Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật môi trường: Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA

DỊCH CHIẾT HẠT QUẢ BƠ VÀ ỨNG DỤNG TRONG

XỬ LÝ NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI

Ngành:

KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

Chuyên ngành: KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

Giảng viên hướng dẫn : Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Sinh viên thực hiện

: Võ Thị Vi

MSSV: 1211090114

Lớp: 12DMT01

TP. Hồ Chí Minh, 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng

Tôi. Các số liệu sử dụng phân tích trong đồ án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố

theo đúng quy định. Các kết quả nghiên cứu trong đồ án do tôi tự tìm hiểu, phân

tích một cách trung thực, khách quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam.

Sinh viên Võ Thị Vi

LỜI CẢM ƠN

Là một sinh viên học xa quê nhà nên ngay khi bước vào giảng đường Đại Học

trong tôi nhiều sự lo lắng, một chút rụt rè nhút nhát. Bao nhiêu suy nghĩ cực đoan

hiện ra trong đầu Tôi, cứ nghĩ rằng môi trường học tập lớn như thế này liệu rằng

mình có vượt qua được trong thời gian dài đằng đẵng hơn bốn năm hay không?

Nhưng rồi trải qua thời gian được tiếp xúc với môi trường học tập tại trường Đại

Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, dần dần Tôi cảm nhận được sự nhiệt

huyết của các Thầy Cô giáo, sự hăng say ham học của các bạn sinh viên, từng ngày

Tôi dần dần như được tiếp thêm ngọn lửa để cố gắn bước tiếp trên con đường học

tập.

Để thực hiện được đề tài này, Tôi xin chân thành cảm ơn đến Ban Giám Hiệu

nhà trường đã tạo điều kiện cho Tôi thực hiện được đề tài của mình. Đặc biệt, Tôi

xin cảm ơn ngôi nhà chung của sinh viên khoa Tôi “Khoa Công nghệ sinh học –

Thực phẩm – Môi trường” cảm ơn tất cả các Thầy Cô giáo trong khoa đã góp phần

tạo ra động lực để cho sinh viên chúng tôi có được hành trang đến lớp và tiếp thu

được nhiều kiến thức, để rồi khi bước ra ngoài xã hội, chúng tôi vẫn tự hào được là

một thành viên của ngôi nhà chung này. Lời cảm ơn sâu sắc nhất Tôi xin được gửi

đến Thầy hướng dẫn của mình là Thầy Lâm Vĩnh Sơn. Mang trong mình sự nhiệt

huyết, yêu nghề, hết mực giúp đỡ với các sinh viên, Thầy đã giúp Tôi từng bước

một hoàn thiện đồ án một cách tốt nhất. Được thầy hướng dẫn nhiệt tình, Tôi đã học

được nhiều kiến thức, trâu dồi thêm nhiều kỹ năng thông qua đề tài này.

Bên cạnh nhận được sự chỉ dẫn của Thầy hướng dẫn, Tôi xin gửi lời cảm ơn

chân thành nhất đến sự đóng góp về mặt tinh thần, luôn động viên của gia đình Tôi,

cũng như được tiếp thêm sức mạnh của những người bạn trong lớp 12DMT01 luôn

đồng hành cùng Tôi.

Cuối cùng, Tôi xin gửi lời chúc sức khỏe đến toàn thể quý Thầy Cô cùng Ban Giám

Hiệu nhà trường ngày càng gặt hái được nhiều thành công trong công tác giảng dạy.

Xin chân thành cảm!

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề ................................................................................................................... 1

2 Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................................ 4

3 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ................................................................................. 6

4 Nội dung nghiên cứu .................................................................................................. 6

5 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................................. 6

5.1 Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................... 6

5.2 Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 7

6 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................... 7

6.1 Phương pháp luận ............................................................................................... 7

6.2 Phương pháp thực nghiệm ................................................................................. 8

6.2.1 Phương pháp lấy mẫu: ............................................................................... 9

6.2.2 Phương pháp phân tích trọng lượng ........................................................................... 9

6.2.3 Phương pháp tách chất ............................................................................... 9

6.2.4 Phương pháp khảo sát ................................................................................ 9

6.2.5 Phương pháp vật lý ..................................................................................... 9

6.2.6 Phương pháp sinh học ................................................................................. 9

6.2.7 Phương pháp kiểm tra thống kê sinh học ................................................. 9

7 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của để tài ................................................................. 9

7.1 Ý nghĩa khoa học............................................................................................... 10

7.2 Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................... 10

8 Bố cục luận văn ......................................................................................................... 10

i

Chương 1 TỔNG QUAN ............................................................................................ 11

1.1 Đại cương về cây bơ .............................................................................................. 11

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại thực vật ................................................................... 11

1.1.2 Đặc tính sinh học ............................................................................................ 13

1.1.2.1 Nhiệt độ .................................................................................................... 13

1.1.2.2 Độ ẩm ....................................................................................................... 13

1.1.2.3Gió ............................................................................................................. 13

1.1.2.4 Đất trồng .................................................................................................. 13

1.1.3 Đặc điểm thực vật ........................................................................................... 14

1.1.4 Giá trị dinh dưỡng .......................................................................................... 15

1.2 Thành phần hóa học và các công dụng của hạt quả bơ ..................................... 16

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước trên đối tượng là quả bơ .............. 17

1.3.1 Các nghiên cứu trong nước............................................................................ 17

1.3.2 Các nghiên cứu trên thế giới .......................................................................... 18

1.4 Tình hình nghiên cứu tách chiết suất từ thực vật và ứng dụng ........................ 20

1.4.1 Các nghiên cứu trong nước............................................................................ 20

1.4.2 Các nghiên cứu trên thế giới .......................................................................... 20

1.5 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết .................. 22

1.5.1 Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán ...................................... 22

1.5.2 Phương pháp pha loãng ................................................................................. 23

1.5.3 Phương pháp E - test ...................................................................................... 24

1.5.4 Phương pháp sử dụng hệ thống thử nghiệm kháng sinh đồ tự động

(automated antimicrobial susceptibility testing systems) ............................................ 24

1.6 Hiện trạng ô nhiễm do nước thải chăn nuôi gây ra ........................................... 25

ii

1.7 Hiện trạng các phương pháp xử lý nước thải chăn nuôi ................................... 27

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 29

2.1 Nguyên liệu ............................................................................................................ 29

2.1.1 Thu gom nguyên liệu ...................................................................................... 29

2.1.2 Xử lý nguyên liệu ............................................................................................ 29

2.2 Dụng cụ và hóa chất .............................................................................................. 29

2.2.1 Dụng cụ ........................................................................................................... 29

2.2.2 Môi trường và hóa chất .................................................................................. 29

2.3 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 30

2.3.1 Phương pháp thu gom và xử lý mẫu .............................................................. 30

2.3.2 Phương pháp vật lý ......................................................................................... 30

2.3.3 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết. ..... 30

2.3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi ............................................. 30

2.3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết .................................................. 31

2.3.4 Phương pháp chiết mẫu thực vật ................................................................... 31

2.3.4.1 Giới thiệu chung ....................................................................................... 31

2.3.4.2 Kỹ thuật chiết Soxhlet ............................................................................... 32

2.3.5 Phương pháp xác định thành phần hóa học của các dịch chiết hạt quả

bơ .......................................................................................................................... 33

2.3.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh ................................................ 35

2.3.6.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết ......................... 35

2.3.6.2 Phương pháp test mẫu nước thải chăn nuôi ............................................ 37

2.3.6.2.1 Phương pháp đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí ................................. 37

iii

2.3.6.2.2 Phương pháp định lượng Coliforms kỹ thuật lên men nhiều ống

đếm số có xác suất lớn nhất MPN (Most Probable Number) ...................................... 38

2.3.6.2.3 Phân tích Escherichia Coli có trong mẫu nước thải chăn nuôi ..... 40

2.3.7 Phương pháp thử nghiệm dịch chiết trong xử lý nước thải chăn nuôi ....... 41

2.3.8 Phương pháp kiểm tra thống kê sinh học ..................................................... 42

2.4 Sơ đồ quy trình thực nghiệm ................................................................................ 43

2.4.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ................................................................... 43

2.4.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ ẩm ......................................................... 44

2.4.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn dung môi và thời gian tối ưu cho quá trình

tách chiết ..................................................................................................................... 45

2.4.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính kháng khuẩn có trong dịch

chiết ..................................................................................................................... 46

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................................... 47

3.1 Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lý .............................................................. 47

3.1.1 Kết quả xác định độ ẩm .................................................................................. 47

3.1.2 Kết quả xác định hàm lượng tro .................................................................... 48

3.2 Kết quả khảo sát điều kiện tách chiết ................................................................ 49

3.2.1 Kết quả khảo sát thời gian chiết bằng dung môi n-hexan ............................ 49

3.2.2 Kết quả khảo sát thời gian chiết bằng dung môi metanol ............................ 51

3.2.3 Kết quả khảo sát thời gian chiết bằng dung môi etyl axetat ......................... 53

3.2.4 Kết quả khảo sát tỉ lệ khối lượng mẫu với thể tích dung môi ....................... 54

3.2.4.1 Trong dung môi n-hexan .......................................................................... 54

3.2.4.2 Trong dung môi metanol .......................................................................... 55

3.2.4.2 Trong dung môi etyl axetat ....................................................................... 57

iv

3.3 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của dịch chiết methanol hạt quả

bơ ..................................................................................................................... 59

3.4 Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn ........................................................... 60

3.5 Kết quả kiểm tra mẫu nước thải chăn nuôi ........................................................ 67

3.5.1 Kết quả đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí.......................................................... 67

3.5.2 Kết quả phân tích tổng số Coliform ............................................................... 68

3.5.3 Kết quả phân tích Escherichia Coli có trong mẫu nước thải ....................... 72

3.6 Kết quả thử nghiệm dịch chiết hạt quả bơ trong xử lý nước thải chăn nuôi ...... 73

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 80

Kết luận ..................................................................................................................... 80

Kiến nghị ..................................................................................................................... 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 81

PHỤ LỤC ....................................................................................................................... a

v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BGBL : Brilliant Green Bile Salt

: Food and Agriculture Organization of the United FAO

Nations (Tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hợp

Quốc)

GC/MS : Gas Chromatography Mass Spectometry (sắc ký và

khối phổ)

: Greenhouse Gas (khí hiệu ứng nhà kính) GHG

KH : Khoa học

LB : Latose Broth

MCP : Methylcyclopropene

NA : Nutrient Agar

NB : Nutrient Broth

PCA : Plate count agar

PW : Pepton Water

TNHH : Trách nhiệm hữu hạn

XH : Xã hội

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Đặc điểm phân biệt các chủng bơ ................................................................... 12

Bảng 1.2: So sánh một số trái cây về mặt chất lượng (trong 100g phần ăn được) .......... 15

Bảng 2.1: Thành phần dung dịch của các ống nghiệm trong thí nghiệm Mc Farland..... 36

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát độ ẩm ................................................................................... 48

Bảng 3.2: Kết quả xác định hàm lượng tro ...................................................................... 49

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát thời gian chiết bằng dung môi n-hexan ............................... 51

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet trong dung môi metanol .................. 52

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet trong dung môi EtOAc ................... 53

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát tỉ lệ khối lượng chất chiết với thể tích dung môi ................ 55

n-hexan ............................................................................................................................. 55

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát tỉ lệ khối lượng chất chiết với thể tích dung môi ................ 56

metanol ............................................................................................................................. 56

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tỉ lệ khối lượng chất chiết với thể tích dung môi ................ 57

EtOAc .............................................................................................................................. 57

Bảng 3.9: TPHH của dịch chiết methanol hạt quả bơ ..................................................... 59

Bảng 3.10: Kết quả quả đo vòng kháng khuẩn trung bình đối với các chuẩn vi

khuẩn trong từng mẫu của dung dịch chiết từ hạt trái bơ ................................................ 64

Bảng 3.11: Kết quả đo vòng vô khuẩn trung bình đối với các chuẩn vi khuẩn khi

xử lý bằng dịch chiết hạt trái bơ ...................................................................................... 65

Bảng 3.12: Kết quả tính trung bình số lượng vi khuẩn hiếu khí có trong 1ml mẫu

nước thải (A) .................................................................................................................... 68

Bảng 3.12: kết quả sau 24h nuôi cấy và quan sát được hiện tượng ................................ 71

Bảng 3.13: Kết quả tính số lượng trung bình vi khuẩn hiếu khí trên các đĩa .................. 76

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Trình tự pha loãng ........................................................................................... 42

Hình 3.1: Mẫu sau khi sấy ............................................................................................... 47

Hình 3.2: Lắp ráp bộ chiết Soxhlet .................................................................................. 50

Hình 3.3: Chiết Soxhlet (bên trái) và lôi cuốn hơi nước để thu hồi dung môi (bên

phải) ................................................................................................................................. 50

Hình 3.4: Kết quả thu được sau khi chiết (bên trái) và loại bỏ dung môi (bên phải) ...... 52

Hình 3.5: Bao gói dụng cụ, môi trường chuẩn bị thao tác hấp ........................................ 61

Hình 3.6: Tác dụng kháng Salmonella của dịch chiết hạt trái bơ (bên phải sau khi

đổ dịch chiết vào lỗ thạch) ............................................................................................... 61

Hình 3.7: Tác dụng kháng Staphylococcus aureus của dịch chiết hạt trái bơ (bên

phải sau khi đổ dịch chiết vào lỗ thạch) .......................................................................... 62

Hình 3.8: Tác dụng kháng Pseudomonas của dịch chiết hạt trái bơ (bên phải sau

khi đổ dịch chiết vào lỗ thạch) ......................................................................................... 62

Hình 3.9: Tác dụng kháng E.Coli của dịch chiết hạt trái bơ (bên phải sau khi đổ

dịch chiết vào lỗ thạch) .................................................................................................... 62

Hình 3.10: Vòng vô khuẩn tạo ra trên các chủng thí nghiệm khi xử lý với dịch chiết

hạt trái bơ ......................................................................................................................... 63

Hình 3.11: Vi khuẩn hiếu khí mọc lên sau 24h nuôi cấy với các độ pha loãng 10-1,

10-2, 10-3 ........................................................................................................................... 68

Hình 3.12: Thử nghiệm xác định E.Coli bằng xét nghiệm sinh hóa ............................... 73

Hình 3.13: Khuẩn lạc mọc sau 24h nuôi cấy trên các môi trường khi xử lý với dịch

chiết 20% và 40% được hòa trộn cùng với nước thải ...................................................... 76

viii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Bố trí thí nghiệm tổng quát ............................................................................ 43

Sơ đồ 2.2: Bố trí xác định độ ẩm ..................................................................................... 44

Sơ đồ 2.3: Bố trí thí nghiệm chọn dung môi và thời gian tối ưu cho quá trình tách

chiết .................................................................................................................................. 45

Sơ đồ 2.4: Bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính kháng khuẩn có trong dịch chiết .......... 46

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Biểu đồ thể hiện khối lượng dịch chiết của từng dung môi chiết với

thời gian chiết khác nhau ................................................................................................. 54

Biểu đồ 3.2: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ khối lượng cắn và thể tích dung môi ....................... 58

Biểu đồ 3.3: Biểu đồ thể hiện hiệu suất phần trăm dịch chiết khi xử lý và môi

trường nuôi cấy ................................................................................................................ 78

ix

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Chăn nuôi đã và đang là xu thế của nền nông nghiệp nước nhà, một trang trại

chăn nuôi được xây dựng, tùy theo quy mô, sẽ xả ra môi trường một lượng chất thải

gây ô nhiễm môi trường xung quanh, nếu không có hướng xử lý nước thải chăn

nuôi này sẽ làm ô nhiễm môi trường ảnh hưởng đến sức khỏe con người và các

động thực vật khác. Đặt biệt là các loại virut gây bệnh như lở mòm long móng, dịch

tai xanh… Việc xử lý nước thải chăn nuôi nhằm giảm nồng độ các chất ô nhiễm

trong nước thải đến một nồng độ cho phép mới được xả vào nguồn tiếp nhận.

Ô nhiễm môi trường trong chăn nuôi đang là vấn nạn nhức nhối không chỉ ở

Việt Nam mà còn tồn tại ở nhiều nước trên thế giới. Phải xử lý chất thải của sản

xuất chăn nuôi. Đúng vậy, nhưng xử lý bằng những công cụ, phương pháp, kỹ

thuật, công nghệ, ….., thậm chí mẹo gì thì chưa có cơ quan nào hệ thống và hướng

dẫn đầy đủ cho người chăn nuôi. Nên trên thực tế, ô nhiễm do chăn nuôi vẫn đang

hiện hữu một cách thách thức.

Trong những năm qua ngành chăn nuôi đã phát triển và đạt kết quả đáng ghi

nhận, đáp ứng cơ bản nhu cầu thực phẩm trong nước ngày càng cao của xã hội.

Ngày nay, ngành chăn nuôi nước ta đang có những dịch chuyển nhanh chóng từ

chăn nuôi nông hộ sang chăn nuôi trang trại, công nghiệp; từ chăn nuôi nhỏ lẻ lên

chăn nuôi quy mô lớn. Đảng và Chính phủ quan tâm tới ngành chăn nuôi để cùng

với ngành trồng trọt, thủy sản đảm bảo an ninh lương thực, thức phẩm thông qua

những chủ trương, chính sách nhằm định hướng và tạo ra những cơ chế khuyến

khích để ngành chăn nuôi phát triển nhanh, mạnh và vững chắc. Tuy nhiên, mặt

chưa được của chăn nuôi đó là vấn đề ô nhiễm môi trường. Cộng đồng khoa học

trong và ngoài nước đã chỉ rõ gây ô nhiễm môi trường lớn nhất trong nông nghiệp ở

Việt Nam là từ trồng trọt và chăn nuôi. Theo báo cáo của Tổ chức Nông Lương Thế

giới (FAO), chất thải của gia súc toàn cầu tạo ra 65% lượng Nitơ oxit (N2O) trong

khí quyển. Đây là loại khí có khả năng hấp thụ năng lượng mặt trời cao gấp 296 lần

SVTH: Võ Thị Vi 1 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

so với khí CO2. Cùng với các loại khí khác như CO2, CH4,… gây nên hiệu ứng nhà

kính làm trái đất nóng lên.

Theo số liệu của Tổng cục thống kê, năm 2014 đàn lợn nước ta có khoảng

26.76 triệu con, đàn trâu bò khoảng 7.75 triệu con, đàn gia cầm khoảng 327.69 triệu

con. Trong đó chăn nuôi nông hộ hiện tại vẫn chiếm tỷ trọng khoảng 65-70% về số

lượng và sản lượng. Từ số đầu gia súc, gia cầm đó có quy đổi được lượng chất thải

rắn (phân chất độn chuồng, các loại thức ăn thừa hoặc rơi vãi) đàn gia súc, gia cầm

thải ra khoảng trên 76 triệu tấn, và khoảng trên 30 triệu khối chất thải lỏng (nước

tiểu, nước rửa chuồng, nước từ sân chơi, bãi vận động, bãi chăn). Phân của vật nuôi

chứa nhiều chất chứa nitơ, phốt pho, kẽm, đồng, chì, Asen, Niken(kim loại nặng)…

và các vi sinh vật gây hại khác không những gây ô nhiễm không khí mà còn làm ô

nhiễm môi trường đất, làm rối loạn độ phì đất, mặt nước và còn cả nguồn nước

ngầm. Đi kèm theo đó là gần 14.5 triệu tấn thức ăn chăn nuôi được sản xuất từ 203

nhà máy. Quá trình sản xuất thức ăn chăn nuôi từ các nhà máy đã thải ra môi trường

lượng rất lớn chất khí gây hiệu ứng nhà khí kính (GHG) và các chất thải khác gây ô

nhiễm môi trường.

Ngoài ra, ô nhiễm môi trường còn có thể xảy ra trong quá trình giết mổ, sơ

chế sản phẩm động vật; Trong các cơ sở sản xuất thuốc thú y, chẩn đoán xét

nghiệm bệnh động vật; Trong quá trình xử lý các ổ dịch và xử lý xác động vật bị

dịch bệnh…là không nhỏ. Quá trình sinh sống của gia súc, gia cầm ngoài thải ra

chất thải như nói trên thì còn bài thải các loại khí hình thành từ quá trình hô hấp của

vật nuôi và thải ra các loại mầm bệnh, ký sinh trùng, các vi sinh vật có thể gây hại

trực tiếp hoặc gián tiếp đến sức khỏe con người và môi trường sinh thái như: E.

Coli, Salmonella, Streptococcus fecalis, Enterobacteriae,...

Sức khỏe con người, hệ vi khuẩn ở ruột và bệnh tật là những vấn đề đang được

quan tâm đến. Các nghiên cứu gần đây cũng đã chỉ rõ vi khuẩn chính là thủ phạm

thường xuyên gây ngộ độc thực phẩm. Trong số các loại vi khuẩn đáng kể đến là vi

khuẩn gây bệnh đường ruột “Escherichia” Vi khuẩn này hiện diện một cách tự

SVTH: Võ Thị Vi 2 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

nhiên trong ruột của chúng ta cũng như của động vật. Có cả hằng trăm chủng E.coli

có thể được tìm thấy trong ruột và trong phân của các loài gia súc, đặc biệt là trong

phân bò... “Staphylococcus aureus” được tìm thấy nhiều trong nước thải từ các phân

của các loại gia súc, gia cầm, vi khuẩn có thể nhiễm vào thức ăn lúc chúng được chế

biến, hoặc lây truyền từ người này sang người khác lúc họ tiếp xúc với nhau.

Staphylococcus aureus gây bệnh bằng độc tố. Đau bụng, tiêu chảy và nôn mửa dữ

dội là những biểu hiện chính.

Tóm lại, chăn nuôi phát triển có thể cũng sẽ tạo ra những rủi ro cho môi trường

sinh thái và là một trong những nguyên nhân làm trái đất nóng lên nếu vấn đề môi

trường chăn nuôi không được quản lý hiệu quả. Tuy nhiên, trong điều kiện kinh tế

xã hội ở nước ta hiện nay phát triển chăn nuôi sẽ vẫn là sinh kế quan trọng của

nhiều triệu nông dân, cung cấp thực phẩm bổ dưỡng cho con người, tạo việc làm,

tăng thu nhập và cải thiện điều kiện sống cho hầu hết người lao động. Nếu các chất

thải chăn nuôi đặc biệt phân chuồng không được xử lý hiệu quả sẽ là một trong

những nguồn gây ô nhiễm lớn cho môi trường, ảnh hưởng xấu đến đời sống, sức

khoẻ của cộng đồng dân cư trước mắt cũng như lâu dài.

Trong các kỹ thuật xử lý chất thải chăn nuôi hiện mới chỉ thường được nhắc

đến công nghệ Biogas nhưng thực tế thì không phải chỉ có công nghệ khí sinh học

là tối ưu, là thay thế được tất cả các phương pháp khác, giải quyết triệt để vấn đề ô

nhiễm môi trường do chăn nuôi gây ra, còn chưa kể đến giá thành đắt, công nghệ

nhập từ nhiều nguồn khác nhau hiện còn chưa thống nhất, đòi hỏi người sử dụng

phải có hiểu biết kỹ thuật, ….Tuy nhiên, một vài nghiên cứu gần đây đã thông báo

rằng nước từ hệ thống biogas vẫn chứa nhiều vi khuẩn, ấu trùng giun sán và các kim

loại nặng.

