Mục tiêu của đề tài nghiên cứu nhằm xác định sự lưu hành của virus Gumboro trên gà nuôi ở quy mô trang trại, hộ gia đình tại ĐBSCL; xác định đặc tính di truyền của virus Gumboro được phân lập tại ĐBSCL; khảo sát tỉ lệ đáp ứng miễn dịch và sự khác biệt đáp ứng miễn dịch của 3 loại vaccine Gumboro trên 2 giống (gà nòi Bến Tre và gà Lương Phượng).
Qua thời gian học tập và rèn luyện của bản thân tại trường Đại học Cần Thơ, tôi đã hoàn thành luận án. Tôi đã không ngừng học tập và tích lũy những kiến thức tại trường và kinh nghiệm từ thực tiễn. Trong khoảng thời gian đó tôi đã nhận được sự ủng hộ và động viên rất lớn từ gia đình, sự nhiệt tình giúp đỡ từ quý Thầy Cô giảng dạy, sự chia sẻ từ bạn bè. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:
Đến Cha mẹ, người đã sinh ra và nuôi dưỡng tôi nên người. Cha mẹ đã cho tôi niềm tin và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ vật chất đến tinh thần để tôi hoàn thành tốt con đường học tập.
Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Sau Đại học,
Khoa Nông nghiệp đã tạo điều kiện để cho tôi học tập và rèn luyện.
Ban Giám Hiệu Trường Cao Đẳng Cộng Đồng Đồng Tháp, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông Nghiệp – Thủy Sản, Bộ môn Thú Y đã tạo điều kiện để tôi nghiên cứu và hoàn thành luận án này
Xin chân thành cảm ơn PGs.Ts. Trần Ngọc Bích – cán bộ hướng dẫn đã tạo điều kiện thuận lợi và truyền đạt cho tôi nhiều ý kiến quý báu trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này.
Xin cám ơn các anh chị nghiên cứu sinh K2, K3 đã tạo điều kiện, giúp đỡ
trong quá trình học tập.
Xin gửi lời tri ân đến các em Tứ, Tín – học viên cao học K21, K22, K23 đã
tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn và kính chúc quý thầy cô và tất cả dồi
dào sức khỏe, hạnh phúc và thành công!
Cần Thơ, ngày 07 tháng 10 năm 2019
Tác giả
i
Ngô Phú Cường
Luận án “Nghiên cứu bệnh Gumboro trên gà tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện từ tháng 10 năm 2015 đến tháng 10 năm 2018. Nội dung thực hiện gồm: Khảo sát tình hình bệnh Gumboro trên gà tại ĐBSCL. Phân tích di truyền virus Gumboro được phân lập tại ĐBSCL. Đáp ứng miễn dịch với 3 loại vaccine Gumboro được lựa chọn từ kết quả nghiên cứu trên 2 giống gà (Lương Phượng, nòi Bến Tre).
Kết quả khảo sát cho tỉ lệ nhiễm bệnh Gumboro của giống gà Tàu Vàng cao nhất (68,4%), thấp nhất là gà Nòi lai (28,8%). Bệnh xảy ra chủ yếu trên gà nuôi theo hình thức nhốt hoàn toàn và bán chăn thả (tương đương 57,1% và 55,0%), nuôi thả hoàn toàn là 28,0%. Gà mắc bệnh tập trung ở giai đoạn từ 3 đến 6 tuần tuổi (21 - 42 ngày tuổi). Gà không tiêm vaccine có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất (66,7%), thấp nhất ở những đàn được tiêm nhắc lại lần 2 (24,5%). Đàn gà nuôi tại Hậu Giang có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất (60,0%) và thấp nhất ở An Giang (37,9%).
Kết quả giải trình tự nucleotide và amino aicd từ vị trí 634-1022 ở vùng siêu biến đổi gene VP2 cho thấy các mẫu virus Gumboro tại Hậu Giang, An Giang, Cần Thơ, Bến Tre, Vĩnh Long, Trà Vinh thuộc chủng có độc lực cao. Mẫu Cần Thơ 1 và các mẫu vaccine Bur 706, Cevac Gumboro L, Georgia thuộc nhóm nhược độc, mẫu vaccine IBD Blen và Nobilis thuộc nhóm biến đổi độc lực
Đáp ứng miễn dịch của 3 loại vaccine Gumboro được lựa chọn từ kết quả nội dung 2 trên 2 giống gà (Lương Phượng, nòi Bến Tre). Kết quả cho thấy gà được tiêm phòng 2 lần cho đáp ứng miễn dịch cao nhất 86,6%, 1 lần là 62,2% và thấp nhất ở gà không được tiêm phòng (18,3%). Giống gà nòi Bến Tre có tỉ lệ đáp ứng miễn dịch cao hơn giống gà Lương Phượng ở cả 2 lần tiêm phòng vaccine nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Tất cả các loại vaccine đều tạo miễn dịch cho gà sau khi tiêm phòng. Gà được tiêm vaccine 1 lần có tỉ lệ đáp ứng miễn dịch giữa 3 loại vaccine thử nghiệm gần tương đồng nhau (60,0% – 63,3%). Gà được tiêm vaccine 2 lần cho đáp ứng miễn dịch cao nhất ở vaccine 3 (93,3%) và thấp nhất là vaccine 2 (80,0%) nhưng sự sai khác không có ý nghĩa thống kê.
ii
Từ khóa: ĐBSCL, Elisa, gà, Gumboro, RT – PCR, vaccine, VP2,
The PhD dissertation named "Study on chicken gumboro disease in some provinces of the Mekong Delta" was conducted from October 2015 to October 2018. The research objectives are to survey the IBD in chickens in some provinces of the Mekong Delta; to analyse the genetic characterization of infectious bursal disease viruses (IBDVs) isolated in the Mekong Delta; and to evaluate the immune responses of vaccinated chickens by using three common vaccines on both Noi Ben Tre and Luong Phuong breeds.
Survey findings showed that the prevalence of IBD was highest in Tau Vang breed (68.4%) and lowest in hybrid Noi (28.8%). In addition, the IBD occurred mainly in chickens that reared in confined and semi-confined housing types (57.1% and 55.0% repectively) while it was 28.0% prevalence of IBD in free-range housing type. Moreover, chickens with the ages from 3 to 6 weeks (21 to 42 days of ages) were sensitive with IBD. The prevalence of IBD was highest in non- vaccinated chickens (66.7%) and lowest in second-immunized chickens (24.5%). Furthermore, the highest prevalence of IBD was detected in the chicken flocks in Hau Giang province (60.0%) and lowest in An Giang province (37.9%).
The sequencing results of partial VP2 sequences at position 634 to 1022 including hypervariation region revealed that IBDVs presented in Hau Giang, An Giang, Can Tho, Ben Tre, Vinh Long and Tra Vinh provinces were clustered to very virulent IBDV group. On the other hand, IBDV circulating in Can Tho (Can Tho 1) was attenuated IBDV that was similar to vaccine strains such as vaccine Bur 706, Cevac Gumboro L, Georgia. Meanwhile, other vaccine strains including vaccine IBD Blen and Nobilis were grouped to antigenic variant IBDV group.
iii
According to the results of phylogentic and pairwise sequence comparison analysis, three IBD vaccines such as IBD BLEN, Cevac Gumboro and Nobilis were selected for evaluating the immune responses of chickens after vaccination. In the present study, the prevalence of chickens owned maternal passive immunity was higher in Luong Phuong breed (86.6%) compared to Noi Ben Tre (73.3%). In addition, chickens with twice vaccinations provided the most effective immune response (86.6%), following by only one vaccination (62.2%) and least in non- vaccinated chickens (18.3%). In case of twice vaccination, Noi Ben Tre chickens had higher immune response rates to vaccines than in Luong Phuong chickens; however, this difference was not statistical signification (P<0.05). All used vaccines provided immune reponses in chickens after vaccination. The immune
response rates of vaccinated chickens with each vaccine without booster were almost similar (60.0% - 63.3%). In booster vaccination, immune responses in chickens to Nobilis vaccine were the most effective (93,35%) and least effective in Cevac Gumboro L vaccine (80.0%); however, this difference was not statistical signification (P<0.05).
Key words: Infectious bursal disease, VP2, vaccination, chicken, Mekong
iv
Delta
Tôi xin cam kết luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi với sự hướng dẫn của PGS.TS. Trần Ngọc Bích. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa được công bố bởi tác giả khác trong bất cứ luận án cùng cấp nào trước đây
Cần Thơ, Ngày 07 tháng 10 năm 2019
Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận án
v
PGS.TS. Trần Ngọc Bích Ngô Phú Cường
Trang
Tóm tắt .................................................................................................................... ii
Abstract .................................................................................................................. iii
Lời cam kết kết quả ................................................................................................ v
Mục lục .................................................................................................................. vi
Danh sách bảng ....................................................................................................... x
Danh sách hình ..................................................................................................... xii
Danh mục từ viết tắt ............................................................................................ xiv
Chương 1: GIỚI THIỆU ...................................................................................... 1
1.1 Tính cấp thiết của luận án ................................................................................. 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 2
1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .......................................................... 2
1.4 Điểm mới của đề tài .......................................................................................... 3
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4
2.1 Virus Gumboro ................................................................................................. 4
2.1.1 Sơ lược lịch sử phát hiện virus Gumboro ...................................................... 4
2.1.2 Hình thái, cấu trúc và phân loại virus gây bệnh Gumboro ............................ 4
2.1.3 Tính chất và cơ chế gây bệnh của IBDV ....................................................... 5
2.1.4 Triệu chứng lâm sàng do IBDV..................................................................... 7
2.1.5 Bệnh tích do IBDV ........................................................................................ 8
2.1.6 Chẩn đoán bệnh do IBDV ........................................................................... 10
2.2 Sinh học phân tử, biển đổi di truyền virus Gumboro ..................................... 17
2.2.1 Hệ gene của virus Gumboro ........................................................................ 17
2.2.2 Protein của virus - cấu trúc và chức năng .................................................... 19
2.2.3 Biến đổi di truyền và tiến hóa của virus Gumboro ...................................... 24
vi
2.2.4 Nhóm quyết định kháng nguyên và sự tiến hóa .......................................... 25
2.3 Hệ miễn dịch ở gà ........................................................................................... 30
2.3.1 Cơ quan chính tạo miễn dịch ở gà ............................................................... 30
2.3.2 Ảnh hưởng của IBDV đến khả năng đáp ứng miễn dịch ............................ 32
2.3.3 Sự ức chế miễn dịch..................................................................................... 33
2.4 Tình hình nghiên cứu về bệnh Gumboro ........................................................ 34
2.4.1 Nghiên cứu trong nước ................................................................................ 34
2.4.2 Nghiên cứu ngoài nước ................................................................................ 38
Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 43
3.1 Nội dung, thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................. 43
3.1.1 Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 43
3.1.2 Thời gian nghiên cứu: .................................................................................. 43
3.1.3 Địa điểm nghiên cứu .................................................................................... 43
3.2 Phương tiện nghiên cứu .................................................................................. 44
3.2.1 Thiết bị ......................................................................................................... 44
3.2.2 Hóa chất ....................................................................................................... 44
3.2.3 Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 45
3.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 45
3.3.1 Phương pháp khảo sát hộ/trại chăn nuôi về tình hình dịch bệnh Gumboro trên gà ................................................................................................................... 45
3.3.2 Phương pháp khảo sát một số đặc điểm triệu chứng và bệnh tích đặc trưng trên đàn gà nghi bệnh ............................................................................................ 46
3.3.3 Phương pháp xét nghiệm chẩn đoán virus Gumboro .................................. 47
3.3.4 Phương pháp xác định gene VP2 của virus Gumboro thu thập tại thực địa 49
3.3.5 Phương pháp giải trình tự Nucleotide gene VP2 và xác định độc lực của virus gây bệnh Gumboro ............................................................................................... 52
vii
3.3.6 Phương pháp so sánh và xây dựng cây phả hệ của các mẫu virus thực địa với ngân hàng gene (genbank) và các chủng vaccine sử dụng phổ biến tại ĐBSCL . 53
3.3.7 Phương pháp khảo sát đáp ứng miễn dịch của 3 loại vaccine Gumboro trên 2 giống gà nòi Bến Tre và Lương Phượng .............................................................. 55
3.4 Chỉ tiêu theo dõi.............................................................................................. 62
3.4.1 Nội dung 1 ................................................................................................... 62
3.4.2 Nội dung 2 ................................................................................................... 62
3.4.3 Nội dung 3 ................................................................................................... 62
3.5 Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 62
Chương IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................. 63
4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu tình hình bệnh Gumboro trên gà tại một số tỉnh/ thành vùng ĐBSCL ........................................................................................................ 63
4.1.1 Đặc điểm của các đàn gà bệnh Gumboro .................................................... 63
4.1.2 Tần suất xuất hiện triệu chứng và bệnh tích của gà mắc bệnh Gumboro .... 68
4.1.3 Tỉ lệ mẫu nhiễm bệnh Gumboro ở các tỉnh/ thành vùng ĐBSCL ............... 72
4.1.4 Tỉ lệ gà chết do bệnh Gumboro ................................................................... 73
4.2 Nội dung 2: Nghiên cứu đặc điểm di truyền virus Gumboro phân lập trên gà bệnh tại ĐBSCL .................................................................................................... 74
4.2.1 Trình tự chuỗi nucleotide và chuỗi amino acid của các chủng phân lập và vaccine .................................................................................................................. 74
4.2.2 Phân tích tương đồng chuỗi nucleotide, chuỗi amino acid giữa các chủng thực địa và các chủng vaccine ...................................................................................... 82
4.2.3 Mức độ tương đồng chuỗi nucleotide và amino acid của các chủng thực địa với một số chủng khác của Việt Nam và trên thế giới ......................................... 83
4.2.4 Xây dựng cây phả hệ của các chủng virus Gumboro phân lập được trong nghiên cứu so với các chủng trong và ngoài nước. .............................................. 87
4.3 Nội dung 3: Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch với 3 loại vaccine Gumboro trên 2 giống gà nòi Bến Tre và Lương Phượng .............................................................. 90
4.3.1 Tỉ lệ đáp ứng miễn dịch giữa 2 giống gà và số lần tiêm phòng .................. 90
viii
4.3.2 Sự khác biệt đáp ứng miễn dịch giữa 2 giống gà, vaccine và số lần tiêm phòng ............................................................................................................ 92
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 97
5.1 Kết luận ........................................................................................................... 97
5.2 Đề nghị ............................................................................................................ 98
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 99
ix
PHỤ LỤC .......................................................................................................... 121
Bảng Trang
3.1: Thành phần bộ kit ELISA gián tiếp ............................................................... 44
3.2: Số lượng đàn gà khảo sát tại các tỉnh ĐBSCL .............................................. 46
3.3: Danh sách các chủng virus Gumboro và vaccine trong ngân hàng gene sử dụng phân tích so sánh trong nghiên cứu ...................................................................... 54
3.4: Mật độ gà phân bố theo tuần tuổi .................................................................. 56
3.5: Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của thức ăn gà ............................ 57
3.6: Quy trình phòng bệnh chung ......................................................................... 57
3.7: Bố trí thí nghiệm ............................................................................................ 58
3.8: Tóm tắt thời điểm tiêm phòng và lấy máu để kiểm tra kháng thể ................. 59
4.1: Tỉ lệ đàn gà bệnh Gumboro giữa các giống gà .............................................. 63
4.2: Tỉ lệ gà bệnh Gumboro theo các hình thức chăn nuôi ................................... 64
4.3: Tỉ lệ gà nhiễm bệnh Gumboro giữa các lứa tuổi ........................................... 66
4.4: Tỉ lệ đàn gà bệnh theo số lần sử dụng vaccine .............................................. 67
4.5: Tần suất xuất hiện triệu chứng lâm sàng trên đàn gà mắc bệnh .................... 68
4.6: Tần suất xuất hiện bệnh tích trên đàn gà mắc bệnh Gumboro ...................... 69
4.7: Tỉ lệ mẫu nhiễm Gumboro theo địa phương khảo sát ................................... 72
4.8: Tỉ lệ gà chết do bệnh Gumboro ..................................................................... 73
4.9: Vị trí sai khác Nucleotide dẫn đến sai khác amino acid giữa các mẫu nghiên cứu............................................................................................................. 76
4.10: Vị trí sai khác Nucleotide dẫn đến sai khác amino acid giữa các mẫu nghiên cứu và vaccine ...................................................................................................... 77
4.11: Vị trí amino acid thay đổi của nhóm quyết định kháng nguyên kháng nguyên VP2 ở các chủng thực địa với ngân hàng gene (genbank) ................................... 79
x
4.12: Tỉ lệ (%) tương đồng về nucleotide (trên đường chéo) và amino acid (dưới đường chéo) của các mẫu IBDV trong nghiên cứu và vaccine ............................ 82
4.13: Tương đồng về nucleotide (trên đường chéo) và amino acid (dưới đường chéo) của các mẫu IBDV trong nghiên cứu với một số chủng khác ở Việt Nam và thế giới .................................................................................................................. 85
4.14: Tỉ lệ kháng thể thụ động mẹ truyền của 2 giống gà. ................................... 90
4.15: Tỉ lệ đáp ứng miễn dịch giữa các lần tiêm vaccine Gumboro ..................... 91
4.16: Sự khác biệt đáp ứng miễn dịch giữa 2 giống gà ........................................ 92
4.17: Sự khác biệt đáp ứng miễn dịch giữa các chủng vaccine khi tiêm phòng cho gà lúc 7 và 28 ngày tuổi. ....................................................................................... 93
4.18: Sự khác biệt đáp ứng miễn dịch giữa các chủng vaccine và giống gà ........ 94
4.1 : Tỉ lệ đàn gà bệnh Gumboro giữa các giống gà ........................................... 134
4.2 : Tỉ lệ gà bệnh Gumboro theo các hình thức chăn nuôi ................................ 134
4.8: Tỉ lệ gà chết do bệnh Gumboro ................................................................... 136
4.15: Tỉ lệ đáp ứng miễn dịch giữa các lần tiêm vaccine Gumboro ................... 136
xi
4.18: Sự khác biệt đáp ứng miễn dịch giữa các chủng vaccine và giống gà ...... 139
Hình Trang
2.1: Cấu trúc của hạt IBDV dưới kính hiển vi điện tử ........................................... 5
2.2: Virus Gumboro tập hợp thành từng cụm nằm trong tế bào lympho B ............ 5
2.3: Cơ chế sinh bệnh của virus gây bệnh Gumboro .............................................. 7
2.4: Bệnh tích túi Fabricius và hệ cơ của gà mắc bệnh Gumboro .......................... 9
2.5: Tế bào đại thực bào trong túi Fabricius bị virus Gumboro tấn công ............. 10
2.6: Phản ứng ELISA trực tiếp ............................................................................. 13
2.7: Phản ứng ELISA gián tiếp ............................................................................. 14
2.8: Sơ đồ các bước của phản ứng RT – PCR ...................................................... 16
2.9: Hệ gene của virus Gumboro bao gồm 2 phân đoạn A và B nhìn dưới kính hiện vi điện tử ............................................................................................................... 17
2.10: Sơ đồ hệ gene và một số vùng quan trọng của IBDV serotype I và II ........ 18
2.11: Các phân đoạn A và B của virus Gumboro qua điện di .............................. 20
2.12: Sơ đồ minh hoạ hệ gene của virus Gumboro và quá trình tổng hợp protein cấu trúc .................................................................................................................. 23
2.13: Quy luật biến đổi nhóm quyết định kháng nguyên. .................................... 28
2.14: Hệ thống miễn dịch gia cầm ........................................................................ 31
3.1: Bộ kít thử IBDV Ag Test .............................................................................. 47
3.2: Quy trình thực hiện lấy mẫu phân và kiểm tra kết quả ................................. 48
3.3: Đọc kết quả bộ kit thử IBDV Ag Test ........................................................... 48
3.4: Các bước thực hiện phản ứng RT-PCR ......................................................... 49
3.5: Vị trí VP2 trong phân đoạn A của hệ gene virus Gumboro và vùng siêu biến đổi làm đích nhân bản gene của phản ứng PCR ................................................... 50
3.6 Quy luật biến đổi epitope ................................................................................ 53
3.7: Bố trí ô chuồng thí nghiệm ............................................................................ 56
3.8: Bộ kit Idexx ELISA kiểm tra kháng thể IBDV ............................................. 59
xii
3.9: Sơ đồ bố trí huyết thanh xét nghiệm ELISA gián tiếp .................................. 60
4.1: Hình thức chăn nuôi tại các đàn gà khảo sát ................................................. 65
4.2: Một số triệu chứng lâm sàng gà mắc bệnh Gumboro .................................... 69
4.3: Bệnh tích bệnh Gumboro ở đàn gà bệnh ....................................................... 71
4.4: Điện di sản phẩm PCR của các chủng IBDV. ............................................... 74
4.5: Giản đồ (chromatogram) một phần trình tự vùng siêu biến đổi gene kháng nguyên VP2 .......................................................................................................... 75
4.6: Cây phả hệ xác định phân nhóm độc lực giữa chủng Gumboro Việt Nam và thế giới .................................................................................................................. 89
xiii
4.7: Tỉ lệ đáp ứng miễn dịch giữa giống gà và vaccine ........................................ 95
Antibody
Kháng thể
Ab
Antigen
Kháng nguyên
Ag
AGP
Agar Gel Precipitation
Antigenic variant
Kháng nguyên độc lực biến đổi
Av
Attenuated
Kháng nguyên nhược độc
At
Base pair
Cặp bazơ
Bp
Chorioallantoic membrane
màng nhung niệu
CAM
complementary DNA
cDNA
Chicken embryo fibroblasts
Tế bào xơ phôi gà sơ cấp
CEF
Classical virulent
Virus độc lực cổ điển
cv
Cytopathogenic effect
CPE
Deoxyribonucleic acid
DNA
Double-stranded RNA
RNA sợi đôi
dsRNA
Đồng bằng sông Cửu Long
ĐBSCL
Phản ứng miễn dịch liên kết Enyme
ELISA
Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
Enzyme Immuno Assay
Kỹ thuật miễn dịch gắn men
EIA
Nhóm quyết định kháng nguyên
Epitope
Infectious Bronchitis
Viêm phế quản truyền nhiễm
IB
Infectious bursal disease
Bệnh bursal truyền nhiễm
IBD
Infectious bursal disease virus
Virus gây bệnh bursal truyền nhiễm
IBDV
Immunoglobulin
Ig
Kháng thể globulin (globulin miễn dịch)
Kilo Dalton
kDa
Monoclonal Abs
Kháng thể đơn dòng trung hòa
mAb
mRNA
messenger RNA
RNA thông tin
NC
Non coding region
Vùng không mã hoá
xiv
Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt
NCBI
National Center for Biotechnology Information
Trung tâm quốc gia thông tin công nghệ sinh học
Nghiệm thức
NT
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng khuếch đại gene
PCR
Precapsid VP2
pVP2
RT- PCR
Phản ứng chuổi sao chép ngược
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
Ribonucleic Acid
RNA
Open Reading Frame
Khung đọc mở
ORF
Special pathogen free
Không có mầm bệnh chuyên biệt
SPF
VN mAbs
Kháng thể đơn dòng trung hòa virus
virus neutralizing
Kháng thể trung hòa virus
VN
Viral protein
Protein virus
VP
Very virulent
Virus độc lực cao
vv
xv
Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt
1.1 Tính cấp thiết của luận án
Trong nhiều năm qua, bệnh Gumboro là một trong những bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gà tại nhiều địa phương ở nước ta. Ngày nay, bệnh Gumboro có nhiều biến chủng khác nhau nhưng đều thuộc về serotype I và II, trong đó serotype I có mức độ độc lực và tính gây bệnh cao (OIE, 2008). Tại Việt Nam, bệnh Gumboro được chính thức phát hiện từ những năm 1980 dựa vào triệu chứng lâm sàng, bệnh tích, dịch tễ học. Nhiều phân lập IBDV với kiểu gene khác nhau và kiểu hình đa dạng cùng tồn tại đã làm cho diễn biến của bệnh này trở nên phức tạp hơn và khó đạt được hiệu quả phòng chống bệnh bằng tiêm chủng vaccine (Nguyễn Bá Thành và ctv, 2007; Lê Thị Kim Xuyến và Lê Thanh Hòa, 2008; Hồ Thị Việt Thu, 2012a). Nghiên cứu của Hồ Thị Việt Thu (2012a), cho rằng bệnh Gumboro thường xảy ra ở các đàn không được tiêm vaccine (70,0%), kế đến là các gà chỉ được tiêm vaccine một lần (62,5%) và gà được tiêm vaccine 2 lần (28,6%).
Virus Gumboro có hệ gene RNA (ribonucleic acid) gồm hai sợi dương (dsRNA) cuộn tròn được phân làm hai đoạn riêng biệt, thuộc họ Birnaviridae. Hai phân đoạn trong hệ gene của virus Gumboro là phân đoạn A và phân đoạn B, đều mang thông tin di truyền và có nhiệm vụ sinh tổng hợp 5 loại protein từ VP1 đến VP5 (VP = viral protein), đó là VP1, VP2, VP3, VP4, VP5 (Tacken et al., 2002). VP2 có độ bảo tồn cao về thành phần nucleotide ở hai đầu 5’ và 3’, nhưng lại có một vùng khoảng 500 nucleotide ở giữa của gene có sự biến đổi ở các chủng khác nhau, gọi là vùng “siêu biến đổi” (hypervariable region) (Yuwen et al., 2008). Vùng này có 120 - 150 amino acid mà ở đó có một số amino acid quan trọng, chúng là các amino acid khung cấu tạo nên nhóm quyết định kháng nguyên và độc lực. Nếu không đồng nhất về thành phần khung nhóm quyết định kháng nguyên, kháng nguyên vaccine sử dụng có thể kích thích sinh kháng thể với hàm lượng cao nhưng kháng thể này không thể hoặc không hoàn toàn trung hòa được chủng virus gây bệnh khác vì không có vị trí kết hợp kháng nguyên - kháng thể tương ứng do sai lệch về nhóm quyết định kháng nguyên của vaccine với chủng gây bệnh, như vậy mặc dù đàn gà được tiêm vaccine nhưng bệnh vẫn xảy ra (Letzel et al., 2007).
1
Tại Việt Nam nói chung và ĐBSCL nói riêng virus Gumboro rất đa dạng và phức tạp do chúng ta nhập khẩu con giống từ nhiều nước khác nhau trên thế giới. Ngoài ra, phân lập IBDV với kiểu gene khác nhau và kiểu hình đa dạng cùng tồn tại đã làm cho diễn biến của bệnh này trở nên phức tạp hơn và khó đạt được hiệu
quả phòng chống bệnh bằng tiêm chủng vaccine. Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu bệnh Gumboro trên gà tại một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long”
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định sự lưu hành của virus Gumboro trên gà nuôi ở quy mô trang trại, hộ gia đình tại ĐBSCL. Các yếu tố có liên quan như giống gà, lứa tuổi, số lần sử dụng vaccine, hình thức chăn nuôi, số gà chết,… và một số đặc điểm lâm sàng trên đàn gà nghi bệnh.
- Xác định đặc tính di truyền của virus Gumboro được phân lập tại ĐBSCL. Tiến hành so sánh gene mã hóa vùng VP2 với ngân hàng gene, các chủng vaccine hiện có trên thị trường và xây dựng cây phả hệ của các mẫu virus thực địa
- Khảo sát tỉ lệ đáp ứng miễn dịch và sự khác biệt đáp ứng miễn dịch của 3
loại vaccine Gumboro trên 2 giống (gà nòi Bến Tre và gà Lương Phượng).
1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Bệnh Gumboro là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus gây ra trên gia cầm (chủ yếu ở gà và gà tây), được xem là một bệnh cổ điển của ngành chăn nuôi gà. Có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh, virus gây bệnh và vaccine phòng bệnh nhưng bệnh vẫn bùng phát. Sự suy giảm miễn dịch đã ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả phòng bệnh của nhiều chương trình phòng vaccine trên đàn gà và đồng thời làm tăng tính mẫn cảm của đàn gà đối với những căn nguyên gây bệnh cơ hội khác. Nhiều bằng chứng cho thấy đàn gà bị nhiễm IBDV có thể trở thành vật chủ lan truyền các virus gây bệnh khác (Phạm Hồng Sơn và ctv, 2012; Hồ Thị Việt Thu, 2012a).
Các báo cáo gần đây cho thấy IBDV tiếp tục là một nguyên nhân hàng đầu gây ra những thiệt hại kinh tế đáng kể trong ngành công nghiệp gia cầm. Nhiều phân lập IBDV với kiểu gene khác nhau và kiểu hình đa dạng cùng tồn tại đã làm cho diễn biến của bệnh này trở nên phức tạp hơn và khó đạt được hiệu quả phòng chống bệnh bằng tiêm chủng vaccine (Nguyễn Bá Thành và ctv, 2007; Lê Thị Kim Xuyến và Lê Thanh Hòa, 2008; Hồ Thị Việt Thu, 2012a).
2
Việc phòng chống IBDV hiệu quả sẽ góp phần nâng cao sức khỏe tổng thể đàn gà đồng thời làm giảm thiệt hại về kinh tế. Nghiên cứu tạo vaccine dựa trên trình tự nucleotide của hệ gene virus Gumboro phân lập tại thực địa đã được tiến hành trong và ngoài nước. Tuy nhiên, tại khu vực ĐBSCL cho đến thời điểm hiện
tại thông tin về giải mã phân đoạn VP2 của virus Gumboro phân lập được còn nhiều hạn chế. Do vậy, việc giải trình tự nucleotide virus Gumboro phân lập được tại thực địa góp phần xác định mức độ độc lực, lựa chọn vaccine phù hợp giúp việc phòng bệnh Gumboro cho đàn gà góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm là cần thiết.
1.4 Điểm mới của đề tài
3
Bằng việc thu thập các chủng virus gây bệnh Gumboro thực địa tại một số tỉnh/ thành vùng ĐBSCL, so sánh sự biến đổi về thành phần gene, tính kháng nguyên và độc lực, nguồn gốc và mối quan hệ phả hệ của các chủng virus, sẽ giúp chúng ta có thể lựa chọn các chủng vaccine phù hợp để phòng bệnh một cách hiệu quả. Đồng thời, góp phần thiết lập một cơ sở khoa học chắc chắn cho việc phát triển chiến lược phòng bệnh IBD ở ĐBSCL nói riêng và bảo vệ sức khỏe đàn gà ở nước ta nói chung.
2.1 Virus Gumboro
2.1.1 Sơ lược lịch sử phát hiện virus Gumboro
Năm 1962, Cosgrove đã phát hiện và mô tả một bệnh mới xuất hiện trên gà ở thành phố Gumboro, vùng Dalaware ở Hoa Kỳ. Bệnh thường thấy trên gà con với bệnh tích thường gặp chủ yếu ở thận và túi Fabricius. Ban đầu, người ta cho rằng bệnh là biến thể của bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis, IB) vì bệnh tích ở thận tương đối giống nhau. Khi đó người ta gọi là bệnh hư thận trên gà do triệu chứng không tái hấp thu được nước tiểu, làm gà tiêu chảy rất nặng, gây mất nước. Sau này, Winterfield và Hitchner đã chứng minh rằng những con gà đã miễn dịch với IB vẫn nhiễm bệnh viêm túi Fabricius. Cuối năm 1962, Winterfield và Hitchner đã phân lập được từ phôi trứng tác nhân gây bệnh truyền nhiễm ở gà (bệnh phẩm lấy ở túi Fabricius và thận). Năm 1986-1987, lần đầu tiên những dòng biến thể của IBDV được công bố. Năm 1970, Hitchner đề nghị tên chính thức cho bệnh này là Infectious Bursal Disease (IBD) hay còn gọi là bệnh Gumboro trên gà. Virus gây bệnh là Infectious Bursal Disease Virus (IBDV).
Ở Việt Nam bệnh được phát hiện vào năm 1981 ở một số trại nuôi gà công nghiệp thuộc các tỉnh phía Bắc, nhưng chưa được chú ý, vào các năm 1987-1993 bệnh phát triển rất mạnh gây chết rất nhiều gà, từ đó gây được sự chú ý cho các nhà chuyên môn. Nhiều biện pháp phòng bệnh đã được nghiên cứu nhưng đến ngày nay việc khống chế bệnh vẫn còn nhiều hạn chế.
2.1.2 Hình thái, cấu trúc và phân loại virus gây bệnh Gumboro
IBDV là một virus có kích thước không lớn, khoảng 58 - 60 nm, dạng hình khối đa diện cấu trúc đối xứng 20 mặt (Dobos et al., 1979) (Hình 2.1). IBDV có cấu trúc mạch đôi RNA cuộn tròn và được phân thành 2 đoạn riêng biệt, nó thuộc loài Avibirnavirus của họ Birnaviridae (Leong et al., 2000). Quanh nhân là vỏ protein (vỏ capsid). Lớp capsid này được hợp thành bởi 32 capsomer (đơn vị hình thái). Mỗi capsomer được tạo bởi 5 loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5.
4
Trong nguyên sinh chất của tế bào bị nhiễm, quan sát dưới kính hiển vi điện tử thấy tập hợp virus Gumboro xếp đều đặn cạnh nhau (Hình 2.2). IBDV không có vỏ bọc ngoài cùng (envelop) chỉ gồm nhân chứa ribonucleic acid (RNA) và bao quanh hệ gene là lớp vỏ protein hay còn gọi là capsid. Vỏ capsid có 32 đơn vị hình thái, mỗi một đơn vị hình thái là capsomer đan chéo nhau tạo thành (Hirai et al.,
www.sciencephoto.com
1979). Mỗi capsomer được tạo thành bởi 5 loại protein khác nhau. Các nucleotide trong ribonucleic acid (RNA) của virus Gumboro được xếp thành đôi cuộn tròn và phân làm hai đoạn riêng biệt là đặc điểm đặc trưng của loại virus này. Do vậy, theo sự phân loại mới nhất hiện nay IBDV được xếp vào nhóm virus có chứa RNA và là thành viên đại diện đầu tiên của nhóm Avibirnavirus (Leong et al., 2000).
www.talk.ictvonline.org
Hình 2.1: Cấu trúc của hạt IBDV dưới kính hiển vi điện tử (nguồn: www.sciencephoto.com)
Hình 2.2: Virus Gumboro tập hợp thành từng cụm nằm trong tế bào lympho B (nguồn: www.talk.ictvonline.org)
2.1.3 Tính chất và cơ chế gây bệnh của IBDV
5
Trong tự nhiên: gà nhà và gà tây là hai loài mẫn cảm với virus Gumboro, trong đó type I gây bệnh cho gà nhà và type II gây bệnh cho gà tây. Người ta cũng tìm thấy IBDV ở gà Nhật và chim bồ câu sống hoang dã ở Châu Phi (Kasanga et al., 2007; 2008). Một số loài chim hoang dã như vịt trời, ngỗng trời, chim ác là, cũng có thể bị nhiễm virus Gumboro, bị bệnh và chết. Virus Gumboro phân lập từ
những loài chim hoang dã này có thể gây bệnh trở lại cho gà mẫn cảm, gây chết tới 60% và làm teo túi Fabricius (Jeon et al., 2008).
Trong phòng thí nghiệm: virus chỉ có khả năng gây bệnh trên gia cầm mẫn cảm (gà 2 - 6 tuần tuổi), phôi gà hoặc môi trường tế bào xơ phôi gà mà không có khả năng gây bệnh trên các động vật cảm thụ phòng thí nghiệm (Kasanga et al., 2007). Khác với nhiều loại virus gây bệnh ở gia cầm mà cơ quan thích ứng cho sự nhân lên và gây bệnh thuộc về các cơ quan nội tạng hay da, niêm mạc, virus gây bệnh Gumboro lại chọn túi Fabricius – cơ quan có thẩm quyền miễn dịch chủ yếu ở gia cầm làm cơ quan đích cho sự nhân lên và gây bệnh, cụ thể là các tế bào lympho B mang thụ thể kháng thể IgY bề mặt và đại thực bào (Terasaki et al., 2008).
Qua đường tiêu hóa virus xâm nhập vào hệ tiêu hóa (Hình 2.3). Tại đây, chúng được các tế bào đại thực bào tiếp nhận, đồng thời tiếp xúc với tế bào lympho B còn non là loại mẫn cảm với virus, bắt đầu thực hiện quá trình nhân lên, quá trình này là sự nhân lên cục bộ, hay sự nhân lên sơ cấp. Chỉ sau 6 - 8 giờ, một số lượng virus Gumboro đáng kể được giải phóng và xâm nhập vào hệ tuần hoàn, đây là lần thứ nhất virus xuất hiện trong máu, nhưng người ta không gọi là sự nhiễm trùng máu vì số lượng virus không nhiều. Hệ tuần hoàn chỉ làm nhiệm vụ vận chuyển virus đi khắp cơ thể mà trước hết là đến lách, túi Fabricius và một số cơ quan khác. Thông thường 9 - 11 giờ sau khi vào hệ tiêu hóa, một số lượng lớn virus Gumboro đã có mặt trong túi Fabricius và bắt đầu tấn công các tế bào lympho B, đây là quá trình nhân lên toàn phần hay sự nhân lên thứ cấp. Số lượng lớn virus Gumboro được giải phóng đã xâm nhập vào hệ tuần hoàn lần thứ hai, lúc này người ta xem sự có mặt của virus Gumboro trong máu là sự nhiễm trùng máu (Hebata, 2012; Li Zan et al., 2015).
6
Virus Gumboro tác động gây nên hiện tượng bệnh lý đông máu, do vậy trong hệ tuần hoàn xuất hiện các cục huyết khối, làm nghẽn mạch mao quản, chủ yếu là vùng niêm mạc túi Fabricius và ở một số nơi khác, dẫn đến hiện tượng xung huyết. Khi không chịu nổi áp suất gia tăng của máu, mao mạch bị đứt gây nên hiện tượng xuất huyết. Sự sung huyết, xuất huyết từ quy mô nhỏ (từng điểm li ti) đến quy mô lớn (vệt, mảng) và có màu sắc đa dạng từ hồng đến tím hoặc nâu đen. Một số biến đổi bệnh lý trong một số cơ quan có thể dần mất đi và dần phục hồi chức năng vốn có, nhưng đối với túi Fabricius sự phục hồi không xảy ra. Do virus Gumboro phá hủy túi Fabricius một cách trầm trọng, virus nhân lên trong tế bào lympho B, phá hủy tế bào lympho B làm giảm đáng kể số lượng tế bào này. Số lượng tế bào lympho
mất đi không được bù đắp nên chức năng miễn dịch của túi Fabricius bị mất một phần hoặc hoàn toàn dẫn đến sự suy giảm miễn dịch (immunosuppression). Mức độ suy giảm miễn dịch phụ thuộc vào độc lực của virus, thời gian và điểm xâm nhập của virus vào cơ thể gà (Sharma et al., 2000; Li Zan et al., 2015).
Virus gây bệnh Gumboro
Xâm nhập qua đường tiêu hóa
Đại thực bào, Lympho B (virus nhân lên cục bộ)
Xâm nhập hệ tuần hoàn lần thứ nhất
Theo hệ tuần hoàn
Túi Fabricius và các cơ quan khác (virus nhân lên mạnh, tiêu diệt tế bào lymbo B và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch, phá hủy túi Fabricius)
Xâm nhập hệ tuần hoàn lần thứ hai nhiễm trùng huyết (Viraemia)
Xâm nhập các cơ quan thích ứng
Phá hủy, gây bệnh tích ở các cơ quan (túi Fabricius, gan, thận,lách, hệ cơ)
Triệu chứng lâm sàng, bệnh tích, tử vong
Hình 2.3: Cơ chế sinh bệnh của virus gây bệnh Gumboro
(Trương Minh Dũng và ctv., 2006)
2.1.4 Triệu chứng lâm sàng do IBDV
7
Đối với đàn gà mẫn cảm, thời gian nung bệnh xảy ra ngắn, khoảng 2-3 ngày: gà ủ rũ, rút mỏ vào cánh, có khi gục sang một bên, thích nằm, mắt lim dim mỏi mệt và thường dồn về một góc chuồng, gà kém ăn hoặc bỏ ăn, uống nhiều nước, mất định hướng, đi phân trắng, loãng hoặc toàn nước có khi lẫn máu, lúc đầu nhiệt độ tăng, sau giảm và nếu không qua khỏi thì gà chết trong vòng vài ngày (Nguyễn Đức
Hiền, 2009). Do đặc tính truyền ngang rất mạnh, virus Gumboro gây tỉ lệ nhiễm trong đàn có khi đạt 100%. Thông thường từ ngày thứ 3 sau triệu chứng lâm sàng đầu tiên, trong đàn bắt đầu có cá thể chết và chết ồ ạt trong vòng 5-7 ngày, sau đó giảm chết rất nhanh, thường 10 – 12 ngày có thể dứt bệnh, gà dần hồi phục, tuy nhiên các cá thể bị bệnh qua khỏi thông thường bị tổn thương khá nặng, đặc biệt là hệ miễn dịch dẫn đến suy giảm miễn dịch (Lê Thị Kim Xuyến, 2010).
2.1.5 Bệnh tích do IBDV
2.1.5.1 Bệnh tích đại thể
Túi Fabricius: sau 72 giờ bị nhiễm, virus Gumboro có độc lực mạnh đã có thể gây bệnh với bệnh tích đại thể điển hình như túi Fabricius thường sưng rất to, có kích thước và trọng lượng gấp 2 – 3 lần bình thường. Xung quanh túi có thủy thủng keo nhầy vàng, đôi khi có dịch thẩm xuất bọc quanh túi Fabricius. Nếu rút hết nước, túi lộ rõ ra, căng tròn, sưng phù. Túi chuyển màu sắc từ vàng sáng sang màu trắng đục, các nếp gấp múi khế sưng không rõ nét. Niêm mạc sưng dầy lên làm cho dung tích khoang túi trở nên hẹp lại, đây là giai đoạn viêm sưng (Hình 2.4A).
Nhiều cá thể bị bệnh Gumboro, hiện tượng viêm sưng đi kèm với hiện tượng xuất huyết và thẩm xuất dịch vào trong lòng túi Fabricius, niêm mạc túi có điểm xuất huyết, đôi khi thành vệt, niêm mạc túi chuyển từ màu trắng sang màu thâm tím, nâu đen (Hình 2.4B).
Theo Cheville (1967), túi Fabricius bắt đầu tăng về kích thước và trọng lượng trong khoảng 48 – 72 giờ sau khi nhiễm do thủy thủng và xuất huyết. Kích thước túi có thể tăng gấp 2 – 3 lần so với bình thường. Vào ngày thứ 4 sau nhiễm, kích thước túi vẫn còn to gấp đôi, sau đó mới nhỏ dần lại. Ngày thứ 5 sau nhiễm, trọng lượng túi bằng trọng lượng ban đầu và teo đi. Đến ngày thứ 8 trọng lượng túi chỉ bằng 1/3 trọng lượng ban đầu.
Hệ cơ: gà bệnh bị tiêu chảy mất nước nên cơ khô rất nhanh, chỉ vài phút sau khi lột da, cơ ngực của gà đã khô nhăn lại, có màu thẫm, đặc biệt có xuất huyết lấm chấm hoặc thành từng vệt, có khi các vệt xuất huyết hợp lại tạo thành mảng lớn (Hình 2.4C).
8
Ngoài ra, lách có thể bị sưng nhẹ. Gan sưng, bề mặt có những vệt loang lổ màu vàng, có thể có hoại tử rìa gan, đôi khi điểm hoại tử hợp thành từng vệt nhỏ, màu vàng sáng ăn sâu vào nội mô của gan. Thận có thể bị sưng, trên bề mặt có những điểm xuất huyết, hoại tử. Tuyến ức bị xuất huyết điểm, vệt hoặc từng mảng, đôi khi xuất huyết ăn sâu vào các thùy của tuyến.
Hình 2.4: Bệnh tích túi Fabricius và hệ cơ của gà mắc bệnh Gumboro
A: Hình ảnh túi Fabricius sưng to, xung quanh có thủy thủng keo nhầy (Nguồn: www.vemedim.vn/benhvadieutri), B: Hình ảnh xuất huyết bên trong túi (Nguồn: www.medvet.umontreal.ca/.../OrigiInfect/), C: Hình ảnh cơ đùi, cơ lườn bị xuất huyết điểm hoặc thành từng vệt, từng mảng có màu đỏ hay màu nâu thẫm (Nguồn: http://www.anova.com.vn/contents/article).
