Một số đa hình gen TP53 trong ung thư tế bào gan nguyên phát

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> MỘT SỐ ĐA HÌNH GEN TP53<br /> TRONG UNG THƯ TẾ BÀO GAN NGUYÊN PHÁT<br /> Trịnh Quốc Đạt, Trần Huy Thịnh<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Tính đa hình thái của gen áp chế ung thư TP53 được xem như là nhân tố quan trọng đối với sự hình<br /> thành và phát triển bệnh ung thư. Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, có rất nhiều đa hình kiểu gen được<br /> phát hiện trên vùng mã hóa và không mã hóa của TP53, các đa hình này tạo ra những kiểu gen TP53 khác<br /> nhau trong cộng đồng. Một số nghiên cứu khác cũng ghi nhận sự khác biệt về khả năng mắc ung thư của<br /> các kiểu gen TP53. Nghiên cứu này đã tiến hành phân tích một số đa hình kiểu gen TP53 (D21D, P34P,<br /> P36P, P47S, V217M, G360A và dup16) ở 280 bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát so với 267 người<br /> lành đối chứng. Kết quả cho thấy, không có sự liên quan có ý nghĩa giữa các đa hình kiểu gen D21D, P34P,<br /> P36P, P47S, V217M, G360A với ung thư tế bào gan nguyên phát. Kiểu gen A1A2 của dup16 gặp nhiều hơn<br /> ở nhóm bệnh nhân so với nhóm chứng (p = 0,02).<br /> Từ khóa: gen TP53, đa hình kiểu gen, ung thư gan tế bào gan nguyên phát<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> TP53 là gen áp chế ung thư hoạt động như<br /> <br /> SNPs có liên quan đến khả năng mắc một số<br /> <br /> một yếu tố phiên mã, đóng vai trò quan trọng<br /> <br /> loại hình ung thư. Đây được coi là những yếu<br /> <br /> trong các con đường chuyển hóa và một số<br /> <br /> tố nguy cơ cần được quan tâm. Một số SNPs<br /> <br /> quá trình hoạt động tế bào như sửa chữa<br /> <br /> của TP53 thường được nghiên cứu trong ung<br /> <br /> DNA, ức chế tăng sinh mạch, kìm hãm chu<br /> <br /> thư bao gồm: dup16, D21D, P34P, P36P,<br /> <br /> trình tế bào, tế bào chết theo chương trình [1;<br /> <br /> Pro47Ser, V217M, G360A [1]. SNP dup16 là<br /> <br /> 2; 3]. Khi có tổn thương DNA, TP53 có thể<br /> <br /> hiện tượng đa hình thái do sự thêm 16 base<br /> <br /> dừng chu trình tế bào cho đến khi DNA được<br /> <br /> pair (dup16) tại vùng không mã hóa thứ 3 của<br /> <br /> sửa chữa hoặc gây chết tế bào theo chương<br /> <br /> TP53. Những người mang kiểu gen dup16 có<br /> <br /> trình (apoptosis) nếu không còn khả năng sửa<br /> <br /> sự biểu hiện protein p53 trong tế bào ở mức<br /> <br /> chữa [2; 3]. Chính vì các đặc tính sinh học<br /> <br /> thấp. Điều này chứng tỏ rằng, dup16 có khả<br /> <br /> này, TP53 được xem như một trong những<br /> <br /> năng thay đổi quá trình hoàn thiện mRNA [4].<br /> <br /> gen ức chế khối u quan trọng.