Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu: Nghiên cứu biến tính dendrimer polyamidoamine bằng polymer tương hợp sinh học (PEG và Pluronic) ứng dụng mang thuốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------------------

NGUYỄN THỊ TRÂM CHÂU

NGHIÊN CỨU BIẾN TÍNH DENDRIMER

POLYAMIDOAMINE BẰNG POLYMER

TƯƠNG HỢP SINH HỌC (PEG VÀ PLURONIC)

ỨNG DỤNG MANG THUỐC

Chuyên ngành: Vật liệu cao phân tử và tổ hợp

Mã số: 62.44.01.25

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

TP. Hồ Chí Minh - 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------------------

NGUYỄN THỊ TRÂM CHÂU

NGHIÊN CỨU BIẾN TÍNH DENDRIMER

POLYAMIDOAMINE BẰNG POLYMER

TƯƠNG HỢP SINH HỌC (PEG VÀ PLURONIC)

ỨNG DỤNG MANG THUỐC

Chuyên ngành: Vật liệu cao phân tử và tổ hợp

Mã số: 62.44.01.25

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. NGUYỄN CỬU KHOA

2. TS. TRẦN NGỌC QUYỂN

TP. Hồ Chí Minh - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Công trình được thực hiện tại phòng Hóa dược - Viện Khoa học Vật liệu ứng

dụng - Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tại Thành phố Hồ Chí Minh;

và phòng thí nghiệm Hóa Hữu cơ trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí

Minh - Cơ sở Quảng Ngãi.

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và được sự hướng dẫn

khoa học của PGS. TS. Nguyễn Cửu Khoa và TS. Trần Ngọc Quyển. Các nội dung

nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực, được hoàn thành dựa trên các

kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho

bất cứ luận văn cùng cấp nào khác.

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Trâm Châu

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Cửu Khoa

và TS. Trần Ngọc Quyển, những người Thầy đã dành cho tôi sự động viên giúp đỡ

tận tình và những định hướng khoa học hiệu quả trong suốt quá trình thực hiện

luận án này.

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và khích lệ của các cán bộ, đồng nghiệp khác trong

trường Đại học Công Nghiệp TP HCM.

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Viện Khoa học vật

liệu đối với tôi trong quá trình thực hiện luận án.

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của trường Đại học Công

Nghiệp TP HCM đối với tôi trong quá trình thực hiện luận án.

Luận án này được hỗ trợ kinh phí của đề tài nghiên cứu cơ bản của Quỹ Phát

triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), mã số 106.YS.99-2013.29.

Sau cùng, tôi xin cảm ơn và thực sự không thể quên được sự giúp đỡ tận tình

của các thầy cô, bạn bè, anh em xa gần và sự động viên, tạo điều kiện của những

người thân trong gia đình trong suốt quá trình tôi hoàn thành luận án này.

Tp. HCM, tháng 10 năm 2015

Tác giả

Nguyễn Thị Trâm Châu

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3

1.1. DENDRIMER ...................................................................................................... 3

1.1.1. Giới thiệu dendrimer ......................................................................................... 3

1.1.2. Tính chất của dendrimer ................................................................................... 7

1.1.3. Yếu tố ảnh hưởng lên dendrimer .................................................................... 10

1.1.4. Phương pháp tổng hợp dendrimer ................................................................... 14

1.2. DENDRIMER POLYAMIDOAMINE .............................................................. 16

1.2.1. Khái niệm dendrimer polyamidoamine .......................................................... 16

1.2.2. Phương pháp nang hóa thuốc của dendrimer PAMAM .................................. 20

1.3. Ý NGHĨA CỦA VIỆC BIẾN TÍNH CHẤT MANG NANO DENDRIMER

PAMAM LÀM CHẤT MANG THUỐC .................................................................. 21

1.4. CÁC CHẤT BIẾN TÍNH NHÓM AMINE TRÊN BỀ MẶT CỦA

DENDRIMER PAMAM ........................................................................................... 23

1.4.1. Polyethylene glycol ......................................................................................... 23

1.4.2. Pluronic ........................................................................................................... 24

1.5. Ý NGHĨA ỨNG DỤNG DENDRIMER PAMAM LÀM CHẤT MANG

THUỐC CHỐNG UNG THƯ ................................................................................... 27

1.5.1. Dendrimer phân phối thuốc tới đích thụ động ................................................ 28

1.5.2. Dendrimer phân phối thuốc tới đích chủ động................................................ 29

1.5.3. Thuốc 5-Fluorouracil (5-FU) ......................................................................... 29

1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC HỆ NANO DENDRIMER MANG THUỐC

................................................................................................................................... 31

1.6.1. Các nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM nhằm giảm độc tính .............. 31

1.6.2 Các nghiên cứu tăng cường hiệu quả mang và giải phóng thuốc của hệ

dendrimer PAMAM biến tính với PEG và Pluronic ................................................. 34

1.6.3. Các nghiên cứu của dendrimer PAMAM biến tính với polymer khác ........... 41

Chương 2. NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM ........................................................... 44

2.1. HÓA CHẤT ....................................................................................................... 44

2.2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ ................................................................................. 45

2.3. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM .................................................................. 46

2.3.1. Tổng hợp dendrimer PAMAM đến thế hệ G5.0 từ tâm ethylenediamine

(EDA) ........................................................................................................................ 46

2.3.2. Biến tính dendrimer PAMAM thế hệ G2.0, G3.0, G4.0 và G5.0 bằng các

PEG4K, PEG6K, PEG10K và PEG12K ................................................................... 51

2.3.3. Biến tính dendrimer PAMAM thế hệ G2.0, G3.0, G4.0 và G5.0 bằng các

Pluronic P123, F68, F127 và F108. .......................................................................... 55

2.3.4. Tổng hợp chất mang nano PAMAM G4.0-F127 với các tỷ lệ mol PAMAM

G4.0 : F127 khác nhau .............................................................................................. 59

2.3.5. Nang hóa thuốc 5-Fluorouracil (5-FU) lên các loại dendrimer PAMAM-PEG

................................................................................................................................... 60

2.3.6. Nang hóa thuốc 5-Fluorouracil (5-FU) lên các loại dendrimer PAMAM-

Pluronic ..................................................................................................................... 61

2.3.7. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU của PAMAM G4.0-PEG/5-FU in vitro trong

đệm PBS ..................................................................................................................... 63

2.3.8. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU của PAMAM G4.0-Pluronic/5-FU in

vitro trong đệm PBS .................................................................................................. 64

2.3.9. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU in vitro trong đệm PBS .................... 65

2.3.10. Phương pháp xác định độc tính tế bào của các chất mang nano ................... 65

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 70

3.1. TỔNG HỢP DENDRIMER PAMAM TỪ THẾ HỆ G-0.5 ĐẾN THẾ HỆ G5.0 ... 70

3.1.1. Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối lượng MS ...... 70

3.1.2. Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR ................ 72

3.2. TỔNG HỢP PAMAM-PEG ............................................................................... 78

3.2.1. Kết quả phân tích 1H-NMR các sản phẩm trung gian NPC-PEG-NPC, NPC-

PEG-TA, PAMAM và PAMAM-PEG ...................................................................... 78

3.2.2. Kết quả phân tích FTIR của PAMAM và PAMAM-PEG .............................. 83

3.2.3. Kết quả GPC của PAMAM-PEG .................................................................... 84

3.2.4. Kết quả TEM của PAMAM và PAMAM-PEG .............................................. 89

3.3. TỔNG HỢP PAMAM-PLURONIC .................................................................. 89

3.3.1. Kết quả phân tích 1H-NMR của sản phẩm trung gian NPC-Plu-NPC, NPC-

Plu-TA, PAMAM và PAMAM-Pluronic .................................................................. 90

Để tổng hợp PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 với Pluronic cần phải hoạt hóa 2

nhóm -OH đầu và cuối mạch của Pluronic bởi pnitrophenyl chloroformate (NPC)

tạo sản phẩm NPC-Plu-NPC theo phản ứng sau: ...................................................... 90

3.3.2. Kết quả phân tích FTIR của PAMAM và PAMAM-Pluronic ........................ 94

3.3.3. Kết quả GPC của PAMAM-Pluronic .............................................................. 95

d. Kết quả GPC của PAMAM-F108 ....................................................................... 100

3.3.4. Kết quả TEM của PAMAM và PAMAM-Pluronic ...................................... 101

3.4. SO SÁNH KHẢ NĂNG BIẾN TÍNH CỦA DENDRIMER PAMAM G2.0,

G3.0, G4.0, G5.0 BẰNG CÁC BIOPOLYMER (PEG VÀ PLURONIC) ............. 102

3.4.1. Kết quả biến tính của dendrimer PAMAM với PEG .................................... 102

3.4.2. Kết quả biến tính của dendrimer PAMAM với Pluronic .............................. 103

3.5. TỔNG HỢP CHẤT MANG NANO PAMAM G4.0-F127 VỚI CÁC TỶ LỆ

MOL KHÁC NHAU ............................................................................................... 105

3.6. NANG HÓA THUỐC CHỐNG UNG THƯ 5-FLUOROURACIL TRONG

CÁC CHẤT MANG NANO ................................................................................... 106

3.6.1. Nang hóa thuốc trong các chất mang nano dendrimer PAMAM G2.0, G3.0,

G4.0 và G5.0 ........................................................................................................... 108

3.6.2. Nang hóa thuốc 5-FU trong polymer PEG và Pluronic ................................ 110

3.6.3. Nang hóa thuốc 5-FU trong các chất mang dendrimer PAMAM-PEG ........ 111

3.6.4. Nang hóa thuốc 5-FU trong các chất mang dendrimer PAMAM-Pluronic .. 118

3.6.5. So sánh hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của các chất mang nano dendrimer

PAMAM-PEG ......................................................................................................... 124

3.6.6. So sánh hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của các chất mang nano dendrimer

PAMAM-Pluronic ................................................................................................... 126

3.7. KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH TỐC ĐỘ GIẢI PHÓNG THUỐC 5-FU CỦA

PAMAM G4.0-PEG/5-FU VÀ 5-FU IN VITRO TRONG MÔI TRƯỜNG ĐỆM

PBS (pH=7.4) .......................................................................................................... 129

3.8. KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH TỐC ĐỘ GIẢI PHÓNG THUỐC 5-FU CỦA

PAMAM G4.0-PLURONIC/5-FU VÀ 5-FU IN VITRO TRONG MÔI TRƯỜNG

ĐỆM PBS (pH=7.4) ................................................................................................ 129

3.9. KẾT QUẢ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA HỆ CHẤT MANG NANO DẪN

TRUYỀN 5-FU ....................................................................................................... 130

3.9.1. Kết quả gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ chất mang nano dẫn truyền

5-FU ........................................................................................................................ 130

3.9.2. Kết quả gây độc nguyên bào sợi (Fibroblast) của hệ chất mang nano dẫn

truyền 5-FU ............................................................................................................. 132

KẾT LUẬN ............................................................................................................. 136

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 138

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ............................................... 139 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phụ lục 1. Xây dựng phương trình đường chuẩn A = 33,101C + 27,857 .............. PL1

Phụ lục 2. Xây dựng phương trình đường chuẩn A = 17346C – 26,26 ................. PL2

Phụ lục 3. Xây dựng phương trình đường chuẩn A = 14732C + 45,44 ................. PL3

Phụ lục 4. Phổ 1H-NMR của các NPC-PEG-NPC ................................................. PL4

Phụ lục 5. Phổ 1H-NMR của các NPC-PEG-TA ................................................... PL5

Phụ lục 6. Phổ 1H-NMR của các PAMAM-PEG ................................................... PL6

Phụ lục 7. Phổ FTIR của PAMAM và PAMAM-PEG .......................................... PL7

Phụ lục 8. Phổ 1H-NMR của các NPC-Plu-NPC ................................................... PL8

Phụ lục 9. Phổ 1H-NMR của các NPC-Plu-TA .................................................... PL10

vii

Phụ lục 10. Phổ 1H-NMR của PAMAM-Pluronic ............................................... PL11

Phụ lục 11. Bảng thống kê kết quả giải phóng thuốc 5-FU mẫu đối chứng ........ PL12

Phụ lục 12. Bảng thống kê kết quả giải phóng thuốc 5-FU mẫu PAMAM G4.0-

PEG6K/5-FU ........................................................................................................ PL13

Phụ lục 13. Bảng thống kê kết quả giải phóng thuốc 5-FU mẫu PAMAM G4.0-

P123/5-FU ............................................................................................................ PL14

Phụ lục 14. Bảng thống kê kết quả giải phóng thuốc 5-FU mẫu PAMAM G4.0-

F127/5-FU ............................................................................................................ PL15

viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Thông số đặc trưng của Polyethylene glycol ............................................ 24

Bảng 1.2. Thông số đặc trưng của Pluronic ............................................................. 26

Bảng 2.1. Danh mục hóa chất ................................................................................... 44

Bảng 2.2. Bảng số liệu dendrimer PAMAM các thế hệ lẻ ........................................ 47

Bảng 2.3. Bảng số liệu dendrimer PAMAM các thế hệ chẵn .................................. 47

Bảng 2.4. Thành phần và khối lượng các chất tham gia phản ứng tổng hợp

PAMAM-PEG ........................................................................................................... 53

Bảng 2.5. Thành phần và khối lượng các chất tham gia phản ứng tổng hợp

PAMAM-Pluronic ..................................................................................................... 57

Bảng 2.6. Thành phần và khối lượng các chất tham gia phản ứng tổng hợp

PAMAM-F127 với tỷ lệ mol khác nhau ................................................................... 59

Bảng 3.1. Khối lượng phân tử các dendrimer PAMAM dựa vào phổ MS ............... 71

Bảng 3.2. Khối lượng phân tử dựa trên 1H-NMR của PAMAM G-0.5 đến G5.0 .... 77

Bảng 3.3. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-PEG4K (PAMAM

G2.0-PEG4K, PAMAM G3.0-PEG4K, PAMAM G4.0-PEG4K và PAMAM G5.0-

PEG4K) ..................................................................................................................... 85

Bảng 3.4. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-PEG6K (PAMAM

G2.0-PEG6K, G3.0-PEG6K, G4.0-PEG6K và G5.0-PEG6K) ................................. 86

Bảng 3.5. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-PEG10K (PAMAM

G2.0-PEG10K, PAMAM G3.0-PEG10K, PAMAM G4.0-PEG10K và PAMAM

G5.0-PEG10K) .......................................................................................................... 87

Bảng 3.6. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-PEG12K (PAMAM

G2.0-PEG12K, PAMAM G3.0-PEG12K, PAMAM G4.0-PEG12K và PAMAM

G5.0-PEG12K) .......................................................................................................... 88

Bảng 3.7. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-P123 (PAMAM

G2.0-P123, PAMAM G3.0-P123, PAMAM G4.0-P123 và PAMAM G5.0-P123) . 96

Bảng 3.8. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-F68 (PAMAM

G2.0-F68, PAMAM G3.0-F68, PAMAM G4.0-F68 và PAMAM G5.0-F68) ......... 98

Bảng 3.9. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-F127 (PAMAM

PAMAM G2.0-F127, PAMAM G3.0-F127, PAMAM G4.0-F127 và PAMAM

G5.0-F127) ................................................................................................................ 99

Bảng 3.10. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-F108 (PAMAM

G2.0-F108, PAMAM G3.0-F108, PAMAM G4.0-F108 và PAMAM G5.0-F108)

................................................................................................................................. 100

Bảng 3.11. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM G4.0-F127 với các

tỷ lệ mol PAMAM : Pluronic F127 khác nhau ....................................................... 105

Bảng 3.12. Thống kê hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU trong PAMAM G2.0, G3.0,

G4.0 và G5.0 ........................................................................................................... 109

Bảng 3.13. Hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của PEG6K và Pluronic F127 ............ 111

Bảng 3.14. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-PEG4K ................... 113

Bảng 3.15. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-PEG6K ................... 115

Bảng 3.16. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-PEG10K ................. 116

Bảng 3.17. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-PEG12K ................. 117

Bảng 3.18. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-P123 ....................... 119

Bảng 3.19. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-F68 ........................ 121

Bảng 3.20. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-F127 ....................... 122

Bảng 3.21. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-F108 ....................... 123

Bảng 3.22. Kết quả gây độc tế bào MCF-7 theo phương pháp nhuộm SRB .......... 131

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1. Tỷ lệ liên hợp của PAMAM-PEG ......................................................... 102

Đồ thị 3.2. Tỷ lệ liên hợp của PAMAM-Pluronic ................................................... 104

Đồ thị 3.3. Hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của các PAMAM-PEG ....................... 124

Đồ thị 3.4. Hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-Pluronic ....................... 126

Đồ thị 3.5. Kết quả giải phóng thuốc 5-FU của PAMAM G4.0-PEG6K (Xanh) và 5-

FU đối chứng (Đỏ) .................................................................................................. 129

Đồ thị 3.6. Kết quả giải phóng thuốc 5-FU của PAMAM G4.0-P123 (Xanh nhạt),

PAMAM G4.0-F127 (Xanh đậm) và 5-FU đối chứng (Đỏ) .................................. 130

Đồ thị 3.7. Kết quả gây độc tế bào IC50 của các chất mang nano theo phương pháp

nhuộm SRB ............................................................................................................. 132

Đồ thị 3.8. Kết quả gây độc nguyên bào sợi theo phương pháp nhuộm MTT ....... 133

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử dendrimer ......................................................................... 3

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của dendrgraft, dendron và dendrimer [61] ..................... 4

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của dendrimer có nguyên tử tạo nhánh khác nhau .......... 5

Hình 1.4. Dendrimer cầu nối N và dendrimer cầu nối aryl ......................................... 5

Hình 1.5. Dendrimer với tâm NH3 (a) và tâm BDA (b) .............................................. 6

Hình 1.6. Tổng hợp divergent theo mô hình tạo nhánh 1→2 ..................................... 6

Hình 1.7. Tổng hợp divergent theo mô hình tạo nhánh 1→3 ..................................... 7

Hình 1.8. G3.0, G4.0, G5.0 của PAMAM có kích thước phù hợp với kích thước của

insulin (30 Å), Cytochrome C (40 Å) và hemoglobin (55 Å)… ................................. 9

Hình 1.9. Dendrimer “che phủ” bởi các nhóm bề mặt khác nhau dẫn tới sự khác biệt

lớn về đặc tính sinh học ............................................................................................. 10

Hình 1.10. Sơ đồ dự đoán kết quả của hiện tượng “nếp gấp ngược” khi mật độ phân

tử bên trong dendrimer tăng ..................................................................................... 11

Hình 1.11. Cấu trúc không gian 3 chiều của dendrimer PAMAM G6.0 ở các điều

kiện pH khác nhau dựa trên động lực học phân tử.................................................... 12

Hình 1.12. Sự thay đổi hình dạng dendrimer trong dung môi khác nhau ................. 12

Hình 1.13. Sự thay đổi hình dạng dendrimer trong nồng độ muối khác nhau ......... 13

Hình 1.14. Các nồng độ dendrimer khác nhau ......................................................... 13

Hình 1.15. Sơ đồ tổng hợp dendrimer bằng phương pháp phân kỳ .......................... 14

Hình 1.16 Tổng hợp dendrimer bằng phương pháp hội tụ ........................................ 15

Hình 1.17. Tổng hợp dendrimer bằng phương pháp tăng lũy thừa hai ..................... 15

Hình 1.18. Công thức của phân tử dendrimer PAMAM G3.0 tâm EDA. ................. 17

Hình 1.19. Phương trình phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G -0.5................ 18

Hình 1.20. Phương trình phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G 0.0 ................. 18

Hình 1.21. Cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G0.5 (a); G1.5 (b); G2.5 (c) 19

Hình 1.22. Cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G 1.0 (a) và G 2.0 (b) .......... 19

Hình 1.23. Cơ chế nang hóa thuốc của dendrimer ................................................... 20

xii

Hình 1.24. Nồng độ thuốc trong máu tương ứng với các phương pháp sử dụng

thuốc: a) Thuốc uống; b) Thuốc được tiêm qua tĩnh mạch và c) Thuốc giải phóng

chậm từ chất mang .................................................................................................... 22

Hình 1.25. Cấu trúc của Polyethylene glycol ............................................................ 23

Hình 1.26. Cấu trúc của Pluronic .............................................................................. 25

Hình 1.27. Hình dạng của Pluronic. .......................................................................... 25

Hình 1.28. Cơ chế thay đổi cấu trúc của Pluronic .................................................... 25

Hình 1.29. Vật liệu mao quản SPA-15 ...................................................................... 27

Hình 1.30. Mô hình định hướng thụ động dựa theo cơ chế EPR .............................. 28

Hình 1.31. Cấu trúc 5-Fluorouracil ........................................................................... 30

Hình 1.32. Ảnh hưởng việc biến tính bề mặt PAMAM lên khả năng gây độc tế bào,

thấm xuyên bào và sự hấp thu của tế bào .................................................................. 32

Hình 1.33. Sự kết hợp của PEG-PAMAM với adriamycin (a), methotrexate (b) .... 34

Hình 1.34. Mô hình PAMAM-MPEG mang thuốc 5-Fluorouracil .......................... 35

Hình 1.35. Cấu trúc hóa học của PEG-Dendrimer gắn với doxorubicin thông qua

mối nối hydrazone ..................................................................................................... 37

Hình 1.36. Sơ đồ giải phóng thuốc của PAMAM chưa biến tính và PAMAM đã

biến tính. .................................................................................................................... 38

Hình 1.37. Sơ đồ tổng hợp dendrimer PAMAM G5-Pluronic F127 ........................ 39

Hình 1.38. Sơ đồ tổng hợp P123-g-PAMAM dendrimer ......................................... 40

Hình 1.39. Cấu trúc của dendrimer PAMAM G5 theo lý thuyết (trái) và thực tế

(phải) do khiếm khuyết của quá trình phản ứng ....................................................... 41

Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp dendrimer PAMAM các thế hệ........................................ 46

Hình 2.2. Hình phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM .......................................... 48

Hình 2.3. Hình tinh chế sản phẩm dendrimer PAMAM ........................................... 48

Hình 2.4. Sơ đồ qui trình tổng hợp các dendrimer PAMAM thế hệ lẻ ..................... 49

Hình 2.5. Sơ đồ qui trình tổng hợp các dendrimer PAMAM thế hệ chẵn ................ 50

Hình 2.6. Hình sản phẩm dendrimer PAMAM thế hệ G1.0, G2.0, G3.0, G4.0, G5.0

................................................................................................................................... 50

xiii

Hình 2.7. Hình phản ứng PEG với NPC (a), Kết tủa sản phẩm (b), Sản phẩm NPC-

PEG-NPC (c) ............................................................................................................. 51

Hình 2.8. Hình phản ứng NPC-PEG-NPC với TA (a), Cô quay sản phẩm (b), Sản

phẩm NPC-PEG-TA (b) ............................................................................................ 52

Hình 2.9. Hình cô quay sản phẩm PAMAM-PEG (a),Sản phẩm PAMAM-PEG (b)

................................................................................................................................... 52

Hình 2.10. Sơ đồ tổng hợp 16 hệ PAMAM-PEG ..................................................... 54

Hình 2.11. Hình phản ứng Pluronic với NPC ........................................................... 55

Hình 2.12. Phản ứng NPC-Plu-NPC với TA (a), sản phẩm NPC-Plu-TA (b) .......... 56

Hình 2.13. Phản ứng biến tính PAMAM bằng Pluronic (a), Thẩm tách sản phẩm (b),

Sản phẩm PAMAM-Pluronic (c) .............................................................................. 56

Hình 2.14. Sơ đồ tổng hợp 16 hệ PAMAM-Pluronic ............................................... 58

Kiểm tra cấu trúc các sản phẩm cuối PAMAM G4.0-F127 với 4 tỷ lệ mol phản ứng

(1:8, 1:16, 1:32, 1:64) bằng các phương pháp FTIR, 1H NMR. ............................... 59

Hình 2.15. Sơ đồ tổng hợp PAMAM G4.0-F127 với 4 tỷ lệ mol phản ứng (1:8, 1:16,

1:32, 1:64) ................................................................................................................. 60

Hình 2.16. Hình nang hóa thuốc 5-FU lên PAMAM-PEG (a), Cơ chế mang thuốc

trong cấu trúc các loại chất mang nano PAMAM-PEG (b) ...................................... 61

Hình 2.17. Sơ đồ quy trình nang hóa thuốc 5-FU của các loại PAMAM-PEG ........ 61

Hình 2.18. Hình nang hóa thuốc 5-FU lên PAMAM-Pluronic (a), Cơ chế nang hóa

thuốc trong cấu trúc các loại chất mang nano PAMAM-Pluronic (b) ...................... 62

Hình 2.19. Sơ đồ quy trình nang hóa thuốc 5-FU của các loại PAMAM-Pluronic .. 62

Hình 2.20. Sơ đồ quy trình giải phóng thuốc 5-FU của hệ chất mang PAMAM

G4.0-PEG6K ............................................................................................................. 63

Hình 2.21. Sơ đồ quy trình giải phóng thuốc 5-FU của hệ chất mang PAMAM

G4.0-P123 và PAMAM G4.0-F127 .......................................................................... 64

Hình 2.22. Sơ đồ quy trình giải phóng thuốc 5-FU mẫu đối chứng ......................... 65

Hình 3.1. Cấu trúc dendrimer PAMAM từ EDA đến thế hệ G5.0............................ 70

Hình 3.2. Phổ MS của dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G2.0 ............................... 71

xiv

Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của dendrimer PAMAM thế hệ G-0.5 đến G5.0 ................ 75

Hình 3.4. Sơ đồ tổng hợp NPC-PEG-NPC ............................................................... 78

Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của NPC-PEG4K-NPC ....................................................... 79

Hình 3.6. Sơ đồ tổng hợp NPC-PEG-TA .................................................................. 80

Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của NPC-PEG4K-TA ......................................................... 80

Hình 3.8. Sơ đồ tổng hợp PAMAM-PEG ................................................................. 81

Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của PAMAM-PEG4K ........................................................ 82

Hình 3.10. Phổ FTIR của PAMAM G4.0 (a) và PAMAM G4.0-PEG4K(b) ........... 83

Hình 3.11. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-PEG4K, PAMAM G3.0-PEG4K,

PAMAM G4.0-PEG4K, PAMAM G5.0-PEG4K ..................................................... 85

Hình 3.12. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-PEG6K, PAMAM G3.0-PEG6K,

PAMAM G4.0-PEG6K, PAMAM G5.0-PEG6K ..................................................... 87

Hình 3.13. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-PEG10K, PAMAM G3.0-PEG10K,

PAMAM G4.0-PEG10K, PAMAM G5.0-PEG10K ................................................. 88

Hình 3.14. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-PEG12K, PAMAM G3.0-PEG12K, . 89

PAMAM G4.0-PEG12K, PAMAM G5.0-PEG12K ................................................. 89

Hình 3.15. Hình ảnh TEM của PAMAM G4.0 (a), PAMAM G4.0-PEG4K (b) và

PAMAM G4.0-PEG6K (c) ........................................................................................ 89

Hình 3.16. Sơ đồ tổng hợp NPC-Plu-NPC ................................................................ 90

Hình 3.17. Phổ 1H-NMR của NPC-P123-NPC ......................................................... 90

Hình 3.18. Sơ đồ tổng hợp NPC-Plu-TA .................................................................. 91

Hình 3.19. Phổ 1H-NMR của NPC-P123-TA ........................................................... 92

Hình 3.20. Sơ đồ tổng hợp PAMAM-Pluronic ......................................................... 93

Hình 3.21. Phổ 1H-NMR của PAMAM-Pluronic ..................................................... 93

Hình 3.22. Phổ FTIR của PAMAM G4.0 (a) và PAMAM G4.0-F127(b) ................ 95

Hình 3.23. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-P123, PAMAM G3.0-P123, PAMAM

G4.0-P123, PAMAM G5.0-P123 .............................................................................. 97

Hình 3.24. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-F68, PAMAM G3.0-F68, PAMAM

G4.0-F68, PAMAM G5.0-F68 .................................................................................. 99

Hình 3.25. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-F127, PAMAM G3.0-F127, PAMAM

G4.0-F127, PAMAM G5.0-F127 ............................................................................ 100

Hình 3.26. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-F108, PAMAM G3.0-F108, PAMAM

G4.0-F108, PAMAM G5.0-F108 ............................................................................ 101

Hình 3.27. Hình ảnh TEM của Pluronic F127 (a), PAMAM G4.0-P123 (b), ........ 101

PAMAM G4.0-F68 (c), PAMAM G4.0-F127 (d) và PAMAM G4.0-F108 (e)...... 101

Hình 3.28. Kết quả GPC của PAMAM G4.0-F127 tỷ lệ 1:8 ; 1:16; 1:32; 1:64 ..... 106

Hình 3.29. Phổ FTIR của PAMAM-PEG (a) và PAMAM-PEG/5-FU (b) ............. 107

Hình 3.30. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0, G3.0,

G4.0 và G5.0 ........................................................................................................... 109

Hình 3.31. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PEG6K và Pluronic

F127 ......................................................................................................................... 111

Hình 3.32. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0-PEG4K,

PAMAM G3.0-PEG4K, PAMAM G4.0-PEG4K và PAMAM G5.0-PEG4K ....... 112

Hình 3.33. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0-PEG6K,

PAMAM G3.0-PEG6K, PAMAM G4.0-PEG6K và PAMAM G5.0-PEG6K ....... 114

Hình 3.34. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0-

PEG10K, PAMAM G3.0-PEG10K, PAMAM G4.0-PEG10K và PAMAM G5.0-

PEG10K .................................................................................................................. 116

Hình 3.35. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0-

PEG12K, PAMAM G3.0-PEG12K, PAMAM G4.0-PEG12K và PAMAM G5.0-

PEG12K .................................................................................................................. 117

Hình 3.36. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0-P123,

PAMAM G3.0-P123, PAMAM G4.0-P123 và PAMAM G5.0-P123 ................... 118

Hình 3.37. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0-F68,

PAMAM G3.0-F68, PAMAM G4.0-F68 và PAMAM G5.0-F68 .......................... 120

Hình 3.38. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0-F127,

PAMAM G3.0-F127, PAMAM G4.0-F127 và PAMAM G5.0-F127 .................... 122

xvi

Hình 3.39. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0-F108,

PAMAM G3.0-F108, PAMAM G4.0-F108 và PAMAM G5.0-F108 .................... 123

Hình 3.40. Kết quả gây độc nguyên bào sợi theo phương pháp nhuộm huỳnh quang

FDA/EB ................................................................................................................... 134

xvii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Độ hấp thu A

Acetonitrile ACN

Butylenediamine BDA

Nồng độ dung dịch C

Dalton Da

Hàm lượng thuốc được nang hóa trong tổng trọng lượng chất DL%

mang (% drug loading)

Dimethyl formamide DMF

Ethylenediamine EDA

Hàm lượng thuốc được nang hóa so với lượng thuốc tiền sử dụng ( EE%

% drug entrapment)

Ethylene oxide EO

Phương pháp quang phổ hồng ngoại (Fourier transform infrared FTIR

spectroscopy)

GPC Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation

Chromatography)

Hexylene diamine HAD

Hằng số cân bằng ưa nước - kỵ nước (hydrophilic-lipophilic HLB

balance)

HPLC Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

1H-NMR

Chromatography)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Proton Nuclear Magnetic

Resonance)

5-Fuorouracil 5-FU

Methylacrylate MA

Methoxy Polyethylene glycol MPEG

Molecular weight MW

xviii

MWCO Molecular weight cut-off

NPC p-nitrophenyl chloroformate

PAMAM Polyamidoamine

PAMAM G2.0 Polyamidoamine generation 2.0

PAMAM G3.0 Polyamidoamine generation 3.0

PAMAM G4.0 Polyamidoamine generation 4.0

PAMAM G5.0 Polyamidoamine generation 5.0

Dung dịch muối đệm photphat (Phosphate Buffered Saline) PBS

PEG Polyethylene glycol

PEG4K Polyethylene glycol 4000

PEG6K Polyethylene glycol 6000

PEG10K Polyethylene glycol 10000

PEG12K Polyethylene glycol 12000

PO Propylene oxide

Plu Pluronic

P123 Pluronic P123

F68 Pluronic F68

F127 Pluronic F127

F108 Pluronic F108

TA Tyramine

TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron

Microscope)

THF Tetrahydrofurane

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, con người đã không ngừng

nghiên cứu để tìm ra những vật liệu mới nhằm phục vụ cho nhu cầu của cuộc sống.

Công nghệ nano ra đời đã đáp ứng được nhu cầu cấp thiết này. Trong những năm

gần đây, các nanopolymer được tập trung nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực y

dược. Dendrimer là một trong những nanopolymer được nghiên cứu nhiều nhất bởi

cấu trúc hình cầu có nhiều khoảng trống bên trong có thể được ứng dụng làm chất

mang thuốc, protein và phân phối gen.

Ngày càng có nhiều loại thuốc đang được sử dụng phải đối mặt với các vấn đề

về độ hòa tan, tác dụng sinh học, độ hấp thụ kém và thời gian tồn trữ ngắn. Ngoài

ra, các thuốc đặc trị có rất nhiều tác dụng phụ. Đặc biệt thuốc chống ung thư không

những gây độc với tế bào ung thư mà còn gây độc đối với cả các tế bào lành.

Nhiều báo cáo khoa học chỉ ra rằng việc đóng gói các loại thuốc điều trị ung

thư vào các hệ chất mang polymer hay nanopolymer đã nâng cao đáng kể độ tan

trong nước và độ ổn định lưu trữ thuốc, giúp tăng cường hoạt động chống khối u và

giảm tác dụng phụ của thuốc. Dendrimer PAMAM là một trong những chất mang

nanopolymer có thể làm việc như một công cụ hữu ích cho việc phân phối các loại

thuốc, cũng như liệu pháp gen và hóa trị [14, 22, 35, 44, 53, 68, 74-76].

Tuy nhiên, có một nhược điểm của dendrimer PAMAM là gây ra độc tính

trong máu và ly giải tế bào do tương tác mạnh mẽ của các nhóm -NH2 ở trên bề mặt

PAMAM với màng tế bào, dẫn đến sự phá vỡ màng tế bào, đồng nghĩa là diệt tế

bào [44, 53, 79, 88].

Để giải quyết vấn đề này, các nhóm -NH2 trên bề mặt dendrimer PAMAM

được biến tính bằng các polymer tương hợp sinh học, làm triệt tiêu điện tích dương

của các nhóm amine trên hoặc ngăn chặn sự tiếp xúc giữa các nhóm -NH2 với màng

tế bào giúp giảm độc tính, tạo ra khả năng tương tác sinh học cao của chất mang, từ

đó nâng cao hiệu quả mang thuốc và điều trị [14, 35, 80, 83]. Ngoài ra việc biến

tính bề mặt PAMAM cũng có thể làm tăng khả năng mang thuốc của PAMAM.

Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu biến tính dendrimer

polyamidoamine bằng polymer tương hợp sinh học (PEG và Pluronic) ứng dụng

mang thuốc”.

Mục tiêu của luận án:

Nghiên cứu tổng hợp chất mang thuốc trên cơ sở biến tính dendrimer

PAMAM bằng polymer tương hợp sinh học (Pluronic, Polyethylene glycol), với

mục tiêu làm giảm độc tính của PAMAM (tăng tính tương hợp sinh học) và tăng

khả năng mang thuốc của PAMAM.

Nội dung nghiên cứu luận án bao gồm:

1. Tổng hợp dendrimer PAMAM đến thế hệ G5.0 từ tâm ethylenediamine

(EDA).

2. Nghiên cứu biến tính 4 thế hệ dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0

bằng các Polyethylene glycol 4000 (PEG4K), Polyethylene glycol 6000 (PEG6K),

Polyethylene glycol 10000 (PEG10K), Polyethylene glycol 12000 (PEG12K).

3. Nghiên cứu biến tính 4 thế hệ dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0

bằng các Pluronic P123, Pluronic F68, Pluronic F127 và Pluronic F108.

4. Nghiên cứu tổng hợp dendrimer PAMAM G4.0-F127 với các tỷ lệ mol

PAMAM/F127 khác nhau.

5. Nghiên cứu hiệu quả nang hóa thuốc chống ung thư 5-Fluorouracil (5-FU)

của các chất mang nano PAMAM-PEG và PAMAM-Pluronic.

6. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-Fluorouracil của hệ dendrimer PAMAM

G4.0-PEG6K/5-FU trong in vitro với môi trường đệm PBS (pH=7.4).

7. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-Fluorouracil của hệ dendrimer PAMAM

G4.0-P123/5-FU và PAMAM G4.0-F127/5-FU trong in vitro với môi trường đệm

PBS (pH=7.4).

8. Nghiên cứu độc tính tế bào ung thư vú MCF-7 và nguyên bào sợi

(Fibroblast) đối với các hệ chất mang nano dendrimer PAMAM, PAMAM-PEG,

PAMAM-Pluronic, PAMAM-PEG/5-FU và PAMAM-Pluronic/5FU.

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. DENDRIMER

1.1.1. Giới thiệu dendrimer

Hóa học polymer và kỹ thuật sản xuất đã có từ lâu đời trên nền tảng chính là

sản xuất ra polymer mạch thẳng và nhánh, đã thể hiện vai trò là vật liệu quan trọng

trong sản xuất và đời sống. Phân tử polymer có kích thước lớn, cấu tạo mạch thẳng

chỉ chứa một vài nhánh nhỏ hơn hoặc có thể là nhánh lớn được sắp xếp một cách

ngẫu nhiên.

Trong hai thập niên qua người ta nghiên cứu phát triển nhiều loại vật liệu

nanopolymer mới có những tính chất khác biệt so với các polymer cao phân tử

mạch nhánh và thẳng thông thường. Một trong những vật liệu đó là dendrimer và

đây được coi là một loại vật liệu có nhiều ứng dụng tiềm năng.

a. Khái niệm và cấu tạo [2, 106]

Khái niệm dendrimer được Donald A. Tomalia và cộng sự đưa ra đầu tiên vào

năm 1985. Dendrimer được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “Dendron”, có nghĩa là

nhánh cây. Từ đó đến nay có rất nhiều công trình nghiên cứu về cấu trúc, tính chất,

phương pháp tổng hợp và ứng dụng của dendrimer trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử dendrimer

Dendrimer là một nanopolymer có dạng hình cầu, cấu trúc nhánh, có nhiều

tính chất ưu việt hơn so với polymer mạch thẳng.

Cấu tạo phân tử dendrimer gồm ba phần (hình 1.1):

− Tâm phân tử (core, nhân, lõi).

− Các nhánh bên trong: liên kết các nhóm bên ngoài với tâm, giữa các

nhánh có nhiều khoảng không gian trống.