2.1.5.2 Bệnh tích vi thể
Bệnh tích vi thể xuất hiện sớm ở các cơ quan có cấu trúc từ tổ chức lympho và các cơ quan tạo miễn dịch như túi Fabricius, tuyến ức (thymus), lách, hạch, các mô lympho ở ruột chỉ trong vòng vài giờ đến vài chục giờ sau khi virus cường độc Gumboro xâm nhập vào cơ thể. Theo Muller and Lange (1985), có sự tập trung của đại thực bào và các tế bào lympho trong vòng 4 – 5 giờ sau khi gây nhiễm qua đường tiêu hóa và sau 11 giờ xuất hiện những tế bào lympho bị nhiễm virus, nếu gây nhiễm trực tiếp vào túi Fabricius chỉ sau 6 giờ đã xuất hiện những tế bào lympho bị nhiễm virus.
9
Theo Helmboldt and Garner (1964), 24 giờ sau khi nhiễm IBDV các tế bào lympho trong túi Fabricius đã bị thoái hóa, các tế bào lympho ở vùng tủy của nang đã bắt đầu quá trình hoại tử. Virus tấn công và phá hủy các tế bào lympho B chưa trưởng thành và trưởng thành, nên chỉ trong thời gian rất ngắn lượng tế bào lympho B đã giảm đáng kể (Kim et al., 2000). Trung tâm bị hoại tử ngày càng tăng, các vách nang giảm dần, nang bị thu hẹp lại, hình tròn, chữ nhật, ô van khác nhau. Các trung tâm hoại tử xuất hiện không bào (vacuole), không còn tế bào lympho hoặc chỉ còn rất ít tập trung ở vùng nang ngoại vi. Thay vào các vị trí của các tế bào lympho là các tế bào heterophil, các mảnh tế bào bị phân hủy một phần, các tế bào hệ lưới nội mô. Toàn bộ các nang lympho bị hủy hoại và có thể quan sát thấy các mức độ khác nhau (Kulkarui et al., 1982) (Hình 2.5).
Hình 2.5: Tế bào đại thực bào trong túi Fabricius bị virus Gumboro tấn công.
A: sự hủy hoại của tế bào đại thực bào; B: tập hợp virus đang nhân lên trong tế bào đại thực bào (Nguồn: ss.niah.affrc.go.jp/disease/EM/em_en/virus0.html)
Vào ngày thứ 3 hoặc 4, sự thủy thủng, sung huyết và tập trung các tế bào của túi làm cho túi Fabricius sưng to. Vai trò của các tế bào lympho T trong miễn dịch bệnh lý tế bào được gây ra bởi IBDV và sự phục hồi của những mô bị nhiễm cho thấy có sự xâm nhiễm của cả tế bào lympho T (CD4+) và T (CD8+) làm cho số lượng lympho T tăng tối đa vào ngày thứ 7 sau khi nhiễm (Kim et al., 2000). Các tế bào lympho T ở trong túi Fabricius ngăn cản sự nhân lên của virus trong túi Fabricius trong giai đoạn đầu của bệnh, nhưng cũng thúc đẩy quá trình phá hủy mô ở túi Fabricius và làm chậm quá trình hồi phục của mô thông qua việc giải phóng ra các cytokine gây độc tế bào (Rautenschlein et al., 2002). Khi phản ứng viêm mất dần, túi Fabricius teo đi, các nang rỗng phát triển ở vùng tủy nang túi. Có sự hoại tử và thực bào của các tế bào heterophil và tương bào (plasmocyte), có sự xơ hóa của các tế bào phân cách các nang. Sự tăng sinh tế bào nền biểu mô có những đám dịch nhầy (mucin) trên bề mặt.
2.1.6 Chẩn đoán bệnh do IBDV
2.1.6.1 Chẩn đoán bằng virus học (phôi trứng, phân lập và nuôi cấy)
10
Túi Fabricius và lách là những cơ quan được chọn làm bệnh phẩm để phân lập IBDV và chẩn đoán bệnh. Bệnh phẩm được nghiền trong nước sinh lý hoặc nước thịt Peptone (có kháng sinh) sau đó ly tâm lấy nước nổi và tiêm vào phôi trứng 9-11 ngày tuổi hoặc nuôi cấy trên tế bào xơ phôi gà, cũng có thể tiêm truyền cho gà SPF (special pathogen free).
a. Chẩn đoán trên phôi trứng
Nước bệnh phẩm có thể tiêm vào màng nhung niệu (chorioallantoic membrane - CAM), xoang niệu (Atlantoie Sac), lòng đỏ phôi (Yellow Sac), nhưng tiêm vào màng nhung niệu là tốt nhất. Phôi 9-11 ngày tuổi sẽ chết sau 3-5 ngày nếu nước bệnh phẩm có chứa IBDV. Bệnh tích thường là phù thủng vùng bụng, sung huyết tụ máu dưới da, xuất huyết lấm tấm dọc lưng phôi, vùng đỉnh đầu. Các phôi chết sau 4-6 ngày xuất huyết và hoại tử rìa mép gan phôi, thận. Phổi tràn dịch, lách nhợt nhạt, màng nhung niệu bị phù nề, đôi khi xuất huyết lấm tấm. Nếu phôi không chết có thể do các lý do sau:
Đàn gà không bị bệnh Gumboro -
Đàn gà bố mẹ đã tiếp xúc với virus trong tự nhiên -
- Bệnh phẩm có virus đã biến chủng nhược độc không gây chết phôi
b. Chẩn đoán phân lập và nuôi cấy trên tế bào
Virus Gumboro có thể sống và phát triển tốt trong các tế bào lympho-B của túi Fabricius, tế bào thận, xơ phôi gà, tế bào gan, lách của phôi gà, tế bào xơ phôi vịt, gà Tây, tế bào thận của thỏ, của khỉ. Trong đó, virus phát triển thuận lợi và dễ dàng nhất trên tế bào xơ phôi gà, vịt một lớp. Các tế bào này sau khi được gây nhiễm IBDV sẽ cho bệnh tích điển hình (cytopathogenic effect - CPE) (Cowen and Braune, 1988)
2.1.6.2 Chẩn đoán lâm sàng
Bệnh Gumboro xảy ra cấp tính trên toàn đàn, dễ nhận ra và việc chẩn đoán dễ dàng thực hiện. Diễn tiến bệnh nhanh, tỉ lệ mắc bệnh cao, chết theo đường cong và phục hồi nhanh chóng (5 – 7 ngày) sau khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh. Việc chẩn đoán có thể thực hiện qua mổ khám bằng cách kiểm tra những biến đổi đặc trưng ở túi Fabricius. Có sự thay đổi về kích thước và màu sắc của túi Fabricius trong quá trình nhiễm (sưng to sau đó teo nhỏ).
11
Sự nhiễm trùng ở gà con hoặc gà có kháng thể do mẹ truyền thường ở thể cận lâm sàng và việc chẩn đoán được thực hiện bằng cách quan sát bệnh tích đại thể và vi thể túi Fabricius. Sự nhiễm trùng ở gà mọi lứa tuổi với các biến chủng virus Gumboro được phát hiện bằng mô bệnh học túi Fabricius hoặc phân lập virus (Lukert and Saif, 2003). Xuất huyết cơ và màng nhầy chỗ nối giữa dạ dày tuyến và diều thì tương tự hội chứng xuất huyết và có thể phân biệt với bệnh Gumboro dựa trên sự thay đổi của túi Fabricius.
Một vài chủng virus gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious bronchitis) gây độc trên thận giống như virus Gumboro nhưng có thể phân biệt được vì không có những biến đổi bệnh lý trên túi Fabricius và thường chết bởi những dấu hiệu hô hấp. Bệnh Marek cũng có biểu hiện teo nhỏ túi Fabricius 12 ngày sau khi nhiễm nhưng quan sát mô học thì thấy có sự phân biệt rõ. Gà nhiễm Avian adenovirus cũng có hiện tượng teo túi Fabricius sau khi nhiễm 2 tuần nhưng vài cơ quan khác như gan, lách, tụy và thận bị ảnh hưởng trầm trọng; các thể vùi trong nhân quan sát được ở gan và tụy (Nguyễn Đức Hiền, 2012).
2.1.6.3 Chẩn đoán ELISA
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) – xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme, là một kỹ thuật sinh hóa hữu ích và mạnh trong việc xác định việc hiện diện cũng như định lượng ở mức ng/ml, pg/ml các chất có trong dung dịch như: huyết thanh, tinh dịch, nước tiểu, dịch huyền phù nuôi cấy. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khoa học sự sống và bệnh học nói chung.
Nguyên lý chung của ELISA
Sử dụng 1 enzyme để phát hiện sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên (Antigen- Ag) và kháng thể (Antibody-Ab). Enzyme sẽ chuyển cơ chất không màu thành sản phẩm có màu, nhờ đó ta sẽ thấy được sự liên kết giữa Ag – Ab. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng Ag hoặc Ab trong mẫu nghiên cứu. Một số ứng dụng của ELISA: Xác định nồng độ của Ab trong huyết thanh; kiểm tra sự có mặt của Ag, phát hiện các yếu tố có khả năng gây dị ứng trong thực phẩm, xác định hoạt tính của một hợp chất sinh học ….
ELISA trực tiếp (phát hiện Ag)
12
Phương pháp ELISA trực tiếp được xem là loại đơn giản nhất trong các phương pháp ELISA, kháng nguyên (Antigen- Ag) được hấp phụ lên một tấm nhựa, sau đó một lượng lớn của một loại protein (thường là albumin huyết thanh bò- BSA) được thêm vào để khóa tất cả các vị trí liên kết khác. Trong lúc đó, một loại enzyme sẽ liên kết với một kháng thể trong một phản ứng riêng biệt, phức hợp enzyme- kháng thể này được sử dụng để hấp phụ các kháng nguyên. Sau khi phức enzyme- kháng thể dư thừa bị loại bỏ hết, phức hợp enzyme- kháng thể nào gắn với kháng nguyên sẽ còn lại trên giếng. Bằng cách thêm vào cơ chất của enzyme, tín hiệu phát ra đại diện cho lượng kháng nguyên trong mẫu (Hình 2.6).
Hình 2.6: Phản ứng ELISA trực tiếp (http://biomedia.vn)
Ưu điểm: so với các phương pháp ELISA khác, phương pháp này được thực hiện trong thời gian ngắn hơn vì chỉ có một kháng thể được sử dụng và ít bước tiến hành hơn. Điều này có thể được sử dụng để kiểm tra phản ứng kháng thể - kháng nguyên cụ thể và giúp loại bỏ phản ứng chéo giữa các kháng thể khác.
Nhược điểm: Các kháng thể chính phải được đánh dấu riêng, nên tốn nhiều thời gian và không linh hoạt khi thực hiện nhiều thí nghiệm. Ngoài ra, kỹ thuật này có độ nhạy thấp hơn do các tín hiệu được khuếch đại ít hơn, độ nhạy thấp hơn.
ELISA gián tiếp (phát hiện Ab)
Phương pháp ELISA gián tiếp bao gồm hai bước ELISA liên quan đến hai quá trình gắn của kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp (kháng kháng thể) được đánh dấu. Kháng thể sơ cấp được ủ với kháng nguyên và sau đó là ủ với kháng thể thứ cấp. Tuy nhiên, việc này có thể dẫn đến các tín hiệu không đặc hiệu bởi vì xảy ra các phản ứng chéo của kháng thể thứ cấp (Hình 2.7).
Các bước tiến hành: bước đầu tiên tương tự như ELISA trực tiếp.
1. Sau khi kháng nguyên được hấp phụ trên bề mặt vật rắn và rửa bỏ những phần không hấp phụ, một kháng thể không đánh dấu được bổ sung vào.
2. Sau khi ủ, rửa bỏ các kháng thể không bám vào kháng nguyên. 3. Bổ sung một kháng thể thứ 2 có gắn enzyme để kháng lại kháng thể thứ nhất
(kháng thể này cũng được pha loãng trong dung dịch đệm khóa).
13
4. Tiến hành ủ, và rửa bỏ các kháng thể không bám.
5. Cuối cùng bổ sung cơ chất cho enzyme để tiến hành phản ứng tạo màu, đọc
kết quả.
Hình 2.7: Phản ứng ELISA gián tiếp (http://biomedia.vn)
Ưu điểm:
- Độ nhạy cao: Nhiều hơn một kháng thể được đánh dấu và gắn trên mỗi phân
tử kháng nguyên.
- Linh động: Nhiều kháng thể sơ cấp khác nhau có thể được dùng với một
kháng thể thứ cấp có đánh dấu.
- Tiết kiệm: Kháng thể thứ cấp được đánh dấu được dùng ít hơn. - Trong phân tích ELISA gián tiếp, kháng thể của mẫu được kẹp theo dạng sandwich ở giữa kháng nguyên trên đĩa và enzyme đánh dấu, liên kết kháng thể đặc hiệu globulin. Việc thêm cơ chất của enzyme vào tạo ra phản ứng màu. Cường độ màu tỉ lệ thuận với lượng kháng thể của mẫu. Mẫu càng nhiều kháng thể, cường độ màu càng mạnh. ELISA gián tiếp phù hợp cho việc xác định mức độ tổng kháng thể có trong mẫu.
2.1.6.4 Phương pháp chẩn đoán RT – PCR (Reverse transcriptase
polymerase chain reaction)
14
Hiện nay, kỹ thuật RT – PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) và các kỹ thuật sinh học phân tử khác được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán và nghiên cứu virus Gumboro. Kỹ thuật RT – PCR chẩn đoán bệnh Gumboro, sử dụng mẫu bệnh phẩm túi Fabricius có độ nhạy và đặc hiệu cao. Hơn nữa, kỹ thuật này có khả năng phát hiện virus Gumboro trong giai đoạn sớm của bệnh. Do vậy kỹ thuật RT – PCR hiện nay được áp dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnh Gumboro.
RT – PCR là một phương pháp dùng để khuyếch đại cDNA được tạo ra từ RNA dựa vào đặc tính phiên mã ngược. RT- PCR thường được sử dụng để tạo ra một số lượng lớn cDNA (complementary DNA) từ một lượng rất nhỏ mRNA, sử dụng trong việc nhận biết các đột biến và đa hình dựa vào những trình tự phiên mã ngược và sử dụng trong việc định lượng mức độ phân tử của gene (Hình 2.8). Ngoài ra, RT – PCR còn có một ứng dụng quan trọng nữa đó là chúng được sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh do virus RNA khác nhau gây ra với các cặp mồi đặc hiệu khác nhau.
Nguyên lý hoạt động
ARN được tổng hợp thành ADN bổ sung nhờ enzyme sao chép ngược. Tiếp đó sợi ADN bổ sung sẽ được khuôn mẫu để khuyếch đại thành nhiều bản ADN thông qua phản ứng PCR. Dựa trên khả năng chịu nhiệt và kéo dài chuỗi của enzyme ADN Polymerase để sao chép thành ADN bằng cách kéo dài sợi bổ sung. Quá trình sao chép được diễn ra nhiều chu kì, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn: giai đoạn biến tính để tạo ADN mạch thẳng, sợi đơn.
15
Tiếp theo là giai đoạn gắn mồi và cuối cùng là kéo dài chuỗi. Thông thường phản ứng PCR trải qua 20 – 30 chu kỳ sẽ tạo ra hàng triệu bản sao ADN và có độ dài bằng khoảng cách giữa các cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được phát hiện thông qua chạy điện di qua thạch và nhuộm ADN bằng SYBR, ethidium bromide, methylen blue, hoặc acridine orange... phản ứng dương tính khi xuất hiện băng ADN có trọng lượng phân tử tương đương với đoạn ADN đích cần khuếch đại.
16
Hình 2.8: Sơ đồ các bước của phản ứng RT – PCR (Lê Thị Kim Xuyến, 2010)
2.2 Sinh học phân tử, biển đổi di truyền virus Gumboro
2.2.1 Hệ gene của virus Gumboro
Đặc điểm hệ gene của IBDV là phân tử RNA sợi đôi (dsRNA=double stranded RNA) chứa hai phân đoạn có tên gọi là phân đoạn A và phân đoạn B (Muller et al., 1979) (Hình 2.9). Hiện nay người ta đã xác định hoàn chỉnh trình tự nucleotide của 2 phân đoạn gene: A (có độ dài khoảng 3.200 bp) và B (có độ dài khoảng 2.800 bp) (Petkov et al., 2007). Trình tự dữ liệu nucleotide của nhiều chủng IBDV đã được xác định và lưu trữ trong Ngân hàng gene. Trình tự nucleotide phân đoạn A của một số chủng virus thuộc serotype I (Hosseini et al., 2004) và serotype II cũng như phân đoạn B của các chủng thuộc serotype I và các chủng thuộc serotype II đã được giải mã và công bố. Vùng trình tự mã hóa của phân đoạn B có sự tồn tại mức độ tương đồng tương đối cao về nucleotide (89%) và amino acid (93 – 98 %), ở cả các chủng gây bệnh thuộc serotype I và không gây bệnh thuộc serotype II.
Hình 2.9: Hệ gene của virus Gumboro bao gồm 2 phân đoạn A và B nhìn dưới
kính hiện vi điện tử (Lê Thanh Hòa, 2003c)
17
Trình tự các motif của RNA polymerase phụ thuộc RNA virus (RdRp) được bảo tồn trong cả hai serotype của IBDV. Trong phân đoạn A, sự tương đồng thấp hơn về nucleotide và amino acid tương ứng là 83% - 84% và 90% đáng chú ý ở các vùng mã hóa giữa các chủng thuộc serotype I và II (Kibenge et al., 1991). Điều này chủ yếu xảy ra tại vùng “siêu biến đổi” liên quan tới các nhóm quyết định kháng
nguyên đặc hiệu của từng serotype virus trong protein cấu trúc VP2 (Kibenge et al., 1999).
Toàn bộ các trình tự không mã hóa đầu 5' và 3' của phân đoạn A và B ở các chủng thuộc serotype I và các chủng thuộc serotype II của IBDV đã được giải mã và công bố (Mundt and Muller, 1995; Kibenge et al., 1996). Trình tự đầu tận cùng 5' trong cả hai phân đoạn gene VP4, VP3 đều tồn tại một trình tự bảo tồn gồm 32- nucleotide là GGA U(A/G)C GAU (C/G)GG UCU GAA CC(C/U) C(G/U)G G(GI-)A GUC AC (Hình 2.10).
Hình 2.10: Sơ đồ hệ gene và một số vùng quan trọng của IBDV serotype I và
II (Lê Thị Kim Xuyến, 2010)
18
Các trình tự đầu tận cùng 3’của cả hai phân đoạn các chủng IBDV được kết thúc với một trình tự gồm 5 nucleotide bảo tồn -GCGGU- (Kibenge et al., 1996). Như vậy, đầu tận cùng của các phân đoạn này ở hệ gene IBDV giống với các phân đoạn khác của các virus RNA khác như Reovirus (Antczak et al., 1982) và
Influenza virus (Stockle et al., 1987) nơi có đầu 5’ và 3’ tương ứng nằm giữa các phân đoạn của hệ gene.
Ngay sát các cấu trúc lặp ở đầu tận cùng 3' trên phân đoạn A và 5’ trên phân đoạn B có khả năng tạo thành các cấu trúc bậc hai hình vòm (loop) và mầm (stem) (Kibenge et al., 1996). Các cấu trúc vòm và mầm là những cấu trúc có liên quan trong quá trình sao chép RNA, dịch mã và khép vỏ của các virus chứa RNA khác như virus bại liệt (Simoes and Sarnow, 1993). Trong phân đoạn A của IBDV, có sự khác nhau giữa các chủng thuộc serotype I và II trong các cấu trúc bậc hai được tạo ra bởi vùng 5' không mã hóa phía trước gene VP5; những cấu trúc này có thể liên quan trong quá trình nhân lên của virus, trong nhận diện tế bào vật chủ đặc hiệu và có lẽ cả tính gây bệnh (Mundt and Muller, 1995).
Hai phân đoạn A và B của IBDV cũng chứa những thay đổi nuleotide đặc hiệu với từng serotype trong các vùng không mã hóa. Khi so sánh các chủng IBDV thuộc serotype II với các chủng thuộc serotype I, đã có sự thay đổi về nucleotide trong vùng 5' không mã hóa mà đặc trưng cho serotype trên phân đoạn A và trên phân đoạn B. Không có sự thay đổi đặc trưng cho serotype được tìm thấy trong trình tự đầu tận cùng 3' của phân đoạn A, rất ít thay đổi nuleotide được xác định trong trình tự đầu tận cùng 3' của phân đoạn B (Kibenge et al., 1996).
2.2.2 Protein của virus - cấu trúc và chức năng
Hai phân đoạn RNA của IBDV đều mang thông tin di truyền và có nhiệm vụ sinh tổng hợp 5 loại protein có tên gọi là VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Hình 2.11). Phân đoạn A (segment A) của hệ gene virus Gumboro bao gồm hai khung đọc mở (ORF = Open Reading Frame). Một khung đọc mở lớn mã hóa cho một tiền protein, gọi là protein chung (polyprotein) có phân tử lượng là 108 kDa, mà trong quá trình tiếp theo sẽ được phân cắt thành các polypeptide riêng biệt, là những protein cấu trúc, có tên gọi là VP2, VP4, VP3 (Becht et al., 1988; Kibenge and Dhama., 1997).
19
VP2 là đoạn RNA đầu tiên trong chuỗi gene hợp nhất VP2, VP4, VP3 mã hóa cho protein chung của phân đoạn A. Toàn bộ chuỗi nucleotide mã hóa cho protein chung VP2, VP4, VP3 của phân đoạn A có độ dài 3039 bp, bao gồm cả bộ mã khởi đầu ATG (của VP2) và bộ mã kết thúc TGA (của VP3), sau khi tổng hợp, polypeptide sắp xếp theo trật tự: NH2-pVP2-VP4-VP3-COOH (Ye et al., 2014). Từ đó, nhờ hoạt động của VP4 là enzyme protease, polypeptide chung này tự phân cắt thành VP2 nguyên thủy (pVP2, còn gọi là VPX) có trọng lượng phân tử là 48 kDa, VP3 (28 kDa) và VP4 (32 kDa) (Lejal et al., 2000). Cuối cùng, polypeptide
.
w w w w e b l o . c o m
VP2 (VPX) được tóm gọn lại tại đầu C (carboxyl, -COOH), để tạo nên VP2 trưởng thành có trọng lượng 37 kDa (Da Costa et al., 2002). VP2 và VP3 là hai loại protein cấu trúc, sau khi được phân cắt thành sản phẩm độc lập, các protein này được lắp ghép lên bề mặt virion tạo nên hai lớp ngoài và trong của cấu trúc capsid virus (Oña et al., 2004). VP2 có độ dài 1.356 bp, có bộ mã khởi đầu ATG nhưng không có bộ mã kết thúc vì tiếp nối vào đó là chuỗi nucleotide của VP4 (Jackwood and Sommer- Wagner, 2007).
Hình 2.11: Các phân đoạn A và B của virus Gumboro qua điện di DNA (trái); và các thành phần protein qua điện di protein (phải) (Lê Thị Kim Xuyến, 2010)
20
VP2 có sự liên quan tồn tại của một sản phẩm tiền phân cắt, đó là một protein lớn hơn VP2 (pVP2) có thể được tìm thấy trong các tế bào nhiễm, sau đó được phân cắt thành VP2 có hoạt tính ở trong hạt virus hoàn chỉnh. Vị trí phân cắt ở giữa các protein pVP2-VP4 là 511LAA513 và giữa VP4-VP3 là 754MAA756. Sự phân cắt cuối cùng chuyển pVP2 thành VP2 được điều khiển bởi sự tương tác qua lại giữa VP3 với VP1 cũng như với phân tử dsRNA của virus (Chevalier et al., 2002; Tacken et al., 2002). Quá trình xử lí pVP2 (chứa các amino acid từ vị trí 1 đến 512) tạo ra phân tử protein VP2 có hoạt tính (chứa các amino acid từ vị trí 1 đến 441) và 4 phân đoạn peptide nhỏ (từ amino acid 442 đến 487, 488 đến 494, 495 đến 501, và 502 đến 512) do enzyme VP4 nhận biết và phân cắt, trong đó có ít nhất 3 phân đoạn peptide kết hợp với hạt virus (Da Costa et al., 2002). Nếu đột biến thay thế S (serine) bằng K (lysine) tại các vị trí nhận biết của enzyme VP4 (487AAS489,
494AAS496 và 501AAS503) thì ảnh hưởng đến quá trình phân cắt của enzyme VP4. Một lượng lớn protein pVP2 đã được tìm thấy, cùng với nhiều chuỗi polypeptide bất thường khác, trong “các tiểu phần virus chưa hoàn thiện”, được hình thành trong điều kiện chênh lệch tỉ lệ gây nhiễm, tạo cho các phân tử này có khả năng ngăn cản quá trình tái tạo các tiểu phần IBDV hoàn chỉnh (Rodríguez- Lecompte and Kibenge, 2002).
Tất cả các chủng IBDV đều có mức độ giống nhau khá cao ở các gene qui định sự tổng hợp protein VP1, VP3, VP4, VP5, chúng chỉ khác nhau ở gene qui định sự tổng hợp protein VP2 hay chính xác hơn chúng chỉ khác nhau ở vùng “siêu biến đổi” của VP2 (Jackwood and Sommer-Wagner, 2007). Chính vì vậy vùng “siêu biến đổi” được chọn làm đích để so sánh, chẩn đoán các chủng virus cường độc Gumboro (Yamaguchi et al., 2007). VP2 bao gồm một vùng được gọi là vùng “siêu biến đổi” có nhiều amino acid có vai trò là các nhóm quyết định kháng nguyên, chịu trách nhiệm trong quá trình kích thích cơ thể động vật bị nhiễm bệnh sản sinh ra kháng thể trung hòa. Sự biến đổi bất kỳ một amino acid nào thuộc loại nhóm quyết định kháng nguyên trong VP2 đều có thể dẫn đến sự thay đổi nhất định của tính kháng nguyên và tính gây bệnh (Letzel et al., 2007).
VP4 chính là protease, một loại enzyme có chức năng phân cắt protein, có vai trò tự động cắt rời chuỗi polypeptide do toàn bộ phân đoạn A tổng hợp gọi là protein chung. Protein chung được tổng hợp do toàn bộ cấu trúc đa gene (polycistronic) của phân đoạn A. Theo Da Costa et al. (2002), có 4 vị trí amino acid quan trọng trong protein enzyme VP4, có vai trò xúc tác trong quá trình phân cắt protein chung đó là Aspartic acid tại vị trí 514 (D514), Histidine tại 546 (H546), Aspartic acid tại 589 (D589), Serine tại 652 (S652) và nếu đột biến xảy ra ở vị trí D514 sẽ ngăn cản một phần quá trình phân cắt protein chung, nếu đột biến thay thế H bằng P (Proline) ở vị trí 546 sẽ không có quá trình phân cắt protein chung, nếu đột biến thay thế D bằng P ở vị trí 589 và S bằng P ở vị trí 652 sẽ gây ra sự thay đổi trong quá trình phân cắt protein chung. Theo Lejal et al. (2000), enzyme này sử dụng bộ đôi xúc tác serine - lysine (S652 và K692), nếu xảy ra đột biến thay thế S và K ở 2 vị trí này thì emzyme VP4 sẽ bị bất hoạt, không có quá trình phân cắt protein chung.
21
VP2 và VP3 lần lượt tạo nên phần vỏ capsid bên ngoài và bên trong của virus (Caston et al., 2001), trong đó VP2 là thành phần protein bề mặt, còn VP3 là thành phần cấu tạo bên trong. Có 2 nhóm quyết định kháng nguyên kháng nguyên của VP3 (từ vị trí amino acid 109 đến 119, 177 đến 190 trong protein VP3 hay từ vị trí
864 đến 874, 932 đến 945 trong chuỗi protein chung) được xác định bằng Western blot và ELISA (Deng et al., 2007a,b).
Khung đọc mở nhỏ là một phần RNA trong phân đoạn A, có chiều dài 438 bp (Yu et al., 2005), mã hóa cho một loại protein khác có tên gọi là VP5, mà chuỗi RNA này lồng vào trong phần gene của VP2. Do vậy hai loại protein này sử dụng chung một phần chuỗi nucleotide làm thành phần của mình, nhưng bộ ba mã hóa cho thành phần amino acid lại khác nhau, hay nói cách khác là sao chép lệch khung. VP5 là một protein có trọng lượng phân tử bé (16,5 – 17 kDa) mới được phát hiện gần đây, VP5 được chứng minh là một loại protein không cấu trúc, không có vai trò trong sự nhân lên của virus nhưng có chức năng trong quá trình điều hòa sao chép và tổng hợp protein, đặc biệt trong quá trình khởi phát sự “chết tự nguyện” (apoptosis) của tế bào dẫn đến suy giảm miễn dịch và được tụ tập gần màng tế bào thực hiện chức năng ly giải tế bào để giải phóng virus (Lombardo et al., 2000).
Phân đoạn A của hệ gene virus Gumboro bao gồm một operon đơn nhất liên kết các gene VP2, VP4 và VP3 với nhau, khi sao chép thông tin thì tạo nên một sợi RNA thông tin hoàn chỉnh, tổng hợp nên một protein chung có phân tử lượng là 108 kDa, sau đó được enzyme do VP4 tổng hợp phân cắt tạo thành các sản phẩm riêng biệt. Phần đầu và phần cuối các phân đoạn của hệ gene có những vùng nucleotide không chứa gene gọi là vùng không mã hoá (NC = non coding region), là ranh giới phân chia hệ gene làm đôi và có tác dụng khởi động, điều hòa trong sao chép và tổng hợp sản phẩm protein.
22
Phân đoạn gene B có độ dài khoảng 2.800 bp chỉ chứa duy nhất một cấu trúc gene mã hóa cho sự tổng hợp một protein duy nhất có tên gọi là VP1. VP1 có hoạt tính sinh học chịu trách nhiệm là enzyme RNA-polymerase phụ thuộc RNA của virus. Enzyme này có vai trò xúc tác trong quá trình tổng hợp nguyên liệu RNA, vật liệu di truyền của virus (Hình 2.12). VP1 là một protein enzyme (RNA- polymerase) có liên kết giữa phân đoạn A và B của hệ gene bằng mối liên kết chặt chẽ với hai đầu tận cùng của nó bằng một protein nhỏ liên kết (VPg) (Muller and Nitschke, 1987). Protein cấu trúc VP1 liên kết với đầu kết thúc của cả hai phân đoạn hệ gene virus và có các hoạt tính của nhiều enzyme (Kibenge and Dhama, 1997). Các protein VP1 tạo thành một nhóm phụ đặc trưng của enzyme RNA polymerase phụ thuộc RNA (Shwed et al., 2002). Phân tích trình tự nucleotide phân đoạn B của các chủng IBDV độc lực cao được phân lập từ các ổ dịch cho thấy các chủng này tách ra thành một nhánh riêng biệt (Islam et al., 2001a). Tuy nhiên, nguồn gốc phát sinh phân đoạn B của các chủng virus này vẫn chưa được xác định,
người ta cho rằng phân đoạn này được tạo ra do sự tự sắp xếp lại cấu trúc của nó. Trong tự nhiên, có hiện tượng sắp xếp chéo các phân đoạn giữa các chủng tạo nên hiện tượng lai ghép khi nhiều chủng cùng tồn tại gây nhiễm với nhau (Luque et al., 2007).
Hình 2.12: Sơ đồ minh hoạ hệ gene của virus Gumboro và quá trình tổng hợp
Ghi chú: hệ gene bao gồm 2 phân đoạn (A và B), trong đó phân đoạn B mã hóa cho 1 protein (VP1); phân đoạn A mã hóa cho protein VP5 và một protein chung, sau khi phân cắt sẽ cho 3 loại protein sản phẩm độc lập bao gồm: VP2; VP4 và VP3
protein cấu trúc (Lê Thanh Hòa, 2003c)
23
Hiện nay, công nghệ “di truyền ngược” (reverse genetics technology) được sử dụng một cách hiệu quả trong nghiên cứu virus RNA. Hệ thống di truyền ngược trở nên phù hợp cho việc xác định các trình tự từ đầu 5’ đến đầu 3’ của cả hai phân đoạn hệ gene IBDV (Ben et al., 2008). Sử dụng hệ thống này tạo ra dòng cDNA có
độ dài đầy đủ của cả hai phân đoạn, nạp vào plasmid trong hộp gene phù hợp, sau đó gây đồng nhiễm trên tế bào thích ứng, tạo nên virus Gumboro với một số tính năng thay đổi có định hướng và những thế hệ tiếp theo của virus vẫn có khả năng di truyền và truyền nhiễm (Mundt et al., 2003). Gene khởi động T7 được gắn ở đầu trên của phân tử cDNA và sử dụng enzyme T7 RNA polymerase cho sự sao chép. Bên cạnh đó, phân tử cDNA có gắn trình tự promoter khởi động T7 được sử dụng để chuyển nạp vào các tế bào đã được tiếp truyền trước với một virus vector tái tổ hợp biểu hiện enzyme T7 polymerase.
Virus Gumboro hoang dã (tự nhiên), không thể nhân lên trong các tế bào nuôi cấy thông thường nhưng có thể được tái tạo bằng phương pháp di truyền ngược. Tuy nhiên, thế hệ virus được sinh ra cần phải được tiếp truyền trong các tế bào của túi Fabricius (Boot et al., 2000a) hoặc trong phôi trứng gà (Islam et al., 2001b). Việc ứng dụng hệ thống này cho phép tạo ra các chủng IBDV không chứa gene mã hóa VP5, sắp xếp lại hoặc tái tổ hợp serotype I và serotype II (Zierenberg et al., 2004) giữa các type huyết thanh hoặc giữa các chủng độc lực tạo ra các chủng IBDV tái tổ hợp (Boot et al., 2000b; Schröder et al., 2001), cũng như các chủng IBDV có các đột biến điểm do đột biến gene tại các vị trí trực tiếp mã hóa cho các amino acid đã làm thay đổi các amino acid do chúng mã hóa (Raue et al., 2004; Van Loon et al., 2002).
2.2.3 Biến đổi di truyền và tiến hóa của virus Gumboro
2.2.3.1 Biến đổi di truyền tại vùng “siêu biến đổi”
24
Vùng “siêu biến đổi” (hypervariable region) là một vùng gồm nhiều amino acid nằm trong cấu trúc của VP2, thành phần nucleotide và amino acid thay đổi trong các chủng khác nhau, có khoảng 500 nucleotide và 150 amino acid chịu trách nhiệm về tính kháng nguyên. Nằm trong vùng “siêu biến đổi”, có khoảng 12-20 amino acid làm khung xen kẽ trong các amino acid khác làm nền, tạo nên chuỗi polypeptide của vùng này. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng có 9 vị trí amino acid quan trọng trong vùng nhóm quyết định kháng nguyên đó là các vị trí 222, 242, 253, 256, 279, 284, 294, 299, và 329, trong đó có 5 vị trí quan trọng hơn cả đó là 222(A), 242(I), 256(I), 294(I) và 299(S) ở các chủng cường độc (Martin et al., 2007). Sự thay đổi các amino acid ở vị trí này có thể làm cho một chủng cường độc trở thành có độc lực yếu hay nhược độc; và ngược lại một chủng nhược độc có thể “độc”, tức là tăng cường độc lực để trở thành cường độc (Yuwen et al., 2008).
Nếu vùng “siêu biến đổi” có thành phần nucleotide biến đổi đến mức dẫn đến thay đổi amino acid nhóm quyết định kháng nguyên của vùng “siêu biến đổi” thì tính kháng nguyên và độc lực của virus sẽ bị thay đổi. Chính vì vậy vùng “siêu biến đổi” được chọn làm đích để so sánh, chẩn đoán các chủng virus Gumboro và phân tích xác định đặc tính độc lực (cường độc, độc lực yếu hay nhược độc) dựa trên chuỗi gene và amino acid sau khi giải trình tự (Lê Thanh Hòa, 2003c; Yamaguchi et al., 2007).
2.2.3.2 Biến đổi di truyền tại gene kháng nguyên VP2
Phân đoạn A của hệ gene IBDV là một phân đoạn rất quan trọng trong hệ gene của virus Gumboro, trong đó có một cấu trúc đơn gene (monocistronic) mã hóa cho một tiền protein gọi là protein chung (polyprotein) có phân tử lượng là 108 kDa, sau đó sẽ được phân cắt thành các polypeptide riêng biệt, là những protein cấu trúc có tên gọi là VP2, VP3, VP4 (Jackwood et al., 2008). Bằng các phương pháp khác nhau trong đó có phương pháp miễn dịch học, phương pháp sinh học phân tử và phương pháp thử nghiệm trên động vật thí nghiệm, VP2 đã được chứng minh là một loại protein có tính kháng nguyên và có tính chất bảo vệ virus. Do vậy, VP2 đại diện cho tính độc lực và tính gây bệnh của virus. Sự biến đổi bất kỳ một amino acid nào trong VP2 đều có thể dẫn đến sự thay đổi nhất định của tính kháng nguyên và tính gây bệnh (Letzel et al., 2007).
Về cơ bản, hầu hết các chủng virus Gumboro trong cùng một nhóm virus, đều giống nhau ở các gene qui định sự tổng hợp protein VP1, VP3, VP4, VP5, chúng chỉ khác nhau ở gene qui định sự tổng hợp protein VP2. Như vậy, VP2 được sử dụng nhằm phân biệt các chủng, type (định type), phân biệt kháng nguyên và tính độc lực khác nhau của các chủng virus. Khi phân tích đặc tính sinh học phân tử của virus Gumboro và so sánh các chủng phân lập từ các vùng địa lý hay quốc gia khác nhau, toàn bộ phân đoạn A (bao gồm VP2, VP4, VP3) có độ dài 3039 bp; hoặc chỉ cần chọn VP2 (độ dài: 1.356 bp) làm chỉ thị phân tử để xem xét mối quan hệ kháng nguyên, phả hệ, nguồn gốc và nhiều đặc tính khác (Sun and Lu, 2003; Letzel et al., 2007).
2.2.4 Nhóm quyết định kháng nguyên và sự tiến hóa
2.2.4.1 Khái niệm về nhóm quyết định kháng nguyên
25
Đối với protein VP2 của virus Gumboro, cấu hình bề mặt có một tầm quan trọng đặc biệt trong cơ chế đáp ứng miễn dịch. Hầu như virus thế hệ sau sinh ra đều có cấu hình bề mặt của protein VP2 như nhau và giống với thế hệ trước, nếu
như chúng cùng một chủng có quan hệ họ hàng với nhau. Đối với virus Gumboro, VP2 vừa quyết định tính kháng nguyên, nghĩa là tham gia tích cực vào việc kích thích hình thành kháng thể, mở đầu cho quá trình đáp ứng miễn dịch; vừa quyết định tính độc lực, tức là khả năng gây bệnh của chủng virus Gumboro đó. Do vậy, VP2 được xem là protein kháng nguyên và độc lực của virus (Raue et al., 2004). Nằm trong chuỗi polypeptide kháng nguyên VP2 có khoảng vài chục amino acid, mà ở đó có một vài amino acid cực kỳ quan trọng (thông thường 12 - 20 amino acid) gọi là amino acid khung, số còn lại là amino acid trợ giúp hay còn gọi là amino acid nền, tất cả tạo nên một bộ phận đặc hiệu gọi là nhóm quyết định kháng nguyên quyết định tính kháng nguyên và khả năng miễn dịch (Lê Thanh Hòa, 2003a).
Về góc độ miễn dịch, nhóm quyết định kháng nguyên là vị trí mà kháng thể đặc hiệu sẽ liên kết tạo nên phức hợp kháng nguyên - kháng thể. Nhóm quyết định kháng nguyên của chuỗi polypeptide kháng nguyên VP2, là một hợp phần có khoảng 120 – 150 amino acid, mà ở đó có một số amino acid khung quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên và khả năng miễn dịch. Trong protein VP2, có 9 vị trí amino acid đóng vai trò tiên quyết trong cơ chế sinh kháng thể trung hòa virus (Lê Thanh Hòa, 2004). VP2 của virus Gumboro còn là một loại protein độc lực, quyết định tính gây bệnh nên nhóm quyết định kháng nguyên của vùng này được gọi là nhóm quyết định kháng nguyên và độc lực (Mickael and Jackwood, 2005).
2.2.4.2 Sự tiến hóa
Hiện nay, nhiều chủng Gumboro khác nhau đã được phân lập trên thế giới. Tất cả quần thể virus Gumboro đều thuộc họ Birnaviridae, nhưng VP2 của từng chủng khác nhau có vùng “siêu biến đổi” không đồng nhất. Hay nói cách khác, thành phần amino acid của nhóm quyết định kháng nguyên nằm trong vùng “siêu biến đổi” là không đồng nhất (Hernández et al., 2006). Đột biến xảy ra trong chuỗi nucleotide của nhóm quyết định kháng nguyên sẽ làm thay đổi amino acid khung, làm cho nhóm quyết định kháng nguyên thay đổi cấu trúc dẫn đến thay đổi tính kháng nguyên và độc lực. Do đó hình thành nên các chủng khác nhau. Như vậy, biến chủng là sự thay đổi thành phần nucleotide và amino acid của cả hệ gene nói chung, của vùng “siêu biến đổi” ở VP2 nói riêng và đặc biệt là của thành phần nhóm quyết định kháng nguyên và độc lực (Boot et al., 2000b).
26
Quá trình "nhược độc hóa" (biến đổi từ chủng cường độc thành độc lực yếu hơn); hoặc trở nên "vô độc"; hoặc "lại độc" (từ chủng nhược biến đổi thành cường độc trở lại), đều là hệ quả của một quá trình biến đổi có tính quy luật của bộ amino
acid làm khung nằm trong nhóm quyết định kháng nguyên của protein VP2. Quy luật biến đổi amino acid khung của nhóm quyết định kháng nguyên được các công trình nghiên cứu chứng minh là xảy ra ở 9 vị trí có biến đổi amino acid khung bao gồm: vị trí 222, 242, 253, 256, 279, 284, 294, 299, và 329 của protein VP2 (Rodriguez-Chavez et al., 2002). Sự thay đổi amino acid ở các vị trí này có ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh và đặc tính kháng nguyên của một chủng virus Gumboro. Các thay đổi của từng amino acid làm khung hợp lại thành một quy luật biến đổi tùy thuộc vào hướng biến đổi độc lực, người ta gọi dãy amino acid biến đổi có quy luật này là motif (Lê Thanh Hòa, 2003c).
Sự biến đổi “giảm độc” tức là từ cường độc thành độc lực yếu (trung gian) và cuối cùng trở thành nhược độc (độc lực thấp), cũng như ngược lại là sự “tăng độc”, phụ thuộc vào sự biến đổi có tính thay thế ở các amino acid tại các vị trí này, bao gồm các vị trí cụ thể như sau: 222 (AP/TP); 242 (IVV); 253 (QQH); 256 (IVV); 279 (DD/NN); 284 (AAT); 294 (ILL); 299 (SNN); 329 (ARR). Như vậy, có 3 loại motif đại diện cho 3 nhóm virus có mức độ độc lực khác nhau: motif (A-I-Q-I-D-A-I-S-A) của virus thuộc loại có mức độ độc lực cao (cường độc); motif (P/T-V-Q-V-D/N-A-L-N-R) của các loại virus Gumboro có mức độ độc lực vừa, đang chuyển đổi nhược độc hóa (theo chiều yếu dần) hoặc cường độc hóa (theo chiều mạnh dần); và motif (P-V-H- V-N-T-L-N-R) của các virus có mức độ độc lực thấp (nhược độc) (Jackwood et al., 2008). Trong 9 vị trí này có 4 vị trí đặc biệt quan trọng hơn cả, đó là các vị trí: 222 (AP/TP), 242 (IVV), 256 (IVV), 299 (SNN). Amino acid tại 9 vị trí là các amino acid thuộc nhóm quyết định kháng nguyên - miễn dịch của chủng virus Gumboro; amino acid tại vị trí 253 có vai trò ảnh hưởng đến độc lực của IBDV (nếu amino aicid tại vị trí này là Histidine (H), virus thuộc motif có độc lực thấp; ngược lại nếu là Glutamine (Q), virus thuộc motif độc lực cao) (Letzel et al., 2007; Yamaguchi et al., 2007; Jackwood et al., 2008).
