Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt động của gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây hoa cúc chiếu sang phá đêm bằng đèn led

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

Nguyễn Thị Thu Hiền

Nghiên cứu hoạt động của gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây hoa cúc chiếu sang phá đêm bằng đèn led

Chuyên ngành: sinh học thực nghiệm

Hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Chu Quang Hà

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn i

MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. iv

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ v

LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... vii

LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. vii

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... ix

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................ 3

1.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY HOA CÚC ........................... 3

1.1.1. Giới thiệu về cây hoa cúc ........................................................................ 3

1.1.2. Nhu cầu ánh sáng cho quá trình sinh trƣởng, phát triển của cây hoa cúc . 5

1.2. TỔNG QUAN VỀ SỰ RA HOA Ở THỰC VẬT .......................................... 9

1.2.1. Con đƣờng ra hoa tự khiển.................................................................... 10

1.2.2. Con đƣờng phụ thuộc gibberellin đòi hỏi mức hoocmon gia tăng ......... 11

1.2.3. Con đƣờng ra hoa phụ thuộc nhiệt độ ( sự xuân hóa) ............................ 11

1.2.4. Quang chu kì ........................................................................................ 13

1.3. TỔNG QUAN VỀ ĐÈN LED ..................................................................... 21

1.3.1. Giới thiệu về đèn LED .......................................................................... 21

1.3.2. Ảnh hƣởng của ánh sáng LED đến sự phát triển của thực vật................ 22

1.3.3. Ƣu, nhƣợc điểm của đèn LED .............................................................. 23

1.4. CÁC NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘ DÀI

THỜI GIAN CHIẾU SÁNG ĐẾN QUANG CHU KỲ CỦA THỰC VẬT ......... 24

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 28

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 38

3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SỰ SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY

HOA CÚC DƢỚI ĐIỀU KIỆN CHIẾU SÁNG BẰNG ĐÈN LED .................... 38

3.1.1. Đánh giá sinh trƣởng và phát triển của cây Hoa cúc 40 ngày tuổi ......... 39

3.1.2. Đánh giá sinh trƣởng và phát triển cây Hoa cúc 50 ngày tuổi ................ 40

3.1.3. Đánh giá sinh trƣởng và phát triển của cây Hoa cúc 70 ngày tuổi ......... 42

3.1.4. Đánh giá sinh trƣởng và phát triển của cây Hoa cúc 110 ngày tuổi ....... 45

3.1.5. Hiệu quả tiết kiệm điện năng của đèn LED ........................................... 49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn ii

3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CO ĐIỀU KHIỂN QUÁ TRÌNH RA HOA Ở

CÂY HOA CÚC ................................................................................................ 51

3.2.1. Tách chiết RNA tổng số........................................................................ 51

3.2.2. Kết quả phân lập gen CO ...................................................................... 54

3.2.3. Kết quả đánh giá sự biểu hiện của gen CO và FT cảm ứng ra hoa ở cây

Hoa cúc .......................................................................................................... 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 68

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.2: Các gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây Arabidopsis ........................... 17

Bảng 2.1: Trình tự nucleotide các cặp mồi sử dụng .................................................. 28

Bảng 2.2: Sơ đồ bố trí đèn trong các ô thí nghiệm .................................................... 29

Bảng 2.3: Kí hiệu mẫu thí nghiệm ............................................................................ 31

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR ...................................................................... 33

Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR .............................................................. 33

Bảng 2.6: Thành phần phản ứng gắn gen vào vector pBT ......................................... 35

Bảng 3.1: Sinh trƣởng và phát triển cây hoa cúc sau 50 ngày tuổi ............................ 40

Bảng 3.2: Sinh trƣởng và phát triển của hoa cúc 70 ngày tuổi .................................. 43

Bảng 3.3: Sinh trƣởng và phát triển của hoa cúc sau 110 ngày tuổi .......................... 45

Bảng 3.4: Hiệu quả tiết kiệm năng lƣợng ................................................................. 50

Bảng 3.5: Kết quả định lƣợng RNA tổng số bằng Nano Drop .................................. 53

Bảng 3.6: Mã số trong Ngân hàng dữ liệu gen và vùng phân lập của các thể phân lập

thuộc chi cúc Chrysanthemum sử dụng trong phân tích, so sánh trình tự gen CO ..... 58

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn iv

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.2: Cây hoa cúc vàng pha lê ............................................................................. 5

Hình 1.3. Sự ra hoa ở cây ngày ngắn và cây ngày dài ............................................... 13

Hình 1.4: Con đƣờng quang chu kỳ điều khiển sự ra hoa ở cây Arabidopsis ............ 19

Hình 1.5: Ảnh hƣởng của ánh sáng đỏ và đỏ xa đến sự ra hoa của cây ngày ngắn và

cây ngày dài ............................................................................................................. 20

Hình 1.6: Hình ảnh đèn Led và đèn Led sử dụng trong nuôi cấy mô ........................ 22

Hình 3.1: Cây hoa cúc 40 ngày tuổi.......................................................................... 39

Hình 3.2: Hình ảnh cây hoa cúc 50 ngày tuổi .......................................................... 41

Hình 3.3: Ảnh hƣởng của đèn Led đến thời gian ra hoa của cây hoa cúc 50 ngày tuổi

................................................................................................................................. 42

Hình 3.4: Ảnh hƣởng của đèn Led đến thời gian ra nụ của cây 70 ngày tuổi ........... 44

Hình 3.5: Hình ảnh Hoa cúc sinh trƣởng ở 70 ngày tuổi ........................................... 44

Hình 3.6: Hình ảnh hoa cúc ở 110 ngày tuổi............................................................. 47

Hình 3.7: Ảnh hƣởng của đèn Led đến đƣờng kính hoa ............................................ 48

Hình 3.8:Tổng năng lƣợng sử dụng trong một vụ ..................................................... 51

Hình 3.9: Kết quả điện di tách chiết RNA tổng số trên gel agarose 1% .................... 52

Hình 3.10: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi MTP ..................... 55

Hình 3.11: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR dùng cặp mồi đặc hiệu (CS_CO

F/R) sử dụng khuôn là cDNA tổng hợp từ RNA tổng số của các mẫu hoa cúc.......... 55

Hình 3.12: Kết quả điện di sản phẩm colony PCR với cặp mồi pUC18F/R............... 57

Hình 3.13 : Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide gen CO của thể phân lập COL-

clone36 với bốn thể phân lập khác thuộc chi Chrysanthemum trên Ngân hàng dữ liệu

gen. .......................................................................................................................... 59

Hình 3.14: Hình ảnh so sánh trình tự axit amin gen CO của thể phân lập COL-clone36

với bốn thể phân lập khác thuộc chi Chrysanthemum trên Ngân hàng dữ liệu gen. ... 60

Hình 3.15: Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide của gen CO chi

Chrysanthemum. Thể phân lập COL-clone36 nghiên cứu đƣợc so sánh với bốn thể

phân lập khác đƣợc công bố trên Ngân hàng dữ liệu gen. ......................................... 60

v Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

Hình 3.16: Kết quả phân tích mức độ biểu hiện ở cấp độ phiên mã của gen CO ở lá

của cây hoa cúc ở 42, 49, 56 và 63 ngày tuổi............................................................ 62

Hình 3.17: Biểu hiện của gen FT ở các giai đoạn phát triển khác nhau ở mẫu lá bánh

tẻ , lá non và đỉnh chồi của cây hoa cúc .................................................................... 64

Hình 3.18: Kết quả phân tích mức độ biểu hiện ở cấp độ phiên mã của gen CO ở lá

của cây hoa cúc ở 42, 49, 56 và 63 ngày tuổi............................................................ 65

vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả trình bày

trong luận án là trung thực, chƣa đƣợc công bố trong bất kể công trình nghiên

cứu nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả

Nguyễn Thị Thu Hiền

vii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS. Chu Hoàng Hà, đã

tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt quá

trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Phạm Bích Ngọc đã dành thời

gian chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình làm việc. Đã có những lúc

khó khăn nhƣng Cô luôn bên cạnh động viên và hƣớng dẫn giúp tôi có thể hoàn

thành đƣợc luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơnThs Phạm Thị Vân, Ths Hoàng Đăng Hiếu,

CN. Nguyễn Văn Đoài cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật,

những ngƣời anh, ngƣời chị,những ngƣời đồng nghiệp đã luôn chia sẻ, giúp đỡ

tôi trong suốt quá trình làm việc.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, những ngƣời thân

luôn bên tôi, ủng hộ và giúp đỡ tôi để tôi có thể hoàn thành tốt công việc cũng

nhƣ luận văn này.

Hà Nội, tháng 1 năm 2016 Học viên

Nguyễn Thị Thu Hiền

viii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Led :Light-emitting diode

cDNA : Complementary DNA

DNA : Deoxirybonucleotide acid

E.coli : Escherichia coli

Bp : base pair

PCR : Polymerase Chain Reaction

RNA : Ribonucleotide acid

CO : CONSTANS

FT : FLOWERING LOCUS T

C/N : Carbonhydrat/ nitrogen

GA : Gibberellin

TSF : TWIN SISTEROF FT

CFL : Compact fluorescent lamp

RT-PCR : Reverse transcriptpolymerase chain reaction

FREL : Far red light

ix Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây nền kinh tế thị trƣờng phát triển, một hƣớng

chuyển đổi cơ cấu cây trồng nông nghiệp sang phát triển hoa cây cảnh đang

đƣợc xã hội quan tâm vì nó không chỉ mang lại giá trị về tinh thần mà còn

mang lại lợi ích kinh tế cao cho ngƣời sản xuất.

Trong các loài hoa, cây hoa cúc đƣợc trồng phổ biến, phát triển nhanh vì

nó là loại hoa đẹp, đƣợc dùng nhiều trong các dịp lễ tết. Cây hoa cúc vừa có giá

trị trang trí lại có thể sử dụng làm dƣợc liệu chính vì vậy nó đƣợc trồng rộng rãi

ở nhiều địa phƣơng bởi khả năng thích nghi cao, dễ sản xuất và dễ dàng trong

việc vận chuyển.

Nhiều giống hoa cúc có phản ứng rất chặt với ánh sáng ngày ngắn ( cúc

vàng pha lê, chi trắng…) chính vì vậy ngay khi mới trồng mà gặp điều kiện ánh

sáng ngày ngắn cây đã ra hoa, không đủ thời gian để cây sinh trƣởng điều này

làm giảm đáng kể chất lƣợng của cành hoa. Để khắc phục hiện tƣợng này,

ngƣời ta thƣờng sử dụng đèn compact, hay đèn sợi đốt để chiếu sáng bổ sung

cho cây hoa cúc nhằm tăng thời gian sinh trƣởng đến khi cây đạt chiều cao cần

thiết mới ra hoa. Tuy nhiên, khi sử dụng đèn compact hay đèn sợi đốt lƣợng

điện năng tiêu thụ lớn, tuổi thọ không cao, mất nhiều chi phí. Chính vì vậy

trong những năm gần đây đèn Led đƣợc đƣa vào nghiên cứu và sử dụng nhằm

loại bỏ những hạn chế trên của đèn compact và đèn sợi đốt. Nhƣng câu hỏi đặt

ra đó là chất lƣợng ánh sáng của đèn Led ảnh hƣởng nhƣ thế nào đến quá trình

ra hoa của cây, không chỉ ở mức độ hình thái, sinh trƣởng mà ở cả mức độ phân

tử. Xuất phát từ những băn khoăn này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu hoạt động của gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây hoa cúc

chiếu sáng phá đêm bằng đèn Led” với mục tiêu, nội dung và phạm vi nghiên

cứu nhƣ sau:

1

Mục tiêu nghiên cứu:

(1). Lựa chọn đƣợc chế độ chiếu sáng thích hợp đối với sự sinh trƣởng

và phát triển của cây hoa cúc.

(2). Phân lập đƣợc một gen liên quan đến sự điều khiển quá trình ra hoa

ở cây hoa cúc.

(3). Đánh giá sự biểu hiện của gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây hoa cúc.

Nội dung nghiên cứu:

(1). Khảo sát sự ảnh hƣởng của một số công thức đèn Led đến sự sinh

trƣởng và phát triển của cây hoa cúc, so sánh với các công thức chiếu sáng

truyền thống.

(2). Tách dòng và xác định trình tự gen CO- một gen quan trọng điều

khiển quá trình ra hoa.

(3). Đánh giá biểu hiện của gen CO và gen FT.

Phạm vi nghiên cứu:

(1). Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật- Viện Công nghệ Sinh học- Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

(2). Trại thực nghiệm Sinh học Cổ Nhuế- Viện Công nghệ Sinh học-

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY HOA CÚC

1.1.1. Giới thiệu về cây hoa cúc

Cây hoa cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản và một số nƣớc

Châu Âu

Giới (Regnum)

Thực vật (Plantae)

Ngành (Divisio)

Thực vật hạt kín (Angiospermae)

Lớp (Class)

Hai lá mầm (Eudicots)

Bộ (Ordo)

Hƣớng dƣơng (Asterales)

Họ (Familia)

Cúc (Asteraceae)

Chi (Genus)

Chrysanthemum

Loài điển hình (Species)

Chrysanthemum indicum

Hoa cúc đƣợc trồng ở nhiều nơi trên thế giới nhƣ: Hà Lan, Italia, Trung

quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc....Ở nƣớc ta cây hoa Cúc (Chrysanthemum sp) đã

du nhập vào từ thế kỷ XV, đến đầu thế kỷ XIX đã hình thành một số vùng

chuyên canh nhỏ cung cấp hoa cho thị trƣờng. Hiện nay Cúc có mặt ở khắp nơi

từ nông thôn đến thành thị, từ miền núi đến đồng bằng. Các vùng trồng nhiều

mang tính tập trung là Hà Nội (450 ha), thành phố Hồ Chí Minh (370 ha), Đà

Lạt (160 ha), Hải Phòng (110 ha).

Tại vùng trồng hoa Tây Tựu-Từ Liêm-Hà Nội, hoa hồng và hoa cúc là

hai loại hoa có diện tích trồng và sản lƣợng cao nhất. Hoa cúc đứng hàng thứ

hai với chu kỳ 3 tháng một lần cho thu hoạch. Hoa cúc của vùng không chỉ

3

đƣợc tiêu thụ tại các thị trƣờng phía Bắc mà đang đƣợc đƣa dần vào thị trƣờng

phía Nam và xuất khẩu sang Trung Quốc .Trong diện tích gần 136 ha trồng hoa

của vùng Trung du và miền núi phía Bắc, diện tích trồng hoa hồng đã chiếm tới

trên 55,27% với sản lƣợng 26,53 triệu bông/năm. Diện tích trồng hoa cúc lớn

thứ hai với 14,5 ha, sản lƣợng 5 triệu cành/năm (Đề án Phát triển sản xuất, xuất

khẩu rau, quả và hoa tƣơi Việt Nam).

Hoa Cúc có tác dụng sơ phong tiết nhiệt, làm nhẹ đầu mắt. Trong phòng

chống cảm cúm, hiệu quả kháng viêm và cải thiện hệ miễn dịch của hoa Cúc có

thể rút ngắn thời gian bệnh và làm giảm các triệu chứng ho, sốt, nhức đầu,

nghẹt mũi.

Tất cả các loài hoa Cúc đều có thể dùng làm thuốc. Tuy nhiên, do hiệu

suất cao, hoa Cúc vàng (hoàng Cúc), tên khoa học Chrysanthemum indicum L.

thƣờng đƣợc sử dụng trong Đông y. Hoàng Cúc đƣợc trồng để lấy hoa làm

cảnh, làm thuốc, ƣớp chè hoặc cất rƣợu. Trong những năm gần đây, các nhà

khoa học phƣơng Tây đặc biệt quan tâm đến giá trị dƣợc học của hoa Cúc tím

(Cúc dại), tên khoa học là Echinacea purpurea.

Theo nghiên cứu của Tiến sĩ Jurg Gertsch, thuộc Việc Công nghệ Swiss,

những hoạt chất alkylamides trong hoa Cúc dại có khả năng điều chỉnh 1 trong

những yếu tố quan trọng nhất của hệ miễn dịch đƣợc gọi là tumor necrosis

factor alpha (TNF-a). Alkylamides kích thích hoạt động của TNF-a để gia tăng

sức đề kháng chống lại những tác động có hại vủa vi trùng, vi khuẩn.

Hoa Cúc là loại dƣợc thảo có tác dụng giải độc tốt nhất cho hệ thống

tuần hoàn và hệ thống hô hấp. Hoạt chất trong hoa Cúc không chỉ giúp giải tỏa

những áp lực ở mắt từ bệnh cảm cúm theo mùa hoặc hiện tƣợng khí nghịch của

Đông y mà còn có khả năng cải thiện hoạt động ở những mao mạch, tăng

cƣờng lƣu thông khí huyết đến mắt. Những chất chống oxy hóa trong hoa Cúc

có khả năng trung hòa những gốc tự do để bảo vệ những cấu trúc collagen ở

4

mắt. Hoa Cúc rất thông dụng ở các dân tộc Bắc Mỹ và châu Âu. Các nhà khoa

học cho biết các hoạt chất của hoa Cúc vừa có tính kháng viêm giống nhƣ

cortisone vừa có tác dụng kháng khuẩn

Hình 0.1: Cây hoa cúc vàng pha lê

Cây hoa cúc là cây ngày ngắn, ƣa đêm lạnh. Thời kỳ đầu cây non mới ra

rễ, cây cần ít ánh sáng; trong quá trình sinh trƣởng, ánh sáng quá mạnh sẽ làm

cây chậm lớn và chất lƣợng hoa giảm. Ngày nay cùng với tiến bộ khoa học kỹ

thuật trong nông nghiệp, thì việc trồng cây nói chung và việc trồng hoa cúc nói

riêng đã đƣợc áp dụng nhiều giống mới, nhiều thiết bị kỹ thuật hiện đại nhƣ nhà

lƣới, nhà kính, kỹ thuật canh tác..., sử dụng các chất kích thích sinh trƣởng, ánh

sáng, phân bón...Và trong đó, việc điều chỉnh các cƣờng độ chiếu sáng khác

nhau cho hoa cúc để đem lại năng suất, chất lƣợng tốt nhất, có hiệu quả kinh tế

cao nhất là vấn đề mà mỗi ngƣời trồng cần quan tâm.

1.1.2. Nhu cầu ánh sáng cho quá trình sinh trƣởng, phát triển của cây hoa cúc

Sự sinh trƣởng phát triển của thực vật nói chung và của cây hoa cúc nói

riêng đều chịu tác động của các yếu tố ngoại cảnh nhƣ ánh sáng, nhiệt độ, độ

ẩm, đất trồng, dinh dƣỡng, quang chu kỳ bổ sung, cơ sở hạ tầng... Trong đó ánh

sáng (quang chu kỳ và quang chu kỳ bổ sung) và nhiệt độ thấp (sự xuân hóa) là

hai yếu tố quan trọng nhất ảnh hƣởng đến giai đoạn cảm ứng hình thành hoa.