− Các nhóm bề mặt: nhóm anion, cation, nhóm trung tính, các nhóm ưa

nước hay kỵ nước.

b. Phân loại [32, 40, 45, 66]

Các dendrimer được phân loại theo các tiêu chí sau:

(1) Theo cấu trúc hình học

Theo cấu trúc hình học, dendrimer được phân chia thành các dạng sau :

dendrgraft; dendron; dendrimer (hình 1.2).

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của dendrgraft, dendron và dendrimer

(2) Theo nguyên tử tạo nhánh khác nhau

Theo nguyên tử tạo nhánh khác nhau thì được phân chia và gọi tên khác nhau

(hình 1.3) : nhánh N ; nhánh aryl ; nhánh C ; nhánh Si ; nhánh saccharide ; nhánh P;

…

Dendrimer nhánh N Dendrimer nhánh aryl

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của dendrimer có nguyên tử tạo nhánh khác nhau

(3) Theo loại kết nối

Theo loại kết nối (connectivity) sẽ phân chia và gọi tên theo các loại liên kết

hóa học tại vị trí kết nối (hình 1.4): cầu nối aryl; cầu nối amide; cầu nối este; cầu

nối ether; cầu nối N; cầu nối O; cầu nối Si; cầu nối urea; cầu nối alkyl; cầu nối

alken; cầu nối alkyn; …

Hình 1.4. Dendrimer cầu nối N và dendrimer cầu nối aryl

(4) Theo thành phần tâm khác nhau

Dendrimer được phân chia theo thành phần tâm khác nhau: ví dụ tâm là NH3,

ethylenediamine (EDA), butylenediamine (BDA), aryl, … Do các tâm có kích

thước khác nhau nên các phản ứng tạo ra dendrimer sẽ bị ảnh hưởng không gian

khác nhau, và do tâm có độ phân cực khác nhau nên phần không gian bên trong

phân tử dendrimer cũng có độ phân cực khác nhau, do đó ảnh hưởng tới khả năng

nang hóa các hoạt chất có độ phân cực khác nhau (hình 1.5).

Hình 1.5. Dendrimer với tâm NH3 (a) và tâm BDA (b)

(5) Theo mối nối tạo nhánh 1→2 và 1→3

Mô hình tạo nhánh 1→2: Đó là mô hình từ một nhánh của thế hệ trước sẽ tạo

ra hai nhánh của thế hệ sau (trong phản ứng divergent). Ví dụ từ nguyên tử X sẽ

tách ra thành hai nhánh Y, từ mỗi nhánh Y tiếp tục được tách ra thành hai nhánh Z

ở thế hệ tiếp theo (hình 1.6).

Hình 1.6. Tổng hợp divergent theo mô hình tạo nhánh 1→2

Mô hình tạo nhánh 1→3: Đó là mô hình từ một nhánh của thế hệ trước sẽ tạo

ra ba nhánh của thế hệ sau. Ví dụ từ nguyên tử X sẽ tách ra thành ba nhánh Y, từ

mỗi nhánh Y sẽ tiếp tục được tách ra thành ba nhánh Z ở thế hệ tiếp theo (hình 1.7)

Hình 1.7. Tổng hợp divergent theo mô hình tạo nhánh 1→3

1.1.2. Tính chất của dendrimer [18, 23, 31, 52, 61, 68]

Dendrimer có những tính chất đặc biệt giúp cho nó ngày càng khẳng định

được vai trò quan trọng trong nghiên cứu khoa học và các ứng dụng trong đời sống.

a. Tính đơn phân tán

Nhược điểm lớn nhất của các polymer thông thường là các phân tử có kích

thước và khối lượng phân tử khác nhau, không đồng đều dẫn đến độ đa phân tán

cao. Nguyên nhân là do trong quá trình tổng hợp các polymer mạch thẳng hay

nhánh thì sự sắp xếp các nhánh xảy ra một cách ngẫu nhiên, không kiểm soát được.

Trong khi đó, kích thước và khối lượng phân tử dendrimer được kiểm soát một cách

chặt chẽ trong suốt quá trình tổng hợp, thể hiện tính đơn phân tán. Chỉ số DPI của

dendrimer gần như bằng 1 (khoảng 1-1,05).

b. Tính tan của dendrimer

Tính tan của dendrimer do các thành phần cấu trúc quyết định. Dendrimer với

tâm và các nhóm bên ngoài là các nhóm ưa nước thì có khả năng tan được trong

nước, trong khi các dendrimer với tâm và các nhóm bên ngoài là các nhóm kỵ nước,

ưa dầu thì chúng không có khả năng tan trong nước mà tan được trong các dung

môi có tính dầu. Độ dài của tâm liên quan đến hình dạng và tính ái dầu của

dendrimer. Nếu số nhóm CH2 trong tâm phân tử càng nhiều sẽ làm tăng tính ái

dầu. Dựa trên cơ sở đó, bằng cách lựa chọn thành phần cấu trúc thích hợp ta có thể

tổng hợp được dendrimer với khả năng hòa tan như mong muốn.

c. Tính nang hóa

Do dendrimer có chứa các khoảng trống ở bên trong nên dendrimer được sử

dụng như một chất mang. Các chất mà dendrimer có thể mang là thuốc, các đoạn

ADN, các hormon, xúc tác kim loại,…

Dendrimer rất thích hợp cho việc nang hóa thuốc vì chúng có độ chọn lọc và

tính bền vững cao khi kết hợp với thuốc.

Đối với các dendrimer thế hệ thấp (G=0-2), phân tử dendrimer chưa có cấu

trúc hình cầu rõ rệt nên chưa thể hiện tốt vai trò mang vác. Từ thế hệ thứ tư trở đi

(G ≥3) thì dạng hình cầu càng rõ rệt, độ chặt càng tăng, các khoảng trống bên trong

dendrimer bắt đầu thể hiện tốt hơn vai trò mang vác. Tuy nhiên, đến các thế hệ cao

hơn thì các nhóm bề mặt hầu như xếp khít nhau, dẫn đến sự xâm nhập của các phân

tử khác vào không gian bên trong bị hạn chế rất nhiều.

d. Tính đa hóa trị

Tính đa hóa trị của dendrimer do các nhóm bên ngoài quyết định. Dendrimer

với các nhóm chức bề mặt có khả năng tương tác qua lại đa hóa trị với các phân tử

xung quanh.

Trong sinh học, phối tử đơn hóa trị rất khó kết nối. Vì thế dendrimer với khả năng

tương tác đa hóa trị rất có triển vọng sử dụng trong hóa sinh, dendrimer được sử dụng

như chất mang trong nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt tính sinh học dùng để trị bệnh đến

cơ thể người. Tính chất này còn cho phép tạo ra các copolymer có tính chất đặc biệt

như độ nhớt, tính bền ứng dụng để tạo ra các vật liệu khác như composite. Bằng cách

thay đổi nhóm chức trên bề mặt ngoài có thể thay đổi tính chất của dendrimer.

Tính đa hóa trị còn cho phép dendrimer được ứng dụng trong lĩnh vực xúc tác

bằng cách tạo ra các phức giữa kim loại và các nhóm trên bề mặt, tạo ra các cảm

biến, khuôn đúc ở cấp độ nano, chất dẫn ion và photon và những ứng dụng trong

lĩnh vực điện.

e. Tính chất nano

Phân tử dendrimer có sự phân bố kích thước và hình dạng không giống như

các polymer mạch thẳng hay nhánh khác. Trong dung dịch chúng có sự phân bố

kích thước và hình dạng rất phong phú có khi kết thành một chuỗi thẳng dài, có khi

kết thành chùm có hình dạng méo mó hay có khi ở dạng đơn phân tử, dimer, trimer.

Kích thước phân tử của chúng thường khoảng vài chục đến vài trăm nanomet (nm).

Vì thế dendrimer cũng được xem là vật liệu nano.

Dendrimer có kích thước tương tự một số cấu trúc sinh học. Ví dụ, dendrimer

polyamidoamine (PAMAM) thế hệ thứ 3, 4 và 5 có kích thước và hình dạng tương

tự như insulin (30 Å), Cytochrome C (40 Å) và hemoglobin (55 Å)... (hình 1.8).

Hình 1.8. G3.0, G4.0, G5.0 của PAMAM có kích thước phù hợp với kích thước của

insulin (30 Å), Cytochrome C (40 Å) và hemoglobin (55 Å)…

f. Tính tương hợp sinh học

Để có thể ứng dụng dendrimer như tác nhân sinh học, dendrimer phải thỏa

mãn một số yêu cầu sau:

- Không độc;

- Không tạo sự miễn dịch (non-immunogenic);

- Có khả năng thấm sinh học (biopermealbe) tức là có khả năng đi xuyên qua

rào chắn sinh học, ví dụ rào cản bởi mô máu, màng tế bào hoặc màng vi khuẩn,…

- Có khả năng lưu lại trong quá trình lưu thông trong hệ thống sinh học với

thời gian cần thiết để vẫn còn có hoạt tính lâm sàn mong đợi;

- Có khả năng định hướng tới những cấu trúc sinh học đặc biệt.

Các tính chất sinh học của dendrimer phụ thuộc rất nhiều vào kích thước của

dendrimer và các nhóm chức trên bề mặt của dendrimer và ít phụ thuộc vào cấu trúc

bên trong của dendrimer. Với các nhóm chức bề mặt, dendrimer có thể được biến

tính để tạo ra các tính chất sinh học đặc biệt. Hình 1.9 cho thấy một số mô hình

chung của dendrimer với các tính chất tương hợp sinh học tương ứng theo.

Bề mặt dendrimer Bề mặt dendrimer Bề mặt dendrimer Bề mặt

dương điện âm điện trung tính không dendrimer phân

mang điện cực không mang

Độ độc in vitro: + Độ độc in vitro: - Độ độc in vitro: + điện

Kết quả độc tính Kết quả độc tính Kết quả độc tính Độ độc in vitro: -

in vitro: + in vitro: - in vitro: - Kết quả độc tính

Tính thẩm thấu Tính thẩm thấu Tính thẩm thấu in vitro: -

sinh học: + sinh học: -/+ sinh học:+ Tính thẩm thấu

Sinh miễn dịch:+ Sinh miễn dịch:+ Sinh miễn dịch:+ sinh học:-

Sinh miễn dịch:-

Hình 1.9. Dendrimer “che phủ” bởi các nhóm bề mặt khác nhau dẫn tới sự khác biệt

lớn về đặc tính sinh học

1.1.3. Yếu tố ảnh hưởng lên dendrimer [52]

a. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử lên dendrimer

Khi tăng thế hệ dendrimer, tức là tăng khối lượng phân tử của dendrimer, cấu

dạng của dendrimer cũng phát triển và được xác định bằng các yếu tố sau:

- Kích thước của monomer, kích thước monomer ngắn thì sẽ tạo mạch nhanh

với không gian thể tích của dendrimer nhỏ.

- Độ dẻo của dendrons tăng.

- Khả năng của các nhóm chức ngoài cùng tạo nội liên kết giữa chúng với

nhau.

Để có thể dự đoán cấu trúc phân tử của dendrimer khi tăng thế hệ, De Gennes

và Hervet cho rằng khi phát triển thế hệ thì bộ phận ngoài vỏ sò tăng lên rất nhanh,

tuy nhiên đến một mức độ nào đó thì chính bộ phận các nhóm chức bên ngoài sẽ

cản trở việc tiếp tục phát triển thế hệ dendrimer tiếp theo. Khi đó do lực hấp dẫn

giữa các nhóm chức bề mặt giảm kéo theo độ trật tự thấp, và hiện tượng này gọi là

“nếp gấp ngược” (hình 1.10).

Hình 1.10. Sơ đồ dự đoán kết quả của hiện tượng “nếp gấp ngược” khi mật độ phân

tử bên trong dendrimer tăng

b. Ảnh hưởng của pH

Cấu trúc và hình dạng phân tử dendrimer phụ thuộc rất nhiều vào độ pH. Tại

pH thấp (pH<4) thì các nhánh duỗi ra, các phân tử sắp xếp có trật tự hơn, tại pH này

+) và nhóm

không gian rỗng bên trong nhiều hơn. Tại pH trung tính, hiện tượng “nếp gấp

ngược” bắt đầu xuất hiện do liên kết hydro giữa nhóm ammonium (NH4

amine (-NH2). Tại vùng pH cao (pH>9) hiện tượng “nếp gấp ngược” xảy ra ở mức

độ cao do lực đẩy giữa các nhánh và giữa các nhóm chức ở bề mặt đều rất nhỏ, các

phân tử bắt đầu co lại, có hình dạng như một khối cầu, độ chặt bắt đầu tăng lên, các

khúc cuộn ở mức cao hơn (hình 1.11).

Hình 1.11. Cấu trúc không gian 3 chiều của dendrimer PAMAM G6.0 ở các điều

kiện pH khác nhau dựa trên động lực học phân tử

c. Ảnh hưởng của dung môi

Khả năng solvate hóa của dung môi gây ảnh hưởng rất lớn đến cấu dạng của

dendrimer. Động lực học phân tử đã được áp dụng để nghiên cứu sự thay đổi của

hình dạng dendrimer cũng như chức năng của các thế hệ dendrimer trong các dung

môi khác nhau.

Hình 1.12. Sự thay đổi hình dạng dendrimer trong dung môi khác nhau

Trong dung môi không phân cực thì dendrimer co cuộn lại, do lúc này hình

thành liên kết hydro giữa N của nhóm -NH2 bên ngoài và H của nhóm -NH- bên

trong.

Trong dung môi phân cực thì các nhánh của dendrimer duỗi thẳng ra do tạo

liên kết hydro giữa nhóm amine trong và ngoài phân tử hay giữa O (của -COO-) với

H của dung môi.

d. Ảnh hưởng của muối

Nồng độ ion cao (nồng độ muối cao) có ảnh hưởng nhiều tới các dendrimer có

điện tích và dendrimer sẽ bị co lại, tương tự với sự tăng pH hay dung môi ít phân cực.

Nồng độ muối thấp, do lực đẩy giữa các đoạn dendrimer được tích điện, hình

dạng dendrimer sẽ duỗi ra.

Nồng độ muối cao Nồng độ muối thấp

Hình 1.13. Sự thay đổi hình dạng dendrimer trong nồng độ muối khác nhau

e. Ảnh hưởng của nồng độ

Dendrimer với cấu trúc linh hoạt, các cấu trúc không chỉ bị ảnh hưởng bởi các

phân tử nhỏ như dung môi, muối hoặc proton, nhưng cũng có thể bị ảnh hưởng với

các phân tử lớn hơn như dendrimer khác hoặc các bề mặt có thể có một ảnh hưởng

rất lớn về mật độ phân tử và cấu tạo của dendrimer.

Hình 1.14. Các nồng độ dendrimer khác nhau

a) Nồng độ rất loãng, các phân tử ở xa nhau

b) Nồng độ loãng, các phân tử tiếp xúc với nhau

c) Nồng độ đậm đặc, các phân tử ở dạng xa lắng

d) Nồng độ rất đậm đặcc, các phân tử xuyên nhập vào nhau

1.1.4. Phương pháp tổng hợp dendrimer [32, 40, 45, 66]

Dendrimer có thể tổng hợp bằng nhiều phương pháp như phương pháp “tổng

hợp phân kỳ” (devergent), “tổng hợp hội tụ” (convergent), “tổng hợp tăng lũy thừa

hai” (double exponential), …

a. Phương pháp “tổng hợp phân kỳ” (devergent)

Phương pháp tổng hợp dendrimer đầu tiên được biết đến là phương pháp phân

kỳ. Tên gọi này xuất phát từ cách thức phát triển của dendrimer từ tâm ra bên ngoài

và phân nhánh vào không gian. Bắt đầu từ một tâm phản ứng, một thế hệ được phát

triển và sau đó là ngoại vi mới của phân tử được hoạt hóa để phản ứng với các

monome khác. Qui trình trên được lặp lại cho nhiều thế hệ dendrimer khác nhau,

chúng được xây dựng từ lớp này sang lớp khác.

Ưu điểm của phương pháp này là có thể tổng hợp được dendrimer ở thế hệ cao.

Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là thường hay xảy ra nhiều phản

ứng phụ và sản phẩm sinh ra có nhiều khuyết tật. Tổng hợp các thế hệ càng cao, số

lượng phản ứng càng tăng thì khiếm khuyết của dendrimer càng nhiều. Nếu phản

ứng phụ xảy ra nhiều thì điều đó gây trở ngại cho việc tinh chế sản phẩm sau cùng.

Vì vậy để ngăn cản các phản ứng phụ thúc đẩy phản ứng chính thì độ tinh khiết của

tác chất ở mức độ cho phép là một đòi hỏi rất quan trọng, để hạn chế các khiếm

khuyết của sản phẩm.

Hình 1.15. Sơ đồ tổng hợp dendrimer bằng phương pháp phân kỳ

b. Phương pháp “tổng hợp hội tụ” (convergent)

Phương pháp hội tụ được phát triển như là một phản ứng tổng hợp những điểm

khuyết của phương pháp phân kỳ. Quá trình tổng hợp theo phương pháp convergent

bắt đầu từ những đơn vị bề mặt của dendrimer, cấu trúc bên trong dần dần liên kết

với các đơn vị bề mặt. Giống như phương pháp phân kỳ, quá trình tổng hợp này

cũng gồm hai bước: hoạt hóa và phát triển nhánh. Khi các nhánh phát triển đủ lớn,

một số được gắn vào tâm để được một dendrimer hoàn chỉnh. Việc tinh chế các sản

phẩm mong muốn tương đối dễ dàng và sự xuất hiện của các khuyết tật trong cấu

trúc cuối cùng cũng được giảm thiểu. Phương pháp hội tụ không cho phép hình

thành thế hệ dendrimer cao vì các vấn đề về hiệu ứng không gian xảy ra trong các

phản ứng của dendrons và tâm phân tử.

Hình 1.16 Tổng hợp dendrimer bằng phương pháp hội tụ

c. Phương pháp “tổng hợp tăng lũy thừa hai” (double exponential)

Gần đây nhất bước đột phá trong việc tổng hợp dendrimer là phương pháp

tăng trưởng theo cấp số nhân. Trong thực tế, tăng trưởng theo cấp số nhân là quá

nhanh, nó có thể được lặp đi lặp lại có lẽ chỉ có hai hoặc ba lần trước khi tiếp tục

tăng trưởng. Các phương pháp này cung cấp một phương tiện nhờ đó mà một đoạn

hình cây có thể được kéo dài theo hướng hội tụ hay phân kỳ theo hướng khác nhau

tùy theo yêu cầu. Bằng cách này, những khía cạnh tích cực của cả hai phương pháp

trên có thể được áp dụng mà không cần thiết để ý đến nhược điểm của chúng.

Hình 1.17. Tổng hợp dendrimer bằng phương pháp tăng lũy thừa hai

Dendrimer thường được tổng hợp bằng phương pháp phân kỳ và phương pháp

hội tụ. Tuy nhiên, trong trường hợp tổng hợp dendrimer PAMAM sử dụng phương

pháp phân kỳ thuận tiện và hiệu quả hơn [2-3, 5-6].

1.2. DENDRIMER POLYAMIDOAMINE

1.2.1. Khái niệm dendrimer polyamidoamine [2-3, 5-6]

Dendrimer polyamidoamine (PAMAM) là dendrimer trên cơ sở phản ứng

amide và phản ứng Michael.

 Lý thuyết phản ứng Michael (cộng vào nối đôi C=C–C=O)

Phản ứng cộng vào nối đôi C=C tiếp cách là nhóm C=O theo cơ chế ái nhân.

Do hiệu ứng liên hợp nhóm C=O rút điện tử làm cho C=C mang điện tích dương

nên các tác nhân mang điện tích âm rất dễ tấn công vào. Hơn nữa khi có mặt dung

môi phân cực hay xúc tác như acid Lewis làm cho liên kết π trên C=C phân cực hơn

và tác nhân cộng hợp cũng phân cực hơn, do đó phản ứng xảy ra dễ dàng hơn. Cơ

chế phản ứng cộng vào nối đôi C=C–C=O được thực hiện theo phương trình sau:

 Lý thuyết phản ứng amide (cộng hợp vào nối đôi C=O)

Phản ứng thực hiện theo cơ chế ái nhân. Nhóm C=O có khả năng cộng hợp với

rất nhiều nhóm, do nguyên tử oxy có độ âm điện lớn làm cho liên kết π bị phân cực

mạnh làm xuất hiện hai trung tâm: trung tâm tích điện dương trên nguyên tử carbon

và trung tâm tích điện âm trên nguyên tử oxygen. Trung tâm dương sẽ tương tác với

các tác nhân ái nhân, trung tâm âm tương tác với các tác nhân ái điện tử. Cơ chế

phản ứng cộng vào nguyên tử C của nhóm C=O được thực hiện như sau:

Do các ester có khả năng cộng hợp kém hơn aldehyde hay ketone nên quá

trình cộng hợp vào C=O của ester xảy ra khó khăn, vì vậy người ta dùng xúc tác để

thúc đẩy quá trình phản ứng. Gần đây chất trao đổi ion được sử dụng làm xúc tác

thay cho acid. Các dung môi thường sử dụng là methanol, benzene và acetone. Lý

thuyết phản ứng điều chế dendrimer PAMAM

Polyamidoamine được tổng hợp từ tâm (core) khác nhau với tác nhân tạo

mạch nhánh methylacrylate (MA) và ethylenediamine (EDA).

Sản phẩm bắt đầu từ tâm (ví dụ như NH3 hay EDA), qua hai phản ứng amide

hóa và phản ứng Michael. Nhóm -NH2 sẽ thực hiện phản ứng Michael với

methylacrylate, phản ứng amide hóa xảy ra giữa nhóm -COO- trên phân tử

methylacrylate vừa gắn vào sẽ phản ứng với nhóm NH2 của phân tử EDA tiếp đó và

đưa đến hình thành một thế hệ dendrimer.

Hình 1.18. Công thức của phân tử dendrimer PAMAM G3.0 tâm EDA.

Dendrimer PAMAM được quan tâm nhiều vì có các nhóm chức bề mặt là -

NH2 hay -COO- rất hoạt động. Do đó PAMAM dễ tan trong nhiều loại dung môi

phân cực và kém phân cực, dễ biến tính tạo ra các hợp chất mới với cấu trúc đa

dạng và các tính chất mới vô cùng phong phú.

Trong tổng hợp dendrimer PAMAM có thể sử dụng nhiều tâm khác nhau:

EDA, BDA, hexylenediamine (HAD), hay NH3. Với các tâm khác nhau, có kích

thước khác nhau và độ phân cực khác nhau nên sẽ được sử dụng để mang các loại

thuốc hoặc các hoạt chất khác nhau.

Trong công trình này sẽ giới thiệu cụ thể tổng hợp và xác định cấu trúc của

PAMAM với tâm điển hình là EDA. Tổng hợp dendrimer PAMAM với tâm EDA

dựa trên cơ sở các phản ứng lần lượt sẽ là những thế hệ (generation-G) của

dendrimer khác nhau: G -0.5; G 0.0; G 0.5; G 1.0; G 1.5; G 2.0;…

PAMAM thế hệ lẻ -0.5 (PAMAM G -0.5) là kết quả của phản ứng Michael

nhóm NH2 của tâm EDA với bốn phân tử acrylate (hình 1.19).

Hình 1.19. Phương trình phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G -0.5

PAMAM thế hệ chẵn 0.0 (PAMAM G 0.0) là kết quả của phản ứng amide hóa

nhóm COOCH3 của PAMAM G -0.5 với bốn phân tử ethylenediamine (hình 1.20).

Hình 1.20. Phương trình phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM G 0.0

Tiếp theo, tổng hợp dendrimer PAMAM các thế hệ G 0.5; G 1.5; G 2.5 cũng

được tiến hành tương tự như phản ứng tổng hợp PAMAM G -0.5 và sản phẩm thu

được có cấu trúc phân tử trên hình 1.21.

(a) (b)

(c)

Hình 1.21. Cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G0.5 (a); G1.5 (b); G2.5 (c)

Và tương tự, tổng hợp dendrimer các thế hệ G 1.0; G 2.0; G 3.0 cũng được

thực hiện tương tự như phản ứng tổng hợp G 0.0 và sản phẩm thu được có cấu trúc

phân tử trên hình 1.22.

(a) (b)

Hình 1.22. Cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G 1.0 (a) và G 2.0 (b)

Lưu ý: Dendrimer PAMAM có hai loại thế hệ: lẻ và chẵn. Các thế hệ

PAMAM lẻ: G -0.5; G 0.5; G 1.5; G 2.5;… có nhóm chức ngoài cùng là COOCH3.

Còn các thế hệ PAMAM chẵn: G 0.0; G 1.0; G 2.0; G 3.0;… có nhóm chức ngoài

cùng là NH2.

1.2.2. Phương pháp nang hóa thuốc của dendrimer PAMAM

a. Tiêu chí đối với chất nang hóa thuốc

Chất nang hóa thuốc phải được xây dựng trên 3 tiêu chí chính sau:

- Kéo dài và cải thiện tác dụng chữa bệnh;

- Giảm chuyển hóa của thuốc;

- Giảm độ độc của cả hệ thống.

b. Các phương pháp nang hóa thuốc của dendrimer PAMAM

Trên cơ sở hình thức vận chuyển thuốc [18-19, 28, 50-51, 96-97], các phương

pháp nang hóa thuốc của dendrimer được mô tả theo 4 hình thức sau (hình 1.23):

- (a) Các phân tử thuốc chứa trong các khoảng trống bên trong phân tử của

dendrimer;

- (b) Nhiều phân tử dendrimer kết hợp tạo thành mạng lưới bao bọc các phân

tử thuốc;

- (c) Các phân tử thuốc gắn với những nhóm ở bề mặt bằng nối cộng hóa trị;

- (d) Các phân tử thuốc gắn với những nhóm ở bề mặt bằng tương tác không

hóa trị.

Hình 1.23. Cơ chế nang hóa thuốc của dendrimer

Trên cơ sở mối tương tác giữa dendrimer (chất chủ) với các phân tử thuốc

(khách), cơ bản có thể chia các phương pháp vận chuyển thuốc thành 2 nhóm sau:

(1) Không có tương tác giữa dendrimer (chủ) và thuốc (khách):

- Thuốc không tương tác với thành phần tâm và nhánh bên trong của

dendrimer (các nhánh dendrimer bao bọc các phân tử thuốc một cách trực tiếp).

- Nhiều phân tử dendrimer kết hợp tạo thành mạng lưới bao bọc (hay bẫy) các

phân tử thuốc.

(2) Có tương tác giữa dendrimer (chủ) và thuốc (khách):

- Thuốc tương tác với thành phần tâm và nhánh bên trong của dendrimer: các

nhánh bên trong của dendrimer tương tác kỵ nước với các phân tử thuốc có tính ái

dầu, hay các nhóm chức trên nhánh, như amine và amide có thể tạo liên kết

hydrogen, tạo phức với các phân tử thuốc.

- Thuốc tương tác với các nhóm bề mặt của dendrimer: các tương tác có thể là

tương tác tĩnh điện và tương tác hóa trị.

1.3. Ý NGHĨA CỦA VIỆC BIẾN TÍNH CHẤT MANG NANO DENDRIMER

PAMAM LÀM CHẤT MANG THUỐC

Việc sử dụng các phân tử kích thước nano trong lĩnh vực phân phối thuốc

cũng mang lại rất nhiều lợi thế so với công nghệ hóa trị đang được sử dụng. Ngoài

tác dụng mang thuốc, phân phối thuốc và giải phóng thuốc có kiểm soát, kết quả là

giảm hiệu ứng phụ, giảm độ độc với cơ thể, các hệ nang hóa thuốc nano còn có khả

năng nang hóa thuốc hướng tới đích là các tế bào bệnh [85].

Đồ thị trên hình 1.24 biểu diễn nồng độ của thuốc có trong máu thông qua các

phương pháp sử dụng thuốc khác nhau: Thuốc uống (a); Thuốc được tiêm qua tĩnh

mạch (b) và Thuốc giải phóng chậm từ chất mang (c) [37].

Kết quả nghiên cứu cho thấy: nồng độ thuốc trong máu của phương pháp uống

thuốc (a) sẽ tăng lên từ từ, có lúc vượt qua ngưỡng cho phép, rồi lại hạ xuống

ngưỡng cho phép; nồng độ thuốc được tiêm qua đường tĩnh mạch (b) thì ngay lập

tức đã ở trên ngưỡng độc, sau đó giảm nhanh; còn thuốc giải phóng chậm có nồng

độ trong máu (c) tăng từ từ và luôn trong giới hạn cho phép. Đồ thị cho thấy thời

gian có hiệu lực của thuốc giải phóng chậm dài hơn nhiều so với các loại thuốc

uống hay tiêm thông thường.

Hình 1.24. Nồng độ thuốc trong máu tương ứng với các phương pháp sử dụng

thuốc: a) Thuốc uống; b) Thuốc được tiêm qua tĩnh mạch và c) Thuốc giải phóng

chậm từ chất mang

Do đó phương pháp sử dụng hệ dẫn thuốc giải phóng chậm có kiểm soát mang

đến rất nhiều lợi thế so với các phương pháp sử dụng thuốc truyền thống như tăng

hiệu lực của thuốc, giảm độ độc của thuốc, giảm tác dụng phụ và tạo sự thuận tiện

cho người bệnh.

Ngoài ra, chất mang nano dendrimer PAMAM còn được ứng dụng mang các

chất có hoạt tính sinh học như protein, lipid, petide, gen, DNA, RNA,…và chúng

được sử dụng trong các lĩnh vực chuyển đổi gen, cấy ghép sinh học, chế tạo các

chip sinh học, cảm biến hóa học và cảm biến sinh học,…

Tuy nhiên, những nghiên cứu bước đầu cho thấy dendrimer PAMAM có bề

mặt chứa các nhóm amine tích điện dương sẽ gây độc cho cơ thể do có tính gây độc

tế bào hoặc có những phản ứng dễ gây viêm nhiễm trong cơ thể và có thể phân bố

tới phổi gây phù nề phổi; đồng thời các nhóm amine trên bề mặt dendrimer

PAMAM tích điện dương bị đào thải nhanh ra khỏi vòng tuần hoàn máu làm khó

theo dõi. Mặt khác, quá trình vận chuyển thuốc hoặc các hệ thống mang thuốc từ hệ

tuần hoàn máu tới các mô phụ thuộc rất nhiều vào khả năng thấm xuyên màng, các

polymer có cấu trúc hình cầu sẽ thấm xuyên qua màng chậm hơn so với polymer có

cấu trúc hình dây, đó chính là nhược điểm của dendrimer (hình cầu) khi cần thâm

nhập vào các tế bào bệnh, tế bào ung thư, nơi màng tế bào có các lỗ rất không đồng

nhất.

Để giải quyết vấn đề này, cần thiết phải biến tính các nhóm amine trên bề mặt

của dendrimer nhằm triệt tiêu điện tích dương tại đó, hay tạo ra rào cản không gian

xung quanh các nhóm amine trên. Khi đó dendrimer sẽ giảm gây độc tế bào, kéo dài

được thời gian lưu trong tuần hoàn máu và đồng thời làm giảm tích lũy trong cơ thể

và có thế ứng dụng hiệu quả trong y-dược.

1.4. CÁC CHẤT BIẾN TÍNH NHÓM AMINE TRÊN BỀ MẶT CỦA

DENDRIMER PAMAM

Các nhà khoa học trên thế giới sử dụng rất nhiều các tác nhân khác nhau để

biến tính các nhóm amine trên bề mặt dendrimer PAMAM nhằm giảm độ độc của

PAMAM, tức là tăng tính tương hợp sinh học của chúng, đồng thời tăng khả năng

thấm qua màng tế bào và ngoài ra còn tăng khả năng nang hóa thuốc của hệ

dendrimer PAMAM. Các tác nhân thông dụng nhất là các tác nhân alkyl hóa nhóm

amine như các dãy alkyl; protein; amino acid; lipid; DNA; polymer sinh học

(chitosan, alginate, gelatin,…) hay các polymer tương hợp sinh học (PEG, Pluronic,

CMC,...).

1.4.1. Polyethylene glycol [14, 68, 78, 84]

a. Cấu tạo của Polyethylene glycol

Polyethylene glycol (PEG) là polymer mạch dài có công thức chung là

H(OCH2CH2)nOH.

Hình 1.25. Cấu trúc của Polyethylene glycol

Với n (là mức độ polymer hoá) xác định, PEG sẽ có khối lượng phân tử trung

bình và tính chất xác định.

Bảng 1.1. Thông số đặc trưng của Polyethylene glycol

Polyethylene glycol Số nhóm EO Khối lượng phân tửa Trạng tháia (PEG) (x)b (Da)

PEG 4000 Rắn 90 3700-4400

PEG 6000 Rắn 150 5600-6600

PEG 8000 Rắn 180 7300-9000

PEG 10000 Rắn 220 9000-11250

a Khối lượng phân tử và trạng thái của các polyethylene glycol được cung cấp bởi nhà sản xuất

b Số các đơn vị EO được tính toán bằng cách sử dụng khối lượng phân tử

PEG 12000 Rắn 240 10500-15000

b. Tính chất của PEG

Polyethylene glycol là một polymer tan được trong nước, thấm nước, không

miễn dịch và không độc hại, có độ tương hợp sinh học nên được sử dụng rộng rãi

trong lĩnh vực y sinh. Với những tính chất đó, vật liệu được tổng hợp từ PEG là ứng

cử viên sáng giá nhất cho vật liệu sinh học. PEG có thể thay đổi tính chất của một

phân tử khác khi nó tạo liên kết với phân tử đó. Kết quả của việc này là có thể làm

cho phân tử độc hại trở nên không độc hại hoặc không tan trong nước trở nên tan

trong nước khi liên kết với nó.

c. Ứng dụng của PEG

PEG là loại polyether alcohol tan trong nước, được ứng dụng trong nhiều lĩnh

vực khác nhau. PEG được sử dụng để tổng hợp tạo các copolymer ứng dụng trong

phân phối thuốc, chữa lành vết thương và nhiều ứng dụng y sinh khác.

Ngoài ra PEG còn được ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp, gốm sứ, hóa

mỹ phẩm, xi mạ điện, keo dán, dầu bôi trơn và các sản phẩm gia dụng khác...

1.4.2. Pluronic

a. Cấu tạo của Pluronic

Pluronic hay polyethylene-polypropylene glycol copolymer là tên thương mại

của poloxamer. Từ "poloxamer" được đặt ra bởi Irving Schmolka, người phát minh

ra và đã nhận được bằng sáng chế cho các chất này vào năm 1973. Pluronic còn

được biết đến với các tên thương mại khác là Synperonic và Kolliphor [15].

Hình 1.26. Cấu trúc của Pluronic

Pluronic có cấu trúc đặc biệt với 2 nhóm ưa nước (EO) ở ngoài còn ở trong

là nhóm kỵ nước (PO), nhóm này cũng là thành phần nhạy nhiệt của Pluronic

(hình 1.27). Các giá trị x, y được thể hiện trong bảng 1.2.

Hình 1.27. Hình dạng của Pluronic.

Phần màu sáng là EO ưa nước, phần màu tối là PO kỵ nước.

Hình 1.28. Cơ chế thay đổi cấu trúc của Pluronic

Các poloxamer thường có tính chất đặc trưng là phản ứng lại với nhiệt độ

và được dùng rộng rãi trong các hệ thống gel nhiệt. Trong nước, các poloxamer

cho thấy chúng có cấu trúc khá giống micelle. Khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ tới

hạn (CMT) hoặc nồng độ tới hạn (CMC) các nhóm PO kỵ nước sẽ kết vào trong,

còn các đầu EO ưa nước sẽ hướng ra ngoài (hình 1.28). [92]

Bảng 1.2. Thông số đặc trưng của Pluronic [61]

Số nhóm Số nhóm Chỉ số cân bằng Trạng Khối lượng Pluronic EO (x) PO (y) ưa-kỵ nước thái phân tử (Da) (HLB)

L44 Lỏng 10-15 18-23 2090-2360 16

P123 Hồ keo 15-20 60-70 4140-5820 8

F87 Rắn 60-68 35-40 6840-8830 24

F68 Rắn 75-85 25-40 7680-9510 29

F127 Rắn 95-105 54-60 9840-14600 22

a Khối lượng phân tử và trạng thái của các pluronic được cung cấp bởi nhà sản xuất

b Số các đơn vị EO và PO được tính toán bằng cách sử dụng khối lượng phân tử

c Hằng số cân bằng ưa nước – kỵ nước (HLB) được xác định bởi nhà sản xuất

F108 Rắn 137-146 42-47 12700-17400 27

b. Tính chất của Pluronic [33]

Tương tự như Polyethylene glycol, Pluronic cũng là một polymer tan được

trong nước, thấm nước, không miễn dịch, không độc hại, có độ tương hợp sinh học

cao và được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực y sinh.

Pluronic có tiềm năng lớn trong việc mang các thuốc khó tan trong nước, đặc biệt

là thuốc trị ung thư.

Ngoài ra Pluronic có nhóm -OH đầu mạch nên dễ dàng kết hợp với một chất

khác để tạo ra hệ chất nano mang thuốc hiệu quả hơn.

c. Ứng dụng của Pluronic [10, 15, 34, 36]

- Trong ngành dược, Pluronic làm chất đẫn truyền và phân phối thuốc. Với cấu

trúc vừa ưa nước, vừa ưa dầu (amphiphilic), những poloxamer có tính chất hoạt động

bề mặt tốt nên chúng có nhiều ứng dụng trong công nghiệp. Poloxamer có thể làm

tăng khả năng hòa tan trong nước của các chất kỵ nước, chất dầu, hoặc tăng khả năng

trộn lẫn của hai chất kỵ nước khác nhau. Do đó, các poloxamer thường được sử dụng

trong các ứng dụng công nghiệp, mỹ phẩm, dược phẩm. Chúng cũng được đánh giá

cao trong việc phân phối thuốc, đặc biệt với các thuốc kháng tế bào ung thư.

- Trong vật liệu y sinh, Pluronic được sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế

bào, làm chất ổn định của màng tế bào, bảo vệ tế bào tránh các tác động của quá

trình chia cắt và kết hợp.

- Trong khoa học vật liệu, các poloxamer P123 gần đây đã được sử dụng để

thay thế các nhóm bề mặt trong quá trình tổng hợp vật liệu mao quản SPA-15 (một

loại vật liệu có nhiều lỗ mao quản đường kính từ 2-50 nm).