<br /> <br /> Các SNPs D21D, P34P, P36P mặc dù không<br /> <br /> Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các đa<br /> hình gen (SNPs) trên vùng mã hóa và không<br /> mã hóa của gen TP53 đã tạo ra các kiểu gen<br /> khác nhau của TP53 và sự khác biệt của các<br /> <br /> làm thay đổi bộ ba mã hóa nhưng cũng làm<br /> giảm sự biểu hiện của protein p53. Nhiều<br /> nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các SNPs này nằm<br /> tại vùng hoạt hoá, sao chép N-tận của TP53<br /> và chứa đựng vị trí tương tác của với MDM2<br /> (yếu tố điều hoà âm tính của TP53) nên có thể<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ môn Hóa sinh, Trường<br /> Đại học Y Hà Nội<br /> Email: huythinhda@yahoo.com<br /> Ngày nhận: 17/8/2016<br /> Ngày được chấp thuận: 08/12/2016<br /> <br /> TCNCYH 102 (4) - 2016<br /> <br /> làm giảm khả năng phiên mã và dịch mã của<br /> TP53 [1; 5]. Tất cả sự suy giảm biểu hiện của<br /> TP53 đều tạo ra cơ hội lớn hơn cho các dòng<br /> tế bào ác tính được lựa chọn.<br /> <br /> 1<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> P47S là một SNP có sự thay đổi trình tự<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> acid amin của p53. Trong điều kiện bình<br /> thường, dưới tác động của protein p38 và<br /> <br /> 1. Đối tượng<br /> <br /> homeodomain - interacting protein kinase 2<br /> <br /> Nhóm bệnh: 280 mẫu máu của bệnh<br /> <br /> (HIPK2) p53 được phosphoryl hóa tại vị trí<br /> <br /> nhân ung thư tế bào gan nguyên phát đã<br /> <br /> S46 dẫn đến sự tăng cường sao chép các gen<br /> <br /> được chẩn đoán và điều trị tại Khoa Nội tiêu<br /> <br /> liên quan đến kích hoạt appotosis. Khi alen<br /> <br /> hoá Bệnh viện Bạch Mai và Trung tâm Ung<br /> <br /> p53 - P47 được thay thế bởi alen p53 - S47<br /> <br /> bướu Thanh Hoá từ tháng 12/2013 đến tháng<br /> <br /> sự phosphoryl hóa tại vị trí S46 bị giảm sút.<br /> <br /> 12/2015.<br /> <br /> Hậu quả làm suy yếu sự tác động của gen<br /> đích lên quá trình kích hoạt apoptosis, dẫn<br /> đến tăng khả năng mắc ung thư [6; 7].<br /> <br /> Nhóm chứng: 267 mẫu máu được lựa<br /> chọn ngẫu nhiên, của những người đến khám<br /> và điều trị một số bệnh mạn tính tại Bệnh viện<br /> <br /> V217M là SNP nằm trên vùng gắn kết DNA<br /> <br /> Đa khoa tỉnh Thanh Hoá. Những bệnh nhân<br /> <br /> của p53 (DNA binding domain). Sự thay đổi<br /> <br /> này được khám và kết luận là không mắc ung<br /> <br /> trình tự acid amin làm giảm sự gắn kết của<br /> <br /> thư tế bào gan nguyên phát hay bất kỳ một<br /> <br /> p53 với các gen đích. Các gen bị ảnh hưởng<br /> <br /> loại hình ung thư nào khác.<br /> <br /> trực tiếp gồm có CDKN1A, BAX và PMAIP1.<br /> Đây là các gen liên quan đến chức năng<br /> kích hoạt apoptosis của TP53. Nghiên cứu<br /> <br /> Nghiên cứu được thực hiện tại Trung<br /> tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại<br /> học Y Hà Nội.<br /> <br /> trên mô hình chuột cho thấy kiểu gen p53 M217 có sự biểu hiện của những gen trên cao<br /> <br /> 2. Phương pháp<br /> <br /> gấp nhiều lần biến thể p53 - V217. Như vậy,<br /> <br /> 2.1. Thu thập mẫu<br /> <br /> kiểu gen p53 - M217 có khả năng bảo vệ<br /> tế bào chống lại các tác nhân gây ung thư tốt<br /> hơn kiểu gen p53 - V217. Đa hình G360A nằm<br /> tại vùng nối của p53. SNP này tác động lên<br /> sự biểu hiện của BAX và MDM2, đây là những<br /> gen quan trọng trong con đường tín hiệu<br /> p53 [1].<br /> Đã có một số nghiên cứu về các đa hình<br /> kiểu gen TP53 trên các loại hình ung thư khác<br /> nhau, được thực hiện ở nhiều quốc gia, nhiều<br /> chủng tộc trên Thế giới. Tại Việt Nam, chưa<br /> có nghiên cứu nào đánh giá một cách toàn<br /> diện các đa hình kiểu gen của TP53 trên bệnh<br /> nhân ung thư tế bào gan nguyên phát. Do đó,<br /> <br /> - Thu thập mẫu máu của bệnh nhân ung<br /> thư tế bào gan nguyên phát và mẫu chứng.<br /> 2.2. Tách chiết DNA<br /> - DNA được tách chiết theo phương pháp<br /> phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi<br /> của bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên<br /> phát và người lành đối chứng.<br /> - Kiểm tra độ tinh sạch và đo nồng độ của<br /> DNA được tách chiết bằng phương pháp đo<br /> quang, dựa vào tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0.<br /> 2.3. Xác định kiểu gen TP53 bằng kỹ<br /> thuật PCR và giải trình tự gen<br /> <br /> nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu:<br /> <br /> Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để khuếch<br /> <br /> Đánh giá sự liên quan của các kiểu gen D21D,<br /> <br /> đại các vùng gen chứa các SNPs của gen<br /> <br /> P34P, P36P, P47S, V217M, G360A và dup 16<br /> <br /> P53, trình tự của các cặp mồi được trình bày<br /> <br /> với ung thư tế bào gan nguyên phát.<br /> <br /> ở bảng 1.<br /> <br /> 2<br /> <br /> TCNCYH 102 (4) - 2016<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Bảng 1. Trình tự mồi cho phản ứng PCR khuếch đại các SNP<br /> <br /> SNPs<br /> <br /> Mồi xuôi 5’-3’<br /> <br /> Mồi ngược 5’-3’<br /> <br /> PCR<br /> Exon*<br /> <br /> D21D<br /> <br /> GAAGCAGCCATTCTTTTCCT<br /> <br /> GGTCCCCAGCCCAACCCTT<br /> <br /> 334 bp<br /> Exon 2<br /> <br /> P34P, P36P,<br /> P47S<br /> <br /> CAACGTTCTGGTAAGGACAA<br /> <br /> GCCAGGCATTGAAGTCTCAT<br /> <br /> 511bp<br /> Exon 4<br /> <br /> V217M<br /> <br /> AGCGCTGCTCAGATAGCGAT<br /> <br /> TAAGCAGCAGGAGAAAGCCC<br /> <br /> 181 bp<br /> Exon 6<br /> <br /> G360A<br /> <br /> GCTGTATAGGTACTTGAAGTGC<br /> <br /> CTGTCGATACACTGAGGCAAG<br /> <br /> 433 bp<br /> Exon 10<br /> <br /> Dup 16<br /> <br /> TGGGACTGACTTTCTGCTCTT<br /> <br /> TCAAATCATCCATTGCTTGG<br /> <br /> 119 bp<br /> Intron 3<br /> <br /> * Exon được khuếch đại<br /> Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích<br /> <br /> để phân tích số liệu. Dùng kiểm định χ2 để so<br /> <br /> 20μl gồm: 10 μl Taq polymerase, 1μl mồi xuôi,<br /> <br /> sánh tỷ lệ kiểu gen TP53 của hai nhóm ung<br /> <br /> 1μl mồi ngược, 2μl DNA và 6μl H2O. Chu trình<br /> <br /> thư tế bào gan nguyên phát và không bị ung<br /> <br /> o<br /> <br /> nhiệt của phản ứng PCR: 94 C/5 phút, 33 chu<br /> o<br /> <br /> o<br /> <br /> thư tế bào gan nguyên phát. Để ước tính mối<br /> <br /> o<br /> <br /> liên quan giữa các kiểu gen và khả năng mắc<br /> <br /> 72 C/7 phút. Bảo quản mẫu ở 15 C.