Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Biên Hòa, Đồng Nai và đánh giá khả năng phân hủy của một số chủng phân lập

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHẠM QUANG HUY

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT TRONG MẪU ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Ở BIÊN HÒA, ĐỒNG NAI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA MỘT SỐ

CHỦNG PHÂN LẬP

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2021

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHẠM QUANG HUY

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT TRONG MẪU ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Ở BIÊN HÒA, ĐỒNG NAI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA MỘT SỐ

CHỦNG PHÂN LẬP

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 9 42 01 07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà

Viện Công nghệ sinh học

TS. Nguyễn Kim Thoa

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2021

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS. Đặng Thị Cẩm Hà và TS.

Nguyễn Kim Thoa, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất

cũng như động viên tôi trong những lúc khó khăn nhất để tôi có thể thực hiện và

hoàn thành luận án này.

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận

án. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường đã

tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài độc lập cấp nhà nước:

“Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin

nhằm tìm kiếm các gen, enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin” do PGS.

TS. Đặng Thị Cẩm Hà chủ nhiệm.

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào

tạo, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành mọi thủ tục

trong suốt quá trình học tập làm nghiên cứu sinh tại Viện.

Cuối cùng, tôi xin gửi tới người thân trong gia đình cùng bạn bè sự biết ơn,

đặc biệt là bố mẹ đã dành cho tôi tình yêu thương sâu sắc và tạo điều kiện tốt nhất

để tôi học tập và hoàn thành tốt nội dung luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày……tháng……năm 2021

NCS. Phạm Quang Huy

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các

cộng sự khác.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, một phần đã được công

bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng

tác giả.

Các thông tin trích dẫn trong luận án đã được ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày……tháng……năm 2021

Tác giả

NCS. Phạm Quang Huy

ii

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... i

LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................... ii

MỤC LỤC ............................................................................................................... iii

DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... vi

DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ....................................... ix

MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4

1.1. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin .......................................................... 4

1.1.1. Đặc điểm và ảnh hưởng của chất diệt cỏ/dioxin tới môi trường và

con người. ....................................................................................................... 4

1.1.2. Ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng.................... 5

1.1.3. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin trong đất ô nhiễm ............................ 7

1.2. Đa dạng VSV và gene chức năng trong đất ô nhiễm chất diệt

cỏ/dioxin ....................................................................................................... 12

1.2.1. Đa dạng VSV hiếu khí nuôi cấy được trong đất ô nhiễm ......................... 12

1.2.2. Đa dạng vi khuẩn kị khí nuôi cấy được trong đất ô nhiễm dioxin ............ 13

1.2.3. Đa dạng gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia phân hủy

chất diệt cỏ/dioxin ........................................................................................ 18

1.3. Sử dụng công cụ metagenomic nghiên cứu đa dạng VSV ô

nhiễm POPs ................................................................................................. 19

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 27

2.1. Vật liệu .......................................................................................................... 27

iii

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 27

2.1.2. Các hóa chất và thiết bị máy móc ............................................................... 29

2.1.3. Môi trường nuôi cấy .................................................................................... 30

2.1.4. Sơ đồ thí nghiệm .......................................................................................... 30

2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 32

2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu đất để nghiên cứu metagenome ..................... 32

2.2.2. Phân tích thành phần cơ giới và nồng độ dioxin trong mẫu nghiên cứu ...... 32

2.2.3. Phân lập, phân loại VSV từ nguồn đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ............ 32

2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính laccase và laccase-like ........................... 33

2.2.5. Đánh giá phân hủy 2,3,7,8-TCDD trong đất ô nhiễm bởi hỗn

hợp VSV ...................................................................................................... 34

2.2.6. Phương pháp tách chiết DNA metagenome ............................................... 35

2.2.7. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA

metagenome.................................................................................................. 35

2.2.8. Phân tích trình tự DNA metagenome của C và BHR ................................ 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 39

3.1. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp vi khuẩn, xạ khuẩn

quy mô phòng thí nghiệm ............................................................................ 40

3.1.1. Vi khuẩn từ đất nhiễm dioxin phân lập được, định danh và khả năng

phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn có tiềm năng ..................... 40

3.1.2. Xạ khuẩn từ đất nhiễm dioxin đã được phân lập, định danh và khả

năng phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn tiềm năng .................. 42

3.2. Đa dạng VSV và gene chức năng từ trình tự DNA metagenome C

và BHR ......................................................................................................... 46

3.2.1. Thu nhận DNA metagenome từ mẫu C và BHR ....................................... 46

iv

3.2.2. Trình tự, contig và gene chức năng từ metagenome của mẫu C

và BHR ......................................................................................................... 47

3.2.3. Đa dạng VSV của metagenome C và BHR ................................................ 49

3.2.4. Mối liên hệ giữa một số chi vi khuẩn với tổng độ độc và các đặc

tính lý hóa của đất ........................................................................................ 69

3.2.5. Đa dạng gene chức năng tham gia phân hủy xenobiotic của

metagenome C và BHR ............................................................................... 70

3.2.6. Nhóm gene mã hóa enzyme tham gia phân hủy, chuyển hóa chất

diệt cỏ/dioxin ................................................................................................ 72

3.2.7. Gene tham gia vào phân hủy chuyển hóa xenobiotic từ metagenome

đã được phát hiện ......................................................................................... 76

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................. 79

4.1. Đa dạng VSV và gene chức năng từ trình tự DNA metagenome C

và BHR thu được. ........................................................................................ 79

4.2. Đa dạng gene chức năng tham gia phân hủy xenobiotic của

metagenome C và BHR (một trong 4 con đường phân hủy và

khoáng hóa dioxin). ..................................................................................... 92

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 95

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN

QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ............................................................................................ 97

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH.................................................... 98

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 105

PHỤ LỤC

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt

cỏ/dioxin bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn ....................................... 42

Bảng 3.2. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt

cỏ/dioxin bởi chủng XKBHA22 ................................................. 45

Bảng 3.3. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt

cỏ/dioxin bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn ...................................... 45

Bảng 3.4. Trình tự read chất lượng cao ....................................................... 47

Bảng 3.5. Lắp ráp de novo trình tự DNA metagenome C, BHR ................ 48

Bảng 3.6. Phân bố gene từ trình tự DNA metagenome C, BHR ................ 48

Bảng 3.7. Đa dạng ở các mức độ phân loại của metagenome C và BHR ......... 52

Bảng 3.8. Một số chi có các đại diện đã được chứng minh có khả

năng phân huỷ chất diệt cỏ/ dioxin ............................................. 57

Bảng 3.9. Đa dạng nấm sợi và nấm đảm trong metegenome của C và

BHR ............................................................................................ 66

Bảng 3.10. Số lượng trình tự tương đồng cao với các gene chức năng

trong tập dữ liệu chuẩn hóa ......................................................... 71

Bảng 3.11. Số lượng trình tự liên quan đặc thù tới con đường phân 2,4-

D và polychlorinated biphenyl (PCB) dựa trên cơ sở dữ

liệu KEEG ................................................................................... 72

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của PCDD, PCDF và PCB ................................. 4

Hình 1.2. Cơ chế tạo ra 2,3,7,8-TCDD trong quá trình tổng hợp 2,4,5-T ....... 5

Hình 1.3: Các con đường chuyển hóa, phân hủy, khoáng hóa hỗn hợp

chất diệt cỏ/dioxin và các chất trao đổi chất bằng phương

pháp sinh học. ................................................................................. 8

Hình 1.4. Nghiên cứu theo hướng -Omics trong sinh học ............................ 20

Hình 1.5. Các bước thực hiện phân tích metagenomic ................................. 22

Hình 2.1. Mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (ký hiệu C) ................... 27

Hình 2.2. Mặt cắt dọc của lô xử lý. ............................................................... 28

Hình 2.3. Mẫu đất trong lô xử lý bằng công nghệ phân hủy sinh học

(ký hiệu BHR) ............................................................................... 28

Hình 2.4. Sơ đồ thực hiện nghiên cứu .......................................................... 31

Hình 2.5. Quy trình phân tích dữ liệu DNA metagenome trên hệ thống

MG RAST ..................................................................................... 37

Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc 5 chủng vi khuẩn BHBi1, BHBi4,

BHBi5, BHBi7 và BHO9 từ mẫu làm giàu trên môi trường

MSM chứa dịch chiết đất .............................................................. 40

Hình 3.2. Hình thái tế bào 5 chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử quét ..... 41

Hình 3.3. Cây phát sinh chủng loại của 5 chủng vi khuẩn ........................... 41

Hình 3.4. Khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp

vi khuẩn A: Đối chứng (không có VSV); B: Tổ hợp 5 chủng

vi khuẩn ......................................................................................... 42

Hình 3.5. Hình thái khuẩn lạc 5 chủng xạ khuẩn và sinh trưởng của

chúng trên môi trường Gause M chứa DCĐ ................................. 43

vii

Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loài của chủng xạ khuẩn XKBH921 ........... 43

Hình 3.7. Khả năng sinh tổng hợp laccase- like của 5 chủng xạ khuẩn ....... 44

Hình 3.8. Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp xạ khuẩn ..... 45

Hình 3.9. Điện di đồ DNA mẫu nghiên cứu trên gel agarose ....................... 47

Hình 3.10. Đa dạng ở các mức độ khác nhau của metagenome C (vòng

ngoài) và BHR (vòng trong) trên cơ sở dữ liệu RefSeq ............... 51

Hình 3.11. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ ngành trong metagenome C và

BHR ............................................................................................... 52

Hình 3.12. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ lớp trong metagenome C và BHR ....... 53

Hình 3.13. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ bộ trong metagenome C và BHR ........ 54

Hình 3.14. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ họ trong metagenome C và BHR ........ 55

Hình 3.15. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ chi trong metagenome C và BHR ....... 56

Hình 3.16. Đa dạng vi khuẩn cổ mức độ ngành trong metagenome C và

BHR ............................................................................................... 63

Hình 3.17. Đa dạng vi khuẩn cổ ở mức độ lớp trong metagenome C và

BHR ............................................................................................... 63

Hình 3.18. Đa dạng vi khuẩn cổ ở mức độ chi trong metagenome C và

BHR ............................................................................................... 63

Hình 3.19. Đa dạng vi khuẩn cổ sinh metan trong metagenome C và BHR ...... 65

Hình 3.20. Đa dạng vi khuẩn cổ ưa mặn trong metagenome C và BHR ...... 65

Hình 3.21. Các chi vi khuẩn có tỷ lệ chiếm ưu thế ít chênh lệch trong

metagenome của mẫu C và BHR .................................................. 70

Hình 3.22. Tương quan gene liên quan đến chuyển hóa xenobiotic giữa

metagenome C và BHR. ............................................................... 71

viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chú thích

Độ C °C

1,2,3,7,8- 1,2,3,7,8-pentachlorodibenzo-p-dioxin PeCDD

2,3,7,8- 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin/ furan TCDD/F

2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (chất diệt cỏ) 2,4,5-T

2,4,5-TCP 2,4,5-trichlorophenol

2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

2,4-DCP 2,4-dichlorophenol

Base pair bp

Bộ Quốc phòng BQP

Coding sequence (Trình tự mã hóa) CDS

Clusters of Orthologous Groups (Cơ sở dữ liệu về gen và COG protein)

Cộng sự cs

Cơ sở dữ liệu CSDL

Dibenzofuran DBF

Chất diệt cỏ DC

Dịch chiết đất DCĐ

Dichlorophenol DCP

Dibenzo-p-dioxin DD

1-chloro-4-[2,2-dichloro-1-(4-chlorophenyl)ethyl]benzene DDD

1,1'-(2-chloroethane-1,1-diyl)bis(4-chlorobenzene) DDMS

1-chloro-4-[1-(4-chloro-phenyl) ethenyl]benzene DDNU

1,1,1-trichloro-2,2-di(4-chlorophenyl)ethane DDT

ix

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (Điện di trên gel DGGE građient biến tính)

ĐGMT Đánh giá môi trường

Deoxyribonucleic Acid DNA

European Bioinformatics Institute (Ngân hang cơ sở dữ liệu EBI Châu Âu)

evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous eggNOG Groups (Cơ sở dữ liệu về chú thích chức năng gen)

United States Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ EPA Môi trường Hoa Kỳ)

Gigabyte Gb

High Resolution Gas Chromatography Mass Spectrometry HR-GC/MS (Sắc ký khí khối phổ độ phân giải cao)

Integrated Microbial Genome (Hệ thống bộ gen vi sinh vật tích IMG hợp)

Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (Cơ sở dữ liệu về KEGG gen và con đường chuyển hóa giả định)

Mb Megabyte

Metagenomic Rapid Annotations using Subsystems

MG-RAST Technology (Hệ thống phân tích tự động metagenome trực

tuyến mã nguồn mở)

Multiple Sampling (Lấy mẫu đa điểm) MS

Open reading frame (Khung đọc mở) ORF

Open reading frame (Khung đọc mở) ORF

Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (Hydrocarbon thơm đa PAH nhân)

Polychlorinated biphenyl PCB

Polychlorinated dibenzo-p-dioxin PCDD

x

Polychlorinated dibenzofuran PCDF

Pentachlorophenol PCP

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PCR

Protein families database (Cơ sở dữ liệu protein) PFAM

Persistent Organic Pollutants (Hợp chất hữu cơ khó phân hủy) POPs

Part per trillion (10-12) Ppt

Tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam QCVN

Reference Sequence (Cơ sở dữ liệu trình tự tham chiếu) RefSeq

Ribonucleic Acid RNA

RT-PCR Real time PCR (Phản ứng chuỗi trùng hợp theo thời gian thực)

Single Strand Conformation Polymorphism (Đa hình cấu hình SSCP sợi đơn)

Trichlorophenol TCP

Toxic Equivalent Factor (Độ độc tương đương) TEF

Temperature Gradient Gel Electrophoresis (Điện di trên gel TGGE građient nhiệt)

TNT Trinitrotoluen

Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa T-RFLP hình chiều dài đoạn cắt cuối)

United States Agency for International Development (Cơ quan USAID phát triển quốc tế của Hoa Kỳ)

Vi khuẩn VK

Vi khuẩn kị khí VK KK

Vi khuẩn khử sulfate VK KSF

Vi sinh vật VSV

Xạ khuẩn XK

xi

1

MỞ ĐẦU

Gần 50 năm sau chiến tranh, hơn 100 triệu lít thuốc diệt cỏ chứa 2,3,7,8-

tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD là đồng phân dioxin độc nhất với độ

độc tương đương là 1 đã phun rải và hiện vẫn còn tồn lưu ở miền nam Việt Nam

(Cecil, 1986). Hỗn hợp chất độc tại các khu vực ô nhiễm khiến môi trường tự nhiên

bị phá hủy, sức khỏe di truyền của bệnh nhân phơi nhiễm bị ảnh hưởng qua nhiều

thế hệ, quần xã vi sinh vật (VSV) bị thay đổi mà vẫn chưa thể đánh giá chính xác

được. Do đó, ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nói riêng và ô nhiễm các hợp chất hữu cơ

khó phân hủy (POPs) nói chung cần phải được loại bỏ theo công ước Stockholm.

Do đó, nghiên cứu đánh giá vai trò thực chất của các quần xã vi sinh vật trong tự

nhiên cũng như trong các vùng đã và đang được xử lý khử độc là rất cấp thiết.

Trong 20 năm trở lại đây, số lượng nghiên cứu liên quan tới khả năng phân

hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi các VSV phân lập được, số lượng enzyme tham gia vào

con đường chuyển hóa cũng như đa dạng VSV không thông qua nuôi cấy (sử dụng

phương pháp đa hình cấu hình sợi đơn (Single-Strand Conformation Polymorphism

- SSCP, điện di trên gel građient biến tính biến tính (denaturing gradient gel

electrophoresis - DGGE, nhân gene theo thời gian thực (real time Polymerase Chain

Reaction – RT PCR) tăng dần nhằm xây dựng công nghệ xử lý ô nhiễm với hiệu

suất cao và triệt để hơn bởi vi sinh vật.

Ở Việt Nam, quy mô thử nghiệm và triển khai công nghệ xử lý khử độc bằng

phân hủy sinh học (Bioremediation) tăng dần từ pilot 0,5 m3 – 100 m3 ở sân bay Đà

Nẵng tới quy mô hiện trường 3.384 m3 ở sân bay Biên Hòa. Qua các công bố mới

được cập nhật, các VSV có khả năng nuôi cấy chiếm tỷ lệ rất thấp chỉ từ 0,001 đến

0,1% cho thấy hạn chế của các phương pháp nghiên cứu truyền thống đã thực hiện

trong nhiều thập niên qua. Do đó, việc áp dụng các công cụ nghiên cứu hiện đại trở

nên rất cần thiết để có thể từng bước hiểu rõ sự đa dạng và bản chất cấu trúc quần

xã VSV để từ đó cải tiến quy trình công nghệ hiện có nhằm rút ngắn thời gian và

2

nâng cao hiệu suất xử lý khử độc ô nhiễm hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin vẫn còn tồn

đọng ở Việt Nam và các loại chất hữu cơ khó phân hủy (POPs) khác trên thế giới.

Giải trình tự và phân tích nguyên liệu di truyền bằng cách tách DNA trực tiếp từ

mẫu đất ô nhiễm không thông qua nuôi cấy bằng hệ thống máy công năng cao thế hệ

mới Hiseq Illumina và các phần mềm tin sinh chuyên dụng sẽ khắc phục được hạn chế

của các phương pháp nghiên cứu truyền thống. Bởi vì kết quả thu được cung cấp thông

tin chi tiết về sự đa dạng VSV từ ngành, lớp, bộ, họ, chi cho đến loài cùng hệ gene

chức năng tồn tại cũng như đa dạng protein giả định và các con đường chuyển hóa

trong metagenome của mẫu nghiên cứu. Vì vậy, tại thời điểm này sử dụng công cụ

metagenomic với mẫu đất liên quan tới ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sẽ cung cấp bức

tranh đầy đủ nhất có thể về chủng loài và các mối quan hệ quần xã của vi sinh vật

nhằm nâng cao hiệu suất xử lý khử độc bằng công nghệ phân hủy sinh học không chỉ

áp dụng đối với ô nhiễm dioxin mà còn với các POPs khác.

Với các lý do trên, luận án nghiên cứu sinh đã được thực hiện và đây là

nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ nghiên cứu hiện đại với đất ô

nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa thuộc đối tượng đất đặc thù bởi

thành phần hóa học phức tạp để tách và làm sạch được DNA đủ chất lượng đáp ứng

yêu cầu của nghiên cứu. Mẫu ở 2 khu vực đã được chọn để nghiên cứu metagenome

gồm: đất từ khu Tây Nam Biên Hòa bị ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin có độ độc

trung bình 21.605 ng TEQ/kg và đất đã được xử lý làm sạch sau 60 tháng ở khu

chôn lấp Z1 có độ độc trung bình 13,2 ng TEQ/kg. Tên luận án của nghiên cứu sinh

là: ”Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở

Biên Hòa, Đồng Nai và đánh giá khả năng phân hủy của một số chủng phân

lập”. Kết quả về sự đa dạng và các đặc điểm, cấu trúc quần xã và khả năng phân

hủy dioxin của một số đại diện được trình bày trong luận án này là một phần số liệu

thu được từ đề tài độc lập cấp nhà nước “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật

vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm các gene, enzyme mới có khả

năng phân hủy dioxin” mã số ĐTĐLCN.13/14 do PGS. TS. Đặng Thị Cẩm Hà chủ

nhiệm và đã được nghiệm thu năm 2019.

3

1) MỤC TIÊU

Đánh giá đa dạng VSV trong (i) mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin và

(ii) mẫu đất đã được xử lý làm sạch bằng công nghệ phân hủy sinh học ở các lô

“Chôn lấp tích cực” sau 60 tháng ở sân bay Biên Hòa, Đồng Nai, Việt Nam bằng

công cụ metagenomic;

Đánh giá khả năng phân hủy hiếu khí dioxin trong đất ô nhiễm nặng hỗn hợp

chất diệt cỏ/dioxin bằng tổ hợp vi khuẩn (VK) và tổ hợp xạ khuẩn (XK) được phân

lập và lựa chọn từ các mẫu đất nghiên cứu.

2) NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Thu thập, bảo quản, phân tích thành phần cơ giới của mẫu đất ô nhiễm

chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa;

- Tách chiết, tinh sạch DNA từ các mẫu nghiên cứu và xác định trình tự

DNA bằng máy giải trình tự công năng cao thế hệ mới Illumina Hiseq 2500;

- Phân tích, đánh giá đa dạng VSV, đa dạng gene chức năng giả định từ

dữ liệu metagenome của các mẫu nghiên cứu;

- Đánh giá khả năng phân hủy hiếu khí dioxin trong đất ô nhiễm nặng

bằng tổ hợp vi khuẩn và xạ khuẩn được phân lập từ đất ô nhiễm chất diệt

cỏ/dioxin.

3) NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ metagenomic trong

nghiên cứu đa dạng VSV trong đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin, đất đã được xử

lý khử độc sạch ở sân bay quân sự Biên Hòa và phát hiện được sự rất đa dạng trong

các quần xã vi khuẩn, vi khuẩn cổ ưa mặn, loại halogen với số lượng các gene chức

năng mới như laccase và laccase-like tham gia vào phân hủy hợp chất xenobiotic

cùng sự đa dạng của nấm sợi, nấm men và nấm đảm;

- Bổ sung cơ sở khoa học giải thích sự thành công của công nghệ phân hủy

sinh học đã thực hiện ở sân bay Biên Hòa và khả năng cải tiến qui trình công nghệ,

nâng cao hiệu suất xử lý khử độc hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin có tổng độ độc rất cao

cũng như một số loại hình ô nhiễm POPs khác.

4

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin

1.1.1. Đặc điểm và ảnh hưởng của chất diệt cỏ/dioxin tới môi trường và con người.

Dioxin là gọi tắt của nhóm các chất hữu cơ khó phân huỷ với hai vòng thơm

gắn từ 1 đến 8 nguyên tử clo có quan hệ gần gũi với nhau về cấu trúc và tính chất

hóa học. Khi đề cập tới ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin là chủ yếu nhắc tới các nhóm

Policlodibenzo-p-dioxin (PCDD) có 75 chất và Polyclodibenzofuran (PCDF) có 135

chất, polyclobiphenyl (PCB) bởi chúng thường tồn tại dạng hỗn hợp của các chất

hóa học bền vững trong môi trường (Schecter, 2013; Van den Berg và cs., 1998).

Hai đồng phân của dioxin có độ độc cao nhất là 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin

(2,3,7,8-TCDD) và 1,2,3,7,8-pentachlorodibenzo-p-dioxin (1,2,3,7,8-PeCDD) với

tổng độ độc tương đương TEF (Toxic Equivalency Factor) là 1 (tổ chức Y tế thế

giới - WHO).

(Nguồn: Kulkami và cs., 2008)

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của PCDD, PCDF và PCB

Các PCDD, PCDF và PCB có tính không phân cực cao, độ hòa tan trong

nước rất thấp, có xu hướng tích lũy vào đất mùn, trầm tích, các vật chất kị nước như

mô mỡ động vật (Schreiner và cs., 1997) và rất bền vững trong tự nhiên. Dioxin có

thể di chuyển trên bề mặt đất, theo dòng nước và theo không khí gây ra ô nhiễm

môi trường trong phạm vi rộng và phức tạp. Thời gian bán huỷ của dioxin là 10-100

năm tùy vị trí và điều kiện tự nhiên. Thời gian bán huỷ của dioxin trong đất là 4.720

ngày (~13 năm), hexaclobenze là 1.530 ngày (4,2 năm), PCBs là 940 ngày (2,6

năm), PAHs là 570 ngày (1,6 năm), pentaclophenol 100 ngày. Trong cặn đáy ao hồ

hay còn gọi là trầm tích dioxin có thể tồn tại hàng trăm năm. Dioxin có nhiệt độ

5

nóng chảy khá cao, ngay cả ở nhiệt độ 1.200oC quá trình phân huỷ dioxin vẫn là quá

trình thuận nghịch, dioxin chỉ bị phân huỷ hoàn toàn ở nhiệt độ lớn hơn 1.200-

1.400oC.

(Nguồn: Schmalenberger và Tebbe, 2003)

Hình 1.2. Cơ chế tạo ra 2,3,7,8-TCDD trong quá trình tổng hợp 2,4,5-T

Hàng trăm triệu lít chất diệt cỏ chứa dioxin do Mỹ phun rải nhằm phát quang

các cánh rừng tại miền Trung và Nam Việt Nam làm hơn 4 triệu ha rừng đã bị phá

hủy hoàn toàn, sự tồn lưu chất diệt cỏ/dioxin trong đất từ đó phân tán bởi lớp nước

mặt, nước ngầm, tích tụ trong cơ thể sinh vật. Mặt khác, các sân bay đã từng được

sử dụng làm điểm tập kết, súc rửa thùng đựng, máy bay sau khi phun rải nên lượng

lớn chất độc còn tồn lưu làm biến đổi hệ sinh thái, giết chết rất nhiều động, thực vật

cũng như phá hủy hệ VSV đất. EPA đã công nhận dioxin là một chất gây ung thư

nhóm 1 cho con người ở tất cả các liều lượng khi đã phơi nhiễm (Van den Berg và

cs., 2006). Theo Angelo và cộng sự, PCBs có thể ảnh hưởng đến gan, đường ruột,

máu, hệ nội tiết, miễn dịch, hệ thần kinh và hệ sinh sản (D’Angelo và Nunez, 2010)

nên có thể di truyền cho nhiều thế hệ sau. Theo thời gian ô nhiễm, hệ VSV sẽ mất

dần là nguyên nhân đất bị sói mòn vì thiếu dưỡng chất.

1.1.2. Ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng

Ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam phần lớn do tồn dư bởi chiến tranh

hóa học do Mỹ gây ra từ 1961 và tập trung chủ yếu ở các sân bay quân sự cũ như

Biên Hòa, Đà Nẵng với các mức độ khác nhau.

6

Gần đây, cơ quan phát triển quốc tế hoa kỳ (United States Agency for

International Development – USAID) cùng Viện Khoa học và Công nghệ Quân sự

thuộc Bộ Quốc phòng (BQP) lấy từ 76 vị trí theo phương pháp lấy mẫu đa điểm

(MS) để điều tra mức độ ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa. Tổng

cộng thu thập hơn 1.400 mẫu và phân tích nồng độ dioxin đối chiếu với Tiêu chuẩn

quốc gia Việt Nam (QCVN 45:2012/BTNMT) và ngưỡng dioxin của BQP đối với

từng điểm lấy mẫu cho thấy ô nhiễm nặng nhất tập trung ở khu Tây Nam sân bay

(độ độc lên tới 110.000 ppt ở độ sâu 30 – 60cm).

Thống kê cho thấy khoảng 315.700 – 377.700 m3 và 92.800 – 117.600 m3

trầm tích ô nhiễm dioxin (42% ở khu Pacer Ivy, 24% ở khu Z1 (bao gồm cả Bãi

chôn lấp Z1 là khu vực có lô xử lý 3.384 m3 đất ô nhiễm bằng phương pháp phân

hủy sinh học được thực hiện bởi PGS. TS. Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự, Viện

Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), 15% ở

khu Tây nam, 19% ở các khu ZT, Tây bắc và Đông bắc và khoảng 5% tổng khối

lượng nhiễm dioxin nằm ở ngoài khu vực sân bay). Diện tích ô nhiễm ước tính là

khoảng 522.400 m2, trong đó có khoảng 369.600 m2 diện tích đất và 152.800 m2

diện tích trầm tích.

Tình trạng ô nhiễm dioxin ở sân bay Đà Nẵng được thể hiện trong Báo cáo

tổng kết của Văn phòng 33 và công ty Hatfield cho thấy khu vực đầu bắc sân bay

(khu pha trộn và đóng nạp) và khu Pacer Ivy (khu vực lưu trữ ở phía nam sân bay)

nồng độ TCDD cao nhất đạt tương ứng 361.000 ppt và 20.600 ppt ở độ sâu từ 0 – 10

cm với đồng phân 2,3,7,8-TCDD chiếm 99% và 65%. Viện Công nghệ Sinh học đã

tiến hành xử lý thử nghiệm ở quy mô 10 m3 và 100 m3 bằng biện pháp chôn lấp tích

cực với hiệu quả phân hủy dioxin từ 50-70% ở khu đầu bắc sân bay (Hà và cs., 2005).

Đã tiến hành xử lý khử độc đất ô nhiễm có độ độc cao hơn 43.000 ng TEQ/kg ở 11

công thức khác nhau ở qui mô pilot (2 m3) ngay tại sân bay Đà Nẵng, sau 6 tháng xử

lý 30% tổng độ độc đã bị loại bỏ tính chung cả các công thức hiếu khí và kị khí. Đây

là công trình hợp tác giữa viện công nghệ sinh học với Cục bảo vệ Môi trường Hoa

Kỳ (United States Environmental Protection Agency – EPA) năm 2009 với kinh phí

7

từ quỹ Ford (Hà và cộng sự , 2010). Lần đầu tiên ở Việt Nam và cũng là lần đầu tiên

trên thế giới công nghệ phân hủy sinh học khử dioxin (độ độc chủ yếu từ đồng phân

2,3,7,8 TCDD) sản xuất từ công nghệ cũ của những năm 50 của thế kỷ trước được

tiến hành ở qui mô lớn 3384 m3. Bằng sự kết hợp của thi công cơ giới, bán cơ giới (ở

một số công đoạn nhỏ) do các cán bộ khoa học của 2 cơ quan Viện KH&CN Việt

Nam và Bộ Quốc phòng đã cùng thực hiện công nghệ được gọi là: “Chôn lấp tích

cực”. Tháng 3 và 4/2009, Viện Công nghệ Sinh học đã phối hợp với các đơn vị của

Bộ Tư lệnh Hóa học xử lý 3.384 m3 đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại khu Z1 của sân

bay Biên Hòa. Trong các hố chôn lấp tích cực sự phân hủy sinh học xảy ra ở 3 điều

kiện hiếu khí (có oxy), kỵ khí (không có oxy) và kỵ khí không bắt buộc (có ít oxy).

Quá trình xử lý bao gồm thúc đẩy sự chuyển hóa, phân hủy và giai đoạn cuối cùng tốt

nhất là khoáng hóa hoàn toàn các hỗn hợp chất độc bao gồm dioxin (độc nhất) là

2,3,7,8-TCDD (chiếm từ 90 - 99,63% tổng độ độc), 2,4,5-T, 2,4-D, TCP, DCP và các

PAH có nhiều vòng thơm v.v.

Năm 2009 Bộ quốc phòng Việt Nam và cụ thể là Bộ Tư lệnh Hóa học đã

chôn lấp hơn 90.000 m3 trong khuôn khổ dự án ở khu vực Z1 và 3.384 m3 đất thuộc

dự án này đã được làm sạch bằng công nghệ phân hủy sinh học như đã đề cập ở trên.

Năm 2011, USAID và BQP Việt Nam cùng phối hợp thực hiện Dự án Xử lý Môi

trường tại Sân bay Đà Nẵng sử dụng phương pháp khử hấp thu nhiệt và lưu chứa.

Đất, bùn nhiễm dioxin được đưa vào mố kín trên mặt đất và nung nóng tới nhiệt độ

tối thiểu 335ºC để tiêu hủy dioxin. Dự án đã xử lý hơn 90.000 m3 đất, trầm tích ô

nhiễm trầm tích nhiễm dioxin nồng độ thấp và đã bàn giao vào cuối năm 2018. Tuy

nhiên, sản phẩm sau khi sử dụng phương pháp giải hấp phụ nhiệt vẫn gây nhiều tranh

cãi về hiệu quả môi trường và sản phẩm cuối cùng vẫn còn phải xử lý tiếp.

1.1.3. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin trong đất ô nhiễm

Do đất bị ô nhiễm ở mức rất nặng, phức tạp và kéo dài nên việc xử lý triệt để

tuân thủ công ước Stockholm là rất cần thiết. Hiện có rất nhiều phương pháp hóa

học, lý học, sinh học được đề xuất để xử lý nhưng cần có những nghiên cứu kỹ

trước khi áp dụng. Quá trình phân hủy sinh học có thể xảy ra theo 4 con đường chủ

8

yếu (Báo cáo kết quả nhiệm vụ chôn lấp tích cực thuộc dự án “Xử lý khu đất nhiễm

chất độc hóa học chứa Dioxin tại sân bay Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai” do Bộ Tư lệnh

Hóa học - Bộ Quốc phòng làm chủ đầu tư và thực hiện năm 2009). Ba con đường

oxy hóa cắt vòng, loại clo các hợp chất hữu cơ thơm đã được mở vòng và xúc tác

bởi các enzyme ngoại bào hay các chất xúc tác không có cấu trúc enzyme nhưng

hoạt động như enzyme đều cần oxy và con đường thứ tư là loại khử clo đối với các

chất hữu cơ đa vòng thơm (Hình 1.3). Tất cả các quá trình nêu trên được thực hiện

bởi tập đoàn vi sinh vật bản địa trong các tầng đất của lô “Chôn lấp tích cực”.

Hình 1.3: Các con đường chuyển hóa, phân hủy, khoáng hóa hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin và các chất trao đổi chất bằng phương pháp sinh học.

Sản phẩm trung gian của con đường khử loại clo là các hợp chất bớt độc hơn

do loại khử bớt clo. Các sản phẩn tạo ra theo các con đường khác rất phong phú ở

mỗi giai đoạn và điều kiện môi trường luôn biến động tạo cơ hội cho các quần xã vi

sinh vật hoạt động phân hủy, chuyển hóa và sản phẩm cuối cùng của 4 con đường

trao đổi chất nói trên là các chất đi vào chu trình Krebs trước khi được khoáng hóa

tới các axit hữu cơ, nước, CO2 và sinh khối vi sinh vật.

1.1.3.1. Phân hủy sinh học hiếu khí xenobiotic và chất diệt cỏ/dioxin

Chất diệt cỏ/dioxin gồm 2 nhóm là chứa và không chứa clo với cơ chế phân

hủy khác nhau bởi VSV trong các điều kiện khác nhau.

Phân hủy sinh học hợp chất dioxin không chứa clo

Cấu trúc dạng vòng dễ bị quá trình oxy hóa (bởi hệ enzyme được sinh bởi các

vi sinh vật) phá vỡ làm giảm độc tính của dioxin. Quá trình hydroxyl hóa vòng thơm

xuất hiện ở vị trí bên các nguyên tử carbon 1,2; 2,3 hoặc 3,4 như Novosphingobium

9

aromaticivorans IFO15084, N. stygium IFO 16085, N. sunterraneum IFO 16086,

Porphyribacter sanguineus IAM 12620T, Sphingobacterium yanoikuyae B1,

Burkholderia cepacia F297, B. cepacia ET4, Ralstonia sp. SBUG290, Pseudomonas

sp. HL7b v.v. (Hong và cs., 2007) hoặc các vị trí góc 4,4a như Cycloclasticus pugetti,

Comamonas sp. KD7, Rhodococcus sp. NCIMB 12038, Rhodococcus opacus SAO

101 và Rhodococcus sp. HA01 (Chang, 2008). Quá trình này sinh ra các chất trao đổi

trung gian có màu vàng nhạt đến vàng lẫn nâu nhạt (hấp thụ ở bước sóng 460nm)

(Johnson, 2008).

Phân hủy dioxin và các chất tương tự bởi oxy hóa kép vị trí góc như

Sphingomonas sp. HH19k; Sphingomonas sp. HH69; Burkholderia sp. JB1;

Burkholderia sp. LB400; Ralstonia sp. SBUG 290; Pseudomonas sp. F274, v.v.

cũng đã được Fortnagel và cộng sự chứng minh (Fortnagel và cs., 1989). Wittchi và

cộng sự đã công bố về oxy hóa vị trí góc bởi enzyme dioxin dioxygenease từ

Sphingomonas wittchi RW1.

Phân hủy sinh học hợp chất dioxin chứa clo

Quá trình xảy ra theo cơ chế đồng trao đổi chất. Theo nghiên cứu của Field và

Sierra-Alvarez, 84% công bố vi khuẩn (VK) thuộc các chi Rhodococcus, Beijerinckia,

Pseudomonas, Bacillus, Sphingomonas, Terrabacter, Burkholderia, Klebsiell,

Alcaligenees có khả năng phân hủy các PCDDs và PCDFs chứa 1 hoặc 2 clo (Field và

Sierra-Alvarez, 2008). Các hợp chất PCDD/F chứa 5 nguyên tử clo hoặc nhiều hơn thì

mức độ bị phân hủy sinh học hiếu khí cũng khó hơn. Chủng Sphingomonas wittchii

RW1 có khả năng chuyển hóa chậm 1,2,3,4,7,8-HCDD; 2,7-DCDD; 1,2,3-TriCDD;

1,2,3,4-TCDD và 1,2,3,4,7,8-HxCDD thành các chlorocatechol tương ứng nhưng lại

không thể chuyển hóa 2,3,7-TriCDD và 1,2,3,7,8-PeCDD. Schreiner và cộng sự khảo

sát quá trình phân hủy sinh học bởi chủng Sphingomonas sp. HH69 cho thấy 31%

2,3,7,8-TCDF và 15% 2,3,7,8-TCDD đã bị loại bỏ trong 84 ngày (Schreiner và cs.,

1997). Chủng vi khuẩn Pseudomonas sp. PSX cũng phân hủy 64% lượng 2,3,7,8-

TCDF và 82% lượng 2,3,7,8-TCDD trong cùng thời gian.