27
Dựa vào đặc điểm gây bệnh, serotype I phân lập ở tự nhiên có thể được xếp vào nhóm virus độc lực cổ điển (cv = classical virulent) hay type gây bệnh độc lực cao (vv = very virulent) và những chủng biến đổi kháng nguyên. Nhiều nỗ lực được thực hiện để xác định tính tương đồng độc lực, đặc biệt đặc tính tương đồng của type cường độc gây bệnh. Các nghiên cứu trên cơ thể gà bệnh, sự giải trình tự và phân tích phả hệ đã kết luận một số protein VP2 có thể là chỉ thị phân tử xác định độc lực và các kiểu hình gây bệnh của các chủng IBDV (Hernández et al., 2006). Boot et al. (2000b), bằng việc thay đổi VP2 giữa một chủng độc lực cổ điển và một
chủng độc lực cao đã chứng minh rằng VP2 không phải là chỉ thị phân tử duy nhất xác định độc lực của virus. Trình tự nucleotide của ORF mã hóa cho VP1 cho thấy protein đa chức năng này có vai trò quyết định hiệu suất nhân lên cũng như độc lực của virus (Islam et al., 2001a).
Hình 2.13: Quy luật biến đổi nhóm quyết định kháng nguyên: cường độc → độc lực yếu → nhược độc (Lê Thanh Hòa, 2003c).
Việc nhân lên của IBDV trong mô nuôi cấy có liên quan đến sự giảm độc lực của virus để tạo ra các virus nhược độc (Lazarus et al., 2008). Tiếp truyền liên tục các IBDV trong môi trường nuôi cấy tạo nên virus nhược độc và được sử dụng làm vaccine sống. Những chủng IBDV phân lập trong tự nhiên hay còn gọi là IBDV hoang dã (wild type IBDV), trong điều kiện bình thường ở những lần cấy truyền đầu tiên không hoặc rất khó phát triển trong tế bào nuôi cấy. Qua một số đời tiếp truyền, phụ thuộc vào biến đổi thụ thể của tế bào nhận chúng mới có khả năng thích ứng dần và nhân lên được đối với các loại tế bào xơ phôi gà sơ cấp (CEF) và dòng thuần DF-1 hoặc DT40 (Zhu et al., 2008; Luo et al., 2009). Trình tự amino acid đặc trưng của VP2 tương ứng với sự thích ứng của IBDV ở các tế bào nuôi cấy (Shi et al., 2008).
28
Gần đây, chủng IBDV đã có sự thích ứng với các tế bào phôi gà nuôi cấy bằng việc sử dụng các đột biến điểm và phương pháp di truyền ngược đã gây giảm
độc lực một phần với gà SPF (special pathogen free) và gà thịt (Van Loon et al., 2002). Tuy nhiên, sự gia tăng độc lực tự nhiên đã ngăn cản việc ứng dụng virus này làm vaccine sống (Raue et al., 2004).
Hiện tượng “lệch” kháng nguyên (antigenic drift) là biến đổi thành phần nucleotide gene kháng nguyên VP2 sau vài đời sử dụng vaccine trong quần thể IBDV được phát hiện ở Mỹ, việc phân lập một vài chủng virus IBDV thuộc serotype I từ túi Fabricius của những con gà được tiêm chủng vaccine sống nhược độc (Rosenberger and Cloud, 1986). Các chủng virus này được xác định là các virus đã biến đổi do chúng lây nhiễm cho những con gà giò có hàm lượng cao các kháng thể được truyền từ mẹ (Box, 1989). Chúng có đặc tính kháng nguyên khác với các chủng cổ điển được phân lập trước năm 1985 và có khả năng ức chế gây suy giảm miễn dịch cao, gây ra sự teo nhỏ túi Fabricius nhanh chóng mà không có biểu hiện triệu chứng bệnh lý lâm sàng. Các biến chủng cường độc như E/DEL (Rosenberger and Cloud, 1986), chủng GLS và DS326 được phân lập từ bán đảo Delmarva có sự thay đổi cả về tính kháng nguyên và tính gây bệnh so với các chủng cường độc cổ điển.
Vùng mã hóa cho protein VP2 trong protein chung (polyprotein) chịu trách nhiệm kích thích tạo ra các kháng thể trung hòa virus (VN) (Fahey et al., 1989), các biến đổi về trình tự amino acid trong protein VP2 của các biến chủng IBDV nằm giữa vị trí amino acid 206 và 350 (đoạn polypeptide nằm giữa 2 điểm cắt là AccI-SpeI) (Kibenge et al., 1990). Vùng “siêu biến đổi” có khoảng 151-152 amino acid mã hóa cho khung nhóm quyết định kháng nguyên được xác định bằng kháng thể đơn dòng trung hòa (VN) mAb 17/82 (Azad et al., 1987). Có hai vùng “ưa nước” (hydrophilic region) đối xứng cách nhau (amino acid 212-224 và 314-324) đã được xác định trong vùng “siêu biến đổi” (Schnitzler et al., 1993). Những vùng “ưa nước” và các trình tự bên trong VP2 không cùng tồn tại ở giữa các chủng gây bệnh thuộc serotype I và các chủng không gây bệnh thuộc serotype II. Vùng ưa nước thứ nhất được cho là chịu trách nhiệm với việc ổn định khung nhóm quyết định kháng nguyên và vùng ưa nước thứ hai được xác định bằng các kháng thể đơn dòng trung hòa virus (VN mAbs) (Heine et al., 1991).
29
Hiện nay, nhiều nghiên cứu cơ sở phân tử của những biến đổi đặc tính kháng nguyên và độc lực của IBDV, đó là các amino acid tại vùng “siêu biến đổi” của VP2 ở một số vị trí chịu trách nhiệm về sự biến đổi tính kháng nguyên của IBDV. Sự thay đổi của một, hai hay một vài amino acid trong vùng này có tính chất quyết định đến sự kết hợp kháng thể do chúng hoặc do các chủng đồng kháng nguyên
khác kích thích sinh ra. Nếu không đồng nhất về thành phần khung của nhóm quyết định kháng nguyên, kháng nguyên vaccine sử dụng có thể kích thích sinh kháng thể với hàm lượng cao nhưng kháng thể này không thể hoặc không hoàn toàn trung hòa được chủng virus gây bệnh khác vì không có vị trí kết hợp kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu do sai lệch về nhóm quyết định kháng nguyên của vaccine với chủng cường độc gây bệnh tại thực địa. Thêm vào đó, những sự thay đổi nuleotide trong những vùng khác của hệ gene như VP4 và VP1 cũng góp phần tạo ra nhóm gene cần thiết cho sự tiến hóa của những chủng IBDV cường độc (Tiwari et al., 2003; Bais et al., 2004).
2.2.4.3 Các chỉ thị di truyền phân tử trong nghiên cứu virus Gumboro
Tất cả các đặc tính sinh học của một cá thể đều được quyết định bởi hệ gene của chúng. Hệ gene ở động vật là một tập hợp các chuỗi nucleotide phân bố trong các phân đoạn dài ngắn khác nhau gọi là nhiễm sắc thể (đối với hệ gene cá thể bậc cao), hoặc là chuỗi nucleotide (DNA; RNA) (đối với hệ gene cá thể bậc thấp). Tính chính xác khi so sánh cấu trúc trật tự nucleotide của gene và hệ gene các cá thể khác nhau cho phép phân biệt chính xác các đặc tính di truyền của cá thể và quần thể, bất luận sản phẩm gene của chúng có thể bị ảnh hưởng tương tác của môi trường và đồng loại. Ngày nay khảo sát, phân tích cấu trúc gene và hệ gene của cá thể để so sánh, hay còn gọi là khai thác chỉ thị di truyền phân tử DNA; RNA (genetic markers) được xem là phương pháp tối ưu trong nghiên cứu các sinh vật nói chung và virus nói riêng, đặt ra một hướng mới: hướng giám định, chẩn đoán, phân loại, nghiên cứu phả hệ, dịch tễ học bằng phương pháp sinh học phân tử.
Bệnh Gumboro được xem là một bệnh cổ điển của ngành chăn nuôi gà công nghiệp. Từ khi bệnh được phát hiện, có rất nhiều công trình khoa học nghiên cứu về bệnh, virus gây bệnh, các loại vaccine phòng bệnh song Gumboro vẫn là một bệnh nan giải đặc biệt ở khía cạnh suy giảm miễn dịch do virus gây ra. Hiện nay, nghiên cứu sinh học phân tử bằng cách ứng dụng phản ứng RT-PCR, real-time PCR được tiến hành rộng rãi trong đó có nghiên cứu phân tử của virus gây bệnh Gumboro (Moody et al., 2000; Luo et al., 2009; Zhang et al., 2009).
2.3 Hệ miễn dịch ở gà
2.3.1 Cơ quan chính tạo miễn dịch ở gà
Tủy xương là nơi sản sinh ra các tế bào gốc đa năng, tiền thân của các tế bào
30
có chức năng miễn dịch và các tế bào máu khác.
Tuyến ức là cơ quan dạng lympho xuất hiện sớm trong thời kỳ phôi thai. Tuyến ức được tạo nên bởi các tế bào dạng lympho và các tế bào dạng biểu mô, nó không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng miễn dịch, nhưng cần thiết cho sự phân chia, biệt hóa của dòng tế bào lympho T. Tuyến ức tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào.
Theo Ciriaco et al. (2003), túi Faricius là cơ quan thuộc hệ thống miễn dịch thiết yếu của hệ miễn dịch gia cầm (Hình 2.14). Túi Fabricius chỉ có ở loài chim, gia cầm, có nguồn gốc nội bì, nằm phía trên trực tràng, sát hậu môn, có cuống là ống rỗng thông qua trực tràng, túi có cấu tạo hình múi khế và cũng chia ra vùng vỏ và vùng tủy, kích thước to bằng hạt đỗ hoặc hạt lạc. Bên ngoài túi có màng bao bọc, bên trong có niêm mạc bao bọc, hoạt động mạnh nhất khi gia cầm dưới 2 tháng tuổi, teo dần sau 2 tháng tuổi và teo hoàn toàn sau một năm tuổi. Trọng lượng của túi Fabricius tăng từ lúc mới nở cho đến khi gà đạt 10 tuần tuổi. Từ 10 -24 tuần tuổi túi ổn định cùng một kích cỡ. Sau đó túi teo dần, đến 28 tuần tuổi túi Fabricius teo nhỏ nhất và không còn tác dụng (Lê Văn Năm, 2004).
Hình 2.14: Hệ thống miễn dịch gia cầm (Ciriaco et al., 2003)
31
Ở gia cầm, túi Fabricius và tủy xương là nơi biệt hóa và trưởng thành của dòng tế bào lympho B là các tế bào có tiềm năng sinh kháng thể, chịu trách nhiệm chính trong đáp ứng miễn dịch dịch thể (Immunoglobulin).
Từ tế bào gốc, các tiền lympho B được phân chia và biệt hóa ở túi Fabricius tạo thành lympho B. Các lympho B này đến các mô lympho ngoại vi, sau khi được kháng nguyên kích thích thì biệt hóa thành tương bào (plasmocyte) sản xuất kháng thể và các tế bào nhớ miễn dịch.
Vai trò của kháng thể: Trong hệ đáp ứng miễn dịch, kháng thể có 3 chức năng chính: liên kết với kháng nguyên, kích hoạt bổ thể và huy động các tế bào miễn dịch.
Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch bao gồm: kháng nguyên, chất bổ trợ, đường cấp kháng nguyên, tần suất gây nhiễm, khoảng cách giữa các lần gây miễn dịch, liều lượng, bảo quản vaccine, miễn dịch thụ động, cơ thể động vật, ….
2.3.2 Ảnh hưởng của IBDV đến khả năng đáp ứng miễn dịch
2.3.2.1 Miễn dịch chủ động
Đối với miễn dịch chống bệnh Gumboro, quá trình miễn dịch dịch thể là quan trọng. Gà nhỏ hơn 3 – 4 tuần tuổi chỉ cần tiếp xúc virus Gumboro (cường độc hay vaccine) qua đường tiêu hóa là đủ để hình thành miễn dịch tốt, do đó vaccine Gumboro có thể được sử dụng bằng đường uống. Gà ở độ tuổi lớn hơn hoặc gà mẹ, việc đưa vaccine bằng đường tiêu hóa không có hiệu quả cao, mà nên dùng phương pháp tiêm bắp hay tiêm dưới da (Lukert and Saif, 2003). Cần lưu ý điều này trong việc thực hiện một chương trình vaccine toàn diện để phòng chống bệnh Gumboro (Nguyễn Bá Thành, 2006).
Một vấn đề quan trọng là virus Gumboro nhiễm qua đường tiêu hóa, do đó việc tạo miễn dịch tại chỗ trên đường tiêu hóa bằng cách cho uống vaccine là rất quan trọng. Miễn dịch chủ động tạo ra không mạnh, do đó phải chủng ngừa lặp lại sau lần đầu 10 - 14 ngày. Đồng thời phải lưu ý đến sự trung hòa vaccine do kháng thể thụ động mẹ truyền và loại vaccine sử dụng.
2.3.2.2 Miễn dịch thụ động
32
Kháng thể truyền từ mẹ sang con (qua lòng đỏ trứng) có thể bảo vệ gà con chống lại sự nhiễm virus trong thời gian đầu. Nghiên cứu của Skeeles et al. (1979) đã xác định kháng thể kháng virus Gumboro thụ động trong máu gà con giảm đi 1/2 sau 3 - 5 ngày. Khi hiệu giá kháng thể trung hòa nhỏ hơn 100 thì gà hoàn toàn mẫn cảm với virus Gumboro và phát bệnh khi bị nhiễm (Lucio and Hitchner, 1979). Kháng thể trung hòa thụ động có vai trò tích cực trong việc bảo hộ đàn gà con nhưng lại ức chế việc tạo ra miễn dịch chủ động bằng vaccine nhất là vaccine sống
nhược độc. Để tiêm phòng đạt hiệu quả khi hiệu giá kháng thể thụ động phải thấp hơn 64. Hiện nay, quan điểm chung của tất cả các chuyên gia trên thế giới cho rằng việc tiêm phòng cho gà con bằng vaccine nhược độc đang gặp trở ngại lớn nhất là kháng thể thụ động của gà mẹ truyền sang nên nhiều khi vaccine không có tác dụng và việc tiêm phòng không đem lại hiệu quả như mong muốn. Quy trình tiêm phòng bằng vaccine cho gà con không có lịch rõ ràng và cũng không thể có lịch áp dụng chung cho tất cả mọi nơi (Nguyễn Xuân Bình và ctv, 2005).
Muốn tạo ra miễn dịch cho gà con phải tiến hành tiêm ngừa vaccine Gumboro cho gà mẹ, kháng thể truyền qua trứng sẽ bảo hộ gà con khỏi bệnh Gumboro. Thời gian bảo hộ thay đổi theo lượng kháng thể của gà mẹ. Thông thường nếu sức khỏe gà mẹ ổn định và được tiêm phòng tốt, hàm lượng kháng thể thụ động sẽ cao, có thể bảo hộ gà con đến 4 tuần. Song các nghiên cứu gần đây cho thấy kháng thể truyền từ gà mẹ sang gà con không ổn định, lúc cao, lúc thấp, không đồng đều giữa các con trong đàn gà, đa số các trường hợp đều bảo hộ gà con không quá 20 ngày. Chính sự tạo miễn dịch không ổn định trên gà mẹ đã gây nhiều khó khăn cho việc xác định lịch tiêm chủng, vì khó có thể căn cứ vào kết quả xét nghiệm kháng thể mẹ truyền trên một số mẫu gà con để xác định lịch chủng ngừa cho cả đàn gà. Khuynh hướng hiện nay là coi như không có kháng thể mẹ truyền, do đó lịch chủng ngừa cho gà mẹ tỏ ra không cần thiết để từ đó có thể tiêm chủng cho gà con lúc 1 ngày tuổi thay vì phải chờ đến khi hàm lượng kháng thể mẹ truyền xuống dưới mức bảo hộ mới được tiêm phòng.
Bệnh Gumboro là một trong những bệnh phá hủy thống miễn dịch của vật chủ, chúng tấn công và phá hủy các tế bào lympho B đang phát triển trong túi Fabricius (Sharma, et al., 2000), cơ quan miễn dịch trung tâm cho sự phát triển và trưởng thành của tế bào B và tạo ra các kháng thể dịch thể ở gà con (He et al., 2014). Nghiên cứu miễn dịch thu được trên các bệnh truyền nhiễm do virus (Newcastle, Gumboro) cho thấy hàm lượng kháng thể trong máu gà mẹ cao khi tạo miễn dịch bằng vaccine sống và chết. Vaccine sống thuận tiện hơn cho việc dùng vaccine cho lượng lớn gà vì chúng có thể được thêm vào nước uống (Besseboua, et al., 2015). Hơn nữa, vaccine chết đòi hỏi sử dụng thêm tá dược để có hiệu quả và có thể cần nhiều liều, làm tăng chi phí.
2.3.3 Sự ức chế miễn dịch
33
Ức chế miễn dịch do IBDV gây thiệt hại kinh tế lớn ở đàn gà thịt. Mức độ ức chế miễn dịch có liên quan đến tuổi gà mắc bệnh. Sự thiệt hại được nhận thấy rõ nhất nếu gà bị nhiễm trùng trong 2 – 3 tuần tuổi, gà không biểu hiện lâm sàng
nhưng bị ức chế miễn dịch (Jakka et al., 2014). Sau khi virus xâm nhập vào cơ thể, các tế bào bạch cầu và đại thực bào trong ruột bị nhiễm bệnh và mang virus đến túi Fabricius. Các dấu hiệu lâm sàng và tổn thương do IBDV gây ra xuất hiện ngay sau đó. Gà bị nhiễm IBDV dễ bị nhiễm các bệnh khác. Gà nhiễm IBDV lúc 1 ngày tuổi có phản ứng kháng thể thấp hơn và dễ bị nhiễm Newcastle. Gà bị nhiễm bệnh cũng có đáp ứng miễn dịch với vaccine giảm. Ức chế miễn dịch dẫn đến năng suất đàn thấp hơn, nhiễm trùng thứ cấp nhiều hơn, chuyển đổi thức ăn kém, đáp ứng bảo vệ ít hơn với vaccine (Pooja Kundu, 2017).
Tác dụng ức chế miễn dịch của IBDV phụ thuộc vào chủng virus gây bệnh (He et al., 2012). Theo nghiên cứu của Eterradossi and Saif (2013) gà bị nhiễm IBDV có tuổi càng nhỏ càng dễ mắc bệnh khác như viêm gan, cầu trùng, Marek bệnh, viêm thanh phế quản truyền nhiễm, bệnh thiếu máu gà, nhiễm khuẩn Salmonella, Escherichia coli, Mycoplasma synoviae … Mặc dù, IBDV gây ức chế miễn dịch chống lại nhiều kháng nguyên khác nhưng đáp ứng miễn dịch với chính bệnh Gumboro vẫn xảy ra, ngay cả gà trong độ tuổi nhạy cảm nhất. Kích thích chọn lọc làm tăng sinh các tế bào B giúp sản xuất kháng thể chống lại IBDV (Muller et al., 2012).
2.4 Tình hình nghiên cứu về bệnh Gumboro
2.4.1 Nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam, năm 1981 các chuyên gia Hungari đã phát hiện có bệnh Gumboro, sau đó bệnh bùng phát dữ dội. Nhiều tác giả cho rằng, có lẽ bệnh Gumboro đã xuất hiện ở Việt Nam từ những năm 70, nhưng lúc đó chúng ta chưa chú ý đến. Năm 1982, Viện Thú Y Quốc gia chính thức công bố bệnh Gumboro ở Việt Nam (Trần Minh Châu và ctv, 1982).
Theo báo cáo chính thức của các tác giả Trần Minh Châu và ctv (1982) thì bệnh Gumboro được phát hiện vào năm 1982 tại một trại nuôi gà Plymouth ở tỉnh Hà Sơn Bình. Gà bị chết rất nhiều vào lúc 29 – 30 ngày tuổi. Tỉ lệ gà chết là 34% đối với toàn đàn. Dựa vào kết quả nghiên cứu về triệu chứng, bệnh tích đại thể, vi thể và diễn tiến của bệnh, các tác giả trên đã xác định là bệnh Gumboro.
34
Từ năm 1986, bệnh Gumboro xảy ra ồ ạt tại các trại gà công nghiệp. Năm 1987, bệnh Gumboro xảy ra tại trại gà Phúc Thịnh (Hà Nội) làm chết 55.407 con. Đầu tiên, bệnh được nghi là Newcastle nhưng qua dấu hiệu lâm sàng, bệnh tích đại thể và những chẩn đoán phân biệt khác đã xác định là bệnh Gumboro (Lê Văn
Hùng, 1996). Năm 1990, ổ dịch nghi Newcastle ghép Gumboro xảy ra ở xí nghiệp chăn nuôi gà Bình An làm chết 9.500 gà (trích dẫn Nguyễn Thành Trung, 1997).
Những năm 1987 - 1989, bằng kỹ thuật chẩn đoán kết tủa khuếch tán trên thạch (Agar Gel Precipitation – AGP) đã phát hiện được nhiều gà giò, gà đẻ của một trại gà ở Hà Nội có kháng thể đặc hiệu kháng virus Gumboro. Tỉ lệ dương tính với kháng thể kháng virus Gumboro đạt 30 – 40% tổng số mẫu kiểm tra (trích dẫn Nguyễn Thị Mỹ Hoa, 1994).
Năm 1987, Việt Nam có nhiều ổ dịch Gumboro. Bệnh phát ra nghiêm trọng tại xí nghiệp gà Cầu Diễn thuộc liên hiệp gia cầm Hà Nội, xí nghiệp gà giống Tam Đảo và một số xí nghiệp gà giống thương phẩm (Nguyễn Đăng Khải, 1988).
Theo Nguyễn Tiến Dũng (1993), ở Việt Nam giai đoạn từ 1986 – 1990 là thời kỳ bỏ ngỏ đối với bệnh Gumboro do chưa có vaccine phòng bệnh, thiếu kinh nghiệm phòng bệnh nên đã gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gà công nghiệp, tỉ lệ gà bị bệnh từ 80 – 90%, tỉ lệ chết 30 – 40%. Theo số liệu của Cục Thú y từ năm 1986, nhiều tỉnh trong cả nước đều báo cáo có bệnh Gumboro như ở Hà Nội, Hà Tây, Sơn La, Hòa Bình, Nam Định và Vĩnh Phúc. Các tỉnh phía Nam thường xảy ra dịch bệnh Gumboro trên đàn gà có quy mô từ 100 – 6.000 con ở cả trại chăn nuôi gia đình và quốc doanh như ở Thành phố Hồ Chí Minh, Long An, Bình Thuận, Phan Thiết (trích dẫn Nguyễn Bá Thành, 2006).
Từ năm 1989 – 1995 tình hình bệnh Gumboro không ngừng gia tăng, các giống gà công nghiệp nuôi ở Việt Nam đều có thể mắc bệnh. Nếu như năm 1989 tỉ lệ đàn gà nhiễm bệnh 19,23% thì đến năm 1995 tăng lên 90,31% trong tổng số đàn được kiểm tra (Lê Hồng Mận và Phương Song Liên, 1999).
Theo Trần Thị Quỳnh Lan (1999), bước đầu nghiên cứu tình hình dịch tễ của bệnh Gumboro ở các trại gà tư nhân tại thành phố Hồ Chí Minh cho thấy bệnh Gumboro gây thiệt hại kinh tế đáng kể. Tỉ lệ chết trong đàn khảo sát từ 4% đến 29% chủ yếu ở giai đoạn từ 3 đến 7 tuần tuổi, tập trung ở 4 tuần tuổi trên các đàn gà thịt. Chương trình chủng ngừa bệnh Gumboro không đảm bảo 100 % trong việc phòng chống lại bệnh tại các trại khảo sát.
Bệnh Gumboro vẫn là một trong những bệnh có tỉ lệ nhiễm cao nhất khoảng
56,98% so với các bệnh khác trên gia cầm (Lê Văn Năm, 1996).
35
Theo Lê Thanh Hòa (2003b), nghiên cứu các chủng virus cường độc Gumboro tại Việt Nam (9 chủng phân lập ở Hà Nội và vùng phụ cận) hoàn toàn thuộc nhóm phả hệ cùng chủng Gumboro châu Á. Nghiên cứu biến đổi phân tử
nhóm quyết định kháng nguyên (gene kháng nguyên VP2) ở một số chủng virus cường độc Gumboro phân lập tại Việt Nam bằng phương pháp RT- PCR cho thấy 100% các chủng này đều thuộc nhóm cường độc với motif của nhóm quyết định kháng nguyên là A-I-Q-I-I-A-I-S-A (Lê Thanh Hòa, 2004).
Theo Nguyễn Bá Thành (2004), virus Gumboro phân lập ở Đồng Nai thích ứng phát triển tốt trên gà mẫn cảm, nhưng không hoàn toàn trên phôi gà 11 ngày tuổi khi tiêm vào màng nhung niệu (CAM). Khi gây bệnh thực nghiệm chủng virus phân lập tại địa phương cho gà Brown Nick vào 14 ngày tuổi, thấy có triệu chứng và bệnh tích tương tự như triệu chứng và bệnh tích do chủng virus 52/70 gây bệnh ở gà con còn kháng thể mẹ. Tỉ lệ gà có triệu chứng và bệnh tích nghi bệnh Gumboro dao động khoảng 3,6 - 10,7 % và tỉ lệ chết khoảng 8 – 40% tùy theo địa điểm khảo sát (Nguyễn Bá Thành, 2005).
Theo Hoàng Thị Mỹ Hiền (2009), sử dụng vaccine Busaplex chống bệnh Gumboro cho gà đạt hiệu giá kháng thể bảo hộ lúc 42 ngày tuổi cao nhất và hiệu quả kinh tế tốt nhất. Nghiên cứu của Trần Thị Thu Hiền (2010) cho thấy hiệu quả điều trị của chế phẩm Hanvet K. T. G khi gà mắc bệnh Gumboro khi được phát hiện sau 2 – 3 ngày trung bình là 95,05%. Theo Nguyễn Hồng Minh và ctv (2011), gà sử dụng 1 lần vaccine Gumboro, hiệu giá kháng thể đạt cao nhất ở 28 ngày tuổi (914,23±13,78 với vaccine đơn giá và 823,25±15,56 với vaccine đa giá). Gà sử dụng 2 lần vaccine Gumboro vào lúc 7 và 14 ngày tuổi, hiệu giá kháng thể đạt cao nhất ở 42 ngày tuổi (2289,79±18,26 với vaccine đơn giá và 1995,01±24,28 với vaccine đa giá). Công cường độc vào lúc 42 ngày tuổi, toàn bộ gà được sử dụng vaccine đều không bị tiêu chảy và không có bệnh tích ở túi Fabricius. Một tỉ lệ nhất định gà sử dụng 1 lần vaccine có bệnh tích xuất huyết cơ đùi, cơ ngực (13,3% vaccine đơn giá, 20,0% vaccine đa giá).
36
Khảo sát tình hình bệnh Gumboro trên các giống gà nòi Bến Tre được nuôi tại tỉnh Hậu Giang do Hồ Thị Việt Thu nghiên cứu (2010), được thực hiện qua việc khảo sát dấu hiệu lâm sàng, quan sát bệnh tích và xét nghiệm bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch từ 47 đàn gà bệnh tại tỉnh Hậu Giang trong năm 2010. Kết quả cho thấy có 18 đàn gà mắc bệnh Gumboro từ 22 đàn nghi ngờ. Tỉ lệ chết từ gà mắc bệnh Gumboro là (22,3%) cao hơn gà mắc bệnh khác (18,6%). Tỉ lệ đàn nhiễm bệnh Gumboro cao nhất được ghi nhận ở những đàn gà nhỏ hơn 30 ngày tuổi (62,5%), kế đến là gà từ 30-45 ngày tuổi (53,9%) và thấp nhất là ở những đàn gà lớn hơn 45 ngày tuổi (23,1%). Bệnh thường xảy ra nhất ở các đàn không được tiêm vaccine (70,0%), kế đến là các đàn gà chỉ được tiêm vaccine một lần (62,5%)
và gà được tiêm vaccine 2 lần (28,6%). Không có sự khác biệt về tỉ lệ đàn nhiễm giữa các giống gà.
Hiệu quả của bào tử Bacillus subtilis biểu hiện interferon alpha gà (ChIFNα - B. subtilis) trong phòng bệnh Gumboro trên gà do Hồ Thị Việt Thu nghiên cứu (2012b), được thực hiện trên giống gà 3 tuần tuổi. Thí nghiệm thực hiện bằng thử nghiệm cho mỗi gà uống 100 μg bào tử ChIFNα - B. subtilis, sau đó công cường độc virus Gumboro độc lực cao với 4 x 104 ELD50, đồng thời so sánh hiệu quả của ChIFNα chẩn với liều 104UI. Kết quả thử nghiệm cho thấy ChIFNα - B. subtilis có khả năng phòng bệnh Gumboro với tỉ lệ bảo hộ là 77,1% cao hơn so với tỉ lệ bảo hộ bởi ChIFNα (66,7%) và so với đối chứng B. subtilis (12,5%). Kết quả thí nghiệm chứng minh ChIFNα - B. subtilis có tiềm năng trong việc phòng bệnh Gumboro trên gà.
Phát hiện các chủng cường độc Gumboro nguồn gốc Âu-Mỹ tại Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử qua phân tích gene VP2 do Lê Thị Kim Xuyến và Lê Thanh Hòa nghiên cứu (2008) đặc tính di truyền của hệ gene virus Gumboro có xu hướng phân chia các chủng trên thế giới thành 2 nhóm: nhóm có nguồn gốc châu Á và nhóm có nguồn gốc Âu - Mỹ. Bằng phản ứng RT-PCR, tách dòng và giải trình trình tự, toàn bộ gene VP2 (1.359 bp) của một số chủng virus Gumboro phân lập tại Việt Nam. Hai mẫu ký hiệu BDG23 (Bình Dương), GPT (Phúc Thọ) được thu nhận và phân tích thành phần gene so sánh với các chủng Gumboro khác của Việt Nam (GHUT1; GSG4; GT1ST; BDG) và thế giới, bao gồm các chủng cường độc SH92 (Hàn Quốc), HK46 (Hồng Kông), JD1 (Trung Quốc), OKYM (Nhật Bản), 52-70, D78 (Mỹ) và các chủng vaccine Gvx2512, GvxBL (Mỹ). Dựa trên qui luật biến đổi độc lực và kháng nguyên, phân tích các vị trí amio acid là nhóm quyết định kháng nguyên của protein VP2. Kết quả cho thấy, chủng GPT là một chủng cường độc mạnh cùng nhóm với các chủng khác của Việt Nam và châu Á. Trong khi đó chủng BDG23 là chủng có độc lực yếu và cùng với chủng GSG4 trước đây, đều có nguồn gốc châu Âu-Mỹ. Kết quả phân tích phả hệ cũng khẳng định tính hỗn hợp đa nguồn gốc của các chủng virus Gumboro phân lập tại Việt Nam.
37
Khảo sát sự lưu hành virus gây bệnh Gumboro ở gà trên một số địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế trong mùa Xuân-Hè năm 2011 do Phạm Hồng Sơn và ctv. (2012), nghiên cứu sử dụng phương pháp trắc định xê lệch ngưng kết gián tiếp chẩn (SSIA) để xét nghiệm các mẫu phân và dịch họng gà lấy từ gà giết mổ và gà nuôi tại các trung tâm ở một số huyện thuộc ba vùng khác nhau của tỉnh Thừa Thiên Huế trong
mùa Xuân-Hè năm 2011 kết quả là đã xác định được tỉ lệ nhiễm virus Gumboro ở phân gà xấp xỉ bằng 36%, dao động từ 30% (huyện Hương Thủy) đến 46% (huyện A Lưới), trong khi đó ở dịch họng gà tỉ lệ nhiễm virus Gumboro là 30%, dao động từ 21% (huyện Hương Thủy) đến 43% (huyện A Lưới). Tuy nhiên, tỉ lệ nhiễm virus này giữa các vùng không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê. Mặt khác, mẫu phân cho kết quả phát hiện kháng nguyên Gumboro cao hơn so với mẫu dịch họng nhưng sai khác này cũng không có ý nghĩa thống kê. Vì vậy, để xét nghiệm chẩn đoán phát hiện kháng nguyên Gumboro thì có thể sử dụng cả hai loại bệnh phẩm, nhưng mẫu phân có ưu điểm là dễ thu hơn và độ nhạy phát hiện kháng nguyên Gumboro cao hơn.
Đặc điểm dịch tễ học của bệnh Gumboro trên đàn gà tại huyện An Phú, tỉnh An Giang do Trần Ngọc Bích và Nguyễn Thị Mỹ Hiệp (2013) nghiên cứu trên 24 ổ dịch tại huyện An Phú, tỉnh An Giang, lấy huyết thanh tại các ổ dịch để xét nghiệm bằng phản ứng ELISA, qua đó thu được kết quả kiểm tra 24 ổ dịch có 9 đàn cho kết quả dương tính với virus Gumboro chiếm tỉ lệ 33,3%. Bệnh Gumboro xảy ra chủ yếu ở lứa tuổi 19 - 42 ngày chiếm (57,1%), gà ở lứa tuổi > 42 ngày có tỉ lệ mắc bệnh thấp hơn (11,1%). Gà nuôi theo hình thức thả hoàn toàn có tỉ lệ mắc bệnh Gumboro (25,0%) thấp hơn so với gà nuôi nhốt hoàn toàn (60,0%) và bán chăn thả (33,3%). Giống gà Nòi có sức đề kháng đối với bệnh Gumboro tốt hơn gà Lương Phượng.
2.4.2 Nghiên cứu ngoài nước
Bệnh Gumboro được Cosgrove phát hiện vào năm 1962 tại làng Gumboro thuộc bang Delaware (Hoa Kỳ). Đầu tiên người ta gọi bệnh là Avian Nephrosis do có bệnh tích nghiêm trọng ở thận (trích dẫn Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997).
Năm 1962, Winterfield and Hitchner tiến hành một thí nghiệm sàng lọc khẳng định đây là tác nhân gây bệnh mới – bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm. Cũng vào năm 1962, Cosgrove mô tả về bệnh Gumboro và đã phân lập được virus này trên phôi trứng từ 9 đến 10 ngày tuổi.
Năm 1970, Hitchner đề nghị chính thức gọi bệnh do Cosgrove phát hiện là bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm (Infectious Bursal Disease - IBD) hay còn gọi là bệnh Gumboro. Virus gây bệnh được gọi là virus gây viêm túi Fabricius truyền nhiễm IBDV.
38
Tại châu Âu, người ta phát hiện bệnh Gumboro khá sớm, ở Anh vào năm 1962. Năm 1966, bệnh Gumboro lần đầu tiên bùng phát ở Ý. Năm 1967, Landgraf
phát hiện bệnh ở Đức, Rigenbach tìm thấy bệnh ở Thụy Điển. Năm 1969, Maire et al., cho biết ổ dịch Gumboro đang lan tràn ở Pháp và Tây Ban Nha. Đến năm 1987 phát hiện bệnh này ở Bỉ.
Tại châu Á, năm 1966 bệnh Gumboro được phát hiện ở Israel, năm 1973 tại Thái Lan, bệnh Gumboro bắt đầu xuất hiện trên đàn gà nuôi công nghiệp. Năm 1974 tại Đài Loan, Trung Quốc dịch bệnh Gumboro xảy ra liên tiếp, tỉ lệ chết cao từ 40 – 50% (trích dẫn Nguyễn Bá Thành, 2006).
Năm 1972, Allan et al. đã công bố đặc tính gây suy giảm miễn dịch ở gà con của virus Gumboro. Mc Ferran et al. (1980), thông báo về sự tồn tại của serotype 2 và việc phát hiện các biến chủng của serotype 1 ở vùng chăn nuôi gà công nghiệp tại vùng Delmarva, làm cho việc khống chế bệnh trở nên phức tạp hơn. Các biến chủng đã gây bệnh cho đàn gà có kháng thể thụ động kháng virus Gumboro chẩn và khác với các chủng chẩn về đặc tính sinh học (Rosenberger and Cloud, 1986).
Vào năm 1986 bệnh xuất hiện tại châu Phi, theo Abdu et al. (1986) cho biết dịch bệnh Gumboro xảy ra quanh năm ở Nigeria. Năm 1988, Gaffa Elamin et al. đã phát hiện bệnh ở Sudan. Tại Úc vào năm 1974, Firth thông báo có dấu hiệu của bệnh truyền nhiễm túi Fabricius xảy ra trong một đàn gà ở Australia. Vào năm 1988 trường đại học Georgia (Mỹ) đã phân lập được 2 chủng mới của serotype 1 ở gà thịt mà tính kháng nguyên khác với serotype điển hình (Standard IBD virus). Hai chủng mới phân lập này gây teo túi Fabricius trong vòng 3 ngày và gây ức chế miễn dịch mà không có triệu chứng lâm sàng rõ ràng (trích dẫn Nguyễn Bá Thành, 2006).
Vào đầu thập niên 1990, bệnh xảy ra ở Nhật với thể cấp tính, sau đó lây lan nhanh khắp châu Á và nhiều nơi trên thế giới (Eterradossi et al., 1992; Nunoya et al., 1992; Lin et al., 1993). Theo Hirai (1979), tại Nhật Bản khi kiểm tra huyết thanh đàn gà không chủng ngừa vaccine Gumboro có đến 60% có kháng thể kháng virus Gumboro.
39
Năm 1989, Adewuyi et al. kiểm tra huyết thanh của gà nhập từ Nhật được bán tại các thị trường Nigeria có 44,3% số mẫu có phản ứng dương tính với kháng nguyên virus Gumboro. Năm 1991, các nhà nghiên cứu đã công bố dịch và phân lập được virus cường độc Gumboro từ những gà nghi bệnh tại Ai Cập, Malaysia, Kenia, Singapore. Đến năm 1992, các nước Buhtan, Burundi, Kuwait… cũng công bố có bệnh Gumboro. Châu Mỹ là nơi đầu tiên phát hiện bệnh nhưng theo thông báo của tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) tình hình dịch bệnh ở châu lục này không dữ dội, rất ít nước báo cáo phát hiện thấy bệnh Gumboro. Năm 1992, OIE đã công bố
chính thức tên bệnh, mầm bệnh, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích, các phương pháp chẩn đoán và phòng chống bệnh Gumboro (trích dẫn Nguyễn Bá Thành, 2006).
Theo Thierry (2000) nghiên cứu tính phức tạp và tính đa dạng, nguồn gốc của IBDV. Các amino acid trong vùng biến đổi của protein virus VP2 là cơ sở phân tử của sự biến đổi kháng nguyên, xác định tính gây bệnh và được xem là những điểm đánh giá tiến hóa thông thường. Sinh bệnh học của bệnh vẫn còn chưa được hiểu rõ và tế bào bạch cầu có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự xuất hiện của bệnh và trong sự phát triển của miễn dịch. Các cơ chế như chết tự nguyện và hoại tử đã được mô tả trong các cơ quan bạch huyết và có liên quan đến độc lực của bệnh. Các đại thực bào có thể đóng một vai trò trong giai đoạn cấp tính.
Đặc điểm của một số chủng virus IBDV gây bệnh ở Indonesia do Rudd et al. (2002) nghiên cứu được gọi là Tasik94, được mô tả cả về đặc điểm bệnh tích và mức độ phân tử. Tiêm chủng virus Tasik94 vào gà sạch bệnh lúc 5 tuần tuổi cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh là 100% và tỉ lệ tử vong là 45%. Giải trình tự nucleotide hoàn chỉnh và dự đoán trình tự amino acid của phân đoạn gene Avà B. Trên mỗi khung đọc mở (ORFs), Tasik94 cho thấy tính đồng nhất nucleotide lớn nhất đối với dòng D6948 của Hà Lan. Phân tích cây phả hệ cho thấy 105 điểm biến đổi VP2 từ các vùng địa lý và các chủng gây bệnh khác nhau. Trong các trường hợp, Tasik94 tập hợp chặt chẽ với các chủng độc lực cao, đặc biệt là từ châu Âu. Các trình tự protein VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 của Tasik94 phù hợp với các dòng đã được công bố và các yếu tố quyết định độc lực giả định được xác định trong VP2, VP3 và VP4. Việc sắp xếp các trình tự protein bổ sung trên vùng khuếch đại VP2 đã cho thấy các điểm đột biến 242, 256 và 294 đã được bảo tồn rất cao trong số các chủng độc lực cao và có thể giải thích cho tính độc lực của chúng.
40
So sánh các chủng IBDV được phân lập từ các loài gia cầm khác nhau do Wang et al. (2007) nghiên cứu từ 4 chủng IBDV được phân lập từ gà, vịt, ngỗng và chim sẻ tại tỉnh Giang Tô của Trung Quốc. Các virus này tồn tại ở 60°C trong 1 giờ, pH = 2,0 và trong các dung môi lipid. Giá trị kháng nguyên của chúng (R) dao động từ 0,76 đến 0,78. Gà bị nhiễm chủng virus phân lập từ ga cho thấy các triệu chứng lâm sàng nặng của IBD và tỉ lệ tử vong là 33,3%. Gà bị nhiễm virus từ 3 chủng phân lập từ vịt, ngỗng, chim sẽ còn lại vẫn sống nhưng bị tổn thương nặng hơn so với những con không nhiễm bệnh (p <0,01). Các trình tự của vùng biến đổi của VP2 đã được sắp xếp và so sánh, cho thấy các biến đổi nucleotide dao động từ 1,5 đến 6,7% và biến đổi amino acid từ 0,8 đến 2,2%. Tất cả đều có cùng heptapeptide, S-W-S-A-S-G-S, Asp279 và Ala284. Những kết luận này cho thấy
các loài chim khác bị nhiễm IBDV tự nhiên có thể đóng vai trò như là vật chủ tự nhiên trong việc lây truyền IBDV và có thể đóng một vai trò trong sự nổi trội của biến thể IBDV.
Nghiên cứu bệnh IBD cấp tính ở gia cầm, khi so sánh các trình tự gây độc lực cao và thấp do Lazarus et al. nghiên cứu năm 2008 cho thấy 7 nucleotide khác nhau, 4 trong số đó dẫn đến sự thay đổi trình tự amino acid. So sánh trình tự protein của các chủng này và các trình tự được công bố của chủng độc lực cao và thấp đưa đến gợi ý về sự khác biệt gây ra độc lực của các dòng virus ở Israel là: 272 (VP2) và 527 (VP4) cả đoạn A và B (VP1) 96 và 161. Nghiên cứu cho thấy có nhiều hơn một protein có liên quan đến sự suy giảm độc lực IBDV. Trong tất cả các báo cáo, độc lực đã được giảm mà không ảnh hưởng đến tính kháng nguyên của các nhóm quyết định kháng nguyên trung hòa trong VP2. Điều này, có thể có ý nghĩa thực tế đối với việc phát triển vaccine nhược độc.