Nhưng nếu ngành chăn nuôi tập trung hơn vào phát huy nội lực, hoàn thiện và

nâng cao nhiều giải pháp truyền thống để sử dụng hiệu quả hơn, phát huy tối đa

kinh nghiệm, kế thừa kết quả nghiên cứu của nhiều ngành khác,… thì cũng đã có

khá nhiều phương pháp hữu hiệu sử dụng được ngay cho công tác giảm thiểu ô

SVTH: Võ Thị Vi 3 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

nhiễm môi trường do chăn nuôi gây ra mà giá thành lại rẻ, dễ sử dụng. Nhưng vấn

đề đặt ra là phát triển chăn nuôi nhưng phải bền vững để hạn chế tối đa mức độ gây

ô nhiễm và bảo vệ được môi trường sinh thái.

Hơn thế nửa, hiện nay việc lạm dụng các chất kháng sinh quá nhiều vào trong

việc xử lý. Mặc dù việc làm kiềm hãm hay tiêu diệt các chủng vi khuẩn có hại là rất

quan trọng tuy nhiên vẫn còn phải xem xét đến hậu quả và những ảnh hưởng bất lợi

đối với các thế hệ tương lai. Để đem lại hiệu quả cao, các giải pháp về chất kháng

sinh cần có sự thay đổi về liều lượng và đặc tính của kháng sinh đó.

Vậy câu hỏi đặt ra là “Liệu có chất nào có thể khắc phục được tình trạng ô

nhiễm nước thải chăn nuôi trên, mà lại có sẵn, đồng thời còn tận dụng được phế

phẩm hay không?” hay “Trong tự nhiên có chiết suất nào từ thực vật có thể sử dụng

như một chất kháng sinh thay thế cho các hợp chất kháng sinh hóa học đắt tiền mà

còn ảnh hưởng đến sức khỏe con người hay không?”

Nhằm giải quyết những mối lo ngại trên, đề tài “Nghiên cứu khả năng kháng

khuẩn từ hạt trái bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi” sẽ tập trung

nghiên cứu chiết suất chất có khả năng kháng khuẩn từ loại trái này, từ đó ứng dụng

trong quy trình xử lý nước thải chăn nuôi nhằm khắc phục được các điểm yếu của

các phương pháp xử lý trước kia, vừa đảm bảo môi trường sinh thái lại vừa xử lý

hiệu quả các vi sinh vật gây mầm bệnh có trong nước thải chăn nuôi. Việc nghiên

cứu đề tài này mang ý nghĩa hết sức quan trọng bởi đây là vấn đề tận dụng phế

phẩm từ nguồn thực phẩm mà chúng ta đều tiêu thụ hằng ngày. Kỳ vọng nghiên cứu

này sẽ đạt được kết quả như mong muốn, thì loại phế phẩm này hứa hẹn sẽ là mang

lại sự thành công trong công tác nghiên cứu chiết suất chất có khả năng kháng

khuẩn và ứng dụng để xử lý nước thải chăn nuôi.

2 Tính cấp thiết của đề tài

Đất nước Việt Nam ta với nguồn tài nguyên thiên nhiên dồi dào, phong phú là

một thuận lợi trong việc nghiên cứu và điều chế ra những loại thuốc có nguồn gốc

từ tự nhiên để phục vụ cho sức khỏe con người cũng như chống lại sự xâm nhập của

SVTH: Võ Thị Vi 4 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

các côn trùng gây hại mùa màn. Với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, nước ta

được xem là mảnh đất màu mỡ cho sự phát triển của các chủng loại hoa màu, trong

đó có không ít loại cây được sử dụng với nhiều mục đích. Trong số vô vàn loài thực

vật ở Việt Nam, Bơ là loại trái cây có giá trị sử dụng cao, là loại thực phẩm mang

lại nguồn dinh dưỡng cao, không chỉ thế, bơ còn được sử dụng như một vị thuốc bổ

dưỡng, chữa được nhiều loại bệnh, giúp chị em phụ nữ trong việc chăm sóc sức

khỏe và làm đẹp nhờ tinh dầu bơ, hay các vitamin khác có trong thịt bơ. Tuy nhiên,

việc nghiên cứu chỉ mới sử dụng phần thịt trái bơ, trong khi đó, phần hạt chiếm thể

tích lớn nhất trong trái bơ, nhưng lại ít được quan tâm, chú ý đến thành phần hóa

học, cũng như hoạt tính sinh học của nó. Trong hạt trái bơ có nhiều các axit amin

và có một số chất có khả năng ngăn cản một số tác nhân gây hại (vi khuẩn, vi

rus, côn trùng, ). Đặc biệt trong hạt quả bơ có còn chứa các hợp chất của

Flavonoid ( thuộc nhóm chất của phenol phức tạp). Đây là nhóm chất oxy hóa

chậm. Ngoài ra, Các flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn cao do chúng có khả

năng tạo phức với các protein ngoại bào và thành tế bào của vi khuẩn.

Trên thị trường hiện nay, đã có các dòng chế phẩm chứa các chủng vi sinh vật

đặc hiệu chuyên xử lý mùi hôi hầm cầu, hầm tự hoại, nhà vệ sinh , cải thiện hệ

thống xử lý nước thải, rác thải…; bổ sung hàm lượng vi sinh vật hữu ích vào nước

thải, nhằm cạnh tranh dinh dưỡng và ức chế các vi khuẩn gây bệnh. Tuy nhiên,

những chế phẩm này bán với giá rất đắt, muốn xử lý triệt để thì phải tốn chi phí khá

cao, trong khi đó, việc duy trì bổ sung hàm lượng chất chỉ mang tính chất tạm thời.

Đáng quan tâm và quan trọng hơn cả chính là sức khỏe của những con người

đang hằng ngày tiếp xúc với loại nước thải có chứa nhiều thành phần vi khuẩn gây

bệnh, những người làm công tác cấp thoát nước liên quan nhiều nhất và trực tiếp

đến đường bệnh qua nước và có trách nhiệm diệt trùng gây bệnh trên đường truyền

bệnh này.

Chính vì thế mà đề tài này cần phải được thực hiện, với mong muốn phát huy

hết khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ loại hạt bỏ đi này, và tìm ra loại chất ức

SVTH: Võ Thị Vi 5 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

chế được sự sinh trưởng của vi khuẩn, làm giảm số lượng vi khuẩn hiếu khí và yếm

khí trong nước thải trực tiếp từ các trang trại chăn nuôi. Đồng thời giảm chi phí xử

lý cho các khu trang trại hay các hộ gia đình có quy mô chăn nuôi lớn.

3 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Mục tiêu ngắn hạn: Xây dựng quy trình công nghệ chiết suất chất có khả

năng kháng khuẩn từ hạt trái bơ.

Mục tiêu dài hạn: Sử dụng dịch chiết và ứng dụng vào trong xử lý nước thải

chăn nuôi

4 Nội dung nghiên cứu

− Nghiên cứu, khảo sát nguyên liệu hạt trái bơ

− Nghiên cứu lựa chọn loại hóa chất trung gian nhằm gia tăng hiệu suất thu hồi

− Nghiên cứu công nghệ tách chất có hoạt tính sinh học cao và khảo sát các chỉ

tiêu hóa lý.

− Nghiên cứu ứng dụng chất chiết suất vào trong xử lý nước thải chăn nuôi.

− Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết đối với một số vi khuẩn:

E.coli, Salmonnella, Staphylococcus aureus, Pseudomonas có trong nước

thải chăn nuôi.

− Môi trường nghiên cứu dịch chiết là nước thải trực tiếp của chuồng nuôi và

sau hầm biogas. Nước thải chuồng nuôi và nước sau hầm biogas được lấy từ

Trang Trại Chăn Nuôi Heo Phước Long (xã Nguyễn Văn Cội, huyện Củ Chi,

Tp Hồ Chí Minh).

5 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

5.1 Đối tượng nghiên cứu

− Nghiên cứu trên đối tượng là hạt trái bơ được chiết suất.

− Môi trường nghiên cứu dịch chiết là nước thải trực tiếp của chuồng nuôi và

sau hầm biogas. Nước thải chuồng nuôi và nước sau hầm biogas được lấy từ

SVTH: Võ Thị Vi 6 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Trang Trại Chăn Nuôi Heo Phước Long (xã Nguyễn Văn Cội, huyện Củ Chi,

Tp Hồ Chí Minh).

− Sử dụng các chủng vi khuẩn do phòng thí nghiệm bộ môn sinh học ĐH Công

Nghệ Tp HCM cung cấp.

5.2 Phạm vi nghiên cứu

− Xác định thành phần hóa học có trong dịch chiết hạt trái bơ

− Thử nghiệm hoạt tính sinh học của dịch chiết trong hạt trái bơ và khảo sát

khả năng kháng khuẩn đối với một số vi sinh vật có trong nước thải chăn

nuôi.

− Sử dụng các chủng vi khuẩn: E.Coli, Samolnelle, Staphylococcus nhằm thử

hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết đối với những loại vi khuẩn trên.

6 Phương pháp nghiên cứu

6.1 Phương pháp luận

Nước thải chăn nuôi chứa nhiều vi khuẩn và ấu trùng gây bệnh. Nếu như

không được xử lý một cách hợp lý thì sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe con người và làm

ô nhiễm môi trường một cách rất nặng nề. Các phương pháp xử lý hóa học hay dùng

các chế phẩm có thành phần hóa học cũng không thể giải quyết triệt để vấn đề ô

nhiễm do nước thải chăn nuôi gây ra cho môi trường cách bấp hiện nay, một phần

phải tính toán về kinh phí, phần khác là ảnh hưởng trực tiếp đến những con người

đang trực tiếp phải tiếp xúc hàng ngày với những loại hóa chất có nguy cơ về tình

trạng sức khỏe ngày càng suy giảm.

SVTH: Võ Thị Vi 7 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Đề tài dựa trên phương pháp thu thập thông tin khoa học trên cơ sở nghiên

cứu các thông tin. Trên cơ sở đó, đề tài lập ra khung nghiên cứu cho phương pháp

Tình hình ô nhiễm nước thải chăn nuôi hiện nay

luận cụ thể như sau:

Thu thập dữ liệu

Các biện pháp xử lý Tìm phế phẩm môi trường Xử lý vi khuẩn có hại trong nước thải chăn nuôi: E.Coli, Salmonelle, Staphyloccocus, Pseudomonas

Xử lý bằng chất có sẵn trong tự nhiên: Hạt quả bơ

Phân tích số liệu lựa chọn phương pháp xử lý

Thu gom nguyên liệu: Hạt quả bơ

Thành phần hóa học: axit amin, hợp chất Flavonoid (Phenol phức tạp) cùng một số ester của acid béo

Hoạt tính kháng khuẩn: có khả năng kháng khuẩn nhờ những nhóm chất của Phenol phức tạp tạo phức với protein ngoại bào và thành tế bào của vi khuẩn

Xử lý mẫu thành dạng bột

Xử lý nguyên liệu

Phương pháp chiết Soxhlet

Chiết mẫu dưới dạng dung dịch (thí nghiệm trên mẫu nước thải)

Xác định

Độ ẩm

Sơ đồ 2.2

Hàm lượng tro

Khảo sát

Thời gian chiết tối ưu (với 3 loại dung môi: n-hexan, metanol, etyl axetat

Mẫu sau xử lý (dạng bột)

Mẫu sau xử lý (dạng dung dịch)

Sơ đồ 2.3

Thể tích chiết tối ưu đối với 3 loại dung môi

Thành phần hóa học có trong dịch chiết

Phân tích

Mẫu tối ưu

Khả năng kháng khuẩn với 4 chủng: E.Coli, Salmonelle, Staphyloccocus, Pseudomonas

Sơ đồ 2.4

Thử nghiệm trên mẫu nước thải chăn nuôi với dung dịch chiết 20% và 40%

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch chiết và hiệu suất xử VKHK trong nước thải chăn nuôi

6.2 Phương pháp thực nghiệm

SVTH: Võ Thị Vi 8 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

6.2.1 Phương pháp lấy mẫu: Thu hái và xử lý mẫu

6.2.2 Phương pháp phân tích trọng lượng

Xác định độ ẩm trong hạt bơ: Phương pháp sấy khô

Xác định hàm lượng tro: Phương pháp nung

6.2.3 Phương pháp tách chất

Chiết trong các dung môi có độ phân cực khác nhau: n-hexan, etyl axetat,

metanol bằng phương pháp chiết soxhlet.

6.2.4 Phương pháp khảo sát

− Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi và thời gian chiết.

− Khảo sát hiệu quả dịch chiết khi tái sử dụng.

− Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ khối lượng chất chiết với thể tích dung môi.

6.2.5 Phương pháp vật lý

− Xác định thành phần hóa học có trong dịch chiết bằng phương pháp GC –

MS (sắc ký ghép phổ)

6.2.6 Phương pháp sinh học

Dùng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kirby – Bauer để xác định khả năng

kháng khuẩn của dịch chiết.

6.2.7 Phương pháp kiểm tra thống kê sinh học

Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lý số liêụ sinh học. Xác định sai số,

phương sai mẫu,…

7 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của để tài

SVTH: Võ Thị Vi 9 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

7.1 Ý nghĩa khoa học

− Cung cấp những thông tin khoa học về quy trình chiết tách, xác định thành

phần hóa học trong hạt bơ ở Đăk Nông.

− Cung cấp những thông tin, tư liệu làm cơ sở cho việc nghiên cứu sau này.

7.2 Ý nghĩa thực tiễn

− Nhằm giúp cho việc ứng dụng hạt bơ một cách khoa học. Gắn liền với vấn đề

bảo vệ môi trường, tận dụng nguồn phế phẩm.

− Ứng dụng được trong lĩnh vực xử lý nước thải chăn nuôi, kháng khuẩn đối

với một số vi khuẩn có trong loại nước thải này.

− Mang ý nghĩa đối với sức khỏe con người, những người hằng ngày đang tiếp

xúc với nguồn thải có chứa nhiều vi khuẩn mang mầm bệnh.

8 Bố cục luận văn

Nội dung của luận văn chia làm 4 chương:

Chương 1 – Tổng quan

Chương 2 – Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu

Chương 3 – Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 4 – Kết luận và kiến nghị

SVTH: Võ Thị Vi 10 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về cây bơ

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại thực vật

1.1.1.1 Nguồn gốc

Bơ (Avocado) có nguồn gốc từ Mexico và Trung Mỹ, được trồng từ Rio

Grande trung tâm Peru trước người châu Âu. Sau đó, nó được đưa vào Jamaica và

Tây Ban Nha vào thế kỷ XVII đến Califonia vào thế kỷ XIX, sau đó cây bơ trồng

không chỉ ở Tây Ấn mà còn lan rộng sang các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới

với điều kiện môi trường thích hợp.

Tại Việt Nam cây bơ xuất hiện đầu tiên tại tỉnh Lâm Đồng do người

Pháp đưa vào từ những năm 1940, trồng ở huyện Di Linh (Lâm Đồng) cho kết quả

sinh trưởng tốt. Đến năm 1958, phái đoàn viện trợ Hoa Kỳ đưa vào khoảng 60.000

hạt bơ và trồng ở ba trung tâm thực nghiệm là Nông Lâm súc miền Đông Bảo Lộc

(Lâm Đồng), Hưng Lộc (Đồng Nai), và Eakmat (Đắk Lắk). Từ đó cây bơ được lan

rộng ra ở các tỉnh khác.

1.1.1.2 Phân loại

Cây bơ là cây hai lá mầm, thuộc họ Laraceae (Long não), có tên khoa

học là Persea americana. Tùy theo từng nước mà nó có tên gọi khác nhau, Anh gọi

là Avocado, Pháp gọi là Avocatier, Indonesia gọi là Adpukat, Việt Nam gọi là

bơ,..Cây bơ được chia thành 3 nhóm chính là: Mehico, Guatemala và Antilles. Đặc

tính của chúng như sau:

Chủng Mexico

Là cây á nhiệt đới, cây nhỏ, có tán hẹp, lá màu xanh nhạt, khi vò nát lá

non có mùi hôi. Quả nhỏ (khoảng 200 – 250g), hình thuôn dài, vỏ mỏng chuyển

màu xanh bóng hoặc đỏ thẩm khi chín. Hạt tương đối lớn, lỏng, lắc kêu. Thịt quả

màu vàng kem hay màu vàng đậm, hàm lượng chất béo cao (15 – 20%).

Chủng Guatemala

SVTH: Võ Thị Vi 11 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Là cây cận nhiệt đới, cây có tán rộng nhiều cành rậm rạp, màu xanh

thẫm. Trọng lượng quả lớn (khoảng 250 – 800g), hình trứng, vỏ quả dày, khi chưa

chín có màu xanh đậm, bóng và chuyển sang màu đỏ thẫm khi chín, hạt nhỏ lắc

không kêu, thịt quả màu vàng pha xanh lá cây (viền ngoài gần vỏ). Hàm lượng chất

béo là trung bình từ 12 – 15%.

Chủng Antilles

Là cây nhiệt đới, cây có tán lá rộng và to, lá màu xanh nhạt. Quả lớn

(trọng lượng có thể lên tới 900g/quả), có nhiều hình dạng khác nhau, vỏ quả nhẵn,

dày hơn chủng Mehico nhưng mỏng hơn chủng Guatemala, khi chín có màu xanh

cũng có khi là màu tím. Hạt to, lỏng, lắc kêu, thịt quả có màu vàng kem, hàm lượng

chất béo thấp (7 -8%), nhiều nước, nhiều xơ.

Dầu

Khoảng

Ưu điểm

Chủng bơ Màu lá Cở trái Vỏ trái

trong

Hạt

Chụi rét

rỗng hạt

chung

cơm

Lỏng

Chịu rét

Mỏng

Mùi hôi

Mexico

Nhỏ

Cao

To

không sát

Tốt

chất

0.8mm

Anique

thịt

lượng tốt

Dày từ

Dính

Chịu rét

Không

Nhỏ lớn

Trung

1.5-

Guatemala

Nhỏ

chặt vào

Khá tốt

khá tốt

hôi

đều có

bình

1.8mm

cơm

Trung

Lỏng, khi

Chịu

Không

Rất lớn

nóng

Antilles

bình 0.8-

Thấp

To

chín lắc

Yếu

hôi

và nhỏ

1.5mm

kêu

chịu mặn

Bảng 1.1 Đặc điểm phân biệt các chủng bơ

(nguồn: Viện nghiên cứu Ea Kamat)

Hiện nay trên thị trường đã xuất hiện một giống bơ có tên Booth mới,

nguồn gốc từ Mỹ được nghiện cứu và tiến hành khảo nghiệm từ Cty TNHH Tư vấn

đầu tư phát triển nông lâm nghiệp EaKmát (Viện KHKTNLN Tây Nguyên).

SVTH: Võ Thị Vi 12 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

1.1.2 Đặc tính sinh học

1.1.2.1 Nhiệt độ

Như đã được trình bày, cây bơ có nguồn gốc ở các xứ nhiệt đới Trung

Mỹ, phân bố ở độ cao dưới 1000 – 2700 m. Ở đây các giống thuộc chủng

Guatemala, Mexico có thể chịu được nhiệt độ từ -200 - -600C, các giống Antilles chỉ

chịu được nhiệt độ khoảng 00C.

Tại Đà Lạt, nhiệt độ tuyệt đối thấp rất hiếm khi đạt được mức 0 – 100C,

nên các giống Antilles kém chịu rét nhất cũng chịu được, do đó vấn đề nhiệt độ thấp

đối với cây bơ không quan trọng lắm.

1.1.2.2 Độ ẩm

Lượng mưa tốt thích hợp cho cả năm là 1000 – 1500 mm. Khi bơ ra hoa,

nếu gặp trời mưa dầm, độ ẩm không khí cao, hoa sẽ rụng nhiều. Do đó, cây bơ cần

có một mùa khô mát để ra hoa đậu quả tốt. Mưa nhiều vào mùa quả chín cũng làm

giảm chất lượng quả.

1.1.2.3 Gió

Cây bơ có gỗ dòn, chống gió yếu nên vấn đề trồng cây che chắn gió có

tác dụng hạn chế đổ gãy đồng thời giảm tốc độ bốc thoát hơi nước vào mùa ra quả

(mùa khô) để cây không bị rụng trái. Gió còn làm trái cọ sát lẫn nhau, cọ sát với

lá, cành gây ra bệnh sinh lý làm giảm giá trị trái bơ.

1.1.2.4 Đất trồng

Có thể trồng bơ trên nhiều loại đất khác nhau: đất sét pha cát, đất pha sét,

đất thịt nặng. Nhưng vấn đề đặc biệt cần lưu ý là đất phải thông thoáng, dễ thoát

nước, giàu chất hữu cơ. Lớp đất thông thoáng thoát nước phải sâu ít nhất là 90 cm.

Đất có mạch nước ngầm thấp sâu ít nhất là 2m, vì trong thời kỳ đầu sinh trưởng,

rễ bơ ăn cạn, cây vẫn phát triển tốt nhưng càng về sau, bộ rễ ăn càng sâu, gặp

đất úng thủy, rễ phát sinh nấm Phytophthora làm chết cây.

SVTH: Võ Thị Vi 13 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

1.1.3 Đặc điểm thực vật

Cây to được xếp vào loại cây xanh lá quanh năm, nhưng vài giống có tính

rụng lá một phần hoặc rụng hết khi cây trổ hoa, những đặc tính này chỉ có tính cách

tạm thời vì sau đó chồi non lại phát sinh ngay. Trên đa số giống lá già chỉ rụng dần

trong một thời gian khá dài vào mùa xuân nên cây lúc nào cũng xanh lá.

Lá lúc còn non thường có lông mịn, màu hơi đỏ hoặc màu đồng nhưng đến

khi trưởng thành, lá có màu xanh láng và dài. Chiều dài lá rất thay đổi từ hình thuẫn

đến hình dao. Chóp lá thường bén nhọn nhưng có vài giống chóp lá hơi tròn. Mùi vị

của lá thường chỉ đặc trưng cho loài Persea drymifolia Cham.et Schect. Khi vò ngửi

có mùi hôi.

Hoa có màu xanh nhạt, hoặc xanh vàng, thường phát sinh thành chùm trên

đoạn cuối cánh quả. Khi hoa nở, hoa có đường kính 12-14mm. Hoa có 12 nhị,

nhưng chỉ có 9 nhị hoạt động, mỗi nhị mang 4 túi phấn. Hoa chỉ có một nhụy và

một tâm bì chứa một tiểu noãn. Đa số các bộ phận của hoa có lông mịn.

Quả bơ có trọng lượng và hình dáng khác nhau tùy giống: tròn, trứng, quả lê,

thuỗn… Trọng lượng thay đổi từ 60-150g, có giống quả rất to nặng đến 1,5 kg. Trên

thương trường những giống quả bé hoặc quá lớn đều ít được ưa chuộng.

Quả có ba phần rõ rệt: vỏ, thịt và hạt. Bề dày và cấu tạo của vỏ thay đổi tùy

giống. Quả của những giống thuộc chủng Mexico thường có vỏ mỏng và láng,

chủng Guatemala và Antilles thường có vỏ dày hơn. Có giống quả vỏ sần sùi, có

giống vỏ láng và đôi khi có sớ gỗ. Màu sắc của vỏ quả biến động từ màu xanh sáng,

màu xanh nhạt, xanh vàng, hoặc tím đến tím sẫm khi quả chín.

Thịt quả thường có màu vàng kem, vàng bơ, hoặc màu vàng sáng, có giống

cho thịt quả có màu vàng xanh ở sát phần vỏ quả. Thịt quả có hàm lượng dầu béo

rất cao so với các loại quả khác.

Hạt được 2 lớp vỏ lụa bao bọc, gồm có hai tử diệp hình bán cầu. Giữa hai tử

diệp có phôi hạt nằm về phía cuống quả, và khi hạt nẩy mầm, cây mầm sẽ mọc

SVTH: Võ Thị Vi 14 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

thẳng từ dưới lên theo trục thẳng đứng của hạt. Mặt ngoài tử diệp (nội nhũ) trơn

láng hoặc sần sùi tùy theo giống và hình dạng cũng biến động khá nhiều.

