Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu tính đa hình gen mã hóa thụ thể vitamin D ở một số thể bệnh lâm sàng do nhiễm vi rút viêm gan B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

NGUYỄN KHUYẾN

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH GEN MÃ HÓA THỤ

THỂ VITAMIN D Ở MỘT SỐ THỂ BỆNH LÂM SÀNG

DO NHIỄM VI RÚT VIÊM GAN B

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

NGUYỄN KHUYẾN

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH GEN MÃ HÓA THỤ

THỂ VITAMIN D Ở MỘT SỐ THỂ BỆNH LÂM SÀNG

DO NHIỄM VI RÚT VIÊM GAN B

Chuyên ngành: Truyền nhiễm và các bệnh nhiệt đới

Mã số: 972 01 09

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Hƣớng dẫn khoa học:

1. PGS. TS. Lê Hữu Song

2. PGS. TS. Đỗ Tuấn Anh

HÀ NỘI - 2021

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện luận án này, tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ

tận tình của nhiều tập thể và các cá nhân.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân

thành tới: Đảng ủy và Ban Giám đốc Bệnh viện TWQĐ 108, Học viện Quân

Y, Bệnh viện Quân Y 103, Bệnh viện Đa khoa Đức Giang, Bệnh viện Đa

khoa huyện Mỹ Đức, Bộ môn truyền nhiễm – Viện Nghiên cứu khoa học y

dƣợc lâm sàng 108, Bộ môn truyền nhiễm – Học viện Quân y đã cho phép,

tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án.

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS.

Lê Hữu Song và PGS. TS. Đỗ Tuấn Anh, những ngƣời Thầy đã tận tình

hƣớng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các Bác sỹ, Điều dƣỡng viên tại Viện lâm

sàng các bệnh truyền nhiễm – Bệnh viện TƢQĐ 108; Khoa Truyền nhiễm

bệnh viện Quân y 103; Khoa tiêu hóa - Bệnh viện TWQĐ 108 và Bệnh viện

Quân Y 103 đã cung cấp mẫu bệnh phẩm cho nghiên cứu này. Tôi cũng xin

gửi lời cảm ơn chân thành tới các bạn kỹ thuật viên Khoa sinh học phân tử -

Bệnh viện TWQĐ 108 đã hƣớng dẫn tôi thực hiện các xét nghiệm sinh học

phân tử.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô trong hội đồng chấm luận án đã

đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thành luận án.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và ngƣời thân đã

luôn ủng hộ, động viên tôi trong cuộc sống cũng nhƣ trong suốt quá trình

hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng 04 năm 2021

Học viên

Nguyễn Khuyến

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự hƣớng

dẫn khoa học của tập thể nhóm nghiên cứu và cán bộ hƣớng dẫn. Các số liệu,

kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và đƣợc công bố một phần

trong các bài báo khoa học. Luận án chƣa từng đƣợc công bố. Nếu có điều gì

sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Hà Nội, ngày tháng 4 năm 2021

Tác giả luận án

Nguyễn Khuyến

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3

1.1. NHIỄM VI RÚT VIÊM GAN B VÀ TIẾN TRIỂN LÂM SÀNG ........ 3

1.1.1. Tình hình nhiễm vi rút viêm gan B trên thế giới và Việt Nam ....... 3

1.1.2. Quá trình tiến triển bệnh ở ngƣời nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính ... 5

1.2. TỔNG QUAN VỀ VITAMIN D ........................................................... 7

1.2.1. Bản chất hóa học và chuyển hóa của vitamin D ............................. 7

1.2.2. Vai trò của vitamin D trong hệ miễn dịch của cơ thể ................... 11

1.3. SỰ THIẾU HỤT VITAMIN D ............................................................ 13

1.3.1. Dịch tễ học về tình trạng thiếu vitamin D ..................................... 13

1.3.2. Thiếu hụt vitamin D ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính ............... 15

1.3.3. Mối liên quan giữa thiếu hụt vitamin D và xơ gan ....................... 16

1.3.4. Mối liên quan giữa thiếu hụt vitamin D và ung thƣ biểu mô tế bào gan .. 17

1.4. ĐA HÌNH GEN VDR VÀ BỆNH LÝ GAN DO NHIỄM VI RÚT

VIÊM GAN B MẠN TÍNH ................................................................ 18

1.4.1. Các biến thể đa hình của VDR ...................................................... 18

1.4.2. Tính đa hình gen VDR trong viêm gan mạn do nhiễm vi rút

viêm gan B .................................................................................... 21

1.4.3. Đa hình gen VDR và xơ hóa gan ................................................... 23

1.4.4. Đa hình gen VDR và ung thƣ gan ................................................. 24

1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐA HÌNH GEN ............. 26

1.5.1. Định nghĩa đa hình đơn nucleotide .................................................. 26

1.5.2. Phƣơng pháp điện di ..................................................................... 27

1.5.3. Phƣơng pháp realtime PCR ........................................................... 31

1.5.4. Phƣơng pháp giải trình tự Sanger ................................................. 31

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 33

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................. 33

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................... 33

2.1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán các nhóm bệnh nhân nhiễm vi rút viêm gan

B mạn tính ...................................................................................... 33

2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ ........................................................................ 36

2.1.4. Cỡ mẫu nghiên cứu ....................................................................... 36

2.1.5. Phân loại mức độ xơ gan và ung thƣ gan ...................................... 37

2.1.6. Mẫu bệnh phẩm nghiên cứu .......................................................... 38

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 39

2.2.1. Thiết kế và sơ đồ nghiên cứu ........................................................ 39

2.2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................... 40

2.3. PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU .................................................... 51

2.4. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ..................................... 52

2.5. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU ................................................................. 52

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 53

3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA CÁC ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ...... 53

3.1.1. Đặc điểm lâm sàng ........................................................................ 53

3.1.2. Đặc điểm phân bố về tuổi của các nhóm nghiên cứu ................... 53

3.1.3. Phân bố giới tính của các nhóm nghiên cứu ................................. 53

3.1.4. Đặc điểm cận lâm sàng ở nhóm bệnh nhân viêm gan B ............... 54

3.2. PHÂN BỐ KIỂU GEN VÀ ALEN CỦA CÁC BIẾN THỂ VDR

APAI, FOKI, TAQI VÀ BSMI Ở CÁC NHÓM NGHIÊN CỨU ........ 54

3.2.1. Đa hình VDR ApaI ........................................................................ 55

3.2.2. Đa hình VDR FokI ......................................................................... 66

3.2.3. Đa hình VDR BsmI ........................................................................ 68

3.2.4. Đa hình VDR TaqI ......................................................................... 71

3.3. PHÂN BỐ HAPLOTYPE Ở CÁC NHÓM NGHIÊN CỨU ............... 73

3.3.1. Phân bố haplotype (FokI/BsmI/ApaI/TaqI) ở các nhóm nghiên cứu .... 73

3.3.2. Mối liên quan giữa các haplotype và các chỉ số cận lâm sàng ..... 77

3.4. ĐẶC ĐIỂM VỀ NỒNG ĐỘ VITAMIN D Ở CÁC NHÓM

NGHIÊN CỨU ........................................................................... 77

3.4.1. Thiếu hụt vitamin D ở nhóm khỏe mạnh và nhóm bệnh nhân ..... 77

3.4.2. Thiếu hụt vitamin D ở nhóm bệnh nhân viêm gan B mạn tính, xơ

gan và ung thƣ biểu mô tế bào gan .................................................. 78

3.4.3. Phân bố nồng độ vitamin D theo kiểu gen của các biến thể VDR 82

3.4.4. Mối liên quan giữa biến thể VDR và nồng độ vitamin D với các

thông số cận lâm sàng. .................................................................. 84

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN .............................................................................. 86

4.1. ĐA HÌNH GEN VDR TRONG BỆNH LÝ VIÊM GẠN MẠN

TÍNH DO VI RÚT VIÊM GAN B ..................................................... 88

4.1.1. Mối liên quan giữa tính đa hình gen VDR đối với nguy cơ

nhiễm vi rút viêm gan B và biểu hiện lâm sàng ........................... 88

4.1.2. Mối liên quan giữa tính đa hình gen VDR và mức độ nặng của

bệnh lý gan mạn tính ..................................................................... 96

4.2. MỐI LIÊN QUAN GIỮA CÁC HAPLOTYPE CỦA VDR VÀ

VIÊM GAN B MẠN TÍNH ................................................................ 97

4.3. THIẾU HỤT VITAMIN D VÀ TIẾN TRIỂN BỆNH Ở NGƢỜI

NHIỄM VI RÚT VIÊM GAN B MẠN TÍNH.................................. 100

KẾT LUẬN ................................................................................................... 109

KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 111

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ............................................................................. 112

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Các từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

Alpha-fetoprotein AFP

Alanin Amino Transferase ALT

ARMS

Amplification refractory mutation system Hệ thống khuyếch đại đột biến

AST Aspartate Amino Transferase

BCLC Barcelona Clinic Liver Cancer

CI Confidence Interval Khoảng tin cậy

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxynucelside triphosphate

ECOG Eastern Cooperative Oncology

Group

HBsAg Hepatitis B surface Antigen

Kháng nguyên bề mặt vi rút viêm gan B

HIV/AIDS

Human Immunodeficiency virus/Acquired

Hội chứng nhiễm vi rút làm suy giảm miễn dịch ở ngƣời Immuno Deficiency syndrome

IFN Interferon

IL Interleukin

NAFLD

Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Bệnh gan nhiêm mỡ không do rƣợu

NASH Non-Alcoholic SteatoHepatitis Viêm gan nhiễm mỡ không

do rƣợu

NKM Ngƣời khỏe mạnh

OR Odd Ratio Tỷ suất chênh

Các từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

Polymerase chain reaction PCR

RFLP

Restriction Fregment Length Polymorphism

Xác định đa hình chiều dài đoạn bằng enzyme cắt giới hạn

Ribonucleic Acid RNA

Tenofovir Disoproxil Fumarate TDF

Toll Like Receptor 2 TLR2

Toll Like Receptor 4 TLR4

Ultraviolet B Tia cực tím B UVB

UTBMTBG Ung thƣ biểu mô tế bào gan

VDR Vitamin D Receptor Thụ thể vitamin D

Vi rút viêm gan B VRVGB

Viêm gan B mạn tính VGBMT

Vi rút viêm gan C VRVGC

Viêm gan C mạn tính VGCMT

World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới WHO

Xơ gan XG

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

1.1. Phân bố kiểu alen của bốn biến thể theo khu vực địa lý ....................... 19

1.2. Phân tích tổng hợp của Uitterlinden và cộng sự ................................... 21

2.1. Đánh giá chức năng gan theo Child - Pugh .......................................... 37

2.2. Phân chia giai đoạn ung thƣ gan theo phân loại Barcelona .................. 37

2.3. Trình tự các mồi đặc hiệu thực hiện tetra primer ARMS-PCR ............ 49

2.4. Trình tự các mồi đƣợc sử dụng trong kỹ thuật giải trình tự gen ........... 50

3.1. Phân bố về tuổi ở các nhóm nghiên cứu ............................................... 53

3.1. Phân bố giới tính ở các nhóm nghiên cứu ............................................ 53

3.2. Đặc điểm cận lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan B ................................. 54

3.3. Phân bố kiểu gen biến thể VDR ApaI giữa các nhóm nghiên cứu ............ 56

3.4. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ nhiễm vi rút viêm gan B .................... 57

3.5. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ viêm gan B mạn tính ......................... 58

3.6. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ xơ gan ................................................ 59

3.7. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ xơ gan ................................................ 60

3.8. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ ung thƣ biểu mô tế bào gan ................... 61

3.9. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ ung thƣ biểu mô tế bào gan ............... 62

3.10. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ ung thƣ biểu mô tế bào gan ................... 63

3.11. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ ung thƣ biểu mô tế bào gan ............... 64

3.12. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ tiến triển bệnh gan .............................. 65

3.13. Phân bố kiểu gen của biến thể VDR FokI ở các nhóm đối tƣợng

nghiên cứu ............................................................................................. 67

3.14. Phân bố kiểu gen của biến thể VDR BsmI ở các nhóm đối tƣợng

nghiên cứu ............................................................................................. 70

3.15. Phân bố kiểu gen của biến thể VDR TaqI ở các nhóm đối tƣợng

nghiên cứu ............................................................................................. 72

Bảng Tên bảng Trang

3.16. Phân bố haplotype ở nhóm ngƣời khỏe mạnh và nhóm bệnh nhân

nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính ........................................................ 73

3.17. Phân bố các haplotype điển hình ở các nhóm bệnh nhân ..................... 74

3.18. Phân bố các haplotype điển hình ở nhóm bệnh nhân UTBMTBG và

nhóm không UTBMTBG ...................................................................... 75

3.19. Phân bố các haplotype điển hình ở nhóm bệnh nhân VGBMT và

UTBMTBG+XG ................................................................................... 76

3.20. Thiếu hụt vitamin D ở nhóm khỏe mạnh và nhóm bệnh nhân ............. 77

3.21. Phân bố thiếu hụt vitamin D theo nhóm bệnh ...................................... 78

3.22. Phân loại mức độ thiếu hụt vitamin D ở nhóm chứng và nhóm bệnh. ...... 80

3.23. Mức độ thiếu hụt vitamin D theo các nhóm bệnh ................................. 81

3.24. Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D theo giới tính ở nhóm ngƣời khỏe mạnh ..... 81

3.25. Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D theo giới tính ở ngƣời nhiễm vi rút viêm

gan B ..................................................................................................... 82

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình Tên hình Trang

1.1. Tình hình dịch tễ nhiễm VRVGB trên thế giới ...................................... 4

1.2. Phân bố số ca mắc viêm gan B theo quốc gia ......................................... 4

1.3. Tỉ lệ mắc mới (A) và tử vong (B) của UTBMTBG trong tổng số các

bệnh ung thƣ trên thế giới. ...................................................................... 6

1.4. Tỉ lệ mắc mới ung thƣ gan ở Việt Nam .................................................. 7

1.5. Sơ đồ tóm tắt quá trình chuyển hóa vitamin D trong cơ thể. .................. 9

1.6. Tóm tắt cơ chế chứng minh vai trò của vitamin D trong đáp ứng

miễn dịch của cơ thể ............................................................................. 11

1.7. Phân bố tình trạng thiếu hụt vitamin D trên thế giới ............................ 14

1.8. Minh họa cấu trúc của VDR và vị trí các các biến thể. ........................ 19

1.9. Nguyên lý phƣơng pháp Tetra-primer ARMS PCR. ............................ 30

2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ..................................................................... 39

2.2. Máy PCR thƣờng thực hiện kĩ thuật Tetra-primer ARMS ................... 44

2.3. Máy giải trình tự gen ABI 3130 XL 16 kênh màu................................ 45

2.4. Hệ thống máy chạy Elisa ...................................................................... 45

3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đại diện xác định kiểu gen ApaI ............ 55

3.2. Giải trình tự đại diện xác định kiểu gen của biến thể ApaI .................. 56

3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đại diện xác định kiểu gen FokI ............ 66

3.4. Giải trình tự đại diện xác định kiểu gen của biến thể FokI ................... 66

3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đại diện xác định kiểu gen BsmI ...... 68

3.6. Giải trình tự đại diện xác định kiểu gen của biến thể VDR BsmI ........ 69

3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đại diện xác định kiểu gen TaqI ....... 71

3.8. Giải trình tự đại diện các kiểu gen của biến thể TaqI ........................... 71

3.9. So sánh đặc điểm sinh hóa giữa các haplotype phổ biến ...................... 77

Hình Tên hình Trang

3.10. So sánh nồng độ vitamin D giữa nhóm bệnh nhân và nhóm NKM........... 78

3.11. Phân bố nồng độ vitamin D giữa có nhóm bệnh nhân nhiễm

VRVGB mạn tính.................................................................................. 79

3.12. Nồng độ vitamin D nhóm viêm gan B mạn và nhóm UTBMTBG+XG ...... 79

3.13. Nồng độ vitamin D ở nhóm bệnh UTBMTBG và không UTBMTBG 80

3.14. Phân bố nồng độ vitamin D theo kiểu gen của biến thể ApaI .............. 82

3.15. Phân bố nồng độ vitamin D theo kiểu gen của biến thể FokI ............... 83

3.16. Phân bố nồng độ vitamin D theo kiểu gen của biến thể BsmI .............. 83

3.17. Phân bố nồng độ vitamin D theo kiểu gen của biến thể TaqI ............... 84

3.18. Mối tƣơng quan giữa kiểu gen ApaI với các chỉ số cận lâm sàng ............. 84

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một trong những nƣớc có tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan B

(VRVGB) cao trên thế giới với tỷ lệ HBsAg dƣơng tính dao động từ 10-20%

trong cộng đồng [1]. Diễn biến tự nhiên và hậu quả lâm sàng của nhiễm

VRVGB rất đa dạng có thể là ngƣời mang vi rút không triệu chứng, viêm gan

B mạn tính (VGBMT), xơ gan (XG) và ung thƣ biểu mô tế bào gan

(UTBMTBG). Yếu tố và nguyên nhân nào dẫn đến những diễn biến và hậu

quả lâm sàng khác nhau đó cho đến nay vẫn còn nhiều tranh luận. Bằng

chứng cho thấy VRVGB là vi rút không gây tổn thƣơng trực tiếp tế bào gan,

tổn thƣơng gan là do hậu quả của quá trình đáp ứng miễn dịch của cơ thể

chống lại vi rút.

Vitamin D đƣợc xem là một hormone steroid có vai trò quan trọng trong

việc điều hòa chuyển hóa canxi và phosphate cần thiết cho quá trình chuyển

hóa xƣơng và nhiều chức năng sinh học khác trong đó có chức năng miễn

dịch. Chức năng của vitamin D đƣợc thực hiện thông qua sự liên kết với thụ

thể vitamin D (vitamin D receptor, VDR). VDR là một thụ thể, khi đƣợc kích

hoạt thông qua các trình tự đặc hiệu nằm ở các vùng gen khởi động sẽ điều

hòa sự biểu hiện phiên mã của các gen đích. Sự biểu hiện của VDR trên nhiều

tế bào miễn dịch và nhiều mô cơ quan khác nhau trong cơ thể, do đó thông

qua VDR mà Vitamin D có thể liên quan đến các con đƣờng tín hiệu sinh học,

đáp ứng miễn dịch trong nhiều bệnh lý bao gồm ung thƣ, rối loạn chuyển hóa

và bệnh truyền nhiễm [2].

Trong số các biến thể của gen mã hoá VDR (VDR), ngƣời ta thấy bốn biến

thể: FokI (rs2228570C>T), BsmI (rs1544410T>C), ApaI (rs7975232G>T) và

TaqI (rs731236T>C) là có liên quan nhiều đến cơ chế bệnh sinh của một số

bệnh lý mạn tính, ung thƣ, truyền nhiễm [3], [4]. Tuy nhiên, trong bệnh lý

2

nhiễm VRVGB thì kết quả nghiên cứu vẫn còn chƣa thống nhất [5], [6], [7],

[8], [9]. Thêm vào đó, các nghiên cứu cho thấy thiếu hụt vitamin D là rất phổ

biến ở bệnh nhân viêm gan do các nguyên nhân khác nhau [10], [11]. Tuy

nhiên, cơ chế sinh lý bệnh liên quan giữa vitamin D với viêm gan vẫn chƣa

đƣợc làm sáng tỏ [12], [13], [14], [15], [16].

Ở Việt Nam chƣa có nghiên cứu nào tìm hiểu mối liên quan giữa các

biến thể FokI, BsmI, ApaI và TaqI của VDR cũng nhƣ ảnh hƣởng của thiếu

hụt vitamin D huyết thanh đối với bệnh lý viêm gan do nhiễm VRVGB. Do

đó, chúng tôi nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu tính đa hình gen mã hóa thụ

thể vitamin D ở một số thể bệnh lâm sàng do nhiễm vi rút viêm gan B” với

hai mục tiêu sau:

1. Xác định mối liên quan của một số biến thể (FokI, BsmI, ApaI và

TaqI) gen mã hóa thụ thể vitamin D với tình trạng viêm gan mạn, xơ gan

và ung thư gan do nhiễm VRVGB.

2. Khảo sát nồng độ vitamin D huyết thanh ở bệnh nhân viêm gan

mạn, xơ gan và ung thư gan do nhiễm VRVGB.

3

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. NHIỄM VI RÚT VIÊM GAN B VÀ TIẾN TRIỂN LÂM SÀNG

1.1.1. Tình hình nhiễm vi rút viêm gan B trên thế giới và Việt Nam

Trên thế giới

Theo ƣớc tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) có khoảng hai tỷ ngƣời

đã phơi nhiễm với VRVGB, trong đó ƣớc tính có khoảng 257 triệu ngƣời

nhiễm VRVGB mạn tính (khoảng 3,5% dân số toàn cầu) và có đến 780 nghìn

ngƣời tử vong hàng năm do các biến chứng của nó [17]. Mặc dù tỷ lệ nhiễm

VRVGB đã đƣợc kiểm soát thông qua chƣơng trình tiêm chủng vaccine mở

rộng, tuy nhiên gánh nặng bệnh tật do nhiễm VRVGB mạn tính vẫn còn là

một thách thức rất lớn [17]. Cho tới nay, VGBMT vẫn là một trong những

bệnh truyền nhiễm xuất hiện phổ biến nhất trên thế giới, đặc biệt là ở

những nƣớc đang phát triển.

Tỷ lệ ngƣời nhiễm VRVGB mạn tính thay đổi theo khu vực địa lý và có

thể khác nhau ngay trong cùng một quốc gia. Nhƣ tại Ấn độ tỷ lệ ngƣời nhiễm

VRVGB giao động từ 5% đến 75% tùy theo khu vực. Tƣơng tự nhƣ vậy

Brazil và Tây Ban Nha cũng có sự khác biệt về tỷ lệ HBsAg (+) giữa các khu

vực [18].

4

* Nguồn: theo WHO (2017) [17].

Hình 1.1. Tình hình dịch tễ nhiễmvi rút viêm gan B trên thế giới

* Nguồn: theo Razavi-Shearer D. và cs (2018) [19].

Hình 1.2. Phân bố số ca mắc viêm gan B theo quốc gia

5

Tại Việt Nam

Việt Nam nằm trong khu vực nhiễm VRVGB cao, thống kê của WHO

năm 2017 cho thấy có khoảng hơn 7.000.000 ngƣời nhiễm VRVGB mạn tính,

tƣơng đƣơng với 8% dân số. Cũng theo WHO, hàng năm có khoảng 0,5% số

ca tử vong liên quan đến nhiễm VRVGB.

Tỷ lệ ngƣời mang HBsAg ở Việt Nam phân bố khác nhau phụ thuộc vào

từng tỉnh thành. Ngoài ra, sự khác nhau giữa các tiêu chí lựa chọn nhƣ chọn

đối tƣợng nghiên cứu, độ tuổi, giới tính hay khác nhau về trình độ kĩ thuật

phát hiện bệnh ở các thời kì dẫn đến các kết quả dịch tễ học khác nhau. Theo

điều tra của Trịnh Thị Ngọc [20], tỷ lệ HBsAg (+) trong nhóm bệnh nhân

viêm gan là 82,5%. Nhƣ vậy, có thể thấy ở Việt Nam, nhiễm VRVGB là căn

nguyên chính dẫn đến viêm gan.

Theo các mô hình dự đoán của WHO, tỷ lệ VGBMT sẽ giảm từ 8,4%

năm 2015 còn khoảng 6,3% năm 2030, tƣơng đƣơng với giảm gần 2 triệu

ngƣời mắc bệnh. Tuy nhiên, các ƣớc tính cũng chỉ ra rằng tỉ lệ bệnh nhân ung

thƣ gan trên nền nhiễm VRVGB tăng tuyến tính từ 21.900 năm 1990 lên

58.650 trong năm 2025, đồng thời tỉ lệ tử vong của các bệnh lý liên quan đến

VRVGB tăng từ 12.600 năm 1990 lên 40.000 trong năm 2025 [21].

1.1.2. Quá trình tiến triển bệnh ở ngƣời nhiễm vi rút viêm gan B mạn

tính

Nhiễm VRVGB có thể dẫn đến các biểu hiện lâm sàng khác nhau bao

gồm viêm gan cấp, VGBMT, XG và UTBMTBG. Nguy cơ tiến triển XG và

UTBMTBG từ VGBMT tích lũy theo thời gian. Khoảng 10% đến 20% bệnh

nhân VGBMT có nguy cơ phát triển thành XG trong vòng 5 năm [22] và hầu

hết các trƣờng hợp UTBMTBG (70%-80%) xảy ra ở bệnh nhân XG do nhiễm

VRVGB [23]. Mặt khác, XG cũng là nguyên nhân ngày càng gia tăng gánh

nặng bệnh tật và tử vong với ƣớc tính khoảng 1,03 triệu ca tử vong mỗi năm

trên toàn thế giới [24]. Khoảng 53% các trƣờng hợp UTBMTBG trên toàn

6

thế giới là hậu quả lâm sàng của nhiễm VRVGB [25]. UTBMTBG là một

trong những bệnh lý ác tính đứng thứ 6 về tỉ lệ mắc phải và đứng thứ 2 về tỉ

lệ tử vong trên thế giới. Theo Globan 2018, mỗi năm có hơn 800.000 ca

đƣợc chẩn đoán UTBMTBG, trong đó nam giới chiếm 2/3, ngoài ra có hơn

700.000 ngƣời chết vì căn bệnh ác tính này (Hình 1.3). Thời gian sống thêm

5 năm của UTBMTBG giảm từ 60% ở giai đoạn khởi phát xuống dƣới 10%

ở giai đoạn cuối.

Theo một thông báo gần đây, tỷ lệ phát sinh UTBMTBG tại Việt Nam

cao thứ 3 trên thế giới trong số gần 200 quốc gia trong thống kê này và chỉ

đứng sau Mongolia và Lào. Tính trên cả hai giới, UTBMTBG đã vƣợt qua

ung thƣ phổi và chiếm tỷ lệ cao nhất trong tổng số các bệnh ung thƣ tại Việt

Nam với hơn 25 nghìn trƣờng hợp mới mắc năm 2018. Tính riêng nam giới

thì số ca mới mắc UTBMTBG năm 2018 là gần 20 nghìn trƣờng hợp (Hình

1.4). Tỉ lệ tử vong của căn bệnh này cũng đứng hàng thứ nhất chiếm 23,56%

tổng số ca tử vong do ung thƣ.

Hình 1.3. Tỉ lệ mắc mới (A) và tử vong (B) của ung thƣ biểu mô tế bào

* Nguồn: theo Bray, F và cs (2018) [26].

gan trong tổng số các bệnh ung thƣ trên thế giới

7

* Nguồn: theo Bray, F và cs (2018) [26]

Hình 1.4. Tỉ lệ mắc mới ung thƣ gan ở Việt Nam

1.2. TỔNG QUAN VỀ VITAMIN D

1.2.1. Bản chất hóa học và chuyển hóa của vitamin D

1.2.1.1. Bản chất hóa học và nguồn cung cấp vitamin D

Vitamin D là một nhóm các secosteroid tan đƣợc trong chất béo, có chức

năng làm tăng cƣờng khả năng hấp thu canxi và phosphat ở đƣờng ruột.

Trong tự nhiên, vitamin D gồm 2 loại là Cholecalciferol (vitamin D3) - dẫn

suất 27 nguyên tử carbon của cholesterol và Ergocalciferol (vitamin D2) - dẫn

suất 28 nguyên tử carbon của sterol ergosterol thực vật. Trong đó, dạng

8

vitamin D3 chiếm 90% và chủ yếu đƣợc sản xuất khi da tiếp xúc trực tiếp với

ánh nắng mặt trời (vì thế nó còn đƣợc gọi là "vitamin ánh nắng") [27]. Quá

trình tổng hợp vitamin D3 này xảy ra dƣới tác động của tia cực tím trong ánh

nắng mặt trời với bƣớc sóng 290 - 315 nm. Khác với vitamin D3, lƣợng

vitamin D2 hấp thụ không phụ thuộc vào ánh sáng mặt trời mà nguồn cung

cấp thứ yếu vitamin D là từ thức ăn. Vitamin D2 không đƣợc tổng hợp trong

cơ thể mà một lƣợng nhỏ vitamin D2 (Ergocalciferol) trong cơ thể đƣợc thu

nhận từ thực vật. Nhƣ vậy, nồng độ vitamin D trong cơ thể phụ thuộc rất lớn

vào mùa, lối sống, đặc điểm màu da - chủng tộc, yếu tố di truyền.

Việc tổng hợp vitamin D khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, cùng với

việc hấp thụ từ chế độ ăn uống đều giúp duy trì nồng độ thích hợp của vitamin

này trong huyết thanh. Vitamin D theo nghĩa hẹp thì nó không phải là một

vitamin thiết yếu trong chế độ ăn, bởi vì hầu hết động vật có vú đều có thể tự

tổng hợp đủ cho cơ thể khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời. Một chất chỉ đƣợc

phân loại là vitamin thiết yếu khi nó không thể đƣợc cơ thể tổng hợp đủ, mà

phải nạp vào thông qua việc ăn uống.

1.2.1.2. Chuyển hóa của vitamin D trong cơ thể

Cả hai dạng vitamin D3 và vitamin D2 (viết chung là vitamin D) đều là

dạng không có hoạt tính. Để trở thành các chất có hoạt tính sinh học, chúng

cần trải qua quá trình biến đổi tuần tự thành chất trung gian (calcidiol,

25(OH)D) rồi trở thành chất có hoạt tính sinh học (calcitriol, 1,25(OH)2D)

thông qua phản ứng hydroxyl hóa xảy ra ở gan và thận. Tại gan, quá trình

hydrocyl hóa (hydroxylation) đƣợc thực hiện bởi 2 enzymes: CYP2R1 và

CYP27A1. Cholecalciferol (vitamin D3) đƣợc chuyển hóa thành calcidiol, còn

đƣợc gọi là calcifediol, 25-hydroxycholecalciferol, hoặc 25-hydroxyVitamin

D3 [25(OH)D3]. Trong khi đó, Ergocalciferol (vitamin D2) đƣợc chuyển hóa

thành 25-hydroxyErgocalciferol, còn đƣợc gọi là 25-hydroxy-vitamin D2

9

[25(OH)D2]. Đây là hai chất chuyển hóa đặc trƣng của vitamin D đƣợc đo

nồng độ trong huyết thanh để xác định tình trạng vitamin D của một ngƣời.

Quá trình hydroxylation này xảy ra tại gan tạo thành một cơ chất trung gian là

calcidiol, 25-(OH)D. Calcidiol sau đó đƣợc chuyển thành dạng hoạt tính

calcitriol ở thận và nó có tính chất nhƣ một hormone trong máu [28] và giải

phóng vào hệ thống tuần hoàn dƣới tác dụng xúc tác của enzyme 1-α-

hydroxylase (CYP27B1) (Hình 1.5). Nồng độ calcitriol đƣợc điều hòa chặt

chẽ trong vòng phản hồi âm tính ở thận, bao gồm sự ức chế CYP27B1 bởi

nồng độ cao của calcitriol và yếu tố tăng trƣởng nguyên bào sợi 23 (FGF-23)

và kích thích enzyme CYP24A1 (24-hydroxylase) chuyển hóa calcitriol thành

dạng không hoạt động, hòa tan trong nƣớc, sau đó đƣợc bài tiết qua mật.

* Nguồn: theo Keane, J.T. và cs (2018) [29].

Hình 1.5. Sơ đồ tóm tắt quá trình chuyển hóa vitamin D trong cơ thể

10

Tổng hợp vitamin D nội sinh xảy ra chủ yếu thông qua tiếp xúc với ánh

sáng mặt trời tạo ra tiền vitamin D3. Nó đƣợc hydroxyl hóa ở gan và sau đó ở

thận, tạo ra 1,25D (1,25 dihyroxy vitamin D), dạng vitamin D sinh lý hoạt

động ở các vị trí đích trong xƣơng và tế bào miễn dịch, cũng nhƣ tế bào gan.

Chú thích: CYP = cytochrom P450, UVB = tia cực tím B, hν = biểu thị phản

ứng quang hóa.