10

Phân hủy sinh học hiếu khí chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam

Vi sinh vật trong các công thức xử lý tại sân bay Đà Nẵng năm 2009 (dự án

hợp tác với EPA Hòa Kỳ được Quỹ For tài trợ) cho thấy số lượng dao động trong

khoảng 102-105 CFU/g và thay đổi theo thời gian bổ sung chế phẩm và đảo trộn

đất. Vi khuẩn có số lượng cao nhất rồi đến nấm sợi và xạ khuẩn. Chúng sinh trưởng

trên môi trường chứa chất diệt cỏ/dioxin như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất

hay sử dụng chất độc theo cơ chế đồng trao đổi chất.

Hỗn hợp vi khuẩn của SETDN 20 được làm giàu từ lô đất xử lý tẩy độc bằng

phân hủy sinh học ở Đà Nẵng, loại bỏ 17,9% tổng độ độc trong đó đồng phân

2,3,7,8-TCDD giảm từ 4.299 ppt xuống còn 3.528 ppt sau 60 ngày nuôi cấy trên

môi trường xử lý chứa dịch chiết đất. Một số chủng có khả năng phân hủy dioxin;

2,4,5-T; 2,4-D và các PAHs đa vòng (pyren và fluoranthen) đã được chứng minh

như Streptomyces sp. XKDN11, Streptomyces sp. XKDN19, Streptomyces sp.

XKDNR1, Brevibacillus sp.XKDN3, Brebacillus sp. BDNR10, Bacillus sp. BDN6,

Bacillus sp. BU3, Pseudomonas sp. BDN15, Pseudomonas sp. BDNR1,

Pseudomonas sp. Setdn1, Aspergillus sp. FDN9, Aspergillus sp. FDN20. Chủng

Rhodococcus sp. HDN3 và Terrabacter sp. DMA phân hủy hoàn toàn DBF với

nồng độ 4 mM sau 24 và 48 giờ nuôi cấy tương ứng.

Ngoài ra, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam phối hợp Bộ Tư lệnh Hóa học - Bộ Quốc phòng tiến hành khử độc thành công 3.384 m3 đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa.

Số lượng VSV hiếu khí tùy tiện sử dụng dioxin như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất dao động từ 3,3x104 đến 8,7x107. Sau 27 tháng xử lý, tổng độ độc của dioxin

trong các mẫu đất giảm từ 10.000 ng TEQ/kg đất khô xuống còn 52 ng TEQ/kg đất khô, hiệu quả xử lý đạt 99,48%. Ở Đà Nẵng với các công thức gồm 0,5 m3, 1,5 m3, 10 và 100 m3 cũng được thực hiện với độ độc giảm từ 32,84% đến 71,04% sau 1 tháng

và giảm 50-70% sau gần 2 năm xử lý (Hà và cs., 2008).

1.1.3.2. Phân hủy sinh học kị khí chất diệt cỏ/dioxin

Phân hủy sinh học kị khí chất diệt cỏ/dioxin chứa clo

Các vi khuẩn kị khí tham gia vào quá trình loại khử clo cũng khá đa dạng,

bao gồm nhóm vi khuẩn khử sulfate như Desulfovibrio, Desulfitobacterium,

11

Desulfomonile, nhóm Dehalobacter, Dehalococcoides, Dehalogenimonas v.v. được

xếp vào ba ngành chính là Chloroflexi, Firmicute và Proteobacteria (Hiraishi, 2008;

Maphosa và cs., 2010).

Chủng Dehalococcoides ethenogenes 195 có khả năng loại khử clo của 1,2,3,4-

TCDD thành 1,2,4-TrCDD; 1,3-DiCDD; loại clo của hexachlorobenzene thành 1,2,3,5-

tetrachlorobenzene; loại clo của 2,3,4,5,6-petachlorobiphenyl thành 2,3,4,6-

tetrachlorobenzene; 1,3,5-trichlorobenzene; loại clo của 1,2,3,4-tetrachloronaphthalene

tạo ra các đồng phân dichloronaphthalene chưa xác định (Fennell và cs., 2004). Việc bổ

sung 1,2,3,4-TCB và 2,3,4,5-tetrachloroanisole đã tăng cường quá trình loại clo của

1,2,3,4-TCDD và TCDF của VSV trong các trầm tích (Hiraishi, 2008). Các vi khuẩn

thuộc chi Dehalococcoides có thể loại khử clo của hợp chất hữu cơ chứa nhiều clo

thành các hợp chất có độ độc giảm và chứa ít clo để các VSV hiếu khí phân hủy tiếp

bằng cách oxy hóa mở vòng (Bunge và Lechner, 2009).

Phân hủy sinh học hiếu khí-kị khí chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam

Nguyễn Bá Hữu trong nghiên cứu luận án tiến sỹ của mình đã sử dụng các

phương pháp nghiên cứu như Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (Điện di trên

gel građient biến tính – DGGE), Single Strand Conformation Polymorphism (Đa

hình cấu hình sợi đơn – SSCP) để nghiên cứu cấu trúc tập đoàn VSV, tập đoàn vi

khuẩn hiếu khí, vi khuẩn kị khí tùy tiện và nhóm Dehalococcoides trong các mẫu

bùn hồ, mẫu đất và trầm tích ở một số lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng (Hữu và cs.,

2006; 2007). Một số dòng vi khuẩn ở bùn hồ thuộc các lớp α-proteobacteria,

Chlorobi, Chloroflexi, Sulfuricurvum, Fusobacteria, Nitrospiraceae, vi khuẩn chưa

xác định và vi khuẩn Dehalococcoides bước đầu đã được phát hiện sự có mặt trong

lô xử lý 10 m3 ở Đà Nẵng. Số lượng VSV ban đầu trong các công thức xử lý kị khí

rất thấp (từ 1 tế bào đến 5,1x102 MPN/g ) và đạt từ 2,95x102 đến 3,02x107 sau 6

tháng xử lý mặc dù tổng độ độc ban đầu rất cao 43.000 ng TEQ/kg. Bên cạnh đó,

biến động về tập đoàn vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn sử dụng chất diệt cỏ/dioxin làm

nguồn cacbon và năng lượng duy nhất và cơ chế đồng trao đổi chất cũng được thực

hiện trong báo cáo (Hà và cs., 2010). Nếu tính tốc độ khử độc trung bình trên ngày

12

thì ở các công thức xử lý hiếu khí lên tới 100 ng TEQ/kg/ngày và 50 ng

TEQ/kg/ngày ở các công thức xử lý kị khí.

Nguyễn Thị Tâm Thư cũng đã thực hiện đề tài nghiên cứu sinh của mình và đã

phát hiện được cả 3 nhóm vi khuẩn hô hấp loại khử clo bao gồm loại khử clo bắt buộc

(Dehalococcoides, Dehalogenimonas), loại khử clo không bắt buộc (Desulfovibrio,

Desulfitobacterium, Desulfuromonas) và loại khử clo đồng trao đổi chất (Pseudomonas,

Shewanella, Clostridium) và đa dạng vi khuẩn khử sulfate (VK KSF) trong các lô xử lý

bằng phương pháp DGGE với mẫu từ các lô xử lý ở Đà Nẵng và Biên Hòa (Thư, 2013).

1.2. Đa dạng VSV và gene chức năng trong đất ô nhiễm chất diệt

cỏ/dioxin

1.2.1. Đa dạng VSV hiếu khí nuôi cấy được trong đất ô nhiễm

Tập đoàn VSV hiếu khí có khả năng phân hủy chất độc khá phong phú trong

các loại hình đất ô nhiễm POPs và các chất tương tự gồm nấm sợi, vi khuẩn và xạ

khuẩn đã được ghi nhận ở Việt Nam (Hà và cs, 2005).

Hong và cộng sự đã chứng minh chủng vi khuẩn Pseudomonas veronii PH-

03 có thể phân hủy được một số đồng loại dioxin và furan: dibenzo-p-dioxin (DD);

dibenzofuran (DBF); 1-MCDD và 2-CDD (Hong và cs., 2004). Chủng

Hydrocarboniphaga effusa strain AP103 phân lập từ đất nhiễm dầu máy ở New

Jersey. Một số vi khuẩn thuộc chi Microbacterium đã được công bố về sự có mặt

trong mẫu đất ô nhiễm dioxin tại Nhật Bản (Hiraishi, 2003) và đất nhiễm chất diệt

cỏ dioxin tại sân bay quân sự Đà Nẵng (Hữu, 2007).

Hiện nay, công bố về khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD bởi các chủng VSV

thuần khiết trên thế giới có rất ít. Các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào khả năng

phân hủy các đồng phân ít độc của dioxin bởi các chủng nấm có khả năng sinh

enzyme ngoại bào như Acremonium sp. 622, Cordyceps sinensis A, Phanerochaete

chrysosporium IFO31249, Phanerochaete sordida YK-624 v.v. (Nakamiya và cs.,

2002; Ishii và cs., 2004) và một số chủng vi khuẩn thuộc các chi Rhodococcus,

Beijerinckia, Pseudomonas, Bacillus, Sphingomonas, Terrabacter, Burkholderia,

Klebsiella, Alcaligenes, Erwinia, Nocardioides, Ralstonia, Novosphingobium,

13

Sphingobacterium v.v. (Field và Sierra-Alvarez, 2008). Các chi này thuộc 2 ngành

Proteobacteria và Actinobacteria. Khả năng phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD bởi

đơn chủng nấm đảm FBV40 và hỗn hợp 3 chủng nấm FBV40, FBD154 và FNBLa1

cũng được thông báo.

Bên cạnh phát hiện vi khuẩn, nấm sợi và xạ khuẩn với khả năng sinh laccase và

laccase-like là các enzyme đã được chứng minh có khả năng phân hủy chất diệt

cỏ/dioxin. Các chủng xạ khuẩn như Streptomyces sp. M7 được phân lập từ nước thải

trầm tích có khả năng sử dụng γ-HCH (Alvarez và cs., 2012), Streptomyces werraensis

và Streptomyces rochei phân lập từ đất thể hiện khả năng phân hủy plastic,

Streptomyces badius, S. setnii và S. viridosporous phân lập từ Ấn Độ đã được thông

báo có khả năng phân hủy LDPE (Arutchelvi và cs., 2007), Streptomyces sp. ERI-

CPDA-1 có thể phân hủy PAHs trong đất nhiễm ở Chennai, Ấn Độ (Balachandrana và

cs., 2012), Streptomyces rochei 303 phân hủy pentachlorophenol (PCP) (Zaborina và

cs., 1997).

Bộ sưu tập giống VSV có khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD hoặc 2,4,5-T; 2,4-

D, DBF, PAH v.v. của cộng sự thuộc phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường đã

được định danh gồm Streptomyces sp. XKDN11, Streptomyces sp. XKDN19,

Streptomyces sp. XKDNR1, Brevibacillus sp.XKDN3, Brebacillus sp. BDNR10,

Bacillus sp. BDN6, Bacillus sp. BU3, Pseudomonas sp. BDN15, Pseudomonas sp.

BDNR1, Pseudomonas sp. Setdn1, Aspergillus sp. FDN9, Aspergillus sp. FDN20 v.v.

1.2.2. Đa dạng vi khuẩn kị khí nuôi cấy được trong đất ô nhiễm dioxin

1.2.2.1. Vi khuẩn hô hấp loại khử clo

Các nghiên cứu đã chỉ ra 12 chi vi khuẩn tham gia hô hấp loại khử clo đã được

công bố gồm: Desulfitobacterium, Dehalobacter, Desulfuromonas, Desulfomonile,

Desulfovibrio, Dehalospirillum, Sulfurospirillum, Anaeromyxobacter, Geobacter,

Dehalococcoides, Dehalobium, Dehalogenimonas và một số vi khuẩn không nuôi cấy

thuộc 3 ngành chính là Chloroflexi, Firmicutes, Proteobacteria (Smidt và cs., 2000;

Hiraishi, 2008; Richardson, 2013).

14

Dựa vào đặc tính và sinh lý, vi khuẩn hô hấp loại khử clo được chia thành 2

nhóm là vi khuẩn hô hấp loại khử clo bắt buộc và không bắt buộc.

Vi khuẩn hô hấp loại khử clo không bắt buộc (vi khuẩn khử sulfate-

đóng vai trò chủ đạo)

Vi khuẩn khử sulfate (VK KSF) được chia thành 6 phân nhóm với các đại

diện có khả năng loại clo của hợp chất hữu cơ chứa clo gồm: nhóm 1

(Desulfuromaculum), nhóm 2 (Desulfobulbus), nhóm 3 (Desulfobacterium), nhóm 4

(Desulfobacter), nhóm 5 (Desulfococcus, Desulfovibrio, Desulfosarcina,

Desulfonema), nhóm 6 (Desulfovibrio, Desulfomicrobium) (Boyle và cs., 1999;

Reineke, 2001; Muyzer và Stams, 2008; D’Angelo và Nunez, 2010). Ngoài ra,

nhiều vi khuẩn khử sunlfate cũng tham gia loại clo của các hợp chất hữu cơ chứa

clo như các đại diện thuộc chi Desulfitobacterium, Desulfomonas, Desulfomonile

(Kranzioch và cs., 2013).

Các vi khuẩn khử sulfate thuộc các chi Desulfitobacterium, Desulfovibrio,

Desulfomonile, Desulfuromonas, Desulfobacterium có khả năng loại khử clo của cả

các hợp chất hữu cơ vòng thơm chứa clo (chlorobenzene, chlorophenol) và mạch

thẳng (PCE, TCE). Trong số đó, Desulfovibrio là chi kị khí không bắt buộc và có

khá nhiều nghiên cứu trên thế giới về khả năng hô hấp loại halogen (clo, brom) của

một số hợp chất halogen hữu cơ, chi này đã được xác định là có mặt trong lô xử lý ở

sân bay Đà Nẵng (Sun và cs., 2000; Boyle và cs., 1999; Häggblom và cs., 2006;

Sánh và cs., 2005).

Có thể kể đến một số chủng thuộc chi Desulfovibrio được nghiên cứu trên

thế giới như: Chủng Desulfovibrio dechloracetivorans SF3 phân lập từ biển có khả

năng loại clo ở vị trí ortho của 2-chlorophenol và 2,6-dichlorophenol tạo ra phenol

(Sun và cs., 2000); Chủng Desulfovibrio phân lập từ vùng bùn cửa sông có thể sinh

trưởng trên lactate kết hợp với loại khử halogen của 2,4,6-tribromphenol (Boyle và

cs., 1999); Chủng Desulfovibrio sp. 2BP-48 đơn lẻ có khả năng khoáng hóa 2-

bromophenol kết hợp với quá trình khử sulfate và kết hợp chủng Desulfovibrio khác

15

có thể loại khử halogen của các chất 2-bromophenol, 2,6-dibromophenol, 2-

iodophenol tạo ra phenol (Häggblom và cs., 2006).

Theo Drzyzga, chủng Desulfovibrio sp. TBP1 có khả năng loại khử brom của

các hợp chất chứa brom trong trầm tích biển như 2-bromo-; 4-bromo-; 2,4-dibromo-

; 2,6-dibromo-; 2,4,6-tribromophenol (Drzyzga và cs., 2001). Chi Desulfovibrio và

Desulfitobacterium cùng tồn tại trong mẫu làm giàu từ đất ô nhiễm PCE và loại clo

2-/PCE cao. Theo Boyle và cộng sự, các loài Desulfovibrio gigas, D.

của hợp chất này đến 1,2-DCE. Chi Desulfovibrio chiếm ưu thế trong môi trường có

tỷ lệ SO4

africanus, Desulfococcus multivorans có khả năng loại clo của lindane tới benzene

và chlorobenzene trong vòng 48 giờ (Boyle và cs., 1999). Vi khuẩn thuộc chi

Desulfitobacterium có khả năng loại khử clo của hợp chất chứa clo mạch thẳng và

vòng thơm nhưng lại khó phân lập, nuôi cấy (Ritalahti và Löffler, 2004).

Ngoài ra, một số VK KSF thuộc các chi khác cũng có khả năng hô hấp loại

clo như chủng Desulfomonile tiedjei DCB-1 và loài D. liminaris loại khử clo của 3-

chlorobenzoate tạo thành benzoate (Muyzer và Stams, 2008). Desulfococcus

multivorans có khả năng loại clo của lindane tới benzene và chlorobenzene trong

vòng 48 giờ (Boyle và cs., 1999). Các vi khuẩn có khả năng loại khử PCB được

phát hiện ở sông Ohio bị nhiễm PCB với mức độ 0,01-8,5 mg/kg bùn bao gồm

Geobacter, Desulfitobacterium, Desulforomonas, Desulfomonile (D’Angelo và

Nunez, 2010). Trong mẫu nuôi cấy các vi khuẩn phân hủy PCE đến ethene cũng có

mặt các VK KSF như Desulfomonile, Desulfitobacterium (Kranzioch và cs., 2013).

Vi khuẩn kị khí loại khử clo bắt buộc (Dehalococcoides)

Các vi khuẩn nhóm này khó phân lập và nuôi cấy bởi chúng không có khả

năng sử dụng chất không chứa clo để sinh trưởng gồm các chi Dehalobacter,

Dehalococcoides, Dehalogenimonas, Dehalobium và một số đại diện thuộc ngành

Chloroflexi không nuôi cấy (Hiraishi, 2008). Do đó, nhóm vi khuẩn này đóng vai

trò rất quan trọng trong quá trình xử lý các chất ô nhiễm hữu cơ chứa clo (Lee và

cs., 2006; Krajmalnik-Brown, 2005; Richardson, 2013). Vi khuẩn được nghiên cứu

16

nhiều nhất là Dehalococcoides sử dụng H2 làm chất cho điện tử và các chất hữu cơ

chứa clo như pyruvate, lactate, furmarate, formate v.v. làm chất nhận điện tử để

sinh trưởng và chúng thường tồn tại dưới dạng tập đoàn (Hug và cs., 2012).

Futagami và cộng sự đã chứng minh chỉ có nhóm vi khuẩn Dehalococcoides có khả

năng loại khử clo của PCE, TCE tới hợp chất ethene hoàn toàn không độc thay vì

hợp chất 1,2-cis-DCE là sản phẩm cuối cùng (Futagami và cs., 2008); (Kranzioch

và cs., 2013). Các nhà khoa học xem Dehalococcoides là thợ loại khử clo.

Hiện nay, nghiên cứu khả năng loại khử clo bởi các quần xã và chủng

Dehalococcoides thuần khiết khác nhau đã được thực hiện. Löffler đã xác định

được loài Dehalococcoides mccartyi gen. nov với 6 chủng (gồm các chủng 195 –

chiếm đa số, CBDB1, BAV1, VS, FL2 và GT) (Löffler và cs., 2013). Henrickson lại

chia các vi khuẩn Dehalococcoides thành 3 nhóm là Cornell, Victoria và Pinellas.

Trong rất nhiều nghiên cứu đất, trầm tích ô nhiễm các chất xenobiotic đã

phát hiện thấy chi Pseudomonas luôn chiếm ưu thế và có mặt ở rất nhiều loại môi

trường với nồng độ chất ô nhiễm khác nhau. Chính vì vậy sự đa dạng của chi vi sinh

vật này đã được nghiên cứu sinh tổng hợp từ các công bố được trình bày dưới đây.

1.2.2.2. Đa dạng vi khuẩn Pseudomonas

Rất nhiều công bố đã phân lập và nghiên cứu khả năng chuyển hóa, phân hủy

các hợp chất đa vòng thơm và các hợp chất halogen, có thể kể đến: Pseudomonas

sp. PS14 phân hủy 1,2,3,5-TCB bằng enzyme benzene dioxygenase,

chloromuconate cycloisomerase, maleylacetate reductase (Reineke, 2001);

Pseudomonas sp. B13 phân hủy 3-chlorobenzoate, 4-chlorophenol như nguồn

carbon duy nhất và 2-3-chloro-phenol như nguồn carbon đồng trao đổi chất;

Pseudomonas putida GJ31 phân hủy chlorobenzene tới 3-chlorocatechol;

Pseudomonas pickettii loại clo của 2,4,6-TCP thành 2,6-dichlorohydro-quinone

(Reineke, 2001); Pseudomonas sp. WR912 có khả năng sinh trưởng trên 3-chloro-;

4-chloro-; 3,5-dichlorobenzoate. Chủng P. aeruginosa JB2 sinh trưởng kị khí trên

17

2,5-dichlorobenzoate. Chủng P. veronii PH-03 có khả năng sinh trưởng trên môi

trường chứa dioxin là nguồn carbon và năng lượng duy nhất. Chủng này phân hủy

được 90,7% DD; 79,7% DBF; 88,3% 1-MCDD; 78,6% 2-CDD 1 mM sau 60 giờ

(Hong và cs., 2004). Chủng vi khuẩn P. aeruginosa phân lập từ bùn hoạt tính hay từ

đất tham gia loại khử clo của 1,1,1-trichloro-2,2-di(4-chlorophenyl)ethane (DDT)

thành 1-chloro-4-[2,2-dichloro-1-(4-chlorophenyl)ethyl]benzene (DDD) ở điều kiện

kị khí, sau đó chúng chuyển hóa tiếp bằng cách cắt vòng thơm ở điều kiện hiếu khí.

Dịch chiết tế bào của Pseudomonas có thể phân hủy các sản phẩm DDT, DDD, 1,1'-

(2-chloroethane-1,1-diyl)bis(4-chlorobenzene) (DDMS), 1-chloro-4-[1-(4-chloro-

phenyl) ethenyl]benzene (DDNU) theo con đường chuyển hóa kị khí (Gohil, 2011).

Nghiên cứu đa dạng VSV các lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng bằng phương

pháp DGGE hay SSCP cho thấy VK thuộc chi Pseudomonas có mặt và chiếm đa số

trong các lô xử lý với số lượng các dòng khác nhau (Hữu và cs., 2007; Hữu, 2009).

Ngoài ra, chủng Pseudomonas sp. SETDN1 phân lập từ lô xử lý 10 DNT sinh

trưởng trên môi trường chứa dịch chiết đất bao gồm 2,4-D; 2,4,5-T; TCDD; PCDD;

PCDF (Sánh và cs., 2005). Chủng Pseudomonas sp. BDN15 sinh trưởng trên môi

trường muối khoáng chứa 2,4,5-T ở nồng độ 1.000 ppm như nguồn carbon và năng

lượng duy nhất (Phương và cs., 2005). Hỗn hợp chủng SETDN20 nuôi kị khí không

bắt buộc trong phòng thí nghiệm có khả năng phân hủy 17,9% tổng độ độc sau 60

ngày với nồng độ 4.299 pg TEQ/ml. Bằng phương pháp DGGE đã xác định hỗn

hợp này có ít nhất 3 chủng vi khuẩn (Sánh và cs., 2007). Chủng Pseudomonas sp.

HR5.1 phân lập từ bioreactor xử lý chất độc hóa học có mặt 2,4,5-T ở nồng độ 200

ppm (Long và cs., 2009). Chủng Pseudomonas sp. BQNR có khả năng phân hủy

trinitrotoluen (TNT) tới nồng độ 600 ppm (Hà và cs., 2009). Ngoài ra, một số gene

mã hóa cho enzyme tham gia phân hủy 2,4-D; 2,4,5-T của Pseudomonas cũng đã

được công bố trong kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Tâm Thư và cộng sự bằng

công cụ metagenomic.

18

1.2.3. Đa dạng gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia phân hủy chất diệt

cỏ/dioxin

Việt Nam đã có một số công bố về phân hủy sinh học 2,4-D và 2,4,5-T,

Nguyễn Lan Hương và cộng sự phân lập được một số VK thuộc nhóm

Burkholderia, Sphingomonas, Ralstonia chứa gen tfdA, tfdA và tftA (cadA).

Nguyễn Bá Hữu và cộng sự đã xác định được số lượng bản sao gen tfdA trong 1 g

đất ô nhiễm từ 1,06x105 đến 5,99x106 và xác định sự có mặt của gen mã hóa

dioxygenase, tfdA, tftA trong 3 chủng vi khuẩn phân lập Paenibacillus sp. Ao3,

Terrabacter sp. DMA và Rhodococcus sp. HDN3 (Hữu và cs., 2009). Phùng Khắc

Huy Chú và cộng sự cũng phát hiện thấy hai chủng Pseudomonas sp. BHNA1 và

Acinetobacter sp. BHNB1 có mang gene chức năng tfdA (Chú và cs., 2012). Như đã

đề cập, trong dự án hợp tác khử độc dioxin ở sân bay Đà Nẵng năm 2009 với Cục

bảo vệ môi trường Hoa Kỳ các tác giả Việt Nam đã xác định số lượng bản sao của

gene chức năng C230 (Catechol 2,3 dioxygenase). Kết quả định lượng cho thấy số

bản sao của gen C230 được phát hiện ở tất cả các mẫu phân tích với số lượng dao

động từ 2,1 x105 ở mẫu M9.0 đến 6,7x106 ở M8.3 (Hà và cs., 2010).

Với dioxin và các hợp chất tương tự, quá trình phân hủy thường diễn ra trong 2

điều kiện là hiếu khí và kị khí bởi VSV cũng như hệ enzyme khác nhau. Một số VK

mang gen mã hóa enzyme dioxin dioxygenase có khả năng oxy hóa vị trí bên như

Novosphingobium aromaticivorans IFO15084, N. stygium IFO 16085, N.

sunterraneum IFO 16086, Porphyribacter sanguineus IAM 12620T, Sphingobacterium

yanoikuyae B1, B. cepacia F297, B. cepacia ET4, Ralstonia sp. SBUG290,

Pseudomonas sp. HL7b v.v. Kubota và cộng sự (2005), Sphingomonas wittichii RW1

(Hartmann, 2014) hoặc cả vị trí góc như Cycloclasticus pugetti, Comamonas sp. KD7,

Rhodococcus sp. NCIMB 12038, Rhodococcus opacus SAO 101 (Chang, 2008) và

Rhodococcus sp. HA01 (Hamdy và Aly, 2008). Bên cạnh đó còn 1 số enzyme có thể kể

đến như toluene monooxygenase, toluene dioxygenase, phenol monooxygenase và

methane monooxygenase. Một số chủng nấm chứa hệ enzyme oxy hóa ngoại bào

(ligninolytic enzyme) và enzyme nội bào (cytochrome P450 monooxygenase,

arylalcohol dehydrogenase, arylaldehyde dehydrogenase) (Stella và cs., 2013) phân

19

hủy dioxin cũng được chứng minh như Cerrena sp. F0607, Pleurotus ostreatus

(Hidayat và Tachibana, 2013).

Tuy các enzyme tham gia phân hủy kị khí hợp chất chứa clo rất đa dạng

nhưng các nghiên cứu mới chỉ chủ yếu tập trung enzyme RdhA (reductive

dehalogenase) bởi enzyme này có thể xúc tác cho quá trình loại clo của nhiều hợp

chất hữu cơ chứa clo khác nhau (Krajmalnik, 2005). Các vi khuẩn khác nhau có thể

cùng mang gene rdhA (gene pceA, cprA) mã hóa enzyme tương đồng nhau như

enzyme PceA của các chủng Dehalobacter restrictus, Desulfitobacterium hafniense

Y51 và D. hafniense TCE1.

Ngoài ra, có thể kể đến nhiều gene và enzyme tham gia vào quá trình hô hấp

loại clo như benzoyl-CoA, chlorocatechol dioxygenase, 4-hydroxybenzoyl-CoA

thioesterase (Gohil, 2011), enzyme benzene dioxygenase, chloromuconate

cycloisomerase, maleylacetate reductase tham gia quá trình phân hủy 1,2,3,5-TCB ở

chủng Pseudomonas sp. PS14 (Reineke, 2001); 3-oxoadipate enol-lactone hydrolase;

3-oxoadipate:succinyl-CoA transferase; 3-oxoadipyl-CoA thiolase tham gia vào quá

trình phân hủy và chuyển hóa benzoate, chlorobenzoate ở chủng Pseudomonas sp. B13

(Stefan và cs., 2002); pentylacetyl-CoA ligase, enoyl-CoA hydratase, acyl-CoA

dehydrogenase, ketothiolase mã hóa enzyme tham gia vào quá trình phân hủy

phenylacetate acid ở chủng P. putida KT2440 (Kim và cs., 2009). Nguyễn Thị Tâm

Thư và cộng sự đã xác định được 30/1883 gene chức năng mã hóa enzyme phân hủy

các hợp chất vòng thơm nhưng không phát hiện được RdhA, đây là câu hỏi cần được

trả lời bằng những nghiên cứu tiếp theo (Thư và cs., 2013).

1.3. Sử dụng công cụ metagenomic nghiên cứu đa dạng VSV ô nhiễm POPs

Công nghệ giải trình tự bằng máy giải trình tự công năng cao thế hệ mới kết

hợp phần mềm tin sinh (Công cụ metagenomic) dựa trên các thuật toán lắp ráp,

phân tích dữ liệu lớn nhằm hiểu sâu hơn về đa dạng vi sinh vật trong mẫu môi

trường đặc biệt là địa điểm có cấu trúc phức tạp, xác định VSV hoặc cụm gene mã

hóa cho các enzyme phân hủy chất ô nhiễm, chẩn đoán bệnh v.v. (Breitwieser và

cs., 2017; Quince và cs., 2017).

20

(Nguồn: Mukesh Kumar Awasthi và cs., 2020)

Hình 1.4. Nghiên cứu theo hướng -Omics trong sinh học

Số lượng mẫu phân tích metagenomic từ môi trường gia tăng gấp 10 lần từ

2015 tới 2017, tính đến tháng 1 năm 2019 dữ liệu trên ngân hang cơ sở dữ liệu Châu

Âu (European Bioinformatics Institute – EBI) đạt 140.000 mẫu và 1,9 triệu phân tích

(Mitchell và cs., 2017). Với sự phát triển nhanh chóng như vậy đã tạo ra dữ liệu lớn

các nghiên cứu metagenome và cần có các công cụ để theo dõi, thống kê và liên kết

các kết quả đó với nhau. Do đó, Sử dụng metagenomic trong nghiên cứu đa dạng

VSV phân hủy chất diệt cỏ/dioxin là cần thiết và có tính khả thi cao. Trong tương lai,

những cải tiến cũng như đổi mới công nghệ sẽ giúp giảm chi phí và sự thay đổi của

các nền tảng công nghệ sẽ giúp khai thác sâu hơn các metagenome từ đó ứng dụng

vào y tế, nông nghiệp và tạo môi trường bền vững. Hiện tại, dữ liệu về VSV liên quan

đến chất diệt cỏ/dioxin trong đất còn rất hạn chế nên luận án chỉ đề cập thông tin có

thể tiếp cận được ở mức độ chung tới các gene chức năng liên quan đến chuyển hóa,

phân hủy xenobiotics. Sự đa dạng của các nhóm VSV có mặt trong đất ô nhiễm nặng

và đã xử lý làm sạch sẽ được thông báo trong luận án của nghiên cứu sinh.

Nghiên cứu metagenomic hiện nay có thể được thực hiện theo các hướng tiếp

cận khác nhau nhưng đều có các bước cơ bản gồm: Thu nhận và tách chiết DNA

mẫu môi trường, giải trình tự toàn bộ DNA và phân tích các trình tự thu được bằng

các phần mềm tin sinh chuyên dụng với các cơ sở dữ liệu đã có (về đa dạng VSV,

gen chức năng, protein và con đường chuyển hóa giả định). Các bước thực hiện

chính được thể hiện ở hình 1.5.

21

Việc sử dụng các Kit thương mại như PowerSoil® DNA Isolation Kit (MO

BIO Laboratories, Inc.), Soil DNA Isolation Kit (Norgen Biotek Corp.), E.Z.N.A.®

Soil DNA Kit (Omega Bio-tek) giúp thu được lượng lớn DNA với độ tinh sạch cao

theo yêu cầu. Công nghệ giải trình tự có thể kể đến gồm: Sanger, pyrosequencing

454/Roche, whole genome shotgun sequencing Illumina/Solexa với kích thước các

đoạn read tương ứng >700 bp, 400-600 bp và 100-300 bp (Thomas và cs., 2012; Lim

và cs., 2012). Tiếp đó, các trình tự được lắp ráp để tạo nên các trình tự có nghĩa dựa

trên trình tự tham chiếu (reference-based assembly) và lắp ráp de novo (Ayling và

cs., 2019) bằng một số phần mềm như: Newbler (Roche), AMOS hay MIRA, Meta

Velvet, Meta – IDBA, SOAP v.v. (Chevreux và cs., 1999; Miller và cs., 2010;

Pevzner và cs., 2001). Bước cuối cùng trong phân tích metagenome là chú giải các

trình tự trên các cơ sở dữ liệu (CSDL) online như rapid annotation using subsystem

technology (MG-RAST) (Meyer và cs., 2008), integrated microbial genome (IMG),

Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (Kanehisa và Goto, 2000),

evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups (eggNOG)

(Muller và cs., 2009), Clusters of Orthologous Groups (COG/KOG) (Tatusov và cs.,

2000), PFAM (Bateman và cs., 2004) v.v. với các phần mềm dự đoán các trình tự

có nghĩa từ metagenome (CDS) như FragGene Scan, MetaGene Mark, MetaGene

Annotator v.v. (Thomas và cs., 2012; Rho và cs., 2010).

Công cụ metagenomic đã được sử dụng để nghiên cứu quần xã sinh vật trong

nhiều loại môi trường khác nhau như ruột mối, đường ruột ở người, hệ thống xử lý

nước thải, bể phân hủy kị khí và hệ thống thoát nước mỏ acid, đất ô nhiễm cadimi

v.v. (Beloqui và cs., 2006; Fang và cs., 2011; Zhang và cs., 2019). Nhiều nghiên

cứu liên quan đến sự đa dạng của VK hô hấp loại khử clo và quá trình trao đổi chất

của chúng đã được thực hiện. Các quần xã VK thường có sự tương tác đa loài trong

mạng lưới, chúng thường sống trong quần xã nhưng rất khó phân lập ở dạng thuần

khiết nên cần thiết phải xác định các đặc điểm của quần xã dựa vào công cụ

metagenomic.

22

(Nguồn: Spichler và cs., 2015)

Hình 1.5. Các bước thực hiện phân tích metagenomic

Metagenomic được sử dụng trong xác định các chủng Dehalobacter sp. E1 và

Sedimentibacter sp. B4 có khả năng loại khử clo của beta-hexa-chlorocyclohexane

(Maphosa và cs., 2010). Dehalobacter sp. không thể được nuôi cấy ở dạng chủng sạch và

cần có cả VK Sedimentibacter để duy trì khả năng loại khử clo (Van Doesburg và cs.,

2005). Metagenome của hỗn hợp KB-1 có khả năng loại khử clo của TCE chứa các chi

Dehalococcoides, Geobacter, Methanosarcina, Spirochaeeta và Sporomusa (Hug và cs.,

2012). Kết hợp metagenomic với metatranscriptomic và metaproteomic (nghiên cứu -

Omics) cho phép chúng ta biết được hoạt động sống thực của quần xã VSV ở tự nhiên.

Qua các kết quả nghiên cứu metagenome đa dạng VSV phân hủy hợp chất

hữu cơ chứa clo cho thấy các vi khuẩn kị khí (VK KK) hô hấp loại khử clo chỉ

chiếm một phần rất nhỏ trong tổng số quần xã VSV nhưng vẫn có thể hiểu được

quan hệ tương tác giữa chúng. Đó cũng là điểm khác biệt rõ ràng nhất khi nghiên

cứu sử dụng các kỹ thuật như DGGE, đa hình chiều dài đoạn cắt cuối (Terminal

Restriction Fragment Length Polymorphism – TRFLP) chỉ dựa vào các đoạn gene

16S rRNA so với công cụ metagenomic. Khi sử dụng Metagenomic và các phương

23

pháp truyền thống nghiên cứu cấu trúc của quần xã VK KK được làm giàu từ bùn ô

nhiễm ở Alameda Naval Air Station (ANAS), California cho thấy các vi khuẩn đã

loại clo của TCE đến ethene (Freeborn và cs., 2005; Holmes và cs., 2006). Trong

metagenome đã tìm thấy sự thay đổi loài chiếm ưu thế và sự có mặt cả nhóm VK

sinh metan. Dựa trên cơ sở dữ liệu chung các nhà nghiên cứu có thể phân tích so

sánh các nhóm VK KK hô hấp loại khử clo như Dehalococcoides, Dehalobacter,

Desulfitobacterium trong các quần xã khác nhau.

