

và khả năng sản sinh kháng thể

Ở điều kiện bình thường, quá trình tổng hợp nucleotide dạng purin

(Adenin và Guanin) ở tất cả các tế bào đều xảy ra thông qua 2 con đường:

tổng hợp mới (de novo synthesis) và tái tổng hợp (salvage pathway) base nitơ

từ các base có sẵn. Tuy nhiên, như trên đã phân tích, ở tế bào u tủy chuột, quá

trình này chỉ xảy ra bởi con đường mới, vì vậy trong tế bào này thiếu enzyme

hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl transferase (HGPRT) để tạo ra các

base nitơ theo con đường tái tổng hợp. Bên cạnh đó, khả năng tổng hợp

enzyme tham gia vào vào con đường mới là hydrofolate reductase (HFR) lại

rất dễ dàng bị mất đi bởi aminopretin. Dựa vào đặc điểm này, người ta bổ

sung thêm aminopterin vào công thức của môi trường nuôi cấy tế bào sau khi

lai để loại bỏ các tế bào u tủy chuột không dung hợp. Bên cạnh đó, để đảm

bảo cho các tế bào lai phát triển, trong công thức môi trường nuôi nhân tạo tế

bào lai, người ta bổ sung thêm các yếu tố: hypoxanthin (H) và thymin (T) là

các vật liệu tổng hợp enzyme và nucleotide cho quá trình phát triển của các tế

bào lai (Littlefield, 1964) [72]. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng môi

trường HAT (Invitrogen code: 21060017) có hàm lượng các chất cụ thể là:

50mM disodium hypoxanthin, 20mM aminopretin, 0,8mM thymin.

Tuy nhiên, người ta thấy rằng các yếu tố bổ sung vào môi trường nuôi tế

bào lai ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng cũng như sinh kháng thể của

loại tế bào này. Theo tác giả Hayter và cộng sự, (1992) [49], khả năng sinh

kháng thể không lệ thuộc vào khả năng sinh trưởng của tế bào lai; và hàm

lượng huyết thanh trong môi trường nuôi có ảnh hưởng tỷ lệ thuận với hàm

lượng kháng thể tạo thành nhưng tỷ lệ nghịch với khả năng phát triển của tế

bào.

Ngoài ra, các yếu tố ảnh sinh trưởng tế bào như insulin, acid oxaloacetic

và sodium pyruvate cũng được bổ sung vào môi trường nuôi dưỡng tế bào lai

Yoshihito Kihiwaraki, (2002) [147]. Còn theo tác giả Fazekaz và cộng sự,

(1980) [40], các đại thực bào trong xoang phúc mạc chuột cũng chứa các yếu

tố kích thích sự phát triển của tế bào lai.

Vấn đề đặt ra là, với hàm lượng huyết thanh là bao nhiêu? sử dụng các

yếu tố sinh trưởng như thế nào để tế bào lai có khả năng sinh trưởng ổn định

và sinh kháng thể với hàm lượng cao? Để xác định yếu tố này, chúng tôi bố trí

các thí nghiệm nuôi tế bào lai trong môi trường MEM-HAT có bổ sung OPI

50X (0.15g oxaloacetate, 0.05g pyruvate và 0.0082g bovine insulin) (Sigma,

code. 5003) và đại thực bào thu từ xoang phúc mạc chuột (hình 3.13).

Từ các cơ sở lý thuyết trên, trong nghiên cứu này, chúng tôi bố trí thí

nghiệm với 3 yếu tố sau: i) tỷ lệ hàm lượng huyết thanh thai bê (FCS); ii) tỷ lệ hàm lượng OPI; iii) tỷ lệ hàm lượng đại thực bào (ĐTB) (mật độ 105 tế

bào/ml). Theo dõi các chỉ tiêu mật độ tế bào lai và hiệu giá kháng thể đặc hiệu

(thông qua hiệu giá ELISA với OD450>0,4). Các thí nghiệm được bố trí theo

bảng 3.13.

Bảng 3.13 Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của các yếu tố bổ sung đến quá

Mật độ tế

Hàm lượng

Hiệu giá

Thí nghiệm

FCS (%)

OPI (%)

ELISA

Hàm lượng ĐTB (%)

bào sau 10 ngày (106

TB/ml)

0.96

640

30.00

3.00

10.00

0.88

1280

20.00

1.00

15.00

0.86

640

20.00

1.00

5.00

0.92

640

30.00

2.00

5.00

0.51

640

10.00

1.00

10.00

0.88

640

30.00

1.00

10.00

0.54

640

10.00

2.00

5.00

1.06

1280

20.00

3.00

15.00

1.2

1280

20.00

2.00

10.00

0.97

1280

20.00

3.00

5.00

1.1

1280

20.00

2.00

10.00

0.6

640

10.00

2.00

15.00

1.22

1280

30.00

2.00

15.00

0.58

640

10.00

3.00

10.00

trình sinh trưởng và sinh kháng thể của tế bào lai

Các ống tế bào lai được nuôi trong các môi trường với thành phần khác

nhau, theo dõi trong vòng 10 ngày, mỗi ngày bổ sung thêm môi trường 1 lần.

Kết quả thí nghiệm cho thấy: khả năng sinh trưởng của tế bào lai bị ảnh

hưởng lớn bởi hai thành phần: i) hàm lượng huyết thanh và ii) các tác nhân

tăng trưởng có trong OPI là insulin, oxaloacetic acid và pyruvate (p≤0,05);

còn khả năng sản sinh kháng thể đặc hiệu lại phụ thuộc vào 2 thành phần: i)

hàm lượng đại thực bào bổ sung vào môi trường nuôi và ii) hàm lượng huyết

thanh (p≤0,05). Kết quả này cho thấy, huyết thanh là yếu tố quan trọng, nó

ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào và hoạt động sinh lý của tế bào lai, còn các tác

nhân tăng trưởng thì chỉ ảnh hưởng đến chu kỳ sinh sản của tế bào mà không

ảnh hưởng nhiều đến khả năng sinh kháng thể đặc hiệu. Thí nghiệm này cũng

chỉ rõ, đại thực bào là tác nhân kích thích sản sinh kháng thể đặc hiệu của tế

bào lai in vitro, kết quả này tương tự với hoạt động đáp ứng miễn dịch in vivo.

Hình 3.13 Đại thực bào thu nhận từ ổ bụng chuột BALB/c

Phân tích kết quả thí nghiệm trong bảng 3.12 bằng phần mềm xác định

các điều kiện thí nghiệm tối ưu DX. 7.3.1, chúng tôi đã dựng được các đồ thị

biểu thị mối tương quan giữa các yếu tố thí nghiệm với kết quả thu được (hình

3.14). Trong các đồ thị này phổ màu đỏ là vùng biểu thị mức độ sinh trưởng

và sinh kháng thể của tế bào lai cao nhất, màu xanh nước biển biểu thị mức độ

thấp nhất.

* Theo dõi khả năng sinh trưởng của tế bào (hình 3.14a, b, c):

- Xét ảnh hưởng của huyết thanh thai bê và các yếu tố tăng trưởng trong

OPI thì điều kiện thích hợp nhất về tỷ lệ hàm lượng của hai thành phần này

là: huyết thanh thai bê: 20%, OPI: 2% (hình 3.14a).Xét ảnh hưởng của huyết

thanh thai bê và đại thực bào thì điều kiện thích hợp nhất về tỷ lệ hàm lượng

của hai thành phần này là: huyết thanh thai bê: 20%, đại thực bào: 10% (hình

3.14b).

- Xét ảnh hưởng của OPI và đại thực bào thì điều kiện thích hợp nhất về

tỷ lệ hàm lượng của hai thành phần này là: OPI: 2%, đại thực bào: 10% (hình

3.14c).

Phân tích ảnh hưởng của tất cả các yếu tố thí nghiệm đến kết quả nuôi tế

bào lai chúng tôi xác định được hàm lượng các chất bổ sung vào môi trường

MEM-HAT thích hợp nhất cho sự phát triển của tế bào lai là: huyết thanh thai

bê 20%, OPI 2% (oxaloacetic 0,3g/100ml, sodium pyruvate 0,1g/100ml,

insulin 200UI/100ml), đại thực bào 10%.

* Theo dõi khả năng sinh kháng thể đặc hiệu của tế bào lai với kháng

nguyên H7:

- Xét ảnh hưởng của huyết thanh thai bê và các yếu tố tăng trưởng trong

OPI thì điều kiện thích hợp nhất về tỷ lệ hàm lượng của hai thành phần này

là: huyết thanh thai bê: 20%, OPI: 2% (hình 3.14d).

- Xét ảnh hưởng của huyết thanh thai bê và đại thực bào thì điều kiện

thích hợp nhất về tỷ lệ hàm lượng của hai thành phần này là: huyết thanh thai

bê: 20%, đại thực bào: 10% (hình 3.14e).

- Xét ảnh hưởng của OPI và đại thực bào thì điều kiện thích hợp nhất về

tỷ lệ hàm lượng của hai thành phần này là: OPI: 2%, đại thực bào: 10% (hình

3.14f).

Khả năng sinh trưởng

Design-Expert® Software

at do te bao/ml

3.00

15.00

at do te bao/ml

Design Points 1.22

0.51

2.50

12.50

0.51

12.50

X1 = A: FCS X2 = B: OPI

X1 = B: OPI X2 = C: DTB

X1 = A: FCS X2 = C: DTB

B T

P O

2.00

10.00

B T

0.830425

0.808235

10.00

0.953483

0.912353 1.01647

Actual Factor C: DTB = 10.00

1.00877

Actual Factor A: FCS = 20.00

Actual Factor B: OPI = 2.00

0.707367

1.07654

0.954594

1.11711

1.50

7.50

1.12059

7.50

1.06294

1.00877

0.704118

0.584308

0.900422

(c)

(b)

(a)

0.954594

1.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

1.00

1.50

2.00

2.50

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

A: FCS

B: OPI

A: FCS

Khả năng sinh kháng thể đặc hiệu

Hieu gia ELISA

3.00

15.00

Design-Expert® Software Original Scale Hieu gia ELISA

Design Points 1280

640

2.50

640

12.50

640

12.50

1328.33

1318.33

X1 = A: FCS X2 = B: OPI

X1 = B: OPI X2 = C: DTB

X1 = A: FCS X2 = C: DTB

B T

2.00

10.00

863.333

1015

10.00

B T D

886.65

1022.2

Actual Factor C: DTB = 10.00

Actual Factor A: FCS = 20.00

Actual Factor B: OPI = 2.00

1206.67

751.1

1085

1.50

7.50

963.333

1157.75

1166.67

841.667

615.55

(e)

(f)

(d)

1.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

1.00

1.50

2.00

2.50

10.00

15.00

20.00

25.00

A: FCS

B: OPI

A: FCS

Hình 3.14 Ảnh hưởng của các thành phần bổ sung vào môi trường nuôi

đến khả năng sinh trưởng và sinh kháng thể của tế bào lai

Phân tích ảnh hưởng của tất cả các yếu tố thí nghiệm đến kết quả nuôi tế

bào lai chúng tôi xác định được hàm lượng các chất bổ sung vào môi trường

MEM-HAT thích hợp nhất cho khả năng sản sinh kháng thể đặc hiệu của tế

bào lai cũng như khả năng sinh trưởng là: huyết thanh thai bê 20%, OPI 2%

(tương đương với oxaloacetic 0,3g/100ml, sodium pyruvate 0,1g/100ml,

insulin 200UI/100ml), đại thực bào 10%.

Kết hợp các yếu tố trên, chúng tôi cho rằng: công thức môi trường thích

hợp nhất cho sự phát triển và sinh kháng thể của tế bào lai là: MEM 70%,

HAT 50x 2%, huyết thanh thai bê 20%, đại thực bào 10%, OPI 2%, kháng

sinh và kháng nấm 0,2%. Và công thức môi trường này được sử dụng nuôi tế

100

bào lai và theo dõi quá trình sinh trưởng và sinh kháng thể của tế bào. Hàng

ngày kiểm tra các đĩa nuôi cấy để bổ sung môi trường. Sau 5 ngày, bắt đầu

kiểm tra sự phát triển của tế bào trong đĩa, đồng thời xác định hiệu giá kháng

thể bằng phản ứng ELISA. Kết quả theo dõi tế bào lai sau 15 ngày được trình

1800

1600

1260

1400

1280

1200

1260

970

1246

1280

1000

800

Mật độ tế bào ( TBx 1000)

Hiệu giá kháng thể

600

640

400

Ngày

200

bày trong đồ thị 3.4.

