Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu bệnh nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt tại một số tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP

NGUYỄN THU TÂM

NGHIÊN CỨU BỆNH NHIỄM ĐỘC TỐ BOTULIN

CỦA VI KHUẨN Clostridium botulinum TRÊN VỊT

TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG

SÔNG CỬU LONG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI

NĂM 2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI

MÃ NGÀNH: 62.64.01.02

NGHIÊN CỨU BỆNH NHIỄM ĐỘC TỐ BOTULIN

CỦA VI KHUẨN Clostridium botulinum TRÊN VỊT

TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG

SÔNG CỬU LONG

Cán bộ hướng dẫn khoa học

PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC HIỀN

Nghiên cứu sinh thực hiện

Nguyễn Thu Tâm

NĂM 2020

CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG

Luận án đính kèm theo đây, với tên đề tài: “Nghiên cứu bệnh nhiễm

độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt tại một số tỉnh

Đồng bằng Sông Cửu Long” do Nghiên cứu sinh Nguyễn Thu Tâm thực hiện

và báo cáo đã được hội đồng chấm luận án thông qua.

Ủy viên Thư ký

Phản biện 1 Phản biện 2

Cán bộ hướng dẫn 1 Chủ tịch Hội đồng

i

LỜI CẢM TẠ

Trong suốt quá trình học tập và làm luận án tiến sĩ, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ từ quý thầy cô, gia đình và bạn bè. Hôm nay, tôi đã hoàn thành luận án, tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn.

Trước hết tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban chủ nhiệm khoa Nông nghiệp, Ban chủ nhiệm Bộ môn Thú Y đã chấp thuận, tạo điều kiện thuận lợi và có chính sách ưu đãi cho tôi được học tập nâng cao trình độ chuyên môn.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy hướng dẫn – PGS. TS. Nguyễn Đức Hiền đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu, bổ sung kiến thức và hoàn thành luận án.

Xin cảm ơn đến quý thầy cô thuộc Bộ môn Thú Y, trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giảng dạy và chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong quá trình học tập cũng như làm việc.

Xin gởi lời cảm ơn đến thầy PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải – Trường Đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh và các nhân viên phòng thí nghiệm Việt-Hàn – Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình hướng dẫn, hỗ trợ kỹ thuật chuyên môn cho tôi trong quá trình nghiên cứu.

Tôi cũng xin đặc biệt cảm ơn đến các anh chị và em là cựu sinh viên của ngành Chăn nuôi, ngành Thú Y và các anh chị làm công tác thú y tại các tỉnh An Giang, Hậu Giang, Kiên Giang và thành Phố Cần Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong việc thu thập mẫu được kịp thời và chính xác. Tôi xin chân thành cảm ơn các chủ hộ chăn nuôi vịt đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong việc lấy mẫu và lấy thông tin liên quan đến đề tài nghiên cứu.

Xin chân thành cảm ơn các cán bộ thuộc Trạm chẩn đoán xét nghiệm và điều trị bệnh động vật – Chi cục chăn nuôi và Thú Y thành phố Cần Thơ, Ban lãnh đạo Công ty TNHH Một thành viên chăn nuôi Vemedim đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ cho tôi hoàn thành một số thí nghiệm trong nghiên cứu.

Xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp, bạn bè và gia đình đã động viên, khích lệ, giúp đỡ và chia sẻ những buồn vui trong học tập, công việc và trong cuộc sống để tôi có thêm nghị lực, niềm tin và điểm tựa để phấn đấu và hoàn thành luận án của mình.

Xin chân thành cám ơn!

Tác giả luận án

Nguyễn Thu Tâm

ii

TÓM TẮT

Luận án “Nghiên cứu bệnh nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium

botulinum trên vịt tại một số tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long” được thực hiện từ

năm 2013 đến 2017, tại các tỉnh, thành phố gồm An Giang, Kiên Giang, Hậu Giang

và thành phố Cần Thơ (TPCT) với mục tiêu chung là đánh giá tần suất lưu hành

bệnh botulism trên đàn vịt chạy đồng của Đồng bằng sông Cửu Long; xác định sự

hiện diện vi khuẩn C. botulinum cũng như type độc lực của botulin trên vịt bệnh và

môi trường chăn nuôi; đồng thời đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng C.

botulinum phân lập được tại Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL).

Điều tra 187.505 vịt chạy đồng (VCĐ) được nuôi dưỡng tại tỉnh An Giang,

Kiên Giang, Hậu Giang và thành phố Cần Thơ (TPCT), trong đó có 108.505 con vịt

đẻ và 79.000 con vịt thịt. Kết quả cho thấy, 2.253 con VCĐ được nuôi dưỡng tại

ĐBSCL mắc bệnh botulism chiếm 1,19 %. Tỷ lệ vịt đẻ mắc bệnh 1,52% cao hơn vịt

thịt (0.91%) và khác nhau có ý nghĩa thống kê. Triệu chứng lâm sàng của bệnh

botulism trên VCĐ là liệt cổ, liệt mí mắt - đồng tử dãn và liệt chân xuất hiện ở tần

suất khá cao lần lượt là 87,92%, 90,07%, 79,78%, triệu chứng vịt giảm ăn ủ rũ, xù

lông, kém vận động với tỷ lệ 68,55%; tiêu chảy phân trắng - xanh 70,96% và tiêu

chảy máu là 34,30%. Bệnh tích gan, phổi xuất huyết chiếm tỷ lệ cao lần lượt là

95,48%, 86,19%, bệnh tích ruột trống thức ăn và sinh hơi cũng chiếm tỷ lệ 92,14%.

Phân lập vi khuẩn C. botulinum trên bệnh phẩm của vịt bệnh theo Lindstrom

and Korkeala (2006) và qui trình có cải tiến, kết quả cho thấy tỷ lệ hiện diện vi

khuẩn C. botulinum trên mẫu phân vịt bệnh chiếm tỷ lệ cao hơn trên mẫu gan với tỷ

lệ lần lượt là 50,72% và 43,13%. Xác định độc tố trong 200 mẫu huyết thanh của vịt

bệnh botulism bằng thử nghiệm trên chuột bạch theo tiêu chuẩn CDC - Hoa Kỳ

(1998) với kết quả của huyết thanh không xử lý nhiệt xuất hiện 63% chuột chết và

37% chuột có triệu chứng bất thường. Định type độc tố botulin bằng phản ứng trung

hòa với huyết thanh chuẩn, kết quả thể hiện tỷ lệ mẫu huyết thanh chứa độc tố

botulin type C là khá cao, chiếm 40,48%; kế đến là mẫu huyết thanh chứa độc tố

botulin type E với tỷ lệ 28,57%, thấp nhất là mẫu huyết thanh chứa độc tố botulin

type D với 25,40%; Đặc biệt, kết quả thí nghiệm còn có sự hiện diện kết hợp giữa

type C + type D là 3,97% và giữa type C + type E là 1,59%.

Xác định các các yếu tố nguy cơ gây bệnh botulism trên VCĐ ở ĐBSCL bằng

cách phân lập vi khuẩn C. botulinum trên đất ruộng, nước trên mặt ruộng, cua và ốc

trên ruộng nuôi có vịt bệnh theo qui trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium

iii

botulinum của Lindstrom and Korkeala (2006) và qui trình có cải tiến. Kết quả cho

thấy sự hiện diện của vi khuẩn C. botulinum trên đất 17,5%, nước trên mặt ruộng

19,67%; trên cua (8,33%) cao hơn trên ốc (3,00%) và sự sai khác của hai tỷ lệ này

rất có ý nghĩa về mặt thống kê với P<0,01.

Đánh giá tính gây bệnh của vi khuẩn C. botulinum phân lập được bằng cách

xác định LD50 trên vịt được tiêm truyền độc tố botulin vào tĩnh mạch và đường uống.

Sau 7 ngày theo dõi, kết quả cho thấy 23/32 mẫu làm vịt chết, chiếm 71,88% và vịt

có biểu hiện triệu chứng bất thường 28,12%. Vịt xuất hiện các triệu chứng lâm sàng

như ủ rủ, ít đi lại, xù lông, giảm ăn, giảm đẻ chiếm tỷ lệ 100%; triệu chứng liệt cổ

chiếm 92,19%; liệt mí mắt, dãn đồng tử với tỷ lệ 76,19%; liệt chân chiếm 60,94%;

tiêu chảy phân trắng - xanh chiếm 35,94%. Mổ khám bệnh tích cho thấy gan xuất

huyết chiếm 92,19%, bệnh tích ruột trống thức ăn, sinh hơi chiếm 89,06%, phổi tụ

huyết với tỷ lệ 81,25%.

Từ khóa: Botulin, Clostridium botulinum, limberneck, đồng bằng sông Cửu Long.

iv

ABSTRACT

The thesis named “Study on botulin poisonging disease of Clostridium

botulinum on ducks in the Mekong Delta” was conducted from 2013 to 2017 in An

Giang, Hau Giang, Kien Giang and Can Tho to clarify the frequency of the botulism

disease on the free-grazing ducks of the Mekong Delta; the prevalence and botulin

toxin types of C. botulinum isolated from infected ducks and the environment; the

evaluation of pathogenicity of isolated C. botulinum strains in the Mekong Delta.

A total of 187,505 free-grazing ducks were examined in An Giang, Hau Giang,

Kien Giang and Can Tho including 108,505 laying ducks and 79,000 meat ducks.

The results indicated that 2,253 ducks were infected with botulism disease with 1.19

% in a total of ducks. Laying ducks were infected disease (1.52%) higher than meat

ducks were (0.91%) with a significant statistical difference. The clinical symptoms of

botulism infected ducks were neck paralysis, eyelids paralysis – mydriasis, leg

paralysis at high rates of 87.92%, 90.07%, 79.78% respectively; ducks were less

eating, moody, ruffled feathers, less activities 68.55%; greenish diarrhea and blood

diarrhea were 70.96% and 34.30%. The lesions of liver and haemorrhage lung were

also high at 95.48%, 86.19%; and gas in the intestine was 92.14%.

The isolation of C. botulinum from duck specimens was followed the method of

Lindstrom and Korkeala (2006) and had modification. The prevalence of C.

botulinum was in feces (50.72%) higher than that in liver (43.13%). The

determination of botulin toxin with 200 serum samples from infected ducks was

examined on mice following the standard of CDC (1998); the result in without heat

treatment Group showed that mice were died at 63% and abnormal at 37%. By the

neautral reaction, the sera were with botulin type C at a relatively high rate

(40.48%), followed by type E (28.57%), type D (25.40%); especially, there were the

combination types of type C + type D (3.97%) and type C+ type E (1.59%).

The risk factors of the botulism disease in the free-grazing ducks were

determined via the isolation of C. botulinum from soil, water, crabs and snails at the

fields with infected ducks. It was also done by following the modified method of

Lindstrom and Korkeala (2006). The prevalence of C. botulinum was 17.5% in soil,

19.67% in water; especially, C. botulinum was present in crabs (8.33%) higher than

in snails (3.00%) (P<0,01).

The pathogenicity of isolated C. botulinum strains was examined the LD50 on

ducks by injection of toxin suspension via intravenous and oral route. Ater 7

v

observed days, it showed that 23/32 samples made ducks die (71.88%) and abnormal

ducks was 28.12%. Ducks exhibited the clinical symptoms such as moody, less

movement, ruffled fearthers, less eating and laying (100%); neck paralysis (92.19%);

eyelids paralysis and mydriasis (76.19%); leg paralysis (60.94%); greenish diarrhea

(35.94%). The lesions were heamorrhage liver (92.19%), the empty and gas

producing in intestine (89.06%), and haemorrhage lung (81.25%).

Key words: Botulin, Clostridium botulinum, limberneck, Mekong delta.

vi

TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả

nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa

từng dùng để bảo vệ ở bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp

đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong

luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Cán bộ hướng dẫn Tác giả luận án

PGS. TS. Nguyễn Đức Hiền

Nguyễn Thu Tâm

vii

MỤC LỤC

CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG .................................................................. i

LỜI CẢM TẠ ................................................................................................... ii

TÓM TẮT ........................................................................................................ iii

ABSTRACT ...................................................................................................... v

TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ .................................................................... vii

MỤC LỤC ..................................................................................................... viii

DANH SÁCH BẢNG ..................................................................................... xii

DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................... xiv

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. xvi

Chương 1: GIỚI THIỆU ................................................................................. 1

1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài .................................................................... 2

1.3 Những đóng góp mới về khoa học ............................................................... 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3

2.1 Giới thiệu về bệnh nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium

botulinum ........................................................................................................... 3

2.2 Tác nhân gây bệnh nhiễm độc tố botulin ..................................................... 4

2.3 Đặc tính sinh học của vi khuẩn C. botulinum .............................................. 4

2.3.1 Phân loại, đặc điểm hình thái .................................................................... 4

2.3.2 Đặc tính nuôi cấy ...................................................................................... 6

2.3.3 Đặc tính sinh hóa ...................................................................................... 6

2.3.4 Khả năng hình thành bào tử của Clostridium ........................................... 7

2.3.5 Sức đề kháng ............................................................................................. 8

2.3.6 Sự phân bố và ảnh hưởng của vi khuẩn C. botulinum trong tự nhiên ...... 8

2.3.7 Độc tố của vi khuẩn ................................................................................ 10

2.3.7.1 Độc tố botulin ...................................................................................... 10

2.3.7.2 Cơ chế gây bệnh của độc tố botulin ..................................................... 13

2.4 Bệnh do nhiễm độc tố của Clostridum botulinum ..................................... 15

2.4.1 Bệnh ở người .......................................................................................... 15

viii

2.4.2 Bệnh ở động vật hữu nhũ ........................................................................ 17

2.4.3 Bệnh do độc tố của Clostridium botulinum ở loài gia cầm .................... 18

2.4.4 Ảnh hưởng của độc tố botulin trên cá ..................................................... 24

2.4.5 Ảnh hưởng của độc tố botulin trên chuột ............................................... 24

2.5 Phương pháp xác định độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum25

2.5.1 Phương pháp tiêm truyền cho chuột bạch (Mouse bioassay) ................. 26

2.5.2 Xác định độc tố botulin bằng sinh học phân tử ...................................... 29

2.5.3 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum ........ 29

2.5.3.1 Phương pháp lấy mẫu .......................................................................... 29

2.5.3.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn C. botulinum ..................... 31

2.6 Những ứng dụng của độc tố botulin của vi khuẩn C. botulinum ............... 31

2.6.1 Trong y học ............................................................................................. 31

2.6.2 Trong thẩm mỹ........................................................................................ 33

2.7 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn C. botulinum trong và ngoài nước ...... 33

2.7.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn C. botulinum trên thế giới ................ 33

2.7.2 Tình hình ngộ độc do độc tố của vi khuẩn C. botulinum trên thế giới .. 41

2.7.3 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn C. botulinum ở Việt Nam ................ 43

2.8 Một số đặc điểm sinh học của vịt đẻ .......................................................... 44

2.8.1 Nguồn gốc, đặc điểm của vịt .................................................................. 44

2.8.2 Đặc điểm tiêu hóa, hấp thu thức ăn của vịt ............................................. 45

2.8.3 Nuôi vịt đẻ .............................................................................................. 47

2.8.4 Những điều lưu ý khi nuôi vịt đẻ ............................................................ 47

Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 49

3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................ 49

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................... 49

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu ............................................................................... 49

3.1.2.1 Địa điểm thu thập mẫu ......................................................................... 49

3.1.2.2 Phân tích mẫu và nuôi chuột thí nghiệm ............................................. 49

3.1.2.3 Thí nghiệm trên thực địa ...................................................................... 49

3.2 Trang thiết bị dụng cụ và hóa chất ............................................................. 49

3.3 Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 50

ix

3.3.1 Nội dung 1 .............................................................................................. 50

3.3.1.1 Mục tiêu ............................................................................................... 50

3.3.1.2 Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 50

3.3.1.3 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 51

3.3.1.4 Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................... 52

3.3.2 Nội dung 2 .............................................................................................. 52

3.3.2.1 Mục tiêu ............................................................................................... 52

3.3.2.2 Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 52

3.3.2.3 Phương pháp tiến hành ........................................................................ 53

3.3.2.4 Chỉ tiêu theo dỏi ................................................................................... 60

3.3.3 Nội dung 3 .............................................................................................. 60

3.3.3.1 Mục tiêu ............................................................................................... 60

3.3.3.2 Đối tượng nghiên cứu: môi trường chăn nuôi: đất, nước, cua, ốc ....... 60

3.3.3.3 Phương pháp thực hiện ........................................................................ 60

3.3.3.4 Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................... 61

3.3.4 Nội dung 4 .............................................................................................. 62

3.3.4.1 Mục tiêu ............................................................................................... 62

3.3.4.2 Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 62

3.3.4.3 Phương pháp tiến hành ........................................................................ 62

3.3.4.4 Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................... 66

3.4 Xử lý số liệu ............................................................................................... 66

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 67

4.1 Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng (VCĐ) Đồng bằng sông Cửu

Long (ĐBSCL) ................................................................................................ 67

4.1.1 Điều kiện tự nhiên của các tỉnh An Giang, Hậu Giang, Kiên Giang và

thành phố Cần Thơ........................................................................................... 67

4.1.2 Tình hình chăn nuôi vịt chạy đồng ở ĐBSCL ........................................ 70

4.1.3. Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng ở (ĐBSCL) ...................... 72

4.1.4 Tình hình vịt bệnh botulism theo mục đích nuôi .................................... 74

4.1.5 Triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh botulism trên vịt chạy đồng . 75

4.1.6 Bệnh tích đại thể trên vịt bệnh botulism ................................................. 76

x

4.2 Phân lập vi khuẩn C. botulinum và xác định độc tố botulin trên vịt chạy

đồng mắc bệnh botulism .................................................................................. 77

4.2.1 Phân lập vi khuẩn C. botulinum trên bệnh phẩm của vịt bệnh botulism 77

4.2.2 Xác định độc tố trong huyết thanh của vịt bệnh botulism bằng thử

nghiệm trên chuột bạch .................................................................................... 79

4.2.2.1 Kết quả gây độc trên chuột .................................................................. 79

4.2.2.2 Kết quả xác định type độc tố botulin ................................................... 82

4.3 Xác định các các yếu tố nguy cơ gây bệnh botulism trên vịt chạy đồng ở

ĐBSCL có bệnh botulism ................................................................................ 84

4.3.1 Tình hình nhiễm vi khuẩn C. botulinum từ các mẫu đất và nước trên

ruộng ................................................................................................................ 84

4.3.2 Tình hình nhiễm vi khuẩn C. botulinum từ mẫu cua và ốc trên ruộng ... 87

4.4 Tính gây bệnh của vi khuẩn C. botulinum phân lập được trên vịt bệnh và

môi trường........................................................................................................ 88

4.4.1 Kiểm tra độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn C. botulinum ................ 88

4.1.2 Sự đa kháng của vi khuẩn C. botulinum phân lập được với một số loại

kháng sinh ........................................................................................................ 91

4.4.3 Thử nghiệm độc tố botulin trên vịt ......................................................... 93

4.4.4 Những triệu chứng lâm sàng trên vịt thử nghiệm độc tố ........................ 94

4.4.5 Khảo sát bệnh tích đại thể trên vịt thử nghiệm độc tố botulin ................ 96

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................ 99

5.1 Kết Luận .................................................................................................... 99

5.2 Đề nghị ..................................................................................................... 100

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 100

PHỤ LỤC MẪU ĐIỀU TRA DỊCH BỆNH TRÊN ĐÀN VỊT ................. 119

KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ CÁC SỐ LIỆU ...................................... 120

xi

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Đặc trưng tổng quát hệ gen một số loài Clostridium ......................... 5

Bảng 2.2 Một số phản ứng sinh hóa của các Clostridium ................................. 6

Bảng 2.3 Sự hiện diện của vi khuẩn Clostridium trong một số loại mẫu .......... 9

Bảng 2.4 Quan hệ giữa các nhóm của độc tố botulin và một số ký chủ .......... 13

Bảng 2.5 Phương pháp xác định độc tố botulin bằng sinh học phân tử theo loại

mẫu ................................................................................................................... 29

Bảng 2.6 Bảng hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm để xác định bệnh botulism.... 30

Bảng 3.1 Phân bố mẫu khảo sát tại 4 địa điểm lấy mẫu .................................. 51

Bảng 3.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. botulinum trong bộ API 20A..... 55

Bảng 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ..................................................................... 56

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm Định type độc tố botulin ...................................... 57

Bảng 3.5 Phân bố mẫu trên môi trường nuôi ................................................... 60

Bảng 3.6 Tiêu chuẩn đường kính vòng vô khuẩn của một số loại kháng sinh 62

Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm để xác định liều LD50 của độc tố botulin ............ 64

Bảng 4.1 Số lượng VCĐ nuôi tại tỉnh An Giang, Hậu Giang, Kiên Giang và

thành phố Cần Thơ........................................................................................... 71

Bảng 4.2 Tỷ lệ vịt bệnh botulism tại Đồng bằng sông Cửu Long ................... 72

Bảng 4.3 Tỷ lệ bệnh botulism trên vịt đẻ và vịt thịt ........................................ 74

Bảng 4.4 Tần suất xuất hiện triệu chứng lâm sàng trên vịt bệnh botulism ..... 76

Bảng 4.5 Tần suất xuất hiện bệnh tích đại thể trên vịt bệnh botulism............. 77

Bảng 4.6 Tỷ lệ vi khuẩn C. botulinum hiện diện trên bệnh phẩm của vịt bệnh

botulism ........................................................................................................... 77

Bảng 4.7 Tỷ lệ chuột bị nhiễm độc botulin trong huyết thanh của vịt bệnh

botulism ........................................................................................................... 79

Bảng 4.8 Tần suất xuất hiện các biểu hiện bất thường trên chuột thí nghiệm. 80

Bảng 4.9 Các bệnh tích đại thể trên chuột thí nghiệm ..................................... 81

Bảng 4.10 Xác định type độc tố botulin .......................................................... 83

Bảng 4.11 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. botulinum từ các mẫu đất và nước trên

ruộng ................................................................................................................ 85

Bảng 4.12 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. botulinum từ các mẫu cua và ốc ruộng ... 87

xii

Bảng 4.13 Tỷ lệ độ nhậy của vi khuẩn C. botulinum phân lập được với một số

loại kháng sinh ................................................................................................. 89

Bảng 4.14 Kết quả khảo sát tính đa kháng của vi khuẩn C. botulinum với một

số loại kháng sinh ............................................................................................ 91

Bảng 4.15 Tỷ lệ vịt chết sau 7 ngày thử độc tố botulin ................................... 93

Bảng 4.16 Triệu chứng lâm sàng trên vịt thử nghiệm độc tố botulin .............. 94

Bảng 4.17 Kết quả khảo sát bệnh tích đại thể trên vịt thử nghiệm độc tố

botulin .............................................................................................................. 96

xiii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Hình dạng vi khuẩn C. botulinum và nha bào .................................... 5

Hình 2.2 Cấu trúc bào tử của vi khuẩn Clostridium spp. .................................. 8

Hình 2.3 Cơ chế tác động của độc tố botulin................................................... 14

Hình 2.4 Triệu chứng ngộ độc ở cáo ............................................................... 18

Hình 2.5. Triệu chứng ngộ độc ở bò ................................................................ 18

Hình 2.6 Chu trình lan truyền botulism ở gia cầm .......................................... 20

Hình 2.7 Liệt mí mắt ở vịt ............................................................................. 22

Hình 2.8 Cổ vịt liệt .......................................................................................... 22

Hình 2.9 Vịt nhiễm độc tố botulin không nâng đầu được khỏi mặt nước ....... 22

Hình 2.10 Vai trò của C. botulinum trong một hệ sinh thái nước ngọt .......... 41

Hình 3.1 Vịt bị liệt mềm cổ ............................................................................. 52

Hình 3.2 Sơ đồ qui trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum có

cải tiến .............................................................................................................. 53

Hình 3.3 Khuẩn lạc của vi khuẩn C. botulinum trên thạch máu ...................... 54

Hình 3.4 Khuẩn lạc của vi khuẩn C. botulinum trên môi trường SFP ............. 54

Hình 3.5 Hình ảnh nha bào của vi khuẩn C. botulinum dưới KHV ................ 54

Hình 3.6 Đặc tính sinh hóa theo API 20A của vi khuẩn C. botulinum............ 55

Hình 3.7: Kháng độc tố chuẩn ......................................................................... 58

Hình 3.8 Sơ đồ xác định type độc tố botulin trong huyết thanh vịt ................. 59

Hình 3.9 Sơ đồ qui trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum

trên môi trường nuôi có cải tiến ....................................................................... 61

Hình 3.10 Sơ đồ quy trình chuẩn bị canh khuẩn chứa độc tố botulin ............. 63

Hình 4.1 Bản đồ các tỉnh ĐBSCL ................................................................... 68

Hình 4.2 Vịt chạy đồng .................................................................................... 72

Hình 4.3 Vịt chạy đồng bị liệt mềm cổ ............................................................ 74

Hình 4.4 Phổi chuột xuất huyết ....................................................................... 82

Hình 4.5 Gan chuột xuất huyết ........................................................................ 82

Hình 4.6 Mí mắt chuột sung có ghèn ............................................................... 82

Hình 4.7 Dạ dày, ruột chuột trồng thức ăn ...................................................... 82

Hình 4.8 Lông xù, rụng lông ........................................................................... 95

xiv

Hình 4.9 Liệt mi mắt ........................................................................................ 95

Hình 4.10 Phân chảy trắng- xanh .................................................................... 95

Hình 4.11 Liệt mềm cổ .................................................................................... 95

Hình 4.12 Phổi vịt tụ huyết .............................................................................. 98

Hình 4.13 Gan vịt xuát huyết ........................................................................... 98

Hình 4.14 Ruột vịt trống thức ăn ..................................................................... 98

Hình 4.15 Ruột vịt sinh hơi ............................................................................. 98

xv

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tăt Từ viết nguyên văn Ý nghĩa

Vịt chạy đồng VCĐ

Acid ribonucleotid ARN

Analytical Profile Index API

Botulinum neurotoxins Độc tố thần kinh BoNTs

Control of Disease Center Trung tâm kiểm soat bệnh tật CDC

C. bifermentans Clostridium bifermentans

C. botulinum Clostridium botulinum

C. butyticum Clostridium butyticum

C. carnis Clostridium carnis

C. chauvoei Clostridium chauvoei

C. colinum Clostridium colinum

C. difficile Clostridium difficile

C. fallax Clostridium fallax

C. histolyticum Clostridium histolyticum

C. novji Clostridium novji

C. perfringens Clostridium perfringens

C. septicum Clostridium septicum

C. sordellii Clostridium sordellii

C. spiroforme Clostridium spiroforme

C. sporogenes Clostridium sporogenes

Clostridium tetani C. tetani

Acid dipicolinic- calcium DPA-Ca

Đồng bằng sông Cửu Long ĐBSCL

Enzyme-linked ELISA

Immunosorbent assay

FDA Food and Drug Cục Quản lý Thực phẩm và

Administration Dược phẩm

LD Lethal dose Liều gây chết

xvi

MLD Minimum Lethal Dose Liều gây chết tối thiểu

PCR Polemerase Chain Reaction phản ứng chuỗi polymerase

SNAREs Soluble N-ethyl maleimide Protein SNARE

(NEM)-sensitive factor

attachment protein receptor

Synaptosomal-associated

SNAP

protein

protein family

xvii

Chương 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) với hệ thống sông ngòi chằng chịt

và khí hậu nóng ẩm, diện tích trồng lúa lớn, và nguồn động thực vật thủy sinh

phong phú; đây là những điều kiện thuận lợi để có thể chăn nuôi vịt quanh

năm, đặc biệt là nuôi vịt chạy đồng. Số lượng vịt nuôi theo phương thức chạy

đồng ở ĐBSCL khoảng 31,5 triệu con, chiếm hơn 70% đàn vịt trong vùng và

chiếm 40% trong tổng đàn vịt cả nước (Niên giám thống kê, 2019). Phương

thức chăn nuôi này có ưu điểm là tận dụng được thức ăn tự nhiên có sẵn của

vùng sông nước, lúa rơi vãi sau thu hoạch của nông dân nhằm giảm đáng kể

chi phí trong chăn nuôi. Nhưng điều này cũng là một mối đe dọa lớn cho

ngành thú y vì không thể kiểm soát được môi trường chăn thả dẫn đến nguy cơ

xảy ra dịch bệnh rất cao. Một trong những bệnh phổ biến trên đàn vịt chạy

đồng ở Đồng bằng Sông Cửu Long hiện nay là bệnh “limberneck” hay bệnh

“cúm cần” theo cách đặt tên của địa phương. Bệnh cúm cần là bệnh trên thủy

cầm do ngoại độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum gây ra; thế

nên, bệnh còn được gọi là bệnh botulism.

Vi khuẩn Clostridium botulinum là vi khuẩn kị khí tuyệt đối, sinh bào tử

hình oval và có nha bào, thường tồn tại trong đất, nhất là các vùng bùn lắng

trầm tích, trong xác các loài nhuyễn thể, trong ruột các loài động vật trên cạn và

dưới nước, sinh độc tố thần kinh botulinum neurotoxin rất mạnh, phá huỷ hoàn

toàn thần kinh trung ương (Todar, 2009). Vịt ăn phải độc tố này sẽ xuất hiện các

triệu chứng là liệt mềm cổ, liệt mí mắt, liệt cánh, liệt chân và tử số cao, gây thiệt

hại kinh tế nặng nề cho người chăn nuôi (Rocke and Friend, 1998).

Hiện nay, những trong nhân y và thú y trên thế giới đã và đang nghiên

cứu bệnh botulism trên con người và trên các loại gia cầm. Tuy nhiên, những

nghiên cứu và thông tin về tình hình về bệnh botulism, yếu tố nguy cơ cũng

như đặc điểm sinh học của vi khuẩn Clostridium botulinum tại Việt Nam nói

chung, Đồng bằng sông Cửu Long nói riêng còn khá hạn chế. Với mong muốn

thông qua nghiên cứu này sẽ cung cấp thông tin khá toàn diện về vi khuẩn

Clostridium botulinum và bệnh do vi khuẩn gây ra trên vịt chạy đồng ở Đồng

bằng sông Cửu Long. Từ đó, đề tài “Nghiên cứu bệnh nhiễm độc tố botulin

1

của vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt tại một số tỉnh Đồng bằng

sông Cửu Long” được tiến hành.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng (VCĐ) ở Đồng bằng sông

Cửu Long.

- Xác định sự hiện diện vi khuẩn C. botulinum và xác định type độc lực

của botulin trên vịt mắc bệnh botulsim.

- Đánh giá sự lưu hành của vi khuẩn C. botulinum trên môi trường chăn

nuôi VCĐ ở ĐBSCL.

- Xác định khả năng gây bệnh của các chủng C. botulinum phân lập được.

1.3 Những đóng góp mới về khoa học

- Đã đưa ra những bằng chứng khoa học xác thực đầu tiên về bệnh liệt

mềm cổ trên vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.

- Khẳng định sự hiện diện của bệnh nhiễm độc tố botulin trên vịt chạy

đồng ở Đồng bằng sông Cửu Long.

- Xác định được các type độc tố của vi khuẩn Clostridium botulinum gây

bệnh liệt cổ trên vịt.

- Kỹ thuật mouse bioassay lần đầu tiên được áp dụng để xác định bệnh

nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt ở Việt Nam.

1.4 Ý nghĩa khoa học của luận án

Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách cơ bản có hệ

thống về bệnh botulism trên vịt chạy đồng ở Đồng bằng sông Cửu Long. Từ

đó xây dựng được quy trình khoa học trong chẩn đoán xác định bệnh, đồng

thời là cơ sở khoa học trong việc xây dựng qui trình phòng trị bệnh botulism

trên vịt chạy đồng ở Đồng bằng sông Cửu Long nói riêng, cả nước nói chung.

2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về bệnh nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium

botulinum

Botulism được báo cáo lần đầu ở gà năm 1917 (Dickson, 1917) còn ở vịt

được phát hiện lần đầu ở Hoa Kỳ vào những năm 1900 và sau đó vào năm

1923, bệnh được phát hiện ở gà khi ăn giòi (ấu trùng ruồi xanh) và đây là lần

đầu tiên C. botulinum type C được phân lập từ loài thân mềm này (Bengtson,

1922). Đến năm 1930, nhiều tác giả như Giltner and Couch, Gunderson and

Hobmairer đã phân lập được C. botulinum type C từ thủy cầm hoang dã bị

bệnh tại Hoa Kỳ (Shaw and Simpson, 1936).

Ở gia cầm, bệnh còn được gọi là bệnh liệt cổ (limberneck) và bệnh vịt

phương Tây (Western duck sickness). Hầu hết gia cầm bị nhiễm C.

botulinum type C và trong ổ dịch thì vịt là loài cảm nhiễm nhất (Rosen,

1971). Bệnh xảy ra nhiều vào những tháng thời tiết nóng hơn là những tháng

lạnh (Rocke and Bollinger, 2007). Người không bị ảnh hưởng bởi type C, tuy

nhiên thí nghiệm cho thấy khỉ chết sau khi cho ăn gà nhiễm độc tố type C

(Giltner and Couch, 1930).

Đối với gia cầm, C. botulinum type E và C được xem là tác nhân chính

gây ra bệnh mặc dù một số type khác cũng có khả năng gây bệnh cho gia cầm

(Dohms, 1987). Bình thường vi khuẩn sống cộng sinh trong đường ruột gia

cầm và không gây bệnh nhưng khi con vật chết thì vi khuẩn sẽ phát triển và

sản sinh độc tố. Khi xác động vật phân hủy, ruồi đẻ trứng vào nở ra những ấu

trùng (giòi) mang độc tố. Trên mô xác gia cầm chết đã xác định được lượng

độc tố type C lớn hơn 2000 liều gây chết tối thiểu (MLD) và trong con giòi chứa lượng độc tố lên đến 104 – 105 liều MLD. Do đó khi gà, chim, vịt ăn giòi

hoặc xác động vật chết sẽ dễ dàng bộc phát bệnh.

Trong môi trường nước, các động vật giáp xác nhỏ và ấu trùng côn trùng

có thể chứa Clostridium botulinum trong ruột. Khi các loài động vật này chết

xác động vật phân hủy sẽ cung cấp một nguồn protein thúc đẩy việc sản xuất

các loại độc tố botulin type C trong thịt, trầm tích hoặc vùng đất ngập nước

(Bell et al., 1955 ; Soos & Wobeser, 2006). Botulism gây ra bởi type A và E ở

3

gia cầm hiếm xảy ra và nó thường liên quan với việc sử dụng thức ăn hư hỏng

của người để nuôi gà nhà.

Do đặc điểm trên, bệnh thường xảy ra ở những vùng ngập nước vừa rút

cạn, nơi có điều kiện ấm áp, môi trường có nhiều xác động vật chết và phân

hủy. Các nghiên cứu cho thấy bệnh là nguyên nhân gây chết chủ yếu đối với

các loài chim di cư trên toàn thế giới (Wobeser, 1997).

2.2 Tác nhân gây bệnh nhiễm độc tố botulin

Năm 1895, Emile Van Ermengem là người đầu tiên phát hiện người ngộ

độc và chết do ăn dăm bông, gọi là bệnh ngộ độc thịt và năm 1896 tác giả đã

xác định được nguyên nhân là Clostridium botulinum, một loại vi khuẩn kỵ

khí, có nha bào, rất khó bị tiêu diệt. Sau này, các nhà khoa học khác còn thấy

chúng trong đất, ruột cá, đồ hộp thịt cá, phân người. Năm 1928, Tessmer

Snipe & Hermann Sommer chiết tách được độc tố từ C.botulinum. Năm 1949,

Arnold Burgen phát hiện độc tố của C. botulinum làm tổn thương hệ thần kinh

trung ương (đặc biệt là đến các tín hiệu từ não đến cơ bắp), gây liệt cơ rõ nhất

là liệt cơ mắt (không có phản ứng với ánh sáng, song thị), liệt cơ vòm miệng,

lưỡi hầu, gây nên biến dạng mặt, nguy hiểm nhất là gây liệt trung tâm hô hấp,

tim dẫn đến tử vong cao. Năm 1960, Alan Scott & Edward Schantz sử dụng

độc tố botulin cho các mục đích điều trị (Dressler, 2006)

2.3 Đặc tính sinh học của vi khuẩn C. botulinum

2.3.1 Phân loại, đặc điểm hình thái

Vi khuẩn Clostridium botulinum thuộc chi Clostridium, họ Clostridiaceae,

bộ Clostridiales, lớp Clostridia, ngành Firmicutes.

Clostridium botulinum cũng được gọi với nhiều tên là Botulobacillus

botulinus, Ermengemillus botulinus, Bacillus botulinus, Bacillus putrificus,

Pacinia putrifica, Clostridium putrificum, Bacillus putrificus, Pacinia putrifica,

Clostridium putrificum, Botulobacillus botulinus, Ermengemillus botulinus.

Clostridium botulinum có thể phân biệt với các Clostridium khác dựa vào

các đặc trưng cấu trúc phân tử theo bảng 2.1.

4

Bảng 2.1 Đặc trưng tổng quát hệ gen một số loài Clostridium

Các loài Clostridium

Đặc điểm

botulinum

difficile acetobutylicum perfringens

tetani

Kích thước(bp)

3.886.916 4.290.252

3.940.880

3.031.430

2.799.250

G+C (%)

28,24

29,06

30,93

28,60

28,75

Chuỗi mã hoá

3650

3774

3740

2660

2368

Mật độ mã hoá

0,93

0,87

0,93

0,87

0,85

Kích thước gen

875

943

920

946

1011

trung bình (bp)

r ARN

9

11

11

10

6

t ARN

80

87

73

96

54

(Mohammed Sebaihial et al., 2007)

Vi khuẩn C. botulinum là một trực khuẩn thẳng hai đầu tròn, dài từ 4–6

µm, rộng từ 0,9–1.2 µm, có thể đứng riêng lẻ hay tập trung thành song trực

khuẩn, có khi thành chuỗi ngắn. Trong canh khuẩn có đường glucose vi khuẩn

có dạng sợi dài, vi khuẩn có nha bào.

Nha bào có tính đề kháng cao nhưng bị tiêu diệt ở nhiệt độ 1200C trong 15 phút trong khi độc tố bị phá hủy ở nhiệt độ 1000C trong 20 phút. Nha bào

có hình trứng nằm ở một đầu vi khuẩn. Vi khuẩn có 4 – 8 lông quanh thân,

Hình 2.1 Hình dạng vi khuẩn C. botulinum và nha bào (mũi tên)

(Nguồn: Yeh et al., 2014)

nhưng di động không mạnh (Quinn et al, 1994).

5

2.3.2 Đặc tính nuôi cấy

C. botulinum là loại vi khuẩn yếm khí tuyệt đối. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 28–30oC, độ pH 8,2–8,5. Trong nước thịt yếm khí có đường glucose: canh

khuẩn mọc đều, sản sinh nhiều hơi, có cặn lắng dưới đáy, sau đó canh khuẩn

trở nên trong và có mùi butyric. Thạch Vaillon hình thành những khuẩn lạc

trong suốt, dần dần trở nên đục, màu nâu nhạt, vi khuẩn sản sinh nhiều hơi làm

nứt thạch hoặc vỡ thạch, môi trường có mùi butyric. Môi trường Gelatin có

glucose: cấy chích sâu vi khuẩn mọc tốt theo đường cấy, sản sinh nhiều hơi và

làm tan chảy chậm. Nước thịt yếm khí có óc: làm đen óc. Thạch máu: dung

huyết sau khi nuôi cấy 3–4 ngày.

2.3.3 Đặc tính sinh hóa

Vi khuẩn lên men có sinh hơi glucose, mantose, levulose, dextrin. Lên

men không đều galactose, saccarose, lactose, raffinose, xylose, dunxit,

maltose, arabinose, salixin. Trực khuẩn hóa lỏng nhanh gelatin. Không sinh

Bảng 2.2 Một số phản ứng sinh hóa của các Clostridium (Quinn et al., 1994)

Thạch lòng

Sinh axit

đỏ trứng gà

Loài

Clostridium

e s o t l a

l o d n I h n i s n ả S

e s o c u l G

e s o t c a L

e s o r c u S

M

e s a p i L

e s a n i h t i c e L

n i e s a C a ó h u ê i T

v

-

-

-

-

C. tetani

-

-

+

-

-

+

-

-

+

C. botulinum I

-

+

+

+

-

+

-

-

+

II

-

+

+

-

v

+

-

-

v

III

V

+

+

-

-

-

.

