Luận văn Thạc sỹ: Nghiên cứu vai trò của một số Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ POLYAMINE

LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH CÂY SÂM

NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET

GRUSHV.) NUÔI CẤY IN VITRO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS. TS. DƯƠNG TẤN NHỰT

2. PGS. TS. BÙI VĂN LỆ

Học viên thực hiện: VŨ THỊ THỦY

MỤC LỤC

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình và đồ thị

Mở đầu ........................................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. SƠ LƯỢC VỀ PHÔI VÔ TÍNH .......................................................................... 3

1.1.1. Quá trình phát sinh phôi ở thực vật .......................................................... 3

1.1.2. Khả năng phát sinh phôi vô tính của các tế bào sinh dưỡng .................... 4

1.1.3. Sự cảm ứng phát sinh phôi vô tính ........................................................... 8

1.1.4. Trạng thái của các tế bào phát sinh phôi vô tính ...................................... 9

1.1.5. Sự phát sinh phôi vô tính ........................................................................ 11

1.1.6. Ứng dụng của quá trình tạo phôi vô tính ................................................ 13

1.2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH ......... 13

1.2.1. Chất điều hòa sinh trưởng ...................................................................... 13

1.2.2. Nguồn Nitơ ............................................................................................. 15

1.2.3. Ánh sáng ................................................................................................. 16

1.2.4. Đường ..................................................................................................... 16

1.2.5. Độ pH ..................................................................................................... 17

1.3. VAI TRÒ CỦA POLYAMINE .......................................................................... 17

1.3.1. Giới thiệu ................................................................................................ 17

1.3.2. Con đường trao đổi chất của Polyamine ................................................ 18

1.3.2.1. Sinh tổng hợp Polyamine .......................................................... 18

1.3.2.2. Sự vận chuyển Polyamine ......................................................... 21

1.3.2.3. Sự tiếp hợp Polyamine .............................................................. 22

1.3.2.4. Polyamine trong tương tác với các con đường sinh tổng

hợp khác ................................................................................... 22

1.3.2.5. Các chất ức chế sinh tổng hợp Polyamine ............................... 22

1.3.3. Polyamine đóng vai trò là chất điều hòa sinh trưởng ............................. 23

1.4. SƠ LƯỢC VỀ CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA

ET GRUSHV.) .................................................................................................. 25

1.4.1. Phân loại và đặc điểm hình thái .............................................................. 25

1.4.1.1. Phân loại .................................................................................. 25

1.4.1.2. Đặc điểm hình thái ................................................................... 25

1.4.2. Phân bố ................................................................................................... 26

1.4.3. Thành phần hóa học ............................................................................... 26

1.4.3.1. Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ) ....................................... 26

1.4.3.2. Phần trên mặt đất (thân và lá) ................................................. 28

1.4.3.3. Các thành phần khác ................................................................ 28

1.4.4. Các tác dụng của sâm Ngọc Linh ........................................................... 28

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU ......................................................................................................... 30

2.1.1. Nguồn mẫu ............................................................................................. 30

2.1.2. Môi trường nuôi cấy ............................................................................... 30

2.1.3. Điều kiện thí nghiệm .............................................................................. 30

2.1.4. Địa điểm thực hiện đề tài ....................................................................... 30

2.2. PHƯƠNG PHÁP ................................................................................................ 31

2.2.1. Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh

quang ..................................................................................................... 31

2.2.2. Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát bằng kính hiển vi điện tử

quét ........................................................................................................ 31

2.2.3. Thu thập mẫu và phân tích Polyamine nội sinh ..................................... 32

2.2.4. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................... 32

2.2.4.1. Thí nghiệm 1. Khảo sát khả năng hình thành mô sẹo xốp

từ các nguồn mẫu cấy khác nhau của cây sâm Ngọc Linh .... 32

2.2.4.2. Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường

khoáng khác nhau lên sự hình thành mô sẹo xốp sâm

Ngọc Linh ............................................................................... 33

2.2.4.3. Thí nghiệm 3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D

kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kin lên sự hình thành

phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ............................ 33

2.2.4.4. Thí nghiệm 4. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện

nuôi cấy và điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi

vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh .................................... 34

2.2.4.5. Thí nghiệm 5. Khảo sát ảnh hưởng của một số tiền chất

sinh tổng hợp Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính

từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ................................................ 35

2.2.4.6. Thí nghiệm 6. Khảo sát ảnh hưởng của một số

Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp

sâm Ngọc Linh ........................................................................ 35

2.2.5. Xử lý số liệu ........................................................................................... 35

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN MẪU LÊN SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO

CÓ KHẢ NĂNG PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH SÂM NGỌC LINH ............ 36

3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC MÔI TRƯỜNG KHOÁNG LÊN KHẢ

NĂNG HÌNH THÀNH MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH ........................... 38

3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ 2,4-D KẾT HỢP VỚI 0,5 mg/l NAA

VÀ 0,2 mg/l KIN LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ

SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH ......................................................................... 41

3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ ĐIỀU KIỆN

CHIẾU SÁNG LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO

XỐP SÂM NGỌC LINH ................................................................................. 44

3.4.1. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (đặc, lỏng tĩnh, lỏng lắc)

lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh.............. 44

3.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô

tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ....................................................... 46

3.5. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ TIỀN CHẤT SINH TỔNG HỢP

POLYAMINE LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO

XỐP SÂM NGỌC LINH ................................................................................. 49

3.5.1. Ảnh hưởng của Arginine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo

xốp sâm Ngọc Linh ............................................................................... 49

3.5.2. Ảnh hưởng của Ornithine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo

xốp sâm Ngọc Linh ............................................................................... 50

3.6. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THUỘC NHÓM

POLYAMINE LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO

XỐP SÂM NGỌC LINH ................................................................................. 52

3.6.1. Ảnh hưởng của Putrescine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô

sẹo xốp sâm Ngọc Linh ......................................................................... 52

3.6.2. Ảnh hưởng của Spermidine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô

sẹo xốp sâm Ngọc Linh ......................................................................... 55

3.6.3 Ảnh hưởng của Spermine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo

xốp sâm Ngọc Linh ............................................................................... 57

3.7. PHÂN TÍCH POLYAMINE NỘI SINH ........................................................... 60

3.8. GIẢI PHẪU CÁC DẠNG HÌNH THÁI PHÔI KHÁC NHAU CỦA SÂM

NGỌC LINH ...................................................................................................... 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN ............................................................................................................... 65

KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 66

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

½MS : Môi trường MS với thành phần khoáng đa lượng giảm ½, vi lượng giữ

nguyên

½SH : Môi trường SH với thành phần khoáng đa lượng giảm ½, vi lượng giữ

nguyên

2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

ABA : Absisic acid

ACC : 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid

ACD : Arginine decarboxylase

Arg : Arginine

ATP : Adenosine-5’-triphosphate

BAP : 6-benzylaminopurine

: Casein CH

: Các cụm phát triển phôi (Embryogenic cluster) EC

G- : Ginsenoside

: Gibberellic acid GA3

G-Rb1 : Ginsenoside-Rb1

G-Rg1 : Ginsenoside-Rg1

IAA : Indole-3-acetic acid

IBA : Indole-3-butyric acid

Kin : Kinetin

LDC : Udecarboxylase

MR2 : Majonoside-R2

MS : Môi trường Murashige và Skoog, 1962

MS½ : Môi trường MS với thành phần khoáng đa lượng và vi lượng giảm ½

NAA : Acid -naphtaleneacetic

ODC : Ornithine decarboxylase

: Ornithine Orn

: Polyamine PA

PEM : Cụm tiền phôi (Pre-embryo mass)

: Gene pickle (Một dạng đột biến gene ở cây Arabidopsis) pkl

: Putrescine Put

SAM : S-adenosylmethionine

SERK : Somatic embryogenesis receptor-like kinase

SH : Môi trường Schenk and Hildebrandt, 1972

SH½ : Môi trường SH với thành phần khoáng đa lượng và vi lượng giảm ½

Spd : Spermidine

Spm : Spermine

TDZ : Thidiazuron

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1. Khả năng hình thành mô sẹo xốp từ các nguồn mẫu khác nhau

của sâm Ngọc Linh ............................................................................. 36

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên khả năng hình thành mô

sẹo xốp từ lá sâm Ngọc Linh ........................................................... 39

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D (0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,5; 2

mg/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA và 0,2 mg/l Kin lên sự hình

thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ............................. 42

Bảng 3.4.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự hình thành phôi vô

tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh .................................................... 45

Bảng 3.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô

tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ................................................... 47

Bảng 3.5.1. Ảnh hưởng của Arg lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo

xốp sâm Ngọc Linh ............................................................................. 49

Bảng 3.5.2. Ảnh hưởng của Orn lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo

xốp sâm Ngọc Linh ............................................................................. 51

Bảng 3.6.1. Ảnh hưởng của Put lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp

sâm Ngọc Linh ....................................................................................... 53

Bảng 3.6.2. Ảnh hưởng của Spd lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp

sâm Ngọc Linh .................................................................................... 56

Bảng 3.6.3. Ảnh hưởng của Spm lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo

xốp sâm Ngọc Linh ................................................................................... 57

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1. Các dạng phát sinh phôi ở thực vật ....................................................... 3

Hình 1.2. Mô hình giả thuyết các sự kiện xảy ra trong quá trình phát sinh

phôi vô tính ............................................................................................ 7

Hình 1.3. Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển của phôi .................... 9

Hình 1.4. Trao đổi chất PA và tương tác với các con đường trao đổi chất

khác ..................................................................................................... 19

Hình 1.5. Cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) .................. 25

Hình 3.1. Ảnh hưởng của nguồn mẫu lên khả năng hình thành mô sẹo xốp

sâm Ngọc Linh .................................................................................... 37

Hình 3.2. Ảnh hưởng của các môi trường khoáng lên khả năng hình thành

mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ................................................................. 41

Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D lên sự hình thành phôi vô tính từ

mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ................................................................. 44

Hình 3.4.1. Mô sẹo và phôi trong điều kiện nuôi cấy lỏng lắc, lỏng tĩnh và

đặc. ...................................................................................................... 46

Hình 3.4.2. Mô sẹo trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày và tối hoàn toàn ....... 48

Hình 3.5.1. Ảnh hưởng của Arg lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp

sâm Ngọc Linh .................................................................................... 50

Hình 3.5.2. Ảnh hưởng của Orn lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp

sâm Ngọc Linh .................................................................................... 52

Hình 3.6.1. Ảnh hưởng của Put lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp

sâm Ngọc Linh .................................................................................... 54

Hình 3.6.2. Ảnh hưởng của Spd lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp

sâm Ngọc Linh .................................................................................... 56

Hình 3.6.3. Ảnh hưởng của Spm lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo

xốp sâm Ngọc Linh ............................................................................. 58

Hình 3.6.4. Một số cây con tái sinh từ mô sẹo xốp trên môi trường ĐC, Spd,

Put và Spm. ......................................................................................... 58

Biểu đồ 3.1. Sự thay đổi hàm lượng PA ở các giai đoạn phát triển cụm mô

phôi ở sâm Ngọc Linh trên môi trường ĐC và môi trường bổ

sung Spd .............................................................................................. 61

Hình 3.7. Sự thay đổi hình thái và cấu trúc trong quá trình phát sinh phôi

vô tính sâm Ngọc Linh ........................................................................ 64

MỞ ĐẦU

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là cây dược liệu đặc hữu

quý hiếm của Việt Nam và thế giới, được biết đến bởi hàm lượng cao các hợp chất

Saponin triterpenoic tiêu biểu như MR2, G-Rb1 và G-Rg1 [Trần Công Luận, 2003].

Không chỉ có dược tính đặc trưng của chi nhân sâm mà loài cây này còn có tác dụng

điển hình như chống stress, chống trầm cảm, tác dụng chống oxi hóa in vitro và in

vivo… Hiện nay, do nhu cầu cao của thị trường kết hợp với việc khai thác ồ ạt, thiếu

khoa học, trồng, nhân giống hạn chế và bảo tồn lỏng lẻo, đã và đang đẩy sâm Ngọc

Linh đến bờ vực của sự tuyệt chủng. Do đó, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã

được áp dụng cho loài cây này [Nguyễn Ngọc Dung, 1995; Dương Tấn Nhựt et al.,

2010]. Đây là phương pháp hiệu quả trong việc nhân nhanh số lượng cây sâm Ngọc

Linh trong thời gian ngắn mà vẫn đảm bảo chất lượng cây giống. Trong đó, nhân

giống vô tính thông qua con đường phát sinh phôi vô tính đã mang lại nhiều ứng

dụng thực tiễn, có tính thương mại cao bởi tạo ra lượng lớn cây con sâm Ngọc Linh

trong thời gian ngắn, cây con đồng đều về di truyền và có tỉ lệ sống sót cao ngoài

vườn ươm.

Tương tự phôi hữu tính, phôi vô tính gồm có mầm chóp rễ và chồi đỉnh nên có

thể nảy mầm thành một cây hoàn chỉnh. Tuy nhiên, sự hình thành phôi vô tính là

một quá trình phức tạp, chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nguồn mẫu, nhiệt độ,

ánh sáng, độ pH … Trong đó, các chất điều hòa sinh trưởng như 2,4-D, NAA,

Kinetin, Proline…. đóng vai trò rất quan trọng. Gần đây, các Polyamine gồm

Putrescine, Spermidine và Spermine cùng các tiền chất của chúng (Arginine và

Ornithine) được chú ý như là một lớp chất điều hòa sinh trưởng mới có các dụng

trong nhiều chu trình của cây như sự chín quả, già lá, sinh trưởng và phát triển hoa;

đặc biệt, có sự liên quan mật thiết với quá trình phát sinh phôi vô tính. Ở nồng độ

cao, Polyamine có tác dụng giúp cho tế bào lớn lên và phân chia. Trong giai đoạn

cảm ứng tạo phôi, Polyamine thúc đẩy các tế bào vùng mô phân sinh phân chia

nhanh chóng và biệt hóa tạo phôi. Nồng độ Polyamine giảm có thể gia tăng các tế

bào mô sẹo nhưng sẽ làm giảm sự hình thành phôi. Polyamine nâng cao hiệu suất

phát sinh phôi ở nhiều loại cây đã được nghiên cứu như cây cà rốt, Pinus

gerardiana Wall, Momordica charatia L., cây ổi [Hadrami và D’Auzac, 1992;

Ravindra et al., 2007; Ananya et al., 2009; Nasim, 2013].

Mặc dù, việc sử dụng Polyamine kết hợp với các chất điều hòa sinh trưởng

khác mang lại hiệu quả trong biệt hóa tế bào hình thành phôi [Rajam, 1997] cũng

như các giai đoạn hình thành cây hoàn chỉnh ở thực vật đã được chứng minh

[Kevers et al., 2000] song cơ chế tác động vẫn chưa được hiểu một cách rõ ràng.

Trong nỗ lực bảo tồn và nhân giống cây sâm Ngọc Linh, chúng tôi đã tiến hành

“Nghiên cứu vai trò của một số Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây

sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro”. Ảnh

hưởng nguồn mẫu, điều kiện khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, điều kiện nuôi cấy

và điều kiện chiếu sáng được đánh giá trước khi nghiên cứu vai trò của các

Polyamine cũng như tiền chất của chúng lên sự hình thành và tần suất phát sinh

phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh in vitro. Đồng thời, nồng độ Polyamine nội sinh

cũng được tiến thành phân tích để những kết luận trở nên thuyết phục, có giá trị hơn

và mở đầu cho những nghiên cứu tiếp theo về Polyamine trên loài cây quý này.

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. SƠ LƯỢC VỀ PHÔI VÔ TÍNH

Phôi vô tính chứa chất dinh dưỡng tương tự phôi hữu tính, có mầm chóp rễ và

chồi đỉnh nên có thể nảy mầm trực tiếp thành cây không qua giai đoạn phát sinh

chồi, rễ. Các mô và tế bào sinh dưỡng nuôi cấy in vitro tạo ra phôi vô tính trực tiếp;

hoặc gián tiếp thông qua một quá trình tạo mô sẹo. Tế bào mô sẹo có thể phân chia

theo cấp số nhân, nhờ vậy chỉ sau một thời gian ngắn nó có thể tạo được một số

lượng phôi đáng kể. Ưu điểm nổi bật của phôi vô tính là có thể bảo quản được lâu

dài và cho nảy mầm vào thời vụ thích hợp. Hiện nay, trên 200 loài cây trồng đã

được nhân giống thành công bằng công nghệ phôi vô tính. Công nghệ tạo phôi vô

tính hiện nay vẫn đang là công nghệ tiên tiến trên thế giới [Nguyễn Văn Uyển,

2006; Dương Tấn Nhựt, 2007].

1.1.1. Quá trình phát sinh phôi ở thực vật

Hình 1.1. Các dạng phát sinh phôi ở thực vật [Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007]

Ở các loài thực vật bậc cao, phôi và nội nhũ là kết quả của sự thụ phấn kép (sự

thụ phấn của tế bào noãn đồng thời với sự thụ phấn của tế bào trung tâm) được bao

bọc trong hạt. Sự phát sinh phôi hợp tử ở thực vật là một quá trình phức tạp ẩn sâu

trong mô mẹ. Ngoài những dữ liệu mô học thu thập được trên nhiều loài thực vật thì

việc phân tích các dạng đột biến ở cây Arabidopsis cũng đã góp phần làm sáng tỏ

một chuỗi các sự kiện xảy ra trong quá trình phát triển phôi ở thực vật. Ngày nay, vi

nhân giống và thụ phấn in vitro, kết hợp với các biện pháp phân tử và gene, đã làm

rõ ràng thêm một số chi tiết và đồng thời cũng có những đóng góp thiết thực vào

vốn hiểu biết của chúng ta về quá trình phát sinh phôi sinh dưỡng ở thực vật. Tuy

nhiên, ở các loài thực vật bậc cao, việc không thể phát sinh phôi hợp tử ở một số

loài được cho là có liên quan đến sự sinh sản vô phối (apomixis-sự sinh sản không

thông qua quá trình thụ tinh) (gồm hơn 400 loài cây thuộc ít nhất 40 họ khác nhau).

Trong quá trình sinh sản vô phối, sự hình thành hạt vô tính bắt đầu từ mô mẹ của

noãn, không trải qua quá trình giảm phân và thụ phấn, dẫn đến sự phát triển của

phôi. Hiện tượng sinh sản vô phối đã bộc lộ hai khía cạnh quan trọng của quá trình

phát sinh phôi ở thực vật: (1) Các điểm nhấn kích hoạt sự thụ phấn có thể được thay

thế bằng những cơ chế nội sinh; (2) Ở một số loài thực vật bậc cao, ngoài tế bào

noãn được thụ phấn thì các loại tế bào khác cũng có thể duy trì và giữ lại khả năng

phát triển phôi. Mặc dù quá trình sinh sản vô phối chỉ hạn chế ở các tế bào phát sinh

đỉnh hoặc noãn, nhưng cũng có một số lượng lớn tế bào sinh dưỡng thực vật có thể

trải qua quá trình phát triển phôi dưới những điều kiện thích hợp. Ví dụ, sự hình

thành phôi (có vai trò như lá mầm sinh dưỡng) cũng có thể xảy ra trên mép lá của

cây sống đời Kalanchoe, cây Malaxis paludosa [Taylor, 1967]. Có nhiều thí nghiệm

phát sinh phôi được bắt đầu từ nuôi cấy in vitro các tế bào sinh dưỡng hoặc tế bào

giao tử (ví dụ: tiểu bào tử). Các dạng thức phát sinh phôi ở thực vật được tóm lược

trên Hình 1.1.

1.1.2. Khả năng phát sinh phôi vô tính của các tế bào sinh dưỡng

Theo Moltrasio và cộng sự (2004) thì khả năng phát sinh phôi vô tính được

biểu hiện trước hết là ở mức kiểu gene và điều này có thể được chứng minh dễ dàng

bằng cách chuyển khả năng phát sinh phôi từ kiểu gene có khả năng phát sinh phôi

sang kiểu gene ngăn cản sự phát sinh phôi thông qua quá trình lai giống hữu tính.

Mặc dù các điều kiện kích thích sự phát sinh phôi đã được thiết lập cho nhiều loài,

nhưng vẫn còn một số lượng lớn các loài chưa thể tạo phôi vô tính. Thậm chí ngay

trong cùng một loài, có kiểu gene dễ tạo phôi nhưng cũng có kiểu gene ngăn cản sự

tạo phôi. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, sự ngăn cản tạo phôi có thể được giải

quyết bằng cách tối ưu hóa các điều kiện sinh trưởng của cây hoặc bằng cách chọn

lựa mẫu cấy thích hợp. Vì vậy, việc xác định các đặc tính di truyền có thể chỉ được

sử dụng để xác định vị trí và thời điểm biểu hiện khả năng phát sinh phôi. Do đó

khả năng phát sinh phôi chủ yếu được xác định thông qua chương trình phát triển

của thực vật cũng như những dấu hiệu của môi trường.

Phôi vô tính có thể phát triển trên tất cả các cơ quan của cây cà rốt hoặc cỏ linh

lăng mà có mang những kiểu gene nhất định quy định sự phát sinh phôi; từ đó, cho

thấy biên độ biểu hiện rộng của khả năng phát sinh phôi. Tuy nhiên, ở phần lớn các

loài thực vật, khả năng phát sinh phôi bị hạn chế ở những mô nhất định của kiểu

gene nói trên. Những thí nghiệm nuôi cấy mô cho thấy giữa các cơ quan khác nhau

của cây tồn tại một gradient phản ứng phát sinh phôi. Các mô có nguồn gốc từ phôi

thì có khả năng phát sinh phôi cao nhất và khả năng này giảm dần ở cọng dưới lá

mầm, cuống lá, lá và rễ [Neumann, 2000]. Nhưng điều thú vị là vẫn có thể được

phục hồi khả năng phát sinh phôi vô tính bằng con đường tạo mô sẹo trung gian từ

các tế bào sinh dưỡng đã mất đi tiềm năng này.

Rõ ràng, khả năng phát sinh phôi của tế bào thực vật không ngừng giảm trong

suốt quá trình phát triển cá thể và phụ thuộc vào loài. Ở thực vật một lá mầm, bao

gồm hầu hết các loài ngũ cốc quan trọng, khả năng phát sinh phôi hầu như chỉ giới

hạn ở các tế bào có nguồn gốc từ phôi hoặc mô phân sinh bao gồm phôi non, hạt,

gốc lá của Graminae, đỉnh chồi của Orchidaceae, vảy củ và chồi bên của Liliaceae.

Trong nuôi cấy in vitro, khả năng phát sinh phôi của những tế bào mô phân sinh này

có thể được duy trì nếu mẫu cấy được nuôi trên môi trường có bổ sung 2,4-D, tiếp

đó cho tạo mô sẹo. Cấy chuyền những tế bào mô sẹo có khả năng phát sinh phôi này

sang môi trường không có chất kích thích sinh trưởng hoặc môi trường có bổ sung

auxin với nồng độ thấp thì có thể đạt được một tỉ lệ phát sinh phôi vô tính cao.

Ngược với các tế bào mô phân sinh, các tế bào sinh dưỡng của cây một lá mầm

được biệt hóa sớm hơn và nhanh hơn, điều này làm mất khả năng phân chia và phát

sinh hình thái của chúng. Ở mặt này, cần lưu ý là sự điều hòa quá trình phát triển

chuyển tiếp từ giai đoạn còn non đến giai đoạn trưởng thành có thể khác nhau giữa

cây một lá mầm và hai lá mầm. Mặc dù lý do trực tiếp của việc sớm mất đi tính toàn

năng ở thực vật một lá mầm vẫn chưa được biết đến, nhưng người ta đã có thể liên

hệ giữa sự điều hòa nghiêm ngặt của quá trình tổng hợp này với quá trình chuyển

hóa của các chất điều hoà nội sinh, chẳng hạn như auxin.

Nhiều thí nghiệm đã được thực hiện để so sánh kiểu gene điều khiển sự phát

sinh phôi và kiểu gene ngăn cản sự phát sinh phôi nhằm chỉ ra những khác biệt

chính giữa chúng [Fehér et al., 2003]. Ở cỏ linh lăng (Medicago sativa), những kiểu

gene có quan hệ mật thiết được chọn lọc dựa trên khả năng phát sinh phôi của

chúng; các phản ứng của chúng với auxin được so sánh và những đặc điểm khác

nhau được ghi nhận; trong đó, những gene đáp ứng với auxin được kích thích hoặc

bị ức chế ở nồng độ auxin rất thấp để chống lại những kiểu gene ngăn cản sự phát

sinh phôi [Börge et al., 1990]. Ngoài ra, auxin còn có tác dụng ức chế sự ra rễ của

những mẫu cắt chồi sinh trưởng in vitro ở nồng độ thấp hơn nhiều [Börge et al.,

1990]. Mô sẹo của các kiểu gene không phát sinh phôi vẫn tiếp tục sinh trưởng

trong môi trường bổ sung 2,4-D có nồng độ tương đương với nồng độ ức chế sự

phân bào của những kiểu gene điều khiển sự phát sinh phôi. Các quan sát trên chỉ ra

những khác biệt đáng kể về tính nhạy cảm với auxin của hai kiểu gene này. Vai trò

quan trọng của các hormone biến dưỡng nội sinh (bị ảnh hưởng bởi tính di truyền,

các dấu hiệu sinh lý và môi trường) trong giai đoạn kích thích phát sinh phôi sinh

dưỡng đã được thừa nhận.

Những tế bào có khả năng phát sinh phôi có đặc điểm là nhân nằm ở vị trí

trung tâm, có những ống siêu nhỏ nổi bật ở gần nhân và những sợi nhỏ actin [Šamaj

et al., 2003]. Verdeil và cộng sự (2001), đã mô tả các tế bào phát sinh phôi ở cây

dừa có các đặc điểm rất rõ ràng: lõm sâu vào vỏ nhân, các thể lưới dictyosomes và

bộ máy golgi nhân lên có quan hệ trực tiếp với sự dày lên các vách tế bào. Ngoài ra,

chúng còn có một cấu trúc thành tế bào đặc biệt. Các dạng tế bào này vừa có nguồn

gốc từ các mô phân sinh (hoặc mô phát sinh phôi) vừa có thể được tạo ra từ những

tế bào có khoảng không bào lớn trong một số điều kiện thích hợp; chẳng hạn như

sau khi xử lý với 2,4-D. Tuy nhiên, một số loại hormone (ABA, cytokinin) hoặc

stress khác cũng có thể kích thích sự hình thành những kiểu tế bào có khả năng phát

sinh phôi.

Hình 1.2. Mô hình giả thuyết các sự kiện xảy ra trong quá trình phát sinh phôi vô tính [Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007]

Hệ thống nuôi cấy tế bào trần của cỏ linh lăng cho phép tiến hành những

nghiên cứu chi tiết ở mức độ tế bào đơn và cả ở mức độ quần thể tế bào. Kết quả

cho thấy sự phát triển của những tế bào này phụ thuộc vào nồng độ 2,4-D: môi

trường có bổ sung 1 µM 2,4-D cho phép hình thành những tế bào có khoảng không

bào lớn (không có khả năng phát sinh phôi), trong khi môi trường có bổ sung 2,4-D

với nồng độ cao gấp 10 lần cho phép hình thành những tế bào nhỏ và dày đặc tế bào

chất (có khả năng phát sinh phôi) [Pasternak et al., 2002]. Ngoài ra, hệ thống này

còn được sử dụng để tiến hành so sánh giữa các kiểu gene có hoặc không có khả

năng phát sinh phôi [Bögre et al., 1990]. Kết quả so sánh giữa những tế bào có khả

năng phát sinh phôi và những tế bào không có khả năng phát sinh phôi cho thấy cả

2 kiểu gene trên không những thể hiện những khác biệt về đặc điểm hình thái mà

còn thể hiện những biến đổi trong quá trình sinh lý.

Gene đặc trưng nhất liên quan đến tiềm năng phát sinh phôi là gene mã hóa

cho enzyme SERK1, được Schmidt và cộng sự (1997) phát hiện lần đầu tiên ở cây

cà rốt. Tác giả này dụng promoter SERK để nối vào đoạn gene mã hóa cho enzyme

luciferase và tiến hành theo dõi tế bào bằng video, kết quả cho thấy tế bào đơn mà

có sự biểu hiện của SERK thì thực sự có thể phát triển thành phôi sinh dưỡng.

Ngoài ra, sự biểu hiện lệch vị trí gene AtSERK có thể làm cho sự hình thành phôi

sinh dưỡng diễn ra một cách dễ dàng hơn [Hecht et al., 2001]. Do đó, sự biểu hiện

của gene SERK được sử dụng như là một nhân tố đánh dấu khả năng sinh phôi. Ở

thực vật, AtSERK được biểu hiện lần đầu tiên trong quá trình phát sinh đại bào tử và

sau đó là trong các đại bào tử có chức năng, trong tất cả các tế bào của túi phôi cho

đến khi thụ phấn và trong túi phôi cho tới giai đoạn hình tim. Sau giai đoạn hình tim

này, sự biểu hiện của gene không còn được tìm thấy ở bất kì bộ phận nào của hạt

đang phát triển. Tuy nhiên, gene này có sự biểu hiện thấp ở những mô mạch trưởng

thành. Sự biểu hiện gene AtSERK1 cũng được quan sát ở đỉnh chồi, mô phân sinh

và lá mầm của hạt cây Arabidopsis nuôi cấy trong môi trường có bổ sung auxin

trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy mô sẹo phát sinh phôi [Hecht et al.,

2001]. Có ý kiến cho rằng protein SERK đơn thuần chỉ là một marker phát sinh

hình thái tổng quát chứ không hẳn là một marker phát sinh phôi.

1.1.3. Sự cảm ứng phát sinh phôi vô tính

Có nhiều hệ thống nuôi cấy mô sử dụng 2,4-D như là một chất cảm ứng có

hiệu quả trong quá trình phát sinh phôi vô tính. Hiện nay, thừa nhận quan điểm rằng

việc xác định trạng thái của tế bào xảy ra trong môi trường có 2,4-D, nhưng trong

cùng thời điểm đó thì sự phát triển lại bị ức chế. Việc 2,4-D chỉ là một điểm nút

chuyển đổi trạng thái của tế bào thì đã được nhấn mạnh bằng các thí nghiệm sử

dụng một hệ thống đặc biệt (nuôi cấy huyền phù các vi mô sẹo) nuôi cấy các tế bào

Medicago trong môi trường có bổ sung một loại auxin tổng hợp khác là NAA

[Dudits et al., 1991]. Nếu cấy chuyền những tế bào này sang môi trường không có

chất điều hòa sinh trưởng thì chúng sẽ tạo rễ với tần số cao. Nếu những tế bào này

được xử lý 2,4-D ở nồng độ cao (100 M) trong một khoảng thời gian ngắn

(khoảng vài phút) rồi cấy chuyền sang môi trường không có chất điều hòa tăng

trưởng thì chúng sẽ phát triển thành phôi vô tính. Tuy nhiên, phải 2-3 tuần sau khi

xử lý thì mới có thể quan sát được những khối phôi đầu tiên trên bề mặt của mô sẹo.

Dựa trên cơ sở những thí nghiệm này, hiệu quả phát sinh phôi cao đạt được khi nuôi

cấy các mảnh cấy lá mầm cây cà rốt trên môi trường bổ sung 450 M 2,4-D trong

thời gian 2 giờ [Kitamiya et al., 2000].

Thực ra, những nghiên cứu này đã chỉ ra rằng 2,4-D rất cần thiết để khởi sự

chương trình phát sinh phôi. Việc cấy chuyền mẫu cấy sang môi trường không có

2,4-D có vai trò quan trọng trong việc thiết lập tính phân cực của tế bào, đây được

xem là một trong những sự kiện đầu tiên của quá trình phát triển phôi [Fehér et al.,

2003].

1.1.4. Trạng thái của các tế bào phát sinh phôi vô tính

Hình 1.3. Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển của phôi. [Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007]

Sự khởi đầu quá trình phát triển phát sinh phôi ở các tế bào đã biệt hóa đòi hỏi

một quá trình tái chương trình hóa tế bào hoàn chỉnh. Quá trình này đi kèm với

những thay đổi hoàn toàn về mặt hình thái và sinh lý; trong đó, việc tái chương trình

hóa kiểu biểu hiện tổng thể của các gene là hết sức quan trọng. Trong những năm

gần đây, việc kiểm soát nghiêm ngặt sự cải biến các nhiễm sắc thể phản ứng lại các

tín hiệu môi trường và tín hiệu phát triển nhằm xác định chính xác vị trí và thời

điểm biểu hiện của các gene này đã được chấp nhận rộng rãi [Li et al., 2002]. Mức

độ tổ chức cao của nhiễm sắc thể sẽ tạo ra tính ổn định về kiểu biểu hiện của những

gene xác định vùng nào của bộ gene là im lặng hay hoạt động trong tế bào hoặc

trong giai đoạn phát triển đang khảo sát. Các bằng chứng thực nghiệm đã chứng tỏ

được tầm quan trọng của cấu trúc nhiễm sắc thể trong việc điều hòa sự chuyển vị

sinh phôi. Ví dụ, việc bất hoạt một số gene trong bộ nhiễm sắc thể có vai trò quan

trọng trong việc quyết định sự sinh trưởng của phôi và nội nhũ của Arabidopsis.

Người ta đã xác định được những gene đột biến mã hóa cho những protein tương tự

như những protein có chức năng bất hoạt nhiễm sắc thể (nhóm Polycomb trong suốt

quá trình phát triển của ruồi giấm) ở Arabidopsis. Kết quả của những đột biến này

là sự hình thành hạt hoặc nội nhũ mà không lệ thuộc vào quá trình thụ phấn. Dạng

đột biến medea gây ra sự thiếu hụt protein trong cùng một con đường điều hòa. Các

kết quả nghiên cứu cho thấy chương trình phát sinh phôi bị ức chế bởi các gene im

lặng trong nhiễm sắc thể và sau đó được kích hoạt nhằm đáp ứng với sự thụ phấn.

Một dạng đột biến nữa ở Arabidopsis, pickle (pkl), có kiểu hình được xác định

dựa trên sự biểu hiện của các marker phôi chuyên biệt trong giai đoạn hậu phát sinh

phôi và quá trình tái sinh tự phát của các phôi vô tính ở rễ. Sản phẩm của gene pkl

được mô tả như là một nhân tố tái tổ chức nhiễm sắc thể mà có thể ức chế sự biểu

hiện của những gene liên quan đến sự phát sinh phôi cũng như điều hòa sự chuyển

vị phát triển từ trạng thái phát sinh phôi sang trạng thái sinh dưỡng. Ngoài việc tổ

chức nhiễm sắc thể, sự điều hòa trực tiếp của các gene liên quan đến các nhân tố

phiên mã đặc hiệu. Cho tới nay, nhiều nhân tố phiên mã (leafy cotyledon 1 và 2,

wuschell, baby woom) đã được xác định là có liên quan đến sự phát sinh phôi hợp tử

và gây ra sự lệch vị trí trong quá trình hình thành phôi nếu chúng được biểu hiện

trong mô sinh dưỡng. Mối liên hệ giữa sự tái tổ chức nhiễm sắc thể và những nhân

tố phiên mã này đã được chứng minh bằng cách làm giảm tác dụng ức chế biểu hiện

của lec1 trong đột biến pickle, và điều này đã dẫn tới sự phát triển phôi ở rễ. Pickle

được nhận định là nhân tố ức chế tế bào phát sinh phôi trong tất cả các mô sinh

dưỡng, nhưng người ta cũng đã chứng minh được rằng có thể chọn lọc được những

chức năng không ức chế sự phát sinh phôi trong những đột biến pickle.

Dựa vào những bằng chứng trên, chúng ta có thể đưa ra giả thiết rằng trong

suốt quá trình cảm ứng phát sinh phôi vô tính, sự tái tổ chức của nhiễm sắc thể đã

làm giảm chương trình phát sinh phôi, mặt khác bị ức chế bởi các cơ chế bất hoạt

nhiễm sắc thể trong các tế bào sinh dưỡng thực vật. Những protein có chứa vùng

nhiễm sắc thể có cấu trúc tương tự Polycomb đã được tìm thấy trong quá trình phát

sinh phôi hợp tử và phôi vô tính của cà rốt. Ngoài ra, sự biểu hiện của lec1 trong

suốt quá trình phát sinh phôi vô tính đã được chứng minh ở cà rốt và cỏ linh lăng

[Yazawa et al., 2004]. Cụ thể, với cà rốt, gene c-lec1 xuất hiện trong các mẫu cấy

phôi và gene này biểu hiện rõ chỉ 1 ngày sau khi cấy chuyền sang môi trường không

có 2,4-D ; trong khi đó, ở cỏ linh lăng, khi gây shock mẫu cấy bằng 2,4-D trong 1

giờ sau nhiều tuần nuôi cấy trong môi trường không có chất điều hòa tăng trưởng,

sự biểu hiện của ms-lec1 chỉ gia tăng vào giai đoạn biệt hóa phôi (3 tuần sau khi

cảm ứng) [Fehér et al., 2003]. Nghiên cứu này đã củng cố cho giả thuyết rằng ở hệ

thống nuôi cấy phát sinh phôi cây cà rốt thì quá trình phát sinh phôi diễn ra trước

khi mẫu cấy được cấy chuyền sang môi trường không có 2,4-D.

1.1.5. Sự phát sinh phôi vô tính

Sự phát sinh phôi vô tính được định nghĩa là một quá trình mà trong đó cấu

trúc lưỡng cực giống phôi hữu tính phát triển từ một tế bào sinh dưỡng và không có

liên kết mao mạch với tế bào gốc ban đầu. Sự phát sinh phôi vô tính xảy ra thông

qua một số giai đoạn tương tự như phôi hữu tính. Phôi vô tính có thể biệt hóa trực

tiếp từ mẫu cấy không cần đi qua giai đoạn mô sẹo hoặc gián tiếp thông qua giai

đoạn tạo mô sẹo trung gian. Mẫu cấy trong phát sinh phôi trực tiếp thường là các vi

bào tử, noãn bào, phôi hữu tính hoặc phôi vô tính và cây con.

Khác biệt giữa phát sinh phôi trực tiếp và gián tiếp vẫn chưa được hiểu rõ.

Theo những giả thuyết trước đây, phát sinh trực tiếp xảy ra từ các tế bào có nguồn

gốc từ phôi. Ngược lại, phát sinh gián tiếp lại xảy ra ở các tế bào chưa biệt hóa và

đầu tiên sẽ tạo thành các mô sẹo không biệt hóa. Tuy nhiên, trong thực tế mô sẹo

được tạo thành có thể là những mô sẹo có khả năng phát sinh phôi (embryogenic

callus) hoặc không có khả năng phát sinh phôi (non-embryogenic callus). Thông

thường dễ phân biệt giữa embryogenic callus và non-embryogenic callus dựa vào

hình thái và màu sắc của chúng. Embryogenic callus bao gồm các cụm tiền phôi

(PEM). Hiện tại, người ta chưa biết liệu các PEM này có phải là phôi hay không, có

phải do chúng đi chệch con đường phát triển phôi và chỉ tăng sinh khi đáp ứng lại

sự hiện diện của các chất điều hòa sinh trưởng?

Phát sinh phôi vô tính là một quá trình gồm nhiều bước khởi đầu bằng PEM,

theo sau đó là sự hình thành phôi vô tính, phôi trưởng thành, phôi ở giai đoạn miên

trạng và cuối cùng là giai đoạn tái sinh cây. Tóm lại, các giai đoạn phát triển phôi

vô tính đều phải trải qua các giai đoạn như minh họa ở Hình 1.3. Để theo đúng con

đường này, một số các biện pháp lý hóa quan trọng phải được xử lý đúng thời điểm.

Mặc dù có những tiến bộ đáng kể trong việc tìm kiếm, khám phá các hướng xử lý

mới nhưng một số cách tiếp cận trong việc cải thiện khả năng trưởng thành của phôi

nhằm tăng hiệu quả phát triển phôi lại gây ra những ảnh hưởng xấu đến chất lượng

phôi, từ đó làm giảm khả năng nảy mầm và tăng trưởng ex vitro của thực vật từ phôi

vô tính. Do vậy, tăng trưởng ex vitro của thực vật chịu ảnh hưởng của toàn bộ quá

trình nuôi cấy và biện pháp xử lý trong giai đoạn in vitro.

Tóm lại, có thể tóm tắt sự tái sinh thực vật thông qua con đường phát sinh

phôi vô tính bao gồm năm giai đoạn:

 Nuôi cấy tạo phôi bằng cách chọn lựa mẫu cấy sơ cấp cấy vào môi trường bổ

sung chất điều hòa sinh trưởng, chủ yếu là auxin (đôi khi là cytokinin).

 Tăng sinh của quá trình nuôi cấy phôi trên môi trường rắn hoặc lỏng có bổ

sung các chất điều hòa sinh trưởng tương tự như trên.

 Giai đoạn trước khi trưởng thành của phôi trong môi trường không có chất

điều hòa sinh trưởng, để ngăn sự tăng sinh và kích thích sự tạo phôi và phát

triển sớm.

 Giai đoạn phôi trưởng thành bằng cách nuôi cấy phôi trong môi trường bổ

sung ABA và/hoặc giảm áp lực thẩm thấu.

 Sự phát triển của cây trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng.

1.1.6. Ứng dụng của quá trình tạo phôi vô tính

Quá trình hình thành phôi vô tính đã mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn quan

trọng và có tính chất thương mại rất lớn, đặc biệt là trong vi nhân giống in vitro.

Trên lý thuyết, từ một mẫu mô được nuôi cấy có thể sản xuất ra vô số tế bào phôi.

Tốc độ nhân giống từ phôi cao hơn nhiều so với nhân giống từ mô phân sinh. Ngoài

ra, số lượng lớn của phôi chính là một nguồn nguyên liệu đáng kể phục vụ cho

những ứng dụng thực tiễn quan trọng khác như sản xuất hạt nhân tạo, cải thiện chất

lượng cây trồng (là nguyên liệu cho chọn lọc tế bào, biến nạp gene, lai soma, tạo

thành những cây đa bội), bảo quản chất mầm, loại trừ virus, sản xuất các chất biến

dưỡng in vitro và sự thành lập khuẩn căn in vitro.

1.2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH

1.2.1. Chất điều hòa sinh trưởng

Nhằm khôi phục khả năng phát sinh phôi vô tính từ các tế bào đã suy giảm

hoặc mất đi khả năng này, các chất điều hòa sinh trưởng phải được sử dụng trong

hầu hết các hệ thống nuôi cấy phôi vô tính. Trong đó, 2,4-D là loại auxin tổng hợp

được sử dụng phổ biến nhất. Những auxin khác như IBA và picloram cũng được sử

dụng; thậm chí cả các auxin yếu như NAA và IAA cũng được dùng trong một vài

hệ thống nuôi cấy. Auxin được dùng cho cảm ứng hình thành tế bào phát triển phôi,

có lẽ do hoạt hóa phân hóa gene khởi đầu và cũng thúc đẩy tăng quần thể tế bào qua

phân bào liên tiếp; đồng thời ngăn cản sinh trưởng và biệt hóa tế bào thành các

phôi. Trong trường hợp mẫu cấy có chứa các tế bào phát triển phôi thì môi trường

nuôi cấy có thể không cần đến auxin.

Ngoài auxin, các cytokinin cũng được dùng cho cảm ứng phát sinh ở các loài

thực vật hai lá mầm. Loại cytokinin được sử dụng nhiều trong môi trường nuôi cấy

là BAP, nhưng các cytokinin khác như Kin, zeatin và TDZ cũng cho kết quả tốt tùy

thuộc vào loại thực vật. Trong nuôi cấy phôi, nồng độ của các chất điều hòa sinh

trưởng là rất quan trọng đối với phản ứng sinh trưởng tối ưu của mẫu cấy. Khi nồng

độ quá thấp sẽ không kích thích sinh trưởng, ngược lại hàm lượng quá cao có thể

gây độc cho mẫu…

Ví dụ điển hình là về sự phát triển của phôi vô tính cà rốt trong nuôi cấy trải

qua một quá trình gồm hai giai đoạn, mỗi giai đoạn cần có môi trường riêng. Các

mô sẹo được nuôi cấy khởi đầu và nhân sinh khối trên môi trường giàu auxin và

thường được sử dụng 2,4-D ở nồng độ 0,5-1 mg/l. Trên môi trường này, sự phân

hóa mô sẹo xảy ra tại các nhóm tế bào phân sinh được gọi là “các cụm phát triển

phôi” (EC). Nếu các EC được chuyển sang môi trường có nồng độ auxin rất thấp

(0,01-0,1 mg/l) hoặc không có auxin, chúng sẽ phát triển thành phôi trưởng thành.

Sự có mặt của auxin trong môi trường tăng sinh là cần thiết cho mẫu có thể phát

triển thành phôi khi chuyển sang môi trường phù hợp. Các môi trường tăng sinh có

thể coi là môi trường cảm ứng đối với sự hình thành phôi vô tính. Những mẫu duy

trì liên tục trong môi trường không có auxin sẽ không hình thành phôi.

Ở cây cà phê Coffea arabica, các phôi vô tính chỉ phát triển khi mô sẹo hình

thành trên môi trường chứa 2,4-D được chuyển sang môi trường không có loại

hormone này. Đối với một số loài thực vật, những auxin khác lại sử dụng hiệu quả

hơn 2,4-D, như trong trường hợp của cây bí ngô, NAA và IBA được dùng cho phát

sinh phôi. Trong nuôi cấy phôi tâm cây Vitus, sự hình thành phôi xảy ra khi có mặt

của NAA và BAP [Mullin và Schlegel, 1976]. Các mô sẹo của phôi tâm cây Citrus

sinensis thuộc họ Cam chanh yêu cầu có IAA và Kin cho sinh trưởng và biệt hóa

phôi. Sự cấy chuyền lặp lại của mô sẹo đã làm giảm dần khả năng phát sinh phôi và

sau khoảng hai năm các dòng mô có biểu hiện tự dưỡng hormone. Ở những dòng

mô này, sự có mặt của IAA nồng độ thấp (0,001 mg/l) trong môi trường đã ức chế

sự hình thành phôi. Khi xử lý mô với những hóa chất ức chế sinh tổng hợp auxin

như 2-hydroxy-5-nitro-benzyl bromide hoặc 7-aza-indole và chiếu xạ, sự phân hóa

phôi đã có sự cải thiện rõ rệt. Như vậy nồng độ auxin nội sinh cao đã làm giảm khả

năng phát sinh phôi của mô sẹo Citrus.

Các chất điều hòa sinh trưởng khác như GA3, ABA ở nồng độ thấp cũng có tác

dụng kích thích trong phát sinh phôi của cà rốt, Citrus medica, Phaseolus…, GA3

có thể thúc đẩy sự phát triển phôi đến giai đoạn trưởng thành và hình thành cây con.

1.2.2. Nguồn nitơ

Nitơ (N) là thành phần của acid nucleic và thành phần chủ yếu của chất

nguyên sinh đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất nên ảnh hưởng trực tiếp tới

-. Tỉ lệ và tổng nồng độ của hai ion này trong môi trường thay

sự trao đổi chất ở cây. Dạng sử dụng của N trong môi trường nuôi cấy là amonium

+ và nitrat NO3

NH4

đổi tùy loại cây và trạng thái phát triển của mô thực vật [Nguyễn Đức Lượng, Lê

+.

Thị Thủy Tiên, 2002]. Thiếu một trong hai ion trên, có thể khiến thực vật phát triển

-/NH4

+ trong môi trường nuôi cấy

bất thường. Do đó, trong môi trường nuôi cấy, phải có sự cân bằng giữa NO3

- được trung hòa bởi NH4

+

Thông thường, hàm lượng NO3

-/NH4

+ khiến rễ bên hình thành

và hàm lượng N trong môi trường nuôi cấy khoảng từ 25-40 mM và tỉ lệ NO3

+ đều

từ 50:50 tới 85:15 [Grimes và Hodges, 1990]. Thiếu NH4

-/NH4

nhiều hơn rễ chính ở cây Carica papaya [Drew, 1987]. Cả hai ion NO3

thiết yếu cho cảm ứng mô sẹo có khả năng phát sinh phôi và phôi cây lúa mì; đặc

biệt, ở nồng độ 50 mM NH4NO3 kết hợp với 20 mM KNO3 tạo số lượng phôi cao.

Song ở mức 100 mM KNO3 thì ức chế cảm ứng tạo phôi [Menke-Milczarek và

Zimmy, 2001].

Amonium dùng trong môi trường nuôi cấy thường phối hợp với các acid hữu

cơ, đặc biệt là các hợp chất của acid malic và citric. Phôi của lúa mì đã sinh trưởng

+) làm nguồn nitơ vô cơ sẽ gây ra hiện tượng acid hóa

tốt khi môi trường có chứa amon malat, glutamin và saccharose ở nồng độ thấp.

Nhưng nếu chỉ có amon (NH4

môi trường, vì vậy thường kết hợp với nitơ dạng nitrat (NO3-). Theo Dougall và

Verna (1978), trong môi trường chỉ chứa NH4Cl làm nguồn nitơ độc nhất, độ pH đã

giảm từ 5,4 xuống đến 4-3,5 sau 4 ngày nuôi cấy và có biểu hiện ức chế sự hình

thành phôi.

Các nitơ hữu cơ bao gồm các amino acid và các amit được dùng nhiều trong

nuôi cấy phôi. Glutamin và asparagin có tác dụng kích thích phát triển phôi cây cà

độc dược Datura và nhiều loại thực vật khác, nhưng glutamin có hiệu quả rõ rệt

hơn. Những hỗn hợp hữu cơ không xác định như casein (CH), nước dừa cũng có

ảnh hưởng tốt với sự hình thành phôi, do chúng chứa nhiều thành phần khoáng, các

amino acid… Sự phát sinh phôi đã xảy ra trong nuôi cấy tế bào trần trụ dưới lá mầm

cây cải Brassica naplus và Brassica nigra. Các mô sẹo được hình thành từ trụ dưới

lá mầm sau hai tuần nuôi trên môi trường MS có 2,4-D và 10% nước dừa được

chuyển sang môi trường không chứa chất kích thích sinh trưởng đã hình thành phôi.

Phát sinh phôi vô tính trực tiếp và tái sinh cây con có thể xảy ra trong nuôi cấy tế

bào trần Brassic naplus.

1.2.3. Ánh sáng

Phôi vô tính có thể được tạo ra trong những điều kiện sáng và tối khác nhau.

Có những loài có nhu cầu ánh sáng cao nhưng cũng có những loài sự hình thành

phôi xảy ra trong điều kiện tối hoàn toàn. Ở cây họ Cà, sự phát sinh phôi vô tính

hoàn toàn cần ánh sáng [Gleddie et al., 1983] nhưng ở cây Podophyllum, cây bí đỏ

Cucurbita pepo L. hoàn toàn cần điều kiện tối [Arumugam et al., 1990; Lelkak-

Levanic et al., 2004]. Ở cây Vân Sam Nauy thì việc hình thành phôi vô tính chỉ có

thể thực hiện được trong điều kiện tối hoàn toàn nếu có sự hiện diện của ammonium

trong môi trường và việc loại bỏ ammonium ra khỏi môi trường là hoàn toàn cần

thiết trước khi việc tạo phôi được tiến hành ngoài sáng [Verhagen et al., 1989].

Hiểu biết về hiệu quả và vai trò của ánh sáng lên quá trình phát sinh phôi vô

tính có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu tạo phôi vô tính.

1.2.4. Đường

Sucrose là một loại đường thường được sử dụng để cung cấp nguồn

cacbonhydrate cho sự phát sinh phôi nhất. Người ta còn thấy rằng sucrose và auxin

có mối tương tác với nhau, nồng độ sucrose hoặc auxin đều phụ thuộc lẫn nhau.