Theo Alkhalaf (2009) về tình trạng nhiễm IBDV trên đàn gà thịt ở Saudi Arabia từ năm 2007 – 2008 trên 2 hình thức chăn nuôi công nghiệp và bán công nghiệp. Đối với hình thức chăn nuôi công nghiệp (qui mô đàn 5.000 – 15.000 con) gà được phòng vaccine IBD cổ điển ở 14 ngày tuổi bằng đường uống, chăn nuôi bán công nghiệp (qui mô đàn 200 – 300 con) quy trình tiêm phòng của những đàn gà này không được biết. Nghiên cứu cho thấy tuổi gà nhiễm bệnh IBD dao động từ 2 đến 8 tuần, trong đó gà Lương Phượng nhiễm bệnh Gumboro có tỉ lệ chết cao, các triệu chứng hô hấp, còi cọc và túi Fabricius sưng. IBDV được chẩn đoán dựa trên các triệu chứng lâm sàng và kết quả mổ khám, mặc dù những đàn gà này đã được tiêm vaccine phòng bệnh IBD. Để chứng minh kết quả chẩn đoán và xác định tác nhân gây bệnh, bằng phản ứng hấp thu miễn dịch kết hợp enzyme chụp-enzyme (AC- ELISA) sử dụng bộ dụng cụ có chứa kháng thể đơn dòng chống lại các chủng biến thể của IBDV được tiến hành trên 142 mẫu Gumboro thu thập từ các gà bị bệnh. Kết quả, có 61,2% mẫu dương tính trong đó chủng vaccine cổ điển (54,0%) cao hơn các chủng ít gây bệnh (không được phòng bằng vaccine) (29,9%) và các dòng IBDV biến đổi (16,1%)
41
Đặc điểm phân tử của gene VP2 của IBDV phân lập từ một trang trại trong vòng 20 năm do Yinju Li et al. (2009) nghiên cứu để kiểm tra mối quan hệ phát sinh loài của 25 mẫu phân lập từ một trang trại trong giai đoạn 1989 – 2008. Phân tích bằng kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gene 714 bp của VP2 cho thấy tất cả các mẫu đều có nguồn gốc từ IBDV độc lực cao (vvIBDV) và có liên quan chặt chẽ hơn với chủng UK661. Từ năm 1999, phân lập được chủng XA1999 có các amino
acid I228 và các chủng T394, XA2000, XA2001, XA2002, và XA2003-09 có các amino acid E279. Từ năm 2004 đến năm 2008, các phân lập có các amino acid H320, I349, S375 và R381 trong khi đó virus UK661 có T228, D279, Q320, V349, P375, K381, và A394. Những đột biến này không làm thay đổi amino acid quan trọng cần thiết quy định độc lực của virus. Nó cho thấy một dòng IBDV độc lực cao có thể duy trì độc lực của nó trong một thời gian dài trong cùng một trang trại gà và tồn tại rất lâu trong môi trường bình thường.
Tổng quan về bệnh IBD do Hebata (2012) nghiên cứu về tình hình bệnh do IBDV và các biện pháp phòng bệnh khác nhau đã được thử nghiệm thực tế. So với các vaccine sống nhược độc và vaccine chết thì vaccine tái tổ hợp đã chứng minh thành công trong việc bảo hộ chống lại IBDV, tùy thuộc vào đường dùng, hàm lượng hoặc hiệu giá của vaccine và liều gây độc của virus. Trong khi chế độ tiêm vaccine sử dụng vaccine chết bắt đầu lúc 14 ngày tuổi (trong trường hợp có sự hiện diện của kháng thể thụ động từ mẹ), vaccine DNA có thể được sử dụng sớm hơn mà không bị ảnh hưởng bởi kháng thể thụ động từ mẹ. Ngoài ra, vaccine tái tổ hợp có thể bảo vệ chống lại nhiều tác nhân gây bệnh (thông qua việc chèn các gene gây miễn dịch cụ thể của chúng trong cấu tạo vaccine), tiết kiệm chi phí lao động, chi phí tiêm vaccine và áp lực thời gian tiêm phòng.
42
Các đặc tính phân tử và phân tích tiến hoá của virus IBDV do Li Zan et al. (2015) nghiên cứu dựa trên protein virus (VP2), protein cấu trúc chính của IBDV, gây ra đột biến dẫn đến sự đa dạng di truyền. Để xác định sự đột biến của amino acid có thể ảnh hưởng đến độc lực của IBDV, xây dựng mô hình cấu trúc VP2 của một chủng IBDV rất độc hại tại Trung Quốc, chủng Gx (vvIBDV) đã được thực hiện mô phỏng động lực học phân tử về sự tương tác giữa các điểm độc lực. Nghiên cứu chỉ ra rằng sự thay thế amino acid của đầu ưa nước từ IBDV làm suy yếu (H253Q và T284A) tạo ra hình dạng và linh hoạt của vòng lặp β-barrel trong VP2, có thể thúc đẩy sự tương tác giữa virus và các receptor IBDV tiềm năng. Phân tích chuỗi các dòng IBDV phổ biến ở Đông Á cho thấy sự tương đồng tại các điểm biến đổi ở vị trí 253 và 284. Những kết quả này cho thấy những thay đổi về độc lực của IBDV có thể là kết quả của cả sự tương tác lẫn sự tiến hóa thay thế amino acid ở các điểm độc lực của VP2.
3.1 Nội dung, thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu tình hình bệnh Gumboro trên gà tại ĐBSCL.
Mục tiêu là khảo sát hộ/trại chăn nuôi về tình hình dịch bệnh Gumboro trên gà với các chỉ tiêu như giống gà, lứa tuổi, số lần sử dụng vaccine, hình thức chăn nuôi, số gà chết,… Khảo sát một số triệu chứng – bệnh tích lâm sàng trên đàn gà nghi bệnh.
Nội dung 2: Nghiên cứu đặc điểm di truyền virus Gumboro được phân lập tại
ĐBSCL.
Mục tiêu là xác định độc lực của Virus gây bệnh Gumboro, so sánh gene mã hóa vùng VP2 với ngân hàng gene (gene bank) và chủng vaccine có trên thị trường, từ đó xây dựng cây phả hệ của các mẫu virus thực địa.
Nội dung 3: Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của 3 loại vaccine Gumboro được lựa chọn từ kết quả ở nội dung 2 trên 2 giống gà nòi Bến Tre và gà Lương Phượng
Mục tiêu là khảo sát tỉ lệ đáp ứng miễn dịch thụ động mẹ truyền giữa 2 giống gà, đánh giá tỉ lệ đáp ứng miễn dịch giữa các lần tiêm vaccine và sự khác biệt đáp ứng miễn dịch giữa 2 giống gà với 3 chủng vaccine và số lần tiêm phòng vaccine.
3.1.2 Thời gian nghiên cứu: từ 10/2015 đến 10/2018
3.1.3 Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại 6 tỉnh/ thành phố của ĐBSCL là Bến Tre, Hậu Giang, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Trà Vinh. Về chăn nuôi gia cầm, các địa phương này rất phát triển cả hai hình thức chăn nuôi là nuôi gà công nghiệp ở các trang trại lớn và gà thả vườn ở nông hộ. Các tỉnh này tương đối tiêu biểu cho chăn nuôi gia cầm ở các tỉnh ĐBSCL.
Địa điểm lưu trữ và xét nghiệm mẫu bệnh phẩm, huyết thanh gà tại Bộ môn
Thú y, Khoa Nông Nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ.
Địa điểm thực hiện RT – PCR tại viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội.
Địa điểm phân tích trình tự gene VP2 của virus Gumboro thực địa tại công ty
43
Macrogen Hàn Quốc.
Địa điểm bố trí thí nghiệm khảo sát đáp ứng miễn dịch của 3 chủng vaccine
Gumboro trên 2 giống gà (nòi Bến Tre và Lương Phượng) tại tỉnh Đồng Tháp.
3.2 Phương tiện nghiên cứu
3.2.1 Thiết bị
Dụng cụ: túi đựng mẫu, ống tiêm y tế 3 ml, bông gòn, găng tay, khẩu trang, ống nghiệm vô trùng, giá đựng ống nghiệm, thùng bảo quản lạnh, tybe nhựa đựng huyết thanh, micropipete, ống falcon, kéo, dao mổ, găng tay.
Một số thiết bị quan trọng phục vụ công tác nghiên cứu gồm: tủ lạnh trữ mẫu (Toshiba, Nhật), tủ -20oC, tủ -80oC (Acson, Nhật), máy lắc mẫu (Velp ZX3, Nhật), cân phân tích (Sartorius –TE214S, Nhật), máy quang phổ UV-VIS (Thermo Scientific, Mỹ), máy ly tâm (Chibitan II, Nhật), máy PCR (Cleaver Scientific, Anh), bộ điện di một chiều (Bio-Rad, Mỹ, máy ghi nhận và phân tích kết quả điện di ENDURO GDS (Labnet, Mỹ).
3.2.2 Hóa chất
Hóa chất sử dụng cho RT-PCR: chiết tách ARN bằng bộ Kit RNeasy Mini Kit 250 của QIAgen, MyTagTM Mix, dNTPs, Taq-polymerase, dung dịch đệm, agarose, ethidium bromide, PCR water không chứa enzyme Dnase, Rnase (Công ty Bioline, Anh); 100bp DNA ladder, mồi xuôi, mồi ngược (Công ty Promega, Mỹ).
Bộ kit sử dụng cho ELISA trực tiếp là IBDV Ag Test của công ty Thời Đại
Xanh xuất xứ từ Bỉ.
Hóa chất sử dụng cho ELISA gián tiếp: Dung dịch sinh lý 0,85%, nước cất,
ELISA kit của công ty Thịnh Á. Thành phần bộ kit (Bảng 3.1).
Bảng 3.1: Thành phần bộ kit ELISA gián tiếp
Đĩa 96 giếng
1
5
Đối chứng dương IBD
2
1,9 ml
Đối chứng âm IBD
3
1,9 ml
Kháng nguyên gà
4
50 ml
Dung dịch pha loãng mẫu
5
253 ml
Dung dịch TMB
6
60 ml
Dung dịch Stop
7
60 ml
44
3.2.3 Đối tượng nghiên cứu
3.2.3.1 Nội dung 1:
- Khảo sát các đàn gà được nuôi tại các tỉnh/ thành phố Bến Tre, Hậu Giang, An
Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Trà Vinh.
- Phiếu điều tra thông tin trên đàn gà nghi bệnh (phụ lục 3) - Biên bản mổ khám (phụ lục 4). - Số lượng mẫu điều tra: 131 đàn gà.
3.2.3.2 Nội dung 2:
- Mẫu bệnh phẩm túi Fabricius đã được thu thập trên đàn gà nghi mắc bệnh
Gumboro (nội dung 1).
- Trình tự Nucleotide gene VP2 của virus Gumboro thu thập tại 6 tỉnh/thành phố
Bến Tre, Hậu Giang, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Trà Vinh.
3.2.3.3 Nội dung 3:
Gà thí nghiệm được nuôi tại hộ gia đình thuộc tỉnh Đồng Tháp. Giống gà nòi Bến Tre 1 ngày tuổi được mua tại lò ấp địa phương. Giống gà Lương Phượng 1 ngày tuổi được mua của Công ty TNHH Nông Nghiệp Trí Việt. Gà giống đã tiêm phòng bệnh Marek trước khi đóng thùng bán cho người chăn nuôi. Gà trong thí nghiệm được nuôi nhốt hoàn toàn, đảm bảo vệ sinh môi trường trong chăn nuôi, nguồn dinh dưỡng được đảm bảo, chăm sóc và tiêm phòng đúng theo quy định.
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp khảo sát hộ/trại chăn nuôi về tình hình dịch bệnh
Gumboro trên gà
Chăn nuôi gà ở 6 tỉnh khảo sát là chăn nuôi nhỏ ở hộ gia đình và chăn nuôi trang trại. Thực tế, các hộ gia đình được khảo sát trong nghiên cứu này có quy mô đàn từ 50-180 con và chăn nuôi trang trại có quy mô đàn từ 2.000 - 5.000 con.
45
Các giống gà khảo sát chủ yếu là Nòi lai, Tàu vàng, Bình Định, Lương Phượng theo 3 hình thức chăn nuôi chủ yếu là thả hoàn toàn, bán chăn thả và nhốt hoàn toàn. Hình thức nuôi thả hoàn toàn là hình thức nuôi lâu đời, đàn gà nuôi thả lan và tận dụng nguồn thức ăn tự nhiên trong sân vườn, không có chuồng trại kiên cố. Hình thức bán chăn thả là hình thức kết hợp vừa nuôi nhốt vừa thả vườn trong giới hạn nhất định, có chuồng nuôi kiên cố cho đàn gà nghỉ ngơi và có khu vực sân vườn xung quanh chuồng nuôi cho gà tự do vận động, ra vào. Hình thức nuôi nhốt
hoàn toàn là hình thức chăn nuôi tập trung, nuôi nhốt hoàn toàn theo hình thức chuồng trại nghiêm ngặt, gà được chăm sóc và nuôi dưỡng theo quy trình.
Khảo sát các hộ và trại chăn nuôi gà về tình hình dịch bệnh Gumboro trên gà tại các tỉnh/ thành phố: Bến Tre, Hậu Giang, An Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ, Trà Vinh (Bảng 3.2). Ghi nhận ngẫu nhiên 131 đàn gà có dấu hiệu nhiễm bệnh Gumboro tại các tỉnh. Các chỉ tiêu khảo sát: Giống gà, lứa tuổi, số lần sử dụng vaccine, hình thức chăn nuôi, số gà chết, …. (Phụ lục 3).
Bảng 3.2: Số lượng đàn gà khảo sát tại các tỉnh ĐBSCL
STT Tỉnh Số đàn
1 Bến Tre 26
2 Hậu Giang 15
3 Cần Thơ 14
4 Trà Vinh 19
5 Vĩnh Long 28
6 An Giang 29
Tổng 131
3.3.2 Phương pháp khảo sát một số đặc điểm triệu chứng và bệnh tích
đặc trưng trên đàn gà nghi bệnh
Thu thập thông tin: Khi được thông báo là có dịch bệnh xảy ra tiến hành ghi chép những thông tin liên quan đến đàn gà nghiên cứu thông qua phiếu khảo sát (Phụ lục 3). Trước khi mổ khám ghi nhận tất cả các dấu hiệu về thể trạng, triệu chứng sau đó tiến hành mổ khám ghi nhận bệnh tích (Phụ lục 4). Những gà được kết luận nghi mắc bệnh Gumboro là những gà có triệu chứng và bệnh tích như: gà ủ rũ, rút mỏ vào cánh, có khi gục sang một bên, thích nằm, mắt lim dim mỏi mệt và thường dồn về một góc chuồng, gà kém ăn hoặc bỏ ăn, uống nhiều nước, mất định hướng, đi phân trắng, loãng hoặc toàn nước có khi lẫn máu, túi Fabricius sưng hoặc xuất huyết, cơ ngực hoặc cơ đùi xuất huyết, …
46
Phương pháp mổ khám: Làm chết gà bằng cách cắt cổ hoặc hủy não (đâm kim vào lỗ hõm ở sau gáy). Đặt gà ở tư thế nằm ngữa cắt hai bên da bẹn, bẻ lật khớp háng qua hai bên để ổn định gà. Dùng kéo cắt da phía trên hậu môn lột ngược lên trên sau đó lột tiếp da ở hai bên đùi để kiểm tra tình trạng xuất huyết cơ dưới
da. Dùng kéo cắt cơ ở thành bụng sau đó cắt lên hai bên xương sườn đến hết lòng ngực, lật ngược lên để quan sát bệnh tích trên các cơ quan nội tạng. Dùng kéo cắt dọc từ khóe miệng đến diều để quan sát bệnh tích ở hầu, họng, thực quản. Tiến hành lấy mẫu bệnh phẩm (túi Fabricius và mẫu phân) để xét nghiệm (Phụ lục 4).
Cách lấy, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm nghi bệnh: Khi khảo sát đàn gà bệnh chọn những gà có triệu chứng bệnh tích điển hình của bệnh Gumboro từ những con đã mổ khám để lấy túi Fabricius và mẫu phân. Mẫu được cho vào túi nylon sạch, mã hóa và đặt trong bình trữ lạnh trong lúc mang về phòng thí nghiệm. Sau khi mang về phòng thí nghiệm mẫu được bảo quản ở -80oC cho đến khi thực hiện xét nghiệm.
3.3.3 Phương pháp xét nghiệm chẩn đoán virus Gumboro
Kiểm tra lâm sàng những đàn gà nghi bệnh Gumboro tiến hành lấy mẫu phân để xét nghiệm bằng kit IBDV Ag Test của công ty Thời Đại Xanh xuất xứ từ Bỉ (Hình 3.1).
Hình 3.1: Bộ kít thử IBDV Ag Test
Cách thực hiện (Hình 3.2):
- Bước 1: Lấy mẫu phân bằng tăm bông vô trùng. - Bước 2: Hòa tan mẫu bệnh phẩm trong dung dịch chất pha loãng khoảng
10 giây.
- Bước 3: Nhỏ mẫu bệnh phẩm sau khi pha loãng vào vị trí chữ “S” của kit thử,
để yên trong 5-10 phút.
- Bước 4: Đọc kết quả xét nghiệm trong khoảng thời gian từ 5-10 phút kể từ khi
47
nhỏ mẫu vào bộ kit.
Hình 3.2: Quy trình thực hiện lấy mẫu phân và kiểm tra kết quả
- Bước 5: Đọc kết quả (Hình 3.3):
Mẫu dương tính Mẫu âm tính
Hình 3.3: Đọc kết quả bộ kit thử IBDV Ag Test
Âm tính: chỉ xuất hiện vạch chứng “C”.
Dương tính: xuất hiện cả vạch mẫu “T” và vạch chứng “C”.
Dương tính giả: cả hai vạch mẫu “T” và vạch chứng “C” đều không xuất hiện
hay hiện màu không rõ ràng hoặc chỉ có vạch mẫu “T” xuất hiện.
Kết quả xét nghiệm có thể được biểu lộ qua sự xuất hiện các vạch C và T theo
nguyên lý của “phương pháp sắc ký miễn dịch” (immunochromatography).
Những chú ý khi sử dụng kít:
- Chỉ sử dụng với mục đích chẩn đoán virus Gumboro. - Sử dụng trong vòng 10 phút sau khi tháo bỏ bao chứa vì kít xét nghiệm rất nhạy
cảm với ẩm độ và hiệu lực có thể giảm sút.
- Cần thận trọng không được chạm vào “cửa sổ kết quả”. - Phải sử dụng các ống nhỏ giọt khác nhau cho mỗi mẫu xét nghiệm. - Mỗi lần xét nghiệm, phải sử dụng chất pha loãng riêng. - Cần xử lý mẫu xét nghiệm cẩn thận tránh vấy nhiễm virus, vi khuẩn lạ. - Nên dùng găng tay trong quá trình sử dụng bộ kít. - Không được sử dụng thiết bị xét nghiệm khi bao chứa bị rách, đóng gói không
48
đúng quy cách và hết hạn sử dụng.
3.3.4 Phương pháp xác định gene VP2 của virus Gumboro thu thập tại
thực địa
Bước 1: Chọn và lấy mẫu: Túi Fabricius có kích thước bằng hạt đậu (tùy tuổi gà), có cấu tạo hình múi khế, nằm ngay dưới hậu môn. Ở gà bị bệnh Gumboro, đây là cơ quan chứa nhiều virus nhất, có bệnh tích đặc trưng là túi sưng to, mủn, có nhiều dịch thẩm xuất màu vàng sáng đọng ở giữa túi và màng bọc ngoài, khi cắt ra có thể có xuất huyết điểm trên niêm mạc của túi.
Mẫu bệnh phẩm
Tách chiết RNA
Tổng hợp cDNA
Phản ứng PCR
Điện di
Hình 3.4: Các bước thực hiện phản ứng RT-PCR
Bước 2: Chiết Tách ARN tổng số từ các mẫu được thu thập (Hình 3.4)
- Nghiền các mẫu trên bằng nitơ lỏng; thêm 500 µl H2O được huyễn dịch
mẫu.
- Tiến hành chiết tách ARN bằng bộ Kit RNeasy Mini Kit 250 của QIAgen
theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
+ 350 µl RLT working + 150 µl mẫu, lắc đều.
+ Thêm 350 µl Ethanol 70%, lắc đều.
+ Chuyển cột, ly tâm 10.000 vp/1’, bỏ dịch.
+ Thêm 700 µl RW1, ly tâm 10.000 vp/1’, bỏ dịch.
+ Thêm 500 µl RPE working, ly tâm 10.000 vp/1’, bỏ dịch.
+ Ly tâm 13.000 vp/2’, bỏ dịch.
+ Thêm 30 µl H20, để to phòng 2’, ly tâm 13.000 vp/2’, bỏ cột.
49
- Ký hiệu mẫu: theo địa phương lấy mẫu bệnh phẩm Gumboro.
- Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng RT-PCR là: Mồi xuôi GVF: 5’ CAAACGATCGCAGCGATGACAAACCTGCAAGAT 3’ và mồi ngược GVR: 5’ GGCTTCAAAGACATAATTCGGGCC 3’. Khuếch đại đoạn gene của vùng "siêu biến đổi", cho độ dài khoảng 0.47 kb (Hình 3.5) (Lê Thanh Hòa, 2003c). Phản ứng được thực hiện qua 2 giai đoạn:
Hình 3.5: Vị trí VP2 trong phân đoạn A của hệ gene virus Gumboro và vùng siêu biến đổi làm đích nhân bản gene của phản ứng PCR (Lê Thanh Hòa, 2003c)
Bước 3: Chuyển c.DNA các mẫu ARN trên bằng bộ Kit của Themor
- Thành phần:
Thành phần Thể tích
10X dsDNase Buffer 1 µl
1 µl ds Dnase
5 µl ARN TS
3 µl Nước Kit
10 µl Tổng
Mix nhẹ nhàn, ly tâm. Ủ 37oC/2 phút, đặt đá
50
- Tiếp tục thêm:
Thành phần Thể tích
5X Reaction Mix 4 µl
E. Maximar 2 µl
Nước Kit 4 µl
20 µl Tổng
Mix nhẹ nhàn, ly tâm
- Chu trình nhiệt
Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
1 25oC 10 phút
1 50oC 30 phút
1 85oC 05 phút
4oC Nhiệt độ bảo quản sản phẩm
Bước 4: Thực hiện phản ứng PCR từ khuôn c. DNA
- Thành phần:
Thể tích Thành phần
25 µl Dream Taq PCR Mastermix
1 µl P1 (10 pmol/µl)
1 µl P2 (10 pmol/µl)
2 µl DMSO
5 µl Khuôn c.DNA
16µl Nước của bộ Kit đi kèm tương ứng
50 µl Tổng
51
- Chu trình nhiệt
Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
5 phút 1 940C
1 phút 940C
1 phút 650C 35
2 phút 720C
10 phút 1 720C
40C Nhiệt độ bảo quản sản phẩm
Bước 5: Điện di kiểm tra trên gel agarose
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2%, ở 75V trong 50 phút để phân tích kết quả. Phương pháp điện di trên gel agarose để kiểm tra sự khuếch đại đoạn gene thành công.
Chuẩn bị gel agarose: Chuẩn bị khuôn gel có gắn lược. Nấu tan hoàn toàn hỗn hợp gel 2% (2gam agarose/100ml dung dịch TAE 1X) lắc nhẹ (tránh tạo bọt khí khi lắc), để nguội khoảng 60oC. Đổ vào khuôn gel đã chuẩn bị, chờ gel đông hẳn. Đổ 1 lớp mỏng dung dịch điện di TAE 1X lên bề mặt gel sau đó nhẹ nhàng rút lược ra. Gel này phải qua bước nhuộm BET (EthiumBromide 10 mg/ml).
Thực hiện quá trình điện di: Chuẩn bị gel có số giếng bằng với số mẫu, thêm 1 giếng cho thang chuẩn, một giếng cho mẫu đối chứng âm và các mẫu vaccine được xem như giếng đối chứng dương. Đổ ngập bản gel dung dịch TAE 1X. Cho vào mỗi giếng trên đĩa nạp mẫu hoặc giấy parafilm 7µl sản phẩm hoặc thang chuẩn và 3µl dịch nạp mẫu. Trộn đều, nạp hết vào các giếng trên gel. Chạy điện di với hiệu thế 50V trong 5 phút, sau đó tăng lên 80V trong 45 phút. Nhuộm gel trong BET trong 30 phút. Ghi nhận và phân tích kết bằng máy ENDURO GDS (Labnet)
3.3.5 Phương pháp giải trình tự Nucleotide gene VP2 và xác định độc lực
của virus gây bệnh Gumboro
52
Sau khi xác định gene VP2 của virus Gumboro thu thập tại thực địa, tiến hành chọn 10 mẫu virus Gumboro có chất lượng tốt, băng DNA sáng, đơn băng (đánh dấu ký hiệu đại diện cho từng tỉnh/ thành phố) để phân tích sự tương đồng di truyền
gene VP2. Trình tự gene VP2 của virus Gumboro thực địa được giải trình tự tại công ty Macrogen Hàn Quốc. Các chuỗi nucleotide gene VP2 được sắp xếp so sánh bằng chương trình GENEDOC2.7 (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/).
Hình 3.6 Quy luật biến đổi epitope: cường độc -> độc lực yếu -> nhược độc
và ngược lại (Lê Thanh Hòa, 2003c)
Quy luật biến đổi amino acid của gene kháng nguyên VP2 xảy ra ở 9 vị trí có biến đổi amino acid khung bao gồm: vị trí 222, 242, 253, 256, 279, 284, 294, 299, và 329 của protein VP2 (Kibenge et al., 1990). Dựa trên thành phần amino acid tại 9 vị trí của các chủng Gumboro thu tại thực địa, so sánh được phân chia thành 3 phân nhóm theo độc lực của IBDV (Hình 3.6).
3.3.6 Phương pháp so sánh và xây dựng cây phả hệ của các mẫu virus thực địa với ngân hàng gene (genbank) và các chủng vaccine sử dụng phổ biến tại ĐBSCL
53
Truy cập vào Ngân hàng gene để thu nhận thông tin về các chủng virus Gumboro đã được công bố ở Việt Nam và thế giới (Bảng 3.3), các chủng vaccine phổ biến tại ĐBSCL.
Bảng 3.3: Danh sách các chủng virus Gumboro và vaccine trong ngân hàng gene sử dụng phân tích so sánh trong nghiên cứu
TT Ký hiệu Số đăng kí Năm *Nước phân lập Phân nhóm
chủng phân lập độc lực
Ngân hàng gene
1 GTN FJ842498 2003 Việt Nam vv
2 GHUT12 FJ842493 2003 Việt Nam vv
3 GPT FJ842495 2002 Việt Nam vv
4 GT1ST DQ355815 2003 Việt Nam vv
5 GTG25 DQ355818 2003 Việt Nam vv
6 GTG FJ842499 2003 Việt Nam vv
7 HuN11 LM651367 Trung Quốc vv
8 YS07 FJ695138 2007 Trung Quốc vv
9 9109 AY462027 2001 Hoa Kỳ av
10 variantE AF133904 Hoa Kỳ av
11 GLS AY368653 Hoa Kỳ av
12 IM AY029166 Hoa Kỳ av
13 STC D00499 Hoa Kỳ av
14 Cu-1wt AF362747 Đức av
15 HN04 KC109816 2011 Trung Quốc at
16 D78 AF499929 Luxembourg at
17 HZ2 AF321054 1997 Trung Quốc at
18 JD1 AF321055 1997 Trung Quốc at
19 903-78 JQ411012 1978 Hungary at
54
20 IBD BLEN AY332560 Hoa Kỳ av
TT Ký hiệu Số đăng kí Năm *Nước phân lập Phân nhóm
chủng phân lập độc lực
Ngân hàng gene
21 BUR-706 EU544156 Brazil at
22 Cevac EU544158 Hungary at
23 Georgia KF573194 Ấn Độ at
vv: very virulent (siêu cường độc/độc lực rất cao); av: antigenic variant (biến đổi kháng nguyên/độc lực thay đổi) và at: attenuated (nhược độc)
24 Nobilis AJ586966 Hà Lan av
Trong quá trình điều tra khảo sát các loại vaccine dùng phổ biến tại hộ chăn nuôi là IBD Blen, Bur 706, Ceve Gumboro, Georgia, Nobilis, do đó vaccine được dùng trong nghiên cứu:
- Vaccine 1: IBD BLEN của MERIAL – Mỹ - Vaccine 2: BUR 706 của MERIAL – Pháp - Vaccine 3: Cevac Gumboro L của Hungary - Vaccine 4: Georgia của Ấn Độ - Vaccine 5: Nobilis của MSD – Hà Lan
Kết quả phân tích trình tự nucleotide của gene VP2 thu thập tại thực địa được so sánh tương đồng di truyền với các gene VP2 của virus Gumboro trong cơ sở dữ liệu ngân hàng gene thuộc Trung tâm quốc gia về Thông tin Công nghệ Sinh học của Mỹ (NCBI: National Center for Biotechnology Information) bằng chương trình (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch). BLAST Phần mềm MEGA 6.0 được sử dụng để xây dựng cây phả hệ di truyền, sử dụng phương pháp “tiếp cận cực đại” (Maximum likelihood), với hệ số kiểm định tin tưởng bootstrap là 1000 lần lặp lại (Kumar et al., 2016).
3.3.7 Phương pháp khảo sát đáp ứng miễn dịch của 3 loại vaccine
Gumboro trên 2 giống gà nòi Bến Tre và Lương Phượng
3.3.7.1 Chuồng trại thí nghiệm
55
Chuồng nuôi gà là kiểu chuồng đất, diện tích 3,5 m2 được chuẩn bị trước khi thả giống. Nền chuồng được phủ một lớp cát dày khoảng 20 cm, lớp độn chuồng bằng trấu dày khoảng 15 – 20 cm, mái chuồng được làm bằng lá dừa nước, xung
quanh chuồng được rào bằng lưới B40 kiên cố, có bạt che kín để tránh gió lùa, có hệ thống đèn máng ăn, máng uống cho gà (Hình 3.7). Chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi được sát trùng trước khi đưa gà vào thí nghiệm.
Hình 3.7: Bố trí ô chuồng thí nghiệm
3.3.7.2 Qui trình chăm sóc nuôi dưỡng gà
Gà từ 1 ngày tuổi đến 3 tuần tuổi được nuôi tại chuồng úm, mỗi chuồng úm sử dụng một bóng đèn tròn có công suất 65 W. Xung quanh chuồng được che kín cẩn thận để tránh mưa tạt, gió lùa, phía dưới nền được rải lớp trấu dày 15 - 20 cm. Từ tuần thứ 4 gà không còn nuôi úm, cho ăn uống tự do, vệ sinh chuồng trại.
Bảng 3.4: Mật độ gà phân bố theo tuần tuổi
1 – 2
50
2 – 3
35
3 – 4
25
4 – 5
20
5 – 6
15
6 – 7
10
8 – 12
10
56
Gà được cho ăn uống tự do bằng thức ăn công nghiệp, bổ sung thêm vitamin C, Neo-sulfazyme, phòng bệnh cầu trùng. Nguồn nước cho gà uống là nước máy,
nước được khử trùng và chứa trong các bồn chứa để bốc hơi chất khử trùng trước khi cho gà uống, đảm bảo cung cấp đầy đủ nhu cầu nước sạch cho gà.
Thí nghiệm sử dụng thức ăn nuôi gà con E-442 (1 – 42 ngày tuổi) của Công ty TNHH Dinh Dưỡng Âu Châu. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của thức ăn sử dụng trong thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 3.5.
Bảng 3.5: Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của thức ăn gà (E-442).
Độ ẩm (%, max)
13,0
Protein thô (%, min)
20,0
Xơ thô (%, max)
6,0
Canxi (%, min - max)
0,7 – 1,5
Phospho tổng số (%, min - max)
0,4 – 1,4
Năng lượng trao đổi (Kcal/kg, min)
2800
Lysine (%, min)
0,7
Methionine + Cystine (%, min)
0,3
Công ty TNHH Dinh Dưỡng Âu Châu (2017)
3.3.7.3 Quy trình phòng bệnh chung
Quy trình phòng bệnh gia cầm được tóm tắt qua Bảng 3.6:
Bảng 3.6: Quy trình phòng bệnh chung
1
Phòng bệnh Marek
Chích dưới da cổ
4
Phòng Newcastle và viêm thanh khí quản lần 1 Nhỏ mắt
7
Phòng Gumboro lần 1
Nhỏ mắt
10
Đậu
Chủng qua màng cánh
15
Chích dưới da
Phòng H5N1
21
Phòng Newcastle và viêm thanh khí quản lần 2 Cho uống
28
Phòng Gumboro lần 2
Nhỏ mắt
57
Ngày tuổi Tiêm phòng Đường cấp thuốc
3.3.7.4 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức và 3 lần lặp lại (Bảng 3.7). Mỗi đơn vị nghiệm thức nuôi 30 con gà/ nghiệm thức. Tại thời điểm 3 ngày tuổi tiến hành lấy máu tim để xét nghiệm kháng thể mẹ truyền, do đó số gà cần lấy máu là 60 con. Tiến hành nuôi gà thí nghiệm và lấy máu tĩnh mạch cánh. Số gà cần thí nghiệm (4 NT x 2 giống x 3 lần lặp lại = 720 con gà).
Bảng 3.7: Bố trí thí nghiệm
Số gà dùng trong thí nghiệm (con)
Giống gà Số lần lặp lại NT1 NT2 NT3 NT4
Gà nòi Bến Tre 3 lần 30 30 30 30
Gà Lương Phượng 3 lần 30 30 30 30
- NT1: nghiệm thức đối chứng (không tiêm vaccine) - NT2: IBD BLEN của MERIAL – Mỹ - NT3: Cevac Gumboro L của Hungary - NT4: Nobilis của MSD – Hà Lan
3.3.7.5 Phương pháp lấy máu để kiểm tra kháng thể
Phương pháp lấy máu : khi gà được 3 ngày tuổi tiến hành lấy máu tim để kiểm tra kháng thể thụ động mẹ truyền. Sau đó, tiến hành tiêm vaccine cho gà vào lúc 7 và 28 ngày tuổi (Bảng 3.8). Tiến hành lấy mẫu máu ở tĩnh mạch cánh đối với gà sau khi tiêm vaccine lúc 21 và 42 ngày tuổi để kiểm tra hàm lượng kháng thể sau tiêm phòng. Mỗi nghiệm thức lấy máu 20 gà (10 gà Nòi Bến Tre, 10 gà Lương Phượng) với 3 lần lặp lại nên số gà cần lấy máu ở mỗi nghiệm thức là 60 con.
58
Mỗi con lấy khoảng 0,5 ml máu cho vào ống nghiệm vô trùng ghi lại ký hiệu của gà thí nghiệm. Đặt ống nghiệm nằm nghiêng cho máu đông, đến khi có huyết thanh đem ly tâm 2000 vòng/phút trong 15 phút, chiết lấy huyết thanh cho vào ống tybe bảo quản ở - 20oC.
Bảng 3.8: Tóm tắt thời điểm tiêm phòng và lấy máu để kiểm tra kháng thể
Lần 1
7
Không tiêm
180
180
180
Lần 2
28
Không tiêm
180
180
180
3
Trước tiêm phòng
60
Lần 1
21
60
60
60
60
Lần 2
42
60
60
60
60
NT1: Đối chứng; NT2: Vaccine IBD BLEN; NT3: Vaccine Cevac Gumboro L; NT4: Vaccine Nobilis
Thực hiện kiểm tra kháng thể kháng virus Gumboro bằng phản ứng ELISA gián tiếp. Bộ kit Idexx ELISA (USA) do công ty Thịnh Á tại TP. HCM phân phối.
Hình 3.8: Bộ kit Idexx ELISA kiểm tra kháng thể IBDV
Phương pháp thực hiện: Tất cả các thuốc thử và bộ kit để ở nhiệt độ phòng
trước khi bắt đầu sử dụng.
Chuẩn bị mẫu
59
Cho 500 l dung dịch đệm cho mỗi giếng của đĩa 96 giếng (đĩa sạch). Đĩa này được gọi là đĩa pha loãng huyết thanh. Sau đó thêm 1l huyết thanh cần kiểm tra vào mỗi giếng (pha loãng theo tỉ lệ 1:500). Bắt đầu với giếng A5 và kết thúc bằng giếng H12 (di chuyển trái sang phải) như hình sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 2 3 4 5 6 7 8 A + - - +
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 B
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 C
33 34 35 36 37 38 38 40 41 42 43 44 D
45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 E
57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 F
69 70 71 71 73 74 75 76 77 78 79 80 G
81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 H
Hình 3.9: Sơ đồ bố trí huyết thanh xét nghiệm ELISA gián tiếp
Tất cả các huyết thanh pha loãng để trong dung dịch đệm pha loãng khoảng 5 phút trước khi cho vào một đĩa ELISA có gắn kháng nguyên IBD. Huyết thanh đã pha loãng nên được xét nghiệm trong 24 giờ. Quy trình thực hiện phản ứng như sau:
1. Phủ Ag vào các đĩa và ghi lại vị trí mẫu bố trí trên giếng
2. Thêm 100 l huyết thanh dương tính không bị pha loãng vào đĩa A1 và A2
3. Thêm 100 l huyết thanh âm tính không bị pha loãng vào đĩa A3 và A4
4. Thêm 100 l mẫu pha loãng vào đúng vị trí các đĩa còn lại. Mẫu đơn là tốt nhất
5. Ủ đĩa trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
6. Lấy đĩa ra ngoài và giũ hết chất lỏng trong các giếng vào bồn rửa dụng cụ.
7. Cho 350 l dung dịch rửa là nước cất vào mỗi giếng để trong 3 phút, sau đó loại bỏ các chất lỏng. Lập lại việc rửa 3 - 5 lần.
8. Cho 100 l Conjugate (chuẩn bị như mô tả ở trên) vào mỗi giếng thí nghiệm.
9. Ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
10. Rửa như trong bước 6 và 7 ở trên.
11. Cho 100 l dung dịch TMB vào mỗi giếng.
60
12. Ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.
13. Cho 100 l dung dịch Stop (chuẩn bị như mô tả ở trên) vào mỗi giếng.
14. Quan sát bằng mắt thường.
15. Đo và đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 650nm.
Tính toán kết quả
a. Tính trung bình độ hấp thu của huyết thanh dương tính (Mật độ quang - OD) sử dụng các giá trị hấp thu của giếng A1, A2. Tính trung bình độ hấp thu huyết thanh âm tính bằng cách sử dụng giá trị thu được từ các giếng A3, A4.
- Đối chứng dương (PCX): [Giếng 1 (650) + Giếng 2 (650)]/2
b. Hiệu chỉnh dương tính = trung bình dương tính – trung bình âm tính.
- Đối chứng âm (NCX): [Giếng 3 (650) + Giếng 4 (650)]/2
c. S/P = (mẫu hấp thu - trung bình âm tính) / hiệu chỉnh dương tính
- Tỉ số S/P: (Trung bình mẫu – NCX)/(PCX – NCX)
d. Nồng độ kháng thể (X):
- Log10 = 1,09 log10 S/P + 3,36
- X = 10 ^ [1,09 (log10 S/P + 3,36]
Kết quả
Kết quả IBD ELISA thu được hợp lý khi mật độ quang học trung bình (OD) của đối chứng huyết thanh âm tính là nhỏ hơn 0,15 và hiệu chỉnh dương tính lớn hơn 0,75. Nếu một trong những giá trị này vượt ra khỏi phạm vi, kết quả xét nghiệm IBD nên được coi là không hợp lý và mẫu phải được kiểm tra lại. Dưới điều kiện tối ưu giá trị OD trong phạm vi nhỏ hơn hoặc bằng 0,20 (Nồng độ kháng thể X≤396) cho kết quả âm tính và lớn hơn 0,20 (Nồng độ kháng thể X>396) cho kết quả dương tính. Nếu xét nghiệm với giá trị OD mà không thuộc các OD trong phạm vi nêu trên không phải là kiểm tra không hợp lý.
Điều kiện tối ưu là ở nhiệt độ phòng (21oC đến 24oC). Cao hơn nhiệt độ phòng
có thể dẫn đến các giá trị OD cao hơn.
Giải thích Kết quả
61
Giá trị "0" IBD ELISA đại diện cho một mẫu huyết thanh gà có kháng thể IBD cực kỳ thấp đến mức không đáng kể so với kit ELISA IBD dương tính và kiểm tra huyết thanh âm tính.
Hàm lượng IBD ELISA giá trị trên "0" chỉ các mẫu huyết thanh gà chứa một
lượng kháng thể IBD đáng kể mà bộ kit ELISA phát hiện được.
3.4 Chỉ tiêu theo dõi
3.4.1 Nội dung 1
- Đặc điểm của các đàn gà bệnh Gumboro: giống, hình thức chăn nuôi, tuổi,
số lần tiêm vaccine …
- Tần suất xuất hiện triệu chứng và bệnh tích của gà mắc bệnh Gumboro. - Tỉ lệ mẫu nhiễm. - Tỉ lệ gà chết do bệnh Gumboro.
3.4.2 Nội dung 2
- Trình tự chuỗi nucleotide và chuỗi amino acid của các chủng phân lập. - Mức độ tương đồng chuỗi nucleotide và amino acid giữa chủng thực địa và
các chủng vaccine IBDV.
- Mức độ tương đồng chuỗi nucleotide và amino acid giữa chủng thực địa và một số chủng khác ở Việt Nam và trên thế giới (đã công bố trên ngân hàng genbank).
- Nguồn gốc phả hệ của các mẫu virus thực địa.
3.4.3 Nội dung 3
- Tỉ lệ đáp ứng miễn dịch giữa 2 giống gà, vaccine và số lần tiêm phòng - Sự khác biệt đáp ứng miễn dịch giữa 2 giống gà, vaccine và số lần tiêm
phòng.
3.5 Phương pháp xử lý số liệu
62
Số liệu thí nghiệm được xử lý sơ bộ trên phần mềm Excel. Các số liệu thống kê mô tả và phân tích phương sai theo chương trình Minitab 16. So sánh sự khác biệt giữa các trung bình nghiệm thức bằng kiểm định Chi-Square và Tukey của chương trình Minitab 16.
4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu tình hình bệnh Gumboro trên gà tại một số
tỉnh/ thành vùng ĐBSCL
4.1.1 Đặc điểm của các đàn gà bệnh Gumboro
4.1.1.1 Tỉ lệ đàn gà có bệnh Gumboro giữa các giống gà
Các giống gà được nuôi phổ biến tại ĐBSCL là gà Nòi Lai, gà Tàu Vàng, gà Bình Định, gà Lương Phượng. Đây là những giống gà thích nghi với điều kiện nuôi chăn thả, bán chăn thả do người dân tự nhân giống hoặc mua giống ở các lò ấp tại địa phương và các tỉnh lân cận (Bảng 4.1)
Bảng 4.1: Tỉ lệ đàn gà bệnh Gumboro giữa các giống gà
Nòi Lai
52
15
28,8
Tàu Vàng
19
13
68,4
Bình Định
31
17
54,8
Lương Phượng
29
14
48,3
P = 0,012
Đàn gà nghi mắc bệnh Gumboro có các triệu chứng: xù lông, ủ rũ, uống nhiều nước, gà kém ăn hoặc bỏ ăn, tiêu chảy phân trắng, thường dồn về một góc chuồng, lúc đầu nhiệt độ tăng sau đó giảm. Để xác định đàn gà bệnh tiến hành lấy mẫu phân để xét nghiệm bằng kit IBDV Ag Test của công ty Thời Đại Xanh. Dựa vào kết quả Bảng 4.1 cho thấy số lượng đàn gà mắc bệnh ở giống gà Nòi lai là 15 đàn, gà Lương Phượng là 14 đàn, gà Tàu Vàng là 13 đàn, gà Bình Định là 17 đàn. Tỉ lệ đàn gà mắc bệnh là 45%, theo Pitcovski et al. (2003); Aricibasi et al. (2010), Gumboro là một bệnh ảnh hưởng nghiêm trọng đến kinh tế toàn cầu, có tỉ lệ nhiễm cao nhất khoảng 56,98% so với các bệnh khác trên gia cầm.
63
Tỉ lệ nhiễm bệnh Gumboro giữa các giống gà khảo sát khác biệt có ý nghĩa về thống kê (P<0,05), gà Tàu Vàng cao nhất (68,4%), thấp nhất là gà Nòi lai (28,8%). Điều này cho thấy sức kháng bệnh Gumboro phụ thuộc vào đặc điểm di truyền của từng giống gà đến các đáp ứng miễn dịch sớm đối với IBDV. Ngoài ra, một số nghiên cứu trên thế giới cũng chứng minh các giống gà địa phương ít mắc bệnh Gumboro (Tippenhauer et al., 2013; Sa et al., 2016). Tuy chưa có tài liệu
trong nước nghiên cứu về khả năng đề kháng của các giống gà thả vườn đối với bệnh Gumboro, nhưng thông thường các giống gà thả vườn ít mắc bệnh hơn so với các giống gà nhập nội, trong đó có bệnh Gumboro (Hồ Thị Việt Thu, 2010). Theo nghiên cứu trước đó của Nguyễn Hữu Nam (2007), khối lượng cơ quan miễn dịch của các giống gà địa phương nuôi theo hình thức chăn thả lớn hơn so với giống gà công nghiệp, Tàu Vàng nuôi công nghiệp, do đó khả năng đề kháng với bệnh nói chung của gà địa phương cao hơn các giống gà ngoại nhập. Kết quả nghiên cứu phù hợp với nhận định của Trần Ngọc Bích và Nguyễn Thị Mỹ Hiệp (2013): “Giống gà Nòi có sức đề kháng với bệnh Gumboro tốt hơn so với Lương Phượng”.