<br /> <br /> ung thư tế bào gan nguyên phát dùng tỷ suất<br /> <br /> kỳ [94 C/30 giây, 60 C/30 giây, 72 C/30 giây],<br /> o<br /> <br /> o<br /> <br /> Sản phẩm PCR được điện di trên gel<br /> agarose 1,5% kiểm tra, sau đó được tiến hành<br /> giải trình tự theo quy trình thường quy. Kết<br /> quả được so với trình tự Genebank.<br /> <br /> OR với khoảng tin cậy 95%. Các kiểm định có<br /> ý nghĩa, p < 0,05.<br /> 3. Đạo đức trong nghiên cứu<br /> Đề tài đã được Hội đồng đạo đức của<br /> <br /> Riêng với SNP dup 16, nhóm nghiên cứu<br /> <br /> Trường Đại học Y Hà Nội thông qua theo<br /> <br /> không tiến hành giải trình tự gen mà so sánh<br /> <br /> chấp thuận số 118/HĐĐĐ-ĐHYHN. Bệnh nhân<br /> <br /> kích thước sản phẩm PCR, bình thường sẽ có<br /> <br /> hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu<br /> <br /> kích thước 119 bp, nếu có thêm đoạn 16bp<br /> <br /> và có quyền rút lui khỏi nghiên cứu bất ký thời<br /> <br /> sản phẩm PCR sẽ có trọng lượng phân tử 135<br /> <br /> điểm nào. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm<br /> <br /> bp. Kiểu gen A1A1 sẽ chỉ có 1 băng 119 bp,<br /> <br /> bảo bí mật.<br /> <br /> kiểu gen A1A2 sẽ có hai băng 119 và 135 bp,<br /> kiểu gen A2A2 sẽ có một băng với kích thước<br /> 135bp.<br /> 3. Phân tích số liệu<br /> Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16.0<br /> <br /> TCNCYH 102 (4) - 2016<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> 1. Đặc điểm của nhóm nghiên cứu<br /> Đối tượng nghiên cứu gồm 280 bệnh nhân<br /> ung thư tế bào gan nguyên phát (nhóm bệnh)<br /> 3<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 267 người bình thường nhóm chứng. Kết quả<br /> <br /> các điều kiện khá tương đồng nhau về tuổi và<br /> <br /> cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa<br /> <br /> giới. Tỷ lệ mắc bệnh ở nam cao hơn nữ<br /> <br /> thống kê (p > 0,05) về độ tuổi và giới tính giữa<br /> <br /> (p < 0,01). Tỷ lệ bệnh nhân ung thư tế bào gan<br /> <br /> hai nhóm bệnh và nhóm chứng. Điều này đồng<br /> <br /> nguyên phát có HBV dương tính là khá cao,<br /> <br /> nghĩa với việc nhóm bệnh và nhóm chứng có<br /> <br /> chiếm 45,3%.<br /> <br /> Bảng 2. Đặc điểm nhóm đối tượng nghiên cứu<br /> Bệnh<br /> <br /> Chứng<br /> <br /> Đặc điểm<br /> <br /> p<br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> Nam<br /> <br /> 223<br /> <br /> 79,6<br /> <br /> 214<br /> <br /> 78<br /> <br /> Nữ<br /> <br /> 57<br /> <br /> 20,4<br /> <br /> 53<br /> <br /> 22<br /> <br /> Giới<br /> <br /> 0,16<br /> <br /> Tuổi (năm) trung bình<br /> <br /> 56,2 ± 12,75<br /> <br /> 55,02 ± 11,97<br /> <br /> 0,24<br /> <br /> Nghiện rượu<br /> <br /> 37<br /> <br /> 13,2<br /> <br /> 9<br /> <br /> 3,3<br /> <br /> Nhiễm HBV<br /> <br /> 127<br /> <br /> 45,3<br /> <br /> 25<br /> <br /> 9,3<br /> <br /> Xơ gan<br /> <br /> 33<br /> <br /> 11,8<br /> <br /> 6<br /> <br /> 2,2<br /> <br /> 2. Đánh giá mối liên quan của đa hình dup 16 với ung thư tế bào gan nguyên phát<br /> Đây là đa hình thái đầu tiên của gen TP53 được nhóm nghiên cứu phân tích. DNA sau khi<br /> tách chiết được khuếch đại đoạn gen vùng intron 3. Đa hình kiểu gen có thêm đoạn hay không<br /> có, được xác định bằng hình ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%.