Tỷ lệ giữa vỏ, thịt và hạt của quả cũng tùy thuộc nhiều vào giống; chẳng hạn

như ở giống Lula, hạt chiếm đến 25% trọng lượng quả.

1.1.4 Giá trị dinh dưỡng

Cây bơ là cây ăn quả có hàm lượng dầu và protêin cao, 100gr bơ cung cấp từ

150 – 300 calo, nó tạo ra một nguồn thức ăn dinh dưỡng quan trọng và là một trong

những loại trái cây bổ dưỡng nhất trên thế giới. Trái bơ chứa hơn 14 loại vitamin và

khoáng chất bao gồm canxi, sắt, đồng, magiê, phôtpho, kali, natri, kẽm, mangan và

selen. Ngoài ra hàm lượng lipid trong trái bơ rất cao, ở dưới dạng nhũ dầu nên rất

dễ tiêu hóa, cơ thể có thể hấp thu đến 92.8%. Các kết quả nghiên cứu ngày nay đã

khẳng định: trái bơ không những là nguồn cung cấp năng lượng và vitamin mà còn

cung cấp cho con người những lợi ích chức năng sinh lí đặc biệt có lợi cho sức

khỏe.

Thành phần dinh dưỡng của trái bơ cao hơn nhiều loại cây khác, nhất là về

mặt calo, protein, các chất muối khoáng; bơ là thực phẩm lý tưởng cho người bị

bệnh

tiểu đường. Hàm lượng các chất dầu thực vật trong quả bơ rất cao (3-30%) và cơ thể

con người có thể hấp thụ đến 92.8%.

Bảng 1.2 : So sánh một số trái cây về mặt chất lượng (trong 100g phần ăn được)

Nước Protein Lipid Đường VitB1 VitC Phospho Cali Loại Calo (g) (mg) (mg) (mg) (mg) trái (g) (g) (g)

Bơ 102 79 1.1 6.1 13.2 0.05 8 38 12

Xoài 70 79.9 0.9 0.1 18.5 0.01 13 4

Đu 45 87.1 0.5 0.1 11.8 00.3 73 24 đủ

Cam 40 86.6 0.8 0.2 9.9 0.07 43 23 21

SVTH: Võ Thị Vi 15 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

(nguồn: Website “dhungcafe.Wordpress.com”)

1.2 Thành phần hóa học và các công dụng của hạt quả bơ

Một số nghiên cứu cho thấy, axit amin của hạt quả bơ có đến 70% ở trong

hạt. Cùng với đó là hạt bơ còn chứa các chất xơ hòa tan nhiều hơn bất kỳ thực phẩm

nào khác, ngoài ra còn có các hợp chất của Flavonoid (hợp chất thuộc nhóm Phenol

phức tạp).

Các chất Flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy

hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động khác thường.

Các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất thường là các gốc tự do như: OH-

, ROO- .

Flavonoid còn có tác dụng chống độc và tác dụng chống viêm nhiễm hay

kháng khuẩn của Flavonoid đã được nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới

chứng minh.

Về tác dụng kháng sinh, một số tác giả nghiên cứu tác dụng của 24

anthocyamin, leucoanthocyamin và axit Phenolic lên vi khuẩn Salmonella và thấy

có tác dụng kìm hãm rõ rệt. Hầu hết các chất này có khả năng kìm hãm sự hô hấp

hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucoza.

Các nghiên cứu về cơ chế tác dụng kháng sinh của Flavonoid còn rất ít và có

thể theo một giả thiết sau:

Flavonoid ức chế transpeptidaza làm cho mucopeptit – yếu tố đảm bảo cho

hình thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được.

Gắn lên màng sinh nguyên chất của vi khuẩn, làm thay đổi làm thay đổi tính

thẩm thấu chọn lọc của màng sinh nguyên chất. Vì vậy làm cho một số chất

cần thiết cho đời sống vi khuẩn như nucleotit, pyrimidin, purin lọt qua màng

sinh nguyên chất ra ngoài.

Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn theo hai kiểu: Phong

tỏa mạch peptit của vi khuẩn bằng cách phong tỏa transferaza chuyển axit

SVTH: Võ Thị Vi 16 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

amin từ ARN vào mạch không kéo dài thêm được hoặc tạo ra protein bất

thường không có tác dụng đối với đời sống của vi khuẩn, làm chúng không

sử dụng được.

Ức chế tổng hợp axit nucleic

Flavonoid có thể tác dụng vào AND khuôn, ức chế tổng hợp ARN của vi

khuẩn.

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước trên đối tượng là quả bơ

1.3.1 Các nghiên cứu trong nước

Tình hình nghiên cứu khoa học về hạt quả bơ trong nước vẫn còn là một đề

tài khá mới mẻ, chưa được khai thác nhiều. Chỉ nghiên cứu theo hướng sử dụng hạt

quả bơ để chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian chưa có hệ thống.

Không có công trình nghiên cứu khoa học về hạt quả bơ mang tính ứng dụng

cao được công bố.

Sau đây là một số công trình đã được công bố nghiên cứu trên quả bơ:

1. Nghiên cứu thuộc Bộ Công Thương và Viện Công Nghiệp Thực Phẩm “

Nghiên cứu công nghệ sản xuất dầu béo và bột bơ loại béo từ trái bơ

(Avocado)”, chủ nhiệm đề tài Võ Tấn Hậu (2009). Đề tài tập trung xây dựng

quy trình công nghệ sản xuất dầu trái bơ đạt tiêu chuẩn sử dụng trong thực

phẩm, mỹ phẩm và bột trái bơ loại béo có hàm lượng chất xơ cao, tận dụng

bã bơ sau khi lấy tinh dầu để chế biến bột trái bơ loại béo này làm nguyên

liệu đầu vào trong quy trình sản xuất bột dinh dưỡng giàu chất xơ.

2. Công trình nghiên cứu “ Ảnh hưởng của 1 – MCP xử lý sau thu hoạch đến

chất lượng và tốn thất trong bảo quản quả bơ”, Nguyễn Minh Nam và

cộng sự (2012). Đã tiến hành xác định chất lượng bơ nguyên liệu ban đầu với

độ cứng 35.50kg/cm2, hàm lượng đường tổng 7.20%, axit tổng số 0.05%,

hàm lượng vitamin C :68 mg%. Xông bơ với chế phẩm 1 – MCP ở các nồng

độ: 300ppm, 400ppm, 500ppm, 600ppm, 700ppm trong các khoảng thời gian

12h, 15h, 18h, 21h, 24h. Sau đó bơ được bảo quản ở nhiệt độ thường (25 –

SVTH: Võ Thị Vi 17 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

300C). Kết quả nghiên cứu cho thấy bơ xông chế phẩm 1- MCP ở nồng độ

500ppm trong 12h, có chất lượng tốt hơn so với các mẫu còn lại.

3. Công trình nghiên cứu “ Sử dụng màng Chitosan để bảo quản bơ”, Vũ

Như Ngọc (2007). Kết quả cho thấy khi bảo quản bơ bằng Chitosan 2%

mang lại kết quả tốt hơn các điều kiện khác.

1.3.2 Các nghiên cứu trên thế giới

Nhiều đề tài được thực hiện qua đối tượng nghiên cứu từ trái bơ, tận dụng

nguồn dinh dưỡng của trái bơ mà đặc biệt thành phần chủ yếu chứa nhiều protein,

carbohydrat và lippit. Cho nên đa số các nghiên cứu ở nước ngoài đều dựa trên các

phương pháp từ các loại hạt có dầu nhằm tinh chế ra các sản phẩm có giá trị dinh

dưỡng cao.

Tương tự như các loại hạt có dầu, dầu trái bơ cũng được tách bằng

phương pháp ép bột trái bơ khô rồi trích ly tiếp theo bằng dung môi hữu cơ. Dầu

thô thu được sử dụng chủ yếu trong lĩnh vực mỹ phẩm và dùng chế tạo avocado

butter (bơ trái). Cùng với sự phát triển kỹ thuật mới trong khai thác dầu thực vật, kỹ

thuật trích bằng nước cũng được nghiên cứu áp dụng khai thác dầu từ trái bơ.

Sau đây là một số công trình tiêu biểu:

1. Khởi đầu là nghiên cứu của Phó Giáo Sư người Mỹ Ông Buenrostro và cộng

sự sử dụng enzyme trích ly dầu vào năm 1986. Bằng phương pháp tối ưu hóa

cổ điển, các tác giả đã xác định được các thông số tối ưu của quy trình trích

dầu khi xử lý purê trái bơ với enzyme α-amylase: tỷ lệ enzyme/cơ chất = 1%,

tỷ lệ nước/cơ chất = 5lần, nhiệt độ quá trình T = 650C trong thời gian 2 giờ

và hiệu suất thu hồi dầu đạt 70% khi ly tâm dung dịch sau xử lý enzyme

19.680 vòng/phút.

2. Năm 1987, Werman và cộng sự đã khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và

nồng độ muối NaCl trong trường hợp ly tâm cố định tại 9 600 vòng/phút. Kết

quả khảo sát cho thấy các điều kiện phân tách tối ưu ở nhiệt độ T = 750C, pH

= 5.5 và NaCl = 5%.

SVTH: Võ Thị Vi 18 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

3. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nước thêm, pH và số vòng ly tâm đến hiệu

suất thu hồi dầu từ trái bơ cũng được thực hiện bởi Bizimana và cộng sự vào

năm 1993. Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu suất thu hồi dầu cao nhất đạt

được với tỷ lệ nước/cơ chất = 5 lần, pH = 5.5 và số vòng ly tâm = 19 680

vòng/phút.

4. Tuy nhiên, đối lập với những hướng đi trên, một nghiên cứu của Francisco

Segovia Gómez; Sara Peiró Sánchez; Maria Gabriela Gallego Iradi; Nurul

Aini Mohd Azman; María Pilar Almajano (2014) họ đã đi sâu vào việc phân

tích chế tạo ra loại hợp chất có khả năng sử dụng như chất chống oxi hóa

trong thực phẩm từ việc chiết suất từ hạt trái bơ. Mục tiêu chính của nghiên

cứu là chạy mô hình chiết suất Polyphenol từ hạt bơ, sử dụng dịch chiết để

đánh giá khả năng chống lại sự oxi hóa trong hệ thống thực phẩm, đối tượng

được nghiên cứu ở đây là hỗn hợp được pha trộn giữa dầu trong nước và

trong thực phẩm thịt. Nhóm nghiên cứu đã hòa trộn dịch chiết suất và lòng

trắng trứng gà để tăng hiệu suất đạt được. Phương pháp được sử dụng là

Response Surface Method (RSM), các biến được sử dụng trong mô hình bao

gồm: nhiệt độ (T), thời gian (t), nồng độ Ethanol. Kết quả đo được là tổng

hàm lượng Polyphenol (TPC) và đo lường khả năng chống oxi hóa bằng

ORAC. Mô hình RSM có R2 =94.69 khi áp dụng tính TPC và có R2 = 96.7

khi áp dụng tính ORAC. Sau quá trình nghiên cứu cho thấy rằng có thể sử

dụng dịch chiết làm chất chống oxi hóa với hiệu suất khoảng 30% đối với

dịch chiết thuần khiết, và 60% đối với dịch chiết được pha trộn với lòng

trắng trứng gà.

5. Đề tài “Chemical composition, toxicity and larvicidal and antifungal

activities of Persea americana(avocado) seed extracts” của tác giả Gislene

G. F. Nascimento, Juliana Locatelli, Giuliana L. Silva, và Paulo C. Freitas.

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng sinh của hạt quả bơ.

SVTH: Võ Thị Vi 19 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

1.4 Tình hình nghiên cứu tách chiết suất từ thực vật và ứng dụng

1.4.1 Các nghiên cứu trong nước

1. Đề tài của nhóm sinh viên Nguyễn Xuân Duy và Hồ Bá Vương, 2013

“nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa và ức chế Enzyme

Polyphenoloxidase của một số loài thực vật ăn được ở Việt Nam”, kết quả

cho thấy rằng hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxi hóa và hoạt tính ức

chế enzyme polyphenolxidase của sáu loài thực vật ăn được ở Việt Nam phụ

thuộc theo loài. Hàm lượng polyphenol dao động từ 11.73 – 188.19mg

GAE/g chất khô.

2. Đặng Thúy Nhung, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2012 “Đánh giá khả năng kháng

khuẩn của dịch chiết hạt Moringa oleifera Lam (cây chùm ngây) đối với

một số vi khuẩn trong nước thải chuồng nuôi lợn”. Kết quả đạt được là

dung dịch chiết hạt Moringa oleifera có tác dụng kháng khuẩn tốt với vi

khuẩn hiếu khí và yếm khí trong nước thải chuồng nuôi và vi khuẩn hiếu khí

trong nước thải sau hầm biogas và làm sạch nước sau hầm biogas.

3. Lê Thị Tuyết Ngân, 2012 “Nghiên cứu xác định thành phần hóa học có

trong dịch chiết của hạt bơ ở Đăk Lắk”,. Bằng phương pháp sắc kí – phổ

khối liên hợp (GC-MS) đã phân tích và xác định thành phần, định danh các

hoạt chất chính có trong các dịch chiết. Tìm được điều kiện tối ưu cho quá

trình chiết tách một số hợp chất từ hạt quả bơ với các dung môi: metanol

(chiết soxhlet với tỉ lệ khối lượng hạt bơ và thể tích dung môi metanol là

1/1.4 trong thời gian 6h), etyl axetat (là 1/1.2 trong thời gian 6h), hexan (là

1/1.4 trong thời gian 8h).

1.4.2 Các nghiên cứu trên thế giới

1. Akinyemi K O, Oladapo O, Okwara C E, Ibe C C, Fasure K A (2005)

“Screeening of Crude extracts of six medicinal plants used in South –

West Nigerian unorthodox medicine for anti-methicilin resistant

SVTH: Võ Thị Vi 20 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Staphylococcus aureus activity”. Chiết suất từ sáu loài thực vật và ứng

dụng kháng sinh đối với vi khuẩn Staphylococccus aureus.

2. Chanda S V, Parekh J, Karathia N. Evalution (2006) “antinbacterial

activity and phytochemical analysis of Bauhinia variegate”. Nghiên cứu

hoạt tính kháng khuẩn từ phương pháp chiết thực vật cây hoa ban.

3. Dahiru D, Onubiyi J A, Umaru H.A (2006) “Phytochemical screening and

antiulcerogenic effect of Mornigo oleifera aqueous leaf extract ”. Nghiên cứu

sàng lọc các hóa chất từ thực vật và tác dụng của chiết suất lá cây chùm

ngây.

Kết luận: Nhìn chung tất cả các nghiên cứu trong và ngoài nước đều hướng

nghiên cứu về hàm lượng các chất dinh dưỡng có trong trái bơ. Từ các kết quả về

hàm lượng dinh dưỡng đã phân tích trong các đề tài được công bố, dẫn đến nhiều ý

tưởng được đưa ra của các nhà nghiên cứu. Nhiều đề tài đã khai thác tận dụng tối ưu

giá trị từ thịt của quả bơ, áp dụng nhiều phương pháp để tách, hay chiết suất,…Tất

cả đều hướng đến tạo ra một nền giá trị kinh tế cao dựa trên các thành phần

dinh dưỡng của trái bơ chế xuất ra các sản phẩm như tinh dầu hay bột bơ,…

Nhiều đề tài đã thực hiện và thành công. Tạo rất nhiều dòng sản phẩm khác

nhau, trong đó có nhiều trong mỹ phẩm cho việc chăm sóc sắc đẹp và đặc biệt là

sức khỏe con người. Tuy nhiên, hầu hết các đề tài nghiên cứu chưa tận dụng triệt để

giá trị dinh dưỡng của quả bơ, sản phẩm được tạo ra đa dạng và phong phú. Thế

nhưng, các nghiên cứu đã bỏ qua một phẩn rất lớn, chiếm khối lượng nhiều chất

trong trái bơ, đó chính là hạt bơ, và vô tình thải ra môi trường một lượng khổng lồ

chất thải. Trong khi hạt bơ lại có nguồn giá trị dinh dưỡng không kém gì phần

thịt của nó. Trong khi hạt trái bơ có nhiều các axit amin và có một số chất có khả

năng ngăn cản một số tác nhân gây hại (vi khuẩn, vi rus, côn trùng, ). Đặc biệt

trong hạt quả bơ có còn chứa các hợp chất của Flavonoid ( thuộc nhóm chất của

phenol phức tạp). Đây là nhóm chất oxy hóa chậm. Ngoài ra, Các flavonoid có

hoạt tính kháng khuẩn cao do chúng có khả năng tạo phức với các protein ngoại

bào và thành tế bào của vi khuẩn.

SVTH: Võ Thị Vi 21 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của flavonoid được giải thích như sau:

Flavonoid ức chế transpeptidaza làm cho mucopeptit – yếu tố đảm bảo cho

hình thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được.

Gắn lên màng sinh nguyên chất của vi khuẩn, làm thay đổi làm thay đổi

tính thẩm thấu chọn lọc của màng sinh nguyên chất. Vì vậy làm cho một

số chất cần thiết cho đời sống vi khuẩn như nucleotit, pyrimidin, purin lọt

qua màng sinh nguyên chất ra ngoài.

Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn theo hai kiểu:

Phong tỏa mạch peptit của vi khuẩn bằng cách phong tỏa transferaza

chuyển axit amin từ ARN vào mạch không kéo dài thêm được hoặc tạo ra

protein bất thường không có tác dụng đối với đời sống của vi khuẩn, làm

chúng không sử dụng được.

Ức chế tổng hợp axit nucleic

Flavonoid có thể tác dụng vào AND khuôn, ức chế tổng hợp ARN của vi

khuẩn.

Các nghiên cứu tại Việt Nam đa phần chỉ dừng lại ở việc phân tích thành

phần hóa học và đánh giá khả năng chống oxi hóa của dịch chiết từ hạt bơ. Đến nay

vẫn chưa có đề tài nghiên cứu nào liên quan đến khả năng kháng khuẩn được chiết

suất từ hạt bơ vào trong ứng dụng xử lý nước thải chăn nuôi. Chính vì vậy, mà đề

tài này được thực hiện với mục tiêu như sau: Dựa trên các kết quả nghiên cứu của

các tác giả trong và ngoài nước về khả năng kháng khuẩn của dịch chiết hạt trái bơ

và khả năng xử lý một số vi khuẩn có trong nước thải chăn nuôi từ những loài thực

vật có ở Việt Nam. Đề tài sẽ tiến hành thực nghiệm nghiên cứu điều kiện tối ưu để

chiết suất hạt bơ và đồng thời bố trí thí nghiệm dịch chiết trong môi trường nước

thải chăn nuôi.

1.5 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết

1.5.1 Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán

Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Muller-hinton có

chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng

SVTH: Võ Thị Vi 22 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy

kháng sinh.

Trên môi trường tăng sinh, thường là thạch Mueller-Hinton, đầu tiên trải đều

khuẩn lên bề mặt thạch với nồng độ đã được pha loãng theo tiêu chuẩn. Các tấm

(wafer) đã ngâm kháng sinh được phân phối đều và ép nhẹ lên bề mặt thạch. Nếu

kháng sinh hoạt động ngăn cản sự phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn, xung quanh

tấm wafer sẽ xuất hiện một vùng, tại đó vi khuẩn phát triển không đủ để có thể nhìn

thấy bằng mắt thường. Khu vực này được gọi là vòng kháng khuẩn hoặc vùng ức

chế. Trong vùng này, kháng sinh lan ra từ tấm wafer tạo ra một gradient nồng độ

kháng sinh trong môi trường thạch, sao cho nồng độ cao nhất nằm gần giấy tẩm và

giảm dần khi ra xa.

Vùng ức chế xấp xỉ với nồng độ kháng sinh tối thiểu đủ để ngăn chặn sự tăng

trưởng của chủng thí nghiệm. Sau đó, đo vùng này bằng đơn vị mm và so sánh với

một biểu đồ tiêu chuẩn được sử dụng để phân loại các chủng như mẫn cảm, trung

tính (Intermediate), hoặc kháng. MIC không được xác định từ kiểm tra định tính

này.

1.5.2 Phương pháp pha loãng

Các chủng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trong các môi trường có nồng

độ kháng sinh khác nhau. Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn

(MIC) – nồng độ thấp nhất mà tại đó sự phát triển của vi khuẩn bị ức chế (không có

sự xuất hiện của các vi khuẩn có thể nhìn thấy) - được xác định khi mật độ khuẩn

lạc ≤ 3 khuẩn lạc trên môi trường agar; trong môi trường lỏng, độ đục của môi

trường được dùng để xác định chỉ tiêu.

Trong phương pháp này cần xây dựng biểu đồ tương quan tuyến tính giữa độ

đục và số lượng vi sinh vật trong môi trường bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trực

tiếp. Độ đục của huyền phù tỷ lệ thuận với số lượng tế bào vi sinh vật có trong môi

trường. Trong một thời gian nhất định, mối quan hệ giữa số lượng vi sinh vật trong

SVTH: Võ Thị Vi 23 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

nước tỷ lệ tuyến tính với độ đục của môi trường. Ưu điểm của phương pháp này là

dễ ghi nhận kết quả.

1.5.3 Phương pháp E - test

E – test là một bộ kiểm tra được thương mại hóa và sản xuất bởi Biomerieux;

gồm một que thử nhựa được ngâm tẩm một kháng sinh với nồng độ giảm dần, phía

trên có một dải hiển thị nồng độ kháng sinh tại vị trí đó. Các phòng thí nghiệm sử

dụng bộ kiểm tra này để xác định MIC và xác định sự có mặt một chủng vi sinh vật

hoặc nấm nhạy cảm với tác động của một kháng sinh cụ thể. Phương pháp này

thường được sử dụng trong các cơ sở y tế vì tính tiện lơi và nhanh chóng. Tuy

nhiên, mỗi que thử chỉ được phép chứa một loại kháng sinh, vì vậy, chí phí sử dụng

phương pháp này có thể cao.

1.5.4 Phương pháp sử dụng hệ thống thử nghiệm kháng sinh đồ tự động

(automated antimicrobial susceptibility testing systems)

Một số hệ thống được phát triển nhằm cung cấp các bước chuẩn bị thuận

tiện, nồng độ pha loãng cũng như các thiết bị đo đạc và đọc dĩa tự động. Những

thiết bị này được sử dụng để rút ngắn thời gian chuẩn bị và giảm các lỗi kỹ thuật có

thể phát sinh khi thao tác bằng tay. Hệ thống thử nghiệm kháng sinh đồ tự động

nhất cung cấp các quá trình tự động pha loãng, đọc kết quả và giải thích.

Các hệ thống này có ưu điểm là nhanh chóng (một số kết quả có thể được tạo

ra trong vòng vài giờ) và thuận tiện. Nhưng một trong những hạn chế lớn đối với

hầu hết các phòng thí nghiệm là chi phí ban đầu trong việc mua, vận hành và bảo

dưỡng các máy móc.

Một số máy phổ biến như: Vitek System (bioMerieux, Pháp), Walk-Away

System (Dade International, Sacramento, Calif.), Sensititre ARIS (Trek Diagnostic

Systems, East Grinstead, Vương quốc Anh), Avantage Test System (Abbott

Laboratories, Irving, Texas), Micronaut (Merlin, Bornheim-Hesel, Đức), Phoenix

(BD Biosciences, Maryland) và các hãng khác.

SVTH: Võ Thị Vi 24 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

1.6 Hiện trạng ô nhiễm do nước thải chăn nuôi gây ra

Nước thải trong chăn nuôi heo bao gồm nước tắm rửa, vệ sinh chuồng trại

gia súc, máng ăn, máng uống,…

 Hàm lượng hữu cơ chiếm khoảng 70 – 80%, bao gồm: Protein, lipid,

hydrocacbon và các dẫn xuất như Cellulose, acid amin.