4.1.1.2 Tỉ lệ gà bệnh Gumboro theo các hình thức chăn nuôi
Qua khảo sát cho thấy người chăn nuôi đã phát triển từ hình thức nuôi chăn thả với qui mô nhỏ sang hình thức nuôi nhốt hoàn toàn hoặc bán chăn thả với qui mô đàn lớn hơn (Bảng 4.2).
Bảng 4.2: Tỉ lệ gà bệnh Gumboro theo các hình thức chăn nuôi
Thả hoàn toàn
50
14
28,0
Bán chăn thả
60
33
55,0
Nhốt hoàn toàn
21
12
57,1
P = 0,009
64
Kết quả Bảng 4.2 cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỉ lệ nhiễm bệnh Gumboro xảy ra chủ yếu trên gà nuôi theo hình thức nhốt hoàn toàn và bán chăn thả (tương đương 57,1% và 55,0%), thấp nhất ở hình thức nuôi thả hoàn toàn (28,0%) (P<0,05). Có thể do gà nuôi theo hình thức chăn thả giảm được các stress từ việc nuôi nhốt (mật độ, điều kiện vệ sinh không đảm bảo, thiếu thông thoáng, …) nên gà có sức đề kháng tốt hơn đối với bệnh từ đó làm giảm nguy cơ nhiễm bệnh so với gà nuôi nhốt. Điều này cũng phù hợp với nghiên cứu của Trần Ngọc Bích và Nguyễn Thị Mỹ Hiệp (2013), gà nuôi theo hình thức thả hoàn toàn có tỉ lệ mắc bệnh là 25% thấp hơn so với gà được nuôi nhốt hoàn toàn (60,0%) và bán chăn thả (33,3%). Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với nhận định của Lê Văn Năm (2004), bệnh Gumboro phát hiện chủ yếu ở những trại nuôi gà tập trung với quy
mô đàn lớn và hình thức nuôi nhốt hoàn toàn với mật độ rất cao so với nuôi thả hoàn toàn hoặc bán chăn thả (Hình 4.1).
A
B
C
D
Ngoài ra, điều kiện chăn nuôi dơ bẩn, virus có thể tồn tại trong môi trường nuôi tới 122 ngày và có khả năng kháng các điều kiện môi trường bất lợi, thậm chí sau khi được vệ sinh và sát trùng kỹ lưỡng (Eterradossi and Saif, 2013). Virus có khả năng chịu nhiệt, tia cực tím và cũng kháng với ether và chloroform. Sau khi bị nhiễm IBDV, gà có khả năng nhiễm virus trong phân trong vòng 16 ngày (Pooja Kundu, 2017). Virus được bài thải ra ngoài từ các gà bệnh, có sức đề kháng cao, khi có điều kiện thuận lợi virus sẽ theo thức ăn, nước uống xâm nhập đường tiêu hóa gà khỏe và làm lan truyền bệnh trên cả đàn cảm thụ.
Hình 4.1: Hình thức chăn nuôi tại các đàn gà khảo sát (A: Hình thức nuôi bán chăn thả; B và D: nuôi nhốt hoàn toàn; C: nuôi thả hoàn toàn)
4.1.1.3 Tỉ lệ gà nhiễm bệnh Gumboro giữa các lứa tuổi
65
Theo Aricibasi et al. (2010) đàn gà mắc bệnh Gumboro phụ thuộc vào giống gà, độ tuổi tại thời điểm nhiễm bệnh, miễn dịch trước đó hoặc hiệu giá kháng thể của mẹ truyền, chủng virus, liều tiêm chủng, đường tiêm chủng... Những con gà bị nhiễm bệnh ở độ tuổi sớm hơn thường có ít dấu hiệu lâm sàng hơn, nhưng vẫn bị ức chế miễn dịch (Bảng 4.3)
Bảng 4.3: Tỉ lệ gà nhiễm bệnh Gumboro giữa các lứa tuổi
43
Từ 12- 21 ngày tuổi
20
46,5
Từ 21-42 ngày tuổi
54
31
57,4
Lớn hơn 42 ngày tuổi
34
8
23,5
P = 0,008
Kết quả Bảng 4.3 cho thấy lứa tuổi gà mắc bệnh Gumboro cao nhất ở gà từ 21 - 42 ngày tuổi chiếm 57,4%, kế đến ở gà từ 12 – 21 ngày tuổi (46,5%), thấp ở gà trên 42 ngày tuổi chiếm tỉ lệ 23,5%. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,05). Điều này cho thấy bệnh Gumboro chủ yếu tập trung ở giai đoạn gà từ 3 đến 6 tuần tuổi (21 - 42 ngày tuổi). Kết quả trên phù hợp với nhận định của Hồ Thị Việt Thu (2012a), gà ở 3 - 6 tuần tuổi mẫn cảm nhất với bệnh Gumboro vì lúc này lượng kháng thể mẹ truyền cho đàn gà đã suy giảm hoặc không còn nữa và ở độ tuổi trên 42 ngày tỉ lệ mắc bệnh (11,1%). Theo Ingrao et al. (2013), độ tuổi nhạy cảm với IBDV có biên độ dao động ngày càng lớn hơn và có thể xảy ra trong suốt thời gian sinh trưởng của gà, nếu như trước đây gà bị bệnh thường ở thể lâm sàng là chủ yếu và gà thường bị bệnh từ 3 - 6 tuần tuổi, thì ngày nay thể lâm sàng đã thấy xuất hiện ở gà 96 ngày tuổi. Ngoài ra, đã có báo cáo cho rằng những con gà bị nhiễm IBDV ở 14 ngày tuổi bị teo túi Fabricius nhiều hơn và số lượng bản sao RNA virus cao hơn so với những con bị nhiễm bệnh vào 1 ngày tuổi (Jayasundara et al., 2016).
66
Tuy nhiên, kháng thể mẹ truyền có thể vô hiệu hóa virus vaccine và làm giảm hiệu quả của chúng. Do đó, cần phải đợi cho đến khi hiệu giá kháng thể của mẹ suy yếu trước khi sử dụng vaccine sống. Mặt khác, khi hàm lượng kháng thể của mẹ suy yếu dần, nguy cơ gà con có thể bị nhiễm IBDV thực địa. Do đó, thời điểm tối ưu để tiêm phòng rất khó dự đoán. Chiến lược sử dụng vaccine sống và chết đã được chứng minh là thành công trong việc cung cấp hàm lượng kháng thể mẹ truyền rất tốt ở gà con mới nở. Kháng thể mẹ truyền cho gà con và bảo vệ đàn gà con được 4 - 5 tuần tuổi. Tuy nhiên, nếu gà mẹ chỉ chủng ngừa bằng vaccine nhược độc thì kháng thể truyền chỉ bảo vệ cho gà con 1 - 3 tuần. Đồng thời do gà nhỏ có thể mắc
bệnh ở thể tiềm ẩn, không có biểu hiện triệu chứng nhưng ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến giai đoạn gà lớn hơn do ức chế khả năng tạo miễn dịch của gà (Muller et al., 2012).
4.1.1.4 Tỉ lệ bệnh Gumboro ở các đàn có và không tiêm vaccine Gumboro
Trong quá trình khảo sát chúng tôi nhận thấy người chăn nuôi sử dụng vaccine chưa đúng kỹ thuật như: bảo quản không đúng theo hướng dẫn của nhà sản xuất (đường cấp, cách pha chế, liều lượng), thời gian sử dụng, vệ sinh chuồng trại kém ..., nên bệnh vẫn xảy ra trên những đàn đã được phòng vaccine (Bảng 4.4).
Bảng 4.4: Tỉ lệ đàn gà bệnh theo số lần sử dụng vaccine
Không sử dụng
36
24
66,7
01 lần
42
22
52,4
02 lần
53
13
24,5
P=0,001
Qua Bảng 4.4 cho thấy những đàn không được tiêm vaccine có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất (66,7%), kế đến là tiêm vaccine một lần (52,4%), tỉ lệ mắc bệnh thấp nhất ở những đàn được tiêm nhắc lại lần hai (24,5%). So sánh tỉ lệ mắc bệnh ở những đàn gà không chủng ngừa vaccine với những đàn sử dụng vaccine 1 lần cho thấy có sự khác có ý nghĩa về mặt thống kê (P = 0,001). Kết quả trên hoàn toàn phù hợp với nhận định của Trần Thị Bích Liên (2001), khẳng định gà không được tiêm phòng vaccine khó tránh được bệnh và khi mắc bệnh tỉ lệ chết cao. Theo Hồ Thị Việt Thu (2010), bệnh thường xảy ra nhất ở các đàn không được tiêm vaccine (70,0%), kế đến là các gà chỉ được tiêm vaccine một lần (62,5%) và gà được tiêm vaccine hai lần (28,6%).
67
Tuy nhiên, kết quả trên cũng cho thấy tiêm phòng 2 lần đàn gà vẫn mắc bệnh (24,5%). Theo nghiên cứu của Lê Văn Năm (2004), do thị trường vaccine Gumboro nước ta có nhiều loại khác nhau, được sản xuất từ nhiều nước. Sự đa dạng, phong phú về chủng loại, tên gọi của các loại vaccine phòng bệnh Gumboro đã gây không ít khó khăn cho người chăn nuôi khi muốn sử dụng vaccine. Có nhiều trường hợp lần đầu dùng vaccine này, lần sau lại sử dụng vaccine khác trên cùng 1 đàn gà và hậu quả là đàn gà được tiêm phòng vaccine nhưng bệnh vẫn xảy ra. Ngoài ra, một
số đàn gà khi được phòng bệnh bằng vaccine theo lịch hướng dẫn nhưng bệnh vẫn xảy ra có thể là do khả năng bảo hộ của vacine chưa cao, điều này phù hợp với Đái Duy Ban và Phạm Công Hoạt (2004), khi sử dụng vaccine không đúng liều lượng hướng dẫn, dung dịch pha không phù hợp, cách bảo quản và quy trình phòng bệnh không đúng yêu cầu về kỹ thuật làm giảm hiệu lực của vaccine, nguy hiểm hơn là sẽ làm cho đàn gà dễ mắc bệnh. Theo Nguyễn Bá Hiên (2007), khi tiêm vaccine lần 1 và lần 2 cách nhau 3 – 4 tuần thì đáp ứng miễn dịch sẽ nhanh hơn, mạnh hơn, có thể gấp hàng trăm lần và thời gian miễn dịch dài hơn.
Ngoài ra, khả năng đáp ứng miễn dịch còn tùy thuộc tình hình sức khỏe của đàn gà khi tiêm phòng như đàn gà mắc bệnh cầu trùng, dinh dưỡng kém, đang sử dụng các thuốc gây ức chế miễn dịch, stress môi trường (nhiệt độ quá cao, độ thông thoáng kém), mật độ nuôi cao, … (Trần Ngọc Bích và ctv, 2016).
4.1.2 Tần suất xuất hiện triệu chứng và bệnh tích của gà mắc bệnh
Gumboro
Kết quả khảo sát cho thấy trong 59 đàn gà bệnh Gumboro đều xuất hiện triệu chứng bỏ ăn, ủ rũ xù lông, uống nhiều nước, gục đầu chiếm tỉ lệ cao nhất là (100,0%) (Bảng 4.5).
Bảng 4.5: Tần suất xuất hiện triệu chứng lâm sàng trên đàn gà mắc bệnh (n=59)
Bỏ ăn, xù lông, uống nhiều nước
59
59
100
Ủ rũ, gục đầu và sà cánh
59
59
100
Tiêu chảy phân trắng, xanh nhiều nước
59
56
94,9
Hậu môn dính đầy phân
59
46
77,9
Da chân khô
59
45
76,3
Tự mổ vào hậu môn
59
21
35,6
68
Triệu chứng gà tiêu chảy phân trắng, xanh nhiều nước (94,9%), hậu môn dính đầy phân với tỉ lệ (77,9%), da chân khô với tỉ lệ (76,3%) thấp nhất là triệu chứng
gà tự mổ vào hậu môn chiếm tỉ lệ (35,6%). Kết quả trên cũng phù hợp với ghi nhận của Nguyễn Bá Thành (2006); Eterradossi and Saif (2008), gà bệnh Gumboro có triệu chứng mệt mỏi, xù lông, thường dồn về một gốc chuồng, phân dính hậu môn, có niêm dịch lợn cợn, nhiều nước, đôi khi có máu. Gà kiệt sức nằm sải cánh.
A B
Hình 4.2: Một số triệu chứng lâm sàng gà mắc bệnh Gumboro (A: Hậu môn ướt, dính phân vấy bẩn; B: Gà xù lông, gụt đầu)
Qua mổ khám 59 gà đại diện cho 59 đàn bệnh Gumboro chúng tôi ghi nhận
tần suất xuất hiện bệnh tích đại thể được thể hiện ở Bảng 4.6 như sau:
Bảng 4.6: Tần suất xuất hiện bệnh tích trên đàn gà mắc bệnh Gumboro (n=59)
Sưng, xuất huyết
41
70
Túi Fabricius
Teo
18
30
Cơ đùi
Xuất huyết
45
76,2
Cơ ngực
Xuất huyết
32
54,2
Lách
Sưng và/hoặc hoại tử
19
32,2
Thận
Sưng
8
13,5
Ruột
Xuất huyết
19
32,2
Xuất huyết
26
44,1
Phần tiếp giáp dạ dày tuyến và dạ dày cơ
69
Qua kết quả ghi nhận cho thấy gà nhiễm bệnh Gumboro trên các đàn khảo sát cho bệnh tích đại thể trên các cơ quan rất điển hình, đặc biệt là trên túi Fabricius và các cơ. Túi Fabricius: qua khảo sát hầu hết các gà nhiễm bệnh đều có bệnh tích ở túi Fabricius với tỉ lệ 100%. Các bệnh tích xuất hiện như túi sưng hoặc teo, thủy thủng, sung huyết, xuất huyết. Những trường hợp gà nhiễm bệnh nặng túi Fabricius xuất huyết rất nặng có màu đỏ sậm. Mặc dù gà sau khi nhiễm Gumboro khỏi bệnh nhanh nhưng thiệt hại đối với túi Fabricius là không thể phục hồi và dẫn đến ức chế miễn dịch, sau đó tăng tính nhạy cảm với các bệnh khác và gây thất bại trong tiêm chủng (Withers et al., 2006).
Kết quả này phù hợp với rất nhiều tác giả khác nghiên cứu trên bệnh Gumboro như Nguyễn Bá Thành (1999; 2006), Nguyễn Văn Cảm (2000), Trần Ngọc Bích và ctv (2016), tất cả đều cho kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể trên túi Fabricius đạt 100%. Diễn tiến của bệnh Gumboro trong tự nhiên sau 3 ngày bệnh mổ khám thấy túi Fabricius đều sưng rất to, có dịch nhầy gelatin bao quanh, màu vàng, một số túi xuất huyết lấm chấm. Điều này có thể được giải thích do virus Gumboro có đặc tính hướng các cơ quan lâm ba, đặc biệt là túi Fabricius (Eterradossi and Saif 2008). Khi gà mắc bệnh Gumboro, virus sẽ tác động đến túi Fabricius và gây ra những biến đổi. Túi Fabricius bắt đầu tăng về kích thước và trọng lượng trong khoảng 48 – 72 giờ sau khi nhiễm do thủy thủng và xuất huyết. Kích thước túi có thể tăng gấp 2 – 3 lần so với bình thường. Vào ngày thứ 4 sau nhiễm, kích thước túi vẫn còn to gấp đôi, sau đó mới nhỏ dần lại. Ngày thứ 5 sau nhiễm trọng lượng túi bằng trọng lượng ban đầu và teo đi. Đến ngày thứ 8 trọng lượng túi chỉ bằng 1/3 trọng lượng ban đầu. Theo nghiên cứu của Lombardo et al. (2000) chứng minh VP5 là một loại protein không cấu trúc, không có vai trò trong sự nhân lên của virus nhưng có chức năng trong quá trình điều hòa sao chép và tổng hợp protein, đặc biệt trong quá trình khởi phát sự “chết tự nguyện” (apoptosis) của tế bào dẫn đến suy giảm miễn dịch và chức năng ly giải tế bào để giải phóng virus, làm vỡ tế bào dẫn đến teo túi Fabricius.
70
Các phản ứng miễn dịch dịch thể đã được chứng minh là không có hiệu quả sau nhiễm IBDV và gà mà có tiền sử nhiễm IBDV là nhạy cảm hơn với một loạt các bệnh bao gồm: viêm gan, cầu trùng, Marek, viêm da, viêm thanh phế quản truyền nhiễm, thiếu máu truyền nhiễm ở gà, nhiễm khuẩn Salmonella, Colibacillosis, Campylobacter và cúm gia cầm (Ramirez-Nieto et al., 2010). Gà sống sót sau khi nhiễm bệnh, có sự tái sinh Fabricius với các tế bào lympho B, tuy nhiên, hai loại nang tế bào B khác biệt đã được quan sát thấy: các nang lớn, rất có
B
A
C
D
thể được tái sinh từ các tế bào gốc bursal nội sinh và các nang nhỏ, phát triển kém (Withers et al., 2006), khi thiếu các nang lớn không thể tạo ra đáp ứng miễn dịch hoạt động, và có thể những thay đổi mô học này góp phần ức chế miễn dịch. Ức chế miễn dịch gây ra bởi nhiễm IBDV rất phức tạp. Một mặt, sự suy giảm lớn của các tế bào B trong quá trình nhiễm IBDV trực tiếp phá vỡ việc tạo ra các kháng thể đa dạng để hệ thống miễn dịch mắc phải không đáp ứng với các mầm bệnh khác. Mặt khác, các thành phần của IBDV có thể ức chế phản ứng miễn dịch bẩm sinh của vật chủ bên cạnh quá trình chết tự nguyện của tế bào B.
(A: xuất huyết cơ đùi; B: Thận sưng, nhạt màu; C: Túi Fabricius sưng, tích tụ keo nhày bên ngoài; D: Chỗ tiếp giáp dạ dày cơ và dạ dày tuyến xuất huyết)
Hình 4.3: Bệnh tích bệnh Gumboro ở đàn gà bệnh
71
Kế đến là xuất huyết cơ đùi (76,2%), cơ ngực (54,2%), lách sưng (32,2%) xuất huyết giữa dạ dày cơ và dạ dày tuyến (44,1%). Virus Gumboro tác động gây nên hiện tượng bệnh lý đông máu do trong hệ tuần hoàn xuất hiện các cục huyết khối, làm nghẽn mạch mao quản, chủ yếu là vùng niêm mạc túi Fabricius và ở một số nơi khác, dẫn đến hiện tượng sung huyết. Khi không chịu nổi áp suất gia tăng của máu, mao mạch bị đứt gây nên hiện tượng xuất huyết. Sự sung huyết, xuất huyết từ quy mô nhỏ (từng điểm li ti) đến quy mô lớn (vệt, mảng) và có màu sắc đa dạng từ hồng đến tím hoặc nâu đen.
Kết quả mổ khám cho thấy bệnh tích xuất hiện chủ yếu ở túi Fabricius, xuất huyết cơ đùi, cơ ngực. Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Xuân Bình và ctv (2005); Lê Văn Năm (2004), gà bệnh Gumboro có bệnh tích điển hình tập trung ở cơ quan miễn dịch (sưng và xuất huyết túi Fabricius) và hệ cơ (xuất huyết cơ ngực, cơ đùi), còn xuất huyết giữa dạ dày tuyến và dạ dày cơ, xuất huyết điểm ở tuyến ức chiếm tỉ lệ thấp. Các tổn thương ở manh tràng, tuyến ức, lá lách và tủy xương cũng được quan sát thấy ở những con gà bị nhiễm IBDV và tuyến Harderian đã được chứng minh là bị ảnh hưởng nghiêm trọng sau khi nhiễm bệnh ở gà con 1 ngày tuổi với IBDV (Eterradossi and Saif, 2013).
4.1.3 Tỉ lệ mẫu nhiễm bệnh Gumboro ở các tỉnh/ thành vùng ĐBSCL
Qua khảo sát 131 đàn gà nghi bệnh có 59 đàn được xác định là mắc bệnh Gumboro với tỉ lệ 45,0% thông qua triệu chứng và bệnh tích đặc trưng. Kết quả ở Bảng 4.7 cho thấy gà nhiễm bệnh Gumboro do chăn nuôi theo tập quán nhỏ lẻ, virus có sức đề kháng cao với các tác nhân lý hóa và môi trường, mầm bệnh tồn tại lâu dài trong chuồng nuôi ngay cả khi qui trình tiêu độc sát trùng được thực hiện kỹ lưỡng. Trong chất thải, phân, nước tiểu virus Gumboro vẫn giữ nguyên tính gây nhiễm và gây bệnh ít nhất là 52 ngày (Nguyễn Đức Hiền, 2009).
Bảng 4.7: Tỉ lệ mẫu nhiễm Gumboro theo địa phương khảo sát
Tỉnh Số mẫu Số mẫu nhiễm Tỉ lệ mẫu nhiễm (%)
Bến Tre 26 11 42,3
Hậu Giang 15 9 60,0
Cần Thơ 14 7 50,0
Trà Vinh 19 9 47,4
Vĩnh Long 28 12 42,8
An Giang 29 11 37,9
Tổng 131 59 45,0
P = 0,812
72
Giữa các tỉnh khảo sát, đàn gà nuôi tại Hậu Giang có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất (60,0%) và thấp nhất ở An Giang (37,9%) do điều kiện địa lý tại An Giang phù hợp chăn nuôi theo quy mô nhỏ với hình thức nuôi thả hoàn toàn là chủ yếu, ngược lại tại Hậu Giang các đàn gà có quy mô lớn hơn và được nuôi theo hình thức bán chăn thả hoặc nuôi nhốt hoàn toàn nên có sự khác biệt về tỉ lệ nhiễm bệnh. Tuy
nhiên, không có sự khác biệt về tỉ lệ nhiễm giữa các tỉnh khảo sát. Kết quả trên khá tương đồng với khảo sát của Phạm Trường Thanh (2016) với tỉ lệ nhiễm bệnh là (46,7%). Theo nhận định của Lê Văn Năm (2004), bệnh Gumboro là một trong những bệnh có tỉ lệ nhiễm cao nhất khoảng (57,0%) so với các bệnh khác trên gia cầm. Theo Nguyễn Bá Thành (2006), nghiên cứu bệnh Gumboro trên đàn gà tại tỉnh Đồng Nai cho kết quả là bệnh Gumboro chiếm tỉ lệ cao nhất (57,5%) trong tổng số mẫu kiểm tra.
4.1.4 Tỉ lệ gà chết do bệnh Gumboro
Kết quả khảo sát tỉ lệ gà chết do bệnh Gumboro (Bảng 4.8) cho thấy tỉ lệ chết được xác định bởi nhiều yếu tố bao gồm độc lực của IBDV, liều lây nhiễm, tuổi, giống gà, và khả năng miễn dịch thụ động (Ingrao et al., 2013).
Bảng 4.8: Tỉ lệ gà chết do bệnh Gumboro
Tỉnh Số đàn bệnh Số gà bệnh Số gà chết Tỉ lệ chết (%)
Bến Tre 26 11.200 365 3,25
Hậu Giang 15 4.500 225 5,00
Cần Thơ 14 3.600 153 4,25
Trà Vinh 19 7.200 450 6,25
Vĩnh Long 28 9.200 455 4,95
An Giang 29 3.900 259 6,64
Tổng 4,81 131 39.600 1.907
P = 0,001
73
Kết quả ở Bảng 4.8 cho thấy tỉ lệ chết của gà do bệnh Gumboro trong khảo sát này không cao (4,81%). Tuy nhiên có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỉ lệ chết giữa các tỉnh khảo sát (P = 0,001), tỉ lệ gà chết cao nhất ở tỉnh An Giang, thấp nhất ở tỉnh Bến Tre. Theo Lê Văn Năm (2004) khi bệnh Gumboro xảy ra thì hầu như 100% số đàn gà bệnh Gumboro đều bị kế phát những bệnh khác tạo thành những bệnh ghép phức tạp, làm tăng tỉ lệ gà chết trong đàn mắc bệnh có thể lên đến 100%. Theo Trần Thị Quỳnh Lan (1999), bước đầu nghiên cứu tình hình dịch tễ của bệnh Gumboro ở các trại gà tư nhân tại thành phố Hồ Chí Minh cho thấy bệnh Gumboro gây thiệt hại kinh tế đáng kể. Tỉ lệ chết trong đàn khảo sát từ 4% đến 29% chủ yếu ở giai đoạn từ 3 đến 7 tuần tuổi, tập trung ở 4 tuần tuổi trên các
đàn gà thịt. Chương trình chủng ngừa bệnh Gumboro không đảm bảo 100 % trong việc phòng chống lại bệnh tại các trại khảo sát.
Hơn nữa, khi được chẩn đoán là bệnh Gumboro thì người chăn nuôi đã tiến hành các biện pháp phòng trị đặc hiệu như tiêm kháng thể kháng virus Gumboro, cho gà uống glucose, chất điện giải và vitamin, kinh nghiệm và kỹ thuật chăn nuôi có nhiều tiến bộ so với trước đây nên hạn chế được tỉ lệ chết do bệnh. Theo Nguyễn Bá Thành (2004), tỉ lệ gà chết còn liên quan đến thời điểm phát hiện và điều trị bệnh, nếu phát hiện bệnh kịp thời ngay khi gà mới mắc bệnh Gumboro, thì hiệu quả điều trị cao và tỉ lệ sống sẽ là 90 - 95%, nếu can thiệp kịp thời vào ngày thứ hai khi mắc bệnh thì tỉ lệ gà sống là 80 - 85% và sau ngày thứ 3 thì tỉ lệ này chỉ còn là 60 - 65%. Do đó việc chẩn đoán nhanh và điều trị kịp thời sẽ làm giảm tỉ lệ gà chết trong đàn do mắc bệnh Gumboro.
4.2 Nội dung 2: Nghiên cứu đặc điểm di truyền virus Gumboro phân
lập trên gà bệnh tại ĐBSCL Kết quả thực hiện phản ứng PCR, giải trình tự gene VP2
Sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 474 bp, kết quả điện di ở Hình
500bp 474b p
4.3 cho thấy chất lượng tốt, băng DNA sáng, đơn băng.
M: chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể Lambda được cắt bằng HindIII.
Hình 4.4: Điện di sản phẩm PCR của các chủng IBDV.
4.2.1 Trình tự chuỗi nucleotide và chuỗi amino acid của các chủng phân
lập và vaccine
74
Hình 4.5 cho thấy mẫu đã được giải trình tự rõ ràng, mỗi đỉnh màu của giản đồ (chromatogram) đều xác định một loại nucleotide, chứng tỏ chuỗi nucleotide ở vùng siêu biến đổi của gene kháng nguyên VP2 thu nhận sau quá trình giải trình tự có chất lượng tốt. Khi so sánh vị trí chuỗi nucleotide này với vị trí một số chuỗi nucleotide của vùng siêu biến đổi được công bố trong Ngân hàng gene thì khá phù
hợp, chứng tỏ toàn bộ quy trình RT-PCR là chính xác từ việc sử dụng mồi, chu trình nhiệt, tiến trình thực hiện và kết quả phản ứng hoàn toàn đặc hiệu với primer.
Hình 4.5: Giản đồ (chromatogram) một phần trình tự vùng siêu biến đổi gene kháng nguyên VP2
Một số nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng bên cạnh virus IBDV có độc lực cao, các chủng khác cũng đã xuất hiện ở châu Âu và điều này cũng có thể đúng với các khu vực khác do đó tình trạng bệnh Gumboro dường như đang gia tăng phức tạp. Những thay đổi về tính kháng nguyên và độc lực làm cho việc kiểm soát IBD bằng cách tiêm chủng trở nên khó khăn hơn (van den Berg, 2000; Muller et al., 2003; Eterradossi and Saif, 2008). Các chủng IBDV cổ điển gây ra tổn thương túi Fabricius và hoại tử tế bào lympho B dẫn đến tỷ lệ tử vong 20-30%. Vào giữa những năm 1980, các chủng IBDV cực độc đã xuất hiện và gây ra sự bùng phát đáng kinh ngạc dẫn đến tỷ lệ tử vong lên đến 60-70% và sau đó lan sang Trung Đông, Châu Á, Châu Phi và Nam Mỹ (Abdel-Alem et al., 2003).
75
Gene VP2 được nghiên cứu một cách phổ biến vì nó mã hóa cho các chất bảo vệ chính, chứa các yếu tố quyết định đến khả năng gây bệnh và biến đổi cao giữa các chủng (Abdel-Alem et al., 2003; Jackwood and Sommer-Wagner, 2007). Trình tự từ vị trí 634-1022 ở vùng siêu biến đổi của gene VP2 thu thập từ 10 mẫu IBDV trong nghiên cứu này được phân tích và so sánh với một số loại virus vaccine đang sử dụng tại địa phương. Kết quả phân tích cho thấy có 53 vị trí sai khác về nucleotide khi so sánh 10 mẫu virus thu thập được trong nghiên cứu. Trong số các vị trí sai khác này có 6 vị trí của nucleotide 724, 725, 726, 766, 767, 881 dẫn đến thay đổi các amino acid tại các vị trí quan trọng là 242, 256, 294 đã làm biến đổi độc lực của các mẫu thực địa (Bảng 4.9). Tỷ lệ đột biến gene cao là đặc điểm chính của virus RNA. Vùng siêu biến của IBDV nằm trong gene VP2 chịu trách nhiệm cho sự biến đổi kháng nguyên do VP2 tạo ra các kháng thể trung hòa virus (Yao Qin and Shijun, 2017). IBDV tận dụng sự linh hoạt di truyền để đạt được các biến thể kháng nguyên, giúp bản thân thoát khỏi sự thanh thải miễn dịch và nhanh chóng thích nghi với sự thay đổi của môi trường. Các đột biến thường gặp ở VP2 cho thấy
một số codon nhất định chịu áp lực chọn lọc liên tục và đột biến điểm (trôi dạt kháng nguyên) có thể xuất hiện để trung hòa các kháng thể mẹ truyền (Vukea et al., 2014).
724
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
725
A
A
A
A
G
A
A
A
A
A
726
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
766
C
C
C
C
C
C
G
G
C
C
767
G
G
G
T
C
G
T
T
T
T
881
A
G
G
A
A
A
A
A
A
A
M1: Trà Vinh; M2: Hậu Giang 1; M3: Hậu Giang 2; M4: An Giang; M5: Cần Thơ 1; M6: Cần Thơ 2; M7: Bến Tre 1; M8: Bến Tre 2; M9: Vĩnh Long 1; M10: Vĩnh Long 2
Bảng 4.9: Vị trí sai khác Nucleotide dẫn đến sai khác amino acid giữa các mẫu nghiên cứu Vị trí sai khác nucleotide
76
Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng có 9 vị trí amino acid quan trọng trong vùng nhóm quyết định kháng nguyên đó là các vị trí 222, 242, 253, 256, 279, 284, 294, 299, và 329, trong đó có 5 vị trí quan trọng hơn cả đó là 222(A), 242(I), 256(I), 294(I) và 299(S) ở các chủng cường độc (Martin et al., 2007). Như vậy, các chủng virus phân lập tại thực địa có 3 vị trí bị biến đổi acid amin làm thay đổi kháng nguyên thuộc 5 vị trí quan trọng quyết định độc lực. Sự thay đổi các amino acid ở vị trí này có thể làm cho một chủng cường độc trở thành có độc lực yếu hay nhược độc và ngược lại một chủng nhược độc có thể “độc”, tức là tăng cường độc lực để trở thành cường độc (Yuwen et al., 2008). Đột biến ở vị trí 212 là phổ biến ở hầu hết các chủng IBDVcường độc gần đây và có thể ảnh hưởng đến cấu trúc của VP2 và tính kháng nguyên của virus (He et al., 2014) Hơn nữa, dư lượng S thay vì glycine (G) ở vị trí 254 đã được báo cáo từ phân lập IBDVcường độc được phát hiện từ gà được tiêm vaccine IBDV cổ điển (Negash et al., 2012)
cho thấy vai trò của đột biến này trong việc tiêm vaccine sống cổ điển (Jackwood and Sommer-Wagner, 2011).
724
A
A
A
A
A
A
A
A
A A
G
A
A
A
A
725
A
A
A
A
G
A
A
A
A A
G
G
G
G
G
726
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
G
C
C
C
C
766
C
C
C
C
C
C
G
G
C
C
C
C
C
C
C
767
G
G
G
T
C
G
T
T
T
T
A
C
C
C
C
836
G
A
A
A
G
G
A
A
A A
G
G
G
G
G
837
A
A
A
A
A
A
A
A
A A
C
A
A
A
A
881
A
G
G
A
A
A
A
A
A A
A
A
A
A
A
M1: Trà Vinh; M2: Hậu Giang 1; M3: Hậu Giang 2; M4: An Giang; M5: Cần Thơ 1; M6: Cần Thơ 2; M7: Bến Tre 1; M8: Bến Tre 2; M9: Vĩnh Long 1; M10: Vĩnh Long 2; VC1: IBD Blen; VC2: Bur 706; VC3: Cevac Gumboro L; VC4: Georgia; VC5: Nobilis
Bảng 4.10: Vị trí sai khác Nucleotide dẫn đến sai khác amino acid giữa các mẫu nghiên cứu và vaccine Vị trí sai khác
77
Kết quả giải trình tự gene và qua phân tích đặc điểm amino acid như đã trình bày Bảng 4.10. Các mẫu thu được tại thực địa M1, M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10 cho thấy tại các vị trí 222, 242, 253, 256, 279, 294, 299 và 329 có dãy amino acid là A-I-Q-I-D-A-I-S-A là dạng sắp xếp tìm thấy của tất cả các chủng độc lực cao. Mẫu M5 thuộc nhóm các chủng nhược độc có nhiều biến đổi nhất, 8 vị trí (A222 P; I242V; Q253H; I256V; D279N; A284T; I294L; S299N) sai khác so với các chủng độc lực cao. So sánh trình tự nucleotide của các mẫu vaccine và trình tự nucleotide của các mẫu virus thu thập tại thực địa, nhận thấy có 81 vị trí sai khác nhưng chỉ có 8 vị trí 724, 725, 726, 766, 767, 836, 837, 881 làm thay đổi amino acid (242, 256, 279, 294) dẫn đến biến đổi độc lực. Như vậy có 3 trên 5 vị trí quan trọng nhất làm biến đổi độc lực là 242, 256, 294. Các phân lập IBDV thu được tại
Trung Quốc giai đoạn 2006-2010 có 11 vị trí đột biến so với các phân lập giai đoạn 2000 - 2005 có bảy vị trí đột biến. Các phân lập từ năm 2006 đến 2010 cũng cho thấy tần số đột biến tăng dần ở D212 N / A (23,53%), T209A (23,53%), L263F (50%) và H338R (47,06%), so với các chủng phân lập từ 2000 đến 2005. Trong số các vị trí đột biến, bốn vị trí (212, 213, 215 và 216) nằm ở đỉnh kỵ nước đầu tiên cho thấy mức độ tự do cao hơn 48,06% (16/34) về đột biến ở các chủng phân lập của năm 2006-2010, trong khi đó vào năm 2000-2005 chỉ có 8% (2/25) (Le et al., 2005; Lu et al., 2015).
Sự biến đổi “giảm độc” tức là từ cường độc thành độc lực yếu (trung gian) và cuối cùng trở thành nhược độc (độc lực thấp), cũng như ngược lại là sự “tăng độc”, phụ thuộc vào sự biến đổi có tính thay thế ở các amino acid tại các vị trí này, bao gồm cụ thể như sau: 222 (AP/TP); 242 (IVV); 253 (QQH); 256 (IVV); 279 (DD/NN); 284 (AAT); 294 (ILL); 299 (SNN); 329 (ARR). Nhóm các chủng vv (độc lực cao) tại các vị trí 222, 242, 253, 256, 279, 294, 299 và 329 có dãy amino acid là A-I-Q-I-D-A-I-S-A l, nhóm các chủng av (độc lực thay đổi) có 6 vị trí amino acid thay đổi: 222 (AT); 242 (IV); 256 (IV); 279 (DN); 294 (IL) và 299 (SN); M5 thuộc nhóm các chủng at (nhược độc) có nhiều biến đổi nhất, 8 vị trí: 222 (AP); 242 (IV); 253 (QH); 256 (IV); 279 (DN); 284 (AT); 294 (IL); 299 (SN). Như vậy, có 3 loại motif đại diện cho 3 nhóm virus có mức độ độc lực khác nhau: motif (A- I-Q-I-D-A-I-S-A) của virus thuộc loại có mức độ độc lực cao (cường độc); motif (P/T-V-Q-V-D/N-A-L-N-R) của các loại virus Gumboro có mức độ độc lực vừa, đang chuyển đổi nhược độc hóa (theo chiều yếu dần) hoặc cường độc hóa (theo chiều mạnh dần); và motif (P-V-H-V-N-T-L-N-R) của các virus có mức độ độc lực thấp (nhược độc) (Jackwood et al., 2008). Trong 9 vị trí này có 4 vị trí đặc biệt quan trọng hơn cả, đó là các vị trí: 222 (AP/TP), 242 (IVV), 256 (IVV), 299 (SNN). Amino acid tại 9 vị trí là các amino acid nhóm quyết định kháng nguyên quyết định tính kháng nguyên - miễn dịch của chủng virus Gumboro; amino acid tại vị trí 253 có vai trò ảnh hưởng đến độc lực (độc lực thấp: Histidine, H; độc lực cao: Glutamine, Q) (Jackwood et al., 2008; Letzel et al., 2007).
78
Trong tự nhiên có 2 serotype (1 và 2) tồn tại, chỉ có serotype 1 gây bệnh cho gà (Eterradossi and Saif, 2013). Dựa trên đặc tính gây bệnh và đặc điểm sinh học phân tử, IBDV được phân làm 3 nhóm chính: nhóm cường độc (vv, very virulent); nhóm nhược độc (at, attenuated) và nhóm độc lực biến đổi (av, antigenic variant)
(Silva et al., 2013; Michel and Jackwood, 2017). VP2 hiển thị số lượng đột biến amino acid lớn nhất trong số các chủng serotype 1 gây bệnh. Sự thay thế các amino acid này có thể ảnh hưởng đến sự thay đổi độc tính của virus, nó có vai trò quan trọng trong việc tăng độc lực gây bệnh khi có kháng thể mẹ truyền. Tại các vị trí trong VP2 (P222A), (V256I), (N279I), 294I, (N299S) đại diện cho tất cả các chủng IBDV độc lực cao so với các dòng cổ điển (Jackwood et al., 2008; Kasanga et al., 2007; van den Berg et al., 2004). Nghiên cứu dịch tễ học phân tử IBDV cho thấy các acid amin 222A, 256I, 279D, 284A, 294I và 299S trong VP2 được bảo tồn trong tất cả các chủng độc lực cao, trong khi các amino acid 222P, 256V, 279N, 284T, 294L và 299N được bảo tồn trong các biến đổi độc lực; 249Q và 254G có liên quan đến chủng cổ điển. Theo Lê Thanh Hòa (2003b), nghiên cứu các chủng virus cường độc Gumboro tại Việt Nam (9 chủng phân lập ở Hà Nội và vùng phụ cận) hoàn toàn thuộc nhóm phả hệ cùng chủng Gumboro châu Á. Nghiên cứu biến đổi phân tử nhóm quyết định kháng nguyên (gene kháng nguyên VP2) ở một số chủng virus cường độc Gumboro phân lập tại Việt Nam bằng phương pháp RT- PCR cho thấy 100% các chủng này đều thuộc nhóm cường độc với motif của nhóm quyết định kháng nguyên là A-I-Q-I-I-A-I-S-A (Lê Thanh Hòa, 2004).
Bảng 4.11: Vị trí amino acid thay đổi của nhóm quyết định kháng nguyên kháng nguyên VP2 ở các chủng thực địa với ngân hàng gene (genbank) Vị trí amino acid của nhóm quyết định kháng nguyên kháng nguyên có biến đổi
A A A A A A A A A A A A A
M1 M2 M3 M4 M6 M7 M8 M9 M10 GTG GTG25 GTN GT1ST
vv vv vv vv vv vv vv vv vv vv vv vv vv
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
I I I I I I I I I I I I I
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
I D A I D A I D A I N A I D A I D A I D A I D A I D A I D A I D A I D A I D A
I I I I I I I I I I I I I
S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A
79
I Q I D A I S A A
GPT GHUT12 YS07 9109 variantE GLS HuN11
I I I I I I I
I D A I D A I D A I D A I D A I D A I D A
av av av av
25
VC5
av
Q
I N A
L N V
S
V
26 M5
at
Nhược độc
27
D78
at
P
V
H V N
L N A
T
28
HZ2
at
P
V
H V N
L N A
T
29
JD1
at
P
V
H V N
L N A
T
30
HN04
at
P
V
H V N
L N A
T
31
VC2
at
P
V
H V N
L N A
T
32
VC3
at
P
V
H V N
L N A
T
33
VC4
at
P
V
H V N
L N A
T
M1: Trà Vinh; M2: Hậu Giang 1; M3: Hậu Giang 2; M4: An Giang; M5: Cần Thơ 1; M6: Cần Thơ 2; M7: Bến Tre 1; M8: Bến Tre 2; M9: Vĩnh Long 1; M10: Vĩnh Long 2; VC1: IBD Blen; VC2: Bur 706; VC3: Cevac Gumboro L; VC4: Georgia; VC5: Nobilis. vv: very virulent (siêu cường độc/độc lực rất cao); av: antigenic variant (biến đổi kháng nguyên/độc lực thay đổi at: attenuated (nhược độc).
P P V V H V N T L N R L N A T N V N
80
Như vậy, các chủng IBDV phân lập được tại các tỉnh Vĩnh Long, Trà Vinh, Bến Tre, Cần Thơ, Hậu Giang, An Giang đều thuộc nhóm độc lực cao, biểu hiện rõ qua các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích khi mổ khám: gà ủ rũ, rút mỏ vào cánh, có khi gục sang một bên, thích nằm, mắt lim dim mỏi mệt và thường dồn về một góc chuồng, gà kém ăn, bỏ ăn, uống nhiều nước, mất định hướng, đi phân trắng, loãng hoặc toàn nước có khi lẫn máu, lúc đầu nhiệt độ tăng sau đó giảm, mổ
khám thấy túi Fabricius đều sưng rất to, có dịch nhầy gelatin bao quanh, màu vàng, một số túi xuất huyết lấm. Tất cả các mẫu này được thu từ những đàn gà không được tiêm phòng Gumboro. Các mẫu thu tại Cần Thơ có mẫu M5 là chủng nhược độc (Bảng 4.11) với các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích không rõ ràng, mẫu này được thu tại đàn gà sau khi đã tiêm phòng lần thứ 2 (3 ngày).