Meier và cộng sự (2014) đã sử dụng công cụ metagenomic để nghiên cứu sự

đa dạng của quần xã VSV từ đất bị ô nhiễm hydrocarbon đa vòng thơm và tìm kiếm

các gen chức năng tham gia vào quá trình phân hủy PAHs. Từ phân tích của họ cho

thấy ngành Proteobacteria chiếm 90%, trong đó chi Pseudomonas chiếm 30% số

lượng VSV trong quần xã. Nhóm tác giả cũng đã xác định sự có mặt của các gen

bph và bphA1 mã hóa cho enzyme carbazole dioxygenases (Meier, 2014).

Yan và cộng sự (2016) nghiên cứu mức độ đa dạng của quần xã VSV từ đất

nhiễm chất phóng xạ Uranium, 2 ngành Actinobacteria và Proteobacteria chiếm ưu

thế trong mẫu nghiên cứu. Trong đó, 3 chi vi khuẩn Robiginitalea, Microlunatus và

Alicyclobacillus chiếm ưu thế trong đất nhiễm chất phóng xạ (Yan và cs., 2016).

Daniel và cộng sự (2018) nghiên cứu metagenome của tổ hợp vi khuẩn được

làm giàu trên PCBs như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất. Phân tích

metagenome đã chỉ ra con đường chuyển hóa biphenyl thành benzoate bởi chủng

Rhodococcus. Các chủng thuộc Pseudomonas và Bordetella tham gia quá trình

chuyển hóa benzoate thành TCA trong khi các bước chuyển hóa trung gian có sự

tham gia của Achromobacter và Variovorax. Garrido-Sanz và cộng sự cũng đã phân

lập được chủng Rhodococcus WAY2 từ tổ hợp vi khuẩn trong mẫu nghiên cứu

(Garrido-Sanz và cs., 2018).

Các nhà khoa học Australia sử dụng công cụ metagenomic nghiên cứu gene

chức năng nhóm xenobiotic trong đất nông nghiệp nhiễm chất diệt cỏ cũng như sự

đa dạng VSV (Jeffries và cs., 2018). Có 2 nhóm khác nhau được đánh giá cùng với

sản phẩm của chúng bởi sự gia tăng của chu trình vận chuyển, chất dinh dưỡng và

enzyme tham gia các quá trình phân hủy. Nghiên cứu đã đề cập tới khả năng tăng

cường xử lý môi trường ô nhiễm thông qua những hiểu biết mới về các đặc tính ô

24

nhiễm môi trường mà công cụ metagenomic đem lại. Jakub và cộng sự (2017) cũng

nghiên cứu mối quan hệ giữa các VSV cũng như đa dạng gene tham gia quá trình

phân hủy sinh học PAHs trong đất. Bằng cách so sánh mẫu đất ô nhiễm với mẫu đất

nông nghiệp, đất rừng tác giả đã chỉ ra khả năng đồng hóa hợp chất hydrocacbon

bởi vi khuẩn ở khắp nơi. Nhóm Gammaproteobacteria chiếm ưu thế trong tất cả các

mẫu sau đó là Alphaproteobacteria. Đặc biệt, nhóm gene mã hóa cho enzyme

dioxygenase tham gia vào quá trình phân hủy hợp chất vòng thơm cũng được xác

định (Jakub Czarny và cs., 2017).

Nghiên cứu đã chỉ ra ngành Proteobacteria chiếm ưu thế, trong đó lớp γ-

Proteobacteria chiếm đa số. Một số ngành chiếm tỷ lệ thấp Bacteroidetes,

Firmicutes chưa được nghiên cứu nhiều và đều có các đại diện thuộc nhóm loại khử

clo không bắt buộc và bắt buộc. Ngành Chloroflexi lại có các đại diện thuộc nhóm

loại khử clo bắt buộc, ngành Actinobacteria có các đại diện có khả năng loại

halogen. Ngoài ra sự đa dạng các gene chức năng tham gia trong quá trình loại khử

hợp chất hữu cơ chứa clo cũng được đề cập.

Trong nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2017) về sự thay đổi đa dạng VSV

trong mẫu đất bùn nhiễm cadimin (Cd) trên sông Long Giang theo phương pháp

khuếch đại gene 16S rRNA và giải trình tự bởi hệ thống Miseq cho thấy vi khuẩn

chiếm đa số (90.65%) tiếp theo là vi khuẩn cổ (7.97%) và các trình tự chưa phân loại

(1.38%). Ở mức độ ngành chiếm ưu thế lần lượt là Proteobacteria (30.88% ± 25.27%),

Bacteroidetes (11.58% ± 9.7%), Chloroflexi (10.14% ± 8.77%), Acidobacteria

(8.88% ± 6.70%) và Verrucomicrobia (7.16% ± 9.13%) (Zhang và cs., 2017).

Nghiên cứu thông qua giải trình tự metagenome đất ô nhiễm gần mỏ dầu

Tianjin Dagang của miền Nam Trung Quốc đã được tiến hành. Quần xã trong

metagenome chiếm ưu thế là γ-Proteobacteria và α-Proteobacteria chúng là các VSV

chìa khóa cho phân hủy hydrocarbon dầu mỏ. Nghiên cứu đa dạng chức năng cho

thấy xuất hiện các nhóm enzyme đại diện và các con đường tham gia phân hủy hàng

loạt các hợp chất vòng thơm xenobiotic bao gồm toluene, xylene, chlorobenzoate,

aminobenzoate, DDT, methylnaphthalene và bisphenol (Bao và cs., 2017).

Ute và đồng tác giả (2018) cũng đã nghiên cứu khả năng phân hủy 2,4,5-T

trong điều kiện kị khí bắt buộc bằng cách làm giàu mẫu đất trong lô xử lý bằng

25

phân hủy sinh học ở Biên Hòa (Giống địa điểm lấy mẫu BHR trong nghiên cứu này

nhưng thời gian lấy mẫu là sau 40 tháng xử lý) với chất nhận điện tử là pyruvate và

nguồn cacbon là 2,4,5-T. Pyruvate chuyển hóa thành hydrogen, acetate và

propionate. Hydrogen sau đó cung cấp điện tử trực tiếp cho quá trình phân tách

2,4,5-T và khử clo của 2,4,5-TCP tạo thành. Phân tích 16S rRNA cho thấy sự hiện

diện của vi khuẩn và cổ khuẩn chủ yếu thuộc Firmicutes, Bacteroidetes,

Spirochaetes, Chloroflexi và Euryarchaeota. Chủng vi khuẩn Desulfitobacterium

hafniense đã được phân lập và xác định thuộc nhóm vi khuẩn loại khử clo. Phân tích

Metaproteonome cũng được thực hiện trong nghiên cứu này đối tượng là mẫu làm

giàu khi có mặt 2,4,5-T đã phát hiện hơn 60 nhóm protein. Enzyme thuộc nhóm loại

khử clo nhiều nhất là RdhA3 của D. hafniense và không phát hiện được enzyme

tham gia cắt, ức chế 2,4,5-TCP tạo thành (Lechner và cs., 2018).

Từ các kết quả nghiên cứu quốc tế và trong nước đã công bố được tổng quan

ở trên chúng tôi rút ra một số nhận xét ngắn gọn và đây cũng là cơ sở để nghiên cứu

sinh thực hiện luận án này:

- Dioxin và các hợp chất tương tự thuộc nhóm các chất hữu cơ khó phân hủy

(POPs) Việt Nam đã ký công ước Stockholm phải được loại bỏ hoàn toàn bởi độc

tính và khả năng tồn tại bền vững của chúng trong môi trường;

- Lượng chất diệt cỏ/dioxin tồn lưu trong đất bởi chiến tranh hóa học do Mỹ

gây ra rất lớn. Điểm nóng Đà Nẵng (Khu bắc sân bay – 361.000 ppt, khu Pacer Ivy

– 20.600 ppt,) và Biên Hòa (Khu Z1 - 1.578 ppt, khu Tây nam – 110.000 ppt, khu

Pacer Ivy – 11.400 ppt, khu Đông bắc – 1.300 ppt, khu Tây bắc – 477 ppt);

- Biên Hòa đã thực hiện chôn lấp 90.000 m3 đất ô nhiễm ở khu vực Z1 và

trong đó đã xử lý thành công 3.384 m3 đất ô nhiễm trên 10.000 ngTEQ/kg bằng

công nghệ phân hủy sinh học, tổng độ độc chỉ còn 13,2 ngTEQ/kg đất khô; Ở sân

bay quân sự Đà Nẵng đã sử dụng phương pháp khử hấp thu nhiệt và lưu chứa để xử

lý dioxin trong 90.000 m3 bùn đất ô nhiễm.

- Sự đa dạng của quần xã VSV ở Đà Nẵng và Biên Hòa thực hiện bằng công

nghệ sinh học phân tử hiện đại của thế hệ đầu như DGGE và SSCP không thông

26

qua nuôi cấy cho thấy số lượng VSV có thể phân hủy hiếu khí, kị khí chất diệt

cỏ/dioxin dao động rất lớn cũng như đa dạng về chủng loài cao hơn hẳn so với các

phương pháp nghiên cứu truyền thống;

- Công cụ nghiên cứu đa dạng quần xã VSV đất hiện nay (metagenomic)

giúp khắc phục được các nhược điểm trong kỹ thuật nuôi cấy và đánh giá cấu trúc

quần xã VSV trong môi trường ô nhiễm phức tạp tạo cơ sở hướng đích tới công

nghệ khử độc, làm sạch hỗn hợp ô nhiễm các chất đa vòng thơm chứa halogen và

không chứa halogen trong đó có chất diệt cỏ/dioxin và các loại POPs khác;

- Sự phát triển của các phần mềm tin sinh chuyên dụng ứng dụng trong

metagenomic nói riêng và các công cụ -Omics nói chung (metagenomics,

metatranscriptomics, proteomics và metabolomics) giúp phát hiện và khai thác VSV

không thông qua nuôi cấy bằng các hình thức khác nhau từ các vùng ô nhiễm nhằm

tạo công nghệ phù hợp và hiệu suất cao hơn để tái tạo lại môi trường đã bị ô nhiễm;

- Bước đầu đã nghiên cứu đa dạng trong metagenome của quần xã vi khuẩn

kỵ khí nuôi cấy được trong mẫu làm giàu đất bùn ô nhiễm rất nặng chất diệt

cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa đã được thực hiện bằng thiết bị giải trình tự Miseq.

Do sự đa dạng của hệ VSV hiếu khí lớn hơn gấp nhiều lần so với VSV kị khí nên

kết quả thu được là một minh chứng nhỏ đầu tiên về đa dạng quần xã cũng như cấu

trúc của chúng trong vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin và hệ enzyme tham gia

cũng như con đường chuyển hóa giả định khác nhau.

Từ những dữ liệu và minh chứng được tổng quan trình bày ở trên nên chúng

tôi đã sử dụng công cụ metagenomic để nghiên cứu sự đa dạng về chủng loài (taxa),

đa dạng về gene chức năng, protein giả định tham gia vào 4 con đường chuyển hóa

đất nhiễm nặng hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin có gì giống và khác so với các công bố

trong và ngoài nước đã tổng quan ở trên. Ngoài ra, hai tổ hợp là vi khuẩn và xạ

khuẩn đã được làm sạch có mặt ở hai metagenome khác nhau cùng với khả năng

phân hủy đồng phân độc nhất 2,3,7,8-TCDD (dioxin) của chúng sẽ được làm rõ

trong luận án này.

27

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu đất được thu thập ở các khu vực, vị trí khác nhau và tính thống kê cùng

tọa độ GPS khu vực thu mẫu. Sau khi đồng nhất, đất được sử dụng trong tách chiết

DNA metagenome và phân lập VSV sử dụng trong thí nghiệm phân hủy dioxin trong đất

bởi tổ hợp vi khuẩn và xạ khuẩn:

+ Đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (ký hiệu là mẫu C) nằm ở phía Tây

Nam của sân bay Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai (10°58'14.3"N 106°48'19.3"E) được lấy

từ 5 vị trí và độ sâu từ 0-100 cm. Mẫu được tiến hành thu nhận vào tháng 4/2014;

Độ độc sau khi đồng nhất của mẫu đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin (C) lên tới

21.605 ng TEQ/kg, đây là mức ô nhiễm nặng cần phải khử độc (xử lý triệt để) theo

hiệp định mà Việt Nam đã ký kết. Hình ảnh hiện trường lấy mẫu và đất đã đồng

nhất được thể hiện ở hình 2.1.

A B

Hình 2.1. Mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (ký hiệu C)

A: Hiện trường lấy mẫu khu Tây Nam; B: Đất đã đồng nhất để nghiên cứu

+ Đất đã được xử lý sạch chất diệt cỏ/dioxin bằng công nghệ phân hủy sinh

học trong các lô Chôn lấp tích cực (Bioremediation – ký hiệu là mẫu BHR) ở khu

Z1 (10°57'46.4"N 106°49'22.6"E) của sân bay Biên Hòa. Đây là khu thực hiện dự

án “Xử lý ô nhiễm dioxin tại các vùng nóng ở Việt Nam” do Bộ Quốc phòng thực hiện tại Đồng Nai. Lô xử lý có khối lượng 3.384 m3 đất ô nhiễm có tổng độ độc ban

đầu khoảng 10.000 ng TEQ/kg đất. Đất được bổ sung chế phẩm Slow-D, DHS1,

DHS2 (là các chất có bản chất sinh học và hóa học khác nhau để cung cấp cho VSV

sinh trưởng) và các phụ phế liệu nông nghiệp với các kích thước khác nhau trước

khi chôn lấp. Công nghệ được gọi là “chôn lấp tích cực”.

28

Hình 2.2: Mặt cắt dọc của lô xử lý.

Thể tích các lô xử lý sinh học trong hố chôn lấp: (chiều dài x chiều rộng x

chiều sâu x 4 lô): 16,8 ± 0,2 m x 25 m x 2m x 4 = 3.384 m3 (Hình 2.2). Chế phẩm

DHS1 được trộn đều với đất bằng máy xúc trước khi chuyển vào lô xử lý, chế phẩm

DHS2 được hòa vào nước và bơm lên bề mặt đất đã trộn chế phẩm (đã chuyển vào

hố) và chất độn (phụ phế liệu nông nghiệp): Chúng có kích thước khác nhau và

được trộn đều vào đất cùng với DHS1 và rải thành nhiều lớp trên bề mặt của đất khi

đã chuyển vào lô xử lý. Tại đây máy xúc và máy gạt tiếp tục trộn để cho các vật liệu

phân bố đều nhất có thể trong đất ở tất cả các tầng của chiều cao đất trong hố là 2m.

Mẫu được lấy ở thời điểm 60 tháng sau khi đã khử độc có màu xám tro với tổng độ

độc sau đồng nhất là 13,2 ng TEQ/kg và đất đã được làm sạch đạt tiêu chuẩn canh

tác nông nghiệp thường xuyên (40 ng TEQ/kg đất khô theo quy chuẩn

QCVN45:2012/BTNMT) (Hình 2.3).

A B

Hình 2.3. Mẫu đất trong lô xử lý bằng công nghệ phân hủy sinh học (ký hiệu BHR)

A: Hiện trường lấy mẫu khu Z1; B: Đất đã đồng nhất để nghiên cứu

- Các chủng xạ khuẩn, vi khuẩn phân lập mới từ đất ô nhiễm lấy ở cùng khu

vực thu mẫu phục vụ tách DNA metagenome kết hợp kế thừa các nghiên cứu trước

đó của cộng sự về dioxin từ 1999.

29

2.1.2. Các hóa chất và thiết bị máy móc

- Đồng phân độc nhất của dioxin là 2,3,7,8-TCDD được cấp bởi Công ty BE-

Basic (Hà Lan) từ phòng cung cấp hóa chất isotop chuẩn, Vương Quốc Anh.

- Dịch chiết đất (DCĐ) là dung dịch chứa hỗn hợp các thành phần 2,4-D;

2,4,5-T, một số sản phẩm phân hủy chất diệt cỏ và đặc biệt là chứa 2,3,7,8-TCDD

với tổng độ độc được xác định dùng để bổ sung vào môi trường phân lập, làm giàu,

nuôi cấy VSV liên quan đến ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Dịch chiết đất được tách

chiết từ đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa theo quy trình sau:

(1) Sấy khô đất hoàn toàn ở 105oC, rây nhỏ để loại bỏ đất đá, các loại hạt to. (2)

Trộn đều với Na2SO4 khan đến khi thấy màu trắng của Na2SO4 để làm khô kiệt

mẫu. (3) Chia đất vào các lọ vial sau đó bổ sung hỗn hợp methanol: toluene = 1:4

vào lọ. (4) Đậy kín nắp và lắc đều cho đất thấm đều dung môi. (5) Siêu âm trong 30

phút ở 30-35oC, tốc độ 90 sonic. (6) Lắc đều để đất không bám vào đáy bình. (7)

Lắc trên máy lắc 110 vòng/phút qua đêm. (8) Để lắng trong khoảng 7 giờ sau đó hút

lấy dịch trong. (9) Bổ sung H2SO4 đặc, lắc đều nhiều lần đến khi dung dịch nguội để

loại bỏ hết tạp chất. (10) Để lắng qua đêm, hút dịch nổi sang bình đựng DCĐ. Dịch

chiết đất cuối cùng thu được chứa 2,4,5-T, 2,4-D, TCP, DCP v.v. và dioxin với độ

độc khoảng 3.500 pg TEQ/ml.

- Hóa chất tinh khiết của các hãng Sigma, Merk và các hóa chất thông

thường có nguồn gốc từ Việt Nam, Trung Quốc. Các kit tách chiết DNA như

PowerSoil® DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc.), Soil DNA Isolation

Kit (Norgen Biotek Corp.), E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-tek), hóa chất

dùng cho sinh học phân tử của các hãng Sigma, Thermo v.v.

- Thiết bị phổ biến trong nghiên cứu VSV thuộc phòng thí nghiệm đạt chuẩn

trong và ngoài nước như: máy điện di DNA (Bio-Rad), máy ly tâm Eppendorf

(ThermoScientific), máy soi gel sử dụng tia UV (Vilber Laurmat), máy đo nồng độ

DNA SimpliNano (GE Healthcare Life Sciences). Thiết bị phòng Công nghệ sinh

học tái tạo môi trường, Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về gene - viện Công

nghệ Sinh học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thiết bị của các

30

đơn vị hợp tác nghiên cứu như trường đại học Hà Lan và Công Ty BDS, phòng thí

nghiệm phân tích dioxin thuộc Trung tâm quan trắc môi trường - Bộ TNMT, Trung

tâm Nhiệt đới Việt Nga v.v.

- Thiết bị giải trình tự DNA trong 2 mẫu nghiên cứu metagenome là Illumina

Hiseq 2500 (BaseClear) và một số thiết bị khác như Agilent 2200 TapeStation

(Agilent Technologies, Santa Clara, C A, USA) của đối tác hợp tác chuyên sâu về

phân tích dioxin bằng Dr-Calux tại Hà Lan.

- Phân tích kết quả giải trình tự DNA sau khi đã lắp ráp bằng hệ thống máy

chủ (Server) của Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam. Hệ thống MG-RAST được phát triển bởi Meyer và cộng sự tại Phòng thí

nghiệm quốc gia Argonne, Hoa Kỳ (Argonne National Laboratory, USA).

- Một số phần mềm được phía Hà Lan cung cấp và phần mềm mã nguồn mở

miễn phí trên mạng như CLC Genomics Workbench v8.0, Prodigal v2.0, BLAST

2.4.0, STAMP v.v.

2.1.3. Môi trường nuôi cấy

- Môi trường Gost (Mineral salts medium – MSM) có cải tiến để sử dụng

phân lập, làm giàu và đánh giá khả năng phân hủy dioxin của vi khuẩn (Hartmans

và cs., 1992). Thành phần môi trường gồm: KNO3 3; MgSO4 0,4; KH2PO4 0,3;

Na2HPO4 0,7; NaCl 1; pH 7,0; Agar 15

- Môi trường Gause có cải tiến để sàng lọc và nuôi cấy xạ khuẩn được sử

dụng ở dạng lỏng và thạch với các thành phần: KNO3 2; MgSO4 0,45; KH2PO4

0,15; Na2HPO4 0,35; NaCl 1; K2HPO4 0,25; FeSO4 0,01; Yeast extract 0,2; Malt

extract 3; Starch soluble 3; Agar 15 (Gauze và cs., 1983).

- Khử trùng môi trường ở 115oC trong 30 phút và để nguội ở nhiệt độ phòng

trước khi sử dụng trong nuôi cấy VSV.

2.1.4. Sơ đồ thí nghiệm

Để thu được kết quả nghiên cứu phù hợp với mục tiêu đề ra, các bước thí

nghiệm của luận án được thực hiện theo sơ đồ hình 2.4.

31

Hình 2.4. Sơ đồ thực hiện nghiên cứu

32

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu đất để nghiên cứu metagenome

Các mẫu đất được thu thập dựa trên phương pháp lấy mẫu tổng hợp hay còn

gọi là lấy mẫu đa điểm (MIS) có cải tiến và đồng nhất mẫu trước khi phân tích các

tính chất lý hóa của đất. Mặt khác, mẫu đất sử dụng để tách DNA metagenome cũng

được thu thập và đựng trong bình thủy tinh tối màu, facol, xi lanh vô trùng kích

thước lớn (50ml) sau đó bảo quản trong điều kiện 4oC và tách DNA nhanh nhất,

sớm nhất có thể. DNA metagenome của các mẫu được phân lập ngay sau khi

chuyển mẫu về phòng thí nghiệm. Chi tiết lấy mẫu được trình bày ở phần phụ lục.

2.2.2. Phân tích thành phần cơ giới và nồng độ dioxin trong mẫu nghiên cứu

Thành phần cơ giới hay các thông số: pH, nhiệt độ, độ ẩm, độ mùn, hàm

lượng nitơ, cacbon tổng số, asen trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin được xác

định theo tiêu chuẩn phòng Lab (VILAS 886, VILAS 430) và quy trình được quy

định trong bộ tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 6648:2000; TCVN 8567:2010; TCVN

8567:2010; TCVN 8567:2010; TCVN 8567:2010; TCVN 5979:2007; TCVN

8941:2011; TCVN 6498:1999; TCVN 8467:2010) tại Phòng Phân tích trung tâm

(CAL), thuộc Viện Thổ nhưỡng nông hóa (SFRI).

Tổng độ độc trung bình của đất nhiễm hỗn hợp 17 đồng loại dioxin và furan

trong chất diệt cỏ được tính theo PCDD/PCDF. Thiết bị Sắc ký khối phổ phân giải

cao đã được sử dụng (EPA 8280A). Phòng Phân tích Dioxin và Độc chất, Trung

tâm Quan trắc môi trường, Tổng cục Môi trường (Chứng nhận đủ điều kiện hoạt

động dịch vụ quan trắc môi trường VIMCERTS 027) đã thực hiện phân tích này.

2.2.3. Phân lập, phân loại VSV từ nguồn đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin

Phân lập vi khuẩn, xạ khuẩn từ đất ô nhiễm

Cân 5 g đất đã đồng nhất vào bình tam giác 250 ml có chứa 45 ml nước muối

sinh lý NaCl 0,85%, và lắc 200 vòng/phút trong 30 phút. Hút 1 ml dịch vào 9 ml

NaCl 0,85%, ta được độ pha loãng 10-2, tiếp tục pha loãng mẫu đến nồng độ 10-3 và

10-4. Hút 100 µl dịch mẫu ở mỗi nồng độ và nhỏ lên đĩa petri môi trường thạch có

33

chứa dịch chiết đất, gạt đều sao cho dịch mẫu trải đều trên mặt thạch, nuôi ở 30oC

trong 48 giờ, chọn những khuẩn lạc mọc riêng rẽ có hình dạng khác nhau. Tiến

hành cấy những khuẩn lạc này sang một đĩa thạch mới có cùng thành phần môi

trường theo đường rích rắc nhằm làm cho các khuẩn lạc mọc rời nhau để thu được

khuẩn lạc thuần khiết (Hữu và cs., 2007).

- VSV phân lập theo phương pháp cấy chuyển trên môi trường thạch Gost

(đối với vi khuẩn) và Gause M (đối với xạ khuẩn) chứa dịch chiết đất (DCĐ có

chứa các chất 2,4,5-T; 2,4-D; trichclorophenol (TCP); dichclorophenol (DCP) và

các đồng phân độc của dioxin trong đó có 2,3,7,8-TCDD). Theo lượng DCĐ tăng

dần (độ độc tăng dần) sẽ lựa chọn được các khuẩn lạc riêng rẽ và có khả năng sinh

trưởng tốt nhất.

- Hình thái khuẩn lạc được quan sát sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường

Gost, Gause M thạch ở 30oC. Hình thái, đặc điểm tế bào được quan sát và chụp ảnh

dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL5410 LV-Nhật Bản với độ phóng đại khác nhau

(5.000 - 20.000 lần). Kỹ thuật này được thực hiện tại Viện 69, Bộ tư lệnh Lăng.

Phân loại vi khuẩn, xạ khuẩn từ đất ô nhiễm

Vi khuẩn và xạ khuẩn được phân loại dựa trên trình tự đoạn gene mã hóa

16S rRNA. DNA xạ khuẩn được phân lập theo phương pháp của Vijay Kumar và

cộng sự (Kumar và cs., 2010) sau đó làm sạch bằng kit Qiaquick® Mini Columns

(Qiagen - Đức). DNA vi khuẩn được phân lập theo mô tả của Sambrook và Russell

(Sambrook và Russell, 2001) với các bước thực hiện được trình bày ở phần phụ lục.

Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium

bromide và quan sát dưới tia UV. Trình tự của đoạn gene mã hóa 16S rRNA của

chủng nghiên cứu được so sánh với dữ liệu trình tự gene các chủng trên GenBank.

Sử dụng phần mềm Finch TV và MEGA6 để xây dựng cây phát sinh chủng loại.

2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính laccase và laccase-like

Các chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân

bay Biên Hòa ngoài khả năng sinh tổng hợp laccase còn có khả năng sinh tổng hợp

một số tác nhân sinh học có khối lượng phân tử thấp, có khả năng oxy hóa các chất

34

đa vòng thơm theo cơ chế giống enzyme laccase, tuy nhiên đặc điểm hóa-lý thì rất

khác. Các hợp chất này không có cấu tạo protein mà chỉ là các đoạn peptides kích

thước ngắn có hoạt tính oxy hóa cao hoạt động như chất xúc tác. Thậm chí đun sôi tới

3 h các chất được gọi là laccase – like vẫn có khả năng phân hủy các chất đa vòng

thơm. Kết quả nghiên cứu đã tìm thấy hiện tượng này từ nhiều năm nay cho đến thời

điểm này vẫn quan sát được như vậy với rất ít công bố. Vì vậy để phân biệt với

những tên gọi và thuật ngữ của các nghiên cứu đã được công bố và để thuận tiện

trong việc gọi tên trong nghiên cứu, hoạt chất này sẽ được gọi là laccase-like.

Hoạt tính laccase và laccase-like đều được xác định cùng phương pháp theo

Childs và Bardsley. Dựa trên nguyên tắc hoạt độ của laccase được xác định bằng sự

tăng độ hấp thụ ánh sáng của sản phẩm tạo thành ở bước sóng 420 nm ở điều kiện

phòng thí nghiệm (Childs và Bardsley, 1975).

2.2.5. Đánh giá phân hủy 2,3,7,8-TCDD trong đất ô nhiễm bởi hỗn hợp VSV

Sau khi nuôi cấy chuyển bình 3 lần với chế độ lắc 150 vòng/phút ở 30oC

trong 15 ngày, dịch nuôi cấy chứa VSV tăng sinh đã được sử dụng làm giống trong

nghiên cứu đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất. Để đảm bảo

sai số thí nghiệm ở mức tối thiểu, đất sau khi được đồng nhất và bổ sung môi

trường đã được khử trùng ở 121oC trong 60 phút (nhằm tiêu diệt VSV trong đất).

Các bình thí nghiệm 500 ml chứa môi trường nuôi cấy gồm: 200 g đất ô nhiễm nặng

chất diệt cỏ/dioxin có bổ sung 100 ml môi trường MSM (với vi khuẩn) hoặc Gause

M (với xạ khuẩn), 50 ml nước máy tạo dạng huyền phù, 15% dung dịch chứa hỗn

hợp 5 chủng vi khuẩn (xạ khuẩn), 1 ml dịch chiết compost (100 g/ 200 ml nước), 50

µl dung dịch chất hoạt động bề mặt sinh học và 1 ml dung dịch vitamin hoa quả tự

nhiên nhằm đẩy nhanh quá trình phân hủy.

Bình thí nghiệm được nuôi lắc 200 vòng/phút ở 30oC trong 30 ngày và được

lặp lại 3 lần. Mẫu đối chứng được thực hiện tương tự các mẫu thí nghiệm nhưng bổ

sung nước cất khử trùng thay thế cho chủng giống.

Toàn bộ thành phần của các bình nuôi cấy và đối chứng đã được phân tích

bằng thiết bị HRGC/HRMS, Model DFS, Thermo theo phương pháp SOP02/DXL,

35

tham khảo US EPA. Hai/ba bình nghiên cứu cùng với đối chứng đã được phân tích

để xác định hiệu suất phân hủy 2,3,7,8-TCDD.

2.2.6. Phương pháp tách chiết DNA metagenome

Phương pháp tách chiết DNA metagenome trực tiếp với mẫu đất ô nhiễm

nặng chất diệt cỏ/dioxin (C) có kết hợp những cải tiến cho phù hợp với điều kiện

phòng thí nghiệm và yêu cầu của mẫu phân tích. Ba phương pháp được sử dụng

gồm: Cải tiến cách làm của Bourrain và cộng sự (1999) (Bourrain và cs., 1999), cải

tiến quy trình của Zhou và cộng sự (1996) (Zhou và cs., 1996), cải tiến quy trình

của Islam MR và cộng sự (2012) (Kuske và cs., 1997), (Islam và cs., 2012).

Phương pháp tách chiết DNA metagenome sử dụng Kit thương mại chuyên

dụng với mẫu đất đã được xử lý làm sạch (BHR). Các kit thương mại sử dụng gồm:

PowerSoil® DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc.) có cải tiến và Soil

DNA Isolation Kit (Norgen Biotek Corp.), E.Z.N.A® Soil DNA Kit (Omega Bio-

tek). Các bước thực hiện chi tiết được trình bày ở phần phụ lục.

2.2.7. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA metagenome

Phương pháp điện di gel agarose

Điện di gel agarose là một phương pháp đơn giản để xác định sự có mặt của

DNA trong mẫu nghiên cứu, cũng như xác định tính toàn vẹn và độ tinh sạch của

sản phẩm DNA. Các bước tiến hành điện di gel agarose được thực hiện theo mô tả

của Sambrook và Russell (Sambrook và Russell, 2001). Các mẫu DNA được chạy

trên gel agarose 1%, bản gel được nhuộm với Ethidium Bromide (EtBr) và soi dưới

ánh sáng tử ngoại để quan sát băng DNA.

Phương pháp đo độ hấp thụ của DNA tại bước sóng 260 nm

Phương pháp đo độ hấp thụ của DNA tại bước sóng 260 nm (A260) là phương

pháp phổ biến nhất để xác định hàm lượng, độ tinh sạch của mẫu DNA. Trong

nghiên cứu này, nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu DNA được xác định dựa theo

nguyên lý của Wilfinger và cs, 1997 với thiết bị SimpliNano (GE Healthcare Life

Sciences) (Wilfinger và cs., 1997; Adams, 2013).

36

Phương pháp định lượng DNA bằng nhuộm huỳnh quang

Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang để chỉ thị liên kết với

phân tử mục tiêu cụ thể (DNA, RNA và protein) kể cả ở nồng độ thấp giúp giảm

thiểu sự ảnh hưởng của các chất gây nhiễm. Kết quả định lượng nhạy và chính xác

hơn nhiều so với các phương pháp thông thường. Trong nghiên cứu này DNA được

định lượng theo nguyên lý của Bolger và cs, 1997 sử dụng hệ thống máy định lượng

Qubit Fluormeter tại phòng thí nghiệm của BE Basic (Hà Lan) (Bolger và cs., 1997).

2.2.8. Phân tích trình tự DNA metagenome của C và BHR

Trình tự DNA metagenome trong nghiên cứu được xác định bằng máy

Illumina Hiseq 2500 tại công ty Baseclear, Hà Lan.Tạo thư viện bằng kit Nextera

XT DNA Library Prep của hãng Illumina và được đọc trình tự hai đầu (paired-end

sequencing).

Giải trình tự DNA metagenome

Các trình tự ngắn (reads) chứa các trình tự nối (adapters) và các trình tự tín

hiệu PhiX control signal được loại bỏ sử dụng công cụ của công ty Baseclear, Hà

Lan. Các trình tự reads chất lượng cao được lắp ráp để tạo thành các trình tự contig

sử dụng công cụ lắp ráp de novo (De novo assembly) của phần mềm CLC

Genomics Workbench phiên bản 8.0 (Bio, 2012).

Lắp ráp và khai thác dữ liệu DNA metagenome sử dụng các công cụ tin sinh

học như:

+ Lắp ráp de novo và gióng hàng trình tự, lắp ráp các trình tự ngắn để thu

được contigs, tiến hành hiệu chỉnh các contigs thu được bằng cách gióng hàng trình

tự các reads vào contigs;

+ Dự đoán gen, nghiên cứu các phương pháp dự đoán gen theo nhiều hướng

tiếp cận khác nhau như là phương pháp tiếp cận kinh nghiệm (Heuristic approach),

ứng dụng mô hình dự đoán ngẫu nhiên;

37

+ Chú giải gene để phân loài (taxa), phân loại theo con đường trao đổi chất

(Metabolic pathway), phân loại chức năng gene;

+ Chú giải protein theo các họ protein;

+ Thống kê số liệu bằng các phần mềm Metastats, Primer-E hoặc Shotgun-

FunctionalizeR v.v. hay các Phần mền cung cấp bởi đối tác Hà Lan

+ Chia sẻ và lưu giữ số liệu để xây dựng metabase;

Sàng lọc các gene mới từ metagenome của các mẫu nghiên cứu bằng các

phần mềm chuyên dụng như (đối với gene laccase và các gene khác) CLC

Genomics Workbench phiên bản 8.0. Các trình tự contig này được sử dụng để dự

đoán gene (hay các pCDS – predicted Coding Sequence) bằng phần mềm Prodigal

v2.0. Sàng lọc gene mã hóa cho laccase và multicopper oxidase thông qua sử dụng

các trình tự pCDS để so sánh với các trình tự trên CSDL Laccase - Laccase

Database (Sirim và cs., 2011). Đã sử dụng phần mềm BLAST 2.4.0 để sàng lọc

enzyme mã hóa cho laccase và multicopper oxidase.

Chú giải đa dạng VSV và gene chức năng có mặt trong metagenome

Các trình tự contig thu được sau khi lắp ráp de novo được đưa lên hệ thống

máy chủ MG-RAST (phiên bản 3.6) để nghiên cứu cấu trúc quần xã VSV và các

nhóm gen chức năng tham gia vào các quá trình chuyển hóa khác nhau của tế bào. Hệ

thống MG-RAST được phát triển bởi Meyer và cộng sự tại Phòng thí nghiệm quốc

gia Argonne, Hoa Kỳ (Argonne National Laboratory, USA) sử dụng một loạt các

công cụ tin sinh học giúp người dùng phân tích dữ liệu metagenomic, dự đoán các

trình tự ORF hay các protein giả định, từ đó chú giải chức năng của các protein này.

Hình 2.5. Quy trình phân tích dữ liệu DNA metagenome trên hệ thống MG RAST

38

Người dùng có thể đưa lên hệ thống MG-RAST trình tự thô (raw reads) hoặc

các trình tự đã được lắp ráp từ các hệ thống giải trình tự khác nhau (hệ thống giải

trình tự 454/Roche pyrosequencing hay hệ thống Illumina Hiseq/Miseq). Sau một

loạt các bước xử lý và đánh giá chất lượng trình tự như: loại bỏ các read kém chất

lượng sử dụng công cụ SolexaQA (Preprocessing), loại bỏ các trình tự lỗi (Artificial

Duplicate Reads - ADRs) trong dữ liệu shotgun metagenomic (Dereplication), loại

bỏ các trình tự giống với trình tự genome của các sinh vật mô hình (Screening),

MG-RAST sử dụng dụng phần mềm FragGeneScan để dự đoán các khung đọc mở

ORFs (Gene calling) (Rho và cs., 2010). Các trình tự RNA cũng được tìm kiếm

trong dữ liệu shotgun metagenomic (RNA detection). Các ORF có độ tương đồng

với nhau lớn hơn 90% và các trình tự RNA có độ tương đồng lớn hơn 97% được

gộp nhóm (aa Clustering 90%, RNA Clustering 97%), trình tự dài nhất sẽ được

dùng làm trình tự đại diện cho mỗi nhóm tương ứng. Toàn bộ trình tự ORF và RNA

từ dữ liệu metagenomic sẽ được so sánh với các cơ sở dữ liệu (M5nr đối với ORF

và M5rna đối với RNA) sử dụng công cụ BLAT (Kent, 2002) nhằm chú giải chức

năng (Annotation Mapping) và nghiên cứu đa dạng VSV trong metagenome

(Abundance Profile).

Trong nghiên cứu này, các kết quả BLAT có giá trị e-value tối đa là 1 x 10-5

(e-5), độ tương đồng tối thiểu là 60% và chiều dài đoạn so sánh (alignment length)

tối thiểu là 15 acid amin được quan tâm nghiên cứu. Trình tự tương đồng cao nhất

(best hit) với trình tự ORF được sử dụng để nhận biết và xác định mối quan hệ phát

sinh chủng loài, từ đó nghiên cứu cấu trúc quần xã VSV trong mẫu đất rừng nghiên

cứu. Các ORF đã dự đoán cũng được so sánh với cơ sở dữ liệu COG (Tatusov và

cs., 2000) với các thông số như trên để xếp các ORF này vào các nhóm chức năng

và cơ sở dữ liệu KEGG để phân loại các ORF này vào các quá trình chuyển hóa

khác nhau của tế bào (Kanehisa và Goto, 2000).

39

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Nội dung nghiên cứu của luận án là công trình đầu tiên được thực hiện ở

Việt Nam áp dụng công nghệ nghiên cứu mới và hiện đại là công cụ metagenomic

trong nghiên cứu đánh giá đa dạng quần xã VSV (chủng loài) và các gene chức

năng của đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (đặc thù) ở Biên Hòa, Việt Nam.

Đồng thời cũng đã trình bày kết quả nghiên cứu về sự đa dạng VSV liên quan đến

đất ô nhiễm sau khi đã xử lý làm sạch.

Nghiên cứu sinh thực hiện luận án này đã tập trung vào phân tích, đánh giá

và trình bày kết quả nhận được từ metagenome của 2 mẫu: (!) đất ô nhiễm nặng

chất diệt cỏ/dioxin sau khi đồng nhất từ nhiều vị trí, độ sâu khác nhau của khu vực

Tây Nam sân bay Biên Hòa và (!!) đất bị ô nhiễm đã được xử lý khử độc thành

công sau 60 tháng ở khu Z1, trong lô xử lý (3.384 m3) bằng công nghệ sinh học mà

tổng độ độc trung bình còn 13,2 ng TEQ/kg. Độ độc này đã nằm dưới ngưỡng cho

đất sản xuất nông nghiệp thường xuyên (quy chuẩn là 40 ng TEQ/kg). Số liệu thu

được khi áp dụng công cụ metagenomic rất lớn về đa dạng VSV và một gene chức

năng liên quan đến phân hủy xenobiotic ở mức độ khác nhau cũng là những phần

quan trọng nhất của luận án sẽ được trình bày. Số liệu thu được sẽ cung cấp kiến

thức mới hơn, sâu sắc hơn về thế giới VSV liên quan đến đất ô nhiễm chất diệt

cỏ/dioxin ở Biên Hòa, Việt Nam mà trước đó chưa có minh chứng rõ ràng và chính

xác. Chỉ có công cụ -Omics, bao gồm metagenomics giúp nghiên cứu thế giới VSV

trong các vùng ô nhiễm ngày càng hoàn chỉnh hơn trên đối tượng môi trường ô

nhiễm bởi hỗn hợp các chất khó phân hủy mà chiến tranh đã để lại.

Mức độ đa dạng VSV trong metagenome của 2 mẫu đại diện được mô tả ở

mức độ ngành, lớp, bộ, họ, chi và loài có liên quan trực tiếp đến phân hủy dioxin và

các chất tương tự. Các chi được phát hiện rất mới trong ngành vi khuẩn, vi khuẩn cổ

và sinh vật nhân thật có mặt trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Do số liệu thu

được quá lớn nên nội dung luận án chỉ tập trung vào những kết quả quan trọng nhất.

40

Vi sinh vật từ hai mẫu đất nghiên cứu nuôi cấy đã được chọn để trình bày đầu tiên

trong phần đầu của chương kết quả nghiên cứu này để chứng minh vai trò của

những nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn hiếu khí trong quá trình xử lý khử độc đất ô nhiễm

hỗn hợp chất diệt cỏ /dioxin và các chất trao đổi chất khác.

3.1. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp vi khuẩn, xạ khuẩn quy

mô phòng thí nghiệm

Nội dung nghiên cứu quan trọng này dựa trên những hiểu biết trước đó về

tiềm năng VSV từ môi trường ô nhiễm tự nhiên và được thực hiện độc lập trước khi

sử dụng công cụ metagenomic nhằm mục đích kiểm chứng với thông tin di truyền

mới thu nhận được khi công cụ metagenomic được sử dụng.

3.1.1. Vi khuẩn từ đất nhiễm dioxin phân lập được, định danh và khả năng

phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn có tiềm năng

Từ đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (C) và đất ở khu vực xử lý bằng

phân hủy sinh học (BHR), 5 chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng tốt trên môi

trường MSM chứa dịch chiết đất đã được phân lập (Hình 3.1).

Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc 5 chủng vi khuẩn BHBi1, BHBi4, BHBi5, BHBi7 và BHO9

từ mẫu làm giàu trên môi trường MSM chứa dịch chiết đất

Các chủng vi khuẩn phân lập được sử dụng trong nghiên cứu có chung 1 đặc

điểm là có kích thươc rất bé và sinh trưởng tốt trên môi trường muối khoáng chứa

DCĐ rất độc. Dưới kính hiển vi điện tử quét có độ phóng đại từ 10.000 đến 50.000

lần, hình dáng và kích thước tế bào rất khác nhau được thể hiện ở Hình 3.2.

41

A B C D E

Hình 3.2. Hình thái tế bào 5 chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử quét

A: BHBi1; B: BHBi4; C: BHBi5; D: BHBi7; E: BHO9

Năm chủng vi khuẩn được định danh dựa vào giải trình tự gene 16S rRNA và đặt

tên tương ứng Methylobacterium sp. BHBi1, Hydrocarboniphaga sp. BHBi4,

Agrobacterium sp. BHBi5, Bosea sp. BHBi7, Microbacterium sp. BHO9 (Hình 3.3).

Hình 3.3. Cây phát sinh chủng loại của 5 chủng vi khuẩn

Ba trong số 5 chủng từ kết quả giải trình tự metagenome của 2 mẫu nghiên

cứu đã được phát hiện thấy ở mức độ chi trong metagenome của các mẫu nghiên

cứu là Agrobacterium sp. BHBi5, Microbacterium sp. BHO9, Methylobacterium sp.

BHBi1. Chi Agrobacterium có 3 đại diện xuất hiện ở trong cả 2 mẫu với tỷ lệ giảm

dần là Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium vitis, Agrobacterium rhizogenes.

Chi Methylobacterium cũng có các đại diện từ 2 mẫu gồm M. chloromethanicum,

M. extorquens, M. nodulans, M. populi, M. radiotolerans, Methylobacterium sp. 4-

42

46. Hai chủng Hydrocarboniphaga sp. BHBi4, Bosea sp. BHBi7 hiện không tìm

thấy đại diện nào trong dữ liệu phân tích metagenome 2 mẫu.

Khả năng phân hủy dioxin trong đất bởi tổ hợp vi khuẩn đã được đánh giá

bằng GC/MS. Hỗn hợp 5 chủng vi khuẩn đã phân hủy 59,1% tương đương 1.756,78

ng TEQ/kg sau 30 ngày nuôi lắc ở 30oC với độ độc ban đầu cao >4.000 ng TEQ/kg.

Nếu tính theo ngày thì hiệu suất phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD lên tới 84,58 ng

TEQ/kg/ngày (Hình 3.4, Bảng 3.1)

A B

Hình 3.4. Khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp vi khuẩn A:

Đối chứng (không có VSV); B: Tổ hợp 5 chủng vi khuẩn

Bảng 3.1. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp 5

chủng vi khuẩn

Tổng độ độc Phân hủy Tổ hợp vi khuẩn (ng TEQ/kg đất khô) (%)

Không có vi khuẩn 4.294,12 0

Hỗn hợp 5 chủng vi khuẩn 1.756,78 59,1

3.1.2. Xạ khuẩn từ đất nhiễm dioxin đã được phân lập, định danh và khả năng

phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn tiềm năng

Từ mẫu ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin 5 chủng xạ khuẩn có hình thái và màu

sắc khác nhau cùng có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường Gause M chứa dịch

chiết đất đã được phân lập (Hình 3.5). Các chủng này được nuôi lắc 150 v/ph ở

30oC trong môi trường chứa chất diệt cỏ/dioxin để tăng khả năng sử dụng chất độc

của chúng làm giống cho các nghiên cứu tiếp theo.

43

XKBHA3 XKBH4 XKBH28 XKBH921 XKBHA22

Hình 3.5. Hình thái khuẩn lạc 5 chủng xạ khuẩn và sinh trưởng của chúng trên môi trường

Gause M chứa DCĐ

Trong số 5 chủng nghiên cứu, chủng xạ khuẩn XKBH921 đã được phân loại

và định danh dựa vào trình tự gene 16S rRNA và đặt tên là Streptomyces sp.

XKBH921 (Hình 3.6).

Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loài của chủng xạ khuẩn XKBH921

Cũng giống như vi khuẩn, xạ khuẩn có vai trò vô cùng quan trọng trong

chuyển hóa, phân hủy dioxin hay các chất khác có trong DCĐ. Rất thú vị là cả 5

chủng đều thuộc chi Streptomyces và đã có mặt ở metagenome của các mẫu nghiên

cứu. Năm chủng xạ khuẩn đều có khả năng sinh tổng hợp laccase-like với hoạt tính

khác nhau. Chủng XKBHA3 sinh laccase cao nhất 167 U/L trong 4 ngày đầu và

giảm dần sau 13 ngày còn 137 U/L. Chủng XKBH28 sinh trưởng nhanh và hoạt

44

tính enzyme cũng đạt rất cao 360 U/L sau 3 ngày nuôi lắc và cũng giảm dần đến

288 U/L sau 13 ngày nuôi. Chủng XKBHA22 sinh laccase-like nhưng lại tăng dần

theo thời gian, sau 3 ngày chỉ đo được 84 U/L, sau 13 ngày là 294 U/L và còn xu

hướng tăng theo thời gian. Tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn trong đất nhiễm chất diệt

cỏ/dioxin cũng xác định được laccase-like (Hình 3.7). Như trong phần nghiên cứu

phân lập, phân loại laccase-like đã chứng minh những đặc tính bền nhiệt cao của

chất xúc tác này, dỳ đun sôi vài giờ khả năng oxy hóa vẫn ổn định. Vậy đơn chủng

có khả năng xử lý khử độc 2,3,7,8-TCDD tốt hơn hay tổ hợp của 5 chủng xạ khuẩn

có hiệu suất khử độc tốt hơn? Vì vậy chủng XKBHA22 cũng đã được sử dụng để

đánh giá khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD, sau 30 ngày nuôi cấy hiệu suất phân

hủy TCDD kém hơn hẳn so với hỗn hợp 5 chủng xạ khuẩn (Hình 3.8 và Bảng 3.2).

A

B

Hình 3.7. Khả năng sinh tổng hợp laccase- like của 5 chủng xạ khuẩn

A: Đơn chủng; B: Hỗn hợp 5 chủng xạ khuẩn

Hiệu suất phân hủy 2,3,7,8-TCDD bởi chủng XKBHA22 là 55,6% khi tổng

độ độc ban đầu là 54 pg TEQ/ml và hoạt tính laccase-like đo được 294 U/L.

45

Bảng 3.2. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin

bởi chủng XKBHA22

Phân hủy Tổng độ độc Chủng xạ khuẩn

(ng TEQ/kg đất khô)

(%)

Không có xạ khuẩn 0 54

Chủng XKBHA22 55,6 24

A B

Hình 3.8. Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp xạ khuẩn

A: Đối chứng (không có VSV); B: Tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn

Hỗn hợp 5 chủng xạ khuẩn trong nghiên cứu này phân hủy 50,7% 2,3,7,8- TCDD trong đất (2.177,96 ng TEQ/kg) sau 30 ngày nuôi lắc ở 30oC được xác đình

bằng HRGC/HRMS (Bảng 3.3). Sự khác biệt so với các công bố khác là sử dụng

hỗn hợp các chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp laccase-like trong môi trường đất nhiễm

chất diệt cỏ/dioxin trong đất có tổng độ độc là 4.294,12 ng TEQ/kg. Nếu tính theo

ngày thì hiệu suất phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD lên tới 72,59 ng TEQ/kg

đất/ngày (Hình 3.8). Ở cùng điều kiện thí nghiệm nhưng hiệu suất phân hủy kém

hơn so với tổ hợp 5 chủng vi khuẩn, nhờ đặc tính có mycelia (sợi) chúng lại trở

thành ưu thế vì có thể len lỏi trong đất ẩm một cách dễ dàng. Chính vì vậy xạ khuẩn

có vai trò đắc lực ở giai đoạn đầu xử lý trong hố chôn lấp tích cực khi mà nước và

chế phẩm dạng nước chưa bổ sung đến mức độ ẩm bão hòa.

Bảng 3.3. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn

Phân Tổng độ độc Tổ hợp xạ khuẩn

(ng TEQ/kg đất khô)

hủy%

Không có xạ khuẩn 4.294,12 0

Hỗn hợp 5 chủng xạ khuẩn 2.116,16 50,7

46

Tóm lược các kết quả được trình bày ở trên gồm:

- Đã phân lập và phân loại được 5 vi khuẩn (Methylobacterium sp. BHBi1,

Hydrocarboniphaga sp. BHBi4, Agrobacterium sp. BHBi5, Bosea sp. BHBi7,

Microbacterium sp. BH09) và 5 xạ khuẩn (XKBHA3, XKBH4, XKBH28,

XKBH921, XKBHA22) trên môi trường phù hợp chứa đất hay DCĐ (nguồn cơ chất

ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin và các chất vòng thơm khác);

- Tổ hợp 5 chủng hay đơn chủng VSV đều có thể sinh trưởng ở các mức độ

khác nhau trên môi trường chứa dịch chiết đất có độ độc cao;

- Sau 30 ngày nuôi cấy tổ hợp 5 vi khuẩn và 5 xạ khuẩn đã xử lý khử độc

được 59,1% và 50,7% đồng loại dioxin 2,3,7,8-TCDD trong đất với độ độc ban đầu

4.294,12 ng TEQ/kg. Nếu tính theo ngày thì hiệu suất phân hủy đồng loại 2,3,7,8-

TCDD tương ứng đạt 84,58 ng TEQ/kg/ngày và 72,59 ng TEQ/kg đất/ngày.

- Đã thu được kết quả ấn tượng khi chưa một phòng thí nghiệm nào nhận

được hiệu suất phân hủy cao như trong nghiên cứu này với tổng độ độc trung bình

cao đến như vậy. Đây cũng là một nghiên cứu hướng đích quan trọng để tìm hiểu

tiềm năng của các nhóm vi sinh vật có thể thực sự tham gia vào xử lý khử độc đất

chứa chất diệt cỏ/dioxin trong đất ở điều kiện phòng thí nghiệm.

3.2. Đa dạng VSV và gene chức năng từ trình tự DNA metagenome C và BHR

3.2.1. Thu nhận DNA metagenome từ mẫu C và BHR

Sau khi tách chiết DNA không sử dụng PowerSoil® DNA Isolation Kit (MO

BIO Laboratories, Inc.) và phải sử dụng đến 0,5 kg đất từ nhiều mẫu đại diện của

khu vực C, sản phẩm thu được đã được xác định tiếp để đáp ứng được tiêu chuẩn

giải trình tự bởi thiết bị công năng cao Illumina Hiseq 2500.

Cô đặc DNA metagenome và điện di kiểm tra sản phẩm sử dụng 3μl. Băng

điện di rõ nét, có kích thước lớn hơn 10 kb và không có vệt. DNA metagenome

được kiểm tra lần cuối bằng thiết bị Qubit Fluorometre để đảm bảo lượng DNA thu

được đáp ứng yêu cầu khi giải trình tự bằng máy Illumina Hiseq 2500 (Hình 3.9).

Lấy 2 µg DNA metagenome của mỗi mẫu để gửi đi giải trình tự toàn bộ trên hệ

thống Illumina Hiseq 2500 tại công ty Baseclear, Hà Lan.

47

Mẫu C (23,2 ng/µl) Mẫu BHR (14,1 ng/µl)

Hình 3.9. Điện di đồ DNA mẫu nghiên cứu trên gel agarose

3.2.2. Trình tự, contig và gene chức năng từ metagenome của mẫu C và BHR

Các thông số chi tiết về 2 mẫu như số lượng contig, tổng số bp, tỷ lệ phần

trăm GC, kích thước Contig lớn nhất, nhỏ nhất và trung bình cùng với các thông tin

khác cũng được thống kê rõ (Bảng 3.4 và Bảng 3.5).

Bảng 3.4. Trình tự read chất lượng cao

Điểm chất lượng Mẫu Số lượng reads Độ lớn của mẫu (Mb) trung bình (Phred)

C 64.339.446 15.635 37,83

BHR 61.600.474 15.522 33,98

Mặc dù số lượng read và độ lớn của 2 mẫu tương đương nhau nhưng số

lượng contig mẫu C (12.133) thấp hơn 10 lần so với mẫu BHR (119.555). Điểm

khác biệt lớn chính là kích thước contig lớn nhất của mẫu C (1.070.898) cao gấp 4

lần mẫu BHR (261.394) và kích thước trung bình của contig mẫu C cũng lớn hơn so

với BHR. Tổng số trình tự mẫu C (61.478.00bp) thấp hơn 4 lần so với BHR

(215.533.770) mặc dù tỷ lệ GC tương đương nhau. Các chỉ số N25, N50, N75 (là độ

dài contig mà tổng độ dài các contig từ dài nhất tới contig đó lần lượt bằng 25%,

50%, 75% tổng độ dài của toàn bộ các contig) mẫu C cao hơn rất nhiều so với mẫu

BHR là khẳng định rõ hơn về kích thước contig mẫu C lớn hơn nhiều so với BHR.

Thống kê cũng cho thấy mẫu C có lỗi trong quá trình phân tích tuy nhiên lỗi này là

rất nhỏ so với dữ liệu mẫu rất lớn thu được.

48

Bảng 3.5. Lắp ráp de novo trình tự DNA metagenome C, BHR

Các đặc tính C BHR

Số lượng Contig 12.133 119.555

Tổng số (bp) 61.478.000 215.533.770

GC (%) 65,10 58,72

Kích thước Contig lớn nhất 1.070.898 261.394

Kích thước Contig nhỏ nhất 700 700

Kích thước trung bình của Contig 5.067 1.802

N25 104.014 5.218

N50 28.891 2.114

N75 4.081 1.142

Số lượng lỗi 8 0

Kích thước lỗi 74 0

Các contig được sắp xếp theo thứ tự từ dài đến ngắn và được đưa lên hệ

thống máy chủ MG-RAST để nghiên cứu cấu trúc quần xã VSV và các nhóm gen

chức năng tham gia vào các quá trình chuyển hóa của tế bào. Nội dung tiếp theo là

các kết quả về sự phân bố của gene thu được từ phân tích metagenome của các mẫu

nghiên cứu (Bảng 3.6).

Bảng 3.6. Phân bố gene từ trình tự DNA metagenome C, BHR

Phân bố của gene trong DNA metagenome C BHR

Tổng số genes 59.225 218.327

Gene đã biết chức năng 36.247 93.222

Gene dự đoán trên GO 36.207 92.986

Số lượng gene trên CaZy 577 2.774

Gene chứa peptide tín hiệu 5.051 10.954

Khối lượng gene (gene/Mbp) 963 1.012

Tổng kích thước gene 49.330.702 145.153.973

Kích thước gene lớn nhất 17.244 21.804

49

Kích thước gene nhỏ nhất 65 70

Kích thước gene trung bình 832 664

Dữ liệu trình tự metagenome của 2 mẫu nghiên cứu sau khi lắp ráp được đưa

lên hệ thống MG-RAST với mã số (MG-RAST ID) là 4730381.3 (C) và 4720115.3

(BHR). Các trình tự mã hóa gene chức năng được so sánh trên các cơ sở dữ liệu

khác nhau như GO, Cazy v.v. Tổng số gene của mẫu C (59.225) thấp hơn BHR

(218.327) do số lượng contig của C cũng thấp hơn BHR nhiều. Với kích thước và

khối lượng gene tương đương thì số lượng gene đã biết chức năng của mẫu C

(36.247) cũng thấp hơn gần 3 lần của mẫu BHR (93.222).

3.2.3. Đa dạng VSV của metagenome C và BHR

Trong tổng số 80.156 đoạn trình tự (OTU) của mẫu C và 268.768 OTU của

mẫu BHR dự đoán được từ cơ sở dữ liệu RefSeq, các trình tự so sánh tương đồng

với các trình tự có nguồn gốc từ vi khuẩn của 2 mẫu đều chiếm đa số (C đạt 79.508

(99,19%) và BHR 263.858 (98,17%)). Tương tự như vậy, các trình tự từ vi khuẩn

cổ (vi khuẩn cổ – Archaea) tương ứng đạt 106 (0,13%) và 3.333 (1,24%), các trình

tự từ sinh vật nhân thật (Eukaryota) đạt 189 (0,24%) và 1.330 (0,49%). Các trình tự

chiếm tỷ lệ rất nhỏ là từ virus đạt 344 (0,43%) và 237 (0,09%), các trình tự chưa

được phân loại của 2 mẫu chỉ chiếm 0,01% (Hình 3.10).

Phân tích metagenome mẫu suối nước nóng Comano Terme (Ý) cũng cho

thấy vi khuẩn chiếm số lượng lớn nhất 78,4% (196 trình tự), tiếp theo là virut với

15,6% (39 trình tự), vi khuẩn cổ 4,8% (12 trình tự) và sinh vật nhân thật 0,8% (2

trình tự) (Pedron và cs., 2019). Nghiên cứu metagenome 2 mẫu đất ở Hiyoriyama

và Amamiya sau sóng thần thu được lần lượt 822.865 và 961.221 read chất lượng

cao. Phân tích đa dạng VSV cho thấy chiếm ưu thế là vi khuẩn (99,01% và 98,99%)

tiếp đến là vi khuẩn cổ (0,81% và 0,63%) và virut (0,18% và 0,38%) (Satoshi

Hiraoka, 2016).

50

51

Hình 3.10. Đa dạng ở các mức độ khác nhau của metagenome C (vòng ngoài) và BHR

(vòng trong) trên cơ sở dữ liệu RefSeq

Sự đa dạng ở các mức độ phân loại như ngành, lớp, bộ, họ, chi, loài của 2

mẫu cũng được thực hiện và số liệu thu được trình bày ở Bảng 3.7. Đa dạng trong

metagenome BHR đều cao hơn ở metagenome của C đối với tất cả các mức độ. Sau

52

khi so sánh chi tiết về đa dạng vi sinh vật (Taxa và gene chức năng) giữa 2 mẫu

nghiên cứu có thể xác định được các sinh vật chiếm ưu thế tham gia phân hủy chất

diệt cỏ/dioxin cũng như chỉ thị về VSV trong mẫu ô nhiễm đã được xử lý khử độc

tại hiện trường ô nhiễm tại Biên Hòa.

Bảng 3.7. Đa dạng ở các mức độ phân loại của metagenome C và BHR

Mẫu Ngành Lớp Bộ Họ Chi Loài

C 45 87 161 301 622 674

BHR 52 110 208 375 786 1070

Tổng số 52 110 208 379 800 1264

3.2.3.1. Đa dạng vi khuẩn từ metagenome C và BHR ở các mức độ

Ở mức độ ngành vi khuẩn có sự thay đổi rõ rệt về số lượng (Hình 3.11). Trong

metagenome C có 27 ngành trong đó chiếm tỷ lệ cao nhất lần lượt là Proteobacteria

(86,05%) và Actinobacteria (11,98%), Firmicutes (0,83%), các ngành còn lại chiếm

tỷ lệ rất nhỏ. Còn đối với BHR đã phát hiện 28 ngành, tỷ lệ tập trung vào 3 ngành

chính là Proteobacteria (61,84%), Bacteroidetes (13,31%), Actinobacteria (8,51%).

Một số ngành khác chiếm tỷ lệ nhỏ hơn như Firmicutes (3,83%), Acidobacteria

(2,75%), Chloroflexi (2,33%), Cyanobacteria (1,35%), Nitrospirae (1,01%).

Hình 3.11. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ ngành trong metagenome C và BHR

Phân tích metagenome mẫu đất ở mỏ mangan (thuộc Odisha, Ấn Độ) cũng

phát hiện ngành chiếm ưu thế là Proteobacteria (42,47%) và Actinobacteria

53

(23,99%) (Ghosh và Das, 2018). Hai ngành Actinobacteria và Proteobacteria đã

được chứng minh là 2 ngành chủ yếu trong đất thường và cả đất nhiễm chất phóng

xạ Uranium (Yan và cs., 2016). Trong nghiên cứu của Puranik và cộng sự về VSV

đảo nổi ở hồ Loktak chỉ ra các ngành chiếm ưu thế có sự khác biệt với mẫu nghiên

cứu lần lượt là Proteobacteria (51%), Acidobacteria (10%), Actinobacteria (9%) and

Bacteroidetes (7%) (Puranik và cs., 2016). Các ngành Proteobacteria (40 ± 2%),

Actinobacteria (18 ± 1%), Firmicutes (5 ± 0,3%) và Acidobacteria (4 ± 0,5%) được

xác định là chiếm ưu thế trong mẫu đất đen Amazon bên cạnh các ngành khác như

Planctomycetes (3,5± 0,4%), Chloroflexi (2,5 ± 0,3%), vi khuẩn lam (2,5 ± 0,1%),

Bacteroidetes (2 ± 0,2%) và Verrucomicrobia (2 ± 0,2%) (Leandro và cs.,, 2016).

Hình 3.12. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ lớp trong metagenome C và BHR

Đa dạng vi khuẩn ở mức độ lớp chỉ ra rằng Betaproteobacteria chiếm

52,20% ở C nhưng chỉ chiếm 15,84% ở BHR. Một số lớp có tỷ lệ không có sự

chênh lệch lớn ở cả C và BHR như Gammaproteobacteria 25,8% và 23,98%,

Actinobateria 11,98% và 8,51%, Alphaproteobacteria 7,36% và 14,38% so với C và

BHR. Trong khi metagenome của BHR có một số lớp chiếm tỷ lệ tương đối cao như

Bacteroidia (5,71%), Deltaproteobacteria (7,27%), Sphingobacteria (3,32%),

54

Clostridia (2,4%), Flavobacteria (2,31%) và còn lại các lớp khác chiếm tỷ lệ thấp

hơn (Hình 3.12). Đây cũng chính là các nhóm ở C chiếm tỷ lệ rất thấp, đất bị ô

nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin kéo dài dẫn tới thay đổi đa dạng VSV đất.

Ở mức độ bộ vi khuẩn, bộ chiếm ưu thế trong metagenome C gồm

Pseudomonadales, Burkholderiales, Actinomycetales, Xanthomonadales,

Rhizobiales, Enterobacteriales với tỷ lệ lần lượt là 42,59%; 23,43%; 11,71%;

4,61%; 4,12% và 2,68%. Mẫu BHR có sự thay đổi lớn số lượng và tỷ lệ các bộ với

sự chênh lệch không nhiều Burkholderiales (15,47%), Rhizobiales (9,93%),

Actinomycetales (7,95%), Xanthomonadales (4,93%), Pseudomonadales (2,15%),

Enterobacteriales (1,04%) và bộ chiếm tỷ lệ cao hơn rất nhiều so với mẫu C như

Bacteroidales (5,7%), Myxococcales (4,4%), Chromatiales (3,41%),

Sphingobacteriales (3,32%), Nitrosomonadales (2,58%), Rhodocyclales (2,3%),

Flavobacteriales (2,25%) (Hình 3.13).

Hình 3.13. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ bộ trong metagenome C và BHR

55

Abbasian và cộng sự (2016) nghiên cứu metagenome đất nhiễm dầu thô phân

tích bằng Hiseq Illumina với cơ sở dữ liệu trên hệ thống MG-RAST cho thấy bộ

Actinomycetales (9,8%) chiếm ưu thế, tiếp theo là Rhizobiales (3,3%). Một số gen

chức năng có vai trò trong chuyển hóa hydrocarbon thơm (2,51%) được tìm thấy

chủ yếu thuộc về Actinobacteria (12,35%), khử lưu huỳnh (0,03%) và kháng kim

loại nặng (1,1%) (Abbasian và cs., 2016).

Hình 3.14. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ họ trong metagenome C và BHR

Ở cấp họ vi khuẩn, chiếm ưu thế trong metagenome C là Alcaligenaceae 12,38%,

Burkholderiaceae 8,16%, Enterobacteriaceae 2,68%, Comamonadaceae 2,16% và

Buetenbergiaceae 1,32%. Với metagenome BHR họ chiếm ưu thế lần lượt là

Comamonadaceae 5,13%, Bradyrhizobiaceae 4,19%, Burkholderiaceae 4,78%,

Alcaligenaceae 4,11%, Bacteroidaceae 3,41%, Flavobacteriaceae 2,17%,

Ectothiorhodospiraceae 1,91%, Cytophagaceae 1,58%, Chromatiaceae 1,42% (Hình 3.14).

Sự khác biệt giữa metagenome C, BHR thể hiện rõ nhất ở mức độ chi (Hình

3.15). Vi khuẩn Pseudomonas là chi chiếm tỷ lệ lớn nhất tới 40,54% tổng số trình tự

thu được từ dữ liệu metagenone của đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (mẫu C).

56

Hình 3.15. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ chi trong metagenome C và BHR

57

Bảng 3.8. Một số chi có các đại diện đã được chứng minh có khả năng phân huỷ chất diệt cỏ/ dioxin

Phylum - ngành Class-lớp Order-bộ Family-họ Genus-chi C BHR

Proteobacteria Betaproteobacteria Burkholderiales Alcaligenaceae Achromobacter 6740 3732

Acidobacteria Acidobacteria (class) Acidobacteriales Acidobacteriaceae Acidobacterium 15 1052

Proteobacteria Betaproteobacteria Burkholderiales Comamonadaceae Acidovorax 549 5211

Proteobacteria Gammaproteobacteria Pseudomonadales Moraxellaceae Acinetobacter 121 488

Actinobacteria Actinobacteria (class) Actinomycetales Actinomycetaceae Actinomyces 498 107

Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Rhizobiaceae Agrobacterium 192 963

Proteobacteria Betaproteobacteria Burkholderiales Comamonadaceae Albidiferax 91 1380

Proteobacteria Deltaproteobacteria Myxococcales Myxococcaceae Anaeromyxobacter 72 6444

unclassified (derived Streptophyta Brassicales Brassicaceae Arabidopsis 8 76 from Streptophyta)

Ascomycota Eurotiomycetes Eurotiales Trichocomaceae Aspergillus 5 32

Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodospirillales Rhodospirillaceae Azospirillum 153 270

Firmicutes Bacilli Bacillales Bacillaceae Bacillus 91 1328

58

Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroidales Bacteroidaceae Bacteroides 21 8985

Proteobacteria Betaproteobacteria Burkholderiales Alcaligenaceae Bordetella 3106 7124

Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Bradyrhizobiaceae Bradyrhizobium 387 2581

Firmicutes Bacilli Bacillales Paenibacillaceae Brevibacillus 4 100

Proteobacteria Betaproteobacteria Burkholderiales Burkholderiaceae Burkholderia 5053 7027

unclassified (derived unclassified (derived unclassified (derived Candidatus Acidobacteria 14 1561 from Acidobacteria) from Acidobacteria) from Acidobacteria) Koribacter

Candidatus Acidobacteria Solibacteres Solibacterales Solibacteraceae 42 4252 Solibacter

Proteobacteria Alphaproteobacteria Caulobacterales Caulobacteraceae Caulobacter 164 759

Proteobacteria Betaproteobacteria Burkholderiales Burkholderiaceae Cupriavidus 957 3092

unclassified (derived unclassified (derived Chloroflexi Dehalococcoidetes Dehalococcoides 5 253 from Dehalococcoidetes) from Dehalococcoidetes)

Firmicutes Clostridia Clostridiales Peptococcaceae Desulfitobacterium 15 312

Proteobacteria Deltaproteobacteria Desulfobacterales Desulfobacteraceae Desulfobacterium 7 151

59

Proteobacteria Deltaproteobacteria Desulfobacterales Desulfobacteraceae Desulfococcus 232 8

Proteobacteria Deltaproteobacteria Desulfovibrionales Desulfohalobiaceae Desulfohalobium 93 4

Proteobacteria Deltaproteobacteria Desulfovibrionales Desulfomicrobiaceae Desulfomicrobium 157 7

Proteobacteria Deltaproteobacteria Desulfovibrionales Desulfohalobiaceae Desulfonatronospira 2 61

Proteobacteria Deltaproteobacteria Desulfobacterales Desulfobulbaceae Desulfotalea 139 6

Firmicutes Clostridia Clostridiales Peptococcaceae Desulfotomaculum 291 22

Proteobacteria Deltaproteobacteria Desulfovibrionales Desulfovibrionaceae Desulfovibrio 904 77

Chrysiogenetes Chrysiogenetes (class) Chrysiogenales Chrysiogenaceae Desulfurispirillum 81 4

Proteobacteria Deltaproteobacteria Desulfobacterales Desulfobulbaceae Desulfurivibrio 151 2

Crenarchaeota Thermoprotei Desulfurococcales Desulfurococcaceae Desulfurococcus 5 0

Proteobacteria Deltaproteobacteria Desulfuromonadales Desulfuromonadaceae Desulfuromonas 157 5

Firmicutes Clostridia Clostridiales Syntrophomonadaceae Dethiobacter 74 5

Synergistetes Synergistia Synergistales Synergistaceae Dethiosulfovibrio 48 6

7 Bacteroidetes Cytophagia Cytophagales Cytophagaceae Dyadobacter 1223

Gemmatimonadales Gemmatimonadaceae Gemmatimonas 12 1786 Gemmatimonadetes Gemmatimonadetes

60

(class)

Bacilli Firmicutes Bacillales Bacillaceae Geobacillus 30 462

Proteobacteria Deltaproteobacteria Desulfuromonadales Geobacteraceae Geobacter 82 2834

Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Methylobacteriaceae Methylobacterium 367 1226

Actinobacteria Actinobacteria (class) Actinomycetales Mycobacteriaceae Mycobacterium 497 5481

Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Bradyrhizobiaceae Nitrobacter 91 6133

Proteobacteria Gammaproteobacteria Chromatiales Chromatiaceae Nitrosococcus 106 3053

Proteobacteria Betaproteobacteria Nitrosomonadales Nitrosomonadaceae Nitrosospira 49 4849

Actinobacteria Actinobacteria (class) Actinomycetales Nocardioidaceae Nocardioides 331 684

Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales Sphingomonadaceae Novosphingobium 31 820

Firmicutes Bacilli Bacillales Paenibacillaceae Paenibacillus 28 422

Proteobacteria Alphaproteobacteria Caulobacterales Caulobacteraceae Phenylobacterium 42 206

Proteobacteria Betaproteobacteria Burkholderiales Comamonadaceae Polaromonas 321 2193

Proteobacteria Gammaproteobacteria Pseudomonadales Pseudomonadaceae Pseudomonas 32415 4332

Proteobacteria Betaproteobacteria Burkholderiales Burkholderiaceae Ralstonia 439 2053

61

Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Rhizobiaceae Rhizobium 278 1594

Actinobacteria Actinobacteria (class) Actinomycetales Nocardiaceae Rhodococcus 415 942

Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Bradyrhizobiaceae Rhodopseudomonas 314 3116

Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Rhizobiaceae Sinorhizobium 269 1516

Proteobacteria Deltaproteobacteria Myxococcales Polyangiaceae Sorangium 36 2344

Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales Sphingomonadaceae Sphingomonas 102 660

Proteobacteria Gammaproteobacteria Xanthomonadales Xanthomonadaceae Stenotrophomonas 900 3433

Actinobacteria Actinobacteria (class) Actinomycetales Streptomycetaceae Streptomyces 713 3056

Actinobacteria Actinobacteria (class) Actinomycetales Streptosporangiaceae Streptosporangium 67 285

Proteobacteria Gammaproteobacteria Chromatiales Ectothiorhodospiraceae Thioalkalivibrio 75 2192

Proteobacteria Betaproteobacteria Hydrogenophilales Hydrogenophilaceae Thiobacillus 58 2617

Proteobacteria Betaproteobacteria Burkholderiales Comamonadaceae Variovorax 110 838

Proteobacteria Betaproteobacteria Burkholderiales Comamonadaceae Verminephrobacter 242 900

Proteobacteria Gammaproteobacteria Xanthomonadales Xanthomonadaceae Xanthomonas 2552 8490

62

Thay đổi lớn nhất trong quần xã VSV là sự tăng số lượng vi khuẩn thuộc chi

Cupriavidus, chi này chiếm hơn 1% ở metagenome C và 6,5% (vị trí thứ 2) trong

metagenome BHR. Chi Cupriavidus được biết đến thông qua các minh chứng là

nhiều chủng của chi này có khả năng phân hủy chất diệt cỏ như chủng Cupriavidus

necator JMP134. Kết quả khảo sát sơ bộ đến loài rất đáng ngạc nhiên là hai chi vi

khuẩn kị khí có số lượng loài rất chênh lệch nhau. Ở chi Anaeromyxobacter chỉ có 3

loài, ngược lại ở Bacteroides có tới 36 loài. Còn ở VSV hiếu khí như Burkhodaria

có 23 loài và xạ khuẩn Streptomyces có tới 33 loài, đối với vi khuẩn hiếu khí tùy

tiện như Pseudomonas và Bacillus có lần lượt là 15 loài và 25 loài. Các chi đã được

cộng đồng các nhà khoa học nghiên cứu rất nhiều và đã chứng minh có khả năng

phân hủy dioxin và hàng loạt các chất đa vòng thơm khác như Dehalococcoides chỉ

có 1 chi và có 5 chủng, Sphingomonas chỉ có 3 loài (Bảng 3.8).

3.2.3.2. Đa dạng vi khuẩn cổ trong metagenome C và BHR

Đa dạng vi khuẩn cổ trong metagenome C và BHR ở các mức độ phân

loại khác nhau

Phát hiện thấy có sự khác biệt về đa dạng vi khuẩn cổ ở mức độ ngành giữa

metagenome của C và BHR (Hình 3.16). Đây có lẽ là kết quả khá mới trong lĩnh vực

nghiên cứu VSV liên quan đến xenobiotic. Ngành Euryarchaeota chiếm tới 92,45% ở C

nhưng chỉ chiếm 59,02% ở BHR. Ngành Crenarchaeota và Korarchaeota chiếm tỷ lệ

tương đương nhau ở cả 2 mẫu lần lượt là 5,66%; 0,94% trong metagenome của C và

9,54%; 1,29% trong BHR. Riêng ngành Thaumarchaeota chiếm tỷ lệ rất nhỏ ở C

(0,94%) nhưng lại chiếm tỷ lệ lớn ở BHR (30,15%). Đây là kết quả rất ngạc nhiên, để

giải thích tỷ lệ chiếm ưu thế trong metagenome của các mẫu nghiên cứu này cần thêm

thời gian và những nghiên cứu sâu sắc tiếp theo.

Ở mức độ lớp vi khuẩn cổ không có sự chênh lệch lớn như của vi khuẩn (Hình

3.17). Lớp chiếm tỷ lệ cao nhất ở cả 2 mẫu là Methanomicrobia chiếm 50% trong

metagenome của C và 24,57% của BHR. Các lớp khác như Archaeoglobi, Halobacteria,

Methanobacteria, Methanococci, Methanopyri, Thermococci, Thermoprotei chiếm tỷ lệ

thấp ở cả 2 mẫu. Rất đặc biệt, tỷ lệ quần xã vi khuẩn kị khí bắt buộc chưa được biết đến

này trong hệ thống phân loại rất cao ở cả C và BHR lần lượt là 19,92% và 36,54%.

63

Hình 3.16. Đa dạng vi khuẩn cổ mức độ ngành trong metagenome C và BHR

Hình 3.17. Đa dạng vi khuẩn cổ ở mức độ lớp trong metagenome C và BHR

Hình 3.18. Đa dạng vi khuẩn cổ ở mức độ chi trong metagenome C và BHR

64

Mức độ chi (Hình 3.18) cho thấy sự thay đổi tỷ lệ của các chi ở 2 mẫu là khác

nhau. Mẫu C đa dạng tập trung lần lượt Methanosarcina (22,64%), Methanocella

(12,26), Methanosaeta (6,6%), Methanococcus (5,66%) và các chi chưa được phân loại

lên tới 16,04%. Vi khuẩn cổ của mẫu BHR cũng tập trung lần lượt Nitrosopumilus

(23,97%), Methanosarcina (9,66%), Cenarchaeum (6,18%), Pyrococcus (3,63%),

Thermococcus (3,6%) và chi chưa phân loại chiếm 4,35% ít hơn mẫu C rất nhiều.

Thông tin về đa dạng loài vi khuẩn cổ cũng được khai thác và chủ yếu tập

trung vào 2 nhóm có vai trò quan trọng trong xử lý ô nhiễm được trình bày ở nội

dung tiếp theo là nhóm vi khuẩn cổ sinh metan và nhóm ưa mặn (Có khả năng chịu

được nhiều loại muối với nồng độ khác nhau).

Đa dạng vi khuẩn cổ sinh metan trong metagenome của các mẫu nghiên cứu

Nhóm vi khuẩn cổ sinh metan cũng có mặt trong metagenome chiếm tỷ lệ

cao ở mẫu BHR (vì chôn lấp với thời gian và điều kiện xử lý đã mô tả chi tiết ở

phần vật liệu và phương pháp. Đặc biệt và ở giai đoạn cuối của qui trình xử lý thì

nước đã được bão hòa) và tổng độ độc của mẫu đã giảm xuống dưới mức cho phép

thì sự có mặt của chúng cũng là hiện tượng dễ hiểu (Hình 3.19).

Đa dạng vi khuẩn cổ ưa mặn trong metagenome C và BHR

Trong metagenome của 2 mẫu nghiên cứu cũng đã phát hiện thấy 10 chi vi khuẩn

cổ (Archaea) thuộc chỉ ngành Euryarchaeota và đều thuộc họ Halobacteriaceae. Số lượng

của mỗi chi trong metagenome mẫu BHR lớn hơn nhiều so với mẫu C (Hình 3.20).

Vậy vai trò của 10 chi vi khuẩn cổ ưa mặn trong metagenome của nghiên

cứu này có chức năng cụ thể trong phân hủy dioxin và các chất diệt cỏ khác như thế

nào? Đây là câu hỏi cần được làm rõ trong các nghiên cứu của tương lai.

65

Hình 3.19. Đa dạng vi khuẩn cổ sinh metan trong metagenome C và BHR

Hình 3.20. Đa dạng vi khuẩn cổ ưa mặn trong metagenome C và BHR

66

Bảng 3.9. Đa dạng nấm sợi và nấm đảm trong metegenome của C và BHR

Ngành Lớp Bộ Họ Chi C BHR

Ascomycota Eurotiomycetes Onygenales Ajellomycetaceae Ajellomyces 1 5

Ascomycota Eurotiomycetes Onygenales Arthrodermataceae Arthroderma 0 3

Ascomycota Eurotiomycetes Eurotiales Trichocomaceae Aspergillus 5 32

Ascomycota Leotiomycetes Helotiales Sclerotiniaceae Botryotinia 0 3

unclassified (derived from

Ascomycota Saccharomycetes Saccharomycetales Saccharomycetales) Candida 0 5

Ascomycota Sordariomycetes Sordariales Chaetomiaceae Chaetomium 0 3

Ascomycota Saccharomycetes Saccharomycetales Metschnikowiaceae Clavispora 0 1

unclassified (derived from

Ascomycota Eurotiomycetes Onygenales Onygenales) Coccidioides 2 5

Ascomycota Saccharomycetes Saccharomycetales Debaryomycetaceae Debaryomyces 2 2

Ascomycota Eurotiomycetes Eurotiales Trichocomaceae Emericella 5 9

Ascomycota Saccharomycetes Saccharomycetales Saccharomycetaceae Eremothecium 0 4

Ascomycota Sordariomycetes Hypocreales Nectriaceae Gibberella 15 25

67

Ascomycota Sordariomycetes Hypocreales Hypocreaceae Hypocrea 5 0

Ascomycota Saccharomycetes Saccharomycetales Saccharomycetaceae Kluyveromyces 0 4

Ascomycota Saccharomycetes Saccharomycetales Saccharomycetaceae Lachancea 0 2

Ascomycota Saccharomycetes Saccharomycetales Debaryomycetaceae Lodderomyces 0 3

Ascomycota Sordariomycetes Magnaporthales Magnaporthaceae Magnaporthe 1 12

Ascomycota Saccharomycetes Saccharomycetales Saccharomycetaceae Nakaseomyces 0 4

Ascomycota Sordariomycetes Hypocreales Nectriaceae Nectria 6 2

Ascomycota Eurotiomycetes Eurotiales Trichocomaceae Neosartorya 2 22

Ascomycota Sordariomycetes Sordariales Sordariaceae Neurospora 0 14

Ascomycota Eurotiomycetes Eurotiales Trichocomaceae Penicillium 4 14

Ascomycota Dothideomycetes Pleosporales Phaeosphaeriaceae Phaeosphaeria 0 10

Ascomycota Saccharomycetes Saccharomycetales Saccharomycetaceae Pichia 1 0

Ascomycota Sordariomycetes Sordariales Lasiosphaeriaceae Podospora 3 13

Ascomycota Dothideomycetes Pleosporales Pleosporaceae Pyrenophora 0 1

Ascomycota Saccharomycetes Saccharomycetales Saccharomycetaceae Saccharomyces 0 8

Ascomycota Saccharomycetes Saccharomycetales Debaryomycetaceae Scheffersomyces 0 4

68

Ascomycota Schizosaccharomycetes Schizosaccharomycetales Schizosaccharomycetaceae Schizosaccharomyces 1 22

Ascomycota Leotiomycetes Helotiales Sclerotiniaceae Sclerotinia 0 5

Ascomycota Eurotiomycetes Eurotiales Trichocomaceae Talaromyces 1 2

Ascomycota Eurotiomycetes Onygenales Onygenaceae Uncinocarpus 1 0

Ascomycota Saccharomycetes Saccharomycetales Saccharomycetaceae Vanderwaltozyma 0 1

unclassified (derived from

Ascomycota Sordariomycetes Phyllachorales Verticillium 0 4 Phyllachorales)

Ascomycota Saccharomycetes Saccharomycetales Dipodascaceae Yarrowia 1 9

Basidiomycota Agaricomycetes Agaricales Psathyrellaceae Coprinopsis 1 8

Basidiomycota Tremellomycetes Tremellales Tremellaceae Filobasidiella 10 0

Basidiomycota Agaricomycetes Agaricales Tricholomataceae Laccaria 0 3

Basidiomycota Exobasidiomycetes Malasseziales Malasseziaceae Malassezia 0 4

Basidiomycota Agaricomycetes Agaricales Marasmiaceae Moniliophthora 0 1

Basidiomycota Agaricomycetes Polyporales Coriolaceae Postia 0 1

Basidiomycota Agaricomycetes Agaricales Schizophyllaceae Schizophyllum 0 8

Basidiomycota Ustilaginomycetes Ustilaginales Ustilaginaceae Ustilago 0 5

69

3.2.3.3. Đa dạng nấm sợi, nấm đảm trong metagenome C và BHR

Số lượng của nấm sợi và nấm đảm trong metagenome không cao và

nấm sợi có số lượng và đa dạng hơn nhiều có tới 36 chi so với nấm đảm chỉ có

8 chi và nấm men 13 chi đã được phát hiện trong 2 mẫu nghiên cứu (Bảng

3.9). Đã có nhiều công bố về khử độc chất diệt cỏ/dioxin bởi các chủng nấm

sợi thuộc các chi khác nhau, trong các nghiên cứu suốt gần 20 năm chúng tôi

đã có nhiều minh chứng về vai trò của nấm sợi. Đặc biệt các chi Aspergillus

và Penicillium phân hủy không chỉ 2,3,7,8-TCDD mà cả 2,4-D; 2,4,5-T cũng

như các chất vòng thơm khác với hiệu suất rất cao. Ngoài ra chúng còn sinh

laccase-like tham gia vào quá trình xúc tác oxy hóa cắt vòng thơm. Nếu so

sánh sự có mặt của một số chi nấm sợi ở mẫu C thì số chi có mặt là 17/35 với

số lượng rất thấp, còn ở BHR là 32/35 với số lượng cao hơn rất nhiều (Bảng

3.9). Đặc biệt, chi Gibberella chiếm số lượng cao nhất ở cả 2 metagenome.

Vai trò của chúng trong quá trình phân hủy chất diệt cỏ/dioxin chưa được làm

rõ mặc dù một vài đại diện của chi này đã được chứng minh sinh tổng hợp

chất kích thích sinh trưởng. Nấm men hiện vẫn chưa có công bố nào và đây là

một phát hiện mới khi mà quần xã nấm men cũng có mặt trong metagenome

của đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tuy số lượng không cao. Các chi rất quen

thuộc với chúng ta đều có mặt như Candida, Saccharomyce, Pichia. Riêng chi

nấm men Schizosaccharomyces có mặt ở BHR với số lượng khá cao, đây là

một phát hiện khá thú vị vì các đại diện của chúng có thể tham gia vào quá

trình lên men các sản phẩm trao đổi chất tạo ra bởi các nhóm khác. Đất ô

nhiễm ở C có độ độc cao như thế nhưng nấm men vẫn có mặt với số lượng rất

thấp. Đây là những câu hỏi cần có lời giải và có thể các nghiên cứu tiếp theo

nên phân lập nấm men, nấm sợi và nấm đảm để đánh giá vai trò của chúng

trong quá trình phân hủy, chuyển hóa và khoáng hóa chất độc bởi các VSV

nhân thật này..

3.2.4. Mối liên hệ giữa một số chi vi khuẩn với tổng độ độc và các đặc tính

lý hóa của đất

Đối với các chi VSV có mặt ở mẫu nghiên cứu nhưng sự chênh lệch về tỷ

lệ trong metagenome rất khác nhau. Ngoài ra các chi được so sánh ở đây đều là

70

các chi có tỷ lệ cao hay đóng vai trò rất quan trọng trong hoạt động sinh lý ở các

sinh thái tiêu biểu cho nghiên cứu này. Ví dụ 7 chi sau đây sẽ cung cấp cho chúng

ta một bức tranh rất nhiều màu sắc về thế giới VSV liên quan đến 2 nhóm mẫu

mà chúng tôi nghiên cứu metagenome (Hình 3.21). Chi và cũng đồng thời là loài

bởi số lượng chỉ có 1 là Candidatus koribacter và Candidatus solibacter ở mẫu

BHR chiếm tỷ lệ cao gấp 10 lần so với mẫu C. Chi Cupriavidus cũng chi chiến

ưu thế rất cao nhưng ở mỗi mẫu nghiên cứu có sự khác biệt rất rõ ràng.

Hình 3.21. Các chi vi khuẩn có tỷ lệ chiếm ưu thế ít chênh lệch trong metagenome của mẫu C và BHR

Công cụ metagenome và cơ sở dữ liệu tiếp cận được đã chỉ ra đa dạng

VSV tới cả mức độ loài. Thông tin về các loài cũng như tỷ lệ của chúng trong

các mẫu nghiên cứu đã được thống kê. Các đặc tính cơ bản nhất của số lượng

hay đa dạng vi khuẩn phân tích đến mức độ loài có thể nhận ra ngay sự khác

biệt giữa cá thể trong từng quần xã của metagenome ở mẫu nghiên cứu liên

quan chặt chẽ với sự có mặt của chất ô nhiễm và điều kiện môi trường nơi

chúng sinh sống.

3.2.5. Đa dạng gene chức năng tham gia phân hủy xenobiotic của

metagenome C và BHR

Nghiên cứu này tập trung vào quá trình trao đổi chất của các hợp chất

vòng thơm ở phần sau của con đường phân hủy. Chú giải phân hệ chức năng ở

cấp một chỉ ra sự vượt trội của các gene thuộc về các con đường trao đổi chất

trong đất, đặc biệt là cacbonhydrat, trao đổi chất axit amin và protein trong cả

hai metagenome. Ở mức độ này, cơ chế trao đổi chất của các hợp chất vòng

thơm không có sự khác biệt quá rõ rệt. Phân tích sâu hơn cho thấy các gene

71

liên quan đến các con đường trao đổi ngoại vi và trao đổi chất thông qua các

hợp chất vòng thơm trung gian chiếm ưu thế trong cả 2 metagenome. Các gene

liên quan đến hoạt động trao đổi chất các hợp chất vòng thơm trung gian hoạt

động mạnh hơn trong mẫu C so với mẫu BHR (Hình 3.22).

Hình 3.22. Tương quan gene liên quan đến chuyển hóa xenobiotic giữa

metagenome C và BHR.

Một điểm đáng chú ý khác là các gene laccase được tìm thấy trong các

metagenome này đều thuộc laccase của vi khuẩn. Trong khi laccases từ nấm

đã được thông báo có khả năng phân hủy các hợp chất liên quan đến dioxin.

Cho đến nay, không có minh chứng về laccase của vi khuẩn tham gia vào quá

trình phân hủy dioxin trực tiếp. Có nhiều gene liên quan đến sự phân hủy các

hợp chất thơm thông qua montoxypase cytochrome P450 thấp hơn đáng kể so

với các nhóm khác, cho thấy xu hướng ưu tiên các con đường khoáng hóa hơn

là tạo thành các chất trung gian độc hại, các chất chuyển hóa ngõ cụt và các

liên hợp chịu trách nhiệm trong sự hình thành các dẫn chất PAH-DNA và các

đột biến kích hoạt ung thư ở động vật (Bảng 3.10).

Bảng 3.10. Số lượng trình tự tương đồng cao với các gene chức năng

trong tập dữ liệu chuẩn hóa

Các gene chức năng C BHR

Catechol 1,2-dioxygenase [EC 1.13.11.1] 25 13

catechol 2,3-dioxygenase [EC 1.13.11.2] 54 31

protocatechute 3,4-dioxygenase [EC 1.13.11.3] 59 8

72

protocatechute 4,5-dioxygenase [EC 1.13.11.8] 13 30

Cytochrome P450 4 5

Do lịch sử cụ thể của các mẫu đất, nghiên cứu các gene chức năng liên

quan đến các con đường phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T và các hợp chất có liên quan

đến dioxin đã được tiến hành (Bảng 3.11).

Bảng 3.11. Số lượng trình tự liên quan đặc thù tới con đường phân 2,4-D và

polychlorinated biphenyl (PCB) dựa trên cơ sở dữ liệu KEEG

Enzyme C BHR

alpha-ketoglutarate-dependent 2,4- 13 5 Phân dichlorophenoxyacetate dioxygenase [EC:1.14.11.-] hủy 2,4-dichlorophenol 6-monooxygenase [EC:1.14.13.20] 46 3 2,4-D chlorocatechol 1,2-dioxygenase [EC:1.13.11.-] 4 0

biphenyl 2,3-dioxygenase [EC:1.14.12.18] 17 2

cis-2,3-dihydrobiphenyl-2,3-diol dehydrogenase 0 0 [EC:1.3.1.56] Phân

hủy biphenyl-2,3-diol 1,2-dioxygenase [EC:1.13.11.39] 17 1

PCB 2,6-dioxo-6-phenylhexa-3-enoate hydrolase 4 3 [EC:3.7.1.8]

2-keto-4-pentenoate hydratase [EC:4.2.1.80] 21 6

3.2.6. Nhóm gene mã hóa enzyme tham gia phân hủy, chuyển hóa chất

diệt cỏ/dioxin:

Nhóm gene này rất quan trọng cho ứng dụng công nghiệp của nhiều

ngành nên một số dự án quốc tế cũng đang thực hiện tìm kiếm và sàng lọc trên

môi trường khác nhau. Đây là các gene chức năng thuộc nhóm oxidoreductase,

laccase là nhóm gene phổ biến nhất của họ này và tham gia vào oxy hóa mở

hay cắt vòng thơm hoạt động như là chất xúc tác mạnh. Nghiên cứu đã không

phát hiện được peroxidase tuy nhiên có tới 18 và 21 mã hóa cho enzyme

laccase đã được phát hiện từ metagenome C và BHR với tỷ lệ gene laccase

mới chiếm hơn một nửa (Bảng 3.12)

73

Bảng 3.12. Danh sách gene mã hóa laccase từ metagenome của C và BHR so với dữ liệu trên CSDL Laccase

Trình tự Độ tương Độ dài đoạn Giá trị Mẫu Trình tự loài tương đồng đồng (%) tương đồng tương đồng dự đoán

Prokka_00305 sid|11409|Pseudomonas moraviensis 100 458 0

Prokka_00967 sid|14148|Pseudomonas moraviensis 99.12 565 0

Prokka_07281 sid|13938|Achromobacter xylosoxidans 100 613 0

Prokka_09347 sid|13604|Pseudoxanthomonas spadix 99.83 601 0

Prokka_16774 sid|13125|Sphingobium lactosutens DS20 71.75 584 0

C có Prokka_19804 sid|13951|Rhodanobacter thiooxydans 61.14 579 0 18 Prokka_20573 sid|13557|Pseudomonas aeruginosa MH38 99.69 639 0 gene

Prokka_20635 sid|13943|Pseudomonas nitroreducens 96.39 498 0

Prokka_21506 sid|11928|Pseudomonas resinovorans 80.66 455 0

Prokka_26873 sid|13068|Burkholderia zhejiangensis 59.25 616 0

Prokka_29204 sid|8518|Bradyrhizobium japonicum 70.47 508 0

Prokka_29254 sid|14540|Cellulomonas carbonis T26 68.15 697 0

74

Prokka_34300 sid|13943|Pseudomonas nitroreducens 92.37 498 0

Prokka_36971 sid|9495|Ruania albidiflava 8.00E-179 60.09 436

Prokka_41532 sid|13977|Pseudoxanthomonas spadix 96.57 496 0

Prokka_42353 sid|9467|Microbacterium profundi 66.73 496 0

Prokka_43501 sid|14540|Cellulomonas carbonis T26 71.57 591 0

Prokka_47801 sid|13994|Pseudomonas sp. Chol1 98.91 459 0

Prokka_14662 sid|9054|Alicycliphilus denitrificans 58.23 577 0

Prokka_19245 sid|14551|Thiobacillus denitrificans 1.00E-178 63.85 390

Prokka_24460 sid|13761|Alcaligenes faecalis 75.7 572 0

BHR sid|12431|Chryseobacterium indologenes có 21 Prokka_49413 70.24 756 0 NBRC14944 gene

Prokka_85327 sid|16173|Acidobacteriaceae bacterium KBS96 80.44 496 0

Prokka_87022 sid|1760|Shewanella woodyi 5.00E-149 59.35 337

Prokka_88258 sid|14481|Pseudogulbenkiania sp. MAI-1 1.00E-116 58.84 311

75

Prokka_90273 sid|12453|Sphingobacterium sp. H1ai 58.29 875 0

Prokka_105664 sid|15908|Dyella jiangningensis 57.74 310 1.00E-118

Prokka_107695 sid|16030|Acidovorax sp. JS42 83.22 429 0

Prokka_123396 sid|13885|Rhodanobacter sp. 115 65.13 347 4.00E-156

Prokka_130875 sid|11567|Nitrobacter hamburgensis 78.7 446 0

Prokka_135268 sid|14555|Nitrosospira multiformis 92.55 631 0

Prokka_148241 sid|13885|Rhodanobacter sp. 115 65.47 611 0

Prokka_152277 sid|12383|Sphingobacterium thalpophilum 100 404 0

Prokka_164942 sid|10347|Arsenicicoccus bolidensis 77.14 315 2.00E-177

Prokka_169983 sid|18232|Intrasporangium oryzae NRRL B-24470 51.64 397 8.00E-131

Prokka_186549 sid|9102|Polaromonas sp. JS666 67.21 552 0

Prokka_192104 sid|13885|Rhodanobacter sp. 115 71.05 304 8.00E-153

Prokka_196163 sid|12402|Pontibacter actiniarum 63.72 736 0

Prokka_207175 sid|13525|Alicycliphilus denitrificans 99.35 619 0

76

3.2.7. Gene tham gia vào phân hủy chuyển hóa xenobiotic từ metagenome đã

được phát hiện

Bằng công cụ metagenome đã phát hiện số lượng gene khổng lồ có trong các

mẫu nghiên cứu và tập trung vào gene tham gia mã hóa enzyme phân hủy hợp chất

thuộc nhóm xenobiotic. Trong số đó enzyme laccase (laccase-like) được tập trung

tìm kiếm để có cơ sở chính xác hơn ứng dụng cho các mục đích khác nhau và nâng

cao hiệu quả khử độc cũng nằm trong định hướng này. Bằng các phần mềm chuyên

dụng, các gene mã hóa laccase mới trong mẫu nghiên cứu được phát hiện và liệt kê

(Bảng 3.13). Có tất cả 20/39 gene laccase mới được phát hiện với trình tự có độ

tương đồng thấp hơn 85% so với các công bố trên CSDL Laccase - Laccase

Database.

Bảng 3.13. Danh sánh gene laccase mới trong hai metagenome C và BHR so sánh

với các trình tự trên CSDL Laccase - Laccase Database

Độ Độ dài Giá Số hiệu

Trình tự Trình tự loài tương tương đoạn trị đăng ký Mẫu đồng đồng tương tương trên dự đoán

(%) đồng đồng Genbank

Prokka_2 Pseudomonas WP_0902 69 98 0 6873 kuykendallii 24340.1

Prokka_2 Bradyrhizobium WP_0243 70 99 0 C 9204 japonicum 41998.1 (6 Prokka_2 PFG3811 gene Georgenia soli 77 95 0 9254 5.1 mới)

Propionibacteriaceae Prokka_3 WP_0944 62 99 0 bacterium NML 6971 52554.1 150081

77

Prokka_4 Microbacterium WP_0331 67 99 0 2353 profundi 07198.1

Prokka_4 PFG3811 Georgenia soli 79 94 0 3501 5.1

59 97 0.0 Prokka_1 Candidimonas WP_0886

4662 nitroreducens 01715.1

69 99 0.0 Prokka_1 Betaproteobacteria KPK1419

9245 bacterium SG8_41 2.1

71 99 0.0 Prokka_4 Elizabethkingia WP_0954

9413 anophelis 39195.1

69 97 0.0 Prokka_8 Edaphobacter WP_0353

5327 aggregans 56032.1

Emcibacter sp. ZYL 62 95 Prokka_8 1e- WP_0994

7022 155 73112.1 BHR 64 98 Prokka_8 Candidatus 5e- WP_0962 (14 8258 Methanoperedens 126 03677.1 gene nitroreducens mới) 64 97 0.0 Prokka_9 Chitinophaga SHL1010

0273 jiangningensis 2.1

76 98 Prokka_1 Rhodanobacter sp. 8e- ODU9472

05664 SCN 66-43 159 9.1

74 99 Prokka_1 Alphaproteobacteria OJU5683 2E-

23396 bacterium 62-8 4.1 178

Nitrobacter sp. 62-23 77 99 0 Prokka_1 OJV0361

30875 6.1

72 97 0 Prokka_1 Alphaproteobacteria OJU5683

48241 bacterium 62-8 4.1

78

59 97 0 Prokka_1 Methylobacter EGW231

69983 tundripaludum SV96 98.1

76 99 0 Prokka_1 Alphaproteobacteria OJU5683

92104 bacterium 62-8 4.1

72 94 0 Prokka_1 Vibrionimonas WP_1054

96163 magnilacihabitans 69515.1

Các kết quả thu được trình bày ở trên có thể tóm tắt như sau:

- Nồng độ DNA tổng số trực tiếp thu được của mẫu C và BHR tương ứng đạt

23,2 ng/µl và 14,1 ng/µl được xác định bằng máy đo Qubit Fluorometre đáp ứng

yêu cầu cho giải trình tự bằng hệ thống Illumina Hiseq 2500.

- Độ lớn của mẫu sau khi giải trình tự với dữ liệu thu được rất lớn và có độ

chính xác cao (15Gb mỗi mẫu với độ chính xác 99,9%);

- Bằng phần mềm tin sinh học dựa trên các cơ sở dữ liệu đã xác định được đa

dạng VSV trong 2 metagenome ở các mức độ từ ngành, lớp, bộ, họ, chi, loài và đa

dạng gene chức năng tham gia vào phân hủy hợp chất xenobiotic;

- Sự khác biệt trong đa dạng thể hiện rõ nhất ở mức độ chi trong đó chi

Pseudomonas chiếm ưu thế ở mẫu ô nhiễm nặng (40,54%) còn ở mẫu đã làm sạch

giảm còn (1,71%);

- Đã xác định được đa dạng vi khuẩn cổ thuộc nhóm ưa mặn và sinh methan

(Methanosarcina, Haloarcula chiếm ưu thế ở đất đã khử độc). Sinh vật nhân thật

không nhiều nhưng phát hiện thấy nấm men, nấm sợi, nấm đảm như Aspergillus,

Penicillium, Gibberella, Emericella (nấm sợi), Candida, Schizosaccharomyces,

Saccharomyce, Pichia (nấm men) và ít nhất là Coprinopsi (nấm đảm);

- Số lượng gene mã hóa cho enzyme tham gia vào phân hủy xenobiotic rất

lớn. Sự có mặt của laccase và laccase-like trong 2 metagenome lên tới 39 gene,

trong đó có 20/39 gene laccase mới.

79

CHƯƠNG 4

BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1. Đa dạng VSV và gene chức năng từ trình tự DNA metagenome C và BHR

thu được.

Độ tồn lưu chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu này

có sự khác biệt rất lớn (Phụ lục 1). Mẫu tồn lưu ô nhiễm dioxin do chiến tranh (C)

có nồng độ chất diệt cỏ/dioxin rất cao trong khi mẫu đất đã xử lý làm sạch (BHR)

nồng độ dioxin đã ở dưới ngưỡng cho phép với đất trong nông nghiệp. Đặc điểm

khác biệt về độ tồn lưu của chất diệt cỏ/dioxin này giúp chúng ta nhận định và lý

giải khoa học hơn về sự biến động quần xã VSV cũng như các protein giả định và

con đường chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin. Khi hiểu và xác định được đa dạng VSV

trong metegenome của 2 loại đất khác nhau nhưng có bản chất như nhau rất quan

trọng đối với các nhà nghiên cứu công nghệ xử lý ô nhiễm bằng phân hủy sinh học.

Các VSV chiếm ưu thế và không chiếm ưu thế hay các quần xã biến động ra sao tại

thời điểm lấy mẫu với độ đại diện cao được coi như chỉ thị giúp hoàn thiện thiết kế

công nghệ xử lý ô nhiễm dioxin nói riêng và các hợp chất vòng thơm nói chung. Bài

toán xử lý khử độc đất ô nhiễm hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin và các chất trao đổi chất

vẫn còn độc tại hiện trường ô nhiễm với điều kiện thổ nhưỡng và đặc tính ô nhiễm

không đồng nhất với các yếu tố phức tạp ảnh hưởng tới phương pháp xử lý bằng

VSV chắc chắn sẽ có lời giải khi hiểu rõ cấu trúc quần xã cũng như hoạt động sinh

lý và sinh hóa của các quần xã VSV này.

Đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin có đặc điểm hóa học rất phức tạp như

hỗn hợp dioxin, furan, 2,4,5-T; 2,4-D, PAHs, dầu DO (phần có mạch cacbon dài

như nhựa đường) v.v. gây khó khăn trong quá trình thu nhận được DNA đảm bảo

tính đại diện, độ tinh sạch, đủ số lượng đáp ứng yêu cầu của hệ thống giải trình tự

Illumina Hiseq 2500. Do đó, nghiên cứu khá công phu trong khâu tách chiết DNA

metagenome từ môi trường ô nhiễm nhiều năm của rất nhiều hợp chất đa vòng thơm

chứa clo và không chứa clo từ các chất trao đổi chất đã được thực hiện và trình bày

chi tiết ở phần vật liệu và phương pháp.

80

Các bước trong tiến hành thu thập, bảo quản, tách chiết, giải trình tự DNA

metagenome được thực hiện một cách khoa học đảm bảo yêu cầu phân tích. Bên

cạnh đó đánh giá thành phần cơ giới, độ độc (yếu tố môi trường) cũng được tiến

hành là các yếu tố rất quan trọng bởi chúng góp phần bổ sung cơ sở khoa học trong

luận giải từ phân tích trình tự DNA metagenome bằng các phần mềm chuyên dụng.

Các thống kê phân tích cũng như đa dạng quần xã VSV (taxa) và một số gene chức

năng tham gia quá trình phân hủy, chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin sẽ được trình bày

ở các nội dung tiếp theo.

Dữ liệu ban đầu giải trình tự bằng máy Illumina Hiseq 2500 quan trọng nhất

của 2 mẫu được thể hiện ở Bảng 3.2 với chất lượng rất tốt (thông qua điểm đánh giá

chất lượng phân tích Phred đạt được ở mức cao). Số lượng read chất lượng cao thu

được cũng như độ lớn của 2 mẫu (Mb) là tương đương nhau (64 triệu read, khoảng

15Gb với mẫu C và 61 triệu read, khoảng 15Gb với mẫu BHR). Điểm chất lượng

trung bình (Phred) của mẫu C (37,83) lớn hơn mẫu BHR (33,98) nhưng không

nhiều và cả 2 giá trị này cùng nằm trong ngưỡng (30-40) mà kết quả có độ chính

xác xấp xỉ 99.95% (P=10^-3.3 ~ 0.0005). Kết quả thu được chứng tỏ các phân tích có

độ chính xác rất cao (Bảng 3.5). Có thể khẳng định số lượng read trong nghiên cứu

này thu được là rất lớn bởi trong môi trường không ô nhiễm nhưng cũng được coi là

khắc nghiệt như nghiên cứu metagenome suối nước nóng ở Comano Terme (Ý) của

Renato Pedron và cộng sự (2019) thì số lượng read thu được là hơn 34 triệu read so

với xấp xỉ 80 triệu read (Mẫu nước nóng trong bồn tắm) (Pedron và cs., 2019). Tiếp

đó, các read này sẽ được sử dụng trong lắp ráp de novo để tạo bộ dữ liệu các trình tự

có nghĩa (contig) phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.

Kết quả khác biệt với một số nghiên cứu khác trên thế giới với các loại hình

ô nhiễm khác nhau khi phân tích theo phương pháp shotgun metagenome. Ghosh đã

sử dụng công cụ metagenomic nghiên cứu đa dạng và gene chức năng quần xã VSV

mỏ khai thác mangan ở bang Odisha, Ấn Độ. Số lượng read thu được thấp hơn 5 lần

chỉ đạt 8.681.960 read (khoảng 3 Gb dữ liệu) (Ghosh và Das, 2018). Jeffries và

cộng sự đã phân tích metagenome của 5 mẫu đất từ trang trại mía đã từng sử dụng

thuốc trừ sâu ở Queensland, Úc nhằm tìm ra đa dạng VSV và gene chức năng tham

81

gia quá trình phân hủy các hợp chất photpho hữu cơ (là ô nhiễm chính và VSV có

thể phân hủy được). Tổng dữ liệu thu được rất lớn 564.033.668 read (khoảng 84

Gb) nhưng tính trung bình là 3,5 Gb/mẫu (Jeffries và cs., 2018). Nhưng có thể dễ

dàng nhận thấy điểm chung giữa nghiên cứu của NCS với các nghiên cứu khác trên

thế giới là tập trung vào đa dạng VSV và gene chức năng để tìm ra quy luật cũng

như định hướng phát triển phương pháp xử lý ô nhiễm môi trường đặc thù.

Sử dụng phương pháp sinh học sẽ tạo điều kiện để phân hủy, chuyển hóa và

khoáng hóa chất diệt cỏ/dioxin theo 4 con đường gồm loại khử clo bởi các VSV kỵ

khí (quá trình này diễn ra chậm ở điều kiện kỵ khí nhưng có thể giảm clo cho các

hợp chất dioxin bớt độc hơn, nhược điểm quá trình này là không thể khoáng hóa

hoàn toàn dioxin) và 3 con đường được thực hiện bởi nhóm VSV hiếu khí (oxy hóa

cắt vòng thơm bởi hàng loạt các enzyme hydrocarbon oxygenase và các enzyme

khác. Loại clo các sản phẩm đã cắt vòng và xúc tác các phản ứng oxy hóa bởi các

enzyme ngoại bào hay chất xúc tác hoạt động giống enzyme nhưng không phải là

protein) có thể khoáng hóa hoàn toàn hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin và các chất trao

đổi chất vẫn còn độc. Sự hiện hữu của các con đường chuyển hóa này được thể hiện

rất rõ qua nghiên cứu phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bởi tổ hợp vi khuẩn, xạ

khuẩn cũng như đa dạng VSV trong 2 mẫu nghiên cứu. Do quá trình phân hủy chất

diệt cỏ/dioxin vẫn đang diễn ra với tốc độ chậm ở mẫu ô nhiễm nặng (C) trong khi

mẫu đã xử lý sạch (BHR) được bổ sung các chất nuôi VSV dẫn tới thay đổi không

chỉ cấu trúc quần xã VSV mà thay đổi luôn các con đường trao đổi chất và đồng

trao đổi chất trong phân hủy, chuyển hóa, khoáng hóa chất diệt cỏ/dioxin. Khi nồng

độ chất ô nhiễm trong mẫu C vẫn cao và kiểu trao đổi chất không thay đổi nhiều

nên các nhóm VSV chiếm ưu thế có xu hướng sử dụng các chất ô nhiễm nguyên

thủy vẫn đóng vai trò chính. Vi sinh vật trong mẫu BHR có số lượng và đa dạng

nhiều hơn nên các con đường trao đổi chất mới khác với ban đầu đã hình thành. Có

thể sự thay đổi quần xã VSV xảy liên tục theo sự thay đổi bản chất hóa học của

hàng loạt chất trao đổi chất trung gian. Kết quả cuối cùng là cấu trúc các quần xã

VSV tham gia vào quá trình phân hủy các chất vòng thơm cũng giảm. Các nhóm

VSV khác sử dụng các chất mới hình thành do quá trình phân hủy, chuyển hóa và

82

khoáng hóa các chất ô nhiễm đa dạng hơn và số lượng tăng lên. Khi bổ sung

compost, các phụ phế liệu nông nghiệp cùng các chế phẩm DSH1 và DSH2 hòa tan

trong nước thì bản thân VSV bản địa của nguồn nguyên liệu này cùng với VSV có

sẵn trong đất ô nhiễm ở hố chôn đã thay đổi. Chúng dần dần thích nghi sau đó

chúng bắt đầu thay đổi về bản chất di truyền phụ thuộc vào “thức ăn”. Kết quả là

tạo nên một quần xã có tỷ lệ và kiểu trao đổi chất khác nhau. Khi các chất đa vòng

thơm chứa clo và không chứa clo đã được mở vòng và các chất khác là sản phẩm

trao đổi chất trung gian mới được hình thành bởi sự hoạt động trong quần xã vi

khuẩn hiếu khí, kỵ khí, xạ khuẩn, nấm v.v. sẽ tiếp tục tạo điều kiện cho các đại diện

của các quần xã mới tham gia vào 4 cơ chế chuyển hóa thay đổi theo thời gian. Kết

qủa cuối cùng là tạo nên sự đa dạng khác trong BHR. Những quần xã có khả năng

phân hủy dioxin hay các chất trao đổi chất trung gian khác nhau cũng thay đổi do

“thức ăn” đã thay đổi. Nhất là khi mẫu đất ở 4 lô của hố chôn lấp tích cực đã được

thu thập đã trải qua sự chuyển hóa phân hủy và khoáng hóa trong thời gian dài đến

60 thàng thì cấu trúc quần xã ở BHR không chỉ rất khác so với ban đầu của chính hố

chôn lấp tích cực BHR này mà còn không tìm thấy nhiều sự trùng lặp về cấu trúc

quần xã ở các mức độ đa dạng taxa và chức năng. Trong metagenome của BHR

xuất hiện nhiều đại diện mới trong quần xã của BHR theo thời gian, tuy nhiên một

số quần xã đã chiếm ưu thế ở mẫu C như Pseudomonas là mẫu có độ độc rất cao thì

ở mẫu của BHR vẫn phát hiện thấy với số rất thấp. Tuy số lượng các VSV thấp

nhưng chúng lại thuộc các quần xã có đại diện tham gia vào quá trình trao đổi chất

theo 4 con đường như đã đề cập thì đất ở BHR vẫn có thể cung cấp để giống VSV

cho các xử lý ô nhiễm mới tương tự bằng công nghệ tăng cường sinh học. Vì trong

đất của BHR còn có thêm các đại diện của quần xã có khả năng phân hủy

lignocellulose sẵn sẽ rút ngắn được thời gian cho xử lý khử độc tại nơi khác.

Phương pháp sử dụng trong nghiên cứu là WGS được hiểu đơn giản là

nghiên cứu đa dạng cũng như hệ gen bằng các đoạn trình tự ngắn (shotgun) kết hợp

với các phần mềm tin sinh chuyên dụng từ đó định hướng nghiên cứu trong thực tế.

Từ DNA trực tiếp thu thập của các mẫu môi trường, bằng hệ thống máy giải trình tự

công năng cao thế hệ mới của Illumina là Hiseq2500 tạo ra các đoạn trình tự ngắn

83

(read), các đoạn này sẽ được nối lại tạo các trình tự dài hơn (contig). Các contig có

thể là 1 đoạn hoặc chứa trình tự được sử dụng trong phân loại gọi là OTU. Nhiều

OTU có thể cùng mã hóa cho 1 loài. Chính vì lý do đó kết hợp với dữ liệu phân tích

rất lớn được trình bày ở phần trên và để đảm bảo việc xác định các chi chiếm ưu thế

trong 2 nhóm mẫu, các giá trị lọc kết quả sau khi tham chiếu trình tự trên cơ sở dữ

liệu Refseq được xác định để loại bỏ các trình tự ngắn có độ tương đồng thấp. Kết

quả BLAT ở phần này được sử dụng với giá trị evalue là 1x10-5, độ tương đồng tối

thiểu 60%, chiều dài đoạn so sánh tối thiểu là 15 trở lên. Trình tự tương đồng so

sánh (hit) của các mẫu với các trình tự đã biết trên cơ sở dữ liệu được xác định dựa

vào kết quả so sánh của đoạn trình tự đầu tiên phát hiện được.

Từ số liệu ban đầu này có thể thấy, tuy có sự xuất hiện của sinh vật nhân thật

cũng như virus và vi khuẩn cổ nhưng tỷ lệ rất thấp so với vi khuẩn chiếm phần lớn

trong DNA metagenome tách chiết được cũng như chúng chiếm số lượng chủ yếu

trong quần xã VSV đất ô nhiễm. Do đó, bên cạnh một số chi sinh vật nhân thật đã

phát hiện thấy chúng có mặt trong mẫu nghiên cứu thì nội dung luận án sẽ tập trung

chủ yếu vào khai thác đa dạng vi khuẩn, vi khuẩn cổ của 2 mẫu nghiên cứu ở các

mức độ khác nhau.

Một điểm thú vị khác được thể hiện rất rõ trong Hình 2.1 đó là sự tỷ lệ

nghịch của một số nhóm VSV chiếm ưu thế giữa 2 mẫu. Mẫu C có đa dạng VSV

thấp hơn và tập trung chủ yếu 1 số nhóm thì ở mẫu BHR các nhóm đó lại chiếm tỷ

lệ thấp hơn rất nhiều cùng với sự tăng lên của các nhóm VSV khác. Nói cách khác,

nghiên cứu đa dạng VSV ở 2 nhóm mẫu này sẽ mở ra một bức tranh mới hướng tới

hiện trường xử lý ô nhiễm POP ở quy mô lớn bằng cách kích thích hướng đích tới

các VSV đóng vai trò quan trọng phát hiện được để đẩy nhanh các con đường phân

hủy chất diệt cỏ/dioxin theo ý muốn. Đây chính là điểm khác biệt của luận án này

so với các công bố tiếp cận được bởi không chỉ ở nghiên cứu cơ bản mà còn định

hướng áp dụng các kết quả thu được vào nâng cao hiệu suất quy trình công nghệ

phân hủy hiện có.

Nếu chúng ta xét kỹ hơn thêm thì thấy một số VSV bị chết, một số đã bị đột

biến và thích nghi được với mức độ độc của hỗn hợp của chất diệt cỏ/dioxin. Kết

84

quả là một số loài VSV có thể sinh trưởng thông qua trao đổi chất theo một cơ chế

khác, dẫn tới chúng luôn chiếm ưu thế trong môi trường có độ ô nhiễm hóa chất cao

đến như vậy. Mẫu BHR là đất có nồng độ độc rất thấp do đã khử độc nên đa dạng

VSV cao hơn mẫu C. Các lớp vi khuẩn này đã tồn tại ở trong đất và được kích thích

khi điều kiện môi trường thuận lợi cho sinh trưởng hay chúng tới từ các chế phẩm

và phụ phế liệu nông nghiệp hay từ dung dịch hòa các chế phẩm DSH1 và DSH2

trong quá trình xử lý. Hơn thế nữa điều kiện môi trường thổ nhưỡng cùng các chất

dinh dưỡng, các chất bổ sung cho cả 4 con đường phân hủy chất diệt cỏ/dioxin

trong hố chôn đã được thay đổi thường xuyên. Câu hỏi được đặt ra là chúng có vai

trò cụ thể gì trong quá trình phân hủy từng thành phần của chất diệt cỏ/dioxin trong

các lô xử lý khử độc. Liệu ở các lớp chiếm tỷ lệ thấp có góp phần quan trọng vào

phân hủy hay không khi mà chưa phân tích được mẫu lúc hoạt động trao đổi chất

mạnh nhất xảy ra của VSV. Cần thêm rất nhiều nghiên cứu nữa để làm rõ thêm cấu

trúc quần xã VSV thay đổi ra sao trong suốt quá trình tiến hành xử lý đến lúc đất đã

hết độc bằng công nghệ phân hủy sinh học. Kết quả sau khi phân tích có thể khẳng

định thêm rằng số lượng và đa dạng VSV trong mẫu BHR có thể được coi là giống

VSV đã được sàng lọc trong xử lý ô nhiễm dioxin ở Biên Hòa nói riêng và các khu

vực khác ở Việt Nam nói chung.

Hai nhóm vi khuẩn tìm thấy trong mỏ vàng cũ ở Kowary và Zloty Stok (Ba Lan)

cho thấy Methylophilaceae và Methylococcaceae là họ ưu thế ở cả hai mẫu là 6.390 ±

4.132 và 8.970 ± 4.086% đối với Methylococcaeae và 10.930 ± 8.217 và 2.272 ± 0.626%

đối với Merthylophilaceae. Trong cộng đồng VSV ở Kowary, lớp Epsilonproteobacteria ,

họ Helicobacteraceae và chi Sulfuricurvum, Sulfurimonas chiếm ưu thế. Trong cộng đồng

VSV ở Zloty Stok đa dạng hơn với lớp Alphaproteobacteria , họ Sphingomonadaceae,

Rhodobacteraceae và Bradyrhizobiaceae chiếm ưu thế. Các chi chiếm ưu thế và có sự

phân bố tương tự trong cả hai mẫu là Leptothrix, Thiothrix, Beggiatoa và Halothermothrix

(Drewniak và cs., 2016). Các số liệu này đều khác biệt so với phân tích trong nghiên cứu

này. Trong metagenome của đất đã xử lý, tỷ lệ của Pseudomonas giảm xuống còn

1,71% và không còn giữ vị trí ưu thế nhất. Khi chất ô nhiễm giảm đến mức thấp

nhất thì chi vi khuẩn này không trao đổi chất được cho nên dẫn tới sự thay đổi của

85

chi Pseudomonas. Bằng các kỹ thuật truyền thống và sử dụng các công cụ giải trình

tự khác đối với mẫu nuôi cấy kị khí có nguồn gốc tương tự như nghiên cứu này thì

chi vi khuẩn “phàm ăn” này cũng luôn chiếm ưu thế khi chất ô nhiễm vẫn ở mức độ

cao (Thư và cs., 2013). Như chúng ta đã biết Pseudomonas có khả năng phân hủy

và tái tạo sinh học các chất ô nhiễm, gồm có dibenzo-p-dioxin, dibenzofuran,

chlorodibenzo-p-dioxins và các hợp chất vòng thơm chứa clo khác.

Các chi chiếm ưu thế trong đất ở đảo nổi hồ Loktak (Ấn Độ) lần lượt là

Candidatus Solibacter, Bradyrhizobium, Candidatus Koribacter, Pedosphaera,

Methylobacterium, Anaeromyxobacter, Sorangium, Opitutus và Acidobacterium

(Puranik và cs., 2016). Trong metagenome mẫu nước ô nhiễm dầu mỏ ở Gezina, Nam

Phi, chi chiếm ưu thế là Naegleria (15.21%), tiếp đến Vorticella (6.67%) với 1 số loài

đại diện như Arabidopsis (2.97%), Asarum (1.84%), Populus (1.04%) (Kachienga và

cs., 2018). Trong metagenome đất rừng ở Đức, sự hiện diện của chi liên quan đến quá

trình halogen hóa và khử halogen như Bradyrhizobium hoặc Pseudomonas với đa dạng

các gene mã hóa enzyme halogen trong đất (Weigold và cs., 2016). Trong mẫu đất khu

vực chịu sóng thần ở Nhật, chi chiếm ưu thế là Burkholderia (4.85 và 7.20%), tiếp theo

Bradyrhizobium (4.66 và 6.30%), Rhodopseudomonas (3.27 và 3.46%), Pseudomonas

(2.98 và 3.13%) (Satoshi Hiraoka và cs., 2016).

Pseudomonas cũng đã được đề cập hay chứng minh là một trong những chi

vi khuẩn thuộc nhóm có nhiều loài nhất và có khả năng phân hủy chất diệt cỏ 2,4-D

hay các chất vòng thơm khác. Ưu thế vượt trội của Pseudomonas trong đất ô nhiễm

có thể được giải thích bởi khả năng của chúng trong việc phân hủy các hợp chất có

độ độc cao. Achromobacter chiếm vị trí ngay sau Pseudomonas trong mẫu C chiếm

8,66%. Công bố gần đây về hệ gene của Achromobacter tiết lộ chúng có tiềm năng

rất lớn trong việc tái tạo sinh học bởi khả năng phân hủy một phổ rộng các hợp chất

xenobiotic, bao gồm nhiều hợp chất đa vòng thơm (PAH). Tuy nhiên với sự tăng

lên của các nhóm khác, Achromobacter chỉ chiếm 1,44% của mẫu đất xử lý.

Burkholderia là nhóm đứng thứ ba trong đất ô nhiễm với nhiều chủng có khả năng

phân hủy 2,4-D và 2,4,5-T và được phân bố rộng rãi trong những vùng bị ô nhiễm

chất diệt cỏ tại Việt Nam. Burkholderia cũng có khả năng phân hủy sinh học một số

86

hợp chất chứa clo bao gồm chlorophenols, 2-chlorodibenzo-p-dioxin, và 2-

chlorodibenzofuran. Trong mẫu đất xử lý, Burkholderia vẫn duy trì là một trong

những chi chiếm tỉ lệ lớn nhất chiếm 2,73%. Chi đáng chú ý cuối cùng trong mẫu C

là Bordetella chiếm 3,96% metagenome. Hiện chỉ có một số ít loài thuộc chi

Bordetella được phân lập từ môi trường, trong đó có một số chủng có khả năng

phân hủy PAH và 1,2,4-trichlorobenzene. Cũng như Achromobacter, tỉ lệ của

Bordetella là chi chiếm vị trí thứ ba trong mẫu BHR.

Không giống như metagenome C, chi phổ biến nhất ở metagenome BHR là

Bacteroides. Trong khi Pseudomonas thuộc chi hiếu khí tùy tiện, còn Bacteroides là

vi khuẩn kị khí bắt buộc. Với điều kiện kị khí ở các lớp đất sau 5 năm xử lý sinh

học của các lô chôn lấp tích cực có độ sâu 2m được bọc bằng 3 lớp vải địa cách ly

với bên ngoài và trên bề mặt có 1 lớp đất sạch dày tới 50 cm thì kết quả này hoàn

toàn không quá ngạc nhiên. Bacteroides được tìm thấy với tỉ lệ khá cao trong quần

xã sinh vật có khả năng phân hủy 1,1,2,2-tetrachloroethane, trichloroethene, cis và

trans 1,2-dichloroethene, 1,1,2-trichloroethane, 1,2-dichloroethane và vinyl

chloride. Tuy nhiên, cho đến thời điểm hiện tại, không có báo cáo nào về nghiên

cứu đặc thù về khả năng khử loại clo của Bacteroides. Xanthomonas là chi đứng thứ

hai trong mẫu BHR chiếm 3.21% metagenome, có những chủng có khả năng phân

hủy dibenzofuran và hexachlorocyclohexane. Anaeromyxobacter là một chi kị khí

bắt buộc khác cũng có mặt trong đất xử lý với tỉ phần lớn. Chi này thuộc về lớp

Deltaproteobacteria và chỉ có duy nhất một loài Anaeromyxobacter dehalogenans,

với khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa 2-chlorophenol, 2,6-dichlorophenol,

2,5-dichlorophenol v.v. như chất nhận điện tử cuối cùng. Metagenome mẫu BHR có

một số lượng lớn các chi vi khuẩn kị khí chiếm ưu thế, tuy nhiên đã không tìm thấy

ưu thế tuyệt đối thuộc về bất kỳ chi vi khuẩn nào. Phân tích metagenome mẫu đất

đã xử lý và làm giàu (BHR) bằng khuếch đại gene 16S rRNA bởi Ute và cộng sự

cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn và vi khuẩn cổ chủ yếu thuộc Firmicutes,

Bacteroidetes, Spirochaetes, Chloroflexi and Euryarchaeota. Nhóm tác giả cũng đã

thực hiện nghiên cứu metaproteome của mẫu làm giàu và phát hiện hơn 60 nhóm

protein liên quan tới 2,4,5-T (Lechner và cs., 2018). Đây cũng là các nhóm xuất

87

hiện trong nghiên cứu này đối với metagenome BHR tuy nhiên số lượng các nhóm

thu được lớn hơn rất nhiều Bacteroides (13.31%), Firmicutes (3.83%), Chloroflexi

(2.33%), Euryarchaeota (0.73%) và Spirochaetes (0.24%).

Chỉ số đa dạng (alpha) của những metagenome này chỉ ra rằng độ độc của

mẫu đất có liên quan mật thiết với độ đa dạng loài. Số lượng loài tăng lên khi độ

độc trong đất giảm xuống. Sự phân hủy những hợp chất độc trong đất có thể tạo nên

các hợp chất bớt độc hơn và chúng có khả năng được phân hủy bởi phổ rộng hơn

các vi khuẩn và do đó dẫn đến sự tăng số lượng loài. Kết quả tương tự cũng được

chứng minh trong nghiên cứu sự phân hủy PAH trong đất với đa dạng VSV tăng khi

nồng độ PAH giảm xuống theo thời gian.

Ngoài các chi có số lượng cao thì một số chi tuy không có số lượng cao nhưng

đã tìm thấy ở tất cả đa số các mẫu nghiên cứu. Các chi đã được chứng minh có khả

năng phân hủy dioxin chứa clo, không chứa clo nói chung và 2,3,7,8-TCDD nói riêng

như đại diện của một số chi Sphingomonas, Streptomyces, Achromobacte,

Burkholderia Ralstonia, Pseudomonas, Rhodococcus, Beijerinckia, Bacillus,

Terrabacter, Burkholderia, Klebsiella, Alcaligenes, Paenibacillus, Arthrobacter v.v..

Hơn thế nữa, 3 ngành Chloroflexi, Firmicutes và Proteobacteria chiếm ưu thế trong

metagenome ở mẫu làm giàu kị khí có tổng độ độc >41.000 ng TEQ pg/kg, thì sau 1

năm do Nguyễn Thị Tâm Thư và cộng sự thực hiện (Thư và cs., 2013) cũng đã

được phát hiện ở 2 mẫu nghiên cứu của luận văn này. Vi khuẩn thuộc Chlorobi,

Chloroflexi, Sulfuricurvum, Fusobacteria, Nitrospira đã được tìm thấy trong mẫu

bùn nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Hồ A tại sân bay Đà Nẵng bằng công cụ DGGE khi

giải trình tự băng thu được cũng được đề tài này tìm thấy bằng công cụ

metagenomic (Hữu và cs., 2010). Ngoài ra, 3 nhóm vi khuẩn hô hấp loại khử clo

tìm thấy bằng DGGE gồm nhóm loại khử clo bắt buộc (Dehalococcoides,

Dehalogenimonas), loại khử clo không bắt buộc (Desulfovibrio,

Desulfitobacterium, Desulfuromonas) và loại khử clo đồng trao đổi chất

(Pseudomonas, Shewanella, Clostridium) và Bacteroides, Geobacter trong mẫu xử

lý “Chôn lấp tích” cực tại Biên Hòa và Đà Nẵng cũng được phát hiện. Tuy nhiên

trong metagenome của các mẫu nghiên cứu này đã tìm thấy 14 chi vi khuẩn khử

88

sulfate với tỷ lệ cao ở mẫu BHR là mẫu có điều kiện kị khí cao. Desulfovibrio luôn

là chi chiếm tỷ lệ cao ở nhóm khử sulfate này. Hai chi thuộc nhóm vi khuẩn kị khí

có tỷ lệ cao và rất cao là Bacteroides và Anaeromyxobacter có mặt ỏ HBR chứng tỏ

chúng đóng góp rất quan trọng trong chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin và các chất trao

đổi chất khác sau 5 năm vẫn tòn tại ở hố xử lý “Chôn lấp tích cực”. Các vi khuẩn

hiếu khí khác cũng được phát hiện với tỷ lệ rất cao và khá cao là Pseudomonas,

Azotobacter và vi khuẩn kị khí tùy tiện như Vibrio, Klebsiella, Shewanella v.v trong

metagenome của các mẫu nghiên cứu này cũng có mặt với số lượng khác nhau. Tuy

nhiên, ở các nghiên cứu trước đây chỉ thông báo được sự có mặt của vi khuẩn mà

thôi. Ví dụ, với số lượng rất nhỏ, được phân loại là chi nhưng Dehalococcoides chỉ

có 1 loài nhưng gồm nhiều chủng đã được chứng minh tham gia vào qúa trình loại

khử clo của PeCDD và TCDD để tạo sản phẩn chứa 2,3 clo ít độc hơn. Phát hiện

của chúng tôi sẽ làm thay đổi các nhận định đã công bố về vai trò loại khử clo của

Dehalocccoides. Vì các tác giả đã nhận định rằng chi vi khuẩn này là “công nhân

chủ yếu loại khử clo của dioxin”. Còn số lượng quá thấp của Dehalococcoides trong

metagenome ở nghiên cứu này không ủng hộ nhận định nêu trên. Đây là sự khác

biệt rất có ý nghĩa giữa công cụ metagenomic và các công cụ sinh học phân tử tiên

tiến trước đó.

Kết quả thu được cung cấp cho chúng ta thông tin về điều kiện môi trường

thích hợp cho nhóm VSV này. Trong đó ở các lô xử lý bằng công nghệ phân hủy

sinh học ở tầng đáy của hố chôn vào giai đoạn cuối nước bão hòa nên vi khuẩn kị

khí bắt buộc trong đó có vi khuẩn cổ sinh metan chiếm tỷ lệ cao hơn. Còn ở

metagenome của C, số lượng trình tự thuộc vi khuẩn cổ sinh metan chưa được phân

loại cũng chiếm gần 20% cũng phản ánh một sự thật là mẫu đất được thu thập để

tách chiết DNA metaegnome bao gồm cả phần kị khí. Ngoài ra nhiều đại diện chưa

được nghiên cứu và chưa được phát hiện bằng cả kỹ thuật truyền thống và sinh học

phân tử nên khi đối chiếu với các dữ liệu có thể tiếp cận được thì chúng có thể sẽ rất

mới đối với khoa học. Sự đa dạng VSV ngoài những trình tự từ ADN metagenome

đã được đối chiếu và phân loại rồi cùng với những trình tự chưa biết hiện vẫn là

thách thức trong nghiên cứu sử dụng công cụ metagenomic nhưng đây cũng kiến

89

thức quí báu và cũng là tiềm năng lớn trong việc khai thác VSV trong đất ô nhiễm

hỗn hợp nhiều loại chất đa vòng thơm tại sân bay Biên Hòa.

Trong metagenome của 2 mẫu nghiên cứu đã phát hiện thấy 20 chi vi khuẩn

cổ (Archaea) thuộc ngành Euryarchaeota với 14 họ khác nhau, có cả vi khuẩn cổ

chưa được phân loại. Số lượng của mỗi chi trong metagenome không lớn và chiếm tỷ

lệ không giống nhau ở cả C và BHR. Qua các nghiên cứu gần đây cho thấy các

nghiên cứu về vi khuẩn sinh metan đã cung cấp các minh chứng về khả năng phân

hủy dầu thô, PAH và các sản phẩm trao đổi chất và một số chất hóa học khác có liên

quan bởi nhiều đại diện khác nhau của các chi vi khuẩn cổ nêu trên. Chúng có vai trò

rất quan trọng trong phân hủy sinh học tái tạo môi trường.

Ở giai đoạn cuối của qui trình xử lý thì nước đã được bão hòa và tổng độ độc

của mẫu đã giảm xuống dưới mức cho phép thì sự có mặt của chúng cũng là hiện

tượng dễ hiểu. Một số chi có số lượng thấp ở mẫu BHR và không thấy sự hiện diện

của chúng ở mẫu C. Phát hiện 3 chi là Methanosarcina, Methanosaeta,

Methanospirillum và một số đại diện thuộc các chi Methanomicrobiales,

Methanomethylovorans, Methanobacterium, Methanothrix đã được công bố có khả

năng khử loại halogen một số hợp chất liệt kê dưới đây đã không phát hiện được.

Các đại diện thuộc chi vi khuẩn này thường sống cùng với vi khuẩn khử sulphat

(synthrophic). Các nghiên cứu đã được công bố trong nhiều thập niên trước và gần

đây cho thấy nhóm vi khuẩn sinh metan là vi khuẩn hô hấp hợp chất halogene hữu

cơ khi sử dụng chúng như là chất nhận điện tử trung gian. Các vi khuẩn cổ ở dạng

đơn chủng, hay hỗn hợp chủng các đại diện vi khuẩn cổ sinh metan khác hay cùng

với vi khuẩn kị khí bắt buộc Dehalococcoides đã được chứng minh có khả năng loại

khử pentachlorophenol, perchloroethylene, trichloroethene, chloroform,

trichlorofluoromethane, 1,2-dichloroethane tới sản phẩm cuối cùng là chloroethane

hay loại khử chloroethenes và perchloroethene v.v. Vậy sự đa dạng của các vi khuẩn

cổ sinh metan phát hiện thấy ở metaegnome trong đất hay đất xử lý ở điều kiện kị khí

có vai trò gì cụ thể ?. Cũng như vi khuẩn cổ ưa mặn chúng chắc chắn tham gia vào

quá trình loại khử clo dioxin và các chất halogene khác để số lượng clo giảm đi. Từ

90

hợp chất vẫn chưa mở vòng chứa ít nguyên tử clo sẽ dễ dàng cho nhóm vi khuẩn khác

mở vòng và các quá trình trao đổi chất khác được xảy ra thuận lợi hơn.

Vi khuẩn cổ thuộc nhóm ưa mặn có khả năng phân hủy dầu hay các hợp chất

xenobiotic đã được nuôi cấy cho thấy có 2 chi (Halogeometricum, Halomicrobium)

trong 10 chi phát hiện bằng công cụ metagenomic của nghiên cứu này chưa hề được

nghiên cứu vai trò của chúng trong tái tạo môi trường ở đất, trầm tích ô nhiễm các

chất xenobiotic, trong đó có dioxin và các chất diệt cỏ cùng các chất trao đổi chất

của chúng.

Vi khuẩn cổ oxy hóa vòng thơm ở vị trí ortho thông qua phản ứng oxy hóa bởi

catechol 1,2-dioxygenase hay protocatechuate 3,4-dioxygenase. Nhiều đại diện thuộc các

chi vi khuẩn cổ ưa mặn này đã được chứng minh có khả năng phân hủy các chất sau đây:

Dầu thô các loại, Pyrene, Anthracene, Naphthalene, Phenanthrene, Pristane, Biphenyl

Toluene, Benzene, and Benzoate, Hylnapthalene, Alkanes (C9-C40), Benzene, n-

hexadecane, n-octadecane, p-hydroxybenzoate, Benzoic, p-hydroxybenzoic acid,

Tetradecane, Hexadecane, Eicosane, Heneicosane, acenaphthene, 9-methyl anthracene,

Benzoate, p-hydroxybenzoate, Cinnamate, Phenylpropionate, 4-Hydroxybenzoic acid,

Heptadecane, C8-C34 n-alkanes, biphenyl benz[a]anthracene, Tween v.v.. Còn chủng

Haloterrigena mahii sp. H13 phân hủy giả định 1,2-dichloroethane,

naphthalene/anthracene, γ-hexachlorocyclohexane, 1-2-met Naphthalene.

Một số đại diện thuộc các chi nấm sợi đã được tìm thấy trong metagenome của

các mẫu nghiên cứu cho thấy vai trò rất quan trọng của chúng trong quá trình phân

hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin. Đặc biệt chi Aspergillus và Penicillium đã được các

nhà khoa học Việt Nam và Nhật Bản thông báo có mặt trong đất nhiễm dioxin do đốt

rác và đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin. Hơn thế nữa chúng còn có khả năng phân

hủy dioxin, chất diệt cỏ và PAHs. Đại diện của chi Chaetomium với các đại diện

thuộc nấm ưa nhiệt, có khả năng sinh hàng loạt enzyme tham gia vào quá trình

chuyển hóa lignocellulose. Vai trò của đa số các chi còn lại cần thêm thời gian để

nghiên cứu làm rõ. Qua phân tích bằng công cụ metagenome có thể khẳng định quần

xã nấm sợi đã luôn có mặt ở giai đoạn đầu tiên của quá trình phân hủy trong các công

91

thức xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở qui mô phòng thí nghiệm, qui mô pilot 0,5- 100 m3

đất ở Đà Nẵng và đặc biệt là trong các lô xử lý chôn lấp tích cực ở Biên Hòa.

Nhiều chủng nấm sợi và nấm đảm có khả năng nuôi cấy nên chúng đã được

phân lập. Một số đã được chứng minh có khả năng sinh tổng hợp laccase, laccase-

like và loại bỏ chất diệt cỏ, PAHs thông qua các con đường khác nhau. Cho nên

hoạt động của quần xã trong trao đổi chất đối với các hỗn hợp chất ô nhiễm khó

phân hủy của VSV Prokaryot hay Eukaryot đã là cơ sở vững chắc để ứng dụng khử

độc thành công quy mô hiện trường ô nhiễm. Mỗi một cá thể trong quần xã của

VSV hoạt động ở mỗi giai đoạn khác nhau đã đồng trao đổi chất kết quả tạo nên sự

chuyển hóa, phân hủy và có thể khoáng hóa các chất ô nhiễm khó phân hủy trong tự

nhiên hay trong áp dụng công nghệ phân hủy sinh học để xử lý khử độc.

Có thể phát hiện nấm đảm trong metagenome của mẫu đất trong nghiên cứu

này cũng sẽ làm chúng ta ngạc nhiên. Tuy nhiên trong thời điểm lấy mẫu để tách

DNA metagenome nấm đảm ở dạng sợi hay bào tử cũng có thể đã đồng hành cùng

các vi khuẩn khác và nấm sợi thuộc Ascomycota. Chi Coprinopsis cũng đã được

phát hiện được ở metagenome C là mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin. Các chi

còn lại được phát hiện với số lượng khác nhau trong hai mẫu nghiên cứu. Một số

chi nấm đảm xuất hiện trong metagenome của đất nhiễm chất diệt cỏ (C) thật sự rất

mới lạ. Vai trò cụ thể của chúng trong quá trình phân hủy sinh học chất diệt

cỏ/dioxin sẽ được tiếp tục làm rõ trong các nghiên cứu tiếp theo.

Hai chi Burkholderia và Bordetella tỷ lệ chiếm ưu thế cao và số lượng chênh

lệch nhau không nhiều. Bradyzhizobium là chi được biết đến tham gia cố định đạm

ở cây họ đậu khi sinh nốt sần ở rễ, tuy nhiên ở 2 mẫu nghiên cứu chúng đều có mặt

với số lượng khiêm tốn hơn nhiều so với các chi đã đề cập. Chi Streptomyces có

nhiều đại diện đã được thông báo về khả năng phân hủy các chất đa vòng thơm

trong đó có dioxin. Ngay trong nghiên cứu này chúng tôi đã chứng minh chúng có

khả năng khử độc với hiệu suất cao 2,3,7,8-TCDD là đồng loại dioxin độc nhất.

Trong 2 metagenome đều có mặt chi này với số lượng xếp gấp 4 lần của mẫu BHR

so với mẫu C.

92

Điểm thú vị khác biệt còn lại của nghiên cứu này chính là phần nội dung

nghiên cứu khả năng phân hủy bởi tổ hợp vi khuẩn, xạ khuẩn được phân lập từ đất ô

nhiễm nhằm kiểm chứng kết quả phân tích bằng công cụ metagenomic hiện đại so

với phương pháp phân lập truyền thống. trong số 5 chủng vi khuẩn sử dụng thì 3

chủng gồm Methylobacterium sp. BHBi1, Agrobacterium sp. BHBi5,

Microbacterium sp. BH09 cũng như các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces

đều có xuất hiện trong metagenome với tỷ lệ khác nhau. Đây đều là các VSV có thể

dễ dàng tìm thấy trong đất và các chi này cũng được đề cập đến trong nhiều nghiên

cứu trước đây về khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin nhưng nếu tính trung bình

ngày thì vẫn thấp hơn so với sử dụng tổ hợp trong nghiên cứu này. Một điểm khác

biệt cần quan tâm là 2 chủng Hydrocarboniphaga sp. BHBi4, Bosea sp. BHBi7

không có công bố nào về khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin cũng như không

phát hiện trong phân tích metagenome 2 mẫu. Có thể do tỷ lệ của chúng trong toàn

bộ genome là quá nhỏ do đó quá trình tách chiết DNA chưa thể thu nhận hết để có

thể có đủ tín hiệu chứng minh sự có mặt của chúng trong phân tích. Do đó để có thể

tối ưu công nghệ phân hủy sinh học với hiệu suất cao nhất cần phải có hiểu biết rất

rộng về VSV và sử dụng nhiều nhất có thể các cách tiếp cận, công cụ nghiên cứu

mới có thể giải bài toán khó một cách hoàn toàn.

4.2. Đa dạng gene chức năng tham gia phân hủy xenobiotic của metagenome C

và BHR (một trong 4 con đường phân hủy và khoáng hóa dioxin).

Các gene tham gia vào các bước đầu tiên của quá trình phân hủy dioxin hay

furan đã không phát hiện được ở cả 2 mẫu nghiên cứu. Cũng có thể chúng vẫn có

mặt ở metagenome của mẫu đất ô nhiễm nặng, tuy nhiên số lượng thấp nên đã

không có mặt. Hy vọng công cụ được cải tiến dần cũng sẽ tạo cơ hội tìm thấy các

nhóm gene này. Bằng sử dụng cặp mồi dioxin dioxygenase Nguyễn Bá Hữu và đtg

đã phát hiện được các đoạn gene mã hóa của 3 chủng vi khuẩn Ao3, DMA và

HDN3 tương đồng cao với gene ahDO và dbfA1 mã hóa cho enzyme dioxygenase

vị trí góc ơ các chủng khác có cùng vị trí phân loại. Ngoài ra sử dụng cặp mồi C230

để phát hiện Catechol 2,3-dioxygenase trong các mẫu đất nhiễm nặng chất diệt

cỏ/dioxin bằng các kỹ thuật sinh học phân tử cho thấy con đường chuyển hóa phân

93

hủy các chất đa vòng thơm đã được công bố trong các nghiên cứu của Nguyễn Ngọc

Bảo và đtg thông qua xã định số lượng bản sao gene này bằng RT PCR khá cao.

So sánh giữa cơ chế trao đổi chất của các hợp chất vòng thơm cho thấy số

lượng gene liên quan đến con đường phân hủy benzoate và protocatechute (các chất

này là sản phẩm gần cuối của các con đường chuyển hóa các chất đa vòng thơm)

trong đất ô nhiễm nhiều hơn đáng kể so với trong mẫu đất đã xử lý, trong khi số

lượng gene liên quá đến các quá trình trao đổi chất kị khí bao gồm con đường phân

hủy benzoate, toluene và ethylbenzen nhiều hơn hẳn ở trong mẫu đất xử lý BHR.

Nghiên cứu xử lý sinh học PAH cũng cho thấy sự tăng đa dạng các gene liên quan

đến quá trình trao đổi và phân hủy benzoate, phân hủy protocatechute và phân hủy

các hợp chất vòng thơm chứa clo.

Vì hầu hết các enzyme phân hủy các chất thơm không được chú thích rõ ràng

trong SEED, các gene chính liên quan đến quá trình phân hủy từ kết quả chú giải dựa

trên hệ thống chú giải Prokka Prokaryotic Genome. Các enzyme này bao gồm intradiol

và extradiol ring-cleaving dioxygenases: catechol 1,2-dioxygenase [EC 1.13.11.1],

catechol 2,3-dioxygenase [EC 1.13.11.2], protocatechute 3.4-dioxygenase [EC

1.13.11.3] , protocatechute 4,5-dioxygenase [EC 1.13.11.8]; laccase [EC 1.10.3.2] và

cytochrome P450. Các dioxygenase cắt vòng xúc tác sự phân hạch oxy hóa của các hợp

chất catecholic, một bước quan trọng trong sự phân hủy hiếu khí của các hợp chất thơm

bằng vi khuẩn. Các dioxygenase cắt vòng (cả intradiol và extradiol) phong phú hơn

trong mẫu bị ô nhiễm với số trình tự liên quan đến catechol 1,2-dioxygenase, catechol

2,3-dioxygenase và protocatechute 3,4-dioxygenase cao hơn đáng kể so với trong các

mẫu làm giàu và xử lý sinh học.Tuy nhiên, số lượng các trình tự liên quan đến

protocatechute 4,5-dioxygenase cao hơn nhiều trong đất xử lý sinh học BHR. Trong

nghiên cứu về xử lý sinh học đất ô nhiễm dầu ở vùng Bắc Cực, Canada, các enzyme

này cũng hiện hữu trong mẫu ô nhiễm với số lượng cao hơn đáng kể so với đất đã xử lý.

