luận văn: NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM –––––––––––––––––––––––––

HỨA THỊ NGA

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH

VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ

CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN - 2009

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM –––––––––––––––––––––––––

HỨA THỊ NGA

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH

VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ

CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:PGS.TS NGUYỄN TRỌNG LẠNG

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN - 2009

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Trọng Lạng -

Bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học

Thái Nguyên đã hƣớng dẫn tôi tận tình, chu đáo trong quá trình tôi học tập và

nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ DNA ứng

dụng Viện Công nghệ Sinh học đặc biệt là PGS.TS Nông Văn Hải đã tận

tình giúp đỡ, hƣớng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành bản khóa

luận này. Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tôi đã đƣợc các anh chị

NCS Nguyễn Đăng Tôn, CN Địch Thị Kim Hƣơng, CN Vũ Hải Chi - cán bộ

nghiên cứu trong phòng quan tâm, hƣớng dẫn và cho tôi những lời khuyên

quý báu. Tôi luôn trân trọng và biết ơn sự giúp đỡ hết mình đó.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở Đào Tạo

thuộc Khoa Sinh - KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hứa Thị Nga

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các số

liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố

trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hứa Thị Nga

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A Adenin

bp Base pair (cặp bazơ)

cs Cộng sự

C Cytozin

ddNTP Dideoxynucleside triphosphate

dNTP Deoxynucleside triphosphate

DNA Deoxyribonucleic acid

D-Loop Displacement loop - đoạn điều khiển ty thể

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

EtBr Ethidium brommide

EtOH Ethanol

Epp Eppendorf

G Guamin

Kb kilo base

kDa kilo Dalton

mtDNA DNA ty thể (mitochondrial DNA)

NXB Nhà xuất bản

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide

PBS Phosphate - buffer saline

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonucleic Acid

RNase Ribonuclease

SDS Sodium Doecyl Sulphate

T Timin

TAE Tris - Acetate - EDTA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Tm Melting Temperature (Nhiệt độ nóng chảy)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng khuếch đại gen ........................................... 28

Bảng 2.2. Chu trình nhiệt ............................................................................. 29

Bảng 2.3. Chu trình nhiệt cho PCR trong máy luân nhiệt GenAmp PCR

System 9700 .......................................................................................... 30

Bảng 3.1. Thống kê các điểm đa hình ở hai mẫu nghiên cứu so với trình tự

chuẩn ..................................................................................................... 41

Bảng 3.2. So sánh mức độ sai khác về trình tự nucleotide ............................ 42

Bảng 3.3. Thống kê sự xuất hiện các băng điện di protein huyết thanh gà thí

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

nghiệm ................................................................................................... 45

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Sơ đồ tổ chức của DNA ty thể Gà...................................................16

Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số ............................................................. 33

Hình 3.2. Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR ...................................... 36

Hình 3.3. So sánh trình tự D-Loop của hai mẫu gà nghiên cứu Ri (RI) và Đa

cựa (Da) với trình tự tham khảo mã số AB114078 ................................. 40

Hình 3.4. Quan hệ di truyền của một số giống gà ......................................... 42

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.5: Phổ điện di SDS – PAGE protein huyết thanh. ............................. 43

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1

1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................................ 1

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ................................................................................. 2

3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4

CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU .................................................................. 4

1.1. SƠ LƢỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM

1.1.1. Sơ lƣợc về nguồn gốc và vị trí phân loại của gà nhà ............................. 4

1.1.2. Một số đặc điểm của ba giống gà nghiên cứu ....................................... 5

1.2. ĐẠI CƢƠNG VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ ............................................................... 7

1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI ......................................................................... 8

1.3.1. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh máu

của gia cầm .............................................................................................. 8

1.3.2. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu tính đa hình protein huyết

thanh máu .............................................................................................. 10

1.4. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TY THỂ GÀ ................................................................ 12

1.3.3. Thành phần protein huyết thanh của gia súc và một số động vật ......... 11

1.4.1. Cấu trúc và chức năng của ty thể ........................................................ 12

1.4.2. Sự tổng hợp protein trong ty thể ......................................................... 13

1.4.3. Chủng loại phát sinh của ty thể ........................................................... 14

1.4.4. MtDNA của động vật có xƣơng sống và mtDNA gà ........................... 14

1.4.5. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới .............................. 17

1.4.6. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam ............................... 20

2.1. VẬT LIỆU............................................................................................................... 22

2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .................................................................................... 22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 22

2.2.1. Hóa chất ............................................................................................. 22

2.2.2. Thiết bị ............................................................................................... 23

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 23

2.3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu của động vật ................. 23

2.3.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose ................................................ 24

2.3.3. Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE ....................................................... 25

2.3.4. Nhân vùng điều khiển D-Loop bằng kĩ thuật PCR .............................. 27

2.3.5. Tinh sạch sản phẩm DNA ................................................................... 29

2.3.6. Phƣơng pháp xác định trình tự ............................................................ 30

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 31

3.1. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ .................... 31

3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà ................................. 31

3.1.2. Nhân vùng điều khiển D-Loop của DNA ty thể .................................. 33

3.1.3. Xác định trình tự vùng điều khiển của DNA ty thể ............................. 37

3.2. THÀNH PHẦN ĐIỆN DI PROTEIN HUYẾT THANH GÀ THÍ NGHIỆM ............. 43

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 47

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Gần một thế kỉ qua ngành chăn nuôi gia cầm đƣợc cả thế giới quan tâm

và phát triển mạnh cả về số lƣợng và chất lƣợng. Chăn nuôi gia cầm chiếm

một vị trí quan trọng trong chƣơng trình cung cấp protein động vật cho con

ngƣời. Gia cầm chiếm 20-25% trong tổng sản phẩm thịt, ở các nƣớc phát triển

thịt gà chiếm tới 30% hoặc hơn thế nữa.

Ở nƣớc ta ngành chăn nuôi gia cầm là một nghề sản xuất truyền thống,

giữ vị trí quan trọng thứ hai trong tổng giá trị sản xuất. Đàn gia cầm ở nƣớc ta

phân bố không đều, đàn gà tập trung chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc (66%), ở các

tỉnh phía Nam chiếm 34%. Đàn vịt thì ngƣợc lại phân bố chủ yếu ở các tỉnh

phía Nam (60%) và ở miền Bắc đàn vịt chỉ chiếm khoảng 40%.

Theo số liệu của Tổng cục thống kê, số lƣợng đàn gia cầm của nƣớc ta

đến ngày 1/8/2004 là 218,15 triệu con, tƣơng đƣơng với số đầu con năm 2001

(218,1 triệu con) thấp hơn năm 2002 ( 233,3 triệu con) và năm 2003 (254,06

triệu). Sản lƣợng thịt là 316,41 ngàn tấn, thấp hơn năm 2001 (322,6 ngàn tấn),

năm 2002 (338,4 ngàn tấn) và 2003 (372,72 ngàn tấn). Sản lƣợng trứng là

3,94 tỷ quả, thấp hơn năm 2001 (4,16 tỷ quả), 2002 (4,85 tỷ quả) và 2003

(4,85 tỷ). Nguyên nhân là do ảnh hƣởng của dịch cúm gia cầm [10].Năm

2005, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã hoàn thành việc xây dựng đề

án đổi mới hệ thống chăn nuôi gia cầm ở nƣớc ta. Theo đề án, ngành chăn

nuôi gia cầm phải chuyển đổi mạnh từ chăn nuôi phân tán, quy mô nhỏ sang

sản xuất hàng hóa lớn theo hƣớng công nghiệp hóa và bán công nghiệp trên

cơ sở có quy hoạch vùng chăn nuôi hàng hóa tập trung tại từng địa phƣơng;

mục tiêu là đến năm 2015, tổng đàn gia cầm đạt 560-580 triệu con, khối

lƣợng thịt 1000 nghìn tấn , sản lƣợng trứng 11,0 tỷ quả và tổng giá trị sản xuất

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

chăn nuôi gia cầm đạt xấp xỉ 20000 tỷ đồng [10].

Hiện nay 75-80% chăn nuôi gà ở nƣớc ta là sử dụng các giống địa

phƣơng, nuôi gà chăn thả với các giống truyền thống địa phƣơng cũng không

ngừng phát triển và hiệu quả ngày càng tăng bởi các giống địa phƣơng đã

đƣợc đầu tƣ để bảo tồn quỹ gen nhằm chọn lọc nâng cao năng suất. Các giống

gà nội của ta mặc dù có hạn chế về năng suất, nhƣng khả năng thích ứng với

điều kiện chăn nuôi Việt Nam cao, phẩm chất trứng thịt tốt đặc biệt là một số

giống gà còn có giá trị dƣợc liệu cao, tốt cho việc bồi bổ sức khỏe của con

ngƣời. Gà Ri của ta, gà của ngƣời H'Mông là một trong những giống gà có

phẩm chất quý đó.Và một giống gà hiện đƣợc rất nhiều ngƣời quan tâm về

phẩm chất, tác dụng của nó đó là gà Đa cựa.

Bên cạnh việc đánh giá chọn giống vật nuôi dựa vào những đặc điểm

hình thái còn dựa vào đặc tính di truyền, sinh lí, sinh hóa. Các đặc tính này

chịu sự kiểm soát bởi các gen, thuộc hệ gen của cơ thể sinh vật và sự tƣơng

tác giữa các gen với môi trƣờng. phân tích đa hình protein huyết thanh của

các giống gà để thấy đƣợc chất lƣợng của các giống gà thí nghiệm, so sánh

trình tự đoạn D-loop của các giống gà Ri, gà Mông, gà Đa cựa nhằm xác định

mối quan hệ di truyền giữa các giống gà, đó là một việc làm cần thiết nhằm

cung cấp thêm thông tin khoa học cho nghành chọn giống, tạo cơ sở cho việc

lai tạo các giống mới đáp ứng đƣợc các nhu cầu thị trƣờng hiện nay. Vì vậy

chúng tôi lựa chọn đề tài:

"Nghiên cứu đa hình protein huyết thanh và trình tự vùng điều

khiển D-loop ty thể của ba giống gà: Ri, Mông và Đa cựa" .

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- So sánh trình tự đoạn điều khiển trong DNA ty thể giữa các giống gà.

- Xác định mối quan hệ di truyền của ba đại diện của ba giống gà.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Phân tích đa hình protein huyết thanh của ba đại diện của ba giống gà.

3. Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mô máu của gà Ri, gà Mông,

và gà Đa cựa.

- Phân lập vùng D-Loop của hệ gen ty thể bằng kỹ thuật PCR.

- Xác định trình tự vùng D-Loop và so sánh với trình tự tham khảo đã

đƣợc công bố trên Ngân hàng trình tự gen quốc tế.

Trên cơ sở đó, đánh giá sơ bộ về sự khác biệt di truyền giữa ba đại

diện của ba giống gà nói trên. Từ đó cung cấp dữ liệu ban đầu cho các

nghiên cứu về đa dạng di truyền và cải tạo giống gà bằng Công nghệ gen

và Công nghệ tế bào.

- Dùng phƣơng pháp điện di để điện di huyết thanh của ba đại diện của

ba giống gà từ đó phân tích đa hình protein huyết thanh của ba đại diện của ba

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

giống gà nói trên.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. SƠ LƢỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM

CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU

1.1.1. Sơ lƣợc về nguồn gốc và vị trí phân loại của gà nhà

Các giống gà hiện nay đƣợc hình thành từ quá trình lai tạo, tiến hóa lâu

dài và phức tạp của 4 loại hình sau của gà rừng.

- Gallus Bankiva: Phân bố ở Miến Điện, Đông Dƣơng và Philippin.

- Gallus Soneratii: Phân bố ở Tây và Nam Ấn Độ.

- Gallus Lafazetti: Phân bố ở Sri Lanca.

- Gallus Varius: Phân bố ở Inđônêxia.

Ở các vùng thung lũng sông Ấn, sự thuần hóa đầu tiên của gà nhà diễn

ra ở thời kỳ đồ đồng, khoảng 3000 năm trƣớc Công nguyên (CN). Vào

khoảng 2000 năm trƣớc CN gà đƣợc đƣa sang Trung Quốc. Sau đó gà phân

bố ở Hy Lạp, ở đây gà vừa là con vật để làm cảnh, tế lễ, và giải trí (chọi gà).

Thông qua ngƣời Hy Lạp có mối quan hệ buôn bán rộng rãi mà gà đƣợc đƣa

sang các nƣớc thuộc miền Địa Trung Hải và giữa Châu Âu. Đến thế kỉ I gà

nuôi đã đƣợc phân bố rộng rãi ở Trung Âu và Đông Âu.

Dẫn theo Nguyễn Đình Ân và nhiều tác giả, trong hệ thống phân loại

sinh giới, gà nhà có vị trí phân loại nhƣ sau:

Giới Động vật (Animalia)

Nghành Động vật có xƣơng sống (Chordata)

Lớp Chim (Aves)

Bộ Gà (Galliformes)

Họ Trĩ (Phasianidae)

Giống Gallus

Loài Gallus gallus

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Phân loài Gallus gallus domesticus

Theo tác giả Nguyễn Thị Mai [10] gà nhà của ta bắt nguồn từ gà rừng

Gallus bankiva hay còn có tên là Gallus gallus. Cách đây khoảng 3000 năm từ

giống gà hoang ban đầu, trải qua thời gian dài nhân dân ta đã tạo ra đƣợc

nhiều giống gà khác nhau: Gà chọi, gà Đông Cảo, gà Hồ, gà Mía, và gà Ri

đƣợc phân bố rất rộng rãi.

Theo tác giả Nguyễn Văn Tiêu, Nguyễn Duy Ti [12] việc nuôi gà ở nƣớc

ta đã có từ giai đoạn Phùng Nguyên cách đây 3500 năm. Cơ sở của kết luận

này là tƣợng gà bằng đất nung tìm thấy ở xóm Rền, Đồng Đậu, Vĩnh Phúc.

Theo Nguyễn Đức Tâm [9] nghề nuôi gà ở nƣớc ta muộn hơn cách đây

khoảng 3328 ± 100 năm, đến giai đoạn Đông Sơn (2800 ± 100 năm) đã có

tƣợng gà bằng đồng khá phổ biến.

Theo tác giả Đào Văn Tiến (1971) [11] thì gà đƣợc nuôi cách đây 3000 năm.

Theo các tài liệu nghiên cứu về khảo cổ và di chỉ tìm đƣợc cho thấy

vùng nuôi gà sớm nhất ở nƣớc ta nằm giữa hai dãy núi Ba Vì và Tam Đảo. Gà

nuôi lúc bấy giờ tầm vóc còn bé, khả năng sinh sản thấp và đó chính là tổ tiên

giống gà hiện nay. Trải qua thời kì dài làm nông nghiệp, chăn nuôi tùy theo sở

thích và điều kiện khí hậu, đất đai, trình độ canh tác, tập quán.. tổ tiên ta đã

tạo nên các giống gà khác nhau mà cho đến ngày nay vẫn tồn tại và phát triển

nhƣ gà Ri, gà Đông Tảo, gà Hồ, gà Tre...

1.1.2. Một số đặc điểm của ba giống gà nghiên cứu

1.1.2.1. Gà Ri

Có nguồn gốc thuộc nhóm gà rừng Gallus banguira thƣờng gặp ở các

nƣớc Đông Nam Á nhƣ Ấn Độ, Mianma, Malaysia...

Ở nƣớc ta gà Ri đƣợc nuôi phổ biến ở mọi miền trong cả nƣớc. Mầu

sắc lông có nhiều loại: Vàng , nâu, đen, trắng, xám...thể hiện tính pha tạp

nặng. Tầm vóc nhỏ, dáng thanh gọn, chân có hai hàng vẩy xếp nhƣ hình mái

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ngói. Đến tuổi thành thục, con trống nặng từ 1,6- 2,2 kg; con mái nặng từ 1,1

- 1,6 kg. Sản lƣợng trứng 80 - 100 quả/năm. Khối lƣợng trứng nhỏ: 40 - 50

gam. Gà Ri đƣợc chọn lọc, sản lƣợng trứng có thể đạt 120 - 130 quả/năm. Gà

Ri có sức chống chịu bệnh tật cao, thịt có hƣơng vị thơm ngon, phẩm chất tốt

[7].

Gà Ri có đặc tính cần cù, chịu khó kiếm ăn, khả năng chống chịu tốt

với thời tiết, bệnh tật, nuôi con khéo, đẻ trứng sớm với khẩu phần ăn nghèo

chất dinh dƣỡng 13-15% đạm thì vẫn nuôi đƣợc gà đẻ trứng bình thƣờng.

1.1.2.2. Gà Mông

Ở nƣớc ta gà Mông đƣợc nuôi chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía bắc

trong các gia đình dân tộc thiểu số, đặc biệt là ngƣời H'Mông, đƣợc nuôi với

phƣơng thức chăn thả quảng canh không có đầu tƣ.

Đặc điểm gần giống với kiểu Bakira, Gà Mông có tầm vóc tƣơng đối

lớn từ 3 - 4kg, có chân cao, tốc độ sinh trƣởng khá, nhiều lông, ức nở, mào và

dái tai lớn, mỏ hơi cong và nhọn, màu sắc lông đa dạng. Gà Mông thích nghi

tốt với điều kiện thời tiết khí hậu, dịch bệnh, phẩm chất thịt ngon, ít mỡ, giàu

dinh dƣỡng. Tuy nhiên gà Mông thƣờng nuôi con và chăm sóc con kém hơn

gà Ri [7].

Gà Mông không những là món ăn ngon, bổ mà còn có giá trị dƣợc liệu

cao, rất tốt cho những ngƣời bị bệnh tim mạch. Đồng bào ngƣời Mông dùng

xƣơng, thịt của gà Mông nhƣ một loại thuốc bồi dƣỡng sức khỏe cho những

ngƣời ốm yếu. Gà mái đẻ ít và thƣa số trứng/mái/lứa là 13,65 quả, khoảng

cách giữa 2 lứa đẻ là 19,88 ngày. Trứng gà Mông có khối lƣợng ở mức trung

bình với 44,04g. Tỷ lệ vật chất khô ở lòng đỏ trứng là 50,56%, ở lòng trắng

12,41. Tỷ lệ protein lòng đỏ 16,66%, lòng trắng 11,01% lòng đỏ trứng có tỷ lệ

lipit khá cao 26,94% [20].

Đặc tính riêng biệt: Da, thịt, xƣơng và phủ tạng có màu đen chiếm 90%,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ngoại trừ màu lông do quá trình nuôi bị lai tạp, chƣa đƣợc chọn lọc nên màu sắc

lông gà Mông thƣờng rất đa dạng: Vàng rơm, nâu, đen, xám, hoa mơ, trắng......

Về tập tính, trƣớc đây, gà Mông đƣợc nuôi thả tự do nên tập tính có

phần hoang dại. Ban ngày gà đƣợc thả rông tự kiếm ăn, tối về chuồng hoặc

đậu trên cây ngủ. Thức ăn có thể là giun, dế, ngô, thóc....., ngƣời nuôi ít cho

ăn thêm.

1.1.2.3. Gà Đa cựa

Là giống gà địa phƣơng đƣợc nuôi ở chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía

bắc trong các gia đình dân tộc thiểu số. Tầm vóc tƣơng đối lớn, màu sắc lông

đa dạng: Xám, vàng, đỏ nâu.....Phẩm chất thịt ngon, ít mỡ. Gà có khả năng

chống chịu tốt với thời tiết, bệnh tật. Đặc điểm đặc biệt dễ nhận thấy là chân

có nhiều cựa nên đƣợc gọi là gà Đa cựa.

1.2. ĐẠI CƢƠNG VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ

Sinh học phân tử nghiên cứu ở mức độ phân tử các phản ứng sinh học

xảy ra trong tế bào. Hoạt động của từng gen cũng nhƣ sự phối hợp giữa các

gen; Kiểm soát sự phiên mã, dịch mã cũng nhƣ sự phân bố của các protein

trong tế bào; các phản ứng sinh học đảm bảo hoạt động sống của tế bào cũng

nhƣ điều hòa hoạt động giữa các tế bào trong một mô, giữa các mô với nhau....

Sự phát hiện cấu trúc chuỗi xoắn kép của DNA bởi James D.Watson và

Francis H.C. Crick (1953) chính thức khởi đầu cho thời kì hiện đại của sinh

học phân tử.

Trải qua hơn nửa thế kỉ sinh học phân tử đã đạt đƣợc những thành tựu

vĩ đại mà đỉnh cao của sự phát triển này là những khám phá bản chất sinh học

của sự sống ở cấp độ phân tử và xây dựng các kĩ thuật sinh học phân tử ứng

dụng vào thực tiễn. Geneomics và Proteomics là vấn đề đang đƣợc quan tâm

đặc biệt hiện nay mà cơ sở của các lĩnh vực này là những phát hiện về cấu

trúc và chức năng của axit nucleic, về đặc điểm của genome nhân, genome ty

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

thể, genome lạp thể. Những đặc điểm khác nhau về cấu trúc và chức năng của

các hệ gene cho phép ứng dụng vào thực tế chọn giống và nghiên cứu ở

ngƣời. Cùng với cấu trúc DNA và RNA còn có đặc điểm của quá trình tái bản

DNA và phiên mã cũng đƣợc quan tâm, vì nó là cơ sở của những kĩ thuật sinh

học phân tử - các thao tác ở DNA và RNA.

Phân loại học phân tử (Molecular systematics ) là sự phát hiện, mô tả

và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử giữa các loài trong phạm

vi loài [16]. Các phƣơng pháp dùng trong phân loại phân tử: Hiện nay có hàng

loạt các phƣơng pháp đang đƣợc sử dụng trong phân loại học phân tử nhƣ:

Điện di isozym, phản ứng chuỗi polymerase (PCR); Kĩ thuật phân tích hiện

tƣợng đa hình của độ dài các phân đoạn ADN (RFLP technology); Phân tích

đa hình của ADN đƣợc nhân bản ngẫu nhiên (Random Amplified Polimorphic

DNA - RAPD) ;Phân tích tính đa hình chiều dài các phân đoạn ADN đƣợc

nhân bản có chọn lọc (Amplified Fragment Length Polimorphism-AFLP).......

1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.3.1. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh máu

của gia cầm

Máu là một loại dịch thể lỏng, có màu đỏ, vị hơi mặn và đƣợc lƣu

thông liên tục trong hệ tuần hoàn của cơ thể. Máu cũng là một mô lỏng (mô

máu) bao gồm các tế bào máu nhƣ: Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu. Ngoài ra

còn có huyết tƣơng (dịch ngoại bào). Máu cùng với các dịch thể khác của cơ

thể nhƣ: Dịch bạch cầu, dịch gian bào, dịch tiêu hóa...là những môi trƣờng

sống của tất cả các loại tế bào trong cơ thể và đƣợc gọi là nội bào. Máu là

thành phần rất quan trọng của nội môi. Nội môi luôn đƣợc ổn định và cân

bằng đã đảm bảo cho các quá trình sống của cơ thể đƣợc diễn ra một cách

bình thƣờng và do đó cơ thể mới đƣợc tồn tại, sinh trƣởng và phát triển

tốt...Các tế bào máu luôn đƣợc đổi mới trong cơ thể nhƣng vẫn luôn duy trì

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

một tỷ lệ tƣơng đối ổn định.

Việc nghiên cứu các thành phần của máu cũng nhƣ các chỉ số sinh lý,

hóa sinh máu có ý nghĩa quan trọng trong công tác giống, chỉ số sinh lý, hóa

sinh đã trở thành hằng số đặc trƣng cho phẩm chất giống, quy định đặc tính di

truyền bên trong cơ thể, từ đó cho phép khảo sát và điều tra các chỉ tiêu cho

công tác chọn giống và lai tạo giống gia súc, gia cầm.

Thành phần của máu: Lấy máu và chống đông rồi cho vào một ống

nghiệm, sau đó ly tâm, ta sẽ thấy máu đƣợc chia làm hai phần rõ rệt:

- Phần trên có màu vàng nhạt vì có các sắc tố màu vàng và chiếm

khoảng 55-60% thể tích của máu.

- Phần dƣới đặc hơn có màu đỏ thẫm, chiếm khoảng từ 40-45% thể tích

của máu, đó là các tế bào máu gồm có : Các hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu.

Lƣợng máu trong cơ thể là tỉ lệ % của khối lƣợng máu so với trọng

lƣợng cơ thể. Tỉ lệ này thay đổi tùy loài: Ở mèo 6,6%, ở thỏ 5,5% và ở gà

8,5% - 9% (gà 180 - 315ml; vịt 360ml).

Tỉ trọng của máu thay đổi thuộc vào tùy loài, thành phần nhóm tuổi

nhƣng mức độ thay đổi không lớn.

Số lƣợng hồng cầu, bạch cầu của gia cầm không giống nhau, phụ thuộc

vào giống, tuổi và giới tính.

pH của máu và hệ đệm: Phản ứng của máu phụ thuộc vào tỉ lệ ion H+ và OH- trong máu, phản ứng máu nói chung ổn định ít có sự dao động giữa

các loài:

Máu Ngựa pH=7,4; Dê=7,49; Gà=7,42; Lợn=7,49.

pH máu đƣợc duy trì ở trạng thái ổn định nhờ sự hoạt động của cơ quan

bài tiết và các hệ đệm của máu: Hồng cầu có 5 đôi hệ đệm, huyết tƣơng có 4

đôi hệ đệm. Nghiên cứu về hệ đệm của máu là cơ sở để sử dụng các dung dịch

đệm trong điện di huyết thanh và hemoglobin cho phù hợp với pH của nó.

Trong điện di ngƣời ta sử dụng các dung dịch đệm khác nhau phù hợp với

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

từng đối tƣợng.

1.3.2. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu tính đa hình protein huyết

thanh máu

Trong những năm gần đây, nhờ các phƣơng pháp và kỹ thuật phân tích

sinh hóa hiện đại phát triển mạnh mẽ, đặc biệt là phƣơng pháp điện di và các

phƣơng pháp nhuộm hóa tế bào đã góp phần quan trọng để nghiên cứu, phát

hiện cấu trúc enzym của protein huyết thanh, sữa, các kiểu hemoglobin…trên

cơ sở đó nghiên cứu cơ chế phân tử của trao đổi chất, hoạt động của gen trong

tế bào. Nhiều dẫn liệu trong lĩnh vực phân tích tính đa hình di truyền của các

tính trạng hóa sinh đã đƣợc ứng dụng trong công tác chọn giống vật nuôi một

cách có hiệu quả.

Các tính trạng hoá sinh là những tính trạng muốn xác định nó, ngƣời ta

phải dùng các phƣơng pháp phân tích hoá học, hoá sinh học. Hƣớng nghiên

cứu di truyền học hoá sinh ngày càng phát triển mạnh mẽ trên tất cả các đối

tƣợng vi sinh vật, thực vật, động vật và ngƣời. Nhờ cải tiến các kĩ thuật phân

tích hoá sinh ngày càng hiện đại, chính xác, có sự kết hợp giữa các máy phân

tích tự động với máy vi tính đã rút ngắn khá nhiều thời gian phân tích các tính

trạng tới hàng trăm, hàng nghìn lần.

Nghiên cứu tính đa hình di truyền của hemoglobin, protein, huyết thanh

máu, protein trong sữa hoặc các enzym trong máu và các cơ quan…..đã đƣợc

tiến hành từ lâu.

Năm 1955, Smithies O. đã chứng minh tính đa dạng di truyền các

protein huyết thanh máu động vật. Ông đã dùng hai phƣơng pháp chính là:

Phƣơng pháp miễn dịch học phát hiện nhóm globin, lipoprotein…và phƣơng

pháp miễn dịch học phát hiện hemoglobin, haptoglobin, transferin.

Nhiều nhà nghiên cứu về sau đã sử dụng các phƣơng pháp điện di trên

giấy, trên gel tinh bột, gel agarose, gel polyacrylamide…để xác định tính đa

hình của hemoglobin, các protein trong máu, mô cơ quan, sữa, trứng và các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

enzym trong máu, trong các dịch của cơ thể.

Protein huyết thanh máu là hỗn hợp các chất khác nhau. Ngƣời ta đã đi

sâu chứng minh vai trò quan trọng của các tiểu phần huyết thanh với các quá

trình trao đổi chất và liên quan của chúng với các chỉ tiêu kinh tế khác.

1.3.3. Thành phần protein huyết thanh của gia súc và một số động vật

Tùy theo phƣơng pháp xác định thành phần protein huyết thanh mà ta

đƣợc số tiểu phần (cấu tử) khác nhau.

Phƣơng pháp điện di trên giấy tách protein huyết thanh bò, lợn đƣợc

bốn tiểu phần chính; Anbumin là tiểu phần chạy nhanh nhất về phía cực

dƣơng, tiếp theo là các tiểu phần αglobulin, βglobulin, γglobulin.

Về thành phần protein huyết thanh của lợn, gà, cá và một số động vật

nuôi khác khi điện di trên giấy cũng đƣợc 4 tiểu phần chính là anbumin,

αglobulin, βglobulin, γglobulin.

Khi phân tích protein huyết thanh trên gel tinh bột thủy phân, gel

polyacrylamide…số cấu tử sẽ lớn hơn do mỗi tiểu phần ở trên giấy sẽ đƣợc

tách ra nhiều phần nhỏ nhƣ tiền anbumin, anbumin, hậu anbumin, α1globulin,

α2globulin βglobulin, γ1globulin, γ2globulin…

Anbumin là nguyên liệu xây dựng các tế bào, anbumin huyết thanh

đóng vai trò giữ áp lực thẩm thấu keo, vận chuyển và liên kết axít béo,

vitamin…

Anbumin liên quan đến một số tính trạng kinh tế nhƣ lợn sinh trƣởng

nhanh, tỷ lệ nạc cao thì chúng có hàm lƣợng anbumin cao.

αglobulin tuy hàm lƣợng thấp so với tổng lƣợng protein huyết thanh

nhƣng chúng có vai trò quan trọng trong liên kết với gluxit, lipit để tạo ra

lipoprotein, glucoprotein. Đồng thời, chúng tham gia vận chuyển cholestron.

Khi dùng thạch, tinh bột tách đƣợc 2 phần α1globulin, α2globulin.

α2globulin đƣợc quan tâm nhiều hơn vì nó chứa haptoglobin, nó liên quan

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

đến hàm lƣợng mỡ sữa và sự tích lũy mỡ sữa ở động vật.

βglobulin có nhiệm vụ liên kết và chuyển hóa sắt, tạo máu, vận chuyển

các ion kim loại, chuyển hóa mỡ…

Khi tách βglobulin bằng gel tinh bột đƣợc phần transferin có vai trò

quan trọng trong việc tạo máu. Liên quan đến sản lƣợng sữa ở bò, sức kháng

bệnh tự nhiên ở gia súc.

γ globulin là tiểu phần rất quan trọng. Nó là protein miễn dịch, ở động

vật γ- globulin đƣợc chia ra làm 5 nhóm: IgA, IgG, IgH, IgD và IgE (do các

lympho B sản xuất). Các globulin miễn dịch có tác dụng chống lại các kháng

nguyên lạ xâm nhập vào cơ thể. Thông qua hệ thống miễn dịch, các globulin

miễn dịch đã bảo vệ cho cơ thể, và có vai trò trong bảo tồn nòi giống [2].

1.4. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TY THỂ GÀ

1.4.1. Cấu trúc và chức năng của ty thể

Ty thể là bào quan có mặt trong tất cả tế bào hô hấp hiếu khí, có chức

năng vô cùng quan trọng là trạm chuyển hóa năng lƣợng từ các phân tử dinh

dƣỡng thành dạng năng lƣợng tích trữ trong phân tử ATP là dạng năng lƣợng

cần thiết cho tất cả các hoạt động sống của tế bào.

Ty thể đƣợc Altman phát hiện vào năm 1894 và đến năm 1897 đƣợc

Benđa đặt tên là Mitochondria (theo tiếng Hy Lạp- Mistos là sợi và chondira-

là hạt) vì chúng có dạng sợi hoặc dạng hạt khi xem dƣới kính hiển vi thƣờng.

Ty thể là những thể nhỏ có màng bao bọc, số lƣợng ty thể trong các tế

bào rất khác nhau, có thể hàng trăm hoặc hàng nghìn. Ty thể có nhiều hình

dạng khác nhau nhƣ hình cầu, hình que, hình sợi... Ty thể có khả năng chuyển

động, thay đổi kích thƣớc, hình dạng và liên kết lại với nhau thành các cấu

trúc dài hơn hoặc phân ra thành các cấu trúc ngắn hơn. Trong tế bào, ty thể

thƣờng tập trung ở các nơi đang diễn ra sự trao đổi chất mạnh nhất.

Cấu trúc của ty thể đƣợc bao bọc bằng một màng kép lớp ngoài nhẵn,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

lớp trong có nhiều nếp gấp chạy song song và ăn sâu vào trung tâm của ty thể.

Giữa hai lớp màng trong và màng ngoài có chứa dịch kẽ màng. Mặt ngoài của

lớp ngoài và mặt trong của lớp trong có chứa nhiều hạt với kích thƣớc từ 80- 90 Ao chứa các enzyme và cofacto. Ty thể nhƣ một nhà máy để sản sinh ra

năng lƣợng của tế bào. Hệ thống sản sinh ra năng lƣợng trong ty thể bao gồm

hai quá trình oxy hóa và photphoril hóa. Quá trình oxy hóa giải phóng ra các

điện tử, các điện tử tác dụng nhƣ tác nhân tích lũy và biến đổi năng lƣợng.

Trong điều kiện nếu thiếu oxy sẽ diễn ra quá trình tổng hợp ATP là chất tích

lũy năng lƣợng dƣới dạng các cầu nối photphát giầu năng lƣợng. Tại ty thể sẽ

tiếp nhận các sản phẩm đƣợc phân giải từ các chất nhƣ protein, lipit và gluxit

diễn ra trong bào tƣơng đến dạng pyruvat và chuyển sang dạng Axetyl

coenzimA. Trong ty thể, axetyl coenzimA đã qua quá trình oxy hóa trong chu trình Krebs. Với chu trình này, đã có bốn lần giải phóng 2H+ nghĩa là giải phóng hai điện tử. Các ion H+ giải phóng ra đƣợc các chất vận chuyển H+ tiếp

nhận chuyển vào chuỗi hô hấp và cuối cùng chuyển hydro cho oxy. Trong

chuỗi hô hấp, năng lƣợng giải phóng đƣợc tích lại dƣới dạng ATP. Ty thể còn

có đặc điểm là trong dịch nền của nó có những hạt DNA và ARN. Ty thể đã

sử dụng DNA làm khuôn mẫu để sản sinh ra ty thể mới.

1.4.2. Sự tổng hợp protein trong ty thể

Nhờ có đủ các nhân tố riêng của mình (mtDNA, mARN, tARN và

riboxom) nên ty thể có thể tự tổng hợp các protein cho mình. Sự tổng hợp

protein cũng diễn ra trên riboxom theo cơ chế chung, nhƣng axit amin khởi

động, giống nhƣ ở Bacteria là N-fomyl- methionin, chứ không phải methionin

nhƣ ở tế bào Eukaryota. Ty thể không thể tự tổng hợp tất cả protein của ty thể

bởi vì mtDNA chỉ chứa lƣợng nucleotit mã hóa cho khoảng 500 axit amin.

Rất nhiều protein của ty thể đƣợc tổng hợp từ mạng lƣới nội chất có hạt trong

tế bào chất theo mã của các gen trong nhiễm sắc thể của nhân, sau đó đƣợc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

vận chuyển vào ty thể. Ty thể tự tổng hợp một số protein không hòa tan cần

cho màng trong và một số protein có chức năng điều chỉnh quá trình hoạt hóa

các gen ty thể của nhân tế bào.

1.4.3. Chủng loại phát sinh của ty thể

Trƣớc đây có giả thuyết cho rằng trong quá trình tiến hóa của tế bào thì

ty thể có nguồn gốc từ sự phân hóa của màng sinh chất ăn sâu vào tế bào chất,

về sau tách ra và phức tạp hóa hệ thống mào trở thành một bào quan độc lập,

với dẫn chứng là nhiều bọn vi khuẩn có cấu trúc mezoxom - là một phần của

màng sinh chất gấp nếp ăn sâu vào tế bào chất, có chứa các enzym và nhân tố

của sự hô hấp hiếu khí - đó là hình ảnh của ty thể ở dạng nguyên thủy. Nhƣng

hiện nay ngƣời ta công nhận giả thuyết cộng sinh về nguồn gốc chủng loại

của ty thể. Sự xuất hiện ty thể trong tế bào Eukaryota là kết quả cộng sinh của

một dạng vi khuẩn hiếu khí với tế bào. Dẫn chứng thuyết phục nhất là trong ty

thể có chứa DNA giống DNA của vi khuẩn, riboxom của ty thể về kích thƣớc

và rARN giống với riboxm vi khuẩn, và đặc biệt là cơ chế và hoạt động tổng

hợp protein trong ty thể có nhiều đặc điểm giống với vi khuẩn.

1.4.4. MtDNA của động vật có xƣơng sống và mtDNA gà

MtDNA là sợi xoắn kép có cấu trúc vòng, có chiều dài chừng 5µm.

Trong tế bào mtDNA chiếm từ 1 - 5% DNA của tế bào. MtDNA tự tái bản

theo kiểu bán bảo thủ nhờ hệ DNA polimerase có trong chất nền ty thể và xảy

ra ở gian kỳ của chu kì tế bào. MtDNA có dạng vòng và không liên kết với

histon, điều này làm cho mtDNA khác với DNA của nhân tế bào và mtDNA

tƣơng tự với DNA của vi khuẩn. MtDNA là một trong các nhân tố qui định

tính di truyền tế bào chất.

Sự di truyền của các gen ty thể phụ thuộc vào hai yếu tố: Kiểu di truyền

của bản thân bào quan và số bản sao nhiễm sắc thể trong tế bào. Ở phần lớn

các loài, mỗi cá thể nhận đƣợc các bào quan từ mẹ cùng với tế bào chất của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

trứng. Kiểu di truyền này đƣợc gọi là di truyền theo dòng mẹ. Kiểu di truyền

này có đặc điểm: Thứ nhất, kiểu gen của con hoàn toàn do mẹ quyết định.

Nếu mẹ mang đột biến ở gen bào quan thì con sẽ có kiểu hình đột biến cho dù

bố bình thƣờng. Thứ hai, ảnh hƣởng đến kiểu di truyền này là số lƣợng bản

sao nhiễm sắc thể trong bào quan.

Phân tử mtADN có các đặc điểm chú ý sau:

- Tốc độ đột biến lớn gấp 5 lần so với gen nhân.

- Số lƣợng bản sao lớn.

- Đơn bội, không có sự tái tổ hợp.

- Chỉ di truyền theo dòng mẹ.

Mt DNA của động vật có xƣơng sống nói chung có dạng vòng kép,

gồm một chuỗi nặng (chuỗi H) giàu Guamin, và một chuỗi nhẹ (chuỗi L) giàu

cytozin, có chiều dài khoảng 5µm. Phân tử mtDNA không liên kết với protein

histone, có khả năng tái bản theo cơ chế bán bảo toàn nhờ sử dụng các

enzyme DNA polymerase trong chất nền ty thể. Ở đa số các động vật, phân tử

mtDNA chứa khoảng 16-17kb, mã hóa cho các loại protein/enzyme tham gia

vào các quá trình tổng hợp năng lƣợng, trao đổi chất...của tế bào, trong đó

gồm 22 loại tRNA, 2 loại rRNA 16S và 12S, 13 chuỗi polypeptide [15, 25].

Tất cả các động vật có xƣơng sống đã đƣợc phân tích đều có 37 gen

trên phân tử DNA ty thể và thƣờng không có khoảng trống giữa các gen

(không có intron). Tuy nhiên, trật tự sắp xếp các gen trong phân tử DNA dạng

vòng có thể không giống nhau giữa các loài, điều này đƣợc thể hiện rõ khi so

sánh trình tự genome ty thể các bậc taxon bậc bộ trở lên. Vì thế, các đặc điểm

về trật tự các gen trên ty thể có triển vọng đƣợc sử dụng nhƣ một dấu hiệu

phân loại với các taxon bậc cao [30].

Phân tử mtDNA có tốc độ tiến hóa nhanh hơn 5 lần so với các gen nhân

do thiếu cơ chế sửa chữa DNA do đó dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

không chỉ giữa các loài mà còn cả trong cùng một loài. Bên cạnh đó, các biến

dị này không giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế

bào khác nhau. MtDNA còn có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền

theo dòng mẹ, có nhiều bản sao trong tế bào và bền vững hơn DNA nhân

trong khi tách chiết do có cấu trúc dạng vòng [18], vì vậy có thể đƣợc sử dụng

nhƣ một dấu hiệu để nhận biết các sai khác di truyền.

Năm 1990, trình tự genome mtDNA lần đầu tiên đƣợc công bố trên đối

tƣợng gà Leghorn trắng bởi các tác giả Desjardins và Moais [16]. MtDNA có

chiều dài khoảng 16,8 kb và ngoài các gen cấu trúc còn có một vùng điều

khiển không mang mã di truyền gọi là vùng D-Loop. Tuy có nhiều đặc điểm

tƣơng đồng với hệ genome mtDNA của các động vật có xƣơng sống, hệ

genome mtDNA của gà vẫn mang những điểm khác biệt:

- Trên chuỗi nhẹ, trật tự gen theo chiều 5'-3' là NADH dehydrogenase

(ND5), Cytochrome b (Cyt b), tRNAthr , tRNApro, ND6, tRNAGlu và vùng điều

khiển trong khi ở các động vật khác, gen Cyt b lại nằm gần vùng điều khiển

hơn [16].

- Ở gà thiếu 1 điểm khởi đầu sao chép nằm giữa 2 gen tRNACys và

tRNAAsn nhƣ ở các động vật có xƣơng sống khác [16].

- Gen Cytochrome oxydase I (COI) có bộ 3 mở đầu là GTG thay vì

ATG. Toàn bộ genome ty thể gà (Galuss galuss) đƣợc tổ chức nhƣ sơ đồ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

trong hình 1.1.

Hình 1.1. Sơ đồ tổ chức của DNA ty thể Gà

ND: NADH dehydrogenase; CO: Cytochrome oxydase

Đoạn D-loop trên mtDNA là một vùng không mang mã di truyền, có

chiều dài 1227bp ở gà nhà [16], chứa điểm khởi đầu sao chép và các promoter

cho quá trình phiên mã của cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Về cấu trúc vùng

trình tự D-Loop có thể chia thành ba domain I, II và III [14]. Trong đó

domain II bảo thủ nhất, chứa một số đơn vị cấu trúc không thay đổi ngay cả ở

bậc phân loại họ. Ngƣợc lại domain III đƣợc coi là biến đổi nhiều nhất [25].

Đoạn trình tự D-Loop là vùng tiến hóa nhanh nhất trong phân tử

mtDNA. Trung bình, nó tích lũy các đột biến nhanh hơn 5-10 lần so với bất kì

gen nào trong hệ gen ty thể vì vậy có thể xem trình tự nucleotide của vùng D-

Loop là một công cụ quan trọng để đánh giá đa dạng di truyền, sự phân hóa

bên trong loài và giữa các quần thể cùng loài.

1.4.5. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Năm 1994-1995, Fuhimito và cộng sự [33] đã tiến hành nghiên cứu

mối quan hệ chủng loại giữa các loài gà rừng, Công , Trĩ, chim Cun cút...dựa

trên các phân tích đoạn điều khiển ty thể. Kết quả phân tích đa hình chiều dài

các đoạn giới hạn (RFLP) trên vùng điều khiển mtDNA cho phép các tác giả

này đƣa ra một sơ đồ phân loại giữa các loài trên. Đồng thời họ đã xác định

đƣợc trình tự của 400bp đầu tiên trên vùng điều khiển mtDNA. Kết quả nhận

đƣợc đã chỉ ra sự lặp lại của một đoạn khoảng 60bp trên vùng điều khiển

mtDNA là điểm đặc trƣng của giống Gallus.

Randi và cộng sự (1997) [19]; Scott(1997) [24] phân tích trình tự của

một phân đoạn điều khiển ty thể (đoạn D-Loop)của 2 loài gà lôi đặc hữu ở

Việt Nam đã chỉ ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa 2 giống gà này.

Năm 1999, Kimball và cộng sự [21] cũng dựa trên sự phân tích đầy đủ

của gen cytochrom b (1143 bp) và đoạn siêu biến 1 (350 bp) của vùng điều

khiển mtDNA để xác định mối quan hệ chủng loại của một số loài Trĩ và gà

Gô. Hai cây phân loại đƣợc xây dựng từ hai hệ thống số liệu nhận đƣợc trên

một đoạn trình tự ngắn trên mtDNA cũng cho kết quả khá phù hợp với kết

quả phân tích trên toàn bộ gen cytochrom b, điều này cho thấy trình tự vùng

điều khiển có đủ cơ sở để phân tích quan hệ chủng loại.

Năm 2001, D.Niu và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nguồn gốc và

đánh giá đa dạng di truyền 6 giống gà bản địa của trung Quốc. Họ giải trình tự

539 nucleotide vùng trình tự D-Loop của 6 giống gà, so sánh với trình tự

nucleotide của các giống gà G. gallus, G.sonneratii, G.varius, G. lafayettei lƣu

giữ trong GenBank và thiết lập cây chủng loại phát sinh giữa các giống. Đồng

thời, dựa trên đoạn trình tự phân tích đƣợc họ cũng nhân thấy sự khác biệt đáng

kể về mặt di truyền giữa các giống gà chuyên trứng và các giống nuôi với mục

đích khác, chủ yếu là do sự khác biệt về dòng mẹ giữa các giống [31].

Năm 2002 Zang và đồng tác giả đã giải trình tự 539 nucleotide đầu tiên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

trong vùng D-Loop của 6 chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) Trung

Quốc và so sánh dữ liệu này với trình tự DNA của 4 loài khác: Gallus gallus,

Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei đã đƣợc công bố trong ngân

hàng gen quốc tế. Ông đã thiết lập đƣợc mối quan hệ nguồn gốc của chúng

dựa trên trình tự vùng D-Loop. Kết quả cho thấy 4 loài thuộc giống Gallus có

rất nhiều điểm khác nhau. G. g. domesticus có mối quan hệ thân thuộc nhất

với G. gallus của Thái Lan và các vùng lân cận. Nhóm nghiên cứu đã giả

thuyết rằng, gà nhà Trung Quốc có thể có nguồn gốc từ loài G.gallus ở các

nơi này và hai loài phụ G. g. Gallus, G. g. spadiceus có thể thuộc một loài phụ

do tính tƣơng đồng cao giữa chúng [36].

Năm 2003, S. Moulin và cộng sự đã sử dụng 800 bp của đoạn D-Loop

và 400 bp của gen cyt b để nghiên cứu sự phát sinh chủng loại của 2 loài gà

Lôi Lophura nycthemera và L. leucomelanos. Các kết quả thu đƣợc đã góp

phần phân biệt 2 loài trên và đồng thời làm sáng tỏ nguồn gốc của một số loài

thuộc 2 loài này [29].

Năm 2003, T. Komiyama và cộng sự cũng dựa trên trình tự đầy đủ của

vùng D-Loop để nghiên cứu nguồn gốc tiến hóa và quá trình thuần hóa của 3

giống gà Naganakidori của Nhật Bản. Trên cơ sở cây chủng loại phát sinh xây

dựng đƣợc các nhà nghiên cứu cho rằng tuy có nhiều điểm khác biệt đáng chú

ý, 3 giống gà trên đều có nguồn gốc từ giống gà chọi Shamo. Kết quả này còn

dẫn đến kết luận 3 giống gà đƣợc đƣa từ các vùng lân cận miền Nam trung

Quốc hoặc Đông Dƣơng qua Okinawa vào Nhật Bản [22, 23].

Pereira và cộng sự (2004) đã tìm đƣợc ít nhất 13 gen giả (pseudogene

hay Numt) trong genome của G.gallus với kích thƣớc dao động từ 131 đến

1733 nucleotide. Đây là các đoạn DNA ty thể đƣợc tìm thấy trong hệ gen

nhân của sinh vật nhân thật. Một số trong chúng có nhiều điểm tƣơng đồng

với các đoạn trong ty thể. Do đó, chúng có thể đƣợc dùng trong các nghiên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

cứu mối quan hệ chủng loại và di truyền quần thể sử dụng DNA ty thể làm

đối tƣợng nghiên cứu. Tuy nhiên, ngƣời ta vẫn chƣa xác định đƣợc tần số bắt

gặp của Numt cũng nhƣ đóng góp của nó đối với genome trong nhân [33].

Komiya T và đồng tác giả (2004) [23] đã tiến hành phân tích trình tự

vùng D-Loop trong ty thể từ mẫu của 9 con gà cảnh đuôi dài và 74 con thuộc

gà địa phƣơng của Nhật Bản đồng thời chọn trình tự DNA của 2 loài gà nhà

lông đỏ (Jungle Fowl) đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen Quốc Tế

EMBL/Genbank/DDBJ, làm nhóm ngoại (outgroup). Trên cơ sở đó họ đã

thiết lập cây phát sinh và kết quả cho thấy cả 3 chủng Naganakidori có nguồn

gốc từ gà chọi Shamo. Các kết quả này đã gợi ý rằng 3 mẫu gà cảnh đuôi dài

đều có chung nguồn gốc mặc dù đặc điểm hình thái bên ngoài rất khác nhau.

Hơn thế 3 chủng gà đuôi dài đầu tiên đã phân ly từ các con gà chọi Okinawa

vốn có nguồn gốc địa lý gần với Nam Trung Quốc và Đông Nam Á hơn so

với Honshu/Kyushu Nhật Bản. Điều này dẫn đến giả thiết rằng gà đuôi dài

Nhật Bản đầu tiên đƣợc đƣa đến Nhật Bản là gà chọi các vùng lân cận của

vùng Nam Trung Quốc và Đông Nam Á. Nhƣ vậy có thể thấy trình tự

nucleotide của vùng D-Loop là một công cụ hữu hiệu để đánh giá tính đa

dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể địa lý.

1.4.6. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam

Năm 1999, Kim Thị Phƣơng Oanh và cộng sự đã sử dụng phƣơng pháp

đa hình các đoạn cắt giới hạn (RFLP) nghiên cứu vùng D-Loop của 3 loài gà

lôi Việt Nam gồm: gà lôi đuôi trắng, trĩ bạc và gà lôi hông tía. Các kết quả thu

đƣợc cho thấy sự sai khác về trình tự nhận biết các enzyme trong vùng trình

tự nói trên [13].

Năm 2000 Nguyễn Hải Hà và cộng sự [3] đã tạo dòng phân tử đoạn gen

điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà lôi đặc hữu Việt Nam trong vector

pBluescript KS (-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotide

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

vùng D-Loop.

Năm 2006 Địch Thị Kim Hƣơng và cộng sự [6] đã xác định đƣợc trình

tự vùng D-Loop gồm 1277 nucleotide của 2 mẫu giống gà Ác Tiềm, Lƣơng

Phƣợng, đã phát hiện đƣợc 22 vị trí khác biệt về nuclotide giữa hai đại diện.

Năm 2007 Lê Đức long và cộng sự đã giải trình tự và so sánh trình tự

nucleotide vùng D-Loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên,

Hà Giang và Yên Bái đƣợc nuôi tại trại gà Nông Lâm Thái Nguyên theo dự

án gà sạch. Kết quả nghiên cứu đã xác định đƣợc trình tự vùng D-Loop gồm

1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định đƣợc 10 vị trí khác

biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này.

Năm 2008 Nguyễn Trƣờng Huy và cộng sự [5] đã xác định đƣợc trình

tự 300 nucleotide đầu tiên trong đoạn D-Loop của 4 mẫu thuộc 4 giống gà:

Gà Ác, gà Mía, gà Hồ và gà Mông và so sánh với trình tự tƣơng ứng trên

đoạn D-Loop 2 giống gà Leghorn và gà bản địa Lào. Dựa trên cây chủng loại

phát sinh xây dựng đƣợc, có thể đƣa ra kết luận sơ bộ về mối quan hệ di

truyền giữa các mẫu thuộc 4 giống gà nghiên cứu so với 2 giống gà đƣợc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

chọn để so sánh.

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU

Vật liệu nghiên cứu là mẫu máu của các giống gà:

- Gà Ri Bắc Kạn (RI): Lông vàng, da vàng, chân vàng.

- Gà Mông Bắc Kạn (Mo): Lông đỏ thẫm điểm đốm trắng nhỏ, da vàng,

chân chì.

- Gà Đa Cựa Bắc Kạn (Da): Lông màu đỏ thẫm, da vàng, chân vàng và

có nhiều cựa.

Các giống gà trên đƣợc lấy từ Bản Hậu - Xã Mỹ Phƣơng - Huyện Ba

Bể - Tỉnh Bắc Kạn.

2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.2.1. Hóa chất

Protease K (20mg/l); phenol:chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1);

Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1); Agarose 0.8%; Tris-HCl (0.1M; pH7.5);

NaOH 1M; H2O khử ion vô trùng; Ethidium bromide.

Bộ hóa chất dùng để tách DNA tổng số của hãng Biosciences, Sigma.

Dung dịch đệm PBS (phosphate Buffer Saline) 10x, NaCl 8g; KCl

0.2g; Na2HPO4 1.44g; KH2PO4 0.24g. Dẫn nƣớc đến 100ml.

Dung dịch đệm tách tế bào (Lysis buffer): Tris - HCl (10mM, pH8);

EDTA (10mM, pH8); NaCl 0.1M; SDS 2.1%.

Dung dịch đệm TAE dùng trong kĩ thuật điện di: Tris base;

CH3COOH; EDTA (0.5mM, pH8).

Bộ hóa chất dùng cho PCR (dNTPs, MgCl2, enzym chịu nhiệt...)

Gel cô 5% : 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6.8, 10 l 10% (w/v) SDS,

0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 l 10% (w/v) APS, 2 l TEMED

Gel tách 12,6%: 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8, 45l 10%

(w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

30 l 10% (w/v) APS, 3 l TEMED.

Đệm hòa mẫu 5x: 25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol,

2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8

Đệm điện di: 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3

2.2.2. Thiết bị

Các thiết bị và hóa chất đƣợc sử dụng thuộc sở hữu của phòng thí

nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và Phòng Công nghệ ADN ứng dụng -

Viện Công Nghệ Sinh Học.

Các thiết bị sử dụng trong đề tài

- Bể ổn nhiệt hãng Tempette Junior Tech

- Cân phân tích hãng metter Toledo, Thụy Sỹ

- Máy li tâm hãng Sorvall

- Máy điện di hãng PowerPac 300, Mỹ

- Máy khuấy trộn hãng OSI, Rotolab

- Máy làm khô chân không hãng Speed Vac Sc 110A- Savan, Mỹ

- Máy PCR-PTC 100 hãng MJ Research, Mỹ

- Máy chụp ảnh hãng Bio-Rad, Mỹ

- Lò vi sóng hãng Samsung, Hàn Quốc

- Pipetman các loại hãng Gilson, Pháp - Tủ lạnh sâu -20oC, -84oC do hãng Sanyo, Nhật Bản sản xuất.

- Máy gene AmpPCR System 9700 do hãng Applied Biosystems, Mỹ

sản xuất.

- Máy xác định trình tự tự động ABI PRISMTM3100 Genetic Analyser

do hãng Applied Biosystems, Mỹ sản xuất.

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu của động vật

• Nguyên tắc chung

Màng tế bào đƣợc phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh, DNA trong và ngoài

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

nhân đƣợc giải phóng cùng với các protein. Sau đó DNA đƣợc tinh sạch nhờ

proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol: chloroform:isoamylalcohol. Cuối

cùng, DNA đƣợc tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phƣơng pháp ly tâm.

• Quy trình kĩ thuật Làm tan máu đông lạnh ở 37-39oC trong bể ổn nhiệt khoảng 1 giờ, chia

máu vào các ống eppendof 1,5 ml với thể tích 500µl/ống, tách chiết DNA

tổng số theo phƣơng pháp của Sambrook và Russell [35] các bƣớc nhƣ sau:

Bƣớc 1: Hòa tan 500 µl PBS vortex và ly tâm ở 6000 v/p, 15 phút, 4 oC,

đổ dịch, thu cặn.

Bƣớc 2: Thêm 1ml dung dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 µl proteinase K. Mẫu thu đƣợc ủ ở 65oC trong 1h, sau đó để ở nhiệt độ phòng,

chia vào mỗi ống Epp 500 µl dịch.

Bƣớc 3: Bổ sung một lƣợng tƣơng đƣơng Phenol: Chlroform: Isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4 oC.

Hút pha trên vào ống mới.

Bƣớc 4: Thêm một thể tích tƣơng đƣơng Chloroform: Isoamyl alcohol

(24:1), vortex và ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4oC. Thu pha trên.

Bƣớc 5: Thêm CH3COONa một lƣợng bằng 1/10 thể tích dung dịch trong

ống. Thêm 3 thể tích cồn 100%, để ở tủ lạnh -20oC trong 15h (qua đêm).

Bƣớc 6: Ly tâm ở 12000v/p, 15 phút, 4oC để thu DNA. Tiếp đó, bổ sung

500µl cồn 70% để rửa, ly tâm ở 12000v/p, 15 phút, 4oC, bỏ dịch và thu cặn.

Bƣớc 7: Làm khô cặn trong máy sấy, hòa tan cặn trong 50 µl H2O,

búng nhẹ.

2.3.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose

• Nguyên tắc chung

Điện di là kĩ thuật dùng để tách và định lƣợng axit nucleic với các kích

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

thƣớc và hàm lƣợng khác nhau. Kĩ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của 3- trên bề axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm do sự có mặt của gốc PO4

mặt. Do đó, khi đặt axit nucleic trong điện trƣờng với cƣờng độ dòng điện và

hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển dần về phía cực dƣơng. Gel đƣợc

sử dụng trong kĩ thuật điện di có thể là gel agarose hoặc polyacrylamid. Trong

thí nghiệm này chúng tôi đã dùng gel agarose 0,8 bởi nồng độ này phù hợp

kích thƣớc trung bình của các đoạn DNA cần phân tích (1-20kb).

• Quy trình kĩ thuật

Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8g agrose vào 100ml dung dịch đệm TAE.

Đun trong lò vi sóng cho đến khi thu đƣợc dung dịch trong suốt. Để nguội đến khoảng 50-60oC, đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn răng lƣợc. Sau 30

phút gel đông lại thì rút răng lƣợc ra và đặt bản gel vào bể điện di có chứa

dung dịch đệm TAE.

Tra mẫu DNA: Trộn một lƣợng mẫu thích hợp (3 µl) với đệm tra mẫu

(2,5 µl), tra vào các giếng trên bản gel. Điện di với dòng điện một chiều có

hiệu điện thế 100V, dòng 60-80mA trong khoảng 30 phút.

Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung

dịch EtBr nồng độ 0,5 µl/ml. Lấy bản gel ra sau 10-15 phút và rửa trong

nƣớc sạch.

Quan sát và chụp ảnh bằng máy Bio-Rab.

2.3.3. Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE

• Nguyên tắc

SDS-PAGE đƣợc thực hiện theo LaemLi [26].Trong phƣơng pháp này,

các phân tử protein đƣợc phân tách theo trọng lƣợng dƣới tác dụng của điện

trƣờng không đổi. Protein đƣợc phân tách trong gel polyacrylamide với các

nồng độ khác nhau. Dƣới tác dụng của dòng điện một chiều, các protein có

kích thƣớc khác nhau sẽ di chuyển về điện cực trái dấu. Các phân tử protein

gắn với SDS nên chúng sẽ tích điện âm, do đó sự khác biệt về điện tích đƣợc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

loại trừ.

Khi protein đƣợc chạy trong điện trƣờng không đổi, phức hệ protein-

SDS sẽ di chuyển xuyên qua các lỗ gel polyacrylamid với vận tốc phục thuộc

vào hình dáng, kích thƣớc phân tử. Khi đó protein sẽ đƣợc phân tách thành

các băng, vạch khác nhau. Gel thƣờng đƣợc sử dụng với nồng độ từ 5%-15%

và có thể đƣợc chạy theo chiều nằm ngang hoặc chiều thẳng đứng.

• Phƣơng pháp

Máu ngoại vi đƣợc lấy khoảng 3ml -5ml từ ba đại diện của ba giống gà

. Để mẫu máu tại nhiệt độ phòng trong 3h. Sau đó ly tâm 3000 vòng/phút

trong 15 phút. Hút chuyển phần huyết thanh sang eppendorf mới. Mẫu huyết thanh sau đó đƣợc giữ tại điều kiện -25oC hoặc -75oC.

Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE)

Kỹ thuật SDS-PAGE đƣợc thực hiện theo LaemLi, 1970 .Các thiết bị,

hóa chất đƣợc sử dụng trong kỹ thuật SDS-PAGE do hãng Bio-Rad cung cấp.

Protein đƣợc phân tách trong gel polyacrylamide với các nồng độ

khác nhau.

Đối với các protein có trọng lƣợng phân tử từ 6 kDa-160 kDa, gel 10%,

12.6% và 15% (w/v) thƣờng đƣợc sử dụng. Trong nghiên cứu này, SDS-

PAGE đƣợc tiến hành trên gel 12.6% với các thành phần cơ bản nhƣ sau cho

3 mẫu huyết thanh của 3 dòng gà thí nghiệm đã pha loãng 30 lần.

Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE

Gel cô 5% : 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6.8, 10 l 10% (w/v) SDS,

0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 l 10% (w/v) APS, 2 l TEMED

Gel tách 12,6%: 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8, 45l 10%

(w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O,

30 l 10% (w/v) APS, 3 l TEMED

Đệm hòa mẫu 5x: 25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8

Đệm điện di: 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3

Quá trình điện di đƣợc thực hiện ở 2 vùng điện thế: (i) 75V trong 30

phút và (ii) 150V cho đến khi thuốc nhuộm trong mẫu bắt đầu đi ra khỏi bản

gel. Kết thúc quá trình điện di, bản gel đƣợc nhuộm bằng Coomassie Brilliant

Blue R-250. Sau khi ủ với dung dịch nhuộm (0.1% (w/v) Coomassie Brilliant

Blue, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phút, bản gel đƣợc

tẩy màu bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho

đến khi có thể quan sát thấy .

2.3.4. Nhân vùng điều khiển D-Loop bằng kĩ thuật PCR

Kĩ thuật phản ứng chuỗi dùng enzyme polimerase (polimerase chain

reaction = PCR hay PCR Technology) lần đầu tiên đƣợc Mullis và cộng sự

mô tả năm 1986.

• Nguyên tắc:

Phản ứng chuỗi polimerase là một kĩ thuật đơn giản, cho phép khuếch

đại invitro một trình tự DNA lên hàng triệu lần trong vài giờ. Điều này rất

thuận lợi cho việc phát hiện những trình tự hiếm trong các bộ gene từ những

đoạn DNA ngắn đƣợc phân lập hoặc từ một lƣợng rất nhỏ lấy ra đƣợc khuếch

đại cho các thử nghiệm sinh học, y học và nông nghiệp. Đồng thời nó giúp

cho các nhà sinh học phân tử nghiên cứu cấu trúc trình tự DNA trong bộ gene

của các cơ thể sinh vật khác nhau.

Phản ứng chuỗi polimerase đƣợc thực hiện khi có DNA mẫu, 2 đoạn

mồi, Taq polimerase, bốn loại deoxyronucleotit triphotphat( dATP, dTTP, dGTP, dCTP), dung dịch đệm và ion Mg2+. Phản ứng chuỗi PCR đƣợc thực

hiện trên thiết bị nhân DNA.

Một chu kì PCR gồm 3 giai đoạn cơ bản có nhiệt độ khác nhau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Giai đoạn tách chuỗi DNA: DNA bị biến tính từ dạng kép sang sợi đơn ở nhiệt độ 94o- 95oC trong khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 1- 1.5 phút)

- Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng đƣợc hạ thấp xuống 40- 65oC

cho phép hai đoạn mồi gắn DNA mẫu ở vị trí tƣơng đồng theo nguyên tắc bổ

sung ( A - T, G - X) ở hai đầu DNA cần nhân.

- Giai đoạn kéo dài: Ở nhiệt độ 72oC DNA Taq polimerase hoạt động

kéo dài DNA từ đoạn mồi và hai đoạn DNA mới đƣợc tổng hợp theo nguyên

tắc bổ sung từ hai đầu đoạn DNA khuôn ban đầu.

Sau một chu kì gồm 3 giai đoạn nhƣ trên, một đoạn DNA khuôn đƣợc

nhân lên thành hai, các đoạn DNA đƣợc nhân bản trong mỗi chu kì lại đƣợc

coi là DNA khuôn cho chu kì nhân bản tiếp theo. Chính vì vậy sau k chu kì nhân bản sẽ tạo ra 2k DNA giống đoạn DNA khuôn ban đầu.

• Nguyên liệu

- DNA khuôn (Teplate)

- Cặp mồi H1255- L16725 chuyên biệt. Ở đây, H(Heavy) và L( Light)

là kí hiệu chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, còn chữ số là vị trí nuclotide đầu 3' của

primer trong trình tự đầy đủ của mtDNA ở gà [15].

+, dNTPs 10mM, MgCl2

- Bộ hóa chất: Dung dịch đệm có chứa NH4

10mM, Taq DNA polymerase của hãng Fermentas.

- Nƣớc khử ion vô trùng.

Thành phần của phản ứng khuếch đại gen cho một mẫu với tổng thể

tích 25 µl nhƣ trong bảng 2.1.

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng khuếch đại gen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nƣớc Buffer MgCl2 dNTPs Mồi H1255-F Mồi L16725-R Taq DNA polymerase DNA temp Tổng thể tích 10,85 µl 2,5 µl 4 µl 2,5 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,15 µl 4 µl 25 µl

Bảng 2.2. Chu trình nhiệt

Gắn

Các

Khởi động

Giữ

Biến tính

Kéo dài Ổn định

bƣớc

mồi 50oC

Nhiệt độ

nóng 94oC

94oC

mẫu 4oC

72oC

Thời gian

∞

1'20"

10'

Số chu kì

Sau khi kết thúc phản ứng, điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel

agarose 0,8%.