<br /> <br /> K70<br /> <br /> K79 K80 K82 K83 K84 C7 C8<br /> <br /> C9<br /> <br /> C10 M<br /> <br /> 135 bp<br /> 119 bp<br /> Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của dup 16<br /> M: Marker 100bp, K mẫu bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát, C: mẫu đối chứng<br /> K70: kiểu gen A2A2, K79: kiểu gen A2A1, K80-C10: kiểu gen A1A1<br /> Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại đoạn gen intron 3 của TP53 cho kết quả phù hợp với lý<br /> thuyết. Mẫu K70 có một vạch 135 bp là kiểu gen đồng hợp A2A2. Mẫu 79 có hai vạch 135 bp và<br /> 4<br /> <br /> TCNCYH 102 (4) - 2016<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 119 bp tương ứng kiểu gen A2A1. Còn lại các mẫu từ K80 - C10 là kiểu gen A1A1 do chỉ có một<br /> vạch tương đương 119 bp. Tiến hành trên tổng số 547 mẫu DNA của nhóm đối tượng nghiên<br /> cứu thu được kết quả ở bảng 3.<br /> Bảng 3. Kết quả phân tích đa hình kiểu gen dup 16<br /> Nhóm bệnh (280)<br /> <br /> Nhóm chứng (267)<br /> <br /> Kiểu gen<br /> Alen A2<br /> <br /> p<br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> 17<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> OR<br /> <br /> %<br /> 5<br /> <br /> 0,9<br /> <br /> 3,31 (1,22 - 8,67)<br /> 0,021<br /> <br /> Alen A1<br /> <br /> 543<br /> <br /> 97,0<br /> <br /> 529<br /> <br /> 99,1<br /> <br /> A2A2<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0,3<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> A2A1<br /> <br /> 15<br /> <br /> 5,0<br /> <br /> 5<br /> <br /> 1,9<br /> <br /> 1,00<br /> <br /> 2,97 (1,07 - 8,31)<br /> 0,025<br /> <br /> A1A1<br /> <br /> 264<br /> <br /> 94,7<br /> <br /> 262<br /> <br /> 98,1<br /> <br /> 1,00<br /> <br /> Biến thể có thêm đoạn 16 bp (A2A2) gặp rất thấp trong nhóm đối tượng nghiên cứu. Kiểu gen<br /> đồng hợp A2A2 chỉ gặp một trường hợp nên không tính được tỷ suất OR cũng như kiểm định χ2<br /> không có giá trị. Tuy nhiên, kiểu gen dị hợp A1A2 gặp nhiều hơn ở nhóm bệnh nhân (p = 0,02).<br /> Kiểu gen A1A2 cũng làm tăng khả năng mắc bệnh hơn so với kiểu gen không có đột biến A1A1.<br /> Kết quả phân tích cũng cho thấy alen A2 có nguy cơ mắc bệnh cao hơn alen A1 (p = 0,02).<br /> 3. Đánh giá mối liên quan của các kiểu gen D21D, P34P, P36P, P47S, V217M, G360A với<br /> ung thư tế bào gan nguyên phát<br /> Sử dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp phân tích kiểu gen tại các SNPs D21D, P34P, P36P,<br /> P47S, V217M, G360A trên gen TP53. So sánh với trình tự Genebank của TP53. Hình 2 là kết<br /> quả minh họa đại diện một số kiểu gen.<br /> <br /> Hình 2. Kết quả giải trình tự xác định kiểu gen tại codon 36 và codon 360<br /> Hình 2 cho thấy tại vị trí codon 36, chỉ gặp 2 kiểu gen là G/A (hình a) và G/G (hình b), tại<br /> codon 360 chỉ gặp kiểu gen G/G (hình c).<br /> <br /> TCNCYH 102 (4) - 2016<br /> <br /> 5<br /> <br />