Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

UYỄ Ị A ỦY

Ê ỨU M SỐ Ặ Í ỦA V K UẨ

ESCHERICHIA COLI ( ÓM V E ) Â LẬ

Ừ BÒ, LỢ Ợ Ế MỔ

LUẬ Á Ế SĨ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học hú y

Mã số

: 62 62 50 10

i h n n h học: 1. S. uyễn Bá iên

2. S. ỗ ọc húy

- 2012

L AM OA

Tôi xin cam đoan: Luận án “Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn

Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội”

là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Những số liệu, kết quả nghiên cứu

nêu trong luận án này là trung thực, khách quan và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận án

này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án đều được chỉ rõ

nguồn gốc.

ác iả luận án

uyễn hị h nh hủy

L ẢM Ơ

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án, tôi

luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này, tôi

xin cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện Đào

tạo Sau Đại học, Khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh - Truyền nhiễm, Cơ quan Thú

y vùng I đã tạo điều kiện cho tôi được theo học chương trình đào tạo Nghiên

cứu sinh tại trường.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo và tập thể cán bộ Chi cục Thú

y Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi điều tra, lấy mẫu thực hiện đề tài.

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa

học là TS. Nguyễn Bá Hiên - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và TS. Đỗ

Ngọc Thúy - Viện Thú y đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực

hiện đề tài và hoàn thành luận án.

Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Cù Hữu Phú, ThS. Lưu Thị Hải Yến và tập thể

cán bộ Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia đã giúp đỡ tôi thực hiện đề tài

nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc Ban lãnh đạo và tập thể cán bộ Cơ

quan Thú y vùng I, nơi tôi công tác đã ủng hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực

hiện luận án này.

Tôi xin đặc biệt gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình, bố mẹ, chồng

và hai con trai cùng các bạn đồng nghiệp, bạn bè đã đồng hành, đóng góp công

sức, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

ác iả luận án

uyễn hị h nh hủy

iii

MỤ LỤ

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các chữ viết tắt vii

Danh mục các bảng ix

Danh mục hình xi

MỞ ẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 3

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

4 Những đóng góp mới của luận án 4

h ơn 1 Ổ QUA L U 5

1.1 Vi khuẩn E. coli 5

1.1.1 Phân loại E. coli 8

1.1.2 Đặc tính của vi khuẩn E. coli 9

1.2 Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) 14

1.2.1 Danh pháp 14

1.2.2 Một số yếu tố độc lực của vi khuẩn nhóm VTEC 15

1.2.3 Vai trò của VTEC không thuộc nhóm O157 22

1.2.4 VTEC ở động vật 24

1.2.5 VTEC trong thực phẩm 28

1.2.6 Nhiễm VTEC ở người 29

1.3 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E. coli và bệnh do chúng gây

ra tại Việt Nam 31

1.4 Phương pháp phát hiện VTEC trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm 32

1.4.1 Phương pháp vi sinh vật 33

1.4.2 Phương pháp miễn dịch học 33

1.4.3 Phương pháp sinh học phân tử 34

1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng để phân loại vi sinh vật 40

1.5.1 Nguyên tắc 41

1.5.2. Kỹ thuật 42

1.5.3 Ứng dụng của kỹ thuật phân tích PFGE 44

h ơn 2 DU , UYÊ L U V Ơ Á

Ê ỨU 45

2.1 Nội dung nghiên cứu 45

2.1.1 Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ, vệ sinh thú y trên địa

bàn Hà Nội 45

2.1.2 Thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR dùng để xác định vi

khuẩn VTEC 45

2.1.3 Tỷ lệ nhiễm và một số đặc tính cơ bản của những chủng

VTEC phân lập được 45

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 46

2.3 Đối tượng nghiên cứu 46

2.4 Nguyên liệu nghiên cứu 46

2.4.1 Môi trường, hóa chất, dụng cụ thí nghiệm 46

2.4.2 Các chủng vi khuẩn đối chứng dương và âm 47

2.5 Phương pháp nghiên cứu 47

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 47

2.5.2 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn trong canh khuẩn

nuôi cấy 48

2.5.3 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR 48

2.5.4 Phương pháp xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR 51

2.5.5 Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng PCR 52

2.5.6 Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn VTEC 52

2.5.7 Phương pháp xác định serotyp kháng nguyên O của các chủng

vi khuẩn phân lập được 54

2.5.8 Xác định sự đa dạng di truyền của các chủng VTEC có nguồn

gốc khác nhau bằng phản ứng PFGE (Pulsed-field gel

electrophoresis) 55

2.5.9 Xử lý số liệu 56

h ơn 3 KẾ QUẢ V ẢO LUẬ 57

3.1 Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ, vệ sinh thú y trên địa bàn

Hà Nội 57

3.1.1 Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ tại các điểm giết mổ

gia súc, gia cầm trên địa bàn Hà Nội 57

3.1.2 Kết quả điều tra điều kiện giết mổ và phương tiện vận chuyển

của các điểm giết mổ trên địa bàn Hà Nội 60

3.1.3 Thực trạng vệ sinh tại khu giết mổ gia súc, gia cầm trên địa

bàn Hà Nội 64

3.1.4 Thực trạng điều kiện vệ sinh thú y tại cơ sở kinh doanh, chợ,

tiêu thụ sản phẩm thịt gia súc, gia cầm 69

3.2 Thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR dùng để xác định vi

khuẩn VTEC 70

3.2.1 Lựa chọn giữa PCR đơn mồi và Multiplex - PCR 70

3.2.2 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp để tách chiết DNA mẫu 73

3.2.3 Kết quả thực hiện phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn

E. coli tham chiếu 75

3.2.4 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR

dùng để xác định VTEC trong môi trường nhân tạo 77

3.2.5 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp

PCR dùng để xác định VTEC trong mẫu thịt sạch 83

3.2.6 Quy trình xác định sự có mặt của vi khuẩn VTEC trong các

mẫu thịt 85

3.3 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm VTEC trên bò, lợn tại các điểm giết

mổ và chợ thuộc địa bàn Hà Nội 87

3.3.1 Thu thập mẫu 87

3.3.2 Phân lập và giám định đặc tính sinh vật hóa học của các chủng

E. coli 89

3.3.3 Kết quả phân lập VTEC trong thịt 93

3.3.4 Kết quả phân lập VTEC từ mẫu lau thân thịt và mẫu phân tại

lò mổ 96

3.3.5 Kết quả xác định các loại độc tố của các chủng VTEC phân

lập được 98

3.3.6 Kết quả xác định serotyp O của các chủng VTEC phân lập được 100

3.3.7 Kết quả phân tích quan hệ di truyền của một số chủng vi

khuẩn VTEC phân lập được có nguồn gốc khác nhau 103

KẾ LUẬ V Ề Ị 107

Kết luận 107

Đề nghị 108

Danh mục các công trình đã công bố có liên quan đến luận án 109

Tài liệu tham khảo 110

Phụ lục 125

vii

DA MỤ Á Ữ V Ế Ắ

Attaching and Effacing A/E

Brain Heart Infusion BHI

base pair bp

Buffer Peptone Water BPW

Cộng sự Cs.

CT-SMAC Cefixime Tellurite Selective Supplement

DNA Deoxyribonucleic Acid

EaggEC Enteroaggregative E. coli

Escherichia coli E. coli

Enterohaemorrhagic E. coli EHEC

Entero invasive E. coli EIEC

Enteropathogenic E. coli EPEC

Enzyme-linked immunosorbent asay ELISA

Enterotoxigenic E. coli ETEC

Food and Drug Administration FDA

Hemorrhagic colitis HC

Hemolytic uremic syndrome HUS

Kilodalton kDa

Luria Bertani LB

Methyl Red MR

Megadalton mDa

m-TSB modified Trypticase Soy Broth

Nutrient Broth NB

Outer membrane protein OMP

Polymerase chain reaction PCR

Pulsed Field Gel Electrophoresis PFGE

viii

Shiga - like toxin SLT

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN

Tris-EDTA buffer TE

Thrombotic thrombocytopenic purpure TTP

Tryptic Soy Broth TSB

Vi khuẩn VK

Voges-Proskauer VP

VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm

Verotoxin VT

Verotoxigenic Escherichia coli VTEC

Tổ chức Y tế thế giới WHO

DAN MỤ Á BẢ

STT Tên bảng Trang

1.1 Hoạt tính sinh học của các loại VT 19

1.2 Một số enzym cắt hạn chế được dùng cho kỹ thuật PFGE 43

Trình tự mồi dùng để xác định các gen VT1, VT2 và eae 49 2.1

Thành phần các chất trong phản ứng PCR dùng để xác định các 2.2

gen VT1, VT2 và eae 50

2.3 Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng để xác định gen VT1,

VT2 và eae 50

2.4 Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu của các chủng vi khuẩn E. coli

đối chứng dương 51

2.5 Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu của các chủng vi khuẩn đối

chứng âm 51

Số lượng các điểm giết mổ gia súc, gia cầm trên địa bàn Hà Nội 59 3.1

Kết quả điều tra điều kiện điểm giết mổ và phương tiện vận 3.2

chuyển của các điểm giết mổ trên địa bàn Hà Nội 62

3.3 Thực trạng vệ sinh của các điểm giết mổ gia súc, gia cầm thuộc

địa bàn Hà Nội 68

3.4 Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR đơn và Multiplex - PCR để

phát hiện một số gen độc lực của VTEC 72

3.5 Kết quả xác định môi trường thích hợp nuôi cấy vi khuẩn E. coli

để chiết tách DNA cho phản ứng PCR 73

3.6a Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex – PCR để phát hiện các

chủng vi khuẩn E. coli đối chứng dương 75

3.6b Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex – PCR với

75 các chủng vi khuẩn đối chứng âm

3.7 Kết quả nuôi cấy hai chủng vi khuẩn đối chứng dương trên một

số môi trường nuôi cấy 78

3.8 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR khi

xác định VTEC trên môi trường nuôi cấy 80

3.9 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR khi

xác định VTEC trong mẫu thịt sạch 84

3.10 Tổng hợp số lượng và chủng loại mẫu thu thập được tại một số

điểm giết mổ trên địa bàn Hà Nội 88

3.11 Tổng hợp số lượng mẫu thịt thu thập được tại một số chợ trên

địa bàn Hà Nội 89

3.12 Kết quả phân lập chủng E. coli từ mẫu ban đầu 90

3.13 Kết quả kiểm tra các đặc tính của vi khuẩn E. coli phân lập được 91

3.14 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn VTEC từ mẫu thịt 93

3.15 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn VTEC từ mẫu lau thân thịt và mẫu phân 96

3.16 Khả năng sản sinh độc tố của các chủng VTEC phân lập được 98

3.17 Kết quả xác định serotyp của các chủng VTEC phân lập được 101

DA MỤ Ì

Tên hình Trang TT

Cấu trúc kháng nguyên O 12 1.1

Cơ chế tác động của độc tố VT 18 1.2

Nguyên lý của phản ứng PCR 38 1.3

Chu trình nhiệt độ của phản ứng PCR 38 1.4

Sử dụng kỹ thuật PFGE phân tích nhiễm sắc thể sau khi xử lý với 1.5

enzym cắt hạn chế Sma I với vi khuẩn Haemophilus influenzae. 42

Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn 53 2.1

Sản phẩm của phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn đối chứng 3.1

dương và âm sau quá trình điện di 77

3.2 Kết quả nuôi cấy chủng FD636 ở các nồng độ pha loãng khác

nhau trên thạch máu 79

3.3 Sản phẩm của phản ứng PCR với nồng độ pha loãng khác nhau

từ môi trường LB đã nuôi cấy chủng FD636 82

3.4 Sản phẩm của phản ứng PCR với nồng độ pha loãng khác nhau

từ môi trường LB đã nuôi cấy chủng FD523 82

Quy trình xác định VTEC trên thịt 86 3.5

Tính chất mọc của E. coli trên môi trường MacConkey 92 3.7

Tính chất mọc của E. coli trên môi trường thạch máu 92 3.8

Tính chất mọc của E. coli trên môi trường EMB 92 3.9

3.10 Tính chất mọc của E. coli trên môi trường CT-SMAC 92

3.11 Khả năng lên men sinh hơi một số loại đường của E. coli 92

3.12 Khả năng sinh Indol của E. coli 92

3.13 Sản phẩm của phản ứng PCR từ mẫu thịt sau quá trình điện di 94

3.14 Sản phẩm của phản ứng PCR từ khuẩn lạc riêng biệt của một số

mẫu thịt sau quá trình điện di 95

xii

3.15 Sản phẩm của phản ứng PCR từ mẫu phân và mẫu lau thân thịt

sau quá trình điện di 97

3.16 Sản phẩm của phản ứng PCR từ những khuẩn lạc riêng biệt của

mẫu phân sau quá trình điện di 98

3.17 Kết quả phân tích quan hệ di truyền của vi khuẩn VTEC bằng

phương pháp PFGE 105

3.18 Hình ảnh điện di xung trường (PFGE) của một số chủng vi khuẩn

VTEC phân lập được 106

MỞ ẦU

Tính cấp thiết củ đề tài 1

Trên phạm vi thế giới, ước tính hàng năm có khoảng 2 tỷ người bị ngộ

độc thực phẩm (Đậu Ngọc Hào, 2011) [2].

Ở Việt Nam, theo ước tính và thống kê của Tổ chức y tế thế giới

(WHO) có khoảng 8 triệu người bị ngộ độc thực phẩm mỗi năm, trong đó

phần lớn xảy ra tại các bếp ăn tập thể, khu công nghiệp, bếp ăn của học sinh.

Năm 2010, cả nước xảy ra 175 vụ ngộ độc thực phẩm, làm hơn 5.000 người

mắc và 42 trường hợp tử vong. Thiệt hại kinh tế cho chi phí điều trị bệnh và

nghỉ làm việc khoảng 8 triệu USD/năm (Phương Thuận, 2011) [101].

Các con số trên đây cho thấy một thực trạng đáng lo ngại về vấn đề vệ

sinh an toàn thực phẩm (VSATTP). VSATTP có vai trò rất quan trọng đối với

cuộc sống con người, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe, tuổi thọ, chất lượng

môi trường, chất lượng cuộc sống, phát triển kinh tế và uy tín thương hiệu sản

phẩm, uy tín quốc gia.

Trong số rất nhiều nguyên nhân vi sinh vật gây ra các vụ ngộ độc thực

phẩm ở người (Salmonella, E. coli, Vibrio cholera, Listeria, Clostridium

botulinum ...), những năm gần đây, các vi khuẩn E. coli thuộc nhóm

Verotoxigenic (VTEC) ngày càng được biết đến như là một trong những tác

nhân quan trọng. Verotoxigenic E. coli là khái niệm dùng để chỉ nhóm các vi

khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ra độc tố Verotoxin hoặc Shiga-like toxin.

Các chủng VTEC là nguyên nhân gây ra các ca bệnh lẻ tẻ hoặc các ổ dịch

lớn bệnh viêm ruột xuất huyết (HC) và hội chứng urê huyết (HUS), ban xuất

huyết giảm tiểu cầu (TTP), viêm đường niệu (Urinary tract infections), viêm

màng não (meningitis) (XU và cs. 1999) [92]; (Lake và Cressey, 2002) [49].

Mặc dù E. coli O157: H7 vẫn được biết đến như là một serotyp chính

phân lập được từ các vụ dịch ở hầu hết các quốc gia, các chủng VTEC thuộc

các serotyp khác cũng đã được chứng minh là có mối liên quan chặt chẽ với

các vụ dịch tương tự như serotyp O111 ở Canada, Italia, Đức và Australia,

O103 ở Pháp, Italia và O104 ở Mỹ.

Ở rất nhiều quốc gia, VTEC là tác nhân gây bệnh tiêu chảy rất hay gặp

(Wachsmuth, 1994) [95]. Ví dụ, ở Đức, VTEC được phân lập từ trẻ em bị tiêu

chảy là nguyên nhân vi khuẩn thường gặp đứng thứ 2, sau Salmonella và ở

Áo, VTEC là nguyên nhân thường gặp thứ 3, sau Salmonella và

Campylobacter (Allerberger và cs. 1996) [12].

Gần đây nhất, tháng 6 năm 2011, một đợt dịch do E. coli đã bùng phát

tại Đức và nhanh chóng lan ra các quốc gia châu Âu khác. WHO cho biết,

trên phạm vi toàn thế giới có hơn 1.270 ca nhiễm và 552 ca tiến triển thành

HUS; con số tử vong lên tới 18 người bao gồm 17 trường hợp ở Đức và 1

trường hợp ở Thụy Điển. Nguyên nhân của đợt dịch được xác định là do rau

quả bị nhiễm E. coli O104. Vụ dịch này gây tổn thất nặng nề tới nền kinh tế

thuộc liên minh châu Âu (EU), ước tính mỗi tuần người nông dân tại đây thất

thu 200 triệu euro (tương đương 290 triệu USD).

Ở động vật, VTEC là nguyên nhân gây ra chứng viêm ruột xuất huyết

và tiêu chảy ở bò, gây phù đầu ở lợn. Động vật nhai lại, đặc biệt bê và bò là

nguồn tàng trữ mầm bệnh tiềm tàng và việc tiêu thụ các loại thực phẩm (thịt

bê, bò, các sản phẩm sữa) chưa qua xử lý kỹ là nguyên nhân chính gây ra các

trường hợp bị bệnh ở người do VTEC. Các nghiên cứu tại một số quốc gia về

sự tạp nhiễm phân ở các trang trại chăn nuôi bò sữa, đã chỉ ra sự dao động rất

lớn về tỷ lệ nhiễm của các chủng VTEC thuộc nhóm O157 (từ 0,2 đến 48,8%)

và không thuộc nhóm O157 (từ 0,4 đến 74,0%).

Trong những thập kỷ gần đây, ô nhiễm vi khuẩn E. coli thuộc nhóm

VTEC sản sinh độc tố Verotoxin (VT) trong thực phẩm đã trở thành đề tài

nghiên cứu của nhiều tác giả vì tính nghiêm trọng của các bệnh do vi khuẩn

này gây ra ở người (Bergamini, 2007) [16]. Việc xác định chính xác loại vi

khuẩn thuộc nhóm này là rất cần thiết, do mối nguy hại của vi khuẩn này liên

quan đến các nạn dịch tiêu chảy trầm trọng ở người và khả năng truyền lây

bệnh của chúng thông qua thức ăn có nguồn gốc động vật. Hiểu biết về các

đặc tính của vi khuẩn VTEC ở thịt các loài động vật nuôi (bò, lợn…) làm thực

phẩm cho con người có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các hệ thống

cảnh báo sớm và tiến hành các biện pháp phòng chống bệnh thích hợp. Nhiều

công trình nghiên cứu đã được thực hiện và công bố ở hầu khắp các quốc gia

trên thế giới. Tuy nhiên, ở Việt Nam vấn đề này vẫn chưa được chú ý.

Để có được những hiểu biết về vi khuẩn nhóm VTEC trong thực trạng

giết mổ và chế biến thực phẩm tại Việt Nam, chúng tôi đặt vấn đề thực hiện đề

tài: "Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC)

phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội ”

2 Mục tiêu củ đề tài

- Xác định đặc tính của vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập được từ

bò, lợn tại điểm giết mổ.

- Xây dựng được quy trình chẩn đoán, xác định vi khuẩn VTEC trong

sản phẩm thịt tươi.

3 Ý n hĩ h học và thực tiễn củ đề tài

- Đề tài luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống về vi khuẩn

E. coli nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội.

- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp chúng ta xác định và hiểu được

một số đặc tính cơ bản của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập được từ bò, lợn.

- Một số kỹ thuật mới và phương pháp phân tích kết quả có hệ thống

của đề tài luận án có thể ứng dụng trong nghiên cứu một số vi khuẩn khác ở

mức độ phân tử cũng như tài liệu giảng dạy về vi khuẩn nhóm VTEC.

- Hiểu biết về vi khuẩn nhóm VTEC ở các loài động vật nuôi làm thực

phẩm cho con người có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các hệ thống

cảnh báo sớm và tiến hành các biện pháp phòng chống bệnh thích hợp.

4 hữn đón óp m i củ luận án

- Đề tài luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu đặc tính

của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn tại cơ sở giết mổ và một số sản

phẩm thịt bò, lợn bày bán trên một số chợ tại địa bàn Hà Nội.

- Thiết lập thành công phương pháp Multiplex PCR để xác định vi

khuẩn nhóm VTEC trên thịt trong điều kiện Việt Nam.

- Sử dụng phương pháp PCR, PFGE để xác định các yếu tố độc lực của

vi khuẩn E. coli và xác định sự đa dạng di truyền của các chủng VTEC có

nguồn gốc khác nhau.

h ơn 1

Ổ QUA L U

1.1 Vi huẩn E. coli

Hơn 100 năm trước, năm 1885, bác sỹ nhi khoa người Đức Theodore

Escherich đã lần đầu tiên mô tả một loài vi khuẩn phân lập được từ phân của

một bệnh nhân nhi. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacterium coli commune, và

sau nhiều lần đổi tên, vào năm 1919, vi khuẩn này được gọi với một tên thống

nhất là Escherichia coli, viết tắt là E. coli. Từ đó đến nay, E. coli được xác

định là loài vi khuẩn thường gặp nhất trong hệ vi sinh vật đường ruột của

người và động vật (Vu Khac Hung, 2004) [91].

E. coli là loài chủ yếu của giống Escherichia, họ Enterobacteriaceae.

Chúng là những vi khuẩn bắt màu Gram âm, hình gậy ngắn. Quan sát dưới

kính hiển vi thường thấy vi khuẩn đứng riêng hoặc thành đôi. Phản ứng

Catalase dương tính, Oxidase âm tính, hiếu khí tùy tiện, có thể di động nhờ

lông (flagella) hoặc không di động. Hầu hết các chủng vi khuẩn đều lên men

đường Lactose, một số lên men chậm và một số không sinh hơi. Thông

thường, E. coli có phản ứng Citrate âm tính, Methyl Red (MR) dương tính,

Voges - Proskauer (VP) âm tính và Indol dương tính. E. coli là vi khuẩn

thường thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật; từ đó E. coli được

thải vào nước, đất và đồng cỏ, không chỉ nhiễm lan trong đàn mà có thể

nhiễm vào một số sản phẩm nông nghiệp như rau, củ,...

Từ đầu những năm 1940, một số ý kiến cho rằng vi khuẩn E. coli là tác

nhân gây một số bệnh ở trẻ em. Doyle và Padhye (trích dẫn từ Bray và

Beavan, 1989) [28] gọi vi khuẩn này là Bacillus coli typ neopolitanum, mà

sau này được gọi là nhóm O111, và thuộc lớp EPEC. Từ đó, những nhóm

E. coli khác được thừa nhận là nguyên nhân gây tiêu chảy. Các vi khuẩn

E. coli gây bệnh có độc lực rất khác nhau và có khả năng gây ra một số bệnh

nghiêm trọng. Một số chủng sản sinh độc tố gây phá hủy tế bào Vero và Hela,

tương tự như độc tố do Shigella dysenteriae typ 1 sản sinh ra. Những độc tố

này được gọi với những tên khác nhau như Verotoxin, Verocytotoxin hoặc

Shiga-like toxin. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tên gọi thống nhất

là Verotoxin (VT) và các vi khuẩn có khả năng sản sinh độc tố này được gọi

là Verotoxigenic Escherichia coli, viết tắt là VTEC.

Trong những năm gần đây, các chủng E. coli gây tiêu chảy được chia

thành ít nhất 5 nhóm. Đó là E. coli gây độc ruột (ETEC - Enterotoxigenic

E. coli) - sản sinh độc tố ruột nhưng không xâm nhập, E. coli xâm nhập ruột

(EIEC - Entero invasive E. coli) có khả năng xâm nhập tế bào biểu mô ruột,

E. coli gây bệnh tích ruột (EPEC - Enteropathogenic E. coli) có khả năng bám

dính vào tế bào biểu mô và gây bệnh tích bám dính và xâm nhập (Attaching

and Effacing - A/E), E. coli gây ngưng kết (EaggEC - Enteroaggregative

E. coli) có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô nhờ một cơ quan giống

lông nhung và khuếch tán vào trong biểu mô ruột. Nhóm cuối cùng là VTEC

gây bệnh viêm ruột xuất huyết, huyết niệu và ban xuất huyết giảm tiểu cầu ở

người. Trước đây, VTEC là một phân nhóm của EPEC vì chúng cũng có khả

năng gây bệnh tích A/E ở biểu mô ruột của động vật cảm thụ. Nhưng khi phát

hiện một số chủng của VTEC có khả năng sản sinh độc tố VT để trợ giúp cho

yếu tố bám dính này, chúng đã được tách ra thành một nhóm riêng là VTEC.

E. coli O157: H7 hiện nay là chủng VTEC được báo cáo nhiều nhất gây

ra các vụ dịch lớn ở nhiều nước gồm cả Mỹ (MacDonald và Osterholm, 1993)

[55], Canada (Waters và cs. 1994) [96], Anh (Thomas và cs. 1996) [88] và

Nhật Bản (Bettelheim, 1997) [17]. Vi khuẩn này được xác định là một trong

các tác nhân gây ngộ độc nguy hiểm nhất trong các bệnh phát sinh do ngộ độc

thực phẩm gây nên hội chứng huyết niệu (Phạm Thị Tâm và cs. 2009, trích

dẫn theo Griffin, 1995) [6].

Vụ dịch đầu tiên được báo cáo vào năm 1982, E. coli O157: H7 được

xác định là nguyên nhân gây viêm ruột xuất huyết ở Mỹ. Trong một thập kỷ

sau đó, vi khuẩn này đã trở thành một vấn đề lớn liên quan đến sức khỏe cộng

đồng, được chính phủ nhiều nước quan tâm. Vụ dịch lớn nhất được báo cáo

xảy ra ở Nhật Bản trong tháng 7 - 8/1996, với 9.578 ca bệnh được ghi nhận và

11 người chết, 90 bệnh nhân được xác định là bị HUS. Vụ dịch lớn thứ hai xảy

ra ở Mỹ, với 732 ca bệnh trong đó 4 người chết, 55 người bị HUS hoặc TTP.

Mặc dù, serotyp O157: H7 là typ vi khuẩn nổi bật nhất của nhóm VTEC, một

số serotyp khác của nhóm này cũng liên quan tới một số bệnh ở người. Hơn

nữa, sự tồn tại của các serotyp này là khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau.

Có hơn 100 serotyp VTEC được xác định dựa trên kháng nguyên O có khả

năng gây một số bệnh nghiêm trọng ở người như HC, HUS, TTP.

Ở nhiều nước, VTEC là một tác nhân gây tiêu chảy thông thường

(Wachsmuth, 1994) [95]. VTEC gây nên các triệu chứng khác nhau, từ gần

như không có triệu chứng gì, có hoặc không có triệu chứng đau bụng nhẹ, đến

những triệu chứng nặng hơn như HC, HUS hoặc TTP. Đối tượng thường bị

nhiễm VTEC là trẻ em dưới 5 tuổi hoặc người già. Ở những người trưởng

thành và trung niên, các triệu chứng có thể nhẹ như bị tiêu chảy nhưng không

xuất huyết. Điều này xảy ra khi bị nhiễm ở liều thấp, dưới 100 vi khuẩn. Ở

động vật, VTEC gây viêm ruột xuất huyết và tiêu chảy ở trâu bò, chúng cũng

có thể gây bệnh phù đầu ở lợn (Đỗ Ngọc Thúy, 2004) [8].

Hầu hết các vụ dịch VTEC, thường do serotyp O157: H7, có liên

quan tới sử dụng thịt bò chưa chín kỹ, và một số thực phẩm tương tự hoặc

sữa tươi. Truyền qua thực phẩm là phương thức lây truyền chủ yếu của

VTEC. Vật nuôi, đặc biệt là trâu bò, là nguồn tàng trữ VTEC chính (Beutin

và cs. 1993) [18]. Trong quá trình giết mổ, động vật mang trùng có thể

truyền vi khuẩn sang thịt qua phân, nhiễm chéo sang thân thịt của các gia

súc khác qua tay người giết mổ và dụng cụ lò mổ. Hiện nay, người ta vẫn

chưa khẳng định được liệu tất cả các chủng VTEC phân lập được từ động

vật có gây bệnh cho người hay không.

Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm của Việt Nam quy định : vi

khuẩn này không được phép có mặt trong 1g các loại thực phẩm như thịt hộp,

rau quả muối, nước uống, sữa và các sản phẩm từ sữa.

Ở Việt Nam, có rất ít thông tin về VTEC ở những động vật mang trùng,

thân thịt sau khi giết mổ và thực phẩm. Hiện nay trên thị trường thế giới có rất

ít bộ kít phát hiện VTEC ngoài nhóm O157 (kit PCR DNA vòm, VTEC-

LAMP). Do đó, các phương pháp phát hiện nhanh VTEC ở Việt Nam cần

phải được phát triển để xác định được vai trò của vi khuẩn này ở động vật

mang trùng và các sản phẩm từ động vật.

1.1.1 Phân loại E. coli

E. coli có thể được chia thành các nhóm dựa trên bệnh lý mà chúng gây

ra, vị trí các kháng nguyên, định typ phage, thông tin về plasmid và khả năng

sản sinh yếu tố dung huyết. Tuy nhiên, các phản ứng huyết thanh học thường

được sử dụng và hiệu quả khi phân loại E. coli (Hanna Evelina Sidjabat-

Tambunan, 1997) [38].

Năm 1944, Kauffman là người đầu tiên đưa ra một phương pháp phân

loại vi khuẩn E. coli dựa trên đặc điểm huyết thanh học, và cùng với một số

cải tiến, phương pháp này vẫn được áp dụng cho tới ngày nay. Theo đó, vi

khuẩn E. coli được phân loại dựa theo các kháng nguyên bề mặt, gồm có

kháng nguyên thân O (Somatic), kháng nguyên lông H (Flagellar) và kháng

nguyên giáp mô K (Capsular) (Lior, 1996) [53].

Mặc dù, E. coli được phân loại dựa trên 3 loại kháng nguyên này nhưng

kháng nguyên O và H thường được sử dụng nhiều hơn. Do đó, thuật ngữ

serotyp chỉ được sử dụng khi hai kháng nguyên này đã được xác định. Khi chỉ

có kháng nguyên O được xác định, các vi khuẩn E. coli được xếp thành nhóm

kháng nguyên O (serogroup O). Hiện nay, nhóm E. coli dựa trên kháng

nguyên O đã được xác định được đánh số từ O1 đến O173 (trừ 7 nhóm đã bị

loại : O31, O47, O67, O72, O93, O94, O122).

1.1.2 Đặc tính của vi khuẩn E. coli

1.1.2.1 Đặc tính hình thái

E. coli là trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, có kích thước 2 - 3 x 0,6 µm.

Trên tiêu bản nhuộm Gram, vi khuẩn bắt màu Gram âm, đứng riêng rẽ, đôi

khi xếp 2 - 3 vi khuẩn thành một chuỗi dài. Vi khuẩn không sinh nha bào và

không bắt màu với các thuốc nhuộm axit. Vi khuẩn có lông và có khả năng di

động (Nguyễn Như Thanh và cs. 2001) [7]. Khi quan sát dưới kính hiển vi

điện tử, một số chủng vi khuẩn nhất định có mang cấu trúc fimbriae hay còn

gọi là yếu tố bám dính (Nguyễn Thị Liên Hương, 2010) [4].

1.1.2.2 Đặc tính nuôi cấy

E. coli là trực khuẩn hiếu khí tùy tiện. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn này là 370C, pH thích hợp là 7,4; nhưng vi

khuẩn cũng có thể phát triển được ở môi trường có pH từ 5,5 - 8,0 (Nguyễn

Như Thanh và cs. 2001) [7].

Vi khuẩn E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông

thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản.

- Môi trường thạch thường: hình thành những khuẩn lạc dạng S tròn,

ướt, bóng láng không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2 -

3mm. Nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát

thấy cả những khuẩn lạc dạng R và M.

- Môi trường nước thịt: phát triển rất nhanh, tốt, môi trường đục đều có

lắng cặn màu tro nhạt dưới đáy, đôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi

phân thối.

- Môi trường MacConkey: khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ,

hơi lồi, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.

- Môi trường thạch máu: khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu

xám nhạt, một số chủng có khả năng gây dung huyết.

- Môi trường CT-SMAC: khuẩn lạc tròn nhỏ, hơi lồi, rìa gọn, màu hồng

cánh sen (lên men đường Sorbitol) hoặc màu trắng đục (không lên men đường

Sorbitol).

- Môi trường Simmon citrate: khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục.

- Môi trường Endo: khuẩn lạc màu đỏ.

- Môi trường EMB: khuẩn lạc màu tím đen.

- Môi trường SS: khuẩn lạc có màu đỏ.

1.1.2.3 Đặc tính sinh hóa

- Đặc tính lên men và sinh hơi các loại đường: vi khuẩn E. coli có khả

năng lên men và sinh hơi một số loại đường như: Glucose, Fructose,

Galactose, Lactose, Manitol, Levulose, Xylose; lên men không chắc chắn với

các loại đường như: Dulcitol, Saccarose, Salixin.

Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi nhanh đường Lactose, còn vi khuẩn

Salmonella spp. không có đặc tính này. Đây chính là đặc điểm quan trọng để

phân biệt với E. coli và Salmonella.

- Đặc tính khác: + Vi khuẩn làm đông vón sữa sau 24 - 72 giờ nuôi cấy ở 370C

+ Vi khuẩn không làm tan chảy gelatin

+ Các phản ứng: Indol, Catalase, MR dương tính; Citrat, Oxidase, VP,

Urease, H2S âm tính. Vi khuẩn E. coli có khả năng khử nitrat thành nitrit, khử

cacboxyl trong môi trường lysine decacboxylase.

1.1.2.4 Sức đề kháng

Vi khuẩn E. coli có sức đề kháng yếu, bị diệt ở nhiệt độ 550C trong 1

giờ hoặc 600C trong 30 phút, đun sôi ở 1000C thì chết ngay. Các chất sát trùng

như axit phenic 3%, HgCl2 0,5%, formol 1-2% có thể tiêu diệt vi khuẩn nhanh

trong 5 phút.

Trong phân, chất độn chuồng ẩm ướt, thiếu ánh sáng mặt trời, vi khuẩn

có thể tồn tại trên 2 tháng. Vi khuẩn E. coli có khả năng đề kháng với sự sấy

khô và hun khói. Những chủng E. coli trong phân có xu hướng đề kháng với

nhiệt cao hơn những chủng phân lập được ở môi trường bên ngoài. Ở môi

trường bên ngoài, các chủng E. coli gây bệnh có thể tồn tại đến 4 tháng

(Gross W. G. 1994) [34].

1.1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli

Vi khuẩn E. coli được chia làm các serotyp khác nhau dựa trên cấu trúc

kháng nguyên O, K, H và F. Cho đến nay, có ít nhất 173 kháng nguyên O, 89

kháng nguyên K, 56 kháng nguyên H đã được xác định (Gyles, 2004) [35];

(Orskov và Orskov, 1992) [67].

1.1.2.5.1 Kháng nguyên O (Somatic antigen)

Kháng nguyên O còn gọi là kháng nguyên thân, bản chất là

polysaccharide. Polysaccharide là một thành phần của lipopolysaccharide, đây

là thành phần cơ bản cấu tạo nên màng ngoài của vi khuẩn gram âm. Kháng

nguyên O có khả năng chịu được nhiệt độ, các chất cồn và axit HCN 1N.

Cấu trúc phân tử lipopolysaccharide gồm 3 phần: gồm chuỗi lipit A,

một vùng lõi và chuỗi polysaccharide (kháng nguyên O). Khi làm mất dần

từng đơn vị đường của các chuỗi polysaccharide hoặc làm thay đổi vị trí ở các

đơn vị này sẽ dẫn đến thay đổi độc lực của vi khuẩn. Thành phần lipit trong

kháng nguyên có tác dụng quyết định độc tính của vi khuẩn E. coli.

Kháng nguyên O không phải là một kháng nguyên đơn (single antigen)

mà gồm một số thành phần và thường được gọi là nhóm kháng nguyên O. Các

nhóm kháng nguyên O khác nhau có thể có một vài thành phần kháng nguyên

chung, và do đó có thể gây phản ứng chéo giữa các nhóm. Phản ứng chéo với

các vi khuẩn khác cũng đã được ghi nhận như Shigella, Salmonella và

Citrobacter (Winkle và cs. 1972) [100].

ình 1.1. ấu trúc hán n uyên O (M i n và M rtin , 2006) [56]. KDO: ketodeoxyoctonate, Hep: hepto, Glu: gluco, Gal: galasto, GluNac: Nacetylglucosamine, GlcN: glucosamine, P: phosphate

1.1.2.5.2 Kháng nguyên H (Flagella antigen)

Kháng nguyên H được cấu tạo bởi thành phần lông của vi khuẩn, có

bản chất là protein. Việc xác định kháng nguyên H chỉ phù hợp khi khả năng

di động của vi khuẩn được thể hiện tốt qua một hoặc vài lần cấy chuyển trên

môi trường bán cố thể. Hầu hết các kháng nguyên H đều có tính đặc hiệu cao,

ít hoặc không có phản ứng chéo. Các chủng không di động được ký hiệu là NM (Non motile) hoặc H-.

Kháng nguyên H kém bền vững hơn so với kháng nguyên O, kém chịu

nhiệt, bị phá hủy trong cồn 50% và các enzyme tiêu hóa protein, không bị tác

động khi xử lý bằng formol 0,5% .

Kháng nguyên H khi gặp kháng thể H tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng

ngưng kết. Phản ứng xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O và các hạt

ngưng kết cũng lớn hơn, giống như những cụm bông. Do vậy, vi khuẩn có

khả năng di động, khi tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thành không

di động.

Kháng nguyên H không có vai trò về độc lực và cũng không có ý nghĩa

trong đáp ứng tạo miễn dịch nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý

nghĩa rất quan trọng trong việc xác định giống, loài của vi khuẩn (Gyles,

2004) [35].

1.1.2.5.3 Kháng nguyên K (Capsular antigen)

Kháng nguyên K còn được gọi là kháng nguyên vỏ bọc, chúng bao

quanh tế bào vi khuẩn và có bản chất hóa học là Polysaccharide. Thông

thường, kháng nguyên K sử dụng để định typ E. coli không gây ngưng kết

với kháng huyết thanh O tương ứng. Việc xác định kháng nguyên K dựa trên

đặc điểm hóa học của kháng nguyên vỏ lipopolysaccharide. Có 3 nhóm kháng

nguyên K đã được sử dụng là L, A và B ; chúng khác nhau về đặc tính kháng

nguyên và khả năng kết hợp với kháng thể khi ở nhiệt độ khác nhau. Kháng nguyên K nhóm B và L vô hoạt sau khi đun ở 1000C trong 1 giờ, trong khi nhóm A sau 1 giờ nhưng ở 1210C. Khả năng kết hợp với kháng thể của nhóm B không bị mất đi sau khi đun ở 1210C trong 1 giờ, trong khi nhóm L thì bị mất sau khi ở 1000C trong 1 giờ. Xác định kháng nguyên K có thể tiến hành bằng

phản ứng ngưng kết trên phiến kính hoặc trong ống nghiệm. Nhưng hiện nay,

kháng nguyên K ít được sử dụng, mà thường sử dụng kháng nguyên O: H.

Một số nhà nghiên cứu cho rằng kháng nguyên K không có ý nghĩa về

độc lực (Pourbakhsh và cs. 1997) [75]; (McPeake và cs. 2005) [60]. Bên cạnh

đó, có công trình nghiên cứu chứng minh kháng nguyên K có ý nghĩa về độc

lực vì chúng tham gia bảo vệ vi khuẩn trước những yếu tố phòng vệ của vật

chủ và giúp gắn kết kháng nguyên bám dính vào tế bào biểu mô nhung mao

ruột dễ dàng (Gyles, 2004) [35]. Kháng nguyên K có tác dụng chống lại sự

thực bào, gồm cả kháng bổ thể trong huyết thanh.

Nói chung, các nghiên cứu đều thống nhất về kháng nguyên K với hai

chức năng sau:

+ Hỗ trợ trong phản ứng ngưng kết kháng nguyên O của vi khuẩn.

+ Tạo ra hàng rào bảo vệ cho vi khuẩn chống lại tác động của ngoại

cảnh và hiện tượng thực bào cũng như các yếu tố phòng vệ khác của vật chủ.

1.1.2.5.4 Kháng nguyên F (Fimbriae antigen)

Hầu hết các chủng E. coli gây bệnh đều có khả năng sản sinh ra một

hoặc nhiều loại kháng nguyên bám dính. Các chủng không gây bệnh thì

không có kháng nguyên bám dính (Carter và cs. 1995) [25]. Kháng nguyên

bám dính giúp vi khuẩn E. coli có thể bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề

mặt tế bào biểu mô ruột và lớp màng nhày, chống lại khả năng đào thải vi

khuẩn do nhu động ruột. Kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E. coli chính

là các cấu trúc pili (hay còn gọi là Fimbriae) có cấu trúc giống sợi lông, ngắn.

Fimbriae có bản chất là protein, bao phủ trên bề mặt ngoài của tế bào vi

khuẩn với số lượng từ 200 - 400/ tế bào vi khuẩn.

Trước khi cấu trúc hóa học của chúng được biết đến, các kháng nguyên

này được gọi là kháng nguyên K như K88 và K99. Tuy nhiên, ngày nay,

chúng được gọi là kháng nguyên bám dính F4 và F5.

1.2 Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC)

Trong số E. coli có khả năng gây tiêu chảy, VTEC được xem là một nhóm

quan trọng gây tiêu chảy có lẫn máu ở người (Levent Akkaya và cs. 2006) [52].

1.2.1 Danh pháp

Mặc dù đã được xác định là các chủng E. coli có khả năng sản sinh độc

tố VT hoặc Shiga-like toxin và được phân loại là nhóm VTEC, nhưng danh

pháp quốc tế của nhóm vi khuẩn này vẫn chưa thống nhất. SLTEC (Shiga-like

toxin-producing Escherichia coli) và STEC (Shiga toxin-producing

Escherichia coli) là những tên gọi khác của VTEC.

1.2.2 Một số yếu tố độc lực của vi khuẩn nhóm VTEC

Nhìn chung, ngoại độc tố VT được coi là yếu tố độc lực của VTEC.

Tuy nhiên, sự có mặt của riêng độc tố VT có thể không đủ gây ra bệnh, những

yếu tố được cho là độc lực khác có thể đóng một vai trò nào đó. Người ta cho

rằng một số yếu tố có liên quan đến khả năng bám dính của VTEC với tế bào

biểu mô ruột, gây nên bệnh tích A/E. Trong những yếu tố này có plasmid 60-

Mda, mã hóa cho yếu tố bám dính - một loại protein màng ngoài (OMP -

Outer membrane protein), có trọng lượng phân tử 94 kDa, có yếu tố intimin

do gen eae quy định tổng hợp.

Trong số các yếu tố này, mới chỉ có VT được xác định rõ vai trò trong

quá trình gây bệnh của VTEC.

1.2.2.1 Độc tố Verocytotoxin (VT)

Konowalchuk và cs. (1977) [46] đã có một công trình nghiên cứu về độc

tố gây độc tế bào (cytotoxin) của E. coli. Các tác giả đặt tên độc tố này là VT

(Verotoxin). Vero là tế bào thận khỉ xanh châu Phi (Cercopithecus aethiops),

thường được dùng trong phòng thí nghiệm, đặc biệt trong các nghiên cứu về

virus học. Theo Konowalchuk, có hai loại độc tố VT: VT1 và VT2. Độc tố VT1

rất giống độc tố của Shigella dysenteriae typ 1 về mọi phương diện, kể cả miễn

dịch học. Trong điều kiện in vitro, có thể dùng kháng độc tố Shiga để trung hòa

VT1. Vì thế, VT1 còn được gọi là độc tố giống độc tố Shiga (SLT). Độc tố VT2

không có liên quan gì về miễn dịch học với độc tố của Shigella dysenteriae typ

1, nhưng cũng có khả năng gây độc tế bào như VT1. Konowalchuk nhận thấy

rằng một số chủng EPEC có khả năng tổng hợp độc tố VT1 và/hoặc VT2, vì

những chủng này gây độc và làm biến dạng tế bào Vero đơn lớp. Tuy nhiên, phát

hiện này chưa được chú ý đến khi một vụ dịch do E. coli O157: H7 xảy ra ở Mỹ,

và vi khuẩn này có khả năng sản sinh VT.

Trong một nghiên cứu độc lập khác, O’Brien và cs. (1993) [66] phát

hiện một loại độc tố do E. coli O26 sản sinh, gây độc cho tế bào Hela và bị

trung hòa bởi kháng huyết thanh kháng độc tố Shiga. Độc tố này được O’Brien

gọi là độc tố gần giống độc tố Shiga. Nhóm tác giả nhận thấy độc tố này giống

độc tố E. coli O157: H7 sản sinh. Do đó, cả hai tên gọi SLT và VT đều chỉ một

loại độc tố.

Tại hội nghị châu Á về bệnh tiêu chảy tại Bangkok năm 1985, các nhà

vi khuẩn học Sri Lanka (Peiris, Mohamed và Perera) [74] khi trình bày kết

quả nghiên cứu các EPEC có nhận định rằng: các chủng E. coli có độc tố VT

thường thấy gây bệnh ở gia súc (trâu, bò), nhưng không có vai trò gì quan

trọng trong bệnh tiêu chảy ở người, ít nhất là ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á.

Trình tự nucleotit của gen chịu trách nhiệm sản sinh VT1 và trình tự

axit amin đã được xác định và so sánh với gen sản sinh độc tố SLT. Mặt khác,

VT2 và các biến thể của nó có những đặc điểm khác biệt với VT1. Mức độ

tương đồng của trình tự nucleotit và axit amin của VT2 và VT1 khoảng 55 -

60%. Các loại VT2 hiện nay đã xác định được gồm có VT2, VT2vha

(VT2va), VT2vhb (VT2vb), VT2vp1 (VT2e) và VT2vp2.

Schmidt và cs. (1994) [82] đã mô tả gen tương tự mã hóa VT2 ở

Citrobacter freundii, được gọi là C. freundii slt-IIcA và slt-IIcB. Những gen

này cũng đã phân lập được từ Enterobacter cloacae - vi khuẩn có liên quan

đến bệnh HUS ở người. Nhóm tác giả này cũng báo cáo rằng VT2 từ C.

freundii không ổn định do độc tố mất hoạt tính, đồng nghĩa với việc mất gen

mã hóa VT trong quá trình cấy chuyển. Các gen giống VT1 cũng đã được

phân lập từ Aeromonas spp. từ bệnh nhân bị tiêu chảy và từ môi trường, có

khả năng gây độc đối với tế bào Vero.

Cấu trúc chung và cơ chế tác động của các độc tố VT giống với độc tố

Shiga. Mỗi độc tố có cấu trúc gồm tiểu phần A - B, 1 tiểu phần A (khoảng 33

kDa) và 5 tiểu phần B (khoảng 7,5 kDa). Tiểu phần A có hoạt tính của một

enzyme, tác động ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào, gồm có dung

giải protein và phá hủy liên kết disulfide. Tiểu phần B có mang vị trí tiếp xúc

của phân tử độc tố với một receptor glycolipid trên màng tế bào.

Stein và cs. (1992) [84] đã xác định cấu trúc tinh thể của tiểu phần B

của VT1 và nhận thấy nó giống với cấu trúc của tiểu phần B của độc tố LT

được sản sinh bởi hầu hết các chủng E. coli. VT là protein không chịu nhiệt,

nhưng khả năng chịu nhiệt của các loại VT khác nhau là khác nhau. VT2e là kém chịu nhiệt nhất, nó mất hoạt tính hoàn toàn khi ở 650C trong 30 phút. VT2d có khả năng chịu nhiệt cao nhất, không mất hoạt tính khi ở 750C trong

60 phút. VT1 và VT2 là những độc tố có khả năng chịu nhiệt trung bình.

Receptor của VT1 và VT2 là Globotriosylceramide (Gb3), của VT2e là

Globotetraosylceramide (Gb4). Gb3 là phức hợp trên màng tế bào nội mạc

quản cầu thận. Cấu trúc và số lượng những receptor đặc hiệu ở những loài và

mô khác nhau tạo nên sự khác nhau về độ mẫn cảm của tế bào, mô hoặc cơ

quan đối với độc tố. Tuy nhiên, nguyên nhân chính gây phá hủy thận trong

bệnh tiêu chảy có liên quan đến HUS vẫn chưa được làm rõ.

Vì ái lực của VT1 đối với Gb3 lớn hơn so với VT2, người ta cho rằng

VT1 gắn với tế bào biểu mô ruột và gây phá hủy các tế bào này cũng như hệ

thống mạch quản ở ruột, trong khi đó, VT2 có ái lực nhỏ hơn với Gb3 do đó

khả năng vào được hệ thống tuần hoàn lớn hơn, theo máu đến các cơ quan, có

thể gây HUS hoặc TTP.

Khi độc tố được gắn với receptor, tiểu phần A sẽ xâm nhập vào trong tế

bào theo cơ chế ẩm bào. Sau đó, nó gây dung giải protein và phá hủy liên kết

disulfide, từ đó ức chế việc tổng hợp yếu tố kéo dài chuỗi gắn với ribosome

của phân tử RNA vận chuyển. Do đó, về cơ bản, sự kéo dài chuỗi peptit bị

ngừng lại, ức chế sự tổng hợp protein, dẫn tới giết chết tế bào đích. Hình 1.2

minh họa quá trình tác động của độc tố VT.

Hình 1.2. ơ chế tác độn củ độc tố V

Các nghiên cứu dịch tễ học trong thời gian gần đây tại Mỹ và Anh đều

chỉ ra rằng bị nhiễm VTEC có thể sản sinh cả hai loại độc tố VT1 và VT2

hoặc chỉ VT2 gây ra các tình trạng bệnh phức tạp hơn so với khi nhiễm các

chủng chỉ sản sinh VT1. Các nhà nghiên cứu đã so sánh khả năng gây độc của

những độc tố này trên chuột. Họ phát hiện VT2 có liều LD50 thấp hơn gần 400

lần so với VT1. Hơn nữa, VT2 bền hơn với nhiệt độ và pH. Độc tính của VT

đã được thí nghiệm trong điều kiện in vitro sử dụng phương pháp nhân nhanh

tế bào nội mạc tĩnh mạch rốn của người. Phương pháp sử dụng tế bào Vero để

đo lường khả năng gây độc bằng tính toán số lượng tế bào hủy hoại, rời ra

khỏi lớp tế bào tầng đơn. Một liều gây độc 50% tế bào đòi hỏi khoảng 1 pg

độc tố. Nó gần tương tự như giá trị CD50 của VT1 và VT2 đối với tế bào Hela.

Khả năng gây độc của từng loại VT cũng khác nhau. Takeda (1995) [86] đã

thống kê hoạt tính sinh học của các loại VT như sau:

Độc tố

CD50 (pg)(-12)

LD50 (ng)(-9)

1,0

Shiga

1,0

VT1

0,75

VT2

VT2vh

2,7

VT2vp 1

VT2vp 2

Bản 1.1: ạt tính sinh học củ các l ại V

Ghi chú : CD50 (đơn vị tính) : Liều gây độc 50% tế bào Vero

LD50 (đơn vị tính): Liều gây chết 50% chuột thí nghiệm

1.2.2.2 Gen eaeA (giúp bám dính và xâm nhập)

Gen eaeA đặc trưng của nhóm EPEC. Gen này đóng vai trò cho việc

gắn tế bào vi khuẩn vào màng tế bào ruột, gây nên bệnh tích đặc trưng A/E.

Một số vi khuẩn thuộc nhóm EHEC cũng gây ra bệnh tích này do chúng có

thể có gen eae. Vị trí gắn của các tế bào vi khuẩn dẫn tới sự phá hủy các lông

rung và hệ xương của tế bào chủ. Beebakhee và cs. (1992) [13] đã giải trình

tự gen eae của serotyp O157: H7 và thấy có sự tương đồng với gen này của

nhóm EPEC. Các tác giả cũng khẳng định sự tương đồng tới 50% với gen eae

của Yersinia pseudotuberculosis. Tương tự, Yu và Kaper (1992) [93] cho rằng

gen eae có thể mã hóa cho một protein ngoài màng có trọng lượng phân tử 94

kDa (OMP). Tuy nhiên, Dytoc và cs. (1994) [29] khẳng định gen eae khác so

với gen mã hóa cho OMP (sử dụng phương pháp giải trình tự peptit và miễn

dịch học). Các tác giả quan tâm đến các yếu tố khác đã xác định được độc

tính hơn là gen eae và plasmid 60 - Mda, như CL8 - 57JB, Cl8 - 106JB, là

những protein bị bất hoạt nếu có sự đột biến của gen TnphoA. Dytoc và cs.

(1994) [29] đã có báo cáo về sự khác nhau của khả năng bám dính giữa

serotyp O113: H21 (không có gen eae) và O157: H7. Allerberger và cs.

(1996) [12] cũng đã phân lập thêm hai chủng VTEC không thuộc nhóm

O157: H7 và không mang gen eae từ những trẻ em bị tiêu chảy xuất huyết.

Các tác giả cho rằng chúng có thể mang yếu tố bám dính khác mà chưa được

xác định rõ.

Một nghiên cứu về khả năng gây tiêu chảy của E. coli O157: H7 sử

dụng lợn con làm động vật gây nhiễm đã được Donnenberg và cs tiến hành

năm 1993 [27]. Các tác giả cho rằng một sự đột biến của gen eae ở chủng vi

khuẩn này có thể hạn chế khả năng bám dính của vi khuẩn. Hơn nữa, khi gen

eae ở các vi khuẩn thuộc nhóm EPEC hoặc EHEC được bộc lộ, khả năng bám

dính sẽ được phục hồi. McKee và O’Brien (1996) [60] đã xác định được yếu

tố intimin - sản phẩm của gen eae. Intimin là một protein ngoài màng, trọng

lượng phân tử 97 kDa, đóng vai trò quan trọng trong quá trình bám dính của

E. coli O157: H7. Kết luận này được khẳng định bằng phân tích cấu trúc -

chức năng của gen eae và bằng phương pháp chặn sự bám dính của vi khuẩn

vào tế bào HEp-2 sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu của intimin.

Louie và cs. (1994) [54] nghiên cứu gen eae ở VTEC phân lập từ trâu

bò bị tiêu chảy nặng và từ người bị HUS hoặc HC và đã kết luận rằng 82%

VTEC phân lập từ người và 59% phân lập từ trâu bò có mang gen eae. Mainil

và cs. (1993) [57] nhận thấy rằng 75% các chủng E. coli phân lập từ trâu bò bị

tiêu chảy có gen eae là VTEC. Sandhu và cs. (1996) [81] nghiên cứu về gen

eae ở các chủng VTEC phân lập được từ trâu bò khỏe mạnh, kết quả có

35,2% số chủng VTEC có gen này và hầu hết đều thuộc các nhóm kháng

nguyên O chính. Kết quả tương tự cũng được ghi nhận ở nghiên cứu của

Wieler và cs. (1996) [97]. Cấu trúc gen eae ở E. coli O157 được nghiên cứu

bằng phương pháp lai mẫu dò DNA. Kết quả cho thấy tất cả các chủng VTEC

O157 đều có phản ứng bắt cặp với mẫu dò gen eae. Tuy nhiên, trong 129

E. coli O157 không sản sinh VT, 10 chủng vẫn có phản ứng với mẫu dò gen

eae. Beutin và cs. (1994) [19] đã nghiên cứu các yếu tố độc lực của các chủng

VTEC phân lập được từ người. Trong 54 chủng, 94% có gen eae. Tuy nhiên,

Schmidt và cs. (1994) [82] cho rằng không nên sử dụng mồi eae mà sử dụng

mồi VT để xác định VTEC. Kết quả của nhóm tác giả này chỉ ra 2 trong 6

VTEC không phản ứng với mồi eae, 3 trong 7 chủng E. coli có gen eae không

phản ứng với mồi VT. Các chủng VTEC phân lập được từ phân người và thực

phẩm có nguồn gốc động vật ở Úc cũng có gen eae và kết quả này được công bố trong nghiên cứu của Paton và cs. (1996) [70]. VTEC chủng O111: H- và O157: H- phân lập được từ bệnh nhân bị HUS và HC cũng dương tính với

eae. Nhưng, chủng O91, O123 và O128 phân lập được từ bệnh nhân HC cho

kết quả âm tính với eae. Kết quả trên cho thấy vai trò của gen eae trong cơ

chế gây bệnh của vi khuẩn vẫn chưa được khẳng định chắc chắn và cần thêm

nhiều nghiên cứu nữa về yếu tố này.

1.2.2.3 Plasmid 60 - Megadalton

Karch và cs. (1987) [45] là nhóm tác giả đầu tiên quan sát và nghiên

cứu về plasmid 60 - Megadalton (MDa) ở E. coli O157: H7 phân lập được từ

bệnh nhân bị HC và HUS. Mặc dù được phát hiện từ 13 trong 14 chủng

E. coli O157: H7 phân lập được nhưng vai trò của yếu tố này trong quá trình

gây bệnh chưa được làm rõ khi thí nghiệm với lợn con gây nhiễm. Do đó,

mặc dù có mặt ở các chủng O157: H7, vai trò gây độc của yếu tố này vẫn

chưa được kết luận đầy đủ.

1.2.2.4 Độc tố gây xuất huyết ruột (Enterohaemolysin)

Một vài chủng có khả năng gây dung huyết đã được xác định trong các

nhóm E. coli khác nhau. Gây xuất huyết ruột là một đặc điểm điển hình của

nhóm EHEC. Schmidt và cs. (1994, 1995) [82][83] cho biết hiện tượng xuất

huyết ruột là kết quả của sự có mặt của một loại protein - đó là protein gây

xuất huyết ruột EHEC (EHEC Hly - EHEC haemolysin protein). EHEC - Hly

được mã hóa bởi một plasmid lớn, liên quan tới dung huyết kiểu alpha.

Schmidt và cs. (1995) [83] cũng đã xây dựng phương pháp PCR để xác

định EHEC - hlyA. Khoảng 90% VTEC có khả năng sản sinh độc tố này. Hầu

hết các chủng VTEC gây xuất huyết ruột (98,4%) phân lập từ động vật đều có

trình tự DNA đặc hiệu cho plasmid mã hóa độc tố xuất huyết ruột. Để xác

định yếu tố này, sử dụng thạch máu cừu có bổ sung Canxi (WSBA-Ca : Wash

sheep blood agar with Calcium). Sau 4 giờ nuôi cấy, nếu quan sát thấy hiện

tượng dung huyết là dung huyết kiểu alpha ; còn nếu để qua đêm mới quan sát

thấy hiện tượng dung huyết thì chỉ chứng tỏ sự có mặt của độc tố xuất huyết

ruột. Do có sự liên quan chặt chẽ giữa sự sản sinh VT và độc tố gây xuất

huyết ruột nên sự biểu hiện của độc tố này là một đặc điểm tốt cho việc xác

định nhanh và đơn giản các chủng VTEC. Sự tồn tại của EHEC - Hly ở

EHEC là một đặc điểm quan trọng vì nó có ở mọi chủng O157 phân lập được

từ bệnh nhân HUS và từ mọi chủng VTEC phân lập được từ trẻ em bị HC.

1.2.3 Vai trò của VTEC không thuộc nhóm O157

Mặc dù các triệu chứng của các bệnh nghiêm trọng ở người như HC và

HUS hầu hết đều liên quan đến các chủng O157 (Beutin và cs. 1994) [19], vẫn

còn một số trường hợp bệnh lẻ tẻ do các chủng không thuộc nhóm O157 gây ra.

Có hơn 30 nhóm kháng nguyên O hoặc 100 serotyp O: H khác nhau

được cho là có liên quan tới một số ca bệnh HUS và HC ở người (Paton và cs.

1996) [70]. Đó là các nhóm O1, O2, O4, O5, O6, O18, O22, O23, O25, O26,

O38, O39, O45, O48, O50, O55, O73, O75, O82, O84, O91, O100, O103,

O104, O111, O113, O114, O115, O117, O118, O119, O121, O125, O126,

O128ab, O132, O145, O146, O153, O163, O165, O166 và một số chủng chưa

được định typ khác. Các VTEC khác không thuộc nhóm O157 nên được chú ý

hơn ở một số quốc gia. Ví dụ nguyên nhân thường gặp của HUS là các chủng không thuộc nhóm O157 như O104: H2 ở Pháp, O111: H- ở Úc. Trước đây, đã

có một sự nhầm lẫn khi cho rằng chỉ những chủng E. coli O157 không lên men

sorbitol mới thuộc nhóm EHEC, do đó đã có rất nhiều chủng EHEC quan trọng

bị bỏ qua. Có rất nhiều chủng EHEC phân lập được từ các trẻ em bị HUS như O6: H31, O26: H11, O91: H10, O98: H-, O111: H-, O111: H12, O146: H8, O157: H-,… (Hanna Evelina Sidjabat-Tambunan, 1997) [38].

Cũng đã có một số báo cáo về các vụ dịch do VTEC không thuộc nhóm O157 gây ra. Năm 1992, ở Italia, O111: H- đã gây ra nhiều ca bệnh HUS. Ở

Úc, báo cáo ca bệnh HUS đầu tiên do VTEC gây ra là vào năm 1987. Kiểm tra

mẫu phân, các bác sỹ đã phân lập được chủng E. coli O111: H2. Pryor và cs.

(1990) [76] phân lập được O111 từ các bệnh nhân bị HC, mà trong đó không

sử dụng phương pháp phân lập các chủng O157 không lên men sorbitol. Ở Úc, Paton và cs. (1996) [70] kết luận chủng O111: H- là nguyên nhân gây ra một vụ

dịch HUS ở Adelaide, Nam Úc, liên quan tới việc sử dụng nước sốt lên men.

Các chủng vi khuẩn này đã gây chết một người, 23 trẻ em phải nhập viện và 18

trẻ em bị HUS. Chủng vi khuẩn này đã được phân lập từ mẫu phân của 18

trong số 23 bệnh nhân và từ 4 trong 5 mẫu nước sốt. Do đó, chủng O111 trở thành nguyên nhân gây HC và HUS chủ yếu ở Úc. Ở Đức, chủng O111: H- là

chủng không thuộc nhóm O157 thường gặp nhất liên quan tới HUS ở trẻ em.

Có một số chủng E. coli không thuộc nhóm O157, không lên men đường

sorbitol, là nguyên nhân gây HUS, như O104: H21 ở Montana (Mỹ). Ở Đức, từ

1988 - 1989, từ 91% bệnh nhân HUS đã phân lập được E. coli O157. Tuy

nhiên, năm 1994, một số chủng khác phân lập được thường xuyên hơn chủng

O157. Điều này đưa ra một gợi ý về sự dịch chuyển dịch tễ học hướng về các

chủng khác hơn là về O157 và có thể xảy ra ở các quốc gia khác nhau. Ở Úc, tỷ

lệ phân lập O157 và các chủng khác ở trẻ em là tương đương nhau. Các chủng O157: H- lên men sorbitol cũng đã được phân lập từ 21 bệnh nhân HUS ở Đức

năm 1988. Ngoài ra, kiểu gen và kiểu hình của chúng giống với các chủng

O157: H7 lên men sorbitol. Ở Canada, VTEC O26: H11 là chủng phổ biến thứ

hai sau O157: H7. Serotyp này thường gặp ở trâu bò, bê bị tiêu chảy và đã

được báo cáo ở nhiều nước trên thế giới, nhưng không nhiều ở Nhật Bản, Anh,

Argentina. Ở người, VTEC O26: H11 gây một vài trường hợp bệnh riêng lẻ và

một số ca bệnh tiêu chảy, HC và HUS (Lai king và cs. 2005) [48].

Nhiều chủng không thuộc nhóm O157 có nhiều yếu tố độc lực như sản

sinh độc tố VT, gen eae, plasmid EHEC và độc tố gây xuất huyết ruột, do

vậy, chúng được xếp vào nhóm EHEC. Tuy nhiên, nhiều vi khuẩn thuộc

nhóm EHEC thiếu một hoặc nhiều yếu tố độc lực nhưng vẫn gây HUS và HC.

Liều gây nhiễm của các chủng không thuộc nhóm O157 cũng tương đương

với chủng thuộc nhóm O157. Có thể chỉ với một số lượng rất nhỏ, dưới 10 vi

khuẩn cũng có thể gây ra những bệnh trầm trọng ở người mẫn cảm. Do đó,

các chủng VTEC không thuộc nhóm O157 gây bệnh HUS và HC ở người

cũng cần được chú ý như VTEC O157 (Hanna Evelina Sidjabat-Tambunan,

1997) [38].

1.2.4 VTEC ở động vật

Carlton (2004) [24] cho rằng tỷ lệ VTEC ở động vật dao động khoảng

6% - 100%. Các nghiên cứu đều cho thấy hầu hết các đàn gia súc đều có

O157 cũng như các VTEC khác nhưng hiện có ít thông tin về các yếu tố ảnh

hưởng tới sự thải VTEC ra ngoài môi trường của động vật.

1.2.4.1 VTEC O157 ở động vật

Thông thường, E. coli O157 có thể được tìm thấy trong đường tiêu hóa

của một số loài như trâu bò, cừu, gia cầm, trong đó trâu bò đóng vai trò là

nguồn tàng trữ chính (Levent Akkaya và cs. 2006) [52].

Trên thế giới, đặc biệt ở Mỹ, đã có nhiều nghiên cứu về E. coli O157:

H7 ở vật nuôi, thường trên trâu bò. Hancock và cs. (1994) [37] thấy rằng chỉ có

10 trong 3.570 (0,28%) mẫu phân bò sữa và 10 trong 1.412 (0,71%) mẫu phân

bò thịt có chứa E. coli O157: H7. Zhao và cs. (1995) [94] đã tiến hành xác định

sự tồn tại của E. coli O157: H7 trên bê ở các đàn bò sữa. Nhóm nghiên cứu đã

sử dụng các đàn bò đã phân lập được E. coli O157: H7 trước đó làm đàn thí

nghiệm, ở các đàn này tỷ lệ dương tính với vi khuẩn cao hơn so với đàn đối

chứng (50% và 22%). Tương tự, tỷ lệ phân lập phụ thuộc vào lứa tuổi của động

vật. Tuy nhiên, không có sự khác nhau về lứa tuổi giữa đàn đối chứng và đàn

thí nghiệm. Bê sau cai sữa 4 tháng thường thải E. coli O157: H7 theo phân, với

tỷ lệ phân lập từ các mẫu phân ở đàn thí nghiệm là 5,3% và 4,9% ở đàn đối

chứng. E. coli O157: H7 phân lập được từ những bê trong độ tuổi từ 24 giờ sau

khi sinh đến cai sữa là 1,5% ở đàn đối chứng và 2,9% ở đàn thí nghiệm. Một

nghiên cứu bệnh chứng của Garber và cs. (1995) [33] cũng cho kết quả tương

tự. Họ nhận thấy E. coli O157: H7 phân lập được ở các bê nuôi lấy sữa thường

là những bê sau cai sữa (4,8%) hơn là trước cai sữa (1,4%).

Trong một nghiên cứu khác, Faith và cs. (1996) [31] đưa ra kết luận tỷ

lệ E. coli O157: H7 ở đàn bò sữa là 7% và ở các động vật khác là 1,8%. Hơn

nữa, các tác giả này cũng kết luận rằng: bò cái tơ và trâu là nguồn tàng trữ

E. coli O157: H7 quan trọng giống như bê. Ở Anh, Mechie và cs. (1997) [61]

nghiên cứu tỷ lệ E. coli O157: H7 ở một đàn bò sữa đã dương tính với vi

khuẩn này trước đó trong một thời gian khoảng 15 tháng. Kết quả là tỷ lệ vi

khuẩn này trong khoảng từ 0% vào mùa đông và đạt cao nhất là 14% ở bò

đang tiết sữa, 40% ở bò cạn sữa, 56% ở bê và 68% ở bò cái tơ vào đầu mùa hè.

Kết quả tương tự cũng thu được khi nghiên cứu trên cừu và trên bò thịt. Kudva

và cs. (1997) [47] thấy tỷ lệ E. coli O157: H7 ở cừu trong khoảng từ 0% (vào

mùa đông) đến 30% (vào mùa hè). Các kết quả trên cho thấy tỷ lệ E. coli O157:

H7 ở bò và cừu có ý nghĩa quan trọng và phụ thuộc vào mùa trong năm.

E. coli O157: H7 không gây bệnh cho bê từ 3 tuần tuổi trở lên. Tính

gây bệnh của vi khuẩn có liên quan đến tuổi, bê ở giai đoạn dưới 36 giờ sau

khi sinh bị gây nhiễm E. coli O157: H7 ở giai đoạn 18 giờ sau khi sinh thấy

có biểu hiện tiêu chảy, viêm ruột, có bệnh tích A/E ở cả ruột non và ruột

già. Không có bằng chứng cho thấy E. coli O157: H7 không gây bệnh ở bê

đã cai sữa.

Một số thí nghiệm khác cho thấy E. coli O157: H7 không gây bệnh cho

bê. Vi khuẩn không phát triển ở niêm mạc đường tiêu hóa, nhưng có thể tồn

tại trong chất chứa dạ cỏ và kết tràng, có thể phát hiện theo từng đợt trong

phân một thời gian dài. Rasmussen và cs. (1993) [77] nhận thấy chất chứa dạ

cỏ đặc biệt ở những trâu bò lớn nhanh là một nguồn chứa E. coli O157: H7.

Hơn nữa, vi khuẩn này có khả năng tồn tại một thời gian ngoài đường tiêu hóa

có thể là một nguyên nhân gây ra các vụ dịch liên quan đến sử dụng rau được

bón phân trâu bò. Tương tự, các hoạt động sống của động vật và việc sử dụng

chung nước uống, thức ăn trong chuồng có thể có tác động làm lây lan vi

khuẩn trong đàn. Hơn nữa, nước uống bị nhiễm vi khuẩn còn là một nguồn

tàng trữ và lan truyền E. coli O157: H7.

Khi nghiên cứu về E. coli O157: H7 trên thịt gà ở Thổ Nhĩ Kỳ, Levent

Akkaya và cs. (2006) [52] cho rằng vi khuẩn này có trong đường ruột của gà

và được thải ra ngoài theo phân trong vài tháng. Sau đó, từ những gà này,

E. coli O157: H7 có thể nhiễm chéo sang các gà hoặc thịt gà trong quá trình

vận chuyển và/hoặc quá trình giết mổ; bằng chứng là tỷ lệ dương tính 1,05%

trong số 190 mẫu thịt gà được kiểm tra trong nghiên cứu. Việc phân lập được

E. coli O157: H7 trên thịt gà cho thấy gà nói riêng và gia cầm nói chung có

thể là một nguồn tàng trữ khác, dễ dàng lây nhiễm sang người nếu không có

các biện pháp kiểm soát nghiêm ngặt.

1.2.4.2 VTEC không thuộc nhóm O157 ở động vật

Có nhiều nghiên cứu về VTEC ở động vật đã được tiến hành. Cray và

cs. (1996) [26] đưa ra tỷ lệ 5,9% của 1.305 chủng E. coli phân lập được từ

phân của bò cái tơ là VTEC. Ở Đức, Beutin và cs. (1993) [18] đã nghiên cứu

về VTEC ở 7 loài khác nhau. VTEC thường phân lập được từ cừu (66,6%)

hơn là từ dê (56,1%) và trâu bò (21,1%) và thấp hơn nữa là ở lợn (7,5%), mèo

(13,8%) và chó (4,8%). Không phân lập được chủng nào từ gà. Ở Tây Ban

Nha, phân lập được VTEC từ 35% bò khỏe mạnh và 37% bê khỏe mạnh. Ở

Canada, VTEC thường phân lập được ở bê nuôi lấy sữa (24,7%) hơn là từ bò

sữa trưởng thành (9,5%). Ở Italia, VTEC phân lập được từ 18,3% bê nuôi lấy

sữa và 7,8% lợn.

Một nghiên cứu về tỷ lệ VTEC từ các chủng E. coli phân lập được từ

vật nuôi bị bệnh ở Mỹ chỉ ra rằng 2,8% các chủng E. coli phân lập từ bò,

6,1% từ cừu, 4% từ lợn là VTEC. Ở Tây Ban Nha, VTEC thường phân lập

được từ bê bị tiêu chảy (20,5%). Nghiên cứu này cũng cho biết các chủng

khác không thuộc nhóm O157 có tỷ lệ phân lập trội hơn ở cả trâu bò bị tiêu

chảy và khỏe mạnh. Hơn nữa, trong 126 chủng VTEC phân lập được có 27

nhóm kháng nguyên O khác nhau đã được xác định; trong khi đó con số này ở

Đức là 16 nhóm (trong 28 chủng). Tuy nhiên, ở Mỹ, Cray và cs. (1996) [26]

chỉ thấy 18 nhóm kháng nguyên O khác nhau trong 77 chủng VTEC phân lập

từ phân bò cái tơ.

60% các chủng VTEC không thuộc nhóm O157 phân lập từ trâu bò có

khả năng gây bệnh cho người, đặc biệt các bệnh nặng như HC và HUS.

Montenegro và cs. (1990) [65] cho rằng tỷ lệ này chỉ khoảng 40% trong khi

Blanco và cs. (2006) [20] cho rằng tỷ lệ này thay đổi từ 45% vào năm 1994

đến 60% năm 1997. Beutin và cs. (1993) [18] thấy rằng 60% VTEC phân lập

từ 7 loài vật nuôi khỏe mạnh có khả năng gây bệnh cho người. Hiện nay,

VTEC O26 thường phân lập được từ trâu bò và có các đặc tính giống với các

chủng phân lập được ở người (Wieler và cs. 1996) [97]. Mặc dù, cho tới nay

vẫn chưa có bằng chứng cụ thể rằng các chủng O26 có nguồn gốc từ trâu bò

gây bệnh cho người (Jenkins và cs. 2003) [43]. Nhóm vi khuẩn này đã được

cảnh báo là nguyên nhân gây nhiều bệnh ở người và được cho có liên quan tới

một vụ dịch lớn ở Ireland (McMaster và cs. 2001) [59].

Một nghiên cứu về các yếu tố độc lực của VTEC trên động vật cho

thấy 57% VTEC có gen VT1, 28% có gen VT2 và 15% có cả 2 gen. Bloton

và cs. (1996) [21] cho rằng 10% số VTEC phân lập được có mang gen gây

bệnh tích A/E.

1.2.5 VTEC trong thực phẩm

Có nhiều vụ dịch do VTEC đã xảy ra ở nhiều quốc gia, trong đó

nguyên nhân chính là do sử dụng thực phẩm bị ô nhiễm, chủ yếu là các thực

phẩm có nguồn gốc từ bò. Sử dụng bánh hamburger nhân thịt bò là nguyên

nhân chính gây ra các vụ dịch ở Anh, Mỹ và Canada. Ngoài ra, cũng đã xảy ra

một vài vụ dịch liên quan đến sữa và các sản phẩm từ sữa, như sữa tươi, sữa

chua, nước táo chưa tiệt trùng. EHEC đã được khẳng định là nguyên nhân gây

bệnh trong một vụ dịch có liên quan đến nước uống. Các vụ dịch thường xảy

ra ở những nơi công cộng, trung tâm chăm sóc sức khỏe, trường học,... Chế

biến thực phẩm không đúng cách như nhiệt độ nấu thức ăn chưa đảm bảo,

nhiễm từ các dụng cụ sử dụng chế biến thực phẩm tươi và thực phẩm đã nấu

chín là những cách thức phổ biến gây ra các vụ dịch.

Sự có mặt của VTEC trong thực phẩm đã được khẳng định ở nhiều quốc

gia. Ở Mỹ, chủng O157: H7 phân lập được từ 3,7% mẫu thịt bò xay, từ 1,5%

mẫu thịt gia cầm, 1,5% mẫu thịt lợn và 2% mẫu thịt cừu. Ở Ai Cập, E. coli

O157: H7 có trong 6% mẫu thịt bò, 4% thịt gà, 4% thịt cừu và 6% mẫu sữa.

Ở Mỹ, Willshaw và cs. (1993) [98] phát hiện 17% mẫu thịt bò tươi có

VTEC. VTEC cũng được phân lập ở Canada từ thịt bò (10,4%) và thịt lợn

(3,8%). Samadpour và cs. (1994) [79] sử dụng mồi của gen VT để xác định

sự có mặt của VTEC trong các thực phẩm bán trên thị trường ở Seattle,

Washington. Kết quả là 23% mẫu thịt bò, 18% mẫu thịt lợn, 48% mẫu thịt

cừu, 12% mẫu thịt gà, 7% thịt gà tây, 10% cá, 5% sứa có kết quả dương tính.

Tuy nhiên, chỉ thu được VTEC từ 12 mẫu (23,5%) có phản ứng dương tính

với gen VT.

Mặt khác, liều gây nhiễm của VTEC O157 rất thấp. Bolton và cs.

(1996) [21] báo cáo rằng từ liều rất thấp như 0,3 đến 2.300 CFU/g đã phân lập

được từ các mẫu thực phẩm có liên quan tới các ca tiêu chảy ở người. Chỉ cần

1 VTEC trong 10g nước sốt lên men cũng có thể gây HUS. Liều gây nhiễm

thấp nhất là một lợi thế vì chủng vi khuẩn này có thể tồn tại trong môi trường

axit. Benjamin và Datra (1995) [15] thấy E. coli O157: H7 tồn tại trong môi trường axit, pH 3,0 và 2,5 trong ít nhất 5 giờ ở 370C. Khả năng kháng axit của

vi khuẩn này giống Shigella flexneri, Buchanan và Edelson (1996) [22] cũng

đã quan sát khả năng kháng axit của vi khuẩn này trong điều kiện có hoặc

không có glucose.

Khả năng tồn tại của VTEC O157: H7 và độc tố trong thực phẩm đã

được nghiên cứu. VT1 được vi khuẩn sản sinh trong thịt bò xay nhiều hơn

trong sữa, hơn nữa, điều kiện bao gói, bảo quản thông thường dường như

không ảnh hưởng tới việc sản sinh VT1.

1.2.6 Nhiễm VTEC ở người

Kể từ khi được phân lập lần đầu tiên trong một vụ dịch tiêu chảy lớn ở

người vào năm 1982, E. coli O157: H7 đã được tìm thấy trong hàng trăm ca

bệnh riêng lẻ cũng như trong các vụ dịch lớn ở hơn 30 quốc gia trên thế giới.

Do vi khuẩn này có liều gây nhiễm thấp cộng với khả năng gây các trường

hợp bệnh nguy hiểm và phức tạp, E. coli O157: H7 được xem như một vấn đề

ảnh hưởng nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng. Hầu hết các vụ dịch ở

người đều có liên quan tới thức ăn và/hoặc nước uống (Levent Akkaya và cs.

2006) [52]; tuy cũng có một số bằng chứng cho thấy một số trường hợp

truyền từ người sang người, và truyền từ động vật sang người (Hanna Eveline

Sidjabat-Tambunan, 1997) [38].

VTEC, đặc biệt chủng O157: H7 được khẳng định có khả năng gây một

số bệnh nghiêm trọng ở người, thường gây chết. Trẻ em, người già và người

suy giảm miễn dịch là những đối tượng dễ bị nhiễm nhất.

Đặc biệt, hầu hết các trường hợp nhiễm VTEC đều xảy ra vào mùa hè.

64 - 81,7% trường hợp nhiễm VTEC vào mùa hè ở Alberta, Canada và

Scotland. Tương tự, ở Italia, giai đoạn từ tháng 3 đến tháng 10 năm 1993,

Tozzi và cs. (1994) [90] ghi nhận một vụ dịch HUS xảy ra trên 14 trẻ em do E.

coli O157 và/hoặc O111. Ở Úc, trong 49 ca HUS được báo cáo trong năm 1994

- 1995 có 38 ca xảy ra vào những tháng hè (tháng 12/1994 đến tháng 2/1995).

Tuy nhiên, chỉ có 5 trong 14 mẫu phân được kiểm tra dương tính với VTEC.

Ở Anh, các chủng VTEC O157: H7 và O157: H- (không di động) là

các chủng thường gặp nhất trong số các trường hợp bệnh ở người

(Willshaw và cs. 2001) [99]. Số bệnh nhân bị HUS chiếm 12% các ca

nhiễm VTEC. Tỷ lệ chết là 4%.

Ở Mỹ, tỷ lệ người bị tiêu chảy lẫn máu, sau đó tiến triển thành HUS hoặc

TTP là 3,6% ; tỷ lệ chết là 1,9%. Trong một vụ dịch do O157: H7 ở Nhật Bản,

33% trẻ em bị nhiễm tiến triển thành HUS, 50% trẻ em bị tiêu chảy và không có

biểu hiện triệu chứng khác. Trong một nghiên cứu ở Tây Úc, tỷ lệ người bị suy

thận mãn và chết lần lượt là 20% và 9,7% (Lai king và cs.2005) [48].

Nhiễm các chủng VTEC thuộc các nhóm kháng nguyên O khác như

O26, O103, O111 và O145 ngày càng được phát hiện nhiều hơn ở các quốc

gia khác nhau (Jenkins và cs. 2003) [43]. Cũng trong nghiên cứu này, các tác

giả nhận thấy VTEC O145 được tìm thấy nhiều nhất ở nhóm các bệnh nhân bị

HUS. Và ở nhóm bệnh nhân bị tiêu chảy nhưng không bị tiến triển thành

HUS thì O26 là nhóm được tìm thấy nhiều hơn cả (trừ nhóm O157).

Gần đây nhất, tháng 6 năm 2011, một đợt dịch do E. coli đã bùng phát

tại Đức và nhanh chóng lan ra các quốc gia châu Âu khác. WHO cho biết,

trên phạm vi toàn thế giới có hơn 1.270 ca nhiễm và 552 ca tiến triển thành

HUS; con số tử vong lên tới 18 người bao gồm 17 trường hợp ở Đức và 1

trường hợp ở thụy Điển. Nguyên nhân của đợt dịch được xác định là do rau

quả bị nhiễm E. coli O104. Vụ dịch này gây tổn thất nặng nề tới các nền kinh

tế thuộc liên minh châu Âu (EU), ước tính mỗi tuần người nông dân tại đây

thất thu 200 triệu euro (tương đương 290 triệu USD). Cũng trong thời gian

này, tại Nhật Bản, ít nhất 20 người đã bị nhiễm vi khuẩn E. coli sau khi ăn tại

một nhà hàng đồ nướng kiểu Hàn Quốc tại thủ đô Tokyo. Trong đó 15 người

bị nhiễm E. coli O157. Nguyên nhân của các ca bệnh này là do họ đã sử dụng

đũa nấu thịt sống để ăn.

1.3 ình hình n hiên cứu về vi huẩn E. coli và bệnh chún ây r

tại Việt m

Các báo cáo về các vụ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E. coli gây ra tại

Việt Nam cũng đã được công bố. Năm 2004, các nhà nghiên cứu Việt - Úc đã

tiến hành nghiên cứu để biết tần số hiện diện của E. coli trong thực phẩm (Thi

Thu Thao Van, 2007) [89]. Trong nghiên cứu này, 50 mẫu thịt bò, 30 mẫu thịt

gà, 50 mẫu thịt heo, và 50 mẫu hải sản (tôm, sò, cua, ghẹ, v.v…) từ các chợ ở

Thành phố Hồ Chí Minh đã được nghiên cứu. Phát hiện trên 90% các mẫu thịt

và hải sản chứa E. coli, nhưng chưa xác định được cụ thể là loại E. coli nào.

Ngoài ra, trong nghiên cứu này có đến 61% các mẫu thịt và 18% các mẫu hải

sản bị nhiễm khuẩn Salmonella spp.

Một nghiên cứu khác, 258 con lợn ở Cần Thơ vào năm 2002

(Kobayashi, 2003) cho thấy khoảng 9% phân heo bị nhiễm E. coli (phần

lớn là AEEC và VTEC).

Trong một nghiên cứu ở làng Yên Sở (Hà Nội) các nhà nghiên cứu theo

dõi 636 người (tuổi từ 15 đến 70) thuộc 400 gia đình từ tháng 11/2002 đến

tháng 5/2004 ( Do Thuy Trang, 2007) [30]. Trong thời gian khoảng 2,5

năm đó, họ ghi nhận có 196 người (~31%) bị tiêu chảy. Để tìm hiểu vi

khuẩn nào gây bệnh, các nhà nghiên cứu chọn 163 người mắc bệnh và 163

người không mắc bệnh, các mẫu phân cho thấy có khoảng 14% bệnh nhân

tiêu chảy bị nhiễm vi khuẩn E. coli, nhưng trong nhóm người không mắc bệnh

tiêu chảy vẫn có khoảng 10% nhiễm vi khuẩn E. coli. Ngoài ra, qua phân tích

trong nghiên cứu này, phần lớn vi khuẩn gây tiêu chảy là EAEC và

AEEC/EPEC, nhưng vì số lượng còn thấp nên chưa kết luận gì về ảnh hưởng

của hai loại vi khuẩn này đến tiêu chảy.

Trong một nghiên cứu ở trẻ em tại Hà Nội cho thấy vi khuẩn E. coli có

liên quan trực tiếp đến bệnh tiêu chảy. Trong nghiên cứu này, các nhà nghiên

cứu Việt - Thụy Điển sử dụng mô hình nghiên cứu bệnh chứng (case-control

design), với 249 trẻ em (dưới 5 tuổi) mắc bệnh tiêu chảy và 124 em không

mắc bệnh tiêu chảy. Qua kiểm tra phân, họ phát hiện trong nhóm tiêu chảy, số

trẻ em bị nhiễm E. coli là 26%, cao hơn nhóm không tiêu chảy (tỉ lệ nhiễm là

10,5%). Nói cách khác, trẻ em nhiễm E. coli có nguy cơ mắc bệnh tiêu chảy

cao gần 3 lần so với trẻ em không nhiễm (Bui Thi Thu Hien, 2008) [23]. Các

vi khuẩn này thuộc 3 nhóm chính là: AEEC (chiếm 39% trong tổng số

E. coli), EAEC (chiếm khoảng 1/3), và ETEC (chiếm 15%).

Các nghiên cứu về vi khuẩn E. coli và bệnh do chúng gây ra ở gia súc

(lợn, bê) cũng đã được nhiều tác giả tập trung nghiên cứu, nhưng các công

trình này chủ yếu đi sâu nghiên cứu về vi khuẩn thuộc nhóm Enterotoxigenic

E. coli (Đỗ Ngọc Thúy 2004) [8].

1.4 Ph ơn pháp phát hiện V E tr n m u bệnh phẩm và thực phẩm

Có thể chia các phương pháp phát hiện VTEC thành 3 nhóm:

- Phương pháp vi sinh vật

- Phương pháp miễn dịch học

- Phương pháp sinh học phân tử

1.4.1 Phương pháp vi sinh vật

Phương pháp phân lập trực tiếp VTEC thông qua nuôi cấy mẫu bệnh

phẩm hoặc thực phẩm vẫn chưa được thiết lập, trừ nhóm O157 vì nó có những

đặc điểm sinh hóa riêng, phân biệt với các chủng khác. Các môi trường thạch

chọn lọc, dựa trên hiện tượng không lên men sorbitol của O157 hoặc không có

beta-glucuronidase hoạt hóa. Môi trường chọn lọc là môi trường được bổ sung

thêm Cefixime và Rhamnose. Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy trực tiếp nhằm phân

lập nhanh VTEC dựa trên hiện tượng dung huyết đã được báo cáo. Phương

pháp này có sự chính xác cao vì 90% VTEC được kiểm tra đều gây dung huyết.

Hiện nay, đã có một số loại môi trường bồi dưỡng cho phép VTEC

nhân lên đạt tới số lượng có thể phát hiện được như mTSB (modified

Trypticase Soy Broth) có bổ sung thêm Novobiocin hoặc Acriflavine để làm

giảm sự phát triển của các vi sinh vật Gram âm khác đã được sử dụng tốt. Một

môi trường khác là BPW (Buffered Pepton Water) có bổ sung Vancomycin,

Cefsulodin và Cefixime giúp hạn chế sự phát triển của Aeromonas spp.

Tuy nhiên, khi sử dụng phương pháp sốc nhiệt hoặc sốc lạnh thì phân

lập được nhiều VTEC O157: H7 từ môi trường thạch TSA thông thường hơn

là từ môi trường SMAC (Sorbitol MacConkey agar) (Hanna Evelina Sidjabat-

Tambunan, 1997) [38].

Nhiệt độ nuôi cấy cũng có vai trò đáng kể, vì VTEC O157 trong môi trường TSB phát triển nhanh ở nhiệt độ từ 300C - 420C, mọc kém ở 440C - 450C, không mọc ở 100C hoặc 45,50C trong 48 giờ. Do đó, nuôi cấy mẫu phân bằng các phương pháp thông thường ở 44,50C sẽ không phân lập được E. coli

O157: H7. Quá trình bồi dưỡng có thể sử dụng phương pháp miễn dịch hoặc

sinh học phân tử để xác định VTEC.

1.4.2 Phương pháp miễn dịch học

Đã có một số phương pháp miễn dịch để xác định VTEC như ELISA,

miễn dịch huỳnh quang,….Và trên thị trường cũng đã có bán các bộ kit như

EHEC - Tek dựa trên hệ thống enzyme miễn dịch, ELISA test kit cho phương

pháp ELISA, ….

Độ nhạy và đặc hiệu của phương pháp ELISA dựa trên kháng thể đơn

dòng sử dụng trong xác định VTEC ở phân gia súc lần lượt là 80,5% và

91,2%. Phương pháp ELISA cũng được sử dụng để xác định và tách độc tố

VT. Độc tố VT gắn với α-D-galp (1-4) D-galp có thành phần glycolipid. Chất

này có trong các nang sán giống như glycoprotein (P1gp) với 1 đầu α-D-galp

(1-4) D-galp disaccharide. Phương pháp này có thể xác định được độc tố VT1

với lượng tối thiểu 80 pg/giếng và 132 pg/giếng đối với VT2.

1.4.3 Phương pháp sinh học phân tử

Có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và thí nghiệm thành công,

trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi xin đi sâu vào kỹ thuật Polymerase

chain reaction (PCR).

Sự ra đời của kỹ thuật PCR đã đưa lại một cuộc cách mạng trong việc

nghiên cứu, phân tích gen và hệ gen. Trước đây, khó khăn lớn nhất trong việc

phân tích gen nằm ở chỗ chúng là đơn vị rất nhỏ, số lượng ít trong hệ gen

phức tạp và khổng lồ. Kỹ thuật PCR ra đời đã thay đổi tất cả, giúp chúng ta có

thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một đoạn DNA mong muốn.

1.4.3.1 Nguyên tắc kỹ thuật PCR

PCR là một kỹ thuật nhằm khuếch đại một đoạn DNA nhờ 1 cặp mồi

đặc hiệu. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một

đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch

mới. Các mồi này gồm có mồi “xuôi” (forward primer: mồi bám lên sợi 3’→5’) và mồi “ngược” (reverse primer : mồi bám lên sợi 5’→3’).

Phản ứng PCR dựa trên nguyên lý giống như tổng hợp DNA trong tế

bào, trong đó DNA được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn. Thành phần của

PCR là: khuôn DNA đích, cặp mồi có trình tự bổ sung với DNA đích, hỗn

hợp của 4 loại nucleotide triphosphate và enzym - polymerase phù hợp.

Quá trình khuếch đại là một sự lặp lại các chu kỳ của tăng và giảm

nhiệt độ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: dãn xoắn sợi DNA kép, các mồi bắt cặp

với từng sợi DNA đơn, tổng hợp sợi DNA mới nhờ DNA - polymerase. Theo đó, số lượng DNA tạo ra tăng lên 2n với n là số chu kỳ.

Kỹ thuật PCR ban đầu sử dụng đoạn Klenow nhạy cảm với nhiệt độ

của Escherichia coli DNA polymerase. Saiki và cs. (1987) [78] là những

người đầu tiên sử dụng DNA polymerase bền với nhiệt độ có nguồn gốc từ vi khuẩn Thermus aquaticus (Taq), enzyme này không bị phân hủy ở 950C. Sự

cải tiến này không chỉ đơn giản hóa phương pháp mà còn cho phép nó hoạt

động tự động và giảm nguy cơ tạp nhiễm. Sản phẩm của PCR có thể kiểm tra

dễ dàng bằng phương pháp điện di trên thạch và nhuộm Ethidium bromide

(EtBr).

Một trong những ứng dụng của PCR là xác định chính xác vi khuẩn.

Đây là phương pháp nhanh, đặc hiệu, nhạy và tự động trong việc xác định các

mầm bệnh là vi sinh vật.

Nhiều tác giả đã sử dụng thành công phương pháp này trong xác định

gen VT của VTEC. Trong một số trường hợp, các phương pháp như xác định

độc tố trong mẫu phân sử dụng tế bào Vero hoặc ELISA không sử dụng được

do số lượng VTEC trong các mẫu rất thấp và gen VT thường bị mất đi trong

quá trình xử lý mẫu. Phương pháp PCR xác định gen VT có thể phát hiện được dưới 10 VTEC trong tổng 109 coliform và là một phương pháp phù hợp

để phát hiện VTEC trong mẫu phân hoặc mẫu thực phẩm nghi ngờ.

1.4.3.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ

gồm 3 bước:

Bước 1 (giai đoạn biến tính - denaturation): hai mạch của phân tử DNA

tách rời nhau thành hai mạch đơn. Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là ở 950C trong vòng 5

phút.

Bước 2 (giai đoạn ủ bắt cặp - anealing): nhiệt độ được hạ thấp (thấp

hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 400C - 600C tùy thuộc Tm của các mồi sử

dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.

Bước 3 (giai đoạn kéo dài - elongation hay extension): nhiệt độ ở giai đoạn này được tăng lên 720C giúp DNA polymerase hoạt động tổng hợp DNA

tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxiribonucleotide triphosphate. Đoạn DNA

nằm giữa hai mồi được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA.

Mỗi chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần

lại làm tăng gấp đôi lượng DNA mẫu của lần trước. Tổng DNA khuyếch đại

được tính theo công thức:

Tổng DNA khuếch đại = m x 2n (với n là số chu kỳ, m là số bản sao của

chuỗi mã hóa).

Trong thực tế, không vượt quá 40 chu kỳ trong một phản ứng, vì phản

ứng PCR diễn ra qua hai giai đoạn:

Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng

mẫu ban đầu.

Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:

+ Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.

+ Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng.

+ Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà lại bắt cặp với nhau.

1.4.3.3 Các thành phần của một phản ứng PCR

- DNA mẫu: là thành phần cần khuyếch đại.

- Mồi (primer): mồi là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự

bổ sung với trình tự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp

DNA. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR. Các mồi được

chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình

tự lặp lại trên gen, không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược và

cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một

mồi. Chiều dài các mồi tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide

(thường 18 - 24 nucleotide). Trình tự nằm giữa hai mồi “xuôi” và “ngược”

không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1 Kb.

- Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt,

được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng. Taq DNA

polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg2+. Taq DNA polymerase tổng hợp DNA theo hướng 5’→3’ và hoạt động tốt nhất ở 70 - 720C.

- Các dẫn chất (dNTP - deoxiribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4

loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA.

- Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại enzym được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+. Nó hình thành một phức

hợp hòa tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho

enzym polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi. Nồng độ Mg2+ (thường được sử dụng ở dạng MgCl2) là một yếu tố ảnh hưởng

mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Ngoài ra nồng độ

MgCl2 có thể ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của mồi, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn, hoạt động của enzym và của kết quả. Nồng độ Mg2+

phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. Nồng độ MgCl2

trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 - 5mM (Hồ

Huỳnh Thùy Dương, 1998) [1].

5’ 3’

3’ 5’

5’

3’

D A K U MẪU

3’

5’

3’

5’

3’

B Lặp lại n vòng

3’

5’

Hình 1.3. Nguyên lý củ phản ứn

A: Biến tính - tách rời hai mạch của phân tử DNA B: Ủ bắt cặp - cặp mồi chuyên biệt bắt cặp với khuôn C: Kéo dài - DNA polymerase tổng hợp mạch mới từ mồi đã bắt cặp dưới sự hiện

diện của 4 loại dNTP và chất đệm thích hợp.

hiệt độ (0C)

1 chu kỳ

Lặp lại n lần

100

94 - 95 0C A

72 0C

C

40 - 60 0C

B

h i i n (phút)

Hình 1.4. Chu trình nhiệt độ củ phản ứn

1.4.3.4 Phân tích kết quả PCR

Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA được khuếch đại) sẽ được

phát hiện bằng phương pháp điện di.

Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của

các DNA. DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên bề mặt nên khi

chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện

trường. Sự di chuyển của phân tử trong bản gel dưới tác động của một điện

trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử (tức là số nucleotide) và nồng độ

các chất cấu thành gel, điện thế.

Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng. Các DNA

trong gel agarose được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ Ethidium

Bromide, chất này có khả năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát

huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV (bước sóng λ = 300nm) thành vạch

màu đỏ da cam. Khi chụp ảnh lưu lại hiển thị màu trắng sáng.

Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng một

“yếu tố chỉ thị phân tử” cho điện di protein (DNA genetic marker).

1.4.3.5 Multiplex - PCR

Theo nguyên lý ban đầu, mỗi phản ứng PCR sẽ được thực hiện với sự

tham gia của một cặp mồi đặc hiệu. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, việc

tiến hành nhiều phản ứng PCR sẽ mất khá nhiều thời gian và việc sàng lọc sẽ

gây tốn kém (Lê Thị Tuyết Trinh, 2007) [9]. Để giảm số lượng phản ứng PCR

cần thiết và sàng lọc gen độc tố của các loại E. coli, nhiều tác giả đã cải tiến

đưa ra phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR, để cùng

khuếch đại được nhiều đoạn DNA. Kỹ thuật này được gọi là “PCR đa mồi -

Multiplex PCR”. Multiplex - PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong

đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng

đồng thời nhiều cặp mồi trong một phản ứng. Multiplex - PCR đầu tiên được

mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kể từ đó nhiều tác giả trên thế giới đã

ứng dụng kỹ thuật này (Nguyễn Bình Minh, 2004) [5].

1.5 Một số ỹ thuật sinh học phân tử ùn để phân l ại vi sinh vật

Trước đây công tác phân loại vi sinh vật vẫn căn bản dựa trên các đặc

tính hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật: nhuộm màu, hình dạng tế bào,

khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh acid trong

môi trường, sắc tố tạo thành… Tuy nhiên, các đặc trưng này đôi khi cũng bộc

lộ những hạn chế do các đặc tính được dùng cho nhóm vi sinh vật này nhưng

lại không có ý nghĩa đối với nhóm khác. Hạn chế của các phương pháp phân

loại truyền thống là nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loại của một số

vi sinh vật. Từ trước đến nay, đơn vị cơ bản của định tên vi sinh vật là loài, bao

gồm nhóm các cơ thể có mức độ tương đồng cao về các đặc điểm hình thái.

Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng

dụng hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Nếu

như các phương pháp truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh

vật thì phương pháp sinh học phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng vi

sinh vật.

Nói chung, các phương pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ

thuật chủ yếu là:

+ Phân tích acid nucleic

+ Phân tích protein

+ Phân tích lipopolysaccharid

+ Hóa phân loại học

Kỹ thuật phân tích acid nucleic liên quan chủ yếu đến phân tích kích

thước, cấu trúc acid nucleic, mối tương quan về trình tự acid nucleic thông

qua giải trình tự DNA và lai DNA.

PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) là một trong các phương pháp

dựa trên phân tích acid nucleic (DNA nhiễm sắc thể). Đây là phương pháp

dùng enzym cắt hạn chế để cắt DNA của nhiễm sắc thể thành nhiều mảnh cắt

khác nhau có kích thước khoảng 50 kb hoặc nhỏ hơn và được phân biệt bằng

kỹ thuật PFGE.

1.5.1 Nguyên tắc

Trước tiên, các mẫu đưa vào phân tích được xử lý trước bằng loại

enzym cắt hạn chế (có rất ít điểm cắt). Kết quả là tạo ra được các mảnh có

kích thước lớn (50 kb – 12 Mb). Với kích thước này, không thể điện di theo

phương pháp thông thường mà chỉ có thể tách ra bằng kỹ thuật PFGE.

Kỹ thuật PFGE lần đầu tiên được Schwartz và Cantor (1984) giới

thiệu. Tuy nhiên sau đó đã có nhiều tác giả mô tả lại kỹ thuật này, tuy có sai

khác ít nhiều nhưng cơ sở lý thuyết của các phương pháp này là như nhau:

Mục đích của kỹ thuật này là tăng khả năng di động của các mảnh DNA có

kích thước lớn trong điện trường, do đó các thành phần gel và đệm hầu như

không thay đổi theo các phương pháp điện di thông thường. Tuy nhiên theo

phương pháp thông thường thì sự điện di liên quan đến sự di động của các

mảnh DNA có kích thước khác nhau trên gel agarose trong một trường điện

không đổi. Kết quả là phân tử lớn khó di động hơn phân tử nhỏ qua mắt xích

agarose, tạo ra sự tách biệt trong trường điện di.

Trong trường hợp PFGE, lực làm thay đổi khả năng di động lại là

trường điện tích thay đổi liên tục dẫn đến các mảnh DNA có kích thước khác

nhau thay đổi hướng di động. Như vậy kết quả là các mảnh có kích thước

khác nhau sẽ có khả năng di động khác nhau. Kích thước càng lớn thì mức

độ di động càng chậm. Sự di động khác nhau của DNA chủ yếu phụ thuộc

vào kích thước chứ không phải do gel agarose như ở phương pháp điện di

thông thường.

Hình 1.5: Sử ụn ỹ thuật F E phân tích nhiễm sắc thể s u hi xử lý v i enzym cắt hạn chế Sm v i vi huẩn Haemophilus influenzae. (Nguồn: Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương)

Tiếp theo các mô tả của Schwartz va Cantor, Smith và Codemine

(1990) đã đề cập đến sự di chuyển của các mảnh DNA khác nhau là hàm số

tuyến tính với kích thước của chúng. Trên cơ sở đó có thể điều chỉnh các

xung điện và điện trường. Tuy nhiên, một số yếu tố khác cũng có mối tương

tác lẫn nhau và ảnh hưởng đến khả năng di động của DNA như: nhiệt độ, điện

thế, nồng độ agarose, nồng độ ion trong đệm.

1.5.2. Kỹ thuật

Việc chuẩn bị DNA từ nhiễm sắc thể không giống như các phương pháp

chuẩn bị DNA từ plasmid. Một vấn đề thường xảy ra là sự đứt gãy ngẫu nhiên

DNA dẫn đến sai khác trong kết quả phân tích. Để hạn chế điều này, người ta

phải thực hiện kỹ thuật tách DNA nhiễm sắc thể khỏi tế bào mẫu agarose có

nhiệt độ nóng chảy thấp (Low melting temperature). Theo phương pháp này, hỗn

dịch tế bào (dịch nuôi cấy hoặc dịch huyền phù) được trộn với LMT agarose thấp tại 37oC. Hỗn dịch đầu tiên được xử lý với enzym và chất tẩy rửa để tách

DNA nhiễm sắc thể khỏi thành, màng tế bào, RNA và protein. Sau đó xử lý với

EDTA, bất hoạt nuclease tế bào với proteinase K và N-lauroylsarcosine để loại

các thành phần khác của tế bào. Kết quả là phần LMT agarose có chứa DNA nhiễm sắc thể được dùng làm mẫu chạy gel 0,5-1,0% (nên làm tan ở 65oC) và

đưa lên khuôn chạy gel PFGE. Riêng đối với các trường hợp có thành tế bào thì

cần đến enzym để phá thành tế bào. Lượng DNA nhiễm sắc thể thường dao

động trong khoảng 0,5-20 µg DNA là thích hợp. Nếu quá nhiều DNA thì không

thể phân tích được, còn quá ít thì cũng không thể phát hiện được các băng DNA

trong kết quả phân tích. Mẫu DNA dùng cho kỹ thuật PFGE có thể được giữ 1

năm trong lạnh có chứa 0,5M EDTA.

Bản 1.2. Một số enzym cắt hạn chế đ ợc ùn ch ỹ thuật F E

Enzym

Vị trí cắt

AatII

GACGT/C

ApaI

GGGCC/C

ClaI

AT/CGAT

MluI

A/CGCGT

NarI

GG/CGCC

NheI

G/CTAGC

NotI

GC/GGCCGC

NruI

TCG/CGA

PvuI

CGAT/CG

SacII

CCGC/GG

SalI

C/TCGAC

SfiI

GGCC(N)4/NGGCC

SmaI

CCC/GGG

XhoI

C/TCGAG

1.5.3 Ứng dụng của kỹ thuật phân tích PFGE

Kỹ thuật PFGE đã được sử dụng cho nghiên cứu trên nhiều đối tượng

khác nhau.

Mỗi một đối tượng có đặc trưng riêng về kết quả phân tích PFGE và được

dùng cho nghiên cứu so sánh với nhau về sự tương đồng. Đối với nhiều đối tượng

có nhiễm sắc thể thì không nhất thiết phải thực hiện đối với mọi nhiễm sắc thể mà

chỉ cần trên một số nhiễm sắc thể mà thôi. Ví dụ trong trường hợp của nấm

C. albicans chỉ cần thực hiện phép phân tích với một trong 4 tổ hợp của một số

nhiễm sắc thể là đủ. Cho dù theo các cách chuẩn bị nhiễm sắc thể khác nhau thì

kết quả của phép phân tích PFGE đều giống nhau. Phép phân tích PFGE được ứng

dụng cho các nghiên cứu ở mức độ loài với loài.

1.5.4 Một số hạn chế khi sử dụng kỹ thuật PFGE

+ Kỹ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dụng, kỹ thuật

cũng như kinh nghiệm vì việc tách nhiễm sắc thể đôi khi gặp khó khăn trên

một số đối tượng vi sinh vật.

+ Kỹ thuật PFGE không đủ nhạy để phát hiện những sai khác nhỏ giữa

các mẫu, đặc biệt khi thực hiện với một enzym thì kết quả có thể giống nhau

nhưng không chắc chắn là hai mẫu giống nhau hoàn toàn. Điều đó có nghĩa là

kỹ thuật này nên dùng để xác định sự khác nhau còn việc xác định sự giống

nhau thì không đủ tin cậy. Tuy nhiên ngay cả khi xác định sự khác nhau đôi

khi các mẫu có plasmid nhỏ hay thực khuẩn thể cũng cần xét đến vì chính

nguồn DNA này cũng tạo ra những sai khác giả.

+ Sự khác biệt giữa các mẫu có thể phát hiện được khi dùng các

enzym cắt giới hạn khác nhau.

h ơn 2

DU , UYÊ L U V Ơ Á

Ê ỨU

2.1 Nội un n hiên cứu

2.1.1 Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ, vệ sinh thú y trên địa bàn Hà Nội

- Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ tại các điểm giết mổ gia súc, gia

cầm trên địa bàn Hà Nội

- Điều tra điều kiện điểm giết mổ và phương tiện vận chuyển của các

điểm giết mổ trên địa bàn Hà Nội

- Thực trạng vệ sinh tại khu giết mổ gia súc, gia cầm trên địa bàn Hà Nội

- Thực trạng điều kiện vệ sinh thú y tại cơ sở kinh doanh, chợ, tiêu thụ

sản phẩm thịt gia súc, gia cầm

2.1.2 Thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR dùng để xác định vi

khuẩn VTEC

- Lựa chọn giữa PCR đơn mồi và Multiplex - PCR

- Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp để tách chiết DNA mẫu

- Thực hiện phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn đối chứng

- Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR dùng để xác định

VTEC trong môi trường nhân tạo

- Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR dùng để xác định

VTEC trong mẫu thịt sạch

- Xây dựng quy trình xác định sự có mặt của vi khuẩn VTEC trong các

mẫu thịt

2.1.3 Tỷ lệ nhiễm và một số đặc tính cơ bản của những chủng VTEC phân

lập được

- Tỷ lệ nhiễm trong phân

- Tỷ lệ nhiễm trong thân thịt và mẫu lau thân thịt

- Xác định các yếu tố độc lực cơ bản

+ Độc tố VT1

+ Độc tố VT2

+ Yếu tố bám dính intimin

- Xác định serotyp

- Xác định sự đa dạng di truyền của các VTEC có nguồn gốc phân lập

khác nhau

2.2 ị điểm và th i i n n hiên cứu

- Mẫu được lấy tại một số chợ, lò mổ trên địa bàn thành phố Hà Nội

- Phòng thí nghiệm: các thí nghiệm được tiến hành tại (1) Bộ môn Vi

trùng, Viện Thú y quốc gia; (2) Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, khoa Thú

y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội; (3) Trạm chẩn đoán xét nghiệm, Cơ

quan Thú y vùng I, Cục Thú y; (4) Phòng thí nghiệm Vi khuẩn, Viện vệ sinh

dịch tễ Trung ương.

- Thời gian: từ năm 2009 đến 2011

2.3 ối t ợn n hiên cứu

- Các chủng vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập được

- Các chủng vi khuẩn E. coli đối chứng dương và âm

2.4 uyên liệu n hiên cứu

2.4.1 Môi trường, hóa chất, dụng cụ thí nghiệm

- Môi trường sử dụng trong nghiên cứu vi khuẩn E. coli là các loại môi

trường tổng hợp sẵn có bán trên thị trường của các hãng như Oxoid, Merck,

Biorad, Microbiology,...

Khi dùng pha theo công thức của nhà sản xuất. Bao gồm: Thạch máu,

thạch thường, thạch MacConkey, thạch CT-SMAC, thạch EMB, nutrient

broth, LB broth, BHI broth, m-TSB broth, BPW broth,...

- Các loại dung dịch đường: Glucose, Lactose, Fructose, Xylose,

Arabinose, Galactose, Succrose, Mannit, Manitol,...

- Thuốc nhuộm Gram, dung dịch Kovac’s, dung dịch Andrader,...

- Các loại hóa chất, sinh phẩm dùng trong phản ứng PCR/Multiplex

PCR và điện di sản phẩm PCR do hãng Fermentas sản xuất. Gồm: AMP x 5

bufer, dNTP stock, 50 x TAE, Taq-DNA polymerase, Mồi, Gel loading bufer,

Ethidium bromide.

- Các kháng huyết thanh chuẩn dùng để xác định serotyp O (đa giá và

đơn giá) do hãng Denka (Seiken Co., Ltd, Niigata, Nhật Bản) sản xuất.

- Các loại dụng cụ, trang thiết bị máy móc phòng thí nghiệm bao gồm:

Đĩa petri, lam kính, ống nghiệm, bình tam giác, micropipet, ống hút, que cấy,

đèn cồn, nồi hấp khử trùng, tủ lạnh, lò vi sóng, kính hiển vi, máy PCR,...

2.4.2 Các chủng vi khuẩn đối chứng dương và âm

Các chủng vi khuẩn E. coli làm đối chứng dương và âm do Viện nghiên

cứu thú y (NVRI), Ba Lan; Phòng thí nghiệm tham chiếu E. coli, Tây Ban

Nha (Laboratorio de Referencia de E. coli - LREC); Phòng thí nghiệm tham

chiếu vi khuẩn E. coli của OIE, Canada (OIE Reference Laboratory for

Escherichia coli) cung cấp.

2.5 Ph ơn pháp n hiên cứu

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu

- Dun l ợn m u

Theo TCVN 4833-2002, tham khảo một số tài liệu của các nước trong

khu vực và quốc tế. Để xác định được dung lượng mẫu cần thiết của đề tài

nghiên cứu, trước hết khảo sát xét nghiệm khoảng 30 - 50 mẫu để tính toán tỷ

lệ lưu hành sơ bộ của E. coli.

Căn cứ tỷ lệ nhiễm E. coli khảo sát, áp dụng công thức tính dịch tễ học

phần mềm máy tính WinEpiscope 2.0 sẽ tính được dung lượng mẫu cần thiết

cho nghiên cứu của đề tài đảm bảo độ chính xác 95%.

- h ơn pháp lấy m u thịt t ơi từ chợ

Mẫu thịt lợn, bò được mua ngẫu nhiên tại một số chợ và siêu thị trên

địa bàn Hà Nội. Mẫu được lấy vào buổi sáng (6 - 7 giờ). Mỗi mẫu được đựng

riêng rẽ vào 1 túi nilon sạch, có ghi rõ ký hiệu. Các mẫu được bảo quản trong nhiệt độ lạnh (4 - 80C) và chuyển về phòng thí nghiệm để xử lý mẫu trong

cùng ngày.

- h ơn pháp lấy m u l u thân thịt

Dùng gạc tiệt trùng lau trên thân thịt sau khi đã được giết mổ, tách toàn bộ nội tạng, mỗi thân thịt lau tại 3 vị trí, 100 cm2/vị trí. Sau khi lau, gạc được

đặt vào lọ có chứa 20ml môi trường mTSB.

2.5.2 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn trong canh khuẩn nuôi cấy

Canh khuẩn sau khi nuôi cấy được pha loãng trong dung dịch PBS thành các nồng độ 10-1, 10-2, …, 10-8. Lấy 0,1ml dung dịch ở các nồng độ pha loãng 10-6, 10-7, 10-8 nhỏ và dàn đều trên bề mặt thạch máu, bồi dưỡng ở 370C

trong 24 giờ. Mỗi nồng độ pha loãng dùng 03 đĩa thạch. Đếm số khuẩn lạc

mọc trên đĩa thạch, rồi tính trung bình cho mỗi nồng độ.

Số lượng vi khuẩn được tính theo công thức:

X = 10  a  b

Trong đó: X: là số lượng vi khuẩn có trong 1ml canh khuẩn ban đầu

a: là số lượng vi khuẩn trung bình của 1 nồng độ pha loãng

b: là hệ số pha loãng mẫu

Hệ số 10 vì nhỏ 0,1ml canh khuẩn trên đĩa thạch.

2.5.3 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR

- PCR đơn mồi: mỗi phản ứng PCR sẽ được thực hiện với sự tham gia của

một cặp mồi đặc hiệu để phát hiện một gen nhất định (VT1, VT2 hoặc eae).

- Multiplex - PCR: sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR để

phát hiện một số gen cần thiết. Trường hợp này là các gen VT1, VT2 và eae. Các

thành phần khác của phản ứng giống như ở phản ứng PCR đơn mồi. Việc làm này

nhằm mục đích xác định đồng thời nhiều gen thay vì chỉ xác định được 1 gen.

- Xử lý DNA mẫu

+ Đối với canh khuẩn: DNA mẫu được tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt như sau: 1 ml canh khuẩn được đun ở 1000C/30 phút, đông lạnh ở âm 200C/qua đêm và sử dụng làm DNA mẫu (2,0 µl/phản ứng).

+ Đối với môi trường thạch: một lượng nhỏ khuẩn lạc được lấy trực

tiếp và dùng làm DNA mẫu cho phản ứng PCR.

- Các cặp mồi

Mồi của phản ứng được thiết kế dựa vào chuỗi gen mã hóa sinh tổng

hợp protein của độc tố VT1, VT2 và protein intimin quy định đặc tính xâm

nhập và bám dính của VTEC. Trình tự các mồi và các sản phẩm tương ứng

của chúng tạo ra được trình bày ở bảng 2.1.

Bản 2.1. rình tự mồi ùn để xác định các en V 1, V 2 và eae

Gen

Ký hiệu

Kích cỡ sản

huỗi primers (5 ’- 3 ’)

đích

primers

phẩm (bp)

VT1-F

5’ - CAGTTAATGTGGTGGCGAAG - 3’

VT1

894

VT1-R

5’ - CTGCTAATAGTTCTGCGCATG - 3’

VT2-F

5’ - CTTCGGTATCCTATTCCCGG - 3’

VT2

481

VT2-R

5’ - GGATGCATCTCTGGTCATTG - 3’

eae-F

5’ - ACGTTGCAGCATGGGTAACTC - 3’

eae

816

eae-R

5’ - GATCGGCAACAGTTTCACCTG - 3’

- Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tích là 25µl, được trình

bày bảng 2.2.

Bản 2.2. hành phần các chất tr n phản ứn ùn để xác định

các gen VT1, VT2 và eae

hành phần

ồn độ

hể tích (l)

Mồi xuôi

3,2 M /l

Mồi ngược

3,2 M /l

Dung dịch đệm AMP x 5 (Fermentas) gồm:

+ 750 mM Tris - HCl (pH=8) + 200 mM (NH4)2SO4 + 0,1% (v/v) Tween 20

+ dNTPs + 2 mM MgCl2 Taq - polymerase (Fermentas)

500 UI

0,62 l

(1 U/1 l)

DNA mẫu

thích hợp

Nước khử ion

vừa đủ 25 l

Tổng cộng

25 l

- Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2.3.

Bản 2.3. ác chu ỳ nhiệt củ phản ứn ùn để xác định en

VT1, VT2 và eae

ác i i đ ạn củ phản ứn hiệt độ (oC) h i i n (phút) Số chu ỳ

Giai đoạn tiền biến tính

Giai đoạn biến tính

Giai đoạn bắt cặp

Giai đoạn tổng hợp

Giai đoạn kéo dài

72 Giữ ở 40C

- Phân tích sản phẩm: Các sản phẩm của phản ứng PCR được tiến hành

chạy điện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch 1 x TAE với hiệu điện thế

50V trong 30 phút. Đọc kết quả và chụp ảnh bằng hệ thống Gel Doc 2000.

Ảnh được lưu giữ lại và được tiến hành xử lý kết quả khi cần thiết.

2.5.4 Phương pháp xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR

Độ đặc hiệu của phản ứng PCR được xác định bằng cách kiểm tra với

10 chủng VTEC đối chứng dương và 10 chủng đối chứng âm với các thông

tin về đặc tính của một số yếu tố gây bệnh đã được công bố ở bảng 2.4 và 2.5.

Bản 2.4: Một số yếu tố ây bệnh chủ yếu củ các chủn vi huẩn E. coli

đối chứn ơn

Ký hiệu chủng Ghi chú (Nguồn gốc) Đặc tính về một số yếu tố gây bệnh

Viện nghiên cứu thú y (NVRI), Ba Lan

VT1/VT2 VT1 VT2 VT1/VT2/eae/Hly E. coli FD523 E. coli FD526 E. coli FD528 E. coli FD635

E. coli FD636 VT1/VT2/eae/Hly

Đối chứng dương

Phòng tham thí nghiệm chiếu E. coli, Tây Ban Nha (Laboratorio de Referencia de E. coli - LREC) Phòng tham thí nghiệm chiếu vi khuẩn E. coli của (OIE Canada OIE, Reference Laboratory for Escherichia coli) E. coli BDL9.1 VT2 E. coli BKT29.1 VT2 E. coli E4 E. coli E7 E. coli E41 VT1/VT2 VT1/VT2 VT1/VT2

Bản 2.5: Một số yếu tố ây bệnh chủ yếu củ các chủn vi huẩn đối

chứn âm

Ký hiệu chủng Ghi chú (Nguồn gốc)

Đối chứng âm Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y

E. coli (C-600) (K-12) E. coli FV847a E. coli FV2289 E. coli FV2586 E. coli FV2593 S. typhumirium (FD675) P. multocida (PM-VT3) S. suis (HN-25) S. aureus (FD231) C. perfringens (BCD6) Đặc tính về một số yếu tố gây bệnh - F4/STa/STb/LT F18/STa/STb/VT2v F4/STb/LT F18/STa/STb/VT2v - - - - -

2.5.5 Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng PCR

2.5.5.1 Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng PCR dùng để xác định

VTEC trong môi trường nhân tạo

Tiến hành cấy 1 khuẩn lạc của mỗi chủng vi khuẩn vào lọ đựng 20 ml môi trường (LB, m-TSB và BHI). Sau 20 giờ ủ ở 37oC, tiến hành pha loãng canh khuẩn theo cơ số 10 để được các nồng độ pha loãng thích hợp (10-1, 10-2, ....,10-8), đếm số trên môi trường thạch máu, đồng thời tiến hành các bước

tách DNA mẫu từ tất cả các nồng độ pha loãng (kể cả canh khuẩn ban đầu) để

dùng cho phản ứng PCR. Lưu ý khi nuôi cấy E. coli không lắc, vì ảnh hưởng

lớn đến sinh trưởng vi khuẩn và độ nhạy phản ứng.

2.5.5.2 Phương pháp xác định độ nhạy của phương pháp PCR dùng để xác

định VTEC trong các mẫu thịt sạch

- Chọn 2 mẫu thịt (bò, lợn) đã được xác định là âm tính trong phản ứng

PCR để tiến hành gây nhiễm với mỗi một chủng vi khuẩn đối chứng dương.

- 25 g thịt đã được cắt nhỏ và cho vào 225 ml môi trường m-TSB.

- Môi trường (m-TSB) đã nuôi cấy chủng vi khuẩn ở 37oC/24 giờ. Pha

loãng thành các nồng độ từ 10-1 đến 10-8.

- Cho 0,4 ml canh khuẩn ở mỗi nồng độ pha loãng vào lọ môi trường

m-TSB đã có 25g thịt.

- Tách DNA mẫu và tiến hành phản ứng PCR với tất cả các nồng độ

pha loãng (kể cả canh khuẩn ban đầu).

2.5.6 Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn VTEC

Từ các mẫu thu thập được, chúng tôi tiến hành phân lập và giám định

vi khuẩn VTEC theo quy trình tham khảo của FDA (US Food and Drug

Administration) và Phòng Thí nghiệm tham chiếu vi khuẩn E. coli của OIE, Canada (Universite’ de Montre’al, Canada).

Mẫu (thịt tươi, lau thân thịt, phân)

Tăng sinh

- 25 g thịt + 225 ml m-TSB - Gạc lau thân thịt đặt trong lọ có 20 ml m-TSB - 0,5 g phân + 10 ml m-TSB

370C/ qua đêm

100 µl canh khuẩn cấy lên thạch MacConkey

370C/ qua đêm

Chọn 2-3 khuẩn lạc điển hình /mẫu (khuẩn lạc màu hồng cánh sen)

Kiểm tra các đặc tính sinh hóa

PCR

Dương tính

Âm tính

PCR cho từng khuẩn lạc

Dương tính

Âm tính

Định typ

Giữ giống

Quy trình này được thể hiện bằng hình 2.1 như sau:

ình 2.1: Quy trình phân lập và iám định vi huẩn

2.5.7 Phương pháp xác định serotyp kháng nguyên O của các chủng vi

khuẩn phân lập được

Phương pháp xác định serotyp kháng nguyên O của vi khuẩn E. coli

bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính. Các chủng vi khuẩn được

tiến hành xác định nhóm với huyết thanh đa giá trước, sau đó đến các huyết

thanh đơn giá trong nhóm.

* Chuẩn bị

- Các chủng vi khuẩn VTEC cần định serotyp được cấy trên thạch máu

cừu, ủ ở tủ ấm 370C trong 18 - 24 giờ.

- Các kháng huyết thanh O chuẩn (đa giá và đơn giá).

- Nước muối sinh lý 0,9%; phiến kính sạch, que cấy nhựa.

* Phương pháp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính

Nhỏ lên phiến kính sạch, mỗi đầu một giọt nước muối sinh lý, dùng que

cấy vô trùng lấy khuẩn lạc VTEC cần xác định trộn đều với 2 giọt nước muối

sinh lý để tạo thành huyễn dịch vi khuẩn. Nhỏ một giọt kháng huyết thanh chuẩn

vào một bên huyễn dịch và một giọt nước muối sinh lý vào bên huyễn dịch còn

lại (đối chứng). Hiện tượng ngưng kết (nếu có) sẽ xuất hiện trong vòng 30 giây,

hỗn dịch xuất hiện những hạt nhỏ trắng lấm tấm, tách ra làm hai phần gồm các

hạt ngưng kết và phần nước trong. Với phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, rõ rệt

thì được đánh giá ở mức ++++. Tùy theo khả năng ngưng kết, có thể đánh giá

ngưng kết ở các mức độ khác nhau (+, ++, +++). Phản ứng là âm tính khi hỗn

dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh đục đều như bên đối chứng.

Với những chủng có ngưng kết với kháng huyết thanh đa giá, thực hiện

tiếp với các kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm để xác định rõ từng

serotyp.

Trong trường hợp chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm

hoặc với nhiều đơn giá khác nhau hoặc chủng không ngưng kết với tất cả các

nhóm kháng huyết thanh đa giá, khuẩn lạc của chủng vi khuẩn đó được lấy vào 1 ống eppendorf đã có 200 µl nước muối sinh lý, đun ở 1000C trong 30

phút, ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, lấy cặn và tiến hành lại phản ứng

ngưng kết.

Những chủng cho kết quả âm tính với tất cả các nhóm kháng huyết

thanh đa giá (kể cả sau khi đã tiến hành đun và ly tâm như trên) được kết luận

là “không xác định”.

2.5.8 Xác định sự đa dạng di truyền của các chủng VTEC có nguồn gốc

khác nhau bằng phản ứng PFGE (Pulsed-field gel electrophoresis)

Sự tương đồng hệ gen của một số chủng vi khuẩn E. coli phân lập được

xác định bằng phương pháp PFGE tại phòng thí nghiệm Vi khuẩn, Viện Vệ

sinh dịch tễ Trung ương. Quy trình chuẩn bị mẫu DNA và thực hiện phản ứng

dựa theo Hopkins và cs. (2000) [40], Helgerson và cs. (2006) [39], Sambrook

và Russell (2001) [80].

Chủng vi khuẩn E. coli được cấy trên môi trường TSB và ủ qua đêm ở 370C. Vi khuẩn được thu hoạch và gắn vào thạch agarose. Phức hợp này được

xử lý bằng Lysozyme (1 mg/ml) trong dung dịch phá vỡ tế bào vi khuẩn bacterial cell lysis solution ở 370C trong 2 giờ. Sau đó, hỗn dịch được xử lý

tiếp bằng dung dịch Proteinase K (0,5 mg/ml - Bacterial cell proteinase K solution) ở 550C qua đêm. Hỗn dịch được rửa bằng Phenylmethylsulfonyl

fluoride 1 mM và dung dịch đệm Tris 10 mM / EDTA 1 mM. Mẫu DNA được phân cắt bằng enzyme XbaI (10 đơn vị/µl, Promega) ở 370C trong 16 giờ. Sản

phẩm sau phân cắt được điện di trên thạch Seakem Gold 1% bằng hệ thống

điện di trường xung (CHEF-DR II, Bio-Rad, Hercules, Canada) trong dung

môi điện di là TE 0,5X, chế độ cài đặt là:

(1) Thời gian chuyển đổi ban đầu: 2,16 giây

(2) Thời gian chuyển đổi kết thúc: 54,17 giây

(3)Thời gian điện di: 22 giờ

(4) Hiệu điện thế: 150V (5) Nhiệt độ: 140C

Sau khi điện di kết thúc, thạch agarose được nhuộm bằng Ethidium

bromide (1µg/ml). Đọc và phân tích kết quả bằng phần mềm GelCompare

(Bio-Rad). Đánh giá mức độ tương đồng hệ gen dựa trên tiêu chuẩn của

Tenover và cs. (1995) [87].

2.5.9 Xử lý số liệu

Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm MS Excel 2003 để tính. Sự

sai khác giữa các giá trị được xem là có ý nghĩa thống kê khi P < 0,05.

h ơn 3

KẾ QUẢ V ẢO LUẬ

3.1 hực trạn côn tác iểm s át iết mổ, vệ sinh thú y trên đị bàn

à ội

Hà Nội có vị trí tự nhiên ở trung tâm đồng bằng Bắc Bộ, có địa giới

hành chính giáp với 08 tỉnh (Thái nguyên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hưng Yên,

Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà Nam, Hòa Bình) với nhiều tuyến quốc lộ, tỉnh lộ, có

đường sắt quốc gia nối liền với nhiều tỉnh trong cả nước.

Theo số liệu thống kê, Hà Nội có khoảng 245.000 con trâu bò,

1.670.000 con lợn và gần 16 triệu con gia cầm. Trung bình mỗi ngày Hà Nội

tiêu thụ khoảng 500 - 600 tấn thịt gia súc, gia cầm (20% là thịt gia cầm).

Trong đó Hà Nội tự sản xuất khoảng 60%, phần còn lại do các địa phương

khác cung cấp hoặc nhập khẩu từ nước ngoài. Bao gồm: gia súc, gia cầm

sống, thân thịt gia súc, gia cầm sau khi giết mổ và thịt mảnh các loại. Vì vậy,

thị trường thực phẩm tươi sống có nguồn gốc động vật ở Hà Nội rất phong

phú đa dạng.

3.1.1 Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ tại các điểm giết mổ gia súc,

gia cầm trên địa bàn Hà Nội

Thành phố Hà Nội đã xây dựng được 14 cơ sở giết mổ gia súc, gia cầm

tập trung. Tuy nhiên cho đến nay đã có nhiều cơ sở giết mổ không còn hoạt

động, một số chỉ hoạt động cầm chừng, hoặc có cơ sở giết mổ lợn công

nghiệp nhưng lại tổ chức giết mổ thủ công khoảng 10 con lợn/ngày để cung

cấp cho các siêu thị, bếp ăn tập thể. Hiện nay, thành phố Hà Nội có 04 cơ sở

giết mổ gia súc tập trung công suất 50 - 700 con/ngày: cơ sở giết mổ lợn lớn

nhất là cơ sở giết mổ gia súc Minh Hiền - Thanh Oai, cơ sở giết mổ thủ công

Trung Văn - Từ Liêm, cơ sở giết mổ thủ công Thụy Phương - Từ Liêm và cơ

sở giết mổ Foodex - Đan Phượng. Các cơ sở giết mổ này về cơ bản đảm bảo

các điều kiện vệ sinh thú y, được bố trí sắp xếp thành các khu riêng biệt, có

khu xử lý thịt và phụ phẩm không đạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y, có hệ thống xử

lý chất thải và đều có cán bộ thú y thực hiện kiểm tra, kiểm dịch.

Ngoài ra có 3.725 điểm, hộ giết mổ gia súc, gia cầm (theo thống kê của

Sở Công thương Hà Nội) hầu hết phân tán rải rác ở các huyện ngoại thành,

chủ yếu phục vụ nhu cầu tiêu thụ tại chỗ. Các điểm, hộ giết mổ nhỏ lẻ hoạt

động giết mổ rất đa dạng, một số chủ giết mổ hoạt động theo mùa vụ nên việc

kiểm tra, kiểm soát gặp nhiều khó khăn, không đảm bảo các điều kiện vệ sinh

theo quy định.

Do địa bàn quản lý rộng, các điểm, hộ giết mổ gia súc, gia cầm nhỏ lẻ ở

các huyện ngoại thành chiếm 50% số lượng sản phẩm gia súc, gia cầm trên

địa bàn Hà Nội. Vì vậy, việc quản lý giết mổ gặp nhiều khó khăn, không kiểm

soát được. Nguồn thực phẩm này không đảm bảo các điều kiện vệ sinh thú y,

an toàn thực phẩm, không được cơ quan thú y kiểm soát theo quy định nhưng

lại là nguồn cung cấp chính thực phẩm cho thành phố Hà Nội. Số lượng các

điểm giết mổ gia súc, gia cầm trên địa bàn Hà Nội được trình bày ở bảng 3.1.

Tổng số điểm giết mổ gia súc, gia cầm của 22 quận, huyện trên địa bàn

thành phố Hà Nội mà cơ quan thú y kiểm soát được là 467 điểm. Trong đó 89

điểm giết mổ trâu bò, 199 điểm giết mổ lợn và 179 điểm giết mổ gia cầm.

Huyện Thường Tín có số điểm giết mổ nhiều nhất 111 điểm, chủ yếu

là điểm giết mổ gia cầm 102 điểm, 2 điểm giết mổ trâu, bò và 7 điểm giết

mổ lợn. Tiếp theo là huyện Mỹ Đức có 65 điểm, trong đó 41 điểm giết mổ

lợn, 12 điểm giết mổ trâu, bò và 12 điểm giết mổ gia cầm. Quận Tây Hồ có

số điểm giết mổ ít nhất, chỉ có 2 điểm giết mổ lợn. Huyện Thạch Thất có số

Bản 3.1. Số l ợn các điểm iết mổ i súc, i cầm trên đị bàn à ội

ối t ợn iết mổ ổn số TT Quận, uyện điểm iết mổ Lợn Trâu, bò i cầm

4 2 6 1 Ba Vì

1 5 3 9 2 Chương Mỹ

4 4 3 Đan Phượng

9 4 2 15 4 Đông Anh

3 2 3 8 5 Gia lâm

3 1 4 6 Hà Đông

4 4 7 Hoàng Mai

4 1 1 6 8 Hoài Đức

5 21 3 29 9 Mê Linh

41 12 12 65 10 Mỹ Đức

33 1 34 11 Phú Xuyên

3 23 8 34 12 Phúc Thọ

3 3 13 Quốc Oai

3 1 4 14 Sóc Sơn

6 6 15 Sơn Tây

2 2 16 Tây Hồ

2 24 26 17 Thanh Oai

1 59 3 63 18 Thạch Thất

10 10 19 Thanh Trì

2 7 102 111 20 Thường Tín

9 9 21 Từ Liêm

15 15 22 Ứng Hòa

179 467 ổn số 199 89

(Nguồn: Chi cục Thú y Hà Nội)

điểm giết mổ lợn nhiều nhất là 59 điểm. Các huyện Phú Xuyên, Quốc Oai,

Sóc Sơn, Thanh Oai, Ứng Hòa và quận Hoàng Mai không có điểm giết mổ

lợn. Huyện Phú Xuyên có số điểm giết mổ trâu, bò nhiều nhất là 33 điểm.

Các huyện Đan Phượng, thị trấn Sơn Tây, Thanh Trì, Từ Liêm, Ứng Hòa,

quận Hà Đông và Tây Hồ không có điểm giết mổ trâu bò. Huyện Thường

Tín có số điểm giết mổ gia cầm nhiều nhất là 102 điểm. Các huyện Ba Vì,

Đan Phượng, Quốc Oai, Sơn Tây, Thanh Trì, Từ Liêm, Ứng Hòa, quận

Hoàng Mai, quận Tây Hồ không có điểm giết mổ gia cầm.

3.1.2 Kết quả điều tra điều kiện giết mổ và phương tiện vận chuyển của

các điểm giết mổ trên địa bàn Hà Nội

- Về điều kiện giết mổ

Hầu hết các điểm giết mổ gia súc, gia cầm này đều không được phân

thành từng khu riêng biệt. Đa số các điểm giết mổ là của tư nhân nên việc xây

dựng rất đơn giản. Có nhiều điểm cải tạo phần bếp hay nhà ở của gia đình làm

nơi giết mổ hoặc lợi dụng phần sân giếng, sàn nhà,… làm bàn giết mổ. Với

các điểm giết mổ gia cầm còn được thực hiện ngay trên nền chợ hoặc vỉa hè,

vì thế không tuân thủ đầy đủ các quy định về điều kiện vệ sinh thú y đối với

điểm giết mổ. Nền, sàn nơi giết mổ không được cọ rửa vệ sinh thường xuyên,

nếu có chỉ làm qua loa. Đây là nơi trú ẩn, lưu cữu nhiều loại vi sinh vật gây

bệnh cho con người, vật nuôi làm cho thân thịt bị nhiễm bẩn.

Khả năng thoát nước không đạt yêu cầu, không có hệ thống bể lắng và

xử lý nước thải trước khi đưa vào hệ thống thoát nước công cộng. Tường bao

không có hoặc nếu có lại không được ốp lát mà chỉ trát bằng vôi vữa thông

thường. Các khâu giết mổ: tháo tiết, cạo lông, làm lòng, pha lóc và phân loại

thịt đều tiến hành chung trên cùng diện tích, giết mổ trên sàn nền xi măng.

Các công đoạn giết mổ chồng chéo lên nhau. Do hầu hết tại các điểm giết mổ

không phân thành khu riêng nên thân thịt, phủ tạng và chất thải đều để chung

lẫn nhau.

Giết mổ trong một môi trường không vệ sinh là điều kiện thuận lợi

cho các vi khuẩn có ở môi trường hay trong đường tiêu hoá gia súc, gia

cầm xâm nhập vào thịt gây ô nhiễm thịt, từ đó gây ngộ độc thực phẩm cho

người tiêu dùng.

Một số điểm giết mổ gia súc, gia cầm khi nhập gia cầm, gia súc về

không kiểm tra xem chúng có bị mắc hoặc nghi mắc bệnh truyền nhiễm, đem

giết mổ ngay. Đây là nguyên nhân làm mầm bệnh có điều kiện phân tán, lây

lan sang vật nuôi và có thể lây sang con người.

Kết quả cụ thể được trình bày bảng 3.2

Trong 467 điểm giết mổ chỉ có 02 điểm giết mổ lợn và 02 điểm giết mổ

gia cầm được phân thành khu riêng biệt, chiếm tỷ lệ 0,9%. Có 04 điểm giết

mổ lợn và 05 điểm giết mổ gia cầm được giết mổ trên bàn hoặc bệ xi măng,

chiếm tỷ lệ 1,9%. 02 điểm giết mổ lợn có khu khám thân thịt và phủ tạng

riêng biệt chiếm tỷ lệ 0,4%. Các điểm giết mổ gia súc, gia cầm chủ yếu là giết

mổ trên sàn nhà, 191 điểm giết mổ lợn, 89 điểm giết mổ trâu, bò và 172 điểm

giết mổ gia cầm, chiếm tỷ lệ 96,8%.

Về vệ sinh tiêu độc nhà xưởng, trang thiết bị, dụng cụ giết mổ trước và

sau khi giết mổ cũng như việc vệ sinh tiêu độc định kỳ có ý nghĩa rất quan

trọng trong khâu vệ sinh giết mổ nhằm tiêu diệt các vi sinh vật gây ô nhiễm

lưu trú trên nền, sàn, bàn bệ và các vật dụng khác. Thực trạng hiện nay hầu

hết các điểm giết mổ trên địa bàn Hà Nội đều không quan tâm đến vệ sinh

tiêu độc.

Bảng 3.2: Kết quả điều tr điều iện điểm iết mổ và ph ơn tiện vận chuyển củ các điểm iết mổ

trên đị bàn à ội

iều iện điểm iết mổ

h ơn tiện vận chuyển

Số l ợn

ối t ợn

các điểm

ợc phân

Bao gói

TT

iết mổ

thành khu

iết mổ trên

Có khu khám thân

Ôtô Xe máy

hi vận

riên biệt

bàn, bệ

sàn nhà

thịt, phủ tạn

chuyển

Lợn

199

191

179

Trâu, bò

Gia cầm

179

172

164

ổn

467

04

09

452

02

40

427

0 ỷ lệ %

0,9

1,9

96,8

0,4

8,6

91,4

0

- Về phương tiện vận chuyển

Điều tra 467 điểm giết mổ gia súc, gia cầm. Chúng tôi thấy vận chuyển

bằng ô tô có 40 điểm, chiếm tỷ lệ 8,6%; trong đó có 20 điểm giết mổ lợn, 05

điểm giết mổ trâu, bò và 15 điểm giết mổ gia cầm. Phương tiện vận chuyển

chủ yếu bằng xe máy, có 427 điểm, chiếm tỷ lệ 91,4%; trong đó 179 điểm giết

mổ lợn, 84 điểm giết mổ trâu, bò và 164 điểm giết mổ gia cầm. Tất cả các

điểm giết mổ đều không bao gói thân thịt khi vận chuyển tới nơi tiêu thụ.

Đối với các cơ sở giết mổ gia cầm: gia cầm sống được nhốt trong các

lồng sắt hoặc lồng tre chật chội và vận chuyển đến nơi giết mổ bằng xe máy.

Sau khi giết mổ, tất cả các điểm giết mổ đều sử dụng xe máy để vận chuyển

thân thịt, phủ tạng đến nơi bày bán. Các thân thịt này đều không được bao gói

trong khi vận chuyển, chúng thường được đựng trong các lồng sắt, làn mây,

làn tre, bao tải dứa,... Riêng đối với thân thịt lợn sau khi giết mổ xong thường

không được đựng trong dụng cụ chuyên biệt mà được để trực tiếp lên khung

xe hoặc yên xe để vận chuyển đến nơi bày bán.

Các phương tiện vận chuyển thịt, gia súc và gia cầm sống ở các điểm

giết mổ trên thường không phải là các phương tiện vận chuyển chuyên dụng,

chúng có thể được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau không đảm bảo vệ

sinh theo quy định của Pháp lệnh thú y. Vì thế thịt và các sản phẩm từ thịt có

thể bị ô nhiễm trong quá trình vận chuyển hoặc ô nhiễm từ các phương tiện

này. Việc vận chuyển gia súc, gia cầm sống như trên cũng là nguyên nhân

làm lây lan dịch bệnh, gieo rắc mầm bệnh ra môi trường xung quanh và gây ô

nhiễm môi trường.

Trang thiết bị phục vụ trong quá trình giết mổ: tại 467 điểm giết mổ

chúng tôi điều tra đều giết mổ theo lối thủ công với các dụng cụ đơn giản như

dao, xô, chậu, cân, móc, rổ, rá, bao tải dứa, túi nilon,... Các dụng cụ này có

thể được sử dụng từ ngày này sang ngày khác, việc đánh rửa, vệ sinh ít được

quan tâm. Không đảm bảo yêu cầu vệ sinh cũng là nguồn gây ô nhiễm vào

thân thịt.

3.1.3 Thực trạng vệ sinh tại khu giết mổ gia súc, gia cầm trên địa bàn Hà Nội

Qua điều tra hoạt động giết mổ trên địa bàn Hà Nội cho thấy thực trạng

vệ sinh tại khu giết mổ gia súc, gia cầm như sau:

- Đối với nước sử dụng trong quá trình giết mổ

Như đã biết nước sử dụng trong giết mổ là một trong những yếu tố

quan trọng ảnh hưởng lớn đến chất lượng vệ sinh của thịt. Số liệu trong bảng

3.3 cho thấy nguồn nước sử dụng trong giết mổ ở các điểm giết mổ lợn, trâu,

bò, gia cầm chủ yếu là nước giếng khoan chưa qua xử lý. Có tới 309 điểm

trong tổng số 467 điểm giết mổ sử dụng nước giếng khoan, chiếm tỷ lệ

66,2%. Cụ thể 141 điểm giết mổ lợn, 62 điểm giết mổ trâu, bò và 106 điểm

giết mổ gia cầm sử dụng nước giếng khoan. Chỉ có 158 điểm có sử dụng nước

máy (đạt tiêu chuẩn vệ sinh), chiếm tỷ lệ 33,8%. Trong đó, có 58 điểm giết

mổ lợn, 27 điểm giết mổ trâu, bò và 73 điểm giết mổ gia cầm. Không có điểm

giết mổ nào dùng nguồn nước giếng khơi.

Trong quá trình điều tra chúng tôi thấy hầu hết các hộ đều sử dụng bể

chứa nước nằm trong khu giết mổ. Nước được đựng trong các thùng, xô,

chậu,... tận dụng, có thể sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau trong sinh

hoạt gia đình. Sau đó những dụng cụ này lại được dùng để đựng nước phục vụ

cho các công đoạn của quá trình giết mổ như dội rửa khi cạo lông (vặt lông),

mổ thịt hay làm lòng,... Chính việc làm này đã tạo điều kiện cho các loại vi

khuẩn từ môi trường, lông, da, phân của gia súc xâm nhập vào thân thịt qua

nguồn nước gây nhiễm vi khuẩn vào thân thịt, ảnh hưởng lớn đến sức khoẻ

người tiêu dùng.

- Về việc xử lý chất thải tại các điểm giết mổ

Các chất thải rắn ở các điểm giết mổ thường là phân, lông, các chất

chứa trong dạ dày, diều, bạc nhạc, xương, gân, thịt vụn, một số phần bỏ đi của

cơ quan nội tạng,... Các chất thải lỏng ở các điểm giết mổ thường là cặn hữu

cơ, mỡ, máu, nước bọt, dịch tiết các tuyến,... Đi kèm với các chất thải rắn và

chất thải lỏng ở các điểm giết mổ này bao gồm rất nhiều tập đoàn vi khuẩn

yếm khí, hiếu khí, trứng giun sán các loại và thậm chí còn có rất nhiều loại vi

khuẩn có khả năng gây bệnh cho người và gia súc. Nếu không qua xử lý thì

nó là nguồn gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng và làm lây lan dịch bệnh,

ảnh hưởng đến sức khỏe của con người và vật nuôi, làm ảnh hưởng xấu đến

môi trường sinh thái. Lượng chất thải rắn và chất thải lỏng ở các điểm giết mổ

phụ thuộc vào công suất giết mổ, từ đó định ra các biện pháp xử lý thích hợp.

Đối với chất thải rắn thường thu gom và xử lý theo phương pháp nhiệt sinh

học. Đối với chất thải lỏng thường được tách mỡ, khử trùng bằng hóa chất

hoặc đưa vào hầm chứa yếm khí, hồ sinh học, bể biogas,... được pha loãng

trước khi đưa vào hệ thống cống rãnh chung hoặc đổ ra ao, hồ, sông ngòi,...

Qua điều tra 467 điểm giết mổ gia súc, gia cầm trên địa bàn Hà Nội

chúng tôi thấy: có 393/467 điểm giết mổ (chiếm tỷ lệ 84,2%), chất thải được

thải tự do ra môi trường. Cụ thể, 170 điểm giết mổ lợn, 71 điểm giết mổ trâu,

bò và 152 điểm giết mổ gia cầm cho chất thải tự do ra môi trường. Chỉ có 29

điểm giết mổ lợn, 18 điểm giết mổ trâu, bò và 27 điểm giết mổ gia cầm dùng

hồ chứa sinh học. Tổng số 74 điểm chiếm tỷ lệ 15,8%, có sử dụng hầm chứa,

hồ sinh học để xử lý chất thải. Trong 467 điểm giết mổ gia súc, gia cầm,

không có điểm nào sử dụng phương pháp Biogas để xử lý chất thải.

- Vệ sinh tiêu độc nơi giết mổ

Vi sinh vật luôn luôn tồn tại với số lượng rất lớn trong môi trường xung

quanh khu vực giết mổ, trên các dụng cụ dùng trong giết mổ. Nền, sàn, các đồ

dùng, dụng cụ sử dụng trong quá trình giết mổ nếu như không được vệ sinh

và khử trùng tốt sẽ là nguồn gây ô nhiễm vi sinh vật vào trong thân thịt. Do

vậy, việc vệ sinh tiêu độc khu vực, dụng cụ giết mổ trước và sau khi giết mổ

cũng như việc tiêu độc định kỳ có ý nghĩa rất quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp

đến chất lượng vệ sinh thân thịt.

Thực trạng hiện nay hầu hết các điểm giết mổ tư nhân trên địa bàn Hà Nội

đều không quan tâm đến vệ sinh tiêu độc. Hơn nữa các điểm giết mổ gia súc, gia

cầm phần lớn không chịu sự quản lý, kiểm tra, giám sát của trạm thú y, nên các

điểm giết mổ tiến hành giết mổ một cách tự do không thực hiện theo quy trình vệ

sinh thú y. Cách giết mổ tùy tiện này đã làm cho hệ vi sinh vật phát triển và tồn

tại trên nền, sàn khu giết mổ, tường nhà và các vật dụng tham gia vào quá trình

giết mổ sau đó gây ô nhiễm vào thịt. Việc vệ sinh tiêu độc khử trùng dụng cụ

giết mổ không được tiến hành thường xuyên. Dụng cụ giết mổ thường là dao,

được sử dụng với nhiều mục đích và tham gia vào nhiều khâu của quá trình giết

mổ như chọc tiết, cạo lông, làm lòng sau đó lại được sử dụng để pha thịt bán cho

người tiêu dùng tại các chợ. Trước và sau khi giết mổ hay trong từng công đoạn

khác nhau của quá trình giết mổ, dao không hề được khử trùng dù bằng nước

nóng, xà phòng hoặc các hóa chất khử trùng khác,... Chính các dụng cụ giết mổ

này là một trong những tác nhân gây ô nhiễm vi sinh vào thịt.

Điều tra thực tế cho thấy các khu giết mổ của các điểm giết mổ gia súc,

gia cầm trên địa bàn Hà Nội thường tận dụng nền sân, nền bếp hoặc sân

giếng, vỉa hè,... không có khu giết mổ riêng. Khu giết mổ thường gần bếp, gần

nơi có nguồn nước, rãnh thoát nước của gia đình hoặc cống rãnh chung, có

khi ngay trước nơi nhốt gia súc, gia cầm hoặc gần khu công trình vệ sinh của

gia đình, nơi có nhiều người và vật nuôi thường xuyên qua lại.

Hơn nữa việc vệ sinh tiêu độc khu giết mổ không được thực hiện trước

và sau khi giết mổ hoặc không được tiêu độc định kỳ. Nếu có việc tiêu độc

cũng chỉ được thực hiện bằng các phương pháp cơ giới như dùng chổi tre

quét nền hoặc dùng nước dội rửa. Mặt khác nền, sàn khu giết mổ thường ẩm

ướt và có nhiều chất hữu cơ nên chính những nơi này là nơi lưu cữu rất

nhiều loại vi sinh vật, trong đó có cả các loại vi sinh vật gây bệnh cho người

và gia súc hoặc gây ngộ độc thực phẩm do bị vấy nhiễm vào thịt.

Trong 467 điểm giết mổ, chỉ có 91 điểm giết mổ vệ sinh tiêu độc dụng

cụ giết mổ, chiếm tỷ lệ 19,5%. Với 41 điểm giết mổ lợn, 21 điểm giết mổ

trâu, bò và 29 điểm giết mổ gia cầm. Thực hiện vệ sinh tiêu độc trước và sau

khi giết mổ, có 16 điểm giết mổ lợn, 15 điểm giết mổ trâu, bò và 21 điểm

giết mổ gia cầm. Tổng 52 điểm giết mổ vệ sinh tiêu độc trước và sau khi giết

mổ, chiếm tỷ lệ 11,1%. Vệ sinh tiêu độc định kỳ khu giết mổ có 66 điểm,

chiếm tỷ lệ 14,1%. Trong đó: 28 điểm giết mổ lợn, 14 điểm giết mổ trâu, bò

và 24 điểm giết mổ gia cầm.

Thực trạng vệ sinh tại khu giết mổ của các điểm giết mổ gia súc, gia

cầm trên địa bàn Hà Nội được trình bày cụ thể ở bảng 3.3

Qua kết quả điều tra cho thấy, ý thức của những người trực tiếp tham

gia giết mổ chưa cao do thiếu hiểu biết về vệ sinh môi trường và an toàn vệ

sinh thực phẩm. Họ chưa được đào tạo qua các lớp hướng dẫn quy trình

giết mổ, do không được học tập và phổ biến kiến thức các văn bản pháp

luật của nhà nước, do chạy theo lợi nhuận trước mắt mà coi nhẹ chất lượng

vệ sinh an toàn thực phẩm, coi nhẹ trách nhiệm của người kinh doanh đối

với quyền lợi của người tiêu dùng, coi thường công tác bảo vệ sức khỏe

cho cả cộng đồng.

Bảng 3.3: hực trạn vệ sinh củ các điểm iết mổ i súc, i cầm thuộc đị bàn à ội

uồn n c sử ụn

h ơn pháp xử lý chất thải

Vệ sinh tiêu độc

trong GM(*)

Số l ợn

ối t ợn

STT

điểm iết

c

ầm

VS (**)

VS

iết mổ

hải tự

c

mổ

iến

chứ , hồ

Biogas

ụn cụ

tr c, s u

định ỳ

do

máy

khoan

hơi

sinh học

GM

khi GM

khu GM

170

141

199

Lợn

Trâu, bò

152

106

179

Gia cầm

393

0

74

0

91

52

66

467 ổn hợp

158

309 ỷ lệ (%)

33,8

66,2

0,0

15,8

0,0

84,2

19,5

11,1

14,1

Ghi chú:

(*)GM: Giết mổ (**) VSTĐ: Vệ sinh tiêu độc

Tồn tại lớn nhất trong hoạt động giết mổ ở địa bàn Hà Nội hiện nay là tại

các điểm giết mổ thiếu cán bộ thú y kiểm soát. Như vậy, một số lượng thịt rất

lớn chưa qua kiểm soát giết mổ vẫn được buôn bán tự do, lưu thông trên thị

trường, nhưng người tiêu dùng không hề biết thịt mình mua có được an toàn hay

không. Không ai có thể biết trước được khi nào nguồn thực phẩm này gây ra ngộ

độc. Đây là điều hết sức lo ngại vì từ khi giết mổ qua quá trình vận chuyển đến

nơi tiêu thụ, mầm bệnh có nhiều điều kiện thuận lợi để phát tán trên diện rộng,

đó cũng là nguyên nhân gây ra những ổ dịch bệnh động vật trên địa bàn.

3.1.4 Thực trạng điều kiện vệ sinh thú y tại cơ sở kinh doanh, chợ, tiêu thụ

sản phẩm thịt gia súc, gia cầm

Thành phố Hà Nội đã tổ chức xây dựng nhiều chợ đầu mối, tuy

nhiên sau khi xây dựng xong đã có nhiều chợ đầu mối hoạt động không

hiệu quả, phải đóng cửa, chuyển đổi hình thức kinh doanh, chuyển sang

hình thức kinh doanh bán lẻ. Có khoảng 300 chợ có hoạt động kinh doanh

sản phẩm gia súc, gia cầm không bao gồm cả chợ cóc, chợ tạm. Ý thức

chấp hành quy định của pháp luật về kiểm dịch, kiểm soát giết mổ, kiểm

tra vệ sinh thú y của người kinh doanh, buôn bán sản phẩm gia súc, gia

cầm thấp. Hầu hết thịt gia súc bày bán ở chợ được vận chuyển bằng xe

máy, không được che đậy. Thịt gia súc, gia cầm bày bán ở các chợ cóc,

chợ tạm thường không qua kiểm soát thú y, không có dấu kiểm soát giết

mổ, tem kiểm tra vệ sinh thú y theo đúng quy định.

Theo báo cáo của Chi cục Thú y Hà Nội, khoảng 75% trường hợp kinh

doanh sản phẩm gia súc, gia cầm không rõ nguồn gốc, không có giấy chứng

nhận kiểm dịch, không được kiểm tra, kiểm soát giết mổ. Trong đó, 35 - 40%

sản phẩm gia súc, gia cầm được giết mổ tại các điểm, hộ giết mổ thủ công ở

các tỉnh lân cận chuyển về Hà Nội tiêu thụ, 30 - 35% sản phẩm gia súc, gia

cầm được giết mổ tại các điểm, hộ giết mổ tại các huyện ngoại thành Hà Nội.

3.2 hiết lập và chuẩn hó ph ơn pháp ùn để xác định vi

huẩn VTEC

Với những trường hợp bệnh ở người và động vật có liên quan tới

VTEC, trong đó có cả những bệnh gây nguy hiểm tới tính mạng con người

như hội chứng huyết niệu (HUS), thực tế đòi hỏi phải có một phương pháp

nghiên cứu nhạy và đặc hiệu nhằm phát hiện vi khuẩn này. Trong đó, PCR đã

và đang được đánh giá là phương pháp chính xác, nhanh và tiện dụng nhất để

phát hiện các mẫu thực phẩm hoặc mẫu phân có chứa VTEC thông qua xác

định gen quy định các yếu tố độc lực của vi khuẩn này (Paton A. W. và J. C.

Paton, 2002) [72]. Tuy nhiên, hiện nay, ở Việt Nam chưa có công trình

nghiên cứu nào khẳng định cũng như chưa có những nghiên cứu cụ thể để

thiết lập và chuẩn hóa quy trình xác định VTEC trong thịt bằng PCR.

3.2.1 Lựa chọn giữa PCR đơn mồi và Multiplex - PCR

Phản ứng PCR đơn mồi đã được nhiều tác giả nghiên cứu và thiết lập

để xác định sự có mặt của vi khuẩn VTEC. Tuy nhiên, phương pháp này đòi

hỏi một số lượng lớn phản ứng PCR để có thể xác định được các đặc tính

của VTEC.

Theo nguyên lý ban đầu, mỗi phản ứng PCR sẽ được thực hiện với sự

tham gia của một cặp mồi đặc biệt. Trong nhiều trường hợp, việc tiến hành

nhiều phản ứng PCR sẽ mất khá nhiều thời gian và việc sàng lọc sẽ gây tốn

kém (Lê Thị Tuyết Trinh, 2007) [9]. Để giảm số lượng phản ứng PCR cần

thiết và sàng lọc gen độc tố của các loại E. coli, nhiều tác giả đã cải tiến đưa

ra phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi trong 1 phản ứng PCR, để cùng

khuếch đại được nhiều đoạn DNA (Nguyễn Bình Minh, 2004) [5].

Với mục đích tiết kiệm chi phí, thời gian và sức lao động, các phản ứng

Multiplex - PCR cần thiết để chẩn đoán VTEC đã được nghiên cứu và áp

dụng (Paton A. W. và J. C. Paton, 2002) [72].

Độc lực của VTEC gồm nhiều yếu tố khác nhau, trong đó hai yếu tố

độc lực chính là độc tố verocytotoxin (VT1 và VT2). Hai loại độc tố này gây ra

một số thể bệnh ở những người bị nhiễm, từ thể bệnh tiêu chảy nhẹ đến những

thể bệnh nặng hơn như tiêu chảy có lẫn máu, viêm ruột xuất huyết, hội chứng

huyết niệu, viêm màng não,...(Paton A. W. và J. C. Paton, 2002) [72]. Bên cạnh

đó, intimin cũng được coi là một yếu tố độc lực của VTEC vì là yếu tố hỗ trợ

cho quá trình sản sinh độc tố. Intimin có bản chất là protein, mã hóa bởi gen

eae, giúp cho quá trình VTEC gắn vào tế bào biểu mô ruột, gây nên bệnh tích

bám dính và xâm nhập (A/E) ở niêm mạc ruột. Mối liên quan giữa việc nhiễm

các chủng VTEC có khả năng sản sinh intimin và các trường hợp bệnh nặng ở

người cũng đã được chứng minh (Jorge Blanco và cs. 2007) [44].

Hai loại độc tố VT và yếu tố intimin có liên quan mật thiết tới khả năng

gây bệnh của vi khuẩn E. coli, trong đó gen VT mã hóa cho độc tố VT, là

nguyên nhân gây hội chứng huyết niệu trên các bệnh nhân, còn gen eae mã

hóa cho yếu tố bám dính intimin - là yếu tố then chốt giúp cho vi khuẩn tấn

công qua niêm mạc đường tiêu hóa.

Theo đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng một phương

pháp Multiplex - PCR nhằm xác định 3 loại gen độc lực của các chủng VTEC

đối chứng, từ đó áp dụng đối với các chủng phân lập được, lần lượt là gen

VT1 mã hóa cho độc tố VT1, gen VT2 mã hóa cho độc tố VT2 và gen eae mã

hóa cho yếu tố intimin.

Thí nghiệm được tiến hành với 2 chủng vi khuẩn E. coli đối chứng

dương (FD523, FD636) và 1 chủng vi khuẩn E. coli đối chứng âm (C-600).

DNA mẫu là một lượng nhỏ khuẩn lạc của vi khuẩn đã được nuôi cấy trên đĩa thạch máu cừu (370C/24 giờ).

Ban đầu, phản ứng PCR đơn được thực hiện với từng cặp mồi riêng

biệt. Sau đó, phản ứng Multiplex - PCR được thực hiện với sự phối hợp đồng

thời của 3 cặp mồi. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4.

Bản 3.4: Kết quả thử n hiệm phản ứn đơn và Multiplex - PCR để

phát hiện một số en độc lực củ V E

đơn mồi Multiplex - PCR Chủn vi huẩn

iểm tr VT1 VT2 eae VT1 VT2 eae

E. coli FD523 + + - + + -

E. coli FD636 + + + + + +

E. coli C-600 - - - - - -

Kết quả cho thấy: khi dùng phản ứng PCR đơn mồi và Multiplex - PCR

chủng E. coli FD523 đều có kết quả dương tính với gen VT1, VT2 và âm tính

với gen eae. Chủng E. coli FD636 cho kết quả dương tính với cả 3 loại gen

VT1, VT2 và eae. Riêng chủng E. coli C-600 kết quả âm tính với cả 3 loại

gen khi dùng phản ứng ứng PCR đơn mồi và Multiplex - PCR.

Như vậy, phản ứng Multiplex - PCR với cả 3 loại cặp mồi đều cho các

sản phẩm riêng biệt và ổn định như trong phản ứng với từng cặp mồi riêng

biệt. Ngoài ra, phản ứng Multiplex - PCR còn thể hiện một số ưu điểm khác

như: tiết kiệm thời gian, công lao động và đặc biệt là tiêu hao vật tư, hóa chất

cho một phản ứng cũng giảm đáng kể. Do đó, để xác định vi khuẩn VTEC

trong thịt nên sử dụng phản ứng Multiplex - PCR.

Trên thế giới, cũng như Việt Nam có một số công trình nghiên cứu về

phản ứng Multiplex - PCR. Meng và cs. (1996, 1997) [62] [63] đã phát triển

một phương pháp PCR, ngoài gen VT, cũng có thể sử dụng để xác định gen

eae và plasmid 60-Mda. Catalina Lopez-Saucedo đã sử dụng 7 cặp mồi lt, st,

bfpA, stx1, stx2, ial trong một phản ứng để phát hiện ETEC, EPEC, EHEC,

EIEC (trích dẫn theo Matar và cs. 2002) [58]. Trần Trí Tuệ, (2001) [10] đã

dùng 8 cặp mồi nhằm chẩn đoán các E. coli gây tiêu chảy.

Nhìn chung, các tác giả đều có chung một nhận xét là kỹ thuật

Multiplex - PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có ý nghĩa thiết thực và đặc

biệt kỹ thuật Multiplex - PCR là một chẩn đoán có giá trị dịch tễ học (Nguyễn

Bình Minh, 2004) [5]. Nhờ kỹ thuật này có thể tiến hành đồng thời số lượng

lớn mẫu, tiết kiệm thời gian và sinh phẩm.

3.2.2 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp để tách chiết DNA mẫu

Thí nghiệm được tiến hành với 2 chủng vi khuẩn E. coli đối chứng

dương (FD523, FD636) và 1 chủng vi khuẩn E. coli đối chứng âm (C-600).

Vi khuẩn được nuôi cấy trên 5 loại môi trường lỏng (LB, m-TSB, BHI,

BPW và NB) và thạch máu. Ủ ở tủ ấm 370C qua đêm.

Sau đó, phản ứng PCR được tiến hành theo phương pháp như đã mô tả ở

mục 2.5.3, kết quả trình bày ở bảng 3.5.

Bản 3.5. Kết quả xác định môi tr n thích hợp nuôi cấy vi huẩn E.

coli để chiết tách D A ch phản ứn

Kết quả phản ứn

Số lần

L ại môi

tr n nuôi

hủn đối chứng dương hủn đối chứn âm

thí

nghiệm

cấy

FD523

FD636

C-600

m-TSB

BHI

BPW

+ Đối với chủng vi khuẩn E. coli đối chứng dương (FD523, FD636):

DNA được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nuôi cấy trên các loại môi trường

khác nhau đều cho kết quả tương đương

+ Đối với chủng vi khuẩn E. coli đối chứng âm (C-600): DNA được

tách chiết từ chủng vi khuẩn nuôi cấy trên các loại môi trường khác nhau cho

kết quả âm tính ổn định

Như vậy, có thể thấy: cả 5 loại môi trường lỏng đều không gây ảnh

hưởng đến chất lượng và kết quả của phản ứng PCR. Tuy nhiên, khi tiến

hành so sánh và phân tích thêm một số chỉ tiêu khác (chất lượng môi trường

ảnh hưởng tới mức độ tăng sinh của vi khuẩn, giá thành, tác động tới môi

trường, ...), chúng tôi đã quyết định lựa chọn môi trường m-TSB là môi

trường tăng sinh thích hợp ban đầu cho việc kiểm tra sự có mặt của nhóm vi

khuẩn VTEC đối với các mẫu thịt tươi. Riêng đối với vi khuẩn đã được nuôi

cấy lên môi trường thạch máu, cũng có thể sử dụng trực tiếp cho phản ứng

PCR, không cần chiết tách và không làm ảnh hưởng tới chất lượng phản ứng.

Mặc dù việc kiểm tra trực tiếp mẫu thực phẩm hoàn toàn có thể thực

hiện được, nhưng để thu được kết quả tốt nhất, nên nuôi cấy tăng sinh mẫu

trong một môi trường thích hợp, sau đó sử dụng canh khuẩn đó làm mẫu

DNA cho phản ứng PCR (Gannon và cs. 1992) [32]; (Paton và cs. 1993) [69];

(Begum và Jackson, 1995) [14]; (Paton, 1998) [71] và (Paton, 2002) [72].

Việc lựa chọn một loại môi trường thích hợp, vừa có tác dụng tăng sinh vi

khuẩn từ mẫu ban đầu, vừa có thể được sử dụng trực tiếp để tách DNA cho

phản ứng PCR là việc làm cần thiết, có ý nghĩa quan trọng đối với việc kiểm

tra chất lượng vi sinh của thực phẩm, đặc biệt là trong trường hợp các mẫu là

thực phẩm chín và cần phải trả lời kết quả ngay trong thời gian ngắn.

3.2.3 Kết quả thực hiện phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn E. coli

tham chiếu

Bản 3.6 : Kết quả thực hiện phản ứn Multiplex – PCR để phát hiện

các chủn vi huẩn E. coli đối chứn ơn

Một số yếu tố ây bệnh Ký hiệu chủn vi huẩn VT1 VT2 eae

E. coli FD523 + - +

E. coli FD526 E. coli FD528 - + - - + -

E. coli FD635 + + +

Đối chứng dương

E. coli FD636 E. coli BDL9.1 E. coli BKT29.1 E. coli E4 E. coli E7 E. coli E41 + + + + + + + - - - - - + - - + + +

Bản 3.6b: Kết quả thực hiện phản ứn Multiplex – PCR v i

các chủn vi huẩn đối chứn âm

Ký hiệu chủn vi huẩn

Đối chứng âm

E. coli (C-600) (K-12) E. coli FV847a E. coli FV2289 E. coli FV2586 E. coli FV2593 S. typhymurium (FD675) P. multocida (PM-VT3) S. suis (HN-25) S. aureus (FD231) C. perfringens (BCD6) Một số yếu tố ây bệnh VT2 - - - - - - - - - - VT1 - - - - - - - - - - eae - - - - - - - - - -

Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex - PCR đã được chuẩn hóa dùng

để xác định 3 gen (VT1, VT2 và eae) với 10 chủng đối chứng dương và 10

chủng đối chứng âm được trình bày ở bảng 3.6a và 3.6b. Hình ảnh Multiplex

– PCR cung cấp ở hình 3.1

Từ kết quả bảng 3.6a cho thấy: các chủng vi khuẩn E. coli FD523,

E. coli E4, E. coli E7, E. coli E41 dương tính với gen VT1, VT2 và âm tính

với gen eae. Chủng vi khuẩn E. coli FD635, E. coli FD636 dương tính với cả

3 gen. Chủng vi khuẩn E. coli FD528, E. coli BDL9.1, E. coli BKT29.1 chỉ

dương tính với gen VT2. Chủng vi khuẩn E. coli FD526 chỉ dương tính với

gen VT1.

Kết quả bảng 3.6b: tất cả 10 chủng vi khuẩn đối chứng âm đều âm tính

với cả 3 gen VT1, VT2 và eae.

So sánh kết quả với các thông tin về đặc tính của một số yếu tố gây

bệnh được công bố ở bảng 2.4 và 2.5, thì kết quả hoàn toàn phù hợp.

Như vậy, có thể kết luận: phản ứng PCR đã được chuẩn hóa trong

nghiên cứu này dùng để xác định 3 loại gen có độ đặc hiệu là 100% khi được

xem xét thử nghiệm trên các chủng đối chứng.

Trong nghiên cứu này, sau khi đã phát triển và hoàn thiện quy trình

tách DNA của các chủng vi khuẩn đối chứng, chúng tôi đã đánh giá độ nhạy

và độ đặc hiệu của phản ứng PCR trong môi trường nhân tạo và trên các mẫu

thịt sạch.

Kỹ thuật PCR hiện đang được đánh giá là một phương pháp có độ nhạy

và độ đặc hiệu rất cao, gần 100%. Sở dĩ có độ nhạy và độ đặc hiệu cao như

vậy là do nguyên lý của PCR sử dụng cặp mồi gắn đặc hiệu vào đoạn DNA

đích. Khi thực hiện phản ứng PCR, người ta nhận thấy độ nhạy của phản ứng

cũng chính là giới hạn phát hiện của phản ứng. Giới hạn này chính là nồng độ

của đoạn DNA đích trong hỗn hợp phản ứng. Bên cạnh đó, độ đặc hiệu của

phản ứng PCR là độ đặc hiệu của các cặp mồi sử dụng. Cặp mồi phải được

lựa chọn sao cho có khả năng ghép cặp tốt với trình tự ở 2 đầu của đoạn DNA

đích. Kết quả xác định độ đặc hiệu ghi nhận được còn cho thấy đoạn DNA

đích được lựa chọn để khuếch đại có trình tự các nucleotide trong đoạn gen

tương đối ổn định và xuất hiện với tần số cao ở các chủng vi khuẩn cần

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

nghiên cứu nhưng lại không thấy ở các chủng vi khuẩn khác.

Ghi chú: M: 100 bp marker. Giếng 1: FD523 (VT1/VT2). Giếng 2: FD526 (VT1).

Giếng 3: FD528 (VT2). Giếng 4: FD635 (VT1/VT2/eae). Giếng 5: FD636 (VT1/VT2/eae).

Giếng 6: BDL9.1 (VT2). Giếng 7: BKT29.1(VT2). Giếng 8: E4 (VT1/VT2). Giếng 9: E7

(VT1/VT2). Giếng 10: E41 (VT1/VT2). Giếng 11, 12, 13, 14, 15: Các chủng đối chứng âm.

ình 3.1: Sản phẩm củ phản ứn v i các chủn vi huẩn đối chứn ơn và âm s u quá trình điện i

3.2.4 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR dùng để

xác định VTEC trong môi trường nhân tạo

Để xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR, trước hết cần

xác định số lượng vi khuẩn trên một số môi trường nuôi cấy, từ đó lựa chọn

được môi trường thích hợp để nhân số lượng vi khuẩn và tách DNA cho phản

ứng PCR. Ngoài ra, thí nghiệm này cũng giúp lựa chọn được môi trường tăng

sinh thích hợp cho việc xác định VTEC trong thịt.

Thí nghiệm được tiến hành như sau: Cấy 1 khuẩn lạc của chủng vi

khuẩn đối chứng dương (FD523, FD636) vào mỗi lọ đựng 20 ml môi trường (LB, m-TSB và BHI). Sau 20 giờ ủ ở 370C, tiến hành pha loãng canh khuẩn theo cơ số 10 để được các nồng độ pha loãng thích hợp (10-1, 10-2, ....,10-8),

đếm số trên môi trường thạch máu, đồng thời tiến hành các bước tách DNA

mẫu (mục 2.5.3) từ tất cả các nồng độ pha loãng (kể cả canh khuẩn ban đầu)

để dùng cho phản ứng PCR.

3.2.4.1Kết quả xác định môi trường tăng sinh thích hợp ban đầu để kiểm tra

sự có mặt của VTEC trong các mẫu thịt tươi

Kết quả đếm số lượng vi khuẩn trong ba loại môi trường nuôi cấy được

thể hiện ở bảng 3.7.

Bản 3.7. Kết quả nuôi cấy h i chủn vi huẩn đối chứn ơn

trên một số môi tr n nuôi cấy

Số l ợn vi huẩn (x 106) iá trị Số lần TN Môi tr n nuôi cấy hủn FD523 hủn FD636

BHI 2375,2 2508,3 P > 0,05

LB 622,5 570,4 3 P > 0,05

m-TSB 660,3 657,5 P > 0,05

Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy, số lượng hai chủng vi khuẩn đối chứng FD523, FD636 trên môi trường nuôi cấy BHI lần lượt là: 2375,2 x 106 CFU/ml, 2508,3 x 106 CFU/ml; trên môi trường LB là 622,5 x 106 CFU/ml, 570,4 x 106 CFU/ml; trên môi trường m-TSB là 660,3 x 106 CFU/ml, 657,5 x 106 CFU/ml. Hình ảnh nuôi cấy chủng FD636 với các nồng độ khác nhau

được cung cấp ở hình 3.2

Các số liệu được xử lý thống kê, sự sai khác này không có ý nghĩa

thống kê (P>0,05). Như vậy, số lượng hai chủng vi khuẩn đối chứng là tương

đương nhau ở cả 3 loại môi trường. Trong đó môi trường BHI cho kết quả cao nhất (2.300 – 2.500 x 106 CFU/ml), sau đó đến môi trường m-TSB với số lượng vi khuẩn đếm được khoảng 660 x 106 trong 1 ml môi trường nuôi cấy

và thấp nhất là môi trường LB.

Hình 3.2: Kết quả nuôi cấy chủn FD636 ở các nồn độ ph l ãn khác nhau trên thạch máu

Điều này chứng tỏ BHI là môi trường có dinh dưỡng tốt nhất cho nuôi

cấy vi khuẩn VTEC. Tuy nhiên, khi tiến hành so sánh và phân tích thêm một

số chỉ tiêu khác (chất lượng môi trường ảnh hưởng tới mức độ tăng sinh của

vi khuẩn, giá thành, tác động tới môi trường, ...), chúng tôi đã quyết định lựa

chọn môi trường m-TSB là môi trường tăng sinh thích hợp ban đầu cho việc

kiểm tra sự có mặt của nhóm vi khuẩn VTEC đối với các mẫu thịt tươi.

Trong thành phần môi trường m-TSB có bổ sung thêm Novobiocin, có

tác dụng ức chế các vi khuẩn Gram dương phát triển, nhằm tạo điều kiện

thuận lợi cho vi khuẩn VTEC (nếu có) phát triển. Môi trường này đã được

một số tác giả sử dụng với mục đích tương tự (Alfredo và cs. 2001) [11];

(Mohammad A. Islam và cs. 2008) [64]; (P. Alexa và cs. 2011) [73].

3.2.4.2 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR dùng để

xác định VTEC trong môi trường nhân tạo

Để xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR, chúng tôi

đã thực hiện phản ứng PCR với 3 cặp mồi đặc hiệu với các gen VT1, VT2 và

eae theo phương pháp như đã mô tả ở mục 2.5.3. Mẫu DNA là vi khuẩn

VTEC ở tất cả các nồng độ pha loãng của canh khuẩn nuôi cấy (kể cả canh

khuẩn ban đầu) của 2 chủng đối chứng dương trên 3 loại môi trường. Kết quả

của phản ứng PCR được thể hiện ở bảng 3.8.

Bản 3.8: Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu củ phản ứn

hi xác định V E trên môi tr n nuôi cấy

Kết quả củ phản ứn

ánh

hủn FD523

hủn FD636

giá

ồn

Số

độ

lần

LB

m-TSB

BHI

LB

m-TSB

BHI

pha

đặc

TN

(6,2x108

(6,6x108

(23,7x108

(5,7x108

(6,5x108

(25,1x108

loãng

hiệu

CFU/ml)

CKBĐ 2/2

10-1

2/2

10-2

2/2

10-3

2/2

10-4

2/2

(%)

10-5

2/2

10-6

2/2

10-7

2/2

10-8

2/2

100

Ghi chú CKBĐ: Canh khuẩn ban đầu

+ Phản ứng dương tính với cả 3 loại gen VT1, VT2 và eae

- Phản ứng âm tính với cả 3 loại gen VT1, VT2 và eae

Bảng 3.8 cho thấy: ở cả 2 chủng đối chứng, phản ứng PCR đều cho kết

quả dương tính với cả 3 gen. Kết quả dương tính này được thể hiện ở canh khuẩn ban đầu và các nồng độ pha loãng 10-1,10-2, 10-3, 10-4. Cả hai chủng đối chứng với nồng độ pha loãng 10-6, 10-7, 10-8 và 10-5( trên môi trường LB, m-

TSB) cho kết quả âm tính. Riêng ở môi trường BHI, cả hai chủng FD523 và FD63 đều cho kết quả dương tính đến nồng độ pha loãng 10-5. Có sự khác biệt

này là do số lượng vi khuẩn trong môi trường BHI sau khi nuôi cấy 24 giờ

nhiều hơn hẳn so với hai môi trường còn lại. Vì vậy, với một lượng mẫu

giống nhau trong thành phần của phản ứng PCR, số lượng DNA trong phản

ứng thực hiện với môi trường BHI sẽ nhiều hơn, do đó phản ứng PCR trong

trường hợp này có độ nhạy cao hơn. Hình 3.3 - 3.4 là sản phẩm của phản ứng

PCR với nồng độ pha loãng khác nhau từ môi trường LB đã nuôi cấy chủng

FD636, FD523.

Như vậy:

- Về độ đặc hiệu của phản ứng: DNA được tách ra từ 3 loại môi trường

nuôi cấy đều cho phản ứng PCR dương tính với độ đặc hiệu là 100% với cả 3

loại gen VT1, VT2 và eae.

- Về độ nhạy của phản ứng: Ngưỡng giới hạn dưới (Lower limit) về số

lượng của vi khuẩn VTEC để có thể phát hiện được trong một số môi trường

nuôi cấy như sau:

+ Môi trường LB: 5,7 - 6,26 x 104 CFU/ml

+ Môi trường m-TSB: 6,5 - 6,6 x 104 CFU/ml

+ Môi trường BHI: 23,75 – 25,08 x 104 CFU/ml

Có thể thấy: ở cả 3 loại môi trường, ngưỡng giới hạn dưới hay mật độ

của vi khuẩn để từ đó có thể dùng để phát hiện được VTEC bằng phản ứng PCR là tương đương nhau, khoảng 5,7 – 25,08 x 104 CFU/ml.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Ghi chú: M: 100 bp marker. Giếng 1: CTBĐ. Giếng 2: nồng độ pha loãng 10- 1 (VT1/VT2/eae). Giếng 3: nồng độ pha loãng 10-2 (VT1/VT2/eae). Giếng 4: nồng độ pha loãng 10-3 (VT1/VT2/eae). Giếng 5: nồng độ pha loãng 10-4 (VT1/VT2/eae). Giếng 6: nồng độ pha loãng 10-5. Giếng 7: nồng độ pha loãng 10-6. Giếng 8: nồng độ pha loãng 10-7. Giếng 9: nồng độ pha loãng 10-8.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Hình 3.3: Sản phẩm củ phản ứn v i nồn độ ph l ãn hác nh u từ môi tr n LB đã nuôi cấy chủn FD636

Ghi chú: M: 100 bp marker. Giếng 1: N/c. Giếng 2: nồng độ pha loãng 10-1 (VT1/VT2/eae). Giếng 3: nồng độ pha loãng 10-2 (VT1/VT2/eae). Giếng 4: nồng độ pha loãng 10-3 (VT1/VT2/eae). Giếng 5: nồng độ pha loãng 10-4 (VT1/VT2/eae). Giếng 6: nồng độ pha loãng 10-5. Giếng 7: nồng độ pha loãng 10-6. Giếng 8: nồng độ pha loãng 10-7. Giếng 9: nồng độ pha loãng 10-8.

Hình 3.4. Sản phẩm củ phản ứn v i nồn độ ph l ãn hác nh u từ môi tr n LB đã nuôi cấy chủn FD523

Trong một nghiên cứu được tiến hành năm 2007, tác giả Lê Thị Tuyết

Trinh [9] đã tiến hành xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR

nhằm hoàn thiện hệ thống Multiplex - PCR để xác định các E. coli gây tiêu

chảy. Với các cặp mồi VT1, VT2 và eae dùng để xác định nhóm EHEC, tác giả đã thu được kết quả về độ nhạy của phản ứng Multiplex - PCR là 105 CFU

/ml. So sánh với kết quả nghiên cứu của chúng tôi, phản ứng PCR của chúng tôi có độ nhạy cao hơn do có thể phát hiện được số lượng 5,7 – 25,08 x 104

CFU/ml.

3.2.5 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR

dùng để xác định VTEC trong mẫu thịt sạch

Thí nghiệm được tiến hành như sau: Chọn 2 mẫu thịt bò, lợn được xác

định là âm tính với VTEC để tiến hành gây nhiễm với mỗi chủng vi khuẩn đối

chứng dương. Lấy 25g thịt cắt nhỏ cho vào 225 ml môi trường m-TSB nuôi cấy vi khuẩn ở 370C/24 giờ. Pha loãng canh khuẩn thành các nồng độ từ 10-1 đến 10-8. Tách DNA theo phương pháp như đã mô tả ở mục 2.5.3 với tất cả

các nồng độ pha loãng (kể cả canh khuẩn ban đầu).

Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR trong mẫu

thịt sạch như sau:

Trong hai loại mẫu thịt sạch (bò, lợn), phản ứng PCR của hai chủng đối

chứng dương đều cho kết quả như nhau. Các phản ứng PCR cho kết quả dương tính từ canh khuẩn ban đầu đến nồng độ pha loãng 10-2, từ nồng độ 10- 3 đến 10-8 đều cho kết quả âm tính (bảng 3.9).

Như vậy, có thể kết luận độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR như sau:

+ Về độ đặc hiệu của phản ứng: DNA được tách ra từ môi trường m-

TSB có các mẫu thịt đều cho các phản ứng PCR dương tính, tương đương độ

đặc hiệu 100% với cả 3 loại gen VT1, VT2 và eae.

+ Về độ nhạy của phản ứng: Với cả 2 loại thịt, ngưỡng giới hạn dưới

(Lower limit) về số lượng của vi khuẩn VTEC để có thể phát hiện được trong

môi trường có các mẫu thịt và đã được gây nhiễm với số vi khuẩn đạt nồng độ cuối cùng là 6,6 x 106 CFU/ml đối với chủng FD523 và 6,2 x 106 CFU/ml đối

với chủng FD636. Hay nói cách khác, số lượng vi khuẩn VTEC nhiễm trong 25 g thịt tươi phải đạt ở mức ~ 6,2 - 6,6 x 106 CFU thì mới có thể xác định được

bằng phương pháp PCR như đã được chuẩn hóa trong nghiên cứu này.

Bản 3.9. Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu củ phản ứn

hi xác định V E tr n m u thịt sạch

Số lần

Kết quả củ phản ứn

ánh iá

ồn độ

TN

độ đặc

pha loãng

hiệu

FD523 (6,6 x 108 CFU/ml)

FD636 (6,2 x 108 CFU/ml)

(m-TSB)

(%)

Lợn

Bò

Lợn

Bò

2/2

+ -

2/2 2/2

+ -

100

2/2

CKBĐ 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8

2/2

Ghi chú: CKBĐ: Canh khuẩn ban đầu

+: Phản ứng dương tính với cả 3 loại gen VT1, VT2 và eae

-: Phản ứng âm tính với cả 3 loại gen VT1, VT2 và eae

Hanna Evelina Sidjabat-Tambunan (1997) [38] tiến hành một nghiên

cứu tương tự với 2 chủng VTEC gây nhiễm trên phân lợn và cừu. DNA được tách chiết từ môi trường tăng sinh LB hoặc EC (ủ ở 370C qua đêm). Kết quả

cho thấy: phản ứng PCR có thể dùng để phát hiện với số vi khuẩn gây nhiễm

vào 500 mg phân bò hoặc lợn là khoảng 10 vi khuẩn đối với môi trường LB,

hoặc 103 đối với môi trường EC (10 ml môi trường, ủ ở 37oC qua đêm). Tuy

nhiên, đây không phải là số lượng dùng cho phản ứng PCR vì với số lượng vi

khuẩn gây nhiễm ban đầu này, mật độ vi khuẩn sau 16 - 18 giờ nuôi cấy ở 370C thường đạt tới 108 CFU/ml.

3.2.6 Quy trình xác định sự có mặt của vi khuẩn VTEC trong các mẫu thịt

Sau khi tiến hành thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR, chúng tôi

đã xây dựng được một quy trình nhằm xác định sự có mặt của vi khuẩn VTEC

trong các mẫu thịt.

Các bước tiến hành như sau:

- Bước 1: Cân 25 gam thịt tươi (không lấy mỡ), cắt nhỏ, cho vào túi

đựng mẫu chuyên dụng, xử l ý trong máy dập mẫu (100 lần/phút) trong 2 - 3

phút hoặc nghiền nhuyễn tiếp trong máy xay thịt từ 2 - 3 phút với vận tốc

10.000 vòng/phút.

- Bước 2: Cho mẫu đã xử l ý vào 225 ml môi trường m-TSB. Ủ ở tủ ấm

370C trong 24 giờ.

- Bước 3: Hút 0,1 ml huyễn dịch đã nuôi cấy, bổ sung vào 5 ml môi trường TPB (Tryptone Phophate Broth). Ủ ở tủ ấm 370C trong 6 giờ. Tiến

hành tách DNA và thực hiện phản ứng PCR như đã mô tả tại phần 2.5.3.

- Bước 4: Ria cấy trực tiếp huyễn dịch đã nuôi cấy lên đĩa thạch MacConkey. Ủ ở tủ ấm 370C trong 24 giờ. Chọn 2 - 3 khuẩn lạc Lactose dương

tính, tiến hành tách DNA và thực hiện phản ứng PCR như đã mô tả tại phần 2.5.3.

- Bước 5: Đối với các mẫu dương tính, tiếp tục thực hiện phản ứng

PCR với từng khuẩn lạc riêng lẻ để xác định các khuẩn lạc dương tính và xác

định serotyp.

Quy trình này được thể hiện rõ hơn qua hình 3.5.

Mẫu thịt (25g, cắt nhỏ)

225 ml môi trường m-TSB

370C/24 giờ

0,1 ml + 5 ml TPB

370C/6 giờ/ lắc

PCR (VT1, VT2, eae)

Dương tính

Thạch MacConkey

2-3 khuẩn lạc Lactose (+)

PCR (VT1, VT2, eae)

Âm tính

Dương tính

PCR (VT1, VT2, eae) từng khuẩn lạc

Xác định serotyp

Âm tính

Hình 3.5. Quy trình xác định V E trên thịt

3.3 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm VTEC trên bò, lợn tại các điểm iết

mổ và chợ thuộc đị bàn Hà Nội

3.3.1 Thu thập mẫu

Từ thực trạng công tác kiểm soát giết mổ, vệ sinh thú y tại các cơ sở

giết mổ và chợ trên địa bàn Hà Nội. Để làm rõ hơn tình hình an toàn thực

phẩm, chúng tôi tiến hành lấy mẫu phân tại các điểm giết mổ, mẫu thịt tại các

điểm giết mổ và chợ trên địa bàn Hà Nội để kiểm tra.

Như đã trình bày ở phần tổng quan, các vật nuôi dùng cung cấp thực

phẩm có thể là nguồn tàng trữ VTEC trong thời gian dài. Do đó, quá trình giết

mổ có thể làm vi khuẩn từ đường tiêu hóa của những động vật này nhiễm vào

các thân thịt; đặc biệt trong điều kiện của các cơ sở giết mổ còn rất thô sơ ở

Hà Nội. Việc giết mổ theo hướng tự phát, phân tán không theo định hướng và

quy hoạch nào, các chủ lò mổ, chủ kinh doanh sản phẩm động vật không có

sự đầu tư và nhận thức đúng mức, hoạt động giết mổ gia súc nhiều khi vượt ra

khỏi sự kiểm soát của các cơ quan chức năng.

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu với một số mẫu phân và mẫu lau

thân thịt thu thập từ lò mổ, được trình bày bảng 3.10.

Tổng số mẫu thu thập là 170 mẫu, trong đó có 35 mẫu lau thân thịt

lợn, 45 mẫu lau thân thịt bò, 30 mẫu phân lợn và 60 mẫu phân bò. Tại cơ

sở giết mổ lợn Trung Văn - Từ Liêm chúng tôi thu thập 15 mẫu lau thân

thịt và 15 mẫu phân lợn. Cơ sở giết mổ Minh Hiền - Thanh Oai, thu thập 20

mẫu lau thân thịt và 15 mẫu phân lợn. Các cơ sở giết mổ bò: Hoàng Mai,

Bình Đà và Đông Anh thu thập mỗi cơ sở 15 mẫu lau thân thịt. Các cơ sở

giết mổ bò: Long Biên, Thanh Trì và Đông Anh, chúng tôi thu thập mỗi cơ

sở 20 mẫu phân.

Bản 3.10: ổn hợp số l ợn và chủn l ại m u thu thập đ ợc

tại một số điểm iết mổ trên đị bàn à ội

M u l u thân thịt M u phân

ổn số m u

TT

ị điểm

thu thập

hịt lợn hịt bò Lợn Bò

Trung Văn

2 Minh Hiền

Hoàng Mai

Bình Đà

Đông Anh

Long Biên

Thanh Trì

Đông Anh

ổn

35

45

30

60

170

Đồng thời, chúng tôi tiến hành lấy mẫu thịt lợn, bò tại một số chợ trên

địa bàn Hà Nội. Tổng hợp số lượng mẫu được trình bày bảng 3.11

Tại chợ Hôm, Bách Khoa, chúng tôi thu thập mỗi chợ 10 mẫu thịt lợn

và 10 mẫu thịt bò. Các chợ Tựu Liệt, Châu Long và siêu thị Unimart mỗi chợ

10 mẫu thịt lợn và 5 mẫu thịt bò. Chợ Cầu Giấy và chợ Hòe Nhai, mỗi chợ 5

mẫu thịt lợn và 10 mẫu thịt bò. Tổng số mẫu thu thập từ các chợ và siêu thị là

115 mẫu, trong đó gồm: 60 mẫu thịt lợn và 55 mẫu thịt bò.

Bản 3.11: ổn hợp số l ợn m u thịt thu thập đ ợc tại một số chợ

trên đị bàn à ội

L ại m u

TT

ị điểm

ổn số

hịt lợn

hịt bò

Chợ Hôm

Chợ Cầu Giấy

Chợ Tựu Liệt

Chợ Bách Khoa

Chợ Hòe Nhai

Chợ Châu Long

Siêu thị Unimart

ổn

55

115

60

3.3.2 Phân lập và giám định đặc tính sinh vật hóa học của các chủng E. coli

Với phương pháp phân lập VTEC theo quy trình xây dựng được trình

bày ở mục 2.5.6. Từ 30 mẫu phân lợn, phân lập được 60 chủng E. coli; từ 60

mẫu phân bò phân lập được 120 chủng E. coli, tổng số chủng E. coli phân lập

được từ 90 mẫu phân là 180 chủng. Với mẫu lau thân thịt, 35 mẫu lau thịt lợn

phân lập được 70 chủng E. coli, 45 mẫu lau thịt bò phân lập được 90 chủng

E. coli. Từ 80 mẫu lau thân thịt ở lò mổ, chúng tôi phân lập được 160 chủng

E. coli. Với mẫu thịt lấy từ các chợ và siêu thị, từ 60 mẫu thịt lợn phân lập

được 120 chủng E. coli, từ 55 mẫu thịt bò phân lập được 110 chủng E. coli.

Như vậy, 115 mẫu thịt lấy từ chợ và siêu thị đã phân lập được 230 chủng

E. coli. Tổng số chủng E. coli phân lập được từ 285 mẫu phân, thịt lấy ở lò

mổ và chợ là 570 chủng.

Bản 3.12: Kết quả phân lập chủn E. coli từ m u b n đầu

Số l ợn Số l ợn chủn ổn

TT uồn ốc m u m u b n đầu E. coli phân lập đ ợc số

chủn Lợn Bò Lợn Bò

1 Phân 30 60 60 120 180

2 Lau thân thịt ở lò mổ 35 45 70 90 160

3 Thịt ở chợ, siêu thị 60 55 120 110 230

125 160 250 320 570 ổn

Năm 2004, các nhà nghiên cứu Việt – Úc đã tiến hành nghiên cứu tần

số hiện diện của E. coli trong thực phẩm (Thi Thu Thao Van, 2007) [89].

Trong nghiên cứu này 180 mẫu thịt bò, thịt lợn, thịt gà, hải sản được lấy từ

các chợ ở Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả phát hiện trên 90% các mẫu thịt,

hải sản chứa E. coli, nhưng chưa xác định được cụ thể là loại E. coli nào. Như

vậy, kết quả phân lập các chủng E. coli từ mẫu phân, mẫu lau thân thịt, mẫu

thịt tại các điểm giết mổ và chợ của chúng tôi hoàn toàn phù hợp.

Kết quả giám định các đặc tính sinh vật hóa học của các chủng này

được trình bày ở bảng 3.13. Các hình ảnh 3.7 - 3.12 là kết quả nuôi cấy vi

khuẩn E. coli trên các môi trường giám định vi khuẩn và các đặc tính sinh hóa

của vi khuẩn.

Kết quả kiểm tra cho thấy tất cả các chủng E. coli phân lập được đều có

các đặc tính sinh vật hóa học giống như các tài liệu trong và ngoài nước đã

mô tả, như bắt mầu Gram âm, Indol dương tính, H2S âm tính, có khả năng di

động, lên men một số loại đường như Lactose, Mannit, Manitol, Glucose,

Xylose, Galactose, Fructose và Sorbitol; lên men không chắc chắn với

Saccarose; không lên men đường Arabinose.

Bản 3.13: Kết quả iểm tr các đặc tính củ vi huẩn E. coli

phân lập đ ợc

ỷ lệ

TT

L ại phản ứn

Số chủn ơn tính

(%)

Gram âm

100

570

Di động

100

570

Indol

100

570

100

570

H2S

Citrat

Đặc tính lên men đường

Lactose

100

570

Mannit

100

570

10 Manitol

100

570

Glucose

100

570

Xylose

100

570

Galactose

100

570

Fructose

100

570

Sorbitol

100

570

Saccarose

37,5

214

Arabinose

Hình 3.7: ính chất mọc củ E. coli trên môi tr n M c n ey Hình 3.8: ính chất mọc củ E. coli trên môi tr n thạch máu

Hình 3.9: ính chất mọc củ E. coli trên môi tr n EMB Hình 3.10: ính chất mọc củ E. coli trên môi tr n -SMAC

Hình 3.11: Khả năn lên men sinh hơi một số l ại đ n củ E. coli Hình 3.12: Khả năn sinh n l củ E. coli

3.3.3 Kết quả phân lập VTEC trong thịt

Các số liệu so sánh về VTEC trong thực phẩm hiện nay còn rất hạn chế

do một số nguyên nhân nhất định. Trước hết là do việc sử dụng các phương

pháp nghiên cứu khác nhau với từng loại sản phẩm khác nhau. Thứ 2 là do

quy trình phân lập và giám định vi khuẩn khác nhau và không thống nhất giữa

các phòng thí nghiệm. Thứ 3, do hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào

E. coli O157: H7 và bỏ qua các chủng vi khuẩn VTEC không thuộc nhóm

O157 (Jorge Blanco và cs. 2007) [44]. Mặc dù vậy, với mục đích xác định tỷ

lệ VTEC trên thịt, chúng tôi đã thu thập mẫu tại chợ và tiến hành thí nghiệm.

Kết quả phân lập VTEC trên mẫu thịt được trình bày ở bảng 3.14.

Bản 3.14. ỷ lệ phân lập vi huẩn V E từ m u thịt

Số m u xét

Số chủn

Số m u ơn

L ại thịt

ỷ lệ %

n hiệm

E. coli

tính v i V E

Thịt lợn

120

40,0

Thịt bò

110

23,6

ổn

115

230

37 32,2

Kết quả bảng 3.14 cho thấy, khi xét nghiệm 60 mẫu thịt lợn phân lập

được 120 chủng E. coli và số mẫu dương tính với VTEC là 24 mẫu, chiếm tỷ

lệ 40,0%. Xét nghiệm 55 mẫu thịt bò phân lập được 110 chủng E. coli và số

mẫu dương tính với VTEC là 13 mẫu, chiếm tỷ lệ 23,6%. Tổng số mẫu dương

tính với VTEC phân lập được trên 115 mẫu thịt lợn và bò là 37 mẫu, đạt tỷ lệ

32,2%. Như vậy, khi tiến hành nghiên cứu trên 115 mẫu thịt tươi, tỷ lệ nhiễm

VTEC ở thịt lợn và thịt bò có sự sai khác và sự sai khác này có ý nghĩa thống

kê (P<0,05).

Sự có mặt của VTEC trong thực phẩm đã được khẳng định ở nhiều

quốc gia. Ở Mỹ, Willshaw và cs. (1993) [98] phát hiện 17% mẫu thịt bò tươi

có VTEC. Ở Canada, VTEC cũng được phân lập từ thịt bò là 10,4% và thịt

lợn 3,8%. Samadpour và cs. (1994) [79] sử dụng mồi của gen VT để xác định

sự có mặt của VTEC trong các thực phẩm bán trên thị trường ở Washington,

kết quả 23% mẫu thịt bò, 18% mẫu thịt lợn, 12% mẫu thịt gà, 7% mẫu thịt gà

tây, 10% mẫu cá, 5% mẫu sứa có kết quả dương tính.

Rất nhiều nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đều đã khẳng định:

bò (kể cả phân bò và thịt bò ô nhiễm) là nguồn tàng trữ VTEC lớn nhất. Tuy

nhiên, trong nghiên cứu này, tỷ lệ phân lập của chúng tôi lại đạt thấp hơn ở

500 bp 300 bp

100 bp

nhóm thịt bò.

Ghi chú: M: 100 bp marker. Giếng 1: FD635 (VT1/VT2/eae). Giếng 2, 10, 15: mẫu

thịt âm tính. Giếng 3, 6, 13, 14: mẫu thịt dương tính(VT1/VT2). Giếng 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12:

mẫu thịt dương tính (VT2).

Hình 3.13: Sản phẩm củ phản ứn từ m u thịt s u quá trình điện i

Bên cạnh đó, qua hình ảnh các sản phẩm của phản ứng PCR từ các mẫu

thịt sau quá trình điện di (hình 3.13), chúng tôi nhận thấy, các mẫu đều chỉ dương

tính với gen VT1 và/hoặc VT2, mà không có mẫu nào dương tính với gen eae.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với một số

nghiên cứu khác. Samadpour và cs. (1994) [79] khi xác định sự có mặt của

VTEC trong thực phẩm, chỉ thu được VTEC từ 12 mẫu (23,5%) mẫu có phản

ứng dương tính với gen VT, không có mẫu nào dương tính với gen eae.

Như đã trình bày ở trên, sau khi tiến hành phản ứng PCR, với các mẫu

thịt dương tính với 1 trong 3 cặp mồi sử dụng, chúng tôi tiếp tục tiến hành

phản ứng PCR với từng khuẩn lạc riêng biệt (hình 3.14). Kết quả thu được 42

mẫu chỉ dương tính với VT1 và/hoặc VT2 (không có mẫu nào dương tính với

gen eae), tương ứng với 42 chủng VTEC; trong đó, có một số trường hợp

phân lập được nhiều hơn 1 chủng từ cùng 1 mẫu thịt, do đó mà có kết quả

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5

phân lập được 42 chủng từ 37 mẫu dương tính.

500 bp 100 bp

6, 9, 11: Chủng phân lập (âm tính). Giếng 7, 8, 10, 12, 13, 14 và 15: Chủng phân lập

(VT1). Hàng dưới: M: 100 bp marker. Giếng 1: FD635 (VT1/VT2/eae). Giếng 2, 10, 11,

12, 14: Chủng phân lập (âm tính). Giếng 4, 6: Chủng phân lập (VT1/VT2). Giếng 3, 5, 7,

8, 9, 13 và 15: Chủng phân lập (VT1).

Hình 3.14: Sản phẩm củ phản ứn từ huẩn lạc riên biệt củ một số m u thịt s u quá trình điện i Ghi chú: Hàng trên: M: 100 bp marker. Giếng 1: FD635 (VT1/VT2/eae). Giếng 2, 3, 4, 5,

3.3.4 Kết quả phân lập VTEC từ mẫu lau thân thịt và mẫu phân tại lò mổ

Đảm bảo chất lượng VSATTP cũng có nghĩa là phải quản lý, giám sát

được các nguy cơ gây ô nhiễm từ quá trình chăn nuôi, giết mổ, chế biến đến

quá trình lưu thông tiêu thụ trên thị trường. Trong đó việc quản lý giết mổ,

kiểm soát giết mổ là một khâu có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với việc đảm

bảo VSATTP, an toàn dịch bệnh động vật, bảo vệ sức khỏe con người và vệ

sinh môi trường. Trong thời kỳ bao cấp, việc giết mổ gia súc được tập trung

tại các lò mổ do nhà nước quản lý. Quá trình chuyển đổi sang nền kinh tế thị

trường, các lò giết mổ tập trung không còn hoạt động, thay vào đó là các điểm

giết mổ tư nhân, và hiện đang có xu hướng phát triển ngày càng rộng; hoạt

động quản lý thú y không phát triển kịp với sự phát triển này (chỉ có khoảng

40% số cơ sở giết mổ được cơ quan thú y thẩm định các điều kiện vệ sinh thú

y - Bùi Thị Phương Hòa, 2008) [3]. Tình trạng này dẫn tới nguy cơ lây lan

dịch bệnh và ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Kết quả phân lập vi khuẩn

VTEC từ mẫu lau thân thịt và mẫu phân được trình bày bảng 3.15.

Bản 3.15. ỷ lệ phân lập vi huẩn V E từ m u l u thân thịt và m u phân

Số m u xét

Số chủn

Số m u ơn

ỷ lệ

L ại m u

n hiệm

E. coli

tính

(%)

160

11,3

Lau thân thịt

180

14,5

Mẫu phân

170

340

22 12,9

ổn

Từ 80 mẫu lau thân thịt phân lập được 160 chủng E. coli và 9 mẫu

dương tính với VTEC, chiếm tỷ lệ 11,3%. Từ 90 mẫu phân, chúng tôi phân

lập được 180 chủng E. coli và 13 mẫu dương tính với VTEC, chiếm tỷ lệ

14,5%. Như vậy, từ 170 mẫu lau thân thịt và mẫu phân bò, lợn đã phân lập

được 22 mẫu dương tính với VTEC, chiếm tỷ lệ 12,9%.

Có nhiều nghiên cứu về VTEC ở động vật đã được tiến hành. Cray và

cs. (1996) [26] đưa ra tỷ lệ 5,9% của 1.305 chủng E. coli phân lập được từ

phân của bò là VTEC. Ở Đức, Beutin và cs. (1993) [18] đã phân lập được

VTEC từ trâu bò là 21,1%, ở lợn là 7,5%. Ở Canada, VTEC thường phân lập

được ở bê là 24,7%, ở bò sữa trưởng thành là 9,5%.

Kết quả phân tích bằng phản ứng PCR cho thấy: có 9 mẫu lau thân thịt

dương tính với 1 trong 2 gen độc lực VT1 và VT2, chỉ có 13 mẫu phân cho

kết quả dương tính chỉ với gen VT1 (hình 3.15). Khi kiểm tra từng khuẩn lạc

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

500 bp 300 bp

100 bp

riêng biệt ở 2 mẫu này, chúng tôi phân lập được 25 chủng VTEC (hình 3.16).

12, 13, 14, 15: mẫu âm tính. Giếng 3, 6: mẫu phân dương tính (VT1).

Hình 3.15: Sản phẩm củ phản ứn từ m u phân và m u lau thân thịt s u quá trình điện i Ghi chú: M: 100 bp marker. Giếng 1: FD635 (VT1/VT2/eae). Giếng 2, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11,

M 1 2 3 4 5 6 7

500 bp 300 bp

100 bp

Giếng 3, 4, 6: mẫu dương tính (VT1).

Hình 3.16: Sản phẩm củ phản ứn từ nhữn khuẩn lạc riên biệt củ m u phân s u quá trình điện i Ghi chú: M: 100 bp marker. Giếng 1: FD635 (VT1/VT2/eae). Giếng 2, 5, 7: âm tính.

3.3.5 Kết quả xác định các loại độc tố của các chủng VTEC phân lập được

Bằng kỹ thuật PCR, xác định các loại độc tố của các chủng VTEC phân

lập được. Kết quả trình bày bảng 3.16.

Bản 3.16: Khả năn sản sinh độc tố củ các chủn

V E phân lập đ ợc

uồn ốc

Số chủn

Khả năn sản sinh độc tố

phân lập

xét n hiệm

VT1

VT2

VT1 + VT2

eae

Thịt lợn

20 (76,9%)

4 (15,4%)

2 (7,7%)

0 (0%)

Thịt bò

12 (75,0%)

3 (18,8%)

1 (6,2%)

0 (0%)

Lau thân thịt

10 (83,3%)

2 (16,7%)

0 (0%)

Phân

13 (100%)

0 (0%)

ổn

67 55 (82%)

9 (13%)

3 (5%)

0 (0%)

Trong 26 chủng VTEC phân lập được từ thịt lợn, 20 chủng chỉ mang

gen VT1, chiếm tỷ lệ 76,9%; 4 chủng chỉ mang gen VT2, chiếm tỷ lệ 15,4%;

có 2 chủng mang cả 2 gen VT1 và VT2, chiếm tỷ lệ 7,7%; không có chủng

nào mang gen eae.

Với 16 chủng VTEC phân lập được từ thịt bò, có 12 chủng chỉ mang

gen VT1, chiếm tỷ lệ 75%; 3 chủng chỉ mang gen VT2, chiếm tỷ lệ 18,8%; 1

chủng mang cả 2 gen VT1 và VT2, chiếm tỷ lệ 6,2% và không có chủng nào

mang gen eae.

Trong 12 chủng VTEC phân lập được từ mẫu lau thân thịt, 10 chủng

chỉ mang gen VT1, chiếm tỷ lệ 83,3%; 2 chủng chỉ mang gen VT2, chiếm tỷ

lệ 16,7%; không có chủng nào mang cả 2 gen VT1, VT2 và mang gen eae.

Với 13 chủng VTEC phân lập được từ mẫu phân thì cả 13 chủng chỉ

mang gen VT1, chiếm tỷ lệ 100%.

Như vậy, trong 67 chủng VTEC phân lập được, đa số chỉ mang gen

VT1 (hơn 75%), một số ít chủng chỉ mang gen VT2, có 3 chủng phân lập được

có cả hai gen độc tố VT1 và VT2. Đặc biệt, không chủng nào trong số các chủng

VTEC phân lập được có gen eae.

Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trên thế giới cũng như

ở Việt Nam, cho rằng tỷ lệ có gen eae ở các chủng VTEC không thuộc nhóm

O157 là rất thấp. Nguyễn Bình Minh (2004) [5] khi nghiên cứu về VTEC ở Việt

Nam đã phân lập được 9 chủng từ 400 bệnh nhân bị tiêu chảy và 42 bò thịt. Kết

quả cho thấy không chủng nào có gen eae. Mohammad A. Islam và cs. (2008)

[64] thu thập mẫu phân trực tiếp từ trực tràng của trâu, bò và dê ngay sau khi giết

mổ ở Bangladesh. Tất cả các chủng VTEC không thuộc nhóm O157 phân lập

được đều không có gen eae. Một nghiên cứu về các yếu tố độc lực của VTEC

trên động vật cho thấy 57% VTEC chỉ có gen VT1, 28% chỉ có gen VT2 và

15% có cả 2 gen. Bloton và cs. (1996) [21] cho rằng 10% số VTEC phân lập

100

được có mang gen gây bệnh tích A/E. Ngoài ra, còn một số nghiên cứu khác

cũng báo cáo kết quả tỷ lệ mang gen eae của các chủng VTEC thấp hoặc không

có, như Peiris và cs. (2001) [74]; Irino và cs. (2005) [42].

Thực tế cho thấy: các chủng phân lập được ở nghiên cứu này chưa thể

hiện khả năng gây bệnh một cách rõ ràng, do chúng không có một gen độc lực

quan trọng (eae).

3.3.6 Kết quả xác định serotyp O của các chủng VTEC phân lập được

Kháng nguyên O được coi như một nội độc tố có thể tìm thấy ở màng

ngoài vỏ bọc vi khuẩn. Vì thế, kháng nguyên O cũng được xem là một yếu tố

độc lực của vi khuẩn. Bản chất của kháng nguyên O là LPS và sự đa dạng về

cấu trúc của phần O-specific polysaccharide trong chuỗi LPS tạo nên các

nhóm kháng nguyên O khác nhau.

Trong nghiên cứu này, nhóm kháng nguyên O của 67 chủng VTEC phân

lập từ lợn và bò được xác định bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính

với kháng huyết thanh chuẩn do phòng thí nghiệm tham chiếu E. coli, Tây Ban

Nha cung cấp là O1, O2, O5, O6, O8, O11, O12, O14, O15, O17, O18, O20,

O26, O28ae, O35, O45, O53, O78, O83, O88, O91, O102, O103, O116, O125,

O126, O128, O132, O136, O138, O139, O143, O146, O148, O149, O152,

O153, O157, O158, O159, O166, O168, O169. Phản ứng dương tính khi có hiện

tượng ngưng kết, hỗn dịch xuất hiện những hạt nhỏ trắng lấm tấm, tách ra làm

hai phần gồm các hạt ngưng kết và phần nước trong. Phản ứng âm tính khi hỗn

dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh đục đều như bên đối chứng. Với những

chủng có ngưng kết với kháng huyết thanh đa giá, thực hiện tiếp với các kháng

huyết thanh đơn giá thuộc nhóm để xác định rõ từng typ.

Kết quả xác định serotyp của các chủng vi khuẩn phân lập được với 9

nhóm huyết thanh O đa giá (gồm 50 loại huyết thanh O đơn giá) được trình

bày ở bảng 3.17.

101

Bản 3.17: Kết quả xác định ser typ củ các chủn V E phân lập đ ợc

uồn ốc chủn V E

Kết quả

ị điểm

L ại m u

Số chủn phân

Số chủn

ỷ lệ

Serotyp

lấy m u

xét n hiệm

lập đ ợc

ơn tính

(%)

7,7

23,2

O18

11,5

O103

7,7

Thịt lợn

O143

11,5

O148

11,5

Chợ

O159

11,5

O166

7,7

KXĐ

7,7

62,5

Thịt bò

O125

37,5

16,7

O15

16,7

Lau thân

O28ae

16,7

thịt

O152

24,9

Lò mổ

O158

8,3

O169

16,7

O103

100

Phân

Ghi chú - KXĐ: Không xác định với 9 nhóm huyết thanh đa giá

Kết quả bảng 3.17 cho thấy với loại mẫu thịt lợn lấy tại các chợ và siêu

thị có 24 chủng E. coli thuộc 1 trong 8 nhóm kháng nguyên O. Trong đó

nhiều nhất có 6 chủng thuộc nhóm kháng nguyên O8 (chiếm 23,2%); các

nhóm O18, O143, O148, O159 có 3 chủng được xác định (chiếm 11,5%); các

102

nhóm O1, O103, O166 có 2 chủng được xác định (chiếm 7,7%) và có 2 chủng

chưa xác định được với nhóm kháng nguyên O (chiếm 7,7%).

Với loại mẫu thịt bò, 16 chủng E. coli thuộc về 2 nhóm kháng nguyên

O8 và O125. Tỷ lệ chủng vi khuẩn thuộc nhóm O8 là cao hơn (62,5%), thuộc

nhóm O125 thấp hơn (37,5%).

Loại mẫu lau thân thịt tại lò mổ, gồm 12 chủng E. coli thuộc về 6 nhóm

kháng nguyên là O1, O15, O28ae, O152, O158, O169. Trong đó, chủng vi

khuẩn thuộc nhóm O152 là cao nhất (24,9%), chủng vi khuẩn thuộc nhóm

O158 là thấp nhất (8,3%). Các nhóm O1, O15, O28ae, O169 đều có 2 chủng,

chiếm tỷ lệ 16,7%.

Loại mẫu phân lấy tại lò mổ, cả 13 chủng vi khuẩn đều thuộc nhóm

O103, chiếm tỷ lệ 100%.

Kết quả xác định serotyp kháng nguyên O của 67 chủng VTEC phân

lập được cho thấy các chủng VTEC thuộc về 14 nhóm kháng nguyên O khác

nhau, nhưng không có chủng nào được xác định là thuộc nhóm O157, O111

hay O26: H11 là 3 trong số các serotyp đã được xác định là thường gây ra các

vụ ngộ độc và một số các chứng bệnh khác trên người như HC, HUS và TTP

do ăn phải thực phẩm bị ô nhiễm.

Trên thế giới, đặc biệt ở Mỹ, đã có nhiều nghiên cứu về E. coli

O157:H7 ở vật nuôi. Hancock và cs. (1994) [37] thấy rằng chỉ có 10 trong

3.570 (0,28%) mẫu phân bò sữa và 10 trong 1.412 (0,71%) mẫu phân bò thịt

có chứa E. coli O157:H7. Trong một nghiên cứu khác, Faith và cs. (1996)

[31] đưa ra kết luận tỷ lệ E. coli O157:H7 ở đàn bò sữa là 7% và ở các động

vật khác là 1,8%. Khi nghiên cứu về E. coli O157:H7 trên thịt gà ở Thổ Nhĩ

Kỳ, Levent Akkaya và cs. (2006) [52] cho biết tỷ lệ dương tính là 1,05%

trong số 190 mẫu kiểm tra. Ở Tây Ban Nha, trong 126 chủng VTEC phân lập

được có 27 nhóm kháng nguyên O khác nhau đã được xác định; trong khi đó

103

con số này ở Đức là 16 nhóm trong 28 chủng. Tuy nhiên, ở Mỹ, Cray và cs.

(1996) [26] chỉ thấy 18 nhóm kháng nguyên O khác nhau trong 77 chủng

VTEC phân lập từ bò cái tơ. So sánh kết quả của chúng tôi với các kết quả

nghiên cứu trên, chúng tôi thấy phù hợp.

Các kết quả nuôi cấy và giám định đặc tính sinh hóa của 67 chủng vi

khuẩn VTEC, đặc biệt là trên môi trường CT-SMAC cũng đã một lần nữa

khẳng định các kết quả này là hoàn toàn phù hợp.

Tuy nhiên, điều đáng lưu ý ở đây là 2 loại serotyp O8 và O103 đều đã

được phát hiện thấy ở một tỷ lệ nhất định trong số các chủng có nguồn gốc từ

thịt lợn và thịt bò. Chúng thuộc trong số 8 loại serotyp thường gây tiêu chảy

xuất huyết ở bò và có khả năng lây sang người, đặc biệt O8 là nhóm vi khuẩn

có khả năng gây tiêu chảy không xuất huyết và HUS ở người. Ngoài ra các

loại serotyp O1, O18, O103, O125, O166 được cho là có liên quan tới một số

ca bệnh HUS và HC ở người (Paton và cs. 1996) [70].

3.3.7 Kết quả phân tích quan hệ di truyền của một số chủng vi khuẩn

VTEC phân lập được có nguồn gốc khác nhau

Quan hệ di truyền của một số chủng vi khuẩn VTEC phân lập được và có

nguồn gốc khác nhau được xác định bằng phương pháp PFGE (Tenover và cs.

1995 [87], Hopkins và cs. 2000 [40]). Hệ gen của vi khuẩn E. coli được phân cắt

bằng enzyme XbaI và được điện di trên hệ thống CHEF-DR II (Bio-Rad).

Trong nghiên cứu này, chúng tôi so sánh quan hệ di truyền của 28

chủng vi khuẩn VTEC đại diện cho các serotyp và có nguồn gốc khác nhau

(mẫu phân, mẫu lò mổ, thịt mua tại chợ và siêu thị). Kết quả đánh giá sự quan

hệ di truyền dựa trên tiêu chuẩn của Tenover và cs. (1995) [87]. Theo tác giả,

mức độ quan hệ di truyền của các chủng vi khuẩn E. coli được chia thành các

cấp độ khi phân tích bằng phương pháp PFGE:

104

- Không thể phân biệt được (không có sự khác biệt, Indistinguishable):

thể hiện số vạch trên thạch như nhau và kích thước các vạch tương tự nhau.

Đây có thể là cùng 1 chủng gây bệnh và là chủng đại điện cho ổ dịch. Những

chủng này cũng có thể không phân biệt được bằng các phương pháp khác.

- Quan hệ rất gần (closely related): những chủng có sự khác biệt rất

nhỏ chỉ với 1 yếu tố di truyền phân tử như 1 điểm đột biến, mất đi hoặc chèn

thêm vào 1 đoạn DNA. Khi phân tích PFGE, các chủng này thể hiện sự sai

khác ở 2 - 3 vạch. Những chủng này có thể là những chủng tham gia gây nên

ổ dịch và có đặc điểm dịch tễ của bệnh tương đối giống nhau.

- Có thể có quan hệ (possibly related): gồm những chủng có 2 điểm khác

biệt về di truyền phân tử độc lập, thể hiện có trên vạch là có 4 - 6 vạch khác

nhau. Những chủng này có rất ít đặc điểm về dịch tễ của bệnh giống nhau.

- Không có quan hệ: có ít nhất 3 yếu tố di truyền phân tử độc lập khác

nhau, thể hiện có ít nhất 7 vạch khác nhau. Các chủng này không có quan hệ

với nhau về đặc điểm dịch tễ của bệnh cũng như khả năng gây bệnh.

Các chủng vi khuẩn được xếp vào các nhóm không thể phân biệt, quan

hệ rất gần và có thể có quan hệ thường có mức độ tương đồng trên 85%.

Kết quả phân tích quan hệ di truyền về hệ gen sử dụng phương pháp

PFGE của các chủng vi khuẩn VTEC được thể hiện ở hình 3.17 và 3.18

Theo cấp độ đánh giá PFGE, kết quả phân tích của chúng tôi cho thấy

quan hệ giữa các chủng vi khuẩn thuộc cùng serotyp phân lập được từ thịt lợn

hoặc bò (O8, O125) hoặc từ mẫu thịt và phân (O1, O103) là không phân biệt;

các chủng có quan hệ rất gần là O8, O143 và O148 phân lập từ các mẫu thịt;

và O103, O1, O15, O143, O148, O28ae và O152. Sự sai khác về hệ gen giữa

các chủng chủng vi khuẩn phân lập từ thịt thu thập từ chợ và các mẫu tại lò mổ

(mẫu lau thân thịt, mẫu phân) là không lớn (mức độ tương đồng trên 85%).

105

Leotta và cs. (2009) [51] đã tiến hành nghiên cứu và so sánh đặc tính

của các chủng O157 phân lập được từ Achentina, Úc và New Zealand bằng

phương pháp PFGE. Kết quả cho thấy kiểu PFGE có 46 mẫu PFGE đã được

quan sát thấy khi sử dụng enzym XbaI để phân cắt, trong đó có 37 chủng

O8 O8 O8 O8 O8 O143 O143 O148 O148 O148 O125 O125 O125 O125 O125 O125 O103 O1 O1 O15 O143 O143 O148 O28ae O28ae O152 O152 O148

được chia thành 10 nhóm khác nhau.

Hình 3.17 Kết quả phân tích qu n hệ i truyền củ vi huẩn V E bằn ph ơn pháp F E

Xia và cs. (2010) [85] trong một nghiên cứu với các chủng VTEC phân

lập được từ thịt được bán lẻ tại Mỹ cũng đã công bố kết quả phân biệt các

chủng bằng kỹ thuật PFGE. Kết quả cho thấy 17 chủng được phân loại vào 14

nhóm, chứng tỏ mức độ quan hệ di truyền giữa các chủng là rất cao.

Tương tự, Hung và cs. (2006) [41] cho biết 46 chủng vi khuẩn E. coli

khi phân tích bằng PFGE có thể được xếp thành 36 nhóm, trong đó có 9 nhóm

106

(1-13 chủng vi khuẩn/nhóm) có quan hệ gần với nhau (mức độ quan hệ di

truyền trên 85%). Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của Lee và cs. (2009) [50]

cho thấy mức độ quan hệ di truyền của các chủng vi khuẩn phân lập từ lợn tại

Hàn Quốc là rất thấp, chỉ có 4/74 chủng có mức quan hệ di truyền trên 80%.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 M

Hình 3.18 ình ảnh điện i xun tr n ( F E) củ một số chủn vi huẩn V E phân lập đ ợc Giếng M: Thang chuẩn (Lambda ladder DNA) (Biorad), Giếng 1: Chủng từ

chợ (lợn), 2: Chủng từ lò mổ (lau thân thịt), 3: Chủng từ lò mổ (lau thân thịt),

4: Chủng từ lò mổ (phân), 5: Chủng sản sinh VT2, 6: Chủng sản sinh VT1 và

VT2, 7: Chủng sản sinh VT2, 8: Chủng sản sinh VT1.

107

KẾ LUẬ V Ề Ị

Kết luận

Từ kết quả của nghiên cứu, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:

1. Thành phố Hà Nội có 467 điểm giết mổ gia súc, gia cầm. Hầu hết các điểm

giết mổ đều không được phân thành khu riêng biệt, không quan tâm đến vệ

sinh tiêu độc. Các phương tiện vận chuyển thịt gia súc, gia cầm thường

không phải là các phương tiện vận chuyển chuyên dụng. Từ khi giết mổ

qua quá trình vận chuyển đến nơi tiêu thụ, mầm bệnh có nhiều điều kiện

thuận lợi để phát tán trên diện rộng, đó cũng là nguyên nhân gây ra những ổ

dịch bệnh động vật trên địa bàn.

2. Phương pháp Multiplex – PCR với 3 loại cặp mồi phát hiện (VT1, VT2 và

eae) cùng các điều kiện phản ứng như đã được thiết lập và chuẩn hóa trong

nghiên cứu này có thể được áp dụng để xác định vi khuẩn VTEC, phản ứng

có độ đặc hiệu 100% và độ nhạy 5,7 – 25,08 x 104 CFU/ml

3. Đã xây dựng được một quy trình xác định vi khuẩn VTEC trong thịt. Quy

trình này có thể dễ dàng áp dụng trong các phòng thí nghiệm vi khuẩn để

xác định mức độ vệ sinh an toàn của thịt tươi

4. Kết quả phân lập vi khuẩn VTEC với 115 mẫu,gồm 60 mẫu thịt lợn và 55

mẫu thịt bò tại chợ cho tỷ lệ dương tính lần lượt là 40,0% và 23,6%. Tỷ lệ

dương tính với VTEC trên 115 mẫu thịt lấy tại chợ là 32,2%. Tỷ lệ phân

lập trên mẫu lau thân thịt cho tỷ lệ dương tính với vi khuẩn VTEC là

11,3%, với mẫu phân tỷ lệ dương tính là 14,5%.

5. Trong 67 chủng VTEC phân lập được, đa số đều chỉ có gen VT1 (từ 75 -

100%), một số ít chủng chỉ có gen VT2 (từ 0 - 18,8%), có 3 chủng phân lập

được có cả hai gen độc tố VT1 và VT2 (từ 0 - 7,7%). Đặc biệt, không

108

chủng nào trong số các chủng VTEC phân lập được có gen eae.

6. Kết quả xác định serotyp kháng nguyên O của 67 chủng VTEC phân lập

được cho thấy các chủng VTEC thuộc về 14 nhóm kháng nguyên O khác

nhau, nhưng không có chủng nào thuộc nhóm O157, O111 hay O26. Nhóm

O8 và O103 đều đã được phát hiện thấy ở một tỷ lệ nhất định trong số các

chủng có nguồn gốc từ thịt lợn và thịt bò.

7. Kết quả phân tích quan hệ di truyền về hệ gen của các chủng vi khuẩn

VTEC cho thấy sự sai khác về hệ gen giữa các chủng vi khuẩn phân lập từ

thịt thu thập từ chợ và các mẫu tại lò mổ (mẫu lau thân thịt, mẫu phân) là

không lớn (mức độ quan hệ trên 85%).

ề n hị

1. Áp dụng thử nghiệm quy trình với các mẫu phân và môi trường tại các trại

chăn nuôi để xác định mức độ lưu hành của vi khuẩn thuộc nhóm VTEC và

khả năng lây nhiễm của chúng sang các vật nuôi và thực phẩm dùng làm

thức ăn cho con người.

2. Tiếp tục tiến hành thí nghiệm trên các loại mẫu để xác định được tỷ lệ

VTEC trong thịt cũng như ở các động vật cung cấp thực phẩm, đồng thời

xác định được nguồn gốc của VTEC ở Việt Nam.

109

DA MỤ Á Ì Ã BỐ

Ó L Ê QUA Ế LUẬ Á

1. Đỗ Ngọc Thúy, Lê Thị Minh Hằng, Lưu Thị Hải Yến, uyễn hị h nh

hủy (2011), “Kết quả áp dụng thử nghiệm quy trình xác định vi

khuẩn Verotoxigenic E. coli trong mẫu thịt tươi”, Tạp chí Khoa học

kỹ thuật Thú y, số 4/2011. Trang 19-23.

2. uyễn hị h nh hủy, Đỗ Ngọc Thúy, Lưu Thị Hải Yến, Nguyễn Bá

Hiên (2011), “Xác định tỷ lệ vi khuẩn Verotoxigenic E. coli (VTEC)

trong mẫu thịt tại chợ, lò mổ địa bàn Hà Nội”, Tạp chí Khoa học và

Phát triển, số 6/2011. Trang 972-977.

3. uyễn hị h nh hủy, Đỗ Ngọc Thúy, Nguyễn Bá Hiên (2012), “Thiết

lập phương pháp PCR để xác định vi khuẩn Verotoxigenic E. coli

(VTEC) trong thịt”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 1/2012.

Trang 61-67.

110

L U AM K ẢO

Ế V

1. Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), ”Sinh học phân tử (Khái niệm -

phương pháp - Ứng dụng)”, Nhà Xuất Bản Giáo dục Thành phố Hồ

Chí Minh.

2. Đậu Ngọc Hào (2011), “An toàn sản phẩm chăn nuôi từ sản xuất tới tiêu

dùng”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, Tập XVIII (1), tr. 84 – 88.

3. Bùi Thị Phương Hòa (2008), “ Thực trạng công tác vệ sinh an toàn thực

phẩm trong ngành chăn nuôi thú y và giải pháp khắc phục”, Tạp chí

khoa học kỹ thuật thú y, tập XV (2), tr. 93 – 99.

4. Nguyễn Thị Liên Hương (2010), “Nghiên cứu một số đặc tính của vi

khuẩn Escherichia coli phân lập từ ngan bệnh và biện pháp phòng

trị”, Luận án Tiến sĩ, Hà Nội.

5. Nguyễn Bình Minh (2004), “Kỹ thuật PCR đa mồi xác định các loại

Escherichia coli gây bệnh”, Tạp chí Y học Việt Nam, số 7, Tổng hội

y dược học Việt Nam, tr. 1 - 4.

6. Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt, Trần Thị Hạnh, Tô Long Thành và Lê

Văn Nhương (2009), “Nghiên cứu chế tạo và lựa chọn kháng

nguyên của vi khuẩn E. coli O157:H7 phục vụ thiết lập phản ứng

ELISA”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, Tập XVI (5), tr.11 – 15.

7. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2001), Vi

sinh vật thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

8. Đỗ Ngọc Thúy (2004), “Vai trò của Enterotoxigenic E. coli trong gây

bệnh tiêu chảy cho lợn con theo mẹ ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam”,

Luận án Tiến Sĩ, Australia.

111

9. Lê Thị Tuyết Trinh (2007), ”Phát triển và hoàn thiện hệ thống PCR đa

mồi xác định trực tiếp các Escherichia coli gây tiêu chảy từ phân”,

Luận văn thạc sỹ y học, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội.

10. Trần Trí Tuệ (2001), ”Góp phần nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật PCR

đa mồi trong chẩn đoán Escherichia coli gây tiêu chảy”, Luận văn

Thạc sỹ y học, Trường đại học Y Hà Nội.

Ế A

11. Alfredo Caprioli, Silvia Bonardia, Emilio Maggia, Gisella Pizzina and

Stefano Morabitob (2001), “Faecal carriage of Verocytotoxin-

producing Escherichia coli O157 and carcass contamination in cattle

at slaughter in northern Italy”, International Journal of Food

Microbiology, Vol. 6, Issues 1 – 2, p. 47 – 53.

12. Allerberger F., Rossboth D., Dierich M. P., Aleksic S., Schmidt H. and

Karch H. (1996), “Prevalence and clinical manifestations of Shiga-

like toxin-producing Escherichia coli infections in Australian

children”, European Journal of Clinical Microbiology and

Infectious Disease, 15(7), p. 545 – 550.

13. Beebakhee G., Louie M., de Azavedo J. and Brunton J. (1992), “Cloning

and nucleotide sequence of the eae gene homologue from

enterohemorrhagic Escherichia coli serotyp O157:H7”, FEMS

Microbiology Letters, 91, p. 63 – 68.

14. Begum D., M. P. Jackson (1995), “Direct detection of Shiga-like toxin-

producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase

chain reaction”, Mol. Cell probes, 9, p. 259 – 264.

15. Benjamin M. M. and Datta A. R. (1995), “Acid tolerance of

enterohemorrhagic Escherichia coli”, Applied and Environmental

Microbiology, 61 (4), p. 1669 – 1672.

16. Bergamini A.M.M (2007), “Prevalence and characteristics of Shiga

112

toxin-producing Escherichia coli (STEC) strains in ground beef in

Sao Paulo, Brazil”, Brazilian Journal of Microbiology, 75 (8), p.

1517 – 8382.

17. Bettelheim K. A. (1997), “Escherichia coli O157 outbreak in Japan:

lesson for Australia”, Australian Veterinary Journal, 75 (2), p. 108.

18. Beutin L., Geier D., Steinruck H., Zimmermann S. and Scheuts F.

(1993), “Prevalence and some properties of Verotoxin (Shiga-like

toxin)-producing Escherichia coli in seven different species of

healthy dosmetic animals”, Journal of Clinical Microbiology, 31

(9), p. 2483 – 2488.

19. Beutin L., Aleksic S., Zimmermann S. and Gleier K. (1994), “Virulence

factors and phenotypical traits of verotoxigenic strains of

Escherichia coli isolated from human patients in Germany”,

Medical Microbiology and Immunology, 183, p. 13 – 21.

20. Blanco M., Lazo L., Blanco J.E., Dahbi G., Mora a., Lopez C., Gonzalez

E.a., Blanco J., (2006), “Serotyps, virulence genes, and PFGE

patterns of enteropathogenic Escherichia coli isolated from Cuban

pigs with diarrhea”, International Microbiology, 9, pp.53-60.

21. Bolton F. J., Crozier L. and Williamson J. K. (1996), “Isolation of

Escherichia coli from raw meat products”, Letters in Applied

Microbiology, 23, p. 317 – 321.

22. Buchanan R. L. and Edelson S. G. (1996), “Culturing enterohemorrhagic

Escherichia coli in the presence and absence of glucose as a simple

means of evaluating the acid tolerance of stationery-phase cells”,

Applied and Environmental Microbiology, 62 (11), p. 4009 – 4013.

23. Bui Thi Thu Hien, Flemming Scheutz, Phung Dac Cam, Oralak

Serichangtalergs, Tran Thu Huong, Tran Minh Thu, Amders

Dalsgaard (2008), “Diarrheagenic E. coli and Shigella strains

113

isolated from children in a hospital case-control study in Hanoi,

Vietnam”. J Clin Microbiol. March:996-1004.

24. Carlton L. Gyles (2004), “Pathogenesis, epidemiology, and control of VTEC infection in the cattle industry”, 23rd World Buiatrics

Congress, Quebec city, Canada.

25. Carter G. R., Chengappa M. M. and Rober T. S. A. W. (1995),

“Essentials of veterinary Microbiology, Williams and Wikkins”,

Rose tree corporate Center building 21400 North providence Rd,

Suite 5025 Media PA 19063-2043, A waverly Company.

26. Cray W. C., Thomas L. A., Schneider R. A. and Moon H. W. (1996),

“Virulence attributes of Escherichia coli from dairy heifer feces”,

Veterinary Microbiology, 53 (3-4), p. 467 – 474.

27. Donnenberg M. S., Tzipori S., Mc Kee M. L., O’Brien A. D., Alroy J.

and Kaper J. B. (1993), “The role of the eae gene of

enterohemorrhagic Escherichia coli in intimate attachment in vitro

and in a porcine model”, Journal of Clinical Investigation, 92, p.

1418 – 1424.

28. Doyle M. P. and Padhye V. V. (1989), “Escherichia coli”, Foodborn

bacterial pathogens, Marcel Dekker, Inc., New York, p. 235 – 281.

29. Dytoc M., Soni R., Cockerill III F., de Azacedo J., Louie M., Brunton J.

and Sherman P. (1994), “Multiple determinants of Verotoxin-

producing Escherichia coli O157:H7 attachment-effacement”,

Infection and Immunity, Vol. 61 No. 8, p. 3382 – 3391.

30. Do Thuy Trang, Bui Thi Thu Hien, Kare Molbak, Phung Dac Cam,

Anders Dalsgaard (2007), “Epidemiology and etiology of diarrhoeal

disease in adults engaged in wastewater-fed agriculture and

aquaculture in Hanoi, Vietnam. Tropical Medicine and International

Health, p.23-233.

114

31. Faith N. G., Shere J. A., Brosch R., Arnold K. W., Ansay S. E., Lee M.

S., Luchansky J. B. and Kaspar C. W. (1996), “Prevalence and

clonal nature of Escherichia coli O157:H7 on dairy farms in

Wisconsin”, Appiled and Environmental Microbiology, 62 (5), p.

1519 – 1525.

32. Gannon V. P. J., R. K. King, E. J. Thomas (1992), “Rapid and sensitive

method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli

in ground beef using the polymerase chain reaction”, Appl. Environ.

Microbiol, 58, p. 3809 – 3815.

33. Garber L. P., Wells S. J., Hancock D. D., Doyle M. P., Tuttle J., Shere J.

A. and Zhao T. (1995), “Risk factors for fecal shedding of

Escherichia coli O157:H7 in dairy calves”, Journal of American

Veterinary Medicine Association, 207 (1), p. 46 – 49.

34. Gross W. G. (1994), “Disease due to Escherichia coli in poultry. In

Escherichia coli in Dosmetic animals and human”, Edited by C. L.

Gyles, Wallingford, England: CAB International, p. 237 – 259.

35. Gyles C.L., Fairbrother J.M (2004), “Escherichia coli” In: Pathogens of

bacterial infection in animal”, Editor: Gyles C.L, Prescott J.F,

Songer J.G and Thoen C.O. Blackwill publishing, p. 193 – 214.

36. Gyles C.L., Fairbrother J.M (2010), “Escherichia coli” In: Pathogens of bacterial infection in animal (4th edition). Editor: Gyles C.L.,

Prescott J.F., Songer J.G., and Thoen C.O., Blackwill publishing,

USA, pp. 241 – 250.

37. Hancock D. D., Besser T. E., Kinsel M. L., Tarr P. I., Rice D. H. and

Paros M. G. (1994), “The prevalence of Escherichia coli O157:H7

in dairy and beef cattle in Washington state”, Epidemiology and

Infection, 113, p. 199 – 207.

115

38. Hanna Evelina Sidjabat-Tambunan (1997), “Verocytotoxin producing

Escherichia coli in food-producing animals”, The degree of master

of veterinary science, The University of Queensland, Australia.

39. Helgerson A.F., Sharma V., Dow A.M., Schroeder R., Post K., Cornick

N.A. (2006), “Edema disease caused by a clone of Escherichia coli

O147”, J Clin Microbiol., 44(9), pp.3074-3077.

40. Hopkins, Anthony C. Hilton (2000). Methods available for the sub-

typing of Escherichia coli O157. World Journal of Microbiology &

Biotechnology, 16, p. 741 - 748.

41. Hung V.K., Holoda E., Pilipcinec E., Blanco M., Blanco J.E., Mora A.,

Dahbi G., Lopez C., Gonzalez E.A., Blanco J. (2006), “Serotyps,

virulence genes, and PFGE profiles of E. coli isolated from pigs

with postweaning diarrhea in Slovakia”, BMC Vet Res., 20, pp.2-10.

42. Irino K., Kato M.A.M.F., Vaz T.M.I., Ramos I.I., Souza M.A.C., Cruz

A.S., Gomes T.A.T., Vieira M.A.M. and Guth B.E.C. (2005),

“Serotyps and virulence markers of Shiga toxin-producing

Escherichia coli (STEC) isolated from dairy cattle in Sao Paulo

state, Brazil”, Veterinary Microbiology, 105, p. 29 – 36.

43. Jenkins C., G. A. Willshaw, J. Evans, T. Cheasty, H. Chart, D.J. Shaw, G.

Dougan, G. Frankel and H.R. Smith (2003), “Subtyping of virulence

genes in verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) other

than serogroup O157 associated with disease in the United

Kingdom”, Journal of Medical Microbiology, 52, p. 941 – 947.

44. Jorge Blanco, Azucena Mora, Miguel Blanco, Jesus E Blanco, Ghizlane

Dahbi, Cecilia Lopez, Paula Justel, Maria Pilar Alonso, Aurora

Echeita, Maria Isabel Bernardez and Enrique A Gonzalez (2007),

“Serotyps, virulence genes and intimin typs os Shiga toxin

116

(verocytotoxin)-producing Escherichia coli isolates from minced

beef in Lugo (Spain) from 1995 through 2003”, BMC Microbiology,

7:13, p. 1 – 9.

45. Karch H., Heesemann J., Laufs R., O’Brien A. D., Tacket C. O. and

Levine M. M. (1987), “A plasmid of enterohemorrhagic Escherichia

coli O157:H7 is required for expression of a new fimbrial antigen

and for adhesion to epithelial cells”, Infection and Immunity, 55 (2),

p. 455 – 461.

46. Konowalchuk J., Speirs J. I. and Stavric S. (1977), “Vero response to a

cytotoxin of Escherichia coli”, Infection and Immunity, 18 (3), p.

775 – 779.

47. Kudva I. T., Hatfield P. G. and Hovde C. J. (1997), “Characterization of

Escherichia coli O157:H7 and other shiga toxin-producing E. coli

serotyps isolated from sheep”, Journal of Clinical Microbiology, 35

(4), p. 892 – 899.

48. Lai King Ng., Matthew W. Gilmoiur, Tyler Cote, Jamie Munro, Linda

Chui, John Wylie, Judith Issac-Renton, Greg Horsman, Dobryan M.

Tracz and Ashleigh Andrysiak (2005), “Multilocus sequence typing

of Escherichia coli O26:H11 isolates carrying stx in Canada does

not identify genetic diversity”, Journal of Clinical Microbiology,

Vol. 43, No. 10, p. 5319 – 5323.

49. Lake R. and Cresscy A.H (2002), “Rick profile: Shiga toxin-producing

Escherichia coli in red meat and meat products”, Institute of

Environment Science & Research Limited Christchurch Scienve

Centre, New Zealand.

50. Lee S.I., Rayamahji N., Lee W.J., Cha S.B., Shin M.K., Roh Y.M., Yoo

H.S. (2009), “Genotyps, antibiogram, and pulsed-field gel

117

electrophoresis profiles of Escherichia coli strains from piglets in

Korea”, J Vet Diagn Invest., 21(4), pp.510-516.

51. Leotta, Elizabeth S Miliwebsky, Isabel Chinen, Estela M Espinosa, Kristy

Azzopardi, Sharon M Tennant3, Roy M Robins- Browne, Marta Rivas.

(2008). Characterisation of Shiga toxin-producing Escherichia coli

O157 strains isolated from humans in Argentina, Australia and New

Zealand. BMC Microbiology, 8, p. 46-54.

52. Levent Akkaya, Halil Ibrahim Atabay, Beytullah Kenar and Mustafa

Alisarli (2006), “Prevalence of verotoxigenic Escherichia coli

O157:H7 on chicken carcasses sold in Turkey”, Bull Vet Inst

Pulawy, 50, p. 513 – 516.

53. Lior H. (1996), “Classification of Escherichia coli”, In: Gyles C. L. (ed.)

Escherichia coli in domestic animals and humans, CAB

International, Wallingford, p. 31 – 72.

54. Louie M., de Azavedo J., Clarke R., Borczyk A., Lior H., Richter M.

and Brunton J. (1994), “Sequence heterogeneity of the eae gene and

detection of verotoxin-producing Escherichia coli using serotyp-

specific primers”, Epidemiology and Infection, 112, p. 449 – 461.

55. MacDonald K. L. and Osterholm M. T. (1993), “The emergence of

Escherichia coli O157:H7 infection in the United States”, Journal of

American Medical Association, 269 (17), p. 2264 – 2266.

56. Madigan M.T., and Martinko J.M. (2006), “Brock biology of microorganisms (11th edition)”. Pearson Prentice Hall, Inc. Upper

Saddle Rever, New Jersey, pp.79-85.

57. Mainil J. G., Jacquemin E. R., Kaeckenbeeck A. E. and Pohl P. H.

(1993), “Association between the effacing (eae) gene and the Shiga-

like toxin-encoding genes in Escherichia coli isolates from cattle”,

American Journal of Veterinary Research, 54 (7), p. 1064 – 1067.

118

58. Matar G. M., Abdo D., Khneisser I., Youssef M., Zouheiry H.,

Abdelnour G. and Harakeh H. S. (2002), “The multiplex PCR based

detection and genotyping of diarrhoeagenic Escherichia coli in

diarrhoeal stools”, Ann Trop Med Parasitol, 96 (3), p. 317 - 324.

59. McMaster C., Roch E.A., Willshaw G.A., Doherty A., Kinnear W. and

Cheasty (2001), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli

serotyp O26:H11 outbreak in an Irish Creche”, Eur J Clin

Microbiol Infect Dis., 20(6), p. 430 - 432.

60. McPaeke S. J. W., Smyth J. A. and Ball H. J. (2005), “Characterisation

of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) associated with

colisepticaemia compared to faecal isolates from healthy birds”,

Veterinary Microbiology, 110, p. 245 – 253.

61. Mechie S. C., Chapman P. A. and Siddons C. A. (1997), “A fifteen

month study of Escherichia coli O157:H7 in dairy herd”,

Epidemiology and Infection, 118, p. 17 – 25.

62. Meng J., Zhao S., Doyle M. P., Mitchell S. E. and Kresovich S. (1996),

“Polymerase chain reaction for detecting Escherichia coli

O157:H7”, International Journal of Food Microbiology, 32, p. 103

– 113.

63. Meng J., Zhao S., Doyle M. P., Mitchell S. E. and Kresovich S. (1997),

“A multiplex PCR for identifying Shiga-like toxin-producing

Escherichia coli O157:H7”, Letters in Applied Microbiology, 24, p.

172 – 176.

64. Mohammad A. Islam, Abdus S. Mondol, Enne de Boer, Rijkelt R.

Beumer, Marcel H. Zwietering, Kaisar A. Talukder and Annet E.

Heuvelink (2008), “Prevalence and Genetic Characterization of

Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Isolates from Slaughtered

119

Animals in Bangladesh”, Applied and environmental microbiology,

Vol. 74, No. 17, p. 5414–5421.

65. Montenegro M. A., Bulte M., Trumpf T., Aleksic S., Reuter G., Bulling

E. and Helmuth R. (1990), “Detection and characterization of fecal

verotoxin-producing Escherichia coli from healthy cattle”, Journal

of Clinical Microbiology, 28 (6), p. 1417 – 1421.

66. O’Brien A. D. and Samuel J. E., Tesh V. L., Burris J. A., Owens J. W.,

Gordon V. M., Wadolkowski E. A., (1993), “Comparison of the

relative toxicities of Shiga-like toxins typ I and typ II for mice”,

Infection and Immunity, 61, p. 3392 – 3402.

67. Orskov F., and Orskov I. (1992), “Escherichia coli serotyping and

disease in man and animal”, Can.J. Micro., 38, pp.699-704.

68. Osek J. (2000), “Clonal analysis of Escherichia coli strains isolated

from pigs with post-weaning diarrhea by pulsed-field gel

electrophoresis”, FEMS Microbiol Lett., 186, pp.327-331.

69. Paton A. W., J. C. Paton, P. N. Goldwater, P. A. Manning (1993),

“Direct detection of Escherichia coli Shiga-like toxin genes in

primary fecal cultures using the polymerase chain reaction”, J. Clin.

Microbiol, 31, p. 3063 – 3067.

70. Paton A. W., Ratcliff R. M., Doyle R. M., Seymour-Murray J., Davos

D., Lanser J. A. and Paton J. C. (1996), “Molecular microbiological

investigation of an outbreak of hemolytic-uremic syndrome caused

by dry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin-

producing Escherichia coli”, Journal of Clinical Microbiology, 34

(7), p. 1622 – 1627.

71. Paton J. C. and A. W. Paton (1998), “Pathogenesis and diagnosis of

Shiga toxin-producing Escherichia coli infections”, Clin. Microbiol.

Rev., 11, p. 450 – 479.

120

72. Paton J. C. and A. W. Paton (2002), “Direct detection and

characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by multiplex

PCR for stx1, stx2, eae, ehxA and saa”, Journal of clinical

microbiology, Vol. 40, No. 1, p. 271 – 274.

73. P. Alexa, L. Konstantinova, Z. Sramkova-Zajacova (2011), “Faecal

shedding of verotoxigenic Escherichia coli in cattle in the Czech

Republic”, Veterinarni Medicina, 56 (4), p. 149 – 155.

74. Peiris J.S.M., P.H.M. Leung, W.C. Yam and W.W.S. Ng. (2001), “The

prevalence and characterization of verotoxin-producing Escherichia

coli isolated from cattle and pigs in an abattoir in Hong Kong”,

Epidemiol. Infect., 126, p. 173 – 179.

75. Pourbakhsh S., Dho-Moulin M., Bree A., Desautels C., Martineau-Doize

B. and Fairbrother J. M. (1997), “Localization of the in vivo

expression of P and F1 fimbriae in chickens experimentally

inoculated with pathogenic Escherichia coli”, Microbiol. Pathog.,

22, p. 331 – 341.

76. Pryor W., Hodson E., McIntyre P. and Bettelheim K. A. (1990),

“Toxigenic Escherichia coli in haemolytic ureamic syndrome” , The

Medical Journal of Australia, 152, p. 221 – 222.

77. Rasmussen M. A., Cray W. C. Jr., Casey T. A. and Whipp S. C. (1993),

“Rumen contents as a reservoir of enterohemorrhagic Escherichia

coli”, FEMS Microbiology Letters, 114, p. 79 – 84.

78. Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel S., Scharf S. J., Higuchi R., Horn G.

T., Mullis K. B. and Erlich H. A. (1987), “Primer-directed

enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA

polymerase”, Science, 239, p. 487 – 491.

79. Samadpour M., Onerth J. E., Liston J., Tran N. Nguyen D., Whittam T.

S., Wilson R. A. and Tarr P. I. (1994), “Occurrence of Shiga-like

121

toxin producing Escherichia coli in retail fresh seafood, beef, lamb,

pork and poultry from grocery stores in Seattle, Washington”,

Applied and Environmental Microbiology, 60 (3), p. 1038 – 1040.

80. Sambrook J., and Russell D.W. (editor) (2001), “Chapter 5: Gel

electrophoresis of DNA and Pulsed –field agarose gel electrophoresis”, In: Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd

edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,

N.Y., 5.55-5.90.

81. Sandhu K. S., Clarke R. C., McFadden K., Brouwer A., Louie M.,

Wilson J., Lior H. and Gyles C. L. (1996), “Prevalence of the eaeA

gene in verotoxigenic Escherichia coli strains from dairy cattle in

Southwest Ontario”, Epidemiology and Infection, 116, p. 1 -7.

82. Schmidt H., Rusmann H., Schwarzkoft A., Aleksic S., Heesemann J. and

Karch H. (1994), “Prevalence of attaching and effacing Escherichia

coli in stool samples from patients and controls”, Zentrablatt fur

Bakteriologie, 281 (2), p. 201 – 213.

83. Schmidt H., Beutin L. and Karch H. (1995), “Molecular analysis of the

plasmid-encoded hemolysin of Escherichia coli O157:H7 strain

EDL 933”, Infection and Immunity, 63 (3), p. 1055 – 1061.

84. Stein P. E, Boodhoo A., Tyrrell G. J., Brunton J. L. and Read R. J.

(1992), “cvCrystal structure of the cell-binding B oligomer of

verotoxin-1 from E. coli”, Nature (London), 355, p. 748 – 750.

85. Xiaodong Xia, Jianghong Meng, Patrick F. McDermott, Sherry Ayers,

Karen Blickenstaff, Thu-Thuy Tran, Jason Abbott, Jie Zheng, and

Shaohua Zhao (2010). Presence and Characterization of Shiga

Toxin-Producing Escherichia coli and Other Potentially

Diarrheagenic E. coli Strains in Retail Meats. Applied and

environmental microbiology, 76, p. 1709-1717.

122

86. Takeda Y. (1995), “Shiga and Shiga-like (Vero) toxins”, Bacterial toxins

and virulence factors in disease (Edited by: Moss J., Iglewski B.,

Vaughan M. and Tu A. T..), Marcel Dekker Inc., p. 313 – 326.

87. Tenover F.C., Arbeit R.D., Goering R.V., Mickelsen P.A., Murray B.E.,

Persing D.H., and Swaminathan B. (1995), “Intrepreting

chromosomal DNA restriction paterns produced by pulsed-field gel

electrophoresis: criteria for bacterial strain typing”, J.Clin.

Microbiol., 33, pp.2233-2239.

88. Thomas A., Cheasty T., Frost J. A., Chart H., Smith H. R. and Rowe B.

(1996), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli, particularly

serogroup O157, associated with human infections in England and

Wales: 1992 – 4”, Epidemiology and Infection, 117, p. 1 – 10.

89. Thi Thu Thao Van, George Moutafis, Peter J Coloe (2007), “Antibiotic

resistance in food-borne bacterial contaminants in Vietnam”.

Applied Environmental Microbiology, 73:7906-11.

90. Tozzi A. E., Niccolini A., Caprioli A., Luzzi I., Montini G., Zacchello G.,

Gianviti A., Principato F. and Rizzoni G. (1994), “A community

outbreak of haemolytic-uraemic syndrome in children occurring in a

large area of Northern Italy over a period of several months”,

Epidemiology and Infection, 113, p. 209 – 219.

91. Vu Khac Hung (2004), “Escherichia coli – prevalence and comparison of

virulence factors in strains isolated from pigs with diarrhea in

Slovak Republic”, The degree of Doctor, Slovak Republic.

92. Xu Jian-Guo, Cheng Bo-Kun and Jing Hual-Qi (1999), “Escherichia coli

O157:H7 and Shiga like-toxin-producing Escherichia coli in

China”, World Journal of Gastroenterology, ISSN 1007-9327.

93. Yu J. and Kapper J. B. (1992), “Cloning and characterization of the eae

gene of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7”, Molecular

biology, 6 (3), p. 411 – 417.

123

94. Zhao T., Doyle M. P., Shere J. and Garber L. (1995), “Prevalence of

enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in a survey of a dairy

herds”, Applied and Environmental Microbiology, 61 (4), p. 1290 –

1293.

95. Wachsmuth (1994), “Summary: public health, epidemiology, food

safety, laboratory diagnosis”, Recent advances in Verocytotoxin-

producing Escherichia coli infection, Karmali M. A. and Goglio A.

G. (eds.), Elsevier, Amsterdam, p. 3 -6.

96. Waters J. R., Sharp J. C. M. and Dev V. J. (1994), “Infection caused by

Escherichia coli O157:H7 in Alberta, Canada and in Scotland: a five year

review, 1987 – 1991”, Clinical Infectious Disease, 19, p. 834 – 843.

97. Wieler L. H., Vieler E., Erpenstein C., Schlapp T., Steinruck H.,

Bauerfeind R., Byomi A. and Baljer G. (1996), “Shiga toxin-

producing Escherichia coli strains from bovines association of

adhesion with carriage of eae and other genes”, Journal of Clinical

Microbiology, 34 (12), p. 2980 – 2984.

98. Willshaw G. A., Smith H. R., Roberts D., Thirlwell J., Cheasty T. and Rowe B.

(1993), “Examination of raw beef products for the presence of

verocytotoxin producing Escherichia coli, particularly those of serogroup

O157”, Journal of Applied Bacteriology, 75, p. 420 – 426.

99. Willshaw G.A., Cheasty T., Smith H.R., O'Brien S.J. and Adak G.K.

(2001), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) O157

and other VTEC from human infections in England and Wales:

1995-1998”, J Med Microbiol, 50 (2), p. 135 – 142.

100. Winkle S. M., Refai M. and Rhode R. (1972), “On the antigenic

relationship of Vibrio cholera to Enterobacteriaceae”, Annales de

L’institut Pastuer, 123, p. 775 – 781.

124

TRANG WEB

101. Phương Thuận (2011), “Hơn 6000 người bị ngộ độc thực phẩm mỗi

năm”, ttp://giadinh.net.vn/2011032509425334p1044c1045/hon-6000 -

nguoi-bi-ngo-doc-thuc-pham-moi-nam.htm

125

Ụ LỤ

Phụ lục 1. Môi tr n , hó chất phân lập, iám định vi huẩn E. coli

(nhóm V E ) và thực hiện các phản ứn hác.

1. Môi tr n , hó chất phân lập, iám định vi huẩn E. coli

 Môi tr n M c n ey (Oxoid - England): Hòa tan 52g môi trường trong 1 lít nước cất vô trùng, hấp 1210C trong 15 phút, sau đó để nguội 500C

đổ ra đĩa Petri.

 Môi tr n thạch máu (Blood agar base) hãng Sanofi - France: Hòa tan 40g trong 1 lít nước cất, hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội đến 45-500C. Bổ sung thêm 5% máu thỏ hoặc máu cừu đã tách sợi huyết lắc đều,

pH =7,4±0,2.

 Môi tr n utrient br th (Merck – Germany): Hòa tan 8g trong 1 lít nước cất, hấp vô trùng 1210C trong 15 phút, pH =7,4±0,2, ở 250C.

 Môi tr n m SB (Merck – Germany): Hòa tan 33g trong 1 lít nước cất, hấp vô trùng 1210C trong 15 phút, pH =7,3±0,2, đổ ra ống farcol lấy mẫu.

 Môi tr n B W (Oxoid - England): ): Hòa tan 20g trong 1 lít nước cất, hấp vô trùng 1210C trong 15 phút, pH =7,3±0,2.

 Môi tr n EMB A r (Merck – Germany): Hòa tan 36g trong 1 lít nước cất, hấp vô trùng 1210C trong 15 phút, pH =7,4±0,2.

 Môi tr n S M (Eiken – Japan): Hòa tan 39g trong 1 lít nước cất, chia ống nút vặn khoảng 3-5ml/ống, hấp vô trùng 1210C trong 15 phút, pH

=7,4±0,2.

 Môi tr n -SMAC (Cefixime Tellurite Selective Supplement) của

hãng Oxoid – England: 1 lọ cho 2ml nước cất vô trùng vào lắc đều đến tan

hết, bổ sung vào 500ml môi trường SMAC (Sorbitol MacConkey Agar) đã vô

trùng, lắc đều, đổ ra đĩa petri.

126

 Môi tr n đ n các l ại: Pha dung dịch đường các loại 20%, hấp cách quãng 1000C trong vòng 30 phút/ 1 ngày, hấp trong 3 ngày.

2. ó chất ùn tr n phản ứn , Multiplex-PCR

 Mồi các l ại: do hãng Fermentas cung cấp. Mồi được hoàn nguyên trong

đệm TE (Invitrogen, USA).

 AMP x 5 bufer, dNTP stock, 50 x TAE, Taq-DNA polymerase, Gel

loading bufer do hãng Fermentas cung cấp.

 Ethidium bromide 10mg/ml: do Invitrogen, USA cung cấp.

 Dun ịch điện di TBE 10X (Tris – Borate – EDTA): Hòa tan 108g Tris-

Base (Merck), 55g axit Boric (Sigma) và 5,84g EDTA (Fluka) trong 1 lít

nước cất, lắc đều cho tan hết. Khi sử dụng, pha loãng 10 lần với nước cất.

 hạch r se 0,8-2% : Cân chính xác lượng agarose (US-Bio) cần sử

dụng cho vào bình tam giác, bổ sung đệm TBE vừa đủ để đạt nồng độ theo

yêu cầu. Làm tan chảy toàn bộ thạch trong lò vi sóng. Khi thạch nguội đến 500C, bổ sung ethidium bromide (0,5µl ethidium bromide /10ml thạch

agarose), lắc đều và đổ ra khuôn đã được chuẩn bị trước, gắn lược. Để thạch

đông tự nhiên trong khoảng 15 - 30 phút. Gỡ bỏ lược, đặt thạch vào bể điện

di, bổ sung đệm TBE ngập mặt thạch và tiến hành bơm mẫu để điện di sản

phẩm PCR.

3. ó chất ùn tr n phản ứn F E

 Dun ịch rử (Wash buffer): Hòa 40ml NaCl 5M, 10ml Tris-HCl 1M

(pH 7,2), 200ml EDTA 0,5M (pH 8,0) trong 750 ml nước cất. Lắc đều và hấp 1210C trong 15 phút.

 Dun ịch phá vỡ tế bà vi huẩn (bacterial cell lysis solution)

Hòa tan 0,5ml Tris-HCl 1M (pH 7,5), 0,5ml NaCl 5M, 10ml EDTA 0,5M (pH

8,0), 100mg sodium deoxycholate, 250 mg N-lauroylsarcosine/sodium salt

với 39ml nước cất. Lắc cho tan hết và vô trùng bằng cách lọc qua giấy lọc

127

0,22µm. Sau đó, bổ sung 50mg lysozyme, lắc cho tan đều, bảo quản 40C.

 Dun ịch pr tein se K (Bacterial cell protenase K solution)

Hòa tan 0,5g N-lauroylsarcosine/sodium salt trong 50ml EDTA 0,5M (pH

8,0). Lắc nhẹ và làm ấm dung dịch để cho tan hết, vô trùng dung dịch cách lọc

qua giấy lọc 0,22µm. Sau đó, bổ sung 1,25 ml proteinase K (nồng độ 20mg/ml), lắc cho tan đều, bảo quản 40C.

 Dun ịch đệm E (Tris –EDTA buffer)

Hòa tan 5ml Tris-HCl 1M và 1 ml EDTA 0,5M (pH 8,0) trong 495 ml nước

cất.

 Dun ịch MSF 1mM Hòa tan 17,4 mg PMSF trong 100ml nước cất. Lắc đều và hấp 1210C trong 15

phút.

 Dun ịch BSA/spermi ine restricti n enzyme

Trộn đều 100µl Restriction enzyme buffer 10X (promega), 10µl acetylated

BSA (10mg/ml), 20µl spermidine trihydrochloride (100mM) với 0,87 ml

nước cất. Dung dịch này chỉ chuẩn bị trước khi tiến hành phản ứng.

128

Phụ lục 2. Một số hình ảnh lấy m u tại cơ sở iết mổ Minh iền, run Văn.

129

Phụ lục 3. Một số hình ảnh về thực trạn h ạt độn iết mổ tại một số cơ

sở iết mổ nhỏ lẻ.

ạ lôn trên nền bẩn h lọc thân thịt trên nền bẩn

ách lòn và thân thịt trên nền bẩn ách lòn và thân thịt trên nền bẩn

Làm lòn cạnh thân thịt Khôn có hu làm lòn riên biệt

130

ình thức vận chuyển phổ biến Vận chuyển thân thịt bằn xe máy

hôn che đậy

Phụ lục 4. Một số hình ảnh mu bán thịt tại chợ.

ằn s u các quầy bán thịt tại chợ hạch Bàn.

131

Phụ lục 5: Một số hình ảnh tr n phòn thí n hiệm

132

Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội

Luận án xác định đặc tính của vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập được từ bò, lợn tại điểm giết mổ; xây dựng được quy trình chẩn đoán, xác định vi khuẩn VTEC trong sản phẩm thịt tươi.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

UYỄ Ị A ỦY

Ê ỨU M SỐ Ặ Í ỦA V K UẨ

ESCHERICHIA COLI ( ÓM V E ) Â LẬ

Ừ BÒ, LỢ Ợ Ế MỔ

LUẬ Á Ế SĨ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học hú y

Mã số

: 62 62 50 10

i h n n h học: 1. S. uyễn Bá iên

2. S. ỗ ọc húy

- 2012

L AM OA

ác iả luận án

L ẢM Ơ

MỤ LỤ

DA MỤ Á Ữ V Ế Ắ

DAN MỤ Á BẢ

DA MỤ Ì

MỞ ẦU

h ơn 1

Ổ QUA L U

Hình 1.3. Nguyên lý củ phản ứn

A: Biến tính - tách rời hai mạch của phân tử DNA B: Ủ bắt cặp - cặp mồi chuyên biệt bắt cặp với khuôn C: Kéo dài - DNA polymerase tổng hợp mạch mới từ mồi đã bắt cặp dưới sự hiện

hiệt độ (0C)

94 - 95 0C A

C

B

h i i n (phút)

Enzym

Vị trí cắt

h ơn 2

DU , UYÊ L U V Ơ Á

Ê ỨU

Gen

Ký hiệu

Kích cỡ sản

huỗi primers (5 ’- 3 ’)

đích

primers

phẩm (bp)

hành phần

ồn độ

hể tích (l)

ác i i đ ạn củ phản ứn hiệt độ (oC) h i i n (phút) Số chu ỳ

h ơn 3

KẾ QUẢ V ẢO LUẬ

iều iện điểm iết mổ

h ơn tiện vận chuyển

Số l ợn

ối t ợn

các điểm

ợc phân

Bao gói

TT

iết mổ

iết mổ

thành khu

iết mổ trên

iết mổ trên

Có khu khám thân

Ôtô Xe máy

hi vận

riên biệt

bàn, bệ

sàn nhà

thịt, phủ tạn

chuyển

ổn

467

04

09

452

02

40

427

0

ỷ lệ %