2.3.5. Tinh sạch sản phẩm DNA

- Cân ống eppendoff (1,5ml)

- Điện di toàn bộ sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%, sau đó tiến

hành cắt gel trên máy soi DNA, thu lấy các vạch DNA đặc hiệu rồi cho vào

ống eff đã cân.

- Cân lại ống eff có chứa gel để biết đƣợc trọng lƣợng của băng gel ta

vừa cắt.

- Bổ sung dung dịch MBS (Membrane Binding Solution) với tỉ lệ 1mg

gel: 1 µl dung dịch MBS và ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 50-60oC để gel tan hoàn toàn.

- Hút dịch gel hòa tan vào các vi cột, giữ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 phút, sau đó ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC và đổ dịch thừa.

- Bổ sung 700 µl dung dịch MBW (Membrane Wash Solution) và ly

tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC, sau khi ly tâm cũng loại bỏ dịch.

- Lặp lại bƣớc trên với 500 µl dung dịch MBW và ly tâm 12000 vòng

trong 1 phút ở 4oC. Đổ dịch thừa và ly tâm lại trong 1 phút.

- Chuyển vi cột sang 1 ống eff 1,5 ml mới, sau đó cho vào máy sấy

khoảng 5 phút.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Bổ sung thêm khoảng 30-35 µl H2O 2x để ở nhiệt độ phòng 1 phút rồi ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC, cuối cùng bảo quản mẫu sau khi tinh sạch ở -20oC.

2.3.6. Phƣơng pháp xác định trình tự

• Nguyên tắc chung

Trình tự vùng D-Loop đƣợc xác định dựa trên nguyên tắc chung của

phƣơng pháp Sanger: Tạo ra các đoạn Oligonuclotide hơn kém nhau 1

nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã đƣợc đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra

các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR

sử dụng BigDya Terminator v3.1 Cycle Squencing Kit đã có chứa sẵn các hóa

chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự nhƣ dNTPs,ddNTPs,

DNA polymerase... Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn và mồi phù

hợp. Phản ứng đƣợc thực hiện trong 1 ống vì 4 loại ddNTP đx đƣợc đánh dấu

bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc

trình tự bao gồm: Mồi 3,2pM, 200ng DNA khuôn, BigDye và nƣớc với tổng

thể tích là 15 µl.

Bảng 2.3. Chu trình nhiệt cho PCR trong máy luân nhiệt GenAmp PCR

System 9700

Khởi Các bƣớc Biến tính Gắn mồi Kéo dài Giữ mẫu

động nóng 94oC Nhiệt độ 96oC 50oC 60oC 4oC

Thời gian 1' 10'' 5'' 4' ∞

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Số chu kì 1 25

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ

Để tìm hiểu sự khác biệt ở mức độ phân tử giữa các cá thể thuộc ba

giống gà Ri, Mông, Đa cựa chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số của

chúng, dùng kỹ thuật PCR để nhân đoạn điều khiển trong ty thể, xác định

trình tự của vùng D-Loop. Từ đó, so sánh các trình tự này để tìm ra sự khác

biệt giữa chúng.

3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà

Để tiến hành đánh giá đa dạng di truyền các giống gà, vấn đề quan trọng

đầu tiên là phải thu nhận đƣợc DNA tổng số ở dạng tinh sạch và không bị

phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học. Có nhiều phƣơng pháp tách

chiết DNA từ máu động vật nhƣng việc lựa chọn một phƣơng pháp tách chiết

có nhiều ƣu điểm và phù hợp với đối tƣợng nghiên cứu là rất quan trọng. Vì

mẫu sử dụng trong thí nghiệm này là mẫu máu cho nên chúng tôi đã lựa chọn

phƣơng pháp có sử dụng protease K và SDS của Sambrook và Russel để tách

chiết DNA.

Trƣớc tiên, máu đông đƣợc làm tan trong bể ổn nhiệt ở 39oC trong 2

giờ. Trong điều kiện về nhiệt độ và thời gian nhƣ vậy, plasminogen trong

huyết tƣơng sẽ đƣợc chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân

hủy các protein nhƣ fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào

đƣợc giải phóng. Sau khi rã đông đem ly tâm dung dịch máu đã đƣợc hòa tan

trong dung dịch đệm PBS. Dung dịch muối này có tác dụng duy trì dộ pH của

máu. Các tế bào thu đƣợc đem hòa tantrong dung dịch đệm tách có chứa

EDTA và SDS. Sự có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải

phóng DNA ra môi trƣờng. Thành phần EDTA sẽ liên kết với các Mg2+, nhờ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

vậy mà hoạt động của các nuclease bị ức chế. Nhƣ vậy, cả SDS và EDTA đều

tham gia bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của các nuclease. Ngoài ra, protease

K có trong đệm chiết sẽ phân hủy các liên kết peptit trong protein. pH kiềm

của dung dịch đệm chiết làm DNA trở nên ổn định.

Để loại bỏ thành phần protein trong mẫu tách, chúng tôi tiến hành lắc

mạnh mẫu với hỗn hợp phenol: chloroform: isoamy alcohol. Chloroform làm

tăng cƣờng hoạt động của phenol trong việc biến tính protein nhƣng không

làm ảnh hƣởng đến cấu trúc của DNA. Đồng thời, nó còn tạo điều kiện thuận

lợi cho việc tách pha nƣớc với với pha hữu cơ. Isoamy alcohol có tác dụng

làm giảm bọt trong quá trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn

hợp đƣợc phân làm ba pha: pha trên cùng là pha nƣớc có chứa DNA, pha giữa

là protein đã bị biến tính, và pha cuối cùng là hỗn hợp phenol, chloroform và

isoamy alcohol. Pha nƣớc đƣợc hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này

sau đó đƣợc xử lý bằng hỗn hợp chloroform: isoamy alcohol nhằm loại bỏ

hoàn toàn phenol có lẫn trong dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA. Bƣớc

này có thể lặp lại 1-2 lần.

Thu tủa bằng cách bổ sung vào dịch chiết 50 µm CH3COONa 3M, pH

5,2 và 1ml EtOH 100%. EtOH có tác dụng hút lớp nƣớc bao quanh phân tử DNA, để lộ ra các gốc phosphat tích điện âm. Khi đó các ion Na+ sẽ kết hợp

với các gốc phosphate này khiến cho lực đẩy giữa các chuỗi nucleitit giảm, do đó DNA bị kết tủa. Trong điều kiện -20oC trong 15 giờ thì DNA kết tủa gần

nhƣ DNA kết tủa hoàn toàn. Tủa thu đƣợc đƣợc rửa bằng EtOH 70%, Làm

khô và hòa tan trong nƣớc. Trong dung dịch này có lẫn nhiều RNA, vì thế chúng tôi đã loại RNA bằng RNase, ủ ở 37oC trong 2-3 giờ. DNA tinh sạch

đƣợc hòa tan trong nƣớc khử ion vô trùng và đem điện di kiểm tra trên gel

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

agrose 0,8%. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.1.

Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số

1: DNA tổng số gà Ri; 2: DNA tổng số gà Mông;

3: DNA tổng số gà Đa Cựa

Trên ảnh điện di, các mẫu đều xuất hiện một vạch DNA sáng đậm ở vị

trí cao nhất trên bản gel. Theo lý thuyết, DNA tổng số bao gồm các đoạn có

kích thƣớc từ 10 kb đến 300 kb, khi điện di sẽ tập trung thành một vạch đậm.

Nếu DNA tách chiết đƣợc có lẫn protein, các phân tử protein chƣa đƣợc loại

hoàn toàn sẽ tạo thành vạch sáng kéo dài phía trên vạch DNA tổng số. Hình

1.3 cho thấy sản phẩm DNA tách chiết ít bị lẫn protein tạp và dựa vào độ sáng

của vạch DNA tổng số, có thể thấy nồng độ DNA thu đƣợc khá cao. Chúng

tôi kết luận DNA tổng số tách chiết từ các mẫu máu gà đảm bảo chất lƣợng để

phục vụ các thí nghiệm tiếp theo.

3.1.2. Nhân vùng điều khiển D-Loop của DNA ty thể

Tốc độ tích lũy đột biến trong vùng trình tự điều khiển cao gấp 5-10 lần

so với các gen khác trong hệ gen ty thể, do đó nó rất có ý nghĩa rất quan trọng

trong nghiên cứu đa dạng sinh học và sự phát sinh chủng loại của sinh vật.

Nhằm mục đích đánh giá tính đa dạng di truyền của 3 giống gà Ri, Mông và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Đa cựa, chúng tôi đã sử dụng vùng trình tự D-Loop trong hệ gen ty thể làm

đối tƣợng nghiên cứu.

Để nhân vùng D-Loop từ mẫu DNA tổng số đã thu đƣợc chúng tôi tiến

hành PCR với việc sử dụng cặp mồi H1255 và L16725.

L16725 (Tm = 60oC): 5'-AGGACTACGGCTTGAAAGC-3 '(19 nucleotit) H1255 (Tm = 55OC): 5'-CATCTTGGCATCTTCAGTGCC-3 '(21nucleotit)

Cặp mồi này đƣợc thiết kế dựa trên trình tự hai đầu đoạn D-Loop ở gà

nhà và là cặp mồi bảo thủ, do đó có thể sử dụng cho nhiều đối tƣợng khác

trong bộ gà. Theo lý thuyết, sản phẩm thu đƣợc khi nhân bản bằng cặp mồi

trên có chiều dài khoảng 1,3 kb.

PCR là loại phản ứng đòi hỏi sự chính xác về chu trình nhiệt của phản

ứng cũng nhƣ thành phần và nồng độ các chất tham gia.

• Chu trình nhiệt của PCR

- Giai đoạn biến tính (Denaturation): Nhiệt độ biến tính thƣờng khoảng 94 - 95oC để đảm bảo sau khoảng 30 chu kỳ PCR, Taq vẫn giữ đƣợc hoạt

tính. Thời gian biến tính tùy thuộc vào hàm lƣợng G - C và chiều dài của phân tử DNA. Chúng tôi chọn nhiệt độ biến tính là 94oC trong 1 phút. Trƣớc khi bƣớc vào chu kỳ thứ nhất, nhiệt độ đƣợc đặt 94oC trong 4 phút để đảm bảo

phân tử DNA đƣợc biến tính hoàn toàn.

- Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Vì Tm nhỏ nhất của cặp mồi trên là 55oC nên nhiệt độ gắn mồi có thể từ 50 - 52oC. Chúng tôi đã thử chạy phản

ứng ở một số giá trị khác nhau trong khoảng nhiệt độ này và chọn đƣợc nhiệt độ gắn mồi tối ƣu trong thí nghiệm này là 50oC.

- Giai đoạn kéo dài chuỗi (Extension): Nhiệt độ lúc này đƣợc tăng đến 72oC để cho enzym Taq polymerase hoạt dộng tốt nhất. Tốc độ tổng hợp của

phản ứng vào khoảng 1000 nucleotit/phút. Trình tự vùng D-Loop quan tâm có

kích thƣớc khoảng 1,3 kb nên thời gian giai đoạn kéo dài chuỗi đƣợc lựa chọn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

là 1 phút 20 giây.

Sau khi kết thúc 30 chu kỳ, chúng tôi đặt nhiệt độ lên 72oC trong 10

phút để đảm bảo sự tổng hợp đƣợc kết thúc hoàn toàn. Sau đó sản phẩm PCR đƣợc giữ ở nhiệt độ 4oC.

• Thành phần và nồng độ các chất tham gia:

Tham gia vào phản ứng này là 7 thành phần thiết yếu, đó là: Taq DNA

polymerse, dung dịch đệm, mồi, MgCl2, các dNTP, DNA khuôn và nƣớc.

Trong đó có 3 thành phần thƣờng thay đổi trong từng phản ứng đó là: Mồi,

MgCl2 và DNA khuôn.

- Dung dịch đệm: PCR đƣợc thực hiện trong một môi trƣờng đệm phù

+ của hãng Fementas, nó

hợp với hoạt động của enzym với giá trị pH là 7,2. Trong thí nghiệm này, sau

khi khảo sát, chúng tôi sử dụng loại đệm có chứa NH4

phù hợp với hoạt động của enzym Taq polymerase và khoảng biến thiên rộng

về nồng độ của MgCl2. Hơn nữa, loại đệm này cho chất lƣợng sản phẩm tốt +. hơn so với loại đệm không có chứaNH4

- Mồi: Đây là một yếu tố rất quan trọng trong PCR bởi việc điều chỉnh

nhiệt độ gắn mồi và nồng độ của mồi có ảnh hƣởng đến lƣợng sản phẩm thu

đƣợc. Nồng độ mồi xuôi và ngƣợc đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này là

10pmol/µl.

- MgCl2: Vai trò của ion Mg2+ là tạo phức với dNTP và gắn chúng với enzym, kích hoạt và tăng sự kết hợp giữa mồi và khuôn. Nồng độ Mg2+ quá

thấp sẽ làm giảm hoạt tính của enzym. Tuy nhiên, nếu nồng độ này quá cao sẽ ức chế hoạt động của enzym. Sau khi khảo sát, chúng tôi thấy nồng độ Mg2+

là 10mM cho kết quả tốt nhất.

- 4 loại dNTP: Nồng độ của mỗi loại dNTP đều phải bằng nhau và phụ

thuộc nhiều vào kích thƣớc của đoạn DNA đích, nồng độ của mồi và MgCl2. Nồng độ của các dNTP lớn hơn 4mM sẽ ức chế phản ứng PCR do ion Mg2+ bị

cô lập, dễ dẫn đến sự nhân lên của các đoạn không cần thiết. Qua thử nghiệm,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

chúng tôi thấy nồng độ của các dNTP 1mM là phù hợp.

- Thành phần cuối cùng của PCR là DNA khuôn có chứa trình tự đích

cần nhân lên, nó phải đảm bảo yêu cầu đƣợc tinh sạch và ít bị đứt gãy. Thông

thƣờng, hàm lƣợng DNA khuôn trong mỗi hỗn hợp phản ứng là 10 - 100ng/

phản ứng.

Sản phẩm PCR đƣợc bảo quản ở 4oC. Sau khi đƣợc kiểm tra trên gel

agarose 0,8%.

Kết quả thu đƣợc thể hiện trên hình 3.2.

M 1 2 3

1,5 1,3

1,0

Hình 3.2. Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR

M: Marker; 1: Mẫu gà RI; 2: Mẫu gà Mông; 3: Mẫu gà Đa Cựa

Quan sát ảnh chụp kết quả điện di, cả 3 mẫu đều xuất hiện băng DNA

nằm ở vị trí giữa vạch 1,5 kb và 1 kb trên thang kích thƣớc chuẩn (marker),

cho thấy kích thƣớc phân tử của sản phẩm PCR vào khoảng 1,3 kb, tức là phù

hợp với tính toán theo lý thuyết. Các băng sáng đậm, rõ nét, tập trung và chỉ

nhìn thấy băng phụ rất mờ bên dƣới chứng tỏ sản phẩm PCR tƣơng đối đặc

hiệu. Kết quả này cho thấy chúng tôi đã nhân đƣợc vùng D-loop. Sản phẩm

PCR đặc hiệu chứng tỏ chƣơng trình đã lựa chọn và nồng độ các chất tham

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

gia phản ứng là phù hợp.

3.1.3. Xác định trình tự vùng điều khiển của DNA ty thể

Đoạn D-Loop đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Sanger. Do xác

định trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR nên chúng tôi sử dụng cặp mồi

H1255 và L16725 làm cặp mồi cho 2 chiều đọc. Sở dĩ phải dùng cả mồi xuôi

và mồi ngƣợc vì đoạn DNA cần xác định trình tự dài 1,3 kb trong khi ở điều

kiện thí nghiệm tối ƣu, chỉ có thể xác định trình tự tối đa 900 - 1000

nuclotitde. Kết quả đƣợc kết hợp và xử lý bằng phần mềm Seqscape và

BioEdit giúp xác định đƣợc trình tự đầy đủ của vùng D-Loop của các mẫu gà.

Do mẫu gà Mông đọc trình tự gặp phải khó khăn nên trình tự D-Loop

của gà Mông chƣa đầy đủ. Vì vậy chúng tôi công bố và so sánh kết quả hai

mẫu Da và RI.

So sánh trình tự Da và RI với nhau và với trình tự D-Loop của gà đã

đƣợc công bố Galuss galuss gốc Nhật lấy trình tự trong trên ngân hàng gen

mang mã số AB114078 quốc tế EMBL (EBI)/Gen Bank/DDBJ, chúng tôi thu

10 20 30 40 50 60

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

đƣợc kết quả hình 3.3.

AB114078 aattttattt tttaacctaa ctcccctact aagtgtaccc cccctttccc ccccaggggg

DA G.CG..T.A. ...T...... .......... .......... .......... ..........

RI C......... .......... .......... .......... .......... ..........

70 80 90 100 110 120

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 ggtatactat gcataatcgt gcatacattt atataccaca tatattatgg taccggtaat

DA .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI1 .......... .......... .......... .......... .......... ..........

130 140 150 160 170 180

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 atatactata tatgtactaa acccattata tgtatacggg cattaaccta tattccacat

DA .......... .......... .......... .......... ......T... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

190 200 210 220 230 240

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 ttctcccaat gtccattcta tgcatgatcc aggacatact catttaccct ccccatagac

DA .......... .......... .......... .A........ ....C..... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

250 260 270 280 290 300

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 agttccaaac cactatcaag ccacctaact atgaatggtt acaggacata aatctcactc

DA .....T.... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

310 320 330 340 350 360

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 tcatgttctc cccccaacaa gtcacctaac tatgaatggt tacaggacat acatctaact

DA .......... ....T..... .......... .......... .......... ....T.....

RI .......... .......... .......... .......... .......... ....T.....

370 380 390 400 410 420

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 accatgttct aacccatttg gttatgctcg ccgtatcaga tggatttatt gatcgtccac

DA .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

430 440 450 460 470 480

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 ctcacgagag atcagcaacc cctgcctgta atgtacttca tgaccagtct caggcccatt

DA .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

490 500 510 520 530 540

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 ctttccccct acacccctcg cccaacttgc cttccaccgt acctctggtt cctcggtcag

DA .......... .......... ...T...... .......... .......... ..........

RI .......... .......... ...T...... .......... .......... ..........

550 560 570 580 590 600

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 gcacatccca tgcataactc ctgaactttc tcacttttca cgaagtcatc tgtggattat

DA .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

610 620 630 640 650 660

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 cttcccctct ttagtccgtg atcgcggcat cttctctctt ctattgctgt tggttccttc

DA .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

670 680 690 700 710 720

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 tctttttggg gcttcttcac aggttgccct tcacagtgcg ggtgcggagt gctattcaag

DA .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

730 740 750 760 770 780

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 tgaagcctgg actacacctg cgttgcgtcc tatcctagtc ctctcgtgtc cctcgatgag

DA .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

790 800 810 820 830 840

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 acggtttgcg tgtatgggga atcatcttga cactgatgca ctttggatcg catttggtta

DA .......... .A........ .......... .......... .......... ..........

RI1 .......... .......... .......... .......... .......... ..........

850 860 870 880 890 900

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 tggttcttcc accccccc-g gtaaatggtg ctatttagtg aatgcttgtc ggacatattt

DA .......... ........-. .......... .......... .......... ..........

RI .......... ........-. .......... .......... .......... ..........

910 920 930 940 950 960

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 ttatcaattt tcacttcctc tattttcttc acaaaactag gaaattcacc acaatttttt

DA .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

970 980 990 1000 1010 1020

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 c-tttgttat tttttaattt tttttttatt tattaaaaac attttttaaa aaactaaatt

DA .-........ .......... .......... .T........ .......... ..........

RI .-........ .......... .......... .T........ .......... ..........

1030 1040 1050 1060 1070 1080

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 acatacaaac taccgcataa aatccctcaa actatacaaa cgtttatcgt ataatatata

DA .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

1090 1100 1110 1120 1130 1140

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 tacattattg tttattctat cattattaga gaaactccac taccaaaacc atcattaaaa

DA .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1150 1160 1170 1180 1190 1200

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 caaaaattta catgccactt aactcccctc acaaacaatc gttatttata ttgttaatta

DA .......... .......... .......... .......... .......... ..A.......

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

1210 1220

....|....| ....|....|

AB114078 gcaaacacaa aacccgcctt

DA .......... .....A....

RI .......... ..........

Hình 3.3. So sánh trình tự D-Loop của hai mẫu gà nghiên cứu Ri (RI)

và Đa cựa (Da) với trình tự tham khảo mã số AB114078

So sánh hai mẫu Ri (RI) và Đa cựa (Da) với trình tự chuẩn chúng tôi

thấy có 16 điểm đa hình/ đột biến (khác biệt nucleotide). Mẫu gà Da có 15

điểm (chiếm 1,23%) và RI có 4 điểm (chiếm 0.33%) khác với trình tự chuẩn.

Cả hai giống thuộc mẫu gà Da và RI đều có cùng sự khác biệt nucleotide so

với trình tự chuẩn AB114078 đó là các đột biến: Thay thế C bằng T ở vị trí

355, thay thế A bằng T ở vị trí 504 và vị trí 992.

Ngoài ra giữa hai giống thuộc mẫu gà Da và RI còn có sự khác biệt với

nhau ở 14 điểm đa hình ở các vị trí:

Mẫu Da đột biến thay A thành G ở vị trí 1; đột biến thay G thành A ở

vị trí 212, 792, 1193,1216; đột biến thay A thành T ở vị trí 7, 14; đột biến

thay T thành A ở vị trí 9; đột biến thay T thành C ở vị trí 3, 225; đột biến C

thành T ở vị trí 246, 315; Mẫu RI đột biến thay A thành C ở vị trí 1. Các sai

khác giữa các mẫu là đột biến kiểu đồng hoán, và dị hoán đƣợc thống kê ở

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

bảng 3.1.

Bảng 3.1. Thống kê các điểm đa hình ở hai mẫu nghiên cứu

so với trình tự chuẩn

Thay đổi STT Mẫu Vị trí trên ty thể Kiểu biến dị nucleotide

C thành T 1 Da, RI 335 Đồng hoán

A thành T 2 Da, RI 504 Dị hoán

A thànhT 3 Da, RI 992 Dị hoán

A thành G 4 Da 1 Đồng hoán

G thành A 5 Da 212 Đồng hoán

G thành A 6 Da 792 Đồng hoán

G thành A 7 Da 1193 Đồng hoán

G thành A 8 Da 1216 Đồng hoán

A thành T 9 Da 7 Dị hoán

A thành T 10 Da 14 Dị hoán

T thành A 11 Da 9 Dị hoán

T thành C 12 Da 3 Đồng hoán

T thành C 13 Da 225 Đồng hoán

C thành T 14 Da 246 Đồng hoán

C thành T 15 Da 315 Đồng hoán

A thành C 16 RI 1 Dị hoán

Chúng tôi so sánh trình tự vùng D-Loop của 2 mẫu gà nghiên cứu với

một số trình tự của các chủng gà đã đƣợc công bố: Giống Galuss galuss

Murghi gốc Ấn Độ lấy trình tự trong ngân hàng gen mã số GQ293096, giống

gốc Mỹ lấy trình tự trong ngân hàng gen mã số AY235570 và AY235571 để

so sánh mức độ sai khác về trình tự nucleotide và xác định mối quan hệ di

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

truyền giữa chúng kết quả so sánh bảng 3.2.

Bảng 3.2. So sánh mức độ sai khác về trình tự nucleotide

AB114078

RI

DA GQ293096 AY235570 AY235571

0.0000

0.0033 0.0123

0.8156

0.1844

0.1329

AB114078

0.0033

0.0000 0.0115

0.8156

0.1819

0.1312

RI

0.0123

0.0115 0.0000

0.8164

0.1803

0.1296

DA

0.8156

0.8156 0.8164

0.0000

0.7713

0.7705

GQ293096

0.1844

0.1819 0.1803

0.7713

0.0000

0.1803

AY235570

0.1329

0.1312 0.1296

0.7705

0.1803

0.0000

AY235571

Qua bảng 3.2 và so sánh sự sai khác trên trình tự gen cho thấy sự sai

khác trình tự nucleotide giữa giống gà DA với giống gà Gallus galuss Murghi

gốc Ấn Độ là cao nhất 81,64% (996 điểm đa hình), gà DA với giống gà

Gallus galuss gốc Nhật là 15 điểm đa hình chiếm 1,23% , gà RI và gà DA là

14 điểm đa hình chiếm 1,15%, và sai khác về trình tự nucleotide giữa gà RI

với giống gà Gallus galuss gốc Nhật là thấp nhất 0,33% (4 điểm đa hình).

AB114078

GQ293096

AY235570

AY235571

Mối quan hệ di truyền giữa các giống gà trên đƣợc thể hiện ở hình 3.4.

Hình 3.4. Quan hệ di truyền của một số giống gà

Kết quả thu đƣợc hình 3.4 cho thấy các giống gà trên đƣợc chia thành 2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

nhánh : Nhánh 1 gồm giống Gallus gallus gốc Nhật đƣợc đăng kí với mã số

AB114078 có quan hệ gần nhất với giống gà RI, mức độ đồng nhất về thành

phần nucleotide giữa chúng là 99,67%.

Nhánh 2 gồm giống Gallus galuss Murghi gốc Ấn Độ, và 2 giống gà

gốc Mỹ đƣợc đăng kí với mã số AY235570 và AY235571, trong đó giống gà

đƣợc đăng kí với mã số AY235570 có quan hệ gần với giống gà đƣợc đăng kí

với mã số AY235571, mức đồng nhất về thành phần nucleotide là 99,82%.

3.2. THÀNH PHẦN ĐIỆN DI PROTEIN HUYẾT THANH GÀ THÍ NGHIỆM

Nghiên cứu xác định tính đa hình protein huyết thanh đã đƣợc tiến

hành trên các mẫu huyết thanh của 3 giống gà: Ri, Mông và Đa cựa theo

phƣơng pháp điện di SDS-PAGE, SDS-PAGE theo LaemLi, nguyên tắc và

phƣơng pháp đã trình bày trong mục 2.3.3.

Phổ điện di trong huyết thanh của các giống gà đặc trƣng cho loài. Giữa

các cá thể cùng loài cũng có thể có phổ điện di có độ đậm nhạt khác nhau. Vì

vậy để nghiên cứu sâu hơn về thành phần protein ở mức độ tiểu đơn vị cấu

thành các đại phân tử protein trong máu gà và đánh giá chất lƣợng thịt cũng

nhƣ phát hiện sự sai khác về protein máu của các dòng gà chúng tôi tiến hành

phân tích thành phần điện di protein trong máu của các giống gà thí nghiệm,

kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.3.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.5: Phổ điện di SDS – PAGE protein huyết thanh.

Đƣờng chạy M: Thang protein marker chuẩn;

Đƣờng chạy 1 đến 3: Dung dịch huyết thanh pha loãng của ba đại diện

của giống gà Ri Mông và Đa cựa.

Kết quả điện di cho thấy hệ protein trong huyết thanh gà tƣơng đối

phức tạp về thành phần và hàm lƣợng: số lƣợng băng – vạch thu đƣợc rất

nhiều nhƣng cũng rất đa dạng về hàm lƣợng. Trong khi đa số các băng protein

đều nhỏ và có hàm lƣợng thấp thì 2 protein có hàm lƣợng lớn nhất trong

huyết thanh là Albumin (chiếm từ 50 – 75%) và IgG (khoảng 10%) lại hiện

băng khá lớn.

Số băng điện di protein huyết thanh gà thí nghiệm dao động từ 7 đến 10

băng. Trong đó gà Ri có 10 băng, gà Mông có 8 băng, gà Đa cựa có 9 băng.

Trong đó gà Ri xuất hiện thêm 4 băng ở các kích thƣớc: 15.4 KDa; 16.4Kda ;

32Kda ; 36KDa . Gà Mông xuất hiện băng 16.4 Kda, 32Kda; mất băng 14.4

Kda, 15.4KDa; Gà Đa cựa xuất hiện băng 15.4Kda; 16.4Kda ;32Kda ;mất

băng 14.4.

Quan sát hình ta thấy băng Albumin của gà Đa cựa là lớn nhất, băng

lớn thứ 2 là gà Mông, băng nhỏ nhất là băng của gà Ri. Hàm lƣợng IgG

(protein miễn dịch) của gà Đa cựa lớn nhất biểu hiện ở băng ta thấy đậm và

lớn nhất so với băng của gà Mông và gà Ri. Điều đó có khả năng gà Đa cựa

có hệ thống miễn dịch tốt hơn so với gà Mông và gà Ri, có tác dụng chống

chịu với điều kiện khí hậu khắc nghiệt, chống lại các kháng nguyên lạ xâm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

nhập vào cơ thể và có vai trò quan trọng trong bảo tồn nòi giống.

Bảng 3.3. Thống kê sự xuất hiện các băng điện di protein

huyết thanh gà thí nghiệm

Số lƣợng băng điện di huyết thanh gà thí nghiệm Kích thƣớc KDa RI Mo Da

14.4 1 0 0

15.4 1 0 1

16.4 1 1 1

18.4 1 1 1

25.0 1 1 1

32.0 1 1 1

36.0 1 1 1

45.0 1 1 1

66.2 1 1 1

116 1 1 1

8 9 Tổng 10

Nhƣ vậy giữa các mẫu gà thí nghiệm có sự khác nhau về số lƣợng, vị

trí và độ đậm nhạt của các băng điện di chứng tỏ protein trong huyết thanh gà

thí nghiệm đã biểu hiện tính đa hình. Mặt khác, protein trong huyết thanh có

tính bảo thủ di truyền khá cao nên sự khác nhau về cấu trúc gen mã hóa

protein trong huyết thanh hoặc sự biểu hiện của các gen này khác nhau giữa

các giống. Đây là cơ sở để giải thích sự khác nhau về chất lƣợng của các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

giống gà thí nghiệm.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Đã tách chiết và tinh sạch đƣợc DNA tổng số từ mẫu gà thuộc ba

giống Ri, H'Mông và Đa cựa.

2. Đã nhân bản thành công đoạn điều khiển (Vùng D-Loop) của DNA

ty thể của ba giống gà này với kích thƣớc khoảng 1,3 kb của ba mẫu trên bằng

kĩ thuật PCR nhờ cặp mồi H1255 và L16725.

3. Đã xác định đƣợc trình tự của vùng D-Loop gồm 1220 nucleotit của

vùng D-Loop của hai trong ba mẫu gà nghiên cứu và phát hiện đƣợc 16 điểm

đa hình/ đột biến về nucleotit giữa đại diện của hai mẫu giống gà nghiên cứu

với trình tự chuẩn.

4. Kết quả phân tích thành phần điện di protein trong huyết thanh của

ba mẫu gà thí nghiệm cho thấy sự khác nhau về số lƣợng, độ đậm nhạt và vị

trí của một số băng điện di của các giống gà. Protein huyết thanh trong máu

gà thể hiện tính đa hình.

ĐỀ NGHỊ

Trong phạm vi nghiên cứu này, với số lƣợng chỉ lấy từ một cá thể

thuộc mỗi giống, chúng tôi chỉ đƣa ra đƣợc số liệu ban đầu về đặc điểm đa

hình vùng D-Loop trên ty thể của hai giống gà Ri và Đa cựa thuộc loài Gallus

gallus domesticus. Để có thể đánh giá đƣợc toàn diện hơn về ý nghĩa của các

vị trí đa hình/ đột biến trên vùng D-Loop hoặc đƣa ra đƣợc các kết luận đày

đủ hơn về sự đa dạng DNA giữa các giống gà này cần phải tiến hành nghiên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

cứu và phân tích trên một số lƣợng mẫu lớn hơn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Ân (1983), Di truyền học động vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

2. Trịnh Đình Đạt (2003), Di truyền và chọn giống động vật, Nxb Đại

Học Quốc Gia Hà Nội.

3. Nguyễn Hải Hà (2000), Tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển ADN ty

thể của hai loài gà Lôi đặc hữu Việt Nam, khóa luận tốt nghiệp nghành

công nghệ sinh học, ĐHQG Hà Nội, Trƣờng ĐHKHTN.

4. Trịnh Hữu Hằng, Trần Công Yên (1998), Sinh học cơ thể động vật,

NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội.

5. Nguyễn Trƣờng Huy (2008), Nghiên cứu đa hình trình tự đoạn D-Loop

trong hệ gen ty thể ở một số giống gà Việt Nam, khóa luận tốt nghiệp,

Trƣờng ĐHKH tự nhiên, Hà Nội

6. Địch Thị Kim Hƣơng (2006), phân định một số chủng gà nhà (Gallus

gallus domesticus) qua ADN ty thể , khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng

ĐHKH tự nhiên, Hà Nội.

7. Nguyễn duy Hoan (1999), Chăn nuôi gia cầm (giáo trình dùng cho cao

học và nghiên cứu sinh), NXB Nông Nghiệp Hà Nội.

8. Nguyễn Trọng Lạng, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Tâm (2005), Sinh

học tế bào, NXB Nông Nghiệp.

9. Dƣơng Văn lộc (2004), Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, năng suất

thịt và một số chỉ tiêu hóa sinh gà lai F1 Lương Phượng - Ri và Ai Cập

- Ri nuôi bán chăn thả tại Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ, Trƣờng Đại

Học Sƣ Phạm, Đại Học Thái Nguyên.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

10. Nguyễn Thị Mai (2007), chăn nuôi gia cầm, Nxb Hà Nội.

11. Lê Minh (2002), Ảnh hưởng của thuốc Avicoc và Rigecocsin đến khả

năng sản xuất gà thịt Lương Phượng và Sasso nuôi bán chăn thả tại

Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Trƣờng Đại Học

Nông Lâm, Đại Học Thái Nguyên.

12. Trần Thanh Vân, Hoàng Văn Tiêu, Nguyễn Khánh Quắc (1997), Kết

quả nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu vịt

Khakicampbell, vịt cỏ và con lai F1 của chúng nuôi chăn thả tại Thái

Nguyên, Báo cáo khoa học NCTY, hội nghị khoa học Bộ nông nghiệp

và phát triển nông thôn 8/1997 Nha Trang, Khánh Hòa.

13. Kim Thị Phƣơng oanh (1999), Ứng dụng các phương pháp sinh học

phân tử trong nghiên cứu sự khác biệt di truyền ở một số loài gà lôi

Việt Nam, luận án Thạc sĩ Sinh học, trƣờng Đại Học Sƣ Phạm, ĐHQG

Hà Nội.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

14. Baker A. J., Marshall H. D. (1997), "Mitochondrial control region

sequences astools of understanding evolution of avian taxa", In "Avian

Molecular Systematics and Evolution" (Mindell D. P., Ed), 51-80,

Academic Press, San Diego.

15. Chinnery P. F., Schon E. A. (2003), "Mitochondria", J. neurol.

Neurosurg. Psychiatry, 74: 1188-1199.

16. Desjadins P., Morais R. (1990), "Sequence DNA gene organisation of

the chicken mitochondrial genome, A novel gene order in higher

vertebrates", J.Mol.Biol.,212,pp.599-635).

17. Ingman M.,(2001), "Mitochondrial DNA Clarifies Human Evolution",

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

http://www.uu.se/findperson.php?uid=N99-1523.

18. Ingman M.,(2003), "Mitochondrial and Clarifies Human Evolution",

summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Medicine

1288. 50, Acta University, Uppsala.

19. Gilbert, A.B (1971), "The egg, ist physical and biochemical aspectc",

In:domestic fowl, Bd.3, Academic press, London/ NewYork,1971).

20. Hillis D. M., Moritz C., Mable B. K., 1996. Molecular Systematics.

Sinamer Associates, Inc., second edition.

21. Kimball R.T.,Braun E.L., Zwarrtjes P.W., Crowe T.M.(1999),and ligon

J.D.A Molecula phylogeny of the pheasants and partridges suggests

that these lineages are not monophyletic. Mol. Phylogenet. Evol.,

11(1)tr.38-54).

22. Komiyama T., Ikeo K., Tateno Y., Gojobori T. (2004), "Japanese

domesticated chickens have been derived from Shamo traditional

fighting cocks", Mol. Phylogenet. Evol., 33(1):16-21).

23. Komiyama T., Ikeo K., Gojobori T (2004)," The evolutionary origin of

long-crowing chicken: its evolutionary relationship with fighting cocks

disclose by the mtDNA sequence analysis", Gene,333: 91-99))

24. krist L.(2000), Phylogeny DNA phylogeography of European parids,

Oulu university, Oulu).

25. Kris L (2002) "Phylogeny and phylogeography of Euro pean Parids",

chapter 1. Introduction: Evolution and mitochondrial DNA in birds.

Department of Biology, Oulu Universsity library.

26. Laemli U.K(1970), Cleava of structural proteins during the assembly

of head of baterio phage T4, Nature, 277, pp.680.685.

27. Lander E. S., Botstein D. (1989), "Mapping Mendelian factors underlying

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

quantitive traits using RFLP linkege maps", Genet. 121: 185-199.

28. Litti M., Luty J. A. (1989), "A hypervariable microsatellite revealed by

in vitro amplification of dinucleotide repeat winthin the cardiac muscle

actin gene", Am. J .hum. Genet. 44:397-401.

29. Moulin S., Randi E., Tabarroni C., Hennache A.(2003),"Mitochondrial

DNA diversification among the subspecies of the Silver and Kalij

pheasants, Lophura nycthemera and L. leucomelanos, phasinidae", Ibis,

145(online), E1-E11.)

30. Mindell D. P, Sorenson M. D., Dimcheff D. E (1998), "Multi

endependent origins of mitochondrial gene order in birds", Mol. Biol.

Evol., 95, pp. 10693-10697.

31. Niu D., Fu Y., Luo., Ruan H., Yu X., Chen G., Zhang Y. (2002),"The

origin and genetic diversity of Chinese native chicken breeds",Biochem.

Genet., 40:5-6.)

32. Niu D., Fu Y., Luo J., Ruan H., Yu X.P., Chen G., Zang Y. P.

(2002),"The origin DNA genetic diversity of Chinese native chicken

breeds", Biochem. Gene., 40(5),pp. 163-174))

33. Fuhimito A., Miyake T.,Takada M., Shinggu R., Endo T., Gojobori T.,

Kondo N., Ohno S.(1996), "Monophyletic origin DNA unique dispersal

patterns of domestic fowls", Pro. Natl. Acad. Sci. USA,

93(13),pp.6792-6795).

34. Pereira S. L., Bakern A. J (2004),"Low number of mitochondrial

pseudogenes in the chiken (GALLUS GALLUS) nuclear genome:

implications for molecular inference of population history DNA

phylogenetics", BMC Evol. Biol., 4(17).)

35. SambrookJ., Russell D.W, (2001), Moleular Cloning: Alabroratory

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, NewYork.

36. Wang J., He X., Ruan J., Dai M., Chen J.,Zhang Y., Hu C., Cong L.,

Fang L., Liu B., Li S., Wang L., Burt D. W., Ka G., Wong S., Yu J.,

Yang H., Wang J.(2005)"Chick VD: A sequence variation database for

the chicken genome", Nucle Acids Res., 33(5),pp.438-441.

37. http://www.geneticorigins.org/geneticorigins/mito/mitoframeset.htm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

http://www. ncbi.nlm.nih.gov. 38.

Phô lôc

Ảnh 1: Gà Ri (RI) nuôi tại Bắc Kạn

Ảnh 2a: Gà Đa Cựa (Da) nuôi tại Bắc Kạn

Ảnh 2b: Gà Đa Cựa (Da) nuôi tại Bắc Kạn

Ảnh 3: Gà Mông (Mo) nuôi tại Bắc Kạn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn