Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (Chicken Infectious Anemia Virus

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐÀO ĐOAN TRANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ

CỦA VIRUS GÂY BỆNH THIẾU MÁU TRUYỀN NHIỄM

Ở GÀ (CHICKEN INFECTIOUS ANEMIA VIRUS- CIAV)

LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2020

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

------------------

ĐÀO ĐOAN TRANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ

CỦA VIRUS GÂY BỆNH THIẾU MÁU TRUYỀN NHIỄM

Ở GÀ (CHICKEN INFECTIOUS ANEMIA VIRUS- CIAV)

LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y

Mã số:

9.64.01.08 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ

TS. Nguyễn Văn Giáp

HÀ NỘI, NĂM 2020

LỜI CAM ĐOAN

Dữ liệu trong luận án là một phần của đề tài “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và

dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm gà (chicken infectious

anemia virus, CIAV) lưu hành ở miền Bắc Việt Nam”, mã số 04/DAVB, được tài trợ bởi

Dự án Việt- Bỉ, giai đoạn 2014-2019.

Tôi xin cam đoan: (1) tất cả các kết quả thu được trong luận án này do bản thân

tôi và nhóm nghiên cứu thực hiện và được phép công bố với sự đồng ý của chủ nhiệm

đề tài và các thành viên tham gia thực hiện; (2) các kết quả được trình bày trong luận án

là trung thực, khách quan và không trùng lặp với bất kỳ một luận án tiến sĩ nào đã công

bố trước đây; (3) mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cảm ơn, các thông

tin trích dẫn trong luận án đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Tác giả luận án

Đào Đoan Trang

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất

nhiều cá nhân, đơn vị và tổ chức.

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ và

TS. Nguyễn Văn Giáp, những người đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình, giúp đỡ

tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Bên cạnh đó, tôi muốn gửi lời

cảm ơn đến dự án Việt- Bỉ tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã cấp kinh phí đề tài để

tôi có thể thực hiện được nội dung nghiên cứu của luận án.

Đồng thời, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt

Nam, Ban Quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền

nhiễm, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp

Việt Nam, đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình học tập, trang bị cho tôi những

kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này.

Nhân dịp hoàn thành luận án, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể

Lãnh đạo và toàn thể cán bộ công nhân viên Trung tâm Thực nghiệm và Bảo tồn Vật

nuôi (Viện Chăn nuôi), các đồng nghiệp, gia đình và bạn bè đã luôn tạo điều kiện về

thời gian, động viên, chia sẻ vật chất, tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập,

nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Nghiên cứu sinh

Đào Đoan Trang

MỤC LỤC

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

iii

Danh mục các từ viết tắt

Danh mục bảng

viii

Danh mục hình

Trích yếu luận án

Thesis abstract

xiii

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1.

Tính cấp thiết của đề tài

1.2. Mục tiêu nghiên cứu

Phạm vi nghiên cứu

1.3.

1.4.

Những đóng góp mới của đề tài

1.5.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.

Virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà

2.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại virus gây bệnh

2.1.2. Hình thái, cấu trúc CIAV

2.1.3. Sức đề kháng của CIAV

2.1.4. Tính kháng nguyên và sự biến đổi chủng của CIAV

2.2.

Bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà

2.2.1. Giới thiệu chung

2.2.2. Địa dư bệnh

2.2.3. Thiệt hại do bệnh thiếu máu truyền nhiễm gây ra

2.2.4. Loài vật mắc bệnh

2.2.5. Phương thức truyền lây

2.2.6. Cơ chế sinh bệnh

2.2.7. Triệu chứng bệnh thiếu máu truyền nhiễm

2.2.8. Bệnh tích bệnh thiếu máu truyền nhiễm

2.2.9. Chẩn đoán bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà

iii

2.2.10. Biện pháp phòng bệnh

2.3.

Đặc điểm dịch tễ học phân tử của CIAV

2.3.1. Mối quan hệ di truyền giữa các chủng CIAV

2.3.2. Sự lưu hành CIAV theo nhóm di truyền ở một số quốc gia

2.3.3. Khác biệt di truyền của CIAV

2.4.

Tình hình nghiên cứu về CIAV tại Việt Nam

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.

Địa điểm nghiên cứu

3.2.

Thời gian nghiên cứu

3.3.

Đối tượng/ vật liệu nghiên cứu

3.3.1. Đối tượng nghiên cứu

3.3.2. Dụng cụ và thiết bị

3.3.3. Vật liệu nghiên cứu

3.4.

Nội dung nghiên cứu

3.4.1. Nghiên cứu sự lưu hành của virus và bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà

nuôi tại một số tỉnh/thành phố miền Bắc Việt Nam

3.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm đặc điểm dịch tễ học phân tử của CIAV

3.5.

Phương pháp nghiên cứu

3.5.1. Phương pháp lựa chọn cơ sở chăn nuôi để thu mẫu

3.5.2. Phương pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đặc trưng

3.5.3. Phương pháp mổ khám và lấy mẫu

3.5.4. Phương pháp tách chiết ADN

3.5.5. Phương pháp PCR phát hiện CIAV

3.5.6. Phương pháp chứng minh độc lực của CIAV

3.5.7. Phương pháp giải trình tự gen và chú giải cấu trúc gen

3.5.8. Phương pháp phân tích đặc điểm di truyền

3.5.9. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại

3.5.10. Phương pháp phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử

3.5.11. Phương pháp xử lý số liệu

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1.

Sự lưu hành virus và bệnh thiếu máu truyền nhiễm

4.1.1. Kết quả nghiên cứu sự lưu hành CIAV

4.1.2. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của gà nhiễm CIAV trong tự nhiên

4.1.3. Đặc điểm về sự lưu hành của CIAV

4.1.4. Kết quả chứng minh độc lực của CIAV lưu hành ở gà tại miền Bắc

4.2.

ĐẶc điểm dịch tễ học phân tử của CIAV tại miền Bắc

4.2.1. Đặc điểm di truyền bộ gen của CIAV lưu hành ở miền Bắc

4.2.2. Đặc điểm di truyền của gen mã hóa capsid protein

4.2.3. Nguồn gốc phát sinh chủng loại của CIAV lưu hành tại miền Bắc

4.2.4. Đặc điểm phát tán theo không gian và thời gian của CIAV lưu hành tại

miền Bắc

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1.

Kết luận

5.2.

Đề nghị

Danh mục công trình công bố có liên quan đến luận án

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

101

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

Nghĩa tiếng Việt

ADN

Acid Deoxyribonucleic

Axit Deoxyribonucleic

ALV

Avian Leukosis Virus

Virus gây bệnh Lơ-cô ở gà

ARV

Avian Reovirus

Reovirus ở gà

ATF

Activating Transcription Factor

Yếu tố khởi đầu phiên mã

BWD

Blue Wing Disease

Bệnh cánh xanh

CAA

Chicken Anemia Agent

Tác nhân gây thiếu máu ở gà

CIA

Chicken Infectious Anemia

Thiếu máu truyền nhiễm ở gà

CIAV

Chicken Infectious Anemia Virus

thiếu máu

truyền

Virus gây nhiễm ở gà

ELISA

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Phản ứng ELISA

FAdV

Fowl Adenovirus

Adenovirus ở loài cầm

FAdV4

Fowl Adenovirus serotype 4

FPV

Fowlpox Virus

Adenovirus ở loài cầm thuộc serotype 4 Virus gây bệnh đậu gia cầm

GDP

Gross Domestic Product

Tổng sản phẩm quốc nội

HPS

Hydropericardium

Bao tim tích nước

ICTV

Committee

IBD

International Taxonomy of Viruses Infectious Brusal Disease

Ủy ban quốc tế về phân loại virus Bệnh Gumboro

IBDV

Infectious Brusal Disease Virus

Virus gây bệnh Gumboro

IBH

Inclusion Body Hepatitis

Viêm gan thể vùi

IFA

Indirect Immunofluorescence Assay

ILTV

Infectious Laryngotracheitis Virus

Lymphoid Leukosis

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp Virus gây bệnh viêm thanh - khí quản truyền nhiễm Bệnh Lơ-cô

Marek’s Disease

Bệnh Marek’s

MDCC-JP2

Marek’s Disease Chicken Cell-JP2

MDCC-MSB1 Marek’s Disease Chicken Cell- MSB1

Tế bào JP2 của gà mắc bệnh Marek’s Tế bào MSB1 của gà mắc Marek’s

MDV

Marek’s Disease Virus

Virus gây bệnh Marek’s

Newcastle Disease

Bệnh Newcastle

NDV

Newcastle Disease Virus

Virus gây bệnh Newcastle

ORF

Open Reading Frame

Khung đọc mở

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng tổng hợp chuỗi ADN

PCV

Packed Cell Volume

Tỷ khối huyết cầu

REV

Reticuloendotheliosis Virus

RFLP

SPF

Restriction Fragment Length Polymorphism Specific Pathogen Free

Virus gây bệnh hệ lưới nội bì ở gia cầm Đa hình chiều dài các đoạn được cắt bằng enzyme Sạch với một số loại mầm bệnh

TTMV

Torque Teno Mini Virus

Virus Torque Teno Mini

TTV

Torque Teno Virus

Virus Torque Teno

VNT

Virus Neutralization Test

Phản ứng trung hòa virus

Virion Protein

Protein cấu tạo nên virion

vii

DANH MỤC BẢNG

Tên bảng

Trang

TT

Đối chiếu cách phân loại nhóm di truyền của CIAV

2.1.

Khoảng cách di truyền của CIAV dựa vào gen ORF1

2.2.

Trình tự mồi đặc hiệu dùng trong nghiên cứu

3.1.

Kết quả PCR phát hiện CIAV trong mẫu bệnh phẩm

4.1.

Kết quả PCR phát hiện CIAV ở mẫu bệnh phẩm thu từ 10 tỉnh/thành phố

4.2.

miền Bắc Việt Nam

Kết quả phát hiện virus huyết ở gà sau gây nhiễm CIAV

4.3.

Bệnh tích đại thể ở nhóm gà nhiễm CIAV

4.4.

Trình tự amino acid của VP1 liên quan đến độc lực của CIAV

4.5.

viii

DANH MỤC HÌNH

TT

Tên hình

Trang

2.1.

Cây phát sinh chủng loại của giống Gyrovirus

2.2.

Hạt virus dưới kính hiển vi điện tử

2.3.

Cấu trúc bộ gen CIAV

2.4.

Bản đồ phân bố của CIAV ở các nước trên thế giới

2.5.

Tương quan giữa biểu hiện bệnh, lứa tuổi và tình trạng miễn dịch trong

bệnh thiếu máu truyền nhiễm

2.6.

Triệu chứng của gà mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm

2.7.

Biến động tỷ khối huyết cầu ở gà mắc bệnh

2.8.

Bệnh tích đại thể ở gà mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm

2.9.

Kết quả RFLP-PCR phân biệt các chủng CIAV

2.10. Kết quả giải trình tự gen phát hiện đồng nhiễm các chủng CIAV

2.11. Cây phát sinh chủng loại CIAV

2.12. Đặc điểm biến đổi amino acid của VP1 protein

4.1.

Một số triệu chứng của gà nhiễm CIAV tự nhiên

4.2.

Bệnh tích ở tuyến ức của gà nhiễm CIAV trong tự nhiên

4.3.

Bệnh tích ở tủy xương gà nhiễm CIAV trong tự nhiên

4.4.

Bệnh tích ở túi Fabricius của gà nhiễm CIAV trong tự nhiên

4.5.

Sự phân bố của CIAV tại một số tỉnh miền Bắc

4.6.

Kết quả phát hiện CIAV theo một số chỉ tiêu trong chăn nuôi

4.7.

Kết quả semi-nested PCR phát hiện CIAV ở nhóm gà gây nhiễm

4.8.

Mào, tích của gà sau gây nhiễm CIAV

4.9.

Ảnh hưởng của CIAV đến khả năng tăng trọng của gà

4.10. Biến động tỷ khối huyết cầu ở nhóm gà gây nhiễm và đối chứng

4.11. Bệnh tích đại thể ở tuyến ức và tủy xương

4.12. Bệnh tích đại thể ở túi Fabricius và gan

4.13. Cấu trúc vùng khởi đầu phiên mã của CIAV ở miền Bắc

4.14. Cấu trúc vùng mã hóa protein của CIAV ở miền Bắc

4.15.

Tương đồng trình tự nucleotide bộ gen giữa các chủng CIAV

4.16. Biến động về mức tương đồng dọc chiều dài bộ gen của CIAV

4.17.

Trình tự gen ORF1 của CIAV (nucleotide 1-582)

4.18. Kết quả so sánh trình tự phân đoạn gen ORF1

4.19.

Trình tự amino acid suy diễn của một phần protein VP1

4.20. Cây phát sinh loài của CIAV dựa vào gen ORF1

4.21.

Trình tự các vị trí amino acid quan trọng của protein VP1

4.22. Cây phát sinh loài của CIAV dựa trên bộ gen hoàn chỉnh

4.23. Cây phát sinh loài của CIAV dựa trên gen VP1 hoàn chỉnh

4.24. Cây phát sinh loài của CIAV dựa trên một phần gen VP1

4.25. Kết quả xác định đặc điểm phân nhánh CIAV

4.26. Nguồn gốc, sự phát tán của CIAV nhánh G2.1 tại miền Bắc

4.27. Nguồn gốc, sự phát tán của CIAV nhánh G2.2 tại miền Bắc

4.28.

Sự phát tán theo không gian và thời gian của nhánh 3.1

4.29.

Sự phát tán theo không gian và thời gian của nhánh 3.2

4.30.

Sự phát tán theo không gian và thời gian của nhánh 3.3

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Đào Đoan Trang

Tên Luận án: Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh thiếu máu truyền

nhiễm ở gà (Chicken Infectious Anemia Virus - CIAV) lưu hành tại miền Bắc Việt Nam

Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y

Mã số: 9.64.01.08

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu này nhằm trả lời câu hỏi có hay không virus gây bệnh thiếu máu

truyền nhiễm (CIAV) ở đàn gà tại 10 tỉnh/thành phố thuộc miền Bắc Việt Nam. Trên cơ

sở xác định được sự lưu hành của CIAV cùng các triệu chứng lâm sàng, phi lâm sàng và

các biến đổi bệnh lý của bệnh thiếu máu truyền nhiễm, đặc điểm sinh học và dịch tễ học

phân tử của virus đã được phân tích đa chiều nhằm làm rõ đặc điểm gen, các nhóm di

truyền và sự phân bố theo không gian - thời gian của của CIAV tại miền Bắc Việt Nam.

Phương pháp nghiên cứu

Hai nhóm phương pháp chính được dùng trong nghiên cứu này, bao gồm: (i) kỹ

thuật PCR dùng để phát hiện CIAV trong mẫu bệnh phẩm và giải trình tự gen virus. (ii)

Ứng dụng tin sinh học, với các phần mềm như MEGA, Weblogo, BEAST, PastML

v.v... để phân tích đặc điểm sinh học phân tử và dịch tễ học phân tử của CIAV.

Kết quả chính và kết luận

Có 2 nhóm kết quả nghiên cứu chính đã đạt được trong nghiên cứu này, bao gồm:

(1.1) Đã chứng minh được sự có mặt phổ biến của virus gây bệnh thiếu máu

truyền nhiễm ở 10 tỉnh miền Bắc. Gà ở mọi lứa tuổi, mục đích chăn nuôi, quy mô và

phương thức chăn nuôi đều nhiễm CIAV, với tỷ lệ trung bình là 62,2%. (1.2) Đã xác

định được có bệnh thiếu máu truyền nhiễm gà nuôi với các biến đổi bệnh lý đại thể điển

hình ở: teo cơ quan lympho và tủy xương nhạt màu. (1.3) Bằng gây bệnh thực nghiệm,

đã chứng minh virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở miền Bắc có độc lực, gây ra

các biến đổi bệnh lý điển hình của bệnh như giảm tỷ khối huyết cầu, teo tuyến ức, teo

túi Fabricius và tủy xương nhạt màu.

(2) Đặc điểm dịch tễ học phân tử của CIAV ở miền Bắc Việt Nam đã được làm rõ

thông qua việc (2.1) xác định được hai nhóm di truyền là genogroup G2 và G3 lưu

hành, với 100% số chủng CIAV không nằm cùng nhánh với các chủng virus vacxin

(2.2) Kết quả phân tích còn cho thấy CIAV lưu hành ở miền Bắc Việt Nam có nguồn

gốc đa dạng: virus thuộc genogroup G2 có nguồn gốc từ các chủng virus lưu hành ở

Argentina và Mỹ. Trong khi đó virus thuộc genogroup G3 có nguồn gốc từ chủng virus

lưu hành ở Trung Quốc, Đài Loan và Ba Lan. Sau khi xâm nhập, các chủng CIAV có

khả năng đã tạo thành những nhánh di truyền riêng biệt và tiếp tục lây lan.

xii

THESIS ABSTRACT

PhD candidate: Dao, Doan Trang

Thesis title: Molecular epidemiological study of chicken infectious anemia virus

(CIAV) in Northern of Vietnam

Major: Veterinary epidemiology

Code: 9.64.01.08

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

This study firstly investigated the prevalence of CIAV in ten northern provinces

of Vietnam. Based on the identification of CIAV, compatible clinical and gross lesions

of chicken infectious anemia, the molecular epidemiology of CIAV was analyzed under

different aspects in order to revealed genetic, phylogenetic characterizations and spatial-

temporal distributions of CIAV in northern provinces.

Materials and Methods

Two major groups of methods were used, including: (i) PCR based method for

viral detection and Sanger’s sequencing. (ii) Applied bioinformatics for genetic,

phylogenetic and molecular epidemiological. Several tools were utilized, such as:

BioEdit, MEGA, WebLogo, BEAST, PastML, etc.

Main findings and conclusions

Two findings were obtained from this study, as following:

(1.1) The wide prevalence of CIAV in ten northern provinces were proven. The

virus was detected in chickens of all ages, scales and production types, with an average

positive rates of 62.2%. (1.2) The clinical disease of chicken infectious anemia readily

existed with the typical pathological changes were detected in naturally infected birds,

such as: atrophy of lymphoid tissues, and pale of bone marrow. (1.3) Being able to

induce compatible gross lesions of chicken infectious anemia under experiment

conditions, the pathogenicity of a CIAV strain circulating in the North was proven.

(2) The molecular epidemiological characterisation of CIAV in Northern Vietnam

were elucidated through (2.1) the identification of two circulating genogroups of G2 and

G3. All of detected CIAV strains was proven not belonging to vaccine strain and did not

display significant motifs of attenuated viruses. (2.2) The analysis also showed that

CIAV circulating in Northern Vietnam has diverse origins: the genogroup G2 virus was

xiii

derived from the strains circulating in Argentina. Meanwhile, the viruses of genogroup

G3 were originated from the strains circulating in China, Taiwan and Poland. Upon

introduction, CIAV seemed to diversify locally and started to diffuse spatial-temporally

into different geographic areas.

xiv

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Chăn nuôi là một bộ phận quan trọng của nền nông nghiệp Việt Nam. Bên cạnh nhiều cơ hội và thuận lợi, ngành chăn nuôi gia cầm đã và đang phải đối mặt với không ít thách thức và khó khăn; trong đó, dịch bệnh được xem là trở ngại lớn, gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi. Hiện nay, một trong những bệnh ở gia cầm ít được quan tâm nghiên cứu ở nước ta là tình trạng suy giảm miễn dịch, với vai trò lớn thuộc về các virus tác động trực tiếp tới hệ miễn dịch của vật nuôi.

Virus gây ức chế miễn dịch đã và đang đe dọa ngành chăn nuôi gia cầm bởi thiệt hại kinh tế trong sản xuất với tỷ lệ tử vong cao do gà dễ bị nhiễm trùng thứ cấp (Dohms & Saif, 1984) và có đáp ứng miễn dịch thấp đối với vacxin phòng bệnh (Lutticken, 1997). Trong số đó, CIAV (chicken infectious anemia virus)- nguyên nhân gây bệnh bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (chicken infectious anemia- CIA) (Yuasa & cs., 1979) được xem là một trong các bệnh có ảnh hưởng lớn về kinh tế trên phạm vi thế giới (Balamurugan & Kataria, 2006). Bệnh trở lên phổ biến, được thông báo xuất hiện ở hầu hết các nước chăn nuôi gà trên thế giới (Toro & cs., 2006; Bougiouklis & cs., 2007; Oluwayelu, 2010) do virus có khả năng lây lan, đề kháng mạnh với các yếu tố sát trùng và gây ức chế đơn thuần hoặc kết hợp với các tác nhân truyền nhiễm khác.

Từ khi CIAV được phát hiện đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về CIAV và bệnh do virus gây ra trên phạm vi toàn cầu với kết quả thu được từ nhiều khía cạnh: đặc tính sinh học, cơ chế sinh bệnh, cơ chế gây ức chế miễn dịch của virus; đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng, bệnh tích của bệnh và biện pháp can thiệp. Đáng chú ý là cơ chế gây ức chế miễn dịch của virus bởi khả năng tấn công vào các cơ quan miễn dịch, làm cạn kiệt các tế bào lympho của tuyến ức, túi Fabricius và tế bào tạo máu tiền thân (hemocytoblast) ở tủy xương (Adair, 2000; Dhama & cs., 2008). Ngày nay, sinh học phân tử phát triển đã tạo thuận lợi cho các nghiên cứu chuyên sâu về CIAV. Cấu trúc bộ gen virus đã được giải mã cùng với các đặc điểm về di truyền đã giúp cho việc xác định chủng, phân loại virus và sản xuất vacxin phòng bệnh, từ đó góp phần hạn chế thiệt hại do virus gây ra.

Đến nay, vacxin phòng CIA đã được sử dụng phổ biến trên thế giới, đặc biệt ở các nước có ngành chăn nuôi gà phát triển. Tuy nhiên, thông tin về CIA cũng như sự hiểu biết về CIAV tại Việt Nam có phần hạn chế. Tính đến thời điểm hiện tại, công bố

về sự có mặt của kháng thể kháng CIAV trong huyết thanh gà vào năm 2013 (Trinh & cs., 2015b) cũng như kết quả phân loại phát sinh gen của các chủng CIAV tại miền Bắc Việt Nam (Van Dong & cs., 2019) là hai nghiên cứu về CIAV với các mẫu bệnh phẩm lấy tại Việt Nam nhưng được thực hiện ở nước ngoài. Bên cạnh đó, theo thông tư 10/2016/TT-BNNPTNT, hiện có 2 loại vacxin phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm được phép lưu hành: Nobilis CAV P4 (Intervet) và AviPro Thymovac (Lohmann Animal Health GmbH) tuy nhiên việc sử dụng vacxin cũng như hiểu biết của người chăn nuôi ở Việt Nam về CIAV và CIA rất khiêm tốn. Vì vậy, chúng tôi nhận thấy rằng nghiên cứu các đặc điểm sinh học phân tử của các chủng CIAV lưu hành ở một số tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam rất cần thiết, là cơ sở khoa học của việc sử dụng các vacxin hiện có trên thị trường để phòng CIA. Kết quả thu được sẽ là nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo về CIAV tại Việt Nam, góp phần tiến tới kiểm soát và hạn chế ảnh hưởng của bệnh do CIAV gây ra đối với ngành chăn nuôi gà của Việt Nam, giai đoạn hiện nay và trong tương lai.

1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

* Mục tiêu tổng quát: trả lời câu hỏi có hay không có sự lưu hành gây bệnh của CIAV ở đàn gà nuôi tại Việt Nam và nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus làm cơ sở để đề xuất biện pháp phòng bệnh hiệu quả giúp nâng cao năng suất, chất lượng đàn gà.

* Mục tiêu cụ thể:

- Xác định có sự lưu hành của CIAV và CIA ở đàn gà nuôi tại một số tỉnh miền

Bắc Việt Nam nhằm đề xuất việc sử dụng vacxin phòng bệnh;

- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng CIAV đang

lưu hành tại miền Bắc Việt Nam để giúp lựa chọn loại vacxin phù hợp.

1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Các trạng trại, gia trại nuôi gà tại một số tỉnh miền Bắc giai đoạn 2016- 2019. Các tỉnh/ thành phố gồm Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hà Nội, Bắc Ninh, Hải Dương, Hà Nam, Nam Định, Hải Phòng và Quảng Ninh;

1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đã xác định được có sự lưu hành của CIAV ở đàn gà trên địa bàn của 10 tỉnh/thành phố ở miền Bắc Việt Nam: Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hà Nội, Bắc Ninh, Hải Dương, Hà Nam, Nam Định, Hải Phòng và Quảng Ninh;

- Kết quả nghiên cứu đã giải mã được 3 trình tự gen hoàn chỉnh và 52 trình tự gen ORF1 của các chủng CIAV lưu hành tại thực địa; cho thấy virus thuộc 2

nhóm di truyền G2 và G3; có độc lực và không cùng nguồn gốc với các chủng

vacxin đang được sử dụng.

1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Nghiên cứu đã khẳng định sự lưu hành của CIAV cũng như sự có mặt của

CIA trong các đàn gà nuôi ở một số tỉnh phía Bắc của Việt Nam. Biểu hiện lâm sàng, biến đổi bệnh lý của gà trong tự nhiên được khẳng định bởi kết quả PCR

đối với các mẫu bệnh phẩm và kết quả gây bệnh thực nghiệm bởi chính các chủng CIAV lưu hành đã nhấn mạnh sự cần thiết phải xem xét đến vai trò và ảnh

hưởng của CIAV và CIA đối với ngành chăn nuôi gà hiện nay.

- Nghiên cứu đã phân tích và chỉ ra một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của

các chủng CIAV đã và đang lưu hành ở đàn gà nuôi tại 10 tỉnh/thành phố thuộc

miền Bắc Việt Nam: các chủng thuộc về 2 nhóm di truyền G2, G3; là các chủng có

độc lực và không cùng nhánh với các chủng virus vacxin. Từ thực tế trên, việc sử

dụng vacxin trở nên cần thiết để bảo vệ các đàn gà đối với bệnh do CIAV gây ra.

- Kết quả là nguồn tài liệu tham khảo phục vụ cho nghiên cứu về bệnh

(CIA) và virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm (CIAV); cũng như cho công tác

giảng dạy của chuyên ngành Thú y và Chăn nuôi- Thú y tại Việt Nam.

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. VIRUS GÂY BỆNH THIẾU MÁU TRUYỀN NHIỄM Ở GÀ

2.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại virus gây bệnh

Virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (chicken infectious anemia virus- CIAV) lần đầu tiên được phát hiện từ đàn gà thương phẩm bị bệnh ở Nhật Bản (Yuasa & cs., 1979) với tên ban đầu là CAA (chicken anemia agent- yếu tố gây thiếu máu ở gà). Tên gọi CAA bắt nguồn từ đặc điểm tác nhân gây bệnh không nhân lên trên một số môi trường nuôi cấy tế bào (Yuasa, 1983). Về sau, CAA được chứng minh là một virus khi phát hiện ra tác nhân này nhân lên trên một số dòng tế bào lymphoblastoid của gà (Yuasa & cs., 1983). Sau khi được chứng minh là virus, tên gọi CAV hoặc CIAV được dùng thay cho CAA (Mcnulty, 1991; Noteborn & cs., 1991; Meehan & cs., 1992).

Về phân loại, trước đây, CIAV được xếp vào giống Gyrovirus và họ Circoviridae (Meehan & cs., 1992; Pringle, 1999). Năm 2017, trên cơ sở phân tích lại một cách có hệ thống các bằng chứng về sự khác biệt rõ rệt của CIAV với virus thuộc họ Circoviridae, ủy ban quốc tế về phân loại virus (ICTV), đã chuyển CIAV và giống Gyrovirus vào họ Anelloviridae (Rosario & cs., 2017).

Hình 2.1. Cây phát sinh chủng loại của giống Gyrovirus

Nguồn: Truchado & cs. (2019)

Trước năm 2011, CIAV là thành viên duy nhất của giống Gyrovirus được biết đến. Hiện tại, đã xác định được 12 virus, bao gồm GyV2 -GyV10, HGyV1

(Human Gyrovirus), ASPaGyV (Ashy storm petrel Gyrovirus) và GyV11

(Truchado & cs., 2019). Mối liên hệ giữa các thành viên được trình bày ở hình 2.1.

Dựa vào đặc điểm phân nhánh, CIAV (đóng khung, hình 2.1) là một nhánh độc lập trong giống Gyrovirus, có quan hệ gần gũi với GyV6 và GyV7.

2.1.2. Hình thái, cấu trúc CIAV

CIAV là một virus không có vỏ bọc, đường kính trung bình từ 19,1 nm-

26,5 nm (Gelderblom & cs., 1989). Cấu trúc bề mặt capsid có 60 tiểu đơn vị

được sắp xếp theo 12 vòng hình loa kèn (King & cs., 2011).

Hình 2.2. Hạt virus dưới kính hiển vi điện tử

Nguồn: Todd & cs. (1990)

Dưới kính hiển vi điện tử, hình ảnh nhuộm âm bản CIAV tinh khiết cho thấy hạt virus có dạng hình cầu, với khoảng 10 gai nhô lên rõ ràng trên bề mặt (Todd & cs., 1990). Về vật chất di truyền, bộ gen CIAV là sợi ADN đơn, dạng vòng, dài khoảng 2,3 kb. Bộ gen CIAV có 3 khung đọc mở (ORF) lồng một phần

vào nhau, theo thứ tự ORF2- ORF3- ORF1. Trong đó ORF2, ORF3 và ORF1 mã hóa lần lượt cho 3 protein là: VP2 (24 kDa), VP3 (14 kDa) và VP1 (52 kDa) (Noteborn & cs., 1991; Schat & Van Santen, 2008).

Hình 2.3. Cấu trúc bộ gen CIAV

Nguồn: Rosario & cs. (2017)

Hình 2.3 so sánh cấu trúc gen giữa thành viên của họ Circoviridae và

Anelloviridae. Virus thuộc họ Anelloviridae có đặc điểm (i) gen mã hóa protein

lồng nhau và cùng chiều, (ii) không có cấu trúc stem-loop với 9 nucleotide đặc

trưng. Hai đặc điểm cơ bản trên thấy ở các thành viên của họ Circoviridae. Trong

số 3 protein virus, VP1 là protein cấu trúc duy nhất được biết đến có vai trò tạo

thành capsid, có thể được phát hiện trong các hạt virus có độ tinh khiết cao (Todd

& cs., 1990). Nó đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra kháng thể trung hòa ở

gà bị nhiễm bệnh. VP2 là protein không cấu trúc, có thể hoạt động như một

protein làm khung (scaffold) trong quá trình lắp ráp virion (Noteborn & cs.,

1998). VP2 còn có hoạt tính của phosphatase (dual-specificity phosphatase) nhận

biết đặc hiệu đồng thời phân tử tyrosine, serine hoặc threonine ở vị trí cắt (Peters

& cs., 2002). VP3 là protein không cấu trúc hay là 1 apoptin gây ra cơ chế chết

chương trình hóa (apoptosis) cho các tế bào tiền thân ở vùng tủy của tuyến ức và

các tế bào hemocytoblasts trong tủy xương (Noteborn & cs., 1994).

2.1.3. Sức đề kháng của CIAV CIAV mang các đặc điểm đề kháng cao với nhiệt độ, chloroform của một virus không có vỏ bọc (Yuasa, 1992). Nhìn chung, virus có sức đề kháng cao

trong điều kiện tự nhiên. CIAV chịu được nhiệt độ 56oC hoặc 70oC trong 1 giờ và 80oC trong 15 phút (Natesan & cs., 2006). Virus bị bất hoạt một phần sau khi đun ở 80oC trong 30 phút và bất hoạt hoàn toàn sau 15 phút ở 100oC. Vì vậy, sản phẩm gà bệnh yêu cầu xử lý ở 95oC trong vòng 30 phút hoặc ở 100o trong 10 phút (Urlings & cs., 1993). Đối với các hóa chất dùng sát trùng chuồng trại, CIAV trong huyễn dịch bệnh phẩm bị bất hoạt hoàn toàn bởi iodine hoặc sodium hypochlorite ở nồng độ 10% ở 37oC trong vòng 2 giờ (Yuasa, 1992).

2.1.4. Tính kháng nguyên và sự biến đổi chủng của CIAV

Sử dụng kháng thể đa dòng, các nhà khoa học trên thế giới không phát

hiện sự khác nhau về đặc tính kháng nguyên giữa các chủng CIAV phân lập được

ở Nhật Bản, châu Âu và châu Mỹ (Yuasa & Imai, 1986; Mcnulty & cs., 1990).

Với kháng thể đơn dòng, sự khác biệt nhỏ về đặc tính kháng nguyên giữa các

chủng CIAV đã được tìm thấy (Trinh & cs., 2015a). Trên capsid protein của

CIAV tồn tại vùng “siêu biến đổi” từ amino acid 139 đến 151 (Renshaw & cs.,

1996), nhưng mới chỉ có bằng chứng về sự thay đổi amino acid của vùng này đến

đặc tính nhân lên của CIAV in vitro (Renshaw & cs., 1996).

Dựa vào phản ứng huyết thanh học, nhìn chung các chủng CIAV được

xem thuộc về một type huyết thanh đơn (Schat & Van Santen, 2008). Năm 2002,

một nhóm nhà khoa học ở Mỹ công bố phát hiện CIAV-7 phân lập từ gà 17 tuần

tuổi có bệnh tích của bệnh thiếu máu truyền nhiễm (Spackman & cs., 2002a).

Trong điều kiện thí nghiệm, CIAV-7 gây ra tình trạng bệnh giống bệnh thiếu máu

truyền nhiễm, nhưng CIAV-7 lại có đặc tính kháng nguyên khác với chủng

CIAV tham chiếu (không bị trung hòa bởi kháng thể đặc hiệu kháng CIAV chủng

Del-Ros) (Spackman & cs., 2002b). Do đó, chủng CIAV-7 được giả định là một

type huyết thanh học thứ 2 của virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm

(Spackman & cs., 2002b). Tuy nhiên, cho đến nay, vẫn chưa có thêm nghiên cứu

về CIAV-7 được công bố.

2.2. BỆNH THIẾU MÁU TRUYỀN NHIỄM Ở GÀ

2.2.1. Giới thiệu chung Bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (CIA) được đặc trưng bởi tình trạng thiếu máu không tái tạo (aplastic anemia) do sự phá hủy các tế bào tạo máu

(hematopoietic stem cell) ở tủy xương và thoái hóa các mô lympho (lymphoid

depletion) (Mcnulty, 1991). Bên cạnh đó, do tình trạng ức chế miễn dịch (immunosuppression), gà mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm dễ mắc các bệnh kế

phát, giảm đáp ứng với các loại vacxin phòng bệnh (Hagood & cs., 2000). Sự xuất hiện của CIA là được đánh giá là một trong những mối đe dọa nghiêm trọng

cho ngành chăn nuôi gà ở các nước trên thế giới (Mcnulty, 1991; Balamurugan &

Kataria, 2006).

2.2.2. Địa dư bệnh

Lịch sử phát hiện CIA gắn với sự phát hiện CIAV (chủng Gifu-1) lần đầu

tiên năm 1979 ở Nhật Bản (Yuasa, 1983). Tiếp sau đó, CIAV đã được phân lập ở nhiều nước: chủng ConnB được phân lập từ gà bị bệnh Marek’s (Goryo & cs.,

1987b); chủng CIA-1 được phân lập năm 1988 tại một trang trại ở Delaware

(Mỹ) (Lucio & cs., 1990); chủng Cux-1 (C) được phân lập ở Cuxhaven (Đức)

vào năm 1991 (Chandratilleke & cs., 1991); chủng L-028 được phân lập vào năm

1992 tại một trang trại ở New York (Mỹ) (Renshaw & cs., 1996), v.v... Bằng

phản ứng huyết thanh học, CIAV được xác định có mặt ở khắp các nước, ví dụ

như ở Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, Úc, NewZealand và Nam Phi, v.v... Nghiên

cứu hồi cứu các mẫu huyết thanh thu thập từ 1959- 2005 cho biết nhiều khả năng

virus đã hiện diện từ trước những năm 1970 (Toro & cs., 2006).

Ghi chú: dựa vào thông tin được công bố qua các bài báo khoa học, trình tự gen được công bố trên GenBank, đã xác định được các quốc gia có sự hiện diện của CIAV (đánh dấu)

Hình 2.4. Bản đồ phân bố của CIAV ở các nước trên thế giới

Cho đến nay CIAV và bệnh thiếu máu truyền nhiễm đã có mặt ở nhiều nước

thuộc tất cả các châu lục (hình 2.4). Ở khu vực Đông Nam Á, CIAV đã được xác định ở Thái Lan, Campuchia, Lào, Malaysia, Indonesia và Việt Nam (Hailemariam & cs., 2008; Kye & cs., 2013; Wanasawaeng & cs., 2013; Trinh & cs., 2015b).

2.2.3. Thiệt hại do bệnh thiếu máu truyền nhiễm gây ra

Nghiên cứu tại Israel (Davidson & cs., 2004) khi quan sát 6 đàn gà thịt cho

thấy nhiễm CIAV làm giảm sức sản xuất, ví dụ như tăng trưởng kém hơn, tỷ lệ tử

vong cao hoặc tăng cường các triệu chứng của các bệnh trong trường hợp nhiễm

ghép. Cụ thể, nghiên cứu đã chỉ ra dấu hiệu giảm tổng tăng trưởng ở mức 35.000

kg của một đàn so với hai đàn khác cùng với dấu hiệu của bệnh thiếu máu truyền

nhiễm (viêm da, xuất huyết cơ, tủy xương nhạt màu, tỷ lệ tử vong cao). Bên cạnh

đó, tỷ lệ tử vong tăng cao ở các đàn nhiễm CIAV (gấp 4 lần so với đàn bình

thường). Tuy nhiên, hậu quả cuối cùng và phổ biến là sự cộng gộp ảnh hưởng từ

nhiều yếu tố: quản lý yếu kém, các stress trong đàn, yếu tố di truyền của giống và

các mầm bệnh ghép.

Đối với gà thịt, nhiễm IBDV làm chậm sự phục hồi tuyến ức sau khi CIAV

gây teo tuyến ức ở gia cầm (Hoerr, 2010); nhiễm CIAV làm tăng cường khả năng

gây bệnh của MDV (Jeurissen & De Boer, 1993) hoặc CIAV có liên quan đến

nhiễm trùng tụ cầu khuẩn và viêm da hoại tử. Khi gà bị nhiễm nhiều loại mầm

bênh, ví dụ như CIAV với MDV, REV hoặc IBDV, v.v… sẽ làm cho tỷ lệ ốm và

tỷ lệ chết tăng cao. Bệnh thường xảy ra với đàn gà từ 2 - 4 tuần tuổi khiến cho gà

chậm phát triển, tỷ lệ chết dao động từ 10 - 20%, có trường hợp lên đến 60%.

Với gà trên 6 tuần tuổi, bệnh thường liên quan đến hội chứng thiếu máu - xuất huyết (aplastic anemia - hemorrhagic syndrome).

Bệnh thiếu máu truyền nhiễm gây thiệt hại kinh tế, giảm lợi nhuận khoảng

18,5% do giảm tăng trọng, tăng tỷ lệ chết của gà từ 3- 15 tuần tuổi (Mcilroy &

cs., 1992). Tuy nhiên, đối với ngành sản xuất trứng gà sạch, bệnh thường gây ra

những khó khăn và ảnh hưởng lớn nhất bởi Ủy ban châu Âu yêu cầu trứng dùng

để sản xuất vacxin dùng cho gà dưới 7 ngày tuổi không được tạp CIAV. Ngoài

ra, tại Úc, châu Âu và Mỹ, chỉ những trứng sạch CIAV mới được dùng để sản

xuất vacxin phòng bệnh quai bị và sởi cho người. Bên cạnh đó, chi phí bỏ ra để

đảm bảo và duy trì các biện pháp an toàn sinh học là không nhỏ bởi virus có sức đề kháng mạnh với các hóa chất sát trùng (Toro & cs., 2006). Đứng ở khía cạnh này, CIAV gián tiếp gây ra các thiệt hại về kinh tế do phải áp dụng các biện pháp an toàn sinh học nghiêm ngặt trong quá trình nuôi.

2.2.4. Loài vật mắc bệnh Gà là vật chủ chính của CIAV mặc dù gà tây và chim cút ở Nhật Bản có thể nhiễm CIAV (Schat & Van Santen, 2008). CIAV không chỉ được phát hiện ở

các đàn gà thịt mà ở cả các đàn gà SPF (Cardona & cs., 2000). Gà trống và mái đều mẫn cảm; gà giống thịt được cho rằng mẫn cảm hơn với bệnh. Gà ở các lứa

tuổi đều cảm nhiễm với CIAV nhưng giai đoạn sau 2 tuần tuổi sự mẫn cảm với

bệnh giảm nhanh do sự hoàn thiện của hệ miễn dịch (immuno competency) (Hu

& cs., 1993b), trong đó gà 1 ngày tuổi mẫn cảm nhất (Rosenberger & Cloud, 1989). Từ 2012 trở lại đây, bằng phương pháp PCR, tại Trung Quốc đã phát hiện

được CIAV từ phân của người (Zhang & cs., 2012), chuột, chó hoang (Fang &

cs., 2017) và mèo (Niu & cs., 2019). Mặc dù vậy, các loài này chưa được chứng

minh là vật chủ của CIAV (Fang & cs., 2017).

2.2.5. Phương thức truyền lây

Có 2 phương thức làm lây truyền CIAV, truyền dọc và truyền ngang.

Phương thức lây truyền ngang hay dọc đều dẫn đến sự lây lan của CIAV trong

các đàn gà (Yuasa, 1983; Mcnulty, 1991). Một lượng lớn CIAV được bài thải

qua phân từ các gà nhiễm bệnh (Imai & cs., 1999). Vì vậy, phân gà được xem là

một nguồn lây nhiễm quan trọng. Theo nghiên cứu trên, lây truyền ngang thông

qua tiếp xúc trực tiếp/ gián tiếp với virus qua đường miệng. Cách lây nhiễm này

chủ yếu xảy ra ở gà không có kháng thể mẹ truyền trong giai đoạn từ 2- 4 tuần

tuổi. Chuyển dương tính huyết thanh học xảy ra ở giai đoạn 8- 12 tuần tuổi và sự

lây nhiễm ngang gây bệnh phần lớn ở thể cận lâm sàng (Mcnulty & cs., 1988).

CIAV có thể lây lan theo đường truyền dọc và truyền ngang nhưng

phương thức truyền dọc là quan trọng nhất, virus được truyền từ bố mẹ qua trứng

(Dhama & cs., 2002). Sự lây nhiễm qua trứng đã được Yuasa và cộng sự khẳng

định (Yuasa & Yoshida, 1983) và từ đó việc ngăn chặn bệnh xảy ra trong môi

trường chăn nuôi gà trở nên khó khăn. CIAV từ các đàn gà giống âm tính khi

kiểm tra kháng thể do có sự lây nhiễm ngang hoặc qua tinh dịch con trống có thể

lây nhiễm bệnh cho đời con (Yuasa & cs., 1987; Hoop, 1993). Trong tự nhiên, sự

lây truyền dọc thường xuất hiện ở giai đoạn 3- 9 tuần tuổi sau khi gà tiếp xúc với

CIAV, thậm chí xảy ra sớm hơn ở giai đoạn gà từ 1- 3 tuần tuổi và đáp ứng miễn dịch phát triển ở các gà giống lây nhiễm có thể bảo vệ đàn con khỏi sự lây nhiễm dọc (Schat & Van Santen, 2008). Ngoài ra, các yếu tố gây stress trong quá trình sản xuất và vận chuyển có thể làm tăng sự lây nhiễm CIAV hoặc kéo dài thời

gian nhiễm CIAV bởi sự thay đổi nội tiết tố dẫn đến sự lây truyền dọc và chuyển dương tính huyết thanh học khi gà ở giai đoạn gần thành thục về tính biệt (Cardona & cs., 2000).

2.2.6. Cơ chế sinh bệnh

CIAV tấn công và phá hủy các tế bào tạo máu tiền thân (hemocytoblast),

làm cạn kiệt các tế bào tiền lympho ở tuyến ức với biểu hiện teo tuyến ức, từ đó

xuất huyết ở các mô dưới da, trong cơ và gây suy giảm miễn dịch (Adair, 2000;

Todd, 2000; Dhama & cs., 2002; Miller & Schat, 2004; Van Santen & cs., 2004).

Đích tấn công chủ yếu của CIAV vào tế bào lympho tiền thân của tuyến ức

(CD4+/CD8+, T-cells) và tiền tế bào máu, sau đó chúng tái tạo chủ yếu trong các

tiền tế bào máu ở tủy xương và tế bào tuyến ức tiền thân ở vùng vỏ của tuyến ức,

nơi diễn ra sự nhiễm trùng gây teo và gây chết tế bào bởi cơ chế apoptosis (cơ

chế chết tự nhiên) (Jeurissen & cs., 1992; Smyth & cs., 1993; Noteborn & Koch,

1995). Sự tạo máu, tạo tủy và sản xuất tế bào lympho bị ảnh hưởng nghiêm trọng

dẫn đến biểu hiện lâm sàng của sự thiếu máu do giảm hồng cầu, tiểu cầu và bạch

cầu; ngoài ra, các tế bào lympho nhiễm virus còn bị phá hủy bởi cơ chế

apoptosis, kích hoạt bởi protein VP3 (Dhama, 2002).

Cho đến nay, các nghiên cứu về khả năng gây bệnh của CIAV cho thấy

khả năng gây thiếu máu của CIAV phụ thuộc trực tiếp vào liều virus nhiễm, tuổi

gia cầm nhiễm và sự kế phát của các yếu tố gây bệnh khác (Yuasa & cs., 1988;

Dhama, 2002). Ngoài ra, các tác nhân gây ức chế miễn dịch có tác dụng hiệp

đồng với CIAV làm bệnh tiến triển ở thể nặng. Bằng thực nghiệm, người ta đã

chứng minh rằng IBDV ức chế và làm giảm cường độ sự sản sinh kháng thể trung hòa chống lại CIAV, dẫn tới lượng CIAV huyết cao, trong khoảng 102,5 đến 105,5 TCID50/0,1 ml (Imai & cs., 1999). Nhiễm ghép IBDV còn kéo dài độ tuổi

mẫn cảm của gà đối với CIAV (Rosenberger & Cloud, 1989).

2.2.7. Triệu chứng bệnh thiếu máu truyền nhiễm

Triệu chứng lâm sàng của bệnh thiếu máu truyền nhiễm phụ thuộc vào

nhiều yếu tố như: lứa tuổi, tình trạng miễn dịch; liều lượng và đường xâm nhập

của virus. Hình 2.5 trình bày tóm tắt mối tương quan giữa biểu hiện bệnh, lứa

tuổi và tình trạng miễn dịch. Gà ở mọi lứa tuổi đều mẫn cảm với CIAV (virus

gây ra tình trạng nhiễm trùng) (Kaffashi & cs., 2006), tuy nhiên, gà càng lớn khả

năng mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm càng giảm (age resistance) (Mcnulty,

1991). Gà trên 3 tuần tuổi sau khi nhiễm CIAV thường sản sinh đáp ứng miễn

dịch có khả năng bảo hộ, ngăn cản tiến triển thành thể bệnh lâm sàng. Mặc dù

vậy, đặc tính đề kháng theo lứa tuổi có thể bị phá vỡ nếu trong giai đoạn này gà

bị nhiễm các virus gây ức chế miễn dịch (ví dụ như IBDV) làm cho khả năng sản

sinh đáp ứng miễn dịch chống lại CIAV bị giảm sút, dẫn tới tiến triển bệnh ở thể

lâm sàng (vùng E, hình 2.5) (Mcnulty, 1991; Hu & cs., 1993a). Gà dưới 3 tuần

tuổi nhiễm CIAV thường mắc bệnh rất điển hình (Yuasa & cs., 1979; Goodwin

& cs., 1989; Buscaglia & cs., 1994). Trường hợp có kháng thể thụ động ở

ngưỡng bảo hộ, hiệu giá kháng thể trung hòa ≥ 40 (vùng A, hình 2.5), gà con dù

ở lứa tuổi mẫn cảm vẫn không mắc bệnh ở thể lâm sàng (Otaki & cs., 1992).

Hình 2.5. Tương quan giữa biểu hiện bệnh, lứa tuổi và tình trạng miễn dịch trong bệnh thiếu máu truyền nhiễm

Biểu hiện bệnh thiếu máu truyền nhiễm được trình bày ở phần dưới đây.

Khi bệnh xảy ra ở thể cấp tính, thời gian ủ bệnh từ 1- 14 ngày. Ngoài các triệu

chứng không điển hình (ủ rũ, xù lông, giảm ăn), gà bệnh có biểu hiện thiếu máu

như mào yếm nhợt nhạt (Yuasa & cs., 1979; Adair, 2000). Tỷ lệ chết thường từ

5- 10% (trong 2- 4 tuần sau khi nhiễm) nhưng có thể lên tới 60% trong trường

hợp kế phát bệnh khác (Bulow, 1991; Dhama, 2002; Dhama & cs., 2002; Dhama

& cs., 2004; Balamurugan & Kataria, 2006). Nếu sống sót qua giai đoạn này, các

gà sẽ dần hồi phục sau 4- 5 tuần nhiễm bệnh. Thông thường, các triệu chứng sẽ

biểu hiện nặng nề khi có sự kế phát các mầm bệnh khác, đặc biệt là virus gây suy

giảm miễn dịch (Adair, 2000). Điển hình là các trường hợp nhiễm kế phát với

MDV (Miles & cs., 1999), với IBDV (Imai & cs., 1999), FAV (Toro & cs.,

2001), reovirus (Mcneilly & cs., 1995) và NDV (De Boer & cs., 1994).

Hình 2.6. Triệu chứng của gà mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm

Nguồn: Gowthaman (2019)

Chỉ tiêu phi lâm sàng của tình trạng thiếu máu là tỷ khối huyết cầu giảm,

dao động từ 6 - 27% (Balamurugan & Kataria, 2006). Ở gà khỏe mạnh, tỷ khối

huyết cầu thường lớn hơn 27% mặc dù chỉ số này cũng thay đổi tùy theo từng

giống gà. Ví dụ gà giống trứng có chỉ số PCV thấp hơn gà giống thịt; gà càng lớn

thì chỉ số này càng giảm. Khi gà bị bệnh thiếu máu truyền nhiễm, máu gà có thể

bị đặc hoặc loãng hơn, thời gian đông máu tăng, tương bào nhạt hơn bình

thường. Chỉ số hematocrit xuống dưới 27% sau khi gây nhiễm 8 - 10 ngày, dao

động từ 10 - 20% ở ngày 14 - 20 và thậm chí có thể xuống dưới 6% ở những gà

gần chết. Ở những gà hồi phục, sau 6 - 21 ngày chỉ số PCV bắt đầu tăng trở lại,

về mức bình thường (29 - 35%) sau khi nhiễm 28 - 35 ngày (Dhama & cs., 2008)

(hình 2.7).

Hình 2.7. Biến động tỷ khối huyết cầu ở gà mắc bệnh

Nguồn: Wani & cs. (2014)

Bằng gây bệnh thực nghiệm, tỷ khối huyết cầu của nhóm gây nhiễm (đường nét đứt, hình 2.7) giảm so với nhóm đối chứng. Sự giảm này rõ nhất sau gây nhiễm 14 ngày với tỷ khối huyết cầu trung bình ở nhóm gây nhiễm là 18,22 ± 2,22 trong khi đó của nhóm đối chứng là 34,12 ± 4,72 (Wani & cs., 2014). Nguyên nhân dẫn đến chỉ số hematocrit giảm là do hiện tượng giảm tế bào máu, bao gồm giảm số lượng hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu - hậu quả khi các tiền tế bào máu bị dung giải rất sớm (3 - 4 ngày sau khi gây nhiễm). Khi gà qua khỏi, công thức máu sẽ trở lại bình thường sau 40 ngày.

2.2.8. Bệnh tích bệnh thiếu máu truyền nhiễm

Teo cơ quan lympho nói chung, đặc biệt là tuyến ức và biểu hiện tủy xương nhạt màu (hình 2.8) được xem là bệnh tích đại thể đặc trưng nhất (Yuasa & cs.,

1979; Mcnulty, 1991; Pope, 1991; Smyth & cs., 1993; Dhama & cs., 2002). Ngoài ra, có một số biến đổi khác như: xuất huyết, tụ máu ở tổ chức liên kết dưới

da; gan sưng, nhạt màu hoặc vàng nhạt (Yuasa & cs., 1979; Dhama, 2002).

Hình 2.8. Bệnh tích đại thể ở gà mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm

Nguồn: Yuasa & cs. (1979)

Có một vấn đề cần chú ý là: khi gà nhiễm CIAV gây ra tình trạng suy giảm miễn dịch nghiêm trọng và gà dễ mẫn cảm với các mầm bệnh là virus như MDV (Miles & cs., 1999); IBDV (Imai & cs., 1999); FadV4 (Toro & cs., 2001); reovirus (Mcneilly & cs., 1995) và NDV (De Boer & cs., 1994) dẫn tới những ảnh hưởng hiệp đồng của các yếu tố (Pope, 1991). Chính vì vậy, bệnh tích ở gà mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm khi bị nhiễm ghép có sự thay đổi, khác với trường hợp nhiễm đơn.

2.2.9. Chẩn đoán bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà 2.2.9.1. Chẩn đoán lâm sàng

Chẩn đoán lâm sàng CIA có thể dựa vào lịch sử đàn giống, tình trạng hoặc

dấu hiệu lâm sàng, kết luận về huyết học và bệnh lý mổ khám (Goodwin & cs.,

1992a). Chẩn đoán lâm sàng dựa vào các dấu hiệu điển hình ở gà bệnh trong giai

đoạn mẫn cảm và các bệnh tích phản ánh hiện tượng thiếu máu, ví dụ như: mào,

tích nhợt nhạt, gan sưng và nhạt màu, thận nhạt màu, tủy xương nhạt màu và mô

lympho tập trung bị teo (túi Fabricius, tuyến ức).

2.2.9.2. Chẩn đoán phi lâm sàng

- Phương pháp phân lập virus:

CIAV có khả năng nhân lên và được phân lập ở gà SPF mẫn cảm, trong

phôi gà và trong nuôi cấy tế bào (Yuasa & cs., 1979; Mcnulty, 1991; Dhama &

cs., 2002; Balamurugan & Kataria, 2006); trong khi đó thời điểm 12 - 16 ngày

sau khi gây nhiễm CIAV cho gà lớn thấy có biểu hiện bệnh tích. Trong phôi gà,

CIAV nhân lên ở túi lòng đỏ nhưng hiệu giá virus không đủ cao để gây chết phôi

hoặc gây ra các tổn thương điển hình của bệnh. Tuy nhiên, gà con mới nở mang

các dấu hiệu của bệnh. CIAV không nhân lên được trong các môi trường nuôi

cấy tế bào thông thường nhưng phát triển được trong một số dòng tế bào lympho

hình thành trong bệnh Marek’s (Marek’s disease virus- MDV) và bệnh gây khối

u lympho (Yuasa, 1983; Renshaw & cs., 1996). Cho đến nay, dòng tế bào được

sử dụng phổ biến cho việc phân lập CIAV là dòng tế bào MDCC-MSB1 lấy từ

khối u lympho ở lách của gà bị bệnh Marek’s. Các chủng virus có thể gây nhiễm

khác nhau cho các dòng tế bào phụ như MDCC-CU147, khi đó dòng tế bào T

(lấy từ tổn thương cục bộ của MD) được báo cáo nhạy cảm nhất để phân lập

virus, có thể sản xuất ra một lượng virus gấp từ 10- 100 lần so với dòng MSB1.

- Kỹ thuật PCR:

PCR được ứng dụng từ rất sớm để phát hiện CIAV, mồi đặc hiệu được

thiết kế phát hiện trình tự gen bảo thủ mã hóa protein VP2 (Noteborn & cs., 1992b). Ở những vùng đã sử dụng vacxin nhược độc phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm, việc sử dụng cặp mồi kể trên không cho phép phân biệt giữa chủng virus vacxin và chủng virus gây bệnh. Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng cặp mồi

nhân lên toàn bộ gen mã hóa protein VP1 của virus, sau đó cắt bằng enzyme cắt

giới hạn (Van Santen & cs., 2001; Natesan & cs., 2006; Mohamed, 2010; Nayabian & Mardani, 2013). Ví dụ cụ thể trình bày ở hình 2.9.

Tác giả Mohamed đã dùng cặp mồi đặc hiệu nhân lên toàn bộ gen mã hóa protein VP1 (VP1-1: 5’-ATGGCAAGACGAACTCGCAGACCGAGAGGC-3’,

VP1-R: 5’-TCAGGGCTGCGTCCCCCAGTACATGGTGCT-3’). Tinh sạch sản

phẩm PCR và cắt bởi enzyme MboI (Mohamed, 2010). Hình 2.9 cho thấy, sản

phẩm cắt là khác nhau giữa các chủng thực địa (3- 5 sản phẩm cắt) với chủng virus vacxin (6 sản phẩm). Đáng chú ý, các đoạn sản phẩm cắt cũng khác nhau

giữa các chủng thực địa và cho phép phân biệt các chủng CIAV giữa các mẫu xét

nghiệm. Hiện có nhiều loại enzyme được dùng trong phản ứng RFLP-PCR để

phân biệt các chủng, ví dụ như: BamHI, BgM, SstI và XbaI (Noteborn & cs.,

1992b), HinfI (Nayabian & Mardani, 2013). Để tăng khả năng phân biệt, có thể

kết hợp một số enzym cắt giới hạn để phân biệt các chủng CIAV, ví dụ như: HhaI, DdeI và HaeIII (Natesan & cs., 2006).

Ghi chú: giếng 1: chủng virus Cux-1 từ vacxin Thymovac; giếng 2-5: các chủng CIAV thực địa

Hình 2.9. Kết quả RFLP-PCR phân biệt các chủng CIAV

Nguồn: Mohamed (2010)

Ý nghĩa của RFLP-PCR không chỉ dừng lại ở khả năng phân biệt giữa các chủng, mà còn có thể cho phép phát hiện đồng nhiễm nhiều chủng CIAV khác

nhau ở cùng một trang trại. Ở cấp độ cá thể, việc phát hiện đồng nhiễm CIAV

cần phải sử dụng đến công cụ giải trình tự gen (hình 2.10).

Ghi chú: mũi tên biểu thị các vị trí có 2 đỉnh tín hiệu (đa hình nucleotide)

Hình 2.10. Kết quả giải trình tự gen phát hiện đồng nhiễm các chủng CIAV

Nguồn: Ducatez & cs. (2006)

Việc phát hiện ra các đỉnh tín hiệu kép (mũi tên, hình 2.10) ở một vài vị trí nucleotide là minh chứng cho sự tồn tại các chủng CIAV mang các đột biến khác

nhau (đồng nhiễm). Hiện tượng đồng nhiễm CIAV thuộc hai cụm di truyền khác

nhau đã được phát hiện ở mẫu bệnh phẩm gà bệnh tại Trung Phi và Cameroon (Snoeck & cs., 2012).

Nói tóm lại, PCR được xem là kỹ thuật có độ nhạy và độ chính xác cao,

phù hợp cho sự phát hiện ADN của CIAV trong các mẫu bệnh phẩm (Miller &

cs., 2003). PCR với độ nhạy và chính xác cao giúp phát hiện CIAV ngay cả trong

các ca bệnh biểu hiện ở thể cận lâm sàng (Balamurugan & Kataria, 2006; Simionatto & cs., 2006). Sử dụng kỹ thuật PCR cạnh tranh; hoặc realtime PCR

có thể định lượng virus (Dhama & cs., 2002; Markowski-Grimsrud & cs., 2002;

Caterina & cs., 2004; Van Santen & cs., 2004). Ngày nay, giải trình tự gen là một

công cụ cho chẩn đoán và nghiên cứu dịch tễ học phân tử của CIAV (Todd & cs.,

1990; Dhama & cs., 2002; Dhama & cs., 2004; Natesan & cs., 2006; Simionatto

& cs., 2006).

- Phương pháp phát hiện gián tiếp

Đối với việc phát hiện huyết thanh: ELISA, VNT và IFA là những kỹ

thuật được sử dụng phổ biến nhất (Dhama & cs., 2002; Tannock & cs., 2003) bởi

kháng thể kháng CIAV là dấu hiệu tồn tại trước đó của CIAV, trong đó phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp và các test ELISA có thể được áp dụng để phát hiện kháng thể kháng CIAV (Rosenberger & Cloud, 1989). Hiện nay, các kit ELISA được sử dụng phổ biến để sàng lọc các đàn giống nghi nhiễm virus trước khi vào giai đoạn đẻ trứng (Miller & Schat, 2004). Kỹ thuật ngưng kết gián tiếp

bằng hạt nhựa (blocking latex agglutination test) cũng đã được phát triển và cho

kết quả tương đồng 93,6% so với phản ứng trung hòa (Trinh & cs., 2015b).

2.2.9.3. Chẩn đoán phân biệt

Cần tiến hành các chẩn đoán phân biệt với các bệnh Marek’s, Gumboro,

bệnh do FAdV4 gây ra, bệnh do các độc tố nấm mốc (mycotoxin), v.v... (Dhama,

2002). Do đặc điểm giống nhau về lứa tuổi và bệnh tích ở cơ quan có thẩm quyền

miễn dịch, cần chẩn đoán phân biệt giữa bệnh Gumboro và bệnh thiếu máu

truyền nhiễm. Cụ thể: gà dưới 13 tuần tuổi khi mắc Gumboro và bệnh thiếu máu

truyền nhiễm đều có biểu hiện ủ rũ khá giống nhau (Wang & cs., 2011;

Gowthaman, 2019). Tuy nhiên, bệnh thiếu máu truyền nhiễm thường có các biểu

hiện bên ngoài như xuất huyết ở da cánh. Bệnh tích mổ khám có nhiều điểm

chung, ví dụ như hiện tượng teo túi Fabricius. Tuy nhiên, bệnh tích sưng và xuất

huyết túi Fabricius chỉ gặp ở bệnh Gumboro (Wang & cs., 2011) mà không có ở bệnh thiếu máu truyền nhiễm (Bahmaninejad & cs., 2012). Một số bệnh tích điển

hình chỉ gặp trong bệnh thiếu máu truyền nhiễm, ví dụ như tủy xương nhạt màu.

2.2.10. Biện pháp phòng bệnh

* Vệ sinh phòng bệnh: công tác chăm sóc, quản lý tốt đàn giống và vệ sinh

phòng bệnh, tăng cường biện pháp đảm bảo an toàn sinh học là những biện pháp

tổng hợp giúp ngăn chặn bệnh xảy ra (Engstrom, 1999).

* Phòng bệnh bằng vacxin: biện pháp kiểm soát trực tiếp nhất và hạn chế

được sự lây truyền dọc của bệnh là sử dụng vacxin cho đàn bố mẹ trước khi vào

giai đoạn khai thác trứng khoảng vài tuần. Vacxin được sử dụng vào thời điểm

13 - 15 tuần tuổi, không được muộn quá 3 tuần trước khi gà bắt đầu đẻ bói để tạo

đáp ứng miễn dịch ở ngưỡng cao (hiệu giá trung hòa > 8 log2) giúp ngăn chặn sự

truyền virus qua trứng (Vielitz & cs., 1987; Mcnulty, 1991). Vacxin nhược độc

được sử dụng bằng cách cho uống, vacxin vô hoạt được sử dụng theo đường

tiêm. Tại Việt Nam hiện đang lưu hành vacxin phòng bệnh cho đàn gà gồm:

- Nobilis CAV P4 của hãng Intervet (Hà Lan): vacxin nhược độc đông khô,

mỗi liều có ít nhất 2,3 log10 TCID50 virus vacxin CIAV được nuôi cấy trên phôi

gà. Vacxin dùng để tiêm cho gà khỏe mạnh từ 6 tuần trở lên. Gà đẻ được phòng ít

nhất 6 tuần trước khi bắt đầu đẻ. Nên tiêm vacxin cho tất cả những con gà dễ mắc bệnh trong trang trại cùng một lúc. Trong mọi trường hợp, không được dùng vacxin cho gà nhỏ hơn 6 tuần tuổi. Virus vacxin mặc dù không có khả năng gây bệnh thể lâm sàng, vẫn có thể tồn tại lâu dài trong tuyến ức, lách và tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể ở mức thấp (Vaziry & cs., 2011).

- AviPro Thymovac (Lohmann Animal Health GmbH): vacxin nhược độc đông khô chủng Cux-1 phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm gà. Vacxin được

dùng bằng cách pha nước uống cho gà từ 12 - 14 tuần tuổi nhưng không được

muộn hơn 6 tuần trước khi đẻ (nếu dùng trong giai đoạn 6 tuần trước khi đẻ virus

có thể truyền qua trứng).

2.3. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA CIAV

2.3.1. Mối quan hệ di truyền giữa các chủng CIAV

Bộ gen của CIAV có tính bảo thủ tương đối cao (Schat, 2009) nên sự khác biệt giữa các chủng virus là thấp. Gen mã hóa protein VP1 có vùng mang nhiều biến đổi (amino acid 139 - 151) (Renshaw & cs., 1996).

Bảng 2.1. Đối chiếu cách phân loại nhóm di truyền của CIAV

Geno-

Nhóm

Nhánh

Cụm

GenBank

group

(Group)

(Lineage)

(Cluster)

EF683159

Group C

Lineage 1

Cluster-II

AF227982

Group C

Lineage 1

Cluster-II

AB119448

Group D

Lineage 7

Cluster-III

AF285882

Group D

Lineage 7

Cluster-III

AB027470

Group D

Lineage 7

Cluster-III

AF311900

Group D

Lineage 7

AY040632

III

Group A

Lineage 3

Cluster-I

AF311892

III

Group A

Lineage 4

Cluster-I

AF313470

III

Group A

Lineage 4

Cluster-I

M55918

III

Group A

Lineage 5

Cluster-I

U66304

III

Group A

Lineage 5

Cluster-I

AF395114

III

Group A

Lineage 6

Cluster-I

AB046590 AY846844

III III

Group A Group A

Lineage 8 Lineage 8

Cluster-I Cluster-I

Group A

Cluster-I Cluster-I

AF527037 JF507715 AF390102 AB031296

III III III III

Group A Group A

Lineage 8 Lineage 3 Lineage 3

D31965

III

Group B

Cluster-I

AY999018

Lineage 7

Cluster-I

Do đó, từ trước đến nay, trình tự gen mã hóa capsid protein của CIAV thường được dùng để nghiên cứu mối liên hệ di truyền giữa các chủng virus (Islam & cs., 2002; Ducatez & cs., 2006; Eltahir & cs., 2011; Olszewska-Tomczyk & cs., 2016; Ou & cs., 2018). Từ 2002 cho đến nay có nhiều hơn 30 công bố về mối liên hệ di truyền giữa các chủng CIAV (Chowdhury & cs., 2002; Ducatez & cs., 2006; Hailemariam & cs., 2008; Eltahir & cs., 2011; Snoeck & cs., 2012; Kye & cs., 2013; Wanasawaeng & cs., 2013; Olszewska-Tomczyk & cs., 2016; Li & cs., 2017a; Ou & cs., 2018; Van Dong & cs., 2019). Tuy nhiên, do phân tích với số lượng trình tự gen khác nhau, tiêu chí phân loại không thống nhất đã dẫn tới tồn tại đồng thời nhiều phân loại nhóm di truyền của CIAV (bảng 2.1).

Nhìn chung, cách phân loại CIAV thành 3 genogroup (I, II, III) được nhiều nhà khoa học trên thế giới sử dụng (Ducatez & cs., 2006; Olszewska- Tomczyk & cs., 2016; Ou & cs., 2018), minh họa ở hình 2.13.

Ghi chú: cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide và trình tự amino acid được mã hóa của gen ORF1 được biểu diễn cạnh nhau. Đường nét đứt nối vị trí các chủng ở hai cây phát sinh chủng loại

Hình 2.11. Cây phát sinh chủng loại CIAV

Nguồn: Ducatez & cs. (2006)

Kết quả trên cho thấy, genogroup II và III của CIAV chiếm đa số, trong khi đó genogroup I chỉ có 2 trình tự gen thu thập được ở Australia. Đáng chú ý, có sự thay đổi về phân nhóm giữa cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide và trình tự amino acid (đường nét đứt, hình 2.13). Đặc điểm phân nhánh khác nhau kể trên có thể gặp ở nhiều công bố khác (Olszewska-Tomczyk & cs., 2016; Ou & cs., 2018; Van Dong & cs., 2019). Bên cạnh hệ thống phân loại kể trên, gần đây có một số nghiên cứu đề xuất thêm 2 genogroup IV và V của CIAV (Ou & cs., 2018; Van Dong & cs., 2019). Do không đưa ra tiêu chí phân loại rõ ràng, chủ yếu dựa vào đặc điểm phân nhánh của cây phát sinh chủng loại, nên cách phân chia CIAV thành 5 genogroup cần được kiểm chứng.

2.3.2. Sự lưu hành CIAV theo nhóm di truyền ở một số quốc gia

Ở khu vực châu Á, với tổng số 25 chủng CIAV có genome hoàn chỉnh thu thập từ các trang trại khác nhau tại Trung Quốc, nghiên cứu (Eltahir & cs., 2011) đã phân tích và xây dựng cây phát sinh loài của CIAV. Theo đó, cùng với sự so sánh với các chủng CIAV trên thế giới có trong GenBank, nghiên cứu đã chứng minh có 4 nhóm di truyền (A- D) với giá trị boostrap cao. Gần đây tại Trung Quốc (Li & cs., 2017b) đã phát hiện sự tái tổ hợp trong cấu trúc gen của chủng CIAV-F10, với khả năng cao đã xảy ra sự tái tổ hợp gen giữa 2 trình tự có mã số GenBank là JQ690762 và KJ728816. Một số tác giả còn phân chia CIAV lưu hành ở Trung Quốc thành các đơn vị dưới nhóm (subgroup) bao gồm: subgroup A1- A3, D1- D4 và E1- E3 (Eltahir & cs., 2011; Zhang & cs., 2013).

Phân tích phát chủng loại dựa vào gen mã hóa cho việc tổng hợp VP1, nghiên cứu tại Hàn Quốc (Kim & cs., 2010) chỉ ra các chủng CIAV lưu hành thuộc nhóm di truyền genogroup II, IIIa và IIIb. CIAV lưu hành trong các đàn gà giống dù được phòng vacxin hay không đều có sự tương đồng với các chủng virus vacxin được sử dụng (Kim & cs., 2010).

Tại Thái Lan, khi phân tích cây phát sinh loài từ cơ sở dữ liệu gồm 13 trình tự nucleotide của Thái Lan và trình tự CIAV trên thế giới, đã xác định có 3 cụm di truyền (cluster I, cluster II, cluster III) với giá trị bootstrap cao, lần lượt là 91%, 100% và 96%. Trong đó, các chủng CIAV của Thái Lan thuộc về cluster I và cluster III; đồng thời gần gũi với CIAV lưu hành ở Trung Quốc và Nhật Bản (Wanasawaeng & cs., 2013).

Nghiên cứu tại Ấn Độ (Gowthaman & cs., 2014) khi xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng chương trình MEGA 5 với 29 chủng CIAV có sẵn trong

GenBank đã chỉ ra các chủng thực địa thuộc nhánh với các chủng virus từ Trung Quốc, Brazil, Mỹ, Malaysia, Bangladesh và Australia. Ở một báo cáo khác, 11

chủng CIAV thu thập ở tỉnh Nagpur (Ấn Độ) từ 2012 - 2015 được xếp vào nhóm

di truyền group A (Ganar & cs., 2017).

Ở châu Âu, một số kết quả về nguồn gốc phát sinh loài của CIAV đã được

công bố. Tại Slovenia, CIAV phân lập từ 2000 - 2003 nằm cùng nhánh và có

mức mức tương đồng gen cao với các chủng virus của Bangladesh, Nhật Bản và Mỹ (Krapez & cs., 2006). Ở Ba Lan, đã xác định được cụ thể hơn sự lưu hành

của 2 genogroup II và III của CIAV. Hơn nữa, các chủng virus thực địa này khác

biệt rõ với chủng virus vacxin (Olszewska-Tomczyk & cs., 2016)

Ở châu Phi, nhiều nhóm di truyền của CIAV (group A - D; genogroup II,

III) đã được phát hiện ở một số quốc gia, ví dụ như: Nam Phi, Ai Cập, Trung Phi,

Cameroon, Nigeria, v.v... (Oluwayelu, 2010; Snoeck & cs., 2012; Erfan & cs.,

2018). Ở Trung Phi và Cameroon, có 9 cụm di truyền khác biệt (phylogenetic

cluster) được xác định CIAV (Snoeck & cs., 2012). Đáng chú ý, các cụm di

truyền này (CAF1 - CAF4, CMR1 - CMR5) không bao gồm các chủng virus lưu

hành ở các nước khác trên thế giới (Snoeck & cs., 2012).

Từ các tổng hợp về sự có mặt và nguồn gốc phát sinh chủng loại của CIAV

ở các nước trên thế giới, có thể nhận xét rằng: có sự lưu hành của nhiều nhóm di

truyền của CIAV phạm vi quốc gia và trên phạm vi châu lục.

2.3.3. Khác biệt di truyền của CIAV

Các kết quả nghiên cứu trên thế giới cho thấy: ít có sự khác biệt trình tự

gen của CIAV phân lập từ các vùng địa lý khác nhau (Ducatez & cs., 2006;

Ducatez & cs., 2008; Hailemariam & cs., 2008). Mức tương đồng trình tự

nucleotide giữa các chủng phân lập ở mỗi nước mặc dù có khác nhau, nhưng

thường ở mức tương đồng cao, ví dụ như 93% (CIAV phân lập tại Alabama, Mỹ)

(Van Santen & cs., 2001) hoặc 94,7% - 99,8% (CIAV phân lập tại Ba Lan) (Olszewska-Tomczyk & cs., 2016). Nhìn chung, sự sai khác di truyền giữa các chuỗi nucleotide của CIAV thường dưới 5% và là khoảng cách lớn nhất được tìm thấy giữa các chủng CIAV trên thế giới (Ducatez & cs., 2006; Eltahir & cs., 2011; Zhang & cs., 2013). Bảng 2.2 trình bày kết quả so sánh mức tương đồng

giữa các chủng CIAV (Ducatez & cs., 2008).

Bảng 2.2. Khoảng cách di truyền của CIAV dựa vào gen ORF1

Số lượng

Sai khác ở cấp

Vùng địa lý

trình tự gen

độ nucleotide (%)

độ amino acid (%)

112

2,5

1,4

5 9

1,4 2,9

1,4 1,7

2,7

0,7

Thế giới Châu Âu1 Châu Mỹ2 Châu Phi3 Châu Á

0,5

0,2

Ghi chú: (1) gồm Đức và Slovenia; (2) giữa các trình tự của Mỹ; (3) giữa các trình tự của Nigeria

Phân tích ở cấp độ amino acid cho thấy VP2 và VP3 bảo thủ giữa các chủng; trong khi VP1 đa dạng hơn, với vùng nhiều biến đổi amino acid từ vị trí 139 đến 151 của VP1 (Renshaw & cs., 1996). Sự khác biệt giữa các genogroup I- III của CIAV còn thấp hơn, trong khoảng 1,4% - 3,4% (genogroup I - II); 1,2% - 2,5% (genogroup I - III) và 1,8% - 4,1% (genogroup II - III) (Ducatez & cs., 2006). Do tính tương đồng cao về trình tự amino acid của VP1, sự khác biệt ở một hoặc một vài vị trí cũng có giá trị trong phân biệt giữa các nhóm di truyền của CIAV (hình 2.14).

Hình 2.12. Đặc điểm biến đổi amino acid của VP1 protein

Nguồn: Ducatez & cs. (2008)

Dựa vào trình tự amino acid của capsid protein, CIAV được chia thành 2 nhóm: 75V97M139K144E/K/N (genogroup I, III) và 75I/T97L139Q144Q (genogroup II) (Ducatez & cs., 2008).

2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CIAV TẠI VIỆT NAM

Cho đến nay, có ít tài liệu về CIAV cũng như bệnh do virus gây ra tại Việt

Nam. Thông tin đầu tiên về CIAV ở Việt Nam là báo cáo sự có mặt của kháng

thể kháng CIAV trong huyết thanh gà được lấy mẫu năm 2013 (Trinh & cs.,

2015b). Nghiên cứu đã giải trình tự gen và kết quả thu được: 6 trình tự gen CIAV

thu được từ gà ở Việt Nam ở địa bàn lấy mẫu thuộc 2 genogroup là II và III.

Trong đó, 4 trình tự gen thuộc genogroup III có nguồn gốc ở 3 tỉnh (Hà Nam, Hà

Nội và Bắc Ninh) và 2 trình tự thuộc genogroup II chỉ tìm thấy ở tỉnh Vĩnh Phúc.

Kết quả đã gợi ý về sự lưu hành phổ biến của genogroup III ở một số đàn gà tại

miền Bắc Việt Nam. Ngoài ra trình tự amino acid của tất cả 6 chủng CIAV tại

Việt Nam có chứa Q394 được coi là dấu hiệu chỉ thị độc lực của các chủng

CIAV (Yamaguchi & cs., 2001).

Nghiên cứu thứ hai mới được công bố gần đây về CIAV dựa trên kết quả

phân tích các mẫu bệnh phẩm thu thập tại miền Bắc Việt Nam (Van Dong & cs.,

2019). Bằng phản ứng realtime-PCR, đã chứng minh sự lưu hành phổ biến của

CIAV, đặc biệt ở giai đoạn gà nhỏ (61,43% gà ở giai đoạn 2 - 3 tuần tuổi và

44,83% gà ở giai đoạn 4 - 11 tuần tuổi) (Van Dong & cs., 2019). Ngoài ra, kết

quả phân tích trình tự gen VP1 đã chỉ ra các chủng CIAV lưu hành thuộc về 3

genogroup là II, III và V; trong đó genogroup III phổ biến nhất trong số các

chủng lưu hành tại miền Bắc. Mặc dù phân tích trên mẫu lấy ở Việt Nam, hai

nghiên cứu kể trên được thực hiện hoàn toàn ở nước ngoài.

Với các thông tin tổng hợp ở trên, có thể thấy CIAV và bệnh do virus này

gây ra đã được nghiên cứu sâu và rộng ở trên thế giới. Trong khi đó, tại Việt

Nam, hiểu biết về bệnh do CIAV gây ra cũng như các nghiên cứu về CIAV còn

hạn chế. Đối với người chăn nuôi, thông tin về bệnh thiếu máu truyền nhiễm

cũng như vacxin phòng bệnh hầu hết chưa được biết đến.

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Mẫu của gà nghi mắc bệnh được thu thập tại 64 trang trại chăn nuôi gà

thuộc 10 tỉnh/thành phố miền Bắc: Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hà Nội, Bắc

Ninh, Hải Dương, Hà Nam, Nam Định, Hải Phòng và Quảng Ninh;

- Nghiên cứu được thực hiện tại bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa

Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đề tài nghiên cứu được triển khai từ tháng 11/2016 đến tháng 9/2019.

3.3. ĐỐI TƯỢNG/ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.3.1. Đối tượng nghiên cứu

(i) Đặc điểm dịch tễ học phân tử của CIAV lưu hành ở miền Bắc;

(ii) Bệnh do CIAV gây ra ở gà trong tự nhiên và trong điều kiện thí nghiệm.

3.3.2. Dụng cụ và thiết bị - Thiết bị:

+ Tủ lạnh thường (0 - 4oC), tủ lạnh -80oC

+ Máy ly tâm thường, máy ly tâm lạnh

+ Máy PCR (Master Cycler) của hãng Eppendorf

+ Bộ điện di kiểm tra sản phẩm PCR của hãng Cleaver Scientific

+ Máy soi gel safeVIEW-MINI2 (Cleaver Scientific)

+ Máy vortex

+ Buồng cấy vô trùng

+ Buồng thao tác PCR

+ Bể ổn nhiệt

+ Máy tính và các phần mềm sinh - tin học

- Dụng cụ: bộ micropipette gồm các cỡ 1l, 10l, 20l, 100l, 200l,

1000l và 5000l, các loại đầu typ, các loại ống Eppendorf, chai lọ đựng môi

trường, chai T25 nuôi tế bào. Bộ dụng cụ mổ khám chuyên dụng, hộp đựng đá,

găng tay, ống lấy mẫu.

3.3.3. Vật liệu nghiên cứu

+ Gà nghi ngờ mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở các đàn gà chưa được

tiêm vacxin phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm, thu thập ở 10 tỉnh/ thành phố

thuộc phạm vi nghiên cứu;

+ Mẫu bệnh phẩm: gộp phủ tạng của gà ốm (tuyến Harder, tuyến ức, túi

Fabricius, tủy xương, hạch lympho manh tràng; tim, gan, lách, thận);

+ Huyễn dịch virus dùng gây nhiễm (do bộ môn VSV - TN, khoa Thú y,

HVNNVN cung cấp): CIAV được phân lập từ gà mắc bệnh tự nhiên trên môi

trường tế bào MSB1, theo phương pháp được công bố trước đây (Yuasa, 1983).

Huyễn dịch bệnh phẩm 10% dùng phân lập virus là mẫu gộp phủ tạng (gan, lách,

thận, tuyến ức, tủy xương và túi Fabricius) đã được bất hoạt virus có vỏ bọc (nếu

có) bằng chloroform (tỷ lệ 1ml huyễn dịch và 50ml chloroform) ở nhiệt độ phòng

trong 10 phút. Huyễn dịch virus phân lập được khẳng định là CIAV bằng phản

ứng PCR (van Santen & cs, 2001) với cặp mồi đặc hiệu. CIAV phân lập được

kiểm tra âm tính với virus Newcastle, cúm gia cầm, Gumboro, IB, ILT (kết quả

không trình bày);

+ Gà thí nghiệm để gây nhiễm: trứng gà có phôi được lấy từ đàn gà âm

tính CIAV, chưa từng được tiêm vacxin phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm.

Trứng được ấp nở tại phòng thí nghiệm của bộ môn VSV - TN, khoa TY,

HVNNVN, gà con 1 ngày tuổi được kiểm tra âm tính CIAV bằng phản ứng semi-

nested PCR;

+ Hóa chất dùng tách chiết ADN tổng số: (i) dung dịch ly giải mẫu có

chứa 27% sucrose, 15 mM trisodium citrate, 0,15 M NaCl, 1 mM ethylene

diaminetetraacetic acid, 1% sodium dodecyl sulphate, 200 µg/ml proteinase K;

(ii) phenol-chloroform-isoamyl alcohol (PCI, 25:24:1); (iii) isopropyl; (iv) cồn

70%; (v) đệm TE (pH = 8);

+ Kít thương mại dùng để tách chiết ADN tổng số: the taco DNA/RNA

Extraction Kit (atc-d/rna, GeneReach Bio-technology Corp., Taiwan) và hệ thống

tách chiết tự động (taco Nucleic Acid Automated Extraction System);

+ Mồi đặc hiệu (bảng 3.1) dùng phát hiện và giải trình tự gen VP1/

genome của CIAV được tham khảo theo nghiên cứu trước đây (Van Santen &

cs., 2001; Li & cs., 2016).

Bảng 3.1. Trình tự mồi đặc hiệu dùng trong nghiên cứu

Trình tự (5’-3’)

Mục đích

Tên mồi CAVVP3F TTAAGATGGACGCTCTCCAAGAAGATACT

Phát hiện CIAV

Giải trình tự gen

CAV1 CAV2 F1 R1 F2 R2

GACTGTAAGATGGCAAGACGAGCTC GGCTGAAGGATCCCTCATTC GCATTCCGAGTGGTTACTATTCC CGTCTTGCCATCTTACAGTCTTAT CGAGTACAGGGTAAGCGAGCTAAA TGCTATTCATGCAGCGGACTT

F3 R3

ACGAGCAACAGTACCCTGCTAT CTGTACATGCTCCACTCGTT

+ Kít PCR: Maxime PCR PreMix i-Taq (iNtRON, Hàn Quốc), hoặc 2X

PCR Master mix Solution (iNtRON, Hàn Quốc).

+ Hóa chất dùng phân tích sản phẩm PCR gồm: agarose (Biosesang, Hàn Quốc); thuốc nhuộm ADN (RedSafe nucleic acid staining solution, 20.000x, iNtRON, Hàn Quốc); 100bp DNA ladder (iNtRON, Hàn Quốc).

+ Kít tinh sạch sản phẩm PCR: GeneJET gel extraction kit (Thermo Fisher

Scientific).

+ Các trình tự gen: (i) 58 trình tự được tạo ra trong nghiên cứu này (mã số MH536104- MH536106 và MF611928 - MF611982) và (ii) các trình tự gen của CIAV được công bố ở GenBank (phụ lục 1). Có 984 trình tự gen, của 30 quốc gia (châu Á, châu Âu, châu Mỹ, châu Phi và châu Úc) được thu thập từ năm 1974 - 2018 được dùng trong nghiên cứu này (phục lục 2).

3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.4.1. Nghiên cứu sự lưu hành của virus và bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà nuôi tại một số tỉnh/thành phố miền Bắc Việt Nam

- Xác định tỷ lệ dương tính CIAV ở đàn gà nuôi tại 10 tỉnh/ thành phố thuộc

miền Bắc Việt Nam: Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hà Nội, Bắc Ninh, Hải

Dương, Hà Nam, Nam Định, Hải Phòng và Quảng Ninh;

- Tìm hiểu đặc điểm sự lưu hành CIAV theo: vị trí địa lý, lứa tuổi, mục đích

sản xuất (hướng thịt, hướng trứng), quy mô chăn nuôi, phương thức chăn nuôi;

- Nghiên cứu triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh thiếu máu truyền

- Chứng minh chủng CIAV lưu hành là virus có độc lực thông qua gây bệnh

nhiễm ở gà mắc tự nhiên; thực nghiệm cho gà.

3.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm đặc điểm dịch tễ học phân tử của CIAV

- Đặc điểm di truyền của các chủng CIAV lưu hành ở đàn gà nuôi tại 10

tỉnh/ thành phố thuộc miền Bắc Việt Nam;

- Đặc điểm di truyền của gen mã hóa capsid protein của CIAV ở đàn gà

nuôi tại 10 tỉnh/ thành phố;

- Nghiên cứu nguồn gốc phát sinh chủng loại dựa vào trình tự bộ gen, gen

mã hóa protein VP1 của CIAV lưu hành tại miền Bắc;

- Nghiên cứu đặc điểm phát tán theo không gian và thời gian của CIAV lưu

hành tại miền Bắc.

3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1. Phương pháp lựa chọn cơ sở chăn nuôi để thu mẫu

Với mục đích khẳng định có sự lưu hành của virus gây bệnh Thiếu máu

truyền nhiễm ở gà, chúng tôi tiến hành lấy mẫu ngẫu nhiên tại 64 trại gà với quy

mô chăn nuôi (< 500 con, 500- 1000 con và > 1000 con), mục đích chăn nuôi khác

nhau, phân bố tại các vùng chăn nuôi gà tập trung thuộc 10 tỉnh miền bắc Việt

Nam, chưa từng sử dụng vacxin phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm để tiến hành

nghiên cứu. Để thu thập các thông tin cần thiết, chúng tôi sử dụng phương pháp

nghiên cứu hồi cứu và nghiên cứu cắt ngang. Khi mẫu bệnh phẩm được kiểm tra

cho kết quả dương tính với CIAV thì kết luận: đàn và trại gà đó có lưu hành CIAV.

3.5.2. Phương pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đặc trưng

- Bước 1: điều tra thông tin về đàn giống nuôi tại trang trại: nguồn gốc con

giống; chương trình vacxin được sử dụng cho đàn bố mẹ và đàn gà hiện được

nuôi; tình hình đàn gà trong thời gian nuôi;

- Bước 2: quan sát tình trạng đàn gà và các biểu hiện lâm sàng của những

gà ốm. Kết hợp thông tin thu được từ hộ chăn nuôi và các dấu hiệu lâm sàng đã biết về bệnh dựa trên các kết quả nghiên cứu trước đây, ghi chép và tổng hợp

trước khi quyết định mổ khám các gà nghi mắc CIA;

- Bước 3: mổ khám các gà nghi mắc. Dựa vào kết quả quan sát các triệu

chứng và bệnh tích cùng với thông tin về đàn gà (qua điều tra hồi cứu) để bước

đầu xác định bệnh. Phần lớn các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích điển hình

thường không dễ dàng phát hiện trong những trường gia cầm mắc bệnh tự nhiên,

ngoại trừ gà nhiễm bệnh dưới 3 tuần tuổi (Hoop & cs., 1992). Tiến hành ghi chép

biến đổi bệnh lý, chụp ảnh các ca mổ khám.

3.5.3. Phương pháp mổ khám và lấy mẫu

Mẫu bệnh phẩm được lấy từ gà ốm tại trang trại theo “Quy chuẩn kỹ thuật

quốc gia về bệnh động vật - yêu cầu chung lấy mẫu bệnh phẩm, bảo quản và vận

chuyển” (QCVN 01- 83: 2011/BNNPTNT).

Bệnh phẩm gồm tuyến Harder, tuyến ức, tủy xương, lách, túi Fabricius,

v.v... được tách riêng khỏi cơ thể để quan sát và chụp ảnh; sau đó được bảo quản

lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.

3.5.4. Phương pháp tách chiết ADN

ADN tổng số được tách chiết từ huyễn dịch bệnh phẩm 10% hoặc huyết

thanh theo quy trình được mô tả trước đây (Yang & cs., 2003). Các bước chính

được tóm tắt như sau:

(i) Ly giải mẫu: 250 µl huyễn dịch mẫu bệnh phẩm được trộn đều trong 500 µl dung dịch sucrose/proteinase K; ủ huyễn dịch bệnh phẩm ở 56oC/90 phút hoặc 37oC/12giờ;

(ii) Tách pha ADN: Bổ sung 200 µl dung dịch PCI vào ống mẫu sau khi ly

giải; vortex hỗn hợp; ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC;

(iii) Tủa ADN: thu 450 μl dịch nổi phía trên ở bước (ii), trộn đều với 450 µl

isopropyl. Tủa ADN ở -20oC/15 phút, ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút ở 4oC;

(iv) Rửa tủa ADN: Rửa bằng 1ml cồn 70% (pha trong nước cất đã xử lý DEPC). Ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút ở 4oC, loại bỏ hết cồn; hong khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút;

(v) Hòa tan tủa ADN: Tủa được hòa tan trong 30µl đệm TE (pH = 8,0).

3.5.5. Phương pháp PCR phát hiện CIAV

Nghiên cứu này sử dụng kít PCR thương mại (mục 3.3.3) với các thành

phần cơ bản của phản ứng (trừ sợi khuôn, mồi đặc hiệu) được trộn sẵn. Phối trộn thành phần phản ứng PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất, bao gồm: 17 µl

nước, 1 µl mỗi loại mồi (pha ở nồng độ 10 pmol/ µl), 1 µl ADN mẫu tách chiết.

Đối với thí nghiệm nghiên cứu sự lưu hành CIAV, phản ứng PCR phát hiện CIAV được thực hiện bằng cặp mồi CAVVP3F/ CAV2 (Van Santen & cs., 2001) với chu trình nhiệt như sau: tiền biến tính ở 94oC trong 5 phút; theo sau bởi 40 chu kỳ nhiệt bao gồm biến tính 94oC/ 20 giây, bắt mồi 58,5oC/ 30 giây, kéo dài 72oC/ 60 giây; giữ ở nhiệt độ 25oC cho tới khi dừng.

Đối với thí nghiệm chứng minh độc lực của virus, CIAV được phát hiện bằng phản ứng semi-nested PCR, sử dụng 3 mồi CAVVP3F/CAV1/CAV2. Chu trình nhiệt phản ứng PCR dùng 3 mồi: tiền biến tính ở 94oC trong 5 phút; theo sau bởi 40 chu kỳ nhiệt bao gồm biến tính 94oC/ 20 giây, bắt mồi 57oC/ 30 giây, kéo dài 72oC/ 60 giây; giữ ở nhiệt độ 25oC cho tới khi dừng.

Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di trong thạch agarose 2% có bổ sung

thuốc nhuộm ADN 1x (RedSafe Nucleic Acid Staining Solution, iNtRON). Vạch sản phẩm PCR được quan sát ở bước sóng ánh sáng 514nm.

3.5.6. Phương pháp chứng minh độc lực của CIAV 3.5.6.1. Bố trí thí nghiệm gây nhiễm CIAV

Tổng số có 20 gà 1 ngày tuổi âm tính CIAV, được chia thành 2 nhóm. Nhóm thí nghiệm: 10 gà, được tiêm 1 ml huyễn dịch CIAV (104,0 TCID50/ml) vào xoang phúc mạc, 7 ngày sau tiêm nhắc lại lần 2. Nhóm đối chứng: 10 gà

được tiêm 1 ml dung dịch PBS 1x vào xoang phúc mạc.

(Liều gây nhiễm được chọn dựa vào (i) liều nhiễm từ 104,0 TCID50/ml cho đến 2 x 104,5 TCID50/ml của một số nghiên cứu đã công bố (Kaffashi & cs., 2006; Wani & cs., 2015; Tongkamsai & cs., 2019) và (ii) kết quả gây nhiễm thử được

thực hiện một số lần trước đó của chúng tôi).

Gà của nhóm thí nghiệm và đối chứng được nuôi riêng biệt, cách ly hoàn toàn với nhau và được cho ăn - uống tự do trong thời gian nuôi thí nghiệm (8

tuần). Để chứng minh việc gây nhiễm CIAV thành công, lấy mẫu máu chắt huyết

thanh từ tuần 1 đến tuần 8 sau gây nhiễm, lấy mẫu 1 tuần/lần đối với tất cả các gà

thuộc nhóm thí nghiệm và đối chứng.

3.5.6.2. Theo dõi khả năng tăng trọng ở gà sau khi nhiễm CIAV

Dùng cân điện tử cân khối lượng từng cá thể vào buổi sáng trước khi cho

ăn. Thực hiện với tần suất 1 lần/ tuần và từ tuần 1 đến tuần 8. Tính khối lượng

trung bình và độ lệch chuẩn của mỗi nhóm tại từng thời điểm cân và dùng giá trị

này để so sánh giữa nhóm đối chứng và nhóm thí nghiệm.

3.5.6.3. Xác định tỷ khối huyết cầu ở gà sau khi nhiễm CIAV

Tỷ khối huyết cầu (%) của từng cá thể trong mỗi nhóm thí nghiệm và đối

chứng được xác định hàng tuần. Các bước thực hiện được tóm tắt như sau: lấy

máu tĩnh mạch cổ (gà < 2 tuần tuổi) hoặc tĩnh mạch cánh vào buổi sáng trước khi

cho ăn, mỗi con 0,5 ml. Máu được cho vào ống có chất chống đông EDTA. Hút

máu vào ống mao quản, bịt chặt 1 đầu ống bằng đất sét chuyên dụng. Mối tương

quan giữa lực ly tâm và thời gian ly tâm được xác định theo công thức: thời gian

ly tâm (phút) = 100000/ lực ly tâm (RCF). Ống mao quản được ly tâm ở tốc độ 10000 xg, trong vòng 10 phút ở 25oC. Sau khi ly tâm, máu sẽ tách được 2 phần:

phần trên lỏng là huyết tương, phần dưới đặc bao gồm tất cả các tế bào máu.

Dùng thước đo chuyên dụng (Janetzki) để xác định chiều cao của cột hồng cầu

(tỷ lệ phần trăm giữa thể tích khối hồng cầu và máu toàn phần).

3.5.7. Phương pháp giải trình tự gen và chú giải cấu trúc gen

Sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự theo hai chiều (xuôi và ngược) bằng phương pháp Sanger’s (thực hiện tại công ty 1st BASE, Malaysia), sử dụng

3 cặp mồi như được mô tả trước đây (Li & cs., 2016). Trình tự nucleotide tiếp tục được phân tích bằng chương trình tin sinh học BioEdit v7.1.3.0 (Hall, 1999) trên

cơ sở đối chiếu so sánh (i) giữa các trình tự nucleotide được giải trình tự theo

chiều xuôi, chiều ngược và (ii) với trình tự gen ORF1 và toàn bộ genome tham

chiếu công bố trên ngân hàng gen.

Bộ gen hoàn chỉnh của 3 chủng CIAV trong nghiên cứu này được chú giải

cấu trúc gen dựa vào thông tin đã biết trước của chủng CIAV tham chiếu

(GenBank M81223), sử dụng phần mềm GATU (Tcherepanov & cs., 2006).

3.5.8. Phương pháp phân tích đặc điểm di truyền

Mức tương đồng trình tự nucleotide của bộ gen CIAV được phân tích dựa

vào phần mềm SDT phiên bản 1.2 (Muhire & cs., 2014). Danh sách trình tự gen

dùng so sánh được trình bày ở phụ lục 1;

Đánh giá sự biến động mức tương đồng dọc theo chiều dài bộ gen của

CIAV được thực hiện bằng phân phần mềm SimPlot (Lole & cs., 1999) với các

tham số mặc định;

Ngoài ra, những thay đổi của gen VP1 được đánh giá thông qua 12 vị trí

amino acid đóng vai trò trong quá trình nhân lên và độc lực của virus (Renshaw &

cs., 1996; Scott & cs., 2001; Yamaguchi & cs., 2001; Todd & cs., 2002). Biến đổi

amino acid tại mỗi vị trí được hiển thị bằng chương trình WebLogo (Crooks & cs.,

2004). Ở mỗi vị trí, chỉ có các thay đổi thường xuyên nhất được hiển thị. Chiều

cao của các chữ cái tương ứng với mỗi amino acid ở một vị trí phản ánh tần suất

xuất hiện của amino acid tại vị trí đó.

3.5.9. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại

Dựa vào các công bố trước đây (Ducatez & cs., 2008; Kye & cs., 2013; Ou

& cs., 2018) mối liên hệ di truyền của các chủng CIAV được xây dựng bằng

phương pháp Neighbor-joining, sử dụng mô hình Kimura-2 parameter mô phỏng

sự biến đổi của nucleotide. Mức tin cậy ở các nhánh cây phát sinh chủng loại

được ước tính bằng phương pháp bootstrap, với số lần lặp lại là 1000 lần. Phân

tích trên được thực hiện bởi phần mềm MEGA6 (Tamura & cs., 2013). Các

chủng CIAV tham chiếu (phụ lục 1) của genogroup G1-G3 (Ducatez & cs., 2006;

Olszewska-Tomczyk & cs., 2016) và của genogroup G4 được đề xuất gần đây

(Ou & cs., 2018) đã được đưa vào để xây dựng cây phát sinh chủng loại.

3.5.10. Phương pháp phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử

Sử dụng phần mềm BEAST (Drummond & cs., 2012) có thể dựng cây phát

sinh chủng loại dựa vào số lượng lớn các trình tự gen ORF1. Dựa vào đặc điểm

phân nhánh để xác định các nhánh phụ dẫn tới các chủng CIAV lưu hành ở miền

Bắc. Đặc điểm dịch tễ học theo thời gian và không gian được phân tích riêng cho

từng nhánh phụ bằng phần mềm chương trình PastML (Ishikawa & cs., 2019).

Phần mềm PastML yêu cầu tham số đầu vào là cây phát sinh chủng loại và bảng

danh sách các địa điểm lấy mẫu tương ứng với các trình tự gen. Phần mềm iTOL

(Letunic & Bork, 2007) biểu diễn và hiệu đính dựng cây phát sinh chủng loại (phylogenetic tree).

3.5.11. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được nhập và tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel 2010. Để

đánh giá tỷ lệ lưu hành của CIAV theo trang trại, nhóm tuổi khác nhau, thực hiện

phân tích phương sai (ANOVA one -way) tích hợp trong phần mềm SPSS (IBM

Corp.) phiên bản 22. Sự sai khác có ý nghĩa thống kê nếu giá trị p  0,05.

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tại thời điểm đề tài này được thực hiện, chỉ có thông tin dương tính huyết

thanh học với CIAV ở gà tại 3 tỉnh miền Bắc (Trinh & cs., 2015b), thiếu thông

tin cũng như bằng chứng khoa học về bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà nuôi tại Việt Nam. Để nâng cao ý nghĩa khoa học và thực tiễn của nghiên cứu này, cần

chứng minh có bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà nuôi tại Việt Nam và chủng

virus phân lập được có độc lực. Với những lập luận đó, các kết quả nghiên cứu

của chúng tôi được trình bày gồm hai phần: (1) xác định có bệnh thiếu máu truyền nhiễm, sự lưu hành và khả năng gây bệnh của các chủng CIAV thực địa;

(2) nghiên cứu đặc điểm di truyền, dự đoán nguồn gốc, sự phát tán theo không

gian và thời gian của virus ở miền Bắc Việt Nam.

4.1. SỰ LƯU HÀNH VIRUS VÀ BỆNH THIẾU MÁU TRUYỀN NHIỄM

4.1.1. Kết quả nghiên cứu sự lưu hành CIAV

Đối với bệnh thiếu máu truyền nhiễm, lứa tuổi mẫn cảm nhất và thường

biểu hiện lâm sàng ở nhóm gà ≤ 3 tuần tuổi có biểu hiện thiếu máu, gầy yếu,

chậm phát triển và tỷ lệ tử vong cao (Mcnulty, 1991). Nghiên cứu (Rimondi &

cs., 2014) cho biết CIAV còn được phát hiện ở gà không có biểu hiện triệu chứng

lâm sàng của bệnh thiếu máu truyền nhiễm. Do chưa có nhiều thông tin về CIAV

ở Việt Nam và để chuẩn hóa quy trình PCR nhằm tăng khả năng phát hiện virus,

nghiên cứu đã chọn lấy mẫu (đợt 1) ở đàn gà nuôi tại 14 trang trại thuộc Hà Nội

và vùng phụ cận. Đối tượng lấy mẫu là tất cả các gà ở mọi lứa tuổi bao gồm gà

bình thường và gà ốm chưa rõ nguyên nhân. Bảng 4.1 trình bày kết quả PCR phát

hiện CIAV trong mẫu bệnh phẩm thu thập được như sau:

Bảng 4.1. Kết quả PCR phát hiện CIAV trong mẫu bệnh phẩm

Âm tính

Dương tính

Phân nhóm

Số mẫu kiểm tra

Số mẫu Tỷ lệ (%) Số mẫu Tỷ lệ (%)

Theo cá thể

124

49,2

50,8

Theo trang trại

7,1

92,9

Trong 14 trang trại được lấy mẫu xét nghiệm có đến 13 trang trại (chiếm tỷ lệ 92,86%) dương tính với CIAV, chỉ duy nhất 01 trại (tỷ lệ 7,14%) có kết quả

PCR âm tính. Trong tổng số 124 mẫu bệnh phẩm của gà được kiểm tra thì tỷ lệ

phát hiện được CIAV rất cao (63 mẫu dương tính, tỷ lệ 50,81%). Câu hỏi tiếp

theo được đặt ra cho nhóm nghiên cứu là phải xác định virus lưu hành là chủng gây bệnh tự nhiên hay chủng virus vacxin. Trên thực tế, vacxin nhược độc phòng

bệnh thiếu máu truyền nhiễm có giấy phép nhập khẩu vào Việt Nam từ năm

2007. Theo tìm hiểu của chúng tôi, cho đến nay, người chăn nuôi gà ít biết tới

bệnh thiếu máu truyền nhiễm, nên đại đa số các cơ sở chăn nuôi (trong đó có 14 trang trại kể trên) không sử dụng vacxin phòng bệnh do CIAV gây ra. Vì vậy,

mặc dù kỹ thuật PCR dùng trong nghiên cứu này không phân biệt được chủng

virus vacxin và chủng virus gây bệnh, nhưng kết quả dương tính CIAV (tỷ lệ

50,81%) ở gà chưa từng sử dụng vacxin phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm cho

thấy gà dương tính CIAV là do nhiễm tự nhiên.

Dựa vào kết quả thăm dò bước đầu nêu trên, nghiên cứu đã triển khai lấy

mẫu ở phạm vi rộng hơn (đợt 2) và phát hiện CIAV ở các trang trại khác thuộc 10 tỉnh/thành phố miền Bắc Việt Nam. Tổng hợp kết quả điều tra ở 10 tỉnh/thành

phố được thể hiện ở bảng 4.2:

Bảng 4.2. Kết quả PCR phát hiện CIAV ở mẫu bệnh phẩm thu từ 10

tỉnh/thành phố miền Bắc Việt Nam

TT

Địa điểm

Số mẫu kiểm tra

Số mẫu dương tính

Tỷ lệ (%) dương tính

1 2

Hòa Bình Vĩnh Phúc

4 14

25,0 100

16 14

Phú Thọ

27,3

Hà Nội

50,0

5 6

Bắc Ninh Hải Dương

10 7

66,7 100

15 7

Hà Nam

100

Nam Định

21,1

Hải Phòng

9 10 Quảng Ninh

8 9

100 100

8 9

Tổng hợp

74 62,2

119

Do mục đích của nghiên cứu này là xác định có hay không CIAV ở đàn gà nuôi tại các trang trại, vì vậy với tổng số 119 mẫu được lấy ngẫu nhiên kiểm tra

bằng kỹ thuật PCR có 74 mẫu cho kết quả dương tính với ADN của CIAV (chiếm

tỷ lệ 62,2%); tại các tỉnh/thành phố được lấy mẫu đều cho kết quả dương tính phát hiện được CIAV đã chứng tỏ có virus lưu hành rộng rãi ở gà nuôi tại miền Bắc Việt Nam.

Trước đó, nghiên cứu (Trinh & cs., 2015b) bằng việc kiểm tra 311 mẫu huyết thanh (từ 16 đàn gà nuôi tại 2 tỉnh Hà Nội, Hà Nam trong độ tuổi 4- 6 tuần và những gà lớn hơn 8 tuần tuổi tại 4 chợ đầu mối của Hà Nội), kết quả cho thấy: có tất cả 169/311 mẫu dương tính (chiếm 54,3%) với kháng thể kháng CIAV. Tuy nhiên có 14/311 mẫu huyết thanh cho kết quả không rõ ràng (khi phân tích trong b-LAT). Khi tiến hành xác định ADN từ 51 mẫu mô bệnh phẩm thu được bằng kỹ thuật PCR thu được kết quả: 10/51 mẫu dương tính (chiếm 19,6%) từ các mẫu gà không có biểu hiện bệnh (Trung tâm chẩn đoán của công ty Dabaco) và các mẫu gà khỏe (ở Hà Nội, Hà Nam). Kết quả dương tính với CIAV đã được khẳng định chắc chắn nhờ kỹ thuật real - time PCR. Nghiên cứu thứ hai mới được công bố gần đây của (Van Dong & cs., 2019) tiến hành cùng lúc với nghiên cứu này đã thu được một tỷ lệ dương tính với CIAV khá cao (157/330 mẫu dương tính, chiếm tỷ lệ 47,58%) khi kiểm tra các mẫu lấy từ 11 tỉnh thuộc miền Bắc bằng kỹ thuật PCR và real - time PCR, sự có mặt của CIAV trong quần thể gà nuôi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam đã được khẳng định.

Như vậy, với kết quả như đã trình bày ở trên, nghiên cứu này một lần nữa góp phần khẳng định có sự lưu hành của CIAV ở đàn gà nuôi tại 10 tỉnh/thành phố miền Bắc. Đây là kết có có ý nghĩa khoa học và thực tiễn giúp cho những người làm công tác chăn nuôi, thú y có sự quan tâm đến vai trò gây bệnh của CIAV, từ đó xây dựng được chiến lược phòng chống bệnh truyền nhiễm nói chung và bệnh do CIAV nói riêng cho đàn gà một cách có hiệu quả.

Kết quả nghiên cứu phù hợp với một số kết quả đã được công bố trên thế giới khi khẳng định CIAV lưu hành với tỷ lệ cao ở gà. Ví dụ, bằng phản ứng PCR đã xác định được 55,4% mẫu dương tính với CIAV tại vùng Ontario, Canada (Eregae & cs., 2014). Tại Thổ Nhĩ Kỳ, có tới 80% số trang trại kiểm tra dương tính với CIAV với tỷ lệ nhiễm virus trung bình là 55,8% (Hadimli & cs., 2008). Nghiên cứu tại bang Sharkia của Ai cập (Hegazy & cs., 2014) đã chứng minh CIAV phân bố rộng rãi trong các trang trại nuôi gà có các dấu hiệu lâm sàng, tỷ khối huyết cầu giảm và các tổn thương mổ khám sau khi chết và mẫu thu thập là tủy xương, tuyến ức, túi Fabricius, gan và lách của gà thuộc các lứa tuổi và giống khác nhau. Tuy nhiên tại Ba Lan, một nghiên cứu phát hiện 16 đàn trong tổng số 106 đàn gà thịt dương tính với CIAV (chiếm tỷ lệ 15%) khi sử dụng kỹ thuật PCR; trong đó 6 đàn dương tính không có biểu hiện lâm sàng và các đàn dương tính còn lại chủ yếu biểu hiện ở tỷ lệ chết cao, tiêu chảy và tăng trưởng chậm (Olszewska-Tomczyk & cs., 2016).

4.1.2. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của gà nhiễm CIAV trong tự nhiên Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của bệnh thiếu máu

truyền nhiễm được tổng hợp từ các đàn gà thỏa mãn các tiêu chí: (i) chưa từng sử

dụng vacxin phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm; (ii) dương tính CIAV bằng

phương pháp PCR. Hình ảnh triệu chứng của gà được minh họa ở hình 4.1.

Ghi chú: gà ủ rũ, gầy yếu (A, B); chảy máu dưới da cánh và bụng (C-F)

Hình 4.1. Một số triệu chứng của gà nhiễm CIAV tự nhiên

Nhìn chung, các triệu chứng phổ biến thu được từ thực tế (với các đàn được khẳng định dương tính CIAV) là : mào tích nhợt nhạt, xuất huyết ở da vùng cánh, v.v... Đàn gà nhiễm CIAV còn có biểu hiện triệu chứng không điển hình như: ủ rũ, giảm ăn, rụng lông, nhợt nhạt và còi cọc. Một số nghiên cứu trên thế giới còn đề cập tới tỷ lệ chết do bệnh thiếu máu truyền nhiễm, dao động từ 5 - 10% trong 2 - 4 tuần tuổi đầu tiên và có thể lên tới 60% trong trường hợp nhiễm ghép với một số bệnh khác (Mcnulty, 1991; Dhama, 2002; Dhama & cs., 2002; Balamurugan & Kataria, 2006). Tuy nhiên, trong phạm vi của nghiên cứu này, tỷ lệ chết ở các đàn dương tính CIAV không được thu thập.

CIAV là nguyên nhân gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gia cầm, gây nhiều thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi gà thịt (Yuasa & cs., 1987; Mcnulty,

1991). Đã có nhiều công trình nghiên cứu chỉ ra các biến đổi bệnh lý do CIAV

gây ra ở gà, biểu hiện lâm sàng thường thấy ở nhóm gà dưới 3 tuần tuổi mắc tự

nhiên với các biểu hiện: ủ rũ, bỏ ăn, rụng lông, xanh xao, (Bulow, 1991; Dhama, 2002; Dhama & cs., 2002; Dhama & cs., 2004; Balamurugan & Kataria, 2006).

Tuy nhiên, các triệu chứng cận lâm sàng dường như phổ biến ở nhóm gà lớn tuổi

hơn bởi sự có mặt của kháng thể trung hòa (Sommer & Cardona, 2003). Vì vậy,

việc theo dõi các biến đổi bệnh lý của gà mắc bệnh trong tự nhiên góp phần

khẳng định khả năng gây bệnh của CIAV và hỗ trợ cho công tác chẩn đoán bệnh

CIA trong tự nhiên. Bệnh tích của gà mắc bệnh bệnh thiếu máu truyền nhiễm tự

nhiên được trình bày ở hình 4.2- hình 4.4.

Ghi chú: tuyến ức của gà teo nhỏ (A-C) và gần như biến mất (D-F); điểm xuất huyết lấm tấm ở các thùy của tuyến ức (G-I)

Hình 4.2. Bệnh tích ở tuyến ức của gà nhiễm CIAV trong tự nhiên

Tuyến ức và tủy xương là hai tổ chức chịu sự tác động chính của virus. Chính vì vậy, biến đổi lâm sàng tại hai cơ quan này thường là căn cứ để nghi ngờ có bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà. Các gà mổ khám (hình 4.2) đều < 13 tuần tuổi, thời điểm tuyến ức chưa bị teo sinh lý. Tuy nhiên, có thể quan sát rõ mức độ

teo tuyến ức khác nhau: gần như mất hoàn toàn các thùy (hình 4.2F) hoặc các thùy teo to - nhỏ không đều (hình 4.2G)

Ghi chú: tủy xương nhạt màu, có màu vàng ở các mức độ khác nhau

Hình 4.3. Bệnh tích ở tủy xương gà nhiễm CIAV trong tự nhiên

Đối với tủy xương, kết quả kiểm tra bệnh tích cũng thấy phần lớn các trường hợp tủy xương có màu vàng. Tuy nhiên, mức độ biến đổi bệnh tích ở tủy

xương là khác nhau giữa các cá thể (hình 4.3). Ngoài tuyến ức và tủy xương,

nghiên cứu còn làm rõ biến đổi bệnh tích đại thể ở túi Fabricius (hình 4.4).

Hình 4.4. Bệnh tích ở túi Fabricius của gà nhiễm CIAV trong tự nhiên

Ở gà < 13 tuần tuổi, túi Fabricius chưa teo sinh lý và thường có kích thước

lớn hơn so với lách. Ở gà có biểu hiện bệnh thiếu máu truyền nhiễm, có thể thấy

rõ sự teo nhỏ của túi Fabricius thông qua việc so sánh kích thước tương đối với

lách (hình 4.4). Đến nay, có nhiều kết quả nghiên cứu về bệnh thiếu máu truyền

nhiễm của gà mắc tự nhiên và trong điều kiện thí nghiệm (Goodwin & cs., 1989;

Goryo & cs., 1989; Buscaglia & cs., 1994; Ledesma & cs., 2001; Saleemi & cs.,

2013; Hegazy & cs., 2014; Rimondi & cs., 2014). Các kết quả nghiên cứu kể trên

cho biết: ngoại trừ một số bệnh tích đại thể không phổ biến như xuất huyết dưới

da và cơ, gan sưng hay nhợt nhạt…, biến đổi bệnh tích ở tuyến ức và tủy xương là những biến đổi đặc trưng và thường gặp của bệnh. Trong nghiên cứu này, việc

quan sát được biến đổi bệnh tích đặc trưng ở gà chứng tỏ CIAV đã gây ra bệnh cho gà tại các địa phương lấy mẫu. Những kết quả trên khẳng định sự lưu hành của virus và bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà tại các tỉnh nghiên cứu.

4.1.3. Đặc điểm về sự lưu hành của CIAV 4.1.3.1. Sự lưu hành của CIAV theo địa điểm nghiên cứu Mặc dù CIAV xuất hiện phổ biến ở tất cả các nước có ngành chăn nuôi gia cầm (Dhama & cs., 2008) nhưng cho đến nay, tại Việt Nam các nghiên cứu về

virus và bệnh của nó còn rất khiêm tốn. Đối với nghiên cứu này, bên cạnh việc kiểm tra xác định chính xác mẫu dương tính, thống kê và phân tích các mẫu bệnh phẩm tại địa điểm lấy mẫu sẽ góp phần thể hiện mức độ phân bố của CIAV. Theo yếu tố không gian- vùng địa lý, ban đầu nghiên cứu tập trung tìm hiểu sự phân bố của virus ở một phạm vi nhỏ là Hà Nội và vùng phụ cận, sau đó mở rộng ra 10 tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam. Trong nghiên cứu này, mẫu đã được thu thập từ 10 tỉnh/thành phố miền Bắc Việt Nam, là nơi chăn nuôi gia cầm tập trung với tỷ trọng chăn nuôi gà cao, chiếm gần 24,6% trong tổng số gia cầm của Việt Nam, gồm có: Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hà Nội, Bắc Ninh, Hải Dương, Hà Nam, Nam Định, Hải Phòng và Quảng Ninh. Tại Việt Nam, gia cầm được nuôi ở từng vùng sinh thái khác nhau. Việc thu thập mẫu có tính đại diện cho nguồn mẫu với mục đích phát hiện mầm bệnh nói chung và CIAV nói riêng. Sự phân bố theo không gian của CIAV tại các địa điểm lấy mẫu thuộc miền Bắc Việt Nam được minh họa qua hình 4.5.

Số trang trại

Âm tinh Dương tính

Ghi chú: 10 tỉnh được làm nổi bật. Từng cột có vách ngăn chỉ ra tỷ lệ kiểm tra đối với mẫu CIAV dương tính (màu đỏ) và âm tính (màu xanh) cho toàn bộ mẫu thu thập ở mỗi tỉnh

Hình 4.5. Sự phân bố của CIAV tại một số tỉnh miền Bắc

Tỷ lệ phát hiện CIAV cao ở một số tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam tương

xứng với một vài công bố ở các nước (74/119 mẫu, chiếm tỷ lệ trung bình là 62,2%). Ở Iran, 58,4% đàn gà được phát hiện dương tính với CIAV bằng phản

ứng PCR (Gholami-Ahangaran & cs., 2013) và tỷ lệ này ở Thổ Nhĩ Kỳ là 80,0% (Hadimli & cs., 2008). Nghiên cứu tại Thái Lan (Wanasawaeng & cs., 2013) khi

kiểm tra PCR cho kết quả hầu hết các gà ở giai đoạn 11 - 21 ngày tuổi nhiễm

CIAV với tỷ lệ rất cao (94,12%). Nghiên cứu (Wani & cs., 2013) tại Ấn Độ đã

báo cáo sự lưu hành của CIAV khi sử dụng kỹ thuật PCR với tỷ lệ dương tính là 73,3% trong tổng số mẫu kiểm tra.

4.1.3.2. Sự lưu hành của CIAV theo một số chỉ tiêu trong chăn nuôi gia cầm

Để làm rõ hơn các đặc điểm dịch tễ học của bệnh thiếu máu truyền nhiễm

do CIAV gây ra ở gia cầm, nghiên cứu đi sâu phân tích sự lưu hành theo một số

yếu tố trong chăn nuôi gia cầm hiện nay. Kết quả được thể hiện ở hình 4.6 và chi tiết ở phụ lục 4.

Loại gà (A), phương thức nuôi (B), quy mô đàn (C) và nhóm tuổi (D). Tỷ lệ CIAV dương tính (tính bằng phần trăm, dấu ●) và khoảng tin cậy 95%. Giá trị xác suất p ở góc trên bên trái tương ứng với mức ý nghĩa là 0,05 hoặc nhỏ hơn đã chỉ ra sự khác nhau đáng kể có tính thống kê giữa các nhóm.

Hình 4.6. Kết quả phát hiện CIAV theo một số chỉ tiêu trong chăn nuôi

Về đặc điểm lưu hành của CIAV theo mục đích chăn nuôi (loại gà): nhìn

chung, tại Việt Nam phần lớn người chăn nuôi tập trung vào khai thác giống gia cầm

với hai mục đích chính là hướng thịt và hướng trứng. Chính vì vậy, nghiên cứu đặt ra vấn đề: tỷ lệ dương tính với CIAV ở hai nhóm gà như thế nào và có khác biệt không? Kết quả thu được sau khi phân tích 119 mẫu của 2 nhóm gà (hình 4.6A) cho

thấy: CIAV được phát hiện ở cả gà hướng thịt và hướng trứng với tỷ lệ dương tính lần lượt là 69,8% và 57,9%. Mặc dù tỷ lệ này ở nhóm gà hướng thịt cao hơn so với

nhóm gà hướng trứng nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p = 0,201)

hay nói cách khác, yếu tố giống không có ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm CIAV ở gà.

Nghiên cứu (Davidson & cs., 2004) tại Israel tuy không xác định tỷ lệ nhiễm CIAV theo giống gà nhưng bằng cách liệt kê tổng hợp các biểu hiện lâm sàng và kết quả

kiểm tra PCR trong các đàn gà đẻ và gà thịt đều nhiễm CIAV với các biểu hiện đặc

trưng của bệnh. Khi kiểm tra PCR với bệnh phẩm từ các cơ quan (tủy xương, tuyến

ức, túi Fabricius, gan và lách) từ các gà ở các lứa tuổi và giống khác nhau đều khẳng

định dương tính CIAV (Hegazy & cs., 2014). Một nghiên cứu ở Mỹ khi gây nhiễm

đồng thời CIAV và IBDV cho hai nhóm gà đẻ và gà thịt kết hợp theo dõi kháng thể

cũng như các biểu hiện lâm sàng ở con cháu của chúng đã rút ra nhận xét: Tỷ lệ tử

vong và biểu hiện lâm sàng của bệnh CIA đều được quan sát thấy ở đàn gà thịt và gà đẻ và có sự chuyển huyết thanh dương tính lúc gà được 35 ngày tuổi (Toro & cs.,

2009). Như vậy, cho dù các nghiên cứu trước đây không xác định tỷ lệ nhiễm CIAV

theo mục đích chăn nuôi nhưng bằng kết quả chứng minh CIAV gây bệnh cho cả gà

thịt và gà đẻ cho thấy kết quả nghiên cứu này là phù hợp khi chỉ ra tỷ lệ nhiễm

CIAV trên cả hai giống đều khá cao (> 50%).

Về đặc điểm lưu hành của CIAV theo phương thức chăn nuôi: kết quả

phân tích theo yếu tố phương thức chăn nuôi (hình 4.6B), nghiên cứu nhận thấy gia cầm chủ yếu được nuôi theo hai phương thức: nuôi thả và nuôi nhốt. Một

thực tế hiện nay ở Việt Nam cũng như trên thế giới, phương thức nuôi nhốt đang

dần chiếm ưu thế bởi những điểm tích cực mà nó mang lại cho ngành chăn nuôi

như: hạn chế rủi ro từ nhiều nguyên nhân khách quan và hiệu quả kinh tế vượt trội

mang lại như năng suất trứng và thịt cao hơn rất nhiều so với hình thức nuôi thả.

Thực tế trên đã phần nào được chứng minh khi kết quả phân tích của nghiên chỉ ra: tỷ lệ dương tính với CIAV ở hình thức nuôi thả cao hơn rõ rệt so với hình thức nuôi

nhốt (80,5% và 52,6%). Kết quả có ý nghĩa thống kê (p = 0,003) đã chỉ ra sự khác nhau đáng kể giữa hai phương thức chăn nuôi. Như vậy, phương thức chăn nuôi có ảnh hưởng đến sự lây nhiễm CIAV và các gà nuôi thả có nguy cơ nhiễm bệnh CIA cao hơn so với gà nuôi nhốt. Theo nghiên cứu tìm hiểu về khía cạnh này, các nghiên

cứu trước đây không đề cập tới bởi hầu như ngành công nghiệp chăn nuôi gà trên thế giới đều phát triển theo hướng nuôi nhốt để đảm bảo an toàn sinh học và hạn chế ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài ở mức tối đa. Chính vì vậy, các kết quả công bố

về CIA hay CIAV đều tập trung vào các nội dung chuyên sâu và ít xem xét đến đặc điểm dịch tễ học lâm sàng trên của CIA. Lý giải cho sự sai khác về tỷ lệ nhiễm

CIAV theo hai phương thức chăn nuôi của nghiên cứu này có thể đặc điểm của

phương thức nuôi thả: người chăn nuôi khó kiểm soát dịch bệnh do gia cầm đi lại tự

do, điều kiện chuồng trại không đảm bảo an toàn sinh học nên gia cầm dễ bị nhiễm mầm bệnh từ môi trường. Do đây mới chỉ là những kết quả bước đầu về yếu tố nguy

cơ khiến cho gà mắc bệnh do CIAV nên để khẳng định cần phải tiếp tục nghiên cứu.

Về sự lưu hành của CIAV theo quy mô chăn nuôi: đặc điểm dịch tễ học của

sự lây nhiễm CIAV được làm rõ hơn bởi sự phân tích các mẫu dương tính theo quy

mô đàn trong chăn nuôi gia cầm (hình 4.6C). Nhìn vào quy mô đàn, tỷ lệ dương tính

ở quy mô đàn nhỏ (< 500 con), trung bình (500 - 1000 con) và lớn (> 1000 con) lần

lượt là 64,3%; 58,3% và 63%. Với mức tin cậy (95%) chồng chéo nên tỷ lệ dương tính với CIAV giữa các quy mô chăn nuôi không khác nhau đáng kể (p = 0,804).

Điều đó có nghĩa là gà nuôi ở bất cứ quy mô nào đều có thể nhiễm CIAV và không

theo một xu hướng cụ thể. Do đây cũng mới chỉ là những kết quả bước đầu về yếu

tố nguy cơ (quy mô chăn nuôi) khiến cho gà mắc bệnh do CIAV nên để khẳng định

cần phải tiếp tục nghiên cứu.

Về sự lưu hành của CIAV theo lứa tuổi: dựa trên kết quả nghiên cứu trước

đây khi cho rằng CIAV gây bệnh ở thể lâm sàng cho gà dưới 3 tuần tuổi (Mcilroy &

cs., 1992) và thể cận lâm sàng ở gà trên 3 tuần tuổi (Adair, 2000). Để làm rõ vấn đề

này tại Việt Nam, nghiên cứu đã lấy mẫu và phân tích sự lưu hành theo nhóm tuổi

gà với 3 nhóm tuổi: dưới 4 tuần tuổi, từ 5 - 15 tuần tuổi và trên 16 tuần tuổi bởi theo

nghiên cứu của (Sommer & Cardona, 2003): tất cả gà con dưới 4 tuần tuổi có tỷ lệ

huyết thanh dương tính với CIAV giảm dần từ 1 đến 3 tuần tuổi và đến 4 tuần không

phát hiện mẫu dương tính với CIAV. Kết quả thể hiện ở hình 4.6D cho thấy tỷ lệ

dương tính với CIAV ở 3 nhóm tuổi gà lần lượt là 60,9%; 64,7% và 60%. Bằng phép

phân tích ANOVA-1 nhân tố thì giả thuyết đưa ra có sự tương quan về tỷ lệ dương

tính với CIAV ở 3 nhóm tuổi gà đã bị bác bỏ (p = 0,887). Điều này cũng có nghĩa là tỷ lệ dương tính với CIAV ở gà nuôi tại miền Bắc Việt Nam trong phạm vi nghiên cứu này không có một xu hướng cụ thể nào đối với từng nhóm tuổi.

Bên cạnh các nhận xét về đặc điểm dịch tễ học lâm sàng của bệnh do CIAV

gây ra: CIAV được phát hiện trong tất cả các giai đoạn sinh trưởng của gà và không có một xu hướng nhiễm cao ở một nhóm tuổi nào (hình 4.6D); kết quả phát hiện CIAV ở nhiều nhóm tuổi gà là phù hợp bởi CIAV có thể nhiễm và

nhân lên với mức tương tự nhau với gà 01 ngày tuổi và 6 tuần tuổi (Kaffashi & cs., 2006). Ngoài ra, do khả năng đề kháng rất cao với các chất sát trùng của

CIAV (Yuasa, 1992), virus có thể tồn tại lâu dài trong khu vực chăn nuôi và dẫn

tới tỷ lệ nhiễm trung bình ở gà khá cao (62,2%). Kết quả này có khác với kết quả

của nghiên cứu (Wani & cs., 2014) khi cho rằng tỷ lệ mắc CIAV tỷ lệ nghịch với tuổi của gà. Sự khác biệt trên có thể do trong nghiên cứu này, tỷ lệ lưu hành được

xác định theo nhóm tuổi thay vì từng tuần tuổi.

Các kết quả bước đầu đã chứng minh sự hiện diện của CIAV cũng như

bệnh CIA trong môi trường chăn nuôi gia cầm ở một số tỉnh phía Bắc của Việt

Nam. Một số triệu chứng và bệnh tích thu tập tại thực địa ít nhiều đã góp phần

minh họa biểu hiện lâm sàng của bệnh do CIAV gây ra ở gà, từ đó làm tăng ý

nghĩa thực tiễn của nội dung nghiên cứu dịch tễ học phân tử khi khẳng định phần nào vai trò gây bệnh của CIAV trong lĩnh vực chăn nuôi gia cầm. Cho đến thời

điểm này ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về nhóm virus gây ức chế miễn

dịch nói chung và về CIAV nói riêng. Nghiên cứu được xem như công trình đầu

tiên đã xác định được có sự lưu hành của CIAV ở đàn gà trên địa bàn của 10

tỉnh/thành phố ở miền Bắc Việt Nam tại Việt Nam. Bởi vậy, cùng với mục tiêu làm

rõ một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của CIAV, nghiên cứu đặt ra vấn đề cần

phải khẳng định các chủng CIAV hiện đang lưu hành tại miền Bắc Việt Nam có

khả năng gây bệnh CIA với các biểu hiện lâm sàng như đã được công bố trên thế giới hay không? Trên cơ sở tham khảo một số nghiên cứu đã công bố ở nhiều nơi

trên thế giới, việc gây bệnh thực nghiệm sẽ giúp giải đáp cho vấn đề trên một

cách thuyết phục nhất. Theo đó, với điều kiện thực hiện đề tài, nghiên cứu tiến

hành gây bệnh thực nghiệm cho nhóm gà 01 ngày tuổi để đánh giá khả năng gây

bệnh hay tính độc của các chủng CIAV có mặt tại miền Bắc Việt Nam trong giai

đoạn hiện nay. Kết quả thu được sẽ góp phần nâng cao giá trị cho nội dung nghiên cứu lớn của đề tài khi xem xét chuyên sâu về một số đặc điểm dịch tễ học

phân tử của các chủng CIAV lưu hành tại thực địa.

4.1.4. Kết quả chứng minh độc lực của CIAV lưu hành ở gà tại miền Bắc

Trên thế giới đã có nhiều công bố về kết quả gây nhiễm thực nghiệm để tìm hiểu các biến đổi bệnh lý của bệnh thiếu máu do các chủng thực địa gây ra, điển

hình là nghiên cứu tại Chi-lê (Toro & cs., 1997). Bởi theo tìm hiểu của nghiên cứu này, mặc dù CIAV phân bố rộng trong cơ thể gà (Smyth & cs., 1993) nhưng tổn thương của bệnh được tìm thấy chủ yếu ở tuyến ức, tủy xương, lách và túi Fabricius

do các chủng độc lực gây ra. Thực tế có nhiều nghiên cứu tiến hành gây bệnh thực nghiệm cho gà ở giai đoạn 1 ngày tuổi đến 4 tuần tuổi (Goryo & cs., 1987a; Smyth

& cs., 1993). Trên cơ sở đó, nghiên cứu đã tiến hành gây bệnh thực nghiệm bởi

chủng phân lập tại Chi-lê có độc lực cao (chủng 10343) và đánh giá tuần tự các biểu

hiện của bệnh. Kết quả đã chỉ ra sự giảm tăng trọng, biểu hiện thiếu máu ở gà lúc 21 ngày tuổi; tổn thương mô bệnh học ở tuyến ức, túi Fabricius, lách và gan được tìm

thấy khi gà lúc 14 và 21 ngày tuổi sau khi gây nhiễm. Các kết quả này khá tương

đồng với các phát hiện của nghiên cứu (Goryo & cs., 1989). Từ những phân tích

trên, nghiên cứu tiến hành gây nhiễm thực nghiệm cho gà 01 ngày tuổi bởi chủng

CIAV được xác định nhằm khẳng định độc lực của các chủng virus lưu hành tại địa

điểm lấy mẫu trong phạm vi nghiên cứu của đề tài.

4.1.4.1 Kết quả gây nhiễm thực nghiệm CIAV

Sau gây nhiễm, mẫu máu được thu định kỳ để kiểm tra virus huyết. Kết quả

semi-nested PCR phát hiện virus huyết tại thời điểm 4 tuần sau gây nhiễm cho

thấy chỉ có 5/9 gà được tiêm virus có hiện tượng virus huyết (giếng số 1, 2, 5, 7

và 8, hình 4.7).

Ghi chú: đối chứng dương (+) và đối chứng âm (-) của phản ứng PCR, thang 100 bp ADN (M), giếng ký hiệu từ 1 - 9 là các mẫu xét nghiệm. Sản phẩm PCR của cặp mồi CAVVP3F/CAV2 (đầu mũi tên) và CAV1/CAV2 (mũi tên) có kích thước lần lượt là 1038 bp và 676 bp.

Hình 4.7. Kết quả semi-nested PCR phát hiện CIAV ở nhóm gà gây nhiễm

Kết quả phát hiện CIAV trong máu gà 8 tuần sau gây nhiễm (bảng 4.3) cho thấy: bằng phương pháp semi - nested PCR, nghiên cứu này không phát hiện được

CIAV ở máu của gà nhóm gây nhiễm trong 2 tuần đầu. Hiện tượng virus huyết bắt

đầu xuất hiện ở tuần thứ 3 sau gây nhiễm (tỷ lệ 20%) và tăng dần cho đến tuần thứ 6

(100%). Virus huyết duy trì tới tuần thứ 8 (thời điểm dừng thí nghiệm). Ở nhóm đối chứng (không gây nhiễm virus), trong toàn bộ thời gian thí nghiệm (tuần 1- tuần 8)

đều không phát hiện được virus trong máu, kể cả ở 01 gà chết ở tuần thứ 6.

Bảng 4.3. Kết quả phát hiện virus huyết ở gà sau gây nhiễm CIAV

Nhóm

Tuổi gà (ngày)

Số mẫu kiểm tra*

Số mẫu dương tính

Tỷ lệ dương tính (%)

Đối chứng

Thí nghiệm

Thời gian sau gây nhiễm (tuần) 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

9 16 23 30 37 44 51 56 9 16 23 30 37 44 51 56

10 10 10 10 10 9 9 9 10 10 10 9 9 9 9 9

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 5 7 9 9 9

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20,0 55,6 77,8 100 100 100

Ghi chú: * 01 gà nhóm đối chứng chết ở tuần thứ 6, 01 gà nhóm thí nghiệm chết ở tuần thứ 4

Trong nhiều nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm trên thế giới, tại mỗi thời

điểm cố định sau gây nhiễm, đều mổ khám và kiểm tra virus ở các cơ quan nội

tạng của gà (Toro & cs., 1997; Cardona & cs., 2000; Tan & Tannock, 2005). Để hạn chế số lượng động vật thí nghiệm, nghiên này dùng chỉ tiêu virus huyết để đánh giá sự thành công của gây nhiễm và mổ khám kiểm tra bệnh tích tại thời điểm kết thúc thí nghiệm. Đối với bệnh thiếu máu truyền nhiễm, lứa tuổi mẫn

cảm nhất và thường biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở nhóm gà ≤ 3 tuần tuổi (Mcnulty, 1991). Mặc dù vậy, hiện tượng nhiễm CIAV có thể xảy ra ở gà mọi

lứa tuổi, với khả năng nhân lên của virus ở gà 1 ngày tuổi và 6 tuần tuổi được xác định là tương đương (Kaffashi & cs., 2006). Trong nghiên cứu này, gà được gây

nhiễm virus vào giai đoạn mẫn cảm, tuy nhiên hiện tượng virus huyết xuất hiện

tương đối muộn so với nhiều công bố trước đây. Ví dụ, thí nghiệm gây nhiễm

cho gà 1 ngày tuổi qua đường tiêm bắp, sau 5 ngày hoặc 7 ngày đã phát hiện CIAV ở trong máu (Toro & cs., 1997; Tan & Tannock, 2005). Đối với vacxin

CIAV nhược độc, sau khi tiêm cho gà 23 tuần tuổi có thể phát hiện virus huyết

(với lượng thấp hơn so với các cơ quan nội tạng) sau 7 ngày (Vagnozzi & cs.,

2018). Nguyên nhân dẫn tới sự sai khác về thời điểm xuất hiện virus huyết ở

nghiên cứu này so với một số nghiên cứu sử dụng đường gây nhiễm tương tự

(Toro & cs., 1997; Tan & Tannock, 2005) chưa được làm rõ. Mặc dù xuất hiện

muộn, hiện tượng virus huyết ở tuần thứ 3 sau gây nhiễm với tỷ lệ tăng dần và

duy trì cho tới thời điểm dừng thí nghiệm chứng tỏ đã gây nhiễm thực nghiệm thành công chủng CIAV thực địa cho gà 1 tuần tuổi.

4.1.4.2. Một số chỉ tiêu lâm sàng của gà sau gây nhiễm CIAV

Ở Việt Nam, đã có công bố cho thấy sự lưu hành phổ biến của CIAV ở một số tỉnh miền Bắc (Trinh & cs., 2015b; Van Dong & cs., 2019). Tuy nhiên, chưa có nhiều thông tin về triệu chứng, bệnh tích của gà chỉ nhiễm CIAV. Vì

vậy, nghiên cứu đã theo dõi một số chỉ tiêu lâm sàng của gà được gây nhiễm thành công CIAV.

Biểu hiện lâm sàng của hiện tượng thiếu máu ở gà thường xuất hiện trong

tuần thứ 2 đến tuần thứ 3 sau gây nhiễm (Yuasa & cs., 1979; Mcnulty, 1991; Tan

& Tannock, 2005). Một nghiên cứu tại Ấn Độ (Dhama & cs., 2008) đã tổng hợp

các kết quả từ nhiều nghiên cứu trước đó về CIAV và đã chỉ ra những điểm

chung: Bệnh CIA ở thể lâm sàng được quan sát ở tuần tuổi thứ 3 - 4 ở các gà mẫn

cảm không có kháng thể mẹ truyền dù cho nhiễm theo phương thức truyền dọc

hay ngang; giai đoạn cận lâm sàng kéo dài đến tuần thứ 8 - 10 sau khi nhiễm;

quãng thời gian thiếu máu từ nhẹ đến nghiêm trọng diễn ra từ ngày thứ 10 - 20 sau khi nhiễm. Theo đó, bức tranh lâm sàng của bệnh là tình trạng thiếu máu không tái tạo, teo cơ quan bạch huyết nói chung, xuất huyết, tăng tỷ lệ tử vong và sự suy giảm miễn dịch và các biến chứng kế phát. Các gà nhiễm CIAV thường ủ

rũ, bỏ ăn, rụng lông, thiếu máu, thấp còi. Bên cạnh đó tỷ khối huyết cầu giảm (<25%), máu loãng và nhạt màu. Các gà nhiễm bệnh sau 4 - 5 tuần còn sống sót thì chúng sẽ qua khỏi giai đoạn thiếu máu. Do đó, nghiên cứu tập trung quan sát

triệu chứng lâm sàng của gà tại thời điểm 6 tuần tuổi (2 tuần sau khi bắt đầu có hiện tượng virus huyết, cũng là thời điểm 100% gà gây nhiễm dương tính với

virus huyết). Tuy nhiên, trong suốt quá trình theo dõi, hầu như không quan sát

được triệu chứng thiếu máu của gà nhiễm virus thực nghiệm. Ví dụ hình 4.8,

không thấy sự khác biệt về màu sắc mào của nhóm gà thí nghiệm và đối chứng.

Hình 4.8. Mào, tích của gà sau gây nhiễm CIAV

Ở một số nghiên cứu gây nhiễm CIAV qua đường tiêm bắp, ngoài hiện tượng chết, gà thí nghiệm mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm có biểu hiện ủ rũ, bỏ ăn, xù lông và mào yếm nhợt nhạt (Yuasa & cs., 1979; Tan & Tannock, 2005). Ngược lại, kết quả gây nhiễm đơn CIAV (chủng CAA 1/80) qua đường tiêm phúc mạc cho thấy gà thí nghiệm không có triệu chứng lâm sàng, chỉ có thay đổi chỉ tiêu huyết học và biến đổi bệnh lý điển hình của bệnh (Engstrom & cs., 1988). Vẫn dùng chủng CAA 1/80 để nhiễm đồng thời với reovirus (chủng Reo 1/80), gà thí nghiệm biểu hiện triệu chứng như lười vận động, xù lông và chết (Engstrom & cs., 1988). Có thể nhận xét rằng: trong điều kiện thí nghiệm, triệu chứng của bệnh thiếu máu truyền nhiễm còn phụ thuộc vào hiện tượng đồng nhiễm. Như vậy, việc không quan sát được triệu chứng lâm sàng ở gà nhiễm CIAV trong nghiên cứu này không phải là trường hợp đặc biệt.

Trong thực tế, gà nhiễm CIAV có một số biểu hiện triệu chứng liên quan đến thiếu máu truyền nhiễm như: mào tích nhợt nhạt, xuất huyết ở da cánh, v.v... (Goryo & cs., 1989; Buscaglia & cs., 1994; Toro & cs., 1997; Zhou & cs., 1997; Ledesma & cs., 2001). Theo một số bài nghiên cứu tổng hợp, bệnh thiếu máu

truyền nhiễm ở gà thường biểu hiện nặng nhất khi nhiễm ghép với một số mầm bệnh khác như: Avian Reoviruses, Avian Adenoviruses, Reticuloendotheliosis virus, Marek’s disease virus, hoặc virus gây bệnh Gumboro (Mcneilly & cs., 1995). Vì vậy, trong điều kiện thí nghiệm, khi gà chỉ gây nhiễm CIAV có thể không có những triệu chứng giống như ngoài tự nhiên.

4.1.4.3. Khả năng tăng trọng của gà nhiễm CIAV

Bên cạnh tình trạng thiếu máu, gà nhiễm CIAV còn giảm sức sinh trưởng

(Tan & Tannock, 2005), do đó mức tăng khối lượng của gà đã được theo dõi để

lượng hóa ảnh hưởng này. Kết quả theo dõi: gà thuộc nhóm thí nghiệm (gây

nhiễm CIAV) và nhóm đối chứng (không gây nhiễm CIAV) đều tăng khối lượng

qua các mốc thời gian theo dõi (hình 4.9). Từ thời điểm 1 - 4 tuần sau khi gây

nhiễm (9 - 30 ngày tuổi), gà thuộc nhóm thí nghiệm và đối chứng có sự chênh

lệch về khối lượng nhưng sự khác biệt tại mỗi thời điểm không có ý nghĩa thống

kê (khoảng tin cậy 95% giao nhau, hình 4.9). Từ tuần thứ 5 sau gây nhiễm (thời

điểm có từ > 70% đến 100% gà dương tính virus huyết), nhóm nhiễm virus có

khối lượng thấp hơn rõ rệt so với nhóm đối chứng (dấu *, hình 4.9).

Ghi chú: mức tăng khối lượng của thời điểm sau (t2) so với thời điểm ban đầu (t0): Tại mỗi thời điểm, mức tăng khối lượng được tính trung bình cho nhóm (biểu diễn dưới dạng cột) và biên độ dao động của mức tăng khối lượng (biểu diễn dưới dạng đoạn thẳng). Dấu * biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức p < 0,05.

Hình 4.9. Ảnh hưởng của CIAV đến khả năng tăng trọng của gà

Bằng gây nhiễm thực nghiệm, ảnh hưởng của CIAV tới tăng khối lượng trung bình của nhóm gà thí nghiệm thể hiện rõ nhất sau gây nhiễm 2 - 3 tuần:

nhóm gây nhiễm là 85 ± 8 và 94 ± 33g; nhóm đối chứng là 139 ± 11 và 163 ±

27g (Goryo & cs., 1989). Kết quả tương tự thu được khi gây nhiễm thực nghiệm

chủng CIAV 10343 cho gà 1 ngày tuổi (Toro & cs., 1997): khối lượng trung bình của nhóm gà thí nghiệm có sự giảm rõ rệt và sự khác biệt này là đáng kể so với

nhóm đối chứng từ thời điểm tuần thứ 2 - 3 sau khi gây nhiễm. So với các kết

quả nghiên cứu trên thì ảnh hưởng của CIAV tới sự tăng khối lượng của gà mới

thực sự rõ vào tuần thứ 6 đến tuần thứ 8 sau gây nhiễm. Sự sai khác về thời điểm

nhiễm CIAV ảnh hưởng tới việc tăng khối lượng của gà như đã nêu có thể được

giải thích bởi hiện tượng virus huyết xuất hiện tương đối muộn ở nghiên cứu này.

Kết quả được trình bày ở hình 4.9 cho biết CIAV thực sự có ảnh hưởng tới khả

năng sinh trưởng của gà thí nghiệm. Kết hợp với kết quả nghiên cứu về triệu chứng lâm sàng và so sánh với nhóm gà đối chứng, có thể rút ra nhận xét: trong

điều kiện thí nghiệm, gà nhiễm CIAV mặc dù ít biểu hiện triệu chứng điển hình

của bệnh nhưng vẫn có thể đo lường tác hại của bệnh do CIAV gây ra qua chỉ

tiêu phi lâm sàng, ví dụ như mức tăng khối lượng. Mặc dù thiếu bằng chứng về

biểu hiện của bệnh ở các gà có khả năng miễn dịch thì tổn thất về mặt kinh tế liên

quan đến sự giảm tăng trọng cũng như sự đồng nhiễm với các bệnh khác là biểu

hiện cận lâm sàng của sự lây nhiễm (Miller & Schat, 2004). Như vậy, sự giảm

tăng trọng ở gà nhiễm CIAV là một biểu hiện đáng được quan tâm khi xem xét

ảnh hưởng của bệnh trên đàn gia cầm.

4.1.4.4. Biến động tỷ khối huyết cầu ở gà gây nhiễm CIAV

Một trong các cơ chế gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm do CIAV là chúng

nhân lên và phá hủy các tiền tế bào tạo máu ở tủy xương, dẫn tới giảm số lượng

hồng cầu. Để lượng hóa ảnh hưởng của hiện tượng nhiễm CIAV, một chỉ tiêu cần theo dõi tiếp theo là tỷ khối huyết cầu ở các thời điểm sau gây nhiễm. Tỷ khối

huyết cầu của gà khác nhau giữa các giống (Goodwin & cs., 1992a) và thay đổi theo lứa tuổi (Goodwin & cs., 1992b). Vì vậy, cần căn cứ vào các yếu tố kể trên để đưa ra ngưỡng tỷ khối huyết cầu chỉ thị cho thiếu máu (Goodwin & cs., 1991; Goodwin & cs., 1992b). Mặc dù vậy, nhiều nghiên cứu không tuân theo khuyến

cáo nêu trên khi xác định giá trị tỷ khối huyết cầu để đánh giá hiện tượng thiếu máu ở gà bệnh (Aly, 2001; Van Santen & cs., 2004; Tan & Tannock, 2005; Hegazy & cs., 2014; Wani & cs., 2014; Tongkamsai & cs., 2019). Nhận biết

được các chú ý quan trọng đó, biến động về tỷ khối huyết cầu trong nghiên cứu này không dùng để đánh giá hiện tượng thiếu máu (do gây nhiễm virus cho giống

gà Hisex white) mà để chứng minh có hay không có sự khác biệt giữa nhóm gà

nhiễm CIAV và nhóm gà không nhiễm CIAV.

Ghi chú: tại mỗi thời điểm, tỷ khối huyết cầu được biểu diễn dưới dạng trung bình cho nhóm và biên độ dao động. Dấu * biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức p < 0,05.

Hình 4.10. Biến động tỷ khối huyết cầu ở nhóm gà gây nhiễm và đối chứng

Tại thời điểm 1 tuần sau gây nhiễm CIAV, tỷ khối huyết cầu trung bình của

nhóm gây nhiễm CIAV thấp hơn nhóm đối chứng, nhưng sự khác biệt này không

có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Dựa vào kết quả PCR, sau gây nhiễm 3 tuần bắt

đầu phát hiện gà dương tính với CIAV, tỷ khối huyết cầu từ thời điểm này ở

nhóm thí nghiệm bắt đầu giảm nhiều so với nhóm đối chứng. Từ tuần 5 sau gây

nhiễm trở đi, kết quả kiểm định về sự khác biệt tỷ khối huyết cầu giữa 2 nhóm gà

cho giá trị p < 0,05, chứng tỏ kết quả bắt đầu sai khác và có ý nghĩa thống kê. Trong đó, thấy rõ nhóm gà nhiễm CIAV có tỷ khối huyết cầu thấp hơn rõ rệt so với nhóm gà đối chứng (các vị trí đánh dấu *, hình 4.10).

Về thời điểm, các kết quả gây bệnh thực nghiệm cho biết biểu hiện thiếu máu (đánh giá qua chỉ tiêu bệnh lý vi thể hoặc tỷ khối huyết cầu) bắt đầu xuất

hiện trong tuần thứ nhất sau gây nhiễm, tiến triển nặng dần và nặng nhất sau khi nhiễm virus 2- 3 tuần (Yuasa & cs., 1979). Nghiên cứu (Toro & cs., 1997) cũng

thu được kết quả tương tự khi gây nhiễm chủng CIAV 10343 cho gà 1 ngày tuổi: giá trị hematocrit bắt đầu giảm ở tuần thứ 1 và giảm thấp xuống thấp nhất ở tuần thứ 3

sau khi nhiễm ở nhóm gà thí nghiệm, khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng.

Trong một số trường hợp, sự thay đổi chỉ số huyết học có thể xảy ra sớm, khoảng 8

ngày sau gây nhiễm virus (Mcnulty, 1991). Đối chiếu thời điểm bắt đầu xuất hiện hiện tượng virus huyết ở nhóm gà gây nhiễm (bảng 4.3) với thời điểm tỷ khối huyết

cầu có sự khác biệt giữa nhóm thí nghiệm và đối chứng (hình 4.10) có thể thấy độ

trễ là 2 tuần. Ở khía cạnh này, kết quả trên phù hợp với các mô tả trước đây.

4.1.4.5. Bệnh tích đại thể ở gà được gây nhiễm CIAV

Tại thời điểm hiện tượng thiếu máu là khác biệt rõ rệt nhất giữa nhóm thí

nghiệm và đối chứng (ngày 56 sau nhiễm virus, hình 4.10), toàn bộ gà của 2

nhóm được mổ khám để nghiên cứu biến đổi bệnh tích đại thể. Bệnh tích đại thể

được trình bày ở hình 4.11 và hình 4.12 là cơ quan tạo máu, mô lympho tập trung

và vị trí có biến đổi bệnh lý.

Hình 4.11. Bệnh tích đại thể ở tuyến ức và tủy xương

Hình 4.11 cho biết các thùy của tuyến ức ở nhóm gà đối chứng có kích thước tương đối đồng đều (hình 4.11E, 4.11F), trong khi đó kích thước của các

thùy này của nhóm thí nghiệm có sự teo một phần (hình 4.11B) hoặc teo gần như hoàn toàn (hình 4.11A). Tủy xương ở nhóm thí nghiệm nhạt màu (hình 4.11D) hoặc có màu vàng rõ (hình 4.11C). Ngược lại, tủy xương của nhóm gà đối chứng

luôn có màu đỏ nâu (hình 4.11G, 4.11H). Như vậy, gà được gây nhiễm bởi chủng CIAV thực địa trong nghiên cứu này có biến đổi bệnh tích điển hình của bệnh

thiếu máu truyền nhiễm, giống như mô tả của nhiều nghiên cứu trên thế giới

(Yuasa & cs., 1979; Yuasa & cs., 1980).

Hình 4.12. Bệnh tích đại thể ở túi Fabricius và gan

Trong trạng thái sinh lý bình thường, tuyến ức và túi Fabricius teo nhỏ/

thoái hóa khi gà > 13 tuần tuổi (Tarek & cs., 2012). Hiện tượng teo túi Fabricius

ở gà < 13 tuần tuổi có thể quan sát rõ ràng hơn khi so sánh kích thước với lách. Một số nghiên cứu trước đây (Mcnulty, 1991; Smyth & cs., 1993; Dhama & cs., 2002) đã khẳng định tổn thương do CIAV gây ra không chỉ làm cạn kiệt các yếu tố bạch huyết không những ở tuyến ức mà còn ở túi Fabricius, các hạch manh

tràng cùng với các tổn thương ở mô sinh sản. Ở nhóm gà nhiễm CIAV, ngoài

tuyến ức, túi Fabricius cũng là cơ quan có biến đổi rõ với hiện tượng teo nhỏ, kết quả được trình bày ở hình 4.12A - 4.12F. Hình 4.12A - 4.12C cho thấy kích

thước túi Fabricius của nhóm gà đối chứng luôn lớn gấp 3 lần so với kích thước lách. Ngược lại, ở nhóm gà nhiễm CIAV, kích thước tương đối túi Fabricius so

với kích thước của lách chỉ gấp khoảng 1,5 lần (hình 4.12D, 4.12E), thậm chí là

nhỏ hơn (hình 4.12F). Kết quả trên cho thấy túi Fabricius ở nhóm gà thí nghiệm

đã teo nhỏ. Hiện tượng thoái hóa/ teo nhỏ của tuyến ức và túi Fabricius ở gà nhiễm CIAV có thể được giải thích là do virus có thể nhân lên ở nhiều loại tế bào

của gà mẫn cảm, trong đó có các tế bào tiền lympho T (Adair, 2000). Ngoài các

cơ quan kể trên, khi đối chiếu màu gan giữa nhóm thí nghiệm và nhóm đối

chứng, có thể thấy rõ màu gan vàng hơn ở nhóm thí nghiệm (hình 4.12J - 4.12L)

so với nhóm đối chứng (hình 4.12G - 4.12I). Kết quả này phản ánh tình trạng

thiếu máu, dẫn tới nhạt màu của một số cơ quan nội tạng, nhất là gan. Trong quá

trình mổ khám, ngoài những cơ quan kể trên, hầu hết các hệ cơ quan khác của gà

nhiễm CIAV đều không có biến đổi bệnh tích đại thể rõ so với nhóm đối chứng. Biến đổi bệnh tích chính ở gà sau một thời gian gây nhiễm thực nghiệm được

tổng hợp và trình bày ở bảng 4.4.

Bảng 4.4. Bệnh tích đại thể ở nhóm gà nhiễm CIAV

Số gà

Tỷ lệ

Biến đổi bệnh tích

mổ khám (con)

có bệnh tích (con)

(%)

Tủy xương nhạt màu

77,8

Tuyến ức teo

33,3

Tuyến ức xuất huyết

88,9

Gan có ánh vàng

77,8

Túi Fabricius teo

55,6

Túi Fabricius xuất huyết

0,0

Xuất huyết cơ

0,0

Kết quả tổng hợp (bảng 4.4) cho thấy nhóm gà thí nghiệm xuất hiện bệnh tích điển hình của bệnh thiếu máu truyền nhiễm là hiện tượng tủy xương nhạt

màu với tỷ lệ 77,8%, tiếp sau là teo túi Fabricius (55,6%) và teo tuyến ức (33,3%). Ngoài ra, các bệnh tích khác như gan nhạt màu và xuất huyết điểm ở tuyến ức cũng gặp với tỷ lệ cao, lần lượt là 77,8% và 88,9%. Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về biến đổi bệnh tích đại thể của gà mắc bệnh thiếu

máu truyền nhiễm ở ngoài tự nhiên (Buscaglia & cs., 1994; Toro & cs., 1997; Ledesma & cs., 2001; Rimondi & cs., 2014) cũng như trong điều kiện thí nghiệm (Goodwin & cs., 1989; Bougiouklis & cs., 2007; Hegazy & cs., 2014; Simeonov

& cs., 2014; Hussein & cs., 2016), điểm chung của các nghiên cứu này là: ngoại trừ một số bệnh tích ít gặp như xuất huyết dưới da, xuất huyết cơ, biến đổi ở

tuyến ức và tủy xương là phổ biến nhất. Dựa vào đặc điểm trên, kết quả nghiên

cứu về biến đổi bệnh tích đại thể của nhóm gà nhiễm CIAV trong nghiên cứu này

là phù hợp. Tuy nhiên, nghiên cứu này không phát hiện được bệnh tích xuất huyết ở một số cơ quan như dạ dày tuyến và cơ đùi, cơ lườn đã được mô tả khi

gây bệnh thực nghiệm cho gà SPF 1 ngày tuổi (Yuasa & cs., 1979). Sự khác biệt

về loại tổn thương cũng như mức độ nghiêm trọng của tổn thương đã được chứng

minh phụ thuộc vào độc lực của chủng virus (Spackman & cs., 2002a). Cũng cần

chú ý, bệnh tích teo túi Fabricius hoặc teo tuyến ức có thể do nhiễm virus gây

bệnh Gumboro hoặc virus Marek’s thể tăng độc lực (vvIBDV, vv+ MDV)

(Calnek & cs., 1998; Stoute & cs., 2009). Do đó, chẩn đoán lâm sàng bệnh thiếu

máu truyền nhiễm cần (i) phân biệt với các bệnh kể trên và (ii) dựa vào đặc điểm về lứa tuổi và bệnh tích ở tủy xương.

Từ các kết quả đạt được, nghiên cứu hoàn toàn có cơ sở khẳng định sự có

mặt của bệnh thiếu máu truyền nhiễm cũng như sự lưu hành của các chủng CIAV

tại miền Bắc Việt Nam là các chủng có độc lực. Bên cạnh đó, các biểu hiện lâm

sàng trong điều kiện gây nhiễm thực nghiệm cùng các quan sát thực tế đã góp

phần không nhỏ trong việc phát hiện bệnh, là cơ sở để thực hiện các nghiên cứu

chuyên sâu về CIAV tại Việt Nam. Trên cơ sở các kết quả đã đạt được, nghiên cứu tiến hành làm rõ một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng CIAV

lưu hành tại miền Bắc Việt Nam thông qua các bước: giải trình tự, phân tích gen

và xây dựng cây phát sinh loài của các chủng CIAV thực địa kết hợp so sánh và

phân tích với các trình tự đã có trong GenBank. Kết quả thu được sẽ góp phần

hoàn thiện bức tranh về sự lưu hành của các chủng CIAV tại miền Bắc Việt Nam.

4.2. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA CIAV TẠI MIỀN BẮC

4.2.1. Đặc điểm di truyền bộ gen của CIAV lưu hành ở miền Bắc 4.2.1.1. Cấu trúc bộ gen của CIAV

Để tìm hiểu đặc điểm cấu trúc bộ gen của CIAV lưu hành tại miền Bắc, bộ gen của 3 chủng virus đã được giải mã thành công (MH536104 - MH536106) và đều có kích thước 2298 nucleotide. Kích thước bộ gen của CIAV thu được trong

nghiên cứu này tương đương với đa số các chủng CIAV trên thế giới (161/ 176 chủng công bố trên GenBank dài 2298 nucleotide). Kết quả phân tích cấu trúc bộ gen 3 chủng CIAV ở miền Bắc được lần lượt trình bày ở các phần dưới đây.

Ghi chú:  ÷  trình tự nucleotide lặp (direct repeat); ATF: trình tự bám yếu tố khởi động phiên mã; CCAAT: trình tự tăng cường tính bám của yếu tố khởi đầu phiên mã; Sp1: trình tự giàu GC bám protein Sp1; TFIID: trình tự bám yếu tố khởi động phiên mã II D.

Hình 4.13. Cấu trúc vùng khởi đầu phiên mã của CIAV ở miền Bắc

Hình 4.13 trình bày cấu trúc đầu 5’ không mã hóa protein của CIAV. So với 2 chủng tham chiếu, 3/3 chủng CIAV của Việt Nam đều có 4 vùng trình tự

lặp lại (ký hiệu 1, 2, 4, 5, hình 4.13) và giống với chủng virus có độc lực (Cux-1,

mã số M81223). Vùng 5’ này còn chứa các trình tự bám cho yếu tố khởi động

quá trình phiên mã, ví dụ như ATF, CCAAT, Sp1 và TFIID (hình 4.13). Như vậy, 3 chủng virus ở miền Bắc mang cấu trúc gen đặc trưng ở vùng 5’ của CIAV

(Noteborn & cs., 1991). So sánh với chủng CIAV clone 10 (U66304) đã được

chứng minh có độc lực thấp (Meehan & cs., 1997), 3/3 chủng CIAV trong nghiên

cứu này và chủng Cux-1 độc lực cao đều không có đột biến thêm 21 nucleotide

(đánh dấu màu xám, hình 4.13) nằm giữa trình tự lặp số 2 và số 4.

Cho đến nay, cấu trúc vùng mã hóa protein trong bộ gen của CIAV đã

được làm rõ (Noteborn & cs., 1992a). Dựa vào chủng CIAV tham chiếu (M81223), đã xác định cấu trúc vùng gen mã hóa protein của 3/3 chủng CIAV

trong nghiên cứu này (hình 4.14).

Ghi chú: giá trị (%) biểu thị mức tương đồng nucleotide giữa các gen của 3 chủng CIAV ở miền Bắc với chủng virus tham chiếu M81223. Chiều của mũi tên biểu thị hướng của quá trình dịch mã.

Hình 4.14. Cấu trúc vùng mã hóa protein của CIAV ở miền Bắc

Có thể thấy vùng mã hóa protein của 3 chủng CIAV gồm 3 gen cùng chiều, lồng nhau, theo thứ tự ORF2 - ORF3 - ORF1 (hình 4.14). Về mức tương đồng, gen ORF2 tương đồng 100%, gen ORF3 tương đồng 98,3% - 99,2% và

gen ORF1 tương đồng từ 98,9% -99,1% so với chủng CIAV tham chiếu. Từ hai kết quả phân tích (hình 4.13 và hình 4.14) cho thấy: 3 chủng virus ở miền Bắc mang đầy đủ các cấu trúc bộ gen điển hình của CIAV.

4.2.1.2. Mức tương đồng trình tự nucleotide của bộ gen virus

Mức tương đồng trình tự bộ gen của 3 chủng CIAV ở miền Bắc đã được

so sánh với 176 chủng CIAV trên thế giới. Kết quả được trình bày ở hình 4.15.

Hình 4.15. Tương đồng trình tự nucleotide bộ gen giữa các chủng CIAV

Dựa vào sự phân bố về màu sắc (tương quan với mức tương đồng trình tự

nucleotide của bộ gen), có thể thấy rõ 179 chủng CIAV được chia thành 2 nhóm lớn: nhóm có mức tương đồng từ 94% - 96% và nhóm có mức tương đồng từ

97% - 100%. Kết quả trên cũng phù hợp với các công bố trước đây trên thế giới. Tại Ấn Độ, nghiên cứu (Gowthaman & cs., 2014) đã chỉ ra mức tương đồng rất cao (98%- 100%) giữa 16 chủng phân lập tại nước này; mức tương đồng (98,5% - 99,7%) với các chủng của Mỹ và Australia và (98,8% - 100%) là mức tương

đồng gen khi so sánh chúng với các chủng của Brazil, Malaysia và Bangladesh.

Nghiên cứu tiếp tục so sánh mức tương đồng dọc theo chiều dài bộ gen hoàn

chỉnh giữa 3 chủng CIAV của miền Bắc với các chủng virus thuộc 3 genogroup

(G1, G2 và G3) công bố trên GenBank. Kết quả thể hiện ở hình 4.16.

Ghi chú: 3 bộ gen CIAV lần lượt được so sánh với chủng virus tham chiếu thuộc genogroup 1 (A), 2 (B) và 3 (C). Dấu * và ★ đánh dấu các vùng có mức tương đồng < 95% (đường nét đứt).

Hình 4.16. Biến động về mức tương đồng dọc chiều dài bộ gen của CIAV

Khi xem xét toàn bộ genome của 3 chủng CIAV của Việt Nam kết hợp so

sánh với các chủng virus thuộc 3 genogroup của CIAV trên thế giới, kết quả cho

thấy: vùng gen có mức tương đồng cao (> 95%) của 3 chủng CIAV của Việt

Nam rộng hơn khi so sánh với các chủng thuộc nhóm di truyền G2, G3 (hình

4.15B, 4.15C); ngược lại vùng gen có mức tương đồng thấp (< 95%) giữa 3

chủng của Việt Nam chiếm diện tích rộng hơn khi so sánh với các chủng thuộc nhóm di truyền G1. Các nhận xét trên đã góp phần khẳng định gen mã hóa protein VP1 có nhiều biến đổi nhất so với 2 gen còn lại.

4.2.2. Đặc điểm di truyền của gen mã hóa capsid protein 4.2.2.1. Biến đổi di truyền ở cấp độ nucleotide

Đối với CIAV, sự biến đổi về trình tự nucleotide thường dao động trong

phạm vi 5% và tập trung ở vùng gen mã hóa cho protein VP1 (Ducatez & cs.,

2006; Eltahir & cs., 2011; Zhang & cs., 2013). Từ đó, nghiên cứu tiếp tục phân tích đặc điểm di truyền của gen mã hóa capsid protein (hình 4.17 - hình 4.18).

Dấu “.” biểu thị các nucleotide giống với trình tự của chủng virus tham chiếu Vx_P4_AJ890284

Hình 4.17. Trình tự gen ORF1 của CIAV (nucleotide 1-582)

7 chủng CIAV lần lượt được so sánh với 3 chủng virus vacxin. Chủng P4 và Cux-1 có trong các

vacxin tương ứng là Nobilis CAV P4 và AviPro Thymovac. Chủng 3711 được xác định là chủng virus vacxin qua thông tin truy cập ngân hàng gen (EF683159). Vị trí có trình tự khác so với

chủng vacxin tham chiếu được biểu thị bằng màu tương ứng với nucleotide sai khác.

Hình 4.18. Kết quả so sánh trình tự phân đoạn gen ORF1

Từ các mẫu dương tính với CIAV, 2 mẫu ngẫu nhiên của mỗi trại được chọn để giải trình tự. Sau khi lược bỏ các trình tự nucleotide giống nhau, có 7 trình tự gen

đại diện được giữ lại. Kết quả so sánh trình tự phân đoạn gen ORF1 giữa 7 chủng

CIAV thực địa (C1, C5, C8, C10, C12, C13, C16) được minh họa ở hình 4.17. Kết

quả cho thấy: 7 chủng CIAV đại điện sai khác nhau ở 27 vị trí nucleotide so với chủng tham chiếu Cux-1; giữa chúng có mức tương đồng gen cao về trình tự

nucleotide (dao động từ 96,7% đến 99,8%); có 561/582 vị trí (chiếm 93,39%) không

có đột biến nucleotide và 21/582 vị trí (chiếm 3,61%) đột biến (đa hình nucleotide,

polymorphic). Trong số 21 đột biến điểm, vùng biến đổi của gen VP1 (Renshaw &

cs., 1996) chiếm 5 vị trí. Khi so sánh phân đoạn gen ORF1 (nucleotide 1 đến 580)

giữa các chủng CIAV của Việt Nam với 3 chủng CIAV dùng sản xuất vacxin phòng

bệnh thiếu máu truyền nhiễm, kết quả được trình bày ở hình 4.18.

Đối với 7 chủng đại diện (đóng khung nét đứt, hình 4.18), kết quả cho thấy

trong khoảng nucleotide 1- 200, chúng có mức tương đồng cao với 3 chủng virus

vacxin (chỉ sai khác ở 3 vị trí đối với chủng Cux-1 hoặc P4, và ở 7 vị trí đối với

chủng 3711). Tuy nhiên, sự sai khác tập trung trong khoảng nucleotide 201 - 582:

có đến 24 đột biến điểm khi so sánh với chủng Cux-1 hoặc P4; và 32 đột biến điểm

khi so sánh với chủng 3711. Tính chung trên chiều dài phân đoạn gen ORF1 được

so sánh (582 nucleotide), 7 chủng CIAV này sai khác từ 4,64% đến 6,70% so với 3

chủng virus vacxin. Nhận xét tương tự cũng được rút ra về đặc điểm đột biến trong khoảng nucleotide 1 - 200 và 201 - 582 khi so sánh 6 chủng CIAV của Việt Nam

năm 2013 (BN1, HN1, VP7-VP10) với 3 chủng virus vacxin (hình 4.18).

Kết quả phân tích đặc điểm di truyền của gen mã hóa cho VP1 của nghiên

cứu không những tương đồng với các kết quả của hai nghiên cứu (Trinh & cs.,

2015b; Van Dong & cs., 2019) mà còn chỉ ra sự khác biệt về nucleotide cho từng

phân đoạn gen trên gen ORF1, từ đó làm rõ mức tương đồng gen trên từng phân

đoạn giữa các chủng. Nếu như nghiên cứu của (Trinh & cs., 2015b) chỉ dừng lại

ở việc chỉ ra mức tương động gen giữa 6 chủng CIAV là 96,21%- 100%, trong đó mức tương đồng gen cao nhất của chủng BN1 và HN1, VP8 và VP9 (100%); nghiên cứu thứ hai của tác giả (Van Dong & cs., 2019) khẳng định mức tương đồng gen trong khoảng 94,66% - 99,77% giữa các chủng CIAV của nghiên cứu

này, trong đó mức tương đồng cao nhất (99,77%) khi so sánh trình tự gen VP1 giữa chủng Vietnam/HN2/16 và Vietnam/HN1/17 và mức tương đồng gen thấp nhất (94,66%) giữa chủng Vietnam/BN1/17 và Vietnam/BN2/16 thì với các kết

quả phân tích gen ở cấp độ nucleotide của nghiên cứu đã đi sâu phát hiện sự sai khác trong từng vị trí nucleotide trên gen VP1 cũng như khẳng định cụ thể hơn

về vùng dễ biến đổi trên gen ORF1 của các chủng CIAV lưu hành thực địa.

Ngoài việc xem xét sự tương đồng gen giữa các chủng phân lập tại thực địa,

các nghiên cứu còn tập trung tìm hiểu sự giống và khác biệt về cấu trúc gen với

các chủng có trong GenBank. Kết quả phân tích cho thấy: trình tự gen giữa các

chủng CIAV lưu hành tại miền Bắc Việt Nam tính đến thời điểm này có sự khác biệt về cấu trúc gen khi so sánh với chủng virus vacxin Cux-1. Bên cạnh đó, một

số nghiên cứu trên thế giới như Hàn Quốc đã chỉ ra 7 chủng CIAV được phân lập

có mối quan hệ di truyền gần với chủng virus vacxin 26P4 (D10068) với mức

tương đồng gen hơn 99,5% (Kim & cs., 2010) và các chủng này giống với các

chủng phân lập ở Nigeria, Malaysia và Ấn Độ (Chowdhury & cs., 2002; Ducatez & cs., 2006). Sự giống nhau về cấu trúc gen VP1 cũng được xác nhận giữa 19

chủng phân lập với chủng BD-3 ở Bangladesh trong nghiên cứu ở Slovenia

(Krapez & cs., 2006). Nghiên cứu ở Thái Lan trong nhiều năm (Wanasawaeng &

cs., 2013) đã chỉ ra 13 chủng phân lập có quan hệ gần gũi với các chủng ở Trung

Quốc và Nhật Bản (mức tương đồng gen là 99,2- 99,4%) tuy nhiên không có

chủng nào giống với chủng virus vacxin Cux-1 (M55918, M81223). Về khía

cạnh này, hai công trình nghiên cứu ở thời gian trước và cùng thời điểm với

nghiên cứu cũng chỉ ra: mức tương đồng cao (99,67% - 99,72%) của 4 chủng (BN1, HN1, VP8 và VP9) với trình tự gen (KJ728818) của Đài Loan và mức

tương đồng gen 99,34% của 2 chủng (VP7, VP10) với chủng KJ728827 tại nước

này (Trinh & cs., 2015b). Nghiên cứu thứ hai của (Van Dong & cs., 2019) cho

biết 7 trong số 9 chủng CIAV của nghiên cứu này có mức tương đồng gen cao

(99,03%) khi so sánh với các một số chủng của Trung Quốc (KU645516,

KU645510, KU050677 và KY486146) hoặc chủng KJ728827 của Đài Loan; mức tương đồng thấp hơn (98,74% và 97,25%) là mức tương đồng khi so sánh 2

trình tự gen còn lại với hai chủng của Mỹ (AF311892 và AF311900).

4.2.2.2. Biến đổi di truyền ở cấp độ amino acid

Đã có nhiều nghiên cứu kết hợp xem xét trình tự nucleotide trên gen ORF1 kết hợp phân tích trình tự amino acid tương ứng để làm rõ thêm một số đặc điểm sinh

học phân tử của các chủng CIAV. Vì vậy, nghiên cứu này tiếp tục phân tích trình tự amino acid của các chủng CIAV để tìm hiểu thêm đặc điểm phân tử của CIAV (hình 4.19). Phân tích trình tự amino acid suy diễn (vị trí 1 đến 194 của protein VP1)

của 7 chủng CIAV đại diện cho biết sự tương đồng rất cao (giống nhau ở 188/194 vị trí) và khác nhau ở 6 vị trí amino acid trên VP1.

Ghi chú: các vị trí amino acid đặc trưng theo nhóm di truyền được đánh dấu màu xám. Vùng biến đổi

(amino acid 139-151) được đóng khung. Dấu “.” biểu thị các amino acid giống với trình tự tham chiếu

Vx_P4_ AJ890284.

Hình 4.19. Trình tự amino acid suy diễn của một phần protein VP1

Kết quả này phù hợp với công bố của nhiều nghiên cứu trên thế giới. Tại Slovenia, nghiên cứu chỉ ra 19 chủng phân lập có mức tương đồng về amino acid

cao (100%) khi so sánh với nhau và giống với chủng BD-3 của Bangledesh ở mức 99,6%; với chủng G6 của Nhật Bản là 99,1% (Krapez & cs., 2006). Một nghiên cứu trước thời gian này tại Alabama của Hoa Kỳ (Van Santen & cs., 2001) chỉ ra mức khác biệt giữa các chủng CIAV phân lập khi xem xét gen VP1 ở mức độ amino acid trong khoảng 2,4% đến 2,8% (chỉ có một sự khác biệt trong vùng gen VP1 tại vị trí amino acid 22). Điều đó có nghĩa: mức tương đồng ở cấp độ amino acid giữa các chủng CIAV trong nghiên cứu rất cao. 22 trình tự amino acid trong nghiên cứu tại Slovenia (Krapez & cs., 2006) có mức tương đồng cao (96,6%- 99,8%) và sự khác biệt giữa các chủng được quan sát ở các vị trí 75, 97, 139, 144, 287, 370 và 447.

Nghiên cứu của (Van Dong & cs., 2019) đã phát hiện ra 9 vị trí amino acid (22H/N/Q, 75V/I, 97M/L, 125I/L, 139K/Q, 144E/Q, 287S/A, 370G/S và 376L/I) khác biệt khi so sánh các chủng của nghiên cứu với các chủng từ các khu vực. Tất cả các chủng CIAV của Việt Nam có amino acid T và Q tại hai vị trí 89 và 394 trên VP1. Trong khi đó nghiên cứu trước đây của (Trinh & cs., 2015b) chỉ ra 12 vị trí amino acid (22, 75, 97, 125,139, 144, 287, 290, 370, 376, 394, 413) khi so sánh trình tự amino acid trên VP1 của 6 chủng thuộc nghiên cứu với các trình tự khác trong ngân hàng gen; tất cả 6 chủng đều chứa Q ở vị trí 394 (Q394).

Bên cạnh đó, trình tự amino acid trên gen VP1 còn đặc trưng cho các nhóm di truyền. Theo đó, capsid protein VP1 có trình tự amino acid đặc trưng theo nhóm di truyền: của nhóm 1 hoặc nhóm 3 là 75V97M139K144E/K/N và của nhóm 2 là 75I/T97L139Q144Q (Ducatez & cs., 2008). Kết quả phân tích trình tự amino acid của các chủng CIAV thuộc nghiên cứu cho phép khẳng định: 4 chủng (C5, C12, C13 và C16) mang trình tự amino acid 75V97M139K144E là đặc trưng của nhóm 1 hoặc nhóm 3; 3 chủng còn lại (C1, C8 và C10) mang trình tự amino acid 75I/T97L139Q144Q là đặc trưng của nhóm 2. Như vậy, dự đoán có ít nhất hai nhóm di truyền của CIAV lưu hành ở gà tại các địa điểm lấy mẫu. Ở 4 vị trí amino acid đặc trưng về nhóm di truyền có 2 vị trí nằm ở vùng biến đổi. Kết quả trên cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu CIAV đầu tiên ở Việt Nam (Trinh & cs., 2015b). Theo đó, 4 chủng (BN1, HN1, VP8 và VP9) mang trình tự amino acid đặc trưng của nhóm III (V75, M97, K139, E144) và 2 chủng (VP7 và VP10) mang đặc trưng của nhóm II (I75, L97, Q139, Q144). Phân tích phát sinh chủng loại dựa vào trình tự amino acid của VP1 cho phép xếp các chủng CIAV vào 3 nhóm di truyền. Theo đó, nghiên cứu tại Slovenia (Krapez & cs., 2006) đã xếp 3 chủng CIAV trong nghiên cứu vào cùng nhóm với chủng BD-3 phân lập ở Bangladesh, chủng G6 của Nhật Bản và chủng L-028 của Mỹ. Nghiên cứu đã khẳng định việc tập trung phân

tích đặc điểm của vùng gen VP1 có thể chỉ ra đặc điểm sinh học phân tử của các chủng CIAV mà không cần thiết phải xem xét toàn bộ genome. Đáng chú ý, các nghiên cứu gần đây tại Trung Quốc (Eltahir & cs., 2011; Zhang & cs., 2013) đã chỉ ra có nhiều đột biến amino acid, đặc biệt trên VP1 (60 vị trí) và sự tái tổ hợp trong cấu trúc gen CIAV. Theo đó việc phân chia chủng loại dựa vào trình tự amino acid có khác biệt so với khi phân chia dựa vào trình tự nucleotide.

4.2.2.3. Biến đổi amino acid ở các vị trí liên quan tới độc lực

Một số nghiên cứu trước đây cho biết vùng biến đổi có ảnh hưởng tới độc lực của CIAV (Renshaw & cs., 1996; Yamaguchi & cs., 2001). Trên cơ sở đó, nghiên cứu này tập trung phân tích một số vị trí amino acid được xem có ảnh hưởng đến khả năng gây độc của CIAV. Kết quả cho thấy: một số sự thay thế amino acid được chứng minh bằng thực nghiệm có liên quan đến sự giảm độc lực của CIAV (trong đó có ở các chủng virus vacxin) không thấy ở các chủng phân lập từ Việt Nam (bảng 4.5, phụ lục 3).

Bảng 4.5. Trình tự amino acid của VP1 liên quan đến độc lực của CIAV

Chủng đại diện

Số lượng trình tự

MH536105_G17.33.5_2017

75 I

89 T

Vị trí ở protein VP1 141 125 Q I

144 Q

394 Q

MF611946_C27_Han_2017

MH536106_G17.3.1_2017

MF611930_C12_HN_2017

Ghi chú: * chưa được xác định

Trình tự di truyền ở cấp độ amino acid trong bảng 4.5 cung cấp bằng chứng rõ ràng rằng không có chủng CIAV ở Việt Nam nào có sự biến đổi liên quan đến kiểu hình của chủng CIAV có độc lực thấp: 75I- 89T- 125L- 141L- 144E (Todd & cs., 2002). Bên cạnh đó, chỉ có 2 chủng (MH536105 và MH536106) có vị trí amino acid 394 (glutamin- Q) quy định tính độc lực của CIAV được tìm thấy trong 4 chủng đại diện thuộc nghiên cứu (bảng 4.5). Có sự tương đồng khi nghiên cứu tại Trung Quốc (Eltahir & cs., 2011) phân tích 430 amino acid của VP1 của các chủng thực địa đã chỉ ra 30 vị trí mà amino acid có thay đổi, 2 trong số các vị trí thay đổi nằm trong vùng gen dễ biến đổi (aa 139 - 151); các chủng CIAV trong nghiên cứu có độc lực cao nếu tại vị trí đó là glutamin (Q) và ít độc lực hơn nếu vị trí đó là histidin (H). Và kết quả của nghiên cứu đã xác định toàn bộ các chủng của nghiên cứu có glutamin (Q) tại vị trí đó, hay các chủng phân lập có độc lực cao. Kết quả của nghiên cứu này tương tự với một số công bố trước đây (Todd &

cs., 1992; Yamaguchi & cs., 2001; Dhama, 2002; Natesan & cs., 2006; Hailemariam & cs., 2008; Eltahir & cs., 2011). Các nghiên cứu trên chỉ ra sự thay thế amino acid tại vị trí 394 có thể làm giảm độc lực nếu có sự thay thế glutamin bởi histidin. Bên cạnh đó, tất cả 6 chủng trong nghiên cứu của (Trinh & cs., 2015b) và 9 chủng trong nghiên cứu của (Van Dong & cs., 2019) đều xác nhận vị trí amino acid 394 có Q (glutamin). Điều này góp phần khẳng định tính độc của các chủng CIAV đang lưu hành tại địa điểm lấy mẫu ở miền Bắc Việt Nam.

4.2.3. Nguồn gốc phát sinh chủng loại của CIAV lưu hành tại miền Bắc 4.2.3.1. Nguồn gốc phát sinh chủng loại dựa vào trình tự amino acid đặc trưng Sự khác biệt giữa 7 chủng CIAV đại diện của nghiên cứu này với 3 chủng

virus vacxin và 6 chủng CIAV của Việt Nam (công bố năm 2013) được làm rõ.

Ghi chú: Dựa vào các chủng tham chiếu đã biết nhóm di truyền, CIAV được chia thành nhóm 1, nhóm 2

và nhóm 3 (phân nhóm 3a, 3b). Giá trị bootstrap tại các nút node của cây phát sinh chủng loại được hiển thị cho phân nhánh chính. Bảng đính kèm liệt kê các vị trí có thay đổi amino acid được mã hóa, trong đó các vị trí amino acid đặc trưng nhóm di truyền được đánh dấu màu xám. Những vị trí amino acid có sai khác giữa 7 chủng CIAV trong nghiên cứu này với chủng virus vacxin P4 được đóng khung.

Hình 4.20. Cây phát sinh loài của CIAV dựa vào gen ORF1

Giống như một số nghiên cứu đã công bố (Snoeck & cs., 2012; Olszewska- Tomczyk & cs., 2016) cây phát sinh chủng loại dựa vào một phần trình tự gen

ORF1 (hình 4.20) cho biết CIAV có thể chia thành 3 nhóm di truyền. Trên cơ sở

đó, 100% chủng virus lưu hành ở Việt Nam thuộc nhóm G2 và G3. Đáng chú ý,

7/7 chủng CIAV của nghiên cứu này không nằm cùng nhánh với các chủng virus vacxin (chủng P4, Cux-1 và 3711). Thêm vào đó, kết quả so sánh trình tự amino

acid với chủng virus vacxin (P4) cho biết: (i) 4 chủng CIAV thực địa trong

nghiên cứu này (chủng C5, C12, C13 và C16) có 3 vị trí sai khác và (ii) 3 chủng

(C1, C8 và C10) có 7 vị trí sai khác (đóng khung, hình 4.20). Như vậy, các kết

quả trình bày ở trên cho thấy: (i) có hai nhóm di truyền của CIAV lưu hành ở gà

nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận khi dựa vào gen ORF1 (nhóm di truyền G2 và

G3 với 2 phân nhóm phụ là G3a, G3b); (ii) các chủng virus này khác với chủng

virus vacxin phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm hiện có trên thị trường Việt Nam (CAV P4- AJ890284). Nghiên cứu của (Van Dong & cs., 2019) phân tích

phát sinh gen dựa vào gen mã hóa cho VP1 cũng khẳng định: 9 chủng CIAV của

nghiên cứu thuộc về 3 nhóm di truyền (II, III và V), nhóm III có 3 phân nhóm

(IIIa, IIIb và IIIc). Nhóm II và nhóm V chỉ có 1 chủng đại diện và 7 chủng còn

lại thuộc nhóm III. Chủng CIAV thuộc nhóm V được cho là kết quả tái tổ hợp

giữa nhóm II và phân nhóm IIIc. Nghiên cứu cũng xác nhận: không có chủng nào

trong số 9 chủng cùng nhánh với các chủng virus vacxin (26P4 và Cuxhaven 1),

hiện có trên thị trường vacxin tại Việt Nam. Kết quả phân tích gen VP1 thuộc 6

chủng CIAV của nghiên cứu (Trinh & cs., 2015b) cũng chỉ ra sự khác biệt trong

hồ sơ amino acid của tất cả 6 chủng với các chủng virus vacxin (26P4, Cux-1 và

Del-Ros). Như vậy, có sự phù hợp về đặc điểm phân loại CIAV dựa vào đặc

trưng của gen VP1 cho tất cả các chủng CIAV của 2 nghiên cứu trên với 7 chủng

CIAV của nghiên cứu. Kết quả trên cũng phù hợp với công bố của nghiên cứu

(Craig & cs., 2009) khi khẳng định các chủng CIAV lưu hành tại Argentina có

chung trình tự amino acid tại các vị trí 22, 75, 97, 139, 144 và 414 và khác so với các chủng virus vacxin (Cux-1, Del-Ros) được sử dụng ở 4 vị trí 75, 97, 139, 144. Theo đó các chủng CIAV lưu hành được xếp vào nhóm di truyền G1, khác với các chủng virus vacxin thuộc về nhóm di truyền G2. Các kết quả thu được làm rõ thêm sự lưu hành rất phổ biến và đa nhóm di truyền của CIAV ở miền Bắc Việt Nam, qua đó góp phần vào hiểu biết chung về sự lưu hành của CIAV trên thế giới (Kim & cs., 2010; Snoeck & cs., 2012; Wani & cs., 2013).

Đặc điểm di truyền của các chủng CIAV ở miền Bắc Việt Nam được phân tích sâu hơn dựa trên việc xem xét sự biến đổi của gen VP1 được đánh giá thông

qua 12 vị trí amino acid đóng vai trò trong sự sao chép và độc lực của virus

(Renshaw & cs., 1996; Scott & cs., 2001; Yamaguchi & cs., 2001; Todd & cs.,

2002). Kết quả được minh họa qua hình 4.21. Có thể dễ nhận thấy trình tự amino acid đặc trưng là khác nhau giữa các genogroup G2 và G3 (hình 4.21A - 4.21C).

Điều này cũng được phản ánh giữa các genogroup G2 và G3 của các chủng

CIAV lưu hành ở một số tỉnh phía Bắc (hình 4.21B - 4.21D). Trong genogroup

G3, có 5 vị trí (mũi tên, hình 4.21C - 4.21E) có sự khác biệt rõ về trình tự amino

acid ở mỗi vị trí giữa các chủng CIAV thực địa và chủng vacxin/ các chủng được

tiếp đời nhiều lần. Theo đó, kết quả cho thấy tất cả các chủng virus thuộc

genogroup G3 của Việt Nam (hình 4.21D) giống với kiểu trình tự của các chủng

CIAV phân lập từ thực địa (hình 4.21C).

Ghi chú: các biểu đồ được tạo bằng WebLogo3 cho genogroup G2 (n = 63, A) và genogroup G3 (n = 319, C, E). Để so sánh, trình tự amino acid cũng được xây dựng cho CIAV của Việt Nam thuộc genogroup G2

(B) và genogroup G3 (D). Đối với genogroup G3, biểu đồ được tạo riêng cho các trình tự thuộc nhánh gồm các chủng vacxin (n = 74), các chủng tiếp đời nhiều lần (n = 245) (E) và các chủng khác (C, D). Mũi tên đánh dấu các vị trí có sự biến đổi khác nhau giữa các nhánh này. Chiều cao tổng thể của mỗi vị trí (tính bằng bit) cho thấy sự bảo thủ trình tự ở vị trí đó. Ở mỗi vị trí, chỉ có các thay đổi thường xuyên nhất được

hiển thị. Chiều cao của các kí hiệu trong chùm cho biết tần số tương đối của mỗi amino acid tại vị trí đó. Các amino acid được tô màu theo tính kỵ nước: màu xanh lam là ưa nước, xanh lá cây là trung tính và đen là kỵ nước. Các số trên trục hoành là vị trí amino acid của protein VP1

Hình 4.21. Trình tự các vị trí amino acid quan trọng của protein VP1

4.2.3.2. Nguồn gốc phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide

Nguồn gốc phát sinh chủng loại của CIAV lưu hành ở miền Bắc dựa vào

trình tự nucleotide được phân tích dưới nhiều cấp độ. Cây phát sinh loài của

CIAV được xây dựng từ bộ gen hoàn chỉnh (n = 162), gen VP1 hoàn chỉnh (n =

395) và một phần gen VP1 (n = 450) được trình bày ở hình 4.22.

Ghi chú: các chủng được phân chia thành 3 nhóm riêng biệt từ G1 đến G3. Các chủng CIAV phân lập ở Việt Nam được biểu thị bằng màu tím và đánh dấu bằng mũi tên theo năm phân lập: 2013 (mũi tên trống), 2016 (đầu mũi tên), 2017 (mũi tên đầy). Nhánh của các chủng vacxin và các chủng CIAV tiếp đời nhiều lần được đánh dấu bởi một mũi tên nét đứt

Hình 4.22. Cây phát sinh loài của CIAV dựa trên bộ gen hoàn chỉnh

Trong tất cả các trường hợp, CIAV luôn được chia làm 3 nhóm từ G1 đến

G3 với giá trị bootstrap cao (100%). Hình 4.22 và 4.23 cho thấy có một nhóm CIAV mới là G4 (Ou & cs., 2018). Tuy nhiên, sự phân chia đó có mức tin cậy không cao do giá trị bootstrap thấp (nhỏ hơn 50% trong cả hai cây phát sinh

chủng loại dựa trên cả bộ gen và gen VP1 hoàn chỉnh). Dựa trên cây phát sinh được suy ra từ bộ gen hoàn chỉnh, một chủng thuộc genogroup G3 được thu thập trong nghiên cứu này (G17.33.3, MH536104) nằm cùng nhóm với các chủng

vacxin (Nobilis P4, Del-Ros) cũng như các chủng tiếp đời nhiều lần (Cux -1 đời 310, SMSC-1 đời 60, đời 123, v.v.). Tuy nhiên, khi số lượng trình tự gen tham

chiếu tăng lên (n = 395 cho gen VP1 hoàn chỉnh, n = 450 cho một phần gen

VP1), mối quan hệ giữa các chủng CIAV lưu hành tại miền Bắc Việt Nam được

xác định chính xác hơn. Kết quả: không có chủng CIAV nào của Việt Nam (được thu thập trong năm 2013, 2016 và 2017) nằm cùng nhóm với các chủng virus

vacxin (hình 4.22, hình 4.23).

Hình 4.23. Cây phát sinh loài của CIAV dựa trên gen VP1 hoàn chỉnh

Ghi chú: các chủng được phân chia thành 3 nhóm riêng biệt từ G1 đến G3. Các chủng CIAV phân lập ở Việt Nam được biểu thị bằng màu tím và đánh dấu bằng mũi tên theo năm phân lập.

Hình 4.24. Cây phát sinh loài của CIAV dựa trên một phần gen VP1

Tất cả các chủng CIAV phân lập được ở Việt Nam (mũi tên đầy, hình 4.22, 4.23, 4.24) đều thuộc genogroup G2 và G3. Một điều nhận thấy rõ: khi một số lượng lớn các trình tự (450 trình tự ở hình 4.24) được đưa vào phân tích phát sinh gen thì kết quả: toàn bộ các chủng CIAV thuộc về 2 nhóm di truyền là G2 và G3; trong đó phần lớn các chủng của Việt Nam thuộc nhóm di truyền G3 và chỉ có vài chủng thuộc nhóm G2, phù hợp với các kết quả của hai công bố trước đây (Trinh & cs., 2015b; Van Dong & cs., 2019) khi đều khẳng định đa số các chủng đều thuộc nhóm di truyền G3. Tuy nhiên, (Van Dong & cs., 2019) cho rằng có 1 chủng CIAV thuộc nhóm di truyền mới (genogroup V) là kết quả của sự tái tổ hợp gen giữa genogroup II và IIIc. Mặc dù vậy, kết luận này cần được kiểm chứng với số lượng trình tự gen CIAV nhiều hơn. Vì vậy, có thể khẳng định các nghiên cứu về CIAV tại Việt Nam từ trước đến nay đều chung khẳng định sự lưu hành phổ biến của 2 nhóm di truyền G2 và G3, trong đó phần lớn các chủng thực địa đều thuộc nhóm di truyền G3.

4.2.4. Đặc điểm phát tán theo không gian và thời gian của CIAV lưu hành tại miền Bắc

Kết quả trình bày ở hình 4.22 - 4.24 đã cho thấy số lượng trình tự gen có

ảnh hưởng tới tính chính xác của việc xác định nguồn gốc phát sinh chủng loại

của CIAV. Để nghiên cứu một cách đầy đủ và chính xác nhất về nguồn gốc phát sinh, quá trình phát tán theo không gian và thời gian của CIAV lưu hành ở miền

Bắc, nghiên cứu đã phân tích cơ sở dữ liệu gồm 984 trình tự gen (hình 4.25).

Hình 4.25. Kết quả xác định đặc điểm phân nhánh CIAV

Kết quả phân tích tiếp tục khẳng định có 2 genogroup là G2 và G3 lưu hành ở miền Bắc Việt Nam và phù hợp với các kết quả trình bày ở hình 4.22 - hình

4.24. Từ kết quả trình bày ở hình 4.25, đã xác định được một số nhánh của cây phát sinh chủng loại dẫn tới các chủng CIAV ở miền Bắc. Trên cơ sở đó, sự phát tán của virus theo không gian và thời gian đã được phân tích cho từng nhánh.

4.2.4.1. Đặc điểm phát tán theo không gian và thời gian của genogroup G2

Ghi chú: (A) cây phát sinh chủng loại với các nhánh được vẽ bằng màu riêng biệt, tương ứng với địa điểm

(quốc gia/ tỉnh của Việt Nam) mà chủng CIAV được dự đoán bắt nguồn. (B) Mũi tên có hướng chỉ con đường phát tán của virus giữa các địa điểm. Địa điểm được dự đoán là nguồn gốc phát sinh và lây lan của

virus tới địa điểm khác được đánh dấu bởi hình tròn; với kích thước của vòng tròn tỷ lệ thuận với số lượng trình tự gen virus trong mỗi địa điểm được dự đoán. Ở các nút (node) không dự đoán được địa điểm phát sinh và lây lan của virus sẽ được đánh dấu bởi nét đứt (hình A) hoặc hình đa giác (hình B)

Hình 4.26. Nguồn gốc, sự phát tán của CIAV nhánh G2.1 tại miền Bắc

Hình 4.27. Nguồn gốc, sự phát tán của CIAV nhánh G2.2 tại miền Bắc

Các nhánh được đánh dấu bằng màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ được dự đoán và chiều dài được căn chỉnh tương ứng với trục thời gian được dự

đoán. Hình 4.25 cho biết CIAV thuộc genogroup G2 lưu hành ở miền Bắc thuộc

về 2 nhánh, ký hiệu là G2.1 và G2.2. Kết quả phân tích đặc điểm dịch tễ học

phân tử của CIAV thuộc genogroup G2 lưu hành ở miền Bắc dựa vào trình tự gen ORF1 được trình bày cho từng nhánh (hình 4.26 và hình 4.27). Kết quả phân

tích cơ sở dữ liệu gồm 344 trình tự ORF1 của genogroup G2 dự đoán CIAV

thuộc nhóm này phát sinh từ khoảng những năm 1971, khoảng tin cậy 95% trong

khoảng 1953 - 1976. Chủng virus tổ tiên của genogroup này được dự đoán có

nguồn gốc từ Nhật Bản. Ở các nhánh chính của cây phát sinh chủng loại, đã dự

đoán có sự phát tán của CIAV qua một số nước, ví dụ: Nhật Bản -> Braxin,

Braxin -> Argentina, v.v...

Về nguồn gốc, CIAV ở miền Bắc thuộc genogroup này được dự đoán bắt

nguồn từ chủng virus lưu hành ở Argentina (nhánh G2.1), Mỹ (nhánh G2.2). Kết

quả phân tích này cho biết có nhiều đợt xâm nhập của genogroup G2 vào Việt

Nam. Kết quả phân tích đã cho biết sau khi xâm nhập vào Việt Nam (khoảng

năm 2010), các chủng virus này đã có sự phát tán ra một số tỉnh/thành phố: Hà

Nội và Vĩnh Phúc. Về mặt thời gian, hình 4.26- hình 4.27 cho thấy, mặc dù 6

mẫu CIAV thuộc nhánh G2.1 đều được lấy vào năm 2017, nhưng kết quả dự

đoán thời điểm sớm nhất mà virus xuất hiện tại các địa phương sớm hơn khoảng 10 năm trước thời điểm mẫu được lấy. Kết quả phân tích đặc điểm dịch tễ học

phân tử cho thấy sự đa dạng về nguồn gốc phát sinh của CIAV genogroup G2 lưu

hành ở miền Bắc. Nghiên cứu trước đây tại của (Trinh & cs., 2015b) nhận thấy 2

chủng VP7 và VP10 thuộc nhóm di truyền G2 và các chủng được báo cáo có

nguồn gốc từ châu Á, phía Bắc và phía Nam của Mỹ và vùng biển Thái Bình

Dương. Với đặc điểm phát sinh và nguồn gốc của các chủng CIAV thuộc genogroup 2 thì kết quả nghiên cứu của chúng tôi cụ thể và chính xác hơn.

4.2.4.2. Đặc điểm phát tán theo không gian và thời gian của genogroup G3

Kết quả phân tích cơ sở dữ liệu gồm 601 trình tự ORF1 của genogroup G3 dự đoán CIAV thuộc nhóm này phát sinh từ khoảng những năm 1941, khoảng tin cậy 95% trong khoảng 1921 - 1960. Giống như genogroup G2 (nhánh G2.1),

chủng virus tổ tiên của genogroup G3 cũng được dự đoán có nguồn gốc từ Nhật Bản. Ở các nhánh chính của cây phát sinh chủng loại, đã dự đoán có sự phát tán của CIAV qua một số nước: Nhật Bản -> Braxin, Nhật Bản -> Mỹ, v.v...

Ghi chú: sau khi xâm nhập, CIAV thuộc nhánh 3.1 lây lan giữa các đàn gà nuôi tại Hà Nội là

chủ yếu. Một số chủng được dự đoán phát tán sang đàn gà nuôi tại Hải Phòng.

Hình 4.28. Sự phát tán theo không gian và thời gian của nhánh 3.1

Ghi chú: sau khi xâm nhập, CIAV thuộc nhánh 3.2 được tìm thấy ở nhiều địa phương (Bắc Ninh, Quảng Ninh, Hà Nam, Hòa Bình và Vĩnh Phúc). Tuy nhiên, chưa thấy rõ sự phát tán của

virus giữa các đàn gà trong cùng một tỉnh.

Hình 4.29. Sự phát tán theo không gian và thời gian của nhánh 3.2

Ghi chú: sau khi xâm nhập, CIAV thuộc nhánh 3.3 lây lan giữa các đàn gà nuôi tại Hà Nam là chủ yếu. Một số chủng được dự đoán phát tán sang đàn gà nuôi tại Bắc Ninh, Quảng Ninh và Hà Nội.

Hình 4.30. Sự phát tán theo không gian và thời gian của nhánh 3.3

CIAV lưu hành tại miền Bắc Việt Nam thuộc genogroup G3 chiếm số lượng nhiều nhất (62/73 trình tự gen ORF1). Đáng chú ý, kết quả trình bày ở

hình 4.28- hình 4.30 cho thấy chúng có nguồn gốc không thuần nhất (thuộc về

nhiều nhánh khác nhau của cây phát sinh chủng loại, nhánh G3.1 - G3.3). Về

nguồn gốc, CIAV ở miền Bắc thuộc genogroup G3 được dự đoán bắt nguồn từ chủng virus lưu hành ở một số quốc gia như: Trung Quốc (nhánh G3.3), Đài

Loan (nhánh G3.2); và Ba Lan (nhánh G3.1). Dựa vào đặc điểm phân nhánh này,

kết quả phân tích cho biết có nhiều đợt xâm nhập của genogroup G3 vào Việt

Nam. Đặc điểm phát tán theo không gian và thời gian của CIAV thuộc

genogroup G3 (nhánh G3.1- G3.3) sau khi xâm nhập vào các tỉnh miền Bắc Việt

Nam được trình bày cụ thể ở các (hình 4.28 - hình 4.30). Các hình trình bày cho

thấy CIAV thuộc nhánh G3.1, G3.2 và G3.4 sau khi xâm nhập, có khả năng đã

tạo thành những nhánh di truyền riêng biệt và tiếp tục lây lan ra các địa phương khác. Ở Việt Nam, xu hướng nhập nội các giống gà thịt chất lượng và gà sinh sản

cho năng suất cao đã diễn ra phổ biến trong nhiều năm nay. Theo ước tính, số

lượng các giống gà nhập nội từ hàng nghìn đến hàng triệu con, với số lượng

giống gà đa dạng (giống Hybro, AA, Hyline, Isa Brown, Leghorn trắng, v.v...) và

từ nhiều nước như Pháp, Hà Lan, Mỹ, CuBa, Thái Lan, Indonexia, v.v... Do đó,

kết quả phân tích chỉ ra nguồn gốc đa dạng (bắt nguồn từ chủng virus lưu hành ở

nhiều nước trên thế giới) của CIAV lưu hành ở miền Bắc Việt Nam là phù hợp

với lịch sử nhập nội con giống.

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. KẾT LUẬN

1) Về sự lưu hành virus và bệnh thiếu máu truyền nhiễm

- Đã xác định được CIAV lưu hành rộng rãi ở đàn gà nuôi tại 10 tỉnh/thành

phố miền Bắc Việt Nam với tỷ lệ nhiễm trung bình theo cá thể và trang trại lần lượt

là 62,2% và 73,4%;

- Gà ở mọi lứa tuổi, mục đích chăn nuôi, quy mô và phương thức chăn nuôi

đều nhiễm CIAV với tỷ lệ khác nhau; tuy nhiên chỉ thấy sự sai khác rõ rệt về tỷ lệ

nhiễm ở yếu tố phương thức chăn nuôi (nuôi thả tự do có tỷ lệ nhiễm 80,5% cao hơn

so với nuôi nhốt 52,6%);

- Bệnh thiếu máu truyền nhiễm đã xuất hiện ở đàn gà nuôi tại miền Bắc, với biến đổi bệnh tích đại thể điển hình ở gà mắc tự nhiên là teo cơ quan lympho và tủy

xương nhạt màu;

- CIAV lưu hành ở miền Bắc có độc lực; khi gây bệnh thực nghiệm đã gây ra

các biến đổi bệnh lý điển hình của bệnh thiếu máu truyền nhiễm: (i) tỷ khối huyết

cầu trung bình nhỏ hơn 27% và thấp hơn rõ rệt so với nhóm đối chứng; (ii) tủy

xương nhạt màu (77,8%), teo tuyến ức (33,3%), teo túi Fabricius (55,6%).

2) Về đặc điểm dịch tễ học phân tử của CIAV ở miền Bắc

- Trình tự ba chủng virus đại diện ở miền Bắc cho thấy chúng mang đầy

đủ cấu trúc bộ gen điển hình của CIAV, bao gồm đầu 5’ không mã hóa protein,

theo sau bởi 3 gen mã hóa protein cùng chiều, lồng nhau, theo thứ tự ORF2-

ORF3- ORF1;

- 100% số chủng CIAV ở miền Bắc có trình tự amino acid đặc trưng của

nhóm di truyền G3 là 75V97M139K144E/K/N và G2 là 75I/T97L139Q144Q; không có

chủng CIAV nào có sự biến đổi liên quan đến kiểu hình của virus có độc lực thấp (75I- 89T- 125L- 141L- 144E);

- Các chủng CIAV lưu hành tại miền Bắc thuộc về hai nhóm di truyền là genogroup G2 và G3; 100% số chủng không nằm cùng nhánh với các chủng

virus vacxin;

- CIAV lưu hành ở miền Bắc Việt Nam có nguồn gốc đa dạng, trong đó genogroup G2 có nguồn gốc từ các chủng virus lưu hành ở Argentina và Mỹ;

genogroup G3 có nguồn gốc từ chủng virus lưu hành ở Trung Quốc, Đài Loan và Ba Lan. Sau khi xâm nhập vào đàn gà nuôi tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam, các

chủng CIAV có khả năng đã tạo thành những nhánh di truyền riêng biệt và tiếp

tục lây lan ra các địa phương khác.

5.2. ĐỀ NGHỊ

1) Do sự lưu hành phổ biến của CIAV và sự có mặt của CIA ở đàn gà nuôi

tại miền Bắc Việt Nam nên để phòng bệnh có hiệu quả cần sử dụng vacxin phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm, đặc biệt là đối với đàn gà giống.

Tuy nhiên, do chủng lưu hành không nằm cùng nhánh với các chủng virus

vacxin hiện đang được cấp phép lưu hành tại Việt Nam nên việc nghiên cứu lựa

chọn loại vacxin phù hợp là rất cần thiết;

2) Do nghiên cứu này mới chỉ giới hạn lấy mẫu ở 10 tỉnh/thành phố miền

Bắc, nhưng đã thấy sự phát tán phức tạp của virus nên cần tiếp tục mở rộng phạm

vi nghiên cứu để có kết luận toàn diện hơn về sự lưu hành cũng như đặc điểm

dịch tễ học phân tử của CIAV ở đàn gà nuôi tại Việt Nam.

3) Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng của CIAV đến

hệ miễn dịch của gà, nhưng trong nghiên cứu này mới chỉ chứng minh độc lực

của CIAV dựa vào biến đổi bệnh lý một số chỉ tiêu; vì vậy cần tiếp cần tiếp tục

nghiên cứu chứng minh được khả năng gây ức chế miễn dịch

(immunosuppression) của các chủng CIAV lưu hành ở Việt Nam.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Đào Đoan Trang, Cao Thị Bích Phượng, Vũ Thị Ngọc, Nguyễn Văn Giáp & Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2018). Nghiên cứu sự lưu hành của virus gây bệnh thiếu

máu truyền nhiễm (chicken infectious anemia virus- CIAV) tại Hà Nội và

vùng phụ cận. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 16 (1): 36 - 45.

2. Đào Đoan Trang, Nguyễn Văn Giáp, Lê Thị Trinh, Trương Hà Thái, Lại Thị Lan Hương, Cao Thị Bích Phượng & Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2019). Nghiên cứu

một số chỉ tiêu lâm sàng, phi lâm sàng và biến đổi bệnh lý đại thể của gà

nhiễm virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm (chicken infectious anemia

virus- CIAV) trong điều kiện thí nghiệm. Tạp chí khoa học Nông nghiệp Việt

Nam, 17 (7): 546 - 557.

3. Le Thi My Huynh, Giap Van Nguyen, Luc Duc Do, Trang Doan Dao, Truong Van Le, Ngoc Thi Vu & Phuong Thi Bich Cao (2019). Chicken

infectious anemia virus infections in chickens in Northen Vietnam:

epidemiological features and genetic characterization of the causative agent.

Avian Pathology, 49 (1): 5 - 14.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Adair B. (2000). Immunopathogenesis of chicken anemia virus infection,

Developmental Comparative Immunology, 24(2-3): 247-255.

2. Aly M. M. (2001). Isolation of chicken infectious anemia virus from outbreaks in

broiler chickens in Egypt, Egypt. Vet. Med. Ass, 61(6): 137-147.

3. Bahmaninejad M. A., Tavasoly, A., Toroghi, R., Marjanmehr, H., Shoushtari, A.

& Ezzi, A. (2012). Experimental studies of pathogenecity of chicken infectious

anaemia virus (3 isolates) in Iran, Archives of Razi Institute, 67(1): 13-19.

4. Balamurugan V. & Kataria, J. M. (2006). Economically important non-oncogenic

immunosuppressive viral diseases of chicken- current status, Vet Res Commun,

30(5): 541-66.

5. Bougiouklis P. A., Sofia, M., Brellou, G., Georgopoulou, I., Billinis, C. &

Vlemmas, I. (2007). A clinical case of chicken infectious anemia disease and

virus DNA detection in naturally infected broilers in Greece, Avian Dis, 51(2):

639-42.

6. Bulow V. V. J. (1991). Avian infectious anemia and related syndromes caused by

chicken anemia virus, Critical Reviews in Poultry Biology.

7. Buscaglia C., Crosetti, C. F. & Nervi, P. 1994. Identification of chicken infectious

anaemia, isolation of the virus and reproduction of the disease in Argentina. Avian

Pathol. 1994/06/01 ed.

8. Calnek B., Harris, R., Buscaglia, C., Schat, K. & Lucio, B. (1998). Relationship

between the immunosuppressive potential and the pathotype of Marek's disease

virus isolates, Avian diseases, 42(1): 124-132.

9. Cardona C. J., Oswald, W. B. & Schat, K. (2000). Distribution of chicken

anaemia virus in the reproductive tissues of specific-pathogen-free chickens,

Journal of General Virology, 81(8): 2067-2075.

10. Caterina K. M., Frasca, S., Jr., Girshick, T. & Khan, M. I. (2004). Development of

a multiplex PCR for detection of avian adenovirus, avian reovirus, infectious

bursal disease virus, and chicken anemia virus, Mol Cell Probes, 18(5): 293-8.

11. Chandratilleke D., O'connell, P. & Schat, K. A. (1991). Characterization of

proteins of chicken infectious anemia virus with monoclonal antibodies, Avian

Dis, 35(4): 854-62.

12. Chowdhury S. M., Omar, A. R., Aini, I., Hair-Bejo, M., Jamaluddin, A. A., Kono,

Y., Darus, A. & Yatim, H. M. (2002). Isolation, identification and characterization

of chicken anaemia virus in Malaysia, J Biochem Mol Biol Biophys, 6(4): 249-55.

13. Craig M. I., Rimondi, A., Delamer, M., Sansalone, P., Konig, G., Vagnozzi, A. &

Pereda, A. (2009). Molecular characterization of chicken infectious anemia virus

circulating in Argentina during 2007, Avian Dis, 53(3): 331-5.

14. Crooks G. E., Hon, G., Chandonia, J. M. & Brenner, S. E. (2004). WebLogo: a

sequence logo generator, Genome Res, 14(6): 1188-90.

15. Davidson I., Kedem, M., Borochovitz, H., Kass, N., Ayali, G., Hamzani, E.,

Perelman, B., Smith, B. & Perk, S. (2004). Chicken infectious anemia virus

infection in Israeli commercial flocks: virus amplification, clinical signs,

performance, and antibody status, Avian diseases, 48(1): 108-118.

16. De Boer G. F., Van Roozelaar, D. J., Moormann, R. J., Jeurissen, S. H.,

Wijngaard, J. C., Hilbink, F. & Koch, G. (1994). Interaction between chicken

anaemia virus and live Newcastle disease vaccine, Avian Pathol, 23(2): 263-75.

17. Dhama K. (2002). Pathogenicity and immunosuppressive effects of chicken

infectious anaemia virus (CIAV) in chicks and evaluation of diagnostic tests for

its detection, Ph.D. Thesis, Indian Veterinary Research Institute; Bareilly, tr.

18. Dhama K., Kataria, J., Dash, B., Kumar, N. & Tomar, S. (2002). Chicken

infectious anaemia (CIA): a review, Indian Journal of Comparative Microbiology,

Immunology, Infectious Diseases, 23(1): 1-16.

19. Dhama K., Kataria, J., Senthilkumar, N. & Tomar, S. J. (2004). Differentiation of

Indian isolates of chicken anaemia virus by polymerase chain reaction-restriction

enzyme analysis, Indian Journal of Comparative Microbiology, Immunology,

Infectious Diseases, 25(2): 75-79.

20. Dhama K., Mahendran, M., Somvanshi, R. & Chawak, M. (2008). Chicken

infectious anaemia virus: an immunosuppressive pathogen of poultry- a review,

Indian J. Vet. Pathol, 32(2): 158-167.

21. Dohms J. E. & Saif, Y. M. (1984). Criteria for evaluating immunosuppression,

Avian Diseases, 28(2): 305-310.

22. Drummond A. J., Suchard, M. A., Xie, D. & Rambaut, A. (2012). Bayesian

phylogenetics with BEAUti and the BEAST 1.7, Mol Biol Evol, 29(8): 1969-73.

23. Ducatez M., Owoade, A., Abiola, J. & Muller, C. (2006). Molecular epidemiology

of chicken anemia virus in Nigeria, Archives of Virology, 151(1): 97-111.

24. Ducatez M. F., Chen, H., Guan, Y. & Muller, C. P. (2008). Molecular

epidemiology of chicken anemia virus (CAV) in southeastern Chinese live birds

markets, Avian Dis, 52(1): 68-73.

25. Eltahir Y. M., Qian, K., Jin, W., Wang, P. & Qin, A. (2011). Molecular

epidemiology of chicken anemia virus in commercial farms in China, Virology

journal, 8(1): 145.

26. Engstrom B. E. (1999). Prevalence of antibody to chicken anaemia virus (CAV)

in Swedish chicken breeding flocks correlated to outbreaks of blue wing disease

(BWD) in their progeny, Acta Vet Scand, 40(2): 97-107.

27. Engstrom B. E., Fossum, O. & Luthman, M. (1988). Blue wing disease of

chickens: experimental infection with a Swedish isolate of chicken anaemia agent

and an avian reovirus, Avian Pathol, 17(1): 33-50.

28. Eregae M. E., Dewey, C. E., Mcewen, S. A., Ouckama, R., Ojkic, D. & Guerin,

M. T. (2014). Flock prevalence of exposure to avian adeno-associated virus,

chicken anemia virus, fowl adenovirus, and infectious bursal disease virus among

Ontario broiler chicken flocks, Avian Dis., 58(1): 71-77.

29. Erfan A. M., Selim, A. A. & Naguib, M. M. (2018). Characterization of full

genome sequences of chicken anemia viruses circulating in Egypt reveals distinct

genetic diversity and evidence of recombination, Virus Res, 251: 78-85.

30. Fang L., Li, Y., Wang, Y., Fu, J., Cui, S., Li, X., Chang, S. & Zhao, P. (2017).

Genetic analysis of two chicken infectious anemia virus variants-related

Gyrovirus in stray mice and dogs: the first report in China, 2015, BioMed

research international, 2017(2017): 1-9.

31. Ganar K., Shah, M., Kamdi, B. P., Kurkure, N. V. & Kumar, S. (2017). Molecular

characterization of chicken anemia virus outbreaks in Nagpur province, India

from 2012 to 2015, Microb Pathog, 102: 113-119.

32. Gelderblom H., Kling, S., Lurz, R., Tischer, I. & Bülow, V. V. (1989).

Morphological characterization of chicken anaemia agent (CAA), Archives of

virology, 109(1-2): 115-120.

33. Gholami-Ahangaran M., Fathi-Hafshejani, E. & Seyed-Hosseini, R. (2013).

Seromolecular study of chicken infectious anemia in chickens, ostriches, and

turkeys in Iran, Journal of Applied Poultry Research, 22(3): 404-409.

34. Goodwin M. A., Brown, J., Davis, J. F., Girshick, T., Miller, S. L., Nordgren, R.

M. & Rodenberg, J. (1992a). Comparisons of packed cell volumes (PCVs) from

so-called chicken anemia agent (CAA; a virus)-free broilers to PCVs from CAA-

free specific-pathogen-free leghorns, Avian Dis, 36(4): 1063-6.

35. Goodwin M. A., Brown, J., Latimer, K. S. & Miller, S. L. (1991). Packed cell

volume reference intervals to aid in the diagnosis of anemia and polycythemia in

young leghorn chickens, Avian Dis, 35(4): 820-3.

36. Goodwin M. A., Brown, J., Miller, S. L., Smeltzer, M. A., Steffens, W. L. &

Waltman, W. D. (1989). Infectious anemia caused by a parvovirus-like virus in

Georgia broilers, Avian Dis, 33(3): 438-45.

37. Goodwin M. A., Davis, J. F. & Brown, J. (1992b). Packed cell volume reference

intervals to aid in the diagnosis of anemia and polycythemia in young broiler

chickens, Avian Dis, 36(2): 440-3.

38. Goryo M., Shibata, Y., Suwa, T., Umemura, T. & Itakura, C. (1987a). Outbreak of

anemia associated with chicken anemia agent in young chicks, Nihon Juigaku

Zasshi, 49(5): 867-73.

39. Goryo M., Suwa, T., Matsumoto, S., Umemura, T. & Itakura, C. (1987b). Serial

propagation and purification of chicken anaemia agent in MDCC-MSB1 cell line,

Avian Pathol, 16(1): 149-63.

40. Goryo M., Suwa, T., Umemura, T., Itakura, C. & Yamashiro, S. (1989).

Histopathology of chicks inoculated with chicken anaemia agent (MSB1-TK5803

strain), Avian Pathol, 18(1): 73-89.

41. Gowthaman V. (2019). Chicken infectious anaemia virus. In: Recent Advances in

Animal Virology. Malik, Y. S., Singh, R. K. and Yadav, M. P. (eds.). Springer

Singapore Singapore: 197-205 tr.

42. Gowthaman V., Singh, S. D., Dhama, K., Barathidasan, R., Srinivasan, P.,

Mahajan, N. K. & Ramakrishnan, M. A. (2014). Molecular characterization of

chicken infectious anemia virus isolated from commercial poultry with respiratory

disease complex in India, Adv. Anim. Vet. Sci, 2: 171-176.

43. Hadimli H. H., Erganis, O., Guler, L. & Ucan, U. S. (2008). Investigation of

chicken infectious anemia virus infection by PCR and ELISA in chicken flocks,

Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, 32(2): 79-84.

44. Hagood L. T., Kelly, T. F., Wright, J. C. & Hoerr, F. J. (2000). Evaluation of

chicken infectious anemia virus and associated risk factors with disease and

production losses in broilers, Avian Dis, 44(4): 803-8.

45. Hailemariam Z., Omar, A. R., Hair-Bejo, M. & Giap, T. C. (2008). Detection and

characterization of chicken anemia virus from commercial broiler breeder

chickens, Virol J, 5: 128.

46. Hall T. A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor

and analysis program for Windows 95/98/NT, Nucleic acids symposium series,

41(41): 95-98.

47. Haridy M., Sasaki, J., Ikezawa, M., Okada, K. & Goryo, M. (2012). Pathological

and immunohistochemical studies of subclinical infection of chicken anemia virus

in 4-week-old chickens, J Vet Med Sci, 74(6): 757-64.

48. Hoerr F. J. (2010). Clinical aspects of immunosuppression in poultry, Avian

diseases, 54(1): 2-15.

49. Hoop R. (1993). Transmission of chicken anaemia virus with semen, The

Veterinary record, 133(22): 551-552.

50. Hoop R. K., Guscetti, F. & Keller, B. (1992). An outbreak of infectious chicken

anemia in fattening chickens in Switzerland, Schweiz Arch Tierheilkd, 134(10):

485-9.

51. Hu L. B., Lucio, B. & Schat, K. A. (1993a). Abrogation of age-related

resistance to chicken infectious anemia by embryonal bursectomy, Avian Dis,

37(1): 157-69.

52. Hu L. B., Lucio, B. & Schat, K. A. (1993b). Depletion of CD4+ and CD8+ T

lymphocyte subpopulations by CIA-1, a chicken infectious anemia virus, Avian

Dis, 37(2): 492-500.

53. Hussein E., Arafa, A., Anwar, N. & Khafaga, A. (2016). Molecular and

pathological analysis of chicken anemia virus isolated from field infection in three

Egyptian Provinces, Adv. Anim. Vet. Sci, 4(5): 218-229.

54.

Imai K., Mase, M., Tsukamoto, K., Hihara, H. & Yuasa, N. (1999). Persistent

infection with chicken anaemia virus and some effects of highly virulent

infectious bursal disease virus infection on its persistency, Research in Veterinary

Science, 67(3): 233-238.

55.

Ishikawa S. A., Zhukova, A., Iwasaki, W. & Gascuel, O. (2019). A Fast

Likelihood Method to Reconstruct and Visualize Ancestral Scenarios, Mol Biol

Evol, 36(9): 2069-2085.

56.

Islam A., Wong, C., Walkden-Brown, S., Colditz, I., Arzey, K. & Groves, P.

(2002). Immunosuppressive effects of Marek's disease virus (MDV) and

herpesvirus of turkeys (HVT) in broiler chickens and the protective effect of HVT

vaccination against MDV challenge, Avian Pathology, 31(5): 449-461.

57.

Jeurissen S. & De Boer, G. J. V. Q. (1993). Chicken anaemia virus influences the

pathogenesis of Marek's disease in experimental infections, depending on the dose

of Marek's disease virus, Veterinary Quarterly, 15(3): 81-84.

58.

Jeurissen S. H., Wagenaar, F., Pol, J. M., Van Der Eb, A. J. & Noteborn, M. H.

(1992). Chicken anemia virus causes apoptosis of thymocytes after in vivo

infection and of cell lines after in vitro infection, J Virol, 66(12): 7383-8.

59. Kaffashi A., Noormohammadi, A. H., Allott, M. L. & Browning, G. F. (2006).

Viral load in 1-day-old and 6-week-old chickens infected with chicken anaemia

virus by the intraocular route, Avian Pathol, 35(6): 471-4.

60. Kim H. R., Kwon, Y. K., Bae, Y. C., Oem, J. K. & Lee, O. S. (2010). Molecular

characterization of chicken infectious anemia viruses detected from breeder and

broiler chickens in South Korea, Poult Sci, 89(11): 2426-31.

61. King A. M., Lefkowitz, E., Adams, M. J. & Carstens, E. B. (2011). Virus

taxonomy: ninth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses,

Elsevier, tr.

62. Krapez U., Barlic-Maganja, D., Toplak, I., Hostnik, P. & Rojs, O. Z. (2006).

Biological and molecular characterization of chicken anemia virus isolates from

Slovenia, Avian Dis, 50(1): 69-76.

63. Kye S. J., Kim, J. Y., Seul, H. J., Kim, S., Kim, S. E., Lee, H. S., Sorn, S. & Choi,

K. S. (2013). Phylogenetic analysis and genetic characterization of chicken

anemia virus isolates from Cambodia, Poult Sci, 92(10): 2681-6.

64. Ledesma N., Fehervari, T., Casaubon, M. T., Lucio, E. & Ratz, F. (2001).

Chicken infectious anemia in Mexico: virus identification and serology survey,

Avian diseases: 788-796.

65. Letunic I. & Bork, P. (2007). Interactive Tree Of Life (iTOL): an online tool for

phylogenetic tree display and annotation, Bioinformatics, 23(1): 127-128.

66. Li Y., Fang, L., Cui, S., Fu, J., Li, X., Zhang, H., Cui, Z., Chang, S., Shi, W. &

Zhao, P. (2017a). Genomic characterization of recent chicken anemia virus

isolates in China, Front Microbiol, 8: 401.

67. Li Y., Hu, Y., Cui, S., Fu, J., Wang, Y., Cui, Z., Fang, L., Chang, S. & Zhao, P.

(2017b). Molecular characterization of chicken infectious anemia virus from

contaminated live-virus vaccines, Poult Sci, 96(5): 1045-1051.

68. Li Y., Wang, Y., Fang, L., Fu, J., Cui, S., Zhao, Y., Cui, Z., Chang, S. & Zhao, P.

(2016). Genomic analysis of the chicken infectious anemia virus in a specific

pathogen-free chicken population in China, Biomed Res Int, 2016: 1-5.

69. Lole K. S., Bollinger, R. C., Paranjape, R. S., Gadkari, D., Kulkarni, S. S., Novak,

N. G., Ingersoll, R., Sheppard, H. W. & Ray, S. C. (1999). Full-length human

immunodeficiency virus type 1 genomes from subtype C-infected seroconverters

in India, with evidence of intersubtype recombination, J Virol, 73(1): 152-60.

70. Lucio B., Schat, K. & Shivaprasad, H. (1990). Identification of the chicken

anemia agent, reproduction of the disease, and serological survey in the United

States, Avian diseases, 34(1): 146-153.

71. Lutticken D. (1997). Viral diseases of the immune system and strategies to control

infectious bursal disease by vaccination, Acta Vet Hung, 45(3): 239-49.

72. Markowski-Grimsrud C. J., Miller, M. M. & Schat, K. A. (2002). Development of

strain-specific real-time PCR and RT-PCR assays for quantitation of chicken

anemia virus, Journal of virological methods, 101(1-2): 135-147.

73. Mcilroy S., Mcnulty, M., Bruce, D., Smyth, J., Goodall, E. & Alcorn, M. (1992).

Economic effects of clinical chicken anemia agent infection on profitable broiler

production, Avian diseases, 36(3): 566-574.

74. Mcneilly F., Smyth, J., Adair, B. & Mcnulty, M. (1995). Synergism between

chicken anemia virus (CAV) and avian reovirus following dual infection of 1-day-

old chicks by a natural route, Avian diseases, 39(3): 532-537.

75. Mcnulty M. S. (1991). Chicken anaemia agent: a review, Avian Pathology, 20(2):

187-203.

76. Mcnulty M. S., Connor, T. J., Mcneilly, F., Kirkpatrick, K. S. & Mcferran, J. B.

(1988). A serological survey of domestic poultry in the United Kingdom for

antibody to chicken anaemia agent, Avian Pathol, 17(2): 315-24.

77. Mcnulty M. S., Connor, T. J., Mcneilly, F., Mcloughlin, M. F. & Kirkpatrick, K.

S. (1990). Preliminary characterisation of isolates of chicken anaemia agent from

the United Kingdom, Avian Pathol, 19(1): 67-73.

78. Meehan B. M., Todd, D., Creelan, J. L., Connor, T. J. & Mcnulty, M. S. (1997).

Investigation of the attenuation exhibited by a molecularly cloned chicken anemia

virus isolate by utilizing a chimeric virus approach, J Virol, 71(11): 8362-7.

79. Meehan B. M., Todd, D., Creelan, J. L., Earle, J. A., Hoey, E. M. & Mcnulty, M.

S. (1992). Characterization of viral DNAs from cells infected with chicken

anaemia agent: sequence analysis of the cloned replicative form and transfection

capabilities of cloned genome fragments, Arch Virol, 124(3-4): 301-19.

80. Miles A. M., Anderson, A. S., Bernberg, E. L., Kent, J., Rosenberger, J. K., Pope,

C. R. & Morgan, R. W. (1999). Comparison of two serotype 1 MDV isolates,

Acta Virol, 43(2-3): 102-5.

81. Miller M. M., Ealey, K. A., Oswald, W. B. & Schat, K. A. (2003). Detection of

chicken anemia virus DNA in embryonal tissues and eggshell membranes, Avian

diseases, 47(3): 662-671.

82. Miller M. M. & Schat, K. (2004). Chicken infectious anemia virus: an example of

the ultimate host–parasite relationship, Avian Dis, 48(4): 734-745.

83. Mohamed M. A. (2010). Chicken infectious anemia status in commercial broiler

chickens flocks in Assiut-upper Egypt: occurrence, molecular analysis using PCR-

RFLP and apoptosis effect on affected tissues, International Journal of Poultry

Science, 9: 591-598.

84. Muhire B. M., Varsani, A. & Martin, D. P. (2014). SDT: a virus classification tool

based on pairwise sequence alignment and identity calculation, PLoS One, 9(9):

e108277.

85. Natesan S., Kataria, J. M., Dhama, K., Rahul, S. & Bhardwaj, N. (2006).

Biological and molecular characterization of chicken anaemia virus isolates of

Indian origin, Virus Res, 118(1-2): 78-86.

86. Nayabian H. & Mardani, K. (2013). Molecular characterization of the chicken

anaemia viruses isolated from broiler farms of west Azerbaijan, Iran, Avian

Pathol, 42(2): 108-13.

87. Niu J. T., Yi, S. S., Dong, G. Y., Guo, Y. B., Zhao, Y. L., Huang, H. L., Wang,

K., Hu, G. X. & Dong, H. (2019). Genomic characterization of diverse

gyroviruses identified in the feces of domestic cats, Sci Rep, 9(1): 13303.

88. Noteborn M., Verschueren, C., Koch, G. & Van Der Eb, A. J. (1998).

Simultaneous expression of recombinant baculovirus-encoded chicken anaemia

virus (CAV) proteins VP1 and VP2 is required for formation of the CAV-specific

neutralizing epitope, Journal of General Virology, 79(12): 3073-3077.

89. Noteborn M. H., De Boer, G. F., Van Roozelaar, D. J., Karreman, C., Kranenburg,

O., Vos, J. G., Jeurissen, S. H., Hoeben, R. C., Zantema, A., Koch, G. & Et Al.

(1991). Characterization of cloned chicken anemia virus DNA that contains all

elements for the infectious replication cycle, J Virol, 65(6): 3131-9.

90. Noteborn M. H. & Koch, G. (1995). Chicken anaemia virus infection: molecular

basis of pathogenicity, Avian Pathol, 24(1): 11-31.

91. Noteborn M. H., Kranenburg, O., Zantema, A., Koch, G., De Boer, G. F. & Van

Der Eb, A. J. (1992a). Transcription of the chicken anemia virus (CAV) genome

and synthesis of its 52-kDa protein, Gene, 118(2): 267-71.

92. Noteborn M. H., Todd, D., Verschueren, C. A., De Gauw, H. W., Curran, W. L.,

Veldkamp, S., Douglas, A. J., Mcnulty, M. S., Van Der, E. A. & Koch, G. (1994).

A single chicken anemia virus protein induces apoptosis, J Virol, 68(1): 346-51.

93. Noteborn M. H., Verschueren, C. A., Van Roozelaar, D. J., Veldkamp, S., Van

Der Eb, A. J. & De Boer, G. F. (1992b). Detection of chicken anaemia virus by

DNA hybridization and polymerase chain reaction, Avian Pathol, 21(1): 107-18.

94. Olszewska-Tomczyk M., Swieton, E., Minta, Z. & Smietanka, K. (2016).

Occurrence and phylogenetic studies of chicken anemia virus from Polish broiler

flocks, Avian Dis, 60(1): 70-4.

95. Oluwayelu D. O. (2010). Diagnosis and epidemiology of chicken infectious

anemia in Africa, African Journal of Biotechnology, 9(14): 2043-2049.

96. Otaki Y., Saito, K., Tajima, M. & Nomura, Y. (1992). Persistence of maternal

antibody to chicken anaemia agent and its effect on the susceptibility of young

chickens, Avian Pathol, 21(1): 147-51.

97. Ou S. C., Lin, H. L., Liu, P. C., Huang, H. J., Lee, M. S., Lien, Y. Y. & Tsai, Y.

L. (2018). Epidemiology and molecular characterization of chicken anaemia virus

from commercial and native chickens in Taiwan, Transbound Emerg Dis, 65(6):

1493-1501.

98. Peters M. A., Jackson, D. C., Crabb, B. S. & Browning, G. F. (2002). Chicken

anemia virus VP2 is a novel dual specificity protein phosphatase, J Biol Chem,

277(42): 39566-73.

99. Pope C. R. (1991). Chicken anemia agent, Vet Immunol Immunopathol, 30(1):

51-65.

100. Pringle C. R. (1999). Virus taxonomy at the XIth International Congress of

Virology, Sydney, Australia, 1999, Arch Virol, 144(10): 2065-70.

101. Renshaw R. W., Soiné, C., Weinkle, T., O'connell, P. H., Ohashi, K., Watson, S.,

Lucio, B., Harrington, S. & Schat, K. A. (1996). A hypervariable region in VP1 of

chicken infectious anemia virus mediates rate of spread and cell tropism in tissue

culture, Journal of virology, 70(12): 8872-8878.

102. Rimondi A., Pinto, S., Olivera, V., Dibarbora, M., Perez-Filgueira, M., Craig, M.

I. & Pereda, A. (2014). Comparative histopathological and immunological study

of two field strains of chicken anemia virus, Vet Res, 45: 102.

103. Rosario K., Breitbart, M., Harrach, B., Segalés, J., Delwart, E., Biagini, P. &

Varsani, A. (2017). Revisiting the taxonomy of the family Circoviridae:

establishment of the genus Cyclovirus and removal of the genus Gyrovirus,

Archives of virology, 162(5): 1447-1463.

104. Rosenberger J. K. & Cloud, S. S. (1989). The effects of age, route of exposure,

and coinfection with infectious bursal disease virus on the pathogenicity and

transmissibility of chicken anemia agent (CAA), Avian Dis, 33(4): 753-9.

105. Saleemi M. K., Khan, M. Z., Butt, S. L., Khan, A., Javed, I., Awan, F. S. &

Rafique, S. (2013). Molecular diagnosis and pathology of chicken infectious

anemia in commercial white Leghorn layer flocks in Pakistan, Pakistan Veterinary

Journal, 33(3).

106. Schat K. (2009). Chicken anemia virus. In: TT Viruses. Springer: 151-183 tr.

107. Schat K. & Van Santen, V. (2008). Chicken infectious anemia virus and other

circovirus infection, Diseases of Poultry: 209-249.

108. Scott A. N., Mcnulty, M. S. & Todd, D. (2001). Characterisation of a chicken

anaemia virus variant population that resists neutralisation with a group-specific

monoclonal antibody, Arch Virol, 146(4): 713-28.

109. Simeonov K., Petrova, R., Gyurov, B., Peshev, R. & Mitov, B. (2014). Isolation

and PCR identification of chicken anaemia virus infection in Bulgaria, Bulgarian

Journal of Veterinary Medicine, 17(4): 276-284.

110. Simionatto S., Lima-Rosa, C. A., Binneck, E., Ravazzolo, A. P. & Canal, C. W.

(2006). Characterization and phylogenetic analysis of Brazilian chicken anaemia

virus, Virus Genes, 33(1): 5-10.

111. Smyth J. A., Moffett, D. A., Mcnulty, M. S., Todd, D. & Mackie, D. P. (1993). A

sequential histopathologic and immunocytochemical study of chicken anemia

virus infection at one day of age, Avian Dis, 37(2): 324-38.

112. Snoeck C. J., Komoyo, G. F., Mbee, B. P., Nakoune, E., Le Faou, A., Okwen, M.

P. & Muller, C. P. (2012). Epidemiology of chicken anemia virus in Central

African Republic and Cameroon, Virol J, 9: 189.

113. Sommer F. & Cardona, C. (2003). Chicken anemia virus in broilers: dynamics of

the infection in two commercial broiler flocks, Avian Dis, 47(4): 1466-73.

114. Spackman E., Cloud, S., Pope, C. & Rosenberger, J. (2002a). Comparison of a

putative second serotype of chicken infectious anemia virus with a prototypical

isolate I. Pathogenesis, Avian diseases, 46(4): 945-955.

115. Spackman E., Cloud, S. S. & Rosenberger, J. K. (2002b). Comparison of a

putative second serotype of chicken infectious anemia virus with a prototypical

isolate II. Antigenic and physicochemical characteristics, Avian Dis, 46(4):

956-63.

116. Stoute S. T., Jackwood, D. J., Sommer-Wagner, S. E., Cooper, G. L., Anderson,

M. L., Woolcock, P. R., Bickford, A. A., Sentíes-Cué, C. G. & Charlton, B. R.

(2009). The diagnosis of very virulent infectious bursal disease in California

pullets, Avian diseases, 53(2): 321-326.

117. Tamura K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A. & Kumar, S. (2013). MEGA6:

molecular evolutionary genetics analysis version 6.0, Mol Biol Evol, 30(12):

2725-9.

118. Tan J. & Tannock, G. A. (2005). Role of viral load in the pathogenesis of chicken

anemia virus, Journal of General Virology, 86(5): 1327-1333.

119. Tannock G., Tan, J., Mawhinney, K., Todd, D., O'rourke, D. & Bagust, T. (2003).

A modified blocking ELISA for the detection of antibody to chicken anaemia

virus using an Australian strain, Australian veterinary journal, 81(7): 428-430.

120. Tarek K., Mohamed, M., Omar, B. & Hassina, B. (2012). Morpho-histological

study of the thymus of broiler chickens during post-hashing age, International

Journal of Poultry Science, 11(1): 78-80.

121. Tcherepanov V., Ehlers, A. & Upton, C. (2006). Genome Annotation Transfer

Utility (GATU): rapid annotation of viral genomes using a closely related

reference genome, BMC Genomics, 7: 150.

122. Todd D. (2000). Circoviruses: immunosuppressive threats to avian species: a

review, Avian Pathology, 29(5): 373-394.

123. Todd D., Creelan, J. L., Mackie, D. P., Rixon, F. & Mcnulty, M. S. (1990).

Purification and biochemical characterization of chicken anaemia agent, Journal

of General Virology, 71(4): 819-823.

124. Todd D., Mawhinney, K. A. & Mcnulty, M. S. (1992). Detection and

differentiation of chicken anemia virus isolates by using the polymerase chain

reaction, J Clin Microbiol, 30(7): 1661-6.

125. Todd D., Scott, A. N., Ball, N. W., Borghmans, B. J. & Adair, B. M. (2002).

Molecular basis of the attenuation exhibited by molecularly cloned highly

passaged chicken anemia virus isolates, J Virol, 76(16): 8472-4.

126. Tongkamsai S., Lee, M. S., Cheng, M. C., Chaung, H. C., Tsai, Y. L. & Lien, Y.

Y. (2019). Persistent infection with chicken anemia virus in 3-week-old chickens

induced by inoculation of the virus by the natural route, Pathogens, 8(2).

127. Toro H., Ewald, S. & Hoerr, F. J. (2006). Serological evidence of chicken

infectious anemia virus in the United States at least since 1959, Avian Dis, 50(1):

124-6.

128. Toro H., Gonzalez, O., Escobar, C., Cerda, L., Morales, M. A. & Gonzalez, C.

(2001). Vertical induction of the inclusion body hepatitis/hydropericardium syndrome

with fowl adenovirus and chicken anemia virus, Avian Dis, 45(1): 215-22.

129. Toro H., Ramirez, A. M. & Larenas, J. (1997). Pathogenicity of chicken anaemia

virus (isolate 10343) for young and older chickens, Avian Pathol, 26(3): 485-99.

130. Toro H., Van Santen, V. L., Hoerr, F. J. & Breedlove, C. (2009). Effects of

chicken anemia virus and infectious bursal disease virus in commercial chickens,

Avian Dis, 53(1): 94-102.

131. Trinh D. Q., Ogawa, H., Bui, V. N., Baatartsogt, T., Kizito, M. K., Yamaguchi, S.

& Imai, K. (2015a). Characterization of mAbs to chicken anemia virus and

epitope mapping on its viral protein, VP1, J Gen Virol, 96(Pt 5): 1086-1097.

132. Trinh D. Q., Ogawa, H., Bui, V. N., Nguyen, T. T. H., Gronsang, D., Baatartsogt,

T., Kizito, M. K., Aboelkhair, M., Yamaguchi, S., Nguyen, V. K. & Imai, K.

(2015b). Development of a blocking latex agglutination test for the detection of

antibodies to chicken anemia virus, Journal of Virological Methods, 221: 74-80.

133. Truchado D. A., Diaz-Piqueras, J. M., Gomez-Lucia, E., Domenech, A., Mila, B.,

Perez-Tris, J., Schmidt-Chanasit, J., Cadar, D. & Benitez, L. (2019). A novel and

divergent Gyrovirus with unusual genomic features detected in wild passerine

birds from a remote rainforest in French Guiana, Viruses, 11(12).

134. Urlings H. A., De Boer, G. F., Van Roozelaar, D. J. & Koch, G. (1993).

Inactivation of chicken anaemia virus in chickens by heating and fermentation,

Vet Q, 15(3): 85-8.

135. Vagnozzi A. E., Espinosa, R., Cheng, S., Brinson, D., O'kane, P., Wilson, J. &

Zavala, G. (2018). Study of dynamic of chicken infectious anaemia virus

infection: which sample is more reliable for viral detection?, Avian Pathol, 47(5):

489-496.

136. Van Dong H., Tran, G. T. H., Van Nguyen, G., Dao, T. D., Bui, V. N., Huynh, L.

T. M., Takeda, Y., Ogawa, H. & Imai, K. (2019). Chicken anemia virus in

northern Vietnam: molecular characterization reveals multiple genotypes and

evidence of recombination, Virus Genes, 55(5): 643-653.

137. Van Santen V. L., Joiner, K. S., Murray, C., Petrenko, N., Hoerr, F. J. & Toro, H.

(2004). Pathogenesis of chicken anemia virus: comparison of the oral and the

intramuscular routes of infection, Avian Dis, 48(3): 494-504.

138. Van Santen V. L., Li, L., Hoerr, F. J. & Lauerman, L. H. (2001). Genetic

characterization of chicken anemia virus from commercial broiler chickens in

Alabama, Avian Dis, 45(2): 373-88.

139. Vaziry A., Silim, A., Bleau, C., Frenette, D. & Lamontagne, L. (2011). Chicken

infectious anaemia vaccinal strain persists in the spleen and thymus of young chicks

and induces thymic lymphoid cell disorders, Avian pathology, 40(4): 377-385.

140. Vielitz E., Von Bulow, V., Landgraf, H. & Conrad, C. (1987). Anemia in broilers-

development of a vaccine for breeder stock, Zentralbl Veterinarmed B, 34(8):

553-7.

141. Wanasawaeng W., Buatong, J., Chaichote, S. & Chansiripornchai, N. (2013).

Molecular Characterization of chicken infectious anemia virus outbreaks during

2008-2011 in Thailand, The Thai Journal of Veterinary Medicine, 43(4): 497-502.

142. Wang A., Liu, F., Wang, Z., Jiang, X., Wang, W., Teng, K. & Xu, J. (2011).

Pathological study of SPF chickens experimentally infected with a Chinese IBDV

strain BC6/85, Asian Journal of Animal and Veterinary Advances, 6: 36-50.

143. Wani M., Dhama, K., Barathidasan, R., Gowthaman, V., Tiwari, R., Bhatt, P.,

Mahajan, N., Chawak, M., Singh, S. & Kataria, J. (2013). Molecular detection and

epidemiology of chicken infectious anaemia virus in India, J South Asian J. Exp.

Bio, 3(4): 145-151.

144. Wani M., Dhama, K., Tiwari, R., Barathidasan, R., Malik, Y., Singh, S. & Singh,

R. J. a. a. V. S. (2015). Immunosuppressive effects of chicken infectious anaemia

virus on T lymphocyte populations using flow cytometry and hematological

parameters during experimental subclinical infection in chicks, Advances in

Animal and Veterinary Sciences, 3(3): 143-150.

145. Wani M. Y., Dhama, K., Latheef, S. K., Barathidassan, R., Tiwari, R.,

Chakraborty, S., Chawak, M. M. & Singh, S. D. (2014). Experimental

pathological studies of an Indian chicken anaemia virus isolate and its detection

by PCR and FAT, Pak J Biol Sci, 17(6): 802-811.

146. Yamaguchi S., Imada, T., Kaji, N., Mase, M., Tsukamoto, K., Tanimura, N. &

Yuasa, N. (2001). Identification of a genetic determinant of pathogenicity in

chicken anaemia virus, J Gen Virol, 82(Pt 5): 1233-8.

147. Yang J. S., Song, D. S., Kim, S. Y., Lyoo, K. S. & Park, B. K. (2003). Detection

of porcine circovirus type 2 in feces of pigs with or without enteric disease by

polymerase chain reaction, J Vet Diagn Invest, 15(4): 369-73.

148. Yuasa N. (1983). Propagation and infectivity titration of the Gifu-1 strain of

chicken anemia agent in a cell line (MDCC-MSB1) derived from Marek's disease

lymphoma, National Institute of Animal Health Quarterly, 23(1): 13-20.

149. Yuasa N. (1992). Effect of chemicals on the infectivity of chicken anaemia virus,

Avian Pathology, 21(2): 315-319.

150. Yuasa N. & Imai, K. (1986). Pathogenicity and antigenicity of eleven isolates of

chicken anaemia agent (CAA), Avian Pathol, 15(4): 639-45.

151. Yuasa N., Imai, K. & Nakamura, K. (1988). Pathogenicity of chicken anaemia

agent in bursectomised chickens, Avian Pathol, 17(2): 363-9.

152. Yuasa N., Imai, K., Watanabe, K., Saito, F., Abe, M. & Komi, K. (1987).

Aetiological examination of an outbreak of haemorrhagic syndrome in a broiler

flock in Japan, Avian Pathology, 16(3): 521-526.

153. Yuasa N., Taniguchi, T., Goda, M., Shibatani, M., Imada, T. & Hihara, H. (1983).

Isolation of chicken anemia agent with MDCC-MSB1 cells from chickens in the

field, National Institute of Animal Health Quarterly, 23(3): 75-77.

154. Yuasa N., Taniguchi, T., Noguchi, T. & Yoshida, I. (1980). Effect of infectious

bursal disease virus infection on incidence of anemia by chicken anemia agent,

Avian Diseases: 202-209.

155. Yuasa N., Taniguchi, T. & Yoshida, I. (1979). Isolation and some characteristics

of an agent inducing anemia in chicks, Avian diseases: 366-385.

156. Yuasa N. & Yoshida, I. (1983). Experimental egg transmission of chicken anemia

agent, National Institute of Animal Health Quarterly, 23(3): 99-100.

157. Zhang X., Liu, Y., Wu, B., Sun, B., Chen, F., Ji, J., Ma, J. & Xie, Q. (2013).

Phylogenetic and molecular characterization of chicken anemia virus in southern

China from 2011 to 2012, Sci Rep, 3: 3519.

158. Zhang X., Xie, Q., Ji, J., Chang, S., Liu, J., Chen, F., Ma, J. & Bee, Y. (2012).

Complete genome sequence analysis of a recent chicken anemia virus isolate and

comparison with a chicken anemia virus isolate from human fecal samples in

China, J Virol, 86(19): 10896-7.

159. Zhou W., Shen, B., Yang, B., Han, S., Wei, L., Xiao, B. & Zhou, J. (1997).

Isolation and identification of chicken infectious anemia virus in China, Avian

Dis, 41(2): 361-4.

100

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Danh mục các trình tự gen sử dụng trong nghiên cứu

TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm GenBank Quốc gia Năm Nhóm GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT TT

1 KJ955377 Ai Cập 2010 AY583755 Ấn Độ 2004 KJ621016 Ấn Độ 2011 G2 81 41

2 82 KJ955380 Ai Cập 2010 AY583757 Ấn Độ 2004 KJ621003 Ấn Độ 2011 42 3 83 KJ955378 Ai Cập 2010 EF159948 Ấn Độ 2006 KJ621001 Ấn Độ 2011 43 G2

4 84 KJ955379 Ai Cập 2010 FJ883781 Ấn Độ 2006 KJ620998 Ấn Độ 2011 44 G2 5 85 KX171348 Ai Cập 2015 FJ896818 Ấn Độ 2006 KJ621006 Ấn Độ 2011 45 G2

6 86 MG827101 Ai Cập 2015 FJ883782 Ấn Độ 2007 KJ621019 Ấn Độ 2011 46 7 87 KX171349 Ai Cập 2015 EU424059 Ấn Độ 2008 KJ621020 Ấn Độ 2011 47

8 88 MG827098 Ai Cập 2015 KJ620989 Ấn Độ 2008 KJ621005 Ấn Độ 2011 48 9 89 MG827102 Ai Cập 2015 FJ498867 Ấn Độ 2008 KJ621010 Ấn Độ 2011 49

10 90 MG827103 Ai Cập 2015 KJ620992 Ấn Độ 2009 KP090256 Ấn Độ 2011 50 11 91 KX171350 Ai Cập 2015 KJ620994 Ấn Độ 2009 KJ621007 Ấn Độ 2011 51

12 92 KX171347 Ai Cập 2015 KP120758 Ấn Độ 2009 KJ621002 Ấn Độ 2011 52 13 93 MG827104 Ai Cập 2016 KP120756 Ấn Độ 2009 KJ621023 Ấn Độ 2012 53

14 94 MG827099 Ai Cập 2016 KP120757 Ấn Độ 2009 KJ621025 Ấn Độ 2012 54 15 95 MG827105 Ai Cập 2016 KJ620993 Ấn Độ 2009 KP090253 Ấn Độ 2012 55

16 96 MG827106 Ai Cập 2016 KJ620995 Ấn Độ 2009 KP090254 Ấn Độ 2012 56 17 97 MG827107 Ai Cập 2016 JF712621 Ấn Độ 2009 KJ621021 Ấn Độ 2012 57

18 98 MG827108 Ai Cập 2016 KY053900 Ấn Độ 2009 KJ621026 Ấn Độ 2012 58 19 99 MH001566 Ai Cập 2017 KJ620991 Ấn Độ 2010 KX377124 Ấn Độ 2012 59

20 MH001570 Ai Cập 2017 KP090251 Ấn Độ 2010 100 KX377127 Ấn Độ 2012 60 21 MH001567 Ai Cập 2017 KP120755 Ấn Độ 2010 101 KX377125 Ấn Độ 2012 61

22 MH001569 Ai Cập 2017 KJ620996 Ấn Độ 2010 102 KX377128 Ấn Độ 2012 62 23 MH001558 Ai Cập 2017 KP120759 Ấn Độ 2010 103 KX377126 Ấn Độ 2012 63

24 MH001564 Ai Cập 2017 KP120760 Ấn Độ 2010 104 KJ621022 Ấn Độ 2012 64 25 MG827109 Ai Cập 2017 G3a KJ620990 Ấn Độ 2010 G2 105 KJ621024 Ấn Độ 2012 65

26 MG827100 Ai Cập 2017 KF716159 Ấn Độ 2010 106 MF998081 Ấn Độ 2013 66 27 MH001553 Ai Cập 2017 KJ621000 Ấn Độ 2011 107 KP090257 Ấn Độ 2014 67

28 MH001557 Ai Cập 2017 KJ621011 Ấn Độ 2011 G2 108 KX377130 Ấn Độ 2015 68 29 MH001559 Ai Cập 2017 KJ621017 Ấn Độ 2011 109 KX377129 Ấn Độ 2015 69

30 MH001556 Ai Cập 2017 JQ040531 Ấn Độ 2011 110 MH269371 Ấn Độ 2016 70 31 MH001555 Ai Cập 2017 KJ621004 Ấn Độ 2011 111 MG720294 Ấn Độ 2017 71

32 MH001554 Ai Cập 2017 KJ621018 Ấn Độ 2011 112 MF576069 Ấn Độ 2017 72 33 MH001560 Ai Cập 2017 KJ621015 Ấn Độ 2011 113 EU871777 Argentina 2007 73

34 MH001561 Ai Cập 2017 KJ620997 Ấn Độ 2011 114 KJ872514 Argentina 2007 74 35 MH001563 Ai Cập 2017 KJ621009 Ấn Độ 2011 115 EU871772 Argentina 2007 75

36 76 MH001562 Ai Cập 2017 KJ621013 Ấn Độ 2011 116 EU871782 Argentina 2007 G2 37 77 MH001565 Ai Cập 2017 KJ621008 Ấn Độ 2011 117 EU871775 Argentina 2007

101

38 78 MH001568 Ai Cập 2017 KJ621012 Ấn Độ 2011 118 KJ872513 Argentina 2007

TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT

39 79 AY583758 Ấn Độ 2004 KJ621014 Ấn Độ 2011 119 EU871767 Argentina 2007

40 80 AY583756 Ấn Độ 2004 KJ620999 Ấn Độ 2011 G2 120 EU871770 Argentina 2007 122 EU871771 Argentina 2007 162 AY739206 Brazil 1990 121 EU871768 Argentina 2007

123 EU871773 Argentina 2007 163 AY705212 Brazil 1990 202 JX415529 Brazil 2012 124 EU871774 Argentina 2007 164 AY633926 Brazil 1990 203 KY024579 Brazil 2015

125 EU871776 Argentina 2007 165 AY739208 Brazil 1992 204 MG846491 Brazil 2015 126 EU871779 Argentina 2007 166 AY739209 Brazil 1998 205 MN175605 Brazil 2016

127 EU871780 Argentina 2007 167 AY739207 Brazil 1998 206 KC691411 Cambodia 2011 128 EU871769 Argentina 2007 168 AY739211 Brazil 1999 207 KC691412 Cambodia 2011

129 EU871781 Argentina 2007 169 AY739210 Brazil 1999 208 KC691410 Cambodia 2012 130 EU871778 Argentina 2007 170 AY739212 Brazil 2000 209 HE662878 Cameroon 2007

131 EU871783 Argentina 2008 171 AY739213 Brazil 2001 210 HE662914 Cameroon 2007 132 EU871784 Argentina 2008 172 AY739214 Brazil 2003 211 HE662915 Cameroon 2007

133 DQ360826 Australia 2006 173 AY739215 Brazil 2003 212 HE662909 Cameroon 2007 134 EF673044 Australia 2007 174 AY855085 Brazil 2004 213 HE662910 Cameroon 2007

135 EF683157 Australia 2007 175 AY855082 Brazil 2004 214 HE662882 Cameroon 2007 136 EF673047 Australia 2007 176 AY855087 Brazil 2004 215 HE662920 Cameroon 2007

137 EF599955 Australia 2007 G2 177 AY855081 Brazil 2004 216 HE662888 Cameroon 2007 138 EF673045 Australia 2007 178 AY855080 Brazil 2004 217 HE662887 Cameroon 2007

139 EF683158 Australia 2007 179 AY855084 Brazil 2004 218 HE662902 Cameroon 2007 140 EF673046 Australia 2007 180 AY855079 Brazil 2004 219 HE662893 Cameroon 2007

141 EF673048 Australia 2007 181 AY855086 Brazil 2004 220 HE662905 Cameroon 2007 142 AF227982 Australia 182 AY855083 Brazil 2004 221 HE662903 Cameroon 2007

143 EF683159 Australia 183 AY855088 Brazil 2004 222 HE662879 Cameroon 2007 144 S71488 Australia 184 KJ865877 Brazil 2006 223 HE662899 Cameroon 2007

145 U65414 Australia 185 KJ865876 Brazil 2006 224 HE662890 Cameroon 2007 146 KM458185 Ba Lan 1995 186 KJ865875 Brazil 2006 225 HE662898 Cameroon 2007

147 KM458177 Ba Lan 2013 187 KJ865873 Brazil 2008 226 HE662891 Cameroon 2007 148 KM458179 Ba Lan 2013 188 KJ865874 Brazil 2008 227 HE662911 Cameroon 2007

149 KM458180 Ba Lan 2013 189 KJ865872 Brazil 2008 228 HE662917 Cameroon 2007 150 KM458171 Ba Lan 2013 190 KJ865868 Brazil 2009 229 HE662885 Cameroon 2007

151 KM458175 Ba Lan 2013 191 KJ865871 Brazil 2009 230 HE662906 Cameroon 2007 152 KM458172 Ba Lan 2013 192 KJ865870 Brazil 2009 231 HE662883 Cameroon 2007

153 KM458182 Ba Lan 2013 193 KJ865869 Brazil 2009 232 HE662908 Cameroon 2007 154 KM458178 Ba Lan 2013 194 KJ865864 Brazil 2010 233 HE662895 Cameroon 2007

155 KM458174 Ba Lan 2013 195 KJ865865 Brazil 2010 234 HE662904 Cameroon 2007 156 KM458176 Ba Lan 2013 196 KJ865866 Brazil 2010 235 HE662926 Cameroon 2007

157 KM458184 Ba Lan 2013 197 KJ865867 Brazil 2010 236 HE662934 Cameroon 2007 158 KM458181 Ba Lan 2013 198 KJ865862 Brazil 2010 237 HE662939 Cameroon 2007

159 KM458173 Ba Lan 2013 199 KJ865863 Brazil 2010 238 HE662929 Cameroon 2007 160 KM458183 Ba Lan 2014 200 JX415531 Brazil 2011 239 HE662896 Cameroon 2007

102

161 AF395114 Bangladesh 1999 201 JX415530 Brazil 2011 240 HE662932 Cameroon 2007 242 HE662940 Cameroon 2007 G2 283 HE687004 Cameroon 2009 241 HE662938 Cameroon 2007

TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm

243 HE662919 Cameroon 2007 284 HE686973 Cameroon 2009 324 HE662978 Cameroon 2009

244 HE662927 Cameroon 2007 285 HE687010 Cameroon 2009 325 HE686994 Cameroon 2009 245 HE662931 Cameroon 2007 286 HE662953 Cameroon 2009 326 HE662979 Cameroon 2009

246 HE662937 Cameroon 2007 287 HE663003 Cameroon 2009 327 HE662983 Cameroon 2009 247 HE662925 Cameroon 2007 288 HE662998 Cameroon 2009 328 HE662980 Cameroon 2009

248 HE662928 Cameroon 2007 289 HE663002 Cameroon 2009 329 HE662982 Cameroon 2009 249 HE662941 Cameroon 2007 290 HE662999 Cameroon 2009 330 HE686993 Cameroon 2009

250 HE662930 Cameroon 2007 291 HE687015 Cameroon 2009 331 HE662981 Cameroon 2009 251 HE662933 Cameroon 2007 292 HE662984 Cameroon 2009 332 HE662986 Cameroon 2009

252 HE662936 Cameroon 2007 293 HE686996 Cameroon 2009 333 HE662996 Cameroon 2009 253 HE662935 Cameroon 2007 294 HE663000 Cameroon 2009 334 HE662997 Cameroon 2009

254 HE662884 Cameroon 2007 295 HE662988 Cameroon 2009 335 HE686991 Cameroon 2009 255 HE662877 Cameroon 2007 296 HE662952 Cameroon 2009 336 HE662987 Cameroon 2009

256 HE662880 Cameroon 2007 297 HE662954 Cameroon 2009 337 HE686995 Cameroon 2009 G3a 257 HE662913 Cameroon 2007 298 HE686978 Cameroon 2009 338 HE662942 Cameroon 2009

258 HE662897 Cameroon 2007 299 HE686979 Cameroon 2009 339 HE662943 Cameroon 2009 259 HE662900 Cameroon 2007 300 HE663001 Cameroon 2009 340 HE662956 Cameroon 2009

260 HE662921 Cameroon 2007 301 HE662950 Cameroon 2009 341 HE662945 Cameroon 2009 261 HE662916 Cameroon 2007 302 HE686982 Cameroon 2009 342 HE662958 Cameroon 2009

262 HE662892 Cameroon 2007 303 HE686983 Cameroon 2009 343 HE662966 Cameroon 2009 263 HE662886 Cameroon 2007 304 HE662944 Cameroon 2009 344 HE662971 Cameroon 2009

264 HE662918 Cameroon 2007 305 HE662965 Cameroon 2009 345 HE662970 Cameroon 2009 265 HE662923 Cameroon 2007 306 HE686989 Cameroon 2009 346 HE686988 Cameroon 2009

266 HE662876 Cameroon 2007 307 HE662955 Cameroon 2009 347 HE662968 Cameroon 2009 267 HE662881 Cameroon 2007 308 HE662961 Cameroon 2009 348 HE686971 Cameroon 2009

268 HE662894 Cameroon 2007 309 HE662957 Cameroon 2009 349 HE662969 Cameroon 2009 269 HE662907 Cameroon 2007 310 HE662960 Cameroon 2009 350 HE662973 Cameroon 2009

270 HE662922 Cameroon 2007 311 HE662964 Cameroon 2009 351 HE686972 Cameroon 2009 271 HE662889 Cameroon 2007 312 HE686970 Cameroon 2009 352 HE662972 Cameroon 2009

272 HE662901 Cameroon 2007 313 HE662959 Cameroon 2009 353 HE686985 Cameroon 2009 273 HE662912 Cameroon 2007 314 HE662962 Cameroon 2009 354 HE662975 Cameroon 2009

274 HE662924 Cameroon 2007 315 HE662946 Cameroon 2009 355 HE662976 Cameroon 2009 275 HE662974 Cameroon 2009 316 HE662963 Cameroon 2009 356 HE662993 Cameroon 2009

276 HE686990 Cameroon 2009 317 HE686981 Cameroon 2009 357 HE687013 Cameroon 2009 277 HE687009 Cameroon 2009 318 HE662967 Cameroon 2009 358 HE687005 Cameroon 2009

278 HE662947 Cameroon 2009 319 HE687016 Cameroon 2009 359 HE687007 Cameroon 2009 279 HE662949 Cameroon 2009 320 HE686986 Cameroon 2009 360 HE687012 Cameroon 2009

280 HE662948 Cameroon 2009 321 HE686987 Cameroon 2009 361 HE687006 Cameroon 2009 281 HE662994 Cameroon 2009 322 HE686984 Cameroon 2009 362 HE687014 Cameroon 2009

282 HE662995 Cameroon 2009 323 HE662977 Cameroon 2009 363 HE687008 Cameroon 2009 365 HE662951 Cameroon 2009 406 KJ728829 Đài Loan 2012 364 HE687011 Cameroon 2009

103

366 HE686976 Cameroon 2009 407 KY888904 Đài Loan 2012 447 KY888916 Đài Loan 2014 367 HE686977 Cameroon 2009 408 KJ728828 Đài Loan 2012 448 KY888926 Đài Loan 2014

TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm

368 HE686974 Cameroon 2009 409 KY888903 Đài Loan 2012 449 KY888930 Đài Loan 2014

369 HE686992 Cameroon 2009 410 KJ728816 Đài Loan 2012 450 KY888933 Đài Loan 2014 370 HE686975 Cameroon 2009 411 KJ728820 Đài Loan 2012 451 KY888929 Đài Loan 2014

371 HE662985 Cameroon 2009 412 KJ728819 Đài Loan 2012 452 KY888918 Đài Loan 2014 372 HE686999 Cameroon 2009 413 KJ728818 Đài Loan 2012 453 KY888925 Đài Loan 2014

373 HE687003 Cameroon 2009 414 KJ728823 Đài Loan 2012 454 KY888935 Đài Loan 2014 374 HE686980 Cameroon 2009 415 KJ728821 Đài Loan 2012 455 KY888920 Đài Loan 2014

375 HE662989 Cameroon 2009 416 KJ728825 Đài Loan 2012 456 KY888932 Đài Loan 2014 376 HE662990 Cameroon 2009 417 KY888900 Đài Loan 2012 457 MK358456 Đài Loan 2015

377 HE686998 Cameroon 2009 418 KJ728814 Đài Loan 2012 458 MK360817 Đài Loan 2015 378 HE687002 Cameroon 2009 419 KJ728830 Đài Loan 2012 459 KY888939 Đài Loan 2015

379 HE662991 Cameroon 2009 420 KY888905 Đài Loan 2012 460 MK376316 Đài Loan 2016 380 HE662992 Cameroon 2009 421 KJ728815 Đài Loan 2012 461 MK376315 Đài Loan 2016

381 HE687000 Cameroon 2009 422 KJ728824 Đài Loan 2012 462 MK386570 Đài Loan 2016 382 HE687001 Cameroon 2009 423 KJ728817 Đài Loan 2012 463 AB031296 G3b

383 HE686997 Cameroon 2009 424 KY888906 Đài Loan 2013 464 AJ297678 Germany 384 JQ308214 Chile 2006 425 KY888915 Đài Loan 2013 465 AJ297679 Germany G3a

385 JQ308213 Chile 2008 426 KY888912 Đài Loan 2013 466 AJ297680 Germany 386 KC602112 Croatia 2011 427 KY888913 Đài Loan 2013 467 AJ297681 Germany

387 KC602113 Croatia 2012 428 KY888914 Đài Loan 2013 468 AJ297682 Germany 388 KC602115 Croatia 2012 429 KY888907 Đài Loan 2013 469 AJ297683 Germany

389 KC602114 Croatia 2012 430 KY888911 Đài Loan 2013 470 AJ297684 Germany 390 KY888890 Đài Loan 2010 431 KY888909 Đài Loan 2013 471 AJ297685 Germany

391 KY888891 Đài Loan 2010 432 KY888908 Đài Loan 2013 472 AJ297686 Germany 392 KY888898 Đài Loan 2011 433 KY888910 Đài Loan 2013 473 AJ297687 Germany

393 KY888897 Đài Loan 2011 434 KY888924 Đài Loan 2014 474 AJ401053 Germany 394 KY888895 Đài Loan 2011 435 KY888936 Đài Loan 2014 475 AJ536295 Germany

395 KY888893 Đài Loan 2011 436 KY888921 Đài Loan 2014 476 M55918 Germany 396 KY888899 Đài Loan 2011 437 KY888922 Đài Loan 2014 477 M81223 Germany

397 KY888896 Đài Loan 2011 438 KY888917 Đài Loan 2014 478 U66304 Germany 398 KY888892 Đài Loan 2011 439 KY888928 Đài Loan 2014 479 JF507715 Hàn Quốc 1991

399 KY888894 Đài Loan 2011 440 KY888927 Đài Loan 2014 480 HM018709 Hàn Quốc 2008 400 KJ728827 Đài Loan 2012 441 KY888931 Đài Loan 2014 481 HM018711 Hàn Quốc 2009

401 KY888902 Đài Loan 2012 442 KY888937 Đài Loan 2014 482 HM018713 Hàn Quốc 2009 402 KX772161 Đài Loan 2012 443 KY888938 Đài Loan 2014 483 HM018712 Hàn Quốc 2009

403 KJ728822 Đài Loan 2012 444 KY888923 Đài Loan 2014 484 HM018714 Hàn Quốc 2009 404 KJ728826 Đài Loan 2012 445 KY888919 Đài Loan 2014 485 HM018717 Hàn Quốc 2009

405 KY888901 Đài Loan 2012 446 KY888934 Đài Loan 2014 486 HM018715 Hàn Quốc 2009 488 HM018724 Hàn Quốc 2009 530 AB046587 Japan 487 HM018716 Hàn Quốc 2009

489 HM018725 Hàn Quốc 2009 531 AB046588 Japan 572 AF311898 Mỹ 1998 490 HM018726 Hàn Quốc 2009 532 AB046589 Japan 573 AF311890 Mỹ 1998

104

491 HM018730 Hàn Quốc 2009 533 AB046590 Japan 574 AF311894 Mỹ 1998 492 HM018729 Hàn Quốc 2009 534 D31965 Japan 575 AF311888 Mỹ 1998

TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm

493 HM018727 Hàn Quốc 2009 535 MH496998 576 AF311891 Mỹ 1998 Lào 2014

494 HM018728 Hàn Quốc 2009 536 MH496996 577 AF311892 Mỹ 1998 Lào 2014 495 HM018722 Hàn Quốc 2009 537 MH496989 2014 G3b 578 AF311897 Mỹ 1998 Lào

496 HM018718 Hàn Quốc 2009 538 MH496986 579 AF311899 Mỹ 1998 Lào 2014 497 HM018719 Hàn Quốc 2009 539 MH496987 580 GQ168469 Mỹ 2001 Lào 2014

498 HM018720 Hàn Quốc 2009 540 MH496988 581 GQ168471 Mỹ 2001 Lào 2014 499 HM018721 Hàn Quốc 2009 541 MH496992 2014 G4 582 GQ168470 Mỹ 2001 Lào

500 HM018723 Hàn Quốc 2009 542 MH496983 583 GQ168468 Mỹ 2001 Lào 2015 501 HM018735 Hàn Quốc 2009 543 MH496984 584 GQ168473 Mỹ 2001 Lào 2015

502 HM018736 Hàn Quốc 2009 544 MH496997 585 GQ168472 Mỹ 2001 Lào 2015 503 HM018733 Hàn Quốc 2009 545 MH496995 2015 G3b 586 AF372658 Mỹ 2001 Lào

504 HM018740 Hàn Quốc 2009 546 MH496994 2015 G3b 587 GQ168457 Mỹ 2001 Lào 505 HM018737 Hàn Quốc 2009 547 MH496993 588 DQ991394 Mỹ 2001 Lào 2015

506 HM018739 Hàn Quốc 2009 548 MH496990 589 GQ168465 Mỹ 2003 Lào 2015 507 HM018738 Hàn Quốc 2009 549 MH496991 590 GQ168476 Mỹ 2003 Lào 2015

508 HM018734 Hàn Quốc 2009 550 MH496985 591 GQ168478 Mỹ 2003 Lào 2015 509 HM018731 Hàn Quốc 2009 G3a 551 AF390038 Malaysia 2001 592 AY513714 Mỹ 2003

510 HM018732 Hàn Quốc 2009 G3a 552 FJ167515 Malaysia 2007 G3a 593 GQ168459 Mỹ 2003 511 HM018710 Hàn Quốc 2009 553 FJ167517 Malaysia 2007 594 GQ168467 Mỹ 2003

554 FJ167518 Malaysia 2007 595 GQ168477 512 JN903251 Iran 2009 Mỹ 2003 555 FJ167516 Malaysia 2007 596 GQ168463 513 JN903250 Iran 2009 Mỹ 2003

556 FJ167514 Malaysia 2007 597 GQ168466 514 JN903252 Iran 2009 Mỹ 2003 557 FJ167513 Malaysia 2007 598 GQ168458 515 KU195692 Iran 2013 Mỹ 2003

558 FJ167522 Malaysia 2007 G3a 599 GQ168464 516 KU195690 Iran 2013 Mỹ 2003 559 FJ167521 Malaysia 2007 600 GQ168461 517 KU195691 Iran 2013 Mỹ 2004

560 FJ167520 Malaysia 2007 601 GQ168460 2004 G3a 518 KU195693 Iran 2013 Mỹ 561 AF285882 Malaysia 602 GQ168474 519 KU195694 Iran 2013 Mỹ 2004

562 AF390102 Malaysia 603 GQ168475 520 KU195689 Iran 2013 Mỹ 2004 563 AF527037 Malaysia 604 GQ168462 521 KU523251 Iran 2015 Mỹ 2004

564 AY040632 Malaysia 605 GQ168479 522 KT276305 Iran 2015 Mỹ 2006 565 DQ217400 Malaysia 606 GQ168480 523 MH095973 Iraq 2017 Mỹ 2006

566 DQ217401 Malaysia 607 GQ168481 524 MH095975 Iraq 2017 Mỹ 2006 567 AF311887 608 MF416374 525 MH095976 Iraq 2017 Mỹ 2014 Mỹ 1998

568 AF311895 609 KT390281 Nam Phi 2006 526 MH095977 Iraq 2017 Mỹ 1998 569 AF311889 610 KT390283 Nam Phi 2006 527 MH095974 Iraq 2017 Mỹ 1998

528 KF649567 Israel 2004 570 AF311893 611 KT390282 Nam Phi 2006 Mỹ 1998 529 AB027470 Japan 571 AF311896 612 KT390280 Nam Phi 2006 Mỹ 1998

614 KT390278 Nam Phi 2006 653 DQ016139 Slovenia 2000 613 KT390279 Nam Phi 2006 615 KT390277 Nam Phi 2006 654 DQ016140 Slovenia 2000 692 HE663005 Trung Phi 2008

655 KC762955 Thái Lan 2008 693 HE663006 Trung Phi 2008 616 MK687563 Nga 2012 656 KC762957 Thái Lan 2008 694 HE663049 Trung Phi 2009 617 MK687565 Nga 2013

105

657 KC762956 Thái Lan 2008 695 HE663030 Trung Phi 2009 618 MK687564 Nga 2013 658 KC762958 Thái Lan 2009 696 HE663031 Trung Phi 2009 619 MK687566 Nga 2014

TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm

620 KM226339 Nhật Bản 1974 659 KC762959 Thái Lan 2010 697 HE663038 Trung Phi 2009

621 KM226337 Nhật Bản 1976 660 KC762960 Thái Lan 2010 698 HE663036 Trung Phi 2009 622 KM226338 Nhật Bản 1977 G3a 661 KC762961 Thái Lan 2010 699 HE663035 Trung Phi 2009

623 KJ004669 Nhật Bản 1977 G3a 662 KC762964 Thái Lan 2011 700 HE663034 Trung Phi 2009 624 KJ004667 Nhật Bản 1979 663 KC762967 Thái Lan 2011 701 HE663042 Trung Phi 2009

625 KM226341 Nhật Bản 1980 G3a 664 KC762962 Thái Lan 2011 702 HE663051 Trung Phi 2009 626 KJ004668 Nhật Bản 1980 665 KC762965 Thái Lan 2011 703 HE663043 Trung Phi 2009

627 KM226342 Nhật Bản 1991 666 KC762966 Thái Lan 2011 704 HE663046 Trung Phi 2009 628 KM226343 Nhật Bản 1992 667 KC762963 Thái Lan 2011 705 HE663040 Trung Phi 2009

629 KM226340 Nhật Bản 1994 668 HE663029 Trung Phi 2008 G3b 706 HE663044 Trung Phi 2009 630 AB119448 Nhật Bản 2003 G3b 669 HE663022 Trung Phi 2008 707 HE663033 Trung Phi 2009

631 KJ126838 Nhật Bản 2013 670 HE663004 Trung Phi 2008 708 HE663032 Trung Phi 2009 632 KJ004670 Nhật Bản 2013 671 HE663013 Trung Phi 2008 709 HE663039 Trung Phi 2009

633 KJ004672 Nhật Bản 2013 672 HE663023 Trung Phi 2008 710 HE663037 Trung Phi 2009 634 KJ004671 Nhật Bản 2013 673 HE663007 Trung Phi 2008 711 HE663045 Trung Phi 2009

635 MK624991 Nhật Bản 2017 674 HE663008 Trung Phi 2008 712 HE663048 Trung Phi 2009 636 AJ888519 Nigeria 2002 675 HE663012 Trung Phi 2008 713 HE663047 Trung Phi 2009

637 AJ888520 Nigeria 2002 676 HE663018 Trung Phi 2008 714 HE663050 Trung Phi 2009 638 AJ888522 Nigeria 2002 677 HE663014 Trung Phi 2008 715 HE663041 Trung Phi 2009

639 AJ888523 Nigeria 2002 678 HE663026 Trung Phi 2008 716 HE663053 Trung Phi 2010 640 AJ888526 Nigeria 2002 679 HE663020 Trung Phi 2008 717 HE663056 Trung Phi 2010

641 AJ888527 Nigeria 2002 680 HE663019 Trung Phi 2008 718 HE663055 Trung Phi 2010 642 AJ888530 Nigeria 2002 681 HE663024 Trung Phi 2008 719 HE663054 Trung Phi 2010

643 AJ888528 Nigeria 2002 682 HE663011 Trung Phi 2008 720 HE663052 Trung Phi 2010 644 AJ888529 Nigeria 2002 683 HE663010 Trung Phi 2008 721 AF448446 Trung Quốc 2001

645 AJ888525 Nigeria 2004 684 HE663017 Trung Phi 2008 722 AF475908 Trung Quốc 2002 646 AJ888532 Nigeria 2004 685 HE663015 Trung Phi 2008 723 AM407847 Trung Quốc 2004

647 AJ888521 Nigeria 2004 686 HE663016 Trung Phi 2008 724 AM407851 Trung Quốc 2004 648 AJ888524 Nigeria 2004 687 HE663028 Trung Phi 2008 725 AM407864 Trung Quốc 2004

649 AJ888531 Nigeria 2004 688 HE663021 Trung Phi 2008 726 AM407862 Trung Quốc 2004 650 KY055442 Pakistan 2016 689 HE663025 Trung Phi 2008 727 AM407858 Trung Quốc 2004

651 KY055441 Pakistan 2016 G3b 690 HE663027 Trung Phi 2008 728 AM407859 Trung Quốc 2004 652 DQ016138 Slovenia 2000 691 HE663009 Trung Phi 2008 729 AM407856 Trung Quốc 2004

731 AM407879 Trung Quốc 2004 771 AM407835 Trung Quốc 2005 730 AM407874 Trung Quốc 2004 732 AM407857 Trung Quốc 2004 772 AM407867 Trung Quốc 2005 811 HQ872046 Trung Quốc 2010

733 AM407881 Trung Quốc 2004 773 AM407863 Trung Quốc 2005 812 HQ872045 Trung Quốc 2010 G3b 734 AM407865 Trung Quốc 2004 774 AM407830 Trung Quốc 2005 813 FR850023 Trung Quốc 2010 G3b

735 AM407823 Trung Quốc 2004 775 AM407871 Trung Quốc 2005 814 HQ872023 Trung Quốc 2010 736 AY846844 Trung Quốc 2004 776 AM407838 Trung Quốc 2005 815 HQ872035 Trung Quốc 2010

737 AM407850 Trung Quốc 2004 777 AM407870 Trung Quốc 2005 816 HQ872033 Trung Quốc 2010 738 AM407854 Trung Quốc 2005 778 AM407849 Trung Quốc 2005 817 HQ872036 Trung Quốc 2010 G3b

106

739 AM407860 Trung Quốc 2005 779 AM407828 Trung Quốc 2005 818 HQ872047 Trung Quốc 2010 740 AM407821 Trung Quốc 2005 780 AM407825 Trung Quốc 2005 819 HQ872038 Trung Quốc 2010

TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm

741 AM407836 Trung Quốc 2005 781 AM407829 Trung Quốc 2005 820 HM134240 Trung Quốc 2010

742 DQ124936 Trung Quốc 2005 782 AM407845 Trung Quốc 2005 821 FR850025 Trung Quốc 2010 743 AM407839 Trung Quốc 2005 783 AM407840 Trung Quốc 2005 822 FR850026 Trung Quốc 2010

744 AM407824 Trung Quốc 2005 784 AM407841 Trung Quốc 2005 823 HQ872030 Trung Quốc 2010 745 AM407853 Trung Quốc 2005 785 AM407861 Trung Quốc 2005 824 HQ872029 Trung Quốc 2010

746 AM407837 Trung Quốc 2005 786 AM407872 Trung Quốc 2005 825 HQ872034 Trung Quốc 2010 747 AM407831 Trung Quốc 2005 787 AM407846 Trung Quốc 2005 826 FR850028 Trung Quốc 2010

748 DQ124935 Trung Quốc 2005 788 AM407875 Trung Quốc 2005 827 FR850029 Trung Quốc 2010 749 AM407843 Trung Quốc 2005 789 AM407878 Trung Quốc 2005 828 HQ872031 Trung Quốc 2010

750 AM407844 Trung Quốc 2005 790 AM407876 Trung Quốc 2005 829 HQ872032 Trung Quốc 2010 751 AM407869 Trung Quốc 2005 791 AY999018 Trung Quốc 2005 830 HQ872025 Trung Quốc 2010

752 AM407852 Trung Quốc 2005 792 DQ141673 Trung Quốc 2005 831 HQ872041 Trung Quốc 2010 753 AM407868 Trung Quốc 2005 793 AM407880 Trung Quốc 2005 832 HQ872039 Trung Quốc 2010

754 AM407877 Trung Quốc 2005 794 AY839944 Trung Quốc 2005 833 HQ872040 Trung Quốc 2010 755 DQ124934 Trung Quốc 2005 795 DQ141671 Trung Quốc 2005 834 FR850024 Trung Quốc 2010

756 AM407817 Trung Quốc 2005 796 DQ141672 Trung Quốc 2005 835 FR850027 Trung Quốc 2010 757 AM407848 Trung Quốc 2005 797 AY843527 Trung Quốc 2005 836 FR850022 Trung Quốc 2010

758 AM407827 Trung Quốc 2005 798 DQ141670 Trung Quốc 2005 837 FR850021 Trung Quốc 2010 759 AM407832 Trung Quốc 2005 799 EF176599 Trung Quốc 2006 838 FR850030 Trung Quốc 2010

760 AM407818 Trung Quốc 2005 800 JX964755 Trung Quốc 2006 839 KF224935 Trung Quốc 2012 761 AM407819 Trung Quốc 2005 801 JQ690762 Trung Quốc 2007 G3b 840 KF224937 Trung Quốc 2012

762 AM407873 Trung Quốc 2005 802 FJ172347 Trung Quốc 2008 841 KC414026 Trung Quốc 2012 763 AM407822 Trung Quốc 2005 803 HQ872026 Trung Quốc 2010 G4 842 KF224927 Trung Quốc 2012

764 AM407820 Trung Quốc 2005 804 HQ872027 Trung Quốc 2010 843 JX260426 Trung Quốc 2012 765 AM407842 Trung Quốc 2005 805 HQ872043 Trung Quốc 2010 G4 844 KF224926 Trung Quốc 2012

766 AM407826 Trung Quốc 2005 806 HQ872028 Trung Quốc 2010 845 KF224928 Trung Quốc 2012 767 AM407855 Trung Quốc 2005 807 HQ872042 Trung Quốc 2010 846 KF224929 Trung Quốc 2012

768 AM407866 Trung Quốc 2005 808 HQ872024 Trung Quốc 2010 G4 847 KF224930 Trung Quốc 2012 769 AM407834 Trung Quốc 2005 809 HQ872037 Trung Quốc 2010 848 KF224931 Trung Quốc 2012

770 AM407833 Trung Quốc 2005 810 HQ872044 Trung Quốc 2010 849 KF224934 Trung Quốc 2012 851 KF224933 Trung Quốc 2012 891 KU050678 Trung Quốc 2015 850 KF224932 Trung Quốc 2012

852 KF224936 Trung Quốc 2012 892 KU050679 Trung Quốc 2015 931 MH801130 Trung Quốc 2017 853 KF224938 Trung Quốc 2012 893 KY486141 Trung Quốc 2015 932 MK089240 Trung Quốc 2017

854 KM496309 Trung Quốc 2013 894 KY486153 Trung Quốc 2015 933 MK089242 Trung Quốc 2017 855 KM496308 Trung Quốc 2013 G3b 895 KY486142 Trung Quốc 2015 934 MK089241 Trung Quốc 2017

856 KM496310 Trung Quốc 2013 896 KU645507 Trung Quốc 2015 935 MK089243 Trung Quốc 2017 857 KM496300 Trung Quốc 2013 897 KU598851 Trung Quốc 2015 936 MH186137 Trung Quốc 2018

858 KM496307 Trung Quốc 2013 898 KY486143 Trung Quốc 2015 937 MH186141 Trung Quốc 2018 859 KM496306 Trung Quốc 2013 899 KY486154 Trung Quốc 2015 938 MH186139 Trung Quốc 2018

860 KM496304 Trung Quốc 2014 900 KY486139 Trung Quốc 2015 939 MH186142 Trung Quốc 2018 861 KU221054 Trung Quốc 2014 901 KU645523 Trung Quốc 2015 940 MH186138 Trung Quốc 2018

107

862 KU645520 Trung Quốc 2014 902 KU645506 Trung Quốc 2015 941 MK484615 Trung Quốc 2018 863 KM496305 Trung Quốc 2014 903 KU645508 Trung Quốc 2015 942 MK484614 Trung Quốc 2018

TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm

864 KU645513 Trung Quốc 2014 904 KU645509 Trung Quốc 2015 943 MK484616 Trung Quốc 2018

865 KM496301 Trung Quốc 2014 905 KU645519 Trung Quốc 2015 944 MH186140 Trung Quốc 2018 866 KM496302 Trung Quốc 2014 906 KU645515 Trung Quốc 2015 945 KU095829 Tunisia 2009

867 KY486148 Trung Quốc 2014 907 KU645510 Trung Quốc 2015 946 MH144347 Tunisia 2016 868 KY486136 Trung Quốc 2014 908 KU645516 Trung Quốc 2015 947 AF311900 USA

869 KU645511 Trung Quốc 2014 909 KU645512 Trung Quốc 2015 948 AF313470 USA 870 KU641013 Trung Quốc 2014 910 KU641015 Trung Quốc 2015 949 D10068 USA

871 KU645514 Trung Quốc 2014 911 KU050677 Trung Quốc 2015 950 L14767 USA 872 KY486147 Trung Quốc 2014 912 KU050680 Trung Quốc 2015 951 KP780289 Việt Nam 2013

873 KM496303 Trung Quốc 2014 913 KY486138 Trung Quốc 2015 952 KP780292 Việt Nam 2013 874 KY486146 Trung Quốc 2014 914 KY486140 Trung Quốc 2015 953 KP780287 Việt Nam 2013

875 KY486145 Trung Quốc 2014 915 KY486151 Trung Quốc 2015 954 KP780288 Việt Nam 2013 876 KU641014 Trung Quốc 2015 916 KU645524 Trung Quốc 2015 955 KP780290 Việt Nam 2013

877 KX811526 Trung Quốc 2015 917 KX447637 Trung Quốc 2016 956 KP780291 Việt Nam 2013 878 KU645517 Trung Quốc 2015 918 KX447636 Trung Quốc 2016 957 MF611979 Việt Nam 2016

879 KU645525 Trung Quốc 2015 919 KX447633 Trung Quốc 2016 958 MF611938 Việt Nam 2016 880 KU845734 Trung Quốc 2015 920 KX447635 Trung Quốc 2016 959 MF611949 Việt Nam 2016

881 KU845735 Trung Quốc 2015 921 MK887168 Trung Quốc 2016 960 MF611970 Việt Nam 2016 882 KU645518 Trung Quốc 2015 922 MK887171 Trung Quốc 2016 961 MF611960 Việt Nam 2016

883 KY486150 Trung Quốc 2015 923 MK887167 Trung Quốc 2016 962 MF611928 Việt Nam 2016 884 KY486144 Trung Quốc 2015 924 MK887169 Trung Quốc 2016 963 MF611929 Việt Nam 2016

885 KY486155 Trung Quốc 2015 925 MK887164 Trung Quốc 2016 964 MF611982 Việt Nam 2016 886 KY486149 Trung Quốc 2015 926 MK887170 Trung Quốc 2016 965 MF611980 Việt Nam 2016

887 KU645521 Trung Quốc 2015 927 KX447634 Trung Quốc 2016 966 MF611981 Việt Nam 2016 888 KU645522 Trung Quốc 2015 928 MK770259 Trung Quốc 2016 967 MF611947 Việt Nam 2016

889 KY486137 Trung Quốc 2015 929 MK887165 Trung Quốc 2016 968 MF611948 Việt Nam 2016 890 KY486152 Trung Quốc 2015 930 MK887166 Trung Quốc 2016 969 MF611978 Việt Nam 2016

971 MF611946 Việt Nam 2017 1011 MF611950 Việt Nam 2017 970 MF611951 Việt Nam 2017 972 MF611954 Việt Nam 2017 1012 MF611934 Việt Nam 2017 G3b 1051 U69548 G3b

973 MF611959 Việt Nam 2017 1013 MF611941 Việt Nam 2017 G3b 1052 U69549 G2 974 MH536105 Việt Nam 2017 1014 MF611940 Việt Nam 2017 G2

975 MF611956 Việt Nam 2017 1015 MK423867 Việt Nam 2018 G3b 976 MF611961 Việt Nam 2017 1016 MK423873 Việt Nam 2018 G3b

977 MF611964 Việt Nam 2017 G2 1017 MK423871 Việt Nam 2018 G3b 978 MF611971 Việt Nam 2017 1018 MK423870 Việt Nam 2018

979 MF611974 Việt Nam 2017 1019 MK423866 Việt Nam 2018 980 MF611942 Việt Nam 2017 1020 MK423872 Việt Nam 2018 G2

981 MF611943 Việt Nam 2017 G2 1021 MK423868 Việt Nam 2018 G3b 982 MF611944 Việt Nam 2017 1022 MK423869 Việt Nam 2018 G3b

983 MF611963 Việt Nam 2017 1023 MK423874 Việt Nam 2018 G3a 984 MF611965 Việt Nam 2017 1024 A48606

108

985 MF611976 Việt Nam 2017 1025 AB248708 986 MF611966 Việt Nam 2017 1026 AJ133507

TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm TT GenBank Quốc gia Năm Nhóm

987 MF611967 Việt Nam 2017 1027 AJ133508

988 MF611969 Việt Nam 2017 1028 AJ133509 G1 989 MF611972 Việt Nam 2017 1029 AJ133510 G1

990 MF611977 Việt Nam 2017 1030 AJ133511 991 MF611968 Việt Nam 2017 G2 1031 AJ133512

992 MF611973 Việt Nam 2017 1032 AJ133513 993 MF611933 Việt Nam 2017 1033 AJ133514

994 MF611952 Việt Nam 2017 1034 AJ133515 995 MF611975 Việt Nam 2017 1035 AJ133516

996 MF611945 Việt Nam 2017 1036 AJ133517 997 MF611962 Việt Nam 2017 1037 AJ133518

998 MF611953 Việt Nam 2017 1038 AJ890284 G3b 999 MF611955 Việt Nam 2017 1039 AY150576 G3b

1000 MF611957 Việt Nam 2017 1040 DD273157* 1001 MF611958 Việt Nam 2017 1041 DI010342

1002 MH536104 Việt Nam 2017 1042 DI071423 1003 MF611930 Việt Nam 2017 1043 DI072479

1004 MH536106 Việt Nam 2017 1044 E51057 1005 MF611935 Việt Nam 2017 G3b 1045 EF552227

1006 MF611936 Việt Nam 2017 G3b 1046 EF552229 1007 MF611931 Việt Nam 2017 1047 EF552230

1008 MF611937 Việt Nam 2017 G2 1048 HH982173 1009 MF611932 Việt Nam 2017 1049 JA844115

Việt Nam 2017 1050 NC001427

Ghi chú: * trình tự DD273157 truy cập từ cơ sở dữ liệu của Nhật Bản (DNA Data Bank

of Japan), http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/getentry/na/DD273157/?filetype=html

109

1010 MF611939

Phụ lục 2. Tóm tắt thông tin trình tự gen dùng trong phân tích

Ghi chú: chữ số trong các ô là số lượng trình tự gen ORF1 thu thập được tại mỗi quốc gia/ vùng lãnh thổ, tương ứng ở các năm.

110

Phụ lục 3. Bảng phân tích trình tự amino acid của VP1 (75I- 89T- 125L- 141L- 144E) liên quan đến sự giảm độc lực của các chủng CIAV của Việt Nam

Vị trí amino acid ở VP1***

Nhóm di

Tên chủng**

truyền*

75

89 125 141 144 394

KP780289_2013 KP780292_2013

KP780287_2013 KP780288_2013 KP780290_2013 KP780291_2013

I I I I I I I I I V V V V V I I I V V V V V V V V I V V V I I I I I I I

T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T

I I I I I I I I I L L L L L I I I L L L L L L L L I L L L I I I I I I I

Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q

Q Q Q Q Q Q Q Q Q E E E E E Q Q Q E E E E E E E E Q E E E Q Q Q Q Q Q Q

Q Q Q Q Q Q Q Q Q

G2 G2 G2 MH536105_G17.33.5_2017 G2 MF611946_C27_Han_2017 G2 MF611951_C31_BN_2017 G2 MF611954_C34_Han_2017 G2 MF611956_C36_VP_2017 G2 MF611959_C39_VP_2017 G2 MF611961_C40_ VP_2017 G3 G3 G3 G3 G3 MH536106_G17.3.1_2017 G3 MH536104_G17.33.3_2017 G3 MF611928_C10_HB_2016 G3 MF611929_C11_HB_2016 G3 MF611930_C12_HN_2017 G3 MF611931_C13_HN_2017 G3 MF611932_C14_HN_2017 G3 MF611933_C15_HN_2017 G3 MF611934_C16_HN_2017 G3 MF611935_C17_HN_2017 G3 MF611936_C18_HN_2017 G3 MF611937_C19_HN_2017 G3 MF611938_C1_Han_2016 G3 MF611939_C20_Qni_2017 G3 MF611940_C21_Qni_2017 G3 MF611941_C22_Qni_2017 G3 MF611942_C23_Han_2017 G3 MF611943_C24_Han_2017 G3 MF611944_C25_Han_2017 G3 MF611945_C26_Han_2017 G3 MF611947_C28_Han_2016 G3 MF611948_C29_Han_2016 G3 MF611949_C2_Han_2016

111

Vị trí amino acid ở VP1***

Nhóm di

Tên chủng**

truyền*

75

89 125 141 144 394

V I I I I I I I V V V V V V V I V V V V I V V V I I I I

T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T

L I I I I I I I L L L L L L L I L L L L I L L L I I I I

Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q

E Q Q Q Q Q Q Q E E E E E E E Q E E E E Q E E E Q Q Q Q

G3 MF611950_C30_BN_2017 G3 MF611952_C32_BN_2017 G3 MF611953_C33_Han_2017 G3 MF611955_C35_VP_2017 G3 MF611957_C37_VP_2017 G3 MF611958_C38_VP_2017 G3 MF611960_C3_Han_2016 G3 MF611962_C41_VP_2017 G3 MF611963_C43_Han_2017 G3 MF611964_C44_Han_2017 G3 MF611965_C45_Han_2017 G3 MF611966_C46_Han_2017 G3 MF611967_C47_Han_2017 G3 MF611968_C48_Han_2017 G3 MF611969_C49_Han_2017 G3 MF611970_C4_Han_2016 G3 MF611971_C50_Han_2017 G3 MF611972_C51_Han_2017 G3 MF611973_C52_Han_2017 G3 MF611974_C53_Han_2017 G3 MF611975_C54_Han_2017 G3 MF611976_C55_Han_2017 G3 MF611977_C56_Han_2017 G3 MF611978_C5_HB_2016 G3 MF611979_C6_HB_2016 G3 MF611980_C7_HB_2016 G3 MF611981_C8_HB_2016 G3 MF611982_C9_HB_2016

* Theo gen VP1 ** 9 trình tự gen VP1 hoàn chỉnh *** Không có chủng nào của Việt Nam có trình tự liên quan đến sự giảm độc lực

của CIAV: 75I- 89T- 125L- 141L- 144E (Todd et al., 2002).

112

Phụ lục 4. Thông tin mẫu xét nghiệm CIAV

TT

Đàn

Ký hiệu

CIAV

Giống

Địa phương

Tuổi gà (tuần)

Loại hình nuôi

Quy mô (con)

Hà Nội Bắc Ninh Bắc Ninh Hà Nội Phú Thọ

Đàn 64 G18.69.2 1 Đàn 49 G18.34.2 2 Đàn 48 G18.34.1 3 Đàn 37 G17.94 4 Đàn 47 G17.97 5 Đàn 1 G16.17.2.2 Vĩnh Phúc 6 Hải Phòng Đàn 20 G17.3.5 7 Phú Thọ Đàn 46 G17.96.9 8 Hà Nội 9 Đàn 32 G17.6.3 10 Đàn 33 G17.6.4 Hà Nội 11 Đàn 2 G16.18.2.2 Vĩnh Phúc Vĩnh Phúc 12 Đàn 23 G17.33.1 Vĩnh Phúc 13 Đàn 23 G17.33.2 Vĩnh Phúc 14 Đàn 23 G17.33.3 Vĩnh Phúc 15 Đàn 23 G17.33.4 Vĩnh Phúc 16 Đàn 53 G18.38.4 Vĩnh Phúc 17 Đàn 6 G16.37 Vĩnh Phúc 18 Đàn 8 G16.41 Hà Nội 19 Đàn 9 G16.42

5 8 10 10 10 3 17 60 17 17 3 12 12 12 12 5 17 12 25

<100 <100 <100 <100 <100 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

(siêu

20 Đàn 28 G17.5.1

Quảng Ninh

Kín

>1000

(siêu

21 Đàn 29 G17.5.3

Quảng Ninh

Kín

>1000

(siêu

22 Đàn 30 G17.5.7

Quảng Ninh

Kín

>1000

23 Đàn 4 G16.19.3

Hải Phòng

Hở

>1000

24 Đàn 51 G18.38.2

Hà Nội

Kín

>1000

25 Đàn 31 G17.6.14 26 Đàn 34 G17.6.5 27 Đàn 42 G17.96.5 28 Đàn 43 G17.96.6 29 Đàn 44 G17.96.7 30 Đàn 45 G17.96.8 31 Đàn 26 G17.4.6 32 Đàn 38 G17.96.1 33 Đàn 39 G17.96.2 34 Đàn 40 G17.96.3

Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Nam Định Nam Định Nam Định

3 3 9 9 9 9 6 50 50 50

Hở + Gà ta lai Hở + Gà hồ Hở - Gà hồ + Hở + Minh Dư Hở + Ai cập lai Hở Hở + Ai cập Hở - Ai cập Hở + Ai cập + Ai cập Hở + Ai cập lai Hở Hở + Ai cập Hở + Ai cập Hở + Ai cập Hở + Ai cập + Ai cập Kín + Ai cập lai Hở Hở + Ai cập + Ai cập Kín Isa trứng) Isa trứng) Isa trứng) + Ri lai Lương Phượng Kín + Ai cập Kín + Ai cập Kín - Ai cập Kín - Ai cập Kín - Ai cập Kín - Ai cập + Lạc Thủy Hở Kín + Ai cập Kín - Ai cập Kín - Ai cập

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

113

TT

Đàn

Ký hiệu

CIAV

Giống

Địa phương

Tuổi gà (tuần)

Loại hình nuôi

Nam Định

35 Đàn 41 G17.96.4 36 Đàn 59 G18.51.12 Hà Nội Hà Nội 37 Đàn 59 G18.51.3 Hà Nội 38 Đàn 59 G18.51.7 Hà Nội 39 Đàn 59 G18.51.9

50 2 2 2 2

Quy mô (con) >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

Kín - Ai cập + Lạc Thủy Kín + Lạc Thủy Kín - Lạc Thủy Kín - Lạc Thủy Kín

40 Đàn 63 G18.69.1

Hà Nội

>1000

Kín

41 Đàn 10 G16.45

Nam Định

>1000

Kín

42 Đàn 17 G17.20.2.3 Bắc Ninh

>1000

Kín

43 Đàn 17 G17.22.1

Bắc Ninh

>1000

Kín

44 Đàn 17 G17.22.3

Bắc Ninh

>1000

Kín

45 Đàn 17 G17.22.4

Bắc Ninh

>1000

Kín

46 Đàn 17 G17.22.5

Bắc Ninh

>1000

Kín

47 Đàn 17 G17.22.6

Bắc Ninh

>1000

Kín

48 Đàn 17 G17.22.7

Bắc Ninh

>1000

Kín

49 Đàn 17 G17.22.8

Bắc Ninh

>1000

Kín

50 Đàn 18 G17.20.5.1 Bắc Ninh

>1000

Kín

51 Đàn 18 G17.24.1

Bắc Ninh

>1000

Kín

52 Đàn 18 G17.24.2

Bắc Ninh

>1000

Kín

53 Đàn 18 G17.24.3

Bắc Ninh

>1000

Kín

54 Đàn 18 G17.24.4

Bắc Ninh

>1000

Kín

55 Đàn 18 G17.24.6

Bắc Ninh

>1000

Kín

56 Đàn 18 G17.24.7

Bắc Ninh

>1000

Kín

57 Đàn 18 G17.24.8

Bắc Ninh

>1000

Kín

58 Đàn 18 G17.24.9

Bắc Ninh

>1000

Kín

59 Đàn 56 G18.47.1

Bắc Ninh

>1000

Lương phượng + Ai cập Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Isa Brown Kín

114

TT

Đàn

Ký hiệu

CIAV

Giống

Địa phương

Tuổi gà (tuần)

Loại hình nuôi

60 Đàn 56 G18.47.2

Bắc Ninh

+ Isa Brown Kín

Quy mô (con) >1000

61 Đàn 15 G17.20.1.1 Bắc Ninh

Kín

>1000

62 Đàn 15 G17.20.1.2 Bắc Ninh

Kín

>1000

63 Đàn 16 G17.20.2.1 Bắc Ninh

Kín

>1000

64 Đàn 16 G17.23.1

Bắc Ninh

Kín

>1000

65 Đàn 16 G17.23.3

Bắc Ninh

Kín

>1000

66 Đàn 16 G17.23.4

Bắc Ninh

Kín

>1000

67 Đàn 16 G17.23.5

Bắc Ninh

Kín

>1000

68 Đàn 16 G17.23.6

Bắc Ninh

Kín

>1000

69 Đàn 62 G18.59.1 70 Đàn 62 G18.59.2 71 Đàn 62 G18.59.3 72 Đàn 62 G18.59.4 73 Đàn 62 G18.59.5

Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội

Kín Kín Kín Kín Kín

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000

3 3 3 3 3

74 Đàn 12 G17.20.4.1 Bắc Ninh

Kín

>1000

75 Đàn 13 G17.21.1

Bắc Ninh

Kín

>1000

76 Đàn 13 G17.21.10 Bắc Ninh

Kín

>1000

77 Đàn 13 G17.21.2

Bắc Ninh

Kín

>1000

78 Đàn 13 G17.21.3

Bắc Ninh

Kín

>1000

79 Đàn 13 G17.21.4

Bắc Ninh

Kín

>1000

80 Đàn 13 G17.21.5

Bắc Ninh

Kín

>1000

81 Đàn 13 G17.21.6

Bắc Ninh

Kín

>1000

82 Đàn 13 G17.21.7

Bắc Ninh

Kín

>1000

83 Đàn 13 G17.21.8

Bắc Ninh

Kín

>1000

84 Đàn 13 G17.21.9

Bắc Ninh

Kín

>1000

Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng + gà jafa + gà jafa + gà jafa + gà jafa + gà jafa Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng Lương Phượng + Lương

115

TT

Đàn

Ký hiệu

CIAV

Giống

Địa phương

Tuổi gà (tuần)

Loại hình nuôi

Quy mô (con)

85 Đàn 14 G17.20.3.1 Bắc Ninh

Kín

>1000

Quảng Ninh

86 Đàn 19 G17.3.1 87 Đàn 58 G18.51.10 Hà Nội Hà Nội 88 Đàn 25 G17.4.5 Hà Nội 89 Đàn 57 G18.51.1 90 Đàn 57 G18.51.11 Hà Nội

Phượng Lương Phượng Kín + Ai cập + Quý Phi Kín + Phu Phan Hở - Ai Cập lai Kín - Ai Cập lai Kín

>1000 100-500 100-500 100-500 100-500

27 2 6 2 2

91 Đàn 61 G18.51.4

Hà Nội

Kín

100-500

Lương Phượng

92 Đàn 50 G18.38.1 93 Đàn 54 G18.45.1 94 Đàn 54 G18.45.2 95 Đàn 54 G18.45.3

Bắc Ninh Hà Nội Hà Nội Hà Nội

- Gà lai hồ Hở Hở + Hở + Hở +

lai mía lai mía lai mía

3 8 8 8

96 Đàn 11 G16.46

Nam Định

+ Ai cập

Hở

97 Đàn 27 G17.4.8

Hải Dương

+ Gà Chọi

Hở

98 Đàn 24 G17.4.13

Hải Dương

Kín

Lương Phượng

99 Đàn 5 G16.26.2

Hải Phòng

+ Ri lai

Hở

100 Đàn 21 G17.3.7

Vĩnh Phúc

+ Ai cập

Hở

101 Đàn 22 G17.32.1

Hòa Bình

- Lạc Thủy Hở

102 Đàn 22 G17.32.2

Hòa Bình

- Lạc Thủy Hở

103 Đàn 3 G16.19.1

Vĩnh phúc

+ Ai cập lai Hở

104 Đàn 52 G18.38.3

Hà Nội

Kín

105 Đàn 55 G18.46

Hà Nội

Kín

Lương Phượng Lương Phượng

106 Đàn 60 G18.51.2

Hà Nội

- H'Mông

Kín

107 Đàn 60 G18.51.5

Hà Nội

- H'Mông

Kín

108 Đàn 60 G18.51.6

Hà Nội

- H'Mông

Kín

109 Đàn 60 G18.51.8

Hà Nội

+ H'Mông

Kín

100-500 100-500 100-500 100-500 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500-

110 Đàn 7 G16.40

Hòa Bình

+ Lạc Thủy Hở

116

TT

Đàn

Ký hiệu

CIAV

Giống

Địa phương

Tuổi gà (tuần)

Loại hình nuôi

Quy mô (con)

111 Đàn 35 G17.69.1

Hòa Bình

Hở

112 Đàn 35 G17.69.2

Hòa Bình

Hở

113 Đàn 35 G17.69.3

Hòa Bình

Hở

114 Đàn 36 G17.74.1

Hà Nam

Hở

115 Đàn 36 G17.74.2

Hà Nam

Hở

116 Đàn 36 G17.74.3

Hà Nam

Hở

117 Đàn 36 G17.75.1

Hà Nam

Hở

118 Đàn 36 G17.75.2

Hà Nam

Hở

119 Đàn 36 G17.75.3

Hà Nam

Hở

1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000 500- 1000

117

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (Chicken Infectious Anemia Virus - CIAV) lưu hành tại miền Bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐÀO ĐOAN TRANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ

CỦA VIRUS GÂY BỆNH THIẾU MÁU TRUYỀN NHIỄM

Ở GÀ (CHICKEN INFECTIOUS ANEMIA VIRUS- CIAV)

LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐÀO ĐOAN TRANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ

CỦA VIRUS GÂY BỆNH THIẾU MÁU TRUYỀN NHIỄM

Ở GÀ (CHICKEN INFECTIOUS ANEMIA VIRUS- CIAV)

LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y

Mã số:

9.64.01.08

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ

TS. Nguyễn Văn Giáp

HÀ NỘI, NĂM 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả luận án

Đào Đoan Trang

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu sinh

Đào Đoan Trang

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

Nghĩa tiếng Việt

DANH MỤC BẢNG

Tên bảng

Trang

TT

DANH MỤC HÌNH

TT

Tên hình

Trang

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Đào Đoan Trang

Tên Luận án: Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh thiếu máu truyền

Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y

Mã số: 9.64.01.08

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu

Kết quả chính và kết luận

(1.1) Đã chứng minh được sự có mặt phổ biến của virus gây bệnh thiếu máu

(2) Đặc điểm dịch tễ học phân tử của CIAV ở miền Bắc Việt Nam đã được làm rõ

(2.2) Kết quả phân tích còn cho thấy CIAV lưu hành ở miền Bắc Việt Nam có nguồn

THESIS ABSTRACT

PhD candidate: Dao, Doan Trang

Thesis title: Molecular epidemiological study of chicken infectious anemia virus

Major: Veterinary epidemiology

Code: 9.64.01.08

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

Materials and Methods

Main findings and conclusions

(1.1) The wide prevalence of CIAV in ten northern provinces were proven. The

(2) The molecular epidemiological characterisation of CIAV in Northern Vietnam

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. VIRUS GÂY BỆNH THIẾU MÁU TRUYỀN NHIỄM Ở GÀ

2.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại virus gây bệnh

Hình 2.1. Cây phát sinh chủng loại của giống Gyrovirus

2.1.2. Hình thái, cấu trúc CIAV

Hình 2.2. Hạt virus dưới kính hiển vi điện tử

Hình 2.3. Cấu trúc bộ gen CIAV

2.1.3. Sức đề kháng của CIAV CIAV mang các đặc điểm đề kháng cao với nhiệt độ, chloroform của một virus không có vỏ bọc (Yuasa, 1992). Nhìn chung, virus có sức đề kháng cao

2.1.4. Tính kháng nguyên và sự biến đổi chủng của CIAV

2.2. BỆNH THIẾU MÁU TRUYỀN NHIỄM Ở GÀ

2.2.1. Giới thiệu chung Bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (CIA) được đặc trưng bởi tình trạng thiếu máu không tái tạo (aplastic anemia) do sự phá hủy các tế bào tạo máu

2.2.2. Địa dư bệnh