Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa cho enzyme luciferase trong hệ biểu hiện E.coli

Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO ENZYME<br /> LUCIFERASE TRONG HỆ BIỂU HIỆN E.coli<br /> Nghiêm Ngọc Hoa*, Nguyễn Hà Trung, Tô Lan Anh, Trần Thị Thanh Quỳnh,<br /> Phạm Kiên Cường<br /> Tóm tắt: Luciferase (Luc) là một enzyme quan trọng tham gia vào việc xúc tác<br /> cho phản ứng phát quang sinh học. Cơ chế phản ứng phát quang sinh học liên quan<br /> đến enzyme luciferase là một quá trình gồm nhiều bước với sự tham gia của ATP,<br /> cơ chất luciferin, enzyme luciferase, oxy, ion Magie. Đây cũng là cơ chế phản ứng<br /> phát quang sinh học ở đom đóm. Trong nghiên cứu này, gen mã hóa cho luciferase<br /> đom đóm trong vector pGEMT đã được nhân bản bằng PCR và được chuyển vào<br /> vector biểu hiện pET43a,để tạo ra vector biểu hiện pET43a-Luc. Vector này được<br /> biến nạp vào chủng E.coli BL21-DE3 tạo nên dạng tái tổ hợp BL21-DE3-pET43a-<br /> Luc. Sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme Luciferase đã được kiểm tra bằng<br /> phương pháp điện di SDS PAGE và thẩm tách miễn dịch.<br /> Từ khóa: Luciferase; Đom đóm; Tái tổ hợp.<br /> <br /> 1. MỞ ĐẦU<br /> Từ phản ứng phát sáng được quan sát ở một số sinh vật như nấm, đom đóm, sứa, vi<br /> khuẩn...các nhà hóa sinh học đã tách chiết thành công chất có khả năng thúc đẩy quá trình<br /> phát sáng trong các tế bào sinh vật và thống nhất gọi chúng là luciferase. Luciferase là một<br /> thuật ngữ thường được sử dụng để mô tả các enzyme có khả năng xúc tác cho phản ứng<br /> phát quang sinh học, thuộc họ protein dạng aldelynate và có một nhóm oxy-4-<br /> oxidoreductase để thực hiện các hoạt động chính là khử carboxyl hóa và thủy phân ATP.<br /> Bước sóng phát sáng cũng như thành phần tham gia vào phản ứng phát quang ở mỗi loài là<br /> khác nhau. Hiện nay đã có trên 20 loại luciferase khác nhau đã được xác định dựa vào<br /> nguồn gốc và cơ chế tác dụng của chúng. Trong đó, luciferase của đom đóm được tập<br /> trung nghiên cứu nhiều nhất [3,4]. Các gen luciferase đã được phân lập từ một số loài đom<br /> đóm [8]. Cùng với lợi ích thương mại lớn, các gen luciferase đom đóm đang ngày càng<br /> được sử dụng như một gen chỉ thị trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử. Trong<br /> thực tế các gen luciferase đã được sử dụng như một gen chỉ thị hiệu quả cao trong nhiều<br /> sinh vật như amip, vi khuẩn, nấm mốc, thực vật, tằm và chuột.<br /> Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu về luciferase tuy nhiên các công bố về ứng dụng<br /> của phương pháp phát quang sinh học nói chung và luciferase nói riêng còn hạn chế và<br /> chưa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu về enzyme này [1,2]. Đặc biệt là việc ứng dụng<br /> enzyme luciferase trong các lĩnh vực phục vụ cho quân đội như trong trinh sát phát hiện<br /> chất độc hóa học còn chưa được quan tâm nghiên cứu.<br /> Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện enzyme<br /> luciferase bằng phương pháp tái tổ hợp ở các hệ thống biểu hiện khác nhau như: vi khuẩn<br /> E.coli, tế bào động vật, cây cà rốt và thuốc lá, cá ngựa vằn, ruồi giấm... [6,7,9]. Tuy nhiên,<br /> hệ thống biểu hiện ở vi khuẩn E.coli vẫn là sự lựa chọn chủ yếu của các nghiên cứu vì sự<br /> đơn giản và hiệu quả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nhân dòng gen mã hóa enzyme<br /> luciferase vào vector pET 43a và biểu hiện ở E.coli.<br /> 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất<br /> Chủng E. coli DH5α , BL21 DE3 được mua từ hãng Invitrogen.<br /> <br /> <br /> <br /> 120 N. N. Hoa, …, P. K. Cường, “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa … hệ biểu hiện E.coli.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> Hỗn hợp dNTP, thang chuẩn DNA được mua từ hãng Fermentas; Taq DNA<br /> polymerase, enzyme giới của hãng Enzynomics, T4 DNA ligase của hãng Promega, bộ kit<br /> tinh sạch plasmid của hãng Anabio R&D JSC. Các hóa chất còn lại đều đạt độ tinh sạch<br /> dành cho phân tích và được mua từ các hãng tin cậy (Sigma, Merk…).<br /> 2.2. Thiết bị<br /> Máy PCR (Bio-Rad, Singapore), máy điện di (Cleaver-Anh), hệ thống phân tích hình<br /> ảnh (Biorad-Italia), máy Deltatox (Mỹ), máy ly tâm lạnh (Sigma- Đức), máy đo quang phổ<br /> Halo RB (RB-10), tủ ấm (Memer-Đức), máy đo pH (Mette toledo), máy lắc (Big bill, Mỹ).<br /> 2.3. Phương pháp, kĩ thuật nghiên cứu<br /> 2.3.1. Nhân dòng đoạn gen mã hóa enzyme luciferase<br /> Gen mã hóa cho enzyme luciferase được nhân bản trực tiếp bằng phương pháp PCR.<br /> Đoạn mồi được sử dụng có chứa trình tự nhận biết của enzyme NdeI (Luc-Fw:5’-<br /> GATATACATATGGAAAACATGGAGAACGATGAAAAT -3’) và enzyme XhoI (Luc-<br /> Rv:5’- GTGCTCGAGCATCTTAGCAACTGG -3’)<br /> PCR chứa 1xTaq polymerase buffer, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs và 2,5 đơn vị Taq<br /> polymerase với tổng thể tích cuối là 25 µl. Quá trình nhân bản được tiến hành bởi máy<br /> GeneAmp PCR System 9700 với 1 vòng ở 94oC trong 5 phút để khởi động nóng, tiếp theo<br /> là 35 chu kì gồm 30s ở 94oC, 45s ở 53oC, và 2 phút ở 72oC, tiếp theo là kéo dài ở 72oC<br /> trong 7 phút và bảo quản ở 4oC cho đến khi sử dụng.<br /> Sản phẩm PCR sau khi được tạo thành và vector pET 43a được xử lý bằng enzym giới<br /> hạn NdeI XhoI, sau đó được gắn vào vector pET 43a nhờ kit ligase và được biến nạp vào<br /> E.coli DH5α. Chủng vi khuẩn được cấy gạt trên đĩa thạch LB, có bổ sung Ampicilin đến<br /> nồng độ 50μg/ml qua đêm ở 37ºC. Các khuẩn lạc dương tính mang vector tái tổ hợp được<br /> phát hiện bằng phương pháp PCR sử dụng trực tiếp khuẩn lạc làm nguồn cho DNA khuôn<br /> với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen Luciferase (Luc Fw/Rv) và cặp mồi vector (T7 Fw/<br /> Rv). Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.<br /> 2.3.2. Tách plasmid chứa vector tái tổ hợp pET43a- Luc<br /> Plasmid tái tổ hợp pET43a-Luc được tinh sạch theo kit Anapure plasmid mini kit của<br /> hãng Anabio R&D JSC với các dung dịch đệm kèm theo: Resuspension Buffer, Lysis<br /> Buffer, Binding Buffer, Washing Buffer, Elution Buffer.<br /> 2.3.3. Biểu hiện gen mã hóa enzyme luciferase ở E.coli<br /> Vector tái tổ hợp pET43a-Luc được biến nạp vào chủng vi khuẩn biểu hiện E.coli BL21-<br /> DE3 và được nuôi cấy trong môi trường LB có chứa ampicillin 50 µg/ml, chloramphenicol<br /> 34 µg/ml. Sinh tổng hợp enzyme luciferase được cảm ứng bằng IPTG 1mM.<br /> 2.3.4. Kiểm tra sự biểu hiện của enzyme luciferase ở E.coli<br /> Lấy một khuẩn lạc dương tính chứa vector tái tổ hợp pET43a-Luc trên đĩa LB đặc cho<br /> vào 50ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp 50 µg/ml và Cm 34 µg/ml,<br /> nuôi lắc qua đêm với tốc độ 200 vòng/phút tại 37oC.<br /> 10ml dịch nuôi đem trẻ hóa 50 lần trong 500ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh amp 50<br /> µg/ml và Cm 34 µg/ml. Vi khuẩn được nuôi cho đến khi OD600 đạt 0,6 – 0,8, bổ sung<br /> IPTG đến nồng độ cuối 1mM rồi đem nuôi ở 20oC, 200 vòng/phút, 4 giờ.<br /> Sau 4 giờ nuôi cấy, thu sinh khối tế bào bằng cách li tâm ở 8000 vòng/phút, trong 5<br /> phút ở 4oC. Tủa được hòa lại trong đệm PBS, pH=7,8 thu được dịch sau hòa tủa. Bảo quản<br /> dịch sau hòa tủa tại -20oC.<br /> Dịch sau hòa tủa được đem đi phá vỡ tế bào bằng siêu âm 4 lần trên đá, mỗi lần 30<br /> giây. Dịch sau phá tế bào được đem đi li tâm 13000 vòng/phút, trong 20 phút ở 4oC, thu<br /> dịch. Dịch chứa enzyme được bảo quản ở -20oC cho các bước tiếp theo.<br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 60, 4 - 2019 121<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> Sự có mặt của protein Luc (khối lượng phân tử khoảng 61kDa) trong dịch chiết tế bào<br /> BL21 được kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide 12% có SDS và khẳng định<br /> bằng thẩm tách miễn dịch.<br /> 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> 3.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa enzyme luciferase<br /> Đoạn gen mã hóa Luciferase được nhân bản bằng PCR với cặp mồi Luc- Fw/Rv, sử<br /> dụng plasmid pGEMT-Luc làm khuôn. Kết quả thu được (hình 1) cho thấy sự có mặt băng<br /> ADN nhân bản kích thước khoảng 1,6kb, tương ứng với kích thước của đoạn gen<br /> Luciferase (đường chạy 1,2), chứng tỏ chúng tôi đã nhân bản thành công đoạn gen<br /> Luciferase.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Điện di sản phẩm PCR nhân bản gen Luciferase trên gel agarose 1%.<br /> M: Thang chuẩn ADN 1kb; (-) Sản phẩm PCR từ đối chứng âm ( không có ADN); 1,2:<br /> Sản phẩm PCR sử dụng pGEMT-Luc làm khuôn<br /> 3.2. Biểu hiện gen mã hóa enzyme luciferase trong pET43a<br /> Để thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa Luciferase, chúng tôi đã sử dụng vector<br /> pET43a. Chúng tôi đã tiến hành xử lý vector pET43a và sản phẩm PCR của đoạn gen<br /> Luciferase bằng cặp enzyme cắt giới hạn XhoI và NdeI. Sản phẩm cắt sau khi điện di kiểm<br /> tra (hình 2) được tinh sạch nhằm thu được gen Luciferase và vector pET 43a. Sản phẩm<br /> sau tinh sạch được đem đi ligase bằng T4 ligase, để 4ºC qua đêm. Sau đó sản phẩm ligase<br /> được đem biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Các khuẩn lạc được lựa chọn ngẫu<br /> nhiên để làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi Luc Fw/ Rv và cặp mồi vector T7<br /> promoter, T7 terminator để kiểm tra sự có mặt của gen Luciferase ở mỗi khuẩn lạc.<br /> Kết quả thu được (hình 3) cho thấy khi sử dụng cặp mồi T7 của vector pET43a, sản<br /> phẩm PCR cho băng ADN có kích thước khoảng 1,9 kb (tương ứng với tổng kích thước<br /> của đoạn gen luciferase cộng với đoạn 300 bp của vector), còn khi sử dụng cặp mồi Luc<br /> Fw/Rv cho băng DNA có kích thước khoảng 1,6 kb, tương ứng với kích thước đoạn gen<br /> luciferase.<br /> <br /> <br /> 122 N. N. Hoa, …, P. K. Cường, “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa … hệ biểu hiện E.coli.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> Kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã gắn thành công đoạn gen mã hóa Luciferase vào<br /> vector pET43a, kí hiệu pET43a-luc.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid Hình 3. Kết quả PCR kiểm tra plasmid<br /> pET 43a và gen Luciferase với enzyme giới pET 43a-Luc.<br /> hạn XhoI và NdeI.<br /> M: 1 kb DNA marker 5: 1 kb DNA marker<br /> 1: Sản phẩm PCR gen luciferase 1,2,3: Sản phẩm PCR với mồi T7 Fw/Rv<br /> 2: Sản phẩm cắt gen luciferase 4,6: Đối chứng âm<br /> 3: Plasmid pET 43a cắt với enzyme giới hạn 7,8,9: Sản phẩm PCR với mồi Luc Fw/Rv<br /> NdeI và XhoI<br /> 4: plasmid pET 43a nguyên bản<br /> Để kiểm tra biểu hiện gen mã hóa cho Luciferase, vector pET43a-Luc được biến nạp<br /> vào tế bào E.coli BL21 DE3 và cấy trải trên môi trường LB có kháng sinh Amp 50µg/ml<br /> và chloramphenicol 34 µg/ml. Để khẳng định pET43a-Luc có thực sự biểu hiện hay<br /> không, dịch chiết sinh khối tế bào E.coli DH5α đã được cho kiểm tra bằng điện di trên gel<br /> poyacrylamide 12% có chứa SDS- PAGE.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. Điện di gel polyacrylamide có SDS (A) và thẩm tách miễn dịch kiểm tra sự biểu<br /> hiện của pET43a-Luc ở E.coli BL21 DE3 (B).<br /> M: Thang chuẩn protein; 1,2: dịch chiết E.coli không chứa protein biểu hiện.; 3,4: dịch<br /> chiết E.coli có sự biểu hiện của enzyme Luciferase.<br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 60, 4 - 2019 123<br />  Hóa học & Kỹ thuật môi trường<br /> <br /> Kết quả điện di protein (hình 4A) cho thấy sự xuất hiện của một băng protein khoảng<br /> 61 kDa ở dịch chiết tổng số tế bào E.coli BL21 DE3 tương ứng với kích thước Luciferase<br /> tái tổ hợp tính toán lý thuyết, trong khi đó dịch chiết tổng sổ tế bào E.coli không mang<br /> vector pET 43a- Luc không xuất hiện băng protein có kích thước 61 kDa. Do đó, chúng tôi<br /> bước đầu khẳng định vi khuẩn E.coli BL21 DE3 đã biểu hiện được enzyme luciferase tái<br /> tổ hợp. Kết quả xác định hoạt tính Luciferase tái tổ hợp thu được trong dịch chiết protein<br /> tổng số có hoạt độ là 2,1x104 RLU/ml. Kết quả này tương đồng với kết quả của Haoran và<br /> cộng sự (2013) cũng đã biểu hiện thành công gen mã hóa cho luciferase đom đóm<br /> Photinus pyralis trên E.coli BL21-DE3 dưới dạng plasmid tái tổ hợp pET28a-luc với kích<br /> thước 1652bp, protein tái tổ hợp có khối lượng phân từ 60024Da [5]..<br /> 4. KẾT LUẬN<br /> Chúng tôi đã nhân dòng thành công đoạn ADN 1.6 kb của gen mã hóa cho luciferase<br /> vào hệ thống vector biểu hiện pET43a và chuyển thành công vào hệ thống sinh vật biểu<br /> hiện E.coli BL21 DE3. Luciferase tái tổ hợp có kích thước khoảng 61 kDa có hoạt độ là<br /> 2,1x104 RLU/ml.<br /> Lời cảm ơn: Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài nghiên<br /> cứu khoa học và công nghệ: “ Nghiên cứu khả năng tạo chủng E.coli biểu hiện enzyme<br /> luciferase định hướng để phát hiện TNT (trinitrotoluene) trong đất”.