Hình 1.29. Vật liệu mao quản SPA-15 [10]

1.5. Ý NGHĨA ỨNG DỤNG DENDRIMER PAMAM LÀM CHẤT MANG

THUỐC CHỐNG UNG THƯ

Liệu pháp hóa trị là một trong ít phương pháp điều trị hiệu quả căn bệnh ung

thư. Trong quá trình hóa trị, hoạt chất phá vỡ các tế bào phát triển nhanh (tế bào ung

thư) nhưng đồng thời cũng phá vỡ các tế bào lành và gây ra những phản ứng phụ

không mong đợi. Đó là hạn chế lớn của liệu pháp này. Hiện nay, các nhà khoa học

trên thế giới đang cố gắng tìm những giải pháp mới nhằm nâng cao hiệu lực của

thuốc và giảm tác động phụ của quá trình chữa bệnh, đặc biệt là đối với bệnh ung

thư. Đó là ý tưởng làm sao dẫn được thuốc tới trực tiếp tế bào ung thư và bảo vệ các

tế bào lành của cơ thể [45].

Dendrimer là một trong các nanopolymer (nanomicelle, liposome, nanocapule,

protein, DNA, dendrimer, …) có khả năng mang các hoạt chất hay thuốc. Ngoài các

ưu điểm như tính xác định của cấu trúc, độ ổn định lập thể cao, dendrimer còn có

nhiều nhóm chức trên bề mặt nên có thể gắn với nhiều tác nhân như tác nhân tăng

tính tương hợp sinh học, tăng khả năng thấm qua màng tế bào, đặc biệt là tác nhân

hướng đích. Khi đó dendrimer sẽ có khả năng dẫn truyền và phân phối thuốc tới

đích bằng cả hai cách thụ động và chủ động [13, 23, 45, 68, 89, 98].

1.5.1. Dendrimer phân phối thuốc tới đích thụ động

Sự định hướng thụ động (passive targeting) xuất phát từ hiện tượng tăng tính

thấm và tăng hiệu quả lưu giữ (Enhanced Permeability and Retention Effect - EPR)

đặc trưng ở các mô ung thư (hình 1.30). Tại hầu hết các mô khoẻ mạnh, kích thước

các khe hở lớp nội mô thành mạch máu thường nhỏ hơn 2 nm. Với khe hẹp giữa các

lớp nội mô thành mạch máu, các phân tử thuốc có khối lượng phân tử nhỏ cũng có

thể lọt qua, gây độc cho tế bào lành. Tuy nhiên, các khe hở này quá nhỏ so với kích

thước của hầu hết các chất mang nano [102].

Còn tại mô ung thư, do sự phát triển của tế bào ung thư đòi hỏi sự tăng sinh

mạch máu, các vi mạch máu mới được hình thành tại các mô ung thư và có kích

thước lên đến từ 100 đến 800 nm. Do đó các phức hợp chất mang thuốc tồn tại

trong tuần hoàn máu có thể vượt qua dễ dàng và đi vào mô ung thư. Hơn nữa, sau

khi xâm nhập vào, các phức hợp này sẽ tập trung ở dịch gian bào bao quanh các tế

bào ung thư. Sự phân bố này có được là kết quả của 2 yếu tố: không gian và áp suất

thẩm thấu lớn hơn tại các khe giữa các tế bào ung thư so với mô bình thường. Đặc

điểm hình thái của các tế bào ung thư tạo ra khoảng không gian giữa các tế bào rộng

hơn so với các mô bình thường. Các phức hợp chất mang-thuốc sau khi đã đi vào

các khe hở tế bào này sẽ bị kẹt giữ lại khi các tế bào ung thư phát triển. Thêm vào

đó, do không có hệ bạch huyết cần thiết, tốc độ đào thải các phức hợp này ra khỏi

mô ung thư là rất hạn chế.

Hình 1.30. Mô hình định hướng thụ động dựa theo cơ chế EPR

1.5.2. Dendrimer phân phối thuốc tới đích chủ động

Chất mang thuốc được gọi là lí tưởng nếu như nó là chất mang thuốc “thông

minh” tức là mang và phân phối thuốc hoặc các hoạt chất đến đúng nơi cần chữa trị

mà không tới các tế bào bình thường.

Dendrimer dẫn truyền và phân phối thuốc tới đích chủ động (active targeting)

là hệ dendrimer mang thuốc với chủ đích vận chuyển thuốc đến đúng nơi cần chữa

trịddin9, 78, 82, 116, 124].

Dendrimer mang và phân phối thuốc tới đích thụ động theo cơ chế EPR đã cho

thấy ưu thế hơn hẳn thuốc không có chất mang, tuy nhiên hiệu ứng EPR là chưa đủ

để bảo đảm hiệu quả tấn công đặc hiệu vào tế bào ung thư. Hiệu ứng EPR chỉ giúp

cho các phức hợp chất mang-thuốc tập trung tại các khe kẽ của vùng mô ung thư.

Điều trị ung thư chỉ thực sự hiệu quả khi thuốc chống ung thư xâm nhập được vào

bên trong tế bào và phát huy tác dụng. Nếu chất mang không thể xâm nhập được

vào tế bào, cuối cùng thuốc chống ung thư cũng sẽ bị giải phóng bên ngoài tế bào

và lại được hệ tuần hoàn phân bố đến các vùng mô khác nhau trong cơ thể và cuối

cùng là đào thải ra khỏi cơ thể.

Để khắc phục hạn chế này, trên bề mặt của chất mang được gắn thêm các phần

tử định hướng. Các phần tử định hướng có thể là các kháng thể, các peptide, các

aptamer, hoặc là các ligand carbohydrate đặc hiệu với các kháng nguyên và thụ thể

trên bề mặt tế bào ung thư. So sánh giữa chất mang có phần tử định hướng và chất

mang thông thường, các chỉ số dược động học là không có khác biệt, song hiệu quả

điều trị đặc biệt được tăng lên.

1.5.3. Thuốc 5-Fluorouracil (5-FU) [1, 62]

Nhiều loại thuốc chống ung thư được nghiên cứu mang bởi dendrimer

PAMAM như Doxorubicin (DOX), Methotrexate (MTX), Paclitaxel (Taxol), 5-

Flourouracil (5-FU), cis Platin,…Trong đề tài này chúng tôi sử dụng 5-FU.

5-Fluorouracil (5-FU) thuộc loại thuốc chống chuyển hóa là một trong những

thuốc chống ung thư quan trọng nhất được sử dụng rộng rãi trong suốt 4 thập kỷ

qua. Cấu tạo 5-Fluorouracil như sau:

Hình 1.31. Cấu trúc 5-Fluorouracil

a. Dược lực

Fluorouracil là thuốc chống ung thư kháng pyrimidin.

b. Động lực học

Hấp thu: Fluorouracil dùng đường tiêm tĩnh mạch hoặc bôi da.

Phân bố: Thuốc được khuyếch tán nhanh vào các mô, đặc biệt thấm tốt vào

các mô u, mô tăng trưởng nhanh như tủy xương, niêm mạc ruột (nồng độ thuốc ở

các nơi này gấp 6-8 lần ở các mô bình thường) vào được dịch não tủy.

Chuyển hóa: thuốc chuyển hóa ở gan.

Thải trừ: Fluorouracil thải trừ chủ yếu qua đường hô hấp (60%), một phần thải

qua thận.

c. Cơ chế tác dụng của thuốc

Fluorouracil khi vào cơ thể chuyển thành 5-fluoro-2-deroxyuridin

5’monophosphat (5-FdUMP). Chất này cạnh tranh với deroxyuridinmonophosphat

(dUMP) nên ức chế thymidylat synthtase gây thiếu thymidin cho quá trình tổng hợp

AND làm cho tế bào ung thư bị tiêu diệt

d. Chỉ định

Ung thư đại tràng, trực tràng, vú, dạ dày, tụy. Hỗ trợ trong điều trị các u đặc. Ít

hiệu quả hơn trên ung thư buồng trứng, cổ tử cung, bàng quang, gan tụy.

e. Tác dụng phụ

Biếng ăn, buồn nôn, mất vị giác, viêm ruột nặng. Suy tim sung huyết, nhồi

máu cơ tim, đau thắt ngực, đau tim, đau ngực. Giảm huyết cầu, giảm bạch cầu, thiếu

máu, giảm tiểu cầu.

Hiếm gặp: triệu chứng ngoại tháp, liệt mặt, loạn ngôn, vận động khó khăn, mờ

mắt, lú lẫn, co giật, mất phương hướng, viêm chất trắng ở não, parkinson. Viêm

gan, đạm niệu, mất nước.

1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC HỆ NANO DENDRIMER MANG

THUỐC

1.6.1. Các nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM nhằm giảm độc tính

Dendrimer được Donald A. Tomalia và cộng sự tổng hợp lần đầu tiên vào

những năm 1980. Nó là những polymer đa nhánh, từ tâm (lõi) ở giữa người ta phát

triển các nhánh dần ra bên ngoài. PAMAM được tổng hợp từ ethylenediamine,

methylacrylate.

Sau 5 năm, năm 1985 khái niệm dendrimer được Donald A. Tomalia và cộng

sự đưa ra đầu tiên [106-107].

Năm 1985, George R. Newkon, chuyên gia hoá học và trung tâm ở trường Đại

Học South Floride đã xuất bản bài báo về dendrimer, ông tổng hợp dendrimer từ

polyamidoalcol.

Trong những năm tám mươi người ta đã tổng hợp dendrimer và xác định được

tính chất vật lí và hóa học của nó [108-109].

Năm 1999, Khoa Hóa học, đại học Califonia, Mỹ đã nghiên cứu thiết kế

dendrimer ứng dụng làm tác nhân mang thuốc, mang gen, và tác nhân hình ảnh

trong cộng hưởng từ hạt nhân. Và theo hướng nghiên cứu này, nhiều nhà khoa học

tiếp tục đi sâu và phát triển hơn nữa. [71]

Năm 2000, Malik và cộng sự đã phát hiện ra các dendrimer PAMAM cationic

có nhóm bên ngoài là -NH2 là nguyên nhân gây huyết giải và đầu độc tế bào [70].

Do bề mặt tế bào mang điện tích âm nên khi gặp những dendrimer mang điện tích

dương này sẽ có sự tương tác với nhau làm phá vỡ màng tế bào, dẫn đến sự tiêu hủy

tế bào [21, 56, 59, 77, 85].

Tại Việt Nam, bắt đầu từ năm 2007, nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Nguyễn Cửu

Khoa, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng-Viện Khoa học Công nghệ thành phố Hồ Chí

Minh được xem là đơn vị đầu tiên nghiên cứu tổng hợp dendrimer với nhiều dạng khác

nhau [2-3, 5-6].

Từ năm 2010 đến 2013, nhóm tác giả Nguyễn Cửu Khoa cũng cho thấy

dendrimer ở thế hệ chẵn (với các nhóm amine trên bề mặt) có độc tính với tế bào (in

vitro) cao hơn so với dendrimer thế hệ lẻ (với các nhóm chức ester trên bề mặt) [4,

68, 79]. Điều này có thể giải thích bởi nhóm amine tích điện dương nên có thể tạo

liên kết tốt hơn với màng tế bào (tích điện âm) và gây độc cho tế bào bởi điện tích

dương trên bề mặt của chúng [33, 87, 92]

Đối với dendrimer, những đặc tính sinh học như độc tố hay tính sinh miễn

dịch chịu sự ảnh hưởng lớn của kích thước và các nhóm chức bên ngoài. Độc tính

2- >COO->PEG

giảm dần đối với các nhóm chức bên ngoài theo thứ tự như sau:

+> Guanidin+ >SO3

2- >PO3

NH3

Muốn làm giảm độ độc của dendrimer có thể biến tính các nhóm chức bề mặt

với các tác nhân ít độc hại hơn. Trong đó việc gắn nhóm PEG, Pluronic, acetyl,

alcolhol mạch dài, acid mạch dài, … vừa có tác dụng giảm độ độc của dendrimer

vừa kéo dài thêm bán chu kỳ tuần hoàn trong máu (blood halflives) và giảm sự tích

lũy trong cơ thể [14, 19, 35, 50-51, 80, 95-97].

Hình 1.32. Ảnh hưởng việc biến tính bề mặt PAMAM lên khả năng gây độc tế bào,

thấm xuyên bào và sự hấp thu của tế bào

Nhiều báo cáo đã chỉ ra các polymer tương hợp sinh học như PEG, Pluronic…

khi lai hóa với PAMAM trước hết sẽ che chắn bề mặt cationic của PAMAM, tránh

khỏi sự tương tác với bề mặt anionic của màng tế bào, giảm khả năng đầu độc tế

bào và tăng cường tính tương hợp sinh học. Thuận lợi thứ hai là khi polymer này

kết hợp với PAMAM sẽ giảm được độc tính của PAMAM rất nhiều và không sinh

kháng thể. Thông thường khi có “vật lạ” xâm nhập vào cơ thể, cơ thể sẽ có các cơ

chế để chống lại “vật lạ” này. “Vật lạ” bị coi là “ngoại lai” và sẽ bị đào thải theo cơ

chế miễn dịch, chủ yếu thông qua tác dụng thực bào hoặc bị phá vỡ trong huyết

tương. Nhưng khi PAMAM kết hợp với PEG hay Pluronic, do sự kết hợp giữa

nhóm ethylene oxide trên chuỗi PEG với các phân tử nước gây khó khăn cho hệ

thống miễn dịch trong sự nhận biết PAMAM-PEG hay PAMAM-Pluronic là vật lạ,

bảo vệ dendrimer chống lại cơ chế phá hủy của cơ thể [4, 65, 86, 94].

Năm 2003, D. Bhadra và các đồng nghiệp đã tiến hành lai hóa MPEG 5000

với PAMAM tâm EDA thế hệ G4.0. Kết quả xác định độ độc trên chuột của nhóm

nghiên cứu cho thấy PAMAM không lai hóa có hiện tượng gây độc máu và tế bào,

số lượng hồng cầu giảm xuống 106-2  106/L và số lượng bạch cầu tăng lên đến 3

 103-4  103/l; còn PAMAM lai hóa MPEG có độc tính giảm đi, số lượng bạch

cầu tăng chỉ từ 103-1,5  103/L. Các nghiên cứu in vivo trên các loại dendrimer

khác cũng cho thấy PEG hóa làm giảm độc tính rất nhiều. Trên các con chuột

nghiên cứu, liều độc của melamine dendrimer đối với gan chỉ là ≥10 mg/kg, trong

khi đó liều độc của dendrimer lai hóa 50% PEG trên bề mặt lên đến 1 g/kg [17].

Năm 2005, Viện công nghệ nano Michigan về sinh học và thuốc của Mỹ đã

nghiên cứu động lực học phân phối thuốc của dendrimer đã biến tính nhằm làm tăng

độ tan trong nước và giảm độc tính của thuốc điều trị [12].

Một loạt các báo cáo của nhóm nghiên cứu Thommey P. Thomas và James R.

Baker Jr từ năm 2004 đến 2010 về các hợp chất mang thuốc chữa trị ung thư hướng

mục tiêu đến các tế bào ung thư dựa trên cơ sở dendrimer PAMAM G5 với các

kháng thể đơn dòng (kháng thể anti-PSMA, kháng thể Anti-HER2). Những tổ hợp

này nhắm mục tiêu đến các dòng tế bào ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, … và có

độc tính tế bào thấp hơn so với thuốc chống ung thư tự do methotrexate [11, 90-91,

104-105].

Một số công trình nghiên cứu khác của nước ngoài đã chỉ ra rằng các loại thuốc

chống ung thư (Camptothecin, 6-Mercaptopurin, Methotrexate, Adriamycin, 5-

Fluorouracil, Doxorubicin và Paclitaxel) khi được bao bọc trong dendrimer PAMAM

làm tăng đáng kể độ tan, khả năng lưu trữ và hoạt tính chống ung thư của thuốc.

1.6.2 Các nghiên cứu tăng cường hiệu quả mang và giải phóng thuốc của hệ

dendrimer PAMAM biến tính với PEG và Pluronic

Như đã đề cập ở trên, mục đích đầu tiên của việc PEG hóa là giảm tính sinh

miễn dịch của chất mang PAMAM. Ngoài ra, với tính chất đặc biệt của PEG là vừa

có khả năng tan tốt trong nước vừa có thể tan được trong dầu nên khi PEG kết hợp

với PAMAM sẽ tăng khả năng hydrate hóa trên bề mặt, tạo thuận lợi cho việc dẫn các

thuốc kỵ nước trong cơ thể [62]. Một lợi ích khác nữa là khi lai hóa những chuỗi PEG

có khối lượng phân tử lớn (550, 2000, 5000,…), các nhóm bên ngoài PAMAM trở

nên đông đúc và chằng chịt hơn, những chuỗi PEG co lại nhốt các phân tử thuốc, làm

tăng khả mang thuốc lẫn kiểm soát quá trình giải phóng thuốc [17, 59].

Năm 2000, Chie Kojima và cộng sự đã tổng hợp PAMAM ở thế hệ 3.0 và 4.0

gắn kết với MPEG khối lượng phân tử 550 và 2000. Sau đó, nhóm nghiên cứu đã sử

dụng sản phẩm PAMAM-MPEG nang hóa và khảo sát sự giải phóng thuốc của hai

loại thuốc trị ung thư có tính ái dầu là adriamycin (ADR), methotrexate (MTX). Kết

quả là sản phẩm PAMAM 4.0 kết hợp với MPEG 2000 sẽ mang được 6,5% ADR và

26% MTX. Thuốc MTX được nang hóa trong PAMAM-MPEG được phóng thích ra

một cách từ từ trong dung dịch nước [59].

Hình 1.33. Sự kết hợp của PEG-PAMAM với adriamycin (a), methotrexate (b)

Không những vậy, một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng việc lai hóa PEG

còn kéo dài thời gian lưu của dendrimer trong tuần hoàn máu. Dendrimer không lai

hóa nhanh chóng bị thải trừ khỏi máu và tập trung ở các cơ quan như gan hay thận

chỉ sau vài phút hay vài giờ. Theo nghiên cứu của Kukowska-Latallo [63],

PAMAM G5.0 đánh dấu tritium được cơ thể nhanh chóng đào thải qua đường thận

chỉ trong 24 h sau khi tiêm. Trong một nghiên cứu khác [70], PAMAM được đánh

dấu với đồng vị 125I và tiêm thử nghiệm vào chuột Wistar, sau 1 h chỉ còn khoảng

1% lượng PAMAM lưu lại trong máu và hơn 60% lượng PAMAM đã tập trung tại

gan. Nhưng khi lai hóa với PEG, thời gian lưu trong tuần hoàn chung được tăng lên

đến 24 h, dendrimer chủ yếu được phân bố trong máu hơn là ở các cơ quan khác,

nhờ đó kéo dài thời gian bán thải và giảm độ thanh thải của thuốc.

Cũng trong nghiên cứu của nhóm Bhadra năm 2003 [17], thuốc chống ung thư

5-Fluorouracil được lần lượt nang hóa trong chất mang PAMAM G4.0 không lai

hóa và lai hóa 25% bề mặt với MPEG 5000. Kết quả khảo sát in vitro cho thấy so

với PAMAM không lai hóa, PAMAM lai hóa có khả năng mang lượng thuốc gấp

đến 12 lần và tốc độ giải phóng thuốc giảm đi 6 lần, thời gian phóng thích thuốc

hoàn toàn kéo dài đến 6 ngày. Nhóm nghiên cứu tiếp tục tiến hành so sánh in vivo

trên chuột và kết quả cũng tương tự. Khi không PEG hóa, nồng độ cực đại của

thuốc trong huyết tương cao, thời gian đạt nồng độ cực đại nhanh (Cmax =21-23

g/mL, tmax =3 h) và kết quả là thời gian lưu của thuốc trong tuần hoàn thấp (6-7 h).

Còn khi PEG hóa, nồng độ Cmax giảm đi chỉ còn khoảng 1/3, thời gian đạt được

chậm hơn tmax =7 h, mang lại hiệu quả kéo dài thời gian thuốc tồn tại trong huyết

tương, lên đến 12 h.

Hình 1.34. Mô hình PAMAM-MPEG mang thuốc 5-Fluorouracil

Năm 2004, một nghiên cứu khác cũng được H. Yang và các đồng nghiệp tiến

hành nhằm khảo sát ảnh hưởng của yếu tố khối lượng của chuỗi PEG lai hóa trên bề

mặt. PAMAM G3.0 cũng được chọn và lai hóa với các PEG 750, 2000 và 5000, đạt

được mức độ lai hóa lần lượt là 28, 25 và 23/32 nhóm amine bề mặt. Các

PAMAM-PEG hóa này được sử dụng để hòa tan pyrene. Kết quả cho thấy PAMAM

lai hóa PEG 2000 có khả năng hòa tan pyrene tốt nhất, hơn cả PAMAM lai hóa

PEG 5000. Để giải thích điều này, nhóm nghiên cứu cho rằng các chuỗi PEG quá

dài có thể bị vướng vào nhau dẫn đến hiệu quả hòa tan giảm [120].

Năm 2008, Shuhua Bai và cộng sự tiếp tục tổng hợp PAMAM-MPEG với

MPEG khối lượng phân tử 2000 và PAMAM ở thế hệ G3.0. Sau khi tổng hợp thành

công PAMAM-MPEG, nhóm nghiên cứu đã tiến hành nang hóa PAMAM-MPEG

với thuốc chống đông máu Heparin (LMWH). Nhờ nang hóa trong cấu trúc

PAMAM-MPEG mà độ hấp thu qua đường hô hấp và sinh khả dụng của LMWH

tăng 60,6% so với LMWH tiêm dưới da bình thường. Thời gian bán thải của thuốc

được nang hóa là 11,9 h; tăng gấp 2,4 lần so với LMWH trong saline thông thường.

Đáng chú ý là hiệu quả phóng thích thuốc từ từ của MPEG-PAMAM cho phép giãn

khoảng cách giữa hai lần dùng thuốc lên gấp đôi (48 h), mà vẫn bảo đảm hiệu quả

như LMWH thông thường tiêm cách quãng 24 h trong việc giảm kích thước huyết

khối in vivo trên chuột [100].

Năm 2009 và 2010, hiệu quả mang và giải phóng thuốc của sự lai hóa PEG

cũng được khẳng định trong kết quả của một số nghiên cứu khác của Arunvel

Kailasan và cộng sự [54], Chie Kojima và cộng sự [24].

Năm 2011, nhóm tác giả Dan Liu và cộng sự đã tổng hợp một copolymer nhạy

pH mang thuốc Doxorubicin thử nghiệm trên tế bào ung thư gan của chuột. Cấu tạo

của copolymer dựa trên tương tác tĩnh điện giữa PAMAM mang thuốc Doxorubicin

(Dox) và poly(methacryloyl sulfadimethoxine) (PSD) nhạy pH. Trên PSD này được

gắn với PEG (Polyethylene glycol) để tăng tính tương hợp sinh học và một dẫn xuất

của lactose để định hướng đến tế bào gan [27].

Năm 2011, Zhu S và cộng sự đã tổng hợp thành công hệ mang thuốc

dendrimer trên cơ sở polyester với chất tương hợp sinh học PEG thông qua liên kết

amide và thuốc doxorubicin thông qua cầu nối hydrazone giữa Glu được gắn trên bề

mặt dendrimer và doxorubicin (hình 1.35). [123]

Hình 1.35. Cấu trúc hóa học của PEG-Dendrimer gắn với doxorubicin thông qua mối

nối hydrazone

Năm 2013, nhóm tác giả P. Dinesh Kumar và cộng sự thực hiện biến tính

PAMAM G4 (G5) bằng MPEG. Trong đó MPEG cũng được hoạt hóa bằng NPC và

cho mang thuốc HIV, nhóm tác giả kiểm tra tốc độ giải phóng thuốc in vitro của

PAMAM chưa biến tính và đã biến tính trong môi trường đệm PBS. Kết quả cho thấy

PAMAM khi được biến tính bằng MPEG cho hiệu quả mang thuốc cao, giải phóng

thuốc chậm (hình 1.36) và giảm khả năng gây độc tế bào so với PAMAM khi chưa

biến tính [28].

Hình 1.36. Sơ đồ giải phóng thuốc của PAMAM chưa biến tính và PAMAM đã

biến tính.

Gần đây nhất năm 2015, Luis F. Barraza và cộng sự cũng chỉ dừng lại ở mức

độ biến tính PAMAM G4 bằng PEG mang thuốc 5-FU. Trong đó, PEG được hoạt

hóa trước qua một bước NPC bằng hình thức khống chế tỷ lệ 1:1, điều này dễ dẫn

đến khả năng PEG bị hoạt hóa cả hai đầu bằng NPC và kết quả có thể PEG liên kết

cả 2 đầu vào PAMAM, tạo lớp màng bao phủ bề mặt PAMAM và ngăn cản một

phần thuốc không đi vào khoảng trống trong cấu trúc PAMAM. Nhóm tác giả đã

thực hiện bước khảo sát ảnh hưởng hiệu quả liên kết PEG 25%-100% lên PAMAM

G4 đến hình thức lưu trữ thuốc. Kết quả chỉ ra rằng, hiệu quả biến tính PAMAM G4

bằng PEG đạt trên 50% thì khả năng thuốc 5-FU được mang vào sâu bên trong cấu

trúc PAMAM là thấp, thuốc 5-FU chủ yếu tập trung phía gần bên ngoài bề mặt

PAMAM, còn đối với hiệu quả biến tính PAMAM G4 bằng PEG đạt khoảng 25%

thì lượng thuốc 5-FU được mang vào sâu bên trong cấu trúc PAMAM G4 và kèm

theo sự hỗ trợ của các nhóm PEG có hiện tượng gập chuỗi lại giúp khả năng lưu trữ

thuốc hiệu quả hơn [67].

Về phía biến tính dendrimer PAMAM bằng Pluronic, đặc trưng cấu trúc của

Pluronic cũng có hai nhóm -OH đầu mạch giống với PEG nên việc biến tính

dendrimer PAMAM bằng Pluronic bản chất hóa học là như nhau. Quá trình nghiên

cứu biến tính dendrimer PAMAM theo hướng Pluronic cũng gần với thời điểm bên

hướng PEG, nhưng hướng phát triển chậm hơn, cụ thể:

Từ năm 1998-2004, nhóm nghiêm cứu của Rill R. L [93], Vinogradov S. V

[117] và Gebhart C. L [39] cùng các cộng sự đã chỉ ra rằng Pluronic không gây độc

tế bào.

Năm 2008, T. H. Dung, J. S. Kim, R. L. Juliano và H. Yoo đã tiến hành

nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM G5 bằng Pluronic F127 với các tỷ lệ 1:10,

1:20, 1:30, trong đó Pluronic F127 được hoạt hóa bằng NPC/pyridine (hình 1.37)

Hình 1.37. Sơ đồ tổng hợp dendrimer PAMAM G5-Pluronic F127

[110].

Để hoạt hóa Pluronic F127, nhóm nghiên cứu này đã sử dụng NPC/pyridine tỷ

lệ mol Pluronic F127: NPC/pyridine là 1:1, điều này dễ dẫn đến khả năng Pluronic

F127 bị hoạt hóa cả hai đầu bằng NPC và kết quả có thể Pluronic F127 liên kết cả 2

đầu vào PAMAM G5, tạo lớp màng bao phủ bề mặt PAMAM G5 và ngăn cản một

phần thuốc không đi vào khoảng trống trong cấu trúc PAMAM G5. Ngoài ra, nhóm

tác giả còn sử dụng xúc tác pyridine rất độc với môi trường.

Các phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H

NMR) được sử dụng để phân tích cấu trúc PAMAM dendrimer và PAMAM

dendrimer G5-Pluronic F127 cho thấy pulronic đã liên kết thành công với PAMAM

G5-F127. Độc tính của PAMAM G5-F127 giảm khi tăng tỷ lệ biến tính.

Năm 2012, Shen Gao và cộng sự đã tiến hành biến tính bề mặt PAMAM bằng

Pluronic P123 (hình 1.38).

Hình 1.38. Sơ đồ tổng hợp P123-g-PAMAM dendrimer

Nhóm tác giả cho lắp ghép với ADN và kiểm tra mức độ gây độc trên tế bào

ung thư vú MCF-7, HepG2, 293T, đồng thời thực hiện quá trình chuyển gen. Kết

quả TEM cho thấy kích thước tăng đáng kể 100-250 nm, khả năng gây độc tế bào

thấp, hiệu quả thấm xuyên bào cao hơn đáng kể so với PAMAM chưa biến tính

[119].

Nghiên cứu gần đây, năm 2014 trên tạp chí Informa Healthcare USA của nhóm

tác giả Zhuojun Gu và cộng sự, sử dụng Pluronic F127 biến tính PAMAM dendrimer,

trong đó Pluronic được hoạt hóa bằng NPC trong dung môi benzene và cho nang hóa

thuốc Doxorubicin hydrochloride (DOX.HCl), tiến hành kiểm tra việc giải phóng thuốc

trong PBS và độc tính của các hợp chất trên tế bào MCF-7. Trong nghiên cứu này,

nhóm tác giả Zhuojun Gu cũng đã tiến hành hoạt hóa Pluronic F127 bằng

NPC/benzene với tỷ lệ mol Pluronic F127: NPC/pyridine là 1:1, do đó vẫn có khả

năng Pluronic F127 bị hoạt hóa cả hai đầu bằng NPC và kết quả có thể Pluronic

F127 liên kết cả 2 đầu vào PAMAM, tạo lớp màng bao phủ bề mặt PAMAM và gây

cản trở khả năng nang hóa thuốc. Ngoài ra, nhóm tác giả cũng đã tiến hành kiểm tra

thời gian và tỷ lệ mol phản ứng liên hợp PAMAM và Pluronic F127, kết quả FTIR

và 1H NMR cho thấy rằng việc thêm PF127 thì khả năng liên hợp cũng không xảy ra

hoàn toàn được, thậm chí sau một thời gian phản ứng dài (PAMAM-25%PF127 có tỷ

lệ liên hợp 19%). Nhóm tác giả cho rằng, nguyên nhân là do phản ứng giữa PF127 và

PAMAM có thể bị chặn bởi chuỗi cấu trúc dài và cồng kềnh của PF127. Kết quả UV-

Vis PAMAM-PF127 giải phóng thuốc in vitro chậm, độc tính của PAMAM dendrimer

sau khi biến tính giảm mạnh [124].

1.6.3. Các nghiên cứu của dendrimer PAMAM biến tính với polymer khác

(1) Biến tính PAMAM bằng acetyl: năm 2003-2011 nhóm nghiên cứu

Duncan. R [31], Yashwant Pathak [121], Cheng Y [23] và các cộng sự tiến hành

Acetyl hóa một phần amine trên bề mặt dendrimer. Khối lượng phân tử của

dendrimer G5.0 được đo bằng GPC là 26380 g/mol, nhỏ hơn chút ít so với lý thuyết

là 28826 g/mol (hình 1.39).

Hình 1.39. Cấu trúc của dendrimer PAMAM G5 theo lý thuyết (trái) và thực tế

(phải) do khiếm khuyết của quá trình phản ứng

Phản ứng acetyl hóa một phần được thực hiện giữa nhóm amine trên bề mặt

của dendrimer với anhydride acetic trong dung dịch Et3N ở nhiệt độ phòng qua đêm

theo phương trình sau:

Acetic acid sinh ra tiếp tục được phản ứng với nhóm amine trên bề mặt của

dendrimer theo phương trình sau đây:

Kết quả nghiên cứu của dendrimer-acetyl cho có thể xác định mức độ acetyl

hóa dendrimer thông qua cường độ của peak proton -CH3 của nhóm acetyl và tổng

cường độ của các proton -CH2-.

(2) Biến tính PAMAM bằng alcohol mạch dài ROH

Để gắn được ROH vào dendrimer PAMAM thế hệ chẵn (tức là dendrimer có

các nhóm amine trên bề mặt), nhóm OH của ROH cần được hoạt hóa bởi p-

nitrophenyl chloroformate (NPC) tạo sản phẩm trung gian RO-p-nitrophenyl

carbonate (RO-NPC). Phản ứng được thực hiện theo phương trình sau:

Tiếp theo, chất trung gian được cho tác dụng với PAMAM tạo thành

dendrimer PAMAM-PEG theo phương trình phản ứng sau:

Năm 2013, nhóm tác giả Nguyễn Cửu Khoa và Trần Ngọc Quyển biến tính

PAMAM G 3.0 bằng hexanol. Kết quả phổ 1H-NMR của PAMAM G 3.0-NPC-C6

chỉ ra PAMAM G 3.0 đã được biến tính bề mặt khoảng 16 nhóm hexanol [81, 111].

Nhìn chung trong những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu về biến tính

dendrimer PAMAM bằng polymer tương hợp sinh học. Tuy nhiên, hầu hết các

nghiên cứu đều sử dụng phương pháp hoạt hóa Pluronic, PEG bằng NPC và khống

chế bằng tỷ lệ mol 1:1 (Pluronic/PEG : NPC) và sử dụng xúc tác (pyridine) hay

dung môi (benzene) trong quá trình phản ứng. Nhược điểm của phương pháp này là

dễ xảy ra khả năng Pluronic hay PEG bị hoạt hóa cả hai đầu bằng NPC và kết quả

có thể Pluronic hay PEG liên kết cả 2 đầu vào PAMAM, tạo lớp màng bao phủ bề

mặt PAMAM và ngăn cản một phần thuốc không đi vào khoảng trống trong cấu

trúc PAMAM [67, 110, 124]. Mặt khác, chưa thấy công bố nào sử dụng một hệ

Pluronic có khối lượng phân tử khác nhau để biến tính chuỗi các thế hệ PAMAM,

nhằm xây dựng một hệ thống về sự ảnh hưởng cấu trúc dendrimer PAMAM các thế

hệ, cấu trúc Pluronic các loại đến mức độ biến tính, độc tính tế bào và hiệu quả

nang hóa thuốc. Vì vậy trong công trình nghiên cứu của luận án này, chúng tôi tập

trung biến tính dendrimer PAMAM thế hệ G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 bằng 4 loại PEG

và 4 loại Pluronic có khối lượng phân tử khác nhau để xây dựng tính hệ thống về

mức độ biến tính và khả năng mang thuốc của các nanopolymer.

Chương 2. NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

2.1. HÓA CHẤT

Các hóa chất được cung cấp từ các hãng Acros, Sigma Aldrich, Merck với

chất lượng cao và phù hợp mục đích sử dụng cho tổng hợp hóa học và phân tích.

Bảng 2.1. Danh mục hóa chất

Hóa chất Nguồn gốc

Pluronic P123 (MW= 5,800) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

Pluronic F68 (MW= 8,400) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

Pluronic F127 (MW= 12,600) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

Pluronic F108 (MW= 14,000) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

Polyethylene glycol (Mw = 4,000-5,000) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

Polyethylene glycol (Mw = 6,000-8,000) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

Polyethylene glycol (Mw = 9,000-11,000) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

Polyethylene glycol (Mw = 12,000-14,000) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

pNitrophenyl chloroformate (NPC) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

Acros Organics, Hoa Kỳ Tyramine (TA)

Tetrahydrofuran (THF) Merck, Đức

Diethyl ether Merck, Đức

Dimethylformamide (DMF) Merck, Đức

Methanol Merck, Đức

5-Fluorouracil (5-FU) Acros Organics, Hoa Kỳ

Phosphate buffered salinetablets (PBS) Amresco, Hàn Quốc

Ethylenediamine (EDA) Merck, Đức

Methylacrylate (MA) Merck, Đức

Toluene Merck, Đức

Khí Nitrogen Việt Nam

2.2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ

Dụng cụ:

Bình cầu cổ nhám một cổ, bình cầu cổ nhám hai cổ,

Phểu nhỏ giọt; ống đong; pipette; cá từ;

Khóa nhám cung cấp nitơ;

Ttúi thẩm tách Spectra Por Regenerated Cellulose Membrane MWCO 3000-

5000 Da, 6000-8000 Da, 12000-4000 Da và các dụng cụ khác.

Thiết bị:

Cân điện tử - HADAM AEP-250G (4 số lẻ);

Tủ sấy, bồn siêu âm;

Máy cô quay chân không RV 10 Control V, Bể gia nhiệt HB10, IKA-Đức, tại

phòng thí nghiệm chuyên ngành Hữu cơ, trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ

Chí Minh, Phân hiệu Quảng Ngãi.

Máy khuấy từ gia nhiệt hiện số Thermo SP131320-33 (50-1200v/p), Mỹ,

Máy đông khô chân không FDU-2100 Eyela, Nhật Bản, đông khô ở -800C, tại

Viện Công nghệ Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,

Quan sát hình thái, kích thước mẫu (TEM) được chụp bằng máy JEOL JEM

1400 ở 140 KV, Nhật Bản, Trường Đại học Bách Khoa, TP.HCM.

Phân tích quang phổ hồng ngoại FTIR trên máy Equinox 55 Bruker, Đức, tại

Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Các mẫu được nén ép thành viên với KBr. Phạm vi bước sóng từ 400–4000 cm-1.

Sắc ký gel GPC Đo bằng máy Agilent 1260, Hoa Kỳ, Trường Đại Học Khoa

Học Tự Nhiên, TP.HCM.

Phổ 1H-NMR đo trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500, được

thực hiện bằng cách sử dụng D2O làm dung môi và methanol là đồng dung môi ở

tần số 500 MHz, Viện Khoa học Vật liệu Hà Nội.

Phổ khối lượng MS đo trên máy Agilent 1100 LC-MSD Trap (dạng phun mù

điện ESI-MS), Viện Khoa học Vật liệu Hà Nội.

Sắc ký lỏng HPLC đo bằng máy Agilent 1260, Hoa Kỳ, Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh.

Đánh giá độc tính tế bào MCF-7 đo tại PTN-SHPT- BM Di truyền, Trường

Đại học Khoa học Tự Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh.

Đánh giá độc tính nguyên bào sợi đo tại Khoa Kỹ thuật Y sinh, Trường Đại

học Quốc tế, Thành phố Hồ Chí Minh.

2.3. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

2.3.1. Tổng hợp dendrimer PAMAM đến thế hệ G5.0 từ tâm ethylenediamine

(EDA)

Quá trình tổng hợp dendrimer PAMAM thế hệ G5.0 qua 12 giai đoạn, bắt đầu

giai đoạn tổng hợp thế hệ G-0.5 từ ethylenediamine (EDA) lần lượt đến các thế hệ

kế tiếp G0, G0.5, G1.0, G1.5, G2.0, G2.5, G3.0, G3.5, G4.0, G4.5 và G5.0 (hình

2.1).

Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp dendrimer PAMAM các thế hệ

Phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM các thế hệ lẻ (G-0.5; G0.5; G1.5;

G2.5; G3.5 và G4.5) bằng methylacrylate (MA), thời gian phản ứng 1-4 ngày (tùy

vào giai đoạn tổng hợp thế hệ càng lớn thì thời gian phản ứng càng tăng). Thu hồi MA

bằng methanol tại nhiệt độ 420C.

