Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR và phân tích đặc điểm di truyền phân tử của virus BK ở bệnh nhân ghép thận

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

LÊ THỊ BẢO QUYÊN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV-DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

LÊ THỊ BẢO QUYÊN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV-DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR VÀ

PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN

Chuyên ngành Vi sinh vật học

Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn: TS. Hoàng Xuân Sử

TS. Mai Thị Đàm Linh

Hà Nội - 2020

LỜI CẢM ƠN

Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin trân trọng gửi tới TS. Hoàng Xuân Sử, người

thầy đã truyền cảm hứng nghiên cứu khoa học cũng như tận tình giúp đỡ, giảng giải

và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

nghiên cứu này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Mai Thị Đàm Linh, người thầy đã

hướng dẫn và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đinh Thị Thu Hằng cùng các cán bộ nhân

viên trong phòng thí nghiệm “Vi sinh và các Mầm bệnh Sinh học – Viện Nghiên

cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân y đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình

thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy, các cô trong bộ môn Vi sinh vật

cùng các thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học

Quốc gia Hà Nội đã hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho tôi trong quá trình

học tập và nghiên cứu tại trường.

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp

đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.

Hà Nội, 18 tháng 2 năm 2020

Học viên

Lê Thị Bảo Quyên

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Axit amin aa

Acquired Immunodeficiency Syndrome AIDS

Base pair Bp

BK virus BKV

BKVN BK virus nephropathy

Cytomegalo virus CMV

Cycle Threshold Ct

Deoxyribonucleic acid DNA

ELISA Enzyme - Linked - immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme)

Ethidium Bromide Etbr

Epstein-Barr Virus EBV

Hepatitis B virus HBV

Herpes Simplex Herpes HSV

Intravenous Nutritional Fluid INF

Forward/ Reverase F/R

Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside IPTG

In vitro diagnostic IVD

JC virus JCV

Kilobase pairs Kb

Luria-Bertani LB

Negative predictive value NPV

Polymerase Chain Reaction PCR

Tumor Necrosis Factors TNF

Positive predictive value PPV

Relative centrifugal force RCF

Restriction fragment length polymorphism RFLP

Receiver operating characteristic ROC

Revolutions per minute Rpm

Super Optimal broth Catabolite repression SOC (Môi trường dinh dưỡng tối ưu)

TBE Tris-boric-EDTA

UV Ultra violet (Tử ngoại)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2. 1. Các bộ kit tách chiết, các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ................ 30

Bảng 2. 2. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ..................................... 31

Bảng 2. 3. Thành phần và điều kiện Nested PCR khuếch đại gen VP1 .................... 35

Bảng 2. 4. Thí nghiệm đánh giá độ nhạy mẫu bệnh phẩm ........................................ 42

Bảng 3. 1. Thành phần phản ứng real-time PCR ...................................................... 51

Bảng 3. 2. Đánh giá độ đặc hiệu ............................................................................... 52

Bảng 3. 3. Khảo sát độ nhạy của kỹ thuật real-time PCR trên mẫu bệnh phẩm ....... 56

Bảng 3. 4. Đánh giá độ ổn định của mẫu chuẩn nồng độ 101-103 IU/µl ................... 58

Bảng 3. 5. Tỷ lệ nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận ............................................... 61

Bảng 3. 6. So sánh giữa ba nhóm bệnh nhân dựa vào giá trị ngưỡng ....................... 65

Bảng 3. 7. Đánh giá vai trò BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng ở bệnh nhân ghép thận .. 66

Bảng 3. 8. Sự phân bố các phân nhóm của BKV ...................................................... 69

Bảng 3. 9. Vị trí SNP khác nhau giữa kiểu gen BKV-I và BKV-IV ........................ 70

Bảng 3. 10. Xác định vị trí SNP BKV-I trong vùng gen VP1 (1630-1956) ............. 71

Bảng 3. 11. Đa dạng SNP ở kiểu gen BKV-IV ......................................................... 72

Bảng 3. 12. Trình tự axit amin ở những vị trí SNP trong phân nhóm IV ................. 73

Bảng 3. 13. So sánh trình BKV phân lập theo cặp từ mẫu máu ............................... 74

Bảng 3. 14. Sự phân bố kiểu gen BKV theo các chỉ số lâm sàng ............................. 77

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1. 1. Cấu trúc virion BKV ................................................................................. 7

Hình 1. 2. Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của BKV ............................................. 9

Hình 1. 3. Các tế bào decoy trong nước tiểu . ........................................................... 17

Hình 2. 1. Vector pGEM T easy ............................................................................... 29

Hình 3. 1. Khuếch đại đoạn chèn cho tách dòng ....................................................... 45

Hình 3. 2. Kết quả sàng lọc plasmid tái tổ hợp trên môi trường ............................... 46

Hình 3. 3. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme và AvaII ................................. 47

Hình 3. 4. Kết quả so sánh trình tự đoạn chèn với trình tự trên Ngân hàng gen Quốc

tế bằng phần mềm Blast ............................................................................................ 48

Hình 3. 5. Kiểm tra lại trình tự mồi và probe cho real-time PCR ............................. 49

Hình 3. 6. Tối ưu nồng độ probe ............................................................................... 50

Hình 3. 7. Tối ưu nồng độ mồi .................................................................................. 50

Hình 3. 8. So sánh sự tương quan giữa bộ mẫu chuẩn WHO và LDA ..................... 53

Hình 3. 9. Xác định khoảng định lượng của bộ mẫu chuẩn ...................................... 56

Hình 3. 10. Ngưỡng phát hiện BKV-DNA trên mẫu bệnh phẩm ............................. 57

Hình 3. 11. So sánh sự tương quan giữa hai bộ kit ................................................... 58

Hình 3. 12. Phân tích sự khác biệt giữa hai bộ kit .................................................... 59

Hình 3. 13. Đường cong ROC BKV-DNA trong máu nhằm phát hiện BKVN ........ 63

Hình 3. 14. Đường cong ROC BKV-DNA trong nước tiểu nhằm phát hiện BKVN63

Hình 3. 15. Cây phát sinh loài trên vùng gen VP1-BKV (1630-1956) ..................... 68

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3

1.1. Dịch tễ học ................................................................................................ 3

1.2. Tổng quan về BKV .................................................................................. 5

1.2.1. Lịch sử phát hiện BKV ............................................................................... 5

1.2.2. Đặc điểm sinh học ..................................................................................... 6

1.3. Mối quan hệ giữa BKV và bệnh lý ghép thận ..................................... 11

1.3.1. Mối tương quan giữa nồng độ BKV-DNA và bệnh lý ghép thận ............. 11

1.3.2. Độc lực kiểu gen BKV và bệnh lý ghép thận ............................................ 13

1.4. Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán BKV .................................. 16

1.4.1. Tế bào học ................................................................................................ 16

1.4.2. Sinh thiết thận .......................................................................................... 17

1.4.3. Chẩn đoán sinh học phân tử .................................................................... 17

1.5. Tình hình nghiên cứu BKV ................................................................... 19

1.5.1. Tình hình nghiên cứu phát triển kit ......................................................... 19

1.5.2. Tình hình nghiên cứu hiện trạng nhiễm BKV .......................................... 21

1.6. Phương pháp xây dựng cây chủng loại phát sinh ............................... 22

1.6.1. Định nghĩa ............................................................................................... 22

1.6.2. Đặc điểm của các phương pháp xây dựng cây chủng loại ...................... 23

1.6.3. Ứng dụng cây chủng loại phát sinh trong xác định genotype BKV ........ 25

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 27

2.1. Nguyên liệu ................................................................................................. 27

2.1.1. Mẫu nghiên cứu ........................................................................................ 27

2.1.2. Các vật liệu ............................................................................................... 27

2.1.3. Hóa chất ................................................................................................... 29

2.2. Thiết bị chính ............................................................................................. 31

2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 33

2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu ..................................................................................... 33

2.3.2. Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time

PCR .......................................................................................................... 34

2.3.3. Phân tích đặc điểm di truyền BKV ở bệnh nhân ghép thận .................... 43

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 45

3.1. Xây dựng quy trình định lượng BKV-DNA bằng real-time PCR ........ 45

3.1.1. Tách dòng vùng gen VP1 .......................................................................... 45

3.1.2. Thiết lập bộ mẫu chuẩn ............................................................................ 48

3.1.3. Thiết kế mồi và probe cho real-time PCR ................................................ 49

3.1.4. Tối ưu kỹ thuật real-time PCR .................................................................. 49

3.1.5. Đánh giá kỹ thuật real-time PCR ............................................................. 52

3.1.6. Quy trình xác định tải lượng virus BK trong máu và nước tiểu ở bệnh

nhân ghép thận ........................................................................................ 60

3.2. Xác định vai trò BKV-DNA với bệnh thận do BKV .............................. 61

3.2.1. Xác định tỷ lệ lưu hành BKV ở bệnh nhân ghép thận bằng kỹ thuật real-time PCR61

3.2.2. Xác định giá trị ngưỡng BKV-DNA dự đoán BKVN ................................ 62

3.2.3. Đánh giá vai trò BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng ............................... 66

3.3. Phân tích đặc điểm di truyền phân tử BKV............................................ 67

3.3.1. Xác định kiểu gen BKV lưu hành tại Việt Nam ........................................ 67

3.3.2. Phân tích các vị trí SNP-BKV trên vùng gen VP1 ở bệnh nhân ghép thận70

3.3.3. Đánh giá vai trò của kiểu gen BKV với bệnh thận do BKV ..................... 77

KẾT LUẬN ....................................................................................................... 79

KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 81

MỞ ĐẦU

Ghép thận là phương pháp điều trị thay thế hiệu quả nhất hiện nay cho những

bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối. Ở nước ta, ước tính khoảng 80.000 bệnh

nhân suy thận mạn giai đoạn cuối, 90% bệnh nhân suy thận mạn dẫn đến tử vong do

không được điều trị và khoảng 4.000 bệnh nhân có nhu cầu ghép thận mỗi năm.

Cho đến nay nhiều cơ sở y tế trong cả nước đã triển khai thành công kỹ thuật này,

góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cũng như hiệu quả kinh tế cho những bệnh

nhân suy thận mạn giai đoạn cuối.

Với sự ra đời của các loại thuốc ức chế miễn dịch thế hệ mới kèm theo là sự

tái hoạt động mạnh của BK virus (BKV) được khẳng định là nguyên nhân quan

trọng hàng đầu dẫn đến rối loạn chức năng thận ghép, thậm chí mất mô ghép ở bệnh

nhân sau ghép thận. Một số nghiên cứu tiến cứu theo dõi ở những người nhận thận

ghép cho thấy sự xuất hiện rất sớm BKV trong máu và nước tiểu, thậm chí trong

những giờ đầu sau ghép, với tỷ lệ mắc cao nhất xảy ra khoảng từ 1-3 tháng sau

ghép. Tỷ lệ BKVN (BK Virus Nephropathy: bệnh thận do BKV) ước tính khoảng 1-

10% trong năm đầu sau ghép thận, trong đó 50% trường hợp BKVN bị thải ghép

hoàn toàn [8].

Hiện nay, vấn đề theo dõi và giám sát nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận tại

nước ta chưa nhận được sự quan tâm đúng mức trong các cơ sở y tế có khả năng

thực hiện ghép thận. Chẩn đoán BKVN ban đầu thường gặp nhiều khó khăn do biểu

hiện lâm sàng không đặc hiệu, nghèo triệu chứng, do đó dễ bỏ sót chẩn đoán hoặc

nhầm với giai đoạn thải ghép cấp. Sinh thiết thận được coi là tiêu chuẩn vàng trong

xác định BKVN, nhưng đây lại là phương pháp xâm lấn, đòi hỏi trang thiết bị đồng

bộ và đào tạo chuyên sâu. Trong khi đó, việc xác định, theo dõi, giám sát tải lượng

BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR trong máu của bệnh nhân ghép thận đã

được công nhận là công cụ rất có giá trị tiên đoán BKVN [8]. Cho đến nay, chưa có

nghiên cứu phát triển kỹ thuật phân tử về BKV được công bố ở Việt Nam. Một số

cơ sở y tế đã sử dụng các kit thương mại như Realstar BKV PCR Kit (Altona

1

Diagnostics, Germany), Artus® BK Virus RG PCR Kit (Qiagen, Germany) … xác

định tải lượng BKV-DNA, tuy nhiên giá thành các kit này rất cao và đòi hỏi đầu tư

trang thiết bị đồng bộ, đồng thời còn chưa đề cập đến khía cạnh các kit này có thể

không phù hợp với một số chủng BKV lưu hành ở Việt Nam.

Một số nghiên cứu đề nghị rằng tải lượng BKV trong nước tiểu >107 copy/ml hay trong máu >104 copy/ml là giá trị cho phép chẩn đoán sớm BKVN [35]. Tuy

nhiên con số chính xác về giá trị ngưỡng cho phép phát hiện BKVN phụ thuộc vào

độ nhạy kỹ thuật real-time PCR cũng như sự tương tác giữa virus và người bệnh ở

những khu vực địa lý khác nhau. Mặt khác, BKV genotype I-IV cũng như các biến

thể khác của virus đã được tìm thấy ở những bệnh nhân BKVN [7]. Giải trình tự

vùng gen VP1 từ mẫu sinh thiết thận từ bệnh nhân viêm thận kẽ sau ghép nhấn

mạnh sự tồn tại của các “điểm nóng” đa hình, với trình tự không ổn định theo thời

gian ở hầu hết các trường hợp được theo dõi [18]. Các nghiên cứu in vitro gần đây

về các phân nhóm biến thể cho thấy sự thay thế axit amin có thể làm thay đổi khả

năng tương tác của virus với các tế bào chủ, do đó thay đổi độc lực của virus với

người bệnh [18]. Như vậy, sự đa dạng về đặc điểm di truyền BKV rất cần thiết để

tìm kiếm mối quan hệ tiềm năng giữa kiểu gen của BK virus và bệnh cảnh lâm sàng

sau ghép thận.

Cho đến nay, ở nước ta mới chỉ có một vài công bố về ca lâm sàng nhiễm

BKV ở bệnh nhân sau ghép thận. Nhận thấy tính cấp thiết của tình hình trên, chúng

tôi thực hiện đề tài với hai mục tiêu:

1. Xây dựng quy trình xác định tải lượng BK virus trong máu và nước

tiểu của bệnh nhân ghép thận bằng kỹ thuật real-time PCR.

2. Xác định tỷ lệ lưu hành và kiểu gen BKV, kết hợp phân tích các đặc

điểm di truyền phân tử của BKV ở những bệnh nhân ghép thận tại Việt

Nam.

2

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Dịch tễ học

BK virus là tác nhân gây nhiễm trùng phổ biến ở người nhưng không gây ra

triệu chứng lâm sàng, với tỷ lệ huyết thanh dương tính ở người trưởng thành là

80%. Các nghiên cứu dịch tễ học đã được thực hiện ở nhiều quốc gia khác nhau trên

thế giới, như Anh (tỷ lệ huyết thanh dương tính ở trẻ em, 83%), Phần Lan (60%),

Đức (71%), Ý (83%) [60]. Nhiễm trùng tiên phát thường xảy ra trong thời thơ ấu,

sau đó virus thiết lập trạng thái tiềm ẩn ở các tế bào biểu mô thận và biểu mô niệu

đạo, với khoảng 60-90% người trưởng thành có kháng thể kháng BKV trong

máu. Ở những người khỏe mạnh hay bệnh nhân có khả năng miễn dịch, hiện tượng

tái hoạt động của BKV và xuất hiện BKV trong nước tiểu rất hiếm khi xảy ra [38].

Sự tái hoạt động của BKV được kích hoạt khi phản ứng miễn dịch trung gian

qua tế bào suy giảm, điển hình ở các cá nhân bị suy giảm miễn dịch như AIDS, phụ

nữ có thai, bệnh nhân bị tiểu đường và đặc biệt là những trường hợp ghép tạng. Sau

khi nhân lên, BKV đi vào các mao mạch, xuất hiện trong nước tiểu và tấn công bộ

phận ghép, dẫn đến các tổn thương khác nhau. Khi sự nhân lên của BKV bắt đầu

xảy ra ở vùng vỏ thận thì có sự liên quan rõ rệt với sự hoại tử của tế bào biểu mô

ống thận và nồng độ creatinine huyết thanh tăng [42]. Người ta cho rằng cơ chế dẫn

đến rối loạn chức năng mô ghép thận đồng loại là do rò rỉ và sự chảy ngược nước

tiểu từ các ống thận bị tổn thương vào các khoang kẽ và các mao mạch quanh ống

thận. Do đó tổn thương và hoại tử ống thận cấp là đặc điểm quan trọng của bệnh

thận do BKV và là một yếu tố xác định BKVN [38]. Sự tổn thương thận mạn tính

do BKV dẫn đến xơ hóa mô kẽ của thận không thể hồi phục và teo ống thận.

Khoảng 1/3 số bệnh nhân xuất hiện BKV trong nước tiểu sẽ phát triển BKV trong

máu và nếu không được can thiệp kịp thời sẽ phát triển thành BKVN (tỷ lệ dao

động từ 1 đến 10%) [71]. Sự tái hoạt động của BKV ở bệnh nhân ghép thận lần đầu

tiên được chứng minh qua sự phát tán virus trong nước tiểu, với tỷ lệ từ 20% đến

60% bệnh nhân. Dữ liệu từ Mạng lưới chia sẻ nội tạng Hoa Kỳ (The United

3

Network for Organ Sharing) cho thấy tổn thương về thận ghép liên quan đến BKV

là 7,5% (70/938) trong năm 2009 và 5,7% (36/632) vào năm 2010 [68].

Một số yếu tố nguy cơ nhiễm BKV trước ghép bao gồm giới tính nữ, mô

ghép từ người cho chết não, những chấn thương gây thiếu máu cục bộ, kháng thể

đặc hiệu BKV cao ở người cho thận, sự không phù hợp HLA cũng như người cho là

người Mỹ gốc Phi [8]. Mức độ ức chế miễn dịch là yếu tố nguy cơ quan trọng nhất

ở những bệnh nhân ghép thận dẫn tới nhiễm BKV cũng như phát triển BKVN, tuy

nhiên chưa có những tiêu chuẩn liều lượng ức chế miễn dịch liên quan chắc chắn

đến sự xuất hiện của BK trong nước tiểu. Bên cạnh đó, những giả thuyết cho rằng

kháng thể trong huyết thanh của người cho có thể là nguyên nhân chính làm tăng

nguy cơ nhiễm BKV cũng như BKVN ở bệnh nhân sau ghép thận còn gây nhiều

tranh cãi. Kết quả nghiên cứu của Shah và cộng sự (2000) [75], cho thấy những

trường hợp mà BKV âm tính trong huyết thanh người nhận nhưng dương tính với

huyết thanh người cho có nguy cơ phát triển BKVN cao nhất (43%). Trong khi đó,

Bohl và cộng sự (2005) [25], lại ghi nhận nhóm có nguy cơ cao nhất phát triển

BKVN (50%) là nhóm huyết thanh dương tính với BKV ở cả người cho và người

nhận. Mặt khác, trong cả hai nghiên cứu, đều đồng nhất kết quả nhiễm BKV thấp

nhất (10%) khi huyết thanh đồng thời của người cho và người nhận âm tính với

BKV. Hơn nữa, Bohl và cộng sự cũng chỉ ra sự vắng mặt của HLA-C7 ở người

nhận có liên quan đến tăng nguy cơ nhiễm trùng [25].

Các yếu tố nguy cơ sau ghép dẫn tới BKVN bao gồm tổn thương niệu quản,

đái tháo đường, độ trễ chức năng thận ghép, nhiễm cytomegalovirus, điều trị thải

ghép cấp tính bằng các loại thuốc ức chế calcineurin hoặc steroid. Ngoài ra, những

bệnh nhân có HLA và ABO không tương thích với người cho hoặc tổn thương niệu

quản do đặt stent niệu quản có thể dẫn tới nguy cơ bị BKVN cao hơn [8].

Một số báo cáo cũng cho thấy sự xuất hiện của BKV trong máu hoặc nước

tiểu có thể phát hiện ở những bệnh nhân ghép tạng khác [6], [49], như ghép tim,

phổi và gan, nhưng nhìn chung sự có mặt của BKV trong máu hoặc nước tiểu không

4

liên quan đến chức năng thận suy giảm ở những bệnh nhân này [60], [71]. Ở những

bệnh nhân ghép tế bào gốc, sự tái hoạt động của BKV gắn liền với tình trạng viêm

bàng quang xuất huyết với các triệu chứng như khó tiểu, tiểu ra máu. Tỷ lệ nhiễm

BKV trong nước tiểu dao động từ 50%-100% ở người nhận ghép tủy xương và ghép

tế bào gốc tạo máu trong vòng 2 tháng sau cấy ghép [18].

BKV cũng được báo cáo là nguyên nhân gây ra hẹp niệu quản, hội chứng

thận hư, viêm bàng quang, viêm phổi, hội chứng tan máu và bệnh đa hồng cầu liên

quan đến polyomavirus. BKV cũng có thể liên quan đến bệnh lupus ban đỏ hệ thống

bằng cách tạo ra các kháng thể chống lại DNA và histones cũng như liên quan đến

các khối u và ung thư [38]. Hẹp niệu quản liên quan đến BKV đã được báo cáo ở

những người nhận ghép thận cũng như những người ghép tế bào gốc tạo máu.

Barasa.N và cộng sự (2010) [63], đã ghi nhận trường hợp ghép tế bào gốc tạo máu

xuất hiện một loạt các biến chứng sau ghép bao gồm hẹp niệu quản, viêm bàng

quang xuất huyết và hội chứng thận ứ nước. Bệnh nhân này được chỉ định xét

nghiệm máu với sự xuất hiện của herpes simplex virus (HSV) sau 21 ngày ghép, và

BKV sau 28 ngày. Mặt khác, sự lan rộng nhiễm trùng nội mô do BKV được ghi

nhận là có liên quan đến những tổn thương tế bào nội mô, dẫn đến tổn thương mao

mạch, phù nề và tăng sinh khối u trên cả hai bên thận. Báo cáo của Bratt G và cộng

sự (1999) [26], về một trường hợp bệnh nhân bị viêm võng mạc đang trong giai

đoạn AIDS tiến triển, ghi nhận BKV liên quan chặt chẽ tới viêm phổi. Hai trường

hợp tử vong do viêm phổi khác đã được báo cáo, trong đó 1 bệnh nhân sau ghép tế

bào gốc tạo máu và một bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu lympho mãn tính trong giai

đoạn hóa trị liệu [4], [89].

1.2. Tổng quan về BKV

1.2.1. Lịch sử phát hiện BKV

BKV được phát hiện lần đầu vào năm 1971, tại phòng thí nghiệm nghiên cứu

virus thuộc Lodon, Anh. Trong một nghiên cứu dịch tễ học về nhiễm

cytomegalovirus ở những người nhận ghép thận, Sylvia Gardner đã quan sát thấy

5

những mụn cóc sinh dục chứa hạt virus tương tự như papillomavirus ở một bệnh

nhân nam người Sudan. Những báo cáo tương tự về tình trạng mụn cóc xuất hiện

nhiều ở những bệnh nhân ghép thận cũng đã được công bố trước đó, tuy nhiên, yếu

tố quan trọng trong lâm sàng của bệnh nhân này là hiện tượng hẹp niệu quản, dẫn

tới phải can thiệp phẫu thuật. Sau khi tiêm nước tiểu của bệnh nhân vào tế bào thận

khỉ rhesus và các tế bào thận trong phôi thai người, xuất hiện bệnh học tế bào nhưng

không phải do papillomavirus. Do đó, virus này được xác định là virus mới, đặt tên

là BK theo tên viết tắt của bệnh nhân được phân lập lần đầu tiên [70].

1.2.2. Đặc điểm sinh học

1.2.2.1. Phân loại

BKV thuộc họ Polyomaviridae, chi Polyomavirus. BKV cùng họ với JC

virus (JCV) cũng như virus Simian 40 (SV40). BKV, JCV và SV40 là ba virus

thuộc họ polyomavirus, có tính tương đồng cao ở trình tự DNA và promassimotein.

Sự tương đồng trong trình tự gen giữa BKV – JCV và BKV - SV40 lần lượt là 72%

và 69%. Cả ba virus đều mã hóa cho 6 loại protein. Sự tương đồng axit amin trong

vùng sớm là 88% giữa BKV - JCV, 81% giữa BKV - SV40 và 79% giữa JCV -

SV40. Ở khu vực mã hóa muộn (các protein cấu trúc), sự tương đồng là 86% giữa

BKV- JCV, 85% giữa BKV - SV40 và 82% giữa JCV - SV40 [9].

1.2.2.2. Cấu trúc virion

BKV không có vỏ bao ngoài nhưng có vỏ capsid hình khối đa diện với 20

mặt tam giác đều, đường kính dao động từ 40-44 nm. Capsid gồm các protein cấu

trúc VP1, VP2 và VP3, bao quanh phân tử DNA kép mạch vòng được gắn kết cùng

với protein histone. Protein capsid được sắp xếp trong một cấu trúc đa diện 7 mặt có

chứa 360 phân tử VP1, sắp xếp thành 72 patamers. Mỗi patamer liên kết với bên

trong bằng một phân tử protein capsid VP2 hoặc VP3. Do đó, VP1 là protein duy

nhất bộc lộ bên ngoài virion, chịu trách nhiệm gắn kết virus với thụ thể tế bào chủ

cũng như thúc đẩy quá trình xâm nhập [3]. Trong những nghiên cứu gần đây, khi

quan sát BKV dưới kính hiển vi điện tử, các nhà khoa học thấy những điểm tương

6

tác giữa protein VP2, VP3 với protein histone và hệ gen. Nhiều giả thuyết đặt ra,

VP2 và VP3 là cầu nối giữa VP1 và cấu trúc chromatin [43].

Kích thước bộ gen BKV khoảng 5,3 kb, chứa các gen mã hóa cho protein cấu

trúc (VP1, VP2, VP3), các protein giúp cho quá trình nhân lên của virus (LTA:

Large T antigen, STA: Small T antigen, agnoprotein) và vùng không mã hóa

(NCCR: Non coding control region). NCCR là một vùng biến thể cao, có chứa các

vị trí liên kết khác nhau với các nhân tố điều hòa của tế bào chủ, do đó được xem là

vùng điều hòa biến thể (HVRR: Hypervariable Regulatory Region) [23]. Khung đọc

mở nằm ở trung tâm của bộ gen, thúc đẩy việc sao chép diễn ra theo hai chiều.

Trong quá trình nhân lên, LTA tạo thành một phức hợp đa phân liên kết với vị trí

khởi đầu sao chép (Ori) và hoạt động như một helicase để tạo điều kiện cho việc sao

chép vùng mã hóa muộn [86]. LTA cũng là một yếu tố điều hòa quan trọng, thúc

đẩy tế bào chủ đến pha S của chu trình tế bào bằng cách liên kết với các protein ức

chế khối u Rb, p107, p130 và p53 [39]. Bên cạnh đó, STA liên quan đến khả năng

nhân lên của virus, sự vận hành chu trình tế bào và biến nạp. Các protein capsid

VP1, VP2, VP3 được tạo ra trong tế bào chất, vận chuyển vào nhân thông qua các

tín hiệu định hướng nhân liên kết với proteins. Một khi các protein capsid xâm nhập

vào nhân, sự lan truyền của virus sẽ diễn ra [57].

Hình 1. 1. Cấu trúc virion BKV [3]

1.2.2.3. Con đường lây nhiễm

Con đường lây nhiễm BKV vẫn chưa được xác định rõ ràng [51]. Nhiều

bằng chứng cho thấy đường hô hấp và tiêu hóa là hai con đường lây truyền chính.

7

Các con đường lây nhiễm khác như truyền máu, đường sinh dục, ghép tạng (đặc

biệt là ghép thận đồng loại) và từ mẹ sang con cũng đã được báo cáo [3]. Nhiễm

trùng tiên phát thường hiếm khi xuất hiện các triệu chứng bệnh hoặc chỉ xuất hiện

triệu chứng viêm đường hô hấp nhẹ. Điều này cho thấy BKV thâm nhập đường máu

thông qua nhiễm trùng ở amidan. Sau khi thâm nhập vào các tế bào máu ngoại vi,

virus sẽ lan truyền sang các mô khác nhau, điển hình là thận [70]. Trong lần nhiễm

trùng tiên phát, BKV tồn tại dai dẳng trong các tế bào ống thận và sự tái hoạt động

không triệu chứng xảy ra khi virus được bài tiết trong nước tiểu. Trong khi đó, ở

những người khỏe mạnh hay bệnh nhân có khả năng miễn dịch, hiện tượng tái hoạt

động của BKV và sự xuất hiện của BKV trong nước tiểu rất hiếm khi xảy ra. BKV

cũng được tìm thấy trong tế bào bạch cầu, não, hạch bạch huyết với các bằng chứng

về sự xuất hiện BKV-DNA. Sự phát tán BKV trong nước tiểu phổ biến hơn ở những

bệnh nhân ghép thận so với người khỏe mạnh. Tuy nhiên, cơ chế về sự tồn tại dai

dẳng của BKV và những điều kiện dẫn tới sự tái hoạt động của BKV ở bệnh nhân

suy giảm miễn dịch vẫn chưa được nghiên cứu rõ ràng [51].

1.2.2.4. Chu trình nhân lên

Quá trình nhân lên của BKV được bắt đầu bằng sự kiện kháng nguyên VP1

gắn với acid sialic hoặc GD1b/GT1b trên màng tế bào chủ [27]. Sau khi phức hợp

gắn kết, BKV thâm nhập tế bào bằng con đường nhập bào (endocytosis) và được

vận chuyển tới lưới nội chất nhờ các microtubule [29]. Thông qua VP2, VP3 và con

đường importin, BKV tiếp cận nhân và giải phóng DNA vào tế bào vật chủ. Tuy

nhiên, genome của BKV xâm nhập vào trong nhân của tế bào vật chủ nhưng không

tích hợp vào hệ gen người. Mặt khác, nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng tích

hợp genome BKV vào hệ gen ở động vật gặm nhấm dẫn đến sự hình thành và phát

triển các khối u [3]. Hơn nữa, những hiểu biết về cơ chế tương tác giữa BKV-DNA

với hệ gen động vật gặm nhấm để hình thành khối u còn nhiều hạn chế. Sau khi giải

phóng DNA vào nhân, nhờ phức hệ enzyme của tế bào chủ, quá trình phiên mã sớm

diễn ra nhằm tạo ra các protein hỗ trợ quá trình sao chép của virus (STA, LTA).

Tiếp theo, các protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3) được hình thành từ tế bào chất và

8

vận chuyển vào nhân thông qua các tín hiệu định hướng nhân liên kết với proteins.

Một khi các proteins capsid xâm nhập vào nhân, sự lan truyền của virus sẽ diễn ra.

Hình 1. 2. Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của BKV [3]

1.2.2.5. Đáp ứng miễn dịch

• Đáp ứng miễn dịch tự nhiên

Phần lớn các nghiên cứu về mối tương tác giữa BKV với hệ thống miễn dịch

tự nhiên tập trung vào thiết lập sự tái hoạt động của BKV và BKVN ở những bệnh

nhân ghép thận (KTRs: Kidney transplant recipients). Womer và cộng sự đã chỉ ra

rằng có sự giảm số lượng tế bào tua (DC: Dendritic cells) trong máu ngoại vi ở bệnh

nhân BKVN. Các nghiên cứu sâu hơn đã xác định các bệnh nhân có số lượng DC

thấp hơn trước khi ghép có nguy cơ bị BKVN cao hơn [88]. DC cũng thực hiện một

9

vai trò quan trọng trong việc kích hoạt đáp ứng miễn dịch thích ứng, đặc biệt là biệt

hóa thành các tế bào T đặc hiệu BKV [31].

Các tế bào giết tự nhiên (NKs: Natural Killer Cells) cũng có vai trò trong

việc kiểm soát lây nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận. Các thụ thể giống với kháng

thể của tế bào NK (KIR) có vai trò trong đề kháng miễn dịch đối với BKV. Các

nghiên cứu mới đây đã chỉ ra rằng chiến lược giám sát miễn dịch của BKV có thể

thông qua việc ức chế quá trình nhận diện của các tế bào NK. Các yếu tố trung gian

khác của hệ miễn dịch tự nhiên cũng đóng góp vào việc kiểm soát BKV, như

defensins thể hiện hoạt tính chống nhiễm trùng với đa số các virus, nấm và vi

khuẩn. Nghiên cứu của Dugna và cộng sự đã chỉ ra Defensins 5 của người (HD5) ức

chế sự bám của BKV vào tế bào chủ bằng cách kết tụ virus [28]. HD5 thường được

tìm thấy trong đường niệu sinh dục, cũng chính là vị trí khu trú của BKV và HD5

có thể bất hoạt BKV theo kiểu phụ thuộc huyết thanh, thực hiện một vai trò quan

trọng trong việc điều tiết sự tái hoạt động không triệu chứng nhiễm virus trong

đường tiết niệu sinh dục.

Yếu tố trung gian trong hệ miễn dịch tự nhiên cũng có khả năng tác động lên

việc làm mất mô ghép ở bệnh nhân ghép thận do nhiễm BKV. Hơn nữa, người ta

cũng chỉ ra rằng nhiễm BKV thúc đẩy sự xơ hóa mô ghép ở bệnh nhân BKVN với

bằng chứng là sự tăng biểu hiện collagens nền, các yếu tố tăng trưởng khối u beta

(TGF-β), MMP2 và -9, cũng như là tín hiệu của quá trình chuyển đổi biểu mô

(EMT) trong mẫu sinh thiết thận [3].

• Đáp ứng miễn dịch thích ứng

Đáp ứng dịch thể

Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống BKV thường diễn ra không lâu sau khi

tiếp xúc với kháng nguyên của virus. BKV thường lây nhiễm từ thời thơ ấu, dẫn đến

các đáp ứng kháng thể trung hòa đặc hiệu BKV. Nghiên cứu của Egli và cộng sự

(2009) [30] trên nhóm người khỏe mạnh chỉ ra rằng kháng thể IgG đặc hiệu BKV

xuất hiện ở 87% những người trẻ tuổi (20-29) và 71% ở nhóm người tuổi trung niên

(50-59). Tương tự, Randhawa và cộng sự (2002) [70], đã phát hiện 80% người cho

10

thận có kháng thể IgG và 22% có kháng thể IgA đặc hiệu BKV. Các báo cáo cũng

chứng minh sự có mặt của các kháng thể đặc hiệu BKV không đủ để bảo vệ cơ thể

trước sự tái hoạt động mạnh mẽ của BKV và các bệnh liên quan. Mặt khác, các đột

biến kháng nguyên của virus có thể giúp virus trốn thoát khỏi sự trung hòa qua

trung gian kháng thể.

Đáp ứng miễn dịch tế bào

Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh vai trò quan trọng của tế bào T trong

việc kiểm soát sự lây nhiễm BKV. Các phân tích tế bào T-CD4 và T-CD8 đặc hiệu

với BKV ở trong máu ngoại vi và các tập hợp tế bào từ mẫu sinh thiết thận của bệnh

nhân BKVN cho thấy đáp ứng của tế bào T diễn ra rất mạnh và liên quan chặt chẽ

tới tải lượng cao của BKV. T-CD4 có thể kiểm soát sự tái kích hoạt BKV kể cả

trong hệ miễn dịch thiếu hụt tế bào T-CD8. Các thuốc ức chế miễn dịch ngăn cản

thải ghép ở bệnh nhân ghép thận có thể gây giảm biểu hiện các cytokine, như IFN-γ

và TNF. Một trong những trở ngại chính trong nghiên cứu tế bào T đặc hiệu BKV là

tỉ lệ thấp các tế bào tiền thân trong máu ngoại vi ở cả người cho và người ghép thận.

Các nghiên cứu chỉ ra rằng sự tái lập tế bào T đặc hiệu (T-CD4 và T-CD8 ) với

BKV liên quan tới khả năng kiểm soát tải lượng BKV trong máu và trong nước tiểu

tốt hơn. Do đó việc theo dõi tỷ lệ tế bào T đặc hiệu với BKV sau ghép có thể đưa

gia chiến lược giúp tiên lượng nguy cơ sự tái hoạt động của BKV và BKVN [3].

1.3. Mối quan hệ giữa BKV và bệnh lý ghép thận

1.3.1. Mối tương quan giữa nồng độ BKV-DNA và bệnh lý ghép thận

Trước thời kỳ sử dụng thuốc ức chế miễn dịch chống thải ghép là

cyclosporine, hẹp niệu quản là biến chứng thường gặp hơn là BKVN sau ghép thận.

Nhiều nghiên cứu đã phát hiện việc sử dụng các thuốc ức chế miễn dịch chống thải

ghép làm gia tăng nhiễm BKV ở người ghép thận. Một số nghiên cứu tiến cứu đã

chỉ ra rằng BKV dương tính cả trong huyết thanh và nước tiểu thậm chí ngay sau

giờ đầu tiên, và tỷ lệ cao nhất từ 1 đến 3 tháng sau ghép thận. Điều này cho thấy giả

thuyết về nguồn gốc của BKV có thể xuất hiện từ người cho thận chứ không chỉ

đơn thuần là sự tái hoạt động của BKV ở bệnh nhân ghép thận. BKV được công

11

nhận như là một dấu ấn liên quan đến sử dụng thuốc ức chế miễn dịch chống thải

ghép với liều quá cao [35].

Năm 2002, một nghiên cứu tiến cứu theo dõi sự hoạt động của BKV ở bệnh

nhân ghép thận một cách có hệ thống được thực hiện bởi Hirsch và cộng sự trên 78

bệnh nhân ghép thận. Kết quả nghiên cứu đã xác định BKV trong máu trung bình ở

tuần thứ 23 sau ghép và có 5 bệnh nhân phát triển BKVN trung bình ở tuần thứ 28.

Tải lượng BKV-DNA ở bệnh nhân BKVN cao hơn ở bệnh nhân không BKVN [36].

Nghiên cứu khác của Thakur và cộng sự đã theo dõi sự tái hoạt động của BKV ở 32

bệnh nhân ghép thận trong thời gian 3 năm cho thấy tỷ lệ cao nhất của BKV trong

nước tiểu và trong máu khoảng 1 tháng sau ghép [69]. Almeras và cộng sự theo dõi

119 bệnh nhân trong 12 tháng, 10,9% bệnh nhân dương tính với BKV và thời gian

trung bình phát hiện được là 90 ngày (23-214 ngày), trong đó 77% bệnh nhân xuất

hiện virus trong máu trước tháng thứ 4. Tất cả các bệnh nhân có BKV trong máu

đều có sinh thiết mô ghép và chỉ một người được chẩn đoán BKVN, trong đó tất cả

bệnh nhân có tải lượng virus ban đầu <4 log copy/ml (từ 2,69-3,45 log) [20]. Tương

tự, nghiên cứu của Mitterhofer và cộng sự trên 36 bệnh nhân ghép thận chỉ ra tỷ lệ

cao nhiễm BKV có thể phát hiện được cả trong máu và nước tiểu trong 12 giờ sau

ghép và không thay đổi cho đến tháng thứ 6 [6]. Nghiên cứu gần đây nhất khảo sát

214 cặp bệnh nhân ghép thận từ người cho sống xác định 85 bệnh nhân nhận thận

ghép có BKV trong nước tiểu, trong đó 61 bệnh nhân có BKV trong máu và 22

bệnh nhân có BKVN. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng sự xuất hiện BKV trong

nước tiểu ở người cho và người nhận trước ghép là yếu tố nguy cơ cho sự xuất hiện

BKV trong nước tiểu và trong máu ở bệnh nhân sau ghép cũng như sự xuất hiện của

BKVN sau ghép [74].

Theo Hướng dẫn Thực hành bệnh truyền nhiễm Hội ghép tạng Hoa Kỳ -

AST (AST Infectious Disease Community of Practice) đã được công bố gần đây và

các hướng dẫn của Hội đồng cải thiện toàn cầu về bệnh thận (The Kidney Disease

Improving Global Outcomes, KDIGO) khuyến cao bắt đầu kiểm tra xét nghiệm

BKV từ tháng nhất sau khi ghép và sàng lọc thường xuyên hơn (sàng lọc huyết

12

tương hàng tháng trong 6 tháng đầu, sau đó 3 tháng một lần cho đến 2 năm sau) có

thể thích hợp hơn trong các trung tâm ghép tạng chuyên khoa. Xét nghiệm sàng lọc

BKV kết hợp với giảm liều thuốc ức chế miễn dịch là một biện pháp hiệu quả để

ngăn ngừa tổn thương mô ghép đồng loại do BKVN. Tỷ lệ thải ghép cấp tính được

báo cáo sau khi giảm liều thuốc ức chế miễn dịch dao động từ 8 đến 12% và hầu hết

đều đáp ứng với điều trị bằng steroid [63]. Những bệnh nhân nhiễm BKV khi giảm

liều thuốc ức chế miễn dịch nên được theo dõi cẩn thận kết hợp với creatinine huyết

thanh được kiểm tra 1-2 tuần/lần và tải lượng BKV-DNA lặp lại trong khoảng thời

gian từ 2-4 tuần [71].

Nhiều nghiên cứu đã xác định rằng, tải lượng BKV-DNA trong nước tiểu > 107 copy/ml hay trong máu > 104 copy/ml là giá trị cho phép chẩn đoán sớm

BKVN. Sau khi BKV tái hoạt động, virus này có thể phát tán ra trong nước tiểu và

xuất hiện virus trong máu sau vài tuần. Đã có báo cáo về những trường hợp bệnh

nhân phát triển virus trong máu mà không có virus nước tiểu, nhưng hiếm gặp.

BKV trong máu có giá trị chẩn đoán dương (PPV, positive predictive value) cao đối

với BKVN so với BKV nước tiểu; do đó việc sàng lọc cho BKV máu là chiến lược

sàng lọc lý tưởng của nhiều tổ chức chuyên ngành thận uy tín trên thế giới. Bệnh

nhân ghép thận nghi ngờ có BKVN trên lâm sàng nên được chỉ định làm xét nghiệm

real-time PCR để xác định tải lượng BKV-DNA trong máu và trong nước tiểu [35].

Khi các chỉ số xét nghiệm BKV cao hơn giá trị ngưỡng cho phép chẩn đoán BKVN,

bệnh nhân cần được chỉ định sinh thiết thận để khẳng định chẩn đoán. Nếu bệnh

nhân không được điều trị thì nguy cơ không hồi phục chức năng thận ghép hoặc mất

thận ghép rất cao. Vì vậy, việc theo dõi và giám sát BKV hoạt động đóng vai trò rất

quan trọng trong chẩn đoán sớm BKVN và theo dõi điều trị thuốc ức chế miễn dịch

chống thải ghép [66].

1.3.2. Độc lực kiểu gen BKV và bệnh lý ghép thận

BKV được phân lập từ các khu vực địa lý khác nhau trên thế giới và được

chia thành bốn kiểu gen (BKV-I, II, III, IV) theo phương pháp huyết thanh học và

13

sinh học phân tử [80]. Kiểu gen I phổ biến nhất trong quần thể người khỏe mạnh

trên toàn thế giới (80%), tiếp đến là kiểu gen IV (15%), trong khi kiểu gen II và III

hiếm khi được phát hiện (2%). Xây dựng cây chủng loại phát sinh dựa trên so sánh

trình tự toàn bộ gen hoặc trình tự vùng gen đặc trưng VP1, BKV-I tiếp tục được

chia thành 4 phân nhóm I/a, I/b-1, I/b-2 và I/c; trong khi đó BKV-IV đa dạng hơn

với 6 phân nhóm IV/a-1, IV/a-2, IV/b-1, IV/b-2, IV/c-1, IV/c-2 [64]. Sự phân bố đa

dạng của các kiểu gen BKV cũng như phân nhóm BKV ở quần thể người đã được

nghiên cứu ở nhiều nước [80], trong đó phân nhóm I/a phổ biến ở châu Phi, phân

nhóm I/b-1 phổ biến ở Đông Nam Á, phân nhóm I/b-2 phổ biến ở châu Âu và phân

nhóm I/c phổ biến ở Đông Bắc Á [54]. Cũng như phân nhóm I, mỗi phân nhóm

BKV-IV tương ứng với một vị trí địa lý nhất định [64].

Trong nghiên cứu huyết thanh học, các kiểu gen BKV (I-IV) là các kiểu

huyết thanh hoàn toàn khác biệt [67]. Ở những người khỏe mạnh, hầu hết có kháng

thể trung hòa kiểu gen I, trong khi đó không hình thành kháng thể trung hòa kiểu

gen III hoặc IV. Hơn nữa, các phân nhóm I/b-1, I/b-2 có thể hoạt động như các kiểu

huyết thanh riêng biệt. Phân tích huyết thanh học trên chuột được tiêm vắc-xin

BKV dựa trên hạt giống virus (VLP) cho thấy sự khác biệt này được chi phối chặt

chẽ bởi vị trí gắn kết thụ thể glycan của tế bào trên bề mặt virion. Trong khi đó, tất

cả các phân nhóm trong kiểu gen IV có cùng một kiểu huyết thanh duy nhất. Mỗi

kiểu huyết thanh trung hòa liên kết với một phổ riêng biệt của các thụ thể bề mặt tế

bào, cho thấy các kiểu gen BKV khác nhau có mức độ nhân lên và khả năng gây

bệnh khác nhau. Do đó, các cá thể đã nhiễm một kiểu huyết thanh BKV vẫn có

nguy cơ bị tổn thương khi nhiễm các kiểu huyết thanh BKV khác sau khi điều trị

bằng thuốc ức chế miễn dịch tế bào T [67]. Điều này rất quan trọng vì nhiễm BKV

sau ghép thận chủ yếu xuất phát từ người cho thận [8]. Hơn nữa, người nhận ghép

thiếu kháng thể trung hòa (NAb) chống lại BKV dẫn đến nguy cơ có nồng độ BKV-

DNA trong máu cao hơn sau ghép thận [68]. Các nghiên cứu chỉ ra rằng 83 đến

98% dân số có phản ứng kháng thể trong huyết thanh với protein capsid chính

(VP1) của kiểu gen BKV-I khi họ 21 tuổi [79].

14

Các kiểu gen BKV I-IV cũng như các biến thể khác của BKV đã được tìm

thấy ở những bệnh nhân BKVN [7]. Giải trình tự vùng gen VP1 từ mẫu sinh thiết

thận từ bệnh nhân viêm thận kẽ sau ghép đã nhấn mạnh sự tồn tại của các “điểm

nóng” đa hình, với trình tự không ổn định theo thời gian ở hầu hết các trường hợp

được theo dõi. Các đột biến tập trung tại vòng lặp BC (thuộc vùng VP1) là nơi liên

kết với các thụ thể, liên quan trực tiếp đến khả năng lây nhiễm kém hơn so với

chủng hoang dại trên một số dòng tế bào nhưng những “điểm nóng” về đột biến có

thể mang lại lợi thế cho virus trong việc trốn thoát khỏi sự kiểm soát đối với hệ

miễn dịch của vật chủ [70]. Trong một số trường hợp, sự thay đổi chuỗi axit amin là

mối nguy cơ tiềm ẩn ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc bậc hai và bậc ba của protein.

Sự thay đổi axit amin trong khu vực VP1 đã được phát hiện trong các mẫu nước

tiểu thu thập từ cả nhóm bệnh nhân ghép thận không phát triển BKVN và nhóm

bệnh nhân BKVN. Các phân tích di truyền trên chuỗi VP1 cho thấy khu vực này

chứa vùng biến đổi cao bộ gen BKV từ nucleotide 1744 đến 1812 (axit amin 61 đến

83), trong đó một số sự thay thế axit amin luôn bảo tồn ở kiểu gen I-IV nhưng cũng

có một số thay thế chỉ mang tính tạm thời. Nghiên cứu của Tremolada S. và công sự

(2010) cho thấy sự thay đổi axit amin K69R và E73Q chỉ gặp ở những bệnh nhân

BKVN [84].

Các nghiên cứu in vitro gần đây về các phân nhóm biến thể cho thấy sự thay

thế axit amin có thể làm thay đổi khả năng tương tác của virus với các tế bào chủ,

do đó có thể làm thay đổi độc lực của virus với người bệnh [27]. Nghiên cứu của

Johannes Korth và cộng sự (2018) [52] tại Đức trên 56 bệnh nhân dương tính với

BKV trong máu cho thấy những bệnh nhân nhiễm BKV-II hoặc BKV-IV có nguy

cơ bị BKVN cao hơn so với nhiễm những kiểu gen khác. Trong khi đó, một số

nghiên cứu khác chỉ ra kiểu gen BKV-I/b-2 và BKV-IV thường dẫn đến nguy cơ

phát triển của BKVN cao hơn [73],[74] hoặc không có mối tương quan giữa các

phân nhóm BKV và sự phát triển của nhiễm BKV ở những người nhận ghép thận

[53]. Như vậy, vai trò của biến thể kiểu gen BKV trong sinh bệnh học các hội

chứng lâm sàng vẫn chưa được khẳng định rõ ràng và cần được làm sáng tỏ thêm.

15

Ngoài ra, những hiểu biết về kiểu gen BKV cần được hiểu rõ để đảm bảo

chất lượng của các xét nghiệm chẩn đoán được thực hiện trong các phòng thí

nghiệm sinh học phân tử. Có bằng chứng cho thấy kiểu gen III và IV không khuếch

đại tốt với một số bộ mồi PCR hiện đang được sử dụng. Việc xác định kiểu gen của

BKV cũng rất quan trọng để truy tìm dấu vết nhiễm trùng trong các nghiên cứu dịch

tễ học, ghi nhận các bệnh nhiễm trùng với nhiều chủng virus, xác định đáp ứng

miễn dịch đối với nhiễm virus và thiết kế vắc-xin với khả năng bảo vệ rộng

nhất. Mặt khác, kiểu gen liên quan mật thiết tới cách thức virus phát sinh, lây lan

trên toàn cầu từ điểm định vị địa lý đầu tiên để tiến hóa thành các chủng khác nhau

dưới tác động của chọn lọc tự nhiên.

1.4. Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán BKV

1.4.1. Tế bào học

Việc chẩn đoán sớm BKVN sau ghép thận ban đầu còn gặp nhiều khó khăn

và thách thức do triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu, nhiều trường hợp có thể

nhầm với giai đoạn thải ghép cấp khi sử dụng các thuốc ức chế miễn dịch chống

thải ghép.

Quy trình chẩn đoán được nhiều trung tâm hiện nay thực hiện bao gồm xét

nghiệm nước tiểu để tìm “tế bào bẫy” (decoy cell), thể "Haufen" hoặc định lượng

BKV trong nước tiểu và trong máu bằng kỹ thuật real-time PCR [71]. Thể Haufen

có thể phát hiện được bằng kính hiển vi điện tử. Việc xác định thể Haufen được báo

cáo liên quan đến BKVN có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, với giá trị chẩn đoán

dương tính (positive predictive value, PPV) và giá trị chẩn đoán âm tính (negative

predictive value, NPV) đều trên 97% [37]. Nước tiểu có thể được sàng lọc cho BKV

bằng phương pháp tế bào học hoặc định lượng BKV-DNA. Các tế bào biểu mô ống

thận có nhiễm BKV được đổ vào nước tiểu - tế bào decoy (Hình 1.3). Trong so sánh

tế bào học nước tiểu với PCR nước tiểu, tế bào decoy có độ nhạy chỉ 25% và độ đặc

hiệu 84% đối với BKVN so với PCR nước tiểu đạt độ nhạy, độ đặc hiệu tương tứng

là 100% và 78% [33]. Tuy nhiên, những kết quả ban đầu này cần được nghiên cứu

16

trên số mẫu lớn hơn, và nếu được kiểm chứng thì đây có thể là một phương pháp

không xâm lấn, có chi phí thấp trong sàng lọc BKVN [71].

1.4.2. Sinh thiết thận

Hiện nay xét nghiệm sinh thiết mô bệnh học (xác định bằng hóa mô miễn

dịch, in situ hybridization hay PCR) kèm theo bằng chứng của viêm thận kết mạc

hoặc creatinine huyết thanh tăng cao vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán

BKVN. Tuy nhiên, hiện nay xét nghiệm sinh thiết mô bệnh học (xác định bằng hóa

mô miễn dịch, lai tại chỗ hay PCR) kèm theo bằng chứng của viêm thận kẽ hoặc

creatinine huyết thanh tăng cao vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán BKVN.

Xét nghiệm được khuyến cáo thực hiện ít nhất 2 lần lặp lại, hạn chế tối đa sai số

trong lấy mẫu và ưu tiên mẫu có chứa các mô tế bào tủy thận. Do đó, khi có kết quả

BKV trong máu kèm creatinine huyết thanh tăng cao hoặc khi tình trạng virus trong

máu cao dai dẳng mặc dù đã giảm ức chế miễn dịch, bệnh nhân nên được chỉ định

xét nghiệm sinh thiết mô bệnh học [21]. Chiến lược này dựa trên hiện tượng BKV

trong máu được ghi nhận giảm có giá trị trong vòng 6 tháng sau khi giảm ức chế

miễn dịch. Như vậy, việc theo dõi thường xuyên sự hiện diện của BKV trong máu

có vai trò rất quan trọng trong quản lý và theo dõi điều trị bệnh nhân sau ghép thận

[24], [68].

Hình 1. 3. Các tế bào decoy trong nước tiểu [71].

1.4.3. Chẩn đoán sinh học phân tử

1.4.3.1. Dấu ấn sinh học Biomarker

17

Ngoài ra, dấu ấn sinh học mRNA trong BKVN cũng đang được quan tâm. Trong công bố của Ding và cộng sự, giá trị là 6,5 × 105 VP1 mRNA/ng RNA được

thiết lập như một ngưỡng dự báo của BKVN [85]. Ngưỡng này đã được xác nhận

trong một nghiên cứu khác, 12 trong số đó đã được kiểm tra sinh thiết BKVN [72].

mRNA granzyme B nước tiểu và mức mRNA protease inhibitor -9 cũng được

chứng minh là dự báo về sự suy giảm chức năng ghép, cho thấy các nghiên cứu mới

trong tương lai. Cơ sở dữ liệu mRNA nước tiểu có thể cung cấp thêm thông tin chẩn

đoán và tiên lượng ngoài sinh thiết thận trong tương lai khi có những căn cứ rõ ràng

hơn [71].

1.4.3.2. Realtime PCR

Phát hiện BKV trong huyết tương bằng kỹ thuật real-time PCR rất nhạy và

đặc hiệu cho BKVN. Tùy thuộc vào nghiên cứu, độ nhạy có thể đạt 100% và độ đặc

hiệu là khoảng 90%, với PPV là 50% và NPV là 100%, vượt trội hơn so với việc

phát hiện BKV-DNA trong nước tiểu bằng xét nghiệm tìm tế bào decoy hoặc PCR.

Đây là phương pháp sàng lọc lý tưởng ở hầu hết các trung tâm ghép tạng [71]. Đồng

thời, BKV máu rò rỉ trong nước tiểu là phổ biến và có thể xảy ra ở 30% số người

ghép thận [49]. Với ưu điểm của real-time PCR huyết tương và giá trị tiên đoán của

nó lớn hơn cho BKVN, không cần thực hiện xét nghiệm nước tiểu BKV trước khi

xét nghiệm huyết tương [71]. Tuy nhiên, tương tự như các xét nghiệm real-time

PCR trong theo dõi tải lượng EBV và CMV khác, hiện có sự khác biệt đáng kể

trong cách thức phát triển kỹ thuật giữa các phòng thí nghiệm dẫn đến khó so sánh

kết quả giữa các phòng thí nghiệm khác nhau cũng như xác định một giá trị ngưỡng

trong chẩn đoán và điều trị BKVN [24]. Vấn đề này đã được Bechert và cộng sự

nghiên cứu chi tiết khi so sánh kết quả giữa các kỹ thuật real-time PCR cũng như

các bộ mồi đã công bố [63]. Tuy nhiên, Hirsch và cộng sự xác định rằng mức BKV huyết tương > 104 copy/ml trong hơn 4 tuần có liên quan đến sự xuất hiện của

BKVN với độ đặc hiệu 93% [34] và giá trị này cũng được nêu trong các hướng dẫn

và khuyến cáo gần đây [32], [68]. Khuyến nghị này cũng đang được các trung tâm

18

ghép tạng sử dụng và cùng khảo nghiệm, sự thay đổi được xác nhận là ít nhất 1 log

nồng độ [24].

Tuy nhiên, hiện nay xét nghiệm sinh thiết mô bệnh học (xác định bằng hóa

mô miễn dịch, lai tại chỗ hay PCR) kèm theo bằng chứng của viêm thận kẽ hoặc

creatinine huyết thanh tăng cao vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán BKVN.

Xét nghiệm được khuyến cáo thực hiện ít nhất 2 lần lặp lại, hạn chế tối đa sai số

trong lấy mẫu và ưu tiên mẫu có chứa các mô tế bào tủy thận. Do đó, khi có kết quả

BKV trong máu kèm creatinine huyết thanh tăng cao hoặc khi tình trạng virus trong

máu cao dai dẳng mặc dù đã giảm ức chế miễn dịch, bệnh nhân nên được chỉ định

xét nghiệm sinh thiết mô bệnh học [21]. Chiến lược này dựa trên hiện tượng BKV

trong máu được ghi nhận giảm có giá trị trong vòng 6 tháng sau khi giảm ức chế

miễn dịch. Như vậy, việc theo dõi thường xuyên sự hiện diện của BKV trong máu

có vai trò rất quan trọng trong quản lý và theo dõi điều trị bệnh nhân sau ghép thận

[24], [68].

1.5. Tình hình nghiên cứu BKV

1.5.1. Tình hình nghiên cứu phát triển kit

Nồng độ BKV-DNA xác định bằng kỹ thuật real-time PCR với trình tự đặc

hiệu cao của BKV được khuếch đại bằng một đầu dò huỳnh quang và số lượng bản

sao khuếch đại được so sánh với đường cong chuẩn được tạo ra với các pha loãng

nối tiếp của một nồng độ BKV- DNA đã biết. Hầu hết, các phòng thí nghiệm tự

phát triển các xét nghiệm của mình nên đã có sự khác biệt đáng kể về kết quả định

lượng và ngưỡng phát hiện. Đồng thời, sự khác biệt về nguồn mẫu, quy trình tách

chiết DNA, trình tự primer, probe và chủng BKV được sử dụng cho việc thiết lập

đường chuẩn có thể ảnh hưởng đến kết quả định lượng và dẫn đến sự khó khăn khi

đưa ra các quyết định khi can thiệp điều trị trên lâm sàng. Hầu hết các xét nghiệm

real-time PCR định lượng sử dụng chủng BKV kiểu gen I (Dunlop) như là trình tự

tham chiếu để thiết kế mồi và probe [4].

19

Năm 2008, Hoffmann và cộng sự đã so sánh các kết quả từ 7 kit thương mại

khác nhau sử dụng chủng Dunlop hoặc mẫu lâm sàng (the mixed patient standard,

MPS) làm mẫu tham chiếu, kết quả xét nghiệm cho thấy có hiện tượng không nhất

quán (khác biệt > 1 log) được xác định trong 23% các xét nghiệm sử dụng MPS và

94% các xét nghiệm sử dụng Dunlop làm mẫu tham chiếu. Hiện tượng này được

phát hiện rõ nhất ở kiểu gen III và IV, do sự không phù hợp primer, probe cũng như

sự đa hình trình tự BKV-DNA [71]. Một công trình khác đã khẳng định rằng các

thử nghiệm PCR của BKV bằng cách sử dụng kiểu gen I như là mẫu tham chiếu có

thể ít nhạy hơn với các dòng biến thể (ngưỡng phát hiện 104 copy/μl đối với biến

thể so với 10 copy/μl cho kiểu gen I). Đây là một vấn đề cần lưu ý vì các biến thể

phụ hiếm gặp của BKV có liên quan đến BKVN [69], có lẽ do khó khăn trong việc

phát hiện chúng với tải lượng virus thấp. Để khắc phục hạn chế này, các xét nghiệm

nên được thống nhất thực hiện ở một phòng thí nghiệm phù hợp, đủ tiêu chuẩn để

theo dõi cho một bệnh nhân, trong trường hợp có nghi ngờ với các biến thể hiếm

gặp trong quá trình theo dõi điều trị, biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân không tương

quan với tải lượng virus, cần thực hiện các xét nghiệm phân tích sâu hơn về kiểu

gen [71]. Do các lựa chọn trong điều trị BKVN hiện nay còn hạn chế nên mục tiêu

sàng lọc BKV theo quy trình giúp chẩn đoán sớm bệnh nhân khi có virus nước tiểu

hoặc virus máu và can thiệp điều trị phù hợp trước khi phát triển thành BKVN.

Nghiên cứu tại Nhật Bản về phát triển kỹ thuật real-time PCR cho định

lượng BKV đã được Iwaki KK và cộng sự công bố năm 2010. Nghiên cứu hướng

tới phân tích các điểm đa hình trên một vùng trình tự bảo tồn của BKV (vùng VP2)

ảnh hưởng đến xét nghiệm phân tích định lượng BKV. Sử dụng kết hợp các kỹ thuật

phân tích, bao gồm phân tích biến đổi trình tự nucleotide trong các chủng của BKV,

phân tích và so sánh trình tự axit amin trong vùng gen đích ở các thành viên của họ

Polyomaviridae, dựa vào đó thiết kế mồi và probe cho xét nghiệm PCR và phát

triển real-time PCR đối với vùng gen đích VP2 của BKV. Kết quả đánh giá sơ bộ

cho thấy, thử nghiệm BKV có dải nồng độ rộng 6log với giới hạn phát hiện thấp nhất là 1,5 x 101 copy/phản ứng và độ chính xác cao với hệ số biến thiên nội phản

20

ứng thấp (CV<5%). Ngoài ra kỹ thuật cũng đưa ra độ nhạy và độ đặc hiệu cao đối

với BKV. Công bố này rất có giá trị trong việc đánh giá tác động của các biến thể

trình tự vùng VP2, đồng thời cung cấp nguồn dữ liệu phân tử BKV cho các nghiên

cứu về dịch tễ học [45].

Nghiên cứu gần đây tại Mỹ (2016) đã so sánh sự khác biệt về nồng độ BKV-

DNA khi thiết kế mồi, probe dựa trên trình tự hai vùng gen là VP1 và LTA. Sau khi

phân tích hồi quy probit trên những dải nồng độ pha loãng khác nhau cho thấy giới

hạn phát hiện của kỹ thuật real-time PCR dựa trên trình tự gen VP1 và LTA lần lượt là 1,8 x 102 copy/ml và 3,5 x 102 copy/ml với độ tin cậy 95%. Phân tích độ nhạy và

độ đặc hiệu trên 116 mẫu bệnh phẩm lâm sàng, xác định được độ nhạy và độ đặc

hiệu của kỹ thuật real-time PCR dựa trên trình tự gen VP1 và LTA lần lượt là 90%,

96% và 97%, 98% [40].

1.5.2. Tình hình nghiên cứu hiện trạng nhiễm BKV

Ở nước ta cho đến nay mới chỉ có một vài công bố về ca lâm sàng nhiễm

BKV ở bệnh nhân sau ghép thận. Năm 2015, Hà Phan Hải An và cộng sự đã báo

cáo một ca lâm sàng BKVN tại bệnh viện Hữu nghị Việt Đức ở một bệnh nhân suy

thận giai đoạn cuối được ghép thận từ người cho sống. Sau ghép 8 tháng bệnh nhân

có biểu hiện tăng creatinine máu (156 µmol/l) trong khi đó tình trạng lâm sàng vẫn

ổn định và các xét nghiệm chức năng khác trong giới hạn bình thường. Để xác định

nguyên nhân gây suy chức năng thận ghép, bệnh nhân được chỉ định xác định tải

lượng BKV và sinh thiết thận ghép chẩn đoán mô bệnh học. Kết quả xét nghiệm xác định BKV bằng kỹ thuật real-time PCR cho thấy: BKV nước tiểu: 8,27x1010 copy/ml; BKV máu: 1,7x104 copy/ml. Kết quả sinh thiết thận ghép cho thấy có hình

ảnh tổn thương ống thận và mô kẽ, thâm nhập tế bào đơn nhân mô kẽ. Không thấy

có dấu hiệu tập trung tế bào viêm ở mao mạch quanh ống thận và ở ống thận,

nhuộm hóa mô miễn dịch với CD4 âm tính. Từ các kết quả xét nghiệm, bệnh nhân

được chẩn đoán BKVN và được điều trị bằng điều chỉnh thuốc ức chế miễn dịch,

chức năng thận ghép được cải thiện và ổn định, tuy nhiên không thể hồi phục về

21

tình trạng ban đầu ngay sau ghép. Từ ca bệnh lâm sàng trên cho thấy vấn đề chẩn

đoán BKVN sau ghép còn nhiều thách thức nếu không có cách tiếp cận đúng và

việc chỉ định xét nghiệm xác định tải lượng BKV-DNA trong máu và nước tiểu

đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán sớm và theo dõi điều trị BKVN [1].

Công bố của Trịnh Hùng và cộng sự đã phát hiện 2 trường hợp nhiễm BKV

(trong đó có 1 trường hợp đồng nhiễm BKV và CMV) trong quá trình sàng lọc và

theo dõi điều trị sau ghép thận tại Bệnh viện 19-8. Bệnh nhân sau ghép thận cần

theo dõi nguy cơ nhiễm BKV đặc biệt là trong năm đầu tiên. Sử dụng các công cụ

chẩn đoán như BKV- DNA trong nước tiểu và huyết tương, đánh giá mô bệnh học

thận là rất quan trọng để chẩn đoán sớm. Điều trị bằng việc giảm liều thuốc ức chế

miễn dịch để ngăn ngừa tiến triển suy thận ghép giúp đem lại hiệu quả nhất định

[2].

1.6. Phương pháp xây dựng cây chủng loại phát sinh

1.6.1. Định nghĩa

Cây phát sinh chủng loại (phylogenic tree) mô tả lịch sử tiến hóa của một

nhóm các loài với những đặc tính khác nhau nhưng cùng có mối quan hệ họ hàng

với nhau và cùng hình thành từ một tổ tiên chung trong quá khứ. Có nhiều hướng

nghiên cứu khác nhau để xây dựng cây chủng loại phát sinh như so sánh các hóa

thạch (fossil) hoặc các di chỉ (record) của cổ sinh vật học (thuộc khảo cổ học -

paleontology), đặc điểm hành vi của sinh vật hay so sánh trình tự các đoạn DNA

(thuộc sinh học phân tử hay hệ gen học (genomics) [90].

Các chỉ số đại diện cho độ tin cậy của cây chủng loại được xây dựng bao

gồm chỉ số bootstrap, chỉ số CI, chỉ số RI. Chỉ số bootstrap là tần số xuất hiện của

một nhóm (cluster) trên số lần giản đồ được thiết lập, với đơn vị tính là % (phần

trăm). Theo Felsenstein (1985), bootstrap là một công cụ hỗ trợ cho việc xây dựng

cây phát sinh loài. Chỉ số bootstrap nói lên độ tin cậy của sự gần gũi các thành viên

của nhóm trong cây phả hệ. Trong khi đó, chỉ số CI (Consistency Index) là tỉ số đo

tương thích giữa một cây bất kỳ trong tổng số các cây được phân tích có tổng số

22

nhánh ít nhất. Giá trị CI biến động trong khoảng 1.0 (tương thích tối đa) tiệm cận

đến 0 (ít tương thích nhất). Giá trị CI càng lớn thì kết quả có mức độ tin cậy càng

cao. Ngoài ra, RI (Retention Index) là chỉ số thể hiện số lượng tính trạng tương

đồng của 2 hay nhiều giống cùng tổ tiên trên cây phân loại [90].

1.6.2. Đặc điểm của các phương pháp xây dựng cây chủng loại

Hai tiêu chí chính được sử dụng để phân loại các phương pháp xây dựng cây

phát sinh gồm loại dữ liệu sử dụng làm đầu vào và thuật toán sử dụng để xác định

cây. Dữ liệu đầu vào có thể là dữ liệu phân tử hoặc có thể là dữ liệu khoảng cách.

Dữ liệu phân tử đặc trưng bởi các chuỗi liên kết (nucleotide hoặc axit amin), trong

khi đó dữ liệu khoảng cách là một ma trận với một thước đo khoảng cách tiến hóa

giữa mỗi cặp trình tự trong nhiều liên kết đã được tính toán. Ưu điểm chính của dữ

liệu khoảng cách là cho phép tính toán nhanh chóng các cây phát sinh, tuy nhiên lại

mất thông tin khi chuyển từ dữ liệu phân tử sang dữ liệu khoảng cách.

Phương pháp khoảng cách chỉ có thể được sử dụng trên dữ liệu khoảng cách,

dựa trên ý tưởng từng cặp trình tự sẽ được so sánh thẳng hàng và ứng với từng cặp,

khoảng cách di truyền được xác định. Thuật toán chỉ dừng lại khi tất cả các chuỗi đã

được phân nhóm và các trình tự được nhóm lại sẽ xác định cấu trúc liên kết cây.

Phương pháp khoảng cách gồm hai thuật toán là UPGMA (Unweighted pair-group

method using arithmetic averages) và NJ (Neighbour Joining).

UPGMA là thuật toán xây dựng cây đơn giản nhất với việc giả định tốc độ

tiến hóa không đổi của các chuỗi trong tất cả các nhánh của cây (giả định đồng hồ

phân tử). Giả định này rất khó có thể xảy ra nếu các trình tự cách nhau với khoảng

cách tiến hóa lớn. Tuy nhiên, thuật toán này có ưu điểm là tạo ra cây có gốc với tốc

độ rất nhanh [90].

Bên cạnh đó, NJ là phương pháp tiến hóa tối thiểu ở mỗi bước trong quá

trình tính toán phân cụm. Khác với UPGMA, NJ không cho rằng tốc độ tiến hóa là

như nhau trong tất cả các nhánh của cây và điều chỉnh tỷ lệ biến thể giữa các nhánh.

Phương pháp này bắt đầu với một cây gốc dạng như ngôi sao. Mỗi cặp sẽ được

23

đánh giá riêng và tổng của tất cả các chiều dài nhánh được tính toán để hình thành

cây. Cặp có tổng nhỏ nhất thì có mối quan hệ gần nhất và do đó được nối lại với

nhau để hình thành một nhánh mới. Quá trình này được lặp lại cho đến khi chỉ có

một điểm đầu và một điểm cuối duy nhất. Phương pháp NJ tương đối nhanh và

thường cho kết quả tốt hơn phương pháp UPGMA [90].

Phương pháp dựa trên ký tự có thể được sử dụng trên cả dữ liệu chuỗi và

khoảng cách, dựa trên ý tưởng tạo ra tất cả các cấu trúc liên kết cây có thể từ các

chuỗi dữ liệu đầu vào. Cây có xác suất xuất hiện cao nhất là cây phù hợp nhất với

dữ liệu đầu vào. Nhược điểm của các thuật toán này là rất tốn thời gian vì số lượng

cấu trúc liên kết cây phát triển rất nhanh với số lượng trình tự. May mắn thay, có

các phương pháp tìm kiếm tránh phải đánh giá tất cả các cây, tuy nhiên, việc đánh

giá nhiều cây khác nhau làm cho các phương pháp dựa trên ký tự tốn nhiều thời

gian hơn so với các phương pháp phân cụm (khoảng cách). Trong khi phương pháp

phân cụm cho kết quả trong vòng vài giây thì phương pháp ký tự có thể mất vài

phút, thậm chí là hàng giờ, tùy thuộc vào số lượng trình tự và độ dài của chúng. Ưu

điểm chính của các phương pháp dựa trên ký tự là chúng cho phép tính toán các

chuỗi tổ tiên (nghĩa là chuỗi tại các nút bên trong của cây) và không bị mất thông

tin (hoạt động trực tiếp trên nhiều dữ liệu căn chỉnh chuỗi) [90]. Thuật toán này

gồm hai phương pháp là:

* MP (Maximum Parsimony: khả năng tối thiểu): cơ sở lý thuyết của

phương pháp này là ý tưởng triết học của William of Ockham, với giả thuyết tốt

nhất để giải thích một quá trình là một yêu cầu đặt ra các giả định nhỏ nhất. Phân

tích tối đa được áp dụng cho việc xây dựng cây phát sinh liên quan đến việc tính

toán số lượng thay thế tối thiểu trên tất cả các vị trí cho mỗi cấu trúc liên kết để hình

thành chiều dài cây. Cây MP là cây có chiều dài cây tối thiểu với ưu điểm chính là

phù hợp với các chuỗi liên quan rất xa do thông tin trong một số vị trí bảo tồn có xu

hướng biến mất nếu sử dụng các phương pháp khoảng cách cho các chuỗi [90].

* ML (Maximum Likehood: khả năng tối đa): Đây là phương pháp tốn

nhiều thời gian nhất nhưng lại cho kết quả đáng tin cậy nhất với khả năng tái cấu

24

trúc chính xác các mối quan hệ giữa các chuỗi đã được tách ra trong một thời gian

dài hoặc đang phát triển nhanh chóng, đòi hỏi một phương pháp sửa chữa cho nhiều

sự kiện đột biến tại cùng một vị trí. Ứng với mỗi mô hình tiến hóa được chọn,

phương pháp này sẽ tính toán khả năng xác suất mà một cây tiến hóa có thể có từ

chuỗi trình tự phân tích. Cây tiến hóa có xác suất cao nhất là cây cuối cùng được

chọn [90].

1.6.3. Ứng dụng cây chủng loại phát sinh trong xác định genotype BKV

Kiểu gen BKV có thể được xác định thông qua phương pháp huyết thanh học

và sinh học phân tử. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của lĩnh vực sinh học

phân tử, việc xác định kiểu gen BKV có thể được thực hiện thông qua các phương

pháp như PCR hoặc real-time PCR đa mồi, RFLP… Tuy nhiên, giải trình tự và xây

dựng cây chủng loại phát sinh là phương pháp tối ưu nhất với độ tin cậy, độ chính

xác cao, đồng thời cho phép phân tích những đột biến SNP (Single Nucleotide

Polymorphism) làm thay đổi độc lực của virus.

Việc lựa chọn gen đích và phương pháp xây dựng cây chủng loại phù hợp để

xác định kiểu gen là vấn đề mấu chốt giúp cây chủng loại phát sinh có độ tin cậy

cao. Nghiên cứu của Zhang-Yang Wang và cộng sự (2015) [87] trên 23 mẫu huyết

tương và 95 mẫu nước tiểu dương tính với BKV dựa trên trình tự vùng gen VP2 và

hai phương pháp phân tích UPGMA, Neighbour Joining cho độ tin cậy không cao

khi giá trị bootstraps lần lượt là 25%-61% và 0%-17%. Trong quá trình phân tích

phát sinh dựa trên trình tự gen VP2, nghiên cứu này cho thấy phương pháp NJ

không thể tạo ra một cây phát sinh gen phù hợp và chỉ ra rằng phương pháp

UPMGA tốt hơn cho kiểu gen. Mặt khác, đa hình cũng xuất hiện nhiều ở gen kháng

nguyên T lớn, chiếm 11,39% trong tất cả các vị trí nucleotide. Các locus đa hình

BKV cũng đã được phát hiện khi so sánh các vùng kiểm soát không mã hóa

(NCCR). Nghiên cứu của Luo C và cộng sự cho thấy cây phát sinh gen dựa trên

kháng nguyên T lớn (LTA) cho phép tách kiểu gen I thành các phân nhóm I/a, I/b-1,

I/b-2 và I/c, với giá trị bootstrap là 100%, tốt hơn so với bootstraps thu được khi sử

25

dụng chuỗi VP1 (giá trị bootstrap từ 71% đến 97%). Tuy nhiên, sự phân chia của

các phân nhóm IV cho giá trị bootstraps không cao (33%) [58].

Do bộ gen của BKV có rất nhiều vị trí đột biến, đặc biệt khu vực mã hóa đa

hình nhiều nhất trong bộ gen virus là VP1 nên các nghiên cứu phần lớn đều tập

trung vào tính đa hình của gen VP1 cũng như các đột biến trong dư lượng axit amin

được mã hóa bởi gen VP1. Hơn nữa, hầu hết các nghiên cứu trước đây xác định 4

kiểu gen BKV dựa vào trình tự toàn bộ gen hoặc trình tự vùng gen VP1 với công bố

đầu tiên của Jin và cộng sự (1993) [47]. Khi xây dựng cây chủng loại phát sinh dựa

trên trình tự gen VP1, phương pháp NJ thường được áp dụng cho gen VP1 do tính

đa dạng đa hình cao [15]. Đáng chú ý là kiểu gen dựa trên gen VP1 mang lại định

nghĩa rõ ràng hơn về các phân nhóm khi phân tích các đoạn gen ngắn hơn 300 bp

[46]. Điều này chỉ ra rằng VP1 mang nhiều thông tin hơn. Nghiên cứu của

Boukoum H và cộng sự (2016) [16] trên 72 bệnh nhân ghép thận tại Tunisia dựa

trên đoạn trình tự 287 bp (1650-1936, chủng Dunlop-V01108) gen VP1 theo

phương pháp xây dựng cây chủng loại phát sinh NJ cho thấy giá trị bootrap chính

đều lớn hơn 60%. Tương tự, những nghiên cứu khác [44],[56] cũng đều chỉ ra việc

xác định kiểu gen BKV bằng việc phân tích đoạn trình tự 287 bp trên vùng lặp BC

thuộc gen VP1 cho độ tin cậy, độ chính xác cao. Do đó, kiểu gen BKV trên những

bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam xác định trong nghiên cứu này dựa trên vùng gen

VP1 (1630-1956) và phương pháp NJ.

26

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Mẫu nghiên cứu

Mẫu huyết tương và nước tiểu của 131 bệnh nhân ghép thận (được thu thập

tại cùng một thời điểm sau ghép) tại Bệnh viện Quân y 103 trong giai đoạn từ năm

2017 đến 2018.

Mẫu nước tiểu được thu thập trong ống fancol 50 ml, ly tâm 3200 vòng/phút,

thu cặn nước tiểu, bảo quản -80oC cho đến khi tách chiết DNA.

Mẫu máu chống đông với K2/EDTA, ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút,

thu huyết tương, bảo quản -80oC cho đến khi tách chiết DNA.

Địa điểm nghiên cứu: Phòng Vi sinh và các mầm bệnh Sinh học, Viện

Nghiên cứu Y dược học Quân sự, Học viện Quân y.

2.1.2. Các vật liệu

+ Dòng tế bào khả biến Escherichia DH5α được cung cấp bởi hãng

ThermoFisher Scientific, Hoa Kỳ.

+ Vector tách dòng: Vector pGEM T easy cho phép chèn các đoạn có kích

thước 6 bp - 10 kp. Kích thước plasmid nhỏ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình

biến nạp dễ dàng. Vector với hai đầu dính T giúp gắn kết đoạn chèn và vector dễ

dàng hơn, thuận tiện cho quá trình thao tác. Sản phẩm PCR đầu bằng tạo bởi DNA

polymerase có chức năng đọc sửa, sau khi được gắn thêm đầu A sẽ gắn trực tiếp

vào vector trong vòng 5 phút với hiệu suất 99% sản phẩm DNA tái tổ hợp. Mặt

khác, DNA tái tổ hợp có thể biến nạp vào tất cả các chủng E. coli trong phòng thí

nghiệm. Vector pGEM T easy chứa gen kháng kháng sinh ampicilin nên các tế bào

nhận vector có thể mọc trên môi trường chọn lọc ampicilin. Mặt khác, ở vị trí đa

điểm có chứa gen lac Z bị gián đoạn bởi đoạn chèn. Vì vậy, chỉ có những vi khuẩn

mang DNA tái tổ hợp mới mọc thành khuẩn lạc có màu trắng. Những khuẩn lạc

27

không chứa đoạn chèn sẽ có màu xanh do gen lacZ hoạt động, mã hóa cho enzyme

β galactosidase, kết hợp với cơ chất X-gal và IPTG tạo sản phẩm có màu xanh.

+ Bộ mẫu chuẩn được thiết lập bởi hãng Altona (RealStar® BKV PCR

Kit, Đức, 2018)

Đây là bộ mẫu chuẩn đã được hiệu chỉnh từ bộ mẫu chuẩn của Tổ chức Y tế

Thế giới về BKV, đã được cấp chứng chỉ IVD (In vitro diagnostic) của châu Âu. Bộ

mẫu chuẩn định lượng chứa DNA đặc hiệu BKV có dải nồng độ từ 1.00E+01 đến

1.00E+4 [IU/µl]. Độ nhạy của kỹ thuật real-time PCR trung bình phát hiện được là

0,712 copy/μl (dao động từ 0,404 – 1,693 copy/μl, với độ tin cậy 95%). Độ đặc hiệu

cũng được đánh giá trên những chủng polyomavirus khác hoặc trên những mầm

bệnh có ý nghĩa ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch như: Cytomegalovirus, Epstein-

Barr virus, Hepatitis A virus, Hepatitis B virus, Hepatitis C virus, Herpes simplex

virus 1, Herpes simplex virus 2, Human herpesvirus 6A, Human herpesvirus 6B,

Human herpesvirus 7, Human herpesvirus 8, Human immunodeficiency virus 1, JC

virus, Simian virus 40, Varicella-zoster virus.

+ Bộ mẫu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (1st WHO International

Standard for BK Virus DNA (2016, NIBSC code: 14/212)

Vào năm 2006 và năm 2008, Tổ chức Y tế thế giới đã tổ chức một cuộc họp

quốc tế để thảo luận về yêu cầu tiêu chuẩn hóa quốc tế các xét nghiệm BKV NAT

(BKV nucleic acid test) với sự tham gia của các giáo sư từ các trường đại học, công

ty công nghiệp dược phẩm, các đơn vị ngoại kiểm (QCMD: Quality Control

Molecular Diagnostics) và các tổ chức chính phủ (NIBSC: National Institute of

Biologicals and Standards Control). Hai mẫu chuẩn BKV đông khô (subtype I/b-1

và subtype I/b-2) được pha trong 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,5% albumin huyết

thanh người, 0,1% D - (+) - Trehalose dehydrate được gửi tới 33 phòng thí nghiệm

từ 15 quốc gia phân tích đánh giá, mỗi phòng thí nghiệm sử dụng các xét nghiệm

thường quy để phát hiện và định lượng BKV. Kết quả khảo sát cho thấy trong 2

mẫu chuẩn thì mẫu chuẩn thứ 2 (code: 14/212) phù hợp nhất để sử dụng làm mẫu

28

chuẩn quốc tế của WHO. Đây cũng là bộ mẫu chuẩn được lựa chọn để đánh giá chất

lượng bộ mẫu chuẩn cũng như kỹ thuật real-time PCR tự phát triển trong nghiên

cứu này.

Hình 2. 1. Vector pGEM T easy

2.1.3. Hóa chất

Các kit sử dụng trong nghiên cứu này được trình bày cụ thể trong bảng 2.1.

Trình tự các cặp mồi tham khảo từ các bài báo quốc tế và các cặp mồi tự thiết kế

được cung cấp bởi IDT trong bảng 2.2.

29

Bảng 2. 1. Các bộ kit tách chiết, các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên kit, hóa chất Hãng sản xuất Cat No.

Kit tách chiết DNA từ máu và nước tiểu Gene - All GA-105-101 1 Exgene™ Blood SV (Hàn Quốc)

Kit tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu Qiagen 51104 2 QIAamp DNA Blood Mini Kit (Đức)

Kit tinh sạch DNA từ gel agarose: Thermo Fisher K0691 3 GeneJET Gel Extraction Kit (Mỹ)

Kit tinh sạch sản phẩm PCR: Thermo Fisher K0692 4 GeneJET PCR Purification Kit (Mỹ)

Kit tách Plasmid Thermo Fisher K0502 5 (Mỹ) GeneJET Plasmid Miniprep Kit

Promega Kit tách dòng: A1360 6 (Mỹ) pGEM-T Easy Vector System

18260517 Invitrogen 7 Dòng tế bào khả biến DH5α

Các hóa chất chính:

Thermo Fisher F531S Master mix PCR

QIAGEN 204345 Quantitect probe PCR 8 Merck 1076800500 Tryptone

Merck 1037530500 Cao nấm men

32032 iNtRON Agarose

30

Bảng 2. 2. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu [82]

Kích

thước Mục đích Mồi Trình tự (5’-3’)

(bp)

Mồi xuôi, BKS ATCAAAGAACTGCTCCTCAAT vòng ngoài 580

bp Mồi ngược, BKAS GCACTCCCTGCATTTCCAAGGG vòng ngoài

Mồi xuôi, BKF1 CAAGTGCCAAAACTACTAAT vòng trong 327

bp Mồi ngược, BKR TGCATGAAGGTTAAGCATGC vòng trong

Mồi xuôi qBKF ATGGCCCCAACCAAAAGAA realtime PCR 81bp Mồi ngược qBKR TAGTTTTGGCACTTGCACGG realtime PCR

Taqman FAM-

probe, Pr BK TCCAGGGGCAGCTCCCAAAAAGCC-

realtime PCR BHQ1

2.2. Thiết bị chính

• Máy PCR: Master cycler PCR (Eppendorf)

• Máy Real-time PCR: Rotor-Gene Q MDx (QIAGEN)

• Bộ điện di DNA (Labnet)

• Máy chụp ảnh gel (UVP Eppendorf)

• Máy lắc Gyromax 737R (Amerex instrument)

• Tủ ấm (Shelab)

• Tủ cấy an toàn sinh học (Nuaire)

• Máy ly tâm lạnh (Heraeus)

31

• Máy đo quang phổ nanodrop (Quickdrop) • Tủ lạnh 0oC, 4 oC, -20 oC, -80 oC (Nuaire)

• Máy Vortex (OSI Rotolab)

• Bể ổn nhiệt (Memmert)

• Lò vi sóng (Sanyo)

• Cân điện tử (Adam)

• Pippetman (Gilson, Haminlton, Bio-rad)

• Các thiết bị chuyên dụng khác

32

2.3. Phương pháp nghiên cứu

- Thực nghiệm mô tả và phân tích trong phòng thí nghiệm với các kỹ thuật vi sinh

và sinh học phân tử.

- Xử lý thống kê sinh học (SPSS version 20): Kiểm định khi bình phương cho biến định tính, T student và Mann- Whithney cho biến định lượng, đường cong ROC

với khoảng tin cậy 95%, ý nghĩa thống kê được công nhận với ngưỡng p<0,05.

- Phân tích trình tự gen: Bioedit, Mega 7. 2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu

PCR với cặp mồi

đặc hiệu BKV

Tách chiết BKV-DNA từ mẫu huyết tương hoặc nước tiểu

Tinh sạch và giải trình

Thiết kế mồi, probe cho real-time PCR

Xác định SNP, xây dựng cây chủng loại phát sinh, xác định kiểu gen BKV

Tối ưu kỹ thuật real-time PCR

Phân tích ý nghĩa kiểu gen BKV với

BKVN và các yếu tố lâm sàng khác

Đánh giá kỹ thuật real-time PCR

So sánh với kit

Đánh giá mối tương quan giữa nồng độ BKV-DNA với các

thương mại

Hiệu chỉnh nồng độ chuẩn theo

Độ đặc hiệu, độ nhạy, ngưỡng phát hiện, độ ổn định

WHO

yếu tố lâm sàng 33

2.3.2. Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR

2.3.2.1. Tách chiết DNA tổng số

Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm (máu hoặc nước tiểu) bằng bộ kit

Exgene™ Blood SV (GeneAll, Hàn Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất như

sau:

Bước 1: Hút 20 µl protein K, 200 µl bệnh phẩm (huyết tương hoặc nước tiểu) và 200 µl Buffer AL vào ống eppendorf 1,5 ml. Vortex hỗn hợp 4-6 giây, ủ 56oC

trong 10 phút.

Bước 2: Thêm 200 µl ethanol 96% vào hỗn hợp, chuyển dịch lên Spin

column. Ly tâm 8.000 rpm, 1 phút. Loại bỏ Collection tube chứa dịch.

Bước 3: Thêm 600 µl Buffer BW vào Spin column. Ly tâm 8.000 rpm, 1

phút.

Bước 4: Thêm 700 µl Buffer TW vào Spin column. Ly tâm 8.000 rpm, 1

phút.

Bước 5: Chuyển Spin column sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm 54 µl

Elution Buffer, ủ ở nhiệt độ phòng từ 2-5 phút. Ly tâm 14.000 rpm, 1 phút.

Bước 6: DNA được bảo quản ở -20oC.

2.3.2.2. Phương pháp PCR

PCR là một chuỗi phản ứng bao gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau nhằm nhân

đoạn gen mong muốn qua các chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm có ba bước chính: biến tính,

khuếch đại và kéo dài. Trong nghiên cứu này, phương pháp PCR được sử dụng

nhằm thu sản phẩm khuếch đại gen VP1 với kích thước vòng ngoài 580 bp (đoạn

chèn cho vector tách dòng) và vòng trong 327 bp (phân tích kiểu gen).

Để giảm thiểu sự ức chế trong các mẫu nước tiểu cũng như nhằm tăng hiệu

quả khuếch đại PCR, mẫu bệnh phẩm được thực hiện Nested PCR với các cặp mồi

đặc hiệu BKV (Bảng 2.2). Sau khi tinh sạch sản phẩm Nested PCR và giải trình tự,

34

so sánh trình tự và xây dựng cây chủng loại phát sinh nhằm xác định kiểu gen BKV

của bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam. Thành phần PCR và Nested PCR được thể

hiện ở bảng 2.3.

Bảng 2. 3. Thành phần và điều kiện Nested PCR khuếch đại gen VP1

Vòng 1 Vòng 2

Hóa chất Thể tích Hóa chất Thể tích

Master mix Gotaq Green 10 Master mix Gotaq Green 10

P(BKS+AS) 1 P(F1+R1) 1

Nước 4 Nước 7,5

DNA 5 DNA 1,5

(95oC, 5’) (94oC30’’, (95oC, 5’) (94oC30’’,

Điều kiện: 56oC30’’, 72oC30’’) (72oC, 7’) Điều kiện: 42oC30’’, 72oC30’’) (72oC, 7’)

2.3.2.3. Tinh sạch PCR

Tinh sạch sản phẩm PCR giúp loại bỏ các thành phần dư thừa của phản ứng

PCR, qua đó tạo điều kiện lai tốt nhất. Mặt khác, tinh sạch còn giúp loại bỏ các sản

phẩm PCR không đặc hiệu, tránh trường hợp DNA tái tổ hợp chứa đoạn chèn không

mong muốn. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR bằng GeneJET PCR Purification

Kit như sau:

- Bước 1: Thêm PB Buffer vào ống đựng sản phẩm PCR theo tỷ lệ 5:1

- Bước 2: Chuyển hỗn hợp lên Binding Column tube và ly tâm 13.000 rpm, 1 phút.

- Bước 3: Chuyển Binding Column sang tube mới. Thêm 500µl WB Buffer, ly tâm

13.000 rpm, 1 phút.

- Bước 4: Lặp lại bước 3

- Bước 5: Ly tâm 13.000 rpm, 1 phút

- Bước 6: Chuyển Binding Column sang ống eppendorf 1.5 ml, thêm 30µl Elution

Buffer, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.

35

- Bước 7: Ly tâm 13.000 rpm, 1 phút, bỏ Binding Column, thu dịch và bảo quản ở

-20oC.

Chất lượng của sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng phương

pháp điện di.

2.3.2.4. Phương pháp điện di

Điện di là phương pháp phổ biến để phân tách các đoạn DNA có kích thước

khác nhau. Sau khi PCR, sản phẩm khuếch đại gen VP1 (580 bp) và sản phẩm

Nested PCR (327bp) nhằm tăng hiệu quả khuếch đại gen VP1 được điện di trên gel

agarose 1,2%; 110V, đệm TBE 0,5X. Mặt khác, sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tái

tổ hợp được thực hiện trên gel 1%. Gel agarose được ngâm EtBr 30 phút, các sản

phẩm được quan sát, phân tích bằng máy UV vis.

2.3.2.5. Tách dòng gen

• Phương pháp tạo tế bào khả biến

Tế bào khả biến có khả năng nhận plasmid tái tổ hợp được chuẩn bị như sau:

+ Chủng vi khuẩn E. coli DH5α được cấy ria trên đĩa LB đặc và nuôi cấy qua

đêm ở 37oC.

+ Cấy một khuẩn lạc đơn trong 5 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 37oC. Chuyển 300 µl dịch nuôi cấy qua đêm vào 15 ml LB lỏng (tỷ lệ 1:50), lắc tiếp ở 37oC, tốc độ 200 vòng/phút đến khi A260 đạt 0,4-0,6 thì chuyển dịch nuôi sang

ống ly tâm đã giữ lạnh trên đá.

+ Ly tâm 5000 vòng/phút, 4oC, 10 phút, thu cặn tế bào. Hòa cặn trong 9 ml hỗn hợp dung dịch (MgCl2 80 Mm và CaCl2 20 Mm), ly tâm 5000 vòng/phút, 4oC,

10 phút để thu cặn. Hòa cặn trong 600 µl CaCl2 100 Mm.

+ Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước

sóng 600 nm. Pha loãng dịch trên về A260=1 bằng glycerol 15%. Chia dịch vi khuẩn

trên vào các ống eppendorf (100 µl – 150 µl/ống) được giữ lạnh trên đá. Bảo quản ở -80oC.

36

• Phương pháp biến nạp

Sản phẩm của phản ứng nối được biến nạp vào tế bào vi khuẩn theo phương

pháp sốc nhiệt. Các tế bào vi khuẩn đã được xử lý với CaCl2 có màng trở nên xốp,

tạo điều kiện cho DNA plasmid có thể chui qua các lỗ trên màng khi nhiệt độ thay

đổi đột ngột. Biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt gồm các bước cơ bản sau:

+ Tế bào khả biến E. coli được lấy ra từ tủ -80oC, được làm tan từ từ trên đá

trong 5 phút.

+ Bổ sung vào mỗi ống tế bào khả biến 4 µl hỗn hợp phản ứng lai, búng nhẹ

để DNA phân bố đều trong dịch tế bào khả biến, ủ mẫu trên đá 30 phút.

+ Mẫu được sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây, sau đó được ủ trên đá 3 phút.

+ Bổ sung 1 ml môi trường dinh dưỡng SOC, nuôi cấy trong điều kiện lắc

200 vòng/phút ở 37oC trong 1 giờ.

+ Ly tâm hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, 3000 vòng/phút, trong 5 phút, loại bỏ

900 µl dịch phía trên, trải 100 µl dung dịch còn lại trên đĩa thạch LB có bổ sung ampicilin (50 µl/ml), ủ đĩa ở 37oC, qua đêm.

• Sàng lọc khuẩn lạc và nuôi tế bào qua đêm

Khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch rắn có bổ sung ampicilin/IPTG/Xgal

được nuôi trong 5 ml dung dịch LB lỏng, có bổ sung ampicilin (100 µl/ml), lắc 200 vòng/phút, qua đêm. Ly tâm lạnh 4oC, 8000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế

bào. Cặn tế bào vi khuẩn được tiến hành tách chiết plasmid.

• Tách plasmid

Quy trình tách plasmid tái tổ hợp bằng GeneJET Plasmid Miniprep Kit:

Bước 1: Ly tâm dịch nuôi cấy trong 5 phút, 5.000 rpm, 4oC.

Bước 2: Thêm 250 µl Buffer 1 và mix đều.

Bước 3: Thêm 250 µl Buffer 2, đảo ống 3-4 lần.

Bước 4: Thêm 350 µl Buffer 3, đảo ống 3-4 lần.

37

Bước 5: Ly tâm 13.000 rpm, 4oC, 10 phút.

Bước 6: Chuyển hỗn hợp lên Binding Column tube, ly tâm 13.000 rpm, 1 phút.

Bước 7: Loại bỏ tube chứa dịch, chuyển Binding Column sang tube mới,

thêm 500 µl Buffer D, ủ 5 phút. Ly tâm 13.000 rpm, 1 phút. Loại bỏ tube

chứa dịch.

Bước 8: Thêm 700 µl Buffer 4, ly tâm 13.000 rpm, 1 phút, loại bỏ tube chứa dịch.

Bước 9: Ly tâm 13.000 rpm, 1 phút.

Bước 10: Chuyển Binding Column sang ống eppendorf 1,5 ml. Thêm 100 µl

Elution Buffer, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng. Bước 11: Ly tâm 13.000 rpm, 1 phút. Thu dịch, bảo quản ở -20oC.

Quy trình kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI và AvaII:

Bước 1: Thiết lập phản ứng như bảng sau:

STT Thành phần phản ứng Thể tích phản ứng (µl)

1 pGEMT easy 4

2 Buffer 10X 1

3 Enzyme giới hạn 0,5

4 Distilled water 6

Bước 2: Ủ hỗn hợp ở 37oC, 2 tiếng.

Bước 3: Điện di để kiểm tra kích thước sản phẩm.

2.3.2.6. Thiết lập bộ mẫu chuẩn DNA

Nồng độ plasmid tái tổ hợp được xác định bằng hệ thống Nanodrop. Từ nồng

độ (ng/µl) quy đổi thành (copy/µl) theo công thức sau:

A: Nồng độ plasmid (ng/µl)

N: Kích thước DNA tái tổ hợp (bp)

38

Từ dung dịch plasmid ban đầu, 9 dải nồng độ pha loãng với cơ số 10 được

tạo ra bằng cách pha loãng plasmid với nước khử ion [10].

2.3.2.7. Tối ưu hóa kỹ thuật real-time PCR

Để xác định điều kiện tốt nhất cho phản ứng real-time PCR, các thành phần

của phản ứng real-time PCR được thay đổi với các nồng độ khác nhau. Quá trình

này bao gồm thử trên chu trình nhiệt, trong đó lần lượt thử ở các nhiệt độ gắn mồi

khác nhau dựa trên đặc điểm, thành phần mồi, kích thước probe, kích thước đoạn

gen đích cần khuếch đại và dựa vào chu trình chuẩn của phản ứng real-time PCR.

Đối với phản ứng real-time PCR, mồi là yếu tố quyết định tính đặc hiệu của

phản ứng. Cặp mồi được thiết kế phải đặc trưng cho đoạn DNA cần khuếch đại,

không trùng với các trình tự lặp lại trên gen. Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng

nồng độ mồi thích hợp sẽ ảnh hưởng đến việc có cho sản phẩm khuếch đại hay

không. Nếu nồng độ mồi quá cao có thể cho kết quả khuếch đại không đặc hiệu và

tạo ra cấu trúc nhị phân mồi. Nồng độ mồi quá thấp cũng ảnh hưởng đến việc phân

tích kết quả của phản ứng. Nồng độ mồi thấp trừ khi mồi có độ suy biến cao. Để tối

ưu nồng độ mồi chúng tôi tiến hành các phản ứng real-time PCR giống nhau về

thành phần và chu trình nhiệt, chỉ khác nhau về nồng độ mồi. Chúng tôi tiến hành

khảo sát thực hiện phản ứng real-time PCR với nồng độ mồi xuôi, mồi ngược mỗi

loại từ 0,1 µM, 0,2 µM ; 0,3 µM ; 0,4 µM; 0,5 µM.

Probe trong phản ứng phải đặc hiệu với trình tự đích và để tạo ra tín hiệu

huỳnh quan thì mẫu dò phải nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược. Trong phản ứng

realtime PCR với mẫu dò Taqman, khuếch đại không đặc hiệu do mồi sai vị trí hoặc

do hiện tượng nhị phân mồi cũng không tạo ra tín hiệu. Do vậy, nồng độ probe cũng

ảnh hưởng đến sự phát huỳnh quang và đọc tín hiệu sau mỗi chu kỳ của phản ứng.

Nồng độ probe quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng xấu đến kết quả phản ứng. Để

tối ưu nồng độ probe dùng cho phản ứng real-time RT-PCR chúng tôi tiến hành các

phản ứng giống nhau về thành phần và chu trình nhiệt, chỉ khác nhau về nồng độ

39

probe. Chúng tôi tiến hành khảo sát thực hiện phản ứng real-time PCR với nồng độ

probe ở các mức 0,05 µM; 0,1 µM; 0,15 µM; 0,2 µM.

Kết quả tối ưu real-time PCR được lựa chọn tại những vị trí cho chu kỳ ngưỡng sớm. Quá trình tối ưu được tiến hành trên mẫu chuẩn có nồng độ 104 IU/ml.

2.3.2.8. Đánh giá kỹ thuật real-time PCR

• Đánh giá độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu được xác định thông qua việc lựa chọn các oligo-nucleotide

(mồi, probe) đối với từng tác nhân đích cụ thể. Các oligo-nucleotide được kiểm tra

bằng cách so sánh trình tự với các trình tự công bố quốc tế để đảm bảo tất cả kiểu

gen BKV đều được phát hiện nhưng không bắt cặp với các tác nhân khác.

30 mẫu huyết tương âm tính BKV từ người khỏe mạnh và 30 mẫu huyết

tương dương tính với các tác nhân gây bệnh khác (JCV, CMV, EBV, HSV, HBV)

được lựa chọn để phân tích, đánh giá độ đặc hiệu.

• Hiệu chỉnh nồng độ theo bộ mẫu chuẩn của WHO

+ Hoàn nguyên mẫu chuẩn WHO trong nước khử ion vô trùng

Mẫu chuẩn WHO BKV-DNA (NIBSC code: 14/212) được hoàn nguyên

trong 1 ml nước cất (nuclease-free) với nồng độ gốc 7,2 log10 IU/ml, tương đương với 5,87 x 104 IU/µl.

Hòa tan mẫu trong 20 phút, vortex nhanh, spin mẫu.

+ Thiết lập panel mẫu chuẩn WHO bằng cách pha loãng mẫu chuẩn trong

huyết tương âm tính của người khỏe mạnh.

Từ dung dịch stock, pha loãng theo tỷ lệ 1:3 (200 µl chuẩn WHO: 400 µl

huyết thanh âm tính) để đạt được nồng độ 1,96 x 104 IU/µl.

Pha loãng 10 lần (50 µl mẫu: 450 µl HT âm tính) thành các dải nồng độ 1,96

x 103 IU/µl – 1,96 x 10-1 IU/µl.

40

Tách DNA theo quy trình kit QIAamp DNA Blood Mini Kit (Đức) với thể

tích đầu vào 200 µl mẫu, thể tích Elution là 54 µl.

+ Thiết lập panel mẫu chuẩn nghiên cứu (LDA)

Từ dung dịch plasmid gốc ban đầu, hòa loãng thành dải nồng độ 104– 100

copy/ µl trong dung dịch TE.

Sau khi thiết lập hai bộ mẫu chuẩn (WHO và LDA), hai bộ mẫu chuẩn được

chạy real-time PCR với thành phần của kit nghiên cứu đã được tối ưu.

Xây dựng đường cong tuyến tính bằng phương pháp phân tích hồi quy tuyến

tính để quy đổi nồng độ copy/µl sang IU/µl.

• Đánh giá độ nhạy của kỹ thuật real-time PCR

Độ nhạy được định nghĩa là nồng độ DNA tập trung ít nhất có thể phát hiện

dương tính BKV-DNA với độ tin cậy 95%. Trong nghiên cứu này, độ nhạy của kỹ

thuật được xác định dựa trên bộ mẫu chuẩn và mẫu bệnh phẩm.

Trước tiên, chúng tôi khảo sát nồng độ ngưỡng dưới và ngưỡng trên để xác

định giới hạn định lượng của bộ mẫu chuẩn. Plasmid gốc được pha loãng với dung dịch TE để thiết lập dải nồng độ từ 10-1-107 (IU/µl), ở mỗi nồng độ tiến hành định

lượng BKV-DNA lặp lại 3 lần. Sau đó, so sánh nồng độ thực tế và nồng độ lý

thuyết bằng phân tích hồi quy tuyến tính (Excel). Sự tuyến tính giữa các nồng độ

trong dãy được kiểm tra bằng phương pháp phân tích hồi quy đa thức [50].

Để khảo sát độ nhạy của kỹ thuật real-time PCR trên mẫu lâm sàng, mẫu huyết tương với nồng độ 106 IU/ml (xác định bằng bộ mẫu chuẩn WHO) được pha

loãng thành các dải nồng độ khác nhau (bảng 2.4). Ứng với mỗi nồng độ, kết quả

được phân tích sau khi chạy lặp lại 12 lần. Sử dụng phần mềm Quodata

(quodata.de) để xác định ngưỡng phát hiện.

41

Bảng 2. 4. Thí nghiệm đánh giá độ nhạy mẫu bệnh phẩm

Nồng độ (IU/ml) Số lần chạy

900 12

600 12

12

300 150 12

50 12

25 12

• Đánh giá độ ổn định của kỹ thuật real-time PCR trong xét nghiệm

Để xác định độ ổn định, ba mẫu chuẩn có nồng độ 101-103 (IU/µl) được chạy

lặp lại bảy lần, mỗi lần cách nhau một tháng. Sau đó, dựa vào hệ số biến thiên liên

phản ứng để khẳng định độ ổn định của mẫu chuẩn [12]. Để khảo sát hệ số biến

thiên liên phản ứng, tỷ số phần trăm giữa độ lệch chuẩn trung bình và trị số trung bình chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn 101-103 (IU/µl) được tính qua các lần chạy

khác nhau. Mẫu chuẩn có độ chính xác cao khi hệ số biến thiên liên phản ứng nhỏ

hơn 15% [12].

• So sánh bộ mẫu chuẩn nghiên cứu với bộ mẫu chuẩn thương mại

Tiến hành định lượng BKV-DNA trên 30 mẫu huyết tương, nước tiểu bằng

bộ mẫu chuẩn nghiên cứu và bộ mẫu chuẩn RealStar BKV PCR Kit. Sử dụng phần

mềm Excel 2016 để so sánh, phân tích kết quả định lượng bằng phương pháp hồi

quy tuyến tính và thống kê Bland-Altman để đưa ra kết luận cuối cùng về chất

lượng của bộ mẫu chuẩn nghiên cứu [19].

2.3.2.9. Xác định vai trò BKV-DNA với bệnh thận do BKV

• Xác định giá trị ngưỡng nồng độ BKV-DNA dự đoán BKVN

Sử dụng đường cong ROC để phân tích giá trị ngưỡng dự đoán các trường

hợp BKVN, dựa vào nồng độ BKV-DNA trong máu và nước tiểu ở bệnh nhân ghép

42

thận. Khoảng tin cậy 95% được áp dụng, ý nghĩa thống kê được công nhận với

p<0,05, mối liên quan giữa nồng độ BKV-DNA trong máu, trong nước tiểu với

BKVN được thể hiện qua đường cong ROC. Mỗi điểm trên đường cong có tọa độ

tương ứng với tần suất dương tính thật (độ nhạy) trên trục tung và tần suất dương

tính giả (1-độ đặc hiệu) trên trục hoành. Đường biểu diễn càng lệch về phía bên trên

và bên trái thì mối liên quan thu được càng rõ ràng. Độ chính xác, mức độ hiệu quả

xét nghiệm được đánh giá qua diện tích nằm dưới đường cong ROC, cụ thể như sau:

Giá trị đạt 0,9-1: tốt, giá trị đạt 0,8-0,9: khá, giá trị đạt 0,7-0,8: trung bình, giá trị đạt

0,6-0,7: ít và giá trị dưới 0,6: vô nghĩa.

• Đánh giá vai trò BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng

Khảo sát tỷ lệ nhiễm BKV trên 131 bệnh nhân ghép thận bằng kỹ thuật

realtime PCR. Những trường hợp nhiễm BKV, được chia thành hai nhóm: nhóm

dương tính với BKV và nhóm BKVN. Sử dụng phần mềm thống kê sinh học SPSS

(Version 20) để phân tích mối tương quan giữa nồng độ BKV-DNA với các đặc

điểm lâm sàng của bệnh nhân ghép thận qua các kiểm định khi bình phương cho

biến định tính, T student và Mann-Whithney cho biến định lượng.

2.3.3. Phân tích đặc điểm di truyền BKV ở bệnh nhân ghép thận

2.3.3.1. Xây dựng cây chủng loại phát sinh

Để phân tích kiểu gen BKV, 26 trình tự tham chiếu bao gồm tất cả các kiểu

gen BKV (thu thập từ ngân hàng gen Quốc tế) cùng với các trình tự BKV thu thập

từ bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam được so sánh dựa vào phần mềm Bioedit 7.0.

Tiếp tục phân tích, loại bỏ các trình tự thừa và những giá trị gap trước khi xây dựng

cây chủng loại bằng phần mềm Mega 7 (www.megasoftware.net). Cây chủng loại

được xây dựng dựa vào phương pháp khoảng cách (NJ) với giá trị bootstrap lặp lại

1000 lần.

2.3.3.2. Phân tích đa hình đơn nucleotide (SNP: Single Nucleotide Polymorphism)

SNP được định nghĩa là một thay đổi base đơn lẻ trên một chuỗi trình tự

DNA mà sự thay đổi đó chiếm một tỉ trọng đủ lớn (trên 1%) trong một cộng đồng

43

lớn. Để xác định những vị trí SNP trong vùng gen VP1 (1630-1956) của BKV trên

những bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam, phương pháp giải trình tự được lựa chọn.

Các bước phân tích SNP như sau:

- PCR và giải trình tự vùng gen VP1 (1630-1956).

- So sánh các trình tự thu được bằng phần mềm Bioedit

(www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)

- Xây dựng cây chủng loại phát sinh để xác định kiểu gen BKV dựa vào phần

mềm Mega 7.

- Từ kiểu gen xác định, tiến hành so sánh trình tự của các kiểu gen với nhau và

trình tự của các phân nhóm trong cùng một kiểu gen để xác định vị trí đa

hình cũng như sự thay thế axit amin tại những vị trí này.

2.3.3.3. Phân tích SNP theo cặp (máu+nước tiểu) ở những bệnh nhân BKVN

Các trường hợp BKVN (khẳng định bằng sinh thiết thận) được lựa chọn để

phân tích kiểu gen BKV theo cặp (máu và nước tiểu) với các bước cụ thể như sau:

- DNA tổng số tách từ huyết tương và nước tiểu của bệnh nhân BKVN được

PCR bằng cặp mồi đặc hiệu BKS/AS.

- Giải trình tự gen theo nguyên lý Sanger.

- Xác định kiểu gen BKV bằng phương pháp xây dựng cây chủng loại phát sinh.

- So sánh kết quả giải trình tự gen theo từng cặp để xác định các vị trí SNP (so

với chủng Dunlop) dựa vào phần mềm bioedit.

2.3.3.4. Đánh giá vai trò của kiểu gen BKV với bệnh thận do BKV

Từ kết quả xây dựng cây chủng loại phát sinh, xác định được kiểu gen BKV.

Tiếp tục đánh giá vai trò của kiểu gen với các đặc điểm lâm sàng như tuổi, giới tính,

nồng độ BKV-DNA trong máu, nồng độ BKV-DNA trong nước tiểu, nồng độ

creatinin, sự khác biệt HLA và tình trạng BKVN. Sử dụng phần mềm thống kê sinh

học SPSS (Version 20) để phân tích mối tương quan giữa kiểu gen với các đặc điểm

lâm sàng của bệnh nhân ghép thận qua các kiểm định khi bình phương cho biến

định tính, T student và MannWhithney cho biến định lượng.

44

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xây dựng quy trình định lượng BKV-DNA bằng real-time PCR

3.1.1. Tách dòng vùng gen VP1

• Tạo đoạn chèn bằng PCR

Để tạo đoạn chèn vùng gen VP1 gắn vào vector tách dòng, BKV-DNA sau

khi tách bằng Exgen SV-mini blood kit (GeneAll) được khuếch đại bằng cặp mồi

đặc hiệu BKS/BKAS. Kết quả PCR được thể hiện ở hình 3.1.

Hình 3. 1. Khuếch đại đoạn chèn cho tách dòng

Chú thích: 1. Marker 100 bp (Thermo Fisher, USA), 2. Đối chứng âm (nước

thay cho DNA), 3-4. Mẫu dương tính với BKV.

Từ kết quả điện di cho thấy, băng đặc hiệu có kích thước là 580 bp, đậm nét

và không có sản phẩm phụ (giếng 3-4). Đối chứng âm không lên băng (giếng 2)

chứng tỏ thao tác kỹ thuật tốt, đáng tin cậy. Trong nghiên cứu này, Phusion Hight-

Fidelity PCR master mix 2X được sử dụng gồm hỗn hợp chứa Phusion DNA

Polymerase, các nucleotide, buffer và MgCl2. Phusion DNA polymerase có hai hoạt

tính: 5’-3’ DNA polymerase và 3’-5’ exonuclease. Tỷ lệ lỗi của Phusion DNA

45

polymerase trong buffer HF là 4,4 x10-7, thấp hơn 50 lần so với Taq DNA

polymerase, thấp hơn 6 lần so với Pfu DNA polymerase. Phusion DNA polymerase

đạt được hiệu suất cao trong thời gian ngắn ngay cả khi có mặt của các chất ức chế

phản ứng PCR, do đó tạo ra năng suất cao hơn với lượng enzyme thấp hơn các

DNA polymerase khác. Như vậy, Phusion DNA polymerase là sự lựa chọn tốt nhất

cho tách dòng.

Chu trình nhiệt phản ứng PCR với sự có mặt của Phusion DNA polymerase

có nhiều khác biệt so với các điều kiện chuẩn của DNA polymerase khác. Nhiệt độ biến tính là 98oC (cao hơn nhiệt độ biến tính của enzyme thông thường là 95oC),

cho phép cải thiện khả năng phân tách DNA ngay cả với khuôn dài và giàu GC, thời

gian ngắn (biến tính (5 giây- 10 giây); kéo dài (15 giây- 30 giây); gắn mồi (10 giây-

30 giây)) giúp tiết kiệm thời gian nhưng hiệu quả PCR vẫn không thay đổi.

• Biến nạp

Sau khi biến nạp, tế bào E. coli DH5α được nuôi lỏng trên môi trường dinh dưỡng (SOC) trong 2 giờ 30 phút, lắc 225 vòng/phút, 37oC và được cấy trải trên

môi trường LB-ampicilin (50 µg/µl)/IPTG/Xgal. Sau 24 giờ, xuất hiện các khuẩn

lạc trắng (chứa plamid tái tổ hợp) và khuẩn lạc xanh (chỉ chứa plasmid) trên đĩa

Khuẩn lạc xanh

Khuẩn lạc trắng

thạch (Hình 3.2).

Hình 3. 2. Kết quả sàng lọc plasmid tái tổ hợp trên môi trường

LB đặc/IPTG/Xgal

46

• Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn EcoRI, AvaII và giải

trình tự

Để xác định chính xác khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp, tiến hành nuôi

riêng rẽ các khuẩn trắng trong 5ml LB-ampicilin (100 µg/µl), 24 giờ, lắc 225 vòng/phút, 37oC, tách plasmid và kiểm tra bằng AvaII và EcoRI. Kết quả kiểm tra

bằng enzyme giới hạn được thể hiện ở hình 3.3.

Hình 3. 3. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI và AvaII

Chú thích: 1. Plasmid tái tổ hợp được cắt bằng enzyme EcoRI, 2. Marker

1kb (Thermo Fisher, USA), 3. Marker 100 bp (Thermo Fisher, USA), 4. Plasmid tái

tổ hợp được cắt bằng enzyme AvaII.

Plasmid tái tổ hợp có kích thước là 3595 bp. Enzyme EcoRI có ba vị trí trên

plasmid tái tổ hợp (một điểm nằm bên trong đoạn chèn VP1, hai điểm nằm trên

vector pGEM-T easy). Như vậy, nếu plasmid tái tổ hợp được cắt bằng EcoRI sẽ cho

ba băng có kích thước lần lượt là 222bp, 376bp và 2997bp. Plasmid tái tổ hợp tiếp

tục được kiểm tra bằng enzyme AvaII. Do có bốn vị trí cắt trên plasmid tái tổ hợp

(hai điểm nằm bên trong đoạn chèn VP1, 2 điểm nằm trên vector pGEM-T easy)

nên sẽ cho 4 băng có kích thước lần lượt là 45bp, 222bp, 1529bp và 1839bp (Hình

47

3.3). Từ kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt bằng hai enzyme cho thấy những sản

phẩm thu được đúng như trong tính toán lý thuyết, do đó khả năng plasmid chứa

đoạn chèn VP1 rất cao.

Sau đó, plasmid tái tổ hợp tiếp tục được giải trình tự theo nguyên lý Sanger

(máy ABI 3730XL) trên cả 2 chiều sử dụng mồi của vector. So sánh trình tự thu

được với các trình tự trên Ngân hàng gen quốc tế bằng phần mềm Blast đã khẳng

định plasmid chứa đoạn gen VP1-BKV với độ tin cậy 99% (Hình 3.4).

Hình 3. 4. Kết quả so sánh trình tự đoạn chèn với trình tự trên Ngân hàng gen

Quốc tế bằng phần mềm Blast

3.1.2. Thiết lập bộ mẫu chuẩn

Sau khi tách chiết plasmid tái tổ hợp, nồng độ plasmid được xác định bằng

máy Nanodrop (Quickdrop, USA). Kết quả như sau:

C(ng/µl) = 379 = 9,77 x 1010 (copy/µl) •

A260/280 = 2,0 •

Đối với kết quả tách DNA tái tổ hợp cho thấy hàm lượng DNA khá cao. Độ

tinh sạch tốt (A260/A280 = 2,0), lượng mẫu tách được không lẫn nhiều RNA hoặc

48

protein. Như vậy, kết quả tách DNA plasmid là đạt yêu cầu. Từ nồng độ gốc, 9 dải

nồng độ được pha loãng theo cơ số 10 trong dung dịch TE (pH=7,0) để tạo thành bộ

mẫu chuẩn, phục vụ cho việc đánh giá kỹ thuật real-time PCR.

3.1.3. Thiết kế mồi và probe cho real-time PCR

10 mẫu PCR dương tính với cặp mồi BKS/BKAS được tách dòng và giải

trình tự. Từ kết quả giải trình tự, tiến hành so sánh trình tự BKV-DNA các chủng

BK phân lập tại Việt Nam, sau đó thiết kế mồi và probe cho real-time PCR dựa trên

phần mềm Primer 3. Trình tự mồi và probe được kiểm tra lại bằng phần mềm

Bioedit 7.0 như trên hình 3.5.

Hình 3. 5. Kiểm tra lại trình tự mồi và probe cho real-time PCR

Sau khi so sánh bằng phần mềm Bioedit 7.0 nhận thấy cặp mồi và probe

được thiết kế cho real-time PCR, không có bất kỳ vị trí mismatch nào và phù hợp

100% với chủng BK lưu hành tại Việt Nam.

3.1.4. Tối ưu kỹ thuật real-time PCR

Để xác định nồng độ các thành phần tham gia vào quá trình PCR nhằm đạt

được hiệu quả khuếch đại tốt nhất, chúng tôi tiến hành tối ưu nồng độ mồi và nồng

độ probe. Kết quả tối ưu nồng đô mồi, probe được thể hiện ở hình 3.6 và 3.7.

49

0,05 µM

Hình 3. 6. Tối ưu nồng độ probe

Nồng độ probe được khảo sát ở các mức 0,05 µM; 0,1 µM ; 0,15 µM; 0,2

µM; 0,3 µM. Kết quả cho thấy, nồng độ probe 0,05 µM lên ở chu kỳ ngưỡng sớm

nhất cũng như tín hiệu huỳnh quang ổn định nhất (Hình 3.6). Do đó, nồng độ 0,05

µM được lựa chọn do là nồng độ thấp nhất nhưng vẫn cho kết quả Ct đáng tin cậy.

0,2 µM

Hình 3. 7. Tối ưu nồng độ mồi

50

Tiếp tục khảo sát nồng độ mồi ở các mức 0,1 µM, 0,2 µM; 0,3 µM; 0,4 µM;

0,5 µM. Kết quả cho thấy nồng độ mồi có độ tin cậy cao là 0,2µM (Hình 3.7). Do

đó, nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng real-time PCR BKV- DNA là 0,2µM.

Từ các kết quả tối ưu nồng độ probe và nồng độ mồi, các thành phần của phản

ứng real-time PCR được xác định (Bảng 3.1)

Bảng 3. 1. Thành phần phản ứng real-time PCR

STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl)

Quantitect Probe master mix 1X 10 1

Primer (F+R) 5 µM 0,2 µM 0,8 2

Probe 5 µM 0,05 µM 0,2 3

Nước đã khử ion DNA/RNAase free 0 4

DNA template 9 5

20 Tổng

Chu trình nhiệt được xác định như sau:

(50oC x 2 phút) (95oC x 15phút) (94oC x 15 giây, 58oC x 60 giây) x 45 chu kỳ, duy trì ở 7oC.

2X Quantitect probe PCR Mastermix là hỗn hợp bao gồm HotStarTaq DNA

Polymerase, QuantiTect Probe PCR Buffer và ROX passive reference dye. HotstarTaq

DNA polymerase là một enzyme Taq DNA polymerase cải tiến, được cung cấp ở

trạng thái enzyme không hoạt động trong điều kiện nhiệt độ môi trường. Khả năng

tái hoạt động được kích hoạt khi bắt đầu phản ứng bằng bước ủ 95°C- 15 phút, qua

đó ngăn chặn sự hình thành các sản phẩm ngoại lai và sự bắt cặp ngẫu nhiên giữa

các mồi trong quá trình thiết lập phản ứng và bước biến tính đầu tiên, tăng khả năng

đặc hiệu cho phản ứng PCR cũng như định lượng chính xác. Trong khi đó,

QuantiTect Probe PCR Buffer chứa sự kết hợp cân bằng giữa KCl và (NH4)2SO4,

giúp tăng khả năng cạnh tranh giữa sản phẩm đặc hiệu với liên kết mồi không đặc

51

hiệu trong bước ủ của mỗi chu kỳ PCR. Ngoài ra, với sự thay thế dTTP thành dUTP

cộng thêm bổ sung uracil-N-glycosylase (UNG) cho phản ứng giúp đề phòng ngoại

nhiễm với các sản phẩm PCR từ những lần chạy trước. Mặt khác, sự có mặt của

thuốc nhuộm ROX cung cấp một đường cơ sở ổn định để tín hiệu huỳnh quang của

PCR được chuẩn hóa. Như vậy, tất các các thành phần của phản ứng real-time PCR

đã được tối ưu hóa nhằm đạt được hiệu suất khuếch đại tốt nhất.

3.1.5. Đánh giá kỹ thuật real-time PCR

• Đánh giá độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu trong định lượng BKV bằng kỹ thuật real-time PCR được thể

hiện qua khả năng nhân bản chọn lọc BKV. Trong nghiên cứu này, độ đặc hiệu

được thử nghiệm trên các mẫu bệnh phẩm nhiễm JCV (10 mẫu), CMV (5 mẫu),

EBV (5 mẫu), HBV (5 mẫu), HSV (5 mẫu) và 30 mẫu máu của bệnh nhân khỏe

mạnh. Kết quả đánh giá được thể hiện ở bảng 3.2.

Bảng 3. 2. Đánh giá độ đặc hiệu

Realtime-PCR Mẫu

JCV (-)

CMV (-)

EBV (-)

HSV (-)

Khỏe mạnh (-)

Sau khi đánh giá trên các mẫu bệnh phẩm nhiễm virus khác nhận thấy các

cặp mồi và probe chỉ đặc hiệu với BKV-DNA (Bảng 3.2). Như vậy, bộ kit nghiên

cứu chỉ nhân bản vật liệu di truyền BKV-DNA mà không nhân bản chọn lọc vật liệu

di truyền của các tác nhân khác.

Những nghiên cứu trước đây cho thấy sự xuất hiện của JCV, CMV, HSV,

EBV ở bệnh nhân ghép tạng khác với tỷ lệ khá cao, làm tăng nguy cơ mắc bệnh và

tử vong. Sự tái hoạt động kết hợp của các virus này đã được quan sát nhiều lần ở

52

những bệnh nhân sau ghép tạng trong đó JCV là virus cùng họ với BKV cũng được

chỉ ra xuất hiện trong nước tiểu của bệnh nhân ghép thận với tỷ lệ từ 16-28% [17].

Tỷ lệ lưu hành của CMV ở những bệnh nhân ghép tim dao động từ 9-23%, bệnh

nhân ghép gan 22%-29%, đặc biệt ở những bệnh nhân sau ghép thận từ 8-32% [5]

và sự tái kích hoạt CMV thường liên quan tới viêm võng mạc, viêm phổi, viêm đại

tràng, viêm não, đặc biệt gây tổn thương thận ghép, mất ghép và tử vong. Bên cạnh

đó, EBV sau ghép thận chủ yếu liên quan đến rối loạn tăng sinh tế bào lympho sau

ghép, một biến chứng nặng nề trong ghép tạng, chủ yếu ở những bệnh nhân sau năm

đầu tiên, với các triệu chứng bao gồm những rối loạn từ thoái triển tự phát đến tăng

sinh tế bào B gây tử vong [14]. Trong khi đó, HBV là virus lây lan chủ yếu thông

qua đường máu và chiếm tỷ lệ lưu hành khá lớn trong cộng đồng dân cư Việt Nam.

Do đó, những virus này được chọn để đánh giá độ đặc hiệu.

• Hiệu chỉnh nồng độ mẫu chuẩn theo bộ mẫu chuẩn của WHO

Kết quả phân tích mối tương quan giữa bộ mẫu chuẩn WHO và bộ mẫu

chuẩn nghiên cứu (LDA) được thể hiện ở hình 3.8.

5

4.5

y = 0.9915x - 0.9612 R² = 0.9963

4

3.5

/

3

) l µ U I (

2.5

2

O H W

1.5

1

0.5

0

0

1

2

5

6

4

3 LDA (copy/µl)

Hình 3. 8. So sánh sự tương quan giữa bộ mẫu chuẩn WHO và LDA

Sau khi xây dựng đường cong tuyến tính và phân tích cho thấy sự tương

quan tuyến tính mạnh giữa bộ mẫu chuẩn WHO và bộ mẫu chuẩn nghiên cứu

53

(R2=0,9963, p<0,0001). Từ phương trình tương quan Log10 (IU/µl) = 0,9915 Log10

(IU/µl) – 0,9612 xác định được 1IU= 9,6 copy. Bộ mẫu chuẩn quốc tế đầu tiên của

WHO được giới thiệu vào năm 2016 với vai trò là một bộ mẫu hiệu chuẩn chung

nhằm cải thiện và thống nhất chung các xét nghiệm khuếch đại acid nucleic BKV

(NAT) cũng như cho phép so sánh các phép đo sinh học trên toàn thế giới. Tương tự

như các bộ mẫu chuẩn được phát hành trước đây đối với cytomegalovirus (CMV)

và virus Epstein-Barr (EBV), bộ mẫu chuẩn quốc tế đầu tiên của WHO về BKV là

một tài liệu tham khảo định lượng được thể hiện trong một đơn vị quốc tế (IU). Cho

đến nay, vẫn chưa có nhiều các nghiên cứu hiệu chuẩn các xét nghiệm tự phát triển

của các phòng nghiên cứu (in-house laboratory-developed assays) trên đối tượng

BKV mà chỉ có những thí nghiệm đánh giá những bộ kit thương mại trên thị trường

như Altona RealStar BKV PCR kit (Hamburg, Germany), AcroMetrix (BKVtc

panel; AcroMetrix Inc., Benicia, CA), ZeptoMetrix (NATtrol bkvirus linearity

panel; ZeptoMetrix Corporation, Buffalo, NY). Nghiên cứu của Susanna K. Tan và

cộng sự (2017) đối với bộ kit Altona RealStar BKV PCR (Hamburg, Germany) cho

kết quả là 1 IU = 1,11 copy [81], trong khi đối với ZeptoMetrix thì 1 IU= 0,7 copy,

AcroMetrix 1 IU= 0,76 copy [11]. Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng các mẫu

chuẩn tự phát triển không phải lúc nào cũng chứa số lượng bản sao bằng nhau của

trình tự đích, và một trong số những nguyên nhân dẫn tới sự sai khác có thể do việc

lựa chọn vị trí đích hoặc nồng độ plasmid thu được cao hơn so với thực tế do còn

lẫn DNA của vi khuẩn E. coli. Chính vì thế, một đơn vị chuẩn quốc tế cho xác định

nồng độ BKV-DNA trên mẫu lâm sàng là cần thiết để hỗ trợ cho sinh thiết thận

trong chẩn đoán BKVN trong thực hành lâm sàng.

Định lượng BKV được khuyến cáo trong các hướng dẫn cho các chỉ định

khác nhau, bao gồm sàng lọc sau ghép thường quy để xác định bệnh nhân có nguy

cơ cao mắc BKVN (trường hợp cần giảm liều thuốc ức chế miễn dịch), do đó xác

định tải lượng BKV-DNA là một biện pháp bổ trợ cho sinh thiết thận nhằm chẩn

đoán bệnh thận cũng như theo dõi quá trình diễn biến lâm sàng của bệnh thận đã có

sự hình thành BKV. Sự sai khác trong định lượng BKV khi chưa hiệu chuẩn với

54

mẫu chuẩn của WHO có thể dẫn đến việc ra quyết định can thiệp điều trị không phù

hợp. Nếu không chẩn đoán kịp thời, khả năng tái kích hoạt sớm BKV trong quá

trình sàng lọc do kết quả xét nghiệm âm tính giả trong việc xác định tải lượng BKV,

làm tăng nguy cơ bỏ qua các trường hợp có khả năng bị BKVN. Ngược lại, việc

đánh giá quá cao tải lượng BKV có thể dẫn đến chỉ định sinh thiết thận không cần

thiết hoặc giảm liều thuốc ức chế miễn dịch không phù hợp. Việc hiệu chuẩn các

xét nghiệm BKV NAT theo đơn vị quốc tế ngày càng được áp dụng trong các

phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng trên toàn thế giới và là một bước cần thiết để xác

định giá trị cut off BKV-DNA phù hợp trong định lượng, áp dụng rộng rãi cho thực

hành lâm sàng. Việc công bố mẫu chuẩn quốc tế đầu tiên của WHO về BKV-DNA

mang đến tiềm năng cải thiện khả năng so sánh giữa các bộ kit xét nghiệm và thiết

lập ngưỡng tải lượng BK virus cho chẩn đoán sớm BKVN. Sự thống nhất một đơn

vị chung mở ra những cơ hội mới để chuẩn hóa phòng ngừa sự xuất hiện BKVN

tiên phát và thứ phát, theo dõi và đánh giá các phương pháp trị liệu mới và các

chiến lược trị liệu ở bệnh nhân nhiễm BKV.

• Khảo sát khoảng định lượng và xác định ngưỡng phát hiện

Trước tiên, nồng độ ngưỡng dưới và ngưỡng trên của bộ mẫu chuẩn được

khảo sát để xác định giới hạn định lượng của bộ mẫu chuẩn. Kết quả xác định khoảng định lượng của bộ mẫu chuẩn từ 10-1-107 (IU/µl) được thể hiện ở hình 3.9.

55

Hình 3. 9. Xác định khoảng định lượng của bộ mẫu chuẩn

A, Biểu đồ đường cong khuếch đại tín hiệu huỳnh quang B, Đường chuẩn xây dựng từ dải nồng độ 10-1-107 (IU/µl)

Hiệu suất phản ứng PCR là 90% cho thấy quy trình tối ưu phản ứng real-time

-1

PCR cũng như các thao tác kỹ thuật tốt. Kết quả khảo sát khoảng định lượng cho

thấy các nồng độ trong khoảng này có độ tuyến tính cao, thể hiện qua hệ số tuyến 7 tính bằng 0,99 (Hình 3.9). Do đó, khoảng định lượng của bộ mẫu chuẩn từ 10 -10

(IU/µl) là chính xác và đáng tin cậy.

Mẫu huyết tương với nồng độ 106 IU/ml (xác định bằng bộ mẫu chuẩn của

WHO) được hòa loãng thành các dải nồng độ khác nhau. Kết quả phân tích ngưỡng

phát hiện được thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.10.

Bảng 3. 3. Khảo sát độ nhạy của kỹ thuật real-time PCR trên mẫu bệnh phẩm

Nồng độ (IU/ml) Số lần chạy Số lần phát hiện Tần số phát hiện

900 12 12 100%

600 12 12 100%

12 12 100%

300 150 12 12 100%

50 12 8 66,67%

25 12 4 33,33%

56

Hình 3. 10. Ngưỡng phát hiện BKV-DNA trên mẫu bệnh phẩm

Xác định độ nhạy thông qua phân tích thống kê probit sử dụng phần mềm

Quodata cho thấy, ngưỡng phát hiện BKV-DNA của kỹ thuật real-time PCR là

LOD95% =135 IU/ml, tương đương [84,34 - 215,88 IU/ml] với độ tin cậy 95% (Hình

3.10). Trong khi đó, nghiên cứu của Susanna K. Tan và cộng sự (2017) [81], đối với

bộ kit Altona RealStar BKV PCR kit (Hamburg, Đức) xác định giá trị ngưỡng là 66

IU/ml. Như vậy, bộ kit nghiên cứu LDA có độ nhạy tương đương so với bộ kit

thương mại, trong khi giá thành cạnh tranh hơn, giảm thiểu chi phí đáng kể cho

người bệnh.

• Đánh giá độ ổn định

Từ kết quả đánh giá panel mẫu chuẩn cũng như xác định ngưỡng phát hiện trên mẫu bệnh phẩm, ba mẫu chuẩn có nồng độ 101-103 IU/µl được lựa chọn làm

đường chuẩn trong xét nghiệm lâm sàng. Đánh giá độ ổn định của mẫu chuẩn trong

thời gian 7 tháng, thu được kết quả như bảng 3.4.

57

Bảng 3. 4. Đánh giá độ ổn định của mẫu chuẩn nồng độ 101-103 IU/µl

Ct mean Nồng độ (IU/µl) SD CV (%)

103 21,43 0,43 2,02

102 24,60 0,26 1,08

101 27,99 0,17 0,59

Chú thích: Ct mean: chu kỳ ngưỡng trung bình sau 7 tháng, SD: độ lệch chuẩn, CV:

hệ số biến thiên.

Các mẫu chuẩn có hệ số biến thiên (CV%) thấp lần lượt là 2,02%; 1,08%;

0,59% cho thấy mẫu chuẩn có độ ổn định cao.

• So sánh với kit thương mại Realstar BKV PCR Kit

Bộ kit nghiên cứu được so sánh với bộ kit thương mại RealStar BKV PCR

Kit dựa trên kết quả định lượng BKV của 30 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân ghép

thận tại Bệnh viện Quân y 103. Kết quả định lượng giữa hai bộ kit được so sánh

bằng phương pháp hồi quy tuyến tính (Hình 3.11) và bằng biểu đồ Bland-Altman

(Hình 3.12).

12

y = 1,0751x - 0,0218 R² = 0,9442

10

)

8

A D L

l

/

6

4

m U I 0 1 g o L

2

( u ứ c n ê i h g n t i

K

0

0

2

4

6

8

10

Kit thương mại (RealStar) Log10 IU/ml

Hình 3. 11. So sánh sự tương quan giữa hai bộ kit

58

1

) l

0.5

/

0

0

2

4

6

8

10

12

m U I 0 1 1 g o L

-0.5

-1

( t ệ i b c á h k ự S

-1.5

-2

Nồng độ (Log10 IU/ml)

Hình 3. 12. Phân tích sự khác biệt giữa hai bộ kit

Kết quả định lượng giữa hai bộ kit cho thấy 26/30 mẫu dương tính với cả hai

bộ kit, 4/30 mẫu âm tính với cả hai bộ kit. Kết quả định lượng trên 25 mẫu dương

tính với cả hai bộ kit được so sánh bằng phương pháp hồi quy tuyến tính (Hình

3.11) và bằng biểu đồ Bland-Altman (Hình 3.12). Hệ số tuyến tính là 0,94 chứng tỏ

độ tương quan cao trong định lượng giữa hai bộ kit. Hệ số dốc của phương trình

tuyến tính là 1,07, rất gần với giá trị 1 cho thấy không có sự sai lệch tỷ lệ nào. Hệ số

chắn là -0,02 hơi xa với giá trị 0, chỉ ra một sự sai lệch trong hệ thống bất biến. Tuy

nhiên khi phân tích bằng Bland-Altman, sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê

với độ tin cậy 95% cho phép sai số trong khoảng (-1,3; 0,69). Do đó, hai bộ kit có

độ tương quan cao trong định lượng BKV.

Như vậy, bộ kit nghiên cứu đã đáp ứng được những yêu cầu về chất lượng sinh phẩm như: khoảng định lượng rộng 10-1-107 (IU/µl), độ ổn định cao (hệ số biến

thiên là 2,02%; 1,08% và 0,59%), chất lượng bộ sinh phẩm tương đương với bộ kit

ngoại nhập RealStar BKV PCR Kit. Với những kết quả quan sát ở trên, bộ kit

nghiên cứu có thể thay thế bộ kit ngoại nhập mà không bị mất đi tính hiệu quả và

chính xác.

59

3.1.6. Quy trình xác định tải lượng virus BK trong máu và nước tiểu ở bệnh nhân

ghép thận

Mẫu máu và nước tiểu sau khi thu thập, được vận chuyển tới phòng xét

nghiệm và xử lý như sau:

B1: Mẫu máu ly tâm 3000 rpm, 1 phút, thu huyết tương. Mẫu nước tiểu ly

tâm 3200 rpm, 1 phút, thu cặn nước tiểu. Mẫu máu và nước tiểu được bảo quản - 20oC cho tới khi tiến hành tách chiết DNA.

B2: Tiến hành tách chiết DNA theo quy trình hướng dẫn của bộ kit Geneall

B3: Sau khi rã đông các thành phần trên đá, tiến hành vortex, spin trong 5s

và mix các thành phần phản ứng realtime PCR tối ưu như bảng sau:

Nồng độ Thể tích (µl) Thể tích (µl) STT Thành phần cuối (n=1) (n mẫu)

10 x n Quantitect Probe master mix 1X 10 1

0,8 x n Primer (F+R) 5 µM 0,2 µM 0,8 2

0,2 x n Probe 5 µM 0,05 µM 0,2 3

DNA template 9 4

20 Tổng

B4: Tiến hành chạy mẫu trên máy realtime PCR với chu trình nhiệt như sau

(50oC 2’) (95oC 15’) (94oC 15’’ 58oC 60’’)x45

B5: Phân tích kết quả realtime PCR như sau

• Phân tích Standard:

- Hệ số tuyến tính (R2) phải nằm trong khoảng 0.960-1.000, tốt nhất 0.990-

1.000.

- Hiệu suất nhân bản (PCR efficiency) phải nằm trong khoảng 90-115%, tốt

nhất 95-110%.

60

- Hệ số dốc (Slope) phải nằm trong khoảng -3 đến -4, tốt nhất -3.3 đến -3.6.

• Phân tích mẫu:

Nồng độ Các trường hợp Nhận định kết quả (IU/ml)

≤ 135 Dưới giới hạn phát hiện hoặc âm tính 1

>135 Mẫu dương tính với nồng độ a IU/ml 2

3.2. Xác định vai trò BKV-DNA với bệnh thận do BKV

3.2.1. Xác định tỷ lệ lưu hành BKV ở bệnh nhân ghép thận bằng kỹ thuật real-time PCR

Mẫu bệnh phẩm gồm máu và nước tiểu thu thập tại cùng một thời điểm từ

131 bệnh nhân ghép thận được sàng lọc bằng kỹ thuật real-time PCR để xác định tỷ

lệ lưu hành BKV. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5.

Bảng 3. 5. Tỷ lệ nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận

Thông số Dương tính Âm tính

Huyết tương 53 (40,46%) 78 (59,54%)

Nước tiểu 84 (64,12%) 47 (35,88%)

Cả huyết tương và nước tiểu 53 (40,46%) 47 (35,88%)

Huyết tương hoặc nước tiểu 84 (64,12%) 47 (35,88%)

61

Tổng số 131 bệnh nhân được đưa vào nghiên cứu với tỷ lệ BKV dương tính

bằng kỹ thuật real-time PCR là 64,12% (Bảng 3.5). Trong 84 bệnh nhân dương tính

với BKV-DNA trong huyết tương hoặc nước tiểu, 53 bệnh nhân (40,46%) dương

tính trong huyết tương, 84 bệnh nhân (64,12%) dương tính trong nước tiểu, 53 bệnh

nhân (40,46%) dương tính cả trong huyết tương và nước tiểu. Một nghiên cứu khác

của Yoon.S.H và cộng sự (2015) [91] trên 213 bệnh nhân ghép thận tại Hàn Quốc

cho thấy tỷ lệ nhiễm BKV trong máu rất cao (142/213 trường hợp, tương ứng với

66,67%). Nghiên cứu gần đây tại Thái Lan vào năm 2018 được thực hiện bởi P.

Skulratanasak và cộng sự [78], trên 173 bệnh nhân ghép thận đã phát hiện 53 bệnh

nhân dương tính với BKV, tương ứng với tỷ lệ nhiễm BKV là 30,6%. Nghiên cứu

khác của Si-Mohamed A và cộng sự [77], trên 855 bệnh nhân ghép thận tại Pháp đã

quan sát được sự hiện diện của BKV ở 460 bệnh nhân (53,80%), trong đó 128 bệnh

nhân (15%) xuất hiện BKV-DNA trong cả máu và nước tiểu, 332 bệnh nhân

(39%) xuất hiện BKV-DNA trong nước tiểu nhưng không được phát hiện trong

máu. Như vậy, tỷ lệ BKV dương tính ở bệnh nhân ghép thận trong nghiên cứu này

khá cao và tương đồng nhất với kết quả nghiên cứu của Yoon.S.H và cộng sự

(2015) [91] tại Hàn Quốc, Shenagari. M (2017) [76] 69% tại Iran, Bicalho. C. S

(2018) [13] 62,4% tại Brazil. Sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm BKV ở các quốc gia có

thể do nhiều nguyên nhân khác nhau, bao gồm vị trí địa lý, tuổi tác, giới tính của

bệnh nhân cũng như liệu pháp ức chế miễn dịch được áp dụng khác nhau ở mỗi

quốc gia.

3.2.2. Xác định giá trị ngưỡng BKV-DNA dự đoán BKVN

Phân tích ROC bằng phương pháp hồi quy logistic được thực hiện để dự

đoán những trường hợp mắc BKVN dựa trên nồng độ BKV-DNA trong máu và

nước tiểu của bệnh nhân ghép thận. Kết quả phân tích được thể hiện ở hình 3.13 và

hình 3.14.

62

Hình 3. 13. Đường cong ROC BKV-DNA trong máu nhằm phát hiện BKVN

Hình 3. 14. Đường cong ROC BKV-DNA trong nước tiểu nhằm phát hiện BKVN

63

Từ kết quả của đường cong ROC cho thấy vùng diện tích dưới đường cong

BKV-DNA trong máu và nước tiểu lần lượt là 0,99 và 0,92 (p<0,001), chứng tỏ

đường cong có ý nghĩa thống kê. Qua đó, nồng độ của BKV-DNA trong máu dự

đoán BKVN là 4,12 log10 (IU/ml) tương đương 5,09 log10 (copy/ml), với độ nhạy

đạt 100%, độ đặc hiệu 95,56%. Tương tự, giá trị ngưỡng BKV-DNA trong nước

tiểu là 6,95 log10 (IU/ml) tương đương với 7,93 log10 (copy/ml), độ nhạy 87,5%, độ

đặc hiệu 84,21%. Nghiên cứu của Hirch và cộng sự (2002) [41], là nghiên cứu đầu tiên xác định giá trị ngưỡng dự đoán BKVN, với nồng độ trong máu >104 copy/ml, nồng độ trong nước tiểu >107 copy/ml giúp dự đoán chính xác BKVN với độ đặc

hiệu 93%. Một số nghiên cứu khác trong khoảng thời gian 2007-2008, chỉ ra giá trị

ngưỡng phát hiện trong máu dao động từ 4,2-4,5 log10 (copy/ml), trong nước tiểu từ

5,9-7,4 log10 (copy/ml) với độ nhạy, độ đặc hiệu trong máu đạt 96%-100%; tuy

nhiên độ đặc hiệu trong nước tiểu thấp hơn, dao động từ 83-96,4%. Nghiên cứu gần

đây của Kudose S và cộng sự (2014) [55], công bố giá trị ngưỡng tốt nhất cho dự

đoán BKVN trên mẫu máu là 3,7 log10 (copy/ml), nước tiểu là 7,2 log10 (copy/ml).

Như vậy, giá trị ngưỡng giữa các labo xét nghiệm khác nhau phụ thuộc vào việc

thiết kế primer, probe, lựa chọn gen đích cũng như sự chính xác của các nồng độ mẫu chuẩn. Mặc dù, những gợi ý cho dự đoán giá trị ngưỡng trong máu là 104

copy/ml, tuy nhiên để tăng tính đặc hiệu và độ chính xác cho xét nghiệm chẩn đoán

BKVN, một giá trị ngưỡng riêng cho từng labo là cần thiết.

Dựa vào kết quả xác định giá trị ngưỡng dự đoán BKVN trong máu và nước

tiểu, 84 bệnh nhân ghép thận dương tính với BKV được chia thành ba nhóm: nhóm

có nồng độ BKV-DNA trong huyết tương và nước tiểu trên giá trị ngưỡng, nhóm

bệnh nhân có nồng độ BKV-DNA trong máu hoặc nước tiểu vượt ngưỡng, nhóm

bệnh nhân với nồng độ BKV-DNA máu và nước tiểu đều dưới giá trị ngưỡng. Kết

quả quan sát được thể hiện ở bảng 3.6.

64

Bảng 3. 6. So sánh giữa ba nhóm bệnh nhân dựa vào giá trị ngưỡng

dự đoán BKVN

Máu và nước tiểu Một trong hai trên Máu và nước tiểu Nồng độ trên giá trị ngưỡng giá trị ngưỡng dưới giá trị ngưỡng

Thông số log10 IU/ml log10 IU/ml log10 IU/ml

5,59 ± 0,88 3,40 ± 0,95 2,17 ± 0,66

9,54 ± 1,53 7,88 ± 1,69 3,55 ± 1,80 Nồng độ trung bình trong máu Nồng độ trung bình trong nước tiểu

Tổng số bệnh nhân 8 11 35

BKVN 7/8 1/8 0/8

Sau khi định lượng bằng real-time PCR, tiến hành khảo sát nồng độ BKV-

DNA ở những bệnh nhân ghép thận cho thấy 8 bệnh nhân có cả nồng độ BKV-DNA

trong máu và nước tiểu trên giá trị ngưỡng, với nồng độ BKV-DNA trung bình

trong máu và nước tiểu lần lượt là 5,59 ± 0,88 log10 IU/ml và 9,54 ± 1,53 log10

IU/ml. 35 bệnh nhân có nồng độ BKV-DNA thấp hơn giá trị ngưỡng, trung bình đạt

2,17 ± 0,66 log10 IU/ml trong máu và 3,55 ± 1,80 log10 copy/ml trong nước tiểu.

Ngoài ra, 11 bệnh nhân (20,37%), có nồng độ BKV-DNA trong nước tiểu hoặc

trong máu vượt giá trị ngưỡng, trong đó 2 bệnh nhân có nồng độ BKV-DNA trên

ngưỡng không bị BKVN, 1 bệnh nhân có nồng độ BKV-DNA trong máu trên

ngưỡng bị BKVN. Mặt khác, 7 bệnh nhân có nồng độ máu và nước tiểu trên giá trị

ngưỡng đã được khẳng định bị BKVN. Một số nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng, sự

ổn định của BKV-DNA trong máu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn BKV trong

nước tiểu khi dự đoán BKVN. Nhận định này cũng phù hợp với kết qủa nghiên cứu

của chúng tôi khi 11 trường hợp có nồng độ BKV-DNA cao hơn giá trị ngưỡng

trong nước tiểu nhưng không bị BKVN, một trường hợp có nồng độ BKV-DNA

trong máu cao bị BKVN. Tuy nhiên, sự kết hợp giữa giá trị ngưỡng trong máu và

nước tiểu trong dự đoán BKVN sẽ giúp đưa ra được kết luận chính xác với độ tin

cậy cao hơn.

65

3.2.3. Đánh giá vai trò BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng

Để đánh giá vai trò BKV-DNA, 84 bệnh nhân dương tính BKV được chia

thành hai nhóm: BKV dương tính và BKVN, sau đó đánh giá trên các phương diện

giới tính, tuổi, liệu pháp miễn dịch, nồng độ creatinine. Kết quả đánh giá được thể

hiện ở bảng 3.7.

Bảng 3. 7. Đánh giá vai trò BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng ở bệnh nhân ghép

thận

Nhóm BKV (+) BKVN P Thông số

38,73 ± 10,58 42,13 ± 6,29 0,38 Tuổi

5 55 Nam 0,69 Giới tính 3 23 Nữ

2,47 ± 0,91 5,50 ± 0,92 BKV-DNA trong máu (logIU/ml) <0,001

4,11 ± 2,55 8,97 ± 2,23 BKV-DNA nước tiểu (logIU/ml) <0,001

Creatinine (µmol/l) 114,18 ± 30,68 157,50 ± 34,18 <0,001

3,52 ± 1,32 3,63 ± 2,45 0,85 HLA mismatch

1,48 ± 2,11 3,0 ± 2,2 0,06 Thời gian sau ghép thận (Năm±SD)

6 65 Tacrolimus 0,61 Liệu pháp miễn dịch 2 12 Cyclosporin

So sánh giữa hai nhóm bệnh nhân BKV (+) và BKVN nhận thấy không có sự

khác biệt giữa hai nhóm liên quan với tuổi, giới tính, HLA mismatch, thời gian sau

ghép thận cũng như việc lựa chọn liệu pháp miễn dịch khác nhau (p>0,05). Tuy

nhiên sự khác biệt về nồng độ BKV-DNA trong máu, nước tiểu và nồng độ

creatinin có ý nghĩa thống kê với p<0,001. Như vậy, việc xác định nồng độ BKV-

DNA trong máu và nước tiểu có vai trò quan trọng trong việc theo dõi tình trạng

chức năng thận sau ghép cũng như đưa ra các phương pháp điều trị can thiệp kịp

thời cho những bệnh nhân ghép thận nhiễm BKV.

66

3.3. Phân tích đặc điểm di truyền phân tử BKV

3.3.1. Xác định kiểu gen BKV lưu hành tại Việt Nam

Cây chủng loại phát sinh được xây dựng dựa trên vùng trình tự 327 bp thuộc

vùng gen VP1, bao gồm 26 trình tự tham chiếu được công bố trên Genbank cùng

với kết quả giải trình tự của 40 mẫu dương tính với BKV bằng phương pháp Nested

PCR (Hình 3.15).

67

Hình 3. 15. Cây phát sinh loài trên vùng gen VP1-BKV (1630-1956)

68

Bảng 3. 8. Sự phân bố các phân nhóm của BKV

BKV-I (n=25) BKV-IV (n=15)

I/a I/-b1 I/b-2 I/c IV/a-1 IV/a-2 IV/b-1 IV/c-1 IV/c-2

0 25 0 0 4 1 0 10 0

(0%) (100%) (0%) (0%) (26,67%) (6,67%) (0%) (66,66%) (0%)

Kết quả phân tích bằng cây chủng loại phát sinh cho thấy: 25 mẫu (62,5%)

thuộc BKV-I, 15 mẫu (37,5%) thuộc BKV-IV, không phát hiện được BKV-II, III

trong các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam. Phân tích sâu hơn

về trình tự dưới loài, 27/27 mẫu BKV-I thuộc về phân nhóm I/b-1, không phát hiện

được các phân nhóm I/b-2, I/a hay I/c. Tuy nhiên, BKV-IV thể hiện sự đa dạng các

phân nhóm cao hơn: 10 mẫu thuộc phân nhóm IV/c-1, 4 mẫu thuộc phân nhóm

IV/a-1 và 1 mẫu thuộc nhóm IV/a-2 (Bảng 3.8). Một số trình tự trong nghiên cứu

này đã được đăng ký trên ngân hàng gen quốc tế với các mã số như MF817712.1,

MH019287.1, MH019286.1, MH019285.1…, cung cấp nguồn dữ liệu phân tử quan

trọng cho những nghiên cứu dịch tễ học về BKV tại Việt Nam.

BKV có 4 kiểu gen chính là BKV-I, II, III, IV lưu hành trên thế giới và sự

phân bố của các kiểu gen cũng như các phân nhóm phụ thuộc vào các vùng địa lý

khác nhau. Trong đó, BKV-I phổ biến nhất trên toàn thế giới, chiếm tỷ lệ 70%-80%

[80], tiếp đến là BKV-IV chiếm 15%-25%, được phát hiện ở Châu Âu, Châu Á

nhưng không phát hiện ở Châu Phi. BKV-II và BKV-III rất hiếm gặp ở mọi vùng

địa lý [44]. BKV-I có 4 phân nhóm gồm I/a, I/b-1, I/b-2 và I/c nhưng nguồn gốc và

sự phân bố của các phân nhóm là khác nhau. Phân nhóm I/a có nguồn gốc ở Châu

Phi, I/b-1 có nguồn gốc từ Đông Nam Á, I/b-2 đến từ châu Âu và I/c chủ yếu ở

Đông Bắc Á. Trong nghiên cứu này, khi phân tích trình tự DNA của vùng gen VP1

cho thấy BKV-I là kiểu gen chiếm ưu thế (62,5%), tiếp đến là BKV-IV (32,5%).

Phân tích sâu hơn để xác định phân nhóm, 25/25 mẫu thuộc BKV-I ở những bệnh

nhân ghép thận tại miền Bắc trong nghiên cứu này đều thuộc nhóm I/b-1. Kết quả

này phù hợp với sự phân bố kiểu gen BKV trên thế giới cũng như nguồn gốc và sự

phân bố nhóm I/b-1 ở Đông Nam Á trong các nghiên cứu trước đây [22], [44], [92].

69

3.3.2. Phân tích các vị trí SNP-BKV trên vùng gen VP1 ở bệnh nhân ghép thận

Các khu vực đa hình gen dẫn tới các kiểu đột biến khác nhau ở những vị trí

địa lý khác nhau. Phân tích cây chủng loại phát sinh cho thấy, BKV lưu hành tại

Việt Nam chỉ thuộc kiểu gen I và kiểu gen IV, do đó dựa vào đoạn trình tự 327 bp,

tương ứng với trình tự nucleotide ở vị trí 1630-1956 được phân tích để xác định sự

khác biệt giữa BKV-I và BKV-IV. Kết quả phân tích từ 26 trình tự tham chiếu và

40 trình tự chứa đoạn gen VP1 phân lập tại Việt Nam có kích thước 327 bp (1630 -

1956) được thể hiện ở bảng 3.9.

Bảng 3. 9. Vị trí SNP khác nhau giữa kiểu gen BKV-I và BKV-IV

Thay đổi aa

E=>N/S

N=>D E=>Y

K=>R

S=>T N=>T

S=>D/N/E/Q/H

Vị trí SNP 1704 1716 1722 1744 1746 1747 1760 1769 1770 1775 1784 1787 1792 1793 1809 1848 1851 1854 1869 1890 1912 1938 Vị trí aa 47 51 53 61 61 62 66 69 69 71 74 75 77 77 82 95 96 97 102 109 117 125 BKV-I G C C G A A T A G G A A A G G/A C C C C G C C BKV-IV A T T A T G A G A C C C G A C A A/G T T A A T E=>D Q=>K

70

Sau khi so sánh, 22 vị trí SNP khác nhau giữa kiểu gen I và IV đã được phát

hiện (bảng 3.9). Trong số đó, 10 SNP làm thay đổi trình tự axit amin capsid của

BKV (1746, 1747, 1760, 1769, 1775, 1784, 1792, 1793, 1809, 1912). Nghiên cứu

của Preety M. Sharma và cộng sự (2006) [4] ở tiểu bang Pennsylvania, Hoa Kỳ phát

hiện 10 vị trí SNP khác nhau giữa BKV-I và BKV-IV từ vị trí 1630-1956, trong đó

9/10 SNP (1704, 1722, 1747, 1760, 1769, 1770, 1784, 1851, 1854) trùng với SNP

trong nghiên cứu này. Vị trí SNP khác biệt duy nhất ở vị trí 1912, khi có sự thay đổi

nucleotide C=>A (BKV-I => BKV-IV), trong khi đó ở nghiên cứu của Preety M.

Sharma không có sự khác biệt ở vị trí nucleotide 1912 giữa BKV-I và BKV-IV. Tuy

nhiên, trong nghiên cứu Luo C và cộng sự (2008) [58], có sự thay đổi nucleotide

1912 từ C=>A giữa hai kiểu gen I và IV. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng

đồng nhất với các kết quả nghiên cứu khác trên thế giới [62].

25 mẫu BKV-I tiếp tục được so sánh với chủng Dunlop và các chủng quốc tế

thuộc phân nhóm I trong vùng gen VP1 (1630-1956) để xác định vị trí đa hình. Kết

quả so sánh được thể hiện ở bảng 3.10.

Bảng 3. 10. Xác định vị trí SNP BKV-I trong vùng gen VP1 (1630-1956)

Dunlop AB211369 AB211370 AB211372 Mẫu NC Tần số SNP

(I/a) T (I/b-1) A (I/b-2) A (I/c) A A 25/25 1698

5/25, A/G G 1786 G G G 20/25

A 25/25 G 1809 G A A

C 25/25 T 1923 T C C

24/25, A/G A 1929 A A A 1/25

Kết quả phân tích cho thấy 5 vị trí khác biệt giữa phân nhóm I/b-1 (Việt

Nam) so với chủng Dunlop (bảng 3.10), với 3/5 vị trí khác biệt (1698, 1809, 1923)

tương đồng với chủng tham chiếu I/b-1. Các phân nhóm I có trình tự khá bảo thủ,

71

trong đó phân nhóm I/b-1 Việt Nam tương đồng khoảng 98,5% so với chủng

Dunlop, không có sự khác biệt SNP đặc trưng BKV-I trong vùng gen VP1 (1630-

1956) để phân biệt các phân nhóm với nhau. Tuy nhiên, ở vị trí 1786 (tương ứng

với axit amin 75) trên một số chủng Việt Nam, xuất hiện vị trí SNP (G=>A), làm

thay đổi axit amin Asp=>Asn, với tần số 5/25 mẫu (20%). Đây là vị trí SNP hiếm,

không nằm trong phạm vi SNP mà Jin và cộng sự đã mô tả năm 1993 nhằm phân

biệt các kiểu gen BKV [47], nhưng đã được Tremolada S và cộng sự (2010) ghi

nhận là kiểu đột biến hiếm và thường xuất hiện trong nước tiểu ở những bệnh nhân

BKVN [84].

Từ kết quả cây chủng loại phát sinh, 15 trình tự BKV-IV đều thuộc ba phân

nhóm IV/a-1, IV/a-2, IV/c-1. Do đó, để khảo sát sự đa dạng trình tự nucleotide trong

phân nhóm IV, 15 trình tự BKV-IV trong nghiên cứu này tiếp tục được so sánh với các

phân nhóm IV/a-1 (AB269869), IV/a-2 (AB211389), IV/c-1(AB269867) quốc tế. Kết

quả được thể hiện ở bảng 3.11 và 3.12.

Bảng 3. 11. Đa dạng SNP ở kiểu gen BKV-IV

IV/c-1 Mẫu NC

SNP 1726 1735 1737 1741 1745 1766 1769 1778

IV G G T G A T G C 1780/1781 GA G G A G G C G 1792 1794 1851 1860 1905 1938 1954 IV/a-1 G G T G A T G C GA G G A G G T G IV/a-2 G G T G A T G C GA G C A A G T G G G T G A T G C GA G C A G A T G G/C G/A T/C G/C A/G T/A G/A C/T GA/TC G/A/C C/G/A A/G A/G A/G T T/G Tần số 14/15,1/15 14/15,1/15 11/5, 4/15 14/15, 1/15 2/15, 13/15 14/15, 1/15 12/15, 3/15 14/15, 1/15 14/15, 1/15 10/15, 2/15, 3/15 10/15, 4/15, 1/15 11/15, 4/15 10/15, 5/15 9/15, 6/15 15/15 1/15, 14/15

72

Bảng 3. 12. Trình tự axit amin ở những vị trí SNP trong phân nhóm IV

Vị trí Dunlop aa IV aa NC aa SNP

axit amin 55 1726 E P Q

1735 58 D D N 1737 58 D D

1741 60 D D H

1745 61 E N S

1766 68 L L Q

1769/1770 69 K R K

1778 72 A A V

1780/1781 73 E S E

1792 77 S E D, E, Q, H, N 1794 77 S E

1851 96 D A A

1860 99 D D D

1905 114 R R R

1938 125 T T T

1954 131 M M M

Khác với phân nhóm I có sự tương đồng khá cao trình tự nucleotide, phân

nhóm IV thể hiện sự đa dạng các vị trí SNP hơn khi so sánh với chủng gốc (trình tự

IV, Z19535, Jin L (1993) [47], phân lập tại Anh). Sau khi phân tích, 17 vị trí SNP

khác biệt giữa chủng gốc IV và các chủng phân lập tại Việt Nam được quan sát,

trong đó nhiều SNP làm thay đổi axit amin. Tuy nhiên, hầu hết các vị trí SNP này

xuất hiện đơn lẻ (8/17 vị trí) nhưng đều làm thay đổi trình tự axit amin. Ở vị trí

1737 và 1769 xuất hiện những vị trí SNP với tần suất khá cao trên các chủng Việt

Nam, nhưng không xuất hiện trên những phân nhóm IV khác như: 1737 (T=>C)

26,67% dẫn tới sự thay đổi axit amin D=>N, 1769 (G=>A) 20% và thay đổi R=>K.

Mặt khác, ở vị trí 1851, xuất hiện đa hình A (73,33%) và G (26,67%), trong đó đa

73

hình A xuất hiện tại tất cả trình tự tham chiếu thuộc nhóm IV (AB269869,

AB269868, AB269858, AB211389, AB269867) còn đa hình G chủ yếu xuất hiện ở

kiểu gen BKV-II, BKV-III. Tuy nhiên, đa hình G cũng xuất hiện trong trình tự tham

chiếu AB269859 thuộc phân nhóm IV/a-1, phân lập tại Philippine nhưng vị trí đa

hình này không làm thay đổi trình tự axit amin. Đặc biệt ở vị trí 1745, trên các

chủng Việt Nam xuất hiện vị trí SNP (A=>G) với tần suất 13/15 mẫu (86,67%), dẫn

tới sự thay đổi axit amin N=>S. Đây là vị trí SNP đặc biệt để phát hiện kiểu gen IV

tại Việt Nam, đại diện cho sự tiến hóa và đột biến theo phương thức riêng và không

được tìm thấy ở bất kỳ chủng quốc tế khác.

• Phân tích SNP ở những bệnh nhân BKVN trong mẫu máu và nước tiểu

Chúng tôi tiến hành phân tích trình tự BKV sau khi phân lập theo cặp từ mẫu

máu và nước tiểu của 8 bệnh nhân bị BKVN. Kết quả phân tích được thể hiện ở

bảng 3.13.

Bảng 3. 13. So sánh trình BKV phân lập theo cặp từ mẫu máu

và nước tiểu của 8 bệnh nhân BKVN

KH Loại Kiểu Sự thay thế axit amin Giới STT mẫu mẫu gen (so với chủng Dunlop) tính

D60H, E61S, N62D, F66Y, K69R,

Máu 45P IV/c-1 S71T, N74T, D75A, S77D, E82D,

Q117K. 1 Nam

E61S, N62D, F66Y, K69R, S71T, Nước tiểu 58UF IV/c-1 N74T, D75A, S77D, E82D, Q117K.

E61S, N62D, F66Y, K69R, S71T, Máu 124PF IV/c-1 N74T, D75A, S77D, E82D, Q117K. 2 Nam

E61S, N62D, F66Y, K69R, S71T, Nước tiểu 124UF IV/c-1 N74T, D75A, S77D, E82D, Q117K.

74

KH Kiểu Sự thay thế axit amin Giới Loại STT mẫu gen (so với chủng Dunlop) tính mẫu

E61S, N62D, F66Y, K69R, S71T, Máu 152PF IV/c-1 N74T, D75A, S77D, E82D, Q117K. 3 Nữ

E61S, N62D, F66Y, K69R, S71T, Nước tiểu 152UF IV/c-1 N74T, D75A, S77D, E82D, Q117K.

Máu 8P I/b-1 D75N

4 Nữ E61S, N62D, F66Y, K69R, S71T, Nước tiểu 8U IV/c-1 N74T, D75A, S77D, E82D, Q117K.

Máu 33P I/b-1 D75N 5 Nam

Nước tiểu CM10U I/b-1

Máu CM11P I/b-1 D75N 6 Nam

Nước tiểu BKV2 I/b-1

Máu 145P I/b-1 7 Nữ

Nước tiểu 145U I/b-1

Máu 14P I/b-1 D75N 8 Nam

Nước tiểu 14U I/b-1 D75N

Trong 8 bệnh nhân BKVN, 7/8 trường hợp (87,5%) có kiểu gen BKV đồng

nhất trong máu và nước tiểu, 1 trường hợp (12,5%) bất đồng kiểu gen khi kiểu gen

BKV trong máu là I/b-1, trong nước tiểu là IV/c-1. Những nghiên cứu đầu tiên phát

hiện đồng nhiễm hai kiểu gen ở cùng một bệnh nhân được công bố vào năm 1995

khi Jin và cộng sự quan sát thấy những trường hợp nhiễm kiểu gen hỗn hợp, đặc

trưng bởi sự hiện diện của kiểu gen I và các kiểu gen khác trong mẫu nước tiểu của

bệnh nhân nhiễm HIV, trẻ em và phụ nữ có thai [48]. Những nghiên cứu khác trong

giai đoạn tiếp theo cũng ghi nhận các trường hợp có sự khác biệt về các phân nhóm

75

phụ trong mẫu nước tiểu của bệnh nhân ghép thận và người khỏe mạnh [59]. Sự bất

đồng kiểu gen BKV giữa máu và nước tiểu cũng được chỉ ra trong nghiên cứu của

Ledesma J và cộng sự (2013) [56] khi phân tích vùng gen VP1 của 7 bệnh nhân

ghép thận với sự phối kết hợp ngẫu nhiên của cả 4 kiểu gen (I/III, II/III, IV/II, II/I),

thậm chí là sự khác biệt phân nhóm trong cùng một kiểu gen (I/b-1, I/b-2). Nhiều

giả thuyết cho sự khác biệt kiểu gen BKV trong máu và nước tiểu của bệnh nhân

ghép thận đã được công bố, trong đó nguyên nhân đến từ người cho có nguy cơ cao

dẫn tới tình trạng trên. Nghiên cứu của Schwarz. A và cộng sự chỉ ra rằng lây

truyền virus có nguồn gốc từ người cho là một yếu tố nguy cơ chủ yếu đối với sự

phát triển BKV sau ghép hơn là sự tái kích hoạt virus tiềm ẩn từ người nhận. Tình

trạng huyết thanh học của người cho được khẳng định là dương tính với BKV nếu

người nhận phát hiện bị nhiễm BKV sau khi ghép, và sự nhân lên của virus trong

nước tiểu có liên quan đến tình trạng nhiễm virus trong máu của người nhận sau

ghép. BKV có thể tương ứng giữa người cho và người nhận hoặc có thể thay đổi

trong quá trình lây nhiễm của người nhận đã được mô tả trước đây [74].

Hầu hết các virus trong phân nhóm I/b-1 không khác so với chủng tham

chiếu Dunlop nhưng các biến thể virus đã được tìm thấy trong số các virus có trong

phân nhóm I/b-1 được đặc trưng bởi sự thay thế D75N. Trong số 5 bệnh nhân thuộc

phân nhóm I/b-1, sự thay thế D75N chỉ xuất hiện trong máu (3/5 bệnh nhân), cả

máu và nước tiểu (1/5 bệnh nhân), không xuất hiện (1/5 bệnh nhân). Sự thay thế

D75N chiếm ưu thế hơn trong máu có thể được giải thích do sự khác biệt bởi áp lực

chọn lọc trong máu so với các tế bào biểu mô thận ở bệnh nhân dẫn đến sự đa dạng

di truyền. Trong số 5 bệnh nhân có BKV-I xuất hiện sự thay thế nucleotide 1786

(D75N, Bảng 3.10), 4/5 trường hợp mắc BKVN. Hiện tượng thay thế D75N thường

xuất hiện nhiều hơn ở bệnh nhân BKVN cũng được chỉ ra trong nghiên cứu của

Tremolada S và cộng sự (2010) [84]. Khác với kiểu gen I, các phân nhóm IV thể

hiện sự đa dạng SNP hơn khi so sánh với chủng tham chiếu Dunlop và được đặc

trưng bởi 10 sự thay thế (E61S, N62D, F66Y, K69R, S71T, N74T, D75A, S77D,

E82D, Q117K) ở tất cả các trường hợp. Sự thay thế này xuất hiện đồng nhất ở trong

76

máu và nước tiểu ở cả 3 trường hợp có kiểu gen BKV-IV. Cũng giống như D75N,

sự thay thế tại vị trí K69R cũng được ghi nhận ở những trường hợp mắc BKVN, tuy

nhiên biến thể K69R có tốc độ sao chép nhanh hơn so với D75N [84]. Phân tích

theo cặp phát hiện 1 vị trí thay thế D60H xuất hiện trong máu nhưng không xuất

hiện trong nước tiểu ở bệnh nhân số 1.

3.3.3. Đánh giá vai trò của kiểu gen BKV với bệnh thận do BKV

Từ kết quả cây chủng loại phát sinh cho thấy kiểu gen BKV lưu hành tại Việt

Nam gồm BKV-I và BKV-IV. Kết quả phân tích sự phân bố và sự khác biệt giữa

các kiểu gen BKV liên quan đến tuổi, giới, các chỉ số xét nghiệm và tình trạng

BKVN được trình bày ở bảng 3.14.

Bảng 3. 14. Sự phân bố kiểu gen BKV theo các chỉ số lâm sàng

và cận lâm sàng

BKV-I BKV-IV Kiểu gen p Thông số (n=25) (n=15)

41,12 ± 10,94 38,94 ± 8,49 0,50 Độ tuổi

6 (14,63%) 4 (9,76%) Nữ 1 Giới tính 19 (46,34%) 12 (29,27%) Nam

126,16 ± 33,86 134,06 ± 39,62 0,50 Creatinin T1 (µmol/ml)

Nồng độ BKV-DNA trong máu 4,39 ± 1,65 4,57 ± 1,63 0,76 (log IU/ml)

Nồng độ BKV-DNA nước tiểu 7,21 ± 2,66 8,25 ± 2,87 0,26 (log IU/ml)

1 5/25 (20%) 3/15 (20%) BKVN

Từ bảng 3.14 cho thấy không có sự khác biệt giữa các kiểu gen BKV liên

quan đến tuổi, giới, các chỉ số xét nghiệm và tình trạng BKVN (p>0,05).

77

Bệnh thận do BKV là một vấn đề thách thức lâm sàng ở bệnh nhân sau ghép

thận khi mà các lựa chọn trong điều trị còn hạn chế, phụ thuộc nhiều vào kinh

nghiệm của bác sĩ. Việc theo dõi điều trị bệnh nhân sau ghép thận đóng vai trò rất

quan trọng trong duy trì chức năng thận ghép, giảm thiểu tối đa nguy cơ mất mô

ghép hay suy chức năng thận ghép. Trong nghiên cứu này, khi phân tích kiểu gen

BKV của 8 bệnh nhân BKVN được khẳng định bằng sinh thiết thận, 5/8 (62,5%)

thuộc nhóm I/b-1; 3/8 (37,5%) thuộc nhóm IV/c-1, và sự khác biệt này không có ý

nghĩa thống kê (p>0,05). Nghiên cứu của của Boukoum H và cộng sự (2016) trên

34 mẫu bệnh phẩm (máu hoặc nước tiểu) của bệnh nhân ghép thận tại Tunisia cho

thấy BKV-I có tỷ lệ lưu hành cao nhất (79,5%), trong đó phân nhóm I/b-2 chiếm ưu

thế (76,5%). Boukoum H và cộng sự cũng đưa ra nhận định không có sự liên quan

giữa kiểu gen và tình trạng BKVN (p>0,05), mặc dù cả hai bệnh nhân bị BKVN đều

thuộc phân nhóm I/b-2 [16]. Trong khi đó, nghiên cứu của Pastrana và cộng sự.

(2013) [67] chỉ ra rằng BKV -IV chiếm tỷ lệ cao hơn ở bệnh nhân bị BKVN sau

ghép thận so với bệnh nhân sau ghép chỉ có BKV dương tính trong máu và nước

tiểu. Một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra mối liên hệ giữa kiểu gen BKV-II, III, IV

với nguy cơ bị BKVN cao hơn ở bệnh nhân ghép thận [61], [83]. Nghiên cứu gần

đây của Johannes Korth và cộng sự (2018) [52], cho thấy BKV-I chiếm tỷ lệ cao

với 82%, tiếp theo là BKV-IV (14%) và cuối cùng là BKV-II (4%). Điểm đáng chú

ý là bệnh nhân BKVN do BKV-II và IV được phát hiện với tỷ lệ cao hơn so với

bệnh nhân bị BKVN do BKV-I ((8/10 (80%) so với 17/46 (37%); p = 0,001). Trong

nghiên cứu này chúng tôi chỉ ra BKV-I xuất hiện ở nhóm bệnh nhân BKVN cao

hơn (5/8 bệnh nhân) có thể do BKV-I sao chép hiệu quả hơn BKV-IV trong tế bào

biểu mô thận cũng như BKV-I chiếm ưu thế trong dân số Việt Nam [65].

78

KẾT LUẬN

1. Xây dựng thành công quy trình định lượng BKV-DNA bằng phương pháp real-

time PCR ứng dụng trong kiểm nghiệm xét nghiệm acid nucleic của BKV tại Việt

Nam.

+ Hiệu chỉnh thành công bộ mẫu chuẩn nghiên cứu với bộ mẫu chuẩn của

WHO: 1 IU = 9,6 copy.

+ Ngưỡng phát hiện 135 IU/ml, độ đặc hiệu (100%) và độ ổn định cao.

+ Ngưỡng dự đoán phát triển BKVN ở bệnh nhân ghép thận: trong máu với

giá trị 4,12 log10 (IU/ml), độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 95,56%. Trong nước tiểu xác

định giá trị ngưỡng BKV-DNA là 6,95 log10 (IU/ml), độ nhạy 87,5%, độ đặc hiệu

84,21%.

2. Phân tích một số đặc điểm di truyền phân tử của BKV ở vùng gen VP1 (1630-

1956) trên những bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam.

+ Tỷ lệ lưu hành BKV là 64,12%.

+ Phân tích kiểu gen BKV trên 40 mẫu dương tính: BKV-I chiếm 62,5%,

BKV-IV (37,5%), không phát hiện được BKV-II và BKV-III trên quần thể bệnh

nhân ghép thận người Việt Nam. Tỷ lệ lưu hành các phân nhóm BKV-I và BKV-IV như

sau: BKV-I/b-1 (100%), BKV-IV/a-1 (26,67%), BKV-IV/a-2 (6,67%), BKV-IV/c-1

(66,66%).

+ Phân tích đa hình trên đoạn gen VP1 cho thấy các chủng BKV-I có sự

tương đồng khá cao giữa các phân nhóm, trong khi các chủng thuộc phân nhóm IV

cho thấy sự đa dạng trình tự.

79

KIẾN NGHỊ

1. Phân tích đặc điểm di truyền phân tử BKV ở người cho thận để xác định nguồn

gốc BKV sau ghép thận.

2. Phân tích trình tự toàn bộ gen BKV xác định đặc điểm di truyền phân tử BKV ở

bệnh nhân ghép thận nhiễm BKV.

80

TÀI LIỆU THAM KHẢO

 Tài liệu Tiếng Việt

1. Hà Phan Hải An (2015), "Ca lâm sàng nhiễm virus BK ở bệnh nhân sau ghép

thận", Tạp chí Nghiên cứu Y học, 93(1), tr. 142-148.

2. Trịnh Hùng (2016), http://benhvien198.vn/thong-bao-hai-truong-hop-nhiem-

virus-bk-tren-benh-nhan-sau-ghep-than-tai-benh-vien-19-8.

 Tài liệu Tiếng Anh

3. Ambalathingal G. R. et al. (2017), "BK polyomavirus: clinical aspects,

immune regulation, and emerging therapies", Clinical microbiology reviews,

30(2), pp. 503-528.

4. Anjela Galan C. A. R., Christopher N Otis (2005), "Fatal BK polyoma viral

pneumonia associated with immunosuppression", Human pathology, 36(9),

pp. 1031-1034.

5. Azevedo L. S. et al. (2015), "Cytomegalovirus infection in transplant

recipients", Clinics, 70(7), pp. 515-523.

6. B. Loeches M. V., M. Perez, et al. (2009), "BK virus in liver transplant

recipients: a prospective study", Transplant Proc, 41(3), pp. 1033-7.

7. Baksh F. K. et al. (2001), "Molecular genotyping of BK and JC viruses in

human polyomavirus [ndash] associated interstitial nephritis after renal

transplantation", American journal of kidney diseases, 38(2), pp. 354-365.

8. Balba G. P. et al. (2013), "BK polyomavirus infection in the renal transplant

recipient", Infectious Disease Clinics, 27(2), pp. 271-283.

9. Barbanti-Brodano G. et al. (2006), "BK virus, JC virus and Simian Virus 40

infection in humans, and association with human tumors", Polyomaviruses

and Human Diseases, Springer, pp. 319-341.

10. Barker P. (2006), Standarization of Diagnostic Markers, IOS Press.

81

11. Bateman A. C. et al. (2017), "Quantification of BK virus standards by

quantitative real-time PCR and droplet digital PCR is confounded by

multiple virus populations in the WHO BKV international standard",

Clinical chemistry, 63(3), pp. 761-769.

12. Baylis S. et al. (2008), "An international collaborative study to establish the

2nd World Health Organization International Standard for hepatitis B virus

DNA nucleic acid amplification technology‐based assays", Vox sanguinis,

94(4), pp. 358-362.

13. Bicalho C. S. et al. (2018), "Determination of viremia cut‐off for risk to

develop BKP yV‐associated nephropathy among kidney transplant

recipients", Transplant Infectious Disease, 20(5), p. e12969.

14. Blazquez-Navarro A. et al. (2018), "BKV, CMV, and EBV interactions and

their effect on graft function one year post-renal transplantation: results from

a large multi-Centre study", EBioMedicine, 34, pp. 113-121.

15. Boukoum H. et al. (2011), "Distribution of BK polyomavirus genotypes in

Tunisian renal transplant recipients", Journal of medical virology, 83(4), pp.

725-730.

16. Boukoum H. et al. (2016), "BK polyomavirus genotypes and nephropathy: is

there a relationship?", Transplant Infectious Disease, 18(2), pp. 309-311.

17. Boukoum H. et al. (2015), "BK and JC polyomavirus infections in Tunisian

renal transplant recipients", Journal of medical virology, 87(10), pp. 1788-

1795.

18. Browne L. and Karubian J. (2018), "Rare genotype advantage promotes

survival and genetic diversity of a tropical palm", New Phytologist, 218(4),

pp. 1658-1667.

19. Burd E. M. (2010), "Validation of laboratory-developed molecular assays for

infectious diseases", Clinical microbiology reviews, 23(3), pp. 550-576.

82

20. C. Almeras F. V., V. Garrigue, et al. (2011), "Monthly screening for BK

viremia is an effective strategy to prevent BK virus nephropathy in renal

transplant recipients", Transpl Infect Dis, 13(2), pp. 101-8.

21. C. J. Bechert V. J. S., D. A. Payne, et al. (2010), "Monitoring of BK viral

load in renal allograft recipients by real-time PCR assays", Am J Clin Pathol,

133(2), pp. 242-50.

22. Chen Q. et al. (2006), "Subtype IV of the BK polyomavirus is prevalent in

East Asia", Archives of virology, 151(12), pp. 2419-2429.

23. Cubitt C. L. (2006), "Molecular genetics of the BK virus", Polyomaviruses

and Human Diseases, Springer, pp. 85-95.

24. D. Dadhania C. S., R. Ding, et al. (2010), "Validation of noninvasive

diagnosis of BK virus nephropathy and identification of prognostic

biomarkers", Transplantation, 90(2), pp. 189-97.

25. D. L. Bohl D. C. B. (2007), "BK virus nephropathy and kidney

transplantation", Clin J Am Soc Nephrol, 2 Suppl 1, pp. S36-46.

26. Daniel L Bohl G. A. S., Caroline Ryschkewitsch, et al. (2005), "Donor origin

of BK virus in renal transplantation and role of HLA C7 in susceptibility to

sustained BK viremia", American Journal of Transplantation, 5(9), pp.

2213-2221.

27. Dugan A. et al. (2006), "Update on BK virus entry and intracellular

trafficking", Transplant infectious disease, 8(2), pp. 62-67.

28. Dugan A. S. et al. (2008), "Human α-defensins inhibit BK virus infection by

aggregating virions and blocking binding to host cells", Journal of Biological

Chemistry, 283(45), pp. 31125-31132.

29. Eash S. et al. (2004), "Infection of vero cells by BK virus is dependent on

caveolae", Journal of virology, 78(21), pp. 11583-11590.

83

30. Egli A. et al. (2009), "Prevalence of polyomavirus BK and JC infection and

replication in 400 healthy blood donors", The Journal of infectious diseases,

199(6), pp. 837-846.

31. Gedvilaite A. et al. (2006), "Virus-like particles derived from major capsid

protein VP1 of different polyomaviruses differ in their ability to induce

maturation in human dendritic cells", Virology, 354(2), pp. 252-260.

32. Göran Bratt A. L. H., Monica Grandien, et al. (1999), "BK virus as the cause

of meningoencephalitis, retinitis and nephritis in a patient with AIDS", Aids,

13(9), pp. 1071-1075.

33. H. B. Viscount A. J. E., M. J. Espy, et al. (2007), "Polyomavirus polymerase

chain reaction as a surrogate marker of polyomavirus-associated

nephropathy", Transplantation, 84(3), pp. 340-5.

34. H. H. Hirsch C. B. D., J. Steiger, et al. (2006), "Polyomavirus-associated

nephropathy in renal transplantation: critical issues of screening and

management", Adv Exp Med Biol, 577, pp. 160-73.

35. H. H. Hirsch P. R. (2009), "BK virus in solid organ transplant recipients",

Am J Transplant, 9 Suppl 4, pp. S136-46.

36. H. H. Hirsch W. K., M. Dickenmann, et al. (2002), "Prospective study of

polyomavirus type BK replication and nephropathy in renal-transplant

recipients", N Engl J Med, 347(7), pp. 488-96.

37. H. K. Singh K. A. A., V. Madden, et al. (2009), "Presence of urinary Haufen

accurately predicts polyomavirus nephropathy", J Am Soc Nephrol, 20(2),

pp. 416-27.

38. Hariharan S. (2006), "BK virus nephritis after renal transplantation", Kidney

international, 69(4), pp. 655-662.

84

39. Harris K. F. et al. (1998), "Novel mechanisms of E2F induction by BK virus

large-T antigen: requirement of both the pRb-binding and the J domains",

Molecular and cellular biology, 18(3), pp. 1746-1756.

40. Hasan M. R. et al. (2016), "Comparative evaluation of laboratory developed

real-time PCR assays and RealStar® BKV PCR Kit for quantitative

detection of BK polyomavirus", Journal of virological methods, 234, pp. 80-

86.

41. Hirsch H. H. et al. (2002), "Prospective study of polyomavirus type BK

replication and nephropathy in renal-transplant recipients", New England

Journal of Medicine, 347(7), pp. 488-496.

42. Hirsch H. H. and Snydman D. R. (2005), "BK virus: opportunity makes a

pathogen", Clinical Infectious Diseases, 41(3), pp. 354-360.

43. Hurdiss D. L. et al. (2016), "New structural insights into the genome and

minor capsid proteins of BK polyomavirus using cryo-electron microscopy",

Structure, 24(4), pp. 528-536.

44. Ikegaya H. et al. (2006), "Identification of a genomic subgroup of BK

polyomavirus spread in European populations", Journal of general virology,

87(11), pp. 3201-3208.

45. Iwaki K. K. et al. (2010), "Development of a real-time quantitative PCR

assay for detection of a stable genomic region of BK virus", Virology

journal, 7(1), p. 295.

46. Jin L. and Gibson P. (1996), "Genomic function and variation of human

polyomavirus BK (BKV)", Reviews in medical virology, 6(4), pp. 201-214.

47. Jin L. et al. (1993), "Genomic typing of BK virus in clinical specimens by

direct sequencing of polymerase chain reaction products", Journal of medical

virology, 41(1), pp. 11-17.

85

48. Jin L. et al. (1995), "Prevalence and distribution of BK virus subtypes in

healthy people and immunocompromised patients detected by PCR-

restriction enzyme analysis", Clinical and diagnostic virology, 3(3), pp. 285-

295.

49. K. F. Remund M. B., J. J. Egan (2009), "Infections relevant to lung

transplantation", Proc Am Thorac Soc, 6(1), pp. 94-100.

50. Kessler H. et al. (2012), "Ninth International Symposium on Molecular

Diagnostics", Clin Chem Lab Med, 50(4), pp. A71-A88.

51. Knowles W. A. (2006), "Discovery and epidemiology of the human

polyomaviruses BK virus (BKV) and JC virus (JCV)", Polyomaviruses and

human diseases, Springer, pp. 19-45.

52. Korth J. et al. (2018), "Impact of low‐level BK polyomavirus viremia on

intermediate‐term renal allograft function", Transplant Infectious Disease,

20(1), p. e12817.

53. Krautkrämer E. et al. (2009), "Mutations in the BC‐loop of the BKV VP1

region do not influence viral load in renal transplant patients", Journal of

medical virology, 81(1), pp. 75-81.

54. Krumbholz A. et al. (2006), "Prevalence of BK virus subtype I in Germany",

Journal of medical virology, 78(12), pp. 1588-1598.

55. Kudose S. and Dong J. (2014), "Clinical validation study of quantitative real-

time PCR assay for detection and monitoring of BK virus nephropathy",

Annals of Clinical & Laboratory Science, 44(4), pp. 455-460.

56. Ledesma J. et al. (2013), "BK polyomavirus genotyping at inter‐and intra‐

patient level in Spain", Journal of medical virology, 85(8), pp. 1402-1408.

57. Li T.-C. et al. (2003), "Characterization of self-assembled virus-like particles

of human polyomavirus BK generated by recombinant baculoviruses",

Virology, 311(1), pp. 115-124.

86

58. Luo C. et al. (2009), "Genotyping schemes for polyomavirus BK, using

gene-specific phylogenetic trees and single nucleotide polymorphism

analysis", Journal of virology, 83(5), pp. 2285-2297.

59. Luo C. et al. (2012), "VP‐1 quasispecies in human infection with

polyomavirus BK", Journal of medical virology, 84(1), pp. 152-161.

60. M. D. Reploeg G. A. S., D. B. Clifford (2001), "Bk virus: a clinical review",

Clin Infect Dis, 33(2), pp. 191-202.

61. Matsuda Y. et al. (2011), "A rapid and efficient method BK polyomavirus

genotyping by high‐resolution melting analysis", Journal of medical

virology, 83(12), pp. 2128-2134.

62. Morel V. et al. (2017), "A simple and reliable strategy for BK virus

subtyping and subgrouping", Journal of clinical microbiology, 55(4), pp.

1177-1185.

63. N Basara F.-M. R., T Schwalenberg, et al. (2010), "Hydronephrosis resulting

from bilateral ureteral stenosis: a late complication of polyoma BK virus

cystitis?", Journal of transplantation, p. 2010.

64. Nishimoto Y. et al. (2007), "An Asian origin for subtype IV BK virus based

on phylogenetic analysis", Journal of molecular evolution, 65(1), pp. 103-

111.

65. Nukuzuma S. et al. (2006), "Subtype I BK polyomavirus strains grow more

efficiently in human renal epithelial cells than subtype IV strains", Journal of

general virology, 87(7), pp. 1893-1901.

66. O. Johnston D. J., J. S. Gill, et al. (2010), "Treatment of polyomavirus

infection in kidney transplant recipients: a systematic review",

Transplantation, 89(9), pp. 1057-70.

87

67. Pastrana D. V. et al. (2013), "BK polyomavirus genotypes represent distinct

serotypes with distinct entry tropism", Journal of virology, 87(18), pp.

10105-10113.

68. R. Sharma S. T., S. Patel, et al. (2016), "BK Virus in Kidney Transplant:

Current Concepts, Recent Advances, and Future Directions", Exp Clin

Transplant, 14(4), pp. 377-84.

69. R. Thakur S. A., R. Nada, et al (2011), "Prospective monitoring of BK virus

reactivation in renal transplant recipients in North India", Transpl Infect Dis,

13(6), pp. 575-83.

70. Randhawa P. et al. (2002), "BK virus: discovery, epidemiology, and

biology", Graft, 5(suppl 1), p. S19.

71. S. Gonzalez D. P. E.-S., O. Suarez, et al. (2015), "BK Virus Nephropathy in

Kidney Transplantation: An Approach Proposal and Update on Risk Factors,

Diagnosis, and Treatment", Transplant Proc, 47(6), pp. 1777-85.

72. S. J. Chadban K. A. B., S. B. Campbell, et al. (2012), "KHA-CARI

guideline: KHA-CARI adaptation of the KDIGO Clinical Practice Guideline

for the Care of Kidney Transplant Recipients", Nephrology (Carlton), 17(3),

pp. 204-14.

73. Schmitt C. et al. (2014), "Donor origin of BKV replication after kidney

transplantation", Journal of Clinical Virology, 59(2), pp. 120-125.

74. Schwarz A. et al. (2016), "Viral origin, clinical course, and renal outcomes in

patients with BK virus infection after living-donor renal transplantation",

Transplantation, 100(4), pp. 844-853.

75. Shah K. V. (2000), "Human polyomavirus BKV and renal disease",

Nephrology Dialysis Transplantation, 15(6), pp. 754-755.

88

76. Shenagari M. et al. (2017), "BK virus replication in renal transplant

recipients: Analysis of potential risk factors may contribute in reactivation",

Journal of Clinical Virology, 96, pp. 7-11.

77. Si-Mohamed A. et al. (2006), "Detection and quantitation of BK virus DNA

by real-time polymerase chain reaction in the LT-ag gene in adult renal

transplant recipients", Journal of virological methods, 131(1), pp. 21-27.

78. Skulratanasak P. et al. (2018), BK virus infection in Thai kidney transplant

recipients: a single-center experience, Transplantation proceedings, Elsevier,

pp. 1077-1079.

79. Stolt A. et al. (2003), "Seroepidemiology of the human polyomaviruses",

Journal of General Virology, 84(6), pp. 1499-1504.

80. Takasaka T. et al. (2004), "Subtypes of BK virus prevalent in Japan and

variation in their transcriptional control region", Journal of General

Virology, 85(10), pp. 2821-2827.

81. Tan S. K. et al. (2017), "Calibration of BK virus nucleic acid amplification

testing to the 1st WHO international standard for BK virus", Journal of

clinical microbiology, 55(3), pp. 923-930.

82. Toan P. Q. et al. (2019), Identification of BK Virus Genotypes in Recipients

of Renal Transplant in Vietnam, Transplantation proceedings, Elsevier, pp.

2683-2688.

83. Tremolada S. et al. (2010), "Rare subtypes of BK virus are viable and

frequently detected in renal transplant recipients with BK virus-associated

nephropathy", Virology, 404(2), pp. 312-318.

84. Tremolada S. et al. (2010), "Mutations in the external loops of BK virus VP1

and urine viral load in renal transplant recipients", Journal of cellular

physiology, 222(1), pp. 195-199.

89

85. V. R. Dharnidharka H. A. A., C. E. Araya (2011), "The BK virus in renal

transplant recipients-review of pathogenesis, diagnosis, and treatment",

Pediatr Nephrol, 26(10), pp. 1763-74.

86. Wang W. and Simmons D. T. (2009), "Simian virus 40 large T antigen can

specifically unwind the central palindrome at the origin of DNA replication",

Journal of virology, 83(7), pp. 3312-3322.

87. Wang Z. Y. et al. (2015), "Phylogenetic reconstruction and polymorphism

analysis of BK virus VP2 gene isolated from renal transplant recipients in

China", Experimental and therapeutic medicine, 10(5), pp. 1759-1767.

88. Womer K. L. et al. (2010), "Dendritic cell deficiency associated with

development of BK viremia and nephropathy in renal transplant recipients",

Transplantation, 89(1), pp. 115-123.

89. Y Akazawa Y. T., T Yamane, et al. (2012), "Fatal BK virus pneumonia

following stem cell transplantation", Transplant Infectious Disease, 14(6),

pp. E142-E146.

90. Yang Z. and Rannala B. (2012), "Molecular phylogenetics: principles and

practice", Nature reviews genetics, 13(5), p. 303.

91. Yoon S.-H. et al. (2015), Clinical impact of BK virus surveillance on

outcomes in kidney transplant recipients, Transplantation proceedings,

Elsevier, pp. 660-665.

92. Zheng H.-Y. et al. (2007), "Relationships between BK virus lineages and

human populations", Microbes and infection, 9(2), pp. 204-213.

90