-

.

IV

-

-

+

+

Chú thích:

(+): Phản ứng dương tính

(v): Phản ứng thay đổi

(-): Phản ứng âm tính

(.): Không có dữ kiện

indole nhưng sinh H2S (Nguyễn Như Thanh et al., 2001)

6

2.3.4 Khả năng hình thành bào tử của Clostridium

Vào cuối thời kỳ sinh trưởng, khi chất dinh dưỡng trong môi trường cạn

kiệt, các Clostridia sẽ thay đổi điều kiện sinh trưởng bằng cách hình thành một

thể nghỉ ở bên trong tế bào có dạng hình cầu hay hình bầu dục là nội bào tử

(endospore), nha bào hay gọi chung là bào tử (spore). Bào tử có tính kháng

nhiệt, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu. Bào tử được

hình thành từ trong tế bào vi khuẩn qua nhiều giai đoạn và mỗi tế bào chỉ sinh

ra một bào tử. Các tế bào có khả năng tạo bào tử gọi là tế bào sinh dưỡng.

Trong tế bào này, bào tử dần được hình thành đồng thời tế bào sinh dưỡng tự

tiêu hủy dần đến cuối cùng chỉ còn lại nha bào tự do. Cấu tạo từ ngoài vào

trong gồm:

Màng ngoài: Là phần còn sót lại của tế bào sinh dưỡng, khi có khi

không, khi dày khi xốp và gồm 2 lớp, thành phần chủ yếu là lipoprotein, một

lượng nhỏ acid amin, tính thẩm thấu kém.

Lớp áo bào tử: Nằm dưới màng ngoài, cấu tạo chủ yếu là các protein

sừng và một ít phospholipoprotein. Có sức đề kháng rất cao với lysozyme,

proteinase, các chất hoạt động bề mặt.

Lớp vỏ bào tử: Nằm dưới lớp áo, chứa một lượng lớn peptidoglycan,

không có acid teichoic. Ngoài ra còn chứa nhiều calcium, dưới dạng muối

calcium dipicolinate. Acid dipicolinic là chất đặc hiệu của nha bào và chính

nhờ calcium dipicolinate (DPA-Ca) quyết định khả năng chịu đựng của nha

bào đối với sức nóng. Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ này cao tới 20 atm.

7

Hình 2.2 Cấu trúc bào tử của vi khuẩn Clostridium spp.

(Thomas Mark Corrol II, 2008)

Lõi bào tử: Dưới lớp vỏ, được cấu tạo bởi 4 thành phần như một tế bào

bình thường của vi khuẩn: thành bào tử màng bào tử, bào tử chất và vùng nhân.

Tuy nhiên, người ta nhận thấy rằng không có sự hiện diện của acid teichoic mà

lại có DPA-Ca trong bào tử chất. Tuổi thọ của bào tử gần như vô hạn. Các nhà

khoa học đã phân lập được bào tử sống từ mật ong hóa thạch có tuổi 25 triệu

năm và thậm chí từ một tinh thể muối 250 triệu năm tuổi (Talaro, 2002).

2.3.5 Sức đề kháng

Nha bào có sức đề kháng rất cao, ở nhiệt độ bình thường nó sống được nhiều năm, ở nhiệt độ 110oC trong 10 phút chưa đủ để diệt nó. Nếu sấy ướt 1150C thì mới diệt được 80% nha bào, 8 phút mới diệt được 95%, phải ở nhiệt độ 1200C trong 10 phút mới diệt được hoàn toàn nha bào, trong môi trường có

10% NaCl thì khả năng ngăn cản hình thành nha bào (Lê Huy Chính, 2003).

2.3.6 Sự phân bố và ảnh hưởng của vi khuẩn C. botulinum trong tự nhiên

Theo Nguyễn Như Thanh (2004), C. botulinum phát triển thích hợp trong

những đất có độ ẩm tuyệt đối. Chúng phát triển nhiều trong lớp đất canh tác vì

8

ở đó có nhiều chất hữu cơ. Phospho và kali cũng là hai yếu tố cần thiết cho

quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Clostridium spp. không quá

mẫn cảm với nồng độ calci trong đất, tuy nhiên calci rất cần cho việc tạo thành

bào tử Clostridium.

Haagsma (1991) nói về sự hiện diện của vi khuẩn Clostridium spp. trong

một số loại mẫu như phân, đất (nước), trầm tích biển, thức ăn, cho thấy rằng vi

khuẩn Clostridium spp. xuất hiện nhiều nhất trong phân, tiếp đến là trong đất

Bảng 2.3 Sự hiện diện của vi khuẩn Clostridium trong một số loại mẫu (Haagsma 1991)

Loại mẫu

Loài Clostridium

Phân

Đất (nước)

Trầm tích biển

Thức ăn

C. bifermentans

+

+

+

C. botulinum

+

+

+

+

C. butyticum

+

+

+

C. carnis

+

+

C. chauvoei

+

C. colinum

+

C. difficile

+

C. fallax

+

C. histolyticum

+

C. novji

+

+

+

C. perfringens

+

+

+

+

C. septicum

+

+

C. sordellii

+

C. spiroforme

+

C. sporogenes

+

+

+

C. tetani

+

+

(nước), thấp nhất là trong các mẫu trầm tích biển và thức ăn.

Theo kết quả nghiên cứu của Johnson et al.,2007, có thể thấy rằng vi

khuẩn Clostridium spp. tập trung chủ yếu ở đất, nước thải và trầm tích biển,

9

đôi khi có ở ruột của cả động vật và con người. Ở một số loài khác của

Clostridium có thể hiện diện trong các vật liệu mục nát, xác các loài gặm

nhấm nhỏ, xác chết chim hoặc trong phân bón. Vì thế, việc phân lập vi khuẩn

Clostridium spp. từ nhiều nguồn khác nhau là rất cần thiết trong chăn nuôi thú

y, nó hạn chế giảm bớt một phần ảnh hưởng to lớn đến sức khỏe của vật nuôi.

Sự khuếch tán oxy trong đất là điều kiện quan trong ảnh hưởng đến sự

phát triển của vi khuẩn yếm khí. Đặc biệt, đối với vi khuẩn Clostridium spp.

thì lại không phát triển khi có sự hiện diện của oxy, tùy thuộc vào từng chủng

mà nồng độ oxy thay đổi khác nhau thì chúng mới có thể tăng trưởng và phát

triển. Một số chủng có thể chịu được nồng độ oxy cao đến 3%.Trong các loại

đất thì sự khuếch tán oxy trong đất tốt là đất ruộng, đất phù sa.

2.3.7 Độc tố của vi khuẩn

2.3.7.1 Độc tố botulin

Botulin là tên gọi chung của một loại ngoại độc tố do vi khuẩn

Clostridium botulinum sản sinh (viết tắt là BoNTs), gồm có 8 type độc tố là A,

B, C, D, E, F, G và H. Các loại độc tố được phân biệt bằng đặc tính kháng

nguyên. Trong đó 3 type gây độc đáng chú ý là A, B, E (độc nhất là A, kế là

B). Botulin có độc tính mạnh nhất trong các chất độc sinh học đã biết. Nó độc

gấp 7 lần so với độc tố uốn ván, 1mg có thể giết chết 100 triệu chuột nhắt

(Hall et al., 1985; McCroskey et al., 1991). Trong 8 type độc tố thì đã có 6

loại độc tố có đến 05 phân nhóm. Tuy nhiên, không phải tất cả các chủng C.

botulinum đều sản sinh độc tố. Độc tố được hấp thụ ở ruột vào máu đi đến các

khớp nối thần kinh cơ ngoại vi tấn công các protein dung hợp (SNAP-25,

syntaxin hoặc synaptobrevin) tại điểm tiếp hợp thần kinh cơ gây ức chế sản

sinh acetylcholine từ đó gây cản trở quá trình dẫn truyền xung thần kinh gây

liệt cơ bắp, trái ngược với tình trạng co cơ trong các bệnh uốn ván (độc tố của

C. botulinum tác động trên thần kinh ngoại vi gây hiện tượng “liệt mềm”,

trong khi đó độc tố C. tetani tác động lên hệ thần kinh trung ương gây “liệt

cứng”) (MacKenzie and Debora, 2013).

Biểu hiện của ngộ độc ở người bắt đầu 18–36 giờ sau khi nhiễm độc là

chóng mặt, khô miệng, nôn ói có thể xảy ra. Các thần kinh chức năng bị ức

chế gây mờ mắt, mất khả năng nuốt, liệt vận động và liệt hô hấp. Độc tố

10

botulin có thể tác động vào thần kinh trung ương, tuy nhiên triệu chứng thần

Miễn dịch đối với ngộ độc botulin không phát triển vì lượng độc tố cần

kinh trung ương rất hiếm (MacKenzie and Debora, 2013).

thiết để tạo ra một đáp ứng miễn dịch sẽ gây tử vong. Dù chất độc không bền

với nhiệt nhưng các bào tử của C. botulinum có thể sống sót nhiệt độ sôi (100oC) trong 1 giờ cho nên để phòng chống ngộ độc thực phẩm cần có biện

pháp xử lý thích hợp.

Các loại độc tố có cấu trúc và đặc tính riêng: Botulin type A thì phân giải

protein, gây ngộ độc thịt cho người (gồm ngộ độc vết thương và ngộ độc trẻ sơ

sinh), thường tìm thấy trong thịt cá, rau củ, thịt đóng hộp, các sản phẩm lên

men. Trong khi đó botulin type B cũng phân giải protein, thường tìm thấy

trong thịt, đặc biệt là thịt heo. Loại độc tố này ngoài việc gây ngộ độc thịt cho

người nó còn gây bệnh cho ngựa và bò. Botulin type C không phân giải

protein, gây độc cho các loài chim và gia cầm, tìm thấy trong thực vật đầm

lầy, sinh vật thủy sinh. Botulin type D không phân giải protein, gây ngộ độc

cho các loài động vật như: bò, lừa, ngựa… có thể tìm thấy trong gia súc nhiễm

độc. Botulin type E không phân giải protein, gây ngộ độc cho người, cá, chim

biển, thường tìm thấy trong thủy sản và các sản phẩm thủy sản. Botulin type F

gây độc cho người đặc biệt là trẻ em, tìm thấy trong các sản phẩm thịt. Riêng

botulin type G phân giải protein, hiện chưa có thông tin đầy đủ về tính gây

bệnh của type này, tìm được trong đất (MacKenzie and Debora, 2013).

Năm 2013, các nhà nghiên cứu tại Khoa Y tế cộng đồng California đã

phát hiện một độc tố thứ tám, đó là type H. Botulin type H được coi là độc tố

mạnh nhất, chỉ cần một mũi tiêm với liều 2 nanogram hoặc hít phải 13

nanogram có độc tố botulin này cũng có thể giết chết một người trưởng thành

(MacKenzie and Debora, 2013).

Tất cả các độc tố trên đều bị trung hoà bởi kháng độc tố tương tứng

(riêng type H hiện nay chưa có kháng độc tố). Mặc dù các botulin này có tính độc cao nhưng chúng có sức đề kháng kém với nhiệt độ, chỉ cần đun 60–80oC

trong 10 phút thì độc tố sẽ bị phá huỷ, chúng cũng không bền khi ở ngoài môi

trường quá lâu. Nhưng chúng lại có sức đề kháng mạnh với men tiêu hoá,

chúng hầu như không bị phân huỷ bởi dịch vị và men tiêu hoá trong dạ dày.

11

Độc tố botulin là một protein và là chất độc thần kinh, botulin có thể gây ngộ

độc nghiêm trọng và đe dọa tính mạng của con người và động vật (Miia

Lindstrom and Hannu Korkeala, 2006).

Vi khuẩn được chia thành 4 nhóm (I – IV) dựa trên các đặc điểm nuôi

cấy và 8 nhóm độc tố khác nhau (A, B, Cα, Cβ, D, E, F, và G). Bệnh ở người

chủ yếu do các type A, B, E, F. Bệnh ở loài chim thì chủ yếu do các type A, C,

E (Miia Lindstrom and Hannu Korkeala, 2006).

Nhóm I

Bao gồm các chủng độc tố type A, những biến dạng thủy phân protein

của độc tố type B và F và những kiểu độc tố kép AB, AF, BF. Đặc điểm chính

của nhóm này là những trực khuẩn hơi cong với lông roi có lông rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 – 40oC, sản xuất bào tử chịu nhiệt cao, độ pH

tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước là 0,94–4,6.

Nhóm II

Bao gồm chủng độc tố type E và những biến dạng không thủy phân

protein nhưng phân giải đường của độc tố type B và F. Đặc điểm chính của

nhóm này là những trực khuẩn với lông roi rải rác, là nhóm ưa lạnh nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 18 – 25oC, sản xuất bào tử chịu nhiệt thấp, độ pH tối

thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn là 0,97–5.

Nhóm III

Bao gồm chủng độc tố type C và D và những sự biến dạng nói chung là

không có thủy phân protein. Đặc điểm chính của nhóm này là những trực

khuẩn với lông roi có lông rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 – 40oC, sản xuất những bào tử với khả năng chịu nhiệt trung gian, độ pH tối

thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước vẫn chưa biết.

Nhóm IV

Bao gồm những chủng thủy phân protein của chủng độc tố type G. Đặc

điểm chính của nhóm này bao gồm: những trực khuẩn với lông roi có lông rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 – 40oC, sản sinh những bào tử

với khả năng chịu nhiệt trung gian, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động

của vi khuẩn trong nước vẫn chưa biết.

12

Bảng 2.4 Quan hệ giữa các nhóm của độc tố botulin và một số ký chủ (Haagsma 1991)

Nhóm

Nhóm I

Nhóm II

Nhóm III

Nhóm IV

Các type độc tố

A B, F

B, E, F

C, D

G

Phân giải protein

+

-

yếu

-

Phân giải đường

-

+

-

-

Bệnh chủ

con người

con người

động vật

-

Gen độc tố

nhiễm sắc thể nhiễm sắc thể

bacteriophage

plasmid

C. porogenes,

C. butyricum,

C.haemolyticum

C. subterminale,

Quan hệ gần

C. putrificum

C. beijerinicki

C. novyi type A

C. aemolyticum

2.3.7.2 Cơ chế gây bệnh của độc tố botulin

Độc tố của C. botulinum (botulin) được tổng hợp từ một chuỗi

polypeptid có trọng lượng phân tử khoảng 150.000 dalton. Ở cấu trúc này,

độc tố có hoạt lực tương đối thấp, nhưng dưới tác động của một số enzym

của vi khuẩn và trypsin thì chuỗi này tách ra thành hai chuỗi, chuỗi nặng

(100.000 dalton) và chuỗi nhẹ (50.000 dalton) nối với nhau bằng cầu nối

disulfur (Todar, 2009). Với cấu tạo này, botulin có tác dụng ức chế sự dẫn

truyền thần kinh cơ. Diễn tiến tác động của botulin gồm 3 giai đoạn: kết nối,

thâm nhập và ức chế sự phóng thích chất dẫn truyền thần kinh. Botulin

không có ảnh hưởng đến sự tổng hợp hay dự trữ acetylcholine nhưng ảnh

hưởng đến sự phóng thích chất này ở nơi tiếp giáp giữa thần kinh và cơ.

Chuỗi nặng có khả năng kết nối, còn chuỗi nhẹ là cấu trúc gây độc nội bào

(Pirazzini et al., 2013).

Khi hoạt động thần kinh vận động tạo nên sự khử cực ở đầu cuối của sợi

trục (axon), acetylcholine sẽ đươc phóng thích từ tế bào chất vào khe synapse.

Acetylcholine được chuỗi protein vận chuyển phóng thích. Khi botulin xâm

nhập vào mô thì chuỗi nặng của botulin gắn chuyên biệt với cấu trúc

glycoprotein ở đầu thần kinh dẫn truyền acetylcholine và chuỗi nhẹ của

botulin sẽ gắn lên protein đích. Tuỳ vào loại botulin khác nhau sẽ có các

protein đích khác nhau. Sự gắn kết chuỗi nhẹ với protein đích sẽ ngăn cản quá

trình chuyển acetylcholine ở các lỗ trên bề mặt trong của màng tế bào dẫn đến

13

sự khoá chặt các lỗ vận chuyển này. Khi đích là cơ thì sẽ xảy ra sự liệt cơ (liệt

nặng hay nhẹ tuỳ vào lượng độc tố) do bị ức chế dẫn truyền thần kinh. Khi

đích là các tuyến ngoại tiết thì sự tiết ở các tuyến này bị khoá chặt (Dickenson

and Janda, 2006). Nếu các liên kết disulfur nối hai chuỗi bị hỏng trước khi các

độc tố xâm nhập vào trong các tế bào, các chuỗi polypeptid không thể tiếp

nhận các thiết bị đầu cuối sợi trục màng, và khi đó độc tố sẽ mất hoàn toàn độc

tiếp hợp thần kinh cơ

điểm tiếp nối

Dẫn truyền giải phóng bình thường

Hoạt động của độc tố botulin

Chuỗi nặng

Chuỗi nhẹ

tế bào cơ

Túi Synapp

Botulinum cắt phức hợp protein SNARE

Thụ thể độc tố botulin

Phóng giải acetycholine

độc tố botulin

Khe khớp thần kinh

thụ thể acetycholine

tế bào cơ

Hình 2.3 Cơ chế tác động của độc tố botulin

(Dickenson and Janda, 2006)

tính (Peck et al., 2010).

Khi botulin được sử dụng để điều trị tăng tiết mồ hôi (Bushara and Park,

1994), sự tăng tiết nước bọt, sự tiết nước mắt, hay khi những tác động đối lập

của độc tố loại B như là khô mắt hay sự khô niêm mạc xuất hiện, mô tuyến

ngoại tiết cũng bị ảnh hưởng bởi botulin. Do đó, botulin cũng ảnh hưởng đến

các sợi thần kinh ly tâm của hệ thần kinh tự chủ.

14

2.4 Bệnh do nhiễm độc tố của Clostridum botulinum

2.4.1 Bệnh ở người

Ở người ngộ độc do nhiễm độc tố botulin (botulism) thường xảy ra ở

ba dạng:

 Ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm là việc tiêu thụ thực phẩm có chứa chất độc thần kinh

được hình thành từ trước, tùy thuộc vào liều lượng chất độc và tình trạng cơ

thể mà thời gian ủ bệnh có thể thay đổi từ 12 đến 72 giờ. Ngoài các dấu hiệu

chung của bệnh ngộ độc, các triệu chứng về tiêu hóa như nôn mửa, mệt mỏi,

đầu quay cuồng, nhức đầu, mắt nhìn mờ không rõ (thấy ảnh đôi), khô họng,

khô mũi, khó nuốt, sụp mí mắt, ăn nói khó khăn, các cơ yếu đi bắt đầu từ trên

vai đi lần xuống phần cánh tay. Tiếp đến là các cơ giúp hô hấp bị liệt nên bệnh

nhân thở rất khó khăn và nếu không chữa trị kịp thời sẽ chết vì liệt hô hấp.

Việc điều trị chủ yếu là điều trị triệu chứng như hỗ trợ hô hấp.

Nghiên cứu của Sobel et al.,(2004) cho thấy ở các nước phát triển, tỷ lệ

tử vong của bệnh ngộ độc thực phẩm là từ 5 đến 10%. Năm 1995, Hatheway

khảo sát về nguyên nhân các trường hợp ngộ độc thực phẩm trên toàn thế giới.

Kết quả cho thấy hơn một nửa các trường hợp (52%) là do độc tố type B, type

A chiếm 34% và type E chiếm 12%. Type F ít có liên quan đến ngộ độc thực

phẩm (Harvey et al., 2002).

Hai kháng độc tố botulin chính có sẵn để điều trị ngộ độc thực phẩm gồm

một loại có nguồn gốc từ các nguồn kháng thể ngựa (Fab và Fc). Loại kháng

độc tố thứ hai là Heptavalent (A, B, C, D, E, F, G). Kháng độc tố này có sẵn từ

các cơ sở y tế địa phương thông qua CDC tại Mỹ

 Ngộ độc trẻ sơ sinh

Trong hầu hết các trường hợp ngộ độc ở trẻ sơ sinh, nguyên nhân gây độc

chưa rõ nhưng với nghiên cứu của Franciosa (2002) cho thấy 15% các trường

hợp có liên quan đến mật ong, mật ong có thể chứa một số lượng lớn bào tử C.

botulinum. Có nhiều báo cáo từ các nước trên thế giới, hầu hết các trường hợp

được báo cáo ở Mỹ, các độc tố chủ yếu là type A và B. Ngộ độc thường xảy ra

ở trẻ em dưới một tuổi và chủ yếu là những trẻ từ sáu tháng tuổi trở xuống. Do

15

ruột của trẻ còn yếu chưa hoạt động mạnh, vì thế bào tử C. botulinum có thể

nảy mầm và hình thành độc tố trong ruột.

Trẻ em nhiễm bệnh thường thấy có những triệu chứng như: Có vẻ uể oải

yếu ớt, táo bón kinh niên, tay, chân và cổ đều yếu ớt không còn một sức co

thắt nào cả. Tiếng khóc yếu, nhè. Mút bú rất yếu. Bệnh có thể biến chuyển đưa

đến sự liệt tứ chi cũng như liệt các vùng khác của cơ thể để cuối cùng chết vì

liệt hô hấp.

Báo cáo của Johnson et al. (1979) cho thấy các biểu hiện lâm sàng của

ngộ độc botulin ở trẻ sơ sinh thay đổi từ cận lâm sàng đến chết đột ngột, triệu

chứng thường bắt đầu với táo bón, có thể kéo dài nhiều ngày, tiếp theo là liệt

mềm, biểu hiện đặc biệt là sự giảm ăn do suy yếu cơ bắp ở miệng và cổ họng,

liệt cơ mặt và liệt mí mắt.

Điều trị

Không khuyến khích sử dụng thuốc kháng sinh ở trẻ sơ sinh bị ngộ độc,

bởi vì như thế sẽ làm tăng hàm lượng độc tố trong máu. Trong thí nghiệm mô

hình chuột và dựa trên kinh nghiệm, Wang et al. (1984) cho kết quả kháng

sinh aminoglycosid sẽ làm tăng sự phong tỏa thần kinh cơ. Bên cạnh đó, thuốc

có chứa magie nên tránh dùng vì nó có thể làm tăng tác động của độc tố

botulin (Shapiro et al., 1998).

Việc điều trị chủ yếu cho bệnh ngộ độc ở trẻ sơ sinh là chăm sóc hỗ trợ,

đặc biệt chú ý tập trung vào dinh dưỡng của trẻ và hô hấp (CDC, 1998:

Control of Disease Center)

 Ngộ độc vết thương

Trong số 40 trường hợp được công bố trong các tài liệu của Mechem và

Walter, (1994) về ngộ độc botulin ở người cho thấy 78% nguyên nhân liên

quan đến vết thương, trong đó có trầy xước, gãy xương hỡ, vết rách, vết

thương đâm thủng và áp- xe. Khi nạn nhân bị vết thương sâu hoặc vết áp-xe,

nơi vết thương sẽ hình thành môi trường yếm khí, tạo điều kiện thích hợp cho

bào tử C. botulinum nảy mầm và phát triển. Kết quả lâm sàng tương tự như

ngộ độc thực phẩm nhưng không có biểu hiện của đường tiêu hóa. Thời gian ủ

bệnh trung bình là 7 ngày. Khi điều trị, ngoài việc hỗ trợ hô hấp còn phải thực

16

hiện việc phẫu thuật mở rộng vết thương, thuốc kháng sinh và thuốc kháng

độc. Ước tính tỷ lệ tử vong là 15% (Hatheway, 1995). Giai đoạn phục hồi

chậm, kháng độc tố có thể cần phải sử dụng nhiều lần (CDC, 2008).

 Ngộ độc vô ý

Trường hợp này đã được báo cáo ở những bệnh nhân đã từng có lịch sử

tiêm độc tố botulin type A vào cơ thể, đặc biệt là vào các bắp thịt lớn cho tác

dụng toàn thân. Hơn thế, theo Cherington (1998) thì nhiều trường hợp gần đây

của ngộ độc gây ra bởi việc sử dụng chất độc botulin để điều trị chứng loạn

ngôn ngữ và các rối loạn vận động khác. Ở những trường hợp khi bệnh nhân

có tật vẹo cổ và có sử dụng độc tố botulin type A để điều trị, khi tiêm độc tố

vào cơ bắp cổ có thể độc tố thâm nhập vào các cơ bắp hầu xung quanh.

Việc sử dụng điều trị của độc tố botulin cần thận trọng đặc biệt ở những

bệnh nhân bị rối loạn cơ dẫn truyền thần kinh và ở những bệnh nhân được điều

trị đồng thời với aminoglycosid. Các trường hợp khác của ngộ độc botulin là

do sự hít vào và có thể do khí dung của các chất độc thần kinh (Holzer, 1962).

2.4.2 Bệnh ở động vật hữu nhũ

Bệnh lâm sàng thường thấy xảy ra ở chồn, bò, cừu, ngựa. Đôi khi bệnh

xảy ra ở chó và heo nhưng bệnh chưa thấy nói đến bệnh ở mèo.

Ủ bệnh: 2 giờ đến 2 tuần (đa số trường hợp xuất hiện sau 12 – 24 giờ).

Bệnh tích: Không có bệnh tích đặc trưng; các tổn thương thường là kết

quả của tình trạng tê liệt cơ bắp nói chung. Tê liệt hô hấp có thể gây ra dấu

hiệu không đặc hiệu như màng ngoài tim chứa nhiều dịch fibrin, phổi phù nề

và xung huyết.

Triệu chứng: Bệnh thể hiện ở một số loài có thể quan sát được.

Ở trâu bò và ngựa: Con vật không cử động, các khớp co gập, lưỡi tê liệt,

chảy nước dãi, bí tiểu tiện, khó nuốt, cơ bắp tê liệt bắt đầu từ chân sau ra trước

đến đầu và cổ, con vật bệnh nằm úp bụng.

Khi gia súc bệnh nằm nghiêng một bên là dấu hiệu sắp chết, sẽ xảy ra

trong vòng 6 – 72 giờ.

17

Ở những gia súc dưới 4 tuần tuổi nhiễm bệnh: con vật đi xiêu vẹo, run

rẩy và không có khả năng đứng lâu hơn 4 – 5 phút. Các triệu chứng thể hiện

là: chứng khó nuốt, táo bón, dãn đồng tử, đi tiểu thường xuyên; nhịp tim

nhanh và khó thở ở các giai đoạn. Cái chết xảy ra trong vòng 24 – 72 giờ sau

khi vật thể hiện triệu chứng ban đầu do tê liệt hô hấp.

Ở cừu: Triệu chứng chung là chảy nước mũi, nước dãi. Thở thể bụng.

Rối loạn vận động, bước chân cứng nhắc. Tê liệt 4 chân. Đuôi ngoặt sang

một bên.

Ở heo, chó và mèo: Các loài này đề kháng bệnh tương đối tốt, đặc biệt là

mèo. Các triệu chứng bệnh (ở chó và heo) là biếng ăn, biếng uống, ói mữa, cơ

bắp tê liệt. Hầu hết chó bệnh tự hồi phục bệnh trong vòng 2 tuần.

Ở cáo và chồn: Con vật thường chết do tê liệt và khó thở với các mức

Hình 2.4 Triệu chứng ngộ độc ở cáo

Hình 2.5. Triệu chứng ngộ độc ở bò

(Nguồn: www.cfsph.iastate.edu)

(Nguồn: www.cfsph.iastate.edu)

độ khác nhau.

2.4.3 Bệnh do độc tố của Clostridium botulinum ở loài gia cầm

Ký chủ tự nhiên và trong phòng thí nghiệm

Bệnh do C. botulinum type C xảy ra ở nhiều loài bao gồm gà, gà tây, vịt,

chim trĩ, đà điểu. Trong tự nhiên 117 loài thuộc 22 họ chim bị ảnh hưởng bởi

bệnh này (Giltner & Couch, 1930).

18

Các loài hữu nhũ bị tác động bởi độc tố type C bao gồm chồn, trâu bò,

heo, chó, ngựa và nhiều loài khác. Con người, chó và mèo thường được coi là

đề kháng với type C gây ngộ độc ở gia cầm. Cá cũng ảnh hưởng bởi type C

(Smith, 1987).

Trong phòng thí nghiệm, loài gậm nhấm cảm nhiễm mạnh mẽ với độc tố

type C, cho nên chuột là động vật hữu ích trong sự dò tìm sinh học để phát

hiện các type độc tố. Trong phòng thí nghiệm khi tiêm tĩnh mạch hay dưới da

cho chuột lang liều 0,5ml canh khuẩn, chuột chết sau 3–4 ngày với các triệu

chứng chảy nước dãi, khó thở, liệt chi sau.

Gà 2 – 8 tuần tuổi dễ bị bệnh hơn gà lớn, gà bị bệnh thường ở lứa tuổi

6,2 ± 1,7 tuần (Dohms, Allen & Rosenberger, 1982). Gà lớn hơn đôi khi

cũng xảy ra bệnh cho dù gà lớn được xác định là rất đề kháng với C1. Gà, gà

tây, chim trĩ, công cảm nhiễm với độc tố type A, B, C, D nhưng không cảm

nhiễm type F (Gross and Smith, 1971). Gà broiler ít cảm nhiễm với độc tố

type C1. Ngược lại, vịt và chim trĩ rất mẫn cảm với type C1. Gà mới nở với

liều LD50 qua đường uống là 103 LD50/kgP, gà 8 tuần là 106.3 LD50/kgP

(Dohms & Cloud, 1982).

Tiêm tĩnh mạch cho vịt và ngỗng với độc tố C2 thấy có bệnh tích ở tim -

phổi. Tuy nhiên vai trò của độc tố C2 trong các ổ dịch tự nhiên thì không rõ

ràng (Jensen & Duncan, 1980).

Lan truyền bệnh

Clostridium botulinum rất phổ biến trong đất bề mặt của cả trên cạn lẫn

môi trường nước. Tuy nhiên độc tố chỉ được chỉ sản sinh khi vi khuẩn có điều

kiện thuận lợi cho phát triển và nhân rộng. Theo Locke & Friend, 1989 thì một

ổ dịch do C. botulinum type C gây ra là do các chuỗi sự kiện sau:

Khi mức nước hạ thấp làm tăng nhiệt độ nên làm cho một số loài động

vật không xương sống là ký chủ của C. botulinum sẽ bị chết. Những xác chết

của động vật không xương sống sẽ là môi trường tốt cho sự phát triển của vi

khuẩn và các vi khuẩn sẽ sản sinh nhiều độc tố. Khi vịt ăn xác các động vật

không xương sống chết ở trong lớp bùn trầm tích sẽ bị nhiễm độc và chết.

19

Giòi sản sinh từ xác vịt chết sẽ là vật mang bệnh, khi các con vịt khác

hay chim hoang ăn phải những con giòi này sẽ mắc bệnh và làm cho dịch bệnh

bùng nổ.

Các Clostridium botulinum type E cũng phân lập được từ bùn đáy, trong

động vật không xương sống dưới nước. Cá nhiễm bệnh do ăn các loại vi khuẩn

một cách trực tiếp từ bùn đáy, hoặc do ăn động vật không xương sống. Khi

chết, xác cá sẽ là một môi trường tốt cho sự phát triển của vi khuẩn và sản sinh

độc tố. Chim và động vật có vú bị nhiễm độc do ăn cá chết. Theo cách truyền

O

F

lây này thì chim và động vật có vú chết sẽ đồng thời với cá.

Chu trình lan truyền Botulism ở gia cầm

Quá trình chết diễn ra nhanh chóng

Hình 2.6 Chu trình lan truyền botulism ở gia cầm

(Nguồn: Locke & Friend, 1989)

Chu trình này được giải thích như sau: Hầu hết các loài thủy cầm đều có

ăn ốc, ấu trùng côn trùng và các động vật không xương sống khác trong môi

trường nước và các loài này khi chết thì độc tố botulin type C phát triển

trong xác chúng rất nhiều, khi thủy cầm ăn phải xác chết của những loài này

20

sẽ nhiễm độc và chết. Khi vịt chết, giòi sẽ hình thành trên xác chết thối rữa,

chúng hấp thu một lượng lớn độc tố từ xác vịt thối rữa nhưng không bị ảnh

hưởng. Khi những vịt khác ăn phải giòi sẽ phát bệnh, từ đó vịt bệnh lan rộng

trong quần thể. Nếu các loài chim hoang, thủy cầm di cư ăn phải những con

giòi này chúng sẽ chết trong một địa bàn rộng lớn, xác chết thối rữa lại hình

thành giòi, chu trình tiếp tục và bệnh lan rộng trong phạm vi rất lớn.

Leighton (2000), cho rằng lượng độc tố chứa trong 5 con giòi đã đủ để làm

chết 1 con vịt.

Triệu chứng và bệnh tích

Thí nghiệm tiêm dưới da, tiêm tĩnh mạch hoặc cho uống độc tố type C

cho gà và vịt thấy triệu chứng lâm sàng giống với các ổ dịch trong tự nhiên. Số

bệnh và số chết có liên quan đến liều sử dụng.

Với mức độ độc tố cao, bệnh xuất hiện trong vài giờ, với mức độc tố thấp

bệnh có thể xuất hiện trong vòng 1–2 ngày.

Ở gà, gà tây, chim trĩ và vịt thì tương tự nhau. Ở gà triệu chứng liệt chân,

cánh, cổ và mí mắt là những dấu hiệu đặc trưng của bệnh. Đầu tiên có thể thấy

gà không đứng được, ít đi lại, nếu bị đuổi đi thì chúng có biểu hiện liệt chân,

cánh sã xuống. Mí mắt thường khép lại, tiếp theo là cơ cổ bị liệt, gà không

ngẩng đầu lên được nên ban đầu bệnh được đặt tên là “liệt cổ”. Những gà bị

bệnh có lông xơ xác, khi bắt lông dễ bị rụng. Gà thịt thể hiện triệu chứng tiêu

chảy, phân có nhiều chất tiết urates.

Ở vịt: triệu chứng đầu tiên là không có khả năng bay hoặc lặn, một số

con có biểu hiện tiêu chảy, chân liệt, vịt không thể bơi và dùng cánh để đẩy

mình trên mặt nước, mí mắt sụp xuống, cổ mềm không giữ được đầu làm mỏ

chìm xuống nước dẫn tới vịt ngộp thở và chết.

21

Hình 2.7 Liệt mí mắt ở vịt

Hình 2.8 Cổ vịt liệt

(Worbeser, 1997)

(Worbeser, 1997)

Số vịt bị bệnh và số chết có liên quan đến lượng độc tố được thu nhận.

Mức độc tố thấp làm số con bị bệnh và chết trong đàn thấp và việc này có thể

gây nhầm lẫn trong chẩn đoán bệnh. Trong những trường hợp nhiễm nặng số

bị chết đối với gà thịt lên đến 40%. Ở thủy cầm thì đây là một trong những

Hình 2.9 Vịt nhiễm độc tố botulin không nâng đầu được khỏi mặt nước

(Nguồn: Worbeser, 1997)

bệnh gây thiệt hại nặng nề cho dù số bị chết chưa được đánh giá cụ thể.

22

Bệnh tích

Bệnh tích đại thể và vi thể của bệnh ngộ độc do độc tố của vi khuẩn

C.botulinum type C gây ra ở thủy cầm chưa được nghiên cứu đầy đủ, thỉnh

thoảng những con giòi hoặc lông có thể tìm thấy trong phân thủy cầm

nhiễm bệnh. Do khi nhiễm độc vịt thường bị liệt cổ, chúi đầu xuống nước

nên bệnh tích thường có liên quan đến chết ngạt, có thể thấy phổi tích nước,

tim tụ huyết. Những bệnh tích khác không điển hình thường là của những

bệnh bội nhiễm.

Những gà và vịt phục hồi sau khi bị bệnh thì không có miễn dịch. Tuy

nhiên, những con chim kên kên ăn xác chết và gà tây có kháng thể chống lại

độc tố botulin. Điều này có thể giải thích một phần tại sao những con chim kên

kên thì đề kháng trong các thí nghiệm tiêm độc tố.

Phòng bệnh

Các thí nghiệm sử dụng vaccine giải độc tố để tiêm phòng cho một số

loài cầm như chim trĩ, gà, vịt đã đem lại hiệu quả nhất định. Tuy nhiên việc sử

dụng để phòng bệnh cho chăn nuôi thương mại thì rất tốn kém và không thực

tế mà chủ yếu là áp dụng phương pháp an toàn sinh học như:

Loại bỏ những nguồn chứa vi khuẩn hoặc độc tố tiềm tàng trong môi

trường. Xử lý xác gia cầm chết và phát hiện ra những gia cầm bệnh để xử lý là

vấn đề quan trọng trong phòng bệnh và kiểm soát dịch bệnh.

Việc xử lý chất thải và tiêu độc cần thực hiện. Có thể sử dụng các hoá

chất như calcium hypochlorite, iodophor, formalin để diệt bào tử trong môi

trường, tuy nhiên trong điều kiện chuồng nuôi dơ bẩn, nhiều chất hữu cơ thì sự

phá huỷ các bào tử này khó thực hiện. Cần chú ý là bào tử có thể tồn tại trong

đất bên ngoài chuồng nuôi và có thể lây nhiễm vào chuồng nuôi qua phương

tiện vận chuyển, ruồi, giòi, cho nên việc định kỳ tiêu độc, sát trùng cũng cần

thực hiện bên ngoài chuồng nuôi là rất cần thiết.

Trong thời gian xảy ra dịch cần cho ăn khẩu phần ít năng lượng sẽ làm

giảm số lượng gia cầm chết. Chú ý việc bổ sung sắt vào khẩu phần thức ăn,

nước uống làm gia tăng sự phát triển của nhiều vi khuẩn đường ruột trong

đó có Clostridium botulinum. Sự acid hóa nước uống bằng acid citric sẽ

23

làm pH đường ruột giảm, có tác dụng kích thích sự phát triển của hệ vi sinh

bình thường ở đường ruột tạo sự cạnh tranh ức chế Clostridium botulinum

phát triển.

Điều trị

Nhiều gia cầm bệnh nếu được cách ly, cung cấp nước và thức ăn sẽ dần

hồi phục. Nếu số lượng lớn thì cần dùng kháng sinh như bacitracin,

streptomycin hay chlortetracycline (Sato,1987) cũng làm giảm số chết. Tuy

nhiên sự thành công của những phương pháp này thì khó đưa thành một qui

trình cố định trong sản xuất vì sự tái nhiễm của bệnh thường xảy ra.

Phương pháp tiêm kháng độc tố đặc hiệu để trung hòa độc tố ngoài tế bào

chỉ có thể áp dụng cho các loài chim quí hiếm và hiệu quả rất nhanh trong

vòng 24 giờ.

2.4.4 Ảnh hưởng của độc tố botulin trên cá

Cá nhạy cảm với botulin type E chúng có thể bị ảnh hưởng đến trạng thái

cân bằng, một con cá bị nhiễm thường chúng bơi gần mặt nước và sẽ nổi với

cái đầu của nó hướng lên bề mặt và đuôi hạ xuống bên dưới. Cá nhiễm thường

chết rất nhanh và có thể nhìn thấy chúng trôi dạt vào bờ.

2.4.5 Ảnh hưởng của độc tố botulin trên chuột

Nghiên cứu của CDC (1998) cho thấy những con chuột với các dấu hiệu

điển hình của ngộ độc botulin bao gồm yếu cơ và suy hô hấp, những triệu

chứng này thường xuất hiện trong vòng một ngày nhưng có khi cũng có thể

vài ngày mới xuất hiện. Bên cạnh đó, với nghiên cứu về độc lực của botulin

trên chuột của Nguyễn Đức Hiền (2012) cho kết quả 15% gây ảnh hưởng tới

tim và 10% liên quan vấn đề ở phổi.