Hoa Cúc là loại cây hoa ngày ngắn, sự phân hoá và phát dục của hoa

đƣợc tác động dƣới tác dụng đồng thời của quang chu kì và nhiệt độ. Trong quá

5

trình sinh trƣởng, phát dục, dƣới tác dụng phối hợp của độ dài chiếu sáng trong

ngày và nhiệt độ ở mức độ nhất định mới có thể ra hoa, trong đó độ dài chiếu

sáng là yếu tố quan trọng hơn, yêu cầu khắt khe hơn. Khi thời gian chiếu sáng

kéo dài thì thời gian sinh trƣởng của cây hoa Cúc dài hơn, thân cao, lá to, chất

lƣợng hoa tăng. Thời gian chiếu sáng ngắn thì sẽ kích thích phân hóa mầm hoa

sớm: cây ngắn, chất lƣợng hoa kém. Thời kỳ để phân hóa mầm hoa tốt nhất là

10 giờ chiếu sáng trên ngày với nhiệt độ là 20-25ºC.

Khống chế chiều cao cây: Tuỳ theo các mục đích sử dụng khác nhau mà

yêu cầu độ cao của cây cũng khác nhau, vì vậy khống chế chiều cao cây cũng là

một biện pháp kĩ thuật không thể thiếu đối với hoa cúc. Chiều cao cây do yếu

tố di truyền của giống và điều kiện thâm canh chăm sóc quyết định. Giống thấp

cây nhất chỉ cao khoảng 20–30cm, giống cao nhất có thể cao trên 3m. Thời

gian sinh trƣởng dài, ngắn ảnh hƣởng trực tiếp đến chiều cao cây. Trong thời

gian sinh trƣởng dinh dƣỡng với điều kiện thích hợp mỗi tuần có thể tăng 2–4

đốt, với giống sinh trƣởng nhanh có thể dài thêm 6–13cm. Vì vậy điều chỉnh

thời gian cắm cành, thời vụ trồng rút ngắn độ dài thời ki sinh trƣởng dinh

dƣỡng là biện pháp khống chế chiều cao đơn giản, nhanh nhạy nhất. Yếu tố ánh

sáng gây tác động lên độ dài thời gian sinh trƣởng sinh dƣỡng nên cũng gây

ảnh hƣởng đến chiều cao cây.

Ảnh hưởng đến độ lớn của hoa: Độ lớn của hoa là một chỉ tiêu quan

trọng để đánh giá chất lƣợng hoa Cúc. Trong trồng trọt ngƣời ta thƣờng dùng

các biện pháp tăng cƣờng bón phân, tƣới nƣớc, phun phân qua lá, phun chất

kích thích sinh trƣởng, biện pháp ghép… để làm tăng đƣờng kính hoa. Có thể

dùng biện pháp kéo dài độ chiếu sáng trong ngày sau khi mầm hoa đã phân hoá

để tăng đƣờng kính hoa. Sau khi xử lí chiếu sáng ngày ngắn 35 ngày để cho

mầm hoa phân hoá, khi đã có nụ và sau khi tỉa bớt nụ, đặt cây trong điều kiện

chiếu sáng ngày dài cho đến khi hoa nở. Điều này có thể làm cho rất nhiều

giống tăng đƣờng kính hoa.

6

Điều chỉnh sự ra hoa: thời gian ra hoa ở cây cúc có thể điều chỉnh bằng

hoá chất và nhiệt độ hoặc khống chế quang chu kỳ. Độ dài chiếu sáng tới hạn

trong ngày có tác dụng điều tiết quá trình sinh trƣởng phát triển của cây và phụ

thuộc vào các loài khác nhau gọi là hiện tƣợng quang chu kỳ. Mỗi loài thực vật

có độ dài ngày tới hạn nhất định, trong đó cây ra hoa trong điều kiện thời gian

chiếu sáng trong ngày ngắn hơn thời gian chiếu sáng tới hạn gọi là cây ngày

ngắn và cây ra hoa trong điều kiện thời gian chiếu sáng trong ngày dài hơn thời

gian chiếu sáng tới hạn gọi cây ngày dài. Hoa cúc thuộc lớp hai lá mầm và là

loại cây ngày ngắn nghĩa là sự hình thành và phát triển của hoa diễn ra trong

điều kiện ngày có thời gian chiếu sáng ngắn hơn 12-13 giờ. Cây hoa cúc cần

trên 16 giờ chiếu sáng để phân hóa hoa và sinh trƣởng mạnh, vì vậy khi độ dài

ngày tự nhiên ít hơn 16 giờ thì cần phải bổ sung thêm ánh sáng đèn để giúp cây

phát triển chiều cao. Ví dụ: ở Đà lạt, vào mùa hè độ dài ngày từ 12 đến 13 giờ,

vì vậy cần bổ sung quang chu kỳ từ 3 đến 4 giờ vào ban đêm sẽ đảm bảo đủ

ánh sáng ngày dài cho sự sinh trƣởng của cây. Vào mùa đông, độ dài ngày từ

11 đến 12 giờ, vì vậy cần bổ sung quang chu kỳ từ 4 đến 5 giờ vào ban đêm.

Thời gian bắt đầu chiếu sáng bổ sung hiệu quả nhất là từ 22 giờ đêm đến 2 giờ

sáng. Những giống hoa cúc có nguồn gốc từ Châu âu cơ bản là nở vào mùa thu

đông nhƣng những năm gần đây ngƣời ta đã phát hiện ra phản ứng với quang

chu kỳ của cúc kết hợp với việc tạo giống với các nguồn gen khác nhau, có thể

khống chế làm cho cúc ra hoa theo ý muốn. Hiện nay các nhà sản xuất thông

qua khống chế quang chu kỳ kết hợp với khống chế nhiệt độ có thể làm cho cúc

quanh năm có hoa.

Nhiệt độ không chỉ ảnh hƣởng đến tốc độ phát triển của nụ của cây hoa

cúc mà còn ảnh hƣởng đến sự phân hóa và phát dục của hoa. Nụ đã đƣợc phân

hóa nếu gặp nhiệt độ thấp, quá trình phát dục sẽ bị chậm nên hoa cũng nở

muộn. Thời gian nở hoa sớm hay muộn tùy thuộc vào chế độ nhiệt và đặc tính

di truyền của giống. Khi nghiên cứu về ảnh hƣởng của nhiệt độ tới sự ra hoa

của các giống Cúc tại Châu Âu, Karlson, chia cúc làm 3 nhóm:

7

 Nhóm giống không bị ảnh hƣởng bởi nhiệt độ: trong phạm vi từ 10 -

27ºC, nhiệt độ không ảnh hƣởng gì đến sự phân hóa và phát dục của hoa.

Nhƣng nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn nhiệt độ trên sẽ ức chế sự ra hoa.

 Nhóm giống bị nhiệt độ thấp ức chế ra hoa: bình thƣờng chúng bắt đầu

phân hóa mầm hoa từ 16ºC trở lên, nhiệt độ thấp hơn 16ºC sẽ ức chế sự phân

hóa hoa.

 Nhóm giống bị nhiệt độ cao ức chế ra hoa: thời điểm bắt đầu phân hóa

hoa của nhóm này ở nhiệt độ cao (>20ºC), nhƣng nếu nhiệt độ quá cao (>35ºC)

thì kéo dài sự phát dục của nụ bị ngừng trệ.

Cúc là cây ngày ngắn, ƣa ánh sáng và đêm lạnh. Thời kỳ đầu non mới ra

rễ cây cần ít ánh sáng, nhƣng trong quá trình sinh trƣởng ánh sáng mạnh cũng

làm cho cây chậm lớn. Ngoài ra Jong (1989) và Strojuy (1985) đã khẳng định,

thời gian chiếu sáng rất quan trọng cho cây hay nói cách khác ngày đêm dài

hay ngắn có tác dụng khác nhau đối với loại hoa này, hầu hết các giống Cúc

trong thời kỳ sinh trƣởng sinh dƣỡng cần ánh sáng ngày dài trên 13h, còn trong

giai đoạn trổ hoa cây chỉ cần ánh sáng ngày ngắn từ 10-11h và nhiệt độ không

khí < 20ºC. Bởi vậy trong điều kiện Việt Nam cây Cúc rất phù hợp với thời tiết

thu đông, nhƣng hiện nay một số giống Cúc nhập nội có thể ra hoa trong điều

kiện ngày dài. Theo Wang và Chen (1990) nhiệt độ, ánh sáng không tác động

một cách riêng rẽ mà phối hợp nhau, kìm hãm hay thúc đẩy sự sinh trƣởng và

phát triển của cây hoa Cúc. Fukuda và các cộng sự (1987), đã cho rằng đối với

nhóm Cúc ra hoa mùa thu, sự hình thành và phát triển chồi là trong điều kiện

ngày ngắn, chồi hoa hình thành ≥ 15ºC, ở nhiệt độ cao không gây ức chế. Còn

nhóm ra hoa mùa đông dù trong điều kiện ngày ngắn, nhƣng nếu ở nhiệt độ cao

sẽ ức chế sự phát triển của chồi hoa. Riêng nhóm ra hoa ở mùa hè, chồi hoa

thƣờng hình thành ở 10ºC trong điều kiện ngày trung tính. Nhiều nghiên cứu

khác cũng cho thấy độ dài ngày có ảnh hƣởng đến sự ra hoa của cây Cúc, theo

8

Novatna (1988) vào thời kỳ ra hoa, cây yêu cầu thời gian chiếu sáng là 10 giờ,

nhiệt độ thích hợp là 18ºC, nếu thời gian chiếu sáng dài Cúc sẽ kéo dài thời

gian sinh trƣởng, cây cao, lá to và ra hoa muộn.

* Biện pháp kéo dài thời kỳ sinh trưởng dinh dưỡng làm chậm sự nở hoa

bằng: chiếu sáng bổ sung:Mục đích của chiếu sáng bổ sung là giảm thời gian

tối của mỗi ngày chứ không phải là kéo dài thời gian chiếu sáng liên tục vì vậy

nếu chiếu sáng thực hiện vào lúc nửa đêm để chia cắt thời gian tối liên tục

thành hai giai đoạn tối, đồng thời cũng là để tăng số giờ chiếu sáng thì hiệu quả

hơn nhiều. Nguyên tắc xác định thời gian chiếu sáng bổ sung là làm cho thời

gian tối liên tục trong đêm mỗi đoạn ngắn hơn 7 h. Nói chung đƣợc thực hiện

vào khoảng 11h đêm đến 4h sáng hôm sau. Nhƣ vậy mỗi nửa kỳ tối đều không

vƣợt quá 7h.

* Biện pháp rút ngắn thời kỳ sinh trưởng dinh dưỡng, kích thích sự nở

hoa của cúc

Ở thực tế sản xuất song song với việc chiếu sáng bổ xung để làm chậm

sự nở hoa của cúc, ngƣời ta cũng còn sử dụng biện pháp ngƣợc lại là che sáng

để kích thích hoa nở sớm hơn.

1.2. TỔNG QUAN VỀ SỰ RA HOA Ở THỰC VẬT

Trong suốt cuộc đời mình, cơ thể thực vật chịu nhiều biến đổi đặc trƣng

phù hợp với từng giai đoạn khác nhau của vòng đời. Ở thực vật có hoa, sự ra

hoa là bƣớc chuyển quan trọng đánh dấu bƣớc phát triển mới của thực vật và có

ý nghĩa quyết định đối với sự tồn tại của thực vật. Hoa đƣợc thành lập từ chồi

ngọn hay chồi nách qua ba giai đoạn chính: chuyển tiếp ra hoa; hình thành cơ

quan hoa; tăng trƣởng và nở hoa.

Sự chuyển tiếp ra hoa gây nên các biến đổi sâu sắc của mô phân sinh

ngọn, từ mô phân sinh dinh dƣỡng thành mô phân sinh tiền hoa. Các biểu hiện

đầu tiên của sự chuyển tiếp ra hoa không thấy đƣợc bằng mắt thƣờng, chỉ biết

đƣợc bởi các phân tích tế bào học hay sinh hóa học, với sự tăng mạnh hoạt tính

9

biến dƣỡng (tổng hợp RNA, ribosome, protein), đặc biệt trong vùng đỉnh. Sự

chuyển tiếp ra hoa xảy ra đồng thời với sự biến đổi rất rõ của bộ máy dinh

dƣỡng, đặc biệt là sự kéo dài lóng thân do hoạt động mạnh của vùng dƣới ngọn

của mô phân sinh tiền hoa.

Sự hình thành cơ quan hoa: Sự chuyển tiếp ra hoa cần khoảng 2-3 ngày

để dẫn tới hình thành cơ quan hoa (quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi). Sự phát

triển của các sơ khởi hoa nói chung xảy ra nhanh chóng, làm chồi phồng lên

thành nụ hoa (dễ thấy dƣới kính lúp, qua lát cắt dọc).

Sự tăng trƣởng và nở hoa: Khi sự tƣợng hoa hoàn thành, nụ hoa có thể

tiếp tục tăng trƣởng và nở (trƣờng hợp các cây nhất niên). Tuy nhiên nụ hoa có

thể vào trạng thái ngủ

Ngày nay, đã nhận biết đƣợc bốn con đƣờng tạo hoa đƣợc di truyền điều

phối. (1) con đƣờng phụ thuộc tuổi (tự khiển), (2) con đƣờng phụ thuộc gibberellin,

(3) con đƣờng phụ thuộc nhiệt độ, (4) con đƣờng phụ thuộc ánh sáng.

1.2.1. Con đƣờng ra hoa tự khiển

Ra hoa tự khiển là con đƣờng tạo hoa không phụ thuộc vào các điều

khiện ngoại cảnh. Khi cây sinh trƣởng đến một độ tuổi nhất định nào đó cây sẽ

ra hoa. Tùy theo các loài thực vật khác nhau mà có chu kỳ phát triển khác nhau.

Nhƣ cây lạc ở pha chồi lá mầm đã sẵn sàng ra hoa,hay nhƣ cây lúa mạch đen

chỉ ra hoa khi có ít nhất 7 lá hoàn chỉnh, một số cây cà chua sau khi có 5 lá đã

bắt đầu chuyển sang trạng thái phát triển sinh sản. Cây sồi ra hoa sau 10 đến 12

năm, một số loài tre bắt đầu chuyển sang pha trƣởng thành ra hoa sau 50 năm.

Sự chuyển đổi nhƣ vậy gọi là sự chuyển đổi pha trog mô phân sinh đỉnh cành,

nó xảy ra dƣới tác động của các nhân tố nhất định, trong trƣờng hợp này đó là

các nhân tố nội tại.

10

1.2.2. Con đƣờng phụ thuộc gibberellin đòi hỏi mức hoocmon gia tăng

Mỗi thời kỳ sinh trƣởng và phát triển của thực vật có nhu cầu dinh dƣỡng

khác nhau. Trong thời kỳ ra hoa cây cần nhu cầu dinh dƣỡng không nhiều nhƣng

phải cân đối. Lƣợng dinh dƣỡng phải đảm bảo nằm trong giới hạn cho phép:

Giới hạn trên là giới hạn mà ở đó sự phát triển dinh dƣỡng chiếm ƣu thế.

Giới hạn dƣới là giới hạn mà dƣới đó, dinh dƣỡng không đủ cho sự ra

hoa. Thông thƣờng, sự dinh dƣỡng nhiều đạm kích thích sự phát triển dinh

dƣỡng và ngƣợc lại, sự dinh dƣỡng giàu carbon kích thích sự ra hoa. Do đó,

việc lựa chọn tỉ lệ C/N ( carbonhydrat/ nitrogen) cao thích hợp sẽ kích thích sự

ra hoa, nếu tỉ lệ này thấp sẽ làm cây phát triển sinh dƣỡng cao, nếu tỉ lệ này quá

cao hoặc quá thấp sẽ ức chế sinh trƣởng của thực vật. Tóm lại, có nhiều yếu tố

dinh dƣỡng ảnh hƣởng tới sự ra hoa, tuy nhiên quan trọng nhất là: sự cạnh tranh

giữa phát triển dinh dƣỡng và phát triển sinh sản, sự thiếu dinh dƣỡng nhẹ (trên

mức tối thiểu), và cân bằng C/N.

Tƣơng quan hoocmon

Đỉnh sinh trƣởng của cành nhận đƣợc từ những phần còn lại của cây các

hoocmon và các chất khác ngoài cacbon hidrat và các chất dinh dƣỡng. Trong

Arabidopsis và một số loài khác, giảm thiểu các mức gibberellin đã làm chậm trễ

sự nở hoa. Vai trò của GA nội sinh trong sự điều tiết sinh sản cũng đã đƣợc

chứng minh trong cách xử lí khác vốn xúc tiến sự ra hoa của cây thông cũng

thƣờng do sự gia tăng lƣợng GA trong cây. Mặt khác, trong khi GA xúc tiến sự

trƣởng thành sinh sản ở các loài cây Hạt trần và nhiều thực vật Hạt kín thân cỏ,

xử lí GA3 đã gây nên sự trẻ lại ở cây thƣờng xuân và một số thực vật Hạt kín

thân gỗ

1.2.3. Con đƣờng ra hoa phụ thuộc nhiệt độ ( sự xuân hóa)

Xuân hóa là mối phụ thuộc của phát triển thực vật vào nhiệt độ. Nhiệt độ

lạnh có thể gia tăng hoặc cho phép tạo hoa trong nhiều loài. Hiện tƣợng xuân

hóa ở thực vật là hiện tƣợng cảm ứng thực vật nảy chồi hoặc ra hoa bằng xử lý

11

nhiệt độ lạnh (cây chỉ ra hoa sau khi trải qua một giai đoạn nhiệt độ lạnh nhất

định) đặc biệt là thực vật ôn đới.

Trong phản ứng xuân hóa, cơ quan tiếp nhận nhiệt độ thấp là đỉnh sinh

trƣởng ngọn. Chỉ cần đỉnh sinh trƣởng ngọn tiếp xúc với nhiệt độ thấp là đủ để

gây nên sự phân hóa mầm hoa mà không cần nhiệt độ thấp ở các cơ quan khác.

Giới hạn nhiệt độ cho sự xuân hóa khác nhau đối với từng loại thực vật nhƣng

đều nằm trong khoảng từ 0ºC- 15ºC. Trong khoảng nhiệt độ xuân hóa nếu nhiệt

độ càng thấp thì thời gian tiếp xúc càng ngắn.

Dựa vào yêu cầu của sự xuân hóa có thể phân thực vật ra làm 3 loại:

- Cây xuân hóa tuyệt đối (thƣờng có dạng hoa hồng): phải trải qua một

thời gian nhiệt độ lạnh mới ra hoa thƣờng là cây hai năm ( cải đƣờng, cà

rốt,…), cây nhiều năm

- Cây xuân hóa không bắt buộc (ra hoa sớm hơn nếu đƣợc tiếp xúc với

nhiệt độ lạnh): lúa mạch đen Petkus ra hoa khi có 7 lá nếu hạt đƣợc tiếp xúc

nhiệt độ lạnh, nhƣng cần 16-25 lá nếu không đƣợc tiếp xúc với nhiệt độ lạnh

- Cây không cần xuân hóa: cây một năm không qua mùa đông, cây đa

niên tƣợng hoa trƣớc mùa đông. Cơ quan để cây tiếp nhận kích thích của nhiệt

độ thấp là phôi hay chồi. Nhiệt độ thấp là yếu tố khởi động hoạt tính phân sinh

của phôi hay chồi và làm cho tất cả các chồi xuất phát từ đó cũng đƣợc xuân

hóa. Việc hiểu biết ảnh hƣởng của nhiệt độ thấp hay hiện tƣợng xuân hóa đến

sự phát triển của cây có ý nghĩa trong sản xuất. Bằng biện pháp xử lý nhiệt độ

thấp thích hợp, ngƣời ta có thể biến lúa mì đông thành lúa mì xuân, biến cây

hai năm thành cây một năm. Hơn nữa, với hầu hết các loại cây trồng, việc xử lý

nhiệt độ thấp hoặc bảo quản nhiệt độ thấp cho hạt giống, củ hoặc căn hành sẽ

làm tăng khả năng rút ngắn thời gian sinh trƣởng, xúc tiến sự ra hoa nhanh và

làm tăng năng suất, phẩm chất thu hoạch.

12

1.2.4. Quang chu kì

Sự tạo hoa đòi hỏi nhiều năng lƣợng đƣợc tích lũy trong quang hợp, tất

cả thực vật đều đòi hỏi ánh sáng để tạo hoa nhƣng điều này khác biệt với con

đƣờng tạo hoa phụ thuộc ánh sáng, chu kì quang.

Hiện tƣợng quang chu kì ánh sáng đƣợc khám phá bởi Tournis năm

1912, sau đó đƣợc Garner và Allard mở rộng sự quan sát trên nhiều loại cây

khác trong giai đoạn 1920-1940. Sự đáp ứng của cây trồng với quang chu kì

đƣợc chia thành 3 loại: Cây ngày ngắn, cây ngày dài và cây trung tính. Theo

quan điểm của Allard và Garner thì chu kì quang không dựa vào độ dài tuyệt

đối của ngày và đêm mà nói về ngày dài hơn hay ngắn hơn độ dài tới hạn. Thực

vật từ ngày ngắn ra hoa đƣợc khởi đầu khi độ dài của ngày trở nên ngắn hơn so

với độ dài tới hạn. Đối với thực vật từ ngày dài sự ra hoa bắt đầu khi độ dài của

ngày trở nên dài hơn. Thực vật trung tính ra hoa trong bất kì độ dài nào của

ngày nhƣ cây hoa mõm chó ( Antirrhininum), hoa hồng ( Rose).

Cây ngày ngắn sẽ không ra hoa nếu thời gian chiếu sáng vƣợt quá số giờ

tới hạn xác định. Nhƣ cây hoa cúc ( Chrysanthenum) sẽ không ra hoa nếu đƣợc

chiếu sáng hơn 15 giờ ( điều này có nghĩa là đòi hỏi tối thiểu 9 giờ bóng tối)

Hình 0.2. Sự ra hoa ở cây ngày ngắn và cây ngày dài

13

Cây ngày dài sẽ không ra hoa trừ khi nó nhận đƣợc số giờ chiếu sáng lớn

hơn một giới hạn xác định. Nhƣ cây yến mạch (Avena sativa) đòi hỏi ít nhất 9

giờ chiếu sáng trong 1 ngày và nó sẽ ra hoa hầu nhƣ nhanh hơn nếu duy trì

chiếu sáng liên tục. Nhƣ vậy, cây hoa cúc (Chrysanthenum sp), cây ngày ngắn

có khả năng ra hoa trong thời gian ngày sáng dài hơn so với thời gian tối thiểu

cần cho cây yến mạch, một cây ngày dài.

Từ những năm 40 của thế kỉ XX đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sự ra

hoa và các phản ứng khác nhau đối với quang chu kì thực chất là độ dài đêm

mà không phải độ dài ngày. Nhƣ vậy, với những cây ngày dài thực chất là độ

dài đêm ngắn, còn cây ngày ngắn là thực vật có đêm dài. Có nhiều nghiên cứu

thực nghiệm cho thấy rằng những cây đƣợc cho là ngày ngắn cần có đêm tối

liên tục. Nếu trong thời gian tối bị lóe sáng với cƣờng độ rất thấp (khoảng 3-5

lux) trong thời gian 3-5 phút đủ để ngăn chặn cây ngày ngắn ra hoa. Thực

nghiệm ngắt quãng chu kì tối bằng ánh sáng có thành phần quang phổ khác

nhau đến thực vật ngày ngắn cho thấy hiệu quả nhất là các tia đỏ (660 nm) và

cũng nhƣ ảnh hƣởng của ánh sáng đỏ bị các tia đỏ xa (730 nm) loại bỏ.

Chu kì quang đƣợc các dạng khác nhau của phytocrom cũng nhƣ các

phân tử nhạy cảm đối với ánh sáng xanh (blue light) tiếp nhận. Phân tử nhạy

cảm ánh sáng xanh, đó là phân tử phototropin. Phototropin ảnh hƣởng đến phát

sinh hình thái và crytocrom ảnh hƣởng đến các phản ứng chu kỳ quang.

1.2.4.1. Quang chu kì của cây hoa cúc

Cúc là cây ngày ngắn. Hầu hết các giống cúc, việc thay đổi từ ngày dài

sang ngày ngắn có ảnh hƣởng đến sự ra hoa của cúc. Cúc sẽ ra hoa khi độ dài

đêm dài hơn thời gian tối thiểu. Nếu chia một vòng đời của cây cúc thành hai

đoạn là giai đoạn sinh dƣỡng (từ lúc nảy mầm đến khi chẩn bị ra hoa) và giai

đoạn sinh sản (từ lúc ra hoa đến khi đậu quả và chết) thì: ở giai đoạn sinh

dƣỡng, cây cần lƣợng chiếu sáng đủ lớn, kéo dài trong ngày (ngày dài) để tích

14

cực tổng hợp chất dinh dƣỡng cho sự phát triển. Quá trình chuyển đổi từ giai

đoạn sinh dƣỡng đến sinh sản có liên quan mật thiết đến việc chuyển từ ngày

dài sang ngày ngắn.

Các nghiên cứu về quang chu kì của hoa cúc đƣợc tiến hành từ rất lâu.

Năm 1990, công bố trên tạp chí khoa học làm vƣờn (Scientia Horticulturae) của

Andersson và cộng sự về ảnh hƣởng của cƣờng độ và thời gian ánh sáng bổ

sung đối với sự phát triển của hoa cúc. Công trình cho thấy, trong trƣờng hợp

ngày ngắn (11h ánh sáng mặt trời) việc bổ sung thời lƣợng chiếu sáng nhân tạo

làm tăng số lƣợng hoa và giảm thời gian sản xuất (phát triển) khi cây trong giai

đoạn sinh dƣỡng. Đến năm 1994, Cecilia Hidén và Rolf U. Larsen đã lập ra mô

hình dự đoán gần chính xác sự phát triển của hoa cúc trong nhà kính dựa vào

các thông số về chế độ ánh sáng và nhiệt độ. Phát hiện này dựa trên hiện tƣợng

quang chu kì của hoa cúc.

Năm 2012, nghiên cứu về ảnh hƣởng của chất lƣợng ánh sáng sử dụng

trong kỹ thuật phá đêm, Higuchi và cộng sự tiến hành thử nghiệm các chế độ

sáng khác nhau cho kỹ thuật này ở cúc. Trong thí nghiệm này, ngày dài đƣợc

duy trì 16h chiếu sáng bằng các nguồn sáng khác nhau. Ngày ngắn dƣới 12h

chiếu sáng. Ánh sáng cung cấp cho ban ngày 200 μmol.m−2.s−1. Ánh sáng cho

16 phản ứng ngắt đêm 90 μmol.m−2.s−1. Sự ra hoa có thể bị ức chế khi đêm

dài bị gián đoạn bởi việc chiếu ánh sáng đỏ trong thời gian ngắn (4 tiếng vào

ban đêm 23h – 3h) (night break).. Sự ra hoa đƣợc theo dõi dƣới chế độ ngày

ngắn có bổ sung chiếu sáng với ánh sáng trắng, ánh sáng đơn sắc màu đỏ (660

nm), đỏ xa (740 nm), ánh sáng đơn sắc màu xanh (465 nm). Khi sử dụng ánh

sáng trắng cho ngày ngắn, phá đêm bằng ánh sáng đơn sắc đỏ tỏ ra hiệu quả

nhất, trong khi với ánh sáng đơn sắc xanh và đỏ xa thì gây ức chế ra hoa ít.

Ngƣợc lại khi sử dụng ánh sáng đỏ cho ngày ngắn, sự ức chế ra hoa khi chiếu

sáng bổ sung với ánh sáng đơn sắc xanh và đỏ xa cho ban đêm lại mạnh hơn.

Tuy nhiên, khi sử dụng ánh sáng xanh cho ban ngày, kết hợp với ánh sáng đơn

15

sắc xanh và đỏ, không có sự ức chế ra hoa khi phá đêm bằng ánh sáng xanh và

đỏ xa. Tác giả cũng đặt ra giả thuyết : “có ít nhất 2 phức hệ phytochromes liên

quan đến phản ứng ra hoa của hoa cúc” và hơn nữa, chất lƣợng ánh sáng cho

thời gian chiếu sáng ban ngày ảnh hƣởng đến chất lƣợng ánh sáng cần thiết cho

phản ứng ngắt đêm.

1.2.4.2. Gen kiểm soát sự ra hoa

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về những gen kiểm soát quá

trình ra hoa, chủ yếu nghiên cứu trên đối tƣợng là cây Arabidopsis. Đây là loài

cây đƣợc sử dụng phổ biến trong những nghiên cứu thực vật, là thực vật ngày

dài không bắt buộc và nở hoa trong phản ứng đối với cả hai ánh sáng đỏ và ánh

sáng xanh.

sự ra hoa của cây cây Arabidopsis đƣợc quy định bởi bốn con đƣờng

chính: con đƣờng tự khiển, xuân hóa, con đƣờng phụ thuộc GA và con đƣờng

quang chu kì (Zeevaart et al.,2008), Song (et al., 2013)

Có hơn 80 locus liên quan đến sự ra hoa đƣợc giải mã trong bộ gen của

cây Arabidopsis thông qua đột biến. Nhiều gen trong số này đã đƣợc xác định

chức năng, cùng với những nghiên cứu toàn bộ bộ gen đã cho ta những hiểu

biết về các mô hình sinh học phức tạp qui định trong Arabidopsis (Locke et al.

2006; Zeilinger et al. 2006). Tùy thuộc vào thời kỳ hoạt động khác nhau trong

sự kiểm soát sự ra hoa, các gen này có thể chia thành hai nhóm là nhóm gen

định dạng mô phân sinh hoa và gen định dạng cơ quan. Sự sinh trƣởng dinh

dƣỡng và sự ra hoa là hai mặt trái ngƣợc trong cây đƣợc cân bằng bởi nhiều

yếu tố. Một số gen thúc đẩy sự sinh trƣởng dinh dƣỡng và ức chế sự ra hoa và

một số gen có tác động ngƣợc lại. Do đó, có hai con đƣờng kiểm soát sự ra hoa

là ức chế và thúc đẩy.

16

Bảng 0.1: Các gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây Arabidopsis

Chức năng

Tác giả

Genes

Sunget al., 1992

EMF

Ra hoa sớm, ra hoa mà không cần sự sinh trƣởng dinh dƣỡng

Ra hoa sớm, phát hoa xác định

Bradley et al., 1997

TFL

Koornneef et al., 1991

FCA

Đột biến ra hoa trễ và đáp ứng rất mạnh với sự thụ hàn

LD

Đột biến ra hoa trễ và đáp ứng với sự thụ hàn

Pineiro và Coupland,1998

FPA, FVA, FY

Đột biến ra hoa trễ và đáp ứng với sự thụ hàn

Martinez-Zapater et al., 1994

2. Ảnh hƣởng

quang kỳ

Đột biến ra hoa trễ

CO

Putterill et al., 1995

Đột biến ra hoa trễ

Gou et al., 1998

FHA

Đột biến ra hoa trễ

Koornneef et al., 1980

HY4

Đột biến ra hoa trễ

FD, FE, FT, FWA, GI,

Pineiro & Coupland,1998

LHY, CCAI

Đột biến ra hoa trễ và biến

Wang & Tobing,1998

mất theo chu kỳngày/lần

3. Ảnh hƣởng

nhiệt độ thấp

17

Đột biến ra hoa trễ kết hợp

Chandler et al.,1996

VRN1, VRN2, VRN3,VRN4

với sự đáp ứng với sự thụ hàn

Có hơn 29 đột biến ra hoa trễ trên cây Arabidopsis tuy nhiên trong tất cả

những đột biến này không có đột biến nào không ra hoa tuyệt đối. Điều này cho

thấy rằng sự mất chức năng trong những đột biến có thể đƣợc bổ sung bằng

những gen khác. Đột biến ra hoa trễ bao gồm các gen co, fd, fe, fha, ft, fwa và

gi ít hoặc không đáp ứng với nhiệt độ thấp và kiểu hình ra hoa dƣới điều kiện

ngày dàigiống nhƣ dƣới điều kiện ngày ngắn. Điều này cho thấy rằng nhóm này

tác động theo con đƣờng ngày dài mà thúc đẩy sự ra hoa. Một số gen quan

trọng trong con đƣờng quang chu kì nhƣ COSTANS (CO), FLOWERING

LOCUS T (FT) và TWIN SISTEROF FT (TSF).

Gen CO mã hóa một yếu tố phiên mã kiểu ngón tay kẽm (Ballerini,

2011; Valverde, F.(2011)). Sự thể hiện chủ yếu của CO dẫn đến sự ra hoa sớm

và những bản sao của CO có tƣơng quan thuận với thời điểm ra hoa. Điều này

cho thấy rằng gen CO có vai trò thúc đẩy sự ra hoa và sự hoạt động của nó là

một yếu tố giới hạn điều chỉnh thời điểm ra hoa. Ở miền Bắc nƣớc ta , sự biểu

hiện của gen CO phong phú trong cây dƣới điều kiện ngày dài hơn là cây trồng

trong điều kiện ngày ngắn. Trong các nghiên cứu trƣớc đã chỉ ra rằng promoter

điều khiển gen CO đóng vai trò quan trọng trong việc nhận thức ngày dài và

biểu hiện những quy định phức tạp mRNA CO đƣợc quy định bởi đồng hồ sinh

học và protein CO đƣợc ổn định bằng ánh sáng và suy thoái bởi bóng tối. Các

promoter điều khiển gen CO là một thành phần quan trọng trong việc thúc đẩy

quá trình ra hoa ở cây ngày dài. Protein CO là sản phẩm của thời gian chiếu

sáng ở ngày dài và kích hoạt FT và TSF phiên mã (Tiwari et al,2010). Độ dài

ngày ảnh hƣởng trực tiếp đến sự tích lũy FT mRNA (Imaizumi et al. 2003;

Corbesier et al. 2007). Ngƣợc lại với FT, CO mRNA có thể dễ dàng phát hiện

trong cả ngày ngắn và ngày dài.

18

Gen FT và TSF biểu hiện ở lá và trụ dƣới lá mầm , protein của nó sẽ di

chuyển lên mô phân sinh đỉnh chồi ( SAM) (Yamaguchi, 2005).Tại các mô

phân sinh chồi , gen FT và TSF tạo thành một phức hợp với

FLOWERINGLOCUS D (FD) và tăng điều tiết ở mô phân sinh hoa đến gen

APETALA1 để phát triển thành nụ hoa (Abe et al,. 2005).Nói chung, chức

năng của gen FT giống nhau ở đa số các loài thực vật nhƣng có biểu hiện khác

nhau ở từng loài.

Hình 0.3: Con đƣờng quang chu kỳ điều khiển sự ra hoa ở cây Arabidopsis Một số thí nghiệm trên cây Arabidopsis chỉ ra rằng FT mRNA nhiều hơn

ở trong lá đặc biệt là ở lá mầm và trong lá già hơn là ở đỉnh chồi (Wigge et

al.,2005), thí nghiệm này cũng đƣợc lặp lại với đối tƣợng là cây rau bina cũng

cho kết quả tƣơng tự (Erika Abe et al., 2014). Khác với thí nghiệm ở gen FT,

thí nghiệm biểu hiện quá mức ở một mô cụ thể đã cho thấy rằng CO không có

hiệu quả khi chỉ ở chồi đỉnh, trong khi đó biểu hiện quá mức đặc hiệu ở những

tế bào chuyên biệt trên lá có tác dụng tƣơng tự nhƣ biểu hiện quá mức ở mọi nơi

(An et al. 2004; Ayre and Turgeon 2004;Corbesier et al. 2007). Thí nghiệm ngƣợc

lại, biểu hiện quá mức ở mô cụ thể FT gây ra hoa sớm, cho dù điều này xảy ra

trong các tế bào chuyên biệt ở lá và thân cây hoặc đỉnh chồi (An et al. 2004).

Một minh chứng cụ thể khi nghiên cứu điều khiển sự ra hoa của cây

Arabidopsis(hình 1.3) cho thấy: khi lá nhận đúng quang chu kỳ sẽ kích thích

nhóm gen CO tăng biểu hiện → gen T Locus Flowerring (kí hiệu FT) tạo sản

phẩm là một loại protein có khối lƣợng 20 kDa, protein này sẽ di chuyển theo

19

mạch đến mô phân sinh đỉnh, hoạt hóa sự biểu hiện nhóm gen LFY, nhóm gen

này hoạt động chuyển mô phân sinh đỉnh thành hoa.

Sự ra hoa không chỉ phụ thuộc vào thời gian chiếu sáng mà nó còn đƣợc

qui định bởi chất lƣợng ánh sáng (Sang Yeol Kim, 2008). Các chất nhận ánh

sáng đỏ, ánh sáng xanh và phytocrom và crytocrom điều hòa tƣơng ứng sự ra

hoa theo con đƣờng gen CO. Co đƣợc ổn định bằng ánh sáng xanh , đỏ xa hay

trắng bởi phytocrom A và crytocrom nhƣng xuống cấp dƣới ánh sáng đỏ bởi

phytocrom B hay trong bóng tối (Valverde et al., 2004).Nhiều nghiên cứu chỉ

ra rằng cây trồng dƣới điều kiện làm giàu ánh sáng đỏ xa chứa hàm lƣợng

mRNA CO cao hơn cây trồng dƣới ánh sáng trắng (Sang Yeol Kim, 2008).

Tỷ lệ thấp ánh sáng đỏ: đỏ xa đƣợc cảm nhận bởi phytocrom trong tế bào

cảm quang gây ra một loạt những phản ứng gồm kéo dài thân và cuống lá, giảm

bớt nhánh và ra hoa sớm.

Cây ngày ngắn ( đêm dài)

Cây ngày dài (đêm ngắn)

Hình 0.4: Ảnh hƣởng của ánh sáng đỏ và đỏ xa đến sự ra hoa của cây ngày ngắn và cây ngày dài

Bổ sung ánh sáng đỏ trong chu kì tối sẽ kích thích tạo hoa ở cây ngày dài

và ức chế sự tạo hoa ở cây ngày ngắn, còn ánh sáng đỏ xa có tác dụng ngƣợc

lại tức là ức chế sự ra hoa ở cây ngày dài và kích thích sự tạo hoa ở cây ngày

20

ngắn. Các tác dụng giàu ánh sáng đỏ xa (FREL) về thời gian ra hoa đã đƣợc

nghiên cứu trên cây Arabidopsis hoang dại cũng nhƣ những dòng chứa đột biến

trong con đƣờng ra hoa tự khiển hay gen trong con đƣờng quang chu kì

(Martinez-Zapater and Somerville,1990; Eskins, 1992; Bagnall, 1993; Lee and

Amasino,1995; Cerdan and Chory, 2003). Ở mức độ phân tử về cách FREL thúc

đẩy quá trình ra hoa còn chƣa rõ ràng nhƣng tỷ lệ thấp ánh sáng đỏ: đỏ xa đƣợc

biết là làm tăng biểu hiện của FT (Cerdan & Chory, 2003; Halliday et al., 2003).

Đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm đánh giá biểu hiện hoạt động của gen

CO và FT cũng nhƣ một số gen đồng dạng của hai gen này trên các đối tƣợng

thực vật khác nhau nhƣ trên cây rau bina (Erika Abe et al., 2014), trên cây mô

hình Arabidopsis (Wigge et al.,2005; Cheng et al, 2005; …), cây lúa (Ryosuke

Hayama et al, 2003)

1.3. TỔNG QUAN VỀ ĐÈN LED 1.3.1. Giới thiệu về đèn LED

Đi-ốt phát quang (LED) là nguồn sáng bán dẫn, sẽ cung cấp lƣợng ánh

sáng đơn sắc (1/2 chiều rộng dài sóng khoảng 30 nm) khi có dòng điện một

chiều chạy qua nó. LED đầu tiên đƣợc phát minh bởi Texas Instrument vào

năm 1960. Tại thời điểm đó cƣờng độ sáng của LED còn rất thấp và chỉ có ánh

sáng đơn sắc đỏ. Sau này cƣờng độ sáng của LED đã tăng lên rất nhiều và biên

độ dải màu cũng tăng theo (đỏ, cam, vàng, xanh lá, xanh dƣơng, trắng,…)

Đến những năm cuối thế kỷ 20 và đầu thế kỷ 21, đèn LED tạo nên một

cuộc cách mạng nhanh chóng, đem lại nhiều tiện dụng cho các thiết bị kỹ thuật

số và một dãy các thiết bị mới đa chức năng, nhƣ tín hiệu ra vào, đèn nổi, đèn

giao thông, đèn vòm, đèn tƣờng, đèn dƣới nƣớc, đèn ngoài trời. Trong những

năm gần đây, LED mới thực sự đƣợc quan tâm nhƣ là một nguồn bức xạ cho

thực vật do tiềm năng ứng dụng thƣơng mại của nó rất lớn (Nhut, 2002).

21

Nguồn:https://en.wikipedia.org/wiki/Light- emitting_diode#/media/File:RBG-LED.jpg

Hình 0.5: Hình ảnh đèn Led và đèn Led sử dụng trong nuôi cấy mô 1.3.2. Ảnh hƣởng của ánh sáng LED đến sự phát triển của thực vật

Trong những năm gần đây, ánh sáng đèn Led là nguồn chiếu sáng nhân

tạo đang đƣợc nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật

cũng nhƣ ngoài nhà lƣới. Đèn Led có thể khắc phục đƣợc một số hạn chế khi sử

dụng đèn huỳnh quang nhƣ quang phổ phát ra từ đèn huỳnh quang ngoài vùng

ánh sáng đỏ và xanh có hiệu quả với khả năng quang hợp của cây thì vẫn còn

một tỉ lệ lớn các vùng quang phổ xanh lá cây và vàng gây lãng phí năng lƣợng.

Cùng với sự phát triển của công nghệ chiếu sáng LED, nhiều loài cây đã đƣợc

khảo sát khả năng sinh trƣởng và phát triển dƣới điều kiện chiếu sáng LED.

Khi bổ sung 10% ánh sáng đèn huỳnh quang xanh vào ánh sáng LED đỏ

đã cho trọng lƣợng khô và sản lƣợng hạt của cây Lúa mì gần với cây sinh trƣởng

và phát triển dƣới điều kiện ánh sáng trắng (Goins, 1997). Moreira da Silva và

Debergh (1997) đã đánh giá ảnh hƣởng của tỷ lệ ánh sáng xanh/đỏ cao (2,3),

thấp (0,9) và tỷ lệ ánh sáng đỏ/đỏ xa cao (1,1), thấp (0,6) lên sự phát triển chồi

cây Azorina vidalii Seeds trong nuôi cấy in vitro. Chiều cao, chiều dài đốt thân,

diện tích lá của cây Azorina vidalii Seeds đạt cao nhất khi nuôi cấy dƣới tỷ lệ

thấp ánh sáng đỏ/đỏ xa. Tuy nhiên, tỷ lệ chồi bất định phát sinh trong điều kiện

này lại rất thấp. Ánh sáng xanh khi phối hợp với ánh sáng đỏ ở các tỷ lệ dù cao

hay thấp cũng ức chế sự phát triển chiều cao, chiều dài đốt thân cũng nhƣ diện

tích lá (Moreira da Silva 1997).

22

Mặc dù ánh sáng xanh ức chế sự phát triển chiều cao cây nhƣng nếu thiếu

ánh sáng xanh trong quá trình sinh trƣởng thì thân và cuống lá của cây con kéo

dài bất thƣờng. Sự tăng trƣởng bình thƣờng của cây rõ ràng có liên quan đến sự

hiện diện của loại ánh sáng này. Ánh sáng xanh dƣờng nhƣ tƣơng tác với hệ

thống phytochrome hoặc thông qua một thụ quan ánh sáng xanh, gây ra các phản

ứng của thực vật (Rajapakse 1999).

Trong nƣớc cũng đã có một số nghiên cứu về ảnh hƣởng của đèn Led

đến sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Cây Dâu tây tăng trƣởng khỏe

mạnh khi nuôi cấy dƣới nhiều tỷ lệ đỏ/xanh khác nhau, nhƣng chúng tăng

trƣởng tốt nhất ở điều kiện 70% ánh sáng LED đỏ và 30% ánh sáng LED xanh

(Nhut et al., 2003a). Mặc khác, cây Chuối, Eucalyptus citriodora, Phalaenopsis

tăng trƣởng tốt dƣới điều kiện 80% ánh sáng LED đỏ và 20% ánh sáng LED

xanh (Nhut et al., 2000; 2002a; 2002b; 2003b)

Ngoài việc tăng năng suất thu hoạch rau, quả, hoa, nếu thay đèn compact

bằng đèn LED chúng ta có thể tiết kiệm trên 50% lƣợng điện tiêu thụ ( Phan

Hồng Khôi và cộng sự 2011, 2012)

1.3.3. Ƣu, nhƣợc điểm của đèn LED

Đèn LED có các ƣu điểm vƣợt trội so với các loại đèn truyền thống nhƣ tuổi thọ

cao, tiết kiệm năng lƣợng. Mặt khác khả năng tạo màu và tính uyển chuyển trong

việc tích hợp với các hệ thống chiếu sáng và hiển thị mới đem lại cho chúng

những giá trị độc đáo.

Tuổi thọ của đèn Led cao: từ 20 000- 100 000 giờ chiếu sáng trong khi

đèn sợi đốt là 1000 giờ và đèn huỳnh qung có tuổi thọ 8000 giờ.

Dải màu: Led có nhiều dải màu gồm cả ánh sáng trắng. Ánh sáng trắng

có thể đƣợc tạo ra khi hòa trộn Led đỏ, xanh lơ và xanh lục. Thay vào đó, thông

qua việc kết hợp một cách sáng tạo các Led có dải màu sắc khác nhau, ảnh

hƣởng thay đổi màu có thể tạo ra từ một vật cố định đơn giản nhờ sự hoạt hóa

động lực của các phần khác nhau của Led.

23

Không phát ra tia UV và tia hồng ngoại: Led không tạo ra tia UV, tạo ra

rất ít nhiệt và hầu nhƣ không làm nóng môi trƣờng xung quang, do đó làm giảm

nhu cầu sử dụng hệ thống làm lạnh. Ánh sáng Led không gây chói, mỏi mắt.

Độ bền: Đèn LED có độ bền rất cao vì nó không có dây tóc nên ít bị hƣ

hỏng do va chạm và dao động. Mặt khác, đèn LED thƣờng đƣợc chế tạo từ vật

liệu polyme nên không vỡ giúp vận chuyển dễ dàng.

Kích thước nhỏ và dễ thay đổi linh hoạt trong thiết kế: Một LED đơn lẻ

rất nhỏ và tạo ra ít ánh sáng toàn bộ. Tuy vậy, điểm yếu thực sự là thế mạnh

của nó. Các LED có thể gắn với nhau thành bất cứ hình dạng nào tạo nên một

loạt kiện lumen mong muốn. Thêm nữa, LED có thể thu nhỏ hỗn hợp ánh sáng;

kiểm soát sự phân phối ánh sáng nhờ các thấu kính epoxy, đơn giản hóa cấu

trúc của hệ đèn LED. Một thiết bị kiểm soát có thể đƣợc gắn với phức hợp đèn

LED để làm mờ một cách chọn lọc các đèn LED độc lập, dẫn đến việc kiểm

soát phân phối động lực, lƣợng và màu của ánh sáng.

Nhược điểm của đèn LED:Ít sự lựa chọn, chất lƣợng ánh sáng, tiêu chuẩn

hóa sản phẩm, giá thành cao.

Rõ ràng đèn LED có rất nhiều ƣu điểm và chính những đặc trƣng đó

đóng vai trò quan trọng trong việc lựa chọn nguồn sáng nhân tạo giúp cây trồng

sinh trƣởng tối ƣu. Với khả năng phát xạ các quang phổ tùy chọn, các nguồn

sáng LED có thể tùy biến để phù hợp với yêu cầu của từng loại cây trồng và

cho phép điều chỉnh ánh sáng theo từng thời kỳ sinh trƣởng của cây. Có thể nói

LED cho phép điều khiển các tính năng của ánh sáng mà các công nghệ chiếu

sáng truyền thống không thể làm đƣợc.

1.4. CÁC NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘ DÀI THỜI

GIAN CHIẾU SÁNG ĐẾN QUANG CHU KỲ CỦA THỰC VẬT Cây họ cúc Chrysanthemum đã đƣợc nghiên cứu kỹ lƣỡng và đƣợc phân

loại là cây ngày ngắn, tức là chỉ ra hoa khi độ dài của ngày ngắn hơn khoảng

13,5 giờ, hay nói cách khác là đêm dài hơn 10,5 giờ (tùy theo loại Cúc). Nhƣ

vậy ở Viêt nam, cây Cúc sẽ không ra hoa trong khoảng từ tháng 5 đến tháng 8,

24

và có thể ra hoa trong những tháng còn lại. Vấn đề là ở chỗ, để cây cúc chậm ra

hoa, có thời gian dài hơn để sinh trƣởng, nhất là vào mùa đông khi cây cúc rất

dễ ra hoa, ngƣời ta dùng chiếu sáng nhân tạo để ức chế sự ra hoa của cây cúc.

Các giải pháp điều khiển này đã đƣợc nghiên cứu rất nhiều trên thế giới, chủ

yếu dựa trên hai phƣơng pháp: chiếu sáng bổ sung kéo dài ngày và dùng ánh

sáng đặc biệt để phá đêm. Để kéo dài ngày cho cây cúc thƣơng mại quan trọng

(Dendranthema grandiflora), ngƣời ta dùng đènsợi đốt hoặc đèn huỳnh quang

chiếu khoảng 4- 6 giờ một từ ngày, nhƣng cũng có thể dùng phƣơng pháp phá

đêm dùng ánh sáng đo trong khoảng vài chục phút để ức chế hoàn toàn sự ra

hoa. Việc ứng dụng phƣơng pháp phá đêm phụ thuộc vào đặc tính quang chu

kỳ của từng loại cây, độ nhạy phá đêm phụ thuộc vào cấu trúc phổ của ánh

sáng, thông lƣợng ánh sáng hấp thụ bởi sắc tố thực vật Phytochrome PC, thời

điểm chiếu sáng trong đêm và độ dài chiếu sáng. Học thuyết đƣợc chấp nhận

rộng rãi nhất điều chỉnh quá trình ra hoa của thực vật dƣới tác dụng của ánh

sáng là học thuyết dựa trên tế bào nhạy quang Phytochrome (PC) do Hendrick

và Borthwick đề xuất. Phytochrome là loại sắc tố có hai trạng thái, Pfr và Pr,

trạng thái Pfr là trạng thái kích hoạt, còn trạng thái Pr là trạng thái ức chế. Hai

trạng thái này của một loại sắc tố gọi là trạng thái đồng phân, tức là có thể luân

chuyển tƣơng hỗ sang nhau khi hấp thụ ánh sáng có bƣớc sóng thích hợp.

Trạng thái ức chế Pr sẽ chuyển sang trạng thái kích hoạt Pfr khi Phytochrome

hấp thụ ánh sáng đỏ R (660 nm), ngƣợc lại, Phytochrome khi ở trạng thái Pfr có

thể chuyển lại trạng thái Pr khi hấp thụ ánh sáng FR (730nm), hoặc để lâu trong

bóng tối. Phytochrome có mặt trong lá cây từ lúc bắt đầu nảy mầm, trong khi

đó diệp lục phát triển dần dần khi đƣợc chiếu sáng. Quá trình sinh trƣởng của

cây tiếp tục cho đến khi chuyển sang giai đoạn sinh sản, mà ánh sáng đóng một

vai trò quan trọng đối với các loại cây nhạy sáng, trong trƣờng hợp này là cây

hoa Cúc. Có bốn thông số chiếu sáng đóng vai trò quan trọng trong tƣơng tác

của thực vật với ánh sáng, đó là cấu trúc phổ của ánh sáng, cƣờng độ chiếu

sáng, thời gian và thời điểm chiếu sáng. Các thông số này không hoàn toàn độc

25

lập mà phụ thuộc lẫn nhau một cách tƣơng đối, vì vậy để có thể nghiên cứu

đƣợc một cách toàn diện tác động của ánh sáng vào quy trình quang hợp và

hiện tƣợng quang chu kỳ của một giống thực vật nào đó cần rất nhiều thời gian

thí nghiệm.

Các kết quả nghiên cứu tại Việt Nam

Tại Việt nam, một số nghiên cứu về sử dụng ánh sáng điều khiển ra hoa

của cây hoa cúc có thể đƣợc tóm tắt nhƣ sau. Năm 2011, tác giả Đặng Thị Tố

Nga và các đồng nghiệp (Đại học Thái nguyên) đã sử dụng bóng đèn sợi đốt 100

W chiếu bổ sung 4 giờ 1 đêm, t 22 giờ đêm đến 2 giờ sáng, mật độ 5 m2/bóng,

đã tăng chiều cao của cây hoa khoảng 25 cm. Năm 2012, Công ty Bóng đèn

Phích nƣớc Rạng Đông đã sử dụng các loại đènkhác nhau nhƣ đèn sợi đốt, đèn

compact, đèn phóng điện cao áp (HID) tiến hành chiếu sáng bổ sung với cây hoa

Cúc (pha lê vàng Hà nội và đại đóa Đà lạt), trong khoảng thời gian 4 tiếng. Kết

quả cho thấy, tỷ lệ ra hoa của công thức không chiếu sáng bổ sung là 73%, trong

khi các công thức khác là hoàn toàn không xuất hiện hoa. Vài năm gần đây,

những ngƣời trồng hoa ở Đà lạt đã biết sử dụng các loại nguồn sáng khác nhau

để chiếu sáng bổ sung cho cây hoa Cúc, nhằm ngăn cản không cho cây ra hoa

sớm khi còn chƣa trƣởng thành, đồng thời điều khiển cho cây Cúc ra hoa đúng

những thời kỳ quan trọng nhất nhƣ những ngày lễ, ngày Tết.

Trong nghiên cứu ảnh hƣởng của ánh sáng đèn LED bổ sung vào ban đêm lên

sự sinh trƣởng và phát triển của hoa Cúc, các tác giả Dƣơng tuấn Nhựt và

Nguyễn Bá Nam (2013) đã sử dụng đènLED có công suất 10 để thay thế bóng

đèn compact. Việc sử dụng đènLED không chỉ giảm công suất tiêu thụ điện

năng uống 50% mà còn giúp cây sinh trƣởng mạnh hơn so với đèncompact.

Tóm tắt lại, quá trình sử dụng kỹ thuật chiếu sáng bổ sung để ức chế sinh sản

(ra hoa) ở Việt nam đã trải qua các giai đoạn sau đây:

- Giai đoạn tự phát (trƣớc 2010): sử dụng đènsợi đốt 75-100 W chiếu sáng

4-6 giờ mỗi đêm

26

- Các nhà sản xuất đèn (Cty Rạng Đông, Điện quang 2011): sử dụng đèn

compact 20 W chiếu sáng 4-6 giờ mỗi đêm, tiết kiệm khoảng lần điện

năng.

- Chƣơng trình quốc gia về sử dụng năng lƣợng tiết kiệm cùng các đơn vị

Công ty Rạng Đông, Viện Sinh học Tây nguyên (2012): thử nghiệm

dùng đènCFL hai phổ và LED tăng trƣởng chiếu sáng 5 giờ mỗi đêm cho

cây hoa Cúc, tiết kiệm thêm 0% đến 50% so với đèn CFL thông thƣờng.

27

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu thực vật

Cây hoa cúc giống cúc vàng pha lê trồng tại Trại thực nghiệm Sinh

học Cổ Nhuế, đƣợc chiếu sáng phá đêm bằng hệ thống đèn Led do phòng

Công nghệ tế bào Thực vật cung cấp.

2.1.2. Thiết bị, hóa chất

Hệ thống nhà lƣới và đèn Led thí nghiệm tại trại Thực nghiệm Sinh học

Cổ Nhuế

Thiết bị: Thí nghiệm sử dụng các thiết bị, máy móc của phòng Công

nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Các loại máy móc nhƣ máy

nghiền mẫu, máy PCR, máy Real time PCR, bể điện di, máy chụp ảnh gel, máy

đo nano drop và một số máy móc dụng cụ, thiết bị khác của các hãng.

Hóa chất: Sử dụng các loại phân bón vi sinh để bón cho cây hoa. Các hóa

chất nhƣ Trizol, ethanol, isopropanol, isoamyl, chloroform, Master mix, bộ kit

tổng hợp cDNA, thang marker chuẩn… đƣợc cung cấp bởi các hãng hóa chất

uy tín và chất lƣợng trên thế giới nhƣ Thermo Fisher, sigma…

Bảng 2.1: Trình tự nucleotide các cặp mồi sử dụng

Mục đích

Tên mồi

Trình tự nucleotide (5’-3’)

Đối chứng

MTP- F

GGTGTTATGATTGGTGCTGCTGT

MTP-R

ATCTATCTCTCGTGGGGTGCTTT

Phân lập gen CO

CS-CO- F

AAGGTTGAAGTTCGTGGTGG

CS-CO- R

TACCTCAACACCCTTGCCTC

Đánh giá biểu hiện gen CO

CO -F

TGGGTGTGTGAAGCTTGTGA

CO- R

CCTAGGCCTATGACGGACCT

Đánh giá biểu hiện gen FT

AGGGAAGTTGCTAACGGGTG

FT- F

GCTCCTGTTGTCGCTGGAAT

FT-R

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

28

2.2.1. Đánh giá ảnh hƣởng của đèn LED đến sự sinh trƣởng phát

triển của cây hoa cúc

Mầm sống của cây hoa cúc đƣợc sử dụng làm nguyên liệu để trồng thí nghiệm.

Tất cả phần mái và khung sắt bao quanh đều đƣợc che bằng lƣới trắng để chống

côn trùng gây hại, đồng thời có chức năng tán xạ ánh sáng mặt trời chiếu thẳng.

Khu vực xung quanh đƣợc cách ly với khu dân cƣ và hoàn toàn không có ánh

sáng nhân tạo vào ban đêm. Nhà thực nghiệm đƣợc chia thành 16 ô thí nghiệm,

mỗi ô có kích thƣớc 2m*2,5m. Các ô thí nghiệm đƣợc che ánh sáng xuất phát

từ các nguồn sáng treo ở các ô bên cạnh nhờ có các tấm bạt màu trắng cao 2m

sử dụng làm tấm cách ly giữa hai phía. Thời gian chiếu sáng và đèn thí nghiệm

đƣợc bố trí theo sơ đồ:

Bảng 2.2: Sơ đồ bố trí đèn trong các ô thí nghiệm

Thời gian chiếu

TT Ký hiệu ô

Tên đèn

Chế độ chiếu

Bật

Tắt

1

Compact

22:00

2:00

8A

4h

2

30’( 1’ bật 1’ tắt)

LED 630nm-5W

23:45

0:15

1A

3

23:15

30’ (1’ bật 1’ tắt

LED 630nm-5W

22:45

1B

4

LED 630nm-5W

0:45

1:15

2A

30’

5

LED 630nm-5W

23:45

0:15

2B

30’

6

LED 630nm-5W

22:45

23:15

3A

30’

7

30’ (1’ bật 1’ tắt)

LED 630nm-5W

23:45

0:15

3B

8

LED 630nm-3W

22:45

23:15

30’(1’ bật 1’ tắt)

4A

9

LED 630nm-3W

0:45

1:15

4B

30’

10

LED 630nm-3W

23:45

0:15

5A

30’

11

LED 630nm-3W

22:45

23:15

5B

30’

12

LED 660nm-3W

23:45

0:15

6A

30’( 1’ bật 1’ tắt)

13

LED 660nm-3W

0:45

1:15

6B

30’

14

7A

LED 660nm-3W

22:45

23:15

30’

15

7B

Đối chứng

Không chiếu đèn

29

Mục đích của chiếu sáng bổ sung là giảm thời gian tối của mỗi ngày chứ

không phải là kéo dài thời gian chiếu sáng liên tục vì vậy nếu chiếu sáng thực

hiện vào lúc nửa đêm để chia cắt thời gian tối liên tục thành hai giai đoạn tối,

đồng thời cũng là để tăng số giờ chiếu sáng thì hiệu quả hơn nhiều. Nguyên tắc

xác định thời gian chiếu sáng bổ sung là làm cho thời gian tối liên tục trong

đêm mỗi đoạn ngắn hơn 7 h.

Điều kiện nuôi trồng: các ô thí nghiệm đƣợc trồng trong nhà lƣới chống

côn trùng chế độ chăm sóc và phân bón nhƣ nhau.

Sau khi trồng 10 ngày bắt đầu thời gian chiếu sáng phá đêm.

Thời gian chiếu sáng 25 ngày, sau đó dừng chiếu sáng để cây tiếp tục

phát triển và ra hoa.

Chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hại: sau 3 ngày phun thuốc diệt

nấm bệnh, cách 15 ngày phun thuốc trừ sâu và nấm 1 lần.

Quan sát và đánh giá sự sinh trƣởng và phát triển của cây hoa cúc sau khi

trồng 40, 70, 100 ngày tuổi.

Song song với việc đánh giá quá trình sinh trƣởng của cây, tiến hành thu

mẫu lá non ở các dàn đèn để nghiên cứu hoạt động của gen điều khiển quá trình

ra hoa. Các mẫu đƣợc thu và cất giữ trong tủ -80 đến khi sử dụng.

2.2.2. Phƣơng pháp thu mẫu và tách chiết RNA

Bắt đầu thu mẫu hoa cúc sau khi ngừng chiếu đèn 1 tuần, mỗi tuần thu

mẫu một lần đến khi cây hoa cúc bắt đầu xuất hiện nụ thì dừng việc thu mẫu.

Thời điểm thu mẫu vào lúc xế chiều khi chuẩn bị bắt đầu chu kì tối.

30

Bảng 2.3: Kí hiệu mẫu thí nghiệm

Kí hiệu

Thời gian sau chiếu đèn

L3-1

Đèn Led 3A-1 tuần

L3-2

Đèn Led 3A- 2 tuần

L3-3

Đèn Led 3A- 3 tuần

L3-4

Đèn Led3A- 4 tuần

C-1

Đèn Compact- 1 tuần

C-2

ĐènCompact- 2 tuần

C-3

ĐènCompact- 3 tuần

C-4

ĐènCompact - 4 tuần

ĐB-1

Đèn Led điều biến 1 tuần

ĐB-2

Đèn Led điều biến 2 tuần

ĐB-3

Đèn Led điều biến 3 tuần

ĐB-4

Đèn Led điều biến 4 tuần

K-1

Không chiếu đèn 1 tuần

K-2

Không chiếu đèn 2 tuần

K-3

Không chiếu đèn 3 tuần

K-4

Không chiếu đèn 4 tuần

Mẫu sau khi thu đƣợc bảo quản trong tủ âm 80ºC trƣớc khi sử dụng làm

thí nghiệm tiếp theo

Tất cả dụng cụ dùng để tách chiết RNA đều đƣợc khử trùng bằng dung

dịch DEPC 0,1% để tránh nhiễm RNase từ dụng cụ.

Quy trình tách chiết RNA đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau: Cân 100 mg

mẫu, nghiền nhanh bằng nitơ lỏng. Bổ sung 1ml Trizol đảo đều trong 5 phút.

Bổ sung tiếp 200 µl chrolofrom: isoamyl (v/v: 24:1) và đảo đều. Li tâm dịch

31

chiết ở 12000 v/p trong 10 phút. Sau đó hút 500 µl dịch pha trên sang ống

eppendorf mới và bổ sung 500µl isopropanol lạnh, đảo đều. Ủ dịch ở nhiệt độ

phòng trong vòng 20 phút. Li tâm 12 000 v/p trong 15 phút.Thu cặn, rửa cặn

bằng ethanol 70%. Li tâm tiếp 12000 v/p trong 5 phút và bỏ dịch, thu cặn, làm

khô. Cuối cùng bổ sung 40 µl nƣớc khử ion đã khử trùng và xử lý DEPC.

Mẫu RNA đƣợc kiểm tra trên gel agarose, định lƣợng và xác định độ

sạch bằng máy đo quang phổ NanoDrop.

Sau khi đo nồng độ, mẫu đƣợc pha loãng đến nồng độ 100 ng/μl. Mẫu

RNA tổng số sau khi pha loãng đƣợc đo nồng độ lần 2 bằng máy Nanodrop rồi

tiếp tục đƣợc pha loãng tới nồng độ 20 ng/μl.

2.2.3. Phƣơng pháp đo nồng độ RNA bằng máy nano drop

Phƣơng pháp này cho phép xác định một cách tƣơng đối nồng độ RNA

đồng thời kiểm tra độ tinh sạch của mẫu RNA tách chiết. Sử dụng 1 µl H20 pha

dùng để hòa tan RNA làm blank và 1 µl mẫu RNA để đo.

Hàm lƣợng RNA tách chiết đƣợc tính dựa vào hệ số A260=1 tƣơng ứng

với 50 µg/ml. Bên cạnh đó, tỉ số A260/A280 đƣợc sử dụng để đánh giá độ sạch

của RNA. Hệ số nằm trong khoảng 1,8-2,0 chứng tỏ chế phẩm RNA có độ sạch

cần thiết cho các nghiên cứu phân tích sau đó.

Mẫu RNA tổng số sau đó đƣợc giữ ở -80oC cho đến khi tiến hành các thí

nghiệm tiếp theo.

2.2.4. Phƣơng pháp RT –PCR (Reverse transcription polymerase

chain reaction)

Tổng hợp cDNA

RNA vừa tách chiết đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng tổng hợp

cDNAtheo kít RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit

(Thermo Scientific). Phản ứng cDNA đƣợc thực hiện trong thể tích 20 l gồm

có các thành phần sau: 4 g RNA tổng số; 250 ng mồi ngẫu nhiên (Hexamer

primer) . Bổ sung nƣớc khử ion có xử lý DEPC tới thể tích 12 l. Ủ 70°C trong

5 phút, sau đó đặt vào đá. Tiếp tục bổ sung các thành phần vào ống phản ứng

32

trên: 4 l đệm RT 5X tổng hợp cDNA; 1l riboLock Ribonuclease inhibitor

(20u/l); 2 l dNTP (10 mM). Hỗn hợp sau đó đảo và ly tâm nhẹ; ủ 25°C trong

5 phút. Tiếp tục bổ sung 1 l enzyme RevertAid (200 u/l) và thực hiện một

chu trình nhiệt nhƣ sau: 25°C/10 phút, 42°C/60 phút, 72°C/10 phút, 40°C/10

phút và 4°C/.

PCR (Poymerase chain reaction)

Sau khi tổng hợp cDNA, phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi

MTP và có khuôn cDNA là để kiểm tra chất lƣợng của phản ứng cDNA. cDNA

sau khi kiểm tra sẽ đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR khuyếch đại gen CO với

cặp mồi đặc hiệu cho gen CO (Bảng 2.2 và 2.3).

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR

STT

Thành phần

Thể tích (µl)

1

H2O

5.5

2

Master Mix

7,5

3

Primer F

0,5

4

Primer R

0,5

5

cDNA

1

Tổng

15

Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

Bƣớc

Phản ứng

Nhiệt độ (oC)

Thời gian

Chu kì

1

Biến tính

3 phút

1

94

2

Biến tính

30 giây

94

25

3

Gắn mồi

30 giây

58

4

Kéo dài chuỗi

30 giây

72

5

Hoàn tất kéo dài

10 phút

1

72

6

Kết thúc phản ứng

∞

4

33

Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel argarose 1%.

2.2.5. Phân lập gen cảm ứng ra hoa

Thôi gel và tinh sạch sản phẩm thôi gel

Sản phẩm PCR của gen COđƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.

Sau đó đƣợc tinh sạch theo sự hƣớng dẫn của bộ kit DNA extraction Kit

K05013của hãng fermentas. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:

Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% nhuộm và cắt lấy băng quan

tâm. Cân gel

Bổ sung binding buffer vào ống có chứa đoạn gel vừa cắt theo tỉ lệ 1:1

Ủ ở 65ºC trong 5 phút , đảo nhẹ đến khi gel tan hết

Chuyển hỗn hợp sang cột thôi gel. Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại

bỏ dịch bên dƣới

Bổ sung 700 µl washing buffer vào cột thôi gel, để ở nhiệt độ phòng

trong 5 phút

Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, đổ dịch. Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút

để loại bỏ hết dung dịch washing buffer.

Chuyển cột lọc sang ống effendorf 1,5ml

Hòa tan DNA trong 30-50 µl nƣớc deion khử trùng. Ủ ở 50ºC trong 5-10

phút

Ly tâm 13000 v/p trong 2 phút. Thu dịch và cất giữ ở tủ -20ºC.

Gắn gen vào vector tách dòng pBT

Sản phẩm tinh sạch gene đƣợc gắn vào vector tách dòng pBT . Thành

phần phản ứng gắn kết đƣợc thể hiện trên bảng 2.4.

34

Bảng 2.6: Thành phần phản ứng gắn gen vào vector pBT

STT 1 2 3 Thành phần Đệm gắn (10x) Mẫu DNA Vector pBT (30ng/µl) Thể tích(µl) 1 5 1

4 5 T4 ligase (1 u/µl) H20 1 1

Tổng 10

Biến bạp vector tái tổ hợp vào tế bảo khả biến E.coli DH5α bằng sốc

nhiệt

Tế bào khả biến E.coli DH5αlấy ra từ tủ lạnh -80ºC đặt ngay vào đá lạnh

trong 5 phút. Bổ sung 10µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và

lắc nhẹ. Đặt lại ống trong đálạnh trong 10 phút. Ủ ở 42ºC trong 1 phút, sau đó

đặt vào đá lạnh trong 5 phút. Bổ sung 300µl môi trƣờng LB lỏng vào ống phản

ứng. Hỗn hợp đƣợc nuôi ở 37ºC, lắc 200 v/p trong 1 giờ. Cấy trải 200 µl dịch

khuẩn lên đĩa LB đặc có bổ sung 100mg/l carbenicillin, X-Gal 40 mg/l, IPTG

100 µM. Nuôi ở 37ºC qua đêm.

Phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc

Sau khi nuôi dịch khuẩn trên môi trƣờng LB đặc, một lƣợng lớn khuẩn

lạc xanh trắng mọc trên đĩa. Tiến hành chọn 5 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để

chạy phản ứng colony PCR với cặp mồi pUC18F/R. Sản phẩm colony PCR

đƣợc điện di trên gel agarose 1% để chọn ra những khuẩn lạc mang gen có kích

thƣớc mong muốn. Những dòng khuẩn lạc mang gen mong muốn đƣợc nuôi

trong LB lỏng có bổ sung carbenicillin 100 mg/l.

Tách chiết plasmid

Thu dịch khuẩn E.coli đã nuôi qua đêm trong môi trƣờng LB lỏng,

chuyển sang ống eppendorf 2 ml. Ly tâm 4000 v/p trong 10 phút. Đổ dịch thu

cặn. Bổ sung 200 µl Sollution I + lysozym. Votex nhằm đánh tan cặn khuẩn

35

dƣới đáy ống.Bổ sung tiếp 400 µl Sollution II, đảo đều. Bổ sung tiếp 300 µl

Sollution III và đảo đều ngay lập tức. Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút. Hút

600µl dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml.Bổ sung 600 µl chloroform: isoamyl

(v/v:24:1). Đảo đều , đặt vào đá trong 10 phút. Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút.

Hút 500 µl dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml. Bổ sung 500µl isopropanol

(4ºC). Đảo đều, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Ly tâm 12000 v/p trong 15

phút. Bỏ dịch, thấm khô.Bổ sung 700 µl cồn 70%, ly tâm 12000 v/p trong 5

phút. Loại bỏ dịch, thấm khô vàlàm khô. Bổ sung 30-50 µl H2O có bổ sung

RNase ủ ở 37ºC để loại RNase.

Plasmid đƣợc tinh sạch và đọc trình tự. Trình tự thu sau khi đọc đƣợc xử

lý bằng các phần mềm tin sinh chuyên dụng nhƣ BioEdit, DNAstar.

2.2.6. Phƣơng pháp Real time PCR

Để thực hiện phản ứng Real-time PCR, các cặp mồi phải đáp ứng các

yêu cầu sau:

-Kích thƣớc sản phẩm PCR mà cặp mồi nhân lên không đƣợc quá 200 bp

-Nhiệt độ nóng chảy của mồi trong khoảng 57-63°C và nên đạt lí tƣởng ở

60°C.

-Tỉ lệ G-C nằm trong khoảng 50-60%

-Để tránh việc khuếch đại sản phẩm không đặc hiệu từ ADN tổng số thì

khoảng 50% số nucleotide của mồi sẽ lai với đầu 3’ của 1 exon và nửa còn lại

lại với đầu 5’ của exon liền kề.

Phản ứng Real-time PCR sử dụng SYBR® Green I làm chất phát huỳnh

quang theo kit LightCycler® FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche).

Thành phần phản ứng đƣợc tối ƣu hóa theo với 40 chu kì nhiệt: 95°C-10s,

60°C-10s, 72°C-20s. Tại bƣớc cuối của phản ứng, đƣờng cong biến tính đƣợc

thực hiện để khẳng định khuếch đại chính xác sản phẩm mong muốn.

Phân tích kết quả

36

Các giá trị Ct thu đƣợc từ phản ứng Real-time PCR đƣợc lựa chọn đƣa

vào bảng kết quả, sau đó sử dụng phƣơng pháp định lƣợng tƣơng đối dựa trên

gen tham chiếu (reference gene) để xác định mức độ biểu hiện.

37

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SỰ SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA

CÂY HOA CÚC DƢỚI ĐIỀU KIỆN CHIẾU SÁNG BẰNG ĐÈN LED

Giống Cúc Pha lê có nguồn gốc từ giâm cành sau 7 ngày tuổi, cao 8-9

cm, có 2-4 rễ, dài 1-3 cm đƣợc trồng tại Trại Thực nghiệm sinh học nằm tại

xã Cổ Nhuế, Từ Liêm, Hà Nội. Thí nghiệm bắt đầu trồng từ tháng 10, khi độ

dài của ngày đã giảm xuống dƣới 10,5 giờ là độ dài thuận lợi cho việc ra hoa

của cây Cúc.

Hoa Cúc là loại cây hoa ngày ngắn, sự phân hoá và phát dục của hoa

đƣợc tác động dƣới tác dụng đồng thời của quang chu kì và nhiệt độ. Trong

quá trình sinh trƣởng, phát dục, dƣới tác dụng phối hợp của độ dài chiếu sáng

trong ngày và nhiệt độ ở mức độ nhất định mới có thể ra hoa, trong đó độ dài

chiếu sáng là yếu tố quan trọng hơn, yêu cầu khắt khe hơn. Khi thời gian

chiếu sáng kéo dài thì thời gian sinh trƣởng của cây hoa Cúc dài hơn, thân

cao, lá to, chất lƣợng hoa tăng. Thời gian chiếu sáng ngắn thì sẽ kích thích

phân hóa mầm hoa sớm: cây ngắn, chất lƣợng hoa kém. Thời kỳ để phân hóa mầm hoa tốt nhất là 10 giờ chiếu sáng trên ngày với nhiệt độ là 20-25oC.

Một loạt các nguồn sáng đã đƣợc sử dụng để bổ sung ánh sáng đặc biệt

là ánh sáng đỏ nhƣ đèn huỳnh quang, đèn sợi đốt, đèn compact và gần đây là

đèn Led. Đèn Led có nhiều đặc điểm so với các nguồn ánh sáng khác nhƣ

lƣợng nhiệt tỏa ra ít, và kiểm soát chính xác hơn chất lƣợng của ánh sáng

(bƣớc sóng). Trong thí nghiệm này, cây hoa cúc đƣợc trồng dƣới ánh sáng

đèn compact, và trong điều kiện đèn Led có bƣớc sóng 630-660 nm, đối

chứng không chiếu đèn với các thời gian chiếu sáng khác nhau. Hai loại Led

đƣợc sử dụng có bƣớc sóng 630 nm và 660 nm là những loại thông dụng nhất

trong các loại LED đỏ. Thời gian bắt đầu chiếu sáng và cách chiếu sáng cũng

38

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

đƣợc thí nghiệm với các công thức khác nhau. Chu kỳ phá đêm là 30 phút,

thời điểm bắt đầu chiếu sáng là lúc nửa đêm (xung quanh 12 giờ đêm).

3.1.1. Đánh giá sinh trƣởng và phát triển của cây Hoa cúc 40 ngày tuổi

Quan sát cây ở 40 ngày tuổi các luống 7B, 4A, 6A đã bắt đầu xuất hiện

nụ . Tuy nhiên do cƣờng độ chiếu sáng tập trung nhiều ở khu vực trung tâm

của đèn nên hầu hết những cây ra nụ đều là những cây nằm hai bên đầu rìa

của luống, điều này nhận thấy rõ nhất khi hoa nở ở 70 ngày tuổi. Điều này có

thể giải thích là do sự suy giảm mật độ sáng theo khoảng cách. Chính sự mất

đồng đều khi sử dụng một đèn LED để chiếu sáng thí nghiệm đã làm giảm

tính chính xác của việc xác định các thông số ngƣỡng cần đạt đƣợc của

Cây 70 ngày tuổi

Cây 40 ngày tuổi

phƣơng pháp chiếu sáng phá đêm.

Hình 3.1: Cây hoa cúc 40 ngày tuổi. Ghi chú: Mũi tên chỉ nụ hoa xuất hiện ở hai đầu rìa của luống

Bên cạnh việc đánh giá về thời gian ra hoa thì theo dõi chỉ tiêu sinh

trƣởng của cây hoa cúc cũng rất quan trọng. Thời gian sinh trƣởng dài, ngắn ảnh

hƣởng trực tiếp đến chiều cao cây. Trong thời gian sinh trƣởng dinh dƣỡng với

điều kiện thích hợp mỗi tuần có thể tăng 2 – 4 đốt, với giống sinh trƣởng nhanh

có thể dài thêm 6 – 13 cm. Yếu tố ánh sáng gây tác động lên độ dài thời gian

sinh trƣởng sinh dƣỡng nên cũng gây ảnh hƣởng đến chiều cao cây.

39

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

3.1.2. Đánh giá sinh trƣởng và phát triển cây Hoa cúc 50 ngày tuổi

Đánh giá sự sinh trƣởng của cây sau 50 ngày cho thấy có sự chênh lệch

đáng kể giữa những cây đối chứng không chiếu đèn và các công thức chiếu

sáng điều biến với cây chiếu sáng bằng đèn Led và công thức chiếu sáng bằng

đèn compact. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy những cây đƣợc chiếu sáng bằng

đèn Led thời gian chiếu sáng liên tục và đèn compact có chiều cao cây tốt hơn

hẳn so với những cây cùng thời gian chiếu sáng nhƣng đƣợc chiếu sáng điều

biến với chu kì một phút bật, 1 phút tắt, và cả những cây đối chứng. Cụ thể

nhƣ các luống 6B cây có chiều cao trung bình là 38 cm, luống 5B là 37 cm,

luống 8A có chiều cao là 36 cm, luống 3A có chiều cao khoảng 37 cm trong

khi đó luống 7B (đối chứng không chiếu đèn) cây chỉ có chiều cao khoảng 32

cm, các luống có chu kì chiếu sáng điều biến1 phút bật:1 phút tắt có chiều cao

trung bình khoảng 33 cm.

Bảng 3.1: Sinh trƣởng và phát triển cây hoa cúc sau 50 ngày tuổi

Ký hiệu ô Chiều cao cây(cm) Tỷ lệ cây có nụ/ô(%)

8A 7B 7A 6B 6A 5B 5A 4B 4A 3B 36,3 ± 1,6 32,4 ± 1,4 34,0 ±2,8 38,45 ± 2,9 32,4 ± 2,57 35,2 ± 1,2 35,5 ± 1,7 34,68 ± 2,1 31,6 ± 1,6 32,7 ± 1,5 9,8 95 9 8 85 17 11 12 80 77

3A 2B 2A 1B 1A 37,2 ± 2,4 34,2 ± 1,8 36,1 ± 1,5 34,7 ± 2,9 33,6 ± 2,6 11 13 10,6 72 26

40

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

Bên cạnh đó, các luống cũng đã có sự chệnh lệch rõ ràng về tỷ lệ cây ra

nụ. Tuy nhiên cũng không có sự khác biệt giữa các luống chiếu đèn Led với

chu kì 1 phút bật: 1 phút tắt với công thức đối chứng, các luống này đều có tỷ

lệ cây ra nụ cao trên 70%, đặc biệt cây ở luống đối chứng đã ra nụ gần hết

khoảng 95%. Trong khi đó ở các công thức chiếu đèn Led còn lại cũng không

có sự khác biệt với luống công thức chiếu đèn compact, tỷ lệ ra nụ rất thấp

chƣa đến 15% nhƣ các luống 7A, 6B, 5A, 4B, 3A, 2A, giảm 4-6 lần so với đối

chứng và các công thức chiếu sáng điều biến với chu kì 1 phút bật: 1 phút tắt

.

Đèn compact

Đèn Led 3A

Đèn LED

( chiếu sáng điều biến)

Đối chứng ( không chiếu sáng)

Hình 3.2: Hình ảnh cây hoa cúc 50 ngày tuổi

41

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

Hình 3.3: Ảnh hƣởng của đèn Led đến thời gian ra hoa của cây hoa cúc 50 ngày tuổi

Nhƣ vậy, ở 50 ngày tuổi không có sự khác biệt nhiều giữa các luống

chiếu đèn Led với đèn compact, các chỉ số về chiều cao cây cũng nhƣ tỷ lệ nụ

trên cây đều tƣơng đƣơng với nhau. Các luống sử dụng đèn LED chiếu sáng

điều biến không cho kết quả tốt, chiều cao cây thấp, tỷ lệ ra nụ cao tƣơng

đƣơng với công thức không chiếu sáng.

So sánh sự sinh trƣởng và phát triển của cây hoa cúc dƣới bƣớc sóng

630nm và 660nm nhận thấy không có sự khác biệt giữa hai loại đèn này vì

vậy có thể sử dụng cả hai loại đèn với mục đích chiếu sáng phá đêm cho cây

hoa cúc.

3.1.3. Đánh giá sinh trƣởng và phát triển của cây Hoa cúc 70 ngày tuổi

Sau 70 ngày tuổi chúng tôi tiếp tục tiến hành đo đếm và thu thập số liệu

về chiều cao, tỷ lệ nở hoa/ô thí nghiệm, số nụ hoa/cây tại các ô thí nghiệm và

thu đƣợc kết quả nhƣ sau

42

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

Bảng 3.2: Sinh trƣởng và phát triển của hoa cúc 70 ngày tuổi

% cây nở hoa

Đƣờng kính hoa(cm)

Chiều cao cây(cm)

Ký hiệu ô (Loại đèn)

8A

59 ± 1,5

77

0,4 – 1,2

7B (Ko đèn)

52,8 ±1,3

100

4 – 5

7A (LED)

56,8 ± 1,78

55

0,3– 0,8

6B (LED)

60.4 ± 1,58

82

0,5 - 1,2

6A (LED)

54,8 ± 1,47

100

1 – 1,5

5B (LED)

59,8 ± 2,04

100

1 - 1,5

5A (LED)

60,2 ± 1,58

63

0,4 – 0,6

4B (LED)

57,2 ± 1,9

100

0,8- 1

4A (LED)

54,2 ± 1,3

100

1,5 – 2

3B (LED)

59,4 ± 1,8

100

3 – 4,5

3A (LED)

59,8 ± 1,8

48

0,5

2B (LED)

58,4 ± 2,4

80

0,5 – 1

2A (LED)

59,5 ± 2,3

67

0,9 – 1,2

1B (LED)

57,1 ± 2,05

100

1,5 – 3

1A (LED)

55,16 ± 2,67

100

2 – 3,5

Sau 70 ngày tuổi chiều cao cây cũng không có biến động so với kết quả

khi cây 50 ngày tuổi, chiều cao thấp nhất là cây ở luống đối chứng cây cao

khoảng 52 cm. Các luống còn lại không có sự khác biệt nhiều về mặt thống

kê, chiều cao trung bình của cây đạt khoảng 56-60 cm. Luống thí nghiệm có

chiều cao tốt nhất là luống đèn Led 3A và 8A (đèn compact) với chiều cao

trung bình khoảng 59 cm.

43

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

Hình 3.4: Ảnh hƣởng của đèn Led đến thời gian ra nụ của cây 70 ngày tuổi

Đèn compact

Đèn Led 3A

Đối chứng

Đèn LED

(chiếu sáng điều biến)

(không chiếu sáng)

Hình 3.5: Hình ảnh Hoa cúc sinh trƣởng ở 70 ngày tuổi

44

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

Trong khi chiều cao không có sự chênh lệch đáng kể thì tỷ lệ cây đã nở

hoa lại khác biệt đáng kể. 100% cây ở luống đối chứng và các luống chiếu

đèn điều biến đã nở hoa. Nhƣng hoa ở luống đối chứng mở to, cánh hoa đã

mở rộng,đƣờng kính hoa lớn nhất trung bình đạt 4-5 cm. Ở các luống chiếu

đèn điều biến 1 phút bật: 1 phút tắt hoa cũng bắt đầu nở to nhƣng cánh hoa

chƣa mở rộng hết, đƣờng kính hoa trung bình đạt 2,5- 3,5 cm. Trong khi đó, ở

các luống đèn Led và chiếu đèn compact cánh hoa mới bắt đầu mở, đƣờng

kính hoa nhỏ chƣa đến 1cm, nhƣ luống 7A đƣờng kính hoa nở khoảng 0,3-0,8

cm.

Ở giai đoạn 70 ngày đã có thể nhận thấy rõ sự khác biệt giữa các luống

chiếu đèn Led liên tục thì hiệu quả kìm hãm sự ra hoa là tốt hơn hẳn so với

các luống chiếu đèn Led điều biến cũng nhƣ luống đối chứng không chiếu

đèn.

3.1.4. Đánh giá sinh trƣởng và phát triển của cây Hoa cúc 110 ngày tuổi

Sau 110 ngày tuổi cây ở tất cả các luống thí nghiệm đều đã nở hoa.

Luống có đƣờng kính hoa lớn nhất là luống 3A với đƣờng kính là khoảng hơn

8 cm.

Bảng 3.3: Sinh trƣởng và phát triển của hoa cúc sau 110 ngày tuổi

Chiều cao cây(cm)

Ký hiệu ô (Loại đèn)

Đƣờng kính hoa (cm)

8A

69,7 ±3,16

6,8 ±0,75

7B

46,2± 3,56

5,5 ± 0,5

7A

71,4 ±2,7

6,8± 0,35

6B

65,2 ± 5,4

7,4 ± 0,4

6A

62 ± 2,23

6,67± 0,25

5B

60 ± 1,87

7,3± 0,4

5A

66,4± 4,03

8,1± 0,22

4B

57,4 ± 1,8

6,6± 1,04

45

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

4A

55,8 ±1,9

7,1±0,7

3B

57,8±1,3

6,7± 0,5

3A

72,6± 1,8

8,2± 0,89

2B

70,2± 2,28

7,2± 0,2

2A

73,8± 1,8

7,3 ± 1,05

1B

62,4± 2,4

7,2± 0,36

1A

58,6± 2,7

7,54± 0,25

Hoa ở công thức đèn đối chứng đã bắt đầu tàn, cánh hoa rũ xuống,

những cánh phía ngoài bắt đầu đổi màu, đƣờng kính hoa trung bình là 5,5 cm.

Hoa ở cây các luống chiếu sáng điều biến cũng đều có hƣớng tàn dần và nhỏ

hơn các luống chiếu đèn liên tục, đƣờng kính hoa trung bình đạt khoảng 7 cm.

Trong khi đó, hoa ở các luống chiếu đèn LED liên tục đang trong giai đoạn nở

cực đại, bông to đều, cánh dày, đƣờng kính hoa ở luống 3A đạt tới 8,2 cm, tức

là to hơn so với bông nở cực đại ở luống đối chứng 1,5 lần.

46

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

Đèn compact

Đèn Led 3A

Đối chứng

Đèn LED

( chiếu sáng điều biến)

( không chiếu sáng)

Hình 3.6: Hình ảnh hoa cúc ở 110 ngày tuổi

47

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

Hình 3.7: Ảnh hƣởng của đèn Led đến đƣờng kính hoa

Độ lớn của hoa là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lƣợng hoa

Cúc. Trong trồng trọt ngƣời ta thƣờng dùng các biện pháp tăng cƣờng bón

phân, tƣới nƣớc, phun phân qua lá, phun chất kích thích sinh trƣởng, biện

pháp ghép… để làm tăng đƣờng kính hoa.

Hoa cúc là loại hoa cắt cành chính vì vậy, việc tăng đáng kể kích thƣớc

của bông và chiều cao của cây cúc nhất là vào vụ đông hoa thƣờng nhỏ và số

cánh hoa giảm, tâm hoa bị lộ ra, sẽ mang lại giá trị kinh tế cao hơn cho cây và

lợi ích cho ngƣời trồng. Các chỉ tiêu về chiều cao cây và thời gian ra hoa của

công thức đèn Led chiếu sáng liên tục và đèn compact là tƣơng đƣơng nhau

nhƣng xét về kích thƣớc của hoa thì hoa ở công thức đèn Led có độ lớn hơn

hẳn so với đèn compact.

Từ những kết quả trên cho thấy việc chiếu sáng phá đêm bằng đèn Led

bƣớc đầu thu đƣợc kết quả khả quan. Tuy nhiên các công thức chiếu đèn điều

biến không có khác biệt rõ rệt với công thức đối chứng không chiếu sáng từ

chiều cao cây hay thời gian ra hoa. Các công thức chiếu đèn liên tục cây hoa

cúc có thời gian sinh trƣởng dài hơn, cây cao hơn, hiệu quả ức chế ra hoa rõ

48

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

rệt hơn hẳn so với công thức đối chứng không chiếu đèn, và có kết quả tƣơng

đƣơng với công thức sử dụng đèn compact với thời gian chiếu sáng 4 giờ, bên

cạnh đó việc chiếu đèn Led liên tục còn cải thiện đƣợc đáng kể chất lƣợng của

hoa, bông nở lớn hơn gấp rƣỡi so với luống không chiếu đèn và kích thƣớc

hoa cũng lớn hơn khi chiếu sáng bằng đèn compact.

Từ những kết quả sinh trƣởng và phát triển của cây hoa cúc chiếu sáng

phá đêm thu thập qua các giai đoạn 50 ngày, 70 ngày và 110 ngày tuổi cho

thấy sự khác biệt và lợi ích của việc chiếu sáng phá đêm bằng đèn Led. Công

thức chiếu sáng bằng đèn Led liên tục trong 30 phút cho kết quả sinh trƣởng,

phát triển và ức chế sự ra hoa tốt hơn ánh sáng compact truyền thống.

3.1.5. Hiệu quả tiết kiệm điện năng của đèn LED

Với điều kiện khí hậu tại Việt Nam đặc biệt là khu vực miền Bắc, vào

mùa thu – đông thời gian ngày rút ngắn và ban đêm dài ra nên các loại Cúc

dƣới điều kiện bình thƣờng không đƣợc chiếu sáng đều ra hoa sớm với chất

lƣợng kém. Nhu cầu sử dụng các nguồn sáng nhân tạo chiếu sáng cho hoa cúc

nhằm ức chế cây ra hoa trong các hộ nông dân trồng hoa là rất lớn. Bên cạnh

những tiêu chí về hiệu quả sử dụng (hiệu quả ức chế ra hoa) của các loại

nguồn sáng, thì nhu cầu tiết kiệm năng lƣợng của các nguồn sáng sử dụng

cũng rất đƣợc quan tâm.

Các hình thức chiếu sáng nhằm điều khiển ra hoa của cây cúc đang

đƣợc áp dụng rộng rãi nhất hiện nay gồm có: sử dụng đèn sợi đốt 60W, đèn

compact 20W. Trong đề tài này chúng tôi đề xuất phƣơng án sử dụng đèn Led

tiên tiến để thay thế các loại đèn truyền thống đang sử dụng.

49

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

Giả sử diện tích trồng hoa cúc tại Việt Nam chiếm khoảng 100 ha,

trong đó mỗi ha sử dụng khoảng 170 bóng đèn để chiếu sáng. Bài toán tiết

kiệm năng lƣợng đƣợc đặt ra với các giả thiết nhƣ sau:

Diện tích trồng Cúc: 100 ha

Số lƣợng đèn sử dụng: 100 × 170 = 17×103 bóng

Đèn sợi đốt 60W chiếu liên tục trong vòng 4 giờ

Đèn compact 20W chiếu liên tục trong vòng 4 giờ

Đèn LED 5W chiếu liên tục trong vòng 30 phút

Đèn LED 5W điều biến 1 phút bật – 1 phút tắt trong vòng 30 phút

Khoảng thời gian cần chiếu sáng trong một vụ: 30 ngày

Các loại đèn thay thế cho nhau theo tỷ lệ 1 đổi 1.

Năng lƣợng điện cần thiết sử dụng trong một ngày để chiếu sáng cho

hoa cúc đƣợc tính theo công thức:

E = Số lƣợng đèn × công suất đèn × thời gian thắp sáng (Wh)

Năng lƣợng điện cần thiết sử dụng trong cả vụ:

Eo= E × 30 (Wh)

Bảng 3.4: Hiệu quả tiết kiệm năng lƣợng

Tên đèn

Năng lƣợng (kW.h)

% tiết kiệm so với đèn sợi đốt

Sợi đốt 60W

122400

0

Compact 20W

40800

67

LED 5W

1275

99

LED 5W - 1phút

637

99.5

50

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

Hình 3.8:Tổng năng lƣợng sử dụng trong một vụ

Khi sử dụng đèn compact để chiếu sáng sẽ tiêu tốn năng lƣợng hơn gấp

hơn 20% so với đèn Led trong khi hiệu quả kĩm hãm ra hoa và các chỉ tiêu

sinh lý không cao hơn khi sử dụng đèn Led. So với đèn sợi đốt, đèn Led tiết

kiệm tới 99% điện năng tiêu thụ, một con số không nhỏ trong bài toán tiết

kiệm năng lƣợng. Sử dụng đèn Led để chiếu sáng phá đêm hoa cúc vừa có tác

dụng kìm hãm thời gian ra hoa của cây, tăng chất lƣợng của bông so với khi

không chiếu đèn vừa tiết kiệm đƣợc năng lƣợng hơn so với đèn compact và

đèn sợi đốt. Nhƣ vậy, đèn Led có thể xem là một thay thế có hiệu quả so với

các phƣơng thức chiếu đèn truyền thống.

3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CO ĐIỀU KHIỂN QUÁ TRÌNH RA HOA Ở CÂY

HOA CÚC

3.2.1. Tách chiết RNA tổng số

Sử dụng phƣơng pháp tách chiết RNA bằng Trizol. Các phân tử RNA

đều không bền, dễ bị phân hủy bởi RNase. Hơn nữa, RNase lại có mặt ở khắp

mọi nơi, có hoạt tính rất cao và rất bền vững với các tác nhân thƣờng dùng để

51

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

loại bỏ enzyme (việc xử lý nhiệt ở 90ºC trong 1 giờ không làm mất hoạt tính

của RNase. Chính vì vậy, việc tách chiết RNA đòi hỏi thao tác làm phải thân

trọng, luôn sử dụng găng tay trong quá trình tách chiết và dụng cụ thí nghiệm

đều phải đƣợc xử lí với DEPC 0,1%, các hóa chất khác đƣợc pha trong nƣớc

DEPC 0,01% trƣớc khi sử dụng.

RNA vừa tách chiết đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả

M 1 2 3 4

điện di cho thấy đã tách chiết thành công RNA tổng số của cây hoa cúc.

Hình 3.9: Kết quả điện di tách chiết RNA tổng số trên gel agarose 1%

M: Marker, 1: L3-1, 2: Compact-1, 3: Đèn sợi đốt-1, 4: Đối chứng không chiếu đèn-1

Đo hàm lƣợng các mẫu RNA tổng số

Để xác định hàm lƣợng và chất lƣợng của RNA tổng số tách chiết

nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo, sản phẩm RNA tổng số nồng độ

và độ tinh sạch thông qua hệ thống Thermo Scientific NanoDrop 2000.

Các phân tử nucleic acid (DNA và RNA) hấp thụ mạnh ánh sáng tử

ngoại ở bƣớc sóng 260 nm, thông thƣờng các sản phẩm tách chiết RNA hay

DNA sẽ có lẫn một lƣợng protein nhất định, nên khi đánh giá mức độ sạch và

hàm lƣợng RNA trong mẫu tách chiết chúng ta dựa vào chỉ số A260/ A280. Một

sản phẩm RNA hay DNA đƣợc coi là tinh kiết nếu chỉ số A260/ A280 nằm trong

khoảng 1,8-2,0.

52

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

Bảng 3.5: Kết quả định lƣợng RNA tổng số bằng Nano Drop

Nồng độ ng/μl

Mẫu

A260/A280

L3-1

270,3

1,92

L3-2

321,8

2,2

L3-3

232,7

1,85

L3-4

186,5

1,98

C-1

214,5

2,05

C-2

137,7

1,93

C-3

203,9

1,87

C-4

217,4

2,11

K-1

199,2

1,86

K-2

189,6

2,1

K-3

259,2

1,89

K-4

193,8

1,95

ĐB-1

225,5

1,9

ĐB-2

198,6

1,95

ĐB-3

223,5

1,88

ĐB-4

215,7

2,07

*Ghi chú: L3-1 - L3-4: các mẫu cúc luống 3A thu sau khi dừng chiếu đèn 1-4 tuần

C1-C4: các mẫu cúc luống chiếu đèn compact thu mẫu sau dừng chiếu đèn 1-4 tuần

K1- K4: các mẫu cúc luống không chiếu đèn thu mẫu sau dừng chiếu đèn 1-4 tuần

ĐB1-ĐB4: mẫu cúc luống chiếu đèn điều biến 4A thu mẫu sau dừng chiếu đèn 1-4 tuần

53

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

Kết quả định lƣợng RNA tổng số thể hiện trên cho thấy RNA vừa

tách chiết có đủ nồng độ và đảm bảo độ sạch để sử dụng cho các thí

nghiệm tiếp theo.

3.2.2. Kết quả phân lập gen CO

3.2.2.1. Đánh giá chất lƣợng mRNA

Bƣớc phiên mã ngƣợc (reverse transcript) là rất quan trọng quyết định

độ nhạy và tính chính xác khi định lƣợng, vì số lƣợng cDNA đƣợc tạo ra, phải

phản ánh một cách chính xác số lƣợng đầu vào của mRNA. Chất lƣợng của

RNA vừa tách chiết là nhân tố quan trọng quyết định chất lƣợng và thành

công của phản ứng tổng hợp cDNA. RNA rất dễ bị phân hủy bởi RNase vốn

có ở khắp mọi nơi trong môi trƣờng phòng thí nghiệm. Vì vậy, việc bảo quản

RNA luôn đòi hỏi thực hiện nghiêm ngặt ở -80ºC khi chƣa sử dụng.

Trong thí nghiệm này, RNA ngay sau tách chiết và sau khi bảo quản ở - 800C đƣợc sử dụng để tổng hợp cDNA. cDNA tổng số đƣợc tổng hợp bằng bộ

kit First Strand cDNA Synthesis Kit của hãng Thermo Scientific sử dụng mồi

random hexamers. Để đánh giá chất lƣợng của sản phẩm cDNA, 1 µl của

cDNA đƣợc dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi khuếch đại gen

MTP. Theo tính toán lý thuyết , cặp mồi này sẽ nhân đƣợc đoạn gen có kích thƣớc 184 bp

54

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

1000

250

184

Hình 3.10: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi MTP

M: Thang DNA chuẩn 1kb, mẫu 1-4: L1- L4; 5-8: C1- C4; 9-12: K1-K4; 13-16: ĐB 1-

ĐB4

Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR cho thấy tại các đƣờng chạy

đều xuất hiện một băng DNA sáng sắc nét chứng tỏ gen MTP đã đƣợc khuếch

đại thành công từ cDNA các mẫu lá hoa cúc. Nhƣ vậy, chúng tôi đã tổng hợp

đƣợc nguồn cDNA đủ hàm lƣợng và chất lƣợng từ lá qua các giai đoạn phát

triển khác nhau làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.

1200

1000

250

Bp M 1 2 3 4 5 6

Hình 3.11: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR dùng cặp mồi đặc hiệu (CS_CO

F/R) sử dụng khuôn là cDNA tổng hợp từ RNA tổng số của các mẫu hoa cúc. 55

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

M: Thang DNA chuẩn 1kb, 1-5: các mẫu cDNA hoa cúc dƣới các điều kiện chiếu sáng

khác nhau.

cDNA vừa tổng hợp tiếp tục đƣợc sử dụng để khuyếch đại gen đích CO

bằng cặp mồi đặc hiệu CS_CO F/R. Theo tính toán lí thuyết kích thƣớc của

sản phẩm PCR là 1200 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy có một

phân đoạn DNAsắc nét, có kích thƣớc khoảng 1200 bp đúng nhƣ tính toán lý

thuyết. Điều này chứng tỏ gen CO đã đƣợc khuyếch đại thành công. Tuy

nhiên để khẳng định chính xác đây là gen CO thì đoạn gen này tiếp tục đƣợc

tách dòng và xác định trình tự.

3.2.2.2. Kết quả tách dòng gen

Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng cách gắn sản phẩm PCR

vào vector tách dòng pBT do phòng Công nghệ Tế bào thực vật cung cấp . Để

việc gắn có hiệu quả, sản phẩm PCR từ gen đích đƣợc làm sạch, thu duy nhất

một băng đặc hiệu có kích thƣớc mong muốn và loại bỏ những thành phần tạp

chất nhƣ mồi, đệm, enzyme...Quá trình làm sạch DNA thực hiện theo sự

hƣớng dẫn của bộ kit hãng Fermentas.

Sản phẩm thôi gel sau đó đƣợc gắn vào vector pBT dƣới sự xúc tác của

enzyme T4 ligase. Kết quả chúng tôi thu đƣợc một lƣợng lớn khuẩn lạc, chọn ở

mỗi mẫu 4 khuẩn lạc để tiến hành colony PCR với cặp mồi pUC18F/R. Theo

tính toán sản phẩm PCR sẽ cho kích thƣớc khoảng 1364 (=1200+164) bp.

56

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

1364

1000

250

1 2 3 4 5 M bp

Hình 3.12: Kết quả điện di sản phẩm colony PCR với cặp mồi pUC18F/R

M: Thang DNA chuẩn 1kb, 1-5 dòng khuẩn lạc đại diện cho từng mẫu cúc ở các công thức

chiếu sáng khác nhau

Sản phẩm colony PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.12)

cho những băng có kích thƣớc đúng nhƣ dự đoán. Những dòng khuẩn lạc này

tiếp tục đƣợc nuôi lỏng, tách chiết plasmid và đọc trình tự.Kết quả xác định

và phân tích trình tự cho thấy kích thƣớc đoạn gen phân lập là 1200 bp đúng

nhƣ tính toán lý thuyết. Trình tự này tiếp tục đƣợc so sánh bằng BLAST trong

NCBI, kết quả cho thấy trình tự thu đƣợc chính là trình tự gen CO của loài

hoa cúc chi Chrysanthemum.

3.2.2.3. Kết quả phân tích trình tự gen CO

Trình tự gen CO của thể phân lập COL-clone36 đƣợc so sánh với bốn

thể phân lập thuộc chi Chrysanthemum đã đƣợc công bố trên Ngân hàng dữ

liệu gen (Bảng 3.). Phân tích trình tự cho thấy trình tự gen CO của thể phân

lập COL-clone36 có độ tƣơng đồng khá cao so với bốn thể phân lập còn lại,

độ tƣơng đồng dao động từ 98,5 (so với thể phân lập AB733628_Nhật bản)

đến 99,7% (so với thể phân lập KC175548và JQ693394 _Trung Quốc) ở mức

độ nucleotide và 98,6 (so với thể phân lập AB733628_Nhật bản) đến 99,7%

57

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

(so với thể phân lậpJQ693394_Trung Quốc) ở mức độ amino acid. Có 36 vị

trí nucleotide sai khác giữa các thể phân lập nhƣng chỉ có 8 vị trí làm thay đổi

trình tự amino acid .

Bảng 3.6: Mã số trong Ngân hàng dữ liệu gen và vùng phân lập của các thể phân lập

thuộc chi cúc Chrysanthemum sử dụng trong phân tích, so sánh trình tự gen CO

STT

Mã số trong NCBI

Vùng phân lập

1

KC175548

Trung Quốc

2

JQ693394

Trung Quốc

3

KC589293

Trung Quốc

4

AB733628

Nhật Bản

58

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

Hình 3.13 : Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide gen CO của thể phân lập COL-clone36

với bốn thể phân lập khác thuộc chi Chrysanthemum trên Ngân hàng dữ liệu gen.

59

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

Hình 3.14: Hình ảnh so sánh trình tự axit amin gen CO của thể phân lập COL- clone36 với bốn thể phân lập khác thuộc chi Chrysanthemum trên Ngân hàng dữ liệu gen.

Hình 3.15: Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide của gen CO chi

Chrysanthemum. Thể phân lập COL-clone36 nghiên cứu đƣợc so sánh với bốn thể

phân lập khác đƣợc công bố trên Ngân hàng dữ liệu gen.

Đa dạng di truyền ở mực độ phân tử là cần thiết trong một quần thể,

giúp các cá thể có thể thích nghị trong những môi trƣờng khác nhau. Dựa vào

sự đa dạng này có thể xây dựng đƣợc cây phát sinh chủng loại, mối liên hệ

giữa các loài và cho biết một loài tiến hóa nhƣ thế nào dƣới áp lực của môi

trƣờng biến đổi (Schneider and Roossinck, 2001). Phân tích cây phát sinh

chủng loại cũng cho kết quả tƣơng tự nhƣ phân tích trình tự nucleotide, thể

phân lập COL-clone36 có mối quan hệ gần gũi với các thể phân lập có nguồn

60

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

gốc từ Trung Quốc hơn so với thể phân lập có nguồn gốc Nhật Bản. Điều này

phải chăng do khoảng cách địa lý giữa Việt Nam với Trung Quốc gần hơn so

với Nhật Bản dẫn đến điều kiện môi trƣờng cũng tƣơng thích hơn. Tuy nhiên

để có kết luận chính xác cần phải có những nghiên cứu sâu rộng hơn nữa.

Nhƣ vậy, gen CO từ cây hoa cúc giống Pha Lê đã đƣợc phân lập và xác định

trình tự thành công.

3.2.3. Kết quả đánh giá sự biểu hiện của gen CO và FT cảm ứng ra hoa ở

cây Hoa cúc

Một trong những yếu tố quan trọng nhất để kiểm soát thời gian ra hoa ở

vùng ôn đới là độ dài thời gian chiếu sáng hàng ngày. Các phƣơng pháp

nghiên cứu phân tử đã xác định đƣợc những gen cần thiết cho quá trình ra hoa

trong điều kiện ngày dài.

Co là một yếu tố quan trọng trong con đƣờng quang chu kì, tích hợp

đồng hồ sinh học và tín hiệu ánh sáng tạo thành một yếu tố điều khiển cho

quá trình ra hoa. Theo lý thuyết khi gen CO hoạt động sẽ tạo ra một yếu tố

phiên mã kích thích gen FT hoạt động, gen FT hoạt động sẽ tạo ra protein FT,

protein này di chuyển theo mạch dẫn đến mô phân sinh đỉnh, hoạt hóa sự biểu

hiện của nhóm gen FLY, nhóm gen này kích thích chuyển mô phân sinh đỉnh

thành hoa. Vì vậy, 2 gen đƣợc quan tâm trong thí nghiệm này là gen CO và

FT, đánh giá hoạt động của 2 gen này ở mức độ phiên mã bằng phản ứng real

time PCR phiên mã ngƣợc.

Realtime PCR là kĩ thuật mà kết quả khuếch đại DNA đích đƣợc hiển

thị ngay sau mỗi chu kì nhiệt của phản ứng, chính vì vậy khi sử dụng realtime

PCR không cần phải thực hiện tiếp các bƣớc thí nghiệm tiếp theo để đọc và

phân tích kết quả. Sự ra đời của kỹ thuật Real-time PCR là một bƣớc đột phá

61

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

trong công nghệ sinh họcvà là một trong những phƣơng pháp định lƣợng gen

đƣợc sử dụng phổ biến nhất tại nhiều phòng thí nghiệm sinh học phân tử

3.2.3.1. Kết quả biểu hiện gen CO trong lá ở các giai đoạn sinh trƣởng

của cây hoa cúc

Tiến hành đánh giá biểu hiện gen CO ở các giai đoạn phát triển sau khi

chiếu sáng phá đêm.

Hình 3.16: Kết quả phân tích mức độ biểu hiện ở cấp độ phiên mã của gen CO ở lá của cây hoa cúc ở 42, 49, 56 và 63 ngày tuổi

Ngay sau khi dừng chiếu đèn 1 tuần gen CO đã bắt đầu hoạt động, ở

luống không chiếu đèn mức độ biểu hiện khá cao, cao hơn 7 lần so với công

thức chiếu đèn Led liên tục tại cùng thời điểm cây 42 ngày tuổi và cũng là

mức độ biểu hiện cao nhất của gen CO của các mẫu ở công thức đối chứng

không chiếu đèn. Ở các giai đoạn sau khi chiếu đèn 2,3 tuần biểu hiện có

chiều hƣớng giảm dần và ở 63 ngày tuổi thì không thấy sự biểu hiện của gen

CO. Điều này có thể giải thích là do giai đoạn 42 ngày tuổi là giai đoạn cây ở

luống đối chứng không chiếu đèn đang trong quá trình chuyển sang giai đoạn

phát triển sinh sản vì vậy gen CO hoạt động mạnh nhất. Ở 50 ngày tuổi là khi

62

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

luống đối chứng không chiếu đèn đã xuất hiện nụ vì vậy hoạt động của gen

CO giảm mạnh. Cây ở 49 ngày tuổi biểu hiện của gen CO ở các luống chiếu

đèn Led liên tục, điều biến và đèn compact không có sự chênh lệch rõ ràng

nhƣ biểu hiện ở cây 56 ngày tuổi. Đây là giai đoạn biểu hiện mạnh mẽ nhất

của gen CO ở công thức chiếu đèn Led liên tục và cũng là biểu hiện mạnh

nhất trong các công thức chiếu đèn thí nghiệm. Biểu hiện mạnh của gen CO ở

luống thí nghiệm 3A cao gấp 2 lần so với biểu hiện mạnh của gen CO ở luống

đối chứng không chiếu đèn và cũng cao hơn ở các luống chiếu đèn điều biến

và chiếu đèn compact. Khi cây ở 63 ngày tuổi không thấy có sự biểu hiện của

gen CO ở hai luống không chiếu đèn và chiếu đèn Led điều biến, điều này có

thể giải thích do ở giai đoạn này hai luống thí nghiệm đã nở hoa, vì vậy gen

không còn hoạt động để kích thích phát sinh hoa nữa, mà do một nhóm gen

khác hoạt động để hình thành các cơ quan hoa.

3.2.3.2. Kết quả đánh giá biểu hiện của gen FT trong mô

Nhằm đánh giá ảnh hƣởng của mẫu đến sự biểu hiện của gen FT, mẫu

lá bánh tẻ, đỉnh chồi ngọn và mẫu lá non của cây hoa cúc sinh trƣởng phát

triển dƣới đèn compact đƣợc sử dụng để tiến hành thí nghiệm. Dựa vào mức

độ phát triển của cây chúng tôi tiến hành thí nghiệm ở ba giai đoạn: giai đoạn

1: cây trồng đƣợc 20 ngày tuổi, giai đoạn 2: cây trồng 30 ngày tuổi, giai đoạn

3: cây trồng 40 ngày tuổi.

RNA tổng số đƣợc tách chiết từ các mẫu lá bánh tẻ và đỉnh chồi ngọn

của cây hoa cúc 20, 30, 40 ngày tuổi. Mức độ biểu hiện của FT đƣợc định

lƣợng bằng qRT-PCR

63

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

Hình 3.17: Biểu hiện của gen FT ở các giai đoạn phát triển khác nhau ở mẫu lá bánh tẻ , lá non và đỉnh chồi của cây hoa cúc

Biểu hiện của gen FT cao ở tất cả các mẫu lá bánh tẻ ở các giai đoạn

khảo sát và tăng dần cùng với sự sinh trƣởng của cây, cao nhất ở giai đoạn 40

ngày khi cây chuẩn bị chuyển sang giai đoạn phát triển hoa, biểu hiện của gen

FT ở mẫu lá non cũng rõ ràng trong giai đoạn này. Biểu biểu hiện của gen FT

ở các mẫu đỉnh chồi ngọn rất yếu, cƣờng độ huỳnh quang phát ra từ sản phẩm

khuếch đại của phản ứng PCR đƣợc ghi nhận ở các chu kỳ ngƣỡng Ct > 30

chu kỳ, không đặc hiệu.

Kết quả này cũng đƣợc ghi nhận ở nhiều nghiên cứu trên các đối tƣợng

khác nhau nhƣ trên đối tƣợng Arabidopsis (Wigge et al.2005) hay một

nhóm nghiên cứu Nhật Bản khi thực hiện thí nghiệm tƣơng tự trên đối tƣợng

cây rau bina năm 2014 (Erika Abe et al.,2014). Nhƣ vậy, trên một số đối

tƣợng thực vật đã nghiên cứu, gen FT luôn có biểu hiện cao ở lá mầm, lá bánh

tẻ và biểu hiện kém ở đỉnh chồi.

64

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

3.2.3.3. Kết quả biểu hiện gen FT trong lá ở các giai đoạn sinh trƣởng

của cây hoa cúc

Từ kết quả thí nghiệm trƣớc chúng tôi nhận thấy gen FT biểu hiện

mạnh ở lá bánh tẻ hơn là ở đỉnh chồi ngọn. Vì vậy, chúng tôi sử dụng lá bánh

tẻ của các mẫu cúc để tiến hành thí nghiệm đánh giá biểu hiện của gen FT.

Hình 3.18: Kết quả phân tích mức độ biểu hiện ở cấp độ phiên mã của gen CO ở lá của cây hoa cúc ở 42, 49, 56 và 63 ngày tuổi

Ở 42 ngày tuổi gen FT của mẫu không chiếu đèn và chiếu đèn Led điều

biến có biểu hiện cao nhất sau đó giảm dần theo ngày tuổi và ở 63 ngày tuổi

thì gần nhƣ gen này không còn biểu hiện. Gen FT biểu hiện mạnh nhất trong

các mẫu thí nghiệm đèn Led 3A ở 56 ngày tuổi, cao gấp rƣỡi so với mức độ

gen FT biểu hiện cao nhất của mẫu không chiếu đèn. Cƣờng độ huỳnh quang

phát ra từ sản phẩm khuếch đại của phản ứng PCR đƣợc ghi nhận ở các chu

kỳ ngƣỡng Ct >20 chu kỳ. Biểu hiện của gen FT của các mẫu chiếu đèn

compact thấp hơn so với các mẫu chiếu đèn Led 3A.

Kết quả này có sự liên quan logic với lý thuyết về sự ra hoa tức là thời

điểm khi gen CO hoạt động mạnh nhất cũng là lúc mà của gen FT trong lá

65

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

biểu hiện mạnh nhất. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Erika Abe và cộng sự

năm 2014 thì biểu hiện của hai gen này đƣợc quy định bởi nhịp độ ngày và

đêm. Theo kết quả nghiên cứu này gen CO biểu hiện mạnh nhất vào thời điểm

giữa của chu kỳ tối trong cả cây ngày dài và cây ngày ngắn. Trong khi đó gen

FT lại có biểu hiện ở các cây con trồng trong điều kiện ngày dài mạnh hơn

nhiều so với cây ngày ngắn. Trong điều kiện ngày dài thì gen FT có sự biểu

hiện cao nhất ở cuối của chu kì chiếu sáng.

Nghiên cứu này cũng đã lý giải vì sao khi sử dụng đèn Led để chiếu

sáng phá đêm lại có hiệu quả ức chế sự ra hoa hơn so với đèn compact. Điều

này có thể giải thích là do ngay khi phytocrom trên lá tiếp nhận ánh sáng đỏ

từ đèn Led đơn sắc sẽ ức chế hoàn toàn biểu hiện của gen CO, làm cho gen

CO không hoạt động để tạo ra yếu tố phiên mã nhằm kích thích gen FT , ức

chế quá trình ra hoa. Nhƣng nếu sử dụng đèn compact để chiếu sáng thì do

đèn compact là ánh sáng đa sắc bao gồm nhiều dải màu : đỏ, đỏ xa, xanh…mà

ánh sáng đỏ xa có tác dụng kích thích sự ra hoa ở cây ngày ngắn do đó dù

chiếu với thời gian dài hơn nhƣng hiệu quả ức chế gen CO không hoàn toàn,

cây vẫn ra hoa sớm.

Nhƣ vậy, khả năng ứng dụng đèn Led ( Led 630nm-3W) vào quá trình

chiếu sáng phá đêm ở cây hoa cúc là hoàn toàn có tính khả thi vừa có ức chế

đƣợc thời gian ra hoa vừa có khả năng tăng chất lƣợng của hoa cúc.

66

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

(1). Đã xác định đƣợc công thức đèn Led tốt nhất cho sự sinh trƣởng và

phát triển của cây hoa cúc. Đèn Led có công suất 630nm- 5W thời gian chiếu

liên tục trong 30 phút từ 22h45 đến 23h15 có ảnh hƣởng tốt nhất đến cây hoa

cúc. Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy sử dụng đèn Led chiếu sáng điều biến

theo chu kì 1 phút bật: 1 phút tắt không có hiệu quả ức chế ra hoa cho cây

cúc.

(2). Đã phân lập và xác định trình tự gen CO của giống hoa cúc pha lê

vàng với kích thƣớc 1160 nucleotide. Độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide

gen CO này với một số loài cúc thuộc chi Chrysanthemum đã công bố trên

Ngân hàng dữ liệu gen tƣơng đối cao (98,5-99,7%).

(3). Đã đánh giá đƣợc biểu hiện của gen CO và FT ở các giai đoạn phát

triển khác nhau của cây hoa cúc.

2. KIẾN NGHỊ

Tiếp tục phân lập và xác định trình tự gen FT ở cây hoa cúc.

Tiếp tục nghiên cứu và phát triển hệ thống chiếu sáng đèn Led trên một

số cây trồng có giá trị kinh tế khác.

67

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Công ty Bóng đèn Phích nƣớc Rạng Đông. Báo cáo tổng kết năm

2013

2. Đặng thị Tố Nga, Đào Thanh Vân, Nguyễn xuân Linh (2010),

Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian chiếu sáng bổ sung đến hoa cúc vàng

thƣợc dƣợc (Chrysanthemum sp) tại Thái nguyên”, Tạp chí Khoa học và

Công nghệ số 14 (76), Đại học Thái nguyên, tr. 41-45.

3. Nguyễn Bá Nam, Lê Thị Thanh, Lê Thị Thanh Trà, Vũ Quốc Luận,

Nguyễn Đình Lâm, Dƣơng Tấn Nhựt (2013 ), Ảnh hƣởng của ánh sáng đen

LED bổ sung vào ban đêm lên sự sinh trƣởng và phát triển trên ba giống hoa

cúc”. Báo cáo nghiệm thu đề tài Bộ Công thƣơng trong chƣơng trình mục tiêu

quốc gia về sử dụng năng lƣợng tiết kiệm và hiệu quả

4. Nguyễn Thị Bắc Kinh, Nguyễn Đức Lƣơng, Tổng quan đánh giá

tình hình ứng dụng công nghệ chiếu sáng LED trong nông nghiệp trên thế

giới và trong nƣớc. Báo cáo số 1 đề tài “Nghiên cứu tiếp cận công nghệ chiếu

sáng LED ứng dụng trong nông nghiệp và chế tạo thử nghiệm bộ đèn LED

chiếu sáng kích thích sinh trƣởng hoa và rau” CTDAS, Viện KH&CNVN, Hà

Nội 11-2011.

5. Phan Hồng Khôi, Nguyễn Thị Bắc Kinh, Hoàng Cao Dũng, Nguyễn

Đức Lƣơng, Nguyễn Văn Thao, Hoàng Thị Thu Linh, Nghiên cứu phát triển

công nghệ chiếu sáng LED ứng dụng trong nông nghiệp. Báo cáo tại Hội nghị

Khoa học và Công nghệ phục vụ phát triển kinh tế - xã hội các tỉnh thuộc khu

vực Tây Bắc. Yên Bái 12/4/2012

6. Phan Hồng Khôi, Nguyễn Thị Bắc Kinh, Vũ Đình Thịnh, Nguyễn

Văn Thao, Phát triển công nghệ chế tạo các bộ đèn LED dung để chiếu sáng.

68

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

Báo cáo tại Hội nghị Khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học và Công nghệ

Việt Nam – Hà Nội, ngày 26/10/2010.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

7. Abdul Mateen Khattak. Simon Pearson. Light quality and

temperature effects on antirrhinum growth and development. J Zhejiang Univ

Sci B. 2005 Feb; 6(2): 119–124.

8. Abe M, Kobayashi Y, Yamamoto S, Daimon Y, Yamaguchi A,

Ikeda Y, Ichinoki H, Notaguchi M, Goto K, Araki T. FD, a bZIP protein

mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot

apex. Science. 2005;309:1052–1056

9. An, H., Roussot, C., Suárez-López, P., Corbesier, L., Vincent,

C.,Piñeiro, M., Hepworth, S., Mouradov, A., Justin, S., Turnbull, C., et al.

2004. CONSTANS acts in the phloem to regulate a systemic signal that

induces photoperiodic flowering of Arabidopsis. Development 131: 3615–

3626.

10. and Araki, T. (2005) FD, a bZIP Protein Mediating Signals from

the Floral Pathway Integrator FT at the Shoot Apex.

11. and Its Role in Photoperiodic Regulation of Flowering Time.

Frontiers in Plant Science, 2, 81.

12. Andersson N.E., 1990: Effects of level and duration of

supplementary light on development of chrysanthemum. Scientia

Horticulturae (amsterdam). 44(1-2): 163-170

13. Ayre, B.G. and Turgeon, R. 2004. Graft transmission of a floral

stimulant derived from CONSTANS. Plant Physiol. 135:2271–2278.

69

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

14. Ballerini, E.S. and Kramer, E.M. (2011) In the Light of Evolution:

A Reevaluation of Conservation in the CO-FT Regulon

15. Bowman, J.L., H. Sakai, T. Jack, D. Weigel, U. Mayer, and

E.M.Meyerowitz. 1992. SUPERMAN, a regulator of floral homeotic genes in

Arabidopsis. Development 114: 599--615.

16. Bradley D, Ratcliffe O, Vincent C, Carpenter R, Coen E (1997)

Inflorescence commitment and architecture in Arabidopsis. Science 275: 80–

83

17. C., Belachew, A., Repetti, P.P., Reuber, T.L. and Ratcliffe, O.J.

(2010) The Flowering Time Regulator CONSTANS Is Recruited to the

FLOWERING LOCUS T Promoter via a Unique cis-Element. New

Phytologist, 187, 57-66.

18. Cecilia Hidén and Rolf U. Larsen (1994). Predicting flower

development in greenhouse grown chrysanthemum. Scientia Horticulturae,

Volume 58, Issues 1–2, June 1994, Pages 123–138

19. Cecilia Volmaro, Mariela Pontín, Virginia Luna, Rita Baraldi, Rubé

n Bottini (1998), “Blue light control of hypocotyl elongation in etiolated

seedlings of Lactuca sativa (L.) cv. Grand Rapids related to exogenous

growth regulators and endogenous IAA, GA3 and abscisic acid” Plant

Growth Regulation, Volume 26, Issue 3, pp 165-173

20. Corbesier, L., Vincent, C., Jang, S., Fornara, F., Fan, Q., Searle,

I.,Giakountis, A., Farrona, S., Gissot, L., Turnbull, C., et al.2007. FT protein

movement contributes to long-distance signaling in floral induction of

Arabidopsis. Science 316: 1030–1033.

21. Corbesier, L., Vincent, C., Jang, S., Fornara, F., Fan, Q., Searle, I.,

Giakountis, A., Farrona, S., Gissot, L., Turnbull, C., et al. 2007. “FT protein 70

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

movement contributes to long-distance signaling in floral induction of

Arabidopsis”. Science 316: 1030–1033.

22. Cheng XF, Wang ZY (2005). “Overexpression of COL9, a

CONSTANS-LIKE gene, delays flowering by reducing expression of CO and

FT in Arabidopsis thaliana” Plant J. 43(5):758-68.

23. Fukuda.M, Nishio.J, Arai.K (1987), “ The effects of temperature

and light on the growth of Chrysanthemum” Japan, No19, pp- 203

24. G (2004) Photoreceptor regulation of CONSTANS protein in

photoperiodic

25. Garner, W.W. and Allard, H.A. 1920. Effect of the relative length

of day and night and other factors of the environment on growth and

reproduction in plants. J. Agric. Res. 18: 553– 606.

26. Garner, W.W. and Allard, H.A. 1923. Further studies on

photoperiodism, the response of plants to relative length of day and night. J.

Agric. Res. 23: 871–920

27. Goins, G.D., Yorio, N.C., Sanwo, M.M., Brown, C.S. (1997).

Photomorphogenesis, photosynthesis, and seedyield of wheat plants grown

under light emitting diodes (LEDs) with or without supplemental blue

lighting. J Exp Bot, 48, 1407-1413.

28. Higuchi Y, Sumitomo K, Oda A, Shimizu H, Hisamatsu T. Day

light quality affects the night-break response in the short-day plant

chrysanthemum, suggesting differential phytochrome-mediated regulation of

flowering. J Plant Physiol. 2012;169(18):1789-1796.

71

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

29. Imaizumi, T., Tran, H.G., Swartz, T.E., Briggs, W.R., and Kay,S.A.

2003. FKF1 is essential for photoperiodic-specific light signalling in

Arabidopsis. Nature 426: 302–306.

30. Irish, V.F., and Sussex, I.M. (1990). Function of the apetala1–1

gene during Arabidopsis floral development. Plant Cell 2, 741–751.

31. Jjong, J.D (1989), “ The flowering of Chrysanthemum morifolium

seedlings and cutting in relation to seasonal fluctuation in light” Science

Horticulture, pp 117-124

32. Jofuku, K.D., Boer, B.G.W.d., Montagu, M.V., and Okamuro, J.K.

(1994). Control of Arabidopsis flower and seed development by the homeotic

gene APETALA2. Plant Cell 6 1211–1225.

33. Klein, A. O.: Persistent photoreversibility in leaf development.

Plant Physiol.1969; 44: 897–902

34. Locke, J.C., Kozma-Bognár, L., Gould, P.D., Fehér, B., Kevei,

E.,Nagy, F.,Turner, M.S., Hall, A., and Millar, A.J. 2006. Experimental

validation of a predicted feedback loop in the multi-oscillator clock of

Arabidopsis thaliana. Mol. Syst.Biol. 2: 59. doi: 10.1038/msb4100102.

35. M.H. Moreira da Silva, P.C. Debergh (1997), “The effect of light

quality on the morphogenesis of in vitro cultures of Azorina vidalii

(Wats.) Feer”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture

36. Mandel, M.A., Gustafson-Brown, C., Savidge, B., and Yanofsky,

M.F. (1992). Molecular characterization of the Arabidopsis floral homeotic

gene APETALA1. Nature 360, 273–277.

37. Mizukami Y Determination of Arabidopsis floral meristem identity

by AGAMOUS. Plant Cell. 1997;9:393–408.

72

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

38. Navotva (1988), “ Breeding research of thermotolaranse in small

flowering Chrysanthemum for controlLed growing” No55, pp15-24

39. Nhut, D.T., Hong, L.T.A., Watanabe, H., Goi, M., Tanaka, M.

(2002b). In vitro growth of banana plantlets cultured under red and blue light-

emitting diodes (LEDs) irradiation source. Act Hort, 575, 117-123.

40. Nhut, D.T., Takamura, T., Goi, M., Watanabe, H., Satao, M.,

Tanaka, M. (2000). The effect of various blue to red ratios for LED

irradiation system on the in vitro growth of Phalaenopsis plantlets. J Japan

Soc Hortic Sc, 218 (Abstract).

41. Nhut, D.T., Takamura, T., Watanabe, H., Murakami, A., Murakami,

K., Tanaka, M. (2002a). Sugar-free micropropagation of Eucalyptus

citriodora using light-emitting diodes (LEDs) and film-rockwool culture

system. Environ Control Biol, 40, 147-155.

42. Nhut, D.T., Takamura, T., Watanabe, H., Okamoto, K., Tanaka, M.

(2003a). Responses of strawberry plantlets cultured in vitro under superbright

red and blue lightemitting diodes (LEDs). Plant Cell Tiss Org, 73, 43-52.

43. Nhut, D.T., Takamura, T., Watanabe, H., Tanaka, M. (2003b).

Efficiency of a novel culture system by using lightemitting diodes (LEDs) on

in vitro and subsequent of micropropagated banana. Acta Hort, 616, 121-128.

44. Pathway Integrator Redundantly with FT. Plant and Cell

Physiology, 46, 1175-1189

45. Pineiro M, Coupland G (1998) The control of flowering time and

floral identity in Arabidopsis. Plant Physiol 117: 1-8

73

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

46. Rajapakse, N.C., Young, R.E., McMahon, M.J., Oi, R. (1999).

Plant height control by photoselective filters: current status and future

prospects. HortTech 9, 618-624

47. Ryosuke Hayama, Shuji Yokoi, Shojiro Tamaki, Masahiro

Yano&Ko Shimamoto (2003). “Adaptation of photoperiodic control pathways

48. Sang Yeol Kim, Xuhong Yu,and Scott D. Michaels, “Regulation

produces short-day flowering in rice” Nature 422, 719-722

of CONSTANS and FLOWERING LOCUS T Expression in Response to

Changing Light Quality” Plant Physiol. 2008 Sep; 148(1): 269–279

49. Schneider WL and Roossinck MJ (2001). Genetic diversity in RNA

viral quasispecies is controlLed by host-virus interactions. J Virol75(14):

6566-6571.

50. Song, Y.H., Ito, S. and Imaizumi, T. (2013) Flowering Time

Regulation: Photoperiod- and Temperature-Sensing in Leaves. Trends in

Plant Science, 18, 575-583.

51. Strojuy. Z (1985), Year- round Chrysanthemum growing in Poland,

“ Effect of the length of the long-day period and time of pinching on

Chrysanthemum quaility” 21 ref, pp 91-104

52. Sung, Z.R., Belachew, A., Shunong, B., and Bertrand-Garcia, R.

(1992). EMF, an Arabidopsis gene required for vegetative shoot development.

Science 258, 1645–1647.

53. Tiwari S. B., Shen Y., Chang H. C., Hou Y., Harris A., Ma S. F., et

al. (2010). The flowering time regulator CONSTANS is recruited to

the FLOWERING LOCUS T promoter via a unique cis-element.New

Phytol. 187, 57–66

74

BCTK Đề tài thuốc lá - Bộ NNPTNT Phụ lục

54. Tournois, J. 1912. Influence de la lumière sur la floraison du

houblon japonais et du chanvre déterminées par des semis haitifs. C. R. Acad.

Sci. Paris 155: 297–300.

55. Valverde, F, Mouradov A, Soppe W, Ravenscroft D, Samach A,

Coupland (2011) CONSTANS and the Evolutionary Origin of Photoperiodic

Timing of Flowering. Journal of Experimental Botany, 62, 2453-2463.

56. Wang SM, Lue WL, Yu TS, Long JH, Wang CN, Eimert K, Chen J.

Characterization of ADG1, and Arabidopsis locus encoding for ADPG

pyrophosphorylase small subunit, demonstrates that the presence of the small

subunit is required for large subunit stability. Plant J. 1998;13:63–70.

57. Wang.P and J.Cheng (1990), “Studies on breeding ground- Cover

Chrysanthemum new culitvar”, Acta/ Hort, Sinica, 17, pp. 223-228

58. Wigge, P.A., Kim, M.C., Jaeger, K.E., Busch, W., Schmid,

M.,Lohmann, J.U., and Weigel, D. 2005. Integration of spatial and temporal

information during floral induction in Arabidopsis.Science 309: 1056–1059.

59. Yamaguchi, A., Kobayashi, Y., Goto, K., Abe, M. and Araki, T.

(2005) TWIN SISTER OF FT (TSF) Acts as a Floral

60. Zeevaart, J.A. (2008) Leaf-Produced Floral Signals. Current

Opinion in Plant Biology, 11, 541-547.

61. Zeilinger, M.N., Farré, E.M., Taylor, S.R., Kay, S.A., and Doyle

III, F.J. 2006. A novel computational model of the circadian clock in

Arabidopsis that incorporates PRR7 and PRR9. Mol.Syst. Biol. 2: 58. doi:

10.1038/msb4100101.

75