3-,…

 Hàm lượng các chất vô cơ chiếm từ 20 – 30%, bao gồm: đất, cát, bụi muối

2-, PO4

phosphate, muối nitrat, ion Cl-, SO4

 Vi sinh, vi khuẩn điển hình: E.Coli, Steptococcus, Salmonella, Shighela,

Clostridium,…

 Các loại virus có thể tìm thấy trong nước thải chăn nuôi như: Corona virus,

aphtovirus…

Theo Cục chăn nuôi Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (NN&PTNT),

mỗi năm, ngành chăn nuôi gia súc gia cầm thải ra khoảng 75-85 triệu tấn chất thải,

với phương thức sử dụng phân chuồng không qua xử lý ổn định và nước thải không

qua xử lý xả trực tiếp ra môi trường gây ô nhiễm nghiêm trọng.

Hiện cả nước có 8.5 triệu hộ chăn nuôi quy mô gia đình, 18 000 trang trại

chăn nuôi tập trung, nhưng mới chỉ có 8.7% số hộ xây dựng công trình khí sinh học

(hầm biogas). Tỷ lệ hộ gia đình có chuồng trại chăn nuôi hợp vệ sinh cũng chỉ

chiếm 10% và chỉ có 0.6% số hộ có cam kết bảo vệ môi trường. Vẫn còn khoảng

23% số hộ chăn nuôi không xử lý chất thải bằng bất kỳ phương pháp nào mà xả

thẳng ra môi trường bên ngoài…gây sức ép đến môi trường.

Chất thải chăn nuôi tác động đến môi trường và sức khỏe con người trên

nhiều khía cạnh: Gây ô nhiễm nguồn nước mặt, nước ngầm, môi trường khí, môi

trường đất và các sản phẩm nông nghiệp. Đây chính là nguyên nhân gây ra nhiều

căn bệnh về hô hấp, tiêu hóa, do trong chất thải chứa nhiều vi sinh vật gây bệnh. Tổ

chức Y tế Thế giới (WHO) đã cảnh báo, nếu không có biện pháp thu gom và xử lý

chất thải chăn nuôi một cách thỏa đáng sẽ ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con

người, vật nuôi và gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Đặc biệt là các virus biến

SVTH: Võ Thị Vi 25 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

thể từ các dịch bệnh như: lở mồm long móng, dịch bệnh tai xanh ở lợn có thể lây

lan nhanh chóng và có thể cướp đi sinh mạng của rất nhiều người. Theo báo cáo

tổng kết của Viện Chăn nuôi (Bộ NN&PTNT), nồng độ khí H2S và NH3 trong chất

thải chăn nuôi cao hơn mức cho phép khoảng 30-40 lần. Tổng số vi sinh vật và bào

tử nấm cũng cao hơn mức cho phép rất nhiều lần. Ngoài ra, nước thải chăn nuôi còn

chứa Coliform, E.coli, COD... và trứng giun sán cao hơn rất nhiều lần so với tiêu

chuẩn cho phép.

Các tỉnh thuộc đồng bằng sông Hồng, đồng bằng sông Cửu Long là những

địa phương có ngành chăn nuôi phát triển. Tại tỉnh Bến Tre, tính đến thời điểm

tháng 6/2013 đã có đàn lợn trên 424.000 con, đàn bò gần 148.000 con, là địa

phương có đàn gia súc đứng đầu khu vực đồng bằng sông Cửu Long. Tuy nhiên,

việc đảm bảo vệ sinh môi trường ở đây mới chỉ chú trọng ở các doanh nghiệp chăn

nuôi, còn các hộ chăn nuôi nhỏ chưa được quan tâm. Trong khi, các hộ chăn nuôi

nhỏ chiếm tỷ lệ khá lớn, nhưng việc chăn nuôi của các hộ dân phần lớn theo tập

quán, thói quen xả chất thải xuống kênh, rạch dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi

trường, tăng nguy cơ dịch bệnh cho vật nuôi, con người và ảnh hưởng lớn đến sự

phát triển bền vững của ngành Chăn nuôi.

Theo dự báo của ngành Tài nguyên và Môi trường (TN&MT), với tốc độ

phát triển mạnh của ngành Chăn nuôi như hiện nay dự tính đến năm 2020, lượng

chất thải rắn trong chăn nuôi phát sinh khoảng gần 1.212.000 tấn/năm, tăng 14,05%

so với năm 2010.

Nước thải trong chăn nuôi heo bao gồm nước tắm rửa, vệ sinh chuồng trại

gia súc, máng ăn, máng uống… là loại nước gây ô nhiễm nặng nhất vì nó có chứa

các chất vô cơ, hữu cơ, khoáng chất… Hàm lượng chất hữu cơ trong nước thải chăn

nuôi heo chiếm khoảng 70- 80 %, bao gồm: Protein, lipid, hydrocacbon và các dẫn

3-… Ngoài ra,

xuất như cellulose, acid amin. Hàm lượng các chất vô cơ chiếm từ 20 -30%, bao

2-, PO4

gồm: đất, cát, bụi muối phosphate, muối nitrat, ion Cl-, SO4

nước thải trong chăn nuôi còn chứa rất nhiều vi sinh vật. Các vi sinh vật này là

những tác nhân gây ô nhiễm nguồn nước, chúng bao gồm các nhóm: vi khuẩn điển

SVTH: Võ Thị Vi 26 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

hình như: E.coli, Streptococcus sp, Salmonella sp, Shigenla sp,Proteus, Clostridium

sp…đây là các vi khuẩn gây bệnh tả, lỵ, thương hàn, kiết lỵ. Các loại virus có thể

tìm thấy trong nước thải như: corona virus, poio virus, aphtovirurrus… và ký sinh

trùng trong nước gồm các loại trứng và ấu trùng, ký sinh trùng đều được thải qua

phân, nước tiểu và dễ dàng hòa nhập vào nguồn nước.

Tổ chức Y tế Thế giới đã cảnh báo, nếu không có biện pháp thu gom và xử lý

chất thải chăn nuôi sẽ ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người, vật nuôi và gây ô

nhiễm môi trường nghiêm trọng. Đặc biệt là các virus biến thể từ các dịch bệnh như

lở mồm long móng, dịch bệnh tai xanh ở heo có thể lây lan nhanh chóng và có thể

cướp đi sinh mạng của rất nhiều người.

1.7 Hiện trạng các phương pháp xử lý nước thải chăn nuôi

Công nghệ xử lý nước thải chăn nuôi hiện nay có nhiều phương pháp như:

phương pháp cơ học, hóa lý, sinh học. Trong đó phương pháp sinh học bằng hầm

Biogas (hệ thống khí sinh học) hiện nay được áp dụng rộng rãi nhất.

Phương pháp cơ học: Dùng song chắn rác, bể lắng sơ bộ để loại bỏ cặn thô,

dễ lắng tạo điều kiện thuận lợi và giảm khối tích của các công trình xử lý tiếp

theo. Hàm lượng cặn lơ lửng trong nước thải chăn nuôi khá lớn và dễ dàng

lắng nên có thể lắng sơ bộ trước rồi mới đưa sang công trình xử lý nước thải

phía sau.

Phương pháp xử lý hóa lý: Nước thải chăn nuôi còn chứa nhiều chất hữu cơ,

chất vô cơ dạng hạt có kích thước nhỏ, khó lắng, khó có thể tách ra bằng

phương pháp cơ học thông thường vì tốn nhiều thời gian và hiệu quả không

cao. Ta có thể áp dụng phương pháp keo tụ để loại bỏ chúng. Phương pháp

này thường loại bỏ được hầu hết các chất bẩn. Tuy nhiên chi phí xử lý cao,

nên không hiệu quả về mặt kinh tế. Ngoài ra, tuyển nổi cũng là một phương

pháp để tách các hạt có khả năng lắng kém nhưng có thể kết dính vào các bọt

khí nổi lên trên. Tuy nhiên chi phí đầu tư, vận hành cho phương pháp này

cao, cũng không hiệu quả về mặt kinh tế đối với các trại chăn nuôi nhỏ, lẻ.

SVTH: Võ Thị Vi 27 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Phương pháp xử lý sinh học: Dựa trên sự hoạt động của các vi sinh vật có

khả năng phân hủy các chất hữu cơ. Các vi sinh vật sử dụng các chất hữu cơ

và một số khoáng chất làm nguồn dinh dưỡng và tạo ra năng lượng. Tùy theo

nhóm vi khuẩn sử dụng là hiếu khí hay kị khí mà người ta thiết kế các công

trình khác nhau. Và tùy theo khả năng về tài chính, diện tích đất mà người ta

có thể dùng hồ sinh học hoặc xây dựng các bể nhân tạo để xử lý. Trong đó

hầm biogas là biện pháp dễ thực thi nhất đối với hầu hết tất cả các trang trại

chăn nuôi.

Tuy nhiên điểm hạn chế của các công trình trên là không xử lý triệt để các vi

khuẩn có hại đối với sức khỏe con người. Sau khi đã qua xử lý bằng các công trình

trên hàm lượng vi khuẩn đã giảm bớt nhưng không hoàn toàn triệt để, khi đó sẽ phải

sử dụng biện pháp khử trùng. khử trùng chỉ nhằm tiêu diệt những vi khuẩn, virut

loại có hại, gây bệnh, không phải tiêu diệt tất cả vi khuẩn có trong nước. Cơ sở của

phương pháp khử trùng bằng các chất hóa chất là sử dụng chất oxy hóa mạnh hơn

để oxy hóa men của tế bào vi sinh vật và tiêu diệt chúng. Các hóa chất thường dùng

là: các halogen clo, brom; clo dioxyt; các hypoclorit và các muối của nó; ozôn,…

Tất cả các biện pháp khử trùng trên đều là sử dụng các chất hóa học, không những

giá thành thường rất đắt mà còn ảnh hướng đến sức khỏe của con người. Hiện nay

chưa có loại hợp chất thiên nhiên nào được chiết suất với mục đích xử lý hiệu quả

các loại vi khuẩn, virus có hại trong nước thải chăn nuôi heo.

SVTH: Võ Thị Vi 28 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Thu gom nguyên liệu

Hạt quả bơ dùng làm nguyên liệu được thu mua từ giống bơ của chú Phạm

Văn Hai ở Đắk Nông.

2.1.2 Xử lý nguyên liệu

Hạt bơ sau khi mua về bóc lớp vỏ lụa, rửa sạch. Sau đó đem phơi khô, được

xoay nghiền nhỏ và bảo quản trong bình thủy tinh kín.

2.2 Dụng cụ và hóa chất

2.2.1 Dụng cụ

− Dụng cụ thu mẫu: găng tay, bông thấm, bao thùng, chai lọ.

− Dụng cụ phân tích mẫu: cân phân tích, tủ sấy, bộ chiết soxhlet, ống nghiệm

các loại, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, pipet, tủ lạnh, tủ ấm, tủ cấy, thiết bị cô

quay chân không,…

− Dụng cụ quan sát thử nghiệm kháng sinh đồ: thước đo vòng vô khuẩn, dụng

cụ đục lỗ thạch, dao gắp thạch.

− Dụng cụ kiểm tra chất lượng nước sau xử lý: pH, test BOD, COD.

2.2.2 Môi trường và hóa chất

− Môi trường NA, NB (phụ lục A) môi trường đặc trưng dùng làm kháng sinh

khảo sát tác dụng kháng khuẩn của các hợp chất thử nghiệm

− Môi trường thạch thường, thạch Macconkey.(phụ lục A)

− Hóa chất cần khi thực hiện quá trình chiết: dung môi n-hexan, etyl axetat,

metanol.

SVTH: Võ Thị Vi 29 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu gom và xử lý mẫu

Hạt bơ sau khi được lựa chọn kỹ lưỡng đem đi rửa sạch loại bỏ lớp vỏ lụa, để

khô trong vòng ít nhất 1giờ, phải để cho thật khô tránh sai số sau này. Sau đó

nghiền hạt bơ đã khô và bảo quản mẫu.

2.3.2 Phương pháp vật lý

Phương pháp phân tích trọng lượng là phương pháp phân tích định lượng dựa

vào kết quả cân khối lượng của sản phẩm, hình thành sau khi sấy. Do bản chất phân

tích chiếm một tỷ lệ xác định trong sản phẩm đem cân dễ dàng suy ra lượng chất

phân tích trong đối tượng phân tích.

Quá trình phân tích một chất theo phương pháp trọng lượng:

− Chọn mẫu và gia công mẫu

− Tách trực tiếp chất cần xác định hoặc các thành phần của nó khỏi sản phẩm

phân tích dưới dạng trạng thái tinh khiết hóa học. Tuy nhiên trong nhiều

trường hợp việc làm này rất khó khăn, nhiều khi không thực hiện được, do

đó chất cần xác định thường được tách ra thành kết tủa dưới dạng hợp chất

có thành phần xác định.

− Xử lý sản phẩm đã tách bằng các biện pháp thích hợp (rửa, nung, sấy…) Rồi

đem cân để tính kết quả.

2.3.3 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách

chiết.

2.3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi

Về nguyên tắc dung môi để trích ly phải hòa tan các chất cần tách chiết.

Các loại dung môi khác nhau có khả năng chiết khác nhau. Hiệu suất chiết còn phụ

thuộc vào tỷ lệ hàm lượng dung môi so với nguyên liệu. Tỷ lệ này càng cao thì dung

môi chiết càng nhiều. Hệ dung môi là yếu tố quan trọng nhất quyết định hiệu suất

chiết.

SVTH: Võ Thị Vi 30 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Cơ sở để lựa chọn dung môi là dựa vào tính phân cực của các hợp chất

trong hạt quả bơ và của dung môi sử dụng. Vì thành phần cơ bản có trong hạt quả

bơ là các hợp chất có tính chống oxi hóa và kháng khuẩn mạnh và các axit amin,

đặc biệt là các hợp chất thuộc nhóm Flavonoid phân cực vì vậy nên lựa chọn những

loại dung môi có tính phân cực. Dung môi để điều chế cao thường là nước,

methanol, ete ethylic. Nước là dung môi thông dụng và rẻ tiền, nhưng có nhược

điểm hoà tan nhiều tạp chất, cao khó bảo quản. Methanol hoà tan được nhiều loại

hoạt chất, hoà tan ít tạp chất nên được dùng rộng rãi hơn, cao thuốc dễ bảo quản

hơn. Ete ít dùng vì đắt tiền và dễ cháy nổ. Dùng ete trong trường hợp hoạt chất chỉ

tan trong ete, hoặc dùng để loại tạp chất dầu, mỡ, sáp trong dịch chiết.Luận văn này

lựa chọn ba loại dung môi: metanol, n-hexan và etyl axetat và tiến hành khảo sát,

tìm ra loại dung thích hợp cho quá trình ly trích.

2.3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết

Thời gian tiếp xúc của dung môi và nguyên liệu càng dài thì khả năng

trích ly càng cao. Khi đó nồng độ chất tan đạt giá trị cân bằng. Tuy nhiên nếu thời

gian quá dài sẽ hòa tan các chất trong nguyên liệu vào dung môi, sản phẩm thu được

không thuần khiết.

2.3.4 Phương pháp chiết mẫu thực vật

2.3.4.1 Giới thiệu chung

Chiết là dùng dung môi thích hợp có khả năng hòa tan chất đang cần tách

và tinh chế để tách chất cần chiết ra khỏi môi trường rắn hoặc lỏng khác. Người ta

thường dùng một dung môi thấp hay ít tan trong nước (vì chất hữu cơ cần tinh chế

thường ít tan trong nước), chất đó sẽ chuyển phần lớn lên dung môi và ta có thể

dùng phễu để tách riêng dung dịch thu được ra khỏi nước.

Bằng cách lặp đi lặp lại chiết một số lần, ta có thể tách hoàn toàn chất

cần tinh chế vào dung môi đã chọn, sau đó cất loại dung môi và cất lấy chất tinh

khiết ở nhiệt độ và áp suất thích hợp.

Người ta cũng thường chiết một chất từ hỗn hợp rắn bằng một dung môi

hoặc hỗn hợp dung môi với một dụng cụ chuyên dùng đặc biệt là bình chiết soxhlet.

SVTH: Võ Thị Vi 31 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Dung môi được đun nóng, cho bay hơi liên tục chảy vào chất rắn cần tinh chế và

nhờ một ống xiphông, dung dịch chảy xuống bình cầu bên dưới, dung môi nguyên

chất lại tiếp tục liếp tục được cất lên. Phương pháp này tiết kiệm được dung môi và

hiệu quả tương đối cao.

2.3.4.2 Kỹ thuật chiết Soxhlet

 Dụng cụ

Gồm một bình cầu A đặt trong một bếp đun có thể điều chỉnh nhiệt độ.

Một bộ phận chứa mẫu bột vật liệu, gồm ba ống: Ống D có đường kính lớn, ở giữa

để chứa bột vật liệu, ống B có đường kính trung bình để dẫn dung môi từ bình A

bay lên đi vào ống D chứa bột vật liệu; ống E có đường kính nhỏ, là ống thông nhau

để dẫn dung môi từ D trả lại bình cầu A. Trên cao là ống C ngưng hơi.

 Cách tiến hành

Bột vật liệu khô đựng trong một cái túi bằng giấy lọc được đặt trực tiếp

trong ống D. Lưu ý đặt vài viên bi thủy tinh dưới đáy ống D để tránh làm ngẹt lối ra

vào của ống thông nhau E. Rót dung môi đã lựa chọn vào bình cầu bằng cách tháo

hệ thống nút mài số 2, như thế dung môi sẽ thấm ướt bột vật liệu rồi mới chảy

xuống bình cầu, ngang qua ngõ ống thông nhau E.

Kiểm tra hệ thống kín, mở nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi.

Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều.

Dung môi tinh khiết khi được đun nóng sẽ bốc hơi lên cao, theo ống B lên cao hơn,

rồi theo ống ngưng hơi để lên cao hơn nữa, ngưng tại đây hơi dung môi bị ống

ngưng hơi làm lạnh, ngưng tụ thành chất lỏng rớt xuống ống D đang chứa bột vật

liệu. Dung môi ngấm vào bột vật liệu và chiết những chất hữu cơ nào có thể hòa tan

vào dung môi. Theo quá trình đun nóng, lượng dung môi rơi vào ống D và đồng

thời cũng dâng lên trong ống E. Đến một mức cao nhất trong ống E, dung môi sẽ bị

hút vào bình A, lực hút này sẽ rút lượng dung môi đang chứa trong ống D.

Bếp vẫn tiếp tục đun và một quy trình mới vận chuyển dung môi theo

như mô tả lúc đầu. Các hợp chất được rút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có

dung môi tinh khiết là được bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết.

SVTH: Võ Thị Vi 32 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Sau khi hoàn tất lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu A, đuổi dung môi và

thu được cao chiết.

 Ưu nhược điểm của phương pháp chiết soxhlet

− Ưu điểm:

 Tiết kiệm dung môi, chỉ một ít lượng dung môi mà chiết kiệt được

mẫu. Không tốn công lọc và châm dung môi mới.

 Không tốn các thao tác và châm dung môi mới như các kỹ thuật

khác. Chỉ cẩn cắm điện, mở nước hoàn lưu và thiết bị sẽ thực hiện

chiết.

 Chiết kết hợp chất trong bột dược liệu vì bột vật liệu luôn được

chiết liên tục bằng dung môi tinh khiết.

− Nhược điểm

 Kích thước của thiết bị làm giới hạn lượng bột vật liệu cần thiết.

 Trong quá trình chiết, các hợp chất chiết ra từ bột vật liệu được trữ

lại trong bình cầu, nên chúng luôn bị đun nóng ở nhiệt độ sôi của

dung môi vì thế hợp chất nào kém bền nhiệt dễ bị hư hại.

 Do toàn hệ thống của thiết bị đều bằng thủy tinh và gia công thủ

công nên dễ vỡ, trong đó các bộ phận của máy, nhất là nút mài

được gia công nên chỉ cần làm bể một bộ phận nào đó thì khó tìm

được một bộ phận khác vừa khớp để thay thế.

2.3.5 Phương pháp xác định thành phần hóa học của các dịch chiết hạt

quả bơ

Sau khi lựa chọn dung môi chiết trong thời gian chiết tối ưu. Lấy dung dịch

chiết thu được đem phân tích thành phần hóa học có trong dịch chiết.

Bằng phương pháp sắc ký ghép phổ (GC/MS _ Gas Chromatography Mass

Spectometry) sẽ là phương pháp lựa chọn hiệu quả nhất. Phương pháp này với độ

nhạy cảm cực kỳ cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp.

Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành hai phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân

tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các

SVTH: Võ Thị Vi 33 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

hợp hợp phần riêng lẽ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp hai kỹ thuật này ta

có thể phân tích định tính và định lượng với một số chất cần tìm.

 Nguyên lý:

 Sắc ký khí được dùng để chia tách các hỗn hợp của hóa chất ra các phần

riêng lẻ, mỗi phần có một giá trị riêng biệt. Trong sắc ký khí (GC) chia tách

xuất hiện khi mẫu bơm vào pha động. Pha động mang hỗn hợp mẫu đi qua

pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là các hóa chất, hóa chất này có độ nhạy cảm

và hấp thụ thành phần hỗn hợp trong mẫu.

 Thành phần hỗn hợp trong pha động tương tác với pha tĩnh, mỗi hợp chất

trong hỗn hợp tương tác với một tỷ lệ khác nhau, hợp chất tương tác nhanh

sẽ thoát ra khỏi cột trước và hợp chất tương tác chậm sẽ ra khỏi cột sau. Đó

là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh, hơn nửa quá trình chia tách có

thể xảy ra bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là áp suất của pha động.

 Cột trong GC được làm bằng thủy tinh, inox hoặc thép không rỉ có kích

thước, kích cỡ rất đa dạng. Cột của GC dài có thể là 25m, 30m, 50m, 100m

và có đường kính rất nhỏ, bên trong đường kính được tránh bằng một lớp

polimer đặc biệt như phenyl 5 % + dimetylsiloxane polimer 95%), đường

kính cột thường rất nhỏ giống như là một ống mao dẫn. Thông thường cột

được sử dụng là semivolatile, hợp chất hữu cơ không phân cực như PAHs,

các hợp chất trong hỗn hợp được phân tích bằng cách chạy dọc theo cột này.

 Một chất chia tách, rửa giải phóng đi ra khỏi cột và đi vào đầu dò. Đầu dò có

khả năng tạo ra một tín hiệu bất kỳ lúc nào, khi phát hiện ra chất cần phân

tích. Tín hiệu này phát ra từ máy tính, thời gian từ khi bơm mẫu đến khi rửa

giải gọi là thời gian lưu (TR). Trong khi các thiết bị chạy, máy sẽ đưa ra các

biểu đồ từ các tín hiệu.

 Khối phổ được dùng để xác định một chất hóa học dựa trên cấu trúc của nó.

Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ một cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò có

dòng điện ion hóa (mass spectrometry). Khi đó chúng sẽ tấn công vào các

luồng, do chúng bị bỡ thành những mảnh vụn, những mảnh vụn này có thể

SVTH: Võ Thị Vi 34 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

lớn hoặc nhỏ. Khi tiêu điểm của các mảnh vụn đi xuyên qua các khe hở và đi

vào đầu dò detector, tứ cự được thành lập bởi phần mền chương trình và

hướng các mảnh vụn đi vào khe hở của khối phổ.

 Phân tích kết quả:

 Máy tính sẽ ghi lại các biểu đồ của mỗi lần quét.

 Dựa vào đồ thị các nhà nghiên cứu có thể so sánh khối phổ thu được

trong phòng thí nghiệm với một thư viện khối phổ của các chất đã được

xác định trước. Việc này có thể giúp họ định danh được chất đó (nếu

phép so sánh tìm được kết quả tương ứng) hoặc là cơ sở để đăng kí một

chất mới (nếu phép so sánh không tìm được kết quả tương ứng).