Gene VP2 được nghiên cứu một cách phổ biến vì nó mã hóa cho các chất bảo vệ chính, chứa các yếu tố quyết định đến kháng nguyên và đột biến cao giữa các chủng (Abdel-Alem et al., 2003; Jackwood and Sommer-Wagner, 2007). Chủng IBDV độc lực cao làm cho các nang bạch huyết bị suy giảm nhanh hơn và nghiêm trọng hơn so với các chủng độc lực yếu (Islam et al., 2008; Shrivastav et al., 2004; Raue et al., 2004). Trao đổi amino acid bên trong hoặc bên ngoài các vùng ưa nước đều chịu trách nhiệm về sự thay đổi kháng nguyên IBDV. Jackwood et al. (2008) đã khẳng định rằng một đột biến điểm duy nhất trong VP2 góp phần không nhỏ vào sự trôi dạt kháng nguyên trong IBDV. Việc nhiễm IBDV có độc lực yếu vượt qua khả năng miễn dịch do vaccine gây ra là bằng chứng mạnh mẽ cho thấy các đột biến acid amin ở vị trí 222 và 254 trong VP2 đã góp phần làm trôi dạt kháng nguyên. Tuy nhiên, một số nghiên cứu kháng thể đơn dòng cho thấy các vị trí amino aicd 222 và 254 không phải là hai vị trí duy nhất góp phần vào sự trôi dạt kháng nguyên (Letzel et al., 2007, Yamaguchi et al., 2007). Phân tích đặc điểm di truyền cho thấy hầu hết các IBDV tái tổ hợp đều có phân đoạn A từ độc lực cao duy trì dấu hiệu độc lực chính amino acid trong VP2 (222A, 256I, 294I và 299S) (Xia et al., 2008) chủng độc lực yếu có 253H và 284T và 253Q và 284A thường được tìm thấy trong các chủng biến đổi độc lực (Negash et al., 2012)
81
Các amino acid ở các vị trí 253 và 284 được xem là nguyên nhân gây bệnh và là độc nhất đối với các IBDV có tính gây bệnh cao (Brandt et al., 2001; Islam et al., 2001b). Nhiều nghiên cứu về quá trình thích nghi nuôi cấy tế bào của IBDV cho thấy sự khác biệt trong nuôi cấy tế bào giữa các chủng phân lập. Các chủng có vị trí Glutamine 253 được báo cáo là có khả năng gây bệnh cao hơn so với các chủng có Histidine ở vị trí 253 ít gây bệnh hơn nhiều. Dư lượng Alanine ở vị trí 253 đã được tìm thấy trong các chủng được phân lập hiện tại cũng như phân lập IBDV trước đây cho thấy khả năng gây bệnh cao, đều này cho thấy có sự đột biến dẫn đến thay đổi khả năng gây bệnh của IBDV (Zierenberg et al., 2004)
4.2.2 Phân tích tương đồng chuỗi nucleotide, chuỗi amino acid giữa các
chủng thực địa và các chủng vaccine
Đoạn gene 389 nucleotide (634-1022) mã hóa cho 128 amino acid vùng siêu
biến đổi ở gene VP2 của các mẫu virus thu thập được từ thực địa và 05 mẫu vaccine được đưa vào chương trình Mega 6.0 để phân tích mức độ tương đồng về nucleotide và amino acid giữa các nhóm với nhau (Bảng 4.12). Kết quả phân tích cho thấy:
Bảng 4.12: Tỉ lệ (%) tương đồng về nucleotide (trên đường chéo) và amino acid (dưới đường chéo) của các mẫu IBDV trong nghiên cứu và vaccine
M1
96
96
97
91
99
95
95
96
96
85
91
90
91
92
M2
100
100
95
88
95
93
93
94
94
80
88
87
88
89
M3
100 100
95
88
95
93
93
94
94
80
88
87
88
89
M4
98
98
98
92
97
96
96
97
97
86
93
92
93
93
M5
92
92
92
92
91
90
90
91
91
92
99
98
100
96
M6
100 100 100
98
92
95
95
96
96
85
91
90
91
92
M7
98
98
98
96
89
98
99
100
99
82
90
90
90
90
M8
98
98
98
96
89
99
98 100
99
82
90
90
90
90
M9
99
99
99
98
91
99
98
98
100
84
91
91
91
91
M10
99
99
99
98
91
99
98
98 100
84
91
91
91
91
VC1
76
76
76
76
83
76
72
72
75
75
91
91
92
89
VC2
91
91
91
91
98
91
88
88
90
90
82
98
99
96
VC3
89
89
89
89
95
89
86
86
88
88
79
97
98
94
VC4
92
92
92
92
99
92
89
89
91
91
83
99
96
96
VC5
94
94
94
94
95
94
92
92
93
93
78
94
91
95
M1: Trà Vinh; M2: Hậu Giang 1; M3: Hậu Giang 2; M4: An Giang; M5: Cần Thơ 1; M6: Cần Thơ 2; M7: Bến Tre 1; M8: Bến Tre 2; M9: Vĩnh Long 1; M10: Vĩnh Long 2; VC1: IBD Blen; VC2: Bur 706; VC3: Cevac Gumboro L; VC4: Georgia; VC5: Nobilis.
Mẫu M1, M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10 có độ tương đồng về nucleotide với các chủng vaccine từ 80 – 93%, vaccine 1 có độ tương đối thấp với tất cả các chủng thực địa (80 – 86%), vaccine 4 có độ tương đồng cao nhất (89 – 93%). Mẫu M5 có độ tương đồng cao nhất so với các chủng vaccine (92 – 100%), thấp nhất so với vaccine 1, cao nhất so với vaccine 4.
82
Mẫu M1, M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10 có độ tương đồng về amino acid với các chủng vaccine từ 72 – 94%, VC1 có độ tương đối thấp với tất cả các chủng thực địa (72 – 76%), vaccine 4 có độ tương đồng cao nhất (89 – 99%). Mẫu
M5 có độ tương đồng cao nhất so với các chủng vaccine (83 – 99%), thấp nhất so với VC1, cao nhất so với VC4.
Tại Việt Nam, chuỗi gene kháng nguyên VP2 đã được sử dụng trong nghiên cứu đặc tính phân tử, phân tích nguồn gốc phả hệ và biến đổi kháng nguyên (Lê Thanh Hòa, 2003a; Lê Thị Kim Xuyến và Lê Thanh Hòa, 2008). Sự thay đổi của một, hai hay vài amino acid có tính chất quyết định đến sự kết hợp kháng thể do chúng hoặc do các chủng đồng kháng nguyên khác kích thích sinh ra. Nếu không đồng nhất về thành phần khung nhóm quyết định kháng nguyên, kháng nguyên vaccine sử dụng có thể kích thích sinh kháng thể với hàm lượng cao nhưng kháng thể này không thể hoặc không hoàn toàn trung hòa được chủng virus gây bệnh khác vì không có vị trí kết hợp kháng nguyên - kháng thể tương ứng, do sai lệch về nhóm quyết định kháng nguyên của vaccine với chủng cường độc gây bệnh, do vậy mặc dù đàn gà được tiêm vaccine nhưng bệnh vẫn xảy ra (Letzel et al., 2007). Từ kết quả trên cho thấy độ tương đồng giữa các chủng vaccine với các chủng thu thập từ thực địa là không cao, dẫn đến hiệu quả của việc tiêm phòng còn hạn chế nên bệnh vẫn có thể xảy ra tại các trại đã được tiêm phòng từ 1 – 2 lần.
Tương đồng thấp hơn và khoảng cách di truyền dài giữa các phân lập kiểu gene độc lực cao và các chủng vaccine được sử dụng phổ biến cũng có thể gợi ý, ít nhất là ở cấp độ phân tử, rằng các kiểu gene độc lực cao khác với các chủng vaccine. Đây có thể là một trong những lý do tại sao ngày càng có nhiều IBDV kiểu gene được phân lập từ các loại vaccine do sự thất bại hoặc thiếu bảo vệ hoàn toàn (He et al., 2014)
Nghiên cứu dịch tễ học phân tử của IBDV phân lập từ 7 tỉnh ở miền nam Trung Quốc trong 2000-2012 cho thấy phần lớn các chủng phân lập (85,71%, 78/91) được xác định là các chủng được tái tổ hợp tự nhiên (He et al., 2014). Sự tái tổ hợp dẫn đến sự biến đổi của độc lực IBDV có thể được chứng minh ở vùng A phù hợp với chủng độc lực cao (Pitesky et al., 2013; Gallardo et al., 2014). Với việc sử dụng nhiều vaccine sống, số lượng các chủng IBDV cường độc và các chất tái tổ hợp của chúng liên tục tăng lên và trở thành dịch bệnh. Do đó, việc so sánh nhóm này đã được cho là lựa chọn tốt nhất cho nghiên cứu dịch tễ học phân tử và phát sinh loài IBDV.
4.2.3 Mức độ tương đồng chuỗi nucleotide và amino acid của các chủng
thực địa với một số chủng khác của Việt Nam và trên thế giới.
83
Kết quả so sánh mức độ tương đồng chuỗi nucleotide và amino acid của các chủng thực địa với một số chủng khác của Việt Nam và trên thế giới được trình bày
trong Bảng 4.13. Nghiên cứu cho thấy giữa các mẫu M1, M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10 có độ tương đồng về nucleotide 93 – 100%, riêng mẫu M5 có độ tương đồng với các mẫu còn lại từ 88 – 92%. Khi so sánh với ngân hàng gene, các chủng thực địa có độ tương đồng 88 – 100%, thấp nhất ở mẫu M2, M3 so với chủng HN04, độ tương đồng cao nhất là mẫu M9, M10 so với chủng GT1ST.
Giữa các mẫu M1, M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10 có độ tương đồng về amino acid từ 96 – 100%, riêng mẫu M5 có độ tương đồng với các mẫu còn lại từ 89 – 92%. Khi so sánh với ngân hàng gene, các chủng thực địa có độ tương đồng từ 89 – 100%. Các mẫu M1, M2, M3, M6 có độ tương đồng 100% với các chủng GT1ST, GPT, YS07, 9109, variantE, GLS, HuN11. Các mẫu M7, M8 chỉ tương đồng 89% với các chủng D78, HZ2, JD1, HN04.
84
Kết quả nghiên cứu phù hợp với nhận định của Kibenge et al. (1991; 1999), trong phân đoạn A, sự tương đồng thấp hơn về nucleotide và amino acid tương ứng là 83% - 84% và 90% đáng chú ý ở các vùng mã hóa giữa các chủng thuộc serotype I và II. Điều này chủ yếu xảy ra tại vùng “siêu biến đổi” liên quan tới các nhóm quyết định kháng nguyên đặc hiệu của từng serotype virus trong protein cấu trúc VP2. Kiểu gene khác nhau của IBDV đôi khi được phân lập từ cùng một bursa có nghĩa là đồng nhiễm phổ biến trong túi Fabricus (He et al., 2012). Nghiên cứu dịch tễ học cho thấy sự xuất hiện của các chủng IBDV mới với độc lực gia tăng vẫn chưa được hiểu rõ vì các vaccin có sẵn có thể dễ dàng thích nghi hơn bằng cách thay thế gene VP2 trong một số vaccine biến đổi gene hơn bằng cách làm suy yếu virus mới xuất hiện. Tuy nhiên, cần thận trọng trong việc theo dõi virus tại thực địa và lịch sử phát bệnh tại trại nuôi (Saif, 2004). Dựa trên độc lực và tính kháng nguyên, các IBDV biến đổi độc lực không gây tử vong, trong khi các chủng cổ điển gây ra tỷ lệ tử vong lên tới 20%. IBDV rất độc cao (vvIBDV) gây ra tỷ lệ tử vong vượt quá 50% ở những con gà dễ mắc bệnh (Muller et al., 2003).
Bảng 4.13: Tương đồng về nucleotide (trên đường chéo) và amino acid (dưới đường chéo) của các mẫu IBDV trong nghiên cứu với một số chủng khác ở Việt Nam và thế giới
96
96 97 91
99
95
95
96
96 95
96 97
97
97
97 92
92
98
98
98
91
98 92
91
91
98 91
100
100 95 88
95
93
93
94
94 93
94 95
95
95
95 89
90
95
95
95
88
95 89
88
88
95 88
100 100
95 88
95
93
93
94
94 93
94 95
95
95
95 89
90
95
95
95
88
95 89
88
88
95 88
98
92
97
96
96
97
97 96
96 98
98
98
98 93
93
98
98
98
93
98 93
93
93
98 92
98
98
92 92
91
90
90
91
91 90
90 91
91
91
90 96
96
91
91
91
99
91 95
98
99
91 99
92
92
100 100 100 98 92
95
95
96
96 95
95 97
97
97
97 92
92
98
98
98
91
98 92
91
91
98 90
98 96 89
98
100
99 97
97 98
99
99
99
98 90
91
98
98
98
90
98 90
91
90
98 89
98
98
98 96 89
98 100
99 97
97 98
99
99
99
98 90
91
98
98
98
90
98 90
91
90
98 89
98
98
100 98
98 99 100
99
98
98
99
99 91
92
99
99
99
91
99 91
92
91
99 90
99 98 91
99
99
98 100
98
98 99 100
99
98
99
99 91
92
99
99
99
91
99 91
92
91
99 90
99 98 91
99
99
98
96
96
98
98
100 97
98
98
97 91
91
97
97
97
90
97 90
91
90
97 90
98 97 90
98
98
99
97
97
98
98 99
98
98
98
98 90
91
98
98
98
91
98 91
91
91
98 90
99 98 91
99
99
99
97
97
98
98 98
98
99
99
99 91
92
99
99
99
91
99 91
91
91
99 90
99 98 91
99
99
98
98
99
93
99
99
99
92
99 92
92
92
99 91
99 98
99 99
100
99 91
98
98
99
93
99
99
99
91
99 92
92
91
99 90
99 98
99 99 100
100 92
99
97
97
98
98 98
98 98
99
99
91
93
99
99
99
91
99 92
91
91
99 90
99 98 91
99
99
93
91
91
93
93 93
93 93
93
93
93
98
92
92
92
95
92 96
95
95
92 96
93 92 95
93
93
97
94
94
96
96 95
96 96
97
97
96 97
93
93
93
96
93 98
96
96
93 96
97 95 95
97
97
85
99 98
99 99 100 100
99 93
97
100 100
92 100 92
92 100 91
98
98
99
92
99 98
99 99 100 100
99 93
97 100
100
92 100 92
92 100 91
98
98
99
92
99 98
99 99 100 100
99 93
97 100 100
92 100 92
92 100 91
98
98
99
92
92
92
92 92 98
92
91 90
91 91
92
92
91 93
95
92
92
92
92 95
99 100
92 99
89
89
91
99 98
99 99 100 100
99 93
97 100 100 100
92
92 100 91
92
98
98
99
92
97
97
97 95 95
97
96 95
96 96
97
97
96 97 100
97
97
97
97
95
92 94
95
94
94
96
94
92
92
92 92 98
92
91 90
91 91
92
92
91 93
95
92
92
92 100
92 95
100
92 98
89
89
91
92
92
92 92 98
92
91 90
91 91
92
92
91 93
95
92
92
92 100
92 95 100
92 98
89
89
91
99 98
99 99 100 100
99 93
97 100 100 100
92 100 97
92
92
91
98
98
99
92
92
92 92 99
92
91 90
91 91
92
92
91 95
95
92
92
92
98
92 95
98
98
92
89
89
91
1: M1 = Trà Vinh
11: GTG (Việt Nam)
21: variant (Hoa Kỳ)
2: M2 = Hậu Giang 1
12: GTG25 (Việt Nam)
22: D78 (Luxembourg)
3: M3 = Hậu Giang 2
13: GTN (Việt Nam)
23: GLS (Hoa Kỳ)
4: M4 = An Giang
14: GT1ST (Việt Nam)
24: Cu-1wt (Đức)
5: M5 = Cần Thơ 1
15: GPT (Việt Nam)
25: HZ2 (Trung Quốc)
6: M6 = Cần Thơ 2
16: GHUT12 (Việt Nam)
26: JD1 (Trung Quốc)
7: M7 = Bến Tre 1
17: STC (Hoa Kỳ)
27: HuN11 (Trung Quốc)
8: M8 = Bến Tre 2
18: IM (Hoa Kỳ)
28: HN04 (Trung Quốc)
9: M9 = Vĩnh Long 1
19: YS07 (Trung Quốc)
10: M10 = Vĩnh Long 2
20: 9109 (Hoa Kỳ)
86
4.2.4 Xây dựng cây phả hệ của các chủng virus Gumboro phân lập được
trong nghiên cứu so với các chủng trong và ngoài nước.
Đoạn gene dùng xây dựng cây phả hệ của các chủng virus Gumboro thu thập được từ thực địa và 05 mẫu vaccine phân lập tại thực địa có chiều dài 389 nucleotide (634- 1022) mã hóa cho 128 amino acid vùng siêu biến đổi ở gene VP2. Phân tích dựa trên so sánh trình tự nucleotide gene kháng nguyên VP2 bằng chương trình MEGA6.0, sử dụng phương pháp “tiếp cận cực đại” (maximum likelihood, ML) với độ tin cậy bootstrap 1000 lần lặp lại (Kumar et al., 2016).
Các chủng M1, M2, M3, M6 thuộc chủng cường độc và có mối quan hệ gần gũi với các chủng phân lập tại Việt Nam (GT1ST, GPT), Trung Quốc (YS07, HuN11) và Mỹ (9109, variant, GLS). Các chủng M9, M10 có mối quan hệ gần gũi tại Việt Nam (GTN, GHUT12). Chủng M4 là một dạng biến chủng của M7, M8 và có mối quan hệ với các chủng đã phân lập tại Việt Nam (GTG, GTG25). M5 có mối quan hệ gần gũi với các chủng vaccine 2, vaccine 3, vaccine 4. Vaccine 1 có sự biến đổi độc lực theo chiều hướng giảm dần độc lực. Vaccine 5 có sự biến đổi độc lực theo hướng tăng dần (Hình 4.6). Do quá trình "nhược độc hóa" (biến đổi từ chủng cường độc thành độc lực yếu hơn); hoặc trở nên "vô độc"; hoặc "lại độc" (từ chủng nhược biến đổi độc trở lại thành cường độc), đều là hệ quả của một quá trình biến đổi có tính quy luật của bộ amino acid làm khung nằm trong nhóm quyết định kháng nguyên của protein VP2. Quy luật biến đổi amino acid khung của nhóm quyết định kháng nguyên được các công trình nghiên cứu chứng minh là xảy ra ở 9 vị trí có biến đổi amino acid khung bao gồm: vị trí 222, 242, 253, 256, 279, 284, 294, 299, và 329 của protein VP2 (Rodriguez-Chavez et al., 2002). Nghiên cứu Li Zan et al. (2015) cho rằng các dòng IBDV phổ biến ở Đông Á có sự tương đồng tại các vị trí biến đổi 253 và 284 và kết quả này cho thấy những thay đổi về độc lực của IBDV có thể là kết quả của cả sự tương tác lẫn sự tiến hóa thay thế amino acid ở các điểm độc lực.
Phân tích phả hệ một lần nữa khẳng định các mẫu virus thu thập được thuộc cùng một nhóm và có quan hệ nguồn gốc với một số chủng virus cường độc khác của Việt Nam và Châu Á. Điều này phù hợp với nhận định của (Lê Thanh Hòa, 2003a) các chủng IBDV cường độc ở Việt Nam có quan hệ cận vùng địa lý chặt chẽ với các chủng virus gây bệnh của Trung Quốc, các vùng kế cận và cũng phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị Kim Xuyến (2010).
87
Theo Yinju Li et al. (2009), nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài của 25 mẫu phân lập từ một trang trại trong giai đoạn 1989 – 2008. Phân tích bằng PCR
88
khuếch đại đoạn gene 714 bp của VP2 cho thấy tất cả các mẫu đều có nguồn gốc từ IBDV độc lực cao (vvIBDV) và có liên quan chặt chẽ hơn với chủng UK661. Từ năm 1999, phân lập được chủng XA1999 có các amino acid I228 và và các chủng T394, XA2000, XA2001, XA2002, và XA2003-09 có các amino acid E279. Từ năm 2004 đến năm 2008, các phân lập có các amino acid H320, I349, S375 và R381 trong khi đó virus UK661 có T228, D279, Q320, V349, P375, K381, và A394. Những đột biến này không làm thay đổi amino acid quan trọng cần thiết quy định độc lực của virus. Nó cho thấy một dòng IBDV độc lực cao có thể duy trì độc lực của nó trong một thời gian dài trong cùng một trang trại gà và tồn tại rất lâu trong môi trường bình thường.
Hình 4.6: Cây phả hệ xác định phân nhóm độc lực giữa chủng Gumboro Việt Nam và thế giới
89
(VC1: IBD Blen; VC2: Bur 706; VC3: Cevac Gumboro L; VC4: Georgia; VC5: Nobilis; vv: very virulent (độc lực cao); av: antigenic variant (biến đổi độc lực); at: attenuated (nhược độc)
4.3 Nội dung 3: Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch với 3 loại vaccine
Gumboro trên 2 giống gà nòi Bến Tre và Lương Phượng
4.3.1 Tỉ lệ đáp ứng miễn dịch giữa 2 giống gà và số lần tiêm phòng
Để biết được hàm lượng kháng thể từ gà mẹ truyền sang gà con trước khi phòng bệnh trong thí nghiệm, chúng tôi tiến hành phân tích kháng thể thụ động từ gà mẹ truyền qua khi gà được 3 ngày tuổi, trình bày ở Bảng 4.14
Bảng 4.14: Tỉ lệ kháng thể thụ động mẹ truyền của 2 giống gà.
Giống gà Số gà thí nghiệm Số gà có miễn dịch Tỉ lệ đáp ứng miễn dịch (%)
Lương Phương 30 26 86,6
Nòi Bến Tre 30 22 73,3
P = 0,853
Qua kết quả Bảng 4.14 cho thấy tỉ lệ gà có miễn dịch thụ động khi kiểm tra bằng phương pháp ELISA đối với gà Lương Phượng là 86,6% cao hơn gà nòi Bến Tre (73,3%). Có sự khác nhau về tỉ lệ đáp ứng miễn dịch thụ động giữa 2 giống gà có thể do gà Lương Phượng được nuôi tập trung và qui trình tiêm phòng thực hiện nghiêm ngặt nên tỉ tệ đáp ứng miễn dịch thụ động cao hơn gà nòi Bến Tre (có thể do nguồn trứng được thu gom tại nhiều hộ chăn nuôi nhỏ với qui trình tiêm phòng chưa được kiểm tra chặt chẽ). Tuy nhiên, qua phân tích thống kê không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức (P>0.05). Trong giai đoạn đầu của gà con, kháng thể thụ động được truyền từ gà mẹ đóng vai trò quan trọng và kháng thể này sẽ biến mất khi gà con được 25 ngày tuổi. Theo Simoes and Sarnow (1993), kháng thể thụ động có thể bảo hộ đàn gia cầm con khi tiếp xúc với một số mầm bệnh từ khi mới nở tới 2 tuần. Các kháng thể từ gia cầm mẹ truyền sang lưu hành trong máu sẽ tăng từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 3 khi lòng đỏ trứng bị hấp thụ.
90
Kháng thể truyền từ mẹ sang con (qua lòng đỏ trứng) có thể bảo vệ gà con chống lại sự nhiễm virus trong thời gian đầu. Skeeles et al. (1979) đã xác định kháng thể kháng virus Gumboro thụ động trong máu gà con giảm đi 1/2 sau 3 - 5 ngày. Khi hiệu giá kháng thể trung hòa nhỏ hơn 100 thì gà hoàn toàn mẫn cảm với virus Gumboro và phát bệnh khi gà bị nhiễm (Lucio and Hitchner, 1979). Kháng thể trung hòa thụ động có vai trò tích cực trong việc bảo hộ đàn gà con nhưng lại ức chế việc tạo ra miễn dịch chủ động bằng vaccine nhất là vaccine sống nhược độc. Để tiêm phòng đạt hiệu quả khi hiệu giá kháng thể thụ động phải thấp hơn 64.
Hiện nay, quan điểm chung của tất cả các chuyên gia trên thế giới cho rằng việc tiêm phòng cho gà con bằng vaccine nhược độc đang gặp trở ngại lớn nhất là kháng thể thụ động của gà mẹ truyền sang làm cho vaccine không có tác dụng và việc tiêm phòng không đem lại hiệu quả như mong muốn.
Trong khi các cơ chế miễn dịch bẩm sinh (tự nhiên) dường như có đầy đủ chức năng ở gà con mới nở, các phản ứng miễn dịch thích nghi (thu được) tối ưu chỉ phát triển trong tuần đầu sau khi nở và miễn dịch bẩm sinh giúp bảo vệ gà con cho đến khi phản ứng miễn dịch thích nghi có hiệu quả hoàn toàn (Davison et al., 2008). Ở gà con mới nở, các kháng thể có nguồn gốc từ mẹ biểu hiện sự suy giảm tuyến tính với thời gian bán hủy trung bình từ 5 đến 6 ngày. Fahey et al., (1989) đã báo cáo thời gian bán hủy là 6,7 ngày đối với các kháng thể thụ động mẹ truyền của IBDV. Nghiên cứu của Knoblich et al. (2000) và Alam et al. (2002), kết luận rằng tiêm phòng vaccine IBDV cho gà con 1 ngày tuổi có miễn dịch thụ động mẹ truyền không thúc đẩy quá trình giảm kháng thể mẹ truyền và không có sự gia tăng về hiệu giá kháng thể. Tuy nhiên, khi tiêm vaccine sau 14 ngày có sự gia tăng về hiệu giá kháng thể (Kumar et al., 2000).
Bảng 4.15: Tỉ lệ đáp ứng miễn dịch giữa các lần tiêm vaccine Gumboro (7 và 28 ngày tuổi)
Số lần Tổng số gà Tỉ lệ đáp ứng
Số gà có miễn dịch (con) tiêm phòng (con) miễn dịch (%)
Lần 1
18,3b Không tiêm phòng 60 11
62,2a Tiêm phòng lần 1 180 112
P = 0,001
Lần 2
11,7b Không tiêm phòng 60 7
86,6a Tiêm phòng lần 2 180 156
Các tỉ lệ mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê
P = 0,001
91
Qua kết quả bảng 4.15 cho thấy những gà được tiêm phòng 2 lần cho hiệu quả đáp ứng miễn dịch cao nhất 86,6%, kế đến là gà được tiêm vaccine phòng bệnh
Gumboro 1 lần có tỉ lệ 62,2% và gà không được tiêm phòng tỉ lệ đáp ứng miễn dịch thấp (18,3%) khi kiểm tra ở 21 ngày tuổi và (11,7%) khi kiểm tra lúc 42 ngày tuổi . Theo nghiên cứu của Nguyễn Hồng Minh và ctv (2011), khi gà không được tiêm phòng vaccine thì tại thời điểm 7 ngày tuổi đều âm tính qua xét nghiệm ELISA. Thời gian bán hủy của kháng thể mẹ truyền thường 4-5 ngày, cho nên ở 21 ngày tuổi hầu hết gà không còn kháng thể thụ động mẹ truyền hoặc còn tồn tại ở một số ít gà nhưng với hiệu giá rất thấp. Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa về hiệu quả đáp ứng miễn dịch giữa gà được tiêm và không tiêm phòng vaccine (P<0.05). Qua đó cho thấy gà có đáp ứng miễn dịch với vaccine đang sử dụng. Theo Lê Văn Năm (2004) sau khi tiêm vaccine từ 2 đến 3 tuần cơ thể sẽ tạo được miễn dịch vì kháng nguyên (vaccine) lúc đầu mới vào cơ thể đã kích thích hệ thống miễn dịch nhưng cơ thể không thể sản sinh ra ngay kháng thể mà phải trải qua một thời gian nhất định mới tạo được đáp ứng miễn dịch. Mặt khác, gà không được tiêm vaccine có được kháng thể là do trong quá trình thí nghiệm những gà này có thể bị nhiễm tự nhiên, nhưng hàm lượng kháng thể thấp không đủ bảo hộ cho đàn gà khi bị nhiễm bệnh. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với Trần Ngọc Bích và ctv (2016). Điều này có thể giải thích vaccine khi đưa vào cơ thể gà sẽ kích thích cơ thể tạo ra kháng thể, đây là loại kháng thể do cơ thể tạo ra nên nó có tính bền và lâu hơn, hơn nữa đây là loại vaccine nhược độc có khả năng gây đáp ứng miễn dịch mạnh, chúng nhân lên trong cơ thể vật chủ và tiếp tục tạo ra kích thích của kháng nguyên trong 1 khoảng thời gian (Nguyễn Bá Hiên, 2007).
4.3.2 Sự khác biệt đáp ứng miễn dịch giữa 2 giống gà, vaccine và số lần
tiêm phòng
Bảng 4.16: Sự khác biệt đáp ứng miễn dịch giữa 2 giống gà (7 và 28 ngày tuổi)
90
60
66,6
Lần 1
90
80
88,9
Lần 2
90
52
57,7
Lần 1
90
76
84,4
Lần 2
P = 0,921
Thời điểm lấy máu lần 1 = 21 ngày, lần 2 = 42 ngày
92
Qua Bảng 4.16 cho thấy giống gà nòi Bến Tre có tỉ lệ đáp ứng miễn dịch cao hơn giống gà Lương Phượng ở cả 2 lần tiêm phòng vaccine nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Thử nghiệm tiêm phòng vaccine lần 1 và 2 vào lúc 7 và 28 ngày tuổi, tỉ lệ đáp ứng miễn dịch ở gà nòi Bến Tre (66,6% và 88,9%) cao hơn gà Lương Phượng (57,7% và 84,4%). Ngoài ra, gà được tiêm vaccine 2 lần có tỉ lệ đáp ứng miễn dịch cao hơn gà được tiêm vaccine 1 lần và sự khác biệt này rất có ý nghĩa về mặt thống kê (P=0,001). Theo Nguyễn Hữu Nam (2007), khối lượng cơ quan miễn dịch của các giống gà địa phương nuôi theo hình thức thả vườn lớn hơn so với giống gà Lương Phượng nuôi công nghiệp, do đó khả năng đề kháng với bệnh nói chung của gà địa phương cao hơn các giống gà ngoại nhập. Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Trần Ngọc Bích và Nguyễn Thị Mỹ Hiệp (2013) cho thấy gà nòi có đáp ứng miễn dịch cao hơn gà Lương Phượng, gà tiêm vaccine lần 2 có đáp ứng miễn dịch lần 1 là do gà đã có trí nhớ miễn dịch nên đáp ứng miễn dịch tiêm phòng lần 2 (đáp ứng miễn dịch thứ cấp) sẽ cao hơn hơn so với gà tiêm phòng lần 1 do chưa có trí nhớ đáp miễn dịch (đáp ứng miễn dịch sơ cấp). Theo Nguyễn Hồng Minh và ctv (2011), công cường độc vào lúc 42 ngày tuổi sau khi gà được sử dụng vaccine 2 lần đều không bị tiêu chảy và không có bệnh tích ở túi Fabricius. Trong khi một tỉ lệ nhất định gà sử dụng 1 lần vaccine có bệnh tích xuất huyết cơ đùi, cơ ngực.
Bảng 4.17: Sự khác biệt đáp ứng miễn dịch giữa các chủng vaccine khi tiêm phòng cho gà lúc 7 và 28 ngày tuổi.
1 lần
60
36
60,0
60
38
63,3
60
38
63,3
2 lần
60
48
80,0
60
52
86,7
60
56
93,3
P = 0,887
Vaccine 1: IBD BLEN; Vaccine 2: Cevac Gumboro L; Vaccine 3: Nobilis
93
Kết quả Bảng 4.17 cho thấy tất cả các loại vaccine đều gây đáp ứng miễn dịch cho gà sau khi tiêm phòng. Gà được tiêm vaccine 1 lần có tỉ lệ đáp ứng miễn dịch giữa 3 loại vaccine thử nghiệm gần tương đồng nhau (60,0% – 63,3%) (P>0,05).
Gà được tiêm vaccine 2 lần cho đáp ứng miễn dịch cao nhất ở vaccine 3 (93,3%) và thấp nhất là vaccine 1 (80,0%), tuy nhiên sự khác biệt giữa các loại vaccine thí nghiệm không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Mặt khác, tỉ lệ đáp ứng miễn dịch giữa 2 lần tiêm có sự khác biệt là do khi tiêm vaccine lần 1 sẽ tác động lên hệ thống miễn dịch của cơ thể, kích thích sinh kháng thể, nhưng lượng kháng thể này thấp và không kéo dài. Khi tiêm vaccine lần 2, cơ thể đã hình thành trí nhớ miễn dịch do đó lượng kháng thể sinh ra nhiều và kéo dài (Stanislav et al., 2009; Nguyễn Hồng Minh và ctv, 2011). Kết quả ghi nhận được giống với kết luận của Hồ Thị Việt Thu (2012a), bệnh Gumboro thường xảy ra nhất ở các đàn không được tiêm vaccine, kế đến là các gà chỉ được tiêm vaccine một lần và gà được tiêm vaccine hai lần.
Bảng 4.18: Sự khác biệt đáp ứng miễn dịch giữa các chủng vaccine và giống gà (thời gian tiêm phòng lần 1 = 7 ngày tuổi, lần 2 = 28 ngày tuổi)
Lần 1
30
20
66,7
20
66,7
20
66,7
30
30
Lần 2
30
26
86,7
27
90,0
27
90,0
30
30
Nòi Bến Tre
Lần 1
30
16
53,3
18
60,0
18
60,0
30
30
Lương Phượng
Lần 2
30
22
73,3
25
83,3
29
96,7
30
30
Vaccine 1: IBD BLEN; Vaccine 2: Cevac Gumboro L; Vaccine 3: Nobilis
94
Thử nghiệm 3 loại vaccine trên 2 giống gà nòi Bến Tre và Lương Phượng được thể hiện qua Bảng 4.18. Kết quả cho thấy gà nòi Bến Tre có tỉ lệ đáp ứng miễn dịch cao hơn gà Lương Phượng ở cả 3 loại vaccine với 2 lần tiêm phòng. Vaccine 3 có tỉ lệ đáp ứng miễn dịch cao nhất trên 2 giống gà và ở 2 lần tiêm phòng, thấp nhất ở vaccine 1. Nghiên cứu của Trần Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương (2010), khi đưa vaccine vào cơ thể, kháng thể chưa sinh ra ngay mà phải sau một thời gian tiềm tàng, dài hay ngắn phụ thuộc vào kháng nguyên chứa trong vaccine và sự xâm nhập của kháng nguyên lần đầu hay lần thứ hai, thứ ba,...sau đó kháng thể mới được sinh ra, tăng dần đạt mức cao nhất sau 2 đến 3 tuần rồi giảm dần và mất đi sau vài tháng hoặc hàng năm. Ngoài ra, vaccine Gumboro được tiêm phòng
lần 1 vào cơ thể gà 1 phần vaccine sẽ bị trung hòa bởi kháng thể thụ động từ mẹ truyền nên lượng kháng thể giảm thấp, 1 phần kích thích cơ thể gà sinh đáp ứng miễn dịch (Võ Thị Ngọc Bích, 2015).
120
)
%
100
( h c ị d
80
60
Nòi Bến Tre
Lương Phượng
40
n ễ i m g n ứ p á đ ệ l ỉ
20
T
0
Lần 1
Lần 2
Lần 1
Lần 2
Lần 1
Lần 2
Vaccine 1
Vaccine 2
Vaccine 3
Hiện nay, vaccine sống IBD có một mức độ ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch, nhiều trong số chúng có thể gây ra teo túi Fabricius do đó gây ức chế miễn dịch làm cho đáp ứng miễn dịch kém với vaccine chống lại các mầm bệnh khác và làm tăng tính mẫn cảm đối với các loại nhiễm trùng khác nhau. Tùy thuộc vào đặc điểm nội tại của chúng hoặc vào quy trình tiêm phòng, một số vaccine có thể không tạo ra sự bảo vệ hoàn toàn chống lại các chủng IBDV rất độc và các biến thể kháng nguyên được quan sát thấy trong ba thập kỷ qua, điều này đã tạo ra sự thất bại trong tiêm phòng. Có ý kiến cho rằng sự phát triển của mầm bệnh trong vật chủ sẽ quyết định khả năng lây truyền mầm bệnh sang vật chủ mới và duy trì trong quần thể, do đó, sự hiểu biết thêm về sinh bệnh học IBDV và tương tác của nó với hệ thống miễn dịch bẩm sinh vẫn còn cần thiết để cung cấp cơ sở khoa học cho việc cải thiện quy trình tiêm phòng (Ingrao et al., 2013).
Hình 4.7: Tỉ lệ đáp ứng miễn dịch giữa giống gà và vaccine
95
Sử dụng vaccine chứa vi khuẩn biến đổi gây ra các phản ứng mẹ truyền giúp bảo vệ khoảng 73% đàn gà trước các chủng IBDV có độc lực (Mahmood et al., 2007). Vaccine sống tạo sự nhiễm trùng trong vật chủ, nó có thể gây ra cả miễn dịch tế bào và dịch thể. Vaccine sống được sử dụng phổ biến ở các trang trại vì không cần các chất bổ trợ để đạt hiệu quả, nhưng nó có những tác dụng phụ không mong muốn như sự di truyền điểm đột biến (ngang và dọc), sự đảo ngược độc tính
và phản ứng vaccine có thể dẫn đến bệnh hoặc ức chế miễn dịch (Schijns et al., 2008). Nguyên nhân của sự thất bại trong tiêm chủng vaccine sống là rất nhiều. Sự xuất hiện của các chủng virus biến thể gây ra thất bại trong quy trình tiêm phòng (Moemen et al., 2014). Hơn nữa, các mức độ suy giảm khác nhau của vaccine sống có bán trên thị trường đối với IBD dẫn đến mức độ ức chế miễn dịch khác nhau, tăng tính mẫn cảm với các bệnh cơ hội khác. Nói chung, hiệu quả của vaccine phụ thuộc nhiều vào liều lượng, chủng của vaccine, virus gây bệnh cũng như đường dùng, thời gian tiêm vaccine thích hợp và sự hiện diện của kháng thể mẹ truyền (OIE, 2012). Cải thiện hiệu quả sử dụng của vaccine bằng cách hướng đến các tế bào trình diện kháng nguyên để tăng hấp thu kháng nguyên và cần thiết để kiểm soát IBDV (Kazzaz et al., 2006).
96
Sử dụng vaccine sống để chống lại sự hiện diện của các kháng thể mẹ truyền đến sự hấp thu vaccine chống lại IBD là vấn đề lớn hiện nay (Block et al., 2007). Để ngăn chặn IBD hiệu quả hơn, các công nghệ mới và vắc-xin thế hệ tiếp theo đã được phát triển và đưa vào thị trường (Meeusen et al., 2007). Hầu hết các vaccine IBDV sống có bán trên thị trường đều dựa trên các chủng độc lực cổ điển. Chúng thường được xem là loại vaccine có độc lực yếu và chỉ có hiệu quả kém khi có miễn dịch bẩm sinh mạnh và chống lại IBDV độc lực cao. Vaccine tổ hợp có hiệu quả tốt trong phòng bệnh vì có thể vượt qua nồng độ cao các kháng thể có nguồn gốc từ mẹ, nhưng chúng có thể gây ra tổn thương bursal từ vừa đến nặng và do đó gây ra mức độ ức chế miễn dịch tương ứng (Kumar et al., 2000; Rautenschlein et al., 2005), nó không bảo vệ hoàn toàn gà chống lại sự lây nhiễm của các chủng độc lực cao (Rautenschlein et al., 2005) hoặc chủng biến đổi độc lực
5.1 Kết luận
Tình hình bệnh Gumboro trên một số đàn gà tại thời điểm nghiên cứu của một số tỉnh ĐBSCL cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh Gumboro của giống gà Tàu Vàng cao nhất (68,4%), thấp nhất là gà Nòi lai (28,8%). Bệnh xảy ra chủ yếu trên gà nuôi theo hình thức nhốt hoàn toàn và bán chăn thả (tương đương 57,1% và 55,0%), thấp nhất ở hình thức nuôi thả hoàn toàn (28,0%). Lứa tuổi gà mắc bệnh chủ yếu tập trung ở giai đoạn gà từ 3 đến 6 tuần tuổi (21 - 42 ngày tuổi). Gà không được tiêm vaccine có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất (66,7%), thấp nhất ở những đàn được tiêm nhắc lại lần hai (24,5%). Tại các tỉnh khảo sát, đàn gà nuôi tại Hậu Giang có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất (60,0%) và thấp nhất ở An Giang, (37,9%). Tỉ lệ chết của gà do bệnh Gumboro trong khảo sát này không cao (4,81%). Gà bị bệnh Gumboro đều xuất hiện triệu chứng bỏ ăn, ủ rũ xù lông, uống nhiều nước, gục đầu (100%). Đàn gà mắc bệnh có triệu chứng tiêu chảy phân trắng, xanh nhiều nước (94,9%), hậu môn dính đầy phân với tỉ lệ (77,9%), da chân khô với tỉ lệ (76,3%) thấp nhất là triệu chứng gà tự mổ vào hậu môn chiếm tỉ lệ (35,6%). Gà nhiễm bệnh Gumboro trên các đàn khảo sát cho bệnh tích đại thể trên các cơ quan rất điển hình đặc biệt là trên túi Fabricius và các cơ.
Kết quả giải trình tự nucleotide và amino aicd từ vị trí 634-1022 ở vùng siêu biến đổi của gene VP2 cho thấy các mẫu virus tại Hậu Giang, An Giang, Cần Thơ, Bến Tre, Vĩnh Long, Trà Vinh thuộc chủng có độc lực cao, những mẫu này đồng nhất hoàn toàn với các chủng GTG, GTG25, GTN, GT1ST, GPT, GHUT12 được phân lâp tại Việt Nam và các chủng HuN11, YS07 ở Trung Quốc. Qua phân tích thành phần amino acid của vùng siêu biến đổi gene VP2 mẫu M5, VC2, VC3, VC4 thuộc nhóm nhược độc, mẫu VC1 thuộc nhóm biến đổi độc lực theo chiều nhược độc và VC5 thuộc nhóm biến đổi độc lực theo chiều tăng độc
97
Đáp ứng miễn dịch với 3 loại vaccine Gumboro được lựa chọn từ kết quả ở nội dung 2 trên 2 giống gà (Lương Phượng, nòi Bến Tre). Kết quả cho thấy miễn dịch thụ động của giống gà Lương Phượng là 86,6% cao hơn giống gà nòi Bến Tre (73,3%). Gà được tiêm phòng 2 lần cho hiệu quả đáp ứng miễn dịch cao nhất 86,6% và 1 lần là 62,2%. Giống gà nòi Bến Tre có tỉ lệ đáp ứng miễn dịch cao hơn giống gà Lương Phượng ở cả 2 lần tiêm phòng vaccine nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Tất cả các loại vaccine đều gây đáp ứng miễn dịch cho gà sau khi tiêm phòng. Gà được tiêm vaccine 1 lần có tỉ lệ đáp ứng miễn dịch giữa 3 loại vaccine thử nghiệm gần tương đồng nhau (60,0% – 63,3%). Gà được tiêm vaccine 2 lần
cho đáp ứng miễn dịch cao nhất ở vaccine 3 (93,3%) và thấp nhất là vaccine 2 (80,0%), tuy nhiên không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức.
5.2 Đề nghị
Nhà chăn nuôi cần bảo vệ tốt cho đàn gà nuôi qua từng giai đoạn tuổi nhất gà giai đoạn gà 3 – 6 tuần tuổi. Cần chú trọng việc chủng ngừa cho đàn gà bố mẹ nhằm tạo kháng thể thụ động cho đàn gà con là rất quan trọng.
Sử dụng vaccine 3 tại nội dung 3 cho việc phòng bệnh vì đây là vaccine thuộc
nhóm có sự biến đổi độc lực theo hướng tăng dần.
98
Tiếp tục nghiên cứu sự biến đổi vùng gene VP2 của virus Gumboro thực địa, làm cơ sở tạo nguồn vaccine thế hệ mới phù hợp với các chủng virus đang lưu hành
Tiếng Anh
Abdu, M. A., R.T. Medeiros, J.H.A. Sobral and J.A. Bittencourt, 1986. Spread F plasma vertical rise velocities determined from spaced ionososnde observations. Journal of Geophysical Research, 88, 9197-9204.
Abdel-Alem, G.A., M.H.H. Awad and Y.M. Saif, 2003. Characterization of Egyptian field strains of infectious bursal disease virus. Avian Diseases, 47: 1452- 1457.
Adewuyi, O.A., O.A. Dumjaiye and D.F. Adene, 1989. The status of guinea fowls (Nurnida meleagris) in the epidemiology of infectious bursal disease (IBD) of poultry in Nigeria. Journal of Veterinary Medicine, Series B, 36: 43-48.
Alam, J., M.M. Rahman, B.K. Sil, M.S.R. Khan and M.S.K. Sarker, 2002. Effect of maternally derived antibody on vaccination against infectious bursal disease (Gumboro) with live vaccine in broiler. International Journal of Poultry Science, 1(4): 98-101.
Alkhalaf, A.N, 2009. Detection of variant strains of infectious bursal disease virus in broiler flocks in Saudi Arabia using antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay. Pakistan Veterinary Journal, 29(4): 161-164.
Allan, W.H., J.T. Faragher and G.A. Cullen, 1972. Immunosuppression by the infectious bursal agent in chickens immunised against Newcastle disease. Veterinary Record, 90: 5112.
Antczak, J.B., R. Chemelo, D.J. Pickup and W.K. Joklik, 1982. Sequences in both termini of the ten genes of reovirus serotype 3 (strain Dearing). Virology Journal, 121: 307-319.
99
Aricibasi, M., A. Jung, E.D. Heller and S. Rautenschlein, 2010. Differences in genetic background influence the induction of innate and acquired immune responses in chickens depending on the virulence of the infecting infectious bursal disease virus (IBDV) strain. Veterinary Immunology and Immunopathology, 135: 79–92.
Azad, A.A., M.N. Jagadish, M.A. Brown and P.J. Hudson, 1987. Delerion mapping and expression in E. coli of the large geneomic segment of a Birnavirus. Virology Journal, 161: 145-151.
Bais, M.V., R.S. Kataria, A.K. Tiwari, K.N. Viswas, A.V. Reddy, N. Prasad, 2004. Sequence analysis of an Indian field isolate of infectious bursal disease virus shows six unique amino acid changes in the VP1 gene. Veterinary Research Communications, 28: 641-646.
Becht, H., H. Miller and K. Muller, 1988. Comparative studies on structural and antigenic properties of two serotypes of infectious bursal disease virus. Journal of General Virology, 69: 631-640.
Ben, A.N., N. Khabouchi and H. Mardassi, 2008. Efficient rescue of infectious bursal disease virus using a simplified RNA polymerase II-based reverse genetics strategy. Archives of Virology, 153: 1131-11377.
Besseboua, O., A. Ayad and H. Benbarek, 2015. Determination of the optimal time of vaccination against infectious bursal disease virus (Gumboro) in Algeria. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 82(1): 01-06
Block, H., K. Meyer-Block, D.E. Rebeski, H. Scharr, S. de Wit, K. Rohn and S. Rautenschlein, 2007. A field study on the significance of vaccination against infectious bursal disease virus (IBDV) at the optimal time point in broiler flocks with maternally derived IBDV antibodies. Avian Pathology, 36: 401 – 409.
Boot, H.J., A.H.T. Huurne and B.P. Peeters, 2000a. Generation of full-length cDNA of the two genomic dsRNA segments of infectious bursal disease virus. Journal of Virological Methods, 84: 49-58.
Boot, H.J., A.A.T. Huurne, A.J. Hoekman, B.P. Peeters and A.L. Gielkens, 2000b. Rescue of very virulent and mosaic infectious bursal disease virus from cloned cDNA: VP2 is not the sole determinant of the very virulent phenotype. Journal of Virology, 74: 6701–6711.
Box, P.G., 1989. High maternal antibodies help chicks beat virulent virus.
World Poult, 53: 17-19
100
Brandt, M., K. Yao, M. Liu, R.A. Heckert and V.N. Vakharia, 2001. Molecular determinants of virulence, cell tropism and pathogenic phenotype of infectious bursal disease virus. Journal of Virology, 75: 11974 – 11982.
Caston, J.R., J.L. Martinez-Torrecuadrada, A. Maraver, E. Lombardo, J.F. Rodriguez, J.I. Casal and J.L. Carrascosa, 2001. C terminus of infectious bursal disease virus major capsid protein VP2 is involved in definition of the T number for capsid assembly. Journal of Virology, 75: 10815-10828.
Cheville, N.F., 1967. Study on pathogensis of gumboro disease in the bursal of fabricius, speen and thymus of the chicken. Journal of Pathology, 51: 527 – 551.
Chevalier, C., J. Lepault, I. Erk, B. Da Costa and B. Delmas, 2002. The maturation process of pVP2 requires assembly of infectious bursal disease virus capsids. Journal of Virology, 76: 2384-2392.
Ciriaco, E., P.P. Pinera, B. Diaz-Esnal and R. Laura, 2003. Age-related changes in the avian primary lymphoid organs (thymus and bursa of Fabricius). Microscopy Research and Technique, 62: 482-487.
Cowen, B.S. and M.O. Braune, 1988. The propagation of avian viruses in a continuous cell-line (QT-35) of Japanese quail origin. Avian Diseases, 32: 282- 297.
Da Costa, B., C. Chevalier, C. Henry, J.C. Huet, S. Petit, J. Lepault, H. Boot and B. Delmas, 2002. The capsid of infectious bursal disease virus contains several small peptides arising from the maturation process of pVP2. Journal of Virology, 76: 2393-2402.
Davison, F., K.E. Magor and B. Kaspers, 2008. Structure and evolution of avian immunoglobulins. In F. Davison, B. Kaspers and K.A. Schat (Eds.). Avian Immunology 1st edn, London: Academic Press, 107 - 128
Deng, X.Y., Y.L. Gao, H.L. Gao, X.L. Qi, X.Y. Wang and X.M. Wang, 2007a. Identification of VP3 antigenic nhóm quyết định kháng nguyêns of infectious bursal disease virus. Chinese Journal of Virology, 23: 305-311.
Deng, X.Y., Y.L. Gao, H.L. Gao, X.L. Qi, Y. Cheng, X.Y. Wang and X.M. Wang, 2007b. Antigenic structure analysis of VP3 of infectious bursal disease virus. Virus Research, 129: 35- 42.
Dobos. P., B.J. Hill, R. Hallet, D.T.C. Kells and H. Becht, 1979. Biophysical and biochemical characterization of five animal viruses with bisegmented double- stranded RNA genomes. Journal of Virology, 32: 593 – 605.
101
Eterradossi, N., C. Arnauld, D. Toquin and G. Rivallan, 1992. Critical amino acid changes in VP2 variable domain are associated with typical and atypical
antigenicity in very virulent infectious bursal disease viruses. Archives of Virology, 143: 1627-1636.
Eterradossi, N. and Y.M. Saif, 2008. Infectious bursal disease. In: Saif Y.M., Fadly A.M., Glisson J.R., McDougald L.R., Nolan L.K., Swayne D.E., editors. Diseases of Poultry. 12th ed. Wiley-Blackwell; Ames, IA, USA: 185–208.
Eterradossi, N. and Y.M. Saif, 2013. Infectious bursal disease. In: Swayne DE, Glisson JR, McDougald LR, Nolan LK, Suarez DL, Nair VL (Eds.). Diseases of Poultry, 13: 219–246.
Fahey, K.J., K. Erny and J. Crooks, 1989. A conformational immunogen on VP2 of infectious bursal disease virus that induces virus-neutralizing antibodies that passively protect chickens. Journal of General Virology, 70: 1473-1481.
Jackwood, D.J. and S. Sommer-Wagner, 2007. Genetic characteristics of infectious bursal disease viruses from four continents. Virology Journal, 365: 369- 375.
Jackwood, D.J., B. Sreedevi, L.J. Lefever and S. Sommer-Wagner, 2008. Studies on naturally occurring infectious bursal disease viruses suggest that a single amino acid substitution at position 253 in VP2 increases pathogenicity. Virology Journal, 377(1): 110-116.
Jackwood, D.J. and S. Sommer-Wagner, 2011. Amino acids contributing to antigenic drift in the infectious bursal disease Birnavirus (IBDV). Virology Journal, 409(1): 33–37.
Jakka, P., Y.K. Reddy, J.J. Kirubaharan and N.D. Chandran, 2014. Evaluation of immune responses by live infectious bursal disease vaccines to avoid vaccination failures. European Journal of Microbiology and Immunology, 4(2): 123–127.
Jayasundara, J.M., S.W. Walkden-Brown, M.E. Katz, A.F. Islam, K.G. Renz, J. McNally and P.W. Hunt, 2016. Pathogenicity, tissue distribution, shedding and environmental detection of two strains of IBDV following infection of chickens at 0 and 14 days of age. Avian Pathology, 46: 1–14.
Jeon, W.J., E.K. Lee, S.J. Joh, J.H. Kwon, C.B. Yang, Y.S. Yoon and K.S. Choi, 2008. Very virulent infectious bursal disease virus isolated from wild birds in Korea: Epidemiological implications. Virus Research, 137(1): 153-156.
102
Gallardo, R.A., R. Carrasco-Medanic, H. Zhou, S. Lyu, Y. Wang, P.R. Woolcock and F.J. Hoerr, 2014. Effects of challenge with very virulent infectious
bursal disease virus reassortants in commercial chickens. Avian Diseases, 58: 579– 586
He, X., P. Wei, X. Yang, D. Guan, U.G. Wang and A. Qin, 2012. Molecular epidemiology of infectious bursal disease viruses isolated from Southern China during the years 2000- 2010. Virus Gene. 45: 1-10.
He X., Z. Xiong, L. Yang, D. Guan, X. Yang and P. Wei, 2014. Molecular epidemiology studies on partial sequences of both genome segments reveal that reassortant infectious bursal disease viruses were dominantly prevalent in southern China during 2000–2012. Archives of Virology, 159:3279–3292.
Hebata Allah Mahgoub, 2012. An overview of infectious bursal disease.
Archives of Virology, 157: 2047–2057
Heine, H.G., M. Haritou, P. Failla, K. Fahey and A.A. Azad, 1991. Sequence analysis and expression of the host-protective immunogen VP2 of a variant strain of infectious bursal disease virus which can circumvent vaccination with standard type 1 strains. Journal of General Virology, 72: 1835-1843.
Helmboldt, C.F. and E. Garner, 1964. Experimentally-induced Gumboro
disease (IBA). Avian Diseases, 8: 61-76.
Hernández, M., A. Banda, D. Hernández, F. Panzera and R. Pérez, 2006. Detection of very virulent strains of infectious bursal disease virus (vvIBDV) in commercial broilers from Uruguay. Avian Diseases, 50: 624-631.
Hitchner, S.B., 1970. Infectivity of infectious bursal disease virus for
embrionating egg. Poultry Science Association, 49: 511-516.
Hirai, K., K. Kunihiro and S. Shimakura, 1979. Characterization of immunosuppression in chickens by infectious bursal disease virus. Nucleic Acids Research, 14: 5001-5010.
Hosseini, S.D., A.R. Omar and I. Aini, 2004. Molecular characterization of
an infectious bursal disease virus isolate from Iran. Virology Journal, 48: 79–83.
Ingrao, F., F. Rauw, B. Lambrecht and T. van den Berg, 2013. Infectious Bursal Disease: A complex host-pathogen interaction. Developmental and Comparative Immunology, 41 : 429–438.
103
Islam, M.R., K. Zierenberg and H. Muller, 2001a. The genome segment B encoding the RNA-dependent RNA polymerase protein VP1 of very virulent
infectious bursal disease virus (IBDV) is phylogentically distinct from that of all other IBDV strains. Archives of Virology, 146: 2481-2492.
Islam, M.R., K. Zierenberg, N. Eterradossi, D. Toquin, G. Rivallan and H. Muller, 2001b. Molecular and antigenic characterization of Bangladeshi isolates of infectious bursal disease virus demonstrate their similarities with recent European, Asian and African very virulent strains. Journal of Veterinary Medicine, 48b: 211- 221.
Islam, M.N., S.M.H. Rashid, M.F. Hoque, M.S.B. Juli and M. Khatun, 2008. Pathogenicity of IBDV related to outbreaks in the vaccinated flocks and the causes of vaccination failure. Journal of Innovation and Development Strategy, 2: 22 – 30.
Kasanga, C.J., T. Yamaguchi, P.N. Wambura, A.D. Maeda-Machang'u, K. Ohya and H. Fukushi, 2007. Molecular characterization of infectious bursal disease virus (IBDV): diversity of very virulent IBDV in Tanzania. Archives of Virology, 152(4): 783-790.
Kasanga, C.J., T. Yamaguchi, P.N. Wambura, H.M. Munang'andu, K. Ohya and H. Fukushi, 2008. Detection of infectious bursal disease virus (IBDV) genome in free-living pigeon and guinea fowl in Africa suggests involvement of wild birds in the epidemiology of IBDV. Virus Genes, 36(3): 521-5299.
Kazzaz, J., M. Singh, M. Ugozzoli, J. Chesko, E. Soenawan and D.T. O’Hagan, 2006. Encapsulation of the immune potentiators MPL and RC529 in PLG microparticles enhances their potency. Journal of Controlled Release, 110(3): 566–573.
Kibenge, F.S.B., D.J. Jackwood and C.C. Mercado, 1990. Nucleotide sequence analysis of genome segment A of infectious bursal disease virus. Journal of General Virology, 71: 569-577.
Kibenge, F.S.B., P.K. Mckenna and J.K. Dybing, 1991. Genomic cloning and analysis of the large RNA segment (segment A) of a naturally avirulent serotype 2 infectious bursal disease virus. Virology Journal, 184: 437- 440.
104
Kibenge, F.S.B., M.M. Nagarajan and B. Qian, 1996. Determination of the 5' and 3' terminal noncoding sequences of the bisegmented genome of the Avibirnavirus infectious bursal disease virus. Archives of Virology, 141: 1133- 1141.
Kibenge, F.S.B. and V. Dhama, 1997. Evidence that virion-associated VP1 of Avibirnavirus es contains viral RNA sequences. Archives of Virology, 142: 1227-1236.
Kibenge, F.S.B., B. Qian, E. Nagy, J.R. Cleghorn and D. Wadowska, 1999. Formation of virus-like particles when the polyprotein gene (segment A) of infectious bursal disease virus is expressed in insect cells. Canadian Journal of Veterinary Research, 63: 49-55
Kim, I.J., S.K. You, H. Kim, H.Y. Yeh and J.M. Sharma, 2000. Characteristics of bursal T lymphocytes induced by infectious bursal disease virus. Journal of Virology, 74: 8884-8892.
Knoblich, H.V., S.E. Sommer and D.J. Jackwood, 2000. Antibody titers to infectious bursal disease virus in broiler chicks after vaccination at one day of age with infectious bursal disease virus and Marek's disease virus. Avian Diseases, 44: 874 – 884.
Kumar, K., K.C.P. Singh and C.B. Prasad, 2000. Immune response to intermediate strain IBD vaccine at different levels of maternal antibody in broiler chickens. Tropical Animal Health and Production, 32: 357 – 360.
Kumar, S., G. Stecher and K. Tamura, 2016. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Molecular Biology and Evolution, 33(7): 1870–1874.
Kulkarui, D.D., B.B. Deshpande, M.B. Gujar and M.N. Kulkarui, 1982. Histopathologycal boservations in bursa of fabricius of chick infected with infectius bursal disease. Indian Journal of Veterinary Pathology, 6: 13-15.
Landgraf, H., E. Velitz and R. Kirsch, 1967. Studies on the occurrence of aninfectious disease affecting the bursal of Fabricius (Gumboro disease). Dtsch Tierarztl Wochenschr, 74: 6-10.
Lazarus, D., M. Pasmanik-Chor, B. Gutter, G. Gallili, M. Barbakov, S. Krispel and J. Pitcovski, 2008. Attenuation of very virulent infectious bursal disease virus and comparison of full sequences of virulent and attenuated strains. Avian Pathology, 37: 151-159.
105
Le, N.C., G. Rivallan, D. Toquin and N. Eterradossi, 2005. Significance of the genetic relationships deduced from partial nucleotide sequencing of infectious
bursal disease virus genome segments A or B. Archives of Virology, 150(2): 313– 325.
Lejal, N., B. Da Costa, J.C. Huet and B. Delmas, 2000. Role of Ser-652 and Lys-692 in the protease activity of infectious bursal disease virus VP4 and identification of its substrate cleavage sites. Journal of General Virology, 81: 983- 992.
Leong, J.C., D. Brown, P. Dobos, F. Kibenge, J.E. Ludert, H. Muller, E. Mundt and B. Nicholson, 2000. Virus taxonomy classification and nomenclature of viruses. Academic Press, 3: 481-490.
Letzel, T., F. Coulibaly, F.A. Rey, B. Delmas, E. Jagt, A.A. Van Loon and E. Mundt, 2007. Molecular and structure bases for the antigenicity of VP2 of infectious bursal disease virus. Journal of Virology, 81(23): 12827-12835.
Li Zan, Qi XiaoLe, Ren XianGang, Cui Lei, Wang XiaoMei and Zhu Ping, 2015. Molecular characteristics and evolutionary analysis of a very virulent infectious bursal disease virus. Science China Life Sciences, 58(8): 731–738.
Lin, Z., A Kato, Y. Otaki, T. Nakamura, E. Sasmaz and S. Ueda, 1993. Sequence comparasion of a highly virulent infectious bursal disease virus prevalent in Japan. Avian Diseases, 315-323.
Lombardo, E., A. Maraver, I. Espinosa, A. Fernandez-Arias and J.F. Rodriguez, 2000. VP5, the nonstructural polypeptide of infectious bursal disease virus, accumulates within the host plasma membrane and induces cell lysis. Virology Journal, 277: 345-357.
Lu, Z., L. Zhang and N. Wang, 2015. Naturally occurring reassortant
infectious bursal disease virus in northern China. Virus Research, 203: 92–95.
Lucio, B., and S.B. Hitchner, 1979. Infectious bursal disease emulsified vaccine: Effect upon neutralizing -antibody levels in the dam and subsequent protection of the progeny. Avian Diseases, 23: 466-478.
Lukert, P.D. and Y.M. Saif, 2003. Infectious bural disease. In: Saif, Y.M., H.J. Barnes, J.R. Glission, A.M. Fadly and L.R. Mc Dougald (Editors). Disease of poultry, 11th edition. Iowa State Press. Ames, Iowa. 1080 pages
106
Luque, D., I. Saugar, J.F. Rodríguez, N. Verdaguer, D. Garriga, C.S. Martín, J.A. Velázquez-Muriel, B.L. Trus, J.L. Carrascosa and J.R. Castón, 2007. Infectious bursal disease virus capsid assembly and maturation by structural
rearrangements of a transient molecular switch. Journal of Virology, 81: 6869- 6878.
Luo, J., G.P. Zhang, J.M. Fan, M. Teng, L.M. You, L. Zhou, R.G. Deng, X.N. Wang, Y.Y. Yang, L. Wang, G.X. Xing and N. Cheng, 2009. Infectivity and propagation of attenuated infectious bursal disease virus in the chicken Blymphocyte cell line DT40. Archives of Virology, 154: 513-517.
Mahmood, M.S., I. Hussain, M. Siddique, M. Akhtar and S. Ali, 2007. DNA vaccination with VP2 gene of very virulent infectious bursal disease virus (vvIBDV) delivered by transgenic E. coli DH5 alpha given orally confers protective immune responses in chickens. Vaccine, 25: 7629 – 7635.
Maire, C., L. Renault, A. Alamagny and M. de Breuille, 1969. Existence de la maladie de Gumboro en France. Recueil de Médecine Vétérinaire de l'Ecole d'Alfort, 145: 875-884.
Martin, A.M., F. Fallacara, I. Barbieri, G. Tosi, G. Rivallan, N. Eterradossi, R. Ceruti and P. Cordioli, 2007. Genetic and antigenic characterization of infectious bursal disease viruses isolated in Italy during the period 2002-2005. Avian Diseases, 51(4): 863-872.
Mc Ferran, J.B., M.S. Mc Nulty, W.F. Odenwale, T.J. Conner, R.M. Mc Cracker, D.S. Collin and G.M. Allan, 1980. Isolation and serological studies with infectious bursal disease viruses from 10 weeks turkey and duck, Demonstration of second serotypes. Avian Pathology, 9: 395-404.
Meeusen, E.N.T., J. Walker, A. Peters, P.P. Pastoret and G. Jungersen, 2007. Current status of veterinary vaccines. Clinical Microbiology Reviews, 20: 489 – 510.
Mickael, C.S. and D.J. Jackwood, 2005. Real-time RT-PCR analysis of two epitope regions encoded by the VP2 gene of infectious bursal disease viruses. Journal of Virological Methods, 128: 37–46.
Michel, L.O. and D.J. Jackwood, 2017. Classification of infectious bursal
disease virus into geneogroups. Archives of Virology, 162(12): 3661–3670.
107
Moemen, A.M., E.S. Kamal, M.B. Bakhit and M.S. Marwa, 2014. Genetic Characterization of Infectious Bursal Disease Viruses Associated with Gumboro Outbreaks in Commercial Broilers from Asyut Province, Egypt. Hindawi
Publishing Corporation ISRN Veterinary Science Volume 2014, Article ID 916412, 9 pages
Moody, A., S. Sellers and N. Bumstead, 2000. Measuring infectious bursal disease virus RNA in blood by multiplex real-time quantitative RT-PCR. Journal of Virological Methods 85: 55-64.
Muller, H., C. Scholtissek and H. Becht, 1979. The genome of infectiousbursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA. Journal of Virology, 31: 584-589.
Muller, H. and H. Lange, 1985. Interfering of avian infectious bursitis virus. Berichtdes 16 kongresses der deutsche veterinar medizinischen gesellschaft, 17(20): 127-130
Muller, H. and R. Nitschke, 1987. The two segments of the infectious bursal disease virus genome are circularized by a 90.000 da protein. Virology Journal, 159: 174- 177
Muller H., M.R. Islam and R. Raue, 2003. Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future. Veterinary Microbiology, 97(1-2): 153- 165.
Muller, H., E. Mundt, N. Eterradossi and M.R. Islam, 2012. Current status of
vaccines against infectious bursal disease. Avian Pathology, 41: 133-199.
Mundt, E. and H. Muller, 1995. Complete nucleotide sequences of 5-and 3- noncoding regions of both genome segments of different strains of infectious bursal disease virus. Virology Journal, 209:10-18.
Mundt, E., N. de Haas and A.A. van Loon, 2003. Development of a vaccine for immunization against classical as well as variant strains of infectious bursal disease virus using reverse genetics. Vaccine, 21: 4616-4624.
Negash, T., E. Gelaye, H. Petersen, B. Grummer and S. Rautenschlein, 2012. Molecular evidence of very virulent infectious bursal disease viruses in chickens in Ethiopia. Avian Diseases, 56(3): 605–610.
108
Ndashe, K., E. Simulundu, B.M. Hang'ombe, L. Moonga, H. Ogawa, A. Takada and A.S. Mweene. 2016. Molecular characterization of infectious bursal disease viruses detected in vaccinated commercial broiler flocks in Lusaka, Zambia. Archives of Virology, 161(3): 513–519.
Nunoya, T., Y. Otaki, M. Tajima, M. Hiraga and T. Saito, 1992. Occurrence of acute infectious disease with high mortality in Japan and pathogenicity of field isolates in SPF chicken. Avian Diseases 36: 597-609.
Oña, A., D. Luque, F. Abaitua, A. Maraver, J.R. Castón and J.F. Rodríguez, 2004. The C-terminal domain of the pVP2 precursor is essential for the interaction between VP2 and VP3, the capsid polypeptides of infectious bursal disease virus. Virology Journal, 322: 135-142.
OIE (World Organization for Animal Health), 2008. Infectious bursal disease (Gumboro disease). Chapter 2.3.12. In: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 549-565.
OIE (World Organization for Animal Health), 2012. Office of International des Epizooties. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Infectious Bursal Disease, 12: 549-65
Petkov, D., E. Linnemann, D.R. Kapczynski and H.S. Sellers, 2007. Full- length sequence analysis of four IBDV strains with different pathogenicities. Virus Genes, 34(3): 315-326.
Pitcovski, J., B. Gutter, G. Gallili, M. Goldway, B. Perelman, G. Gross, S. Krispel, M. Barbakov and A. Michael, 2003. Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens. Vaccine, 21: 4736-4743.
Pitesky, M., K. Cataline, B. Crossley, M. Poulos, G. Ramos, D. Willoughby, P. Woolcock, G. Cutler, M. Bland and J. Tran, 2013. Historical, spatial, temporal, and time-space epidemiology of very virulent infectious bursal disease in California: a retrospective study 2008–2011. Avian Diseases, 57(1): 76–82.
Pooja Kundu, G. Narang, Rajesh Chhabra, Sushma Kajal, N.K. Mahajan and Naresh Kakkar, 2017. Immune response study to live infectious bursal disease vaccines in broiler chickens. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 6(12): 2655-2668.
109
Ramirez-Nieto, G., H.L. Shivaprasad, C.H. Kim, H.S. Lillehoj, H. Song, I.G. Osorio and D.R. Perez, 2010. Adaptation of a mallard H5N2 low pathogenicity influenza virus in chickens with prior history of infection with infectious bursal disease virus. Avian Diseases, 54(1): 513–521.1
Rautenschlein, S., H.Y. Yeh, M.K. Njenga and J.M. Sharma, 2002. Role of intrabursal T cells in infectious bursal disease virus (IBDV) infection: T cells promote viral clearance but delay follicular recovery. Archives of Virology, 147: 285-304.
Rautenschlein, S., C. Kraemer, J. Vanmarcke and E. Montiel, 2005. Protective efficacy of intermediate and intermediate plus infectious bursal disease virus (IBDV) vaccines against very virulent IBDV in commercial broilers. Avian Diseases, 49: 231 – 237
Raue, R., M.R. Islam, M.N. Islam, K.M. Islam, S.C. Badhy, P.M. Das and H. Muller, 2004. Reversion of molecularly engineered, partially attenuated very virulent infectious bursal disease virus during infection of commercial chickens. Avian Pathology, 33: 181-189.
Rodriguez-Chavez,
I.R., J.K. Rosenberger and S.S. Cloud, 2002. Characterization of the antigenic, immunogenic, and pathogenic variation of infectious bursal disease virus (IBDV) due to propagation in different host systems (bursa, embryo, and cell culture). I. Antigenicity and immunogenicity. Avian Pathology, 31: 463–471.
Rodriguez-Chavez, I. R., J. K. Rosenberger, S. S. Cloud and C. R. Pope, 2002. Characterization of the antigenic, immunogenic and pathogenic variation of infectious bursal disease virus due to propagation in different host systems (bursa, embryo and cell culture). Avian Pathology, 31:485-92.
Rodríguez-Lecompte, J.C. and F.S. Kibenge, 2002. Site-directed mutagensis
of Avibirnavirus VP4 gene. Virology Journal, 292: 241-246.
Rosenberger, J.K. and S.S. Cloud, 1986. Isolation and characterization of variant infectious bursal disease viruses (Abstract no. 181), Proc 123rd Annu Meet Am Vet Med Assoc.
Rudd, M.F., H.G. Heine, S.I. Sapats, L. Parede and J. Ignjatovic, 2002. Characterisation of an Indonesian very virulent strain of infectious bursal disease virus. Archives of Virology, 147: 1303–1322.
110
Sa, E.S.M., D.R, Rissi and D.E. Swayne, 2016. Very virulent infectious bursal disease virus produces more-severe disease and lesions in specific-pathogen-free (SPF) Leghorns than in SPF broiler chickens. Avian Diseases, 60: 63–66
Saif, Y.M., 2004. Control of infectious bursal disease virus by vaccination.
Developmental Biology, 119: 143 - 146
Schnitzler, D., F. Bernstein, H. Muller and H. Becht, 1993. The genetic basis for the antigenicity of the VP2 protein of the infectious bursal disease virus. Journal of General Virology, 74: 1563-1571.
Schröder, A., A.A. Van Loon, D. Goovaerts, J.P. Teifke and E. Mundt, 2001. VP5 and the N terminus of VP2 are not responsible for the different pathotype of serotype I and II infectious bursal disease virus. Journal of General Virology, 82: 159-169.
Schijns, V.E.J.C., J. Sharma and I. Tarpy, 2008. Practical aspects of poultry vaccination. In F. Davison, B. Kaspers and K.A. Schat (Eds.). Avian Immunology 1st edn, London: Academic Press, 373 – 393.
Sharma, J.M., I.J. Kim, S. Rautenschlein and H.Y. Yeh, 2000. Infectious immunosuppression.
bursal disease virus of chickens: pathogensis and Developmental and Comparative Immunology, 24(2-3): 223-235
Shi, L., H. Li, G. Ma, J. Zhou, L. Hong, X. Zheng, Y. Wu, Y. Wang and Y. Yan, 2008. Competitive replication of different genotypes of infectious bursal disease virus on chicken embryo fibroblasts. Virus Genes, 39: 46-52.
Shwed, P.S., P. Dobos, L.A. Cameron, V.N. Vakharia and R. Duncan, 2002. Birnavirus VP1 proteins form a distinct subgroup of RNA-dependent RNA polymerases lacking a GDD motif. Virology Journal, 296: 241-250.
Skeeles, J.K., M.E. Slavik, Y.N. Beasley, H. Brown, C.F. Meinecke, S. Maruca and Weich, 1979. An age-related coagulation disorder associated with experimental infection with infectious bursal disease virus. American Journal of Veterinary Research, 41(9): 458-461.
Silva, F.M., P.M. Vidigal, L.W. Myrrha, J.L. Fietto, A.Jr. Silva and M.R. Almeida, 2013. Tracking the molecular epidemiology of Brazilian infectious bursal disease virus (IBDV) isolates. Infection Genetics and Evolution, 13: 18–26.
Simoes, E.A. and P. Sarnow, 1993. An RNA hairpin at the extreme 5' end of the poliovirus RNA geneome modulates viral translation in human cells. Journal of General Virology, 74: 661-668.
111
Shrivastav, A-K., Minaksih, Swati-Dahiya and N-K. Mahajan, 2004. Direct detection of viral genome and histopathological studies of bursan tissues collected
from an infectious bursal disease suspected outbreak. Indian Journal of Poultry Science, 39(2): 201 – 203.
Stanislav, S., N. Egrotic and N. Cizelj, 2009. Process for preparing viral
vaccine. Praxis veterinaria, 53: 91-102.
Stockle, M.Y., M.W. Shaw and P.W. Chopin, 1987. Segment specific and common nucleotide sequences in the noncoding region of influenza B virus genome RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84: 2703-2709.
Sun, J.H. and P. Lu, 2003. Sequence and analysis of genomic segment A and B of very virulent infectious bursal disease virus isolated from China. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health, 50(3):148-154.
Tacken, M.G., B.P. Peeters, A.A. Thomas, P.J. Rottier and H. J. Boot, 2002. Infectious bursal disease virus capsid protein VP3 interacts both with VP1, the RNA-dependent RNA polymerase and with viral double-stranded RNA. Journal of Virology, 76: 11301-11311.
Terasaki, K., H. Hirayama, C.J. Kasanga, M.T. Maw, K. Ohya, T. Yamaguchi and H. Fukushi, 2008. Chicken B lymphoma DT40 cells as a useful tool for in vitro analysis of pathogenic infectious bursal disease virus. Journal of Veterinary Medical Science, 70(4): 407- 410.
Tippenhauer, M., D.E. Heller, S. Weigend and S. Rautenschlein, 2013. The host genotype influences infectious bursal disease virus pathogensis in chickens by modulation of T cells responses and cytokine gene expression. Developmental and Comparative Immunology, 40: 1–10.
Tiwari, A.K., R.S. Kataria, N. Prasad and R. Gupta, 2003. Differentiation of infectious bursal disease viruses by restriction enzyme analysis of RT-PCR amplified VP1 gene sequence, Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 26: 47-53.
Thierry, P.V.D.B., 2000. Acute infectious bursal disease in poultry. Avian
Pathology, 29: 175 – 194
Van den Berg, T.P., 2000. Acute infectious bursal disease in poultry: A
review. Avian Pathology, 29:175–194.
112
Van den Berg, T.P., D. Morales, N. Eterradossi, G. Rivallan, D. Toquin, R. Raue, K. Zierenberg, M. F. Zhang, Y.P. Zhu, C.Q. Wang, H.J. Zheng, X. Wang,
G.C. Chen, B.L. Lim, and H. Muller, 2004. Assessment of genetic, antigenic and pathotypic criteria for the characterization of IBDV strains. Avian Pathology, 33(5): 470-476.
Van Loon, A.A., N. De Haas, I. Zeyda and E. Mundt, 2002. Alteration of amino acids in VP2 of very virulent infectious bursal disease virus results in tissue culture adaptation and attenuation in chickens. Journal of General Virology, 83:121-129.
Vukea, P.R., S. Willows-Munro, R.F. Horner and T.H. Coetzer, 2014. Phylogentic analysis of the polyprotein coding region of an infectious South African bursal disease virus (IBDV) strain. Infection Genetics and Evolution, 21: 279–286.
Xia, R.X., H.Y. Wang, G.M. Huang and M.F. Zhang, 2008. Sequence and phylogentic analysis of a Chinese very virulent infectious bursal disease virus. Archives of Virology, 153(9): 1725–1729
Yamaguchi, T., C.J. Kasanga, K. Terasaki, M.T. Maw, K. Ohya and H. Fukushi, 2007. Nucleotide sequence analysis of VP2 hypervariable domain of infectious bursal disease virus detected in Japan from 1993 to 2004. Journal of Veterinary Medical Science, 69: 733-738.
Yao Qin and J.Z. Shijun, 2017. Infectious bursal disease virus-host interactions: Multifunctional viral proteins that perform multiple and differing jobs. International Journal of Molecular Sciences, 18: 1 – 13.
Ye, C., L. Jia, Y. Sun, B. Hu, L. Wang, X. Lu and J. Zhou, 2014. Inhibition of antiviral innate immunity by Birnavirus VP3 protein via blockage of viral double-stranded RNA binding to the host cytoplasmic RNA detector mda5. Journal of Virology, 88: 11154-11165.
Yinju Li, Tingcai Wu, Xiangchao Cheng and Chunjie Zhang, 2009. Molecular characteristic of VP2 gene of infectious bursal disease viruses isolated from a farm in two decades. Virus Genes, 38: 408–413.
Yu, L., L. Li, Y. Liu, J.T. Zheng, Y.W. Wei and J. Xu, 2005. Cloning, expression and preparation of polyclonal antibody for IBDV non-structure protein gene. Acta microbiologica Sinica, 45(5):763-766.
113
Yuwen, Y., Y. Gao, H. Gao, X. Qi, T. Li, W. Liu and X. Wang, 2008. Sequence analysis of the VP2 hypervariable region of eight very vurulent infectious
bursal disease virus isolates from the northeast of China. Avian Diseases, 52(2): 284-290.
Wang, Y.S., Z.C. Wang, Y.D. Tang, Z.L. Shi, K.W. He, Y.Li, J.B. Hou, H.C. Yao, H.J. Fan and C.P. Lu, 2007. Comparison of four infectious bursal disease viruses isolated from different bird species. Archives of Virology, 152: 1787–1797.
Winterfield, R. and W. Hitchner, 1962. Avian nephrosis, nephritis and
gumboro disease. L and M News and Views, 3: 103.
Withers, D.R., T.F. Davison and J.R. Young, 2006. Diversified bursal medullary B cells survive and expand independently after depletion following neonatal infectious bursal disease virus infection. Immunology, 117: 558-565.
Zhang, G., J. Guo and X. Wang, 2009. Immunochromatographic lateral flow
strip tests. Methods in Molecular Biology, 504: 169-183.
Zierenberg, K., R. Raue, H. Nieper, M.R. Islam, N. Eterradossi, D. Toquin and H. Muller, 2004. Genration of serotype 1/serotype 2 reassortant viruses of the infectious bursal disease virus and their investigation in vitro and in vivo. Virus Research, 105: 23-34.
Zhu, L.Q., S.L. Wu, G.P. Zhang and G.Q. Zhu, 2008. The cellular receptors for infectious bursal disease virus. African Journal of Biotechnology, 7: 4832-4835.
Tiếng Việt
Đái Duy Ban và Phạm Công Hoạt, 2004. Vaccine Gumboro phòng chống suy
giảm miễn dịch cho gia cầm. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, tr. 9 – 56.
Hoàng Thị Mỹ Hiền, 2009. Ðánh giá độ an toàn và hiệu lực của vaccine bursaplex phòng bệnh Gumboro trên gà khi tiêm chủng qua phôi trứng 18 ngày tuổi. Tủ sách khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Hồ Thị Việt Thu, 2010. Tình hình bệnh Gumboro trên các giống gà thả vườn
tại tỉnh Hậu Giang. Tạp chí khoa học Đại Học Cần Thơ, 22a: 25-32.
Hồ Thị Việt Thu, 2012a. Tình hình bệnh Gumboro trên các giống gà nòi Bến
Tre tại tỉnh Hậu Giang. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 22a: 25-32
114
Hồ Thị Việt Thu, 2012b. Khảo sát hiệu quả của bào tử Bacillus subtilis biểu hiện interferon alpha gà (ChIFNα-B. subtilis) trong phòng bệnh Gumboro trên gà. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 22c: 30-39
Lê Hồng Mận và Phương Song Liên, 1999. Bệnh gia cầm và biện pháp phòng
trị. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, 34-35
Lê Hồng Mận và Trần Văn Bình, 2009. Cẩm nang chăn nuôi gà. NXB Nông
Nghiệp, Hà Nội, 180 trang.
Lê Thanh Hòa, 2003a. Bước đầu khảo sát nguồn gốc và phả hệ virus cường độc Gumboro phân lập ở Hà Nội và vùng phụ cận. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 3: 6-13.
Lê Thanh Hòa, 2003b. So sánh thành phần gene kháng nguyên VP2 của 9 chủng virus Gumboro phân lập tại phía Bắc Việt Nam. Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn, 10: 1255-1257
Lê Thanh Hòa, 2003c. Sinh học phân tử virus Gumboro, nghiên cứu ứng dụng
tại Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
Lê Thanh Hòa, 2004. Biến đổi phân tử nhóm quyết định kháng nguyên gene kháng nguyên VP2 ở một số chủng virus cường độc Gumboro phân lập tại Việt Nam. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 4: 6-13
Lê Thị Kim Xuyến và Lê Thanh Hòa, 2008. Phát hiện các chủng cường độc Gumboro nguồn gốc Âu-Mỹ tại Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử phân tích gene VP2. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 6(5): 437-443.
Lê Thị Kim Xuyến, 2010. Giải mã phân đoạn A hệ gene các chủng virus Gumboro phân lập ở Việt Nam nhằm cung cấp nguồn gene cho nghiên cứu vaccine thế hệ mới. Luận án tiến sĩ nông nghiệp ngành vi sinh vật học thú y. Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. Hà Nội.
Lê Văn Hùng, 1996. Nghiên cứu miễn dịch thu được trên các bệnh truyền nhiễm do virus (Newcastle, Gumboro) đề xuất những cải tiến trong quy trình phòng bệnh bằng vaccine cho gà. Luận án tiến sĩ Nông nghiệp. Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, 11-12.
Lê Văn Năm, 1996. Sáu mươi câu hỏi và đáp về những bệnh ghép phức tạp ở
gà. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, 48-54.
Lê Văn Năm, 2004. Bệnh Gumboro ở gà và biện pháp phòng trị, NXB Nông
115
nghiệp, Hà Nội, 76 trang.
Phùng Đức Tiến, Đỗ Thị Sợi, Nguyễn Quý Khiêm, Lê Thu Hiền và Ninh Thị Len, 2003. Nghiên cứu khả năng sản xuất của tổ hợp lai ¾ máu Lương Phượng, ¼ máu Sasso, Báo cáo Khoa học năm 2003, Hội nghị khoa học, Viện chăn nuôi.
Nguyễn Bá Hiên, 2007. Miễn dịch học ứng học. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội,
tr 73
Nguyễn Bá Thành, 1999. Khảo sát bệnh Gumboro và thử nghiệm bốn qui trình tiêm phòng trên gà thịt Arbor acres nuôi tại thị xã Thủ Dầu Một tỉnh Bình Dương, Luận án thạc sĩ khoa học Nông nghiệp Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, 74 trang.
Nguyễn Bá Thành, 2004. Một số đặc điểm dịch tễ bệnh Gumboro trên đàn gà
tỉnh Đồng Nai. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 15(3): 22 - 28.
Nguyễn Bá Thành, 2005. Khảo sát đặc tính gây bệnh thực nghiệm của chủng virut Gumboro 52/70 và chủng phân lập tại địa phương trên gà con có hiệu giá kháng thể mẹ truyền cao. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 10(2): 26 - 32.
Nguyễn Bá Thành, 2006. Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh Gumboro, virus gây bệnh và đề xuất quy trình tiêm chủng vaccine phù hợp để phòng bệnh cho đàn gà tại tỉnh Đồng Nai. Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, 4-43.
Nguyễn Bá Thành, Lê Thanh Hòa và Trần Đình Từ, 2007. Phân lập và giám định chuỗi gene VP2 của virus Gumboro gây bệnh trên đàn gà tại Việt Nam. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 4: 23-29.
Nguyễn Đăng Khải, 1988. Bệnh Gumboro ở gia cầm. Thông tin Thú y tháng
10 – 1988.
Nguyễn Đức Hiền, 2009. Bệnh truyền nhiễm gia cầm. Tủ sách khoa Nông
Nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Cần Thơ. 100 - 110.
Nguyễn Đức Hiền, 2012. Bệnh truyền nhiễm gia cầm. Nhà xuất bản Đại học
Cần Thơ. Cần Thơ. 360 trang
116
Nguyễn Hồng Minh, Trần Thị Liên và Trương Quang, 2011. Kết quả nghiên cứu đáp ứng miễn dịch chống bệnh Gumboro của gà được sử dụng vaccine đơn giá và đa giá sản xuất tại xí nghiệp thuốc thú y trung ương. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 12(4): 13 – 19.
Nguyễn Hữu Nam, 2007. Kết quả khảo sát khối lượng túi Fabricius, tuyến ức, lách của một số giống gà từ sơ sinh đến 6 tuần tuổi. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Hội Thú y Việt Nam, 17(1): 99 - 100.
Nguyễn Hữu Vũ và Nguyễn Đức Lưu, 2001. Bí quyết thành công trong chăn
nuôi gà, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, 100 trang.
Nguyễn Huy Đạt, Nguyễn Thành Đồng, Lê Thanh Ân, Hồ Xuân Tùng và Phạm Bích Hường, 2001. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, tính năng sản xuất gà Lương Phượng Hoa nuôi tại Trại thực nghiệm Liên Ninh, Báo cáo khoa học chăn nuôi Thú y 1999 – 2000, Bộ nông nghiệp và Phát triển nông thôn, thành phố Hồ Chí Minh.
Nguyễn Mạnh Dũng và Huỳnh Hồng Hải, 2006. Điều tra tình hình chăn nuôi
giống gà Nòi thả vườn ở ĐBSCL. Luận án tốt nghiệp, tr 15 - 17
Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 1997. Vi sinh
vật Thú y. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, 246 – 251.
Nguyễn Thành Trung, 1997. Tình hình và biện pháp phòng tổng hợp bệnh Gumboro tại xí nghiệp gia cầm Meko. Luận án thạc sĩ Khoa học Nông Nghiệp, Đại học Cần Thơ. Cần Thơ, 9-21.
Nguyễn Thị Mỹ Hoa, 1994. Thử nghiệm xây dựng quy trình phòng bệnh Gumboro cho gà nuôi công nghiệp. Tủ sách khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Cần Thơ, 20 trang.
Nguyễn Thị Mai, Bùi Hữu Đoàn và Hoàng Thanh, 2009. Giáo trình chăn nuôi gia cầm. Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
Nguyễn Thị Thủy, 2012. Ảnh hưởng của bột cá Tra trong khẩu phần lên năng suất và chất lượng thịt gà Lương Phượng nuôi tại nông hộ. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 24a: 206-211.
Nguyễn Tiến Dũng, 1993. Kết quả nghiên cứu vaccine Gumboro trong phòng thí nghiệm. Công trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật 1990-1991, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
117
Nguyễn Trọng Ngữ, Châu Thanh Vũ, Nguyễn Thị Mười, Huỳnh Chí Nghĩa, Nguyễn Văn Hớn, Nguyễn Văn Quyên, Nguyễn Hồng Xuân và Nguyễn Thị Hồng Nhân, 2016. Đặc điểm ngoại hình gà Nòi tại ĐBSCL. Tạp chí khoa học kỹ thuật chăn nuôi, 203(2): 7 – 13.
Nguyễn Văn Cảm, 2000. Phân lập giám định virus cường độc Gumboro và
biến đổi bệnh lý một số cơ quan ở gà tây gây bệnh thực nghiệm, 158 trang.
Nguyễn Văn Quyên, 2008. Nghiên cứu ảnh hưởng các mức năng lượng trao đổi và đạm thô trên sự tăng trưởng phát dục và tỷ lệ đẻ của gà Nòi ở ĐBSCL. Luận án tiến sĩ ngành Chăn nuôi, Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Xuân Bình, Trần Xuân Hạnh và Tô Thị Phấn, 2005. Một trăm lẻ chín
bệnh gia cầm và biện pháp phòng trị, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, tr. 156-164.
Phạm Hồng Sơn, Phạm Thị Hồng Hà, Trịnh Công Chiến và Bùi Thị Hiền, 2012. Tình hình lưu hành mầm bệnh và miễn dịch với virus gây bệnh Gumboro ở gà trên một số địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế trong mùa Xuân-Hè năm 201. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 6: 33-40.