Bên cạnh sucrose cũng có một số đường đôi, đường đơn khác có thể được sử dụng

thành công và cho thấy có hiệu quả hơn trên những đối tượng khác. Galactose và

lactose tốt hơn sucrose cho việc cảm ứng tạo phôi từ mô sẹo của Citrus, trong khi

đó thì sucrose tốt hơn glucose và fructose [Kochba et al., 1982]. Đôi khi sự kết hợp

hai loại đường được sử dụng cho sự thành lập các phôi vô tính.

1.2.5. Độ pH

Độ pH trong tế bào là một nhân tố ảnh hưởng đến sự biệt hóa và sự phân chia

tế bào. Sự biến đổi pH trong tế bào chất được biết là rất cần thiết để điều khiển chu

kì tế bào, sự sinh trưởng và phân chia tế bào [Pasternak et al., 2002]. Giá trị pH

trong không bào cũng như trong lục lạp có thể được xem như là một nhân tố chỉ thị

của kiểu tế bào có khả năng phát sinh và không có khả năng phát sinh phôi hay

không; đồng thời sự tăng pH trong tế bào chất có liên quan đến sự phân chia tế bào.

Auxin làm tăng sự vận chuyển proton đi ra, kết quả là làm giảm pH. Độ pH trong tế

bào thấp được đề nghị là có liên quan đến quá trình nới lỏng thành tế bào cần thiết

cho sự kéo dài tế bào trực tiếp trong quá trình phát triển phôi.

1.3. VAI TRÒ CỦA POLYAMINE

1.3.1. Giới thiệu

Trong số các hợp chất hóa học được biết đến, PA là một trong những hợp

chất lâu đời nhất [Galston, 1991]. Ngay từ hơn 300 năm trước trong tinh trùng lạnh

(Sperm) ở người, Spm dạng tinh thể đã được phát hiện, sau đó là Spermidine. Tên

gọi gắn chữ “Sperm” ghi nhận nguồn gốc tìm thấy chúng. Gần 200 năm sau, các

diamine Put và Cadverine (Cad) cũng được tìm thấy. Cấu trúc hóa học của hầu hết

các dẫn xuất Put, Spm và Spd đã được hiểu biết đầy đủ hơn vào cuối thế kỉ thứ 20.

Có rất nhiều dạng PA khác nhau, phổ biến là Put, Spd và Spm. PA được biết đến là

những hợp chất chứa nitơ kết hợp của các phân tử có trọng lượng thấp. Đây là

những polycation phân tử nhỏ được tìm thấy trong tất cả các cơ thể sống. Ở thực

vật, PA xuất hiện ở nhiều quá trình khác nhau gồm sự phát sinh cơ quan, sự cảm

ứng và sự phát triển hoa; sự già hóa lá, quá trình phát triển và chín của quả, đáp ứng

với các stress vô sinh và hữu sinh [Kusano et al., 2008] và cả quá trình phát sinh

phôi vô tính [Silveira et al., 2004a,b].

Trong tế bào thực vật, các diamine (Put), triamine (Spd) và tetramine (Spm)

là những PA chủ yếu. Chúng xuất hiện dưới dạng tự do hoặc là hợp chất liên kết với

các acid phenolic và các hợp chất có phân tử lượng thấp khác hoặc các đại phân tử

như protein và acid nucleic. Hỗn hợp của các PA cũng cần thiết trong thực vật, phản

ứng với những vi sinh vật cộng sinh quan trọng trong dinh dưỡng của thực vật. Bản

chất polycation tự nhiên của PA tại pH sinh lý giải thích cho hoạt động sinh học của

chúng. Do đó, PA cũng liên quan đến sự phosphoryl hóa protein, sự cải thiện sau

quá trình phiên mã và sự vận chuyển thích hợp của DNA. Có một dấu hiệu trực tiếp

cho thấy chúng cũng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển ở Procaryote và

Eucaryote [Slocum, 1991; Tiburcio et al., 1990] và vai trò của chúng trong quá trình

điều hòa sự sinh trưởng và phát triển thực vật đã được quan tâm nhiều trong những

thập kỉ vừa qua [Evans và Malmberg, 1989].

1.3.2. Con đường trao đổi chất của Polyamine

1.3.2.1. Sinh tổng hợp Polyamine

Các PA như Put, Spd, Spm và tiền chất của chúng gồm Arg và Orn đều là các

amine có mặt trong tất cả các tế bào. Sự tổng hợp các PA từ các amino acid thông

qua quá trình loại CO2. Các amino acid cơ bản như Arginine và Ornithine có vai trò

cung cấp khung carbon chính để tạo nên Put, nhờ hoạt động của ODC và ADC,

trong khi có sự đóng góp của Methinonine với nhóm propylamine để Put chuyển

thành Spd và từ Spd chuyển thành Spm đã được thực hiện bởi SAMDC [Kakkar et

al., 2000].

Ở động vật có vú và nấm, Put được hình thành từ Orn trong một phản ứng

được xúc tác bởi ODC. Tuy nhiên ở thực vật, tồn tại thêm một con đường thay thế

cho sự hình thành Put bắt đầu từ Arg trong phản ứng được xúc tác bởi Agmatine

iminohydrolase và N-carbamonylputrescine amidohydrolase (CPA) [Slocum et al.,

1984]. Trong hai con đường ODC và ADC, con đường ODC có phổ biến ở tất cả

các sinh vật sống. Hoạt động của con đường này đã được phát hiện có trong hầu hết

các loài và gene mã hóa cho ODC cũng đã được mô tả [Michael et al., 1996,

Imanishi et al., 1998].

Hình 1.4. Trao đổi chất PA và tương tác với các con đường trao đổi chất khác [Alcázar et al., 2010]

Con đường sinh tổng hợp cho PA và các chất chuyển hóa có liên quan được mô tả bởi các đường liên tục. Đường đứt nét cho thấy sự hình thành của alkaloid putrescine có nguồn gốc từ PA liên hợp và các quá trình dị hóa. Các số tương ứng với các enzyme sau: 1 nitrate reductase, 2 reductase nitrit, 3 nitrogenase, 4 glutamine synthetase, 5 glutamate synthase, 6 glutamate N-acetyltransferase, 7 acetylglutamate kinase, 8 N-acetyl - reductase phosphate, 9 acetylornithine transaminase, 10 acetylornithine deacetylase, 11 ornithine- carbamoyl transferase, 12 synthase arginosuccinate, 13 arginosuccinate lyase, 14 decarboxylase arginine, 15 agmatine iminohydrolase, 16 N-carbamoylputrescine amidohydrolase, 17 decarboxylase ornithine, 18 SAM synthetase, 19 SAM decarboxylase, 20 spermidine synthase, 21 spermine synthase , 22 thermospermine synthase, 23 glutamate decarboxylase, 24 diamine oxidase, 25 putrescine hydroxycinnamoyl transferase, 26 polyamine oxidase, 27 aminotransferase -aminobutyrate, 28 succinic dehydrogenase semialdehyde, 29 arginase, 30 aminotransferase ornithine, 31 nitric oxide synthase, 32 ACC synthase, 33 ACC oxidase, 34 reductase nitrat, 35 lysine decarboxylase. Chứng minh gần đây cho thấy rằng polyamine oxidase (26) không chỉ tham gia vào quá trình dị hóa sản phẩm đầu cuối của PA mà còn ở phía sau chuyển đổi từ spermine ra spermidine và từ spermidine tạo ra putrescine.

Đầu tiên, L-Arginine được biến đổi thành agmatine (Agm) nhờ enzyme ADC;

sau đó Agmatine được biến đổi thành N-carbamoylputrescine nhờ enzyme agmitine

iminohydrolase và cuối cùng biến đổi thành Put bởi enzyme N-carbamoylputrescine

amidohydrolase. Có vai trò cho methyl, SAM là một tiền chất cho cả PA và

ethylene thông qua 1-aminocyclopropane 1-carboxylic acid (Hình 1.4) và SAM

dùng để điều hòa con đường sinh tổng hợp [Evans và Malmberg, 1989]. Hơn thế

nữa, ở một vài loài thực vật, một nửa aminopropyl của SAM có thể chuyển thành

Put thông qua Put-N-methyl-transferase để hình thành N-methyl-Put [Hibi et al.,

1994; Tiburcio et al., 1990].

Sự tổng hợp Put bởi hai con đường xen kẽ ACD/ODC có thể được giải thích là

do sự tạo ngăn tế bào khác biệt của 2 enzyme trong sự điều hòa các quá trình thực

vật riêng biệt đặc hiệu [Borrell et al., 1995]. Điều này cũng chỉ ra rằng hoạt động

của ADC thật sự được tìm thấy ở động vật. Nhưng sự biểu hiện nói chung cho thấy

ADC có thể chỉ là con đường thứ yếu cho sự tổng hợp Put trong mô động vật có vú

đặc hiệu. PA được giới hạn trong không bào, ti thể và lục lạp [Slocum, 1991].

Borrell và cộng sự (1995) tìm thấy PA trong màng thylakoid của loài spinach, kết

hợp với phức hợp tiếp nhận ánh sáng (LHC) và quang hệ thống II. Những kháng thể

tăng ADC của lúa yến mạch đã tiết lộ rằng enzyme này có mặt trong màng

thylakoid của lục lạp và bởi sự định vị của ADC trong diệp lục, ông kết luận rằng

vai trò của sự tổng hợp PA có thể duy trì hoạt động của quá trình quang hợp, ngăn

cản stress thẩm thấu được cảm ứng. Nói chung, SAMDC và Spd synthase định vị

trong tế bào chất, trong khi ODC được phân bố trong nhân tế bào; đồng thời, vòng

tuần hoàn của ODC khá nhanh với bán chu kì sống thường ít hơn 1 giờ và thỉnh

thoảng nhanh hơn một vài phút [Slocum, 1991]. SAMDC của cây thuốc lá có bán

chu kì sống ức chế việc tổng hợp SAMDC bởi những PA (Spd và Spm) có thể mô

tả cơ chế điều hòa quan trọng của việc tổng hợp PA ở thực vật [Slocum, 1991]. Tuy

nhiên, ở lúa yến mạch, ADC được tổng hợp như là một tiền chất được tách ra để sản

xuất các enzyme hoạt động trong một phản ứng mà chúng bị ức chế bởi Spm

[Borrell et al., 1996].

Sự đa dạng của những hợp chất sơ cấp khác được tìm thấy ở thực vật, gồm có

udecarboxylase (LDC). Hoạt động của nó tương quan chặt chẽ với sự tích lũy của

alkaloid quinolizidine mà Cad là một tiền chất. Hoạt động của LDC được phân bố

trong stroma của lục lạp [Slocum, 1991]. Một vài mạch chính PA dị thường

(caidine, thermine, caldopentamine) mà chúng khác biệt từ PA tổng quát trong số

lượng một nửa methylenic giữa những chức năng amine mà nó được thăm dò trong

sự phát triển của thực vật ở môi trường tối ưu. Có một bằng chứng tiêu biểu chống

lại những giả thuyết rằng những mạch chính PA có thể đáp ứng các chất bảo vệ

stress khô hạn hay stress nhiệt từ những điều kiện trong thực vật.

1.3.2.2. Sự vận chuyển Polyamine

Thông thường, những tế bào có thể tổng hợp PA mà chúng cần. Thật vậy,

những tế bào này được trang bị với hệ thống vận chuyển đặc hiệu để hấp thu PA

ngoại sinh. Nó được biết đến như là những hệ thống vận chuyển riêng cho các PA

khác nhau, hay chỉ một hệ thống vận chuyển riêng biệt có khả năng vận chuyển tất

cả các phân tử PA. Ở thực vật bậc cao hơn, PA hấp thu ở cấp độ tế bào rất nhanh,

đạt trạng thái bão hòa sau 1-2 phút và biểu lộ 2 pha hệ thống với 2 thành phần bão

hòa cho Put. Sự vận chuyển PA là một cơ chế hoạt động mạnh được kích thích bởi

auxin và PA hấp thu được bảo quản chủ yếu là trong nội bào [Bagni và Pistocchi,

1991]. Sự vận chuyển PA đến các cơ quan tế bào, sự vận chuyển gián tiếp dọc theo

tonoplast được tìm thấy trong không bào, trong khi hoạt động vận chuyển đến

khoảng matrix, phụ thuộc vào khả năng của màng được tìm thấy trong ti thể. Sự vận

chuyển PA dọc theo plasma phụ thuộc vào năng lượng và canxi mà chúng cần trong

cơ chế. Những xử lý hóa học mà nó đối kháng với phản ứng calmodulin hay ức chế

hoạt động của protein kinase và phosphatase khử Ca2+- hấp thu Put hoạt động.

Những kết quả này đề nghị những giả thuyết rằng canxi ảnh hưởng đến quá trình

vận chuyển trong suốt con đường truyền tín hiệu thứ cấp, gồm hoạt động protein

kinasephophatase.

Vận chuyển đường dài có lẽ là một phần chức năng của hormone cần thiết. Do

đó, xác định việc PA được chuyển chỗ trong thực vật là rất quan trọng. Những

nghiên cứu trong sự vận chuyển PA đoạn đường dài không nhiều nhưng chúng có

khả năng chứng tỏ sự tồn tại của sự chuyển chỗ không cực ở phạm vi thực vật. Kết

luận là có sự chuyển chỗ PA xuất hiện chính thông qua mạch xylem và nó phụ

thuộc vào tỉ số thoát hơi nước [Bagni và Pistocchi, 1991].

1.3.2.3. Sự tiếp hợp Polyamine

Trong tự nhiên, PA xuất hiện như là phân tử tự do cơ bản nhưng thường được

tiếp hợp thành những phân tử nhỏ như những acid phenolic và cũng thành những

phân tử lớn khác nhau như protein [Tiburcio et al., 1997].

Những PA tiếp hợp nói chung kết nối đồng hóa trị thành acid

hydroxycinnamic. PA được tiếp hợp bởi sự hình thành của liên kết amide, sử dụng

este của CoA để cung cấp nhóm carboxyl hoạt động và sự liên kết này được xúc tác

bởi một nhóm enzyme được biết đến như transferase. Những hợp chất này xuất hiện

như là dạng cơ bản hay là dạng trung tính. Trong dạng cơ bản, nhóm amine tự do

của amine aliphatic được liên kết với acid phenolic cinnamic. Trong dạng trung hòa,

mỗi nhóm amine kết thúc của amine aliphatic được kết hợp thành acid cinnamic. Sự

kết nối đồng hóa trị của PA thành protein sau quá trình phiên mã được xúc tác bởi

một nhóm enzyme transglutaminase, chúng được định vị cả trong và ngoài tế bào.

1.3.2.4. Polyamine trong tương tác với các con đường sinh tổng hợp khác

Sự trao đổi chất PA được kết nối với một số đường nội tiết và trao đổi chất

quan trọng có liên quan đến phát triển, phản ứng stress, đồng hóa nitơ và chuyển

hóa hô hấp. Con đường trao đổi chất PA cũng được kết nối với các con đường trao

đổi chất khác có liên quan đến sự hình thành các phân tử tín hiệu khác nhau và các

chất chuyển hóa khác nhau trong đáp ứng stress ở thực vật. Theo đó, sự tổng hợp

PA và ethylene thông qua một tiền chất chung là SAM – một tiền chất phổ biến cho

sinh tổng hợp. PA và ethylene có hiệu quả đối kháng trong quá trình già lá và chín

quả. Năm 2006, Yamasaki và Cohen cũng đã chứng minh sự sinh tổng hợp PA có

ảnh hưởng tới sự hình thành NO. GABA – một sản phẩm của quá trình dị hóa PA

được hình thành thông qua pyroline (xem sơ đồ Hình 1.4).

1.3.2.5. Các chất ức chế sinh tổng hợp Polyamine

Các chất ức chế sinh tổng hợp PA là các chất làm bất hoạt các enzyme sinh

tổng hợp PA gồm: DL--diflouromethylarginine (DFMA) ức chế enzyme ADC; -

diflouromethylornithine (DFMO) ức chế ODC; methylglyoxal-bis-

(guanylhydrazone) (MGBG) ức chế SAM; Dicyclohexylammonium sulphate

(DCHA) hoặc Cyclohexylammonium phosphate (CHAP): ức chế enzyme

spermidine synthase.

Khi bổ sung các chất trên vào môi trường nuôi cấy làm giảm hiệu quả của PA,

gây ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát sinh hình thái thông qua tăng cường hoặc

giảm bớt tác dụng của các chất khác. Ví dụ, xử lý với DFMA và DFMO làm tăng

cường sản xuất ethylene ở một số thực vật; DFMO ức chế sự thành lập rễ từ đoạn

cắt dưới lá mầm cây Euphorbia esula nhưng bổ sung IAA và 2,4-D có thể khắc

phục điều này; DFMO ức chế sự tạo phôi trực tiếp từ lá mầm Solanum melongena

cao hơn so với DFMA song điều này được khắc phục khi thêm Put vào môi trường

nuôi cấy; MGBG ngăn chặn sự tạo rễ nhưng thúc đẩy sự tạo củ ở cây Solanum

tuberosum (Bais và Ravishankar, 2002).

1.3.3. Polyamine đóng vai trò là chất điều hòa sinh trưởng

Các PA đã được quan tâm như là một lớp mới trong các chất điều hòa sinh

trưởng và là tín hiệu hormone sơ cấp trong quá trình nhân lên và biệt hóa tế bào ở

nhiều quá trình sinh lý thực vật [Kakkar et al., 2000; Bais và Ravishankar, 2002;

Jiménez, 2005]. Trong những năm đầu tiên sau khi nghiên cứu PA trong tế bào thực

vật, một điều đáng chú ý về khả năng của chúng mang những hoạt động sinh trưởng

cao ở những giai đoạn phát triển. Những tác động của PA ngoại sinh và nội sinh

được nhận thấy rõ ở cấp độ thực vật tương đồng không làm ảnh hưởng đến tác động

của phytohormone. Điều đáng chú ý là nó tác động gián tiếp và trực tiếp giữa PA và

các phytohormone cảm ứng phát triển. Vì vậy, trong một vài thực vật, auxin,

gibberellin và cytokinin kích thích sinh tổng hợp và gia tăng hàm lượng PA, ở đó

PA ngoại sinh tác động đến các phytohormone nội sinh. Đối với Arabidopsis, IAA

cảm ứng gene ACL5 ghi mã tổng hợp Spm nhưng ABA hay acid gibberelic có thể

không cảm ứng gene này. Sự không hoạt động của gene này làm chậm trễ sự kéo

dài thân và ức chế sự phân chia tế bào.

Theo sự hoạt động sinh hóa của chúng, PA có thể phân chia thành 2 nhóm: Put

và Cad kích thích sự phân chia tế bào và hình thành rễ như những auxin và

gibberellin, trong khi đó Spd và Spm điều hòa sự phân chia tế bào, hình thành các

cơ quan và nhiễm sắc thể như những cytokinin. Nồng độ PA cao thường có mặt

trong các mô sinh trưởng mạnh và trong giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi sinh

dưỡng. Trong nuôi cấy tế bào cà rốt, PA được biến nạp với gene ODC cDNA và

nồng độ Put được gia tăng trong không bào. Điều này cho phép PA được đưa vào sử

dụng như auxin ở giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi trong tế bào sinh dưỡng cà

rốt.

Sự thay đổi trong trao đổi PA ở giai đoạn phát sinh phôi sinh dưỡng được

nghiên cứu trong nhiều hệ thống khác nhau ở thực vật. Đây là một hướng đi quan

trọng trong sự tái sinh cây trồng và là hệ thống hiện đại, tiềm năng để nghiên cứu

các sự kiện sinh trưởng, phát triển và phát sinh hình thái in vitro [Yadav và Rajam,

1998]. Vì vậy những nghiên cứu gần đây, sự phân tích toàn diện hàm lượng của PA,

hoạt động của những enzyme tổng hợp nên chúng, sự biểu hiện của gene điều hòa

phiên mã được biểu diễn ở những giai đoạn khác nhau của sự phát sinh phôi sinh

dưỡng ở Vitis vinifera: hình tim, hình cá đuối, phôi trưởng thành và tái sinh cây.

Hoạt động của ODC vượt quá ADC. Sự biểu hiện của gene ODC và SAMDC có

liên quan đến hoạt động của những enzyme tương ứng với những cấp độ của Put và

Spd ở giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi. Mối quan hệ không có mặt giữa hàm

lượng PA tự do, hoạt động của enzyme để sinh tổng hợp và cấp độ biểu hiện gene ở

giai đoạn sau của sự phát sinh phôi và tái sinh cây có thể mang lại kết quả hệ thống

điều hòa tế bào.

Nghiên cứu gần đây chỉ ra vai trò quan trọng của PA ngoại sinh trong quá trình

phát triển in vitro như quá trình phát sinh phôi vô tính. Tần xuất phát sinh phôi vô

tính cũng có thể được điều chỉnh bởi nồng độ các PA đã được Kever và cộng sự

(2000) chứng minh trên cây Panax ginseng. Đối với cây Araucaria angustifolia, sự

thay đổi hàm lượng các PA cũng đã được tìm thấy trong các giai đoạn phát triển

khác nhau của phôi và ở mô hạt trong suốt quá trình phát triển của hạt [Astarita và

cộng sự 2003]. Trục phôi là cơ quan xuất hiện hàm lượng PA cao nhất gồm Put và

Spm trong giai đoạn phôi sớm; trong khi nồng độ Spd cao và nồng độ Put giảm

xuống khi lá mầm mọc ra.

1.4. SƠ LƯỢC VỀ CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA

ET GRUSHV.)

1.4.1. Phân loại và đặc điểm hình thái

1.4.1.1. Phân loại

Giới : Plantae

Ngành : Magnoliophyta

Lớp : Magnoliopsida

Bộ : Apiales

Họ : Araliaceae

Chi : Panax

Loài : Panax vietnamensis Ha et Grushv.

Hình 1.5. Cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

[Nguồn: http://samngoclinhtkh.com/]

1.4.1.2. Đặc điểm hình thái

Sâm Ngọc Linh trưởng thành có dạng thân khí sinh thẳng đứng, màu lục hoặc

hơi tím, nhỏ với đường kính thân khoảng 4-8 cm, thường tàn lụi hàng năm. Phần

thân rễ có đường kính 1-2 cm, mọc bò ngang như củ hoàng tinh trên hoặc dưới mặt

đất khoảng 1-3 cm, mang nhiều rễ nhánh và củ. Các thân mang lá và tương ứng với

mỗi thân mang lá là một đốt dài khoảng 0,5-0,7 cm. Cây chỉ có một lá duy nhất

trong suốt từ năm thứ 1 đến năm thứ 3 và chỉ từ năm thứ 4 trở đi mới mọc thêm 2

đến 3 lá. Trên đỉnh của thân mang lá kép hình chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá.

Cuống lá kép dài 6-12 mm, mang 5 lá chét, lá chét ở chính giữa lớn hơn cả với độ

dài 12-15 cm, rộng 3-4 cm. Lá chét có phiến hình bầu dục, mép khía răng cưa, chóp

nhọn, lá có lông ở cả hai mặt. Cây 4-5 năm tuổi có hoa hình tán đơn mọc dưới các

lá thẳng với thân, cuống tán hoa dài 10-20 cm có thể kèm 1-4 tán phụ hay một hoa

riêng lẻ ở phía dưới tán chính. Mỗi tán có 60-100 hoa, cuống hoa ngắn 1-1,5 cm, lá

đài, cánh hoa màu vàng nhạt, nhị, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy. Quả mọc tập trung ở

trung tâm của tán lá, dài độ 0,8-1 cm và rộng khoảng 0,5-0,6 cm, sau hai tháng bắt

đầu chuyển từ màu xanh đến xanh thẫm, vàng lục, khi chín ngả sang màu đỏ cam

với một chấm đen không đều ở đỉnh quả. Mỗi quả chứa một hạt, một số quả chứa 2

hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả.

Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá

và rễ con. Vào đầu tháng 1 hàng năm, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông,

thân khí sinh lớn dần lên thành cây trưởng thành có 1 tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng

6, cây nở hoa và kết quả. Tháng 7 quả bắt đầu chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối

tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ và cây

bắt đầu giai đoạn ngủ đông đến hết tháng 12. Dựa vào số lượng vết sẹo trên đầu củ,

người ta có thể nhận biết độ tuổi của cây sâm. Sau 3 năm đầu, cây sâm mới rụng lá

và để lại vết sẹo đầu tiên. Khi thu hoạch, chỉ nên thu nhận các củ từ 3 tuổi trở lên,

tốt nhất là trên 5 tuổi. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của

sâm.

1.4.2. Phân bố

Đến nay, vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum là nơi

duy nhất được phát hiện có sâm Ngọc Linh. Đây cũng là giới hạn xa nhất về phía

Nam (ở 15o vĩ tuyến Bắc) của bản đồ phân bố chi Panax L. trên thế giới.

Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai ở Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107o5’-

108o7’ kinh tuyến Đông và từ 15o0’-15o1’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc Linh

cao 2598 m. Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ cao

khoảng 1500-2200 m, chủ yếu tập trung ở 1800-2000 m, thuộc địa bàn của hai

huyện Đắk Tô (Kon Tum) và Trà My (Quảng Nam). Hiện nay, về giới hạn cũng

như phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh đã có nhiều thay đổi [Nguyễn

Thượng Dong et al., 2007].

1.4.3. Thành phần hóa học

1.4.3.1. Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ)

Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây sâm

Ngọc Linh cũng như các loài sâm khác trên thế giới. Từ phần dưới mặt đất của sâm

Ngọc Linh hoang dại đã phân lập và xác định được cấu trúc protopanaxatriol oxyd

II và 52 hợp chất saponin bao gồm 26 saponin đã biết và 26 saponin có cấu trúc mới

được đặt tên là vina-ginsenoside (VG) -R1 đến -R25 và 20-O-Me-G-Rh1.

