Luận văn Thạc sĩ Thú Y: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

VƯƠNG THỊ CHUNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở BÒ TẠI HUYỆN THẠCH THẤT- HÀ NỘI VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

THÁI NGUYÊN - 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

VƯƠNG THỊ CHUNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở BÒ TẠI HUYỆN THẠCH THẤT- HÀ NỘI VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ

Ngành: Thú y Mã số:8 64 01 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. ĐẶNG XUÂN BÌNH

THÁI NGUYÊN - 2019

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

- Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực, khách

quan và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình khoa học nào

khác.

- Mọi sự giúp đỡ trong quá trình thực hiện, nghiên cứu, viết luận văn này

đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn, sử dụng trong luận văn được ghi rõ

nguồn gốc.

Thái Nguyên, ngày 04 tháng 11 năm 2019

Tác giả luận văn

Vương Thị Chung

ii

LỜI CẢM ƠN

Được sự cho phép của Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái

Nguyên và Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Pasteurella multocida

gây bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất - Hà Nội và Biện pháp

phòng trị”.

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường, Ban Chủ

nhiệm Khoa thú y, phòng Đào tạo cùng các thầy giáo, cô giáo đã giảng dạy

trong chương trình đào tạo thạc sĩ ngành Thú y, những người đã truyền đạt cho

tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại Nhà trường, là

những cơ sở quan trọng giúp tôi hoàn thành các nội dung của đề tài.

Tôi xin được chân thành cảm ơn Thầy giáo PGS.TS. Đặng Xuân Bình

đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn

thành luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình, người thân, bạn bè của tôi đã

luôn cổ vũ, động viên và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian thực tập và

hoàn thành đề tài tốt nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 04 tháng 11 năm 2019

Tác giả luận văn

Vương Thị Chung

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................... ii

MỤC LỤC ................................................................................................ iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................... vi

DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH ......................................................... vii

MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1

1. Đặt vấn đề .............................................................................................. 1

2. Mục tiêu nghiên cứu .............................................................................. 2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................. 2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................... 3

1.1. Những hiểu biết về vi khuẩn Pasteurella multocida ......................... 3

1.1. Hình thái .......................................................................................... 3

1.2. Đặc tính nuôi cấy ............................................................................ 3

1.3. Đặc tính sinh hóa ............................................................................. 3

1.4. Sức đề kháng ................................................................................... 6

1.5. Kháng nguyên ................................................................................. 6

1.2. Những hiểu hiểu biết về bệnh Tụ huyết trùng ở bò ........................ 7

1.2.1. Dịch tễ học ...................................................................................... 7

1.2.2. Triệu chứng lâm sàng .................................................................... 10

1.2.3. Bệnh tích ....................................................................................... 10

1.2.4. Chẩn đoán bệnh ............................................................................. 11

1.2.5. Phòng và trị bệnh Tụ huyết trùng ở bò. ........................................ 12

.1. 3. Tình hình nghiên cứu về bệnh Tụ huyết trùng ở bò trên thế giới và

Việt Nam ....................................................................................... 15

1.3.1. Trên thế giới .................................................................................. 15

1.3.2. Việt Nam ....................................................................................... 16

iv

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU .............................................................................................. 20

2.1. Đối Tượng nghiên cứu .................................................................. 20

2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu .................................................... 20

2.3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................... 20

2.4. Nguyên vật liệu ............................................................................. 20

2.4.1. Máy móc........................................................................................ 20

2.4.2. Dụng cụ ......................................................................................... 21

2.4.3. Môi trường - Hóa chất - Nguyên liệu ........................................... 21

2.5. Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 21

2.5.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học ............................................ 21

2.5.2. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng ................................................. 22

2.5.3. Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn Pasteurella

multocida ....................................................................................... 22

2.5.4. Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida

phân lập được ................................................................................ 25

2.5.5. Phương pháp thử kháng sinh đồ .................................................... 25

2.5.6. Phương pháp PCR (theo Nagai et al., 1994) ................................. 26

2.5.7. Thử nghiệm phác đồ điều trị ......................................................... 29

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................ 30

3.1. Tình hình chăn nuôi trâu bò tại huyện Thạch Thất, thành phố Hà

Nội ................................................................................................. 30

3.2. Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện

Thạch Thất năm 2018 - 2019 ........................................................ 31

3.2.1. Tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất năm 2018

và 2019 .......................................................................................... 31

3.2.2. Tỷ lệ bò mắc bệnh Tụ huyết trùng theo tháng trong năm 2018 và

2019 ............................................................................................... 34

3.2.3. Tỷ lệ bò mắc bệnh do bệnh Tụ huyết trùng theo lứa tuổi ............. 37

v

3.2.4. Triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng ở bò mắc bệnh Tụ huyết

trùng bò ......................................................................................... 39

3.2.5. Tình hình tiêm phòng vắc xin Tụ huyết trùng cho bò của huyện

Thạch Thất .................................................................................... 41

3.3. Phân lập và xác định đặc tính sinh vật hóa học của Pasteurella

multocida trong bệnh tụ huyết trùng bò tại huyện Thạch Thất .... 42

3.3.1. Kết quả phân lập và xác định đặc tính sinh vật hóa học

của Pasteurella multocida từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe và từ các

mẫu bệnh phẩm của trâu, bò nghi mắc bệnh ................................. 42

3.3.2. Kết quả xác định đặc tính sinh vật hóa học của Pasteurella

multocida từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe và từ các mẫu bệnh phẩm

của trâu, bò nghi mắc bệnh ............................................................. 45

3.3.3. Kết quả giám định vi khuẩn Pasterulla multocida bằng kỹ thuật

PCR ............................................................................................... 48

3.3.4. Kết quả xác định độc lực của các chủng Pasteurella multocida phân

lập được ......................................................................................... 49

3.3.5. Kết quả thử kháng sinh đồ các chủng Pasteurella multocida phân

lập được ........................................................................................ 51

3.4. Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tụ huyết trùng bò, đề

xuất biện pháp phòng bệnh tụ huyết trùng bò tại huyện Thạch Thất . 52

3.4.1. Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh Tụ huyết trùng bò

....................................................................................................... 52

3.4.2. Đề xuất biện pháp phòng bệnh tụ huyết trùng bò tại huyện Thạch

Thất ................................................................................................ 54

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 57

1. Kết luận ............................................................................................... 57

2. Đề nghị ................................................................................................ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................... 59

Phụ lục .................................................................................................... 68

vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

P. multocida Pasteurella multocida

DNA: deoxyribonucleic acid

PCR: Polymerase Chain Reaction

TB: Trung bình

TLMBC: Tỷ lệ mắc bệnh chung

TLTV: Tỷ lệ tử vong

Cs: Cộng sự

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH

Bảng:

Bảng 1.1. Đặc tính sinh hóa chung của Pasteurella multocida ....................... 6

Bảng 2.1. Đặc tính sinh hóa chung của Pasteurella multocida ..................... 27

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR phát hiện Pasterella multocida . 27

Bảng 3.1. Kết quả điều tra tổng đàn trâu, bò phân bố trên địa bàn huyện Thạch

Thất, thành phố Hà Nội ................................................................... 30

Bảng 3.2. Tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất trong 2

năm 2018 và 2019 ........................................................................... 32

Bảng 3.3. Tỷ lệ mắc bệnh Tụ huyết trùng ở bò theo các tháng trong năm tại

huyện Thạch Thất trong 2 năm 2018 và 2019 ................................ 34

Bảng 3.4. Tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò nuôi tại huyện Thạch Thất năm

2018 và 2019 theo lứa tuổi.............................................................. 37

Bảng 3.5. Triệu chứng lâm sàng, chủ yếu của bệnh Tụ huyết trùng ở bò nuôi

tại huyện Thạch Thất ...................................................................... 40 Bảng 3.6. Tổng hợp kết quả tiêm phòng vắc xin Tụ huyết trùngcho bò của

huyện Thạch Thất năm 2018 và 2019 ............................................. 41

Bảng 3.7. Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ mẫu dịch ngoáy mũi bò

khỏe tại huyện Thạch Thất .............................................................. 43

Bảng 3.8. Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ bò nghi mắc bệnh Tụ

huyết trùng tại huyện Thạch Thất ................................................... 44

Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh vật hóa học của các chủng vi

khuẩn Pasteurella multocida phân lập được .................................. 46

Bảng 3.10. Kết quả kiểm tra khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn

Pasterulla multocida phân lập được ............................................... 47

Bảng 3.11. Kết quả giám định vi khuẩn Pasteurella multocida bằng phản ứng PCR

......................................................................................................... 48

Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn Pasteurella

multocida phân lập được trên chuột bạch ....................................... 49

Bảng 3.13. Kết quả kháng sinh đồ của các chủng Pasteurella multocida phân

lập được ........................................................................................... 51

Bảng 3.14. Kết quả điều trị bệnh Tụ huyết trùng bò tại huyện Thạch Thất .. 56

viii

Hình, sơ đồ

Hình 3.1. Biểu đồ tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất trong

2 năm 2018 và 2019 .......................................................................... 32

Hình 3.2. Biểu đồ tỷ lệ mắc bệnh Tụ huyết trùng ở bò theo các tháng trong năm

tại huyện Thạch Thất trong 2 năm 2018 và 2019 ............................. 35

Hình 3.3. Biểu đồ tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò nuôi tại huyện Thạch Thất

năm 2018 và 2019 theo lứa tuổi ........................................................ 38

Hình 3.4. Biểu đồ tỷ lệ dương tính với Pasteurella multocida từ mẫu dịch ngoáy

mũi bò khỏe tại huyện Thạch Thất ................................................... 43

Hình 3.5. Biểu đồ tỷ lệ dương tính với Pasteurella multocidatừ bò nghi mắc

bệnh Tụ huyết trùng tại huyện Thạch Thất ....................................... 44

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Những năm qua ngành chăn nuôi ở nước ta đã và đang có những bước

phát triển đáng kể, nhằm cung cấp sức kéo, thịt và sữa... Tuy nhiên, ngành chăn

nuôi bò vẫn luôn phải đối mặt với những thách thức và khó khăn như: dịch

bệnh, bệnh truyền nhiễm và bệnh ký sinh trùng, trong đó có bệnh Tụ huyết

trùng. Bệnh Tụ huyết trùng ở bò thể bại huyết (Hemorrhagic Septicemia) là

một bệnh truyền nhiễm cấp tính, do cầu trực khuẩn Pasteurella multocida thuộc

các type A, B, D, E gây ra hiện tượng tụ huyết, xuất huyết ở một số vùng trong

cơ thể, chủ yếu là phổi, tim và có thể cả ruột. Vi khuẩn xâm nhập vào máu gây

bại huyết toàn thân.

Bệnh Tụ huyết trùng bò có ở khắp nơi trên thế giới. Ở Việt Nam, bệnh

có thể gặp khắp các tỉnh thành, thường xảy ra lẻ tẻ, mang tính địa phương. Theo

các báo cáo tổng kết công tác thú y hàng năm của các địa phương và kết quả

nghiên cứu của Đặng Xuân Bình và cs (2010); tại tỉnh Hà Giang năm 2008 đã

có 276 con trâu, 157 con bò chết vì bệnh Tụ huyết trùng, tương tự như vậy, tại

tỉnh Cao Bằng trong năm 2008 đã có 455 con trâu, bò chết và năm 2009 có gần

400 con trâu bò chết do bệnh Tụ huyết trùng. Theo thông báo của Cục thú y,

hiện nay ở Việt Nam có đến 30 đến 35 tỉnh thành có bệnh Tụ huyết trùng trâu,

bò chúng gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi, Bệnh xảy ra quanh năm, nhưng

thường bùng phát vào mùa mưa, lúc khí hậu nóng ẩm, và những lúc giao mùa

thời tiết thay đổi đột ngột, sức đề kháng trâu, bò giảm sút và giết chết nhiều

trâu, bò

Huyện Thạch Thất là địa phương có nhiều hộ nuôi bò, đặc biệt là các

xãvùng đồi gò bán sơn địa và các xã miền núi như: Tiến Xuân, Yên Bình, Yên

Trung,... Tình hình bò mắc bệnh Tụ huyết trùng thường xuyên xảy ra và gây

thiệt hại cho người chăn nuôi tại địa phương. Vấn đề tìm được loại kháng sinh

phù hợp giúp điều trị bệnh hiệu quả là đòi hỏi rất cấp thiết. Xuất phát từ yêu

2

cầu của thực tiễn sản xuất, căn cứ vào cơ sở khoa học và năng lực của cơ quan

nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học

của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện

Thạch Thất - Hà Nội và biện pháp phòng trị”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định đặc điểm dịch tễ, sự lưu hành của vi khuẩn Pasteurella

multocida ở bò khỏe và bò nghi mắc bệnh Tụ huyết trùng bệnh Tụ huyết trùng

bò tại các xã thuộc huyện Thạch Thất - Hà Nội.

- Giám định đặc tính sinh vật hóa học, yếu tố gây bệnh của vi khuẩn

Pasteurella multocida phân lập được.

- Lựa chọn được phác đồ điều trị bệnh Tụ huyết trùng hiệu quả tại địa phương.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

+ Ý nghĩa khoa học:

- Bổ sung tư liệu về đặc điểm dịch tễ bệnh Tụ huyết trùng ở bò huyện

Thạch Thất (Hà Nội) vào bản đồ dịch tễ học của bệnh khu vực các tỉnh phía

Bắc Việt Nam.

- Bổ sung tư liệu về kết quả phân lập, giám định đặc tính sinh vật hóa

học, yếu tố độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được.

+ Ý nghĩa thực tiễn:

- Cơ sở để lựa chọn kháng sinhcó hiệu quả điều trị cao. Góp phần khống

chế bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất, thành phố Hà Nội.

- Kết quả nghiên cứu phục vụ cho công tác phòng chống bệnh của cán

bộ thú y cơ sở và người chăn nuôi bò địa phương.

3

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. Những hiểu biết về vi khuẩn Pasteurella multocida

1.1. Hình thái

Pasteurella multocida là một cầu trực khuẩn nhỏ 2 đầu tròn, kích thước từ

0,6 - 2,5µm x 0,2 - 0,4 µm, vi khuẩn không có lông, không di động, không hình

thành nha bào và bắt màu Gram âm (Smith JE., 1959).

Trong cơ thể bệnh, vi khuẩn hình thành giáp mô nhưng khó quan sát và

khi nhuộm vi khuẩn có hiện tượng bắt màu sẫm hơn ở hai đầu tế bào nên

P.multocida được gọi là vi khuẩn lưỡng cực (Smith JE., 1959).

Hình thái và kích thước của vi khuẩn có thể thay đổi tuỳ thuộc vào các

điều kiện nuôi cấy khác nhau (Rimler R.B., 1992). Trong máu động vật, hình

thái của vi khuẩn thường đồng nhất, còn khi phát triển trong môi trường nhân

tạo vi khuẩn thường đa hình thái, hình trứng, hình cầu hoặc hình que. Khi nuôi

cấy trong môi trường có cho thêm carbonhydrate, vi khuẩn thường kết lại thành

chuỗi dài (Rosenbusch C. T, Merchant I. A., 1939).

1.2. Đặc tính nuôi cấy

P. multocida là vi khuẩn yếu khí tùy tiện, nhiệt độ thích hợp 370C, pH

thích hợp từ 7,2-7,4. Mọc chủ yếu trên các môi trường nuôi cấy thông thường,

môi trường có bổ sung huyết thanh hoặc máu thì vi khuẩn mọc tốt (Nguyễn

Như Thanh và cộng sự, 2001). Tuy nhiên không mọc trên thạch MacConkey.

Môi trường nước thịt: sau 24 giờ nuôi cấy, môi trường đục vừa, mùi tanh

đặc biệt như mùi nước dãi khô, lắc có vẩn như sương mù rồi lại mất, đáy ống

có cặn nhày, trên mặt môi trường có màng mỏng.

Môi trường thạch thường: sau 24 giờ nuôi cấy trên mặt thạch hình thành

khuẩn lạc dạng S nhỏ, trong suốt, long lanh như giọt sương. Nuôi lâu khuẩn lạc

có màu trắng ngà dính vào môi trường. P. multocida có thể phát triển thành

khuẩn lạc dạng S, dạng R hay dạng M trong môi trường này. Khuẩn lạc dạng S

(Smooth) là khuẩn lạc trơn, bóng láng, mặt vồng, có dung quang sắc cầu vồng,

là dạng khuẩn lạc có độc lực mạnh, vi khuẩn thuộc dạng khuẩn lạc này thường

4

tạo thành lớp giáp mô nhiều hơn khuẩn lạc dạng xù xì. Khuẩn lạc dạng R

(Rough) thường dẹt, có rìa nhám xù xì, trơn nhám, có dung quang màu xanh,

có độc lực yếu hơn. Khuẩn lạc dạng M (Mucoid) ướt nhày, có kích thước to

nhất, rìa khuẩn lạc nhẵn, dung quang sắc cầu vồng yếu hơn dạng S. Hình dạng

khuẩn lạc có thể thay đổi, khi nuôi cấy lâu ngày khuẩn lạc tăng kích thước, nhớt

và dính chặt vào mặt thạch, còn khi cấy chuyển nhiều lần thì giáp mô mất đi,

kích thước khuẩn lạc nhỏ lại, không màu và trong suốt.

Môi trường thạch máu: vi khuẩn không gây dung huyết, phát triển tốt,

khuẩn lạc to hơn thạch thường. Đây là môi trường dùng để nhân và giữ giống

vi khuẩn (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001).

Đặc trưng của vi khuẩn P. multocida là khuẩn lạc có mùi thơm ngọt và

không gây dung huyết.

Môi trường thạch - huyết thanh - huyết cầu tố: là môi trường dùng để phân

lập, giám định, xác định độc lực của vi khuẩn. Môi trường này, khuẩn lạc hình

thành có hiện tượng tán sắc (iridescent). Khi xem khuẩn lạc dưới kính hiển vi

hai thị kính với độ phóng đại thấp (x20) và góc chiếu phản quang của ánh sáng đèn điện 450, tùy theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc của khuẩn lạc khác

nhau.Vi khuẩn có độc lực cao thì khuẩn lạc của chúng quan sát thấy 2/3 diện

tích khuẩn lạc về phía đèn có màu xanh lơ hay xanh lá mạ; 1/3 diện tích khuẩn

lạc có màu vàng ánh kim hay màu da cam; gọi là khuẩn lạc Fg (Greenish

Fluorescent). Vi khuẩn có độc lực vừa biểu hiện 2/3 diện tích khuẩn lạc về phía

đèn có màu vàng ánh kim hay màu da cam, gọi là khuẩn lạc Fo (Orange

Fluorescent). Vi khuẩn có độc lực yếu, khuẩn lạc của chúng không có hiện

tượng tán sắc, không màu gọi là Nf (Not Fluorescent).

Hiện tượng tán sắc của khuẩn lạc thấy rõ sau nuôi cấy 24 giờ, chúng sẽ

mất đi nếu để qua 72 giờ nuôi cấy.

Môi trường nước thịt pepton: sau cấy 24 giờ vi khuẩn làm đục môi trường,

vài ngày sau môi trường trở nên trong, dưới đáy có cặn nhày, lắc khó tan.

Để nuôi cấy vi khuẩn chế tạo vắc xin người ta thường sử dụng môi trường

cơ bản có thêm đường sucrose, peptone và chất chiết men bia. Theo Namioka

và Murata (1961), môi trường nuôi cây tốt nhất cho vi khuẩn P. multocida là

5

Yeast extract Pepton-L-Cystin (YPC) có thêm sucrose và natri sulfite (Na2SO3).

Đây là môi trường giúp cho sự tái tạo giáp mô của vi khuẩn và cũng là môi

trường phân lập, giữ giống và nhân giống. Môi trường Hottinger cũng rất tốt

cho vi khuẩn Pasteurella phát triển.

1.3. Đặc tính sinh hóa

Mỗi vi khuẩn có một phản ứng sinh hóa đặc trưng, vì vậy bước đầu cần giám định các đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn nghiên cứu. Đa số các chủng vi khuẩn P. multocida có khả năng lên men không sinh hơi đường galactose, glucose, mannose, sorbitol, mannit, sozbit, xylose và sucrose. Vi khuẩn P. multocida không lên men đường lactose, maltose, arabino, rammo, salixin, dunxin, adonit. P. multocida không làm tan chảy gelatin, không mọc trên môi trường khoai tây, không làm đông vón sữa.

Các chủng vi khuẩn P. multocida có khả năng sinh indol và khi thay đổi thành phần của môi trường cũng ảnh hưởng đến khả năng sinh indol sớm hay muộn.Vi khuẩn P. multocida sẽ mất đặc tính sinh indol khi cấy chuyển nhiều lần trên môi trường nhân tạo. Nhưng chúng sẽ có lại đặc tính này khi tăng cường giống bằng cách tiêm truyền cho bản động vật. Ngoài ra vi khuẩn này còn cho kết quả catalazavà oxydaza dương tính.

Nhiều nghiên cứu đã cho biết đặc tính sinh hóa của các chủng P.multocida được phân lập từ các vùng khác nhau: Phùng Duy Hồng Hà (1990) đã nghiên cứu về khả năng lên men đường của P. multocida phân lập từ gia cầm bị bệnh Tụ huyết trùng tại Việt Nam, chúng có đặc tính hoá thông thường như lên men glucose, sucrose. Riêng đường sorbitol có 3 chủng luôn cho phản ứng âm tính, 3 chủng luôn cho phản ứng dương tính, 26 chủng còn lại cho kết quả thay đổi, lúc âm lúc dương. Nghiên cứu P.multocida trên lợn của Úc và Việt Nam của Trần Xuân Hạnh (2002) cho thấy khoảng 24,1% dương tính với đường lactose và 100% dương tính với đường sorbitol.

6

Bảng 1.1. Đặc tính sinh hóa chung của Pasteurella multocida

(Theo Smith JE, 1959)

Đặc tính sinh hóa Dung huyết Glucoza Lactoza H2S Catalaza Oxidaza Indol Ureaza

Kết quả - + - - + + + -

Chú thích: “-”: âm tính, “+” : dương tính.

Theo Hoàng Ðăng Huyến (2004) nghiên cứu về đặc tính sinh hóa của vi

khuẩn P. multocida phân lập từ trâu, bò tại Bắc Giang và Phạm Thị Phương Lan

và cộng sự (2012) xác định đặc tính sinh hóa các chủng vi khuẩn này tại hai tỉnh

Hà Giang và Cao Bằng đều cho biết 100% các chủng P. Multocida đều lên men

các đường glucose, mannitol, saccarose, fructose, galactose và sorbitol, không lên

men đường lactose,mantose, arabinose..

1.4. Sức đề kháng

Vi khuẩn P. multocida có sức đề kháng yếu với các chất sát trùng thông

thường, chúng không thể tồn tại lâu ngoài cơ thể động vật, ánh sáng mặt trời và

sức nóng. P. multocida có thể tồn tại trong đất ẩm, nền chuồng, trên đồng cỏ

đến hàng tháng, có khi hàng năm. P. multocida bị tiêu diệt trong vài giây ở 1000C, 3-5 phút ở nước vôi 1% (Nguyễn Như Thanh, 2001).

1.5. Kháng nguyên

Kháng nguyên của P. multocida có cấu trúc phức tạp và luôn thay đổi. Chúng

bao gồm hai loại kháng nguyên là kháng nguyên vỏ và kháng nguyên thân.

- Kháng nguyên vỏ (K)

Kháng nguyên vỏ là một bản kháng nguyên, có bản chất là một polysaccarit,

che phủ lớp kháng nguyên O. Kháng nguyên vỏ có tính kháng nguyên yếu

không có khả năng tạo được sự bảo hộ chuột và thỏ khi thử thách bằng công

cường độc. Bằng phương pháp bảo hộ chéo trên chuột bạch Robert (1947) đã

7

xác định P. Multocida có 4 loại kháng nguyên vỏ và được ghi lại theo số La mã

là I, II, III và IV.

Carter (1955) cũng xác định được 4 nhóm kháng nguyên K đánh theo chữ

cái in hoa là A, B, C và D dựa vào phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu

(Indirect Haemagglutination Test - IHA). Đến năm 1961, bằng phản ứng ngưng

kết Carter đã xác định thêm type mới đặt tên là E, tác giả đề nghị bỏ type C và

bổ sung thêm type F vào năm 1963.

- Kháng nguyên thân (O)

Kháng nguyên thân lipopolysaccharide của vi khuẩn P. multocida được

Pirosky thông báo vào năm 1938. Kháng nguyên thân có 2 nhóm đặc hiệu và

không đặc hiệu. Các chủng khác nhau sẽ khác nhau về kháng nguyên thân. Chỉ

có serotyp B hầu như đồng nhất thuộc một nhóm kháng nguyên thân. Kháng

nguyên thân có 2 hệ thống phân loại là phân loại theo Namioka và Murata (1961),

kháng nguyên thân có 12 yếu tố và phân loại theo Heddleston (1972), kháng

nguyên thân có 16 yếu tố.

Lipopolysaccharide là kháng nguyên thân quan trọng, có khả năng tạo đáp

ứng miễn dịch cao và đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch dịch thể

(Ryu H.I., Kim C.J., 2000).

1.2. Những hiểu biết về bệnh Tụ huyết trùng ở bò

1.2.1. Dịch tễ học

a. Loài mắc bệnh

Trong tự nhiên hầu hết các loài gia súc, gia cầm, loài có vú và loài chim

đều mẫn cảm với bệnh. Theo Lignieres (1900) ít nhất có 6 dạng bệnh tụ huyết

trùng khác nhau: Ở gà, trâu, bò, lợn, cừu, dê, ngựa và chó, cả 6 dạng bệnh này đều

thấy ở thỏ. Bệnh thấy ở trâu, bò, lợn, thỏ, chó, mèo, hươu, ngựa, chồn, khỉ, dê và

cừu (Carter, 1959). Bệnh còn thấy ở bò rừng, nai, sơn dương, lợn rừng, thỏ rừng,

voi, lạc đà và báo tuyết ở Hymalaya (De Alwis, 1982). Nhiều tác giả đã khẳng

định: Nơi nào có bệnh tụ huyết trùng trâu, bò thì ở đó người ta cũng phát hiện

bệnh này ở động vật hoang dã. De Alwis (1982) cho rằng loài vật cảm nhiễm mạnh

nhất đối với bệnh tụ huyết trùng là trâu, bò trong đó trâu mẫn cảm hơn bò. Ở Việt

8

Nam, trâu dễ bị nhiễm và mắc bệnh nặng hơn bò.Trâu, bò rừng cũng mắc bệnh

(Đoàn Thị Băng Tâm, 1987). Trâu thường chết khi gặp thể quá cấp hoặc cấp tính.

Trong phòng thí nghiệm, mức độ mẫn cảm của động vật thí nghiệm

với vi khuẩn P. multocida thuộc serotype B:2 giảm dần theo thứ tự thỏ, chuột

bạch, trâu bò, chuột lang, bồ câu, lợn, ngựa, cừu và cuối cùng là dê. Chó, gà,

vịt không mẫn cảm (Bain R.V.S et al., 1982). Ngoài ra, một số bệnh Tụ huyết

trùng cũng đã được thông báo trên lạc đà và hươu.

Một số ổ dịch Tụ huyết trùng trâu bò có thể xảy ra đồng thời với bệnh

Tụ huyết trùng ở lợn và ngựa. Tại Quảng Ninh đã xác nhận xác lợn rừng chết

trong ổ dịch Tụ huyết trùng trâu, bò (Bùi Quý Huy, 1988).Năm 2002, tại

Kontum có ghi nhận một ổ dịch Tụ huyết trùng ở trâu, bò và lợn. Ổ dịch bắt

đầu xảy ra ở lợn, sau đó lây sang cho trâu bò (Trần Xuân Hạnh, 2002).

b. Tuổi mắc bệnh

Với động vật mẫn cảm bệnh xảy ra ở hầu hết các lứa tuổi, tuy nhiên những

con đang bú mẹ ít mắc hơn những con trưởng thành. De Alwis (1984) cho biết

mức độ cảm nhiễm của động vật non mạnh hơn động vật già, kết quả nghiên

cứu của tác giả cho thấy ở bò và trâu tỷ lệ mắc bệnh ở lứa tuổi dưới 6 tháng là

3,5%, trong khi đó trâu, bò ở lứa tuổi từ 6 tháng đến 2 năm là 30 - 32%, ngược

lại trâu, bò trên 2 năm tuổi tỷ lệ mắc bệnh chiếm từ 3 - 5% toàn đàn. Nghiên

cứu cũng cho thấy tỷ lệ chết của trâu, bò trong mỗi ổ dịch là 84% và 91% tập

trung vào lứa tuổi 6 tháng đến 18 tháng. Bò 1 - 3 tuổi dễ mắc hơn bò già và khi

mắc thì tỷ lệ chết cao hơn. Bò càng béo, khỏe, trẻ càng dễ mắc bệnh và tỷ lệ

chết cao. Mức độ cảm nhiễm của động vật non mạnh hơn động vật già (De

Alwis M. C. L, 1984). Bê dưới 6 tháng tuổi ít mắc bệnh.

Trâu, bò càng béo, khỏe, trẻ càng dễ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao. Bê, nghé

dưới 6 tháng tuổi ít mắc bệnh (Bùi Quý Huy, 1998). Cao Văn Hồng (2002) tại

Đắk Lắk cũng cho thấy lứa tuổi cảm nhiễm với bệnh nhất là dưới 36 tháng tuổi.

Hoàng Đăng Huyến (2004) cho biết tại Bắc Giang trâu, bò nhỏ hơn 2 năm tuổi

mẫn cảm với bệnh nhất.

c. Nguồn bệnh và phương thức truyền lây

9

Nguồn lây bệnh tụ huyết trùng là những trâu, bò, lợn và gia cầm bị bệnh

và mang trùng. Trong cơ thể gia súc khỏe mạnh, P.multocida thường tồn tại ở

đường hô hấp trên nhưng đây không phải là quan hệ cộng sinh. Khi sức đề

kháng của cơ thể giảm, vi khuẩn tăng độc lực và tác động gây bệnh. Cho đến

nay không rõ là vi khuẩn tồn tại bằng cách truyền lần lượt trong một số cá thể

của một quần thể hay nó còn tồn tại lâu dài một số con. Có nhiều cách lây bệnh

khác nhau: Nhiễm qua đường hô hấp, đường tiêu hóa, qua vết xước trên da,

bệnh có thể lây từ con ốm sang con khỏe qua tiếp xúc. Bệnh lây lan do việc giết

mổ gia súc ốm, chó mèo và một số côn trùng hút máu như ruồi, mòng… cũng

có thể là vật môi giới truyền mầm bệnh đi xa (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978).

Trong giai đoạn đầu của bệnh, khi con vật còn đi lại được, vi khuẩn từ nước

dãi, phân, nước tiểu được bài ra xung quanh. Ổ dịch rộng hay hẹp tùy theo điều

kiện tồn tại của vi khuẩn và sức miễn dịch của đàn (Phan Thanh Phượng, 1994).

d. Phân bố và mùa vụ mắc bệnh

Bệnh Tụ huyết trùng trâu, bò xảy ra ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là

các nước thuộc châu Á và châu Phi. Tại châu Á vi khuẩn gây bệnh thường thuộc

serotype B:2 và ở châu Phi là serotype E:2 (Carter G. R., 1982). Tại Ấn Độ P.

multocida gây bệnh Tụ huyết trùng trâu, bò phân lập được thuộc serotype A:1

và A:3, A:1,3, A:4, B:2, D:1(Kumar A.A. et al., 1996; 2004). Ở một số nước tồn

tại cả hai serotype B:2, E:2 như Sudan và Ai Cập.

Tỷ lệ trâu bị bệnh là 45,2%; tỷ lệ bò bị bệnh (15,8%) thuộc về Sri-Lanka,

một trong những nước có tỷ lệ trâu bò nhiễm bệnh cao nhất thế giới. Tại vùng

Punjab thuộc Pakistan, tỉ lệ trâu bò mang trùng là 11%, tỷ lệ trâu bệnh là 9%

và tỷ lệ tử vong lên tới 78%; ở bò tỷ lệ tương ứng có thấp hơn 4%, 2,5% và

62%. Bò thường bị bệnh vào mùa mưa, các mùa khác tỷ lệ bò bị bệnh Tụ huyết

trùng chiếm rất nhỏ (Sheikh M.A. et al., 1996). Carter (1982) đã nghiên cứu và

phát hiện bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại Nhật Bản, bệnh không thành dịch và

biểu hiện dịch tễ không điển hình.

Nghiên cứu tại Namibia cho thấy, bệnh Tụ huyết trùng xảy ra ở trâu

thường xuyên và nhiều hơn ở bò, đặc biệt là những vùng ẩm ướt, có nhiều

10

đầm lầy, tập tính đằm mình của trâu càng tạo điều kiện cho khả năng gây

nhiễm của P.multocida (Voigts A. et al., 1997). Tại Cameroon, bệnh tụ huyết

trùng trâu, bò lần đầu tiên được phát hiện tại vùng Maga ở giống bò Zebu. Khi

phân lập thấy vi khuẩn gây bệnh thuộc serotype B:2, serotype này ít phổ biến

tại châu Phi.

Ở Việt Nam bệnh có ở khắp nơi, có tính chất lẻ tẻ địa phương. Bệnh

xảy ra rải rác quanh năm ở các vùng nóng ẩm, tập trung hơn vào mùa mưa

từ tháng 6 - 9. Theo thống kê của Cục thú y, hàng năm nước ta có 30 - 35

tỉnh thành có bệnh Tụ huyết trùng trâu, bò gây thiệt hại đáng kể. Các tỉnh

miền Tây Nam Bộ do khí hậu nóng ẩm và nhiều đầm lầy nên bệnh xảy ra

nhiều hơn. Hiện nay bệnh gặp nhiều ở các tỉnh miền núi như Lạng Sơn, Lai

Châu, Sơn La, Tuyên Quang, Hà Giang.

1.2.2. Triệu chứng lâm sàng

Bệnh Tụ huyết trùng ở bò thường mắc ở ba thể gồm thể ác tính, cấp tính

và mạn tính (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2011). Thể ác tính hay thể quá cấp tính

có tần suất rất nhỏ. Bò bị bệnh ở thể này phát bệnh rất nhanh, con vật đột nhiên lên cơn sốt cao 41-420C và trở nên hung dữ, điên loạn, đập đầu vào tường và

chết trong vòng 24 giờ. Với bê có thể có triệu chứng thần kinh như giãy dụa

ngã vật xuống rồi chết, có khi đang ăn chạy lồng lên, điên loạn, run rẩy, ngã

xuống rồi lịm đi.

Thể cấp tính xảy ra phổ biến ở trâu, bò. Thời gian nung bệnh ngắn từ 1

- 3 ngày, con vật không nhai lại, mệt lả, bứt rứt, sốt cao đột ngột 40 - 420C.

Xuất huyết niêm mạc mũi, mắt chảy nước mắt, nước mũi. Các hạch lympho

đều sưng, hạch dưới hầu sưng rất to, làm cho con vật lè lưỡi ra, thở khó nên

được gọi là bệnh “trâu, bò hai lưỡi”. Hạch lympho trước vai, trước đùi sưng,

thủy thũng làm con vật đi lại khó khăn. Con vật thể hiện hội chứng hô hấp,

thở mạnh do viêm màng phổi, tràn dịch màng phổi, có tụ huyết và viêm phổi

cấp. Lúc sắp chết con vật nằm liệt, đái ra máu, thở khó khăn, niêm mạc có

nhiều điểm xuất huyết đỏ thẫm. Bệnh tiến triển 3 - 5 ngày. Tỷ lệ chết 90 -

100%. Nếu con vật nhiễm trùng huyết thì chết trong vòng 24 - 36 giờ.

11

Con vật bị bệnh ở thể cấp tính, nếu không chết, bệnh sẽ chuyển thành mạn

tính. Bò bị bệnh thể hiện viêm ruột mạn tính: lúc ỉa chảy, lúc táo bón, viêm

khớp làm cho con vật đi lại khó khăn, viêm phế quản và viêm phổi mạn tính.

Bệnh tiến triển trong vài tuần, con vật có thể khỏi bệnh, các triệu chứng nhẹ

dần nhưng thường gầy rạc và chết do kiệt sức.

Khaleel et al (2014) đã nghiên cứu và khẳng định tác động của P.

Multocida lên não và nơ ron thần kinh của động vật mắc bệnh. Điều này giải

thích trong nhiều trường hợp con vật mắc bệnh có biểu hiện thần kinh trước

khi chết.

1.2.3. Bệnh tích

Bệnh tích đại thể của bệnh Tụ huyết trùng ở bò thể hiện đặc trưng và điển

hình ở thể bệnh cấp tính với hiện tượng tụ huyết và xuất huyết ở niêm mạc mắt,

mũi, miệng. Tổ chức liên kết dưới da đều tụ huyết màu đỏ thẫm và lấm tấm

xuất huyết từng mảng. Hệ thống hạch lâm ba sưng to, thủy thũng, xuất huyết,

rõ nhất là hạch lâm ba sau hầu, vai và trước đùi. Ngoài ra phổi bị viêm thùy,

các xoang có tương dịch.

Khi nhuộm HE (Hematoxylin-Eosin) bệnh phẩm là cơ tim thấy các sợi cơ

mô liên kết tách rời nhau, có nơi xuất hiện dày đặc hồng cầu hoặc sợi cơ thoái hóa,

xuất hiện các vi khuẩn hình que tại tổ chức liên kết. Với bệnh phẩm là gan thì

trung tâm thùy gan có nhiều điểm thoái hoá, gan tụ máu, tế bào kuffer tăng sinh.

Bệnh phẩm là lách cũng có các thay đổi nghiêm trọng như trung tâm lympho bị

teo, phần tủy đỏ có nhiều điểm hoại tử (Đỗ Tuấn Cương và cs, 2004).

1.2.4. Chẩn đoán bệnh

- Chẩn đoán lâm sàng căn cứ vào điều kiện phát sinh, phát triển của bệnh,

các biểu hiện đặc trưng về triệu chứng lâm sàng và bệnh tích để chẩn đoán bệnh

như sốt cao, có dấu hiệu thần kinh, tụ huyết và xuất huyết nặng hầu như ở tất

cả các tổ chức. Hạch lympho vùng hầu, trước vai và trước đùi sưng to, có biểu

hiện triệu chứng hô hấp rõ.

12

- Chẩn đoán phân biệt: Phân biệt bệnh Tụ huyết trùng bò với bệnh bệnh

nhiệt thán và bệnh ung khí thán trên bò. Bệnh nhiệt thán tiến triển cũng

nhanh, có sưng cổ nhưng ít thủy thũng hơn bệnh tụ huyết trùng; thịt xác động

vật bị nhiệt thán đen, ướt nhão, máu đen đặc khó đông, lá lách sưng to gấp

2-3 lần, tổ chức lách nát nhũn như bùn. Còn bệnh ung khí thán chỉ sưng trong

bắp thịt, ở giữa chỗ sưng thịt bị hoại tử màu đen nát, ấn tay vào có tiếng kêu

lạo xạo.

+ Chẩn đoán phòng thí nghiệm:

+ Chẩn đoán vi khuẩn học ta có thể lấy bệnh phẩm là máu tim, gan, lách,

tủy xương, phổi, hạch lympho, thận và dịch thủy thũng. Tiến hành làm tiêu bản

nhuộm Gram hoặc Giemsa (nếu bệnh phẩm là máu) rồi tìm vi khuẩn. Phân lập

vi khuẩn trên các môi trường thích hợp, quan sát tính chất mọc và xác định các

phản ứng sinh hóa cần thiết.

Tiêm động vật thí nghiệm: dùng bệnh phẩm hoặc canh trùng đã có vi khuẩn

mọc sau khi nuôi cấy bệnh phẩm tiêm dưới da hoặc phúc mạc cho chuột bạch

trong vòng 24 - 48 giờ. Nếu bệnh phẩm có vi khuẩn Tụ huyết trùng bệnh sẽ

phát ra và giết chết chuột. Mổ khám quan sát bệnh tích.

+ Chẩn đoán huyết thanh học giúp ta xác định các serotype P. multocida

bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính, phản ứng ngưng kết hồng cầu

gián tiếp, phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch. Nhưng kết quả của phản

ứng kém chính xác nên thường không sử dụng.

+ Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể kháng P. multocida sau khi tiêm

phòng vắc xin hoặc kháng thể tự nhiên (Rajeswari Shome và cs, 2019).

+ Kỹ thuật PCR được sử dụng để chẩn đoán chính xác sự có mặt của

P. multocida từ các loại mẫu bệnh phẩm khác nhau (Townsend và cs, 1998;

Hunt và cs, 2000; Ranjan và cs, 2011; Jesse và cs, 2013). Tuy nhiên phương

pháp này yêu cầu người thực hiện có trình độ chuyên môn cao, kinh phí cao.

1.2.5. Phòng và trị bệnh Tụ huyết trùng ở bò.

- Phòng bệnh

13

+ Do đặc tính gây bệnh của vi khuẩn Tụ huyết trùng ở bò là khi bò suy

giảm sức đề kháng nên biện pháp phòng bệnh chủ động trước tiên cần đảm bảo

vệ sinh chuồng trại, chăm sóc, nuôi dưỡng hợp lý kết hợp với tiêm phòng định

kỳ cho vật nuôi.

+ Phòng bệnh bằng vắc xin: Theo Johnson (1989) hiệu lực phòng bệnh của

vắc xin còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Do đặc tính của bệnh Tụ huyết trùng bò

thường xảy ra ở thể quá cấp tính nên điều trị kém hiệu quả, kết quả đạt được chỉ

khi phát hiện bệnh và sử dụng kháng sinh sớm (Mosier, 1992). Trong trường hợp

sử dụng kháng sinh ở giai đoạn cuối, khi con vật đã xuất huyết chỉ làm tăng

nhanh quá trình chết của chúng, cho nên việc phòng chống bệnh phải coi trọng

công tác tiêm phòng bằng vắc xin cho gia súc là chính (De Alwis, 1992a). Cũng

quan điểm đó, Abeynay và cs (1992) cho rằng tiêm phòng là biện pháp tích cực

và hiệu quả nhất để khống chế và ngăn chặn bệnh này.

Gần đây, Abubakar M.A (2014) đã phát triển vắc xin tái tổ hợp chống

lại P. multocida. Vắc xin phổ rộng và mạnh hơn có thể đạt đượcthông qua việc

xác định các chất kích thích miễn dịch của P. multocida (Shivachandra và csự,

2011). Do đó, đáp ứng miễn dịch và vai trò bảo vệ của các OMP của P. Multocida

tiếp tục được nghiên cứu.

Rita, D.V và cs (2018) đã chế tạo thành công đoạn gen ABA392 thành một

vec tơ biểu hiện protein, pET-30a. Protein được biểu thị từ bản sao

ABA392/pET30a có khả năng miễn dịch và đã được thử nghiệm trên chuột.

Protein tái tổ hợp này có thể kích hoạt phản ứng miễn dịch và do đó có khả

năng được thử nghiệm là ứng cử viên vắc xin phù hợp trong các nghiên cứu

trong tương lai. Dự kiến rằng vắc xin tiểu đơn vị này sẽ đóng góp đáng kể trong

việc quản lý bệnh Tụ huyết trùng trâu bò trong tương lai.

Hiện nay nước ta có sử dụng các loại vắc xin như vắc xin Tụ huyết trùng

trâu, bò keo phèn chủng Robert I, vắc xin Tụ huyết trùng trâu, bò nhũ dầu chủng

P52, vắc xin Tụ huyết trùng chủng Iran, vắc xin Tụ huyết trùng trâu, bò nhũ hoá

của Viện Thú y Quốc gia và vắc xin vô hoạt Tụ huyết trùng trâu, bò của Xí

nghiệp Thuốc thú y Trung ương.

14

Vắc xin Tụ huyết trùng trâu, bò keo phèn chủng Robert I là loại vắc xin

vô hoạt. Ưu điểm của loại vắc xin này là liều tiêm thấp 2ml/con, thời gian miễn

dịch kéo dài, tỷ lệ miễn dịch cao. Nhược điểm là sau khi tiêm một tỷ lệ gia súc

bị phản ứng phụ.

Vắc xin Tụ huyết trùng trâu, bò nhũ dầu chủng P52 do Công ty thuốc thú y

Trung ương nghiên cứu sản xuất. Vắc xin ở dạng vô hoạt, chất bổ trợ nhũ dầu.

Vắc xin có liều tiêm thấp, an toàn cho động vật, có hiệu lực miễn dịch tốt và

thời gian miễn dịch kéo dài 12 tháng.

Vắc xin Tụ huyết trùng chủng Iran là vắc xin ở dạng vô hoạt, chất bổ trợ

keo phèn hydroxide aluminium. Mỗi liều tiêm vắc xin là 2ml, độ dài miễn dịch

6 - 7 tháng. Vắc xin an toàn cho động vật và có hiệu lực cao.

Vắc xin Tụ huyết trùng trâu, bò nhũ hoá được Viện Thú y Quốc gia nghiên

cứu dùng chủng P52 có bổ trợ dầu maccon và montanit để sản xuất. Vắc xin có

dạng nhũ tương, liều tiêm 2ml/con, thời gian miễn dịch trên 12 tháng.

Vắc xin vô hoạt Tụ huyết trùng trâu bò do Xí nghiệp Thuốc thú y Trung ương

sản xuất các chủng T2, T4 có nguồn gốc từ Trung Quốc. Vắc xin có liều tiêm 2ml,

miễn dịch cho trâu, bò 6 tháng, có thể phản ứng cục bộ nơi tiêm.

Ở Việt Nam, Viện vắc xin Nha Trang cũng đã chế kháng huyết thanh đa

giá tụ huyết trùng trên ngựa để điều trị bệnh tụ huyết trùng trâu, bò và lợn. Liều

lượng có thể sử dụng như sau:

- Trâu, bò: Liều tiêm phòng tiêm 30-50 ml/con, liều điều trị 60-100 ml/con.

- Bê, nghé: Liều tiêm phòng tiêm 10 - 20 ml/con, liều điều trị 20 - 40 ml/con.

- Lợn dưới 3 tháng tuổi: Liều tiêm phòng tiêm 10 - 20 ml/con, liều điều

trị 20 - 40 ml/con. Lợn 5 tháng tuổi: Liều tiêm phòng tiêm 20 - 30 ml/con, liều

điều trị 40 - 60 ml/con. Lợn trên 5 tháng tuổi: Liều tiêm phòng tiêm 30-40

ml/con, liều điều trị 60 - 80 ml/con.

- Trị bệnh

15

Bệnh Tụ huyết trùng có thể điều trị bằng kháng sinh. Sự mẫn cảm của

bò ở các địa phương khác nhau là khác nhau. Muốn có hiệu quả điều trị cao cần

phải làm kháng sinh đồ. Nói chung các chủng vi khuẩnTụ huyết trùng đều rất

nhạy với streptomycin (Phan Thanh Phượng, 2000). Ngoài ra còn có thể điều

trị bằng các kháng sinh như gentamycine, ampicilline và tetracycline.

Theo nghiên cứu của Azmat Jabeen et al, (2013) vi khuẩn Tụ huyết trùng

có 5 chủng A, B, D, E, F và 16 serotypes (1-16). Tác giả đã kiểm tra tính kháng

kháng sinh của P. multocida bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch, kết

quả thấy rằng P. Multocida kháng với các kháng sinh augmentin, amoxicillin

and aztreonam và mẫn cảm cao với ceftiofur.

Theo nghiên cứu của Yami Bote và cs (2017) tại Ethiopia trong thời gian

2016-2017 về độ mẫn cảm của các chủng P. multocida với các loại kháng sinh,

kết quả công bố phát hiện 13 trâu, bò dương tính với vi khuẩn P. multocida

chiếm tỷ lệ 3,39% trong tổng số 384 mẫu kiểm tra. Kết quả kiểm tra kháng sinh

đồ của các chủng vi khuẩn phân lập được với các loại kháng sinh cho thấy mức

độ kháng và mẫn cảm rất khác nhau các chủng P. Multocida với các loại kháng

sinh, cụ thể tỷ lệ mẫn cảm 15,4% với tetracycline, 61,5% với streptomycin; và

tỷ lệ kháng 15,4% với streptomycin, clindamycin 69,2% với tetracycline. Kết

quả khẳng định streptomycin, clindamycin là những thuốc có thể sử dụng để

điều trị bệnh do Pasteurella multocida.

1.3.Tình hình nghiên cứu về bệnh Tụ huyết trùng ở bò trên thế giới và Việt

Nam

1.3.1.Trên thế giới

Bệnh Tụ huyết trùng được Bollinger phát hiện lần đầu tiên trên bò năm

1878 ở Munich (Đức). Những năm tiếp theo bệnh được phát hiện ở khắp mọi

nơi trên thế giới, trên nhiều loài gia súc, gia cầm. Năm 1885, Kitt đã phân lập

được vi khuẩn. Khi nghiên cứu vi khuẩn Tụ huyết trùng gây bệnh ở các loài gia

súc, các nhà khoa học thấy sự giống nhau về tính chất gây bệnh, tương đồng

kháng nguyên, nhưng khác nhau về tính gây bệnh cho các loài vật. Năm 1887,

Trevisan đã đề nghị đặt tên cho vi khuẩn là Pasteurella để ghi nhớ công lao của

16

Louis Pasteur, người có nhiều đóng góp nghiên cứu phát hiện ra loại vi khuẩn

này (De Alwis, 1992). Vi khuẩn Pasteurella gây bệnh cho nhiều loài gia súc

nên tên của chúng được gắn với tên của loài vật mà chúng gây bệnh: Pasteurella

suiseptica gây bệnh ở lợn Pasteurella boviseptica gây bệnh ở bò Pasteurella

oviseptica gây bệnh ở dê, cừu Pasteurella aviseptica gây bệnh ở gà… Đến năm

1939, Rosenbush và Merchant đã đề nghị đặt tên cho vi khuẩn này là

Pasteurella multocida, để chỉ khả năng gây bệnh cho nhiều loài vật của chúng,

tên này đã được công nhận chính thức trên thế giới và sử dụng cho đến ngày

nay. Lignieres (1900) cho rằng: bệnh Tụ huyết trùng có ít nhất ở 6 loài vật

nuôi khác nhau. Tuy nhiên, gần đây theo qui ước của tổ chức FAO

(FAO/WHO/CIF, 1970), trong các tài liệu quốc tế về súc sản, hai thuật ngữ

này được dùng phân biệt, Haemorrhagic septicaemia dùng chỉ bệnh do P.

multocida thuộc serotype I Roberts gây ra, còn Pasteurellosis dùng chỉ bệnh

do vi khuẩn Pasteurella gây ra. Ở Châu Á, bệnh Tụ huyết trùng trâu, bò do P.

multocida gây ra thường ở hai thể chủ yếu: Nhiễm trùng máu - xuất huyết

(Haemorrhagic septicaemia - HS) và viêm phổi ở bò (Bovine pneumonic

pasteurellosis). Ngày nay, sau hơn một trăm năm kể từ khi phát hiện lần đầu,

P. multocida vẫn là nguyên nhân gây bệnh Tụ huyết trùng cho nhiều loài gia

súc gia cầm. Tuy có tính thích nghi gây bệnh trên các loài vật khác nhau,

nhưng P. multocida đều có những đặc tính cơ bản giống nhau.

Cho đến nay bệnh gây thiệt hại nặng nề ở nhiều nước Châu Á, đặc biệt là

ở Ấn Độ, Pakistan, Sri lanka và các nước thuộc vùng Đông Nam Á. Theo một

nghiên cứu gần đây của nhóm tác giả người Camphuchia, 24% tổng số hộ gia

đình bị ảnh hưởng với tỷ lệ mắc bệnhTụ huyết trùng trên trâu, bò tại khu vực

nghiên cứu, trung bình là 10,1% và tỷ lệ tử vong là 28,8%. Giải quyết vấn đề

kiểm soát bệnh Tụ huyết trùng trên trâu, bò đòi hỏi phải tập trung vào nâng

cao kiến thức của nông dân về an toàn sinh học và tiêm phòng cho gia súc nên

được ưu tiên cho các bên liên quan quan tâm đến việc giải quyết vấn đề mất

an ninh lương thực trong khu vực và giảm nghèo (Kawasaki M và cs, 2015).

Theo Jakeen K.El-Jakee và cs (2016) nghiên cứu về bệnh Tụ huyết trùng

do P. multocida gây ra ở gia súc và trâu ở tại Ai Cập tháng 1 năm 2013 đến tháng

17

3 năm 2014 từ các địa phương khác nhau. Tổng số 88 chủng P. multocida đã được

phân lập từ 256 mẫu bệnh phẩm mũi họng và mô phổi (34,4%). Những con bê

chết cho thấy tỷ lệ phân lập P. multocida cao nhất, sau đó là những con bê bị

giết mổ khẩn cấp, những con bê bị bệnh sau đó rõ ràng là những con khỏe mạnh.

Phương pháp phát hiện P. multocida bằng kính hiển vi, phản ứng sinh hóa và

bằng phương pháp PCR.

Tác giả Hossein Jamali và cs (2014) nghiên cứu xác định tỷ lệ lưu hành,

đặc tính và kháng kháng sinh của Pasteurella multocida phân lập từ bò ở Iran.

Đã phát hiện P. multocida trong 141/169 trường hợp bò sữa và bò thịt. Các

chủng P. multocida thuộc các nhóm huyết thanh A (126/141), D (12/141) và B

(3/141). Trong số các chủng P. multocida, tất cả đều mang các gen psl, ompH,

oma87, fimA, ptfA, nanB và nanH, 139/141 có hsf-2 và 115/141 pfhA và tadD.

Các chủng được kháng kháng sinh với penicillin G (các chủng kháng 43/141;

30,5%) và streptomycin (31/141; 22%)…

1.3.2. Việt Nam

Bệnh Tụ huyết trùng ở Việt Nam được phát hiện vào những năm cuối

thế kỷ 19: Cudamie thông báo về bệnh ở trâu thuộc tỉnh Bà Rịa và Long Thành

năm 1868, sau đó Gemain (1869) phát hiện bệnh ở Gò Công, Yersin phát hiện

bệnh ở các tỉnh miền Trung vào các năm 1889-1895. Năm 1901, Shein bằng

phương pháp phân lập và tiêm truyền qua động vật thí nghiệm đã xác nhận ổ

dịch ở trâu, bò xảy ra ở Tây Ninh là do vi khuẩn Pasteurella multocida (Phan

Đình Đỗ và Trịnh Văn Thịnh, 1958). Theo Đoàn Thị Băng Tâm (1987), tại Việt

Nam bệnh thường xảy ra ở Nam Bộ và đặc biệt ở miền tây Nam Bộ, vào những

năm 1910, 1919, 1920, 1933, 1935 dịch xảy ra rất lớn và mạnh. Bệnh gây thiệt

hại và lây lan nhiều hơn ở những vùng đất trũng, thấp, khí hậu ẩm ướt. Bùi Quý

Huy (1998) cũng cho biết: Trước đây bệnh Tụ huyết trùng xảy ra mạnh ở các

tỉnh phía Nam và xảy ra lẻ tẻ ở các tỉnh phía Bắc. Trong những năm 70 có 80%

số ổ dịch Tụ huyết trùng và 84% số thiệt hại gia súc do bệnh Tụ huyết trùng

thuộc về các tỉnh ở phía Nam. Đến những năm 90 phân bố địa lý của bệnh

nghiêng về các tỉnh phía Bắc, số địa phương có dịch Tụ huyết trùng cũng tăng

18

lên nhiều, hàng năm có 20 - 25 tỉnh thông báo có bệnh lưu hành. Nguyễn Thiên

Thu (1996) đã nhận định bệnh tụ huyết trùng trâu, bò xảy ra thường trùng với

những cơn mưa ở từng vùng và kéo dài đến hết mùa mưa.

Thống kê trong 10 năm từ 1986 - 1995 dịch bệnh Tụ huyết trùng ở bò là

nguyên nhân gây chết hơn 70% số trâu, bò trong tổng số trâu, bò chết bệnh

hàng năm. Trong một số vụ dịch, nhiều hộ nông dân bị chết tới 4 - 5 con trâu,

bò, ảnh hưởng rất lớn đến sản xuất và kinh tế gia đình (Bùi Quý Huy,1988).

Tại Sơn La số trâu, bò chết biến động từ 21 đến 155 con/tháng trong 13 năm

1980 đến 1993 (Dương Thế Long, 1994). Ở Vĩnh Phúc trong 3 năm 1997 -

1999 đã có 212 ổ dịch Tụ huyết trùng trâu, bò với 1.610 con ốm và 557 con

chết (Phan Huy Thụy, 2000). Theo điều tra của Trần Văn Chương (2004), từ

năm 1999 - 2003, tỷ lệ mắc bệnh Tụ huyết trùng là 1,12% (chết 0,47%); tỷ số

chết là 41,93%. Tại một số tỉnh phía Nam, dịch bệnh Tụ huyết trùng trâu, bò

cũng là nguyên nhân gây chết hàng nghìn con trâu, bò mỗi năm như ở Long An,

Minh Hải, Kiên Giang, Bình Phước (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1988).

Nhiều tác giả cũng đã đi sâu nghiên cứu đặc tính sinh vật hoá học của vi

khuẩn P.multocida, phương pháp chẩn đoán, phân lập và chế tạo vắc xin phòng

bệnh. Trần Xuân Hạnh và Tô Thị Phấn (2007) tiến hành nghiên cứu một số đặc

tính của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ trâu, bò, lợn. Phan Thanh

Phượng (1986 - 1990) đã nghiên cứu, chế tạo và sử dụng vắc xin nhũ hoá bằng

công nghệ lên men sục khí để phòng chống bệnh Tụ huyết trùng trâu, bò, lợn

và gia cầm có nhiều ưu việt hơn vắc xin cũ.

Dương Thế Long (1995) đã phân lập được vi khuẩn P. multocida gây

bệnh cho các loài vật nuôi (trâu, bò, lợn và gà) tại tỉnh Sơn La.

Nguyễn Ngã (1996), Nguyễn Thiên Thu (1996) đã phân lập được vi

khuẩn P. Multocida từ trâu, bò mang trùng ở khu vực miền Trung và xác định

tính tương đồng kháng nguyên của các chủng vi khuẩn phân lập được với chủng

vắc xin Iran.

Có nhiều nghiên cứu về bệnh Tụ huyết trùng tại các địa phương khác

nhau như Bùi Văn Dũng (2000) nghiên cứu tình hình bệnh tụ huyết trùng và

19

vi khuẩn P. multocida phân lập từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe ở tỉnh Lai

Châu.

Hoàng Đăng Huyến (2004) nghiên cứu đặc điểm dịch tễ, các yếu tố ảnh

hưởng đến bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở Bắc Giang.

Nguyễn Đăng Minh (2005) nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh Tụ

huyết trùng và xác định tỷ lệ mang trùng Pasteurella ở đàn trâu, bò tỉnh Hà Tây.

Đỗ Ngọc Thúy và cs (2007) đã ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định Type

các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập từ vật nuôi.

Phạm Thị Phương Lan và Đặng Xuân Bình (2012) đã nghiên cứu đặc

tính sinh vật hóa học của vi khuẩn P. multocida gây bệnh Tụ huyết trùng trâu,

bò trên địa bàn hai tỉnh Hà Giang và Cao Bằng. Kết quả cho thấy, các chủng vi

khuẩn P. multocida phân lập được có đặc tính sinh vật hóa học đặc trưng của

loài: dạng cầu trực khuẩn, bắt màu gram âm, không gây dung huyết trên thạch

máu, lên men các đường glucose, mannitol, saccarose, fructose, không lên men

đường lactose, mantose. Sản sinh Indol, không di động và không sinh H2S, độc lực mạnh, gây chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 8-48 giờ.

Hiện tại, Viện Thú y đang thực hiện triển khai đề tài nghiên cứu sản xuất

vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Tụ huyết trùng cho lợn, đây là hướng nghiên cứu

của các nhà khoa học Việt Nam phù hợp với trình độ khoa học của các nước

trong khu vực về lĩnh vực vắc xin phòng bệnh cho gia súc, gia cầm. Triển vọng

tương lai ra đời các loại vắc xin phòng bệnh Tụ huyết trùng có hiệu quả bảo hộ

cao phục vụ thiết thực cho sự phát triển ngành chăn nuôi bò nói riêng và các

vật nuôi khác ở nước ta.

20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Đàn bò nuôi tại các hộ gia đình, gia trại và trang trại ở ba xã miền núi Tiến

2.1. Đối Tượng nghiên cứu Xuân, Yên Bình, Yên Trung - Huyện Thạch Thất (Hà Nội). - Vi khuẩn Tụ huyết trùng (Pasteurella multocida).

2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu - Địa điểm nghiên cứu: + Xã Tiến Xuân,Yên Bình, Yên Trung - Huyện Thạch Thất (Hà Nội). + Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y, Khoa Thú y,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

- Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 8 năm 2018 đến tháng 8 năm 2019.

2.3. Nội dung nghiên cứu

- Xác định tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chết bệnh Tụ huyết trùng bò năm 2018-2019

theo mùa vụ, lứa tuổi tại huyện Thạch Thất - Hà Nội.

- Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Pasteurella multocida ở bò khỏe và bò

nghi mắc bệnh Tụ huyết trùng.

- Xác định các đặc tính sinh vật hóa học, độc lực của vi khuẩn Pasteurella

multocida phân lập được.

- Lựa chọn được kháng sinh điều trị bệnh Tụ huyết trùng hiệu quả tại

địa phương. 2.4.Nguyên vật liệu 2.4.1. Máy móc

- Tủ lạnh âm 200C (Frigor) và âm 700C (Sanyo). - Máy ly tâm (Mini spin). - Máy votex (Ika). - Máy chạy điện di (Scie-Plas). - Máy chụp ảnh gel (Benchtop 3UV). - Cân điện tử (AGN 200, Poland). - Lò vi sóng (Panasonic). - Máy PCR (Bio - rad). - Box an toàn sinh học cấp II. - Tủ ấm.

21

2.4.2. Dụng cụ - Micropipet các loại từ 0,5µl đến 1000 µl (eppendorf). - Đầu tip các loại từ 0,5µl đến 1000 µl (eppendorf). - Ống PCR DNase/RNase free. - Ống eppendorf 1,5 ml DNase/RNase free. - Găng tay. - Dụng cụ đổ gel.

2.4.3. Môi trường - Hóa chất - Nguyên liệu

- Bộ Kit tách chiết DNA: QIAamp DNA-69506. - KitGoTaqGreen PCR. - Primer cho phản ứng PCR. - Nước khử ion -DEPC-treated. - Thạch agarose (Bioron). - Thuốc nhuộm Redgel. - Đệm TBE (Sigma). - DNA marker. - Loading dye.

2.5. Phương pháp nghiên cứu 2.5.1.Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học

Số liệu được thu thập theo phương pháp dịch tễ học hồi cứu. Số liệu được

cung cấp bởi Trạm Chăn nuôi và thú y Thạch Thất, và điều tra trực tiếp từ hộ

chăn nuôi. Mẫu điều tra và mẫu xét nghiệm được lựa chọn ngẫu nhiên

Một số công thức tính toán được sử dụng trong báo cáo gồm:

* Tỷ lệ mắc bệnh và chết trong năm nghiên cứu:

x 100

Số động vật mắc bệnh trong một thời kỳ - Tỷ lệ mắc bệnh chung = TLMBC (%) Tổng đàn loài động vật trong thời kỳ đó

- Tỷ lệ mắc bệnh ở đàn đe dọa:

Số con mắc bệnh trong một thời kỳ x 100 TLMB (%)= Tổng đàn bị đe dọa trong thời kỳ đó

- Tỷ lệ tử vong/tổng đàn (TLTV)

Số động vật chết vì bệnh trong một thời kỳ x 100 TLTV (%)= Số động vật mắc bệnh trong thời kỳ đó

22

2.5.2. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng

Bò được xác định mắc bệnh Tụ huyết trùng dựa vào đặc điểm đặc trưng

về triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể như sau:

Bò sốt cao đột ngột 40-420C, niêm mạc mắt mũi đỏ sẫm. Chảy nước mắt, nước mũi. Hạch hầu sưng, đi lại khó khăn do hạch lympho trước vai và trước

đùi sưng. Bò thở mạnh và khó khăn.

Trường hợp bò bị chết, mổ khám thấy thịt màu tím hồng, thấm nước.

Hạch lympho sau hầu, vai và trước đùi sưng to và thủy thũng. Tim sưng to,

xoang bao tim, màng phổi, xoang ngực và xoang bụng đều có tương dịch (nước

vàng). Phổi bị viêm cata hoặc viêm tơ huyết, viêm màng phổi, viêm ngoại tâm mạc.

2.5.3. Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn Pasteurella multocida

* Phương pháp nuôi cấy phân lập

Mỗi mẫu được ria cấy trực tiếp lên các môi trường thông thường và đặc biệt như nước thịt, thạch máu, thạch MacConkey, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ. Sau khi vi khuẩn mọc, căn cứ vào tính chất mọc trên các môi trường để

chọn khuẩn lạc điển hình đem nuôi cấy lại trên các môi trường chọn lọc để

thuần khiết rồi tiến hành các phương pháp thử sinh hóa để giám định vi khuẩn.

Khuẩn lạc của P. multocida được xác định theo tiêu chuẩn của Hedleston và

cs (1966).

Phân lập Pasteurella multocida theo TCVN

* Phương pháp lấy mẫu:

- Dịch ngoáy mũi: Lấy dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe.

- Bệnh phẩm: Lấy mẫu máu tim, gan, tủy xương bò nghi mắc bệnh tụ

huyết trùng, được bảo quản lạnh đem về phòng thí nghiệm.

Từ bò khỏe: Mẫu dịch ngoáy mũi: Dùng tăm bông đã được vô trùng

ngoáy sâu vào mũi họng của bò khỏe để lấy dịch tiết của mũi, họng. Sau đó cho

vào một ống nghiệm vô trùng, đậy nút, ghi nhãn đánh số thứ tự, mẫu được bảo

quản trong phích đá lạnh.

Từ bò chết trong ổ dịch: Lấy xương ống chân, máu tim, phủ tạng bò mới

chết trong các ổ dịch nghi bệnh Tụ huyết trùng với triệu chứng điển hình ở thể

cấp tính.

23

* Phương pháp xác định tính chất sinh vật, hóa học của Pasteurella multocida

* Kiểm tra hình thái vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram

Lấy một phiến kính sạch, nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên phiến kính,

dùng que cấy lấy một khuẩn lạc điển hình, trộn đều vi khuẩn với giọt nước sinh

lý. Sau đó cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn. Tiến hành nhuộm Gram và kiểm

tra hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi có độ phòng đại 1000 lần.

* Xác định tính chất sinh vật, hóa học của P. multocida bằng cách thử

các phản ứng sinh hóa như: phản ứng Oxydaza, phản ứng Catalaza, phản ứng

phân hủy Urea, phản ứng sinh Indol, khả năng lên men đường, khả năng sinh

H2S.

* Giám định P. multocida bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain

Reaction).

Dịch ngoáy mũi, mẫu bệnh phẩm

Thạch máu ( Bloodagar), 370C/24h

24

Sơ đồ 2.1: Phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida

(Quin P.J. et al (1994) [74])

25

2.5.4. Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida

phân lập được

* Kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên chuột nhắt trắng

Sau khi nuôi cấy và tiến hành thuần khiết vi khuẩn phân lập được qua

các môi trường nuôi chọn lọc, cấy chủng vi khuẩn thử lên môi trường BHI, bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ tạo điều kiện cho vi khuẩn sản sinh độc

tố rồi tiến hành thử độc lực trên chuột thí nghiệm.

Sử dụng chuột nhắt trắng (18 - 22g/con) khỏe, mỗi chủng dùng tiêm 2 chuột, liều tiêm xoang bụng 0,2ml/chuột. Theo dõi chuột chết trong 72 giờ và đến hết 7 ngày.

Chuột chết mổ khám kiểm tra bệnh tích, thu thập bệnh phẩm, nuôi cấy

phân lập lại vi khuẩn.

2.5.5 . Phương pháp thử kháng sinh đồ

Phương pháp kháng sinh đồ dựa trên sự khuếch tán của kháng sinh trên thạch đĩa của Kirby-Bauer, dựa trên đường kính vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn của Hội đồng Quốc gia Hoa Kỳ (1999) để đánh giá mức độ nhạy cảm với kháng sinh.

Chuẩn bị canh trùng: Các chủng P. multocida được cấy vào môi trường BHI, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ. Dùng pipet Pasteur lấy 0,1- 0,2 ml canh trùng, nhỏ 3-5 giọt vào đĩa thạch, láng đều, để 3-5 phút cho khô mặt thạch. Dùng panh đặt và ấn nhẹ các giấy đã tẩm các loại kháng sinh lên mặt thạch đặt cách nhau 20mm. Sau 15 phút thì lật úp đĩa thạch vào tủ ấm 370C. Đọc kết quả và đánh giá khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn. Trong nghiên cứu này chúng tôi dùng giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh) sản xuất, Code 1332 E. Kết quả đánh giá theo bảng hướng dẫn của nhà sản xuất. Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng phân lập được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán trên thạch đĩa và đánh giá theo tiêu chuẩn của Hội đồng Quốc gia Hoa Kỳ (1999).

* Phương pháp tiến hành như sau: + Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Muller Hinton. + Bước 2: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường thạch máu ở 370C. Lấy 1 khuẩn lạc hòa vào 1,5ml nước sinh lý để đạt được độ đục

26

0,5 trong dãy so màu Mc Farland. Dùng tăm bông vô trùng, tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều trên thạch đĩa Muller Hinton.

+ Bước 3: Đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh) sản xuất lên mặt đĩa thạch. Khoảng cách đều 2cm, mỗi đĩa đặt từ 6-8 khoanh. + Bước 4: Bồi dưỡng đĩa thạch ở 370C trong 18 - 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra.

Kết quả được đọc bằng cách: dùng thước mm để đo đường kính của vòng vô khuẩn, đo phía sau mặt đĩa thạch. Nếu cạnh của vòng vô khuẩn không rõ nét thì phải đo chỗ hẹp nhất và rộng nhất rồi lấy giá trị trung bình (đường kính của vòng vô khuẩn được tính bằng mm). Nếu khuẩn lạc mọc trong vòng vô khuẩn vi khuẩn rõ ràng thì phải nuôi cấy, phân lập và thử lại. Kết quả kháng sinh đồ được ứng dụng điều trị với vi khuẩn còn mẫn cảm với thuốc kháng sinh, khi vi khuẩn đã kháng thuốc tức vòng vô khuẩn dưới mức diệt khuẩn thì không được dùng. Không dùng thuốc kháng sinh đã bị vi khuẩn kháng lại để điều trị bệnh. Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm của từng kháng sinh (theo Hội

đồng Quốc gia Hoa Kỳ, 1999):

+ Rất mẫn cảm: ϕ> 20mm + Mẫn cảm trung bình: ϕ 13-20mm + Kháng thuốc: ϕ< 13mm Trên cở sở kết quả thử tính mẫn cảm trung kháng sinh của chủng vi khuẩn phân lập được để tiến hành lựa chọn sản phẩm thuốc điều trị bệnh thương mại với từng thành phần kháng sinh có mức độ mẫn cảm ϕ>20mm. 2.5.6. Phương pháp PCR (theo Nagai et al., 1994)

Bước 2: Cho 200 µl đệm Buffer AL và trộn đều bằng vortex trong 15

- Cách tiến hành tách chiết DNA. * Tách chiết DNA bằng Kit QIAgen Bước 1: Dùng pipet hút 20µl Proteinase K vào ống eppendorf 1,5ml, thêm 100 µl mẫu và cho thêm PBS cho đủ 220 µl. Để bất hoạt RNA trong phản ứng thì bổ sung thêm 4µl RNase A (100mg/ml), ủ ở nhiệt độ phòng trong 2phút. giây. Ủ ở 560C trong 10 phút. Bước 3: Thêm 200µl ethanol (100%), trộn bằng máy vortex trong 15 giây.

27

Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa DNA tổng số. Cuối cùng ký

- Cách tiến hành chạy PCR. (theo Nagai et al, 1994). Mẫu DNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được

Bước 4: Chuyển phần dịch pha trộn từ bước 3 trên vào cột DNeasy Mini spin, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới. Bước 5: Đặt cột vào ống 2ml sạch mới. Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500µl Buffer AW1 không để rơi lên thành, miệng, đóng nắp và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới. Bước 6: Đặt cột vào ống 2ml sạch mới. Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500µl Buffer AW2 và ly tâm 14.000 vòng/phút trong 3 phút và loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới. Bước 7: Đặt cột DNeasy Mini spin sang ống 1,5 ml mới và loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới. Thêm 200 µl đệm AE trực tiếp lên màng DNeasy. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới. hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -200C hoặc -700C. trình bày ở bảng 2.1:

Bảng 2.1. Đặc tính sinh hóa chung của Pasteurella multocida (Theo Smith JE, 1959)

Đặc tính sinh hóa Kết quả

Dung huyết -

Glucose +

Lactose -

H2S Catalaza +

Oxidase +

Indol +

Ureaza -

Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ

nhiệt ở bảng 2.2:

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR phát hiện Pasterella multocida

28

Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Chu kỳ Thời gian

95 2 phút 1 1 Duỗi mạch

94 30 giây Duỗi mạch

50 30 giây 30 2 Gắn mồi

72 60 giây Tổng hợp sợi mới

72 10 phút 1 3 Hoàn chỉnh

4 ∞ 4 Giữ sản phẩm

Cặp mồi đặc hiệu được sử dụng như sau:

Tên mồi Trình tự (NU)(Nagai et al., 1994) Kích thước sản phẩm

Mồi xuôi ATC CGC TAT TTA CCC AGT GG 457bp Mồi ngược GCT GTA AAC GAA CTC GCC AC

- Cách tiến hành điện di trên gel agarose đọc kết quả Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1x hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 1000C trong 5 phút, để nguội 45-500C bổ sung 10µl Red gel (nồng độ 10µg/10µl). Sau đó đổ vào khuôn có các lược được cài sẵn để tạo bản gel. Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào bể điện di và đổ đung dịch đệm TBE ngập bản gel.

Bước 2: Tra mẫu điện di Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA thường sử dụng từ 4-6 µl DNA marker.

Bước 3: Chạy điện di Nguồn điện trong điện di sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA,

thời gian chạy điện di trong 30 phút.

Bước 4: Đọc kết quả Sau khi điện di, vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng máy phát tia

UV. Sau đó chụp ảnh và lưu kết quả.

- Mẫu dương tính với vi rút khi giếng chứa mẫu điện di xuất hiện vạch

DNA tương ứng với độ dài đoạn gen nhân lên 457bp.

29

- Mẫu âm tính khi không xuất hiện vạch DNA tương ứng với độ dài đoạn

gen khuếch đại.

2.5.7. Thử nghiệm phác đồ điều trị

Từ kết quả kháng sinh đồ với các chủng P. multocida phân lập được, lựa chọn được loại kháng sinh có độ mẫn cảm cao để điều trị thử nghiệm cho những bò có chẩn đoán dương tính với vi khuẩn Tụ huyết trùng bằng phương pháp PCR.

Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thu được từ kết quả nghiên cứu sẽ được xử lý theo phương pháp

thống kê sinh học trên phần mềm Minitab.

30

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tình hình chăn nuôi trâu, bò tại huyện Thạch Thất, thành phố Hà

Nội

Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thống kê số lượng trâu, bò

được nuôi tại huyện Thạch Thất trong 3 năm 2017 và 2018 và nửa đầu năm

2019. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1. Kết quả điều tra tổng đàn trâu, bò phân bố trên địa bàn

huyện Thạch Thất, thành phố Hà Nội

ĐVT: con

Tên Xã

Cẩm Yên Lại Thượng

Canh Nậu

Thạch Xá Chàng Sơn

Năm 2017 123 487 93 264 52 77 23 47 12 101 0 231 20 111 41 462 148 156 33 38 856 942 2806 7123

Năm 2018 151 468 108 276 68 99 20 120 43 121 0 273 34 143 47 480 159 150 86 25 977 1089 3352 8289

6 tháng đầu năm 2019 178 608 116 297 88 107 20 146 49 143 0 293 35 164 59 496 159 184 123 32 1163 1257 3496 9213

STT 1 2 3 Đại Đồng 4 Phú Kim 5 Hương Ngải 6 7 Dị Nậu 8 9 10 Bình Phú 11 Hữu Bằng 12 Cần Kiệm 13 Phùng Xá 14 Kim Quan 15 Liên Quan 16 Bình Yên 17 Tân Xã 18 Hạ Bằng 19 Đồng Trúc 20 Thạch Hòa 21 Tiến Xuân 22 Yên Bình 23 Yên Trung

Tổng số

31

Qua bảng 3.1 kết quả điều tra thống kê số lượng trâu, bò nuôi trên địa

bàn huyện Thạch Thất có thể thấy tỷ lệ tăng trưởng cao rõ rệt, sáu tháng đầu

năm 2019 theo kết quả thống kê cho thấy tỷ lệ tăng 10,3% so với năm 2016.

Trên toàn huyện có 22 xã và 1 thị trấn đều có nghề nuôi trâu, bò tuy nhiên phân

bố không đồng đều, trong đó nuôi nhiều ở các xã thuộc vùng đồi gò, bán sơn

địa và xã miền núi như: Tiến Xuân, Yên Bình, Yên Trung, Bình Yên, Lại

Thượng.... Đặc biệt tại ba xã tiến hành theo dõi trong nghiên cứu có sự gia tăng

số lượng trâu, bò tăng đáng kể từ năm 2017 đến nửa đầu năm 2019, cụ thể xã

Tiến Xuân (từ số lượng trâu, bò 856 con trong năm 2017 tăng lên 1.163 con

nửa đầu năm 2019), xã Yên Bình (từ số lượng trâu, bò 942 con trong năm 2017

tăng lên 1.257con nửa đầu năm 2019), xã Yên Trung (từ số lượng trâu, bò 2.806

con trong năm 2017 tăng lên 3.496 con nửa đầu năm 2019).

Việc gia tăng về số lượng trâu, bò cho thấy giá trị kinh tế trâu, bò mang

lại cũng như nhu cầu sản phẩm thịt trâu, bò đang tăng mạnh bên cạnh đó các

chính sách chủ trương của Nhà nước, của Đảng bộ huyện Thạch Thất góp phần

không nhỏ.

Loại hình chăn nuôi phổ biến ở huyện hiện này là chăn thả hoàn toàn

hoặc bán chăn thả phù hợp với địa hình tự nhiên của địa phương.

3.2. Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch

Thất năm 2018-2019

3.2.1. Tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất năm 2018

và 2019

Nhằm đánh giá tình hình mắc bệnh Tụ huyết trùng tại các địa phương

nghiên cứu qua 2 năm 2018 và 2019 trên đàn bò và thiệt hại kinh tế do bệnh tụ

huyết trùng gây ra cho người chăn nuôi, chúng tôi tiến hành nghiên cứu và thu

thập số liệu bò mắc và chết do bệnh Tụ huyết trùng tại địa phương, kết quả

được thể hiện qua bảng 3.2.

32

Bảng 3.2. Tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất

trong 2 năm 2018 và 2019

Số bò Số bò mắc Số bò chết Địa điểm Tỷ lệ Tỷ lệ STT điều tra bệnh THT do bệnh (Xã) (%) (%) (con) (con) THT (con)

1,04c 0,23a 2 1 Tiến Xuân 867 9

1,44d 0,16b 2 2 Yên Bình 1254 18

2,01d 0,19b 8 3 Yên Trung 4133 83

Ghi chú: Chữ cái a,b,c,d theo cột dọc khác nhau thể hiện sự sai khác về mặt thống kê

(P<0.05)

Tỷ lệ (%)

2.5

2.01

1.44

1.5

Tỷ lệ mắc bệnh (%)

1.04

Tỷ lệ chết (%)

0.5

0.23

0.19

0.16

1,76 0,19 12 Tổng chung 6254 110

Xã Tiến Xuân

Xã Yên Bình

Xã Yên Trung

Hình 3.1. Biểu đồ tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất trong 2 năm 2018 và 2019

Qua bảng 3.2 cho thấy trong thời gian 2 năm 2018 và 2019 tại 3 xã Tiến

Xuân, Yên Trung, Yên Bình bò đều bị mắc bệnh Tụ huyết trùng do vi khuẩn

33

Pasteurella multocida gây ra, tỷ lệ bò mắc bệnh và chết do bệnh Tụ huyết trùng

khác nhau giữa các xã, lần lượt dao động từ 1,04 - 2,01% và 0,16 - 0,23%.

Xã Yên Trung có số bò mắc bệnh Tụ huyết trùng trong 2 năm 2018 và

2019 là: tổng số bò điều tra là 4.133 con, trong đó có 83 con mắc bệnh, chiếm

tỷ lệ 2,01% và số bò chết do bệnh tụ huyết trùng là 8 con, chiếm tỷ lệ 0,19%.

Xã Yên Bình có số bò mắc bệnh tụ huyết trùng là: Số bò điều tra là 1.254

con, trong đó có 18 con mắc bệnh, chiếm tỷ lệ 1,44% và số bò chết do bệnh Tụ

huyết trùng là 2 con, chiếm tỷ lệ 0,16%.

Xã Tiến Xuân có số bò mắc bệnh Tụ huyết trùng là: Số bò điều tra là 867

con, trong đó có 9 con mắc bệnh, chiếm tỷ lệ 1,04% và số bò chết do bệnh Tụ

huyết trùng là 2 con, chiếm tỷ lệ 0,23%. Sự khác nhau về tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết

do bệnh Tụ huyết trùng của xã Tiến Xuân có ý nghĩa về mặt thống kê so với

hai xã Yên Bình và Yên Trung.

Sở dĩ có tỷ lệ bò chết do bệnh Tụ huyết trùng ở xã Yên Trung và xã Tiến

Xuân cao là do ở hai địa phương này dân số chủ yếu là người dân tộc thiểu số,

trình độ dân trí không đồng đều, việc áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật của

người dân còn nhiều hạn chế, phương thức chăn nuôi còn nhỏ lẻ, không tập

trung, thức ăn không được đáp ứng đầy đủ, điều kiện chuồng trại còn chưa đảm

bảo vệ sinh. Tỷ lệ tiêm phòng đạt thấp (năm 2019), thông tin về dịch bệnh còn

chưa kịp thời nên hiệu quả điều trị không cao.

Sự chênh lệch về tỷ lệ mắc bệnh giữa các xã còn do việc thiếu hiểu biết

về vấn đề phòng bệnh cũng như điều trị bệnh. Mặt khác, đặc thù dịch tễ và điều

kiện thời tiết của vùng miền cũng là yếu tố ảnh hưởng đến dịch bệnh cũng như

tốc độ lan truyền và khả năng khỏi bệnh. Bằng chứng là các nghiên cứu trước

đây về vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ dịch ngoáy mũi trâu, bò

khỏe ở tỉnh Lai Châu, Bắc Giang, Hà Tây... đều cho thấy sự khác nhau về tỷ lệ

nhiễm bệnh do Pasteurella multocida (Bùi văn Dũng, 2000; Hoàng Đăng

Huyến, 2004; Nguyễn Đăng Minh, 2005).

34

3.2.2. Tỷ lệ bò mắc bệnh Tụ huyết trùng theo tháng trong năm 2018 và 2019

Để đánh giá sự ảnh hưởng của yếu tố mùa vụ lên tỷ lệ nhiễm bệnh Tụ huyết

trùng trên bò nuôi. Chúng tôi tổng hợp số liệu bò nhiễm bệnh của 12 tháng (từ

tháng 1 đến tháng 12) từ số liệu cung cấp của cán bộ thú y 3 địa phương (xã Tiến

Xuân, xã Yên Trung, xã Yên Bình) trong thời gian 2 năm 2018 và 2019. Kết quả

được thể hiện ở bảng 3.3 và biểu đồ 3.2.

Bảng 3.3. Tỷ lệ mắc bệnh Tụ huyết trùng ở bò theo các tháng trong năm

tại huyện Thạch Thất trong 2 năm 2018 và 2019

Tháng

Số bò mắc bệnh (con)

Tỷ lệ (%)

1 0,91d

1

10 9,09c

2

17 15,45b

3

22 20,00a

4

13 11,82b

5

15 13,64b

6

14 12,73b

7

4 3,64d

8

3 2,73d

9

3 2,73d

10

4 3,64d

11

4 3,64d

12

100 Tổng số

110

Ghi chú: Chữ cái a,b,c,d theo cột dọc khác nhau thể hiện sự sai khác về mặt thống kê

(P<0.05)

35 Tỷ lệ (%)

15.45

13.64 12.73

11.82

9.09

3.64

2.73 2.73

0.91

Tháng trong năm

Hình 3.2. Biểu đồ tỷ lệ mắc bệnh Tụ huyết trùng ở bò theo các tháng trong năm tại huyện Thạch Thất trong 2 năm 2018 và 2019

Qua bảng 3.3 chúng tôi nhận thấy bệnh Tụ huyết trùng ở bò có thể xảy

ra ở tất cả các tháng trong năm.Tuy nhiên, tỷ lệ ca bệnh nhiễm bệnh Tụ huyết

trùng ở bò tập trung vào tháng 3 đến tháng 7, dao động số ca bệnh từ 13 đến

22 ca chiếm tỷ lệ 11,82 - 20,00%. Số ca mắc bệnh cao nhất vào tháng 4

(22/110 ca bệnh, chiếm tỷ lệ 20,00%), sau đó đến số ca mắc bệnh vào tháng

3 và tháng 6, tháng 7 (tỷ lệ 11,82-15,45%); sự khác nhau tỷ lệ giữa các tháng

này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Tỷ lệ mắc bệnhTụ huyết trùng ở bò

thấp nhất vào tháng 1 với 0,91% và 5 tháng từ tháng 8 đến tháng 12 trong năm

dao động từ 2,73 đến 3,96%.

Có thể nhận thấy tỷ lệ mắc bệnh Tụ huyết trùng bò tập trung nhiều vào

các tháng cuối xuân và các tháng hè, theo chúng tôi đây là tháng giao mùa trong

năm, lượng mưa tăng nhanh, thời tiết thay đổi nhiều làm ảnh hưởng đến nền khí

hậu chuồng nuôi tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển, gây bệnh và lây

lan nhanh. Ở tháng 8 số lượng bò mắc bệnh đã giảm xuống do nền nhiệt đã ổn

định trở lại tuy nhiên vẫn còn cao (3,64%). Như vậy những tháng giao mùa trong

năm thời tiết thay đổi đột ngột, nóng ẩm, mưa nhiều làm nền chuồng ẩm ướt tạo

36

stress cho con vật nên bệnh có điều kiện phát triển mạnh, do vậy người nuôi bò

cần chủ động có các biện pháp phòng bệnh như tăng cường dinh dưỡng cho bò,

kết hợp tăng cường trợ sức trợ lực thường xuyên cho bò nhằm nâng cao hệ miễn

dịch của bò.

Ngoài ra, đây cũng là căn cứ để trạm thú y các huyện thị xây dựng kế

hoạch phòng bệnh Tụ huyết trùng cho bò hàng năm. Để phòng bệnh Tụ huyết

trùng bò ngoài các biện pháp như vệ sinh, chăm sóc nuôi dưỡng,… cần tổ chức

tiêm phòng vắc xin phòng bệnh Tụ huyết trùng cho bò trước mùa phát dịch, tức

là vào tháng 3 và 8 hàng năm tại địa phương.

Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới, bệnh Tụ huyết trùng trâu, bò phụ

thuộc rất lớn vào thời tiết, khí hậu và đặc biệt dễ xảy ra trên động vật ở điều

kiện khí hậu ẩm ướt bởi ở điều kiện này vi sinh vật phát triển mạnh Mustafa và

cs (1978). Mùa phát bệnh Tụ huyết trùng ở các nước Châu Á tập trung vào các

các tháng và mùa khác nhau trong năm. Carter và De Alwis (1989) cho biết

bệnh Tụ huyết trùng xảy ra quanh năm song tập trung vào các tháng mưa, ẩm.

Ở Lào bệnh phát ra từ tháng 4 đến tháng 8, ở Pakistan bệnh xảy ra rải rác quanh

năm song thường ở tháng 4 đến tháng 6 hàng năm (FAO, 1991). Thực tế qua

nghiên cứu này, chúng tôi khẳng định dịch tễ bệnh Tụ huyết trùng phụ thuộc

rất lớn vào khí hậu và thổ nhưỡng địa phương, nên cần xây dựng biện pháp

phòng bệnh tùy theo yếu tố đó.

Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu về mùa mắc bệnh Tụ huyết trùng trâu,

bò, như Dương Thế Long (1995), Nguyễn Xuân Bình (1996), Nguyễn Thiên

Thu (1996), Võ Văn Hùng (1997) đều cho rằng vào thời gian mưa, bệnh xảy ra

nhiều. Bùi Quý Huy (1998) cho biết, ở miền Bắc bệnh xảy ra quanh năm nhưng

tập trung vào các tháng mưa nhiều từ tháng 7 đến tháng 9.

Theo Bùi Văn Dũng (2000), ở Lai Châu bệnh tụ huyết trùng xảy ra quanh

năm nhưng tập trung vào các tháng 3, 4, 7, 8 hàng năm, vào cuối mùa khô, đầu

mùa mưa. Cao Văn Hồng (2001), cho biết, mùa dịch tụ huyết trùng ở Đăk Lăk

từ tháng 5 đến tháng 9, đây là những tháng mưa nhiều. Theo Hoàng Đăng

37

Huyến (2004) bệnh tụ huyết trùng xảy ra ở Bắc Giang từ tháng 4 đến tháng 9

hàng năm, thời gian này cũng đang là mùa mưa. Cũng theo Nguyễn Văn Minh

(2005) bệnh tụ huyết trùng xảy ra rải rác quanh năm nhưng tập trung từ tháng

3 đến tháng 8, vào đầu mùa mưa đến cuối mùa mưa của vụ hè thu, cao nhất là

tháng 5, 6 đây là những tháng nắng, nhiệt độ cao và mưa nhiều. Kết quả nghiên

cứu của chúng tôi phù hợp với các nghiên cứu trên.

3.2.3. Tỷ lệ bò mắc bệnh do bệnh Tụ huyết trùng theo lứa tuổi

Tổng hợp số liệu bò bị bệnh Tụ huyết trùng theo lứa tuổi tại huyện Thạch

Thất năm 2018 và 2019, kết quả trình bày ở bảng 3.4 và biểu đồ 3.3.

Bảng 3.4. Tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò nuôi tại huyện Thạch Thất

năm 2018 và 2019 theo lứa tuổi

Lứa tuổi bò Số bò

mắc Dưới 1 năm 1- 3 năm 4-5 năm Trên 5 năm Năm bệnh Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ

(con) mắc (%) mắc (%) mắc (%) mắc (%)

10,42 31 64,58 8 16,67 4 8,33 2018 48 5

3,23 36 58,06 18 29,03 6 9,68 2019 62 2

Ghi chú: Chữ cái a,b,c,d theo hàng ngang khác nhau thể hiện sự sai khác về mặt thống kê

(P<0.05)

Tổng 110 6,36d 67 60,91a 26 23,64b 10 9,09c 7 chung

38

60.91

Tỷ lệ (%)

Dưới 1 năm

1 - 3 năm

4 - 5 năm

23.64

Trên 5 năm

9.09

6.36

Lứa tuổi bò

Hình 3.3. Biểu đồ tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò nuôi

tại huyện Thạch Thất năm 2018 và 2019 theo lứa tuổi

Từ bảng 3.4 và biểu đồ 3.3. chúng tôi thấy:

Với bò từ 1-3 năm tuổi, số bò mắc bệnh Tụ huyết trùng chiếm tỷ lệ cao

nhất dao động từ 58,06% đến 64,58%; trung bình là 60,91%.

Với bò từ 4 - 5 năm tuổi, số bò mắc bệnh Tụ huyết trùng chiếm tỷ lệ dao

động từ 16,67% đến 29,03%; trung bình là 23,64%.

Với bò dưới 1 năm tuổi và bò trên 5 năm tuổi, tỷ lệ bò mắc bệnh Tụ huyết

trùng thấp nhất chiếm tỷ lệ dao động từ 3,23% đến10,42%, trung bình là 6,36 -

9,09%. Sử dụng phương pháp thông kê sinh học, chúng tôi thấy rằng sự sai

khác tỷ lệ nhiễm bệnh Tụ huyết trùng giữa các lứa tuổi có ý nghĩa về mặt thông

kê, điều đó cho thấy nguy cơ mắc bệnh Tụ huyết trùng giữa các lứa tuổi bò là

khác nhau. Theo chúng tôi, bê con bú sữa mẹ nên có các loại kháng thể giúp

bảo vệ bê con chống chịu tốt hơn với các mầm bệnh, bên cạnh đó do bê con

được chăm sóc cẩn thận nên nguy cơ nhiễm bệnh thấp hơn. Với những con

39

trưởng thành phải làm việc, điều kiện chăm sóc không đảm bảo, gây stress nên

khả năng mắc bệnh là rất cao.

Như vậy, bò từ 1-3 năm tuổi dễ mắc bệnh Tụ huyết trùng nhất. Theo

Nguyễn Bá Hiên và cs (2013) thì trâu, bò khoảng 2 năm tuổi là mẫn cảm nhất

và trâu mẫn cảm với vi khuẩn Tụ huyết trùng hơn bò. Kết quả của chúng tôi

cũng phù hợp với số liệu cho thấy trâu, bò giai đoạn 1-3 năm tuổi có tỷ lệ mắc

Tụ huyết trùng cao nhất.

Nhiều nghiên cứu đã xác định độ tuổi mẫn cảm của bò với vi khuẩn

Pasteurella mutocida, cụ thể theo De Alwis (1984) mức độ cảm nhiễm của

động vật non mạnh hơn động vật già, ở trâu và bò tỷ lệ mắc bệnh ở lứa tuổi

dưới 6 tháng là 3,5%, trong khi đó trâu, bò ở lứa tuổi từ 6 tháng đến 2 năm là

30-32%. Trâu, bò trên 2 năm tuổi chỉ mắc bệnh 3-5% ở bò và 8-9% ở trâu.

Dương Thế Long (1995) nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở Sơn La cho

biết tuổi cảm nhiễm với bệnh nhất là dưới 36 tháng tuổi. Cao Văn Hồng (2002)

tại Đắk Lắk cũng cho thấy lứa tuổi cảm nhiễm với bệnh nhất là dưới 36 tháng

tuổi. Tại Bắc Giang trâu, bò nhỏ hơn 2 năm tuổi mẫn cảm với bệnh nhất (Hoàng

Đăng Huyến, 2004). Số liệu chúng tôi thu được phù hợp với các nghiên cứu

này.

3.2.4. Triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng ở bò mắc bệnh Tụ huyết

trùng bò

Tổng hợp triệu chứng lâm sàng của 110 bò mắc bệnh Tụ huyết trùng ở

huyện Thạch Thất, kết quả thể hiện ở bảng 3.5.

- Triệu chứng đầu tiên là sốt cao 41- 420C (88,18%) là phản ứng phòng vệ

khi có sự xâm nhập của kháng nguyên lạ.

40

Bảng 3.5. Triệu chứng lâm sàng, chủ yếu của bệnh Tụ huyết trùng

ở bò nuôi tại huyện Thạch Thất

Số bò có biểu hiện Tỷ lệ STT Triệu chứng lâm sàng chủ yếu (con) (%)

1 Sốt cao 97 88,18

2 Hạch hầu sưng to 83 75,45

3 Ủ rũ, mệt mỏi 98 89,09

4 Bụng chướng to 23 20,91

Qua bảng 3.5 cho thấy triệu chứng lâm sàng phổ biến nhất là bỏ ăn lờ đờ, mệt mỏi (89,09%), bụng chướng to (20,91%), sốt cao 41-420C (chiếm tỷ lệ

88,18%), đây là phản ứng phòng vệ khi có sự xâm nhập của kháng nguyên lạ.

Ngoài ra, bò có biểu hiện khó thở, hầu sưng to (75,45%) cuống lưỡi sưng đẩy

lưỡi thè ra ngoài, không nhai lại, khó nuốt, nước dãi chảy ra ngoài, khi tiến

hành kiểm tra kỹ thấy một số có hiện tượng chảy nước mắt, nước mũi, trạng

thái không bình thường, biểu hiện bất thường và chết trong vài giờ. Nhiều con

chết đột ngột chưa kịp phát hiện thường thấy ở dạng quá cấp tính với những

con bò còn non, béo khỏe dưới 3 năm tuổi và xảy ra vào giai đoạn chuyển mùa

tháng 4,5 trong năm.

Khi tiến hành quan sát, các triệu chứng được quan sát thấy là: Ủ rũ, mệt

mỏi, có hiện tượng sốt, khi tiến hành kiểm tra kĩ thấy một số có hiện tượng chảy

nước mắt, nước mũi. Con vật chết sau 12-24 giờ. Khi chết bụng thường chướng

to, lòi dom.

Biểu hiện triệu chứng, bệnh tích bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch

Thất cho thấy bệnh thuộc thể nhiễm trùng máu, xuất huyết. Bệnh thường diễn

biến ở thể quá cấp tính hoặc cấp tính do vi khuẩn Pastereulla mutocida có độc

lực cao gây ra.

41

Một số tác giả cũng có nhận xét tương tự: Phan Đình Đỗ và Trịnh Văn

Thịnh (1958) cho rằng ở Việt Nam bệnh Tụ huyết trùng chủ yếu ở thể nhiễm

trùng máu, xuất huyết được phát hiện từ thế kỷ 19. Tác giả Bain và cs (1982)

thông báo bệnh Tụ huyết trùng đường máu thường thấy ở các nước Châu Á hoặc

châu Phi. Cao Văn Hồng (2001) khi nghiên cứu về thể bệnh, triệu chứng, bệnh

tích của bệnh Tụ huyết trùng trâu, bò tại Đăk Lăk đã kết luận bệnh Tụ huyết

trùng ở Đăk Lăk thuộc thể nhiễm trùng máu, xuất huyết, diễn biến ở thể quá cấp

tính do vi khuẩn Pasteurella mutocida có độc lực cao gây ra. Nhận xét của chúng

tôi phù hợp với các kết quả nghiên cứu của các tác giả trên.

3.2.5. Tình hình tiêm phòng vắc xin Tụ huyết trùng cho bò của huyện Thạch

Thất

Chúng tôi tổng hợp tình hình tiêm phòng vắc xin Tụ huyết trùng cho bò

của huyện Thạch Thất trong thời gian 2 năm 2018 và 2019, số liệu trình bày ở

bảng 3.6.

Bảng 3.6. Tổng hợp kết quả tiêm phòng vắc xin Tụ huyết trùngcho bò

của huyện Thạch Thất năm 2018 và 2019

Tổng số Tổng số bò được

tiêm bò STT Năm Tỷ lệ (%)

(con) vắc xin (con)

3.061 2018 1 2.762 90,04

2 Tháng 8/2019 3.193 607 19,01

(Ghi chú: nguồn dữ liệu của cán bộ thú y địa phương cung cấp )

Qua bảng 3.6 cho thấy tỷ lệ tiêm phòng vắc xin Tụ huyết trùng cho bò

năm 2018 đạt 90,04%; tỷ lệ tiêm phòng đến thời điểm tháng 8 năm 2019 đạt rất

thấp (19,01%) so với cùng kỳ năm 2018. Nguyên nhân sự giảm sút tỷ lệ tiêm

phòng vắc xin phòng bệnh Tụ huyết trùng bò tại địa phương đến thời điểm

42

tháng 8/2019 so với tháng 2018, là do năm 2019 không có sự hỗ trợ kinh phí

mua vắc xin của Trạm chăn nuôi và Thú y huyện Thạch Thất cho các hộ chăn

nuôi bò.

Trong quá trình điều tra chúng tôi thấy rằng:

- Hầu hết những bò mắc bệnh Tụ huyết trùng và chết của năm 2018 đều

do được chuyển từ nơi khác đến và chưa được tiêm phòng bổ sung.

- Một số vùng và một số khu vực trong vùng chăn thả tự do, không chăm

sóc nuôi dưỡng quản lý tốt, tổ chức tiêm phòng còn gặp khó khăn.

- Do đặc điểm địa lý, địa hình khu vực khó khăn cho tổ chức tiêm phòng.

- Trình độ nhận thức về công tác chăn nuôi thú y chưa cao, chưa coi

trọng công tác tiêm phòng, điều kiện kinh tế còn gặp nhiều khó khăn.

- Một số thôn, xóm đội ngũ thú y còn ít, địa bàn rộng.

- Trình độ thú y cơ sở còn hạn chế, tuổi cao và thời gian đào tạo đã lâu.

Đó là những lý do làm cho kết quả tiêm phòng bệnhTụ huyết trùng cho

đàn bò trong huyện đạt tỷ lệ thấp, ảnh hưởng lớn đến tình hình dịch bệnh Tụ

huyết trùng trên đàn bò của huyện. Nếu tỷ lệ tiêm phòng vắc xin bệnh Tụ huyết

trùng không được cải thiện thì dịch bệnh thường xuyên xảy ra là khó tránh khỏi.

3.3. Phân lập và xác định đặc tính sinh vật hóa học của Pasteurella

multocida trong bệnh tụ huyết trùng bò tại huyện Thạch Thất

3.3.1. Kết quả phân lập và xác định đặc tính sinh vật hóa học của Pasteurella

multocida từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe và từ các mẫu bệnh phẩm của trâu,

bò nghi mắc bệnh

Các mẫu bệnh phẩm ở bò khỏe và bò nghi mắc Tụ huyết trùng tại các xã

của huyện Thạch Thất được bảo quản và đưa về Phòng thí nghiệm Trọng điểm

Công nghệ sinh học Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Tiến hành phân lập

vi khuẩn theo phương pháp thường quy. Kết quả được trình bày ở bảng 3.7, 3.8,

biểu đồ 3.5 và biểu đồ 3.6.

43

Bảng 3.7. Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ mẫu dịch ngoáy mũi

bò khỏe tại huyện Thạch Thất

Kết quả phân lập P. Multocida

Địa điểm

STT

Số mẫu kiểm tra

(Xã)

Số mẫu dương tính

Tỷ lệ (%)

4 16,00a

25 Tiến Xuân

1

2 8,00c

25 Yên Bình

2

5 20,00b

25 Yên Trung

3

11 14,67

75 Tổng

Ghi chú: Chữ số khác nhau a,b,c theo cột dọc thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê

(P<0.05)

20.00

Tỷ lệ (%)

20.00

16.00

18.00

16.00

14.00

Xã Tiến Xuân

12.00

Xã Yên Bình

8.00

10.00

Xã Yên Trung

8.00

6.00

4.00

2.00

0.00

Địa điểm

Hình 3.4. Biểu đồ tỷ lệ dương tính với Pasteurella multocida từ mẫu dịch

ngoáy mũi bò khỏe tại huyện Thạch Thất

Qua bảng 3.7 cho thấy đã phát hiện 11 mẫu dương tính với P. multocida

từ 75 mẫu dịch ngoáy mũi của bò khỏe mạnh bằng phương pháp phân lập vi

khuẩn, chiếm tỷ lệ 14,67%. Như vậy, vi khuẩn P. Multocida có tồn tại trong

đường hô hấp của bò khỏe mạnh.

44

Bảng 3.8. Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ bò nghi mắc bệnh

Tụ huyết trùng tại huyện Thạch Thất

Kết quả phân lập P. Multocida

Địa điểm

Số mẫu

STT

(Xã)

kiểm tra

Số mẫu dương tính

Tỷ lệ(%)

1 Tiến Xuân

21

6 28,57b

2 Yên Bình

26

8 30,77a

3 Yên Trung

30

10 33,33a

77

24 31,17

Tổng

Ghi chú: Chữ số khác nhau a,b theo cột dọc thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê

(P<0.05)

Tỷ lệ (%)

33.33

34.00

33.00

32.00

30.77

Xã Tiến Xuân

31.00

Xã Yên Bình

30.00

28.57

Xã Yên Trung

29.00

28.00

27.00

26.00

Địa điểm

Hình 3.5. Biểu đồ tỷ lệ dương tính với Pasteurella multocidatừ bò nghi

mắc bệnh Tụ huyết trùng tại huyện Thạch Thất

Từ bảng 3.8 cho biết trong tổng số 77 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bò

nghi mắc bệnh Tụ huyết trùng đã phân lập thu được 24 mẫu dương tính với

Pasteurella multocida, chiếm tỷ lệ 31,17%.

45

Ở cả mẫu dịch ngoáy mũi của bò khỏe mạnh và mẫu bệnh phẩm thu thập

từ bò nghi mắc bệnh Tụ huyết trùng đều phát hiện mẫu dương tính với vi khuẩn

Pasteurella multocida ở 3 xã miền núi Tiến Xuân, Yên Trung và Yên Bình.

Không có sự sai khác về mặt thống kê tỷ lệ nhiễm Pasteurella multocida giữa

các xã trong huyện (p<0.05). Tỷ lệ này thể hiện đúng tình hình dịch tễ bệnh Tụ

huyết trùng trên bò tại huyện Thạch Thất, bệnh xảy ra hàng năm do vi khuẩn

tồn tại ở các cá thể khỏe mạnh và luôn được bài xuất nguồn bệnh ra ngoài và

lây nhiễm cho các cá thể khác, khi gặp các điều kiện bất lợi làm giảm sức đề

kháng của con vật, vi khuẩn tăng độc lực và gây bệnh.

Điều này có ý nghĩa rất lớn về mặt dịch tễ học, khi nghiên cứu về bệnh

Tụ huyết trùng không thể coi nhẹ yếu tố mang trùng ở bò khỏe vì những con

mang trùng là những nguồn dịch tiềm tàng và bệnh sẽ phát ra bất cứ lúc nào

khi có điều kiện bất lợi làm giảm sức đề kháng.

3.3.2. Kết quả xác định đặc tính sinh vật hóa học của Pasteurella

multocida từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe và từ các mẫu bệnh phẩm của

trâu, bò nghi mắc bệnh

Kết quả kiểm tra đặc điểm hình thái vi khuẩn P. Multocida phân lập được

+ Hình thái, tính chất nhuộm màu: Các chủng vi khuẩn phân lập được

tiến hành phiết kính, nhuộm Gram thấy vi khuẩn bắt màu Gram âm (-), có dạng

cầu trực khuẩn, thường đứng riêng lẻ, đôi khi tạo thành đôi và chuỗi. Số chủng

phân lập đều không di động.

+ Đặc tính nuôi cấy: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên các môi

trường: nước thịt BHI, thạch huyết thanh, thạch máu, thạch MacConkey, bồi

dưỡng ở 370C trong 24h.

Trên môi trường BHI: Sau 24h nuôi cấy, vi khuẩn phát triển làm môi

trường vẩn đục, đáy có căn nhầy, lắc nhẹ vẩn đục như sương mù. Môi trường

có mùi tanh đặc trưng của nước dãi khô.

46

Trên môi trường thạch thường: Sau 24h nuôi cấy, vi khuẩn phát triển

thành khuẩn lạc nhỏ như hạt sương, để lâu khuẩn lạc to màu trắng đục, nhớt và

dính chặt vào mặt thạch.

Trên môi trường thạch máu: Sau 24h nuôi cấy, vi khuẩn phát triển mạnh,

có hình tròn, kích thước khuẩn lạc lớn hơn thạch thường, có màu tro xám hình

hạt sương, không làm dung huyết và có mùi tanh đặc trưng.

Trên môi trường thạch Mac Conkey: Vi khuẩn không mọc trên môi

trường này.

Kết hợp các đặc tính hình thái, đặc tính nuôi cấy với các chỉ tiêu đánh

giá theo Carter, (1984) chứng tỏ các chủng vi khuẩn mà chúng tôi phân lập đều

có các đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy và tính chất bắt màu phù hợp với

đặc tính của chủng vi khuẩn Pasteurella multocida theo quy định.

Sau khi tiến hành giám định các đặc điểm về hình thái, đặc tính nuôi cấy

của các chủng vi khuẩn phân lập được, chúng tôi tiếp tục tiến hành kiểm tra

một số đặc tính sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn này. Kết quả được

trình bày ở bảng 3.9.

Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh vật hóa học

của các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được

STT

Sinh Indol

Số chủng dương tính 35 0 35 35 35 Tỷ lệ (%) 100 0 100 100 100

Số chủng kiểm tra 35 35 35 35 35 35 6 0 0

Sinh H2S

Các đặc tính 1 Gram âm 2 Di động 3 4 Oxidase 5 Catalase Phân hủy ure 7 Gelatin 8 9 Dung huyết 10 MacConkey 35 35 35 35 0 0 0 0 0 0 0 0

47

Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy 100% các chủng vi khuẩn dương tính với

phản ứng sinh Indol, Oxidase và Catalase. Sau khi giám định đặc tính sinh hóa

của vi khuẩn, tiến hành giám định khả năng lên men đường của các chủng vi

khuẩn, kết quả được thể hiện ở bảng 3.10.

Bảng 3.10. Kết quả kiểm tra khả năng lên men đường của các chủng

vi khuẩn Pasterulla multocida phân lập được

STT Các loại đường Số chủng kiểm tra Số chủng dương tính

1 Glucose Tỷ lệ (%) 100 35 35

2 Mannitol 100 35 35

3 Maltose 0 0 35

4 Sorbitol 100 35 35

5 Saccarose 100 35 35

6 Galacose 100 35 35

7 Lactose 0 0 35

8 Fructose 100 35 35

Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy 100% các chủng vi khuẩn P. Multocida phân

lập được trên bò đều lên men các loại đường: glucose, mannitol, sorbitol,

saccarose, galacose và fructose.

Ở Việt Nam cũng có nhiều tác giả nghiên cứu đặc tính sinh vật, hóa học của

Pasteurella multocida như: Nguyễn Xuân Bình (1996), Hoàng Đạo Phấn (1996),...

Gần đây có các nghiên cứu của Trương Quang Hải và cs (2012)

xác định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Pasteurella multocida,

Streptococcus suis gây viêm phổi ở lợn tại Bắc Giang và biện pháp phòng trị.

Đặng Ngọc Lương (2012) đã xác định một số đặc tính sinh học của vi

khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Cao Bằng và

lựa chọn vắc xin phòng bệnh. Đỗ Quốc Tuấn (2012) nghiên cứu đặc tính sinh

48

vật hóa học của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết trùng dê ở

tỉnh Thái Nguyên và biện pháp phòng trị. Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học

của Pasteurella multocida của chúng tôi tương đồng với kết quả của những

nghiên cứu trên.

3.3.3. Kết quả giám định vi khuẩn Pasterulla multocida bằng kỹ thuật PCR

Phản ứng PCR được sử dụng nhằm giám định các chủng vi khuẩn

Pasteurella multocida phân lập đã kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học. Do đó,

chúng tôi đã tiến hành giám định lại các chủng vi khuẩn P. Multocida phân lập

được bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho sản phẩm PCR có

độ dài là 457bp. Kết quả được trình bày ở bảng 3.11và hình 3.5.

Kết quả ở bảng 3.11 cho thấy 29 chủng Pasteurella multocida được giám

định bằng phương pháp PCR từ 35 mẫu phân lập được từ dịch ngoáy mũi của bò

khỏe và từ các bệnh phẩm của bò nghi mắc bệnh nuôi tại địa phương nghiên cứu,

chiếm 82,85%. Sau quá trình chạy PCR và điện di cho sản phẩm PCR đặc hiệu

khoảng 457bp giống đối chứng dương còn đối chứng âm không lên vạch, không

cho phản ứng PCR như đối chứng dương; chứng tỏ phản ứng đặc hiệu, có độ tin

cậy cao trong quá trình phân tích và đánh giá kết quả.

Bảng 3.11. Kết quả giám định vi khuẩn Pasteurella multocida

bằng phản ứng PCR

Kết quả PCR phát hiện Số mẫu canh Địa điểm khuẩn P. multocida STT (Xã) kiểm tra Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%)

1 Bình Yên 10 9 90,00

2 Yên Bình 10 8 80,00

3 Yên Trung 15 10 66,67

Tổng 35 29 82,86

49

Hiện nay phương pháp PCR là kỹ thuật được sử dụng phổ biến tại các

phòng thí nghiệm chẩn đoán bệnh trong nhân y và thú y bởi có nhiều ưu điểm

như thời gian cho kết quả nhanh, độ chính xác cao. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật

PCR ở đây là để chẩn đoán bệnh Tụ huyết trùng bò do vi khuẩn Pasteurella

mutocida gây ra, cho thấy kết quả kịp thời giúp cho công tác chẩn đoán và

phòng trị bệnh.

3.3.4. Kết quả xác định độc lực của các chủng Pasteurella multocida phân

lập được

Tiến hành kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn Pasteurella

multocida phân lập được trên chuột bạch nhằm xác định chúng có độc lực hay

không thông qua khả năng gây chết chuột. Phương pháp xác định độc lực của

các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida được thực hiện theo trình bày ở phần

phương pháp. Kết quả trình bày ở bảng 3.12.

Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn Pasteurella

multocida phân lập được trên chuột bạch

Kết quả độc lực

Không

Gây chết

Số chủng

Số

gây chết

100%

Tỷ lệ

50%

Tỷ lệ

STT

chủng

chuột

P. multocida

chuột thí

(%)

chuột thí

(%)

thí

nghiệm

Chủng phân

28,5

lập từ dịch

42,8

7

2 28,57

3

2

1

7 ngoáy mũi bò

6 khỏe

Chủng phân

lập từ bò mắc

13,6

22

19 86,36

3

0

2 bệnh Tụ huyết

4 trùng

50 20,6

Tổng

29

21 72,41

6

2 6,90

9

Qua bảng 3.12 cho thấy 29 chủng Pasteurella multocida phân lập được

đem thử trên chuột nhắt trắng, thì 27 chủng có độc lực, giết chết chuột trong

vòng 18-48h, chuột sau khi tiêm thấy biểu hiện ủ rũ, kém vận động và chết. Có

2 chủng không có độc lực, không giết chết chuột trong thời gian theo dõi.

Trong tổng số 27 chủng Pasteurella multocida có độc lực thì 21 chủng

có độc lực cao giết chết 100% chuột nhắt trắng trong vòng 18-24h chiếm tỷ

lệ 72,41%; còn 6 chủng có độc lực thấp hơn chỉ giết chết 50% chuột với thời

gian chết sau khi tiêm là 24-48h, chiểm tỷ lệ 20,69%. Chuột thí nghiệm được

mổ khám đều cho bệnh tích điển hình của bệnh như xoang bao tim tích nước,

gan, phổi sưng, các phủ tạng xuất huyết. Đây là những bệnh tích đặc trưng

của chuột chết khi gây nhiễm vi khuẩn Pasteurella multocida thuần khiết

phân lập được.

Trong số các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida có độc lực gây chết

chuột thì chỉ có 5/7 chủng Pasteurella multocida phân lập từ dịch ngoáy mũi

bò khỏe, thấp hơn nhiều so với số chủng Pasteurella multocida phân lập từ bò

mắc bệnh (22/22 chủng). Các chủng phân lập từ bò khỏe có độc lực giết chết

chuột yếu hơn (giết chết 1/2 hay không giết chết chuột) so với các chủng phân

lập từ bệnh phẩm.

Kết quả trên cũng cho thấy bò khỏe mang trùng là nguồn thải mầm bệnh

ra ngoài môi trường. Trong các ổ dịch Tụ huyết trùng bò ở huyện Thạch Thất

có vai trò của các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida độc lực yếu hoặc

không có độc lực ở đường hô hấp trên của bò khỏe, chúng tăng độc lực và gây

bệnh khi sức đề kháng của gia súc giảm sút. Đây cũng chính là nguồn bệnh

tiềm tàng cần được lưu ý trong công tác phòng chống dịch bệnh Tụ huyết

trùng bò và các loài gia súc khác. Kết quả xác định độc lực của vi khuẩn

Pasteurella multocida trong nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu

51

của Blackall và cs (1998) cho biết trong các chủng phân lập được tại Australia

thì chỉ có một số chủng có độc lực cao, các chủng còn lại có độc lực thấp.