Phạm Trường Thanh, 2016. So sánh sự biến đổi gene giữa chủng virus Gumboro gây bệnh thực địa và chủng virus Gumboro vaccine tại tỉnh Vĩnh Long. Luận văn Cao học ngành Thú Y, Đại học Cần Thơ, 65 trang.
Quyết định Ban hành quy định về điều kiện chăn nuôi, ấp trứng, vận chuyển, giết mổ, buôn bán gia cầm và sản phẩm gia cầm số 3065/QĐ-BNNNN ngày 07/11/2005 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn.
Trần Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010. Miễn dịch học ứng dụng, NXB
Nông Nghiệp, Hà Nội, 187 trang.
Trần Minh Châu, Dương Công Thuận và Bitayzotan, 1982. Phát hiện bệnh Gumboro ở gà Lương Phượng. Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật thú y của Viện thú y (1979-1984): 28-31
Trần Ngọc Bích và Nguyễn Thị Mỹ Hiệp, 2013. Đặc điểm dịch tễ học của bệnh Gumboro trên đàn gà tại huyện An Phú tỉnh An Giang. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 25: 255-259
Trần Ngọc Bích, Nguyễn Văn Lộc, Ngô Phú Cường và Nguyễn Phúc Khánh, 2016. Phân biệt chủng virus gây bệnh Ggumboro trên đàn gà với chủng virus vaccine qua vùng siêu biến đổi gene VP2 ở Trà Vinh. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 42: 29-37.
Trần Thị Bích Liên và Lê Anh Phụng, 2001. Virus chuyên biệt. Tủ sách Đại
118
học Nông Lâm, tr. 65 – 67.
Trần Thị Thu Hiền, 2010. K. T. G Hanvet– sản phẩm đa kháng thể cho gia
cầm. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 14(5): 60 - 67.
Trần Thị Quỳnh Lan, 1999. Bước đầu nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ trên bệnh Gumboro tại một số trang trại nuôi trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh. Luận án Thạc sĩ khọc học nông nghiệp, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Trần Công Xuân, Phùng Đức Tiến, Hoàng Văn Lộc, Bạch Thị Thanh Dân, Nguyễn Qúy Khiêm, Lê Thu Hiền, Phạm Thị Minh Thu và Phạm Thùy Linh, 2003. Kết quả chọn tạo 3 dòng gà LV1; LV2; LV3. Báo cáo khoa học Chăn nuôi- Thú y, Phần Chăn nuôi gia cầm, NXB Nông nghiệp, trang 317- 342.
Trương Minh Dũng, Nguyễn Hồng Phong, Nguyễn Thị Minh Thư và Ngô Thị Thu Ngân, 2006. Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử. Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh, tr. 7-19.
Võ Thị Ngọc Bích, 2015. Khảo sát bệnh gumboro và thử nghiệm bốn loại vaccine phòng bệnh Gumboro trên gà thịt Lohmann nuôi tại huyện Mang Thít tỉnh Vĩnh Long. Luận văn Cao học ngành Thú Y, trường Đại học Cần Thơ, 84 trang.
Internet
www.sciencephoto.com
www.talk.ictvonline.org
www.vemedim.vn/benhvadieutri)
www.medvet.umontreal.ca/.../OrigiInfect/
www.anova.com.vn/contents/article
www.ss.niah.affrc.go.jp/disease/EM/em_en/virus0.html
http://biomedia.vn
www.navetco.com.vn
www.bukalapak.com
www.ceva.vn
http://viphavet.com
www.zoetisus.com
www.msd-animal-health.co.za
119
http://phanvienthuy.com.vn/san-pham/56-KT-Gumboro-va-Newcastle.html
http://hanvet.com.vn
www.navetco.com.vn
www.nrbsc.org/gfx/genedoc/
120
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch
AAs = FFLLSSSSYY**CC*WLLLLPPPPHHQQRRRRIIIMTTTTNNKKSSRRVVVVAAAADDEEGGGG Starts = ---M---------------M------------MMMM---------------M------------ Base1 = TTTTTTTTTTTTTTTTCCCCCCCCCCCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAGGGGGGGGGGGGGGGG Base2 = TTTTCCCCAAAAGGGGTTTTCCCCAAAAGGGGTTTTCCCCAAAAGGGGTTTTCCCCAAAAGGGG Base3 = TCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAG TTT F Phe TCT S Ser TAT Y Tyr TGT C Cys TTC F Phe TCC S Ser TAC Y Tyr TGC C Cys TTA L Leu TCA S Ser TAA * Ter TGA * Ter TTG L Leu TCG S Ser TAG * Ter TGG W Trp CTT L Leu CCT P Pro CAT H His CGT R Arg CTC L Leu CCC P Pro CAC H His CGC R Arg CTA L Leu CCA P Pro CAA Q Gln CGA R Arg CTG L Leu CCG P Pro CAG Q Gln CGG R Arg ATT I Ile ACT T Thr AAT N Asn AGT S Ser ATC I Ile ACC T Thr AAC N Asn AGC S Ser ATA I Ile ACA T Thr AAA K Lys AGA R Arg ATG M Met ACG T Thr AAG K Lys AGG R Arg GTT V Val GCT A Ala GAT D Asp GGT G Gly GTC V Val GCC A Ala GAC D Asp GGC G Gly GTA V Val GCA A Ala GAA E Glu GGA G Gly GTG V Val GCG A Ala GAG E Glu GGG G Gly (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/index.cgi?chapter=tgene codes#SG11)
Phụ lục 2: TÊN VÀ TÊN VIẾT TẮT CỦA 20 LOẠI AMINO ACID
Alanine Arginine Asparagine Aspartic acid Cysteine Glutamine Glutamic acid Glycine Histidine Isoleucine
Leucine Lysine Methionine Phenylalanine Proline Serine Threonine Tryptophan Tyrosine Valine
121
Phụ lục 3: PHIẾU ĐIỀU TRA THÔNG TIN TRÊN ĐÀN GÀ NGHI BỆNH
Số:
Bảng câu hỏi khảo sát cho từng cá thể
Số: Số:
1. Họ và tên chủ hộ: ............................................................................................
Địa chỉ Ấp (khóm) ..........................;Xã (phường): ...............................................
Huyện (Quận) .................................;Tỉnh (Thành phố) ........................................
2. Tình hình chăn nuôi và dịch bệnh
Tổng đàn .................................. con; Giống gà ....................................................
Lứa tuổi .................................... ngày; Trọng lượng ........................................kg
Thời gian bệnh ......................... ngày ...................................................................
Số gà bệnh .................................. con; số chết ................................................. con
Tiêm phòng Gumboro: không tiêm , 1 lần , 2 lần , 3 lần
Hình thức nuôi: nuôi nhốt hoàn toàn , bán nhốt , thả hoàn toàn
Hình thức nuôi: lấy thịt , hay nuôi lấy trứng
Loại thức ăn. Tận dụng , công nghiệp
Vệ sinh chuồng trại: không sát trùng lần nào........................................
Sát trùng chuồng trại giữa hai đợt nuôi gà...........
Bỏ trống chuồng 2 - 3 tuần trước khi nhập gà.....
3. Triệu chứng:
Bỏ ăn, ủ rũ xù lông, uống nhiều nước..........................
Gục đầu và sà cánh.......................................................
Tiêu chảy phân trắng, xanh nhiều nước........................
Hậu môn dính đầy phân................................................
Da chân khô..................................................................
122
Tự mổ vào hậu môn.....................................................
4. Bệnh tích:
Túi Fabricius sưng, xuất huyết, teo....................
Cơ đùi xuất huyết................................................
Cơ ngực xuất huyết.............................................
Lách sưng và hoại tử...........................................
Thận sưng, xuất huyết.........................................
Liên kết dd tuyến và dd cơ xuất huyết...............
Dạ dày tuyến xuất huyết.......................................
Da dày cơ xuất huyết...........................................
Manh tràng sưng to và xuất huyết.......................
Phổi có u, nấm.....................................................
Khí quản xuất huyết............................................
Gan, xuất huyết hoại tử........................................
Não xuất huyết...................................................
Hậu môn xuất huyết............................................
Chẩn đoán ban đầu ................................................................................................
5. Loại mẫu ......................................................... Ký hiệu mẫu ............................
Ngày……tháng……..năm……...
123
Người thực hiện
Phụ lục 4: BIÊN BẢN MỔ KHÁM
CỘNG HÒA XÃ HÔI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập- Tự do- Hạnh phúc
BIÊN BẢN MỔ KHÁM
Hôm nay .............ngày....tháng.....năm ……
Tại: ........................................................................................................................
Chúng tôi gồm có:
1..........................................................;chức vụ ....................................................
2..........................................................;chức vụ ....................................................
3..........................................................;chức vụ ....................................................
Cùng tiến hành lấy mẫu xét nghiệm: ....................................................................
Loại gia súc gia cầm: ............................................................................................
Tổng đàn ...............................................................................................................
Giống.....................................................tuổi .........................................................
Ngày phát bệnh.......................; số chết:..........................số bệnh: ........................
Triệu chứng : .........................................................................................................
................................................................................................................................... .........................................................................................................................
Bệnh tích:.............................................................................................................
................................................................................................................................... .........................................................................................................................
Thông tin khác:.....................................................................................................
..............................................................................................................................
124
Nghi bệnh:............................................................................................................
Loại bệnh phẩm:...................................................................................................
Số lượng mẫu:......................................................................................................
Ký hiệu mẫu:........................................................................................................
Tình trạng bệnh phẩm:.........................................................................................
Ngày trả kết quả:.................................................................................................
Biên bản được lập thành 2 bảng có giá trị như nhau, mỗi bên giữ 1 bản, căn cứ thực hiện.
125
Đại diện chủ gia súc gia cầm Người lấy mẫu
126
Phụ lục 5: VỊ TRÍ SAI KHÁC NUCLEOTIDE GIỮA CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI THỰC ĐỊA, CÁC CHỦNG VACCINE VÀ NGÂN HÀNG GENE
127
128
129
Phụ lục 6: VỊ TRÍ SAI KHÁC ACID AMIND GIỮA CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI THỰC ĐỊA, CÁC CHỦNG VACCINE VÀ NGÂN HÀNG GENE
Phụ lục 7: VỊ TRÍ SAI KHÁC NUCLEOTIDE GIỮA CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI THỰC ĐỊA VÀ CÁC CHỦNG VACCINE
G
G
G
G
C
G
G
G
G
G
C
C
C
C
T
654
A
A
A
A
G
A
A
A
A
A
G
G
G
G
G
662
G
G
G
A
A
G
G
G
G
G
A
A
A
A
A
665
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
G
A
A
668
A
G
G
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
683
A
A
A
T
C
A
A
A
A
A
C
C
C
C
C
686
C
C
C
C
C
C
T
T
T
T
C
C
C
C
C
689
C
C
C
C
T
C
C
C
C
C
T
T
T
T
T
692
C
C
C
C
C
C
T
T
T
T
C
C
C
C
C
701
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
C
704
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
A
C
C
C
C
713
A
A
A
A
G
A
A
A
A
A
G
G
G
G
G
714
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
G
T
T
T
T
715
C
C
C
C
T
C
C
C
C
C
T
T
T
T
T
716
G
A
A
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
719
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
G
722
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
G
A
A
A
A
724
A
A
A
A
G
A
A
A
A
A
G
G
G
G
G
725
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
G
C
C
C
C
726
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
C
T
T
T
T
727
T
C
C
C
C
T
C
C
C
C
G
C
C
C
C
728
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
G
A
A
A
A
736
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
T
A
A
A
A
737
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
C
A
A
A
A
738
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
C
A
A
A
A
741
130
744
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
C
G
G
G
G
747
C
C
C
C
A
C
C
C
C
C
T
C
C
C
C
748
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
749
A
A
A
A
C
A
A
A
A
A
C
C
C
C
A
753
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
G
C
C
C
C
754
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
755
T
A
A
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
756
A
A
A
A
G
A
A
A
A
A
C
G
G
G
A
764
T
T
T
C
C
T
C
C
C
C
C
C
C
C
C
766
C
C
C
C
C
C
G
G
C
C
C
C
C
C
C
767
G
G
G
T
C
G
T
T
T
T
A
C
C
C
C
770
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
T
C
C
C
C
773
C
C
C
C
C
C
T
T
C
C
C
C
C
C
C
774
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
C
T
T
779
T
T
T
T
C
T
C
C
C
C
T
C
C
C
T
788
T
T
T
T
T
T
C
C
C
C
T
T
A
T
T
794
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
T
G
G
G
G
797
T
T
T
T
A
T
T
T
T
T
T
A
A
A
A
798
G
G
G
G
A
G
G
G
G
G
A
A
G
A
A
802
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
A
T
T
T
T
803
A
G
G
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
805
T
T
T
C
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
812
A
A
A
A
G
A
A
A
A
A
G
G
G
G
A
825
G
G
G
A
A
G
G
G
G
G
A
A
A
A
A
829
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
C
A
A
A
A
830
T
T
T
T
T
C
T
T
T
T
T
T
T
T
T
834
C
C
C
C
C
C
G
G
C
C
C
C
C
C
C
131
836
G
A
A
A
G
G
A
A
A
A
G
G
G
G
G
837
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
C
A
A
A
A
840
G
G
G
G
A
G
G
G
G
G
A
A
A
A
G
844
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
A
G
G
G
G
848
T
T
T
T
C
T
T
T
T
T
C
C
T
C
C
857
T
C
C
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
858
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
T
T
A
A
865
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
A
T
T
T
T
868
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
T
A
A
A
A
869
C
C
C
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
870
A
A
A
A
C
A
A
A
A
A
C
C
C
C
C
878
T
C
C
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
881
A
G
G
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
884
C
C
C
C
A
C
C
C
C
C
A
C
A
A
C
886
G
G
G
G
A
G
G
G
G
G
C
A
A
A
A
887
C
C
C
C
C
T
C
C
C
C
C
C
C
C
C
898
A
A
A
A
A
A
G
G
G
G
A
A
A
A
A
908
A
C
C
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
914
T
C
C
C
C
T
C
C
C
C
C
C
C
C
C
929
G
G
G
G
G
G
T
T
T
T
G
G
G
G
G
947
T
C
C
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
953
G
G
G
G
A
G
G
G
G
G
A
A
A
A
A
959
C
C
C
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
967
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
T
C
T
C
C
968
A
G
G
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
974
A
A
A
A
G
A
A
A
A
A
G
C
G
G
G
976
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
T
132
980
T
T
T
T
A
T
T
T
T
T
A
A
A
A
T
1004 C
C
C
C
T
C
C
C
C
C
T
T
T
T
T
1016
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
C
133
Phụ lục 8: PHÂN TÍCH THỐNG KÊ
Bảng 4.1 : Tỉ lệ đàn gà bệnh Gumboro giữa các giống gà
Giống gà Số đàn khảo sát Số đàn có bệnh
Số đàn không bệnh 37 6 14 15 72 52 19 31 29 131
52 28.58
23.42 19 8.56 10.44
31
17.04 0.542 29
37 2.481 6 1.890 14 15 15.94 0.055 72 Nòi Lai 15 Tàu Vàng 13 Bình Định 17 Lương Phượng 14 59 Tổng Chi-Square Test: Số đàn có bệnh, Số đàn không bệnh Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Số đàn có bệnh Số đàn không bệnh Total 1 15 3.027 2 13 2.307 3 17 13.96 0.661 4 14 13.06 0.067 Total 59 131 Chi-Sq = 11.030, DF = 3, P-Value = 0.012
Bảng 4.2 : Tỉ lệ gà bệnh Gumboro theo các hình thức chăn nuôi
Hình Thức Số đàn khảo sát Số đàn bệnh
Thả hoàn toàn Bán chăn thả Nhốt hoàn toàn Tổng 50 60 21 131 14 33 12 59 Số đàn không bệnh 36 27 9 72
Trị số Chi Bình Phương 9.512
Độ Tự do 2
134
P = 0.009
Số đàn bệnh Số đàn không bệnh
Bảng 4.3: Tỉ lệ gà nhiễm bệnh Gumboro giữa các lứa tuổi Lứa tuổi Từ 12- 21 ngày tuổi Từ 21-42 ngày tuổi Lớn hơn 42 ngày tuổi Tổng Số đàn khảo sát 43 54 34 131 20 31 8 59 23 23 26 72
Trị số Chi Bình Phương Trị số Chi Bình Phương 9.730 9.730
Độ Tự do Độ Tự do 2 2
P = P = 0.008 0.008
Số đàn bệnh Số đàn không bệnh
Bảng 4.4: Tỉ lệ đàn gà bệnh theo số lần sử dụng vaccine Số lần sử dụng vaccine Không sử dụng 01 lần 02 lần Tổng Số đàn sử dụng vaccine 36 42 53 131 24 22 13 59 12 20 40 72
Trị số Chi Bình Phương 16.725
2 Độ Tự do
0.001 P =
Bảng 4.7: Tỉ lệ mẫu nhiễm Gumboro
Tỉnh
Số mẫu 26 15 14 19 28 29 131 Số mẫu nhiễm 11 9 7 9 12 11 59 Số mẫu không nhiễm 15 6 7 10 16 18 72 Bến Tre Hậu Giang Cần Thơ Trà Vinh Vĩnh Long An Giang Tổng
Trị số Chi Bình Phương 2.261
Độ Tự do 5
135
P = 0.812
Bảng 4.8: Tỉ lệ gà chết do bệnh Gumboro
Tỉnh
Bến Tre Hậu Giang Cần Thơ Trà Vinh Vĩnh Long An Giang Tổng Số đàn bệnh 26 15 14 19 28 29 131 Số gà bệnh 11.200 4.500 3.600 7.200 9.200 3.900 39.600 Số gà chết 365 225 153 450 455 259 1.907 Số gà sống 10.835 4.275 3.447 6.750 8.745 3.641 37.693
Trị số Chi Bình Phương 123.065
Độ Tự do 5
P = 0.001
0.835
Bảng 4.14: Tỉ lệ kháng thể thụ động mẹ truyền của 2 giống gà General Linear Model: Khangthe versus Giong Factor Type Levels Values Giong fixed 2 Lương Phượng, Nòi Bến Tre Analysis of Variance for Miendich, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Giong 1 0.130 0.130 0.130 0.04 Error 50 147.918 147.918 2.958 Total 51 148.048 S = 1.71999 R-Sq = 0.09% R-Sq(adj) = 0.00% Least Squares Means for Miendich Giong Mean SE Mean Lương Phượng 433.0 0.3373 Nòi Bến Tre 432.9 0.3373
136
Bảng 4.15: Tỉ lệ đáp ứng miễn dịch giữa các lần tiêm vaccine Gumboro (7 và 28 ngày tuổi) General Linear Model: kháng thể versus Lần tiêm 1 Factor Type Levels Values Lần tiêm fixed 2 không tiêm, lần 1 Analysis of Variance for kháng thể, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Lần tiêm 1 148926 148926 148926 21.31 0.000 Error 121 845774 845774 6990 Total 122 994700
137
S = 83.6054 R-Sq = 14.97% R-Sq(adj) = 14.27% Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Lần tiêm N Mean Grouping lần 1 112 523.9 A không tiêm 11 401.9 B Means that do not share a letter are significantly different. General Linear Model: kháng thể versus Lần tiêm 2 Factor Type Levels Values Lần tiêm fixed 2 không tiêm, lần 2 Analysis of Variance for kháng thể, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Lần tiêm 1 29854130 29854130 29854130 76.94 0.000 Error 161 62470149 62470149 388013 Total 162 92324278 S = 622.907 R-Sq = 32.34% R-Sq(adj) = 31.92% Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Lần tiêm N Mean Grouping lần 2 156 2514.4 A không tiêm 7 403.4 B Means that do not share a letter are significantly different. Bảng 4.16: Sự khác biệt đáp ứng miễn dịch giữa 2 giống gà General Linear Model: khangthe versus giong, lantiem Factor Type Levels Values giong fixed 2 Lương Phượng, Nòi Bến Tre lantiem fixed 2 lần 1, lần 2 Analysis of Variance for khangthe, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P giong 1 482567 101613 101613 0.42 0.515 lantiem 1 257950379 257324797 257324797 1074.86 0.000 giong*lantiem 1 2336 2336 2336 0.01 0.921 Error 264 63202194 63202194 239402 Total 267 321637476 S = 489.287 R-Sq = 80.35% R-Sq(adj) = 80.13% Least Squares Means for khangthe giong Mean SE Mean Lương Phượng 1539.8 44.03 Nòi Bến Tre 1500.3 41.78 lantiem lần 1 525.1 46.35 lần 2 2515.0 39.19 giong*lantiem Lương Phượng lần 1 541.8 67.85 Lương Phượng lần 2 2537.8 56.13
138
Nòi Bến Tre lần 1 508.3 63.17 Nòi Bến Tre lần 2 2492.2 54.70 Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence lantiem N Mean Grouping lần 2 156 2515.0 A lần 1 112 525.1 B Means that do not share a letter are significantly different. Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence giong lantiem N Mean Grouping Lương Phượng lần 2 76 2537.8 A Nòi Bến Tre lần 2 80 2492.2 A Lương Phượng lần 1 52 541.8 B Nòi Bến Tre lần 1 60 508.3 B Means that do not share a letter are significantly different. Bảng 4.17: Sự khác biệt đáp ứng miễn dịch giữa các chủng vaccine khi tiêm phòng cho gà lúc 7 và 28 ngày tuổi General Linear Model: Khangthe versus Vaccine, Lan tiem Factor Type Levels Values Vaccine fixed 3 VC1, VC2, VC3 Lan tiem fixed 2 lần 1, lần 2 Analysis of Variance for Khangthe, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Vaccine 2 301206 35820 17910 0.07 0.928 Lan tiem 1 258074566 257361777 257361777 1066.84 0.000 Vaccine*Lan tiem 2 57724 57724 28862 0.12 0.887 Error 262 63203981 63203981 241237 Total 267 321637476 S = 491.158 R-Sq = 80.35% R-Sq(adj) = 79.97% Least Squares Means for Khangthe Vaccine Mean SE Mean VC1 1502.4 54.15 VC2 1522.2 52.41 VC3 1530.6 51.61 Lan tiem lần 1 523.9 46.43 lần 2 2512.8 39.40 Vaccine*Lan tiem VC1 lần 1 529.1 81.86 VC1 lần 2 2475.6 70.89 VC2 lần 1 519.3 79.68 VC2 lần 2 2525.1 68.11 VC3 lần 1 523.4 79.68 VC3 lần 2 2537.8 65.63
Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Lan tiem N Mean Grouping lần 2 156 2512.8 A lần 1 112 523.9 B Means that do not share a letter are significantly different. Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Vaccine Lan tiem N Mean Grouping VC3 lần 2 56 2537.8 A VC2 lần 2 52 2525.1 A VC1 lần 2 48 2475.6 A VC1 lần 1 36 529.1 B VC3 lần 1 38 523.4 B VC2 lần 1 38 519.3 B Means that do not share a letter are significantly different.
139
Bảng 4.18: Sự khác biệt đáp ứng miễn dịch giữa các chủng vaccine và giống gà General Linear Model: Kháng thể versus Giống, Vaccine, Lần tiêm Factor Type Levels Values Giống fixed 2 Lương Phượng, Nòi Bến Tre Vaccine fixed 3 VC1, VC2, VC3 Lần tiêm fixed 2 lần 1, lần 2 Analysis of Variance for Kháng thể, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Giống 1 482567 97148 97148 0.40 0.527 Vaccine 2 278027 72265 36132 0.15 0.861 Lần tiêm 1 257735420 256040626 256040626 1059.53 0.000 Giống*Vaccine 2 777935 774470 387235 1.60 0.203 Vaccine*Lần tiêm 2 15598 15328 7664 0.03 0.969 Giống*Lần tiêm 1 908 908 908 0.00 0.951 Error 258 62347020 62347020 241655 Total 267 321637476 Least Squares Means for Kháng thể Giống Mean SE Mean Lương Phượng 1538.8 44.38 Nòi Bến Tre 1500.1 41.98 Vaccine VC1 1525.4 54.45 VC2 1496.9 52.51 VC3 1536.1 51.68 Lần tiêm lần 1 525.8 46.60 lần 2 2513.2 39.48
140
Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence Lần tiêm N Mean Grouping lần 2 156 2513.2 A lần 1 112 525.8 B Means that do not share a letter are significantly different.
1 Một số loại vaccine và kháng thể phòng chống bệnh Gumboro trên gà
tại ĐBSCL
1.1 Một số vaccine phòng bệnh Gumboro
1.1.1 Vaccine Gumboro của công ty cổ phần thuốc thú y Navetco
www.navetco.com.vn
Đặc tính: vaccine nhược độc dạng đông khô được sản xuất từ virus Gumboro nuôi cấy trên môi trường tế bào xơ phôi gà. Vaccine an toàn, tạo miễn dịch tốt cho gà mọi lứa tuổi (Hình 2.15).
Hình 1: Vaccine Gumboro của công ty thuốc thú y Navetco
(www.navetco.com.vn)
Thành phần: Mỗi liều vaccine chứa ít nhất 103TCID50 virus Gumboro nhược
độc và chất ổn định (sữa không kem).
Chỉ định: Dùng để phòng bệnh Gumboro cho gà khỏe mạnh từ 1 ngày tuổi
trở lên.
141
Cách sử dụng: Vaccine có thể sử dụng bằng phương pháp nhỏ mắt, cho uống hoặc tiêm dưới da. Để tạo được miễn dịch đầy đủ, gà phải được chủng vaccine 2 lần:
- Lần 1: 5-10 ngày tuổi. - Lần 2: 20-25 ngày tuổi. - Không nên sử dụng vaccine Gumboro đồng thời với các loại vaccine khác.
Bảo quản: bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8oC, không để vaccine vào ngăn đông,
tránh ánh sáng mặt trời.
Hạn sử dụng: 18 tháng kể từ ngày sản xuất.
1.1.2 Medivac Gumboro A của Medion-Indonesia
Thành phần: Medivac Gumboro A chứa virus Gumboro chủng Cheville
1/68. Mỗi liều chứa ít nhất 102EID50 virus (Hình 2.16).
Chỉ định: Medivac Gumboro A được chỉ định để phòng bệnh Gumboro cho
gà ở 7 ngày tuổi.
Cách sử dụng: Medivac Gumboro A chủng cho gà theo phương pháp nhỏ miệng hoặc pha nước uống. Gà một tuần tuổi trở lên có thể chủng theo phương pháp pha nước uống nhưng để đạt được hiệu quả tối đa nên chủng bằng phương pháp nhỏ miệng.
www.bukalapak.com
Bảo quản: bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8oC
Hình 2: Vaccine Medivac Gumboro A
(www.bukalapak.com)
1.1.3 Cevac® IBD L của Ceva-Hungary
142
Thành phần: Cevac®IBD L chứa virus dòng Winterfield 2512 G-61 gây viêm túi Bursal, ở dạng nhược độc, đông khô. Phôi trứng gà dùng để sản xuất vaccine được lấy từ đàn gà "sạch" không có mầm bệnh (SPF) (Hình 2.17).
Chỉ định: dùng để phòng bệnh Gumboro cho gà khỏe mạnh.
Chống chỉ định: không dùng cho gà không có kháng thể mẹ truyền.
Cách sử dụng: Có thể xác định ngày thực hiện chủng ngừa chính xác bằng cách kiểm tra hiệu giá kháng thể mẹ truyền bằng các phương pháp huyết thanh học. Cevac® IBD L được sử dụng bằng cách pha nước uống. Gà thịt nên được phòng bệnh từ 10 đến 18 ngày tuổi, phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể mẹ truyền.
Bảo quản: bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8oC, tránh đông đá, tránh ánh sáng
trực tiếp.
Hình 3: Vaccine Cevac® IBD L
(www.ceva.vn)
1.1.4 BUR-706 của MERIAL-Pháp
Thành phần: vaccine sống cải tiến, đông khô. Mỗi liều vaccine có chứa tối
thiểu 104 CCID50 chủng S 706 trên gà (Hình 2.18).
Đường cấp thuốc: nhỏ mắt, nhúng mỏ, pha vào nước uống, phun sương.
Lịch chủng ngừa: Bur-706 cấp được cho gà ngay lúc 01 ngày tuổi. Lịch cấp vaccine phải phù hợp với điều kiện dịch tễ của địa phương (dòng virus tại địa phương, điều kiện vệ sinh, kháng thể gà bố mẹ không) và mô hình chăn nuôi (gà thịt, gà hậu bị hướng đẻ).
Chú ý: Chỉ cấp cho gà khoẻ. Khi pha loãng vaccine, nên dùng dụng cụ đã tiệt
trùng và hoàn toàn không có bất kỳ chất sát trùng nào.
143
Bảo quản: Bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8oC, tránh ánh sáng.
viphavet.com
Hình 4: Vaccine BUR-706 của MERIAL-Pháp
(http://viphavet.com)
1.1.5 IBD BLEN của MERIAL-Mỹ
http://viphavet.com
Thành phần: Vaccine sống gây bệnh Gumboro chứa virus dòng Winterfield 2512 (chủng cổ điển) IBD Blen. Mỗi liều vaccine có chứa tối thiểu 102 EID50 (Hình 2.19).
Hình 5: Vaccine IBD BLEN
144
(http://viphavet.com)
Cách sử dụng: Pha vào nước uống cho gà khoẻ mạnh từ 07 đến 14 ngày tuổi.
Chú ý:
- Chỉ cấp vaccine cho gà khỏe mạnh. - Cấp vaccine cho tất cả gà cùng một lúc. - Cấp tối thiểu 01 liều/con. - Tránh gây stress cho gà trong và sau khi cấp vaccine. - Sử dụng hết toàn bộ vaccine khi mở nắp lần đầu. - Đốt các lọ chứa vaccine và toàn bộ vaccine dư không sử dụng.
Bảo quản: Bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8oC, không đông đá.
1.1.6 Bursine®-2 của Zoetis-Mỹ
Thành phần: Vaccine chứa virus Gumboro nhược độc dòng trung bình.
www.zoetisus.com
Chỉ định: sử dụng để phòng bệnh Gumboro cho gà khỏe mạnh (Hình 2.20).
Hình 6: Vaccine Bursine -2
(www.zoetisus.com)
Hướng dẫn sử dụng:
- Gà thương phẩm: chủng cho gà khỏe mạnh từ 7 ngày tuổi. Rất an toàn cho
gà 1 ngày tuổi khi mức kháng thể mẹ truyền thấp.
- Gà giống: cho uống lúc 6-8 tuần trước khi sử dụng vaccine chết.
145
Bảo quản: Bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8oC, tránh ánh nắng chiếu trực tiếp.
1.1.7 Bursine®-Plus của Zoetis-Mỹ
Thành phần: Vaccine chứa virus Gumboro nhược độc dòng trung bình cộng.
Chỉ định: sử dụng để phòng bệnh Gumboro cho gà khỏe mạnh.
Hướng dẫn sử dụng:
- Gà thương phẩm: chủng cho gà khỏe mạnh từ 7 ngày tuổi. - Gà giống: cho uống lúc 6-8 tuần trước khi sử dụng vaccine chết.
Bảo quản: Bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8oC, tránh ánh nắng chiếu trực tiếp.
1.1.8 NOBILIS® GUMBORO D78
www.msd-animal-health.co.za
Thành phần: Nobilis® Gumboro D78 là một loại vaccine sống đông khô có chứa chủng virus D78 sống truyền bệnh (Gumboro) với chất ổn định và gentamycin. Mỗi liều chứa ít nhất 4log10 TCID50 chủng IBDV D78 (Hình 2.21).
Hình 7: Vaccine NOBILIS® GUMBORO288E
(www.msd-animal-health.co.za)
Chỉ định: Tiêm phòng cho gà chống lại bệnh Gumboro (IBD).
Hướng dẫn sử dụng: Nobilis® Gumboro D78 có thể được dùng cho gà trong
khoảng từ 7 đến 28 ngày tuổi.
Bảo quản: Bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8oC, tránh ánh nắng chiếu trực tiếp.
1.2 Một số loại kháng thể Gumboro đang lưu hành trên thị trường
1.2.1 Kháng thể Gumboro và Newcastle của Phân viện Thú y Miền
Trung
146
Đặc tính kỹ thuật: Kháng thể Gumboro và Newcastle là sinh phẩm thú y được sản xuất từ lòng đỏ trứng gà chứa kháng thể kháng virus Gumboro, Newcastle
và viêm phế quản truyền nhiễm. Sinh phẩm có tính ổn định cao về an toàn và hiệu lực.
Chỉ định: Dùng để phòng và trị bệnh Gumboro, Newcastle và viêm phế quản
truyền nhiễm cho gà ở mọi lứa tuổi.
Thành phần
Kháng thể Gumboro (hiệu giá AGP 4log2). -
Kháng thể Newcastle (hiệu giá HI 9 log2). -
Kháng thể viêm phế quản truyền nhiễm (chỉ số S/P 0,85). -
Cách sử dụng: Để kháng thể ở nhiệt độ phòng cho đến khi trở lại dạng lỏng
bình thường, lắc đều trước khi dùng và sử dụng ngay trong ngày.
Điều trị bệnh: Gà dưới 2 tháng tuổi tiêm bắp 1ml/con/lần. Gà trên 2 tháng
tuổi tiêm 2ml/con/lần. Tiềm hai lần, mỗi lần cách nhau 3 ngày.
Phòng bệnh: Bằng nửa liều điều trị (tiêm một lần duy nhất).
Bảo quản: bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8oC (http://phanvienthuy.com.vn/san-
pham/56-KT-Gumboro-va-Newcastle.html).
1.2.2 HANVET K.T.G
Thành phần: Là kháng thể đa giá chiết xuất từ gà được tối miễn dịch bao gồm: Kháng thể chống bệnh Gumboro, Newcastle, viêm phế quản truyền nhiễm, CRD, cúm gia cầm và các kháng thể không đặc hiệu khác (Hình 2.22).
Tác dụng
- Do sử dụng hệ virus địa phương nên kháng thể rất có hiệu quả trong điều trị
các bệnh Gumboro, Newcastle, viêm phế quản truyền nhiễm.
- Thay vaccine phòng bệnh Gumboro ở gà thịt. - Phòng bệnh: IB, CRD, Cúm. - Kháng thể có tác dụng điều trị ngay sau khi tiêm vài giờ. - Có tác dụng như một Protein liệu pháp nhằm tăng sức đề kháng, tăng trọng
cho gia cầm.
- Kháng thể lưu giữ trong máu 20 ngày nhưng tác dụng bảo hộ tốt nhất trong
vòng 10 ngày sau khi tiêm.
Bảo quản
147
- Bảo quản lạnh ở nhiệt độ 2 - 4°C, tránh ánh sáng trực tiếp.
gian quản ngày bảo sản kể từ 6
http://hanvet.com.vn
xuất. tháng (http://www.hanvet.com.vn/vn/scripts/prodView.asp?idproduct=258).
Hình 8: Kháng thể Hanvet K.T.G
(http://hanvet.com.vn)
1.2.3 Navet – kháng Gum
Đặc điểm: Chế phẩm dạng dung dịch, màu vàng, chứa kháng thể Gumboro đặc hiệu dùng phòng và trị bệnh Gumboro. Kháng thể chứa trong sản phẩm thu được từ lòng đỏ trứng gà của những gà đã được gây tối miễn dịch với virus Gumboro và tiêm vaccine phòng một số bệnh nguy hiểm khác của gà như: Newcastle, Cúm gia cầm, IB,.... (Hình 2.23).
Thành phần: Kháng thể Gumboro, với hiệu giá VN≥8 log2. Chất bảo quản.
Công dụng: Phòng và trị bệnh Gumboro. Cho gà đẻ cung cấp trứng để sản xuất Navet-Kháng Gum được tiêm phòng các loại vaccine như: Newcastle, Cúm gia cầm H5N1, IB,... Nên trong chế phẩm này có thể có các kháng thể đặc hiệu phòng và trị các loại bệnh trên.
148
Bảo quản: Bảo quản ở 2 – 8oC. Thời gian sử dụng: 12 tháng kể từ ngày sản xuất. (http://www.navetco.com.vn/vi/sanpham/navet-kh%C3%A1ng-gum-0).
www.navetco.com.vn
Hình 9: Kháng thể Navet – kháng Gum
(www.navetco.com.vn)
2 Một số đặc điểm của gà Nòi lai và gà Lương Phượng nuôi tại ĐBSCL
2.1 Gà Nòi lai
2.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm ngoại hình
Giống gà Nòi lai được nuôi phổ biến ở các tỉnh Nam Bộ, là sự kết hợp giữa gà Nòi với một số giống gà địa phương hoặc giống gà nhập nội để sản xuất con lai nuôi thịt, thích nghi tốt với điều kiện chăn thả do sức đề kháng cao. Ngoại hình của gà Nòi với những đặc điểm chân cao, mình dài, cổ cao, mào đỏ tía, cựa sắc và dài, màu sắc lông rất đa dạng (Nguyễn Thị Mai và ctv, 2009).
149
Giống gà Nòi được người chăn nuôi rất ưa chuộng vì chúng có rất nhiều ưu điểm gà thích nghi tốt với điều kiện chăn thả vì chúng có sức đề kháng cao và ít bệnh hơn so với một số giống gà thả vườn khác. Theo Nguyễn Hữu Vũ và Nguyễn Đức Lưu (2001) giống gà Nòi được nuôi khắp nơi trong cả nước và thường được gọi là gà Chọi (Nguyễn Mạnh Dũng và Huỳnh Hồng Hải, 2006). Về ngoại hình giống gà Nòi có tầm vóc lớn con, cao ráo, màu sắc lông rất đa dạng (Bảng 2.1). Da cổ, da ức có màu đỏ tía, da vùng nách màu vàng nhạt, đùi to, chân không lông, chân thường có màu đen, vàng hoặc trắng.
Bảng 1: Một số màu sắc lông của gà Nòi (Nguyễn Trọng Ngữ và ctv., 2016)
Trống Mái Toàn đàn
Màu lông Tỷ lệ Tỷ lệ
Tỷ lệ (%) (%) (%) Số lượng (con) Số lượng (con)
Đen (ô) 61 36,53 48 35,56 36,09
Đen (tía) 23 13,77 17 12,59 13,25
Xám (xám tro) 27 16,17 26 19,26 17,55
Trắng (nhạn) 11 6,59 9 6,67 6,62
Nâu, bịp 9 5,39 7 5,19 5,3
Mã mây 13 7,78 13 9,63 8,61
Ngũ sắc 12 7,19 5 3,7 5,63
Mã chuối (vàng trắng) 11 6,59 10 7,41 6,95
100 Tổng 135 100 116 100
2.1.2 Khả năng sinh trưởng
Khả năng tăng khối lượng của gà Nòi nuôi ở các nông hộ ĐBSCL hiện nay nhìn chung còn rất thấp. Khối lượng cơ thể lúc 4,5 – 5 tháng tuổi trống nặng khoảng 1,2 – 1,4Kg, con mái nặng 1,1 – 1,2Kg (Lê Hồng Mận và Trần Văn Bình, 2009). Theo kết quả nghiên cứu Nguyễn Văn Quyên (2008) khối lượng cơ thể gà mới nở trung bình là 31,97g, ở 18 tuần tuổi gà mái có khối lượng 1.178g và khối lượng gà trống là 1.261g (Bảng 2.2). Tuổi đẻ quả trứng đầu là 219 ngày và khối lượng cơ thể lúc 30 tuần tuổi của gà trống nặng 1.874g và mái nặng 1.682g. Lúc 48 tuần tuổi gà trống 3.132g, gà mái nặng 2.216g.
150
Theo Nguyễn Trọng Ngữ và ctv (2016) giống gà Nòi lai nuôi nhốt cho ăn khẩu phần đầy đủ dinh dưỡng sẽ kết thúc lúc 14 tuần tuổi, đạt khối lượng sống trung bình là 1,3 kg/mái và 1,5 kg/trống. Gà đẻ 50 – 70 quả trứng/năm, khối lượng trứng 50 – 55g. Thịt gà Nòi săn chắc, thơm, ngon có hàm lượng dinh dưỡng cao và có thể chế biến được món ăn ngon
Bảng 2: Khối lượng cơ thể gà Nòi (g) qua các tuần tuổi (n = 100) (Nguyễn Văn Quyên, 2008)
Gà trống Gà mái
Tuần
TL trung CV TL trung CV tuổi
bình (%) bình (%)
Mới nở 31,97 ± 0,12 3,8 31,97 ± 0,12 3.8
8 367,38 ± 3,14 7,38 367,38 ± 3,14 8,56
18 1.261,75 ± 7,78 5,33 1.178,68±4,55 3,86
24 1.546,95 ± 7,78 4,31 1.447,22±6,13 4,24
30 1.874,16 ± 7,16 4,12 1.682,38±5,98 4,06
48 3.132,36±13,33 4,19 2.216,39±8,92 4,03
2.2 Gà Lương Phượng
2.2.1 Nguồn gốc và đặc điểm ngoại hình
Gà Lương Phượng (còn được gọi là gà Lương Phượng Hoa) được các nhà tạo giống của xí nghiệp gà thành phố Nam Ninh, tỉnh Quảng Tây Trung Quốc nghiên cứu sử dụng dòng gà trống địa phương và mái ngoại nhập, đã được Ủy ban khoa học Thành phố Nam Ninh giám định tính ổn định đặc điểm di truyền các tính trạng và tính năng sản suất. Năm 1995, hàng chục ngàn gà Lương Phượng bố mẹ chính thống lần đầu tiên đã được nhập về Việt Nam theo dự án “Đầu tư phát triển giống gà năng suất chất lượng cao”. Tiếp đến, nhằm từng bước chủ động giống, các nghiên cứu chọn tạo dòng Lương Phượng có năng suất trên 95% nguyên gốc nhưng có chất lượng sản phẩm tương đương (Trần Công Xuân và ctv, 2003). Không chỉ chọn tạo trong dòng, gà Lương Phượng còn được nghiên cứu lai tạo với các giống gà nội địa khác nhằm phục vụ nuôi thả vườn tại nông hộ như: lai tạo giữa gà Lương Phượng và gà Ri (Nguyễn Huy Đạt và ctv, 2001) nghiên cứu khả năng sản xuất của tổ hợp lai ¾ máu Lương Phượng và ¼ máu Sasso (Phùng Đức Tiến và ctv, 2003).
151
Tại Việt Nam qua 3 thế hệ chọn tạo dòng gà Lương Phượng vẫn còn duy trì đặc điểm ngoại hình của từng dòng: có màu sắc lông đa đạng khi mới nở gà có màu
lông vàng nhạt, chấm đen có ba sọc đen dọc lưng, số còn lại màu xám tro, vàng đậm, vàng nhạt và trắng. Khi trưởng thành gà trống có lông màu vàng đậm và nhiều đốm đen trong khi gà mái phần lớn có lông màu vàng nhạt đốm đen phân biệt ở phần lông cổ và cánh (Trần Công Xuân và ctv, 2003).
2.2.2 Khả năng sinh trưởng
Cùng với các yếu tố thích nghi về điều kiện khí hậu thì việc chăm sóc, nuôi dưỡng, thõa mãn đủ các nhu cầu sinh lý cần cho mỗi giai đoạn phát triển của cơ thể là rất cần thiết vì giúp khai khác tối đa tiềm năng di truyền và khối lượng hạ thịt cho gia cầm nói chung. Khối lượng trưởng thành của gà trống 2,7kg và gà mái 2,1kg. Gà mái bắt đầu đẻ trứng lúc 24 tuần, đến 66 tuần tuổi đạt 170 quả/mái. Gà thịt nuôi đến 70 ngày 1,58 – 1,87kg, tiêu tốn thức ăn 2,53 kg/kg tăng khối lượng (Trần Công Xuân và ctv, 2003).
152
Khối lượng gà mái lúc 20 tuần tuổi là 1,9 – 2,1 kg, gà trống là 2,8 – 3,1kg, tuổi đẻ quả trứng đầu tiên 22 – 23 tuần tuổi, tuổi đẻ cao nhất của gà là 29 – 31 tuần tuổi, sản lượng trứng lú 68 tuần tuổi 150 – 170 quả/mái, tỷ lệ ấp nở 80 – 85%. Chỉ tiêu năng suất thịt đến 12 tuần tuổi; khối lượng 2 – 2,5kg, tiêu tốn thức ăn/ kg tăng trọng 3 – 3,2 kg, chất lượng thịt mềm ngon (Nguyễn Thị Thủy, 2012).