Đồ thị 3.4 Kết quả theo dõi sự sinh trưởng và sinh kháng thể của các

dòng tế bào lai

Kết quả trong đồ thị thể hiện: tế bào sinh trưởng và đạt mật độ tối đa (1,2 x106 tế bào/ml) từ ngày thứ 9 (hình 3.15), sau đó tiếp tục bổ sung môi

trường dinh dưỡng và nuôi cho đến ngày thứ 15 thì mật độ tế bào vẫn không

thay đổi. Theo dõi hiệu giá kháng thể cho phản ứng ELISA (OD450≥0,4)

chúng tôi thấy giá trị này tăng nhanh trong 11 ngày nuôi cấy đầu tiên và đạt

ngưỡng tối đa (1/1600) tại ngày thứ 11, sau đó giá trị này giảm ở ngày thứ 13

và duy trì mức đó cho đến ngày thứ 15. Ở đây chúng tôi thấy, tại thời điểm

theo dõi vào ngày thứ 13, mật độ tế bào cũng giảm nhẹ so với ngày thứ 11,

như vậy, có thể là khả năng sinh trưởng của tế bào có tỷ lệ thuận với khả năng

sinh kháng thể đặc hiệu.

101

Kết luận: Môi trường HAT có thành phần gồm có: MEM 70%, HAT

50x 2%, huyết thanh thai bê 20%, đại thực bào 10%, OPI 2%, kháng sinh và

kháng nấm 0,2%, là môi trường thích hợp cho cả khả năng sinh trưởng và

khả năng sinh kháng thể đặc hiệu của tế bào lai

Hình 3.15 Tế bào lai

3.3.5 Kết quả tách dòng tế bào lai và kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể

đơn dòng với kháng nguyên H7

Từ kết quả của nghiên cứu về các điều kiện dung hợp tế bào lách với u tủy

chuột và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và ổn định của các tế bào lai

chúng tôi tiếp tục tách dòng các tế bào để sản xuất kháng thể đơn dòng đặc

hiệu.

Khi tế bào lai được tách dòng và tiếp tục nuôi để tạo ra kháng thể đơn

dòng thì môi trường sử dụng lại là MEM-HT (HT 50x: hypoxanthin 100mM

và thymin 1,5mM) (Invitrogen, cod.11067030), lúc này aminopterin không

cần thiết phải có mặt trong môi trường nuôi cấy tế bào do các tế bào u tủy

chuột không dung hợp đã bị loại bỏ trong quá trình nuôi sau dung hợp.

Chúng tôi đã tách dòng tế bào bằng phương pháp pha loãng tới hạn sao cho

mật độ đạt 5 tế bào/ml môi trường MEM- HT rồi chia vào các giếng của đĩa

96 giếng với lượng 100µl/giếng. Các đĩa nuôi tế bào này được đưa vào tủ ấm CO2 5% ở 370C để tiếp tục nuôi, hàng này kiểm tra đĩa nuôi tế bào và bổ sung

môi trường dinh dưỡng. Các dòng tế bào được phát hiện từ ngày nuôi cấy thứ

102

5 (hình 3.16), và bắt đầu kiểm tra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên H7

của vi khuẩn E.coli O157:H7 từ ngày nuôi cấy thứ 11 bằng phản ứng ELISA,

các giếng tế bào nuôi cấy có từ 2 khuẩn lạc trở lên không kiểm tra kháng thể.

Kết quả kiểm tra kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên H7 được

trình bày trong bảng 3.14.

Bảng 3.14 Kết quả tách dòng các tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng

Tỷ lệ dòng tế bào sinh kháng thể (%) Tỷ lệ

dòng tế

Đợt tách bào không OD450 0,2≥OD450 0,4≥OD450 dòng sinh >0,8 OD450<0.2 ≤0.4 ≤0,8 kháng thể

(%)

Đợt I 68 16 12 2 2

Đợt II 72 20 4 3 1

Đợt III 63 19 16 2 0

Đợt IV 79 12 4 4 1

Đợt V 82 13 4 0 1

Từ 5 đợt tách dòng tế bào lai nuôi trong môi trường MEM-HT chúng

tôi nhận thấy: phần lớn các tế bào này không sản sinh kháng thể, chiếm tỷ lệ

từ 63-82%. Số tế bào có khả năng sinh kháng thể thì với hàm lượng thấp

(OD450<0,2) cũng chiếm đa số, số tế bào sinh kháng thể với hàm lượng cao

(OD450>0,8) chỉ đạt từ 1-2%. Từ kết quả tách dòng này, chúng tôi lựa chọn

các dòng tế bào có khả năng sản sinh kháng thể với hàm lượng cao

(OD450>0,8) để xác định độ đặc hiệu của các kháng thể đơn dòng.

103

Sau khi tách dòng các tế bào và lựa chọn được 10 dòng có khả năng

sinh kháng thể kháng kháng nguyên H7 của vi khuẩn E.coli O157:H7 mạnh

nhất, các kháng thể đơn dòng được sinh ra trong dịch nuôi cấy tế bào được

đánh giá độ đặc hiệu bằng phản ứng ELISA và Western blot với 4 chủng

E.coli O157:H7 phân lập ở Hà Nội và một số chủng vi khuẩn gram âm khác

như: Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Vibrio cholerae, E.coli

K88 , E.coli K99, E.coli 987p. Kết quả trình bày ở bảng 3.15 và hình 3.16.

Hình 3.16 Dòng tế bào sau 5 ngày tách dòng

Kết quả trong bảng 3.14 cho thấy: cả 10 dòng kháng thể đều phát hiện

duy nhất vi khuẩn E.coli O157:H7 mà không phát hiện được các vi khuẩn

gram âm cũng như các chủng vi khuẩn E.coli khác, điều này chứng tỏ, các

kháng thể đơn dòng tạo ra có độ đặc hiệu 100% với vi khuẩn E.coli O157:H7.

Tuy nhiên, phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên của các

chủng vi khuẩn E.coli O157:H7 của các dòng kháng thể là khác nhau, một số

dòng như C6.16.I, C3.16.II, D8.16.II và B11.26.III cho kết quả phát hiện vi

khuẩn E.coli O157:H7 ở các giá trị OD450 khác nhau và không ổn định. Vì

vậy, căn cứ vào tính đặc hiệu, mức độ ổn định khi phát hiện vi khuẩn, chúng

tôi có nhận xét rằng, hai kháng thể đơn dòng A10.16.I và C3.26.IV là đặc

hiệu nhất với vi khuẩn E.coli O157:H7.

Kết quả phát hiện tiểu phần kháng nguyên kích thích sinh kháng thể

đơn dòng đặc hiệu bằng phản ứng Western blot cho thấy: tiểu phần kháng

104

nguyên có trọng lượng khoảng 65 kDa chính là tiểu phần kích thích sinh

kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên H7, kết quả này hoàn toàn

tương đồng với nghiên cứu của Yongsheng He và cộng sự (1996) [149].

Hình 3.17 Hình ảnh điện di kháng nguyên E.coli O157:H7 trên gel

( từ vạch 1-4: kháng nguyên toàn thân của E. coli O157:H7; từ vạch 5-8: kháng nguyên

H7; từ vạch 9-12: phát hiện kháng nguyên H7 bằng Mab C3.26.IV; thang protein

chuẩn)

SDS-PAGE và Western blot với Mab C3.26.IV

Kết luận: từ các tế bào lai có khả năng sản sinh kháng thể đơn dòng

kháng kháng nguyên H của vi khuẩn E.coli O157:H7, chúng tôi đã lựa chọn

được 02 dòng tế bào có khả năng sản sinh kháng thể đặc hiệu và ổn định nhất

với vi khuẩn này.

105

Bảng 3.15 Kết quả xác định độ đặc hiệu của các kháng thể đơn dòng

E.coli

Dòng kháng thể

S.typ S.enter V.cholera

STT

O157:H7

(OD450)

K88

K99

987p

FD41

M8

M9

M61

M128

1 A10.16.I (0,98)

1.01

0.97

94 1.09 0.07

0.05

0.09

0.13

0.11 +

2 C1.16.I (0,92)

0.78

0.69

0.83

0.75 0.09

0.1

0.06

0.07

0.09

0.12

3 C6.16.I (0,84)

0.64

0.67

0.71

0.77 0.08

0.07

0.09

0.15

0.08

0.11

4 C3.16.II (0,72)

0.53

0.57

0.71

0.76 0.09

0.1

0.15

0.07

0.09

5 D8.16.II (0,87)

0.83

0.58

0.79

0.81 0.12

0.16

0.2

0.09

0.17

0.11

6 D5.26.III (0,87)

0.69

0.85

0.73

0.77 0.09

0.06

0.11

0.18

0.05

0.09

B11.26.III

0.51

0.76

0.79

0.43 0.14

0.11

0.09

0.19

0.16

0.14

(0,74)

8 C3.26.IV (0,91)

1.05

1.02

0.98 0.93 0.07

0.08

0.09

0.12

0.11 +

A10.26.IV

0.71

0.48

0.73

0.68 0.12

0.29

0.05

0.12

0.16

0.09

(0,76)

10 A10.26.V (0,83

0.92

0.82

0.77

0.84 0.26

0.11

0.21

0.09

0.11

0.1

106

CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1 Kết luận

4.1.1 Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 trong thịt bò bán ở

một số địa điểm tại Hà Nội

- Đã xác định được 4/143 mẫu thịt bò bán ở một số địa bàn tại Hà Nội,

nhiễm E.coli O157:H7, tương đương với tỷ lệ nhiễm là 2,8%.

- Cả 4 chủng vi khuẩn E.coli O157:H7 phân lập đều mang gen mã hóa

độc tố Stx2 và eae, hai trong số đó mang gen mã hóa độc tố Stx1.

- 1 trong 4 chủng E.coli O157:H7 ký hiệu M61 có khả năng gây bệnh

đối với tế bào Vero. Thời gian độc tố phá hủy tế bào mạnh nhất là sau 48 giờ,

tỷ lệ tế bào chết lên tới 90%.

4.1.2 Chế tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu của E.coli O157:H7

- Đã chế tạo thành công và lựa chọn kháng nguyên lông E.coli

O157:H7 để gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm, kháng nguyên này gồm

hai tiểu phần chính có trọng lượng là 65kDa và 118kDa.

- Hàm lượng kháng nguyên H7 thích hợp để gây đáp ứng miễn dịch ở

chuột Balb/C là 30µg/con.

- Dầu bổ trợ Montanide ISA 70 vừa có khả năng kích thích gây đáp

ứng miễn dịch mạnh, vừa an toàn với chuột Balb/C .

- Dung dịch dung giải hồng cầu trong lách chuột mẫn cảm với kháng

nguyên H7 có thành phần: NH4Cl 0,8%, KHCO30,1%, EDTA 0,37%, tỷ lệ

dung dịch này so với dịch tế bào lách là 2: 1(v/v).

- Điều kiện tối ưu để dung hợp tế bào lách chuột với tế bào u tủy chuột

dòng Sp/2.0-Ag14 là: PEG: 1450 50%: 12,5%; tỷ lệ myeloma 30%; nhiệt độ lai 240C; thời gian: 120 giây.

107

- Môi trường nuôi tế bào lai thích hợp có thành phần chính là: MEM

70%, HAT 50x: 2%, huyết thanh thai bê 20%, đại thực bào 10%, OPI

(oxaloacetic 0,3g/100ml, sodium pyruvate 0,1g, insulin 200UI) 2% .

- 68-82% các dòng tế bào lai không sản sinh kháng thể đặc hiệu, 10-

12% số dòng tế bào sinh kháng thể ở mức độ thấp (OD450<0,2). Chỉ có 1-2%

dòng tế bào sinh kháng thể đặc hiệu ở mức OD450≥0,8.

- 10 dòng tế bào lai (OD450≥0,8) được sử dụng để tạo kháng thể đơn

dòng, các kháng thể tạo ra có độ đặc hiệu 100% với E.coli O157:H7, hai dòng

tế bào ký hiệu A10.16.I và C3.26.IV tạo kháng thể ổn định nhất được lựa

chọn để sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên H7 của

E.coli O157:H7.

4.2 Đề nghị

- Thu thập số lượng mẫu lớn hơn, đa dạng hơn để xác sự có mặt của vi

khuẩn E.coli O157:H7, từ đó có cơ sở để chủ động phòng và điều trị bệnh

ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn này.

- Nghiên cứu sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên

H7 vào sản xuất KIT chẩn đoán nhanh vi khuẩn dạng que nhúng hoặc KIT

phát hiện số lượng vi khuẩn bằng công nghệ nano.

108

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

Vò TriÖu An (2001), MiÔn dÞch häc, Nhµ xuÊt b¶n y häc.

Ban chỉ đạo liên ngành về Vệ sinh an toàn thực phẩm (2010), " Báo cáo Hội

nghị toàn quốc lần thứ II về công tác đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm",

Hà Nội ngày 08/4/2008;

Phạm Công Hoạt, Đoàn Thị Kim Dung, Nguyễn Hữu Cường, Hoàng Minh

Châu, Lê Trung Dũng, Lê Thị Kim Xuyến, Đoàn Thanh Hương (2003),

"Phân lập và giám định E.coli O157:H7 từ gia súc nghi bệnh", Kỷ yếu Hội

nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, tr. 284-287.