Bảng 2.2. Bảng số liệu dendrimer PAMAM các thế hệ lẻ [99, 107]

MA : Dendrimer Khối lượng Kích thước Nhóm bề EDA/PAMAM PAMAM phân tử (Da) (nm) mặt (Z) (MA dư 1,2 lần) thế hệ lẻ (G)

1,4 4 4,8 : 1 -0.5 404

1,9 8 9,6 : 1 0.5 1206

2,6 16 19,2 : 1 1.5 2807

3,6 32 38,4 : 1 2.5 6011

4,4 64 76,8 : 1 3.5 12419

5,7 128 153,6 : 1 4.5 25234

Phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM các thế hệ chẵn (G0.0; G1.0;

G2.0;3.0; G4.0 và G5.0) bằng ethylenediamine (EDA), thời gian 4-8 ngày (tùy vào

thế hệ càng lớn thì ngày càng tăng). Thu hồi EDA bằng hỗn hợp (Toluene :

methanol) = (9 : 1) tại nhiệt độ 450C.

Bảng 2.3. Bảng số liệu dendrimer PAMAM các thế hệ chẵn [99, 107]

Dendrimer Khối lượng Kích thước Nhóm bề EDA : PAMAM

phân tử (Da) (nm) mặt (Z) (EDA dư 10 lần) PAMAM thế hệ chẵn (G)

1,4 4 40:1 0 517

1,9 8 80:1 1 1430

2,6 16 160:1 2 3256

3,6 32 320:1 3 6909

4,4 64 640:1 4 14215

5,7 128 1280:1 5 28826

a. Qui trình tổng hợp dendrimer PAMAM các thế hệ lẻ (G-0.5; G0.5; G1.5;

G2.5; G3.5 và G4.5)

Tiến hành phản ứng:

Cho (1,2a x Z) mmol (V mL) dung dịch methylacrylate (MA) và V ml dung dịch

methanol vào bình cầu hai cổ, lắp hệ thống khuấy từ. Nhỏ từ từ từng giọt hỗn hợp a

mmol (b mL) dung dịch ethylenediamine (EDA) / a mmol (b g) PAMAM và 10b ml

dung dịch methanol vào hỗn hợp trên, giữ lạnh hỗn hợp phản ứng tại 00C trong 2

giờ và sau đó tiến hành phản ứng tại nhịêt độ phòng trong 1-4 ngày (thế hệ càng cao

thì càng tăng thời gian phản ứng) trong môi trường khí N2. Tỷ lệ giữa (MA :

EDA/PAMAM) phản ứng là (1,2Z :1).

Hình 2.2. Hình phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM

Tinh chế sản phẩm:

Cô quay thu hồi hết dung dịch MA còn dư sau phản ứng bằng dung môi

methanol, trong khoảng 2 ngày, tại nhịêt độ 420C. Tiến hành thẩm tách sản phẩm 3

ngày bằng túi thẩm tách MWCO trong dung môi methanol, sau đó cô quay lại để

thu sản phẩm.

Hình 2.3. Hình tinh chế sản phẩm dendrimer PAMAM

Hình 2.4. Sơ đồ qui trình tổng hợp các dendrimer PAMAM thế hệ lẻ

b. Qui trình tổng hợp dendrimer PAMAM các thế hệ chẵn (G0; G1.0;

G2.0;3.0; G4.0 và G5.0)

Tiến hành phản ứng:

Cho (10a x Z) mmol hay V mL dung dịch EDA và 2V ml dung dịch methanol

vào bình cầu hai cổ, lắp hệ thống khuấy từ. Nhỏ từ từ từng giọt hỗn hợp a mmol hay

b g dung dịch PAMAM và 10b ml dung dịch methanol vào hỗn hợp trên, giữ lạnh

hỗn hợp phản ứng tại 00C trong 2 giờ và sau đó tiến hành phản ứng tại nhịêt độ

phòng trong 4-8 ngày (thế hệ càng cao thì càng tăng thời gian phản ứng) trong môi

trường khí N2. Tỷ lệ giữa (EDA : PAMAM) phản ứng là (10Z :1).

Tinh chế sản phẩm:

Cô quay thu hồi hết dung dịch EDA còn dư sau phản ứng bằng hệ dung môi

toluene : methanol (9:1), trong khoảng 2 ngày, tại nhịêt độ 450C. Tiến hành thẩm

tách sản phẩm 3 ngày bằng túi thẩm tách MWCO trong dung môi methanol, sau đó

cô quay lại để thu sản phẩm.

Hình 2.5. Sơ đồ qui trình tổng hợp các dendrimer PAMAM thế hệ chẵn

Hình 2.6. Hình sản phẩm dendrimer PAMAM thế hệ G1.0, G2.0, G3.0, G4.0, G5.0

Lượng EDA được dùng với tỷ lệ mol so với các thế hệ G = (-0.5; 0.5; 1.5; 2.5;

3.5) được tính như sau:

nEDA = nPAMAM x Z x 10

Lượng methylacrylate được dùng với tỷ lệ mol so với các thế hệ G = (0.0; 1.0;

2.0; 3.0; 4.0; 5.0) được tính như sau:

nMA = nPAMAM x Z x 1,2

Với nEDA, nMA và nPAMAM là số mol EDA, MA và PAMAM

Z là số nhóm bề mặt.

Tỷ lệ trên tương ứng với lượng EDA được lấy dư 10 lần và MA dư 1,2 lần so

với lượng lý thuyết để tạo điều kiện cho phản ứng chính đạt hiệu xuất cao, hạn chế

tạo ra sản phẩm phụ.

Sản phẩm PAMAM G-0.5, G0.0, G0.5, G1.0, G1.5, G2.0, G2.5, G3.0, G3.5, G4.0,

G4.5 và G5.0 sau khi tổng hợp được xác định cấu trúc bằng phổ MS và 1H-NMR.

2.3.2. Biến tính dendrimer PAMAM các thế hệ G2.0, G3.0, G4.0 và G5.0 với

các PEG4K, PEG6K, PEG10K và PEG12K

Hệ chất mang nano dendrimer PAMAM-PEG được tổng hợp thông qua ba giai

đoạn.

Giai đoạn 1: PEG (A mmol) đun nóng chảy ở 650C, có khuấy từ trong môi

trường khí N2. Sau đó thêm NPC (3A mmol) vào PEG nóng chảy và hỗn hợp được

khuấy trong 4 giờ. Sau đó thêm 10 ml THF vào hỗn hợp phản ứng và đưa về nhiệt

độ phòng. Kết tủa sản phẩm với diethylether. Sản phẩm thu được sau khi cô quay là

NPC-PEG-NPC. Xác định cấu trúc sản phẩm bằng phương pháp phân tích phổ

proton 1H-NMR.

(a) (b) (c)

Hình 2.7. Hình phản ứng PEG với NPC (a), Kết tủa sản phẩm (b), Sản phẩm NPC-

PEG-NPC (c)

Giai đoạn 2: Nhỏ từ từ hỗn hợp 0,055mmol dung dịch tyramine (TA)/(1mL

DMF và 5 mL THF) vào dung dịch NPC-PEG-NPC (0,05 mmol) và khuấy từ ở nhiệt

độ phòng trong 24 giờ. Sản phẩm phản ứng NPC-PEG-TA được kết tủa trong diethyl

ether. Xác định cấu trúc sản phẩm bằng phương pháp phân tích phổ proton 1H-NMR.

(a) (b) (c)

Hình 2.8. Hình phản ứng NPC-PEG-NPC với TA (a), Cô quay sản phẩm (b), Sản

phẩm NPC-PEG-TA (b)

Giai đoạn 3: Để có được G2.0-PEG, G3.0-PEG, G4.0-PEG, G5.0-PEG, nhỏ

từ từ hỗn hợp B mmol NPC-PEG-TA /20 mL THF vào dung dịch A mmol

PAMAM /20 mL methanol (tỷ lệ mol A : B sẽ thay đổi tùy theo số nhóm bề mặt

của mỗi thế hệ PAMAM) và sau đó khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau

thời gian này, sản phẩm thô được lọc với methanol trong 3 ngày sử dụng màng

MWCO 3000-5000 Da (G2.0-PEG), MWCO 6000-8000 Da (G3.0-PEG), MWCO

12000-14000 Da (G4.0-PEG, G5.0-PEG). Sau đó, tiến hành kết tủa dung dịch còn

lại trong màng MWCO bằng diethyl ether rồi đem ly tâm và cô quay thu được hệ

chất mang nano dendrimer PAMAM-PEG (G2.0-PEG4K, G3.0-PEG4K, G4.0-

PEG4K, G5.0-PEG4K; G2.0-PEG6K, G3.0-PEG6K, G4.0-PEG6K, G5.0-PEG6K;

G2.0-PEG10K, G3.0-PEG10K, G4.0-PEG10K, G5.0-PEG10K; G2.0-PEG12K,

G3.0-PEG12K, 4.0-PEG12K, G5.0-PEG12K).

(a) (b)

Hình 2.9. Hình cô quay sản phẩm PAMAM-PEG (a), Sản phẩm PAMAM-PEG (b)

Bảng 2.4. Thành phần và khối lượng các chất tham gia phản ứng tổng hợp

PAMAM-PEG

Sản phẩm Lượng và mẫu PAMAM Lượng và mẫu NPC-PEG-TA Tỷ lệ mol PAMAM:NPC- PEG-TA = A : B

G2.0-PEG4K 1:16

G2.0-PEG6K 1:16

G2.0-PEG10K 1:16

G2.0 (0,05g ;0,0154 mmol) G2.0-PEG12K 1:16

G3.0-PEG4K 1:32

G3.0-PEG6K 1:32

G3.0-PEG10K 1:32

G3.0 (0,05g ;0,0072 mmol)

G3.0-PEG12K 1:32

G4.0-PEG4K 1:64

G4.0-PEG6K 1:64

G4.0-PEG10K 1:64

G4.0 (0,05g ;0,0035 mmol) G4.0-PEG12K 1:64

1:128 G5.0-PEG4K

1:128 G5.0-PEG6K

1:128 G5.0-PEG10K

G5.0 (0,05g ;0,0017 mmol) 1:128 G5.0-PEG12K NPC-PEG4K-TA (1,0635g ;0,2457 mmol) NPC-PEG6K-TA (1,5549g ;0,2457 mmol) NPC-PEG10K-TA (2,292g ;0,2457 mmol) NPC-PEG12K-TA (3,029g ;0,2457 mmol) NPC-PEG4K-TA (1,0024g;0,2316 mmol) NPC-PEG6K-TA (1,4655g;0,2316 mmol) NPC-PEG10K-TA (2,1603g;0,2316 mmol) NPC-PEG12K-TA (2,855g;0,2316 mmol) NPC-PEG4K-TA (0,9744g ;0,2251 mmol) NPC-PEG6K-TA (1,4246g ;0,2251 mmol) NPC-PEG10K-TA (2,0999g ;0,2251 mmol) NPC-PEG12K-TA (2,7753g ;0,2251 mmol) NPC-PEG4K-TA (0,961g; 0,222 mmol) NPC-PEG6K-TA (1,405g; 0,222 mmol) NPC-PEG10K-TA (2,0711g; 0,222 mmol) NPC-PEG12K-TA (2,7371g; 0,222 mmol)

Hình 2.10. Sơ đồ tổng hợp 16 hệ PAMAM-PEG (G2.0-PEG4K, G3.0-PEG4K,

G4.0-PEG4K, G5.0-PEG4K; G2.0-PEG6K, G3.0-PEG6K, G4.0-PEG6K, G5.0-

PEG6K; G2.0-PEG10K, G3.0-PEG10K, G4.0-PEG10K, G5.0-PEG10K; G2.0-

PEG12K, G3.0-PEG12K, 4.0-PEG12K, G5.0-PEG12K)

Kiểm tra cấu trúc các sản phẩm trung gian NPC-PEG-NPC; NPC-PEG-TA và

các sản phẩm cuối PAMAM-PEG bằng các phương pháp FTIR, 1H NMR.

Hình thái của PAMAM-PEG được khảo sát bằng hình TEM.

Khối lượng phân tử của PAMAM-PEG và mức độ biến tính được xác định

thông qua phổ 1H-NMR và GPC.

Các chất mang nano dendrimer PAMAM G2.0-PEG4K, G3.0-PEG4K, G4.0-

PEG4K, G5.0-PEG4K; G2.0-PEG6K, G3.0-PEG6K, G4.0-PEG6K, G5.0-PEG6K;

G2.0-PEG10K, G3.0-PEG10K, G4.0-PEG10K, G5.0-PEG10K; G2.0-PEG12K,

G3.0-PEG12K, 4.0-PEG12K, G5.0-PEG12K được sử dụng để nang hóa thuốc 5-

FU.

2.3.3. Biến tính dendrimer PAMAM các thế hệ G2.0, G3.0, G4.0, và G5.0 bằng

các Pluronic P123, F68, F127 và F108.

Hệ chất mang nano dendrimer PAMAM-Pluronic cũng được tổng hợp thông

qua ba giai đoạn.

Giai đoạn 1: Đầu tiên, Pluronic (1,25 mmol) đun nóng chảy trong môi trường

khí N2 ở 650C và thêm NPC (3,75 mmol) vào Pluronic nóng chảy. Hỗn hợp được

khuấy từ trong 4 giờ tại điều kiện trên. Sau đó, thêm 10 ml THF vào hỗn hợp phản

ứng và đưa về nhiệt độ phòng. Kết tủa sản phẩm với diethyl ether. Sản phẩm thu

được sau khi cô quay là NPC-Plu-NPC có dạng bột màu trắng [16].

Hình 2.11. Hình phản ứng Pluronic với NPC

Giai đoạn 2: Nhỏ từ từ 0,055 mmol trong 1mL DMF và 5 mL THF dung dịch

tyramine (TA) vào dung dịch NPC-Plu-NPC (0,05 mmol) và khuấy từ ở nhiệt độ

phòng trong 24 giờ. Kết tủa sản phẩm trong diethylether, sau đó cô quay thu được

NPC-Plu-TA dạng bột màu trắng.

(a) (b)

Hình 2.12. Phản ứng NPC-Plu-NPC với TA (a), sản phẩm NPC-Plu-TA (b)

Giai đoạn 3: Để có được G2.0-Pluronic, G3.0-Pluronic, G4.0-Pluronic, G5.0-

Pluronic, nhỏ từ từ hỗn hợp B mmol NPC-Plu-TA /20 mL THF vào dung dịch A

mmol PAMAM /20 mL methanol (tỷ lệ mol A : B sẽ thay đổi tùy theo số nhóm bề

mặt của mỗi thế hệ PAMAM) và sau đó khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

Sau thời gian này, sản phẩm thô được thẩm tách với methanol trong 3 ngày sử dụng

màng MWCO 3000-5000 Da (G2.0-Pluronic), MWCO 6000-8000 Da (G3.0-

Pluronic), MWCO 12000-14000 Da (G4.0-Pluronic, G5.0-Pluronic). Sau đó, tiến

hành kết tủa dung dịch còn lại trong màng MWCO bằng diethyl ether rồi đem ly

tâm và cô quay thu được hệ chất mang nano dendrimer PAMAM-Pluronic (G2.0-

P123, G3.0-P123, G4.0-P123, G5.0-P123; G2.0-F68, G3.0-F68, G4.0-F68, G5.0-

F68; G2.0-F127, G3.0-F127, G4.0-F127, G5.0-F127; G2.0-F108, G3.0-F108, G4.0-

F108, G5.0-F108).

(a) (b) (c)

Hình 2.13. Phản ứng biến tính PAMAM bằng Pluronic (a), Thẩm tách sản phẩm (b),

Sản phẩm PAMAM-Pluronic (c)

Bảng 2.5. Thành phần và khối lượng các chất tham gia phản ứng tổng hợp

PAMAM-Pluronic

Sản phẩm Lượng và mẫu PAMAM Lượng và mẫu NPC-Plu-TA Tỷ lệ mol PAMAM:NPC-Plu-TA = A : B

G2.0-P123 1:16

G2.0-F68 1:16

G2.0-F127 1:16

G2.0 (0,05g ;0,0154 mmol) G2.0-F108 1:16

G3.0-P123 1:32

G3.0-F68 1:32

G3.0-F127 1:32

G3.0 (0,05g ;0,0072 mmol) G3.0-F108 1:32

G4.0-P123 1:64

G4.0-F68 1:64

G4.0-F127 1:64

G4.0 (0,05g ;0,0035 mmol) G4.0-F108 1:64

G5.0-P123 1:128

G5.0-F68 1:128

G5.0-F127 1:128

G5.0 (0,05g ;0,0017 mmol) G5.0-F108 1:128 NPC-P123-TA (1,5057g ;0,2457 mmol) NPC-F68-TA (2,1323g ;0,2457 mmol) NPC-F127-TA (3,1765g ;0,2457 mmol) NPC-F108-TA (3,6679g ;0,2457 mmol) NPC-P123-TA (1,4192g;0,2316mmol) NPC-F68-TA (2,0097g;0,2316mmol) NPC-F127-TA (2,994g;0,2316mmol) NPC-F108-TA (3,4571g;0,2316mmol) NPC-P123-TA (1,3796g ;0,2251 mmol) NPC-F68-TA (1,9536g ;0,2251 mmol) NPC-F127-TA (2,9103g ;0,2251 mmol) NPC-F108-TA (3,3606g ;0,2251 mmol) NPC-P123-TA (1,3606g ;0,222mmol) NPC-F68-TA (1,9268g ;0,222mmol) NPC-F127-TA (2,8704g ;0,222mmol) NPC-F108-TA (3,3144g ;0,222mmol)

Kiểm tra cấu trúc các sản phẩm trung gian NPC-Plu-NPC; NPC-Plu-TA và

các sản phẩm cuối PAMAM-Pluronic bằng các phương pháp FTIR, 1H NMR.

Hình thái của PAMAM-Pluronic được khảo sát bằng hình TEM.

Khối lượng phân tử của PAMAM-Pluronic và mức độ biến tính được xác định

thông qua phổ 1H-NMR và GPC.

Các chất mang nano dendrimer PAMAM G2.0-Pluronic, G3.0-Pluronic, G4.0-

Pluronic, G5.0-Pluronic được sử dụng để nang hóa thuốc 5-FU.

Hình 2.14. Sơ đồ tổng hợp 16 hệ PAMAM-Pluronic (G2.0-P123, G3.0-P123, G4.0-

P123, G5.0-P123; G2.0-F68, G3.0-F68, G4.0-F68, G5.0-F68; G2.0-F127, G3.0-

F127, G4.0-F127, G5.0-F127; G2.0-F108, G3.0-F108, G4.0-F108, G5.0-F108)

2.3.4. Tổng hợp chất mang nano PAMAM G4.0-F127 với các tỷ lệ mol

PAMAM G4.0 : F127 khác nhau

Để tổng hợp chất mang nano dendrimer PAMAM G4.0-F127 tỷ lệ 1:8, 1:16,

1:32, 1:64 ta nhỏ từ từ hỗn hợp b mmol NPC-F127-TA /20 mL THF vào dung dịch a

mmol PAMAM G4.0 /20 mL methanol với các tỷ lệ a:b lần lượt là 1:8, 1:16, 1:32,

1:64, khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau thời gian này, sản phẩm thô được lọc

với methanol trong 3 ngày sử dụng màng MWCO 12000-14000 Da. Tiến hành kết tủa

dung dịch còn lại trong màng MWCO bằng diethylether rồi đem ly tâm và cô quay thu

được hệ chất mang dendrimer PAMAM G4.0-F127 (tỷ lệ 1:8, 1:16, 1:32, 1:64).

Bảng 2.6. Thành phần và khối lượng các chất tham gia phản ứng tổng hợp

PAMAM-F127 với tỷ lệ mol khác nhau

Tỷ lệ mol Lượng và Lượng và mẫu PAMAM:NPC-PEG-TA Sản phẩm mẫu PAMAM NPC-F127-TA = A : B

NPC-F127-TA 1:8 G4.0-F127 (0,3638g ;0,0281 mmol)

NPC-F127-TA 1:16 G4.0-F127 (0,7276g ;0,0563 mmol)

G4.0 NPC-F127-TA 1:32 G4.0-F127 (0,05g ;0,0035 (1,4552g ; 0,1126 mmol)

mmol) NPC-F127-TA 1:64 G4.0-F127 (2,9103g ;0,2251 mmol)

Kiểm tra cấu trúc các sản phẩm cuối PAMAM G4.0-F127 với 4 tỷ lệ mol phản

ứng (1:8, 1:16, 1:32, 1:64) bằng các phương pháp FTIR, 1H-NMR.

Hình thái của PAMAM G4.0-F127 được khảo sát bằng hình TEM.

Khối lượng phân tử của PAMAM G4.0-F127 và mức độ biến tính được xác

định thông qua phổ 1H-NMR và GPC.

Các chất mang nano dendrimer PAMAM G4.0-F127 được sử dụng để nang

hóa thuốc 5-FU.

Hình 2.15. Sơ đồ tổng hợp PAMAM G4.0-F127 với 4 tỷ lệ mol phản ứng (1:8, 1:16,

1:32, 1:64)

2.3.5. Nang hóa thuốc 5-Fluorouracil (5-FU) lên các loại dendrimer PAMAM-

PEG

Tiến hành cho 100 mg chất mang nano dendrimer PAMAM-PEG4K (

PAMAM-PEG6K, PAMAM-PEG10K, PAMAM-PEG12K) vào dung dịch 20 mg 5-

FU/2 mL nước cất (độ tan trong nước của 5-FU là 12,2 g/L 20 ºC), khuấy từ tại

nhiệt độ phòng trong 24 giờ [hình 2.16 và hình 2.17]. Hỗn hợp được cho vào màng

lọc MWCO 3500-5000 Da để loại bỏ lượng 5-FU dư. Tiến hành lọc 3 lần, mỗi lần

60 phút trong 500 mL nước cất. HPLC được sử dụng để xác định gián tiếp số lượng

thuốc 5-FU được nang hóa trong vật liệu chất mang nano.

Sử dụng phương pháp HPLC để tính toán lượng thuốc 5-FU và kiểm tra cấu

trúc dendrimer PAMAM-PEG bằng phương pháp FTIR.

Sản phẩm sau khi thẩm tách được đông khô kiểm tra độc tính trên tế bào ung

thư vú MCF-7 và nguyên bào sợi (Fibroblast) bằng phương pháp nhuộm SRB,

MTT, FDA/EB và sử dụng nghiên cứu tốc độ giải phóng thuốc 5-FU in vitro.

(a) (b)

Hình 2.16. Hình nang hóa thuốc 5-FU lên PAMAM-PEG (a),

Cơ chế mang thuốc trong cấu trúc các loại chất mang nano PAMAM-PEG (b)

Hình 2.17. Sơ đồ quy trình nang hóa thuốc 5-FU của các loại PAMAM-PEG

2.3.6. Nang hóa thuốc 5-Fluorouracil (5-FU) lên các loại dendrimer PAMAM-

Pluronic

Tiến hành cho 100 mg chất mang dendrimer PAMAM-P123 (PAMAM-F68,

PAMAM-F127, PAMAM-F108) vào dung dịch 20 mg 5-FU/2 mL nước cất (độ tan

trong nước của 5-FU là 12,2 g/L 20 ºC), khuấy từ tại nhiệt độ phòng trong 24 giờ

[hình 2.18 và hình 2.19]. Hỗn hợp được cho vào màng lọc MWCO 3500-5000 Da

để loại bỏ lượng 5-FU dư. Tiến hành lọc 3 lần, mỗi lần 60 phút trong 500 mL nước

cất. HPLC được sử dụng để xác định gián tiếp số lượng thuốc 5-FU được mang

trong vật liệu chất mang nano dendrimer PAMAM-Pluronic.

Sản phẩm sau khi thẩm tách được đông khô kiểm tra độc tính trên tế bào ung

thư vú MCF-7 và nguyên bào sợi (Fibroblast) bằng phương pháp nhuộm SRB,

MTT, FDA/EB và sử dụng nghiên cứu tốc độ giải phóng thuốc 5-FU in vitro.

(a) (b)

Hình 2.18. Hình nang hóa thuốc 5-FU lên PAMAM-Pluronic (a), Cơ chế nang hóa

thuốc trong cấu trúc các loại chất mang nano PAMAM-Pluronic (b)

Hình 2.19. Sơ đồ quy trình nang hóa thuốc 5-FU của các loại PAMAM-Pluronic

2.3.7. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU của PAMAM G4.0-PEG6K/5-FU in vitro

trong đệm PBS

Đệm PBS là một dung dịch đẳng trương có pH (7,4) giống với pH trong cơ thể

sinh vật, đây là dung dịch điển hình để thẩm tách các chất tương hợp sinh học.

Thành phần của đệm này gồm: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 theo tỷ lệ thích hợp.

Cân 26,4 mg PAMAM G4.0-PEG6K/5-FU (có chứa 3 mg 5-FU) hòa tan trong

3ml nước cất. Chia dung dịch trên thành 3 phần bằng nhau cho vào 3 túi thẩm tách

MWCO (3000-5000 Da) tiến hành thẩm tách trong 12ml đệm PBS.

Để xác định lượng 5-FU được giải phóng ra ta tiến hành lấy mẫu nước thẩm

tách bên ngoài màng, mỗi lần lấy 1,5 mL trong 1 giờ, 3 giờ, 7 giờ, 12 giờ, 24 giờ,

48 giờ, 72 giờ, 96 giờ. Mỗi lần lấy mẫu xong, loại bỏ dung môi thẩm tách bên ngoài

màng và thêm vào lượng dung môi tương ứng ban đầu là 12 mL. Nồng độ 5-FU

khuếch tán ra ngoài màng thẩm tách được xác định bằng phương pháp đo HPLC.

Hình 2.20. Sơ đồ quy trình giải phóng thuốc 5-FU của hệ chất mang PAMAM

G4.0-PEG6K

2.3.8. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU của PAMAM G4.0-Pluronic/5-FU

in vitro trong đệm PBS

Cân 22,67 mg PAMAM G4.0-P123/5-FU (24 mg đối với mẫu PAMAM G4.0-

F127/5-FU) có chứa 3 mg 5-FU, hòa tan trong 3ml nước cất. Chia dung dịch trên

thành 3 phần bằng nhau cho vào 3 túi thẩm tách MWCO (3000-5000 Da) tiến hành

thẩm tách trong 12ml đệm PBS.

Để xác định lượng 5-FU được giải phóng ra ta tiến hành lấy mẫu nước thẩm

tách bên ngoài màng, mỗi lần lấy 1,5 mL trong 1 giờ, 3 giờ, 7 giờ, 12 giờ, 24 giờ,

48 giờ, 72 giờ, 96 giờ. Mỗi lần lấy mẫu xong, loại bỏ dung môi thẩm tách bên ngoài

màng và thêm vào lượng dung môi tương ứng ban đầu là 12 mL. Nồng độ 5-FU

khuếch tán ra ngoài màng thẩm tách được xác định bằng phương pháp đo HPLC.

Hình 2.21. Sơ đồ quy trình giải phóng thuốc 5-FU của hệ chất mang PAMAM

G4.0-P123 và PAMAM G4.0-F127

2.3.9. Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-FU in vitro trong đệm PBS

Cân 3 mg 5-FU hòa tan trong 3ml nước cất. Chia dung dịch trên thành 3 phần

bằng nhau cho vào 3 túi thẩm tách MWCO (3000-5000 Da) tiến hành thẩm tách

trong 12ml đệm PBS.

Để xác định lượng 5-FU được giải phóng ra ta tiến hành lấy mẫu nước thẩm

tách bên ngoài màng, mỗi lần lấy 1,5 mL trong 1 giờ, 3 giờ, 7 giờ, 12 giờ, 24 giờ,

48 giờ, 72 giờ, 96 giờ. Mỗi lần lấy mẫu xong, loại bỏ dung môi thẩm tách bên ngoài

màng và thêm vào lượng dung môi tương ứng ban đầu là 12 mL. Nồng độ 5-FU

khuếch tán ra ngoài màng thẩm tách được xác định bằng phương pháp đo HPLC.

Hình 2.22. Sơ đồ quy trình giải phóng thuốc 5-FU mẫu đối chứng

2.3.10. Phương pháp xác định độc tính tế bào của các chất mang nano

(1) Xác định độc tính tế bào ung thư MCF-7 bằng phương pháp nhuộm SRB

a. Nguyên tắc

- Thử nghiệm SRB (Sulforhodamine B) là một phương pháp so màu đơn giản và

nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất. SRB là một thuốc nhuộm tích điện

âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein. Lượng

thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào.

- Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau đó SRB

liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng. Mật

độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế

bào. Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất

nghiên cứu.

b. Chuẩn bị tế bào MCF-7

Dòng tế bào ung thư vú MCF-7 do ATCC (Hoa Kỳ) cung cấp, được nuôi cấy

trong môi trường E’MEM có bổ sung L-glutamine (2 mM), HEPES (20 mM),

amphotericin B (0,025 μg/ml), penicillin G (100 UI/ml), streptomycin (100 μg/ml),

10% (v/v) huyết thanh bào thai bò FBS và ủ ở 37oC, 5% CO2.

c. Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB

Tế bào đơn được cấy trên những đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ là 104 tế

bào/giếng. Sau 24 giờ nuôi cấy, quần thể tế bào được ủ với chất khảo sát ở các nồng

độ trong 48 giờ. Sau đó, protein tổng từ tế bào thử nghiệm được cố định bằng dung

dịch Trichloroacetic acid (Sigma) 50% lạnh và nhuộm với dung dịch

Sulforhodamine B 0,2% (Sigma). Kết quả được đọc bằng máy ELISA reader ở hai

bước sóng 492 nm và 620 nm. Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được

trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.

d. Xử lý kết quả

Sau khi có giá trị mật độ quang ở bước sóng 492nm và 620nm (ký hiệu là

OD492 và OD620):

- Tính giá trị OD = OD492 - OD620 (1)

- Tính OD492 (hoặc OD620) = ODtb - ODblank (2)

- Tính tỷ lệ (%) gây độc tế bào theo công thức:

Với:

- ODtb: giá trị OD của giếng có chứa tế bào

- ODblank: giá trị OD của giếng blank (không có tế bào)

- ODTN: giá trị OD của mẫu thử tình từ công thức (1) và (2)

- ODC: giá trị OD của mẫu chứng (control) tình từ công thức (1) và (2)

IC50 được xác định như sau:

- Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ khảo sát của

chất cần thử nghiệm bằng phầm mềm Excel. Từ đồ thị, nội suy ra giá trị nồng độ

cho tỷ lệ gây độc tế bào 50% bằng cách:

o Tính phương trình đường thẳng qua 2 điểm có tỷ lệ gây độc tế bào gần

50% nhất (1 điểm có tỷ lệ gây độc tế bào nhỏ hơn 50%, điểm còn lại có tỷ lệ gây

độc tế bào lớn hơn 50%).

o Từ phương trình trên (có dạng y = ax + b), thế y = 50 vào, ta suy ra được

giá trị nồng độ x chính là IC50.

(2) Xác định độc tính nguyên bào sợi (Fibroblast) bằng phương pháp nhuộm

MTT

a. Nguyên tắc

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được thực

hiện tại Khoa Kỹ Thuật Y sinh, trường Đại học Quốc tế - VNU theo phương pháp

MTT (Goldbio Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) và tại bước sóng 490 nm và

sử dụng máy ELISA

b. Chuẩn bị nguyên bào sợi

Dòng tế bào thử nghiệm: Nguyên bào sợi được phân lập từ mô mỡ của chuột

(L929). Nguyên bào sợi được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, sử dụng môi trường

nuôi cấy bao gồm (DMEM : F12 : FBS: Gentamicin) theo tỷ lệ (50 : 50 : 10 : 1). Tế

bào sau khi nuôi đến mật độ 80 - 85% diện tích đáy của đĩa nuôi được phân tách

bằng Trypsin 1%. Sử dụng thuốc nhuộm Trypan blue và buồng đếm

Hemocytometer để tính mật độ tế bào có trong dung dịch.

c. Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp MTT

Dung dịch nguyên bào sợi đã biết nồng độ được cấy vào đĩa 96 giếng chuyên

dụng, với mật độ 104 tế bào/giếng trong môi trường đã đề cập ở trên, và được nuôi

ở 37oC, hơi nước trên 95% và nồng độ CO2 ở mức 5% trong 24 giờ. Sau đó, 4 loại

mẫu thử được pha trong môi trường nuôi cấy với nồng độ 100µg/1mL được thay thế

cho môi trường nuôi cấy cũ với liều lượng 200µL/giếng. Các giếng không thay môi

trường được xem như mẫu đối chứng.

d. Nhuộm MTT

24 và 48 giờ sau khi thay môi trường có chứa thuốc, dung dịch nhuộm MTT

(Goldbio Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) được cho vào từng giếng với nồng

độ 2µL/giếng và ủ ở 37oC trong 4 giờ. Sau đó cho thêm 20µL DMSO vào từng

giếng, tiếp tục ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 tiếng trong điều kiện tránh sáng. Sử

dụng máy ELISA để đọc kết quả nhuộm MTT ở bước sóng 590 nm. Quy trình thí

nghiệm được lặp lại 4 lần cho mỗi thuốc cũng như mẫu đối chứng.

(3) Xác định độc tính nguyên bào sợi bằng phương pháp nhuộm FDA/EB

a. Nguyên tắc

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được thực

hiện tại Khoa Kỹ Thuật Y sinh, trường Đại học Quốc tế - VNU theo phương pháp

nhuộm tế bào sống/chết (live/dead). Kết quả được chụp trên ánh sáng huỳnh quang

và bằng kính hiển vi soi ngược quang học ECLIPSE Ti (Nikon Instruments Inc.) sử

dụng phần mềm NIS-Elements BR (Nikon Instruments Inc.)

b. Chuẩn bị nguyên bào sợi (tương tự như trên)

c. Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp FDA/EB

Dung dịch nguyên bào sợi đã biết nồng độ được cấy vào đĩa 96 giếng chuyên

dụng, với mật độ 104 tế bào/giếng trong môi trường đã đề cập ở trên, và được nuôi

ở 37oC, hơi nước trên 95% và nồng độ CO2 ở mức 5% trong 24 giờ. Sau đó, 4 loại

mẫu thử (G4.0, G4.0-PEG6K, G4.0-F127 và G4.0-F68) được pha trong môi trường

nuôi cấy với nồng độ 100µg/1mL được thay thế cho môi trường nuôi cấy cũ với liều

lượng 200µL/giếng. Các giếng được thay môi trường không pha thuốc được xem

như mẫu đối chứng.

d. Nhuộm FDA/EB (sống/chết)

FDA (Fluorescein Diacetate) từ dạng bột được pha trong dung môi DMSO với

tỷ lệ 1.5mg/mL tạo dung dịch FDA. Bột EB (Ethidium Bromide) được pha trong

dung môi PBS 1x với tỷ lệ 1mg/mL để tạo dung dịch EB. Pha dung dịch nhuộm

FDA/EB bằng hai dung dịch trên theo tỷ lệ (dd FDA : dd EB : PBS 1x) = (10 : 5 : 3)

24 và 48 giờ sau khi thay môi trường có chứa thuốc, dung dịch nhuộm FDA/EB

được cho vào từng giếng với nồng độ 10µL/giếng. Sau thời gian 2-3 phút, tiến hành

chụp hình mẫu dưới ánh sáng huỳnh quang.

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TỔNG HỢP DENDRIMER PAMAM TỪ THẾ HỆ G-0.5 ĐẾN THẾ HỆ G5.0

- Các sản phẩm dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G5.0 được tổng hợp

từ ethylenediamine (EDA) có dạng dẻo màu vàng nhạt đậm dần từ G-0.5 đến G5.0.

Hình 3.1. Cấu trúc dendrimer PAMAM từ EDA đến thế hệ G5.0

3.1.1. Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối lượng MS

Phổ khối lượng MS là phương pháp hiệu quả để xác định khối lượng phân tử

các polymer.

Hình 3.2. Phổ MS của dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G2.0

Phổ MS chứng minh sản phẩm từ G-0.5 đến G 2.0 đúng với cấu trúc sản

phẩm, phù hợp với lý thuyết (hình 3.2 và bảng 3.1).

Bảng 3.1. Khối lượng phân tử các dendrimer PAMAM dựa vào phổ MS

Lý thuyết

MS

CTPT

Thế hệ PAMAM

MLT

MMS

Hiệu số sai lệch (%)

C18H32O8N2

G-0.5

C22H48O4N10

0,02 407 405

G0.0

C54H96O20N10

0,00 517 517

G0.5

C62H128O12N26

0,06 1212 1206

G1.0

C126H224O44N26

G1.5

0,02 1430 1428

C142H288O28N58

G2.0

0,15 2823 2808

C270H480O92N58

0,03 3256 3259

G2.5

C302H608O60N122

6045 *

G3.0

6909 *

C558H992O188N122

G3.5

C622H1248O124N250

G4.0

12489 *

C1262H2528O252N506

14215 *

G5.0

28826 *

(*: Không xác định được)

Tuy MS là phương pháp hiệu quả để xác định khối lượng phân tử, nhưng với

các dendrimer có khối lượng phân tử lớn từ G2.5 (M = 6049) trở đi thì MS không

xác định được. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của nhóm Schwartz [98] và

Hood [46]. Bên cạnh MS, GPC dùng để xác định trọng lượng của hợp chất cao phân

tử nhưng với dendrimer PAMAM, ở các phòng thí nghiệm thường gặp nhiều khó

khăn để phân tích do hệ dung môi sử dụng cho pha động là hệ đệm với pH cao

(pH=11) và cần có loại cột phù hợp. Hơn nửa phân tích thường cho kết quả với độ

đa phân tán cao [8, 69, 89]. Cho nên 1H-NMR có thể là phương pháp hiệu quả để

theo dõi, đánh giá khối lượng phân tử và độ chuyển hóa của dendrimer [25, 29, 49,

58, 73, 112-113] và đặc biệt là các dendrimer ở thế hệ (G) lớn [47, 69].

3.1.2. Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR

Độ dịch chuyển hóa học cho các proton đặc trưng trong dendrimer PAMAM

đã được ghi nhận theo nhiều báo cáo trước [38, 88-89, 98, 102, 106, 119, 124].

Trong kết quả phổ 1H-NMR tương ứng với proton điển hình trong cấu trúc

dendrimer: -CH2CH2N< (a) tại δH = 2.6 ppm; -CH2CH2CO- (b) tại δH = 2.8-2.9

ppm; -CH2CH2CONH- (c) tại δH = 2.3-2.4 ppm; -CH2CH2NH2 (d) tại δH = 2.7-

2.8 ppm; -CONHCH2CH2N- (e) tại δH = 3.2-3.4 ppm; -CH2CH2COOCH3- (g) tại

δH = 2.4-2.5 ppm và -COOCH3 (h) tại δH = 3,7 ppm. Dưới đây là kết quả 1H-

1H-NMR PAMAM G-0.5: tại δH = 2.497 ppm (a), δH = 2.756-2.784 ppm (b), δH =

NMR của dendrimer PAMAM các thế hệ (hình 3.3). [80]

1H-NMR PAMAM G0.0: tại δH = 2.561-2.573 ppm (a), δH = 2.771-2.815

2.386-2.454 ppm (g) và δH = 3.628-3.702 ppm (h).

ppm (b), δH = 2.373-2.400 ppm (c), δH = 2.728-2.753 ppm (d) và δH = 3.246-3.336

ppm (e).