Các saponin dammaran được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng

sinh học có giá trị của sâm Triều Tiên cũng chiếm một tỉ lệ rất cao về hàm lượng và

số lượng trong thành phần hợp chất saponin của sâm Ngọc Linh (50/52 saponin

phân lập được). Trong đó các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol gồm 22

hợp chất với đại diện chính là ginsenoside-Rb1, -Rb3, -Rd. Các saponin dẫn chất

của protopanaxatriol gồm 17 hợp chất với các đại diện chính là ginsenoside-Re, -

Rg1, notoginsenoside-R1. Các saponin có cấu trúc occotillol gồm 11 hợp chất với

các đại diện chính là majoside-R1 và -R2 [Nguyễn Thượng Dong et al., 2007].

Theo Yamasaki (2000), các hợp chất saponin mới của sâm Ngọc Linh có một

số đặc điểm đáng chú ý như sau:

+ VG-R1 và VG-R2 là saponin ocotillol có nhóm acetyl trên chuỗi đường ở C-6.

+ VG-R3 là chất duy nhất thiếu nhóm -OH tại vị trí C-12 trong tất cả các

saponin được phân lập từ loài này.

+ VG-R4 là một saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol có mang một trong

hai chuỗi đường ở C-3, trong khi các saponin này được tìm thấy trước đây chỉ mang

các chuỗi đường ở C-6 và C-20, hoặc C-6 và C-12.

+ VG-R5 và -R6 là hai saponin có chứa cầu nối α-glycoside hiếm gặp trong tự

nhiên. VG-R7 là G-Rd xylosyl hoá.

+ VG-R8 có một mạch có liên kết đôi có hướng tại -OH ở C-25. Cấu trúc này có

điểm tương đồng với majonoside F4, có 3-O- và 20-O-diβ-d-glucoside trên cùng

một nhóm aglycone. VG-R9 cũng có liên kết đôi có hướng tại C-36 và có cấu trúc

tương đồng với majonoside-F1.

+ Các VG-R10, -R12, -R13, -R14, -R15, -R16, -R17, -R19, -R20, -R21 là các

saponin có cấu trúc aglycon mới. VG-R13 là một glycoside đầu tiên phát hiện trong

một loài Panax có aglycon là dammarenediol. Chất này có thể là một chất trung

gian trong quá trình sinh tổng hợp của 20(S)-protopanaxadiol và 20(S)-

protopanaxatriol [Nguyễn Thượng Dong et al., 2007].

1.4.3.2. Phần trên mặt đất (thân và lá)

Có 19 saponin dammaran đã được phân lập từ phần trên mặt đất của sâm Ngọc

Linh, bao gồm 11 saponin đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là

vinaginsenoside-L1 đến -L8. Khác với phần dưới mặt đất, các saponin dẫn chất của

20(S)-protopanaxadiol chiếm tỉ lệ rất cao trong thành phần saponin từ phần trên mặt

đất với đại diện chính là notoginsenoside-Fc, G-Rb3, N-Fe và VG-L2. Các saponin

20(S)-protopanaxatriol gồm có P-RS1, G-Re và G-Rg1 với tỉ lệ thấp. Ngoài ra còn

có các saponin có cấu trúc ocotillol với đại diện chính là VG-R1 nhưng chiếm tỉ lệ

thấp.

1.4.3.3. Các thành phần khác

 Polyacetylene: 7 hợp chất polyacetylene đã được phân lập ở phân đoạn ít phân

cực từ phần dưới mặt đất của sâm Ngọc Linh.

 Acid béo: Có 17 acid béo từ 8-20 cacbon, trong đó chiếm tỉ lệ lớn nhất là acid

linoleic (40,04%); acid palmitic (29,62%); acid oleic (13,26%); acid stearic (4,48%)

và acid linolenic (2,61%).

 Acid amin: 18 acid amin đã được xác định. Thành phần này gồm đủ 8 acid

amin cần thiết cho cơ thể, một số acid amin có tỉ lệ rất cao như arginine 46,66%,

lysine 17,90% và tryptophan 10,20% đã được xác định có tính chống lão hoá tế bào.

 Các nguyên tố vi lượng và đa lượng: 20 nguyên tố vi lượng và đa lượng của

phần dưới mặt đất sâm Ngọc Linh đã được xác định, trong đó bao gồm một số các

nguyên tố có tác dụng sinh học như K, Na, Mg, Mn, Cu, Fe, Co, Zn, Se.

1.4.4. Các tác dụng của sâm Ngọc Linh

 Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương: Sâm Ngọc Linh liều thấp có tác dụng

kích thích thần kinh, làm tăng hoạt động vận động và trí nhớ, nhưng liều cao lại ức

chế thần kinh.

 Tác dụng chống trầm cảm: Sâm Ngọc Linh có tác dụng chống trầm cảm ở liều

uống một lần 200 mg/kg hoặc liều 50 – 100 mg/kg dùng trong 7 ngày ở chuột nhắt

trắng; majonosid-R2 tiêm màng bụng có tác dụng chống trầm cảm ở cả 3 liều 3,1;

6,2 và 12,5 mg/kg.

 Tác dụng tăng sinh lực: Sâm Ngọc Linh có tác dụng tăng lực trong thí nghiệm

chuột bơi, làm tăng sinh lực chống lại sự mệt mỏi, giúp phục hồi sức lực.

 Tác dụng sinh thích ứng (adaptogenesis): Trong stress vật lý, cho chuột nhắt

trắng uống sâm Ngọc Linh liều 100 mg/kg có tác dụng làm tăng khả năng chịu đựng

của chuột đối với nhiệt độ cao (37-42oC) và nhiệt độ thấp (–5oC), làm kéo dài thời

gian sống thêm của chuột thí nghiệm.

Trong stress vật lý, chuột nhắt trắng được nuôi riêng từng con trong 4 tuần,

thời gian ngủ khi tiêm natri barbital giảm đi 30%. Sâm Ngọc Linh liều uống 50-200

mg/kg hoặc hoạt chất majonosid-R2 tiêm màng bụng liều 3,1-12,5 mg/kg làm cho

thời gian ngủ trở lại bình thường.

 Tác dụng chống oxy hóa: Trên thí nghiệm in vitro dùng dịch nổi của mô não,

gan và phân đoạn vi thể gan của chuột nhắt trắng, saponin sâm Ngọc Linh ở nồng

độ 0,05-0,5 mg/kg có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA (malonyl

dialdehyde) là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng sinh học.

 Tác dụng kích thích miễn dịch: Bột chiết sâm Ngọc Linh liều uống 500 mg/kg

và majonosid-R2 tiêm trong màng bụng có tác dụng làm tăng chỉ số thực bào trong

thí nghiệm in vitro và in vivo ở chuột nhắt trắng. Dùng liều E. coli gây chết chuột

nhắt trắng. Nếu kết hợp dùng sâm và majonosid-R2 với liều như trên sẽ làm tăng tỉ

lệ chuột sống sót. Có lẽ do thuốc có tác dụng làm tăng đại thực bào đối với E. coli.

 Tác dụng phục hồi máu: Trong thí nghiệm làm giảm hồng cầu và bạch cầu ở

động vật thí nghiệm, sâm Ngọc Linh có tác dụng làm phục hồi số lượng hồng cầu

và bạch cầu đã bị giảm.

 Tác dụng dược lý khác: Sâm Ngọc Linh còn có tác dụng tăng cường nội tiết tố

sinh dục, điều hòa hoạt động của tim, tác dụng chống tăng cholesterol máu, tác

dụng bảo vệ gan khỏi các yếu tố gây độc đối với gan.

Chương 2

VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Nguồn mẫu

Vật liệu thí nghiệm là các mẫu cấy lá, cuống lá, củ từ cây sâm Ngọc Linh in

vitro 3 tháng tuổi được nuôi cấy tại phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây

trồng thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên. Vật liệu thực vật được cắt với

kích thước: Lá 1 x 1 cm, cuống dài 1 cm, củ 0,5 x 0,5 x 0,1 cm; mô sẹo 0,5 x 0,5

cm.

2.1.2. Môi trường nuôi cấy

Môi trường MS cơ bản, ½MS, MS½, SH, ½SH và SH½.

Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật: 2,4-D, NAA, Kin.

Các chất phụ gia: các tiền chất của nhóm PA (Arg, Orn), các hợp chất thuộc

nhóm PA (Put, Spd, Spm).

Các thành phần khác: đường sucrose (30 g/l), agar (8 g/l).

Môi trường được điều chỉnh về pH = 5,8 (bằng NaOH 1N hay HCl 1N) trước

khi hấp khử trùng bằng autoclave ở 1 atm (121oC) trong 30 phút.

2.1.3. Điều kiện thí nghiệm

Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 25 ± 2ᴏC, thời gian chiếu

sáng 16 giờ/ngày với cường độ 40 - 45 µmol.m-2.s-1 (đối với các thí nghiệm có

chiếu sáng) và độ ẩm trung bình 55 - 60%. Một số thí nghiệm được đặt trong điều

kiện tối hoàn toàn hoặc trên máy lắc hãng Innova 2100 plantform shaker (Hermle,

Đức) ở 100 vòng/phút.

2.1.4. Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài

Đề tài được tiến hành tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây

trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, số 116 Xô Viết Nghệ Tĩnh, Đà Lạt,

Lâm Đồng. Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 1 năm 2013 tới tháng 12 năm 2014.

2.2. PHƯƠNG PHÁP

2.2.1. Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang

Giải phẫu hình thái thực vật bằng phương pháp nhuộm đơn, nhuộm kép hay

nhuộm hai màu. Nguyên tắc chung của việc nhuộm màu: các tế bào sống (tế bào

nhu mô, vùng mô phân sinh có tế bào chất đậm đặc, hoạt động trao đổi chất diễn ra

mạnh) sẽ bắt màu hồng, với vùng mô phân sinh chứa các tế bào có kích thước nhỏ,

nằm gần nhau dưới kính hiển vi sẽ bắt màu hồm đậm; còn các tế bào chuyên hóa

hoặc đã chết (các tế bào mô mạch hóa gỗ) sẽ bắt màu xanh.

Mô nuôi cấy được cắt thành các lát mỏng đi qua trục rễ hoặc chồi. Lát cắt

được xử lý với Javel 5% trong 15 phút để loại bỏ nội chất tế bào sau đó rửa với

nước cất rồi xử lý tiếp tục với acid acetic 3% trong 5 phút để loại bỏ Javel trước khi

tiến hành nhuộm với phẩm nhuộm 2 màu (acetocarmine và iodine) trong 3 phút.

Tiếp đó đặt mẫu vật lên lame kính, đặt lamel lên và quan sát dưới kính hiển vi

quang học với độ phóng đại tăng dần.

2.2.2. Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát cấu trúc phôi bằng kính hiển vi

điện tử quét

Các khối phôi được tách ra khỏi mẫu cấy ban đầu và ngâm trong dung dịch

paraformaldehyde 4% ở nhiệt độ 4oC để qua đêm. Mẫu được rửa lại 3 lần trong đệm

sodium phosphate 25 mM (pH = 7) trước khi tiến hành loại nước bằng cách ngâm

trong ethanol lần lượt qua các nồng độ: 10% (30 phút), 30% (30 phút), 50% (30

phút), 65% (30 phút), 75% (30 phút), 90% (30 phút), 95% (30 phút), ethanol tuyệt

đối (30 phút, 3 lần), ethanol tuyệt đối để qua đêm ở 4oC (18-24h). Mẫu được xử lý

khô tới hạn qua carbon dioxide trước khi gắn lên đế aluminum và phủ lên một lớp

palladium 60 nm [Bùi Văn Thế Vinh et al., 2014]. Ảnh hiển vi được ghi nhận bằng

kính hiển vi điện tử quét SEM (scanning electron microscopy Jeol, Nhật Bản) tại

Phòng hiển vi điện tử, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, số 1, đường Yersin, Hà

Nội.

2.2.3. Thu thập mẫu và phân tích Polyamine nội sinh

Thu thập mẫu để phân tích các PA nội sinh: Các mẫu mô sẹo xốp có khối

lượng khoảng 100 mg (trên môi trường cảm ứng phôi ở thí nghiệm 3 có bổ sung

nồng độ PA tối ưu) được thu thập ở các thời điểm 0, 7, 14 và 21 ngày sau nuôi cấy.

Phân tích hàm lượng PA nội sinh: Mẫu sau khi thu thập được gửi tới Trung

tâm sắc kí Hải Đăng (số 79, Trương Định, Quận 1, thành phố Hồ Chí Minh) để

phân tích thành phần PA nội sinh.

2.3. Bố trí thí nghiệm

2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng hình thành mô sẹo xốp từ các nguồn

mẫu cấy khác nhau của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro

Mục đích: Xác định loại mẫu cấy cảm ứng tạo mô sẹo thích hợp nhất từ 3

nguồn mẫu lá, cuống lá, củ của cây sâm Ngọc Linh in vitro trên môi trường cảm

ứng tạo mô sẹo.

Cách tiến hành: Mẫu lá in vitro được cắt thành từng mảnh nhỏ có kích thước 1

x 1 cm, mẫu cuống lá in vitro được cắt thành từng đoạn có chiều dài 1 cm, mẫu củ

in vitro được cắt thành từng mẩu nhỏ có kích thước 0,5 cm x 0,5 cm x 1 mm. Các

mẫu cấy được đặt trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA

[Nhut et al., 2012].

Chỉ tiêu theo dõi: Sau 8 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ

mẫu hình thành mô sẹo (%); khối lượng tươi của mẫu (mg) ; khối lượng khô của

mẫu (mg); hình thái mô sẹo.

2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường khoáng khác

nhau lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc

Linh

Mục đích: Khảo sát khả năng hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi từ

mẫu cấy thích hợp nhất trong thí nghiệm 1 trên các môi trường có bổ sung các thành

phần khoáng khác nhau để xác định thành phần khoáng thích hợp cho môi trường

cảm ứng.

Cách tiến hành: mẫu cấy tốt nhất trong thí nghiệm 1 được cấy vào các môi

trường có thành phần khoáng đa lượng và vi lượng khác nhau như MS, ½MS,

MS½, ½SH, SH½, SH. Mỗi môi trường đều được bổ sung thành phần vitamin của

MS, 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA.

Chỉ tiêu theo dõi: Sau 8 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ

mẫu hình thành mô sẹo (%); khối lượng tươi của mẫu (mg); khối lượng khô của

mẫu (mg); hình thái mô sẹo.

2.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D kết hợp với 0,5

mg/l NAA, 0,2 mg/l Kin lên sự hình thành phôi vô tính có nguồn gốc từ mô sẹo

xốp sâm Ngọc Linh

Mục đích: Tìm ra nồng độ 2,4-D phù hợp nhất khi kết hợp với 0,5 mg/l NAA

và 0,2 mg/l Kin lên khả năng cảm ứng và tần suất phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo

xốp.

Cách tiến hành: Mô sẹo được cảm ứng từ thí nghiệm 2 được cấy chuyền sang

tạo phôi MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kin kết hợp với 2,4-D ở các nồng

độ khác nhau (0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,5; 2 mg/l).

Chỉ tiêu theo dõi: Sau 12 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ

mẫu tạo phôi (%); số lượng phôi/mẫu; khối lượng tươi của mẫu (mg); đặc điểm hình

thái, cấu trúc phôi.

2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy và điều

kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh

nuôi

2.3.4.1. Thí nghiệm 4.1: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (đặc,

lỏng tĩnh, lỏng lắc) lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc

Linh

Mục đích: Đánh giá khả năng hình thành, tần suất phát sinh phôi vô tính và

tìm ra điều kiện nuôi cấy tốt nhất trong 3 điều kiện nuôi cấy khác nhau.

Cách tiến hành: Mô sẹo từ lá cấy chuyền sang môi trường tăng sinh mô sẹo ở

thí nghiệm 2 và chuyển sang môi trường cảm ứng phôi ở thí nghiệm 3. Môi trường

đặc được bổ sung 8 g/l agar, môi trường lỏng không bổ sung agar, môi trường lỏng

lắc được đặt trên máy lắc vòng với tốc độ 100 vòng/phút.

Chỉ tiêu theo dõi: Sau 12 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ

mẫu tạo phôi (%); số lượng phôi/mẫu; khối lượng tươi của mẫu (mg); đặc điểm hình

thái, cấu trúc phôi.

2.3.4.2:Thí nghiệm 4.2: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự

hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh

Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện sáng và tối; tìm ra điều kiện

chiếu sáng thích hợp cho sự cảm ứng và nâng cao tần suất phát sinh phôi vô tính từ

mô sẹo.

Cách tiến hành: Mô sẹo được cấy trên môi trường tạo phôi ở thí nghiệm 3.

Các bình nuôi cấy được đặt trong điều kiện chiếu sáng 0 và 16 giờ/ngày với cường

độ 40 - 45 µmol.m-2.s-1.

Chỉ tiêu theo dõi: Sau 12 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ

mẫu tạo phôi (%); số lượng phôi/mẫu; khối lượng tươi của mẫu (mg); đặc điểm hình

thái, cấu trúc phôi.

2.3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của một số tiền chất sinh tổng hợp

Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh

Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng và hiệu quả của các tiền chất của PA lên khả

năng hình thành và tần suất phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh.

Cách tiến hành: Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường tạo phôi ở thí nghiệm

3 có bổ sung Arg hoặc Orn ở các nồng độ khác nhau (0, 10, 50, 100, 150, 200 μM).

Chỉ tiêu theo dõi: Sau 12 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ

mẫu tạo phôi (%); số lượng phôi/mẫu; khối lượng tươi của mẫu; đặc điểm hình thái,

cấu trúc phôi.

2.3.7. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của một số Polyamine lên sự hình

thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh

Mục đích: Đánh giá hiệu quả Put, Spd, Spm và tìm ra loại PA gây tác dụng tốt

nhất lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh.

Cách tiến hành: Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường tạo phôi ở thí nghiệm

3 có bổ sung Put, Spd và Spm riêng rẽ ở các nồng độ khác nhau (0, 10, 50, 100,

150, 200 μM).

Chỉ tiêu theo dõi: Sau 12 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ

mẫu tạo phôi (%); số lượng phôi/mẫu; khối lượng tươi của mẫu; đặc điểm hình thái,

cấu trúc phôi.

2.4. Xử lý số liệu

Mẫu được cấy vào 10 bình thủy tinh 250 ml chứa 40 ml môi trường. Với thí

nghiệm khảo sát nguồn mẫu cấy 5 mẫu/bình, 5 lần lặp lại; đối với các thí nghiệm

khảo sát mô sẹo xốp: 3 mẫu/bình, 3 lần lặp lại.

Số liệu và biểu đồ được xử lý bằng phần mềm phần mềm SPSS 16.0 với

=0,05 và Microsoft Excel 2013.

Chương 3

KẾT QUẢ & THẢO LUẬN

3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN MẪU LÊN SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO CÓ KHẢ NĂNG PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH SÂM NGỌC LINH

Trong thí nghiệm này, các mẫu cấy cuống lá, lá và củ của cây sâm Ngọc

Linh in vitro 3 tháng tuổi được cắt thành các mẩu nhỏ có kích thước là 1 cm; 0,5 ×

0,5 cm; 0,5 × 0,5 × 0,1 cm; tương ứng và cấy vào môi trường SH có bổ sung 1 mg/l

2,4-D, 1 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 8,5 g/l agar. Sau 8 tuần nuôi cấy khả năng hình

thành mô sẹo xốp từ các nguồn mẫu thì khác nhau và được thể hiện trên Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Khả năng hình thành mô sẹo xốp từ các nguồn mẫu khác nhau của cây sâm Ngọc Linh

Hình thái mô sẹo

Nguồn mẫu Cuống lá Lá Củ

Cảm ứng tạo mô sẹo (%) 92 100 100

Khối lượng tươi (mg) 288,33b 320,67b 471,33a

Khối lượng khô (mg) 17,00b Màu trắng trong, mọng nước 24,67b Màu trắng trong, mọng nước 60,00a Màu trắng trong, mọng nước

Ghi chú: Các chữ cái a, b, ... trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với  =0,05 theo Duncan’s test.

Mô sẹo phát sinh mạnh nhất đối với mẫu lá và củ (Hình 3.1b, c), đạt tỉ lệ

100%. Mô sẹo phát sinh đầu tiên trên mẫu cấy củ, có dạng xốp, hình thành xung

quanh viền củ. Mẫu củ cảm ứng mô sẹo sớm nhất, chỉ sau 2 tuần nuôi cấy. Các mô

sẹo này tập trung viền xung quanh củ, nơi có các tế bào nhu mô vỏ. Ở giữa củ, nơi

tế bào dự trữ nhiều hạt tinh bột đã không hình thành mô sẹo xốp. Mặc dù khối

lượng tươi và khối lượng khô của củ đạt cao nhất nhưng chủ yếu là do lượng tinh

bột dự trữ bên trong (Hình 3.1c1). Mô sẹo xốp, trong, mọng nước cũng được tạo

thành từ các mẫu cấy lá và cuống lá. Với các mẫu lá, mô sẹo hình thành từ các vết

cắt và sau đó tăng sinh, lan dần vào phía trong các mẫu lá làm cho toàn bộ mặt lá

dày lên (Hình 3.1b1). Cuống lá cảm ứng tạo sẹo xốp chậm nhất. Mô sẹo bắt đầu từ

hai đầu cuống và đi dọc dần vào trong cuống. Một số mẫu cuống trở nên xanh hơn

và cứng hơn; đồng thời không phát sinh sẹo xốp cũng được ghi nhận.

Trong thời gian từ tuần thứ 6 và thứ 7 sự tăng sinh của sẹo xốp từ mẫu lá trở

nên rất nhanh. Tuy nhiên tiếp tục theo dõi thí nghiệm tới tuần thứ 12 và 16 nhận

thấy rằng mẫu mô sẹo từ cuống lá tăng sinh mạnh nhất trong 3 nguồn mẫu được

khảo sát (dữ liệu không thể hiện). Ngoài ra, thí nghiệm này cũng ghi nhận sự xuất

hiện phôi trên các mẫu cấy củ và lá. Phôi màu trắng sáng với các trạng thái hình cầu

và hình tim là chủ yếu. Tuy nhiên, mẫu cuống lá chưa có hiện tượng này. Hiện

tượng rễ bất định xuất hiện ở cả 3 nguồn mẫu cũng được quan sát từ các khối cầu

nhỏ màu tím li ti trên đám sẹo xốp.

Hình 3.1. Ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy lên khả năng hình thành mô sẹo xốp của cây sâm Ngọc Linh. a, b, c: mô sẹo trên các mẫu cấy cuống lá, lá và củ sâm Ngọc Linh; a1, b1, c1: hình dưới kính hiển vi soi nổi, tương ứng.

Trong việc tạo mô sẹo sâm Ngọc Linh, nồng độ 1 mg/l 2,4-D kết hợp với 0,2

mg/l TDZ đã được thực hiện trên lát cắt củ bởi Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2010).

Song mô sẹo được tạo thành là loại mô sẹo cứng. Đây là các mô sẹo có khả năng

phát sinh cơ quan (chồi, rễ). Còn muốn phát sinh phôi thì phải thông qua một giai

đoạn tạo mô sẹo xốp trung gian. Điều này sẽ khiến quá trình nhân giống in vitro loài

sâm Ngọc Linh bị kéo dài ít nhất là 2 tháng.

Các nguồn mẫu lá, thân, lóng, lá mầm... cũng được dùng để tạo mô sẹo có khả

năng sinh phôi ở nhiều đối tượng khác nhau. Mẫu lá cũng được chứng minh là cảm

ứng mô sẹo tốt hơn mẫu thân ở cây Citrus jambhiri [Savita et al., 2010], Cannabis

sativa L. [Aurelia et al., 2005; Feeney và Punija, 2003]. Tuy nhiên mẫu thân lại

hình thành nhiều mô sẹo hơn mẫu lá mầm và lá non ở cây Citrullus colocynthis

(thuộc họ Bầu bí) [Shasthree et al., 2012]. Ngược lại mẫu rễ cây Cannabis sativa L.

và mẫu lóng cây Acacia mangium cảm ứng mô sẹo kém [Fisse et al., 1981; Xie và

Hong, 2001].

Trong nghiên cứu này, mặc dù mẫu củ là tốt nhất về các chỉ tiêu theo dõi,

song một cây con in vitro cho thông thường 3 - 4 mảnh cấy củ; 5 - 6 mảnh cấy

cuống và 8 - 10 mảnh cấy lá. Cho nên tổng số mô sẹo được tạo ra từ lá nhiều hơn

hẳn so sánh với cuống và củ. Vì vậy, chúng tôi sử dụng nguồn mô sẹo từ lá cho các

thí nghiệm tiếp theo.

3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC MÔI TRƯỜNG KHOÁNG LÊN SỰ HÌNH

THÀNH MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH

Trong nuôi cấy mô, thành phần môi trường khoáng là một trong các yếu tố

quan trọng ảnh hưởng tới sự cảm ứng và tăng sinh tế bào. Tùy loài thực vật và cơ

quan nuôi cấy mà môi trường khoáng được sử dụng khác nhau [Nguyễn Đức Lượng

và Lê Thị Thủy Tiên, 2002]. Trong thí nghiệm này, các mẫu lá sâm Ngọc Linh in

vitro được cắt và cấy trên 6 loại môi trường khoáng khác nhau gồm MS, ½MS,

MS½ , SH, ½SH, SH½. Trong đó, cố định vitamin của môi trường MS cho tất cả

các thí nghiệm. Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả được thể hiện trên Bảng 3.2.

Kết quả cho thấy trên cả 6 môi trường đều có sự hình thành mô sẹo với tỉ lệ và

khả năng tăng sinh khác nhau. Trong đó môi trường SH½ cho hiệu quả tốt nhất đạt

khối lượng tươi 724,67 mg và khối lượng khô 39 mg; tiếp theo là môi trường SH;

các môi trường MS, ½MS và ½SH cho kết quả tương tự nhau; thấp nhất là môi

trường MS½ (Bảng 3.2). Mô sẹo được tạo ra trên môi trường SH và SH cải biên có

màu trắng trong, sáng, xốp, mọc thành đám dày, xung quanh mặt cắt lá và dễ vỡ

vụn. Trong khi trên môi trường MS và MS cải biên, mô sẹo được tạo ra có màu hơi

nâu, xốp, dễ vỡ vụn nhưng kích thước mô sẹo nhỏ hơn (Hình 3.2); đồng thời, chúng

tôi cũng ghi nhận hiện tượng phôi xuất hiện trên bề mặt đám mô sẹo ở trạng thái

cầu, tim với số lượng từ 4 - 10 phôi. Không có phôi xuất hiện trên môi trường SH

và SH cải biên trong thời gian khảo sát.

Hình thái mô sẹo

Cảm ứng tạo mô sẹo (%)

Khối lượng tươi (mg)

Khối lượng khô (mg)

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên khả năng phát sinh mô sẹo xốp từ lá sâm Ngọc Linh Môi trường khoáng

MS½

96

196,00d

18,00c

MS

100

304,33c

23,00bc

½MS

100

262,00c

22,67bc

SH½

100

724,67a

39,00a

SH

100

387,67b

26,00b

½SH

96

378,67b

19,67bc

Nhỏ, màu trắng hơi nâu, xốp, có các đốm tím Nhỏ, màu trắng hơi nâu, xốp, có các đốm tím Nhỏ, màu trắng hơi nâu, xốp, có các đốm màu tím Lớn, màu trắng trong, mọng nước, xốp bở Lớn, màu trắng trong, mọng nước Nhỏ, màu trắng, trong, mọng nước

Ghi chú: Các chữ cái a, b… trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với  = 0,05 theo Duncan’s test.

Thí nghiệm này cho thấy trên các loại môi trường SH hiệu quả tạo mô sẹo cao

hơn môi các môi trường MS (Bảng 3.2). Điều này có thể được giải thích là do tác

động của hàm lượng nitơ trong môi trường khoáng [George et al., 2008]. Nitơ (N)

-) và

là nguyên tố đa lượng cần thiết trong cấu trúc protein và tham gia vào quá trình tạo

+). Việc sử dụng kết hợp cả hai loại ion này còn giúp duy trì độ

thành DNA, RNA. Trong nuôi cấy in vitro, N được cung cấp ở dạng nitrat (NO3

ion ammonium (NH4

+ sử dụng là khác nhau [George et al., 2008].

pH của môi trường nuôi cấy. Tùy loài cây và trạng thái phát triển của mô mà yêu

-/NH4

cầu về tỉ lệ NO3

Trong một số nghiên cứu về sâm Ngọc Linh gần đây, môi trường khoáng MS

thường được sử dụng để nuôi cấy khởi tạo mô sẹo [Dương Tấn Nhựt et al., 2010;

Lê Kim Cương et al., 2012], phát sinh cơ quan hay tái sinh cây hoàn chỉnh [Dương

Tấn Nhựt et al., 2010, Nguyễn Việt Cường et al., 2013]. Trong khi đó, môi trường

khoáng SH lại tỏ ra hiệu quả để nuôi cấy rễ bất định [Hồ Thanh Tâm et al., 2013],

rễ tóc [Hà Thị Mỹ Ngân et al., 2013; Hà Thị Loan et al., 2014] hoặc tạo củ in vitro

[Hoàng Xuân Chiến et al., 2011].

Trên cùng đối tượng mô sẹo sâm Ngọc Linh, Nhut và cộng sự (2009) đã sử

dụng môi trường khoáng MS kết hợp với 1 mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ để cảm ứng

mô sẹo cứng từ lá ex vitro sâm Ngọc Linh. Trong khi đó, môi trường MS½ bổ sung

1 mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ lại là môi trường phù hợp nhất cho việc tăng sinh mô

sẹo cứng từ lá sâm Ngọc Linh ex vitro [Dương Tấn Nhựt et al., 2010]. Cũng năm

2010, khi đánh giá ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau, Dương Tấn Nhựt

và cộng sự cũng đã tìm ra môi trường SH kết hợp với 1 mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ

là tốt nhất cho sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo cứng sâm Ngọc Linh có nguồn gốc

từ củ in vitro.

Sự xuất hiện phôi trên các môi trường MS, ½MS, MS½ cũng có thể được giải

thích là do ảnh hưởng của hàm lượng nitơ tổng và hoạt động của các kênh ion.

Ngay từ cuối thế kỉ thứ 20, nhiều tác giả đã chứng minh sự cảm ứng phát sinh phôi

vô tính và giai đoạn đầu của sự hình thành phôi vô tính thực vật có liên quan tới sự

hấp thu các nguyên tố khoáng từ môi trường nuôi cấy [Dussert et al., 1995;

+ tối ưu trong nuôi

Fisichella et al., 2000]. Theo quan điểm của Choi và Woong (1997) ảnh hưởng của

+ liên quan tới sự xuất hiện phôi. Nồng độ ion NH4

nồng độ NH4

cấy phôi cây Panax gingseng là khoảng 20 mM trong môi trường MS còn nếu nồng

độ cao 60 mM chỉ làm thúc đẩy sự tạo ra mô sẹo có khả năng phát sinh phôi; nồng

độ thấp hơn lại thúc đẩy rễ bất định hình thành. Ngoài ra, hàm lượng ion K+ và Ca2+

cũng là nguyên nhân tạo phôi. Ion K+ liên quan đến bơm proton và trong sự vận

chuyển gián tiếp các chất hòa tan [Briskin và Hanson, 1992] có thể là yếu tố giới

hạn sự phát sinh phôi vô tính. Vì vậy, trong nuôi cấy huyền phù cây cà rốt, hàm

lượng K thấp trong môi trường nuôi cấy làm hạn chế sự hình thành phôi vô tính mà

không ảnh hưởng đến sự tăng trưởng tế bào trong khi hàm lượng K cao làm tăng

mạnh số lượng phôi [Brown et al., 1976]. Đối với Ca2+ hoạt động như là một tín

hiệu thứ cấp trong con đường truyền tín hiệu kích thích ngoại bào bằng cách gắn với

calmodulin hay các protein gắn calcium khác để kiểm soát nhiều đáp ứng sinh lý tế

bào [Bush, 1995]. Ở cây cà rốt, sự phân cực hình thái của các cụm tế bào sinh phôi

kết hợp với Ca2+ nội bào tự do [Timmers và Schel, 1991]. Hơn nữa, sự gia tăng hàm

lượng CaCl2 trong môi trường làm cảm ứng hình thành số lượng phôi nhiều hơn

[Silva và Ricardo, 1992; Kaul et al., 2014].

Vì vậy, chúng tôi sử dụng môi trường khoáng SH½ để nhân nhanh nguồn mô

sẹo chuẩn bị cho thí nghiệm tạo phôi trên môi trường MS tiếp theo.

Hình 3.2: Ảnh hưởng của các môi trường khoáng lên khả năng hình thành mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh. a, b, c, d, e, f : mẫu mô sẹo cảm ứng từ lá trên các môi trường tạo mô sẹo theo thứ tự MS½, MS, ½MS, SH½, SH, ½SH.

3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ 2,4-D KẾT HỢP VỚI 0,5 mg/l NAA VÀ

0,2 mg/l KIN LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO XỐP

SÂM NGỌC LINH

Auxin là hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật có vai trò quyết định tới sự

cảm ứng mô sẹo có khả năng phát sinh phôi và phôi. Loại auxin và nồng độ đều gây

ảnh hưởng tới sự phát triển cũng như sự phát sinh hình thái của phôi vô tính ở một

số loài [Chengalrayan et al., 1997; Mary và Jayabalan, 1997; Shahana và Gupta,

2002; Mandal và Gupta, 2003; Junaid et al., 2006]. Trong 2 loại auxin, nồng độ kết

hợp tạo phôi của NAA (0,5 mg/l) và 2,4-D (1 mg/l) đã được nghiên cứu trước đây

trên đối tượng mô sẹo sâm Ngọc Linh và Kin ở nồng độ 0,2 mg/l cũng được khảo

sát [Nhut et al., 2012a]. Nghiên cứu của chúng tôi làm trọn vẹn hơn bằng cách khảo

sát ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D kế hợp với Kin (0,2 mg/l) và NAA (0,5 mg/l) đã

được nghiên cứu trước đó. Loại mẫu cấy, kiểu gene và nồng độ 2,4-D có vai trò cực

kỳ quan trọng trong sự hình thành mô sẹo hoặc phôi [Addae-Frimpomaah et al.,

2014].

Sau 12 tuần nuôi cấy các cụm mô sẹo, kết quả cho thấy tại nồng độ 1 mg/l 2,4-

D số lượng phôi/mẫu và tỉ lệ mẫu cảm ứng phôi đạt cao nhất (16 và 70%, tương

ứng) (Bảng 3.3); đồng thời cụm phôi gồm 10-15 phôi ở dạng hình cầu, hình tim và

hình thủy lôi phân bố rải rác trên khối mô sẹo cũng được ghi nhận (Hình 3.3). Đối

chứng không bổ sung 2,4-D, mô sẹo chuyển từ màu trắng trong sang màu vàng,

vàng đậm; nhiều mô sẹo hóa nâu và chết một phần mô sẹo trên cụm mô sẹo chính.

Tăng dần nồng độ 2,4-D khối lượng mô sẹo và số phôi hình thành cũng tăng dần.

Tuy nhiên, số phôi ít và ở dạng chủ yếu là hình cầu; còn màu nâu của mô sẹo giảm

dần. Ở nồng độ 1,5 và 2 mg/l 2,4-D, mô sẹo tăng sinh rất nhanh ngay sau 2 tuần

nuôi cấy, ban đầu có dạng bở, xốp và sau đó cứng đặc dần, màu chuyển sang trắng

xanh và sau đó chuyển sang màu vàng nâu. Ở hai nghiệm thức này không ghi nhận

được sự xuất hiện của bất kỳ trạng thái phôi nào trên khối mô sẹo.

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D (0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,5; 2 mg/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA và 0,2 mg/l Kin lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh

Đặc điểm

2,4-D (mg/l)

Số phôi/mẫu

Tỉ lệ mẫu tạo phôi (%)

Khối lượng tươi (mg)

-

-

223,00h

0

6,67

0,67d

321,00g

0,2

13,33

1,67d

372,3f

0,4

22,33

7c

467,67e

0,6

46,67

10b

506,67d

0,8

1

70

16a

555,00c

-

-

745,67b

1,5

-

-

907,67a

2

Mô sẹo màu nâu, một số bị mô sẹo bị chết hoặc chết một phần Mô sẹo kích thước nhỏ, tăng sinh chậm, phôi hình cầu Mô sẹo kích thước nhỏ, có màu nâu vàng, phôi hình cầu, tim Mô sẹo có kích thước nhỏ, trắng đục, hơi cứng phôi hình cầu, tim Mô sẹo có kích thước nhỏ, màu trắng xanh, xốp, phôi hình cầu, tim, thủy lôi Mô sẹo có kích thước nhỏ, màu trắng xanh, xốp, phôi xuất hiện rải rác hình cầu, tim, thủy lôi và hai lá mầm Mô sẹo có kích thước lớn màu trắng, xanh, cứng, chắc Mô sẹo kích thước lớn nhất, màu vàng nâu, rắn, chắc

Ghi chú: các chữ cái a, b,… trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với  = 0,05 theo Duncan’s test. Dấu “-“: mẫu chết hoặc không cảm ứng tạo phôi.

Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng 2,4-D gây tác động kém lên sự hình thành

phôi vô tính ở nồng độ thấp (0,2 - 0,8 mg/l) thay vào đó là sự tăng sinh khối mô sẹo.

Như đã nêu, tác dụng 2,4-D là phản biệt hóa tế bào, tạo sẹo, tạo phôi chuẩn bị cho

sự phát sinh hình thái tiếp theo từ mô sẹo. Nồng độ thấp, 2,4-D khiến thời gian cảm

ứng tạo mô sẹo kéo dài và sẹo phát triển chậm. Điều này có thể là nguyên nhân

khiến sự biệt hóa tạo phôi kém, dẫn đến số lượng phôi ít. Nồng độ 2,4-D cao, đẩy

mạnh quá trình tạo mô sẹo do đẩy mạnh quá trình tổng hợp DNA và RNA, đặc biệt

là mRNA [Nguyễn Thị Liễu et al., 2011].

Trong môi trường nuôi cấy đã sử dụng 0,5 mg/l NAA là một loại auxin nên

khi bổ sung 2,4-D ở nồng độ cao khiến lượng auxin tổng tăng cao; do đó ức chế quá

trình tạo phôi. Nồng độ 2 mg/l 2,4-D cũng được sử dụng để tạo mô sẹo sâm Ngọc

Linh [Mai Trường et al., 2013] song nồng độ 3 mg/l lại ức chế quá trình này

[Nguyễn Thị Liễu et al., 2011]. Hiệu quả này là do sự ổn định cao của 2,4-D và

hiệu quả chống chịu mạnh với sự suy thoái enzyme kết hợp ở tế bào thực vật

[Moore, 1989]. Theo quan điểm cuả Aboshama và cộng sự (2011), trên cây Cajanus

cajan điều này là do quẩn thể tế bào có khả năng phát sinh phôi bị giảm do sự gián

đoạn và sự kéo dài làm khả năng phát sinh phôi bị mất. Ứng dụng điều này, nồng độ

2,4-D cao đã được sử dụng để tạo sẹo trên nhiều đối tượng cây khác gồm cây khoai

lang (4 mg/l 2,4-D: sẹo cứng, màu xanh sáng) [Addae-Frimpomaah et al., 2014];

mía đường - một loài cây rất khó tạo mô sẹo (13,5 µM 2,4-D) [Alcantara et al.,

2014]; dầu mè Jatropha curcas L. (3 mg/l 2,4-D kết hợp với 1 mg/l BAP)

[Rampadarath et al., 2014].

Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự phát sinh phôi vô tính ở một số loài thực vật khác

cũng được nghiên cứu. Nồng độ 2,5 mg/l 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/l Kin phù hợp

phát sinh phôi vô tính sơ cấp và thứ cấp cây Rumex vesicarius L. [Kakarla et al.,

2014]. Ở lúa gạo và cải, sự trưởng thành của phôi vô tính cũng được thành lập trên

môi trường MS có bổ sung 2,4-D và Kin [Verma et al., 2011; Siong et al., 2011]. Ở

cây đậu tương Glycine max L. Merrill, nồng độ 25 mg/l 2,4-D thúc đẩy sản xuất số

lượng đáng kể phôi vô tính song chỉ có 5% trong số đó là phôi bình thường

[Hartweck, 1988].

Hình 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh. a, b, c, d, e, f, g, h: mô sẹo và phôi trên môi trường MS bổ sung 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,5; 2 mg/l 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/l NAA và 0,2 mg/l Kin; i: hình soi nổi tương ứng với a gồm mô sẹo có khả năng phát sinh phôi (mũi tên bên phải) và một phần mô sẹo bị chết (mũi tên bên trái); k: hình soi nổi tương ứng với f; l: hình soi nổi tương ứng với h; m: phôi sơ cấp và thứ cấp hình thành từ mô sẹo trong hình l được chuyển sang môi trường đối chứng (không có 2,4-D) sau 8 tuần nuôi cấy.

Nhằm kiểm tra ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D lên quá trình phát sinh phôi từ

các mô sẹo có khả năng phát sinh phôi, các cụm mô sẹo thu được từ cả 8 nghiệm

thức nồng độ 2,4-D được chuyển sang môi trường đối chứng (không có 2,4-D). Kết

quả sau 8 tuần cho thấy, các cụm mô sẹo đều có sự hình thành phôi (chủ yếu là hình

cầu) với số lượng khác nhau (Hình 3.3m).

Như vậy, trong nghiên cứu này, nồng độ 1 mg/l 2,4-D trên môi trường MS bổ

sung 0,5 mg/l NAA và 0,2 mg/l Kin là phù hợp nhất lên sự hình thành và tần suất

phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh.

3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ ĐIỀU KIỆN

CHIẾU SÁNG LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO XỐP

SÂM NGỌC LINH

3.4.1. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (đặc, lỏng tĩnh, lỏng lắc) lên sự

hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh

Sau 12 tuần nuôi cấy mô sẹo có khả năng phát sinh phôi của sâm Ngọc Linh,

kết quả thu được cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về các chỉ tiêu theo dõi (Bảng

3.4.1).

Trạng thái vật lý của môi trường và điều kiện khí oxy hòa tan có ảnh hưởng

tích cực tới sự cảm ứng tạo phôi và tần suất phát sinh phôi từ mô sẹo xốp ở thí

nghiệm này. Cụ thể, trên môi trường lỏng tĩnh, khối mô sẹo tăng sinh rất chậm so

với trong môi trường lỏng lắc và trên môi trường thạch rắn (Bảng 3.4.1); đồng thời,

mô sẹo cũng hóa màu nâu sáng và chết sau 12 tuần nuôi cấy. Ngược lại, trên môi

trường thạch rắn, ghi nhận được sự tăng sinh rất mạnh của cụm mô sẹo kể từ tuần

thứ 8 cho tới thứ 12. Cùng với đó là sự phát triển các cấu trúc phôi trên bề mặt và cả

bên trong các cụm mô sẹo được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi (Hình 3.4.1). Đặc

biệt, các chỉ tiêu theo dõi đều nổi bật khi mô sẹo được nuôi cấy trong điều kiện lỏng

lắc với tốc độ 100 vòng/phút. Mô sẹo chuyển sang màu hơi vàng xanh, phôi sớm

dạng hình cầu được tạo ra trên bề mặt và rời ra khỏi khối sẹo do ảnh hưởng của lực

ly tâm. Các phôi cầu rời ra này, sau 8 tuần mọc ra các cực rễ và tới tuần thứ 10 sự

hình thành của lá mầm màu hơi xanh mới được ghi nhận. Mặc dù tỉ lệ phát sinh

phôi trong trường hợp này là trên 100%, các phôi ghi nhận được phần lớn chỉ ở

dạng cầu, tim (Hình 3.4.1)

Bảng 3.4.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh

Số phôi/mẫu

Đặc điểm phôi

Điều kiện nuôi cấy

Tỉ lệ mẫu tạo phôi (%)

Khối lượng tươi (mg)

Đặc

70

554,33b

18

Lỏng tĩnh

-

255,00c

-

Lỏng lắc

100

726,00a

55

Phôi hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Mẫu chết Phôi hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm

Ghi chú: Các chữ cái a, b… trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với  = 0,05 theo Duncan’s test. Dấu “-“: mẫu chết hoặc không hình thành phôi.

Sau 12 tuần nuôi cấy, môi trường lỏng MS có bổ sung thêm 1 mg/l 2,4-D;

0,5 mg/l NAA và 0,2 mg/l Kin đã không chỉ làm tăng số lượng phôi mà còn thúc

đẩy quá trình hình thành phôi. Nguyên nhân được giải thích là do các tế bào trong

môi trường lỏng tiếp xúc trực tiếp với môi trường dinh dưỡng [Duval et al., 1995]

và sự đảo trộn thông khí giúp oxi được cung cấp nhiều hơn cho các mô [Mehrotra et

al., 2007]. Do đó, so với ban đầu, thời gian nuôi cấy được rút ngắn lại gấp 2 lần so

với nuôi cấy trên môi trường đặc. Kết quả của nghiên cứu này cũng phù hợp với

báo cáo của Mai Trường và cộng sự (2014) khi khảo sát sự hình thành phôi vô tính

sâm Ngọc Linh trong môi trường lỏng lắc nhưng sử dụng môi trường B5 được bổ

sung thêm 3 mg/l IBA.

Hình 3.4.1. Mô sẹo và phôi trong điều kiện nuôi cấy lỏng lắc (a, a1); lỏng tĩnh (b, b1) và đặc (c, c1).

Ghi nhận này tương tự với nghiên cứu của Ibraheem và cộng sự (2013) trên

đối tượng cây cọ dầu Phoenix dactylifera L. Zaghlool cũng chứng tỏ thời gian phát

sinh phôi vô tính trên môi trường lỏng ngắn hơn trên môi trường đặc thông thường

(6 và 18 tuần tương ứng); đồng thời số lượng phôi vô tính trong nuôi cấy lỏng

huyền phù mô sẹo tăng 6-16 lần so với môi trường đặc.

3.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô tính từ

mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh

Sau 3 tháng trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l 2,4-D; 0,5 mg/l NAA và 0,2

mg/l Kin ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng (16 giờ/ngày) hay để tối hoàn toàn lên

sự hình thành phôi vô tính có nguồn gốc từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh được ghi

nhận trên Bảng 3.4.2.

Quá trình phát sinh phôi vô tính là một quá trình phức tạp, chịu ảnh hưởng của

nhiều yếu tố. Vì một yếu tố thay đổi có thể làm ảnh hưởng tới nhiều thông số khác;

do đó, việc xác định yếu tố nào có vai trò quan trọng hơn rất khó. Trong số các

thông số về môi trường nuôi cấy thì ánh sáng có tác động tích cực tới sự hình thành

phôi vô tính [Manrique và Roca, 1987]. Thí nghiệm này ghi nhận sự hình thành mô

sẹo có ở cả hai điều kiện chiếu sáng; song các chỉ tiêu về phôi thì rất khác biệt sau

12 tuần nuôi cấy.

Bảng 3.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh

Ngoài sáng

Trong tối

Điều kiện chiếu sáng Chỉ tiêu theo dõi Khối lượng tươi (mg) Hình thái phôi Số lượng phôi Tỉ lệ mẫu tạo phôi (%) Tỉ lệ ra rễ (%)

554,67 ± 6,11 Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm 17,33 ± 2,52 70 0

487,00 ± 7,21 Hình cầu, hình tim 2,00 ± 1,00 8 100

Ghi chú: Giá trị trung bình ± SE cho các thông số khối lượng tươi và số lượng phôi.

Cụ thể, trong điều kiện tối hoàn toàn, sau 3 tuần chuyển vào tủ tối, các mô sẹo

chuyển sang màu vàng sáng. Mô sẹo nhân lên các cấu trúc tế bào hỗn độn, không

quan sát thấy bất kì trạng thái phôi nào cho tới tuần thứ 10. Thay vào đó là sự phát

triển của rễ bất định từ các nốt cầu trên khối mô sẹo ban đầu (Hình 3.4.2). Sau 12

tuần nuôi cấy, tìm thấy được một vài phôi hình cầu trên khối mô sẹo mới hình

thành.

Trong khi đó, nguồn mẫu được nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng cho thấy

sự biệt hóa tạo phôi rõ rệt. Trên các nốt hình cầu màu xanh có từ mô sẹo xốp ban

đầu, có tới 70% mẫu mô sẹo được nuôi cấy được quan sát có sự hình thành phôi ở

các trạng thái khác nhau bao gồm hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và hai lá mầm.

Các phôi có đặc điểm dính liền thành cụm phôi với các khối cầu quay ra ngoài và có

màu sáng hơn nổi bật trên đám sẹo xốp. Đồng thời, khối lượng mô sẹo có khả năng

phát sinh phôi và phôi cũng tăng (Bảng 3.4.2).

Hình 3.4.2. Mô sẹo trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày (a, a1) và tối hoàn toàn (b, b1)

Nghiên cứu gần đây về sự phát sinh phôi trực tiếp từ các nguồn mẫu cấy khác

nhau ở cây sâm Ngọc Linh của Vũ Thị Hiền và cộng sự (2014) báo cáo mẫu cuống

lá có tỉ lệ sinh phôi cao đạt là 86,33% môi trường MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D khi

chiếu sáng16h/ngày trong khi mẫu lá cảm ứng tạo phôi tốt nhất (92%) trong tối.

Chiếu sáng 16h/ngày cũng đã thúc đẩy tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào từ rễ cây sâm

Ngọc Linh trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l BA và để tối

hoàn toàn trên MS bổ sung 1 mg/l 2,4-D và 0,1 mg/l TDZ [Nhut et al., 2012b]. Kết

quả này tương tự với nghiên cứu trên cây Eucalyptus khi nuôi cấy trong điều kiện

chiếu sáng 16 giờ/ngày và 8 giờ để tối [Prakash và Gurumurthi, 2005].

Trong nghiên cứu này, rễ bất định cũng được quan sát thấy khi mô sẹo đặt

trong tối hoàn toàn. Rễ hình thành có màu vàng sáng, mảnh, dài khoảng 1 - 2 cm

mọc thành cụm nhỏ, đồng đều, gồm 5 - 7 rễ. Sự hình thành rễ có thể giải thích là do

ảnh hưởng của NAA kết hợp với điều kiện tối. Quan sát này tương tự như của Nhut

và cộng sự (2012b) khi nghiên cứu khả năng sinh mô sẹo từ lát cắt mỏng rễ chính

của sâm Ngọc Linh. Điều kiện tối thông thường được sử dụng để cảm ứng tạo mô

sẹo các loài thuộc chi Panax từ rễ, lá, đế hoa và trụ dưới lá mầm [Arya et al., 1993;

Gao et al., 2005].

Sự phát triển phôi vô tính có thể bị ảnh hưởng bởi điều kiện chiếu sáng khác

nhau. Cây họ cà cần chiếu sáng hoàn toàn [Gleddie et al., 1983], cây sân sam Nauy

cần điều kiện tối [Verhagen and Wann, 1989]; cây Manihot glaziovii bị ức chế quá

trình tạo phôi khi chiếu sáng hoàn toàn [Joseph et al., 2000]. Ở cây Arabidopsis

thaliana và cây Cydonia oblonga Mill (quince), ánh sáng đỏ (ở cường độ 650/750

nm) thúc đẩy một mức chuyển đổi cao từ các tiền phôi vô tính lên các trạng thái

phát triển cao hơn, trong khi ánh sáng trắng lại thúc đẩy sự hình thành cây

[Kaldenhoff et al., 1994; Onofrio et al., 1998]. Đối với cây lan hồ điệp

(Phalaenopsis amabilis) thì ánh đèn huỳnh quanh 1U màu trắng cho tỉ lệ phát sinh

phôi và số lượng phôi cao nhất [Nguyễn Bá Nam et al., 2012].

Như vậy, điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày và nuôi cấy trên môi trường lỏng

lắc là phù hợp cho sự hình thành và trưởng thành của phôi vô tính sâm Ngọc Linh

được hình thành từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh.

3.5. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ TIỀN CHẤT SINH TỔNG HỢP

POLYAMINE LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO XỐP

SÂM NGỌC LINH

3.5.1. Ảnh hưởng của Arginine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp

sâm Ngọc Linh

Trên môi trường bổ sung Arg với các tỉ lệ khác nhau, sau 12 tuần nuôi cấy, kết

quả thu được cho thấy Arg gây hiệu quả thấp lên sự phát sinh phôi vô tính so với đối

chứng (Bảng 3.5.1, Hình 3.5.1).

Bảng 3.5.1. Ảnh hưởng của Arg lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh

Đặc điểm phôi

Arg (µM)

Tỉ lệ mẫu tạo phôi (%)

Số phôi/mẫu

0 10 50 100 150 200

70,00 10,00 16,67 20,00 23,33 13,33

16,67b 4,00d 6,00cd 8,00c 22,33a 13,67b

Khối lượng tươi (mg) 534,67d 584,67c 626,33c 680,00b 768,33a 688,33b

Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm

Ghi chú: Các chữ cái a, b… trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với  = 0,05 theo Duncan’s test.

Kết quả cho thấy, tất cả các nồng độ Arg đều cho tỉ lệ mẫu phát sinh phôi và số

phôi/mẫu thấp hơn so với đối chứng. Các chỉ tiêu thu được trên môi trường bổ sung

150 µM Arg cho tỉ lệ mẫu tạo phôi cao hơn trong nhóm nồng độ được khảo sát, đạt

23,33% mẫu phát sinh phôi, số lượng phôi là 22,33 phôi/mẫu và khối lượng tươi của

mẫu đạt 768,33 mg (Bảng 3.5.1). Song so sánh với đối chứng, tỉ lệ mẫu tạo phôi, số

phôi trên mẫu đều thấp hơn đối chứng; trong đó tỉ lệ phát sinh phôi giảm 3 lần (Bảng

3.5.1). Ở các nồng độ được khảo sát, Arg cho thấy khả năng kích thích tạo mô sẹo hơn

là tạo phôi. Điều này khiến cho khối lượng của mẫu tăng.

Hình 3.5.1. Ảnh hưởng của Arg lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh. a, b, c, d, e, f: mẫu mô sẹo trên môi trường bổ sung Arg ở các nồng độ 0, 10, 50, 100, 150 và 200 µM; a1, b1, c1, d1, e1, f1: hình chụp soi nổi tương ứng với a, b, c, d, e, f.

Kết quả này tương tự nghiên cứu của Nakagawa và cộng sự (2006) trên cây

Cryptomeria japonica, nồng độ 12,3 mM Arg đã ức chế mạnh quá trình phát sinh phôi.

Ở nồng độ Arg (200 µM) cao, mô sẹo bị ức chế cả khả năng tăng sinh và tạo phôi.

Trong thí nghiệm này, sau 12 tuần nuôi cấy, mô sẹo có hiện tượng vàng nâu và một số

mô sẹo hóa đen hoàn toàn. Kết quả này khác nghiên cứu của Santos và cộng sự (1993)

khi nồng độ 200 µM Arg đã làm tăng cường tới 25% sự cảm ứng phôi vô tính được

quan sát ở cây Zea mays L. Tuy nhiên, nồng độ cao 50 mg/l Arg có tác dụng kép khi

vừa thúc đẩy quá trình tạo mô sẹo vừa gây ra lượng đáng kể số phôi được tạo thành ở

cây Saccharum sp. [Nieves et al., 2008]. Ngược lại nồng độ 0,5 mM Arg kết hợp với

6,8 µM 2,4-D vừa làm thúc đẩy sự tạo phôi vô tính, vừa làm tăng khả năng hình thành

chồi ở cây mía đường Sacchrum officinarum L. [Asad et al., 2007].

3.5.2. Ảnh hưởng của Ornithine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp

sâm Ngọc Linh

Đối với Orn, nồng độ 10 - 200 µM được thêm vào môi trường cảm ứng phôi vô

tính đã cho kết quả tương tự như Arg. Sau 12 tuần nuôi cấy, các tỉ lệ phát sinh phôi và

số phôi/mẫu đều giảm từ 3,5 (150 µM Orn) tới 10,49 lần (10 µM Orn) so với đối

chứng. Nồng độ 150 µM Orn cho tỉ lệ mẫu tạo phôi, số phôi/mẫu và khối lượng mẫu là

cao nhất trong số nồng độ được khảo sát đạt 20%, 12,33 và 721 mg, tương ứng. Hình

thái phôi ghi nhận được gồm có đa số là hình cầu, hình tim. Không chỉ số lượng phôi

thấp hơn, kích thước phôi cũng nhỏ hơn so với đối chứng (Hình 3.5.2). Tất cả các

nghiệm thức đều ức chế tạo phôi, thể hiện ở cả ba chỉ tiêu khối lượng tươi, tỉ lệ mẫu tạo

phôi và số phôi/mẫu đều giảm; thay vào đó là gia tăng khối lượng mô sẹo có khả năng

phát sinh phôi (Bảng 3.5.2).

Đặc điểm phôi

Tỉ lệ mẫu tạo phôi (%)

0 10 50

70,00 6,67 10,00

Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm

Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm

16,67

100

Bảng 3.5.2. Ảnh hưởng của Orn lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh Khối lượng Orn tươi (mg) (µM) 543,00e 571,00d 593,33d 627,00c 721,00a 654,00b

Số phôi/mẫu 15,67a 3,33d 5,67cd 7,67c 12,33b 5,67cd

20,00 13,33

150 200

Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Ghi chú: Các chữ cái a, b… trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với  = 0,05 theo Duncan’s test.

Trong tế bào thực vật, amino acid có vai trò kích thích tế bào sinh trưởng và phát

triển nhanh hơn; đồng thời chúng cũng được chuyển hóa rất nhanh trong cơ thể thực

vật, đặc biệt là ở dạng nitơ hữu cơ khử [Grimes và Hodges, 1990]. Do đó, bổ sung

amino acid vào môi trường nuôi cấy là giúp tăng nồng độ nitơ hữu cơ cho tế bào sử

dụng. Amino acid còn có tác dụng cải thiện việc phát sinh phôi đã được báo cáo ở một

số loài thực vật [Wang et al., 2002], tuy nhiên, hiệu quả cao hay thấp còn phụ thuộc

vào loài cây khác nhau. Một số amino acid gần đây được quan tâm như Proline, Arg

hay Orn. Trong nghiên cứu này, cả Arg và Orn là những tiền chất sinh tổng hợp PA đã

được sử dụng như một nguồn nitơ hữu cơ đã cho thấy hiệu quả chủ yếu lên sự tăng

sinh khối mô sẹo xốp hơn là thúc đẩy hình thành phôi vô tính.

Cả Orn và Arg đều có vai trò chính trong khung Carbon để tạo nên Put nhờ hoạt

động của ADC và ODC, tương ứng. Orn có ảnh hưởng tích cực lên sự phát triển của

cụm tiền phôi PEM trong khi cùng nồng độ đó với Arg lại ức chế quá trình này ở cây

Cryptomeria japonica; nên khi chuyển sang môi trường cảm ứng phôi trưởng thành thì

chỉ các PEM được nuôi cấy trước đó trên môi trường có 12,3 mM Orn mới hình thành

phôi vô tính với tần suất và số lượng phôi cao [Nakagawa et al., 2006]. Môi trường

nuôi cấy có bổ sung 1,5 mM Orn cũng làm thúc đẩy sự hình thành các mô sẹo có khả

năng phát sinh phôi ở cây Zea mays L.; đồng thời hoạt động của hai enzyme ADC và

ODC cũng được tăng cường [Santos et al., 1993].

Hình 3.5.2. Ảnh hưởng Orn lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh. a, b, c, d, e, f: mẫu mô sẹo trên môi trường bổ sung Orn ở các nồng độ 0, 10, 50, 100, 150 và 200 µM; a1, b1, c1, d1, e1, f1: hình chụp soi nổi tương ứng với a, b, c, d, e, f.

Qua thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng Arg và Orn đều không thích hợp cho

việc tạo phôi vô tính sâm Ngọc Linh.

3.6. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THUỘC NHÓM

POLYAMINE LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO XỐP

SÂM NGỌC LINH

3.6.1. Ảnh hưởng của Putrescine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp

sâm Ngọc Linh

Sau 12 tuần nuôi cấy, ảnh hưởng của Put được thể hiện trên Bảng 3.6.1.

Trên môi trường bổ sung Put ở các nồng độ khác nhau, tất cả các nghiệm thức

đều cho thấy sự cảm ứng tạo phôi cao. Tỉ lệ mẫu tạo phôi, số phôi/mẫu và khối lượng

tươi của mẫu cấy tăng dần trên môi trường có bổ sung 10 µM, 50 µM đạt 75%, 26,33

phôi/mẫu, 662,67 mg; 84%, 44,33 phôi/mẫu và 748,33 mg; tương ứng. Trên môi

trường bổ sung 100 µM Put, các chỉ tiêu thu được cao nhất đạt 90% mẫu phát sinh

phôi, 64,33 phôi/mẫu và 890,33 mg khối lượng tươi (Bảng 3.6.1). Ở nghiệm thức này,

khối lượng tươi của của mẫu tăng gấp 1,64 lần, tỉ lệ phát sinh phôi gấp 1,31 lần và số

phôi/mẫu gấp 3,11 lần so với đối chứng (Bảng 3.6.1). Ở nồng độ Put cao (150 và 200

µM), sự hình thành phôi vô tính và tỉ lệ phát sinh phôi đều giảm xuống nhưng vẫn cao

hơn đối chứng (Bảng 3.6.1). Sự tăng số lượng phôi đi kèm với sự tăng sinh khối mô

sẹo có khả năng phát sinh phôi ở sâm Ngọc Linh trong nghiên cứu này tương tự với

nghiên cứu của Ananya và cộng sự (2009) trên cây Momordica charatia L. Tại nồng

độ 1 mM Put vừa làm tăng khối lượng tươi của cụm mô sẹo xốp (gấp 5 lần) vừa tăng

số lượng phôi vô tính tạo thành (gấp 2,5 lần) so với môi trường không có loại diamine

này.

Bảng 3.6.1. Ảnh hưởng của Put lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh

Đặc điểm phôi

Put (µM)

Số phôi/mẫu

Khối lượng tươi (mg)

0 10 50

Tỷ lệ mẫu tạo phôi (%) 70,00 80,00 86,67

20,67c 26,33c 44,33b

542,67d 662,67c 748,33b

64,33a

890,33a

100

93,33

150 200

86,67 83,33

42,00b 23,67c

864,67a 645,00d

Phôi hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Phôi hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Phôi hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Phôi hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm, cây Phôi hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Phôi hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm

Ghi chú: Các kí tự khác nhau (a,b,…) trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức  = 0,05 theo phép thử Duncan.

Trong thí nghiệm này, các phôi trên môi trường có Put đều có màu sáng và bao

gồm các trạng thái phôi khác nhau. Các khối hình cầu sáng nằm trên các khối mô sẹo

bắt đầu phát triển thành phôi hình cầu sau 2 tuần nuôi cấy cũng được ghi nhận. Sau 4

tuần nuôi cấy, phôi chuyển sang trạng thái hình tim và thủy lôi. Sau 12 tuần nuôi cấy,

các giai đoạn phôi khác nhau gồm hình thủy lôi, hai lá mầm, chồi và kể cả các phôi thứ

cấp đều được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi (Hình 3.6.1). Phôi có kích thước lớn,

đồng đều. Một số phôi sau khi trải qua giai đoạn hai lá mầm, mọc thành cây hoàn chỉnh

có xu hướng tách khỏi khối mô sẹo xốp và phát triển độc lập như một cây con khỏe

mạnh với đầy đủ lá, thân, rễ củ trên môi trường nuôi cấy. Sự phát triển chồi, cây ở

nghiên cứu này tương tự với Bais và cộng sự (2000). Tác giả này cho rằng 40 mM Put

có hiệu quả cao nhất lên số lượng chồi và chiều cao chồi cây Cichorium intybus cv.

Lucknow.

Hình 3.6.1. Ảnh hưởng Put lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh. a, b, c, d, e, f: mẫu mô sẹo trên môi trường bổ sung Put ở các nồng độ 0, 10, 50, 100, 150 và 200 µM; a1, b1, c1, d1, e1, f1: hình chụp soi nổi tương ứng với a, b, c, d, e, f.

Tại nồng độ 150 và 200 µM Put, khả năng sinh phôi của mẫu mô sẹo giảm, song

vẫn cao hơn so với đối chứng (Bảng 3.6.1). Trong khi ở nồng độ 150 µM Put kết hợp

với GA3 (50 - 150 µM) cho hiệu quả tốt nhất trong cảm ứng phát sinh phôi vô tính ở ở

cây Zea mays L. (Joshi, 2010). Trong nuôi cấy phôi cây Melia azedarach, có xuất hiện

các phôi hai lá mầm bất thường trên môi trường không có Put. Điều này được khắc

phục khi cấy phôi trên môi trường có bổ sung chất này. Put được ghi nhận còn có vai

trò quan trọng trong sự hình thành phôi thứ cấp.

Tiburcio và cộng sự (1990) báo cáo rằng diamine Put là tiền thân của một số họ

Alkaloid. Trong tế bào thực vật, có hai con đường chuyển hóa Put nhờ hai ezyme quan

trọng cho tổng hợp Put là ADC hoặc ODC. Hoạt động của ADC và ODC phụ thuộc

vào trạng thái vật lý và điều kiện nuôi cấy. Trong khi ADC xuất hiện trong các tế bào

mở rộng, các quá trình trao đổi chất thứ cấp cùng đáp ứng stress thì ODC lại có liên

quan tới sự phân chia tế bào và sự tăng trưởng của các mô [Slocum et al., 1984; Evan

và Malmberg, 1989]. Ở một số loài thực vật, Put bị methyl hóa bởi N-

methyltransferases (PMT), sử dụng SAM (S-adenosylmethionine) như một tiền chất

cho Methyl. Vai trò của Put trong tế bào thực vật được ghi nhận ở quá trình phân chia

tế bào khi nuôi cấy phôi ở cây Pinus oocarpa, Pinus patula [Feirer, 1995]. Nồng độ Put

cao cũng có liên hệ với sự giảm tốc độ tăng trưởng của tế bào mô sẹo của cây

Nicotiana tabacum [Rastogi và Davies, 1991] và huyền phù cây Pinus taeda [Silveira

et al., 2004]. Cảm ứng mô sẹo phát sinh phôi đạt hiệu quả cao khi thêm 2 mg/l Put kết

hợp với 9,0 µM 2,4-D trong khi nồng độ Put cao hơn (7, 10, 12, 15 mg/l) hoặc môi

trường không có Put chỉ tạo ra loại mô sẹo màu trắng trong không có khả năng phát

sinh phôi ở loài cây thông Pinus gerardiana Wall [Ravindra et al., 2007]. Thêm vào

Put ngoại sinh ở nồng độ cao (1 mM) trong môi trường nuôi cấy huyền phù cây

Araucaria angustifolia đã làm tăng nồng độ Put nội sinh, kết quả là làm tăng số lượng

các phôi vô tính; tuy nhiên, không ghi nhận được sự tăng có ý nghĩa nào của Spd và

Spm nội sinh [Silveira et al., 2006]. Trong khi đó ở nồng độ 0,5 mg/l Put ngoại sinh đã

cải thiện sự phát sinh phôi vô tính cây bông vải - một loại cây rất khó phát sinh phôi vô

tính [Hamidou et al., 2005, Kumar et al., 2013].

3.6.2 Ảnh hưởng của Spermidine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp

sâm Ngọc Linh

Ảnh hưởng của Spd được trình bày trong Bảng 3.6.2. Trên môi trường MS, bổ

sung Spd ở nồng độ thấp kết hợp với 1 mg/l 2,4-D, 0,5 mg/l NAA và 0,2 mg/l Kin,

các mẫu mô sẹo được cảm ứng rất nhanh. Chỉ 3 tuần sau nuôi cấy đã xuất hiện các

chấm phôi cầu, số lượng phôi tăng dần lên, các phôi có màu trắng sáng, không xuất

hiện biến dị (Hình 3.6.2). Phôi cũng chuyển sang các trạng thái hình thủy lôi và hai lá

mầm sau đó 1, 2 tuần. Vào các tuần tiếp theo, các phôi tiếp tục tăng sinh và một số

phôi đã phát triển thành chồi. Qua các nghiệm thức, khi tăng dần nồng độ thì các chỉ

tiêu thu được cũng tăng. Đặc biệt, ở nồng độ 150 µM Spd, cho tỉ lệ phát sinh phôi cao

nhất đạt 96,67% mẫu phát sinh phôi, 69,67 phôi/mẫu và khối lượng tươi mẫu là

991,67 mg; gấp 1,37, 4,44 và 1,56 lần, tương ứng so với đối chứng (Bảng 3.6.2).

Nghiên cứu năm 2012 của Nhut và cộng sự (2012a) trên đối tượng mô sẹo cứng

(có nguồn gốc từ củ cây sâm Ngọc Linh in vitro) đã báo cáo rằng nồng độ 0,1 mM

Spd là phù hợp và cho 93,3% mẫu phát sinh phôi. Tuy nhiên, mô sẹo cứng phải trải

qua giai đoạn tạo mô sẹo xốp trước khi tiến hành thí nghiệm và điều này dẫn đến quy

trình nuôi cấy kéo dài thêm 2 - 4 tháng và giảm dần khả năng phát sinh phôi của khối

mô sẹo.

Bảng 3.6.2. Ảnh hưởng của Spd lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh

Đặc điểm phôi

Spd (µM)

Số phôi/mẫu

Khối lượng tươi (mg)

0 10 50 100 150 200

Tỉ lệ mẫu tạo phôi (%) 70,00 83,33 86,67 90,00 96,67 86,67

15,68d 22,68d 25,33c 35,00b 69,67a 21,00d

553,33d 583,33d 665,67c 759,00b 991,67a 760,67b

Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm, cây Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm, cây Hình cầu, hình tim, thủy lôi, hai lá mầm

Ghi chú: Các kí tự khác nhau (a,b,…) trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt với  = 0,05 theo phép thử Duncan.

Hình 3.6.2. Ảnh hưởng của Spd lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh. a, b, c, d, e, f: mẫu mô sẹo trên môi trường bô sung Spd ở các nồng độ 0, 10, 50, 100, 150 và 200 µM; a1, b1, c1, d1, e1, f1: hình chụp soi nổi tương ứng với a, b, c, d, e, f.

Trong nghiên cứu này, hiệu quả cao hơn và hai khó khăn trên được khắc phục

khi dùng nồng độ cao hơn 150 µM Spd trên đối tượng mô sẹo xốp có nguồn gốc từ lá

sâm Ngọc Linh in vitro. Bais và Ravishankar (2002) cho rằng trong số các PA, Spd

có mối quan hệ với khả năng phát sinh hình thái in vitro; đồng thời, làm tăng nồng độ

Spd được chứng minh là chất chỉ thị năng lực của tế bào trong quá trình phát sinh

phôi ở một số loài gồm Solanum melongena, Oryza sativa, Medicago sativa và Panax

gingseng [Yadav và Rajam, 1997; Monteiro et al., 2002]. Chỉ bổ sung Spd vào môi

trường nuôi cấy bị xử lý với các chất ức chế tổng hợp PA đã làm phục hồi khả năng

phát sinh phôi vô tính ở cây cà rốt hoang dại [Hadrami và D’Auzac, 1992].

3.6.3. Ảnh hưởng của Spermine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp

sâm Ngọc Linh

Bổ sung Spm vào môi trường nuôi cấy, kết quả thu được cho thấy số phôi/mẫu và

tỉ lệ phát sinh phôi của mẫu cao nhất ở nồng độ 150 µM (đạt 55 phôi/mẫu, 90% mẫu

cảm ứng phôi) so sánh với đối chứng thì số phôi/mẫu và tỉ lệ phát sinh phôi gấp 3,93 và

1,29 lần; tương ứng. Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê ở chỉ

tiêu khối lượng tươi của mẫu ở hai nghiệm thức bổ sung 150 và 200 µM Spm. Trên các

môi trường bổ sung Spm nồng độ thấp (10, 50, 100 µM) hoặc mức cao (200 µM) thì cả

ba chỉ tiêu theo dõi đều tăng so với đối chứng nhưng không quá rõ rệt (Hình 3.6.3).

Bảng 3.6.3. Ảnh hưởng của Spm lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh

Đặc điểm phôi

Spm (µM)

Số phôi/mẫu

Khối lượng tươi (mg)

0 10 50 100 150 200

Tỉ lệ mẫu tạo phôi (%) 70,00 76,67 83,33 86,67 90,00 83,33

14,00d 16,68d 23,67c 36,33b 55,00a 39,33b

513,00d 642,33c 798,33b 820,33a 883,67a 807,33b

Hình cầu, tim,t hủy lôi, hai lá mầm Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Hình cầu, hình tim, hình thủy lôi. Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm, cây Hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm

Ghi chú: Các kí tự khác nhau (a,b,…) trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt với  = 0,05 theo phép thử Duncan.

Hình thái phôi vô tính sâm Ngọc Linh được ghi nhận gồm tất cả các dạng phôi

hình cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm. Kích thước phôi to hơn, đồng đều, màu sáng hơn,

không có phôi biến dị được ghi nhận (Hình 3.6.3).

Nghiên cứu này cũng ghi nhận hiện tượng các khối hình cầu trên các mô sẹo sau

hai tuần nuôi cấy đã phát triển thành rễ. Điều này được giải thích là có thể do vai trò

cytokinine của PA. Gần đây Couée và cộng sự (2004) đã báo cáo rằng PA có tham gia

vào việc hình thành rễ phụ và rễ bất định. Ở giai đoạn cảm ứng của rễ bất định ở nhiều

loài cây gỗ như là Prunus avium [Biondi et al., 1990], Populus tremula L. x P.

tremuloides L. [Hausman et al., 1995], Pyrus communis [Baraldi et al., 1995] và

Juglans regia [Heloir et al., 1996] đều có liên quan tới các PA ngoại sinh. Nghiên cứu

trên cây Olea europaea L. cho thấy các PA ngoại sinh có hiệu quả tích cực lên sự cảm

ứng hình thành rễ của đoạn vi cắt [Rugini, 1992; Grigoriadou et al., 2002], bởi sự có

mặt của chúng trong các mô phân sinh và mô phát triển cùng với cytokinine đã được

đánh dấu [Benedetta et al., 2006].

Hình 3.6.3. Ảnh hưởng của Spm lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh. a, b, c, d, e, f: mẫu mô sẹo trên môi trường bổ sung Spm ở các nồng độ 0, 10, 50, 100, 150 và 200 µM; a1, b1, c1, d1, e1, f1: hình chụp soi nổi tương ứng với a, b, c, d, e, f.

Ảnh hưởng của Spm lên quá trình phát sinh phôi vô tính đã được đề cập trong rất

nhiều các nghiên cứu trước đây. PA có thể thay thế hiệu quả của auxin như 2,4-D.

Thêm PA gồm Put và Spm vào môi trường nuôi cấy phôi làm tăng nồng độ auxin nội

sinh IAA và liên hệ tích cực với tần suất phát sinh phôi. Điểm đáng chú ý là không

giống hiệu quả của 2,4-D, PA khắc phục sự phát triển dị thường của phôi vô tính trong

suốt quá trình trưởng thành của phôi [Silveir et al., 2004]. Nghiên cứu này không phát

hiện ra hình thái phôi dị thường trên môi trường có Spm, Put và cả Spd (Hình 3.6.4).

Hình 3.6.4. Một số cây con tái sinh từ mô sẹo xốp trên môi trường đối chứng (a), Spd (b,c), Put (d) và Spm (e); a: cây con biến dị không hình thành lá mầm hoặc toàn cây là bản dẹp trên môi trường đối chứng; b, c, d, e: các cây con với đầy đủ rễ, thân, lá.

Nhiều tác giả đã đi sâu nghiên cứu và quan sát sự thay đổi các PA và enzyme

tổng hợp nên chúng trong suốt quá trình phát triển phôi vô tính [Minocha et al.,

2004] và PA trong tương tác với các con đường khác như tạo NO, trao đổi ABA…

Từ đó chỉ ra Put là PA chủ yếu trong các mô tiền phát sinh phôi, trong khi Spd biểu

hiện mạnh trong suốt quá trình phát triển phôi và có hiệu quả mạnh nhất [Kevers et

al., 2000]. Put có liên quan đến sự hình thành phôi vô tính mới, trong khi, Spd và

Spm kích thích phát triển và trưởng thành của phôi vô tính ở Ocotea catharinensis

[Santa-Catarina et al., 2007]. Sự thay đổi trong tỷ lệ Spd/Put hay Spm/Put cũng

được phân tích, so sánh trong mối quan hệ với hoạt động của hai enzyme ADC và

ODC. ADC và ODC hoạt động mạnh trong phôi dạng thủy lôi và giữ nguyên hoạt

động khi phôi ở dạng hai lá mầm và hoạt động của SAMDC giảm dần trong suốt

quá trình phát triển phôi cây Picea rubens Sarg. [Minocha et al., 2004]. Trong quá

trình phát triển phôi giai đoạn sớm, hàm lượng PA gồm Put và Spm cao xuất hiện ở

các trục phôi; trong khi, ở trạng thái lá mầm mở ra hàm lượng Spd cao, đồng thời

Put giảm xuống [Astarita et al., 2003]. Ở cây Araucaria angustifolia, Put nội sinh

nhiều nhất, sau đó là Spd và Spm. Các PA hoạt động theo những con đường khác

nhau về tăng trưởng, phát triển hình thái và sinh tổng hợp NO. Spd và Spm ngoại

sinh làm giảm sự tăng trưởng của tế bào và cho phép tiến hóa hình thái từ các cụm

tế bào ở trạng thái tiền phôi. Put làm tăng NO giải phóng ra môi trường nuôi cấy

trong khi Spd, Spm lại ức chế quá trình này. Sinh tổng hợp NO có liên quan tới sự

phân cực tế bào ở giai đoạn tiền phôi [Silveira et al., 2006]. Ảnh hưởng của Arg,

Spm hoặc sự kết hợp giữa 3 loại PA ở cây thông Hevea brasiliensis được Hadrami

và D’Auzac (1992) cho thấy sự tăng cảm ứng các mô sẹo gia tăng trong suốt quá

trình thêm vào các chất trên, đặc biệt là sự kết hợp cả 3 PA là tốt nhất. Giữa các PA,

Spd có liên hệ nhiều nhất tới khả năng phát sinh hình thái in vitro [Bais và

Ravishankar, 2002]. Nồng độ 1 mM Put cho khối lượng tươi và số lượng phôi vô

tính lớn nhất trong khi ở nồng độ thấp hơn 0,1 µM Spm và Spd cho hiệu quả cao

trên cây Momordica charantia L. có thể là vì các PA đã ức chế hoạt động của ODC

bằng enzyme ODC-antizyme [Theiss et al., 2002]. Thêm cả 3 PA ở nồng độ 1 mM/l

riêng lẻ đều làm tăng tần suất và số lượng phôi vô tính trên cây ổi, quá ngưỡng 1

mM làm ức chế quá trình này [Nasim, 2013].

Các PA ngoại sinh (đặc biệt là Put) được thêm vào môi trường nuôi cấy cây

Araucaria angustifolia đã hoạt động như là tín hiệu phân tử, gây nên tín hiệu stress

đáp ứng, kết quả là tích lũy ABA. Sự tổng hợp ABA là con đường quan trọng trong

phát triển phôi vô tính ở các cây lá kim [Stasolla và Yeung, 2003] vì ABA liên quan

đến sự biểu hiện của gene dự trữ protein và protein trong phôi muộn LEA (Late

embryogenesis abundant) bên trong các hạt sau khi phôi biệt hóa [Wise và

Tunnacliffe, 2004] đồng thời làm xuất hiện tượng ngả màu vàng bởi sự sinh trưởng

chậm và già hóa của phần lớn các cụm mô sẹo [Tautorus et al., 1991].

3.7. PHÂN TÍCH POLYAMINE NỘI SINH

Nghiên cứu các PA nội sinh là tiền đề cho các nghiên cứu về chức năng của

PA lên sự sinh trưởng và biệt hóa tế bào; đồng thời có thể là một mục tiêu hữu ích

trong việc điều khiển dòng PA nội sinh – có mối liện hệ với năng lực sinh phôi ở

nhiều loài thực vật đã được chứng minh [Takeda et al., 2002]. Hàm lượng của các

PA nội sinh (Put, Spd, Spm) ở các giai đoạn phát triển mô sẹo và cụm phôi sâm

Ngọc Linh khác nhau được phân tích bằng phương pháp HPLC. Kết quả phân tích

PA nội sinh trong các mẫu được thể hiện ở Biểu đồ 3.1.

Kết quả cho thấy cả 3 loại PA đều xuất hiện trong cụm mẫu ở đối chứng và bổ

sung 150 µM Spd với hàm lượng khác nhau, tùy giai đoạn nuôi cấy. Trong đó, Put

luôn là PA chứa nồng độ cao nhất, theo sau là Spd và thấp nhất là Spm. Việc bổ

sung Spd vào môi trường nuôi cấy khiến nồng độ các PA nội sinh đều tăng cao so

với đối chứng ở các thời điểm ngày 7, 14 và 21. Lượng PA tổng đều tăng sau 1 tuần

nuôi cấy và giảm ở các tuần sau đó (Biểu đồ 3.1).

Môi trường đối chứng MS được bổ sung 1 mg/l 2,4-D, 0,5 mg/l NAA, 0,2

mg/l Kin. Tại thời điểm ngày 0, trong suốt quá trình cảm ứng phôi từ mô sẹo có khả

năng phát sinh phôi, Spd chiếm tỉ lệ cao nhất trong khi Put nhỏ nhất. Tại thời điểm

ngày 7, khi các mô sẹo này tiếp tục tăng sinh thì Put tăng gấp 7,76 lần so với tuần 0.

Sau 2 tuần nuôi cấy khi các cấu trúc hình cầu xuất hiện trong đám mô sẹo, Put giảm

gần 2 lần. Put tiếp tục giảm sau 4 tuần nuôi cấy song vẫn cao hơn so với thời điểm

ngày 0.

Biểu đồ 3.1. Sự thay đổi hàm lượng PA ở các giai đoạn phát triển cụm mô phôi ở sâm

Ngọc Linh trên môi trường đối chứng (A) và môi trường bổ sung 150 µM Spd (B) (lấy

mẫu tại các thời điểm 0, 7, 14, 21 ngày nuôi cấy trên môi trường tạo phôi).

Đối với mẫu có bổ sung 150 µM Spd: Ở thời điểm ngày 0, nồng độ Put nội

sinh tăng lên song cả Spd và Spm đều giảm xuống so với đối chứng. Trong đó, Spd

chiếm nồng độ cao nhất, tương tự với đối chứng. Song Spm lại có nồng độ nhỏ

nhất. Sau một tuần nuôi cấy, Put và Spd nội sinh tăng vượt bậc, trong khi nồng độ

Spm tăng không đáng kể. Cả 3 loại PA đều giảm từ cuối tuần nuôi cấy thứ 2 sang

tới cuối tuần thứ 3, khi các mầm phôi hình cầu xuất hiện trên đám mô sẹo, nồng độ

Put và Spd tiếp tục giảm mạnh trong khi Spm không đổi. Như vậy thêm Spd vào

môi trường nuôi cấy thúc đẩy quá trình thành thục của phôi sâm Ngọc Linh. Kết

quả này tương tự báo cáo của Kevers (2000) và cộng sự trên đối tượng Panax

gingseng.

Quan sát thấy sự tăng cao đột biến của hàm lượng Put so với Spd và Spm.

Điều này có thể được giải thích là do hoạt động mạnh của enzyme ODC hoặc

enzyme ADC sinh tổng hợp nên Put [Slocum et al., 1984; Yadav và Rajam, 1998].

Đồng thời, trong quá trình chuyển hóa Put, một lượng nhỏ Spd được enzyme

polyamine oxidase xúc tác cho quá trình tổng hợp ngược Spd thành Put (xem Hình

1.4 – Vật liệu và Phương pháp). Mẫu cấy trên môi trường bổ sung Spd có sự tăng

hàm lượng Put rất cao so với đối chứng gấp 18 lần (238,1 µg/kg) ở ngày 7; 26 lần

(185,2 µg/kg) ở ngày 14 và 10 lần (44,1 µg/kg) ở ngày 21. Nồng độ Put nội sinh cao

có liên quan tới sự giảm tăng trưởng tế bào đã được nghiên cứu trong môi trường

huyền phù cây Pinuss taeda [Silvera et al., 2004] và mô sẹo của cây thuốc lá

Nicotiana tabacum [Rastogi và Davies, 1991]. PA có vai trò cả như auxin và

cytokinine. Put là PA có nồng độ cao nhất trong các cụm mô sẹo có khả năng phát

sinh phôi và trong huyền phù tế bào của cây Pinus taeda [Silveira et al., 2004]. Sự

phát sinh phôi vô tính của thực vật ví dụ cà rốt thì đi kèm với sự tăng cường trao đổi

chất các PA [Minocha và Minocha, 1995]. Nghiên cứu của Bastola và Minocha

(1995) cho thấy điều khiển sự trao đổi chất các Put mở đầu cho việc tạo thành phôi

vô tính.

Hàm lượng PA tổng (đường gấp khúc trên biểu đồ) cũng được ghi nhận là có

sự tương quan với hàm lượng Put nội sinh. PA tổng tăng từ tuần đầu nuôi cấy cho

tới tuần 2 thì đạt đỉnh và suy giảm vào 2 tuần nuôi cấy sau đó. Bổ sung các PA

ngoại sinh dẫn đến giảm lượng PA nội sinh cũng đã được báo cáo bởi

Thiruvengadam và cộng sự (2013) ở cây Momordica dioica Roxb. Ex. Willd.

Hiện tại ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào đề cập tới vấn đề PA nội sinh ở

cây sâm Ngọc Linh. Do đó, hiểu biết về cơ chế tác động của PA giúp chúng ta có

thể can thiệp sâu hơn vào quá trình phát sinh phôi vô tính ở loài thực vật quý này.

3.8. GIẢI PHẪU CÁC DẠNG HÌNH THÁI PHÔI KHÁC NHAU CỦA SÂM

NGỌC LINH

Quá trình nuôi cấy tạo phôi vô tính thông thường được tiến hành trên môi

trường có auxin (gồm 2,4-D là chủ yếu), sau đó chuyển sang môi trường có nồng độ

auxin thấp hoặc không có auxin để phôi hình thành và trưởng thành. Các phôi có

định hướng cực rõ ràng, có lá mầm đầy đủ và trục phôi rõ ràng thì dễ dàng phát

triển thành cây con so với các phôi dị hình khác (Lazzeri et al., 1987; Hartweck et

al., 1988; Cruz et al., 1990; Wetzstein và Baker, 1993; Rodriguez và Wetzstein,

1994). Tuy nhiên, quá trình kéo dài trên môi trường có chất điều hòa sinh trưởng

thường làm xuất hiện các thể phôi biến dị và hiển nhiên dẫn đến chất lượng phôi vô

tính kém, không đảm bảo khả năng sống sót và sinh sản của cây con sau này. Hạn

chế được số lượng biến thể phôi vô tính trong quá trình tạo phôi sẽ là tiền đề để tạo

ra số lượng lớn cây con khỏe mạnh cung cấp cho nghiên cứu và thực tiễn, đặc biệt

là đối với sâm Ngọc Linh. Do đó, chúng tôi đã tiến hành giải phẫu các trạng thái

phôi khác nhau trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D; 0,5 mg/l NAA, 0,2

mg/l Kinetine dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét theo các quy

trình đã nêu ở Chương 2. Sau tuần nuôi cấy đầu tiên, những thay đổi hình thái được

ghi nhận cho thấy hình dạng và kích thước của một số tế bào mô sẹo trong mẫu cấy

có nhiều thay đổi (Hình 3.7 a). Trong đó, các tế bào mô sẹo có kích thước lớn, các

hình dạng khác nhau, sắp xếp lỏng lẻo và phân chia theo nhiều hướng khác nhau

(Hình 3.7 a2). Trên bề mặt mô sẹo có hình thành các cấu trúc nốt hình cầu (Hình 3.7

b1) màu vàng đậm hơn, nổi bật trên đám mô sẹo. Theo các nghiên cứu thì đây là

cấu trúc tiền phôi PEM (Proembryogenics mass). Các PEM nằm ở ngoại vi của khối

mô sẹo và xen kẽ với các tế bào mô sẹo có không bào lớn (Hình 3.7 b2, f).

Hình 3.7. Sự thay đổi hình thái và cấu trúc trong quá trình phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh. a1, a2, e: mô sẹo sau 1 tuần nuôi cấy; b1, b2, f: các khối tiền phôi trên bề mặt mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy; c: tế bào được nhuộm bằng acetocarmine (bắt màu đỏ) và Evan’s blue (bắt màu xanh); d: các tế bào chứa hạt tinh bột bắt màu xanh tím khi nhuộm với thuốc nhuộm IKI; g1., g2: các cấu trúc phôi hình cầu với tầng nguyên bì bao bọc bên ngoài; h1, h2: phôi hình tim sớm với sự xuất hiện của hệ thống mạch dẫn; i1, i2, i3, i4: phôi ở các giai đoạn hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và lá mầm; j1: một số phôi có hình thái bất thường (không có lá mầm, lá mầm hình loa kèn, lá mầm hình cổ áo); j2: phôi vô tính có cấu trúc bình thường tương tự như phôi hữu tính; k: cây con có nguồn gốc từ phôi vô tính.

KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu này, chúng tôi đã đạt được một số kết quả như sau:

Lá tạo mô sẹo có khả năng phát sinh phôi tốt nhất trong 3 nguồn mẫu. SH½ có

bổ sung 1 mg/l 2,4-D và 1 mg/l NAA là thích hợp nhất để tạo mô sẹo xốp.

Nồng độ 1 mg/l 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/l NAA và 0,2 mg/l Kin trong môi

trường MS là phù hợp nhất để cảm ứng tạo phôi vô tính từ mô sẹo xốp.

Điều kiện nuôi cấy lỏng lắc sử dụng môi trường MS bổ sung 1 mg/l 2,4-D; 0,5

mg/l NAA, 0,2 mg/l Kin cho hiệu quả tái sinh phôi cao hơn nuôi cấy đặc có cùng

thành phần. Cảm ứng tạo phôi trong điều kiện chiếu sáng có hiệu quả hơn nuôi cấy

trong tối.

Arg và Orn có hiệu quả thấp lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp.

Cả 3 loại PA cho hiệu quả tạo phôi vô tính cao. Nồng độ phù hợp nhất của

Put, Spd và Spm lần lượt là 100, 150, 150 µM. Trong đó bổ sung 150 µM Spd vào

môi trường MS có chứa 1 mg/l 2,4-D; 0,5 mg/ NAA và 0,2 mg/l Kin cho hiệu quả

cao nhất.

KIẾN NGHỊ

Trong quá trình tiến hành đề tài, chúng tôi chỉ mới dừng lại ở việc nghiên cứu

khả năng hình thành và tần suất phát sinh phôi vô tính trong một số điều kiện nhất

định.Vì vậy, nhằm hoàn chỉnh quy trình nhân giống vô tính loài sâm Ngọc Linh,

chúng tôi đề nghị tiếp tục thực hiện các nghiên cứu sau:

Nghiên cứu ảnh hưởng của các PA riêng lẻ hoặc kết hợp trong các hệ thống

lỏng lắc khác nhau lên sự hình thành phôi vô tính sâm Ngọc Linh. Phân tích hàm

lượng của các PA ở các nồng độ khác nhau trong mối tương quan với sự trưởng

thành của phôi vô tính. Đồng thời nghiên cứu hoạt động của các enzyme sinh tổng

hợp PA gồm ODC, ADC và SAMDC trong quá trình cảm ứng và hình thành phôi

sâm Ngọc Linh.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài Liệu Tiếng Việt

[1]. Bùi Văn Thế Vinh, Vũ Thị Thủy, Thái Thương Hiền, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn

Nhựt (2014), “Nghiên cứu hình thái giải phẫu và cấu trúc phôi trong quá trình

phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Tạp

chí Khoa học và Phát triển 12(7), 1140-1148.

[2]. Dương Tấn Nhựt (2007), Công nghệ sinh học thực vật, tập 1. NXB. Nông nghiệp,

thành phố Hồ Chí Minh.

[3]. Dương Tấn Nhựt, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Trực, Nguyễn Bá Nam, Trần

Xuân Tình, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Văn Bình, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hương,

Nguyễn Cửu Thành Nhân, Lê Nữ Minh Thùy, Lý Thị Mỹ Nga, Thái Thương

Hiền, Nguyễn Thành Hải (2010a), “Nhân giống vô tính cây sâm Ngọc Linh

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3B), 1211-

1219.

[4]. Dương Tấn Nhựt, Lâm Thị Mỹ Hằng, Bùi Thế Vinh, Phan Quốc Tâm, Nguyễn Bá

Nam, Nguyễn Cửu Thành Nhân, Hoàng Xuân Chiến, Lê Nữ Minh Thùy, Vũ Thị

Hiền, Nguyễn Văn Bình, Vũ Quốc Luận, Trần Công Luận, Đoàn Trọng Đức

(2010b), “Xác định hàm lượng saponin và dư lượng một số chất điều hòa sinh

trưởng trong callus, chồi và rễ sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Công

nghệ Sinh học 8(2), 189-202.

[5]. Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thành Hải, Nguyễn Đức Huy, Lương Ngọc Thuận

(2007) “Bài tổng quan: Sự phát sinh phôi của các tế bào sinh dưỡng thực vật”,

Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(2), 133-149.

[6]. Hà Thị Loan, Dương Hoa Xô, Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Hoàng Quân, Vũ Thị

Đào, Nathalie Pawlicki-Jullian, Eric Contier (2014), “Nghiên cứu tạo rễ tóc sâm

Ngọc Linh Panax vietnamensis bằng phương pháp chuyển gen Rol nhờ vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes”, Tạp chí Sinh học 36(1se): 293-300.

[7]. Hà Thị Mỹ Ngân, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Bá Nam, Lê Kim Cương, Nguyễn

Phúc Huy, Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Hồng Hoàng, Ngô Thanh Tài,

Nguyễn Đình Trọng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Dương Tấn Nhựt (2013),

“Chuyển gen tạo rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) qua

trung gian vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes”, Tạp chí Công nghệ Sinh học

11(3), 479-486.

[8]. Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Bá Nam, Hoàng Xuân Chiến, Lê Kim Cương, Ngô Thanh

Tài, Nguyễn Việt Cường, Nguyễn Phúc Huy, Dương Tấn Nhựt (2013), “Tối ưu

hóa một số yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy đến quá trình tái sinh rễ bất

định sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Báo cáo khoa học

Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013.

[9]. Hoàng Xuân Chiến, Ngô Thanh Tài, Nguyễn Bá Trực, Trần Xuân Tình, Lâm Bích

Thảo, Trần Công Luận, Dương Tấn Nhựt (2011), “Nghiên cứu một số yếu tố tạo

củ sâm Ngọc Linh ( Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro và xác định hàm

lượng saponin trong cây tạo từ củ trồng thử nghiệm ở núi Ngọc Linh”. Tạp chí

Công nghệ sinh học 9(3), 325-339.

[10]. Lê Kim Cương, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Nam, Trịnh Thị Hương, Dương

Tấn Nhựt (2012), “Ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng tăng sinh mô sẹo

“xốp” và bước đầu nuôi cấy huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.)”, Tạp chí Sinh học 34(3se), 265-276.

[11]. Mai Trường, Trần Thị Ngọc Hà, Phan Trường Lộc, Lê Tấn Đức, Trần Trọng

Tuấn, Đỗ Đăng Giáp, Bùi Đình Thạch, Phạm Đức Trí, Nguyễn Đức Minh Hùng,

Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Kết, Trần Công Luận, Nguyễn Hữu Hổ (2013),

“Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo có khả năng sinh phôi và mô phôi soma sâm Ngọc

Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Tạp chí Sinh học, 35(se), 145-157.

[12]. Mai Trường, Trần Thị Ngọc Hà, Trần Trọng Tuấn, Phan Trường Lộc, Đỗ Đăng

Giáp, Bùi Đình Thạch, Nguyễn Thị Ngọc Hân, Phạm Đức Trí, Lê Tấn Đức,

Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Văn Kết, Nguyễn Hữu Hổ (2014), “Tạo và

nhân nuôi phôi soma sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong

môi trường lỏng”, Tạp chí Khoa học và phát triển 12(7), 1085-1095.

[13]. Nguyễn Bá Nam, Lý Thị Phương Loan, Trịnh Thị Hương, Dương Tấn Nhựt

(2012), “Ảnh hưởng của một số nguồn chiếu sáng nhân tạo lên quá trình phát

sinh phôi vô tính và tái sinh cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis)”, Tạp chí

Công nghệ Sinh học 10(4A), 923-931.

[14]. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, NXB Đại học

quốc gia, thành phố Hồ Chí Minh.

[15]. Nguyễn Ngọc Dung (1995), Nhân giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha

et Grushv.) bằng con đường sinh học, NXB Nông nghiệp, thành phố Hồ Chí

Minh.

[16]. Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết (2011), “Nghiên cứu

khả năng tạo rễ bất định của sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

trong nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học, ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và

Công nghệ 27, 30-36.

[17]. Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm

Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB. Khoa học Kỹ thuật, thành phố

Hồ Chí Minh.

[18]. Nguyễn Văn Uyển (2006), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật,

NXB Nông nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh.

[19]. Nguyễn Việt Cường, Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Bá Nam, Hà Thị Mỹ Ngân, Lê Kim

Cương, Nguyễn Phúc Huy, Dương Tấn Nhựt (2013) Nghiên cứu ảnh hưởng của

một số chất hữu cơ và bạc nitrate (AgNO3) lên sự sinh trưởng và phát triển của

cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro. Báo

cáo khoa học Hội nghị Khoa học và công nghệ sinh học toàn quốc 2013.

[20]. Trần Công Luận (2003), “Kết quả nghiên cứu về hóa học sâm Việt Nam”. Hội thảo

Bảo tồn và phát triển sâm Ngọc Linh tại tỉnh Quảng Nam, 62-75.

[21]. Võ Thị Bạch Mai (2004). Sự phát triển của chồi và rễ. NXB Đại học Quốc gia

thành phố Hồ Chí Minh.

[22]. Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Bùi Văn Thế

Vinh, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhựt (2014), “Phát sinh phôi trực tiếp từ lá,

cuống lá và thân rễ cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”,

Tạp chí Sinh học 36(1se), 277-282.

Tài Liệu Tiếng Anh

[23]. Aboshama H.M.S. (2011), “Somatic embryogenesis proliferation, maturation and

germination in Cajanus cajan”, World Journal of Agriculture Sciences 7, 86-95.

[24]. Addae-Frimpomaah F., Arkorful E., Tengey T.K. (2014), “The effect of 2,4-D on

callus induction using leaf lobe of weet potato as a source of explant”.

International Journal of Agronomy and Agricultural Research 5(1), 16-22.

[25]. Alcantara G.B., Dibax R., de Oliveira R.A., Carlos J., Filho B., Daros E. (2014),

“Plant regeneration and histological study of the somatic embryogenesis of

sugarcane (Saccharum spp.) cultivars RB855156 and RB72454”, Acta

Scientiarum 36(1), 63-72.

[26]. Alcázar R., Altabella T., Marco F., Bortolotti C., Reymond M., Koncz C.,

Carrasco P., Tiburcio A.F. (2010), “Polyamines: molecules with regulatory

functions in plant abiotic stress tolerance”. Physiologia Plantarum 231(6), 1237-

1249.

[27]. Ananya P., Kalyan M., Sarmistha S.R. (2009), “Effect of polyamine on in vitro

somatic embryogenesis in Momordica charantia L.” Plant Cell, Tissue and

Organ Culture 97, 303-311.

[28]. Arumugam, N., Bhojwani, S.S. (1990), “Somatic embryogenesis in tissue cultures

of Podophyllum hexandrum”, Canadian Journal of Botany 68, 487-491.

[29]. Arya S., Arya I.D.I., Eriksson T. (1993), “Rapid multiplication of adventitious

somatic embryos of Panax ginseng”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 34,

157-162.

[30]. Asad S., Arshad M., Mansoor S., Zafar Y. (2009), “Effect of various amino acids

on hoot regeneration of sugarcane (Sacchrum officinarum L.)”, African Journal

of Biotechnology 8(7), 1214-1218.

[31]. Astarita, L.V., Handro, W., Floh, E.I.S. (2003), “Changes in polyamines content

associated with zygotic embryogenesis in the Brazilian pine, Araucaria

angustifolia (Bert.) O. Ktze”, Brazilian Journal of Botany 26(2), 163-168.

[32]. Aurelia S-J., Aleksandra P., Zygmunt K. (2005), “Influence of cultivar, explant

source and plant growth regulator on callus induction and plant regeneration of

Cannabis sativa L”, Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 47(2), 145-

151.

[33]. Bagni, N., Pistocchi, R. (1991), “Uptake and transport of polyamines and

inhibitors of polyamine metabolism in plants”, Biochemistry and Physiology of

Polyamines in plants, 105-118.

[34]. Bais H.P., Ravishankar G.A. (2002), “Role of polyamines in the ontogeny of

plants and their biotechnological applications”, Plant Cell, Tissue and Organ

Culture 69, 1-34.

[35]. Bais H.P., Sudha G.S., Ravishankar G.A. (2002), “Putrescine and silver nitrate

influences shoot multiplication, in vitro flowering and endogenous titers of

polyamines in Cichoorium intybus L.”, Journal of Plant Growth Regulation 19,

238-248.

[36]. Bais, H.P., Ravishankar, G.A. (2002), “Role of polyamines in the ontogeny of

plants and their biotechnological applications”, Plant Cell, Tissue and Organ

Culture 69, 1-34.

[37]. Baraldi R., Bertazza G., Bregoli A., Fasolo F., Rotondi A., Predieri S., Serafini-

Fracassini D., Slovin J., Cohen J. (1995), “Auxins and polyamines in relation to

differential in vitro root induction on microcuttings of two pear cultivars”,

Journal of Plant Growth Regulation 14, 49-59.

[38]. Bastola, D.R., Minocha S.C. (1995), “Increased putrescine biosynthesis through

transfer of mouse ornithine decarboxylase cDNA in carrot (Daucus carota L.)

promotes somatic embryogenesis”, Plant Physiology 109, 63-71.

[39]. Benedetta C., Annalisa T., Nello B., Maria A.G. (2006), “Effect of polyamines on

in vitro anther culture of Citrus clementia Hort. ex Tan”, Plant Cell, Tissue and

Organ Culture 87(2), 145-153.

[40]. Biondi S., Diaz T., Iglesias I., Gamberini G., Bagni N. (1990), “Polyamines and

ethylene in relation to adventitious root formation in Prunus avium shoot

cultures”, Physiologia Plantarum 78(3), 474-483.

[41]. Bögre, L., Stefanov, I., Ábrahám, M., Somogyi, I., Dudits, D. (1990), “Differences

in the responses to 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) treatment between

embryogenic and nonembryogenic lines of Alfalfa”, Progress in Plant Cellular

And Molecular Biology, 427-436.