1.2.1.3. Vai trò sinh lý của vitamin D

Vitamin D lần đầu tiên đƣợc phát hiện vào thế kỉ 20 với chức năng là

3-) trong máu. Khi nồng độ Ca2+, PO4

một tiền hormone. Vitamin D tham gia duy trì ổn định nồng độ ion canxi 3- trong máu (Ca2+) và phosphat (PO4

giảm, sản xuất 1,25(OH)2D ở thận tăng lên thông qua các cơ chế khác nhau. 3- trong máu hoạt hóa 1α-hydroxylase ở thận và giảm nồng Giảm nồng độ PO4 độ Ca2+ máu kích thích bài tiết hormone cận giáp trạng [30] - hormone gây

hoạt hóa 1α-hydroxylase ở thận. Hoạt hóa 1α-hydroxylase dẫn đến tăng sản 3- từ ruột vào xuất 1,25(OH)2D, hormone này làm tăng hấp thụ Ca2+ và PO4 máu, tăng tái hấp thụ Ca2+ ở thận. Dƣới tác động của PTH và 1,25(OH)2D tế

bào tạo xƣơng (osteoblast) đƣợc hoạt hóa và gây chuyển tế bào tiền hủy

xƣơng (preosteoclast) thành tế bào hủy xƣơng trƣởng thành (osteoclast). Tế 3- vào bào hủy xƣơng trƣởng thành gây tiêu xƣơng và giải phóng Ca2+ và PO4

máu. Kết quả của các quá trình trên dẫn đến tăng nồng độ hai ion này trong

máu. Ngƣợc lại, khi nồng độ hai ion này trong máu tăng, sản xuất

1,25(OH)2D ở thận giảm và các quá trình làm tăng 2 ion này trong máu ở trên

giảm đi. Calcitriol, dạng chuyển hóa có hoạt tính của vitamin D, lƣu hành

trong tuần hoàn nhƣ một hormone giúp điều chỉnh nồng độ canxi và

phosphate trong máu và thúc đẩy sự phát triển khỏe mạnh và tái tạo của

xƣơng. Ngoài ra, Calcitriol cũng ảnh hƣởng đến chức năng thần kinh-cơ và hệ

miễn dịch của cơ thể.

11

1.2.2. Vai trò của vitamin D trong hệ miễn dịch của cơ thể

Ngoài vai trò quan trọng đối với điều hòa chuyển hóa canxi và

phosphate rất cần thiết cho quá trình chuyển hóa xƣơng, vai trò của vitamin D

đối với hệ miễn dịch cơ thể đã đƣợc đề cập đến lần đầu tiên cách đây hơn 30

năm khi phát hiện ra VDR. Khả năng thực hiện chức năng của vitamin D

trong cơ thể đƣợc điều khiển thông qua sự biểu hiện của VDR, bao gồm các

phản ứng điều hòa miễn dịch, phát triển tế bào và biệt hóa tế bào. VDR thuộc

họ thụ thể nhân nội bào và đóng vai trò là một yếu tố điều khiển sự phiên mã

của các gen. Ngoài ra, các nghiên cứu chỉ ra VDR đƣợc biểu hiện trên hơn 35

loại mô tế bào khác nhau, kể cả trên các đại thực bào và các tế bào B và tế

bào T [31], [32], [33]. Vì vậy, vitamin D và VDR đƣợc xem là các yếu tố

quan trọng liên quan đến các cơ chế sinh lý bệnh trong một số bệnh truyền

nhiễm, ung thƣ và các rối loạn chuyển hóa… [14], [34], [35].

Hình 1.6. Tóm tắt cơ chế chứng minh vai trò của vitamin D trong đáp

* Nguồn: theo Baeke, F. và cs (2010) [33].

ứng miễn dịch của cơ thể

12

Các nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng quan trọng của vitamin D trong hệ

miễn dịch bẩm sinh cũng nhƣ trong hệ miễn dịch thu nhận. Một dẫn chứng

cho việc này là vitamin D có khả năng điều hòa biểu hiện của các gen thuộc tế

bào miễn dịch bẩm sinh nhƣ gen CAMP với khả năng tạo ra chất kháng khuẩn

Cathelicidin tiêu diệt vi khuẩn lao hay tụ cầu vàng.

Vitamin D tác động tới những thành phần khác nhau của miễn dịch bẩm

sinh và miễn dịch thu nhận. Nó kích thích phản ứng miễn dịch bẩm sinh

thông qua việc tăng cƣờng các phản ứng hóa học và thực bào của đại thực

bào cũng nhƣ sản xuất các protein kháng khuẩn nhƣ cathelicidin. Đối với

miễn dịch thu đƣợc, vitamin D ức chế biểu hiện bề mặt của kháng nguyên

phức hợp MNKM-II và các phân tử đồng kích thích, ngoài việc sản xuất các

cytokine IL-12 và IL-23, do đó gián tiếp chuyển sự phân cực của các tế bào

T từ kiểu hình Th1 và Th17 sang kiểu hình Th2. Ngoài ra, vitamin D tác

động trực tiếp đến phản ứng của tế bào T, bằng cách ức chế sản xuất các

cytokine Th1 (IL-2 và IFN-g), cytokine Th17 (IL-17 và IL-21) và kích thích

sản xuất cytokine Th2 (IL-4).

Ở bệnh nhân VGBMT, vitamin D có khả năng ức chế phản ứng viêm và

quá trình xơ hóa gan. Điều này đã đƣợc chứng minh qua các quan sát trên mô

hình thực nghiệm ở những con chuột đã bị loại bỏ thụ thể cảm thể VDR, làm

ảnh hƣởng đến chức năng của vitamin D [36], [37]. Sự tƣơng tác giữa vitamin

D và thụ thể của nó VDR có thể điều chỉnh phản ứng miễn dịch liên quan đến

sinh bệnh học của nhiều loại ung thƣ [38]. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy mối

liên quan giữa nồng độ vitamin D huyết thanh và UTBMTBG [39], [40], [41],

[42]. Vitamin D có thể ức chế sự phát triển của các dòng tế bào UTBMTBG

trong các nghiên cứu in vitro và in vivo [43].

13

1.3. SỰ THIẾU HỤT VITAMIN D

1.3.1. Dịch tễ học về tình trạng thiếu vitamin D

Nồng độ vitamin D có mối tƣơng quan với hormone cận giáp. Nồng độ

vitamin D thấp dẫn đến kích thích sản xuất hormone này. Tuy nhiên, nồng độ

vitamin D tăng lên không phải lúc nào cũng làm cho nồng độ hormone cận

giáp giảm. Nếu nồng độ của vitamin D nằm trong khoảng 30 ng/ml, nồng độ

hormone cận giáp trong huyết thanh sẽ đƣợc duy trì ổn định ở mức thấp [44],

[45]. Do đó, ngƣời ta lấy mức nồng độ vitamin D huyết thanh ≥30 ng/mL là

nồng độ bình thƣờng trong huyết thanh. Dựa trên các nghiên cứu về nồng độ

vitamin D trong cộng đồng, sự thiếu hụt vitamin D đƣợc phân loại nhƣ sau:

thiếu hụt rất nặng (<10 ng/ml), thiếu hụt nặng (<20 ng/ml), thiếu hụt nhẹ-vừa

(20–30 ng/ml), đủ (>30ng/ml) [28].

Ở những nƣớc phát triển, sự thiếu hụt vitamin D xuất hiện rất phổ biến

với gần một nửa dân số bị ảnh hƣởng [28]. Hơn nữa, theo đánh giá toàn cầu

về tình trạng thiếu vitamin D ở những phụ nữ tiền mãn kinh và bị loãng

xƣơng cho thấy rằng 24% phụ nữ có lƣợng vitamin D thiếu hụt nghiêm trọng

(<10ng/ml), trong đó vùng trung tâm và miền Bắc của châu Âu là hai khu vực

có tỉ lệ thiếu hụt cao nhất [46]. Tình trạng tƣơng tự đã đƣợc báo cáo trong một

nghiên cứu cắt ngang đƣợc thực hiện tại 61 vùng khác nhau tại Mỹ, với tổng

số 1536 những ngƣời phụ nữ tiền mãn kinh thì 52% có nồng độ vitamin D

<30 ng/ ml và 18% có nồng độ vitamin D <20 ng/ ml [44].

14

* Nguồn: theo Hossein-nezhad, A. và cs (2013) [47].

Hình 1.7. Phân bố tình trạng thiếu hụt vitamin D trên thế giới

Sự thiếu hụt vitamin D không chỉ phổ biến trên các thành phố nằm ở

miền Tây hay miền Bắc mà còn xuất hiện nhiều ở châu Phi và châu Á [48],

[49], [50], [51]. Tại châu Á, nồng độ vitamin D trong huyết thanh đƣợc khảo

sát trên hai nghiên cứu lớn thực hiện theo chƣơng trình quốc gia bao gồm:

Trung Quốc (3262 ca) [50], Hàn Quốc (6925 ca) [48] . Với ngƣỡng thiếu

hụt đƣợc xác định là <20ng/ ml, các nghiên cứu trên chỉ ra Trung Quốc là

khu vực có tỉ lệ thiếu hụt cao nhất với 69%, tiếp theo đó là Hàn Quốc (nam

giới là 47% và nữ giới là 65%) [48]. Tại Việt Nam, những nghiên cứu gần

đây với cỡ mẫu nhỏ chỉ ra sự thiếu hụt vitamin D dao động trong khoảng từ

16 đến 63% [49], [52].

Sự thiếu hụt vitamin D ở châu Phi đƣợc giải thích bởi yếu tố sắc tố da,

trang phục truyền thống thƣờng bao kín ngƣời, ngoài ra còn bị ảnh hƣởng

bởi các bệnh truyền nhiễm phổ biến (lao, HIV/AIDS, sốt rét) [53], [54],

15

[55], [56]. Trong kết quả phân tích trên đối tƣợng ngƣời lớn (8415 ca) đƣợc

tiến hành ở ngƣời Mỹ da màu đã chỉ ra rằng sự thiếu vitamin D trong tổng

số ngƣời Mỹ gốc Phi có tỉ lệ rất cao là 81%, nhƣng tỉ lệ này chỉ chiếm 28%

ở những ngƣời Mỹ gốc châu Âu [57]. Các báo cáo đó đã nói lên rằng sắc tố

da là yếu tố rất quan trọng trong việc làm giảm khả năng sinh tổng hợp

vitamin D.

1.3.2. Thiếu hụt vitamin D ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính

Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D > 90% đã đƣợc báo cáo trong rất nhiều nghiên

cứu ở các bệnh nhân có bệnh lý gan mạn tính do các nguyên nhân khác nhau

[13], [58], [59], [60]. Thiếu hụt vitamin D đƣợc cho là có thể ảnh hƣởng xấu

đến chức năng gan và thúc đẩy quá trình tiến triển bệnh lý viêm gan đến xơ

gan [61]. Thiếu hụt vitamin D có thể tác động đến hiệu quả điều trị liệu pháp

kháng vi rút, làm giảm đáp ứng vi rút trong điều trị bằng IFN ở bệnh nhân

viêm gan do VRVGB và VRVGC [13], [14], [62], [63].

Vitamin D có mối liên quan chặt chẽ đến mức độ hoạt động của

VRVGB. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng nồng độ vitamin D thấp có

thể dẫn đến sự thất bại trong việc kiểm soát nhân lên của VRVGB [49], [64],

[65], [66]. Ngoài ra, các nghiên cứu cũng cho thấy nồng độ vitamin D có mối

tƣơng quan thuận với nồng độ albumin và số lƣợng tiểu cầu, tƣơng quan

nghịch với nồng độ ALT ở bệnh nhân viêm gan mạn tính [13], [35], [59].

Nồng độ vitamin D<10 ng/ml là yếu tố tiên lƣợng đánh giá mức độ nghiêm

trọng của các bệnh gan mạn tính [15], [67].

Yu R. và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tìm hiểu sự liên quan giữa

nồng độ vitamin D và sự đáp ứng vi rút duy trì ở các ngƣời bệnh nhiễm

VRVGB mạn tính đƣợc điều trị bởi liệu pháp kháng vi rút (nucleot(s)ide hay

NUCs) hoặc liệu pháp kết hợp IFNα và NUCs [68]. Tỷ lệ đáp ứng vi rút duy

trì (SVR) ở tuần thứ 104 là 67% ở nhóm vitamin D <30ng/mL và 82% ở

nhóm vitamin D > 30ng/mL, p<0,001). Tuy nhiên, kết quả của Chan H.L. và

16

cộng sự đƣa ra lại không thống nhất với nghiên cứu trên. Tác giả đã chỉ ra

ngƣỡng giá trị cơ bản của vitamin D không liên quan đến kết quả điều trị ở

những bệnh nhân sử dụng thuốc tenofovir disoproxil fumarate (TDF) kết hợp

với Peg-IFNα hoặc điều trị riêng bằng TDF hoặc Peg-IFNα [13].

1.3.3. Mối liên quan giữa thiếu hụt vitamin D và xơ gan

Để chứng minh vitamin D có vai trò ức chế quá trình viêm và xơ hóa gan

ngƣời ta đã thí nghiệm bất hoạt hoàn toàn (knockout) gen VDR của chuột và

quan sát thấy chuột sẽ tự phát triển thành XG [36], [37]. Nghiên cứu cũng cho

thấy vitamin D có tác dụng làm giảm sự biểu hiện các yếu tố sinh collagen và

chức năng của TGFB1 và SERPINE1 [69]. Hơn nữa, vitamin D ức chế trực

tiếp sự tăng sinh và chức năng của các tế bào stellate gan và làm giảm xơ hóa

gan trong mô hình động vật [37]. Một số bằng chứng ủng hộ có sự liên quan

tuyến tính nghịch giữa nồng độ vitamin D với bệnh XG do viêm gan siêu vi

mạn tính [49], [61]. Cụ thể hơn, mức độ biểu hiện cao của các thụ thể Toll-

like ở gan (TLR2 và TLR4) có thể dẫn đến tăng cƣờng sản xuất yếu tố hoại tử

khối u alpha (TNFa) trong VGCMT [69]. Cytokine này đƣợc biết đến có vai

trò trong sự phát triển xơ hóa gan. Các nghiên cứu in-vivo gần đây đã ghi

nhận về việc giảm sản xuất TNFa bởi các tế bào đơn nhân, đại thực bào và

các tế bào đuôi gai của tủy đƣợc điều trị bằng vitamin D [70], [71]. Một

nghiên cứu khác cho thấy rằng vitamin D có mối tƣơng quan tuyến tính

nghịch với mức độ biểu hiện TLR2 và TLR4 [72].

Mặc dù, tỷ lệ thiếu hụt vitamin D trong các bệnh gan mạn tính và XG đã

đƣợc ghi nhận một cách rõ ràng, nhƣng mối liên hệ gây bệnh của nó với xơ

hóa gan tiến triển vẫn còn gây tranh cãi. Có bằng chứng về mối liên hệ đáng

kể của nồng độ vitamin D với mức độ rối loạn chức năng gan. Các nghiên cứu

cũng chỉ ra rằng có mối tƣơng quan nghịch của nồng độ vitamin D với chỉ số

Child-Pugh và MELD (Model for End-Stage Liver Disease). Ngoài ra, thiếu

vitamin D đã đƣợc chứng minh là làm tăng nguy cơ tử vong nói chung và

nhiễm trùng ở bệnh nhân XG. Mối liên quan giữa vitamin D và XG cho thấy

17

một tiềm năng ứng dụng lâm sàng rất lớn. Mối liên quan giữa thiếu hụt

vitamin D và chức năng gan, mức độ xơ hóa và các biến chứng nhiễm trùng

có thể gợi ý việc sử dụng nó nhƣ một chỉ số tiên lƣợng và một công cụ hỗ trợ

chẩn đoán trên thực hành lâm sàng.

1.3.4. Mối liên quan giữa thiếu hụt vitamin D và ung thƣ biểu mô tế bào gan

Đã có nhiều nghiên cứu phân tích ảnh hƣởng của khu vực địa lý đối với

khả năng mắc các bệnh ung thƣ. Trong đó, tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong của các

bệnh ung thƣ thƣờng xuất hiện cao hơn ở khu vực phía Bắc, nơi có ánh sáng

mặt trời bị hạn chế do vị trí địa lý [73], [74]. Các nghiên cứu dịch tễ học đã

chỉ ra rằng sự thiếu hụt vitamin D có thể làm tăng nguy cơ ung thƣ đại tràng,

ung thƣ vú và ung thƣ buồng trứng [75], [76], [77], [78]. Tuy nhiên, cho đến

nay chƣa có nhiều nghiên cứu tìm hiểu mối liên quan giữa nồng độ vitamin D

trong huyết thanh với tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong của UTBMTBG trên nền bệnh

nhân VGBMT.

Trong một nghiên cứu cắt ngang gần đây tại Việt Nam, một lƣợng lớn

trƣờng hợp thiếu vitamin D đƣợc ghi nhận ở bệnh nhân UTBMTBG trên nền

nhiễm VRVGB [49]. Các thể đa hình đơn nucleotit khác nhau ở các gen liên

quan đến các con đƣờng truyền tín hiệu vitamin D [họ cytochrome P450 2

phân nhóm R (CYP2R1) và 7-dehydrocholesterol reductase (DNKMR7)] đã

đƣợc nghiên cứu. Kết quả đã cho thấy các đa hình này có mối liên quan đến

sự thiếu hụt vitamin D ở các bệnh nhân UTBMTBG do nhiễm VRVGC [39].

Tiếp đó, một nghiên cứu tiến cứu với cỡ mẫu lớn đã đánh giá mối tƣơng

quan giữa nồng độ vitamin D và khả năng mắc UTBMTBG trong số 520.000

ngƣời tại 10 thành phố ở châu Âu [79]. Ở nghiên cứu này đã phát hiện ra 204

trƣờng hợp phát triển thành UTBMTBG trong vòng 10 năm theo dõi, với

nguyên nhân chủ yếu là do nhiễm VRVGC và VRVGB. Trong đó, các tác giả

nhận thấy nồng độ vitamin D huyết thanh có tỉ lệ nghịch với nguy cơ phát

sinh UTBMTBG. Nghiên cứu này có kết quả tƣơng đồng với một nghiên cứu

18

tiến cứu khác trên 200 bệnh nhân UTBMTBG phát triển trên nền bệnh nhân

nhiễm VRVGC và VRVGB. Nghiên cứu cho thấy nồng độ vitamin D trong

máu ở các bệnh nhân UTBMTBG thƣờng ở mức thấp; ngoài ra những bệnh

nhân có nồng độ vitamin D càng thấp thì tiên lƣợng bệnh xấu hơn trong đáp

ứng với các phƣơng pháp điều trị ung thƣ gan [80]. Tỷ lệ sống sót của bệnh

nhân UTBMTBG với nồng độ vitamin D trong huyết thanh <10ng/ml thấp

hơn đáng kể so với bệnh nhân có nồng độ >10 ng/ml. Từ các minh chứng trên

có thể nhận thấy sự thiếu hụt vitamin D có mối liên quan đối với sự tiến triển

cũng nhƣ là một yếu tố tiên lƣợng xấu đối với UTBMTBG.

1.4. ĐA HÌNH GEN VDR VÀ BỆNH LÝ GAN DO NHIỄM VI RÚT

VIÊM GAN B MẠN TÍNH

Hoạt tính sinh học của vitamin D đƣợc điều hòa thông qua sự tƣơng tác

với VDR. Trong quá trình này, vitamin D nhƣ một phối tử (ligand) tƣơng tác

với VDR và kích hoạt VDR liên kết với vùng điều hòa của gen mục tiêu. Tiếp

đó là quá trình hình thành các phức hợp protein có vai trò quan trọng trong

quá trình phiên mã các gen đích. Việc kích hoạt các mạng lƣới gen mục tiêu

sẽ hình thành nên các đáp ứng sinh học đặc hiệu. Các đáp ứng này đóng vai

trò điều khiển các quá trình chuyển hóa khoáng chất cũng nhƣ kiểm soát quá

trình phát triển và phân chia của các tế bào. Trong cơ thể, thụ thể VDR không

chỉ đƣơc biểu hiện trên các tế bào T, tế bào B, các đại thực bào mà còn trên

hơn 30 dòng tế bào khác nhau [32], [33].

1.4.1. Các biến thể đa hình của VDR

Cấu trúc gen của VDR lần đầu đƣợc mô tả vào năm 1997 bởi Miyamoto

K. và các cộng sự, nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 12 (12q12–14), có

kích thƣớc hơn 100 kb. Các nghiên cứu đã khám phá ra hơn 200 vị trí đa hình

của gen mã hóa VDR (VDR). Tuy nhiên có 4 điểm đa hình đƣợc nghiên cứu

nhiều hơn bao gồm: FokI C>T (F/f) trên exon II, BsmI T>C (B/b) và ApaI

G>T (A/a) trên intron VIII nằm giữa exon VII và IX, TaqI T>C (T/t) trên

19

exon IX [4]. Các đa hình này đã đƣợc nghiên cứu trên nhiều nhóm bệnh lý

nhƣ: tiểu đƣờng, rối loạn chuyển hóa các chất, nhiễm khuẩn, ung thƣ… Tên

các điểm đa hình FokI, BsmI, ApaI và TaqI đƣợc đặt dựa vào tên các enzyme

cắt giới hạn tại các vị trí SNP này trên VDR.

* Nguồn: theo Uitterlinden, A.G.và cs (2004) [4].

Hình 1.8. Minh họa cấu trúc của VDR và vị trí các các biến thể

Tuy nhiên, các số liệu thu đƣợc không thống nhất và khác nhau giữa

các khu vực nghiên cứu. Nghiên cứu phân tích dữ liệu lớn vào năm 2004 của

Uitterlinden A.G. và cộng sự đã cho thấy sự phân bố khác nhau về các thể đa

hình này [4].

Bảng 1.1. Phân bố kiểu alen của bốn biến thể theo khu vực địa lý

% Kiểu alen Các thể đa hình của VDR Da trắng Châu Á Châu Phi

f 34 51 24 FokI

B 42 7 36 BsmI

A 44 74 31 ApaI

T 8 31 TaqI

43 * Nguồn: theo Uitterlinden, A.G. và cs (2004) [4].

1.4.1.1. FokI

Đa hình FokI gồm 2 dạng alen đƣợc kí hiệu là F và f, trong đó F tƣợng

trƣng cho alen C, f biểu diễn cho alen T. Với việc biến đổi từ thể f sang F, vị

20

trí bắt đầu dịch mã sẽ bị thay đổi. Dạng f sẽ tạo thêm vị trí ATG mới trƣớc 3

codon so với vị trí bắt đầu dịch mã của VDR, từ đó sẽ bổ sung thêm 3 acid

amin trong chuỗi protein so với dạng F (trình tự là ACG) [81]. Điều đáng chú

ý là FokI có thể là một dấu ấn sinh học độc lập, không có mối liên kết với các

thể đa hình khác của VDR. Đã có nhiều công bố với các kết quả khác nhau về

ảnh hƣởng của đa hình FokI với chức năng của VDR. Trong một nghiên cứu

bởi Arai H. và cộng sự năm 1997 đánh giá khả năng hoạt động của FokI trên

dòng tế bào Hela, thể F có hoạt tính cao hơn gấp 1,7 lần so với biến thể dài f

[82]. Tuy nhiên, kết quả của Gross C. và cộng sự phân tích lại cho kết quả

khác biệt với nghiên cứu trên. Họ đã phân tích sự khác biệt alen FokI đối với

đặc điểm kích hoạt phiên mã của VDR trên dòng tế bào COS-7. Các kết quả

khảo sát cho thấy không có sự khác biệt về khả năng gắn các phối tử vitamin

D, liên kết với các chuỗi DNA và khả năng điều hòa phiên mã của VDR ở thể

F và f là không khác biệt [81]. Tuy nhiên, sau đó nhiều tác giả cũng có kết

quả tƣơng tự với Arai H. và cs khi chỉ ra rằng thể F tức chuỗi acid amin ngắn

tác động đến quá trình phiên mã mạnh mẽ hơn các chuỗi acid amin dài thể f,

từ đó tăng mức độ biểu hiện của VDR [4].

1.4.1.2. Biến thể VDR BmsI – ApaI – TaqI

Ba điểm đa hình BmsI, ApaI và TaqI đều nằm gần đoạn 3’UTR, là vùng

quan trọng trong việc biểu hiện gen cũng nhƣ quy định đến sự ổn định của

mRNA. Khi mRNA của VDR càng ổn định, khả năng biểu hiện của VDR ở

các tế bào đích cũng nhƣ tƣơng tác của tế bào với vitamin D càng tăng. Vì ba

đa hình này nằm khá gần nhau cùng với vị trí ở đầu 3’ nhƣ vậy, các nghiên

cứu thƣờng khảo sát cùng một lúc các đa hình này cùng với các kiểu gen đơn

bội (haplotype) của nó. Nghiên cứu dữ liệu lớn về hai haplotype baT và BAt

của Uitterlinden và cộng sự đã cho thấy đối với mỗi dòng tế bào khác nhau thì

ảnh hƣởng của các haplotype này sẽ khác nhau [4].

21

Bảng 1.2. Phân tích tổng hợp của Uitterlinden và cộng sự

Tác giả Đối tƣợng nghiên cứu Biểu hiện VDR Các yếu tố đánh giá Độ ổn định mRNA VDR Tăng tốc độ biểu hiện gen

BAt>baT Morrison và cs., 1994

baT>BAt Crofts và cs., 1996 Không khác biệt

BAt>baT BAt>baT Carling và cs., 1997

Colin và cs., 2000 Không khác biệt

Không khác biệt Không khác biệt

Whitfield và cs., 2001 baT>BAt baT>BAt

Tế bào Vero Cos7 Nguyên bào sợi, bạch cầu ngƣời U tuyến cận giáp Tế bào đơn nhân trong máu ngoại vi Tế bào Vero Cos7 Nguyên bào xƣơng * Nguồn: theo Uitterlinden, A.G. và cs (2004) [4].

Có thể thấy rằng mặc dù sự ảnh hƣởng của các đa hình FokI, BmsI, ApaI

và TaqI đối với cấu trúc và chức năng của VDR có kết quả không ổn định trên

các mô hình nghiên cứu khác nhau, các thể đa hình này ít nhiều làm thay đổi

chức năng của VDR, dẫn đến các bất thƣờng trong hệ miễn dịch. Vì vậy, đã có

nhiều nghiên cứu lớn về ảnh hƣởng của các biến thể của VDR trên các bệnh lý

ung thƣ nhƣ ung thƣ vú, ung thƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ gan; các bệnh truyền

nhiễm, trong đó có cả bệnh viêm gan do VRVGB.

1.4.2. Tính đa hình gen VDR trong viêm gan mạn do nhiễm vi rút viêm

gan B

Nhóm tác giả từ Trung Quốc thực hiện nghiên cứu trên 212 bệnh nhân

viêm gan tự miễn, 244 trƣờng hợp không có dấu hiệu có kháng thể HBsAg,

391 ca viêm gan B mạn [5]. Kết quả cho thấy tần suất xuất hiện alen C của đa

hình FokI trên nhóm VGBMT chiếm 45,8%, cao hơn có ý nghĩa so với hai

nhóm còn lại (P = 0,01). Hơn nữa, tần suất của kiểu gen FokI TT, TC và CC ở

22

ngƣời nhiễm VRVGB mạn tính (tƣơng ứng là 30,7%, 47,1% và 22,2%) cũng

khác biệt có ý nghĩa so với nhóm đã khỏi (41,0%, 41,5% và 17,5%, P=0,03).

Tác giả cũng chỉ ra rằng kiểu gen CC và TC tăng nguy cơ trở thành viêm gan

mạn tính gấp 1,57 lần khi bệnh nhân nhiễm VRVGB (OR=1,57, P=0,01).

Ngoài ra, có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về haloptype TC và TT của

TaqI/FokI giữa nhóm VGBMT và các nhóm còn lại [5]. Kết quả phân tích

trên tƣơng tự trên nhóm bệnh nhân ngƣời Hán ở Trung Quốc với 184 ca

VGBMT cùng với 205 NKM không bị nhiễm VRVGB. Kiểu gen FF của FokI

thƣờng xuất hiện trên nhóm bệnh nhân nhiễm VRVGB so với nhóm ngƣời

không nhiễm (OR=1,95, P<0,05).

Một nghiên cứu khác tìm hiểu ảnh hƣởng của các đa hình ApaI và TaqI

đối với việc lây truyền VRVGB từ mẹ sang con. Nhóm đối tƣợng nghiên cứu

bao gồm 102 trẻ em có độ tuổi trung bình 9,17, trong đó có 33 trẻ VGBMT,

36 trẻ âm tính với HBsAg và 33 trẻ mắc nhiễm VRVGB mạn tính không triệu

chứng. Kết quả cho thấy alen a của biến thể ApaI cùng với haplotype aT -

ApaI/TaqI xuất hiện nhiều hơn ở nhóm trẻ em không nhiễm VRVGB so với

nhóm tiến triển thành VGBMT [6]. Từ nghiên cứu này có thể thấy khả năng

cảm nhiễm của VRVGB và khả năng tiến triển lên VGBMT ở trẻ có mẹ bị

nhiễm VRVGB mạn tính cũng phụ thuộc vào các đa hình VDR. Ngoài ra cũng

có thể hiểu rằng các biến thể này có ý nghĩa trong việc kháng lại VRVGB từ

các giai đoạn rất sớm.

VGBMT tiềm ẩn là một thể lâm sàng phổ biến với các đặc điểm sau:

HBsAg âm tính, anti-HBc dƣơng tính hoặc âm tính, HBV DNA mức thấp có

thể phát hiện (thƣờng <200 IU/mL) hoặc có thể không đƣợc phát hiện trong

huyết thanh tuy nhiên VRVGB vẫn tồn tại trong tế bào gan. Nhiễm VRVGB

tiềm ẩn có thể khiến bệnh nhân không phát hiện và điều trị kịp thời các tiến

triển của bệnh nhƣ XG, ung thƣ gan. Khảo sát trên nhóm ngƣời Iran nhiễm

VRVGB tiềm ẩn vào năm 2010 cho thấy có ý nghĩa thống kê sự khác biệt trên

23

đa hình TaqI kiểu gen T/T với 3,5% ở bệnh nhân so với 18% ở nhóm chứng

(P<0,05), kiểu gen T/t trên nhóm bệnh và nhóm chứng lần lƣợt là 43,8% và

35% (P<0,24). Ngoài ra, tác giả cũng chỉ ra kiểu gen t/t của đa hình TaqI và

các kiểu gen ở đa hình ApaI khác biệt giữa hai nhóm không có ý nghĩa thống

kê trong trƣờng hợp bệnh này (P>0.05) [5].

Trong kết quả phân tích tổng hợp 15 nghiên cứu về ảnh hƣởng tính đa

hình VDR đối với việc nhiễm VRVGB, với 4218 ca bệnh nhiễm VRVGB và

2298 ngƣời không nhiễm, kiểu gen FF, Ff và alen F của đa hình FokI tăng

nguy cơ nhiễm VRVGB mạn tính. Còn đối với các đa hình BmsI (3 bài báo),

ApaI (4 bài báo) và TaqI (9 bài báo) tác giả không quan sát thấy có mối tƣơng

quan nào đối với nhiễm VRVGB mạn tính [83].

1.4.3. Đa hình gen VDR và xơ hóa gan

Vitamin D đã đƣợc chứng minh là có thể có vai trò điều chỉnh quá trình

tạo sợi tại các mô đệm của gan nơi có tế bào hình sao (HSCs: hepatic stellate

cells) hiện diện. Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng hoạt động của VDR qua

trung gian vitamin D có thể liên quan đến việc ức chế sự hình thành quá trình

xơ hóa gan. Nghiên cứu gần đây của Ding N. và cộng sự. [84] phát hiện ra

rằng những con chuột bị loại VDR phát triển xơ hóa gan tự phát, chứng minh

rằng tín hiệu vitamin D / VDR điều chỉnh quá trình tạo sợi gan thông qua việc

ức chế kích hoạt HSCs. VDR hoạt động nhƣ một yếu tố phiên mã kích thích

phối tử và kích hoạt vitamin D ở cấp độ phiên mã. Sự kích hoạt VDR góp

phần điều hòa phản ứng miễn dịch bằng cách ức chế sự tăng sinh tế bào T

helper 1 (Th1) và sản xuất cytokine tiền viêm, đồng thời gây ra sự tăng sinh tế

bào Th2 và sản xuất các cytokine chống viêm. Sự hiện diện của các đa hình

VDR có thể dẫn đến một thụ thể bị rối loạn chức năng, ảnh hƣởng đến hoạt

động của VDR và các tác động qua trung gian vitamin D.