2.3.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh

2.3.6.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết

Hoạt tính kháng khuẩn được kiểm định theo phương pháp khuếch tán đĩa

thạch theo phương pháp Mc Farland (Kirby và Bauer, 1997) có chỉnh sữa.

 Nguyên lý

Dùng dụng cụ đục lỗ thạch có đường kính và độ dày nhất định, vô trùng.

Hút dịch kháng sinh đổ vào lỗ thạch đã được đục. Nồng độ vi khuẩn cũng đã được

quy định trước. Để tủ ấm cho vi khuẩn mọc và đo đường kính vòng ức chế vi khuẩn

xung quanh lỗ thạch, dựa vào đó để xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn được

thử với kháng sinh đó.

 Cách tiến hành

− Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn theo phương pháp Mc Farland.(mục

đích để so sánh với độ đục của vi khuẩn đã được cấy chuyển trên môi

trường thạch MHA

SVTH: Võ Thị Vi 35 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Bảng 2.1: Thành phần dung dịch của các ống nghiệm trong thí nghiệm Mc

Farland

Ống số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 BaCl2 1% (ml)

9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0 H2SO4 1% (ml)

Tb/ml (x108) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

Chuẩn bị vi khuẩn để thử nghiệm kháng sinh đồ: sử dụng các chủng

chuẩn vi khuẩn E.coli, Salmonnella, Staphylococcus aureus, Pseudomonas.Vi khuẩn

được cấy tăng sinh trong môi trường NB (Nutrient broth) phụ lục A + 2%NaCl, thu

tế bào vi khuẩn và huyền phù với nước muối sinh lý 2% vô trùng rồi đem đo DO

(mật độ vi sinh vật).

Pha hỗn hợp dịch tế bào của vi khuẩn sao cho dung dịch huyền phù có

cùng độ đục với ống số 5 theo Mc Farrland. (pha bằng cách cho thêm dung dịch

PBS (photphat Buffer Saline).

− Chuẩn bị các đĩa môi trường NA (nutrient agar) để xác định khả năng

kháng khuẩn của dịch chiết.

− Dùng pipet hút 0.1ml dung dịch vi khuẩn đã được pha loãng bằng nước

muối sinh lý theo nồng độ thích hợp (108 cfu) vào môi trường NA trong

đĩa petri, dàn đều dịch vi khuẩn lên đĩa thạch. Sau đó dùng pipet hút hết

phần dung dịch vi khuẩn thừa trên mặt thạch.

− Dùng dụng cụ đục lỗ thạch (chọn cây đục có đường kính 6mm) lên các

đĩa đã được cấy vi khuẩn. Đánh dấu vị trí đục (mỗi lỗ có đường kính

0.5cm) cách nhau ít nhất 2cm.

− Hút 100𝜇l dung dịch kháng sinh (đầy lổ thạch) vào lỗ thạch.

− Để yên cho dung dịch kháng sinh thấm vào môi trường thạch khoảng 2

giờ, sau đó đem ủ 370C trong 24 giờ. Đo vòng kháng khuẩn

Hoạt tính ức chế vi khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính vòng ức

chế vi sinh vật bằng công thức:

SVTH: Võ Thị Vi 36 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

BK (mm) = D – d

Trong đó: D = đường kính vòng vô khuẩn

(mm)

d = đường kính lỗ khoan thạch

(mm)

− Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

− Thí nghiệm tương tự với các mẫu đối chứng để so sánh.

2.3.6.2 Phương pháp test mẫu nước thải chăn nuôi

Nước thải chăn nuôi được lấy sau hầm biogas và hệ thống sàn lọc để

phân tích các chỉ tiêu: Tổng số vi sinh vật hiếu khí, phân tích tổng số Colifom, phân

tích Escherichia Coli (E.Coli) có trong mẫu nước thải.

2.3.6.2.1 Phương pháp đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí

 Nguyên tắc:

Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch, sau

khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 370C trong vòng 24h giờ. Số lượng vi khuẩn hiếu khí trong

1ml mẫu được xác định theo khuẩn lạc riêng lẽ đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo

các độ pha loãng.

 Các bước tiến hành:

 Pha loãng mẫu

Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu nước thải sang ống nghiệm có chứa

9ml nước cất đã được khử trùng để được độ pha loãng 10-1. Tương tự

hút 1ml từ ống có nồng độ 10-1 sang ống nghiệm có chứa 9ml nước

cất đã được khử trùng để được độ pha loãng 10-2. Tương tự đến độ

pha loãng 10-6.

 Hút vào đĩa petri đã khử trùng 1ml mẫu đã pha loãng, mỗi độ pha

loãng chuẩn bị 2 đĩa petri (thao tác vô trùng dưới đèn cồn)

 Ghi ký hiệu độ pha loãng lên từng đĩa, thực hiện 3 độ pha loãng cho

mỗi mẫu.

SVTH: Võ Thị Vi 37 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

 Sau khi để nguội môi trường 35 – 400C, rót vào đĩa petri đã chứa mẫu,

mỗi đĩa khoảng 10ml môi trường (có độ dày từ 2 – 3mm).

 Xoay nhẹ đĩa petri tránh không để môi trường tràn ra ngoài để phân

bố đều lượng ví sinh vật có trong mẫu.

 Chờ thạch đông lại, lật ngược đĩa petri đem ủ 350C. Sau 24 giờ đếm

các khuẩn lạc riêng lẻ quan sát được.

 Đọc kết quả:

Chọn những đĩa có từ 15 – 300 khuẩn lạc của 3 độ pha loãng liên tiếp

để tính kết quả.

Công thức tính số lượng khuẩn lạc có trong 1ml mẫu nước như sau:

𝑁 𝑛1𝑣1𝑓1+ 𝑛2𝑣2𝑓2 +⋯+𝑛𝑖𝑣𝑖𝑓𝑖

A =

Trong đó: A: Tổng số vi sinh vật hiếu khí có trong 1ml mẫu

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa

n1: số đĩa ở độ pha loãng f1

v1: Thể tích mẫu lấy ở mỗi độ pha loãng

f1: Độ pha loãng

2.3.6.2.2 Phương pháp định lượng Coliforms kỹ thuật lên men nhiều

ống đếm số có xác suất lớn nhất MPN (Most Probable Number)

 Nguyên tắc:

Định lượng vi sinh vật lên men lactose có sinh khí nuôi cấy trong môi trường

tăng sinh chọn lọc ở 350C.

 Các bước tiến hành:

Thử nghiệm giả định

 Chọn dãy nồng độ pha loãng kế tiếp nhau của mẫu nước (10-1, 10-2,

10-3).

 Xếp 9 ống nghiệm chứa môi trường Lactose Broth có chứa ống

durham lên giá ống nghiệm làm 3 dãy (hệ thống 1).

 Dùng pepet khử trùng cấy 1ml mẫu nước 10-1 vào 3 ống của dãy 1

SVTH: Võ Thị Vi 38 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

 Dùng pepet khử trùng cấy 1ml mẫu nước 10-2 vào 3 ống của dãy 2.

 Dùng pepet khử trùng cấy 1ml mẫu nước 10-3 vào 3 ống của dãy 3.

 Lắc nhẹ mẫu ống để trộn đều mẫu nước thử với môi trường nuôi cấy,

tránh tạo bọt khí. Mỗi độ pha loãng đổi pepet mới.

 Ủ tất cả các ống ở 350C. Sau 24 giờ lắc đều mỗi ống và quan sát sự

sinh khí, nếu không có sự sinh khí hoặc nghi ngờ, ủ lại và quan sát sự

sinh khí ở 48 giờ.

 Sự sinh khí trong vòng 48 giờ chứng tỏ thử nghiệm giả định dương

tính (+).

Thử nghiệm xác định:

 Đem tất cả các ống giả định dương tính vào thử nghiệm xác định.

 Lắc đều, dùng que cấy vòng lấy từ các ống nghiệm giả định dương

tính cấy chuyển vào các ống có môi trường BGBL (phụ lục A)

 Đem ủ ở 350C trong 48 giờ.

 Quan sát sự sinh khí ở bất kỳ thời điểm nào trong vòng 48 giờ. Sự

sinh khí chứng tỏ thí nghiệm xác định dương tính.

 Đọc kết quả theo bảng MPN của Mac Crady (Phụ lục B).

Có 3 hệ thống thường dùng trong phân tích:

− Hệ thống 1: Mỗi dãy 3 ống

3 ống 10ml mẫu nước Dãy 1:

3 ống 1ml mẫu nước Dãy 2:

3 ống 0.1ml mẫu nước Dãy 3:

− Hệ thống 2: Mỗi dãy 5 ống

5 ống 10ml mẫu nước Dãy 1:

5 ống 1ml mẫu nước Dãy 2:

5 ống 0.1ml mẫu nước Dãy 3:

SVTH: Võ Thị Vi 39 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

− Hệ thống 3: Mỗi dãy 5 ống (dùng trong thử nghiệm nước uống)

Dãy 1: 5 ống 10ml mẫu nước

Dãy 2: 5 ống 1ml mẫu nước

Dãy 3: 5 ống 0.1ml mẫu nước

 Đọc kết quả: Đọc kết quả theo bảng thống kê MPN. Con số đạt được là

số lượng vi khuẩn/100ml

2.3.6.2.3 Phân tích Escherichia Coli có trong mẫu nước thải chăn nuôi

 Nguyên tắc: Định lượng E.Coli bằng các thử nghiệm sinh hóa

IMViC.

 Các bước tiến hành:

Thử nghiệm giả định:

 Thực hiện giống hoàn toàn thử nghiệm giả định phân tích Coliform.

Thử nghiệm xác định:

 Xếp các ống nghiệm dương tính của thử nghiệm giả định trên giá

theo 3 dãy.

 Xếp số ống nghiệm chứa môi trường Pepton Water PW (Phụ lục A)

theo 3 dãy tương ứng.

 Dùng que cấy vòng, cấy truyền từ các ống nghiệm dương tính của

thử nghiệm giả định sang môi trường PW.

 Ủ các ống này ở 440C.

 Đọc kết quả sau 24 và 48 giờ.

 Tiến hành xét nghiệm sinh hóa

Xét nghiệm sinh hóa:

 Thử nghiệm Indol: Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s có màu vàng nhạt vào

ống nghiệm dương tính của thử nghiệm xác định. Nếu thuốc thử đổi màu

thành một vòng đỏ sậm trên bề mặt. Kết luận dương tính.

SVTH: Võ Thị Vi 40 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

 Thử nghiệm methyl đỏ: Nhỏ vài giọt methyl đỏ cho vào ống nghiệm của

thử nghiệm xác định dương tính. Nếu thuốc thử đổi màu đỏ là dương tính

(+), cho màu vàng là âm tính (-).

 Thử nghiệm Voges – Proskauer (VP): Cho vào 0.6ml dung dịch naphthol

và 0.2 ml dung dịch KOH ứng với mỗi ml môi trường trong ống nghiệm

dương tính của giai đoạn thử nghiệm xác định. Màu đỏ đến đỏ thẳm xuất

hiện trong vòng 5 phút là phản ứng dương tính, không đọc sau 5 phút,

ống nghiệm có màu hồng là âm tính.

 Thử nghiệm Simmon citrat agar (sodium citrate test): Sử dụng môi

trường Simmon citrat agar. Đổ thạch nghiêng, sau đó đem cấy chuyền. Ủ

mẫu đã cấy trong vòng 72 – 96 giờ. Quan sát sự sinh trưởng kết luận

dương tính.

Từ các xét nghiệm sinh hóa trên nếu từ một ống dương tính của thử

nghiệm xác định có kết quả là (++--) thì kết luận là dương tính, còn không cho kết

quả như trên thì kết luận âm tính. Tuy nhiên ở mức độ khảo sát ở phòng thí nghiệm

thì chỉ cần xét thử nghiệm indol để xác định dương tính rồi đọc kết quả. Xác định

chỉ số MPN.

Công thức tính lượng tế bào sống có trong 1ml mẫu ban đầu được xác

𝐶ℎỉ 𝑠ố 𝑀𝑃𝑁

định theo công thức:

𝐺𝑖á 𝑡𝑟ị độ 𝑝ℎ𝑎 𝑙𝑜ã𝑛𝑔 𝑚ẫ𝑢 𝑡ℎấ𝑝 𝑛ℎấ𝑡

N =

2.3.7 Phương pháp thử nghiệm dịch chiết trong xử lý nước thải chăn nuôi

 Nguyên tắc:

Cấy trong một lượng mẫu xác định trên bề mặt môi trường thạch đã chọn lọc.

Sau khi ủ, đếm số khuẩn lạc đặc trưng đối với vi khuẩn hiếu khí và yếm khí. Kết

quả nhận được so sánh với mẫu đối chứng.

 Cách tiến hành:

SVTH: Võ Thị Vi 41 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

− Chuẩn bị mẫu:

Tiến hành pha trộn dịch chiết 20% với mẫu nước thải chăn nuôi. Pha loãng

hỗn hợp dung dịch trên theo cơ số 10 (tối đa 10-5). Làm tương tự đối với dịch

chiết 40%.

− Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi khuẩn: cấy trên môi trường thạch thường,

thạch Macconkey. Hấp khử trùng môi trường ở 1200C trong vòng 15 phút.

Chờ môi trường nguội, sau đó phân phối vào đĩa petri (đã sấy ở 1600C trong

90 phút), mỗi đĩa 15 – 20ml. Dùng pipet hút 0.1ml mẫu dung dịch đã pha

loãng ở các nồng độ cho vào đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ và ngày phân

lập. . Dùng que cấy trang đã khử trùng trang đều lên bề mặt thạch cho đến

khi thấy mặt thạch khô. Sau đó, lật ngược đĩa lại cất và nuôi cấy mẫu phân

lập ở 370C. Sau 48 giờ vi khuẩn đã phát triển trên đĩa thạch tiến hành quan

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

9 ml

9 ml

9 ml

sát và đếm các khuẩn lạc. Tiến hành tương tự với mẫu đối chứng.

10-3

10-2

10-5

10-4

10-1

0,1 ml

0,1 ml

0,1 ml

0,1 ml

9 ml

Hình 2.1: Trình tự pha loãng

2.3.8 Phương pháp kiểm tra thống kê sinh học

Tất cả các kết quả thực nghiệm được phân tích bằng phần mềm Microsoft

Excel 2007 và phần mềm Statgraphics Centurion XV (phiên bản 15.2.11). Mỗi thí

nghiệm đã được thực hiện trong ba lần. Phương pháp phân tích phương sai

(ANOVA) với kiểm định LSD được sử dụng để xác định sự khác biệt ý nghĩa

(p<0.05) giữa các trung bình.

SVTH: Võ Thị Vi 42 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

2.4 Sơ đồ quy trình thực nghiệm

2.4.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Sơ đồ 2.1: Bố trí thí nghiệm tổng quát

Hạt quả bơ

Độ ẩm Nghiền

Hàm lượng tro

Xác định Mẫu (dạng bột)

n-hexan metanol etylaxetat Chiết Soxhlet

Dung dịch chiết

Lôi cuốn hơi nước

Dịch thu được Đo GC/MS

Khảo sát tối ưu Xác định thành phần hóa học

Dịch tối ưu

Khuếch tán đĩa

Thử nghiệm trên mẫu PTN (vi sinh)

Đếm tổng số VKHK

Thử nghiệm trên mẫu (Nước thải)

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của hạt quả bơ

SVTH: Võ Thị Vi 43 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

2.4..2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ ẩm

Sơ đồ 2.2: Bố trí xác định độ ẩm

Mẫu (sau khi xử lý)

Sấy ở các nhiệt độ khác nhau

300C 400C 500C

Thời gian sấy lần lượt là 15h, 20h, 25h

Xác định độ ẩm

Chọn nhiệt độ sấy thích hợp

SVTH: Võ Thị Vi 44 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

2.4.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn dung môi và thời gian tối ưu cho quá

trình tách chiết

Sơ đồ 2.3: Bố trí thí nghiệm chọn dung môi và thời gian tối ưu cho

quá trình tách chiết

Mẫu đã sấy (tối ưu)

Chiết soxhlet (3 dung môi)

Etyl axetat n-hexan Methanol

4 giờ 10 giờ 6 giờ 8 giờ

Dịch chiết thu được tối ưu

SVTH: Võ Thị Vi 45 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

2.4.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính kháng khuẩn có trong dịch

chiết

Sơ đồ 2.4: Bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính kháng khuẩn có trong dịch chiết

Mẫu (sau khi chiết với dung môi và thời gian tối ưu)

Xác định hoạt tính sinh học

Dịch chiết 20% Dịch chiết 40%

Mẫu đối chứng

Thử nghiệm dịch chiết trong xử lý nước thải chăn nuôi Thử tính kháng khuẩn của dịch chiết theo phương pháp kirby - bauer

SVTH: Võ Thị Vi 46 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lý

3.1.1 Kết quả xác định độ ẩm

− Chuẩn bị 3 chén sứ có kí hiệu sẵn các mẫu, các chén sứ được rửa sạch và sấy

trong tủ sấy. Sau khi sấy xong lấy ra bỏ vào bình hút ẩm cho đến khi đạt

nhiệt độ phòng thì cân khối lượng của chén sứ đến khối lượng không đổi

(m0).

− Lấy vào mỗi chén 2g bột hạt bơ theo kí hiệu của mẫu ghi trên chén sứ. Cân

cả chén và bột hạt bơ (m1). Tiến hành sấy trên tủ sấy ở nhiệt độ 1050C. Cứ

2h lại lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội rồi đem cân, làm như vậy cho

đến khi khối lượng của mẫu và chén không đổi (m2).

− Độ ẩm của mỗi mẫu được xác định theo công thức sau:

𝑚1− 𝑚2 𝑚1− 𝑚0

W = x 100

Trong đó:

𝑚0 : Khối lượng cốc (g)

m1 : Khối lượng mẫu ban đầu (g)

m2 : Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g)

W : Độ ẩm của mỗi mẫu (%)

Hình 3.1 Mẫu sau khi sấy

Độ ẩm trung bình của 3 mẫu nguyên liệu:

SVTH: Võ Thị Vi 47 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

𝑊̅ =

1 3

3 ∑ 𝑤𝑖 𝑖=1

Kết quả xác định độ ẩm trung bình của mẫu hạt bơ khô được trình bày ở

bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát độ ẩm

Độ ẩm của hạt Chén m0 (g) m1 (g) m2 (g) quả bơ (%)

Chén 1 62.033 64.038 62.706 66.43

Chén 2 64.132 66.139 64.837 64.87

Chén 3 65.368 67.401 66.071 65.42

Độ ẩm trung bình (%) 65.57

Nhận xét: Hàm lượng nước trong hạt trái bơ chiếm tỷ lệ khá cao. Độ ẩm

trung bình của hạt quả bơ cũng tương đối cao là 65.57%.

3.1.2 Kết quả xác định hàm lượng tro

Nung 3 chén sứ đã rửa sạch ở lò nung 550 – 6000C đến trọng lượng không

đổi.

Cho vào mỗi chén sứ khoảng 5gam (m1 g) mẫu bột hạt quả bơ. Cân cả chén

và mẫu m2(g). Cho vào lò nung rồi nâng nhiệt độ từ từ cho đến 550 – 6000C.

Nung cho đến khi tro trắng, nghĩa là đã loại hết các chất hữu cơ.

Hàm lượng tro được xác định theo công thức:

𝐺2− 𝐺3 𝐺

X = x 100

Trong đó: G: Khối lượng mẫu (gam)

G2 : Khối lượng chén và mẫu trước khi nung

SVTH: Võ Thị Vi 48 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

G3 : Khối lượng chén và mẫu sau khi nung

Bảng 3.2: Kết quả xác định hàm lượng tro

Hàm lượng tro Chén m1 (g) m2(g) m3 (g) (%)

Chén 1 4.999 105.192 104.182 20.20

Chén 2 5.001 106.412 105.397 20.30

Chén 3 5.003 108.939 108.939 20.99

Độ ẩm trung bình (%) 20.50

Nhận xét: Kết quả xác định cho thấy hàm lượng tro trung bình trong hạt quả

bơ là 20.50%. Kết quả phù hợp với kết quả của Lê Thị Tuyết Nga “nghiên cứu

thành phần hóa học có trong dịch chiết hạt quả bơ”.

3.2 Kết quả khảo sát điều kiện tách chiết

3.2.1 Kết quả khảo sát thời gian chiết bằng dung môi n-hexan

Cho vào erlen 300ml dung môi n-hexan, 100g bột hạt bơ gói trong giấy lọc.

Tiến hành chiết Soxhlet ở 780C theo các thời gian 4h, 6h, 8h, 10h. Với các khung

giờ thực hiện 3 lần lặp lại (đánh giá sai số).

Sau khi thu được dịch chiết, đong lấy thể tích thu được Vdịch chiết (ml). Hút

10ml dịch chiết đem cân khối lượng thu được mdịch chiết (g) và khối lượng riêng của

dịch chiết được xác định theo công thức:

ddịch chiết = mdịch chiết/10 (g/ml)

Khối lượng cao chiết được xác định theo:

mcao chiết = Vdịch chiết x (ddịch chiết - ddung môi)

𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐𝑎𝑜 𝑐ℎ𝑖ế𝑡

Phần trăm khối lượng cao chiết được xác định:

mdịch chiết

x 100 % mdc =

Từ đó, lựa chọn được thời gian tối ưu cho quá trình chiết suất đối với loại

dung môi đó. Tại thời gian này, thu được lượng dịch thu được lớn nhất.

SVTH: Võ Thị Vi 49 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Hình 3.2: Lắp ráp bộ chiết Soxhlet

Hình 3.3 Chiết Soxhlet (bên trái) và lôi cuốn hơi nước để thu hồi dung môi

(bên phải)

Kết quả thu được của thời gian chiết bằng dung môi n-hexan được trình bày

ở bảng 3.3

SVTH: Võ Thị Vi 50 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát thời gian chiết bằng dung môi n-hexan

Thời Phần trăm ddung môi 𝑉̅ dịch chiết STT gian khối lượng 𝑚̅ cao chiết (g) 𝑑̅dịch chiết (g/ml) (g/ml) (ml) (h) cao chiết (%)

1 4 39 ± 0.1a 0.660 ± 0.001c 2.95 0.195 ± 0.005b

2 6 0.6619 ± 0.002d 0.2262 ± 0.005c 3.42 38 ± 0.1c 0.655 3 8 38 ± 0.2b 0.661 ± 0.001a 0.228 ± 0.01c 3.45

a, b, c, d: Kí hiệu đánh giá sự khác biệt giữa các nghiệm thức (tham khảo thêm phụ lục c)

4 2.81 10 35 ± 0.1d 0.6603 ± 0.002b 0.1855 ± 0.1a

Nhận xét: Vậy thời gian chiết tối ưu là 8h tương ứng với khối lượng dịch

cao chiết trung bình là 0.228g sai số 3 lần lặp lại là tương đối nhỏ ± 0.01 có sự khác

biệt có ý nghĩa hoàn toàn với các khung giờ 4h và 10h, không có sự khác biệt so với

6h. Như vậy kết quả cho thấy thời gian có ảnh hưởng rõ rệt đến khối lượng cao

chiết trong dung môi n-hexan.

3.2.2 Kết quả khảo sát thời gian chiết bằng dung môi metanol

Cân 100g bột hạt bơ gói trong giấy lọc. Sau đó tiến hành chiết soxhlet ở 650C

trong 300ml dung môi methanol với các thời gian chiết là 4h, 6h, 8h, 10h. Với các

khung giờ thực hiện 3 lần lặp lại (đánh giá sai số).