[42]. Bollfill M., Cusido R.M., Palazong J., Canut E., Pinol M.T., Morales C. (2003),

“Relationship between peroxidase activity and organogenesis in Panax ginseng

calluses”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 73, 37-41.

[43]. Borrell, A., Besford, R.T., Altabella, T., Masgrau, C., Tiburcio, A.F. (1996),

“Regulation of arginine decarboxylase by spermine in osmotically-stressed oat

leaves”, Physiologia Plantarum 98, 105-110.

[44]. Borrell, A., Culianez-Macia, F.A., Altabella, T., Besford, R.T., Flores, D.,

Tiburcio, A.F. (1995), “Arginine decarboxylase is localized in chloroplasts”,

Plant Physiology 109, 771-776.

[45]. Briskin D., Hanson J.B. (1992), “How does the plant plasma membrane HC-

ATPase pump protons?” Journal of Experimental Botany 43, 269-289.

[46]. Brown S., Wetherell D.F., Dougall D.K. (1976), “The potassium requirement for

growth and embryogenesis in wild carrot suspension cultures”, Physiologia

Plantarum 37, 73-79.

[47]. Bush D.S. (1995), “Calcium regulation in plant cells and its role in signalling”,

Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 46, 95-122.

[48]. Couée I., Hummel I., Sulmon C., Gouesbet G., Amrani A.E. (2004), “Involvement

of polyamines in root development”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 76(1),

1-10.

[49]. Chengalrayan, K., Mhaske, V.B. and Hazra, S. (1997), “High-frequency

conversion of abnormal peanut somatic embryos”. Plant Cell Reports 16(11),

783-786.

[50]. Choi Y.E., Woong Y.S. (1997), “Effect of Ammonium ion on morphogenesis from

cultured cotyledon explants of Panax ginseng”. Jounal of Plant Biology 40(1):

21-26.

[51]. Danso K.E., Acheampong E., Amoatey H.M. (1999), “Selection and in-vitro

propagation of five cassava Manihotesculenta Crantz cultivars”, Journal of the

Ghana Science Association 1(3), 31-41.

[52]. Dougall, D.K., Verma, D. (1978), “Growth and embryo formation in wild carrot

suspension cultures with ammonium ion as a sole nitrogen source”, In Vitro

Cellular and Developmental Biology-Plant 14, 180-188.

[53]. Dudits, D., Bögre, L., Gyrögyey, J. (1991), “Molecular and cellular approaches to

the analysis of plant embryo development from somatic cells in vitro”, Journal of

Cell Science 99, 475-484.

[54]. Duncan D.B. (1995), “Multiple range and multiple F test”, Biometrics 11, 1-42.

[55]. Dussert S., Verdeil J.L., Buffard-Morel J. (1995), “Specific nutrient uptake during

initiation of somatic embryogenesis in coconut calluses”, Plant Science 111, 229-

236.

[56]. Duval Y., Engelmann F. và Durand-Gasselin T (1995), “Somatic embryogenesis in

oil palm (Elaesis guineensis Jacq)”, Biotechnology in Agriculture and Forestry

30, 235-352.

[57]. Evans P.T., Malmberg R.L. (1989), “Do polyamines have roles in plant

development?”, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology

40, 235-269.

[58]. Feeney M., Punja Z.K. (2003), “Tissue culture and Agrobacterium-mediated

transformation of hemp (Cannabis sativa L.)”, In Vitro Cellular and

Developmental Biology-Plant 39, 578-585.

[59]. Fehér, A., Pasternak, T.P., Dudits, D. (2003), “Transition of somatic plant cells to

an embryogenic state”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 74, 201-228.

[60]. Feirer R.P. (1995), “The biochemistry of conifer embryo development: amino

acids, polyamines, and storage proteins”, Somatic embryogenesis in woody

plants, 1, 317-336.

[61]. Fisichella M., Silvi E., Morini S. (2000), “Regeneration of somatic embryos and

roots from quince leaves cultured on media with different macroelement

composition” Plant Cell, Tissue and Organ Culture 63, 101-107.

[62]. Fisse J., Braut F., cosson L., Paris M. (1981), “Étude in vitro des capacités

organogénétiques de tissus de Cannabis sativa L.; effet de differentes substances

de croissance”, Plantes Médicinales et Phytotherapie 15, 217-223

[63]. Galston, A. W. (1991), “On the trail of a new regulatory system in plants”, New

Biologist 3, 450-453.

[64]. Gao X., Zhu C., Jia W., Gao W., Qiu M., Zhang Y, Xiao P. (2005), “Induction and

charaacterization of adventitious roots directly from the explants of Panax

notogingseng”, Biotechnology Letters 27(22), 1771-1775.

[65]. George E.F., Hall M.A., de Klerk G.J. (2008), “The componets of Plant Tissue

culture media I: Macro- and micro- nutrients”, Plant propagation by tissue

culture 3rd edition, 65-113.

[66]. Gleddie, S., Keller, W., Setterfield, G. (1983), “Somatic embryogenesis and plant

regeneration from leaf explants and cell suspensions of Solanum melongena (egg

plant)”, Canadian Journal of Botany 61, 656-666.

[67]. Grigoriadou K., Vasilakakis M., Eleftheriou E.P. (2002), “In vitro propagation

of the Greek olive cultivar Chondrolia Chalkidikis”. Plant Cell, Tissue and

Organ Culture 71, 47-54.

[68]. Grimes H.D., Hodges T.K. (1990), “The inorganic NO3:NH4 ratio influences plant

regeneration and auxin sensitivity in primary callus derived from immature

embryos of Indica rice (Oryza sativa L.)”, Plant Physiology 136, 362-367.

[69]. Hadrami I., D’Auzac J. (1992), “Effects of polyamine biosynthetic inhibitors on

somatic embryogenesis and cellular polyamines in Hevea brasiliensis”, Journal

of Plant Physiology 140, 33-36.

[70]. Hamidou F.S., Peggy O.A., Lloyd M., Peng W.C. (2005), “Putrescine enhances

somatic embryogenesis and plant regeneration in upland cotton”, Plant Cell,

Tissue and Organ Culture 81, 91-95.

[71]. Hartweck, L. M.; Lazzeri, P. A.; Cui, D.; Collins, G. B. and Williams, E. G.

(1988), “Auxin-orientation effects on somatic embryogenesis from immature

soybean cotyledons”. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 24(8),

821-828.

[72]. Hausman J.F., Kevers C., Gaspar T. (1995). “Putrescine control of peroxidase

activity in the inductive phase of rooting in poplar shoots in vitro, and the

adversary effect of spermidine”, Journal of Plant Physiology 146, 681-685.

[73]. Hecht, V., Vielle-Calzada, J.P., Hartog, M.V., Schmidt, E.D., Boutilier, K.,

Grossniklauss, U., de Vries, S.C. (2001), “The Arabidopsis somatic

embryogenesis receptor kinase 1 gene is expressed in developing ovules and

embryos and enhances Plant Physiology embryogenic competency in culture”,

Plant Physiology 127, 803-816.

[74]. Heloir J.F., Kevers C., Hausman J.F., Gaspar T. (1996), “Changes in the

concentration of auxins and polyamines during rooting of in vitro propagated

walnut shoots”, Tree Physiology 16, 515-519.

[75]. Hibi, N., Higashiguchi, S., Hashimoto, T., Yamada, Y. (1994), “Gene expression

in tobacco low-nicotine mutants”, Plant and Cell Physiology 6, 723-735.

[76]. Huang T., Gao W.Y., Wang J., Cao Y., Zhao Y.X., Huang L.Q., Lui C.X. (2010),

“Selection and optimization of a high-producing tissue culture of Panax gingseng

C. A. Meyer”, Acta Physiologiae Plantarum 32, 765-772.

[77]. Ibraheem Y., Pinker I., Böhme M. (2013), “A comparative study between solid

and liquid cultures relative to callus growth and somatic embryo formation in

date palm (Phonenix dactylifera L.) cv. Zaghlool”, Emirates Journal of Food

and Agriculture 25(11), 883-898.

[78]. Jiménez, V.M. (2005), “Involvement of plant hormones and plant growth

regulators on in vitro somatic embryogenesis”, Plant Growth Regulation 47, 91-

110.

[79]. Joseph T., Yeoh H.H., Loh C.S. (2000), “Somatic embryogenesis, plant

regeneration and cyanogenesis in Manihot glaziovii Muell. Arg. (ceara rubber)”.

Plant Cell Reports 19(5), 535-538.

[80]. Joshi R., Shukla A., Kumar P. (2010), “Interactive effect of GA3 and polyamines

on in vitro somatic embryogenesis from immature embryos in Maize (Zea mays

L.)”, Maydica 55, 111-119.

[81]. Junaid A., Mujib A., Bhat M.A., Ilah A., Sharma M.P. (2006), "Embryogenesis in

Catharanthus roseus: roles of some external factors in proliferation, maturation

and germination of embryos”, Plant cell monographs 2, 259-270.

[82]. Kakarla L., Rama C., Botlagunta M., Krishna M.S.R, Mathi P.S. (2014), “Somatic

embryogenesis and plant regeneration from leaf explants of Rumex vesicarius

L.”, African Journal of Biotechnology 13(45), 4268-4274.

[83]. Kakkar, R.K., Nagar, P.K., Ahuja, P.S., Rai, V.K. (2000), “Polyamines and plant

morphogenesis”, Biologia Plantarum 43, 1-11.

[84]. Kaldenhoff, R., Henningsen U., Ricther G. (1994), “Gene activation in

suspension-cultured cells of Arabidopsis thaliana during blue light-depended

plantlet regeneration”, Planta 195, 182-187.

[85]. Kaul T., Ram B., Pandey S., Reddy C.S., Reddy M.K. (2014), “Unravelling the

regulation of somatic embryogenesis by extracellular calcium and auxin efflux

blockers in hypocotyl explants of Albizzia lebbeck L.: similarity in action”,

International Journal of Bioassays 3(11), 3356-3542.

[86]. Kevers, C., Le G.N., Monteiro, M., Dommes, J., Gaspar, T. (2000), “Somatic

embryogenesis of Panax ginseng in liquid cultures: a role for polyamines and

their metabolic pathways”, Plant Growth Regulation 31, 209-214.

[87]. Kitamiya, E., Suzuki, S., Sano T., Nagata, T. (2000), “Isolation of two genes that

were induced upon the initiation of somatic embryogenesis on carrot hypocotyls

by high concentrations of 2,4-D”, Plant Cell Reports 19, 551-557.

[88]. Kochba, J., Ben-Hayyim, G., Speigel-Roy, P., Saad, S., Neumann, H. (1982),

“Selection of table salt-telerant callus cell lines and embryos in Citrus sinensis

and C. auranticum”, Zeitschrift für Pflanzenphysiologie 106, 111-118.

[89]. Kumar M., Singh H., Shukla A.K., Verma P.C., Singh P.K. (2013), “Induction and

establishment of somatic embryogenesis in elite Indian cotton cultivar

(Gossypium hirsutum L. Cv Khandwa-2)”, Plant Signaling and Behavior 8(10),

1-6.

[90]. Kumari J.P., Asokan M.P., Sobha S., Sankari A.L., Rekha K., Kala R.G., Jayasree

R., Thulaseedharan A. (1999), “Somatic embryogenesis and Plant regeneration

from immature anthers of Heveabrasiliens (Muell. Arg)”, Journal of Current

Science 76, 1242-1245.

[91]. Kusano, T., Berberich, T., Tateda, C., Takahashi, Y. (2008), “Polyamines:

essential factors for growth and survival”, Planta 228, 367-381.

[92]. Lelkak-Levanic D., Bauer N., Mihaljevic S., Jelaska S. (2004), “Somatic

embryogenenic in pumpkin (Cucurbita pepo L.): control of somatic embryo

development by nitrogen compounds”, Journal of Plant Physiology 161: 229-

236.

[93]. Li, G., Hall, T.C., Holmes-Davis, R. (2002), “Plant chromatin: development and

gene control”, Bioessays 24, 234-243.

[94]. Mandal A.K.A., Gupta S. D. (2003), “Somatic embryogenesis of safflower:

influence of auxin and ontogeny of somatic embryos”, Plant Cell Tissue and

Organ Cultrue 72, 27-31.

[95]. Manrique S.L., Roca W. (1987), “Effect of photoperiod and culture medium in

somatic embryogenesis and the histological analysis of the process in cassava.

Manihot esculenta Crantz”, Acta Agrobotanica 37, 7-18.

[96]. Mary R.J., Jayabalan N. (1997), “Influence of growth regulators on somatic

embryogenesis in sesame”, Plant Cell Tissue and Organ Cultrue 49, 67-70.

[97]. Mehrotra S., Goel M.K, Kukreja A.K., Mishra B.N. (2007), “Efficiency of liquid

culture systems over conventional micropropagation: A progress towards

- requirement for wheat

commercialization”, African Jounal of Biotechnology 6(13), 1484-1492.

+ and NO3

[98]. Menke-Milczarek I., Zimmy J. (2001), “NH4

somatic embryogenesis”, Acta Physiolgiae Plantarum 23(1), 37-42.

[99]. Minocha R., Minocha S.C., Long (2004), “Polyamines and their biosynthetic

enzymes during somatic embryo development in red spruce (Picea rubens

Sarg.)”. In Virtro Cellular and Developmental Biology Plant 40, 572-580.

[100]. Minocha S.C., Minocha R. (1995), “Role of polyamines in somatic

embryogenesis”, Biotechnology in Agriculture and Forestry 30, 53-70.

[101]. Moltrasio, R., Robredo, C.G., Gomez, M.C., Paleo, A.H.D., Diaz, D.G., Rios,

R.D., Franzone, P.M. (2004), “Alfalfa (Medicago sativa) somatic embryogenesis:

genetic control and introduction of favourable alleles into elite Argentinean

germplasm”. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 77, 119-124.

[102]. Monteiro M., Kevers C., Dommes J., Gaspar T. (2002), “A specific role for

spermidine in the initiation phase of somatic embryogenesis in Panax ginseng

CA Meyer”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 68, 225-232.

[103]. Moore T.C. (1989), “Biochemistry and physiology of plant hormones”, Springer,

New York.

[104]. Mullin, R.H., Schlegel, D.E. (1976), “Cold storage maintenance of strawberry

meristem plantlets”, Horticultural Sciences 11, 100-101.

[105]. Murashige T., Skoog F. (1962), “A revised medium for rapid growth and

bioassays with tobacco tissue culture”, Physiology Plantarum 15, 473-497.

[106]. Nakagawa N., Ogita S., Kubo T., Funada R. (2006), “Effect of polyamines and L-

Ornithine on the development of proembryogenic masses of Cryptomeria

japonica”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 85, 229-234.

[107]. Nasim A. (2013), “Endogenous polyamines: a temporal cellular modulator of

somatic embryogenesis in Guava (Psidium guajava L. cv. Allahabad Safeda)”,

Plant Science 1(2), 4-14.

[108]. Neumann, K. H. (2000), “Some studies on somatic embryogenesis: A tool in plant

biotechnology”, Based on a lecture at the 87th Indian Science congress Jan in

Pune, India (http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2000/321).

[109]. Neusa S., Claudete S.C., Vanildo S., Eny I.S.F., Miguel P.G. (2007), “Polyamine

effects on growth and endogenous hormones levels in Araucaria angustifolia

embryogenic cultures”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 89, 55-62.

[110]. Nieves N., Sagarra F., González R., Lezcano Y., Cid M., Blanco M.A., Castillo R.

(2008), “Effect of exogenous arginine on sugarcane (Saccharum sp.) somatic

embryogenesis, free polyamines and the contents of the soluble proteins and

proline”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 95, 313-320.

[111]. Nhut D.T, Huy N.P., Chien H.X., Luan T.C., Vinh B.T., Thao L.B. (2012b), “In

vitro culture of petiole longiditunal thin cell layer explants of Vietnam gingseng

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) and preliminary analysis of saponin

content”, International Journal of Applied Biology and Phamarceutical

Technology 3(3), 178-190.

[112]. Nhut D.T., Luan V.Q., Binh N.V., Phong P.T., Huy B.N., Ha D.T.N., Tam P.Q.,

Nam N.B., Hien V.T., Vinh B.T., Hang L.T.M., Ngoc D.T.M., Thao L.B., Luan

T.C. (2009), “The effects of some factors on in vitro biomass production of

Vietnamese gingseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) and prelimitary

analysis of saponin content”, Vietnamese Journal of Biotechnology 7(3), 357-

370.

[113]. Nhut D.T., Nga L.T.M., Chien H.X., Huy N.P. (2012c), “Morphogenesis of in

vitro main root transverse thin cell layers of Vietnam gingseng (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.), African Journal of Biotechnology 11(23), 6274-

6289.

[114]. Nhut, D.T., Vinh, B.V.T., Hien, T.T., Huy N.P., Nam, N.B., Chien, H.X. (2012a),

“Effects of spermidine, proline and carbohydrate sources on somatic

embryogenesis from main root transverse thin cell layers of Vietnamese ginseng

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, African Journal of Biotechnology 11(5):

1084-1091.

[115]. Onofrio, D.C., Morini S., Bellocchi G. (1998), “Effect of light quality on somatic

embriogenesis of quince leaves”. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 53, 91-

98.

[116]. Park S.J., Kim S.M., Kim M.H., Kim C.S., Lee C.H. (2000), “Development of a

prototype continuous flow dryer using far infrared ray and heated-air for white

ginseng”, Journal of the Korean Chemical Society 25(2), 115-122.

[117]. Pasternak, T. P., Prinsen, E., Ayaydin, F., Miskolczi, P., Potters, G., Asard ,H.,

Van Onkelen H. A., Dudits D., Fehér A. (2002), “The role of auxin, pH and

stress in the activation of embryogenic cell division in leaf protoplast-derived

cells of Alfalfa”, Plant Physiology 129, 1807-1819.

[118]. Prakash M.G., Gurumurthi K. (2005), “Somatic embryogenesis and plant

regeneration in Eucalyptus tereticornis”. Journal of Current Science 88, 1311-

1316.

[119]. Rajam M.V. (1997), “Polyamines”, Plant Ecophysiology, 343-374.

[120]. Rampadarath S., Puchooa D., Ranghoo-Sanmukhiya M. (2014), “Optimized in

vitro plant regeneration of the biodiesel plant Jatropha curcas L.: the effects of

using seeds at different stages of maturity as starting materials”, International

Journal of Plant Biology 5, 33-37.

[121]. Rastogi R., Davies P.J. (1991), “Effects of light and plant growth regulators on

polyamine metabolism in higher plants”, Biochemistry and physiology of

polyamines in plants, 187-199.

[122]. Ravindra B., Malabadi K., Nataraja K. (2007), “Putrescine influences somatic

embryogenesis and plant regeneration in Pinus geradiana Wall”, Journal of

Plant Physiology 2, 107-114.

[123]. Rugini E., Luppino M., de Agazio M. (1992), “Endogenous polyamine and root

morphogenesis variations under different treatments in cuttings and in in vitro

explants of olive. Acta Horticulturae 300, 225-232.

[124]. Šamaj, J., Baluska, F., Pretová, A., Volkmann, D. (2003), “Auxin surge following

fertilization in carrots: a mechanism for regulating plant totipotency”, Planta

214, 505-509.

[125]. Santa-Catarina C., Silveira V., Scherer G.F.E., Floh E.I.S. (2007), “Polyamines

and nitric oxide levels relate with morphogenetic evolution in somatic

embryogenesis of Ocotea catharinensis”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture

90, 93-101.

[126]. Santos M., Claparols I., Torné J.M. (1993), “Effect of exogenous arginine,

ornithine, methionine and γ-amino butyric acid on maize (Zea mays L.)

embryogenesis and polyamine content”. Journal of Plant Physiology 142(1), 74-

80.

[127]. Savita, V., Virk G.S., Nagpal A. (2010), “Effect of explant type and different plant

growth regulators on callus induction and plantlet regeneration in Citrus jambhiri

Lush”, International Journal of Science and Technology 5, 97-106.

[128]. Schmidt, E. D., Guzzo, F., Toonen, M. A., de Vries, S. C. (1997), “A leucine-rich

repeat containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent to

form embryos”, Development 124, 2049-2062.

[129]. Shahana S., Gupta S.C. (2002), “Somatic embryogenesis in Sesbania sesban var.

bicolor: a multipurpose fabaceous woody species”. Plant Cell Tissue and Organ

Cultrue 69, 289-292.

[130]. Shasthree T., Chandrashekar C., Savitha R., Imran M., A. (2014), “Adventitious

shoot organogenesis and plant regeneration from leaf and cotyledon explants of

Citrullus colocynthis”, Journal of Herbs, Spices and Medicinal Plant 20(3), 235-

244.

[131]. Silva P., Ricardo C.P.P. (1992), “Beta-fructosidases and in vitro dedifferentiation-

rediffferentiation of carrot cells”, Phytochemical Analysis 31, 1507-1511.

[132]. Silveira, V., Balbuena, T. S., Santa-Catarina, C., Floh, E. I. S., Guerra, M. P.,

Handro W. (2004a), “Biochemical changes during seed development in Pinus

taeda L.”, Plant Growth Regulation 44, 147-156.

[133]. Silveira, V., Floh, E. I. S., Handro, W., Guerra, M. P. (2004b), “Effect of plant

growth regulators on the cellular growth and levels of intracellular protein, starch

and polyamines in embryogenic suspension cultures of Pinus taeda”, Plant Cell,

Tissue and Organ Culture 76, 53-60.

[134]. Silvera V., Santacatarina C., Tun N.N., Scherer G.E.F., Handro W., Guerra M.P.,

Floh E.I.S. (2006), “Polyamine effects on the endogenous polyamine contents,

nitric oxide release, growth and differentiation of embryogenic suspension

cultures of Araucaria angustifolia (Bert.) O Ktze”, Plant Science 171, 91-98.

[135]. Siong P., Taha R.M., Rahiman F.A. (2011), “Somatic embryogenesis and plant

regeneration from hypocotyls and leaf explants of Brassica oleracea var. Botrytis

(Cauliflower)”, Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 53, 26-31.

[136]. Slocum R.D., Kaur-Sawhney R., Galston A.W. (1984), “The physiology and

biochemistry of polyamines in plants”, Archives of Biochem and Biophysics 235,

283-303.

[137]. Slocum, R. D. (1991), “Tissue and subcellular localisation of polyamines and

enzymes of polyamine metabolism”, Biochemistry and Physiology of Polyamines

in plants, 93-105.

[138]. Stasolla C., Yeung E.C. (2003), “Recent advances in conifer somatic

embryogenesis: improving somatic embryo quality”, Plant Cell, Tissue and

Organ Culture 74, 15-35.

[139]. Tautorus T.E., Dunstan D.I. (1991), “Somaticembryogenesis in conifers”,

Canadian Journal of Botany, 69, 1873-1899.

[140]. Taylor, R.L. (1967). The foliar embryos of Malaxis paludosa. Canadian Journal of

Botany, 45, 1553-1556.

[141]. Tiburcio, A. F., Altabella, T., Borrell, A., Masgraw, C. (1997), “Polyamine

metabolism and its regulation”, Physiologia Plantarum 100, 664-674.

[142]. Tiburcio, A. F., Kaur-Sawhney, R., Galston, A. W. (1990), “Polyamine

metabolism”, The Biochemistry of Plants, Intermediary Nitrogen Fixation, 283-

325.

[143]. Timmers A.C.J., Schel J.H.N. (1991), “Localization of cytosolic Ca2+ during carrot

somatic embryogenesis using confocal scanning laser microscopy”, Progress in

Plant Growth Regulation, 347-353.

[144]. Theiss C., Bohley P., Voigt J. (2002), “Regulation by polyamines of ornithine

decarboxylase activity and cell division in the unicellular green

alga Chlamydomonas reinhardtii”, Plant Physiology 128, 1470-1479.

[145]. Verdeil, J.L., Hocher, V., Huet, C., Rosdemange, F., Escoute, J, Ferriere, N.,

Nicole, M. (2001), “Ultrastructural changes in coconut calli associated with the

acquisition of embryogenic competence”, Annals of Botany 88, 9-18.

[146]. Verhagen, S. A., Wann, S. R. (1989) “Norway spruce somatic embryogenesis:

high frequency from light-culture matured embryo”, Plant Cell, Tissue and

Organ Culture 16, 103-111.

[147]. Verma D., Joshi R., Shukla A., Kumar P. (2011), “Protocol for in vitro somatic

embryogenesis and regeneration of rice (Oryza sativa L.)”, Indian Journal of

Experimental Biology 49, 958-963.

[148]. Wang Y., Ruemmele B., Chandlee J., Sullivan M., Knapp J., Kausch A. (2002),

“Embryogenic callus induction and plant regeneration media for bent grasses and

annual bluegrass”. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 38, 460-

467.

[149]. Wise M.J, Tunnacliffe A. (2004), “POPP the question: what do LEA proteins do?”

Trends in Plant Science 9, 13-17.

[150]. Xiang L.Y., Jung Y.H., Young E.C. (2007), “Plant regeneration via direct somatic

embryogenesis in Panax japonicus”, Plant Biotechnology Reports 1:5-9.

[151]. Xie D.Y., Hong Y. (2001), “Regeneration of Acacia mangium through somatic

embryogenesis”, Plant Cell Reports 20, 34-40.

[152]. Yadav J.S., Rajam M.V. (1997), “Spatial distribution of free and conjugated

polyamines in leaves of Solanum melongena L. associated with differential

morphogenetic potential: efficient somatic embryogenesis with putrescine,

Journal of Experimental Botany 48, 1537-1545.

[153]. Yamasaki K. (2000), “Bioactive saponins in Vietnamese gingseng, Panax

vietnamensis”, Pharmaceutical Biology 28, 16-24.

[154]. Yamasaki H., Cohen, M. F. (2006), “NO signal at the crossroads: polyamine-

induced nitric oxide synthesis in plants”. Trends in Plant Science 11, 522-524.

[155]. http://samngoclingtkh.com/