Nghiên cứu của Christos Triantos C. và cộng sự [85] nghiên cứu mối

liên quan giữa các đa hình của VDR gồm BsmI, ApaI, TaqI và FokI và mức độ

24

nặng của XG liên quan đến nồng độ cytokine huyết thanh. Các tác giả nhận

thấy rằng những bệnh nhân có kiểu gen BsmI BB có điểm MELD cao hơn và

phổ biến hơn ở các bệnh nhân XG child-pugh C; những bệnh nhân mang kiểu

gen ApaI AA có nồng độ các cytokine IL-1β và IL-8 tăng hơn và họ hầu hết ở

giai đoạn child-pugh C; Ngƣời mang kiểu gen TaqI TT có điểm MELD cao

hơn ở các bệnh nhân XG child-pugh C. Trong phân tích đa biến, tác giả cho

thấy các biến thể ApaI, BsmI và TaqI có liên quan độc lập với mức độ nặng

của XG. Trong phân tích tỷ lệ sống sót, các yếu tố tiên lƣợng độc lập là điểm

child-pugh, MELD và kiểu gen FokI FF. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng

các đa hình ApaI, TaqI và BsmI có liên quan đến mức độ nghiêm trọng của

XG, thông qua quá trình điều hòa miễn dịch [85]. Ngoài ra, Baur K. và cộng

sự đã nghiên cứu đa hình gen VDR và cho thấy kiểu gen ApaI CC làm tăng

nguy cơ tiến triển xơ hóa gan ở bệnh nhân bị VGCMT [86].

1.4.4. Đa hình gen VDR và ung thƣ gan

Nghiên cứu đã chứng minh VRVGB không gây tổn thƣơng trực tiếp tế

bào gan, tổn thƣơng gan và tiến triển lâm sàng ở ngƣời nhiễm VRVGB mạn

tính đƣợc xác định là do mối tƣơng tác giữa đáp ứng miễn dịch vật chủ và vi

rút [87]. Trong đó, yếu tố di truyền vật chủ có vai trò quan trọng đối với sự

tiến triển viêm gan mạn tính, bao gồm các biến thể di truyền của gen mã hoá

thụ thể vitamin D [7], [87]. VDR thuộc họ thụ thể nhân của các yếu tố phiên

mã. Thụ thể này biểu hiện trên nhiều loại tế bào khác nhau bao gồm các tế

bào miễn dịch (tế bào đơn nhân, đại thực bào, tế bào miễn dịch hình sao, tế

bào T và B) và hơn 30 loại nhu mô khác nhau nhau [32], [33]. Chức năng của

vitamin D thông qua thụ thể VDR liên quan đến nhiều quá trình sinh bệnh học

bao gồm sự tăng sinh, biệt hoá tế bào và vì vậy có liên quan đến quá trình

phát sinh ung thƣ bao gồm UTBMTBG.

Với mối liên quan giữa UTBMTBG và nhiễm VRVGB mạn tính và giữa

nhiễm VRVGB với đa hình gen VDR, chúng ta đặt ra câu hỏi liệu đa hình gen

25

VDR có ảnh hƣởng đến quá trình phát sinh UTBMTBG từ ngƣời nhiễm

VRVGB mạn tính hay không. Thực tế, các nghiên cứu về vai trò của VDR

mới chỉ tập trung trên ung thƣ vú, ung thƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ da, số lƣợng

nghiên cứu trên nhóm bệnh ung thƣ gan còn rất hạn chế [88]. Ngoài ra, các

công bố này phân tích trên các đa hình khác nhau, các khu vực địa lý khác

nhau nên các kết quả thƣờng không đƣợc thống nhất.

Yao X. và cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu với cỡ mẫu lớn chia

làm ba nhóm: 436 bệnh nhân UTBMTBG trên nền VGB, 532 ngƣời

VGBMT đơn thuần và 132 ca UTBMTBG không bị nhiễm VRVGB và/hoặc

VRVGC. Các bệnh nhân này đƣợc phân tích cả 4 thể đa hình của VDR, cùng

với đó là đánh giá các yếu tố lâm sàng khác, từ đó sử dụng các mô hình hồi

quy để đánh giá tác động của đa hình VDR. Trong nghiên cứu này, duy nhất

có đa hình FokI là có ý nghĩa trong phân biệt nhóm UTBMTBG và

VGBMT. Kiểu gen TT thƣờng xuất hiện ở bệnh nhân UTBMTBG (30,05%)

so với nhóm chứng (19,17%, P<0,001). Cùng với đó, tỷ lệ xuất hiện alen T

cũng cao hơn có ý nghĩa trên nhóm UTBMTBG (P<0,001) [8]. Ngoài ra,

không có mối liên quan có ý nghĩa nào đƣợc tìm thấy giữa các đa hình VDR

khác (BmsI, ApaI, TaqI) đối với UTBMTBG ở bệnh nhân mang hoặc không

nhiễm VRVGB mạn tính [8].

Một nghiên cứu khác cũng tại Trung Quốc cũng chỉ ra kết quả tƣơng tự

với báo cáo trên. Bằng phƣơng pháp PCR-RFLP, 660 ngƣời bao gồm 184 ca

UTBMTBG – VGB, 296 ca chỉ nhiễm VRVGB và 180 NKM đƣợc khảo sát

tính đa hình của gen VDR. Một lần nữa chỉ có đa hình FokI là có ý nghĩa khi

so sánh các yếu tố giữa nhóm UTBMTBG và các nhóm còn lại. Kết quả hồi

quy nhị nguyên cho thấy kiểu gen TT và TC làm tăng nguy cơ UTBMTBG so

với kiểu CC (OR =2,15, 95%CI=1,13–4,08, P =0,032 đối với kiểu TT,

OR =1,82, 95%CI=1,04–3,27, P= 0,039 khi kết hợp TT và TC) [89]. Ở kiểu

gen TT, khả năng tăng tốc độ biểu hiện gen của VDR bị giảm, từ đó có thể

26

ảnh hƣởng đến khả năng hoạt động của các tế bào miễn dịch, tích lũy dần dần

các bất thƣờng này sẽ dẫn đến ung thƣ.

Từ các kết quả trên thể hiện rằng tại Trung Quốc đa hình FokI của gen

VDR là một dấu ấn sinh học rất có tiềm năng trong theo dõi các trƣờng hợp

nhiễm VRVGB nói chung và trong chẩn đoán UTBMTBG nói riêng. Chƣa

từng có nghiên cứu nào tại Việt Nam đánh giá các ảnh hƣởng của các đa hình

gen VDR đối với bệnh lý viêm gan và UTBMTBG. Vì vậy, đề tài này sẽ tập

trung vào phân tích về sự ảnh hƣởng của các thể đa hình VDR phổ biến đối

với tiến triển bệnh lý gan tại Việt Nam.

1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐA HÌNH GEN

1.5.1. Định nghĩa đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism)

Đa hình đơn nucleotide là loại biến thể di truyền trong bộ gen chỉ khác

biệt 1 nucleotide. Sự khác biệt này xảy ra ở một phần nhỏ đủ lớn của dân số

thì xếp vào các SNP. Ví dụ, tại một vị trí cụ thể trong bộ gen ngƣời,

nucleotide C có thể xuất hiện ở hầu hết các cá thể, nhƣng ở một số cá thể

khác, vị trí đó lại do một nucleotide A chiếm giữ. Điều này có nghĩa là có một

SNP ở vị trí cụ thể này, và hai biến thể nucleotide có thể có C hoặc A đƣợc

cho là các alen cho vị trí cụ thể này. Trung bình chúng xuất hiện gần nhƣ một

lần trong mỗi 1.000 nucleotide, có nghĩa là có khoảng 4 đến 5 triệu SNP trong

bộ gen của một ngƣời. Những biến thể này có thể là duy nhất hoặc xảy ra ở

nhiều cá nhân; các nhà khoa học đã tìm thấy hơn 100 triệu SNP trong các

quần thể trên khắp thế giới. Thông thƣờng, những biến thể này đƣợc tìm thấy

trong DNA giữa các gen. Chúng có thể hoạt động nhƣ các dấu hiệu sinh học,

giúp các nhà khoa học xác định vị trí các gen có liên quan đến bệnh tật. Khi

SNPs xảy ra trong một gen hoặc trong vùng điều hòa gần gen, chúng có thể

đóng một vai trò trực tiếp hơn đối với bệnh tật bằng cách ảnh hƣởng đến chức

năng của gen.

27

Hầu hết SNP không ảnh hƣởng đến sức khỏe hoặc sự phát triển. Tuy

nhiên, một số khác biệt về gen này đã đƣợc chứng minh là rất quan trọng

trong việc nghiên cứu sức khỏe con ngƣời. Các nhà nghiên cứu đã phát hiện

ra SNP có thể giúp dự đoán phản ứng của một cá nhân với một số loại thuốc,

tính nhạy cảm với các yếu tố môi trƣờng nhƣ chất độc và nguy cơ phát triển

các bệnh cụ thể. SNP cũng có thể đƣợc sử dụng để theo dõi sự di truyền của

các gen bệnh trong gia đình. Các nghiên cứu trong tƣơng lai sẽ làm việc để

xác định SNP có liên quan đến các bệnh phức tạp nhƣ bệnh tim, tiểu đƣờng

và ung thƣ. Sự khác biệt của SNP có liên quan đến một số các bệnh thiếu máu

hồng cầu lƣỡi liềm, β-thalassemia, xơ nang … Mức độ nghiêm trọng của bệnh

và cách cơ thể phản ứng lại các phƣơng pháp điều trị. Ví dụ, một biến thể đơn

trong gen APOE (apolipoprotein E) có liên quan đến nguy cơ mắc bệnh

Alzheimer thấp hơn.

Hiện nay, có nhiều phƣơng pháp dựa trên kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng để

xác định điểm đa hình gen: RFLP-PCR, ARMS-PCR, Tetra primer-ARMS-

PCR (cải tiến phƣơng pháp ARMS cổ điển), Real-time PCR, giải trình tự

gen…). Mỗi phƣơng pháp có ƣu nhƣợc điểm khác nhau trong phát hiện các

điểm đa hình. Do giới hạn của luận văn, trong phần tổng quan này tôi trình

bày một số phƣơng pháp phát hiện các SNP, RFLP-PCR, ARMS-PCR, Tetra

primer-ARMS-PCR, realtime PCR và giải trình tự gen. Trong đó, trong

nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 2 phƣơng pháp phát hiện là Tetra primer-

ARMS-PCR và phƣơng pháp giải trình tự gen Sanger.

1.5.2. Phƣơng pháp điện di

1.5.2.1. Phương pháp cắt enzyme giới hạn - Restericted Fragment Length

Polymorphism (RFLP) PCR

Kỹ thuật RFLP – PCR đƣợc sử dụng cho các SNP đã biết theo nguyên lý

đƣợc phát triển bởi Wolf. C và cộng sự [90]. Phƣơng pháp này bao gồm hai

bƣớc chính. Đầu tiên, DNA mục tiêu liên quan đến SNP đƣợc khuếch đại

28

bằng cách sử dụng PCR. Thứ hai, sản phẩm PCR đƣợc cắt bằng cách sử dụng

các enzyme giới hạn, tại đây các vị trí cắt của các enzyme cắt giới hạn là các

đa hình gen biết trƣớc. Nếu trình tự SNP có trình tự giống với trình tự cắt của

các enzyme giới hạn thì quá trình cắt đƣợc diễn ra. Thông thƣờng, thiết kế

phƣơng pháp RFLP-PCR dựa vào việc các đa hình đã biết, sau khi quá trình

PCR và ủ sản phẩm PCR ở nhiệt độ của enzyme cắt giới hạn, nếu có điểm đa

hình trùng khớp với điểm cắt của enzyme thì phản ứng cắt diễn ra, sau đó sản

phẩm này đƣợc điện di phân biệt ra 2 band (phản ứng cắt diễn ra tạo 2 phân

mảnh), trong trƣờng hợp có 3 band thì hiện tƣợng có thể xảy ra là dị hợp tử -

đa hình có cả 2 SNP, hoặc quá trình cắt chƣa hoàn toàn.

1.5.2.2. Phương pháp ARMS-PCR (Amplification refractory mutation

system – polymerase chain reaction)

Sau 4 năm PCR ra đời, năm 1989, Newton C. R. và cộng sự đã đƣa ra

phƣơng pháp ARMS-PCR (Amplification refractory mutation system –

polymerase chain reaction) hay còn gọi là PCR khuếch đại đặc hiệu alen đột

biến [91]. Amplification refractory mutation system – PCR (ARMS-PCR) là

một ứng dụng của PCR. ARMS dựa trên việc sử dụng mồi PCR cụ thể theo

trình tự cho phép khuếch đại DNA chỉ khi có chứa alen đích trong mẫu. Sau

phản ứng ARMS, sự hiện diện hoặc không có mặt của sản phẩm PCR là chẩn

đoán sự hiện diện hay không có mặt của alen đích. DNA đƣợc khuếch đại bởi

các mồi đặc hiệu của alen. Khi đó trong phản ứng PCR, primer có nucleitide

cuối ở đầu 3’ không bổ sung với trình tự đích, điều này làm giảm đáng kể khả

năng biến tính và khuếch đại, thậm chí sẽ ngăn chặn sự kéo dài chuỗi, làm

phản ứng PCR không thể xảy ra. Điều này xảy ra khi vắng mặt hoạt tính sửa

exonucease 3’-5’. Đối với một số loại Taq polymerase hiệu năng cao thì

không có khả năng này. Nhƣ vậy chỉ một số loại Taq polymerase có thể ứng

dụng cho phƣơng pháp ARMS – PCR. Đây là một phƣơng pháp cực kỳ hiệu

quả để xác định các đột biến điểm hoặc đa hình. Nó có khả năng xác định vị

29

trí thay đổi trên DNA là dị hợp tử hay đồng hợp tử. Một dị hợp tử hoặc đồng

hợp tử đƣợc phân biệt bằng cách sử dụng mồi ARMS đối với các alen đột

biến và các alen bình thƣờng (Kiểu dại). Để xác định một đột biến, cần thiết

kế 2 cặp mồi, một cặp mồi đặc hiệu với kiểu đột biến và một cặp mồi đặc hiệu

cho kiểu dại. Mồi phát hiện thể dại sẽ không gắn vào đoạn DNA có đột biến

và mồi đột biến sẽ không gắn vào đoạn DNA thể dại. Các phản ứng cho đột

biến và các alen bình thƣờng thƣờng đƣợc thực hiện trong các ống riêng biệt.

Ƣu điểm là phƣơng pháp đơn giản, chi phí thấp. Có thể phát hiện đƣợc nhiều

đột biến cùng một lúc. Nhƣng nhƣợc điểm chỉ chẩn đoán đƣợc các đột biến

điểm đã biết. Sự khác biệt chỉ là 1 nucleotide nên rất dễ xảy ra hiện tƣợng bắt

cặp nhầm. Các đoạn mồi suy biến có thể gắn vào các vị trí khác trong hệ gen

và tạo ra những sản phẩm không đặc hiệu.

Ngƣợc lại, phƣơng pháp giải trình tự DNA có thể coi là một phƣơng

pháp tin cậy chính xác nhất để phát hiện các đột biến, nhƣng nó cũng là

phƣơng pháp tốn kém nhất và đòi hỏi các trang thiết bị phức tạp. Do đó, kỹ

thuật này không thể áp dụng rộng rãi trong một số lƣợng lớn các cá thể.

1.5.2.3. Phương pháp Tetra-Primrer ARMS-PCR

Tetra-primer amplification refractory mutation system (Tetra-ARMS hay

T-ARMS) là một sự kết hợp của Tetra-ARMS và kỹ thuật ARMS thông

thƣờng. Đây là một phƣơng pháp đáp ứng đƣợc các tiêu chí đề ra (giá thành

thấp, không phức tạp, không đòi hỏi các thiết bị đắt tiền và đảm bảo độ chính

xác cao). Kỹ thuật này đƣợc thực hiện bởi 1 phản ứng PCR, phân tích bằng

điện di.

Sự khác biệt giữa công nghệ tetra-primer ARMS và ARMS là vị trí

mismatch thiết kế tại các primer. Nếu nhƣ ở phƣơng pháp tetra-primer thì các

vị trí mismatch nằm ở khoảng 4 nucleotide ở đầu 3’ của primer còn ở ARMS

thì vị trí sai khác này nằm ngay nucleotide đầu 3’ của primer. Một điểm khác

nữa là Tetra-primer đƣợc tối ƣu chỉ trong 1 phản ứng còn ARMS thì thực hiện

30

ở hai phản ứng (một phát hiện đột biến, một phát hiện thể dại). Đối với Tetra-

Primrer ARMS- PCR độ đặc hiệu của phản ứng không chỉ quyết định bởi các

mismatch ở vị trí đầu 3’ của primer, mà còn bổ sung vị trí mismatch ở vị trí -2

tính từ đầu 3’ của các primer đặc hiệu alen. Sự bắt cặp không bổ sung ở hai vị

trí này tạo nên sự mất ổn định của phản ứng PCR khác nhau. Theo tính toán

thì mức độ mạnh thuộc về các dạng G và A, C và T, T và T, mức độ trung

bình là A và A, G và C, C và C và mức độ yếu là C và A, G và T. Nhƣ vậy

khi thiết kế mồi cần xem xét loại kiểu gen mình đang quan tâm và lựa chọn

các kiểu mismatch sao cho khả năng khuếch đại sẽ cao hơn. Nhƣ vậy khi có

hai sự bắt cặp không bổ sung giữa mồi và DNA khuôn ở cả hai vị trí thì PCR

không diễn ra, nhƣng với 1 mismatch thì quá trình PCR vẫn diễn ra, điều này

làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng.

* Nguồn: theo Peng, B.Y.và cs (2018) [92].

Hình 1.9. Nguyên lý phƣơng pháp Tetra-primer ARMS PCR

Phƣơng pháp Tetra-Primrer ARMS- PCR sử dụng một cặp mồi ngoài:

mồi xuôi (forward outer) và mồi ngƣợc (reverse outer), khuếch đại đoạn DNA

vòng ngoài, có chứa SNP cần xác định và sản phẩm PCR khi điện di của cặp

31

mồi này đƣợc xem nhƣ một nội chuẩn nội tại để biết chất lƣợng tách DNA,

phản ứng PCR có diễn ra hay không. Một cặp mồi khác bên trong: FI

(forward inner) và RI (reverse inner), hai mồi đặc trƣng cho alen đột biến và

alen bình thƣờng, theo hƣớng ngƣợc nhau và kết hợp với mồi bên ngoài, đồng

thời khuếch đại cả alen đột biến và alen bình thƣờng.

1.5.3. Phƣơng pháp realtime PCR

1.5.3.1. Phương pháp ARMS – qPCR

Phƣơng pháp kết hợp cả ARMS và Realtime PCR đƣợc mô tả bởi Wang.

J và cộng sự [93]. Nếu nhƣ phần trên ARMS chúng ta phải điện di để phát

hiện sự có mặt của sản phẩm PCR, sự khác biệt có và không có các tín hiệu

band sau khi điện di gel agarose/polyacrylamide thì phƣơng pháp này chúng

ta có thể phát hiện thông qua các tín hiệu phát huỳnh quang SYBR Green.

1.5.3.2. Phương pháp sử dụng các đầu dò Realtime PCR (Taqman Probe)

Phƣơng pháp Realtime PCR có sử dụng các đầu dò huỳnh quang sử dụng

hoạt tính nuclease 5’ của Taq DNA polymerase để tạo ra tín hiệu huỳnh

quang [94]. Phƣơng pháp thiết kế 2 probe để có thể phát hiện 2 đa hình SNP,

mỗi probe đánh dấu mầu khác nhau tại vùng 5’ tƣơng ứng cho mỗi alen. Mỗi

đầu dò chứa một fluorophore, dập tắt chất cho khi đầu dò còn nguyên vẹn

(hoặc đƣợc lai ghép hoặc trong dung dịch). Tuy nhiên, khi đầu dò lai với mẫu

PCR, hoạt tính 5'exonuclease của Taq DNA polymerase sẽ cắt nó, do đó giải

phóng hai fluorophores. Kính lọc sẽ phát hiện mầu huỳnh quang tƣơng ứng

với mỗi đa hình

1.5.4. Phƣơng pháp giải trình tự Sanger

Giải trình tự Sanger đƣợc phát triển bởi nhà hóa sinh ngƣời anh Fred

Sanger và các đồng nghiệp vào năm 1977 [95]. Nguyên tắc của phƣơng pháp

dựa trên kỹ thuật “chain termination – kết thúc chuỗi bằng việc sử dụng các

deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân

tử đƣờng. Nhóm 3’-OH đóng vai trò cho phép gắn thêm một nucleotide mới

32

vào chuỗi. Khi một ddNTP đƣợc thêm vào chuỗi, vì không có nhóm 3’-OH

nên một nucleotide không đƣợc thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại.

Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn các dNTP vào mạch đơn của DNA

để kéo dài mạch ở vị trí 3’- OH và dừng lại nếu gắn các dNTP vào chuỗi.

Trong phản ứng PCR sequencing chứa cả dNTP hình thành các đoạn DNA có

độ dài khác nhau (khác nhau 1 nucleitide) do dNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng

phản ứng. Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA và các đoạn này sẽ

đƣợc gắn bởi thuốc nhuộm chỉ ra nucleotide cuối của chúng. Sau khi phản

ứng kết thúc, các phân đoạn DNA chạy qua một ống dài, mỏng chứa ma trận

gel trong một quá trình gọi là điện di gel mao quản (capillary gel

electrophoresis). Các mảnh ngắn di chuyển nhanh chóng qua các lỗ của gel,

trong khi các mảnh dài di chuyển chậm hơn. Khi các phân mảnh DNA đi qua,

nó đƣợc chiếu sáng bằng tia lase, cho phép phát hiện và đánh giá cƣờng độ

huỳnh quang. Trình tự đọc đoạn DNA theo chiều từ 5’ đến 3’. Kính lọc huỳnh

quang sẽ bắt các màu thuốc nhuộm và ghi lại hình ảnh sắc ký đồ. Trình tự

DNA đƣợc đọc dựa trên các sắc ký đồ. Hiện nay có rất nhiều các kỹ thuật giải

trình tự tiếp sau. Mặc dù kỹ thuật tốn kém và không hiệu quả đối với các dự

án quy mô lớn nhƣng phƣơng pháp giải trình tự Sanger có chất lƣợng cao đối

với các đoạn DNA < 700bp, phù hợp khi xác định trình tự DNA đã biết trƣớc,

trong các xét nghiệm phát hiện các đột biến và đa hình gen.

33

CHƢƠNG 2

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu

2.1.1.1. Bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính

Bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính đƣợc thu thập từ các chuyên khoa

lâm sàng tại Viện lâm sàng các bệnh truyền nhiễm (ICID), Khoa Tiêu hóa -

Bệnh viện Trung ƣơng Quân đội 108, Khoa Truyền nhiễm và Khoa tiêu hóa -

Bệnh viên Quân y 103 phù hợp với tiêu chẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ

đƣợc đƣa vào nghiên cứu. Bệnh nhân đƣợc phân loại thành ba nhóm khác

nhau dựa theo chẩn đoán lâm sàng bao gồm: (i) Nhóm VGBMT; (ii) Nhóm

XG; (iii) Nhóm UTBMTBG.

2.1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán các nhóm bệnh nhân nhiễm vi rút viêm gan B

mạn tính

2.1.1.1. Nhóm ung thư biểu mô tế bào gan

Tiêu chuẩn lựa chọn:

Bệnh nhân đƣợc lựa chọn khi có đủ các tiêu chuẩn sau:

+ Chẩn đoán xác định UTBMTBG dựa theo hƣớng dẫn của Bộ Y tế Việt Nam năm 2012 [96] khi có 1 trong 2 tiêu chuẩn sau:

i) Có bằng chứng giải phẫu bệnh là ung thƣ tế bào gan nguyên phát.

ii) Có hình ảnh điển hình trên CT ổ bụng (chụp cắt lớp gan 3 thì) hoặc

cộng hƣởng từ có tiêm thuốc cản quang.

Hình ảnh điển hình trên CT gan 3 thì:

- Thì chƣa cản quang: thƣờng có hình ảnh đồng hay giảm đậm độ. Nếu

khối u lớn, vùng trung tâm hoại tử có thể nhận biết đƣợc

- Thì động mạch: tổn thƣơng có dạng tăng quang, tƣơng ứng với sự

tƣới máu của động mạch gan. Khối u lớn có thể thấy đƣợc vùng hoại tử trung

34

tâm giảm đậm độ trong pha này. Cần phải tìm kiếm hình ảnh tăng sinh mạch

máu nếu nhƣ tổn thƣơng nhỏ, khó định vị.

- Thì tĩnh mạch: khối u nhỏ có hình ảnh đồng hay giảm đậm độ và rất

khó thấy, do phần gan bình thƣờng cũng đang trong giai đoạn thải thuốc. Nếu

khối u có hoại tử thì quan sát thấy giảm đậm độ.

+ Bệnh nhân có HBsAg (+).

Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân nhiễm HIV.

- Bệnh nhân nhiễm VRVGC.

- Bệnh nhân nghiện rƣợu.

- Bệnh nhiễm độc gan do thuốc, do hóa chất.

- Ung thƣ gan di căn từ các cơ quan khác.

- Không đồng ý tham gia nghiên cứu.

2.1.1.2. Nhóm xơ gan

Tiêu chuẩn lựa chọn

Những bệnh nhân đƣợc chẩn đoán xác định bởi các bác sĩ lâm sàng

chuyên khoa dựa trên triệu chứng lâm sàng và các dấu hiệu cận lâm sàng.

Chẩn đoán xác định đƣợc kết luận trong hồ sơ bệnh án. Các dấu hiệu lâm

sàng và cận lâm sàng thƣờng gặp ở các bệnh nhân XG.

+ Triệu chứng l m sàng

- Hội chứng suy tế bào gan: ngƣời bệnh cảm thấy mệt mỏi chán ăn, rối

loạn tiêu hóa. Sau đó có thể sút cân, phù chân, vàng da, sạm da, có thể xuất

huyết dƣới da, chảy máu cam, chảy máu chân răng.

- Hội chứng tăng áp lực tĩnh mạch cửa: cổ chƣớng ở các mức độ, lách

to từ độ 1 đến độ 4, tuần hoàn bàng hệ cửa-chủ. Giai đoạn mất bù có một

trong các tiệu chứng: cổ chƣớng tự do, xuất huyết tiêu hóa do giãn vỡ tĩnh

mạch thực quản và hội chứng não gan.

35

+ Triệu chứng cận l m sàng

- Siêu âm bụng: sẽ thấy bờ gan không đều. Gan to hoặc bị teo nhỏ,

phần thùy dƣới to, có dịch cổ trƣớng tự do. Tĩnh mạch cửa giãn rộng đƣờng

kính lớn hơn 1,2 cm. Lách to, cấu trúc siêu âm lách đồng nhất.

- Nội soi dạ dày: có thể cho kết quả giãn tĩnh mạch thực quản từ độ 1

đến độ 3, các mạch máu căng đỏ trên các búi tĩnh mạch giãn nguy cơ bị chảy

máu rất cao. Giãn tĩnh mạch tâm vị và phình vị thƣờng ít gặp, có thể có các

búi giãn tĩnh mạch ở các phần khác của dạ dày và tá tràng.

- Sinh hóa: protein máu giảm đặc biệt thành phần albumin máu giảm,

gamma globulin tăng, tỷ lệ A/G <1.

- Ứ mật: chỉ số bilirubin máu tăng cao cả liên hợp và bilirubin tự do,

phosphatase kiềm tăng. Nếu có rối loạn đông máu: thì prothrombin giảm.

- Công thức máu: có thể thiếu máu nếu có xuất huyết tiêu hóa, thiếu máu

nhƣợc sắc mức độ nặng. Thƣờng có giảm tiểu cầu tùy theo giai đoạn bệnh.

Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân nhiễm HIV.

- Bệnh nhân nhiễm VRVGC.

- Bệnh nhân nghiện rƣợu.

- XG do các nguyên nhân khác đã đƣợc xác định.

- Bệnh nhiễm độc gan do thuốc, do hóa chất.

- Không đồng ý tham gia nghiên cứu.

2.1.2.3. Nhóm viêm gan B mạn tính (VGBMT)

Tiêu chuẩn lựa chọn

Bệnh nhân đƣợc chẩn đoán xác định VGBMT dựa vào thông tƣ hƣớng

dẫn của Bộ Y tế năm 2014 (Quyết định số 5448/QĐ BYT) [97] và theo

khuyến cáo của hiệp hội gan mật châu Âu - EASL 2012 [98].

- HBsAg (+) >6 tháng hoặc HBsAg (+) và Anti HBc IgG (+)

- Enzyme AST, ALT tăng liên tục hoặc từng đợt

36

Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân nhiễm HIV

- Bệnh nhân nhiễm VRVGC

- Bệnh nhân nghiện rƣợu

- Viêm gan do các nguyên nhân khác đã đƣợc xác định

- Nhiễm độc gan do thuốc, do hóa chất

- Không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.1.2. Nhóm chứng

Nhóm chứng là nhóm ngƣời khỏe mạnh (NKM) đến khám kiểm tra sức

khoẻ tại Bệnh viện Trung ƣơng Quân đội 108 và đối tƣợng hiến máu tình

nguyện tại Bệnh viện Quân y 103 (có danh sách kèm theo). Ngƣời cho máu

không có bất kì triệu chứng lâm sàng hay tiền sử bị viêm gan do tất cả các

nguyên nhân khác, xét nghiệm HBsAg (-), anti VRVGC (-) và anti HIV (-).

2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ

 Nhiễm HIV, VRVGC.

 Nghiện rƣợu.

 Có bất kì các bệnh lý mạn tính.

 Không đồng ý tham gia nghiên cứu.

2.1.4. Cỡ mẫu nghiên cứu

Cỡ mẫu trong nghiên cứu này là cỡ mẫu thuận tiện. 298 bệnh nhân

nhiễm VRVGB mạn tính đƣợc phân loại theo chẩn đoán lâm sàng bao gồm:

104 bệnh nhân VGBMT, 89 bệnh nhân XG và 105 bệnh nhân UTBMTBG và

238 NKM thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn đã nêu ở trên đƣợc lựa chọn đƣa vào

nghiên cứu này.

37

2.1.5. Phân loại mức độ xơ gan và ung thƣ gan

2.1.5.1. Đánh giá mức độ xơ gan theo phân độ Child - Pugh

Bảng 2.1. Đánh giá chức năng gan theo Child - Pugh

Các chỉ số đánh giá 1 điểm 2 điểm 3 điểm

Hội chứng não gan Không Nhẹ Nặng

Cổ trƣớng Không Ít Vừa, nhiều

Bilirubin huyết thanh (µmol/L) < 34 34 - 51 > 51

Albumin huyết thanh (g/l) >35 28 - 35 <28

Tỷ lệ prothrombin (%) (hoặc) INR > 54 < 1,7 45 – 54 1,7-2,3 < 45 > 2,3

* Nguồn: theo Cholongitas E. và cộng sự [99]

Phân loại Child – Pugh A: 5-6 điểm; B: 7-9 điểm; C: 10 - 15 điểm

2.1.5.2. Phân loại giai đoạn ung thư gan

Bảng 2.2. Ph n chia giai đoạn ung thƣ gan theo ph n loại Barcelona

ECOG Hình thái u Okuda Chức năng gan

Giai đoạn BCLC Sớm A1 0 1 u < 5 cm I

A2 0 1 u < 5 cm I

A3 0 1 u < 5 cm I

A4 0 I-II ALTMC và Bilirubin bình thƣờng Tăng ALTMC; Bilirubin bình thƣờng ALTMC và Bilirubin máu tăng Child-pugh: A-B

B 0 I-II Child-pugh: A-B

Trung gian

C 1-2 I-II Child-pugh: A-B

Tiến triển Cuối D 3-4 III Child-pugh: C

* Nguồn: theo Llovet, J.M. và cộng sự [100]

3 u < 3 cm Nhiều khối lan tỏa Xâm lấn mạch, di căn Xâm lấn mạch, di căn

38

2.1.6. Mẫu bệnh phẩm nghiên cứu

Khoảng 3-5 ml máu ngoại vi đƣợc thu thập từ các đối tƣợng tham gia

nghiên cứu. Các mẫu máu của các bệnh nhân đƣợc lấy tại một thời điểm khi

nhập viện. Tất cả mẫu máu đƣợc ly tâm theo tiêu chuẩn để phân tách huyết

tƣơng và khối tế bào máu riêng biệt. Mẫu huyết tƣơng và khối tế bào máu

đƣợc lƣu vào các ống ependoft 1,5ml và đƣợc lƣu trữ ở tủ âm sâu (-20 hoặc -

80 độ C) cho đến khi tiến hành phân tích mẫu.

39

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Thiết kế và sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

40

2.2.2. Nội dung nghiên cứu

2.2.2.1. Cách thức tiến hành nghiên cứu

A. Các bước tiến hành nghiên cứu

Tất cả các đối tƣợng nghiên cứu đƣợc thu thập các thông tin về đặc điểm

chung (tuổi và giới)

Các đối tƣợng nghiên cứu đƣợc khai thác tiền sử, bệnh sử, thăm khám

lâm sàng đƣợc thực hiện bởi các bác sỹ lâm sàng phụ trách trực tiếp.

Tất cả các đối tƣợng nghiên cứu đƣợc chỉ định làm các xét nghiệm

thƣờng quy, xét nghiệm chẩn đoán nhiễm VRVGB, xét nghiệm đo tải lƣợng

HBV DNA, và các xét cần thiết khác đƣợc thực hiện bởi các bác sỹ lâm sàng

phụ trách trực tiếp.

Chẩn đoán xác định, chẩn đoán giai đoạn bệnh, chẩn đoán mức độ bệnh

đƣợc thực hiện bởi các bác sỹ lâm sàng phụ trách trực tiếp.

Lấy mẫu máu nghiên cứu theo tiêu chuẩn sử dụng cho mục tiêu nghiên

cứu bao gồm: xác đinh kiểu gen của các 4 SNPs và đo nồng độ vitamin D.

Tất cả các thông tin chung, lâm sàng và chỉ số cận lâm sàng sẽ đƣợc thu

thập và lƣu vào mẫu thu thập dữ liệu nghiên cứu (phụ lục 1).

B. Đặc điểm và các chỉ tiêu nghiên cứu chính

Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu:

- Tuổi (năm): phân bố độ tuổi ở từng nhóm nghiên cứu.

- Giới (nam, nữ; tỷ lệ nam/nữ) ở từng nhóm nghiên cứu.

- Tiền sử dịch tễ nhiễm VRVGB: có/không.

Triệu chứng lâm sàng:

- Triệu chứng cơ năng (có/không): đau hạ sƣờn phải, mệt mỏi, rối loạn

tiêu hóa, sút cân, tiểu vàng.

- Triệu chứng thực thể (có/không): lách to, cổ chƣớng, sốt, gan to, vàng

da, xuất huyết.

- Đánh giá mức độ xơ hóa gan và chức năng gan theo Child – pugh.

41

- Đánh giá giai đoạn UTBMTBG theo phân loại Barcelona.

Thông số cận lâm sàng:

- Các chỉ số huyết học và đông máu: số lƣợng hồng cầu (T/L), bạch cầu

(G/L), tiểu cầu (G/L), tỷ lệ prothrombin (%).

Các chỉ số sinh hóa: AST (U/L), ALT (U/L), bilirubin toàn phần

(µmol/L), bilirubin gián tiếp (µmol/l), albumin (g/l), protein (g/l), nồng độ

αFP (ng/ml).

- Tải lƣợng vi rút HBV DNA (copies/ml).

- Chỉ số miễn dịch: HBsAg, anti VRVGC, anti HIV, HBeAg, anti HBe,

dấu ấn ung thƣ gan AFP.

- Siêu âm ổ bụng: đánh giá hình thái gan nói chung, tình trạng XG, dịch

ổ bụng, kích thƣớc tĩnh mạch cửa, tình trạng huyết khối tĩnh mạch cửa trong

ung thƣ gan, kích thƣớc lách, vị trí, kích thƣớc, số lƣợng khối u, tính chất tăng

sinh khối u.

- CT hoặc chụp cộng hƣởng từ hạt nhân ổ bụng đánh giá UTBMTBG

+ Vị trí u: gan phải, gan trái, cả hai thùy + Kích thƣớc khối u (cm)

Kích thƣớc tổng u (tổng đƣờng kính lớn các u gan): < 5cm, 5-10 cm,

>10cm

+ Số lƣợng khối u: 1 u hoặc ≥ 2 u.

+ Hình thái khối u (thể khối, thể lan tỏa).

+ Dịch ổ bụng (có, không).

+ Huyết khối tĩnh mạch cửa (có/không).

+ Đặc điểm di căn: phổi, lách... (có/không).

C. Đặc điểm phân bố kiểu gen ApaI, FokI, BsmI, TaqI ở các nhóm nghiên

cứu

- Biến thể ApaI:

+ Tỷ lệ xuất hiện alen G, alen T.

+ Tỷ lệ xuất hiện kiểu gen: GG, GT, TT.

42

- Biến thể FokI rs10735810 G>A

+ Tỷ lệ xuất hiện alen G, alen A.

+ Tỷ lệ xuất hiện kiểu gen: GG, GA, AA.

- Biến thể BsmI rs1544410T>C

+ Tỷ lệ xuất hiện alen T, alen C.

+ Tỷ lệ xuất hiện kiểu gen: TT, TC, CC.

- Biến thể TaqI rs731236T>C

+ Tỷ lệ xuất hiện alen T, alen C.

+ Tỷ lệ xuất hiện kiểu gen: TT, TC, CC.

- Phân bố tỷ lệ kiểu gen đơn bội (haplotype) thiết lập từ 4 biến thể VDR

ApaI, FokI, BsmI, TaqI ở các nhóm nghiên cứu

- Mối tương quan giữa kiểu gen của các biến thể VDR ApaI, FokI, BsmI,

TaqI và các kiểu gen đơn bội (haplotype đối với các chỉ số cận lâm sàng ở

bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính.

C. Mối tương quan của các đa hình gen VDR với nguy cơ nhiễm vi rút viêm

gan B mạn tính

- So sánh tỷ lệ kiểu gen và kiểu alen tƣơng ứng của 4 biến thể ApaI,

FokI, BsmI, TaqI trong nhóm bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính và nhóm

chứng là NKM.

D. Mối liên quan của các đa hình gen VDR với tiến triển bệnh gan

- So sánh tỷ lệ kiểu gen và kiểu alen tƣơng ứng của 4 biến thể ApaI,

FokI, BsmI, TaqI giữa các nhóm bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính

(VGBMT vs. XG; VGBMT vs. UTBMTBG; UTBMTBG vs. XG+VGBMT).

E. Mối liên quan của các đa hình gen VDR với tiến triển bệnh gan

- So sánh tỷ lệ kiểu gen và kiểu alen tƣơng ứng của 4 biến thể ApaI,

FokI, BsmI, TaqI giữa các nhóm bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính

(VGBMT vs. XG; VGBMT vs. UTBMTBG; UTBMTBG vs. XG+VGBMT).

F. Đặc điểm về nồng độ vitamin D huyết thanh ở các nhóm

43

- Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D (<30ng/mL) ở các nhóm nghiên cứu.

- So sánh tỷ lệ thiếu hụt và mức độ thiếu hụt vitamin D (nhẹ, vừa, nặng,

rất nặng) giữa các nhóm nghiên cứu.

- Mối tƣơng quan giữa nồng độ vitamin D và các chỉ số cận lâm sàng.

- Mối tƣơng quan giữa nồng độ vitamin D và kiểu gen của các biến thể

VDR ApaI, FokI, BsmI, TaqI.

- Đánh giá và phân tích các yếu tố độc lập liên quan đến thiếu hụt

vitamin D huyết thanh ở bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính.

2.2.2.2. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất chính dùng trong nghiên cứu

A. Trang thiết bị chính

- Tủ an toàn sinh học cấp II: Microflow advance bio safety cabinet class II. - Tủ lạnh bảo quản bệnh phẩm máu từ 40C đến -800C.

- Máy đo độ tinh sạch DNA: Máy quang phổ NanoDrop Implen – Đức.

- Máy ly tâm lạnh Eppendorf Centrifuge 5224 R và Hitachi (Nhật).

- Máy PCR thƣờng: PCR Fast Aplied Biosystems veriti (Mỹ).

44

Hình 2.2. Máy PCR thƣờng thực hiện kĩ thuật Tetra-primer ARMS

- Hệ thống điện di: UVP Bioling system, Bio-rad (Mỹ).

- Máy soi gel và chụp ảnh tự động EC3 Imaging system.

- Máy giải trình tự gen ABI 3130 XL 16 kênh màu (Mỹ).

45

Hình 2.3. Máy giải trình tự gen ABI 3130 XL 16 kênh màu

- Hệ thống máy chạy Elisa: Máy đọc mật độ quang ELx808 (BioTek,

Mỹ) và máy ủ ELMI (Mỹ) và máy rửa Biotek Elx50 (Mỹ).

Hình 2.4. Hệ thống máy chạy Elisa

46

B. Dụng cụ chính

- Micropipette các loại (0,5-10µL, 20-100µl, 200-1000µl).

- Các loại đầu côn phù hợp với micropipette.

- Ống ependorf thể tích 1,5 mL.

- Ống/đĩa 96 giếng chạy PCR.

C. Hóa chất chính dùng trong nghiên cứu

- Hóa chất chiết tách DNA: QIAamp DNA Mini Kit, QIAamp DNeasy

Blood & Tissue Kits.

- Hóa chất khuếch đại gen và xác định trình tự gen ABI.

+ PCR Mastermix 2X (Promega).

+ Taq polymerase, Buffer, dH2O, dNTP.

+ Go taq – host taq master mix – Promega.

+ Mồi xuôi và mồi ngƣợc.

+ Kit tinh sạch sản phẩm PCR QIAamp DNA minik Kit (Qiagen)

+ T4 ligase.

+ Bộ kit tạo phản ứng đọc trình tự gen BigDye Terminator v3.1, Cycle

Sequencing Kit (Thermo).

+ Bộ mao quản 80 cm (loại 16 mao quản)

- Hóa chất điện di DNA:

+Agarose gel.

+ Đệm TAE 1x.

+ Dung dịch Ethidium bromide để nhuộm DNA.

+ Thang DNA chuẩn 100 bp, thang DNA chuẩn 50bp.

2.2.2.3. Kỹ thuật phân tích kiểu gen bốn biến thể FokI, BsmI, ApaI, TaqI

Phân tích kiểu gen của bốn thể đa hình đƣợc tiến hành tại Khoa sinh học

phân tử (C17) – Bệnh viện Trung ƣơng Quân đội 108.

Tách chiết DNA từ mẫu máu toàn phần và tinh sạch DNA: Tách

DNA từ máu toàn phần bằng bộ kit của hãng Qiagen (QIAamp DNA Mini Kit

47

- CHLB Đức). Sau khi chiết tách xong, các mẫu DNA đƣợc đo mật độ quang

OD và kiểm tra độ tinh sạch. Định lƣợng nồng độ và độ tinh sạch của DNA

bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ quang (OD: Optical Density) với các bƣớc

sóng A260/A280 trên máy Nanodrop 2000 của hãng Implen - CHLB Đức.

Một số lƣu ý quan trọng trƣớc khi thao tác:

Các bƣớc ly tâm tiến hành ở nhiệt độ phòng (15–25°C).

Tránh việc rã đông nhiều lần trong các khâu bảo quản mẫu dẫn đến làm

giảm kích cỡ chất lƣợng DNA.

Lấy mẫu máu ở trong tủ lạnh ra và rã đông tại nhiệt độ thƣờng (15–

25°C).

Nếu các dung dịch đệm (Buffer) tách ATL hoặc AL có hiện tƣợng kết

tủa, thì ủ các dung dịch này ở nhiệt độ 56°C để hoà tan tủa.

Các bƣớc thực hiện tách chiết DNA:

Lấy 200 μl máu tổng số, rửa hồng cầu bằng 3,5 ml RBC (Red Cell

Buffer Lysis). Bổ sung 200 ul AL buffer.

Thêm 20 ul proteinase K, vortex đều, sau đó ủ ở 56oC trong khoảng 15

phút.

Ly tâm ống effendorf 2ml để loại bỏ các giọt trên nắp ống.

Thêm 200 μl Buffer AL vào mẫu, vortex 15s và ủ 70°C trong 10 phút.

Ly tâm ống effendorf 2ml để loại bỏ các giọt trên nắp ống.

Thêm 200 μl ethanol (96–100%) vào mẫu, vortex 15s. Ly tâm ống

effendorf 2ml để loại bỏ các giọt trên nắp ống.

Cẩn thận đƣa lên cột QIAamp Mini spin column. Đóng nắp và ly tâm tốc

độ 6000 x g (8000 rpm) trong 1 phút. Giữ cột và thay ống thu.

Bổ sung 500 μl Buffer AW1 và ly tâm tốc độ 6000 x g (8000 rpm) trong

1 phút. Giữ cột và thay ống thu.

48

Bổ sung 500 μl Buffer AW2 và ly tâm tốc độ 20.000 x g (12.000 rpm)

trong 3 phút. Đổ dung dịch trong ống thu và tiếp tục ly tâm lần 2 để loại bỏ

hoàn toàn buffer AW2 có trên màng cột.

Đặt cột thu vào ống effendorf 1,5ml. Bổ sung 200 μl Buffer AE. Ủ ở

nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm tốc độ 6000 x g (8000 rpm) trong 1 phút. Ly

tâm thêm 1 phút tốc độ 6000 x g (8000 rpm). DNA đƣợc bảo quản ở nhiệt độ

-30 đến -15°C.

Sau khi chiết tách xong, các mẫu DNA đƣợc điện di, đo mật độ quang và

kiểm tra độ tinh sạch. Định lƣợng tƣơng đối nồng độ và độ tinh sạch của

DNA bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ quang (OD: Optical Density) với các

bƣớc sóng A260/A280 trên máy Nanodrop 2000 của hãng Thermo Scientific.

Trong nghiên cứu của chúng tôi chỉ số OD 260/280 của các mẫu DNA nhóm

bệnh trung bình 1,77 ± 0,05, nhóm chứng trung bình 1,88 ± 0,11. Nhƣ vậy, tỉ

số OD 260/280 trong khoảng 1,7 - 2,0, đạt yêu cầu tinh sạch DNA.

 Phản ứng Tetra-ARMS-PCR khuếch đại gen đích

Dùng kỹ thuật Tetra Primer ARMS để xác định kiểu gen của bốn biến

thể FokI, BsmI, ApaI, TaqI. Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR nhƣ sau:

49

Bảng 2.3. Trình tự các mồi đặc hiệu thực hiện tetra primer ARMS-PCR

Trình tự mồi

SNPs TaqI (rs731236) Outer

Inner

F: 5’ GCT GCC GTT GAG TGT CTG TGT GGG TG 3’ R: 5’ ACA AGG GGC GTT AGC TTC ATG CTG CAC TC 3’ T/F: 5’ CAG GAC GCC GCG CTG CTT 3’ C/R: 5’ CGG TCC TGG ATG GCC GCG 3’

BsmI (rs1544410) Outer

Inner

F: 5’ GTG GTG TGT GGA CGC TGA GGT G 3’ R: 5’ TTC CTT GAG CCT CCA GTC CAG GAA AG 3’ T/F: 5’ GGG CCA CAG ACA GGC CTA CA 3’ C/R 5’ CAG AGC CTG AGT ATT GGG AAC GC 3’

ApaI (rs7975232)

Outer

Inner

F: 5’ ATG GAA GGA CCT AGG TCT GGA TCC TAA ATG C 3’ R: 5’ GCT GCA CTC AGG CTG GAA GGA G 3’ A/F: 5’ GTG GTG GGA TTG AGC AGT GAA GT 3’ C/R: 5’ ACA GGA GCT CTC AGC TGG ACC 3’

FokI (rs2228570) Outer

Inner

F: 5’ ATG CCC ACC CTT GCT GAG CTC 3’ R: 5’ ATC TGG AGC TGA GAG GAG GGA AAA GAA GA 3’ G/F: 5’ GCC TGC TTG CTG TTC TTA CAG GAA C 3’ A/R: 5’ CTG GCC GCC ATT GCC TTC A 3’

Chu trình luân nhiệt

Phản ứng PCR đƣợc thực hiện bằng cách nâng nhiệt độ của phản ứng lên

95oC trong 3 phút, tiếp sau đó là 35 chu kỳ nhiệt, mỗi chu kỳ bao gồm:

- Giai đoạn biến tính: 95oC trong 30 giây - Giai đoạn gắn mồi: 60oC trong 30 giây - Giai đoạn nối dài: 72oC trong 30 giây - Cuối cùng là bƣớc kéo dài chuỗi: 72oC trong 5 phút.

Điện di sản phẩm PCR

- Sau mỗi phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành điện di 5 µL sản phẩm P

trên gel agarose 3% ở hiệu điện thế 110 volt trong 40 phút. Sau đó thạch đƣợc

50

nhuộm bằng cách ngâm vào dung dịch Ethidium Bromide 30 phút. Kết quả

điện di đƣợc đọc dƣới đèn chiếu tia cực tím.

- Sản phẩm PCR cho hình ảnh các băng điện di DNA tƣơng đối đồng

đều, gọn, rõ nét. Kích thƣớc các băng tƣơng ứng đoạn mồi khi so sánh trên

thang DNA chuẩn.

Giải trình tự gen để khẳng định độ chính xác của phƣơng pháp tetra

primer ARMS-PCR

Sản phẩm thu đƣợc từ PCR lần 1 sẽ đƣợc tinh sạch bằng kít purify PCR

– Thermo. Sau đó tiếp tục thực hiện PCR lần 2 để giải trình tự trên hệ thống

ABI PRISM 3500, sử dụng BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit

với cùng loại mồi dùng để PCR.

Bảng 2.4. Trình tự các mồi đƣợc sử dụng trong kỹ thuật giải trình tự gen

STT Tên primer Trình tự 5’-3’ Chiều dài PCR

1 TaqI outer F

415bp

2 TaqI outer R GCT GCC GTT GAG TGT CTG TGT GGG TG ACA AGG GGC GTT AGC TTC ATG CTG CAC TC

3 BsmI outer F GTG GTG TGT GGA CGC TGA GGT G

458bp 4 BsmI outer R

5 ApaI outer F TTC CTT GAG CCT CCA GTC CAG GAA AG ATG GAA GGA CCT AGG TCT GGA TCC TAA ATG C 420bp

6 ApaI outer R GCT GCA CTC AGG CTG GAA GGA G FokI outer F ATG CCC ACC CTT GCT GAG CTC 7

477bp 8 FokI outer R ATC TGG AGC TGA GAG GAG GGA AAA GAA GA

Giải trình tự gen bằng phƣơng pháp Sanger sequencing

Sử dụng phần mềm Vector NTI (Invitrogen) và BioEdit phân tích trình

tự gen. Trình tự tham chiếu của của gen VDR (Vitamin D receptor) -

51

AC004466 đƣợc lấy từ cơ sở dữ liệu của Genbank của Trung tâm công nghệ

sinh học Quốc gia Mỹ (NCBI).

2.2.2.4. Định lượng nồng độ vitamin D huyết thanh

Nồng độ vitamin D toàn bộ huyết thanh đƣợc định lƣợng bằng phƣơng

pháp ELISA. Sinh phẩm Elisa sử dụng của hãng Gentaur, Kampenhout,

Belgium. Định lƣợng nồng độ vitamin D huyết thanh đƣợc tiến hành tại Khoa

Sinh học phân tử - Bệnh Viện Trung ƣơng Quân đội 108. Phƣơng pháp phân

tích này có thể xác định nồng độ vitamin D trong giới hạn 4,39-133 ng/mL.

Độ nhạy của phƣơng pháp là 1,5mg/dL. Dựa vào khuyến cáo của Hiệp hội

Nội tiết Mỹ (Maryland, USA; https://www.endocrine.org/), nồng độ vitamin

D huyết thanh lớn hơn hoặc bằng 30 ng/ml đƣợc cho là bình thƣờng. Hầu hết

các nghiên cứu (tổng quan trong tài liệu: [28]) phân loại nồng độ vitamin D

nhƣ sau: nồng độ vitamin D bình thƣờng (≥30 ng/ml), thiếu vitamin D mức

độ nhẹ-vừa (20-29,9 ng/ml), thiếu vitamin D mức độ nặng (10-19,9 mg/ml),

thiếu vitamin D mức độ rất nặng (<10 ng/ml).

2.3. PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU

Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm R. Các số liệu đƣợc trình bày theo

trung bình hoặc trung vị và khoảng giá trị của các biến liên tục khi phù hợp.

Số liệu đƣợc trình bày dƣới dạng tỷ lệ cho các kiểu gen và alen của các biến

thể di truyền nghiên cứu. Kiểm tra tỷ lệ kiểu gen của các điểm đa hình theo

quy luật Hardy Weinberg. Chỉ số OR (Odds ratio: tỷ xuất chênh), 95%CI

(khoảng tin cậy 95%), đƣợc tính toán để đánh giá khả năng bệnh hoặc nguy

cơ tiến triển bệnh. Chi-square test đƣợc sử dụng để so sánh tỷ lệ giữa các

nhóm. Kruskal-Wallis test và Mann-Whitney-Wilcoxon test đƣợc sử dụng để

so sánh giá trị trung bình giữa các nhóm cho các biến liên tục. Biểu đồ hình

hộp (biểu đồ Box-plot) đƣợc sử dụng để biểu diễn sự so sánh của các biến liên

tục giữa các nhóm. Phân tích hồi quy logistic điều chỉnh cho tuổi và giới đƣợc

áp dụng để so sánh tần suất kiểu gen và alen giữa các nhóm và phân nhóm

52

nghiên cứu. Ngoài ra, mối tƣơng quan giữa nồng độ vitamin D và các thông

số cận lâm sàng đƣợc tính toán dựa trên phƣơng pháp Spearman’s rank

correlation test. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng mô hình hồi quy

tuyến tính và logistic đa biến để xác định mối liên quan giữa sự thiếu hụt

vitamin D với các yếu tố nguy cơ độc lập. Tất cả các so sánh có ý nghĩa thống

kê khi P<0,05.

2.4. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Thời gian thực hiện đề tài từ: 2013-2018.

Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Trung ƣơng Quân đội 108 và Bệnh viện

Quân y 103.

2.5. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU

Tất cả các bệnh nhân tham gia nghiên cứu là hoàn toàn tự nguyện và có

quyền rút khỏi nghiên cứu khi không muốn tham gia nghiên cứu.

Các thông tin liên quan đến bệnh nhân đƣợc đảm bảo bí mật.

Kỹ thuật, thao tác liên quan đến bệnh nhân đƣợc bảo đảm đúng

chuyên môn.

53

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA CÁC ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

3.1.1. Đặc điểm lâm sàng

Tổng cộng có 536 đối tƣợng tham gia thoả mãn các tiêu chuẩn lựa chọn

và loại trừ đƣợc đƣa vào nghiên cứu. Trong đó có 298 ngƣời nhiễm VRVGB

mạn tính và 238 ngƣời khỏe mạnh.

3.1.2. Đặc điểm phân bố về tuổi của các nhóm nghiên cứu

Bảng 3.1. Ph n bố về tuổi ở các nhóm nghiên cứu

Tuổi (năm) Ph n nhóm

Trung bình ± SD 25,6 ± 12,4 42,4 ± 12,5 55,1 ± 12,4 55,4 ± 12,2 Trung vị (khoảng) 19 (18 - 86) 41,5 (21 - 79) 56 (19 - 85) 56 (27 -82)

NKM (n=238) VGBMT (n=104) XG (n=89) UTBMTBG (n=105) Tuổi trung bình của nhóm NKM thấp hơn so với các nhóm bệnh nhân

nhiễm VRVGB. Trong nhóm bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính, nhóm XG

và UTBMTBG có độ tuổi trung bình tƣơng tự nhau và cao hơn so với nhóm

VGBMT.

3.1.3. Phân bố giới tính của các nhóm nghiên cứu

Bảng 3.1. Ph n bố giới tính ở các nhóm nghiên cứu

Giới tính Ph n nhóm

Nữ n (%) 78 (32,8) 13 (12,5) 13 (14,6) 0 Nam n (%) 160 (67,2) 91 (87,5) 76 (85,4) 105 (100)

NKM (n=238) VGBMT (n=104) XG (n=89) UTBMTBG (n=105) Đối tƣợng tham gia trong nghiên cứu này đa số là nam giới. Tỷ lệ nam

giới ở nhóm NKM: 67,2%; nhóm VGBMT: 87,5%; nhóm XG: 85,4%. Trong

khi đó ở nhóm bệnh nhân UTBMTBG 100% là nam giới.

54

3.1.4. Đặc điểm cận lâm sàng ở nhóm bệnh nhân viêm gan B

Bảng 3.2. Đặc điểm cận lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan B

P

> 0,05 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001

41,4 (6,4-733)

24,3 (6-499)

18 (9-185)

< 0,0001

15,2 (1,6-449,1) 5,5 (0-156)

8,7 (1-300,1)

< 0,0001

> 0,05

39,5 (22-47,4) < 0,0001 77,9 (19,6-127) < 0,0001 5,66e6 (212- 2,3e8) 191,2 (1,24-400) < 0,0001

29 (16-54) 45,8 (14,1-101) 2,06e5 (463- 4,95e9) 18,4 (0,9-170)

40 (16-53) 87 (41-140) 3,61e6 (1,57e3- 1,13e10) 2,9 (0,9-32)

XG (n=89) 6,2 (1,8-20,5) 3,7 (1,9-5,3) 86 (7,1-641) 93 (25-1221) 53,5 (10-629) UTBMTBG (n=105) 6,4 (2,1-15,1) 4,6 (2,4-7,4) 162 (6,7-428) 53 (18-655) 43,5 (4-401) VGBMT (n=104) 6,5 (3,6-13,9) 6,5 (3,6-13,9) 184 (21,5-472) 231,5 (17-7700) 328 (21-4908)

Thông số cận lâm sàng WBC (x103/L) RBC (x106/L) PLT (x103/L) AST (UI/mL) ALT (UI/mL) Bilirubin toàn phần (mol/L) Bilirubin trực tiếp (mol/L) Albumin (g/L) Prothobin (%) HBV DNA (copies/mL) AFP (UI/mL) Nồng độ enzyme AST và ALT cao hơn có ý nghĩa ở nhóm VGBMT

so với nhóm XG và UTBMTBG với P<0,0001. Nồng độ albumin huyết thanh

thấp hơn có ý nghĩa ở nhóm XG so với 2 nhóm VGBMT và UTBMTBG

(P<0,0001). Trong khi đó nồng độ bilirubin thấp hơn có ý nghĩa ở nhóm

UTBMTBG so với 2 nhóm còn lại (P<0,0001). Nồng độ AFP cao hơn có ý

nghĩa ở nhóm UTBMTBG so với hai nhóm VGBMT và XG. Số lƣợng hồng

cầu, tiểu cầu trong nhóm XG thấp hơn so với nhóm bệnh nhân VGBMT và

UTBMTBG với P<0,0001. Không có sự khác biệt về số lƣợng bạch cầu và tải

lƣợng HBV DNA giữa các nhóm với P>0,05.

3.2. PHÂN BỐ KIỂU GEN VÀ ALEN CỦA CÁC BIẾN THỂ VDR APAI,

FOKI, TAQI VÀ BSMI Ở CÁC NHÓM NGHIÊN CỨU

Trong tổng số 298 BN và 238 NKM đƣợc khảo sát kiểu gen của bốn

biến thể ApaI, FokI, BsmI và TaqI, chúng tôi đã khảo sát thành công trên 270

BN và 234 NKM đối với biến thể ApaI; 269 BN và 235 ngƣời khỏe mạnh đối

với biến thể FokI; 272 BN và 216 ngƣời khỏe mạnh đối với biến thể BsmI;

289 BN và 233 ngƣời khỏe mạnh đối với biến thể TaqI.

55

3.2.1. Đa hình VDR ApaI

3.2.1.1. Kết quả phân tích đa hình VDR ApaI

Phân tích điểm đa hình VDR ApaI bằng kĩ thuật Tetra-primer-ARMS-PCR

Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đại diện xác định kiểu gen ApaI

Sản phẩm PCR của các mẫu đều đƣợc kiểm tra trên băng điện di cho

thấy ApaI rs7975232C>A có 2 alen A(C), a(A) và các kiểu gen đồng hợp, dị

hợp nhƣ sau: AA có 2 băng 420bp và 280bp, CC có 2 băng 420bp và 180 bp,

AC có 3 băng 420bp, 280bp và 180bp.

Để kiểm chứng độ chính xác của phƣơng pháp Tetra-primer-ARMS-PCR,

sản phẩm PCR của một số mẫu sau phản ứng tetra-primer-ARMS-PCR sau khi

đã đƣợc kiểm tra trên gel agarose sẽ đƣợc kiểm chứng lại bằng phƣơng pháp giải

trình tự gen (Sanger sequencing) nhƣ hình minh họa bên dƣới

56

Hình 3.2. Giải trình tự đại diện xác định kiểu gen của biến thể ApaI

Kiểu gen đồng hợp tử CC có một đỉnh C duy nhất; kiểu gen dị hợp tử CA

có hai đỉnh nucleotide C và nucleotid A lồng vào nhau; Kiểu gen đồng hợp tử

lặn AA có một đỉnh A duy nhất.

3.2.1.2. Phân bố kiểu gen và alen của ApaI trong các nhóm nghiên cứu

Bảng 3.3. Phân bố kiểu gen biến thể VDR ApaI giữa các nhóm nghiên cứu

VGBMT n (%) XG n (%) UTBMTBG n (%) NKM n (%) Ngƣời nhiễm VRVGB mạn tính n (%) Nhóm bệnh nh n

Kiểu gen

45 (44,1) 41 (50,6) 39 (44,4) 125 (46,3) 114 (48,7) GG

52 (51,0) 32 (39,5) 36 (41,4) 120 (44,4) 106 (45,3) TG

5 (4,9) 8 (9,9) 12 (13,8) 25 (9,3) 14 (6,0) TT

Kiểu alen

142 (70) 62 (30) 114 (70,4) 114 (65,5) 60 (34,5) 48 (29,6) 370 (68,5) 170 (31,5) 334 (71,4) 134 (28,6) G T

57

Tỷ lệ kiểu gen GG chiếm tỷ lệ cao nhất ở nhóm XG (50,6%). Tỷ lệ

kiểu gen TG chiếm tỷ lệ cao nhất ở nhóm bệnh nhân VGBMT (51%) và thấp

nhất ở nhóm bệnh nhân XG (39,5%). Tỷ lệ kiểu gen TT chiếm tỷ lệ cao nhất

ở nhóm bệnh nhân UTBMTBG (13,8%) và thấp nhất ở nhóm VGBMT

(4,9%).

3.2.1.3. Mối liên quan giữa tính đa hình VDR ApaI đối với nguy cơ nhiễm

vi rút viêm gan B và tiến triển bệnh

A. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ nhiễm vi rút viêm gan B

Bảng 3.4. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ nhiễm vi rút viêm gan B

NKM OR (95%CI) P* Phân nhóm BN Ngƣời mang VRVGB mạn % n N %

125 120 25 46,3 44,4 9,26 114 106 14 48,7 45,3 6,0 1 1,03 (0,7-1,5) 1,7 (0,8-3,3) 0,864 0,17

370 170 68,5 31,5 334 134 71,4 28,6 1 1,1 (0,9-1,5) 0,326

245 25 90,7 9,3 220 14 94,0 6,0 1 1,6 (0,8-3,3) 0,173

125 145 46,3 53,7 114 120 48,7 51,3 1 1,1 (0,8-1,6) 0,587

Mô hình đồng trội GG TG TT Kiểu alen G T Mô hình lặn GG+TG TT Mô hình trội GG TG+TT Chú thích: * Kiểm định 2

Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so sánh tần suất các

kiểu gen và alen của biến thể ApaI trong tất cả các mô hình di truyền (đồng

trội, trội, lặn, alen) giữa 2 nhóm bệnh nhân viêm gan B và nhóm NKM.

58

B. Đa hình gen VDR ApaI và nguy cơ tiến triển bệnh lý gan ở bệnh nhân

nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính

Đa hình VDR ApaI và nguy cơ viêm gan B mạn tính

Bảng 3.5. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ viêm gan B mạn tính (nhóm chứng: NKM)

VGBMT NKM Kiểu gen OR (95%CI) P* n % n %

Mô hình đồng trội

45 44,1 114 48,7 1 GG

52 51,0 TG 106 45,3 1,2 (0,8-2) 0,373

5 4,9 TT 14 6,0 0,9 (0,3-2,7) 0,856

Kiểu alen

142 69,6 G 334 71,4 1

62 30,4 T 134 28,6 1,1 (0,8-1,6) 0,645

Mô hình lặn

97 95,1 220 94,0 1 GG+TG

5 4,9 TT 14 6,0 0,8 (0,3-2,3) 0,694

Mô hình trội

45 44,1 114 48,7 1 GG

1,2 (0,8-1,9) 55,9 51,3 120 57 0,438

TG+TT Chú thích: * Kiểm định 2; VGBMT: viêm gan B mạn tính; NKM: NKM

Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tần suất xuất hiện kiểu

gen và alen của VDR ApaI khi so sánh giữa hai nhóm VGBMT và NKM trong

các mô hình so sánh di truyền.