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> [1]. Trần Linh Phước và tập thể (2002), “Tạo dòng sản xuất luciferase tái tổ hợp dùng<br /> cho phản ứng phát sáng sinh học invitro”, tạp chí phát triển khoa học và công nghệ Đại<br /> học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh, tập 5, số 7.<br /> [2]. Phạm Hồ Trương và tập thể (2006), “Nghiên cứu sản xuất bộ Kit vi sinh xác định<br /> Arsen bằng máy đo huỳnh quang ABOATOX 1253, đề tài cấp Trung tâm<br /> KHKT&CNQS<br /> [3]. Conti E., Franks N. & Brick P. (1996), “Crystal structure of firefly luciferase throws<br /> light on a superfamily of adenylate-forming enzymes”, Structure, 4, 287–298.<br /> [1]. Fraga H. (February 2008), “Firefly luminescence: a historical perspective and recent<br /> developments”, Photochem. Photobiol. Sci. 7 (2): 146–58.<br /> [2]. Haoran Y., Yanjie L., Liujie H., Xinya L., Guangbo K., He H. (2013), “ Soluble<br /> expression of Active Recombinant Firefly Luciferase in Escherichia coli”. Journal of<br /> pure and applied microbiology. 7, 679-685.<br /> [3]. Jeffrey R.D., Keith V.W, Donald R.H. and Marlene D. (1985), “Cloning of firefly<br /> luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli”,<br /> Biochemistry, Vol. 82, pp. 7870-7873.<br /> [4]. Jeffrey R.D., Keith V.W, Marlene D., Donald R.H., and Suresh S. (1987), Firefly<br /> Luciferase Gene: Structure and Expression in Mammalian Cells, Molecular and<br /> cellular biology, p. 725-737.<br /> [5]. Tatsumi H., Kajiyama M., Nakano E., “Molecular cloning and expression in<br /> Escherichia coli of a cDNA clone encoding luciferase of a firefly, Luiciola lateralis”,<br /> Biochim Biophys Acta. (1992 Jun) 15;1131(2):161-5.<br /> [6]. Tatsumi H1, Masuda T, Kajiyama N, Nakano E, “Luciferase cDNA from Japanese<br /> firefly Luciola cruciata: cloning, structure and expession in E.coli”, J Biolumin<br /> Chemilumin. (1989 Apr-Jun);3(2):75-8.<br /> <br /> <br /> 124 N. N. Hoa, …, P. K. Cường, “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa … hệ biểu hiện E.coli.”<br /> Nghiên cứu khoa học công nghệ<br /> <br /> ABSTRACT<br /> STUDY ON EXPRESSION OF ENZYME LUCIFERASE IN E. coli<br /> Luciferase (Luc) is an important enzyme, catalysated bioluminescent reaction<br /> The photoluminescent reaction involving is a multi-step process involving ATP,<br /> luciferin, luciferase, oxygen, magnesium ion. This is also the mechanism of<br /> photoluminescent reaction in fireflies. In this study, the gene encoding for luciferase<br /> in the vector pGEMT was cloned by PCR and transferred into the expression vector<br /> pET43a, to generate the expression vector pET43a-Luc. This vector is transformed<br /> into the E.coli BL21-DE3 strain that forms the recombinant BL21-DE3 -pET43a-<br /> Luc. The expression of the gene encoding enzyme Luc has been tested by<br /> electrophoresis SDS PAGE and Western blot.<br /> Keywords: Acetylcholinesterase; Firefly; Recombinant.<br /> <br /> <br /> <br /> Nhận bài ngày 16 tháng 8 năm 2018<br /> Hoàn thiện ngày 05 tháng 12 năm 2018<br /> Chấp nhận đăng ngày 16 tháng 4 năm 2019<br /> <br /> Địa chỉ: Viện Công nghệ mới/Viện Khoa học và Công nghệ quân sự.<br /> *<br /> Email: nghiemngochoa@gmail.com.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 60, 4 - 2019 125<br />