1H-NMR PAMAM G0.5: tại δH = 2.536-2.560 ppm (a), δH = 2.730-2.783

ppm (b), δH = 2.338-2.394 ppm (c), δH = 3.255-3.312 ppm (e), δH = 2.423-2.496

1H-NMR PAMAM G1.0: tại δH = 2.588-2.601 ppm (a), δH = 2.802-2.829

ppm (g) và δH = 3.631-3.674 ppm (h).

ppm (b), δH = 2.375-2.402 ppm (c), δH = 2.733-2.758 ppm (d) và δH = 3.258-

1H-NMR PAMAM G1.5: tại δH = 2.567-2.654 ppm (a), δH = 2.778-2.848

3.270 ppm (e).

ppm (b), δH = 2.391-2.419 ppm (c), δH = 3.266-3.368 ppm (e), δH = 2.472-2.499

1H-NMR PAMAM G2.0: tại δH = 2.582-2.608 ppm (a), δH = 2.795-2.822

ppm (g) và δH = 3.688 ppm (h).

ppm (b), δH = 2.368-2.394 ppm (c), δH = 2.699-2.741 ppm (d) và δH = 3.250-

1H-NMR PAMAM G2.5: tại δH = 2.536-2.631 ppm (a), δH = 2.748-2.858

3.328 ppm (e).

ppm (b), δH = 2.390-2.417 ppm (c), δH = 3.261-3.331 ppm (e), δH = 2.473-2.499

1H-NMR PAMAM G3.0: tại δH = 2.605-2.618 ppm (a), δH = 2.804-2.831

ppm (g) và δH = 3.683-3.688 ppm (h).

ppm (b), δH = 2.379-2.404 ppm (c), δH = 2.735-2.760 ppm (d) và δH = 3.261-3.334

1H-NMR PAMAM G3.5: tại δH = 2.570-2.634 ppm (a), δH = 2.780-2.846

ppm (e).

ppm (b), δH = 2.393-2.419 ppm (c), δH = 3.268-3.369 ppm (e), δH = 2.475-2.501

1H-NMR PAMAM G4.0: tại δH = 2.550 ppm (a), δH = 2.770 ppm (b), δH =

ppm (g) và δH = 3.631-3.689 ppm (h).

1H-NMR PAMAM G5.0: tại δH = 2.544 ppm (a), δH = 2.849 ppm (b), δH =

2.352 ppm (c), δH = 2.746-2.758 ppm (d) và δH = 3.225-3.259 ppm (e).

2.340 ppm (c), δH = 2.761 ppm (d) và δH = 3.239-3.251 ppm (e).

Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của dendrimer PAMAM thế hệ G-0.5 đến G5.0

Theo kết quả phổ 1H-NMR, các peak đặc trưng của proton tại vị trí (a) và (e)

luôn xuất hiện rõ ràng và không trùng lặp với bất kỳ peak khác, nên hai peak này

được chọn sử dụng để tính toán đánh giá dendrimer PAMAM. So sánh tỷ lệ proton

ở 2 vị trí (a), (e) trên phân tử dendrimer (LT) và tỷ lệ diện tích peak các proton ở 2

vị trí (a), (e) thể hiện trên phổ 1H-MNR (NMR) chúng tôi lập được công thức tính

khối lượng phân tử dendrimer thông qua phổ 1H-NMR như sau:

, : Diện tích

peak của các proton ở vị trí (e) và (a)

xuất hiện trong phổ 1H-NMR.

, : Tổng

số proton ở vị trí (e) và (a) tính

trong công thức phân tử dendrimer

PAMAM.

MLT: Khối lượng phân tử của

dendrimer PAMAM theo lý thuyết

được tính dựa vào công thức phân

tử.

Áp dụng công thức trên, khối lượng phân tử (KLPT) các dendrimer PAMAM

được tính toán dựa vào phổ 1H-NMR không khác nhiều so với KLPT tính dựa vào

công thức phân tử (bảng 3.2).

Cụ thể:

Tính toán KLPT dendrimer PAMAM G-0.5: sử dụng giá trị diện tích peak của

các proton tại vị trí b và a trong phổ 1H-NMR (peak b và a là 8,000 và 4,000; tương

ứng NMR = 8,000/4,000=2); tổng số proton tính trong công thức phân tử dendrimer

PAMAM G-0.5 (peak b và a là 8 và 4, tương ứng LT =8/4=2). MNMR được tính như

Tính toán KLPT dendrimer PAMAM G0.0: giá trị diện tích peak của các proton

tại vị trí e và a trong phổ 1H-NMR (peak e và a là 3,987 và 2,000; tương ứng NMR =

3,987/2,000=1,99); tổng số proton tính trong công thức phân tử dendrimer PAMAM

G-0.5 (peak b và a là 8 và 4, tương ứng LT =8/4=2). MNMR được tính như sau:

Bảng 3.2. Khối lượng phân tử dựa trên 1H-NMR của PAMAM G-0.5 đến G5.0

Lý thuyết

1H-NMR

Thế hệ PAMAM

Hiệu số sai lệch (%)

G-0.5

8 (H ở vị trí b)

LT MLT NMR MNMR 407

2,00

407

0,00

G0.0

517

1,99

514

0,03

G0.5

0.67

1212

0,67

1212

0,00

G1.0

1430

1,88

1344

0,87

G1.5

0.86

2823

0,85

2800

0,23

G2.0

3256

1,88

3061

1,95

G2.5

0.93

6045

0,88

5720

3,25

G3.0

120

6909

1,89

6529

3,80

G3.5

120

124

0.97 12489 0,93 11974

5,15

G4.0

240

120

14215 1,91 13575

6,40

G5.0

504

252

28826 1,95 28105

7,21

Khối lượng phân tử của PAMAM được tính trên phổ 1H-NMR thường nhỏ

hơn từ 0-7% so với lý thuyết. Điều này cho thấy khối lượng dendrimer PAMAM

tính được từ phổ 1H-NMR có độ sai lệch nhỏ nên có thể dùng để xác định KLPT

dendrimer PAMAM có trọng lượng phân tử lớn hơn trong khi phương pháp đo MS

không xác định được.

Phân tử PAMAM các thế hệ ≤ G5.0 đã được tổng hợp thành công và có cấu

trúc tương đối hoàn chỉnh và ổn định nên có thể ứng dụng trong lĩnh vực y-dược.

3.2. TỔNG HỢP PAMAM-PEG

Cấu trúc của sản phẩm trung gian NPC-PEG-NPC, NPC-PEG-TA, PAMAM

và PAMAM-PEG được xác định qua các kết quả phân tích phổ 1H-NMR, FTIR,

GPC và TEM.

3.2.1. Kết quả phân tích 1H-NMR của sản phẩm trung gian NPC-PEG-NPC,

NPC-PEG-TA, PAMAM và PAMAM-PEG

a. Giai đoạn 1: Tổng hợp NPC-PEG-NPC

Để tổng hợp PAMAM-PEG cần phải hoạt hóa 2 nhóm -OH đầu và cuối mạch

của PEG bởi pnitrophenyl chloroformate (NPC) tạo sản phẩm NPC-PEG- NPC

theo phản ứng sau:

Hình 3.4. Sơ đồ tổng hợp NPC-PEG-NPC

Phổ 1H-NMR của NPC-PEG-NPC đo trong dung môi CDCl3 (hình 3.5 và phụ

lục 4):

Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của NPC-PEG4K-NPC

Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của NPC-PEG-NPC được thể hiện qua

phổ cộng hưởng từ hạt nhân (hình 3.5 và phụ lục 4). Phổ đồ có các tín hiệu của các

proton có trong PEG như sau: tín hiệu δH = 3,40-3,79 ppm là proton của nhóm

methylene (-OCH2-CH2O-) trên EO. Tín hiệu của proton methylene liên kết trực

tiếp với nhóm carbonat ở δH = 4,44 ppm (-CH2-O-NPC).

Sự xuất hiện của hai tín hiệu đôi ở δH = 7,39 ppm và δH = 8,29 ppm là hai tín

hiệu đặc trưng của proton nhóm NPC (-CH=CH-). Độ hoạt hóa PEG đạt trên 90%

được tính từ tỷ lệ tích phân của proton thơm (NPC) và proton methylene (PEG). Kết

quả này phù hợp với các nghiên cứu của Park [64] và Nguyen [26].

Phổ đồ 1H-NMR của các NPC-PEG-NPC khác được thể hiện ở phụ lục 4 và

cũng cho kết quả tương tự như ở phổ đồ 1H-NMR của NPC-PEG4K-NPC.

b. Giai đoạn 2: Tổng hợp NPC-PEG-TA

NPC-PEG-NPC được dùng làm tác chất cho phản ứng ghép với TA. Trong

phản ứng này liên kết urethane được tạo thành từ phản ứng giữa nhóm amine trong

phân tử TA và nhóm C=O của hợp chất NPC-PEG-NPC tạo sản phẩm là NPC-

PEG-TA.

Hình 3.6. Sơ đồ tổng hợp NPC-PEG-TA

Phổ 1H-NMR của NPC-PEG-TA đo trong dung môi CDCl3 (hình 3.7 và phụ

lục 5):

Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của NPC-PEG4K-TA

Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của NPC-PEG-TA được thể hiện qua

phổ cộng hưởng từ hạt nhân (hình 3.7 và phụ lục 5). Phổ đồ có các tín hiệu của các

proton có trong PEG như sau: tín hiệu δH = 3,40-3,79 ppm là proton của nhóm

methylene (-OCH2-CH2O-) trên EO của PEG. Proton methylene liên kết trực tiếp

với nhóm carbonate của NPC ở δH = 4,44 ppm (-CH2-O-NPC). Ngoài ra, còn xuất

hiện thêm proton methylene liên kết trực tiếp với nhóm carbonate của TA ở δH =

4,2 ppm (-CH2-O-TA). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Park [64] và

Nguyen [26].

Sự xuất hiện của hai tín hiệu đôi ở δH=7,40 ppm và δH=8.29 ppm là hai tín

hiệu đặc trưng của proton thơm của NPC (-CH=CH-). Phổ đồ xuất hiện tín hiệu ở

δH = 6,78 ppm và δH = 7,02 ppm là tín hiệu proton liên hợp vòng thơm (-CH=CH-)

của nhóm tyramine. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyen [26]. Khoảng

50% gốc NPC đã được thay thế bởi TA. Kết quả này thu được từ phép tính tỷ lệ tích

phân của proton trên NPC và proton của TA.

Phổ đồ 1H-NMR của các NPC-PEG-TA khác được thể hiện ở Phụ lục 5 và

cũng cho kết quả tương tự như ở phổ đồ 1H-NMR của NPC-PEG4K-TA.

c. Giai đoạn 3: Tổng hợp PAMAM-PEG

Trong giai đoạn phản ứng này, nhóm -NH2 trên bề mặt dendrimer PAMAM sẽ

tấn công vào liên kết C=O của hợp chất NPC-PEG-TA tạo sản phẩm PAMAM-

PEG.

Hình 3.8. Sơ đồ tổng hợp PAMAM-PEG

Phổ 1H NMR của PAMAM-PEG đo trong dung môi CDCl3 (hình 3.9 và phụ

lục 6):

Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của PAMAM-PEG4K

Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của PAMAM và PAMAM-PEG được

thể hiện qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân (hình 3.3, hình 3.9 và phụ lục 6). Các

PAMAM-PEG sau khi tổng hợp đã thẩm tách bằng màng MWCO 3 ngày. Phổ đồ

có tín hiệu các proton của PAMAM trong PAMAM-PEG (hình 3.18 và phụ lục 6)

như: -CH2CH2N< tại δH = 2.6 ppm; -CH2CH2CO- tại δH = 2.8 ppm; -

CONHCH2CH2N- tại δH = 3.3-3.4 ppm. Các tín hiệu này giống với tín hiệu các

proton của PAMAM (hình 3.3). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Xiang

Wang [119], Tran [78] và Zhuojun Gu [124].

Ngoài ra, trên phổ đồ hình 3.9 và phụ lục 6, không còn thấy xuất hiện hai tín

hiệu đặc trưng proton thơm của NPC (-CH=CH-) ở δH=7,40 ppm và δH=8.29 ppm;

chỉ thấy có sự xuất hiện của hai tín hiệu đôi tại δH = 6,78 ppm và δH = 7,02 ppm là

các tín hiệu đặc trưng proton liên hợp vòng thơm (-CH=CH-) của TA. Bên cạnh đó

còn xuất hiện các tín hiệu tại δH = 4,2 ppm đặc trưng proton methylene liên kết trực

tiếp với nhóm carbonate của TA (-CH2-O-TA) và tín hiệu δH = 3,40-3,79 ppm là

proton của nhóm methylene (-OCH2-CH2O-) trên EO của PEG. Kết quả này phù

hợp với nghiên cứu của Nguyen [26].

Phổ đồ 1H-NMR của các PAMAM-PEG khác được thể hiện ở phụ lục 6 và

cũng cho kết quả tương tự như ở phổ đồ 1H-NMR của PAMAM-PEG4K.

Điều này cho thấy phần nào về sự thành công trong tổng hợp PAMAM-PEG.

Sự thành công này sẽ được khẳng định thêm qua các kết quả FTIR, GPC và TEM.

3.2.2. Kết quả phân tích FTIR của PAMAM và PAMAM-PEG

Dendrimer PAMAM là polymer có cấu trúc phân nhánh rất đều đặn với số lượng

lớn các nhóm bề mặt là amine rất dễ dàng để gắn kết với một số polymer hoạt hóa như

là nhóm hydroxyl hoạt hóa của Polyethylene glycol (NPC-PEG-TA) [35, 68].

Dendrimer PAMAM và PAMAM-PEG có thể được xác định rõ ràng bởi

quang phổ hồng ngoại FTIR.

Kết quả FTIR hình 3.10.a, cho thấy độ chuyển dịch hóa học tại 3287 cm-1 là

dao động đặc trưng cho nhóm amine bậc 1 (-NH2) và amine bậc 2 (-NH-) của

PAMAM. Đồng thời tín hiệu này cũng xuất hiện trong quang phổ hồng ngoại của

PAMAM G4.0-PEG4K (hình 3.10.b) với độ chuyển dịch hóa học 3423 cm-1, tín

hiệu này đã được thay đổi mạnh, điều này phần nào cho thấy số lượng nhóm -NH2

đã giảm đáng kể.

Hình 3.10. Phổ FTIR của PAMAM G4.0 (a) và PAMAM G4.0-PEG4K(b)

Tín hiệu peak 2942 cm-1 (hình 3.10.a) và 2888 cm-1 (hình 3.10.b) dao động

hóa trị của nhóm methylene (-CH2-); nhóm amide (HNC=O) được thấy tại tín hiệu

1644 cm-1 (hình 3.10.a) và 1648 cm-1 (hình 3.10.b).

Ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu mới trong phổ FTIR của PAMAM G4.0-

PEG4K tại độ chuyển dịch 1113 cm-1 đặc trưng cho nhóm C-O-C của PEG [7].

Kết quả FTIR và 1H-NMR cho thấy NPC-PEG-TA đã được liên hợp với

dendrimer PAMAM.

Phổ FTIR của PAMAM-PEG khác được thể hiện ở phụ lục 7 và cũng cho kết

quả tương tự như ở phổ FTIR của PAMAM G4.0-PEG4K.

3.2.3. Kết quả GPC của PAMAM-PEG

Sự thành công trong quá trình tổng hợp PAMAM-PEG cũng đã được khẳng

định bằng phép đo GPC. Trong đó, số nhóm liên hợp và tỷ lệ liên hợp được tính

toán tương đối theo các công thức sau:

a. Kết quả GPC của PAMAM-PEG4K

Khối lượng phân tử của các dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0 và G5.0

(theo lý thuyết) tương ứng là 3256 Da, 6909 Da, 14215 Da, 28826 Da. Trong khi

đó, theo thống kê kết quả GPC trong bảng 3.3 và hình 3.11, khối lượng phân tử của

PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 sau khi liên hợp với PEG4K tăng lên đáng kể

PAMAM G2.0-PEG4K (18460 Da), PAMAM G3.0-PEG4K (35540 Da), PAMAM

G4.0-PEG4K (147980 Da) và PAMAM G5.0-PEG4K (177440 Da).

Bảng 3.3. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-PEG4K

(PAMAM G2.0-PEG4K, PAMAM G3.0-PEG4K, PAMAM G4.0-PEG4K và

PAMAM G5.0-PEG4K)

Dendrimer PAMAM

Tên mẫu Số nhóm liên hợp Tỷ lệ liên hợp (%) GPC Mw(Da) Thế hệ Nhóm bề mặt

16 18460 4 nhóm 25,00 PAMAM G2.0 (3256 Da)

32 53540 11-12 nhóm 37,50 PAMAM G3.0 (6909 Da)

PEG4K 4000 Da 64 147980 33-34 nhóm 53,13 PAMAM G4.0 (14215 Da)

128 177440 37 nhóm 28,91 PAMAM G5.0 (28826 Da)

Hình 3.11. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-PEG4K, PAMAM G3.0-PEG4K,

PAMAM G4.0-PEG4K, PAMAM G5.0-PEG4K

Từ các kết quả GPC trong bảng 3.3 và hình 3.11 có thể ước tính mức độ liên

hợp PEG4K-hoạt hóa với các nhóm amine (-NH2) của PAMAM G2.0, G3.0, G4.0,

G5.0. Khả năng liên hợp của các PAMAM với PEG4K như sau: PAMAM G2.0-

PEG4K < PAMAM G3.0-PEG4K < PAMAM G5.0-PEG4K < PAMAM G4.0-

PEG4K. Trong đó, dendrimer PAMAM G4.0 có khả năng liên hợp cao nhất (34

trong tổng số 64 nhóm amine của PAMAM G4.0, chiếm tỷ lệ 53,13%); cao hơn các

dendrimer PAMAM G2.0 (4 trong tổng số 16 nhóm amine của PAMAM G2.0,

chiếm tỷ lệ 25,00%), G3.0 (12 trong tổng số 32 nhóm amine của PAMAM G3.0,

chiếm tỷ lệ 37,5%) và G5.0 (37 trong tổng số 128 nhóm amine của PAMAM G5.0,

chiếm tỷ lệ 28,91%). Điều này là do khi các thế hệ dendrimer PAMAM tăng từ

G2.0 đến G5.0 thì số nhóm amine bề mặt các PAMAM cũng tăng theo cùng với

kích thước phân tử (bảng 2.3): PAMAM G2.0 (16 nhóm amine bề mặt, kích thước

phân tử 2,6 nm), PAMAM G3.0 (32 nhóm amine bề mặt, kích thước phân tử 3,6

nm), PAMAM G4.0 (64 nhóm amine bề mặt, kích thước phân tử 4,4 nm), do đó khả

năng liên hợp cũng tăng từ PAMAM G2.0 đến G4.0; Nhưng khi dendrimer

PAMAM lên đến G5.0 thì số nhóm bề mặt tăng lên đáng kể (128 nhóm amine bề

mặt) trong khi đó kích thước phân tử thì tăng nhẹ (5,7 nm) so với PAMAM G4.0

(64 nhóm bề mặt; 4,4 nm) điều này đã gây ảnh hưởng không gian trong cấu trúc

PAMAM G5.0, các nhóm amine tại bề mặt PAMAM G5.0 trở nên đông đúc hơn,

dẫn đến khả năng liên hợp của PAMAM G5.0 < PAMAM G4.0.

Các thống kê kết quả GPC của PAMAM-PEG6K, PAMAM-PEG10K và

PAMAM-PEG12K cũng cho kết quả tương tự.

b. Kết quả GPC của PAMAM-PEG6K

Bảng 3.4. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-PEG6K (PAMAM

G2.0-PEG6K, G3.0-PEG6K, G4.0-PEG6K và G5.0-PEG6K)

Dendrimer PAMAM

Tên mẫu Số nhóm liên hợp Tỷ lệ liên hợp (%) GPC Mw(Da) Thế hệ Nhóm bề mặt

16 21142 3 nhóm 18,75

32 65230 10 nhóm 31,25 PAMAM G2.0 (3256 Da) PAMAM G3.0 (6909 Da)

PEG6K (6000 Da) 64 201020 31-32 nhóm 50,00

128 238320 35 nhóm 27,34 PAMAM G4.0 (14215 Da) PAMAM G5.0 (28826 Da)

Hình 3.12. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-PEG6K, PAMAM G3.0-PEG6K,

PAMAM G4.0-PEG6K, PAMAM G5.0-PEG6K

c. Kết quả GPC của PAMAM-PEG10K

Bảng 3.5. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-PEG10K (PAMAM

G2.0-PEG10K, PAMAM G3.0-PEG10K, PAMAM G4.0-PEG10K và PAMAM

G5.0-PEG10K)

Dendrimer PAMAM

Tên mẫu Số nhóm liên hợp GPC Mw (Da) Thế hệ Tỷ lệ liên hợp (%) Nhóm bề mặt

16 19531 2 nhóm 12,50 PAMAM G2.0 (3256 Da)

32 97995 9 nhóm 28,13 PAMAM G3.0 (6909 Da)

PEG10K (10000 Da) 64 290940 27-28 nhóm 43,75 PAMAM G4.0 (14215 Da)

128 407160 37-38 nhóm 29,69 PAMAM G5.0 (28826 Da)

Hình 3.13. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-PEG10K, PAMAM G3.0-PEG10K,

PAMAM G4.0-PEG10K, PAMAM G5.0-PEG10K

d. Kết quả GPC của PAMAM-PEG12K

Bảng 3.6. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-PEG12K

(PAMAM G2.0-PEG12K, PAMAM G3.0-PEG12K, PAMAM G4.0-PEG12K và

PAMAM G5.0-PEG12K)

Dendrimer PAMAM

Tên mẫu Số nhóm liên hợp GPC Mw (Da) Thế hệ Tỷ lệ liên hợp (%) Nhóm bề mặt

16 22498 2 nhóm 12,50 PAMAM G2.0 (3256 Da)

32 101480 8 nhóm 25,00 PAMAM G3.0 (6909 Da)

PEG12K (12000 Da) 64 307440 24-25 nhóm 39,06

PAMAM G4.0 (14215 Da)

128 417530 32-33 nhóm 25,78 PAMAM G5.0 (28826 Da)

Hình 3.14. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-PEG12K, PAMAM G3.0-PEG12K,

PAMAM G4.0-PEG12K, PAMAM G5.0-PEG12K

3.2.4. Kết quả TEM của PAMAM và PAMAM-PEG

Các phân tử PAMAM và PAMAM-PEG có thể được quan sát thấy rõ trong TEM.

Kết quả TEM cho thấy kích thước của PAMAM G4.0 là chỉ khoảng 4,5 nm (hình

3.15.a), trong khi kích thước của PAMAM-PEG là 50-100 nm (hình 3.15.b và hình

3.15.c). Điều này cho thấy một sự tăng kích thước đáng kể của PAMAM và PAMAM-

PEG, khẳng định rằng chất mang nano PAMAM-PEG đã tổng hợp thành công.

(a) (b) (c)

Hình 3.15. Hình ảnh TEM của PAMAM G4.0 (a), PAMAM G4.0-PEG4K (b) và

PAMAM G4.0-PEG6K (c)

3.3. TỔNG HỢP PAMAM-PLURONIC

Trong tổng hợp PAMAM-Pluronic các thành phần cấu trúc của sản phẩm

trung gian NPC-Plu-NPC, NPC-Plu-TA, PAMAM và PAMAM-Pluronic cũng được

xác định qua các kết quả phân tích phổ 1H-NMR, FTIR, GPC và TEM.

3.3.1. Kết quả phân tích 1H-NMR các sản phẩm trung gian NPC-Plu-NPC,

NPC-Plu-TA, PAMAM và PAMAM-Pluronic

Qui trình tổng hợp PAMAM-Pluronic được thực hiện theo 3 giai đoạn.

a. Giai đoạn 1: Tổng hợp NPC-Plu-NPC

Để tổng hợp PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 với Pluronic cần phải hoạt hóa

2 nhóm -OH đầu và cuối mạch của Pluronic bởi pNitrophenyl chloroformate

(NPC) tạo sản phẩm NPC-Plu-NPC theo phản ứng sau:

Hình 3.16. Sơ đồ tổng hợp NPC-Plu-NPC

Phổ 1H-NMR NPC-Plu-NPC đo trong dung môi CDCl3 (hình 3.17 và phụ lục

8):

Hình 3.17. Phổ 1H-NMR của NPC-P123-NPC

Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của NPC-Plu-NPC được thể hiện qua

phổ cộng hưởng từ hạt nhân (hình 3.17 và phụ lục 8). Phổ đồ có các tín hiệu của các

proton có trong Pluronic như sau: tín hiệu δH = 1,15 ppm đặc trưng proton của

nhóm methyl (-CH3) trên PO của Pluronic. Tín hiệu δH = 3,49-3,79 ppm là proton

của nhóm methylene (-OCH2-CH2O-) trên EO. Tín hiệu proton methylene liên kết

trực tiếp với nhóm carbonat ở δH = 4,44 ppm (-CH2-O-NPC).

Sự xuất hiện của hai tín hiệu đôi ở δH = 7,39 ppm và δH = 8,29 ppm là hai tín

hiệu đặc trưng của proton thơm nhóm (-CH=CH-) của NPC. Độ hoạt hóa Pluronic

đạt trên 90% được tính từ tỷ lệ tích phân của proton thơm (NPC) và proton methyl

(Pluronic). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Park [64] và Nguyen [26].

Phổ đồ 1H-NMR của các NPC-Plu-NPC khác được thể hiện ở phụ lục 8 và

cũng cho kết quả tương tự như ở phổ đồ 1H-NMR của NPC-P123-NPC.

b. Giai đoạn 2: Tổng hợp NPC-Plu-TA

NPC-Plu-NPC được dùng làm tác chất cho phản ứng ghép với TA. Trong

phản ứng này liên kết urethane được tạo thành từ phản ứng giữa nhóm amine trong

phân tử TA và nhóm C=O của hợp chất NPC-Plu-NPC tạo sản phẩm là NPC-Plu-

TA.

Hình 3.18. Sơ đồ tổng hợp NPC-Plu-TA

Phổ 1H-NMR NPC-Plu-TA đo trong dung môi CDCl3 (hình 3.19 và phụ lục

9):

Hình 3.19. Phổ 1H-NMR của NPC-P123-TA

Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của NPC-Plu-TA được thể hiện qua

phổ cộng hưởng từ hạt nhân (hình 3.19 và phụ lục 9). Phổ đồ có các tín hiệu của các

proton có trong Pluronic như sau: tín hiệu δH = 1,15 ppm đặc trưng proton của

nhóm methyl (-CH3) trên PO và tín hiệu δH = 3,40-3,79 ppm là proton của nhóm

methylene (-OCH2-CH2O-) trên EO của Pluronic. Proton methylene liên kết trực

tiếp với nhóm carbonate của NPC xuất hiện tại tín hiệu δH = 4,44 ppm (-CH2-O-

NPC). Ngoài ra, còn xuất hiện thêm tín hiệu proton methylene liên kết trực tiếp với

nhóm carbonate của TA ở δH = 4,2 ppm (-CH2-O-TA). Kết quả này phù hợp với

nghiên cứu của Park [64] và Nguyen [26].

Sự xuất hiện của hai tín hiệu đôi ở δH = 7,40 ppm và δH = 8.29 ppm là hai tín

hiệu đặc trưng của proton thơm của NPC (-CH=CH-). Phổ đồ xuất hiện tín hiệu ở

δH = 6,78 ppm và δH = 7,02 ppm là tín hiệu proton liên hợp vòng thơm (-CH=CH-)

của nhóm tyramine. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyen [26]. Khoảng

50% gốc NPC đã được thay thế bởi TA. Kết quả này thu được từ phép tính tỷ lệ tích

phân của proton trên NPC và proton của TA.

Phổ đồ 1H-NMR của các NPC-Plu-TA khác được thể hiện ở phụ lục 9 và cũng

cho kết quả tương tự như ở phổ đồ 1H-NMR của NPC-P123-TA.

c. Giai đoạn 3: Tổng hợp PAMAM-Pluronic

Trong giai đoạn phản ứng này, nhóm -NH2 trên bề mặt dendrimer PAMAM

(G2.0, G3.0, G4.0, G5.0) sẽ tấn công vào liên kết C=O của hợp chất NPC-Plu-TA

tạo sản phẩm PAMAM-Pluronic.

Hình 3.20. Sơ đồ tổng hợp PAMAM-Pluronic

Phổ 1H-NMR PAMAM-Pluronic đo trong dung môi CDCl3 (hình 3.21 và phụ

lục 10):

Hình 3.21. Phổ 1H-NMR của PAMAM-Pluronic

Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của PAMAM-Pluronic được thể hiện

qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân (hình 3.21 và phụ lục 10). Các PAMAM-Pluronic

sau khi tổng hợp đã thẩm tách bằng màng MWCO trong 3 ngày. Phổ đồ có tín hiệu

các proton của PAMAM trong PAMAM-Pluronic như: -CH2CH2N< tại δH = 2.6

ppm; -CH2CH2CO- tại δH = 2.8 ppm; -CONHCH2CH2N- tại δH = 3.3-3.4 ppm.

Các tín hiệu này giống với tín hiệu các proton của PAMAM (hình 3.3). Kết quả này

phù hợp với các nghiên cứu của Xiang Wang [119], Tran [78] và Zhuojun Gu [124].

Ngoài ra, trên phổ đồ hình 3.21 và phụ lục 10, không còn thấy xuất hiện hai tín

hiệu đặc trưng proton thơm của NPC (-CH=CH-) ở δH=7,40 ppm và δH=8.29 ppm;

chỉ thấy có sự xuất hiện của hai tín hiệu đôi tại δH = 6,78 ppm và δH = 7,02 ppm là

các tín hiệu đặc trưng proton liên hợp vòng thơm (-CH=CH-) của TA. Bên cạnh đó

còn xuất hiện các tín hiệu tại δH = 4,2 ppm đặc trưng proton methylene liên kết trực

tiếp với nhóm carbonate của TA (-CH2-O-TA), tín hiệu δH = 3,40-3,79 ppm là

proton của nhóm methylene (-OCH2-CH2O-) của Pluronic và tín hiệu δH = 1.15 (-

CH3, Pluronic). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyen [26].

Phổ đồ 1H-NMR của PAMAM-Pluronic khác được thể hiện ở Phụ lục 10 và cũng

cho kết quả tương tự như ở phổ đồ 1H-NMR của PAMAM-P123.

Điều này cũng cho thấy phần nào về sự thành công trong tổng hợp PAMAM-

Pluronic. Sự thành công này sẽ được khẳng định thêm qua các kết quả FTIR, GPC

và TEM.

3.3.2. Kết quả phân tích FTIR của PAMAM và PAMAM-Pluronic

Dendrimer PAMAM là polymer có cấu trúc phân nhánh rất đều đặn với số lượng

lớn các nhóm bề mặt là amine rất dễ dàng để gắn kết với một số polymer hoạt hóa như

là nhóm hydroxyl hoạt hóa của Pluronic (NPC-Plu-TA) [35, 68].

Dendrimer PAMAM và PAMAM-Pluronic cũng có thể được xác định rõ ràng

bởi quang phổ hồng ngoại FTIR (tương tự như PAMAM-PEG).

Kết quả FTIR hình 3.22.a, cho thấy độ chuyển dịch hóa học tại 3287 cm-1 là

dao động đặc trưng cho nhóm amine bậc 1 (-NH2) và amine bậc 2 (-NH-) của

PAMAM. Đồng thời tín hiệu này cũng xuất hiện trong quang phổ hồng ngoại của

PAMAM G4.0-F127 (hình 3.22.b) với độ chuyển dịch hóa học 3423 cm-1, tín hiệu

này đã được thay đổi mạnh, điều này phần nào cho thấy số lượng nhóm -NH2 đã

giảm đáng kể.

Hình 3.22. Phổ FTIR của PAMAM G4.0 (a) và PAMAM G4.0-F127(b)

Tín hiệu peak 2942 cm-1 (hình 3.22.a) và 2887 cm-1 (hình 3.22.b) dao động

hóa trị của nhóm methylene (-CH2-), và nhóm amide (HNC=O) được thấy tại tín

hiệu 1644 cm-1 (hình 3.22.a) và 1646 cm-1 (hình 3.22.b).

Ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu mới trong phổ FTIR của PAMAM G4.0-F127

tại độ chuyển dịch 1112 cm-1 đặc trưng cho nhóm C-O-C của Pluronic [7].

Kết quả FTIR và 1H-NMR cho thấy NPC-Plu-TA đã được liên hợp với

dendrimer PAMAM.

3.3.3. Kết quả GPC của PAMAM-Pluronic

Sự thành công trong quá trình tổng hợp PAMAM-Pluronic cũng đã được

khẳng định bằng phép đo GPC. Trong đó, số nhóm liên hợp và tỷ lệ liên hợp được

tính toán tương đối theo các công thức sau:

a. Kết quả GPC của PAMAM-P123

Khối lượng phân tử của các dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0 và G5.0

(theo lý thuyết) tương ứng là 3256 Da, 6909 Da, 14215 Da, 28826 Da. Trong khi

đó, theo thống kê kết quả GPC trong bảng 3.7 và hình 3.23, khối lượng phân tử của

PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 sau khi liên hợp với Pluronic P123 tăng lên đáng

kể PAMAM G2.0-P123 (25053 Da), PAMAM G3.0-P123 (62523 Da), PAMAM

G4.0-P123 (200150 Da) và PAMAM G5.0-P123 (255050 Da).

Bảng 3.7. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-P123

(PAMAM G2.0-P123, PAMAM G3.0-P123, PAMAM G4.0-P123 và PAMAM

G5.0-P123)

Dendrimer PAMAM

Tên mẫu Số nhóm liên hợp Tỷ lệ liên hợp (%) GPC Mw(Da) Thế hệ Nhóm bề mặt

16 25053 4 nhóm 25,00 PAMAM G2.0 (3256 Da)

32 62523 10 nhóm 31,25 PAMAM G3.0 (6909 Da)

Pluronic P123 (5800Da) 64 200150 32 nhóm 50,00 PAMAM G4.0 (14215 Da)

128 255050 39 nhóm 30,47 PAMAM G5.0 (28826 Da)

Hình 3.23. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-P123, PAMAM G3.0-P123, PAMAM

G4.0-P123, PAMAM G5.0-P123

Từ các kết quả GPC trong bảng 3.7 và hình 3.23 có thể ước tính mức độ liên

hợp Pluronic P123-hoạt hóa với các nhóm amine (-NH2) của PAMAM G2.0, G3.0,

G4.0, G5.0. Khả năng liên hợp của các PAMAM với Pluronic P123 như sau:

PAMAM G2.0-P123 < PAMAM G3.0-P123 < PAMAM G5.0-P123 < PAMAM

G4.0-P123. Tương tự như PAMAM-PEG thì PAMAM-P123, dendrimer PAMAM

G4.0 cũng có khả năng liên hợp cao nhất (32 trong tổng số 64 nhóm amine của

PAMAM G4.0, chiếm tỷ lệ 50,00%); cao hơn các dendrimer PAMAM G2.0 (4

trong tổng số 16 nhóm amine của PAMAM G2.0, chiếm tỷ lệ 25,00%), G3.0 (10

trong tổng số 32 nhóm amine của PAMAM G3.0, chiếm tỷ lệ 31,25%) và G5.0 (39

trong tổng số 128 nhóm amine của PAMAM G5.0, chiếm tỷ lệ 30,47%). Điều này

là do khi các thế hệ dendrimer PAMAM tăng từ G2.0 đến G5.0 thì số nhóm amine

bề mặt các PAMAM cũng tăng theo cùng với kích thước phân tử (bảng 2.3):

PAMAM G2.0 (16 nhóm amine bề mặt, kích thước phân tử 2,6 nm), PAMAM G3.0

(32 nhóm amine bề mặt, kích thước phân tử 3,6 nm), PAMAM G4.0 (64 nhóm

amine bề mặt, kích thước phân tử 4,4 nm), do đó khả năng liên hợp cũng tăng từ

PAMAM G2.0 đến G4.0; Nhưng khi dendrimer PAMAM lên đến G5.0 thì số nhóm

bề mặt tăng lên đáng kể (128 nhóm amine bề mặt) trong khi đó kích thước phân tử

thì tăng nhẹ (5,7 nm) so với PAMAM G4.0 (64 nhóm bề mặt; 4,4 nm) điều này đã

gây ảnh hưởng không gian trong cấu trúc PAMAM G5.0, các nhóm amine tại bề

mặt PAMAM G5.0 trở nên đông đúc hơn, dẫn đến khả năng liên hợp của PAMAM

G5.0 < PAMAM G4.0.

Các thống kê kết quả GPC của PAMAM-F68, PAMAM-F127 và PAMAM-

F108 cũng cho kết quả tương tự.

b. Kết quả GPC của PAMAM-F68

Sự thành công trong quá trình tổng hợp PAMAM-F68 cũng đã được khẳng

định bằng phép đo GPC trong bảng 3.8 và hình 3.24.

Bảng 3.8. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-F68

(PAMAM G2.0-F68, PAMAM G3.0-F68, PAMAM G4.0-F68, PAMAM G5.0-F68)

Dendrimer PAMAM

Tên mẫu Số nhóm liên hợp Tỷ lệ liên hợp (%) GPC Mw(Da) Thế hệ Nhóm bề mặt

27450 3 nhóm 18,75 16

76235 8-9 nhóm 28,13 32

Pluronic F68 (8400Da) 277540 31 nhóm 48,44 64

128 356370 39 nhóm 30,47 PAMAM G2.0 (3256 Da) PAMAM G3.0 (6909 Da) PAMAM G4.0 (14215 Da) PAMAM G5.0 (28826 Da)

Hình 3.24. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-F68, PAMAM G3.0-F68, PAMAM

G4.0-F68, PAMAM G5.0-F68

c. Kết quả GPC của PAMAM-F127

Sự thành công trong quá trình tổng hợp PAMAM-F127 cũng đã được khẳng

định bằng phép đo GPC trong bảng 3.9 và hình 3.25.

Bảng 3.9. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-F127 (PAMAM

PAMAM G2.0-F127, PAMAM G3.0-F127, PAMAM G4.0-F127 và PAMAM

G5.0-F127)

Dendrimer PAMAM Tên mẫu Số nhóm liên hợp Tỷ lệ liên hợp (%) GPC Mw(Da) Thế hệ Nhóm bề mặt

16 36297 2-3 nhóm 18,75 PAMAM G2.0 (3256 Da)

32 112100 8-9 nhóm 28,13 PAMAM G3.0 (6909 Da)

64 353310 27 nhóm 42,19 Pluronic F127 (12600Da) PAMAM G4.0 (14215 Da)

128 447100 33 nhóm 25,78 PAMAM G5.0 (28826 Da)

100

Hình 3.25. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-F127, PAMAM G3.0-F127, PAMAM

G4.0-F127, PAMAM G5.0-F127

d. Kết quả GPC của PAMAM-F108

Sự thành công trong quá trình tổng hợp PAMAM-F108 cũng đã được khẳng

định bằng phép đo GPC trong bảng 3.10 và hình 3.26.

Bảng 3.10. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM-F108 (PAMAM

G2.0-F108, PAMAM G3.0-F108, PAMAM G4.0-F108 và PAMAM G5.0-F108)

Dendrimer PAMAM GPC Số nhóm Tỷ lệ liên Tên mẫu Mw(Da) liên hợp hợp (%) Thế hệ Nhóm bề mặt

PAMAM G2.0 16 29400 2 nhóm 12,5 (3256 Da)

PAMAM G3.0 32 127320 8-9 nhóm 28,13 (6909 Da) Pluronic F108

(14600Da) PAMAM G4.0 64 377140 25 nhóm 39,06 (14215 Da)

PAMAM G5.0 31-32 128 488690 25,00 (28826 Da) nhóm

101

Hình 3.26. Kết quả GPC của PAMAM G2.0-F108, PAMAM G3.0-F108, PAMAM

G4.0-F108, PAMAM G5.0-F108

3.3.4. Kết quả TEM của PAMAM và PAMAM-Pluronic

Các phân tử PAMAM và PAMAM-Pluronic có thể được quan sát thấy rõ

trong TEM. Kết quả TEM cho thấy kích thước của PAMAM G4.0 là chỉ khoảng 4,5

nm (hình 3.15.a) và Pluronic F127 15 nm (hình 3.27.a. Trong khi đó, kích thước của

PAMAM-Pluronic là 60-180 nm (hình 3.27.b, hình 3.27.c, hình 3.27.d và hình

3.27.e), cụ thể: PAMAM-P123 có kích thước phân tử từ 60-100 nm, PAMAM-F68

có kích thước phân tử từ 90-130 nm, PAMAM-F127 có kích thước phân tử từ 100-

150 nm và PAMAM-F108 kích thước phân tử từ 120-180 nm. Điều này cho thấy

một sự tăng kích thước đáng kể của PAMAM và PAMAM-Pluronic, khẳng định

rằng chất mang nano PAMAM-Pluronic đã tổng hợp thành công.

(a) (b) (c)

(d) (e)

Hình 3.27. Hình ảnh TEM của Pluronic F127 (a), PAMAM G4.0-P123 (b),

PAMAM G4.0-F68 (c), PAMAM G4.0-F127 (d) và PAMAM G4.0-F108 (e)

102

3.4. SO SÁNH KHẢ NĂNG BIẾN TÍNH CỦA DENDRIMER PAMAM G2.0,

G3.0, G4.0, G5.0 BẰNG CÁC BIOPOLYMER (PEG VÀ PLURONIC)

Các dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0 và G5.0 đã được biến tính thành

công bởi các polymer có tính tương hợp sinh học PEG4K, PEG6K, PEG10K,

PEG12K, Pluronic P123, Pluronic F68, Pluronic F127, Pluronic F108. Tuy nhiên,

với sự phát triển nhánh đều đặn làm tăng số nhóm chức bề mặt lên đáng kể và tăng

kích thước phân tử trong cấu trúc đặc biệt của chất mang dendrimer PAMAM G2.0,

G3.0, G4.0, G5.0 tác động lên khả năng liên hợp với PEG, Pluronic gây ảnh hưởng

đến hiệu quả nang hóa thuốc.

3.4.1. Kết quả biến tính của dendrimer PAMAM với PEG

Thống kê kết quả GPC thu được trên đồ thị 3.1 về mức độ và tỷ lệ biến tính

của PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 với 4 loại polymer có khối lượng phân tử

khác nhau PEG4K, PEG6K, PEG10K, PEG12K.

Đồ thị 3.1. Tỷ lệ liên hợp của PAMAM-PEG

Kết quả đồ thị 3.1 đã cho thấy các dendrimer PAMAM G4.0 có khả năng liên

hợp với PEG cao hơn dendrimer PAMAM G2.0, G3.0 và G5.0 tương ứng (khả năng

liên hợp PAMAM G2.0-PEG < PAMAM G3.0-PEG < PAMAM G5.0-PEG <

103

PAMAM G4.0-PEG). Mặt khác, trong cùng một thế hệ dendrimer PAMAM thì mức

độ liên hợp của các PEG với PAMAM giảm dần theo sự tăng chiều dài mạch phân

tử PEG (tăng khối lượng phân tử), mức độ liên hợp của PAMAM-PEG4K >

PAMAM-PEG6K > PAMAM-PEG10K > PAMAM-PEG12K (Cụ thể, PAMAM

G4.0-PEG4K 53,13% > PAMAM G4.0-PEG6K 50,00% > PAMAM G4.0-PEG10K

43,75% > PAMAM G4.0-PEG12K 39,06%), kết quả này phù hợp với nghiên cứu

của Yang H [120]. Điều này có thể thấy rõ trong cấu trúc của các thế hệ dendrimer

PAMAM, khi các thế hệ dendrimer PAMAM tăng từ G2.0 đến G5.0 thì số nhóm

amine bề mặt các PAMAM cũng tăng theo cùng với kích thước phân tử (bảng 2.3):

PAMAM G2.0 (16 nhóm amine bề mặt, kích thước phân tử 2,6 nm), PAMAM G3.0

(32 nhóm amine bề mặt, kích thước phân tử 3,6 nm), PAMAM G4.0 (64 nhóm

amine bề mặt, kích thước phân tử 4,4 nm), do đó khả năng liên hợp cũng tăng từ

PAMAM G2.0 đến G4.0; Nhưng khi dendrimer PAMAM lên đến G5.0 thì số nhóm

bề mặt tăng lên đáng kể (128 nhóm amine bề mặt) trong khi đó kích thước phân tử

thì tăng nhẹ (5,7 nm) so với PAMAM G4.0 (64 nhóm bề mặt; 4,4 nm) điều này đã

gây ảnh hưởng không gian trong cấu trúc PAMAM G5.0, các nhóm amine tại bề

mặt PAMAM G5.0 trở nên đông đúc hơn, tạo cấu trúc đặc khít, dẫn đến khả năng

liên hợp của PAMAM G5.0 < PAMAM G4.0. Mặt khác, đối với các PEG có khối

lượng phân tử khác nhau (số nhóm EO khác nhau) PEG4K < PEG6K < PEG10K <

PEG12K (Số nhóm EO trong phân tử PEG4K: 90, PEG6K: 150, PEG10K: 220 và

PEG12K: 240) nên chiều dài mạch cấu trúc cũng khác nhau (bảng 1.1), các PEG có

khối lượng phân tử càng lớn thì cấu trúc mạch phân tử càng dài, càng cồng kềnh

gây cản trở không gian do đó khả năng liên hợp với các PAMAM cũng giảm theo

sự tăng chiều dài mạch carbon trong phân tử PEG (mức độ liên hợp: PAMAM-

PEG4K > PAMAM-PEG6K > PAMAM-PEG10K > PAMAM-PEG12K).

3.4.2. Kết quả biến tính của dendrimer PAMAM với Pluronic

Kết quả biến tính của các dendrimer PAMAM-Pluronic cũng cho kết quả

tương tự như PAMAM-PEG, thống kê kết quả GPC để đánh giá về mức độ và tỷ lệ

biến tính của PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 với 4 loại Pluronic có khối lượng

104

phân tử khác nhau Pluronic P123, Pluronic F68, Pluronic F127 và Pluronic F108

được thể hiện trên đồ thị 3.2.

Đồ thị 3.2. Tỷ lệ liên hợp của PAMAM-Pluronic

Thống kê đồ thị 3.2 đã cho thấy các dendrimer PAMAM G4.0 cũng có khả

năng liên hợp cao hơn dendrimer PAMAM G2.0, G3.0 và G5.0 (khả năng liên hợp

PAMAM G2.0-Pluronic < PAMAM G3.0-Pluronic < PAMAM G5.0-Pluronic <

PAMAM G4.0-Pluronic). Mặt khác, trong cùng một thế hệ dendrimer PAMAM thì

mức độ liên hợp của các Pluronic với PAMAM giảm dần theo sự tăng chiều dài

mạch phân tử Pluronic (tăng khối lượng phân tử), mức độ liên hợp của PAMAM-

Pluronic P123 > PAMAM-Pluronic F68 > PAMAM-Pluronic F127 > PAMAM-

Pluronic F108 (Cụ thể: PAMAM G4.0-P123 50,00% > PAMAM G4.0-F68 48,44%

> PAMAM G4.0-F127 42,19% > PAMAM G4.0-F108 39,06%). Điều này cũng

được thấy rõ trong cấu trúc của các thế hệ dendrimer PAMAM, khi tăng các thế hệ

dendrimer PAMAM từ G2.0 đến G5.0 thì số nhóm amine bề mặt các PAMAM cũng

tăng theo cùng với kích thước phân tử (bảng 2.3) do đó khả năng liên hợp cũng tăng

105

từ PAMAM G2.0 đến G4.0; Nhưng khi dendrimer PAMAM lên đến G5.0 thì do

ảnh hưởng không gian trong cấu trúc PAMAM G5.0, các nhóm amine tại bề mặt

PAMAM G5.0 trở nên đông đúc hơn, tạo cấu trúc đặc khít, dẫn đến khả năng liên

hợp của PAMAM G5.0 < PAMAM G4.0. Mặt khác, đối với các Pluronic có khối

lượng phân tử khác nhau (số nhóm EO và PO cũng khác nhau) Pluronic P123 <

Pluronic F68 < Pluronic F127 < Pluronic F108 (tổng số nhóm EO và PO trong phân

tử Pluronic P123: 75-90 < Pluronic F68: 100-125 < Pluronic F127: 149-165 <

Pluronic F108: 169-193) nên chiều dài mạch cấu trúc cũng khác nhau (bảng 1.2),

các Pluronic có khối lượng phân tử càng lớn thì cấu trúc mạch phân tử càng dài,

càng cồng kềnh gây cản trở không gian do đó khả năng liên hợp với các PAMAM

cũng giảm theo sự tăng chiều dài mạch carbon trong phân tử Pluronic (mức độ liên

hợp: Pluronic P123 > Pluronic F68 > Pluronic F127 > Pluronic F108).

3.5. TỔNG HỢP CHẤT MANG NANO PAMAM G4.0-F127 VỚI CÁC TỶ LỆ

MOL KHÁC NHAU

Quá trình biến tính PAMAM G4.0 bằng Pluronic F127 cũng được khảo sát với

các tỷ lệ mol khác nhau (tỷ lệ mol PAMAM : Pluronic F127 = 1:8 ; 1:16; 1:32;

1:64), tại bảng 3.11 và hình 3.28 cũng cho thấy khả năng liên hợp khác nhau.

Bảng 3.11. Khối lượng phân tử và độ biến tính của các PAMAM G4.0-F127 với các

tỷ lệ mol PAMAM : Pluronic F127 khác nhau

PAMAM G4.0 Nhóm liên Tỷ lệ liên polymer Mw(Da) Nhóm bề Tỷ lệ hợp hợp (%) mặt mol

64 1:8 36297 2 nhóm 25,00 Pluronic

F127 64 1:16 73219 5 nhóm 31,25

(12600Da) 64 1:32 147320 11 nhóm 34,38

64 1:64 353301 27 nhóm 42,19

106

Hình 3.28. Kết quả GPC của PAMAM G4.0-F127 tỷ lệ 1:8 ; 1:16; 1:32; 1:64

Kết quả GPC bảng 3.11, hình 3.28 của quá trình biến tính PAMAM G4.0 bằng

Pluronic F127 với các tỷ lệ mol khác nhau (PAMAM : Pluronic F127 = 1:8 ; 1:16;

1:32; 1:64) cho thấy khả năng liên hợp của PAMAM G4.0 và Pluronic F127 tăng

tương ứng với việc tăng tỷ lệ mol phản ứng: 25% (với tỷ lệ 1:8) < 31,25% (với tỷ lệ

1:16) < 34,38% (với tỷ lệ 1:32) < 42,19% (với tỷ lệ 1:64).

Khi tăng tỷ lệ mol phản ứng (PAMAM : Pluronic F127 = 1:8 ; 1:16; 1:32;

1:64) sẽ làm tăng số phân tử của tác chất trong phản ứng, do đó tăng diện tích tiếp

xúc giữa các tác chất tham gia phản ứng nên làm tăng hiệu suất phản ứng, tức là

tăng khả năng phản ứng giữa PAMAM với Pluronic F127 (tỷ lệ liên hợp PAMAM

và Pluronic F127 tăng).

3.6. NANG HÓA THUỐC CHỐNG UNG THƯ 5-FLUOROURACIL TRONG

CÁC CHẤT MANG NANO

Trên cơ sở hình thức vận chuyển thuốc [19, 28, 51-52, 97-98], phương pháp

nang hóa thuốc của dendrimer PAMAM sau khi biến tính bằng PEG và Pluronic

được mô tả theo hình thức (hình 1.23.a; hình 2.16.b và hình 2.18.b): các phân tử

thuốc chứa trong các khoảng trống bên trong phân tử của dendrimer PAMAM sau

khi biến tính; không có tương tác giữa dendrimer PAMAM (chủ) và thuốc (khách),

107

thuốc không tương tác với thành phần tâm và nhánh bên trong của dendrimer (các

nhánh dendrimer bao bọc các phân tử thuốc một cách trực tiếp). Kết quả phân tích

phổ hồng ngoại FTIR của PAMAM-PEG và PAMAM-PEG/5-FU (hình 3.29) cho

thấy điều này.

Hình 3.29. Phổ FTIR của PAMAM-PEG (a) và PAMAM-PEG/5-FU (b)

Kết quả FTIR của PAMAM-PEG (hình 3.29.a) và PAMAM-PEG/5-FU (hình

3.29.b) đều xuất hiện các tín hiệu giống nhau, cụ thể: các tín hiệu đặc trưng cho

PAMAM tại độ chuyển dịch hóa học 3423 cm-1 (hình 3.29.a) và 3425 cm-1 (hình

3.29.b) là dao động đặc trưng cho nhóm amine bậc 1 (-NH2) và amine bậc 2 (-NH),

tín hiệu peak 2888 cm-1 (hình 3.2.9.a) và 2888 cm-1 (hình 3.29.b) dao động hóa trị

của nhóm methylene (-CH2-), nhóm amide (HNC=O) được thấy tại tín hiệu 1648

cm-1 (hình 3.29.a) và 1660 cm-1 (hình 3.29.b); tín hiệu tại độ chuyển dịch 1113 cm-1

(hình 3.29.a) và 1660 cm-1 (hình 3.29.b) đặc trưng cho nhóm C-O-C của PEG [7].

Ngoài ra, không thấy xuất hiện tín hiệu mới 5-FU trong kết quả FTIR (hình 3.29.b),

108

do đó có thể khẳng định rằng không có liên kết hóa học giữa dendrimer PAMAM

và thuốc.

Để đánh giá hiệu quả nang hóa thuốc, dựa vào kết quả HPLC nhằm xác định

gián tiếp lượng thuốc 5-FU được nang hóa trong các chất mang nano (PAMAM,

PAMAM-PEG, PAMAM-Pluronic). Lượng 5-FU tự do, không được nang hóa trong

vật liệu chất mang nano được tính toán trực tiếp dựa trên phương trình đường chuẩn

Y = 33,101x + 27,857 (R2 = 0,9993) được xây với 5 nồng độ khác nhau, từ 20-100

(µg.mL-1) (Phụ lục 1)

Hàm lượng 5-FU nang hóa trong các chất mang nano (EE% và DL%) được

xác định gián tiếp thông qua kết quả đo HPLC và công thức sau, trong đó Wtotal 5-FU

là lượng thuốc 5-FU ban đầu và lượng 5-FU không được nang hóa trong chất mang

nano là Wfree 5-FU [9, 68].

%EE = × 100

× 100 %DL = Wtotal 5−FU − Wfree 5−FU Wtotal 5−FU Wtotal 5−FU − Wfree 5−FU (Wtotal 5−FU + W𝑐ℎấ𝑡 𝑚𝑎𝑛𝑔 − Wfree 5−FU)

3.6.1. Nang hóa thuốc trong các chất mang nano dendrimer PAMAM G2.0,

G3.0, G4.0 và G5.0

Hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của các chất mang dendrimer PAMAM G2.0,

G3.0, G4.0 và G5.0 thể hiện trong hình 3.30 và bảng 3.12.

Theo biểu đồ phương trình đường chuẩn 5-FU (Y = 33,101x + 27,857) và kết

quả sắc ký đồ (HPLC) của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0, G3.0,

G4.0, G5.0 (Hình 3.30), lượng thuốc 5-FU trong các chất mang sẽ được tính như

trong bảng 3.12

109

Hình 3.30. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0, G3.0,

G4.0 và G5.0

Bảng 3.12. Thống kê hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU trong PAMAM G2.0, G3.0,

G4.0 và G5.0

Dendrimer PAMAM/5-FU (A= 33.101C + 27.857) (Inj Volume: 10 µL)

Area DL% EE% Thế hệ PAMAM 5FU không được nang hóa (mg) 5FU được nang hóa(mg)

Dendrimer G2.0 200,15 15,62 4,38 4,20 21,90

Dendrimer G3.0 173,8 13,23 6,77 6,34 33,85

Dendrimer G4.0 155,52 11,57 8,43 7,77 42,15

Dendrimer G5.0 162,57 12,21 7,79 7,23 38,95

Với tỷ lệ thuốc 5-FU được tải trong các chất mang (EE%): 21,90% (PAMAM

G2.0), 33,85% (PAMAM G3.0), 42,15% (PAMAM G4.0) và 38,95% (PAMAM

110

G5.0) trong bảng 3.12, cho thấy dendrimer PAMAM là hệ chất có khả năng nang

hóa thuốc.

Sự thay đổi trong cấu trúc đặc biệt của chất mang dendrimer PAMAM G2.0,

G3.0, G4.0 và G5.0 dẫn đến hiệu quả nang hóa thuốc khác nhau (bảng 3.12).

Kết quả trong hình 3.30 và bảng 3.12 cho thấy sự ảnh hưởng trong cấu trúc

dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 và đặc tính liên hợp của chúng đến

hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của các chất mang. Ảnh hưởng này khá rõ giữa các

thế hệ chất mang PAMAM G2.0 (21,90%) < PAMAM G3.0 (33,85%) < PAMAM

G4.0 (42,15%) > PAMAM G5.0 (38,95%). Điều này có thể nhìn thấy trong sự khác

nhau về cấu trúc dendrimer PAMAM các thế hệ, cụ thể: theo thống kê trong bảng 2.3,

khi các thế hệ dendrimer PAMAM phát triển đều đặn (từ G2.0 đến G4.0) thì số

nhóm bề mặt tăng đáng kể (G2.0: 16 nhóm, G3.0: 32 nhóm, G4.0: 64 nhóm) và kích

thước phân tử cũng tăng theo (G2.0: 2,6 nm; G3.0: 3,6 nm; G4.0: 4,4 nm) dẫn đến

làm tăng kích thước các khoảng trống bên trong cấu trúc phân tử dendrimer

PAMAM nên lượng thuốc 5-FU nang hóa được trong dendrimer PAMAM G2.0 <

G3.0 < G4.0; Tuy nhiên khi lên đến thế hệ G5.0 thì cấu trúc và kích thước khoảng

trống của PAMAM G5.0 bị thu hẹp lại do sự đặc khít của nó vì số nhóm bề mặt tăng

đáng kể (lên đến 128 nhóm) trong khi PAMAM G4.0 thì chỉ có 64 nhóm, nhưng kích

thước phân tử của PAMAM G4.0 (4,4 nm) không chênh lệch nhiều so với PAMAM

G5.0 (5,7 nm) dẫn đến PAMAM G4.0 nang hóa thuốc hiệu quả hơn PAMAM G5.0.

3.6.2. Nang hóa thuốc 5-FU trong polymer PEG và Pluronic

Lượng thuốc 5-FU trong PEG và Pluronic cũng được tính toán tương tự như

PAMAM. Theo biểu đồ phương trình đường chuẩn 5-FU (Y = 33,101x + 27,857) và

kết quả sắc ký đồ (HPLC) của 5-FU không được nang hóa trong polymer PEG và

Pluronic thể hiện trong hình 3.31 và bảng 3.13.

111

Hình 3.31. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PEG6K và Pluronic

F127

Bảng 3.13. Hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của PEG6K và Pluronic F127

PEG/5-FU, Pluronic/5-FU (A= 33.101C + 27.857) (Inj Volume: 10 µL)

PEG/Plu Area DL% EE%

5FU được nang hóa (mg) 5FU không được nang hóa (mg)

PEG6K 248,17 19,97 0,03 0,03 0,15

F127 207,15 16,25 3,75 3,61 18,75

Trong kết quả hình 3.31 và bảng 3.13 đã chỉ ra PEG6K hầu như không có khả

năng nang hóa thuốc kỵ nước như 5-FU (EE%: 0,15) do trong cấu trúc PEG6K chỉ

gồm các nhóm EO ưa nước (hình 1.25), nên PEG6K hay PEG nói chung chỉ có khả

năng nang hóa các loại thuốc ưa nước. Ngược lại, trong khi đó Pluronic F127 hiệu

quả nang hóa thuốc 5-FU đạt 18,75% trong 100mg Pluronic F127, điều này đúng với

cấu trúc của Pluronic F127 hay họ Pluronic nói chung bởi lẽ các Pluronic ngoài nhóm

EO (ưa nước) còn có nhóm PO (kỵ nước) nên Pluronic vừa có khả năng nang hóa

thuốc ưa nước và thuốc kỵ nước, nhưng khả năng nang hóa thuốc này không cao, do

chúng có cấu trúc mạch thẳng (hình 1.26).

3.6.3. Nang hóa thuốc 5-FU trong các chất mang dendrimer PAMAM-PEG

Hiệu quả nang hóa thuốc của các dendrimer PAMAM-PEG được xác định

tương tự như các PAMAM, kết quả HPLC được sử dụng nhằm xác định gián tiếp

112

lượng thuốc 5-FU được nang hóa trong các dendrimer PAMAM-PEG (PAMAM-

PEG4K, PAMAM-PEG6K, PAMAM-PEG10K và PAMAM-PEG12K). Lượng 5-

FU tự do, không được nang hóa trong PAMAM-PEG được tính toán trực tiếp trên

phương trình đường chuẩn Y = 33,101x + 27,857 (phụ lục 1).

a. Hiệu quả nang hóa thuốc của các dendrimer PAMAM-PEG4K

Lượng thuốc 5-FU được nang hóa trong các dendrimer PAMAM-PEG4K

(PAMAM G2.0-PEG4K, PAMAM G3.0-PEG4K, PAMAM G4.0-PEG4K và

PAMAM G5.0-PEG4K) được tính toán dựa trên kết quả HPLC và phương trình

đường chuẩn Y = 33,101x + 27,857 (phụ lục 1).

Kết quả sắc ký đồ (HPLC) của 5-FU không được nang hóa trong các

dendrimer PAMAM G2.0-PEG4K, PAMAM G3.0-PEG4K, PAMAM G4.0-PEG4K

và PAMAM G5.0-PEG4K (hình 3.32), lượng thuốc 5-FU trong các chất mang sẽ

được tính như trong bảng 3.14.

Hình 3.32. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong các PAMAM G2.0-

PEG4K, PAMAM G3.0-PEG4K, PAMAM G4.0-PEG4K và PAMAM G5.0-

PEG4K

113

Bảng 3.14. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-PEG4K

Dendrimer PAMAM-PEG4K/5-FU (A= 33.101C + 27.857) (Inj Volume: 10 µL)

Tên mẫu

Area DL% EE% Polymer 5FU không được nang hóa (mg) 5FU được nang hóa (mg) Dendrimer PAMAM

PAMAM G2.0 172,02 13,07 6,93 6,48 34,65

PAMAM G3.0 141,65 10,31 9,69 8,83 48,45 PEG4K PAMAM G4.0 102,07 6,73 13,27 11,72 66,35

PAMAM G5.0 118,01 8,17 11,83 10,58 59,15

Với tỷ lệ thuốc 5-FU được nang hóa trong các PAMAM-PEG (EE%): 34,65%

(PAMAM G2.0-PEG4K), 48,45% (PAMAM G3.0-PEG4K), 66,35% (PAMAM

G4.0-PEG4K) và 59,15% (PAMAM G5.0-PEG4K) trong bảng 3.14, cho thấy các

dendrimer PAMAM-PEG4K là hệ chất nang hóa thuốc hiệu quả.

Sự thay đổi trong cấu trúc đặc biệt của dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0,

G5.0-PEG4K dẫn đến hiệu quả nang hóa thuốc khác nhau. Kết quả cho thấy cấu trúc

dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 và đặc tính liên hợp của chúng ảnh

hưởng đến hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của các dendrimer PAMAM-PEG4K.

Ảnh hưởng này khá rõ giữa các thế hệ chất mang PAMAM G2.0-PEG4K (36,65%)

< PAMAM G3.0-PEG4K (48,45%) < PAMAM G4.0-PEG4K (66,35%) > PAMAM

G5.0-PEG4K (59,15%). Điều này là do sự khác nhau về cấu trúc các thế hệ của

dendrimer PAMAM, cụ thể: theo thống kê trong bảng 2.3, khi các thế hệ dendrimer

PAMAM phát triển đều đặn (từ G2.0 đến G4.0) thì số nhóm bề mặt tăng đáng kể

(G2.0: 16 nhóm, G3.0: 32 nhóm, G4.0: 64 nhóm) và kích thước phân tử cũng tăng

theo (G2.0: 2,6 nm; G3.0: 3,6 nm; G4.0: 4,4 nm) dẫn đến làm tăng kích thước các

khoảng trống bên trong cấu trúc phân tử dendrimer PAMAM nên lượng thuốc 5-FU

tải được trong dendrimer PAMAM-PEG4K của thế hệ G2.0 < G3.0 < G4.0; Tuy

nhiên khi lên đến thế hệ G5.0 thì cấu trúc và kích thước khoảng trống của PAMAM

G5.0 bị thu hẹp lại tạo cấu trúc đặc khít do số nhóm bề mặt tăng đáng kể (lên đến 128

114

nhóm) trong khi PAMAM G4.0 thì chỉ có 64 nhóm, nhưng kích thước phân tử của

PAMAM G4.0 (4,4 nm) không chênh lệch nhiều so với PAMAM G5.0 (5,7 nm), dẫn

đến kết quả: khi biến tính dendrimer PAMAM các thế hệ khác nhau với cùng một

loại PEG4K thì PAMAM G4.0-PEG4K nang hóa thuốc hiệu quả hơn PAMAM G2.0-

PEG4K, PAMAM G3.0-PEG4K và PAMAM G5.0-PEG4K.

Hiệu quả nang hóa thuốc của các dendrimer PAMAM-PEG6K, PAMAM-

PEG10K, PAMAM-PEG12K cũng cho kết quả tương tự như PAMAM-PEG4K

b. Hiệu quả nang hóa thuốc của các dendrimer PAMAM-PEG6K

Tương tự như PAMAM-PEG4K, các dendrimer PAMAM-PEG6K (PAMAM

G2.0-PEG6K, PAMAM G3.0-PEG6K, PAMAM G4.0-PEG6K và PAMAM G5.0-

PEG6K ) cũng là những chất nang hóa thuốc hiệu quả, được thể hiện trong bảng

Hình 3.33. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0-PEG6K,

3.15 và hình 3.33.

PAMAM G3.0-PEG6K, PAMAM G4.0-PEG6K và PAMAM G5.0-PEG6K

115

Bảng 3.15. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-PEG6K

Dendrimer PAMAM-PEG6K/5-FU (A= 33.101C + 27.857) (Inj Volume: 10 µL)

Tên mẫu

Area DL% EE% Polymer 5FU không được nang hóa (mg) 5FU được nang hóa (mg) Dendrimer PAMAM

PAMAM G2.0 172,93 13,15 6,85 6,41 34,25

PAMAM G3.0 143,93 10,52 9,48 8,66 47,40 PEG6K PAMAM G4.0 107,52 7,22 12,78 11,33 63,90

PAMAM G5.0 121,29 8,47 11,53 10,34 57,65

Kết quả trong bảng 3.15, hình 3.33 cho thấy tỷ lệ thuốc 5-FU được tải trong

các PAMAM-PEG6K (EE%): PAMAM G2.0-PEG6K (34,25%) < PAMAM G3.0-

PEG6K (47,40%) < PAMAM G4.0-PEG6K (63,90%) > PAMAM G5.0-PEG6K

(57,65%).

c. Hiệu quả nang hóa thuốc của các dendrimer PAMAM-PEG10K

Các dendrimer PAMAM-PEG10K (PAMAM G2.0-PEG10K, PAMAM G3.0-

PEG10K, PAMAM G4.0-PEG10K và PAMAM G5.0-PEG10K) cũng là những chất

nang hóa thuốc hiệu quả, được thể hiện trong bảng 3.16, hình 3.34.

Hình 3.34. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0-

116

PEG10K, PAMAM G3.0-PEG10K, PAMAM G4.0-PEG10K và PAMAM G5.0-

PEG10K

Bảng 3.16. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-PEG10K

Dendrimer PAMAM-PEG10K/5-FU (A= 33.101C + 27.857) (Inj Volume: 10 µL)

Tên mẫu

Area DL% EE% Polymer 5FU không được nang hóa (mg) 5FU được nang hóa (mg) Dendrimer PAMAM

PAMAM G2.0 176,49 13,47 6,53 6,13 32,65

PAMAM G3.0 149,34 11,01 8,99 8,25 44,95 PEG10K PAMAM G4.0 115,59 7,95 12,05 10,75 60,25

PAMAM G5.0 131,17 9,36 10,64 10,34 53,20

Lượng thuốc 5-FU được nang hóa trong các dendrimer PAMAM-PEG10K

như sau: PAMAM G2.0-PEG10K (32,65%) < PAMAM G3.0-PEG10K (44,95%) <

PAMAM G5.0-PEG10K (53,20%) < PAMAM G4.0-PEG10K (60,25%). Trong đó

PAMAM G4.0-PEG10K nang hóa thuốc hiệu quả nhất, điều này phù hợp với kích

thước và khoảng trống bên trong cấu trúc dendrimer PAMAM các thế hệ.

d. Hiệu quả nang hóa thuốc của các dendrimer PAMAM-PEG12K

Tương tự như các PAMAM-PEG khác, PAMAM-PEG12K (PAMAM G2.0-

PEG10K, PAMAM G3.0-PEG10K, PAMAM G4.0-PEG10K và PAMAM G5.0-

PEG10K) là những chất nang hóa thuốc hiệu quả, được thể hiện trong bảng 3.17,

hình 3.35.

117

Hình 3.35. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0-

PEG12K, PAMAM G3.0-PEG12K, PAMAM G4.0-PEG12K và

PAMAM G5.0-PEG12K

Bảng 3.17. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-PEG12K

Dendrimer PAMAM-PEG12K/5-FU (A= 33.101C + 27.857) (Inj Volume: 10 µL)

Tên mẫu

Area DL% EE% Polymer 5FU không được nang hóa (mg) 5FU được nang hóa (mg) Dendrimer PAMAM

PEG12K

PAMAM G2.0 180,03 PAMAM G3.0 151,67 PAMAM G4.0 120,63 PAMAM G5.0 139,89 13,79 11,22 8,41 10,15 6,21 8,78 11,59 9,85 31,05 5,85 43,90 8,07 10,39 57,95 49,25 8,97

Kết quả cũng đã chỉ ra sự ảnh hưởng trong cấu trúc dendrimer PAMAM G2.0,

G3.0, G4.0 và G5.0 đến khả năng nang hóa thuốc 5-FU, lượng thuốc 5-FU được

nang hóa trong các dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0-PEG12K như sau:

PAMAM G2.0-PEG12K/5-FU (31,05%) < PAMAM G3.0-PEG12K/5-FU (43,90%)

< PAMAM G5.0-PEG12K/5-FU (49,25%) < PAMAM G4.0-PEG12K/5-FU

(57,95%).

118

3.6.4. Nang hóa thuốc 5-FU trong các chất mang dendrimer PAMAM-Pluronic

Hiệu quả nang hóa thuốc của các dendrimer PAMAM-Pluronic được xác định

tương tự như các PAMAM, kết quả HPLC được sử dụng nhằm xác định gián tiếp

lượng thuốc 5-FU được nang hóa trong các dendrimer PAMAM-Pluronic

(PAMAM-P123, PAMAM-F68, PAMAM-F127 và PAMAM-F108). Lượng 5-FU

tự do, không được nang hóa trong PAMAM- Pluronic được tính toán trực tiếp trên

phương trình đường chuẩn Y = 33,101x + 27,857 (Phụ lục 1).

a. Hiệu quả nang hóa thuốc của các dendrimer PAMAM-P123

Lượng thuốc 5-FU được nang hóa trong các dendrimer PAMAM-P123

(PAMAM G2.0-P123, PAMAM G3.0-P123, PAMAM G4.0-P123 và PAMAM

G5.0-P123) được tính toán dựa trên kết quả HPLC và phương trình đường chuẩn Y

= 33,101x + 27,857 (phụ lục 1).

Kết quả sắc ký đồ (HPLC) của 5-FU không được nang hóa trong các

dendrimer PAMAM G2.0-P123, PAMAM G3.0-P123, PAMAM G4.0-P123 và

PAMAM G5.0-P123 (hình 3.36), lượng thuốc 5-FU trong các chất mang sẽ được

Hình 3.36. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0-P123,

tính như trong bảng 3.18.

PAMAM G3.0-P123, PAMAM G4.0-P123 và PAMAM G5.0-P123

119

Bảng 3.18. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-P123

Dendrimer PAMAM-P123/5-FU (A= 33.101C + 27.857) (Inj Volume: 10 µL)

Tên mẫu

Area DL% EE% Polymer 5FU không được nang hóa (mg) 5FU được nang hóa (mg) Dendrimer PAMAM

PAMAM G2.0 151,01 11,16 8,84 8,12 44,20

PAMAM G3.0 115,47 7,94 12,06 10,76 60,30

Pluronic P123 PAMAM G4.0 80,29 4,75 15,25 13,23 76,25

PAMAM G5.0 95,01 6,09 13,91 12,21 69,55

Với tỷ lệ thuốc 5-FU được nang hóa trong các PAMAM-P123 (EE%): 44,20%

(PAMAM G2.0-P123), 60,30% (PAMAM G3.0-P123), 76,25% (PAMAM G4.0-

P123) và 69,55% (PAMAM G5.0-P123) trong bảng 3.18, cho thấy các dendrimer

PAMAM-P123 là hệ chất nang hóa thuốc hiệu quả.

Sự thay đổi trong cấu trúc đặc biệt của dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0,

G5.0-P123 dẫn đến hiệu quả nang hóa thuốc khác nhau. Kết quả cho thấy cấu trúc

dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 và đặc tính liên hợp của chúng ảnh

hưởng đến hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của các dendrimer PAMAM-P123 Ảnh

hưởng này khá rõ giữa các thế hệ chất mang PAMAM G2.0-P123 (44,20%) <

PAMAM G3.0-P123 (60,30%) < PAMAM G5.0-P123 (69,55%) < PAMAM G4.0-

P123 (76,25%). Điều này là do sự khác nhau về cấu trúc các thế hệ của dendrimer

PAMAM, cụ thể: theo thống kê trong bảng 2.3, khi các thế hệ dendrimer PAMAM

phát triển đều đặn (từ G2.0 đến G4.0) thì số nhóm bề mặt tăng đáng kể (G2.0: 16

nhóm, G3.0: 32 nhóm, G4.0: 64 nhóm) và kích thước phân tử cũng tăng theo (G2.0:

2,6 nm; G3.0: 3,6 nm; G4.0: 4,4 nm) dẫn đến làm tăng kích thước các khoảng trống

bên trong cấu trúc phân tử dendrimer PAMAM nên lượng thuốc 5-FU tải được

trong dendrimer PAMAM-P123 của thế hệ G2.0 < G3.0 < G4.0; Tuy nhiên khi lên

đến thế hệ G5.0 thì cấu trúc và kích thước khoảng trống của PAMAM G5.0 bị thu hẹp

lại tạo cấu trúc đặc khít do số nhóm bề mặt tăng đáng kể (lên đến 128 nhóm) trong khi

120

PAMAM G4.0 thì chỉ có 64 nhóm, nhưng kích thước phân tử của PAMAM G4.0 (4,4

nm) không chênh lệch nhiều so với PAMAM G5.0 (5,7 nm), dẫn đến kết quả: khi biến

tính dendrimer PAMAM các thế hệ khác nhau với cùng một loại Pluronic P123 thì

PAMAM G4.0-P123 nang hóa thuốc hiệu quả hơn PAMAM G2.0-P123, PAMAM

G3.0-P123 và PAMAM G5.0-P123.

Hiệu quả nang hóa thuốc của các dendrimer PAMAM-F68, PAMAM-F127,

PAMAM-F108 cũng cho kết quả tương tự như PAMAM-P123

b. Hiệu quả nang hóa thuốc của các dendrimer PAMAM-F68

Tương tự như PAMAM-P123, các dendrimer PAMAM-F68 (PAMAM G2.0-

F68, PAMAM G3.0-F68, PAMAM G4.0-F68 và PAMAM G5.0-F68) cũng là

những chất nang hóa thuốc hiệu quả, được thể hiện trong bảng 3.19, hình 3.37.

Hình 3.37. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0-F68,

PAMAM G3.0-F68, PAMAM G4.0-F68 và PAMAM G5.0-F68

121

Bảng 3.19. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-F68

Dendrimer PAMAM-F68/5-FU (A= 33.101C + 27.857) (Inj Volume: 10 µL)

Tên mẫu

Area DL% EE% Polymer 5FU không được nang hóa (mg) 5FU được nang hóa (mg) Dendrimer PAMAM

PAMAM G2.0 164,53 12,39 7,61 7,07 38,05

PAMAM G3.0 137,74 9,96 10,04 9,12 50,20

Pluronic F68 PAMAM G4.0 101,94 6,71 13,29 11,73 66,45

PAMAM G5.0 115,54 7,95 12,05 10,75 60,25

Kết quả trong hình 3.37 và bảng 3.19 cho thấy tỷ lệ thuốc 5-FU được nang hóa

trong các PAMAM-F68 (EE%): PAMAM G2.0-F68 (38,05%) < PAMAM G3.0-

F68 (50,20%) < PAMAM G5.0-F68 (60,25%) PAMAM G4.0-F68 (66,45%). Trong

đó PAMAM G4.0-F68 (66,45%) nang hóa thuốc hiệu quả nhất, điều này phù hợp

với kích thước và khoảng trống bên trong cấu trúc dendrimer PAMAM các thế hệ.

c. Hiệu quả nang hóa thuốc của các dendrimer PAMAM-F127

Các dendrimer PAMAM-F127 (PAMAM G2.0-F127, PAMAM G3.0-F127,

PAMAM G4.0-F127 và PAMAM G5.0-F127) cũng là những chất nang hóa thuốc

hiệu quả, được thể hiện trong hình 3.38 và bảng 3.20.

122

Hình 3.38. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0-F127,

PAMAM G3.0-F127, PAMAM G4.0-F127 và PAMAM G5.0-F127

Bảng 3.20. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-F127

Dendrimer PAMAM-F127/5-FU (A= 33.101C + 27.857)

(Inj Volume: 10 µL)

Tên mẫu

5FU được nang hóa Area DL% EE% Polymer 5FU không được nang hóa (mg) (mg) Dendrimer PAMAM

PAMAM G2.0 155,93 11,61 8,39 7,74 41,95

PAMAM G3.0 126,16 11,09 9,98 55,45 8,91

Pluronic F127 PAMAM G4.0 91,13 14,27 12,49 71,35 5,73

PAMAM G5.0 101,14 13,36 11,79 66,80 6,64

Lượng thuốc 5-FU được nang hóa trong các dendrimer PAMAM-F127 như

sau: PAMAM G2.0-F127 (41,95%) < PAMAM G3.0-F127 (55,45%) < PAMAM

G5.0-F127 (66,80%) < PAMAM G4.0-F127 (71,35%). Trong đó PAMAM G4.0-

F127 (71,35%) nang hóa thuốc hiệu quả nhất, điều này phù hợp với kích thước và

khoảng trống bên trong cấu trúc dendrimer PAMAM các thế hệ.

d. Hiệu quả nang hóa thuốc của các dendrimer PAMAM-F108

Tương tự như các PAMAM-Pluronic khác, PAMAM-F108 (PAMAM G2.0-

F108, PAMAM G3.0-F108, PAMAM G4.0-F108 và PAMAM G5.0-F108) là những

chất nang hóa thuốc hiệu quả, được thể hiện trong hình 3.39 và bảng 3.21.

123

Hình 3.39. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0-F108,

PAMAM G3.0-F108, PAMAM G4.0-F108 và PAMAM G5.0-F108

Bảng 3.21. Thống kê độ nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-F108

Dendrimer PAMAM-F108/5-FU (A= 33.101C + 27.857) (Inj Volume: 10 µL)

Tên mẫu

Area DL% EE% Polymer 5FU không được nang hóa (mg) 5FU được nang hóa (mg) Dendrimer PAMAM

PAMAM G2.0 160,8 12,05 7,95 7,36 39,75

PAMAM G3.0 132,93 9,52 10,48 9,49 52,40

Pluronic F108 PAMAM G4.0 96,03 6,18 13,82 12,14 69,10

PAMAM G5.0 107,58 7,23 12,77 11,32 63,85

Kết quả nang hóa thuốc 5-FU trong các dendrimer PAMAM-F108 (hình 3.39

và bảng 3.21) cũng tương tự như các PAMAM-Pluronic/5FU khác, cụ thể lượng

thuốc 5-FU được nang hóa trong các dendrimer PAMAM-F108 như sau: PAMAM

G2.0-F108 (39,75%) < PAMAM G3.0-F108 (52,40%) < PAMAM G5.0-F108

124

(63,85%) < PAMAM G4.0-F108 (69,10%), điều này phù hợp với kích thước và các

khoảng trống bên trong cấu trúc dendrimer PAMAM các thế hệ.

3.6.5. So sánh hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của các chất mang nano

dendrimer PAMAM-PEG

Các dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0 và G5.0 sau khi được biến tính bởi

các PEG có khối lượng phân tử khác nhau (PEG4K, PEG6K, PEG10K, PEG12K)

được sử dụng để nang hóa thuốc kỵ nước 5-FU. Tuy nhiên, với sự sự ảnh hưởng cấu

trúc của các thế hệ dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 và các loại PEG có

mạch phân tử dài ngắn khác nhau đã tác động lên hiệu quả nang hóa thuốc.

Hiệu quả nang hóa thuốc 16 loại chất mang nano của dendrimer PAMAM các

thế hệ G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 với 4 loại PEG (PEG4K, PEG6K, PEG10K và

PEG12K) được thể hiện trên đồ thị 3.3.

Đồ thị 3.3. Hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của các PAMAM-PEG

Cấu trúc dendrimer PAMAM các thế hệ G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 và đặc tính liên

hợp của chúng ảnh hưởng đến hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của các dendrimer

PAMAM-PEG (đồ thị 3.3). Ảnh hưởng này khá rõ giữa các thế hệ dendrimer

125

PAMAM, điển hình: PAMAM G2.0-PEG4K (36,65%) < PAMAM G3.0-PEG4K

(48,45%) < PAMAM G5.0-PEG4K (59,15%) < PAMAM G4.0-PEG4K (66,35%);

PAMAM G2.0-PEG10K (32,65%) < PAMAM G3.0-PEG10K (44,95%) < PAMAM

G5.0-PEG10K (53,20%) < PAMAM G4.0-PEG10K (60,25%); ... Trong đó, các

PAMAM G4.0-PEG có hiệu quả nang hóa thuốc cao nhất PAMAM G4.0-PEG4K

(66,35%), PAMAM G4.0-PEG6K (63,90%), PAMAM G4.0-PEG10K (60,25%) và

PAMAM G4.0-PEG12K (57,95%). Tuy nhiên, trong cùng một thế hệ dendrimer

PAMAM G2.0 (hay G3.0, G4.0, G5.0) thì sự chênh lệch về hiệu quả nang hóa thuốc

không cao: PAMAM G2.0-PEG4K (34,65%), PAMAM G2.0-PEG6K (34,25%),

PAMAM G2.0-PEG10K (32,65%), PAMAM G2.0-PEG12K (31,05%); G4.0-

PEG4K (66,35%), PAMAM G4.0-PEG6K (63,90%), PAMAM G4.0-PEG10K

(60,25%) và PAMAM G4.0-PEG12K (57,95%). Điều này có thể nhìn thấy trong sự

khác nhau về cấu trúc của các chất, khi các thế hệ dendrimer PAMAM phát triển đều

đặn (từ G2.0 đến G4.0) thì số nhóm bề mặt tăng đáng kể (G2.0: 16 nhóm, G3.0: 32

nhóm, G4.0: 64 nhóm) và kích thước phân tử cũng tăng theo (G2.0: 2,6 nm; G3.0:

3,6 nm; G4.0: 4,4 nm) dẫn đến làm tăng kích thước các khoảng trống bên trong cấu

trúc phân tử dendrimer PAMAM nên lượng thuốc 5-FU tải được trong dendrimer

PAMAM-PEG của thế hệ G2.0 < G3.0 < G4.0; Tuy nhiên khi lên đến thế hệ G5.0

thì cấu trúc và kích thước khoảng trống của PAMAM G5.0 bị thu hẹp lại tạo cấu trúc

đặc khít do số nhóm bề mặt tăng đáng kể (lên đến 128 nhóm) trong khi PAMAM G4.0

thì chỉ có 64 nhóm, nhưng kích thước phân tử của PAMAM G4.0 (4,4 nm) không

chênh lệch nhiều so với PAMAM G5.0 (5,7 nm). Mặt khác, trong cùng một thế hệ

dendrimer PAMAM khi liên hợp với các PEG có khối lượng phân tử khác nhau thì

hiệu quả nang hóa thuốc của chúng cũng khác nhau. Số nhóm EO trong phân tử các

PEG: PEG4K (90), PEG6K (150), PEG10K (220) và PEG12K (240) nên chiều dài

mạch cấu trúc cũng khác nhau (bảng 1.1), các PEG có khối lượng phân tử càng lớn

thì cấu trúc mạch phân tử càng dài, càng cồng kềnh gây cản trở không gian làm các

thuốc 5-FU khó vào các khoảng trống bên trong cấu trúc dendrimer PAMAM nên

hiệu quả nang hóa thuốc giảm theo sự tăng chiều dài mạch carbon trong phân tử

126

PEG (hiệu quả nang hóa thuốc: PAMAM-PEG4K > PAMAM-PEG6K > PAMAM-

PEG10K > PAMAM-PEG12K).

3.6.6. So sánh hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của các chất mang nano

dendrimer PAMAM-Pluronic

Thống kê kết quả HPLC thu được trên đồ thị 3.4 về hiệu quả nang hóa thuốc

của các chất mang nano PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 sau khi được biến tính

với 4 loại Pluronic có khối lượng phân tử khác nhau Pluronic P123 (5800 Da),

Pluronic F68 (8400 Da), Pluronic F127 (12600 Da) và Pluronic F108 (14600 Da).

Đồ thị 3.4. Hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-Pluronic

Theo thống kê hiệu quả nang hóa thuốc của các chất mang nano PAMAM-

Pluronic trên đồ thị 3.4 cho thấy hàm lượng 5-FU được nang hóa trong PAMAM

G4.0-Pluronic cao nhất, cao hơn PAMAM G2.0-Pluronic, G3.0-Pluronic, G5.0-

Pluronic, điều này có thể thấy rõ trong cấu trúc của các thế hệ PAMAM và mức độ

biến tính của chúng với Pluronic (tương tự các PAMAM-PEG).

127

Tuy nhiên, hiệu quả nang hóa thuốc của các PAMAM-Pluronic còn ảnh hưởng

bởi hai yếu tố là khối lượng phân tử (hay mức độ liên hợp) và giá trị HLB khác nhau

của các Pluronic. Khối lượng phân tử của Pluronic: Pluronic P123 (5800 Da) <

Pluronic F68 (8400 Da) < Pluronic F127 (12600 Da) < Pluronic F108 (16400 Da)

tương ứng với mức độ liên hợp PAMAM-Pluronic: PAMAM G4.0-P123 (50,00%) >

PAMAM G4.0-F68 (48,44%) > PAMAM G4.0-F127 (42,19%) > PAMAM G4.0-

F108 (39,06%); trong khi đó, giá trị HLB (bảng 1.2): Pluronic P123 (HLB = 8) <

Pluronic F127 (HLB = 22) < Pluronic F108 (HLB = 27) < Pluronic F68 (HLB = 29).

Kết quả cho thấy, trong cùng một thế hệ hiệu quả mang thuốc kỵ nước 5-FU

chênh lệch điển hình như sau: PAMAM G4.0-P123 (76,25%) > PAMAM G4.0-

F127 (71,35%) > PAMAM G4.0-F108 (69,10%) > PAMAM G4.0-F68 (66,45%).

Điều này là do các Pluronic có khối lượng phân tử càng lớn thì cấu trúc mạch phân tử

càng dài, càng cồng kềnh gây cản trở không gian làm ảnh hưởng đến khả năng liên

hợp, do đó hiệu quả nang hóa thuốc của các PAMAM-Pluronic cũng ảnh hưởng theo.

Nhưng đối với Pluronic F68, khối lượng phân tử Pluronic F68 (8400 Da) >

Pluronic P123 (5800 Da) và độ liên hợp chênh lệch không cao (PAMAM G4.0-P123

50,00% > PAMAM G4.0-F68 48,44%), trong khi đó giá trị HLB Pluronic P123

(HLB = 8) nhỏ hơn rất nhiều so với Pluronic F68 (HLB = 29) dẫn đến hiệu quả nang

hóa thuốc 5-FU chênh lệch đáng kể (PAMAM G4.0-P123: 76,25% > PAMAM

G4.0-F68: 66,45%); Ngoài ra, mức độ liên hợp của PAMAM G4.0-F68 (48,44%) >

PAMAM G4.0-F127 (42,19%) > PAMAM G4.0-F108 (39,06%) tương ứng với

khối lượng phân tử Pluronic F68 (8400 Da) < Pluronic F127 (12600 Da) < Pluronic

F108 (16400 Da), nhưng hiệu quả nang hóa thuốc 5-FU của PAMAM-F68 thấp nhất

(PAMAM G4.0-F127 > PAMAM G4.0-F108 > PAMAM G4.0-F68) tương ứng với

giá trị HLB Pluronic F127 (HLB = 22) < Pluronic F108 (HLB = 27) < Pluronic F68

(HLB = 29). Điều này cho thấy rằng sự chênh lệch về hiệu quả nang hóa thuốc của

các PAMAM G4.0-F127, PAMAM G4.0-F108, PAMAM G4.0-F68 không cao và

có thể là do khả năng nang hóa thuốc của các hệ chất này vừa chịu sự ảnh hưởng của

mức độ liên hợp (PAMAM G4.0-F68 > PAMAM G4.0-F127 > PAMAM G4.0-

128

F108) và lại còn chịu sự ảnh hưởng bởi giá trị HLB (Pluronic F127 < Pluronic F108

< Pluronic F68), trong đó giá trị HLB gây ảnh hưởng lớn hơn độ liên hợp nên dẫn

đến hiệu quả nang hóa thuốc của các hệ chất mang này chênh lệch không cao và theo

khuynh hướng giá trị HLB càng lớn thì hiệu quả nang hóa thuốc kỵ nước giảm.

Các PAMAM G2.0-Pluronic, PAMAM G3.0-Pluronic và PAMAM G5.0-

Pluronic cũng cho kết quả tương tự PAMAM G4.0-Pluronic. Điều này cho thấy,

trong cùng một thế hệ thì các PAMAM-P123 nang hóa thuốc kỵ nước 5-FU cao nhất,

hiệu quả nang hóa thuốc kỵ nước 5-FU: PAMAM-P123 > PAMAM-F127 >

PAMAM-F108 > PAMAM-F68.

Mặt khác, trong cấu trúc phân tử các Pluronic ngoài nhóm EO (ưa nước) còn

có nhóm PO (kỵ nước), nhưng các phân tử PEG chỉ gồm các nhóm EO ưa nước nên

nhìn chung theo đồ thị 3.3 và 3.4 cho thấy các PAMAM-Pluronic nang hóa thuốc kỵ

nước 5-FU tốt hơn các PAMAM-PEG. Và cũng chính vì sự khác nhau trong cấu trúc

phân tử các Pluronic và PEG, theo kết quả trong bảng 3.13 về hiệu quả nang hóa

thuốc của PEG và Pluronic thì các phân tử PEG hầu như không có khả năng nang hóa

thuốc kỵ nước; còn các phân tử Pluronic thì có khả năng nang hóa thuốc kỵ nước

(100 mg Pluronic F127 chứa 47,8.1017 phân tử Pluronic: nang hóa được 3,75 mg 5-

FU, với tỷ lệ EE%: 18,75%) điều này có nghĩa là bản thân mỗi phân tử Pluronic có

khả năng nang hóa thuốc kỵ nước nhờ vào cấu trúc của chúng, nhưng lượng thuốc 5-

FU nang hóa được trong mỗi phân tử Pluronic là không cao. Qua đó, chúng ta có thể

thấy rằng khi biến tính dendrimer PAMAM bằng các PEG hay Pluronic thì làm tăng

hiệu quả nang hóa thuốc đáng kể nhờ vào khả năng che chắn của các phân tử PEG và

Pluronic (có mạch phân tử dài), tuy nhiên mạch phân tử của PEG hay Pluronic quá

dài thì cũng làm cản trở khả năng nang hóa thuốc của các dendrimer PAMAM sau

khi biến tính.

129

3.7. KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH TỐC ĐỘ GIẢI PHÓNG THUỐC 5-FU CỦA

PAMAM G4.0-PEG/5-FU VÀ 5-FU IN VITRO TRONG MÔI TRƯỜNG ĐỆM

PBS (pH=7.4)

Một ưu điểm khác về chất mang nano PAMAM-PEG đó là tốc độ giải phóng

thuốc chậm, có sự kiểm soát hơn so với 5-FU (mẫu đối chứng). Tốc độ giải phóng

thuốc (thực hiện 3 lần) được thấy rõ trong đồ thị 3.5. và phụ lục 11, phụ lục 12.

Đồ thị 3.5. Kết quả giải phóng thuốc 5-FU của PAMAM G4.0-PEG6K (Xanh) và 5-

FU đối chứng (Đỏ)

Kết quả trên đồ thị 3.5 đã chỉ rõ và tốc độ giải phóng thuốc 5-FU (mẫu đối

chứng) nhanh hơn rất nhiều so với PAMAM G4.0-PEG6K/5-FU. PAMAM G4.0-

PEG6K/5-FU trong 96 giờ chỉ giải phóng được 22,27%.

3.8. KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH TỐC ĐỘ GIẢI PHÓNG THUỐC 5-FU CỦA

PAMAM G4.0-PLURONIC/5-FU VÀ 5-FU IN VITRO TRONG MÔI

TRƯỜNG ĐỆM PBS (pH=7.4)

Cũng như PAMAM-PEG, PAMAM-Pluronic cũng có tốc độ giải phóng thuốc

chậm, có sự kiểm soát hơn so với 5-FU (mẫu đối chứng). Tốc độ giải phóng thuốc

(thực hiện 3 lần) được thấy rõ trong đồ thị 3.6 và phụ lục 13 và phụ lục 14.

130

Đồ thị 3.6. Kết quả giải phóng thuốc 5-FU của PAMAM G4.0-P123 (Xanh nhạt),

PAMAM G4.0-F127 (Xanh đậm) và 5-FU đối chứng (Đỏ)

Kết quả trong đồ thị 3.6 đã chỉ rõ về tốc độ giải phóng thuốc 5-FU (mẫu đối

chứng) nhanh hơn rất nhiều so với PAMAM G4.0-P123/5-FU và PAMAM G4.0-

F127/5-FU. PAMAM G4.0-P123/5-FU và PAMAM G4.0-F127/5-FU giải phóng

chậm, trong 96 giờ chỉ giải phóng được 22,03% (PAMAM G4.0-P123/5-FU ) và

giải phóng được 22,12% (PAMAM G4.0-F127/5-FU).

3.9. KẾT QUẢ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA HỆ CHẤT MANG NANO DẪN

TRUYỀN 5-FU

Tính tương hợp sinh học của hệ chất mang nano được đánh giá trên cơ sở thử

nghiệm hoạt tính gây độc lên tế bào ung thư vú MCF-7 và dòng nguyên bào sợi

(Fibroblast).

3.9.1. Kết quả gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ chất mang nano dẫn

truyền 5-FU

Đồng nghĩa với mức độ biến tính, hiệu quả nang hóa thuốc của các chất mang

nano thì kết quả gây độc tế bào ung thư của dendrimer PAMAM chưa biến tính

(PAMAM G4.0), dendrimer PAMAM đã biến tính không nang hóa 5-FU (PAMAM

G4.0-PEG và PAMAM G4.0-Pluronic), dendrimer PAMAM đã biến tính bằng PEG

131

nang hóa 5-FU (PAMAM G4.0-PEG6K/5-FU), dendrimer PAMAM đã biến tính

bằng Pluronic nang hóa 5-FU (PAMAM G4.0-F127/5-FU) và 5-FU (đối chứng)

cũng có khả năng gây độc tế bào khác nhau.

Kết quả gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ chất mang nano được thực

hiện bằng phương pháp nhuộm SRB. Kết quả sau 48 giờ chỉ ra trong bảng 3.22 cho

thấy tại nồng độ 100 μg/ml: PAMAM G4.0 ức chế 35,49 ± 3.93% tăng trưởng tế

bào, PAMAM G4.0 sau khi biến tính bằng các PEG có khả năng ức chế tăng trưởng

tế bào từ -12,75% đến -1,10% và các PAMAM G4.0-Pluronic cho kết quả từ -

1,27% đến 4,2 % tế bào bị ức chế.

Bảng 3.22. Kết quả gây độc tế bào MCF-7 theo phương pháp nhuộm SRB

Nồng độ Hoạt động kháng sinh Mẫu (μg/ ml) (Tăng trưởng tế bào %)

PAMAM G4.0 100 Inhibited 35,49 ± 3.93%

G4.0-PEG4K 100 Inhibited -1,10 ± 4,32%

G4.0-PEG6K 100 Inhibited -2,00 ± 2,05%

G4.0-PEG10K 100 Inhibited -4,09 ± 8,13%

G4.0-PEG12K 100 Inhibited -12,75 ± 3,54%

G4.0-P123 100 Inhibited -1,27 ± 4,55%

G4.0-F68 100 Inhibited 2,41 ± 2,99%

G4.0-F127 100 Inhibited 4,20 ± 4,15%

G4.0-F108 100 Inhibited 1,54 ± 3,97%

Các kết quả trên chỉ ra rằng PAMAM khi chưa biến tính (PAMAM G4.0) gây

độc tế bào, các PAMAM sau khi biến tính bằng PEG hay Pluronic (PAMAM G4.0-

PEG và PAMAM G4.0-Pluronic) làm giảm đáng kể khả năng gây độc tế bào của

PAMAM.

132

Ngoài ra, các PAMAM sau khi biến tính bằng PEG hay Pluronic được nang

hóa thuốc 5-FU (PAMAM G4.0-PEG6K/5-FU, PAMAM G4.0-P123/5-FU và

PAMAM G4.0-F127/5-FU) có khả năng gây độc tế bào mạnh với nồng độ gây độc

tế bào IC50: 4,32 μg/ml (PAMAM G4.0-PEG6K/5-FU); 3,77 μg/ml (PAMAM

G4.0-P123/5-FU) và 3,98 μg/ml (PAMAM G4.0-F127/5-FU) cao gấp 2-3 lần so với

5-FU đối chứng (1,625 μg/ml).

Đồ thị 3.7. Kết quả gây độc tế bào IC50 của các chất mang nano theo phương pháp

nhuộm SRB

Các giá trị chỉ ra trên đồ thị 3.7 cho thấy rằng thuốc 5-FU được nang hóa trong

PAMAM G4.0-PEG6K/5-FU, G4.0-P123/5-FU và G4.0-F127/5-FU có độ độc giảm

2-3 lần so với 5-FU đối chứng.

3.9.2. Kết quả gây độc nguyên bào sợi (Fibroblast) của hệ chất mang nano dẫn

truyền 5-FU

a. Kết quả theo phương pháp nhuộm MTT

Kết quả gây độc nguyên bào sợi (Fibroblast) bằng phương pháp nhuộm MTT

được thể hiện trên đồ thị 3.8.

133

Đồ thị 3.8. Kết quả gây độc nguyên bào sợi theo phương pháp nhuộm MTT

Kết quả trên đồ thị 3.8 cho thấy rằng PAMAM G4.0 sau khi biến tính bằng

PEG hay Pluronic (PAMAM G4.0-PEG6K, G4.0-P123, G4.0-F68) cũng đều không

tạo ra sự khác biệt nhiều lên nguyên bào sợi sau 24 giờ và 48 giờ cấy so với mẫu

control (đối chứng). Cả ba mẫu này đều hỗ trợ tế bào phát triển (cụ thể là lượng tế

bào tăng sau 48 giờ. Ngược lại, PAMAM G4.0 thì có sự khác biệt rất rõ ràng so với

mẫu đối chứng, PAMAM G4.0 có khả năng gây độc cao, lượng tế bào sống chỉ

bằng 1/3 mẫu control.

b. Kết quả theo phương pháp nhuộm huỳnh quang FDA/EB

Kết quả gây độc nguyên bào sợi (Fibroblast) của hệ chất mang nano (PAMAM

G4.0, G4.0-PEG6K, G4.0-P123 và G4.0-F68) cũng được khẳng định thêm bằng

phương pháp nhuộm huỳnh quang FDA/EB được thể hiện trên hình 3.40.

(a) (b)

134

(d) (c)

(f) (e)

(h) (g)

(m) (l)

Hình 3.40. Kết quả gây độc nguyên bào sợi theo phương pháp nhuộm huỳnh quang

FDA/EB

Kết quả trên hình 3.40 đánh giá về khả năng tăng trưởng nguyên bào sợi cũng

cho thấy đời sống, phát triển và cái chết của tế bào sau 24 giờ và 48 giờ. Trong đó,

hình nhuộm FDA (màu xanh lá) đặc trưng tế bào sống và hình nhuộm EB (màu đỏ)

đặc trưng tế bào chết. Mẫu đối chứng (control) có thể hiện rõ sự phát triển của tế

bào theo thời gian với lượng tế bào tăng lên rõ rệt so với mẫu 24 giờ (hình 3.40.a).

Ngoài ra, hình thái của tế bào cũng thay đổi ở 48 giờ (hình 3.40.b), hầu hết các tế

bào của mẫu đối chứng đều có dạng hình thoi là trạng thái tốt nhất của nguyên bào

135

sợi. Điều này chứng tỏ tế bào sống và phát triển ổn định trong môi trường nuôi cấy.

So với mẫu đối chứng, ba mẫu G4.0-PEG6K (hình 3.40.e-f), G4.0-P123 (hình

3.40.g-h) và G4.0-F68 (hình 3.40.l-m) vẫn thể hiện sự tăng trưởng mạnh về số

lượng tế bào, với tỷ lệ tế bào chết và hình thái tương đương. Điều này chứng tỏ sau

48 giờ, các mẫu này không gây độc lên nguyên bào sợi, đồng thời kích thích sự phát

triển và phân chia của tế bào. Mẫu PAMAM G4.0 ở 48 giờ (hình 3.40.d), không có

tế bào sống và lượng tế bào chết gần như tương đương, không có sự khác biệt rõ rệt

với mẫu ở 24 giờ (hình 3.40.c).

Từ kết quả thử hoạt tính gây độc của các hệ chất mang nano lên tế bào ung thư

MCF-7 (bảng 3.22, đồ thị 3.7) và nguyên bào sợi (đồ thị 3.8, hình 3.40) cho thấy

rằng PAMAM khi chưa biến tính (PAMAM G4.0) gây độc tế bào, các PAMAM sau

khi biến tính bằng PEG hay Pluronic (G4.0-PEG, G4.0-Pluronic) không gây độc tế

bào (có tính tương hợp sinh học).

136

KẾT LUẬN

Từ những kết quả nghiên cứu hoàn thành nội dung luận án, đã rút ra những kết

luận sau:

(1) Đã tổng hợp thành công dendrimer PAMAM đến thế hệ G5.0. Sản

phẩm dendrimer PAMAM các thế hệ từ G-0.5 đến G5.0 được xác định cấu trúc

bằng phương pháp MS và 1H-NMR và công thức tính toán trên cơ sở dữ liệu của

phổ 1H NMR.

(2) Đã biến tính thành công dendrimer PAMAM thế hệ G2.0, G3.0, G4.0

và G5.0 với polymer tương hợp sinh học PEG có chiều dài mạch khác nhau

(PEG4K, PEG6K, PEG10K và PEG12K). Khối lượng phân tử của sản phẩm

dendrimer PAMAM-PEG và số lượng nhánh polymer PEG gắn trên PAMAM được

xác định và tính toán bằng 1H-NMR và GPC.

(3) Đã biến tính thành công dendrimer PAMAM thế hệ G2.0, G3.0, G4.0

và G5.0 với polymer tương hợp sinh học Pluronic có cấu trúc mạch khác nhau

(P123, F68, F108 và F127). Khối lượng phân tử của các sản phẩm dendrimer

PAMAM-Pluronic và số lượng nhánh polymer Pluronic gắn trên PAMAM được xác

định và tính toán bằng 1H-NMR và GPC.

(4) Trong dendrimer PAMAM các thế hệ G2.0, G3.0, G4.0 và G5.0 thì

PAMAM G4.0 biến tính tốt nhất (có số lượng nhánh polymer gắn lên PAMAM

nhiều nhất) cả khi biến tính với các PEG hay các Pluronic. Ngoài ra, mạch của

polymer (cả PEG lẫn Pluronic) càng dài thì càng khó biến tính (số lượng nhánh

polymer gắn lên PAMAM đều giảm).

(5) Dendrimer PAMAM với các nhóm amine trên bề mặt có khả năng gây

độc tế bào, tuy nhiên tất cả các sản phẩm biến tính PAMAM-PEG và PAMAM-

Pluronic đều không gây độc tế bào (tế bào bệnh và tế bào lành), trong đó PAMAM-

PEG có tính tương hợp sinh học tốt hơn PAMAM-Pluronic.

(6) PEG không có khả năng nang hóa thuốc 5-FU (chỉ nang hóa 0,15%),

Pluronic nang hóa rất ít (18,75%), còn dendrimer các thế hệ G2.0, G3.0, G4.0 và

137

G5.0 nang hóa được từ 21,90% đến 42,35%, trong đó PAMAM thế hệ G4.0 nang

hóa được nhiều nhất. Tuy nhiên, hệ chất mang PAMAM-PEG nang hóa được nhiều

thuốc 5-FU hơn hẳn (từ 31,05% đến 66,35%) trong đó PAMAM-PEG thế hệ G4.0

nang hóa được nhiều hơn cả, còn PAMAM-Pluronic thì nang hóa được nhiều hơn

nữa (từ 38,05% đến 76,25%) trong đó PAMAM-Pluronic thế hệ G4.0 cũng nang

hóa được nhiều nhất.

Ngoài ra, so sánh giữa các PAMAM-PEG và PAMAM-Pluronic tương ứng thì

PAMAM-Pluronic đều nang hóa thuốc kỵ nước 5-FU tốt hơn.

(7) Dendrimer PAMAM-PEG hay PAMAM-Pluronic sau khi nang hóa

thuốc 5-FU thì có tốc độ giải phóng thuốc chậm hơn rất nhiều so với mẫu 5-FU đối

chứng.

(8) Khi được nang hóa trên PAMAM biến tính (PAMAM G4.0-PEG6K,

G4.0-P123 và G.4.0-F127), thuốc 5-FU có độ độc giảm khoảng 2-3 lần so với 5-

FU đối chứng.

138

KIẾN NGHỊ

Nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM bằng các polymer khác như dextran,

chitosan, ancohol mạch dài, chlorue acide…. Sau đó tiến hành kiểm tra khả năng

nang hóa và giải phóng thuốc của các chất mang nano này với nhiều thuốc chống

ung thư khác như Doxorubicin (DOX), Methotrexate (MTX), Paclitaxel (Taxol), cis

Platin.

Nghiên cứu in vivo các PAMAM-PEG/5-FU và PAMAM-Pluronic/5-FU, tiến

đến thử nghiệm trên động vật.

139

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

CÔNG BỐ QUỐC TẾ

1. Thi Bich Tram Nguyen, Thi Tram Chau Nguyen, Hoang Chinh Tran, Cuu Khoa Nguyen & Ngoc Quyen Tran (2014), 1H NMR Spectroscopy as an Effective

Method for Predicting Molecular Weight of Polyaminoamine Dendrimers and their

Derivatives, tạp chí quốc tế (SCIE) International Journal of Polymer Analysis and

Characterization, DOI: 10.1080/1023666X.2014.955632 (IF:1.4);

2. Thi Tram Chau Nguyen, Cuu Khoa Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Thi Hiep

Nguyen (2016), Highly lipophilic pluronics-conjugated polyamidoamine dendrimer

nanocarriers as potential delivery system for hydrophobic drugs, tạp chí quốc tế

(SCIE) International Journal of Materials Science and Engineering C (IF: 3.1).

Accept;

3. T. T. Chau Nguyen, Dai Lam Tran, Cuu Khoa Nguyen, Ngoc Quyen Tran

(2016), pluronic-conjugated dendrimer nanocarrier for enhancing drug entrapment

efficiency and inhibiting mcf-7 cancer cell growth, tạp chí quốc tế (SCIE)

International Journal of Green Processing and Synthesis (IF: 1.3). Accept;

CÔNG BỐ TRONG NƯỚC

4. T. Tram Chau Nguyen, Cuu Khoa Nguyen, Ngoc Quyen Tran, T. Bich

Tram Nguyen (2013), Dendrimer-based nanocarriers demonstrating a high

efficiency for loading and releasing anticancer drugs in vitro and in vivo, Journal of

science and technology, vol. 51, no. 5A2013, pp. 224-232;

5. Nguyen Thi Tram Chau, Tran Hoang Chinh, Mai Bich Thoa, Nguyen Dai

Hai, Tran Ngoc Quyen, Nguyen Cuu Khoa (2015), Thermo-sensitive dendrimer-

based nanocarrier for enhancing anticancer drug loading efficiency, Tạp chí Hóa

Học, no. 53(4e3), pp.60-73;

6. Nguyen Thi Tram Chau, Tran Hoang Chinh, Nguyen Cuu Khoa, Tran

Ngoc Quyen (2015), Efficiency of peglyated PAMAM G4.0 as a potential

nanocarrier enhancing encapsulation fluorouracil, Tạp chí Hóa Học. Accept;

7. Nguyễn Thị Trâm Châu, Nguyễn Đình Trung, Lê Cao Quỳnh, Phan Thị

Hồng Hương, Trần Ngọc Quyển, Nguyễn Cửu Khoa (2015), Nghiên cứu ảnh hưởng

140

của chất mang dendrimer G4, G5 và đặc tính nhóm chức bề mặt đến hiệu quả mang

thuốc, Tạp chí Hóa Học, no. 53(6e1,2), pp.309-314;

THAM GIA HỘI NGHỊ QUỐC TẾ

8. Nguyen Thi Tram Chau, Tran Hoang Chinh, Nguyen Dai Hai, Nguyen Cuu Khoa, Tran Ngoc Quyen (2014), Thermosensitive Dendrimer nanocarrier exhibiting a highly drug loading and releasing eficiency, the 7th International

Workshop on Advanced Materials Science and Nanotechnology (IWAMSN2014),

Halong City, Vietnam;

9. Nguyen Thi Tram Chau, Nguyen Cuu Khoa, Tran Ngoc Quyen (2015),

Drug loading efficiency of pegylated PAMAM nanocarriers and its anticancer cell activity, International Workshop on Nanoscience and Nanotechnology, Joint 4th

Asia-Pacific Chemical and Biological Microfluidics Conference ((IWNN-apcbm),

Da Nang, VietNam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Trần Thị Thu Hằng (2007), Dược lực học, Nhà xuất bản Phương Đông, 1-

50.

2. Nguyễn Cửu Khoa (2006-2007), đề tài “Nghiên cứu điều chế polyme

dendrimer”, Chương trình nghiên cứu cơ bản, Bộ Khoa học và Công nghệ.

3. Nguyễn Cửu Khoa (2008-2009), đề tài “Nghiên cứu tổng hợp nanopolyme

từ polyme dendritic”, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

4. Nguyễn Cửu Khoa (2010-2011), đề tài Nghiên cứu tổng hợp

polyamidoamine lai hóa với PEG cấu trúc nano và ứng dụng làm chất mang thuốc

chống ung thư 5-fluorouracil. Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

5. Nguyễn Cửu Khoa, Hoàng Thị Kim Dung, Lưu Hồng Cúc, Lê Thị Kim

Phụng (2010), Nghiên cứu tổng hợp polyme dendritic có cấu trúc nano. Tuyển tập

Hội nghị Vật lý chất rắn và vật liệu toàn quốc lần thứ 6, 48.

6. Nguyễn Cửu Khoa, Nguyễn Công Trực, Hoàng Thị Kim Dung (2009), Tổng

hợp các dendrimer polyamidoamine (PAMAM). Tạp chí Hóa học, 47.

7. Nguyễn Đình Triệu (2003), Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hóa

học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.

TIẾNG ANH

8. Ahmed, S.M. Budd, P.M. McKeown, N.B. Evans, K.P. Beaumont, G.L.

Donaldson, C. and Brennan, C.M. (2001), Preparation and characterisation of a

chromophore-bearing dendrimer, Polymer 42: 889-896.

9. Alaa Eldeen B. Yassin1,2, Md. Khalid Anwer3, Hammam A. Mowafy1,

Ibrahim M. El-Bagory1, Mohsen A. Bayomi1,2, Ibrahim A. Alsarra1,2 (2010),

“Optimization of 5-fluorouracil solid-lipid nanoparticles: a preliminary study to

treat colon cancer”, Int J Med Sci; 7(6):398-408.

10. Albert Barrabino, (2011). Synthesis of mesoporous silica particles with

control of both pore diameter and particle size. Department of Chemical and

Biological Engineering. Division of Applied Chemistry. Chalmers University of

Technology. Sweden. pp. 7-8.

11. Anil K. Patri, Andrzej Myc, James Beals, Thommey P. Thomas, Neil H.

Bander, and James R. Baker (2004), Synthesis and in Vitro Testing of J591

Antibody−Dendrimer Conjugates for Targeted Prostate Cancer Therapy.

Bioconjugate Chem. 15, 1174−1181;

12. Anil K. Patri, Jolanta F. Kukowska-Latallo, James R. Baker Jr. (2005),

Targeted drug delivery with dendrimers: Comparison of the release kinetics of

covalently conjugated drug and non-covalent drug inclusion complex, Michigan

Nanotechnology Institute for Medicine and Biological Sciences, University of

Michigan Health System, Ann Arbor, MI 48109-0648, USA.

13. Astruc D, Boisselier E, Ornelas C (2010), Dendrimers Designed for

Functions: From Physical, Photophysical, and Supramolecular Properties to

Applications in Sensing, Catalysis, Molecular Electronics, and Nanomedicine.

Chem. Rev, 110(4), 1857-1959. Doi: 10.1021/cr900327d.

14. Bai S and Ahsan F (2009), “Synthesis and evaluation of pegylated

dendrimeric nanocarrier for pulmonary delivery of low molecular weight”, heparin

Pharm. Res, (26), 539.

15. Barbara Klajnert and Maria Bryszewska. (2001). Acta biochmia polonia.

Vol.48, No.2, 199-208.

16. Bezouška, K. (2002), Design functional evaluation and biomedical

applications of carbohydrate dendrimers (glycodendrimers). J. Biotechnol. 90:269-

290.

17. Bhadra D, Bhadra S, Jain S, Jain NK (2003). A PEGylated dendritic nana-

particulate carrier of fluorouracil. Int J Pharm; 257: 111-24.

18. Boas U, Christensen J.B, Heegaard P.M.H. (2006). Dendrimer in

Medicine and biotechnology New Molecular Tools. The Royal Society of

Chemistry, 17-24.

19. Boas U, Heegaard PM, (2004), Dendrimers in drug research, Chem Soc

Rev; 33 (1):43-63.

20. Brayfield, A, ed. (2014). Doxorubicin. Martindale: The Complete Drug

Reference. Pharmaceutical Press.

21. Chen HT, Neerman MF, Parrish AR, Simanek EE, (2004), J Am Chem

Soc, 126:10044-8.

22. Cheng Y, Li M and Xu T (2008), “Potential of poly(amidoamine)

dendrimers as drug carriers of camptothecin based on encapsulation studies”, J.

Phys. Chem. B (112), 8884.

23. Cheng Y, Zhao L, Li Y, Xu T (2011), “Design of biocompatible

dendrimers for cancer diagnosis and therapy: current status and future

perspectives”. Chem Soc Rev; 40(5):2673-703. doi: 10.1039/c0cs00097c. Epub

2011 Feb 1. Review. PMID: 21286593

24. Chie K, Celeste R, Yasuhito U, Hisataka K, Kenji K (2010), Influence of

dendrimer generation and Polyethylene glycol length on the biodistribution of

PEGylated dendrimers, International Journal of Pharmaceutics, 383, 293–296.

25. Choi, J.H. Joung, Y.K. Bae, J.W. Choi, J.W. Tran, N.Q. and Park, K.D.

(2011), Self-assembled nanogel of pluronic-conjugated heparin as a versatile drug

nanocarrier, Macromol. Res. 19: 180-188.

26. Dai Hai Nguyen, Ngoc Quyen Tran, Cuu Khoa Nguyen (2013), Tetronic-

grafted chitosan hydrogel as an injectable and biocompatible scaffold for

biomedical applications, Journal of Biomaterials Science.

27. Dan Liu, Haiyang Hu, Jie Zhang, Xiuli Zhao, Xing Tang, and Dawei Chen

(2011), Drug pH-Sensitive Release in Vitro and Targeting Ability of Polyamido-

amine Dendrimer Complexes for Tumor Cells, Chem. Pharm. Bull. 59(1) 63-71.

28. Dinesh Kumar P., P.Vijayaraj Kumar, T. Panneer Selvam and K.R.S.

Sambasiva Rao (2013), PEG Conjugated PAMAM Dendrimers with a Anti-HIV

Drug Stavudine for prolong release, Research in Biotechnology, 4(2): 10-18.

29. Dizman, C. Ates, S. Torun, L. Yagci, Y. (2010), Synthesis,

characterization and photoinduced curing of polysulfones with (meth)acrylate

functionalities, Beilstein J. Org. Chem. 6: 1-7.

30. Doron Shabat, Ph.D. (January 29, 2007), Drug-Delivering Dendrimers

Devolve on Demand. Nanotech News, US National Cancer Institute.

31. Duncan R and Izzo L (2005), Dendrimer biocompatibility and toxicity.

Advanced Drug Delivery Reviews, 57(15), 2215-2237.

32. Edited by Jean M. J. Fréchet and Donald A. Tomalia (2001), Dendrimers

and other Dendritic Polymers. Copyright, John Wiley & Sons Ltd. ISBNs: 0-471-

63850-1 (Hardback); 0-470-84582-1 (Electronic).

33. Elena V. Batrakova, Alexander V. Kabanov (2008), Pluronic Block

Copolymers: Evolution of Drug Delivery Concept from Inert Nanocarriers to

Biological Response Modifier. NIH Public Access. 130(2). pp. 98–106.

34. Emanuele D, David A (2002), Dendrimer – drug interactions, Advanced

drug delivery review, 40: 2719-28.

35. Erdem M, Turk H (2008), Preparation of cationic latexes with different

length alkyl groups on their quaternary ammonium ions and their use as supports

for IBA catalyst in the hydrolysis of PNPDPP, React. Funct. Polym, (68), 321–331.

36. Escobar-Chávez J. J, López-Cervantes M, Naïk A, Kalia Y. N, Quintanar-

Guerrero D, Ganem-Quintanar A (2006), Applications of thermo-reversible

Pluronic F-127 gels in pharmaceutical formulations, J Pharm Pharmaceut Sci. pp.

339-148;

37. Fan, L. T. & Singh, S. K (1989), Controlled Release: A Quantitative

Treatment Springer-Verlag, New York;

38. Gautam, S. P., A. K. Gupta, S. Agrawal, and S. Sureka (2012),

Spectroscopic characterization of dendrimers, Int. J.Pharm. Sci. 4: 77–80;

39. Gebhart CL, Sriadibhatla S, Vinogradov S, Lemieux P, Alakhov V,

Kabanov AV (2002), Design and formilation of polyplexes based on Pluronic-

polyethylenimine conjugates for gene transfer in prostate cancer cells, Bioconjug.

Chem. 13: 937-944;

40. George R. Newkome, Charles N. Moorefield, Fritz Vogtle (2001),

Dendrimer and Dendrons Concepts, Syntheses, Applications, WILEY-VCH Verlag

GmbH, D-69469 Weinheim (Federal Republic of Germany);

41. Gong Y, Matthews B, McCarthy T, Chua J, Holan G, Raff R, and Sacks S

(2005), Evaluation of dendrimer SPL7013, a lead microbicide candidate against

herpes simplex viruses, Antivir. Res. 68:139-146;

42. Gordon J. K., A. P. Jane, B. S. Oliver, J. F. David, J.W. Nial, (2011),

Evaluation of anionic half generation 3.5 – 6.5 poly(amidoamine) dendrimers as

delivery vehicles for the active component of the anticancer drug cisplatin, J. Inorg.

Biochem., Vol. 105, pp 1115 – 1122;

43. Gurdag S., J. Khandare, S. Stapels, L. H. Matherly, and R. M. Kannan ,

(2006), Activity of dendrimer-methotrexate conjugates on methotrexate-sensitive

and -resistant cell lines, Bioconjugate Chemistry, vol. 17, no. 2, pp. 275–283;

44. Han M H, Chen J, Wang J, Chen S L, Wang X T, Han M H, Chen J, Wang

J, Chen S L and Wang X T, (2010), Blood compatibility of polyamidoamine

dendrimers and erythrocyte protection, J. Biomed. Nanotechnol, (6), 82;

45. Hawker C. J & Frechet J. M. J, (1990), Preparation of polymes with

controlled molecular architecture. A new convergent approach to dendritic

macromolecules, J. Am. Chem. Soc. 112, 7638-7647;

46. Hood, R.J. Watson, J.T. and Jones, A. D. (2006), 54th Annual conference

on mass spectrometry, Washington.

47. Hu, H. Fan, X.D. and Cao, Z.L. (2005, Thermo- and pH-sensitive

dendrimer derivatives with a shell of poly(N,N-dimethylaminoethyl methacrylate)

and study of their controlled drug release behavior, Polymer 46: 9514–9522.

48. Istvan J. Majoros, James R. Baker, (2008), University of Michigan, USA,

Dendrimer- based nanomedicine, Pan Stanford Publishing Pte. Ltd;

49. Izunobi, J.U. and Higginbotham, C.L. (2011), Polymer molecular weight

analysis by 1H-NMR spectroscopy, J. Chem. Educ. 88: 1098–1104.

50. Jain K, Kesharwani P, Gupta U, Jain NK. Int J Pharm ,(2010), 394:122-

42;

51. Jain V, Swarnakar NK, Mishra PR, Verma A, Kaul A, Mishra AK, et al.

Biomaterials (2012), 33:7206-20;

52. Jean M. J. Fréchet, (2001), Dendrimer and other Dendritic polymer, 12,

297-303.

53. Jevprasesphant R, Penny J, Jalal R, Attwood D, McKeown N B and A.

D’Emanuele (2003), The influence of surface modification on the cytotoxicity of

PAMAM dendrimers, Int. J. Pharm, (25), 263;

54. Kailasan A., Yuan Q, Yang H (2009), Synthesis and characterization of

thermoresponsive polyamidoamine Polyethylene glycol-poly(D,L-lactide) core shell

nanoparticles, Acta Biomaterialia, 6(3):1131–1139;

55. Kenji Kono (2012), Dendrimer-based bionanomaterials produced by

surface modification, assembly and hybird for mation. Polymer Journal, 44(6);

56. Kesharwani P, Tekade R K, Jain K, Jain N K, (2014), Biomaterials,

35:5539-48;

57. Khandare J. J, Jayant S, Singh A et al. (2006), Dendrimer versus linear

conjugate: influence of polymeric architecture on the delivery and anticancer effect

of paclitaxel, Bioconjugate Chemistry, vol. 17, no. 6, pp. 1464–1472;

58. Knothe, G. and Kenar, J.A. (2004), Determination of the fatty acid profile

by 1H-NMR spectroscopy, Technology 106: 88–96.

59. Kojima C, Kono K, Maruyama K, Takagishi T, (2000), Synthesis of

polyamidoamine dendrimers having poly (ethylene glycol) grafts and their ability to

encapsulate anticancer drugs, Bioconjug. Chem, 11, 910-917;

60. Kolhatkar, Rohit B; Kitchens, Kelly M; Swaan, Peter W; Ghandehari,

Hamidreza, (2007), Surface Acetylation of Polyamidoamine (PAMAM)

Denddrimers Decreases Cytotoxicity while Maintaining Membrane Permeability.

Bioconjugate Chemistry, 18(6), 2054-60. Doi: 10.1021/bc0603889. PMID

17960872;

61. Kozlov M. Y, Melik-Nubarow N. S, Batrakova E.V, and Kabanov A. V,

(2000), Relationship between Pluronic block copolymer structure, critical

micellization concentration and partitioning coefficients of low molecular mass

solutes, Macrmolecules 33, 3305-3313;

62. Krishnam V. (2008), Design and synthesis of nanoparticle “paint-brush”

for cancer like multi‑ hydroxyl capped poly (ethylene glycol) conjugate

nanotherapy, The graduate faculty at the university of Akron, 9-30;

63. Kukowska-Latallo JF, Candido KA, Cao Z, Nigavekar SS, Majoros IJ,

Thomas TP, et al (2005), Nanoparticle targeting of anticancer drug improves

therapeutic response in animal model of human epithelial cancer. Cancer Res. Jun

15;65(12):5317-24.

64. Kyung Min Park, Yunki Lee, Joo Young Son, Dong Hwan Oh, Jung Seok

Lee, and Ki Dong Park (2012), Synthesis and characterizations of in situ cross-

linkable gelatin and 4-arm-PPO-PEO hydrid hydrogels via enzymatic reaction for

tissue regenerative medicine, Biomacromolecules, 13, 604-611;

65. Le Thi Phuong, Tran Ngoc Quyen, Hoang Thi Thai Thanh, Nguyen Cuu

Khoa (2012), Pegylated Dendrimer and Its Efect in Fluorouracil Loading and

Release for Enhancing Antitumor Activity. The 5th International Workshop on

Advanced Materials Science and Nanotechnology Vung Tau, Vietnam;

66. Lee, Jae Wook; Kim, Jung Hwan; Kim, Byung-Ki; Kim, Ji Hyeon; Shin,

Won Suk; Jin, Sung-Ho (2006), Convergent synthesis of PAMAM dendrimers using

click chemistry of azide-functionalized PAMAM dendrons, Tetrahedron, 62(39):

9193-200. Doi: 10.1016/j.tet.2006.07.030;

67. Luis F. Barraza1, Verónica A. Jiménez and, Joel B. Alderete*, (2015),

Effect of PEGylation on the Structure and Drug Loading Capacity of PAMAM-G4

Dendrimers: A Molecular Modeling Approach on the Complexation of 5-

Fluorouracil with Native and PEGylated PAMAM-G4, Macromolecular Chemistry

and Physics, Volume 216, Issue 16, Pages 1677–1763, DOI:

10.1002/macp.201500179;

68. Ly T U, Tran N Q, Hoang T K D, Phan K N, Truong H N and Nguyen C

K (2013), Pegylated Dendrimer and Its effect in Fluorouracil Loading and Release

for Enhancing Antitumor Activity, J. Biomed. Nanotechnol, (9), 213;

69. Majoros, I.J. Keszler, B. Woehler, S. Bull, T. and Baker, J.R. (2003),

Acetylation of poly(amidoamine) dendrimers, Macromolecules 36: 5526-5529.

70. Malik, N., Wiwattanapatapee, R., Klopsch, R., Lorenz, K. Frey, H.,

Weener, J. –W., Meijer, E. W., Paulus, W. & Duncan, R. (2000), Dendrimers:

Relationship between structure and biocompatibility in vitro, and preliminary

studies on the biodistribution of 125 I-labelled polyamidoamine dendrimers in vivo.

J.Controlled Release, 65,133-148;

71. Malik, Navid; Evagoras G; Ducan, Ruth (1999), Dendrimer-platinate.

Anti-Cancer Drugs, 10 (8), 767-776;

72. Mallory A. van Dongen, Rahul Rattan, Justin Silpe, Casey Dougherty,

Nicole L. Michmerhuizen , Margaret Van Winkle, Baohua Huang, Seok Ki Choi,

Kumar Sinniah, Bradford G. Orr, and Mark M. Banaszak Holl, (2014),

Poly(amidoamine) Dendrimer–Methotrexate Conjugates: The Mechanism of

Interaction with Folate Binding Protein, Mol. Pharmaceutics, 11 (11), pp 4049–

4058. DOI: 10.1021/mp500608s;

73. Mutlib, A. Espina, R. Vishwanathan, K. Babalola, K. Chen, Z. Dehnhardt,

C. Venkatesan, A. Mansour, T. Chaudhary, I. Talaat, R. and Scatina, J. (2011),

Application of quantitative NMR in pharmacological evaluation of biologically

generated metabolites: implications in drug discovery, Drug. Metab. Dispos. 39:

106-116.

74. Myc A, Douce T B, Ahuja N, Kotlyar A, Kukowska-Latallo J, Thomas T

P and Baker J P (2008), Preclinical antitumor efficacy evaluation of dendrimer-

based methotrexate conjugates Antican, Drugs, (19) 43;

75. Nakhlband A, Barar J, Bidmeshkipour A, Heidari H R and Omidi Y

(2010), Bioimpacts of antiepidermal growth factor receptor antisense complexed

with polyamidoamine dendrimers in human lung epithelial adenocarcinoma cells, J

Biomed Nanotechnol, (6), 360;

76. Neerman M F, (2007), The efficiency of a PAMAM dendrimer toward the

encapsulation of the antileukemic drug 6-mercaptopurine AntiCan, Drugs, (18),

839;

77. Neerman M F, Chen H T, Parrish A R, Simanek E E, (2004), Mol Pharm,

1:390-3;

78. Ngoc Quyen Tran, Yoon Ki Joung, Eugene Lih, Kyung Min Park, Ki

Dong Park (2010), Supramolecular hydrogels exhibiting fast in situ gel forming and

adjustable degradation properties, Biomacromolecules, 11, 617-625;

79. Nguyen H, Nguyen C. K, Nguyen N. H, Tran N. Q. (2014), “Improved

method for cisplatin-loading dendrimer and behavior of the complex nanoparticles

in vitro release and cytotoxicity”, J. Nanoscience and Nanotechnol, (16) (6), 4106;

80. Nguyen Thi Bich Tram, Nguyen Thi Tram Chau, Tran Hoang Chinh,

Nguyen Cuu Khoa, Tran Ngoc Quyen (2014), “1H NMR Spectroscopy as an

Effective Method for Predicting Molecular Weight of Polyaminoamine Dendrimers

and their Derivatives”, International Journal of Polymer Analysis and

Characterization, (20) (1), 57-68;

81. Nguyen Thi Bich Tram, Tran Ngoc Quyen, Nguyen Cuu Khoa (2013),

“Biocompatible enhancement of polyamidoamine dendrimer via its alkylation”,

Tạp chí Hóa học, 51, 259-263.

82. Nguyen Thi Phuong, Viet Anh Ho, Dai Hai Nguyen, Nguyen Cuu Khoa,

Tran Ngoc Quyen, Yun Ki Lee and Ki Dong Park, Enzyme-mediated fabrication of

the oxidized chitosan hydrogel for tissue sealant Journal of Bioactive and

compatible polymer, (Accepted).

83. Nguyen Thi Tram Chau, Tran Hoang Chinh, Nguyen Dai Hai, Nguyen

Cuu Khoa, Tran Ngoc Quyen (2014), “Thermosensitive dendrimer nanocarrier

exhibiting a highly drug loading and releasing efficiency”, HTQT-The 7th

International Workshop on Advanced Materials Science and Nanotechnology

(IWAMSN2014);

84. Nikolaos A. Peppas , Kelley B. Keys, Madeline Torres-Lugo, Anthony M.

Lowman, (1999), Poly(ethylene glycol)-containing hydrogels in drug delivery,

Journal of Controlled Release 62, 81–87;

85. Patri A K, Myc A, Beals J, Thomas T P, Bander N H, Baker J R, (2004),

Bioconjugate Chem;15:1174-81;

86. Prasad Shastri V. and at all (2003), Non-Degradable Biocompatible

Polymers in Medicine: Past, Present and Future, Current Pharmaceutical

Biotechnology, 4, 331-337;

87. Priscila Schilrreff, Cecilia Mundiña-Weilenmann, Eder Lilia Romero and

Maria Jose Morilla1 (2012), Selective cytotoxicity of PAMAM G5 core–PAMAM

G2.5 shell tecto-dendrimers on melanoma cells, Int J Nanomedicine, 7: 4121–4133,

doi: 10.2147/IJN.S32785;

88. Qi R, Gao Y, Tang Y, He R, Liu T, He Y, Sun S, Li B, Li Y and Liu G

(2009), “PEG-conjugated PAMAM dendrimers mediate efficient intramuscular

gene expression”, AAPS J, (11), 395;

89. Qiu, S, Huang H, and Dong C. M (2009), “Synthesis and pH-sensitive

self-assembly of dendritic poly(amidoamine)-b-poly(L-glutamate) biohybrids”,

Chin. J. Polym. Sci. 27: 797–805;

90. Rameshwer Shukla, Thommey P Thomas, Ankur M Desai, Alina Kotlyar,

Steve J Park and James R Baker (2008), HER2 speciﬁc delivery of methotrexate by

dendrimer conjugated anti-HER2 mAb. Nanotechnology 19, 295102 (7pp);

91. Rameshwer Shukla, Thommey P. Thomas, Jennifer L. Peters, Ankur M.

Desai, Jolanta Kukowska-Latallo, Anil K. Patri, Alina Kotlyar, and James R. Baker

(2006), HER2 Specific Tumor Targeting with Dendrimer Conjugated Anti-HER2

mAb. Bioconjugate Chemistry. 17 (5), 1109-1115;

92. Raymond, C.R; Paul, J.S; Sian, C.O; (2006), Handbook of Pharmaceutical

Excipients, American Pharmacists Association. Washington.5. pp.172-178;

93. Rill R.L, Locke B.R, Liu Y, and Winkle D.H, (1998), Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 95, 1534;

94. Roberts J. C, Bhalgat M. K, Zera R. T, (1996), J. Biomed. Mater. Res, 30,

53;

95. Sadekar S., H. Ghandehari (2012), Transepithelial transport and toxicity

of PAMAM dendrimers: Implications for oral drug delivery, Adv. Drug Deliv. Rev.,

64, 571;

96. Satija J, Gupta U, Jain N K, (2007), Crit Rev Ther Drug Carrier Syst

24:257-306;

97. Schlick K H, Morgan J R, Weiel J J, Kelsey M S, Cloninger M J, (2011),

Bioorg Med Chem Lett, 21:5078-83;

98. Schwartz, B. L., A. L. Rockwood, R. D. Smith, D. A. Tomalia, and R.

Spindler (1995), “Detection of high molecular weight starburst dendrimers by

electrospray ionization mass spectrometry”, Rapid Commun, Mass Spectrom. 9:

1552–1555;

99. Scott H. Medina and Mohamed E. H. El-Sayed (2009), Dendrimers as

Carriers for Delivery of Chemotherapeutic Agents, Chem. Rev, 109, 3141-3157.

100. Shuhua Bai, Fakhrul Ahsan (2008), Pharmaceutical research, 26, 539

– 548;

101. Simonnet et al. Apr. 30, 2002. Patent US 6, 379, 386 B1. Page 1, 2,

7,8;

102. Singh P, Gupta U, Asthana A, and Jain N. K (2008), “Folate and

folate PEG PAMAM dendrimers: Synthesis, characterization, and targeted

anticancer drug delivery potential in tumor bearing mice”, Bioconjug. Chem. 19:

2239–2252;

103. Szalai M.L., R.M. Kevwitch and D.V. McGrath (2003), Dendrimers:

Towards Catalytic, Material and Biomedical Uses, J. Am. Chem. Soc., 125, 15688;

104. Takuya Miyano, Wassana Wijagkanalan, Shigeru Kawakami,

Fumiyoshi Yamashita and Mitsuru Hashida (2010), Anionic Amino Acid

Dendrimer−Trastuzumab Conjugates for Specific Internalization in HER2-Positive

Cancer Cells. Pharmaceutics. 7 (4), 1318–1327;

105. Thommey P. Thomas, Anil K. Patri, Andrzej Myc, Mon Thiri

Myaing, Jing Yong Ye, Theodore B. Norris, and James R. Baker Jr, (2004), In vitro

targeting of synthesized antibody-conjugated dendrimer nanoparticles.

Biomacromolecules 5, 2269–2274;

106. Tomalia D A, Baker H, Dewald J, Hall M, Kallos G, Martin S, Roeck

J, Ryder J and Smith P (1985), A new class of polymers: starburst-dendritic

macromolecules, Polym. J, (17), 117-132;

107. Tomalia D A, Naylor A M and Goddard W A (1990), Starburst

dendrimers: molecular-level control of size, shape, surface chemistry, topology, and

flexibility from atoms to macroscopic matter. Angew. Chem. Int. Ed. 29, 138-175;

108. Tomalia D. A, Baker H, Dewald J, Hall M, Kallos G, Martin S, Roeck

J, Ryderand J, Smith P, (1986), Macromolecules, 19, 2466;

109. Tomalia D.A; Berry V; Hall M and Hedstrand D. M (1987), Starburst

dendrimers III.The importance of branch junction symmetry in the development of

topological shell molecules, J.Am. Chem. Soc. 109, 1601–1603;

110. Tran Huu Dung, Jina Kim, Myong Su Kim, Joon Seop Kim, and

Hoon Yoo, (2008), Preparation and Biophysical Characterization of Pluronic

F127-Dendrimer Conjugate as a Delivery Agent of Antisense Oligonucleotides, J.

Nanosci. Nanotechnol. 8, 5326–5330;

111. Tran Ngoc Quyen, Ly Tu Uyen, Hoang Thi Kim Dung, Cuu Khoa

Nguyen (2013), Pegylated Dendrimer and Its effect in Fluorouracil Loading and

Release for Enhancing Antitumor Activity, Journal of Biomedical Nanotechnology;

112. Tran, N.Q. Hoang, T.K.D. Nguyen, N.T. and Nguyen, C.K. (2012),

Synthesis of star-shaped poly(methyl acrylate) via ATRP and preliminary

evaluation of its reinforcing properties for PVC, J. Polym. Res. 19: 9819-9825.

113. Tran, N.Q. Joung, Y.K. Lih, E. Park, K.M. and Park, K.D. (2011),

RGD-conjugated in situ forming hydrogels as cell-adhesive injectable scaffolds,

Macromol. Res. 19: 300-306.

114. Tripathi P. K., A. J. Khopade, S. Nagaich, S. Shrivastava, S. Jain, and

N. K. Jain (2002), Dendrimer grafts for delivery of 5-flurouracil, Pharmazie, vol.

57, no. 4, pp. 261–264;

115. Ulrik Boas* and Peter M. H. Heegaard (2004), Dendrimers in drug

research, Chem. Soc. Rev., 33, 43-63. DOI: 10.1039/B309043B;

116. Viet Anh Ho, Phuong Thu Le, Thi Phuong Nguyen, Cuu Khoa

Nguyen, Vinh Truong Nguyen, Ngoc Quyen Tran (2015), Silver core-shell

nanoclusters exhibiting strong growth inhibition of plant-pathogenic fungi, Journal

of nanomaterials;

117. Vinogradov S.V, Batrakova E.V, Li S, Kabanov A.V, (2004), Mixed

polymer micelles of amphiphilic and cationic copolymers for delivery of antisense

oligonucleotides. J Drug Targe, 12:517–526;

118. Volha Dzmitruk, Dzmitry Shcharbin, Elzbieta Pedziwiatr-Werbicka

and Maria Bryszewska, (2011), Dendrimers in Anti-HIV Therapy, book edited by

Abbass Hashim, ISBN 978-953-307-347-7;

119. Xiang Wang, Xin Wu, Wei Fan, Baoyue Ding, Xiaoyu Wang, Wei

Zhang, Xueying Ding, Jing Gao, Quangang Zhu, Jiyong Liu, Zhen Cai, and Shen

Gao*, (2012), Surface Modification with Pluronic P123 Enhances Transfection

Efficiency of PAMAM Dendrimer, Macromolecular Research, Vol. 20, No. 2, pp

162-167. DOI 10.1007/s13233-012-0031-4.

120. Yang H, Morris J. J, Lopina S. T, (2004), Polyethylene glycol–

polyamido-amine dendritic micelle as solubility enhancer and the effect of thelength

of Polyethylene glycol arms on the solubility of pyrene inwater, J Colloid Int Sci,

273: 148-54;

121. Yashwant Pathak, Deepak Thassu (2009), “Drug Delivery

Nanoparticles Formulation and Characterization”. Informa Healthcare USA, Inc;

122. Zhu S, Hong M, Zhang L, Tang G, Jiang Y, Pei Y, (2010), PEGylated

PAMAM dendrimer-doxorubicin conjugates: in vitro evaluation and in vivo tumor

accumulation, 27(1):161-74. doi: 10.1007/s11095-009-9992-1. Epub 2009 Oct 28;

123. Zhu S, Qian L, Hong M, Zhang L, Pei Y, Jiang Y, (2011), RGD-

modified PEG-PAMAM-DOX conjugate: in vitro and in vivo targeting to both

tumor neovascular endothelial cells and tumor cells. Adv Mater; 23(12): H84-9,

doi: 10.1002/adma.201003944. Epub 2011 Mar 1;

124. Zhuojun Gu, Meng Wang, Qiongyan Fang, Huaiyu Zheng

, Feiyue Wu, Dai Lin, Ying Xu, and Yi Jin (2014), Preparation and in vitro

characterization of Pluronic-attached polyamidoamine dendrimers for drug

delivery, Drug Dev Ind Pharm, ISSN: 0363-9045 (print), 1520-5762 (electronic),

DOI: 10.3109/03639045.2014.908899;

PL1

Phụ lục 1

Xây dựng phương trình đường chuẩn sau: A = 33,101C + 27,857 (đường

chuẩn của độ hấp thu A và nồng độ 5-FU)

Mẫu nước thẩm tách được bơm vào vial để tiêm mẫu tự động. Lượng mẫu

tiêm (Inj Volume) là 20 μL, dung môi chạy cột là ACN:H2O tỷ lệ 1:9, tốc độ bơm là

1 mL/phút. Tiến hành đo độ hấp thu A ở bước sóng 260nm ta có độ hấp thu của

dung dịch 5-Fluorouracil chuẩn như sau:

Bảng P.1: Độ hấp thu của dung dịch 5-FU chuẩn ở bước sóng 260 nm

STT Độ hấp thu A Nồng độ dung dịch chuẩn C (ppm)

0 0 0

20 744,8 1

40 1352,2 2

60 1976,2 3

80 2670 5

100 1605.171 6

4000

3500

y = 33,101x + 27,857 R² = 0,9993

3000

2500

Qua đó ta dựng được đồ thị đường chuẩn như sau:

) s * U A m

2000

(

1500

a e r A

1000

500

100

120

60 Nồng độ 5-FU(µg/ml)

Hình P.1: Đồ thị đường chuẩn của 5-FU

Từ đồ thị ta có phương trình đường chuẩn sau: A = 33,101C + 27,857.

PL2

Phụ lục 2

Xây dựng phương trình đường chuẩn sau: A = 17346C – 26,26 (đường

chuẩn của độ hấp thu A và nồng độ 5-FU)

Mẫu nước thẩm tách được bơm vào vial để tiêm mẫu tự động. Lượng mẫu

tiêm (Inj Volume) là 10 μL, dung môi chạy cột là ACN:H2O tỷ lệ 1:9, tốc độ bơm là

1 mL/phút. Tiến hành đo độ hấp thu A ở bước sóng 260nm ta có độ hấp thu của

dung dịch 5-Fluorouracil chuẩn như sau:

Bảng P.2: Độ hấp thu của dung dịch 5-FU chuẩn ở bước sóng 260nm

STT Độ hấp thu A Nồng độ dung dịch chuẩn C (ppm)

0 0 0

0,005 44,3 1

0,01 130 2

0,05 902,7 3

0,1 1680 5

y = 17346x - 26,26 R² = 0,9971

Qua đó ta dựng được đồ thị đường chuẩn như sau:

] s * U A m

[ a e r A

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

0,02

0,1

0,12

0,08 0,06 0,04 Nồng độ [mg/mL]

Hình P.2: Đồ thị đường chuẩn của 5-FU

Từ đồ thị ta có phương trình đường chuẩn sau: A = 17346C – 26,26

PL3

Phụ lục 3

Xây dựng phương trình đường chuẩn sau: A = 14732C + 45,44 (đường

chuẩn của độ hấp thu A và nồng độ 5-FU)

Mẫu nước thẩm tách được bơm vào vial để tiêm mẫu tự động. Lượng mẫu

tiêm (Inj Volume) là 10 μL, dung môi chạy cột là ACN:H2O tỷ lệ 1:9, tốc độ bơm là

1 mL/phút. Tiến hành đo độ hấp thu A ở bước sóng 260nm ta có độ hấp thu của

dung dịch 5-Fluorouracil chuẩn như sau:

Bảng P.3: Độ hấp thu của dung dịch 5-FU chuẩn ở bước sóng 260nm

STT Độ hấp thu A Nồng độ dung dịch chuẩn C (mg/ml)

1 0.00125 29.189

2 0.0025 51.429

3 0.005 97.886

4 0.01 201.425

5 0.05 782.057

6 0.1 1605.171

Từ đó ta dựng được đồ thị đường chuẩn như sau:

)

y = 14732x + 45.44 R² = 0.9999

A

( u h t p ấ h ộ Đ

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

0,02

0,04

0,08

0,1

0,12

0,06 Nồng độ C (mg/ml)

Hình P.3: Đồ thị đường chuẩn của 5-FU

Từ đồ thị ta có phương trình đường chuẩn sau: A = 14732C + 45,44.

PL4

Phụ lục 4. Phổ 1H-NMR của các NPC-PEG-NPC

(1) Phổ 1H-NMR của NPC-PEG6K-NPC

(2) Phổ 1H-NMR của NPC-PEG12K-NPC

PL5

Phụ lục 5. Phổ 1H-NMR của các NPC-PEG-TA

(1) Phổ 1H-NMR của NPC-PEG6K-TA

(2) Phổ 1H-NMR của NPC-PEG10K-TA

PL6

Phụ lục 6. Phổ 1H-NMR của các PAMAM-PEG

(1) Phổ 1H-NMR của PAMAM G4.0-PEG6K

(2) Phổ 1H-NMR của PAMAM G4.0-PEG10K

PL7

Phụ lục 7. Phổ FTIR của PAMAM và PAMAM-PEG

(1) Kết quả phổ FTIR của PAMAM-PEG4K

(2) Kết quả phổ FTIR của PAMAM-PEG6K

PL8

Phụ lục 8. Phổ 1H-NMR của các NPC-Plu-NPC

(1) Phổ 1H-NMR của NPC-F68-NPC

(2) Phổ 1H-NMR của NPC-F127-NPC

PL9

(3) Phổ 1H-NMR của NPC-F108-NPC

PL10

Phụ lục 9. Phổ 1H-NMR của các NPC-Plu-TA

(1) Phổ 1H-NMR của NPC-F68-TA

(2) Phổ 1H-NMR của NPC-F108-TA

PL11

Phụ lục 10. Phổ 1H-NMR của PAMAM-Pluronic

Phổ 1H-NMR của PAMAM G4.0-F68

PL12

Phụ lục 11

Bảng thống kê kết quả giải phóng thuốc 5-FU mẫu đối chứng

(được thực hiện 3 lần)

5-FU (A= 14732C +45,442)

Thời Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Trung STT gian % bình Area 5-FU Area 5-FU Area 5-FU Độ lệch chuẩn (giờ)

1 1268.9 0.9966 1196.1 0.9373 989.13 0.7687 0.9008 0.1182 90.08 1

3 79.38 1.0242 73.09 0.9598 70.101 0.7888 0.9243 0.1217 92.43 2

7 93.87 1.0637 81.384 0.9891 84.793 0.8208 0.9579 0.1244 95.79 3

12 54.188 1.0708 46.559 0.99 42.167 0.8182 0.9596 0.1290 95.96 4

24 60.847 1.0833 41.839 0.987 43.948 0.817 0.9624 0.1348 96.24 5

48 80.875 1.1122 70.466 1.0074 76.232 0.842 0.9872 0.1362 98.72 6

72 63.139 1.1266 41.089 1.0039 48.128 0.8442 0.9916 0.1416 99.16 7

96 65.204 1.1427 40.396 0.9998 45.987 0.8447 0.9957 0.1490 99.57 8

PL13

Phụ lục 12

Bảng thống kê kết quả giải phóng thuốc 5-FU mẫu PAMAM G4.0-PEG6K/5-FU

(được thực hiện 3 lần)

G4.0-PEG6K/5-FU (A = 17346C - 26,26)

Thời Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Trung STT gian % bình Area 5-FU Area 5-FU Area 5-FU Độ lệch chuẩn (giờ)

16.3 0.0294 16.4 0.0295 24.3 0.035 0.0313 0.0032 3.13 1 1

12.8 0.0565 13.7 0.0572 17.3 0.0651 0.0596 0.0048 5.96 3 2

11.3 0.0824 12.7 0.0841 12.9 0.0922 0.0863 0.0052 8.63 7 3

12 11.3 0.1084 11.5 0.1102 12.9 0.1193 0.1127 0.0058 11.27 4

24 12.5 0.1352 13 0.1374 14.1 0.1472 0.14 0.0064 14.00 5

48 9.4 0.1599 12.6 0.1643 14.9 0.1757 0.1666 0.0082 16.66 6

72 13.6 0.1875 13.7 0.1919 15 0.2042 0.1945 0.0087 19.45 7

96 13.7 0.2151 13.7 0.2196 15.8 0.2333 0.2227 0.0095 22.27 8

PL14

Phụ lục 13

Bảng thống kê kết quả giải phóng thuốc 5-FU mẫu PAMAM G4.0-P123/5-FU

(được thực hiện 3 lần)

G4.0-P123/5-FU (A = 17346C - 26,26)

Thời Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Trung STT gian % bình Area 5-FU Area 5-FU Area 5-FU Độ lệch chuẩn (giờ)

16.9 0.0299 14.7 0.0283 18.5 0.0310 0.0297 0.0014 2.97 1 1

11.6 0.0560 12.2 0.0549 16.4 0.0605 0.0572 0.0030 5.72 3 2

11.1 0.0819 11.5 0.0811 12.1 0.0870 0.0833 0.0032 8.33 7 3

12 10.8 0.1075 11.9 0.1075 12.2 0.1136 0.1095 0.0035 10.95 4

24 12.5 0.1343 12.7 0.1344 15.3 0.1424 0.1370 0.0046 13.70 5

48 10.7 0.1599 12.4 0.1612 15.2 0.1711 0.1640 0.0061 16.40 6

72 12.9 0.1870 16.2 0.1905 15.9 0.2002 0.1926 0.0068 19.26 7

96 13.6 0.2146 12.7 0.2175 14.9 0.2287 0.2203 0.0074 22.03 8

PL15

Phụ lục 14

Bảng thống kê kết quả giải phóng thuốc 5-FU mẫu PAMAM G4.0-F127/5-FU

(được thực hiện 3 lần)

G4.0-F127/5-FU (A = 17346C - 26,26)

Thời Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Trung % STT gian bình Area 5-FU Area 5-FU Area 5-FU Độ lệch chuẩn (giờ)

15.3 0.0288 15.6 0.029 23.9 0.0347 0.0308 0.0034 3.08 1 1

10.5 0.0542 10.7 0.0545 15.9 0.0639 0.0575 0.0055 5.75 3 2

11.9 0.0806 12.9 0.0816 16.8 0.0937 0.0853 0.0073 8.53 7 3

12 11.5 0.1067 11.8 0.1079 18.3 0.1245 0.113 0.0099 11.30 4

24 10.8 0.1323 11.9 0.1343 18.2 0.1552 0.1406 0.0127 14.06 5

48 10.6 0.1578 10.8 0.16 17.1 0.1852 0.1677 0.0152 16.77 6

72 10.9 0.1835 10.9 0.1857 15.6 0.2142 0.1945 0.0171 19.45 7

96 9.8 0.2085 9.9 0.2107 17.6 0.2445 0.2212 0.0202 22.12 8

Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu: Nghiên cứu biến tính dendrimer polyamidoamine bằng polymer tương hợp sinh học (PEG và Pluronic) ứng dụng mang thuốc

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------------------

NGHIÊN CỨU BIẾN TÍNH DENDRIMER

POLYAMIDOAMINE BẰNG POLYMER

TƯƠNG HỢP SINH HỌC (PEG VÀ PLURONIC)

ỨNG DỤNG MANG THUỐC

Chuyên ngành: Vật liệu cao phân tử và tổ hợp

Mã số: 62.44.01.25

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

TP. Hồ Chí Minh - 2016

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------------------

NGHIÊN CỨU BIẾN TÍNH DENDRIMER

POLYAMIDOAMINE BẰNG POLYMER

TƯƠNG HỢP SINH HỌC (PEG VÀ PLURONIC)

ỨNG DỤNG MANG THUỐC

Chuyên ngành: Vật liệu cao phân tử và tổ hợp

Mã số: 62.44.01.25

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. NGUYỄN CỬU KHOA

2. TS. TRẦN NGỌC QUYỂN

TP. Hồ Chí Minh - 2016

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC ĐỒ THỊ

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.20. Sơ đồ quy trình giải phóng thuốc 5-FU của hệ chất mang PAMAM

Lý thuyết

MS

CTPT

Thế hệ PAMAM

MLT

MMS

Hiệu số sai lệch (%)

Lý thuyết

1H-NMR

Thế hệ PAMAM

Hiệu số sai lệch (%)

LT MLT NMR MNMR 407

PAMAM G4.0-F68 (c), PAMAM G4.0-F127 (d) và PAMAM G4.0-F108 (e)

Hình 3.30. Sắc ký đồ của 5-FU không được nang hóa trong PAMAM G2.0, G3.0,

) s * U A m

(

a e r A

60 Nồng độ 5-FU(µg/ml)

] s * U A m

[ a e r A

0,08 0,06 0,04 Nồng độ [mg/mL]

)

y = 14732x + 45.44 R² = 0.9999

A

( u h t p ấ h ộ Đ

0,06 Nồng độ C (mg/ml)

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok