Luận án Tiến sĩ chuyên ngành Ký sinh trùng và vi sinh vật học thú y: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút cúm A/H5N1 Clade 7 phân lập ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆ H N I

NGUYỄN TÙNG

NGHIÊN CỨU M T SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT

CÚM A/H5N1 CLADE 7 HÂN LẬ Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ

CHUYÊN NG NH: KÝ SINH TRÙNG V VI SINH VẬT HỌC THÚ Y

H N I, NĂM 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆ H N I

NGUYỄN TÙNG

NGHIÊN CỨU M T SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT

CÚM A/H5N1 CLADE 7 HÂN LẬ Ở VIỆT NAM CHUYÊN NG NH: KÝ SINH TRÙNG V VI SINH VẬT HỌC THÚ Y

MÃ SỐ: 62.64.01.04

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS NGUYỄN BÁ HIÊN

TS NGUYỄN VĂN CẢM

H N I, NĂM 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: công trình khoa học này là của tôi, các số liệu và kết

quả nghiên cứu trong luận án này trung thực và chưa từng được ai công bố trong

bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin cam đoan: mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và

hoàn thành luận án đều được cảm ơn. Các thông tin trích dẫn trong luận án đều

chính xác và được nêu rõ nguồn gốc.

Hà nội, tháng 10 năm 2013 Tác giả

Nguyễn Tùng

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án, tôi luôn

nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này tôi xin cảm ơn

Ban Giám hiệu, Ban Quản lý Đào tạo, Khoa Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp

Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được theo học chương trình đào tạo nghiên cứu

sinh tại trường.

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo và các cán bộ của Trung tâm Chẩn

đoán Thú y đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ cho tôi hoàn thành đề tài nghiên

cứu của mình.

Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ thuộc bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm,

khoa Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, đã giúp đỡ tôi trong quá trình

học tập và nghiên cứu.

Tôi xin bày tỏ long biết ơn sâu sắc đến Thầy giáo, TS Nguyễn Bá Hiên,

Khoa Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và TS Nguyễn Văn Cảm –

Hội Thú y , là những người thầy hướng dẫn khoa học, trực tiếp giúp đỡ tôi trong

quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến những đồng nghiệp công tác tại các tổ chức và

cơ quan quốc tế như FAO, CDC, USDA đã hỗ trợ và cung cấp tài liệu cũng như

các nguyên liệu cần thiết để tôi thực hiện nghiên cứu.

Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn bên cạnh, động

viên và giúp đỡ tôi hoàn thành nghiên cứu và luận án.

Hà Nội, tháng 10 năm 2013

Tác giả

Nguyễn Tùng

M C L C

Lời cảm ơn Lời cam đoan c l c Danh m c các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh m c các bảng Danh m c các hình MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lịch sử bệnh cúm gia cầm 1.1.1. Lịch sử bệnh trên thế giới 1.1.2. Bệnh cúm gia cầm Việt Nam 1.2. Nguyên nhân của bệnh cúm gia cầm 1.2.1. Đặc điểm sinh học phân tử của virus cúm gia cầm 1.2.2. Kháng nguyên của virus cúm gia cầm 1.2.3. Đặc điểm tiến hóa và hình thành genotype của virus cúm gia cầm Trang i ii iii v vi viii 1 4 4 4 7 9 10 14 20 giai đoạn 1996-2008

29 30 32 34 36 36 36 36 37 37 39 41 42 44

1.2.4. Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1 1.2.5. Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ 1.2.6. Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm gia cầm 1.2.7. Triệu chứng lâm sàng của gia cầm mắc bệnh cúm 1.2.8. Bệnh tích của gia cầm mắc cúm gia cầm 1.3. Chẩn đoán bệnh 1.3.1. Chẩn đoán dựa vào dịch tễ học 1.3.2. Chẩn đoán dựa vào triệu chứng và bệnh tích 1.3.3. Chẩn đoán phòng thí nghiệm 1.4. Vacxin phòng bệnh cúm gia cầm 1.4.1. Tình hình sử d ng vắc-xin cúm gia cầm trên thế giới 1.4.2. Tình hình sử s ng vắc-xin cúm gia cầm tại Việt Nam 1.5. Tình hình nghiên cứu cúm gia cầm Việt Nam CHƯƠNG 2. NỘI DUNG – NGUYÊN LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung 2.1.1. Phân lập và giám định virus cúm gia cầm A H N1 từ các mẫu dịch 46 46 ngoáy ổ nhớp

2.1.2. Xác định đặc tính di truyền học của virus cúm A/H5N1 clade 7 2.1.3. Xác định một số đặc tính sinh học của virus A/H5N1 clade 7 2.1.4. Xác định đặc tính kháng nguyên (tính tương đồng kháng nguyên) 2.1.5. Xác định hiệu lực của vacxin H5N1 Re-1 2.2. Địa điểm nghiên cứu 2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu 46 46 46 46 46 47 47 47

iii

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và giám định virus cúm gia cầm H5N1 clade 7 3.2. Xác định đặc tính di truyền của virus cúm A H N1 thuộc clade 59 59 62

phân lập Việt Nam

3.2.1. Giải trình tự gen HA (H ) và phân tích cây phả hệ sử d ng chuỗi 62 gen H5 3.2.2. Giải trình tự gen NA(N1) và phân tích cây phả hệ dựa trên chuỗi 71 nucleotide của gen N1 3.2.3. Giải trình tự gen và phân tích cây phả hệ dựa trên chuỗi 78 nucleotide của gen M 3.3. Xác định một số đặc tính sinh học của chủng virus A/H5N1 clade 84

7 A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008

3.3.1. Tính thích ứng trên phôi gà (xác định chỉ số EID50) 3.3.2. Tính thích ứng trên tế bào xơ phôi gà (xác định chỉ số TCID50) 3.3.3. Kết quả xác định độc lực của virus cúm A/H5N1clade 7 3.3.4. Kết quả đánh giá độ bài thải virus trên động vật thí nghiệm 3.3.5. Đánh giá khả năng nhiễm đa phủ tạng của virus cúm 84 89 92 103 106

A/H5N1clade 7

3.3.6. Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng virus cúm A H N1 113

clade phân lập Việt Nam.

3.3.7. Đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin Re-1 đối với virus cúm 116

A H N1HA clade trên gà.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Tài liệu tham khảo Công trình công bố liên quan đến luận án Ph l c 121 124 135 136

DANH M C CÁC KÝ HIỆU, CÁC CH VIẾT T T

Viết tắt Tên đầy đủ

AI CDC CEF CK cs Ct DEF Dk EID50 ELD50 FAO HA HI HPAI IHC LPAI M MDCK MDEF MDT MEGA NA NCBI NCVD NP NS OIE PA PB1 PB2 RNA RRT-PCR TCID50 WHO Avian Influenza Center of Disease Control and Prevention Chicken Embryo Fibroblast Chicken cộng sự Cycle Threshold Duck Embryo Fibroblast Duck Embryo Infection Dose 50% Embryo Lethal Dose 50% Food and Agriculture Organisation Hemaglutinin Hemagglutination Inhibition Highly Pathogenic Avian Influenza Immuno Histochemistry Low Pathogenic Avian Influenza Matrix protein Mardine Darby Canine Kidney Muscovy Duck Embryo Fibroblast Mean Death Time Molecular Evolution Genetic Analysis Neuraminidase National Center for Biotechonology Information National Centre for Veterinary Diagnostics Nucleoprotein Non-strutural protein Office International des Epizooties Polymerase acidic Polymerase basic protein 1 Polymerase basic protein 2 Ribonucleic acid Realtime Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction Tissue Culture Infection Dose 50% World Health Organisation

DANH M C CÁC BẢNG

TT 1.1. Trang 6 Tên bảng Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A H N1 người báo cáo cho WHO đến 4 2012

1.2. ột số đặc điểm triệu chứng của gia cầm mắc cúm A/H5N1 1.3 Một số loại vacxin phòng cúm gia cầm H N1 đang được sử d ng 34 40

trên thế giới Kết quả tiêm phòng vacxin cúm gia cầm chương trình quốc gia

Trình tự primer để giải trình tự gen(theo quy trình CDC)

1.4 2.1. Bảng tổng hợp số liệu tính toán theo phương pháp eed-Muench 2.2. Primer và probe để phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 2.3. Chuẩn bị mix (hỗn hợp phản ứng cho ealtime T-PCR 2.4. Chuẩn bị mix (hỗn hợp phản ứng) T-PC giải trình tự gen 2.5. 3.1. Kết quả xét nghiệm virus từ chương trình giám sát biên giới 3.2. Kết quả giải trình tự gen và phân tích cây phát sinh loài các mẫu 41 49 52 52 55 56 60 62 virus cúm A H N1 phát hiện Lạng Sơn 3.3. Danh sách các chủng virus cúm A H N1 dùng để so sánh và lập cây 66

3.4. 69 phát sinh loài dựa trên gen H5 So sánh mức độ khác biệt về di truyền trên gen HA của chủng virus A H N1 clade với một số chủng tham chiếu 3.5. Danh sách các chủng virus A H N1 sử d ng để so sánh và lập cây 74

3.6. 77

phát sinh loài dựa trên N1 So sánh mức độ khác biệt về di truyền trên gen N1 của 5 chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 với một số chủng tham chiếu 3.7. Danh sách các chủng virus cúm A H N1 sử d ng để so sánh và lập 80

3.8. 83

cây phát sinh loài dựa trên gen So sánh mức độ khác biệt về di truyền trên gen của 5 chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 với một số chủng tham chiếu Theo dõi thời gian gây chết phôi 3.9. 3.10. Kết quả theo dõi tỷ lệ sống/chết của phôi trứng khi gây nhiễm virus 85 86 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008

3.11. Theo dõi thời gian virus gây nhiễm lên tế bào CEF 3.12. Kết quả theo dõi bệnh tích tế bào trên CEF khi gây nhiễm virus 89 90 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 93 3.13. Các axit amin vùng “cleavage site” của virus cúm H N1 độc lực cao clade và một số chủng virus tham chiếu

3.14. Kết quả đánh giá độc lực của virus cúm A/H5N1clade trên gia 95 cầm

3.15. Kết quả theo dõi lâm sàng của gà thí nghiệm 3.16. Đánh giá độ bài thải virus khi gây nhiễm b ng virus A/chicken/ 96 103 Vietnam/NCVD-016/2008 3.17. Kết quả xét nghiệm T-PC đối với một số loại phủ tạng gà gây 107 bệnh b ng virus A H N1 clade và chuyển đổi sang nồng độ virus

109 3.18. Phân bố bệnh tích vi thể và nhuộm IHC phát hiện kháng nguyên virus cúm H N1A chicken Vietnam NCVD-016/2008 3.19. Kết quả xác định đặc tính kháng nguyên của virus cúm A/H5N1 115 clade phân lập được b ng phản ứng HI 3.20. Kết quả theo dõi thí nghiệm công cường độc gà tiêm vacxin cúm gia 118 cầm H5N1 Re-1

vii

DANH M C CÁC H NH

TT 1.1. 1.2. Trang 5 8

1.3. 10

Tên hình Bản đồ phân bố các ca cúm A/H5N1trên thế giới (tính đến 2009) Biểu đồ biểu diễn dịch cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 theo thời gian (A) ô phỏng hình thái của virus cúm, (B) Hình thái kính hiển vi điện tử

14 15 20 20

1.4. ô hình hệ gen virus cúm A 1.5. ô phỏng cấu trúc kháng nguyên Haemalutinin và Neurminidase Sơ đồ minh họa đột biến điểm của các phân đoạn genvirus cúm A 1.6. Sơ đồ minh họa hiện tượng trộn kháng nguyên của virus cúm 1.7. A/H5N1và H3N2 Cây phả hệ dựa trên gen HA các virus cúm A H N1 độc lực cao Sự tiến hóa của các clade virus A/H5N1 theo thời gian

1.8. 1.9. 1.10. Sự phân bố của các clades virus cúm gia cầm trên thế giới từ 2003- 22 23 24

2009

1.11. Thời gian xuất hiện của các clade H5N1 Việt Nam từ 2001-2007 1.12. Hình 1.12. Sự phân bố các clade virus A/H5N1 khác nhau theo 25 27

không gian

Sơ đồ bố trí primer giải trình tự gen H , N1 và virus cúm A H N1

1.13. Các genotype của virus cúm gia cầm A H N1 độc lực cao 1.14. ối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus cúm A 1.15. ô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A tế bào chủ 1.16. Minh hoạ vùng “Cleavage site” của virus cúm độc lực thấp(LPAI) 2.1. 3.1. Hình 3.1. Bản đồ nơi phát hiện được virus A/H5N1 clade 7 Cây phả hệ dựa trên gen H5 của các virus A H N1 clade 7 3.2. 3.3. Hiện tượng chèn và xóa các axit amin tại vị trí cleavage site của các 28 30 31 33 52 61 62 71

chủng virus A H N1 clade phân lập Việt Nam Cây phả hệ dựa trên gen N1 các virus A H N1 clade Cây phả hệ dựa trên gen các virus A H N1 clade

3.4. 3.5. 3.6. Kiểm tra đặc tính gây ngưng kết hồng cầu(phản ứng HA) 3.7. Kết quả kiểm tra bệnh tích phôi bsau khi gây nhiễm b ng chủng virus 73 79 87 88

cúm A H N1 clade phân lập tại Việt Nam

3.8. Hình ảnh tế bào CEF và DEF khi phân lập và chuẩn độ virus 3.9. Một số hình ảnh bệnh tích đại thể gà gây bệnh b ng virus A/H5N1 92 98

Clade 7 (A/Chicken/Vietnam/NCVD 016)

3.10. ôt số hình ảnh thể hiện bệnh tích đại thể gà gây bệnh b ng 99 virus A H N1 clade 2.3.4 và 2.3.2

viii

3.11. Diễn biến sống/chết của gà sau khi gây nhiễm b ng chủng virus 100

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008

3.12. Phân bố virus các cơ quan phủ tạng qua xét nghiệm RRT-PCR 107

(chuyển đổi sang log10)

110 111

3.13. ột số hình ảnh nhuộm hóa mô miễn dịch phủ tạng gà gây bệnh 3.14. ột số hình ảnh bệnh tích vi thể trên phủ tạng gà gây bệnh

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một đất nước nông nghiệp với khoảng 0% dân số sống

nông thôn và gắn liền với lĩnh vực sản xuất nông nghiệp như trồng trọt và chăn

nuôi. Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi gia

cầm nói riêng đang ngày càng phát triển và dần chiếm vị trí quan trọng trong nền

nông nghiệp nước ta. Trong những năm qua do các tiến bộ kỹ thuật về giống,

thức ăn, quản lý, thú y cùng với các biện pháp khuyến khích chăn nuôi của nhà

nước làm cho ngành chăn nuôi gia cầm nước ta phát triển với tốc độ tương đối

cao. Sự phát triển đó đã mang lại hiệu quả kinh tế cho người dân, tạo nhiều cơ

hội việc làm và nâng cao đời sống vật chất tinh thần cho người dân, góp phần xóa

đói giảm nghèo và tạo cơ hội vươn lên làm giàu cho nhiều hộ gia đình đồng thời

góp phần vào nền kinh tế quốc gia.

Tuy nhiên, bên cạnh với sự phát triển đó cũng có rất nhiều thách thức cho

ngành chăn nuôi đó là sự gia tăng và diễn biến ngày càng phức tạp của dịch bệnh,

trong đó phải kể đến bệnh cúm gia cầm do virus cúm A H N1 độc lực cao thuộc

họ Orthomyxoviridae gây ra. Đây là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm có tốc độ

lây lan nhanh và tỷ lệ chết rất cao trong đàn gia cầm nhiễm bệnh.

Bệnh cúm gia cầm xảy ra lần đầu tiên Việt Nam vào cuối năm 2003 đầu

năm 2004 được ghi nhận là do virus cúm A H N1 độc lực cao (HPAI). Kể từ đó

cho đến nay dịch cúm gia cầm H5N1 vẫn liên t c xảy ra Việt Nam tuy nhiên

quy mô dịch đã thay đổi tr nên nhỏ và lẻ tẻ.

Cũng trong những năm qua, các nước trong khu vực châu Á như Nhật

Bản, Hàn quốc, Trung quốc, Lào Thái lan, Indonesia… dịch cúm gia cầm cũng

xảy ra. Việc khống chế dịch cúm gia cầm đã được tiến hành một cách mạnh mẽ,

đã giảm thiểu đi nhiều những thiệt hại mà virus này gây ra nhưng những nguy cơ

bệnh tái phát vẫn luôn tồn tại.

Virus cúm A H N1 độc lực cao không những nguy hiểm cho gia cầm mà

còn rất nguy hiểm đối với con người. Từ năm 2003 cho đến nay, thế giới đã ghi

nhận virus cúm gia cầm đã gây nhiễm lên người 1 nước, với 602 ca bệnh và

3 người đã chết. (WHO,2012).

Virus cúm A H N1 có đặc tính là biến chủng rất nhanh và đến nay đã có

nhiều biến chủng H N1 đã được phát hiện và phân lập nhiều nước khác nhau

từ châu Á sang châu Âu. Đặc biệt Việt Nam chúng ta đã cũng đã phát hiện

được nhiều chủng virus A H N1 khác nhau được phân loại vào các nhánh

(clade) khác nhau như: clade 1, clade 3, clade 2.3.4, clade 2.3.2.1…(C c Thú y,

2012)

Đầu năm 2008 Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương đã phát hiện và

phân lập được một số chủng virus A/H5N1 mới thuộc clade 7 từ gà nhập lậu

biên giới. Virus cúm A/H5N1 mới này trước đó mới chỉ được phát hiện gà

Trung quốc và từng được phát hiện trên người năm 2003. Trung Quốc đã sản

xuất vacxin (Re-4) từ chủng virus A/H5N1 thuộc clade và đã sử d ng phòng

bệnh một số địa phương từ năm 2006 (Chen và cs, 2008). Với thực tế có rất

nhiều gà nhập lậu vào Việt Nam qua biên giới cho thấy nguy cơ virus này sẽ xâm

nhập và nhiễm cho các đàn gia cầm của Việt Nam và có nguy cơ đối với cả con

người.

Vì vậy việc tiến hành nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus này như

khả năng sinh bệnh đối với các đối tượng gia cầm khác nhau, khả năng bảo hộ

của vacxin hiện hành đối với đối với gia cầm chống lại virus trên là cần thiết. Từ

đó có những phương án chủ động tích cực để đối phó nếu virus này xâm nhập

vào đàn gà nội địa nước ta.

Đứng trước thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứ t

đặc tính inh học củ i c A/H5N1 cl de 7 phân lập ở Việt N ”.

Nh m góp phần cung cấp thông tin làm cơ s cho việc xây dựng biện pháp phòng

chống bệnh cúm gia cầm.

 Mục tiê củ đề tài

- Xác định đặc tính di truyền học, tính kháng nguyên và độc lực của

virus cúm A H N1 clade phân lập Việt Nam năm 2008;

- Tạo cơ s hiểu biết rõ hơn về virus cúm gia cầm độc lực cao H N1,

góp phần xây dựng biện pháp phòng chống bệnh cúm gia cầm.

 Ý nghĩ kho học củ đề tài

Đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên Việt Nam có hệ thống về

đặc tính sinh học của virus cúm A H N1 clade .

- Làm cơ s tham khảo cho việc nghiên cứu sự biến đổi của virus cúm

gia cầm tiếp theo, đặc biệt là đối với ngành thú y.

- Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể được sử d ng ph c v cho công

tác giảng dạy

 Ý nghĩ thực tiễn củ đề tài

- Kết quả nghiên cứu là cơ s cho việc hiểu biết rõ hơn về một số đặc

tính sinh học của virus cúm gia cầm.

- Kết quả nghiên cứu có thể được sử d ng làm tiền đề để tiếp t c nghiên

cứu các virus cúm gia cầm thể độc lực cao H N1, cũng như cúm gia cầm độc lực

thấp, và các loại virus cúm khác trên động vật.

- Khuyến cáo cho việc sử d ng vacxin cúm phù hợp với nhánh virus mới

lưu hành trong thực tế.

- Chủ động trong công tác phòng ngừa sự xâm nhập của chủng virus cúm

mới vào nội địa.

 Những đóng góp ới củ đề tài

- Đã xác định được các đặc tính sinh học của virus cúm gia cầm độc lực

cao H5N1 clade 7 phân lập Việt Nam, như đặc tính kháng nguyên, độc lực, khả

năng nhân lên trên động vật cảm nhiễm, môi trường nuôi cấy.

- Đã xác định được đặc tính di truyền, c thể là giải trình tự các gen HA-

H5, NA-N1 và gen atrix ( ) của virus cúm A/H5N1 clade 7.

- Đánh giá được khả năng bảo hộ của vacxin H5N1 Re-1 với virus cúm

A/H5N1 clade 7 tại Việt Nam.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN T I LIỆU

1.1. Lịch ử bệnh c gi cầ

1.1.1. Lịch sử bệnh t ên thế giới

Cúm gia cầm lần đầu tiên được phát hiện Italia vào năm 18 8 với tên

gọi là dịch hạch gà (Fowl plague) (Stubb và cs, 196 ). Nhưng mãi tới năm 1901

mới xác định được yếu tố gây bệnh là căn nguyên siêu nhỏ có khả năng qua

màng lọc và tới năm 19 mới xác định được nguyên nhân chính xác nguyên

nhân gây bệnh cúm gia cầm là virus cúm type A thông qua kháng thể bề mặt

A H N1 và A H N gây chết nhiều gà và gà tây và các loài động vật khác

(Beard và cs, 1998).

Đã xuất hiện 8 đại dịch cúm trong thế kỉ XVII, đại dịch trong thế kỉ

XX. Đại dịch cúm lần đầu tiên được xác nhận đã xảy ra vào những năm 1 10 và

1580. Kể từ đó đến năm 2003, trên toàn thế giới đã có những đợt dịch lớn như:

- Năm 1918 – 1919, một đại dịch cúm đã nổ ra với mức độ trầm trọng đã

gây tử vong khoảng 20 – 40 triệu người trên toàn thế giới. Vào thời kì đó, chưa

có các phương pháp phòng thí nghiệm để giám định tác nhân gây bệnh. Các số

liệu có sức thuyết ph c sau này cho thấy đại dịch này do virus cúm type

A/H1N1.

- Cúm Châu Á – Asian Flu do virus cúm type A H2N2 gây nên, bắt đầu

từ Hong Kong năm 19 ;

- Cúm Hong Kong – Hong Kong Flu do virus cúm type A H3N2, xảy ra

năm 1968;

- Cúm Nga – ussia flu” do virus cúm type A(H1N1) xảy ra năm 1977.

Trong đó, đại dịch cúm “Châu Á” và “Hong Kong” , người mọi lứa tuổi

đều mắc và tỉ lệ tử vong cao đặc biệt đối với người trên 6 tuổi và người có tiền

sử về bệnh tim phổi (Kilbourne, 2006).

Chủng virus cúm A/H5N1được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên

gà tại Scotland vào năm 19 9 và có thể là biến thể H N1 đầu tiên trên thế giới.

Năm 199 Hong Kong, lần đầu tiên virus cúm gia cầm H N1 đã gây ra ổ dịch

trên gia cầm và lây sang người làm 18 ngưòi nhiễm bệnh, 6 người chết và hàng

triệu gia cầm đã bị tiêu huỷ nh m ngăn chặn dịch lây lan. Đây là lần đầu tiên

virus cúm A/H5N1gây bệnh được trên người (Wu và cs, 2008).

Từ cuối năm 2003 đến 2012, dịch cúm gia cầm H N1 bùng phát nhiều

nước châu Á, trong đó có Việt Nam, lây lan nhanh chóng và liên t c tái bùng

phát hàng năm nhiều nước trên thế giới. Đến nay đã có nhiều nước và vùng

lãnh thổ xuất hiện dịch cúm gia cầm H N1 gồm Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan,

Campuchia, Lào, Indonesia, Trung Quốc, alaysia, Hong Kong, Việt Nam.

Ngoài ra, có nước và vùng lãnh thổ có dịch cúm gia cầm nhưng khác chủng

gồm: Pakistan, Hoa Kì, Canada, Nam Phi, Ai Cập, Cộng hoà dân chủ nhân dân

triều tiên và Đài Loan. Tính đến tháng 4-2012 đã có tổng số nước, vùng lãnh

thổ bùng phát dịch cúm làm 2 0 triệu gia cầm chết hoặc bị tiêu huỷ bắt buộc

(WHO, 2008).

Các nước có c /H5N1trên gia cầ hoặc chi hoang dã

Các nước có c /H5N1trên người

Hình 1.1. Bản đồ phân b c c c c A/H5N1t ên thế giới (tính đến 2009)(WHO-2010)

Bảng 1.1. Tổng t ường hợp nhiễ c gi cầ A/H5N1 ở người b o c o cho WHO đến 4/2012 (WHO

2012)

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

2011

2012

Total

Quốc gia

Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death Cases Death

Ajerbaijan

Bangladesh

Cambodia

China

Djibouti

Egypt

167

Indonesia

188 156

Ỉraq

Lao PDR

Myanmar

Nigeria

Pakistan

Thailand

Turkey

Vietnam

123

Total

115

602 355

Đặc biệt, đã có nhiều người nhiễm và bị tử vong do virus cúm H N1, theo

thống kê số người bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 của các nước báo cáo với Tổ

chức Y tế thế giới (WHO) từ th ng 12 2003 đến 12/4/2012, đã có tới 602 trường

hợp mắc cúm H N1, trong số đó 3 trường hợp đã tử vong chiếm tới 58.9%.

Indonesia, Việt Nam và Ai Cập là 3 nước có số người tử vong và nhiễm cao nhất

do virus cúm A/H5N1trên thế giơi, và đang được Tổ chức Y tế Thế giới-WHO

xác định là quốc gia “điểm nóng” có thể xảy ra dịch cúm mới người trong

tương lai cần được quan tâm ngăn chặn, do virus cúm A/H5N1có được các điều

kiện thuận lợi để tiến hoá thích nghi và lây nhiễm trên người (WHO, 2008).

1.1.2. Bệnh c gi cầ ở Việt N

Bệnh cúm gia cầm xuất hiện lần đầu tiên Việt Nam vào cuối tháng

12/2003 (Bùi Quang Anh, 200 ; BCĐQG, 200 ) do virus cúm gia cầm H5N1

độc lực cao (HPAI) gây ra. Sau đó liên t c tái phát và thường vào lúc chuyển

mùa, nhất là v Đông – Xuân. Theo C c Thú y, tính tới năm 2010 thì có 6 đợt

dịch (epidemic) cúm gia cầm H5N1 xảy ra:

- Đợt 1: từ tháng 12 2003 đến tháng 3 2004: dịch bệnh đã xảy ra 2.574

xã, phường, 381 huyện, thị thuộc 57 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh,

chết và tiêu huỷ là 43,9 triệu con (gà: 30,4 triệu; thuỷ cầm: 13,5 triệu). Trong

năm 2003 có 3 ca tử vong người do virus cúm H N1.

- Đợt 2: từ tháng 4 đến tháng 11 2004: dịch phát ra rải rác với quy mô nhỏ

các hộ gia đình chăn nuôi gia cầm, bệnh xuất hiện 46 xã, phường tại 32

huyện, quận, thị xã thuộc 17 tỉnh, thành. Thời gian cao điểm nhất là tháng , sau

đó giảm dần, đến tháng 11 cả nước chỉ có 1 điểm phát dịch. Tổng số gia cầm mắc

bệnh, chết và tiêu huỷ là 84.0 8 con (gà: .999, vịt: 8.132). Trong năm 2004, có

29 ca H5N1 người, có 20 ca tử vong.

- Đợt 3: từ tháng 12 2004 đến tháng 200 : dịch đã xuất hiện 6 0 xã tại

182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố. Số gia cầm tiêu huỷ là 4 0.49 gà, 82 .689

vịt, ngan. Trong năm 200 , có 61 ca bị nhiễm virus cúm A/H5N1 người, trong

đó có 19 ca tử vong.

- Đợt 4: từ tháng 10 200 đến 01/2006: dịch xảy cả 3 miền với 24 tỉnh,

thành tái phát. Tổng số gia cầm tiêu huỷ là 3.9 2. 63 con, trong đó, gà:

1.338.523; thuỷ cầm và loài khác: 2.13 .081.

Hình 1.2. Bi đồ bi u diễn dịch c gi cầ do i c A/H5N1 theo

thời gi n (Cục Th y, 2012)

- Đợt 5: bắt đầu và kéo dài trong suốt năm 200 . Dịch không tập trung mà

rải rác, lẻ tẻ khắp nơi và có thể chia nhiều đợt:

Từ 12 2006 đến 3/2007 dịch xảy ra trên 83 xã, phường của 33 quận,

huyện thuộc 11 tỉnh, thành. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là

103.092 con, trong đó có 13.622 gà ; 89.4 2 ngan, vịt.

Từ 200 đến 8/2007, dịch xảy ra 16 xã, phường của 10 huyện, thị

thuộc 23 tỉnh, thành. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 294.894 con

(21. 2 gà, ; 264. 49 vịt và 8. ngan). Sau khi bị khống chế trong vòng 1

tháng, đến tháng 10 200 , dịch lại tái 1 xã, phường của 9 huyện, quận, thị trấn

thuộc 6 tỉnh, thành phố.

Năm 200 có 8 ca bị nhiễm virus cúm A/H5N1 người, trong đó có 5

người chết.

- Đợt 6: từ đầu năm 2008: xảy ra rải rác với 4 đàn gia cầm tại xã,

phường của 40 huyện thị thuộc 21 tỉnh phát dịch. Tổng số gia cầm tiêu huỷ là

60.090 con, trong đó có 23.498 gà, 36. 92 thuỷ cầm. Năm 2008 có 6 ca mắc

H5N1 người và trong số 6 ca đã tử vong.

Năm 2009, dịch cúm gia cầm đã xảy ra 68 xã, phường, thị trấn của 34

huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh, thành với tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy

trên 12 .000 con. Năm 2009 có ca mắc H5N1 người và tỷ lệ tử vong là 100%

(5/5).

Năm 2010, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ít nhất 63 xã, phường của 3

huyện, quận thuộc 24 tỉnh, thành phố, làm hơn 6.000 con gia cầm mắc bệnh,

chết và buộc phải tiêu hủy, trong đó chủ yếu là vịt (chiếm hơn 0%). Trong năm

2010, có ca mắc H5N1 người và có 2 ca tử vong

(http://www.cucthuy.gov.vn).

1.2. Tình hình nghiên cứ c gi cầ ở Việt N

Bệnh cúm gia cầm xuất hiện Việt nam từ cuối năm 2003 (Trương Văn

Dung và Nguyễn Viết Không, 2004). Từ đó đến nay đã có nhiều nghiên cứu về

virus và bệnh cúm gia cầm Việt Nam, chủ yếu tập trung nghiên cứu dịch tễ

bệnh, khảo sát sự lưu hành của virus, các phương pháp chẩn đoán, nghiên cứu

ứng d ng vacxin, xác định hàm lượng kháng thể sau tiêm phòng, điều tra mức độ

nhiễm bệnh và giám định phân tử và phân nhóm hệ phả virus gây bệnh, nghiên

cứu sản xuất và thử nghiệm vacxin.

Nghiên cứu định type, biến đổi di truyền và gen học tiến hóa của virus cúm

A/H5N1 được các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ những

tháng đầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003. Những chuỗi gen giúp

xác định subtype H5, subtype N1 và các gen cấu trúc đã được Viện Công nghệ

Sinh học, Viện Pasteur TP Hồ Chí inh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện

Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen (Lê Thanh Hòa, 2006, Dung

Nguyen T và cs, 2008). Trên cơ s phân tích trình tự gen kháng nguyên H và

N1, các tác giả khẳng định nguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và

người tại Việt Nam cùng nhóm với virus A/H5N1 phân lập tại Trung Quốc

(Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Lê Thanh Hòa, 2006; uramoto và cs, 200 ).

Các biến chủng H N1 của Hong Kong, Trung Quốc phân lập những năm 199 -

2001 và Hàn Quốc, Đài Loan (phân lập năm 2003) đều có nguồn gốc từ chim cút

và ngỗng (A Goose Guandong 1 96) vùng Quảng Đông (Trung Quốc), đó là các

biến chủng thuộc dòng Quảng Đông (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Lê Thanh

Hòa, 2006; Lê Trần Bình và cs, 2006). Như vậy, virus cúm gia cầm gây bệnh

gia cầm và người tại Việt Nam là cúm A/H5N1type A thuộc thế hệ mới đã có

biến đổi cơ bản về gen H và gen N1, nhưng vẫn có cùng nguồn gốc với H N1

từ vùng địa lý Nam Trung Quốc và Hong Kong (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004;

Lee và cs, 200 ; Simmons và cs, 200 ). Các chủng phân lập những năm 2004-

2006 đã được nghiên cứu khá chi tiết về góc độ gen học và quan hệ phân tử với

các chủng trong vùng và thế giới, kết quả khẳng định virus A/H5N1 vùng Nam

và Đông Nam Á thuộc nhóm di truyền VT (viết tắt: Vietnam-Thailand-

alaysia), có những đặc tính sinh học nhất định khác với các nhóm vùng Trung

Quốc và Hong Kong (Lee và cs, 200 , Chen và cs, 2006). Năm 200 , xuất hiện

thêm biến chủng H N1 dưới dòng Phúc Kiến tại Việt Nam, đã và đang làm phức

tạp thêm vấn đề dịch tễ học và quan hệ kháng nguyên và miễn dịch, do tỷ lệ

tương đồng kháng nguyên HA(H ) và NA(N1) thấp so với các chủng phân dòng

Quảng Đông, tuy nhiên vẫn còn có khả năng bảo hộ miễn dịch (Nguyễn ạnh

Kiên và cs, 2008, Lê Thanh Hòa và cs, 2008; Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004;

Dung Nguyen T và cs, 2008).

Nghiên cứu vấn đề gen học kháng nguyên liên quan đến vacxin và miễn

dịch, đã được Viện Công nghệ sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện

Pasteur TP Hồ Chí inh, Viện Thú y trung ương tiến hành đó là việc thu thập

gen kháng nguyên H và N1 từ các chủng phân lập trên gà, vịt, ngan của Việt

Nam các năm 2004 - 2008, và so sánh với trình tự chuỗi gen cúm A/H5N1 của

các chủng cường độc đương nhiễm và vacxin của Việt Nam và thế giới (Lê

Thanh Hòa, 2004; Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Lê Trần Bình và cs, 2006; Lê

Thanh Hòa, 2006; Dung Nguyen T và cs, 2008). Năm 200 , xuất hiện thêm

chủng H N1 dưới dòng Phúc Kiến (clade 2.3.4) tại Việt Nam, qua phân tích gen

giữa các chủng phân lập tại Nghệ An (Việt Nam),

A/Dk Vietnam NA114 200 (H N1) và A Dk Vietnam NA 2 200 (H N1),

thuộc dòng Phúc Kiến) với các chủng H N1 thuộc phân dòng Quảng Đông, bao

gồm một số chủng làm vacxin đang sử d ng, chỉ đạt 94% (Lê Thanh Hòa và cs,

2008, Nguyễn ạnh Kiên và cs, 2008). Nhận định hỗn hợp virus gây bệnh và

phân hóa kháng nguyên của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam cũng đã được xác

nhận qua phân tích hàng ch c chủng thu nhận từ nhiều vùng khác nhau trong cả

nước (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Dung Nguyên T và cs, 2008). Điều này

ảnh hư ng đến dịch tễ, chẩn đoán, phòng trừ và quan hệ lây nhiễm trong tự nhiên

(Simmons và cs, 200 ; Alexander, 200 ), cũng như vai trò miễn dịch của các

chủng cổ điển đang làm vacxin tại Việt Nam và thế giới (vacxin H N1, chủng

gốc: A-Gs-CN-Gd1(96)(H5N1); vacxin H N2, chủng gốc: A-Turkey-ENG-

N28(73)(H5N2); vacxin TrovacAIV-H , chủng gốc: A-Tk-IRE-

1378(83)(H5N8)); vacxin H N2, chủng gốc: A-Ck-MEX-Hidalgo-

232(94)(H N2)) và vacxin H N1 thế hệ mới chủng NIB G-14, sử d ng chủng

gốc: A Vietnam 1194 2004(H N1) hiện nay đang được Việt Nam nghiên cứu sản

xuất (Lê Trần Bình và cs, 2006; Nguyễn Thị Lan Phương và Lê Văn Hiệp, 2006;

Lê Trần Bình và cs, 200 ).

Vấn đề chẩn đoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phân biệt

cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt các

subtype HA và NA đã được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết hợp

nghiên cứu với các tổ chức thế giới. Phát hiện nhanh H N1 và các subtype khác

bao gồm việc sử d ng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học phân tử đã

được xây dựng thành phương pháp (Chan và cs, 200 ; WHO, 2008). Nghiên cứu

vacxin và miễn dịch, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã có những đóng góp

nhất định về tạo chế phẩm kháng nguyên, tạo vacxin di truyền ngược hoặc vector

tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam (Gao và cs, 2006; Bạch Thị

Như Quỳnh, 2006; Lu và cs, 2006; Ge và cs, 200 ).

Về nghiên cứu sản xuất vacxin, Viện Công nghệ sinh học tiến thực hiện đề

tài “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vacxin cúm A/H5N1 cho gia cầm”

và “Đánh giá chất lượng vacxin phòng bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm tại Việt

Nam b ng chủng NIB G-14” trong giai đoạn 2006 - 2008, kết hợp với Viện Thú

y, Xí nghiệp thuốc Thú y trung ương (VETVACO), Công ty Thuốc thú y trung

ương II (NAVETCO), Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương, thực

hiện nghiên cứu có được vacxin sản xuất từ chủng NIB G-14 (Lê Trần Bình,

2007). Đây là chủng vacxin được tạo ra b ng công nghệ di truyền ngược tại Viện

Tiêu chuẩn và Kiểm định sinh học Quốc gia (Vương quốc Anh). Kết quả là đã

xây dựng được các quy trình sản xuất giống, sản xuất vacxin, kiểm nghiệm và

bảo quản vacxin cúm A/H5N1 và kiểm nghiệm miễn dịch đạt chất lượng b ng

phương pháp huyết thanh học và thử thách cường độc (Nguyễn Thị Lan Phương

và Lê Văn Hiệp, 2006; Lê Trần Bình, 200 ). Hiện nay, vacxin này đã được

chuyển giao sản xuất tại NAVETCO với tên thương phẩm là NAVETCO-

VIFLUVAC. Song song với những nội dung nghiên cứu về cúm gia cầm gia

cầm, các cơ s y tế gồm bệnh viện, viện nghiên cứu (Bệnh viện Nhi trung ương,

Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Pasteur TP Hồ Chí inh, Viện Vacxin

Nha Trang) đều có những triển khai các lĩnh vực nghiên cứu liên quan đến cúm

A/H5N1 trên người (Nguyễn Thị Kim Tiến, 200 ; Dinh và cs, 2006; Chan và cs,

200 ; Hatta và cs, 200 ).

1.3. C gi cầ à c c đặc đi m củ i c gi cầm

Cúm gia cầm (Avian Influenza-AI) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của

gia cầm, do nhóm virus cúm type A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Đây là

nhóm virus có biên độ vật chủ rộng, được phân chia thành nhiều subtype khác

nhau dựa trên hai kháng nguyên bề mặt capsid của hạt virus là HA và NA (De

Wit, 2008). Nhóm virus cúm A có 16 subtype HA (từ H1 đến H16) và 9 subtype

NA (từ N1 đến N9). Sự tổ hợp (reassortment) giữa các subtype HA và NA, về

mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau. ặt khác, virus cúm A có đặc

tính quan trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen (đặc biệt gen NA và HA),

hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau, trong quá trình xâm nhiễm và tồn

tại lây truyền giữa các loài vật chủ dẫn đến việc tạo nên nhiều subtype có độc

tính và khả năng gây bệnh khác nhau.

Họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện bao gồm 4 nhóm virus, đó là:

nhóm virus cúm A (Influenza A); nhóm virus cúm B (Influenza B); nhóm virus

cúm C (Influenza C); và nhóm Thogotovirus. Các nhóm virus khác nhau b i các

kháng nguyên bề mặt capsid, virus cúm A và B là Hemagglutinin (HA), virus

cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), và Thogotovirus là

Glycoprotein (GP)(Ito và cs, 1998; urphy và Webster, 1996).

1.3.1. Đặc đi inh học phân tử củ i c gi cầ

Hình thái và cấu trúc của virus cúm gia cầm type A đuợc Kawaoka và

urphy (1988) mô tả khá chi tiết. Qua kính hiển vi điện tử, virion có dạng hình

khối tròn, hình trứng, hoặc dạng khối dài, đường kính khoảng 80 – 120 nm.

Nhiều khi virus có dạng hình sợi dài đến vài µm. Phân tử lượng của hạt virus

khoảng 250 triệu Dalton.

A B

Hình 1.3. Hình ảnh i c A (A)Hình ảnh ph ng; (B Hình th i dưới kính hi n i điện tử (http://micro.magnet.fsu.edu/cells/viruses/influenzavirus.html)

Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền NA của virus,

bản chất cấu tạo là màng lipit kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc

hiệu hóa gắn vào các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 00 “gai

mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường

kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là

glycoprotein gồm: HA, NA, A (matrix) và các dấu ấn khác của virus (Bender

và cs, 1999; Zhao và cs, 2008). Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử

NA và HA (tỉ lệ khoảng 1 NA/4 HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai

trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus tế bào cảm nhiễm (Murphy

và Webster, 1996; Uiprasertkul và cs, 200 ).

Hệ gen của virus cúm A là NA sợi đơn âm (viết tắt là (-) ss NA), gồm 8

phân đoạn riêng biệt (HA, NA, , NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành

một sợi duy nhất bên trong vỏ capsid, mã hóa cho 11 protein tương ứng của

virus, trong đó phân đoạn mã hóa cho 2 protein là 1 và 2; phân đoạn NS

mã hóa cho 2 protein là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1

và PB1-F2 (Ito và cs, 1998; Conenello và cs, 200 ) (Hình 1.3.).

- hân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp protein

enzyme PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase của

virus, chịu trách nhiệm kh i đầu phiên mã NA virus. Protein PB2 có khối lượng

phân tử theo tính toán khoảng 84.103 Da (trên thực tế là 8 .103 Da) (Murphy và

Webster, 1996). Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ được cho là có liên

quan đến vị trí amino acid 62 protein PB2 ( virus cúm gia cầm vị trí này là

Glu - thích ứng nhiệt độ cơ thể gia cầm khoảng 40oC, còn virus thích nghi trên

người là Lys - thích ứng nhiệt độ cơ thể người khoảng 3 oC) (Subbarao và cs,

1998; Wang và cs, 2009).

- hân đoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp

enzyme PB1 - tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzym polymerase trong quá

trình tổng hợp NA virus, chịu trách nhiệm gắn mũ NA ( urphy và Webster,

1996). Gần đây, đã có phát hiện thêm một protein (PB1-F2) được mã hóa b i

một khung đọc m khác của PB1, có vai trò gây ra hiện tượng apoptosis (hiện

tượng tế bào chết theo chương trình) (Tumpey và cs, 2002).

- hân đoạn 3 (gen PA) có kích thước 2233 bp, là phân đoạn gen bảo tồn

cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA có khối lượng phân tử theo tính toán

khoảng 83.103 Da (trên thực tế là 96.103 Da). PA là một tiểu đơn vị của

polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã NA trong quá trình tổng hợp

NA của virus (Luong và Palese, 1992).

- hân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm

A ( A H1N1 là 1 8 bp; H9N1 là 1 14 bp; H N1 là khoảng 1 04 - 1710

bp). Đây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề

mặt virus cúm, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2. Vùng nối giữa HA1 và HA2

gồm một số amino acid mang tính kiềm được mã hóa b i một chuỗi

oligonucleotide, đó là điểm cắt của enzym protease, đây là vùng quyết định độc

lực của virus (Bosch và cs, 1981; Gambotto và cs, 2008). Protein HA có khối

lượng phân tử khoảng 63.103 Da (nếu không được glycosyl hóa) và .103 Da

(nếu được glycosyl hóa, trong đó HA1 là 48.103 Da và HA2 là 29.103 Da)

(Keawcharoen và cs, 200 ; Luong và Palese, 1992).

- hân đoạn 5 (gen NP) kích thước khoảng 1 6 bp, mã hóa tổng hợp

nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận

chuyển NA giữa nhân và bào tương tế bào chủ. NP là một protein được

glycosyl hóa, có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong

các hạt virus dạng kết hợp với mỗi phân đoạn NA, có khối lượng phân tử theo

tính toán khoảng 6.103 Da (trên thực tế là 0 - 60.103 Da) (Luong và Palese,

1992; urphy và Webster, 1996; ӧmer-Oberdӧrfer và cs, 2008).

- hân đoạn 6 (gen NA) là một gen kháng nguyên của virus, có chiều dài

thay đổi theo từng chủng virus cúm A ( A H6N2 là 1413 bp, A H N1 thay đổi

khoảng từ 13 0 - 1410 bp) (Lê Thanh Hòa, 2004). Đây là gen mã hóa tổng hợp

protein NA, kháng nguyên bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử theo

tính toán khoảng 0.103 Da (trên thực tế là 0 - 60.103 Da). Các nghiên cứu

phân tử gen NA của virus cúm cho thấy phần đầu ’- của gen này (hay phần tận

cùng N của polypeptide NA) có tính biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng

virus cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quá trình thích ứng và gây bệnh của

virus cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau (Castrucci và Kawaoka, 1993;

Baigent và c Cauley, 2001; Uiprasertkul và cs 200 ). Đặc trưng biến đổi của

gen NA trong virus cúm A là hiện tượng đột biến trượt-xóa một đoạn gen là

nucleotide, rồi sau đó là 60 nucleotide, làm cho độ dài vốn có trước đây của

NA(N1) là 1410 bp còn 13 0 bp (Castrucci và Kawaoka, 1993; Lê Thanh Hòa,

2006; Kaewcharoen và cs, 200 ).

Các phân đoạn gen , NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức năng

khác nhau của virus, có độ dài tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A,

bao gồm:

- hân đoạn 7 (gen ) có kích thước khoảng 102 bp, mã hóa cho

protein đệm (matrix protein - ) của virus (gồm hai tiểu phần là 1 và 2 được

tạo ra b i những khung đọc m khác nhau của cùng một phân đoạn NA), cùng

với HA và NA có khoảng 3000 phân tử P trên bề mặt capsid của virus cúm A,

có mối quan hệ tương tác bề mặt với hemagglutinin (Scholtissek và cs, 2002).

Protein 1 là một protein nền, là thành phần chính của virus có chức năng bao

bọc NA tạo nên phức hợp NP và tham gia vào quá trình “nảy chồi” của virus

(Luong và Palese, 1993; urphy và Webster, 1996; Basler, 200 ). Protein 2 là

chuỗi polypeptide bé, có khối lượng phân tử theo tính toán là 11.103 Da (trên

thực tế là 1 .103 Da), là protein chuyển màng - kênh ion (ion channel) cần thiết

cho khả năng lây nhiễm của virus, chịu trách nhiệm “c i áo” virus trình diện hệ

gen bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ (Scholtissek

và cs, 2002).

- hân đoạn 8 (gen NS), là gen mã hóa protein không cấu trúc (non

structural protein), có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích

thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là

NEP, nuclear export protein), có vai trò bảo vệ hệ gen của virus nếu thiếu chúng

virus sinh ra sẽ bị thiểu năng ( urphy và Webster, 1996; Sekellick và cs, 2000).

Độc tính của virus có sự liên quan với gen không cấu trúc (non-structural gen)

này được tìm thấy biến chủng A H N1 9 (Tian và cs, 200 ), trong tự nhiên,

việc đột biến xóa đi một phần gen có liên quan đến giảm độc lực (Zhou và cs,

2007). NS1 có khối lượng phân tử theo tính toán là 2 .103 Da (trên thực tế là

25.103 Da), chịu trách nhiệm vận chuyển NA thông tin của virus từ nhân ra bào

tương tế bào nhiễm, và tác động lên các NA vận chuyển cũng như các quá trình

cắt và dịch mã của tế bào chủ. NEP hay NS2, là gen hình thành từ hai đoạn gen

(30 bp và 336 bp) mã hóa loại protein có khối lượng phân tử theo tính toán

khoảng 14.103 Da (trên thực tế là 12x103 Da), đóng vai trò vận chuyển các NP

của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới

(Sekellick và cs, 2000; Zhu và cs, 2008).

Hình 1.4. M hình hệ gen i c A (St bb, 1965

Các phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein (HA và NA) bề mặt capsid

của virus, có tính kháng nguyên đặc trưng theo từng chủng virus cúm A. Nói

cách khác protein HA và NA cho phép xác định subtype của virus cúm A nói

chung và virus cúm gia cầm nói riêng.

Như vậy, virus cúm A (c thể: cúm A/H5N1 ) có hệ gen được cấu trúc từ

8 phân đoạn riêng biệt và không có gen mã hóa enzyme sửa chữa NA, tạo điều

kiện thuận lợi cho sự xuất hiện các đột biến điểm trong các phân đoạn gen hệ gen

qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao đổi các phân đoạn gen giữa

các chủng virus cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn đến thay

đổi đặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng virus cúm A mới (Suarez và

Schultz-Cherry, 2000).

1.3.2. Kh ng ng yên củ i c gi cầ

Virus cúm type A được xác định subtype dựa trên cơ s kháng nguyên

(protein) bề mặt là HA (Hemagglutinin-viết tắt là H) và NA (Neuraminidase-viết

tắt là N) có vai trò quan trọng trong miễn dịch bảo hộ. Hemagglutinin được coi

là yếu tố vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus

cúm A.

1.3.2.1. Protein HA (Hemagglutinin)

Protein hemagglutinin là một glycoprotein thuộc protein màng type I

(lectin), có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro),

kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong tỏa sự ngưng kết đó, được gọi là kháng

thể ngăn tr ngưng kết hồng cầu (HI- Hemagglutinin Inhibitory antibody). Có 16

subtype HA đã được phát hiện (H1 - H16), subtype H16 mới được tìm thấy

virus gây bệnh cho hải âu đầu đen - Th y Điển, 1999), ba subtype (H1, H2 và

H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh người liên quan đến các đại dịch cúm trong

lịch sử ( urphy và Webster, 1996). Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt

capsid của một virus, có vai trò quan trọng trong quá trình nhận diện virus và

kh i động quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ (Bender và cs, 1999;

Wagner và cs, 2002). Phân tử HA có dạng hình tr , dài khoảng 130 ăngstron (Å),

cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai

tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (2 kDa), liên kết với nhau b i các cầu nối

disulfide (-S-S-). Các đơn phân sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa

(glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là tiểu đơn vị HA2, phần đầu tự do

hình chỏm cầu được tạo b i dưới đơn vị HA1 chứa đựng vị trí gắn với th thể

thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích (Bosch và cs, 1981; Wagner và

cs, 2002).

Hình 1.5. M ph ng cấ t c kh ng ng yên H e l tinin à

Neuraminidase (www.aht.org.uk)

Sự kết hợp của HA với th thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid)

trên bề mặt màng tế bào, kh i đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ

giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng NA hệ gen thực hiện quá

trình nhân lên trong tế bào cảm nhiễm. Quá trình kết hợp ph thuộc vào sự phù

hợp cấu hình không gian của th thể chứa acid sialic của tế bào đích với vị trí gắn

với th thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng

của virus các loài vật chủ khác nhau (Wagner và cs, 2002; Wasilenko và cs,

2008). Vị trí amino acid 226 (aa226) của HA1 được xác định là vị trí quyết định

phù hợp gắn HA với th thể đặc hiệu của nó, hầu hết các chủng virus cúm A

lưu hành trong tự nhiên vị trí này là Glycine, thích ứng với th thể Gal α-2,3

sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose

góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật chủ

tự nhiên của virus cúm A). Ngoài ra, một số vị trí amino acid khác: Glutamine

222, Glycine 224, hay cấu trúc SGVSS và NGQSG cũng có sự liên quan chặt

chẽ đến khả năng thích ứng với th thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ

(Luong và Palese, 1993). Đặc biệt, một số chủng virus cường độc A H Nx;

A H Nx lưu hành hiện nay có thể xâm nhiễm trên người, khi chúng có tải lượng

cao trong đường hô hấp (do tiếp xúc trực tiếp với chất thải hay gia cầm nhiễm

bệnh) (Bauer và cs, 2006; Hui, 2008; Wasilenko và cs, 2008).

Trình tự mã hóa chuỗi nối, và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng

như các vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với th thể thích ứng, được

coi là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA

(Luong và Palese, 1993). Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của

virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với

từng type HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa virus, được coi là protein vừa

quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích của bảo

vệ miễn dịch học nh m ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus cơ thể nhiễm, cơ s

điều chế các vacxin phòng cúm hiện nay (Bosch và cs, 198; Horimoto và

Kawaoka, 2001; atrosovich và cs, 1999).

1.3.2.2. Protein NA (neuraminidase)

Protein neurominidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C 3.2.1.18),

là một protein enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid

của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng subtype NA

(Baigent và c Cauley, 2001; Uiprasertkul và cs, 2007). Có 9 subtype (từ N1

đến N9) được phát hiện chủ yếu virus cúm gia cầm, hai subtype N1 và N2

được tìm thấy virus cúm người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử

(Wasilenko và cs, 2008). Có khoảng 100 phân tử NA xen giữa các phân tử HA

trên bề mặt capsid hạt virus. Phân tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do

(chứa vùng hoạt động) gồm 4 dưới đơn vị giống như hình cầu n m trên cùng một

mặt phẳng, và phần kị nước gắn vào vỏ capsid (Castrucci và Kawaoka, 1993).

Protein NA có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc acid sialic

của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng

hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ

thể vật chủ, và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào. ặt

khác, NA tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa àng”, đẩy

nhanh quá trình c i áo “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào

tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn

(Uiprasertkul và cs, 200 ). Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải

phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp,

tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các

chất ức chế không đặc hiệu. Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu

tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus cúm

A cơ thể vật chủ. Do đó, NA là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế

virus không đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu)

phong tỏa enzyme này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào

đích, bảo vệ cơ thể (Aoki và cs, 200 ; Castrucci và Kawaoka, 1993).

Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia

kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với

kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác d ng phong tỏa

protein NA (Doherty và cs, 2006). Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng

nguyên HA của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể

với virus cúm A, và là cơ s điều chế các vacxin phòng cúm hiện nay cho người

và gia cầm, nh m ngăn chặn dịch cúm gia cầm và hạn chế lây truyền sang

người (Suarez và Schultz-Cherry, 2000; Wu và cs, 2008).

1.3.2.3. C c phương thức biến đổi kh ng ng yên

Có ba phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên virus cúm A

(Wu và cs, 2008).

a. Hiện tượng lệch kháng nguyên

Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra

các phân đoạn gen hệ gen của virus. Do virus cúm A kí sinh nội bào bắt buộc,

không có cơ chế “đọc và sửa bản sao - proof reading” trong quá trình phiên mã

và sao chép nhân tế bào đích. Sự thiếu h t enzyme sửa chữa NA dẫn đến các

enzyme sao chép ph thuộc NA sẽ có thể “gài” thêm (đột biến giãn nở), làm

mất đi hoặc thay thế (đột biến trượt-xóa) (Lê Thanh Hòa và cs, 2006) một hay

nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử NA chuỗi đơn mới của

virus (Conenello và cs, 200 ; urphy và Webster, 1996). Tuỳ thuộc vị trí xảy ra

các đột biến trong bộ ba mã hóa, mà có thể trực tiếp làm thay đổi các amino acid

trong trình tự của protein được mã hóa biểu hiện, dẫn đến thay đổi thuộc tính của

protein, hoặc được tích lũy trong phân đoạn gen xảy ra đột biến (đột biến điểm).

Tần suất xảy ra đột biến điểm rất cao, cứ mỗi 10.000 nucleotide (tương ứng với

độ dài của NA hệ gen của virus cúm A) thì có 1 nucleotide sai khác (Prel và cs,

2008; Wagner và cs, 2002). Như vậy, gần như mỗi hạt virus mới được sinh ra

đều chứa đựng một đột biến điểm trong hệ gen của nó, và các đột biến này được

tích lũy qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một subtype virus mới có những

đặc tính kháng nguyên mới có thể bị sai lệch (Hình 1.6).

Hiện tượng này thường xảy ra các phân đoạn gen kháng nguyên NA và

HA, tạo ra các bộ mã tổng hợp các amino acid mới, hoặc làm thay đổi cấu trúc

dẫn đến thay đổi đặc tính của protein đó, hoặc có khả năng glycosyl hóa rất cao

trong cấu trúc chuỗi polypeptide kháng nguyên, tạo ra một biến thể virus mới

thay đổi độc lực gây bệnh hay đặc tính kháng nguyên mới (Wasilenko và cs,

2008, acken và cs, 2006; Chen và cs, 2008).

b. Hiện tượng trộn kháng nguyên

Hiện tượng trộn kháng nguyên (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) các gen

kháng nguyên (antigenic shift) chỉ có virus cúm, và rất ít một số virus NA

gây bệnh gia cầm khác, cho phép virus có khả năng biến chủng rất cao. Hệ gen

gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt của virus cúm A được 2 chủng virus cúm A khác

nhau khi đồng nhiễm trong một tế bào trao đổi cho nhau, để có thể xảy ra sự hoà

trộn (reassort) hoặc trao đổi (swap) các phân đoạn gen của hai chủng virus đó

trong quá trình kết hợp lại NA hệ gen, tạo ra các trạng thái khác nhau của NA

hệ gen của các hạt virus mới từ hai NA hệ gen của những virus ban đầu. Kết quả

là đã tạo ra thế hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp, và đôi khi giúp cho

chúng có khả năng lây nhiễm loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh

(Hình 1. ) (Hilleman, 2002; acken và cs, 2006; Chen và cs, 2006).

c. Hiện tượng glycosyl hóa

Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của một chuỗi carbonhydrate

(oligosaccharide) vào với amino acid Asparagine (N) một số vị trí nhất định

trong chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác của virus

cúm. Thông thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí N-X-S/T (N =

Asparagine; X = amino acid bất kì, trừ Proline; S T = Serine hoặc Threonine)

(Baigent và cCauley, 2001). Đây là những vị trí được cho là gắn kết với các

kháng thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên, nh m bảo vệ cơ

thể nhiễm. Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh ra đột biến điểm hình thành bộ

mã của Asparagine, tạo tiền đề cho hiện tượng glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp

chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi biểu hiện đặc tính kháng nguyên của

HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác động miễn dịch bảo hộ của cơ thể chủ

và điều hoà sự nhân lên của virus (Baigent và McCauley, 2001).

Hiện tượng “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” xảy ra liên t c theo thời

gian, còn hiện tượng “trộn kháng nguyên” có thể xảy ra với tất cả các chủng của

virus cúm A, khi đồng nhiễm trong một tế bào tất cả các loài vật chủ khác nhau.

Đây cũng chính là vấn đề đáng lo ngại của virus cúm A/H5N1 hiện nay, mặc dù

virus này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng người, nhưng nó có khả năng

gây bệnh được cho người, và rất có thể A H N1 tái tổ hợp (vay ượn) gen HA hay

NA, hoặc cả hai gen của các chủng virus cúm A đã thích nghi người, để tạo ra

một biến chủng virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng người, gây ra nguy cơ

của một đại dịch cúm mới và đặt ra một định hướng mới trong phòng chống

(Hilleman, 2002; Guan và cs, 2002; Li và cs, 2004; Kim và cs, 2008).

Hình 1.6. Sơ đồ minh họ đ t biến đi m củ c c phân đoạn gen i c A Hình 1.7. Sơ đồ minh họa hiện tượng tr n kh ng ng yên củ i c A/H5N1 à H3N2

1.3.3. Đặc đi tiến hó à hình thành genotype củ i c gi cầ gi i

đoạn 1996-2008

1.3.3.1. Sự tiến hó củ i c A/H5N1 à phân loại Clade dự t ên phân

tích hệ phả gen HA.

Năm 1996, H N1 được phân lập từ ngỗng tại một ổ dịch Quảng Đông

(Trung Quốc) và chủng này được coi là chủng nguyên thủy tạo nên các dòng virus

gây bệnh cúm gia cầm trong 12 năm qua (Xu và cs, 1999). Chủng virus nguyên

thủy này, lúc đó cung cấp nguồn gen HA(H ) cho tiến trình tái tổ hợp tạo nên các

biến chủng gây dịch bệnh trên gia cầm và người Hong Kong năm 199 , và

nguồn gen khung khác của virus cúm A/H5N1 Hong Kong được kiến tạo từ virus

cúm A có chim cút (Guan và cs, 2002). iêng nguồn gen NA(N1) còn chưa biết

được lấy từ đâu, nhưng cấu trúc của gen có hiện tượng xóa đi nucleotide mã

hóa cho 19 amino acid, tại vùng đầu N của protein neuraminidase, và đột biến

“xóa gen” này của N1 có liên quan đến tính thích ứng của virus cúm từ thuỷ cầm

lên gia cầm trên cạn và người ( atrosovich và cs, 1999). Đối với gen HA(H ) đột

biến giãn n chuỗi nối giữa HA1 và HA2 mã hóa cho các amino acid kiềm

(Arginine và Lysine) có liên quan đến tiến trình tăng cường độc lực, và các

chủng thuộc dòng Quảng Đông (Guangdong-like sublineage), các amino acid

thông thường là -RRRKK- (Claas và cs, 1998; atrosovich và cs, 1999).

Sau một năm gây bệnh tại Hong Kong, do toàn bộ đàn gia cầm bị tiêu diệt,

virus cúm A/H5N1 nguyên thủy gốc Quảng Đông không còn gia cầm cạn để gây

bệnh, người ta tư ng chúng đã biến mất, nhưng thực tế chủng nguyên thủy này

vẫn tiếp t c tồn tại trong ngỗng vùng Nam Trung Quốc, tr thành nguồn gen tái

tổ hợp hình thành biến chủng mới (Cauthen và cs, 2000; Wasilenko và cs, 2008).

Trong các năm 199 - 2002, một số biến chủng virus cúm A/H5N1 mang nhiều

đặc tính kháng nguyên khác nhau của subtype H được hình thành tạo nên nhóm

kháng nguyên (clade) 1 có độc lực cao với gà nhưng thấp đối với vịt, để rồi bị

đào thải trong những năm 2001 - 2002 (Guan và cs, 2002; Lee và cs, 200 ). Tiếp

t c, trong năm 2002 - 2003, gen HA(H ) có những đột biến mới do hậu quả của

hiện tượng lệch kháng nguyên (antigenic drift), để rồi tạo nên biến chủng có tính

gây bệnh cực kỳ cao, đặc biệt đối với vịt, và lây sang người (Guan và cs, 2002;

Sturm- amirez và cs, 200 ). Đặc tính thích ứng gây bệnh trên người càng ngày

càng cao dần, cùng với độc lực tăng cường đối với đa vật chủ bao gồm vịt, gà,

ngan, ngỗng, chim cút, chim hoang dã và người, để rồi hình thành nhiều biến

chủng xâm nhập các nước phía Nam châu Á trong đó có Việt Nam, Thái Lan,

Indonesia, Lào, Campuchia…(Guan và cs, 2002; Pantin-Jackwood, 2007).

Có thể nói, sau giai đoạn 199 - 2003, virus cúm A H N1 đã đạt đến mức

độ hoàn thiện về đặc tính gây bệnh và thích ứng đa vật chủ, tr nên mối nguy cơ

gây bệnh rất cao đối với gia cầm và người trong các năm 2004 - 200 (Lee và cs,

200 ; Smith và cs, 2006). Tuy nhiên, xét về di truyền học và tính kháng nguyên,

các chủng H N1 giai đoạn 199 - 2002 vẫn mang tính đồng nhất kháng nguyên

cùng với chủng nguyên thuỷ A Gs Gd 1 96 của Quảng Đông (Chen và cs, 2004),

và bắt đầu phân hóa giai đoạn dịch cúm ác liệt xảy ra năm 2003 - 2005 (De

Jong và Hien, 2006). Sự xuất hiện của genotype Z với tính gây bệnh ác liệt trong

những năm này các nước Đông Nam Á là b ng chứng của sự đột biến “lệch

kháng nguyên” của cúm A H N1 (Lee và cs, 200 ; WHO, 2004).

Hình 1.8. Cây phả hệ dự t ên gen HA c c i c A/H5N1 đ c lực cao

(WHO, 2008)

Cuối năm 200 , có nhiều dưới dòng của virus cúm A/H5N1 cùng lúc được

hình thành, đó là sự xuất hiện phân dòng Thanh Hải (Qinghai and Qinghai-like

sublineage) và phân dòng Phúc Kiến (Fujian and Fujian-like sublineage), tràn

ngập châu Á bao gồm Trung Quốc, Hong Kong, Việt Nam, Indonesia, Thái Lan

(Lee và cs, 200 ; Sim và cs, 200 , Simmons và cs, 200 ), tràn sang Trung Á,

châu Âu và châu Phi có tính gây bệnh cao đối với người (Ducatez và cs, 200 ;

Pantin-Jackwood, 200 ; Zhao và cs, 2008). Các chủng thuộc dưới dòng Phúc

Kiến có cấu trúc gen NA(N1) không thay đổi nhiều, nhưng gen HA(H ) có motif

amino acid vùng nối của điểm cắt protease là -RRRK-, giảm mất một Lysine

(K) so với các chủng dưới dòng Quảng Đông (Simmons và cs, 200 ), và do vậy

kể từ 2006 đến nay, nhiều chủng dòng virus cúm A/H5N1 cùng tồn tại gây bệnh,

trong đó có nước ta (Dung Nguyen T và cs, 2008). Trong các năm 2006 - 2008,

tuy bình diện dịch cúm gia cầm không ác liệt như những năm 2003-200 , nhưng

do xuất hiện nhiều chủng A H N1 có biến động kháng nguyên và độc lực, vấn đề

dịch tễ học cúm A/H5N1 có thể đã tr nên phức tạp hơn (Zhao và cs, 2008;

Gambotto và cs, 2008).

Phân tích phát sinh loài được thực hiện b ng nhiều cách tiếp cận trên dựa

trên tất cả các trình tự gen H5 HA (đã được công bố) tiến hóa từ virus H5N1

A/goose/Guangdong 96. Kết quả ban đầu cho thấy virus H N1 đang lưu hành có

thể được nhóm lại thành nhiều loại "clades" virus dựa trên các đặc điểm phát sinh

loài và trình tự tương đồng của gen HA(H5).

Đến nay, hệ thống thống nhất danh m c H N1 đã xác định được 10 clades

ban đầu riêng biệt của virus (số 0-9) (Nhóm công tác tiến hóa H N1 WHO OIE

FAO, 2008), chúng được gọi là clades lớp thứ nhất. Việc xác định clade được

cần đáp ứng ba tiêu chí định nghĩa nhánh c thể sau đây được phát triển b i

nhóm công tác tiến hóa H5N1 WHO / OIE / FAO:

- N m trong cùng một nốt nhánh (clade);

- Tạo thành nhóm đơn ngành với giá trị bootstrap ≥ 60 tại nốt nhánh (dựa

trên giá trị boostrap 1000 lần);

- Tỷ lệ phần trăm khoảng cách trung bình so sánh theo cặp nucleotide giữa

các clade > 1, % và trong cùng clade <1, %.

Hình 1.9. Sự tiến hó củ c c cl de i A/H5N1 theo thời gi n (WHO,

2010)

Trong giai đoạn 1996-2001, virus cúm gia cầm độc lực cao H N1 chủ yếu

chỉ lưu hành phía Nam Trung Quốc. Giai đoạn này ghi nhận có 4 clade virus

A H N1 khác nhau là clade 0, clade 3, clade và clade 9, trong đó clade 0 là

virus thuỷ tổ A Goose Guangdong 96 và những virus khác cùng loại. Qua sơ đồ

tiến hoá của virus cúm gia cầm H N1 độc lực cao (hình 1.9) qua các giai đoạn

khác nhau, có thể nhận thấy sự biến đổi liên t c của virus cúm và đặc biệt là có

những clade virus tiếp t c tiến hoá và phân loại thành các nhánh ph như clade 2:

Năm 2004 chỉ có 1 lớp clade 2; Đến năm 200 clade 2 đã tiến hoá thành nhánh

ph thuộc lớp thứ 2 từ clade 2.1 – 2.5, rồi đến năm 2008 chúng lại tiến hoá thành

lớp thứ 3. Hiện nay các chuyên gia quốc tế đang tiếp t c tổng hợp và phân tích sự

phát sinh loài của virus cúm và có thể sự phát sinh loài còn đa dạng hơn nữa.

Hình 1.10. Sự phân b củ c c cl de i c gi cầ t ên thế giới từ 2003-

2009 ( feiffe à c , 2011 .

Cho đến nay tất cả 10 clade của virus cúm gia cầm độc lực cao H N1 đã

được phát hiện và phân lập khu vực Đông Á có thể cùng hoặc các thời điểm

khác nhau (Pfeiffer và cs, 2011). Về trình tự gen, hầu hết các virus cúm

A/H5N1của khu vực Đông Á đều bắt nguồn từ Trung Quốc và Hong Kong và

cũng được tìm thấy tại Nhật Bản và Hàn Quốc. ột số clade không phát hiện

thấy Đông Á là clade 2.1.2 và 2.1.3. Dường như chúng đã tiến hóa Indonesia

sau khi tổ tiên của chúng xâm nhập từ tỉnh Hồ Nam của Trung Quốc năm 2002-

2003 (Wang và cs, 2008). ột số clade cho đến nay chỉ mới phát hiện thấy

Trung Quốc (ví d các clade 4, clade 6 và clade 9) trong khi các clade khác có

liên quan đến các v dịch chính (clade 1 khu vực sông ê Kông từ năm 2004-

200 , clade 2.1 Indonesia năm 2004, clade 2.2 lan rộng từ châu Á sang châu

Âu và châu Phi từ năm 200 , và clade 2.3.4 đã tấn công các nước Việt Nam, Lào

và Thái Lan từ năm 200 ) đều đã được phân lập Trung Quốc trước khi được

phát hiện thấy những nơi khác. Clade cũng mới chỉ xuất hiện Trung Quốc

từ năm 200 tr về trước.

Hình 1.11. Thời gian xuất hiện củ c c cl de H5N1 ở Việt Nam từ 2001-2007

(Wallace à c . 2007).

Virus A H N1 gây nên dịch cúm gia cầm Việt Nam từ cuối năm 2003.

Tuy nhiên, qua điều tra, người ta đã từng phát hiện thấy virus A/H5N1 chợ gia

cầm sống Việt Nam từ năm 2001 (Nguyen và cs, 2001). Phân tích phát sinh loài

các virus cúm đã từng phát hiện Việt Nam từ năm 2001-200 , đã thấy ít nhất

có 6 clade HA khác nhau của virus cúm A/H5N1 độc lực cao từng xuất hiện và

lưu hành Việt Nam (Wallace và cs. 200 ). Sáu clade HA này khi phân tích theo

hệ thống danh pháp quốc tế rất tương đồng với các virus A/H5N1 tiền thân đã

được xác định trước đó: clade 0 - giống virus HK97(A/HK/483/97); clade 1 -

giống virus HK821(A/Dk/ HK/821/02); clade 2.3.2 - giống virus E319

(A/Dk/China/E319-2/03); clade 2.3. 4 - giống virus FJ584 (A/Ck/Fujian/584/05);

clade 3-giống virus GX22 (A/Dk/GX/22/01); clade 5-giống virus

F1(A/swine/Fujian/F1/01). Sáu clade virus này n m cùng nhóm với các virus tiền

thân được phân lập trước đây tại Trung Quốc và Hồng Công và các virus tiền

thân này có thể được coi là tổ tiên của các dòng virus cúm gia cầm độc lực cao

xâm nhập vào Việt Nam. Thời điểm phân lập được các clade virus A/H5N1 từ

gia cầm chỉ ra r ng một số dòng virus đã lưu hành trong vòng một năm hoặc

ngắn hơn, trong khi những dòng khác tiếp t c lưu hành tại Việt Nam hơn lâu

hơn. Ví d , sau khi được phát hiện lần đầu tiên trong năm 2003, virus clade 5

lưu hành tại Việt Nam khoảng 1 năm và được thay thế b ng clade 1 virus trong

năm 2004 (Wallace và cs. 200 ).

Cho đến năm 200 , có 2 clade virus A H N1 chủ yếu lưu hành Việt

Nam là clade 1 và clade 2.3.4. Clade 1 đã xuất hiện từ năm 2003 2004 phân bố

trong cả nước, nhưng chủ yếu chỉ còn lưu hành phía miền Nam từ năm 200

cho đến nay; còn clade 2.3.4 xuất hiện từ năm 200 , trước đó đã lưu hành rộng

rãi phía Nam Trung Quốc và xuất hiện phân bố và lưu hành chủ yếu miền

Bắc Việt Nam, và đã thay thế cho clade 1 kể từ năm 200 (Dung Nguyen T và cs,

2008; Wallace và cs. 200 ), nhưng từ 2010 đến nay không còn phát hiện được

nữa (C c Thú y)

Từ 2008-2010, dịch cúm gia cầm H N1 độc lực cao vẫn tiếp t c xảy ra và

hầu hết các mẫu virus A H N1 đều được thu thập để phân tích và giám sát sự

biến đổi của chúng. Kết quả cho thấy trong giai đoạn này, các virus A H N1

Việt Nam, đặc biệt là phía Bắc chủ yếu thuộc về clade 2.3.4, đồng thời các

virus trong clade này tạo thành 1 lớp thứ tư thành 4 nhóm (2.3.4.1-

2.3.4.4)(Nguyen, 2010).

Từ 2009-2010, virus A/H5N1 thuộc clade 2.3.2 cũng đã xuất hiện Việt

Nam và về mặt di truyền những virus này tương tự các virus A H N1 chim

hoang và gia cầm của nhiều nước Đông Âu, Hồng Công, Trung Quốc, Hàn

Quốc.

2007 2008 2009 2010

Hình 1.12. Sự phân b c c cl de i A/H5N1 kh c nh theo kh ng gi n

(Mà đ : cl de 2.3.4; à x nh l cây: cl de 1; à x nh dương: cl de 7 à

à àng: cl de 2.3.2 (Nguyen, 2010).

Một số virus A/H5N1 thuộc clade được phân lập biên giới phía Bắc

và một số chợ gia cầm sống phía Bắc Việt Nam. Sự phân bố của các virus

A/H5N1 thuộc các clade khác nhau đã được thu thập và phân tích được trình bày

trong bản đồ phân bố (Hình 1.12).

1.3.3.2. Sự hình thành c c genotype

Kể từ khi virus cúm A/H5N1 hiện đại xuất hiện tại Quảng Đông

(A Gs CN Gd1 1996(H N1) (Xu và cs, 1999), có tất cả 12 genotype, bao gồm

GD, A, B, C, D, E, X(X0-X3), V, Y, W, Z(Z+) và G đã được phát hiện, trong đó

các chủng A/H5N1 của Việt Nam là loại mới biến đổi, hầu hết thuộc genotype Z

và G Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Dung Nguyen T và cs, 2008). Từ năm 2002

tr lại đây, những genotype nguyên thủy của dòng Quảng Đông đã không còn tồn

tại (đó là các genotype A, C, D, E), nhưng lại tiến hóa xuất hiện 8 genotype của

H N1 (V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z+) (Lee và cs, 200 ; acken và cs, 2006).

Các chủng A H N1 phân lập tại Việt Nam trong những năm 2004 - 2006,

thuộc dòng Quảng Đông, tập trung chủ yếu là genotype Z, gần đây xuất hiện

thêm genotype G, nhưng được phân biệt làm thành 2 nhóm: nhóm N (North) phổ

biến Bắc Việt Nam và nhóm S (South) phân bố miền Nam (Simmons và cs,

200 ; Dung Nguyen T và cs, 2008). Năm 200 , ngoài các chủng và genotype

thuộc phân dòng Quảng Đông gây dịch cúm gia cầm, còn có một phân dòng khác

đã được phân lập và xác định b ng sinh học phân tử phân tích gen H và N1, đó

là dòng Phúc Kiến (Dung Nguyen T và cs, 2008; Lê Thanh Hòa và cs, 2008).

Tiến hóa chủng type và dòng tái tổ hợp mới thường định hình và xuất phát từ các

tỉnh Nam Trung Quốc (Chen và cs, 2006; Simmons và cs, 200 ; Wang và cs,

2008). Trừ phân dòng Thanh Hải (Qinghai-like sublineage) chưa được phát hiện

tại Việt Nam, hai phân dòng Quảng Đông (Guangdong-like sublineage) và Phúc

Kiến (Fujian-like sublineage) đã và đang gây dịch cúm gia cầm nước ta, làm

cho tình hình dịch tễ và phòng chống có thể tr nên phức tạp trong định hướng

đối phó (Dung Nguyen T và cs, 2008).

Hình 1.13. C c genotype củ i c gi cầ A/H5N1 đ c lực cao

(Li à c , 2007)

Từ năm 2001-200 , đã có 9 genotype (ký hiệu VN) VN1-VN9 xuất hiện

hoặc xâm nhập vào Việt Nam (Wan và cs, 2008) được xác định dựa trên phân

tích trao đổi chéo các phân đoạn để tái tổ hợp hình ảnh genotype, theo đó dựa

trên thành phần H chúng thuộc vào các clade khác nhau.

1.3.4. Tính thích ứng đ ật chủ củ i c A/H5N1

Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A/H5N1 là chim hoang

dã (chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự nhiên rất

khó kiểm soát. Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúng

trong quá trình lây truyền tự nhiên (Kash và cs, 2006; De Wit, 2008). Nhờ đặc

tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm A có khả năng xâm

nhiễm nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau như gia cầm, một số loài động

vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn) và cả người, tạo nên tính thích ứng lan

truyền “nội loài” như gà - gà, hay “ngoại loài” như gà - lợn; gà - lợn - người

(Hình 1.1 ). Vịt (vịt trời) và một số loài thuỷ cầm khác (ngỗng) luôn luôn là vật

chủ tàng trữ nguồn virus gây nhiễm (Webster, 1998; Webster và cs, 2002; Chen

và cs, 2004; Hulse-Post và cs, 200 ). Đặc điểm thích ứng vật chủ này là điều

kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi, tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là

các phân đoạn gen kháng nguyên (gen “độc” HA và NA) giữa các chủng, tạo ra

chủng virus cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm loài vật chủ mới của

chúng đặc biệt khi chúng vượt qua được “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây

nhiễm gây bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người (Horimoto và

Kawaoka, 1994; Hilleman, 2002; Chen và cs, 2004). Trong lịch sử các đại dịch

cúm người, lợn thường là vật chủ trung gian chuyển tiếp giúp cho virus cúm A

biến đổi để dễ dàng lây nhiễm sang người gây nên bệnh dịch (Ito và cs, 1998;

Zhu và cs, 2008). Ví d , cúm A H3N2 là kết quả tái tổ hợp tự nhiên của virus

cúm A H2N2 của người và virus chứa gen H3 trong tự nhiên thông qua đồng

nhiễm trên lợn, gây nên đại dịch cúm châu Á năm 1968 (Nicholson và cs, 2003;

Wanasawaeng và cs, 2009; Horimoto và Kawaoka, 1994).

Hình 1.14. M i q n hệ lây nhiễ à thích ứng c c loài ật chủ củ i c A (Wahlgren, 2011)

1.3.5. Cơ chế xâ nhiễ gây bệnh củ i c A t ong tế bào ật chủ

Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân

lên của virus xảy ra chủ yếu các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa

của cơ thể nhiễm ( urphy và Webster, 1996; Nicholson và cs, 2003), có những

nét đặc trưng như sau:

- Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được m đầu b ng sự kết hợp của

HA và th thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và cuối cùng là giải

phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm (Hình 1.15).

- Quá trình nhân lên của NA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế

bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong

nguyên sinh chất), và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm

nhờ vai trò của enzyme neuraminidase. Thời gian một chu trình xâm nhiễm và

giải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng vài giờ (trung bình 6 h).

Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này

bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá trình chết theo

chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ (Wanasawaeng

và cs, 2009; Tumpey và cs, 2002).

- Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của

virus sử d ng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các

NA vận chuyển ph thuộc NA ( NA-dependent NA transcription). Phức

hợp protein – NA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào (Beard,

1998).

- Trong nhân tế bào các NA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương

từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên

NA hệ gen của virus mới nhờ NA-polymerase. Các sợi này không được

Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) đầu ’- và 3’-, chúng kết hợp

với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein ( NP) hoàn chỉnh

và được vận chuyển ra bào tương tế bào. Đồng thời, các NA thông tin của virus

cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme từng phân đoạn gen của virus, và được

enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin đầu ’-, sau đó được vận

chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các

protein của virus (Hình 1.1 ).

Hình 1.15. M hình cơ chế xâ nhiễ à nhân lên củ i c A ở tế bào

chủ (Beard, 1998).

- Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn

lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy

chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển tr lại nhân tế bào để kết

hợp với NA thành NP của virus. Sau cùng các NP của virus được hợp nhất

với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ b i

liên kết giữa HA với th thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các liên kết này

và giải phóng các hạt virus trư ng thành tiếp t c xâm nhiễm các tế bào khác

( urphy và Webster, 1996; Nayak và cs, 2004).

1.3.6. Đ c lực à khả năng gây bệnh củ i c gi cầm

Nghiên cứu mức độ phân tử cho thấy, khả năng lây nhiễm virus ph

thuộc vào tác động của men protease của vật chủ đến sự phá vỡ các liên kết hoá

học sau khi dịch mã của phân tử liên kết. Tính th cảm của ngưng kết tố và sự

phá vỡ liên kết của enzyme protease lại ph thuộc vào số lượng các axit amin

polybasic tại điểm bắt đầu phá vỡ liên kết. Các enzym giống như trypsin có khả

năng phá vỡ liên kết khi chỉ có một phân tử arginin, trong khi đó các men

protease khác lại cần nhiều axit amin polybasic, vì thế một số nước đánh giá

độc lực của virus trên cơ s gây nhiễm cho gia cầm và sau đó phân tích sự sắp

xếp các axit amin của virus. C thể người ta quan tâm đến việc giải trình tự vùng

“cleavage site” (chuỗi nối) của gen HA mà sự có mặt của các aminoaxit như

arginine (R) hay lysine (K) sẽ cho phép dự đoán r ng virus đó có độc lực cao hay

không (Hình 1.16). Tuy nhiên người ta thường chỉ thực hiện điều này đối với các

virus thuộc subtype H và H .

Trong thực tế người ta chia virus cúm ra làm 2 loại: Loại virus có độc lực

thấp – LPAI và loại virus có độc lực cao HPAI.

- LPAI là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm

nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. Đây là

loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm

A. Loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm

trên cùng một tế bào, và tr thành một loại virus HPAI nguy hiểm.

- HPAI là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội

tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị

nhiễm trong vòng 48-72 giờ sau nhiễm. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào

xơ phôi gà, tế bào thận chó ( DCK) không có trypsin. Các v dịch lớn đều do

virus HPAI gây ra, thường là virus có kháng nguyên H và H .

Hình 1.16. Minh hoạ ùng “cle ge ite” củ i c H5N1 đ c lực thấp

(L AI à đ c lực cao (H AI (W gne à c , 2002

Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô hấp,

gây bệnh chủ yếu đường hô hấp, và cũng có thể tác động gây tổn thương nhiều

cơ quan khác trong cơ thể của các động vật cảm nhiễm, do đó còn được gọi là

virus hướng đa phủ tạng (Wanasawaeng và cs, 2009; Nicholson và cs, 2003).

Khả năng gây bệnh của virus cúm A ph thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật

chủ của từng chủng virus. Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây

bệnh nhẹ giới hạn đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng

một số chủng cường độc (H , H và H1, H2 và H3) có thể gây nên bệnh nặng

hầu hết các cơ quan trong cơ thể, gây nên dịch cúm gia cầm và người có lẽ do

tính thích ứng th thể sialic của chúng (Subbarao và Joseph, 200 ; Xu và cs,

1999). Hầu hết các chủng virus cúm A nhân lên rất tốt trong phôi gà sau lần cấy

truyền thứ nhất, tuy nhiên các chủng cường độc subtype H và H gây chết phôi

gà ngay sau vài giờ, cả khi hàm lượng virus rất thấp chưa được nhân lên nhiều,

và có thể gây bệnh cúm thực nghiệm trên chuột lang, chuột hamster, chồn đất

(Horimoto và Kawaoka, 1994, De Wit, 2008).

Sau bị khi nhiễm virus cúm A, cơ thể vật chủ sinh ra đáp ứng miễn dịch

chống lại virus bảo vệ cơ thể, nhưng đáp ứng miễn dịch này có thể không có tác

d ng bảo vệ hoàn toàn cho những lần nhiễm sau, do virus cúm A luôn có sự biến

đổi kháng nguyên của nó trong quá trình lưu hành tự nhiên, và không có đáp

ứng miễn dịch chéo giữa các chủng virus cúm A (Wanasawaeng và cs, 2009). Do

đó, khi xuất hiện những biến chủng virus cúm A có đặc tính kháng nguyên khác

với các chủng virus trước đó, cơ thể nhiễm sẽ không hoặc ít có đáp ứng miễn

dịch bảo hộ thích ứng với chủng virus cúm mới. Đây là nguyên nhân làm cho gia

cầm và con người thường bị mắc bệnh cúm nhiều lần trong năm, và các đợt dịch

cúm xảy ra về sau thường nặng nề hơn và có thể gây nên đại dịch cúm mới

(Doherty và cs, 2006).

1.3.7. Triệu chứng lâ àng của gia cầm mắc bệnh c

Virus cúm gia cầm độc lực cao thường gây bệnh rất trầm trọng cho gia

cầm và thông thường tỷ lệ tử vong cao đặc biệt là với gia cầm cạn. Các loài thủy

cẩm, dã cầm và một số loài lông vũ khác có thể có độ mẫn cảm thấp hơn, nhưng

có thể tr thành động vật mang trùng

1.2.7.1. Đặc đi t iệ chứng t ên gà

- Chết đột ngột

- Ủ rũ, lông xơ xác, bỏ ăn

- Giảm năng suất đẻ trứng

- Phù thũng đầu và cổ

- ào và tích sưng to hoặc có màu tím tái

- Xuất huyết lấm chấm trên mặt các màng tương

- Khát nước nghiêm trọng

- Tiêu chảy ra nước loãng màu xanh ban đầu, sau đó chuyển sang trong

hoặc màu trắng

- àng kết mạc sưng hoặc t máu đôi khi có xuất huyết

- Xuất huyết da chân

- Triệu chứng hô hấp tùy thuộc và mức độ thương tổn trong khí quản

- Chảy nước mũi, miệng

- Con vật yếu sức,

- Ho, hắt hơi

- Triệu chứng thần kinh, loạng choạng

- Ngừng đẻ, trứng dị hình trước khi ngừng đẻ

- Tỷ lệ chết có thể tới 100%, có thể chết trước khi có triệu chứng

1.2.7.2. Đặc đi t iệ chứng t ên thủy cầ

- Ủ rũ

- Bỏ ăn, tiêu chảy

- Triệu chứng thần kinh, quay cuồng, co giật

- ắt màu khói, đ c

- Năng suất trứng giảm

- Có thể chết đột ngột

- Những con khỏi bệnh yếu ớt, có thể đẻ trứng tr lại vài tuần sau khi khỏi

bệnh

- Tỷ lệ tử vong có thể tới 100%

1.3.8. Bệnh tích của gia cầm mắc c gi cầm

1.3.8.1. Bệnh tích đại th

Bệnh tích đại thể các loài khác nhau có biểu hiện khác nhau. Đối với gà,

bệnh tích thường gặp là mào, tích sưng to, tím tái phù quanh mí mắt. Thể nhẹ,

bệnh tích các xoang trong cơ thể đặc trưng b i viêm ca ta, lắng đọng fibrin.

Xuất huyết dưới da ống chân hoặc kẽ ngón chân thành vệt đỏ rất rõ. Xuất huyết

điểm trên bề mặt niêm mạc và tương mạc nội tạng. Xuất huyết hầu hết toàn bộ

đường tiêu hóa, đặc biệt thấy rõ manh tràng và dạ dày tuyến. Túi fabricius xung

huyết và xuất huyết. Nói chung, các bệnh tích rất giống với bệnh tích của bệnh

Newcastle (Lê Văn Năm, 2004; Alexander, 200 ). Các biến đổi bệnh lý đại thể

của bệnh cúm gia cầm trên ngan và và vịt cơ bản cũng giống trên gà. Tuy nhiên

tần suất biến đổi tập trung chủ yếu phổi, túi khí, tim, buồng trứng, xương lồng

ngực và đường ruột (Lê Văn Năm, 2004).

1.3.8.2. Bệnh tích i th

Bệnh tích vi thể chủ yếu là xung huyết, xuất huyết, thâm nhiễm bạch cầu

đơn nhân não và một số cơ quan khác. ạch quản của các cơ quan như mào,

tích, gan, lách, phổi, thận, cơ tim, cơ vân, não và một số cơ quan khác bị giãn

rộng và thâm nhiễm tế bào xung quanh mạch quản (Beard, 1998).

1.4. Chẩn đo n bệnh

1.4.1. Chẩn đo n dự ào dịch tễ học

Căn cứ vào các yếu tố dịch tễ như bệnh lây lan nhanh, gia cầm mọi lựa

tuôi, nhiều loại gia cầm mắc bệnh, tỷ lệ chết cao lên tới 100% số gia cầm mắc

bệnh, những vùng có ổ dịch cũ, những nơi gia cầm chưa được tiêm phòng vacxin

cúm hoặc tiêm phòng chưa đủ thời gian đáp ứng miễn dịch, hoặc đã tiêm phòng

nhưng qua khảo sát hiệu giá kháng thể bảo hộ chỉ đạt mức thấp.

1.4.2. Chẩn đo n dự ào t iệ chứng à bệnh tích

Căn cứ vào các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích để chẩn đoán. Lưu ý các

đặc điểm chính như gia cầm bệnh chảy nhiều nước mắt, viêm xoang mũi, mào,

tích tím tái, phù đầu và mí mắt, lông cổ dựng ngược, ỉa chảy và có triệu chứng

thần kinh, da chân vùng không lông xuất huyết.

Căn cứ những bệnh tích điển hỉnh như phổi, gan, thận lách sưng to. Xuất

huyết mỡ vành tim, ruột viêm cata, xuất huyết. Xuất huyết dạ dày cơ, dạ dày

tuyến giống bệnh Newcastle. Túi fabricius xuất huyết điểm, lỗ huyệt xuất

huyết...Alexander, 200 ; Baigent và c Cauley, 2001). Trong trường hợp gia

cầm chết cấp tính thì biểu hiện bệnh tích thường không điển hình.

1.4.3. Chẩn đo n phòng thí nghiệ

Chẩn đoán virus học: nuôi cấy, phân lập virus trên trứng gà có phôi ấp 9-

10 ngày hoặc trên môi trường tế bào xơ phôi gà hoặc tế bào thận chó DCK.

Giám định virus trong dịch nuôi cấy b ng các phản ứng HA, HI.

Chẩn đoán và giám định virus b ng kỹ thuật Real time RT-PC : cho phép

xác định virus với lượng rất nhỏ. Khẳng định chắc chắn subtyp H và N1 căn cứ

vào primer và probe được thiết kế đặc hiệu. Hiện nay kỹ thuật này đã được ứng

d ng rộng rãi và thường quy Việt Nam, cũng như nhiều nước trên thế giới.

Chẩn đoán huyết thanh học: dùng phản ứng HI để phát hiện và xác định

hiệu giá kháng thể trong huyết thanh gia cầm chưa tiêm phòng. Ngoài ra có thể

dùng phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể.

1.5. V cxin phòng bệnh c gi cầm

Các chủng virus cường độc A/H5N1 sau 1996, qua thời gian tiến hóa, có

xu hướng biến đổi nội gen nh m tăng tính gây bệnh, và thay đổi thành phần nội

gen kháng nguyên làm mất tương quan miễn dịch giữa chúng và các chủng

vacxin được tạo ra. Do vậy, vấn đề này phải được hết sức chú ý trong chiến lược

kiến tạo vacxin, cũng như sử d ng vacxin được tạo ra (Horimoto và Kawaoka,

1994) Trong tự nhiên, “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” là các hiện tượng

xảy ra liên t c theo thời gian, còn “trộn kháng nguyên” tái tổ hợp subtype

Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) thường định kỳ xảy ra giữa các loài

mắc nh m tạo nên các biến thể virus cúm mới mà hệ miễn dịch của cơ thể vật

chủ không có khả năng nhận dạng đáp ứng và kịp hình thành miễn dịch. H5N1

sử d ng th thể sialic xâm nhập tế bào (Xu và cs, 1999).

Đối với bệnh truyền nhiễm, vacxin được coi là biện pháp có tính chiến

lược, nh m ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch (Subbarao và Luke, 200 ).

Kháng thể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên

trong vacxin, và đó là các kháng thể kháng HA, NA, A và nhiều loại hình khác

của virus đương nhiễm, góp phần vô hiệu hóa virus cúm đúng đối tượng khi

chúng xâm nhập vào. Có nhiều loại kháng thể, nhưng trước hết chỉ kháng thể

kháng HA(H ) có vai trò tiên quyết quan trọng trong quá trình trung hòa virus

cho bảo hộ miễn dịch. Các vacxin phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ s hai loại

chính: vacxin truyền thống và vacxin thế hệ mới (Subbarao và Joseph, 200 ;

Capua và Alexander, 2008).

Vacxin truyền thống: bao gồm vacxin vô hoạt đồng chủng và dị chủng.

Vacxin vô hoạt đồng chủng (homologous vacxin), đó là các loại vacxin được sản

xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như chủng gây bệnh trên thực

địa (Swayne, 1999). Vacxin vô hoạt dị chủng (heterologous vacxin) là vacxin sử

d ng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa,

nhưng có kháng nguyên NA dị chủng.

Vacxin thế hệ mới hay vacxin công nghệ gen: là loại vacxin được sản xuất

dựa trên sử d ng kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang được nghiên cứu

và đưa vào sử d ng phổ biến, bao gồm:

- Vacxin tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử d ng virus đậu gia cầm làm

vector tái tổ hợp song song gen H và N1 phòng chống virus type A/H5N1

(Pfeiffer và cs, 2010). Ví d , hãng erial của Pháp sản xuất vacxin TrovacAIV-

H5 lấy nguồn gen H5 từ chủng A/Turkey/Ireland/83 (H5N2), sử d ng được cho

gia cầm lúc 1 ngày tuổi.

- Vacxin dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và

tách chiết làm vacxin (Perkin và Swayne, 2002; Pfeiffer và cs, 2009).

- Vacxin tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử d ng adenovirus hoặc virus

Newcastle hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, lắp ghép gen kháng

nguyên H vào hệ gen của adenovirus, tạo nên virus tái tổ hợp làm vacxin phòng

chống virus cúm A/H5N1 (Hoelscher và cs, 2006; Gao và cs, 2006; Qiao và cs,

2006).

- Vacxin DNA: sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen HA, NA, NP,

2 đơn lẻ hoặc đa gen (Kilpatrick và cs, 2006, Kaewcharoen và cs, 200 ).

- Vacxin nhược độc virus cúm nhân tạo: được sản xuất b ng kỹ thuật di

truyền ngược (reverse genetics), đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy

đủ hệ gen, trong đó các gen kháng nguyên H có vùng "độc" đã được biến đổi

b ng kỹ thuật gen (Liu và cs., 2003; Swayne và Suarez, 2000). Trung Quốc cũng

là nước sản xuất nhiều giống virus vacxin chống cúm, ví d , vacxin vô hoạt nhũ

dầu đơn chủng lấy nguồn gen H và N2 từ chủng A/Turkey/England/N-

28/73(H5N2), loại subtype H N2 có độc lực yếu; hay giống vacxin vô hoạt nhũ

dầu đơn chủng lấy nguồn gen H và N1 từ chủng

A/Goose/Guangdong/1996(H5N1), loại có độc lực yếu (Swayne và Suarez, 2000;

Pfeiffer và cs, 2010). Các loại vacxin này đã được nhập và sử d ng tại Việt Nam

từ năm 2006 (Tô Long Thành, 2006).

1.5.1. Tình hình ử dụng vacxin c gi cầ t ên thế giới

Số lượng vacxin đã được sử d ng trên thực địa chưa được thông báo c

thể, nhưng có một số nguồn thông tin cho r ng exico đã sử d ng 1 tỷ 300 triệu

liều virus vô hoạt và 8 0 triệu liều vacxin tái tổ hợp đậu gà trong chương trình sử

d ng vacxin chống bệnh cúm từ đầu tháng 1 199 và đã thanh toán được bệnh

cúm gia cầm thể độc lực cao do virus H N2 và tháng 6 199 , mặc dù virus H N2

chủng độc lực thấp vẫn lưu hành. Indonexia cũng sử d ng vacxin AI H vô hoạt.

Từ năm 199 , Pakistan cũng sử d ng vacxin phòng cúm cả ổ dịch H7N3 thể

độc lực cao. Các vacxin vô hoạt chế từ chủng virus H9N2 độc lực thấp đã và

đang được sử d ng một số nước châu Á, vùng Cận Đông và Đông Âu. Gần

đây, vacxin vô hoạt nhũ dầu H đã được dùng cho các vùng nguy cơ cao phía

Bắc Italia và tại một công ty nuôi gà con một ngày tuổi Mỹ.

Trung Quốc là nước sử d ng nhiều vacxin cúm nhất. Trung Quốc đã có

bản tường trình về kết quả của các loại vacxin đang được sử d ng tại nước này,

bao gồm:

- Vacxin vô hoạt chủng H5, N-28: được phê chuẩn từ tháng 12 2003 và

được sử d ng rộng rãi Trung Quốc trong các ổ dịch cúm gia cầm thể độc lực

cao vào đầu năm 2004.

Bảng1.3. M t s loại vacxin phòng c gi cầ H5N1 đ ng được sử

dụng t ên thế giới (FAO/EMPRESS/2009)

Stt

Chủng virus sử dụng

Subtype

Loại vacxin

Nước sản xuất)

1 A/Chicken/Mexico/232/94/CPA 2 A/TY/California/20902/2002 3 A/Turkey/England/N-28/73

A H N2, độc lực thấp Vô hoạt nhũ dầu Mexico A H N2, độc lực thấp Vô hoạt nhũ dầu Mỹ A H N2, độc lực thấp Vô hoạt nhũ dầu

4 A/Turkey/

A/H5N2

Vô hoạt nhũ dầu

Trung Quốc, Indonesia Đức

Hà Lan

Minnesota/3689-1551/81 5 A/duck/Potsdam/1402/86 6 A/Turkey/Wisconsin/68 7 A/chicken/Italy/22A/98 8 A/duck/Potsdam/2243/84 9 A/Goose/Guangdong/1996 10 A/Ck/Legok/2003 11 A/Ck/Mansehra/2006 12 rg-A/ck/VN/C58/04 mang gen N3

Hà Lan Trung Quốc Indonesia Pakistan Mỹ

A H N2, độc lực thấp Vô hoạt nhũ dầu A H N9, độc lực thấp Vô hoạt nhũ dầu Mỹ; Italia A H N9, độc lực thấp Vô hoạt nhũ dầu Mỹ; Italia A H N6, độc lực thấp Vô hoạt nhũ dầu A H N1, độc lực cao Vô hoạt nhũ dầu A H N1, độc lực cao Vô hoạt nhũ dầu A H N1, độc lực cao Vô hoạt nhũ dầu Di truyền ngược, A/H5N3 RG nhũ dầu

từ chủng A/Duck/Germany/1215/73 (H2N3) và 6 nội gen của chủng PR8

A/H5N1 RG

Trung Quốc

Di truyền ngược, nhũ dầu

13 A/Goose/Guangdong/1996 (Re-1), và 6 nội gen của chủng PR8

14 BHG/QH/05 (Re-3) và 6 nội gen

A/H5N1 RG

Trung Quốc

của chủng PR8

15 DK/AH/06 (Re- ) và 6 nội gen của

A/H5N1 RG

Trung Quốc

chủng PR8

16 CK/SX/06 (Re-4) và 6 nội gen của

A/H5N1 RG

Trung Quốc

chủng PR8

Trung Quốc

A H phái sinh từ H N1 độc lực cao

Di truyền ngược, nhũ dầu Di truyền ngược, nhũ dầu Di truyền ngược, nhũ dầu Tái tổ hợp sống, đông khô

17 Vacxin virus đậu với cDNA của gen H và N1 lấy từ chủng A/Goose/Guangdong/1996

18 Vacxin Newcastle sống

A H N1, độc lực cao Newcastle tái tổ

Trung Quốc

(LaSota) và gen H của chủng A/Barheadedgoose/Qinghai/3/2005

Mỹ

A H phái sinh từ H N8 độc lực thấp

hơp sống mang gen H , đông khô Tái tổ hợp, đông khô, tiêm dưới da

19 Virus đậu với cDNA của gen H5 lấy từ chủng from A/Turkey/ Ireland/83

- Vacxin vô hoạt virus cúm sản xuất theo công nghệ di truyền ngược

(subtype H5N1, chủng Re-1 thuộc clade 0): được phê chuẩn tháng 1 200 .

Vacxin được đánh giá là rất có hiệu quả trong tạo miễn dịch chống cúm với hiệu

giá kháng thể cao và thời gian bảo hộ dài hơn. Bên cạnh việc sử d ng vacxin Re-

1, Trung Quốc còn sử d ng một số loại vacxin khác được sản xuất theo cùng

công nghệ là vacxin Re-3, vacxin Re-4 và vacxin Re-5. Bốn loại vacxin sản xuất

theo công nghệ di truyền ngược được sản xuất từ 4 chủng virus cúm gia cầm

khác nhau: Vacxin Re-1 sử d ng gen H và N1 của virus A/Goose/GD/1/96

(clade 0); Vacxin Re-3 sử d ng gen H và N1 của virus A/bar-headed

goose/Qinghai/3/2005 (clade 2.2); Vacxin Re-4 sử d ng gen H và N1 của virus

A chicken Shanxi 2 2006 (clade ); và Vacxin Re-5 sử d ng gen H và N1 của

virus A/duck/Anhui/1/2006 (clade 2.3.4).

Theo Báo cáo về kinh nghiệm sử d ng vacxin cúm gia cầm của Trung Quốc

(Chen, 2009) từ năm 2004 đến năm 2008, Trung Quốc đã sử d ng 22,64 tỷ liều

vacxin Re-1, 1,26 tỷ liều vacxin Re-4 và 4,4 tỷ liều vacxin Re-5.

- Vacxin sống virus đậu tái tổ hợp phòng cúm gia cầm H : được phê chuẩn tháng

1 200 và được nhiều nước sử d ng như Trung Quốc, Mexico... sử d ng loại

vacxin này có thể phân biệt được miễn dịch do tiêm phòng vacxin hay bị nhiễm

tự nhiên.

1.5.2. Tình hình ử sụng vacxin c gi cầm tại Việt Nam

Từ tháng 200 , “Dự án sử d ng vacxin nh m khống chế và thanh toán

bệnh cúm gia cầm” đã triển khai tại Việt Nam. Nước ta đã tiến hành tiêm phòng

thử nghiệm các loại vacxin cúm gia cầm ngoại nhập trên địa bàn tỉnh Nam Định

và Tiền Giang. Sau đó đã triển khai tiêm phòng trên địa bàn cả nước và thực hiện

liên t c qua các năm. ỗi năm có 2 đợt tiêm phòng vào tháng 4- và tháng 9-10,

trước thời điểm dịch cúm gia cầm có nguy cơ bùng phát cao nhất. Một số loại

vacxin được sử d ng Việt Nam như:

- Vacxin nhũ dầu vô hoạt H5N2 (Trung Quốc): là loại vacxin dị chủng bất

hoạt, sử d ng chủng virus A/Turkey/England/N28/73 (H5N2).

- Vacxin di truyền ngược vô hoạt dạng nhũ dầu H5N1 (Trung Quốc): là

loại vacxin đồng chủng bất hoạt (Re-1) sử d ng chủng virus

A Goose Guangdong 1 96 và ( e-5) sử d ng chủng A/Duck/Anhui/2006. Trong

đó vacxin Re-1 đã được sử d ng từ năm 200 , còn vacxin Re-5 mới được đưa

vào sử d ng từ năm 2011 thay cho vacxin Re-1 vì công ty Trung Quốc sản xuất

và cung cấp loại vacxin Re-1 ngừng sản xuất loại vacxin Re-1.

Bảng 1.4. Kết quả tiê phòng vacxin c gi cầ chương t ình q c gia

(tổng hợp từ báo cáo của Cục Th y qua các nă 2005-2010)

Nă

S liề vacxin tiê cho gà (t iệ S liề vacxin tiê cho ịt (t iệ Tổng liề VX cho gà à ịt (t iệ

2005 166,40 78,10 244,5

2006 – Đợt 1 100,60 35,40 136

2006 – Đợt 2 91,30 47,33 138,6

2007 – Đợt 1 101,20 89,30 190,5

2007 – Đợt 2 90,46 65,97 156,43

2008 – Đợt 1 84,32 66,42 150,74

2008 – Đợt 2 61,73 55,53 117,26

2009 – Đợt 1 84,86 67,62 152,48

2009 – Đợt 2 79,07 91,49 170,56

2010 – Đợt 1 89,85 50,77 140,62

42,54 72,26 2010 – Đợt 2 29,72

- Vacxin Nobilis Influenza H (Hà Lan): đây là loại vacxin dị chủng, sử

d ng chủng virus A/chicken/Mexico/232/94/CPA (H5N2).

- Vacxin Trovac AIV H5 (vacxin đậu-cúm dạng sống, đông khô): là

vacxin chứa virus đậu gà sống làm vectơ có mang gen virus cúm gia cầm chủng

A, sử d ng chủng A/Turkey/Ireland 13 8 83. Tuy nhiên vacxin này hiện nay

không được sử d ng nữa do không hiệu quả điều kiện Việt Nam, và nhiều đàn

gà sử d ng vacxin này không có hiệu quả bảo hộ chống lại virus A/H5N1 Việt

Nam (Báo cáo của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương)

CHƯƠNG 2

N I DUNG – NGUYÊN LIỆU – HƯƠNG HÁ NGHIÊN CỨU

2.1. N i dung

2.1.1. hân lập à gi định i c gi cầm A/H5N1 từ c c dịch

ngo y ổ nhớp

- Xác định virus cúm gia cầm A H N1 b ng phương pháp ealtime T-

PCR (RRT-PCR)

- Phân lập virus trên phôi trứng gà 9-10 ngày tuổi đối với các mẫu xét

nghiệm dương tính cúm A/H5N1.

- Giám định virus phân lập được b ng phản ứng HA, HI và RRT-PCR.

2.1.2. X c định đặc tính di t yền học của virus c A/H5N1 clade 7

Mối quan hệ về di truyền của virus A/H5N1 clade 7 với các virus A/H5N1

khác thông qua phân tích cây phả hệ của gen HA, NA và .

2.1.3. X c định m t s đặc tính inh học của i c A/H5N1 clade 7

- Tính thích ứng trên phôi gà

- Tính thích ứng trên tế bào xơ phôi gà

- Xác định độc lực của virus cúm A/H5N1 clade trên một số động vật

thí nghiệm (gà, vịt và ngan).

- Một số biến đổi bệnh lý cơ bản của gà mắc virus cúm A/H5N1 clade 7.

2.1.4. X c định đặc tính kh ng ng yên (tính tương đồng kh ng ng yên

- Mối quan hệ về kháng nguyên học của virus A/H5N1 clade 7 với các

virus A/H5N1 khác thông qua phản ứng huyết thanh học chéo của virus cúm gia

cầm A H N1 clade và kháng nguyên, huyết thanh chuẩn của một số chủng

virus cúm A/H5N1 thuộc một số clade khác.

2.1.5. X c định hiệu lực của vacxin H5N1 Re-1

- Hiệu lực của vacxin cúm gia cầm Re-1 Việt Nam đối với virus cúm gia

cầm A/H5N1 clade 7 trên gà.

2.2. Đị đi à phạm vi nghiên cứ

- Nơi thu thập mẫu vùng biên giới Lạng Sơn

- Phòng Virus – Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - C c Thú y.

- Bộ phận Cúm (Influenza Division), Trung tâm Phòng chống dịch bệnh

CDC – Hoa Kỳ

2.3. Vật liệ à phương ph p nghiên cứu:

2.3.1. Vật liệ nghiên cứu

 Dịch swab (ngoáy ổ nhớp) từ gà nhập lậu.

 Virus cúm A/H5N1 phân lập từ dịch swab.

 Phôi trứng gà 9-10 ngày tuổi (lấy từ gà khỏe mạnh, chưa tiêm phòng

vacxin cúm gia cầm), tế bào xơ phôi gà chế từ phôi gà 8 ngày tuổi.

 Gia cầm (gà, vịt và ngan) khỏe mạnh chưa tiêm phòng vacxin cúm gia

cầm và không có kháng thể cúm gia cầm lấy từ cơ s chuyên cung cấp động vật

thí nghiệm của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương.

 Vacxin cúm gia cầm A/H N1 e-1do Trung Quốc sản xuất.

 Kháng nguyên và kháng thể chuẩn cúm gia cầm H5N1 (do CDC - Hoa

Kỳ cung cấp).

 Kít chiết tách RNeasy minikit (công ty Qiagen) và Kít realtime T-

PCR Invitrogen superscriptIII (công ty Invitrogen).

 Primer và probe cho H N1, Primer và kít để giải trình tự gen (CDC-

Hoa Kỳ).

2.3.2. hương ph p nghiên cứu

2.3.2.1. hương ph p điề t hồi cứ

Khi giải trình tự gen và phân tích cây phát sinh loài của virus A/H5N1

clade , điều tra ngược lại các mẫu đã được xét nghiệm trong phòng thí nghiệm

từ cùng nguồn.

2.3.2.2. hương ph p phân lập i t ên ph i t ứng gà

- Bệnh phẩm là dịch swab (ngoáy ổ nhớp của gà) từ gà nhập lậu được xử

lý b ng cách lắc ống dịch swab có tăm bông bên trong, rồi ly tâm sau đó chuyển

dịch nổi sang ống 1, ml và vô trùng b ng kháng sinh.

- Sử d ng phôi trứng gà 9-10 ngày tuổi.

- Tiêm 0,2 ml dịch bệnh phẩm vào xoang niệu mô của phôi trứng gà, tiếp t c ấp nhiệt độ 37oC đến 96 giờ, soi trứng hàng ngày, thu trứng chết và kiểm

tra b ng phản ứng HA để xác định khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà và phản

ứng HI với kháng thể chuẩn kháng virus cúm gia cầm và kháng thể chuẩn kháng

virus Newcastle để giám định virus phân lập được.

- Phôi trứng được giữ tủ mát 2 - 8oC ít nhất 2 giờ trước khi thu hoạch

dịch niệu mô. Dùng syringe ml hoặc 10 ml thu dịch niệu mô b ng cách đâm

xuyên qua nắp buồng hơi. Dịch niệu mô được chia thành nhiều ống nhỏ (0,5 ml/ống) giữ nhiệt độ -70oC.

2.3.2.3. X c định ch EID50

- Để tính EID50, virus cũng được pha loãng thành nhiều nồng độ theo cơ số 10 (ví d 10-1, 10-2….10-8) và tiêm vào xoang niệu mô của phôi trứng, mỗi nồng độ phôi, mỗi phôi 0,1 ml dịch virus, ấp tủ ấp 370C tới 96 giờ.

- Soi trứng hàng ngày để kiểm tra phôi sống và phôi chết, thu các trứng

chết và trứng sống, thu hoạch nước trứng. Thực hiện phản ứng HA đối với nước

trứng. ẫu nào có phản ứng HA dương tính, được coi là nhiễm virus A/H5N1 .

Sử d ng công thức Reed- eunch để xác định chỉ số EID50 của virus.

2.3.2.4. X c định ch TCID50

- Sử d ng môi trường tế bào xơ phôi gà chế từ phôi trứng gà 9-10 ngày

tuổi để chuẩn độ virus cúm gia cầm: Tế bào được nuôi cấy trên đĩa 96 giếng (lượng tế bào là x104 tế bào 100 µl giếng). Virus được pha loãng theo các nồng độ 10-2 - 10-8 với môi trường Eagle’s E , mỗi nồng độ 5 giếng, mỗi giếng 100

µl dung dịch virus đã pha loãng các nồng độ đã xác định. Quan sát CPE sau 2

ngày. Sử d ng công thức Reed- eunch để tính chỉ số TCID50 của virus.

Cách tính TCID50 cũng giống với cách tính EID50.

2.3.2.5. hương ph p Reed-Muench

Sử d ng bảng tổng hợp số liệu (bảng 2.1) để tính toán chỉ số EID50 hoặc

TCID50.

Bảng 2.1. Bảng tổng hợp liệ tính to n theo phương ph p Reed-Muench

Số tích lũy (cộng dồn) Tỷ lệ nhiễm virus

Nhiễm virus (A) Không nhiễm (B) A/(A+B) × 100 Số trứng bị nhiễm virus (HA dương tính) Số trứng không nhiễm virus (HA âm tính) Tổng cộng (A+B)

Độ pha loãng bao gồm cả độ pha loãng có 100% nhiễm virus (HA dương tính) và độ pha loãng không nhiễm virus (HA âm tính)

10-1 10-2 … … 10-8 ¯ ¯ ¯ ¯ ¯

Công thức tính như sau:

Tỷ lệ nhiễm cận trên 50% - 50

Chỉ số =

(Tỷ lệ nhiễm cận trên 50%) – Tỷ lệ nhiễm cận dưới 50%)

Giá trị EID50 và TCID50 được tính hiệu giá pha loãng cận trên 50% cộng với chỉ số tính được trên. Ví d nếu tính được chỉ số là 0, với độ pha loãng virus cao nhất có tỷ lệ nhiễm 0% là 10-7, thì chuẩn độ của virus sẽ là 10-7,5.

2.3.2.6. hương ph p gây bệnh cho đ ng vật thí nghiệm (gà, vịt và ngan)

- Sử d ng gà, vịt và ngan 4-10 tuần tuổi khoẻ mạnh.

- Kiểm tra kháng thể cúm gia cầm H trước khi gây bệnh (công cường

độc) chỉ sử d ng gia cầm không có kháng thể kháng virus cúm gia cầm H5N1.

- Gây nhiễm virus qua đường mũi b ng cách nhỏ 0,2 ml hỗn dịch virus

(nước niệu mô từ phôi trứng sau khi phân lập chứa virus được pha loãng 1 10 với dung dịch PBS pH7,2) hoặc dùng liều gây nhiễm là 10-6 TCID50.

- Theo dõi trong vòng 10 ngày để đánh giá độc lực của virus. (Theo

phương pháp của OIE, virus được đánh giá là có độc lực cao-HPAI nếu giết chết

ít nhất % số gà gây nhiễm sau thời gian theo dõi.

2.3.2.7. hương ph p HA, HI gi định i à x c định đặc tính kh ng

ng yên củ i c A/H5N1 clade 7 (OIE, 1992; OIE 2012).

- Phương pháp HA: tiến hành phản ứng trên đĩa microtiter 96 giếng đáy V

(tổng lượng hỗn dịch phản ứng là µl giếng).

+ Cho 25 µl dung dịch PBS pH ,2 vào các giếng của đĩa phản ứng

+ Cho 25 µl dung dịch chứa virus (nước trứng) vào giếng thứ nhất và bắt

đầu pha loãng kháng nguyên virus theo cơ số 2 từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 11

+ Nhỏ 25 µl dung dịch PBS vào các giếng từ 1đến giếng thứ 12

+ Nhỏ 25 µl dung dịch hồng cầu gà 1% (lấy từ gà trống khỏe mạnh) vào

các giếng từ giếng 1-12. Để 15-30 phút nhiệt độ phòng và đọc kết quả ngưng

kết.

+ Hiệu giá ngưng kết hồng cầu gà (HA) là nồng độ pha loãng cao nhất còn

có hiện tượng ngưng kết toàn phần.

- Phương pháp HI: cũng được tiến hành trên đĩa microtiter 96 giếng đáy

V. Sau khi đã biết hiệu giá HA của virus, virus được pha thành dung dịch kháng

nguyên có chứa 4 đơn vị HA.

+ Cho 25 µl dung dịch PBS pH ,2 vào các giếng của đĩa phản ứng

+ Cho 25 µl kháng huyết thanh chuẩn A/H N1 đã biết được pha loãng với

PBS theo cơ số 2.

+ Sau đó nhỏ vào mỗi giếng 25 µl dung dịch kháng nguyên 4 đơn vị HA,

để nhiệt độ phòng 30 phút,

+ Tiếp t c nhỏ 25 µl dung dịch hồng cầu gà 1% vào các giếng, để 15-30

phút và đọc kết quả.

+ Hiệu giá ngăn tr ngưng kết hồng cầu (HI) là độ pha loãng cao nhất của

huyết thanh còn có hiện tượng ức chế hoàn toàn ngưng kết hồng cầu.

Khi tiến hành phản ứng HI với kháng huyết thanh chế từ chồn (ferret),

huyết thanh được pha loãng trước 1/10, rồi tiếp t c pha theo cơ số 2.

2.3.2.8. h t hiện virus bằng phản ứng realtime RT-PCR

a. Chiết t ch RNA của virus c A/H5N1 bằng kít Qi gen RNe y minikit.

T ình tự c c bước

Chuẩn bị

Chuẩn bị dung môi LT (600µl/mẫu) vào ống ly tâm 0ml. Thêm 1 100 β-

ercaptoethanol (β-ME) vào dung môi LT.

 Dung môi này có thể bảo quản 1 tháng nhiệt độ phòng.

Tiến hành tách chiết

- Lắc vortex mẫu trong giây và ly tâm nhanh (spin down).

- Cho 600 µl dung môi LT đã bổ sung β- E vào ống eppendorf 1,5 ml.

- Chuyển 200 µl mẫu sang ống 1,5.

- Lắc vortex trong 1 giây và ly tâm nhanh .

- Cho 400 µl cồn tuyệt đối 100%, và lắc vortex trong 1 giây.

- (Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng phút trong 1 phút nhiệt độ phòng)

- Đặt ống cột lọc (spin column) vào hệ thống hút chân không.

- Chuyển tất cả dung dịch mẫu sang cột lọc và bật máy hút.

Rửa lần 1

- Cho 00 µl dung môi W1 vào cột lọc và bật máy hút cho đến khi hút

hết lượng mẫu trong cột lọc.

Rửa lần 2

- Cho 00µl dung môi PE vào cột lọc và bật máy hút cho đến khi hút hết

lượng mẫu trong cột lọc.

- Cho tiếp 00 µl dung môi PE vào cột lọc và bật máy hút cho đến khi

hút hết lượng mẫu trong cột lọc.

- Đặt cột lọc vào ống thu mới (collection tube)

- Ly tâm cột lọc với tốc độ 12000 vòng phút trong 2 phút

Thu RNA

- Chuyển cột lọc sang ống 1.5ml eppendorf mới.

- Cho 50l nước (RNase-free H2O) vào cột lọc, đợt 1 phút.

- Ly tâm 1 phút tốc độ >10.000 phòng phút

- Chuyển mẫu NA đã thu sang ống 1.5ml mới.

Cất giữ RNA

Có thể giữ RNA 40C trong vài giờ nếu xét nghiệm ngay. Cất giữ nhiệt

độ -200C nếu chưa dùng ngay trong ngày để bảo quản RNA.

b. Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR (RRT-PCR) sử dụng p i e à

probe matrix thiết kế đặc hiệu cho virus c A/H5N1 (theo quy trình chẩn

đoán - TCN)

Bảng 2.2. i e à p obe đ ph t hiện i c gi cầ A/H5N1

Đầu Chuỗi n cleotide (5’-3’ 3’ 5’

Primer/ Probe Probe TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG FAM BHQ1 Xuôi CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC Ngược AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA

Bảng 2.3. Ch ẩn bị ix (hỗn hợp phản ứng cho Re lti e RT-PCR

Invitrogen superscriptIII qRT-PCR kit

Reagent Lượng (µl)

Nước Rnase/Dnase free 2x Reaction buffer MgCl2 (50mM) Forward primer (20 μ ) Reverse primer (20 μ ) Probe Enzyme mix 4.5 12.5 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5

- Cho 20 µl master mix vào ống PCR.

- Cho µl mẫu NA vào ống PCR.

- Đặt ống PC vào máy real-time PCR machine.

- Chạy chương trình.

- Chọn đọc màu bước kéo dài (annealing).

Ch t ình nhiệt của phản ứng:

- 50oC - 15 phút

- 95oC- 2 phút

- 40 chu kỳ (95oC-10 giây + 58oC-50 giây)

Đọc kết quả:

Kết quả xét nghiệm được công nhận khi:

- Đối chứng dương tính cho giá trị Ct (Cycle threshold – ngưỡng vòng)

đã biết (±2),

- Đối chứng âm tính không có Ct

- Mẫu được coi là dương tính khi có Ct  35

- Mẫu được coi là âm tính nếu không có Ct

- Mẫu được coi là nghi ngờ nếu Ct >35

2.3.2.9. hương ph p là tiê bản xét nghiệm bệnh tích i th

Các mẫu phủ tạng cắt mỏng 0, cm ngâm trong dung dịch formol 10%

trong 24 giờ.

Lấy các miếng tổ chức cố định trong formol ra cắt mỏng 2 - 3mm, rửa

dưới vòi nước chảy trong 2 – 3 giờ cho hết formol thừa.

Chuyển sang ngâm trong cồn 70% thời gian 2 – 3 giờ. Ngâm sang cồn 900 trong 2 – 3 giờ.

Ngâm sang cồn tuyệt đối 2 – 3 lần, mỗi lần 2 – 3 giờ.

Ngâm sang xylen 1 để trong 2 – 3 giờ.

Ngâm sang xylen 2 để trong 2 – 3 giờ.

Ngâm tẩm nến 3 lần, mỗi lần 2 – 3 giờ.

Đúc khuôn.

Cắt tiêu bản:

Cắt gọt khối block nến vuông, mặt cắt b ng phẳng, để trên mặt khay đá

lạnh khoảng 5 – 10 phút.

Đặt mặt khối block nến song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt

3 – µm.

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi chưng cất nhiệt độ nước 30 -

350C; Dùng lam kính chọn lát cắt giãn phẳng, không bị nếp nhăn, dựng nghiêng, để vào tủ ấm 370C cho khô.

Nhuộm tiêu bản H&E (Hematoxylin-Eozin)

Lấy lam kính ra khỏi tủ ấm, tẩy nến trong xylen 3 lần, mỗi lần 3 – phút.

Ngâm trong cồn tuyệt đối 3 – phút.

Ngâm sang cồn 90% để 3 – phút.

Ngâm sang cồn 70% để 3 – phút.

Rửa dưới vòi nước chảy 3 – phút.

Nhuộm Haematoxylin 1 – 5 phút.

Rửa dưới vòi chảy 3 – phút.

Nhuộm Eosin 60 – 90 giây.

Rửa dưới vòi nước chảy 2 – 3 phút. Để khô trong nhiệt độ phòng (hoặc ngâm trong cồn 900 rồi đến cồn tuyệt

đối), chuyển sang xylen 2 lần (mỗi lần 2 – 3 phút), gắn lamen b ng Balm canada.

Để khô, soi kính. Soi kiểm tra dưới kính hiển vi.

2.3.2.10. hương ph p hó iễn dịch

 Cắt tiêu bản dày 4µm, dán lên phiến kính

 Để tiêu bản khô qua đêm trong tủ ấm 49 độ C, sau đó để 10 phút nhiệt

độ 60 độ C

 Tẩy nến: ngâm qua 3 cốc xylen, 3 cốc cồn tuyệt đối, 1 cốc cồn 70% (mỗi

cốc 2 phút). Sau đó rửa trong dòng nước chảy. Để vào nước cất nếu cần

thiết

 Đặt tiêu bản vào khay, rửa tiêu bản b ng Tris buffer

 Nhỏ 200µl H2O2 cho mỗi tiêu bản. Để trong 10 phút, sau đó rửa b ng

dung dịch Tris buffer

 Nhỏ 200µl Proteinase K. Để trong phút, sau đó rửa b ng dung dịch Tris

buffer

 Nhỏ 200µl kháng thể 1 (kháng virus cúm gia cầm chế trên chuột) cho mỗi

tiêu bản. Để trong 1 giờ, sau đó rửa b ng dung dịch Tris buffer

 Nhỏ 200µl kháng thể 2 (DAKO envision reagent – anti – mouse) cho mỗi

tiêu bản. Để trong 4 phút, sau đó rửa b ng dung dịch Tris buffer

 Nhỏ 200µl dung dịch AEC cho mỗi tiêu bản (DAKO AEC + substrate

chromagen). Để trong 2-3 phút, kiểm tra màu b ng kính hiển vi. Dừng

phản ứng b ng cách rửa qua nước cất.

 Nhuộm b ng Haematoxylin trong 3 phút, sau đó nửa qua vòi nước chảy

 Rửa b ng nước cất, sau đó rút nước (b ng cách nhúng qua cồn 90, cồn

tuyệt đối: 2 lần, xylen: 2 lần)

 Gắn lamen

2.3.2.11. hương ph p giải t ình tự gen

- Chiết tách NA như trên (xem 2.3.2. , phần a)

- Nhân đoạn toàn bộ đoạn gen HA, NA b ng phản ứng RT-PCR (PCR

phiên mã ngược) với các cặp primer đặc hiệu

+ Pha master mix để chạy phản ứng PCR (sử d ng kít Promega Access-

Quick RT-PCR (A1701))

Bảng 2.4. Ch ẩn bị ix (hỗn hợp phản ứng RT- CR giải t ình tự gen

Promega Access-Quick RT-PCR (A1701) kit

Reagent Lượng (µl)

Access Quick Master Mix 12,5

Mẫu RNA 2 - 5

Forward primer (20 μ ) 0,5

everse primer (20 μ ) 0,5

AMV Reverse Transcriptase 0,5

Nước Rnase/Dnase free Tới 25

+ Chu trình nhiệt:

Bước 1: 48°C trong 4 phút

Bước 2: 94°C trong 2 phút

Bước 3: 94°C trong 20 giây

Bước 4: 0°C trong 30 giây

Bước : 2°C trong 1 phút

Bước 6: Thực hiện 3 chù kỳ từ bước 3-5

Bước : 2°C trong 10 phút

Bước 8: Giữ 4°C

Bảng 2.5. T ình tự p i e đ giải t ình tự gen (theo q y t ình CDC)

H5F-1

AGC AAA AGC AGG GGT YTA AT

Primer Trình tự nucleotide

H5R-1111r CCA TAC CAA CCA TCT AYC ATT CC

H5F-751r

AYG CMT AYA ARA TTG TCA AG

H5R-1773

AGT AGA AAC AAG GGT GTT TTT AAC TAC AAT

H5F-219r

GAT CTT CTT GRT TGG TRT TAT TGT ARC T

H5R-515r

GAG TGA AGC CTC TRA TYT T

H5R-1000r TGA TTT CAC RTA YTT GGG RCA TTC

H5F-945r

CAT TCC ACA AYA TMC AYC C

H5F-1150r CAA YGA GCA GGG GAG TGG RTA

N1F1

AGC AAA AGC AGG AGA TTA AAA TGA ATC CAA

H5N1 HA

N1R835

CAC ACA TGT GAT TTC GCC AGC

N1F458

GGC AAG TGC TTG CCA TGA TGG

NA-

AGT AGA AAC AAG GAG TTT TTT

N1R561

GAC CAA GCA ACA GAC TCA AAC C

N1F955

TCA AAT AGG ATA YAT ATG CAG TGG

N1R1112

AAC TGA TTG GTC AGG RTA YAG YGG

MF1

AGC AAA AGC AGG TAG ATA TTG AAA GAT GAG

H5N1 NA

MR1027

AGT AGA AAC AAG GTA GTT TTT TAC

AvMF476

TGTGAGCAGATTGCA GATTCAC

AvMR560

TTA GCT GTA GTG CTG GCC AGC ACC

H5N1 M

- Sản phẩm PC được đọc trình tự b ng máy giải trình tự gen tự động ABI

3730 Analyzer (CDC)

- Sử d ng phần mềm Bioedit .0.9 để thực hiện việc so sánh chuỗi trình tự

(Alignment)

- Lập cây phả hệ sử d ng chuỗi gen HA, NA và dựa trên khung đọc mã

m (ORF) sử d ng phương pháp Neighbor-joining (NJ) với phần mềm MEGA 5

(Molecular Evolutionary Genetic Analysis). Lập cây phả hệ so sánh với các virus

cúm A/H5N1 thuộc các clade (nhánh) khác nhau với gốc là virus clade 0

(A/goose/Guangdong/1/1996).

Hình 2.1. Sơ đồ b t í p i e giải t ình tự gen H5, N1 à M i c A/H5N1

2.3.2.12. Tiê phòng vacxin cho gà, đ nh gi c c ch s gây bệnh lâ àng

- Lô Thí nghiệm: 10 con gà 2 tuần tuổi khỏe mạnh, không có kháng thể

cúm A H N1 được tiêm 0,3 ml vacxin cúm A H N1 e-1, dưới da cổ.

- Lô Đối chứng: 0 gà khỏe mạnh, không có kháng thể cúm A H N1 cùng

nguồn gốc với gà thí nghiệm.

- Thời điểm 4 tuần sau khi tiêm vacxin cúm, công cường độc cho gà được

tiêm vacxin (10 con) và gà đối chứng (5 con) với liều công cường độc virus cúm A/H5N1clade là 106TCID50/100 µl gà qua đường nhỏ mũi. Việc công cường

độc được tiến hành trong khu chuồng nuôi động vật đảm bảo điều kiện an toàn

sinh học cấp độ 3 tại Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương.

+ Theo dõi các biểu hiện lâm sàng trong vòng 10 ngày sau khi công cường

độc, đánh giá các chỉ số gây bệnh lâm sàng (khỏe mạnh-0, ốm nhẹ-1, ốm nặng-2,

chết-3).

+ Lấy máu và kiểm tra kháng thể cúm gia cầm trước và sau khi công

cường độc (theo phương pháp HI).

- Tỷ lệ bảo hộ thực sự của gà được tiêm vacxin (PF-Preventable Fraction)

được tính như sau:

(% đối chứng chết-%thí nghiệm chết)

PF= % đối chứng chết

2.3.2.12. C ch tính thời gian chết t ng bình (MDT)

Lấy ngày gia cầm được gây bệnh chết nhân với số gia cầm chết trong

ngày đó, rồi lấy tổng số ngày đã tính được chia cho tổng số gia cầm được gây

bệnh sẽ có thời gian chết trung bình:

Ví d : Gây bệnh cho 10 gà, có 4 con chết vào ngày thứ tư, 4 con chết vào

ngày thứ năm, và 2 con chết vào ngày thứ sau. Ta sẽ tính như sau:

MDT = [(4 x 4) + (4 x 5) + (2 x 6)]/10

MDT = 48 10 = 4,8 (ngày)

2.3.2.13. C ch tính đi lâ àng

Cho điểm lâm sàng gia cầm thí nghiệm như sau: khỏe mạnh – 0 điểm, ốm

nhẹ (bỏ ăn, uống) – 1 điểm, ốm nặng (n m liệt) – 2 điểm, và chết – 3 điểm.

Sau đó cộng điểm từng ngày của mỗi gia cầm thí nghiệm và tính trung

bình trên số ngày thí nghiệm. Có thể tính tiếp trung bình cho cả lô thí nghiệm.

Ngày sau khi tiến hành thí nghiệm

1,5

Gia cầm TN

Ví d :

TB = (0+1+1+2+2+3)/6

TB = 1,5

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU V THẢO LUẬN

3.1. hân lập à gi định i c A/H5N1 cl de 7

Nhiều nghiên cứu trước đây đã cho thấy có nhiều dòng virus cúm A/H5N1

khác nhau đã lưu hành trong khu vực cũng như đã thâm nhập vào Việt Nam. Các

nghiên cứu về phát sinh loài virus A H N1 Việt Nam cũng cho thấy có nhiều

nhánh (clade) virus đã xâm nhập và tái xuất hiện trong nước trong những năm

qua (Nguyen và cs, 2008; Simmons và cs, 200 ; Wallace và cs, 200 ). Mặc dù

cơ chế xâm nhập và lây lan của virus vẫn còn chưa được xác định rõ, nhưng khả

năng virus vẫn còn tiếp t c tái xuất hiện sẽ có thể làm phức tạp thêm cho công

tác phòng chống cúm gia cầm Việt Nam.

Từ cuối năm 200 , để phòng chống dịch cúm gia cầm gây bệnh cho gia

cầm và gây nguy hiểm cho con người, Việt Nam đã áp d ng chương trình tiêm

phòng cúm gia cầm A/H5N1 trong cả nước. Song song với chương trình phòng

bệnh b ng vacxin, để đảm bảo và giám sát chủ động kết quả tiêm phòng C c Thú

y đã tiến hành các chương trình giám sát sau tiêm phòng và đồng thời giám sát sự

lưu hành của virus A H N1. Chương trình giám sát virus đã được thực hiện

những vùng nguy cơ (nơi từng xảy ra dịch) và những nơi có gia cầm nhập lậu

vào Việt Nam.

Để khống chế sự lây lan của virus cúm A/H N1 độc lực cao (HPAI), Việt

Nam đã thiết lập và thực hiện những chương trình giám sát cúm gia cầm trên các

đàn gia cầm, chợ gia cầm sống…đặc biệt là một số điểm (cửa khẩu) dọc theo

tuyến biên giới phía Bắc, c thể là Lạng Sơn, nơi có hiện tượng gia cầm nhập

lậu vào Việt Nam. Tại đây, gia cầm đã bị bắt giữ và tiêu hủy với số lượng tương

đối lớn. Trước khi tiêu hủy, gia cầm đã được lấy mẫu b ng tăm bông ngoáy ổ

nhớp (cloacal swab), sau đó các mẫu tăm bông được giữ trong dung dịch bảo

quản (VTM-viral transport medium) và chuyển về Trung tâm Chẩn đoán Thú y

Trung ương. Chúng tôi đã thực hiện việc xét nghiệm nh m phát hiện virus cúm

gia cầm. Trong luận án này chúng tôi chỉ trình bày về virus cúm A/H5N1 clade

7. Kết quả xét nghiệm được trình bày bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả xét nghiệm à phân lập virus từ chương t ình gi t

biên giới (Lạng Sơn)

Kết quả

Huyện Số mẫu Phân lập virus Dương tính cúm A (RRT-PCR) Dương tính H5N1 (RRT-PCR)

Số mẫu Tỷ lệ % Số mẫu Tỷ lệ % Số mẫu Tỷ lệ %

Cao Lộc 275 10 3,64 8 2,91 5 1,82

220 7 3,18 7 3,18 0 0,00

5 1,01 495 17 3,43 15 3,03 Lộc Bình Tổng c ng

Bảng 3.1 cho thấy trong giai đoạn năm 2008, đã có tổng cộng 495 mẫu

swab ngoáy ổ nhớp từ gà nhập lậu được thu thập và gửi đến Trung tâm Chẩn

đoán Thú y Trung ương để xét nghiệm. Trong đó có 2 mẫu dịch swab từ huyện

Cao Lộc và 220 mẫu dịch swab từ huyện Lộc Bình của tỉnh Lạng Sơn.

Chúng tôi đã tiến hành chiết tách NA từ các mẫu dịch swab b ng kít

RNeasy minikit (cat# 4104) và xét nghiệm b ng phản ứng Realtime RT-PCR

phát hiện virus cúm A (phát hiện gen M).

Như vậy, trong số 495 mẫu xét nghiệm, đã phát hiện 17 mẫu bệnh phẩm

dương tính với virus cúm A, trong đó có 10 mẫu phát hiện Cao Lộc và mẫu

Lộc Bình, đạt tỷ lệ trung bình 3,43% (17/495).

Các mẫu dương tính với virus cúm A, được tiếp t c xét nghiệm b ng

phương pháp ealtime T-PC để phát hiện virus A/H5N1. Kết quả cho thấy có

15/17 mẫu dương tính virus A H N1, đạt tỷ lệ trung bình 3,03% trên tổng số 49

mẫu dịch swab đã xét nghiệm. Các mẫu dương tính virus cúm A/H5N1 đều được

phát hiện các điểm kiểm soát cửa khẩu khác nhau biên giới phía Bắc n m

huyện Cao Lộc và Lộc Bình.

Các mẫu dương tính A/H5N1 được tiếp t c gây nhiễm lên phôi trứng gà 9-

10 ngày tuổi, kết quả là đã phân lập được chủng virus cúm A H N1 trên tổng

số 15 mẫu phát hiện dương tính virus cúm A/H5N1. Cả chủng này đều là các

mẫu từ huyện Cao Lộc. Các mẫu còn lại (Cao Lộc và Lộc Bình) không phân lập

được virus có thể do virus có trong mẫu swab đã chết trong quá trình bảo quản và

vận chuyển.

Hình 3.1. Bản đồ nơi ph t hiện được c c chủng i A/H5N1 thu c clade 7

ở Lạng Sơn

Từ các kết quả xét nghiệm và phân lập virus từ các địa điểm khác nhau

trên tuyến biên giới có thể nhận thấy r ng rõ ràng nguy cơ xâm nhập của virus

cúm gia cầm theo gia cầm nhập lậu, đặc biệt là virus A H N1 từ nước ngoài vào

Việt Nam là rất cao. Đây có thể là một nguyên nhân dẫn đến việc dịch cúm gia

cầm vẫn liên t c xảy ra Việt Nam trong nhiều năm. Đồng thời, việc tiến hành

công tác giám sát virus cúm gia cầm là rất cần thiết với b ng chứng rõ ràng về

virus đã phát hiện và phân lập được, điều này giúp cho việc có thông tin chủ

động trong việc phát hiện sớm những nguy cơ dịch cúm gia cầm có thể xảy ra,

chủ động nâng cao công tác phòng và chống bệnh cúm gia cầm.

3.2. X c định đặc tính di t yền của virus c A/H5N1 th c clade 7 phân

lập ở Việt N (bằng phương ph p giải t ình tự à lập cây phả hệ)

3.2.1. Giải t ình tự gen HA (H5) à phân tích cây phả hệ sử dụng chuỗi gen H5. Trong số 15 mẫu được xác định là virus cúm A/H5N1 clade 7, có mẫu

đã phân lập được virus, còn 10 mẫu còn lại chỉ cho kết quả dương tính b ng

phương pháp ealtime T-PCR. Cả 15 mẫu này đều được chúng tôi tiến hành

chiết tách NA của virus và sau đó sử d ng phản ứng RT-PC để khuếch đại

gen HA để giải trình tự gen tại phòng thí nghiệm cúm của CDC-Hoa Kỳ.

Bảng 3.2. Kết q ả giải t ình tự gen à phân tích cây ph t inh loài

c c chủng i c A/ H5N1 ph t hiện ở Lạng Sơn

S

Đị đi m

hân lo i

Tên chủng virus c phân lập được

Subtype

TT

ph t hiện

cl de/nhó

1 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008

Cao Lộc

H5N1

2 A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008

Cao Lộc

Nhóm B

H5N1

3 A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008

Cao Lộc

Nhóm B

H5N1

4 A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008

Cao Lộc

Nhóm B

H5N1

5 A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008

Cao Lộc

Nhóm A

H5N1

Tên dương tính virus c (kh ng

phân lập được virus)

6 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/2008

Cao Lộc

Nhóm B

H5N1

7 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/2008

Lộc Bình

Nhóm A

H5N1

8 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/2008

Lộc Bình

Nhóm B

H5N1

9 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/2008

Lộc Bình

Nhóm A

H5N1

10 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/2008

Lộc Bình

Nhóm A

H5N1

11 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/2008

Cao Lộc

H5N1

12 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/2008

Cao Lộc

Nhóm B

H5N1

13 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/2008

Lộc Bình

Nhóm B

H5N1

14 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/2008

Lộc Bình

Nhóm B

H5N1

15 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/2008

Lộc Bình

Nhóm B

H5N1

Tên của các mẫu đã phân lập được virus cúm A/H5N1và tên của các mẫu

NA đã phát hiện dương tính virus cúm A/H5N1 được đặt theo danh pháp quốc

tế: Tên type cúm A Loài Tên nước Tên viết tắt Trung tâm Chẩn đoán Thú y

Trung ương b ng tiếng Anh-ký hiệu của virus hoặc mẫu. Kết quả chi tiết về các

mẫu đã phân lập và phát hiện dương tính virus cúm A/H5N1 được trình bày

bảng 3.2.

Tìm kiếm sự tương đồng của các virus cúm được thực hiện b ng chương

trình BLAST trên ngân hàng dữ liệu (NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)

sử d ng chuỗi nucleotide của gen HA cho thấy, các mẫu virus này có độ tương

đồng rất cao với hai chủng virus đã được mô tả trước đây là virus

A chicken Hebei 326 200 H N1 và virus A chicken Shanxi 2 2006 H N1 (độ

tương đồng trung bình của gen HA mức độ nuleotide lần lượt là 96,1% và

96,3%) và cả 1 mẫu này đều được sắp xếp n m trong một nhóm.

Phân tích trình tự gen b ng phương pháp lập cây phả hệ (phylogenetic

tree) để tìm kiếm tổ tiên (nguồn gốc) của 15 mẫu virus cúm này cho thấy gen HA

của các virus n m chung một nhóm với một nhóm ph của các virus cúm H N1

trước đây có gen HA được phân loại là clade . Tên một số chủng virus cúm

A H N1 của tất cả các clade từ 0-9 sử d ng để xây dựng cây phát sinh loài gen

HA H được thể hiện bảng 3.3. Trong số mẫu xét nghiệm trên đây chúng tôi

không phát hiện thấy mẫu virus A/H5N1 thuộc clade 2.3.4. Điều này cũng có thể

hợp lý vì thực ra virus A H N1 clade 2.3.4 đã xâm nhập vào Việt Nam từ năm

2007.

Một điều chú ý là, khi quan sát trên cây phát sinh loài dựa trên gen HA có

thể thể thấy rõ có 13 trong số 15 mẫu virus cúm A H N1 clade của Việt Nam

tách thành 2 nhóm nhỏ rõ rệt (xem hình 3.2.), tạm được gọi là nhóm A và nhóm

B để phân tích (tên c thể của từng mẫu trong mỗi nhóm A và B được tình bày

trong bảng 3.2.). Thêm vào đó, 2 mẫu virus cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD-

016 2008 và A chicken Vietnam NCVD-swab19 2008 dường như đã chiếm vị trí

trung gian trong cây phả hệ, gần với gốc của 2 nhóm nhưng không n m trong 2

nhóm này.

Hình 3.2. Cây phả hệ dự chuỗi nucleotide gen H5 củ những i

c A/H5N1 cl de 7 (Được lập bằng phương ph p phân tích Neighbor-

joining sử dụng phần mề MEGA 5, gi t ị boostrap 1000)

Khoảng cách tiến hóa của gen HA giữa 2 nhóm A và B cho thấy sự khác

biệt giữa các dòng virus n m trong clade này được chỉ ra b ng độ dài của các

nhánh trong cây phả hệ (Hình 3.2.) cũng như khoảng cách trung bình nucleotide

của chúng đối với tổ tiên clade 7 gần nhất (virus A chicken Shanxi 2 2006). Để

định lượng sự dị biệt di truyền giữa các mẫu virus A/H5N1 này và các virus

A/H5N1 khác, chúng tôi tiến hành so sánh theo cặp đôi về sự khác biêt theo tỷ lệ

phần trăm với chuỗi nucleotide và chuỗi axit amin (Bảng 3.4.)

Trong phân tích sự khác biệt di truyền gen HA của virus A H N1 clade

của Việt Nam và các chủng virus A H N1 tham chiếu, chúng tôi chỉ lựa chọn các

mẫu mà đã phân lập được virus vì sau này tiếp t c sử d ng các mẫu virus phân

lập cho việc nghiên cứu đặc tính kháng nguyên. Kết quả phân tích sự khác biệt di

truyền gen HA được trình bày bảng 3.4.

Các chủng virus đại diện từ một số clade H5N1 khác nhau (clade 0, clade

1, clade 4, clade 2.1.3, clade 2.2, clade 2.3.4 và clade ) đã được sử d ng trong

phân tích này để cung cấp các tham chiếu nh m so sánh mức độ của sự khác biệt

về di truyền giữa các mẫu virus cúm A/H5N1 clade 7 mới phát hiện với nhau và

giữa chúng với một số clade khác đã được báo cáo trước đây (Weiss, 2003).

Các gen HA của 2 nhóm virus A hoặc B cho thấy sự khác biệt trong cùng

nhóm mức độ rất thấp đối với chuỗi nucleotide cũng như chuỗi axit amin, c

thể sự khác biệt trung bình tổng thể về nucleotide là 0,39% và về axit amin là

0,38%. Ngược lại, sự khác nhau giữa hai nhóm A và nhóm B đạt trung bình

4,0 % và ,69% lần lượt các mức độ nucleotide và amino acid trên khắp vùng

gen HA mã hóa.

Cũng trong năm 200 – 2009, Trung Quốc cũng phát hiện ra nhiều chủng

virus cúm A/H5N1 khác nhau trong đó có virus cúm A/H5N1 thuộc clade 7.

Theo nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc (Jiang và cs, 2010) các virus

A H N1 clade phân lập trong giai đoạn này cũng khác biệt một cách rõ rệt với

những virus được phân lập từ trước đó, với sự khác biệt trung bình về chuỗi

nucleotide trên gen HA là ,4%.

Bảng 3.3. D nh ch c c chủng i c A/H5N1 dùng đ o nh

à lập cây ph t inh loài dự t ên gen H5

Nă

S đăng ký

Nơi phân

Stt

Tên chủng

Clade Loài ắc

phân

ngân hàng

lập

gen

1 A/goose/Guangdong/1/96

Ngỗng

1996 Trung Quốc AF144305

2 A/Hong Kong/156/97

1997 Hong Kong AF036356

Người

3 A/Hong Kong/213/03

2003 Hong Kong DQ992842

Người

EF541402

4 A/Viet Nam/1194/2004

2004 Việt Nam

Người

5 A/Viet Nam/1203/2004

2004 Việt Nam HM006759

Người

7 A/Cambodia/JP52a/2005

2005 Campuchia EF456805

Người

EF456803

6 A/Viet Nam/HN30408/2005

2005 Việt Nam

Người

9 A/Muscovy duck/Vietnam/4/2007

2007 Việt Nam AB593439

Ngan

8 A/duck/Vietnam/1/2007

2007 Việt Nam CY029559

Vịt

EF473081

10 A/chicken/Indonesia/11/2003 2.1.1

2003 Indonesia

Gà

2.1

CY014272

11 A/Indonesia/CDC594/2006 2.1.2

2006 Indonesia

Người

2.1

CY019384

12 A/Indonesia/CDC1032/2007 2.1.3

2007 Indonesia

Người

2.1

15 A/whooper swan/Mongolia/244/2005

2.2 Chim hoang 2005 ông Cổ GU186700

16 A/turkey/Turkey/1/2005 2.2

2.2

Gà Tây

2005 Thổ Nhĩ Kỳ EF619980

17 A/bar-headed goose/Qinghai/1A/2005

2.2 Chim hoang 2005 Trung Quốc DQ659327

EU623468

13 A/chicken/Egypt/9403-clevb214/2007

Gà

2007 Ai Cập

2.2

EF535817

14 A/Egypt/1394-NAMRU3/2007

2007 Ai Cập

Người

2.2

EF535822

19 A/Egypt/321-NAMRU3/2007

2007 Ai Cập

Người

2.2

EU146920

18 A/Nigeria/6/07 2.2

2007 Nigeria

Người

2.2

21 A/duck/Hunan/127/2005 2.3.1

2005 Trung Quốc DQ320902

Vịt

2.3.1

20 A/duck/Hunan/139/2005 2.3.1

2005 Trung Quốc DQ320903

Vịt

2.3.1

25 A/Chicken/Shantou/810/05 2.3.2

2005 Trung Quốc DQ095626

Gà

2.3.2

22 A/duck/Vietnam/568/2005 2.3.2

2005 Việt Nam DQ320939

Vịt

2.3.2

EU676174

23 A/chicken/Primorje/1/2008 2.3.2

2008 Nga

Gà

2.3.2

24 A/whooper swan/Hokkaido/1/2008 2.3.2 2.3.2 Chim hoang 2008 Nhật Bản AB436550

2.3.3

26 A/chicken/Guiyang/3055/2005 2.3.3

Gà

2005 Trung Quốc DQ992755

2.3.3

27 A/goose/Guiyang/3422/2005 2.3.3

Ngỗng

2055 Trung Quốc DQ992757

FJ147207

2.3.4

28 A/duck/Laos/3295/2006

Vịt

2006 Lào

A/Japanese white-eye/Hong

Chim

2006 Nhật Bản HM172104

2.3.4

Kong/1038/2006

Nă

S đăng ký

Nơi phân

Stt

Tên chủng

Clade Loài ắc

phân

ngân hàng

lập

gen

2.3.4

30 A/Anhui/1/2005

Người

2006 Trung Quốc HM172104

2.3.4

31 A/Muscovy duck/Vietnam/48/2007

Ngan

2007 Việt Nam CY029695

2.3.4

32 A/Muscovy duck/Vietnam/54/2007

Ngan

2007 Việt Nam CY029743

EU294369

2.3.4

33 A/Viet Nam/HN31242/2007

Người

2007 Việt Nam

2.4

34 A/duck/Guangxi/13/2004

Vịt

2004 Trung Quốc DQ366338

2.4

35 A/chicken/Yunnan/493/2005

Gà

2005 Trung Quốc DQ095625

2.5

36 A/chicken/Yamaguchi/7/2004

Gà

2004 Nhật Bản GU186708

2.5

37 A/chicken/Guangdong/174/04

Gà

2004 Trung Quốc AY609312

39 A/duck/Fujian/17/2001

Vịt

2001 Trung Quốc AY585372

38 A/Chicken/Hong_Kong/715.5/01

Gà

2002 Hong Kong AF509025

40 A/goose/Fujian/bb/2003

Ngỗng

2003 Trung Quốc DQ997405

41 A/goose/Guiyang/1175/2006

Ngỗng

2006 Trung Quốc DQ992771

42 A/goose/Guiyang/337/2006

Ngỗng

2006 Trung Quốc DQ992765

43 A/chicken/Jilin/ho/2003

Gà

2003 Trung Quốc DQ997355

EF541407

44 A/chicken/Viet_Nam/Ncvd8/2003

Gà

2003 Việt Nam

45 A/duck/Hubei/wg/2002

Vịt

2002 Trung Quốc DQ997094

46 A/blackbird/Hunan/1/2004

6 Chim hoang 2004 Trung Quốc AY741213

51 A/Beijing/01/2003

Người

2003 Trung Quốc EF587277

47 A/treesparrow/Henan/2/2004

Chim

2004 Trung Quốc AY741217

50 A/domestic mallard/Hunan/79/2005

7 Chim hoang 2005 Trung Quốc EU430511

52 A/chicken/Hebei/326/2005

Gà

2005 Trung Quốc DQ343150

49 A/goose/Yunnan/3315/2005

Ngỗng

2005 Trung Quốc DQ992794

48 A/duck/Yunnan/5133/2005

Vịt

2005 Trung Quốc DQ992801

53 A/chicken/Shanxi/2/2006

Gà

2006 Trung Quốc DQ914814

55 A/chicken/Hong_Kong/61.9/02

Gà

2002 Hong Kong AY575876

54 A/chicken/Hong_Kongi/86.3/2002

Gà

2002 Hong Kong DQ320927

57 A/chicken/Hubei/14/2004

Gà

2004 Trung Quốc EF670482

56 A/chicken/Hubei/489/2004

Gà

2004 Trung Quốc AY770079

ặc dù các gen HA của nhóm A hoặc B có sự khác biệt rất rất thấp trong

nhóm về chuỗi nucleotide hoặc axit amin, nhưng sự khác biệt giữa hai nhóm này

đạt trung bình 4,1% mức độ nucleotide và , % mức độ axit amin trên gen

HA (Bảng 3.4). Mức độ khác biệt cao tương đương với sự thay thế ≥ 30 axit

amin giữa các chuỗi protein HA hai nhóm.

Ngoài ra, các số liệu về sự khác biệt trung bình của tất cả các virus clade 7

đã giải trình tự trong nghiên cứu này so với virus H N1 clade có mối quan hệ

gần nhất về gen HA là A chicken Shanxi 2 2006 là 3,8% (3,3-3,9%) mức độ

nucleotide và ,8% ( ,4-6,1%) mức độ và axit amin (Bảng 3.4). Tóm lại,

những dữ liệu này cho thấy virus A chicken Shanxi 2 2006 là tổ tiên gần nhất

của clade HA gen được xác định trong nghiên cứu này.

So sánh gen HA của những chủng virus cúm A H N1 clade phân lập

Việt Nam với những chủng đại diện từ các clade khác của virus cúm A/H5N1

như clade 0, clade 4, clade 1, clade 2.1.3, clade 2.2 và clade 2.3.4 cho thấy gen

HA cấp độ axit amin liên quan gần nhất với virus nguyên mẫu thuộc clade 4 là

A/goose/Guiyang/337/2006 với sự khác biệt axit amin là 8,2-9,0% (trung bình là

8,38%) và liên quan xa nhất đối với virus nguyên mẫu clade 1 là

A/Vietnam/1203/2004 với sự khác biệt axit amin trung bình là 9,0-9,7% (trung

bình là 9,28%).

Trong số những chủng virus A/H5N1 thuộc các clade HA khác nhau,

chủng virus cúm A/H5N1 thuộc clade 0 (A/goose/Guangdong/1/1996) được sử

d ng để sản xuất vacxin cúm gia cầm H5N1 (Re-1) đang sử d ng Việt Nam từ

năm 200 đến nay. Mức độ khác biệt trung bình cấp độ axit amin giữa các

chủng virus cúm A/H5N1 clade phân lập Việt Nam đối với virus

A goose Guangdong 1 1996 là 8,86% (8,4-9,1%). Đây là sự khác nhau khá lớn

về di truyền, do vậy cần phải xác định rõ khi gia cầm được tiêm vacxin H5N1

Re-1, liệu kháng thể tạo ra có thể bảo hộ chống lại virus cúm A/H5N1clade 7 hay

không. Điều này sẽ được chúng tôi trình bày rõ tại phần 3.3.6 và 3.3. của luận

án này.

Khi phân tích gen HA của 15 mẫu virus cúm A/H5N1clade 7 của Việt

Nam, chúng tôi nhận thấy, các mẫu virus nhóm B có những thay đổi về di truyền

đáng kể nhất. Bên cạnh sự thay đổi codon thường xuyên được quan sát thấy gây

ra hiện tượng thay thế axit amin, còn xác định được có những sự chèn và xóa

các codon đầy đủ khi so sánh với các gen HA của những chủng virus tổ tiên

thuộc clade (hình 3.3).

Bảng 3.4. So nh ức đ kh c biệt về di truyền t ên gen HA củ 5 chủng i A/H5N1 clade 7

ới t chủng th chiế

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

1 Ký hiệ chủng Virus (Xắp xếp theo cl de

Axit amin (%)

A/goose/Guangdong/1/1996 (0)

3,9

3,8

4,3

4,5

3,6

6,5

8,4

9,1

9 8,8

9

A/goose/Guiyang/337/2006 (4)

4,8

5,6

6,1

5,9

4,3

7 8,2

9 8,2

8,1

8,4

3,5

4,5

A/Viet Nam/1203/2004 (1)

3,2

3,4

4,7

7,2

9 9,7

9,3

9,1

9,3

4,4

5,4

3,7

A/Indonesia/5/2005 (2.1.3)

3,6

3,2

4,5

7 8,4

9,5

8,8

8,6

9

4,3

5,4

3,5

3,1

5 7,9

8,6

9,1

9 9,1

A/bar-headed goose/Qinghai/1/2005 (2.2)

5,3

3,3

3,4

3,1

A/Anhui/1/2005 (2.3.4)

4,5

7,2

9,1

9 9,1

3,1

3,7

4,6

4,4

4,1

A/Beijing/01/2003 (7)

5 7,9

7,2

7 7,4

4,6

5,7

5,3

6,2

5,6

3,3

A/chicken/Shanxi/2/2006 (7)

5,4

5,9

5,7

6,1

6,2

6,5

6,6

7,1

6,9

6,8

4,4

3,3

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 (7, Vietnam)

6,1

0,1

A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 (7, Vietnam, nhó B)

0,4

6,6

6,9

7,4

7,2

6,9

4,6

3,8

2,7

0,4

0,3

A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 (7, Vietnam, nhó B)

Nucleotide (%)

Ghi ch -Chữ số trong ngoặc ( ) là clade của virus - Sự khác biệt axit a in được in đậm

Trên cơ s kết quả phân tích chuỗi nucleotide của gen HA (H5), chúng

tôi có một số nhận xét sau:

- Các chủng virus A H N1 nhóm B thuộc clade phát hiện Việt Nam

đều có hiện tượng xóa mất một axit amin là alanine vị trí 2 3 (dựa trên việc

đánh số gen HA (H ) và chèn thêm 3 axit amin vào vị trí polybasic gần

cleavage site (chuỗi nối). Hiện tượng chèn axit amin virus nhóm B (các axit

amin được gạch bên dưới) tạo ra một chuỗi polybasic vị trí chuỗi nối như

sau PQREREGG K *GLF. (xem hình 3.3).

- Trong khi đó, các virus A H N1 nhóm A của clade 7 vẫn duy trì chuỗi

trình tự axit amin thông thường PQIEG K *GLF như tất cả các gen

HAH5 của các virus cúm A H N1 clade khác. Có một điều đáng chú ý là,

virus A/chicken/ Vietnam/NCVD-016 2008, khi phân tích phát sinh loài,

chúng tôi nhận thấy virus này dường như là virus tổ tiên (nguồn gốc) của cả 2

nhóm virus A và B thuộc clade 7 Việt Nam, b i chủng virus này có một chuỗi

poly basic trung gian mang một axit amin được chèn vào như của nhóm B

(PQREGG K *GLF). (hình 3.3).

- Ở một chủng virus trung gian khác giữa 2 nhóm A và B là chủng

A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19 2008, cũng có chuỗi trình tự trung gian

với alanine bị xóa tại vị trí 2 3 và hiện tượng chèn một axit amin (glycine)

gần vị trí cleavage site tạo nên chuỗi trình tự polybasic PQIEGGRRRKR*G

giống như nhóm B (hình 3.3).

- Tất cả 15 mẫu virus cúm A H N1clade phân lập Việt Nam đều

chứa motif glycosyl hóa liên kết-N còn nguyên vẹn tại vị trí 1 4-156 (NNT)

phù hợp với sự glycosyl hóa thông thường vị trí này.

Hình 3.3. Hiện tượng chèn à xó c c xit in tại vị t í cle ge ite củ

c c chủng i A/H5N1 cl de 7 phân lập ở Việt N

3.2.2. Giải t ình tự gen NA(N1) à phân tích cây phả hệ dự t ên ch ỗi

nucleotide của gen N1

Gen NA của virus cúm gia cầm cùng với gen HA đã tạo nên kháng

nguyên trên bề mặt capsid. Vì vậy, song song với việc giải trình tự gen H ,

chúng tôi cũng tiến hành giải trình tự và phân tích gen N1 đối với 5 mẫu virus

cúm A/H5N1 clade mà chúng tôi đã phân lập được. Tên của 0 chủng virus

mà chúng tôi đã giải trình tự gen N1 c thể như sau:

- A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008

- A/Chicken/Vietnam/NCVD-093/2008

- A/Chicken/Vietnam/NCVD-03/2008

- A/Chicken/Vietnam/NCVD-04/2008

- A/Chicken/Vietnam/NCVD-05/2008

Chiều dài của đoạn gen N1 của các mẫu virus cúm A/H5N1clade 7 đã giải

trình tự là 1346 nucleotide, mã hóa cho 448 axit amin, kh i đầu b ng bộ mã

ATG. Trình tự nucleotide của gen N1 của các chủng virus này được so sánh với

chuỗi gen N1 tương ứng của một số chủng virus cúm A/H5N1của Việt Nam và

Trung Quốc phát hiện trong giai đoạn 1996-2010 gồm có chủng virus

A/goose/Guangdong 1 96 được coi là thủy tổ của virus cúm A/H5N1 độc lực

cao. Cùng với sự so sánh sự khác biệt về chuỗi nucleotide giữa các chủng virus

chúng tôi tiến hành lập cây phả hệ của gen N1 dựa trên chuỗi nucleotide và kết

quả được biểu diễn hình 3.4. Các chủng virus A H N1 sử d ng để lập cây phát

sinh loài cùng với các chủng virus A H N1 thuộc clade của Việt Nam được liệt

kê bảng 3.5.

Hình 3.4 cho thấy kết quả phân tích phát sinh loài dựa trên gen N1 cũng

đồng nhất đối với kết quả khi so sánh phát sinh loài dựa trên gen H . Nghĩa là

gen N1 các chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 phân lập Việt Nam cũng có độ

tương đồng cao đối với gen N1 của các chủng virus cúm thuộc clade 7 của Trung

Quốc và n m thành nhóm với nhau trên cây phả hệ.

Quan sát chi tiết cây phả hệ cho thấy trong số 5 chủng virus A/H5N1 clade

7 phân lập Việt Nam có 4 chủng là A chicken Vietnam NCVD-03/2008,

A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008, A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 và

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 n m c m lại thành nhóm với nhau. Trong

khi đó chủng A/chicken/Vietnam/NCVD-093 lại n m tách khá xa khỏi nhóm này

và có mức độ tương đồng gần (n m sát nhau trên cây phát sinh loài) với chủng

virus thuộc clade 7 của Trung Quốc phân lập từ năm 2003 (A/Beijing/01/2003).

Kết quả so sánh về sự phân bố của các chủng virus cúm A/H5N1 clade 7

trong cây phả hệ gen H và N1, có thể nhận xét r ng giữa các chủng virus cúm

A/H5N1clade cũng có sự tiến hóa khác nhau đối với gen N1, c thể là chủng

A/chicken/Vietnam/NCVD-093 khác biệt với nhóm còn lại của các virus clade

của Việt Nam. Tuy nhiên khi so sánh với các các chủng virus cúm A/H5N1của

những clade khác, có thể nhận thấy rõ ràng là các virus cúm A/H5N1thuộc clade

7 của Trung Quốc cũng như Việt Nam đều có độ tương đồng cao và khác biệt

hoàn toàn với các clade khác hiện tại đang lưu hành trong khu vực.

* * *

Virus clade 7 HA

n m a

t i x a 0 2

n ạ o đ

ấ

n m a

t í x a 9 1 n ạ o đ

ấ M

Hình 3.4. Cây phả hệ dự t ên chuỗi nucleotide gen N1 củ c c chủng i

A/H5N1 clade 7(Được lập bằng phương ph p phân tích neighbo -joining sử

dụng phần mề MEGA 5, gi t ị boostrap 1000)

irus có d u là virus /H5N1 clade 7 phân lập t i iệt Na

Bảng 3.5. D nh ch c c chủng i A/H5N1 ử dụng đ o nh à lập cây

ph t inh loài dự t ên gen N1

Stt

D nh ph p q c tế

Nơi phân lập

Loài ắc

S đăng ký ngân hàng gen

1 A/goose/Guangdong/1/96

Nă phân lập 1996 Trung Quốc AF144304

Ngỗng

2 A/chicken/Hongkong/YU822/01

1997 Hong Kong

AY221545

Gà

3 A/Hongkong/156/97

1997 Hong Kong

AF036357

Người

4 A/Hongkong/481/97

1997 Hong Kong

AF102663

Người

5 A/Hongkong/485/1997

1997 Hong Kong

AF102664

Người

6 A/Hongkong/486/1997

1997 Hong Kong

AF102658

Người

7 A/chicken/China/27402/1997

1997 Trung Quốc GU052122

Gà

8 A/goose/Guangdong/3/97

1997 Trung Quốc AF364335

Ngỗng

9 A/goose/Hongkong/437-6/1999

1999 Hong Kong

GU052021

Ngỗng

10 A/pheasan/Hongkong/FY115/01

2001 Hong Kong

AF509096

Trĩ

11 A/goose/Vietnam/113/2001

2001 Việt Nam

EF541474

Ngỗng

12 A/Hongkong/212/2003

2003 Hong Kong

AY575881

Người

13 A/Hongkong/213/2003

2003 Hong Kong

AB557744

Người

14 A/Beijing/01/2003

2003 Trung Quốc

EF587279

Người

15 A/chicken/Vietnam/8/2003

2003 Việt Nam

DQ493042

Gà

16 A/chicken/Vietnam/ncvd8/2003

2003 Việt Nam

EF541468

Gà

17 A/duck/Guangxi/1378/2004

2004 Trung Quốc DQ321016

Vịt

18 A/duck/Guangxi/2291/2004

2004 Trung Quốc DQ321022

Vịt

19 A/chicken/Vietnam/AG-010/2004

2004 Việt Nam

DQ094278

Gà

20 A/chicken/Vietnam/DT-015/2004

2004 Việt Nam

DQ094279

Gà

21 A/Vietnam/1194/2004

2004 Việt Nam

EF541466

Người

22 A/Vietnam/1203/2004

2004 Việt Nam

HM006761

Người

23 A/Vietnam/CL20/2004

2004 Việt Nam

DQ493071

Người

24 A/chicken/hebei/102/2005

2005 Trung Quốc

EU243134

Gà

25 A/chicken/hebei/126/2005

2005 Trung Quốc

EU2431451

Gà

26 A/chicken/hebei/326/2005

2005 Trung Quốc DQ349118

Gà

27 A/chicken/hebei/706/2005

2005 Trung Quốc

EU243127

Gà

28 A/mallard/huadong/hn/2005

2005 Trung Quốc

EU195410

Vịt trời

29 A/goose/Vietnam/3/05

2005 Việt Nam

DQ366316

Ngỗng

30 A/duck/Vietnam/1/05

2005 Việt Nam

DQ366308

Vịt

31 A/duck/Vietnam/8/05

2005 Việt Nam

DQ366324

Vịt

32 A/chicken/ningxia/24/2006

2006 Trung Quốc HM172205

Gà

33 A/chicken/shanxi/10/2006

2006 Trung Quốc HM172172

Gà

34 A/chicken/shanxi/2/2006

2006 Trung Quốc DQ914816

Gà

Stt

D nh ph p q c tế

Loài ắc

Nơi phân lập

35 A/duck/Haiphong/208/2006

Vịt

Nă phân lập 2006 Việt Nam

S đăng ký ngân hàng gen GU052504

36 A/chicken/Liaoning/a-1/2007

Gà

2007 Trung Quốc HM172206

37 A/chicken/Bacgiang/07-74/2007

Gà

2007 Việt Nam

GU050469

38 A/chicken/Baclieu/07-10/2007

Gà

2007 Việt Nam

GU186763

39 A/chicken/Hanam/07-83/2007

Gà

2007 Việt Nam

GU050477

40 A/muscovyduck/Camau/07-04/2007

Ngan

2007 Việt Nam

GU186747

41 A/duck/Hatinh/07-53/2007

Vịt

2007 Việt Nam

GU050430

42 A/duck/Vietnam/38ST/2008

Vịt

2008 Việt Nam

FJ812005

43 A/chicken/Vietnam/TMU025/2009

Gà

2009 Việt Nam

CY095702

44 A/duck/Hue/V6/2010

Vịt

2009 Việt Nam

JN935005

45 A/duck/Vietnam/TMU026/2009

Vịt

2009 Việt Nam

CY095705

Kết quả giải trình tự gen N1 cho thấy các chủng virus cúm A/H5N1clade 7

của Việt Nam có hiện tượng bị đột biến xóa (deletion) nên bị mất 20 axit amin

vị trí từ 49-68 trên vùng thân của phân tử kháng nguyên NA. Hiện tượng đột biến

xóa 20 axit amin này cũng đã được quan sát thấy hầu hết các virus cúm phát

hiện và phân lập được Việt Nam và Trung Quốc từ năm 2004 đến nay.

Có một hiện tượng đột biến khác trên phân tử kháng nguyên NA là sự mất

đoạn 19 axit amin các chủng virus cúm A/H5N1phân lập Hong Kong năm

199 (như chủng A Hongkong 1 6 9 ) và một số chủng virus cúm A/H5N1phân

lập Việt Nam năm 200 , tuy nhiên cho đến gần đây không còn thấy có sự xuất

hiện đột biến xóa 19 axit amin các chủng virus A/H5N1 nữa. Hầu hết các

chủng virus A/H N1 độc lực cao cổ điển (như chủng A/goose/Guangdong/1/96)

đều có gen N1 với độ dài tối đa (không có đột biến xóa axit amin) và hiện tượng

này cũng chỉ còn phát hiện thấy các virus A/H N1 phân lập được cho đến năm

2004.

Phần thân kháng nguyên NA có vai trò quan trọng đối với độc lực của

virus cúm gia cầm. Người ta đã phát hiện hiện tượng đột biến xóa 20 axit amin

vị trí 49-68 có liên quan đến độc lực cao (Zhou và cs, 2006). Hiện tượng này

cũng được phát hiện b i Zhao và cs, 2007 (Zhao và cs, 2008) và điều đó có thể

thể hiện sự thích nghi của virus cúm A/H5N1trên gia cầm ( atrosovich và cs,

1999).

Chúng tôi cũng thực hiện việc phân tích sự khác biệt di truyền trên gen N1

về mức độ nucleotide và mức độ axit amin của các chủng virus A H N1 thuộc

clade 7 thu thập Việt Nam và một số chủng virus A/H5N1 thuộc clade 7 của

Trung Quốc (A/chicken/Shanxi/10/2006, A/chicken/Shanxi/2/2006,

A/Beijing/01/2003) so sánh với một số chủng virus cúm A H N1 khác của Trung

Quốc (A/HongKong/156/97, A/Goose/Guangdong/1 96) và của Việt Nam

(A/VietNam/1194/2004, A/VietNam/1203/2004, A/goose/VietNam/113/2001,

A/Goose/Guangdong/1/96). Kết quả trình bày bảng 3.6.

Khi so sánh mức độ khác biệt về di truyền giữa các chủng virus cúm

A/H5N1clade 7 của Việt Nam chúng tôi nhận thấy sự sai khác giữa nhóm 4 virus

cúm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam đã nêu phần trên là

A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008, A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008,

A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 và A Chicken Vietnam NCVD-016 2008 là

rất thấp, ≤ 2% mức độ nucleotide và ≤2, % mức độ axit amin. Cũng như đã

nhận thấy rõ như cây phả hệ nhóm virus này có độ khác biệt tương đối lớn so

với chủng virus khác của Việt Nam cũng thuộc clade là

A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008. C thể sự sai khác về mức độ nucleotide

và mức độ axit amin của nhóm 4 chủng virus mà chúng tôi nêu trên và virus

A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 lần lượt là 4, ±0,2% (4,5-4,9%) và

,6±0,3% ( ,3-6,0%).

Kết quả phân tích cũng cho thấy chủng virus A/chicken/Vietnam/NCVD-

093 về mặt quan hệ hệ phả cũng gần nhất với chủng virus A/Beijing/01/2003, là

chủng virus phân lập người năm 2003 của Trung Quốc. C thể sự sau khác chỉ

là 2,3% mức độ nucleotide và 2, % mức độ axit amin.

Sự sai khác lớn nhất có thể quan sát thấy giữa các virus cúm A/H5N1

thuộc clade 7 thu thập Việt Nam so với các chủng virus A/H N1 có hiện tượng

đột biến xóa 19 axit amin (virus A/Hong_Kong/156/97 và virus

A goose Vietnam 3 0 ) là 12,3-1 ,1% nucleotide và 9, - 10,4%. mức độ axit

amin.

Bảng 3.6. Mức đ kh c biệt về di truyền t ên gen N1 của 5 chủng i c A/H5N1 cl de 7 o nh ới m t

s chủng tham chiếu

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Tên chủng

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008

Ký hiệ chủng 1

0,4

5,5

2,3

2,7

3,6

6,0

5,8

6,2

10,0

10,2

5,3

A/Chicken/Vietnam/NCVD-093/2008

4,5

4,7

4,9

4,5

5,5

3,6

3,2

3,6

8,2

2,3

A/Viet_Nam/1194/2004

4,7

5,2

5,4

4,3

4,7

4,6

2,8

0,9

5,0

8,7

3,4

A/Viet_Nam/1203/2004

4,2

4,8

5,0

3,8

4,3

4,1

2,3

1,0

4,6

8,2

3,4

A/goose/Viet_Nam/113/2001

6,6

6,7

6,8

6,4

5,7

6,5

6,0

4,5

5,6

4,9

7,9

7,7

2,8

A/Hong_Kong/156/97

14,2

14,8

15,1

14,7

13,8

14,4

13,2

13,0

13,8

13,3

12,2

1,1

6,9

A/goose/Vietnam/3/05

13,0

13,4

13,7

13,3

12,3

13,0

11,9

11,4

12,3

11,7

10,9

1,8

6,9

9,8

A/Goose/Guangdong/1/96

5,2

5,6

5,9

5,5

4,3

5,3

5,0

3,0

3,6

3,3

3,2

11,1

Nucleotide (%)

Sự sai khác di truyền của các chủng virus cúm thuộc clade mà chúng tôi

thu thập Việt Nam so với chủng virus được coi là thủy tổ của virus cúm

A H N1 độc lực cao (A/Goose/Guangdong/1/96) là 4,3 – ,9% mức độ

nucleotide và 4,1 – ,8% mức độ axit amin.

3.2.3. Giải t ình tự gen M à phân tích cây phả hệ dự t ên ch ỗi nucleotide

của gen M

Hệ gen của virus cúm gia cầm type A nói chung và virus A H N1 gồm có

8 phân đoạn, trong đó có 2 phân đoạn gen HA và NA mã hóa tạo nên 2 loại

kháng nguyên bề mặt có ý nghĩa cho việc xác định subtype của virus. Tại thời

điểm hiện tại các chủng virus cúm gia cầm độc lực cao A H N1 Đông Nam Á

có gen HA và NA có nguồn gốc và tiến hóa từ virus tiền thân là

A Goose Guangdong 1 96 phát hiện được Trung Quốc. Trong khi đó các gen

mã hóa cho các protein nội sinh ( , PA, PB2 và PB1) lại từ nhiều nguồn khác

nhau. Điều này đã tạo nên sự tái tổ hợp thành nhiều genotype khác biệt (Guan và

cs, 2002; Li và cs, 2004). Vì vậy để nghiên cứu thêm về đặc tính di truyền của

các chủng virus A H N1 thuộc clade Việt Nam chúng tôi tiến hành giải trình

tự gen của các mẫu virus này.

Chiều dài chuỗi nucleotide của gen đã giải trình tự là 983 bp (base pair)

mã hóa cho 2 đoạn gen 1 và 2. Trình tự của gen M của chủng virus mà

chúng tôi phân lập được mang so sánh với một số chủng virus cúm gia cầm

A H N1 độc lực cao phát hiện các nước thuộc châu Á, trong đó có chủng virus

cúm A Goose Guangdong 1 96 là virus thủy tổ của các virus cúm gia cầm độc

lực cao và một số chủng virus Việt Nam trước đây. Dựa trên sự sai khác chuỗi

gen M của các chủng virus A H N1 so sánh chúng tôi đã lập cây phả hệ

(phylogenetic tree) để theo dõi, phân tích sự tiến hóa của các chủng virus này so

với các chủng virus cúm A H N1 trước kia.

Danh sách các chủng virus A H N1 dùng để so sánh lập cây phát sinh loài

được trình bày bảng 3.7.

Clade 7

Hình 3.5. Cây phả hệ dự t ên chuỗi nucleotide gen M củ c c chủng i

A/H5N1 clade 7 (Được lập bằng phương ph p phân tích neighbo -joining sử

dụng phần mề MEGA 5, gi t ị boostrap 1000)

Bảng 3.7. D nh ch c c chủng i c A/H5N1 ử dụng đ o nh à lập

cây ph t inh loài dự t ên gen M

Loài

Nơi phân

STT D nh ph p q c tế

Nă phân

S đăng ký ngân hàng

ắc

lập

gen

1 A/Goose/Guangdong/1/96

Ngỗng

1996 Trung Quốc AF144306

2 A/Hong Kong/156/1997

Người

1997 Hong Kong AF036358

3 A/Duck/Hong Kong/y283/1997

1997 Hong Kong AF098567

Vịt

4 A/duck/Zhejiang/52/2000

2000 Trung Quốc AY585397

Vịt

5 A/duck/Shantou/195/2001

2001 Hong Kong CY029002

Vịt

6 A/Chicken/Hong Kong/SF219/2001 Gà

2001 Trung Quốc AF509048,

7 A/chicken/Korea/es/2003

2003 Hàn Quốc

EF541460

Gà

8 A/Ck/Indonesia/2A/2003

2003

Indonesia

AY651377

Gà

9 A/goose/Fujian/bb/2003

Ngỗng

2003 Trung Quốc DQ997402

10 A/Beijing/01/2003

Người

2003 Trung Quốc EF587280

11 A/duck/Hunan/1386/2003

Vịt

2003 Trung Quốc CY029310

12 A/Thailand/Kan353/2004 2004

Người

2004 Thái Lan

EF541446

13 A/duck/Guangxi/351/2004

Vịt

2004 Trung Quốc DQ320943

14 A/Vietnam/CL100/2004

Người

2004 Việt Nam

DQ492986

15 A/duck/Vietnam/48/2004 2004

Vịt

2004 Việt Nam

DQ492944

Cam pu

16 A/Cambodia/P0322095/2005

Người

2005

HQ200461

chia

17 A/Indonesia/239H/2005

Người

2005

Indonesia

EU146665

Ngỗng

2005 Trung Quốc DQ100567

A/black-headed goose/Qinghai/1/2005

19 A/Anhui/2/2005

Người

2005 Trung Quốc CY060147

20 A/duck/Guiyang/3834/2005

2005 Trung Quốc EF124151

Vịt

21 A/chicken/Lang Son/200/2005

2005 Việt Nam

GU186717

Gà

22 A/goose/Vietnam/3/05 2005

Ngỗng

2005 Việt Nam

DQ366317

23 A/duck/Vietnam/286/2005

Vịt

2005 Việt Nam

DQ492958

A/crested myna/Hong

Chim

2006 Hong Kong EF12405

Kong/540/2006

25 A/Indonesia/535H/2006

Người

2006

Indonesia

EU146756

26 A/chicken/Shandong/A-10/2006

2006 Trung Quốc HM172139

Gà

27 A/chicken/shanxi/10/2006

2006 Trung Quốc HM172135.1

Gà

28 A/chicken/shanxi/2/2006

2006 Trung Quốc DQ914817

Gà

STT D nh ph p q c tế

Nă phân

S đăng ký ngân hàng

Loài ắc

Nơi phân lập

lập

gen

29 A/Anhui/T2/2006 2006

Người

2006 Trung Quốc EU008577

30 A/Hunan/1/2006

Người

2006 Trung Quốc CY060173

31 A/Shanghai/1/2006

Người

2006 Trung Quốc AB462298

32 A/duck/Guangxi/150/2006

2006 Trung Quốc EF124078

Vịt

33 A/chicken/East Java/UT6045/2007

2007

Indonesia

GQ122542

Gà

34 A/Indonesia/CDC1046/2007

Người

2007

Indonesia

CY019411

35 A/duck/Laos/P0117/2007

Vịt

2007 Lào

CY040921

A/Muscovy duck/Ca Mau/07-

Ngan

2007 Việt Nam

GU186746

04/2007

37 A/duck/India/Tr-NIV4396/2008

2008 Ấn Độ

CY046105

Vịt

38 A/chicken/Bhutan/248006/2010

2010 Bhutan

CY066007

Gà

39 A/mallard/Korea/1195/2010

2010 Hàn Quốc

HQ695916

Vịt trời

40 A/Hong Kong/6841/2010

Người

2010 Hong Kong HQ636463

A/chicken/Thailand/ICRC-

Gà

2010 Thái Lan

HM590792

7356/2010

Dựa trên phân tích cây phả hệ của gen chúng tôi có thể nhận xét r ng

các chủng virus cúm gia cầm A H N1 thuộc clade 7 của Việt Nam có độ tương

đồng cao và xắp xếp thành một nhóm với nhau, và n m trong nhóm với các

chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 của Trung Quốc. Kết quả phân tích này chứng

tỏ gen M của các virus cúm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam và Trung Quốc có

cùng nguồn gốc. Để thấy rõ hơn sự khác biệt di truyền mức độ nucleotide và

axit amin, chúng tôi so sánh gen của các chủng virus cúm A/H5N1clade 7 của

Việt Nam với một số virus cúm A/H5N1của Trung Quốc. Kết quả được biểu thị

bảng 3.8.

Mức độ sai khác về di truyền gen M giữa các chủng virus cúm A/H5N1

clade 7 của Việt Nam với nhau gần như không đáng kể, c thể sự sai khác tối đa

về mức độ nucleotide là 1% và mức độ axit amin là 0,6%.

Mức độ sai khác giữa các chủng virus cúm A/H5N1thuộc clade 7 của Việt

Nam và các chủng thuộc clade của Trung Quốc cũng rất thấp. Sự sai khác tối

đa về di truyền mức độ nucleotide và axit amin giữa các virus của 2 nhóm này

lần lượt là 3,0±0.1% và 3,3±0.2% (virus A chicken/Shanxi/2/2006).

So sánh sự sai khác về di truyền giữa các chủng virus cúm thuộc clade

do chúng tôi phân lập với các chủng virus thuộc clade khác trên cơ s gen ,

chúng tôi nhận thấy sự sai khác về nucleotide và axit amin không nhiều, chỉ trong

khoảng 3,6% về nucleotide và 2-4% về axit amin. Duy chỉ có 2 chủng

A goose Vietnam 3 0 và chủng A HongKong 1 6 9 thuộc clade 0 thì có sự

khác biệt khá lớn: sự sai khác về mức độ nucleotide tới 10% và về mức độ axit

amin tới 7%. Một chủng virus A H N1 khác cũng thuộc clade 0 là chủng

A Goose Guangdong 1 96, được coi là thủy tổ của các chủng virus cúm

A H N1độc lực cao, có độ sai khác về di truyền với các chủng virus thuộc clade

của Việt Nam mức độ nucleotide là ,3±0.2% ( ,2- ,6%) và mức độ axit

amin là 4,2±0.2 % (4,1-4,4%).

Tóm lại, kết quả phân tích phát sinh loài, kết quả phân tích sự sai khác di

truyền dựa trên gen H , N1 và của các chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 của

Việt Nam cho thấy, các chủng virus thuộc clade 7 của Việt Nam có độ tương

đồng cao với nhau chứng tỏ chúng có cùng nguồn gốc, và tương đồng với các

chủng virus A H N1 cũng thuộc clade phân lập Trung Quốc.

Từ các kết quả trên có thể kết luận r ng các chủng virus cúm A H N1

thuộc clade 7 của Việt Nam cùng nguồn gốc với các virus thuộc clade 7 của

Trung Quốc, và xâm nhập vào Việt Nam chứ không phải là các virus tiến hóa từ

các chủng virus cúm A H N1độc lực cao gây bệnh trước đó trên gia cầm (2003-

2008) tại Việt Nam. Hiện tượng các chủng virus thuộc clade được phát hiện

vùng biên giới năm 2008, cùng với sự xuất hiện của nhiều clade khác Việt Nam

như clade 2.3.4 và 2.3.2 Việt Nam rất giống với những chủng virus cúm

A H N1 lưu hành và gây bệnh trên gia cầm Trung Quốc cho thấy nguy cơ xâm

nhập và xuất hiện của các chủng virus cúm A/H5N1từ bên ngoài vào Việt Nam

là rất lớn, vì vậy cần phải tăng cường công tác giám sát nh m phát hiện sớm

những virus cúm A H N1có thể sẽ xâm nhập hoặc đang lưu hành trên gia cầm

Việt Nam.

Bảng 3.8. So nh ức đ kh c biệt về di truyền t ên gen M của 5 chủng virus c A/H5N1 th c clade 7 so

nh ới m t s chủng tham chiếu

Tên chủng i

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15 Ký hiệ chủng

Axit amin (%)

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008

0,6

0,2

0,9

0,3

0,0

1,3

0,9

3,2

1,6

7,1

1,6

1,8

3,5

4,1

7,1

A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008

0,2

0,0

0,9

0,3

1,3

2,8

3,1

3,2

7,4

3,2

3,5

5,1

5,8

7,4

A/Beijing/01/2003_2003

2,3

1,7

2,1

3,5

2,4

5,8

0,0

0,7

1,9

2,8

5,8

10 A/goose/Vietnam/3/05

10,0

10,1

9,7

10,0 10,4

9,3

8,7

5,8

5,7

5,8

3,8

0,0

11 A/Anhui/2/2005

3,0

2,4

2,7

4,0

0,9

8,1

3,0

3,1

0,7

1,9

2,8

5,8

12 A/blackheadedgoose/Qinghai/1/2005

3,2

2,6

2,7

4,0

1,4

9,3

1,3

3,2

2,1

3,2

5,7

13 A/goose/Fujian/bb/2003

3,8

3,4

3,7

4,4

2,1

8,1

2,0

2,3

4,0

4,1

2,8

5,8

14 A/Goose/Guangdong/1/96

5,2

5,0

5,3

5,7

3,5

6,0

3,4

3,8

3,2

5,5

5,6

3,8

15 A/Hong_Kong/156/97

10,7

10,8

10,5 10,5 10,5 10,7 11,1

9,3

9,4

1,3

8,8

9,8

8,8

7,5

Nucleotide (%)

3.3. X c định m t s đặc tính inh học của virus A/H5N1 clade 7 phân lập ở

Việt N (A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008)

3.3.1. Tính thích ứng t ên ph i gà (x c định ch s EID50)

Virus cúm nói chung và virus cúm gia cầm A/H N1 độc lực cao có khả

năng phát triển tốt trên phôi gà, vì vậy phôi gà 9-10 ngày tuổi thường được sử

d ng để phân lập virus cúm gia cầm độc lực cao trong công tác chẩn đoán cũng

như để giữ giống virus. Tuy nhiên, các chủng virus cúm gia cầm có đặc điểm

khác nhau khi nhân lên trên phôi trứng, thể hiện b ng sự gây nhiễm phôi, gây

chết phôi và chuẩn độ tối ưu của virus khi nhân lên trên phôi trứng. Sự khác biệt

về thời gian gây chết phôi trứng và chuẩn độ tối ưu của các chủng virus khác

nhau là khác nhau. Virus có độc lực thấp thường giết chết phôi trứng chậm hơn

và có thể thu được virus với nồng độ cao hơn so với virus cúm có độc lực cao và

ngược lại.

Để xác định tính thích ứng của các chủng virus cúm gia cầm H5N1 clade

phân lập được, chúng tôi lựa chọn chủng A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008

làm chủng đại diện vì chủng này có thể được coi là gần với chủng gốc thuộc

clade có từ Trung Quốc.

Phôi trứng được lấy từ đàn gà khỏe mạnh chưa tiêm vacxin cúm gia cầm

H N1, và không nhiễm virus cúm gia cầm trong tự nhiên để tránh tác động nếu

có (trong lòng đỏ của phôi trứng) của kháng thể từ gà mẹ được tiêm phòng.

Trứng được mua từ lúc 8 ngày tuổi và ấp tiếp 1 ngày để ổn định tại phòng thí

nghiệm trước khi sử d ng cho thí nghiệm xác định sự thích nghi của chủng virus

cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD-016 2008 trên phôi gà.

Chủng virus cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 đã được chia thành nhiều ống nhỏ sau khi phân lập và giữ nhiệt độ -860C. Trước khi tiến

hành thí nghiệm hỗn dịch virus đã được kiểm tra vô trùng theo thường quy và được pha thành nhiều nồng độ từ 10-1 đến 10-8 b ng dung dịch đệm PBS có pH 7,2. Tiến hành gây nhiễm cho phôi trứng với 6 nồng độ pha loãng từ 10-3 đến 10-8

vào xoang niệu mô (allantoic cavity) của phôi trứng, mỗi nồng độ gây nhiễm cho phôi với liều 100µl phôi, ấp tiếp nhiệt độ 370C, theo dõi 2 lần ngày cách nhau

khoảng 8 giờ trong vòng 4 ngày, loại phôi chết trước 24 giờ. Trong thí nghiệm

này có sử d ng 3 phôi trứng tiêm dung dịch PBS làm đối chứng âm và ấp trong

cùng điều kiện.

Các phôi trứng chết trong thời gian theo dõi được làm lạnh nhiệt độ 2 – 80C trong vòng 24 giờ cho mạch máu có lại và tiến hành mổ trứng thu hoạch dịch

niệu mô. Những phôi trứng sống sau thời gian theo dõi (kể cả đối chứng âm tính)

đều được thua dịch niệu mô và được kiểm tra b ng phản ứng HA để xác định khả

năng nhiễm của virus trên phôi trứng và xác định chỉ số EID50 theo công thức

Reed-Muench.

Trước khi gây nhiễm chúng tôi đã tiến hành kiểm tra vô trùng các ống

virus giống trên các môi trường: nước thịt, BHI, thạch thường, thạch máu,

Sabauraud và nước thịt gan yếm khí, nh m m c đích xác định chắc chắn phôi

trứng chết là do virus cúm gây ra. Chúng tôi kiểm tra phôi trứng hàng ngày 2 lần,

cách nhau 8h để ghi nhận chi tiết về thời gian chết của phôi. Kết quả thời gian

gây chết phôi trình bày bảng 3.9.

Kết quả xác định khả năng gây nhiễm trên phôi gà và chỉ số EID50 của

chủng virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 được trình bày bảng 3.10.

Bảng 3.9. Theo dõi thời gi n gây chết ph i

Theo dõi số phôi chết Số phôi Tổng số Tỷ lệ Đợt

phôi chết (%) TN gây nhiễm 0-24 h 25-48 h 49-72 h 73-96h

30 0 10 5 5 20 67 1

30 0 10 5 4 19 63 2

30 0 10 5 4 19 63 3

Kết quả cho thấy: không có phôi chết trước 24 giờ, virus bắt đầu giết chết

phôi trong vòng 2 ngày từ sau khi gây nhiễm. Điều này cũng phù hợp với các ghi

nhận thường nhật khi chúng tôi tiến hành phân lập các mẫu có virus cúm gia cầm

H N1 trên phôi trứng, và cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây (Easterday

và cs, 199 ; Wanasawaeng và cs, 2009) nhận xét r ng virus cúm độc lực cao

thường giết chết phôi trứng trong vòng 48 giờ sau khi gây nhiễm (h.p.i – hour

post-infection) lên xoang niệu mô.

Bảng 3.10. Kết quả theo dõi tỷ lệ s ng/chết của ph i trứng

Lần thí nghiệm

Hiệu giá pha loãng

Số phôi bị nhiễm

Số phôi gây nhiễm

Số phôi không nhiễm

Tỷ lệ nhiễm virus (%) A (A+B) × 100

Nhiễm virus (A)

Tổng cộng (A+B)

Số tích lũy Không nhiễm (B) 0

100

83.3

Lần 1

16.7

10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 ĐC (-)

khi gây nhiễm virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008

107 (theo công thức eed-Muench)

100

80.0

Lần 2

16.7

106.9 (theo công thức eed-Muench)

100

80.0

Lần 3

16.7

3 EID50/0,1ml 10-3 5 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 3 ĐC (-) EID50/0,1 ml 10-3 5 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 ĐC (-)

106.9 (theo công thức eed-Muench)

EID50/0,1 ml

- Ở nồng độ pha loãng 10-3, toàn bộ phôi trứng chết trong vòng 40h sau

khi gây nhiễm.

- Ở nồng độ 10-4 toàn bộ số phôi trứng chết trong ngày thứ hai, trong

khoảng 40-48 giờ sau khi nhiễm.

- Nồng độ 10-5 cũng giết chết toàn bộ phôi trứng nhưng trong thời gian lâu hơn so với nồng độ 10-3 và 10-4, nhưng cũng không quá 2h kể từ khi gây nhiễm. - Ở nồng độ 10-6 có phôi thường chết trong vòng 2 - 96h . Ở độ pha loãng

này thường vẫn có 1 -2 phôi vẫn còn sống (tùy theo lần thí nghiệm khác nhau).

- Nồng độ pha loãng cao nhất gây chết phôi trứng là 10-7, tuy nhiên chỉ có

1 phôi chết thời điểm 96h , và 4 phôi vẫn còn sống. Ở nồng độ pha loãng cao nhất là 10-8, toàn bộ số phôi trứng đều sống bình thường.

- Đối chứng âm: các phôi trứng sống khỏe mạnh, bình thường.

Kết quả tính chuẩn độ của virus A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 lần lượt sau 3 lần là: lần 1 - 107EID50, lần 2 – 106,9EID50 và lần 3 – 106,9EID50 đối với

liều sử d ng gây nhiễm là 100 µl. Tính trung bình chuẩn độ của virus trên phôi gà là 107,9EID50/ml.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Hình 3.6. Ki t đặc tính gây ngưng kết hồng cầu (phản ứng HA)

Để xác định khả năng gây nhiễm phôi trứng của virus

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008, chúng tôi thu dịch niệu mô (allantoic

fluid) của toàn bộ số phôi chết và phôi sống và kiểm tra đặc tính ngưng kết hồng

cầu (HA) với hồng cầu gà (xem hình 3.6).

Kết quả cho thấy chỉ có dịch niêu mô thu thập từ phôi trứng chết mới có

khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà, với hiệu giá HA của dịch niệu mô thường

đạt từ 8-9log2. Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Wanasawaeng và

cộng sự (2009) (Wanasawaeng và cs, 2009) khi nghiên cứu một chủng virus cúm

A/H5N1 của Thái Lan (ký hiệu C210 Dx1) phân lập năm 2004.

Dịch niêu mô thu thập từ phôi trứng sống (kể cả phôi sống các nồng độ 10-6 và 10-7) không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà (Xem hình 3.6). Vì

vậy có thể nhận định r ng liều gây nhiễm phôi trứng gà (EID-Egg Infectious

Dose) cũng chính là liều gây chết phôi (ELD-Egg Lethal Dose).

48giờ

72giờ

Đ i chứng

Phôi đối chứng Phôi nhiễm virus

Hình 3.7. Bệnh tích ph i khi gây nhiễ bằng chủng i c A/H5N1

cl de 7 phân lập tại Việt N

Bên cạnh việc kiểm tra đặc tính ngưng kết hồng cầu, chúng tôi cũng tiến

hành mổ trứng, thu phôi để kiểm tra bệnh tích phôi. Toàn bộ số phôi trứng chết

đều có triệu chứng xuất huyết lan tràn, phôi còi cọc, phát triển kém. Phôi đối

chứng phát triển bình thường (xem hình 3.7). Kết quả của thí nghiệm này cho

thấy virus cúm A/H5N1clade 7 - A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 có khả

năng thích ứng tốt trên phôi trứng gà và đạt được hiệu giá tối ưu trung bình là 107,9EID50/ml (106.9-107,0 EID50 0,1ml (bảng 3.10).

3.3.2. Tính thích ứng t ên tế bào xơ ph i gà (x c định ch s TCID50)

Bên cạnh việc xác định tính thích ứng của virus cúm A/H5N1 clade 7 trên

phôi trứng gà, chúng tôi cũng tiến hành song song việc xác định tính thích ứng

của virus này trên tế bào xơ phôi gà (CEF).

Chúng tôi sử d ng phôi trứng gà 8 ngày tuổi đã kiểm tra khỏe mạnh, bình

thường, mổ trứng và thu hoạch phôi để chế môi trường tế bào CEF. Tế bào CEF

được chuẩn bị trên chai T đã phát triển thành lớp sau khi nuôi dưỡng b ng môi

trường MEM với 5% huyết thanh thai bê (FBS). Sử d ng trypsine để tách tế bào

khỏi thành chai nuôi cấy và tách rời thành từng tế bào và chuyển sang đĩa nuôi

cấy tế bào 96 giếng để tiến hành chuẩn độ virus.

Chúng tôi cũng sử d ng virus được pha loãng như khi chuẩn độ trên phôi gà và sử d ng các nồng độ 10-2 - 10-8 để chuẩn độ virus. Mỗi nồng độ virus đã

pha loãng được nhiễm cho 5 giếng với lượng 100 µl trên giếng. Đĩa tế bào đã nhiễm virus được nuôi trong tủ ấm 370C có %CO2. Nuôi đĩa tế bào trong vòng

ngày và theo dõi hàng ngày để quan sát bệnh tích tế bào (CPE).

Bảng 3.11. Theo dõi thời gi n i gây nhiễ lên tế bào CEF

Theo dõi số giếng có CPE Tổng số Số giếng Đợt TN giếng có Tỷ lệ (%) gây nhiễm 0-24 h 25-48 h 49-72 h 73-96h CPE

30 0 10 14 0 24 80 1

30 0 10 13 0 24 80 2

30 0 10 13 0 23 77 3

- Từ nồng độ pha loãng 10-2 đến nồng độ 10-5 toàn bộ các giếng tế bào đều

có CPE và thảm tế bào đã bị virus phá hủy trong vòng 24-72 giờ. Đặc biệt nồng độ 10-2 và 10-3 thảm tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 24 giờ nhiễm.

Bảng 3.12. Kết quả theo dõi bệnh tích tế bào t ên CEF

Số tích lũy

Lần thí

Hiệu giá

Số có

Không

Tổng

Số giếng gây

Số giếng không có

Tỷ lệ nhiễm virus (%)

Nhiễm

nghiệm

pha loãng

CPE

nhiễm

CPE

A (A+B) × 100

virus (A)

nhiễm (B)

cộng (A+B)

100

57.1

Lần 1

100

5 5

100

Lần 2

100

5 5

100

Lần 3

khi gây nhiễm virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008

10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 ĐC (-) 0 TCID50/0,1ml 106,2 10-2 5 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 ĐC (-) 0 TCID50/0,1ml 106,4 10-2 5 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 0 ĐC (-) TCID50/0,1ml 106,2

- Ở nồng độ pha loãng 10-6 thường chỉ có 2-4 giếng có hiện tượng virus

phá hủy gây nên bệnh tích tế bào (CPE).

- Ở nồng độ pha loãng 10-7 chỉ có 2 giếng nhiễm virus lần thí nghiệm

thứ nhất, lần thứ 2 và 3 không có giếng nào nhiễm virus.

- Ở nồng độ pha loãng 10-8 không có giếng tế bào nào có hiện tượng thảm

tế bào bị phá hủy, không có CPE, tức là không có hiện tượng nhiễm virus.

Với kết quả chuẩn độ trên, chúng tôi tính được chuẩn độ trung bình của

virus cúm A H N1 clade trên tế bào xơ phôi gà (CEF) qua các lần chuẩn độ là:

lần 1 – 106,22TCID50, lần 2 – 106,4TCID50 và lần 3 – 106,2TCID50 đối với liều sử

d ng gây nhiễm là 100 µl. Tính trung bình chuẩn độ của virus trên tế bào xơ phôi

gà là 107,3TCID50/ml.

Như vậy, với kết quả chuẩn độ virus cúm A/H5N1 clade 7

(A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008) thực hiện trên phôi trứng gà và tế bào xơ

phôi gà, chúng tôi nhận thấy virus này có thể thích nghi, phát triển tốt trên cả 2

môi trường trên, và chuẩn độ của virus trên 2 môi trường nuôi dưỡng này là khá

tương đồng với nhau: 107,9EID50 và 107,3TCID50.

Song song với việc sử d ng tế bào xơ phôi gà (CEF-Chicken Embryo

Fibroblast), chúng tôi cũng thử nghiệm sử d ng tế bào xơ phôi vịt (DEF-Duck

Embryo Fibroblast) và tế bào xơ phôi ngan ( DEF-Muscovy Duck Embryo

Fibroblast) tiến hành việc gây nhiễm và chuẩn độ virus cúm A/H5N1 clade 7

trên. Kết quả thí nghiệm cho thấy virus này cũng có thể nhiễm và phát triển tốt

trên 2 loại tế bào này xơ phôi vịt và xơ phôi ngan.

Kết quả chuẩn độ cho thấy virus cúm A H N1 clade có hiệu giá

107,3TCID50 và 106,7TCID50 lần lượt trên 2 loại tế bào DEF và DEF (kết quả chi

tiết không trình bày). Ngoài ra virus A H N1 clade cũng phát triển tốt trên môi

trường tế bào dòng DCK ( ardine Darby Canine Kidney) mà không cần xử lý

tripsine TPCK.

o đối chứng o nhiễ virus (có P )

o đối chứng

o nhiễ virus(có P )

Hình 3.8. Hình ảnh tế bào CEF à DEF khi phân lập à ch ẩn đ i

3.3.3. Kết quả x c định đ c lực củ i c A/H5N1 clade 7

3.3.3.1. Th ng đ c lực dự t ên đặc tính phân tử

Như đã trình bày trong phần tổng quan về virus cúm gia cầm, độc lực và

mức độ lây nhiễm của virus cúm trên gia cầm ph thuộc vào tác động của

enzyme protease của vật chủ đến sự phá vỡ các liên kết hóa học sau khi dịch mã

của phân tử liên kết, và tính th cảm của ngưng kết tố (Hemagglutinin) và sự phá

vỡ liên kết của enzyme protease ph thuộc vào số lượng các axit amin cơ bản tại

điểm bắt đầu phá vỡ liên kết tức là tại vùng chuỗi nối của gen HA của virus, đó

là các axit amin arginine ( ) và lysine (K).

Khi giải trình tự gen HA, chúng tôi cũng đồng thời xác định mức độ có

mặt và số lượng của các axit amin cơ bản Arginine và lysine tại vùng “cleavage

site” của các chủng virus cúm A/H5N1 clade 7. Kết quả trình tự vùng chuỗi nối

của chủng virus đại diện cho clade của Việt Nam là

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016 2008 và một số virus cúm A/H5N1 thuộc một

số clade khác được so sánh tại bảng 3.13.

Bảng 3.13. C c xit in ùng “cle ge ite” củ i c

H5N1 đ c lực cao cl de 7 à t s chủng virus tha chiế

Virus strain Clade Nơi phân lập HA0 cleavage site

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 7 iệt a PQREGGRRRKR*GLF

A/goose/Guangdong/1/96 0 Trung Quốc PQRERRRKKR*GLF

A/Hong_Kong/213/03 1 Hong Kong PQRERRRKKR*GLF

A/chicken/Vietnam/15/2007 1 Việt Nam PQREGRRKKR*GLF

A/chicken/Egypt/9403/2007 2.2 Ai Cập PQGERRRKKR*GLF

A/chicken/Primorje/1/2008 2.3.2 Nga PQRERRRKR*GLF

A/duck/Vietnam/568/2005 2.3.2 Việt Nam PQRERRRKR*GLF

A/Anhui/1/2005 2.3.4 Trung Quốc PLRERRRKR*GLF

A/duck/Vietnam/37/2007 2.3.4 Việt Nam PLRERRRKR*GLF

A/chicken/Yunnan/493/2005 2.4 Trung Quốc PQRERRRKR*GLF

A/crow/Osaka/102/2004 2.5 Nhật Bản PQRE-RRKKR*GLF

A/Pheasant/Hong_Kong/FY155/01 3 Hong Kong PQRERRRKKR*GLF

A/goose/Guiyang/337/2006 Trung Quốc PQRERRRKKR*GLF 4

A/duck/Guangxi/668/2004 Trung Quốc PQREIRRKKR*GLF 5

A/chicken/Yichang/lung-1/04 Trung Quốc PQRERRRKKR*GLF 6

A/chicken/Shanxi/2/2006 Trung Quốc PQREGGRRKR*GLF 7

A/Chicken/Hong_Kong/YU22/2002 8 Hong Kong PQRERRRKKR*GLF

A/goose/Shantou/1621/05 9 Trung Quốc PQRERRRKKR*GLF

Ch thích: * bi u th v trí HA0 t i chuỗi nối (cleavage site) giữa H 1 và H 2

Cũng tương tự các virus cúm A H N1 độc lực cao thuộc các clade

HA khác (clade 0 – clade 9), chủng virus cúm A/H5N1 clade 7

(A/Chicken/Vietnam/NCVD-016 2008) cũng có motif chứa nhiều axit amin

cơ bản như arginine và lysine tại vùng chuỗi nối. Như vậy đây là chỉ thị cho

thấy virus cúm A H N1 này được xếp loại vào nhóm virus cúm có độc lực

cao đối với gia cầm (HPAI).

3.3.3.2. Đ nh gi đ c lực t ên đ ng vật thí nghiệm

Như đã trình bày trên, chúng tôi đã phân lập được 5 mẫu virus cúm

A/H5N1 clade , nhưng để đánh giá độc lực của virus này chúng tôi chỉ sử

d ng một chủng virus là A Chicken Vietnam NCVD-016 2008 vì qua phân

tích phát sinh loài (phylogeny) dựa trên gen HA, virus này n m tại gốc của

nhóm các chủng virus A H N1 clade của Việt Nam và gần nhất với các

virus cúm A/H5N1 clade 7 Trung Quốc.

Trước khi tiến hành gây bệnh, toàn bộ động vật thí nghiệm được lấy

máu, chắt huyết thanh và kiểm tra kháng thể cúm gia cầm H5 b ng kháng

nguyên cúm gia cầm H5N1 (A/Chicken/Scotland/59). Đây là kháng nguyên

được các phòng thí nghiệm thuộc hệ thống của C c Thú y sử d ng để đánh

giá kết quả tiêm phòng. Kết quả kiểm tra đã xác định toàn bộ số động vật thí

nghiệm đều âm tính kháng thể cúm gia cầm H , và đảm bảo đủ điều kiện để

thực hiện thí nghiệm gây bệnh đánh giá độc lực virus cúm A/H5N1 clade 7.

Động vật được đánh số để theo dõi theo chi tiết từng con. Mỗi động

vật thí nghiệm được gây nhiễm với liều 106TCID50 100µl virus cúm A H N1clade qua đường nhỏ mũi (virus được lưu giữ tủ -860C, lấy ra và

chuẩn bị ngay trước khi tiến hành gây nhiễm). Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.

Kết quả tổng hợp theo dõi thí nghiệm đánh giá độc lực của virus

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016 2008 được trình bày trong bảng 3.14.

Bảng 3.14: Kết quả đ nh gi đ c lực của virus c A/H5N1c A/H5N1 cl de 7 t ên gi cầm

Lần thí nghiệm Động vật thí nghiệm Chết (con) Tỷ lệ(%) Điểm lâm sàng Số lượng (con)

Thời gian chết trung bình ( DT) (ngày) 5,4 11 Gà 11 100 1,9

10 Lần 1 Vịt 0 0 0 0

10 Ngan 0 0 0 0

10 Gà 10 100 1,7 6,2

10 Lần 2 Vịt 0 0 0 0

10 Ngan 0 0 0 0

Kết quả thí nghiệm được trình bày bảng 3.14 cho thấy virus cúm

A/H5N1 clade 7 (A/Chicken/Vietnam/NCVD-016 2008) đã gây chết 100% số

gà được gây bệnh. Theo tiêu chí về độc lực của virus cúm gia cầm của Tổ chức

Thú y thế giới-OIE (OIE Terrestrial Manual 2009), nếu một virus cúm gây chết ít

nhất 75% số gà được gây nhiễm thì sẽ được coi là virus cúm độc lực cao. Bên

cạnh đó các lô thí nghiệm, gây nhiễm virus, chúng tôi cũng bố trí gia cầm được

tiêm nước sinh lý, và số gia cầm này hoàn toàn khỏe mạnh bình thường. Như

vậy virus cúm A/H5N1clade là virus cúm có độc lực cao đáp ứng tiêu chí phân

loại của OIE và kết quả này tương đồng với các chỉ thị độc lực mức độ phân tử

của vùng chuỗi nối (cleavage site).

Thời gian gây chết động vật thí nghiệm trung bình - MDT (Mean death

time) của virus cúm A/H5N1Clade 7 đối với gà là ,4 ngày thí nghiệm lần 1 và

6,2 ngày thí nghiệm lần 2. Kết quả này là dài hơn khi so sánh với thời gian gây

chết trung bình của virus cúm A/H5N1HA clade 1 (2,0 ngày) và virus cúm

A/H5N1HA clade 2.3.4 (1,2 ngày) mà chúng tôi cũng thực hiện song song trong

cùng thời gian (kết quả chi tiết không trình bày trong báo cáo này), và cũng ngắn

hơn so với thời gian gây chết trung bình của một số virus cúm A/H5N1của Việt

Nam năm 200 (<36-48 giờ sau khi nhiễm) (Pfeiffer và cs, 2009). Kết quả c

thể về theo dõi lâm sàng và tỷ lệ chết của thí nghiệm gây bệnh được trình bày

bảng 3.1 và hình 3.10.

Biểu hiện lâm sàng sau khi công

Điểm lâm sàng trung

Lần thí nghiệm

Ký hiệu gà

Ngày 7

bình

Ngày 1-3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6

C1-1

- C thể là trong vòng 3 ngày sau khi gà được gây bệnh b ng virus

A/H5N1clade 7, trong cả 2 lần thí nghiệm toàn bộ số gà thí nghiệm vẫn bình

khỏe mạnh bình thường.

- Đến ngày thứ tư sau khi gây nhiễm gà mới bắt đầu thể hiện một số triệu

chứng nhẹ như bỏ ăn, hoặc n m một chỗ, ỉa chảy, phân loãng; một số gà có dấu

hiệu ốm nặng hơn như liệt, thần kinh và chỉ có 1 con chết lần thí nghiệm thứ

nhất.

- Trong 2 ngày tiếp theo, số gà còn lại lần lượt ốm nặng hơn, hầu hết số gà

thí nghiệm đều xuất hiện triệu chứng thần kinh, đầu ngoẹo, liệt chân, n m bệt,

không ăn uống được.

- Trong ngày thứ năm sau khi gây bệnh của thí nghiệm 1 đã có thêm

con chết.

- Triệu chứng nặng dần và đến ngày thứ sáu, toàn bộ số gà gây bệnh của

thí nghiệm 1 chết hết. Ở thí nghiệm lặp lại, vào ngày thứ sáu sau khi công có 8 gà

chết.

- Đến ngày thứ sau khi gây nhiễm của thí nghiệm 2, số gà thí nghiệm

còn lại chết nốt.

- ỗi lần thí nghiệm chúng tôi đều sử d ng 3 gà đối chứng, sử d ng dung

dịch PBS gây nhiễm qua đường mũi. Cho đến khi kết thúc thí nghiệm toàn bộ số

gà đối chứng vẫn khỏe mạnh bình thường.

Quan sát gà chết có hiện tượng phù nhẹ vùng đầu, làm cho đầu sưng lên.

Khi mổ khám các bệnh tích thường gặp là cơ đùi xuất huyết, mào, tích thâm tím,

da chân vùng không lông xuất huyết, phù keo nhày dưới da vùng đầu, não sung

huyết, phổi viêm, sưng, phù và xuất huyết. (Hình 3.8)

Một số bệnh tích khác cũng gặp rải rác một số con là cơ tim xuất huyết,

sung huyết tĩnh mạch vành tim. Thận sung huyết. Ruột non xuất huyết. Túi khí

dày đ c, viêm. ột số gà cũng có hiện tượng xuất huyết dạ dày tuyến, tuyến

t y viêm, sưng và xuất huyết.

Bên cạnh việc gây bệnh thí nghiệm cho gà b ng virus cúm A/H5N1clade

, chúng tôi còn gây bệnh b ng virus cúm A/H5N1clade 2.3.4 và 2.3.2 (kết quả

không trình bày trong luận án này). Nói chung bệnh tích của gà gây bệnh b ng

các virus cúm A/H5N1thuộc clade 2 thường mức độ nặng hơn. Điển hình là gà

thường chết nhanh hơn, trong diều còn căng đầy thức ăn không tiêu, thậm chí có

con chết mồm vẫn còn thức ăn. Các bệnh tích khác điển hình hơn như khí quản

xuất huyết, mỡ vành tim xuất huyết, cơ tim xuất huyết, bao tim tích dịch vàng,

keo đặc (Hình 3.9)

Đầu phù nhẹ ào thâ tí Sung huyết não

Cơ đùi xu t huyết a chân vùng kh ng l ng xu t huyết

Thận sung huyết Phổi viê xu t huyết

Hình 3.9. M t s hình ảnh bệnh tích đại th gà gây bệnh bằng i c

A/H5N1Clade 7 (A/Chicken/Vietnam/NCVD 016)

Nói chung triệu chứng, bệnh tích của gà được gây bệnh b ng chủng virus

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016 2008 không trầm trọng và nặng b ng gà được

gây bệnh b ng các chủng virus cúm A/H5N1thuộc các clade 1, 2.3.4 và 2.3.2,

nhưng các bệnh tích viêm, xuất huyết cũng xuất hiện khắp các phủ tạng của gà

thí nghiệm .

Mào tích xu t huyết

Chết c p tính (thức ăn còn trong iệng)

Khí quản xu t huyết

Xu t huyết cơ ti ỡ vành ti

Hình 3.10. M t hình ảnh th hiện bệnh tích đại th ở gà gây bệnh bằng

i A/H5N1 cl de 2.3.4 à 2.3.2

Như đề cập trên các chủng virus cúm gia cầm A/H N1 độc lực cao

thuộc clade 1, 2.3.2 và clade 2.3.4 thường giết chết gà trong khoảng thời gian 1-2

ngày sau khi gây nhiễm, khi được nhiễm b ng virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-

016/2008 gà chết trong thời gian muộn hơn (5,4-6,2 ngày). Điều này cho thấy

chủng virus cúm A/H5N1clade tuy là virus cúm gia cầm độc lực cao, nhưng

độc lực của chúng so với các chủng virus thuộc clade 1, clade 2.3.2 và 2.3.4

dường như là thấp hơn.

Như vậy, nếu gà nhiễm các chủng virus cúm A H N1 thuộc clade 7, thời

gian ủ bệnh có thể kéo dài, cũng vì thế mà thời gian thải virus ra môi trường có

thể lâu hơn so với các chủng virus thuộc các clade khác đã và đang lưu hành

trong thời gian từ năm 200 -2010 Việt Nam như clade 1 và clade 2.3.4. Như

vậy có thể nhận thấy mối nguy cơ nếu chủng virus này không được phát hiện

sớm thì khi dịch bùng phát sẽ dễ lây lan rộng và khó trừ diệt virus môi trường.

Với b ng chứng là đã có ca tử vong con người khi nhiễm virus cúm A/H5N1

cùng clade Trung Quốc năm 2003 và như thế khi các chủng virus thuộc clade

lưu hành, lây lan vào gà nội địa, sinh mạng con người chắc chắn sẽ bị đe dọa

(http://www.recombinomics.com/News/01060903/H5N1_Beijing_7_Concerns.ht

100

ml).

% e

Gà

l y T

Vịt

Ngan

9 10 11 12 13 14

Ngày sau khi công

Hình 3.11: Diễn biến s ng/chết của gà khi gây nhiễ bằng chủng i

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008

Song song với thí nghiệm gây nhiễm cho gà, chúng tôi đã tiến hành gây

nhiễm 2 đối tượng gia cầm khác là ngan và vịt. Kết quả là tất cả số vịt và ngan

100

đều còn sống sau khi kết thúc thí nghiệm. Thêm vào đó, toàn bộ số vịt và ngan

trên đều khỏe mạnh, ăn uống bình thường và không thể hiện bất kỳ triệu chứng lạ

nào trong suốt 2 tuần theo dõi. Đây là khác biệt khi so sánh về độc lực so với các

chủng virus thuộc clade 1 và clade 2.3.4. Các nhà khoa học Hàn Quốc, khi

nghiên cứu khả năng gây bệnh của một số chủng virus cúm A/H5N1trên vịt nhà

(Kim và cs, 2008), tỷ lệ chết của vịt khi gây nhiễm virus cúm là 0% và 80-100%

lần lượt đối với các chủng virus clade 1 và clade 2.3.4. Tương tự, Pfeiffer

(Pfeiffer và cs, 2009) cũng sử d ng một số chủng virus cúm gia cầm độc lực cao

phân lập Việt Nam (clade 2.3.2 và 2.3.4) gây bệnh cho vịt, những lô thí

nghiệm này vịt bị chết 100%.

Cũng trong một thí nghiệm gây bệnh b ng một chủng virus cúm gia cầm

độc lực cao của Hàn quốc (A/Chicken/Korea/IS/06 virus-H N1) các nhà khoa

học Viện Thú y Hàn Quốc (Jeong và cs, 2009) thấy virus không giết chết vịt trong thí nghiệm khi gây nhiễm qua đường mũi với liều 106.5 EID50. Trước đó một số nhà khoa học khác (Cooley và cs, 1989; Perkin và Swayne, 2002;

Tumpey và cs, 2002; Chen và cs, 2004; Hulse-Post và cs, 200 ) đã quan sát thấy

có các trường hợp khi vịt bị nhiễm tự nhiên hoặc khi gây bệnh thực nghiệm b ng

một số chủng virus cúm A/H5N1 độc lực cao cũng không có triệu chứng lâm

sàng của bệnh.

Một đặc điểm quan trọng về khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1

độc lực cao trên vịt đó là ph thuộc vào lứa tuổi của vịt cảm nhiễm. Một thí

nghiệm đánh giá về mức độ ảnh hư ng của lứa tuổi đến khả năng gây bệnh của

các virus cúm A/H5N1độc lực cao dòng châu Á trên vịt (Pantin-Jackwood, 2007)

cho thấy lứa tuổi vịt khác nhau cảm nhiễm khác nhau với virus cúm. Nghiên cứu

này cho thấy khi gây bệnh cho vịt 2 tuần tuổi, phần lớn các chủng virus A/H5N1

có độc lực cao có thể gây ốm với triệu chứng thần kinh và gây chết tới 100%.

Trong khi đó, đối với lứa tuổi vịt 5 tuần tuổi, các virus kể trên không gây chết,

thậm chí cũng không có triệu chứng thần kinh như đã thấy trên vịt 2 tuần tuổi bị

gây nhiễm cùng loại virus. Nhận định r ng lứa tuổi vịt ảnh hư ng đến sự nhiễm

và mắc bệnh cúm gia cầm do virus A/H N1 cũng đã từng được chỉ ra trước đó

(Kwon và cs, 200 ).

101

Mặc dù các chủng virus cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1 phân lập trong

thời gian gần đây đều có độc lực và gây bệnh đối với vịt (Sturm- amirez và cs,

2004; Hulse-Post và cs, 200 ; Kishida và cs, 200 ; Kwon và cs, 200 ; Lee và cs,

200 ; Nguyen và cs, 200 ; Shinya và cs, 200 ; Sturm- amirez và cs, 200 ;

Antarasena và cs, 2006; Li và cs, 2006; Somserm và cs, 2006; Swayne và Pantin-

Jackwood, 2006; Zhou và cs, 200 ), nhưng khả năng gây bệnh của các chủng

virus khác nhau cũng không ổn định, có liên quan đến lứa tuổi (Sturm-Ramirez

và cs, 2004; Shinya và cs, 200 ; Somserm và cs, 2006; Zhou và cs, 200 ). ức

độ cảm nhiễm bệnh liên quan đến lứa tuổi cũng đã được quan sát thấy một số

loài khác như gà tây và đà điểu khi bị nhiễm chủng virus cúm gia cầm độc lực

thấp (LPAI-Low Pathogenic Avian Influenza) (Capua và cs, 1999; Capua và cs,

2000). Tuy nhiên có thể nói r ng virus cúm gia cầm độc lực cao có thể gây bệnh

và gây chết cho tất cả các loài gà bất cứ lứa tuổi nào (Swayne và cs, 2003;

Swayne và Pantin-Jackwood, 2006).

Đã có nhiều nghiên cứu về việc gây bệnh thí nghiệm bệnh cúm gia cầm

cho vịt, nhưng ít thấy những nghiên cứu tương tự trên ngan vì loài ngan tuy là

thủy cầm như vịt nhưng không được nuôi phổ biến như vịt. Có một thí nghiệm

được thực hiện b i một số nhà khoa học Pháp (Guionie và cs, 2010) về việc gây

bệnh thực nghiệm b ng 2 chủng virus cúm A H5N1 thuộc clade 2.2 trên ngan.

Một chủng chỉ gây ốm 83% và gây chết 73% với thời gian chết trung bình tới

13, ngày; chủng kia gây chết 100% số động vật thí nghiệm trong với thời gian

chết trung bình là 6, ngày.

Kết quả này của nghiên cứu cũng cho thấy sự khác biệt về độc lực của các

chủng virus A/H N1 độc lực cao đối với các loài gia cầm khác nhau cũng khác

nhau. Từ khi dịch cúm gia cầm do virus A/H N1 xâm nhập và gây nên dịch

nước ta cho đến nay, từng có nhiều clade virus A/H N1 độc lực cao khác nhau

như các clade 1, 3, , 2.3.4 và 2.3.2 xuất hiện trong các ổ dịch (Dung Nguyen T

và cs, 2008; Wallace và cs, 200 ), với ngành chăn nuôi gia cầm đa dạng gồm

nhiều loài như gà, vịt, ngan và một số loài cầm khác ít phổ biến hơn (chim cút,

bồ câu), sự phân bố chăn nuôi theo vùng miền rất đa dạng, thì hiện tượng bệnh lý

xảy ra ngoài thực địa chắc chắn cũng rất phức tạp và cần phải có những nghiên

102

cứu để hiểu rõ đặc tính gây bệnh của từng chủng virus đối với từng loài gia cầm

khác nhau.

3.3.4. Kết quả đ nh gi đ bài thải củ i t ên đ ng vật thí nghiệm

gây nhiễ

Bên cạnh việc theo dõi lâm sàng hàng ngày trong suốt thời gian thực hiện

thí nghiệm gây nhiễm bệnh, chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu dịch ngoáy hầu

họng (swab) của những gà thí nghiệm chết hoặc sống vào ngày thứ 4 sau khi

công để đánh giá độ bài thải của virus. Các tăm bông ngoáy hầu họng được bảo

quản trong dung dịch đệm PBS (1 ml), sau đó chiết tách NA b ng kít Qiagen

RNeasy minitkit, và xét nghiệm b ng phản ứng realtime RT- PC theo quy trình

xét nghiệm của C c Thú y.

Bảng 3.16: Đ nh gi đ bài thải i khi gây nhiễ bằng i

A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008

Gà Vịt Ngan ĐVTN

Ct Chuyển đổi Ct Chuyển đổi Ct

Stt 1 Chuyển đổi (mức độ bài thải) ++ 25,3 Âm tính - 27,8 ++

21,7 2 +++ Âm tính - 33,7 +

23,9 3 +++ Âm tính - 24,9 +++

20,7 4 +++ Âm tính - 34,1 +

28,5 5 ++ Âm tính - 26,4 ++

23,2 6 +++ Âm tính - 32,6 +

22,5 7 +++ Âm tính - Âm tính

19,9 8 ++++ Âm tính - 36,1 +

20,6 9 +++ Âm tính - 31,7 +

25,2 10 ++ Âm tính - 31,3 +

22,2 11 +++

- (0) +(1) T ng bình 23,1 +++ (3) Â tính 31,0

Ch thích: Ct – Cycle threshold (ngưỡng vòng của phản ứng RRT-PCR)

Tỷ lệ nhiễ 100% 0% 80%

103

Kết quả xét nghiệm RRT-PCR được thể hiện b ng giá trị Ct (Cycle

threshold – giá trị ngưỡng vòng của phản ứng). Giá trị Ct có tỷ lệ nghịch với mức

độ virus có trong mẫu kiểm tra. Nghĩa là nếu trong mẫu kiểm tra có lượng virus

cao thì giá trị Ct khi xét nghiệm b ng RRT-PCR thấp và ngược lại, nếu lượng

virus có trong mẫu thấp thì giá trị Ct sẽ cao. Mẫu có giá trị Ct ~35 tr xuống là

dương tính.

Do giá trị Ct tỷ lệ nghịch với lượng virus có trong mẫu xét nghiệm, nên

chúng tôi quy ước giá trị Ct sang mức độ từ + đến ++++ để dễ biểu thị kết quả về

lượng virus có trong mẫu kiểm tra. C thể như sau: ẫu có Ct  20 được coi là

++++(4), Ct từ < 20 đến  2 được coi là +++(3), Ct từ < 2 đến  30 được coi là

++(2) và Ct từ < 30 đến  3 được coi là +(1). Dựa vào mức độ của từng mẫu

riêng lẻ và tính trung bình cho từng loài động vật thí nghiệm. Kết quả được trình

bảy bảng 3.16.

- Kết quả nhiễm bệnh như đã thấy khi quan sát lâm sàng đã rất rõ trên gà,

toàn bộ số gà gây bệnh đều ốm, chết với tỷ lệ 100% và số mẫu swab của gà thí

nghiệm đều dương tính virus cúm A/H5N1 khi xét nghiệm b ng phản ứng RRT-

PCR.

- Khi xét nghiệm mẫu trên vịt thấy toàn bộ các mẫu kiểm tra đều âm tính,

chứng tỏ virus cúm A/H5N1 clade không có khả năng gây nhiễm, hay nói cách

khác là không có khả năng thích nghi trên vịt. Điều này cũng phù hợp với thực

tế, khi Trung quốc cũng chỉ phát hiện thấy virus A H N1 thuộc clade trên gà

mà không phát hiện thấy trên vịt (Jiang và cs, 2010).

- Tuy nhiên, kết quả xét nghiệm RRT-PCR đối với các mẫu dịch ngoáy

họng ngan lại có kết quả khác với kết quả của các mẫu từ vịt được gây bệnh. Có

8 trên 10 mẫu ngan cho kết quả dương tính virus cúm khi xét nghiệm b ng RRT-

PCR, mặc dù toàn bộ số ngan đều khỏe mạnh về mặt lâm sàng như đã trình bày

trên. Điều này có nghĩa là ngan có thể nhiễm virus cúm A/H5N1clade nhưng

không mắc bệnh.

Về chi tiết mức độ virus bài thải, hầu hết các mẫu swab lấy từ gà (8 11

mẫu) đều có mức độ là 3 - 4 (+) giá trị Ct n m trong khoảng 19,9 - 23,9, và chỉ

có một số ít mẫu (3 11 mẫu) mức độ 2 (+). Tính trung bình, mức độ bài thải

virus cúm gà nhiễm virus cúm A/H5N1clade là mức độ 3(+). Kết quả này

104

cho thấy khi gà bị nhiễm virus cúm A/H5N1clade 7 sẽ bài thải lượng lớn virus

trước khi chết. Điều này cũng được quan sát thấy khi chúng tôi kiểm tra độ bài

thải virus khi gây bệnh cho gà với các chủng virus cúm A H N1 thuộc clade 1 và

clade 2.3.4.

Như đã đề cập bên trên, vịt không hề nhiễm virus cúm A/H5N1clade 7 sau

khi công, nhưng ngan vẫn có khả năng nhiễm virus này. Tuy số ngan bị nhiễm

virus là khá cao (80%), nhưng mức độ bài thải virus không cao, chủ yếu là mức

độ 1(+). Các nghiên cứu trước đây cho thấy virus cúm A/H5N1độc lực dạng cổ

điển thường có độc lực cao trên gà nhưng không gây nhiễm cho thuỷ cầm giống

như virus cúm A/H5N1clade , tuy nhiên chúng vẫn có khả năng nhân lên rất tốt

trên thuỷ cầm và bài thải với lượng lớn ra ngoài. Nhưng kết quả nghiên cứu của

chúng tôi cho thấy, khác với các virus cúm dạng cổ điển, chủng virus A H N1

thuộc clade 7 mà chúng tôi đã phân lập có khả năng gây nhiễm rất hạn chế trên

thuỷ cầm.

Có một điều đáng chú ý là, khi chúng tôi gây nhiễm virus cúm thuộc clade

trên môi trường tế bào xơ phôi vịt và xơ phôi ngan, virus này lại có khả năng

nhân lên rất tốt giống như khả năng nhân lên trên tế bào xơ phôi gà. C thể chuẩn

độ (giá trị TCID50) của virus cúm A/H5N1clade 7 (A/Chicken/Vietnam/NCVD- 016) trên tế bào xơ phôi vịt và tế bào xơ phôi ngan lần lượt là 107,3 và 106,7 (đã

trình bày phần 3.3.2.)

Cho đến nay, chúng tôi chưa phát hiện thấy virus cúm A/H5N1 clade 7 này

trong các ổ dịch cúm gia cầm Việt Nam, ngoại trừ trên một số gia cầm tại chợ

gia cầm sống khi tiến hành chương trình giám sát virus. Điều này có thể là do

virus này không có hoặc ít có khả năng thích nghi tốt trên thuỷ cầm, mà thuỷ cầm

đã được chứng minh là yếu tố quan trọng làm lây lan virus cúm và là nguồn lưu

trữ virus ngoài môi trường.

Tuy nhiên khi theo dõi tình hình dịch cúm gia cầm và kết quả giám sát

cúm gia cầm độc lực cao H5N1 của Trung Quốc, chúng tôi nhận thấy bên cạnh

các ổ dịch gây ra b i virus cúm A/H5N1thuộc clade 2.3.4 và 2.3.2 thì vẫn có

nhiều ổ dịch gây ra b i virus thuộc clade trong giai đoạn 2007-2010 các tỉnh

phía Bắc của Trung Quốc (Jiang và cs, 2010). Thậm chí có một số ca bệnh trên

người Trung Quốc là do virus cúm gia cầm H5N1 Clade 7 gây ra. Điều này cho

105

thấy, chúng ta không thể chủ quan với công tác giám sát virus cúm gia cầm, vì

virus cúm A/H5N1nói chung có khả năng biến đổi liên t c và virus cúm

A/H5N1Clade 7 hoàn toàn có thể gây ra dịch cúm gia cầm nước ta như đã từng

thấy virus các chủng virus cúm A/H5N1clade 2.3.2 xuất hiện lại các ổ dịch

Việt Nam và Trung Quốc trong năm 2009-2011, và nhánh virus 2.3.2. đã có biến

đổi khá nhiều, được gọi là clade 2.3.2.1 (Nguyen, 2010).

3.3.5. Kết q ả đ nh gi khả năng nhiễ đ phủ tạng củ chủng i c

A/H5N1 th c cl de 7

Theo một số tác giả, virus cúm gia cầm H N1 độc lực cao bên cạnh khả

năng thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô hấp, còn có khả năng tác

động gây tổn thương nhiều cơ quan khác trong cơ thể của động vật cảm nhiễm

gọi là khả năng nhiễm đa phủ tạng. Chính đặc tính này là sự phân biệt về khả

năng gây bệnh và độc lực của virus cúm có độc lực cao (HPAI) và virus cúm có

độc lực thấp (LPAI) (Nicholso và cs, 2003; Wanasawaeng và cs, 2009).

3.3.5.1.Định lượng virus trong phủ tạng bằng phản ứng Realtime RT-PCR

Để đánh giá khả năng nhiễm đa phủ tạng của chủng virus cúm

A/H5N1clade 7 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008, chúng tôi thực hiện việc

thu thập mẫu phủ tạng (não, phổi, gan, lách, thận, ruột và t y) của gà trong thí

nghiệm gây bệnh, nghiền với PBS pH ,4 thành huyễn dịch 10%, sau đó chiết

tách NA và xét nghiệm b ng phương pháp realtime T-PCR với primer và

probe đặc hiệu cho gen H5/HA của virus cúm A/H5N1.

Phản ứng ealtime PC có thể tính toán tương đối chính xác lượng virus có

trong mẫu xét nghiệm, vì vậy chúng tôi đã chuyển đổi kết quả xét nghiệm RRT-

PCR sang chuẩn độ virus trên tế bào (log10 TCID50) dựa trên nồng độ của virus đã biết sau khi chuẩn độ trên tế bào CEF để đánh giá chi tiết hơn về mức độ

nhiễm virus của từng loại phủ tạng.

Như đã nêu trên, chúng tôi thu thập 7 loại cơ quan nội tạng khác nhau để

đánh giá khả năng nhiễm đa phủ tạng là: não, phổi, gan, lách, thận, ruột và t y từ

3 gà đã gây bệnh thí nghiệm. Những loại phủ tạng này cũng thường là phủ tạng

được thu thập khi lấy mẫu để chẩn đoán bệnh. Kết quả chi tiết xét nghiệm T-

PC được trình bày bảng 3.17.

106

Bảng 3.17. Kết q ả xét nghiệ RRT- CR đ i ới t loại phủ tạng gà

gây bệnh bằng i A/H5N1 cl de 7 à ch y n đổi ng nồng đ i .

N o

Tụy

Thận

hổi

R t

Gan

L ch

Gà

Ct Log10 Ct Lgo10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10 Ct Log10

1 13,3 7,6 21,6 5,1 19,4 5,7 18,1 6,2 19,7 5,7 22,5 4,8 24,6 4,2

2 14,5 7,2 21,4 5,1 22,7 4,7 20,2 5,5 22,6 4,8 27,9 3,2 32,4 1,8

3 15,2 7,0 17,7 6,3 19,7 5,6 25,2 4,0 23,2 4,6 26,7 3,5 26,5 3,6

TB 14,3 7,3 20,2 5,5 20,6 5,4 21,1 5,2 21,8 5,0 25,7 3,9 27,8 3,2

Std 1,0

0,3

2,2

0,7

1,8

0,6

3,6

1,1

1,9

0,6

2,8

0,9

4,1

1,2

Ch thích: T – Trung bình

td: độ lệch chu n

Kết quả đánh giá mức độ nhiễm virus của phủ tạng được biểu thị hình

8.0

7.0

6.0

5.0

3.12.

I

4.0

3.0

0 5 D C T 0 1 g o L

2.0

1.0

0.0

Series1

Não 7.3

Tụy 5.5

Thận 5.4

Phổi 5.2

Ruột 5.0

Gan 3.9

Lách 3.2

Hình 3.12. hân b virus ở c c cơ q n phủ tạng q xét nghiệm RRT-PCR

(chuy n đổi sang log10)

107

Xét nghiệm b ng phản ứng T-PCR cho thấy 100% các mẫu phủ tạng

đều dương tính virus cúm A/H5N1. Tuy nhiên mức độ nhiễm virus trong từng

loại khí quan khác nhau thì khác nhau và chênh lệch khá lớn:

- Tổ chức não là nơi bị nhiễm nhiều virus nhất với chuẩn độ virus trung

bình là ,3±0,3 log10 (giá trị Ct trung bình là 14,32±1), tương đương mức độ

4(+). Điều này có thể lý giải cho hiện tượng gà chết nhanh khi bắt đầu có sự xuất

hiện các triệu chứng bệnh, đặc biệt là các triệu chứng thần kinh thường rất điển .

- Các khí quan khác như phổi, thận, ruột và t y có mức độ nhiễm thấp hơn

so với não, với chuẩn độ virus chuyển đổi lần lượt là ,2±1,1 log10(phổi),

,4±0,6 log10 (thận), ,0±0,6 log10(ruột) và , ±0, log10 (t y) (với giá trị Ct

trung bình từ 20,22 – 21,8 ), tương đương mức độ 3(+).

- Gan và lách là 2 khí quan có mức độ tác động b i virus cúm

A/H5N1clade 7 thấp hơn so với các khí quan khác, đặc biệt lách là rất thấp với

giá trị chuyển đổi chuẩn độ virus là 3,2±1,2log10 (giá trị Ct trung bình là 2 ,82)

tương đương mức 2(+).

Nghiên cứu về mức độ nhiễm virus trong phủ tạng của một số nghiên cứu

trước đây với một số chủng virus H N1 khác cho thấy lượng virus A/H N1 có

trong tổ chức phổi lại cao hơn so với não (Pfeiffer và cs, 2009; Jeong và cs,

2009). Thậm chí có chủng virus lại gây nhiễm lách với mức độ rất cao so với não

(Pfeiffer và cs, 2009). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi khá tương đồng với một

nghiên cứu về mức độ nhiễm virus đa phủ tạng của các nhà khoa học Đài Loan

(Lee và cs, 200 ) khi thấy lượng virus trong não cao hơn so với phủ tạng khác

như lách và thận. Trong một nghiên cứu khác lại cho thấy trong một ổ dịch dù

100% gà đều nhiễm bệnh và xét nghiệm dương tính với virus H N1, nhưng

không phải tất cả các khí quan phủ tạng đều nhiễm virus (Antarasena và cs,

2006). Nói chung động vật mẫn cảm (gà), virus A/H N1 đều chủ yếu nhiễm

lên các khí quan đường hô hấp (khí quản, phổi) nhưng cũng có trường hợp lại

không phát hiện thấy virus trong đường hô hấp của gà (Nakatani và cs, 200 ).

Có thể thấy r ng mặc dù mức độ nhiễm virus của các loại phủ tạng khác

nhau của gà được công cường độ b ng virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-

016 2008 là khác nhau, nhưng đều cho thấy virus này cũng có tính hướng đa phủ

tạng như các virus cúm gia cầm A/H N1 độc lực cao khác, phù hợp với đặc điểm

108

chung về đặc tính độc lực của virus cúm gia cầm độc lực cao, và cũng cho thấy

r ng mặc dù virus cúm gia cầm H N1 độc lực cao, nhưng các chủng virus khác

nhau cũng có mức độ gây nhiễm rất khác nhau lên các khí quan phủ tạng của gà.

3.3.5.2. hân b i à bệnh tích i th gây bởi i c A/H5N1 clade

7 ở phụ tạng bằng phương ph p hó iễn dịch (IHC)

Phản ứng RRT-PCR là một phản ứng phát hiện virus nhạy và đặc hiệu, có

tính chất định lượng. Khi sử d ng phản ứng RRT-PCR ta có thể biết lượng virus

các tổ chức phủ tạng cao hay thấp. Tuy nhiên, bên cạnh việc đánh giá mức độ

virus phủ tạng, chúng tôi cũng thực hiện thêm phương pháp đánh giá khác

thông qua nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) và bệnh lý vi thể (nhuộm HE) để thấy

rõ hơn tác động của virus đối với từng loại phủ tạng, qua đó thấy được chính xác

tổn thương mức độ vi thể mà virus gây ra trong phủ tạng của gà.

Kết quả xác định mức độ nhiễm virus cúm A H N1 clade thông qua

nhuộm hóa mô miễn dịch cũng như sự phân bố của bệnh tích vi thể tại các tổ

chức phủ tạng được trình bày bảng 3.18.

Bảng 3.18. Mức đ tổn thương vi th à nh IHC ph t hiện kh ng

ng yên i c H5N1A/chicken/Vietn /NCVD-016/2008

Phủ tạng Bệnh tích vi thể (HE)

Phổi Tim Não T y Gan Thận Lách Diều ++ + + + + + ++ - Phát hiện kháng nguyên (IHC) +++ ++ ++ + ++ + +++ +

Ch thích:

- Nhuộm HE: - = kh ng có bệnh tích; + = nhẹ; ++ = vừa phải; +++ =

trầm trọng. HC Nhuộ hóa i n d ch: - = kh ng có kháng nguyên; + = kháng nguyên ít; ++ = kháng nguyên nhi u; +++ = kháng nguyên lan tràn.

109

Kháng nguyên ở não (nhuộm IHC)

Kháng nguyên ở phổi (nhuộm IHC)

Kháng nguyên ở thận (nhuộm IHC) Kháng nguyên ở tim (nhuộm IHC)

Kháng nguyên ở tụy (nhuộm IHC)

Hình 3.13. M t hình ảnh nh hó iễn dịch phủ tạng gà gây bệnh

(X400 (Kh ng ng yên i c nh à nâ đ )

110

Kết quả xét nghiệm vi thể, khá tương đồng với kết quả xét nghiệm RRT-

PCR cũng cho thấy virus H N1 đã tấn công vào hầu hết các khí quan phủ tạng

với mức độ tổn thương rất khác nhau.

B A

4

1

3

4

hổi (nhuộ H , X 400) Cơ ti (nhuộ H , X 200)

2 a a a

C D

1

Thận (nhuộ H , X 400)

2 a a a ` ách (nhuộ H , X 400)

F E

Não (nhuộ H , X 200) Gan (nhuộ H , X 400)

Hình 3.14. M t hình ảnh bệnh tích i th t ên phủ tạng gà gây bệnh

111

Ch thích hình 3.14 + A - Phổi: iê ch: có hiện tượng phù xung quanh ch quản; Tế bào nội m c bong tróc (1); -Đá tế bào ly pho (2) và d ch rỉ viê (3) tập trung quanh m ch quản; ách phế nang có nhi u hồng cầu – xu t huyết (4) + B - Cơ ti : b viê đá các tế bào heterophil xâ nhập ( i tên) + C - Thận: Tế bào ly pho xâ nhập (1); Tế bào ống thận b ho i tử t nhân ( i tên vàng); nhi u tế bào ống thận đang trong giai đo n nhân đ ng của quá trình ho i tử ( i tên xanh) + D - ách: iê ch: tế bào nội m c bong tróc (1); các tế bào ly pho và đ i thực bào tăng sinh bao quanh ch (2) + E - Não: Xung huyết; D ch phù tập trung xung quanh m ch quản ( i tên đen); Tế bào ly pho xâ nhập ( i tên vàng); Nhi u hồng cầu tập trung trong lòng ch quản-xung huyết ( i tên xanh) + - Gan: iê ch tế bào nội ch b ho i tử ( i tên xanh); Tế bào ly pho và đ i thực bào xâ nhập ( i tên vàng).

Điểm đặc trưng của bệnh tích vi thể các tổ chức cũng thể hiện rõ

(Hình 3.14) là hiện tương viêm mạch rất nặng tất cả các cơ quan nội tạng

với dịch phù bao quanh thành mạch; tế bào nội mạc bị hoạt tử, bong tróc; các

tế bào lympho và một số tế bào đại thực bào bao quanh thành mạch. Chứng

tỏ virus này đã phá hủy tế bào nội mạc trong toàn bộ cơ thể, gây viêm, xuất

huyết. Điều này giải thích lý do tất cả các cơ quan phủ tạng của gà bị nhiễm

virus cúm đều bị xuất huyết nặng.

Kết quả cũng cho thấy phương pháp nhuộm hóa tổ chức miễn dịch

(IHC) có độ tương đồng phát hiện kháng nguyên với biến đổi bệnh tích vi

thể từng cơ quan phủ tạng.

Các tổn thương về đại thể, vi thể cũng như đánh giá b ng phương

pháp hóa mô miễn dịch trong nghiên cứu này khẳng định r ng chủng virus

H N1 thuộc clade cũng có hướng nhiễm đa phủ tạng giống các virus

A H N1 độc lực cao khác như nhiều tác giả khác đã nghiên cứu (Antarasena

và cs, 2006; Aiki- ajii và cs, 2008; Jeong và cs, 2009; Pfeiffer và cs, 2009).

112

3.3.6. X c định đặc tính kh ng ng yên củ c c chủng i c A/H5N1

cl de 7 phân lập ở Việt N

Trong nghiên cứu đặc tính của virus nói chung và của virus cúm nói

riêng, bên cạnh việc phân tích đặc tính về di truyền (phân tích gen, phân tích

phát sinh loài), một đặc tính cần được xác định rõ đó là tính kháng nguyên

của virus. C thể đối với virus cúm, đặc tính kháng nguyên của virus thường

được xác định dựa trên 2 loại kháng nguyên bề mặt thiết yếu là kháng

nguyên HA và kháng nguyên NA. Nghĩa là để xác định subtype của virus

người ta thường sử d ng phản ứng HA, HI để xác định subtype H và phản

ứng NA NI để xác định subtype N. Phản ứng NI test là một phản ứng định

tính vì vậy dù các virus có cùng subtype N thì phản ứng NI không cho biết

được sự khác biệt về tính kháng nguyên của N của các virus đó. Tuy nhiên

phản ứng HI lại là phản ứng có tính chất định lượng, vì vậy phản ứng HI

không những dùng để xác định subtype H của virus cúm, mà còn được sử

d ng để xác định độ tương đồng kháng nguyên của các chủng virus cúm

khác nhau trong cùng subtype H. Do vậy trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ

sử d ng phản ứng HI để xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng virus

cúm A H N1 mà chúng tôi phân lập được.

Chúng tôi sử d ng 4 chủng virus cúm A H N1 clade phân lập được

Việt Nam là A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008;

A chicken Vietnam NCVD-03 2008; A chicken Vietnam NCVD-04 2008; và

A/chicken/Vietnam/NCVD-093 2008 trong nghiên cứu này, thực hiện việc

xác định đặc tính kháng nguyên b ng phản ứng HI với kháng huyết thanh

kháng virus cúm A H N1chế trên chồn (ferret) H5N1 b ng các chủng virus

cúm A/H5N1thuộc clade 1, 2.3.4 và là các chủng virus lưu hành và phân

lập được tại Việt Nam từ 200 -2010. Chúng tôi không sử d ng chủng

A chicken Vietnam NCVD-0 2008 vì kết quả giải trình tự gen HA cho thấy

chủng này giống 100% so với chủng A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008.

Quy trình xét nghiệm ngăn tr ngưng kết hồng cầu là quy trình của tổ chức

Y tế thế giới khuyến cáo sử d ng khi xét nghiệm kháng thể đối với virus

cúm.

113

Kết quả phản ứng HI chéo giữa virus và kháng huyết thanh của các

clade virus A H N1 khác nhau cho thấy có một sự tương đồng cao giữa các

virus và kháng huyết thanh đồng chủng (hiệu giá HI 160) nhưng không có

phản ứng chéo hoặc phản ứng chéo có hiệu giá rất thấp giữa các chủng virus

từ các clade khác nhau (Bảng 3.19).

- Kháng huyết thanh chồn chế từ virus cúm A Vietnam 1203 2004

(HA clade 1) không có phản ứng chéo đáng kể với bất kỳ virus cúm

A H N1nào thuộc về Clade 7 trong cả hai nhóm virus A và B. Tuy nhiên,

kháng huyết thanh kháng virus cúm A chicken Vietnam NCVD-035/2008

(HA clade 2.3.4) có phản ứng chéo mức độ thấp (HI = 1 10 ÷ 1 80) với các

chủng virus cúm A/H5N1 của clade 7.

- Kháng huyết thanh A H N1 thuộc clade được chế từ ba chủng

virus khác nhau thuộc Clade là: chủng A/Chicken/Vietnam/NCVD-

016/2008 (gốc phát sinh), chủng A/chicken/Vietnam/NCVD-03 2008 (nhóm

B), và chủng A chicken Vietnam NCVD- 093 2008 (nhóm A) được sử d ng

để thực hiện phản ứng HI chéo với các chủng virus cúm A/H5N1của các

clade khác. Trong khi kháng huyết thanh kháng virus

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016 2008 không có phản ứng với các virus clade

1 hoặc clade 2.3.4, thì có phản ứng chéo với một chủng virus của nhóm B

mức độ hạn chế (HI = 20) và không phản ứng chéo với các chủng virus cúm

nhóm A. Hiện tượng kháng huyết thanh kháng virus cúm

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016 2008 có phản ứng chéo rất hạn chế (hiệu giá

HI thấp) hoặc không có phản ứng chéo với các chủng virus cúm

A H N1khác thuộc clade 7 cho thấy sự tương đồng về mặt kháng nguyên

giữa các virus cúm A H N1trong cùng clade là rất thấp.

Tuy nhiên giữa các virus A/H5N1 Clade 7 n m trong cùng phân nhóm lại

có mức độ phản ứng chéo rất cao. Ví d , kháng huyết thanh kháng

A/chicken/Vietnam/NCVD-03 2008 (nhóm B) đã có hiệu giá ngăn tr ngưng

115

Tương tự như vậy, hiện tượng không có phản ứng chéo (hiệu giá HI <10)

giữa kháng huyết thanh nhóm A và virus nhóm B, cho thấy sự khác biệt đáng

kể giữa các phân nhóm của clade 7.

Từ kết quả xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng virus A H N1

clade cho thấy:

- Giữa các clade virus A H N1 khác nhau không có phản ứng chéo, tức là

không có sự tương đồng về mặt kháng nguyên.

- ột số clade có phản ứng chéo nhưng có hiệu giá HI thấp, biểu hiện của

tính tương đồng kháng nguyên thấp.

- Ngay trong cùng một clade, các chủng khác nhau cũng có phản ứng chéo

thấp, tức là độ tương đồng về kháng nguyên giữa các chủng này cũng thấp.

Kết quả trên cho thấy, khi các chủng virus A/H5N1 clade 7 xâm nhập vào

các đàn gà nội địa Việt Nam, có thể vacxin chưa chắc đã có khả năng bảo hộ tốt

chống lại các chủng virus mới này. Qua đây cũng thấy r ng nếu có sự xâm nhập

của nhiều clade virus cúm gia cầm A H N1 khác nhau sẽ có thể dẫn đến sự phức

tạp cho công tác phòng chống dịch bệnh do tính đa dạng về di truyền và kháng

nguyên của virus cúm A/H5N1.

3.3.7. Đ nh gi khả năng bảo h của vacxin Re-1 đ i với i c

A/H5N1Cl de 7 t ên gà

Kết quả của những nghiên cứu các đặc điểm di truyền, kháng nguyên và

độc lực của chủng virus cúm gia cầm H5N1 A/Chicken/Vietnam/NCVD-

016 2008, đã chứng tỏ r ng chủng virus này có độc lực cao đối với gà. Để phòng

bệnh cúm trên gia cầm , từ năm 2006 Việt Nam đã sử d ng đại trà vacxin cúm

gia cầm H N1 e-1 do Trung Quốc sản xuất. Nhiều thử nghiệm đã được tiến

hành Việt Nam để đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin này. Vacxin A/H5N1

Re-1 là vacxin vô hoạt chế b ng kỹ thuật di truyền ngược mang gen H và gen

N1 của chủng virus A/Goose/Guangdong/1/96-H N1 (phân lập trên ngỗng tỉnh

Quảng Đông – Trung Quốc năm 1996) và 6 nội gen (internal gene) của virus cúm

A/Puerto Rico/8/34-H1N1. Trong đó gen H của virus A/Goose/Guangdong/1/96

đã được xóa bỏ đoạn gen mã độc và tr thành vô độc. Chủng virus

116

A Goose Guangdong 1 96 cũng được coi là thủy tổ của các virus cúm

A H N1độc lực cao từ năm 1996 cho đến nay, và về mặt phân loại theo danh

pháp quốc tế của WHO-FAO-OIE virus này thuộc HA clade 0.

Đã có nhiều thí nghiệm đánh giá hiệu lực bảo hộ của vacxin H5N1 Re-1

được thực hiện đối với các chủng virus cúm A H N1độc lực cao thuộc các clade

1 và 2.3.4 Việt Nam (báo cáo của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương).

Tuy nhiên đây là lần đầu chúng tôi thực hiện thí nghiệm đánh giá hiệu lực của

vacxin với chủng virus thuộc clade clade 7 (A/chicken/Vietnam/NCVD-

016/2008).

Chúng tôi sử d ng gà đã được tiêm phòng vacxin H N1 e-1 với 1 mũi

vacxin lúc 14 ngày tuổi, sau đó tiến hành công cường độc lúc 4 tuần sau khi tiêm

vacxin (42 ngày tuổi). Số lượng gà tiêm phòng vacxin là 10 con và số gà đối

chứng không tiêm vacxin là con. Trước khi công cường độc, toàn bộ số gà (cả

lô tiêm vacxin và lô đối chứng) đều được lấy máu và kiểm tra kháng thể.

- Lô đối chứng, tất cả đều âm tính kháng thể cúm gia cầm H5N1.

- Lô Vacxin, cả con đều có kháng thể cúm gia cầm H5N1 với hiệu giá

HI đạt từ 7 – 8 log2 (G T = , log2). Như vậy kết quả cho thấy cả 2 lô đều đạt

tiêu chuẩn để tiến hành công cường độc.

Thí nghiệm công cường độc được tiến hành tại khu chuồng công cường

độc an toàn sinh học của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương. ỗi gà được công cường độc với liều 106TCID50 con qua đường nhỏ mũi. Theo dõi thí nghiệm

trong vòng 10 ngày, ghi lại đặc điểm lâm sàng hàng ngày và tính tỷ lệ sống chết

nh m đánh giá sự bảo hộ. Kết quả chi tiết theo dõi thí nghiệm đánh giá hiệu lực

vacxin H N1 đối với virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016 2008 được trình bày

bảng 3.20.

Diễn biến lâm sàng c thể như sau:

- Ngày thứ nhất và thứ hai sau khi công, gà của cả hai lô đều vẫn khỏe

mạnh, ăn uống bình thường.

- Đến ngày thứ ba, 1/10 gà tiêm lô thí nghiệm (VX 3) có dấu hiệu giảm

ăn, số gà khác trong lô thí nghiệm vẫn bình thường. Tất cả gà của lô đối chứng

117

đều có dấu hiệu ốm, trong đó có 3/5 con giảm ăn uống, 2/5 con có dấu hiệu bỏ

ăn, n m liệt, ủ rũ.

Bảng 3.20. Kết quả theo dõi thí nghiệ c ng cường đ c gà thí nghiệ

sau tiê vacxin c gi cầm H5N1 Re-1

Hiệu giá KT Ngày sau công cường độc

Sau khi Ký hiệu Tỷ lệ chết công 1 2 3 4 5 6 7 8/10 Số con chết/tổng số Trước khi công

Lô thí nghiệm (tiêm vacxin)

VX 1 8 ≥12 0 0 0 0 0 0 0 0

VX 2 8 9 0 0 0 0 0 0 0 0

VX 3 7 10 0 0 0 0 0 1 1 1

VX 4 8 10 0 0 0 0 0 0 0 0

VX 5 7 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0/10 0%

VX 6 7 9 0 0 0 0 0 0 0 0

VX 7 8 10 0 0 0 0 0 0 0 0

VX 8 7 10 0 0 0 0 0 0 0 0

VX 9 8 9 0 0 0 0 0 0 0 0

VX 10 7 9 0 0 0 0 0 0 0 0

Lô đối chứng (không tiêm vacxin)

ĐC 1 - 0 0 1 2 1 1 3

- ĐC 2 0 0 2 2 3 5/5 100% - ĐC 3 0 0 1 2 3

- ĐC 4 0 0 2 3

- ĐC 0 0 2 1 1 3

Ch thích: 0-bình thường 1- ố nhẹ 2-ố nặng 3- chết

- Ngày thứ tư và thứ năm sau khi công, lô thí nghiệm 1/10 gà vẫn lờ đờ,

ăn uống kém, 9/10 gà còn lại trong lô tiêm vacxin vẫn khỏe. Ở lô đối chứng, có

118

1 gà ốm nặng đã chết (ĐC 4) vào ngày thứ tư, 2 gà chết vào ngày thứ năm (ĐC 2

và ĐC 3), 2 gà còn lại đều bỏ ăn.

- Từ ngày thứ sáu sau khi công, gà ốm lô tiêm vacxin đã hồi ph c, ăn

uống tr lại bình thường như các gà khác trong cùng lô cho đến ngày cuối cùng

của thí nghiệm (ngày thứ mười). Ở lô đối chứng, 1 gà chết vào ngày thứ sáu và 1

gà còn lại chết vào ngày thứ sau khi công.

Như vậy số gà được tiêm vacxin H5N1 Re-1 đều sống sót 100% sau khi

công cường độc. Trong khi đó, lô gà đối chứng chết 100%. Thời gian chết trong

vòng từ ngày thứ ba đến ngày thứ bảy sau khi công cường độc. Kết quả này cho

thấy vacxin H5N1 Re-1 đã bảo hộ cho gà chống lại chủng virus cúm

A H N1thuộc clade 7.

Để đánh giá rõ hơn về hiệu lực của vacxin A/H N1 e-1 trong việc kích

thích đáp ứng miễn dịch, chúng tôi lấy máu lô gà thí nghiêm (tiêm vacxin) vào

ngày thứ 10 sau khi công (trước khi hủy gà) và xét nghiệm b ng phản ứng ngăn

tr ngưng kết hồng HI. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu đều cho thấy có sự tăng

hiệu giá kháng thể so với trước khi công, thậm chí có mẫu tăng cao hơn 4 đơn vị

pha loãng (gà VX1). Như vậy kháng thể do vacxin tạo ra không những có thể bảo

hộ cho gà chống lại virus mà còn có thể được kích thích b i virus công cường

độc mà được tăng cao thêm. Điều này có ý nghĩa trong thực tế là nếu gà được

tiêm phòng tốt có thể có sức đề kháng chống bệnh tốt.

Kết quả này cũng có thể là một lý giải tại sao cho đến nay chúng ta chưa

phát hiện thấy virus A/H5N1 clade 7 bất kỳ ổ dịch nào. Đó là do, nhiều đàn gà

nếu đã được tiêm phòng vacxin H5N1 Re-1 và đã có kháng thể bảo hộ, sẽ có khả

năng chống lại sự nhiễm virus A/H5N1 clade 7 nếu có tiếp xúc.

Kết quả đánh giá hiệu lực của vacxin cúm gia cầm H5N1 Re-1 của Trung

Quốc sản xuất đối với virus cúm A/H5N1clade cũng phù hợp với kết quả của

các thí nghiệm đánh giá hiệu lực của vacxin này với các virus cúm A/H5N1thuộc

các clade khác như clade 1 và clade 2.3.4 mà Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung

ương đã từng tiến hành, cũng như của một số nhà khoa học Mỹ (Pfeiffer và cs,

119

2010) đã tiến hành tại Mỹ khi sử d ng các virus cúm gia cầm H N1 phân lập

Việt Nam thuộc các clade 2.3.2 và 2.3.4 (Pfeiffer và cs, 2010).

Kết quả này cũng cho thấy sự tương đồng về di truyền và kháng nguyên

(thông qua phản ứng HI) giữa virus vacxin và virus công cường độc không phải

là yếu tố quyết định duy nhất để dự đoán khả năng bảo hộ của vacxin (sự tương

đồng kháng nguyên thông qua phản ứng HI rất thấp, hoặc gần như không có) vì

kháng thể bảo hộ là kháng thể có khả năng trung hòa virus chứ không phải chỉ

riêng kháng thể kháng HA. Có một điều quan trọng là vacxin đó có khả năng

kích thích con vật có đáp ứng sinh kháng thể đủ cao để có thể giúp bảo hộ cho

gia cầm chống lại subtype virus cúm A/H5N1không mắc bệnh và chết. Trong thí

nghiệm này, gà được tiêm vacxin có đáp ứng kháng thể khá tốt với hiệu giá

kháng thể HI G T trung bình là ,6log2 đã chứng tỏ nhận định trên. Tuy nhiên

có một gà có hiệu giá kháng thể HI log2 đã có dấu hiệu mắc bệnh nhẹ trong

vòng 3 ngày từ ngày thứ ba đến ngày thứ năm sau khi công cường độc, rồi sau đó

hồi ph c khỏe lại. Đây có lẽ chỉ là hiện tượng cá thể, vì toàn bộ số gà được tiêm

vacxin đều vẫn khỏe mạnh và bản thân cá thể này cũng không chết khi bị công

cường độc.

Các loài thủy cầm, dù trên thực tế ít được tiêm phòng hơn so với gà, nhưng

với kết quả gây bệnh thí nghiệm đã tiến hành trên cho thấy thủy cầm không bị

nhiễm virus (vịt) hoặc có thể bị nhiễm, nhưng không bị nặng và không có triệu

chứng (ngan) do vậy không có các ổ dịch trên thủy cầm gây ra b i virus này. Kết

quả giám sát virus cúm gia cầm H5N1 Trung Quốc cũng chỉ phát hiện thấy sự

có mặt của virus này trên các đàn gà, mà không có trên thủy cầm cũng phù hợp

với kết quả thí nghiệm của chúng tôi (Jiang và cs, 2010).

120

KẾT LUẬN V ĐỀ NGHỊ

Kết luận

1) Đã tiến hành thu thập mẫu swab gà nhập lậu tại 2 huyện Cao Lộc và

Lộc Bình tỉnh Lạng Sơn, xét nghiệm b ng phản ứng T-PCR phát hiện được

15 mẫu dương tính cúm A H N1 và phân lập được 0 chủng virus cúm A H N1

thuộc clade lần đầu tiên xuất hiện Việt Nam.

2) Giải trình tự gen H , N1 và cho thấy virus cúm A/H5N1 clade 7

Việt Nam có sự khác biệt rất lớn về di truyền, đặc biệt là gen H5 so với các clade

virus khác. Các chủng virus thuộc clade của Việt Nam cũng phân thành 2 nhóm

với sự khác biệt về nucleotide và axit amin cấp độ gen HA giữa hai phân nhóm

của virus clade được phát hiện tại Việt Nam (nhóm A và B) tương ứng đạt mức

độ trung bình 4,1% và , %, với sự thay thế hơn 30 axit amin giữa các virus của

hai nhóm này.

3) Chủng virus cúm A/H N1 clade phân lập Việt Nam thích nghi tốt trên các môi trường nuôi cấy: đạt hiệu giá 107,9EID50 trên phôi trứng gà và hiệu giá 107,3TCID50 trên môi trường tế bào xơ phôi gà. Kết quả xác định độc lực của của virus cúm A H N1 clade trên động

vật thí nghiệm cho thấy:

- Virus có độc lực cao, gây chết 100% số gà gây bệnh, với thời gian gây

chết trung bình từ ,9-6,2 ngày.

- Virus gây nhiễm đa phủ tạng và phát triển trong các tổ chức như não,

t y, phổi, thận, gan, lách, ruột của gà. Ở những cơ quan này có nồng độ virus

khác nhau, não là nơi virus có thể phát triển đạt nồng độ cao nhất.

- Virus cúm A/H N1 clade , có khả năng gây nhiễm cho ngan, không gây

nhiễm cho vịt và hoàn toàn không có độc lực với 2 loài thuỷ cẩm này.

Kết quả nghiên cứu đã cho thấy virus cúm A/H5N1 clade 7,

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016 2008, phân lập từ gia cầm nhập lậu là virus có

độc lực cao và có khả năng gây bệnh trên gà, nhưng kéo dài thời gian bài thải

virus trước khi chết, điều này cũng làm tăng yếu tố nguy cơ cho sức khoẻ của con

người.

121

4) Đặc tính kháng nguyên thông qua phản ứng HI cho thấy virus cúm

A H N1 clade cũng có sự khác biệt rất lớn về mặt kháng nguyên (ít tương

đồng) với các clade khác đang lưu hành Việt Nam. Sự tương đồng giữa các

virus trong cùng clade Việt Nam cũng không cao (<10 ÷ 20).

5) Vacxin cúm A/H5N1 Re-1 do Trung Quốc sản xuất và được sử d ng

Việt Nam có tác d ng bảo hộ tốt chống lại virus cúm A/H5N1clade 7, với tỷ lệ

sống sót sau công cường độc là 100% (lô đối chứng chết 100%).

Đề nghị

- Tiếp t c tiến hành giám sát virus trên gia cầm và chim hoang dã Việt

Nam để giám sát khả năng dòng virus cúm A/H5N1 clade 7 cũng như các clade

khác có khả năng lây lan.

- Tiếp t c nghiên cứu về khả năng bảo hộ của các loại vacxin cúm gia cầm

khác hiện nay đang được sử d ng tại Việt Nam chống lại virus cúm clade này

khi mà virus này đã gây nên dịch tại Trung Quốc và yanmar, đặc biệt là Trung

Quốc đã sản xuất riêng một loại vacxin chế b ng virus cúm A H N1clade này.

- Tiếp t c nghiên cứu về di truyền các gen khác của virus cúm

A H N1clade , cũng như các clade khác để phát hiện và đánh giá khả năng tái

tổ hợp của các chủng virus cúm gia cầm có mặt Việt Nam.

122

T I LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

Bùi Quang Anh (200 ), áo cáo v d ch c gia cầm, Hội nghị kiểm kiểm soát dịch cúm gia cầm khu vực châu Á do FAO, OIE tổ chức, từ 23 – 2 tháng 2 năm 200 , thành phố Hồ Chí inh.

Ban chỉ đạo Quốc gia phòng chống bệnh cúm gia cầm (2005), Báo cáo tổng kết công tác 2 năm phòng chống dịch cúm gia cầm, Hội nghị tổng kết 2 năm phòng chống dịch cúm gà, ngày 18 tháng 4 năm 200 , Hà Nội.

Lê Trần Bình, Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Nguyễn Thị Bích Nga, Trương Nam Hải (2006) Phân tích mối tương đồng kháng nguyên và miễn dịch của virus cúm A, các chủng cường độc đương nhiễm và các chủng vaccine cúm A/H5N1 . Tạp chí Công nghệ Sinh học 4(3): 291-296.

Lê Trần Bình (200 ) Báo cáo tổng kết đề tài độc lập cấp nhà nước: “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm” (2006 - 2007). Trung tâm Thông tin và Tư liệu Quốc gia và Bộ Khoa học và Công nghệ, Hà Nội.

Trương Văn Dung, Nguyễn Viết Không (2004). ột số hoạt động nghiên cứu khoa học của Viện Thú y Quốc gia về bệnh Cúm gia cầm và giải pháp khoa học công nghệ trong thời gian tới, Khoa học kỹ thuật thú y, 11(3), tr62-68.

Nguyễn Tiến Dũng, alik Peiris, obert Webster, Đào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, Nguyễn Thế Vinh, Kent Inui, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Viết Không, Ngô Thanh Long (2004) Nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam năm 2003 - 2004. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y 11(3): 6-14.

Lê Thanh Hoà (2004), Họ Orthomyxoviridae và nhóm virus cúm A gây bệnh cúm trên

gà và người, Viện khoa học công nghệ.

Lê Thanh Hòa (2006a) Chiến lược nghiên cứu ứng d ng virus vector tái tổ hợp trong sản xuất vaccine thế hệ mới. Tạp chí Công nghệ Sinh học 4(4): 397-416. Tổng quan.

Lê Thanh Hòa (2006b) Y-sinh học phân tử (quyển 1). Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

Lê Thanh Hòa, Nguyễn Thị Bích Nga, Trần Quang Vui, Nguyễn Mạnh Kiên, Nguyễn Xuân Vũ, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình (2008) Phát hiện biến chủng virus cúm A/H5N1 dòng Phúc Kiến gây bệnh trên gia cầm người tại Việt Nam. Tập san Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ tư: Hóa sinh và Sinh học phân tử ph c v nông, sinh, y học và công nghiệp thực phẩm (Hà Nội, 16-17/10/2008).

Nguyễn Mạnh Kiên, Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Thanh Hòa (2008) Đặc điểm gen H5 của virus cúm A/H5N1 thuộc dưới dòng Phúc Kiến (Fujian) gây bệnh trên gia cầm và người tại Việt Nam phân lập năm 200 . Tạp chí Y-Dược học quân sự, 33(8), pp36- 41.

Lê Văn Năm (2004) Bệnh cúm gà. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y 11(1): 81-86.

Nguyễn Tiến Minh, Bạch Thị Như Quỳnh, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Bùi Hoàng Anh, Dương Hồng Quân, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Thị Thu Trang, Nguyễn Thanh Liêm, Nông Văn Hải, Lê Thanh Hoà, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình

123

(2004) Tách dòng và phân tích trình tự gen mã hóa hemagglutinin (HA) của virus cúm A (H N1) từ một bệnh nhân. Tạp chí Công nghệ Sinh học 2(3): 279-286.

Nguyễn Thị Lan Phương, Lê Văn Hiệp (2006) Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống cúm A/H5N1 cho người trên phôi gà từ chủng NIBRG-14 tại Viện vaccine và sinh phẩm y tế, Nha trang. Tạp chí Y học dự phòng (84): -10.

Bạch Thi Như Quỳnh (2006) Nghiên cứu tạo giống từ chủng gốc NIBRG - 14 để ph c v sản xuất vaccine cúm H N1. Luận văn Thạc sĩ sinh học, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật.

Tô Long Thành (2006), “Thông tin cập nhật về cúm gia cầm và vacxin phòng chống

bệnh cúm gia cầm”, Tạp chí khoa học kĩ thuật thú y, tr. 66 - 76.

Tô Long Thành (200 ), Các loại vacxin cúm gia cầm và đánh giá hiệu quả tiêm phòng,

Tạp chí khoa học kĩ thuật thú y,14(2), Tr.84 -91.

Nguyễn Thị Kim Tiến (2005) Dịch tễ học, virus học bệnh cúm A(H N1) trên người tại

khu vực phía Nam. Tạp chí Y học thực hành 1 (8): 46-49.

http://cucthuy.gov.vn: Trang web của C c Thú y. TIẾNG ANH

Alexander DJ (2007) An overview of the epidemiology of avian influenza. Vaccine

25(30): 5637-44. Review.

for Disease

Prevention.

Retrieved

Control

and

Aiki-Raji, C. O., Aguilar, P. V., Kwon, Y.-K., Goetz, S., Suarez, D. L., Jethra, A. I., Nash, O., et al. (2008). Phylogenetics and Pathogenesis of Early Avian Influenza Viruses (H5N1), Nigeria. Emerging Infectious Diseases, 14(11), 1753-1755. Centers from http://www.cdc.gov/eid/content/14/11/1753.htm

Antarasena, C., Sirimujalin, R., Prommuang, P., Blacksell, S.D., Promkuntod, N., Prommuang, P., 2006. Tissue tropism of a Thailand strain of high- pathogenicity avian influenza virus (H5N1) in tissues of naturally infected native chickens (Gallus gallus), Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) and ducks (Anas spp.). Avian Pathol. 35, 250–253.

Aoki FY, Boivin G, Roberts N (2007) Influenza virus susceptibility and resistance to

oseltamivir. Antivir Ther 12(4B): 603-616. Review.

Arinaminpathy N, McLean AR (2008) Antiviral treatment for the control of pandemic

influenza: some logistical constraints. J R Soc Interface 5(22): 545-553.

Baigent SJ, McCauley JW (2001) Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture. Virus Res 79(1-2): 177-185.

Basler CF (2007) Influenza viruses: basic biology and potential drug targets. Infect

Disord Drug Targets 7(4): 282-93. Review.

Bauer TT, Ewig S, odloff AC, üller EE (2006) Acute respiratory distress syndrome and pneumonia: a comprehensive review of clinical data. Clin Infect Dis 43(6): 748-756. Review.

124

Beard C.W. Avian Influenza. In Foreign Animal Diseases. Richmond, VA: United

States Animal Health Association, 1998; 71-80.

Bender C, Hall H, Huang J, Klimov A, Cox N, Hay A, Gregory V, Cameron K, Lim W and Subbarao K (1999) Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1) viruses isolated from humans in 1997 - 1998. Virology 254: 115-123.

Bosch FX, Garten W, Klenk HD, Rott R (1981) Proteolytic cleavage of influenza virus hemagglutinins; primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2 determines proteolytic cleavability and pathogenicity of avian influenza viruses. Virology 113: 725-735.

Capua, I., Marangon, S., Selli, L., Alexander, D.J., Swayne, D.E., Pozza, M.D., Parenti, E., Cancellotti, F.M., 1999. Outbreaks of highly pathogenic avian influenza (H5N2) in Italy during October 1997–January 1998.Avian Pathol. 28, 455–460.

Capua, I., Mutinelli,F.,Terregino, C., Cattoli, G.,Manvell, R.J., Burlini,F., 2000. Highly pathogenic avian influenza (H7N1) in ostriches farmed in Italy. Vet. Rec. 146 (12), 356.

Capua I, Alexander DJ (2008) Ecology, epidemiology and human health implications of avian influenza viruses: why do we need to share genetic data? Zoonoses Public Health 55(1): 2-15. Review

Castrucci MR, Kawaoka Y (1993) Biologic importance of neuraminidase stalk length in

influenza A virus. J Virol67: 759-764.

Cauthen AN, Swayne DE, Schultz-Cherry S, Perdue ML, Suarez DL (2000) Continued circulation in China of highly pathogenic avian influenza viruses encoding the hemagglutinin gene associated with the 1997 H5N1 outbreak in poultry and humans. J Virol 74: 6592-6599.

Chan KH, Lam SY, Puthavathana P, Nguyen TD, Long HT, Pang CM, Chan KM, Cheung CY, Seto WH, Peiris JS (2007) Comparative analytical sensitivities of six rapid influenza A antigen detection test kits for detection of influenza A subtypes H1N1, H3N2 and H5N1. J Clin Virol 38(2): 169-171.

Chen, H., G. Deng, Z. Li, G. Tian, Y. Li, P. Jiao, L. Zhang, Z. Liu, R. G. Webster, and K. Yu. 2004. The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:10452–10457.

Chen, H., Smith, G.J., Li, K.S.,Wang, J., Fan, X.H., Rayner, J.M., Vijaykrishna, D., Zhang, J.X., Zhang, L.J., Guo, C.T., Cheung, C.L., Xu, K.M., Duan, L., Huang, K., Qin, K., Leung, Y.H., Wu,W.L., Lu, H.R., Chen, Y., Xia, N.S., Naipospos, T.S., Yuen, K.Y., Hassan, S.S., Bahri, S., Nguyen, T.D., Webster, R.G., Peiris, J.S., Guan, Y., 2006. Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic control. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 2845–2850.

Chen LM, Davis CT, Zhou H, Cox NJ, Donis RO (2008) Genetic compatibility and virulence of reassortants derived from contemporary avian H5N1 and human H3N2 influenza A viruses. PLoS Pathog 4(5): e1000072.

Chen.H., 2009. Avian influenza vaccination : the experience in China Vaccines developed in China Inactivated vaccines. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 2009, 28 (1), 267-274

125

Claas EC, Osterhaus AD, van Beek R, De Jong JC, Rimmelzwaan GF, Senne DA, Krauss S, Shortridge KF, Webster RG (1998) Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus. Lancet 351:472-477

Cooley, A. J., H. Van Campen, M. S. Philpott, B. C. Easterday, and V. S. Hinshaw. 1989. Pathological lesions in the lungs of ducks infected with influenza A viruses. Vet. Pathol. 26:1–5.

Conenello GM, Zamarin D, Perrone LA, Tumpey T, Palese P (2007) A single mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence. PLoS Pathog 3(10): 1414-1421.

De Jong MD, Hien TT (2006) Avian influenza A (H5N1). J Clin Virol 35(1): 2-13.

Review.

De Wit E, Fouchier RA (2008) Emerging influenza. J Clin Virol 41(1): 1-6. Review.

Dinh PN, Long HT, Tien NT, Hien NT, Mai Le TQ, Phong Le H, Tuan le V, Van Tan H, Nguyen NB, Van Tu P, Phuong NT; World Health Organization/Global Outbreak Alert and Response Network Avian Influenza Investigation Team in Vietnam (2006) Risk factors for human infection with avian influenza A H5N1, Vietnam, 2004. Emerg Infect Dis 12(12): 1841-1847.

Doherty PC, Turner SJ, Webby RG, Thomas PG (2006) Influenza and the challenge for

immunology. Nat Immunol 7(5): 449-55. Review.

Ducatez, M.F., Olinger, C.M., Owoade, A.A., Tarnagda, Z., Tahita, M.C., Sow, A., De Landtsheer, S., Ammerlaan, W., Ouedraogo, J.B., Osterhaus, A.D., Fouchier, R.A., Muller, C.P., 2007. Molecular and antigenic evolution and geographical spread of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses in western Africa. J. Gen. Virol. 88, 2297–2306.

Dung Nguyen T, Vinh Nguyen T, Vijaykrishna D, Webster RG, Guan Y, MalikPeiris JS, Smith GJ (2008)Multiple sublineages of influenza A virus (H5N1), Vietnam, 2005-2007.Emerg Infect Dis 14(4): 632-636.

Easterday, B.C., Hinshaw, V.S., Halvorson, D.A., 199 . Inﬂuenza. In: Calnek, B.W. (Ed.), Diseases of Poultry.10th ed. Iowa State University Press, Ames, Iowa, pp. 583–605.

Food and Agricultural Organization, 2008a. New avian influenza flare-ups. FAO,

Geneva. http://www.fao.org/newsroom/en/news/2008/1000775/index.html.

Food and Agricultural Organization, 2008b. Viet Nam needs long-term vaccination

programme against bird flu. FAO, Geneva.

Gambotto A, Barratt-Boyes SM, de Jong MD, Neumann G, Kawaoka Y (2008)Human infection with highly pathogenic H5N1 influenza virus.Lancet 371(9622): 1464- 1475. Review.

Gao W, Soloff AC, Lu X, Montecalvo A, Nguyen DC, Matsuoka Y, Robbins PD, Swayne DE, Donis RO, Katz JM, Barratt-Boyes SM, Gambotto A (2006) Protection of mice and poultry from lethal H5N1 avian influenza virus through adenovirus-based immunization. J Virol 80(4): 1959-1964.

126

Guan Y, Peiris JS, Lipatov AS, Ellis TM, Dyrting KC, Krauss S (2002) Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR. Proc Natl Acad Sci USA 99: 8950-8955.

Guan Y, Poon LL, Cheung CY, Ellis TM, Lim W, Lipatov AS (2004) H5N1 influenza:

a protean pandemic threat. Proc Natl Acad Sci USA 101: 8156-8161.

Ge J, Deng G, Wen Z, Tian G, Wang Y, Shi J (2007) Newcastle disease virus-based live attenuated vaccine completely protects chickens and mice from lethal challenge of homologous and heterologous H5N1 avian influenza viruses. J Virol 81(1): 150- 158.

Guionie O, Guillou-Cloarec C, Courtois D, Bougeard BS, Amelot M, Jestin V. 2010. Experimental infection of Muscovy ducks with highly pathogenic avian influenza virus (H5N1) belonging to clade 2.2. Avian Dis. 2010 Mar;54(1 Suppl):538-47.

Hatta M, Hatta Y, Kim JH, Watanabe S, Shinya K, Nguyen T, Lien PS, Le QM, Kawaoka Y (2007) Growth of H5N1 influenza A viruses in the upper respiratory tracts of mice. PLoS Pathog 3(10): 1374-1379.

Hilleman M (2002) Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis,

epidemiology and control. Vaccine 20(25-26): 3068-3087.

Hoelscher MA, Garg S, Bangari DS, Belser JA, Lu X, Stephenson I, Bright RA, Katz JM, Mittal SK, Sambhara S (2006) Development of adenoviral-vector-based pandemic influenza vaccine against antigenically distinct human H5N1 strains in mice. Lancet 367(9509): 475-481.

Horimoto, T. & Kawaoka, Y. Reverse genetics provides direct evidence for a correlation of hemagglutinin cleavability and virulence of an avian influenza A virus. J. Virol. 68, 3120–3128 (1994).

Horimoto T, Kawaoka Y (2001) Pandemic threat posed by avian influenza A viruses.

Clin Microbiol Rev 14(1): 129-149.

Horimoto T, Kawaoka Y (2006) Strategies for developing vaccines against H5N1

influenza A viruses. Trends Mol Med 12(11): 506-514. Review.

http://www.fao.org/avianflu/news/ vietnam_230608.html.

Hui DS (2008) Review of clinical symptoms and spectrum in humans with influenza

A/H5N1 infection. Respirology 13 Suppl 1: S10-3. Review.

Hulse-Post, D. J., K. M. Sturm-Ramirez, J. Humberd, P. Seiler, E. A. Gov- orkova, S. Krauss, C. Scholtissek, P. Puthavathana, C. Buranathai, T. D. Nguyen, H. T. Long, T. S. P. Naipospos, H. Chen, T. M. Ellis, Y. Guan, J. S. M. Peiris, and R. G. Webster. 2005. Role of domestic ducks in the propagation and biological evolution of highly pathogenic H5N1 influenza viruses in Asia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:10682–10687.

Ito T, Couceiro JN, Kelm S, Baum LG, Krauss S, Castrucci MR, Donatelli I, Kida H, Paulson JC, Webster RG and Kawaoka Y (1998) Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential. J Virol 72: 7367-7373.

Jiang WM, Liu S, Chen J, Hou GY, Li JP, Cao YF, Zhuang QY, Li Y, Huang BX, Chen JM. 2010. Molecular epidemiological surveys of H5 subtype highly pathogenic

127

avian influenza viruses in poultry in China during 2007-2009. J Gen Virol. 2010 Oct;91(Pt 10):2491-6.

Kash JC, Goodman AG, Korth MJ, Katze MG (2006) Hijacking of the host-cell response and translational control during influenza virus infection. Virus Res 119(1): 111-120. Review.

Keawcharoen J, Amonsin A, Oraveerakul K, Wattanodorn S, Papravasit T, Karnda S, Lekakul K, Pattanarangsan R, Noppornpanth S, Fouchier RA, Osterhaus AD, Payungporn S, Theamboonlers A and Poovorawan Y (2005) Characterization of the hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different avian species in Thailand. Acta Virol 49(4):

Keawcharoen, J., van Riel, D., van Amerongen, G., Bestebroer, T., Beyer, W.E., van Lavieren, R., et al. (2008). Wild ducks as long- distance vectors of highly pathogenic avian influenza virus (H5N1). Emerging Infectious Diseases, 14, 600

607.

Kilbourne ED. 2006. Influenza Pandemics of the 20th Century. Emerging Infectious

Diseases • www.cdc.gov eid • Vol. 12, No. 1, January 2006.

Kilpatrick, A.M., Chmura, A.A., Gibbons, D.W., Fleischer, R.C., Marra, P.P., Daszak, P., 2006. Predicting the global spread of H5N1 avian influenza. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 19368–19373.

Kim JK, Seiler P, Forrest HL, Khalenkov AM, Franks J, Kumar M, Karesh WB, Gilbert M, Sodnomdarjaa R, Douangngeun B, Govorkova EA, Webster RG. 2008. Pathogenicity and vaccine efficacy of different clades of Asian H5N1 avian influenza A viruses in domestic ducks. J Virol. 2008 Nov;82(22):11374-82. Epub 2008 Sep 10.

Kishida, N., Sakoda,Y., Isoda, N., Matsuda, K., Eto, M., Sunaga,Y., Umemura, T., Kida, H., 2005. Pathogenicity of H5 influenza viruses for ducks. Arch. Virol. 150 (7), 1383–1392.

Kodihalli S, Goto H, Kobasa DL, Krauss S, Kawaoka Y and Webster RG (1999) DNA vaccine encoding hemagglutinin provides protective immunity against H5N1 influenza virus infection in mice. J Virol 73: 2094-2098.

Korteweg C, Gu J (2008) Pathology, molecular biology, and pathogenesis of avian influenza A (H5N1) infection in humans. Am J Pathol 172(5): 1155-1170. Review.

Kwon, Y.-K.S.-J.J., Kim, M.-C., Sung, H.-W., Lee, Y.-J., Choi, J.-G., Lee, E.- K., Kim, J.-H., 2005. Highly pathogenic avian influenza (H5N1) in the commercial domestic ducks of South Korea. Avian Pathol. 34, 367–370.

Kwon, Y K, Thomas, C, Swayne, D E. 2010. Variability in Pathobiology of South Korean H5N1 High-Pathogenicity Avian Influenza Virus Infection for 5 Species of Migratory Waterfowl. Veterinary pathology. 47: 495-506.

Le Thanh Hoa, Dinh Duy Khang, Phan Van Chi, Nong Van Hai, Truong Nam Hai, Nguyen Thi Bich Nga and Le Tran Binh (2006) Molecular characterization of the H5 gene for the highly pathogenic A/H5N1 strains isolated in Vietnam during 2004 - 2006 (pp68-71). Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture (20.10.2006). Nong Lam University Ho Chi Minh City.

128

Lee, C.W., Suarez, D.L., Tumpey, T.M., Sung, H.W., Kwon, Y.K., Lee, Y.J., Choi, J.G., Joh, S.J., Kim, M.C., Lee, E.K., Park, J.M., Lu, X., Katz, J.M., Spackman, E., Swayne, D.E., Kim, J.H., 2005. Characterization of highly pathogenic H5N1 avian influenza A viruses isolated from South Korea. J. Virol. 79 (6), 3692–3702.

Lee, M.S., Deng, M.C., Lin, Y.J., Chang, C.Y., Shieh, H.K., Shiau, J.Z., Huang, C.C., 2007. Characterization of an H5N1 avian influenza virus from Taiwan. Vet. Microbiol. 124, 193–201.

Li KS, Guan Y, Wang J, Smith GJ, Xu KM, Duan L (16 others) (2004) Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature 430: 209-213.

Li, Y., Lin, Z., Shi, J., Qi, Q., Deng, G., Li, Z., Wang, X., Tian, G. Chen, H, 2006. Detection of Hong Kong 97-like H5N1 influenza viruses from eggs of Vietnamese waterfowl. Arch. Virol.

Liu M, Wood JM, Ellis T, Krauss S, Seiler P, Johnson C, Hoffmann E, Humberd J, Hulse D, Zhang Y, Webster RG, Perez DR (2003) Preparation of a standardized, efficacious agricultural H5N3 vaccine by reverse genetics. Virology 314(2): 580- 590.

Lu X, Edwards LE, Desheva JA, Nguyen DC, Rekstin A, Stephenson I, Szretter K, Cox NJ, Rudenko LG, Klimov A, Katz JM (2006) Cross-protective immunity in mice induced by live-attenuated or inactivated vaccines against highly pathogenic influenza A (H5N1) viruses. Vaccine 24(44-46): 6588-6593.

Luong G, Palese P (1992) Genetic analysis of influenza virus. Curr Opinion Gen

Develop 2: 77-81.

Macken CA, Webby RJ, Bruno WJ (2006) Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus. J Gen Virol 87(10): 2803- 2815.

Mase, M., Eto, M., Tanimura, N., Imai, K., Tsukamoto, K., Horimoto, T., Kawaoka, Y., Yamaguchi, S., 2005. Isolation of a genotypically unique H5N1 influenza virus from duck meat imported into Japan from China. Virology 1339, 101–109.

Matrosovich M, Zhou N, Kawaoka Y, Webster R (1999) The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties. J Virol 73: 1146-1155.

Muramoto Y, Le TQ, Phuong LS, Nguyen T, Nguyen TH, Sakai-Tagawa Y, Horimoto T, Kida H, Kawaoka Y (2006) Pathogenicity of H5N1 influenza A viruses isolated in Vietnam between late 2003 and 2005. J Vet Med Sci 68(7): 735-737.

Murphy B.R and Webster (1996), Orthomyxoviruses, In Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M, (eds.), Fields Virology, 3rd ed, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, pp. 1397-1445.

Nakatani, H., Nakamura, K., Yamamoto, Y., Yamada, M. & Yama- moto, Y. (2005). Epidemiology, pathology, and immunohistochem- istry of layer hens naturally infected with H5N1 highly pathogenic avian influenza in Japan. Avian Diseases, 49,436

441.

129

Nayak D, Hui E, Barman S (2004) Assembly and budding of influenza virus. Virus Res

106(2): 147-165

Nguyen, D.C., Uyeki, T.M., Jadhao, S., Maines, T., Shaw, M., Matsuoka, Y., Smith, C., Rowe, T., Lu, X., Hall, H., Xu, X., Balish, A., Klimov, A., Tumpey, T.M., Swayne, D.E., Huynh, L.P., Nghiem, H.K., Nguyen, H.H., Hoang, L.T., Cox, N.J., Katz, J.M., 2005. Isolation and characterization of avian influenza viruses, including highly pathogenic H5N1, from poultry in live bird markets in Hanoi, Vietnam, in 2001. J. Virol. 79, 4201–4212.

Nguyen, T.D., Nguyen, T.V., Vijaykrishna, D.,Webster, R.G., Guan, Y., Peiris, M.J.S., Smith, G.J., 2008. Multiple sublineages of influenza A virus (H5N1), Vietnam, 2005–2007. Emerg. Infect. Dis. 14, 632–636.

Nicholson KG, Wood JM, Zambon M (2003) Influenza. Lancet 362(93970: 1733-1745.

Office Internation des epizooties (OIE), (1992), Manual of standards for Diagnostic Tests and vaccine, Second Edition, Paris, France.28. Scafer, W.1995, Vergleichende sero-immunolodische Untersuchun-gen uber die viren der influenza and klassichen Gefluegelpest Z Naturforsch 10b:81-91.

OIE - World organisation for animal health (2005) Avian influenza. Manual of (http://www.oie.int/

terrestrial animals,

for

test and vaccines

diagnostic Eng/info_ev/en_AI_avianinfluenza.htm)

Ok-Mi Jeong, Min-Chul Kim, Min-Jeong Kim, Hyun-Mi Kang, Hye-Ryoung Kim, Yong-Joo Kim, Seong-Joon Joh, Jun-Hun Kwon, Youn-Jeong Lee. 2009. Experimental infection of chickens, ducks and quails with the highly pathogenic H5N1 avian influenza virus. J. Vet. Sci. (2009), 10(1), 53-60.

Pantin-Jackwood, M. J., and D. E. Swayne. 2007. Pathobiology of Asian highly pathogenic avian influenza H5N1 virus infections in ducks. Avian Dis. 51:250–259

Peiris JS, Yu WC, Leung CW, Cheung CY, Ng WF, Nicholls JM (2004) Re-emergence

of fatal human influenza A subtype H5N1 disease. Lancet 363: 617-619.

Perkins, L. E., and D. E. Swayne. 2002. Pathogenicity of a Hong Kong-origin H5N1 highly pathogenic avian influenza virus for emus, geese, ducks, and pigeons. Avian Dis. 46:53–63.

Peyre M, Fusheng G, Desvaux S, Roger F (2008) Avian influenza vaccines: a practical review in relation to their application in the field with a focus on the Asian experience. Epidemiol Infect 14: 1-21.

Pfeiffer, D.U., et al. Implications of global and regional patterns of highly pathogenic avian influenza virus cúm A/H5N1clades for risk management. The Veterinary Journal (2011), doi:10.1016/j.tvjl.2010.12.022

Pfeiffer, J., Pantin-Jackwood, M., To, T. L., Nguyen, T., & Suarez, D. L. (2009). Phylogenetic and biological characterization of highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses (Vietnam 2005) in chickens and ducks. Virus research, 142(1-2), 108-20. doi:10.1016/j.virusres.2009.01.019.

Pfeiffer J, Suarez DL, Sarmento L, To TL, Nguyen T, Pantin-Jackwood MJ. 2010. Efficacy of commercial vaccines in protecting chickens and ducks against H5N1

130

highly pathogenic avian influenza viruses from Vietnam. Avian Dis. 2010 Mar;54(1 Suppl):262-71.

Prel A, Le Gall- eculé G, Jestin V (2008) Achievement of avian influenza virus-like particles that could be used as a subunit vaccine against low-pathogenic avian influenza strains in ducks. Avian Pathol 37(5): 513-520.

Qiao C, Tian G, Jiang Y, Li Y, Shi J, Yu K, Chen H (2006) Vaccines developed for H5 highly pathogenic avian influenza in China. Ann N Y Acad Sci 1081: 182-192

Rabadan R, Levine AJ, Robins H (2006) Comparison of avian and human influenza A viruses reveals a mutational bias on the viral genomes. J Virol 80(23): 11887- 11891.

ömer-Oberdörfer A, Veits J, Helferich D, ettenleiter TC (2008)Level of protection of chickens against highly pathogenic H5 avian influenza virus with Newcastle disease virus based live attenuated vector vaccine depends on homology of H5 sequence between vaccine and challenge virus. Vaccine 26(19): 2307-2313.

Salzberg SL (2007) Genome Analysis Linking Recent European and African Influenza

(H5N1) Viruses. Emerg Infect Dis 13(5).

Scholtissek C, Stech J, Krauss S, Webster RG (2002).

Sekellick MJ, Carra SA, Bowman A, Hopkins DA, Marcus PI (2000) Transient resistance of influenza virus to interferon action attributed to random multiple packaging and activity of NS genes. J Interferon Cytokine Res 20(11): 963-970.

Shinya, K., Hatta, M., Yamada, S., Takada, A., Watanabe, S., Halfmann, P., Horimoto, T., Neumann, G., Kim, J.H., Lim,W., Guan, Y., Peiris, M., Kiso, M., Suzuki, T., Suzuki, Y., Kawaoka, Y., 2005. Characterization of a human H5N1 influenza A virus isolated in 2003. J. Virol. 79 (15), 9926–9932.

Sims LD, Domenech J, Benigno C, Kahn S, Kamata A, Lubroth J, Martin V, Roeder P (2005) Origin and evolution of highly pathogenic H5N1 avian influenza in Asia. Vet Rec 157(6): 159-164. Review.

Simmons CP, Bernasconi NL, Suguitan AL, Mills K, Ward JM, Chau NV, Hien TT, Sallusto F, Ha Do Q, Farrar J, de Jong MD, Lanzavecchia A, Subbarao K (2007) Prophylactic and therapeutic efficacy of human monoclonal antibodies against H5N1 influenza. PLoS Med 4(5): e178.

Smith, G.J., Naipospos, T.S., Nguyen, T.D., de Jong, M.D., Vijaykrishna, D., Usman, T.B., Hassan, S.S., Nguyen, T.V., Dao, T.V., Bui, N.A., Leung, Y.H., Cheung, C.L., Rayner, J.M., Zhang, J.X., Zhang, L.J., Poon, L.L., Li, K.S., Nguyen, V.C., Hien, T.T., Farrar, J., Webster, R.G., Chen, H., Peiris, J.S., Guan, Y., 2006. Evolution and adaptation of H5N1 influenza virus in avian and human hosts in Indonesia and Vietnam. Virology 350, 258–268.

Songserm, T., Jam-On, R., Sae-Heng, N., Meemak, N., Hulse-Post, D.J., Sturm- Ramirez, K.M.,Webster, R.G., 2006. Domestic ducks and H5N1 influenza epidemic, Thailand. Emerg. Infect. Dis. 12 (4), 575–581.

Steensels, M., Van Borm, S., Boschmans, M., van den Berg, T., 2007. Lethality and molecular characterization of an HPAI H5N1 virus isolated from eagles smuggled from Thailand into Europe. Avian Dis. 51, 401–407.

131

Stubb, E.L 1965 fowl plague. In H.E. Biester, and L.H. Schwarte (eds), Disease of

Poultry 5th ed. Iowa State Univeristy Press, Ames, pp. 813-822.

Sturm-Ramirez, K.M., Ellis, T., Bousfield, B., Bissett, L., Dyrting, K., Rehg, J.E., Poon, L., Guan,Y., Peiris, M.,Webster, R.G., 2004. Reemerging H5N1 influenza viruses in Hong Kong in 2002 are highly pathogenic to ducks. J. Virol. 78 (9), 4892–4901.

Sturm-Ramirez, K.M., Hulse-Post, D.J., Govorkova, E.A., Humberd, J., Seiler, P., Puthavathana, P., Buranathai, C., Nguyen, T.D., Chaisingh, A., Long, H.T., Naipospos, T.S., Chen, H., Ellis, T.M., Guan, Y., Peiris, J.S.,Webster, R.G., 2005. Are ducks contributing to the endemicity of highly pathogenic H5N1 influenza virus in Asia? J. Virol. 79 (17), 11269–11279.

Suarez DL, Schultz-Cherry S (2000) Immunology of avian influenza virus: a review.

Dev Comp Immunol 24(2-3): 269-283. Review.

Subbarao K, Joseph T. Scientific Barriers to Developing Vaccines Against Avian

Influenza Viruses. Nature Reviews Immunology. 7:267-278.

Subbarao K, Klimov A, Katz J, Regnery H, Lim W, Hall H (1998) Characterization of an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness. Science 279: 393-396.

Subbarao K, Luke C (2007) H5N1 viruses and vaccines. PLoS Pathog 3(3): e40.

Review

Subbarao, K., & Joseph, T. (2007). Scientific barriers to developing vaccines against

avian influenza viruses. Nature Reviews Immunology, 7(4), 267-278.

Suzuki Y (2005) Sialobiology of influenza: molecular mechanism of host range

variation of influenza viruses. Biol Pharm Bull 28(3): 399-408. Review.

Swayne D.E., beck j.r., garcia M. Stone HD. (1999), Influenza of virus strain and

antigen mass on the efficacy of H5 avian influenza inactivated vaccine.

Swayne, D.E., Halvorson, D.A., 2003. Influenza. In: Saif, Y.M., Barnes, H.J., Fadly, A.M., Glisson, J.R., McDougald, L.R.,Swayne, D.E. (Eds.), Diseases of Poultry, 11th ed. Iowa State Press, Ames, IA, pp. 135–160.

Swayne, D.E., Pantin-Jackwood, M.J., 2006. Pathogenicity of avian influenza viruses in

poultry. Dev. Biol. (Basel) 124, 61–67.

Swayne DE, Suarez DL (2000) Highly pathogenic avian influenza. Rev Sci Tech Off Int

Epiz 20: 463-482.

Tian G, Zhang S, Li Y, Bu Z, Liu P, Zhou J, Li C, Shi J, Yu K, Chen H (2005) Protective efficacy in chickens, geese and ducks of an H5N1-inactivated vaccine developed by reverse genetics. Virology 341(1): 153-162.

Tumpey, T.M., Suarez, D.L., Perkins, L.E., Senne, D.A., Lee, J.G., Lee, Y.J., Mo, I.P., Sung, H.W., Swayne, D.E., 2002. Characterization of a highly pathogenic H5N1 avian influenza A virus isolated from duck meat. J. Virol. 76, 6344–6355.

Tung Nguyen, CT Davis, A Balish , P Rivailler, R Loughlin, B Shu, J Jones, I Perry, BK Kapella, J Kile A Klimov, RO. Donis (2010). Molecular epidemiology of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses in Vietnamese poultry, 2008-2009. Poster presentation. Option VII meeting in Hongkong, 2010.

132

Uiprasertkul M, Kitphati R, Puthavathana P, Kriwong R, Kongchanagul A, Ungchusak K, Angkasekwinai S, Chokephaibulkit K, Srisook K, Vanprapar N, Auewarakul P (2007) Apoptosis and pathogenesis of avian influenza A (H5N1) virus in humans. Emerg Infect Dis 13(5): 708-712.

Wagner R, Matrosovich M, Klenk H

(2002) Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections. Med Virol 12(3): 159-166.

Wahlgren John. Infection Ecology and Epidemiology 2011, 1: 6004 - DOI:

10.3402/iee.v1i0.6004

Wallace, R.G., Hodac, H., Lathrop, R.H., Fitch,W.M., 2007. A statistical phylogeography of influenza A H5N1. Proc. Natl. Acad. Sci. 104, 4473–4478.

Wan, X.-F., Nguyen, T., Davis, C.T., Smith, C.B., Zhao, Z.-M., Carrel, M., Inui, K., Do, H.T., Mai, D.T., Jadhao, S., Balish, A., Shu, B., Luo, F., Emch, M., Matsuoka, Y., Lindstrom, S.E., Cox, N.J., Nguyen, C.V., Klimov, A., Donis, R.O., 2008. Evolution of highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses in Vietnam between 2001 and 2007. PLoS ONE 3, e3462.

Wang, J., Vijaykrishna, D., Duan, L., Bahl, J., Zhang, J.X., Webster, R.G., Peiris, J.S., Chen, H., Smith, G.J., Guan, Y., 2008a. Identification of the progenitors of Indonesian and Vietnamese avian influenza A (H5N1) viruses fromsouthern China. J.Virol. 82, 3405–3414.

Wang, G., Zhan, D., Li, L., Lei, F., Liu, B., Liu, D., Xiao, H., Feng, Y., Li, J., Yang, B., Yin, Z., Song, X., Zhu, X., Cong, Y., Pu, J., Wang, J., Liu, J., Gao, G.F., Zhu, Q., 2008b. H5N1 avian influenza re-emergence of Lake Qinghai: phylogenetic and antigenic analyses of the newly isolated viruses and roles of migratory birds in virus circulation. J. Gen. Virol. 89, 697–702.

Wasilenko JL, Lee CW, Sarmento L, Spackman E, Kapczynski DR, Suarez DL, Pantin- Jackwood MJ (2008) NP, PB1, and PB2 viral genes contribute to altered replication of H5N1 avian influenza viruses in chickens. J Virol 82(9): 4544-4553.

Wanasawaeng, Wisanu,

Bunpapong,

Napawan,

Leelamanit, Wichet, Thanawongnuwech, Roongroje.2009. Growth Characteristics of the H5N1 Avian Influenza Virus in Chicken Embryonic Eggs and MDCK Cells. Thai J. Vet. Med., 2009. 39(3): 281-286

Webster RG (1998) Influenza: an emerging disease. Emerg Infect Dis 4: 436-441.

Webster RG, Guan Y, Peiris M, Walker D, Krauss S, Zhou NN, Govorkova EA, Ellis TM, Dyrting KC, Sit T, Perez DR, Shortridge KF (2002) Characterization of H5N1 influenza viruses that continue to circulate in geese in southeastern China. J Virol 76(1): 118-126.

Weiss RA (2003) Cross-species infections. Curr Top Microbiol Immunol 278: 47-71.

World Health Organization/World Organisation for Animal Health/Food and Agriculture Organization H5N1 Evolution Working Group, 2008. Toward a unified nomenclature system for highly pathogenic avian influenza virus (H5N1). Emerg. Infect. Dis. 14 http://www.cdc.gov/EID/content/14/7/e1.html.

WHO:http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/avian_influenza/en/

133

WHO:http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/H5N1_avian-influenza-

update200412.pdf

Wu WL, Chen Y, Wang P, Song W, Lau SY, Rayner JM, Smith GJ, Webster RG, Peiris JS, Lin T, Xia N, Guan Y, Chen H (2008b) Antigenic profile of avian H5N1 viruses in Asia from 2002 to 2007. J Virol 82(4): 1798-17807.

Xu X, Subbarao K, Cox NJ, Guo Y (1999) Genetic characterization of the pathogenic influenza A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) virus: similarity of its hemagglutinin gene to those of H5N1 viruses from the 1997 outbreaks in Hong Kong. Virology 261: 15-19.

Yamada S, Suzuki Y, Suzuki T, Le MQ, Nidom CA, Sakai-Tagawa Y, Muramoto Y, Ito M, Kiso M, Horimoto T, Shinya K, Sawada T, Kiso M, Usui T, Murata T, Lin Y, Hay A, Haire LF, Stevens DJ, Russell RJ, Gamblin SJ, Skehel JJ, Kawaoka Y (2006) Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses to human-type receptors. Nature 444(7117): 378-382.

Zhao ZM, Shortridge KF, Garcia M, Guan Y, Wan XF (2008) Genotypic diversity of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses. J Gen Virol 89(9): 2182-2193.

Zhou, J.Y., Shen, H.G., Chen, H.X., Tong, G.Z., Liao, M., Yang, H.C., Liu, J.X., 2006. Characterization of a highly pathogenic H5N1 influenza virus derived from bar- headed geese in China. J. Gen. Virol. 87 (Pt 7), 1823– 1833.

Zhou JJ, Fu J, Fang DY, Yan HJ, Tian J, Zhou JM, Tao JP, Liang Y, Jiang LF (2007) Molecular characterization of the surface glycoprotein genes of an H5N1 influenza virus isolated from a human in Guangdong, China. Arch Virol 152(8): 1515-1521.

Zhu Q, Yang H, Chen W, Cao W, Zhong G, Jiao P, Deng G, Yu K, Yang C, Bu Z, Kawaoka Y, Chen H (2008) A naturally occurring deletion in its NS gene contributes to the attenuation of an H5N1 swine influenza virus in chickens. J Virol 82(1):220-228.

134

CÁC CÔNG TR NH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Nguyễn Tùng, Đỗ Thị Hoa, Ngô Thị Thu Hương, Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn

Bá Hiên (2011), “Xác định một số đặc tính sinh học của virus cúm gia

cầm độc lực cao H N1 nhánh phân lập Việt Nam”, T p chí Khoa học

Kỹ thuật Th y số 2-2011. Tr5-11.

2. Nguyễn Tùng, Nguyễn Hoàng Đăng, Ngô Thị Thu Hương, Đỗ Thị Hoa,

Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Bá Hiên (2011), “Độc lực của virus cúm gia

cầm độc lực cao H N1 nhánh trên gia cầm”, T p chí Khoa học Kỹ thuật

Th y số 3-2011. Tr5-10.

3. Tung Nguyen, Pierre Rivailler, C. Todd Davis, Do Thi Hoa, Amanda Balish ,

Nguyen Hoang Dang, Joyce Jones, Dam Thi Vui, Natosha Simpson, Ngo

Thu Huong, Bo Shu, Rosette Loughlin, Karen Ferdinand, Stephen E.

Lindstrom, Ian A. York, Alexander Klimov, Ruben O. Donis (2012),

“Evolution of highly pathogenic avian influenza (H5N1) virus populations

in Vietnam between 200 and 2010”, Virology 432 (2012) 405–416.

4. Tung Nguyen, CT Davis, A Balish , P Rivailler, R Loughlin, B Shu, J Jones,

I Perry, BK Kapella, J Kile A Klimov, RO. Donis (2010). Molecular

epidemiology of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses in

Vietnamese poultry, 2008-2009. Poster presentation. Option VII meeting

in Hongkong, 2010.

135

PHỤ LỤC

1) T ình tự gen HA củ c c i c A/H5N1HA clade 7

10 20 30 40 50 60 70 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGCAATGATCGGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACC A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 .............................A.............G.......................... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 .............................A...A.C.................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 .............................A...A.C.................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 .............................A..............................G......... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ .............................A........................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ........................A....A..............C...............G......... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ .............................A........................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ .............................A...............G..............G......... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ .............................A...............G..............G......... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ .............................A........................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ .............................A........................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ .............................A........................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ .............................A........................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ .............................A........................................ 80 90 100 110 120 130 140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 ATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACATGCTCAAGA A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ...............................................A...................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ...................................................................... 150 160 170 180 190 200 210 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 CATACTGGAGAAGACACACAACGGGAAGCTCTGCAACCTAGATGGGGTGAAGCCTCTAATTTTGAAAGAC A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 .............................................A...............C.A...... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 .............................................A...............C.A...... A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 .............................................A...............C.A...... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ........................................A....A.......................T A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ .............................................A...............C.A...... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ........................................A....A.......................T A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ .............................................A...............C.A...... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ........................................A....A.......................T A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ........................................A....A.......................T A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ .....................................T..A....A.......................T A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ .............................................A...............C.A...... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ...........G.................................A...............C.A...... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ .............................................A...............C.A...... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ .............................................A...............C.A...... 220 230 240 250 260 270 280 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 TGTAGTGTAGCTGGATGGCTCCTCGGGAACCCAATGTGTGACGAATTTCTCAATGTGTCAGAATGGTCTT A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ..........................A........................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ..........................A........................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ..........................A........................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ..........................A........................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ ..........................A........................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ...................................................................... 290 300 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 ACATAGTGGAGAAGGCCAGTCCAGCCAATGGCCTCTGTTACCCAGGGGATTTCAATGACTATGAAGAACT A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 ......................................................................

136

A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ..........................................................T........... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ...............................................A..........T........... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ..........................................................T........... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ..........................................................T........... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ...................................................................... 360 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 GAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATCTTAAGAAAATTAAGATCATCCCCAAAAGTTATTGGTCCAAT A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 ............A.A........CA............................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 ............A.A........CA............................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 ............A.A........CA............................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ............................T..G...................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ ............A.A........CA............................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ............................T..G...................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ............A.A........CA............................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ............................T..G...................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ............................T..G...................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ............A.A........CA............................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ............A.A........CA............................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ............A.A........CA............................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ............A.A........CA............................................. 430 440 450 460 470 480 490 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 CATGAAGCCTCATCAGGGGTGAGCGCAGCATGTTCCTATCTGGGAGAGCCCTCCTTTTTCAGAAATGTGG A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 ............................................G......................... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 .......................................A....G......................... A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 ............................................G......................... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ......A......T..........T..................AGA.T.....T..............A. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ .......................................A....G......................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ......A......T..........T..................AGA.T.....T..............A. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ............................................G......................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ......A......T..........T..................AGA.T.....T..............A. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ......A......T..........T..................AGA.T.....T..............A. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ ............................................G........T................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ............................................G......................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ............................................G......................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ............................................G......................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ............................................G......................... 500 510 520 530 540 550 560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 TATGGCTTATCAAAAAGAATAATACATACCCACCAATAAAGGTGAACTACACCAATACCAACCAAGAAGA A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 .............................................................T........ A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 .............................................................T........ A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 .............................................................T........ A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 .........C.........C....................................G........A.... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ .............................................................T........ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ .........C..............................................G........A.... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ .............................................................T........ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ .........C..............................................G........A.... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ .........C..............................................G........A.... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ .........C...................................................T........ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ .............................................................T........ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ .............................................................T........ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ .............................................................T........ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ .............................................................T........ 570 580 590 600 610 620 630 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 TCTTTTGGTACTGTGGGGGATTCACCATCCCAATGATGAGAAAGAGCAGATAAGGATCTATCAAAACCCA A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 ..................................A.....GC..........CA..............T. A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 ..................................A.....GC..........CA..............T. A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 ..................................A.....GC..........CA..............T. A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ..................A...............A.....GC........A..T..............T. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ ..................................A.....GC..........CA..............T. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ..................A...............A.....GC...........T..............T. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ..................................A.....GC..........CA..............T. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ..................A...............A.....GC...........T..............T. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ..................A...............A.....GC...........T..............T. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ ..................................A.....GC..........CA..............T. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ..................................A.....GC..........CA..............T. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ..................................A.....GC..........CA..............T.

137

A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ..................................A.....GC..........CA..............T. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ..................................A.....GC..........CA..............T. 640 650 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 AACACCTCTATTTCAGTTGGAACATCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCAAAAATAGCTACTAGACCCA A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 .T....CA.....................................A....................T... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 .T....CA.....................................A....................T... A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 .T....CA.....................................A....................T... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 .......A.G....C...................................................T... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ .T....CA.....................................A....................T... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ .......A......C..................................................GT... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ .T....CA.R...................................A....................T... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ .......A......C...................................................T... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ .......A......C...................................................T... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ .......A.....................................A....................T... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ .T....CA.G...................................A....................T... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ .T....CA.....................................A....................T... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ .T....CA.....................................A....................T... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ .T....CA.....................................A....................T... 710 720 730 740 750 760 770 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 AAGTGAACGGGCAAAGTGGACGAATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGATTCTATCAATTT A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 .......T............A................................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 ....................A................................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 .......T............A................................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ....................A.......C..............................A.......... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ ....................A................................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ....................A.......C..............................A.......... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ..........A.........A...................G............................. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ....................A.......C..............................A......G... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ....................A.......C..............................A......G... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ ....................A................................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ..........A.........A................................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ..........A.........A................................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ..........A.........A................................................. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ..........A.........A..............................................C.. 780 790 800 810 820 830 840 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 CGATAGCAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGCCAAGAAAGGGGACTCAGTGATT A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 ....................................C....---...T...............G.CA... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 ....................................C....---...T...............G.CA... A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 ....................................C....---...T...............G.CA... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ......T........................................T.................CA... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ ....................................C....---...T...............G.CA... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ......T........................................T.................CA... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ....................................C....---...T...............G.CA... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ......T........................................T.................CA... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ......T........................................T.................CA... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ ....................................---...C....T.................CA... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ....................................C....---...T...............G.CA... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ....................................C....---...T...............G.CA... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ....................................C....---...T...............G.CA... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ....................................C....---...T...............G.CA... 850 860 870 880 890 900 910 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 ATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAATTCTA A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 .................G.................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 .................G.................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 .................G.................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ......................................A..C...........A................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ .................G.................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ......................................A..C...........A................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ .................G.................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ......................................A..C...........A................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ......................................A..C...........A................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ ......................................A............................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ .................G.................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ .................G.................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ .................G.......................C............................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ .................G.......................C............................ 920 930 940 950 960 970 980 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 GTATGCCATTCCACAACATACACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATT A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 ..........................................................G........... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 ..........................................................G........... A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 ..........................................................G........... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ......................................................................

138

A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ ..........................................................G........... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ..........................................................G........... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ....................................................C................. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ..........................................................G........... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ..........................................................G........... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ..........................................................G........... 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 AGTCCTCGCGACTGGACTCAGAAATGCCCCCCAAAGAGAG------GGAGGAAGAAGGAGAAAAAGAGGA A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 ..............................T........AAGAGAG..G........A............ A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 ..............................T........AAGAGAG..G........A............ A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 ..............................T........AAGAGAG..G........A............ A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ..............................T....T....------...---.....A............ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ ..............................T........AAGAGAG..G........A............ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ..............................T....T....------...---.....A............ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ..............................T........AAGAGAG..G........A............ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ..............................T....T....------...---.....A............ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ..............................T....T....------...---.....A............ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ ..............................T....T....------...........A............ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ..............................T........AAGAGAG..G........A............ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ..............................T........AAGAGAG..G........A............ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ..............................T........AAGAGAG..G........A............ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ..............................T........AAGAGAG..G........A............ 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 CTATTTGGAGCCATAGCAGGGTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACC A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ........................................................C............. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ........................................................C............. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ........................................................C............. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ........................................................C............. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ ........................................................C............. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ...................................................................... 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 ACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGATACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAAT A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 .........................G..T...................................C..... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 .........................G............................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 .........................G..T...................................C..... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 .......T...........A...................................A.............. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ .........................G............................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ .......T...............................................A.............. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ .........................G............................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ .......T...............................................A.............. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ .......T...............................................A.............. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ .......T...............................................A.............. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ .........................G............................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ .........................G............................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ .........................G............................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ .........................G............................................ 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 CACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGATCGTTGGAAGGGAATTTAAT A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 ...T......................................A......GC................... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 ...T......................................A......GC................... A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 ...T......................................A......GC................... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ..........A......................................GC................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ ...T......................................A......GC................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ..........A......................................GC................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ...T......................................A......GC................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ..........A......................................GCT.................. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ..........A......................................GCT.................. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ ..........A......................................GC................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ...T......................................A......GC................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ...T......................................A......GC................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ...T......................................A......GC................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ...T......................................A......GC...................

139

1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 AACTTAGAAAGGAGAATAGAAAATTTAAACAAGAAGATGGAGGACGGATTCCTAGATGTCTGGACTTATA A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 ........G.......................A..................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 ........G.......................A..................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 ........G.......................A..................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ................................A..................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ ........G.......................A..................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ................................A..................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ........G.......................A..................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ................................A........A............................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ................................A........A............................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ ................................A..................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ........G.......................A..................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ........G.......................A..................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ........G.......................A..................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ........G.......................A..................................... 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 ACGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAGAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCT A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 .........................A............................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 .........................A............................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 .........................A............................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 .........................A....................C....................T.. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ .........................A............................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ .........................A....................C....................T.. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ...........T.............A............................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ .........................A....................C....................T.. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ .........................A....................C....................T.. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ .........................T....................C....................T.. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ...........T.............A............................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ...........T.............A............................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ...........T.............A............................................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ...........T.............A............................................ 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 TTACGAAAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTTGAGTTCTAC A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 ............................................................C......... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 ............................................................C......... A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 ............................................................C......... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 G...........................................................C......... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ ............................................................C......... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ G...........................................................C......... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ............................................................C......... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ G...........................................................C......... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ G...........................................................C......... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ G...........................................................C......... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ............................................................C.......W. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ............................................................C......... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ............................................................C......... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ............................................................C......... 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 CACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAACGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAG A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 ......................................................T............... A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ..................................A......G............................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ ......................................................T............... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ..................................A......G............................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ .........A........................A...T..G............................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ .........A........................A...T..G............................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ .........................................G............................ A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ...................................................................... 1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 AAGCAAGACTAAGCAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAAATGGAATCAATGGTAACTTATCAAATACTGTC A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 ...........................A..........T...................C........... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 ...........................A..........T...................C........... A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 ...........................A..........T...................C........... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ............A.........................T..........T........C........... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ ...........................A..........T...................C........A.. A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ............A.........................T..........T........C...........

140

A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ...........................A..........C...................C........... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ............A.........................T..........T........C........... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ............A.........................T..........T........C........... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ ............A.........................T..........T........C........... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ...........................A..........T............................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ...........................A..........T...................C........... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ...........................A..........T...................C........... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ...........................A..........T...................C........... 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 AATTTATTCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCATTGGCAATCATGGTGGCTGGTCTATCTTTATGGATGTGC A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ ..................................A................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ ...................................................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ ...................................................................... 1690 1700 1710 ....|....|....|....|....|....|....|. A/chicken/Vietnam/NCVD-016/200 TCCAATGGATCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTGA A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 .................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 .................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 .................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-093/200 .................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/ .................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/ .................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/ .................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/ .................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/ .................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/ .................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/ .................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/ .................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/ .................................... A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/ .................................... 

10 20 30 40 50

2) T ình tự gen NA củ c c i c A/H5N1HA clade 7

10 20 30 40 50 60 70 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 ATGAATCCAAATCAGAAGATAATAACCATCGGATCAATCTGTATGGTAATTGGAATAGTTAGCTTAATGT A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ......................C............................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 ......................C............................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 ......................C............................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 ..........................................G........................... 80 90 100 110 120 130 140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 TACAAATTGGGAACATGGTCTCAATATGGGTCAGTCATTCAATTCAGACTAGGAATCAACGCCAAGCTGA A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ...............................T...................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 ...............................T...................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 ...............................T...................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 .................A...............................AGA.......T.......... 150 160 170 180 190 200 210 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 ACCGATCAGCAACACTAAATCTCTTACTGAGAAAGCTGTGGCTTCAGTAACATTAGCGGGCAATTCATCT A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 .................G.................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 .................G.................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 .................G.................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 .T..........T.......T...C........G.....................AT............. 220 230 240 250 260 270 280 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 CTTTGCCCCATTAGCGGATGGGCTGTATACAGTAAGGACAACAGCATAAGGATCGGTTCCAAGGGGGATG A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 ...........................C..........................................

141

290 300 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 TGTTTGTTATAAGAGAGCCGTTCATCTCATGCTCACACTTGGAATGCAGAACTTTCTTTTTGACTCAGGG A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 ..................................C................................... 360 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 AGCTTTGCTAAATGACAAGCACTCCAATGGGACAATCAAAGACAGAAGTCCTCACAGAACATTAATGAGT A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ..................................G.............C..................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 ..................................G.............C..................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 ..................................G.............C..................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 ...C.....G.......................TG.............C..................... 430 440 450 460 470 480 490 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 TGTCCTGTGGGTGAGGCTCCCTCCCCTTATAACTCAAGGTTTGAGTCTGTCGCTTGGTCAGCAAGTGCTT A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ..C...............................................T................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 ..C...............................................T................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 ..C...............................................T................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 .......................T..A.......................T................... 500 510 520 530 540 550 560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 GCCATGATGGCACCAGTTGGTTGACAATTGGAATTTCTGGCCCAGATAATGGGGCTGTGGCTGTATTGAA A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 .......................................................C.....A...G.... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 .......................................................C.....A...G.... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 .......................................................C.....A...G.... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 ..............................................C....................... 570 580 590 600 610 620 630 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 ATACAATGGCATAATAACAGACACTATCAAGAGTTGGAGAAACAACATACTGAGAACTCAAGAGTCTGAA A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 .........T....................A........G.............................. 640 650 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 TGTGCATGTGTAAATGGCTCTTGCTTTGCTGTAATGACTGATGGACCAAGTAATAGGCAGGCATCATATA A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ....T......................A...........................A.............. A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 ....T...............C......A...........................A.............. A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 ....T...............C......A...........................A.............. A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 ...........................A..........................G............... 710 720 730 740 750 760 770 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 AGATTTTCAAAA--TGGAAAAAGGAAAAGTGGTTAAATCAATCGAA-TTGGATGCTCCTAATTATCACTA A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ............--................................-....................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 ............--................................-....................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 ............--................................-....................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 ....C......T--..........G...............G.T...-....................... 780 790 800 810 820 830 840 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 TGAGGAGTGCTCCTGTTATCCTGATGCTGGCGAAATCACATGTGTGTGCAGAGATTATTGGCATGGCTCA A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ...........................C...........................A.............. A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 ...........................C...........................A.............. A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 .......................................................A.............. A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 ......A............................................G...A.............. 850 860 870 880 890 900 910 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 AATAGGCCATGGTTATCTTTCAATCAAAATTTGGAGTATCAAATAGGGTATATATGCAGCGGAGTTTTTG A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ...........................................................T........C. A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 ...........................................................T........G. A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 ...............................................A...........T........C. A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 ...G........G.............CT...A...............A...........T........C. 920 930 940 950 960 970 980 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 GAGACAATCCACGCCCCAATGATGGAACAGGTAGTTGTGGTCCGGTGTCCTCTAACGGGGCATATGGGGT A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ..................................................CA.................. A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 .................................................A.................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 ..................................................C................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 ...............................G..C...............C....T.............. 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

142

A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 AAAAGGGTTTTCATTTAAATACGGCAATGGTGTTTGGATCGGGAGAACCAAAAGCACTAATTCCAGGAGC A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 ...................................................................... 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 GGTTTTGAAATGATTTGGGATCCAAATGGGTGGACTGAAACGGACAGCAGCTTTTCGATGAAGCAAGATA A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 .....................................G................................ A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 .....................................G................................ A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 .....................................G................................ A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 ..C....................G.............G...................G............ 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 TCGTAGCAATAACTGATTGGTCAGGATATAGCGGGAGTTTTGTTCAGCATCCAGAACTGACAGGATTAGA A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ....G......................................C.......................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 ....G......................................C.......................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 ....G......................................C.......................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 ...........................................C.......................... 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 TTGCATAAGACCTTGTTTCTGGGTTGAGTTGGTCAGAGGGCGGCCCAAAGAGAGCACAATCTGGACTAGT A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ..................T.................................G................. A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 ..................T...........A..........A..........G................. A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 ..................T...........A..........A..........G................. A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 ..............................A....................................... 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 GGGAGCAGCATATCTTTTTGTGGTGTAAATAGTGACACTGTGAGTTGGTCTTGGCCAGACGGTGCTGAGT A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ..............C....................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 ..............C....................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 ..............C....................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 ..............C...........................G..........................G 1340 1350 ....|....|....|....|... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 TGCCATTCACCATTGACAAGTA- A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 ......................- A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 ......................- A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 ......................- A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/200 ......................- 3) T ình tự gen M củ c c i c A/H5N1HA clade 7

10 20 30 40 50 60 70 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/08 ATGAGTCTTCTAACCGAGGTTGAAACGTACGTTCTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGA 80 90 100 110 120 130 140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/08 TAGCGCAAAAACTTGAAGATGTTTTCGCAGGAAAGAACACTGATCTCGAGGCTCTCATGGAGTGGCTAAA 150 160 170 180 190 200 210 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/08 ................................................G..................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/08 ................................................G..................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/08 GACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAAGGGATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGT 220 230 240 250 260 270 280 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 ....................T................................................. A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/08 GAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAGAATGCCCTAAGTGGAAATGGAGATCCAAATAATATGG

143

290 300 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 ..........................................................G........... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/08 ATAGGGCAGTTAAGCTATATAAGAAGCTGAAAAGAGAAATAACATTCCATGGGGCTAAAGAGGTCGCACT 360 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 ............C......................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/08 .....................................................................A A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/08 CAGCTACTCAACTGGTGCACTTGCCAGTTGCATGGGTCTCATATACAACAGAATGGGAACGGTAACTACG 430 440 450 460 470 480 490 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 .................G.................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/08 GAAGTAGCTTTTGGTTTAGTGTGTGCCACTTGTGAGCAGATTGCAGATTCACAGCATCGGTCTCACAGAC 500 510 520 530 540 550 560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 ....................................................G................. A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/08 AGATGGCAACTATCACCAACCCACTAATCAGGCATGAGAACAGAATGGTGCTAGCCAGCACTACAGCTAA 570 580 590 600 610 620 630 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 ...C.........................................C........................ A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/08 .............................................C........................ A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/08 .............................................C........................ A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/08 .............................................C........................ A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/08 GGCTATGGAGCAGATGGCGGGATCAAGTGAGCAGGCAGCGGAAGCAATTGAGATCGCTAATCAGGCTAGG 640 650 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 ........................................................A............. A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/08 CAGATGGTGCAGGCAATGAGGACAATTGGGACTCATCCTAACTCTAGTGCTGGTCTGAGGGACAATCTTC 710 720 730 740 750 760 770 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/08 TTGAAAATTTGCAGGCCTACCAGAAACGAATGGGAGTGCAGATGCAGCGATTCAAGTGATCCTCTTGTTG 780 790 800 810 820 830 840 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/08 TTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCATCTTTTCTTCAAATGCAT 850 860 870 880 890 900 910 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 ............................................T......................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/08 ...................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/08 TTATCGTCGCCTTAAATACGGTTTGAAAAGAGGGCCTTCTACGGCAGGGGTACCTGAGTCTATGAGGGAA 920 930 940 950 960 970 980 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/200 ..G................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/08 ..G................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/08 ..G................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/08 ..G................................................................... A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/08 GAATACCGGCAGGAACAGCAGAGTGCTGTGGATGTTGACGACGGTCATTTTGTCAACATAGAGTTGGAGT

144

SỐ ĐĂNG KÝ NGÂN HÀNG GEN CAC CHỦNG VI US CÚ A H N1 CLADE 7 CỦA VIỆT NAM (SỬ DỤNG T ONG NGHIÊN CỨU)

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008

Tên chủng

A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008

EPI_ISL_80638

FJ842481

A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008

EPI_ISL_80639

FJ842482

A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008

EPI_ISL_80640

FJ842483

A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008

EPI_ISL_80641

FJ842480

A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/2008

FJ842484

A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/2008

FJ842477

A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/2008

FJ842485

A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/2008

FJ842478

A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/2008

FJ842479

A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/2008

FJ842486

A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/2008

FJ842487

A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/2008

FJ842488

A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/2008

FJ842489

A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/2008

FJ842490

Số đăng ký gen HA (GenBank) FJ842476 Số đăng ký full Genome (GISAID) EPI_ISL_28830

145