Laccase, một enzyme có khả năng oxy hóa một phổ rộng của các hợp chất

xenobiotic.Trong metagenome của mẫu C đã tìm thấy 18, mẫu đất đã xử lý BHR có 21

gene laccase (so sánh trình tự trên dữ liệu CSDL Laccase). Kết quả thu được chỉ ra

rằng sự hiện diện của các gene này trong đất liên quan đến chất diệt cỏ/dioxin rất lớn.

94

Cũng có thể đất đã được làm sạch nên các gene hoạt động kém đi. Còn ở mẫu làm giàu

với các chất chứa trong môi trường đã làm các gene laccase biểu hiện nhiều nhất. Ở đất

ô nhiễm nặng các vi khuẩn mang gene này vẫn hoạt động với các chất cảm ứng tồn tại

trong đất nên số lượng laccase vẫn nhiều hơn. Đây là phát hiện rất mới về gene này. Vì

chúng hoạt động như là chất xúc tác quá trình cắt vòng thơm.

Như chúng ta đã biết hàm lượng 2,4,5-T và 2,4-D chiếm một tỷ lệ rất cao

trong đất nhưng độ độc so với dioxin lại rất thấp, thông thường nếu điều kiện môi

trường thuận lợi thì chỉ sau nửa năm là chúng không còn nữa . Điều thú vị là không

có gene đặc thù nào liên quan đến con đường phân hủy 2,4,5-T trong các cơ sở dữ

liệu vào thời điểm mà chúng tôi lấy mẫu. Do độ độc của đất xử lý sinh học đã đạt đến

mức an toàn cho sử dụng nông nghiệp và nồng độ của các hợp chất có liên quan đến

dioxin rất thấp, có thể hiểu được số lượng VSV và gene hoạt động liên quan đến quá

trình phân hủy của các hợp chất này ít hơn nhiều so với mẫu đang nhiễm độc.

Ba gene chính tham gia vào các bước đầu của sự phân hủy 2,4-D đã được tìm

thấy với một số lượng bản sao tương đối cao bao gồm tfdA, tfdB và tfdC lần lượt mã hóa

cho alpha-ketoglutarate phụ thuộc vào 2,4-dichlorophenoxyacetate dioxygenase, 2,4-

dichlorophenol 6-monooxygenase, và chlorocatechol 1,2-dioxygenase. Sự phong phú

của các gene này cao hơn đáng kể trong mẫu C so với BHR. Tuy nhiên, số lượng gene

tfdC thấp hơn nhiều so với tfdA và tfdB. Có khả năng 2,4-D đã được dehalogene để tạo

thành 4-chlorophenoxyacetate trước khi chuyển đổi bởi alpha-ketoglutarate-dependent

dioxygenase 2,4-dichlorophenoxyacetate và 2,4-dichlorophenol 6-monooxygenase để tạo

thành 4-chlorocatechol và tiếp tục được phân hủy bởi catechol 1, 2-dioxygenase hoặc

catechol 2,3-dioxygenase. Các gene liên quan đến sự phân hủy dioxin và furan không

được tìm thấy trong bất kỳ metagenome nào. Tuy nhiên, một tập hợp đầy đủ các gene

liên quan đến sự phân hủy của biphenyl và 4-chlorobiphenyl đã được tìm thấy. Gene mã

hóa cho cis-2,3-dihydrobiphenyl-2,3-diol dehydrogenase không được tìm thấy trong cả 2

mẫu. Số lượng các trình tự liên quan đến gene phân hủy PCB cũng cao hơn đáng kể

trong đất ô nhiễm, đặc biệt là khi so sánh với mẫu được xử lý sinh học BHR.

95

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Vi khuẩn trong 2 metagenome nghiên cứu chiếm tỷ lệ rất cao 99,19% ở C và

98,17% ở BHR, vi khuẩn cổ tương ứng đạt 0,13% và 1,24%, vi sinh vật nhân thật

(nấm sợi, nấm đảm, nấm men) chiếm tỷ lệ 0,24% và 0,49%, virus chiếm tương

ứng 0,43% và 0,09%, các trình tự lỗi và chưa được phân loại nhỏ hơn 0,01%;

- Trong metagenome C có 27 ngành, chiếm tỷ lệ cao nhất lần lượt là

Proteobacteria (86,05%) và Actinobacteria (11,98%), Firmicutes (0,83%), các

ngành còn lại chiếm tỷ lệ rất nhỏ. Còn đối với BHR đã phát hiện 28 ngành, tỷ

lệ tập trung vào 3 ngành chính là Proteobacteria (61,84%), Bacteroidetes

(13,31%), Actinobacteria (8,51%). Một số ngành khác chiếm tỷ lệ nhỏ hơn

như Firmicutes (3,83%), Acidobacteria (2,75%), Chloroflexi (2,33%),

Cyanobacteria (1,35%), Nitrospirae (1,01%);

- Sự đa dạng của vi khuẩn ở 2 metagenome có sự khác biệt rõ rệt và thể hiện rõ

nhất ở mức độ chi trong đó chi Pseudomonas chiếm ưu thế 40,54% ở C còn ở

BHR giảm chỉ còn 1,71%;

-Vi khuẩn cổ chiếm ưu thế là nhóm ưa mặn và sinh methan, hai chi

Methanosarcina và Haloarcula chiếm ưu thế ở BHR;

- Nấm men, nấm sợi và nấm đảm đã được phát hiện ở metagenome của BHR

nhiều hơn gấp đôi (35 chi) so với ở C chỉ là 17 với số đại diện thấp. Các chi

Aspergillus, Penicillium, Gibberella, Emericella (nấm sợi) có số lượng nhiều

nhất ở BHR sau đó đến chi Candida, Schizosaccharomyces, Saccharomyce,

Pichia (nấm men) và ít nhất là Coprinopsi (nấm đảm);

2. Số lượng nhóm gene tham gia vào quá trình xúc tác oxy hóa xenobiotic đã

được phát hiện với số lượng rất lớn tới 39 gene laccase và laccase-like trong

đó có 20 gene mới. Ngoài ra các gene mã hóa các enzyme khác như catechol

1,2-dioxygenase, catechol 2,3-dioxygenase, protocatechute 3,4-dioxygenase,

protocatechute 4,5-dioxygenase, cytochrome P450 cũng được phát hiện với số

lượng khác nhau ở 2 metagenome;

3. Đã phân lập và phân loại được 5 chủng vi khuẩn trong đó có 2 chủng mới là

Hydrocarboniphaga sp. BHBi4, Bosea sp. BHBi7 và 5 xạ khuẩn sinh laccase-

like (XKBHA3, XKBH4, XKBH28, XKBH921, XKBHA22) cũng đã được

96

phân lập; Sau 30 ngày nuôi cấy, tổ hợp 5 vi khuẩn và 5 xạ khuẩn đã khử độc

được 59,1% và 50,7% đồng loại dioxin 2,3,7,8-TCDD trong đất với độ độc

ban đầu 4294,12 ng TEQ/kg. Nếu tính theo ngày thì khả năng phân hủy tương

ứng đạt 84,58 ng TEQ/kg/ngày và 72.59 ng TEQ/kg đất/ngày.

4. Đã phát hiện thấy quần xã vi sinh vật tham gia vào 4 con đường chuyển hóa

hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin và các chất trao đổi chất, trong đó vi sinh vật tham

gia vào 3 con đường phân hủy hiếu khí chiếm tỷ lệ cao vượt trội so với kị khí.

Trong đó quần xã vi sinh vật tham gia vào con đường oxy hóa cắt vòng và loại

khử clo sau khi đã cắt vòng chiếm tỷ lệ cao hơn và lần lượt đến quần xã phân

hủy theo con đường xúc tác;

5. Kết quả của nghiên cứu một lần nữa khẳng định công nghệ phân hủy sinh học

có thể hoàn toàn hiệu quả khi tạo điều kiện phù hợp nhất cho các quần xã của

vi sinh vật trong các môi trường khác nhau hoạt động phân hủy, chuyển hóa và

khoáng hóa hỗn hợp chất ô nhiễm thuộc POPs với tổng độ độc trong đất rất

cao. Tuy nhiên vẫn cần thêm rất nhiều nghiên cứu nữa mới có thể trả lời chi

tiết về vai trò của từng quần xã trong chuyển hóa ô nhiễm ở điều kiện tự nhiên

và xử lý bằng công nghệ phân hủy sinh học (Bioremediation).

KIẾN NGHỊ

Luận án mới chỉ dừng lại ở bước đánh giá đa dạng VSV ở các mức độ để thấy

được sự thay đổi, khác biệt của tập đoàn VSV trong đất ô nhiễm nặng với đất đã

được xử lý nhưng với bộ dữ liệu khổng lồ và sự phát triển không ngừng của các

phần mềm tin sinh sẽ giúp khai thác sâu hơn dữ liệu thu được. Từ những lý do đó

nghiên cứu sinh đề xuất 1 số kiến nghị gồm: 1. Dữ liệu của trình tự metagenome thu được là nguồn nguyên liệu di truyền có thể được khai thác không chỉ phục vụ nghiên cứu cơ bản mà còn rất hữu ích

cho ứng dụng khử độc POP tại hiện trường ô nhiễm (bao gồm laccase, laccase- like); Kết hợp những kiến thức đã biết về các chất hóa học đã bị loại bỏ và các con đường trao đổi chất giả định cùng với phân tích các chỉ số môi trường của các metagenome liên quan đến chất diệt cỏ/dioxin khác nhau để tăng hiệu suất của công nghệ khử độc;

2. Rất cần tiếp tục phân lập mới vi sinh vật có khả năng phân hủy dioxin và các POP khác cùng các enzyme của chúng sinh tổng hợp được nhằm tạo chế phẩm cho các mục đích phân hủy tái tạo mà môi trường có thể kiểm soát được.

97

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN

ĐẾN ĐỀ TÀI

1. Phạm Quang Huy, Đặng Thị Cẩm Hà (2018). Khả năng phân hủy đồng loại

dioxin 2,3,7,8-TCDD bởi tổ hợp xạ khuẩn phân lập từ đất ô nhiễm ở sân bay

Biên Hòa, Đồng Nai. Kỷ yếu “Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2018”,

p796-802.

2. Pham Quang Huy, Nguyen Kim Thoa, Đang Thi Cam Ha (2018). Degradation

of 2,3,7,8-TCDD by a consortium of bacterial strains isolated from heavy

herbicide/dioxin contaminated soil in BienHoa airbase. Journal of

biotechnology, 16(4): 777-784.

reductive declorinating bacteria and archaea in herbicide/dioxin contaminated soils

from Bien Hoa airbase using metagenomic approach. Journal of biotechnology,

3. Pham Quang Huy, Nguyen Kim Thoa, Dang Thi Cam Ha (2020). Diversity of

18(4): 773-784.

98

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH

1. Thesis’s title: “STUDY OF MICROBIAL DIVERSITY FROM

HERBICIDE/DIOXIN CONTAMINATED SOIL IN BIEN HOA, DONG NAI

AND EVALUATION OF DETOXIFIED EFFICIENCY FROM

REPRESENTATIVE STRAINS ISOLATED”.

2. Introduction

During the Vietnam war, the US military sprayed more than 100 million

liters of herbicides containing 1,080 kg of dioxin in the Central and the Southern of

Vietnam. After 43 years, a number of “hot spots” with high level of

herbicide/dioxin still remains in Bienhoa and Danang military airbases.

There exist different dioxin and POP detoxifying technologies, of those thermal

desorption and biological-based landfill and “active landfill” technologies were applied

in Vietnam. The thermal desorption was carried out by Terra Thermal company (USA)

in Danang airbase with the first step has just finished and is moving on the second.

Obviously, this technology required high cost whereas its environmental impact has not

yet been evaluated completely. Since 1999, active landfill bioremediation has been

performed in Z1 region of Bienhoa, succeeded in detoxification of 3384 m3

herbicide/dioxin contaminated soil and their metabolites with total toxicity of 10,000

ng TEQ/kg. After 40 months, evaluation of detoxified efficiency at Governmental level

of the bioremediated soil, the total toxicity decreased to 14.12 ng TEQ/kg dried soil.

This toxic level mets to the requirement for regular agricultural production soil

according to Vietnam regulation QCVN 45:2012 (40 ng TEQ/kg) (Ha et al., 2012).

This technology based on stimulation of indigenous microbes by modification of the

different environmental parameters in combination with other technology, showing

cost-effective and eco-friendly advantages. However, current knowledge about the

process is mostly based on cultured microbes, which results in less dioxin

degradable determinants to be discovered and because traditional microbiological

techniques have only isolate and culture a small proportion (0.1 to 1%) of the

microorganisms in soil samples (Jeffries et al., 2018).

99

The effects of mixture of herbicide/dioxin contamination in this region

microbial ecology have not been studied at Bien Hoa airport. Although Nguyen Ba

Huu was used single strand conformation polymorphism (SSCP), denaturing

gradient gel electrophoresis (DGGE), etc. to investigate the diversity of microbial

and functional genes in soil samples but a little of microbial diversity had detected

in total microorganism (Huu et al., 2007). Nguyen Ba Huu had applied modern

molecular biology methods such as DGGE, SSCP, MPN-PCR to study microbial

community structure in soil and sediment samples at Da Nang airport, the aerobic,

obligate anaerobic bacterial groups and specially Dehalococcoides genus were

detected (Huu et al., 2006, 2007). Alpha-Proteobacteria, Chlorobi, Chloroflexi,

Sulfuricurvum, Fusobacteria, Nitrospiraceae such as Sulfuricurvum kujiense YK-1,

Fusobacteria unculture, Nitrospiraceae uncultured, Alphaproteobacterium

unculture, etc. and bacteria have not been determined. Da Nang airport (Huu et al.,

2006). Nguyen Thi Tam Thu and co-authors, 2013 have discovered all 3 groups of

dechlorinated bacteria including obligate reductive dehalorespiration

(Dehalococcoides, Dehalogenimonas), facultative dehalorespiration (Desulfovibrio,

Desulfitobacterium, Desulfuromonas) and co-metabolic reductive (Pseudomonas,

Shewanella, Clostridium). Three groups of aerobic bacteria (Pseudomonas,

Azotobacter), facultative anaerobic (Vibrio, Klebsiella, Shewanella) and obligate

anaerobic (Bacteroides, Geobacter, Clostridium) bacteria, etc. were identified in

sample (Thu et al., 2013).

Recently, next generation sequencing (NGS) provides new opportunities for

microbial ecologists. Metagenomic research tools are combines biological research

with specialized bioinformatics software. Metagenomic has been developed since

1998 and it is one of the fastest research today (Handelsman et al., 2004). Inreality,

only 0.001 - 0.1% of microorganism was isolated and cultured, more than 99% of

microorganism has not been studied in detail. Metagenomic is therefore the

application of modern genomic tools use to analyze the collective genomes of

whole microbial communities in environmental sample and does not rely on

100

cultivation or prior knowledge of the bacterial communities (Riesenfeld et al.,

2004). Today, the new generation DNA sequencers like Illumina, pyrosequencing,

etc. and combines bioinformatic helping the metagenome studies become simpler.

Metadata from different regions were obtained, the human body (Walter et al.,

2011), sea and ocean, lakes and rivers, wastewater treatment (Wang et al., 2013),

soil (Daniel et al., 2004) and air. So using modern bioinformatics tools to annotate

data metagenomic of taxonomy and genes (functional annotations) was needed.

There are many different algorithms developed to analyses metadata: MG-RAST

(Meyer et al., 2008), EBI-Metagenomic, MEGAN, MOCAT, QIIME, MetaHIT and

MyTaxa.

Bioremediation is the technology using live microbes (Augmentation) or

stimulation of native microbial community for the beneficial removal of

contaminanted mixture of soil, sediment, and wastewater from industry. The

relationship features of these bacterial groups, eukaryote and archaea need deeply

investigation for understanding their role of oxidation process, catalyst and reductive

dechlorination, anaerobic degradation in herbicide/dioxin contaminated heavy soil

and sediment. These results provides additional evidence to explain why heavy

herbicide/dioxin contaminated soil was detoxified successfully at Bien Hoa airbase,

Vietnam.

3. Materials and methods

Materials

- Soil samples include: Heavy contaminated herbicide/dioxin soil (named as C)

in the southwest (10°58'14.3"N 106°48'19.3"E) and the soil has been treated with

herbicide/dioxin after 5 years using biodegradable technology (named as BHR) in Z1

area (10 ° 57'46.4" N 106 ° 49'22.6 "E) of Bien Hoa airport, Dong Nai province.

- The unique type of dioxin (2,3,7,8-TCDD) is supplied by BE Company

(Netherlands) from the standard isotop chemical supply room, United Kingdom.

Pure chemicals of Sigma, Merk firms and common chemicals originating from

Vietnam and China. DNA extraction kits such as PowerSoil® DNA Isolation Kit

101

(MO BIO Laboratories, Inc.), Soil DNA Isolation Kit (Norgen Biotek Corp.),

E.Z.N.A® Soil DNA Kit (Omega Bio-tek), chemicals used for biological fertilizers

of Sigma, Thermo firms etc.

- Particularly, the metagenome self-explanatory device used by BaseClear is

Illumena Hiseq 2500. Devices such as Agilent 2200 TapeStation (Agilent

Technologies, Santa Clara, CA, USA) have been used for research in the

Netherlands and software provided by the Dutch side and free open source software

on the network such as CLC Genomics Workbench v8.0, Prodigal v2.0, BLAST

2.4.0, STAMP etc.

- Server system (Server) of the Institute of Biotechnology - Vietnam Academy

of Science and Technology. MG-RAST system (Metagenomic Rapid Annotations

Using Subsystems Technology) was developed by Meyer and colleagues at Argonne

National Laboratory, USA (Argonne National Laboratory, USA).

- Culture medium and supplements are weighed according to the quantity of

each substance presented for each type (Gost - Hartmans et al., 1992; Gause -

Gauze et al., 1983).

- Separating and extracting chemical pollutants from soil containing

herbicides/dioxin.

Methods

Collect and preserve soil samples to study metagenome use MIS method

Analysis of mechanical composition and dioxin concentration in the sample

follow EPA 8280A

Isolating and classifying microbial from soil contaminated with

herbicides/dioxins, determining morphological characteristics and classifying

microorganisms.

Method of determining the activity of enzyme laccase (Childs and Bardsley, 1975)

Evaluate detoxification of 2,3,7,8-TCDD in herbicide/dioxin contaminated

soil by combine of microbial.

Direct metagenome DNA extraction and using specialized commercial kit

102

Determine the content, purity of DNA metagenome by agarose gel electrophoresis

(Sambrook and Russell, 2001), measure the absorbance of DNA at wavelength of 260 nm

(Wilfinger et al., 1997) and Qubit Fluormeter (Bolger et al., 1997).

Solving sequences and studying microbial diversity, functional genes present

in metagenome C and BHR.

4. Main results

The heavy herbicides/dioxin contaminated of C and detoxified BHR soils

with pH and total toxicity ranging respectively from 8.19; 21,605 ng TEQ/kg and

6.7; 13.2 ng TEQ/kg were analyzed.

Bacterial in two metagenome has high rate, reached to 99.19% in C and 98.17%

in BHR, archaea, eukaryote and virus was much lower respectively at 0.13%, 0.24%

and 0,43% at metagenome C and 1.24%, 0.49% and 0.09% in BHR metagenome.

- There are 27 phylum in C metagenome, the highest proportion is

Proteobacteria (86.05%) and Actinobacteria (11.98%), Firmicutes (0.83%), the

other phylum remaining was a very low percentage. As for BHR, 28 phylum have

been determined and focus in three main phylum is Proteobacteria (61.84%),

Bacteroidetes (13.31%), Actinobacteria (8.51%). Some other phylum has lower

proportion such as Firmicutes (3.83%), Acidobacteria (2.75%), Chloroflexi

(2.33%), Cyanobacteria (1.35%), Nitrospirae (1.01%).

- Microbial diversity in two examined samples showed a significant

difference and was most evident at the level of genus in which the dominant

Pseudomonas occupied 40.54% in C while in BHR only to 1.71%;

- The archaeal bacteria belong to the halophilic and methanogenic groups,

two genus Methanosarcina, Haloarcula have an abundant in BHR metagenome.

- The yeasts, filamentous fungi and basidiomycete fungi were detected in

BHR and C metagenomes belong to 35 and 17 genera respectively, such as

Candida, Schizosaccharomyces, Saccharomyce, Pichia (yeast), Aspergillus,

Penicillium, Gibberella and Emericella (filamentous) dominantly in BHR, follows

is Coprinopsis (Basidiomyces).

103

- The number of gene groups involved in the xenobiotic catalysis was

determined in a very large number of 39 genes of laccase and laccase-like,

including 20 new genes. In addition, genes encoding for other enzymes such as

catechol 1,2-dioxygenase, catechol 2,3-dioxygenase, protocatechute 3,4-

dioxygenase, protocatechute 4.5-dioxygenase, cytochrome P450 are also detected in

different number of 2 metagenomes;

- Two new of five bacterial strains isolated from both BHR and C soils were

classified as Hydrocarboniphaga sp. BHBi4, Bosea sp. BHBi7 and five Streptomycete

laccase-like producing strains (XKBHA3, XKBH4, XKBH28, XKBH921,

XKBHA22) were also isolated and characterized. After 30-day cultivation, both

mixture of 5 bacterial and 5 actinomycete strains 59.1% and 50.7% of 2,3,7,8-

TCDD degraded respectively, with 4,294.12 ng TEQ/kg initial soil toxicity. The

daily detoxification efficiency reached to 84.58 ng TEQ/kg/day and 72.59 ng

TEQ/kg of soil/day respectively;

- Microbial communities involved into four transformation pathways of the

mixture herbicide/dioxin and their metabolites, in which microbes involving in three

aerobic pathways significantly higher in comparison to anaerobic microbes was

revealed. Number of the microbial communities take a role in oxidation and

dechlorination (after aromatic ring cleaving) processes was higher in comparison to

microbes involving in catalytic pathway;

The obtained results of this study, once again confirm the bioremediation

technology maybe completely effective when setting up suitable conditions for

microbial communities in different environments to act in four pathways (oxidation,

catalysis, dechlorination and reductive dechlorination) for mineralization of heavy

herbicide/ dioxin contaminated soils and other POPs. However, more research is

still needed to answer detail role of each microbial community in polluted

transformation in natural condition and bioremediation technology performance.

5. Novelty and actual and scientific meaningfulness of the results

- At the present time, this is the first PhD project in Vietnam to show the

most complete picture of microbial diversity (taxa and functional gene) in heavy

104

herbicide/dioxin contaminated and completely detoxified soils at Bien Hoa military

airport used metagenomic modern tools;

- The diversity and inhabitants of eukaryotes such as yeasts, filamentous

fungi and basidiomycetes have been detected in heavy herbicide/dioxin

contaminated and completely detoxified soils;

- Bacterial diversity and the number of new functional genes such as laccase and

laccase-like involved in xenobiotic decomposition were first discovered in the mixture

of heavy herbicide/dioxin contaminated soil and their natural metabolites in Vietnam;

- The presence of large microbial numbers as well as their physiological

activity in heavy herbicides/dioxin contaminated soil supporting to explain why

application of bioremediation technology was successful for detoxification of the

mixtures of herbicide/dioxin with high toxicity at industrial scale; The results

provide a scientific basis for improvement of technological efficiency in

biotreatment not only for dioxins but also for other POPs.

6. Petition of the thesis's leader: Completion of this project

Continue to update the latest bioinformatic software with databases (maybe

used copyright software and databases) for further analysis at the species level of 2

metagenomes;

Metagenome obtained sequence data is a genetic resource maybe provided

not only for basic research but also further investigation targeting for site

application of microbes and their enzymes involved in the biodegraded processes

and POP detoxification (including laccase, laccase-like).

To combine with known toxicant decomposition, hypothetical metabolic

pathways and environmental parameter analysis of different herbicidal/dioxin-

related metagenomes to improve efficiency detoxification technology; Necessary to

continue isolation of new dioxin and other POP degraders and their enzyme for

biotreatment products providing for bioremediation by using augmentation

technique where environmental parameters are well controlled.

105

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Abbasian F, Palanisami T, Megharaj M, Naidu R, Lockington Rand

Ramadass K (2016) Microbial diversity and hydrocarbon degrading gene

capacity of a crude oil field soil as determined by metagenomics analysis.

Biotechnology Progress 32: (3) 638-648.

2. Adams DS (2013) Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other

quantitative skills for use at the bench. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Alvarez A, Benimeli, C. S., Saez, J. M., Fuentes, M. S., Cuozzo, S. A., Polti,

M. A., & Amoroso, M. J. (2012) Bacterial bio-resources for remediation of

hexachlorocyclohexane. International journal of molecular sciences 13: (11)

15106-15106.

4. Arutchelvi JS, M; Arkatkar, Ambika; Doble, Mukesh; Bhaduri, Sumit;

Uppara, Parasu Veera (2007) Biodegradation of polyethylene and

polypropylene Indian Journal of Biotechnology 7: (1) 9-22.

5. Ayling M, Clark MDand Leggett RM (2019) New approaches for

metagenome assembly with short reads. Briefings in bioinformatics.

6. Bao Y-J, Xu Z, Li Y, Yao Z, Sun Jand Song H (2017) High-throughput

metagenomic analysis of petroleum-contaminated soil microbiome reveals

the versatility in xenobiotic aromatics metabolism. Journal of environmental

sciences 56: 25-35.

7. Bateman A, Coin L, Durbin R, Finn RD, Hollich V, Griffiths‐Jones S,

Khanna A, Marshall M, Moxon Sand Sonnhammer EL (2004) The Pfam

protein families database. Nucleic acids research 32: (suppl_1) D138-D141.

8. Beloqui A, Pita M, Polaina J, Martínez-Arias A, Golyshina OV, Zumárraga

M, Yakimov MM, García-Arellano H, Alcalde Mand Fernández VM (2006)

Novel polyphenol oxidase mined from a metagenome expression library of

106

bovine rumen biochemical properties, structural analysis, and phylogenetic

relationships. Journal of Biological Chemistry 281: (32) 22933-22942.

9. Bio C (2012) White Paper on de novo assembly in CLC Assembly Cell 4.0.

CLC bio A/S, Aarhus, Denmark.

10. Bolger R, Lenoch F, Allen E, Meiklejohn B, Burke T (1997) Fluorescent dye

assay for detection of DNA in recombinant protein products. Biotechniques

23(3):532-7

11. Bourrain M, Achouak W, Urbain Vand Heulin T (1999) DNA extraction

from activated sludges. Current microbiology 38: (6) 315-319.

12. Boyle AW, Häggblom MMand Young LY (1999) Dehalogenation of lindane

(γ-hexachlorocyclohexane) by anaerobic bacteria from marine sediments and

by sulfate-reducing bacteria. FEMS microbiology ecology 29: (4) 379-387.

13. Boyle AW, Phelps CDand Young L (1999) Isolation from estuarine

sediments of aDesulfovibrio strain which can grow on lactate coupled to the

reductive dehalogenation of 2, 4, 6-tribromophenol. Appl. Environ.

Microbiol. 65: (3) 1133-1140.

14. Breitwieser FP, Lu Jand Salzberg SL (2017) A review of methods and

databases for metagenomic classification and assembly. Briefings in

bioinformatics.

15. Bunge Mand Lechner U (2009) Anaerobic reductive dehalogenation of

polychlorinated dioxins. Applied microbiology and biotechnology 84: (3) 429-444.

16. C.Balachandrana VD, K.Balakrishnaa, S.Ignacimuthua (2012) Petroleum and

polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) degradation and naphthalene

metabolism in Streptomyces sp. (ERI-CPDA-1) isolated from oil

contaminated soil. Bioresource Technology 112: 83-90.

17. Cecil PF (1986) Herbicidal warfare: The ranch hand project in Vietnam. Praeger.

18. Chang Y-S (2008) Recent developments in microbial biotransformation and

biodegradation of dioxins. Journal of molecular microbiology and

biotechnology 15: (2-3) 152-171.

107

19. Chevreux B, Wetter Tand Suhai S (1999) Genome sequence assembly using

trace signals and additional sequence information. Vol. 99 ed.^eds.), p.^pp.

45-56. Citeseer.

20. Childs REand Bardsley WG (1975) The steady-state kinetics of peroxidase

with 2, 2′-azino-di-(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulphonic acid) as chromogen.

Biochemical journal 145: (1) 93-103.

21. D’Angelo Eand Nunez A (2010) Effect of environmental conditions on

polychlorinated biphenyl transformations and bacterial communities in a

river sediment. Journal of soils and sediments 10: (6) 1186-1199.

22. Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Bá Hữu, Nguyễn Thị Đệ, Nghiêm Ngọc Minh,

Nguyễn Đương Nhã, Mai Anh Tuấn, La Thanh Phương, Nguyễn Thị Sánh,

Nguyễn Thu Thủy, Đỗ Bích Thanh, Đỗ Ngọc Tuyên, Nguyễn Văn Minh,

Nguyễn Văn Hồng (2005) Nghiên cứu phát triển công nghệ phân hủy sinh

học và kỹ thuật nhả chậm làm sạch chất độc hóa học trong đất. (Báo cáo Đề

tài cấp nhà nước thuộc chương trình 33), Hà Nội.

23. Daniel R (2004) The soil metagenome–a rich resource for the discovery of

novel natural products. Current opinion in biotechnology 15: (3) 199-204.

24. Drewniak L, Krawczyk PS, Mielnicki S, Adamska D, Sobczak A, Lipinski L,

Burec-Drewniak Wand Sklodowska A (2016) Physiological and metagenomic

analyses of microbial mats involved in self-purification of mine waters

contaminated with heavy metals. Frontiers in microbiology 7: 1252.

25. Drzyzga O, Gerritse J, Dijk JA, Elissen Hand Gottschal JC (2001)

Coexistence of a sulphate-reducing Desulfovibrio species and the

dehalorespiring Desulfitobacterium frappieri TCE1 in defined chemostat

cultures grown with various combinations of sulphate and tetrachloroethene.

Environmental Microbiology 3: (2) 92-99.

26. Fang Z, Li T, Wang Q, Zhang X, Peng H, Fang W, Hong Y, Ge Hand Xiao

Y (2011) A bacterial laccase from marine microbial metagenome exhibiting

108

chloride tolerance and dye decolorization ability. Applied microbiology and

Biotechnology 89: (4) 1103-1110.

27. Fennell DE, Nijenhuis I, Wilson SF, Zinder SHand Häggblom MM (2004)

Dehalococcoides ethenogenes strain 195 reductively dechlorinates diverse

chlorinated aromatic pollutants. Environmental science & technology 38: (7)

2075-2081.

28. Field J.A.and Sierra-Alvarez R (2008) Microbial degradation of chlorinated

dioxins. Chemosphere, 71:: 1005-1018.

29. Fortnagel P, Harms H, Wittich R-M, Francke W, Krohn Sand Meyer H

(1989) Cleavage of dibenzofuran and dibenzodioxin ring systems by a

Pseudomonas bacterium. Naturwissenschaften 76: (5) 222-223.

30. Freeborn RA, West KA, Bhupathiraju VK, Chauhan S, Rahm BG,

Richardson REand Alvarez-Cohen L (2005) Phylogenetic analysis of TCE-

dechlorinating consortia enriched on a variety of electron donors.

Environmental science & technology 39: (21) 8358-8368.

31. Futagami T, Goto Mand Furukawa K (2008) Biochemical and genetic bases

of dehalorespiration. The chemical record 8: (1) 1-12.

32. Garrido-Sanz D, Manzano J, Martín M, Redondo-Nieto Mand Rivilla R

(2018) Metagenomic analysis of a biphenyl-degrading soil bacterial

consortium reveals the metabolic roles of specific populations. Frontiers in

Microbiology 9: 232.

33. Gauze, G.F., T.P.Preobrazhenskaya, M. Sveshnikova, L.P.Terechova,

T.S.Maximova (1983) . Key to Actinomycetes. Nauka Publ., Moscow (In

Russian)

34. Ghosh Sand Das AP (2018) Metagenomic insights into the microbial

diversity in manganese-contaminated mine tailings and their role in

biogeochemical cycling of manganese. Scientific reports 8: (1) 8257.

35. Gohil H (2011) Optimization of anaerobic degradation of 1, 1, 1-trichloro-2, 2-di

(4-chlorophenyl) ethane (DDT), 1-chloro-4-[2, 2-dichloro-1-(4-chlorophenyl)

109

ehtyl] benzene (DDD) and1, 1-bis-(4-chlorophenyl)-2, 2-dichloroethene (DDE)

in organic muck soils ofLake Apopka. University of Florida.

36. Häggblom MM, Fennell DE, Ahn Y-B, Ravit Band Kerkhof LJ (2006)

Anaerobic dehalogenation of halogenated organic compounds: Novel strategies

for bioremediation of contaminated sediments. Soil and Water Pollution

Monitoring, Protection and Remediation,ed.^eds.), p.^pp. 505-521. Springer.

37. Hamdy A. H. Aly NBH, Victor Wray, Howard Junca, Dietmar H. Pieper

(2008) Two Angular Dioxygenases Contribute to the Metabolic Versatility of

Dibenzofuran-Degrading Rhodococcus sp. Strain HA01. Applied and

Environmental Microbiology 74: (12) 3812-3822.

38. Handelsman J (2004) Metagenomics: application of genomics to uncultured

microorganisms. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68: (4) 669-685.

39. Hartmann EM JAJ (2014) Shotgun proteomics suggests involvement of

additional enzymes in dioxin degradation by Sphingomonas wittichii RW1.

Environmental Microbiology 16: (Metabolism & Biodegradation) 162-176.

40. Hidayat Aand Tachibana S (2013) Degradation of 2, 4, 8-

trichlorodibenzofuran by a new isolate of Cerrena sp. F0607. International

Biodeterioration & Biodegradation 77: 51-55.

41. Hiraishi A (2003) Biodiversity of dioxin-degrading microorganisms and potential

utilization in bioremediation. Microbes and Environments 18: (3) 105-125.

42. Hiraishi A (2008) Biodiversity of dehalorespiring bacteria with special

emphasis on polychlorinated biphenyl/dioxin dechlorinators. Microbes and

Environments 23: (1) 1-12.

43. Holmes VF, He J, Lee PKand Alvarez-Cohen L (2006) Discrimination of

multiple Dehalococcoides strains in a trichloroethene enrichment by

quantification of their reductive dehalogenase genes. Appl. Environ.

Microbiol. 72: (9) 5877-5883.

110

44. Hong H-B, Nam I-H, Murugesan K, Kim Y-Mand Chang Y-S (2004)

Biodegradation of dibenzo-p-dioxin, dibenzofuran, and chlorodibenzo-p-

dioxins by Pseudomonas veronii PH-03. Biodegradation 15: (5) 303-313.

45. Hong H, Pruden Aand Reardon KF (2007) Comparison of CE-SSCP and

DGGE for monitoring a complex microbial community remediating mine

drainage. Journal of Microbiological Methods 69: (1) 52-64.

46. Hug LA, Beiko RG, Rowe AR, Richardson REand Edwards EA (2012)

Comparative metagenomics of three Dehalococcoides-containing enrichment

cultures: the role of the non-dechlorinating community. BMC genomics 13: (1) 327.

47. Hữu NB (2007) Tính đa dạng của cấu trúc tập đoàn vi khuẩn trong quá trình

xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở quy mô nhỏ hiện trường. Tạp chí

Công nghệ sinh học 5: (2) 255-264.

48. Hữu NB (2007) Xác định cấu trúc tập đoàn vi khuẩn trong đất nhiễm chất

độc hoá học dựa trên phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn gen 16S rRNA. Tạp

chí Công nghệ Sinh học 5: (1) 123-132.

49. Ishii K., Furuichi T., Koike K.and Kuboshima M. (2004) Purification of

highly chlorinated dioxins degrading enzyme. Organohal Compo, 66:: 1262-

1266.

50. Islam MR, Sultana T, Joe MM, Cho J-Cand Sa T (2012) Comparisons of

direct extraction methods of microbial DNA from different paddy soils.

Saudi journal of biological sciences 19: (3) 337-342.

51. Jakub Czarny JS-P, Jolanta Powierska-Czarny, Jacek Nowak, Łukasz Wolko,

Agnieszka Piotrowska-Cyplik (2017) Metagenomic Analysis of Soil

Bacterial Community and Level of Genes Responsible for Biodegradation of

Aromatic Hydrocarbons. Polish journal of microbiology 66: (3) 345-352.

52. Jeffries TC, Rayu S, Nielsen UN, Lai K, Ijaz A, Nazaries Land Singh BK

(2018) Metagenomic functional potential predicts degradation rates of a

model organophosphorus xenobiotic in pesticide contaminated soils.

Frontiers in microbiology 9: 147.

111

53. Johnson T (2008) Bioremediation and detoxification of polychlorinated

dioxin contaminated environments. Biotechnology Journal 4: (1) 1-9.

54. Juhyun Kim JY, Che Ok Jeon and Woojun Park (2009) Intracellular 2-keto-

3-deoxy-6-phosphogluconate is the signal for carbon catabolite repression of

phenylacetic acid metabolism in Pseudomonas putida KT2440. Microbiology

155: 2420-2428.

55. Kachienga L, Jitendra Kand Momba M (2018) Metagenomic profiling for

assessing microbial diversity and microbial adaptation to degradation of

hydrocarbons in two South African petroleum-contaminated water aquifers.

Scientific reports 8: (1) 7564.

56. Kanehisa Mand Goto S (2000) KEGG: kyoto encyclopedia of genes and

genomes. Nucleic Acids Res 28: (1) 27-30.

57. Kent WJ (2002) BLAT—the BLAST-like alignment tool. Genome research

12: (4) 656-664.

58. Krajmalnik-Brown R (2005) Genetic identification of reductive

dehalogenase genes in Dehalococcoides. Georgia Institute of Technology.

59. Kranzioch I, Stoll C, Holbach A, Chen H, Wang L, Zheng B, Norra S, Bi Y,

Schramm K-Wand Tiehm A (2013) Dechlorination and organohalide-respiring

bacteria dynamics in sediment samples of the Yangtze Three Gorges Reservoir.

Environmental Science and Pollution Research 20: (10) 7046-7056.

60. Kumar V, Bisht GSand Institu S (2010) An improved method for isolation of

genomic DNA from filamentous actinomycetes. Int. J. Eng. Technol.

Manage. Appl. Sci. 2: 2.

61. Kuske CR, Barns SMand Busch JD (1997) Diverse uncultivated bacterial

groups from soils of the arid southwestern United States that are present in

many geographic regions. Appl. Environ. Microbiol. 63: (9) 3614-3621.

62. Leandro Nascimento Lemos RCS, Fabianade Souza Cannavana, André

Patricioa, Victor Satler Pylro, Rogério Eiji Hanada, Tsai Siu Mui (2016)

112

Metagenome sequencing of the microbial community of two Brazilian

anthropogenic Amazon dark earth sites, Brazil. Genomics Data 10: (167-168).

63. Lechner U, Türkowsky D, Dinh TTH, Al‐Fathi H, Schwoch S, Franke S,

Gerlach MS, Koch M, von Bergen Mand Jehmlich N (2018)

Desulfitobacterium contributes to the microbial transformation of 2, 4, 5‐T

by methanogenic enrichment cultures from a Vietnamese active landfill.

Microbial Biotechnology 11: (6) 1137-1156.

64. Lee PK, Johnson DR, Holmes VF, He Jand Alvarez-Cohen L (2006)

Reductive dehalogenase gene expression as a biomarker for physiological

activity of Dehalococcoides spp. Appl. Environ. Microbiol. 72: (9) 6161-6168.

65. Lim J-S, Choi B-S, Lee J-S, Shin C, Yang T-J, Rhee J-S, Lee J-Sand Choi I-

Y (2012) Survey of the applications of NGS to whole-genome sequencing

and expression profiling. Genomics & informatics 10: (1) 1.

66. Löffler FE, Yan J, Ritalahti KM, Adrian L, Edwards EA, Konstantinidis KT,

Müller JA, Fullerton H, Zinder SHand Spormann AM (2013)

Dehalococcoides mccartyi gen. nov., sp. nov., obligately organohalide-

respiring anaerobic bacteria relevant to halogen cycling and bioremediation,

belong to a novel bacterial class, Dehalococcoidia classis nov., order

Dehalococcoidales ord. nov. and family Dehalococcoidaceae fam. nov.,

within the phylum Chloroflexi. International journal of systematic and

evolutionary microbiology 63: (2) 625-635.

67. Maphosa F, de Vos WMand Smidt H (2010) Exploiting the ecogenomics

toolbox for environmental diagnostics of organohalide-respiring bacteria.

Trends in biotechnology 28: (6) 308-316.

68. Meier MJ (2014) Metagenomic analysis of contaminated soils. Carleton

University.

69. Meyer F, Paarmann D, D'Souza M, Olson R, Glass EM, Kubal M, Paczian T,

Rodriguez A, Stevens Rand Wilke A (2008) The metagenomics RAST

113

server–a public resource for the automatic phylogenetic and functional

analysis of metagenomes. BMC bioinformatics 9: (1) 386.

70. Miller JR, Koren Sand Sutton G (2010) Assembly algorithms for next-

generation sequencing data. Genomics 95: (6) 315-327.

71. Mitchell AL, Scheremetjew M, Denise H, Potter S, Tarkowska A, Qureshi M,

Salazar GA, Pesseat S, Boland MAand Hunter FMI (2017) EBI Metagenomics

in 2017: enriching the analysis of microbial communities, from sequence reads

to assemblies. Nucleic acids research 46: (D1) D726-D735.

72. Muller J, Szklarczyk D, Julien P, Letunic I, Roth A, Kuhn M, Powell S, von

Mering C, Doerks Tand Jensen LJ (2009) eggNOG v2. 0: extending the

evolutionary genealogy of genes with enhanced non-supervised orthologous

groups, species and functional annotations. Nucleic acids research 38:

(suppl_1) D190-D195.

73. Muyzer Gand Stams AJ (2008) The ecology and biotechnology of sulphate-

reducing bacteria. Nature reviews microbiology 6: (6) 441.

74. Nakamiya K., Furuichi T.and Ishii K. (2002) Isolation of a fugus from

denitrifying activated sludge that degrades highly chlorinated dioxins. J

Master Cycles Waste Manag, 4:: 127-134.

75. Nguyễn Bá Hữu, Ngiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2006) Xác định

nhóm vi khuẩn khử chlor Dehalococcoides trong xử lý tẩy độc đất nhiễm

chất dioxin. Tạp chí Công nghệ sinh học. Số 4. 519-532.

76. Nguyễn Thị Sánh, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2005) Phân loại

và nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên sự phát triển của chủng vi khuẩn

kị khí không bắt buộc SETDN1 từ đất nhiễm độc hóa học tại Đà Nẵng. Tạp

chí Công nghệ sinh học 3: (2) 257-264.

77. Nguyễn Thị Tâm Thư, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2013) Đa

dạng vi khuẩn khử sulfate trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay

Đà Nẵng và Biên Hòa. Tạp chí Công nghệ Sinh học 4: 769-775

114

78. Pascal Weigold ME-H, Alexander Ruecker, Daniel H. Huson,Thomas

Scholten, Maik Jochmann, Andreas Kappler & Sebastian Behrens (2016) A

metagenomic-based survey of microbial (de)halogenation potential in a

German forest soil. Scientific RepoRts 6: 28958.

79. Pedron R, Esposito A, Bianconi I, Pasolli E, Tett A, Asnicar F, Cristofolini

M, Segata Nand Jousson O (2019) Genomic and metagenomic insights into

the microbial community of a thermal spring. Microbiome 7: (1) 8.

80. Pevzner PA, Tang Hand Waterman MS (2001) An Eulerian path approach to

DNA fragment assembly. Proceedings of the national academy of sciences

98: (17) 9748-9753.

81. Phùng Khắc Huy Chú, Đào Thị Ngọc Ánh, Lê Việt Hưng, Đinh Thị Thu

Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2012) Phân lập, phân loại chủng vi khuẩn BHNA1

và xác định gene tfdA mã hóa cho enzyme phân hủy 2, 4-d từ đất nhiễm chất

diệt cỏ/dioxin thuộc khu vực Tây Nam sân bay Biên Hòa. Tạp chí Độc học 21:

3-11.

82. Puranik S, Pal RR, More RPand Purohit HJ (2016) Metagenomic approach to

characterize soil microbial diversity of Phumdi at Loktak Lake. Water

Science and Technology 74: (9) 2075-2086.

83. Quince C, Walker AW, Simpson JT, Loman NJand Segata N (2017) Shotgun

metagenomics, from sampling to analysis. Nature biotechnology 35: (9) 833.

84. Reineke W (2001) Aerobic and anaerobic biodegradation potentials of

microorganisms. Biodegradation and Persistence), 1-161. Springer.

85. Rho M, Tang Hand Ye Y (2010) FragGeneScan: predicting genes in short

and error-prone reads. Nucleic acids research 38: (20) e191-e191.

86. Richardson RE (2013) Genomic insights into organohalide respiration.

Current opinion in biotechnology 24: (3) 498-505.

87. Riesenfeld CS, Schloss PDand Handelsman J (2004) Metagenomics:

genomic analysis of microbial communities. Annu. Rev. Genet. 38: 525-552.

115

88. Ritalahti KMand Löffler FE (2004) Populations implicated in anaerobic

reductive dechlorination of 1, 2-dichloropropane in highly enriched bacterial

communities. Appl. Environ. Microbiol. 70: (7) 4088-4095.

89. Sambrook Jand Russell DW (2001) Molecular cloning: a laboratory manual

3rd edition. Coldspring-Harbour Laboratory Press, UK.

90. Satoshi Hiraoka AM, Minoru Ijichi, Kentaro Inoue, Kenshiro Oshima,

Masahira Hattori, Susumu Yoshizawa, Kazuhiro Kogure and Wataru Iwasaki

(2016) Genomic and metagenomic analysis of microbes in a soil

environment affected by the 2011 Great East Japan Earthquake tsunami.

BMC Genomics 17: 53.

91. Schecter A (2013) Dioxins and health. Springer Science & Business Media.

92. Schreiner G, Wiedmann T, Schimmel Hand Ballschmiter K (1997) Influence

of the substitution pattern on the microbial degradation of mono-to

tetrachlorinated dibenzo-p-dioxins and dibenzofurans. Chemosphere 34: (5-

7) 1315-1331.

93. Sirim D, Wagner F, Wang L, Schmid RDand Pleiss J (2011) The Laccase

Engineering Database: a classification and analysis system for laccases and

related multicopper oxidases. Database 2011.

94. Smidt H, Akkermans AD, van der Oost Jand de Vos WM (2000)

Halorespiring bacteria–molecular characterization and detection. Enzyme and

Microbial Technology 27: (10) 812-820.

95. Stefan R. Kaschabek BK, Dagmar Mu¨ller, Eberhard Schmidt and Walter

Reineke (2002) Degradation of Aromatics and Chloroaromatics by

Pseudomonas sp. Strain B13: Purification and Characterization of 3-

Oxoadipate:Succinyl-Coenzyme A (CoA) Transferase and 3-Oxoadipyl-CoA

Thiolase. Journal of Bacteriology 184: (1) 207-215.

96. Stella T, Covino S, Křesinová Z, D’Annibale A, Petruccioli M, Čvančarová

Mand Cajthaml T (2013) Chlorobenzoic acid degradation by Lentinus (Panus)

116

tigrinus: in vivo and in vitro mechanistic study-evidence for P-450 involvement

in the transformation. Journal of hazardous materials 260: 975-983.

97. Sun B, Cole JR, Sanford RAand Tiedje JM (2000) Isolation and

characterization of Desulfovibrio dechloracetivorans sp. nov., a marine

dechlorinating bacterium growing by coupling the oxidation of acetate to the

reductive dechlorination of 2-chlorophenol. Appl. Environ. Microbiol. 66: (6)

2408-2413.

98. Tatusov RL, Galperin MY, Natale DAand Koonin EV (2000) The COG

database: a tool for genome-scale analysis of protein functions and evolution.

Nucleic acids research 28: (1) 33-36.

99. Thomas T, Gilbert Jand Meyer F (2012) Metagenomics-a guide from sampling

to data analysis. Microbial informatics and experimentation 2: (1) 3.

100. Van den Berg M, Birnbaum L, Bosveld A, Brunström B, Cook P, Feeley M,

Giesy JP, Hanberg A, Hasegawa Rand Kennedy SW (1998) Toxic

equivalency factors (TEFs) for PCBs, PCDDs, PCDFs for humans and

wildlife. Environmental health perspectives 106: (12) 775-792.

101. Van den Berg M, Birnbaum LS, Denison M, De Vito M, Farland W, Feeley

M, Fiedler H, Hakansson H, Hanberg Aand Haws L (2006) The 2005 World

Health Organization reevaluation of human and mammalian toxic

equivalency factors for dioxins and dioxin-like compounds. Toxicological

sciences 93: (2) 223-241.

102. Van Doesburg W, Van Eekert MH, Middeldorp PJ, Balk M, Schraa Gand

Stams AJ (2005) Reductive dechlorination of β-hexachlorocyclohexane (β-

HCH) by a Dehalobacter species in coculture with a Sedimentibacter sp.

FEMS Microbiology Ecology 54: (1) 87-95.

103. Wilfinger WW, Mackey Kand Chomczynski P (1997) Effect of pH and ionic

strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.

Biotechniques 22: (3) 474-476, 478-481.

117

104. Yan X, Luo Xand Zhao M (2016) Metagenomic analysis of microbial

community in uranium-contaminated soil. Applied microbiology and

biotechnology 100: (1) 299-310.

105. Zaborina O BB, Baryshnikova L, Golovleva L. (1997) Institute of

Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of

Sciences, Moscow Region, Russia. J Environ Sci Health B. 32: (1) 55-70.

106. Zhang L, Loh K-C, Lim JWand Zhang J (2019) Bioinformatics analysis of

metagenomics data of biogas-producing microbial communities in anaerobic

digesters: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews 100: 110-126.

107. Zhang M, Huang F, Wang G, Liu X, Wen J, Zhang X, Huang Yand Xia Y

(2017) Geographic distribution of cadmium and its interaction with the

microbial community in the Longjiang River: risk evaluation after a

shocking pollution accident. Scientific reports 7: (1) 227.

108. Zhou J, Bruns MAand Tiedje JM (1996) DNA recovery from soils of diverse

composition. Appl. Environ. Microbiol. 62: (2) 316-322.

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC I: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................1

1.1. Thu thập mẫu nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (C) .......................................1

1.2. Thu thập mẫu đã xử lý làm sạch ô nhiễm (BHR) .........................................2

1.3. Trình tự mồi và phân loại VSV ......................................................................3

1.4. Chi tiết các bước tiến hành xác định hoạt tính laccase .................................4

1.5. Tách chiết DNA dùng Kit ..............................................................................4

1.6. Phương pháp đo độ hấp thụ của DNA tại bước sóng 260 nm .....................6

PHỤ LỤC II: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...........................................................7

2.1. Đặc tính cơ bản về thổ nhưỡng hai khu vực lấy mẫu ...................................7

2.2. Phân tích độ độc của mẫu thí nghiệm phân hủy chất diệt cỏ/dioxin

bởi tổ hợp vi khuẩn, xạ khuẩn ..................................................................... 10

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Vị trí thu thập mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (C) ............ 2

Hình 1.2. Vị trí thu thập mẫu đất đã xử lý làm sạch chất diệt cỏ/dioxin (BHR) ....... 3

Hình 1.3. Các bước tách chiết DNA theo kit MoBio đã cải tiến ..................... 5

Hình 2.1. Kết quả phân tích thành phần cơ giới của đất tại Viện Thổ

nhưỡng nông hóa ............................................................................ 9

Hình 2.2. Kết quả phân tích dioxin bằng GC-MS mẫu đất dùng làm đối

chứng trong thí nghiệm phân hủy có lặp lại ................................. 13

Hình 2.3. Kết quả phân tích dioxin bằng GC-MS thí nghiệm phân hủy

dioxin trong đất bởi tổ hợp vi khuẩn có lặp lại ............................. 17

Hình 2.4. Kết quả phân tích dioxin bằng GC-MS thí nghiệm phân hủy

dioxin trong đất bởi tổ hợp xạ khuẩn có lặp lại ............................ 21

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Các chỉ tiêu thổ nhưỡng cơ bản của đất mẫu C và BHR ................. 7

1

PHỤ LỤC I: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.1. Thu thập mẫu nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (C)

Mẫu C được đồng nhất từ đất ô nhiễm lấy ở 5 hố (bằng máy xúc) thuộc khu

vực Tây nam sân bay Biên Hòa với vị trí và độ sâu khác nhau (Hình 1.1). Đây là khu

vực có địa hình tương đối bằng phẳng, cỏ không mọc được hay rất ít và thưa thớt bởi

mức độ ô nhiễm rất phức tạp và không theo quy luật như đặc điểm chung của mẫu đất

ô nhiễm POPs khác trên toàn thế giới. Đất ở các hố bị ô nhiễm với độ độc khác nhau

dao động từ 241 ngTEQ/kg tới 801.115 ngTEQ/kg với màu sắc của đất chủ yếu là

màu vàng trên bề mặt và màu nâu cho tới xám đen theo chiều sâu (Hình 1.1).

Sự khác biệt về màu sắc của đất biểu hiện cho hoạt động của VSV bản địa

theo các lớp là khác nhau. Khi mới đào lên mùi đặc trưng từ polyphenol nồng nặc.

Khi không có tác động thì quá trình này vẫn luôn hiện hữu trong tự nhiên tuy nhiên

khả năng và tốc độ phân hủy vẫn còn rất chậm. Việc đồng nhất mẫu phục vụ nghiên

cứu tại hiện trường cũng được thực hiện và độ độc của mẫu nghiên cứu được xác

định 21.605 ngTEQ/kg đất khô. Độ độc của mẫu C được xếp vào mức ô nhiễm nặng

và cần phải loại bỏ theo WHO. Theo lý thuyết, đây cũng là độ độc ảnh hưởng rất

lớn tới đa dạng VSV đất bởi khả năng sàng lọc và gây biến đổi gene với VSV đất.

Một lượng lớn đất khu vực này được chuyển ra bằng tàu từ Biên Hòa ra Hà

Nội để phục vụ xây dựng mô hình tăng cường phân hủy sinh học quy mô pilot lên

tới 150kg đất và các thí nghiệm phân hủy 2,3,7,8-TCDD trong đất bằng tổ hợp VSV

quy mô phòng thí nghiệm. Năm mươi (50 kg) đất được lưu trữ trong thùng phi 200

lít và chôn dưới đất phục vụ nghiên cứu cùng với 0,5 kg đất được sử dụng trong

tách chiết DNA metagenome.

2

32 011 16 567 801 115 7 528 241

(ng TEQ/kg) (ng TEQ/kg) (ng TEQ/kg) (ng TEQ/kg) (ng TEQ/kg)

10°58'14.3"N 106°48'19.3"E

Hình 1.1. Vị trí thu thập mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (C)

1.2. Thu thập mẫu đã xử lý làm sạch ô nhiễm (BHR)

Mẫu BHR được lấy ở khu vực đã tiến hành khử độc trong hố chôn lấp tích

cực. Đất ở lô xử lý được lấy bằng khoan chuyên dụng theo tiêu chuẩn của EPA Hoa

Kỳ từ ít nhất 5-7 điểm trên 1 lô (mẫu BHR được đồng nhất từ đất thuộc 4 lô của

3.384 m3 đất đã xử lý làm sạch). Tại các vị trí lấy mẫu, đất đồng nhất và có màu

xám tro. Tổng độ độc của các mẫu thu thập ở khu vực này đều rất thấp từ 8,3 ng

TEQ/kg cho tới 32 ng TEQ/kg và đạt ngưỡng dưới mức ô nhiễm đối với đất sử

dụng trong nông nghiệp hàng năm theo TCVN (40 ng TEQ/kg đất khô - Quy chuẩn

QCVN45:2012/BTNMT).

32ngTEQ/kg 12ngTEQ/kg 11ngTEQ/kg 10ngTEQ/kg

3

11ngTEQ/kg 10ngTEQ/kg 8.3 ngTEQ/kg 12ngTEQ/kg

10°57'46.4"N 106°49'22.6"E

Hình 1.2. Vị trí thu thập mẫu đất đã xử lý làm sạch chất diệt cỏ/dioxin (BHR)

1.3. Trình tự mồi và phân loại VSV

Nhân dòng đoạn gene 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR từ DNA tổng số với cặp

mồi 27F và 1492R.

(27F): 5’ - AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG - 3’;

(1492R): 5’ - GGY TAC CTT GTT ACG ACT T - 3’

Hỗn hợp phản ứng PCR (20µl) gồm các thành phần sau:

Thành phần Thể tích (µl)

Buffer Taq 5X 2,4

2,4 MgCl2 25 mM

dNTPs 2,5 mM 1,6

Mồi xuôi 20 µM 1,0

Mồi ngược 20µM 1,0

Taq DNA polymerase (5 U/µl) 1,0

13,3 dd H2O

AND khuôn 1,0

4

1.4. Chi tiết các bước tiến hành xác định hoạt tính laccase:

Bước 1: Hút các thành phần phản ứng gồm 600 µl đệm acetate natri (20 mM,

pH 5), 200 µl dịch enzyme.

Bước 2: Xác định độ hấp thụ ánh sáng (AC) của dung dịch tại thời điểm τ = 0:

Hút 200 µl ABTS 2,5 mM vào ống nghiệm đã chứa các thành phần ở bước 1, voltex

đều và chuyển sang cuvet, đọc giá trị độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 420 nm.

Bước 3: Xác định giá trị độ hấp thụ ánh sáng (AM) của dung dịch phản ứng

tại thời điểm τ: Hút 200 µl ABTS 2,5 mM vào ống nghiệm đã chứa các thành phần

ở bước 1, voltex đều, trong thời gian τ (thường là 2 phút). Đọc giá trị độ hấp thụ ánh

sáng ở bước sóng 420 nm. Lặp lại 2-3 lần để lấy giá trị độ hấp thụ ánh sáng trung

bình. Công thức tính:

Trong đó:

U: Hoạt độ enzyme (U/l)

ε: Hệ số hấp thụ ánh sáng của sản phẩm, ε420 = 36.000 (M-1 cm-1)

Vpu: Tổng thể tích phản ứng (1 ml)

VE: Thể tích enzyme (200 µl)

Aτ: Giá trị độ hấp thụ ánh sáng đo được tại thời điểm τ

A0: Giá trị độ hấp thụ ánh sáng đo được tại thời điểm τ = 0

Df: Độ pha loãng.

Tpu: Thời gian phản ứng (2 phút)

1.5. Tách chiết DNA dùng Kit

Các bước tách chiết được thực hiện theo hướng dẫn cụ thể của nhà sản xuất với

các dung dịch sử dụng trong từng bước được ký hiệu lần lượt là C1, C2, C3, C4, C5.

Các bước tiếp theo được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:

- Bổ sung 250 µl dung dịch C2, vortex 5 giây. Ủ ở 4oC trong 5 phút

- Ly tâm 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng

- Hút 600 µl dịch nổi sang ống eppendorf mới

5

- Bổ sung 200 µl dung dịch C3, vortex nhẹ. Ủ ở 4oC trong 5 phút

- Ly tâm 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng

- Hút 750 µl dịch nổi sang ống eppendorf mới

- Bổ sung 1.200 µl dung dịch C4 và vortex 5 giây

- Hút 675 µl chuyển sang ống có màng lọc Spin Filter.Ly tâm 10.000 x g trong 1

phút ở nhiệt độ phòng và loại bỏ dịch chảy qua filter. Lặp lại bước này 3 lần để hút

hết phần dịch nổi

- Bổ sung 500 µl dung dịch C5 vào ống Spin Filter, ly tâm 10.000 x g trong 30 giây

ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch chảy qua filter

- Ly tâm lại một lần nữa ở tốc độ 10.000 x g trong 1 phút

- Chuyển màng lọc Spin filter sang ống mới

- Bổ sung 100 µl vào giữa màng filter và ly tâm 10.000 x g trong 30 giây.

- Loại bỏ màng lọc, DNA thu được sẽ được kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch và được

bảo quản ở -20oC để gửi đi giải trình tự.

Hình 1.3. Các bước tách chiết DNA theo kit MoBio đã cải tiến

6

1.6. Phương pháp đo độ hấp thụ của DNA tại bước sóng 260 nm

DNA hấp thụ cực đại ở bước sóng 260 nm và số đọc A260 = 1 tương ứng với

nồng độ 50 µg/ml của DNA sợi đôi có trong mẫu nghiên cứu. Do đó, dựa vào số

đọc A260, nồng độ DNA được xác định theo công thức được trình bày bên dưới.

Hàm lượng DNA (µg/ml) = (A260 – A230) × Df × 50 µg/ml

Trong đó: A260: số đọc tại bước sóng 260 nm

A230: số đọc tại bước sóng 230 nm

Df: Hệ số pha loãng

Công thức trên được áp dụng để xác định nồng độ DNA khi sử dụng tính

năng hiệu chỉnh tín hiệu nền (Background Correction) tại bước sóng 230 nm (áp

dụng cho acid nucleic) của máy Simplinano.

Từ đó, hàm lượng DNA có trong mẫu nghiên được tính như sau:

Hàm lượng DNA (µg) = Nồng độ DNA (µg/ml) × Tổng thể tích mẫu (ml)

Tuy nhiên, không chỉ riêng DNA hấp thụ ở bước sóng 260 nm, RNA cũng

hấp thụ mạnh ở bước sóng này. Các amino acid chứa vòng thơm có mặt trong

protein cũng hấp thụ ở bước sóng 280 nm. Sự có mặt của RNA và protein trong

mẫu nghiên cứu sẽ ảnh hưởng đến số đọc A260. Vì vậy, độ tinh sạch của DNA được

xác định dựa vào tỷ lệ A260/A280. Mẫu DNA được cho là tinh sạch khi tỷ lệ A260/A280

nằm trong khoảng từ 1.8 – 2.0 (Wilfinger và cs., 1997; Adams, 2013).

Tỷ lệ A260/ A280 được xác định như sau:

Tỷ lệ A260/A280 = (A260 - A230) : (A280 - A230)

Trong đó: A260: số đọc tại bước sóng 260 nm

A280: số đọc tại bước sóng 280 nm

A320: số đọc tại bước sóng 230 nm

7

PHỤ LỤC II: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

2.1. Đặc tính cơ bản về thổ nhưỡng hai khu vực lấy mẫu

Điều kiện thổ nhưỡng giúp bổ sung, củng cố và giải thích rõ hơn kết quả đa

dạng VSV khi phân tích bằng metagenome. Các chỉ tiêu gồm: pH, nhiệt độ, độ ẩm,

độ mùn, hàm lượng nitơ, cacbon tổng số, asen trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin

được xác định. Số liệu sau phân tích được thống kê ở Bảng 3.1. Độ ẩm của 2 mẫu

đều rất thấp (<1%) và không thuận lợi cho đa số các VSV sinh trưởng do ô nhiễm

chất diệt cỏ/dioxin đã diễn ra trong thời gian dài. Mẫu C có pH thuộc loại kiềm nhẹ

(8,19) và mẫu BHR có pH gần trung tính (6,67). Chỉ tiêu khác như OM, hàm lượng

nitơ tổng số, độ mùn rất thấp. Ô nhiễm Asen thường đi kèm trong đất chứa chất diệt

cỏ/dioxin nhưng trong 2 mẫu nghiên cứu hàm lượng As đều nằm ở dưới mức cho

phép đối với đất nông nghiệp theo tiêu chuẩn quốc gia.

Bảng 2.1. Các chỉ tiêu thổ nhưỡng cơ bản của đất mẫu C và BHR

Mẫu Chỉ tiêu Phương pháp Đơn vị tính phân tích phân tích C BHR

Độ ẩm TCVN 6648:2000 (%) 0,52 0,73

Cát thô TCVN 8567:2010 (%) 0,04 0,16

Cát mịn TCVN 8567:2010 (%) 53,80 21,52 TPCG Limon TCVN 8567:2010 (%) 26,12 37,48

Sét TCVN 8567:2010 (%) 15,14 9,26

TCVN 5979:2007 (%) 8,19 6,67 pHKCl

OM TCVN 8941:2011 (%) 2,12 0,78

Nitơ tổng số TCVN 6498:1999 (% N) 0,04 0,16

As TCVN 8467:2010 (mg/kg) 11,69 3,23

PCDD/F – TEQ ng TEQ/kg EPA 8280B 21.605 13,2 (WHO 2005) đất khô

8

Phân tích thổ nhưỡng của mẫu tại Viện Thổ nhưỡng nông hóa

9

Hình 2.1. Kết quả phân tích thành phần cơ giới của đất tại Viện Thổ nhưỡng nông hóa

10

2.2. Phân tích độ độc của mẫu thí nghiệm phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp vi khuẩn, xạ khuẩn

STT Các đồng phân Hàm lượng (ng/kg Mẫu) TEF TEQ LOQ

1 2,3,7,8-TCDD 3952.00 1 3,952.00 16.6667

2 2,3,7,8-TCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667

11

1,2,3,7,8-PeCDD 3 384.00 1 384.00 16.6667

1,2,3,7,8-PeCDF 4 565.33 0.03 16.96 0.5000

2,3,4,7,8-PeCDF < 5 5.00 0.3 1.50 5.0000

1,2,3,4,7,8-HxCDD < 6 1.67 0.1 0.17 1.6667

1,2,3,6,7,8-HxCDD < 7 1.67 0.1 0.17 1.6667

1,2,3,7,8,9-HxCDD < 8 1.67 0.1 0.17 1.6667

1,2,3,4,7,8-HxCDF < 9 1.67 0.1 0.17 1.6667

1,2,3,6,7,8-HxCDF < 10 1.67 0.1 0.17 1.6667

2,3,4,6,7,8-HxCDF < 11 1.67 0.1 0.17 1.6667

1,2,3,7,8,9-HxCDF < 12 1.67 0.1 0.17 1.6667

1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 13 48.00 0.01 0.48 0.1667

1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 14 3253.33 0.01 32.53 0.1667

1,2,3,4,6,7,8-HpCDF < 15 0.17 0.01 0.00 0.1667

OCDD 16 261.33 0.0003 0.08 0.0050

OCDF 17 437.330 0.001 0.44 0.0050

4389.33 Tổng độ độc tương đương 2,3,7,8 TCDD tối đa có thể có trong mẫu (pg/g = ppt)

12

STT Các đồng phân Hàm lượng (ng/kg Mẫu) TEF TEQ LOQ

2,3,7,8-TCDD 3794.66 1 1 3,794.66 16.6667

2,3,7,8-TCDF < 1.67 2 0.1 0.17 1.6667

1,2,3,7,8-PeCDD 360.65 3 1 360.65 16.6667

1,2,3,7,8-PeCDF 487.15 4 0.03 14.61 0.5000

13

2,3,4,7,8-PeCDF < 5.00 0.3 1.50 5.0000 5

1,2,3,4,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 6

1,2,3,6,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 7

1,2,3,7,8,9-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 8

1,2,3,4,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 9

1,2,3,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 10

2,3,4,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 11

1,2,3,7,8,9-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 12

1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 56.00 0.01 0.56 0.1667 13

1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 2516.27 0.01 25.16 0.1667 14

1,2,3,4,6,7,8-HpCDF < 0.17 0.01 0.00 0.1667 15

OCDD 190.67 0.0003 0.06 0.0050 16

OCDF 356.700 0.001 0.36 0.0050 17

4198.90 Tổng độ độc tương đương 2,3,7,8 TCDD tối đa có thể có trong mẫu (pg/g = ppt)

Hình 2.2. Kết quả phân tích dioxin bằng GC-MS mẫu đất dùng làm đối chứng trong thí nghiệm phân hủy có lặp lại

14

STT Các đồng phân Hàm lượng (ng/kg Mẫu) TEF TEQ LOQ

2,3,7,8-TCDD 1632.21 1 1 1,632.21 16.6667

2,3,7,8-TCDF < 1.67 2 0.1 0.17 1.6667

1,2,3,7,8-PeCDD 125.33 3 1 125.33 16.6667

15

1,2,3,7,8-PeCDF 210.66 0.03 6.32 0.5000 4

2,3,4,7,8-PeCDF < 5.00 0.3 1.50 5.0000 5

1,2,3,4,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 6

1,2,3,6,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 7

1,2,3,7,8,9-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 8

1,2,3,4,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 9

1,2,3,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 10

2,3,4,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 11

1,2,3,7,8,9-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 12

1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 13.32 0.01 0.13 0.1667 13

1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 1421.33 0.01 14.21 0.1667 14

1,2,3,4,6,7,8-HpCDF < 1.67 0.01 0.02 0.1667 15

OCDD 109.25 0.0003 0.03 0.0050 16

OCDF 370.66 0.001 0.37 0.0050 17

1781.46 Tổng độ độc tương đương 2,3,7,8 TCDD tối đa có thể có trong mẫu (pg/g = ppt)

16

STT Các đồng phân Hàm lượng (ng/kg Mẫu) TEF TEQ LOQ

2,3,7,8-TCDD 1695.30 1 1 1,695.30 16.6667

2,3,7,8-TCDF < 1.67 0.1 2 0.17 1.6667

1,2,3,7,8-PeCDD < 16.67 1 3 16.67 16.6667

1,2,3,7,8-PeCDF 154.00 0.03 4 4.62 0.5000

17

2,3,4,7,8-PeCDF < 5.00 0.3 1.50 5.0000 5

1,2,3,4,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 6

1,2,3,6,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 7

1,2,3,7,8,9-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 8

1,2,3,4,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 9

1,2,3,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 10

2,3,4,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 11

1,2,3,7,8,9-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 12

1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 16.00 0.01 0.16 0.1667 13

1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 1221.15 0.01 12.21 0.1667 14

1,2,3,4,6,7,8-HpCDF < 1.67 0.01 0.02 0.1667 15

OCDD 96.32 0.0003 0.03 0.0050 16

OCDF 248.90 0.001 0.25 0.0050 17

1732.09 Tổng độ độc tương đương 2,3,7,8 TCDD tối đa có thể có trong mẫu (pg/g = ppt)

Hình 2.3. Kết quả phân tích dioxin bằng GC-MS thí nghiệm phân hủy dioxin trong đất bởi tổ hợp vi khuẩn có lặp lại

18

STT Các đồng phân Hàm lượng (ng/kg Mẫu) TEF TEQ LOQ

2,3,7,8-TCDD 1896.25 1 1 1,896.25 16.6667

2,3,7,8-TCDF < 1.67 2 0.1 0.17 1.6667

1,2,3,7,8-PeCDD < 16.66 3 1 16.66 16.6667

1,2,3,7,8-PeCDF 402.30 4 0.03 12.07 0.5000

19

2,3,4,7,8-PeCDF 465.18 0.3 139.55 5.0000 5

1,2,3,4,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 6

1,2,3,6,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 7

1,2,3,7,8,9-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 8

1,2,3,4,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 9

1,2,3,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 10

2,3,4,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 11

1,2,3,7,8,9-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 12

1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 39.10 0.01 0.39 0.1667 13

1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 1608.52 0.01 16.09 0.1667 14

1,2,3,4,6,7,8-HpCDF < 0.16 0.01 0.00 0.1667 15

OCDD 414.15 0.0003 0.12 0.0050 16

OCDF 1200.81 0.001 1.20 0.0050 17

2083.67 Tổng độ độc tương đương 2,3,7,8 TCDD tối đa có thể có trong mẫu (pg/g = ppt)

20

STT Các đồng phân Hàm lượng (ng/kg Mẫu) TEF TEQ LOQ

1 2,3,7,8-TCDD 2095.00 1 2,095.00 16.6667

2 2,3,7,8-TCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667

3 1,2,3,7,8-PeCDD < 16.66 1 16.66 16.6667

21

1,2,3,7,8-PeCDF 335.18 0.03 10.06 0.5000 4

2,3,4,7,8-PeCDF < 5.00 0.3 1.50 5.0000 5

1,2,3,4,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 6

1,2,3,6,7,8-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 7

1,2,3,7,8,9-HxCDD < 1.67 0.1 0.17 1.6667 8

1,2,3,4,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 9

1,2,3,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 10

2,3,4,6,7,8-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 11

1,2,3,7,8,9-HxCDF < 1.67 0.1 0.17 1.6667 12

1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 115.21 0.01 1.15 0.1667 13

1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 2290.00 0.01 22.90 0.1667 14

1,2,3,4,6,7,8-HpCDF < 0.16 0.01 0.00 0.1667 15

OCDD 130.15 0.0003 0.04 0.0050 16

OCDF < 0.0050 0.001 0.00 0.0050 17

2148.64 Tổng độ độc tương đương 2,3,7,8 TCDD tối đa có thể có trong mẫu (pg/g = ppt)

Hình 2.4. Kết quả phân tích dioxin bằng GC-MS thí nghiệm phân hủy dioxin trong đất bởi tổ hợp xạ khuẩn có lặp lại