Sau khi thu được dịch chiết, đong lấy thể tích thu được Vdịch chiết (ml). Hút

10ml dịch chiết đem cân khối lượng thu được mdịch chiết (g) và khối lượng riêng của

dịch chiết được xác định theo công thức:

ddịch chiết = mdịch chiết/10 (g/ml)

Khối lượng dịch cao chiết được xác định theo:

mcao chiết= Vdịch chiết x (ddịch chiết - ddung môi)

𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐𝑎𝑜 𝑐ℎ𝑖ế𝑡

Phần trăm khối lượng cao chiết được xác định:

mdịch chiết

x 100 % mdc =

Từ đó, lựa chọn được thời gian tối ưu cho quá trình chiết suất đối với loại

dung môi đó. Tại thời gian này, lượng dịch thu được lớn nhất.

SVTH: Võ Thị Vi 51 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Dịch chiết Dịch thu được

Hình 3.4 Kết quả thu được sau khi chiết (bên trái) và loại bỏ dung môi

(bên phải)

Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet trong dung môi metanol (MeOH)

môi

Phần trăm Thời ddung khối 𝑉̅ dịch chiết STT gian 𝑚̅ cao chiết (g) 𝑑̅dịch chiết (g/ml) lượng cao (ml) (g/ml) (h) chiết (%)

12.13 44 ± 0.1c 4 1 0.8124 ± 0.003b 0.9856 ± 0.004c

20.32 55 ± 0.1a 0.8203 ± 0.002a 1.6665 ± 0.004d 6 2 0.79 10.23 0.8072 ± 0.001c 0.8256 ± 0.004b 8 3 48 ± 0.2d

a, b, c, d: Kí hiệu đánh giá sự khác biệt giữa các nghiệm thức (tham khảo thêm phụ lục c)

10 52 ± 0.1b 0.8039± 0.001c 0.7228 ± 0.003a 8.99 4

Nhận xét: Vậy thời gian chiết tối ưu là 6h tương ứng với khối lượng dịch

cao thu được là 1.6665g đối với dung môi metanol. Tuy nhiên có sự chênh lệch

đáng kể sau mỗi lần lặp (>0.5) và sự khác biệt trong mỗi giờ chiết rõ rệt nghĩa là

thời gian có ảnh hưởng đến khối lượng dịch chiết.

SVTH: Võ Thị Vi 52 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

3.2.3 Kết quả khảo sát thời gian chiết bằng dung môi etyl axetat

Cân 100g bột hạt bơ gói trong giấy lọc. Sau đó tiến hành chiết soxhlet ở 850C

trong 150ml dung môi etylaxetat với các thời gian chiết là 4h, 6h, 8h, 10h. Với các

khung giờ thực hiện 3 lần lặp lại (đánh giá sai số).

Sau khi thu được dịch chiết, đong lấy thể tích thu được Vdịch chiết (ml). Hút

10ml dịch chiết đem cân khối lượng thu được mdịch chiết (g) và khối lượng riêng của

dịch chiết được xác định theo công thức:

ddịch chiết = mdịch chiết/10 (g/ml)

Khối lượng dịch cao chiết được xác định theo:

mcao chiết= Vdịch chiết x (ddịch chiết - ddung môi)

𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐𝑎𝑜 𝑐ℎ𝑖ế𝑡

Phần trăm khối lượng cao chiết được xác định:

mdịch chiết

x 100 % mdc =

Từ đó, lựa chọn được thời gian tối ưu cho quá trình chiết suất đối với loại

dung môi đó. Tại thời gian này, lượng dịch thu được lớn nhất.

Thời

Phần trăm khối

ddung môi

𝑉̅ dịch chiết

𝑚̅ cao chiết (g)

STT

gian

lượng cao chiết

𝑑̅dịch chiết (g/ml)

(g/ml)

(ml)

(h)

(%)

4

4.18

1

42 ± 0.4b

0.8902 ± 0.004b

0.4284 ± 0.004a

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet trong dung môi EtOAc

6

14.02

2

45 ± 0.3c

0.9083 ± 0.003c

1.2735 ± 0.004c

0.88

8

9.11

3

40 ± 0.1a

0.9005 ± 0.001a

0.82 ± 0.003b

10

5.17

4

43 ± 0.3b

0.8007 ± 0.003b

0.4601 ± 0.005a

a, b, c, d: Kí hiệu đánh giá sự khác biệt giữa các nghiệm thức (tham khảo thêm phụ lục c)

Nhận xét: Vậy thời gian chiết tối ưu là 6h tương ứng với khối lượng dịch

cao thu được là 1.2735g đối với dung môi etyl axetat. Thời gian chiết trong khoảng

4h và 10h không có sự khác biệt lớn nghĩa là khi thời gian tăng thêm nửa thì khối

lượng cao chiết cũng không tăng thêm. Ở khoảng thời gian là 6h khối lượng dịch

chiết thu được là lớn nhất, khi tăng thời gian lên thì khối lượng dịch không tăng.

SVTH: Võ Thị Vi 53 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Biểu đồ thể hiện khối lượng cao chiết của từng dung môi chiết với thời gian chiết khác nhau 1,8 1.665

)

1,6

1,4 1,2735

m a r g ( c ợ ư đ

u h t

0,82

n ắ c

1,2 0,9856 Methanol Etyl axetat n-hexan 1 0,8256 0,7228 0,8

0,4601

0,6 0,4284

g n ợ ư l i ố h K

0,4 0,228 0,2262 0,195 0,1855 0,2

4h

6h

8h

10h

0

Thời gian chiết soxhlet (giờ)

Biểu đồ 3.1: Biểu đồ thể hiện khối lượng dịch thu được của từng dung môi chiết với

thời gian chiết khác nhau

Dựa trên bản đồ được thể hiện, ta nhận thấy rằng khi chiết soxhlet đối với

dung môi methanol ta thu được lượng cao chiết là cao nhất, và thời gian chiết tối ưu

của dung môi methanol là 6h, tại thời điểm này lượng dịch cao chiết là cao nhất

1.665 gam. Kết quả này đều phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị Tuyết Nga “nghiên

cứu thành phần hóa học có trong dịch chiết hạt quả bơ”.

3.2.4 Kết quả khảo sát tỉ lệ khối lượng mẫu với thể tích dung môi

3.2.4.1 Trong dung môi n-hexan

Cân 100 gam bột hạt bơ (đã sấy) được gói trong giấy lọc, sau đó cho vào

lần lượt các erlen có chứa các thể tích dung môi n-hexan V1, V2, V3, V4, V5 (ml)

tương ứng 200, 240, 280, 300(ml). Mỗi một thể tích lặp lại 3 lần (đánh giá sai số).

Tiến hành lắc hỗn hợp cho thật đều trong 30 phút hoặc lắc trên máy lắc.

SVTH: Võ Thị Vi 54 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Lọc hỗn hợp sau khi lắc. Lấy phần đã lọc đem đi cân, ta được khối lượng

của cao cần phân tích.

Hút 10ml dịch chiết đem cân khối lượng thu được mđịch chiết (g) và khối

lượng riêng của dịch chiết được xác định theo:

ddịch chiết = mdịch chiết/10 (g/ml)

Khối lượng dịch cao chiết được xác định theo:

mcao chiết= Vdịch chiết x (ddịch chiết - ddung môi)

𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐𝑎𝑜 𝑐ℎ𝑖ế𝑡

Phần trăm khối lượng cao chiết được xác định:

mdịch chiết

x 100 % mdc =

Kết quả khảo sát tỉ lệ khối lượng chất chiết với thể tích dung môi n-

hexan được trình bày ở bảng 3.6

Bảng 3.6 : Kết quả khảo sát tỉ lệ khối lượng mẫu với thể tích dung môi

n-hexan

Thể tích Phần trăm khối Khối lượng mẫu Khối lượng cao chiết STT dung môi lượng cao chiết trung bình (gam) tb (gam) (ml) (%)

200 1 100.002 ± 0.01 0.24 ± 0.01a 3.63

240 2 100.005 ± 0.02 0.114 ± 0.01b 1.74

280 3 99.998 ± 0.02 0.28 ± 0.01c 4.23

a, b, c, d: Kí hiệu đánh giá sự khác biệt giữa các nghiệm thức (tham khảo thêm phụ lục c)

300 4 100.003 ± 0.02 0.007 ± 0.001d 0.107

Nhận xét: Vậy thể tích chiết thích hợp đối với dung môi n-hexan cần

dùng là 280ml tương ứng với tỷ lệ chất chiết/thể tích dung môi là 1/2.8 và ứng

với mỗi thể tích khác nhau sẽ có khối lượng cao chiết sẽ khác nhau ( nghĩa là có

sự khác biệt có ý nghĩa trong từng nghiệm thức).

3.2.4.2 Trong dung môi metanol

SVTH: Võ Thị Vi 55 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Cân 100 gam bột hạt bơ (đã sấy) được gói trong giấy lọc, sau đó cho vào

lần lượt các erlen có chứa các thể tích dung môi metanol V1, V2, V3, V4, V5 (ml)

tương ứng 200, 240, 280, 300 (ml). Mỗi một thể tích lặp lại 3 lần (đánh giá sai số).

Tiến hành lắc hỗn hợp cho thật đều trong 30 phút hoặc lắc trên máy lắc.

Lọc hỗn hợp sau khi lắc. Lấy phần đã lọc đem đi cân, ta được khối lượng

của cao cần phân tích.

Hút 10ml dịch chiết đem cân khối lượng thu được mđịch chiết (g) và khối

lượng riêng của dịch chiết được xác định theo:

ddịch chiết = mdịch chiết/10 (g/ml)

Khối lượng dịch cao chiết được xác định theo:

mcao chiết= Vdịch chiết x (ddịch chiết - ddung môi)

𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐𝑎𝑜 𝑐ℎ𝑖ế𝑡

Phần trăm khối lượng cao chiết được xác định:

mdịch chiết

x 100 % mdc =

Kết quả khảo sát tỉ lệ khối lượng mẫu với thể tích dung môi n-hexan

được trình bày ở bảng 3.7

Bảng 3.7 : Kết quả khảo sát tỉ lệ khối lượng mẫu với thể tích dung môi

metanol

Thể tích Khối lượng mẫu Khối lượng cao Phần trăm khối STT dung môi (gam) chiết (gam) lượng cao chiết(%) (ml)

200 1 100.001 ± 0.01 0.378 ± 0.06a 4.73

240 2 99.996 ± 0.02 0.54 ± 0.03b 10.47

280 3 100.007 ± 0.01 1.222 ± 0.03c 14.98

a, b, c, d: Kí hiệu đánh giá sự khác biệt giữa các nghiệm thức (tham khảo thêm phụ lục c)

300 4 100.003 ± 0.01 1.62 ± 0.03d 19.62

Nhận xét: Vậy thể tích chiết thích hợp đối với dung môi metanol cần

dùng là 300ml tương ứng với tỷ lệ chất chiết/thể tích dung môi là 1/3. Và với mỗi

SVTH: Võ Thị Vi 56 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

một lượng thể tích sẽ có lượng cao chiết là khác nhau, thể tích dung môi có ảnh

hưởng đáng kể đến lượng cao chiết.

3.2.4.2 Trong dung môi etyl axetat

Cân 100 gam bột hạt bơ (đã sấy) được gói trong giấy lọc, sau đó cho vào

lần lượt các erlen có chứa các thể tích dung môi EtOAc V1, V2, V3, V4, V5 (ml)

tương ứng 200, 240, 280, 300 (ml). Mỗi một thể tích lặp lại 3 lần (đánh giá sai số).

Tiến hành lắc hỗn hợp cho thật đều trong 30 phút hoặc lắc trên máy lắc.

Lọc hỗn hợp sau khi lắc. Lấy phần đã lọc đem đi cân, ta được khối lượng

của cao cần phân tích.

Hút 10ml dịch chiết đem cân khối lượng thu được mđịch chiết (g) và khối

lượng riêng của dịch chiết được xác định theo:

ddịch chiết = mdịch chiết/10 (g/ml)

Khối lượng dịch cao chiết được xác định theo:

mcao chiết= Vdịch chiết x (ddịch chiết - ddung môi)

𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐𝑎𝑜 𝑐ℎ𝑖ế𝑡

Phần trăm khối lượng cao chiết được xác định:

mdịch chiết

x 100 % mdc =

Kết quả khảo sát tỉ lệ khối lượng mẫu với thể tích dung môi n-hexan

được trình bày ở bảng 3.8

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tỉ lệ khối lượng mẫu với thể tích dung môi

EtOAc

Thể tích Phần trăm khối Khối lượng mẫu Khối lượng cao STT dung môi lượng cao chiết (gam) chiết(gam) (ml) (%)

200 1 100.001 ± 0.01 0.814 ± 0.01a 9.02

240 2 100.007 ± 0.02 0.72 0.378 ± 0.03b 8.02

280 3 99.996 ± 0.01 1.05 0.378 ± 0.03c 11.62

300 4 100.003 ± 0.02 1.12 0.378 ± 0.03d 12.34

SVTH: Võ Thị Vi 57 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

a, b, c, d: Kí hiệu đánh giá sự khác biệt giữa các nghiệm thức (tham khảo thêm phụ lục c)

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Nhận xét: Vậy thể tích chiết thích hợp đối với dung môi n-hexan cần

dùng là 280ml tương ứng với tỷ lệ chất chiết/thể tích dung môi là 1/2.8

Biểu đồ thể hiện tỷ lệ khối lượng mẫu và thể tích dung môi 1,8 1,62

)

1,6

m a r g ( c ợ ư đ

1,4 1,222 1,12 1,2

u h t

n ắ c

1 0,814 1,05 Methanol 0,72 0,8 n-hexan

0,6 Etyl axetat

g n ợ ư l i ố h K

0,378 0,54 0,4 0,28

0,114 0,2 0,007 0,24 0

200 240 280 300

Thể tích dung môi (ml)

Biểu đồ 3.2: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ khối lượng dịch thu được và thể tích

dung môi

Nhận xét: Dựa trên biểu đồ, ta thấy với dung môi methanol khi tăng

dung môi thì lượng cao chiết cũng tăng theo, với những loại dung môi còn lại đều

có sự biến thiên. Với dung môi methanol thể tích đạt tới 300ml thì khối lượng cao

chiết là cao nhất 1.62 gram. Nghĩa là tỷ lệ khối lượng mẫu với thể tích dung môi tối

ưu là 1/3. Những kết quả nghiên cứu này đều phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị

Tuyết Nga “nghiên cứu thành phần hóa học có trong dịch chiết hạt quả bơ”.

KẾT LUẬN: Tổng hợp tất cả các quá trình khảo sát tách chiết bằng

phương pháp chiết soxhlet thu được kết quả ta nhận thấy rằng phương pháp chiết

SVTH: Võ Thị Vi 58 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

tách bằng soxhlet đạt hiệu quả cao nhất với dung môi metanol và thời gian tách

thích hợp tương ứng là 6h với thể tích dung môi là 300ml.

Sau khi chọn được loại dung môi và thời gian chiết tối ưu, ta cố định yếu

tố này để thực hiện các bước tiếp theo trong phương pháp xác định khả năng kháng

khuẩn của dịch chiết đối với nước thải chăn nuôi.

3.3 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của dịch chiết methanol hạt quả

bơ

Sau khi chiết soxhlet với ba loại dung môi, kết quả cho thấy rằng trong dung

môi methanol cho ra khối lượng dịch thu được cao nhất. Đuổi hết dung môi, lấy

dịch chiết thuần khiết thu được đem đi đo GC/MS.

Kết quả phân tích thành phần hóa học của dịch chiết methanol của hạt quả bơ

được trình bày ở bảng 3.9

Bảng 3.9: TPHH của dịch chiết methanol hạt quả bơ

STT Tên chất CTPT %

Phenylethyl alcolhol 0.32 1 C8H10O

1,2-Propanediol, 3-methoxy- 0.35 2 C4H10O3

1,2,3,5-Cyclohexanetetrol 8.09 3 C6H12O4

3,7,11,15-Tetrametyl-2-hexadecen-1-ol 2.44 4 C20H40O

5 Beta-Santalol 0.49 C15H24O

17-Octadecen-14-yn-1-ol 3.95 6 C12H20

n-Hexandecanoic acid 3.81 7 C16H32O

17-Octadecen-14-yoic acid, methy ester 2.28 8 C18H32O

9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z) 6.34 9 C18H34O

6,9-Octadecadienoic acid, metyl ester 0.56 10 C19H34O2

11,14-Eicosatrienioc acid, methyl ester 1.32 11 C21H38O2

3-Pyrroline, 1-nitroso- 0.91 12 C4H6ON2

(Z)6-Pantadecen-1-ol 0.19 13 C15H30O

SVTH: Võ Thị Vi 59 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

14 Lauraldehyde, dimethyl acetal 0.18 C14H30O2

15 Glaucyl alcohol 0.26 C15H24O

16 (Z)6,(Z)9-Pentadecadien-1-ol 0.18 C18H34O

17 1,4-Butanediol 0.12 C4H10O2

18 Longifolenaldehyde 9.67 C15H24O

19 17-Octadecene-9,11-diynoic acid, 8-Hydroxy... 3.38 C19H28O3

20 Pentadecanoic acid, 14-methyl-,metyl ester 0.27 C17H34O2

21 8,11,14-Eicosatrienoic acid, (Z,Z,Z) 6.17 C20H34O2

22 Squalene 12.12 C30H50

Isocaryophyllene 23 0.08 C15H24

24 1,3-Dicyclopentyl-2-n-dodecylcyclopentane 25.48 C27H50

25 1H-Cyclopenta[1,3]cyclopropa[1,2]benzene... 0.12 C15H24

26 Thành phần chưa định danh 10.92

Nhận xét: Từ hạt quả bơ (Avocado seed) bằng phương pháp sắc khí

khối phổ (GC/MS) đã tìm ra được 25 loại hợp chất có trong loại hạt này. Trong đó

thành phần chiếm nhiều nhất là các loại acid béo. Có cả những cấu tử có độ phân cự

yếu đến không phân cực, bao gồm các dẫn xuất của phenol, acid mạch dài 13C –

34C và ester của chúng. Trong đó 1,3-Dicyclopentyl-2-n-dodecylcyclopentane

chiếm tỷ lệ cao nhất (25.48%) và các acid thuộc họ acid Stearic như : Squalene

(12.12%), 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z) chiếm 6.34%; 8,11,14-Eicosatrienoic

acid, (Z,Z,Z) chiếm 6.17%. Với sự có mặt của một số thành phần như dẫn xuất của

phenol, acid hữu cơ góp phần giải thích cho hoạt tính kháng khuẩn tốt của dịch

chiết hạt trái bơ. Kết quả nghiên cứu này đều hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của

Lê Thị Tuyết Nga “nghiên cứu thành phần hóa học có trong dịch chiết hạt quả bơ”.

3.4 Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn được kiểm định theo phương pháp khuếch tán đĩa

thạch theo phương pháp Mc Farland (Kirby và Bauer, 1997) và có chỉnh sữa.

SVTH: Võ Thị Vi 60 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Mẫu 20% & 40%

Đối chứng (-) _-

Hình 3.5 Bao gói dụng cụ, môi trường chuẩn bị thao tác hấp

Hình 3.6 Tác dụng kháng Salmonella của dịch chiết hạt trái bơ (bên phải sau

khi đổ dịch chiết vào lỗ thạch)

SVTH: Võ Thị Vi 61 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Hình 3.7 Tác dụng kháng Staphylococcus aureus của dịch chiết hạt trái bơ

(bên phải sau khi đổ dịch chiết vào lỗ thạch)

Hình 3.8 Tác dụng kháng Pseudomonas của dịch chiết hạt trái bơ (bên phải

sau khi đổ dịch chiết vào lỗ thạch)

Hình 3.9 Tác dụng kháng E.Coli của dịch chiết hạt trái bơ (bên phải sau khi

đổ dịch chiết vào lỗ thạch

SVTH: Võ Thị Vi 62 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Các chủng vi khuẩn thử nghiệm Mẫu E.Coli Salmonella Stephylococcus Pseudomonas

Mẫu

1

Mẫu

2

Mẫu

3

Hình 3.10: Vòng vô khuẩn tạo ra trên các chủng thí nghiệm khi xử lý với dịch chiết

hạt trái bơ

Kết quả khảo sát tác dụng kháng khuẩn của dung dịch chiết từ hạt quả bơ

được trình bày ở bảng 3.10

SVTH: Võ Thị Vi 63 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Bảng 3.10: Kết quả quả đo vòng kháng khuẩn trung bình đối với các chuẩn

vi khuẩn trong từng mẫu của dung dịch chiết từ hạt trái bơ

Bán kính vòng ức chế (mm) Dung

Thể tích dịch

(Nghiệm 100𝜇L/đĩa E.coli Salmonella Staphylococcus Pseudomonas

thức)

6 ± 0.5 6 ± 0.6 6 ± 0.5 6 ± 0.6

6 ± 0.4 5.67 ± 0.4 8.67 ± 0.4 6.2 ± 0.6 Dịch

5.67 ± 0.4 8.67 ± 0.5 5± 0.6 4.67 ± 0.5 chiết 20%

- - - -

6.2 ± 0.4 7.67 ± 0.6 6.67 ± 0.6 7 ± 0.4

6.2 ± 0.5 7 ± 0.4 8.67 ± 0.6 5.67 ± 0.5 Dịch

7 ± 0.6 8.67 ± 0.6 6 ± 0.6 7.67 ± 0.6 chiết 40%

- - - - 𝑀1̅̅̅̅ 𝑀2̅̅̅̅ 𝑀3̅̅̅̅ Đối chứng 𝑀1̅̅̅̅ 𝑀2̅̅̅̅ 𝑀3̅̅̅̅ Đối chứng

SVTH: Võ Thị Vi 64 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Bảng 3.11: Kết quả đo vòng vô khuẩn trung bình đối với các chuẩn vi khuẩn khi xử

lý bằng dịch chiết hạt trái bơ

Bán kính vòng ức chế (mm) Dung

Thể tích dịch

(Nghiệm 100𝜇L/đĩa E.coli Salmonella Staphylococcus Pseudomonas

thức)

Dịch chiết Mẫu 5.5556± 0.7a 5.7711± 0.7a 7.7867 ± 0.7b 5.7578 ± 0.7a

- - - 20% Đối chứng -

Dịch chiết Mẫu 6.7156± 0.6ab 7.2189± 0.6b 8.0411 ± 0.6c 6.2267 ± 0.6a

- - 40% Đối chứng - -

Đánh giá khả năng

kháng khuẩn của dịch (+) (++) (+) (++)



a, b, c, d: Kí hiệu đánh giá sự khác biệt giữa các nghiệm thức (tham khảo thêm phụ lục c)

 Đối chứng (-): lỗ thạch rỗng (không sử dụng dịch chiết)



(+): ức chế rất yếu / (++): ức chế yếu / (-): không ức chế

chiết

Nhận xét: Dung dịch chiết 20% có khả năng ức chế cả bốn loại vi khuẩn

trên ở thể tích thử nghiệm là 100𝜇L/đĩa. Ức chế hiệu quả sự sinh trưởng của vi

khuẩn hiếu khí Staphylococcus aureus và chủng Salmonella (bán kính vòng vô

khuẩn >7mm). Sự kháng khuẩn tạo ra sự khác biệt có ý nghĩa lớn nhất đối với

chủng Stephylococcus aureus, còn đới với các chủng còn lại không tạo ra sự

khác biệt lớn. Vòng kháng khuẩn lớn nhất có đường kính 8.67 mm. Trung bình

vòng kháng khuẩn tạo ra đối với dịch chiết 20% là 7.78mm..

Dung dịch chiết 40% cho thấy có khả năng ức chế sự sinh trưởng của các

vi khuẩn trên và đặc biệt là ức chế mạnh hơn đối với dịch chiết 20%. Vòng kháng

khuẩn lớn nhất có đường kính 8.67mm. Trung bình vòng kháng khuẩn tạo ra đối với

dịch chiết 40% là 8.0411mm.

SVTH: Võ Thị Vi 65 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Vậy có thể kết luận rằng dịch chiết của hạt quả bơ có khả năng kháng tất

cả các chủng loại thử nghiệm trên. Có thể lý giải cho kết quả trên như sau:

Cơ chế kháng khuẩn được thể hiện rõ như sau:

 Trong thành phần dịch chiết hạt quả bơ có nhiều dẫn xuất phenol. Vị trí

và số lượng của các nhóm hydroxyl (-OH) trên vòng phenol được cho là

có liên quan đến độc tính của dịch chiết đối với các chủng vi khuẩn.

Trong hạt quả bơ có còn chứa các hợp chất của Flavonoid ( thuộc

nhóm chất của phenol phức tạp). Đây là nhóm chất oxy hóa chậm. Ngoài ra, Các

flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn cao do chúng có khả năng tạo phức với các

protein ngoại bào và thành tế bào của vi khuẩn.

Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của flavonoid được giải thích như sau:

 Flavonoid ức chế transpeptidaza làm cho mucopeptit – yếu tố đảm bảo

cho hình thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được.

 Gắn lên màng sinh nguyên chất của vi khuẩn, làm thay đổi làm thay

đổi tính thẩm thấu chọn lọc của màng sinh nguyên chất. Vì vậy làm

cho một số chất cần thiết cho đời sống vi khuẩn như nucleotit,

pyrimidin, purin lọt qua màng sinh nguyên chất ra ngoài.

 Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn theo hai kiểu:

Phong tỏa mạch peptit của vi khuẩn bằng cách phong tỏa transferaza

chuyển axit amin từ ARN vào mạch không kéo dài thêm được hoặc tạo

ra protein bất thường không có tác dụng đối với đời sống của vi khuẩn,

làm chúng không sử dụng được.

 Ức chế tổng hợp axit nucleic

 Flavonoid có thể tác dụng vào AND khuôn, ức chế tổng hợp ARN của

vi khuẩn.

 Ngoài ra, trong thành phần của hạt quả bơ chứa nhiều loại acid béo, trong

đó đáng chú ý đến nhất là Squalene ( hợp chất của hydrocacbon) có khả

năng chống lại sự sinh trưởng của những loại vi khuẩn. Nhờ liên kết

SVTH: Võ Thị Vi 66 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

trong lipoprotein để tạo ra lipofuscin – một chất có khả năng ngăn ngừa

sự hành thành các gốc tự do.

3.5 Kết quả kiểm tra mẫu nước thải chăn nuôi

3.5.1 Kết quả đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí

Mẫu nước thải chăn nuôi được lấy sau xử lý tại trang trại chăn nuôi heo

Phước Long (Xã Nguyễn Văn Cội, Củ Chi, Tp Hồ Chí Minh).

Nước thải đem về được pha loãng theo cơ số 10 (10-1, 10-2, 10-3). Thực hiện

phương pháp đổ đĩa trên môi trường thạch.

Mẫu Các độ pha loãng mẫu nước thải

10-1 10-2 10-3

𝑀1̅̅̅̅

𝑀2̅̅̅̅

SVTH: Võ Thị Vi 67 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

𝑀3̅̅̅̅

𝑀4̅̅̅̅

Hình 3.11 : Vi khuẩn hiếu khí mọc lên sau 24h nuôi cấy

Bảng 3.12: Kết quả tính trung bình số lượng vi khuẩn hiếu khí có trong 1ml mẫu

Mẫu

Tổng số

Số lượng vi khuẩn

Độ pha loãng

(Nghiệm thức)

khuẩn lạc

hiếu khí (A) cfu/ml

10-1

574

𝑀1̅̅̅̅

10-2

481

50x102

10-3

64

10-1

570

𝑀2̅̅̅̅

10-2

472

48x102

10-3

32

nước thải (A)

Nhận xét: Số lượng vi khuẩn hiếu khí trong mẫu nước thải tương đối nhiều,

tuy nhiên sau mỗi độ pha loãng đã giảm đi nhiều, cụ thể ở độ pha loãng 10-3 khuẩn

lạc hầu như không mọc lên.

3.5.2 Kết quả phân tích tổng số Coliform

SVTH: Võ Thị Vi 68 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Phương pháp xác suất cực đại MPN (Most possible number) là phương pháp

kết hợp với phương pháp thống kê cho ta con số vi khuẩn nhiều nhất có thể trong

100ml mẫu nước giới hạn tin cậy trên và dưới.

Ba hệ thống dùng trong thí nghiệm đều không tìm thấy con số nào thích hợp

trong bảng MPN, có thể vì mẫu nước còn bị ô nhiếm nặng, nên ta có thể pha loãng

mẫu nước thành các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3. Khi đó kết quả tính được là con số trên

bảng MPN nhân với 100.

Khi tiến hành thí nghiệm giả định trên môi trường Lactose Borth có ống

durham, sau 24h nuôi cấy quan sát thì thấy có sự sinh khí kết luận ống dương tính

(dương tính +).

Sau đó tiến hành cấy các ống dương tính vào môi trường BGBL để tiến hành

thí nghiệm giả định.

SVTH: Võ Thị Vi 69 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Hiện tượng kết luận dương Môi Thí Mẫu ban đầu Mẫu sau 24h nuôi cấy tính trường nghiệm

Thí

LB nghiệm

giả định

(đục môi trường và sinh khí)

Thí

BGBL nghiệm

xác định

(đục môi trường)

SVTH: Võ Thị Vi 70 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Bảng 3.12: kết quả sau 24h nuôi cấy và quan sát được hiện tượng

SVTH: Võ Thị Vi 71 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Kết quả thu được từ mỗi dãy thí nghiệm

Dãy 1: + + +

Dãy 2: + + -

Dãy 3: - - -

Kết quả đọc được từ bảng MPN là : 93x 100 = 9300 /100ml

Nhận xét: QCVN 40:2011/BTNMT tổng số Coliform còn trong mẫu nước thải

(3000 MPN/100ml theo cột A, 5000 MPN/100ml theo cột B), tuy nhiên mẫu nước

phân tích 7500 MPN/100ml chưa đạt theo quy chuẩn.

3.5.3 Kết quả phân tích Escherichia Coli có trong mẫu nước thải

Từ các ống nghiệm dương tính ở thí nghiệm giả định xác định Coliform đem

cấy truyền vào các ống nghiệm có chứa môi trường BW và ủ trong vòng 24 – 48h đem

đi tiến hành thí nghiệm sinh hóa.

Vì đề tài làm với quy mô trong phòng thí nghiệm của nhà trường nên chỉ xét thí

nghiệm Indol để xác rồi đọc kết quả theo bảng MPN.

Nhỏ vài giọt thuốc thử kovac’s có màu vàng nhạt vào ống nghiệm dương tính.

Thuốc thử đổi màu thành một vòng đỏ sậm trên bề mặt. Kết luận ống dương tính, có

Ecoli Escherichia.

SVTH: Võ Thị Vi 72 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Hình 3.12: Thử nghiệm xác định E.Coli bằng xét nghiệm sinh hóa

Sau khi xét thí nghiệm sinh hóa để xác định sự hiện diện của E.Coli ta dùng

bảng tra thống kê Mac Crady và nhân với 100 (vì pha loãng đi 100 lần).

Kết quả xét nghiệm sinh hóa như sau:

Dãy 1: + + +

Dãy 2: + + + Tra bảng MPN : 240 x 100 = 2400 vi khuẩn E.Coli/100ml nước

thải

Dãy 3: + - -

3.6 Kết quả thử nghiệm dịch chiết hạt quả bơ trong xử lý nước thải chăn nuôi

Kết quả thử nghiệm xử lý vi khuẩn hiếu khí của hạt quả bơ của dịch chiết trong

nước thải chăn nuôi đã cho thấy: Sau 24h nuôi cấy, số lượng vi khuẩn hiếu khí và yếm

khí ở các mẫu tại các nồng độ dung dịch chiết 20% và 40%.

SVTH: Võ Thị Vi 73 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Dịch Độ pha loãng dịch chiết với nước thải chăn nuôi Thạch nuôi chiết cấy 10-1 10-2 10-3 (%)

Thạch 40% Macconkey

Thạch 40% Thường

Thạch 20% Macconkey

SVTH: Võ Thị Vi 74 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Thạch 20% thường

SVTH: Võ Thị Vi 75 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Hình 3.13: Khuẩn lạc mọc sau 24h nuôi cấy trên các môi trường khi xử lý

với dịch chiết 20% và 40% được hòa trộn cùng với nước thải

Bảng 3.13: Kết quả tính số lượng trung bình vi khuẩn hiếu khí trên các đĩa

Số lượng khuẩn

Ký hiệu Nồng độ lạc trung bình có Thạch nuôi dịch pha loãng Đĩa 1 Đĩa 2 trong 1ml mẫu cấy chiết nước thải (A) mẫu

cfu/ml

63 ± 5 83 ± 4 730 =7.3x102 10-1

10-2 - N1 (20%)

10-3 - 50x102 -

ĐC -

Thạch

10-1 thường 52 ± 4 32 ± 5 420=4.2x102

10-2 - - N2 (40%)

10-3 - -

ĐC 50x102

10-1 39 ± 5 46 ± 3 425 = 4.25x102

10-2 - - N1 (20%)

10-3 - -

ĐC 40x102 Thạch

Macconkey 10-1 22 ± 4 19 ± 5 205 = 2.05x102

10-2 - - N2 (40%)

10-3 - -

ĐC 40x102

SVTH: Võ Thị Vi 76 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Nhận xét: Dung dịch chiết hạt trái bơ có tác dụng kháng khuẩn tốt với vi

khuẩn hiếu khí có trong nước thải chăn nuôi được lấy sau bể Biogas và qua hệ

thống sàn lọc. Trong đó dịch chiết 40% có tác dụng mạnh nhất và đạt được hiệu quả

cao trên môi trường thạch Macconkey. Với số lượng vi khuẩn hiếu khí giảm đi đáng

kể so với mẫu đối chứng.

Hiệu suất đạt được đối với từng dịch chiết tính được như sau:

+ Môi trường là thạch thường

𝑀ẫ𝑢 đầ𝑢 𝑣à𝑜 (𝑚ẫ𝑢 đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔)−𝑀ẫ𝑢 đầ𝑢 𝑟𝑎 (𝑚ẫ𝑢 𝑠𝑎𝑢 𝑘ℎ𝑖 đượ𝑐 𝑥ử 𝑙ý 𝑣ớ𝑖 𝑑ị𝑐ℎ 𝑐ℎ𝑖ế𝑡)

 Dịch chiết 20%:

H =

x100

𝑀ẫ𝑢 đầ𝑢 𝑣à𝑜 (𝑚ẫ𝑢 đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔)

=

= 85.4%

50𝑥102−7.3𝑥102 50𝑥102

𝑀ẫ𝑢 đầ𝑢 𝑣à𝑜 (𝑚ẫ𝑢 đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔)−𝑀ẫ𝑢 đầ𝑢 𝑟𝑎 (𝑚ẫ𝑢 𝑠𝑎𝑢 𝑘ℎ𝑖 đượ𝑐 𝑥ử 𝑙ý 𝑣ớ𝑖 𝑑ị𝑐ℎ 𝑐ℎ𝑖ế𝑡)

 Dịch chiết 40%:

H =

x100

𝑀ẫ𝑢 đầ𝑢 𝑣à𝑜 (𝑚ẫ𝑢 đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔)

=

= 91.6%

50𝑥102−4.2𝑥102 50𝑥102

𝑀ẫ𝑢 đầ𝑢 𝑣à𝑜 (𝑚ẫ𝑢 đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔)−𝑀ẫ𝑢 đầ𝑢 𝑟𝑎 (𝑚ẫ𝑢 𝑠𝑎𝑢 𝑘ℎ𝑖 đượ𝑐 𝑥ử 𝑙ý 𝑣ớ𝑖 𝑑ị𝑐ℎ 𝑐ℎ𝑖ế𝑡)

+ Môi trường là thạch Macconkey

H =

x100

𝑀ẫ𝑢 đầ𝑢 𝑣à𝑜 (𝑚ẫ𝑢 đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔)

=

= 89.375%

40𝑥102−4.25𝑥102 40𝑥102

𝑀ẫ𝑢 đầ𝑢 𝑣à𝑜 (𝑚ẫ𝑢 đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔)−𝑀ẫ𝑢 đầ𝑢 𝑟𝑎 (𝑚ẫ𝑢 𝑠𝑎𝑢 𝑘ℎ𝑖 đượ𝑐 𝑥ử 𝑙ý 𝑣ớ𝑖 𝑑ị𝑐ℎ 𝑐ℎ𝑖ế𝑡)

 Dịch chiết 40%:

H =

x100

𝑀ẫ𝑢 đầ𝑢 𝑣à𝑜 (𝑚ẫ𝑢 đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔)

=

= 94.875%

40𝑥102−2.05𝑥102 40𝑥102

SVTH: Võ Thị Vi 77 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Biểu đồ so sánh hiệu quả % dịch chiết và môi trường nuôi cấy

94,875 96

94

89,375

92

c ợ ư đ

91,6 90

88

u h t t t ấ u s

86 Hiệu suất trên Thạch thường 85,4 84

u ệ i H

82 Hiệu suất trên Thạch Macconkey

80

78

76

20% 40%

% dịch chiết

Biểu đồ 3.3: Biểu đồ thể hiện hiệu suất phần trăm dịch chiết khi xử lý

và môi trường nuôi cấy

Nhận xét: Trên biểu đồ cho ta thấy rằng dịch chiết 40% có hiệu suất cao hơn

dịch chiết 20% và môi trường nuôi cấy trên thạch Macconkey có hiệu quả cao hơn

thạch thường. Hiệu suất xử lý cao nhất đối với dịch chiết 40% đạt được 94.875%.

Như vậy, có thế kết luận rằng dịch chiết hạt quả bơ có khả năng kháng vi khuẩn

hiếu khí trên tất cả các môi trường thử nghiệm và đều cho hiệu suất tương đối cao

H >80%.

Kết quả này so với kết quả nghiên cứu đánh giá khả năng kháng khuẩn của

dịch chiết hạt Moringa oleifera đối với một số vi khuẩn trong nước thải chuồng lợn

được đăng trên tạp chí khoa học và phát triển (2012). Kết quả của hai bài nghiên

cứu này đều cho thấy dịch chiết của hai loại hạt đều có khả năng kháng khuẩn và

kháng mạnh đối với các vi khuẩn hiếu khí. Tuy nhiên so với dịch chiết cây chùm

ngây thì dịch chiết hạt quả bơ kháng khuẩn yếu hơn, cụ thể là đối với dịch chiết cây

SVTH: Võ Thị Vi 78 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

chùm ngây số lượng vi khuẩn hiếu khí giảm đi rất nhiều lần (100 – 200 lần) so với

mẫu đối chứng (không sử dụng dịch chiết), trong khi dịch chiết hạt quả bơ khi xử lý

với vi khuẩn hiếu khí số lượng chỉ giảm 10 đến 20 lần so với mẫu đối chứng.

Có thể thấy rằng trong thành phần hóa học của dịch chiết hạt quả bơ chứa các

chất có khả năng chống lại các chủng vi khuẩn, nhưng so với cây chùm ngây thì độ

kháng khuẩn không mạnh hơn, giải thích cho lý do này là vì trong cây chùm ngây

được nghiên cứu đã tìm ra được hơn 46 thành phần hóa học có trong dịch chiết,

trong đó các thành chủ yếu như là chất pterygospermin là một trụ sinh (antibiotic)

rất mạnh, hợp chất quý hiếm như zeatin, quercetin, alpha-sitosterol, caffeoylquinic

acid và kaempferol. Các hợp chất này đã được minh chứng rằng có khả năng diệt

khuẩn tốt đối với Staphylococcus, Shigella và Pseudomonas aerogenosa.

Trong khi thành phần hóa học trong dịch chiết hạt bơ có đến hơn 10% các chất chưa

được định danh. Mặc dù được tìm thấy nhiều hợp chất của phenol và các aicd có

khả năng khử các gốc tự do và kiềm hãm sự phát triển của các chủng vi khuẩn,

virus có hại nhưng thành phần của những hợp chất không nhiều.

SVTH: Võ Thị Vi 79 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Bằng phương pháp chiết soxhlet với ba loại dung môi trong các khung giờ

thời gian đã cho thấy rằng với dung môi methanol ta thu được dung dịch chiết hạt

quả bơ là cao nhất và chiết trong khoảng thời gian 6 giờ thì hiệu suất đạt cao nhất

so với hai loại dung môi là n-hexan và etyl axetat và khối lượng dịch thu được tối

ưu là 1.665 g/100g chất khô.

Hơn 25 hợp chất được tìm thấy trong đó thành phần chính là các hợp chất

của các axit béo và dẫn suất của hợp chất Flavonol (thuộc nhóm phenol phức

tạp).

Trong thí nghiệm xác định khả năng kháng khuẩn, cho thấy dịch chiết hạt

quả bơ 20% và 40% đều có khả năng kháng các chủng vi khuẩn: E.Coli, salmonella,

Stephylococcus aureus và Pseudomonas. Trong đó dịch chiết 40% kháng mạnh

hơn dịch chiết 20% và kháng mạnh nhất đối với vi khuẩn Stephylococcus. Đường

kính vòng vô khuẩn tạo ra lớn nhất là 8.67mm. Đều này cho thấy rằng dung dịch

chất chiết hạt quả bơ có chứa thành phần các acid có khả năng kiềm hãm sự phát

triển của các loại vi khuẩn.

Dung dịch chiết hạt quả bơ có tác dụng kháng khuẩn tốt với vi khuẩn hiếu

khí trong nước thải chăn nuôi sau hầm Biogas và hệ thống sàn lọc.

Với phương pháp xử lý nước thải chăn nuôi bằng dung dịch chiết hạt quả bơ

đã cho kết quả thấy rằng dung dịch chiết 40% có khả năng xử lý hiệu quả tốt hơn

dung dịch chiết 20%, và tác dụng tốt hơn khi được nuôi cấy trên môi trường là

thạch macconkey. Số lượng vi khuẩn hiếu khí đã giảm đi rõ rệt (giảm đi từ 10 – 20

so với các mẫu đối chứng (không sử dụng dịch chiết hạt quả bơ).

SVTH: Võ Thị Vi 80 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Kiến nghị

Đề tài nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết hạt quả bơ là bước

đầu nghiên cứu cho kết quả khả quan về khả năng kháng năng diệt vi khuẩn hiếu

khí có trong nước thải chăn nuôi.

Khuyến khích các nghiên cứu đi sâu thêm vào phương pháp khảo sát với các

loại dumg môi và nghiên cứu thành phần hóa học có trong từng loại dịch chiết với

từng loại dung môi khác nhau.

Mục tiêu lâu dài cần được hướng tới trong đề tài này là ứng dụng được dung

dịch chiết hạt quả bơ vào trong thực tiễn. Có thể hướng tới sản xuất dung dịch có

tác dụng như một chất dùng trong phương pháp khử trùng nguồn nước thải.

Khuyến khích các nghiên cứu sau này phát huy đề tài hơn nửa. Trên cơ sở

kết quả đạt được trong bài nghiên cứu này sẽ góp phần phục vụ cho nghiên cứu tiếp

theo.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Francisco Segovia Gómez; Sara Peiró Sánchez; Maria Gabriela Gallego Iradi;

Nurul Aini Mohd Azman; María Pilar Almajano (2014). Extraction optimization

and possible use as antioxidant in food.

2. Camberos, Eduardo; MartÃnez-Velázquez, Moisés; Flores-Fernández,

José Miguel; Villanueva-RodrÃguez, Socorro (2013). Acute toxicity and

genotoxic activity of avocado seed extract.

3. Dabas D1, Shegog RM, Ziegler GR, Lambert JD (2013). Avocado seed as a

source of bioactive.

4. Raymond Chia, Teck Wah; Dykes, Gary A (2010). Antimicrobial activity of

crude epicarp and seed extracts from mature avocado fruit (persea american) of

three cultivars.

SVTH: Võ Thị Vi 81 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

5. Sutheimer, Susan; Caster, Jacqueline M.; Smith, Simone H (2015). An extraction

and saponification of Avocado oil.

6. Pahua-Ramos, MarÃa Elena; Ortiz-Moreno, Alicia; Chamorro-Cevallos,

Germán; Hernández-Navarro, MarÃa Dolores; Garduño-Siciliano, Leticia;

(2012). Hypolipidemic effect of avocado (Persea americana Mill) seed in a

hypercholesterolemic mouse model.

7. Yaakobovich, Y; Neeman, I (1983). Partial isolation and characterisation of a

hemagglutinating factor from avocadoseed.

8. Werman, M J; Mokady, S; Nimni, M E; Neeman (1991). The effect of

various avocado oils on skin collagen metabolism.

9. Blumenfeld, A; Gazit (1970). Cytokinin Activity in Avocado Seeds during Fruit

Development.

10. Nguyễn Văn Thọ (2003). Sự phân tán và khả năng phát triển của một số trứng

giun, sán lợn qua hệ thống Biogas. Khoa học Kỹ thuật Thú y, số 3, trang 22-27.

11. Trịnh Quang Tuyên, Nguyễn Quế Côi, Nguyễn Thị Bình, Nguyễn Tiến Thông,

và Đàm Tuấn Tú (2010). Thực trạng ô nhiễm môi trường và xử lý chất thải trong

chăn nuôi lợn trang trại tập trung, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Chăn nuôi, số

23, trang 55-62.

12. Vũ Đình Tôn, Lại Thị Cúc, Nguyễn Văn Duy, Đặng Vũ Bình (2008). Chất

lượng nước dùng trong trang trại chăn nuôi lợn vùng đồng bằng Sông Hồng. Tạp

chí Khoa học và Phát triển – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, tập 6, số 3, trản

279 – 283.

13. Nguyễn Văn Đức (2002). Phương Pháp kiểm tra thống kê sinh học. Khoa học

Kỹ thuật.

SVTH: Võ Thị Vi 82 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

14. Tài liệu giảng dạy Thực hành vi sinh môi trường (biên soạn ThS.Lê Thị Vu Lan

và cộng sự). Trường Đại học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh, khoa Công nghệ

sinh học – thực phẩm – môi trường.

15. Tài liệu giảng dạy Các phương pháp phân lập và nuôi cấy vi sinh vật. Thư viện

Hutech.

SVTH: Võ Thị Vi 83 GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A : MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THUỐC THỬ DÙNG ĐỂ NUÔI

CẤY VI SINH VẬT

1. Thạch thường

Pepton 10g

NaCl 5g

Agar 20g

Cao thịt 4g

Nước cất 1000ml

− Đun tan môi trường thường

− pH = 7,6 ± 0,2. Hấp ướt tới 1210C/15 phút. Trước khi dùng, để môi trường ở

500C.

− Để nguội 45 – 500C đổ đĩa (15 – 20ml/đĩa)

2. Macconkey

Thạch macconkey 50g

Nước cất 1000ml

− Khuấy đều cho tan hết môi trường macconkey

− pH = 7,1 ± 0,2. Hấp ướt tới 1210C/15 phút. Trước khi dùng, để môi trường ở

500C.

− Để nguội 45 – 500C đổ đĩa (15 – 20ml/đĩa)

3. Môi trường NA (Nutrient Agar)

Pepton 5g

NaCl 5g

SVTH: Võ Thị Vi a GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Cao thịt 1.5g

Cao nấm men 1.5g

Agar 15g

Nước cất 1000ml

− Đun tan môi trường NA

− pH = 7,4 ± 0,2. Hấp ướt tới 1210C/15 phút. Trước khi dùng, để môi trường ở

500C.

− Để nguội 45 – 500C đổ đĩa (15 – 20ml/đĩa)

4. Môi trường NB (Nutrient Broth)

Pepton 5g

NaCl 5g

Cao thịt 1.5g

Cao nấm men 1.5g

Nước cất 1000ml

− Đun tan môi trường NA

− pH = 7,6 ± 0,2. Hấp ướt tới 1210C/15 phút. Trước khi dùng, để môi trường ở

500C.

− Để nguội 45 – 500C đổ ống nghiệm

5. Môi trường PCA (Plate Count Agar)

Thạch PCA 23.5g

Nước cất 1000ml

− Đun tan môi trường PCA

− pH = 7,6 ± 0,2. Hấp ướt tới 1210C/15 phút. Trước khi dùng, để môi trường ở

500C.

− Để nguội 45 – 500C đổ đĩa (15 – 20ml/đĩa)

SVTH: Võ Thị Vi b GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

6. Môi trường LB (Latose Broth)

Latose Broth 13g

Nước cất 1000ml

− Khuấy đều cho tan hết môi trường LB

− pH = 7,6 ± 0,2. Hấp ướt tới 1210C/15 phút. Trước khi dùng, để môi trường ở

500C.

− Để nguội 45 – 500C đổ ống nghiệm

7. Môi trường BGBL (Brilliant Green Lactose Bile Salt)

BGBL 10g

Nước cất 1000ml

− Khuấy đều cho tan hết môi trường LB

− pH = 7,4 ± 0,2. Hấp ướt tới 1210C/15 phút. Trước khi dùng, để môi trường ở

500C.

− Để nguội 45 – 500C đổ ống nghiệm

8. Môi trường PW (Pepton Water)

PW 20g

Nước cất 1000ml

− Khuấy đều cho tan hết môi trường LB

− pH = 7,6 ± 0,2. Hấp ướt tới 1210C/15 phút. Trước khi dùng, để môi trường ở

500C.

− Để nguội 45 – 500C đổ ống nghiệm

SVTH: Võ Thị Vi c GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

PHỤ LỤC B: BẢNG THỐNG KÊ MPN MAC CRADY

Bảng tra mpn dùng cho loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp

Số lượng ống dương tính Số Số lượng ống dương tính Số

MPN/100ml MPN/100ml Số ml mẫu sử dụng Số ml mẫu sử dụng

10 0,1 10 0,1 1 1

0 0 0 - 0 2 0 9

0 1 0 3 0 2 1 14

0 2 0 6 0 2 2 20

0 3 0 9 0 2 3 26

1 0 0 3 1 2 0 15

1 1 0 6 1 2 1 20

1 2 0 9 1 2 2 27

1 3 0 12 1 2 3 34

2 0 0 6 2 2 0 21

2 1 0 9 2 2 1 28

2 2 0 12 2 2 2 35

2 3 0 16 2 2 3 42

3 0 0 9 3 2 0 29

3 1 0 13 3 2 1 36

3 2 0 16 3 2 2 44

3 3 0 19 3 2 3 53

0 0 1 4 0 3 0 23

0 1 1 7 0 3 1 39

0 2 1 11 0 3 2 64

0 3 1 15 0 3 3 95

1 0 1 7 1 3 0 43

1 1 1 11 1 3 1 75

1 2 1 15 1 3 2 120

SVTH: Võ Thị Vi d GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

1 1 3 19 3 1 3 160

1 2 0 11 3 2 0 93

1 2 1 15 3 2 1 150

1 2 2 20 3 2 2 210

1 2 3 24 3 2 3 290

1 3 0 16 3 3 0 240

1 3 1 20 3 3 1 460

1 3 2 24 3 3 2 1100

1 3 3 29 3 3 3 -

Bảng tra mpn dùng cho loạt 5 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp

Số lượng ống dương tính Số Số lượng ống dương tính Số

MPN/100ml MPN/100ml Số ml mẫu sử dụng Số ml mẫu sử dụng

10 0,1 10 0,1 1 1

0 0 0 0 4 0 2 20

0 0 1 2 4 0 3 25

0 0 2 4 4 1 0 17

0 1 3 2 4 1 1 20

0 1 0 4 4 1 2 25

0 1 1 6 4 2 0 20

0 2 2 4 4 2 1 25

0 2 3 6 4 2 2 30

0 3 0 6 4 3 0 25

1 0 1 2 4 3 1 35

1 0 2 4 4 3 2 40

1 0 3 6 4 4 0 35

1 0 0 8 4 4 1 40

1 1 1 4 4 4 2 45

SVTH: Võ Thị Vi e GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

1 1 2 6 4 5 0 40

1 1 3 8 4 5 1 50

1 2 0 6 4 5 2 55

1 2 1 8 5 0 0 25

1 2 2 10 5 0 1 30

1 3 0 8 5 0 2 45

1 3 1 10 5 0 3 60

1 4 0 11 5 0 4 75

2 0 0 5 5 1 0 35

2 0 1 7 5 1 1 45

2 0 2 9 5 1 2 65

2 0 3 12 5 1 3 85

2 1 0 7 5 1 4 115

2 1 1 9 5 2 0 50

2 1 2 12 5 2 1 70

2 2 0 9 5 2 2 95

2 2 1 12 3 2 3 120

2 2 2 14 5 2 4 150

2 3 0 12 5 2 5 175

2 3 1 14 5 3 0 80

2 4 0 15 5 3 1 110

3 0 0 8 5 3 2 140

3 0 1 11 5 3 3 175

3 0 2 13 5 3 4 200

3 1 0 11 5 3 5 250

3 1 1 14 5 4 0 130

3 1 2 17 5 4 1 170

3 1 3 20 5 4 2 225

SVTH: Võ Thị Vi f GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

3 2 0 14 5 4 3 275

3 2 1 17 5 4 4 350

3 2 2 20 5 4 5 425

3 3 0 17 5 5 0 250

3 3 1 20 5 5 1 350

3 4 0 20 5 5 2 550

3 4 1 25 5 5 3 900

3 5 0 25 5 5 4 1600

4 0 0 13 5 5 5 1800

4 0 1 17 - - - -

SVTH: Võ Thị Vi g GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

PHỤ LỤC C: BẢNG CÁC GIÁ THỐNG KÊ KIỂM TRA SINH HỌC XUẤT

RA TỪ PHẦN MỀM STATGRAPHIC

BẢNG CÁC GIÁ TRỊ THỐNG KÊ THỜI GIAN CHIẾT VÀ KHỐI LƯỢNG

CHIẾT ĐƯỢC TRONG DUNG MÔI N-HEXAN

Bảng tóm tắt thông tin các con số về khồi lượng dịch chiết trong dung môi

sheet2.thoi

Count Average Standard

Coeff. of

Minimum Maximum Range Stnd. skewness

gian

deviation

variation

10h

3

0.1855

0.0007

0.377358% 0.1847

0.186

0.0013 -1.11323

4h

3

0.195

0.00556776 2.85526%

0.19

0.201

0.011 0.553065

6h

3

0.2262

0.000264575 0.116965% 0.226

0.2265

0.0005 1.03086

8h

3

0.228

0.000173205 0.0759671% 0.2278

0.2281

0.0003 -1.22474

Total

12

0.208675 0.0197189

9.44957%

0.1847

0.2281

0.0434 -0.195688

MeOH

Stnd. error

sheet2.thoi

Count Mean

(pooled s) Lower limit Upper limit

gian

3

0.1855

0.0016225 0.182854

0.188146

10h

3

0.195

0.0016225 0.192354

0.197646

4h

3

0.2262

0.0016225 0.223554

0.228846

6h

3

0.228

0.0016225 0.225354

0.230646

8h

Total

12

0.208675

Với độ tin cậy 95% (mức ý nghĩa 𝜶 =0.05). Các giá trị tính được như sau:

SVTH: Võ Thị Vi h GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Bảng so sánh các giá trị trung bình và sự khác biệt giữa các cặp nghiệm thức

Level Count Mean

Homogeneous Groups

3

10h

0.1855

X

3

4h

0.195

X

3

6h

0.2262

X

3

8h

0.228

X

Contrast Sig. Difference +/- Limits

10h - 4h

*

-0.0095

0.00529127

10h - 6h

*

-0.0407

0.00529127

10h - 8h

*

-0.0425

0.00529127

4h - 6h

*

-0.0312

0.00529127

4h - 8h

*

-0.033

0.00529127

6h - 8h

-0.0018

0.00529127

Method: 95.0 percent LSD

BẢNG CÁC GIÁ TRỊ THỐNG KÊ THỜI GIAN CHIẾT VÀ KHỐI LƯỢNG

CHIẾT ĐƯỢC TRONG DUNG MÔI MEOH

Bảng tóm tắt thông tin các con số về khồi lượng dịch chiết trong dung môi

B.thoi

Count Average Standard

Coeff. of

Minimum Maximum Range Stnd.

deviation

variation

skewness

gian

0.7228

0.000264575 0.0366042% 0.7225

0.723

0.0005 -1.03086

10h

3

0.9856

0.000793725 0.0805322% 0.985

0.9865

0.0015 1.03086

4h

3

1.6666

0.000608276 0.036498% 1.6659

1.667

0.0011 -1.18761

6h

3

0.8254

0.0034176

0.414054% 0.8222

0.829

0.0068 0.367321

8h

3

Total

12

1.0501

0.38442

36.608%

0.7225

1.667

0.9445 1.52868

MeOH

SVTH: Võ Thị Vi i GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Stnd. error

B.thoi

Count Mean

(pooled s)

Lower limit Upper limit

gian

0.7228 0.00103078

0.721119

0.724481

10h

3

0.9856 0.00103078

0.983919

0.987281

4h

3

1.6666 0.00103078

1.66492

1.66828

6h

3

0.8254 0.00103078

0.823719

0.827081

8h

3

Total

12

1.0501

Với độ tin cậy 95% (mức ý nghĩa 𝜶 =0.05). Các giá trị tính được như sau:

Bảng so sánh các giá trị trung bình và sự khác biệt giữa các cặp nghiệm thức

B.thoi

Count

Mean

Homogeneous Groups

gian

10h

3

0.7228

X

8h

3

0.8254

X

4h

3

0.9856

X

6h

3

1.6666

X

Contrast

Sig.

Difference +/- Limits

*

10h - 4h

-0.2628

0.00336156

*

10h - 6h

-0.9438

0.00336156

*

10h - 8h

-0.1026

0.00336156

*

4h - 6h

-0.681

0.00336156

*

4h - 8h

0.1602

0.00336156

*

6h - 8h

0.8412

0.00336156

Method: 95.0 percent LSD

SVTH: Võ Thị Vi j GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

BẢNG CÁC GIÁ TRỊ THỐNG KÊ THỜI GIAN CHIẾT VÀ KHỐI LƯỢNG

CHIẾT ĐƯỢC TRONG DUNG MÔI ETYL AXETAT

Bảng tóm tắt thông tin các con số về khồi lượng dịch chiết trong dung môi

Thoi

Count Average Standard

Coeff. of

Minimum Maximum Range

Stnd.

gian

deviation

variation

skewness

10h

3

0.4601

0.00115326 0.250653%

0.459

0.4613

0.0023

0.273838

4h

3

0.4284

0.00144222 0.336653%

0.4272

0.0028

0.814636

0.43

6h

3

1.2735

0.00567891 0.445929%

1.2695

0.0105

1.12932

1.28

8h

3

0.82

0.0360555

4.39701%

0.78

0.07

-0.814636

0.85

1.28

Total 12

0.7455

0.356968

47.8831%

0.4272

0.8528

0.943157

MeOH

Stnd. error

thoii gian Count Mean

(pooled s)

Lower limit

Upper limit

0.4601

0.0105501

0.442897

0.477303

10h

3

0.4284

0.0105501

0.411197

0.445603

4h

3

1.2735

0.0105501

1.2563

1.2907

6h

3

0.82

0.0105501

0.802797

0.837203

8h

3

Total

12

0.7455

Với độ tin cậy 95% (mức ý nghĩa 𝜶 =0.05). Các giá trị tính được như sau:

Bảng so sánh các giá trị trung bình và sự khác biệt giữa các cặp nghiệm thức

thoii gian Count Mean

Homogeneous Groups

4h

3

0.4284

X

10h

3

0.4601

X

8h

3

0.82

X

6h

3

1.2735

X

Method: 95.0 percent LSD

SVTH: Võ Thị Vi k GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Contrast

Sig. Difference +/- Limits

10h - 4h

0.0317

0.0344059

10h - 6h

*

-0.8134

0.0344059

10h - 8h

*

-0.3599

0.0344059

4h - 6h

*

-0.8451

0.0344059

4h - 8h

*

-0.3916

0.0344059

6h - 8h

*

0.4535

0.0344059

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

* denotes a statistically significant difference.

BẢNG CÁC GIÁ TRỊ THỐNG KÊ ẢNH HƯỞNG THỂ TÍCH DUNG MÔI

CHIẾT ĐẾN KHỐI LƯỢNG DỊCH CHIẾT

Bảng tóm tắt thông tin các con số về khồi lượng dịch chiết trong dung môi n-

the tich Count Average

Standard

Coeff. of

Minimum Maximum Range Stnd.

deviation

variation

skewness

V200 3

0.24

0.01

4.16667% 0.23

0.02

0.0

0.25

V240 3

0.114

0.00173205 1.51934% 0.113

0.003

1.22474

0.116

V280 3

0.28

0.00173205 0.61859% 0.279

0.003

1.22474

0.282

V300 3

0.00666667 0.00152753 22.9129% 0.005

0.003

-0.6613

0.008

0.282

Total

12

0.160167

0.112613

70.3097% 0.005

0.277

-0.476375

hexan

Stnd. error

the tich Count Mean

(pooled s)

Lower limit

Upper limit

V200 3

0.24

0.00300463

0.235101

0.244899

V240 3

0.114

0.00300463

0.109101

0.118899

V280 3

0.28

0.00300463

0.275101

0.284899

V300 3

0.00666667

0.00300463

0.00176734

0.011566

Total

12

0.160167

Với độ tin cậy 95% (mức ý nghĩa 𝜶 =0.05). Các giá trị tính được như sau:

SVTH: Võ Thị Vi l GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Bảng so sánh các giá trị trung bình và sự khác biệt giữa các cặp nghiệm thức

the tich Count Mean

Homogeneous Groups

V300 3

0.00666667 X

V240 3

0.114

X

V200 3

0.24

X

V280 3

0.28

X

Contrast

Sig.

Difference

+/- Limits

V200 - V240

0.126

0.00979866

*

V200 - V280

-0.04

0.00979866

*

V200 - V300

0.233333

0.00979866

*

V240 - V280

-0.166

0.00979866

*

V240 - V300

0.107333

0.00979866

*

V280 - V300

0.273333

0.00979866

*

Method: 95.0 percent LSD

* denotes a statistically significant difference.

BẢNG CÁC GIÁ TRỊ THỐNG KÊ ẢNH HƯỞNG THỂ TÍCH DUNG MÔI

CHIẾT ĐẾN KHỐI LƯỢNG DỊCH CHIẾT

Bảng tóm tắt thông tin các con số về khồi lượng dịch chiết trong dung môi

E.the

Count Average

Standard

Coeff. of

Minimum Maximum Range Stnd.

tich

deviation

variation

skewness

V200

3

0.377667 0.00152753 0.404464% 0.376

0.379

0.003 -0.6613

V240

3

0.546667 0.0152753

2.79425% 0.53

0.56

0.03

-0.6613

V280

3

1.222

0.0034641

0.283478% 1.22

1.226

0.006 1.22474

V300

3

1.62

0.0264575

1.63318% 1.6

1.65

0.05 1.03086

Total

12

0.941583 0.52574

55.8357% 0.376

1.65

1.274 0.299864

MeOH

SVTH: Võ Thị Vi m GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Stnd. error

E.the

Count Mean

(pooled s)

Lower limit Upper limit

tich

0.377667 0.00888663 0.363176

0.392157

V200

3

0.546667 0.00888663 0.532176

0.561157

V240

3

1.222

0.00888663 1.20751

1.23649

V280

3

1.62

0.00888663 1.60551

1.63449

V300

3

Total

12

0.941583

Với độ tin cậy 95% (mức ý nghĩa 𝜶 =0.05). Các giá trị tính được như sau:

Bảng so sánh các giá trị trung bình và sự khác biệt giữa các cặp nghiệm thức

E.the

Count Mean

Homogeneous Groups

tich

V200

3

0.377667 X

V240

3

0.546667

X

V280

3

1.222

X

V300

3

1.62

X

Contrast

Sig. Difference

+/- Limits

V200 - V240

*

-0.169

0.028981

V200 - V280

*

-0.844333

0.028981

V200 - V300

*

-1.24233

0.028981

V240 - V280

*

-0.675333

0.028981

V240 - V300

*

-1.07333

0.028981

V280 - V300

*

-0.398

0.028981

Method: 95.0 percent LSD

* denotes a statistically significant difference.

SVTH: Võ Thị Vi n GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

BẢNG CÁC GIÁ TRỊ THỐNG KÊ ẢNH HƯỞNG THỂ TÍCH DUNG MÔI

CHIẾT ĐẾN KHỐI LƯỢNG DỊCH CHIẾT

Bảng tóm tắt thông tin các con số về khồi lượng dịch chiết trong dung môi etyl

F.the

Count Average Standard

Coeff. of

Minimum Maximum Range Stnd.

deviation

variation

skewness

tich

0.813

0.00264575 0.325431% 0.81

0.815

0.005

-1.03086

V200

3

0.72

0.01

1.38889% 0.71

0.02

0.0

0.73

V240

3

1.05333 0.0208167 1.97627% 1.03

0.04

-0.914531

1.07

V280

3

1.12

0.02

1.78571% 1.1

0.04

0.0

1.14

V300

3

1.14

Total

12

0.926583 0.172953

18.6657% 0.71

0.43

-0.0707234

axetat

Stnd. error

F.the

Count Mean

(pooled s)

Lower limit Upper limit

tich

0.813

0.00885218

0.798566

0.827434

V200

3

0.72

0.00885218

0.705566

0.734434

V240

3

1.05333

0.00885218

1.0389

1.06777

V280

3

1.12

0.00885218

1.10557

1.13443

V300

3

Total

12

0.926583

Với độ tin cậy 95% (mức ý nghĩa 𝜶 =0.05). Các giá trị tính được như sau:

Bảng so sánh các giá trị trung bình và sự khác biệt giữa các cặp nghiệm thức

F.the tich Count Mean

Homogeneous Groups

3

0.72

X

V240

3

0.813

X

V200

3

1.05333

X

V280

3

1.12

X

V300

Method: 95.0 percent LSD

SVTH: Võ Thị Vi o GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Contrast

Sig. Difference +/- Limits

V200 - V240

0.093

0.0288686

*

V200 - V280

-0.240333

0.0288686

*

V200 - V300

-0.307

0.0288686

*

V240 - V280

-0.333333

0.0288686

*

V240 - V300

-0.4

0.0288686

*

V280 - V300

-0.0666667 0.0288686

*

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

* denotes a statistically significant difference.

BẢNG THỐNG KÊ CÁC THÔNG SỐ XỬ LÝ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN

CỦA DỊCH CHIẾT20%

Count Average Standard

Coeff. of

Minimum Maximum Range Stnd.

deviation

variation

skewness

Ecoli

5.55556 0.666673 12.0001% 4.66

1.34

-1.04987

6.0

9

Sallmonella

5.77111 0.174244 3.01925% 5.58

0.42 0.896812

6.0

9

Stephylococcus 9

7.78667 1.34006

17.2096% 6.0

2.7

-1.04939

8.7

Pseu

5.75778 0.535952 9.30831% 5.0

1.3

-0.860362

6.3

9

Total

6.21778 1.19836

19.2731% 4.66

4.04 3.12014

8.7

36

Bảng tóm tắt các thông số

Source

Sum of

Df Mean Square F-Ratio P-Value

Squares

Between groups 29.7996

3

9.93319

15.53

0.0000

Within groups

20.4625

0.639452

32

35

Total (Corr.)

50.262

ANOVA Table

Stnd. error

Count Mean

(pooled s) Lower limit Upper limit

Ecoli

5.55556 0.266552 5.17163

5.93948

9

Sallmonella

5.77111 0.266552 5.38719

6.15504

9

Với độ tin cậy 95% (mức ý nghĩa 𝜶 =0.05). Các giá trị tính được như sau:

SVTH: Võ Thị Vi p GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Stephylococcus 9

7.78667 0.266552 7.40274

8.17059

Pseu

5.75778 0.266552 5.37385

6.1417

9

Total

6.21778

36

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Bảng so sánh các giá trị trung bình và sự khác biệt giữa các cặp nghiệm thức

Count Mean

Homogeneous Groups

9

Ecoli

5.55556 X

9

Pseu

5.75778 X

9

Sallmonella

5.77111 X

Stephylococcus 9

7.78667

X

Contrast

Sig. Difference

+/- Limits

Ecoli - Sallmonella

-0.215556

0.767848

Ecoli - Stephylococcus

*

-2.23111

0.767848

Ecoli - Pseu

-0.202222

0.767848

Sallmonella - Stephylococcus

*

-2.01556

0.767848

Sallmonella - Pseu

0.0133333

0.767848

Stephylococcus - Pseu

*

2.02889

0.767848

Method: 95.0 percent LSD

BẢNG THỐNG KÊ CÁC THÔNG SỐ XỬ LÝ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN

CỦA DỊCH CHIẾT 40%

Count Average Standard

Coeff. of

Minimum Maximum Range Stnd.

deviation

variation

skewness

H.EColi

6.71556 0.724502 10.7884% 6.2

9

1.49 1.03526

7.69

Salmonella

7.21889 0.350765 4.85899% 6.88

9

0.79 0.757548

7.67

Stephyloccus 9

8.04111 0.953342 11.8559% 6.66

2.04

-1.09537

8.7

H.Pseu

6.22667 0.596322 9.57691% 5.68

9

1.32 0.800529

7.0

Total

7.05056 0.948746 13.4563% 5.68

36

3.02 1.08272

8.7

Bảng tóm tắt các thông số

SVTH: Võ Thị Vi q GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn

Nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch chiết hạt quả bơ và ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi

Source

Sum of

Df Mean

F-Ratio

P-Value

Squares

Square

Between

16.205

3

5.40166

11.30

0.0000

groups

Within groups 15.2992

32 0.4781

Total (Corr.) 31.5042

35

ANOVA Table

Stnd. error

Count Mean

(pooled s) Lower

Upper limit

limit

H.EColi

6.71556 0.230483

6.38358

7.04753

9

Salmonella

7.21889 0.230483

6.88692

7.55086

9

Stephyloccus 9

8.04111 0.230483

7.70914

8.37308

H.Pseu

6.22667 0.230483

5.8947

6.55864

9

Total

7.05056

36

Với độ tin cậy 95% (mức ý nghĩa 𝜶 =0.05). Các giá trị tính được như sau:

Count Mean Homogeneous Groups

9

H.Pseu

6.22667 X

9

H.EColi

6.71556 XX

9

Salmonella

7.21889 X

Stephyloccus 9

8.04111 X

Contrast

Sig. Difference +/- Limits

H.EColi - Salmonella

-0.503333 0.663943

H.EColi - Stephyloccus

*

-1.32556

0.663943

H.EColi - H.Pseu

0.488889 0.663943

Salmonella - Stephyloccus *

-0.822222 0.663943

Salmonella - H.Pseu

0.992222 0.663943

*

Stephyloccus - H.Pseu

1.81444

0.663943

*

Bảng so sánh các giá trị trung bình và sự khác biệt giữa các cặp nghiệm thức

SVTH: Võ Thị Vi r GVHD: Th.S Lâm Vĩnh Sơn