59

C. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ xơ gan

Bảng 3.6. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ xơ gan (nhóm chứng: NKM)

NKM XG P* Phân nhóm OR (95%CI) % n % n

Mô hình đồng trội

114 48,7 1 41 50,6 GG

106 45,3 0,8 (0,5-1,4) 0,519 32 TG 39,5

14 6,0 1,6 (0,6-4,1) 0,331 8 TT 9,9

Kiểu alen

334 71,4 1 114 G 70,4

134 28,6 1,1 (0,7-1,6) 0,809 48 T 29,6

Mô hình lặn

220 94,0 1 73 90,1 GG+TG

14 6,0 1,7 (0,7-4,3) 0,236 TT 8 9,9

Mô hình trội

114 48,7 1 41 50,6 GG

120 51,3 0,9 (0,6-1,5) 0,768

TG+TT 40 49,4 Chú thích: * Kiểm định 2

Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tần suất xuất hiện kiểu

gen và alen của VDR ApaI khi so sánh giữa hai nhóm XG và NKM trong các

mô hình so sánh di truyền.

60

Bảng 3.7. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ xơ gan (nhóm chứng: VGBMT)

VGBMT XG OR (95%CI) P* Kiểu gen % n T% n

Mô hình đồng trội

41 45 50,6 44,1 1 GG

32 TG 52 39,5 51,0 0,7 (0,4-1,2) 0,207

8 TT 5 9,9 4,9 1,8 (0,5-5,8) 0,351

Kiểu alen

114 G 142 70,4 69,6 1

48 T 62 29,6 30,4 1 (0,6-1,5) 0,874

Mô hình lặn

73 97 90,1 95,1 1 GG+TG

8 TT 5 9,9 4,9 2,1 (0,7-6,8) 0,193

Mô hình trội

41 45 50,6 44,1 1 GG

40 TG+TT 57 49,4 55,9 0,8 (0,4-1,4) 0,382

Chú thích: * Kiểm định 2

Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tần suất xuất hiện kiểu

gen và alen của VDR ApaI khi so sánh giữa hai nhóm XG và VGBMT trong

các mô hình so sánh di truyền.

61

D. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ ung thƣ gan

Bảng 3.8. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ ung thƣ biểu mô tế bào gan (nhóm

chứng: NKM)

NKM Phân nhóm OR (95%CI) p UTBMTBG n Tỷ lệ % n Tỷ lệ%

Đồng trội GG TG 39 36 47,7 41,4 114 106 48,7 45,3

TT 12 13,9 14 6,0 1 1,0 (0,6-1,7) 2,5 (1,1-5,9) 3,17 (1,05-9,94) 0,978* 0,035* 0,042#

0,152 114 60 65,5 34,5 334 134 71,4 28,6 1 1,3 (0,9-1,9)

75 86,2 220 94,0 Kiểu alen G T Mô hình lặn GG+TG

TT 12 13,8 14 6,0 1 2,5 (1,11-5.68) 3,5 (1,14-10,9) 0,023* 0,024#

1 1,2 (0,7-1,9) 0,44 48,7 51,3 44,8 55,2 114 120 39 48

Mô hình trội GG TG+TT Chú thích: * Kiểm định 2; # Phân tích hồi quy logistic đa biến điều chỉnh cho tuổi và giới.

Tần suất kiểu gen ApaI TT cao hơn có ý nghĩa thống kê ở nhóm

UTBMTBG so với nhóm NKM trong cả 2 mô hình phân tích di truyền: mô

hình đồng trội (OR=2,5; 95%CI=1,1-5,9, P=0,035) và mô hình lặn (OR=2,76;

95%CI=1,2-6,1); P=0,013). Kết quả phân tích vẫn cho thấy có sự khác biệt có

ý nghĩa thống kê khi phân tích hồi quy logistic điều chỉnh cho tuổi và giới

trong hai mô hình đồng trội (OR=3,17; 95%CI=1,05-9,94, P=0,042) và mô

hình lặn (OR=3,5; 95%CI=1,14-10,9, P=0,024). Không có sự khác biệt về sự

phân bố alen giữa 2 nhóm trong phân tích.

62

Bảng 3.9. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ ung thƣ biểu mô tế bào gan (nhóm chứng: Viêm gan B mạn tính)

VGBMT P OR (95%CI) UTBMTBG n Tỷ lệ % n Tỷ lệ %

39 36 12 44,8 41,4 13,8 45 52 5 44,1 51,0 4,9 1 0,8 (0,4-1,5) 2,8 (0,9-8,6) 0,466* 0,077*

114 60 65,5 34,5 142 62 69,6 30,4 1 1,2 (0,8-1,9) 0,397*

75 86,2 97 95,1 Phân nhóm Mô hình đồng trội GG TG TT Kiểu alen G T Mô hình lặn GG+TG

TT 12 13,8 5 4,9 1 3,1 (1,1-9,2) 0,03* 0,017# 4,3 (1,2-15)

1 1 (0,5-1,7) 0,922* 44,8 55,2 44,1 55,9 45 57

Mô hình trội 39 GG 48 TG+TT Chú thích: * Kiểm định 2; # Phân tích hồi quy logistic đa biến điều chỉnh cho tuổi và giới.

Tần suất kiểu gen ApaI TT cao hơn có ý nghĩa thống kê ở nhóm

UTBMTBG so với nhóm VGBMT trong mô hình lặn (OR=3,1; 95%CI: 1,1-

9,2; P=0,03). Trong mô hình phân tích hồi quy logistic điều chỉnh tuổi và

giới cũng cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê: OR=4,3; 95%CI: 1,2-15;

P=0,017. Không có sự khác biệt về sự phân bố alen giữa 2 nhóm trong phân

tích.

63

Bảng 3.10. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ ung thƣ biểu mô tế bào gan (nhóm chứng: Xơ gan)

OR (95%CI) P Kiểu gen % UTBMTBG % n XG n

50,6 39,5 1 1,2 (0,6-2,3) 0,611* 44,8 41,4 Mô hình đồng trội GG TG 39 36 41 32

9,9 1,6 (0,6-4,3) 0,37* 13,8 12 TT 8

Kiểu alen

65,5 114 1 70,4 114 G

34,5 48 29,6 1,3 (0,8-2) 0,342* 60

74 86,2 90,1 1 73 T Mô hình lặn GG+TG

9,9 1,5 (0,6-3,8) 0,435* 13 13,8 8

50,6 49,4 1 1,3 (0,7-2,3) 0,453* 38 39 41 40

TT Mô hình trội 44,8 GG 55,2 TG+TT Chú thích: * Kiểm định 2

Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về sự phân bố kiểu gen và

alen giữa 2 nhóm UTBMTBG và XG trong các mô hình phân tích thống kê di

truyền

64

Bảng 3.11. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ ung thƣ biểu mô tế bào gan (nhóm chứng: Xơ gan+Viêm gan B mạn tính)

UTBMTBG OR (95%CI) P Phân nhóm n % Không UTBMTBG (VGBMT+XG) n %

39 36 12 44,8 41,4 13,8 86 84 13 47,0 45,9 7,1 1 0,9 (0,5-1,6) 2 (0,9-4,9) 0,839* 0,11*

114 60 65,5 34,5 256 110 70 30 1 1,2 (0,8-1,8) 0,301*

75 86,2 170 92,9 Mô hình đồng trội GG TG TT Kiểu alen G T Mô hình lặn GG+TG

TT 12 13,8 13 7,1 1 0,081* 2,1 (0,9-4,8) 2,09 (0,8-5,2) 0.112#

1 1,1 (0,2-1,8) 44,8 55,2 47,0 53,0 86 97 39 48 0,739*

Mô hình trội GG TG+TT Chú thích: * Kiểm định 2; # Phân tích hồi quy logistic đa biến điều chỉnh cho tuổi và giới

Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về sự phân bố kiểu gen và

alen giữa 2 nhóm UTBMTBG và không UTBMTBG (XG+VGBMT) trong

các mô hình phân tích thống kê di truyền.

65

E. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ tiến triển bệnh lý gan giai đoạn cuối

(Xơ gan+Ung thƣ biểu mô tế bào gan)

Bảng 3.12. Đa hình VDR ApaI và nguy cơ tiến triển bệnh gan

OR (95%CI) P VGBMT n % XG + UTBMTBG n %

45 52 5 44,1 51,0 4,9 80 68 20 47,6 40,5 11,9 1 0,7 (0,4-1,2) 2,3 (0,8-6,4) 0,241* 0,129*

142 62 69,6 30,4 228 108 67,9 32,1 1 1,1 (0,7-1,6) 0,67*

Phân nhóm Mô hình đồng trội GG TG TT Kiểu alen G T Mô hình lặn GG+TG 97 95,1 148 88,1

TT 5 4,9 20 11,9 1 2,6 (0,95-7,2) 3,2 (1,03-9,9) 0,054* 0,032#

1 0,9 (0,5-1,5) 44,1 55,9 47 53 79 89 45 57

Mô hình trội GG 0,642* TG+TT Chú thích: * Kiểm định 2; # Phân tích hồi quy logistic đa biến điều chỉnh cho tuổi và giới

Tần suất kiểu gen ApaI TT cao hơn ở nhóm UTBMTBG+XG so với

nhóm VGBMT trong mô hình lặn (OR=2,6; 95%CI:0,95-7,2; P=0,054).

Trong mô hình phân tích hồi quy logistic điều chỉnh tuổi và giới cho thấy sự

khác biệt có ý nghĩa thống kê: OR=3,2; 95%CI:1,03-9,9; P=0,032). Không có

sự khác biệt về sự phân bố alen giữa 2 nhóm trong phân tích.

66

3.2.2. Đa hình VDR FokI

3.2.2.1. Kết quả phân tích đa hình VDR FokI

Phân tích điểm đa hình VDR FokI bằng kĩ thuật Tetra-primer-ARMS-

PCR

Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đại diện xác định kiểu gen FokI

Sản phẩm PCR của các mẫu đều đƣợc kiểm tra trên băng điện di cho thấy: FokI rs10735810C>T có 2 kiểu alen F(G), f(A) các kiểu gen đồng hợp, dị hợp nhƣ sau: GG có 2 băng 477bp và 360bp, AA có 2 băng 477bp và 160 bp, AG có 3 băng 477bp, 360bp và 160bp.

Hình 3.4. Giải trình tự đại diện xác định kiểu gen của biến thể FokI

Kiểu gen đồng hợp tử GG có một đỉnh G duy nhất; kiểu gen dị hợp tử

GA có hai đỉnh nucleotide G và nucleotid A lồng vào nhau; Kiểu gen đồng

hợp tử lặn AA có một đỉnh A duy nhất.

67

3.2.2.2. Mối liên quan giữa đa hình VDR FokI và các bệnh lý gan mạn tính.

FokI

Bảng 3.13. Phân bố kiểu gen của biến thể VDR FokI ở các nhóm đối tƣợng nghiên cứu

VGBMT n (%)

NKM n (%)

UTBMTBG n (%)

XG n (%)

VGBMT vs. NKM P OR; 95%CI

XG vs. NKM OR; 95%CI

P

UTBMTBG vs. NKM P OR; 95%CI

Mô hình đồng trội

51 (21,7)

23 (25)

12 (15,6)

1

1

1

28 (28)

CC

135 (57,5)

53 (57,6)

47 (61,0)

0,7 (0,4-1,3)

>0,05 1,5 (0,7-3,0) NS 0,9 (0,5-1,6)

>0,05

53 (53)

CT

49 (20,8)

16 (17,4)

18 (23,4)

0,7 (0,4-1,4)

>0,05 1,6 (0,7-3,6) NS 0,7 (0,3-1,5)

>0,05

19 (19)

TT

Kiểu alen

109 (54,5)

237 (50,4)

99 (53,8)

71 (46,1)

1

1

1

C

91 (45,5)

233 (49,6)

85 (46,2)

83 (53,9)

1 (0,7-1,5)

>0,05 0,7 (0,5-1,1) NS 0,9 (0,6-1,2)

>0,05

T

Mô hình lặn

CC+CT

81 (81)

186 (79,2)

76 (82,6)

59 (76,6)

1

1

1

TT

19 (19)

49 (20,8)

16 (17,4)

18 (23,4)

0,9 (0,5-1,6)

>0,05 1,1 (0,6-2,1) NS 0,8 (0,4-1,5)

>0,05

Mô hình trội

CC

28 (28)

51 (21,7)

23 (25)

12 (15,6)

1

1

1

CT+TT

72 (72)

184 (78,3)

69 (75)

65 (84,4)

0,7 (0,4-1,2)

>0,05 1,5 (0,8-3,0) NS 0,8 (0,5-1,5)

>0,05

Không có sự khác biệt về tỷ lệ các kiểu gen và alen của biến thể FokI khi so sánh từng cặp giữa các đối tƣợng

nghiên cứu với P>0,05.

68

3.2.3. Đa hình VDR BsmI

3.2.3.1. Kết quả phân tích đa hình gen VDR FokI

Phân tích điểm đa hình VDR BsmI bằng kĩ thuật Tetra-primer-ARMS-PCR

Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đại diện xác định kiểu gen BsmI

BsmI rs1544410T>C có 2 kiểu alen B(T), b(C) các kiểu gen đồng hợp, dị

hợp nhƣ sau: TT có 2 băng 458bp và 350bp, CC có 2 băng 458bp và 150 bp, TC

có 3 băng 458bp, 350bp và 150bp.

69

Hình 3.6. Giải trình tự đại diện xác định kiểu gen của biến thể VDR BsmI

Kiểu gen đồng hợp tử TT có một đỉnh T duy nhất; kiểu gen dị hợp tử TC

có hai đỉnh nucleotide T và nucleotid C lồng vào nhau.

70

3.2.3.2. Mối liên quan giữa đa hình VDR BsmI và các bệnh lý gan mạn tính.

Bảng 3.14. Phân bố kiểu gen của biến thể VDR BsmI ở các nhóm đối tƣợng nghiên cứu

UTBMTB

VGBMT NKM

XG

VGBMT vs. NKM

XG vs. NKM

UTBMTBG vs. NKM

G

BsmI

n (%)

n (%)

n (%)

n (%)

OR; 95%CI P

OR; 95%CI P

OR; 95%CI P

Mô hình đồng trội

93 (92,1)

199 (92,1)

90 (95,7)

70 (92.1)

1

1

1

CC

7 (6,9)

17 (7,9)

4 (4,3)

0,9 (0,4-2,2)

>0,05

0,8 (0,3-2,4)

>0,05 0,5 (0,2-1,6)

>0,05

5 (6,6)

TC

1 (1)

0 (0)

0 (0)

1 (1,3)

TT

Kiểu alen

193 (95,5) 415 (96)

184 (97,9)

145 (95,4) 1

1

1

C

1,14 (0,5-

9 (4,5)

17 (4)

4 (2,1)

7 (4,6)

>0,05

1,2 (0,5-2,9)

>0,05 0,5 (0,2-1,6)

>0,05

T

2,6)

Mô hình trội

1

1

93 (92,1)

199 (92,1)

90 (95,7)

70 (92,1)

1

CC

8 (7,9)

17 (7,9)

4 (4,3)

6 (7,9)

1 (0,4-2,4)

>0,05

1 (0,4-2,6)

>0,05 0,5 (0,2-1,6)

>0,05

TC+TT

Không có sự khác biệt về tỷ lệ kiểu gen của biến thể VDR BsmI khi so sánh từng cặp giữa các đối tƣợng nghiên

cứu với P>0,05.

71

3.2.4. Đa hình VDR TaqI

3.2.4.1. Kết quả phân tích đa hình gen VDR TaqI

Phân tích điểm đa hình VDR TaqI bằng kĩ thuật Tetra-primer-ARMS-PCR

Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đại diện xác định kiểu gen TaqI

TaqI rs731236T>C có 2 kiểu alen T(T), t(C), các kiểu gen đồng hợp, dị hợp

tử nhƣ sau: TT có 2 băng 415bp và 300bp, TC có 3 băng 415bp, 300bp và 150bp.

Hình 3.8. Giải trình tự đại diện các kiểu gen của biến thể TaqI

Kiểu gen đồng hợp tử TT có một đỉnh T duy nhất; kiểu gen dị hợp tử TC

có hai đỉnh nucleotide T và nucleotid C lồng vào nhau.

72

3.2.4.2. Mối liên quan giữa đa hình VDR TaqI và các bệnh lý gan mạn tính.

Bảng 3.15. Phân bố kiểu gen của biến thể VDR TaqI ở các nhóm đối tƣợng nghiên cứu

NKM

VGBMT XG

UTBMTBG VGBMT vs. NKM

XG vs. NKM

UTBMTBG vs. NKM

TaqI

n (%)

n (%)

n (%)

n (%)

OR; 95%CI

P

OR; 95%CI

P

OR; 95%CI

P

Kiểu gen

18 (7,7)

7 (6,7)

8 (9)

12 (12,5)

1

1

1

TC

215 (92,3)

97 (93,3)

81 (91)

84 (87,5)

1,2(0,5-2,9)

>0,05 0,9 (0,3-2)

>0,05 0,6 (0,3-1,3)

>0,05

TT

Kiểu alen

18(3,9)

7 (3,4)

8 (4,5)

12 (6,3)

1

1

1

C

448 (96,1)

201 (96,6) 170 (95,5)

180 (93,8)

1,2 (0,5-2,8)

>0,05 0,9 (0,4-2)

>0,05 0,6 (0,3-1,3)

>0,05

T

Không có sự khác biệt về tỷ lệ các kiểu gen và alen của biến thể TaqI khi so sánh từng cặp giữa các đối tƣợng

nghiên cứu với P>0,05.

73

3.3. PHÂN BỐ HAPLOTYPE Ở CÁC NHÓM NGHIÊN CỨU

3.3.1. Phân bố haplotype (FokI/BsmI/ApaI/TaqI) ở các nhóm nghiên cứu

3.3.1.1. Phân bố các haplotype trong nhóm chứng và nhóm bệnh.

Bảng 3.16. Phân bố haplotype ở nhóm ngƣời khỏe mạnh và nhóm bệnh nhân nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính

P FokI/BsmI/ApaI/TaqI Ngƣời khỏe mạnh Ngƣời nhiễm VRVGB Haplotype mạn tính

<0,0001

123 (29%) 167 (40%) 76 (18%) 32 (8%) 5 (1%) 1 (0,2%) 6 (1%) 1 (0,2%) 0 0 0 0 9 (2,1%) 0 168 (35%) 143 (30%) 59 (12%) 72 (15%) 4 (1%) 5 (1%) 11 (2%) 0 1 (0,2%) 1 (0,2%) 8 (2%) 5 (1%) 0 1 (0,2%) CCGT (FbAT) TCGT (fbAT) CCTT (FbaT) TCTT (fbaT) CCGC (FbAt) CTTC (FBat) CTTT (FBaT) TCGC (fbAt) CTGT (FBAT) TTGC (fBAt) TCTC (fbat) CCTC (FbAT) TTTC (fBat) TTTT (fBaT)

Các haplotyes CCGT (FbAT), TCGT (fbAT), CCTT (FbaT) và TCTT

(fbaT) (dòng in đậm) là các haplotype xuất hiện phổ biến trong cả 2 nhóm

bệnh nhân và nhóm NKM. Kiểm định 2 cho thấy có sự khác biệt giữa tỷ lệ

các loại haplotypes ở nhóm NKM và bệnh nhân nhiễm VRVGB với

P<0,0001.

74

3.3.1.2. Phân bố các haplotype phổ biến ở các nhóm bệnh nhân VGBMT, XG, UTBMTBG

Bảng 3.17. Phân bố các haplotype điển hình ở các nhóm bệnh nhân

Haplotypes P* FokI/BsmI/ApaI/TaqI Khác n,% CCGT (FbAT) n,% TCGT (fbAT) n,% CCTT (FbaT) n,% TCTT (fbaT) n,%

84 (43,3) 44 (22,7) 12 (6,2) 41 (21,1) 13 (6,7) VGBMT

<0,0001 Nhóm bệnh nhân 48 (34,8) 48 (34,8) 9 (6,5) 24 (17,4) 9 (6,5) XG

36 (24,7) 51 (34,9) 38 (26) 7 (4,8) 14 (9,6) UTBMTBG

Chú thích: * Kiểm định 2

Có sự khác biệt về tỷ lệ các haplotypes điển hình ở các nhóm bệnh nhân bao gồm VGBMT, XG và UTBMTBG sự

khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,0001. Trong phân tích này chúng ta thấy haplotype TCTT (fbaT) là yếu tố bảo vệ

phát triển ung thƣ gan trong khi đó haplotype CCTT là yếu tố di truyển có nguy cơ phát sinh ung thƣ gan ở bệnh nhân

nhiễm VRVGB mạn tính.

75

Bảng 3.18. Phân bố các haplotype điển hình ở nhóm bệnh nhân UTBMTBG và nhóm không UTBMTBG

CCGT TCGT CCTT TCTT Khác Haplotypes P* (FbAT) (fbAT) (FbaT) (fbaT) FokI/BsmI/ApaI/TaqI n,% n,% n,% n,% n,%

92 (27,7) 21 (6,3) 65 (19,6) 22 (6,6) VGBMT+XG 132 (39,8)

<0,0001 Nhóm bệnh nhân

36 (24,7) 51 (34,9) 38 (26) 7 (4,8%) 14 (9,6) UTBMTBG

Chú thích: * Kiểm định 2

Có sự khác biệt về tỷ lệ các haplotype điển hình giữa nhóm bệnh nhân UTBMTBG và nhóm không UTBMTBG

(VGBMT+XG), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,0001. Trong đó chúng ta thấy rằng haplotype TCTT (fbaT) là

yếu tố di truyền bảo vệ phát triển ung thƣ gan trong khi đó haplotype CCTT (FbaT) là yếu tố di truyển có nguy cơ phát

sinh ung thƣ gan ở bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính.

76

Bảng 3.19. Phân bố các haplotype điển hình ở nhóm bệnh nhân VGBMT và UTBMTBG+XG

CCGT TCGT CCTT TCTT Haplotypes Khác P* (FbAT) (fbAT) (FbaT) (fbaT) FokI/BsmI/ApaI/TaqI n,% n,% n,% n,% n,%

84 (43,3) 44 (22,7) 12 (6,2) 41 (21,1) 13 (6,7) VGBMT

<0,0001 Nhóm bệnh nhân

99 (34,9) 47 (16,5) 31 (10,9%) 23 (8,1) UTBMTBG+XG 84 (29,6)

Chú thích: * Kiểm định 2

Có sự khác biệt về tỷ lệ các haplotype điển hình giữa nhóm bệnh nhân VGBMT và nhóm UTBMTBG+XG, sự

khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,0001. Trong đó chúng ta thấy rằng haplotype TCTT (fbaT) và CCGT (FbAT) là yếu

tố liên quan đến tác dụng bảo vệ tiến triển đến bệnh giai đoạn cuối là XG và ung thƣ gan. Trong khi đó haplotype CCTT

(FbaT) và TCGT (fbAT) là hai yếu tố liên quan đến nguy cơ tiến triển đến bệnh lý gan giai đoạn cuối ở bệnh nhân nhiễm

VRVGB mạn tính.

77

3.3.2. Mối liên quan giữa các haplotype và các chỉ số cận lâm sàng

Hình 3.9. So sánh đặc điểm sinh hóa giữa các haplotype phổ biến

Ngƣời mang haplotype TCTT (fbaT) có chỉ số AST, ALT cao hơn có ý

nghĩa thống kê so với ngƣời mang haplotype khác: CCGT (FbAT), TCGT

(fbAT), CCTT (FbaT) với P=0,01 và 0,025 (Chi-squared test). Không có sự

khác biệt có ý nghĩa thống kê khi phân tích cho các chỉ số cận lâm sàng khác

bao gồm nồng độ bilirubin, albumin, tỷ lệ prothrombin, số lƣợng tế bào tiểu

cầu, tải lƣợng HBV DNA (dữ liệu không đƣợc trình bày ở đây). Biểu đồ hình

hộp (boxplot) miêu tả giá trị trung vị và các điểm tứ phân vị 25% và 75% với

các giá trị lớn nhất và nhỏ nhất và giá trị ngoại tuyến.

3.4. ĐẶC ĐIỂM VỀ NỒNG ĐỘ VITAMIN D Ở CÁC NHÓM NGHIÊN CỨU

3.4.1. Thiếu hụt vitamin D ở nhóm khỏe mạnh và nhóm bệnh nhân

Bảng 3.20. Thiếu hụt vitamin D ở nhóm khỏe mạnh và nhóm bệnh nhân

Thiếu hụt Bình thƣờng Tổng P* Ph n loại thiếu hụt vitamin D n (%) n (%) n (%)

49 (86) 8 (14) 57 (100) NKM

230 (80,4) 56 (19,6) 286 (100) 0,326 Nhóm đối tƣợng Ngƣời nhiễm VRVGB mạn tính

279 (81,3) 64 (18,7) 343 (100) Tổng

Chú thích: * Kiểm định 2

78

Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D ở NKM là 86%, ở bệnh nhân là 80,4%. Tuy

nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P=0,326.

Hình 3.10. So sánh nồng độ vitamin D giữa nhóm bệnh nhân và nhóm ngƣời

khỏe mạnh

Không có sự khác biệt về nồng độ vitamin D ở nhóm ngƣời khỏe mạnh

và bệnh nhân nhiễm VRVGB với P>0,05. Biểu đồ hình hộp (boxplot) miêu tả

giá trị trung vị và các điểm tứ phân vị 25% và 75% với các râu (whisker) tại

điểm 10% và 90%.

3.4.2. Thiếu hụt vitamin D ở nhóm bệnh nhân viêm gan B mạn tính, xơ gan

và ung thƣ biểu mô tế bào gan

Bảng 3.21. Phân bố thiếu hụt vitamin D theo nhóm bệnh

P Ph n loại thiếu hụt vitamin D Thiếu hụt n (%) Tổng n (%)

65 (70,7) 69 (77,5) Bình thƣờng n (%) 27 (29,4) 20 (22,5) 92 (100) 89 (100) VGBMT XG 0,00085* Nhóm bệnh nhân 9 (8,6) 105 (100) UTBMTBG 96 (91,4)

Chú thích: * Kiểm định 2 Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D ở nhóm bệnh nhân UTBMTBG (91,4%) cao

hơn so với tỷ lệ thiếu hụt vitamin D ở nhóm bệnh nhân VGBMT (70,7%) và

79

nhóm bệnh nhân XG (77,5%), sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với

P=0,00085.

Hình 3.11. Phân bố nồng độ vitamin D giữa có nhóm bệnh nhân nhiễm vi

rút viêm gan B mạn tính

Nồng độ trung bình vitamin D giảm dần theo phân loại giai đoạn tiến

triển bệnh. Thấp nhất ở nhóm UTBMTBG sau đó đến nhóm XG và VGBMT.

Sự khác biệt về nồng độ vitamin D giữa các nhóm có ý nghĩa thống kê với

P=0,0009. Biểu đồ hình hộp (boxplot) miêu tả giá trị trung vị và các điểm tứ

phân vị 25% và 75% với các râu (whisker) tại điểm 10% và 90%.

Hình 3.12. Nồng độ vitamin D nhóm viêm gan B mạn và nhóm ung thƣ

biểu mô tế bào gan + xơ gan

Nồng độ trung bình vitamin D thấp hơn ở nhóm XG+UTBMTBG so

với nhóm VGBMT. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P=0,00025. Biểu đồ

80

hình hộp (boxplot) miêu tả giá trị trung vị và các điểm tứ phân vị 25% và

75% với các râu (whisker) tại điểm 10% và 90%.

Hình 3.13. Nồng độ vitamin D ở nhóm bệnh ung thƣ biểu mô tế bào gan

và không ung thƣ biểu mô tế bào gan

Nồng độ trung bình vitamin D cao hơn nhóm UTBMTBG so với nhóm

không-UTBMTBG. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P=0,0109. Biểu đồ

hình hộp (boxplot) miêu tả giá trị trung vị và các điểm tứ phân vị 25% và

75% với các râu (whisker) tại điểm 10% và 90%.

Bảng 3.22. Phân loại mức độ thiếu hụt vitamin D ở nhóm chứng và

nhóm bệnh.

Nặng Nh -Vừa Rất nặng Bình thƣờng P* Mức độ thiếu hụt vitamin D n (%) n (%) n (%) n (%)

0 21 (36,8) 28 (49,1) 8 (14,1) NKM (n=57)

0,035 25 (8,7) 107 (37,4) 98 (34,3) 56 (19,6) Nhóm đối tƣợng Ngƣời nhiễm VRVGB mạn tính (n=286)

Chú thích: * Kiểm định 2

81

Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D rất nặng ở nhóm bệnh nhân viêm gan B là

8,7% trong khi không có đối tƣợng nào trong nhóm NKM bị bị thiếu hụt

vitamin D rất nặng. Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D nặng + rất nặng cao hơn có ý

nghĩa ở nhóm bệnh so với nhóm NKM (46,1% so với 36,8%). Không có đối

tƣợng nào thiếu hụt vitamin D rất nặng gặp ở nhóm NKM. Sự khác biệt về

mức độ thiếu hụt giữa các nhóm NKM và bệnh nhân có ý nghĩa thống kê với

P=0,035.

Bảng 3.23. Mức độ thiếu hụt vitamin D theo các nhóm bệnh Bình thƣờng Nặng Rất nặng Nh -Vừa P Mức độ thiếu hụt vitamin D n (%) n (%) n (%) n (%)

6 (6,5) 23 (25) 36 (39,1) 27 (29,4) VGBMT (n=92)

12 (13,5) 33 (37,1) 24 (27) 20 (22,5) XG (n=89) 0,00049* Nhóm bệnh

7 (6,6) 51 (48,6) 38 (36,2) 9 (8,6) UTBMTBG (n=105)

Chú thích: * Kiểm định 2

Tỷ lệ ngƣời thiếu hụt vitamin D nặng - rất nặng thƣờng gặp hơn ở

nhóm bệnh nhân XG (50,6%) và UTBMTBG (55,2%) so với nhóm VGBMT

(31,5%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về mức độ thiếu hụt vitamin D

giữa các nhóm bệnh ở bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính với P=0,00049.

P* Giới Bảng 3.24. Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D theo giới tính ở nhóm ngƣời khỏe mạnh Bình thƣờng n (%) Thiếu hụt n (%) Tổng n (%)

29 (78,4) 8 (21,6) 37 (100) Nam >0,05 250 (81,7) 56 (28,3) 306 (100) Nữ

Chú thích: * Kiểm định 2

Tỷ lệ thiếu vitamin D ở giới tính nam và nữ ở nhóm NKM không có sự

khác biệt có ý nghĩa thống kê với P>0,05.

82

Bảng 3.25. Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D theo giới tính ở ngƣời nhiễm vi rút

viêm gan B

P Giới Thiếu hụt n (%) Bình thƣờng n (%) Tổng n (%)

242 (81,2) 56 (18,8) 298 (100) Nam

>0,05*

37 (82,2) 8 (17,8) 45 (100) Nữ

Chú thích: * Kiểm định 2

Không có sự khác biệt về sự thiếu hụt vitamin D ở 2 giới nam và nữ, với

P>0,05

3.4.3. Phân bố nồng độ vitamin D theo kiểu gen của các biến thể VDR

3.4.3.1. So sánh nồng độ vitamin D giữa các kiểu gen VDR ApaI

Hình 3.14. Phân bố nồng độ vitamin D theo kiểu gen của biến thể ApaI

Ngƣời mang kiểu gen ApaI GG có nồng độ vitamin D cao hơn có ý

nghĩa so với 2 kiểu gen TG và TT ở cả 2 nhóm bệnh nhân viêm gan do

VRVGB mạn tính và nhóm khoẻ mạnh (P<0,05). Biểu đồ thể hiện giá trị

trung bình và khoảng tin cậy 95%.

83

3.4.3.2. Nồng độ vitamin D ở các kiểu gen của các biến thể VDR khác

Hình 3.15. Phân bố nồng độ vitamin D theo kiểu gen của biến thể FokI

Không có sự khác biệt về nồng độ vitamin D giữa các kiểu gen của

biến thể VDR FokI ở nhóm NKM và nhóm bệnh nhân nhiễm VRVGB

(P>0,05). Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình và khoảng tin cây 95%.

Hình 3.16. Phân bố nồng độ vitamin D theo kiểu gen của biến thể BsmI

Không có sự khác biệt về nồng độ vitamin D giữa các kiểu gen của

biến thể VDR BsmI ở nhóm NKM và nhóm bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn

tính (P>0,05). Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình và khoảng tin cậy 95%.

84

Hình 3.17. Phân bố nồng độ vitamin D theo kiểu gen của biến thể TaqI

Không có sự khác biệt về nồng độ vitamin D giữa các genotype biến thể

VDR TaqI trong các nhóm đối tƣợng NKM và bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính

P>0,05. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình và khoảng tin cậy 95%.

3.4.4. Mối liên quan giữa biến thể VDR và nồng độ vitamin D với các

thông số cận lâm sàng.

3.4.4.1. Mối liên quan giữa các biến thể VDR và thông số cận lâm sàng

Hình 3.18. Mối tƣơng quan giữa kiểu gen ApaI với các chỉ số cận lâm sàng

85

Biến thể VDR ApaI (rs7975232): Nồng độ enzyme AST và ALT cao

hơn có ý nghĩa ở bệnh nhân mang kiểu gen TG so với GG và TT (Enzyme

AST: P=0,012; Enzyme ALT, P=0,017). Phân tích hậu định (post-hoc

analysis) cho thấy có sự khác biệt khi so sánh từ cặp giữa các genotype TG vs.

GG và TG vs. TT cho cả hai loại enzyme. Không có sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê khi phân tích cho các chỉ số cận lâm sàng khác bao gồm nồng độ

bilirubin, albumin, tỷ lệ prothrombin, số lƣợng tế bào tiểu cầu (dữ liệu không

được trình bày). Đối với các biến thể BsmI (rs1544410), FokI (rs10735810) và

TaqI (rs731236): Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi phân tích cho

tất cả các chỉ số cận lâm sàng bao gồm nồng độ enzyme AST và ALT, bilirubin,

albumin, tỷ lệ prothrombin, số lƣợng tế bào tiểu cầu, tải lƣợng HBV DNA (dữ

liệu không được trình bày). Biểu đồ hình hộp (boxplot) miêu tả giá trị trung vị

và các điểm tứ phân vị 25% và 75% với các râu (whisker) 10% và 90%.

86

CHƢƠNG 4

BÀN LUẬN

Nhiễm VRVGB đƣợc cho là một vấn đề sức khỏe y tế toàn cầu [101],

[102]. WHO ƣớc tính có khoảng 257 triệu ngƣời bị nhiễm mạn tính (chiếm

khoảng 3,9% dân số toàn cầu). Diễn biến tự nhiên và hậu quả lâm sàng của

nhiễm VRVGB rất đa dạng. Khoảng 90-95% ngƣời trƣởng thành bị nhiễm có

thể loại bỏ vi rút, chỉ khoảng 5-10% trong số họ trở thành ngƣời nhiễm

VRVGB mạn tính, 20-30% ngƣời nhiễm VRVGB mạn tính phát triển bệnh

VGBMT và 5% trong số họ phát triển XG và UTBMTBG trong một thời gian

dài của quá trình bệnh. Một số trƣờng hợp hiếm gặp dẫn đến bệnh cảnh viêm

gan tối cấp – dẫn đến suy gan và tử vong nhanh chóng, trong khi một số

ngƣời mang VRVGB mà không hề có bất cứ biểu hiện lâm sàng. Ngoài các

yếu tố về thời gian nhiễm, giới tính, tình trạng miễn dịch, các rối loạn chuyển

hóa, có nhiều bằng chứng cho thấy các yếu tố di truyền đóng vai trò quan

trọng trong việc xác định kết quả của nhiễm VRVGB. Các yếu tố di truyền

chủ yếu là các biến thể di truyền của gen vật chủ ảnh hƣởng đến quá trình

bệnh lý nhiễm VRVGB [103], [104]. Rất nhiều nghiên cứu về vai trò của các

biến thể di truyền của các gen liên quan đến cơ chế đáp ứng miễn dịch của cơ

thể trong mối tƣơng tác với vi rút đối với hậu quả lâm sàng của bệnh nhân

nhiễm VRVGB mạn tính [105], [106], [107], [108], trong đó có nghiên cứu

về vai trò các biến thể của gen VDR [7], [8], [9], [109].

Sự phát hiện ra thụ cảm thể VDR và sự biểu hiện của nó trên nhiều tế bào

miễn dịch cũng nhƣ trong nhiều mô cơ quan khác nhau giúp chúng ta hiểu

biết sâu hơn về vai trò của mối tƣơng tác vitamin D-VDR liên quan đến cơ

chế đáp ứng miễn dịch. Hơn nữa, các nghiên cứu về tác dụng phân tử của

vitamin D và VDR cũng nhƣ mối tƣơng tác của chúng với các con đƣờng tín

hiệu sinh học khác nhau trong cơ thể đã giúp chúng ta hiểu hơn về vai trò của

87

vitamin D và VDR trong sinh bệnh học của nhiều tình trạng bệnh lý của

ngƣời.

Gen mã hoá thụ thể VDR nằm trên nhiễm sắc thể số 12 (12q13.1) và bao

gồm 11 exon. Exon 1A, 1B và 1C tạo nên vùng 5’ không mã hoá. 8 exon

(Exon 2-9) mã hoá các thành phần cấu trúc của VDR. Ngoài ra gen mã hóa

thụ thể VDR có một vùng khung khởi động (promoter region) lớn với nhiều

vùng phiên mã đặc hiệu mô [110]. Sự đa hình của gen VDR có thể ảnh hƣởng

đến ái lực gắn kết của nó với vitamin D và yếu tố đáp ứng vitamin D (VDRE-

vitamin D response element), do đó, ảnh hƣởng đến các hoạt động phiên mã

và protein đƣợc tổng hợp. Trong số rất nhiều các biến thể của VDR, phần lớn

các nghiên cứu tập trung vào nghiên cứu vai trò tính đa hình điểm đơn

nucleotid của các biến thể sau: FokI (rs2228570C>T, các các genotype tƣơng

ứng FF, Ff, ff), BsmI (rs1544410T>C, các genotype tƣơng ứng BB, Bb, bb),

ApaI (rs7975232G>T, các các genotype tƣơng ứng AA, Aa, aa) và TaqI

(rs731236T>C, các genotype tƣơng ứng TT, Tt, tt) trong nhiều bệnh lý khác

nhau [3] trong đó có bệnh lý gan mạn tính liên quan đến nguy cơ nhiễm

VRVGB và tiến triển bệnh lý gan liên quan [5], [6], [7], [9], [109].

Với mối liên quan chặt giữa UTBMTBG-VGB, mối liên quan tiềm tàng

giữa nhiễm VRVGB cũng nhƣ tiến triển lâm sàng với đa hình gen VDR, các

nghiên cứu đã đặt ra câu hỏi liệu đa hình gen VDR có ảnh hƣởng đến quá

trình tiến triển từ VGBMT sang UTBMTBG hay không. Trên thực tế, các

nghiên cứu về các biến thể VDR tập trung trên các loại ung thƣ nhƣ ung thƣ

vú, ung thƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ da… số lƣợng nghiên trên nhóm bệnh ung

thƣ gan còn rất hạn chế [88]. Ngoài ra, các công bố này phân tích trên các đa

hình VDR khác nhau, các khu vực địa lý khác nhau nên các kết quả thƣờng

không đƣợc thống nhất.

Trong luận án này, chúng tôi lần đầu tiên tại Việt Nam tiến hành nghiên

cứu và đánh giá đặc điểm phân tử của bốn biến thể VDR [TaqI (rs731236),

88

FokI (rs2228570), ApaI (rs7975232) và BsmI (rs1544410)] trên các đối tƣợng

bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính và mối tƣơng quan của chúng đối với

diễn biến và bệnh cảnh lâm sàng. Ngoài ra nghiên cứu này cũng tìm hiểu về

tình trạng thiếu hụt nồng độ vitamin D và ảnh hƣởng của sự thiếu hụt đến tình

trạng bệnh lý gan ở ngƣời nhiễm VRVGB mạn tính. Kết quả nghiên cứu của

chúng tôi cho thấy rằng biến thể VDR ApaI và nồng độ vitamin D huyết

thanh có mối liên quan đến tiến triển lâm sàng ở bệnh nhân VGBMT.

4.1. ĐA HÌNH GEN VDR TRONG BỆNH LÝ VIÊM GẠN MẠN TÍNH

DO VI RÚT VIÊM GAN B

4.1.1. Mối liên quan giữa tính đa hình gen VDR đối với nguy cơ nhiễm vi

rút viêm gan B và biểu hiện lâm sàng

Biến thể ApaI

Năm trong số 15 nghiên cứu trong phân tích tổng hợp đã đánh giá mối

liên quan của đa hình ApaI với nguy cơ nhiễm VRVGB. Tuy nhiên không có

mối tƣơng quan nào đƣợc quan sát [CC vs. CA+AA: P=0,84, OR

(95%CI)=1,03 (0,80-1,31)] [83]. Một nghiên cứu khác tìm hiểu ảnh hƣởng

của các đa hình ApaI và TaqI đối với nguy cơ lây truyền VRVGB từ mẹ sang

con. Nhóm đối tƣợng nghiên cứu bao gồm 102 trẻ em có độ tuổi trung bình

9,17, trong đó có 33 trẻ viêm gan mạn, 36 trẻ âm tính với HBsAg và 33 trẻ

nhiễm VRVGB chƣa tiến triển lên mạn tính. Kết quả cho thấy dạng alen ApaI

a (T) cùng với haplotype của đa hình ApaI/TaqI xuất hiện nhiều hơn ở nhóm

trẻ em không nhiễm VRVGB so với nhóm tiến triển lên VGBMT [6]. Từ

nghiên cứu này có thể thấy khả năng cảm nhiễm VRVGB và khả năng tiến

triển lên viêm gan mạn tính của trẻ có mẹ bị nhiễm VRVGB cũng phụ thuộc

vào các đa hình gen VDR. Ngoài ra cũng có thể hiểu rằng các biến thể này có

ý nghĩa trong việc kháng lại VGB từ các giai đoạn rất sớm.

Tuy nhiên, không phải nghiên cứu nào cũng cho thấy các đa hình này có

liên quan ý nghĩa trong VGBMT. Suneetha P.V và cộng sự không tìm thấy sự

89

khác biệt nào khi so sánh 214 ca bệnh nhân VGBMT và 408 ca chứng ở thể

đa hình ApaI và TaqI. Tuy nhiên, kiểu alen T của ApaI lại có ý nghĩa khi xác

định mức độ nghiêm trọng của bệnh. Mức độ đó đƣợc chia theo thang chỉ số

hoạt tính mô học và mức độ xơ hóa gan, những ngƣời mang kiểu gen TT

thƣờng có bệnh nặng hơn so với ngƣời mang các kiểu gen còn lại. Ngoài ra,

mặc dù không có ý nghĩa trong phân chia giữa ngƣời mang bệnh và không

mang bệnh, haplotype TC của đa hình ApaI và TaqI xuất hiện phổ biến trên

bệnh nhân mắc bệnh nặng, ít xuất hiện hơn trên ngƣời mắc bệnh nhẹ tính theo

thang điểm mức độ viêm nhiễm (7,7% so với 18,0%, P=0,02, OR=2,7,

95%CI=1,2-6) hay thang đo độ xơ hóa (3% so với 9,1%, P=0,05, OR=3,3,

95% CI=1-11) [111].

Trong nghiên cứu của chúng tôi khi so sánh tần suất xuất hiện kiểu gen

và kiểu alen giữa nhóm chứng là NKM (n=238) và nhóm bệnh nhân nhiễm

VRVGB (n=298), không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 2 nhóm

này. Tuy nhiên khi phân tích dƣới nhóm: so sánh giữa hai nhóm UTBMTBG

và NKM chúng tôi thấy có sự khác biệt có ý nghĩa về tần suất của các kiểu

gen trong mô hình phân tích di truyền đồng trội [phân tích hồi quy logistic

điều chỉnh tuổi và giới: TT vs. GG: OR=3,17 (1,05-9,94), P=0,042] và mô

hình lặn [phân tích hồi quy logistic điều chỉnh tuổi và giới) TT vs. GG+GT:

OR=3,5 (1,14-10,9), P=0,024]. Các phân tích dƣới nhóm tiếp theo cũng cho

thấy kết quả tƣơng tự khi so sánh tần xuất kiểu gen ApaI giữa hai nhóm

UTBMTBG và VGBMT trong các mô hình phân tích di truyền [mô hình lặn:

phân tích đơn biến: OR=3,1 (1,1-9,2), P=0,033; phân tích đa biến điều chỉnh

cho tuổi và giới: OR=4,3 (1,2-15), P=0,017]. Nhƣ vậy qua nghiên cứu này,

chúng tôi có thể kết luận ngƣời mang kiểu gen ApaI TT (aa) liên quan đến

tăng nguy tiến triển ung thƣ gan ở ngƣời nhiễm VRVGB mạn tính và ngƣời

khỏe mang kiểu gen này. Nghiên cứu về tính đa hình của các biến thể VDR

trên đối tƣợng ngƣời Việt Nam nhiễm VRVGB mạn tính là nghiên cứu đầu

90

tiên cho thấy mối liên hệ độc lập giữa kiểu gen ApaI TT và nguy cơ tiến triển

ung thƣ gan cũng nhƣ bệnh lý gan giai đoạn cuối bao gồm XG và UTBMTBG

ở bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính trong mô hình di truyền lặn

[UTBMTBG+XG vs. VGBMT: phân tích đơn biến OR=2,6 (0,95-7,2,

P=0,054; phân tích đa biến điều chỉnh cho tuổi và giới: OR=3,2 (1,03-9,9),

P=0,032].

Cho đến nay không có nhiều nghiên cứu tìm hiểu mối liên quan giữa đa

hình ApaI và tiến triển của bệnh lý gan liên quan đến nhiễm VRVGB. Một số

ít nghiên cứu trƣớc đây đã chỉ ra rằng đa hình ApaI không cho thấy mối liên

quan có ý nghĩa đối với các nguy cơ và tiến triển của UTBMTBG [8], [111],

[112].

Ngoài ra, mối liên quan của kiểu gen ApaI CC với sự phát triển của

UTBMTBG ở bệnh nhân VGCMT cũng đƣợc báo cáo trong nghiên cứu của

Hung C.H. và cộng sự [113]. Bệnh nhân bị UTBMTBG có kiểu gen ApaI CC

(P=0,027) cao hơn so với nhóm chứng là các bệnh nhân VGCMT và XG

không bị UTBMTBG. Bệnh nhân UTBMTBG có kiểu gen ApaI CC cao hơn

so với những ngƣời bị viêm gan mạn tính (P=0,001) và XG (P=0,009). Sau

khi điều chỉnh tuổi và giới tính, phân tích hồi quy logistic cho thấy kiểu gen

ApaI CC có nguy cơ bị UTBMTBG cao hơn gấp 3,02 (95%CI: 1,65-5,51,

P<0,05) so với nhóm không mang kiểu gen CC (AA+CA) [113]. Tuy nhiên

Mengping Wu M. và các cộng sự nghiên cứu trên một cỡ mẫu lớn với 898

trƣờng hợp nhiễm VRVGC mạn tính, 558 đối tƣợng nhiễm VRVGC tự khỏi

và 1136 đối tƣợng NKM. Các phân tích hồi quy cho thấy alen ApaI C là yếu

tố độc lập làm giảm khả năng nhiễm VRVGC ở một số đối tƣợng có nguy cơ

cao [114]. Một nghiên cứu gần đây cũng đã chỉ ra rằng đa hình ApaI có liên

quan đến mức độ nghiêm trọng của bệnh XG do nhiều nguyên nhân khác

nhau [85].

91

Biến thể FokI

Tính đa hình của FokI đƣợc quan tâm nhiều bởi vì biến thể này tạo ra

một sự thay đổi ở mã khởi đầu ATG thành ACG, dẫn đến sự biến đổi VDR

bằng ba acid amin [4]. Protein biến đổi, đƣợc mã hóa bởi alen FokI F(C),

protein này liên kết hiệu quả hơn đối với vitamin D so với protein không bị

biến đổi (trình tự dài hơn) đƣợc mã hóa bởi alen f(T) [4]. Có ý kiến cho rằng

sự thay đổi cấu trúc VDR có thể làm thay đổi chức năng sinh học của tín hiệu

phiên mã VDR-vitamin D và có thể góp phần gây ung thƣ, tự miễn dịch và dễ

mắc các bệnh truyền nhiễm, bao gồm viêm gan vi rút [9], [88].

Cho đến nay một số nghiên cứu đã công bố có mối liên quan có ý nghĩa

giữa biến thể FokI đối với diễn biến và hậu quả lâm sàng ở bệnh nhân nhiễm

VRVGB [83], [115], [116]. Nghiên cứu của Li J.H. và cộng sự năm 2006

[115] khảo sát tính đa hình của biến thể này trên 212 ngƣời nhiễm VRVGB đã

khỏi, 244 ngƣời mang HBsAg không triệu chứng và 391 bệnh nhân VGBMT

bằng phƣơng pháp đa hình đoạn giới hạn phản ứng chuỗi polymerase (PCR-

RFLP). Kết quả cho thấy rằng n alen C của biến thể FokI ở bệnh nhân

VGBMT là 45,8%, cao hơn có ý nghĩa so với 38,2% ở nhóm ngƣời nhiễm đã

thải loại vi rút (P=0,01). Kết quả phân tích đơn biến cho thấy các đối tƣợng

mang kiểu gen CC/TC VDR-FokI có nguy cơ mắc viêm gan mạn tính cao gấp

1,57 lần khi họ bị nhiễm VRVGB cấp (OR=1,57, P=0,01). Phân tích hồi quy

logistic cũng cho thấy kiểu gen CC/CT VDR-FokI là yếu tố tiên lƣợng độc lập

đối với VGBMT (OR=1,70, P=0,021).

Kết quả phân tích trên tƣơng đƣơng trên nhóm bệnh nhân ngƣời Hán ở

Trung Quốc với 184 bệnh nhân VGBMT và 205 ngƣời mang VRVGB không

triệu chứng. Kết quả phân tích đơn biến cho thấy sự khác biệt đáng kể về đa

hình FokI giữa nhóm bệnh nhân VGBMT và nhóm ngƣời mang VRVGB

không triệu chứng. Tần suất xuất hiện kiểu gen FF (hoặc CC) ở nhóm bệnh

nhân VGBMT là 44,6%, cao hơn 31,7% ở nhóm ngƣời mang VRVGB không

92

triệu chứng (P<0,05). Sau khi điều chỉnh các yếu tố gây nhiễu bằng phân tích

hồi quy logistic nhiều, kết quả vẫn cho thấy sự khác biệt đáng kể về đa hình vị

trí FokI giữa nhóm bệnh nhân VGBMT và nhóm ngƣời mang VRVGB không

triệu chứng (OR=1,95, P<0,05) [116]. Một kết quả phân tích khác cho thấy

haplotype fT-FokI/TaqI có tần suất xuất hiện thấp hơn ở nhóm bệnh nhân

VGBMT so với nhóm ngƣời nhiễm VRVGB đã khỏi (OR=0,72, P<0,05)

[116].

Trong một phân tích tổng hợp [83] năm 2018 tổng hợp từ tám nghiên

cứu về biến thể FokI ở bệnh nhân nhiễm VRVGB - đánh giá về vai trò của đa

hình FokI đối với nguy cơ nhiễm VRVGB. Trong số 8 nghiên cứu có tổng

cộng 2516 trƣờng hợp VGBMT và 1088 NKM thuộc nhóm chứng. Kết quả

phân tích tổng hợp cho thất sự đa hình của FokI có liên quan ý nghĩa đối với

nhiễm VRVGB [83]. Trái ngƣợc với các kết quả của các nghiên cứu trên,

nghiên cứu của Karatayli S.C. và cộng sự [7] khảo sát trên 117 bệnh nhân

VGBMT và 56 bệnh nhân nhiễm VRVGB đã khỏi đƣợc xác định kiểu gen

cho biến thể VDR FokI. Tác giả công bố không có sự khác biệt giữa các

nhóm đã đƣợc quan sát (P>0,05). Tƣơng tự, nghiên cứu của chúng tôi tiến

hành trên 298 bệnh nhân nhiễm VRVGB và 238 NKM là nhóm đối chứng.

Kết quả phân tích về tần suất xuất hiện kiểu gen (phân tích đơn biến và đa

biến) đều không cho thấy mối tƣơng quan giữa biến thể này đối với nguy cơ

nhiễm VRVGB và tiến triển lâm sàng đối với biến thể này.

Yao X. và cộng sự [8] nghiên cứu đánh giá mối liên quan có thể có giữa

SNPs VDR và UTBMTBG ở bệnh nhân nhiễm VRVGB. Trong nghiên cứu

này, 968 bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính đã đƣợc đƣa vào nghiên cứu,

trong đó có 436 bệnh nhân đƣợc chẩn đoán là bệnh nhân UTBMTBG, và 532

bệnh nhân không phải là UTBMTBG. Các bệnh nhân này đƣợc phân tích cả 4

thể đa hình của VDR, cùng với đó là đánh giá các yếu tố lâm sàng khác, từ đó

sử dụng các mô hình hồi quy để đánh giá giá trị của đa hình VDR. Kết quả

93

phân tích thấy rằng n kiểu gen của đa hình VDR FokI C/T khác nhau đáng kể

giữa các nhóm UTBMTBG và không UTBMTBG. Trong công bố này, chỉ

duy nhất có đa hình FokI là có ý nghĩa trong phân biệt nhóm UTBMTBG.

Kiểu gen TT thƣờng xuất hiện ở bệnh nhân UTBMTBG (30,05%) so với

nhóm chứng (19,17%, P<0,001). Với FokI CC nhƣ tham chiếu, ngƣời mang

kiểu gen TT có nguy cơ phát triển UTBMTBG cao hơn đáng kể sau khi điều

chỉnh theo tuổi, giới tính, thời gian nhiễm VRVGB, AFP, tình trạng hút thuốc

và uống rƣợu. Cùng với đó, alen T cũng cho thấy tần suất xuất hiện cao hơn

trên nhóm UTBMTBG (P<0,001) [8]. Ngoài ra, nghiên cứu này cũng phát

hiện ra rằng điểm đa hình FokI có liên quan đến giai đoạn khối u tiến triển, sự

hiện diện của bệnh XG và di căn hạch.

Tuy nhiên có thể thấy rằng trong khi kiểu gen CC và alen C làm tăng khả

năng nhiễm VRVGB [83], trong trƣờng hợp bệnh nhân đã nhiễm VRVGB thì

kiểu alen T lại làm tăng nguy cơ phát triển thành ung thƣ gan. Vì vậy, tuy

cùng là một vị trí đa hình nhƣng lại có ý nghĩa khác nhau trong từng giai đoạn

bệnh. Tiếp đó, với việc phân tích hồi quy và loại bỏ các thông số gây nhiễu,

tác giả đã chỉ ra trên nhóm ung thƣ gan giai đoạn muộn, kiểu gen TT có ảnh

hƣởng hơn kiểu CC (UTBMTBG giai đoạn III+IV, OR=2,335, P<0,001) và

ngƣời mang kiểu gen TT có chỉ số AFP cao hơn so với ngƣời bệnh ung thƣ

gan mang kiểu gen CT (P=0,015) và CC (P=0,011).

Một nghiên cứu khác cũng tại Trung Quốc cũng chỉ ra kết quả tƣơng tự

với báo cáo trên. Bằng phƣơng pháp PCR-RFLP, 660 ngƣời bao gồm 184

bệnh nhân ung thƣ gan do nhiễm VRVGB, 296 ca nhiễm VRVGB không triệu

chứng và 180 NKM đƣợc khảo sát tính đa hình của gen VDR. Một lần nữa

chỉ có đa hình FokI là có ý nghĩa khi so sánh các yếu tố giữa nhóm

UTBMTBG và các nhóm còn lại. Kết quả phân tích hồi quy cho thấy kiểu gen

TT và TC làm tăng nguy cơ UTBMTBG so với kiểu CC (TT vs. CC:

94

OR =2,15, 95%CI =1,13-4,08, P= 0,032; TT+TC vs. CC: OR=1,82,

95%CI=1,04-3,27, P=0,039) [89].

Mặc dù các nghiên cứu về tính đa hình gen FokI đối với nguy cơ nhiễm

VRVGB cũng nhƣ tiến triển bệnh còn chƣa thống nhất, tuy nhiên các kết quả

phân tích từ các nghiên cứu trên thể hiện rằng đa hình FokI của VDR là một

dấu ấn sinh học rất có tiềm năng trong theo dõi các trƣờng hợp nhiễm

VRVGB nói chung và trong chẩn đoán UTBMTBG nói riêng.

Biến thể TaqI và BsmI

Không giống nhƣ biến thể FokI, biến thể TaqI và BsmI không ảnh hƣởng

đến chức năng của VDR [117]. Nghiên cứu của chúng tôi cũng nhƣ hầu hết

các nghiên cứu đã đƣợc thực hiện về mối liên quan giữa tính đa hình của hai

biến thể này đối với nguy cơ nhiễm VRVGB hoặc tiến triển bệnh lý gan mạn

đều không cho kết quả có ý nghĩa. Trong một phân tích tổng hợp bao gồm 15

nghiên cứu về mối liên quan của 4 SNPs và nguy cơ nhiễm VRVGB cũng

nhƣ tiến triển lâm sàng của VGBMT. Đối với đa hình TaqI, 9 nghiên cứu về

mối liên quan giữa biến thể TaqI và nguy cơ nhiễm VRVGB đƣợc đƣa vào

trong phân tích tổng hợp này với 2702 trƣờng hợp nhiễm VRVGB mạn tính

và 1570 ngƣời thuộc nhóm chứng (xét nghiệm phát hiện VRVGB và VGVRC

âm tính) đƣợc đƣa vào để phân tích. Tuy nhiên kết quả phân tích chỉ ra rằng

không có mối liên quan giữa đa hình TaqI và nguy cơ nhiễm VRVGB đƣợc

quan sát dƣới bất kỳ mô hình phân tích di truyền nào.

Trong một nghiên cứu của Karatayli S.C. và cộng sự [7] đánh giá vai trò

của TaqI đối với nhiễm vi rút viêm gan D ở các bệnh nhân VGBMT. Trong

nghiên cứu này, tổng cộng 67 bệnh nhân mắc VGDMT, 118 bệnh nhân

VGBMT và 56 bệnh nhân nhiễm VRVGB đã thải loại vi rút đƣợc xác định

kiểu gen. Kết quả cho thấy tần suất kiểu gen TT là 86,6% ở bệnh nhân

VGDMT, 62,7% ở bệnh nhân VGBMT và 62,5% ở những ngƣời VGB đã

phân giải (VGDMT so với VGBMT, P=0,001).

95

Viêm gan B tiềm ẩn là một thể lâm sàng nguy hiểm, với HBsAg âm tính,

anti-HBc dƣơng tính/ âm tính và tải lƣợng HBV DNA thấp hơn 200 IU/ mL.

Viêm gan B thể tiềm ẩn có thể khiến bệnh nhân không phát hiện và điều trị

kịp thời các tiến triển của bệnh nhƣ XG, ung thƣ gan. Khảo sát trên nhóm

ngƣời Iran nhiễm VRVGB tiềm ẩn vào năm 2010 cho thấy có ý nghĩa thống

kê sự khác biệt trên đa hình TaqI kiểu gen CC với 3,5% ở bệnh nhân so với

18% ở nhóm chứng (P<0,05), kiểu gen CT trên nhóm bệnh và nhóm chứng

lần lƣợt là 43,8% và 35% (P<0,24) [5].

Tính đa hình của biến thể VDR TaqI đƣợc nghiên cứu nhiều trong một

số bệnh ác tính nhƣ ung thƣ vú, ung thƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ da, ung thƣ

đại trực tràng, ung thƣ gan và một số các khối u ác tính khác [88], [118]. Tuy

nhiên, vai trò của biến thể này đối với sự phát triển của ung thƣ vẫn còn nhiều

tranh luận. Hai phân tích tổng hợp nghiên cứu về mối liên quan của đa hình

TaqI với sự phát triển của ung thƣ đại trực tràng, mang lại kết quả không nhất

quán [119], [120]. Trong khi Serrano D. và cộng sự báo cáo rằng kiểu gen

CC làm tăng nguy cơ ung thƣ đại trực tràng lên 43%, nhƣng không là yếu tố

nguy cơ đối với sự phát triển của các ung thƣ khác [119], nhóm nghiên cứu

của Sheng S. và cộng sự kết luận rằng không có mối liên quan giữa kiểu gen

này đối với sự phát triển ung thƣ đại trực tràng [120]. Liên quan đến sự liên

quan của đa hình TaqI với ung thƣ gan, nghiên cứu của chúng tôi xác nhận rõ

ràng các nghiên cứu khác, cho thấy không có mối liên quan đáng kể nào giữa

đa hình TaqI và tiến triển bệnh gan cũng nhƣ sự phát triển của UTBMTBG

trong cả nhiễm VRVGB và VRVGC [8], [113], [121].

Đối với BsmI, dữ liệu về mối liên quan giữa biến thể này với nguy cơ

nhiễm VRVGB là rất ít. Cho đến nay có khoảng hai nghiên cứu về mối liên

quan của đa hình BsmI với nhiễm VRVGB đã đƣợc công bố [8], [122].

Những nghiên cứu này đƣợc đƣa vào phân tích tổng hợp [83] đã đƣợc nêu ở

96

trên. Kết quả phân tích cho thấy biến thể BsmI không liên quan đến nguy cơ

cảm nhiễm VRVGB cũng nhƣ tiến triển lâm sàng.

4.1.2. Mối liên quan giữa tính đa hình gen VDR và mức độ nặng của bệnh

lý gan mạn tính

Ở phần trên chúng tôi đã bàn luận về mối liên quan của các biến thể

VDR đối với nguy cơ nhiễm VRVGB, nguy cơ phát triển XG và ung thƣ gan.

Trong phần bàn luận này chúng tôi sẽ bàn luận thêm về vai trò của các kiểu

gen và haplotype đối với mức độ nặng của bệnh lý gan mạn tính và mối liên

quan của nó đối với các thông số xét nghiệm liên quan đến chức năng gan.

Cho đến nay không nhiều các nghiên cứu về biến thể VDR ở các bệnh nhân

VGBMT đánh giá mối liên quan của các biến thể FokI, BsmI, ApaI, TaqI đối

với mức độ nặng của bệnh và tƣơng quan đối với các thông số chức năng gan.

Huang Y.W. và cộng sự [121] nghiên mối liên quan giữa biến thể VDR đối

với nguy cơ phát triển đợt cấp tính trên nên VGBMT tại Đài Loan. Kết quả

phân tích hồi quy logistic điều chỉnh cho tuổi và giới cho thấy các kiểu gen

BsmI Bb (CT), ApaI AA (GG), TaqI tt (CC) là các yếu tố nguy cơ độc lập

trong tiên lƣợng viêm gan cấp tính trên nền viêm gan mạn tính. Ngoài ra

BsmI BB (CC) và TaqI Tt (TC) là những yếu tố tiên lƣợng độc lập liên quan

đến tình trạng HBeAg ở bệnh nhân nhiễm VRVGB [121].

Nghiên cứu của Suneetha P.V. và cộng sự là nghiên cứu đầu tiên tìm

hiểu mối liên quan của các biến thể VDR đối với mức độ nặng của bệnh gan

do nhiễm VRVGB mạn tính [111]. Nghiên cứu tiến hành phân tích biến thể

ApaI trên 214 bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính và 408 NKM. Kết quả

phân tích cho thấy kiểu gen này cũng là yếu tố độc lập liên quan có ý nghĩa

với mức độ xơ hóa gan dựa trên chỉ số HAI (Hepatic Activity Index) (nặng

vs. nhẹ-trung bình: 23,7% vs. 5%, P<0,001). Kết quả này phù hợp với một

nghiên cứu khác cho thấy alen ApaI a là yếu tố tiên lƣợng độc lập đối với tình

trạng xơ hóa gan ở bệnh nhân VGBMT [123]. Nghiên cứu của Triantos C. và

97

cộng sự cũng chứng minh các đa hình ApaI, TaqI và BsmI có liên quan đến

mức độ nghiêm trọng của bệnh XG, thông qua quá trình điều hòa miễn dịch

[85]. Ngoài ra tỷ lệ ngƣời mang alen T cũng cao hơn có ý nghĩa ở nhóm có tải

lƣợng HBV DNA cao so với nhóm bệnh nhân có tải lƣợng HBV DNA thấp

(11% vs. 2,6%, P=0,002) [111].

Nghiên cứu của chúng tôi không phát hiện đƣợc sự liên quan có ý nghĩa

giữa các đa hình VDR đối với tình trạng xơ hóa gan cũng nhƣ mức độ nặng

xơ hóa gan dựa vào chỉ số child-pugh (dữ liệu không đƣợc trình bày). Tuy

nhiên, chúng tôi thấy rằng trong số bốn biến thể VDR thì chỉ có ApaI có mối

liên quan đến chỉ số enzyme AST và ALT. Không giống với nghiên cứu của

P. V. Suneetha [111], chúng tôi không thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê khi phân tích cho các chỉ số cận lâm sàng khác bao gồm tải lƣợng HBV

DNA, nồng độ bilirubin, albumin, tỷ lệ prothrombin, số lƣợng tế bào tiểu cầu.

Đối với các biến thể BsmI, FokI và TaqI, không có sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê khi phân tích cho tất cả các chỉ số cận lâm sàng nêu trên.

4.2. MỐI LIÊN QUAN GIỮA CÁC HAPLOTYPE CỦA VDR VÀ VIÊM

GAN B MẠN TÍNH

Trong số 4 biến thể VDR đƣợc khảo sát trong nghiên cứu này thì ba

điểm đa hình BmsI, ApaI và TaqI đều nằm gần đoạn 3’UTR. Đây là vùng

quan trọng trong việc biểu hiện gen cũng nhƣ quy định đến sự ổn định của

mRNA. Khi mRNA của VDR càng ổn định, khả năng biểu hiện của VDR ở

các tế bào đích cũng nhƣ tƣơng tác của tế bào với vitamin D càng tăng. Vì ba

biến thể này nằm khá gần nhau ở vùng đầu gần 3’UTR chính vì vậy các

nghiên cứu thƣờng khảo sát cùng một lúc các đa hình này cùng với các kiểu

gen đơn bội (haplotype) của nó. Chính vì thế chúng tôi phân tích tần suất và

mối liên quan giữa các haplotype đƣợc cấu thành từ 4 biến thể (FokI, BsmI,

ApaI và TaqI) đối với nguy cơ nhiễm và tiến triển lâm sàng bệnh lý VGBMT.

98

Gần đây một số nghiên cứu khảo sát mối liên quan của haplotype đƣợc

cấu thành bởi 3 locus này trong một số bệnh lý gan do các tác nhân khác nhau

[124], [125], [126], [127], [128]. Nghiên cứu trên bệnh nhân VGBMT tại Đài

Loan bởi Huang Y.W. và cộng sự [121] cho thấy các haplotype bAT, BaT,

BAT, BAt, bAt có tần suất cao hơn có ý nghĩa ở các bệnh nhân có HBeAg

dƣơng tính. Ngoài ra ở bệnh nhân với biểu hiện đợt viêm gan cấp tính trên

nền mạn tính có tần suất các haplotype Ba, BT và BaT cao hơn có ý nghĩa so

với nhóm không mang các haplotype này (1% vs. 9%, P=0,004; 3 vs. 10%,

P=0,007; 1 vs. 9%, P=0,005). Trong nghiên cứu này, tác giả cũng chỉ ra rằng

không có mối liên quan giữa các kiểu gen và haplotype nghiên cứu đối với sự

tiến triển ung thƣ gan.

Nghiên cứu đƣợc thực hiện bởi Falleti E. và cộng sự đánh giá mối liên

quan giữa các haplotype của VDR đối với nguy cơ tiến triển ung thƣ gan trên

các bệnh nhân có bệnh nền XG khi so sánh hai nhóm XG do rƣợu (n=103) và

nhóm XG do vi rút: VRVGC (n=100) và VRVGB (n=37) [118]. Kết quả cho

thấy haplotype Bat (ATC) và bAT (GGT) là các haplotype phổ biến trong các

nhóm nghiên cứu. Phân tích cho thấy không có sự khác biệt về sự phân bố hai

haplotype ở nhóm ung thƣ và không ung thƣ do nguyên nhân vi rút. Ngƣợc

lại, hai haplotype này liên quan có ý nghĩa đến phát triển ung thƣ gan ở bệnh

nhân XG do rƣợu. Trong khi Bat là haplotype mang tính bảo vệ (protective

factor) thì bAT là yếu tố tiên lƣợng độc lập đối với sự phát sinh ung thƣ gan ở

bệnh nhân XG do rƣợu. Tần suất xuất hiện các haplotype bAT và bAt trong

nghiên cứu của chúng tối phù hợp với một số các nghiên cứu khác cho rằng

bAT là kiểu haplotype phổ biến [118] trong khi bAt là kiểu haplotype hiếm

gặp [129]. Nghiên cứu của chúng tôi là nghiên cứu đầu tiên cho thấy mối liên

quan giữa các haplotype đƣợc cấu thành từ bốn điểm đa hình đơn FokI, BsmI,

ApaI, TaqI đối với tiến triển bệnh lý gan mạn tính do nhiễm VRVGB mạn

tính. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấy rằng CCGT (FbAT) và TCTT

99

(fbaT) là hai haplotype bảo vệ [FbAT: (UTBMTBG: 27% vs. non-

UTBMTBG: 43%; fbaT: (UTBMTBG:5% vs. không UTBMTBG: 21%)].

Trong khi đó haplotype CCTT (FbaT) và TCGT (fbAT) là yếu tố nguy cơ đối

với UTBMTBG [Đối với FbaT; UTBMTBG: 29% vs. non-UTBMTBG: 7%);

đối với fbAT; UTBMTBG: 39% vs. non-UTBMTBG: 30%)].

Mối liên quan giữa tính đa hình của VDR trong đáp ứng điều trị thuốc

kháng vi rút ở bệnh nhân viêm gan do vi rút cũng đƣợc công bố. Nghiên cứu

Mostafa G. và cộng sự về mối liên quan giữa tính đa hình gen VDR và đáp

ứng điều trị với PEG-IFN α-2a (180 μg/kg trong 48 tuần) ở bệnh nhân

VGBMT. Các tác giả thấy rằng haplotype bAt là yếu tố tiên lƣợng độc lập xác

định đáp ứng điều trị ở bệnh nhân VGBMT [127]. Đối với VGCMT, nghiên

cứu của Thanapirom K. và cộng sự tiến hành nghiên cứu trên 155 bênh nhân

[126] và Baur K. và cộng sự nghiên cứu trên 554 bệnh nhân [125] nhằm đánh

giá vai trò của các haplotype đối với đáp ứng điều trị đƣợc điều trị với phác

đồ PEG-IFNa cơ sở. Kết quả phân tích đều cho thấy haplotype bAt là yếu tố

có liên quan đến đáp ứng kém với liệu pháp điều trị PEG-IFNa.

Ngoài ra một số nhóm nghiên cứu đã công bố kết quả phân tích mối liên

quan giữa các haplotype của VDR đối với nguy cơ tiến triển bênh lý gan đặc

biệt là sự phát sinh ung thƣ gan. Hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy rằng

kiểu haplotype bAt xuất hiện phổ biến và là yếu tố tiên lƣợng độc lập đối với

nguy cơ phát sinh ung thƣ gan ở bệnh nhân viêm gan C mạn tính [113], [124],

[128]. Đa số các nghiên cứu đều cho thấy haplotype bAt là phổ biến hơn các

haplotype khác trong nhóm nghiên cứu. Trong nghiên cứu của chúng tôi khi

phân tích haplotype đƣợc kết hợp từ 3 biến thể VDR nằm gần nhau vùng

3’UTR (BsmI T/C, ApaI C/A, TaqI T/C). Tám haplotype đƣợc phát hiện trong

đó bAt là haplotype hiếm gặp (NKM: 1,4%; bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn

tính: 0,2%). Trong khi đó bAT (NKM: 69%; bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn

tính: 67%) và baT (NKM: 26%; bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính: 27%) là

100

2 kiểu haplotype chiếm chủ yếu so với các haplotype còn lại. Phân tích so

sánh tỷ lệ phân bố haplotype chúng tôi không thấy có sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê về tỷ lệ phân bố các kiểu haplotype giữa các nhóm nghiên cứu bao

gồm VGBMT, XG và UTBMTBG cũng nhƣ UTBMTBG so với không-

UTBMTBG. Mặc dù TCTT (fbaT) là yếu tố bảo vệ nguy cơ phát triển ung thƣ

gan tuy nhiên ngƣời mang haplotype này có nồng độ enzyme AST và ALT

cao hơn có ý nghĩa so với các haplotype khác. Điều này đƣợc giải thích vì đa

số các bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính trong nghiên cứu vào viện vì viêm

gan tiến triển đợt cấp có biểu hiện lâm sàng và tăng enzyme AST và ALT.

Trong khi đó các bệnh nhân UTBMTBG có nồng độ enzyme thấp hơn so với

các bệnh nhân VGBMT.

4.3. THIẾU HỤT VITAMIN D VÀ TIẾN TRIỂN BỆNH Ở NGƢỜI

NHIỄM VI RÚT VIÊM GAN B MẠN TÍNH

Vitamin D đƣợc cho là một loại hormone đóng vai trò quan trọng không

chỉ trong cơ chế trao đổi canxi và cơ chế điều hòa cân bằng chuyển hóa hệ

thống xƣơng mà còn có nhiều ảnh hƣởng trong sự điều hòa của hệ miễn dịch

trong cơ thể. Thiếu hụt vitamin D trong huyết thanh là tình trạng rất thƣờng

gặp và có mối liên quan chặt chẽ đối với rất nhiều bệnh, không chỉ xuất hiện ở

các bệnh rối loạn về xƣơng mà nó còn đƣợc phát hiện ở một số các bệnh về

miễn dịch và các bệnh truyền nhiễm, hen suyễn, các bệnh ác tính cũng nhƣ

tình trạng tâm thần [28], [130], [131]. Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D có thể lên tới

>90% đã đƣợc báo cáo trong rất nhiều nghiên cứu ở các bệnh nhân có bệnh lý

gan mạn tính do các nguyên nhân khác nhau [13], [58], [59], [60]. Nghiên cứu

này, chúng tôi cho rằng sự thiếu hụt vitamin D xảy ra với tỷ lệ cao ngay cả

NKM nói chung và ở nhóm bệnh nhân bị nhiễm VRVGB mạn tính. Mức độ

thiếu hụt vitamin D liên quan có ý nghĩa đối với tiến triển và mức độ nặng của

bệnh. Ngoài ra nồng độ vitamin D có liên quan đến tính đa hình của biến thể

ApaI và FokI.

101

Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D cao gặp ở cả ở nhóm NKM và nhóm ngƣời

nhiễm VRVGB mạn tính, điều đó cho thấy rằng tình trạng thiếu hụt vitamin D

là một tình trạng phổ biến. Theo ƣớc tính có khoảng một tỷ ngƣời trên toàn

thế giới, thuộc các vùng địa lý, văn hóa khác nhau có nguy cơ bị thiếu hụt

vitamin D [28], [44]. Ở những nƣớc ôn đới, sự thiếu hụt vitamin D đƣợc xem

là xảy ra phổ biến hơn do vùng địa lý gần với xích đạo và ngƣời dân có thời

gian tiếp xúc với ánh nắng mặt trời rất ít. Ngƣợc lại một giả định rằng ở các

nƣớc Đông Nam Á hay các nƣớc vùng nhiệt đới với khí hậu ấm áp quanh năm

thì tỷ lệ thiếu hụt vitamin D là không phổ biến. Tuy nhiên, một nghiên cứu

gần đây tại Thành Phố Hồ Chí Minh cho thấy sự thiếu hụt vitamin D

(<30ng/mL) ở phụ nữ xảy ra khoảng 30% và ở nam giới là 16% [58]. Nhƣ

vậy so với nghiên cứu của chúng tôi và các nghiên cứu khác thì tỷ lệ thiếu hụt

vitamin D trong nghiên cứu này [58] thấp hơn rất nhiều. Tuy vậy vẫn chƣa có

sự giải thích thỏa đáng nào cho sự khác biệt lớn này giữa hai nghiên cứu này.

Nhƣ chúng ta đều biết, đa số vitamin D trong cơ thể đƣợc hấp thu qua da

dƣới tác dụng của ánh nắng mặt trời và rất ít ảnh hƣởng bởi thức ăn nƣớc

uống hàng ngày. Các nguyên nhân thiếu vitamin D trong bệnh gan mạn tính

đƣợc coi là bị ảnh hƣởng bởi rất nhiều yếu tố [28], [130]. Trong đó, tỷ lệ

nhiễm VRVGB cao tại Việt Nam (10-20%) [1] là một yếu tố quan trọng dẫn

đến sự thiếu hụt vitamin D trong quần thể những ngƣời VGBMT. Ở những

bệnh nhân này, sự thiếu hụt có thể là do chức năng gan bị suy yếu dẫn đến

hấp thu kém. Suy giảm chức năng gan đặc biệt ở bệnh nhân viêm gan cấp,

XG giai đoạn cuối (Child C, D) có thể dẫn đến giảm sản xuất protein vận

chuyển vitamin D nhƣ protein liên kết vitamin D và albumin, và làm suy

yếu quá trình hydroxyl hóa vitamin D của gan thành calcidiol hoặc

25(OH)D trong gan.

Mặc dù nồng độ vitamin D thấp đƣợc cho là nguyên nhân hoặc kết quả

của một số bệnh lý mạn tính bao gồm VGBMT do vi rút nhƣng đây là vấn đề

102

còn gây nhiều tranh cãi do hầu hết các nghiên cứu mô tả mối quan hệ giữa

VGBMT và sự thiếu hụt vitamin D đều là các khảo sát và đánh giá tình trạng

vitamin D tại một thời điểm. Trong các thiết kế nghiên cứu nhƣ vậy, không

thể đánh giá bất kỳ biến động nào của nồng độ vitamin D trong quá trình diễn

biến bệnh dẫn đến mối liên quan nhân quả giữa nồng độ vitamin D với các

bệnh gan liên quan đến VGBMT.

Sự thiếu hụt vitamin D rõ ràng xảy ra phổ biến hơn ở những ngƣời cao

tuổi và ở phụ nữ [28], [52]. Tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi, trong

cả phân tích đơn biến và phân tích đa biến cho thấy rằng yếu tố tiên lƣợng độc

lập có liên quan đến sự thiếu hụt vitamin D là tải lƣợng HBV DNA (liên quan

tuyến tính nghịch với hệ số tƣơng quan rho=-0,6; P<0,0001). Nghiên cứu của

chúng tôi cũng là một trong những nghiên cứu đầu tiên cho thấy rằng HBV

DNA là một yếu tố tiên lƣợng tốt để ƣớc đoán mức độ thiếu hụt vitamin D ở

bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính. Kết quả của chúng tôi cũng tƣơng đồng

với một nghiên cứu trƣớc cho rằng sự thiếu hụt vitamin D có mối tƣơng quan

chặt, đảo nghịch với nồng độ vi rút HBV DNA [64]. Chúng tôi cho rằng sự

thiếu hụt vitamin D ở bệnh nhân nhiễm VRVGB có thể làm lỗi quá trình ức

chế sự nhân lên của vi rút. Ngoài ra, nồng độ vitamin D thấp liên quan đến

đáp ứng vi rút kéo dài với liệu pháp dựa trên interferon trong viêm gan B và C

mạn tính đã đƣợc chứng minh trong các nghiên cứu lâm sàng [13], [14].

Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng thiếu hụt vitamin D liên quan đến thất

bại trong việc ngăn chặn sự sao chép và nhân lên của VRVGB, dẫn đến các

diễn biến lâm sàng bất lợi [49], [64], [65], [66]. Nồng độ vitamin D<10 ng/ml

có thể dự đoán đƣợc mức độ nghiêm trọng của bệnh gan mạn tính [15], [67].

Tiến triển bệnh gan ở bệnh nhân VGBMT bị ảnh hƣởng chủ yếu bởi các yếu

tố vi rút, đặc biệt là các kiểu gen của VRVGB. Kiểu gen C và B là nguyên

nhân chính gây VGBMT và tiếp theo là tiến triển đến XG là ung thƣ gan ở

Đông Nam Á [132], [133], [134]. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng những

103

bệnh nhân bị nhiễm VRVGB có kiểu gen B có tỷ lệ thiếu hụt vitamin D cao

hơn so với những ngƣời bị nhiễm kiểu gen C [16], [135]. Tuy nhiên, nguyên

nhân giữa chuyển hóa vitamin D và quá trình sao chép vi rút vẫn chƣa rõ

ràng. Sự tƣơng tác của nó với thụ thể vitamin D trong sinh bệnh học của

nhiễm VRVGB cần đƣợc nghiên cứu thêm.

Nồng độ vitamin D đƣợc chứng minh là tƣơng quan tuyến tính thuận đối

với nồng độ albumin và số lƣợng tiểu cầu. Trong khi đó nó có mối tƣơng

quan nghịch với nồng độ enzyme ALT trong giai đoạn hoạt động của bệnh

gan mạn tính [13], [35], [59]. Nồng độ vitamin D huyết thanh <10 ng/ml có

thể là yếu tố tiên lƣợng cho nồng độ albumin huyết thanh thấp và mức độ

nghiêm trọng của bệnh gan mạn tính [15], [67]. Tuy nhiên, sự thiếu hụt

vitamin D không tƣơng quan đáng kể với các thông số chức năng gan trong

nghiên cứu hiện tại, có thể là do nồng độ vitamin D trong huyết thanh bị ảnh

hƣởng bởi nhiều yếu tố và hầu hết bệnh nhân XG và UTBMTBG không ở giai

đoạn viêm gan hoạt động trong thời điểm lấy mẫu.

Mặc dù sự thiếu hụt vitamin D liên quan đến những hậu quả lâm sàng

bất lợi ở bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính, nghiên cứu của chúng tôi vẫn

còn một số hạn chế. Nồng độ vitamin D huyết thanh bị ảnh hƣởng bởi nhiều

yếu tố bao gồm tình trạng tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, mùa tại thời điểm

thu thập mẫu nghiên cứu, và chế độ ăn của bệnh nhân…Tuy nhiên những

thông tin này không sẵn có và vì vậy không đƣợc phân tích trong nghiên cứu

này. Một hạn chế khác đó là nghiên cứu của chúng tôi đƣợc thiết kế là nghiên

cứu cắt ngang, nồng độ vitamin D chỉ đƣợc đánh giá tại một thời điểm. Vì

vậy, chúng tôi không thể xác định độ dao động của nồng độ vitamin D theo

quá trình tiến triển lâm sàng của bệnh nhân cũng nhƣ mối liên quan nhân quả

giữa sự thiếu hụt vitamin D và bệnh gan liên quan đến nhiễm VRVGB. Phát

hiện của chúng tôi cho phép suy đoán rằng vitamin D và các chất đồng đẳng

104

của nó có thể là những thuốc điều trị kết hợp tiềm năng trong điều trị

VGBMT.

Thiếu hụt vitamin D và xơ hóa gan

Nồng độ vitamin D thấp đã đƣợc chứng minh là có liên quan với mức độ

nghiêm trọng của bệnh gan mạn tính [14], [58], [59]. Trong nghiên cứu này,

thiếu hụt và thiếu vitamin D nghiêm trọng đƣợc quan sát thƣờng xuyên hơn ở

những bệnh nhân mắc bệnh gan liên quan đến VGB và đƣợc tìm thấy có liên

quan đáng kể với giai đoạn cuối của bệnh XG. Vitamin D có liên quan đến

việc ức chế viêm và hủy bỏ XG, đƣợc chứng minh bằng quan sát rằng chuột

bị loại bỏ thụ thể vitamin D tự phát triển thành XG [36], [37] . Rõ ràng, thiếu

vitamin D là một nguyên nhân của sự tiến triển xơ hóa [14], [35], [67]. Những

nghiên cứu khác cũng chứng minh rõ ràng rằng sự thiếu hụt vitamin D là

nguyên nhân của tình trạng tiến triển xơ hóa nhu mô gan trên những đối tƣợng

bệnh nhân viêm gan thoái hóa mỡ không do rƣợu (NAFLD) và ở bệnh nhân

nhiễm VRVGC mạn tính.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy một kết quả tƣơng đồng rằng sự

thiếu hụt vitamin D mức độ nặng và rất nặng đƣợc phát hiện phổ biến hơn ở

bệnh nhân XG so với bệnh nhân VGBMT đơn thuần. Mức độ thiếu hụt nặng

và rất nặng cũng liên quan có ý nghĩa ở những bệnh nhân XG nặng (child-

Pugh C) so với các bệnh nhân XG mức độ nhẹ (child-pugh A và B). Kết quả

nghiên cứu của chúng tôi cũng tƣơng đồng với nghiên cứu của Zhao. X.Y và

cộng sự [10]. Trong nghiên cứu này tác giả báo cáo tình trạng thiếu hụt

vitamin D ở bệnh nhân XG thuộc nhóm Child-Pugh C cao hơn so với bệnh

nhân ở nhóm Child-Pugh A [10]. Các kết quả tƣơng tự cũng đƣợc chứng

minh từ các nghiên cứu đánh giá mức vitamin D ở bệnh nhân NAFLD và

viêm gan nhiễm mỡ không do rƣợu (NASH) [136], [137]. Theo Barchetta và

cộng sự [136], bệnh nhân NAFLD có nồng độ vitamin D thấp hơn nhóm

chứng (14,8 ± 9,2 so với 20,5 ± 9,7 ng/mL).

105

Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy thiếu vitamin D có liên quan

đến sự tiến triển của XG do các nguyên nhân khác nhau, chủ yếu là do nhiễm

VRVGB và VRVGC, rƣợu và NAFLD [35], [49], [61], [67], [138], [139],

[140], [141], [142]. Thiếu vitamin D cũng phản ánh rối loạn chức năng gan và

liên quan đến tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân XG do các nguyên nhân khác nhau

[139], [141]. Mối liên quan giữa vitamin D với XG đƣợc nghiên cứu nhiều

hơn ở bệnh nhân VGCMT và ở bệnh nhân NAFLD so với bệnh nhân

VGBMT.

Một phân tích tổng hợp gần đây bao gồm bảy nghiên cứu đánh giá mối

liên quan giữa nồng độ vitamin D huyết thanh và tiến triển XG ở bệnh nhân

VGCMT. Nồng độ vitamin D thấp liên quan đến xơ hóa tiến triển, với hai giá

trị ngƣỡng là 10 ng/ml (OR=2,5, 95%CI: 1,2-4,7) hoặc 30 ng/ml (OR=2,2,

95%CI:1,2-4,0) [63]. Hai nghiên cứu gần đây báo cáo mối tƣơng quan nghịch

có ý nghĩa giữa nồng độ vitamin D huyết thanh với sự tiến triển của XG [10],

[49]. Chuyển hóa vitamin D bất thƣờng trong bệnh lý XG đã đƣợc mô tả và

mối liên quan này chủ yếu đƣợc quy cho sự suy yếu quá trình hydroxylation

trong chuyển hóa vitamin D do chức năng gan bị suy yếu [61]. Ở bệnh nhân

XG, thiếu vitamin D cũng là do thiếu chế độ ăn uống, kém hấp thu và giảm

sản xuất protein liên kết với vitamin D của gan [67], [143].

Thiếu hụt vitamin D và ung thƣ gan

Ung thƣ gan là một trong những bệnh lý ác tính đứng thứ 6 về tỉ lệ mắc

phải và đứng thứ 2 về tỉ lệ tử vong trên thế giới. Theo thống kê, mỗi năm có

thêm 800000 ca đƣợc chẩn đoán ung thƣ gan, trong đó tỉ lệ nam giới chiếm

2/3, ngoài ra có hơn 700 000 ngƣời chết vì căn bệnh này. Trong khi đó, tổng

kết năm 2018 chỉ ra tại Việt Nam tỉ lệ mắc phải cũng nhƣ tỉ lệ tử vong bởi

ung thƣ gan đều đứng ở vị trí thứ nhất. Nhiễm VRVGB là yếu tố nguy cơ

hàng đầu của UTBMTBG trên toàn thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam.

106

Đã có nhiều nghiên cứu phân tích ảnh hƣởng của khu vực địa lý đối với

khả năng mắc các bệnh ung thƣ. Trong đó, tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong của các

bệnh ung thƣ thƣờng xuất hiện cao hơn ở khu vực phía Bắc, nơi có ánh sáng

mặt trời khan hiếm [73], [74]. Các nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra rằng sự

thiếu hụt vitamin D có thể làm tăng nguy cơ ung thƣ ruột, ung thƣ vú và ung

thƣ buồng trứng [75], [76], [77], [78]. Tuy nhiên, không có nhiều thông tin về

mối liên quan giữa nồng độ vitamin D trong huyết thanh với tỉ lệ mắc và tỉ lệ

tử vong của UTBMTBG trên nền bệnh nhân VGBMT.

Nghiên cứu của chúng tôi trên cỡ mẫu tƣơng đối lớn thấy rằng một

lƣợng lớn trƣờng hợp thiếu vitamin D đƣợc ghi nhận ở bệnh nhân

UTBMTBG trên nền nhiễm VRVGB so với nhóm viêm gan mạn tính đơn

thuần và nhóm NKM. Hơn nữa nồng độ vitamin D cũng có sự khác biệt khi

so sánh giữa hai nhóm UTBMTBG và không UTBMTBG. Nghiên cứu của

nhóm chúng tôi là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam khảo sát mối tƣơng quan

giữa nồng độ vitamin D trên các thể bệnh lâm sàng của nhiễm VRVGB mạn

tính và trên nhóm NKM.

Đối với viêm gan C mạn tính, một nghiên chỉ ra rằng vitamin D có thể

trở thành một dấu ấn sinh học tiềm năng tiên lƣợng khả năng phát triển thành

UTBMTBG. Tiếp đó, một nghiên cứu tiền cứu với cỡ mẫu lớn đã đánh giá

mối tƣơng quan giữa nồng độ vitamin D và khả năng mắc UTBMTBG trong

số 520.000 ngƣời tại 10 thành phố ở châu Âu [79]. Ở nghiên cứu này đã phát

hiện ra 204 trƣờng hợp chuyển hóa UTBMTBG trong vòng 10 năm theo dõi,

với nguyên nhân chủ yếu là do nhiễm VRVGC và VRVGB. Trong đó, các tác

giả nhận thấy nồng độ vitamin D có tỉ lệ nghịch với nguy cơ UTBMTBG.

Phát hiện này có kết quả tƣơng đồng với một nghiên cứu tiền cứu khác: ở 200

bệnh nhân UTBMTBG phát triển trên nền bệnh nhân nhiễm VRVGC và

VRVGB, nồng độ vitamin D trong máu thƣờng ở mức thấp; ngoài ra những

bệnh nhân có nồng độ vitamin D càng thấp thì càng gặp khó khăn trong việc

107

điều trị và càng tiến triển nhanh đến các giai đoạn sau của bệnh [80]. Tỷ lệ

sống sót của bệnh nhân UTBMTBG với nồng độ vitamin D trong huyết thanh

<10 ng/ ml thấp hơn đáng kể so với bệnh nhân có nồng độ >10 ng/ ml.

Từ các minh chứng trên có thể nhận thấy sự thiếu hụt vitamin D có mối

quan hệ vô cùng mật thiết đối với sự tiến triển của ung thƣ cũng nhƣ là một

yếu tố tiên lƣợng xấu đối với UTBMTBG. Mức độ thiếu hụt vitamin D liên

quan đến UTBMTBG ở bệnh nhân Việt Nam nhiễm VRVGB trong nghiên

cứu của chúng tôi là cơ sở dữ liệu quan trọng và có thể là tiền đề cho các

nghiên cứu tiếp theo để nhằm tiếp tục tìm hiểu về ảnh hƣởng của nồng độ

vitamin D đối với quá trình tiến triển UTBMTBG cùng với đó là ứng dụng

trong chẩn đoán và điều trị UTBMTBG.

Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam khảo sát tính đa hình của bốn

biến thể của gen mã hóa thụ thể vitamin D (TaqI, FokI, ApaI và BsmI) trên

các đối tƣợng bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính và đánh giá mối tƣơng

quan của chúng đối với nguy cơ nhiễm VRVGB, diễn biến bệnh và bệnh cảnh

lâm sàng. Ngoài ra chúng tôi nghiên tình trạng thiếu hụt vitamin D và ảnh

hƣởng của sự thiếu hụt đến tình trạng bệnh lý gan ở ngƣời nhiễm VRVGB

mạn tính. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng biến thể VDR

ApaI, các haplotype cấu thành từ bốn biến thể VDR trên và nồng độ vitamin

D huyết thanh liên quan đến tiến triển của bệnh lý VGBMT.

Tuy nhiên, nghiên cứu này có một số hạn chế sau: (i) Đây là nghiên cứu

bệnh chứng không tƣơng xứng, nhóm NKM và nhóm bệnh nhân không tƣơng

xứng về tuổi và giới mặc dù trong phân phần tích kết quả, chúng tôi đã sử

dụng các phƣơng pháp phân tích so sánh tần suất alen, kiểu gen và haplotype

giữa các nhóm và có điều chỉnh cho các yếu tố nhiễu này. Tuy vậy việc chọn

lựa mẫu nghiên cứu chƣa thật sự phản ánh tính đại diện trong quần thể ngƣời

Việt Nam vì thế sẽ ảnh hƣởng đến kết quả và diễn giải kết quả. Do vậy, kết

quả nghiên cứu nên đƣợc khẳng định thêm ở những nghiên cứu sau với số

108

lƣợng bệnh nhân lớn hơn, đối tƣợng mẫu nên đƣợc lựa chọn từ nhiều bệnh

viện cũng nhƣ trong quần thể dân cƣ và có sự tƣơng đồng về giới và tuổi. (ii)

Nồng độ vitamin D huyết thanh bị ảnh hƣởng bởi nhiều yếu tố bao gồm tình

trạng tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, mùa tại thời điểm thu thập mẫu nghiên

cứu, và chế độ ăn của bệnh nhân…Tuy nhiên những thông tin này khó đánh

giá khách quan và không đƣợc thu thập và do đó không đƣợc phân tích trong

nghiên cứu này. (iii) Một hạn chế khác đó là nghiên cứu của chúng tôi đƣợc

thiết kế là nghiên cứu bệnh chứng, nồng độ vitamin D chỉ đƣợc đánh giá tại

một thời điểm. Vì vậy, chúng tôi không xác định độ dao động của nồng độ

vitamin D theo quá trình tiến triển lâm sàng của bệnh nhân cũng nhƣ mối liên

quan nhân quả giữa sự thiếu hụt vitamin D và diễn tiến của bệnh gan mạn tính

liên quan đến nhiễm VRVGB. Vì đây là nghiên cứu đầu tiên về vai trò của

các biến thê gen VDR và nồng độ vitamin D huyết thanh trên đối tƣợng bệnh

nhân nhiễm VRVGB mạn tính tại Việt Nam cùng với các hạn chế đã đƣợc

nêu ở trên, chúng ta cần phải tiến hành những nghiên cứu với thiết kế chặt chẽ

hơn để đánh giá tác động và ảnh hƣởng của các biến thể của gen VDR, nồng

độ vitamin D huyết thanh đến quá trình diễn biến bệnh ở bệnh nhân VGBMT.

Ngoài ra, nghiên cứu về vai trò của liệu pháp bổ sung vitamin D trong phác

đồ điều trị chuẩn ở bệnh nhân VGBMT là cần thiết trên đối tƣợng bệnh nhân

viêm gan B tại Việt Nam.

109

KẾT LUẬN

Qua kết quả nghiên cứu tính đa hình một số biến thể của gen mã hoá

thụ thể vitamin D và khảo sát nồng độ vitamin D trong huyết thanh ở các

bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính (VGBMT: 104 BN; XG: 89 BN;

UTBMTBG: 105 BN) và 238 NKM, chúng tôi có một số kết luận nhƣ sau:

1. Mối mối liên quan của một số biến thể (ApaI, FokI, BsmI, TaqI) gen

mã hóa thụ thể vitamin D với bệnh nh n viêm gan mạn, xơ gan và ung

thƣ biểu mô tế bào gan do nhiễm vi rút viêm gan B

- Kiểu gen ApaI TT là kiểu gen có tần suất cao hơn có ý nghĩa ở nhóm

UTBMTBG (13,8%) so với nhóm NKM (6%) và VGBMT (4,9%)

[UTBMTBG vs. NKM: OR=3,5 (95% CI: 1,14-10,9), Padj=0,024; UTBMTBG

vs. VGBMT: OR=4,3 (1,2-15), Padj=0,017]

- Bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính mang kiểu gen ApaI TT có nguy cơ tiến

triển bệnh gan giai đoạn tiến triển (XG + UTBMTBG) cao hơn so với ngƣời

không mang kiểu gen này với OR=3,2 (95%CI: 1,03-9,9), Padj=0,032).

- Bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn tính mang kiểu gen ApaI TG có nồng độ

enzyme AST và ALT cao hơn có ý nghĩa so với hai kiểu gen ApaI GG và TT

(P<0,05).

- Tần suất kiểu gen và alen của các biến thể FokI, BsmI, TaqI ở các nhóm

không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so sánh giữa nhóm nghiên cứu.

- Kiểu gen đơn bội CCGT (hoặc FbAT) và TCTT (fbaT) là yếu tố bảo vệ đối

với nguy cơ tiến triển XG và ung thƣ gan ở bệnh nhân nhiễm VRVGB mạn

tính.

2. Nồng độ vitamin D huyết thanh ở bệnh nh n viêm gan mạn, xơ gan và

ung thƣ biểu mô tế bào gan do nhiễm vi rút viêm gan B

- Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D nặng và rất nặng (<20ng/mL) cao hơn ở bệnh nhân

nhiễm VRVGB mạn tính so với nhóm NKM (46,1% vs. 36,8%, P=0,035).

110

- Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D rất nặng (<10 ng/mL) chỉ gặp ở bệnh nhân nhiễm

VRVGB mạn tính (8,7%) so với 0% ở NKM.

- Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D (<30ng/mL) tăng theo tiến triển và giai đoạn bệnh

(VGBMT: 70,7%; XG: 77,5%; UTBMTBG: 91,4%; P=0,00085).

- Tỷ lệ thiếu hụt vitamin D nặng - rất nặng (<20ng/mL) tăng theo giai đoạn

bệnh: VGBMT (31,5%), XG (50,6%) và UTBMTBG (55,2%) (P=0,00049).

111

KIẾN NGHỊ

Cần bổ sung vitamin D trong quá trình điều trị viêm gan B mạn tính và

tiến hành các nghiên cứu tiếp theo nhằm đánh giá hiệu quả điều trị phối

hợp vitamin D và liệu pháp kháng vi rút trong mô hình nghiên cứu tiến

cứu theo dõi dọc ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

112

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

1. Nguyễn Khuyến, Nghiêm Xuân Hoàn, Lê Hữu Song và cs (2020).

Mối liên quan giữa tính đa hình gen mã hoá thụ thể vitamin D ApaI với

biểu hiện và tiến triển lâm sàng ở bệnh nhân nhiễm vi rút viêm gan B

mạn tính, Tạp chí Y- Dược học quân sự, 45 (5): 46-55.

2. Nguyễn Khuyến, Đỗ Tuấn Anh, Lê Hữu Song và cs (2020). Ảnh

hƣởng của sự thiếu hụt vitamin D đối với tiến triển lâm sàng ở bệnh nhân

nhiễm vi rút viêm gan B. Tạp chí Y học Việt Nam, 491 (2): 82-87.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyen V.T. (2010). Hepatitis B infection in Vietnam: current issues

and future challenges. Asia Pac J Public Health. 24(2): 361-373.

2. Hoan N.X., Tong H.V., Song L.H., et al. (2018). Vitamin D deficiency

and hepatitis viruses-associated liver diseases: A literature review.

World J Gastroenterol. 24(4): 445-460.

3. Uitterlinden A.G., Fang Y., van Meurs J.B., et al. (2004). Vitamin D

receptor gene polymorphisms in relation to Vitamin D related disease

states. J Steroid Biochem Mol Biol. 89-90(1-5): 187-193.

4. Uitterlinden A.G., Fang Y., Van Meurs J.B., et al. (2004). Genetics and

biology of vitamin D receptor polymorphisms. Gene. 338(2): 143-156.

5. Arababadi M.K., Pourfathollah A.A., Jafarzadeh A., et al. (2010).

Association of exon 9 but not intron 8 VDR polymorphisms with occult

HBV infection in south-eastern Iranian patients. J Gastroenterol

Hepatol. 25(1): 90-93.

6. Chatzidaki V., Choumerianou D., Dimitriou H., et al. (2012). Genetic

variants associated with susceptibility to mother-to-child transmission

of hepatitis B virus. Eur J Gastroenterol Hepatol. 24(10): 1185-1190.

7. Karatayli S.C., Ulger Z.E., Ergul A.A., et al. (2014). Tumour necrosis

factor-alpha, interleukin-10, interferon-gamma and vitamin D receptor

gene polymorphisms in patients with chronic hepatitis delta. J Viral

Hepat. 21(4): 297-304.

8. Yao X., Zeng H., Zhang G., et al. (2013). The associated ion between

the VDR gene polymorphisms and susceptibility to hepatocellular

carcinoma and the clinicopathological features in subjects infected with

HBV. Biomed Res Int. 2013: 953974.

9. Peng Q., Yang S., Lao X., et al. (2014). Association of single

nucleotide polymorphisms in VDR and DBP genes with HBV-related

hepatocellular carcinoma risk in a Chinese population. PLoS. One.

9(12): e116026.

10. Zhao X.Y., Li J., Wang J.H., et al. (2016). Vitamin D serum level is

associated with Child-Pugh score and metabolic enzyme imbalances,

but not viral load in chronic hepatitis B patients. Medicine (Baltimore).

95(27): e3926.

11. Esmat G., El Raziky M., Elsharkawy A., et al. (2015). Impact of

vitamin D supplementation on sustained virological response in chronic

hepatitis C genotype 4 patients treated by pegylated

interferon/ribavirin. J Interferon Cytokine Res. 35(1): 49-54.

12. Backstedt D., Pedersen M., Choi M., et al. (2017). 25-Vitamin D levels

in chronic hepatitis C infection: association with cirrhosis and sustained

virologic response. Ann Gastroenterol. 30(3): 344-348.

13. Chan H.L., Elkhashab M., Trinh H., et al. (2015). Association of

baseline vitamin D levels with clinical parameters and treatment

outcomes in chronic hepatitis B. J. Hepatol. 63(5): 1086-1092.

14. Petta S., Camma C., Scazzone C., et al. (2010). Low vitamin D serum

level is related to severe fibrosis and low responsiveness to interferon-

based therapy in genotype 1 chronic hepatitis C. Hepatology. 51(4):

1158-1167.

15. Rode A., Fourlanos S., and Nicoll A. (2010). Oral vitamin D

replacement is effective in chronic liver disease. Gastroenterol. Clin.

Biol. 34(11): 618-620.

16. Yu R., Sun J., Zheng Z., et al. (2015). Association between vitamin D

level and viral load or fibrosis stage in chronic hepatitis B patients from

Southern China. J Gastroenterol Hepatol. 30(3): 566-574.

17. WHO, Global hepatitis report, 2017. 2017.

18. Merrill R.M. and Hunter B.D. (2011). Seroprevalence of markers for

hepatitis B viral infection. Int J Infect Dis. 15(2): e78-121.

19. Razavi-Shearer D., Gamkrelidze I., Nguyen M.H., et al. (2018). Global

prevalence, treatment, and prevention of hepatitis B virus infection in

2016: a modelling study. The Lancet Gastroenterology & Hepatology.

3(6): 383-403.

20. Trịnh Thị N., Tình trạng nhiễm các vi rut viêm gan A, B, C, D, E ở các

bệnh nhân viêm gan vi rut tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. 2001.

21. Nguyen V.T., Law M.G., and Dore G.J. (2008). An enormous hepatitis

B virus-related liver disease burden projected in Vietnam by 2025.

Liver Int. 28(4): 525-531.

22. Liu J. and Fan D. (2007). Hepatitis B in China. Lancet. 369(9573):

1582-1583.

23. El-Serag H.B. (2011). Hepatocellular carcinoma. N. Engl. J. Med.

365(12): 1118-1127.

24. Lozano R., Naghavi M., Foreman K., et al. (2012). Global and regional

mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010:

a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.

Lancet. 380(9859): 2095-2128.

25. Perz J.F., Armstrong G.L., Farrington L.A., et al. (2006). The

contributions of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections to

cirrhosis and primary liver cancer worldwide. J Hepatol. 45(4): 529-

538.

26. Bray F., Ferlay J., Soerjomataram I., et al. (2018). Global cancer

statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality

worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 68(6):

394-424.

27. Wintermeyer E., Ihle C., Ehnert S., et al. (2016). Crucial Role of

Vitamin D in the Musculoskeletal System. Nutrients. 8(6).

28. Holick M.F. (2007). Vitamin D deficiency. N. Engl. J. Med. 357(3):

266-281.

29. Keane J.T., Elangovan H., Stokes R.A., et al. (2018). Vitamin D and

the Liver-Correlation or Cause? Nutrients. 10(4).

30. Sita-Lumsden A., Lapthorn G., Swaminathan R., et al. (2007).

Reactivation of tuberculosis and vitamin D deficiency: the contribution

of diet and exposure to sunlight. Thorax. 62(11): 1003-1007.

31. Aranow C. (2011). Vitamin D and the immune system. J. Investig.

Med. 59(6): 881-886.

32. Deluca HF C.M. (2001). Vitamin D: its role and uses in immunology.

FASEB J 15(14): 2579-2585.

33. Baeke F., Takiishi T., Korf H., et al. (2010). Vitamin D: modulator of

the immune system. Curr Opin Pharmacol. 10(4): 482-496.

34. Wactawski-Wende J., Kotchen J.M., Anderson G.L., et al. (2006).

Calcium plus vitamin D supplementation and the risk of colorectal

cancer. N Engl J Med. 354(7): 684-696.

35. Targher G., Bertolini L., Scala L., et al. (2007). Associations between

serum 25-hydroxyvitamin D3 concentrations and liver histology in

patients with non-alcoholic fatty liver disease. Nutr. Metab Cardiovasc.

Dis. 17(7): 517-524.

36. Ding N., Yu R.T., Subramaniam N., et al. (2013). A vitamin D

receptor/SMAD genomic circuit gates hepatic fibrotic response. Cell.

153(3): 601-613.

37. Abramovitch S., Dahan-Bachar L., Sharvit E., et al. (2011). Vitamin D

inhibits proliferation and profibrotic marker expression in hepatic

stellate cells and decreases thioacetamide-induced liver fibrosis in rats.

Gut. 60(12): 1728-1737.

38. Lamprecht S.A. and Lipkin M. (2001). Cellular mechanisms of calcium

and vitamin D in the inhibition of colorectal carcinogenesis. Ann. N. Y.

Acad. Sci. 952: 73-87.

39. Lange C.M., Miki D., Ochi H., et al. (2013). Genetic analyses reveal a

role for vitamin D insufficiency in HCV-associated hepatocellular

carcinoma development. PLoS. One. 8(5): e64053.

40. Fingas C.D., Altinbas A., Schlattjan M., et al. (2013). Expression of

apoptosis- and vitamin D pathway-related genes in hepatocellular

carcinoma. Digestion. 87(3): 176-181.

41. Fedirko V., Duarte-Salles T., Bamia C., et al. (2014). Prediagnostic

circulating vitamin D levels and risk of hepatocellular carcinoma in

European populations: a nested case-control study. Hepatology. 60(4):

1222-1230.

42. Chiang K.C., Yeh C.N., Chen M.F., et al. (2011). Hepatocellular

carcinoma and vitamin D: a review. J. Gastroenterol. Hepatol. 26(11):

1597-1603.

43. Pourgholami M.H., Akhter J., Lu Y., et al. (2000). In vitro and in vivo

inhibition of liver cancer cells by 1,25-dihydroxyvitamin D3. Cancer

Lett. 151(1): 97-102.

44. Holick M.F., Siris E.S., Binkley N., et al. (2005). Prevalence of

Vitamin D inadequacy among postmenopausal North American women

receiving osteoporosis therapy. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90(6):

3215-3224.

45. Thomas M.K., Lloyd-Jones D.M., Thadhani R.I., et al. (1998).

Hypovitaminosis D in medical inpatients. N Engl J Med. 338(12): 777-

783.

46. Lips P., Duong T., Oleksik A., et al. (2001). A global study of vitamin

D status and parathyroid function in postmenopausal women with

osteoporosis: baseline data from the multiple outcomes of raloxifene

evaluation clinical trial. J Clin Endocrinol Metab. 86(3): 1212-1221.

47. Hossein-nezhad A. and Holick M.F. (2013). Vitamin D for health: a

global perspective. Mayo Clin Proc. 88(7): 720-755.

48. Choi H.S., Oh H.J., Choi H., et al. (2011). Vitamin D insufficiency in

Korea--a greater threat to younger generation: the Korea National

Health and Nutrition Examination Survey (KNHANES) 2008. J Clin

Endocrinol Metab. 96(3): 643-651.

49. Hoan N.X., Khuyen N., Binh M.T., et al. (2016). Association of

vitamin D deficiency with hepatitis B virus - related liver diseases.

BMC Infect Dis. 16(1): 507-512.

50. Lu L., Yu Z., Pan A., et al. (2009). Plasma 25-hydroxyvitamin D

concentration and metabolic syndrome among middle-aged and elderly

Chinese individuals. Diabetes Care. 32(7): 1278-1283.

51. Nimitphong H. and Holick M.F. (2013). Vitamin D status and sun

exposure in southeast Asia. Dermatoendocrinol. 5(1): 34-37.

52. Nguyen H.T., von S.B., Nguyen T.V., et al. (2012). Vitamin D

deficiency in northern Vietnam: prevalence, risk factors and

associations with bone mineral density. Bone. 51(6): 1029-1034.

53. Prentice A., Schoenmakers I., Jones K.S., et al. (2009). Vitamin D

Deficiency and Its Health Consequences in Africa. Clin Rev Bone

Miner Metab. 7: 94-106.

54. Cusick S.E., Opoka R.O., Lund T.C., et al. (2014). Vitamin D

insufficiency is common in Ugandan children and is associated with

severe malaria. PLoS One. 9(12): e113185.

55. Kibirige D., Mutebi E., Ssekitoleko R., et al. (2013). Vitamin D

deficiency among adult patients with tuberculosis: a cross sectional

study from a national referral hospital in Uganda. BMC Res Notes. 6:

293.

56. Mehta S., Giovannucci E., Mugusi F.M., et al. (2010). Vitamin D status

of HIV-infected women and its association with HIV disease

progression, anemia, and mortality. PLoS One. 5(1): e8770.

57. Gutierrez O.M., Farwell W.R., Kermah D., et al. (2011). Racial

differences in the relationship between vitamin D, bone mineral

density, and parathyroid hormone in the National Health and Nutrition

Examination Survey. Osteoporos Int. 22(6): 1745-1753.

58. Arteh J., Narra S., and Nair S. (2010). Prevalence of vitamin D

deficiency in chronic liver disease. Dig. Dis. Sci. 55(9): 2624-2628.

59. Wong G.L., Chan H.L., Chan H.Y., et al. (2015). Adverse effects of

vitamin D deficiency on outcomes of patients with chronic hepatitis B.

Clin. Gastroenterol. Hepatol. 13(4): 783-790.

60. Cholongitas E., Theocharidou E., Goulis J., et al. (2012). Review

article: the extra-skeletal effects of vitamin D in chronic hepatitis C

infection. Aliment Pharmacol Ther. 35(6): 634-646.

61. Konstantakis C., Tselekouni P., Kalafateli M., et al. (2016). Vitamin D

deficiency in patients with liver cirrhosis. Ann Gastroenterol. 29(3):

297-306.

62. Villar L.M., Del Campo J.A., Ranchal I., et al. (2013). Association

between vitamin D and hepatitis C virus infection: a meta-analysis.

World J Gastroenterol. 19(35): 5917-5924.

63. Garcia-Alvarez M., Pineda-Tenor D., Jimenez-Sousa M.A., et al.

(2014). Relationship of vitamin D status with advanced liver fibrosis

and response to hepatitis C virus therapy: a meta-analysis. Hepatology.

60(5): 1541-1550.

64. Farnik H., Bojunga J., Berger A., et al. (2013). Low vitamin D serum

concentration is associated with high levels of hepatitis B virus

replication in chronically infected patients. Hepatology. 58(4): 1270-

1276.

65. Chen E.Q., Bai L., Zhou T.Y., et al. (2015). Sustained suppression of

viral replication in improving vitamin D serum concentrations in

patients with chronic hepatitis B. Sci Rep. 5: 15441.

66. Mohamadkhani A., Bastani F., Khorrami S., et al. (2015). Negative

Association of Plasma Levels of Vitamin D and miR-378 With Viral

Load in Patients With Chronic Hepatitis B Infection. Hepat Mon.

15(6): e28315.

67. Fisher L. and Fisher A. (2007). Vitamin D and parathyroid hormone in

outpatients with noncholestatic chronic liver disease. Clin.

Gastroenterol. Hepatol. 5(4): 513-520.

68. Yu R., Tan D., Ning Q., et al. (2017). Association of baseline vitamin

D level with genetic determinants and virologic response in patients

with chronic hepatitis B. Hepatol Res.

69. Berzsenyi M.D., Roberts S.K., Preiss S., et al. (2011). Hepatic TLR2 &

TLR4 expression correlates with hepatic inflammation and TNF-alpha

in HCV & HCV/HIV infection. J Viral Hepat. 18(12): 852-860.

70. Kuo Y.T., Kuo C.H., Lam K.P., et al. (2010). Effects of vitamin D3 on

expression of tumor necrosis factor-alpha and chemokines by

monocytes. J Food Sci. 75(6): H200-204.

71. Sadeghi K., Wessner B., Laggner U., et al. (2006). Vitamin D3 down-

regulates monocyte TLR expression and triggers hyporesponsiveness to

pathogen-associated molecular patterns. Eur J Immunol. 36(2): 361-

370.

72. Do J.E., Kwon S.Y., Park S., et al. (2008). Effects of vitamin D on

expression of Toll-like receptors of monocytes from patients with

Behcet's disease. Rheumatology (Oxford). 47(6): 840-848.

73. Garland C.F., Garland F.C., Gorham E.D., et al. (2006). The role of

vitamin D in cancer prevention. Am J Public Health. 96(2): 252-261.

74. Bertino J.R. (2016). Landmark Study: The Relation of Solar Radiation

to Cancer Mortality in North America. Cancer Res. 76(2): 185.

75. Davis C.D. and Milner J.A. (2011). Vitamin D and colon cancer.

Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 5(1): 67-81.

76. Lefkowitz E.S. and Garland C.F. (1994). Sunlight, vitamin D, and

ovarian cancer mortality rates in US women. Int J Epidemiol. 23(6):

1133-1136.

77. Moan J., Dahlback A., Lagunova Z., et al. (2009). Solar radiation,

vitamin D and cancer incidence and mortality in Norway. Anticancer

Res. 29(9): 3501-3509.

78. Schwartz G.G. (2005). Vitamin D and the epidemiology of prostate

cancer. Semin Dial. 18(4): 276-289.

79. Fedirko V., Duarte-Salles T., Bamia C., et al. (2014). Prediagnostic

circulating vitamin D levels and risk of hepatocellular carcinoma in

European populations: a nested case-control study. Hepatology. 60(4):

1222-1230.

80. Finkelmeier F., Kronenberger B., Koberle V., et al. (2014). Severe 25-

hydroxyvitamin D deficiency identifies a poor prognosis in patients

with hepatocellular carcinoma - a prospective cohort study. Aliment

Pharmacol Ther. 39(10): 1204-1212.

81. Gross C., Krishnan A.V., Malloy P.J., et al. (1998). The vitamin D

receptor gene start codon polymorphism: a functional analysis of FokI

variants. J Bone Miner Res. 13(11): 1691-1699.

82. Arai H., Miyamoto K., Taketani Y., et al. (1997). A vitamin D receptor

gene polymorphism in the translation initiation codon: effect on protein

activity and relation to bone mineral density in Japanese women. J

Bone Miner Res. 12(6): 915-921.

83. He Q., Huang Y., Zhang L., et al. (2018). Association between vitamin

D receptor polymorphisms and hepatitis B virus infection

susceptibility: A meta-analysis study. Gene. 645: 105-112.

84. Ding N., Yu R.T., Subramaniam N., et al. (2013). A vitamin D

receptor/SMAD genomic circuit gates hepatic fibrotic response. Cell.

153(3): 601-613.

85. Triantos C., Aggeletopoulou I., Kalafateli M., et al. (2018). Prognostic

significance of vitamin D receptor (VDR) gene polymorphisms in liver

cirrhosis. Sci Rep. 8(1): 14065.

86. Baur K., Mertens J.C., Schmitt J., et al. (2012). Combined effect of 25-

OH vitamin D plasma levels and genetic vitamin D receptor (NR 1I1)

variants on fibrosis progression rate in HCV patients. Liver Int. 32(4):

635-643.

87. Zeng Z. (2014). Human genes involved in hepatitis B virus infection.

World J Gastroenterol. 20(24): 7696-7706.

88. Rai V., Abdo J., Agrawal S., et al. (2017). Vitamin D Receptor

Polymorphism and Cancer: An Update. Anticancer Res. 37(8): 3991-

4003.

89. Peng Q., Yang S., Lao X., et al. (2014). Association of single

nucleotide polymorphisms in VDR and DBP genes with HBV-related

hepatocellular carcinoma risk in a Chinese population. PLoS One.

9(12): e116026.

90. Wolf C., Rentsch J., and Hubner P. (1999). PCR-RFLP analysis of

mitochondrial DNA: a reliable method for species identification. J

Agric Food Chem. 47(4): 1350-1355.

91. Newton C.R., Graham A., Heptinstall L.E., et al. (1989). Analysis of

any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation

system (ARMS). Nucleic Acids Res. 17(7): 2503-2516.

92. Peng B.Y., Wang Q., Luo Y.H., et al. (2018). A novel and quick PCR-

based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db

mice). Acta Pharmacol Sin. 39(1): 117-123.

93. Wang J., Venegas V., Li F., et al. (2011). Analysis of mitochondrial

DNA point mutation heteroplasmy by ARMS quantitative PCR. Curr

Protoc Hum Genet. Chapter 19: Unit 19 16.

94. De la Vega F.M., Lazaruk K.D., Rhodes M.D., et al. (2005).

Assessment of two flexible and compatible SNP genotyping platforms:

TaqMan SNP Genotyping Assays and the SNPlex Genotyping System.

Mutat Res. 573(1-2): 111-135.

95. Sanger F., Nicklen S., and Coulson A.R. (1977). DNA sequencing with

chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74(12): 5463-

5467.

96. Bộ Y Tế (2012). Hƣớng dẫn chẩn đoán và điều trị ung thƣ biểu mô tế

bào gan. Quyết định số 5250/QĐ-BYT.

97. Bộ Y Tế (2014). Quyết định về việc hướng dân chẩn đoán, điều trị

viêm gan virus B số 5448/QĐ BYT, 2-3. 2014.

98. European Association for the Study of the Liver. Electronic address

e.e.e. and European Association for the Study of the L. (2017). EASL

2017 Clinical Practice Guidelines on the management of hepatitis B

virus infection. J Hepatol.

99. Cholongitas E., Papatheodoridis G.V., Vangeli M., et al. (2005).

Systematic review: The model for end-stage liver disease--should it

replace Child-Pugh's classification for assessing prognosis in cirrhosis?

Aliment. Pharmacol. Ther. 22(11-12): 1079-1089.

100. Llovet J.M., Bru C., and Bruix J. (1999). Prognosis of hepatocellular

carcinoma: the BCLC staging classification. Semin. Liver Dis. 19(3):

329-338.

101. Zhang Z., Wang C., Liu Z., et al. (2019). Host Genetic Determinants of

Hepatitis B Virus Infection. Front Genet. 10: 696.

102. Polaris Observatory C. (2018). Global prevalence, treatment, and

prevention of hepatitis B virus infection in 2016: a modelling study.

Lancet Gastroenterol Hepatol. 3(6): 383-403.

103. Matsuura K., Isogawa M., and Tanaka Y. (2016). Host genetic variants

influencing the clinical course of hepatitis B virus infection. J Med

Virol. 88(3): 371-379.

104. Yano Y., Seo Y., Azuma T., et al. (2013). Hepatitis B virus and host

factors. Hepatobiliary Surg Nutr. 2(2): 121-123.

105. Hoan N.X., Van Tong H., Giang D.P., et al. (2017). SOCS3 genetic

variants and promoter hypermethylation in patients with chronic

hepatitis B. Oncotarget. 8(10): 17127-17139.

106. Hu Z., Liu Y., Zhai X., et al. (2013). New loci associated with chronic

hepatitis B virus infection in Han Chinese. Nat.Genet. 45(12): 1499-

1503.

107. Hoan N.X., Van Tong H., Giang D.P., et al. (2016). Interferon-

stimulated gene 15 in hepatitis B-related liver diseases. Oncotarget.

7(42): 67777-67787.

108. Wang L., Zou Z.Q., and Wang K. (2016). Clinical Relevance of HLA

Gene Variants in HBV Infection. J Immunol Res. 2016: 9069375.

109. Zhu Q., Li N., Han Q., et al. (2012). Single-nucleotide polymorphism at

CYP27B1-1260, but not VDR Taq I, is possibly associated with

persistent hepatitis B virus infection. Genet Test Mol Biomarkers.

16(9): 1115-1121.

110. Crofts L.A., Hancock M.S., Morrison N.A., et al. (1998). Multiple

promoters direct the tissue-specific expression of novel N-terminal

variant human vitamin D receptor gene transcripts. Proc Natl Acad Sci

U S A. 95(18): 10529-10534.

111. Suneetha P.V., Sarin S.K., Goyal A., et al. (2006). Association between

vitamin D receptor, CCR5, TNF-alpha and TNF-beta gene

polymorphisms and HBV infection and severity of liver disease. J

Hepatol. 44(5): 856-863.

112. Mohammed A.M., Hany S., Tarek S., et al. (2017). Vitamin D Receptor

Gene Polymorphisms as a Predictive Risk Factor for Hepatocellular

Carcinoma Development and Severity in Chronic Hepatitis B.

International Journal of Cancer Research. 13(1): 26-35.

113. Hung C.H., Chiu Y.C., Hu T.H., et al. (2014). Significance of vitamin d

receptor gene polymorphisms for risk of hepatocellular carcinoma in

chronic hepatitis C. Transl Oncol. 7(4): 503-507.

114. Wu M., Yue M., Huang P., et al. (2016). Vitamin D level and vitamin

D receptor genetic variations contribute to HCV infection susceptibility

and chronicity in a Chinese population. Infect Genet Evol. 41: 146-152.

115. Li J.H., Li H.Q., Li Z., et al. (2006). Association of Taq I T/C and Fok I

C/T polymorphisms of vitamin D receptor gene with outcome of

hepatitis B virus infection. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 86(28): 1952-

1956.

116. Li J.H., Chen D.M., Li Z., et al. (2006). Study on association between

vitamin D receptor gene polymorphisms and the outcomes of HBV

infection. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 23(4): 402-405.

117. Whitfield G.K., Remus L.S., Jurutka P.W., et al. (2001). Functionally

relevant polymorphisms in the human nuclear vitamin D receptor gene.

Mol Cell Endocrinol. 177(1-2): 145-159.

118. Falleti E., Bitetto D., Fabris C., et al. (2010). Vitamin D receptor gene

polymorphisms and hepatocellular carcinoma in alcoholic cirrhosis.

World J Gastroenterol. 16(24): 3016-3024.

119. Serrano D., Gnagnarella P., Raimondi S., et al. (2016). Meta-analysis

on vitamin D receptor and cancer risk: focus on the role of TaqI, ApaI,

and Cdx2 polymorphisms. Eur J Cancer Prev. 25(1): 85-96.

120. Sheng S., Chen Y., and Shen Z. (2017). Correlation between

polymorphism of vitamin D receptor TaqI and susceptibility to

colorectal cancer: A meta-analysis. Medicine (Baltimore). 96(26):

e7242.

121. Huang Y.W., Liao Y.T., Chen W., et al. (2010). Vitamin D receptor

gene polymorphisms and distinct clinical phenotypes of hepatitis B

carriers in Taiwan. Genes Immun. 11(1): 87-93.

122. Qin H. and Chen H. (2009). Study on association between vitamin D

receptor gene polymorphisms and the chronic hepatitis B. Journal of

Clinical Hepatology.

123. Li J., Dong, P.H., Jin, Y.H, Lu, M.Q, Pan, F.F., Wang, B.S, Chen, Y.P.

(2006). The relationship between vitamin D receptor gene

polymorphism and liver fibrosis. . Zhejiang Med. J. 28: 426–434.

124. Barooah P., Saikia S., Bharadwaj R., et al. (2019). Role of VDR, GC,

and CYP2R1 Polymorphisms in the Development of Hepatocellular

Carcinoma in Hepatitis C Virus-Infected Patients. Genet Test Mol

Biomarkers. 23(5): 325-331.

125. Baur K., Mertens J.C., Schmitt J., et al. (2012). The vitamin D receptor

gene bAt (CCA) haplotype impairs the response to pegylated-

interferon/ribavirin-based therapy in chronic hepatitis C patients.

Antivir Ther. 17(3): 541-547.

126. Thanapirom K., Suksawatamnuay S., Sukeepaisarnjaroen W., et al.

(2019). Genetic associations of vitamin D receptor polymorphisms with

advanced liver fibrosis and response to pegylated interferon-based

therapy in chronic hepatitis C. PeerJ. 7: e7666.

127. Mostafa-Hedeab G., Sabry D., Abdelaziz G.M., et al. (2018). Influence

of Vitamin D Receptor Gene Polymorphisms on Response to Pegylated

Interferon in Chronic Hepatitis B Egyptian Patients. Rep Biochem Mol

Biol. 6(2): 186-196.

128. Mohammed Amin Mohammed, Omar N.M., Soad Amin Mohammed,

et al. (2017). The Significance of Vitamin D Receptor Gene

Polymorphisms for Susceptibility to Hepatocellular Carcinoma in

Subjects Infected with Hepatitis C Virus. Gastroenterology &

Hepatology. 7(4).

129. Amina H. Hassab, Ahmed H. Deif, Dalia A. Elneely, et al. (2019).

Protective association of VDR gene polymorphisms and haplotypes

with multiple sclerosis patients in Egyptian population. Egyptian

Journal of Medical Human Genetics.

130. Rosen C.J. (2011). Clinical practice. Vitamin D insufficiency. N. Engl.

J. Med. 364(3): 248-254.

131. van den Berg K.S., Marijnissen R.M., van den Brink R.H., et al. (2016).

Vitamin D deficiency, depression course and mortality: Longitudinal

results from the Netherlands Study on Depression in Older persons

(NESDO). J Psychosom Res. 83: 50-56.

132. Kao J.H., Chen P.J., Lai M.Y., et al. (2000). Hepatitis B genotypes

correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitis B.

Gastroenterology. 118(3): 554-559.

133. Tong S. and Revill P. (2016). Overview of hepatitis B viral replication

and genetic variability. J Hepatol. 64(1 Suppl): S4-S16.

134. Zhang Z.H., Wu C.C., Chen X.W., et al. (2016). Genetic variation of

hepatitis B virus and its significance for pathogenesis. World J

Gastroenterol. 22(1): 126-144.

135. Zhu H., Liu X., Ding Y., et al. (2016). Relationships between low

serum vitamin D levels and HBV "a" determinant mutations in chronic

hepatitis B patients. J Infect Dev Ctries. 10(9): 1025-1030.

136. Barchetta I., Angelico F., Del Ben M., et al. (2011). Strong association

between non alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and low 25(OH)

vitamin D levels in an adult population with normal serum liver

enzymes. BMC Med. 9: 85.

137. Targher G., Bertolini L., Scala L., et al. (2007). Associations between

serum 25-hydroxyvitamin D3 concentrations and liver histology in

patients with non-alcoholic fatty liver disease. Nutr Metab Cardiovasc

Dis. 17(7): 517-524.

138. El-Maouche D., Mehta S.H., Sutcliffe C.G., et al. (2013). Vitamin D

deficiency and its relation to bone mineral density and liver fibrosis in

HIV-HCV coinfection. Antivir Ther. 18(2): 237-242.

139. Stokes C.S., Krawczyk M., Reichel C., et al. (2014). Vitamin D

deficiency is associated with mortality in patients with advanced liver

cirrhosis. Eur J Clin Invest. 44(2): 176-183.

140. Lim L.Y. and Chalasani N. (2012). Vitamin d deficiency in patients

with chronic liver disease and cirrhosis. Curr Gastroenterol Rep. 14(1):

67-73.

141. Paternostro R., Wagner D., Reiberger T., et al. (2017). Low 25-OH-

vitamin D levels reflect hepatic dysfunction and are associated with

mortality in patients with liver cirrhosis. Wien Klin Wochenschr. 129(1-

2): 8-15.

142. Barchetta I., Cimini F.A., and Cavallo M.G. (2017). Vitamin D

Supplementation and Non-Alcoholic Fatty Liver Disease: Present and

Future. Nutrients. 9(9).

143. Malham M., Jorgensen S.P., Ott P., et al. (2011). Vitamin D deficiency

in cirrhosis relates to liver dysfunction rather than aetiology. World J

Gastroenterol. 17(7): 922-925.