Lª Quang HuÊn, LF ThÞ HuyÒn (2009), Kh¸ng thÓ t¸i tæ hîp vµ øng dông,

Nhµ xuÊt b¶n Khoa häc tù nhiªn vµ C«ng nghÖ.

Trần Thanh Phong, Nguyễn Ngọc Tuân, Bùi Thị Thu Trang, Lê Thị Mai

Khanh (2007), "Phát hiện một số gen độc lực của Escherichia coli trên thịt

bò, heo và trong phân bò, heo bằng kỹ thuật PCR-mutiflex", Tạp chí Khoa

học kỹ thuật Nông lâm nghiệp, số 3, 2007.

TCVN 4833 - 1: 2002 (ISO 3100-1: 1991) Thịt và sản phẩm thịt - Lấy mẫu

và chuẩn bị mẫu thử - Phần 1: Lấy mẫu

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI

7. Acheson D. W. K., S. DeBreuker, A. Donohue-Rolfe, K. Kozak, A. Yi, and G.

T. Keusch (1994), "Development of a clinically useful diagnostic enzyme

immunoassay for enterohemorrhagic Escherichia coli infection", p. 109–112.

In M. A. Karmali and A. G. Goglio

(ed.), Recent advances

verocytotoxinproducing Escherichia coli infections, Elsevier Science B.V.,

Amsterdam, The Netherlands.

8. Ashkenazi S., M. Larocco, B. E. Murray, and T. G. Cleary (1992), "The

adherence of verocytotoxin-producing Escherichia coli to rabbit intestinal

cells", J. Med. Microbiol. 37:304–309.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

109

9. Bahneman H.G., Mesquita J.A. (1987), "Oil adjuvant vaccine against foot-

and-mooth disease", Bol. Centr. Panam. Fiebre Afotsa, 53, 25–30.

10. Banatvala N., A. R. Magnano, M. L. Cartter, T. J. Barrett, W. F. Bibb, L.

L.Vasile, P. Msher, M. A. Lambert-Fair, J. H. Green, N. H. Bean, and R.

V.Tauxe (1996), "Meat grinders and molecular epidemiology:

two

supermarketoutbreaks of Escherichia coli O157:H7 infection", J. Infect. Dis.

173:480–483.

11. Baqui A. H., R. B. Sack, and R. E. Black (1992), "Enteropathogens

associated with acute and persistent diarrhea in Bangladeshi children 2,5

years of age", J. Infect. Dis, 166:792–796.

12. Barrett T. J., M. E. Potter, and I. K. Wachsmuth (1989), "Continuous

peritoneal infusion of Shiga-like toxin II (SLT II) as a model for SLT II-

induced diseases", J. Infect. Dis., 159:774–777.

13. Benjamin M. M., and A. R. Datta (1995), "Acid

tolerance of

enterohemorrhagic Escherichia coli". Appl. Environ. Microbiol. 61:1669–

1672.

14. Besser R. E., S. M. Lett, J. T. Weber, M. P. Doyle, T. J. Barrett, J. G. Wells

and P. M. Griffin (1993), "An outbreak of diarrhea and hemolytic uremic

syndrome from Escherichia coli O157H7 in fresh-pressed apple cider",

JAMA 269:2217–2220.

15. Beutin L., S. Aleksic, S. Zimmermann, and K. Gleier (1994), "Virulence

factors and phenotypic traits of verotoxigenic strains of Escherichia coli

isolated from human patients in Germany", Med. Microbiol. Immunol.

(Berlin) 183:13–21.

16. Blanco M., Blanco J.E, Gonzales E.A., Mora A., Jasen W., Gomes T.A.T.,

Zerbini L.F., Yano T., de Castro A.F.P., and Blanco J., (1997), " Genes

coding for enterotoxins and verotoxins in porcine Escherichia coli strains

belonging to different O:K:H serotypes: Relationship with phenotype". J.Cli.

Mircobiol. 35:2958-2963.

110

17. Boyd B., and C. Lingwood (1989), "Verotoxin receptor glycolipid in human

renal tissue", Nephron 51:207–210.

18. Brown C.A, Harmon, B.G., Zhao, T. and Doyle M.P (1997), "Experimental

Escherichia coli O157:H7 carriage in calves", Environ. Microbiol. 63:27-32.

19. Brunder W., H. Schmidt and Karch

(1996),

"KatP, a novel

catalaseperoxidase encode by the large plasmid of enterohaemorrhagic

Escherichia coli O157:H7", Microbiology. 142:3305-3315.

20. Buchanan R.L. and Klawitter L.A. (1992), "The effect of incubation

temperature, initial pH, and sodium chloride on the growth kinetics of

Escherichia coli O157:H7", Food Microbiol, 9: 185–196.

21. Buchanan R.L. and Bagi L.K. (1994), "Expansion of response surface

models for the growth of Escherichia coli O157:H7 to the include sodium

nitrites as a variable", Intl. J. Food Microbiol. 23:317-322.

22. Buchanan R.L. and Edelson S.G. (1996), "Culturing enterohemorrhagic

Escherichia coli in the presence and absence of glucose as a simple means of

evaluating the acid tolerance of stationary-phase cells", Appl. Environ.

Microbiol. 62:4009-4013.

23. Burioni R, Plaisant P, Bugli F, Delli Carri V, Clementi M, Fadda G. (1998),

"A vector for the expression of recombinant monoclonal Fab fragments in

bacteria", J Immunol Methods, 217: 195-9.

24. Burton DR. "Phage display". (1995), Immunotechnology (Amsterdam), 1:87-

94.

25. Casalvilla R, Duenas M, Ayala M, et al. (1999), "A bacterial singlechain Fv

antibody fragment that inhibits binding of its parental anti-E-selectin

monoclonal antibody to activated human endothelial cells", J Biotechnol. 72:

1-12.

26. Centers for Disease Control and Prevention. (1999), "Laboratory methods

for the diagnosis of epidemic dysentery and cholera", Centers for Disease

Control and Prevention, Atlanta.

111

27. Chang-Kyu Sohn, Wan Huh, Byung-Chun Kim, and Wan Park (2000).

"Producing Verotoxin 2 Isolated from a Patient in Korea". The Journal of

Microbiology, p.93-98 Vol. 38, No. 2.

28. Chitrita DebRoy, Pina M. Fratamico, Elisabeth Roberts, Michael A. Davis,

and Yanhong Liu.( 2005). " Development of PCR Assays Targeting Genes in

O-Antigen Gene Clusters for Detection and Identification of Escherichia coli

O45 and O55 Serogroup. Applied and Environmental Mcrobiology. Aug.

2005, p. 4919–4924.

29. Cravioto A., R.J.Gross, S.M.Scotland and B.Rowe. (1979), "An adhesive

factor found in strains of Escherichia coli belonging to the traditional

infantile enteropathogenic serotypes", Curr. Microbiol,3:95–99.

30. Davidson R.L, O'Malley K. A., Wheeler T. B. (1976), "Polyethylene glycol

induced mamalian cell hydridization: effect of polyethylene glycol moleculer

weight and concentration", Somatic Cell Genetics, 2: 271-280.

31. De Geus B, C. Hendriksen. (1998), " In vivo and in vitro production of

monoclonal antibodies –Introduction", Res Immunol, 149:533-534.

32. Doyle M.P. and Schoeni J.L. (1984), "Survival and growth characteristics of

Escherichia coli associated with hemorrhagic colitis", Appl. Environ.

Microbiol, 48: 855-856.

33. Doyle M. P. and J. L. Schoeni. (1987), " Isolation of Escherichia coli

O157:H7 from retail fresh meats and poultry", Appl. Environ. Microbiol,

53:2394- 2396.

34. Doyle M.P., Zhao T., Meng J. and Zhao S. (1997), " Escherichia coli

O157:H7. In “Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers” ed. M.P.

Doyle, L.R. Beuchat, and T.J. Montville, pp, ASM Press, Washington,D.C,

171–191.

35. DuPont H. L., S. B. Formal, R. B. Hornick, M. J. Snyder, J. P. Libonati, D.

G. Sheahan, E. H. LaBrec and J. P. Kalas. (1971), " Pathogenesis of

Escherichia coli diarrhea", N. Engl. J. Med, 285:1–9.

112

36. Edwards P. R. and W. H. Ewing.

(1972), "

Identification of

Enterobacteriaceae" , 3rd ed. Burgess Publishing Co., Minneapolis, Minn.

37. Ewing W.H.

(1986)," Edwards

and Ewing’s

identification of

Enterobacteriaceae",4th ed. Elsevier Science Publishing, Inc., New York,

N.Y.

38. Eugene Metchener. (2007), " Development and Characterization of Mouse

Hybridomas". Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols. Series:

Methods in Molecular Biology, Volume, 378. pp 1-13.

39. Faith N. G., J. A. Shere, R. Brosch, K. W. Arnold, S. E. Ansay, M. S. Lee, J.

B. Luchansky and C. W. Kaspar. (1996), " Prevalence and clonal nature of

Escherichia coli O157:H7 on dairy farms in Wisconsin", Appl. Environ.

Microbiol, 62:1519–1525.

40. Fazekas de St. Groth, S. and Scheidegger D. (1980), " Production of

monoclonal antibodies: strategy and tactics", J. Immunol. Met, 35:1–21.

41. Feng P., K. A. Lampel, H. Karch and T. S. Whittam. (1998), " Genotypic

and phenotypic changes in the emergence of Escherichia coli O157:H7". J.

Infect. Dis. 177:1750–1753.

42. Frantzen A. (1980), " Kulturelle og serologiske undersogelser over nogle

grupper af Enterobacteriaceae", p. 1-139, E. Munksgaard, Copenhagen

43. Fratamico P. M., S. Bhaduri and R. L. Buchanan. (1993), " Studies on

Escherichia coli serotype O157:H7 strains containing a 60-MDa plasmid and

on 60-MDa plasmid-cured derivatives", J. Med. Microbiol, 39:371–381.

44. Freeman R. R., Holder A. A. " Characteristics of the protective response of

Balb/C mice immunized with a purified Plasmodium yoelii schizont antigen",

Clin. exp. Immunol, (1983) 54, 609-616).

45. Freeman R. R., Holder A. A. " Characteristics of theprotectivresponse of

Balb/C mice immunized with a purified Plasmodium yoelii schizont antigen",

Clin. exp. Immunol, (1983) 54, 609-616) .

113

46. Griffin P. M., L. C. Olmstead and R. E. Petras. (1990), " Escherichia coli

O157:H7-associated colitis: a clinical and histological study of 11 cases",

Gastroenterology 99:142–149.

47. Griffin P. M.

(1995), " Escherichia coli O157:H7 and other

enterohemorrhagic Escherichia coli", p. 739–761. In M. J. Blaser, P. D.

Smith, J. I. Ravdin, H. B. Greenberg, and R. L. Guerrant (ed.), " Infections of

the gastrointestinal tract", Raven Press, New York, N.Y.

48. Hancock D. D., T. E. Besser, M. L. Kinsel, P. I. Tarr, D. H. Rice and M. G.

Paros. (1994), " The prevalence of Escherichia coli O157:H7 in dairy and

beef cattle in Washington State", Epidemiol. Infect, 113:199–207.

49. Hayter P.M., Curling E.A., Baines A.J., Jenkins S.S, Salmon I., (1991),

"Chiness humster ovary cell growth and interferon production kinetics in

stirred batch culture", Applied Micriobiology and Biotechnology, Vol 30,

No.5, p:559-564.

50. Ida Orskov, Frits Orskov, Barbara Jann, Klaus Jann.(1977), Bacteriological.

p. 667-710 Vol. 41, No. 3.

51. Isaacson R. E. (1977), " K99 surface antigen of Escherichia coli:

purification and partial characterization", Infect. Immun, 15:272-279.

52. James C. Paton and Adrienne W.Paton (1998), " Pathogenesis and Diagnosis

of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli

Infections",

Clinical

Microbiology Reviews, p. 450–479 Vol. 11, No. 3.

53. James P. Nataro, James B. Kaper. (1998), Clinical microbiology review, p.

142-201 Vol.11, No.1.

54. Jesus G.M., Silvia G.A, Ana I.A., Francisco R.V. (1999), "Use of 16S, 23S

ribosome gene spacer regions in studies of prokaryotic diversity", Journal

Microbiol Method, 36:pp 55-64

55. Kandel G., A. Donohue-Rolfe, M. Donowitz and G. T. Keusch. (1989), "

Pathogenesis of Shigella diarrhea XVI. Selective targetting of shiga toxin to

114

villus cells of rabbit jejunum explains the effect of the toxin on intestinal

electrolyte transport", J. Clin. Invest, 84:1509–1517.

56. Karmali M. A. (1987), " Laboratory diagnosis of verotoxin-producing

Escherichia coli infections", Clin. Microbiol. Newsl, 9:65–70.

57. Karmali M. A. (1989), " Infection by verocytotoxin-producing Escherichia

coli", Clin. Microbiol. Rev, 2:15–38.

58. Kauffmann F. (1944), " Zur Serologie der Coli-Gruppe", Acta Pathol,

Microbiol. Scand, 21:20-45.

59. Kauffmann F. and G. Vahlne. (1945), " Ueber die Bedeutung des

serologischen Formenwechsels fMr die Bakteriophagenwirkung in der Coli-

Gruppe", Acta Pathol. Microbiol.Scand, 22:119-137.

60. Kauffmann F. (1954), Enterobacteriaceae, 2nd ed. E. Munksgaard,

Copenhagen.

61. Keenan K. P., D. D. Sharpnack, H. Collins, S. B. Formal and A. D. O’Brien.

(1986), " Morphological evaluation of the effects of Shiga toxin and E.coli

Shiga-like toxin on the rabbit intestine", Am. J. Pathol, 125:69–80.

62. Keene W.E., Sazie E., Kok J., Rice D.H., Hancock D.D., Balan V.K., Zhao

T. and Doyle M.P. (1997), " Outbreak of Escherichia coli O157:H7

infections traced to jerky made from deer meat", J. Am. Med. Assn, 277:

1229–1231.

63. Kehl K. S., P. Havens, C. E. Behnke and D. W. K. Acheson. (1997), "

Evaluation of the Premier EHEC assay for detection of Shiga toxin-

producing Escherichia coli", J. Clin. Microbiol, 35:2051–2054.

64. Knipschildt H. E. (1945), " Serology of E.coli groups". Nyt Nordisk Forlag,

Arnold Busck, Kobenhavn.

65. Kiyoshi Suzki, Yasuko Tada and Tadakatu Tazaki (1971), " High

hiobarbiturate-Positive O Antigen of Escherichia coli", Infection and

Immunity, p. 702-704.

115

66. Kohler G., Milstein G., (1975), " Continuous cultures of fused cell secreting

antibody of predifined specificity", Nature, 256: 495-497.

67. Kudva I.T., Hatfield P.G. and Hovde, C.J. (1996), " Escherichia coli

O157:H7 in microbial flora of sheep", Appl. Environ. Microbiol, 34: 431–

433.

68. Le Saux, N., J. S. Spika, B. Friesen, I. Johnson, D. Melnychuk, C.

Anderson, R. Dion, M. Rahman and W. Tostowarky. (1993), " Ground beef

consumption in non-commercial settings is a risk factor for sporadic

Escherichia coli O157:H7 infection in Canada", J. Infect. Dis, 167:500–502.

69. Leiwang and Peter R.Reeves. (1998), " Organization of Escherichia coli

O157 O Antigen Gene Cluster and Identification of Its Specific Genes",

Infection and Immunity, p. 3545–3551.

70. Levine M. M.

(1987), " Escherichia coli

that cause diarrhea:

enterotoxigenic, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohemorrhagic, and

enteroadherent", J. Infect. Dis, 155:377–389.

71. Leyer G. J., L. L. Wang and E. A. Johnson. (1995), " Acid adaptation of

Escherichia coli O157:H7 increases survival in acidic foods", Appl. Environ.

Microbiol, 61:3752–3755.

72. Littlefield J. W. (1964), " Selection of hybrids from matings of fibroblasts in

vitro and their presumed recombinants", Science, 145, 709-710.

73. Lu Feng, Sof’ya N. Senchenkova, Jinghua Yang, Alexander S. Shashkov,

Jiang Tao, Hongjie Guo, Jiansong Cheng, Yi Ren, Yuriy A. Knirel, Peter R.

Reeves, and Lei Wang. (2004), " Synthesis of the Heteropolysaccharide O

Antigen of Escherichia coli O52 Requires an ABC Transporter: Structural

and Genetic Evidence", Journal of Bacteriology, July 2004, p. 4510–4519.

74. Luderitz O., C. Galanos, V. Lehmann, M. Nurminen, E. Rietschel, G.

Rosenfelder, M. Simon and O. Westphal. (1973), " Lipid A, chemical

structure and biological activity", J.Infect. Dis, 128(Suppl.):9-21.

116

75. Ludwig W. and Schleifer K.H. (2000), " Phylogeny of Bacteria beyond the

16S-rRNA

Standerd".

Vermicon.

http:w.w.w.

ermicon.de/english/news/Science/khs99111.htm.

76. Macnab R. M. (1996), Flagella and motility, In F.C, p. 123–145.

77. March SB, Ratnam S. (1986) " Sorbitol-MacConkey medium for detection

of Escherichia coli O157:H7 associated with hemorrhagic colitis", J Clin

Microbiol;23:869-872.

78. McCarthy M. (1996), " E. coli O157:H7 outbreak in USA traced to apple

juice", Lancet, 348:1299.

79. Meng J., Zhao S., Zhao T. and Doyle, M.P. (1995), " Molecular

characterization of Escherichia coli O157:H7 isolates form raw milk, ground

beef, and calf feces using pulsed field gel electrophoresis and plasmid DNA

analysis", J. Med. Microbi,. 42: 258–263.

80. Mercer W.E, Baserga R. (1979), " A simple method for decreasing the

toxicity of polyethylene glycol", Technique in somatic cell genetics,

(J.W.Shay, ed.) New York, Plenu.

81. M.Gleeson, A.W.Cripps, R.L.Clancy, J.H.Wlodarczyk, A.J.Dobson&

M.J.Hensley.(1998), " Development of

IgA-Specific Antibodies

Escherichia coli O Antigen in Children", Scand. J. Immunol, 26, 639-643.

82. Moake J. L. 1994. " Haemolytic-uraemic syndrome: basic science". Lancet

343:393–397.

83. Morgan G. M., C. Newman, S. R. Palmer, J. B. Allen, W. Shepard, A. M.

Rampling, R. E. Warren, R. J. Gross, S. M. Scotland and H. R. Smith.

(1988), " First recognized community outbreak of haemorrhagic colitis due

to verotoxin-producing Escherichia coli O157:H7 in the UK", Epidemiol.

Infect, 101:83–91.

84. Muhammad Saleem (2008), " Monoclonal antibodies in clinical diagnosis:

A brief review application", African Journal of Biotechnology Vol. 7 (8), pp.

923-925, 17 April, 2008.

117

85. Mundell D. H., Anselmo C. R. And Wishnow R. M. (1976), " Factors

influencing heat-labile Escherichia coli enterotoxin activity", Infect. Immun.,

14, 383–388.

86. Muyldermans S., Lauwereys M. (1999), " Unique single-domain antigen

binding fragments derived from naturally occurring camel heavy-chain

antibodies", J. Mol. Recognit, 12:131-140.

87. Muyldermans S. (2001), " Single domain camel antibodies: current status",

J. Biotechnol, 74, 277.

88. Nazmul MHM, Salmah I, Jamal H, Ansary A. (2007), " Detection and

molecular characterization of verotoxin gene in non-O157 diarrheagenic

Escherichia coli

isolated

from Miri hospital, Sarawak, Malaysia",

Biomedical Re-search, 18: 39-43.

89. Neidhardt R., Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B.

Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter and H. E. Umbarger

(ed.), " Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology" ,

2nd ed., vol. 1. ASMPress, Washington, D.C.

90. Noboru Nakasone, Hoang Huy Tran, Minh Binh Nguyen, Naom Higa,

Claudia Toma Tianyan Song, Yochio Ichinose. (2005), " Shorth report:

Isolation of E.coli O157:H7 from fecal samples of cows in Vietnam", Am. J.

Trop. Med. Hyg., 73(3), 2005, pp. 586–587.

91. O’Brien A. D. and R. K. Holmes. (1987), " Shiga and Shiga-like toxins.

Microbiol" . Rev. 51:206–220.

92. Ohnishi M.; Murata T.; Nakayama K.; Kuhara S.; Hattori M.; Kurokawa K.;

Yasunaga T.; Yokoyama K.; Makino K.; Shinagawa H.; Hayashi T. (200), "

Comparative analysis of the whole set of rRNA operons between an

enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Sakai strain and an

Escherichia

coli

K-12

strain

MG1655"

Syst, Appl. Microbiol, 23(3):315-324.

118

93. Orskov I., F. Orskov, W. J. Sojka and J. M.Leach. (1961), " Simultaneous

occurrence of E.coli B and L antigens in strains from diseased swine", Acta

Pathol. Microbiol. Scand, 53:404-422.

94. Orskov I. and F. Orskov. (1966), " Episome-carried surface antigen K88 of

Escherichia coli. I. Transmission of the determinant of the K88 antigen and

influence on the transfer of chromosomal markers", J. Bacteriol, 91:69- 75.

95. Orskov I. and K. Nyman. (1974), " Genetic mapping of the antigenic

determinants of two polysaccharide K antigens, K1O and K54, in

Escherichia coli", J. Bacteriol, 120:43-51.

96. Orskov I., V. Sharma and F. Orskov. (1976), " Genetic mapping of the K1

and K4 antigens (L) of Escherichia coli. Non-allelism of K(L) antigens with

K antigens of 08:K27(A), 08:K8(L) and 09:K57(B)", Acta Pathol. Microbiol.

Scand. Sect, B 84:125-131.

97. Orskov F. and I. Orskov. (1984), " Serotyping of Escherichia coli", Methods

Microbiol, 14:43–112.

98. Ouchterlony O. (1958), " Diffusion-in-gel methods for immunological

analysis", Prog. Allergy, 5:1-78.

99. Palumbo S.A., Call J.E., Schultz F.J. and Williams A.C. (1995), " Minimum

and maximum temperatures for growth and verotoxin production by

hemorrhagic strains of Escherichia coli", J. Food Protect, 58: 352– 356.

100.

Paton A.W., Voss E., Manning P.A. and Paton J.C. (1997), "Shiga

toxin-producing Escherichia coli isolates from cases of human disease show

enhanced adherence to intestinal epithelial (Henle 407) cells", Infect.

Immun., 3799-3805, Vol 65, No. 9

101.

Park C. H., N. M. Vandel and D. L. Hixon. (1996), " Rapid

immunoassay for detection of Escherichia coli O157 directly from stool

specimens", J. Clin. Microbiol, 34:988–990.

119

102.

Padhye N. V., T. Zhao and M. P. Doyle. (1989), Production and

characterization of monoclonal antibodies to verotoxin 1 and 2 from

Escherichia coli of serotype O157:H7. J. Med. Microbiol. 30:219–226.

103.

Perera L. P., L. R. M. Karques and A. D. O’Brien. (1988), Isolation

and characterization of monoclonal antibodies to Shiga-like toxin II of

enterohemorrhagic Escherichia coli and use of the monoclonal antibodies in

a colony enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 26:2127–

2131.

104.

Perry M. B., D. R. Bundle, M. A. J. Gidney and H. Lior. (1988),

Identification of Escherichia coli serotype O157 strains by using a

monoclonal antibody. J. Clin. Microbiol. 26:2391–2394.

105.

Pickering L. K., T. G. Obrig and F. B. Stapleton. (1994), "

Hemolytic-uremic syndrome and enterohemorrhagic Escherichia coli",

Pediatr. Infect. Dis. J, 13:459–476.

106.

Polotsky Y. E., E. M. Dragunskaya, V. G. Seliverstova, T. A.

Avdeeva, M. G. Chakhutinskaya, I. Ke´tyi, A. Verte´nyi, B. Ralovich, L.

Emody, I. Ma´lovics, N. V. Safonova, E. S. Snigirevskaya and E. I.

Karyagina. (1977), " Pathogenic effect of enterotoxigenic Escherichia coli

and Escherichia coli causing infantile diarrhea", Acta Microbiol. Acad. Sci.

Hung, 24:221–236

107.

Pontecorvo G., (1975), " Production of mammalian somatic cell

hybrid by means of polyethylene glycol treament", Somatic Cell Genetics, 1:

397-400.

108.

Rajkowski K.T. and Marmer B.S. (1995), " Growth of Escherichia

coli O157:H7 at fluctuating incubation temperatures", J. Food Protect,

58:1307 -1313.

109.

Rantz L. A. (1962), " Serological grouping of E.coli: study in urinsry

tract infection", Arch. Intern. Med. 109:37-42.

120

110.

Ratiner Y. A. and V. A. Sinelnikova. (1969), " Serological study of

flagellar antigens revealed in some enteropathogenic variants of Escherichia

coli", Zh, Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol, 13:111–116.

111.

Ratiner Y. A., V. S. Balakleets and I. V. Golubeva. (1973), "

Serological pattern of E. coli in feces of healthy persons", Zh. Mikrobiol.

Epidemiol. Immunobiol, 11:112–118.

112.

Ratiner Y. A. (1982), " Phase variation of the H antigen in

Escherichia coli strain Bi7327–41, the standard strain for Escherichia coli

flagellar antigen H3", FEMS Microbiol, Lett. 15:33–36; 26.

113.

Ratiner Y. A., Z. V. Klimova and I. N. Ulisko. (1987), " Use of

factor-H sera for differentiating between the serological variants of

Escherichia coli flagellar antigens", Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol,

5:16–20. (In Russian).

114.

Ratiner Y. A. (1998), " New flagellin-specifying genes in some

Escherichia coli strains", J. Bacteriol, 180:979–984.

115.

Ratiner Y. A. (1999), " Temperature-dependent flagellar antigen

phase variation in Escherichia coli", Res. Microbiol, 150:457–463.

116.

Reeves P. R.

(1994),

" Biosynthesis

and

assembly of

lipopolysaccharide". New Compr. Biochem. 27:281–314,

117.

Reeves P. R., M. Hobbs, M. A. Valvano, M. Skurnik, C. Whitfield, D.

Coplin, N. Kido, J. Klena, D. Maskell, C. R. H. Raetz and P. D. Rick. (1996),

" Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature", Trends

Microbiol, 4:495-503.

118.

Rice D.H., Hancock, D.D. and Besser, T.E. (1995), " Verotoxigenic

E. coli O157:H7 colonization of wild deer and range cattle", Vet. Rec. 137:

524.

119.

Riley L. W., R. S. Remis, S. D. Helgerson, H. B. McGee, J. G. Wells,

B. R. Davis, R. J. Hebert, E. S. Olcott, L. M. Johnson, N. T. Hargrett, P. A.

121

Blake and M. L. Cohen. (1983), " Hemorrhagic colitis associated with a rare

Escherichia coli serotype", N. Engl. J. Med, 308:681–685.

120.

Robinson K., Bellaby, T., Wakelin, D. (1994), "Vaccination against

the nematode Trichinella spiralis in high- and low-responder mice. Effects of

different adjuvants upon protective immunity and immune responsiveness".

Immunology 82, 261–267.

121.

Sambrook J, Russel DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory

Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor,

NY.

122.

Samuel Ratnam, Sandra B. March, Rafiq Ahmed, Gregory S.

Benzánon and Shanti Kasatiya. (1998), " Characterization of Escherichia

coli Serotype 0157:H7", Journal of Clinical Microbiology, p. 2006-2012.

Vol. 26, No. 10.

123.

Sandvig K. and B. Van Deurs. (1994), " Endocytosis and intracellular

sorting of ricin and Shiga toxin", FEBS Lett, 346:99–102.

124.

Savarino S. J., A. McVeigh, J. Watson, J. Molina, A. Cravioto, P.

Echeverria, M. K. Bhan, M. M. Levine and A. Fasano. (1996), "

Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin is not restricted to

enteroaggregative Escherichia coli", J. Infect. Dis, 173:1019–1022.

125.

Scheidegger J. J. (1955). " The method of immuno-electrophoresis" .

Int. Arch. Allergy 7:103-110.

126.

Schmidt H., H. Karch and L. Beutin. (1994), " The large-sized

plasmids of enterohemorrhagic Escherichia coli O157 strains encode

hemolysins which are presumably members of the E. coli a-hemolysin

family", FEMS Microbiol. Lett, 117:189–196.

127.

Schmidt H., L. Beutin and H. Karch. (1995), " Molecular analysis of

the plasmid-encoded hemolysin of Escherichia coli O157:H7 strain EDL

933". Infect. Immun, 63:1055–1061.

122

128.

Schmidt H., C. Kernbach and H. Karch. (1996), " Analysis of the

EHEC hly operon and its location in the physical map of the large plasmid of

enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7". Microbiology 142: 907-914.

129.

Sean A.Reid, Robert K. Selander and Thomas S. Whittam. (1999), "

Sequence Diversity of Flagellin (fliC) Alleles in Pathogenic Escherichia coli".

Journal of bacteriology, Vol. 181, No. 1 Jan. 1999, p. 153–160.

130.

Sjogren R., R. Neill, D. Rachmilewitz, D. Fritz, J. Newland, D.

Sharpnack, C. Colleton, J. Fondacaro, P. Gemski and E. Boedeker. (1994), "

Role of Shiga-like toxin I in bacterial enteritis: comparison between isogenic

Escherichia coli strains induced in rabbits", Gastroenterology, 106:306–317.

131.

Smith H. W. and M. A. Linggood. (1971), " Further observations on

Escherichia coli enterotoxins with particular regard to those produced by

atypical piglet strains and by calf and lamb strains: the transmissible nature

of these enterotoxins and of a K antigen possessed by calf and lamb strains",

J. Med. Microbiol, 5:243-250.

132.

Smith H. R. and S. M. Scotland. (1993), " Isolation and identification

methods for Escherichia coli O157 and other Vero cytotoxin producing

strains", J. Clin. Pathol, 46:10–17.

133.

Son Radu, Shahilah Abdul Mutalib, Gulam Rusul, Zainori Ahmad,

Tadaaki Morigaki, Norio Asai, Yung Bu Kim, Jun Okuda, and Mitsuaki

Nishibuchi, " Detection of Escherichia coli O157:H7 in the Beef Marketed in

Malaysia", Appl Environ Microbiol, 1998 March; 64(3): 1153–1156).

134.

Stirm S., F. Orskov, I., Orskov and B. Mansa. (1967), Episome-

carried surface antigen K88 of Escherichia coli. H. Isolation and chemical

analysis, J. Bacteriol, 93:731-739.

135.

Strocknine N. A., R. M. Marques, R. K. Holmes and A. D. O’Brien.

1985. Characterization of monoclonal antibodies against Shiga-like toxin

from Escherichia coli. Infect. Immunol. 50:695–700

123

136.

Szabo R., E. Todd, J. MacKenzie, L. Parrington and A. Armstrong.

1990. Increased sensitivity of the rapid hydrophobic grid membrane filter

enzymelabeled antibody procedure for Escherichia coli O157 detection in

foods and bovine feces. Appl. Environ. Microbiol. 56:3546–3549

137.

Tarr P. I., M. A. Neill, C. R. Clausen, S. L. Watkins, D. L. Christie

and R. O. Hickman. (1990), " Escherichia coli O157:H7 and the hemolytic

uremic syndrome: importance of early cultures in establishing the etiology",

J. Infect. Dis, 162:553–556.

138.

Tarr P. I. (1995), " Escherichia coli O157:H7: clinical, diagnostic, and

epidemiological aspects of human infection", Clin. Infect. Dis, 20:1–10.

139.

Thompson J. S., D. S. Hodge and A. A. Borczyk. (1990), " Rapid

biochemical test to identify verocytotoxin-positive strains of Escherichia coli

serotype O157", J. Clin. Microbiol, 28:2165–2168.

140.

United States Department of Agriculture, Food Safety Inspection

Service. (2002), "Detection, isolation and identification of Escherichia coli

O157:H7 and O157:NM (Nonmotile) from meat products", MLG 5.03, rev.

10/25/02. USDA/FSIS Microbiology Laboratory Guidebook, 3rd ed. U.S.

Department of Agriculture, Food Safety Inspection Service, Washington,

D.C.

141.

Walter J. Hopkins, Yina Xing, Lisa A. Dahmer, Edward Balish and

David T. Uehling.(1995), " Western Blot Analysis of Anti-Escherichia coli

Serum Immunoglobulins in Women Susceptible to Recurrent Urinary Tract

Infections", The Journal of Infectious Diseases, Vol. 172, No. 6, pp. 1612-

1616.

142.

Whittam T. S.

(1995), " Genetic population structure and

pathogenicity in enteric bacteria" , p. 217–245.

143.

Woese C.R., (1987), " Bacterial evolution". Microbiol. Rev., 51, 221-

271 .

124

144.

Yamada S, Matsushita S, Kai A, Sasaki M, Tsuji A, Kanemitsu T,

Yamashita N, Anzai E, Kudoh Y. (1993), " Detection of verocytotoxin from

stool and serological testing of patients with diarrhea caused by Escherichia

coli O157:H7", Microbiol Immunol, 1993;37:111–118;

145.

Yongsheng He, James E. Keen, Ralph B. Westeman, E. Travis

Littledike, Jimmy Kwang (1996) " Monoclonal Antibodies for Detection of

the H7 Antigen of Escherichia coli", Applied anđ environmental

microbiology, Vol. 62, No. 9 p. 3325–3332.

146.

Yoshida K, Matsumoto T, Tateda K, Uchida K, Tsujimoto S,

Yamaguchi K (2000), " Role of bacterial capsule in local and systemic

inflammatory responses of mice during pulmonary infection with Klebsiella

pneumoniae", J. Med. Microbiol, 49 (11): 1003–10.

147.

Yoshihito Kihiwaraki (2002). Immunological Laboratory techniques,

Japan International Cooperation Agency

148.

Zhao T., Doyle, M.P. and Besser, R.E. (1993), " Fate of

enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in apple cider without

preservatives", Appl. Environ. Microbiol, 59:2526–2530.

149.

Zhao T., Doyle, M.P., Shere, J. and Garber, L. (1995), " Prevalence of

enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in a survey of dairy herds",

Appl. Environ. Microbio,. 61: 1290–1293.

125

iii

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv

MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1

Danh mục các bảng, các hình ảnh, đồ thị v

1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................................. 1

2. Mục tiêu của đề tài ...................................................................................................... 2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................................... 2

3.1 Ý nghĩa khoa học ....................................................................................................... 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn ....................................................................................................... 3

4. Những đóng góp mới của đề tài .................................................................................. 3

Ch−¬ng I. Tæng quan tµi liÖu ......................................................................... 4

1.2 Các đặc tính của vi khuẩn E.coli O157:H7............................................................... 6

1.2.1 Đặc tính sinh học.................................................................................................... 6

1.2.2 Đặc tính sinh hoá..................................................................................................... 8

1.2.3 Đặc tính gây bệnh.................................................................................................. 11

1.2.4 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli O157:H7 ............................................... 11

1.3 Nguồn tàng trữ vi khuẩn E.coli O157:H7 ............................................................... 15

1.4 Các phương pháp chẩn đoán, xác định vi khuẩn ................................................... 16

1.5. Cấu trúc kháng nguyên của E.coli sp. và E.coli O157:H7..................................... 19

1.5.1 Kháng nguyên thân (O) ......................................................................................... 20

1.5.2. Kháng nguyên lông (H) ........................................................................................ 23

1.5.3 Kháng nguyên giáp mô (K)................................................................................... 27

1.6 Kháng thể đơn dòng ................................................................................................ 32

126

1.6.1 Lịch sử phát triển kháng thể đơn dòng.................................................................. 32

1.6.3 Các công nghệ sản xuất kháng thế đơn dòng ........................................................ 33

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU ............................................................................................................................... 44

2.1 Đối tượng ................................................................................................................. 44

2.2 Vật liệu nghiên cứu.................................................................................................. 44

2.1.1 Động vật thí nghiệm .............................................................................................. 44

2.2.2 Hoá chất, vật liệu thí nghiệm................................................................................. 44

2.2.3 Trang thiết bị thí nghiệm ....................................................................................... 45

2.3 Nội dung................................................................................................................... 45

2.4 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 47

2.4.1 Phương pháp thu thập mẫu (TCVN 4833-1-2002, ISO 3100-1-1991) [6].............. 47

2.4.2 Phân lập vi khuẩn E.coli O157:H7 (USDA, 2002) [140] ...................................... 47

2.4.3 Các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn E.coli O157:H7 (Samuel và cộng sự, 1998)

[122] ............................................................................................................................... 48

2.4.4 Giải trình tự gen 16s ARNr (Sambrook và cộng sự, 2001)[121]............................ 49

2.4.5 Phương pháp điện di ADN (Sambrook, 2001) [121]............................................. 51

2.4.6 Phương pháp chế kháng nguyên (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [147]

2.4.7 Ph−¬ng ph¸p ®iÖn di protein (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [147] ......................... 53

2.4.8 Phản ứng ELISA gián tiếp (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [147] ........................... 54

2.4.9 Phản ứng Western blot (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [147] ................................. 55

2.4.10 Phương pháp tạo kháng thể đơn dòng (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [147]

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 59

3.1. Xác định tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà

Nội .................................................................................................................................. 59

3.1.1 Phân lập, xác định tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm

tại Hà Nội ....................................................................................................................... 59

3.2 Xác định độc tố của các chủng E.coli O157:H7 phân lập trong thịt bò ở khu vực

Hà Nội ............................................................................................................................ 69

3.2.1 Xác định các gen độc tố của các chủng E.coli O157:H7 phân lập ........................ 69

3.2.2 Xác định khả năng sinh độc tố gây bệnh của các chủng E.coli O157:H7 phân lập

trên tế bào VERO ........................................................................................................... 73

127

3.3 Chế tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu của E.coli O157:H7.................................... 75

3.3.1 Chế tạo và lựa chọn kháng nguyên của E.coli O157:H7....................................... 75

3.3.1.1 Chế kháng nguyên của vi khuẩn E.coli O157:H7 ................................................. 76

3.3.1.2 Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của các kháng nguyên ........................ 77

3.3.2 Đáp ứng miễn dịch của chuột Babl/C với kháng nguyên lông H7 ........................ 81

3.3.2.1 Xác định hàm lượng kháng nguyên thích hợp cho khả năng gây đáp ứng miễn dịch

trên chuột ........................................................................................................................ 81

3.3.2.2 Ảnh hưởng của chất bổ trợ đến khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của chuột với

kháng nguyên H7 ............................................................................................................ 84

3.3.3 Nghiên cứu các điều kiện lai tế bào lách chuột mẫn cảm với kháng nguyên H7 và

tế bào u tủy chuột ........................................................................................................... 86

3.3.31 Xác định hàm lượng amon clorua thích hợp để loại bỏ hồng cầu trong lách chuột

Babl/c.............................................................................................................................. 87

3.3.3.2 Xác định các điều kiện tối ưu để dung hợp tế bào................................................. 89

3.3.4 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển của tế bào lai và khả năng

sản sinh kháng thể ......................................................................................................... 94

3.3.5 Kết quả tách dòng tế bào lai và kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng với

kháng nguyên H7 ......................................................................................................... 101

CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................. 106

4.1 Kết luận.................................................................................................................. 106

4.1.1 Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số địa

điểm tại Hà Nội............................................................................................................ 106

4.1.2 Chế tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu của E.coli O157:H7............................... 106

4.2 Đề nghị ................................................................................................................... 107

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................108

PHỤ LỤC vi

128

vi PHỤ LỤC

I. Phụ lục bảng

Bảng 1. Các chủng vi khuẩn E.coli gây bệnh điển hình

Nhóm

ETEC

EPEC

Kháng nguyên O O55 O86 O111 O119 O125ac O126 O127 O128 O142

Kháng nguyên H H6, NM H34, NM H2, H12, NM H6, NM H21 H27, NM H6, NM H1, H12 H6

EIEC

EAEC

Kháng nguyên O O6 O8 O11 O15 O20 O25 O27 O78 O128 O148 O149 O159 O173 O3 O15 O44 O86 O77 O111 O127 O?a

Kháng nguyên H H16 H9 H27 H11 NM H42, NM H7 H11, H12 H7 H28 H10 H20 NM H2 H18 H18 NM H18 H21 H2 H10

O28ac O29 O111a O124 O136 O143 O144 O152 O159

NM NM NM H30,NM NM NM NM NM H2,NM

EHEC

O26 O55 O111ab O113 O117 O157

H11,H32,NM H7 H8,NM H21 H14 H7

129

H

O

K

H

K

Bảng 2. Kháng nguyên của các chủng vi khuẩn E.coli (sắp xếp theo kháng nguyên O) Kiểu KN K L L L B L L NE L NE NE L L L L L L L L L L L L L L B A A A A A A A A A A A A - B - NE

28 (A) 29 (A) 30 (A) 31 (A) 32 (A) 33 (A) 34 (A) 35 (A) 36 37 (A) 38 (A) 39 (A) 55 57 NE 5 10 NE NE 5 11 7 14 NE NE NE 1 NE 16 (76) (77) NE 17 83 84 101 20 13 18 (21)i 22

1 51 1 7 (56)c 1 2 NEd 2ab NE NE 3 6 12e 52 4 2ac 13 15 53 54 13 1 7 8 25 27 (A) 40 41 42 (A) 43 44 (A) 45 46 47 48 49 50 84 (A)f 87 102 (A) NE

9ab 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 10 11 11 11 12 13 14h 15 15 15 15 16 16 17 18ab 18ac 19ab 20 20 20 20 21 22 23 23 23

- - 12 - 19 - - - 19 - - 9 - 32 19 4 10 33 52 - 11 - 4 17 25 27 - 48 18 14 7 7 - 26 26 - - 1 15 15 15

7 - 4 7 6 1 8 2 31 44 5 5 - - 4 1 1 16 - 10 49 - 4 4 9 - 9 11 - 11 - 9 30 2 9 21 - - 19 - 20

Kiểu KN K A A A A A A A A A A A A A B NE L L NE NE L L L L NE NE NE L NE L B B B L B B - L L L L L

O 1b 1 2 2 2 2 2 3 3 3 4 4 4 4 5 6 6 6 6 6 6 7 7 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8

130

8 8, 60 9 9a 26 26 27 28 28 29 30 32 33 34 35 36 37 38 38 39 40 41 42 43 44 45 45 46 48 49 50 51 51 52 52 53 54 55 55 56 57 58 59 60 61

NE NE 9 26 (A) (60) (60) - - (73) - - - - - - - - - NE - - - - - 74 1 NE - - + - - NE - NE - - (59) (59) + - - - - -

21 51 12 - - 46 - - - 10 - 19 - 10 10 9 10 26 30 - 4 40 37 2 18 10 23 16 - 12 4 24 24 10 45 3 2 - 6 - - 27 19 33 19

NE NE L A B B - - B - - - - - - - - - NE - - - - - L L NE - - - - - - - NE - - B B - - - - - -

24 25 25 26 69 70 71 73 73 74 75 75 76 77 78 79 80 81 82 83 83 84 85 86 86 86 86 86 86 87 88 89 90 91 92 95 96 97 98 99 100 101 101 101 102

+ 19 23 (60) - - - - 92 - 95 100 - 96 (80) - - 97 - - 24 - - - (61) 2 (62) (64) (61) NE - - - - - - + - - - - - - 99 (L) 103 (A) -

- 12 1 - 38 42 12 31 34 39 5 5 8 - - 40 26 - - 31 31 21 1 25 - 2 36 34 47 12 25 16 - - 33 33 19 - 8 33 2 33 - - 8

- L L B - - - - L - - - - - B - - - - - L - - - B L B B B - - - - - - - - - - - - - - - -

131

62 63 64 65 66 68 109 110 111 112ab

- - - - - - - - (58) (68)

30 - - - 25 4 19 39 - 18

- - - - - - - - B B

103 104 105 106 107 108 139 140 141 141

8 12 8 33 27 10 56 43 4 4

- - - - - - - - B B, L

112ac 113 114 115 116 117 118

(66) (75) (90) - + 98 -

- 21 32 18 10 4 -

B B B B B - -

142 143 144 145 146 147 147

6 - - - 21 19 19

B - - - - B B, L

119 120 121 123 124 125ab 125ac 126 127a 127ab 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 139

(69) + - - (72) (70) (70) (71) (63) (65) (67) - - - + - - - (78) (79) (81) 12 (82) -

27 6 10 16 30 19 6 2 - 4 2 11 9 26 28 29 35 - - 41 - 1 56

B - - - B B B B B B B - - - - - - - B L B B -

147 148 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 169 160 161 162 163 164

+ - - - 98 - - - (85) (85) 88ab (L) (86) - - - - (89) (89) 88ac(L) (89) - NE (91) 93 - - - 94 - - 88ac(L) - - - - - - -

19 28 53 10 6 10 - 7 4 9 47 19 23 20 34 54 10 19 -

B - NE B - - - - - - - L - - - - - - -

Ghi chú: TLTK: tài liệu tham khảo, NE: chưa xác định

132

Bảng 3. Cấu trúc của kháng nguyên O ở một số chủng vi khuẩn E.coli gây

bệnh điển hình

Cấu trúc vùng biến đổi

Kháng nguyên O

Man

1,2 α

1 α

Man

1,3 α

1,2 α

1 α

Ribf

Galp

O20

1,2 α

1 β

GlcNac

Gal

L-Rha

1,3 α

1,4 α

O75

1,4

Man

Gal

GlcNac

O86

L-Fuc

Glc

Gal

GlcNac

1,2 β

1,4 α

1 α

O111

1,6

Col

GlcUA

GlcNAc

Gal

FucNAc

1,3 β

1,3

1,6

(O32)α

1,4

Glc

Man

GlcNAc

1,4 α

1 β

O58

1,3

RhaLA

133

1,4

Gal

Rha

1,2

Glc

O100

1,4 P-Glyc

Galp

Galf

GalNAcp

3 β

1,6 α

1 β

1,3 β

O124

1,4

GlcLA

Glc

1,6 β

GlcUA

1,3

Man

GlcNAc

GlcUA

Man

O141

1,2 1,6

2 4

Rha

1,4

1,3

α-L-Fuc

β-D-Glc

α-D-GalNAc]

O157

[α-D-PerNAc

134

Bảng 4. Phản ứng chéo giữa các kiểu kháng nguyên O của E. coli

Kháng nguyên O

Huyết thanh O 1

Huyết thanh O 61

108

Huyết thanh O 119

3, 48

120

3 4

13, 16, 17, 40, 68, 73, 106 154

121 123

53, 102, 105, 115, 117 101, 116, 123 12, 116, 121

63 64

5, 70, 71

124

125 126

11, 73

6 7

66 68

2, 10, 14, 50, 53, 107, 115, 117, 148, 149, 150, 154 1, 50, 53, 74, 117 13, 23, 53, 115 12, 13, 16, 18, 19, 102 7, 65, 70, 71, 114 57 5, 19, 25, 36, 71, 116, 141

32, 46, 60

8 9

127 128

86, 90, 128

69 70

45 7, 13, 18, 25, 36, 44, 62, 102 13, 51, 150 5, 65, 70, 74, 116 5, 7, 65, 70

129

130

13, 16, 133, 135

125

13, 17, 44, 56, 62, 68, 77, 106 2, 40 1, 163

131 132

113, 125, 143

74 75

12 13

4, 15, 16, 123 3, 16, 18, 19, 50, 62, 69, 129, 133, 147 24

133

12, 40, 45, 143 4, 46, 129, 135

15 16

17, 44, 66, 73 93, 116, 137

134 135

77 78

136

13, 129, 135, 147 46 13, 16, 17, 50, 129, 133

37, 51

137

138

18, 44, 62, 73, 77, 106 4, 13, 16, 19, 23, 133, 138, 147 13, 33, 39, 133, 147 22, 32, 83 3, 13, 18, 38, 68

20 21 23

21, 22, 32, 46 34, 140

139 140 141

7, 18, 25, 148, 150 102 34 7, 88

83 84 85

135

14, 56

142

143

3, 15, 131

19, 48, 90, 127 41, 48, 76, 116 141

144

112, 149

27 28 29 30

4, 7, 13, 18, 19, 26, 36, 68, 102 4, 13, 25, 32, 100, 102

89 91 92 93

115 39 19, 78, 91

145 147 148 149

32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

8, 21, 26, 83 4, 85, 140 25, 43, 109 48 23 7, 91 15 36, 118 68,73, 77, 106 15, 54, 66

94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107

13 19, 102, 133 1, 138 1, 50, 53, 112, 144 1, 69, 138 3, 115 1, 64 7 25 101 75

150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163

108 109 110 111

13, 63 26 117, 162 4, 25, 26, 36 17, 44, 62, 73 50, 102, 117, 123 61

46 48 49 50

51 52 53 54 55 56

8, 16, 134 19, 54, 59 1, 2, 13, 19, 44, 53, 107, 117, 133, 135 1, 2, 3, 50, 149 45, 48, 59 24

112 113 114 115 116 117

57 58 59 60

6 48, 54 8

118

144, 149 112, 117, 131 5, 48 1, 3, 152 7, 123 50, 76, 101, 122 121, 123

136

Bảng 5. Phản ứng chéo giữa kháng nguyên O của E. coli với các vi

khuẩn khác

Với vi khuẩn Shigella

E. coli

Shigella

S. boydii

S. dysenteriae S. flexneri

O28ac, O143, O32, O79, O87ab, O105ab, O112ab O112ac, O144, O124, O53 O129, O55

Với vi khuẩn Salmonella

E. coli O1 O2 O6 O15 O21 O23 O44, O62, O68 O70, O73, O99 O106 và O129 O55 O75 O85 O86, O90 O111 O132 O134

Salmonella O421 O55 O401403 O59 O38 O51 O6, 14 O501502504 O11 O17 O43 O35 O17 O36

Bảng 6. Thành phần cấu tạo của một số loại kháng nguyên K thuộc

nhóm vi khuẩn E.coli O8, O9, O101, O20

Đường trung tính

Đường acid

Đường amin

Kháng nguyên K26 K27 K28* K29 K30 K31 K32 K34* K42 K8 K9 K17, K85b K25 K57 K87

GlcUA GlcUA GlcUA, GalUA GlcUA GlcUA GlcUA GlcUA GlcUA, GalUA GalUA GlcUA NANA GlcUA GlcUA GalUA GlcUA

GalN, GlcN GalN GlcN GalN GlcN FucN, GlcN

Gal Glc Man + - + + + + - + + - + + + + + + + - + - + - + - - - + - + +

- - + + + - - + - - - - - - -

- + + - - - - - + - - - + - -

Fuc Rha Rib + - - - - - + - - - - - - - -

- - - - - - - - - - - - - + -

137

Bảng 7. Cấu trúc của một số loại kháng nguyên K của vi khuẩn E.coli thuộc nhóm O8, O9, O101, O20

Bảng 8. Thành phần cấu tạo của một số loại kháng nguyên K không

thuộc nhóm vi khuẩn E.coli O8, O9, O101, O20

138

Bảng 9. Sự phát triển trong các nghiên cứu về kháng thể đơn dòng Năm 1976

Loại kháng thể

- Kháng thể đa dòng - Mab ( lai tế bào động vật)

Loài vật chủ tạo Mab

- Chuột nhắt

Hệ thống biểu hiện

- Tế bào chuột nhắt

Ứng dụng

- Nghiên cứu - Chẩn đoán

Ứng dụng điều trị bệnh

Chưa có

Năm 2006 - Kháng thể đa dòng - Mab (lai tế bào động vật) - Mab tái tổ hợp - Mab tổng hợp - Chuột nhắt - Chuột cống - Chuột lang - Thỏ - Người - Gà - Tảo - Tế bào chuột nhắt và các tế bào động vật có vú - Vi khuẩn - Nấm mốc - Thực vât ( tảo, thực vật bậc cao) - Nghiên cứu - Chẩn đoán - Điều trị - Công nghệ nano - Ung thư - Kháng virus - Bệnh tim mạch - Loại thải mảnh ghép - Kháng viêm

Bảng 10. Thành phần phản ứng PCR

Thể tích 2.5µl

Thành phần MgCl2 25mM

Taq buffer 10X

2.5µl

Mix dNTP

2µl

Mồi ngược (R) 10pM

1µl

Mồi xuôi (F) 10pM

1µl

Taq DNA polymerase 5u/µl

0.5 µl

Template H2O Tổng thể tích phản ứng

Khuẩn lạc hoặc DNA 11.5 µl 25 µl

139

Bảng 11. Thành phần hỗn hợp phản ứng nối ghép sản phẩm PCR và

vector pBT

Thành phần H2O 2X buffer enzyme T4 ligase Vector pBT Sản phẩm PCR Tổng thể tích

Thể tích 5µl 1µl 1 µl 1 µl 2 µl 10 µl

Bảng 12. Thành phần phản ứng cắt đoạn DNA bằng enzym Bam HI

Đệm 10X Enzyme cắt Bam HI (5 U/µl) RNase (1mg/ml) H2O DNA plasmide Tổng thể tích

2,0µl 0,2µl 0,5µl 15,3 µl 2,0µl 20µl

Bảng 13. Thành phần gel SDS-PAGE

Hoá chất

Thể tích cho 2 bản gel

* Gel tách (separating gel)

4ml 2,5 ml 100 µl 3,3 ml 100 µl 5 µl

30% Acrylamide/bis – acrylamide 1,5 M tris – HCl (pH 8,8) SDS 10% Nước cất Amonium persulfate 3% (AP) N.N.N’.N’- tetramethylene diamin (TEMED)

* Gel cô đặc (stacking gel)

30% acrylamide/0,3% bis acrylamide 1 M tris – HCl (pH 6,8) SDS 10% Nước cất Amonium persulfate 3% (AP) N.N.N’.N’- tetramethylene diamin (TEMED)

0,83ml 0,63ml 0,05ml 2,3ml 0,05ml 5 µl

140

II. Phụ lục hình ảnh

Hình 1. Thời gian biểu hiện bệnh trên người do E. coli O157:H7

Hình 2. Các gen có liên quan đến độc tố của vi khuẩn nhóm EHEC

141

Hình 3. Sơ đồ phân lập E.coli O157:H7

EU118103.1| Escherichia coli strain O157:H7 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Length=1542 Score = 2715 bits (1470), Expect = 0.0 Identities = 1494/1506 (99%), Gaps = 0/1506 (0%) Strand=Plus/Plus Query 9 AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAAC 68 ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 8 AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAAC 67 Query 69 GGTAACAGGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGG 128 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 68 GGTAACAGGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGG 127 Query 129 GAAACTGCCTGATGGAGAGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCG 188 ||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 128 GAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCG 187

142

Query 189 CAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAG 248 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 188 CAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAG 247 Query 249 CTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGAC 308 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 248 CTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGAC 307 Query 309 CAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATAT 368 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 308 CAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATAT 367 Query 369 TGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTT 428 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 368 TGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTT 427 Query 429 GTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTA 488 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 428 GTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTA 487 Query 489 CCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAA 548 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 488 CCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAA 547 Query 549 GCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGA 608 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 548 GCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGA 607 Query 609 AATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGG 668 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 608 AATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGG 667 Query 669 GGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAAGAATACCGGTGGCG 728 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||| Sbjct 668 GGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCG 727 Query 729 AAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA 788 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

143

Sbjct 728 AAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA 787 Query 789 TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGG 848 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 788 TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGG 847 Query 849 CGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGAGGAGTACGGCCGCAAGGTTAA 908 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| Sbjct 848 CGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAA 907 Query 909 AACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGC 968 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 908 AACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGC 967 Query 969 AACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGC 1028 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 968 AACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGC 1027 Query 1029 CTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTG 1088 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1028 CTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTG 1087 Query 1089 GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAAC 1148 |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1088 GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAAC 1147 Query 1149 TCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCGTCATGG 1208 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| Sbjct 1148 TCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG 1207 Query 1209 CCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGC 1268 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1208 CCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGC 1267 Query 1269 GAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGGGTGGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGGCTC 1328 ||||||||||||||||||||||||| || ||||||||||||||||||||||||||| ||| Sbjct 1268 GAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTC 1327

144

Query 1329 CATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGG 1388 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1328 CATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGG 1387 Query 1389 CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAGGAAGTAGGTAGCTTAA 1448 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||| Sbjct 1388 CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAA 1447 Query 1449 CCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGGGAAGTCGTAACAAGGTA 1508 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| Sbjct 1448 CCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA 1507 Query 1509 GCCGTA 1514 ||||| Sbjct 1508 ACCGTA 1513

Hình 4. So sánh trình tự gen 16s ARNr của vi khuẩn E.coli O157:H7 M61 với trình tự của GeneBank ( mã số: EU118103.1)

Hình 5. Chai nuôi cấy tế bào VERO kiểm tra độc tố của E.coli O157:H7

Hình 6. Kiểm tra bệnh tích tế bào VERO do độc tố vi khuẩn

145

Hình 7. Hình ảnh nuôi cấy tế bào lai sau khi tách dòng

Hình 8. Hình ảnh tế bào u tủy chuột dòng Sp 2/0-Ag14

Hình 9. Hai khuẩn lạc tế bào lai trong cũng một giếng nuôi sau khi tách dòng ( giếng lai bị loại)

146

Hình 10. Khuẩn lạc tế bào lai sau khi tách dòng

III. Các loại môi trường, hóa chất thí nghiệm 1. Hóa chất dùng trong tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn Dung dịch sol I (glucose 50 mM, Tris-HCl (pH 8,0) 25 mM, EDTA (pH 8,0) 10 mM),

dung dịch sol II (sodium dodecyl sulfat (SDS) 1%, NaOH 0,2 M), dung dịch III

(potassium acetate 3 M pH 5), RNase 10 mg/ml.

2. Hóa chất dùng cho phản ứng tạo dòng Dung dịch CaCl2 100 mM lạnh, NdeI, SalI (Fermentas), T4 DNA ligase (Fermentas) 3. Hóa chất dùng cho cảm ứng biểu hiện protein Dung dịch IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside) 100 mM (giữ ở -20oC) (Fermentas) 4. Hóa chất dùng cho điện di protein - Gel phân tách (separating gel), acrylamide 12 %: 3,3 ml dH2O, 4 ml acrylamide 30 %, 2,5 ml Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8), 0,1 ml SDS 10 %, 0,1 ml APS 10 %, 30 µl TEMED - Gel gom (stacking gel): 2,8 ml dH2O; 0,66 ml acrylamide 30 %, 0,5 ml Tris-HCl

1M (pH 6,8), 0,04 ml SDS 10 %, 0,04 ml APS 10 %, 16 µl TEMED. - Dung dịch nạp mẫu 5X (giữ ở 4oC): SDS 10 % (w/v), DTT 10 mM, Tris-HCl (pH 6,8) 0,2 M, glycerol 20 % (v/v), bromophenol blue 0,05 %. - Dung dịch điện di 5X (giữ ở nhiệt độ phòng): 15,1 g Tris-base; 94 g glycine; 5 g SDS ; thêm dH2O cho đủ 1 l. - Dung dịch nhuộm gel (giữ ở nhiệt độ phòng): 0,625 g coomassie brilliant blue, 112,5 ml

ethanol tuyệt đối, 25 ml glacial acetic acid ; thêm dH2O cho đủ 250 ml.

- Dung dịch giải nhuộm (giữ ở nhiệt độ phòng): 100 ml glacial acetic acid, 100 ml ethanol tuyệt đối, 800 ml dH2O.

147

5. Hóa chất dùng cho Western blot - Dung dịch điện chuyển 1X (giữ ở 4oC): 3,03 g Tris-base, 14,41 g glycine, 200 ml methanol, thêm dH2O cho đủ 1 l.

- Dung dịch TBS 1X: 0,605 g Tris-base, 4,39 g NaCl, thêm dH2O đủ 500 ml. - Dung dịch TBST (dung dịch rửa): TBS + Tween 20 (1 %) - Dung dịch khóa màng (membrane blocking): TBST + sữa gầy (5 %) - Kháng thể đa dòng kháng IgG chuột đánh dấu horseradish peroxidase (Santa Cruz

biotechnology). - Dung dịch ly giải tế bào (bảo quản ở -20oC): Tris HCl 10 mM pH 7.4, NaCl 50 mM, Triton X100 1%, Na3VO4 (sodium orthovanadate) 1 mM, NaF (sodium fluoride)

50 mM, Na4P2O7 (tetrasodium pyrophosphate) 25 mM, EDTA 5 mM, Pepstatin

10 µg/ml, Protease inhibitor 1 viên/50 ml dung dịch ly giải.

- Phim, dung dịch developer và fixer (Kodak)

7. Hóa chất dùng trong ELISA kiểm tra đáp ứng miễn dịch của động vật Dung dịch PBS 1X (KH2PO4 1,47 mM, Na2HPO4 10 mM, KCl 2,7 mM; NaCl

137mM), dung dịch PBS – BSA 1 % (PBS 1X + BSA 1 % (w/v), dung dịch PBS –

Tween 0,05 % (v/v), kháng IgG thỏ/chuột đánh dấu HRP (horseradish peroxidase)

(Dako), dung dịch TMB (3,3´,5,5´- tetramethylbenzidine) (Kem-En-Tec), dung dịch

H2SO4 0,18 M.

8. Hóa chất dùng cho dung hợp tạo tế bào hydridoma: PEG 1500 (Sigma), dung dịch NH4Cl 0,17 M, HAT 50X (Sigma), HT 50X (Sigma) 9. Hóa chất dùng trong tinh sạch kháng thể đơn dòng - Cột Sepharose gắn protein A (GE Health Care), dung dịch gắn cột (Tris-HCl 0,1 M

pH 7,5, NaCl 0,15 M), dung dịch dung giải (glycine 0,1 M pH 2,8), dung dịch trung

hòa

10. Môi trường - Môi trường Luria-Bertani (LB): 10 g NaCl, 10 g bacto trypton, 5 g cao nấm men, hòa

tan trong H2O, chỉnh pH 7, thêm nước cho đủ 1 l. Hấp khử trùng ở 121°C trong 30 phút

- Môi trường LB + kanamycin : môi trường LB thêm agar 15 g/l, bổ sung kanamycin để

đạt nồng độ cuối 30 µg/ml.

148

- Môi trường MEM nuôi cấy tế bào (Sigma) 8,12 g/l, phenol đỏ 0,4 %, L-glutamine 2

mM, NaHCO3 0,1125 %, HEPES 20 mM, amphotericin-B 0,025 µg/ml, penicillin

G 100 UI/ml, streptomycin 100 µg/ml, huyết thanh (FBS – fetal bovine serum) 10 %,

chỉnh pH 7,2.

- Môi trường DMEM bổ sung HAT: môi trường DMEM (Gibco) bổ sung dung dịch HAT 1X (Hypoxanthine 1 x 10-4M, Aminopterin 4 x 10-7 M, Thymidine 1,6 x 10-5 M).

149

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu

và kết quả nghiên cứu trong luận án này là hoàn toàn trung thực và chưa

được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi thông tin trích dẫn

trong luận án được chỉ rõ nguồn gốc.

TÁC GIẢ LUẬN ÁN

Phạm Thị Tâm

150

ii LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện Đề tài và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ của Khoa Sau đại học, Khoa Chăn nuôi- Thú y, Bộ môn Vi sinh vật và Bệnh lý Trường ĐHNL - Đại học Thái Nguyên cùng các thầy cô giáo, các đồng nghiệp của Trường ĐHNL Thái Nguyên. Đồng thời, tôi cũng nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của Ban lãnh đạo và tập thể cán bộ Viện Công nghệ sinh học, Phòng thí nghiệm Tế bào gốc, trường ĐH Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. Tôi xin trân trọng cảm ơn tới những sự quan tâm giúp đỡ quý báu đó.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới 2 Thầy hướng dẫn khoa học: 1. TS. Phạm Công Hoạt, Bộ Khoa học và Công nghệ; 2. PGS.TS. Tô Long Thành, Giám đốc Trung tâm Chẩn đoán Quốc gia-

Cục Thú y, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.

Hai Thầy đã tận tình hướng dẫn tôi thực hiện đề tài và tạo mọi điều kiện giúp

đỡ tôi hoàn thành Luận án này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới sự giúp đỡ của các thầy, cô: PGS.TS. Nguyễn Thị Kim Lan, Khoa Sau đại học, trường ĐHNL Thái Nguyên đã luôn động viên, nhắc nhở, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành Luận án này; PGS.TS.Trần Thị Hạnh- Hội Thú y, GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên- trường ĐHNL Thái Nguyên đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành Luận án; Ths. Phan Kim Ngọc- Giám đốc Phòng thí nghiệm Tế bào gốc trường ĐH KHTN Thành phố Hồ Chí Minh, PGS.TS. Đinh Duy Kháng – Viện CNSH đã tạo điều kiện cơ sở vật chất, phòng thí nghiệm cho tôi thực hiện Đề tài; PGS.TS. Tống Kim Thuần- Viện CNSH đã giúp tôi kinh phí thực hiện nhánh đề tài sản xuất kháng thể đơn dòng của vi khuẩn E.coli O157:H7.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Viện Đại học Mở Hà Nội, ban Lãnh đạo và toàn thể cán bộ, giảng viên Khoa CNSH, Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình làm việc cũng như hoàn thành Luận án này;

Tôi vô cùng biết ơn các thành viên trong gia đình đã luôn ở bên tôi trong suốt

quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn! NGHIÊN CỨU SINH

151

Trang

DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Danh mục bảng trong báo cáo chính

Bảng 1.1 Các phản ứng sinh hoá của vi khuẩn E.coli O157:H7

Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR- Multiplex

Bảng 1.2

phát hiện vi khuẩn E.coli O157:H7

Trật tự các bộ ba các axit amin và gen fliC của các

Bảng 1.3

subtype kháng nguyên H7 ở vi khuẩn E.coli O157: H7

Bảng 3.1

Tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng cắt ADN plasmide

số địa điểm tại Hà Nội

Bảng 3.3

So sánh mức độ tương đồng của trình tự gen 16s

Các cặp mồi sử dụng để xác định gen độc tố của vi

Bảng 3.4

khuẩn E.coli O157:H7

Kết quả xác định các gen độc tố của các chủng E.coli

Bảng 3.5

O157:H7 phân lập

ARNr thu được với các trình tự của GeneBank

Bảng 3.6

Kết quả đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch

trên thỏ của các kháng nguyên

Bảng 3.7

Kết quả kiểm tra khả năng phát hiện đặc hiệu kháng

Kết quả theo dõi thí nghiệm ảnh hưởng của liều lượng

Bảng 3.8

kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch của chuột

Kết quả theo dõi thí nghiệm ảnh hưởng của chất bổ trợ

Bảng 3.9

đến đáp ứng miễn dịch của chuột

Ảnh hưởng của các loại muối và nồng độ đến khả năng

Bảng

3.10

phá vỡ hồng cầu trong lách chuột

nguyên của các kháng thể tạo thành trên thỏ

152

Bảng

Kết quả theo dõi ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm

3.11

Bảng

Phân tích mô hình thí nghiệm dung hợp tế bào

3.12

đến quá trình dung hợp tế bào

Bảng

3.13

Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của các yếu tố đế quá

Bảng

Kết quả tách dòng các tế bào lai sinh kháng thể đơn

102

3.14

dòng

Kết quả xác định độ đặc hiệu của các dòng kháng thể

Bảng

105

đặc hiệu với kháng nguyên H7 của vi khuẩn E.coli

3.15

O157:H7 (OD450)

trình sinh trưởng và sinh kháng thể của tế bào lai

Danh mục bảng trong phụ lục

Bảng 1 Các chủng vi khuẩn E.coli gây bệnh điển hình

Bảng 2 Kháng nguyên của các chủng vi khuẩn E.coli

Bảng 3 Cấu trúc của kháng nguyên O ở một số chủng vi khuẩn E.coli gây

bệnh điển hình

Bảng 4 Phản ứng chéo giữa các kiểu kháng nguyên O của E. coli

Bảng 5 Phản ứng chéo giữa kháng nguyên O của E. coli với các vi khuẩn

khác

Bảng 6 Thành phần cấu tạo của một số loại kháng nguyên K thuộc nhóm vi

khuẩn E.coli O8, O9, O101, O20

Bảng 7 Cấu trúc của một số loại kháng nguyên K của vi khuẩn E.coli thuộc

nhóm O8, O9, O101, O20

Bảng 8 Thành phần cấu tạo của một số loại kháng nguyên K không thuộc

nhóm vi khuẩn E.coli O8, O9, O101, O20

Bảng 9 Sự phát triển trong các nghiên cứu về kháng thể đơn dòng

Bảng 10 Thành phần phản ứng PCR

Bảng 11 Thành phần phản ứng nối ghép sản phẩm PCR và vector pBT

153

Bảng 12 Thành phần phản ứng cắt đoạn DNA bằng enzym Bam HI

Bảng 13 Thành phần gel SDS-PAGE

Trang

Hình ảnh trong báo cáo chính

Hình 1.1

Cấu trúc của độc tố Stx và cơ chế gây bệnh

Hình 1.2

Cấu trúc cơ bản của LPS

Hình 1. 3

Sơ đồ gen mã hoá kháng nguyên O157

Hình 1.4

Cấu trúc bề mặt tiên mao của vi khuẩn E.coli

Hình 1.5

Sơ đồ gen tổng hợp kháng nguyên H7

Hình 1.6

Sơ đồ gen của chủng vi khuẩn E.coli K12

Hình 1.7

Các loại kháng thể đơn dòng tái tổ hợp

Các hình ảnh sinh hóa và định typ bằng kháng huyết

Hình 3.1

thanh của vi khuẩn E.coli O157:H7

Kết quả tách chiết ADN tổng số của chủng vi khuẩn

Hình 3.2

E.coli O157:H7 phân lập

Hình 3.3 Kết quả phản ứng nhân đoạn gen 16s ARNr

Hình 3.4

Sơ đồ vector pBT

Khuẩn lạc vi khuẩn E.coli DH5α sau biến nạp

Hình 3.5

vector tái tổ hợp

Kết quả tách chiết DNA plasmide từ các khuẩn lạc

Hình 3.6

xanh, trắng

Hình 3.7 Kết quả cắt ADN plasmide bằng enzyme Bam HI

Hình ảnh tách ADN tổng số của vi khuẩn E.coli

Hình 3.8

O157:H7

Kết quả xác định các gen độc tố của các chủng

Hình 3.9

E.coli O157:H7 phân lập

Hình 3.10

Biểu hiện bệnh tích tế bào bị gây nhiễm bởi độc tố tách từ chủng E.coli O157:H7 M61 (pha loãng 102)

Hình 3.11 Kết quả điện di kháng nguyên của vi khuẩn E.coli

154

O157:H7 trên gel SDS-PAGE

Ảnh hưởng của các điều kiện và yếu tố dung hợp

Hình 3.12

đến quá trình lai tế bào

Đại thực bào thu nhận từ ổ bụng chuột BALB/c để

Hình 3.13

làm tế bào nuôi duỡng

Ảnh hưởng của các thành phần bổ sung vào môi

Hình 3.14

trường nuôi đến khả năng sinh trưởng và sinh kháng

thể của tế bào lai

Hình 3.15 Tế bào lai trong giếng của phiến nhựa 96 lỗ

101

Dòng tế bào sau 5 ngày tách dòng (trong phiến nhựa

103

Hình 3.16

96 lỗ)

Hình ảnh điện di kháng nguyên vi khuẩn E.coli

Hình 3.17

O157:H7 trên gel SDS-PAGE và Western blot với

104

Mab C3.26.IV

Biểu đồ, đồ thị trong báo cáo chính

Đồ thị 3.1

Biến thiên kháng thể tạo thành trên thỏ được gây

miễn dịch

Đồ thị 3.2

Biến thiên kháng thể trên chuột được tiêm kháng

nguyên H7 với các hàm lượng khác nhau

Đồ thị 3.3

Biến thiên hàm lượng kháng thể của chuột được

tiêm các chất bổ trợ khác nhau

Đồ thị 3.4

100

Kết quả theo dõi quá trình sinh trưởng và sinh

kháng thể của các dòng tế bào lai

Hình ảnh trong phụ lục

Hình 1

Thời gian biểu hiện bệnh trên người do E. coli O157:H7

Hình 2

Các gen có liên quan đến độc tố của vi khuẩn nhóm EHEC

Hình 3

Sơ đồ phân lập E. coli O157:H7

155

Trình tự gen 16s ARNr của vi khuẩn E.coli O157:H7 trên máy

Hình 4

giải trình tự Perkin Elmer

Hình 5

Chai nuôi cấy tế bào VERO kiểm tra độc tố của E.coli O157:H7

Hình 6

Kiểm tra bệnh tích tế bào VERO do độc tố vi khuẩn

Hình 7

Hình 8

Hình ảnh tế bào u tủy chuột dòng Sp 2/0-Ag14

Hai khuẩn lạc tế bào lai trong cũng một giếng nuôi sau khi tách

Hình 9

dòng (giếng lai bị loại)

Hình 10

Khuẩn lạc tế bào lai sau khi tách dòng

Hình ảnh nuôi cấy tế bào lai sau khi tách dòng

156

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TĂT

: Acid deoxyribonucleic ADN

: Acid ribonucleic ARN

: Acid ribonucleic ribosome ARNr

: Brain Heart Infusion BHI

: Đại thực bào ĐTB

E.coli O157:H7 : Escherichia coli O157:H7

: Enteropathogenic E.coli EPEC

: Enterotoxigenic E.coli ETEC

: Enteroinvasine E.coli EIEC

: Enteroaggregative E.coli EAEC

: Enterohaemorhagic E.coli EHEC

: Ethylenediaminetetraacetic acid EDTA

: Center for Disease Control and Prevetion CDC

: Clorua Cl

: Colony Forming Unit CFU

ELISA : Enzyme Link Immunosorbent Assay

: Food and Agriculture Organization FAO

FDA : Food and Drug Administration

FCA : Freund's Complete Ajuvant

FCS : Fetal Carf Serum

FIA : Freund's incomplete Ajuvant

KIA : Kligler Iron Agar

LB : Luria Agar

LPS : Lipopolysaccharide

Kda : Kilo Dalton

157

: Kilobase Kb

: Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine HAT

: Hypoxanthine, Thymidine HT

: Japan International Cooperation Agency JICA

Kháng nguyên O: Kháng nguyên thân

Kháng nguyên H: Kháng nguyên lông

Kháng nguyên K: Kháng nguyên giáp mô

: heat-labile toxin LT

HGKT : Hiệu giá kháng thể

: Haemolytic Ureamic Syndrome HUS

: miễn dịch cơ sở MDCS

: Natri Na

: oxaloacetate, pyruvate, bovine insulin OPI

: Polymerase Chain Reaction PCR

: Phosphate buffer saline PBS

: polyethylene glycol PEG

SMAC : Sorbitol MacConkey

: Heat stable toxin ST

Stx : Shiga toxin

: tế bào lai TBL

: United States Department of Agriculture USDA

Wzx : Gen mã hóa kháng nguyên thân

Wzy : Gen trùng hợp kháng nguyên thân