Theo Deprez (2006) các biểu hiện khác có thể xảy ra như khô miệng, tắc

ruột hoặc tiêu chảy, bí tiểu và thay đổi của nhịp tim. Ngoài ra nghiên cứu của

Johnson et al. (2010) cho thấy ngộ độc type C có thể xuất hiện các triệu chứng

rõ hơn như giãn đồng tử với mức độ nhiều hơn, dấy hiệu khó thở nặng hơn các

type khác.

24

2.5 Phương pháp xác định độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium

botulinum

Chẩn đoán của botulism dựa trên triệu chứng lâm sàng thường không

chính xác, các bệnh tích đại thể và vi thể thường không đặc trưng. Vì thế, dựa

vào bệnh sử và các triệu chứng đôi khi có thể nhầm lẫn với nhiều bệnh khác.

Để chẩn đoán chính xác cần xác định được sự hiện diện của độc tố botulin

trong huyết thanh hoặc chất chứa lấy ra trong dạ dày, ruột của gia cầm bệnh.

Huyết thanh là mẫu chẩn đoán thích hợp hơn vì C. botulinum có thể được

tìm thấy ở ruột gia cầm khoẻ bình thường, do độc tố có thể là những chất sản

sinh từ mô cơ thể phân huỷ. Do vậy tìm thấy độc tố trong mô gia cầm chết

không xác định là gia cầm chết do botulism. Phương pháp thử nghiệm trên

chuột mẫn cảm thì đáng tin cậy để xác định độc tố chịu nhiệt trong huyết

thanh. Những nhóm chuột được tiêm huyết thanh nghi bệnh, sau đó từng

nhóm sẽ được tiêm kháng huyết thanh với những type gây bệnh đặc trưng.

Nếu độc tố hiện diện trong mẫu, những chuột không được tiêm kháng huyết

thanh sẽ xuất hiện dấu hiệu của bệnh trong vòng 48 giờ và chuột được tiêm

kháng huyết thanh đặc hiệu thì được bảo vệ.

Phương pháp ELISA cũng được dùng phát hiện kháng nguyên C.

botulinum type C nhưng không nhạy bằng phương pháp thử trên chuột (phát

hiện được 0,25ng/ml so với 0,12ng/ml khi dùng phương pháp tiêm chuột mẫn

cảm). Trong khi đó phương pháp PCR có kết quả tương đương với phương

pháp thử trên chuột cảm nhiễm (Franciosa et al., 1996).

Trong các ổ dịch trên thủy cầm và một số gia cầm, mức độc tố có thể quá

thấp không sinh được tiến trình bệnh ở chuột. Khi đó cần làm giàu mẫu bằng

cách cô đặc huyết thanh nghi ngờ và tiêm truyền lập lại ở chuột để khẳng định

kết quả.

Trong những giai đoạn tiến triển của bệnh, các triệu chứng lâm sàng rất

điển hình, trong thời gian nhiễm độc nhẹ chỉ có chứng liệt chân là có thể

quan sát được. Dạng bệnh thể nhẹ cần phân biệt với bệnh Marek, ngộ độc

thuốc và hoá chất hoặc những vấn đề về xương khớp. Trong những trường

hợp này thì chẩn đoán bằng phương pháp gây bệnh cho chuột mẫn cảm là rất

hữu hiệu. Chứng liệt mí mắt là một dấu hiệu điển hình dùng phân biệt bệnh

25

botulism với những bệnh khác. Botulism ở thủy cầm cần phân biệt với bệnh

tụ huyết trùng và nhiễm độc hoá chất. Ngộ độc chì của thủy cầm thường bị

nhầm với botulism.

Phân lập Clostridium botulinum đòi hỏi môi trường yếm khí. Vi khuẩn

phân bố rộng ở ruột, gan, lách của gia cầm bình thường. Tuy nhiên việc phát

hiện mầm bệnh trong mẫu thức ăn, môi trường có thể hữu ích trong nghiên

cứu về dịch tễ học. Mầm bệnh có thể được thể hiện trong mẫu ủ trong môi trường nước thịt yếm khí ở 30oC. Sau 3–5 ngày ủ độc tố có thể được phát hiện

bằng phương pháp tiêm chuột cảm nhiễm kết hợp trung hoà với kháng độc tố

đặc trưng.

2.5.1 Phương pháp tiêm truyền cho chuột bạch (Mouse bioassay)

- Chọn chuột bạch đực có trọng lượng 20-30g

- Kháng độc tố: đơn dòng (type A, B, C, D, E và F)

- Tiêm vào xoang bụng của chuột bạch, có thể dùng huyết thanh hoặc

dịch chiết từ bệnh phẩm (dịch ruột hoặc mẫu từ môi trường xung quanh). Các

dịch bệnh phẩm chia làm 2 lô thí nghiệm: lô 1 tiêm bệnh phẩm có trộn với

kháng độc tố, lô 2 tiêm bệnh phẩm đã qua xử lý nhiệt (đun cách thủy trong 10

phút để loại bỏ độc tố) và kèm theo lô đối chứng dịch bệnh phẩm không qua

xử lý.

- Chỉ tiêu theo dõi:

+ Quan sát biểu hiện của chuột sau 4, 8, 12, 18 và 24 giờ, sau đó quan sát

mỗi ngày trong vòng 4 ngày. Nếu lượng độc tố nhiều các chuột được tiêm sẽ

bị chết, riêng nghiệm thức có xử lý nhiệt đối với dịch bệnh phẩm thì chuột còn

sống bình thường

+ Các dấu hiệu bất thường ở chuột như: xù lông, thở bụng, kém vận

động, liệt toàn thân, suy hô hấp rồi chết (CDC, 1998).

Mẫu là huyết thanh của vịt nghi bệnh

Lấy trực tiếp huyết thanh để tiêm truyền cho chuột, phương pháp xử lý

huyết thanh như sau:

26

- Dùng 6 ống nghiệm sạch đánh số từ 1 – 6, cho vào mỗi ống nghiệm 1ml

huyết thanh, tiếp tục cho vào mỗi ống 0.25ml kháng huyết thanh, riêng ống số

1 không cho kháng huyết thanh vào.

- Trộn đều (tránh làm nổi bọt khí) hỗn hợp huyết thanh và kháng

huyết thanh.

- Để yên hỗn hợp trên ở nhiệt độ phòng 30 – 60 phút.

- Đánh dấu chuột bằng cách cắt lông hoặc sơn màu trên lông để dễ

theo dõi.

- Tiêm vào chuột, sau đó theo dõi và quan sát chuột dựa theo các chỉ tiêu

nêu trên (CDC, 1998).

Mẫu là dịch ruột, phân hoặc vi khuẩn sau khi nuôi cấy

Chuẩn bị dịch chiết

- Cân và nghiền 1g mẫu với 1ml dung dịch gelatin đã làm lạnh (40C)

(dung dịch gelatin: 0.2% gelatin, 0.4% Na2PO4; pH 6.4). Trộn cho hỗn hợp

đều hoàn toàn.

- Trữ trong tủ mát (4oC) trong 30 phút hoặc trữ trong vài ngày.

- Ly tâm lạnh hỗn hợp trên với vận tốc 12.000 v/phút trong 20 phút, loại

bỏ cặn. Có thể ly tâm phần nước bên trên thêm 1 lần nữa để được dung dịch ly

trích dùng tiêm truyền cho chuột.

Tiêm truyền cho chuột

- Tiêm truyền giống như trên mẫu huyết thanh nhưng dịch chiết được xử

lý bằng nhiệt hoặc dùng trypsin

- Đối với mẫu xử lý bằng nhiệt (để làm bất hoạt độc tố): cho 1ml dịch

chiết vào ống nghiệm, đậy nắp lại rồi đun cách thủy ở 100oC trong 10 phút.

- Đối với mẫu xử lý bằng trypsin hoặc kháng độc tố: cho 1ml dịch chiết

vào ống nghiệm, thêm vào 0.25ml trypsin 0.5% (hoặc kháng độc tố), để ở

nhiệt độ phòng 30 – 60 phút rồi tiêm cho chuột.

27

Sau khi tiêm truyền, theo dõi và quan sát chuột dựa theo các chỉ tiêu

nêu trên.

Nuôi cấy vi khuẩn C. botulinum từ dịch chiết

Trước khi nuôi cấy vào môi trường, ta làm tiêu bản dịch chiết ở trên, tiến

hành nhuộm Gram để xem hình dạng vi khuẩn và nha bào (nếu có)

- Mỗi mẫu dịch chiết được cấy vào 2 ống môi trường CMM/CMGS, mỗi

ống cấy 0.5 – 1ml dịch chiết, khử không khí rồi ủ 1 ống ở 80oC trong 10 phút,

làm lạnh nhanh. Sau đó đặt cả 2 ống vào tủ ấm CO2 ở 30oC trong 4 ngày.

Sau khi ủ, ly tâm canh trùng từ môi trường CMM/CMGS, loại bỏ cặn rồi

xử lý nhiệt, xử lý trypsin như thí nghiệm bên trên và tiêm truyền cho chuột thí

nghiệm (CDC, 1998).

Mẫu là độc tố từ vi khuẩn Clostridium botulinum phân lập được

Chọn lấy khuẩn lạc của C. botulinum trên môi trường TSA hòa vào ống

môi trường TPGY broth. Ủ yếm khí canh khuẩn ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó

lấy 1ml cấy vào các ống chứa môi trường MCMM và ủ tiếp ở 35oC trong 5

ngày trong điều kiện yếm khí.

Lấy 10ml huyễn dịch canh trùng sau khi ủ 5 ngày cho vào các ống

nghiệm, đem ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4oC. Lấy

phần nước trong (phần trên của ống ly tâm) pha loãng với dung dịch đệm

Gelatin Phosphate Buffer, tỷ lệ 1:10.

Sau đó chia ra làm 2 phần, một phần đem đun 100oC trong 10 phút, một

phần không đun, sau đó đem tiêm cho chuột. Mỗi lô 2 con chuột được tiêm

vào màng bụng liều 0,5ml/con. Theo dõi diễn biến đối với chuột thí nghiệm

trong 48 giờ sau khi tiêm. Nếu mẫu xét nghiệm có độc tố của C. botulinum thì

2 chuột lô I sống và 2 chuột ở lô II chết trong vòng 48 giờ với triệu chứng của

ngộ độc botulin (Cook et al., 1998).

28

2.5.2 Xác định độc tố botulin bằng sinh học phân tử

Kỹ thuật sinh học phân tử tương ứng với từng loại mẫu được thể hiện ở

Bảng 2.5 Phương pháp xác định độc tố botulin bằng sinh học phân tử theo loại mẫu

Loại mẫu

Loại kỹ thuật

Loại độc tố

DNA từ môi trường tinh khiết PCR, Real time-PCR,

A, B, C, D, E, F

Multiplex PCR

DNA từ thực phẩm

PCR

A, B, E, F, G

DNA từ thực phẩm, môi

PCR

A, B, E

trường và bệnh phẩm

DNA từ phân

PCR, Real time-PCR

A, B, E

(Miia Lindstrom và Hannu Korkeala, 2006)

bảng sau:

Kỹ thuật PCR, Real time-PCR

Ly trích DNA bằng một số kit sau: Chelex®100 matrix, Phenol-

Cloroform-Isoamyl alcohol, NucliSENS® magnetic extraction, DNeasy®Blood

& Tissue.

Những kỹ thuật sinh học phân tử khác

Xác định đặc điểm về gen của Clostridium botulinum bằng kỹ thuật

PFGE (Pulsed-field gel electrophoresis), hoặc kỹ thuật AFLP (Amplified

fragment length polymorphism) (Dario et al., 2013)

2.5.3 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum

2.5.3.1 Phương pháp lấy mẫu

Hướng dẫn lấy mẫu để xác định bệnh do độc tố botulin được thể hiện qua

bảng sau:

29

Bảng 2.6 Bảng hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm để xác định bệnh botulism

Kiểm tra độc

Loại bệnh

Điều kiện

Loại mẫu

Số lượng yêu cầu

tố (T) hoặc

do botulin

bảo quản

nuôi cấy (C)

Huyết thanh

Trữ lạnh

T

5-10ml

Dich nôn, ói

Trữ lạnh

T, C

20ml

Ngộ độc

thực phẩm

Phân

Trữ lạnh

T, C

10-50g

Thức ăn thừa

Trữ lạnh

T, C

50g

Phân

Trữ lạnh

T, C

≥ 0.2g

Ngộ độc ở

Dịch nôn, hoặc

≥ 5ml

Trữ lạnh

T, C

trẻ em

dịch thụt rửa

Huyết thanh

Trữ lạnh

T

≥ 2ml

Huyết thanh

Trữ lạnh

T

5-10ml

Ngộ độc ở

Phân

Trữ lạnh

T, C

10-50g

các vết

Dịch rỉ ra từ

Thấm bằng tampon và

Nhiệt độ

thương

T

vết thương

trữ bằng môi trường

phòng

chuyên chở

(Alaska State Public Health Laboratory, 2011)

 Đối với mẫu vịt

Sau khi thu thập được những vịt có biểu hiện triệu chứng của bệnh thì

tiến hành lấy mẫu gồm: huyết thanh và toàn bộ đường tiêu hóa (chất chứa

trong thực quản- diều-mề, ruột, gan, lách). Cách tiến hành như sau:

Cắt cổ vịt để lấy máu chắt huyết thanh đồng thời làm chết vịt. Đặt vịt

nằm ngữa, dùng kéo cắt da vùng sát hậu môn, cắt cơ ở xoang bụng, sau đó cắt

lên hai bên sườn để mở xoang bụng và ngực. Kiểm tra tổng quát các cơ quan,

sau đó tiến hành lấy mẫu đường tiêu hóa. Dùng dây thun cột hai đầu đường

tiêu hóa: phía trên giáp với hầu, phía dưới giáp với lỗ huyệt. Dùng kéo cắt rời đường tiêu hóa đã được cột, sát trùng bằng cồn 70o, sau đó cho vào môi trường

chuyên chở Thyoglycolate đã được hấp tiệt trùng và đuổi oxy, trữ lạnh và đem

về phòng thí nghiệm trong 24 giờ.

30

 Đối với mẫu bùn đất và nước

Đất được lấy ở độ sâu 10-20 cm so với mặt đất đối với đất khô, đối với

đất bị ngập nước có bùn lắng bên trên thì lớp bùn trên mặt ruộng, rơm rạ mục,

cây thủy sinh chết và thối – mục cũng được thu thập. Mỗi mẫu có khối lượng

khoảng 25 – 30g, cho vào lọ thủy tinh đưa về phòng thí nghiệm. Đối với mẫu

nước thì dùng chai thủy tinh vô trùng lấy khoảng 50 – 100ml nước ở các vũng

nước đọng trên ruộng hoặc đường nước nhỏ trên ruộng, mang về phòng thí

nghiệm (Giovanna Franciosa et al., 1996)

2.5.3.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn C. botulinum

Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn C. botulinum

Các mẫu sau khi đem về phòng thí nghiệm sẽ tiến hành nuôi cấy, phân lập:

- Đối với mẫu chất chứa trong ruột, dịch dạ dày, gan, lách: sát trùng mặt

ngoài các mẫu rồi dùng kéo vô trùng cắt sâu bên trong, dùng tampon vô trùng

lấy bên trong mẫu và cấy trên mặt thạch máu, sau đó đem ủ trong tủ ấm CO2 ở 37o trong 24 giờ, chọn khuẩn lạc điển hình nhuộm Gram để xem hình dạng,

cách bắt màu, dạng nha bào, độ thuần nhất của vi khuẩn. Sau đó, có thể kiểm

tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn bằng bộ API 20A.

- Đối với mẫu là đất, bùn, cây thủy sinh chết, rơm rạ mục, nước đọng: lấy

khoảng 1g hoặc1ml mẫu cho vào lọ môi trường Cooked Meat Medium (CMM), tạo môi trường yếm khí, ủ trong tủ ấm CO2 ở 37o trong 24 giờ. Cấy

chuyển canh trùng sang thạch máu và qui trình giống như trên.

2.6 Những ứng dụng của độc tố botulin của vi khuẩn C. botulinum

2.6.1 Trong y học

Chữa chứng co giật mi mắt: Vào cuối những năm 1960, bác sĩ nhãn

khoa ở San Francisco là Alan Scott và Edward Schantz là những người đầu

tiên đưa độc tố botulin vào các mục đích điều trị. Năm 1973, Scott đã sử dụng

độc tố botulin type A (BTX-A) cho các thí nghiệm trên khỉ. Năm 1980, ông

chính thức sử dụng BTX-A lần đầu tiên ở người để điều trị bệnh co that mi

mắt (bleppharospasm), một tình trạng mà mắt không tự mở mắt được và

không kiểm soát được việc nháy mắt. Năm 1986, Scott và nhà phân phối của

BTX-A đã ngưng cung cấp thuốc vì không đảm bảo được an toàn trong thử

31

nghiệm. Mãi tới tháng 12/1989, Botox được sản xuất bởi Allergan, Inc… được

sự chấp thuận của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) để điều

trị bệnh co thắt mi (bleppharospasm) cho những bệnh nhân trên 12 tuổi.

Chữa chứng tiết nhiều nước bọt: Trong các bệnh thần kinh như

Parkinson, bại não, thoái hóa thần kinh, đột quỵ, xơ cứng teo cơ một bên

(amyotrophic lateral sclerosis) thường có chứng tiết nhiều nước bọt, ảnh

hưởng không tốt đến hình ảnh, hoạt động giao tiếp của người bệnh. Lần lượt

có nhiều tác giả Friedman, Potuska, Jongerius (2001), Suskin, Tuilon đã sử

dụng BoTX-A và BoTX-B để chữa chứng này. Các nghiên cứu này tuy chưa

lớn, nhưng đều nhận thấy có hiệu quả, chưa ghi nhận tai biến, trừ trường hợp

trong bệnh xơ cứng teo cơ một bên. Tuy nhiên, trong bệnh xơ cứng teo cơ một

bên, nếu tiêm vào tuyến mang tai hay các tuyến dưới hàm cũng giảm thiểu

được được tai biến này.

Chữa chứng tiết mồ hôi khu trú nguyên phát: Nghiên cứu của

Naumann (2001 và 2002) cho biết: trong trường hợp đổ mồ hôi vừa và nặng,

dùng BoTX-A tiêm dưới da cho hiệu quả tới 94% trong khi ở nhóm đối chứng

chỉ đạt 36%. Trong thử nghiệm này, nhóm đối chứng cho tác dụng phụ nhiễm

khuẩn cao hơn nhóm tiêm BoTX-A. Các tác giả Dressler et al., (2003) sau đó

cũng lặp lại thử nghiệm này với BoTX-B cho kết quả tương đương, tuy nhiên

có gặp tác dụng phụ là làm khô miệng, gây khó khăn trong điều tiết mắt. Hiện

BoTX-A được chỉ định chính thức dùng cho chứng tiết mồ hôi lưu trú vừa và

nặng tại nhiều nước như Canada, Australia, Vương Quốc Anh.

Chữa chứng đau cơ xương: Foster (2001) đã thử nghiệm dùng BoTX-A

điều trị đau cơ xương thắt lưng mạn tính. Các kết quả cho thấy BoTX-A có

73% người dùng giảm được 50% các triệu chứng (tính theo thang điểm nhìn)

và có 67% giảm được sự tàn tật (đánh giá bằng bộ thang điểm câu hỏi đau thắc

lưng OLBPD), trong khi trên nhóm đối chứng các tỷ lệ tương ứng này chỉ là

25-19%. Lang (2003) cũng đề nghị dùng BoTX-A để cải thiện đau do làm

giảm trương lực, giảm hoạt động quá mức của cơ, coi như một liệu pháp giảm

đau đa phương thức, có lợi hơn trước đó là làm hồi phục chiều dài bình thường

và sự cân bằng sinh học của cơ.

32

2.6.2 Trong thẩm mỹ

Sự co các cơ đã làm cho trán có các vết nhăn gợn sóng, vết nhăn chân

chim ở khóe mắt. Trước cả khi ứng dụng vào y học, các thầy thuốc thẩm mỹ

đã táo bạo tiêm vào các cơ trên mặt, làm liệt có mức độ các cơ này, xóa vết

nhăn. Mãi đến tháng 4/2002, FDA (Mỹ) mới chính thức cho lưu hành, nhưng

ngay từ năm 2001 đã có 1,6 triệu người Mỹ tự nguyện dùng thử, doanh số bán

ra hàng năm lúc ấy là 301 triệu USD và đến năm 2006 thì vượt qua mức 1 tỷ

USD. Đối với việc dùng BoTX-A, nếu trong y học từng bước thăm dò, dè dặt

thì trong thẩm mỹ lại sớm được ưa chuộng và sử dụng phổ biến.

Năm 2002, FDA đã phê chuẩn việc sử dụng Botox (Botulinum toxin-A)

với mục đích thẩm mỹ bằng việc giảm đường nhăn giữa trán thông qua việc

làm liệt cơ mặt.

2.7 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn C. botulinum trong và ngoài nước

2.7.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn C. botulinum trên thế giới

Các nghiên cứu về C. botulinum trên vịt ở nước ngoài cũng không nhiều,

các công bố chủ yếu là ghi nhận các trường hợp ngộ độc do nhiễm độc tố của

C. botulinum ở thủy cầm hoang dã. Một số nghiên cứu tiêu biểu là:

Khảo sát của Leighton (2000), trên thủy cầm ở Canada cho thấy C.

botulinum type C là nguyên nhân gây ngộ độc ở vịt và các loài chim ăn cá tại

các vùng đất ngập nước. Ở những nơi có nhiều đồng cỏ và C. botulinum type

E thì ảnh hưởng đến loài chim ăn cá, đặc biệt là khu vực Great Lakes đã có 22

loài thủy cầm được xác nhận là ngộ độc bởi C. botulinum type E . Hàng năm

vào mùa hè và mùa thu có hàng ngàn thủy cầm hoang dã chết do nhiễm độc tố

C. botulinum type E tại khu vực này. Riêng năm 1998, có trên một triệu thủy

cầm hoang dã chết tại hồ Old Wives do ngộ độc C. botulinum type C.

Khảo sát về mối tương quan bệnh học giữa cá và thủy cầm ăn cá, Yule et

al., (2006) gây nhiễm cho cá bằng C. botulinum type E cho thấy những cá chết

(có độc tố hình thành trong quá trình thối rữa) hay còn sống (độc tố đang có

trong cơ thể do gây nhiễm) đều gây ngộ độc cho các loài thủy cầm ăn cá thí

nghiệm. Tác giả nhận định sẽ có nguy cơ đối với người khi tiêu thụ chim hoặc

33

cá tại thời điểm cá chết vì rất khó để phát hiện độc tố trong cá. Tuy nhiên nguy

cơ này thấp vì chất độc sẽ bị phá huỷ khi chế biến nấu chín trước khi ăn.

Để xác định thời điểm độc tố đạt cao nhất sau khi gây nhiễm, Notermans

et al. (1980) khảo sát đối với vịt Bắc Kinh cho thấy độc tố C. botulinum type

B, C và E có nồng độ cao nhất trong cơ thể vịt sau khi uống 40 phút và nếu xét

nghiệm sau 4 giờ chỉ còn một lượng nhỏ hoặc không tìm thấy độc tố trong

mẫu xét nghiệm. Khảo sát này cũng cho thấy vịt Bắc Kinh nhạy cảm với type C qua đường uống liều 9,6 x 104 LD50 của chuột và ít nhạy với type B và E.

Khảo sát về khả năng gây chết khi ngộ độc Clostridium botulinum type C

trong tự nhiên, Locke & Friend (1989) cho thấy vẫn có 10 – 20% thủy cầm

còn sống trong các ổ dịch với các mức độ tê liệt khác nhau, và các tác giả nhận

định rằng nếu được điều trị thì khả năng hồi phục có thể từ 75 – 90%. Trong

khi đó Schettler (1979) nhận thấy trong ổ dịch nếu sử dụng khẩu phần có năng

lượng thấp cũng làm giảm tỷ lệ chết do ngộ độc.

Nghiên cứu qui trình điều trị khi thủy cầm nhiễm độc tố C. botulinum theo

Wobeser (1987) là cung cấp nước sạch, đưa vịt vào bóng râm và tiêm kháng

độc tố type C. Tuy nhiên do kháng độc tố được quản lý nghiêm và rất đắt tiền,

cho nên chỉ được áp dụng cho những loài thủy cầm có nguy cơ tiệt chủng.

Nghiên cứu về miễn dịch chủ động của Haagsma (1987) cho thấy những

thủy cầm ngộ độc sau khi được điều trị khỏi bệnh không có miễn dịch, do đó

chúng có thể tiếp tục ngộ độc và chết khi ăn phải chất độc lần sau. Do đó cần

tiêm vaccine để giảm tác động của độc tố và tăng tỷ lệ thành công khi điều trị.

Thử nghiệm khả năng hấp thu của độc chất khi gây bệnh qua đường hô

hấp, Dembak et al., (2007) đã chứng minh rằng ở động vật linh trưởng, bệnh

xảy ra từ 12 đến 80 giờ sau khi tiếp xúc và ở chuột thì nồng độ tối đa trong

máu của độc tố botulin đạt được lúc 2 giờ sau phơi nhiễm.

Nghiên cứu về khả năng độc tố botulin có thể “qua mùa đông” trong các

ấu trùng ruồi hay không, Hubálek & Halouka (1991) đã kiểm tra độc tố có

trong hai nhóm mẫu của ấu trùng ruồi. Kết quả cho thấy sau 131 ngày, nồng

độ độc tố giảm 25 lần và 40 lần, tuy nhiên lượng độc tố này vẫn còn cao và

vẫn có thể gây chết gia cầm khi ăn phải vào mùa xuân.

34

Nghiên cứu về khả năng sử dụng kháng sinh can thiệp trong các trường

hợp bệnh do C. boltulinum. Nantel (2002) cho rằng các kháng sinh

aminoglycoside làm tăng thêm sự ức chế thần kinh cơ gây ra bởi độc tố. Vì

vậy, khi nghi ngờ ngộ độc do độc tố C. botulinum thì tránh dùng các thuốc

chứa magiê mà phải dùng ngay kháng độc tố theo chỉ định.

Từ năm 1975 – 2003, khảo sát về các nguyên nhân gây chết thủy cầm

hoang dã tại Hoa Kỳ, Skerratt et al., (2005) cho thấy có 59% số mẫu có

Pasteurella multocida và Clostridium botulinum type E và tác giả cho rằng

đây là nguyên nhân chính gây chết thủy cầm trong những trận dịch lớn hoặc

những trường hợp dịch xảy ra đột xuất.

Tổng hợp tài liệu nghiên cứu của nhiều tác giả về các độc tố của

Clostridium botulinum Dennis et al.,(2003) cho biết: canh khuẩn type Cα sản

sinh 3 độc tố là C1, C2 và một lượng nhỏ type D. Độc tố C1 và D thì được sản

sinh bởi gene thực khuẩn thể. Các type C được sinh ra trong giai đoạn tiền

thực khuẩn thể và có thể được chuyển đổi thành thành type D bằng việc nhiễm

vào các thực khuẩn thể từ các loài type D như là một sự hỗ tương.

Các type Cβ thì thiếu thực khuẩn thể mã hoá cho độc tố C1 và D và chỉ

sản sinh độc tố C2. Các độc tố C1, D, A, B, E, F tổng hợp từ những polypeptid

ban đầu không độc sau đó nhờ sự gắn kết của protease tạo thành chuỗi độc tố

thần kinh có trọng lượng phân tử 150-kD. Khởi đầu của độc tố type C thì

không độc mà chỉ làm gia tăng sự đề kháng với acid và protease. Tuy nhiên ở

pH hơi kiềm của ruột non, một protease sẽ xúc tác kết hợp chuỗi nặng 100-kD

(Heavy chain H) và chuỗi nhẹ 50 kD (Light chain L) với nhau thành một chuỗi

đôi bằng liên kết disulfide.

Độc tố C2 mặc dù không có độc tính thần kinh nhưng những yêu cầu

kích hoạt trypsin đã gây ra tăng tính thấm đa dạng ở màng mô. Tác động của

độc tố chứa 2 protein phân biệt rõ ràng, một là thành phần liên kết và dịch mã

(C2II) và một là thành phần enzyme actin-ADP-ribosylating. Chuỗi acid

nucleic của độc tố C2 tương tự với chuỗi độc tố ribosylating từ các loài

Clostridium và Bacillus khác, ví dụ như Bacillus anthracis.

35

Độc tố của vi khuẩn không chỉ ảnh hưởng nguy hiểm đến sức khỏe của

con người mà còn nguy hại đến các loài động vật khác, đặc biệt là các loài

động vật quý hiếm.

Năm 1895, Emile Van Ermengem tìm ra bệnh ngộ độc thịt do vi khuẩn

C. botulinum. Một số loại vi khuẩn kị khí, có nha bào và rất khó bị tiêu diệt. Ở

Thuỵ Điển và các vùng biển lân cận, C. botulinum type E đã rất phổ biến, nó

có nguồn gốc trong đất và tồn tại nhiều trên lưu vực của Baltic. Do đó Baltic

là hồ chứa C. botulinum type E tồn tại và lây lan đến các vùng nước lân cận

(Johansen.A, 1963).

Nghiên cứu của Bunei và ctv (1977) đã phân lập và xác định botulin type

C bằng kỹ thuật gen tại Nhật Bản. Ông nhận thấy rằng khối lượng phân tử của

botulin type C khoảng 14000bp, trong đó chuỗi nặng có khối lượng khoảng

98000bp và chuỗi nhẹ có khối lượng 50000bp. Các loại độc tố khác có khối

lượng từ 14000 đến 16000bp. Đây là thông tin rất hữu ích cho những nghiên

cứu tiếp theo nhằm xác định các loại độc tố botulin bằng sinh học phân tử.

Tiếp theo, năm 1989 nhà khoa học người Nhật tên là Kasthuri và ctv đã

phân lập và xác định độc tố botulin trong đất. Kết quả cho thấy có 12% (3/26)

số mẫu đất có vi khuẩn Clostridium botulinum, trong đó có 1 mẫu chứa

botulin type C.

Ghi nhận ở Trung Quốc năm 1989 của Gao và ctv tại 15 tỉnh cho thấy

ngộ độc botulin xảy ra do các type khác nhau của vi khuẩn C. botulinum.

Trong 745 vụ ngộ độc bùng phát được ghi nhận, có đến 421 ca tử vong trong

số 2861 ca ngộ độc (chiếm tỷ lệ 14,7%). Nguyên nhân các vụ ngộ độc trên là

do tất các type của vi khuẩn C. botulinum (ngoại trừ type G).

Năm 1996, tại bờ biển Salton ở California, đã ghi nhận sự chết đi với số

lượng lớn của loài Bồ Nông Trắng của Mỹ và chiếm tỷ lệ 15-20% của quần thể

đa dạng loài ở Phương Tây. Đáng chú ý nhất trong vụ ngộ độc này là lần đầu

tiên cá, đặc biệt là cá Rô Phi (Oreochromis mossambicus) được xem như là

nguồn gốc của sự ngộ độc botulin type C ở các loài chim (Rocke và ctv 2005).

Năm 1996, Fransico và ctv đã so sánh kỹ thuật PCR và kỹ thuật tiêm

truyền cho chuột (mouse bioassay) để xác định botulin type C trong mẫu vịt

nước bị bệnh liệt mềm cổ chết và môi trường xung quanh nơi các vịt này sinh

36

sống. Kết quả cho thấy phương pháp PCR khá nhạy, nhanh chóng. Đây là kết

luận rất thiết thực cho nhưng nghiên cứu về sau về botulin.

Tiếp theo, Lindstrom và ctv (2001) đã dùng phương pháp Multiplex PCR

để xác định các độc tố botulin A, B, E và F trong thực phẩm và trong phân của

những bệnh nhân ngộ độc botulin ở Phần Lan. Kết quả cho thấy botulin type

A, E, F hơn type F.

Từ năm 2000 đến 2004, hơn 10.000 loài chim biển, chủ yếu là mòng

biển (Larus argentatus) đã chết không rõ nguyên nhân trong quần đảo

Blekinge ở Đông Nam Thụy Điển. Khi tiến hành nghiên cứu, người ta đã phát

hiện được độc tố botulin type C ở 11/16 (69%) mẫu huyết thanh của mòng

biển bị ngộ độc và đã được kiểm tra trên chuột (Neimanis và ctv, 2007).

Tại Hàn Quốc, 5 vụ ngộ độc ở thuỷ cầm đã xảy ra từ năm 2004-2008.

Trong tháng 10/2008, một đợt cúm đã xảy ra làm chết khảng 2000 thuỷ cầm.

Trong đợt dịch này, độc tố type C của vi khuẩn C. botulinum đã được phát

hiện trong huyết thanh vịt, dịch ruột vịt và dòi từ xác thuỷ cầm. Ngoài ra,

85% mẫu trầm tích trong khu vực dương tính với độc tố botulin (NariShin và

ctv, 2010).

Tại Thái Lan, Wangroongsarb và ctv năm 2010 đã khảo sát sự hiện của

các độc tố botulin trong 19 vụ ngộ độc thực phẩm bằng sinh học phân tử. Kết

quả cho thấy phần lớn các type botulin là A và B.

Năm 2011, ở Miền Bắc nước Ý đã bùng phát vụ ngộ độc ở các loài chim

hoang dã và các động vật khác tại bờ suối Crostolo (Ý). 20/28 mẫu dạ dày của

vịt trời chết có giòi (ấu trùng ruồi xanh) và được thu thập để nghiên cứu. Kết

quả cho thấy trong các mẫu kiểm tra có sự hiện diện của độc tố C. botulinum

type C, độc tố được xác định thử nghiệm trên chuột (Defilippo và ctv, 2013).

Fereshteh và ctv (2013) đã khảo sát sự hiện diện của độc tố botulin từ

1140 mẫu gồm huyết thanh, phân của bệnh nhân và thực phẩm (cá, phomat,

thịt) thu thập từ 21 huyện của Iran. Bằng phương pháp tiêm truyền cho chuột,

ông thu được kết quả 21.8% là botulin type A, 11% botulin type B, 34.3% là

botulin type E và 11% là botulin type AB, còn lại 21.8% chưa xác định được.

Kết quả cho thấy botulin type E ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của con người.

37

 Những nghiên cứu về vi khuẩn C. botulinum trong môi trường

Ngộ độc botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum đã diễn ra đều đặn

và nghiêm trọng ở nhiều nơi trên thế giới, nhiều nhà khoa học đã khẳng định

vi khuẩn Clostridium botulinum tồn tại nhiều trong môi trường sống như đất,

nước, xác nhuyễn thể, các động vật chết kể cả giòi. Vì thế, có nhiều nghiên

cứu về Clostridium botulinum trong môi trường.

Đầu tiên là nghiên cứu của Smith năm 1978 ở nhiều vùng đất của Vương

quốc Anh và Ireland. Đất từ các ao, hồ, đầm lầy, bãi bùn, suối, sông ngòi,

kênh rạch và mẫu tại nơi cư trú và khu bảo tồn của các loài chim đã được lấy

để khảo sát. Kết quả thu được tỷ lệ vi khuẩn C. botulinum hiện diện trong các

mẫu đất là 35,0% (194/554), trong đó cao nhất là type B (30,1%), tiếp theo là

type C (3,4%), type E (2,7%) và thấp nhất là type D (1.1%). Với tỷ lệ nhiễm

ghép hơn một type là 2,3% (Smith và ctv, 1978).

Tại Đan Mạch, qua kiểm tra 684 mẫu đất. C. botulinum type E được tìm

thấy trong 90% các mẫu từ môi trường nước của Đan Mạch, bao gồm bùn từ

hồ nhân tạo trẻ, và trong 86% các mẫu từ môi trường biển Greenland. Đất

canh tác và đất rừng, đất trồng từ đáy biển khai hoang không phát hiện C.

botulinum type E nhưng type B đã được chứng minh xuất hiện thường xuyên

trong môi trường này. C. botulinum type A, B, hoặc E được tìm thấy trong

2,6% các mẫu từ các môi trường ở quần đảo Faroe và Iceland, trong khi các

type C hay type D có trong 42% các mẫu từ Bangladesh. C. botulinum type E

trong trầm tích thủy sản cá hoặc động vật thuỷ sinh chiếm tỉ lệ cao. Dựa trên

những phát hiện này, C. botulinum type E được đề nghị xem như là một sinh

vật thủy sinh thật, bởi vì môi trường này cung cấp những điều kiện tốt nhất

cho sự sống còn của các bào tử trong tự nhiên (Hush, 1980).

Đất từ 98 địa điểm trong toàn bộ hệ thống sông của Nhật Bản đã được

kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn Clostridium botulinum. Botulin type E

chiếm tỉ lệ cao trong những mẫu đã được phân lập 33 – 82%, type B 7% và

type C 9%.

Năm 1986, sau khi phân lập được chủng vi khuẩn C. botulinum tiết ra

độc tố botulin ở hai em bé tại Rome bị ngộ độc, các nghiên cứu được thực

hiện để tìm nguồn có độc tố. Kết quả cho thấy vi khuẩn C. botulinum type A

38

và type B phân lập từ đất lấy ở các vùng lân cận của Rome chiếm tỉ lệ 1,3%

(7/520) (Aureli et al., 1986).

Năm 1987, ở Saskatchewan miền tây Canada, độc tố gây chết chuột được

xác định là của C. botulinum type C, các nhà khoa học phân lập và phát hiện

C. botulinum type C có trong 38,0% của 326 mẫu đất thu thập từ 28 vùng đất

ngập nước ở Saskatchewan. Trong đó C. botulinum type C có trong 59,2%

mẫu lấy từ những nơi có tiền sử bệnh ngộ độc và 6,2% của số mẫu lấy từ

những đầm lầy không có tiền sử ngộ độc. Từ đó cho thấy ở bất kì vùng đất

ngập nước nào đã có tiền sử bệnh ngộ độc, tỉ lệ ngộ độc sẽ xuất hiện lại rất cao

do sự tồn tại bào tử của vi khuẩn (Wobeser, et al., 1987).

Mặc dù cũng có trường hợp nó được tìm thấy ở đường tiêu hoá của loài

chim và động vật có vú, nhưng C. botulinum bản chất là một vi khuẩn hoại

sinh sống trong đất. C. botulinum phân bố khắp nơi trong đất, đặc biệt những

nơi như đất vườn, nghĩa trang, nơi chăn nuôi gia súc, gia cầm. Trong các loại

rau quả, kể cả mật ong. Chúng cũng có trong ruột của các động vật nuôi trong

nhà, trong ruột cá, đôi khi có cả trong ruột người, ở nơi nước bị ô nhiễm. Do

vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên nên thực phẩm dễ bị nhiễm trong quá trình

sản xuất, chế biến, vận chuyển và bảo quản. Đặc biệt chúng có khả năng lây

nhiễm và phát triển mạnh trong các loại thực phẩm như thịt cá ướp muối, ướp

lạnh, hun khói, đồ hộp, xúc xích, lạp xưởng, pho mát bị đóng kín hoặc có độ

dày lớn,…vì các loại thực phẩm này là môi trường thuận lợi về các điều kiện

kỵ khí, nhiệt độ, độ pH, đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho chúng sinh

trưởng và phát triển (Wobeser, et al., 1987).

Bùn cũng là nơi phân bố của vi khuẩn C. botulinum. Bùn cung cấp độ

ẩm, kỵ khí, môi trường giàu chất dinh dưỡng do đó C. botulinum có thể phát

triển, vì vậy việc phân lập các C. botulinum từ nguồn này là nhiều hơn các loại

đất. Độc tố type E ưa lạnh đã được đặc biệt liên quan đến môi trường trong

khu vực như miền tây Bắc Mỹ, Nhật Bản và bờ biển Baltic. Kết quả là, type E

thường là nguyên nhân về sự bùng phát của bệnh ngộ độc mà cá là phương

tiện lây nhiễm chủ yếu (Wobeser, et al., 1987).

Tại châu Á: Phổ biến bởi C. botulinum type A tỉnh Hà Bắc, Trung Quốc.

C. botulinum type A và B ở tỉnh Saraburi và Maehongson, type F ở tỉnh

39

Lampang, Thái Lan. C. botulinum type E thì ở Nhật Bản. C. botulinum type C

cũng được tìm thấy trong xác thuỷ cầm và chim hoang dã ở Incheon, Hàn

Quốc. Trong khi các type C hay D đã được chứng minh trong 42% các mẫu

đất từ Bangladesh (Gye-Hyeong Woo et al., 2010).

Tại Úc: C. botulinum type A được tìm thấy có mặt trong mẫu đất khu

vực Victoria, ngoại ô Sydney, type B trong bùn biển Tasmania, cả 2 type A

và B được phân lập từ khu vực đô thị (Eales and Gillespie, 1947; Ohye and

Scott, 1957).

Tại châu Âu: Sự phân bố của vi khuẩn C. botulinum trong môi trường tự

nhiên của Đan Mạch, Quần đảo Faroe, Iceland và Greenland. Type E được tìm

thấy trong 90% các mẫu từ môi trường nước của Đan Mạch, bao gồm bùn từ

hồ nhân tạo và trong 86% các mẫu từ môi trường biển Greenland. Type B đã

được tìm thấy trong đất canh tác và rừng ở Đan Mạch, bao gồm đất trồng từ

đáy biển khai hoang. C. botulinum type A, B, type E được tìm thấy trong 2,6%

các mẫu từ các môi trường của quần đảo Faroe và Iceland. Type E cũng được

tìm thấy trong các trầm tích thuỷ sản ở Na Uy, Thuỵ Điển, Hà Lan, Ba Lan

(Huss, 1980).

Bắc Mỹ: Khảo sát tiến hành tại Hoa Kỳ tìm thấy độc tố type A là phổ biến

nhất ở phía Tây, hiếm có ở thung lũng Mississippi, rất ít ở vùng dọc theo ven

biển phía Đông, nơi độc tố type B chiếm ưu thế. Phân phối này đã được phản

ánh trong các dịch bệnh ngộ độc tại Hoa Kỳ trong giai đoạn 1950 – 1979, khi

85% những người ở phía tây sông Mississippi bị ngộ độc do loại độc type A và

63% những người phía đông bị ngộ độc do type B (Hauschild, 1989).

Sự phân bố của vi khuẩn C. botulinum type E được xác định trong trầm

tích dọc theo bờ biển của Nunavik, eo biển Hudson, vịnh Hudson, và khu vực

vịnh Ungava, Bắc Quebec, Canada. Sông Koksoak chứa hàm lượng cao của C.

botulinum type E. C. botulinum type E được tìm thấy trong ruột (4,4%) và da

(1,4%) của hải cẩu (Daniel Leclaira và ctv, 2012).

Nam Mỹ: Sự hiện diện của Clostridia tiết độc tố botulinum trong 2.009

mẫu đất từ năm khu vực địa lý của Argentina. Các tỷ lệ là 23,5%, và sự phân

bố không đồng đều giữa các vùng (Carolina Lúquez và ctv, 2004).

40

Và gần đây nhất là một công trình nghiên cứu của Espelund và Klaveness

(2014) về vai trò của C. botulinum trong hệ sinh thái nước ngọt đã tạo ra một

“Vòng sinh thái” khép kín. Trong đó, mỗi yếu tố, mỗi vai trò đều đã được

Yếu tố truyền lây

Làm mồi cho

Động vật không xương sống

Các loài chim

Thực vật

Vật chủ chết

Cá

Tảo

Bào tử

Đất

Bụi

Trầm tích

Môi trường

Vùng đất ngập nước

Nước

Hình 2.10 Vai trò của C. botulinum trong một hệ sinh thái nước ngọt

(Nguồn: Espelund và Klaveness, 2014)

nghiên cứu và trình bài trong nhiều báo cáo khoa học.

2.7.2 Tình hình ngộ độc do độc tố của vi khuẩn C. botulinum trên

thế giới

Theo số liệu của CDC Hoa Kỳ, hàng năm trên thế giới có tới trên 76

triệu người bị ngộ độc thực phẩm và hàng nghìn ca do độc tố của vi khuẩn

Clostridium botulinum gây ra, nhiều ca nặng có thể dẫn đến tử vong. Từ khi

được biết đến thì bệnh đã gây ra nhiều trận dịch, trong đó một số trận dịch

bùng phát nổi bật đã được ghi nhận trên thế giới.

Theo Dolman (1974), kể từ năm 1919 ở Canada có 62 vụ ngộ độc được

xác định là do ngộ độc botulin đã làm 83 người tử vong trong số 181 người bị

ngộ độc (chiếm 46%). Trong số này, 41 vụ xác định là do vi khuẩn

Clostridium botulinum (type A là 6 vụ, type B là 4 vụ, 1 vụ gồm cả hai type A

và B, và 30 vụ do type E) gây ra. Người Eskimo chiếm khoảng hai phần ba số

người trong các vụ dịch và tử vong và những người sống ven bờ biển Thái

41

Bình Dương do tiêu thụ các sản phẩm động vật có vú ở biển và trứng cá hồi.

Tháng 1 năm 1961 có 38 vụ dịch làm 33 người chết trong số 94 người bị ngộ

độc. Mười tám vụ ngộ độc xảy ra ở người Eskimo sống ở Labrador, đảo phía

Nam Baffin, bắc Quebec, và các khu vực Mackenzie. Ngoài ra, bờ biển Thái

Bình Dương đã xảy ra 15 vụ ngộ độc do người dân ăn phải trứng cá hồi thối.

Các vụ ngộ độc liên tục xảy ra ở xung quanh khu vực bờ biển Thái bình

Dường. Theo ghi nhận của Hauschild và ctv (1985) thì ở Canada từ năm 1971

đến năm 1984 đã xuất hiện 122 vụ ngộ độc trong đó có 61 vụ ngộ độc do

botulin, làm 21 người chết. Hầu hết xảy ra ở miền bắc Quebec, phía Tây bắc

Territories hoặc British Columbia. Trong số 122 nạn nhân có 113 là người dân

bản địa, chủ yếu là người Eskimo. Nguyên nhân là do người dân ở đây đã ăn

các sản phẩm lên men từ gạo hay thịt các động vật, trứng cá hồi lên men hoặc

các loại cá khác. Các type Clostridium botulinum chủ yếu trong các vụ dịch là

type E (nhiều nhất), type B và type A.

Trong thời gian 1985 – 2005, có tổng cộng 91 phòng thí nghiệm đã tiếp

nhận và xác nhận có sự bùng phát của bệnh ngộ độc botulism xảy ra ở Canada.

Trong tổng số 205 trường hợp ngộ độc thì 11 trường hợp tử vong. Nguyên

nhân chủ yếu là do vi khuẩn Clostridium botulinum type E, type A và type B

gây ra. Khoảng 85% các ổ dịch xảy ra trong cộng đồng bản xứ Alaska, đặc

biệt là người Inuit của Nunavik ở miền bắc Quebec và là những cư dân đầu

tiên của British Columbia (thuộc Canada) của bờ biển Thái Bình Dương. Các

trường hợp bị ngộ độc chủ yếu là tiếp xúc với độc tố botulinum type E thông

qua việc tiêu thụ các động vật có vú và sản phẩm cá biển được chế biến theo

truyền thống. Hai ổ dịch ngộ độc là do thực phẩm chế biến sẵn để ăn từ các

sản phẩm thịt để phục vụ trong các nhà hàng (Leclair và ctv, 2013).

Vào tháng tư năm 1991, 91 bệnh nhân nhập viện ở Cairo (Ai Cập).

Bệnh nhân nhập viện có triệu chứng giống như bệnh ngộ độc botulin, kết quả

đã làm 18 người chết (20%). Những bệnh nhân này đã ăn mắm cá đối

(faseikh), đa số các trường hợp là do các gia đình này đã mua mắm từ một

cửa hàng. Khi kiểm tra đã phát hiện hàm lượng độc tố của Clostridium

botulinum type E rất cao trong mắm. Ngoài ra, người ta cũng đã phân lập vi

khuẩn Clostridium botulinum type E những bệnh nhân. Đây là ổ dịch đầu tiên

42

của bệnh ngộ độc botulin được ghi nhận ở Ai Cập và là dịch do type E lớn

nhất từng được báo cáo.

Giữa năm 1943, ngộ độc vết thương lần đầu tiên được công nhận và báo

cáo tại Hoa Kỳ. Năm 1990, 47 phòng thí nghiệm đã tiếp nhận các trường hợp

tổn thương liên quan đến vết thương. Tại Cộng hòa Georgia, theo các ghi chép

tóm tắt của bệnh nhân bị ngộ độc botulism từ năm 1980 đến năm 2002 thì có

879 trường hợp bị ngộ độc đã được phát hiện. Tám mươi phần trăm các trường

hợp các bệnh nhân ăn phải rau được bảo quản tại nhà, các trường hợp còn lại

là do ăn xúc xích và thịt lợn xông khói. Georgia được báo cáo là có ngộ độc

thực phẩm cao nhất trên thế giới. Ở Vương quốc Anh, sáu mươi hai trường

hợp ngộ độc đã xảy ra từ năm 1922 đến năm 2005. (McLauchlin và ctv, 2006).

Ở Thái Lan, vụ ngộ độc lớn nhất từ trước đến nay xảy ra miền bắc nước

này vào ngày 14 tháng ba năm 2006 làm 209 người ngộ độc sau ăn măng tây.

Các triệu chứng lâm sàng điển hình là đau bụng, buồn nôn và nôn mửa, tiêu

chảy, nuốt khó hoặc loạn vận ngôn, song thị, suy nhược tổng quát, bí tiểu và

suy hô hấp (Kongsaengdao và ctv, 2006).

Gao và ctv, 1990 ghi nhận ở Trung Quốc vào những năm 1989 cho thấy

đã xuất hiện ngộ độc do các type khác nhau của vi khuẩn C. botulinum. Trong

745 vụ ngộ độc bùng phát được ghi nhận, có đến 421 ca tử vong trong số

2.861 ca ngộ độc (chiếm tỷ lệ 14,7%). Nguyên nhân các vụ ngộ độc trên là do

tất các type của vi khuẩn C. botulinum (ngoại trừ type G). Các đặc điểm dịch

tễ chính và sự phân bố của các type ở Miền Bắc và Nam Trung Quốc.

2.7.3 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn C. botulinum ở Việt Nam

Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới, mỗi năm Việt Nam có khoảng 8

triệu người (chiếm gần 1/10 tổng dân số) bị ngộ độc thực phẩm hoặc ngộ độc

có liên quan đến thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm do nhiều nguyên nhân gây ra,

trong đó do vi sinh vật gây ra trên 50% các vụ ngộ độc thực phẩm. Còn về ngộ

độc do nhiễm độc tố của vi khuẩn Clostridium botulinum thì chưa có số liệu

thống kê cụ thể (Trần Linh Thước, 2010).

Nghiên cứu về botulin hiện có rất ít tại Việt Nam. Điển hình có nghiên

cứu về vi khuẩn vi khuẩn C. botulinum.

43

Đầu tiên là nghiên cứu của Nguyễn Đức Hiền (2012) trên mẫu ruột vịt và

bùn tại nơi chăn nuôi có vịt bệnh liệt mềm cổ. Tỷ lệ mẫu nhiễm vi khuẩn C.

botulinum: trên ruột vịt là 14,77% (52/252) và bùn là 25,71% (27/105). Khi

khảo sát tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh thì cho kết quả: 100%

vi khuẩn nhạy cảm với ceftiofur, fosformycin và cephalexin và tất cả đều đề

kháng với ampicillin.

Tiếp theo là nghiên cứu của Nguyễn Đức Hiền và Phạm Mạnh Hùng

(2012) về độc tố từ vi khuẩn C. botulinum phân lập được từ mẫu ruột vịt và

bùn, được tiến hành trên vịt và chuột thí nghiệm tại thành phố Cần Thơ. Ghi

nhận kết quả: Với liều 1ml dịch nổi ly tâm canh khuẩn pha loãng 1/10 gây

chết 100% chuột thí nghiệm sau khi tiêm vào xoang bụng, trong khi tất cả

chuột được tiêm bởi dịch này sau xử lý nhiệt vẫn bình thường. Khi tiêm dịch

nổi qua đường tĩnh mạch với liều 5ml/vịt gây chết 70% (7/10) và 10ml/vịt gây

chết 100% (10/10) vịt thí nghiệm. cùng với đó là triệu chứng lâm sàng chủ yếu

được ghi nhận: vịt ủ rũ, kém vận động (100%), liệt chân, cổ và mí mắt (80%).

Vịt chết không có bệnh tích đặc trưng, ở một số vịt chết có bệnh tích xuất

huyết tim (15%) và phổi (10%).

2.8 Một số đặc điểm sinh học của vịt đẻ

2.8.1 Nguồn gốc, đặc điểm của vịt

Vịt là tên gọi phổ thông cho một số loài thuộc họ vịt (Anatidae), bộ

ngỗng (Anseriformes). Các loài này được chia thành một số phân họ trong

toàn bộ các phân họ thuộc họ Anatidae (Phùng Đức Tiến, 2013). Vịt là loài

chim nước, thuộc loại thủy cầm có nguồn gốc từ vịt trời (Anas platyrhynchos),

sống được ở cả vùng nước ngọt lẫn nước mặn, có kích thước nhỏ hơn so với

những loài khác trong họ là ngan, ngỗng và thiên nga.

Vịt cỏ là một trong những giống vịt nuôi lâu đời nhất và phổ biến nhất ở

nước ta. Vịt cỏ có nguồn gốc từ vịt trời được thuần hoá tự nhiên. Nuôi vịt cỏ

để lấy trứng và kết hợp lấy thịt theo thời vụ (vịt chạy đồng). Vịt cỏ có nhiều

màu lông khác nhau, con mái có màu lông chủ yếu là cánh sẻ, ngoài ra còn có

màu xám, lông trắng đen, trắng tuyền. Con trống lông ở cổ có màu xanh đen,

màu vàng xanh. Vịt cỏ tầm vóc nhỏ bé, bắt đầu đẻ trứng sau 140 ngày tuổi, vịt

trống nặng 1,5 – 1,7kg, vịt mái nặng 1,4 – 1,5kg. Sản lượng trứng 200 – 225

44

quả/mái/năm. Trứng nhỏ, khối lượng 64-65 gr/quả.Trứng có tỷ lệ phôi cao

(Phùng Đức Tiến, 2013).

2.8.2 Đặc điểm tiêu hóa, hấp thu thức ăn của vịt

Bộ máy tiêu hóa của vịt có những cấu tạo đặc trưng phù hợp với chức

năng lấy thức ăn, tiêu hóa thức ăn thô và cứng. Thức ăn cần thiết cho những

hoạt động sống, sinh trưởng, sinh sản được tiêu hóa và hấp thụ qua bộ máy

tiêu hóa gồm: miệng, diều, dạ dày tuyến, dạ dày cơ, ruột non, ruột già, tuyến

tụy, túi mật và ống mật (Bùi Xuân Mến, 2014).

Miệng: Vịt không có răng nên dùng mỏ để lấy thức ăn. Mỏ vịt dẹt và dài,

bên trong có các mẫu nhỏ để lọc và giữ thức ăn. Mỏ cấu tạo bởi lớp sừng,

trong có nhiều sợi thần kinh bao bọc. Dây thần kinh còn ở trên vòm miệng

cứng và dưới lớp sừng biểu bì của lưỡi.

Lưỡi vịt ở đáy khoang miệng, toàn bộ mặt dưới được phủ bởi một lớp

biểu mô hình vảy, xếp thành lớp hướng vào trong cổ họng để làm chức năng

chuyển thức ăn xuống thực quản. Vịt dùng mỏ để lấy thức ăn và nuốt nhờ lưỡi

chuyển động nhanh, thức ăn xuống lưỡi được đẩy nhanh xuống thực quản. Vịt

có đặc điểm vừa ăn, vừa uống nước để làm ướt và trơn thức ăn giúp cho quá

trình nuốt được dễ dàng. Mặt trong thực quản phủ lớp cơ dày, gấp nếp, trong

đó có các tuyến tiết chất nhầy để bôi trơn thức ăn.

Diều: Là bộ phận phình to của phần cuối thực quản. Diều ở vị trí tiếp

giáp giữa ngực và cổ, nằm phía ngoài xoang ngực. Diều được gắn với lớp da

cổ và ngực, có tính đàn hồi lớn giúp cho thức ăn giữ lại đó dễ dàng. Thức ăn

được giữ lại diều không lâu, tùy thuộc vào loại thức ăn. Diều không có tuyến

tiết dịch nhầy.

Sự co bóp của diều thực hiện ngay sau khi thức ăn xuống diều. Độ pH

của diều khoảng 4,5-6,0. Nhịp và đợt co bóp của diều phụ thuộc vào lượng

thức ăn trong diều. Điều hòa sự co bóp của diều do dây thần kinh phế vị và

thần kinh phó giao cảm.

Dạ dày tuyến: Dạ dày tuyến nằm ở giữa diều và dạ dày cơ, dạ dày tuyến

tiết ra dịch và men tiêu hóa sơ bộ. Cơ vòng của dạ dày tuyến phát triển mạnh và

chắc. Thức ăn không được giữ lâu ở dạ dày tuyến mà được thấm dịch chứa men

45

pepsin rồi chuyển xuốn dạ dày cơ. Các dây thần kinh phế vị, dây thần kinh giao

cảm và hệ thần kinh trung ương điều khiển sự chế tiết dịch ở dạ dày tuyến.

Dạ dày cơ: Tập trung một số lượng lớn của cơ, phía trong phủ một lớp

màng nhày rất dày, có tác dụng chống lại sự ăn mòn của dịch tiêu hóa và khi

dạ dày co bóp nghiền nhỏ thức ăn thì sỏi, sạn không làm tổn thương dạ dày cơ.

Màng nhầy dạ dày cơ có cấu tạo gồm 2 lớp tế bào biểu bì phủ lớp màng và

một lớp nhầy với mô liên kết chặc phía dưới gồm nhiều tuyến hình ống tiết ra

dịch nhầy thấm ướt thức ăn trong khi co bóp nghiền nhỏ thức ăn. Hệ thần kinh

thực vật chi phối hoạt động của dạ dày cơ.

Ruột non: Đoạn trên của ruột non liền với dạ dày cơ. Bên trong của

khoang ruột non là tuyến dịch tiêu hóa và lớp nhung mao nằm khắp bề mặt

trong của ruột non. Thành ruột được cấu tạo bởi 2 lớp cơ: cơ vòng và cơ dọc.

Có hai dạng nhu động ruột - nhu động thuận và nhu động ngược nhờ hệ cơ

vòng và cơ dọc. Có ba tác dụng chủ yếu là: đảo trộn, tiêu hóa và hấp thu thức

ăn.Điều hòa hoạt động của ruột là hệ thần kinh đám rối mặt trời, dây thần kinh

phế vị và hormones tuyến thượng thận.

Ruột già: Ruột già bao gồm manh tràng và trực tràng. Manh tràng là 2

ống tận cùng tịt – chúng bắt đầu từ điểm gặp nhau giữa ruột non và ruột già,

phần tiếp theo là trực tràng và cuối cùng ra lổ huyệt.

Tuyến tụy: Ba thùy của tuyến tụy nằm giũa đoạn cong của tá tràng, ống

tụy đổ vào đoạn cuối của tá tràng có chức năng phân giải lipit thành glycerin

và axit béo.

Túi mật và ống mật: Ống dẫn mật bắt đầu từ thành phải của gan mang túi

mật. Ống dẫn của gan lưu dịch mật từ thành trái tới ống dãn mật. Ống dẫn mật

đi dọc theo tá tràng cùngống dẫn tụy. Dịch mật được đẩy vào tá tràng do sự co

bóp của túi mật.

Do bộ máy tiêu hóa của vịt nói riêng và gia cầm nói chung là khác với

các loài động vật khác nên khả năng tiêu hóa của vịt rất tốt. Vịt là loại động

vật có sức chống chịu đặc biệt với bệnh tật, đồng thời cũng là cái máy sử dụng

côn trùng, ốc, cua... có hiệu quả nhất. Vịt có thể tìm kiếm thức ăn trên cạn,

dưới nước rất tốt, chuyển hóa những loại côn trùng và vi sinh vật thành những

chất dinh dưỡng phục vụ cho sự phát triển và sản xuất.

46

2.8.3 Nuôi vịt đẻ

Trong tháng đầu khi vịt đang đẻ, cần theo dõi và loại thải những vịt

không đẻ bằng cách chỉ chọn những mái có đầu hơi nhỏ, mỏ dài rộng, cổ dài,

lông mướt, thân dài và bụng hơi sệ. Mắt sáng, tiếng kêu to và thanh. Khi chăn

thả vịt đẻ, cần chọn những khu đồng có nhiều thức ăn, đặc biệt có nhiều mồi,

có nước sạch để vịt tắm rửa và phối giống (nếu lấy trứng ấp). Đến chiều lùa

vịt về cho ăn gần chuồng và cho vịt tắm rỉa lông, nhưng đến sụp tối mới cho

vô chuồng. Chuồng vịt đẻ cần làm ở những nơi khô ráo có sân mở ra ao nước

sạch và lối lên xuống dễ dàng. Trong chuồng bố trí đèn thắp đủ sáng vào đầu

buổi tối. Có máng nước sạch cho vịt uống ban đêm, bố trí các ổ đẻ bên trong

lót chất độn khô sạch để vịt đẻ trứng không bị dơ. Cuối kỳ đẻ vịt thường hay

đẻ trễ vì thế không nên chăn thả vịt quá sớm sẽ làm vịt đẻ ở ngoài, mất trứng.

Trong thời gian vịt đẻ cần chăm sóc cẩn thận, hết sức tránh các stress chăn thả

ở những nơi thiếu thức ăn hoặc trong những khu vực có tình trạng ô nhiễm.

Vịt nuôi chăn thả ở Đồng bằng sông Cửu Long có thể cho đẻ liên tục hoặc

theo đợt đẻ trong năm. Do vậy, người nuôi vịt có thể cho vịt thay lông, hoặc cho

đẻ vào thời gian nào có lợi. Một số phương pháp thay lông vịt gồm có thay lông

chuyền bằng cách để cho vịt tự thay lông mà không cần tác động gì, phương

pháp này áp dụng cho những đàn nhỏ nuôi sau nhà lấy trứng ăn quanh năm.

Thay lông cưỡng bức bằng hình thức bỏ vịt đói 1 ngày sau lùa xuống bãi sình

đã rãi thức ăn, vịt đói tranh ăn làm lông dính bếch sình, rồi là lên nhốt vài ngày

vịt tự rỉa lông và bứt lông, sau mới cho tắm. Cũng có thể cho vịt nhịn ăn, ngày

hôm sau bắt vịt nhổ lông cánh và lông đuôi và sau đó để vịt tự thay lông. Cho

vịt ăn lại khẩu phần vịt đẻ sau khi thay lông 1 tháng (Bùi Xuân Mến, 2014).

2.8.4 Những điều lưu ý khi nuôi vịt đẻ

Ở Đồng bằng sông Cửu Long vịt thường đẻ một năm ba vụ, mỗi vụ đẻ

liền hai tháng rưỡi đến 3 tháng, sau mỗi vụ vịt ngừng đẻ và thay lông. Trong 3

vụ đẻ đó vụ đẻ thứ hai thường đẻ nhiều trứng nhất, trứng có chất lượng tốt; tỷ

lệ đẻ đạt 90 – 95%, có khi 100%.

Người chăn vịt có kinh nghiệm thường đi theo đàn vịt bằng chiếc thuyền

con, chiếc thuyền này có thể vác lên vai một cách nhẹ nhàng, do đó mà có thể

theo đàn vịt qua sông, hồ được. Người chăn vịt phải biết là vịt kiếm được

47

nhiều mồi hay ít mồi ngoài đồng để rồi cho vịt ăn thêm nhiều hay ít khi vịt về

chuồng. Ví dụ: Khi thấy vịt mò mải miết, đó là đồng nhiều mồi, ngược lại khi

thấy vịt chạy nhiều, đó là đồng ít mồi… Hoặc là vịt ăn no đủ thì đẻ nhiều,

ngược lại vịt đẻ ít là thiếu ăn; phải chú ý đến số lượng và chất lượng thức ăn

cần bổ sung cho vịt hàng ngày.

Tuyệt đối tránh không làm cho vịt sợ hãi. Lùa vịt đẻ từ ruộng này sang

ruộng khác phải nhẹ nhàng, từ từ để cho vịt đi một cách tự nhiên. Vịt đang đẻ

cần chú ý đừng để chúng phải leo dốc có thể bị đẻ non hoặc ngừng đẻ. Trong

khi đi chăn vịt, đi hết diện tích này đến diện tích khác (phải qua nhiều sông

ngòi, ao, hồ, đầm, kênh…), nếu người chăn nuôi không có kinh nghiệm để vịt

sa vào một nơi không có mồi (nước phèn mặn) thì sẽ làm giảm đẻ.

Vịt mái đẻ không thích những nơi ồn ào, không ưa những nơi đất đầy

bùn, đất quá khô, quá dốc. Vịt không thích sự có mặt của những người lạ và

nhất là chó, vì nếu bị chó rượt đuổi thì ngày hôm sau đó sản lượng trứng sẽ bị

giảm ngay. Đặc điểm của vịt, nhất là vịt mái đẻ, có “phản ứng stress” rất nhạy

bén, nên những gì làm cho vịt hoảng sợ, hoặc làm thay đổi điều kiện sống, đều

có ảnh hưởng xấu đến tỷ lệ đẻ ngay

Ban đêm nếu người chăn nuôi ra thăm nơi nhốt vịt thì phải hết sức cẩn

thận, đêm nào cũng chỉ nên làm đúng những cử chỉ thật cần thiết để cho vịt

quen. Bóng người lạ, tiếng động lạ đều làm cho vịt kêu “thất thanh” làm cho

vịt nhảy loạn xạ, chất đống lên nhau ở một góc chuồng, chúng có thể bị

thương hoặc đè lên nhau mà chết, một số lớn vịt ngày hôm sau sẽ ngừng đẻ.

Có nơi người ta thắp một ngọn đèn để giữa chuồng và chi riêng người chăn vụ

được đi vào khi nhặt trứng, không cho người lạ vào. Buổi trưa phải cho vịt ở

chỗ mát để nghỉ ngơi, nhất là ở bên hồ nước trong sạch, có bóng cây mát (Bùi

Xuân Mến, 2014).

48

Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 10 năm 2013 đến tháng 10 năm 2017

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

3.1.2.1 Địa điểm thu thập mẫu

Mẫu được thu thập tại 3 tỉnh và 1 thành phố của vùng Đồng bằng sông

Cửu Long (ĐBSCL) bao gồm tỉnh An Giang, Hậu Giang, Kiên Giang và thành

phố Cần Thơ.

3.1.2.2 Phân tích mẫu và nuôi chuột thí nghiệm

Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn và thử độc tố trên chuột tại phòng thí

nghiệm Thú y chuyên ngành 3, Bộ môn Thú Y, Khoa Nông nghiệp, Trường

Đại học Cần Thơ

3.1.2.3 Thí nghiệm trên thực địa

Thử nghiệm độc tố của vi khuẩn C. botulinum trên vịt đẻ được thực hiện

tại Công ty TNHH Một thành viên chăn nuôi Vemedim, xã Thới Thạnh, huyện

Thới Lai, Thành phố Cần Thơ.

3.2 Trang thiết bị dụng cụ và hóa chất

Dụng cụ và thiết bị

- Ống đong, ống hút, lame, kính hiển vi, kẹp, dao, kéo, que cấy, găng tay,

đèn cồn, giấy lau kính, tăm bông vô trùng, túi nilong, thùng đá, bình yếm khí,

túi dùng để tạo môi trường yếm khí (Anaerocult C), ống nghiệm Vial,

micropipet, eppendorf, lồng nuôi chuột, chuồng nuôi vịt và dụng cụ chăn nuôi

chuyên biệt cần thiết trong chăn nuôi động vật thí nghiệm.

- Tủ ấm, tủ ấm CO2, tủ sấy, tủ lạnh, autoclave, water bath,

Hóa chất và môi trường

- Cồn 96o, cồn 70o, nước cất, dầu cedar, Crystal violet, Lugol, Safranine,

Bromocresole purple, Gelatin Phosphat Buffer… (Merck, Đức).

- Kháng sinh: sử dụng các loại kháng sinh amikacin, ampicillin,

amoxicillin, ceftiofur, cephalexin, doxycycline, florfenicol, fosfomycin,

marbofloxacin, norfloxacin (Oxoid, Anh).

- Ống chuẩn Mac Farland 0, 5 và 3 (Biorad)

49

- Môi trường

Môi trường NB: Nutrient broth (Merck, Đức)

Môi trường TSA: Tryptis Soy Agar (Merck, Đức)

Môi trường CMM: Cooked Meat Media (Oxoid, Anh)

Môi trường EYA: Egg Yorlk Agar (Merck, Đức)

Môi trường Thioglycollate (MERCK, Đức).

Môi trường SFP Agar Base (Difco, Mỹ).

Môi trường MHA: Mueller Hinton Agar (Merck, Đức)

Các loại đường: Lactose, glucose, maltose, saccarose (Merck, Đức)

Bộ phản ứng sinh hóa API 20A (Biorad)

Máu cừu (công ty Nam Khoa- TP HCM)

Môi trường TPGY broth: 5% Trypticase, 0.5% Pepton, 0.4% Glucose,

2% Yeast extract, 0.1% Sodium thioglycolate

Môi trường CMM (Cooked Meat Medium) (Oxoid, Anh)

Serum Institut, Đan Mạch)

Kháng độc tố dạng lỏng (antitoxins) type C, D, E (10UI/ml) (Statens

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Nội dung 1: Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng (VCĐ) ở

Đồng bằng sông Cửu Long.

3.3.1.1 Mục tiêu

Đánh giá tần suất lưu hành bệnh botulism trên đàn vịt chạy đồng của

Đồng bằng sông Cửu Long.

3.3.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Vịt chạy đồng mắc bệnh botuism được nuôi dưỡng tại Đồng bằng sông

Cửu Long. Đối tượng nghiên cứu có đặc điểm sau:

Vịt bệnh botulism được chia theo mục đích nuôi bao gồm vịt thịt và vịt

đẻ. Vịt thịt được nuôi thả đồng từ 4 – 12 tuần tuổi, đến tuần thứ 12, người dân

bắt đầu tuyển chọn những con vịt mái đủ tiêu chuẩn để tiếp tục nuôi dưỡng

kéo dài trong nhiều năm theo hướng khai thác trứng, những con vịt còn lại thì

được bán thịt. Như vậy, vịt đẻ sẽ bắt đầu tính tuổi sau 24 tuần tuổi (240 – 255

ngày) vịt sẽ rớt trứng đầu tiên.

50

3.3.1.3 Phương pháp nghiên cứu

a. Tình hình chăn nuôi VCĐ ở ĐBSCL

Điều tra hồi cứu tình hình chăn nuôi vịt chạy đồng tại Phòng thống kê

của Chi cục Thú y ở 4 địa điểm thu thập mẫu. Tại đây, nhóm nghiên cứu sẽ

thu thập thông tin về điều kiện tự nhiên cũng như tổng đàn VCĐ của từng tỉnh,

ghi nhận những thuận lợi và bất lợi về điều kiện tự nhiên trong chăn nuôi vịt

theo phương thức chạy đồng từ năm 2012 – 2014.

b. Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng (VCĐ) ở Đồng bằng

sông Cửu Long

- Điều tra cắt ngang và tiến cứu về tình hình bệnh botilism trên VCĐ tại 4

địa điểm thu thập mẫu.

- Cỡ mẫu nghiên cứu: Phân bố mẫu mỗi tỉnh cần khảo sát được trình bày

Bảng 3.1 Phân bố mẫu khảo sát tại 4 địa điểm lấy mẫu

Vịt thịt (con)

Vịt đẻ (con)

Địa điểm

Tỉnh An Giang

20.000

25.800

Thành phố Cần Thơ

19.000

28.700

Tỉnh Hậu Giang

18.000

25.350

Tỉnh Kiên Giang

22.000

31.200

Tổng

79.000

108.505

trong Bảng 3.1.

Xác định tình hình bệnh botulism trên vi khuẩn C. botulinum trên vịt

chạy đồng ở ĐBSCL được tiến hành theo các bước sau

Bước 1: Điều tra

Trong quá trình điều tra và thu mẫu trên từng địa bàn luôn hợp tác với

thú y địa phương để biết tình hình đàn VCĐ ở địa bàn quản lý, hỏi chủ nuôi về

tình hình sức khỏe của đàn vịt đồng thời quan sát trạng thái thần kinh cũng

như quá trình vận động của vịt. Nếu đàn vịt có xuất hiện các triệu chứng của

bệnh botulism như xù lông, giảm ăn, yếu chân, liệt mềm cổ, liệt mí mắt, liệt

cánh, liệt chân thì tiến hành lập phiếu điều tra (Phụ lục 1), đồng thời thương

lượng mua mẫu vịt bệnh để nghiên cứu.

Bước 2: Lấy mẫu

Mẫu bệnh phẩm được lấy trên vịt bệnh còn sống hoặc vừa chết. (1) Trên

vịt bệnh còn sống, lấy khoảng 5-10 ml máu từ tỉnh mạch cổ, trữ trong ống

51

nghiệm vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ từ 4-6oC trong vòng 8 giờ, chắt lấy

huyết thanh và trữ huyết thanh ở -80oC; Sau đó, mổ khảo sát bệnh tích đại thể

của nội quan, thu bệnh phẩm là chất chứa trong ống tiêu hóa bằng cách khóa

kín đoạn hầu và đoạn giáp với hậu môn bằng kẹp nhựa, cắt lấy ống tiêu hóa,

giữ trong túi vô trùng, bảo quản lạnh và phân tích tại phòng thí nghiệm. (2)

trường hợp vịt vừa chết thì tiến hành mổ kháo sát và lấy mẫu giống như trên.

Hình 3.1 Vịt bị liệt mềm cổ

Mỗi đàn vịt lấy từ 1-5 bệnh phẩm.

3.3.1.4 Chỉ tiêu theo dõi

+ Tỷ lệ bệnh botulism trên VCĐ ở ĐBSCL.

+ Tần suất xuất hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh botulism.

+ Tần suất xuất hiện bệnh tích của bệnh botulism.

3.3.2 Nội dung 2

Phân lập vi khuẩn C. botulinum và xác định độc tố botulin trên VCĐ

mắc bệnh botulism

3.3.2.1 Mục tiêu: Xác định sự hiện diện vi khuẩn C. botulinum và xác

định type độc lực của botulin trên VCĐ.

3.3.2.2 Đối tượng nghiên cứu

Huyết thanh và bệnh phẩm của VCĐ bệnh botulism ở nội dung 1.

52

3.3.2.3 Phương pháp tiến hành

a. Phân lập vi khuẩn C. botulinum trên bệnh phẩm của vịt bệnh theo

MiiaLindstrom and Hannu Korkeala (2006) và qui trình có cải tiến

Phân lập vi khuẩn C. botulinum trên bệnh phẩm của vịt bệnh theo

Lindstrom and Korkeala (2006) và qui trình có cải tiến được trình bày trong

Mẫu (chất chứa trong ruột, gan)

Cấy trực tiếp lên môi trường thạch máu và SFP

Ủ yếm khí ở 370C/24h

Chọn khuẩn lạc điển hình

Ủ yếm khí ở 370C/24h

Nhuộm Gram (trực khuẩn, Gr+, có nha bào, thuần)

Cấy thuần (các khuẩn lạc đồng nhất)

Kiểm tra đặc tính sinh hóa bằng API 20A

Ủ yếm khí ở 370C/24-48h

Xác định vk Clostridium botulinum và giữ giống trong CMM/ thioglycolate

Hình 3.2 Sơ đồ qui trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum

(Lindstrom and Korkeala, 2006) và qui trình có cải tiến

Hình 3.2.

Bệnh phẩm ruột, gan, được lấy vô trùng và cấy trực tiếp trên thạch máu và thạch SFP, sau đó đem ủ trong tủ ấm kỵ khí ở 37oC trong 24 giờ. Trên môi

trường thạch máu, khuẩn lạc của vi khuẩn C. botulinum không tròn đều, khô,

53

dẹt hoặc hình dạng không ổn định. Trên môi trường SFP khuẩn lạc C.

botulinum có màu đen, nhỏ, tròn đều, chọn khuẩn lạc điển hình nêu trên

nhuộm Gram để xem hình dạng, cách bắt màu, dạng nha bào, độ thuần nhất

của vi khuẩn. Sau đó, kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn bằng bộ sinh

hóa API 20A. Phân lập vi khuẩn C. botulinum trên bệnh phẩm của vịt bệnh

theo Lindstrom and Korkeala (2006) và qui trình có cải tiến được trình bày

Hình 3.3 Khuẩn lạc của vi khuẩn

Hình 3.4 Khuẩn lạc của vi khuẩn

C. botulinum trên thạch máu

C. botulinum trên môi trường SFP

Hình 3.5 Hình ảnh nha bào của vi khuẩn C. botulinum dưới KHV (X 100)

trong Hình 3.3.

54

b. Kiểm tra đặc tính sinh hóa bằng bộ API 20A (theo hướng dẫn của

nhà sản xuất)

Chuẩn bị canh khuẩn

 C. botulinum được nuôi cấy trên môi trường thạch máu và ủ yếm khí

trong 18 – 24 giờ.

 Khuẩn lạc C. botulinum được cho vào dung dịch NaCl 9‰ và so độ

đục với ống McFarland 3 để tạo thành huyễn dịch vi khuẩn.

Chuẩn bị test kit API 20A

 Cho 5 ml nước cất vô trùng vào các giếng tổ ong (honeycomb) của

khay để tạo độ ẩm không khí.

 Ghi số bệnh phẩm trên khay; đặt thanh API 20A vào khay nước.

 Cho huyễn dịch vi khuẩn vào các giếng, tránh tạo thành bọt khí và

nghiêng thanh nhẹ nhàng về phía trước.

- Với test GEL, phủ đầy cả ống và phần hình chén.

- Với test IND, chỉ phủ đầy giếng với môi trường API 20A và làm đầy

phần hình chén với dầu khoáng để ngăn cản sự bốc hơi.

 Ủ thanh API 20A trong trong tủ ấm CO2 ở 36oC ± 2oC trong 24 giờ, sau

đó đọc kết quả. Kết quả được thể hiện trên Bảng 3.2.

Hình 3.6 Đặc tính sinh hóa theo API 20A của vi khuẩn C. botulinum

Bảng 3.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. botulinum trong bộ API 20A

55

c. Xác định độc tố botulin của vi khuẩn C. botulinum

Xác định độc tố botulin của vi khuẩn C. botulinum trong huyết thanh của

VCĐ bệnh botulism theo quy trình của Cook et al. (1998), được trình bày

trong Hình 3.7.

- Chuẩn bị huyết thanh: Huyết thanh được rả đông, lọc qua màng lọc

0,45µm và thu dịch lọc vô trùng.

- Chuẩn bị động vật thí nghiệm: chuột SPF có nguồn gốc từ viện

Pasteur thành phố Hồ Chí Minh, tiếp tục nuôi 3 ngày để thích nghi với môi

trường sống trước khi tiến hành thí nghiệm.

- Bố trí thí nghiệm

- Chuột được chia làm 3 lô thí nghiệm bao gồm I, lI và đối chứng, mỗi

chuồng nuôi 2 con được phân biệt bằng cách dùng bút lông đánh dấu trên

lưng, trên nắp chuồng đều có đánh code mẫu và 2 con chuột cùng chuồng

được tiêm vào xoang bụng mẫu huyết thanh của 1 con vịt đã lấy mẫu ở trên.

Thí nghiệm I: Tiêm huyết thanh qua lọc, nhưng không xử lý nhiệt.

Thí nghiệm II: Tiêm huyết thanh qua lọc, qua xử lý nhiệt 100oC trong

vòng 10 phút để bất hoạt độc tố (nếu có).

Thí nghiệm III: Tiêm nước muối sinh lý 0,9%. Bố trí thí nghiệm được

Bảng 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm

Số lượng (con)

Liều (ml/con)

Thí nghiệm I

400

0,5

Thí nghiệm II

400

0,5

Đối chứng

20

0,5

trình bày trong Bảng 3.3.

Dịch lọc huyết thanh được kiểm tra không có sự hiện diện của vi khuẩn

bằng cách cáy trên môi trường thạch máu và môi trường SFP, ủ trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí ở 37oC trong 24 giờ. Mẫu huyết thanh được sử dụng

trong thí nghiệm phải đảm bảo vô trùng.

56

Cách đọc kết quả

Nếu chuột thí nghiệm I xuất hiện các triệu chứng liệt chân, liệt mí mắt,

xù lông, thở bụng hoặc chết, đồng thời chuột ở thí nghiệm II và III khỏe mạnh

và không biểu hiện bệnh lý thì kết luận trong mẫu huyết thanh có độc tố

botulin.

d. Định type độc tố botulin

Huyết thanh được xác định có mang độc tố ở thí nghiệm trên được chọn

ra để định type độc tố. Mỗi mẫu huyết thanh qua lọc được chia ra làm 3 phần

bằng nhau, thử lần lượt với 3 loại kháng độc tố type C, D và E theo tỷ lệ 1:1,

mỗi loại hỗn hợp huyết thanh và kháng độc tố tiêm cho 2 con chuột. Kháng

độc tố chuẩn được pha với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/100 trước khi tiến hành thí

nghiệm. Bố trí chuột thí nghiệm định type độc tố botulin được trình bày trong

Bảng 3.4.

Số mẫu TN type C

TN type D

TN type E

TN đối chứng

Liều tiêm/con

(con)

(con)

(con)

(con)

(ml)

1

2

2

2

2

1

TN: Thí nghiệm

TN type C: Tiêm huyết thanh + kháng độc tố type C; TN type D: Tiêm huyết thanh + kháng độc tố

type D; TN type E: Tiêm huyết thanh + kháng độc tố type E; Để yên hỗn hợp trên ở nhiệt độ phòng

30-60 phút (CDC, 1998; TN đối chứng (không có kháng độc tố): Tiêm nước muối sinh lý 0,9%.

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm Định type độc tố botulin

Cách đọc kết quả

Sau 7 ngày nếu chuột ở thí nghiệm nào còn khỏe mạnh bình thường thì

kết luận huyết thanh đã mang type độc tố tương ứng; nghĩa là độc tố trong

huyết thanh đã bị trung hòa bởi kháng độc tố tương ứng thêm vào.

Chuột ở thí nghiệm đối chứng: luôn luôn khỏe mạnh và không có biểu

hiện khác thường. Phương pháp xác định type độc tố botulin trong huyết thanh

vịt theo CDC (1998) được trình bày trong Hình 3.7.

57

Hình 3.7 Kháng độc tố chuẩn

Phân lập vi khuẩn C. botulinum và xác định độc tố botulin trên huyết

thanh VCĐ mắc bệnh botulism được tóm tắt trong Hình 3.8.

58

Mẫu huyết thanh của vịt (liệt và mềm cổ)

Lọc (màng lọc 0,45 µm), chia làm 2 phần bằng nhau

9(qua lưới lọc

Dịch bệnh phẩm

Không xử lý nhiệt

Xử lý nhiệt 1000C/10 phút

Lô I dịch bệnh phẩm tiêm vào xoang bụng của chuột bạch 0,5 ml/con (2 con/ mẫu)

Lô II dịch bệnh phẩm tiêm vào xoang bụng của chuột bạch 0,5 ml/con (2 con/ mẫu)

Giai đoạn 1

Chuột bình thường

Chuột chết hoặc biểu hiện bất thường

Độc tố botulin trong dịch bệnh phẩm bị phá hủy bởi nhiệt

Mổ khám, ghi nhận triệu chứng bất thường và kiểm tra độ vô trùng của dịch qua lọc.

Dương tính (hay mẫu huyết thanh của vịt có chứa độc tố)

Những mẫu huyết thanh dương tính ở thí nghiệm 1, lọc qua màng lọc 0,45 µm, chia làm 3 phần bằng nhau để thử nghiệm với kháng độc tố.

Huyết thanh + KĐT type C

Huyết thanh + KĐT type D

Huyết thanh + KĐT type E

Giai đoạn 2

Tiêm xoang bụng cho 2 con chuột (1ml/con)

Tiêm xoang bụng cho 2 con chuột (1ml/con)

Tiêm xoang bụng cho 2 con chuột (1ml/con)

Chuột bình thường

Chuột bình thường

Chuột bình thường

Bệnh phẩm có chứa độc tố C. botulinum type C

Bệnh phẩm có chứa độc tố C. botulinum type D

Bệnh phẩm có chứa độc tố C. botulinum type E

Hình 3.8 Sơ đồ xác định type độc tố botulin trong huyết thanh vịt (CDC, 1998)

59

3.3.2.4 Chỉ tiêu theo dỏi

- Tỷ lệ hiện diện vi khuẩn trong bệnh phẩm.

- Tỷ lệ huyết thanh có độc tố.

- Tỷ lệ lưu hành của các type độc tố.

- Tần suất xuất hiện các triệu chứng lâm sàng đặc trưng trên chuột bị

nhiểm độc tố botulin.

- Tần suất xuất hiện bệnh tích đại thể trên chuột bị nhiểm độc tố botulin

3.3.3 Nội dung 3

Xác định các các yếu tố nguy cơ gây bệnh botulism trên VCĐ ở ĐBSCL.

3.3.3.1 Mục tiêu

Đánh giá sự lưu hành của vi khuẩn C. botulinum trên môi trường chăn

nuôi VCĐ ở ĐBSCL

3.3.3.2 Đối tượng nghiên cứu: môi trường chăn nuôi: đất, nước, cua, ốc

3.3.3.3 Phương pháp thực hiện

a. Thu thập mẫu

Song song với việc lấy mẫu VCĐ bệnh botulism thì mẫu ở môi trường

nuôi có đàn vịt bệnh cũng được thu thập bao gồm đất, nước, cua, ốc. Cỡ mẫu

được phân bố trong bảng 3.5

Địa điểm

Bùn đất (mẫu) Nước (mẫu) Cua (mẫu)

Ốc (mẫu)

Tổng

An Giang

159

63

106

645

159

Cần Thơ

141

42

94

563

141

Hậu Giang

144

50

96

582

144

Kiên Giang

156

61

104

646

156

Tổng cộng

600

216

400

2.436

600

Bảng 3.5 Phân bố mẫu trên môi trường nuôi

Mẫu đất và nước, số lượng mẫu cần lấy là 3 mẫu. Đất ngập nước lấy mẫu

ở độ sâu 5 – 10cm. Mỗi mẫu có khối lượng khoảng 25 – 30g. Mẫu nước lấy

khoảng 50 – 100ml bằng lọ vô trùng.

60

Mẫu cua, ốc: lấy 2 – 3 mẫu cua, ốc. Trữ lọ vô trùng, chọn những cua, ốc

mới chết hoặc cua nhỏ, ốc nhỏ còn sống (vịt có thể nuốt được). Tất cả mẫu

được bảo quản lạnh (Franciosa et al., 1996).

b. Phân lập vi khuẩn C. botulinum từ đất, nước, cua, ốc

Phương pháp thực hiện được tiến hành như mô tả phân lập vi khuẩn

Mẫu (Đất, nước, cua, ốc)

Cấy trực tiếp lên môi trường thạch máu và SFP

Ủ yếm khí ở 37oC/24h

Chọn khuẩn lạc điển hình

Ủ yếm khí ở 370C/24h

Nhuộm Gram (trực khuẩn, Gr+, có nha bào, thuần)

Cấy thuần (các khuẩn lạc đồng nhất)

Kiểm tra đặc tính sinh hóa bằng API 20A

Ủ yếm khí ở 370C/24-48h

Xác định vk Clostridium botulinum và giữ giống trong CMM/ thioglycolate

Hình 3.9 Sơ đồ qui trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum trên môi

trường nuôi (Lindstrom and Korkeala (2006) và qui trình có cải tiến)

C. botulinum ở mục 3.3.2.3 và được trình bày tóm tắt theo sơ đồ trong Hình 3.9.

3.3.3.4 Chỉ tiêu theo dõi

- Tỷ lệ hiện diện vi khuẩn trong mẫu đất và nước ruộng.

- Tỷ lệ hiện diện vi khuẩn trong mẫu cua, ốc.

61

3.3.4 Nội dung 4

Tính gây bệnh của vi khuẩn C. botulinum phân lập được trên vịt bệnh.

3.3.4.1 Mục tiêu: Xác định khả năng gây bệnh của các chủng C. botulinum

phân lập được

3.3.4.2 Đối tượng nghiên cứu: Các chủng C. botulinum phân lập được.

3.3.4.3 Phương pháp tiến hành

a. Kiểm tra độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn C. botulinum

Sử dụng phương pháp kháng sinh đồ dựa trên sự khuếch tán của kháng

sinh trên thạch đĩa của Kirby-Bauer (Bauer et al., 1966). Đánh giá mức độ

nhạy cảm kháng sinh dựa trên đường kính vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn theo

Clinical and Laboratory Standards Institute (2019) của nhóm trực khuẩn

đường ruột.

- Phương pháp thực hiện kháng sinh đồ: Chuẩn bị canh trùng của vi khuẩn Clostridium botulinum thuần sao cho đạt nồng độ 108 CFU/ml (bằng

cách so độ đục với ống chuẩn Mc Farland 0,5). Dùng que tăm bông vô trùng

nhúng vào canh trùng, ép vào thành ống nghiệm cho bớt nước rồi ria đều khắp

Bảng 3.6 Tiêu chuẩn đường kính vòng vô khuẩn của một số loại kháng sinh (CLSI, 2019)

Đường kính vòng vô khuẩn (mm)

Hàm lượng

STT Loại kháng sinh

(μg)

Nhạy Mẫn cảm trung bình

Kháng

1 Amikacin

30

≥ 17

15-16

≤ 14

2 Ampicillin

10

≥ 17

14-16

≤ 13

3 Amoxicillin

25

≥ 18

14-17

≤ 13

4 Ceftiofur

30

≥ 21

18-20

≤ 17

5 Cephalexin

30

≥ 18

15-17

≤ 14

6 Doxycycline

30

≥13

10-12

≤9

7 Florfenicol

30

≥19

15-18

≤14

8 Fosformycin

200

≥16

13-15

≤12

9 Marbofloxacin

5

≥18

16-17

≤15

10 Norfloxacin

10

≥17

13-16

≤12

mặt thạch MHA.

62

Dùng kẹp vô trùng đặt các đĩa kháng sinh đã chọn lên mặt thạch, các đĩa

kháng sinh cách nhau 2,5-3,5cm và cách rìa đĩa thạch 2cm. Đĩa được ủ trong tủ ấm CO2 ở nhiệt độ 37oC, sau 24 giờ đọc kết quả. Đường kính vòng vô

khuẩn của các kháng sinh thử nghiệm được đo và đối chiếu với bảng tiêu

chuẩn để đánh giá. Tiêu chuẩn đường kính vòng vô khuẩn của một số loại

kháng sinh theo CLSI (2019) được trình bày trong Bảng 3.6.

b. Thử nghiệm độc tố botulin trên vịt

- Chuẩn bị canh khuẩn chứa độc tố botulin

Các chủng C. botulinum có khả năng gây chết chuột thí nghiệm trong nội

dung 1, được tăng sinh trong môi trường TPGY broth. Ủ yếm khí canh khuẩn ở 37oC trong 24 giờ, sau đó cấy vào các ống chứa môi trường CMM và ủ tiếp ở 37oC trong 5 ngày trong điều kiện yếm khí để vi khuẩn sản sinh độc tố.

Sau khi ủ 5 ngày đem ly tâm canh khuẩn ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 5oC và lấy nước trong lọc qua màng lọc 0,45 µm thu được độc

tố botulin để gây bệnh thực nghiệm (Cook et al., 1998).

Quy trình chuẩn bị canh khuẩn chứa độc tố botulin theo Cook et al.

Chọn vài khuẩn lạc của Clostridium botulinum trên môi trường TSA (khuẩn lạc của các mẫu đã được giám định khả năng gây chết chuột thí nghiệm

Cấy

Môi trường TPGY broth

Ủ yếm khí canh khuẩn ở 37oC/24giờ

(1998) được trình bày trong Hình 3.10.

Ủ yếm khí 37oC/5 ngày

Môi trường CMM (Cooked Meat Medium)

Ly tâm ở 12.000 vòng/phút, 15 phút/5oC

Lấy 10 ml huyễn dịch CMM

Thu phần nước trong và lọc qua màng lọc 0,45 µm

Hình 3.10 Sơ đồ quy trình chuẩn bị canh khuẩn chứa độc tố botulin

Dung dịch mẫu có chứa độc tố botulin

63

- Thí nghiệm xác định LD50 (liều gây chết 50% vịt)

Dịch có chứa độc tố được chuẩn bị theo Hình sơ đồ 3.4 ở trên.

Thí nghiệm với 3 mẫu dịch có chứa độc tố trên 90 vịt để xác định liều

LD50 qua hai đường tiêm và uống, mỗi đường cấp là một ô chuồng thử

nghiệm. Những vịt trong cùng một ô được phân biệt nhau bằng cách dùng sơn

xịt vào lông trên lưng và cánh vịt và buộc dây rút, trong đó:

Lô I là thử nghiệm độc tố C. botulinum qua đường uống với liều 3ml, 5ml,

7 ml, 10 ml. Mỗi nồng độ được tiến hành với 3 con vịt trên 1 mẫu canh khuẩn.

Lô II là thử nghiệm độc tố C. botulinum qua đường tiêm tĩnh mạch cánh

với các liều 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml được tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch

cánh vịt. Mỗi nồng độ được tiến hành với 3 con vịt trên 1 mẫu canh khuẩn. Bố

Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm để xác định liều LD50 của độc tố botulin

Đường cấp

Thí nghiệm

Đường tiêm tĩnh mạch

Đường uống

1

2

3

4

5

6

3

5

7

10

Liều (ml)

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

Số mẫu canh khuẩn thí nghiệm

9

9

9

9

9

9

9

9

9

9

Số vịt thí nghiệm

trí thí nghiệm thử độc tố botulin trên vịt được trình bày trong Bảng 3.7

Xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm của từng mẫu canh

khuẩn và lấy giá trị trung bình.

Công thức xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm theo Reed và

Muench (1938).

x (b-a) + a LD50 = -

A: Tỉ lệ phần trăm (%) chết sát trên 50%.

B: Tỉ lệ phần trăm (%) chết sát dưới 50%.

a: Nồng độ pha loãng tại A

b: Nồng độ pha loãng tại B

64

Chuẩn bị vịt thí nghiệm

Vịt khỏe mạnh: Vịt cò khỏe mạnh được chọn từ đàn vịt hậu bị của Công

ty chăn nuôi Vemedim được đưa vào chuồng thí nghiệm theo bố trí thí

nghiệm. Vịt có tầm vóc nhỏ, lông mướt, mắt tinh anh, nhanh nhẹn. Chuồng

trại và môi trường nuôi đảm bảo điều kiện tốt nhất cho vịt sinh sống và phát

triển. Trước khi thực hiện thí nghiệm, vịt được đưa vào ô chuồng thí nghiệm

ổn định 2 ngày cho quên với điều kiện chuồng.

Tiêm truyền độc tố botulin cho vịt

Vi khuẩn C. botulinum nuôi cấy và xử lý giống như Sơ đồ 3.4. Độc tố

được tiêm vào tĩnh mạch cánh của vịt với liều thí nghiệm, mỗi mẫu tiêm cho 2

con vịt, tiếp tục chăm sóc, nuôi dưỡng và theo dõi tình trạng sức khỏe của vịt

Hình 3.11 Tiêm độc tố cho vịt qua đường tĩnh mạch cánh

trong 7 ngày.

Khảo sát triệu chứng

Vịt thí nghiệm sau khi được tiêm hoặc cho uống độc tố botulin được

quan sát, ghi nhận tình trạng sức khỏe thông qua việc quan sát biểu hiện lâm

sàng. Nhưng thông tin này được ghi chép vào phiếu theo dõi từng cá thể 3

lần/ngày (6 giờ, 12 giờ, 18 giờ sau tiêm hoặc uống đến khi vịt chết).

65

Ghi nhận các biểu hiện bên ngoài của vịt như: tình trạng đi đứng, hoạt

động, bộ lông, tiếng kêu, phản ứng khi bị dồn đuổi, tình hình ăn uống, quan

sát nhịp thở, tình trạng phân, tình trạng bơi lội.

Khảo sát bệnh tích

Vịt thí nghiệm được mổ khám khi sắp chết hoặc vừa chết, quan sát và

ghi vào biên bản mổ khám để tìm dấu hiệu bệnh tích trên từng hệ thống như

thần kinh (não), hô hấp (khí quản, phổi), tuần hoàn (tim), tiêu hóa (thực quản,

dạ dày tuyến, dạ dày cơ, ruột non, ruột già, hậu môn), da, cơ, mô liên kết, mô

lympho và các cơ quan nội tạng khác như gan, lách, thận. Chụp hình bệnh tích

điển hình của bệnh do nhiễm độc tố botulin ở vịt để làm tài liệu.

3.3.4.4 Chỉ tiêu theo dõi

- Tỷ lệ vịt chết trong 7 ngày sau gây độc.

- Tần suất xuất hiện triệu chứng lâm sàng đặc trưng của vi khuẩn C.

botulinum bệnh botulism.

- Tần suất xuất hiện bệnh tích trên nội tạng.

3.4 Xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê phân tích và sử dụng

phần mềm Excel (Chi-quare Yates và Fixer’s), Minitab 16.0.

66

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng (VCĐ) Đồng bằng

sông Cửu Long (ĐBSCL)

4.1.1 Điều kiện tự nhiên của các tỉnh An Giang, Hậu Giang, Kiên

Giang và thành phố Cần Thơ

An Giang là tỉnh có dân số đông nhất đồng bằng sông Cửu Long, thuộc

miền Nam Việt Nam. Một phần của An Giang nằm trong tứ giác Long Xuyên.

Đây là tỉnh có dân số đông nhất khu vực Đồng bằng sông Cửu Long. An

Giang có diện tích 3536,7km², đứng thứ 4 trong khu vực đồng bằng sông cửu

long về diện tích sau tỉnh Kiên Giang, tỉnh Cà Mau và tỉnh Long An, phía

đông và phía bắc giáp tỉnh Đồng Tháp, phía tây Bắc giáp Campuchia, phía

nam và Tây Nam giáp tỉnh Kiên Giang, phía đông nam giáp thành phố Cần

Thơ. Tỉnh An Giang gồm 9 quận, một thị xã và một thành phố. An Giang có

37 loại đất khác nhau, hình thành 6 nhóm đất chính, trong đó chủ yếu là nhóm

đất phù sa trên 151.600ha, chiếm 44,5%. Phần lớn đất đai đều màu mỡ vì 72%

diện tích là đất phù sa hoặc có phù sa, địa hình bằng phẳng, thích nghi đối với

nhiều loại cây trồng.

An Giang nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, trong năm có 2

mùa rõ rệt gồm mùa mưa và mùa khô. Nhiệt độ trung bình hàng năm khoảng 27oC, lượng mưa trung bình năm khoảng 1.130mm. Độ ẩm trung bình 75 –

80%, khí hậu cơ bản thuận lợi cho phát triển nông nghiệp.

67

Hình 4.1 Bản đồ các tỉnh ĐBSCL

Khác với An Giang, Hậu Giang là tỉnh nằm ở phần cuối Đồng bằng châu

thổ sông Cửu Long, địa hình thấp, độ cao trung bình dưới 2 mét so với mực

nước biển. Địa hình thấp dần từ Bắc xuống Nam và từ Đông sang Tây. Khu

vực ven sông Hậu cao nhất, trung bình khoảng 1 – 1,5 mét, độ cao thấp dần về

phía Tây. Bề mặt địa hình bị chia cắt mạnh bởi hệ thống kênh rạch nhân tạo.

Hậu Giang có 5 huyện, 1 thị xã và 1 thành phố. Tính đến năm 2011, dân số

toàn tỉnh Hậu Giang đạt gần 769.200 người, mật độ dân số đạt 480 người/km².

Hậu Giang có nhiều dân tộc khác nhau cư trú trên địa bàn tỉnh, trong đó nhiều

nhất là đồng bào dân tộc Khmer, dân tộc Hoa…

Tương tự như An Giang, tỉnh Hậu Giang nằm trong vòng đai Bắc bán

cầu, gần xích đạo, có khí hậu nhiệt đới gió mùa, chia thành hai mùa rõ rệt.

Mùa mưa có gió Tây Nam từ tháng 5 đến tháng 11, mùa khô có gió Đông Bắc từ tháng 12 đến tháng 4 hàng năm. Nhiệt độ trung bình là 27oC không có sự chênh lệch quá lớn qua các năm. Tháng có nhiệt độ cao nhất (35oC) là tháng 4 và thấp nhất vào tháng 12 (20,3oC). Mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11 hàng

68

năm, chiếm từ 92 – 97% lượng mưa cả năm. Lượng mưa ở Hậu Giang thuộc

loại trung bình, khoảng 1800 mm/năm, lượng mưa cao nhất vào khoảng tháng

9 (250,1mm). Ẩm độ tương đối trung bình trong năm phân hoá theo mùa một

cách rõ rệt, chênh lệch độ ẩm trung bình giữa tháng ẩm nhất và tháng ít ẩm

nhất khoảng 11%. Độ ẩm trung bình thấp nhất vào khoảng tháng 3 và 4 (77%)

và giá trị độ ẩm trung bình trong năm là 82%. Tỉnh Hậu Giang có một hệ

thống sông ngòi kênh rạch chằng chịt, mật độ sông rạch khá lớn. Hậu Giang

nằm trong vùng trũng của khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long.

Với điều kiện tự nhiên đặc biệt, Kiên Giang là một tỉnh ven biển thuộc

Đồng bằng sông Cửu Long. Trung tâm tỉnh là thành phố Rạch Giá. Kiên

Giang tiếp giáp Campuchia ở phía Bắc và vịnh Thái Lan ở phía Tây. Ngoài ra,

Kiên Giang có hơn 100 đảo lớn nhỏ ngoài biển. Kiên Giang có vị trí chiến

lược quan trọng, nằm trong vùng vịnh Thái Lan, gần với các nước thuộc Đông

Nam Á như Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Singapore. Kiên Giang có đủ các

dạng địa hình từ đồng bằng, núi rừng và biển đảo. Trong đó, phần đất liền có

địa hình tương đối bằng phẳng, thấp dần từ Đông Bắc xuống Tây Nam. Kiên

Giang có 4 vùng đất đai chính là vùng phù sa ngọt thuộc tây sông Hậu, vùng

phèn ngập lũ thuộc tứ giác Long Xuyên, vùng nhiễm mặn thuộc bán đảo Cà

Mau và vùng đồi núi, hải đảo ở hai huyện Phú Quốc và Kiên Hải.

Do nằm ở vĩ độ thấp và giáp biển nên Kiên Giang có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm nhiệt độ trung bình hàng tháng từ 27 – 27,5oC.

Kiên Giang không chịu ảnh hưởng trực tiếp của bão nhưng lượng nước mưa

do bão chiếm một tỷ trọng đáng kể, nhất là vào cuối mùa mưa. Mùa mưa bắt

đầu từ tháng 4 đến tháng 11, mùa khô từ tháng 12 đến tháng 3 năm sau. Lượng

mưa trung bình hàng năm khoảng 1.600 – 2.000mm ở đất liền và 2.400 –

2.800mm ở vùng đảo Phú Quốc. Khí hậu Kiên Giang rất ít thiên tai, không rét,

không có bão đổ bộ trực tiếp, ánh sáng và nhiệt lượng dồi dào, nên rất thuận

lợi cho nhiều loại cây trồng và vật nuôi sinh trưởng.

Đặc biệt, khác với ba tỉnh nêu trên thì thành phố Cần Thơ nằm trong

vùng trung – hạ lưu và ở vị trí trung tâm châu thổ Đồng bằng sông Cửu Long.

Phía Bắc giáp tỉnh An Giang; phía Đông giáp tỉnh Đồng Tháp và tỉnh Vĩnh

Long; phía Tây giáp tỉnh Kiên Giang; phía Nam giáp tỉnh Hậu Giang. Đơn vị

69

hành chính của thành phố gồm 5 quận (Ninh Kiều, Cái Răng, Bình Thủy, Ô

Môn, Thốt Nốt) và 4 huyện (Phong Điền, Cờ Đỏ, Vĩnh Thạnh, Thới Lai). Cần

Thơ nằm ở khu vực bồi tụ phù sa nhiều năm của sông Mê Kông, có địa hình

rất đặc trưng cho dạng địa hình đồng bằng. Nơi đây có hệ thống sông ngòi,

kênh rạch chằng chịt. Trong đó: Sông Hậu là con sông lớn nhất với tổng chiều

dài chảy qua thành phố là 65km, sông Cái Lớn dài 20km, sông Cần Thơ dài

16km, đổ ra sông Hậu tại bến Ninh Kiều, nước ngọt suốt hai mùa mưa nắng,

tạo điều kiện cho nhà nông làm thuỷ lợi và cải tạo đất. Cần Thơ có nguồn tài

nguyên đất đai màu mỡ, nhất là khu vực phù sa ngọt được bồi đắp thường

xuyên, thích hợp cho canh tác lúa, cây hoa màu, cây lương thực, cây công

nghiệp ngắn ngày, cây ăn quả đặc sản nhiệt đới, tạo điều kiện thuận lợi để Cần

Thơ phát triển nông nghiệp theo hướng toàn diện.

Cần Thơ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới – gió mùa, ít bão, quanh

năm nóng ẩm, không có mùa lạnh. Mùa mưa kéo dài từ tháng 5 đến tháng 11,

mùa khô từ tháng 12 tới tháng 4 năm sau. Nhiệt độ trung bình năm khoảng

28ºC. Độ ẩm trung bình năm: 82% – 87% (thay đổi theo các năm).

4.1.2 Tình hình chăn nuôi VCĐ ở ĐBSCL

Nuôi vịt chạy đồng (VCĐ) là nghề từ lâu đã gắn chặt với cuộc sống của

dân Vùng đồng bằng sông Cửu Long, là phương thức chăn nuôi du canh.

Trong mùa thu hoạch lúa, đàn vịt được lùa từ đồng lúa này sang đồng lúa khác

vừa mới thu hoạch, chúng ăn vét những hột lúa rụng và những động vật sống ở

đồng ruộng như cua, ốc,... Nhờ vậy mà người nuôi không tốn hoặc tốn rất ít

thức ăn cho vịt, giúp nhiều hộ tiết kiệm đáng kể chi phí mua thức ăn, từ đó

tăng thêm lợi nhuận. Giống vịt được chuộng nuôi chạy đồng phổ biến là vịt

tàu (vịt cỏ), là loại vịt nhỏ con, đầu nhỏ, mỏ khỏe mạnh, cổ dài, chân vàng

thấp, nhanh nhẹn, khả năng kiếm mồi tốt và vừa cho thịt, vừa cho trứng.

Chúng chống chịu tốt với điều kiện chăn thả ngoài đồng, có khả năng kháng

nhiều bệnh, tăng trưởng tốt. Giống này lông nhiều màu sắc, nuôi từ 140 đến

150 ngày thì đẻ, mỗi năm đẻ từ 180 đến 220 trứng/con. Thịt vịt nuôi chạy

đồng luôn bán giá cao hơn vịt nuôi công nghiệp vì thịt ngon thơm. Trứng có

nhiều lòng đỏ nên rất được người tiêu dùng ưa chuộng, nhất là được các cơ sở

sản xuất trứng vịt muối luôn chọn mua để làm nguyên liệu xuất khẩu. Thông

70

qua điều tra hồi cứu tình hình chăn nuôi VCĐ ở 4 địa điểm nghiên cứu từ năm

2012 đến 2014 cho thấy số lượng VCĐ của 4 địa phương này rất lớn và được

trình bày trong Bảng 4.1.

phố Cần Thơ (20112 –20114)

Năm 2012

Năm 2013

Năm 2014

Tỉnh/thành

Số lượng

Tỷ lệ

Số lượng

Tỷ lệ

Số lượng

Tỷ lệ

(con)

(%)

(con)

(%)

(con)

(%)

An Giang

3.047.000

30,37 3.125.300

31,46

3.351.850

32,64

Cần Thơ

1.250.000

12,46 1.273.400

12,82

1.191.383

11,59

Hậu Giang

2.626.000

26,17 2.429.200

24,46

2.562.760

24,96

Kiên Giang

3.111.000

31,00 3.105.200

31,26

3.164.530

30,81

Tổng cộng

10.034.000 100,00 9.933.100

100,00 10.269.523

100,00

Bảng 4.1 Số lượng VCĐ nuôi tại tỉnh An Giang, Hậu Giang, Kiên Giang và thành

Bảng 4.1 cho thấy tổng đàn vịt ở tỉnh An Giang và Kiên Giang cao hơn

hai địa phương còn lại. Bởi lẽ, 2 tỉnh này có tổng diện tích trồng lúa lớn nhất

ĐBSCL, đặc biệt tỉnh Kiên Giang với diện tích trồng lúa là 168.782 ha và hiện

đang là tỉnh dẫn đầu cả nước về sản lượng lúa, chiếm 10,10% sản lượng lúa cả

nước và 17,90% sản lượng lúa ĐBSCL (Ủy ban Nhân dân tỉnh Kiên Giang).

Theo tập quán chăn nuôi VCĐ của người dân, nơi nào có đồng lúa nhiều thì

đàn vịt sẽ tập trung ở đấy nhiều, vì vậy số lượng VCĐ ở Kiên Giang, An

Giang chiếm tỷ lệ cao. Trong khi đó, thành phố Cần Thơ là trung tâm của

Đồng bằng sông Cửu Long, dân cư ngày càng tập trung đông đúc, không thích

hợp cho việc chăn nuôi vịt chạy đồng. Qua số liệu thống kê từ 2012 đến 2014

cho ta thấy số lượng vịt nuôi trên địa bàn thành phố Cần Thơ và tỉnh Hậu

Giang đang có chiều hướng giảm nhẹ qua các năm là do từ năm 1997, dịch

cúm H5N1 bắt đầu lan rộng, nhiều đàn vịt bị tiêu hủy đã làm ảnh hưởng rất

lớn đến tình hình phát triển đàn vịt nuôi của toàn khu vực ĐBSCL.

Bên cạnh đó, nuôi vịt chạy đồng càng trở nên khó khăn hơn, do phải di

chuyển đồng xa, trả tiền thuê đồng (trước đây không có), phải thông qua chính

quyền địa phương để kiểm soát sự an toàn của đàn vịt từ nơi khác đến. Trong

tình hình dịch bệnh, người nuôi không thể biết trước cánh đồng nào có dịch

71

bệnh, nhiều nguy cơ rình rập, và việc bị bắt giữ, tiêu hủy do “di chuyển trái

phép từ nơi khác đến”. Mặt khác, đàn vịt dễ suy giảm sức khỏe khi di chuyển

xa, đến cánh đồng mới – môi trường mới dẫn đến stress, sức đề kháng giảm đễ

bị nhiễm bệnh nên một số nông dân bỏ nghề nuôi vịt chạy đồng vì những

Hình 4.2 Vịt chạy đồng

thách thức trên.

4.1.3 Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng ở (ĐBSCL)

Bệnh botulism trên vịt chạy đồng ở Đồng bằng sông Cửu Long được

Bảng 4.2 Tỷ lệ vịt bệnh botulism tại Đồng bằng sông Cửu Long

Vịt bệnh botulism

Số khảo sát

Địa điểm

Số đàn

(con)

Số lượng (con)

Tỷ lệ (%)

An Giang

53

558

45.800

1,22

Cần Thơ

47

497

44.700

1,11

Hậu Giang

48

547

43.350

trình bày trong Bảng 4.2

1,26

Kiên Giang

52

633

53.200

1,19

Tổng

200

187.050

2.235

1,19

72

Bảng 4.2 thể hiện, VCĐ mắc bệnh botulism xuất hiện trên cả 4 tỉnh trong

nghiên cứu. Botulism là bệnh do botulin của vi khuẩn C. botulinum gây ra.

Bệnh xảy ra trên toàn thế giới và đã được xác định ở ít nhất 117 loài chim

hoang dã, đại diện cho 22 họ, bệnh phổ biến nhất ở là loài thủy cầm với tỷ lệ

tử vong cao. Vi khuẩn C. botulinum gặp điều kiện sống bất lợi bào tử của

chúng sẽ chuyển sang dạng nghỉ và có thể tồn tại ở dạng này trong thời gian

khoảng 30 năm hoặc hơn; Khi gặp được điều kiện thuận lợi chúng lại phát

triển bình thường và có khả năng sinh nhiều loại độc tố nhưng quan trọng nhất

là độc tố thần kinh. Trong số đó, độc tố C và D gây độc trên thủy cầm; đối với

độc tố C, sự tăng trưởng tối ưu xảy ra trong khoảng từ 25°C đến 40°C. Vi

khuẩn C. botulinum phân bố khắp nơi trong tự nhiên như xác động thực vật,

trong đất, đặc biệt ở đất bùn trầm tích, đầm lầy, đất nuôi gia súc gia cầm ngập

nước (Abdul-Aziz, 2018). Đồng bằng sông Cửu Long với đặc điểm địa hình

và khí hậu thuận lợi cho vi khuẩn C. botulinum tồn tài và phát triển. Tại khu

vực này, mùa khô bắt đầu từ cuối tháng 11 đến tháng 4 năm sau và vụ lúa

đông xuân gieo sạ vào tháng 11 – 12, gặt vào tháng 2 – 3. Điều này cho thấy

vụ lúa mùa và vụ đông xuân rơi vào mùa khô, mùa này lượng nước ở những

hồ ao, ruộng đồng nơi chăn thả vịt xuống thấp, kết hợp với nhiệt độ tăng tạo

điều kiện cho xác động thực vật phân hủy và thối rữa nhanh hơn, là môi

trường tốt cho Clostridium botulinum phát triển. Phương thức chăn nuôi thủy

cầm phổ biến Vùng ĐBSCL là nuôi vịt chạy đồng, đây là hình thức nuôi

truyền thống mang lại nguồn thu nhập cao cho người dân, vì vậy tổng đàn

VCĐ ở đây chiếm 70% đàn thủy cầm của ĐBSCL và 52% trên cả nước (FAO,

2015). Đến mùa thu hoạch lúa, người dân lùa vịt từ cánh đồng này sang cánh

đồng khác, vịt được thả tìm thức ăn suốt ngày ngoài ruộng, đến tối vịt được

nhốt giữ trong chồi tạm bợ ở bờ kinh. Thế nên, vịt chạy đồng mắc bệnh

botulism là điều tất yếu khách quan. Qua điều tra cho thấy, tỷ lệ bệnh botulism

trên VCĐ ở tỉnh Hậu Giang cao nhất (1,26%). Tuy nhiên, tỷ lệ vịt bệnh của 4

tỉnh khảo sát khác nhau không có ý nghĩa thống kê với p>0,05. Điều này có

thể kết luận rằng vịt chạy đồng tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long có khả

năng mắc phải bệnh bitulism do vi khuẩn C. botulinum, gây ra triệu chứng liệt

cổ, liệt mi mắt, liệt cánh và liệt chân mà người dân địa phương gọi là bệnh

cúm cần.

73

Hình 4.3 Vịt chạy đồng bị liệt mềm cổ

4.1.4 Tình hình vịt bệnh botulism theo mục đích nuôi

Tỷ lệ bệnh botulism trên vịt đẻ và vịt thịt được trình bày trong Bảng 4.3.

Mục đích nuôi

SL khảo sát (con)

SL bệnh (con)

Tỷ lệ (%)

0,91a

Vịt thịt

99.676

905

1,52b

Vịt đẻ

87.374

1.330

1,19

Tổng

187.050

2.235

SL : Số lượng

Bảng 4.3 Tỷ lệ bệnh botulism trên vịt đẻ và vịt thịt

Bảng 4.3 thể hiện tỷ lệ vịt đẻ mắc bệnh botulism (1,52%) cao hơn vịt thịt

(0,91%). Vịt thịt được nuôi thả đồng từ 4-18 tuần tuổi, đến tuần thứ 18 (bán

thịt) người dân bắt đầu tuyển chọn vịt đẻ từ những bầy vịt thit này nuôi kéo

dài trong nhiều năm để khai thác trứng.

Trong kỹ thuật nuôi vịt chạy đồng, vịt sẽ được thả ra đồng để tự tìm thức

ăn tự nhiên sau khi đã bắt đầu biết ăn lúa, vịt sục mỏ vào lớp trầm tích, bùn đất

dưới đáy ao, ruộng để tìm mồi nên cơ hội tiếp xúc với mầm bệnh rất nhiều. Vịt

74

nuôi đến khoảng 24 tháng là bắt đầu đẻ trứng, vịt đẻ có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn

vịt thịt là vì vịt đẻ có thời gian nuôi dài, có cơ hội tiếp xúc với mầm bệnh

nhiều hơn nên khả năng chúng bị ngộ độc và chết khi ăn phải thức ăn nhiễm

độc cao hơn. Hơn nữa, vịt ngộ độc botulin, sau khi được điều trị khỏi bệnh

không có miễn dịch (Haagsma, 1987). Kết quả nghiên cứu này khá phù hợp

với nhận định của Boroff and Reilly (1959), Gross and Smith (1971).

Ngoài ra, chăn nuôi vịt chạy đồng cũng tiềm ẩn nguy cơ dịch bệnh vì vịt

có thể tiếp xúc với nhiều mầm bệnh trong tự nhiên trong đó có độc tố botulin

của vi khuẩn C. botulinum. Friend (1999) cho rằng C. botulinum là nguyên

nhân gây bệnh quan trọng của loài di chim cư trên thế giới, trong đó C.

botulinum type C là nguyên nhân gây chết ở loài thủy cầm sục mỏ vào bùn đất

tìm thức ăn. Ngoài ra khi chạy đồng, vịt cũng có nguy cơ ăn phải xác cá chết

có thể chứa độc tố C. botulinum type E hoặc type C (Smith, 1987) hoặc vịt thả

đồng cũng có điều kiện ăn giòi từ xác động vật phân huỷ có chứa độc tố C.

botulinum type C. Những cánh đồng chăn thả vịt – nơi lấy mẫu chủ yếu là

ruộng lúa vừa được cắt lúa xong, cho nước vào và chăn thả vịt. Những vịt bị

chứng liệt mềm cổ xảy ra thường xuyên trong năm, trong đó tập trung vào lúc

giao mùa giữa mùa khô và mùa mưa từ tháng 5-tháng 10 hàng năm với thời

tiết nóng ẩm. Kết quả này phù hợp với khảo sát của Rocke and Bollinger

(2007), tác giả cho rằng bệnh xảy ra nhiều vào những tháng có thời tiết nóng

hơn là thời tiết lạnh trong năm. Thêm vào đó, nghiên cứu của Friend (1973),

tại Hoa Kỳ và Canada tác giả cũng cho rằng bệnh C. botulinum type C xảy ra

chủ yếu từ tháng nóng.

4.1.5 Triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh botulism trên VCĐ

Độc tố botulin là độc tố protein tự nhiên với độc lực khá mạnh, với lượng

ước tính khoảng 30 – 100ng đủ để gây ngộ độc trên gia cầm. Chúng là những

chất độc thần kinh có ái lực với tế bào thần kinh vận động. Sau khi hấp thụ,

độc tố liên kết với màng trước thần kinh của các đầu dây thần kinh

cholinergic. Độc tố xâm nhập vào tế bào và ngăn chặn sự giải phóng

acetylcholine qua các mối nối thần kinh cơ, dẫn đến tê liệt và cuối cùng chết

do suy tim và suy hô hấp (Burgen et al.,1949). Tần suất xuất hiện các triệu

chứng lâm sàng trên VCĐ mắc bệnh botulism được trình bày trong Bảng 4.4.

75

Bảng 4.4 Tần suất xuất hiện triệu chứng lâm sàng trên vịt bệnh botulism (n=2.235)

Triệu chứng

Số lượng (con)

Tỷ lệ (%)

Giảm ăn, ủ rũ, Xù lông, kém vận động

1.532

68,55

Liệt cổ

1.965

87,92

Liệt mí mắt, đồng tử dãn

2.013

90,07

Liệt chân

1.783

79,78

Tiêu chảy phân trắng- xanh

1.098

49,13

Tiêu chảy máu

768

34,36

Bảng 4.4 thể hiện triệu chứng liệt cổ, liệt mí mắt đồng tử dãn và liệt chân

xuất hiện ở tần suất khá cao lần lượt là 87,92%, 90,07%, 79,78%. Tác giả Shin

et al. (2010) đã mô tả về một trận dịch ngộ độc botulin trên vịt và chim hoang

dã ở Australia, qua khảo sát 2.000 trường hợp vịt ngộ độc gần như 100% xuất

hiện triệu chứng liệt cổ, liệt mí mắt. Tác giả cho rằng độc tố botulin phá hủy

thần kinh trung ương, gây ức chế các dây thần kinh cơ, thần kinh cơ vận động

trong đó có cả cơ miệng, cơ mắt làm cho vịt từ yếu chân giảm vận động đến

bại liệt, cơ cổ, cơ mắt bị mềm. Triệu chứng giảm ăn, xù lông, yếu chân, kém

vận động chiếm tỷ lệ 68,55%. Yếu chân hoặc tê liệt có thể là dấu hiệu duy

nhất trong nhiễm độc nhẹ hoặc bệnh ở giai đoạn đầu (Abdul-Aziz, 2018).

Triệu chứng trên hệ tiêu hóa gây tiêu chảy phân trắng – xanh, và tiêu chảy

máu xuất hiện với tỷ lệ lần lượt 49,13% và 34,36%. Kết quả nghiên cứu này

khá phù hợp với nhận định của Shin (2010), tác giả cho rằng, triệu chứng tiêu

chảy máu và vài con có chất nhày chảy ra từ miệng chiếm 48,1% trong vịt mắc

bệnh botulism.

4.1.6 Bệnh tích đại thể trên vịt bệnh botulism

Độc tố của vi khuẩn C. botulinum có độc lực mạnh; khi vịt ăn phải độc tố

có sẵn trong thức ăn hoặc ở môi trường sống của chúng hoặc ăn phải độc tố

vừa tiết ra ở đường tiêu hóa và các mô do vi khuẩn mới xâm nhập. Khi vào dạ

dày độc tố không bị dịch vị phá hủy cho nên chúng ngấm nhanh vào máu và

phân tán khắp cơ thể, vào các tế bào của các mô khác nhau, trước hết vào tế

bào của hệ thần kinh trung ương rồi gây ra những biểu hiện lâm sàng phát sinh

từ hành tủy. Thời kỳ ủ bệnh từ 6 – 8 giờ vịt có thể chết đột ngột và ít xuất hiện

76

bệnh tích. Trường hợp thời gian ủ bệnh dài hơn (8 – 10 ngày) bệnh tích xuất

Bảng 4.5 Tần suất xuất hiện bệnh tích đại thể trên vịt bệnh botulism

Bệnh tích

Số lượng (con)

Tỷ lệ (%)

Phổi phù - xuất huyết

362

hiện ở nội quan khá phổ biến.

86,19

Gan xuất huyết

401

95,48

Thận xuất huyết

57

13,57

Lách sưng - xuất huyết

40

9,52

Ruột sinh hơi, trống thức ăn

387

92,14

Bảng 4.5 cho thấy, bệnh tích gan, phổi xuất huyết chiếm tỷ lệ cao lần

lượt là 95,48%, 86,19%, bệnh tích ruột sinh hơi cũng chiếm tỷ lệ khá cao

92,14%. Kết quả này khá phù hợp với kết quả nghiên cứu của Jensen and

Duncan (1980), tác giả nghiên cứu về độc tố botulin ở thuỷ cầm hoang dã đã

gây nhiễm cho vịt trời bằng độc tố botulin thì thấy hầu hết các trường hợp vịt

chết bởi ngộ độc botulin là do liệt hô hấp, xuất huyết phổi, gan, phù phổi.

4.2 Phân lập vi khuẩn C. botulinum và xác định độc tố botulin trên

VCĐ mắc bệnh botulism

4.2.1 Phân lập vi khuẩn C. botulinum trên bệnh phẩm của vịt bệnh

botulism

Kết quả phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum từ bệnh phẩm là gan

và phân vịt bệnh botulism trong nội dung 1 được trình bày ở Bảng 4.6.

Kết quả Bảng 4.6 cho thấy tỷ lệ hiện diện vi khuẩn C. botulinum trên

mẫu phân vịt bệnh chiếm tỷ lệ 50,72%. Kết quả này phù hợp với kết quả

nghiên cứu của Dolor (2013), tác giả nghiên cứu về sự tồn tại của vi khuẩn C.

botulinum trong đường tiêu hóa trên thủy cầm với kết quả là vi khuẩn C.

botulinum hiện diện ở đường tiêu hóa dưới như manh tràng và ruột già (14/26

Bảng 4.6 Tỷ lệ vi khuẩn C. botulinum hiện diện trên bệnh phẩm của vịt bệnh botulism

mẫu, chiếm 54%).

77

Loại mẫu

Phân

Gan

Địa điểm

SL DT

SLPL

Tỷ lệ

SLPL

SL DT

Tỷ lệ

(mẫu)

(mẫu)

(%)

(mẫu)

(mẫu)

(%)

An Giang

52

28

53

26

53,05

49,06

Cần Thơ

49

21

42,86

49

42,86

21

Hậu Giang

50

27

54,00

50

38,00

19

Kiên Giang

58

30

51,72

59

42,37

25

91

Tổng

209

106

116

43.13

50.72

SLPL: Số lượng phân lập, SLDT: Số lượng dương tính

Thêm vào đó, một số nghiên cứu khác từ giữa những năm 1978-2008,

tại các vùng đất ngập nước của Mancha Húmeda thuộc miền Trung Tây Ban

Nha đã ghi nhận sự bùng phát của 13 vụ ngộ độc botulin làm chết của khoảng

20.000 con chim từ hơn 50 loài, bao gồm cả vịt đầu trắng (Oxyura

leucoceophala) gây nguy cơ tuyệt chủng trên toàn cầu. Các nghiên cứu cho

thấy, có 75 mẫu ruột của vịt đã chết hiện diện của vi khuẩn C. botulinum

chiếm 38,7% (Vidal et al., 2013). Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm loại vi khuẩn này

trên ruột và trên gan (43,13%) khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P>0,05).

Có lẽ, do điều kiện tự nhiên về khí hậu, nhiệt độ của bốn địa phương trong

nghiên cứu không có sự khác biệt lớn. Hơn nữa, khi vịt bệnh bị nhiễm vi

khuẩn C. botulinum trong đường ruột thì vi khuẩn này có thể đến gan vì gan là

cơ quan duy nhất trong cơ thể cùng một lúc tiếp nhận máu từ 2 nguồn khác

nhau: 30% từ tim và 70% từ tĩnh mạch cửa (portal vein). Vì gan là cơ quan

đầu tiên, tiếp nhận các chất dinh dưỡng và hóa chất khác nhau hấp thụ từ hệ

thống tiêu hóa, gan đã trở thành “nhà máy lọc máu” chính và quan trọng nhất

trong cơ thể. Thức ăn và tất cả các nhiên liệu, vì thế, sẽ phải đi qua gan trước

để được thanh lọc và biến chế thành những vật liệu khác nhau. Ðây cũng là

nguyên nhân chính mà nguồn bệnh từ nhiều cơ quan và bộ phận khác có thể

lan sang gan một cách dễ dàng (Thái Hà và Đặng Mai, 2011).

78

4.2.2 Xác định độc tố trong huyết thanh của vịt bệnh botulism bằng

thử nghiệm trên chuột bạch

4.2.2.1 Kết quả gây độc trên chuột

Thử nghiệm độc tố trên chuột là phương pháp tiêu chuẩn để phát hiện

trên ELISA hoặc PCR có thể xác định các loại độc tố khác nhưng không phát hiện ra

chất độc thần kinh. Độc tố botulinum không bền với nhiệt và có thể bị phá hủy ở

độc tố thần kinh của vi khuẩn C. botulinum, nhưng các xét nghiệm phân tử dựa

80°C trong 10 phút thế nên huyết thanh phải được làm lạnh hoặc đông lạnh

càng sớm càng tốt sau khi thu thập và vận chuyển lạnh đến phòng thí nghiệm

Bảng 4.7 Tỷ lệ chuột bị nhiễm độc botulin trong huyết thanh của vịt bệnh botulism

Lô I (n = 200)

Lô II (n = 200)

Lô đối chứng (n = 20)

Tình trạng chuột

SL

Tỷ lệ

SL

Tỷ lệ

SL

Tỷ lệ

(con)

(%)

(con)

(%)

(con)

(%)

Chuột chết

0

0

0

0

(Abdul-Aziz, 2019).

126

63

Bất thường (*)

74

37

0

0

0

0

Bình thường

0

0

20

100

200

100

Nhiễm bệnh

200

100

0

0

0

0

SL: số lương, (*): Chuột ủ rũ, bỏ ăn xù lông, tiêu chảy, thở bụng

Kết quả ở Bảng 4.7 cho thấy, Lô I- không xử lý nhiệt xuất hiện 63%

chuột chết và 37% chuột bất thường; Lô II với 100% chuột bình thường. Kết

quả của thí nghiệm này hoàn toàn trùng khớp với giả thuyết ban đầu đặt ra và

phù hợp với mô tả của CDC (1998). Như vậy, vịt có triệu chứng mềm cổ liệt

chân được nuôi chạy đồng ở ĐBSCL do độc tố botulin của vi khuẩn C.

botulinum gây ra.

Việc chẩn đoán bệnh do ngộ độc botulin sẽ cho kết quả chính xác hơn

khi dùng phương pháp huyết thanh học (Franciosa et al., 1996). Trong

nghiên cứu này, huyết thanh của vịt có triệu chứng liệt mềm cổ (nghi trúng

độc tố botulin của vi khuẩn C. botulinum) sẽ được gây bệnh thực nghiệm cho

chuột. Kết quả này cũng góp phần khẳng định việc chẩn đoán bệnh do độc tố

79

botulin bằng phản ứng huyết thanh học hiệu quả hơn việc phân lập vi khuẩn

C. botulinum.

a. Khảo sát những biểu hiện lâm sàng trên chuột thí nghiệm

Những biểu hiện trên chuột bạch sau khi tiêm truyền bệnh phẩm huyết

thanh được ghi nhận ở Bảng 4.8.

Kết quả ở Bảng 4.8 cho thấy, chuột thí nghiệm xuất hiện triệu chứng xù

lông, ủ rủ, kém vận động, giảm ăn chiếm tỷ lệ 100%; tiêu chảy, sưng mí mắt

chiếm 90,40%; chân sau yếu 78,40%; suy hô hấp, thở bụng 55,73%; tiêu chảy

30,13%. Những triệu chứng này chỉ xảy ra vào những ngày đầu sau khi tiêm

Bảng 4.8 Tần suất xuất hiện các biểu hiện bất thường trên chuột thí nghiệm (n=375)

Biểu hiện bất thường

Số con

Tỷ lệ (%)

Ủ rủ, xù lông, kém vận động, ăn ít

100,00

375

Sưng mí mắt

338

90,13

Chân sau yếu

294

78,40

Thở bụng

209

55,73

Tiêu chảy

113

30,13

huyết thanh (1 - 4 ngày).

Kết quả này phù hợp với nhận định của Burgen (1949) độc tố botulin

gây ức chế các dây thần kinh cơ, ảnh hưởng thần kinh trung ương, thần kinh

vận động và cơ miệng, việc này làm xuất hiện triệu chứng chậm vận động,

chân sau yếu. Bên cạnh đó, triệu chứng thở bụng xuất hiện với tỷ lệ tương

đối cao là 55,73%. Johnson (2010) cũng đã chứng minh độc tố botulin gây

khó thở, đặc biệt ở type C trên chuột thí nghiệm. Nghiên cứu của Trung tâm

Kiếm soát và Phòng chống dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) (1998) cho biết những

con chuột với các dấu hiệu điển hình của ngộ độc botulin bao gồm yếu cơ và

suy hô hấp, những triệu chứng này thường xuất hiện trong vòng một ngày.

Bên cạnh đó, tài liệu của Nguyễn Đức Hiền (2017) cũng ghi nhận độc tố

botulin tác động làm cản trở sự phóng thích acetylcholine từ dây thần kinh

ngoại biên tác động gây liệt các bắp thịt, điều này phù hợp với việc xuất hiện

triệu chứng chân sau yếu.

80

b. Khảo sát bệnh tích đại thể trên chuột thí nghiệm

Những chuột sau khi tiêm truyền bị chết hoặc có những biểu hiện bất

thường được mổ khảo sát. Những bệnh tích trên các chuột này được thể hiện

trong Bảng 4.9.

Qua Bảng 4.9 đã ghi nhận một số bệnh tích đại thể xuất hiện trên chuột ở

phổi, tim, gan, lách, thận và ruột. Ở những chuột bị chết, tổng số con mổ khám

là 486 con, trong đó phổ biến nhất là bệnh tích ở phổi là phổi phù-xuất huyết

(85,80%), gan xuất huyết (80,86%), tim sung huyết (80,45%, lách xuất huyết

(70,37%), ruột trống thức ăn (61,93%), thấp nhất là thận sưng xuất huyết

Bảng 4.9 Các bệnh tích đại thể trên chuột thí nghiệm

Chuột chết (n =486)

Bệnh tích

Số con

Tỷ lệ (%)

Phổi phù, xuất huyết, sung huyết

417

85,80

99

80,45

Tim sung huyết

342

70,37

Lách xuất huyết

393

80,86

Gan xuất huyết

257

52,88

Thận xuất huyết - sưng

301

61,93

Ruột trống thức ăn

(52,88%).

Ở những chuột có biểu hiện bất thường, khi mổ khám 375 con ghi nhận

được bệnh tích phổi phù-xuất huyết là 99,2%, các bệnh tích ở gan, lách và tim

lần lượt là 78,93%; 71,73% và 74,13%, ruột trống thức ăn (67,47%), thấp nhất

là thận sưng xuất huyết (43,73%). Qua kết quả đó, những chuột chết hay có

triệu chứng bất thường đều có bệnh tích ở phổi là phổ biến nhất. Đây có thể

được xem là một bệnh tích điển hình của chứng nộ độc botulin trên chuột. Bên

cạnh đó, kết quả từ nghiên cứu của Deprez (2006) cho thấy biểu hiện sự thay

đổi nhịp tim do tác dụng của độc tố botulin. Kết quả nghiên cứu này cũng phù

hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Đức Hiền (2012) cho thấy ảnh hưởng

của độc tố botulin chủ yếu thấy phổ biến ở tim và phổi.

81

Hình 4.4 Phổi chuột xuất huyết

Hình 4.5 Gan chuột xuất huyết

Hình 4.6 Mí mắt chuột sung có ghèn

Hình 4.7 Dạ dày, ruột chuột trồng thức ăn

4.2.2.2 Kết quả xác định type độc tố botulin

Phản ứng huyết thanh học để xác định type độc tố botulin bằng kháng

độc tố chuẩn là phương pháp chuẩn cho kết quả chính xác do tính chuyên biệt

của phản ứng. Những mẫu gây chết chuột sẽ được xác định type độc tố botulin

thông qua phản ứng trung hòa bằng kháng độc tố chuẩn và được trình bày

trong Bảng 4.10.

82

Bảng 4.10 Xác định type độc tố botulin

Type C

Type D

Type E

Type C+D

Type C+E Đối chứng

Kết

Số

Tỷ lệ

Số

Tỷ lệ

Số

Tỷ lệ

Số

Tỷ lệ

Số

Tỷ lệ

Số

Tỷ lệ

quả

mẫu

(%)

mẫu

(%)

mẫu

(%)

mẫu

(%)

mẫu

(%)

mẫu

(%)

(1)

49

38,89

72

57,14

65

51,59

-

-

-

0

0

-

(2)

26

20,64

22

17,46

25

19,84

-

-

-

0

0

-

(3)

51

32

36

5

3,97

1,59

12

100

2

40,48a

25,40b

28,57b

(1)Không trung hòa(chuột chết), (2) Trung hòa 1 phần (chuột xuất hiện triệu chứng bệnh lý nhưng

không chết), (3) Chuột khỏe mạnh bình thường

Bảng 4.10 chỉ ra rằng tỷ lệ mẫu huyết thanh chứa độc tố botulin type C là

khá cao, chiếm 40,48%; kế đến là mẫu huyết thanh chứa độc tố botulin type E

với tỷ lệ 28,57% và thấp nhất là mẫu huyết thanh chứa độc tố botulin type D

với 26,19%. Đặc biệt, kết quả thí nghiệm còn có sự kết hiện diện kết hợp của

type C + type D là 3,17% (4/126) và type C + type E là 1,59% (2/126). Sự

khác biệt về tỷ lệ hiện diện của độc tố botulin type C và type C, E là rất có ý

nghĩa (P < 0,05). Điều này có thể kết luận rằng bệnh botulism trên VCĐ ở

ĐBSCL phần lớn do độc lực type C, type D và type E của vi khuẩn C.

botulinum gây ra. Đặc biệt, kết quả thí nghiệm còn có sự kết hiện diện kết hợp

giưa type C + type D là 3,97% và giữa type C + type E là 1,59%.

Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên của Leighton (2000), tác

giả khảo sát độc tố botulism trên thủy cầm ở Canada cho thấy C. botulinum

type C là nguyên nhân gây ngộ độc ở vịt và các loài chim ăn cá tại các vùng

đất ngập nước và ở những nơi có nhiều đồng cỏ. Đặc biệt ở khu vực Great

Lakes đã có 22 loài thủy cầm được xác nhận là ngộ độc bởi C. botulinum type

E, hàng ngàn thủy cầm chết do nhiễm độc tố C. botulinum type E, chúng bị

chết nhiều nhất vào mùa hè và mùa thu hàng năm. Riêng năm 1998, hơn một

triệu thủy cầm hoang dã chết tại hồ Old Wives do ngộ độc C. botulinum type

C. Thêm vào đó, Skerratt et al., (2005) cho thấy có 59% số mẫu có C.

botulinum type E và tác giả cho rằng đây là nguyên nhân chính gây chết thủy

cầm trong những trận dịch lớn hoặc những trường hợp dịch xảy ra đột xuất.

Một nghiên cứu tại Hàn Quốc từ năm 2004-2008 cho thấy, 5 vụ ngộ độc ở

83

thuỷ cầm đã xảy ra làm ảnh hưởng 2.000 loài thuỷ cầm. Trong đợt dịch này,

độc tố type C của vi khuẩn C. botulinum đã được phát hiện trong huyết thanh

vịt, dịch ruột vịt và dòi từ xác thuỷ cầm. Ở Thụy Điển, Neimanis et al. (2007)

đã tiến hành một nghiên cứu từ năm 2000 đến năm 2004, tác giả đã khảo sát

hơn 10.000 loài chim biển, chủ yếu là mòng biển (Larus argentatus) chết

trong quần đảo Blekinge ở Đông Nam Thụy Điển. Tác giả đã tiêm truyền

huyết thanh của của con bệnh trên chuột và trung hòa độc tố, kết quả 69%

(11/16) mồng biển bị ngộ độc độc tố botulin type C. Tại Seoul của Hàn Quốc,

đã xảy ra vụ ngộ độc và gây chết trên 93 chim hoang dã, các loài chim đã

được tìm thấy dọc theo bờ của sông Hangang (tháng 10/2008). Các triệu

chứng lâm sàng đã được ghi nhận, khi tiến hành nghiên cứu đã phát hiện độc

tố type C của vi khuẩn C. botulinum trong huyết thanh của những con chim

hoang dã và đã tiến hành xét nghiệm sinh học trên chuột. Điều đáng quan tâm

trong kết quả này là không có vi khuẩn C. botulinum nào phân lập được từ xác

chết của chúng nhưng khi tìm độc tố trong dịch thực quản và dịch ruột thì phát

hiện độc tố type C của vi khuẩn C. botulinum (Woo et al., 2010). Tháng 8 năm

2011, Miền Bắc nước Ý đã bùng phát vụ ngộ độc ở các loài chim hoang dã và

các động vật khác tại bờ suối Crostolo, ở vùng Emilia Romagna, Ý. Nhóm

nghiên cứu đã tiến hành ghi nhận 20/28 mẫu dạ dày của vịt trời chết có giòi

(ấu trùng ruồi xanh giai đoạn 3). Nhóm tiến hành nghiên cứu và xác định:

nguyên nhân gây chết là do độc tố C. botulinum type C gây ra, độc tố được

xác định bằng một thử nghiệm trên chuột và khẳng định: độc tố trong huyết

thanh và ở ấu trùng ruồi xanh trong dạ dày của vịt chết (Defilippo et al., 2013)

4.3 Xác định các các yếu tố nguy cơ gây bệnh botulism trên VCĐ ở

ĐBSCL có bệnh botulism

4.3.1 Tình hình nhiễm vi khuẩn C. botulinum từ các mẫu đất và nước

trên ruộng

Bảng 4.11 cho thấy C. botulinum được tìm thấy trong 105/600 mẫu đất

đất ruộng được kiểm tra với tỷ lệ 17,5%, đồng thời có 118/600 (19,67%) mẫu

nước ruộng có sự hiện diện của vi khuẩn C. botulinum. Tỷ lệ này tương đối

84

cao. Điều này có thể là do môi trường đất và nước ở các khu vực nuôi ô nhiễm

vi khuẩn do xác động thực vật thối rữa, do sự bài xuất vi khuẩn từ một số vật

nuôi. Tất cả tạo điều kiện cho vi khuẩn C. botulinum tăng sinh phát triển. Sự

hiện diện của vi khuẩn trong đất ruộng và nước trên ruộng khác nhau không có

Bảng 4.11 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. botulinum từ các mẫu đất và nước trên ruộng

Loại mẫu

Đất ruộng (mẫu)

Nước trên ruộng (mẫu)

SL thí

Địa điểm

(n=600)

(n=600)

nghiệm

(mẫu)

SL dương

Tỷ lệ

SL dương

Tỷ lệ

tính (mẫu)

(%)

tính (mẫu)

(%)

An Giang

20

12,58a

25

15,72

159

Cần Thơ

22

15,60ab

25

17,17

141

Hậu Giang

27

18,75ab

31

21,53

144

Kiên Giang

36

23,08b

37

23,72

156

Tổng cộng

19,67

105

17,5

118

600

SL: số lượng

Những giá trị trong cùng một cột mang chữ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê

ý nghĩa.

Kết quả từ bảng trên cho thấy tỷ lệ hiện diện của C. botulinum ở trong

đất ruộng ở Kiên Giang (23,08%) cao hơn đất ruộng thu thập ở các tỉnh khác,

sự khác biệt này rất có ý nghĩa. Điều này có thể là do địa hình tự nhiên của

những phương này tương đối không giống nhau. An Giang với địa hình tương

đối thấp hơn so với mực nước biển. Hàng năm, địa phương luôn đón nhận

những cơn lũ từ thượng nguồn sông Mekong đổ về, đất ruộng có vài tháng bị

ngập sâu trong nước. Đây cũng là thời gian cho đất đặc biệt là vi sinh vật trong

đất cũng bị chết đi và rửa trôi. Trong khi đó, Kiên Giang với địa hình đa dạng,

vừa có đồng bằng vừa có đồi núi và biển đảo. Đặc biệt, phần đất liền tương đối

bằng phẳng có hướng thấp dần từ hướng phía Đông Bắc xuống Tây Nam so

với mặt biển (Cục thống kê, 2012). Vì thế, nhiều vi khuẩn đặc biệt là những vi

khuẩn có nha bào hoặc sống yếm khí có thể được tích tụ, tồn tại và phát triển.

85

Trong nghiên cứu này, mẫu được thu thấp ở 3 huyện của tỉnh Kiên Giang

bao gồm huyện Giồng Riềng, Tân Hiệp và An Biên với tổng diện tích đất

trồng lúa của 3 huyện là 116.086 ha. Theo tỷ lệ trên, ước tính có khoảng

27.721ha diện tích đất trồng lúa của tỉnh bị nhiễm vi khuẩn C. botulinum, gần

bằng diện tích trồng lúa của huyện An Biên (28.436ha) (Ủy Ban Nhân dân

tỉnh Kiên Giang, 2019). Tập quán của người nông dân, vùng nào có đồng lúa

nhiều thì được tập trung chăn thả vịt chạy đồng ở đó để tận dụng lúa rơi vãi

sau thu hoạch và thức ăn thủy sinh trên cánh đồng. Có thể nói, đây là một yếu

tố tiềm ẩn của bệnh tật trên đàn vịt chạy đồng của Vùng đồng bằng sông Cửu

long và cũng là một điều đáng lưu tâm của những người làm công tác thú y.

Sự hiện diện với tỷ lệ của vi khuẩn C. botulinum trong đất ruộng và nước

có thể là hệ quả của sự tích lũy vi khuẩn này nhiều năm trong môi trường. Sự

tồn tại của vi khuẩn này trong môi trường chăn nuôi vịt cao như thế cảnh báo

nguy cơ ngộ độc botulin cho vịt chạy đồng rất cao. Trên thế giới cũng có

nhiều nghiên cứu về sự hiện diện của vi khuẩn C. botulinum trong đất như là

nghiên cứu của Hauschild (1989) phân lập được C. botulinum type A và B ở

các vùng trầm tích tại Bắc Mỹ. Bott et al. (1968) phân lập được C. botulinum

type E khu vực Great Lake, Canada. Các nước như Na Uy và Thụy Điển, Đan

Mạch, Hà Lan, Ba Lan, Nga, Anh đều phân lập có C. botulinum type E ở

những vùng đất ngập nước (Hauschild, 1989). Ý và Úc cũng phân lập được C.

botulinum type A và B trong bùn bã vùng đô thị và bùn biển (Creti et al.,

1990; Eales and Gillespie, 1947; Ohye and Scott, 1957). Khảo sát các ổ dịch

xảy ra trên thủy cầm tại Hoa kỳ, Kalmbach and Gunderson (1934) thuộc Đại

học Alberta cũng đã chứng minh có nguồn độc tố botulin tồn tại trong bùn bã

trầm tích tại nơi xảy ra bệnh. Các nghiên cứu trên cho thấy sự hiện diện của

C. botulinum là rất phổ biến trong đất và bùn bã hữu cơ ở những vùng có thủy

triều lên xuống.

86

4.3.2 Tình hình nhiễm vi khuẩn C. botulinum từ mẫu cua và ốc

Bảng 4.12 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. botulinum từ các mẫu cua và ốc ruộng

Loại mẫu

Cua

Ốc

Địa điểm

Số mẫu

Số mẫu

Tỷ lệ

Số mẫu

Số mẫu

Tỷ lệ

kiểm tra

dương

(%)

kiểm tra

dương

(%)

An Giang

63

5

7,94

4

3,77

106

Cần Thơ

42

3

7,14

3

3,19

94

Hậu Giang

50

4

8,00

2

2,08

96

Kiên Giang

61

6

9,84

3

2,88

104

216

18

8,33a

12

3,00b

Tổng cộng

400

Những giá trị trong cùng một hàng mang chữ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê

trên ruộng

Bảng 4.12 cho thấy, sự hiện diện của vi khuẩn C. botulinum trên cua

(8,33%) cao hơn trên ốc (3,00%) và sự sai khác của hai tỷ lệ này rất có ý nghĩa

về mặt thống kê vi khuẩn C. botulinum với p<0,01. Bởi lẽ, ốc và cua là động

vật giáp xác có thể chứa vi khuẩn C. botulinum trong ruột do trong môi trường

nước (Dohms, 2008). Hơn nữa, vi khuẩn Clostridium spp. thường xuyên hiện

diện trong các vùng đất trầm tích, đầm lầy, ngập nước thường xuyên. Đây

cũng có thể là nguyên nhân làm ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm vi khuẩn trên ốc và

cua (Wosbeser et al.,1987). Todar (2009) Giải thích về đặc điểm bệnh gắn liền

với thời tiết nóng ấm, cho rằng C. botulinum tồn tại trong đất, nhất là các vùng

bùn lắng trầm tích và tồn tại trong xác các loài nhuyễn thể. Vào mùa khô nắng,

đáy ao hồ, các lớp bùn trầm tích phơi ra nhiều hơn, khi vịt chạy đồng tìm mồi,

sục mỏ vào các lớp bùn đất trầm tích, tìm mồi trên bãi cạn và ăn phải các loài

ốc hến hay cá chết, làm cho tỷ lệ nghi mắc bệnh do C. botulinum gia tăng.

Những điều kiện tự nhiên thuận lợi trong sản xuất nông nghiệp ở Đồng

bằng Sông Cửu Long đã có nhiều ảnh hưởng quan trọng đến sản xuất gia cầm

truyền thống ở nhiều địa phương. Theo Bùi Xuân Mến và Đỗ Võ Anh Khoa

87

(2014), trên cơ sở canh tác nông nghiệp nhiều hệ thống chăn nuôi gia cầm đã

được người sản xuất áp dụng mà đặc biệt là phương thức sản xuất vịt- lúa kết

hợp ở Đồng bằng Sông Cửu Long là phổ biến nhất. Trong hệ thống này, khi

giai đoạn cây lúa đang sinh trưởng người chăn nuôi có thể thả vịt con vào

ruộng để ăn sâu rầy, ốc nhỏ. Vào thời kỳ thu hoạch lúa, người chăn thả vịt thịt,

vịt đẻ thả vào ruộng vịt tận dụng lúa rơi rụng và tất cả các loài động vật thủy

sinh mà vịt có thể ăn được. Với tỷ lệ phân lập vi khuẩn C. botulinum khá cao

8,33% và 3,00% trên cua và ốc cho thấy tiềm ẩn nguy cơ ngộ độc botulin của

vi khuẩn C. botulinum là có thể xảy ra. Mặt khác, vịt chạy đồng trở thành

nguồn bệnh mang đến các khu vực khác.

Kết quả thu được từ việc khảo sát điều kiện tự nhiên tại nơi chăn thả vịt

chạy đồng và từ phân vịt đã cho thấy C. botulinum luôn tồn tại tiềm ẩn trong

môi trường, và vịt có thể nhiễm bệnh từ môi trường nơi chăn thả.

4.4 Tính gây bệnh của vi khuẩn C. botulinum phân lập được trên vịt

bệnh và môi trường

4.4.1 Kiểm tra độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn C. botulinum

Hiện nay, kháng sinh được sử dụng rất phổ biến trong phòng và trị bệnh

trên gia súc gia cầm, lượng kháng sinh được sử dụng tăng lên một cách nhanh

chóng. Song song với việc gia tăng sử dụng kháng sinh về chủng loại và liều

lượng, dẫn đến vi khuẩn đề kháng với kháng sinh cũng ngày càng gia tăng.

Trong thực tế điều trị, kháng sinh ít được sử dụng trong điều trị bệnh do vi

khuẩn C. botulinum, nhưng khi sử dụng kháng sinh không kiểm soát cũng cần

lưu ý đến.

Mười loại kháng sinh được chọn để kiểm tra độ nhạy với hai trăm bốn

mươi mốt phân lập của vi khuẩn C. botulinum phân lập được, kết quả được

trình bày ở Bảng 4.13.

88

kháng sinh

Clostridium botulinum (n=241)

Viết

Nhạy cảm

Trung gian

Đề kháng

Loại kháng sinh

tắt

Số

Tỷ lệ

Số

Tỷ lệ

Số

Tỷ lệ

mẫu

(%)

mẫu

(%)

mẫu

(%)

Amikacin

Ak

139

57,68

81

33,61

21

8,71

Ampicillin

Am

0

0

212

29

12,03

Bảng 4.13 Tỷ lệ độ nhậy của vi khuẩn C. botulinum phân lập được với một số loại

87,97

Amoxicillin

Ax

31

12,86

189

21

8,71

78,42

Ceftiofur

Cf

235

6

2,49

0

0

97,51

Cephalexin

Cp

58

24,07

160

66,39

23

9,54

Doxycycline

Dx

237

1,66

0

0

4

98,34

Florfenicol

FFc

0

0

241

0

0

100

Fosformycin

Fos

0

0

241

0

0

100

0

0

241

0

0

Marbofloxacin

Ma

100

0

0

9

Norfloxacin

Nr

232

3,73

96,27

Kết quả ở Bảng 4.13 cho thấy có 6/10 loại kháng sinh được chọn thử độ

nhạy với vi khuẩn C. botulinum phân lập được cho kết quả nhạy cảm (95-

100%). Trong đó, các kháng sinh như florfenicol, fosformycin và

marbofloxacin nhạy 100% với các vi khuẩn C. botulinum. Mặc dù việc điều trị

ngộ độc botulin của vi khuẩn C. botulinum là dùng kháng độc tố botulin thì có

hiệu quả cao nhưng điều này không có ý nghĩa kinh tế trong điều trị bệnh gia

cầm hoặc chim trĩ (Dohms, 2008). Nhưng, người chăn nuôi có thể lựa chọn

các kháng sinh rẻ và phổ biến của địa phương để diệt vi khuẩn sinh độc tố

nguy hiểm đến sức khỏe của gia cầm cũng là điều đáng quan tâm. Kết quả

nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Đức Hiền (2012),

về sự nhạy cảm của vi khuẩn C. botulinum đối với kháng sinh cũng cho thấy,

vi khuẩn này nhạy cảm hoàn toàn với norfloxacin, fosfomycin, ceftiofur.

89

Sự mẫn cảm và đề kháng của C. botulinum đối với kháng sinh cũng được

nhiều tác giả khảo sát cho thấy sự phụ thuộc vào thời điểm khảo sát, vùng địa

lý. Theo nghiên cứu của nhiều tác giả thì hầu hết C. botulinum kháng với

kháng sinh như nhóm aminoglycosid (Johnson et al., 2007), một số chủng

kháng với tetracycline và cephalosporins (Dezfulian and Dowell, 1980),

Nalidixic acid và sulphamethoxazole/trimethoprim (Fenicia et al., 2003).

Trong khi đó, nghiên cứu của Swenson et al., (1980) về kiểm tra mức độ mẫn

cảm của 224 chủng C. botulinum phân lập từ người bị ngộ độc với 13 loại

kháng sinh là tetracycline, metronidazole, erythromycin, penicillin, rifampin,

chloramphenicol, clindamycin, cephalothin, cefoxitin, vancomycin,

sulfamethoxazol-trimethoprim, acid nalidixic, và gentamicin bằng phương

pháp MIC (nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu). Kết quả cho thấy có ít nhất

90% số chủng C. botulinum được kiểm tra (trừ các chủng non-proteolytic của

độc tố loại F với penicillin) đều nhạy cảm với tất cả các loại kháng sinh, trừ

trimethoprim-sulfamethoxazole, acid nalidixic và gentamycin.

Bên cạnh các kháng sinh rất nhạy cảm với vi khuẩn C. botulinum phân

lập được thì cũng có những kháng sinh xuất hiện dấu hiệu bị đề kháng. Trong

Bảng 4.13, các chủng vi khuẩn C. botulinum đề kháng với amikacin,

ampicillin, amoxicillin và cephalexin với tỷ lệ lần lượt là 8,71%; 12,03%;

8,71% và 9,54%. Các tỷ lệ này tuy không cao nhưng cũng cảnh báo có sự đề

kháng với kháng sinh của vi khuẩn C. botulinum. Nguyên nhân này có thể giải

thích là do vi khuẩn C. botulinum là vi khuẩn thường trú trong hệ tiêu hoá của

vịt nên các loại kháng sinh đã được sử dụng điều trị bệnh hoặc bổ sung vào

thức ăn để phòng bệnh cho vịt đều có tác dụng kích thích C. botulinum biến

đổi di truyền hình thành khả năng kháng thuốc. Vì thế, những thông tin về tính

nhạy cảm và đề kháng đối với từng loài vi khuẩn Clostridium cụ thể là những

số liệu hữu ích cho những người làm công tác điều trị.

90

4.1.2 Sự đa kháng của vi khuẩn C. botulinum phân lập được với một

số loại kháng sinh

Với đặc điểm biến đổi để thích ứng với môi trường sống khắc nghiệt, vi

khuẩn cũng có những thích nghi trong đó phải kể đến là sự đề kháng lại với

kháng sinh. Bảng 4.14 dưới đây thể hiện sự đa đề kháng của vi khuẩn C.

botulinum phân lập được từ những vịt bị liệt mềm cổ và môi trường chăn nuôi

Bảng 4.14 Kết quả khảo sát tính đa kháng của vi khuẩn C. botulinum với một số loại

kháng sinh (n=241)

Số loại kháng

Số kiểu đa

Kiểu hình đa

Số chủng

Tổng

Tỷ lệ chung

sinh kháng

kháng

kháng

(%)

vi khuẩn

đề kháng

Ak-Am

4

Ak-Ax

3

Ak-Cp

2

2

6

23

9,54

Am-Ax

10

Am-Cp

3

Ax-Cp

1

Ak-Am-Ax

1

Ak-Am-Cp

2

3

4

13

5,39

Ak-Ax-Cp

2

Am-Ax-Cp

8

Ak-Am-Ax-Cp

6

4

1

6

2,49

11

Tổng

42

những vịt này.

Bảng 4.14 chỉ ra rằng có 42 trong tổng số 241 phân lập C. botulinum đề

kháng với từ 2-4 loại kháng sinh trong tổng số 10 loại kháng sinh khảo sát,

gồm 11 kiểu tổ hợp đề kháng kháng sinh. Trong đó, vi khuẩn C. botulinum đề

kháng với 2 loại kháng sinh chiếm tỷ lệ cao nhất (9,54%). Kiểu tổ hợp đề

91

kháng phổ biến nhất là với 2 loại kháng sinh Am-Ax. Trong nghiên cứu này

có 6 phân lập của vi khuẩn kháng đến 4 loại kháng sinh.

Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn có thể chia làm 2 loại, đó là đề

kháng tự nhiên và đề kháng thu được. Đề kháng tự nhiên là tình trạng chi hoặc

vài loài vi khuẩn nào đó không nhạy với kháng sinh, điều này có thể do vi

khuẩn thiếu cấu trúc đích cho tác động của kháng sinh. Ngoài ra, việc đề

kháng với kháng sinh của vi khuẩn còn có thể do thành tế bào không có kháng

sinh thấm qua. Đề kháng thu được là kết quả của sự thay đổi trong hẹ gene bởi

đột biến hoặc sự truyền nganh thông tin di truyền từ các vi khuẩn khác

(Guardabbasi and Couvalin, 2006). Bên cạnh đề kháng tự nhiên của vi khuẩn

đối với một số loại kháng sinh, đề kháng kháng sinh của vi khuẩn hiện nay

phần lớn là do kết quả của sự đột biến tự nhiên và chuyển gene. Quá trình này

giúp cho vi khuẩn có thể chống lại tác động của một số loại kháng sinh nào đó,

làm cho kháng sinh trở nên mất hiệu lực. Những vi khuẩn này sử dụng nhiều

cơ chế có được để có thể đề kháng với nhiều loại kháng kháng sinh như thay

đổi vách tế bào tránh tác động của kháng sinh, tiết enzyme làm bất hoạt kháng

sinh, giảm tính thấm của màng tế bào ngăn cản xâm nhập của kháng sinh, thay

đổi điểm tiếp nhận làm mất khả năng gắn kết của kháng sinh, đẩy kháng sinh

bằng cơ chế bơm thoát dòng làm giảm nồng độ của kháng sinh trong tế bào vi

khuẩn, gia tăng tỷ lệ đột biến như là cách đáp ứng đối với tình huống bất lợi.

Sự đa đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn hầu hết có liên quan đến sự hiện diện

của plasmid có chứa một hay nhiều gene đề kháng, mỗi gene mã hóa cho một

kiểu hình đề kháng với một loại kháng sinh (Clewell, 1981; Fosster, 1983).

Ngoài ra, một số nghiên cứu gần đây cũng cho thấy sự đa đề kháng với kháng

sinh của vi khuẩn cũng có liên quan đến những đột biến gene ở nhiễm sắc thể,

trong đó những đơn vị hoạt động DNA (operon) có chứa những gene mã hóa

cho yếu tố đa đề kháng kháng sinh bao gồm những biến đổi giúp cho vi khuẩn

có thể bơm thoát dòng kháng sinh (Herbert et al., 1991; Sharma et al., 2017).

Sự đa đề kháng với kháng sinh của vi khuẩn C. botulinum có thể là kết quả

của việc gia tăng sử dụng nhiều loại kháng sinh trong phòng và trị bệnh gia

cầm dẫn đến sự tích lũy biến dị chọn lọc làm cho vi khuẩn đề kháng với nhiều

92

loại kháng sinh. Do đó, việc lựa chọn kháng sinh còn hiệu lực tốt với vi khuẩn

C. botulinum là vấn đề cần được chú ý để bảo vệ vật nuôi và giảm thiểu sự đề

kháng với kháng sinh của vi khuẩn.

4.4.3 Thử nghiệm độc tố botulin trên vịt

Trong các nội dung nghiên cứu liên quan đến vi sinh vật, việc kiểm tra

tính gây bệnh của một loại vi sinh vật gây bệnh thực nghiệm là điều cần thiết.

Điều này phục vụ cho việc kiểm chứng một số ảnh hưởng của vi sinh vật gây

bệnh trên vật nuôi, đồng thời kiểm tra một số triệu chứng và bệnh tích trên vật

nuôi thông qua việc tiêm truyền vi khuẩn gây bệnh. Trong nghiên cứu này,

những phân lập của vi khuẩn C. botulinum sau khi được kiểm chứng trên

chuột bạch về tính gây bệnh, các chủng này được chọn để gây bệnh thực

nghiêm trên vịt chạy đồng. Kết quả được ghi nhận như sau:

Để khảo sát khả năng gây bệnh của độc tố botulin của 32 mẫu dịch lọc có

chứa độc tố qua đường tiêm và uống, và ở ô thử nghiệm đối chứng được tiến

hành trên 8 con vịt khỏe mạnh được nuôi dưỡng và chăm sóc trong cùng điều

Bảng 4.15 Tỷ lệ vịt chết sau 7 ngày thử độc tố botulin

Thí

Đường cấp

Số vịt

Số mẫu

Số mẫu

Tỷ lệ

Số mẫu

Tỷ lệ

nghiệm

thí

dịch lọc

dịch lọc

(%)

dịch lọc

(%)

nghiệm

thí

gây chết

gây bất

nghiệm

thường

Lô thí

Đường

90

32

23

71,88

9

28,12

nghiệm

tiêm/uống

Lô đối

Không tác

8

0

0

0

0

chứng

động

kiện kết quả thể hiện ở Bảng 4.15.

Kết quả ở Bảng 4.15 cho thấy 100% (32/32) mẫu thí nghiệm đều có ảnh

hưởng không tốt đến sức khỏe của vịt thí nghiệm, trong đó có 23/32 mẫu làm

vịt chết, chiếm 71,88%. Từ kết quả ghi nhận trên cho thấy khả năng gây bệnh

của botulin thu được từ những phân lập của vi khuẩn C. botulinum là rất cao.

Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu trước đó của Nguyễn Đức Hiền và Phạm

93

Mạnh Hùng (2012) và cũng phù hợp với kết quả thí nghiệm của một số tác giả

như Notermans et al. (1980) hay Jensen and Duncan (1980) khi nghiên cứu

gây nhiễm cho vịt qua đường tiêm gây chết nhiều hơn đường uống.

4.4.4 Những triệu chứng lâm sàng trên vịt thử nghiệm độc tố

Kết quả ở Bảng 4.16 cho thấy vịt có những biểu hiện đặc trưng của ngộ

độc botulin như vịt giảm ăn, cũng như có biểu hiện ủ rủ, ít đi lại chỉ đi lại khi

bị dồn đuổi, xù lông, giảm ăn, giảm đẻ chiếm tỷ lệ 100%, đặc biệt triệu chứng

liệt cổ chiếm 92,19%, liệt mí mắt, dãn đồng tử với tỷ lệ 76,19%, liệt chân

chiếm 60,94%, tiêu chảy phân trắng - xanh chiếm 35,94% so với ô đối chứng

Bảng 4.16 Triệu chứng lâm sàng trên vịt thử nghiệm độc tố botulin (n=64)

Triệu chứng

Đối

Số vịt thí nghiệm có

Tỷ lệ

chứng

biểu hiện triệu chứng

(%)

Ủ rũ, kém vận động

90

0/8

thì vịt khỏe mạnh, không có những biểu hiện bất thường nào.

100,00

Xù lông, rụng lông

90

0/8

100,00

Liệt mí mắt, giãn đồng tử

60

67,19

0/8

Liệt cổ

83

0/8

92,19

Liệt chân

55

60,94

0/8

Giảm ăn

90

0/8

100,00

Giảm đẻ

90

0/8

100,00

32

35,94

0/8

Tiêu chảy phân trắng – xanh

Những biểu hiện bất thường trên vịt là do bị tác động bởi độc tố botulin

của vi khuẩn C. botulinum. Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn

Đức Hiền (2012) là vịt ủ rủ, kém vận động chiếm tỷ lệ 100%, liệt cổ chiếm

80%, liệt chân chiếm 65%, liệt mí mắt chiếm tỷ lệ 50%, tiêu chảy phân xanh

chiếm 15% và chảy nước mũi chiếm 20%. Burgen et al. (1949) cũng đã cho

thấy rằng độc tố botulin gây ức chế các dây thần kinh cơ, ảnh hưởng thần kinh

94

trung ương, thần kinh cơ vận động và cả cơ miệng, cơ mắt, việc này làm xuất

hiện triệu chứng chậm vận động, chân sau yếu.

Kết quả khảo sát về các biểu hiện triệu chứng lâm sàng sau khi gây

nhiễm thực nghiệm ở vịt trong nghiên cứu này phù hợp với một số nghiên cứu

về việc gây nhiễm độc tố botulin trên một số loài gia cầm. Theo tác giả Dohms

(1987) nhận định là triệu chứng lâm sàng ở vịt, gà, gà tây, gà lôi thì tương tự

nhau, chủ yếu là liệt chân, cánh, cổ và mí mắt. Chính vì triệu chứng điển hình

này mà lúc đầu bệnh được đặt tên “chứng cổ mềm” (Limberneck). Và ở gà các

Hình 4.8 Lông xù, rụng lông

Hình 4.9 Liệt mi mắt

Hình 4.10 Phân chảy trắng- xanh

Hình 4.11 Liệt mềm cổ

tài liệu còn mô tả còn có biểu hiện xù lông, rụng lông.

95

4.4.5 Khảo sát bệnh tích đại thể trên vịt thử nghiệm độc tố botulin

Qua theo dõi khả năng gây độc của 32 mẫu canh khuẩn C. botulinum trên

tổng số 64 con vịt sau khi gây bệnh thực nghiệm với đường tiêm tĩnh mạch.

Những vịt chết và vịt có những biến đổi bất thường được tiến hành mổ khám

sau 14 ngày và bệnh tích được ghi nhận qua bảng 4.17.

Bảng 4.17 cho thấy vịt ở ô thử nghiệm độc tố botulin qua đường tiêm

thì xuất hiện bệnh tích nỗi bật như phổi tụ huyết, gan xuất huyết, và ruột sinh

hơi, trống thức ăn còn bệnh tích trên các cơ quan khác chiếm tỷ lệ nhỏ.

Trong khi đó vịt ở ô đối chứng khi mổ khám thì không phát hiện bệnh tích

Bảng 4.17 Kết quả khảo sát bệnh tích đại thể trên vịt thử nghiệm độc tố botulin

(n=64)

Đối chứng

Số vịt thí nghiệm có

Tỷ lệ

Bệnh tích

biểu hiện bệnh tích

(%)

Phổi tụ huyết

52

0/8

nào trên các mô.

81,25a

19

29,69b

0/8

Lách sưng – xuất huyết

Gan xuất huyết

59

0/8

92,19a

Thận xuất huyết

21

32,81b

0/8

Ruột sinh hơi, trống thức ăn

57

0/8

89,06a

Kết quả từ bảng trên cho ta thấy, bệnh tích gan xuất huyết là cao nhất

chiếm 92,19% (59/64), tiếp theo là bệnh tích ruột trống thức ăn, sinh hơi

chiếm 89,06%), kế tiếp là phổi tụ huyết chiếm tỷ lệ 81,25%, còn ruột sinh

hơi, trống thức ăn chiếm 89,06%. Theo nghiên cứu của Nguyễn Đức Hiền

(2012) thì bệnh tích ghi nhận từ vịt chết do nhiễm độc tố C. botulinum là tim

xuất huyết chiếm tỷ lệ 15% và phổi xuất huyết chiếm tỷ lệ 10%. Vào mùa

khô lượng nước ở những hồ ao, ruộng đồng nơi chăn thả vịt xuống thấp, kết

hợp với nhiệt độ tăng tạo điều kiện cho xác động thực vật phân hủy và thối

rữa nhanh hơn, là môi trường tốt cho C. botulinum phát triển và sản sinh

nhiều độc tố.

96

Nghiên cứu này phù hợp với mô tả của Nguyễn Đức Hiền (2017) cũng

như nhiều tài liệu khác cho thấy hầu hết các trường hợp ngộ độc do độc tố

botulin đều không thể hiện bệnh tích đặc trưng. Theo Nguyễn Đức Hiền

(2017) độc tố botulin thường không có bệnh tích đại thể và vi thể được ghi

nhận, chỉ thấy đường tiêu hóa trống không ngoài ra ảnh hưởng của độc tố

botulin chủ yếu thấy phổ biến ở tim và phổi. Và theo Jensen and Duncan

(1980), khi nghiên cứu về độc tố botulin ở thuỷ cầm hoang dã đã gây nhiễm

cho vịt trời bằng độc tố botulin type C, thì thấy hầu hết các trường hợp vịt chết

bởi ngộ độc botulin là do liệt hô hấp, xuất huyết, phù phổi, ngoài ra không

phát hiện bệnh tích đặc trưng nào.

Qua kết quả trên chứng tỏ mẫu canh khuẩn thử nghiệm có sự hiện diện của

độc tố botulin. Các độc tố được hấp thu ở phần trên của ruột non và đi đến mạch

máu thông qua hệ bạch huyết qua đường uống cũng như được tiêm truyền trực

tiếp vào máu qua đường tiêm. Độc tố botulin của vi khuẩn C. botulinum không

giống như độc tố khác có hoạt động cục bộ trong ruột, chúng ảnh hưởng đến

chủ yếu là các dây thần kinh tiết acetylcholine của hệ thần kinh ngoại vi, làm

tổn thương hệ thần kinh trung ương (đặc biệt là đến các tín hiệu từ não đến cơ

bắp), gây liệt cơ rõ nhất là liệt cơ mắt (không có phản ứng với ánh sáng, song

thị), liệt cơ vòm miệng, lưỡi hầu, gây nên biến dạng mặt, nguy hiểm nhất là gây

liệt trung tâm hô hấp, tim dẫn đến tử vong cao (Burgen, 1949).

Từ những triệu chứng lâm sàng và bệnh tích quan sát được trong

những thí nghiệm trên, chúng ta có thể xác định bệnh “liệt mềm cổ” xảy ra

trên vịt chạy đồng trong thời gian qua là do nhiễm phải độc tố botulin của vi

khuẩn C. botulinum.

97

Hình 4.12 Phổi vịt tụ huyết

Hình 4.13 Gan vịt xuát huyết

Hình 4.14 Ruột vịt trống thức ăn

Hình 4.15 Ruột vịt sinh hơi

98

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết Luận

Độc tố botulin của vi khuẩn C. botulinum là nguyên nhân chính gây chứng

liệt mềm cổ trên vịt chạy đồng tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.

Bệnh liệt mềm cổ trên vịt thường xảy ra ở những vịt chạy đồng, trong đó

vịt thịt chiếm 40,48% (170/420) và vịt đẻ chiếm 59,52% (250/420). Bệnh xảy

ra thường xuyên trong năm, đặc biệt là vào mùa nắng (từ tháng 12 của năm

này đến tháng 5 của năm sau) thì bệnh xảy ra nhiều hơn mùa mưa.

Độc tố botulin trong huyết thanh của vịt bệnh được xác định bằng việc

tiêm truyền huyết thanh đã qua lọc cho chuột thu kết quả 100% chuột bị chết

hoặc có biểu hiện bất thường.

Phản ứng trung hòa giữa độc tố trong huyết thanh vịt bệnh với kháng độc

tố chuẩn đã xác định độc tố botulin type C hiện diện cao nhất (40,48%), độc tố

type E và D cũng được phát hiện với tỷ lệ lần lượt là 28,57% và 26,19%. Đặc

biệt, huyết thanh vịt bệnh có sự nhiễm ghép độc tố type C + D 3,97% và type

C + E 1,59%.

Vi khuẩn C. botulinum phân lập từ mẫu phân và gan thu thập từ vịt có

triệu chứng liệt mềm cổ với tỷ lệ lần lượt là 25,24% và 21,37%. Khi kiểm tra

các mẫu môi trường chăn thả vịt thì đều phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn

C. botulinum trong đất ruộng, nước trên ruộng, cua vừa chết và ốc với tỷ lệ

lần lượt là 17,5%; 19,67%; 8,33% và 3,99%.

Những phân lập của vi khuẩn C. botulinum từ các mẫu vịt bệnh liệt

mềm cổ và môi trường chăn nuôi vịt đều nhạy cảm hoàn toàn với một số

kháng sinh như florfenicol, fosformycin, marbofloxacin, doxycylin, ceftiofur

và norfloxacin. Vi khuẩn này cũng đề kháng với nhiều loại kháng sinh, trong

đó có 6/42 phân lập của vi khuẩn đề kháng với cùng lúc 6 loại kháng sinh

(chiếm 2,49%).

Gây bệnh thực nghiệm trên chuột bạch bằng độc tố botulin trong huyết

tahnh vịt bệnh và gây bệnh cho vịt đẻ bằng độc tố từ vi khuẩn C. botulinum

phân lập được đều cho kết quả 100% chuột và vịt đều bị ảnh hưởng của độc tố

botulin (bị chết hoặc bất thường). Các triệu chưng thường gặp như con vật ủ

99

rũ, kém vận động, liệt cổ, liệt chi, liệt mí mắt. Bệnh tích thường gặp là phổi

phù- xuất huyết, ruột trống thức ăn, gan – thận – lách xuất huyết.

5.2 Đề nghị

Cần xác định nguồn lây nhiễm mầm bệnh từ môi trường chăn nuôi và vịt

chạy đồng thông qua việc sử dụng các kỹ thuật phân tử để chẩn đoán vi khuẩn

C. botulinum từ vịt bệnh và môi trường chăn nuôi vịt.

Nghiên cứu điều chế kháng độc tố từ nguồn vi khuẩn thực địa tại Đồng

bằng sông Cửu Long để giải độc kịp thời cho vịt bị trúng độc.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt

100

1. Bùi Bá Bổng, 2008. Cẩm nang phòng chống bệnh cúm gia cầm thể độc lực

cao (H5N1). NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.

2. Bùi Xuân Mến, Đỗ Võ Anh Khoa, 2014. Giáo trình Chăn Nuôi Gia Cầm.

NXB Đại học Cần Thơ, Trang 294-307.

3. Cục thống kê, 2017. Niên giám thống kê. NXB thống kê

4. Chi Cục Thú Y thành phố Cần Thơ, 2016. Báo cáo tổng kết công tác thú y

năm 2013 đến năm 2016.

5. Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2017. Giáo trình Bệnh truyền

nhiễm gia súc gia cầm. NXB Đại Học Cần Thơ, trang 151-154.

6. Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2010. Nghiên cứu tình hình nhiễm và vai trò của vi

khuẩn Closridium perfringens trong hội chúng tiêu chảy ở bò, lợn nuôi tại

Hà Nội và một số vùng lân cận. Luận án Tiến sỹ Nông Nghiệp.

7. Lâm Minh Thuận và Chế Minh Hùng, 2004. Kỹ thuật chăn nuôi thủy cầm

(Vịt, ngang, ngỗng). Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. Hồ Chí Minh, trang

25-29.

8. Lê Huy Chính, 2003. Vi sinh y học. NXB Y Học, Hà Nội.

9. Lê Văn Sơn, 2011. Nghiên cứu một số đặt tính của vi khuẩn Clostridium

perfringens gây viêm ruột tiêu chảy ở dê và cừu tại một số tỉnh Nam Trung

Bộ và biện pháp phòng trị. Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, tại Viện Thú y

Quốc gia.

10. Mai Văn Nam, 2008. Hiệu quả chăn nuôi vịt đẻ chạy đồng ở ĐBSCL. Tạp

chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 09: 76-85.

11. Nguyễn Bá Hiên, 2001. Một số vi khuẩn đường ruột thường gặp và biến

động của chúng ở gia súc khỏe mạnh và bị tiêu chảy tại vùng ngoại thành

Hà Nội. Điều trị thử nghiệm. Luận án Tiến sĩ Nông Nghiệp, Trường Đại

Học Nông Nghiệp I.

12. Nguyễn Đức Hiền, 2017. Giáo trình Bệnh Truyền Nhiễm Gia Cầm.

NXB Đại học Cần Thơ, Trang 101-111.

13. Nguyễn Đức Hiền, Phạm Mạnh Hùng, 2012. Độc tính và tính gây bệnh

trên vịt của độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum phân lập tại thành phố

Cần Thơ. Tạp chí khoa học 2012 số 22c:40-46.

101

14. Nguyễn Đức Hiền, 2012. Phân lập và xác định tính nhạy cảm kháng sinh

của vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt và môi trường chăn thả tại

thành phố Cần Thơ. Tạp chí khoa học số 2012 số 22c:64-71.

15. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức

Trạch, 1972. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học. NXB

KHKT Hà Nội.

16. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, 2001. Vi

sinh vật học thú y. NXB Nông nghiệp Hà Nội.

17. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Đường, Nguyễn Khắc Tuấn, Nguyễn Thị

Bích Lộc, Nguyễn Bá Hiên, 2004. Vi sinh vật đại cương. NXB Nông

nghiệp Hà Nội.

18. Nguyễn Thiện, Lê Xuân Hồng và Nguyễn Công Quốc, 2005. Xóa đói

giảm nghèo bằng phương thức chăn nuôi kết hợp vịt-cá-lúa. Nhà xuất bản

Nông nghiệp, trang 9-19

19. Nguyễn Thượng Chánh, 2007. Tìm hiểu bệnh botulism. Tạp chí Y Dược

Ngày Nay.

20. Nguyễn Vĩnh Phước, 1977. Vi Sinh Vật Học Thú Y. Nhà xuất bản Đại

Học và Trung Học Chuyên Nghiệp – Hà Nội 1977.

21. Phùng Đức Tiến, 2013. Cẩm Nang Chăn Nuôi Vịt Ở Việt Nam. NXB

Nông Nghiệp.

22. Thái Hà- Đặng Mai, 2011. Kỹ thuật nuôi và chăm sóc vịt. NXB

Hồng Đức.

23. Trần Linh Thước, 2010. Xây dựng quy trình và chế tạo các bộ Kit PCR

để xét nghiệm các vi khuẩn gây bệnh, gây ngộ độc thực phẩm. NXB ĐH

Quốc gia Tp.HCM.

24. Trần Thị Dân, 2007. Giáo trình dịch tễ học thú y. Đại Học Nông Lâm

thành phố Hồ Chí Minh.

25. Peck, MW (2009). "Sinh học và phân tích bộ gen của vi khuẩn

Clostridium botulinum". Những tiến bộ trong sinh lý của vi sinh vật.

Những tiến bộ trong vi sinh vật Sinh lý học.

102

Tiếng anh

1. Alvarez-Perez S, Blanco JL, Bouza E, P Alba, Gibert X, Maldonado J,

Garcia ME, 2009. Prevalence of Clostridium difficile in diarrhoeic and

non-diarrhoeic piglets. Vet Microbiol, 137 (3-4): 302-305.

2. Anderson MW, Sharma K, Feeney CM, 1997. Wound botulism associated

with black tar heroin. Acad Emerg Med, 4: pp. 805-809

3. Anonymous, 2006. Investigation into Outbreaks of Clostridium

4. Aureli, P., L. Fenicia, B. Pasolini, M. Gianfranceschi, L. M. McCroskey, and C.

L. Hatheway, 1986. Two cases of type E infant botulism caused by

neurotoxigenic Clostridium butyricumin Italy. J. Infect. Dis. 154: pp. 207–211.

5. Arnon SA, Schecter R, Inglesby TV, Henderson DA, Bartlett JG, et al.,

2001. Botulinum toxin as a biological weapon. JAMA 285: pp. 1059–1070

6. Balauca N, 1978. Experimentelle Untersuchungen über die Clostridien

Infektion und Intoxikation bei Geflügel, unter besonderer

Berücksichtigung der Kokzidiose Arch Vet, 13:127-141.

7. Bauer A.W., Kirby W.M., Sherris J.C., 1966. Antibiotic susceptibility

testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol., 45, pp.

493-496.

8. Bauer A.W., Kirby W.M., Sherris J.C., Turck M., 1996. Antibiotic

susceptibility testing by a standardized single disk method. American

Journal of Clinical Pathology,45(4): pp.493–496.

9. Bell J.F., George W.S., Hubert A.A., 1955. A microenvironment concept

of the epizoology of avian botulism. Journal Wildlife Management, 19;

pp.352-357

10. Beier, R., G. Amtsberg, and M. Peters, 1994. Bacteriological

investigation of the occurrence and significance of Clostridium difficile

in horses. Pferde-heilkunde 10:3–7

11. Bengtson I.A, 1922. Preliminary note on a toxin-producing anaerobe isolated

from the larvae of Lucilia caesar. Public Health Rep 37: pp.164-170.

12. Berkhoff & H. A , 1991. Ulcerative enteritis (quail disease). p. 258–264.

13. Boroff D.A.., Reilly J.R., 1959. Studies of the toxin of Clostridium

botulinum. V. Prophylactic immunization of pheasants and ducks against

avian botulism. J Bacteriol 77: pp.142-146.

103

14. Bott., 1968. Possible origin of the fish incidences of Clostridium

botulinum type E in an inland bay (Green Bay of Lake Michigan). J.

Bacteriol 95: p.1542.

15. Bruggemann H., Gottschalk G., 2009. Clostridia: Molecular Biology in the

Post-genomic Era”. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-38-7.

16. Burgen. S. V., Dickến & Zatman. J., 1949. The action of botulinum toxin

on the neuromuscular junction. Journal of Physiology 109, 10-24.

17. Burke, G. S., 1919. The occurrence of Bacillus botulinus in nature. J

Bacteriol, 4, pp. 541–53

18. Bushara K.O., Park D.M., 1994. Botulinum toxin and sweating. Neurol

Neurosurg Psychiatry 1994; p.57

19. Carle, Rattone. G ,1884. Studio Sperimentale sull’ eziologia del tetano.

Gior. R. A cad. Med. Torino 32.174-180.

20. Cato, E. P., W. L. George, and S. M. Finegold, 1986. Genus Clostridium,

p.1141–1200. In P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M. E. Sharpe, and J. G.

Holt(ed.), Bergey’s manual of systematic bacteriology, vol. 2. Williams

and Wilkins, Baltimore, Md.

21. Caya, James G; Agni, Rashmi; Miller, Joan E., 2004. Clostridium

botulinum and the Clinical Laboratorian: A Detailed Review of Botulism,

Including Biological Warfare Ramifications Botulinum Toxin.

22. CDC, 1998. ‘Handbook for epidemiologists, clinicans, and laboratory

workers’. Botulism in the United statea, 1899-1996

23. CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), 2014. Performance

Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty- Fourth

International Supplement. M100-S24, Vol 34 N1. CLSI, Wayne,

Pennsylvania

24. Cherington M., 1998. Clinical spectrum of botulism. Muscle Nerve, 21:

701-710.

25. Cook L. Victor, Wei Hwa Lee, Charles P. Lattuada and Gerri M.

Ransom, 1998. Methods for the detection of clostridium Botulinum

toxins in meat and poultry products. In USDA/ FSIS Microbiology Laboratory Guidebook, 3rd edition

104

26. Clark W.E., 1987. Avian botulism” In Eklund M.W., and Dowell V.R.,

(eds.), Avian Botulism: An International Perspective. Charles C.

Thomas: Springfield, IL, pp. 89-105

27. Conrad M.E., and Barton C., 1981. Factors affecting iron balance. Am J

Hematol 10: pp. 199-225.

28. Cordoba, J.J., Collins, M.D. and East, A.K., 1995. Studies on the gene

encoding botulinum neurotoxin type A of Clostridium botulinum from a

variety of sources. Systematic and Applied Microbiology 18, pp. 12–22

29. Creti R., Fenicia J., Aureli P., 1990. Occurrence of Clostridium

botulinum in the soil of the vicinity of Rome. Curr. Microbiol 20: p.317

30. Daniel Leclair, Jeffrey M. Farber, Bill Doidge, Burke Blanchfield, Sandy

Suppa, Franco Pagotto and John W. Austin, 2013. Distribution of

Clostridium botulinum Type E Strains in Nunavik, Northern Quebec,

Canada. Appl. Environ. Microbiol. vol. 79 no. 2, pp. 646–654

31. Dean J.A., 1992. Lange’s handbook of chemistry” 14th edition. McGraw-

Hill: New York.

32. Debast SB, van Leengoed LA, Goorhuis A, Harmanus C, Kuijper EJ,

Bergwerff AA., 2009. Clostridium difficile PCR ribotype 078 toxinotype

V found in diarrhoeal pigs identical to isolates from affected

humans.Environ Microbiol. 11(2):505 – 511.

33. Deprez, P.R., 2006. Tetanus and botulism in animals. In: Mainil, J. (Ed.),

Clostridial in Medical, Veterinary and Food Microbiology- Diagnosis

and Typing. European Commission, Luxembourgy, pp.27-36.

34. Dembek Z.F., Smith L.A., Rusnak J.M., 2007. Botulinum toxin. In:

Dembek ZR, ed. Medical aspects of biological warfare. Washington, DC:

Office of the Surgeon General, Borden Institute, Walter Reed Army

Medical Center, 16: pp. 337-345.

35. Dennis P.Wages, Kenneth Opengar, 2003. Poultry Health Management

Master of Specialized Veterinary Medicine (MSpVM).

36. Dickson E.C., 1917. Botulism, a case of limberneck in chickens”. J Am

Vet Med Assoc 50: pp. 612-613

37. Dickson E.C., 1917. Botulism, a case of limberneck in chickens”. J Am

Vet Med Assoc 50: pp. 612-613

105

38. Dohms J.E., 1987. Laboratory investigation of botulism in poultry. In

Eklund M.W., and Dowell V.R. (eds.), Avian Botulism: An International

Perspective. Charles C. Thomas: Springfield, IL, pp. 295-314.

39. Dohms J.E., Cloud S.S., 1982. Susceptibility of broiler chickens to

Clostridium botulinum type C toxin. Avian Dis.26: pp. 89-96.

40. Dohms J.E., Allen P.H., Rosenberger J.K., 1982. Cases of type C

botulism in broiler chickens. Avian Dis. 26: pp. 204-210

41. Dover, N.; Barash, J. R, J.R.; Hill, K.K.; Xie, G.; Arnon, S.S., January

2014. Molecular characterization of a novel botulinum neurotoxin type H

gene. Journal of Infectious Diseases

42. Dressler D, Benecke R., 2007. Pharmacology of therapeutic botulinum

toxin preparations. J Disability & Rehabilitation 29:1761-86.

43. Droual R, Shivaprasad HL, Chin RP ,1994. Coccidiosis and necrotic

enteritis in turkeys. Avian Dis 38:177–183

44. Droual R, Farver TB, Bickford AA, 1995. Relationship of sex, age, and

concurrent intestinal disease to necrotic enteritis in turkeys. Avian Dis

39:599–605.

45. Dressler D., 2006. Pharmakologische Aspekte therapeutischer

Botulinum-Toxin-Präparationen. Pharmacological aspects of therapeutic

botulinum toxin preparations in German.

46. Dezfulian M., Dowell V.R., 1980. Cultural and physiological

characteristics and antimicrobial suspectibility of Clostridium botulinum

isolates from foodborne and infant botulism cases. Journal of Clinical

Microbiology, 11 (6), pp. 604-609.

47. Dickerson J.T., Janda K.D., 2006. The Use of Small Molecules to

Investigate Molecular Mechanism and Therapeutic Targets for Treatment of

Botulinum Neurotoxin a Intoxication. ACS Chem Biol. 1(6): pp. 359-359

48. Dickson E.C., 1917. Botulism, a case of limberneck in chickens”. J Am

Vet Med Assoc 50: pp. 612-613.

49. Dohms J.E., Allen P.H., Rosenberger J.K., 1982. Cases of type C

botulism in broiler chickens”, Avian Dis. 26: pp. 204-210.

50. Dohms J.E., Cloud S.S., 1982. Susceptibility of broiler chickens to

Clostridium botulinum type C toxin. Avian Dis.26: pp. 89-96.

106

51. Dohms J.E., 2003. Botulism. Diseases of poultry” 11th Edition, Editor-

in-Chief Y.M. Saif produced and distributed by Iowa State Press, A

Blackwell Publishing Company, p. 786 – 790.

52. Dohms J.E., 1987. Laboratory investigation of botulism in poultry. In

Eklund M.W., and Dowell V.R. (eds.), Avian Botulism: An International

Perspective. Charles C. Thomas: Springfield, IL, pp. 295-314.

53. Dowell V.R., Jr., and Hawkins T.M., 1974. Laboratory methods in

anaerobic bacteriology: CDC laboratory manual. U.S. Department of

Health, Education, and Welfare, Atlanta, Ga.

54. Dressler D., 2006. Pharmakologische Aspekte therapeutischer

Botulinum-Toxin-Präparationen. Pharmacological aspects of therapeutic

botulinum toxin preparations in German”.

55. Eales C.E., Gillespie J.M., 1947. The isolation of Clostridium botulinum

type A from Victorian soils. Aust. J. Sci. 10: pp. 20-21

56. Eklund M.W., Peterson M.E., Poysky F.T., Peck L.W., Conrad J.F.,

1984. Botulism in juvenile Coho salmon (Onocorhynchus kisutch). In the

United States. Aquaculture 27: pp. 1-11

57. Fenicia L., Ferrini A.M., Anniballi F., Mannoni V., Aureli, P., 2003.

Considering the antimicrobial sensitivity of the intestinal botulism agent

Clostridium butyricum when treating concomitant infections. European

Journal of Epidemiology, 18 (12), pp. 1153-1154.

58. Foran, P. G., N. Mohammed, G. O. Lisk, S. Nagwaney, G. W. Lawrence,

E. Johnson, L. Smith, K. R. Aoki, and J. O. Dolly, 2003. Evaluation of

the therapeutic usefulness of botulinum neurotoxin B, C1, E, and F

compared with the long lasting type A.

59. Franciosa G., 1996. PCR for Detection of Clostridium botulinum Type C

in Avian and Environmental Samples. JOURNAL OF CLINICAL

MICROBIOLOGY, Apr. 1996, Vol. 34, No. 4 .1996, American Society

for Microbiology, p. 882–885.

60. Friend M., 1996. Increased avian diseases with habitat change. Pages

401-405 in La Roe E.T., Farris G.S., Puckett C.E., Doran P.D., and Mac

M.J. editors. Our living resources: a report to the nation on the

distribution, abundance, and health of U.S. plants, animals, and

107

ecosystems. U.S. Department of the Interior, National Biological Service,

Washington, D.C. p.530.

61. Friend M., Franson J.C., 1999. Field manual of wildlife diseases. General

field procedures and diseases of birds. U.S. Department of the Interior,

U.S. Geological Survey, Information and Technology Report 1999-200 1

62. Friend M., Pearson G.L., 1973. Duck plague (Duck Virus Enteritis) in

wild waterfowl. U.S. Department of Interior, Bureau of Sport Fisheries

and Wildlife. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.

63. Furmanov S., Bezkorovainy A., 1997. Ferrous Iron Oxidation by

Lactobacillus acidophilus and Its Metabolic Products. Agric J. Food

Chem. 1995, 43, 1276 -1282

64. Franciosa G., 1996. PCR for Detection of Clostridium botulinum Type C

in Avian and Environmental Samples. JOURNAL OF CLINICAL

MICROBIOLOGY, Apr. 1996, Vol. 34, No. 4 .1996, American Society

for Microbiology, p. 882–885.

65. Gallagher BA, 1924. Ulcerative enteritis in quail. Am Game Prot Assoc

Bull:14–15.

66. Glover, J. S., 1951. Ulcerative enteritis in pigeons. Can J Comp Med

Vet Sci 15:295—297

67. Ghanem F.M., Ridpath A.C., Moore W.E., Moore L.V., 1991.

Indentification of Clostridium Botulinum, Clostridium argentinase, and

Related Organism by Cellular Fatty Acid Analysis. Journal of Clinical

Microbiology, June 1991. pp. 1114-1124.

68. Giltner L.T., Couch J.F., 1930. Western duck sickness and botulism.

Science 26 December 1930: Vol. 72 no. 1878 p. 660.

69. Gime´nez, D.F. and Cicarelli, A.S., 1970a. Studies on strain 84 of

Clostridium botulinum. Zentralblatt fuer Bakteriologie Parasitenkunde

Infektionskrankheiten und Hygiene, Abt. 1 Orig. Reihe A 215, pp. 212–220.

70. Gimenez, D.F. and Cicarelli, A.S., 1970b. Another type of Clostridium

botulinum. Zentralblatt fuer Bakteriologie Parasitenkunde

Infektionskrankheiten und Hygiene, Abt. 1 Orig. Reihe A 215, pp. 221–224.

71. Gross W.B., Smith L.D.S., 1971. Experimental botulism in gallinaceous

birds. Avian Dis 15: pp. 716-722.

108

72. Giovanna Franciosa, Lucia Fencicia, Carlo Caldiani and Paolo Aureli,

1996. PCR for Detection of Clostridium botunium Type C in Avian and

Environmental Sample. Journal of Clinical Microbiology, Apr. 1996, p.

882-885

73. Gross W.B., Smith L.D.S., 1971. Experimental botulism in gallinaceous

birds. Avian Dis 15: pp. 716-722.

74. Guardabbasi L. and P. Courvalin, 2006. Modes of Antimicrobial Action

and Mechanisms of Bacterial Resistance. In Antimicrobial resistance in

bacteria of animal origin. Amirican Society of Microbiology. ASM Press.

Washington DC. 442 pages

75. Gunnison, J.B. and Meyer, K.F., 1929. Cultural study of an international

collection of Clostridium botulinum and parabotulinum Journal of

Infectious Diseases 45, pp. 119–134

76. Haagsma N., 1987. Laboratory investigation of botulism in wildbirds. In

Eklund M.E., Dowell V. R. (eds.), 1999. Avian Botulism: An International

Perspective. Charles C. Thomas: Springfield, IL, pp. 283 – 293

77. Haim M. Solomon and Timothy Lilly, Jr., 2001. Bacteriologycal

Analytical Manual. Chapter 17 Clostridium botulinum. In Bam:

Clostridium botulinum. U. S. Food and Drug Administration

78. Hall, J. D., L. M. McCroskey, B. J. Pincomb, and C. L. Hatheway,1985.

Isolation of an organism resembling Clostriium baratii which produces

type F botulinal toxin from an infant with botulism. J. Clin. Microbiol.21:

pp. 654–655.

79. Halpern JL, Neale EA ,1995. Neurospecific binding, internalization, and

etrograde axonal transport. Curr Top Microbiol Immunol, 195: 221-241

80. Hauschild A.H.W., 1989. Clostridium botulinum. In M. P. Doyle (ed.),

Food-borne Bacterial Pathogens. Marcel Dekker, New York, pp. 111-189.

81. Hatheway, C.L. and McCroskey, L.M., 1989. Unusual neurotoxigenic

clostridia recovered from human fecal specimens in the investigation of

botulism. In Proceedings of the 5th International Symposium on

Microbial Ecology: Recent Advances in Microbial Ecology ed. Hattori,

T., Ishida, Y., Maruyama, Y., Morita, R.Y. and Uchida, A. pp. 477–481.

Japan Scientific Societies Press.

109

82. Hatheway, C.L., 1990. Toxigenic clostridia. Clinical Microbiology

Reviews 3, pp. 66–98

83. Hatheway, C.L., 1992. Clostridium botulinum and other clostridia that

produce botulinum neurotoxin, In Clostridium botulinum-Ecology and

Control in Foods ed. Hauschild, A.H.W. and Dodds K.L. pp. 3–20. New

York: Marcel Dekker.

84. Hatheway CL, 1995. Botulism: The present status of the disease. Curr

Top Microbiol Immunol, 195: pp. 55–75

85. Harris, A. H.,1961. An outbreak of ulcerative enteritis amongst

bobwhite quail (Colinus virginianus). Vet Rec 73:11—13

86. Harvey, S. M., J. Sturgeon, and D. E. Dassey, 2002. Botulism due to

Clostridium baratii type F toxin. J. Clin. Microbiol. 40:2260-2262

87. Holdeman, L.V. and Brooks, J.B., 1970. Variation among strains of

Clostridium botulinum and related clostridia. In Proceedings of the First

U.S.-Japan Conference of Toxic Microorganisms ed. Herzberg, M. pp.

278–286. Washington DC: US Government Printing Office

88. Holzer, V. E., 1962. Botulism from inhalation. Med. Klin. 57:1735-1738

89. Hopman NE, Keessen EC, Harmanus C, Sanders IM, van Leengoed LA,

Kuijper EJ, Lipman LJ , 2011. Acquisition of Clostridium difficile by

piglets. Vet Microbiol;149(1-2):186 – 192.

90. Huss, H. H., 1980. Distribution of Clostridium botulinum. Appl. Environ.

Microbiol39 (4): 764–769

91. Hubálek Z., Halouka J., 1991. Persistence of Clostridium botulinum type

C toxin in blow fly (Calliphoridae) larvae as a possible cause of avian

botulism in spring. Journal of Wildlife Diseases; 27(1): pp. 81-85.

92. Inglett, P. W., 2005. Stable nitrogen isotopic ratios as an indicator

of wetland eutrophication. A case study in the Florida Everglades. Ph.D.

dissertation, Univ. of Florida

93. Iohansen.A, 1963. Journal of Applied Bacteriology 4/1963

94. Jensen W.I., Duncan R.M., 1980. The susceptibility of the mallard duck

(Anas platyrhynchos) to Clostridium botulinum C2 toxin. Jpn J Med Sci

Biol 1980 Apr; 33(2): pp. 81-6.

110

95. Jeffery J.S., Galey F.D., Meteyer C.V., Kinde H., and Rezvani M., 1994.

Type C botulism in turkeys: Determination of the median toxic dose”. J

Vet Diagn Invest 6: pp. 93-95.

96. Jones, R. L., W. S. Adney, and R. K. Shideler, 1987. Isolation of

Clostridium difficile and detection of cytotoxin in the feces of diarrheic

foals in the absence of antimicrobial treatment. J. Clin. Microbiol.

25:1225–1227.

97. Jones, R. L., R. K. Shideler, and G. L. Cockerell, 1988. Association of

Clostridium difficile with foal diarrhea. In Proc. 5th Int. Conf. Equine

Infect. Dis. The University Press of Kentucky, Lexington.

98. Johnson, R. O., S. A. Clay, and S. S. Arnon, 1979. Diagnosis and

management of infant botulism. Am. J. Dis. Child. 133:586.

99. Johnson E.A., Summanen P., Finegold S.M., 2007. Clostridium. In P.R.

Murray, E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M.L. Landry & M.A. Pfaller (Eds.),

Manual of Clinical microbiology, 9th eds., Washington, DC: ASM press.

pp. 889-910.

100. Kalmbach C., Gunderson., 1934. Infectious Diseases of Wild Birds.

Edited by Nancy J. Thomas; D. Bruce Hunter; Carter T. Atkinson.

Blackwell publishing

101. Kang, M. S., A. Kim, B.Y. Jung, M. J. Kim, S. J. Joh, Y. J. Lee, Y.H.

Bong, N.R. Shin, C.B. Yang, and J. H. Kwon, 2008. An outbreak of

botulism in wild ducks in the Tancheon. In Proceedings of the 2008

KSVS Conference and General Meeting, Korean Journal of Veterinary

Science. 25–26 September 2008, Gwangju, Korea, Korean Society of

Veterinary Science, pp. 281.

102. Katiyar, A. K., A. G. R. Pillai, R. P. Awadhiya, and J. L. Vegad, 1986.

An outbreak of ulcerative enteritis in chickens. Indian J Anim Sci

56:859—862

103. Kaufmann, O.W. and L.D. Fay, 1964. Clostridium botulinum type E

toxin in tissues of dead loons and gulls. Michigan State University

Agricultural Experiment Station Quarterly Bulletin. 47(2):236-242

111

104. Kirma, N., J. L. Ferreira, and B. R. Baumstark, 2004. Characterization of

six type A strains of Clostridium botulinum that contain type B toxin

gene sequences. FEMS Microbiol. Lett. 231:159-164.

105. Kitasato. S., 1889. Die Widerstandfihigkeit der Cholerabacterien gegenn

das Eintrocknen und gegen Hitze. Z. H. Infektionskrankh., 6, 134-140

106. Kondo, F., J. Tottori, and K. Soki, 1988. Ulcerative enteritis in broiler

chickens caused by Clostridium colinum and in vitro activity of 19

antimicrobial agents in tests on isolates. Poult Sci 67(10):1424—1430

107. Leighton F.A., 2000. Type C Botulism in Birds. Canadian Corporative of

Wildlife Health Centre.

108. Leslie G. A., L. N. Martin., 1973. Studies on secretory immunologic

system of fow. 3. Serum and secretory IgA of the chicken. J. Immuno.,

110 (1), 1-9

109. Locke L.N., Friend M., 1989. Avian botulism: Geographic Expansion of a

Historic Disease. USGS. National Wildlife Health Research Center. pp. 579.

110. Lúquez C, Bianco MI, de Jong LIT, et al., 2005. Distribution of Botulinum

Toxin-Producing Clostridia in Soils of Argentina. Applied and Environmental

Microbiology.;71(7):4137-4139. doi:10.1128/AEM.71.7.4137-4139.2005.

111. MacDonald KL, Cohen ML, Blake PA, 1986. The changing

epidemiology of adult botulism in the United States. Am J Epidemiol,

124(5): 7949.

112. Maselli RA, Ellis W, Mandler RN, Sheikh F, Senton G, Knox S, Salari-

Namin H, Agius M, Wollmann RL, Richman DP, 1997. Cluster of

wound botulism in California: clinical, electrophysiologic, and

pathologic study. Muscle Nerve, 20: pp. 1284–1295.

113. McCroskey, L.M., Hatheway, C.L., Fenicia, L., Pasolini, B. and Aurelia,

P., 1986. Characterization of an organism that produces type E botulinal

toxin but which resembles Clostridium botulinum from the feces of an

infant with type E botulism. Journal of Clinical Microbiology 23, pp.

201–202.

114. McLauchlin J, Grant KA, Little CL, 2006. Foodborne botulism in the

United Kingdom. J Public Health (Oxf). Dec; 28 (4) :337-42. Epub 2006

Aug 17.

112

115. Mechem CC & Walter FG, 1994. Wound botulism. Vet Human Toxicol,

36(3): pp. 233–237.

116. Megan E. Reller, Richar W. Douce, Susan E. Maslanka, Dawin S.

Torres, Stephen R. Manock and Jeremy Sobel, 2006. Wound botulism

acquired in the Amazonian rain forest of Ecuador. Am J Trop Med Hyg

April vol. 74 no. 4, pp. 628–631 .

117. Meyer, K.F. and Gunnison, J.B., 1929. South African cultures of

Clostridium botulinum and parabotulinum. XXXVIL (with a description

of Cl. botulinum type D, n. sp.). Journal of Infectious Diseases 45, pp.

106–118.

118. Mohammed Sebaihial., et al, 2007. Clostridium novyi, Edited by student

of Rachel Larsen and Kit Pogliano.

119. Miia Lindstrom và Hannu Korkeala, 2006. Laboratory diagnostics of

botulism. Clinical microbiology reviews, Apr. 2006, p. 298-314

120. Mitchell, W. R. and S. Rosendal, 1987. Type C botulism: The agent, host

susceptibility, and predisposing factors. In M. W. Eklund and V. R.

Dowell, Jr. (eds.). Avian Botulism: An International Perspective.

Charles C. Thomas: Springfield, IL, 55—71.

121. Mohammed Sebaihial et al., 2007. Clostridium novyi. Edited by student

of Rachel Larsen and Kit Pogliano.

122. Mengesha et al., 2009. Clostridia in Anti-tumor Therapy. Clostridia:

Molecular Biology in the Post-genomic Era. Caister Academic Press.

ISBN 978-1-904455-38-7

123. Midura T.F., 1996. Infant botulism: identification of Clostridium

botulinum and its toxin in faeces. Lancet II: pp. 934-936.

124. Meites E, Zane S, Gould C, 2010. Fatal Clostridium sordellii infections

after medical abortions. New England Journal of Medicine

125. Magidan M, Martinko J, 2006. Biology of Microorganisms

126. Nantel J.A., 2002. Clostridium botulinum. International Program on

Chemical Safety. World Health Organization 858. Poisons Information

Monograph: Bacteria. pp. 1 – 32.

127. Na-Ri Shin, Seong hwan Byun, Jeong Hoon Chun, Jeong Hwa Shin,

Yun Jeong Kim, Jeong-Hee Kim, Gi-eun Rhie, Hyen Mi Chung, In-Pil

113

Mo, and Cheon-Kwon Yoo., 2010. An Outbreak of Type C Botulism in

Waterbirds: Incheon, Korea. In SHORT COMMUNICATIONS. Journal

of Wildlife Diseases, 46(3), 2010, pp. 912–917

128. Nantel J.A., 2002. Clostridium botulinum. International Program on

Chemical Safety. World Health Organization 858. Poisons Information

Monograph: Bacteria. pp.1–32.

129. Notermans S., Dufrenne J., Kozaki S., 1980. Notermans. Removal and

inactivation of botulinum toxin during production of drinking water from

surface water. Antonie van Leeuwenhoek 46: pp. 511–514.

130. Panada A. K, M. R. Reddy, 2007. Boosting the chick’s immune system

through early nutrition. Poult. Int.,

131. Quinn P.J, Carter M.E., Markey B., Carter G.R., 1994. Clinical

veterinary microbiology. Wolfe Publishing. London, UK, p. 648.

132. Ohye D.F., Scott W.J., 1957. Studies in the physiology of Clostridium

botulinum type. E. Aust. L. Biol. Sci.10: pp. 85–94

133. Pecelunas K.S., Wages D.P., Helm J.D., 1999. Botulism in chickens

associated with elevated iron levels. Avian Dis. 43: pp. 783-787.

134. Quinn P.J, Carter M.E., Markey B., Carter G.R., 1994. Clinical

veterinary microbiology. Wolfe Publishing. London, UK, p. 648.

135. Roblot P, Roblot F, Fauchère JL, Devilleger A, Maréchaud R, Breux JP,

Grollier G, Becq-Giraudon B, 1994. Retrospective study of 108 cases of

botulism in Poitiers, France. J Med Microbiol, 40: pp. 379–384

136. Roberts T.A., Aitken I.D., 1974. Botulism in birds and mammals in Great

Britain and an assessment of the toxicity of Clostridium botulinum type

C toxin in domestic fowl. In Barker A.N., Gould G.W., Wolf J. (eds.).

Spore Research 1973. Academic Press: London, pp. 1- 9.

137. Rocke T.E., Friend M., 1997. Avian Botulism. Madison WI: Department

of the Interior, 1999: pp. 271-286.

138. Rocke T.E., Bollinger T., 2007. Disease Emergence and Reemergence.

The Wildlife – Human Connection U.S. Geological Survey, Reston, VA,

p. 388.

114

139. Rosen M.N., 1971. Botulism. In J. W. Davis, R. C. Anderson, L. Karstad,

and D. O. Trainer (eds.). “Infectious and Parasitic Diseases of Wild

Birds”. Iowa State University Press: Ames, IA, pp. 100 – 117.

140. Runningen J., 1990. Growth and toxigenesis of c botulinum type e in

fishes packaged under modified atmospheres. International Journal of

Food Microbiolgy. May 1990.

141. Ryan K.J., Ray C.G., 2004. Sherris Medical Microbiology. McGraw Hill.

ISBN 0-8385-8529-9.

142. Rocke T.E., Bollinger T., 2007. Disease Emergence and Reemergence.

The Wildlife – Human Connection U.S. Geological Survey, Reston, VA,

p. 388.

143. Rosen M.N., 1971. Botulism. In J. W. Davis, R. C. Anderson, L. Karstad,

and D. O. Trainer (eds.). “Infectious and Parasitic Diseases of Wild

Birds”. Iowa State University Press: Ames, IA, pp. 100 – 117.

144. Sato S., 1987. Control of botulism in poultry flocks. In M. W. Eklund

and V. R.

145. Szabo E.A., J. M. Pemberton, A. M. Gibson, R. J. Thomas, R. R. Pascore

and P. M. Desmarchelier, 1994. Application of PCR to a Clinical and

Enviromental Investigation of a Case of Equine Botulism. Journal of

Clinical microbiology, Aug. p. 1986-1991

146. Shaw R.M., Simpson G.S., 1936. The anaerobic bacteria: their activities

in nature and disease. A Subject Bibliography-By Elizabeth. McCoy and

L. S. McClung.

147. Skerratt L.F., Franson J.C., Meteyer C.U., Hollmen T.E., 2005. Causes of

mortality in sea ducks. (Mergini) necropsied at the USGS-National

Wildlife Health Center. Waterbirds 28: pp. 192-206.

148. Smith G.R., 1987. Botulism in water birds and its relation to comparative

medicine. In Eklund M.E, Dowell V.R. (eds.). Avian Botulism: An

International Perspective. Charles C. Thomas: Springfield, IL, pp. 73-86.

149. Saif Y.M., Barnes H.J, Glisson J.R, Fadly A.M., McDougald L.R., Swayne D.E., 2003. Diseases of Poultry 11th Ed. Wiley – Blackwell

Publisher, pp. 785 – 791.

115

150. Sato S., 1987. Control of botulism in poultry flocks. In M. W. Eklund

and V. R. Dowell, Jr. (eds.). Avian Botulism: An International

Perspective. Charles C. Thomas: Springfield, IL, pp. 349 – 356.

151. Schettler C.H., 1979. Clostridium botulinum type C toxin infection in

broiler farms in North West Germany.Berl Munch Tierarztl Wochenschr

92: pp.50-57.

152. Scott K.M., Henn-Sax M., Harmer T.L., Longo D.L, Frame C.H.,

Cavanaugh C.M., 1993. Kinetic isotope effect and biochemical

characterization of from IA RubisCO from the marine cyanobacterium

Prochlorococcus marinus MIT 9313”. Department of Boilogy, University

of South Florida, Tampa, Florida 33620.

153. Segner W.P., Schmidt C.F., 1971. Heat resistance of spores of marine

and terrestrial strains of Clostridium botulinum type C”. Appl Microbiol

22: pp.1030-1033.

154. Seddon, H.R., 1922. The specific identify of Bacillus parabotulinus.

Journal of Comparative Pathology and Therapy 35, pp. 275–280

155. Shaw R.M., Simpson G.S., 1936. The anaerobic bacteria: their activities

in nature and disease. A Subject Bibliography-By Elizabeth. McCoy and

L. S. McClung.

156. Shapiro, Roger L., et al., 1998. Botulism in the United States: A Clinical

and Epidemiologic Review. Ann Internal Med. August 1; 129(3): pp.

221–228.

157. Shelley EB, O'Rourke D, Grant K, McArdle E, Capra L, Clarke A,

McNamara E, Cunney R, McKeown P, Amar CF, Cosgrove C, Fitzgerald

M, Harrington P, Garvey P, Grainger F, Griffin J, Lynch BJ, McGrane G,

Murphy J, Ni Shuibhne N, Prosser J. Infant botulism due to C. butyricum

type E toxin: a novel environmental association with pet terrapins.

158. Skerratt L.F., Garner T.W.J., Hyatt A..D, 2005. Tropical Infectious

Diseases. Research Centre at James Cook University.

159. Skerratt L.F., Franson J.C., Meteyer C.U., Hollmen T.E., 2005. Causes of

mortality in sea ducks, (Mergini) necropsied at the USGS-National

Wildlife Health Center. Waterbirds 28: pp. 192-206.

116

160. Smith G.R, 1987. Botulism in water birds and its relation to comparative

medicine. In Eklund M.E, Dowell V.R. (eds.). Avian Botulism: An

International Perspective. Charles C. Thomas: Springfield, IL, pp. 73-86.

161. Smith L.D.S., 1975. The Pathogenic Anaerobic Bacteria, 2nd ed. Charles

C. Thomas: Springfield, IL, pp.203-229.

162. Snipe T., Hermann S., 1928. Studies on Botulinus Toxin: 3. Acid

Precipitation of Botulinus Toxin. The Journal of Infectious Diseases.

University of Chicago Press, 43 (2): pp. 152–160.

163. Slovis CM, Jones ID, 1998. Botulism and food poisoning. In Clinical

management of poisoning and drug overdose. Eds Haddon, Shannon and

Winchester. 3rd ed. Pp. 399-406, Saunders and Co, Philadelphia.

164. Sobel, J., N. Tucker, A. Sulka, J. McLauchlin, and S. Maslanka, 2004.

Foodborne botulism in the United States, 1990-2000. Emerg. Infect.

Dis.10:1606-1611

165. Soos C., Wobeser G., 2006. Identification of Primary Substrate in the

Initiation of Avian Botulism Outbreaks. The Journal of Wildlife

Management. pp. 43-53.

166. Summanen P, Baron EJ, Citron DM, Strong CA, Wexler HM, Finegold

SM., 1993. Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual. 5th Edition, Star

Publishing Co., Belmont, CA.

167. Suen, J. C., C. L. Hatheway, A. G. Steigerwalt, and D. J. Brenner 1988.

Clostridium argentinense, sp. nov: a genetically homogenous group

composed of all strains of Clostridium botulinum type G and some

nontoxigenic strains previously identified as Clostridium subterminale or

Clostridium hastiforme. Int. J. Syst. Bacteriol. 38:375.

168. Swenson J.M., Thornsberry C., McCroskey L.M., 1980. Susceptibility of

Clostridium botulinium to thirteen antimicrobial agents”. Antimicrobial

Agents and Chemotherapy, 18 (1), pp. 13-19.

169. Tanzi M.G., Gabay M.P., 2002. Association between honey consumption

and infant botulism. Pharmacotherapy 22 (11): pp. 1479-83.

170. Talaro, Talaro., 2002. Microbial Biosorption of Metals. Edited by Pavel

Kotrba, Martina Mackova, Tomas Macek. ISBN-10: 9400704429; ISBN-

13: 978-9400704428

117

171. Tahseen Abdul-Aziz, 2019. Botulism in Poultry. The The Merck

Veterinary Manual

172. Tsai, S. S., P. C. Wang, and C. D. Chang, 1986. Ulcerative enteritis in

replacement chickens. Taiwan J. Vet. Med. Anim. Husb. 47:45–49.

173. Todar K., 2009. Botulism. University of Wisconsin-Madison Department

of Bacteriology. The Microbial World. pp.1 - 4.

174. Tonie E. Rocke and Milton Friend, 1998. Avian Botulism. Field Manual

of Wildlife Diseases, chapter 38

175. Thomas Mark Carroll II, 2008. Germination protease: An atypical

aspartic acid protease in Bacillus and Clostridium. Bio-chemistry,

Doctoral Thesis / Dissertation, University of Connecticut. p. 141.

176. Wobeser G.A., 1997. Diseases of wild waterfowl. ISBN 0-306-45590-0,

1997, 1981 Plenum Press, New York. A division of Plenum Publishing

Corporation.

177. Wobeser G.,1988. Effects of botulism on ducks drinking saline water J

Wildl Dis, 24(2):240-245)

178. Yeh, C., Liang, C., Yang, C., Wey, J., Tsui, P., Wu, H., Yu, C., & Shyu,

R. (2014). Comparison of immunostrips with mouse bioassay and

bacterial culture in detecting botulinum toxins in bottles from suspected

Taiwan high-speed rail bomber. Forensic Toxicology, 32, 258-265.

179. Yule A.M., Austin J.W., Barker I.K., Cadieux B., Moccia R.D., 2006.

Persistence of Clostridium botulinum neurotoxin type E in tissues from

selected freshwater fish species: implications to public health. Journal of

Food Protection 69: pp. 1164-1167

180. Valli E., Summers D., 1990. The Nest Gatherers of Tiger Cave. In

National Geographic.

181. Wells C.L., Wilkins T.D., 1996. Clostridia: Sporeforming Anaerobic

Bacilli in: Baron's Medical Microbiology. (Baron S. et al., eds.) (4th).

Univ of Texas Medical Branch.

182. WHO., 2010. International Programme on Chemical Safety Poisons

Information Monograph 858.

118

183. Wobeser G.A., 1997. Diseases of wild waterfowl. ISBN 0-306-45590-0,

1997, 1981 Plenum Press, New York. A division of Plenum Publishing

Corporation.

184. UK Standards for Microbiology Investigations, 2011. Identification of

Clostridium Species".

185. Vidal D, Anza I, Taggart MA, Pérez Ramírez E, Crespo E, Hofle U,

Mateo R. 2013. Environmental factors influencing the prevalence of a

Clostridium botulinum type C/D mosaic strain in nonpermanent

Mediterranean wetlands. Appl. Environ. Microbiol. July vol. 79 no. 14,

pp. 4264–4271

186. Victor Cook L., Lee W.H., Charles P., Lattuada, Gerri M.R., 1998.

Method for the detection of Clostridium Botulinum toxins in meat and

poultry products. USDA/FSIS Microbiology Laboratory guidebook 3rd

Edition/1998. (14) pp. 1-9.

Website

1. http://www.fao.org

2. http://www.en.wikipedia.org

3. http://www.cfsph.iastate.edu

4. http://www.hpa-standardmethods.org.uk/documents/bsopid/ pdf/

5. http://www.sciencemag.org/content/72/1878/660.citation

6. http://wildpro.twycrosszoo.org/s/0zM_Firmicutes/clostridium/

7. http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/clostridium-eng.php

8. http://www.slideshare.net/

9. http://channuoivietnam.com/thong-ke-chan-nuoi/tk-thong-ke-chung

10. http://www. kimicontrol.com

11. http://www.foodnetworksolution.com/vocab/word/695

PHỤ LỤC

MẪU ĐIỀU TRA DỊCH BỆNH TRÊN ĐÀN VỊT Tỉnh : ......................................Huyện: ………………….Xã: …….......……………… 1. Họ tên chủ hộ: ………………………………Điện thoại.………………..…. 2. Địa chỉ: ………………………..………………………………….………… 3. Tổng đàn vịt đang nuôi: ……………………. Con. Trong đó:

119

Vịt con (dưới 4 tuần tuổi): ……......con; Vịt đẻ (>12 tuần tuổi): …........ con

Vịt thịt (từ 4-12 tuần tuổi): ……….…........ con Giống vịt : …………… 4. Phương thức nuôi:

Nuôi trang vịt Nuôi thả vườn quanh nhà Nuôi Chạy đồng

5. Thức ăn chăn nuôi

Lúa Vịt tự tìm mồi + Bổ sung lúa, TĂHH

Có

Thức ăn hỗn hợp 6. Hình thức phòng bệnh - Tiêm vaccine : - Phun thuốc sát trùng định kỳ: Không Không Có

7. Tình hình bệnh ở đàn vịt nuôi trong thời gian qua:

Năm 2012 Năm 2013 Năm 2014

Nội dung điều tra Tổng đàn nuôi trong năm

Số vịt bệnh trong năm

Số vịt chết trong năm

Nghi bệnh (liệt cổ, liệt chân)

8. Biểu hiện nào sau đây có xảy ra trên đàn vịt nuôi: Liệt chân: Vịt hay nằm, không đi hoặc đi xiêu vẹo

Liệt cánh: Cánh sã

Tiêu chảy: Tiêu chảy phân xanh, phân trắng…

Liệt cổ: Khi cầm lên, đầu vịt thòng xuống do cổ bị liệt không nâng đầu lên

được

Vịt có biểu hiện liệt cổ sau khi thả tìm mồi nơi bãi bùn khi thủy triều xuống.

Vịt có biểu hiện liệt cổ sau khi thả vào ruộng lúa để tìm mồi

9. Thời gian thường xảy ra dịch bệnh

Đồng sau khi gặt lúa, ngập nước và nước rút cạn

Sau đợt nắng nóng kéo dài

Vịt sụt tìm thức ăn ở vũng nước đọng, ống bọng lúc nước cạn

10. Biện pháp xử lý khi vịt bị bệnh:

Chủ hộ nuôi vịt Người điều tra

KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ CÁC SỐ LIỆU

Mục đích nuôi

SL khảo sát (con)

SL bệnh (con)

Tỷ lệ (%)

Vịt thịt

99.676

905

0,91a

Vịt đẻ

87.374

1.330

1,52b

Bảng 4.3 Tỷ lệ bệnh botulism trên vịt đẻ và vịt thịt

120

Tổng

187.050

2.235

1,19

Chi-Square Test: vit thit, vịt đẻ Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts vit thit vịt đẻ Total 1 905 1330 2235 1191.00 1044.00 68.677 78.346 2 98771 86044 184815 98485.00 86330.00 0.831 0.947 Total 99676 87374 187050 Chi-Sq = 148.801, DF = 1, P-Value = 0.000

Bảng 4.10 Xác định type độc tố botulin

Type C

Type D

Type E

Type C+D

Type C+E Đối chứng

Kết quả

Số mẫu

Tỷ lệ (%)

Số mẫu

Tỷ lệ (%)

Số mẫu

Tỷ lệ (%)

Số mẫu

Tỷ lệ (%)

Số mẫu

Tỷ lệ (%)

Số mẫu

Tỷ lệ (%)

(1)

49

38,89

57,14

65

51,59

72

0

0

-

-

-

-

(2)

26

20,64

17,46

25

19,84

22

0

0

-

-

-

-

(3)

51

36

32

12

100

40,48a

25,40b

28,57b

5

3,97

2

1,59

Chi-Square Test: Type C, Type D, Type E Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Type C Type D Type E Total 1 51 36 29 116

121

38.67 38.67 38.67 3.934 0.184 2.417 2 75 90 97 262 87.33 87.33 87.33 1.742 0.081 1.070 Total 126 126 126 378 Chi-Sq = 9.428, DF = 2, P-Value = 0.009 Chi-Square Test: Type C, Type D Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Type C Type D Total 1 51 36 87 43.50 43.50 1.293 1.293 2 75 90 165 82.50 82.50 0.682 0.682 Total 126 126 252 Chi-Sq = 3.950, DF = 1, P-Value = 0.047 Chi-Square Test: Type C, Type E Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Type C Type E Total 1 51 29 80 40.00 40.00 3.025 3.025 2 75 97 172 86.00 86.00 1.407 1.407 Total 126 126 252 Chi-Sq = 8.864, DF = 1, P-Value = 0.003

122

Chi-Square Test: Type D, Type E Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Type D Type E Total 1 36 29 65 32.50 32.50 0.377 0.377 2 90 97 187 93.50 93.50 0.131 0.131 Total 126 126 252 Chi-Sq = 1.016, DF = 1, P-Value = 0.313

Bảng 4.11 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Clostridium botulinum từ các mẫu đất và nước ruộng

Loại mẫu

Mẫu đất ruộng

Mẫu nước trên ruộng

Địa điểm

Số mẫu kiểm tra

Tỷ lệ (%)

Tỷ lệ (%)

Số mẫu dương

Số mẫu dương

An Giang

159

20

12,58

25

15,72

Cần Thơ

141

22

15,60

25

17,17

Hậu Giang

144

27

18,75

31

21,53

Kiên Giang

156

36

23,08

37

23,72

Tổng cộng

600

105

17,5

118

19,67

Chi-Square Test: AG, CT, HG, KG Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts AG CT HG KG Total 1 23 22 25 35 105

123

27.82 24.68 25.20 27.30 0.837 0.290 0.002 2.172 2 136 119 119 121 495 131.18 116.33 118.80 128.70 0.177 0.062 0.000 0.461 Total 159 141 144 156 600 Chi-Sq = 4.000, DF = 3, P-Value = 0.261 Chi-Square Test: AG, CT Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts AG CT Total 1 23 22 45 23.85 21.15 0.030 0.034 2 136 119 255 135.15 119.85 0.005 0.006 Total 159 141 300 Chi-Sq = 0.076, DF = 1, P-Value = 0.783 Chi-Square Test: AG, HG Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts AG HG Total 1 23 25 48 25.19 22.81 0.190 0.210 2 136 119 255 133.81 121.19 0.036 0.040 Total 159 144 303 Chi-Sq = 0.475, DF = 1, P-Value = 0.491

124

Chi-Square Test: AG, KG Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts AG KG Total 1 23 35 58 29.28 28.72 1.345 1.371 2 136 121 257 129.72 127.28 0.304 0.309 Total 159 156 315 Chi-Sq = 3.330, DF = 1, P-Value = 0.068 Chi-Square Test: CT, HG Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts CT HG Total 1 22 25 47 23.25 23.75 0.067 0.066 2 119 119 238 117.75 120.25 0.013 0.013 Total 141 144 285 Chi-Sq = 0.160, DF = 1, P-Value = 0.689 Chi-Square Test: CT, KG Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts CT KG Total 1 22 35 57

125

27.06 29.94 0.946 0.855 2 119 121 240 113.94 126.06 0.225 0.203 Total 141 156 297 Chi-Sq = 2.230, DF = 1, P-Value = 0.135 Chi-Square Test: HG, KG Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts HG KG Total 1 25 35 60 28.80 31.20 0.501 0.463 2 119 121 240 115.20 124.80 0.125 0.116 Total 144 156 300 Chi-Sq = 1.205, DF = 1, P-Value = 0.272 Chi-Square Test: AG, CT, HG, KG Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts AG CT HG KG Total 1 20 22 25 35 102 27.03 23.97 24.48 26.52 1.828 0.162 0.011 2.712 2 139 119 119 121 498 131.97 117.03 119.52 129.48 0.374 0.033 0.002 0.555 Total 159 141 144 156 600 Chi-Sq = 5.678, DF = 3, P-Value = 0.128

126

Chi-Square Test: AG, KG Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts AG KG Total 1 20 35 55 27.76 27.24 2.170 2.212 2 139 121 260 131.24 128.76 0.459 0.468 Total 159 156 315 Chi-Sq = 5.309, DF = 1, P-Value = 0.021 So sánh tỷ lệ của mẫu nước giữa các địa phương Chi-Square Test: AG, CT, HG, KG Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts AG CT HG KG Total 1 25 25 31 37 118 31.27 27.73 28.32 30.68 1.257 0.269 0.254 1.302 2 134 116 113 119 482 127.73 113.27 115.68 125.32 0.308 0.066 0.062 0.319 Total 159 141 144 156 600 Chi-Sq = 3.836, DF = 3, P-Value = 0.280 Chi-Square Test: AG, CT Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts AG CT Total 1 25 25 50

127

26.50 23.50 0.085 0.096 2 134 116 250 132.50 117.50 0.017 0.019 Total 159 141 300 Chi-Sq = 0.217, DF = 1, P-Value = 0.642 Chi-Square Test: AG, HG Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts AG HG Total 1 25 31 56 29.39 26.61 0.655 0.723 2 134 113 247 129.61 117.39 0.148 0.164 Total 159 144 303 Chi-Sq = 1.690, DF = 1, P-Value = 0.194 Chi-Square Test: AG, KG Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts AG KG Total 1 25 37 62 31.30 30.70 1.266 1.291 2 134 119 253 127.70 125.30 0.310 0.316 Total 159 156 315 Chi-Sq = 3.184, DF = 1, P-Value = 0.074

128

Chi-Square Test: CT, HG Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts CT HG Total 1 25 31 56 27.71 28.29 0.264 0.259 2 116 113 229 113.29 115.71 0.065 0.063 Total 141 144 285 Chi-Sq = 0.651, DF = 1, P-Value = 0.420 Chi-Square Test: CT, KG Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts CT KG Total 1 25 37 62 29.43 32.57 0.668 0.604 2 116 119 235 111.57 123.43 0.176 0.159 Total 141 156 297 Chi-Sq = 1.607, DF = 1, P-Value = 0.205 Chi-Square Test: HG, KG Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts HG KG Total 1 31 37 68

129

32.64 35.36 0.082 0.076 2 113 119 232 111.36 120.64 0.024 0.022 Total 144 156 300 Chi-Sq = 0.205, DF = 1, P-Value = 0.651

Bảng 4.12 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. botulinum từ các mẫu cua và ốc ruộng

Loại mẫu

Cua

Ốc

Địa điểm

Số mẫu kiểm tra

Số mẫu dương

Tỷ lệ (%)

Số mẫu kiểm tra

Số mẫu dương

Tỷ lệ (%)

An Giang

63

5

7,94

106

4

3,77

Cần Thơ

42

3

7,14

94

3

3,19

Hậu Giang

50

4

8,00

96

2

2,08

Kiên Giang

61

6

9,84

104

3

2,88

Tổng cộng

8,33

400

216

18

12

3,00

Chi-Square Test: cua, oc Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts cua oc Total 1 18 12 30 10.52 19.48 5.319 2.873 2 198 388 586 205.48 380.52 0.272 0.147 Total 216 400 616 Chi-Sq = 8.611, DF = 1, P-Value = 0.003 * NOTE * Command canceled.

130

Bảng 4.17 Kết quả khảo sát bệnh tích đại thể trên vịt thử nghiệm độc tố botulin (n=64)

Bệnh tích

Đối chứng

Tỷ lệ (%)

Số vịt thí nghiệm có biểu hiện bệnh tích

Phổi tụ huyết

0/8

52

81,25

Lách sưng - xuất huyết

0/8

19

29,69

Gan xuất huyết

0/8

59

92,19

Thận xuất huyết

0/8

21

32,81

Ruột sinh hơi, trống thức ăn

0/8

57

89,06

Chi-Square Test: Phoi xuat hu, Lach xuat hu, Gan xuat huy, Than xuat hu, Ruot t Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Phoi xuat Lach xuat Gan xuat Than xuat Ruot huyet huyet huyet huyet trong TA Total 1 52 19 59 21 57 208 41.60 41.60 41.60 41.60 41.60 2.600 12.278 7.278 10.201 5.701 2 12 45 5 43 7 112 22.40 22.40 22.40 22.40 22.40 4.829 22.802 13.516 18.945 10.587 Total 64 64 64 64 64 320 Chi-Sq = 108.736, DF = 4, P-Value = 0.000

Chi-Square Test: Phoi xuat huyet, Lach xuat huyet Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Phoi xuat Lach xuat

131

huyet huyet Total 1 52 19 71 35.50 35.50 7.669 7.669 2 12 45 57 28.50 28.50 9.553 9.553 Total 64 64 128 Chi-Sq = 34.443, DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: Phoi xuat huyet, Gan xuat huyet Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Phoi xuat Gan xuat huyet huyet Total 1 52 59 111 55.50 55.50 0.221 0.221 2 12 5 17 8.50 8.50 1.441 1.441 Total 64 64 128 Chi-Sq = 3.324, DF = 1, P-Value = 0.068 Chi-Square Test: Phoi xuat huyet, Than xuat huyet Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Phoi xuat Than xuat huyet huyet Total 1 52 21 73 36.50 36.50 6.582 6.582 2 12 43 55 27.50 27.50 8.736 8.736

132

Total 64 64 128 Chi-Sq = 30.637, DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: Phoi xuat huyet, Ruot trong TA Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Phoi xuat Ruot huyet trong TA Total 1 52 57 109 54.50 54.50 0.115 0.115 2 12 7 19 9.50 9.50 0.658 0.658 Total 64 64 128 Chi-Sq = 1.545, DF = 1, P-Value = 0.214 Chi-Square Test: Lach xuat huyet, Gan xuat huyet Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Lach xuat Gan xuat huyet huyet Total 1 19 59 78 39.00 39.00 10.256 10.256 2 45 5 50 25.00 25.00 16.000 16.000 Total 64 64 128 Chi-Sq = 52.513, DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: Lach xuat huyet, Than xuat huyet Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Lach xuat Than xuat

133

huyet huyet Total 1 19 21 40 20.00 20.00 0.050 0.050 2 45 43 88 44.00 44.00 0.023 0.023 Total 64 64 128 Chi-Sq = 0.145, DF = 1, P-Value = 0.703 Chi-Square Test: Lach xuat huyet, Ruot trong TA Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Lach xuat Ruot huyet trong TA Total 1 19 57 76 38.00 38.00 9.500 9.500 2 45 7 52 26.00 26.00 13.885 13.885 Total 64 64 128 Chi-Sq = 46.769, DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: Gan xuat huyet, Than xuat huyet Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Gan xuat Than xuat huyet huyet Total 1 59 21 80 40.00 40.00 9.025 9.025 2 5 43 48 24.00 24.00 15.042 15.042

134

Total 64 64 128 Chi-Sq = 48.133, DF = 1, P-Value = 0.000 Chi-Square Test: Gan xuat huyet, Ruot trong TA Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Gan xuat Ruot huyet trong TA Total 1 59 57 116 58.00 58.00 0.017 0.017 2 5 7 12 6.00 6.00 0.167 0.167 Total 64 64 128 Chi-Sq = 0.368, DF = 1, P-Value = 0.544 Chi-Square Test: Than xuat huyet, Ruot trong TA Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Than xuat Ruot huyet trong TA Total 1 21 57 78 39.00 39.00 8.308 8.308 2 43 7 50 25.00 25.00 12.960 12.960 Total 64 64 128 Chi-Sq = 42.535, DF = 1, P-Value = 0.000

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

LÝ LỊCH KHOA HỌC (Dùng cho Nghiên cứu sinh)

I. LÝ LỊCH SƠ LƯỢC:

135

Họ và tên: NGUYỄN THU TÂM Giới tính: Nữ

Ngày sinh: 14 tháng 11 năm 1976 Nơi sinh: Đồng Tháp

Quê quán: An Khánh, Châu Thành, Đồng Tháp Dân tộc: Kinh

Chức vụ, đơn vị công tác trước khi đi học tập, nghiên cứu: Giảng viên

Chỗ ở riêng hoặc địa chỉ liên lạc: C104, đường 30/4, phường Xuân Khánh, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ

Điện thoại cơ quan: Điện thoại DĐ: 0918 150 991

Fax: E-mail: nttamty@ctu.edu.vn

II. QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO:

1. Trung học chuyên nghiệp: không

2. Đại học:

Hệ đào tạo: Chính quy Thời gian đào tạo từ 1996 đến 2001

Nơi học (Trường, thành phố): Trường Đại học Cần Thơ

Ngành học: Chăn nuôi thú y

Tên đồ án, luận án hoặc môn thi tốt nghiệp: Tình hình hiễm vi khuẩn Salmonella spp. trên chuột đồng tại thành phố Cần Thơ

Ngày và nơi bảo vệ đồ án, luận án hoặc thi tốt nghiệp: Năm 2001 tại Trường Đại học Cần Thơ

Người hướng dẫn: TS. Trần Thị Phận

3. Thạc sĩ:

Hệ đào tạo: Không tập trung Thời gian đào tạo từ 2005 đến 2008

Nơi học (Trường, thành phố): Trường Đại học Cần Thơ

Ngành học: Thú y

Tên luận văn: Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella enteritidis và Salmonella typhimurium trên thịt gà, vịt bán tại một số chợ thuộc thành phố Cần Thơ

Ngày và nơi bảo vệ luận văn: Năm 2008 tại Trường Đại học Cần Thơ

Người hướng dẫn: TS. Trần Thị Phận

4. Tiến sĩ:

Hệ đào tạo: Không tập trung Thời gian đào tạo từ 2013 đến 2017

Tại (Trường, Viện, Nước): Trường Đại học Cần Thơ

136

Tên luận án:“Nghiên cứu bệnh nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt tại một số tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long”.

Người hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Đức Hiền

Ngày và nơi bảo vệ:

5. Trình độ ngoại ngữ (biết ngoại ngữ gì, mức độ): Anh văn B2

6. Chức danh khoa học, học vị, chức vụ kỹ thuật được chính thức cấp, số bằng, ngày và nơi cấp:

- Kỹ sư chăn nuôi thú y, số bằng B306438, cấp ngày 18/09/2001, nơi cấp Trường Đại học Cần Thơ

- Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp chuyên ngành Thú y, số bằng A046144, cấp ngày 04/02/2009, nơi cấp Trường Đại học Cần Thơ

1. Nguyễn Thu Tâm. 2012. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Actinobaccillus pleuropnemoniae trên phổi heo và tính nhạy cảm của vi khuẩn phân lập được với một số loại kháng sinh. CAAB 2012. 1. 323.

2. Nguyễn Thu Tâm. 2012. Định lượng vi khuẩn E. coli và xác định tỷ lệ các chủng E. coli K88, K99, 987P trên phân . CAAB 2012. 1. 330.

3. Nguyễn Thu Tâm. 2012. Khảo sát một số bệnh tích trên vịt còi cọc và phân lập vi khuẩn E. coli. CAAB 2012. 1. 339.

4. Nguyễn Phúc Khánh, Trần Ngọc Bích, Nguyễn Thu Tâm. 2014. Bệnh tích đại thể ở vịt được mổ khám tại lò mổ gia cầm thành phố Cao Lãnh- tỉnh Đồng Tháp. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. Số Nông nghiệp 2014. 96-99.

5. Nguyễn Phúc Khánh, Trần Ngọc Bích, Nguyễn Thu Tâm. 2014. Khảo sát những bất thường trên đường sinh dục heo cái được giết mổ tại lò mổ thành phố Cần Thơ. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. Số Nông nghiệp 2014. 170-172.

6. Nguyễn Thu Tâm, Đặng Ngọc Lễ. 2014. Khảo sát triệu trứng bệnh tích của chuột bạch khi tiêm dịch bệnh phẩm dịch ruột từ vịt chạy đồng nghi trúng độc botulin. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. Số Nông nghiệp 2014. 107-110.

7. Nguyễn Thu Tâm, Nguyễn Phúc Khánh, Phan Thị Hồng Nhung. 2014. Tình hình nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. trên tôm bạc (Penaeus merguiensis), tôm sú (Penaeus monodon), tôm rảo đất (Metapenaeus ensis) tại một số chợ thuộc quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. Số Nông nghiệp 2014. 111-115.

137

8. Nguyễn Thu Tâm, Trần thị Phận, Nguyễn Đức Hiền. 2016. Phân lập và định danh vi khuẩn Clostridium botulinum từ vịt bị liệt mềm cổ tại huyện Tân Phú và Tri Tôn, tỉnh An Giang. NN & PTNT. 147-150.

9. Nguyễn Thu Tâm, Lý Thị Liên Khai, Nguyễn Đức Hiền. 2016. Phân lập và định danh vi khuẩn Clostridium spp. từ đất ruộng tại huyện Phú Tân và Châu Phú, tỉnh An Giang. NN & PTNT. tháng 11/2016. 73-77.

10. Lý Thị Liên Khai, Nguyễn Thu Tâm. 2016. Khảo sát sự biến đổi của thịt heo tại chợ và siêu thị. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. Số Nông nghiệp 2016. 61-68.

11. Nguyễn Thu Tâm, Nguyễn Đức Hiền, Hồ Thị Việt Thu. 2016. Chẩn đoán bệnh “Cúm cần” ở vịt bằng phương pháp thử nghiệm trên chuột bạch. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. Số Nông nghiệp 2016. 125-130.

12. Nguyễn Thu Tâm, Nguyễn Đức Hiền, Hồ Thị Việt Thu. 2016. Phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum trên ốc bươu (Pila conica) và cua đồng (Somannia theplusa) tại thành phố Cần Thơ, tỉnh An Giang và Kiên Giang. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. Số Nông nghiệp 2016. 131-134.

III. QUÁ TRÌNH CÔNG TÁC CHUYÊN MÔN KỂ TỪ KHI TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC: Thời gian

Nơi công tác 11/2003 - 12/2008 Đại học Cần Thơ

09/2005 - 09/2008 Đại học Cần Thơ

2003 -2009 2009 đến nay Đại học Cần Thơ Đại học Cần Thơ Công việc đảm nhiệm Nghiên cứu viên tại BM. Thú y Học lấy bằng Thạc sỹ ngành Thú y tại Việt Nam Nghiên cứu viên tại BM Thú Y Giảng viên tại BM Thú Y

IV. CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ:

Cần Thơ, Ngày tháng năm 2020 Người khai ký tên

Nguyễn Thu Tâm

138