Kết quả nghiên cứu độc lực của các chủng Pasteurella multocida trên địa bàn huyện Thạch Thất phù hợp với các nghiên cứu của tác giả khác.Theo tác giả Ðặng Xuân Bình và cs (2010) đã kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được từ trâu, bò và lợn ở 2 tỉnh Cao Bằng, Hà Giang đã cho kết quả các chủng vi khuẩn đều có độc lực mạnh gây chết chuột thí nghiệm từ 80 - 100% trong vòng 48 giờ sau khi công cường độc. Nhóm tác giả đã mổ khám chuột thí nghiệm chết thấy có bệnh tích đặc trưng, điển hình của chuột khi tiêm vi khuẩn Pasteurella multocida cường độc như bao tim tích nước vàng, gan, phổi sưng, các phủ tạng xuất huyết, thực hiện phân lập lại vi khuẩn từ máu tim của những chuột chết cho kết quả đều phân lập được vi khuẩn Pasteurella multocida. 3.3.5. Kết quả thử kháng sinh đồ các chủng Pasteurella multocida phân lập được Để sử dụng kháng sinh một cách hiệu quả trong quá trình điều trị cũng như phòng bệnh, đồng thời làm giảm khả năng vi khuẩn P. Multocida kháng thuốc trong điều trị cho bò mắc bệnh Tụ huyết trùng tại địa phương nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành xác định tính mẫn cảm của 29 vi khuẩn Pasteurella multocida đã được giám định bằng kỹ thuật PCR đối với một số loại kháng sinh đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.13. Bảng 3.13. Kết quả kháng sinh đồ của các chủng Pasteurella multocida phân lập được

Kết quả kháng sinh đồ

STT

Loại kháng sinh

Tỷ lệ (%)

Số chủng vi khuẩn thử

Streptomycin

29 29 29 29 29 29 29 29 29 29

Số chủng rất mẫn cảm 3 17 10 1 2 16 2 0 11 5

Số chủng mẫn cảm trung bình 4 10 12 2 15 12 11 3 5 12

13,79 34,48 41,38 6,90 51,72 41,38 37,93 10,34 17,24 41,38

Số chủng kháng thuốc 22 2 7 26 12 1 16 26 13 12

10,34 58,62 34,48 3,45 6,90 55,17 6,90 0 37,93 17,24

75.86 6,90 24,14 89,66 41,38 3,45 55,17 89,66 44,83 41,38

1 Lincomycin 2 Norfloxacin 3 Colistin 4 5 Amikacin 6 Oxytetracylin 7 Neomycin Penicillin G 8 9 Amoxicillin 10 Ampicilin

52 11 Doxycilin

29

2 6,90

15 51,72

12 41,38

Kết quả bảng 3.13 cho thấy vi khuẩn Pasteurella multocida mẫn cảm mạnh

với một số loại kháng sinh như norfloxacin (58,62%), oxytetracylin (55,17%), tiếp

đến là colistin và amoxicillin (34,48 - 37,93%). Vi khuẩn mẫn cảm trung bình với

amikacin, ampicilin, doxycilin. Hầu hết các chủng vi khuẩn kháng lại các loại

kháng sinh như penicillin G, streptomycin, lincomycin.

Sở dĩ có hiện tượng kháng kháng sinh với một số kháng sinh trên, theo

chúng tôi nguyên nhân chính là do việc sử dụng kháng sinh để phòng bệnh bằng

phương pháp trộn lẫn vào thức ăn hoặc nước uống hằng ngày cho bò.

Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn Pasteurella multocida hiện cũng

được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu trên thế giới, theo công bố

của Yami Bote và cs (2017) kiểm tra độ mẫn cảm của các chủng Pasteurella

multocida với các loại kháng sinh tại Ethiopia trong thời gian 2016-2017,

kết quả công bố phát hiện 13 trường hợp trâu, bò dương tính với vi khuẩn

Pasteurella multocida chiếm tỷ lệ 3.39% trong tổng số 384 mẫu kiểm tra.

Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn phân lập được với

các loại kháng sinh cho thấy mức độ kháng và mẫn cảm rất khác nhau các

chủng Pasteurella multocida với các loại kháng sinh, cụ thể tỷ lệ mẫn cảm

15,4% với tetracycline, 61,5% với streptomycin, và tỷ lệ kháng 15,4% với

streptomycin, clindamycin; 69,2% với tetracycline. Kết quả khẳng định

streptomycin, clindamycin là những thuốc có thể sử dụng để điều trị bệnh do

Pasteurella multocida.

3.4. Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tụ huyết trùng bò,

đề xuất biện pháp phòng bệnh tụ huyết trùng bò tại huyện Thạch Thất

3.4.1. Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh Tụ huyết trùng bò

Từ kết quả kháng sinh đồ với các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida

phân lập được, lựa chọn 02 phác đồ thử nghiệm điều trị bò mắc bệnh như sau:

* Phác đồ 1:

Thuốc norfloxacin 100mg, tiêm bắp 1 ml/15 kg trọng lượng/ngày, trong

thời gian 5 ngày.

53

54

* Phác đồ 2:

Thuốc oxytetracylin 40mg, tiêm bắp 1 ml/10 kg trọng lượng/ngày,

trong 5 ngày.

Ở cả hai phác đồ đều sử dụng bổ sung:

Thuốc hạ nhiệt analgin 1ml/15kg trọng lượng.

Thuốc trợ sức, trợ lực:

Vitamin C: Tiêm bắp 1ml/10kg thể trọng, ngày 1 lần trong thời gian 5 ngày

B - Complex: Tiêm bắp 10ml/con, ngày 1 lần trong thời gian 5 ngày

Vệ sinh chăm sóc nuôi dưỡng tốt. Cách ly bò bị bệnh để theo dõi và điều trị

bệnh tránh lây lan cho toàn đàn. Tăng cường vệ sinh, sát trùng chuồng trại, dụng

cụ chăn nuôi 2 ngày một lần trong thời gian điều trị. Kết quả điều trị với 2

phác đồ thể hiện ở bảng 3.14.

Qua quá trình điều trị với 2 phác đồ điều trị thử nghiệm trên bò bị bệnh

Tụ huyết trùng được chẩn đoán chính xác bằng phương pháp phân lập vi khuẩn

và kỹ thuật PCR, cho thấy phác đồ 01cho hiệu quả cao, có 9/10 bò khỏi bệnh

chiếm tỷ lệ 90,00%; phác đồ 2 cho hiệu quả điều trị thấp hơn (8/10 bò khỏi

bệnh sau 5 ngày điều trị chiếm tỷ lệ 80,00%. Sự sai khác tỷ lệ khỏi bệnh của 2

phác đồ có ý nghĩa về mặt thống kê, cho thấy sự khác nhau về hiệu quả điều trị

của hai phác đồ.

Như vậy, việc áp dụng kết quả kháng sinh đồ, lựa chọn được loại kháng

sinh mà các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được tại thực địa

mẫn cảm cao sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị bệnh, tỷ lệ khỏi bệnh đạt từ 80-

90%; từ đó giúp giảm thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi bò.

3.4.2. Đề xuất biện pháp phòng bệnh tụ huyết trùng bò tại huyện Thạch Thất

Từ các kết quả nghiên cứu tình hình dịch bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại

địa phương và các kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, chúng tôi đề

xuất biện pháp phòng bệnh như sau:

- Tăng cường chăm sóc, nuôi dưỡng, vệ sinh thú y cho đàn bò, đặc biệt

bò giai đoạn 1-3 năm tuổi, đây là giai đoạn mẫn cảm với bệnh Tụ huyết trùng.

55

- Tiêm phòng vắc xin có hiệu quả phòng bệnh cho đàn bò, tiêm phòng

bổ sung cho động vật mới nhập đàn, và tăng cường hiểu biết về phòng bệnh

cho người chăn nuôi bò. Tiêm vào trước thời điểm thường xảy ra dịch bệnh

hằng năm (tháng 3,4 và tháng 8,9 hàng năm).

- Định kỳ hằng năm kiểm tra tỷ lệ mang trùng ở bò khỏe, để biết nguy

cơ xảy ra bệnh và có biện pháp phòng bệnh trị thích hợp.

56

Bảng 3.14. Kết quả điều trị bệnh Tụ huyết trùng bò tại huyện Thạch Thất

Thời gian Số con Phác đồ Đường Số con Tỷ lệ khỏi Thuốc điều trị Liều lượng điều trị khỏi điều trị dùng điều trị bệnh(%) (ngày) bệnh

Norfloxacin 100mg 1 ml/15 kg trọng lượng Analgin 5 1 Tiêm bắp 10 9 90,00a Vitamin C 1ml/10kg thể trọng, ngày

B – Complex 10ml/con/ngày

Oxytetracylin 40mg 1 ml/10 kg trọng lượng

Analgin 1 ml/15 kg trọng lượng 2 Tiêm bắp 5 10 8 80,00b Vitamin C 1ml/10kg thể trọng, ngày

Ghi chú: Chữ số khác nhau a,b thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0.05)

B – Complex 10ml/con/ngày

57

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

- Bò mắc bệnh Tụ huyết trùng gặp ở 3 xã miền núi Tiến Xuân, Yên Bình

và Yên Trung, huyện Thạch Thất, tỷ lệ bò mắc bệnh và chết do bệnh khác nhau

giữa các xã, lần lượt dao động từ 1,04 - 2,01% và 0,16 - 0,23%.

- Bò nhiễm bệnh Tụ huyết trùng tập trung vào lứa tuổi 1-3 năm tuổi, vào

tháng 3 đến tháng 7 trong năm. Tỷ lệ tiêm phòng vắc xin Tụ huyết trùng năm

2019 tại địa đạt phương thấp.

- Đã phân lập được 35 chủng vi khuẩn Pasteurella multocida từ mẫu dịch

ngoáy mũi của bò khỏe và mẫu bệnh phẩm của bò nghi mắc bệnh Tụ huyết

trùng. Các chủng Pasteurella multocida phân lập được đều mang đầy đủ các

đặc tính hình thái và đặc tính sinh hóa đặc trưng.

- Các chủng Pasteurella multocida phân lập được có độc lực cao, tỷ lệ

72,41% số chuột thí nghiệm chết 100% sau 36-48 giờ.

- Các chủng Pasteurella multocida phân lập mẫn cảm với các kháng sinh

như norfloxacin (58,62%), oxytetracylin (55,17%), tiếp đến là colistin và

amoxicillin (34,48-37,93%). Vi khuẩn mẫn cảm trung bình với amikacin,

ampicilin, doxycilin. Hầu hết các chủng vi khuẩn kháng lại các loại kháng sinh

như penicillin G, streptomycin, lincomycin.

-Thử nghiệm điều trị 02 phác đồ điều trị bằng norfloxacin và

oxytetracylin, kết quả điều trị đạt 80,00-90,00%.

2. Đề nghị

- Định kỳ hằng năm kiểm tra tỷ lệ mang trùng ở bò khỏe, để biết nguy cơ

xảy ra bệnh và có biện pháp phòng bệnh trị thích hợp.

- Có chính sách hỗ trợ người chăn nuôi bò về vắc xin Tụ huyết trùng để

tăng tỷ lệ tiêm phòng. Xây dựng kế hoạch tiêm phòng hợp lý, tiêm phòng bổ

sung cho động vật mới nhập đàn, và tăng cường công tác tuyên truyền cho

người chăn nuôi bò hiểu biết về lợi ích của tiêm phòng từ đó người chăn nuôi

58

chủ động tiêm phòng vắc xin. Tiêm vào trước thời điểm thường xảy ra dịch

bệnh hằng năm.

- Tiếp tục nghiên cứu về đặc tính sinh học phân tử, gen độc lực của vi

khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết trùng bò ở huyện Thạch Thất

và trong cả nước.

59

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tài liệu tham khảo tiếng Việt

1. Bùi Quý Huy (1998), Một số đặc điểm bệnh tụ huyết trùng ở Việt Nam trong

những năm vừa qua, KHKT Thú y, 5(1), Hà Nội, tr. 91 - 94.

2. Bùi Văn Dũng (2000), Nghiên cứu tình hình bệnh tụ huyết trùng và vi khuẩn

Pasteurella phân lập từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khoẻ mạnh của tỉnh Lai

Châu, Luận văn thạc sỹ Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà

Nội.

3. Bùi Xuân Đồng (2000), Công tác phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu, bò

tại Hải Phòng, KHKT Thú y, 7 (1), Hà Nội, tr. 91-94.

4. Cao Văn Hồng (2002), Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu,

bò, lợn tại Đắc Lắc và một số biện pháp phòng trị, Luận án Tiến sỹ Nông

nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội.

5. Cù Hữu Phú và cs (2005), Xác định nguyên nhân gây bệnh đường hô hấp

của lợn nuôi tại một số tỉnh phía Bắc, VII (4), KHKT thú y, tr.23 - 32.

6. Cù Hữu Phú, Nguyễn Xuân Huyên, Âu Xuân Tuấn, Lê Thị Minh Hằng, Lưu

Thị Hải Yến, Văn Thị Hường, Trần Việt Dũng Kiên, Tăng Thị Phương

(2013), “Xác định Serotype và một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn

Actinobacillus Pleuropneumoniae, Pasteurella Multocida và Streptococcus

suis để chọn chủng chế tạo vắc xin phòng bệnh viêm phổi cho lợn”, Tạp chí

KHKT Thú y, số 7, tr.24-33.

7. Đặng Xuân Bình, Nguyễn Thị Kim Dung, Nguyễn Thị Hà, Lê Bá Hiệp

(2010), “Khảo sát sự lưu hành của vi khuẩn Pasteurella multocida ở gia súc

một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam”, Tạp chi KHKT Thú y,Tập XVII,

Số 2. 2010.

8. Đinh Duy Kháng, Lê Văn Phan, Phan Thanh Phượng, Trương Văn Dung,

Hoàng Xuân Nghinh (2000), “Ứng dụng kỹ thuật PCR để định type vi

khuẩn Pasteurella multocida ở miền Trung Việt Nam”, Tạp chí KHKT Thú

y, số 2.

60

9. Đỗ Ngọc Thúy và cs (2007), “Ứng dụng kỹ thuật PCR để định type giáp mô

của các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được từ vật nuôi”,

14 (1), KHKT Thú y, tr. 36 - 41.

10. Đoàn Thị Băng Tâm (1987), Bệnh ở động vật nuôi, NXB Khoa học kỹ thuật,

Hà Nội, 1, tr. 51 - 79.

11. Dương Thế Long (1995), Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ và vi khuẩn

học của bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở Sơn La để xác định biện pháp phòng

trị thích hợp, Luận án Phó tiến sỹ Khoa học Nông nghiệp, Viện khoa học

Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội.

12. Hoàng Đăng Huyến (2004), Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ, các yếu tố ảnh

hưởng đến bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Bắc Giang và đề xuất một số biện

pháp phòng chống, Luận án tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Thú y, Hà Nội.

13. Hoàng Đạo Phấn (1986), “Về đặc tính của Pasteurella multocida và type

huyết thanh của chúng”, Tạp chí KHKT Thú y, 3 (1), tr 1 - 7.

14. Hoàng Xuân Nghinh, Trương văn Dung, Hoàng Đăng Huyến (2004), “Khả

năng đáp ứng miễn dịch của một số vắc xin phòng tụ huyết trùng trâu, bò đang

lưu hành ở nước ta”, Tạp chí KHKT Thú y, Số 2. 2004.

15. Lê Minh Trí, Hồ Đình Trúc và Bùi Quý Huy (1999), “Kết quả điều tra dịch

tễ bệnh gia súc, gia cầm ở 5 tỉnh phía Bắc”, Khoa học kỹ thuật thú y, 4 (3),

Hà Nội.

16. Nguyễn Đăng Khải, Đặng Đình Sự, Nguyễn Đăng Tho (1999), “Xác định

nguyên nhân của những ổ dịch trâu, bò chết cấp tính trong thời gian gần

đây”, KHKT Thú y, 6 (4), Hà Nội, tr 83 - 85.

17. Nguyễn Ngã (1996), Đặc tính sinh học và sự tương quan đồng kháng

nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu,

bò ở miền Trung với chủng Iran chế tạo vắc xin, Luận án Phó tiến sỹ khoa

học Nông nghiệp, Viện thú y Quốc gia, Hà Nội.

19. Nguyễn Ngã, Phan Thanh Phượng, Nguyễn Thị Duyên và Nguyễn Thiên

Thu (1999), Nghiên cứu chế tạo vắc xin đa giá phòng 4 bệnh đỏ ở lợn khu

vực miền Trung, KHKT Thú y, 6 (2), Hà Nội, tr 41 - 46.

61

20. Nguyễn Như Thanh (2001), Cơ sở của phương pháp nghiên cứu dịch tễ học

thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

21. Nguyễn Như Thanh, Bùi Quang Anh, Trương Quang (2001), Dịch tễ học

thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

22. Nguyễn Thiên Thu (1996), Nghiên cứu một số đặc tính vi sinh vật và kháng

nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ trâu bò mang trùng

ở khu vực miền Trung Việt Nam, Luận án Phó tiến sỹ khoa học Nông nghiệp,

Viện Thú y Quốc gia, Hà Nội.

23. Nguyễn Văn Minh (2005), Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh THT

và xác định tỷ lệ mang trùng Pasteurella ở đàn trâu, bò tỉnh Hà Tây, Luận

văn thạc sỹ Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội.

24. Nguyễn Văn Quang (1999), Nghiên cứu vắc xin vô hoạt tụ dấu nhũ hóa,

phòng bệnh tụ huyết trùng và đóng dấu lợn, Luận án Phó tiến sỹ.

25. Khoa học Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội.

26. Nguyễn Văn Thiện (1997), Phương pháp nghiên cứu trong chăn nuôi, NXB

Nông nghiệp, Hà Nội, 243 trang.

27. Nguyễn Vĩnh Phước (1964), Đặc tính sinh học Pasteurella multocida, Vi

trùng học thú y, Hà Nội, tr 195 - 209.

28. Nguyễn Vĩnh Phước (1970), Pasteurella multocida, NXB Đại học và Trung

học chuyên nghiệp, Hà Nội, tr 50 - 70.

29. Nguyễn Vĩnh Phước (1978a), “Bệnh tụ huyết trùng trâu, bò” Giáo trình

bệnh truyền nhiễm gia súc, NXB Nông thôn, Hà Nội. tr 223 - 231.

30. Nguyễn Vĩnh Phước, Lê Thanh Tòng, Lê Anh Phụng, Nguyễn Văn Vĩnh, Mai

Hồng Phước (1986a), “Phân lập định type huyết thanh học vi khuẩn tụ huyết

trùng trâu, bò ở các tỉnh phía Nam” Kết quả hoạt động khoa học kỹ thuật thú

y 1975 - 1985, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 126 -128.

31. Phạm Thị Phương Lan, Ðặng Xuân Bình (2012),“Một số đặc tính sinh học

của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết trùng ở trâu, bò phân

lập tại Hà Giang và Cao Bằng”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, số112/2,

trang 163-167.

62

32. Phan Đình Đỗ và Trịnh Văn Thịnh (1958), Bệnh truyền nhiễm gia súc,

những bệnh thường có tại Việt Nam, NXB Nông thôn, Hà Nội.

33. Phan Thanh Phượng (1994), Ba bệnh đỏ của lợn, NXB Nông nghiệp, Hà

Nội, tr 59 - 91.

34. Phan Thanh Phượng (2000), Bệnh tụ huyết trùng gia súc, gia cầm và biện

pháp phòng chống, KHKT Thú y, 7 (2), tr 87 - 96.

35. Trần Đình Từ, Nguyễn Mạnh Thắng, Võ Công Minh, Trần Đức Minh,

Nguyễn Tấn, Đỗ Văn Dũng, Đỗ Thị Lợi, Phạm Quang Thái, Nguyễn Thị

Bích Hà, Lê Công Tiến (2000), Nghiên cứu qui trình công nghệ lên men vi

khuẩn để áp dụng sản xuất các loại vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng cho

gia súc gia cầm, Báo cáo Khoa học của Sở Khoa - Công nghệ thành phố

Hồ Chí Minh.

36. Võ Văn Hùng (1997), Đặc điểm dịch tễ bệnh THT lợn ở Đắk Lắk và biện

pháp phòng trị, Luận văn thạc sỹ Nông nghiệp, Trường Đại học Nông

nghiệp I, Hà Nội.

II. Tài liệu tham khảo tiếng nước ngoài:

37. Abeynayke P., Wijewardana T. G and Thalagoda SA (1992),

“Antimicrobial susceptibility of Pasteurella multocida isolated”,

Pasteurellosis in production animal. An international workshop (ACIAR)

Bali Indonesia, 10 - 13 August, pp: 193 - 196.

38. Dehoux J.P.et al. (1986), Pasteurellosis in a Rapid farm in Senegal, Rev.

Elev. Med. Vet. Plays trop., 2, pp. 98 - 101.

39. Mustafa A.A., Ghalile H.W.and Shighidi M.T (1978), Carrier rate of

Pasteurella multocida in a cattle herd with an out - break of haemorrhagic

septicaemia in Zambia, British Veterinary Journal, 124, pp. 357 - 358.

40. Abubakar Musa Ahmad (2014), Efforts towards thedevelopment of

recombinant vaccines against Pasteurella multocida. Science World J. Vol

9 (No2).

63

41. Ackemann M.R., Debey M.C., Register K.B., Larson D.J.and Kinyon J.M

(1994), Tonsil and turbinate colonization by toxigen and nontoxigen strain

of Pasteurella multocida in conventionally raised Iowa swine. Proceeding

13th IPVS congress, pp: 162.

42. Ahn D.C and Kim B.H (1994), Toxigencity and capsular serotypes of

Pasteurella multocida isolated from pneumonic lungs of slaughter pigs,

Proceeding Int.Pig Vet. Soc.Congr., pp: 165.

43. Azmat Jabeen, Mahrukh Khattak, Shahzad Munir, Qaiser Jamal, Mubashir

Hussain (2013), Antibiotic Susceptibility and Molecular Analysis of Bacterial

Pathogen Pasteurella Multocida Isolated from Cattle. Journal of Applied

Pharmaceutical Science Vol. 3 (04), pp. 106-110.

44. Bain R.V.S., De Alwis M.C.L., Carter G.R. and Gupta B.K (1982),

“Haemorrhagic septicaemia”, Animal production and Health, No 33,

FAO, Rome.

45. Carter. G.R (1952), Typ specific capsulars antigens of Pasteurella

multocida, Canadian Journal of Medical Science, 30, pp.48 - 53.

46. Carter. G.R (1955), Studies on Pasteurella multocida I, a haemaggltination

test for indetification of serological type, American Journal of Vet.

Reseach, 16, pp. 481 - 484.

47. Carter. G.R (1959), Studies on Pasteurella multocida IV, serological types

from species other cattle and swine, American Jounal of Vet. Reseach, 21,

pp.173 - 175.

48. Carter. G.R. (1967), Pasteurellosis and Pasteurella multocida and Pasteurella

haemolytica, In advance in veterinany Science, 11, pp. 321 - 329.

49. Carter. G.R. (1982), Whatever happened to haemorrhagic septicaemia Jounal

of American Association of Veterinary Asscation, 180, pp.1176 - 1777.

50. Carter. G.R. (1984), Pasteurella, Yersinia and Francisella page: 111 - 121,

in Diagnostic procedures in Veterinery Bacteriology and Mycology 4th ed

(Carter G.R.ed) Charles. C Thomas Publisher. Springfield.

64

51. Carter. G.R. and De Alwis M.C.L (1989), Haemorrhagic septicaemia. In

ADLAM C. and RUTTER J.M (eds) Pasteurella and pasteurellosis.

Academic Press. London, pp. 131 - 160.

52. Chandrasekeran S, Yeap P.C., and Rohan S. (1992), Production of a combined

P. haemolytica and P. multocida oil adjuvant vaccine, Proceeding of National

IRPA Semina, Kualalumpur, Malayxia, pp. 481 - 482.

53. De Alwis M.C.L.(1992a), A review, Pasteurellosis in Production Animal

ACIAR proceedings No 43, pp.11 - 20.

54. De Alwis M.C.L.(1999), Pasteurellosis, Pasteurellosis in Production

Animal, ACIAR proceedings No 57.

55. FAO (1991), Proceeding of the FAO/APHHCA workshop on haemorrhagic

septicaemia, February, Kandy, SryLanka.

56. Frank G.H (1989), Pasteurellosis in cattle. In Adlam C. and Rutter M.(eds)

Pasteurella and Pasteurellosis, Academic Press London, pp. 117 - 122.

57. Gupta B.K. (1962), Studies on the cariier problem in Haemorrhagic

Septicaemia in Zambia, Veterinary Journal, 107, pp.135.

58. Gupta B.K. (1980), Int.sym. On dis.Of Liv., 13, pp. 45-53. 65. Heddleston K.L.,

Roberts P.A. and Ritchie A.E (1966): Immunizing and toxin properties of

particulate antigens from two immunogenic types of Pasteurella multocida of

Avian origin, Journal of Immulogy, 96, pp.124 - 133.

59. Hiramune t.and de Alwis M.C.L. (1982), Haemorrhagic Septicaemia

carries status of cattle and buffalos in Srilanka, Tropical Animal Heath and

Production, 14, pp. 91 - 92.

60. Horadagoda N.U., Hodgson J.C., Monon G.M., Eckersall P.D. (2001),

“Roleof endotoxin in the pathogenesis of haemorrhagic septicaemia in the

buffalo”, Micro.Pathog. 33(3), pp.171 - 179.

65

61. Hossein Jamali, Mojtaba Rezagholipour, Sepideh Fallah, Arezoo

Dadrasnia, Shamini Chelliah, Rita Devi Velappan, Kelvin Swee Chuan

Wei, Salmah Ismail (2014), Short Communication Prevalence,

characterization and antibiotic resistance of Pasteurella multocida

isolated from bovine respiratory infection.The Veterinary Journal 202, pp

381-383.

62. Hunt ML, Adler B, Townsend KM (2000), Themolecular biology of

Pasteurella multocida.Veterinary Microbiology, 72: 3-25.

63. Jablonki P.E., Jaworski M., Hovde C.J. (1996), “A minimal medium for growth

of Pasteurella multocida”, FEMS Microbiol.Lett.140(2), pp.165 - 174.

64. Jakeen K.El-Jakee, Samah SaidAli, Ashgan M.Hessain, Moussa

I.Mohamed, (2016) Comparative studies for serodiagnosis of

haemorrhagic septicaemia in cattle sera. Saudi Journal of Biological

SciencesVolume 23, Issue 1, January 2016, Pages 48-53

65. Jesse FFA, Osman AY, Adamu L, Yusof M, Syamil M,Omar AR, Saharee

AA, Haron AW, Abdullah R, ZamriMS (2013e), Polymerase chain

reaction detection of Pasteurella multocida type B: 2 in mice following

oralinoculation. Asian Journal of Animal and Veterinary Advances, 8: 493-

501.

66. Kawasaki M, Young JR, Suon S, (2015), The socioeconomicimpacts of

clinically diagnosed haemorrhagic septicaemiaon smallholder large ruminant

farmers in Cambodia.Transbound Emerg Dis.62(5): pp.535-548.

67. Kumar A. A., S.B. Shivachandra, A. Biswas, V.P. Singh,

Vijendra P. Singh, S.K. Srivastava (2004). Prevalent Serotypes

of Pasteurella multocida Isolated from Different Animal and Avian Species

in India. Veterinary Research Communications, Volume 28, Issue 8, pp

657-667.

66

68. Montserrat B., Elana G., Montserrat L., Ana M., Ignacio B., Jordi B.(2002):

“Pasteurella multocida exbB, exbD and tonB genes are physically linked

but independently transcribed ”210 (2), pp.101 - 108.

69. Namiok S. and Murata M (1961b): Serological studies on Pasteurella

multocida II, characteristic of the somatic “O” antigen of the organism,

Cornell. Veterinarian, 51, pp. 507 - 512.

70. Namioka S.and Mutara M.(1961a): Serological studies on Pasteurella

multocida I, simplified method for capsule typing of the organism, Cornell,

Veterianrian, 51, pp. 458 - 507.

71. Natalia L., Patten B. and Syansudin A. (1992): Evaluation of bovine antibody

responses to haemorrhagic septicaemia vaccine using ELISA and PMPT

pasteurellosis in Production Animals International Workshop, Sponsores by

ACIAR proceeding No43, Indonesia, 10 - 13 August, pp. 219 - 223.

72. Nagai S, Someno S, Yagihashi T., (1994), Differentiation of toxigenic from

nontoxigenic isolates of Pasteurella multocida by PCR. J Clin

Microbiol. 1994 Apr;32(4):1004-10.

73. Omar A.R., Cheaar P.P. and Shahata C.S.(1982), The isolation of a virulent

strain of Pasteurella multocida from an apparent apparent healthy buffalo,

British Veterinary Journal, 118, pp. 71 - 73.

74. Peter E., Marth J., Carolyn J.H (1996), “A minimal medium for growth of

Pasteurella multocida” FEMS mcrobiology letters 140 (2-3), pp. 165 - 169.

75. Rajeswari Shome, Ram Pratim Deka, Swati Sahay, Delia Grace & Johanna F.

Lindahl (2019). Seroprevalence of hemorrhagic septicemia in dairy cows in

Assam, India. Infection Ecology & Epidemiology, Vol. 9, 1604064.

76. Ranjan R, Panda S, Acharya A, Singh A, Gupta M (2011), Molecular

diagnosis of haemorrhagic septicaemia-A review. Veterinary World, 4:

189-192.

77. Rimler R.B. and Rhoades K.R (1987), Serogroup F, a new capsule

serogroup of Pasteurella mulltocida, Journal of Clinical Microbiology, 25,

pp. 615 - 618.

67

78. Rita, D.V., Swee, K.C.W.and Salmah, I., Shamini, C., Kang, T.L.,

Nurshamimi, N.R., Hussin, A.R., Nurul, K.A.(2018), Recombinant Subunit

HS as a potential Vaccinefor Haemorrhagic septicaemia disease in

livestock. Tropical Biomedicine 35(4): 1075-1086.

79. Robets R.S.(1947), An immunological study of the Pasteurella

septicaemia, Journal of comparative pathology, 57, pp. 261 - 278. 87. 38.

80. Rosenbush C.T. and Merchant I.A.(1939): A study of the haemorrhagic

septicaemia pasteurella, Journal of the Bacteriology, 37, pp. 69.

81. Smith JE (1959), Studies on Pasteurella septica III strains from human

beings. J Comp Pathol 69, pp.231-235.

82. Yami Bote, Kibeb Legesse, Asmelash Tassew (2017), Isolation, identification

and antimicrobial susceptibilityof Pasteurella multocida from cattle with

hemorrhagic.

68

PhỤ LỤc

CÁC THÔNG SỐ CHẠY THỐNG KÊ TRONG BÁO CÁO

Bảng 3.1. Tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất

trong 2 năm 2018-2019

Thực nghiệm

Địa điểm (Xã)

Số bò mắc

Tổng hàng

Số bò không mắc

Tiến Xuân

867

858

Yên Bình

1254

1236

Yên Trung

4133

4050

110 Tổng cột

6254

6144

Lý thuyết

Tiến Xuân

11.04

855.96

Yên Bình

12.45

912.23

Giá trị P

0.00744786

Tiến Xuân

14.16

918.46

Yên Trung

15.49

817.64

Giá trị P

0.00285561

Yên Trung

56.88

1219.01

Yên Bình

45.87

1415.74

Giá trị P

0.7125121

69

Bảng 3.6. Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ mẫu dịch ngoáy mũi

bò khỏe tại huyện Thạch Thất

Thực nghiệm

Địa điểm (Xã)

Tổng hàng

Tiến Xuân

Số mẫu dương tính 4

Số mẫu âm tính 21

25

Yên Bình

Yên Trung

11 Tổng cột

75

64 Lý thuyết

Tiến Xuân

3.00

22.00

Yên Bình

3.00

22.00

Giá trị P

0.0215146

Tiến Xuân

4.00

20.00

Yên Trung

4.00

20.00

Giá trị P

0.0128955

Yên Trung

2.00

23.00

Yên Bình

2.00

23.00

Giá trị P

0.01753176

70

Bảng 3.7. Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ bò nghi mắc bệnh

Tụ huyết trùng tại huyện Thạch Thất

Thực nghiệm

Địa điểm (Xã)

Tổng hàng

Số mẫu dương tính

Số mẫu âm tính

Tiến Xuân

Yên Bình

Yên Trung

Tổng

Lý thuyết

Tiến Xuân

6.26

19.21

Yên Bình

5.46

22.11

Giá trị P

0.0374616

Tiến Xuân

4.16

18.46

Yên Trung

5.49

17.64

Giá trị P

0.0228851

Yên Trung

6.88

19.51

Yên Bình

5.77

15.24

Giá trị P

0.0112567

71

Bảng 3.13. Kết quả điều trị bệnh Tụ huyết trùng bò tại huyện Thạch Thất

Thực nghiệm

Phác đồ điều trị

Khỏi bệnh

Không khỏi Tổng hàng

Tổng cột

Lý thuyết

8.500

1.500

8.500

1.500

0.0001

Giá trị P

72

MỘT SỐ ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH THỰC TẬP

Ảnh 1. Bò khỏe mạnh tại xã Tiến Xuân, Ảnh2. Chuẩn bị môi trường đĩa thạch

huyện Thạch Thất, Hà Nội máu để quá trình phân lập P.multucida

Ảnh3. Phân lập vi khuẩn Tụ huyết trùng tại phòng thí nghiệm

73

Ảnh 4. Khuẩn lạc vi khuẩn Ảnh 5: Phản ứng Indol dương tính

P. multocida trên môi trường

thạch máu

Ảnh 6: Hình thái vi khuẩn P. multocida chụp dưới Ảnh 7: Vi khuẩn P. Multocida

kính hiển vi quang học (độ phóng đại 1000 lần). nuôi cấy trên môitrường thạch máu

74

457bp

Ảnh 8. Kết quả kháng sinh đồ

củacác chủng P. multocida

phân lập được

Ảnh 9: Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện vi khuẩn P. multocida M: Marker. Giếng số 2 đến giếng số 7: mẫu phân lập số 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Giếng số 1 là mẫu đối chứng dương.

Giếng số 9 là mẫu đối chứng âm

Ảnh 10: Chuột nhắt trắng trước khi Ảnh 11: Chuồng nuôi chuột nhắt trắng

tiêm vi khuẩn P. multocida

(Ảnh 10,11: Thử nghiệm độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida trên

chuột nhắt trắng)

75

Hình 1. Bản đồ hành chính huyện Thạch Thất, Hà Nội (Nguồn Nhà xuất bản tài nguyên Môi trường và Bản đồ Việt Nam, 2019)

Luận văn Thạc sĩ Thú Y: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất - Hà Nội và biện pháp phòng trị

VƯƠNG THỊ CHUNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở BÒ TẠI HUYỆN THẠCH THẤT- HÀ NỘI VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

THÁI NGUYÊN - 2019

VƯƠNG THỊ CHUNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở BÒ TẠI HUYỆN THẠCH THẤT- HÀ NỘI VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ

Ngành: Thú y Mã số:8 64 01 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. ĐẶNG XUÂN BÌNH

THÁI NGUYÊN - 2019

i

ii

iii

LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................... i

iv

v

vi

vii

Bảng 1.1. Đặc tính sinh hóa chung của Pasteurella multocida ....................... 6

Bảng 2.1. Đặc tính sinh hóa chung của Pasteurella multocida ..................... 27

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR phát hiện Pasterella multocida . 27

Bảng 3.1. Kết quả điều tra tổng đàn trâu, bò phân bố trên địa bàn huyện Thạch

Thất, thành phố Hà Nội ................................................................... 30

Bảng 3.2. Tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất trong 2

năm 2018 và 2019 ........................................................................... 32

Bảng 3.3. Tỷ lệ mắc bệnh Tụ huyết trùng ở bò theo các tháng trong năm tại

huyện Thạch Thất trong 2 năm 2018 và 2019 ................................ 34

Bảng 3.4. Tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò nuôi tại huyện Thạch Thất năm

2018 và 2019 theo lứa tuổi.............................................................. 37

Bảng 3.5. Triệu chứng lâm sàng, chủ yếu của bệnh Tụ huyết trùng ở bò nuôi

tại huyện Thạch Thất ...................................................................... 40 Bảng 3.6. Tổng hợp kết quả tiêm phòng vắc xin Tụ huyết trùngcho bò của

huyện Thạch Thất năm 2018 và 2019 ............................................. 41

Bảng 3.7. Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ mẫu dịch ngoáy mũi bò

khỏe tại huyện Thạch Thất .............................................................. 43

Bảng 3.8. Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ bò nghi mắc bệnh Tụ

huyết trùng tại huyện Thạch Thất ................................................... 44

Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh vật hóa học của các chủng vi

khuẩn Pasteurella multocida phân lập được .................................. 46

Bảng 3.10. Kết quả kiểm tra khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn

Pasterulla multocida phân lập được ............................................... 47

Bảng 3.11. Kết quả giám định vi khuẩn Pasteurella multocida bằng phản ứng PCR

......................................................................................................... 48

Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn Pasteurella

multocida phân lập được trên chuột bạch ....................................... 49

Bảng 3.13. Kết quả kháng sinh đồ của các chủng Pasteurella multocida phân

lập được ........................................................................................... 51

Bảng 3.14. Kết quả điều trị bệnh Tụ huyết trùng bò tại huyện Thạch Thất .. 56

viii

Hình 3.1. Biểu đồ tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất trong

2 năm 2018 và 2019 .......................................................................... 32

Hình 3.2. Biểu đồ tỷ lệ mắc bệnh Tụ huyết trùng ở bò theo các tháng trong năm

tại huyện Thạch Thất trong 2 năm 2018 và 2019 ............................. 35

Hình 3.3. Biểu đồ tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò nuôi tại huyện Thạch Thất

năm 2018 và 2019 theo lứa tuổi ........................................................ 38

Hình 3.4. Biểu đồ tỷ lệ dương tính với Pasteurella multocida từ mẫu dịch ngoáy

mũi bò khỏe tại huyện Thạch Thất ................................................... 43

Hình 3.5. Biểu đồ tỷ lệ dương tính với Pasteurella multocidatừ bò nghi mắc

bệnh Tụ huyết trùng tại huyện Thạch Thất ....................................... 44

1

2

3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

5

6

(Theo Smith JE, 1959)

Đặc tính sinh hóa Dung huyết Glucoza Lactoza H2S Catalaza Oxidaza Indol Ureaza

Kết quả - + - - + + + -

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20